NO330532B1 - Immunogent preparat, vaksine fremstilt av dette, anvendelse for fremstilling av et medikament og fremgangsmate for fremstilling - Google Patents

Description

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Foreliggende oppfinnelse gjelder bakterielle polysakkaridantigenvaksiner, fremstilling av disse og anvendelse av slike polysakkarider i medisiner.

Nærmere bestemt gjelder foreliggende oppfinnelse tre beslektede områder: A - vaksiner som omfatter et pneumokokk polysakkaridantigen, typisk et pneumokokk polysakkairdkonjugat-antigen, utformet med et proteinantigen fra Streptococcus pneumoniae og om ønskelig en TH 1-induserende adjuvans, B - spesifikke polysakkaridkonjugater, fortrinnsvis fra pneumokokker, blandet med en TH 1-adjuvans, og C - bakterielle polysakkaridkonjugater generelt konjugert til protein D fra H. influenzae.

OPPFINNELSENS BAKGRUNN

Streptococcus pneumoniae er en Gram-positiv bakterie som forårsaker betydelig sykelighet og dødelighet (særlig hos yngre og eldre), og som forårsaker invasive sykdommer som pneumoni, bakteriemi og meningitt, og sykdommer forbundet med kolonisering, f. eks. akutt otitis media. Hyppigheten av pneumokokk-pneumoni i USA blant personer over 60 år anslås til mellom 3 og 8 pr. 100 000.120 % av tilfellene fører dette til bakteriemi og andre manifestasjoner, f. eks. meningitt, med en dødelighetsfrekvens på nær 30 %, selv ved behandling med antibiotika.

Pneumococcus er innkapslet i et kjemisk sammenkoplet polysakkarid som gir serotypespesifisitet. Det finnes 90 kjente serotyper av pneumokokker, og kapselen er den viktigste virulensdeterminant for pneumokokker siden den ikke bare beskytter bakteriens indre overflate mot komplement, men også fordi den i seg selv er lite immunogen. Polysakkarider er T-uavhengige antigener, og de kan ikke prosesseres eller presenteres på MHC-molekyler for interaksjon med T-celler. De kan imidlertid stimulere immunsystemet via en alternativ mekanisme som omfatter kryssbinding av overflatereseptorer på B-celler.

Det har blitt vist i flere eksperimenter at beskyttelse mot invasiv pneumokokksykdom i størst grad korrelerer med antistoff spesifikt for kapselen, og beskyttelsen er serotypespesifikk.

Polysakkaridantigenbaserte vaksiner er velkjente innen faget. Fire som er godkjente for anvendelse i mennesker omfatter Vi-polysakkaridet fra Salmonella typhi, PRP-polysakkaridet fra Haemophilus influenzae, den tetravalente meningokokkvaksine som er sammensatt av serotypene A, C, W135 og Y, og den 23-valente pneumokokkvaksine som er sammensatt av polysakkaridene som tilsvarer serotypene 1, 2, 3,4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14,15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20,22F, 23F og 33 (som utgjør mist 90 % av pnemokokkisolater fra blod).

De siste tre vaksinene gir beskyttelse mot bakterier som forårsaker respiratoriske infeksjoner som fører til alvorlig sykdom og dødelighet hos spedbarn, likevel har disse vaksinene ikke blitt godkjent for anvendelse i barn som er yngre enn to år, siden de ikke er tilstrekkelig

immunogene i denne aldersgruppen [Peltola et al., (1984), N. Engl. J. Med. 310:1561-1566]. Streptococcus pneumoniae er den vanligste årsak til invasiv bakteriesykdom og otitis media hos spedbarn og småbarn. Likeså har eldre personer dårlig respons på pneumokokkvaksiner [Roghmann et al., (1987), J. Gerontol. 42:265-270], dette er grunnen til den forhøyede forekomst av bakteriell pneumoni i denne populasjonen [Verghese og Berk, (1983) Medicine (Baltimore) 62:271-285]. Lee C. et al., Immunological epitope, gene and immunity involved in Pneumococcal glycoconjugate. Critical reviews in microbiology, 1997, Vol. 23, nr.2, s.121-142, beskriver immunologiske epitoper i et polysakkarid-antigen fra S. pneumonidae polysakkarider. Her blir det slått fast at en økt immunogenisitet av polysakkaridantigener kan oppnås ved konjugering av polysakkaridantigen til proteiner i en konjugert vaksine. Det gjøres også kjent vaksinesammensetninger som inneholder både polysakkaridantigen og proteinantigen fra S. pneumonidae, samt at det er sannsynlig at slike vaksinesammensetninger kan indusere gode immunsreponser i barn. Briles D., et al., Pneumococcal diversity: considerations for new vaccine strategies with emphasis on Pneumococcal surface protein A (PspA). 1998. Vol 11, nr 4, s.645-657, vurderer mulige vaksinestrategier med hovedvekt på Pneumococcal overflateprotein A (PspA). I likhet med Lee et al., pekes det på at konjugering av polysakkarider til proteiner kan bidra til at konjugatet blir mer immunogent sammenlignet polysakkaridenheten alene.

Alexander J. et al., Immunization of mice with pneumolysin toxid confers a significant degree of protection against at least nine serotypes of Streptococcus pneumonidae. Infection and immunity, 1994. Vol. 62, nr. 12, s. 5683-5688, fokuserer på immunisering av mus med Pneumolysinderivater med redusert toksisitet. Lav immunogenisitet av multivalente Streptococcus pneumonidae polysakkarider i vaksiner er et velkjent problem i denne publikasjonen og løsningen som foreslås er vaksinesammensetninger som inneholder både polysakkaridantigen og proteinantigen fra Streptococcus pneumonidae. Derivater av pneumolysin anvendes som protein bærere eller i form av beskyttende immunogen.

Strategier som har blitt utformet for å overvinne denne manglende immunogenisitet i spedbarn omfatter kopling av polysakkaridet til store immunogene proteiner, som gir hjelper-T-cellehjelp og som induserer immunologisk hukommelse mot polysakkaridantigenet som proteinet er konjugert til. Pneumokokkglykoprotein-konjugatvaksiner evalueres i dag for sikkerhet, immunogenisitet og virkning i forskjellige aldersgrupper.

A) Pneumokokkpolysakkaridvaksiner

Den 23-valente, ikkekonjugerte pneumokokkvaksine har vist stor variasjon i klinisk virkning, fra 0 % til 81 % (Fedson et al. (1994) Arch Intern Med. 154: 2531-2535). Virkningen ser ut til å variere med risikogruppen som immuniseres, f. eks. eldre personer, pasienter med Hodgkins sykdom, splenectomypasienter, pasienter med sigdcelleanemi og pasienter med agammaglobulinemi (Fine et al. (1994) Arch Intern Med. 154:2666-2677), og også med sykdomsmanifestasjonen. Den 23-valente vaksinen gir ikke beskyttelse mot pneumokokk-pneumoni (i visse høyrisikogrupper, f. eks. eldre) og otitis media.

Det foreligger derfor et behov for forbedrede pneumokokkvaksinepreparater, fortrinnsvis preparater som vil være mer effektive når det gjelder beskyttelse eller lindring av pneumokokksykdom (særlig pneumoni) hos eldre og hos småbarn.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en slik forbedret vaksine.

B) Utvalgte pneumokokkpolysakkaridkonjugat + 3D-MPL-preparater

Det er generelt akseptert at den beskyttende virkning av den kommersielle, ikkekonjugerte pneumokokkvaksine i større eller mindre grad er forbundet med konsentrasjonen av antistoff som induseres ved vaksinasjonen, faktisk ble de 23 polysakkaridene godkjent for anvendelse kun basert på immunogenisiteten av hvert polysakkarid i blandingen (Red. Williams et al. New York Academy of Sciences 1995 s. 241-249). En videre forbedring av antistoffresponsen på pneumokokkpolysakkaridene kunne derfor øke prosentandelen av spedbarn og eldre som responderer med beskyttende nivå av antistoff på den første injeksjon av polysakkarid eller polysakkaridkonjugat, og kunne redusere dosen og antall injeksjoner som var nødvendige for å indusere beskyttende immunitet mot infeksjoner forårsaket av Streptococcus pneumoniae.

Siden tidlig i det 20. århundre har forskere eksperimentert med et svært stort antall forbindelser som kan tilsettes til antigener for å forbedre deres immunogenisitet i vaksinepreparater [se oversikt i M.F. Powell & M.J. Newman, Plenum Press, NY, "Vaccine Design - the Subunit and Adjuvants and Excipients"]. Mange er svært effektive, men gir signifikante lokale og systemiske uønskede reaksjoner som hindrer anvendelse av dem i humane vaksinepreparater. Aluminiumbaserte adjuvanser (f. eks. alun, aluminiumhydroksid eller aluminiumfosfat), som først ble beskrevet i 1926, forblir de eneste immunologiske adjuvanser som anvendes i humane vaksiner som er godkjente i USA.

Aluminiumbaserte adjuvanser er eksempler på bærerklassen av adjuvanser, som virker via "deponeringseffekten" som induseres. Antigen absorberes på overflaten av adjuvansen, og når preparatet injiseres vil adjuvans og antigen ikke umiddelbart fordeles i blodstrømmen - i stedet forblir preparatet i det lokale injeksjonsmiljøet, og resultatet er en mer uttalt immunrespons. Slike bæreradjuvanser har den kjente tilleggsfordel at de er egnet for stabilisering av antigener som lett nedbrytes, f. eks. noen polysakkaridantigener.

3D-MPL er et eksempel på en ikkebærer-adjuvans. Forbindelsens fulle navn er 3-0-deacylert monofosforyl-lipid A (eller 3 De-O-acylert monofosforyl-lipid A eller 3- 0-desacyl-4' monofosforyl-lipid A), og forbindelsen betegnes 3D-MPL for å angi at posisjon 3 i glukosamin i den reduserende ende er de-O-acylert. For fremstilling av forbindelsen, se GB 2220211 A. Kjemisk sett er det snakk om en blanding av 3-deacylert monofosforyl-lipid A med 4,5 eller 6 acylerte kjeder. Forbindelsen ble opprinnelig fremstilt tidlig på 1990-tallet, hvor fremgangsmåten for 3-O-deacylering av 4'-monofosforyl derivatet av lipid A (MPL) førte til et molekyl med ytterligere svekket toksisitet, uten endring i den immunstimulerende aktivitet.

3D-MPL har blitt anvendt som adjuvans, enten alene eller fortrinnsvis i kombinasjon med en adjuvans av deponeringstypebærer f. eks. aluminiumhydroksid, aluminiumfosfat eller olje i vann-emulsjoner. I slike preparater inngår antigen og 3D-MPL i den samme partikkelstruktur, noe som tillater mer effektiv tilførsel av antigenet og immunstimulerende signaler. Undersøkelser har vist at 3D-MPL kan ytterligere forsterke immunogenisiteten av et alunabsorbert antigen [Thoelen et al. Vaccine (1998) 16:708-14; EP 689454-B1]. Slike kombinasjoner foretrekkes også innen faget for antigener som lett absorberes (f. eks. bakterielle polysakkaridkonjugater), hvor absorpsjon til alun bidrar til å stabilisere antigenet. Utfelte aluminiumbaserte adjuvanser anvendes hyppigst, da disse er de eneste adjuvanser som i dag anvendes i godkjente, humane vaksiner. Følgelig foretrekkes vaksiner som inneholder 3D-MPL i kombinasjon med aluminiumbaserte adjuvanser innen faget, grunnet lett utvikling og hurtig introduksjon på markedet.

MPL (ikke-3-deacylert) har blitt evaluert som adjuvans med flere monovalente polysakkaridkonjugatvaksineantigener. Samtidiginjeksjon av MPL i saltvann forsterket antistoffresponsen i serum på fire monovalente polysakkaridkonjugater: Pneumokokk-PS 6B-tetanustoksoid, pneumokokk-PS 12-difteritoksoid og S. aureus type 5 og S. aureus type 8 konjugert til Pseudomonas aeruginosa- exotoksin A [Schneerson et al. J. Immunology

(1991) 147:2136-2140]. Den forsterkede respons ble sagt å være antigenspesifikk. MPL i en olje i vann-emulsjon (en adjuvans av bærertype) forsterket gjennomgående virkningen av MPL i saltvann grunnet nærvær av MPL og antigen i samme partikkelstruktur, og ble ansett å være det foretrukne adjuvanssystem for optimal tilførsel av andre

polysakkaridkonjugatvaksiner.

Devi et al. [Infect. Immun. (1991) 59:3700-7] evaluerte adjuvansvirkningen av MPL (ikke-3-deacylert) i saltvann på antistoffresponsen i mus mot et TT-konjugat av kapsulært polysakkarid fra Cryptococcus neoformans. Dersom MPL ble anvendt samtidig med konjugatet var det kun en marginal økning i både den IgM- og IgG-spesifikke respons på polysakkaridet, MPL hadde imidlertid mye større virkning ved tilførsel to dager etter konjugatet. Den praktiske side ved anvendelse av et immuniseringsskjema som krever forsinket tilførsel av MPL relativt til antigenet er tvilsom, særlig når det gjelder spedbarn. Adjuvansvirkningen av MPL med polysakkarider og polysakkarid-proteinkonjugater ser ut til å være avhengig av preparatet. Igjen gir innføring av MPL i et egnet tilførselssystem for langsom frigivelse (f. eks. ved anvendelse av en bæreradjuvans) en kraftigere adjuvansvirkning og unngår problemet når det gjelder tilførselstidspunkter og forsinket tilførsel.

Oppsummert er læren ifølge teknikkens stand at for gitte polysakkarid- eller polysakkaridkonjugatantigener hvor MPL eller 3D-MPL anvendes som adjuvans, anvendes disse fortrinnsvis sammen med en bæreradjuvans (f. eks. de aluminiumbaserte adjuvanser) for å maksimalisere den immunstimulerende virkning.

De foreliggende oppfinnere har overraskende nok funnet at for visse pneumokokk polysakkaridkonjugater er immunogenisiteten av vaksinepreparatet signifikant høyere dersom antigenet utformes med 3D-MPL alene, snarere enn med 3D-MPL sammen med en bæreradjuvans (f. eks. en aluminiumbasert adjuvans). Den observerte forbedring er videre uavhengig av den anvendte konsentrasjon av 3D-MPL og hvorvidt de gitte konjugater foreligger i et monovalent preparat eller er kombinert for dannelse av et polyvalent preparat.

C)Bakterielt polysakkarid - protein D-konjugater

Som nevnt ovenfor er polysakkaridantigenbaserte vaksiner velkjente innen faget. De godkjente polysakkaridvaksinene som er nevnt ovenfor har vist forskjellig klinisk virkning. Vi-polysakkaridvaksinen har blitt anslått til å ha en effektivitet på mellom 55 % og 77 % når det gjelder forebyggelse av tyfusfeber bekreftet ved dyrking (Plotkin og Cam, (1995) Arch Intern Med 155: 2293-99). Meningokokk-C-polysakkaridvaksinen ble vist å ha en effektivitet på 79 % under epidemiske betingelser (De Wals P, et al. (1996) Bull World Health Organ. 74: 407-411). Den 23-valente pneumokokkvaksine har vist stor variabilitet i klinisk virkning fra 0 % til 81 % (Fedson et al. (1994) Arch Intern Med. 154: 2531-2535). Som nevnt ovenfor er det akseptert at den beskyttende virkning av pneumokokkvaksinen i større eller mindre grad er forbundet med konsentrasjonen av antistoff som induseres ved vaksinasjonen.

Blant problemene som er forbundet med polysakkaridtilnærmingen til vaksinasjon er det faktum at polysakkarider i seg selv er dårlige immunogener. Strategier som er utformet for å overvinne denne manglende immunogenisitet omfatter kobling av polysakkaridet til store, svært immunogene proteinbærere som gir hjelper-T-cellehjelp.

Eksempler på slike svært immunogene bærere som i dag hyppig anvendes for fremstilling av polysakkaridimmunogener omfatter difteritoksoid (DT eller CRM197-mutanten), tetanus-toksoid (TT), "Keyhole Limpef-Haemocyanin (KLH), og renset proteinderivat av tuberkulin (PPD).

Problemer forbundet med hyppig anvendte bærere

En rekke problemer er forbundet med alle disse hyppig anvendte bærere, både når det gjelder produksjon av GMP-konjugater og immunologiske egenskaper av konjugatene.

Trass i disse bæreres hyppige anvendelse og deres vellykkethet når det gjelder induksjon av anti-polysakkaridantistoffresponser, er de forbundet med flere ulemper. Det er for eksempel kjent at antigenspesifikke immunresponser kan undertrykkes (epitopsupresjon) ved nærvær av allerede eksisterende antistoffer rettet mot bæreren, i dette tilfelle Tetanus toksin (Di John et al; (1989) Lancet, 2:1415-8). I populasjonen, sett under ett, vil en svært høy prosentandel allerede ha eksisterende immunitet både mot DT og TT, siden folk rutinemessig vaksineres med disse antigenene. I Storbritannia gis for eksempel 95 % av barna DTP-vaksinen, som omfatter både DT og TT. Andre forfattere har beskrevet problemet med epitopsupresjon forbundet med peptidvaksiner i dyremodeller (Sad et al, Immunology, 1991; 74:223-227; Schutze et al, J. Immunol. 135: 4,1985; 2319-2322).

For vaksiner som krever regelmessig forsterkervaksinasjon vil anvendelse av svært immunogene bærere som TT og DT i tillegg sannsynligvis undertrykke polysakkaridantistoffresponsen etter flere injeksjoner. Disse gjentatte vaksinasjonene kan også ledsages av uønskede reaksjoner for eksempel hyperresponsivitet av forsinket type

(DTH).

KLH er kjent som et kraftig immunogen, og har allerede blitt anvendt som bærer for IgE-peptider i kliniske forsøk på mennesker. Noen uønskede reaksjoner (DTH-liknende reaksjoner eller IgE-sensitivisering) har blitt observert, likeså antistoffresponser mot antistoff.

Valg av bærerprotein for en polysakkaridbasert vaksine vil derfor kreve en balanse mellom behovet for å anvende en bærer som fungerer i alle pasienter (bred MHC-gjenkjenning), induksjon av høyt nivå av anti-polysakkaridantistoffresponser og lav antistoffrespons mot bæreren.

Bærerene som hittil har blitt anvendt for polysakkaridbaserte vaksiner har derfor mange ulemper. Dette gjelder spesielt for kombinasjons vaksiner, hvor epitopsupresjon er spesielt problematisk dersom samme bærer anvendes for forskjellige polysakkaridantigener. IWO 98/51339 ble flere bærere i kombinasjonsvaksiner anvendt for å prøve å overvinne denne virkningen.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en ny bærer for anvendelse i fremstilling av polysakkarid/polypeptidbaserte immunogene konjugater som ikke lider av ulempene beskrevet ovenfor.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et protein D (EP 0 594 610 Bl) fra Haemophilus influenzae, eller fragmenter av dette som bærer for polysakkaridbaserte immunogene preparater, innbefattet vaksiner. Anvendelse av denne bærer er spesielt fordelaktig i kombinasjonsvaksiner.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

A) Pneumokokkpolysakkaridvaksiner

Følgelig tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et vaksinepreparat som omfatter minst et polysakkaridantigen fra Streptococcus pneumoniae (fortrinnsvis konjugert) og et proteinantigen fra Streptococcus pneumoniae eller en immunologisk funksjonell ekvivalent av dette, om ønskelig med en TH 1-adjuvans (en adjuvans som induserer en immunrespons av TH 1-type). Fortrinnsvis inngår både et pneumokokkprotein og en TH1-adjuvans. Preparatene ifølge oppfinnelsen er spesielt godt egnet for behandling av pneumoni hos eldre. Pneumokokkvaksiner (konjugerte eller ikkekonjugerte) er ikke nødvendigvis i stand til å beskytte mot pneumoni i den eldre populasjon, hvor forekomsten av denne sykdom er svært høy. Den viktigste forsvarsmekanisme mot pneumococcus er opsonofagocytose (en begivenhet som formidles av humorale B-celler og neutrofile celler og som skyldes produksjon av antistoffer mot pneumokokkpolysakkaridet, hvor bakterien til sist fagocyteres), deler av de opsoniske mekanismer som inngår er imidlertid svekkede hos eldre personer, dvs. superoksiddannelse ved PMN (polymorfonukleære celler), produksjon av andre reaktive oksygenmolekyler, mobilisering av PMN, apoptose av PMN og deformerbarhet av PMN. Antistoffresponsen kan også være svekket hos eldre.

I strid med det normalt aksepterte dogme er normalt nivå av anti-kapsulært polysakkarid-antistoffer ikke nødvendigvis effektive når det gjelder fullstendig fjerning av bakterier, siden pneumokokker kan invadere vertsceller for å unngå denne gren av immunsystemet.

De foreliggende oppfinnere har overraskende nok funnet at ved samtidig stimulering av den celleformidlete gren av immunsystemet (f. eks. T-celleformidlet immunitet) i tillegg til den humorale gren av immunsystemet (B-celleformidlet) er resultatet en synergi (eller et samarbeide) som kan forbedre fjerningen av pneumokokker fra verten. Dette er en oppdagelse som vil bidra til forebyggelse (eller behandling) av pneumokokkinfeksjoner generelt, men som vil være spesielt viktig for forebyggelse (eller behandling) av pneumonier hos eldre, hvor polysakkaridbaserte vaksiner ikke viser virkning.

De foreliggende oppfinnere har funnet at de to grener av immunsystemet kan samarbeide på denne måte dersom et pneumokokkpolysakkarid (fortrinnsvis konjugert) tilføres sammen med et pneumokokkprotein (fortrinnsvis et protein som uttrykkes på overflaten av pneumokokker eller som utskilles eller frigjøres, som kan prosesseres og presenteres sammen med MHC klasse II og klasse I på overflaten av infiserte pattedyrceller). Selv om et pneumokokkprotein i seg selv kan utløse celleformidlet immunitet har oppfinnerne også funnet at nærvær av en TH1-induserende adjuvans i vaksinepreparatet hjelper denne gren av immunsystemet, og overraskende nok gir en ytterligere styrking av samarbeidet mellom immunsystemets to grener.

B) Utvalgte pneumokokkpolysakkaridkonjugat + 3D-MPL-preparater

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer følgelig også et antigent preparat som omfatter ett eller flere pneumokokkpolysakkaridkonjugater sammen med 3D-MPL som adjuvans og i det vesentlige frie for aluminiumbaserte adjuvanser, hvori minst ett av

pneumokokkpolysakkaridkonjugatene er signifikant mer immunogent i preparater som

omfatter 3D-MPL, sammenliknet med preparater som omfatter 3D-MPL sammen med en aluminiumbasert adjuvans.

De foretrukne utførelser som tilveiebringes er antigene preparater som omfatter konjugater av et eller flere av følgende kapsulære polysakkarider fra pneumokokker: Serotype 4,6B, 18C, 19F og 23F. I slike preparater er hvert polysakkarid overraskende nok mer immunogent i preparater som omfatter 3D-MPL alene, sammenliknet med preparater som omfatter 3D-MPL og en aluminiumbasert adjuvans.

I en utførelse av oppfinnelsen tilveiebringes således et antigent preparat som omfatter kapsulært polysakkarid fra Streptococcus pneumoniae av serotype 4, 6B, 18C, 19F og 23F konjugert til et immunogent protein og med en 3D-MPL-adjuvans, hvori preparatet er i det vesentlige fritt for aluminiumbaserte adjuvanser.

I en andre utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et antigent kombinasjonspreparat som i det vesentlige er fritt for aluminiumbaserte adjuvanser og som omfatter 3D-MPL-adjuvans og to eller flere pneumokokkpolysakkaridkonjugater utvalgt fra gruppen bestående av: serotype 4,6B, 18C, 19F og 23F.

C) Bakterielt polysakkarid - protein D-konjugater

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således et polysakkaridkonjugatantigen omfattende et polysakkairdantigen avledet fra en patogen bakterie konjugert til protein D fra Haemophilus influenzae eller et fragment av dette. I tillegg tilveiebringer oppfinnelsen polyvalente vaksinepreparater hvor ett eller flere av polysakkaridantigenene er konjugert til protein D.

Oppsummert omfatter foreliggende oppfinnelse følgende:

Foreliggende oppfinnelse omfatter immunogent preparat, kjennetegnet ved at det omfatter minst ett polysakkaridantigen fra Streptococcus pneumoniae blandet med minst ett proteinantigen fra Streptococcus pneumoniae eller en immunologisk funksjonell ekvivalent av dette, og en adjuvans som er en preferensiell induser av en TH 1-respons og omfatter minst en av de følgende: monofosforyl-lipid A eller et derivat derav, en saponinimmunstimulant eller et immunstimulerende CpG-oligonukleotid.

Videre omfatter oppfinnelsen vaksine, kjennetegnet ved at den omfatter det immunogene preparat ifølge kravene 1-11.

Omfattet av oppfinnelsen er også anvendelse av et pneumokokkpolysakkaridantigen i kombinasjon med et proteinantigen fra Streptococcus pneumoniae og en TH 1-induserende adjuvans som omfatter minst en av de følgende: monofosforyl-lipid A eller et derivat derav, en saponinimmunstimulant eller et immunstimulerende CpG-oligonukleotid, for fremstilling av et medikament for forebyggelse av pneumoni hos pasienter over 55 år.

Til slutt omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av et immunogent preparat ifølge de ovenstående krav, kjennetegnet ved at den omfatter trinnene: - utvelgelse av et eller flere pneumokokkpolysakkaridantigener; - utvelgelse av et eller flere pneumokokkproteinantigener; - utvelgelse av en adjuvans som er en preferensiell induser av en TH1 -respons og omfatter minst en av de følgende: monofosforyl-lipid A eller et derivat derav, en saponinimmunstimulant eller et immunstimulerende CpG-oligonukleotid; og - sammenblanding av polysakkaridantigenet og proteinantigenet med en egnet eksipient.

BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

A) Pneumokokkpolysakkaridvaksiner

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en forbedret vaksine, særlig for forebyggelse eller lindring av pneumokokkinfeksjon hos eldre (og/eller spedbarn og småbarn).

I forbindelse med oppfinnelsen anses en pasient som eldre dersom vedkommende er 55 år gammel eller mer, typisk over 60 år, og mer generelt over 65 år gammel.

I en utførelse av oppfinnelsen tilveiebringes således et vaksinepreparat som er egnet for anvendelse i eldre (og/eller spedbarn og småbarn) som omfatter minst ett polysakkaridantigen fra Streptococcus pneumoniae og minst ett proteinantigen fra Streptococcus pneumoniae.

I en andre, foretrukket utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en vaksine (egnet for forebyggelse av pneumoni hos eldre) som omfatter minst ett polysakkaridantigen fra Streptococcus pneumoniae og minst ett proteinantigen fra Streptococcus pneumoniae samt en TH 1-adjuvans.

Det forventes at en slik vaksine også vil være anvendbar for behandling av pneumokokkinfeksjoner (f. eks. otitis media) i andre høyrisikogrupper i befolkningen, f. eks. hos spedbarn eller småbarn.

I en tredje utførelse tilveiebringes et vaksinepreparat som omfatter et pneumokokkpolysakkaridantigen og en TH 1-adjuvans.

Streptococcus pneumoniae polysakkaridantisener ifølse oppfinnelsen

Streptococcus pneumoniae- waksinen ifølge foreliggende oppfinnelse vil typisk omfatte polysakkaridantigener (fortrinnsvis konjugerte) hvori polysakkaridene er avledet fra minst fire serotyper av pneumococcus. De fire serotypene omfatter fortrinnsvis 6B, 14,19F og 23F. Mer foretrukket inngår minst 7 serotyper i preparatet, for eksempel avledet fra serotypene 4, 6B, 9V, 14,18C, 19F og 23F. Enda mer foretrukket inngår minst 11 serotyper i preparatet, for eksempel omfatter preparatet i en utførelse kapsulære polysakkarider avledet fra serotypene 1, 3,4, 5, 6B, 7F, 9V, 14,18C, 19F og 23F (fortrinnsvis konjugerte). I en foretrukket utførelse av oppfinnelsen inngår minst 13 polysakkaridantigener (fortrinnsvis konjugerte), selv om ytterligere polysakkaridantigener, for eksempel 23-valent (som serotypene 1,2, 3,4, 5,6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 1 IA, 12F, 14,15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20,22F, 23F og 33F), også omfattes av oppfinnelsen.

For vaksinasjon av eldre (f. eks. for forebyggelse av pneumoni) inngår fortrinnsvis serotypene 8 og 12F (og mest foretrukket også 15 og 22) i det 11-valente antigene preparat beskrevet ovenfor slik at det dannes en 15-valent vaksine, mens for spedbarn eller småbarn (hvor otitis media er et større problem) inngår fortrinnsvis serotypene 6A og 19A slik at det dannes en 13-valent vaksine.

For forebyggelse/lindring av pneumoni hos den eldre populasjon (+ 55 år) og otitis media hos spedbarn (opptil 18 måneder) og småbarn (typisk fra 18 måneder til 5 år) er en foretrukket utførelse av oppfinnelsen å kombinere et multivalent Streptococcus pneumoniae- polysakkand som beskrevet heri og et Streptococcuspneumoniae- protein eller en immunologisk funksjonell ekvivalent av dette.

Pneumokokkproteiner ifølse oppfinnelsen

For foreliggende oppfinnelses formål defineres "immunologisk funksjonell ekvivalent" som et peptid av et protein som omfatter minst en beskyttende epitop fra proteinene ifølge oppfinnelsen. Slike epitoper er typisk overflateeksponerte og svært konserverte, og de kan utløse en baktericid antistoffrespons i en vert eller forhindre toksiske virkninger. Den funksjonelle ekvivalent har fortrinnsvis 15, og mer foretrukket 30 eller flere, på hverandre følgende aminosyrer fra proteinet ifølge oppfinnelsen. Mest foretrukket kan fragmenter, delesjoner av proteinet, for eksempel transmembrandelesjonsvarianter av det (dvs. anvendelse av proteinenes ekstracellulære domene), fusjoner, kjemisk eller genetisk detoksifiserte derivater og liknende anvendes, med det forbehold at de er i stand til å utløse idet vesentlige den samme immunrespons som det native protein.

Foretrukne proteiner ifølge oppfinnelsen er pneumokokkproteiner som er eksponert på pneumokokkens ytre overflate (i stand til å gjenkjennes av vertens immunsystem under i det minste en del av pneumokokkens livssyklus), eller proteiner som utskilles eller frigjøres fra pneumokokken. Mest foretrukket er proteinet et toksin, et adhesin, en signaloverfører med to komponenter eller et liposom fra Streptococcus pneumoniae, eller en immunologisk funksjonell ekvivalent av disse.

Spesielt foretrukne proteiner for anvendelse i en slik kombinasjonsvaksine omfatter, men er ikke begrenset til: Pneumolysin (fortrinnsvis detoksifisert ved kjemisk behandling eller mutasjon) [Mitchell et al, Nucleic Acids Res. 1990 Jul 11; 18(13): 4010 "Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2.", Mitchell et al. Biochim Biophys Acta 1989 Jan 23; 1007(1): 67-72 "Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purification and biological properties.", WO 96/05859 (A. Cyanamid), WO 90/06951 (Paton et al), WO 99/03884 (NAVA)]; PspA og transmembrandelesjonsvarianter av dette (U.S. patentskriv nr. 5804193 - Briles et al.) ; PspC og transmembrandelesjonsvarianter av dette (WO 97/09994 - Briles et al); PsaA og transmembrandelesjonsvarianter av dette (Berry & Paton, Infect Immun 1996 Dec;64(12):5255-62 "Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae") ; cholinbindende pneumokokkproteiner og transmembrandelesjonsvarianter av disse, CbpA og transmembrandelesjonsvarianter av dette (WO 97/41151; WO 99/51266); Glyceraldehyd-3-fosfat - dehydrogenase (Infect. Immun. 1996 64:3533); HSP70 (WO 96/40928); PcpA (Sanchez-Beato et al. FEMS Microbiol Lett 1998,164:207-14); M-liknende protein, SB patentsøknad nr. EP0837130, og adhesin 18627, SB patentsøknad nr. EP 0834568.

Proteinene som anvendes i foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis utvalgte fra gruppen pneumolysin, PsaA, PspA, PspC, CbpA eller en kombinasjon av to eller flere slike proteiner. Foreliggende oppfinnelse omfatter også immunologisk funksjonelle ekvivalenter av slike proteiner (som definert ovenfor).

I preparatet kan proteinet bidra til induksjon av en T-celleformidlet respons mot pneumokokksydommer - noe som er spesielt nødvendig for beskyttelse mot pneumoni - som koopererer med immunsystemets humorale gren for inhibering av pneumokokkinvasjon og for stimulering av opsonofagocytose.

Videre fordeler med å la proteinantigenet inngå er presentasjonen av flere antigener for opsonofagocytose prosessen og inhibering av bakteriell adhesjon (dersom et adhesin anvendes) eller nøytralisering av toksin (dersom et toksin anvendes).

Følgelig tilveiebringes i en utførelse av oppfinnelsen en Streptococcus pneumoniae- waksme som omfatter en pneumokokkpolysakkaridkonjugatvaksine som omfatter polysakkairdantigener avledet fra minst fire serotyper, fortrinnsvis minst syv serotyper, mer foretrukket minst elleve serotyper, og minst ett, men fortrinnsvis to Streptococcus pneumoniae-<p>rotemer. Et av proteinene er fortrinnsvis pneumolysin, PsaA, PspA eller CbpA (mest foretrukket detoksifisert pneumolysin). En foretrukket kombinasjon inneholder minst pneumolysin eller et derivat av dette og PspA.

Som nevnt overfor er et problem forbundet med polysakkaridtilnærmingen til vaksinasjon det faktum at polysakkarider i seg selv er dårlige immunogener. For å overvinne dette kan polysakkarider konjugeres til proteinbærere, som gir hjelper-T-cellehjelp. Det foretrekkes derfor at polysakkaridene som anvendes i oppfinnelsen er koblet til en slik proteinbærer. Eksempler på slike bærere som i dag hyppig anvendes for fremstilling av polysakkaridimmunogener omfatter difteritoksoid og tetanus-toksoid (DT, DT CRM197 og TT), "Keyhole Limpef-Haemocyanin (KLH), OMPC fra N. meningitidis, og renset proteinderivat av tuberkulin (PPD).

En rekke problemer er imidlertid forbundet med alle disse hyppig anvendte bærere (se seksjonen "Problemer forbundet med hyppig anvendte bærere" ovenfor).

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer i en foretrukket utførelse en ny bærer for anvendelse ved fremstilling av polysakkaridbaserte immunogene konstruksjoner som ikke lider av disse ulempene. Den foretrukne bærer for de pneumokokkpolysakkaridbaserte immunogene preparatene (eller vaksinene) er protein D fra Haemophilus influenzae (EP 594610-B) eller fragmenter derav. Fragmenter som er egnet for anvendelse omfatter fragmenter som omfatter T-hjelperepitoper. Nærmere bestemt vil et protein D-fragment fortrinnsvis omfatte den N-terminale 1/3 av proteinet.

En ytterligere foretrukket bærer for pneumokokkpolysakkaridet er pneumokokkproteinet selv (som definert ovenfor i seksjonen "Pneumokokkproteiner ifølge oppfinnelsen").

Vaksinene ifølge den foreliggende oppfinnelse inneholder fortrinnsvis adjuvanser. Egnede adjuvanser omfatter et aluminiumsalt, f. eks. aluminiumhydroksidgel (alun) eller aluminiumfosfat, men kan også være et salt av kalsium, jern eller sink, eller de kan være en uløselig suspensjon av acylert tyrosin eller acylerte sukkere, kationisk eller anionisk derivatiserte polysakkarider eller polyfosfazener.

Det foretrekkes at adjuvansen som velges er en preferensiell induser av en respons av TH1-type, for å understøtte den celleformidlete gren av immunresponsen.

TH1 adjuvanser ifølse oppfinnelsen

Høyt nivå av cytokiner av THl-type bidrar til å fremme induksjonen av celleformidlete immunresponser mot et gitt antigen, mens høyt nivå av cytokiner av TH2-type bidrar til å favorisere induksjon av humorale immunresponser mot antigenet.

Det er viktig å huske at grensen mellom immunresponser av THl-type og TH2-type ikke er absolutt. I virkeligheten vil et individ understøtte en immunrespons som beskrives som hovedsakelig av THl-type eller hovedsakelig av TH2-type. Det er imidlertid ofte fordelaktig å betrakte cytokinfamiliene ut fra hva som beskrives for CD4 +ve T-cellekloner fra mus av Mosmann og Coffman (Mosmann, T.R. og Coffman, R.L. (1989) TH1 og TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, s.145-173). Tradisjonelt er responser av THl-type forbundet med cytokinene INF-y og IL-2 av T-lymfocyter. Andre cytokiner som ofte er direkte forbundet med induksjon av immunresponser av THl-type produseres ikke av T-celler, f. eks. IL-12.1 motsetning til dette er responser av TH2-type forbundet med utskillelse av IL-4, IL-5, IL-6 og IL-10. Egnede adjuvanssystemer som fremmer en respons av hovedsakelig THl-type omfatter monofosforyl-lipid A eller et derivat av dette, fortrinnsvis 3-de-O-acylert monofosforyl-lipid A og en kombinasjon av monofosforyl-lipid A, fortrinnsvis 3-de-O-acylert monofosforyl-lipid A (3D-MPL) og et aluminiumsalt.

Et forsterket system omfatter kombinasjonen av monofosforyl-lipid A og et saponinderivat, fortrinnsvis kombinasjonen av QS21 og 3D-MPL, som beskrevet i WO 94/00513, eller et mindre reaktivt preparat hvor QS21 er dempet med kolesterol, som beskrevet i WO 96/33739.

Et spesielt kraftig adjuvanspreparat som omfatter QS21, 3D-MPL og tokoferol i en olje i vann-emulsjon beskrives i WO 95/17210, og dette er et foretrukket preparat.

Vaksinen inneholder fortrinnsvis i tillegg et saponin, mer foretrukket QS21. Preparatet kan også omfatte en olje i vann-emulsjon og tokoferol (WO 95/17210).

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for fremstilling av et vaksinepreparat som omfatter sammenblanding av et protein ifølge foreliggende oppfinnelse og en farmasøytisk akseptabel eksipient, for eksempel 3D-MPL.

Ikke-metylerte, CpG-holdige oligonukleotider (WO 96/02555) er også preferensielle indusere av en THl-response og er egnede for anvendelse i foreliggende oppfinnelse.

Spesielt foretrukne preparater ifølge oppfinnelsen omfatter et eller flere konjugerte pneumokokkpolysakkarider, et eller flere pneumokokkproteiner og en TH 1-adjuvans. Induksjon av en celleformidlet respons ved hjelp av et pneumokokkprotein (som beskrevet ovenfor) og samarbeidet mellom de to grener av immunsystemet kan fremmes ved anvendelse av en slik TH 1-adjuvans, noe som fører til en spesielt effektiv vaksine mot pneumokokksykdommer generelt og, av størst betydning, mot pneumokokk-pneumoni hos eldre.

I ytterligere en utførelse av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes et immunogen eller en vaksine som beskrevet heri for anvendelse i en medisin.

I ytterligere en utførelse av oppfinnelsen tilveiebringes et preparat som omfatter et pneumokokkpolysakkaridkonjugat og en TH 1-adjuvans (fortrinnsvis 3D-MPL) som kan serokonvertere og indusere en humoral antistoffrespons mot polysakkaridantigenet i en populasjon av ikkeresponderende individer.

10-30 % av populasjonen vites ikke å respondere på polysakkaridimmunisering (responderer ikke på mer enn 50 % av serotypene i en vaksine) (Konradsen et al., Scand. J. Immun 40:251 (1994); Rodriguez et al, JID, 173:1347 (1996)). Dette kan også være tilfellet for konjugerte vaksiner (Musher et al., Clin. Inf. Dis. 27:1487 (1998)). Dette kan være spesielt alvorlig for høyrisikogrupper i befolkningen (spedbarn, småbarn og eldre).

De foreliggende oppfinnere har funnet at en kombinasjon av et konjugert pneumokokkpolysakkarid (som gir lav respons i en gitt befolkning) og en TH 1-adjuvans (se "TH 1-adjuvanser ifølge oppfinnelsen" ovenfor) overraskende nok kan overvinne denne ikke-responsivitet. Fortrinnsvis bør 3D-MPL anvendes, og mest foretrukket 3D-MPL uten aluminiumbasert adjuvans (som en gir en enda bedre respons). Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således slike preparater. Foreliggende oppfinnelsen kan anvendes i en fremgangsmåte for behandling av ikke respondere på pneumokokkpolysakkarider ved tilførsel av slike preparater.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en anvendelse av en TH 1-adjuvans ved fremstilling av et medikament som omfatter konjugerte pneumokokkpolysakkaridantigener for behandling av (eller beskyttelse mot) pneumokokksykdommer i individer som ikke responderer på polysakkaridantigenet.

Foreliggende oppfinnelse kan anvendes i en fremgangsmåte for forebyggelse eller lindring av pneumoni hos et eldre menneske som omfatter tilførsel av en sikker og effektiv mengde av en vaksine som beskrevet heri, som omfatter et Streptococcus pneumoniae-polysakkaridantigen og enten en TH 1-adjuvans eller et pneumokokkprotein (og fortrinnsvis begge deler) til den eldre pasienten.

Videre kan foreliggende oppfinnelse anvendes i en fremgangsmåte for å forebygge eller lindre otitis media hos spedbarn eller småbarn som omfatter tilførsel av en sikker og effektiv mengde av en vaksine som omfatter et Streptococcus /?«ewwøw'ae-polysakkaridantigen og enten et Streptococcus pwew/womae-proteinantigen eller en TH 1-adjuvans (og fortrinnsvis begge deler) til spedbarn eller småbarn.

I fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen som beskrevet ovenfor foreligger fortrinnsvis polysakkairdantigenet som et polysakkaridproteinkonjugat.

Vaksinepreparater ifølge oppfinnelsen

Vaksinepreparatene ifølge oppfinnelsen kan anvendes for å beskytte eller behandle pattedyr som er utsatt for infeksjon ved hjelp av systemisk tilførsel eller tilførsel via slimhinner av vaksinen. Slik tilførsel kan omfatte intramuskulær, intraperitonial, intradermal eller subkutan injeksjon eller mukosal tilførsel til magetarmkanalen, respirasjonssystemet, genitalia eller urinsystemet. Intranasal tilførsel av vaksiner for behandling av pneumoni eller otitis media foretrekkes (siden infeksjon med pneumokokker i nese og hals lettere kan forebygges, noe som svekker infeksjonen på dens tidligste stadium).

Mengden av konjugatantigen i hver vaksinedose utvelges som den mengde som induserer en immunbeskyttende respons uten vesentlige, uønskede bivirkninger i typiske vaksiner. En slik mengde vil variere avhengig av hvilket spesifikt immunogen som anvendes og hvordan det presenteres. Generelt forventes det at hver dose vil omfatte 0,1-100 jig polysakkarid, fortrinnsvis 0,1-50 ug, mer foretrukket 0,1-10 pg, og hvor 1 til 5 jig er det mest foretrukne område.

Innholdet av proteinantigener i vaksinen vil typisk være i området fra 1-100 fig, fortrinnsvis fra 5-50 ug, og mest typisk i området fra 5-25 ug.

Optimale mengder av bestanddeler for en gitt vaksine kan fastslås ved standardundersøkelser som omfatter observasjon av egnede immunresponser i individer. Etter en innledende vaksinasjon kan individene gis en eller flere forsterkerimmuniseringer med passende mellomrom.

Vaksinefremstilling beskrives generelt i Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (red. Powell M.F. eks. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press, New York). Innkapsling i liposomer beskrives av Fullerton , U.S. patentskrift nr. 4 235 877.

B) Utvalgte pneumokokksakkaridkonjugat + 3D-MPL-preparater

For foreliggende oppfinnelses formål beskriver begrepet

"pneumokokkpolysakkaridkonjugater ifølge oppfinnelsen" konjugater av kapsulære polysakkarider fra Streptococcus pneumoniae som er mer immunogene i preparater som omfatter 3D-MPL enn i preparater som omfatter 3D-MPL sammen med en aluminiumbasert adjuvans (f. eks. konjugater av serotype 4, serotype 6B, serotype 18C, serotype 19F eller serotype 23F).

For foreliggende oppfinnelses formål beskriver begrepet "i det vesentlige fritt for aluminiumbaserte adjuvanser" et preparat som ikke inneholder tilstrekkelig aluminiumbasert adjuvans (f. eks. aluminiumhydroksid og særlig aluminiumfosfat) til at dette gir en reduksjon av immunogenisiteten va et pneumokokkpolysakkaridkonjugat ifølge oppfinnelsen, sammenliknet med et ekvivalent preparat som omfatter 3D-MPL uten tilsatt aluminiumbasert adjuvans. Det antigene preparat bør inneholde adjuvans som i det vesentlige består av 3D-MPL. Mengden av aluminiumbasert adjuvans som tilsettes pr. dose bør fortrinnsvis være mindre enn 50 ug, mer foretrukket mindre enn 30 jig, enda mer foretrukket mindre enn 10 jtg, og mest foretrukket er ingen aluminiumbasert adjuvans tilsatt til de antigene preparatene ifølge oppfinnelsen.

For foreliggende oppfinnelses formål bør bestemmelse av hvorvidt et pneumokokkpolysakkaridkonjugat er signifikant mer immunogent enn preparater som omfatter 3D-MPL enn i preparater som omfatter 3D-MPL sammen med en aluminiumbasert adjuvans utføres som beskrevet i eksempel 2. Som et mål på hvorvidt et preparat er signifikant mer immunogent når det omfatter 3D-MPL alene bør forholdet mellom GMC IgG-konsentrasjonen (som bestemt i eksempel 2) mellom preparater som omfatter 3D-MPL alene og et ekvivalent preparat som omfatter 3D-MPL sammen med aluminiumbasert adjuvans være høyere enn 2, mer foretrukket høyere enn 5, enda mer foretrukket høyere enn 7, ytterligere mer foretrukket høyere enn 9, og mest foretrukket høyere enn 14.

Blant problemene som er forbundet med polysakkaridtilnærmingen til vaksinasjon er det faktum at polysakkarider i seg selv er dårlige immungener. Strategier som har blitt utformet for å overvinne denne manglende immunogenisitet omfatter kopling (konjugering) av polysakkaridet til store proteinbærere, som gir hjelper-T-cellehjelp. Det foretrekkes at pneumokokkpolysakkaridene ifølge oppfinnelsen er koblet til en proteinbærer som gir hjelper-T-cellehjelp. Eksempler på bærere som kan anvendes omfatter difteritoksoid, mutant av difteritoksoid og tetanus toksoid (DT, CRM197 og TT), "Keyhole Limpet"-Haemocyanin (KLH), renset proteinderivat av tuberkulin (PPD), og OMPC fra Neisseria meningitidis.

Mest foretrukket anvendes protein D fra Haemophilus influenzae (EP 0 594 610-B), eller fragmenter av dette (se seksjon C) som den immunogene proteinbærer for pneumokokkpolysakkaridene ifølge oppfinnelsen.

I en utførelse omfatter det antigene preparat ifølge oppfinnelsen pneumokokkpolysakkarid av serotype 4 (PS4) konjugert til et immunogent protein og utformet med 3D-MPL-adjuvans, hvor preparatet er i det vesentlige fritt for aluminiumbasert adjuvans. I ytterligere utførelser omfatter det antigene preparat PS 6B, 18C, 19F eller 23F, konjugert til et immunogent protein og utformet med 3D-MPL-adjuvans, hvor preparatet er i det vesentlige fritt for aluminiumbasert adjuvans.

I ytterligere en utførelse av oppfinnelsen tilveiebringes et antigent kombinasjonspreparat som omfatter to eller flere pneumokokkpolysakkaridkonjugater utvalgt fra gruppen PS 4, PS 6B, PS 18C, PS 19F og PS 23F, utformet med 3D-MPL-adjuvans, hvor preparatet er i det vesentlige fritt for aluminiumbasert adjuvans.

Immunogenisiteten av pneumokokkpolysakkarider ifølge oppfinnelsen påvirkes ikke i signifikant grad ved at de kombineres med andre pneumokokkpolysakkaridkonjugater (eksempel 3). Følgelig tilveiebringer en foretrukket utførelse av oppfinnelsen et antigent kombinasjonspreparat som omfatter ett eller flere pneumokokkpolysakkaridkonjugater ifølge oppfinnelsen i kombinasjon med ett eller flere andre pneumokokkpolysakkaridkonjugater, hvor preparatet er utformet med 3D-MPL-adjuvans, men er i det vesentlige fritt for aluminiumbasert adjuvans.

I ytterligere foretrukne utførelser av oppfinnelsen tilveiebringes antigenkombinasjonspreparater som inneholder minst ett og fortrinnsvis to, tre, fire eller alle fem av

pneumokokkpolysakkaridkonjugatene PS 4,6B, 18C, 19F eller 23F, og i tillegg enhver kombinasjon av andre pneumokokkpolysakkaridkonjugater, utformet med 3D-MPL-adjuvans, hvor preparatet er i det vesentlige fritt for aluminiumbasert adjuvans.

Det antigene Streptococcus pwew/womae-kombinasjonspreparat ifølge oppfinnelsen vil typisk omfatte polysakkaridkonjugatantigener hvori polysakkaridene er avledet fra minst 4, 7,11, 13,15 eller 23 serotyper (se " Streptococcuspneumoniae-polysakkaridkonjugatantigener ifølge oppfinnelsen" ovenfor for foretrukne kombinasjoner av serotyper avhengig av sykdommen som skal behandles).

De antigene preparatene ifølge oppfinnelsen anvendes fortrinnsvis som vaksinepreparater for å forebygge (eller behandle) pneumokokkinfeksjoner, særlig hos eldre, spedbarn og småbarn.

Videre utførelser av foreliggende oppfinnelse omfatter tilveiebringelse av de ovenfor beskrevne antigene preparater for anvendelse i medisiner, en fremgangsmåte for induksjon av en immunrespons mot et kapsulært polysakkaridkonjugat fra Streptococcus pneumoniae som omfatter trinnene tilførsel av en sikker og effektiv mengde av et av de ovenfor beskrevne antigene preparater til en pasient, og anvendelse av ett av de ovenfor beskrevne antigene preparater ved fremstilling av et medikament for forebyggelse av (eller behandling) av pneumokokksykdom.

Foreliggende oppfinnelse kan anvendes for forebyggelse /lindring av pneumoni hos den eldre (+ 55 år) populasjon og otitis media hos spedbarn (opptil 18 måneder) og småbarn (typisk fra 18 måneder til 5 år), ved kombinere et multivalent Streptococcus pneumoniae-polysakkairdkonjugat, utformet som beskrevet heri, med et Streptococcus pneumoniae- protein eller en immunologisk funksjonell ekvivalent av dette. Se avsnittet "pneumokokkproteiner ifølge oppfinnelsen" ovenfor for foretrukne proteiner og proteinkombinasjoner.

De antigene preparatene (og vaksinene) som beskrives heri ovenfor foreligger fortrinnsvis i frysetørket form inntil de skal anvendes, på hvilket tidspunkt de rekonstitueres etter behov med fortynningsmiddel. Mer foretrukket er de frysetørket i nærvær av 3D-MPL og rekonstitueres etter behov med saltløsning.

Frysetørking av preparatene fører til et mer stabilt preparat (frysetørking hindrer f. eks. nedbryting av polysakkaridantigenene). Prosessen gir også overraskende nok et enda høyere antistofftiter mot pneumokokkpolysakkaridene. Dette har blitt vist å være spesielt av betydning for PS6B-konjugater. En annen utførelse av oppfinnelsen er således et frysetørket antigent preparat som omfatter et PS 6B-konjugat og med 3D-MPL som adjuvans, og i det vesentlige fritt for aluminiumbaserte adjuvanser.

For fremstilling av vaksinene, se seksjonen "Vaksinepreparater ifølge oppfinnelsen" ovenfor.

C) Bakteriepolysakkarid — protein D-konjugater

Tendensen mot kombinasjonsvaksiner har den fordel at den reduserer ubehag for mottakeren, forenkler planleggingen av vaksineringen og sikrer fullføring av vaksineringsskjemaet, men medfører også en fare for at vaksinens effektivitet reduseres (se ovenfor for en diskusjon vedrørende epitopsupresjon grunnet for hyppig anvendelse av bærerproteiner). Det vil derfor være fordelaktig å fremstille vaksinekombinasjoner som oppfyller populasjonens behov og som i tillegg ikke viser immunogen interferens mellom bestanddelene. Disse fordelene kan realiseres ved de immunogene preparatene (eller vaksinene) ifølge oppfinnelsen, som er spesielt gunstige for tilførsel av kombinasjonsvaksiner til høyrisikogrupper som spedbarn, småbarn eller eldre. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et protein D fra Haemophilus influenzae, eller fragmenter av dette som bærer for polysakkaridbaserte immunogene preparater, innbefattet vaksiner. Fragmenter som er egnede for anvendelse omfatter fragmenter som omfatter T-hjelperepitoper. Nærmere bestemt vil protein D-fragmentet fortrinnsvis omfatte den N-terminale 1/3 av proteinet.

Protein D er et IgD-bindende protein fra Haemophilus influenzae (EP 0 594 610 Bl) og er et kraftig immunogen.

Polysakkarider for konjugering til protein D som omfattes av foreliggende oppfinnelse omfatter, men er ikke begrenset til, Vi-polysakkaridantigenet fra Salmonella typhi, meningokokkpolysakkarider (innbefattet type A, C, W135 og Y, og polysakkarid og modifiserte polysakkarider fra gruppe B meningokokker), polysakkarider fra Staphylococcus aureus, polysakkarider fra Streptococcus agalactae, polysakkarider fra Streptococcus pneumoniae, polysakkarider fra mycobakterier, f. eks. Mycobacterium tuberculosis (f. eks. mannofosfoinositider, trehaloser, mycolsyre, arabinomannaner med mannose i enden, kapselen fra mycobakterier og arabinogalaktaner), polysakkarid fra Cryptococcus neoformans, lipopolysakkaridene fra ikke-typbar Haemophilus influenzae, det kapsulære polysakkarid fra Haemophilus influenzae b, lipopolysakkaridene fra Moraxella catharralis, lipopolysakkaridene fra Shigella sonnei, lipopeptidofosfoglykanet (LPPG) fra Trypanosoma cruzi, de cancerforbundende gangliosidene GD3 og GD2, de tumor assosierte myciner, fortrinnsvis T-F-antigenet og sialyl-T-F-antigenet, og det HIV-assossierte polysakkarid som er strukturelt beslektet med T-F-antigenet.

Polysakkaridet kan kobles til bærerproteinet ved enhver kjent fremgangsmåte (se f. eks. fremgangsmåten beskrevet av Likhite, U.S. patentskrift nr. 4 372 945 og av Armor et al., U.S. patentskrift nr. 4 474 757). Fortrinnsvis utføres en CDAP-konjugasjon (WO 95/08348).

I CD AP-fremgangsmåten anvendes fortrinnsvis cyanyleringsreagenset 1-cyanodimetylaminopyridiniumtetrafluorborat (CDAP) for syntese av polysakkarid-proteinkonjugater. Cyanyleringsreaksjonen kan utføres under relativt milde betingelser slik at hydrolyse av de alkalisensitive polysakkaridene unngås. Denne syntesen tillater direkte kobling til et bærerprotein.

Polysakkaridet løses i vann eller i en saltløsning. CD AP løses i acetonitril og tilsettes umiddelbart etter til polysakkaridløsningen. CD AP reagerer med polysakkaridets hydroksylgrupper slik at det dannes en cyanatester. Etter aktiveringstrinnet tilsettes bærerproteinet. Aminogrupper i lysin reagerer med det aktiverte polysakkarid slik at det dannes en kovalent isoureabinding.

Etter koblingsreaksjonen tilsettes så et stort overskudd av glysin for å blokkere gjenværende aktiverte grupper. Produktet sendes så gjennom en gelpermeasjonskolonne for fjerning av ikke-reagert bærerprotein og gjenværende reagenser. Følgelig tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling polysakkarid-protein D-konjugater som omfatter aktivering av polysakkaridet og kobling av polysakkaridet til protein D.

I en foretrukket utførelse av oppfinnelsen tilveiebringes et immunogent preparat (eller et vaksinepreparat) for forebyggelse av infeksjoner med Streptococcus pneumoniae.

Mekanismene ved hvilke pneumokokker sprer seg til lunger, cerebrospinalvæske og blod er dårlig forstått. Vekst av bakterier som når normale lungealveoler inhiberes av disses relative tørrhet og av den fagocytiske aktivitet av alveolære makrofager. Eventuelle anatomiske eller fysiologiske endringer i disse koordinerte forsvarsmekanismene, bidrar til å øke lungenes utsatthet for infeksjon. Celleveggen i Streptococcus pneumoniae har en viktig rolle i frembringelse av en inflammasjonsrespons i lungenes alveoler (Gillespie et al. (1997), I & I 65: 3936).

Streptococcus pneumoniae- waksinen ifølge foreliggende oppfinnelse vil typisk omfatte protein D-polysakkaridkonjugater hvori polysakkaridet er avledet fra minst fire, syv, elleve, tretten, femten eller 23 serotyper. Se " Streptococcus pwew/womae-polysakkaridantigener ifølge oppfinnelsen " ovenfor for foretrukne kombinasjoner av serotyper avhengig av sykdommen som skal behandles.

I ytterligere en utførelse av oppfinnelsen tilveiebringes en Neisseria meningitidis- waksine, nærmere bestemt fra serotypene A, B, C W-135 og Y. Neisseria meningitidis er en av de viktigste årsaker til bakteriell meningitt. Karbohydratkapselen til disse organismene kan virke som en virulensdeterminant og som mål for beskyttende antistoff. Karbohydrater er ikke desto mindre velkjente som dårlige immunogener hos yngre barn. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en spesielt egnet proteinbærer for disse polysakkaridene, protein D, som tilveiebringer T-celleepitoper som kan aktivere en T-cellerespons for å bidra til polysakkaridantigenspesifikk B-celleproliferasjon og -modning så vel som induksjon av immunologisk hukommelse.

I en alternativ utførelse av oppfinnelsen tilveiebringes et kapsulært polysakkarid fra Haemophilus influenzae b (PRP) konjugert med protein D.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også kombinasjonsvaksiner som gir beskyttelse mot en rekke forskjellige patogener. En protein D-bærer er overraskende nok anvendbar som bærer i kombinasjonsvaksiner hvor flere polysakkaridantigener er konjugerte. Som nevnt ovenfor vil sannsynligvis epitopsupresjonen opptre dersom samme bærer anvendes for hvert polysakkarid. WO 98/51339 presenterte preparater som prøvde å minimalisere denne interferensen ved å konjugere en andel av polysakkaridene i preparatet til DT og resten til

TT.

De foreliggende oppfinnere har overraskende nok funnet at protein D er spesielt godt egnet for minimalisering av slike epitopsupresjonsvirkninger i kombinasjonsvaksiner. Et eller flere polysakkarider i en kombinasjon kan med fordel konjugeres til protein D, og fortrinnsvis er alle antigener i slike kombinasjonsvaksiner konjugert til protein D.

En foretrukket kombinasjon omfatter en vaksine som gir beskyttelse mot infeksjon med Neisseria meningitidis C og Y (og fortrinnsvis A), hvori polysakkaridantigen fra en eller flere av serotypene Y og C (og mest foretrukket A) er koblet til protein D.

Haemophilus w/7wewzae-polysakkaridbasert vaksine (PRP, fortrinnsvis konjugert til TT, DT eller CRM197, eller mest foretrukket til protein D) kan utformes med de ovenfor beskrevne kombinasjonsvaksinene.

Mange pediatriske vaksiner gis nå som kombinasjonsvaksiner for å redusere antall injeksjoner et barn må gis. For pediatriske vaksiner kan således andre antigener utformes sammen med vaksinene ifølge oppfinnelsen. Vaksinene ifølge oppfinnelsen kan for eksempel utformes med eller tilføres atskilt fra, men samtidig med, den velkjente "trivalente" kombinasjonsvaksinen som omfatter difteritoksoid (DT), tetanus-toksoid (TT), og pertussis bestanddeler [typisk detoksifisert Pertussis-toksoid (PT) og filamentøst haemagglutinin (FHA), eventuelt med pertactin (PRN) og/eller agglutinin 1+2], for eksempel den markedsførte vaksine "INFANRIX-DTPa" (SmithKlineBeecham Biologicals), som inneholder antigenene DT, TT, PT, FHA og PRN, eller med en helcelle-pertussis bestanddel, for eksempel som markedsført av SmithKlineBeecham Biologicals s.a., som "Tritanrix". Kombinasjonsvaksinen kan også omfatte andre antigener, for eksempel hepatitt B-overflateantigen (HBsG), poliovirusantigener (f. eks. inaktivert trivalent poliovirus - IPV), ytre membranproteiner fra Moraxella catarrhalis, proteiner fra ikke-typbar Haemophilus influenzae og ytre membranproteiner fra N meningitidis B.

Eksempler på foretrukne proteinantigener fra Moraxella catarrhalis som kan inngå i en kombinasjonsvaksine (særlig for forebyggelse av otitis media) er: OMP106 [WO 97/41731 (Antex) & WO 96/34960 (PMC)]; OMP21; LbpA & LbpB [WO 98/55606 (PMC)]; TbpA & TbpB [WO 97/13785 & WO 97/32980 (PMC)]; CopB [Helminen ME, et al. (1993) Infect. Immun. 61:2003-2010]; UspAl/2 [WO 93/03761 (University of Texas)]; og OmpCD. Eksempler på antigener fra ikke-typbar Haemophilus influenzae som kan inngå i en kombinasjonsvaksine (særlig for forebyggelse av otitis media) omfatter: Fimbrin protein [(US 5766608 - Ohio State Research Foundation)] og fusjoner som omfatter peptider av dette [f. eks. LBl(f)-peptidfusjoner; US 5843464 (OSU) eller WO 99/64067]; OMP26 [WO 97/01638 (Cortecs)]; P6 [EP 281673 (State University of New York)]; TbpA og TbpB; Hia; Hmwl,2; HapogD15.

Foretrukne pediatriske vaksiner som omfattes av foreliggende oppfinnelse er:

a) N. meningitidis C-polysakkaridkonjugat og Haemophilus influenzae b-polysakkaridkonjugat, om ønskelig med N. meningitidis A og/eller Y-polysakkaridkonjugat forutsatt at minst ett polysakkaridantigen og fortrinnsvis alle er

konjugert til protein D.

b) Vaksine a) med DT, TT, pertussis bestanddeler (fortrinnsvis PT, FHA og PRN), hepatitt B-overflateantigen og IPV (inaktivert trivalent poliovirusvaksine).

c) Streptococcus/?«ewwøwae-polysakkaridantigener konjugert til protein D.

d) Vaksine c) med ett eller flere antigener fra Moraxella catarrhalis og/eller ikke-typbar

Haemophilus influenzae.

Alle kombinasjonsvaksinene nevnt ovenfor kan dra fordel av at protein D inngår som bærer. Det er åpenbart at jo flere bærere som inngår i en kombinasjonsvaksine (f. eks. for å unngå epitopsupresjon), jo mer kostbar og komplisert er den endelige vaksine. Det å ha alle eller et flertall av polysakkaridantigenene i en kombinasjonsvaksine konjugert til protein D gir således en betydelig fordel.

For forebyggelse av pneumoni i den eldre (+55 år) populasjon og otitis media hos spedbarn og småbarn kan oppfinnelsen kombineres i et multivalent

streptokokkpneumonipolysakkaird-protein D-antigenpreparat som beskrevet heri med et Streptococcus pneumoniae- protein eller en immunologisk funksjonell ekvivalent av dette. Se seksjonen "pneumokokkproteiner ifølge oppfinnelsen" ovenfor for foretrukne proteiner og proteinkombinasjoner som kan inngå i en slik kombinasjon.

Følgelig tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et immunogent preparat som omfatter et Streptococcus pwew/wørøae-polysakkarid-protein D-konjugat og et Streptococcus pneumoniae- proteinantigen.

Polysakkaird-protein D-konjugatantigenene ifølge foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis blandet med adjuvans i vaksinepreparatet ifølge oppfinnelsen. Egnede adjuvanser omfatter et aluminiumsalt, for eksempel aluminiumhydroksidgel (alun) eller aluminiumfosfat, men kan også være et salt av kalsium, jern eller sink, eller det kan være en uløselig suspensjon av acylert tyrosin eller acylerte sukkere, kationisk eller anionisk derivatiserte polysakkarider eller polyfosazener.

For vaksiner for anvendelse på eldre foretrekkes det at adjuvansen er utvalgt til å være en preferensiell induser av en respons av THl-type.

For spesielle TH 1-adjuvanser, se "TH 1-adjuvanser ifølge oppfinnelsen" ovenfor.

I ytterligere en utførelse av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes et immunogen eller en vaksine som beskrevet heri for anvendelse i medisiner.

For vaksinefremstilling/tilførsel av konjugatet, se "Vaksinepreparater ifølge oppfinnelsen" ovenfor.

Protein D anvendes også med fordel i en vaksine mot otitis media, siden proteinet i seg selv er et immunogen som kan gi B-celleformidlet beskyttelse mot ikke-typbar H. influenzae (ntHi). ntHi kan invadere vertsceller og unngå de B-celleformidlede virkninger som induseres av proteinantigenet. De foreliggende oppfinnere har overraskende nok funnet en måte på hvilken effektiviteten av protein D (enten alene eller som bærer for et polysakkarid) som et antigen for en otitis media-vaksine kan økes. Dette gjøres ved å blande protein D med en adjuvans slik at en kraftig TH 1-respons induseres i individet, slik at den celleformidlete gren av immunsystemet optimaliseres mot protein D. Dette oppnås overraskende nok ved anvendelse av et frysetørket preparat som omfatter protein D og en TH 1-adjuvans (fortrinnsvis 3D-MPL) som rekonstitueres kort tid før tilførsel. Oppfinnelsen tilveiebringer således slike preparater, en prosess for fremstilling av slike preparater (ved frysetørking av en blanding som omfatter protein D og en TH 1-adjuvans), og anvendelse av et slikt preparat ved behandling av otitis media.

Bredere sett forventer oppfinnerne at frysetørking av et immunogen i nærvær av en TH1-adjuvans (se "TH 1-adjuvanser ifølge oppfinnelsen"), fortrinnsvis 3D-MPL, generelt vil forsterke TH 1-immunresponsen mot immunogenet. Foreliggende oppfinnelse kan derfor anvendes for ethvert immunogen hvor man ønsker en kraftigere TH 1-immunrespons. Slike immunogener omfatter proteinantigener fra bakterier, virus og tumorer, så vel som "selv"-proteiner og -peptider.

EKSEMPLER

Eksempel 1

Kapsulært polysakkarid fra S. pneumoniae'.

Den 11-valente kandidatvaksine omfatter kapsulære polysakkarider fra serotypene 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F og 23F fremstilt i det vesentlige som beskrevet i EP 72513. Hvert polysakkarid aktiveres og derivatiseres ved anvendelse av CDAP-kjemi (WO 95/08348) og konjugeres til proteinbæreren. Alle polysakkarider konjugeres i sin native form bortsett fra serotype 3 (hvor størrelsen ble redusert for å redusere viskositeten).

Proteinbærer:

Den valgte proteinbærer er det rekombinante protein D (PD) fra ikke-typbar Haemophilus influenzae, uttrykt i E. coli.

EKSPRESJON AV PROTEIN D

Protein D fra Haemophilus influenzae

Genetisk konstruksjon for protein D-ekspresjon

Utgangsmaterialer

DNA som koder for protein D

Protein D er svært konservert blant H. influenzae av alle serotyper og ikke-typbare stammer. Vektoren pHIC348, som inneholder DNA-sekvensen som koder for hele protein D-genet, har blitt erholdt fra Dr. A Forsgren, Medisinsk Mikrobiologi, Lunds Universitet, Universitetssjukhuset MAS, Malmo, Sverige. DNA-sekvensen som koder for protein D har blitt publisert av Janson et al. (1991) Infect. Immun 59: 119-125.

Ekspresjonsvektoren pMGl

Ekspresjonsvektoren pMGl er et derivat av pBR322 (Gross et al., 1985) i hvilket kontrollelementer avledet fra bakteriofag X for transkripsjon og translasjon av fremmede innsatte gener ble innført (Shatzman et al., 1983). I tillegg ble ampicillinresistensgenet byttet ut med kanamycinresistensgenet.

E. coli stamme ARS8

E. coli stamme AR58 ble dannet ved transduksjon av N99 med en bakteriofag Pl-suspensjon som tidligere var dyrket i et SA500-derivat (galE::TN10, lambdaKil"cI857 AH1). N99 og SA500 er E. coli K12-stammer utviklet i Dr. Martin Rosenbergs laboratorium ved National Institute of Health.

Ekspresjonsvektoren pMGl

For fremstilling av protein D har DNA som koder for proteinet blitt klonet i ekspresjonsvektoren pMGl. Dette plasmid anvender signaler fra bakteriofag lambda-DNA for å styre transkripsjonen og translasjonen av innsatte, fremmede gener. Vektoren inneholder promoteren PL, operatoren OL og to utiliseringsseter (NutL og NutR) for å lette transkripsjonspolaritetsvirkninger dersom protein N tilveiebringes (Gross et al., 1985). Vektorer som inneholder PL-promoteren innføres i en lysogen E. coli-vert for stabilisering av plasmid-DNA. Lysogene vertsstammer inneholder replikasjonsdefekt bakteriofag lambda-DNA integrert i genomet (Shatzman et al., 1983). Det kromosomale bakteriofaglambda-DNA styrer syntese av cl-repressorproteinet, som bindes til OL-repressoren i vektoren og forhindrer binding av RNA polymerase til PL-promoteren og derved transkripsjon av det innsatte gen. cl-genet i ekspresjonsstammen AR58 koder for en temperatursensitiv mutant, slik at PL-styrt transkripsjon kan reguleres ved temperaturendringer, dvs. at en økning av dyrkingstemperaturen inaktiverer repressoren og syntese av det fremmede protein initieres. Dette ekspresjonssystemet tillater kontrollert syntese av fremmede proteiner, særlig av proteiner som kan være toksiske for cellen (Shimataka & Rosenberg, 1981).

E. coli stamme ARS8

Den lysogene E. co//-stammen AR58 som anvendes for fremstilling av protein D-bæreren er et derivat av standard-NIH-Æ. coli K12-stammen N99 (F"su"galK2, lacZ"thr"). Den inneholder en defekt, lysogen bakteriofag lambda (galE::TN10, lambdaKil" cI857 AH1). Kil" - fenotypen forhindrer avskruing av vertens syntese av makromolekyler. cI857-mutasjonen innfører en temperatursensitiv lesjon i cl-repressoren. AHl-delesjonen fjerner det høyre operon fra bakteriofag lambda og vertens bio-, uvr3- og chlA-loci. Stamme AR58 ble dannet ved transduksjon av N99 med en bakteriofag Pl-suspensjon som tidligere var dyrket i et SA500-derivat (galE::TN10, lambdaKil" cI857 AH1). Innføring av det defekte lysogen i N99 ble selektert med tetrasyklin, grunnet nærvær av et TNlO-transposon som koder for tetrasyklinresistens i det nærliggende galE-gen.

Konstruksjon av vektor pMGMDPPrD

Vektor pMG 1, som inneholder genet som koder for det ikke-strukturelle Sl-protein fra Influenzae-virus (pMGNSI), ble anvendt for konstruksjon av pMGMDPPrD. Protein D-genet ble amplifisert ved PCR fra vektoren pHIC348 (Janson et al. 1991) med PCR-primere som inneholdt Ncol- og Xbal-restriksjonsseter i 5' henholdsvis 3' ende. NcoI/Xbal-fragmentet ble så innsatt i pMGNSI mellom Ncol og Xbal, slik at det ble dannet et fusjonsprotein som inneholdt de 81 N-terminale aminosyrene fra NS 1-proteinet fulgt av PD-proteinet. Denne vektoren ble betegnet pMGNSlPrD.

Basert på konstruksjonen beskrevet ovenfor ble den endelige konstruksjonen for protein D-ekspresjon dannet. Et BamHJ/BamHI-fragment ble fjernet fra pMGNSlPrD. Denne DNA-hydrolysen fjernet det NS 1-kodende område bortsett fra de tre første N-terminale aminosyrerestene. Ved re-ligering av vektoren dannes et gen som koder for et fusjonsprotein med følgende N-terminale aminosyresekvens:

MDP SSHSSNMANT

NS1 Protein D

Dette protein D inneholder intet lederpeptid eller de N-terminale cystein som lipidkjeder normalt er koblet til. Proteinet vil derfor verken utskilles til periplasma eller lipideres, og forblir i cytoplasma i løselig form.

Den endelige konstruksjon, pMG-MDPPrD, ble innført i vertsstammen AR58 ved varmesjokk ve 37 °C. Plasmidholdige bakterier ble selektert i nærvær av kanamycin. Nærvær av DNA-innskudd som koder for protein D ble vist ved kutting av isolert plasmid-DNA med utvalgte endonukleaser. Den rekombinante E. co//-stamme betegnes ECD4.

Ekspresjon av protein D er under kontroll av PL-promoteren/ OL-operatoren fra bakteriofag lambda. Vertsstammen AR58 inneholder et temperatursensitivt cl-gen i genomet som blokkerer ekspresjon fra lambda Pl ved lav temperatur ved at det bindes til Ol. Når temperaturen heves frigjøres cl fra Ol, og protein D uttrykkes. Etter avsluttet fermentering konsentreres cellene og nedfryses.

Ekstraksjon fra høstede celler og rensing av protein D ble utført som følger: De nedfrosne, nedsentrifugerte cellene tines og resuspenderes i en celleoppbrytningsløsning (citratbuffer pH 6,0) til en endelig OD650= 60. Suspensjonen får passere to ganger gjennom en høytrykkshomogenisator ved P = 1000 bar. Celledyrkingshomogenatet klarnes ved sentrifugering og cellerester fjernes ved filtrering. I det første rensetrinn påsettes det filtrerte lysat en kationbytterkromatografikolonne (SP Sepharose Fast Flow). PD bindes til gelmatriksen ved ioniske interaksjoner og elueres ved en trinnvis økning av elueringsbufferens ionestyrke.

I et andre rensetrinn tilbakeholdes urenheter på en anionbyttermatriks (Q Sepharose Fast Flow). PD bindes ikke til gelen og kan oppsamles i det ubundete materiale.

I begge kolonnekromatografitrinnene følges oppsamlingen av fraksjoner ved OD. Ubundet materiale fra anionbytterkolonnekromatografien, som inneholder det rensete protein D, konsentreres ved ultrafiltrering.

Det protein D-holdige filtrat fra ultrafiltreringen får til slutt passere gjennom en 0,2 pm membran.

Kjemi:

Aktiverings- og koplingskjemi

Aktiverings- og koplingsbetingelsene er spesifikke for hvert polysakkarid. Betingelsene gis i tabell 1. Nativt polysakkarid (bortsett fra for PS3) ble løst i 2M NaCl eller i injeksjonsvann. Den optimale polysakkaridkonsentrasjonen ble evaluert for alle serotyper.

Fra en lagerløsning med 100 mg/ml i acetonitril ble CD AP (CDAP/PS-forhold: 0,75 mg/mg PS) tilsatt til polysakkaridløsningen. 1,5 minutt senere ble 0,2 M trietylamin tilsatt for erholdelse av den spesifikke aktiverings-pH. Aktivering av polysakkaridet ble utført ved denne pH i løpet av 2 minutter ved 25 °C. Protein D (mengden avhenger av utgangs-PS/PD-forholdet) ble tilsatt til det aktiverte polysakkarid, og koplingsreaksjonen ble utført ved den spesifikke pH i 1 time. Reaksjonen ble så stanset med glysin i 30 minutter ved 25 °C og over natten ved 4 °C.

Konjugatene ble renset ved gelfiltrering ved anvendelse av en Sephacryl 500HR gelfiltreringskolonne ekvilibrert med 0,2 M NaCl.

Innholdet av karbohydrat og protein i de eluerte fraksjoner ble bestemt. Konjugatene ble slått sammen og sterilfiltrert gjennom en 0,22 pm steriliseringsmembran. PS/proteinforholdet i konjugatpreparatene ble bestemt.

Karakterisering:

Hvert konjugat blekarakterisertog oppfylte spesifikasjonene som er beskrevet i tabell 2. Polysakkaridinnholdet (fig/ml) ble målt ved Resorcinol-analysen og proteininnholdet (fig/ml) ved Lowry-analysen. Det endelige PS/PD-forhold (vekt/vekt) bestemmes utfra forholdet mellom disse konsentrasjonene.

Innhold av gjenværende DMAP ( ng/ yg PS) :

Aktivering av polysakkaridet med CD AP innfører en cyanatgruppe i polysakkaridet, mens DMAP (4-dimetylaminopyridin) frigjøres. Gjenværende innhold av DMAP ble bestemt ved en spesifikk analyse utviklet ved SB.

Innhold av fritt polysakkarid (%) :

Innhold av fritt polysakkarid i konjugater holdt ved 4 °C eller lagret i 7 dager ved 37 °C ble bestemt i supernatanten erholdt etter inkubering med a-PD-antistoffer og mettet ammoniumsulfat, fulgt av en sentrifugering.

En a-PS/a-PS-ELISA ble anvendt for kvantifisering av fritt polysakkarid i supernatanten. Fravær av konjugat ble også kontrollert ved en a-PD/a-PS-ELISA. En reduksjon av mengden fritt polysakkarid fører til en forbedret konjugatvaksine.

Antigenisitet:

Antigenisiteten av de samme konjugatene ble analysert i en ELISA av "sandwich"-type, hvori innfanging og påvisning av antistoffene skjedde med a-PS henholdsvis a-PD.

Innehold av fritt protein (%).

Innholdet av "fritt" gjenværende protein D ble bestemt ved anvendelse av en fremgangsmåte med SDS-behandling av prøven. Konjugatet ble oppvarmet i 10 minutter ved 100 °C i nærvær av 0,1 % SDS og injisert på en SEC-HPLC gelfiltreirngskolonne (TSK 3000-PWXL). Siden protein D er en dimér er det en fare for å overestimere nivået av "fritt" protein D ved å dissosiere strukturen med SDS.

Molekylstørrelse ( Kav) :

Bestemmelse av molekylstørrelse ble utført på en SEC-HPLC-gelfiltreringskolonne (TSK 5000-PWXL).

Stabilitet:

Stabiliteten ble målt på en HPLC-SEC-gelfiltreringskolonne (TSK 6000-PWXL) for konjugater holdt ved 4 °C og lagret i 7 dager ved 37 °C.

Karakterisering av det 11-valente preparat gis i tabell 2.

Proteinkonjugatet kan absorberes til aluminiumfosfat og sammenblandes for dannelse av den endelige vaksine.

Konklusjon:

Det har blitt fremstilt immunogene konjugater som senere har blitt anvendt som bestanddeler i en lovende vaksine. De optimale CDAP-betingelser for den beste kvalitet av det endelige konjugerte pneumokokkpolysakkaridprodukt ble bestemt for hver av de 11 valensene. Konjugater av disse pneumokokkpolysakkaridene, erholdt ved den ovenfor beskrevne, forbedrede (optimaliserte) CDAP-prosess (uavhengig av bærerproteinet, men fortrinnsvis med protein D) er således ytterligere en utførelse av oppfinnelsen.

Eksempel 2 - Undersøkelse av virkningen av avanserte adjuvanser på immunogenisiteten av den 11- valente pneumokokk- PS- PD- konjugatvaksinen i rotteunger

Rotteunger ble immunisert med 11-valent pneumokokk-PS-PD-konjugatvaksine i en dose på 0,1 jig av hvert polysakkarid (fremstilt ifølge fremgangsmåten i eksempel 1) og ved anvendelse av følgende adjuvanstilsetninger: Ingen, AIPO4, 3D-MPL, 3D-MPL på AIPO4.

Preparatet med kun 3D-MPL var statistisk (og overraskende) mer immunogent (den høyeste GMC av IgG) enn de andre preparatene for 5 av 11 antigener. Dette gjaldt både ved høye og lave konsentrasjoner av 3D-MPL.

Opsonofagocytose bekreftet GMC-resultatene.

Materialer og fremgangsmåter

Immuniseringsfremgangsmåte

OFA-rotteunger ble tilfeldig utplukket fra forskjellige mødre og var 7 dager gamle da de ble gitt den første immunisering. De ble gitt ytterligere to immuniseringer 14 og 28 dager senere. Blod ble tappet på dag 56 (28 dager etter tredje immunisering). Alle vaksiner ble injisert subkutant, og det var 10 rotter i hver vaksinegruppe.

Rottene ble immunisert med en 11-valent pneumokokk-konjugatvaksine som omfattet følgende polysakkairdserotyper konjugert til protein D: 1,3,4,5,6B, 7F, 9V, 14,18C, 19F og 23F.

Utforming

For å undersøke virkningen av forskjellige avanserte adjuvanser ble konjugatdosen holdt konstant på 0,1 pg av hvert polysakkarid, og adjuvansene AIPO4og 3D-MPL ble tilsatt i forskjellige doser og kombinasjoner, innbefattet ingen adjuvans i det hele tatt. Disse er opplistet numerisk i tabell 3 for referanse.

Absorpsjon til AIPO4

De konsentrerte, absorberte monovalente preparatene ble fremstilt ifølge følgende fremgangsmåte: 50 jig AIPO4(pH 5,1) ble blandet med 5 jig konjugerte polysakkarider i 2 timer. pH ble justert til pH 5,1, og blandingen ble inkubert i ytterligere 16 timer. 1500 mM NaCl ble tilsatt til en saltkonsentrasjon på 150 mM. Etter 5 minutter ble 5 mg/ml 2-fenoksyetanol tilsatt. Etter ytterligere 30 minutter ble pH justert til 6,1, og blandingen ble lagret i mer enn 3 dager ved 4 °C.

Fremstilling av fortynningsmidler

Tre fortynningsmidler ble fremstilt i 150 mM NaCl 5mg/ml fenoksyetanol

A: AIPO4i 1 mg/ml

B: 3D-MPL på A1P04, 250 hhv. 1000 pg/ml. Vektforhold 3D-MPL/A1P04= 5/20

C: 3D-MPL på A1P04, 561 hhv. 1000 pg/ml. Vektforhold 3D-MPL/A1P04= 50/89

Fremstilling av absorbert undekavalent preparat

De elleve konsentrerte, absorberte, monovalente PS-PD-preparatene ble sammenblandet i korrekt forhold. Tilsvarende mengde AIPO4ble tilsatt som fortynningsmiddel. Om nødvendig ble 3D-MPL tilsatt, enten som en vandig løsning (ikke absorbert, fremgangsmåte 1, se nedenfor) eller som fortynningsmiddel B eller C (3D-MPL absorbert til AIPO4i 2 doser, fremgangsmåte 2, se nedenfor).

Fremgangsmåte 1

3D-MPL ble tilsatt til de sammenblandede absorberte konjugater som en vandig suspensjon. Forbindelsen ble sammenblandet med det undekavalente preparat i 10 minutter ved romtemperatur og lagret ved 4 °C til det skulle tilføres.

Fremgangsmåte 2

3D-MPL ble preabsorbert til AIPO4før tilsetning til de sammenblandede, absorberte konjugater (fortynningsmiddel B og C). For fremstilling av 1 ml fortynningsmiddel ble en vandig suspensjon av 3D-MPL (250 eller 561 ug) blandet med 1 mg AIPO4i 150 mM NaCl, pH 6,3 i 5 minutter ved romtemperatur. Denne løsningen ble fortynnet med NaCl pH 6,1/fenoksy og inkubert over natten ved 4 °C.

Fremstilling av ikke- absorbert undekavalent preparat

De elleve PS-PD-konjugatene ble sammenblandet og fortynnet ved korrekt forhold i 150 mM NaCl pH 6,1, fenoksy. Om nødvendig ble 3D-MPL tilsatt som en løsning (ikke absorbert).

Utforming av alle injeksjonspreparater ble utført 18 dager før første tilførsel.

ELISA

En ELISA-analyse ble utført for å måle rotte-IgG ved anvendelse av fremgangsmåten avledet fra WHO-arbeidsgruppen vedrørende ELISA-fremgangsmåten for kvantitering av IgG-antistoff mot kapsulære polysakkarider fra Streptococcus pneumoniae i humant serum. Kort beskrevet belegges renset, kapsulært polysakkarid direkte på mikrotiterplaten. Serumprøver preinkuberes med celleveggpolysakkaridet som er felles for alle pneumokokker (substans C) og som foreligger i en mengde på ca. 0,5 % i pneumokokkpolysakkarider renset som beskrevet (EP 72513 Bl). Reagenser fra Jackson ImmunoLaboratories Inc. ble anvendt for påvisning av bundet muse-IgG. Titreringskurvene ble modellert ved en logistisk log-likning ved henvisning til interne standarder (monoklonale antistoffer). Beregningene ble utført ved anvendelse av programvaren SoftMax Pro. Den maksimale absolutte feil i disse resultater forventes å ligge innenfor en faktor på 2. Den relative feil er mindre enn 30 %.

Opsonofagocytose

Opsoniske titere ble bestemt for serotypene 3, 6B, 7F, 14,19F, og 23F ved anvendelse av CDC-fremgangsmåten { Streptococcus pwew/wowae-opsonofagocytose ved anvendelse av differensierte HL60-celler, versjon 1.1) med renset, humant PMN og komplement fra kaninunger. Modifiseringen omfattet anvendelse av pneumokokkstammer utviklet i laboratoriet, og de fagocytiske HL60-cellene ble erstattet med rensete, humane, neutrofile PMN-celler (det er høy grad av korrelasjon mellom disse fagocytiske cellene). I tillegg ble 3 mm glasskuler tilsatt til mikrotiterbrønnene for å forbedre sammenblandingen, og dette tillot reduksjon av forholdet mellom fagocyter og bakterier, som ble anbefalt til 400.

Resultater

IgG- konsentrasjoner

De geometriske middelkonsentrasjoner av IgG bestemt for hver serotype, samt PD, er vist i

tabellene 4 til 10. For serotypene 6B, 14, 19F og 23F inngår tidligere resultater erholdt ved anvendelse av et tetravalent preparat for sammenlikningens skyld.

De høyeste IgG-konsentrasj onene har blitt uthevet i tabellene 4 til 10. Den statistiske p-verdi for 3D-MPL-preparater sammenliknet med 3D-MPL/AlP04-preparater er i tabell 11. Adjuvanspreparat nr. 4 (ikke-absorberte konjugater med høy dose av 3D-MPL) gir de høyeste GMC-verdiene i 9 av 11 tilfeller. 15 av 11 tilfeller er preparater med MPL i den lave dose de nest mest immunogene. I tillegg gir tilsetting av adjuvans høyere GMC enn modifisering av dosen for alle serotyper (resultater ikke vist), og dette er statistisk signifikant for serotypene 4, 6B, 7F, 18C og 23F (p<0,05 fra 95 % CI).

Opsonofagocytose

Opsonofagocytoseresultater fra blandete sera er vist for serotypene 3, 6B, 7F, 14,19F og 23F i tabellene 4 til 8. Stort sett bekrefter disse opsoniske titere GMC-verdiene for IgG. Faktisk er korrelasjonen med IgG-konsentrasjonen høyere enn 85 % for serotypene 6B, 19F og 23F (resultater ikke vist). For serotype 3 er det viktig å merke seg at kun 3D-MPL-gruppen induserte opsonisk aktivitet over basalverdien.

Konklusjoner

I dette eksperiment var det uventet at anvendelse av 3D-MPL alene ville indusere de høyeste IgG-kons entrasj onene.

Den maksimale GMC for IgG erholdt ved modifisering av adjuvansen ble sammenliknet med den maksimale GMC erholdt ved modifisering av PS-dosen, og det ble funnet at 3D-MPL kunne indusere signifikant høyere responser for 5 av 11 serotyper.

Tabell 11 viser at dersom preparater med 3D-MPL og 3D-MPL/AIPO4sammenliknes (en sammenlikning av utformingsprosessen og 3D-MPL-dosen) er 5 av

polysakkaridkonjugatene signifikant forbedret når det gjelder immunogenisitet ved utforming med 3D-MPL alene, snarere enn med 3D-MPL pluss A1P04: PS 4, PS 6B, PS 18C, PS 19F og PS 23F.

Eksempel 3 - Undersøkelse av virkningen av kombinasjon på immunogenisiteten av konjugater av PS 4, PS 6B, PS 18C, PS 19F og PS 23F i voksne rotter

Voksne rotter ble immunisert med pneumokokkpolysakkarid-protein D-konjugatvaksiner, enten hver for seg eller kombinert i et multivalent preparat (enten tetra- penta- hepta- eller dekavalent). Grupper på 10 mus ble immunisert to ganger med 28 dagers mellomrom, og blod ble erholdt på dagene 28 og 42 (14 dager etter den andre dosen).

Sera ble analysert ved ELISA for IgG-antistoffer mot pneumokokkpolysakkaridene. Alle konjugater induserte spesifikke IgG-antistoffer, erholdt ved ELISA. Tabell 12 viser virkningen av kombinasjon av monovalent PS 6B-, PS 18C-, PS 19F- og PS 23F-protein D-konjugater på immunogenisiteten i voksne rotter, målt ved IgG-konsentrasjonen 14 dager etter dose nr. 2. Statistisk analyse ble utført på alle prøver for å fastslå hvorvidt forskjellene i antistoffkonsentrasjonen ved kombinasjon var signifikante. Kombinasjonen av protein D-konjugater av enhver av serotypene PS 6B, PS 18C, PS 19F og PS 23F i en multivalent vaksine endret ikke immunogenisiteten signifikant.

Eksempel 4 - Fordelaktig virkning av tilsetning av pneumolysin og 3D-MPL på den beskyttende virkning av PD-konjugert 11-valent polysakkaridvaksine mot pneumokokk-kolonisering av lunge hos mus

Immunologiske avlesninger

ELISA- dose av pneumolysinspesifikt IgG i serumet

Maxisorp Nunc-immunplater ble belagt i 2 timer ved 37 °C med 100 pl/brønn av 2 ug/ml rekombinant nativt pneumolysin (PLY) fortynnet i PBS. Platene ble vasket 3 ganger med 0,9 % NaCl tilsatt 0,05 % Tween 20. Deretter ble 2 gangers seriefortynninger (i PBS/0,05 % Tween 20,100 pl/brønn) av en anti-PLY-serumreferanse tilsatt som en standard kurve (med start ved 670 ng/ml IgG), og serumprøvene (med start ved en fortynning på 1/10) ble inkubert i 30 minutter ved 20 °C under omrysting. Etter vask, som beskrevet tidligere, ble peroksydasekonjugert anti-muse-IgG fra geit (Jackson), fortynnet 5000x i PBS/0,05 % Tween-20 inkubert (100 pl/brønn) i 30 minutter ved 20 °C under omrysting. Etter vask ble platene inkubert i 15 minutter ved romtemperatur med 100 pl/brønn av fremkallingsbuffer (0,4 mg/ml OPDA og 0,05 % H202i 100 mM citratbuffer pH 4,5). Fremkallingen ble stoppet ved tilsetting av 50 pl/brønn IN HC1. Optisk tetthet ble avlest ved 490 og 620 nm ved anvendelse av en Emax immunleser (Molecular Devices). Antistofftiteren ble beregnet ved den matematiske 4-parameterfremgangsmåte ved anvendelse av programvaren SoftMaxPro.

Hemolyseinhibering

Denne analysen ble utført for å måle serumantistoffers evne til å inhibere den hemolytiske aktivitet av pneumolysin (PLY). For å fjerne kolesterol (som kan interagere med PLY) ble serumprøvene behandlet 2x som følger: De ble blandet med et likt volum kloroform og så inkubert i 45 minutter under omrysting. Supernatanten ble oppsamlet etter sentrifugering i 10 minutter ved 1000 rpm. Kolesterolfritt serum ble fortynnet (to gangers seriefortynninger i ImM ditiotreitol, 0,01 % BSA, 15 mM TRIS, 150 mM NaCl, pH 7,5) i 96-brønners mikroplater (Nunc). 50 pl av en løsning som inneholdt 4 HU (hemolyseenheter) av PLY ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 15 minutter ved 37 °C. Så ble 100 yX røde blodceller fra sau (1 % løsning) tilsatt i 30 minutter ved 37 °C. Etter sentrifugering i 10 minutter ved 1000 rpm ble supernatantene (150 pl) overført til en annen 96-brønners mikroplate for avlesing av optisk tetthet ved 405 nm. Resultatene ble uttrykt som fortynningstiteren som ga 50 % inhibering.

Kjemisk detoksifisering av pneumolysin

Rekombinant, nativt hemolysin (PLY) ble dialysert mot 50 mM fosfatbuffer pH 7,6, 500mM NaCl. Alle påfølgende trinn ble utført ved 39,5 °C under tidvis omrysting. På dag 1 ble 10 % Tween-80 (1/250 vol/vol), 57,4 mM N-acetyltryptofan pH 7,6 (3/100 vol/vol), 2,2 M glysin i fosfatbuffer (1/100 vol/vol) og 10 % formaldehyd i fosfatbuffer (3/100 vol/vol) tilsatt til PLY-løsningen. På dagene 2 og 3 ble 10 % formaldehyd tilsatt igjen, i et forhold på 3/100 hhv. 2/100 (vol/vol). Inkuberingen ved 39,5 °C ble fortsatt til dag 7 under tidvis omrysting. Til slutt ble PLY dialysert mot 50 mM fosfatbuffer pH 7,6, 500 mM NaCl. Fullstendig inaktivering av PLY ble vist i hemolyseanalysen.

Intranasalpneumokokkinfeksjon av OFl- mus

7 uker gamle OFl-hunnmus ble inokulert intranasalt under bedøvelse med 5xl0<5>CFU av musetilpasset S. pneumoniae serotype 6B. Lungene ble fjernet 6 timer etter infeksjonen og homogenisert (Ultramax, 24000 rpm, 4 °C) i Todd-Hewith Broth-medium (THB, Gibco). 10 gangers seriefortynninger av lungehomogenat ble dyrket over natten ved 37 °C på Petri skåler som inneholdt THB-agar tilsatt gjærekstrakt. Pneumokokkinfeksjon i lungen ble bestemt som antall CFU/mus, uttrykt som den logaritmiske, veide gjennomsnittsverdi. Deteksjonsgrensen var 2,14 log CFU/mus.

Eksempel 4A 3D- MPL- adjuvansvirkning på anti- pneumolysin immunrespons

I det foreliggende eksempel evaluerte vi virkningen av 3D-MPL som adjuvans på immunresponsen mot nativt rekombinant pneumolysin (PLY, erholdt fra J. Paton, Children's Hospital, North Adelaide, Austalia) og det kjemisk detoksifiserte motstykke (DPLY). Kjemisk detoksifisering ble utført som beskrevet ovenfor.

Grupper med ti 6 uker gamle Balb/C-hunnmus ble immunisert intramuskulært på dagene 0, 14 og 21 med 1 pg PLY eller DPLY sammenblandet med enten A: 100 pg A1P04; eller B: 100 ug A1P04+ 5 ug 3D-MPL (3 de-O-acylert monofosforyl-lipid A, erholdt fra Ribi Immunochem). Figurene IA og IB viser ELISA-IgG og hemolyseinhiberingstitere (HLI) målt i serum etter tredje immunisering.

Uansett antigenet ble de beste immunresponsene indusert i dyr vaksinert med preparater tilsatt 3D-MPL. Det er av interesse at DPLY var like immunogent som PLY ved tilførsel med AIPO4+ 3D-MPL, mens det var et svakere immunogen ved utforming med AIPO4. Dette viste den fordelaktige evne til 3D-MPL til å forbedre antistofrfesponsen mot detoksifisert pneumolysin.

I preparater som inneholder pneumolysin kan det være fordelaktig å anvende kjemisk detoksifisert pneumolysin snarere enn pneumolysin detoksifisert ved mutasjoner. Dette skyldes at de detoksifiserte mutanter som til nå er oppnådd, fortsatt har gjenværende toksinaktivitet - kjemisk detoksifisert pneumolysin har ikke dette. Det anses derfor som en annen utførelse av oppfinnelsen at preparater som omfatter pneumolysin (eller pneumolysinmutanter) som har blitt kjemisk detoksifiserte for anvendelse i en vaksine generelt bør blandes med en TH 1-adjuvans, fortrinnsvis 3D-MPL. Slike preparater tilveiebringes av oppfinnelsen. En fremgangsmåte for å forsterke immunresponsen mot kjemisk detoksifisert pneumolysin i et immunogent preparat som omfatter trinnene å tilsette en TH 1-adjuvans (fortrinnsvis 3D-MPL) til preparatet omfattes også.

Eksempel 4B Fordelaktig virkning av tilsetting av en svekket mutant av pneumolysin og 3D-MPL- adjuvans på den beskyttende virkning av PD- konjugert 11- valent polysakkaridvaksine mot pneumokokk- kolonisering av lunge hos OFl- mus infisert intranasalt med serotype 6B.

I det foreliggende eksempel evaluerte vi den profylaktiske virkning av en vaksine som inneholdt det 11-valente polysakkarid-protein D-konjugat, svekket mutant pneumolysinantigen (PdB, WO 90/06951 og adjuvansene AIPO4+ 3D-MPL, sammenliknet med det klassiske AlP04-absorberte 11-valente polysakkaird-protein D-konjugatpreparat.

Grupper på tolv 4 uker gamle OFl-hunnmus ble immunisert subkutant på dagene 0 og 14 med preparater som inneholdt A: 50 pg AIPO4; B: 0,1 pg PS/serotype av PD-konjugert 11-valent polysakkairdvaksine + 50 pg AIPO4; eller C: 0,1 pg PS/serotype av PD-konjugert 11-valent polysakkairdvaksine + 10 jig PdB (erholdt fra J. Paton, Children's Hospital, North Adelaide, Austalia) + 50 pg AIPO4+ 5 pg 3D-MPL erholdt fra Ribi Immunochem). Infeksjonen ble utført på dag 21 som beskrevet ovenfor.

Som vist i figur 1C ble en svært signifikant beskyttelse (p<0,007) oppnådd med den 11-valente polysakkaridkonjugatvaksine tilsatt PdB og med AIPO4+ MPL som adjuvans (sorte søyler representerer den aritmetiske middelverdi). I motsetning til dette ble ingen signifikant beskyttelse observert i dyr immunisert med det 11-valente polysakkaridkonjugat/AlP04-preparat. Dette resultat beviser at tilsetting av pneumolysinantigen (selv svekket) og 3D-MPL-adjuvans forsterket virkningen av den 11 -valente polysakkaridkonjugatvaksine mot pneumoni.

Eksempel 4C Immunkorrelater for beskyttelsen vist i eksempel 4B

For å etablere immunkorrelåtene for beskyttelse oppnådd i eksempel 4B med den 11-valente polysakkaridkonjugatvaksine tilsatt svekket mutant pneumolysin (PdB) og 3D-MPL, ble serologiske antistoffresponser før infeksjonen mot polysakkarid 6B og PdB målt som beskrevet ovenfor.

Antistofftiteren ble så sammenliknet med bakteriekolonitallet målt i lunger fra de tilsvarende dyr, oppsamlet 6 timer etter infeksjonen. R2 ble beregnet ut fra Log/Log-lineære regresjoner.

Den beregnede R2 var lik 0,18 henholdsvis 0,02 for anti-PdB-antistoffresponsen, henholdsvis anti-6B-antistoffresponsen. Dette viste manglende korrelasjon mellom de humorale immunresponsene og beskyttelsen oppnådd for begge antigener. Anti-6B-antistofftiteren var ikke signifikant forskjellige i gruppene immunisert med den 11-valente konjugatvaksine (GMT = 0,318 ng/ml) og med den samme vaksine tilsatt PdD og 3D-MPL (GMT = 0,458 ng/ml). Den forbedrede beskyttelse som observeres med preparat C skyldtes således ikke bare en høyere antistoffrespons mot polysakkarid 6B.

Sett under ett tyder resultatene på at beskyttelsen ikke ble formidlet av humorale immunresponser alene, men snarere også av en celleformidlet immunitet indusert av PdB-antigenet i nærvær av 3D-MPL. Dette ga ytterligere støtte for tilsetting av ett eller flere proteinantigener og en eller flere kraftige adjuvanser til pneumokokkpolysakkaridkonjugatvaksinen for å koordinere de to grener av immunsystemet for optimal beskyttelse.

Eksempel 5 - Samarbeid mellom de to grener av immunsystemet i mus som er aktivt immunisert med pneumolysin og passivt immunisert med antistoffer mot pneumokokk-PS

Eksempel 5A - Finn konsentrasjonen av passivt tilført anti-6B-polysakkarid (anti-PS)-antistoff som gir beskyttelse mot pneumoni

Fremgangsmåte

Vaksine<g>rupper: Fire grupper på 16 mus ble passivt immunisert (intraperitonialt) på dag -1 med 100 pl ufortynnet anti-polysakkaridantiserum fra rotte ifølge gruppene beskrevet i detali nedenfor (i alt 64 musi

Dyr: 64 CD-l-hannmus fra Charles River, Canada, med vekt tilnærmet 35 g (tilnærmet 10 uker gamle).

Bedøvelse: Musene ble bedøvet med isofluran (3 %) pluss O2(1 l/min).

Organisme: S. pneumoniae NI387 (serotype 6) ble høstet fra trypticase-soya agar skåler (TSA) tilsatt 5 % hesteblod og suspendert i 6 ml PBS. Umiddelbart før infeksjonen ble 1 ml bakteriesuspensjon fortynnet med 9 ml avkjølt, smeltet næringsagar (BBL) og inkubert ved 41 °C. Musene ble gitt tilnærmet 6,0 log 10 cfu/mus i et volum på 50 pl.

Infeksjon: På dag 0 ble musene bedøvet som beskrevet ovenfor og infisert med S. pneumoniae N1387 (50 pl avkjølt bakteriesuspensjon) ved intrabronkial instillasjon via ikke-kirurgisk intratrakial inkubasjon. Denne fremgangsmåten ble beskrevet av Woodnut og Berry (Antimicrob. Ag. Chemotherap. 43: 29 (1999)).

Prøver: På dag 3 etter infeksjonen ble 8 mus/gruppe avlivet ved en overdose CO2, og lungene ble fjernet og homogenisert i 1 ml PBS. 10 gangers seriefortynninger ble fremstilt i PBS for å måle antall levedyktige bakterier. Prøvene ble inokulert (20 pl) i triplikat på TSA-skåler tilsatt 5 % hesteblod og inkubert over natten ved 37 °C før evaluering. Ytterligere grupper av mus ble avlivet på dag 7 og analysert som ovenfor.

Konklusjon: Generelt var det ingen signifikant forskjell i bakterietallet isolert fra de forskjellige behandlingsgruppene. Dette viser at ingen målbar beskyttelse ble oppnådd ved anti-polysakkarid i konsentrasjoner opptil og innbefattet 5 fig/ml.

Dette tilsvarer det som er observert i noen humane, kliniske forsøk, dvs. at anti-polysakkaridantistoff ikke er tilstrekkelig til å beskytte mot pneumokokk-pneumoni i visse populasjoner.

Eksempel 5 B - Bestemme beskyttelsen mot pneumoni som oppnås ved aktiv tilførsel av PLY (pneumolysin) med eller uten adjuvans, og synergi med superoptimalt anti-PS antistoff.

Fremgangsmåte

Dyr: 128 CD-l-hannmus (6 uker gamle på immuniseringstidspunktet, 10 uker gamle ved infeksjonen) fra Charles River, St. Constant, Quebec, Canada. Dyrene veide tilnærmet 20 g i en alder av 6 uker og 38 g i en alder av 10 uker.

Immuniseringer: 6 grupper på 16 mus ble immunisert ved subkutan injeksjon på dagene -22 og -14 ved 100 pl vaksine som beskrevet i detalj nedenfor. (I alt 128 mus). PdB (WO 90/06951) ble erholdt fra Dr. James Paton, Australia. 3D-MPL ble erholdt fra Ribi/Corixa.

På dag -1 ble spesifikke grupper (se tabellen nedenfor) immunisert (intraperitonialt, 100 pl) passivt med en konsentrasjon på 4,26fig/ml (4 ml med 5 fig/ml + 1,3 ml med 2 ug/ml) antipolysakkarid-antistoff fra mus.

Infeksjon: På dag 0 ble musene bedøvet (3 % isofluran pluss 1 l/min O2). Bakterieinokulat ble fremstilt ved å høste kulturer av S. pneumoniae NI387 (serotype 6) fra trypticase-soya agar skåler (TSA) tilsatt 5 % hesteblod og suspensjon i 6 ml PBS. En ti gangers fortynning (1 ml pluss 9 ml) ble fremstilt i avkjølt, smeltet næringsagar (inkubert ved 41 °C) umiddelbart før infeksjonen. Musene ble infisert ved intrabronkial instillasjon via intratrakial inkubasjon og ble gitt tilnærmet 6,0 log 10 cfu/mus i et volum på 50 pl. Denne fremgangsmåten ble beskrevet av Woodnut og Berry (Antimicrob. Ag. Chemotherap. 43: 29

(1999)).

Prøver. 72 timer etter infeksjonen ble 8 mus/gruppe avlivet med en overdose CO2, og lungene ble fjernet og homogenisert i 1 ml PBS. 10 gangers seriefortynninger ble fremstilt i PBS for å måle antall levedyktige bakterier. Prøvene ble inokulert (20 pl) i triplikat på TSA-skåler tilsatt 5 % hesteblod og inkubert over natten ved 37 °C før evaluering. Ytterligere grupper av mus ble avlivet på dag 8 etter infeksjonen og analysert som ovenfor.

Analyse av måleverdier

Målet for sammenlikning av behandlingene var antall bakterier i lungene 3 og 7 dager etter infeksjonen. Resultatene er gitt som middelverdier innen gruppene med standard avvik. Statistisk analyse ble utført ved anvendelse av Students t-test, hvor en p-verdi på <0,05 ble ansett som signifikant.

Resultater:

72 timer etter infeksjonen

Bakterietallet for gruppe 1-4 var signifikant lavere (p<0,05) enn tallet for gruppe 1-3. Bakterietallet for gruppe 1-4 var signifikant lavere (p<0,05) enn tallet for gruppe 1-5.

168 timer etter infeksjon

Bakterietallet i alle grupper var tilnærmet 2 log lavere etter 8 dager enn etter 3 dager, noe som tyder på at infeksjonen var i ferd med å gi seg.

Bakterietallet for gruppe 1-2 var signifikant lavere (p<0,05) enn for gruppe 1-5.

Som vist ovenfor gir anti-polysakkaridantistoff alene (gruppe 1-5) ikke beskyttelse mot oppvekst av pneumokokker i lungen. PdB med AIPO4som adjuvans gir heller ikke beskyttelse, men på dag 8 er det en tendens mot beskyttelse når PdB kombineres med 3D-MPL (gruppe 1-2).

På dag 3 hadde den mest signifikant beskyttede gruppe, gruppe 1-4, alle de tre elementene: PdB, 3D-MPL og passivt tilført anti-polysakkaridantistoff. Denne konklusjon understøttes av dødelighetshyppigheten. Gruppe 1-4 hadde bare 2/8 dødsfall sammenliknet med 5/10 for gruppene 1-5 og 1-3.

Konklusjon:

Siden eksperimentet ble utført med passivt immuniserte dyr kan den synergistiske virkning av aktiv immunisering med pneumolysin og MPL ikke skyldes øket nivå av antistoff mot polysakkaridantigenet.

Siden dyrene kun ble passivt immunisert mot pneumokokkpolysakkarid ville slike antistoffer på dag 8 i stor grad ha forsvunnet fra verten.

Trass i dette kunne signifikant beskyttelse mot pneumokokk-pneumoni observeres i grupper immunisert med pneumolysin pluss 3D-MPL, og særlig i gruppene immunisert med pneumolysin pluss 3D-MPL pluss passivt tilført anti-polysakkaridantistoff, noe som viser synergien av denne kombinasjonen.

Dersom anti-polysakkairdimmuniseringen hadde blitt utført aktivt (fortrinnsvis med konjugert polysakkarid) ville virkningen ha vært enda mer markant, siden virkningen på B-cellehukommelse og konstant nivå av anti-PS-antistoff ville bidratt til immunresponssamarbeidet (se f. eks. fig. 1C, hvor mange av dyrene som ble aktivt immunisert med polysakkarid og protein ble vist å være uten bakterier i lungene etter infeksjon).

Eksempel 6 - Immunogenisitet i 1 år gamle Balb/C-mus av 11-valent pneumokokkpolysakkarid-protein D-konjugatvaksine med 3D-MPL som adjuvans.

Introduksjon og formål:

Beskyttelse mot pneumokokkinfeksjon formidles av serotypespesifikt antistoff via opsonofagocytose. Det kan forventes at øket antistoffkonsentrasjon vil føre til større beskyttelse, og mange forsøk har derfor blitt gjort på å finne måter å øke den humorale respons på. En strategi som med hell har blitt anvendt for konjugatvaksiner i prekliniske undersøkelser er anvendelse av immunstimulerende adjuvanser (se oversikt i Poolman et al. 1998, Carbohydrate-Based Bacterial Vaccines. I: Handbook of Experimental Pharmacology red. P. Perlmann og H. Wigsell. Springer-Verlag, Heidelberg, Tyskland).

Verdiene som presenteres i denne seksjonen viser resultatene fra det siste eksperiment, som anvendte kliniske partier i en fremgangsmåte utformet for å etterlikne en klinisk utprøvning.

Fremgangsmåte:

Ett år gamle Balb/C-mus ble immunisert med 1/10 av den humane dose av pneumokokkpolysakkarid-protein D-konjugatvaksine eller 23-valent vaksine med rent polysakkarid. De anvendte vaksiner var de kliniske partier DSP009, DSP013 eller DSP014, som tilsvarer en dose på 1 pg av serotypene 6B og 23F og 5 pg av de gjenværende serotyper i den 11-valente konjugatvaksine, en dose på 0,1 pg av den 11-valente konjugatvaksine eller en dose på 0,1 pg av den 11-valente konjugatvaksine med 5 jig 3D-MPL som adjuvans. Alle de 11-valente konjugatvaksinene ble også tilsatt 50 pg AIPO4som adjuvans.

Grupper på 20 mus ble immunisert intramuskulært. Injeksjon av gruppene opplistet i den påfølgende tabell ble utført på dagene 0 og 21. Blod ble erholdt på dag 35 (14 dager etter den andre dose).

Tabell: Immuniseringsskjema for ett år gamle Balb/C-mus immunisert med kliniske partier av pneumokokkpolysakkarid-protein D-konjugatvaksine.

Seraene ble analysert ved ELISA for IgG-antistoff mot pneumokokkpolysakkaridene ifølge konsensusfremgangsmåten til CDC/WHO, dvs. etter nøytralisering av seraene med celleveggpolysakkarid. ELISA-analysen ble kalibrert til å gi antistoffkonsentrasjoner i pg/ml ved anvendelse av serotypespesifikke monoklonale IgG 1-antistoffer.

Statistisk analyse av sammenlikningene ble beregnet ved anvendelse av UNISTAT versjon 5,0 beta. Fremgangsmåten for ANOVA ved Tukey-HSD-metoden ble utført på log-transformerte IgG-konsentrasjoner. En parvis sammenlikning av serokonversjonsgraden ble utført ved anvendelse av Fishers eksakte analyse.

Resultater:

GMC for IgG og 95 % tillitsområde for de 11 serotypene og protein D indusert 14 dager etter den andre immunisering (dose 2) er vist i den påfølgende tabell. Serokonversjonsgraden er vist i de tilfeller hvor et 95 % tillitsområde ikke kunne beregnes.

Gruppe 1 viser virkningen av immunisering med rene polysakkarider, som normalt induserer kun IgM i dyr. De fleste IgG-nivåene er under påvisningsgrensen, ikke desto mindre var Balb/C-mus i stand til å lage IgG mot noen få pneumokokkpolysakkarider, nemlig serotypene 3, 19F og 14.

Immunisering med konjugatvaksiner induserte IgG-antistoff med høy serokonversjonsgrad mot alle serotyper bortsett fra 23F.

En doseavhengig respons (gruppe 4 sammenliknet med gruppe 2) ble kun observert for serotypene 7F og 19F, men disse observasjoner var ikke statistisk signifikante. En større respons ble observert etter 2 doser (b-gruppene sammenliknet med a-gruppene) for serotypene 3, 6B, 7F og 19F samt PD, og disse observasjonene var statistisk signifikante i mange tilfeller for alle 3 preparater.

Mest interessant er virkningen av 3D-MPL. 2 doser av vaksinen utformet med 3D-MPL (gruppe 3b) induserte den høyeste GMC for spesifikt IgG, og dette var statistisk signifikant for alle serotyper bortsett fra 23F, hvor serokonversjonsgraden var signifikant høyere (p = 0,02 for gruppe 3b sammenliknet med gruppe 2b, Fishers eksakte analyse).

Konferer den foregående tabell for definisjon av gruppene.

Konklusjon:

Resultatene som presenteres her viser at tilsetting av 3D-MPL til den 11-valente pneumokokkpolysakkarid-protein D-konjugatvaksinen øket immunresponsen hos eldre Balb/C-mus mot alle de analyserte serotypene.

I de fleste tilfeller induserte to doser med vaksine en høyere geometrisk middelverdi for IgG-konsentrasjonen enn en dose. Siden dette ikke observeres ved anvendelse av ren polysakkaridvaksine, selv ikke hos mennesker, anses dette å indikere en T-celleavhengig immunrespons og induksjon av immunhukommelse.

Disse resultatene understøtter et vaksinetilføringsskjema som anvender konjugerte pneumokokkpolysakkarider med TH 1-adjuvanser (fortrinnsvis 3D-MPL), hvori minst to doser av vaksinen med adjuvans tilføres, fortrinnsvis med 1-12 ukers mellomrom, og mest foretrukket 3 ukers mellomrom. Et slikt tilføringsskjema anses å være ytterligere en utførelse av oppfinnelsen.

Musene som ble anvendt i eksperimentet responderte ikke på PS 23 (verken rent eller konjugert). Det er av interesse at selv om antistofmivået mot polysakkaridet forble lavt uavhengig av det anvendte vaksinepreparat responderte mange flere mus på PS 23 dersom 3D-MPL ble anvendt som adjuvans (serokonversjonen var signifikant høyere). Anvendelse av TH 1-adjuvanser, fortrinnsvis 3D-MPL, i vaksinepreparater som omfatter konjugerte pneumokokkpolysakkarider for å unngå ikke-responsivitet på et pneumokokkpolysakkarid i en vaksine er ytterligere en utførelse av oppfinnelsen. En fremgangsmåte for å unngå ikke-responsivitet med det ovenfor nevnte preparat ved anvendelse av tilføringsskjemaet med to doser som beskrevet ovenfor er ytterligere en utførelse.

Eksempel 7 - Neisseria Meningitidis C-polysakkaird-protein D-konjugat (PSC-PD)

A: EKSPRESJON AV PROTEIN D

Som for eksempel 1.

B: FREMSTILLING AV POLYSAKKARID C

Kilden for gruppe C-polysakkarid er stammen Cl 1 av N. meningitidis. Denne fermenteres ved anvendelse av klassiske fermenteringsteknikker (EP 72513). Polysakkaridene som anvendes i konjugeringsprosessen i form av et tørt pulver er identiske med Mencevax (SB Biologicals s.a.).

Et uttak av Cl 1-stammen tines, og 0,1 ml suspensjon utstrykes på en petriskål med Mueller Hinton-medium tilsatt gjærekstraktdialysat (10 %, vol/vol) og inkuberes i 23 til 25 timer ved 36 °C i en inkubator med vannmettet luft.

Overflatekulturene resuspenderes så i sterilt fermenteringsmedium og utsåes i denne suspensjon i en Roux-kolbe tilsatt Mueller-Hinton-medium tilsatt gjærekstraktdialysat (10 %, vol/vol) og sterile glasskuler. Etter inkubering av Roux-kolben i 23 til 25 timer ved 36 °C i en inkubator med vannmettet luft resuspenderes overflatekulturene i 10 ml sterilt fermenteringsmedium, og 0,2 til 0,3 ml av denne suspensjon utsåes i 12 andre Roux-kolber med Mueller-Hinton-medium.

Etter inkubering i 23 til 25 timer ved 36 °C i en inkubator med vannmettet luft resuspenderes overflatekulturene i 10 ml sterilt fermenteringsmedium. Bakteriesuspensjonen samles i en konisk kolbe.

Denne suspensjonen overføres så aseptisk til en fermentor ved anvendelse av sterile sprøyter.

Fermentering av meningococcus utføres i fermentorer som oppbevares i et rent rom under negativt trykk. Fermenteringen avsluttes generelt etter 10-12 timer, tilsvarende tilnærmet 10<10>bakterier/ml (dvs. tidlig stasjonær fase) og påvises ved øket pH.

På dette stadiet varmeinaktiveres hele kulturen (12 minutter ved 56 °C) før sentrifugering. Før og etter inaktivering uttas en prøve av kulturen og utstrykes på petriskåler med Mueller-Hinton-medium.

C: RENSING AV PS

Rensefremgangsmåten er en flertrinnsfremgangsmåte som utføres på hele fermenteringskulturen. I første rensestadium klarnes den inaktiverte kultur ved sentrifugering, og supernatanten gjenvinnes.

Rensing av polysakkarid er basert på utfelling med et kvaternært ammoniumsalt (Cetyltrimetylammoniumbromid/CTAB,"CETAVLON"). CTAB danner uløselige komplekser med polyanioner som polysakkarider, nukleinsyrer og proteiner, avhengig av disses pl. Under betingelser med kontrollert ionestyrke kan denne fremgangsmåte anvendes for utfelling av urenheter (lav konduktivitet) eller polysakkarider (høy konduktivitet).

Polysakkaridene som inngår i den klarnede supernatant utfelles ved anvendelse av diatomejord ("CELITE" 545) som matriks for å unngå dannelse av uløselig, inert masse under de forskjellige utfellingene/rensetrinnene.

Renseskjema for polysakkarid C fra meningitidis

Trinn 1: PSC-CTAB-kompleksfiksering til "CELITE" 545 og fjerning av cellerester, nukleinsyrer og proteiner ved vask med 0,05 % CTAB.

Trinn 2: Eluering av PS med 50 % EtOH. De første fraksjonene, som er turbide og inneholder urenheter og LPS, kastes. Nærvær av PS i de påfølgende fraksjoner bekreftes ved en flokuleringsanalyse.

Trinn 3: PS-CTAB-kompleksrefiksering til "CELITE" 545 og fjerning av mindre nukleinsyrer og proteiner ved vask med 0,05 % CTAB.

Trinn 4: Eluering av PS med 50 % EtOH. De første, turbide fraksjonene kastes. Nærvær av PS i de påfølgende fraksjoner bekreftes ved en flokuleringsanalyse.

Eluatet filtreres, og filtratet, som inneholder urent polysakkarid, oppsamles. Polysakkaridet utfelles fra filtratet ved tilsetting av etanol til en sluttkonsentrasjon på 80 %. Polysakkaridet gjenvinnes så som et hvitt pulver, vakuumtørkes og lagres ved -20 °C.

D: CDAP-KONJUGERING

Konjugering av PSC og PD

For konjugering av PSC og PD ble CDAP-konjugasjonsteknologien foretrukket fremfor klassisk CNBr-aktivering og kopling via en spacer til bærerproteinet. Polysakkaridet aktiveres først ved cyanylering med l-cyano-4-dimetylaminopyridiniumtetrafluorborat (CDAP). CD AP er et vannløselig cyanyleringsreagens i hvilket elektrofilisiteten til cyanogruppen er høyere enn i CNBr, noe som tillater utførelse av cyanyleringsreaksjonen under relativt milde betingelser. Etter aktivering kan polysakkaridet koples direkte til bærerproteinet via dettes amingrupper, uten innføring av et spacermolekyl. Ikke-reagerte estercyanatgrupper blokkeres ved hjelp av omfattende reaksjon med glysin. Det totale antall trinn som inngår i fremstillingen av konjugatvaksiner reduseres og, mest viktig, eventuelt immunogene spacermolekyler foreligger ikke i sluttproduktet.

Aktivering av polysakkarider med CDAP innfører en cyanatgruppe i polysakkaridene, mens dimetylaminopyridin (DMAP) frigjøres. Cyanatgruppen reagerer med NH2-grupper i proteinet under den påfølgende koplingsfremgangsmåte og overføres til et karbamat.

PSC- aktivering og PSC- PD- kobling

Aktiveringen og koblingen utføres ved +25 °C.

120 mg PS løses i minst 4 timer i WFI.

CDAP-løsning (100 mg/ml, nylaget i acetonitril) tilsettes til et endelig forhold mellom CDAP og PS på 0,75 (vekt/vekt).

Etter 1 minutt og 30 sekunder heves pH til aktiverings-pH (pH 10) ved tilsetting av trietylamin, og pH stabiliseres inntil tilsetting av PD.

Etter 3 minutter og 30 sekunder tilsettes NaCl til en sluttkonsentrasjon på 2 M.

Etter 4 minutter tilsettes renset PD slik at det oppnås et forhold mellom PD og PS på 1,5/1, pH justeres umiddelbart etter til koblings-pH (pH 10). Løsningen inkuberes i 1 time under regulering av pH-verdien.

Blokkering

6 ml av en 2 M glysinløsning tilsettes til PS/PD/CD AP-blandingen. pH justeres til blokkerings-pH (pH 8,8). Løsningen omrøres i 30 minutter ved reaksjonstemperaturen og så over natten ved +2-8 °C under kontinuerlig, langsom omrøring.

PS- PD- rensing

Etter filtrering (5 pm) renses PS-PD-konjugatet i et kjølerom ved

gelpermeasjonskromatografi på en S400HR Sephacryl-gel for fjerning av små molekyler (innbefattet DMAP) og ikkekonjugert PD: Eluering -150 mM NaCl pH 6,5, måling - UV 280 nm, pH og konduktivitet.

Basert på reaksjonsbestanddelenes forskjellige molekylstørrelse elueres PS-PD-konjugater først, fulgt av fritt PD og til slutt DMAP. Fraksjoner som inneholder konjugat, målt med DMAB (PS) og pBCA (protein), slås sammen. De sammenslåtte fraksjoner sterilfiltreres (0,2 pm).

E: UTFORMING AV ABSORBERT PSC-PD-KONJUGATVAKSINE

VaskavAlP04

For å optimalisere absorpsjonen av PSC-PD-konjugat til AIPO4vaskes AIPO4for å redusere konsentrasjonen av PO4<3>": - AIPO4vaskes med 150 mM NaCl og sentrifugeres (4x);

- nedsentrifugert materiale resuspenderes i 150 mM NaCl og filtreres (100 pm); og

- filtratet varmesteriliseres.

Dette vaskede AIPO4betegnes WAP (vasket, autoklavert fosfat).

Utformingsfremgangsmåte

PSC-PD-konjugatmassen absorberes til AIPO4WAP før endelig utforming av det ferdige produkt. AIPO4WAP ble omrørt med PSC-PD i 5 minutter ved romtemperatur. pH ble justert til 5,1, og blandingen ble omrørt i ytterligere 18 timer ved romtemperatur. NaCl-løsning ble tilsatt til 150 mM, og blandingen ble omrørt i 5 minutter ved romtemperatur. 2- fenoksyetanol ble tilsatt til 5 mg/ml, og blandingen ble omrørt i 15 minutter ved romtemperatur og så justert til pH 6,1.

Endelig preparat/ dose

F. PREKLINISK INFORMASJON

Immunogenisitet av polysakkaridkonjugat i mus

Immunogenisiteten av PSC-PD-konjugatet har blitt anslått i 6 til 8 uker gamle Balb/C-mus. Rent, (ikkeabsorbert) konjugat eller konjugatabsorbert til AIPO4ble injisert som en monovalent vaksine. De induserte anti-PSC-antistoffene ble målt ved ELISA, mens funksjonelle antistoffer ble analysert ved anvendelse av baktericidanalysen, hvor begge fremgangsmåter er basert på fremgangsmåtene til CDC (Centers for dise ase Control and Prevention, Atlanta, USA). Resultater fra to forskjellige eksperimenter utført for å anslå dose-responskurver og virkningen av adjuvans (AIPO4) presenteres.

Doseområdeeksperiment

I dette eksperiment ble PSC-PD injisert to ganger (med 2 ukers mellomrom) i Balb/C-mus. Fire forskjellige doser av konjugat utformet med AIPO4ble anvendt: 0,1; 0,5; 2,5 og 9,6fig/dyr. Musene (10/gruppe) ble tappet for blod på dag 14 (14 post I), 28 (14 post II) og 42 (28 post II). Den geometriske middelkonsentrasjon (GMC) av polysakkarid C-spesifikke antistoffer målt ved ELISA ble uttrykt som jig IgG/ml ved anvendelse av renset IgG som referanse. Baktericide antistoffer ble målt i serumblandinger og titere uttrykt som den inverse verdi av den fortynning som kunne drepe 50 % av bakteriene, ved anvendelse av N. meningitidis stamme Cl 1 i nærvær av komplement fra kaninunger.

Den erholdte dose-responskurve viser et platå fra dosen på 2,5 jig. Resultatene viser at det er en god forsterkerrespons mellom 14 post I og 14 post II. Antistoffhivået ved 28 post II er minst ekvivalent med nivået ved 14 post II. Det baktericide antistofftiter er i samsvar med ELISA-konsentrasjonen og bekrefter immunogenisiteten av PSC-PD-konjugatet.

Virkning av adjuvans

I dette forsøk ble et parti PSC-PD-konjugat utformet på AIPO4analysert, rent konjugat (uten adjuvans) ble injisert for sammenlikningens skyld. 10 mus/gruppe ble injisert subkutant 2 ganger med 2 ukers mellomrom med 2 \ xg konjugat. Blod ble tappet på dagene 14(14 post I), 28 (14 post II) og 42 (28 post II), og ELISA-verdiene og titer av funksjonelt antistoff målt (bare på 14 post II og 28 post II for baktericid analysen). AlPCvpreparatet induserte opptil 10 ganger høyere antistofftiter enn preparatene uten adjuvans.

Konklusjoner

Følgende generelle konklusjoner kan trekkes basert på resultatene fra eksperimentene beskrevet ovenfor: - PSC-PD-konjugat induserer en anamnestisk respons, noe som viser at PSC ved konjugering blir et T-celleavhengig antigen. - Anti-PSC-antistoffkonsentrasjonen målt ved ELISA samsvarer godt med den baktericide antistofftiter, noe som viser antistoffer indusert av PSC-PD-konjugatet er funksjonelle mot M meningitidis serogruppe C. - Tilnærmet 2,5 pg konjugat absorbert til AIPO4ser ut til å utløse en optimal antistoffrespons i mus. - CDAP-kjemi ser ut til å være en egnet fremgangsmåte for fremstilling av immunogene PSC-PD-konjugater.

Eksempel 8 - Fremstilling av et konjugat mellom et polysakkarid fra N. meningitidis serogruppe A og PD

Et tørt polysakkarid A (PSA)-pulver løses i en time i 0,2 M NaCl-løsning til en sluttkonsentrasjon på 8 mg/ml. pH justeres så til en verdi på 6 med enten HC1 eller NaOH, og løsningen inkuberes ved 25 °C 0,75 mg CDAP/mg PSA (et preparat med 100 mg/ml i acetonitril) tilsettes til PSA-løsningen. Etter 1,5 minutter uten pH-regulering tilsettes 0,2 M NaOH til en pH-verdi på 10. 2,5 minutter senere tilsettes protein D (i en konsentrasjon på 5 mg/ml) til et PD/PSA-forhold på tilnærmet 1. En pH på 10 opprettholdes under koblingsreaksjonstiden på 1 time. Så tilsettes 10 mg glysin (2 M pH 9,0)/mg PSA, og pH reguleres til en verdi på 9,0 i 30 minutter ved 25 °C. Blandingen lagres så over natten ved 4 °C før rensing ved eksklusjonskolonnekromatografi (Sephacryl S400HR fra Pharmacia). Konjugatet elueres først, fulgt av ikkereagert PD og biprodukter (DMAP, glysin, salter). Konjugatet oppsamles og steriliseres ved filtrering gjennom en 0,2 pm Sartopore-membran fra Sartorius.

Eksempel 9 - in vitro egenskaper ved produktene fra eksemplene 7 og 8

In vivo- resultater

Balb/C-mus ble anvendt som dyremodeller for å analysere immunogenisiteten av konjugatene. Konjugatene ble absorbert, enten til AIPO4eller Al(OH)3(10 pg PS til 500 pg Al<3+>), eller ikke absorbert. Musene ble injisert som følger: 2 injeksjoner med 2 ukers mellomrom (2 pg PS/injeksjon).

Fra disse resultatene kan vi for det første konkludere at fritt PS i stor grad påvirker immunresponsen. Bedre resultater har blitt oppnådd med konjugater med mindre enn 10 % fritt PS. De ovenfor beskrevne forbedringer av CDAP-prosessen er således ytterligere en utførelse av oppfinnelsen.

Utforming er også viktig. AIPO4ser ut til å være den mest egnede adjuvans i denne modellen. Konjugatene induserer en forsterkervirkning som ikke observeres dersom polysakkarider injiseres alene.

Konklusjoner

Konjugater av N. meningitidis A og C ble erholdt med et endelig PS/proteinforhold på 1 henholdsvis 0,6 - 0,7 (vekt/vekt). Fritt PS og fritt bærerprotein forelå i en mengde under 10 %, henholdsvis 15 %. Gjenvinning av polysakkarid er høyere enn 70 %. Konjugater av PSA og PSC som kan erholdes ved den ovenfor beskrevne, forbedrede (optimaliserte) CDAP-prosess (uavhengig av bærerproteinet, men fortrinnsvis med protein D) er således ytterligere en utførelse av oppfinnelsen.

Eksempel 10 - Fremstilling av et konjugat mellom polysakkarid fra H. influenzae b og

PD

H. influenzae b er en av de viktigste årsaker til meningitt hos barn under 2 år. Det kapsulære polysakkarid fra H. influenzae (PRP) konjugert til tetanus-toksoid er velkjent (konjugert ved kjemiske fremgangsmåter utviklet av J. Robbins). CDAP er en forbedret kjemi. Det påfølgende beskriver optimale CDAP-betingelser funnet for konjugering av PRP, fortrinnsvis til PD.

Parametrene som påvirker konjugeringsreaksjonen er de følgende:

• utgangskonsentrasjonen av polysakkarid (som kan ha dobbelt virkning, på sluttnivået av fritt polysakkarid og på sterilfiltreirngstrinnet)

• utgangskonsentrasjonen av bærerproteinet

• utgangsforholdet mellom polysakkarid og protein (som også kan ha dobbelt virkning, på sluttnivået av fritt polysakkarid og på sterilfiltreringstrinnet)

• den anvendte mengde av CDAP (vanligvis i stort overskudd)

• reaksjonstemperaturen (som kan påvirke nedbryting av polysakkarid, reaksjonskinetikken og nedbryting av de reaktive grupper)

• pH under aktivering og kobling

• pH under blokkering (som påvirker nivået av gjenværende DMAP)

• tiden for aktivering, kobling og blokkering

De foreliggende oppfinnere har funnet at de 3 mest avgjørende parametre for optimalisering av sluttproduktets kvalitet er: Utgangsforholdet mellom polysakkarid og protein, utgangskonsentrasjonen av polysakkarid og pH under koplingen.

En reaksjonskubus ble så utformet med de 3 ovenfor nevnte betingelser som de aksene. De sentrale punkter (og det eksperimentelle verdiområde) for disse aksene var: PS/proteinforhold - 1/1 (± 0,3/1); [PS] = 5 mg/ml (± 2 mg/ml); og koblings-pH = 8,0 (± 1,0 pH-enhet).

De mindre essensielle parametre ble holdt konstante ved følgende verdier: 30 mg polysakkarid ble anvendt, temperatur 25 °C; [CDAP] = 0,75 mg/mg PS; pH titrert med 0,2 M NaOH;

aktiverings-pH = 9,5; aktiveringstid =1,5 minutter; koplingstid = 1 time; [protein] = 10 mg/ml; blokkerings-pH = 9,0; blokkeringstid = 1 time; tid for oppløsning av PS i løsemiddel = 1 time i 2 M NaCl; rensing på Sephacryl S-400HR ved eluering med 150 mM NaCl ved 12 cm/time; og sterilfiltrering med et SARTOLAB P20 ved 5 ml/min.

Resultatene som ble vurdert for etablering av optimaliserte betingelser ved fremstilling av produkter innenfor den ovenfor nevnte reaksjonskubus var: prosessdata - maksimalt utbytte etter filtrering, maksimalt nivå av inkorporert protein, og produktkvalitetsdata - endelig forhold PS/protein, nivå av fritt PS, nivå av fritt protein, minimalt nivå av gjenværende DMAP (et nedbrytningsprodukt av CDAP).

Utbytte fra ifltreringen

Faktoren som påvirker utbyttet etter filtrering er interaksjonen mellom utgangskonsentrasjonen av PS og koblings-pH, og utgangsforholdet mellom PS og protein. Ved lav[PS] er det liten interaksjon med de siste to faktorene, og resultatet er alltid god filtrerbarhet (tilnærmet 95 % for alle produkter). Ved høye konsentrasjoner avtar imidlertid filtrerbarheten dersom pH og utgangsforholdet økes (høy [PS], laveste forhold, laveste pH = 99 % filtrering, men høy [PS], det høyeste forhold og pH = 19 % filtrering).

Nivå for inkorporering av protein

Forholdet mellom det endelige PS/proteinforhold og utgangsforholdet er et mål på koplingseffektiviteten. Ved høy [PS] ser pH ikke ut til å påvirke forholdet mellom forholdene. Utgangsforholdet gjør imidlertid dette (1,75 ved lavt utgangsforhold, 1,26 ved høyt utgangsforhold). Ved [PS] er forholdet mellom forholdene stort sett lavere, imidlertid har pH nå en høyere virkning (lav pH, lavt forhold = 0,96, lav pH, høyt forhold = 0,8, høy pH, lavt forhold = 1,4, og høy pH, høyt forhold = 0,92).

Endelig PS/ proteinforhold

Det endelige forhold avhenger av utgangsforholdet og konsentrasjonen av PS. De høyeste, endelige forhold oppnås med en kombinasjon av høyt utgangsforhold og høy [PS]. Virkningen av pH på sluttforholdet er ikke så avgjørende som en lav [PS].

Nivået av fritt protein D

De laveste mengder fritt protein D observeres ved høy pH og høy [PS] (nivået er tilnærmet 0,0). Virkningen av høy [PS] blir spesielt markant dersom pH er lav. En økning av utgangsforholdet bidrar i noen grad til øket mengde fritt protein D.

Gjenværende DMAP

Utgangsforholdet har ingen signifikant virkning. I motsetning til dette øker nivået av DMAP med konsentrasjonen av [PS] og avtar dersom pH økes.

Konklusjoner

De mest foretrukne konjugasjonsbetingelsene er således følgende: Koplings-pH = 9,0, [PS] = 3 mg/ml, og utgangsforhold = 1/1. Med slike betingelser er sluttproduktets egenskaper som følger:

Konjugater av PRP som kan erholdes ved den overfor beskrevne, forbedrede (optimaliserte) CDAP-prosess (uavhengig av bærerproteinet, men fortrinnsvis med protein D) er således ytterligere en utførelse av oppfinnelsen.

Eksempel 11: Protein D som antigen - hvordan dets beskyttende virkning mot ikke-typbar H. influenzae kan forbedres ved utforming med 3D-MPL

Balb/C-hunnmus (10 mus pr. gruppe) ble immunisert (intramuskulært) med den 11-valente pneumokokkpolysakkarid-protein D-konjugatvaksine, første gang i en alder av 20 uker (DO), og ble gitt en andre immunisering 2 uker senere (D14). Blod ble oppsamlet 7 dager etter den andre immunisering. Antistofftiteren mot protein D ble målt som mengden av antistoffer av typene IgGl, IgG2a og IgG2b. Frysetørkede undekavalente vaksiner (uten AIPO4) ble fremstilt ved å sammenblande konjugatene med 15,75 % laktose, omrøre blandingen i 15 minutter ved romtemperatur, justere pH til 6,1 ± 0,1 og frysetørke blandingen (syklusen startet vanligvis ved -69 °C som gradvis ble justert til -24 °C over et tidsrom på 3 timer, bibeholdelse av denne temperatur i 18 timer, gradvis justering til -16 °C over et tidsrom på 1 time, bibeholdelse av denne temperatur i 6 timer, gradvis justering til +34 °C over et tidsrom på 3 timer, og endelig bibeholdelse av denne temperatur over et tidsrom på 9 timer).

Sammensettingen av preparater og rekonstitueringsmidler for frysetørkede preparater gis i tabell 13.

Den mest karakteristiske måling av hvorvidt en celleformidlet immunrespons av THl-type har skjedd vites å korrelere med nivået av IgG2a-antistoff. Som resultatene viser er en overraskende stor økning av IgG2a resultatet dersom protein D har blitt frysetørket med en TH 1-adjuvans (i dette tilfelle 3D-MPL).

Claims (15)

1. Immunogent preparat,karakterisert vedat det omfatter minst ett polysakkaridantigen fra Streptococcus pneumoniae blandet med minst ett proteinantigen fra Streptococcus pneumoniae eller en immunologisk funksjonell ekvivalent av dette, og en adjuvans som er en preferensiell induser av en TH 1-respons og omfatter minst en av de følgende: monofosforyl-lipid A eller et derivat derav, en saponinimmunstimulant eller et immunstimulerende CpG-oligonukleotid.

2. Immunogent preparat ifølge krav 1,karakterisert vedat proteinantigenet er et protein fra den ytre overflate eller et utskilt protein fra Streptococcus pneumoniae eller en immunologisk funksjonell ekvivalent av disse.

3. Immunogent preparat ifølge krav 1 eller 2,karakterisertv e d at proteinantigenet er et toksin, adhesin eller lipoprotein fra Streptococcus pneumoniae eller en immunologisk funksjonell ekvivalent av disse.

4. Immunogent preparat ifølge kravene 1-3,karakterisertv e d at proteinantigenet eller den immunologisk funksjonelle ekvivalent av dette er utvalgt fra gruppen: Pneumolysin, PspA eller transmembrandelesjonsvarianter av dette, PspC eller transmembrandelesjonsvarianter av dette, PsaA eller transmembrandelesjonsvarianter av dette, glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase, og CbpA eller transmembrandelesjonsvarianter av dette.

5. Immunogent preparat ifølge kravene 1-3,karakterisertv e d at polysakkaridantigenet foreligger i form av et polysakkarid-proteinbærerkonjugat.

6. Immunogent preparat ifølge kravene 1-3,karakterisertv e d at bærerproteinet er utvalgt fra gruppen som består av: Difteritoksoid, tetanus- toksoid, CRM197, "keyhole Limpef-Haemocyanin (KLH), proteinderivat av tuberkulin (PPD) og protein D av H. influenzae.

7. Immunogent preparat ifølge et hvert av kravene 1-6,karakterisert vedat vaksinen omfatter minst fire pneumokokkpolysakkaridantigener fra forskjellige serotyper.

8. Immunogent preparat ifølge krav 1,karakterisertv e d at adjuvansen omfatter et aluminiumsalt.

9. Immunogent preparat ifølge krav 8,karakterisertv e d at adjuvansen omfatter minst en av følgende: 3D-MPL, en saponinimmunstimulant, eller et immunstimulerende CpG-oligonukleotid.

10. Immunogent preparat ifølge krav 9,karakterisertv e d at adjuvansen omfatter 3D-MPL.

11. Immunogent preparat ifølge krav 9 eller 10,karakterisertv e d at adjuvansen omfatter en bærer utvalgt fra gruppen som omfatter: En olje i vann-emulsjon, liposomer og et aluminiumsalt.

12. Immunogent preparat ifølge et hvert av de ovenstående krav,karakterisert vedat det anvendes som et medikament.

13. Vaksine,karakterisert vedat den omfatter det immunogene preparat ifølge kravene 1-11.

14. Anvendelse av et pneumokokkpolysakkaridantigen i kombinasjon med et proteinantigen fra Streptococcus pneumoniae og en TH 1-induserende adjuvans som omfatter minst en av de følgende: monofosforyl-lipid A eller et derivat derav, en saponinimmunstimulant eller et immunstimulerende CpG-oligonukleotid, for fremstilling av et medikament for forebyggelse av pneumoni hos pasienter over 55 år.

15. Fremgangsmåte for fremstilling av et immunogent preparat ifølge de ovenstående krav,karakterisert vedat den omfatter trinnene: - utvelgelse av et eller flere pneumokokkpolysakkaridantigener; - utvelgelse av et eller flere pneumokokkproteinantigener; - utvelgelse av en adjuvans som er en preferensiell induser av en TH 1-respons og omfatter minst en av de følgende: monofosforyl-lipid A eller et derivat derav, en saponinimmunstimulant eller et immunstimulerende CpG-oligonukleotid; og - sammenblanding av polysakkaridantigenet og proteinantigenet med en egnet eksipient.