BR102022002426A2

BR102022002426A2 - ADJUVANT NANOPARTICLES FOR USE IN VACCINE COMPOSITIONS

Info

Publication number: BR102022002426A2
Application number: BR102022002426-0A
Authority: BR
Inventors: Luiz Felipe Leomil Coelho; Luiz Cosme Cotta Malaquias; Gabriel Augusto Pires De Souza; João Carlos Vilela Vieira Júnior; Luciana Froes Goulart
Original assignee: Universidade Federal De Alfenas - Unifal-Mg; Fundação De Amparo À Pesquisa Do Estado De Minas Gerais - Fapemig
Filing date: 2022-02-09
Publication date: 2023-08-22

Abstract

A presente invenção refere-se a nanopartículas adjuvantes compostas de albumina sérica bovina associada ao ácido poliinosínico-policitidílico. Essas nanopartículas funcionam como adjuvantes imunológicos e podem ser administradas sozinhas ou coadministradas com antígenos em composições de vacinas. Portanto, essas nanopartículas podem compor diferentes formulações vacinais ou imunobiológicos que visam prevenir doenças ou tratar infecciosas e tumores uma vez que possuem capacidade adjuvante.

The present invention relates to adjuvant nanoparticles composed of bovine serum albumin associated with polyinosinic-polycytidylic acid. These nanoparticles function as immunological adjuvants and can be administered alone or co-administered with antigens in vaccine compositions. Therefore, these nanoparticles can form different vaccine or immunobiological formulations that aim to prevent diseases or treat infectious diseases and tumors since they have adjuvant capacity.

Description

ADJUVANT NANOPARTICLES FOR USE IN VACCINE COMPOSITIONS

Field of invention

[001] A invenção se refere à nanopartículas adjuvantes de albumina sérica bovina associada ao ácido poliinosínico-policitidílico para uso em composições de vacinas. Portanto, a invenção se refere aos campos de imunologia, vacinologia e nanotecnologia.[001] The invention relates to bovine serum albumin adjuvant nanoparticles associated with polyinosinic-polycytidylic acid for use in vaccine compositions. Therefore, the invention relates to the fields of immunology, vaccinology and nanotechnology.

Fundamentals of the invention

[002] A vacinação emergiu como a descoberta médica mais eficaz e economicamente viável para melhorar a saúde pública. O uso de vacinas salvou e ainda salva milhões de vidas em todo o mundo. Certas doenças como varíola, poliomielite e sarampo foram erradicadas ou controladas através da vacinação (ORENSTEIN e AHMED, 2017). As vacinas representam a estratégia de intervenção com a melhor relação custo-benefício aplicada em saúde pública. Avanços biotecnológicos em diversas áreas de pesquisa têm contribuído para o desenvolvimento de formulações mais seguras e eficazes. Além disso, a aplicação de ferramentas biotecnológicas no desenvolvimento de vacinas tem provocado mudanças na maneira como se pensa e produz esses reagentes tanto para uso em humanos como em animais. Apesar do notável sucesso da vacinação contra alguns tipos de doenças, ainda existem várias doenças infecciosas para as quais as vacinas ainda não estão disponíveis.[002] Vaccination has emerged as the most effective and economically viable medical discovery to improve public health. The use of vaccines saved and still saves millions of lives around the world. Certain diseases such as smallpox, polio and measles have been eradicated or controlled through vaccination (ORENSTEIN and AHMED, 2017). Vaccines represent the intervention strategy with the best cost-benefit ratio applied in public health. Biotechnological advances in several areas of research have contributed to the development of safer and more effective formulations. Furthermore, the application of biotechnological tools in the development of vaccines has caused changes in the way these reagents are thought of and produced for use in both humans and animals. Despite the remarkable success of vaccination against some types of diseases, there are still a number of infectious diseases for which vaccines are not yet available.

[003] Para que uma vacina seja efetiva é necessário, em muitas ocasiões a administração de uma substância que possa intensificar ou otimizar a resposta imune ao antígeno a ser administrado. Essas moléculas auxiliadoras foram denominadas de adjuvantes. Originalmente os adjuvantes foram descritos como substâncias potencializadoras da resposta imune a um antígeno. Essas substâncias são capazes de aumentar a resposta imune específica e auxiliar o antígeno a desencadear uma resposta imune precoce, elevada e duradoura (AWATE, BABIUK e MUTWIRI, 2013). Muita atenção tem sido dispensada aos adjuvantes em razão do desenvolvimento de vacinas compostas de proteínas purificadas ou que utilizam subunidades de antígenos. Essas componentes vacinais geralmente se apresentam como fracos imunógenos, requerendo adjuvantes para desencadear uma resposta imunológica protetora (AZMI et al., 2014). Os adjuvantes podem ser usados para o aumento da imunogenicidade, diminuição da dosagem essencial de antígeno, aceleração da resposta imune, redução do número de imunizações recomendadas, aumento da duração da proteção, ou ainda, para a otimização da eficiência da imunização em indivíduos classificados como respondedores fracos. Os adjuvantes podem ser de substâncias naturais ou sintéticas e divididas em duas principais classes com base em seu mecanismo de ação: os adjuvantes carreadores e os imunoestimulatórios (REED, ORR e FOX, 2013).[003] For a vaccine to be effective, it is often necessary to administer a substance that can intensify or optimize the immune response to the antigen to be administered. These helper molecules were called adjuvants. Originally, adjuvants were described as substances that enhance the immune response to an antigen. These substances are capable of increasing the specific immune response and helping the antigen to trigger an early, high and long-lasting immune response (AWATE, BABIUK and MUTWIRI, 2013). Much attention has been paid to adjuvants due to the development of vaccines composed of purified proteins or that use antigen subunits. These vaccine components generally present themselves as weak immunogens, requiring adjuvants to trigger a protective immune response (AZMI et al., 2014). Adjuvants can be used to increase immunogenicity, reduce essential antigen dosage, accelerate the immune response, reduce the number of recommended immunizations, increase the duration of protection, or even to optimize the efficiency of immunization in individuals classified as weak responders. Adjuvants can be natural or synthetic substances and divided into two main classes based on their mechanism of action: carrier adjuvants and immunostimulatory adjuvants (REED, ORR and FOX, 2013).

[004] Diversos mecanismos de ação são apresentados pelos adjuvantes e devem ser selecionados com base na rota de administração e na imunidade requerida pelo tipo de vacina particular (imunidade humoral, celular ou de mucosa). Os adjuvantes podem ser agrupados por sua capacidade de gerar eventos imunológicos necessários para induzir a resposta imune desejada. Os adjuvantes podem exibir seus efeitos imunoestimuladores através dos seguintes mecanismos: 1) fornecer um depósito de antígeno no local de administração favorecendo a constante liberação do antígeno e reconhecimento do mesmo por células apresentadoras de antígenos (APCs); 2) ativação da imunidade inata através do envolvimento de receptores de reconhecimento de patógenos (PRRs); 3) ativação de sinais responsáveis pela co-estimulação de células imunes e 4) capacidade de imunomodulação e maturação de APCs (AZMI et al., 2014).[004] Several mechanisms of action are presented by adjuvants and must be selected based on the route of administration and the immunity required by the particular type of vaccine (humoral, cellular or mucosal immunity). Adjuvants can be grouped by their ability to generate immunological events necessary to induce the desired immune response. Adjuvants can exhibit their immunostimulatory effects through the following mechanisms: 1) provide a deposit of antigen at the site of administration, favoring the constant release of the antigen and its recognition by antigen-presenting cells (APCs); 2) activation of innate immunity through the involvement of pathogen recognition receptors (PRRs); 3) activation of signals responsible for costimulation of immune cells and 4) immunomodulation capacity and maturation of APCs (AZMI et al., 2014).

[005] O adjuvante mais apropriado para cada vacina depende amplamente do tipo de resposta imune necessária para o estabelecimento de imunidade protetora. Desta forma, o estudo das características inflamatórias dos adjuvantes é importante na interpretação de sua capacidade de indução imunogênica e no entendimento dos efeitos colaterais associados ao seu uso (APOSTÓLICO et al., 2016).[005] The most appropriate adjuvant for each vaccine largely depends on the type of immune response necessary to establish protective immunity. Therefore, the study of the inflammatory characteristics of adjuvants is important in interpreting their immunogenic induction capacity and understanding the side effects associated with their use (APOSTÓLICO et al., 2016).

[006] Nanopartículas (NPs) são definidas como dispersões particuladas ou partículas sólidas com tamanho entre 10-1000 nm que podem servir como sistema de entrega de fármacos ou adjuvantes em vacinas sendo utilizadas em tratamentos de câncer, diabetes, alergias, infecções e inflamação (CHOW e HO, 2013). Dentre as razões que fazem as NPs serem usadas em tratamentos é o fato de possuírem grande área de superfície e possuir rápida absorção e liberação (MOHANRAJ e CHEN, 2006). Nanopartículas são estruturas microscópicas que apresentam medidas na faixa de tamanho em torno de 1nm a 100nm (VERT et al., 2012). Existem diferentes tipos de nanopartículas, que podem ser compostas por metais inorgânicos, tais como o ouro, a prata e o carbono. Outras podem ser compostas por óxidos metálicos, tais como o óxido de titânio e o de ferro. Já as nanopartículas biodegradáveis podem ser compostas de materiais orgânicos, tais como lipídeos, proteínas e polissacarídeos, ou por polímeros inorgânicos, tais como o poliestireno. Regularmente as nanopartículas têm sido utilizadas como sistemas de entrega de antígenos ou carreadores vacinais, pois elas podem proteger o imunógeno carreado de fatores que induzem a sua decomposição. Além disso, podem ampliar a administração da vacina favorecendo a absorção destas pelo epitélio e disposição intracelular do imunógeno, acelerando ou melhorando a resposta imune (KHEIROLLAHPOUR et al., 2020).[006] Nanoparticles (NPs) are defined as particulate dispersions or solid particles with a size between 10-1000 nm that can serve as a delivery system for drugs or adjuvants in vaccines being used in treatments for cancer, diabetes, allergies, infections and inflammation ( CHOW and HO, 2013). One of the reasons why NPs are used in treatments is the fact that they have a large surface area and rapid absorption and release (MOHANRAJ and CHEN, 2006). Nanoparticles are microscopic structures that range in size from around 1nm to 100nm (VERT et al., 2012). There are different types of nanoparticles, which can be composed of inorganic metals, such as gold, silver and carbon. Others may be composed of metallic oxides, such as titanium and iron oxides. Biodegradable nanoparticles can be composed of organic materials, such as lipids, proteins and polysaccharides, or inorganic polymers, such as polystyrene. Nanoparticles have regularly been used as antigen delivery systems or vaccine carriers, as they can protect the immunogen carried from factors that induce its decomposition. Furthermore, they can expand the administration of the vaccine, favoring its absorption by the epithelium and intracellular disposition of the immunogen, accelerating or improving the immune response (KHEIROLLAHPOUR et al., 2020).

[007] As NPs vêm sendo produzidas e utilizadas em uma ampla gama de produtos em todo o mundo. NPs têm sido ativamente investigadas quanto à administração de antibióticos, ácidos nucléicos, peptídeos/proteínas e quimioterapêuticos. A nanotecnologia pode desenvolver NPs capazes de carrear moléculas imunomoduladoras naturais e/ou sintéticas, que irão fornecer não apenas uma entrega melhorada de antígenos (direcionando APCs e agindo como um depósito de antígenos), mas também tem um papel importante no início da imunidade, ou seja, o efeito adjuvante (YADAV et al., 2018). Em suma, NPs podem ser usadas como plataformas vacinais ou sistemas adjuvantes, pois são capazes de melhorar a apresentação e processamento de antígenos. A modificação das superfícies das NPs com diferentes moléculas de direcionamento (ex: ligantes de receptores expressos em células imunes) permite a entrega de antígenos às APCs, estimulando assim, respostas imunes seletivas e específicas (KHEIROLLAHPOUR et al., 2020).As NPs podem ainda proteger os antígenos vacinais contra a degradação rápida e aumentando a captação celular do antígeno por células imunes do sistema imune inato. Uma das características mais desejadas dessas formulações é sua funcionalidade como um depósito de adjuvantes e antígenos, o qual pode permitir uma estimulação imunológica sustentada (GREGORY, TITBALL e WILLIAMSON, 2013).[007] NPs have been produced and used in a wide range of products around the world. NPs have been actively investigated for the delivery of antibiotics, nucleic acids, peptides/proteins, and chemotherapeutics. Nanotechnology can develop NPs capable of carrying natural and/or synthetic immunomodulatory molecules, which will not only provide improved antigen delivery (targeting APCs and acting as an antigen depot), but also have an important role in initiating immunity, or that is, the adjuvant effect (YADAV et al., 2018). In short, NPs can be used as vaccine platforms or adjuvant systems, as they are capable of improving antigen presentation and processing. Modifying the surfaces of NPs with different targeting molecules (e.g., receptor ligands expressed on immune cells) allows the delivery of antigens to APCs, thus stimulating selective and specific immune responses (KHEIROLLAHPOUR et al., 2020). further protecting vaccine antigens against rapid degradation and increasing cellular uptake of the antigen by immune cells of the innate immune system. One of the most desired characteristics of these formulations is their functionality as a depot of adjuvants and antigens, which can allow sustained immunological stimulation (GREGORY, TITBALL and WILLIAMSON, 2013).

[008] As NPs podem ser projetadas especificamente para atingir interações com o sistema imunológico. Essa vantagem é atribuída ao tamanho de partícula em nanoescala que facilita ao reconhecimento e a captação do antígeno pelas células fagocíticas, e desta forma, facilita também o processo de apresentação de antígenos. A interação das NPs com os antígenos pode ser realizada de três maneiras diferentes: conjugação (ligação covalente), adsorção (na superfície das nanopartículas) e encapsulamento (dentro das nanopartículas).[008] NPs can be specifically designed to achieve interactions with the immune system. This advantage is attributed to the nanoscale particle size that facilitates the recognition and uptake of antigen by phagocytic cells, and thus also facilitates the process of antigen presentation. The interaction of NPs with antigens can be carried out in three different ways: conjugation (covalent bond), adsorption (on the surface of the nanoparticles) and encapsulation (inside the nanoparticles).

[009] Sistemas de entrega baseados em nanocarreadores são capazes de proteger os antígenos da degradação enzimática, de melhorar a estabilidade da formulação vacinal e também por possuir propriedades adjuvantes. As NPs podem ainda serem manipuladas para otimizar a resposta imune contra o antígeno através da indução de uma resposta específica de células apresentadoras de antígenos (ZAMAN, GOOD e TOTH, 2013; PATI, SHEVTSOV e SONAWANE, 2018). Os antígenos de interesse podem ser encapsulados dentro dos nanocarreadores ou serem adsorvidos à sua superfície. Já a adsorção superficial de antígenos e outros imunoestimuladores (por exemplo os ligantes de receptores do tipo toll) podem facilitar o processamento do antígeno e a ativação das células apresentadoras de antígenos. Essas alternativas podem resultar em uma ativação mais robusta da imunidade celular e humoral, tanto a nível sistêmico como localizado (imunidade de mucosa) se comparadas com o antígeno não-conjugado (PATI, SHEVTSOV e SONAWANE, 2018; VIJAYAN et al., 2019)[009] Delivery systems based on nanocarriers are capable of protecting antigens from enzymatic degradation, improving the stability of the vaccine formulation and also possessing adjuvant properties. NPs can also be manipulated to optimize the immune response against the antigen by inducing a specific response from antigen-presenting cells (ZAMAN, GOOD and TOTH, 2013; PATI, SHEVTSOV and SONAWANE, 2018). The antigens of interest can be encapsulated within the nanocarriers or adsorbed to their surface. The surface adsorption of antigens and other immunostimulators (for example, toll-like receptor ligands) can facilitate antigen processing and the activation of antigen-presenting cells. These alternatives can result in a more robust activation of cellular and humoral immunity, both at a systemic and localized level (mucosal immunity) compared to non-conjugated antigen (PATI, SHEVTSOV and SONAWANE, 2018; VIJAYAN et al., 2019)

[010] O descobrimento dos receptores para o reconhecimento de padrões de microrganismos (PRRs), tais como os receptores Toll-like (TLRs) e os receptores de oligomerização de ligação de nucleotídeos (NOD), impactaram o desenvolvimento de novos adjuvantes capazes de produzir respostas imunes celulares necessárias para combater patógenos e células cancerosas. A interação dos PRRs com seus ligantes é capaz de influenciar as respostas imunes inata e adaptativa. Os TLRs podem ser expressos em na superfície celular (TLRs 1, 2, 4, 5 e 6) e meio intracelular (TLRs 3, 7, 8 e 9) (AKIRA, UEMATSU e TAKEUCHI, 2006).[010] The discovery of microorganism pattern recognition receptors (PRRs), such as Toll-like receptors (TLRs) and nucleotide-binding oligomerization receptors (NOD), impacted the development of new adjuvants capable of producing cellular immune responses needed to fight pathogens and cancer cells. The interaction of PRRs with their ligands is capable of influencing innate and adaptive immune responses. TLRs can be expressed on the cell surface (TLRs 1, 2, 4, 5 and 6) and intracellularly (TLRs 3, 7, 8 and 9) (AKIRA, UEMATSU and TAKEUCHI, 2006).

[011] Receptores do tipo NOD ou receptores similares ao domínio de oligomerização ligante de nucleotídeo (NLRs), são receptores intracelulares, que possuem a capacidade de reconhecer padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), em virtude da entrada de patógenos por fagocitose ou por meio de poros na membrana. Além disso, são capazes de reconhecer padrões moleculares associados a danos (DAMPs), estes amplamente relacionados ao estresse celular (MAHLA et al., 2013).[011] NOD-type receptors or receptors similar to the nucleotide-binding oligomerization domain (NLRs), are intracellular receptors, which have the ability to recognize pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), due to the entry of pathogens by phagocytosis or by through pores in the membrane. Furthermore, they are capable of recognizing damage-associated molecular patterns (DAMPs), which are broadly related to cellular stress (MAHLA et al., 2013).

[012] Os ligantes de TLRs são identificados por possuírem a habilidade de induzir a maturação de DCs, tendo como consequência a expressão de moléculas coestimuladoras e citocinas pró-inflamatórias (GIL-TORREGROSA et al., 2004). Muitos adjuvantes, sob investigação ou aprovados para sua aplicabilidade em formulações vacinais são ligantes de TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 ou TLR9, pois se assemelham aos PAMP bacteriano ou ao PAMP viral. De todos os TLRs, os que estão abrangidos no reconhecimento de ácidos nucléicos, tais como TLR3 e TLR7, são encontrados em compartimentos endolisossomais, (HU et al., 2016) e são, portanto, excelentes moléculas a serem usadas na composição de nanopartículas com potencial adjuvante ou vacinação. O trabalho de (LYNN et al., 2015), demonstrou a importância de combinar ligantes de TLR em nanopartículas como forma de induzir um aumento das respostas aos estímulos vacinais. Essa abordagem pode ser interessante para induzir imunidade protetora contra várias doenças, tais como influenza (NEMBRINI et al., 2011), câncer (HAMDY et al., 2008), hepatite B (CHONG et al., 2005) e encefalite do Nilo Ocidental (DEMENTO et al., 2010).[012] TLR ligands are identified as having the ability to induce the maturation of DCs, resulting in the expression of co-stimulatory molecules and pro-inflammatory cytokines (GIL-TORREGROSA et al., 2004). Many adjuvants, under investigation or approved for their applicability in vaccine formulations, are ligands for TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 or TLR9, as they resemble bacterial PAMP or viral PAMP. Of all TLRs, those involved in the recognition of nucleic acids, such as TLR3 and TLR7, are found in endolysosomal compartments, (HU et al., 2016) and are, therefore, excellent molecules to be used in the composition of nanoparticles with potential adjuvant or vaccination. The work of (LYNN et al., 2015) demonstrated the importance of combining TLR ligands in nanoparticles as a way of inducing an increase in responses to vaccine stimuli. This approach could be interesting to induce protective immunity against various diseases, such as influenza (NEMBRINI et al., 2011), cancer (HAMDY et al., 2008), hepatitis B (CHONG et al., 2005) and West Nile encephalitis. (DEMENTO et al., 2010).

[013] Várias nanopartículas, compostas por diversos polímeros e associadas ao poli (I:C) tiveram sua ação imunoestimulatória comprovada. Nanopartículas magnéticas carreadoras de ovalbumina e associadas a ligantes de TLR3 poli (I:C), TLR7 (imiquimode) foram capazes de induzir resposta immune otimizada em modelo animal de melanoma (GONDAN et al., 2018). Segundo (JEWELL, LÓPEZ e IRVINE, 2011), as micropartículas que carregam o poli (I:C), são imunogênicas, pois possuem habilidade de gerar um depósito extracelular que possibilita a liberação equilibrada e exposição duradoura do agonista de TLR3 no tecido. Nanoparticulas de fosfato de cálcio contendo poli (I:C) também foram capazes de induzir um efeito imunoestimulatório em ensaios in vitro e in vivo (SOKOLOVA., 2017).[013] Several nanoparticles, composed of different polymers and associated with poly (I:C) have had their immunostimulatory action proven. Magnetic nanoparticles carrying ovalbumin and associated with TLR3 poly (I:C) ligands, TLR7 (imiquimod) were able to induce an optimized immune response in an animal model of melanoma (GONDAN et al., 2018). According to (JEWELL, LÓPEZ and IRVINE, 2011), the microparticles that carry poly (I:C) are immunogenic, as they have the ability to generate an extracellular deposit that allows the balanced release and long-lasting exposure of the TLR3 agonist in the tissue. Calcium phosphate nanoparticles containing poly (I:C) were also able to induce an immunostimulatory effect in in vitro and in vivo assays (SOKOLOVA., 2017).

[014] As albuminas do soro são as proteínas mais abundantes no plasma sanguíneo e correspondem a 60% do seu total de proteínas. São frequentemente utilizadas como proteínas-modelo para muitos estudos bioquímicos, físicoquímicos e biofísicos (GELAMO et al., 2002). A albumina pode ser utilizada como veículo para agentes terapêuticos, melhorando o perfil farmacocinético do fármaco, de modo que um grande número de terapias baseadas em albumina está atualmente na fase clínica de testes (WEISSIG, PETTINGER e MURDOCK, 2014). A albumina sérica tem sido considerada um material promissor para produzir nanopartículas para uso em bioimagem e administração de medicamentos (AN e ZHANG, 2017). Albumina foi uma das primeiras moléculas de escolha em sistemas carreadores de fármacos. A albumina é um polímero natural, biocompatível, biodegradável, não tóxico e não imunogênico e, em razão dessas características são prósperos sistemas de aplicação de fármacos ou antígenos (ELZOGHBY, SAMY e ELGINDY, 2012).[014] Serum albumins are the most abundant proteins in blood plasma and correspond to 60% of its total proteins. They are frequently used as model proteins for many biochemical, physicochemical and biophysical studies (GELAMO et al., 2002). Albumin can be used as a vehicle for therapeutic agents, improving the pharmacokinetic profile of the drug, so that a large number of albumin-based therapies are currently in the clinical testing phase (WEISSIG, PETTINGER and MURDOCK, 2014). Serum albumin has been considered a promising material to produce nanoparticles for use in bioimaging and drug delivery (AN and ZHANG, 2017). Albumin was one of the first molecules of choice in drug carrier systems. Albumin is a natural, biocompatible, biodegradable, non-toxic and non-immunogenic polymer and, due to these characteristics, it is a thriving delivery system for drugs or antigens (ELZOGHBY, SAMY and ELGINDY, 2012).

[015] Estudos com NPs contendo BSA (NPVs) apontam que estas são boas carreadoras de fármacos, liberando os medicamentos conjugados nos locais de interesse e aumentando a concentração da droga no tecido. A albumina tem sido uma das primeiras moléculas de escolha em sistemas carreadores de fármacos e foi uma das primeiras NPs aprovadas pela agência de Administração de Medicamentos e Alimentos dos Estados Unidos (USFDA) (ZU et al., 2009; ZHAO et al., 2010). A BSA tem sido utilizada para preparação de NPs devido a sua estrutura primária bem definida em conjunto com a vantagem de permitir a modificação da sua superfície. Essa proteína oferece vários locais alvo para modificação covalente, tais como grupos amino livres. Além disso, a técnica de preparo das NPVs já está bem estabelecida (KOUCHAKZADEH et al., 2010).[015] Studies with NPs containing BSA (NPVs) indicate that they are good drug carriers, releasing the conjugated drugs at the sites of interest and increasing the concentration of the drug in the tissue. Albumin has been one of the first molecules of choice in drug carrier systems and was one of the first NPs approved by the United States Food and Drug Administration (USFDA) (ZU et al., 2009; ZHAO et al., 2010 ). BSA has been used to prepare NPs due to its well-defined primary structure together with the advantage of allowing surface modification. This protein offers several target sites for covalent modification, such as free amino groups. Furthermore, the technique for preparing NPVs is already well established (KOUCHAKZADEH et al., 2010).

[016] As NPVs já são utilizadas por indústrias farmacêuticas como carreadoras e sistema de liberação de fármacos em tratamentos, principalmente contra câncer devido sua alta estabilidade em estoque e in vivo, alta capacidade de ligação com substâncias, atoxicidade, reprodutibilidade e facilidade no aumento de escala durante a produção (KOUCHAKZADEH et al., 2015).[016] NPVs are already used by pharmaceutical industries as carriers and drug release systems in treatments, mainly against cancer due to their high stability in stock and in vivo, high binding capacity with substances, non-toxicity, reproducibility and ease in increasing scale during production (KOUCHAKZADEH et al., 2015).

[017] Estratégias para desenvolver novos veículos de entrega são críticas no desenvolvimento de novos adjuvantes vacinais. Nanopartículas que encapsulam antígenos e adjuvantes são veículos promissores para fornecer antígenos e sinais ativadores para as células apresentadoras de antígeno (APCs), permitindo respostas imunes ideais contra um patógeno específico (KHEIROLLAHPOUR et al., 2020).[017] Strategies to develop new delivery vehicles are critical in the development of new vaccine adjuvants. Nanoparticles that encapsulate antigens and adjuvants are promising vehicles for delivering antigens and activating signals to antigen-presenting cells (APCs), enabling optimal immune responses against a specific pathogen (KHEIROLLAHPOUR et al., 2020).

[018] O ácido polinossinico-policitidílico poli (I:C)] é um análogo sintético do RNA de fita dupla (dsRNA). O dsRNA é um padrão molecular associado à infecção viral que é reconhecido por receptores de padrão molecular. O poli (I:C) ativa os receptores de reconhecimento de padrões TLR3, RIG-I/MDA5 e PKR, induzindo assim a sinalização por várias vias inflamatórias, incluindo as vias de indução da ativação do NF-kB e dos fatores regulatórios de interferon (IRF). O poli (I:C) pode estimular a liberação de citocinas inflamatórias e, ao induzir a produção de interferon-gama, pode aumentar o número e as atividades tumoricidas de várias células imunológicas (PALCHETTI et al., 2015). É sabido também que essa molécula pode influenciar a maturação de células dendríticas, modificando o fenótipo imaturo para maduro e contribuindo dessa forma, para uma melhor ativação de células T e melhor resposta do sistema imunológico.[018] Polynosinic-polycytidylic acid poly (I:C)] is a synthetic analogue of double-stranded RNA (dsRNA). dsRNA is a molecular pattern associated with viral infection that is recognized by molecular pattern receptors. Poly(I:C) activates the pattern recognition receptors TLR3, RIG-I/MDA5 and PKR, thereby inducing signaling through several inflammatory pathways, including the pathways inducing the activation of NF-kB and interferon regulatory factors (IRF). Poly (I:C) can stimulate the release of inflammatory cytokines and, by inducing the production of interferon-gamma, can increase the number and tumoricidal activities of various immune cells (PALCHETTI et al., 2015). It is also known that this molecule can influence the maturation of dendritic cells, changing the immature phenotype to a mature one and thus contributing to better activation of T cells and a better immune system response.

[019] O documento WO2020136657A1 descreve nanopartículas poliméricas adjuvantes para serem utilizadas em vacinas, em particular as produzidas a partir de pelo menos um polímero selecionado do grupo que consiste em poli (ácido lático-co-glicólico) (PLGA), Polietilenoglicol-PLGA (PEG-PLGA), Poli (ácido láctico) (PLA), PEG-PLA, Policaprolactona (PCL) e PEG-PCL.[019] Document WO2020136657A1 describes polymeric nanoparticle adjuvants for use in vaccines, in particular those produced from at least one polymer selected from the group consisting of poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA), Polyethylene glycol-PLGA ( PEG-PLGA), Poly(lactic acid) (PLA), PEG-PLA, Polycaprolactone (PCL) and PEG-PCL.

[020] O documento PI0621185- 2 A2 é reinvidicado uma composição imunogênica que compreende um adjuvante baseado no ácido polirriboinosínicopolirribocitidílico em combinação com antibiótico, íon positivo e um antígeno. No entanto, o documento reinvindica a composição imunogênica adjuvante a base de ácido polirriboinosínico-polirribocitidílico, sem descrever de forma específica o uso de nanopartículas associadas à essa molécula.[020] Document PI0621185-2 A2 claims an immunogenic composition comprising an adjuvant based on polyriboinosinic polyribocytidylic acid in combination with an antibiotic, positive ion and an antigen. However, the document claims the adjuvant immunogenic composition based on polyriboinosinic-polyribocytidylic acid, without specifically describing the use of nanoparticles associated with this molecule.

[021] No documento PI 0415574-2 A, os inventores reivindicam nanopartículas construídas a partir de compostos tensoativos, principalmente lipídeos, para o uso dessas como vetores de princípios ativos terapêuticos, para uso no diagnóstico, para uso em vacinas ou em cosméticos, sem citar especificamente quais princípios seriam esses.[021] In document PI 0415574-2 A, the inventors claim nanoparticles constructed from surfactant compounds, mainly lipids, for their use as vectors of therapeutic active ingredients, for use in diagnosis, for use in vaccines or in cosmetics, without specifically mention what these principles would be.

[022] O documento US10265407 B2 é reivindicado uma composição vacinal baseada em nanopartículas poliméricas que podem ativar o sistema imunológico. Essas nanopartículas devem estar associadas a um ou mais antígenos e adjuvantes, porém o documento não faz menção de forma específica qual o tipo de polímero a ser utilizado e quais as moléculas a serem incorporadas nas nanopartículas.[022] Document US10265407 B2 claims a vaccine composition based on polymeric nanoparticles that can activate the immune system. These nanoparticles must be associated with one or more antigens and adjuvants, however the document does not specifically mention the type of polymer to be used and which molecules will be incorporated into the nanoparticles.

[023] O documento AU2020103603A4 é reivindicado nanopavacinas miméticas para o vírus influenza caracterizada por partículas de ouro revestidas polímeros catiônicos fluorados capazes de entregar vacina de DNA.[023] Document AU2020103603A4 claims mimetic nanovaccines for the influenza virus characterized by gold particles coated with fluorinated cationic polymers capable of delivering DNA vaccine.

[024] O objetivo da presente invenção consiste em nanopartículas de albumina sérica bovina associadas ao ácido poliinosínico-policitidílico com ação adjuvante e que, portanto, possam ser usadas na preparação de composições de vacinas destinadas ao tratamento ou prevenção de doenças.[024] The objective of the present invention consists of bovine serum albumin nanoparticles associated with polyinosinic-polycytidylic acid with adjuvant action and which, therefore, can be used in the preparation of vaccine compositions intended for the treatment or prevention of diseases.

[025] Os adjuvantes são substâncias que aumentam a resposta do organismo (humano ou animal) a um estímulo antigênico e por serem extremamente úteis no desenvolvimento de vacinas são amplamente utilizados na composição de vacinas para uso humano e veterinário. Várias vacinas necessitam da inclusão de adjuvantes em sua composição, de forma a induzir uma resposta imune mais robusta do organismo frente a um antígeno e dessa forma induzir proteção sustentada pela formação de memória imunológica. Existem poucos adjuvantes no mercado, os quais podem induzir reações adversas e ainda serem de custo elevado. Um adjuvante é uma substância adicionada a uma vacina para estimular e aumentar a magnitude e a durabilidade da resposta imune. O desenvolvimento de novos adjuvantes para vacinas é lento e ainda existem poucas substâncias aprovadas e, portanto a presente invenção contribui para a deficiência existente no mercado, pois acrescenta mais uma opção de uso de adjuvantes em vacinas para prevenção de doenças em animais e homem. Por mais de sete décadas, desde o seu licenciamento inicial na década de 1920, os sais insolúveis de alumínio (alúmen) permaneceram como uma das únicas opções de adjuvante a ser incluído nas mais diversas vacinas. Somente em 1990, o adjuvante de emulsão de óleo em água MF59 foi incluído na composição de vacinas licenciadas para uso na Europa (influenza sazonal indicada para adultos com mais de 65 anos de idade). Outros adjuvantes foram desenvolvidos nos anos seguintes, tais como o AS0, AS04, AS03 e citosina fosfoguanosina (CpG) 1018. Embora muitos outros adjuvantes tenham demonstrado alta potência e efetividade em modelos pré-clínicos, a maioria ainda não obteve licença em humanos, muitas vezes devido a questões de segurança ou tolerabilidade. Além disso, apesar de seu uso difundido, os mecanismos moleculares pelos quais os adjuvantes disponíveis - incluindo alúmen, MF59 e os adjuvantes do Sistema de Adjuvante AS0 - realmente funcionam em humanos não são bem compreendidos.[025] Adjuvants are substances that increase the organism's response (human or animal) to an antigenic stimulus and because they are extremely useful in the development of vaccines, they are widely used in the composition of vaccines for human and veterinary use. Several vaccines require the inclusion of adjuvants in their composition, in order to induce a more robust immune response from the body against an antigen and thus induce protection sustained by the formation of immunological memory. There are few adjuvants on the market, which can induce adverse reactions and are still expensive. An adjuvant is a substance added to a vaccine to stimulate and increase the magnitude and durability of the immune response. The development of new adjuvants for vaccines is slow and there are still few approved substances and, therefore, the present invention contributes to the existing deficiency on the market, as it adds another option for using adjuvants in vaccines to prevent diseases in animals and humans. For more than seven decades, since its initial licensing in the 1920s, insoluble aluminum salts (alum) remained one of the only adjuvant options to be included in the most diverse vaccines. Only in 1990, the oil-in-water emulsion adjuvant MF59 was included in the composition of vaccines licensed for use in Europe (seasonal influenza indicated for adults over 65 years of age). Other adjuvants were developed in the following years, such as AS0, AS04, AS03 and cytosine phosphoguanosine (CpG) 1018. Although many other adjuvants have demonstrated high potency and effectiveness in preclinical models, most have not yet been licensed in humans, many sometimes due to safety or tolerability concerns. Furthermore, despite their widespread use, the molecular mechanisms by which available adjuvants—including alum, MF59, and the AS0 Adjuvant System adjuvants—actually work in humans are not well understood.

[026] Assim sendo, a presente invenção é importante para que possa aumentar a gama de adjuvantes no mercado, uma vez que existem poucas opções e dentre as atuais, existem problemas em relação à toxicidade e indução de reações adversas. O uso dessas nanopartículas com capacidade adjuvante mostrou, em modelos animais, uma atividade inflamatória e potencializadora do sistema imunológico. Ao ser administrada em conjunto com uma proteína de interesse (antígeno), foi possível verificar que os animais inoculados com essa formulação demonstraram uma significativa produção de anticorpos contra a proteína de interesse. A matriz dessas nanopartículas é composta de albumina sérica bovina e ácido poliinosínico-policitidílico. Os dados experimentais demonstraram que essa combinação de moléculas apresenta forte ação adjuvante do sistema imunológico e, portanto, pode ser extremamente útil se utilizado na composição de vacinas para a prevenção de doenças que afetam animais e humanos. O diferencial dessa tecnologia, portanto, está baseado em seu baixo custo de produção, elevada capacidade adjuvante, ser bem tolerada e ser biodegradável. Além de utilizar um polímero não-tóxico de baixo custo (albumina), a síntese química dessa nanopartícula apresenta um número reduzido de reações, as quais geram uma quantidade mínima de resíduos. Portanto, devido ao fato de serem biodegradáveis, gerar uma forte resposta imunológica ao antígeno vacinal e serem de baixo custo de produção. Assim sendo, essas nanopartículas podem reduzir o custo final por dose de vacina, tornando-as mais acessíveis aos mercados de interesse (saúde humana e veterinária).[026] Therefore, the present invention is important to increase the range of adjuvants on the market, since there are few options and among the current ones, there are problems regarding toxicity and induction of adverse reactions. The use of these nanoparticles with adjuvant capacity has shown, in animal models, inflammatory and immune system enhancing activity. When administered together with a protein of interest (antigen), it was possible to verify that animals inoculated with this formulation demonstrated a significant production of antibodies against the protein of interest. The matrix of these nanoparticles is composed of bovine serum albumin and polyinosinic-polycytidylic acid. Experimental data demonstrated that this combination of molecules has a strong adjuvant action on the immune system and, therefore, can be extremely useful if used in the composition of vaccines for the prevention of diseases that affect animals and humans. The differential of this technology, therefore, is based on its low production cost, high adjuvant capacity, being well tolerated and biodegradable. In addition to using a low-cost, non-toxic polymer (albumin), the chemical synthesis of this nanoparticle involves a reduced number of reactions, which generate a minimum amount of waste. Therefore, due to the fact that they are biodegradable, generate a strong immunological response to the vaccine antigen and have a low production cost. Therefore, these nanoparticles can reduce the final cost per vaccine dose, making them more accessible to markets of interest (human and veterinary health).

Brief description of the drawings

[027] A Figura 1 apresenta a morfologia determinada por microscopia de força atômica das nanopartículas de albumina sérica bovina associadas ao ácido poliinosínico-policitidílico.[027] Figure 1 shows the morphology determined by atomic force microscopy of bovine serum albumin nanoparticles associated with polyinosinic-polycytidylic acid.

[028] A Figura 2 apresenta a avaliação do encapsulamento do ácido poliinosínicopolicitidílico nas nanopartículas de albumina sérica. A figura 2A apresenta a quantificação por espectrofotometria a 290 nm dos sobrenadantes coletados antes e após a formação das nanopartículas. O gráfico representa o resultado representativo de três experimentos realizados de forma independente. A figura 2B representa um gel de agarose a 1,5% onde foi adicionado à superfície do mesmo diferentes concentrações de nanopartículas de albumina associadas ao ácido poliinosínico-policitidílico e nanopartículas compostas apenas de albumina (NPV). A fluorescência observada é resultado da emissão da fluorescência do corante GelRed® associado ao ácido poliinosínico-policitidílico.[028] Figure 2 shows the evaluation of the encapsulation of polyinosinic polycytidylic acid in serum albumin nanoparticles. Figure 2A shows the quantification by spectrophotometry at 290 nm of the supernatants collected before and after the formation of the nanoparticles. The graph represents the representative result of three experiments carried out independently. Figure 2B represents a 1.5% agarose gel where different concentrations of albumin nanoparticles associated with polyinosinic-polycytidylic acid and nanoparticles composed only of albumin (NPV) were added to its surface. The observed fluorescence is the result of the fluorescence emission of the GelRed® dye associated with polyinosinic-polycytidylic acid.

[029] A Figura 3 apresenta o teste de estabilidade das nanopartículas de albumina sérica bovina associadas ao ácido poliinosínico-policitidílico nas temperaturas de 4ºC e 37ºC. Legenda: As nanopartículas foram incubadas a 4ºC e 37ºC durante 1, 2 e 4 dias. Após o tempo de incubação, as nanonopartículas associadas ao ácido poliinosínico-policitidílico foram processadas para quantificação da liberação de poli (I:C) no sobrenadante (a); determinação do tamanho (b), PDI (c) e potencial Zeta (d).[029] Figure 3 shows the stability test of bovine serum albumin nanoparticles associated with polyinosinic-polycytidylic acid at temperatures of 4ºC and 37ºC. Caption: The nanoparticles were incubated at 4ºC and 37ºC for 1, 2 and 4 days. After the incubation time, the nanoparticles associated with polyinosinic-polycytidylic acid were processed to quantify the release of poly (I:C) in the supernatant (a); determination of size (b), PDI (c) and Zeta potential (d).

[030] A Figura 4 apresenta a análise da captura de nanopartículas associadas ao ácido poliinosínico-policitidílico por células dendríticas derivadas da medula óssea de camundongos. Legenda: A) Fotos representativas demonstrando a captura das nanopartículas pelas células dendríticas derivadas da medula óssea de camundongos. CC: controle de célula; NPVs: nanopartículas compostas de BSA (vazias); NPPI: nanopartículas de albumina sérica bovina associadas ao ácido poliinosínico-policitidílico. B) Quantificação das células FITC+ /DAPI+ por Microscopia de fluorescência.[030] Figure 4 shows the analysis of the capture of nanoparticles associated with polyinosinic-polycytidylic acid by dendritic cells derived from mouse bone marrow. Caption: A) Representative photos demonstrating the capture of nanoparticles by dendritic cells derived from mouse bone marrow. CC: cell control; NPVs: nanoparticles composed of BSA (empty); NPPI: bovine serum albumin nanoparticles associated with polyinosinic-polycytidylic acid. B) Quantification of FITC+ /DAPI+ cells by Fluorescence Microscopy.

[031] A Figura 5 apresenta imagens microscópicas representativas da pele de camundongos tratados com nanopartículas de albumina sérica bovina associadas ao ácido poliinosínico-policitidílico (Coloração: hematoxilina e eosina. Aumento 400×). Legenda: PBS: tampão fosfato de sódio, nanopartículas compostas de BSA (vazias), NPPI: nanopartículas de albumina sérica bovina associadas ao ácido poliinosínico-policitidílico, poli (I:C): ácido poliinosínico-policitidílico. Barra: 50 µm.[031] Figure 5 shows representative microscopic images of the skin of mice treated with bovine serum albumin nanoparticles associated with polyinosinic-polycytidylic acid (Coloring: hematoxylin and eosin. Magnification 400×). Legend: PBS: sodium phosphate buffer, nanoparticles composed of BSA (empty), NPPI: bovine serum albumin nanoparticles associated with polyinosinic-polycytidylic acid, poly (I:C): polyinosinic-polycytidylic acid. Bar: 50 µm.

[032] A figura 6 apresenta a análise da celularidade dérmica na pele de camundongos C57BL/6 tratados com nanopartículas de albumina sérica bovina associadas ao ácido poliinosínico-policitidílico. Legenda: A) Diagrama de campo com a categorização semi-quantitativa da celularidade dérmica na pele de camundongos. Sem alteração, 1: aumento leve, 2: aumento moderado. A linha contínua azul representa a influência simultânea dos grupos sobre o escore histopatológico. A linha apresenta maior deslocamento em direção aos grupos com maior efeito sobre o escore histopatológico. B) Total de células por mm² no tecido dérmico de camundongos. a: indica significância de p <0,001 em relação ao grupo PBS; b: indica significância de P <0,01 em relação ao grupo NPV e poli (I:C). PBS: tampão fosfato de sódio, NPV: nanopartículas compostas de BSA (vazias), NPPI: nanopartículas de albumina sérica bovina associadas ao ácido poliinosínico-policitidílico, poli (I:C): ácido poliinosínico-policitidílico.[032] Figure 6 shows the analysis of dermal cellularity in the skin of C57BL/6 mice treated with bovine serum albumin nanoparticles associated with polyinosinic-polycytidylic acid. Caption: A) Field diagram with semi-quantitative categorization of dermal cellularity in mouse skin. No change, 1: slight increase, 2: moderate increase. The blue solid line represents the simultaneous influence of the groups on the histopathological score. The line shows greater displacement towards the groups with greater effect on the histopathological score. B) Total cells per mm² in mouse dermal tissue. a: indicates significance of p <0.001 in relation to the PBS group; b: indicates significance of P <0.01 in relation to the NPV and poly (I:C) group. PBS: sodium phosphate buffer, NPV: nanoparticles composed of BSA (empty), NPPI: bovine serum albumin nanoparticles associated with polyinosinic-polycytidylic acid, poly (I:C): polyinosinic-polycytidylic acid.

[033] A figura 7 apresenta o resultado da imunização de camundongos C57BL/6 com uma proteína recombinante (domínio III da proteína do envelope do Zika vírus) na presença das nanopartículas de albumina sérica bovina associadas ao ácido poliinosínico-policitidílico. Legenda: NPV: nanopartículas compostas de BSA (vazias), NPPI: nanopartículas de albumina sérica bovina associadas ao ácido poliinosínico-policitidílico; PBS+EDIII: solução salina tamponada e domínio III da proteína do envelope do Zika vírus; NPV+EDIII: nanopartículas compostas de BSA (vazias) e domínio III da proteína do envelope do Zika vírus; NPPI+EDIII: nanopartículas de albumina sérica bovina associadas ao ácido poliinosínicopolicitidílico e domínio III da proteína do envelope do Zika vírus. **: <0,01; **** p <0,001.[033] Figure 7 shows the result of immunization of C57BL/6 mice with a recombinant protein (domain III of the Zika virus envelope protein) in the presence of bovine serum albumin nanoparticles associated with polyinosinic-polycytidylic acid. Caption: NPV: nanoparticles composed of BSA (empty), NPPI: bovine serum albumin nanoparticles associated with polyinosinic-polycytidylic acid; PBS+EDIII: buffered saline and domain III of the Zika virus envelope protein; NPV+EDIII: nanoparticles composed of BSA (empty) and domain III of the Zika virus envelope protein; NPPI+EDIII: bovine serum albumin nanoparticles associated with polyinosinic polycytidylic acid and domain III of the Zika virus envelope protein. **: <0.01; **** p <0.001.

[034] A figura 8 apresenta o resultado da titulação de anticorpos anti-EDIII antes e depois da infecção dos animais imunizados por Zika vírus. Legenda: NPV: nanopartículas compostas de BSA (vazias), NPPI: nanopartículas de albumina sérica bovina associadas ao ácido poliinosínico-policitidílico; PBS+EDIII: solução salina tamponada e domínio III da proteína do envelope do Zika vírus; NPV+EDIII: nanopartículas compostas de BSA (vazias) e domínio III da proteína do envelope do Zika vírus; NPPI+EDIII: nanopartículas de albumina sérica bovina associadas ao ácido poliinosínico-policitidílico e domínio III da proteína do envelope do Zika vírus.[034] Figure 8 shows the results of the titration of anti-EDIII antibodies before and after infection of animals immunized by Zika virus. Caption: NPV: nanoparticles composed of BSA (empty), NPPI: bovine serum albumin nanoparticles associated with polyinosinic-polycytidylic acid; PBS+EDIII: buffered saline and domain III of the Zika virus envelope protein; NPV+EDIII: nanoparticles composed of BSA (empty) and domain III of the Zika virus envelope protein; NPPI+EDIII: bovine serum albumin nanoparticles associated with polyinosinic-polycytidylic acid and domain III of the Zika virus envelope protein.

Description of the invention

[035] A invenção se refere à nanopartículas com ação adjuvante compostas de albumina sérica bovina associada ao ácido poliinosínico-policitidílico que podem ser utilizadas na preparação de composições de vacinas.[035] The invention refers to nanoparticles with adjuvant action composed of bovine serum albumin associated with polyinosinic-polycytidylic acid that can be used in the preparation of vaccine compositions.

[036] Empregam-se como reagentes na síntese das nanopartículas de albumina sérica bovina associada ao ácido poliinosínico-policitidílico, os monômeros de albumina sérica bovina e o ácido poliinosínico-policitidílico, sendo esse um ligante de receptor do tipo toll .[036] Bovine serum albumin monomers and polyinosinic-polycytidylic acid are used as reagents in the synthesis of bovine serum albumin nanoparticles associated with polyinosinic-polycytidylic acid, which is a toll-type receptor ligand.

[037] Empregam-se como reagente na síntese das nanopartículas de albumina sérica bovina associada ao ácido poliinosínico-policitidílico, o solvente etanol ou outro que induz o processo de co-acervação da albumina;[037] The solvent ethanol or another solvent that induces the albumin co-acervation process is used as a reagent in the synthesis of bovine serum albumin nanoparticles associated with polyinosinic-polycytidylic acid;

[038] Empregam-se como reagente na síntese das nanopartículas de albumina sérica bovina associada ao ácido poliinosínico-policitidílico, o agente de ligação cruzada glutaraldeído;[038] The cross-linking agent glutaraldehyde is used as a reagent in the synthesis of bovine serum albumin nanoparticles associated with polyinosinic-polycytidylic acid;

[039] A síntese é executada solubilizando-se a solução de albumina de 0,1 a 10%, sendo preferencialmente na faixa de 1 a 3% em água deionizada ou destilada estéril. O ácido poliinosínico-policitidílico é solubilizado em água estéril em concentrações de 0,01 a 0,5%, sendo preferencialmente na faixa de 0,1 a 0,2%. Ambas as soluções devem ser misturadas em diferentes proporções, sendo preferencialmente utilizada a faixa de 10 a 20 partes da solução de BSA para 1 a 5 partes do ácido poliinosínico-policitidílico. A mistura deve ser agitada por 30 minutos utilizando agitador magnético. O solvente, preferencialmente o etanol, é adicionado gota a gota na solução em agitação até a formação das nanopartículas. A formação das nanopartículas se caracteriza pela mudança da solução com coloração transparente para uma com coloração opalescente. Após, a formação das nanopartículas o agente de ligação cruzada é adicionado, sendo a faixa preferencial utilizada de 10 a 25 microlitros de glutaraldeído a 25% por ml de solução inicial (albumina e ácido poliinosínico-policitidílico).[039] The synthesis is carried out by solubilizing the albumin solution from 0.1 to 10%, preferably in the range of 1 to 3% in sterile deionized or distilled water. Polyinosinic-polycytidylic acid is solubilized in sterile water in concentrations of 0.01 to 0.5%, preferably in the range of 0.1 to 0.2%. Both solutions must be mixed in different proportions, preferably using a range of 10 to 20 parts of the BSA solution to 1 to 5 parts of polyinosinic-polycytidylic acid. The mixture must be stirred for 30 minutes using a magnetic stirrer. The solvent, preferably ethanol, is added drop by drop to the stirring solution until the nanoparticles are formed. The formation of nanoparticles is characterized by the change of the solution with a transparent color to one with an opalescent color. After the formation of nanoparticles, the cross-linking agent is added, with the preferred range used being 10 to 25 microliters of 25% glutaraldehyde per ml of initial solution (albumin and polyinosinic-polycytidylic acid).

[040] Após a síntese, as nanopartículas de interesse devem ser purificadas por ciclos de centrifugação, sendo preferencialmente utilizada a temperatura ambiente por 15 minutos e 12500 rotações por minuto. Após a sedimentação, as nanopartículas são ressuspendidas em solução estéril de interesse na concentração desejada, sendo preferencialmente a faixa de 1 a 20 mg/ml. Essa etapa é importante para que os reagentes remanescentes da síntese sejam eliminados. A solução empregada para ressuspensão pode ser água estéril, solução salina estéril ou outra solução que não afete a estabilidade das nanopartículas.[040] After synthesis, the nanoparticles of interest must be purified by centrifugation cycles, preferably using room temperature for 15 minutes and 12500 rotations per minute. After sedimentation, the nanoparticles are resuspended in a sterile solution of interest at the desired concentration, preferably in the range of 1 to 20 mg/ml. This step is important so that the remaining synthesis reagents are eliminated. The solution used for resuspension can be sterile water, sterile saline or another solution that does not affect the stability of the nanoparticles.

[041] O tamanho de tais nanopartículas apresentaram-se na faixa de 1 a 900 nm, preferencialmente de 100 a 600 nm, com morfologia esférica-ovalada e com valores baixos de índice de polidispersividade, preferencialmente abaixo de 0,500. O potencial elétrico em torno da nanopartícula apresentaram valores variando de - 40,0 mV a +30,0, mV; no entanto, as nanopartículas propostas apresentam uma superioridade de cargas negativas, preferencialmente de -40 mV a – 10 mV.[041] The size of such nanoparticles ranged from 1 to 900 nm, preferably from 100 to 600 nm, with a spherical-oval morphology and low polydispersity index values, preferably below 0.500. The electrical potential around the nanoparticle showed values ranging from -40.0 mV to +30.0 mV; however, the proposed nanoparticles present a superiority of negative charges, preferably from -40 mV to – 10 mV.

[042] As nanopartículas sintetizadas possuem ação adjuvante e podem fazer parte de uma composição vacinal. As nanopartículas poderão ser incluídas em diferentes concentrações na preparação de composições de vacinas destinadas à prevenção ou tratamento de doenças infecciosas e tumores. Para tal, as nanopartículas deverão ser misturadas ao antígeno que se deseja induzir resposta imune contra ele. As concentrações de antígeno variam de 0,01% a 50%, sendo preferencialmente a faixa de concentração de 0,1 a 30%. Esse antígeno pode ser um micro-organismo atenuado, um micro-organismo morto ou uma subunidade do micro-organismo (proteína, polissacarídeo, DNA ou RNA) ou algum antígeno tumoral purificado.[042] The synthesized nanoparticles have adjuvant action and can be part of a vaccine composition. Nanoparticles may be included in different concentrations in the preparation of vaccine compositions intended for the prevention or treatment of infectious diseases and tumors. To do this, the nanoparticles must be mixed with the antigen that is desired to induce an immune response against it. Antigen concentrations range from 0.01% to 50%, with a concentration range of 0.1 to 30% being preferred. This antigen can be an attenuated microorganism, a dead microorganism or a subunit of the microorganism (protein, polysaccharide, DNA or RNA) or some purified tumor antigen.

[043] Como exemplo, descrevemos a síntese de nanopartículas de albumina sérica bovina associada ao ácido poliinosínico-policitidílico e seu uso em formulação vacinal contendo uma proteína do Zika virus.[043] As an example, we describe the synthesis of bovine serum albumin nanoparticles associated with polyinosinic-polycytidylic acid and their use in a vaccine formulation containing a Zika virus protein.

[044] O ácido poliinosínico-policitidílico foi dissolvido em água deionizada estéril na concentração de 5mg/ml. Foi também produzida uma solução de BSA em água estéril, com a concentração final de 2%. Ambas foram filtradas em filtros de 0,5 micrômetros e essas foram misturadas e incubadas por 30 minutos em agitação à temperatura ambiente. Nesse exemplo foram utilizadas 2 ml de uma solução de albumina sérica bovina a 2% e 200 microlitros de uma solução de ácido poliinosínico-policitidílico a 5 mg/ml. Em seguida foi realizada a etapa de dessolvatação, que consiste na adição de álcool etílico absoluto gota a gota sob agitação. Nesse caso foi adicionado 1,5 ml de etanol.[044] Polyinosinic-polycytidylic acid was dissolved in sterile deionized water at a concentration of 5mg/ml. A solution of BSA in sterile water was also produced, with a final concentration of 2%. Both were filtered through 0.5 micrometer filters and mixed and incubated for 30 minutes with agitation at room temperature. In this example, 2 ml of a 2% bovine serum albumin solution and 200 microliters of a 5 mg/ml polyinosinic-polycytidylic acid solution were used. Next, the desolvation step was carried out, which consists of adding absolute ethyl alcohol drop by drop under stirring. In this case, 1.5 ml of ethanol was added.

[045] Após a formação da nanopartícula contendo o ácido poliinosínicopolicitidílico, foi realizado a ligação cruzada através da adição de 25µL de glutaraldeído a 25%. A solução foi mantida sob agitação magnética por 2 horas à temperatura ambiente. Ao término do tempo necessário para promover a ligação cruzada, as nanopartículas foram submetidas à centrifugação a 12.500 rpm durante 15 minutos. Os sedimentos foram lavados uma vez com 10 mL de solução salina fosfatada tamponada (PBS) estéril e centrifugado novamente conforme as condições descritas anteriormente. O sobrenadante foi descartado e o sedimento ressuspendido em PBS estéril na concentração de 1 mg/mL.[045] After the formation of the nanoparticle containing polyinosinic polycytidylic acid, cross-linking was carried out by adding 25µL of 25% glutaraldehyde. The solution was kept under magnetic stirring for 2 hours at room temperature. At the end of the time necessary to promote cross-linking, the nanoparticles were subjected to centrifugation at 12,500 rpm for 15 minutes. The sediments were washed once with 10 mL of sterile phosphate-buffered saline (PBS) and centrifuged again according to the conditions described previously. The supernatant was discarded and the pellet was resuspended in sterile PBS at a concentration of 1 mg/mL.

[046] Como exemplo descrevemos formulação vacinal contendo as nanopartículas de albumina sérica bovina associada ao ácido poliinosínicopolicitidílico e a uma proteína do Zika vírus. Nesse caso foi utilizada uma proteína recombinante referente ao domínio III da proteína do envelope do Zika vírus na concentração de 1 mg/ml em PBS e a concentração de nanopartículas utilizada foi de 1 mg/ml em PBS. A proporção utilizada para geração da formulação vacinal foi de 2:1 (nanopartícula:antígeno). A concentração de antígeno na suspensão foi de 33%.[046] As an example, we describe a vaccine formulation containing bovine serum albumin nanoparticles associated with polyinosinic polycytidylic acid and a Zika virus protein. In this case, a recombinant protein referring to domain III of the Zika virus envelope protein was used at a concentration of 1 mg/ml in PBS and the concentration of nanoparticles used was 1 mg/ml in PBS. The proportion used to generate the vaccine formulation was 2:1 (nanoparticle:antigen). The antigen concentration in the suspension was 33%.

[047] As soluções foram misturadas, e 100 microlitros dessa mistura foram inoculados em camundongos C57Bl/6. A dose administrada compreende, portanto 100 microgramas de nanopartículas e 50 microgramas de antígeno. Os animais receberam três doses em intervalos de sete dias e após vinte e um dias da última imunização, o sangue dos animais foi coletado e utilizado para a dosagem de anticorpos. Os animais imunizados com as nanopartículas propostas nessa invenção em conjunto com a proteína de interesse (antígeno) apresentaram quantidades maiores de anticorpos se comparado aos outros grupos (Figura 7). De forma semelhante, quando esses animais foram infectados com o Zika vírus foi observado também uma quantidade maior de anticorpos nos animais imunizados nanopartículas propostas nessa invenção em conjunto com a proteína de interesse (antígeno) (Figura 8).[047] The solutions were mixed, and 100 microliters of this mixture were inoculated into C57Bl/6 mice. The administered dose therefore comprises 100 micrograms of nanoparticles and 50 micrograms of antigen. The animals received three doses at intervals of seven days and twenty-one days after the last immunization, the animals' blood was collected and used to measure antibodies. Animals immunized with the nanoparticles proposed in this invention together with the protein of interest (antigen) showed greater amounts of antibodies compared to other groups (Figure 7). Similarly, when these animals were infected with the Zika virus, a greater amount of antibodies were also observed in the immunized animals with the nanoparticles proposed in this invention together with the protein of interest (antigen) (Figure 8).

Claims

ADJUVANT NANOPARTICLES for use in vaccine compositions characterized by the fact that they comprise albumin nanoparticles associated with polyinosinic-polycytidylic acid.

ADJUVANT NANOPARTICLES according to claim 1, characterized by the fact that they preferably comprise bovine serum albumin in concentrations of 0.1 to 10%, preferably in the range of 1 to 3%.

ADJUVANT NANOPARTICLES according to claim 1 and 2, characterized by the fact that they comprise polyinosinic-polycytidylic acid in concentrations of 0.01 to 0.5%, preferably in the range of 0.1 to 0.2%.

ADJUVANT NANOPARTICLES, according to claims 1 to 3, characterized by the fact that such nanoparticles have a spherical-oval morphology and an average size in the range of 1 to 900 nm, preferably from 100 to 600 nm with low polydispersity index values, below 0.500.

ADJUVANT NANOPARTICLES, according to claims 1 to 4, characterized by the fact that such nanoparticles have zeta potential values ranging from -40.0 mV to +30.0 mV, preferably from -40 mV to – 10 mV.

USE OF ADJUVANT NANOPARTICLES, according to claims 1 to 5, characterized by the fact that they are applied in vaccine compositions.

USE OF ADJUVANT NANOPARTICLES, according to claims 1 to 6, characterized by the fact that it is used in conjunction with antigens, preferably immunogenic.

USE OF ADJUVANT NANOPARTICLES, according to claims 1 to 7, characterized by the fact that the concentrations of the antigens of interest vary from 0.01% to 50%, preferably with a concentration range of 0.1 to 30%.