DE102011122891B4

DE102011122891B4 - Fermentationsmedium, das frei von tierischen Bestandteilen ist, zur Herstellung von Diphtherie-Toxoiden zur Verwendung bei der Impfung von Menschen

Info

Publication number: DE102011122891B4
Application number: DE102011122891.1A
Authority: DE
Inventors: Friedrich BLACKKOLB; Martha REITH; Manfred ISENBERG; Bernd Becker; Anne Katrin HILBERT
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2011-11-11
Filing date: 2011-11-11
Publication date: 2014-12-24
Anticipated expiration: 2031-11-12
Also published as: DE102011122891A1

Abstract

Verfahren zur Herstellung eines Diphtherie-Toxoids, bei dem man: (i) einen Stamm von Corynebacterium diphtheriae, der ein Diphtherie-Toxin exprimiert, in einem Fermentationsmedium anzüchtet; (ii) das Diphtherie-Toxin aus dem Fermentationsmedium abtrennt, um eine Diphtherie-Toxin-Lösung zu erhalten; (iii) aus der Diphtherie-Toxin-Lösung ein Diphtherie-Toxin-Konzentrat mit einer Konzentration des Diphtherie-Toxins von mindestens 2000 Lf/mL herstellt; (iv) zu dem Konzentrat eine Aminosäure und Formaldehyd zugibt; und (v) das Konzentrat in Gegenwart der Aminosäure und des Formaldehyds inkubiert, um das Diphtherie-Toxoid zu erhalten.

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft ein Fermentationsmedium zur Kultivierung von Corynebacterium diphtheriae. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung des Fermentationsmediums in Verfahren zur Gewinnung von Diphtherie-Toxin von kultivierten C. diphtheriae-Bakterien, die Herstellung von Impfstoffen, welche die mittels der Verfahren erhaltenen Diphtherie-Toxine verwenden, und die Toxine selbst. Die Erfindung betrifft ferner die Aufreinigungs- und Detoxifizierungsverfahren zur Herstellung der Diphtherie-Toxoide aus dem Toxin, z. B. zum Zwecke der Einbringung in einen Impfstoff.
HINTERGRUND
Corynebacterium diphtheriae verursacht Diphtherie. Das Bakterium produziert ein toxisches Protein, Diphtherie-Toxin, welches (z. B. mit Formalin oder Formaldehyd) behandelt werden kann, so dass es seine Toxizität verliert, aber die Fähigkeit beibehält, protektive Anti-Toxin-Antikörper nach der Injektion zu induzieren. Diese Behandlung wird als ”Detoxifizierung” oder ”Toxoidierung” bezeichnet, und das detoxifizierte Toxin wird als ”Toxoid” bezeichnet. Die Diphtherie-Toxoide werden in Diphtherie-Impfstoffen verwendet und werden in Kapitel 13 des Buches ”Vaccines” [1] und in Kapitel 31 von ”New Generation Vaccines” [2] detaillierter beschrieben.
Jedes therapeutische Mittel, das an Menschen verabreicht wird und mittels eines biologischen Prozesses hergestellt worden ist, hat das Potential, schädliche Stoffe in den menschlichen Körper einzubringen. Diese schädlichen Substanzen können Bestandteil Mediums sein, das während des biologischen Prozesses verwendet wird. Beispielsweise sind von Tieren erhaltene Medium-Bestandteile, wie z. B. fötales Rinderserum, mit dem Risiko behaftet, dass sie anormal gefaltete Proteine wie Prione enthalten. Traditionell wurde Diphtherie-Toxoid durch Anzüchten von C. diphtheriae in einem Wachstumsmedium erhalten, das tierische Bestandteile enthielt (z. B. in Feton-Medium oder in Linggoud & Fenton-Medium), wie z. B. Rinderextrakt und/oder aus Kuhmilch erhaltene Casaminosäuren.
Die Verwendung von proteinhaltigem Material, welches nicht tierischen Ursprungs ist, beseitigt dieses Risiko. EP-B-1849860 offenbart ein Medium zur Kultivierung von C. diphtheriae, welches mindestens 20% Trockenmasse eines nicht-tierischen proteinhaltigen Materials umfasst, wobei es sich um einen Hefeextrakt handelt [3]. WO 2005/056773 offenbart ein Kulturmedium für C. diphtheriae zur Herstellung von Diphtherie-Toxin, welches im Wesentlichen frei von tierischen Bestandteilen ist, sowie Verfahren zur Herstellung des Toxins [4]. WO 2006/042542 offenbart ein Fermentationsmedium zur Herstellung bakterieller Toxine unter Verwendung einer Proteinquelle, die nicht von Tieren und nicht von Soja erhalten wurde [5]. WO 00/50449 offenbart ein Verfahren zur Aufreinigung von Diphtherie-Toxin, bei dem man einen Mikroorganismus-Stamm fermentiert, der in der Lage ist, unter Verwendung von Glucose als Kohlenstoffquelle Diphtherie-Toxin zu produzieren. In einer bevorzugten Ausführungsform offenbart diese Patentanmeldung die Verwendung eines Wachstumsmediums, das nicht mehr als 1% Hefeextrakt umfasst [6].
Auch wenn diese Medien auf nicht-tierischen Proteinquellen basieren und somit das Risiko von Verunreinigungen verringern können, führt keines bei der industriellen Produktion (z. B. bei Verwendung von Fermentern im Bereich von 100–600 L) zu hohen Ausbeuten an Diphtherie-Toxin, und geringe Ausbeuten sind ein Nachteil dieser Verfahren.
Es ist somit Aufgabe der vorliegenden Erfindung, weitere und verbesserte Fermentationsmedien bereitzustellen, die für die Verwendung bei der Herstellung von Diphtherie-Toxin für die Impfstoffproduktion mit hohen Ausbeuten im industriellen Maßstab geeignet sind.
In herkömmlichen Verfahren zur Herstellung von Diphtherie-Toxoid wird das Toxin mit Formaldehyd in Gegenwart von Bestandteilen des Kulturmediums behandelt, siehe z. B. 4 von Kapitel 31 in Literaturstelle 2. Neben der Vernetzung und Detoxifizierung des Diphtherie-Toxins verursacht Formaldehyd eine kovalente Vernetzung der Bestandteile des Mediums. Diese Vernetzung bedeutet, dass die von Tieren erhaltenden Bestandteile, sofern diese im Medium vorhanden sind, irreversibel in das humane Impfstoffprodukt eingeschlossen werden können. Toxoide mit einer höheren Reinheit zur Verwendung in Impfstoffen können mittels Aufreinigung des Toxins vor der Behandlung mit Formaldehyd erhalten werden. Patentanmeldung GB-969772 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Toxoiden aus Diphtherie-Toxin, bei dem das Toxin in einem wässrigen Medium mit Formaldehyd in Gegenwart von aliphatischem Diamin mit einem Molekulargewicht unterhalb von 200, welches eine primäre oder eine sekundäre Aminogruppe umfasst, behandelt wird [7]. Frech et al. [8] offenbaren eine physiochemische Analyse von zwei gereinigten Diphtherie-Toxoiden: das erste wurde mittels eines herkömmlichen Verfahrens hergestellt, bei dem das Diphtherie-Toxin mit Formalin behandelt und anschließend gereinigt wurde; das zweite wurde zuerst stark gereinigt und dann detoxifiziert. WO 2005/056773 offenbart die Detoxifizierung eines zu mindestens 75% reinen Diphtherie-Toxins. Selbst wenn in einem Reinigungsschritt vor der Detoxifizierung eine hohe Reinheit erreicht werden sollte, so werden dennoch Restbestandteile tierischen Ursprungs aus dem zur Herstellung des Diphtherie-Toxins verwendeten Fermentationsmediums durch Formaldehyd mit dem während des Detoxifizierungsschritts erhaltenen Diphtherie-Toxoid vernetzt.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Diphtherie-Toxoid bereitzustellen, das frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs ist, die durch Formaldehyd vernetzt werden. Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, weitere verbesserte Verfahren bereitzustellen, bei denen Diphtherie-Toxin zunächst stark aufgereinigt und dann detoxifiziert wird.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
A. Fermentationsmedium
Die Erfindung stellt unterschiedliche Medien zur Kultivierung von Corynebacterium diphtheriae bereit. Diese Medien erlauben die Herstellung von Diphtherie-Toxin in industriellem Maßstab in Fermentern, die ein Produktionsvolumen von mindestens 300 Litern aufweisen, wobei Ausbeuten erreicht werden, die gleichbleibend im Bereich von 200 Lf/ml bis 250 Lf/ml (oder höher) liegen. Die vorliegend offenbarten Medien und Verfahren können sogar die Ausbeuten übertreffen, die bei der Produktion von Diphtherie-Toxin mit Medien tierischen Ursprungs erzielt werden.
Im Allgemeinen stellt die Erfindung ein Fermentationsmedium bereit, das für die Kultivierung eines Stamms von Corynebacterium diphtheriae zur Herstellung von Diphtherie-Toxin oder eines Derivats davon geeignet ist, wobei das Medium frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs ist und eine Stickstoffquelle, eine Kohlenstoffquelle, einen Eisenzusatz, Phosphor und Wachstumsfaktoren umfasst. Das Medium ist insbesondere für die Herstellung von Diphtherie-Toxin in hohen Ausbeuten und in industriellem Maßstab bei der Herstellung von Impfstoffen zur humanen Anwendung geeignet.
In einem Aspekt stellt die Erfindung ein Fermentationsmedium, das für die Kultivierung eines Stamms von Corynebacterium diphtheriae geeignet ist, zur Herstellung von Diphtherie-Toxin oder eines Derivats davon bereit, wobei das Medium frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs ist und Wasser, einen an Eisen entreicherten Hefeextrakt, und mindestens 0,08 M eines Disaccharids als Kohlenstoffquelle enthält. In einer Ausführungsform umfasst das Fermentationsmedium zwischen 0,08 M und 0,16 M des Disaccharids. In einer spezifischen Ausführungsform umfasst das Fermentationsmedium 0,15 M des Disaccharids.
In einem weiteren Aspekt stellt die ein Erfindung ein Fermentationsmedium, das für die Kultivierung eines Stamms von Corynebacterium diphtheriae geeignet ist, zur Herstellung von Diphtherie-Toxin oder eines Derivats davon bereit, wobei das Medium frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs ist und Wasser, einen an Eisen entreicherten Hefeextrakt und ein Salz von Fe(III) enthält.
In einem noch weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Fermentationsmedium, das für die Kultivierung eines Stamms von Corynebacterium diphtheriae geeignet ist, zur Herstellung von Diphtherie-Toxin oder eines Derivats davon bereit, wobei das Medium frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs ist und Wasser sowie einen Hefeextrakt mit geringem Mannan-Anteil enthält. In einer Ausführungsform ist der Hefeextrakt mit geringem Mannan-Anteil an Eisen entreichert.
In einem noch weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Fermentationsmedium, das für die Kultivierung eines Stamms von Corynebacterium diphtheriae geeignet ist, zur Herstellung von Diphtherie-Toxin oder eines Derivats davon bereit, wobei das Medium frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs ist und Wasser, einen Hefeextrakt, der frei von Bestandteilen mit einem Molekulargewicht größer als 30 kDa ist, und ein Salz von Fe(II) oder Fe(III) in einer Konzentration zwischen 1,5 μM und 30 μM enthält.
B. Verfahren zur Herstellung eines Fermentationsmediums
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Fermentationsmediums bereit, bei dem man (i) eine Stickstoffquelle, (ii) eine Kohlenstoffquelle, und (iii) einen Eisenzusatz zu Wasser gibt.
In einem Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Fermentationsmediums bereit, bei dam man Hefeextrakt in Wasser löst, um eine Hefeextraktlösung zu erhalten, die Hefeextraktlösung an Eisen entreichert, um eine an Eisen entreicherte Hefeextraktlösung zu erhalten, und mindestens 0,08 M eines Disaccharids zu der an Eisen entreicherten Hefeextraktlösung gibt, um das Fermentationsmedium herzustellen. In einer Ausführungsform werden zwischen 0,08 M und 0,16 M des Disaccharids zu der an Eisen entreicherten Hefeextraktlösung gegeben. In einer spezifischen Ausführungsform werden 0,15 M Disaccharid zu der an Eisen entreicherten Hefeextraktlösung gegeben.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Fermentationsmediums bereit, bei dam man Hefeextrakt in Wasser löst, um eine Hefeextraktlösung zu erhalten; die Hefeextraktlösung an Eisen entreichert, um eine an Eisen entreicherte Hefeextraktlösung zu erhalten, und ein Salz von Fe(III) zu der an Eisen entreicherten Hefeextraktlösung gibt, um das Fermentationsmedium herzustellen. In einer Ausführungsform wird das Salz von Fe(III) in Kombination mit Phosphat und einem Kalziumsalz zu der an Eisen entreicherten Hefeextraktlösung gegeben, um die Bildung einer Eisenformulierung mit verzögerter Freisetzung zu begünstigen.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Fermentationsmediums bereit, bei dem man einen Hefeextrakt mit geringem Mannan-Anteil herstellt, und den Hefeextrakt mit geringem Mannan-Anteil in Wasser löst, um das Fermentationsmedium herzustellen. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren das Entreichern des Hefeextrakts mit geringem Mannan-Anteil an Eisen.
In einem noch weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Fermentationsmediums bereit, bei dem man Hefeextrakt in Wasser löst, um eine Hefeextraktlösung zu erhalten, die Hefeextraktlösung unter Verwendung einer Membran ultrafiltriert, die einen Molekulargewichtsausschluss von größer als 30 kDa aufweist, die Hefeextraktlösung an Eisen entreichert, um eine an Eisen entreicherte Hefeextraktlösung zu erhalten, und ein Salz von Fe(II) oder Fe(III) bis zu einer finalen Konzentration von zwischen 1,5 μM und 30 μM zu der an Eisen entreicherten Hefeextraktlösung gibt, um das Fermentationsmedium herzustellen.
C. Verfahren zur Herstellung eines Diphtherie-Toxins oder eines Derivats davon
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Züchtung von Corynebacterium diphtheriae bereit, welches die Kultivierung eines Stamms von Corynebacterium diphtheriae in einem erfindungsgemäßen Fermentationsmedium umfasst.
In einem Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Diphtherie-Toxins oder eines Derivats davon, bei dem man einen Stamm von Corynebacterium diphtheriae, der ein Diphtherie-Toxin oder ein Derivat davon exprimiert, in dem erfindungsgemäß Fermentationsmedium anzüchtet und das Diphtherie-Toxin oder das Derivat von dem Fermentationsmedium abtrennt.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Diphtherie-Toxins oder eines Derivats davon bereit, bei dem man eine Kultur eines Stamms von Corynebacterium diphtheriae, der ein Diphtherie-Toxin oder ein Derivat davon exprimiert, in mindestens 100 L Fermentationsmedium, das frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs ist, herstellt, die Kultur auf eine Konzentration des Diphtherie-Toxins oder des Derivats von mindestens 140 Lf/ml in dem Fermentationsmedium anzüchtet und das Diphtherie-Toxin oder das Derivat von dem Fermentationsmedium abtrennt.
D. Verfahren zur Herstellung eines Diphtherie-Toxoids
Die Erfindung stellt diverse Verfahren zur Herstellung von Diphtherie-Toxoiden bereit. Diese Verfahren umfassen Idealerweise die Aufreinigung vor der Detoxifizierung, wodurch die Vernetzung von Bestandteilen des Mediums mit dem Toxoid minimiert oder vermieden wird. Wenn Hefeextrakte in dem Kulturmedium verwendet wurden, sollte der Prozess die meisten (idealerweise alle) Restbestandteile des Hefeextrakts von dem Diphtherie-Toxin vor der Behandlung mit Formaldehyd entfernen, wodurch die Vernetzung von potentiell allergenen Hefebestandteilen mit dem Diphtherie-Toxoid verhindert werden kann. Die hohe Reinheit des finalen Diphtherie-Toxoids ist ebenfalls vorteilhaft, da die Zugabe von Konservierungsmitteln vermieden werden kann, was das Potential von Abwehrreaktionen während der Impfung reduziert.
Des Weiteren ist es möglich, kleinere Mengen während des Behandlungsschritts mit Formaldehyd zu verwenden, wenn das gereinigte Material vor der Detoxifizierung aufkonzentriert wird. Die Anfangskonzentration kann beispielsweise durch mehrere Diafiltrationsschritte erreicht werden, die zu einer stärker konzentrierten Diphtherie-Toxin-Lösung führen. Die Verwendung von geringeren Volumen während der Detoxifizierung ist vorteilhaft, weil es Zeit und Lagerungskapazität spart.
Demzufolge stellt die Erfindung in einem noch weiteren Aspekt ein Verfahren zur Herstellung von Diphtherie-Toxoid bereit, bei dem man eine Kultur eines Stamms von Corynebacterium diphtheriae, der ein Diphtherie-Toxin exprimiert, in einem erfindungsgemäßen Fermentationsmedium anzüchtet, das Diphtherie-Toxin aus dem Fermentationsmedium aufreinigt, um ein gereinigtes Diphtherie-Toxin zu erhalten, Formaldehyd zu dem gereinigten Diphtherie-Toxin gibt und aus dem vorherigen Schritt erhaltene, aufgereinigte Diphtherie-Toxin inkubiert, um das Diphtherie-Toxoid zu erhalten.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Diphtherie-Toxoids bereit, bei dem man: (i) einem Stamm von Corynebacterium diphtheriae, der ein Diphtherie-Toxin oder ein Derivat davon exprimiert, in einem Fermentationsmedium anzüchtet, vorzugsweise in einer Menge von mindestens 100 Litern und/oder, um eine Ausbeute von mindestens 140 Lf/ml des Toxins/Derivats zu erhalten, (ii) das Diphtherie-Toxin oder das Derivat von dem Fermentationsmedium abtrennt, um eine Diphtherie-Toxin-Lösung zu erhalten; (iii) ein Diphtherie-Toxin-Konzentrat aus der Diphtherie-Toxin-Lösung herstellt, wobei die Konzentrierung des Diphtherie-Toxins oder des Derivats in dem Konzentrat mindestens 20-fach höher ist als die Konzentration des Diphtherie-Toxins oder des Derivats in dem Fermentationsmedium, das am Ende von Schritt (i) erhalten wurde oder in der Toxin-Lösung, die am Ende von Schritt (ii) erhalten wurde; (iv) ein Amid und Formaldehyd zu dem Konzentrat gibt und das Konzentrat aus Schritt (iv) inkubiert, um das Diphtherie-Toxoid zu erhalten. In einer Ausführungsform ist die Konzentration des Diphtherie-Toxins oder des Derivats in dem Konzentrat aus Schritt (iii) zwischen 20-fach und 36 fach höher als die Konzentration des Diphtherie-Toxins oder des Derivats in dem Fermentationsmedium.
In einem noch weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Diphtherie-Toxoids bereit, bei dem man (i) einen Stamm von Corynebacterium diphtheriae, der ein Diphtherie-Toxin oder ein Derivat davon exprimiert, in einem Fermentationsmedium anzüchtet, das Hefeextrakt als einzige Quelle für alle essentiellen Aminosäuren umfasst, (ii) das Diphtherie-Toxin oder das Derivat aus dem Fermentationsmedium aufreinigt, um ein gereinigtes Diphtherie-Toxin oder Derivat zu erhalten, (iii) Formaldehyd zu dem gereinigten Diphtherie-Toxin oder dem Derivat gibt, und (iv) das aus Schritt (iii) erhaltene, gereinigte Diphtherie-Toxin oder das Derivat inkubiert, um das Diphtherie-Toxoid zu erhalten.
In einem noch weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Diphtherie-Toxoids für die Herstellung eines Impfstoffs zur Verwendung beim Menschen bereit, bei dem man (i) einen Stamm von Corynebacterium diphtheriae, der ein Diphtherie-Toxin oder ein Derivat davon exprimiert, in einem Fermentationsmedium anzüchtet, das frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs ist, wobei das Fermentationsmedium wahlweise Hefeextrakt umfasst, (ii) das Diphtherie-Toxin oder das Derivat aus dem Fermentationsmedium aufreinigt, um ein gereinigtes Diphtherie-Toxin oder ein Derivat zu erhalten, das eine Reinheit von mindestens 1500 Lf/mg Stickstoff aufweist, (iii) die Formaldehyd zu dem gereinigtem Diphtherie-Toxin oder dem Derivat gibt, und (iv) das aus Schritt (iii) erhaltene gereinigte Diphtherie-Toxin oder Derivat inkubiert, um das Diphtherie-Toxoid zu erhalten.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren Herstellung eines Diphtherie-Toxoids bereit, bei dem man (i) einen Stamm von Corynebacterium diphtheriae, der ein Diphtherie-Toxin oder ein Derivat davon exprimiert, in einem Fermentationsmedium anzüchtet, das frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs ist, wobei das Fermentationsmedium wahlweise Hefeextrakt umfasst, (ii) das Diphtherie-Toxins oder das Derivat aus dem Fermentationsmedium aufreinigt, um ein gereinigtes Diphtherie-Toxin oder Derivat zu erhalten, wobei das gereinigte Toxin oder Derivat zu mindestens 85% rein ist, (iii) Formaldehyd zu dem gereinigten Diphtherie-Toxin oder Derivat gibt, und (iv) das aus Schritt (iii) erhaltene gereinigte Diphtherie-Toxin oder Derivat inkubiert, um das Diphtherie-Toxoid zu erhalten.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Diphtherie-Toxoids bereit, bei dem man (i) einen Stamm von Corynebacterium diphtheriae, der ein Diphtherie-Toxin oder ein Derivat davon exprimiert, in einem Fermentationsmedium anzüchtet, das frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs ist, wobei das Fermentationsmedium wahlweise Hefeextrakt umfasst, (ii) das Diphtherie-Toxin oder das Derivat aus dem Fermentationsmedium mittels einer Anionen-Austausch-Chromatographie aufreinigt, um ein gereinigtes Diphtherie-Toxin oder Derivat zu erhalten, (iii) Formaldehyd zu dem gereinigten Diphtherie-Toxin oder Derivat, gibt, und (iv) das aus Schritt (iii) erhaltene gereinigte Diphtherie-Toxin oder Derivat inkubiert, um das Diphtherie-Toxoid zu erhalten.
In einer besonderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Diphtherie-Toxoids bereit, bei dem man (i) eine Lösung eines Diphtherie-Toxins oder eines Derivats davon in einer Menge von mindestens 2000 Lf/ml herstellt, (ii) zu der Lösung (a) ein Amid in einer finalen Konzentration von nicht mehr als 0,025 M und (b) Formaldehyd in einer finalen Konzentration im Bereich von 0,75–1% gibt, und (iii) die aus Schritt (ii) erhaltene Lösung inkubiert, um das Diphtherie-Toxoid zu erhalten. In einer besonderen Ausführungsform ist die Toxinkonzentration der in Schritt (i) hergestellten Lösung etwa 5000 Lf/ml. In ähnlicher Weise stellt die Erfindung in einem weiteren besonderen Aspekt ein Verfahren zur Herstellung eines Diphtherie-Toxoids bereit, bei dem man (i) eine Lösung eines Diphtherie-Toxins in einer Konzentration von mindestens 2000 Lf/ml herstellt, (ii) zu der Lösung (a) nicht mehr als 5 nMol eines Amids pro Lf des Diphtherie-Toxins und (b) zwischen 40 und 55 nMol Formaldehyd pro Lf des Diphtherie-Toxins gibt und (iii) die Lösung aus Schritt (ii) inkubiert, um das Diphtherie-Toxoid zu erhalten. In einer spezifischen Ausführungsform ist die Toxinkonzentration in der in Schritt (i) hergestellten Lösung etwa 5000 Lf/ml.
In einer spezifischen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Diphtherie-Toxoids bereit, bei dem man (i) eine Kultur eines Stamms von Corynebacterium diphtheriae, der ein Diphtherie-Toxin exprimiert, in einem Fermentationsmedium anzüchtet, das Hefeextrakt umfasst, (ii) das Diphtherie-Toxin aus dem Fermentationsmedium aufreinigt, um eine Diphtherie-Toxin-Lösung zu erhalten, (iii) die Konzentration des Diphtherie-Toxins in der Diphtherie-Toxin-Lösung auf mindestens 2000 Lf/ml einstellt, um ein Diphtherie-Toxin-Konzentrat zu erhalten, (iv) zu dem Konzentrat (a) ein Amid in einer finalen Konzentration von nicht mehr als 0,025 M und (b) Formaldehyd in einer finalen Konzentration im Bereich von etwa 0,75–1% zugibt, und (v) das Konzentrat aus Schritt (iv) inkubiert, um das Diphtherie-Toxoid zu erhalten. In einer spezifischen Ausführungsform wird die Toxinkonzentration in Schritt (iii) auf 5000 Lf/ml eingestellt.
In einer noch weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Diphtherie-Toxins bereit, das für die Impfung geeignet ist, bei dem man eine Kultur eines Stamms von Corynebacterium diphtheriae, der ein Diphtherie-Toxin exprimiert, in einem Fermentationsmedium anzüchtet, das Hefeextrakt umfasst, (ii) das Diphtherie-Toxin aus dem Fermentationsmedium aufreinigt, um eine Diphtherie-Toxin-Lösung zu erhalten, (iii) die Konzentration des Diphtherie-Toxins in der Diphtherie-Toxin-Lösung auf mindestens 2000 Lf/ml einstellt, um ein Diphtherie-Toxin-Konzentrat zu erhalten, (iv) zu dem Konzentrat (a) nicht mehr als 5 nMol eines Amids pro Lf des Diphtherie-Toxins und (b) zwischen 40 und 55 nMol Formaldehyd pro Lf des Diphtherie-Toxins zugibt, und (v) das Konzentrat aus Schritt (iv) inkubiert, um das Diphtherie-Toxoid zu erhalten. In einer spezifischen Ausführungsform wird die Toxin-Konzentration in Schritt (iii) auf 5000 Lf eingestellt.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Kombinationsimpfstoffs zur humanen Anwendung bereit, bei dem man

(i) eine Kultur von einem Stamm von Corynebacterium diphtheriae, der ein Diphtherie-Toxin oder ein Derivat davon exprimiert, in mindestens 100 L eines Fermentationsmedium anzüchtet, das frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs ist, und das Folgendes umfasst: eine Stickstoffquelle; mindestens 0,08 M einer Kohlenstoffquelle; 1,5 μM–30 μM lösliches Fe²⁺/Fe³⁺; Phosphor; und Wachstumsfaktoren
(ii) die Kultur unter aeroben Bedingungen zu einer Konzentration von mindestens 140 Lf/ml des Diphtherie-Toxins oder des Derivats in dem Fermentationsmedium anzüchtet;
(iii) das Diphtherie-Toxin oder das Derivat von dem Fermentationsmedium abtrennt, wobei der Trennungsschritt einen Zentrifugationsschritt und einen Filtrationsschritt umfasst,
(iv) das aus Schritt (iii) erhaltene Diphtherie-Toxin oder Derivat unter Verwendung einer Anionen-Austausch-Chromatographie aufreinigt, um eine Lösung zu erhalten, die ein gereinigtes Diphtherie-Toxin oder Derivat umfasst;
(v) die Konzentration des gereinigten Diphtherie-Toxins oder Derivats in der Lösung auf mindestens 2000 Lf/ml einstellt, um ein Diphtherie-Toxin-Konzentrat zu erhalten;
(vi) zu dem Konzentrat (a) ein Amid in einer finalen Konzentration von nicht mehr als 0,025 M und (b) Formaldehyd in einer finalen Konzentration im Bereich von 0,75–1% gibt; und
(vii) das Konzentrat aus Schritt (vi) inkubiert, um das Diphtherie-Toxoid zu erhalten.

E. Diphtherie-Toxoide
Verfahren der Erfindung stellen Diphtherie-Toxoide bereit, die als Impfstoffe für Menschen besser geeignet sind als die momentan hergestellten. Die Toxoide unterscheiden sich analytisch von bekannten Toxoiden, z. B. durch ihre Vernetzung, durch das Fehlen von vernetzten Medienbestandteilen, anhand der Potenz, und/oder durch ihre Reinheit. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das durch die vorliegend beschriebenen Verfahren erhaltene Diphtherie-Toxoid frei von Formaldehydvernetzten Bestandteilen tierischen Ursprungs.
In einem Aspekt stellt die Erfindung ein Diphtherie-Toxoid für die Impfung von Menschen bereit, welches erhältlich ist, indem man einen Stamm von Corynebacterium diphtheriae, der ein Diphtherie-Toxin exprimiert, in einem Fermentationsmedium anzüchtet, das frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs ist, das Diphtherie-Toxin von dem Fermentationsmedium abtrennt, und das Diphtherie-Toxin in Gegenwart von Formaldehyd inkubiert, um das Diphtherie-Toxoid zu erhalten. In einer spezifischen Ausführungsform ist das auf diese Weise erhältliche Diphtherie-Toxoid durch Formaldehyd mit mindestens einem Bestandteil des Fermentationsmediums vernetzt.
Die Erfindung stellt ferner ein Diphtherie-Toxoid bereit, das aus einem Diphtherie-Toxin hergestellt wurde, das von einem Corynebacterium diphtheriae-Bakterium produziert wurde, welches ein Diphtherie-Toxin exprimiert, wobei das Bakterium in einem Fermentationsmedium angezüchtet wurde, das frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs ist, und wobei das Toxoid mit mindestens einem Bestandteil des Fermentationsmedium vernetzt ist.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Diphtherie-Toxoid für die Verwendung bei der Impfung von Menschen bereit, das durch ein Verfahren erhältlich ist, bei dem man (i) einen Stamm von Corynebacterium diphtheriae, der ein Diphtherie-Toxin oder ein Derivat davon exprimiert, in mindestens 100 L eines Fermentationsmediums anzüchtet, das frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs ist, wobei das Fermentationsmedium wahlweise Hefeextrakt umfasst, (ii) das Diphtherie-Toxin oder Derivat aus dem Fermentationsmedium aufreinigt, um ein gereinigtes Diphtherie-Toxin oder Derivat zu erhalten, wobei das gereinigte Diphtherie-Toxin oder Derivat zu mindestens 85% rein ist und/oder eine Reinheit von mindestens 1500 Lf/mg Stickstoff aufweist, (iii) Formaldehyd zu dem gereinigten Diphtherie-Toxin oder dem Derivat gibt und (iv) das gereinigte Diphtherie-Toxin oder das Derivat aus Schritt (iii) inkubiert, um das Diphtherie-Toxoid zu erhalten. In einer besonderen Ausführungsform ist das durch dieses Verfahren erhaltene Diphtherie-Toxoid durch Formaldehyd mit mindestens einem Bestandteil aus dem Fermentationsmedium vernetzt.
In einer spezifischen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Diphtherie-Toxoid für die Verwendung bei der Impfung von Menschen bereit, das durch ein Verfahren erhältlich ist, bei dem man:

(i) ein Fermentationsmedium herstellt, das frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs ist, indem man einen Hefeextrakt mit geringem Mannan-Anteil in Wasser löst, um eine Hefeextraktlösung zu erhalten, die Hefeextraktlösung an Eisen entreichert, um eine an Eisen entreicherte Hefeextraktlösung zu erhalten, und 50 g/L Maltose, eine Wachstumsfaktorlösung und ein Salz von Fe(III) in einer Konzentration zwischen 10–14 μM zu der an Eisen entreicherten Hefeextraktlösung gibt, um das Fermentationsmedium herzustellen, wobei das Salz von Fe(III) in Kombination mit Phosphat und einem Kalziumsalz zugegeben wird, um die Bildung einer Formulierung mit verzögerter Eisen-Freisetzung zu fördern;
(ii) das Fermentationsmedium zentrifugiert, um sämtliches Eisenpräzipitat zu entfernen, das sich gebildet haben könnte;
(iii) das Fermentationsmedium unter Verwendung einer Membran mit einem Molekulargewichtsauschluss von größer als 30 kDa ultrafiltriert;
(iv) eine Kultur eines Stamms von Corynebacterium diphtheriae, der ein Diphtherie-Toxin exprimiert, in mindestens 100 L Fermentationsmedium herstellt;
(v) die Kultur auf eine Konzentration von mindestens 140 Lf/ml des Diphtherie-Toxins in dem Fermentationsmedium anzüchtet;
(vi) das Diphtherie-Toxin mittels Zentrifugation von dem Fermentationsmedium abtrennt, um eine Diphtherie-Toxin-Lösung zu erhalten;
(vii) die Diphtherie-Toxin-Lösung filtersterilisiert, um ein steriles Diphtherie-Toxin zu erhalten;
(viii) das sterile Diphtherie-Toxin aufreinigt, um ein gereinigtes Diphtherie-Toxin zu erhalten;
(ix) Formaldehyd zu dem gereinigten Diphtherie-Toxin gibt, und
(x) das gereinigte Diphtherie-Toxin aus Schritt (ix) inkubiert, um das Diphtherie-Toxoid zu erhalten.

In einer weiteren spezifischen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Diphtherie-Toxoid für die Verwendung bei der Impfung von Menschen bereit, das durch ein Verfahren erhältlich ist, bei dem man:

(i) eine Kultur von einem Stamm von Corynebacterium diphtheriae, der ein Diphtherie-Toxin exprimiert, in mindestens 100 L eines Fermentationsmediums anzüchtet, das frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs und von Bestanteilen mit einem Molekulargewicht von mehr als 30 kDa ist, wobei das Fermentationsmedium (a) Wasser, (b) einen an Eisen entreicherten Hefeextrakt mit geringem Mannan-Anteil, (c) 50 g/L Maltose, (d) eine Wachstumsfaktorlösung, die Magnesium, Kupfer, Zink, Mangan, Pimelinsäure, Nikotinsäure und β-Alanin enthält, (e) Ammonium-Eisen-Citrat bei einer Anfangskonzentration zwischen 10–14 μM und (f) Phosphat umfasst;
(ii) die Kultur unter aeroben Bedingungen auf eine Konzentration von mindestens 200 Lf/ml des Diphtherie-Toxins in dem Fermentationsmedium anzüchtet;
(iii) das Diphtherie-Toxin von dem Fermentationsmedium durch Zentrifugation abtrennt, um eine Diphtherie-Toxin-Lösung zu erhalten;
(iv) die Diphtherie-Toxin-Lösung filtersterilisiert, um ein steriles Diphtherie-Toxin zu erhalten;
(v) das sterile Diphtherie-Toxin aufreinigt, um ein gereinigtes Diphtherie-Toxin zu erhalten;
(vi) das gereinigte Diphtherie-Toxin auf das mindestens 20-fache der Konzentration des Diphtherie-Toxin in dem Fermentationsmedium aufkonzentriert, um ein Diphtherie-Toxin-Konzentrat zu erhalten;
(vii) Formaldehyd und Lysin zu dem Diphtherie-Toxin-Konzentrat gibt, und
(viii) das Diphtherie-Toxin-Konzentrat in Gegenwart von Formaldehyd und Lysin inkubiert, um das Diphtherie-Toxoid zu erhalten.

In einer noch weiteren spezifischen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Diphtherie-Toxoid zur Verwendung bei der Impfung von Menschen bereit, das durch ein Verfahren erhältlich ist, bei dem man:

(i) eine Kultur von einem Stamm von Corynebacterium diphtheriae, der ein Diphtherie-Toxin exprimiert, in einem Fermentationsmedium anzüchtet;
(ii) das Diphtherie-Toxin mittels Anionen-Austausch-Chromatographie aus dem Fermentationsmedium aufreinigt, um eine Lösung zu erhalten, die ein gereinigtes Diphtherie-Toxin mit mindestens 2000 Lf/mg Stickstoff umfasst;
(iii) die Konzentration des gereinigten Diphtherie-Toxins in der Lösung mittels Diafiltration auf 5000 Lf/mL einstellt, um ein Diphtherie-Toxin-Konzentrat zu erhalten;
(iv) zu dem Konzentrat (a) Lysin in einer finalen Konzentration von 0,025 M und (b) Formaldehyd in einer finalen Konzentration von 1% zu dem Konzentrat zugibt;
(v) das Konzentrat aus dem vorherigen Schritts inkubiert, um ein Diphtherie-Toxoid-Konzentrat zu erhalten;
(vi) das Diphtherie-Toxoid-Konzentrat sterilfiltriert, um eine sterile Lösung zu erhalten;
(vii) die Konzentration des Diphtherie-Toxoids in der sterilen Lösung mittels Diafiltration auf 10000 Lf/ml einstellt, um eine konzentrierte Lösung zu erhalten; und
(viii) den pH der konzentrierten Lösung auf 7,5 einstellt, um ein Diphtherie-Toxoid zu erhalten, das für die Verwendung bei der Impfung von Menschen geeignet ist.

In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Diphtherie-Toxoid bereit, das durch die Behandlung eines Diphtherie-Toxins mit einer Konzentration von mindestens 2000 Lf/ml mit Formaldehyd erhältlich ist. Die Formaldehydbehandlung kann (wie an anderer Stelle vorliegend beschrieben) die Zugabe (a) eines Amids in einer finalen Konzentration von nicht mehr als 0,025 M und (b) von Formaldehyd in einer finalen Konzentration in einem Bereich von 0,75–1% zu der Toxinlösung umfassen. In ähnlicher Weise kann die Formaldehydbehandlung (wie an anderer Stelle vorliegend beschrieben) die Zugabe von (a) nicht mehr als 5 nmol eines Amids pro Lf des Diphtherie-Toxins und (b) zwischen 40 und 55 nMol Formaldehyd pro Lf des Diphtherie-Toxins zu der Toxinlösung umfassen. Diese Mengen an Formaldehyd (und, wahlweise des Amids, z. B. Lysin) sind im Stand der Technik bekannt, jedoch nicht für die Behandlung eines Toxins in so hoher Konzentration. Das veränderte Verhältnis stellt ein Toxoid bereit, das sich auf der molekularen Ebene von bekannten Toxoiden unterscheidet.
Die Erfindung stellt ferner ein Diphtherie-Toxoid bereit, das durch ein wie hier beschriebenes Verfahren der Erfindung erhältlich ist. Die Erfindung stellt insbesondere ein Diphtherie-Toxoid bereits, das durch ein Verfahren erhältlich ist, wie es in den vorliegenden Beispielen beschrieben wird (z. B. erhältlich durch Anzüchten von C. diphtheriae in einem Medium aus Tabelle 3, Aufreinigen des Toxins und Detoxifizierung des Toxins, wie vorliegend beschrieben).
F. Zusammensetzungen, die für die Impfung von Menschen geeignet sind
Die Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die für die Impfung von Menschen geeignet ist und ein Diphtherie-Toxoid enthält, das frei von Formaldehyd-vernetzten Bestandteilen tierischen Ursprungs ist und eine Potenz von mindestens 60 IU/ml aufweist. In ähnlicher Weise stellt die Erfindung eine Zusammensetzung für die Impfung von Menschen bereit, die Diphtherie-Toxoid umfasst, welches von Corynebacterium diphtheriae aufgereinigt wurde, der in einem Medium angezüchtet wurde, das frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs ist, und eine Potenz von mindestens 60 IU/ml aufweist. In einer Ausführungsform weist die Zusammensetzung ein Verhältnis von Monomer:Dimer des Diphtherie-Toxoids im Bereich von 3:1 bis 10:1 auf, vorzugsweise im Bereich von 3:1 bis 6:1 (oder 4:1 bis 9:1), und das Diphtherie-Toxoid kann einen isoelektrischen Punkt im Bereich von 4,0 bis 5,0 aufweisen. In einer weiteren Ausführungsform liegen mindestens 70% des Toxoids in monomerer Form. In einer weiteren Ausführungsform enthält die Zusammensetzung ein protektives Antigen von mindestens einem Erreger, bei dem es sich nicht um Corynebacterium diphtheriae handelt. Beispielsweise kann das protektive Antigen ausgewählt sein aus dem Oberflächenantigen von Hepatitis A Virus (HBsAg), dem Tetanus-Antigen, Pertussis-Antigen, einem Kapselsaccharid von H. influenzae Typ B, einem Kapselsaccharid von N. meningitidis, einem Kapselsaccharid von S. pneumoniae und IPV.
Die Erfindung stellt auch eine Zusammensetzung bereit, die für die Impfung von Menschen geeignet ist und ein Formaldehydvernetztes Diphtherie-Toxoid mit einem isoelektrischen Punkt im Bereich von 4,0 bis 5,0 umfasst, und die frei von Formaldehyd-vernetzten Bestandteilen tierischen Ursprungs ist, wobei mindestens 70% des Toxoids in monomerer Form vorliegen. Die Erfindung stellt ferner eine Zusammensetzung für die Impfung von Menschen bereit, die ein Formaldehyd-gebundenes Diphtherie-Toxoid umfasst, das frei von Formaldehyd-vernetzten Bestandteilen tierischen Ursprungs ist, wobei mindestens 70% des Toxoids monomerer Form vorliegen. Wie oben diskutiert, können diese Bestandteile ein protektives Antigen von mindestens einem Erreger umfassen, bei dem es sich nicht um C. diphtheriae handelt.
In einer spezifischen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, die für die Impfung von Menschen geeignet ist und ein Diphtherie-Toxoid enthält, das frei von Formaldehyd-vernetzten Bestandteilen tierischen Ursprungs ist, und mindestens ein protektives Antigen, bei dem es sich nicht um Corynebacterium diphtheriae handelt. In einer weiteren spezifischen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, die für die Impfung von Menschen geeignet ist, und die ein Diphtherie-Toxoid umfasst, das frei von Formaldehyd-vernetzten Bestandteilen tierischen Ursprungs ist und ein Monomer:Dimer-Verhältnis im Bereich von 3:1 bis 8:1 aufweist, stärker bevorzugt im Bereich von 3:1 bis 6:1, und wobei das Diphtherie-Toxoid einen isoelektrischen Punkt im Bereich von 5,0 bis 4,0 aufweist. In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, die für die Impfung von Menschen geeignet ist, und die ein Diphtherie-Toxoid umfasst, das frei von Formaldehyd-vernetzten Bestandteilen tierischen Ursprungs ist, und wobei mindestens 70% des Diphtherie-Toxoids in monomerer Form vorliegen.
In einer noch weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung zur Verwendung bei der Herstellung eines humanen Impfstoffs bereit, die (i) zwischen 100–250 Lf/ml Diphtherie-Toxoid, das frei von Formaldehyd-vernetzten Bestandteilen tierischen Ursprungs ist, und (ii) zwischen 40–100 Lf/ml Tetanus-Toxoid enthält; wobei das Verhältnis von Diphtherie-Toxoid zu Tetanus-Toxoid in der Zusammensetzung zwischen 2:1 und 3:1 ist. In einer besonderen Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung keine anderen Antigene außer dem Diphtherie-Toxoid und dem Tetanus-Toxoid.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, die für die Impfung von Menschen geeignet ist, und die ein Diphtherie-Toxoid der Erfindung umfasst, das an ein nicht lösliches Aluminiumsalz-Adjuvans gebunden ist (z. B. Aluminiumhydroxid). Beispielsweise stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, die für die Impfung von Menschen geeignet ist, und die ein Diphtherie-Toxoid umfasst, das frei von Formaldehyd-vernetzten Bestandteilen tierischen Ursprungs ist und an ein nicht lösliches Aluminiumsalz-Adjuvans gebunden ist (z. B. Aluminiumhydroxid). In ähnlicher Weise stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, die für die Impfung von Menschen geeignet ist, und die ein Diphtherie-Toxoid umfasst, das aus Corynebacterium diphtheriae aufgereinigt wurde, der in einem Kulturmedium angezüchtet wurde, das frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs ist, und das eine Potenz von mindestens 60 IU/ml aufweist, und das an ein unlösliches Aluminiumsalz-Adjuvans adsorbiert ist (z. B. Aluminiumhydroxid).
Die Diphtherie-Toxoide der Erfindung können als Trägerproteine in Saccharid-Konjugaten verwendet werden. Dementsprechend stellt die Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Konjugat aus einem bakteriellen Saccharid und einem Diphtherie-Toxoid-Trägerprotein bereit, wobei das Diphtherie-Toxoid ein wie oben auf verschiedene Weise beschriebenes Toxoid ist (das z. B. frei von Formaldehyd-vernetzten Bestandteilen tierischen Ursprungs ist).
In einem noch weiteren Aspekt stellt die Erfindung Impfstoffformulierungen bereit, die das erfindungsgemäße Diphtherie-Toxoid umfassen, sowie Zusammensetzung, die dieses enthalten.
In einer spezifischen Ausführungsform stellt die Erfindung einen Kombinationsimpfstoff bereit, der (i) ein Diphtherie-Toxoid umfasst, das frei von Formaldehyd-vernetzten Bestandteilen tierischen Ursprungs ist, und das eine Potenz von mindestens 60 IU/ml aufweist, und (ii) ein protektives Antigen von mindestens einem Erreger, bei dem es sich nicht um Corynebacterium diphtheriae handelt. Das protektive Antigen kann ausgewählt sein aus dem Oberflächenantigen von Hepatitis A Virus (HBsAg), einem Kapselsaccharid von H. influenzae Typ B und einem Kapselsaccharid von N. meningitidis. Vorzugsweise ist das HBsAg frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs. Vorzugsweise ist das Kapselsaccharid von H. influenzae Typ B frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs. Vorzugsweise ist das Kapselsaccharid von N. meningitidis frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs.
Die Erfindung stellt ferner einen Kombinationsimpfstoff bereit, der (i) ein Diphtherie-Toxoid enthält, das durch Formaldehydbehandlung eines Diphtherie-Toxins mit einer Konzentration von mindestens 2000 Lf/ml wie oben beschrieben erhältlich ist, und (ii) ein protektives Antigen von mindestens einem Erreger, bei dem es sich nicht um Corynebacterium diphtheriae handelt, wie es oben beschrieben ist.
Im Allgemeinen stellt die Erfindung auch einen humanen Impfstoff bereit, der ein erfindungsgemäßes Diphtherie-Toxoid umfasst, wobei (i) das Toxoid an ein unlösliches Aluminiumsalz-Adjuvans adsorbiert ist und/oder (ii) der Impfstoff ein protektives Antigen von mindestens einem Erreger umfasst, bei dem es sich nicht um Corynebacterium diphtheriae handelt.
G. Verfahren zur Herstellung von Zusammensetzungen, die für die humane Impfung geeignet sind
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung bereit, die für die Impfung von Menschen geeignet ist, bei dem man Folgendes kombiniert: (i) ein Diphtherie-Toxoid, das frei von Formaldehydvernetzten Bestandteilen tierischen Ursprungs ist; (ii) HBsAg, das frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs ist; (iii) ein Kapselsaccharid von H. influenzae Typ B, das frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs ist; und (iv) ein Kapselsaccharid von N. meningitidis, das frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs ist.
In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines humanen Impfstoffs, bei dem man eine Zusammensetzung, die: (i) zwischen 100–250 Lf/ml Diphtherie-Toxoid, das frei von Formaldehyd-vernetzten Bestandteilen tierischen Ursprungs ist, und (ii) zwischen 40–100 Lf/ml Tetanus-Toxoid, wobei das Verhältnis von Diphtherie-Toxoid zu Tetanus-Toxoid in der Zusammensetzung zwischen 2:1 und 3:1 liegt, umfasst, mit mindestens einer weiteren Antigen-haltigen Zusammensetzung mischt. In einer spezifischen Ausführungsform führt das Verfahren zu einem humanen Impfstoff, der zwischen 20–30 Lf/ml Diphtherie-Toxoid und zwischen 5–15 Lf/ml Tetanus-Toxoid enthält.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung bereit, die für die Impfung von Menschen geeignet ist, bei dem man (i) ein Diphtherie-Toxoid, das aus Corynebacterium diphtheriae gereinigt wurde, der in einem Kulturmedium angezüchtet wurde, das frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs ist; (ii) HBsAg, das frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs ist; (iii) Kapselsaccharid von H. influenzae Typ B, das frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs ist; und (iv) Kapselsaccharid von N. meningitidis, das frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs ist, miteinander kombiniert. Die Zusammensetzung kann ein Diphtherie-Toxoid mit einer Potenz von mindestens 60 IU/ml umfassen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Fermentationsmedium
In einem Aspekt betriff die Erfindung ein Fermentationsmedium, das geeignet ist, einen Stamm von Corynebacterium diphtheriae anzuzüchten, um ein Diphtherie-Toxin oder ein Derivat davon herzustellen. Das Medium sollte eine Stickstoffquelle, eine Kohlenstoffquelle, eine Phosphorquelle und Wachstumsfaktoren enthalten, um das Bakterienwachstum zu fördern. Um die Toxinproduktion des Bakteriums zu fördern, sollte das Medium eine geeignete Eisenquelle umfassen.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das Medium frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs. Dementsprechend sollten alle Bestandteile des Mediums aus nicht-tierischen Quellen hergestellt sein. Die Bestandteile können z. B. aus pflanzlichen Quellen hergestellt sein (z. B. aus Soja), oder sie können synthetisch sein, wobei Bestandteile aus Milch oder Fleisch jedoch nicht verwendet werden.
Stickstoffquelle
Die Stickstoffquelle des erfindungsgemäßen Fermentationsmediums ist vorzugsweise ein Hefeextrakt. Hefeextrakte werden im Allgemeinen mittels salzfreier Autolyse primärer Hefe und anschließender gründlicher Reinigung erhalten, wodurch der Hefeextrakt frei von unerwünschten Bestandteilen wie beispielsweise Sporen und DNA ist.
In einer Ausführungsform weist der Hefeextrakt einen geringen Mannan-Anteil auf. Verfahren zur Herstellung von Hefeextrakten mit geringem Mannan-Anteil sind im Stand der Technik hinreichend bekannt. Beispielsweise kann ein Hefeextrakt mit geringem Mannan-Anteil aus einem Hefestamm hergestellt werden, der reduzierte Mengen von Mannanen exprimiert. Ein Hefestamm, der nur geringe Mengen von Mannan exprimiert (z. B. weniger als 70% der Mengen des Wildtyps) ist teilweise seiner Zellwand-Integrität beraubt, setzt leicht seinen intrazellulären Inhalt frei und ist dementsprechend besonders geeignet, um Hefeextrakte herzustellen, die eine geringe Variation von Charge zu Charge aufweisen. Idealerweise ist der Hefestamm mit geringem Mannan-Anteil in der Lage, in einem flüssigen Medium zu wachsen, so dass er für die Herstellung von Hefeextrakt im industriellen Maßstab geeignet ist. Ein solcher Hefestamm kann ein Hefestamm sein, bei dem ein oder mehrere Gene mutiert wurden, die für die Mannan-Expression benötigt werden. Alternativ dazu kann ein natürlich vorkommender Hefestamm, der geringe Mengen an Mannan exprimiert, für die Herstellung des Hefeextrakts verwendet werden. Beispiele für Hefestämme mit einer Zellwand, die einen geringen Mannangehalt aufweist, und Verfahren zu deren Herstellung werden in Literaturstelle 9 und 10 offenbart. Insbesondere können natürlich vorkommende oder chemisch oder physikalisch mutierte Hefestämme mittels Gramfärbung auf einen geringen Mannangehalt in der Zellwand untersucht werden. Grampositive Stämme, die auch bei einer Elektronenmikroskopuntersuchung eine geringe Elektronendichte in der äußeren Schicht der Zellwand aufweisen, werden wahrscheinlich einen geringen Mannangehalt haben. Der Mannangehalt kann durch chemische Analyse bestimmt werden. Alternativ dazu kann der geringe Mannangehalt der Zellwand der Hefe mit Mannan-spezifischen Antikörpern oder mit Lektinen wie Concanavalin A bestätigt werden.
In einer anderen Ausführungsform ist der Hefeextrakt ein ultrafiltrierter Hefeextrakt, z. B. das Produkt einer Ultrafiltration von unbehandeltem Hefeextrakt. Beispielsweise kann während der Herstellung des Hefeextrakts ein Ultrafiltrationsschritt enthalten sein, oder ein bereits vorhandener Hefeextrakt kann einer Ultrafiltration unterzogen werden bevor er zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Fermentationsmediums verwendet wird. In einer besonderen Ausführungsform wird die Ultrafiltration verwendet, um alle Bestandteile mit einem Molekulargewicht von größer als 30 kDa zu entfernen. Durch das Entfernen von Bestandteilen mit einem hohen Molekulargewicht aus dem Hefeextrakt werden Sporen sowie Proteine und DNA, die nicht ausreichend hydrolysiert wurden, entfernt, wodurch die Variation von Charge zu Charge zwischen den verschiedenen Hefeextrakt-Herstellungen minimiert und ein reproduzierbarer Herstellungsprozess garantiert wird.
In einer weiteren Ausführungsform wird der Hefeextrakt an Eisen entreichert. Wie unten beschrieben inhibieren hohe Eisenkonzentrationen die Expression des Diphtherie-Toxins während des Wachstums von Corynebacterium diphtheriae. Verfahren zur Entreicherung eines Hefeextrakts an Eisen sind dem Fachmann hinreichend bekannt. Beispielsweise kann das in Stainer & Scholte [11] beschriebene Verfahren verwendet werden, um Eisen aus dem Hefeextrakt vor seiner Verwendung im Fermentationsmedium zu präzipitieren. Die Präzipitation von Eisen kann durch Lösen von Hefeextrakt in Wasser, Einstellen des pH-Werts auf 9,3, Zugabe von Na₂HPO₄ und KH₂PO₄ zur Hefeextrakt-Lösung, Erhitzen der Lösung auf 85°C und Zugabe von CaCl₂ erreicht werden. Die Ablagerung bildet sich dann durch langsames Abkühlen der Lösung. Besonders gute Resultate wurden erzielt, indem man den Hefeextrakt in Wasser löst, den pH-Wert auf 9,3 einstellt, die Lösung auf 60°C erhitzt, Na₂HPO₄ und KH₂PO₄ zu der Hefeextraktlösung gibt, die Lösung weiter auf 79°C erhitzt, CaCl₂ zugibt, erneut auf 85°C erhitzt und die Lösung anschließend auf 25°C über einen Zeitraum von 3 Stunden abkühlt, um die Eisen-Präzipitation zu erlauben. Das Präzipitat kann z. B. durch Filtration oder Zentrifugation entfernt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Ultrafiltration und das Entreichern des Hefeextrakts an Eisen miteinander kombiniert. Es hat sich herausgestellt, das die Kombination von Ultrafiltration und Entreichern des Hefeextrakts an Eisen vor Zugabe von Wachstumsfaktoren und einem Eisenzusatz zu einem Fermentationsmedium führte, dass ungefähr 200 Lf/ml oder mehr Diphtherie-Toxin ergab, wenn dieses zum Anzüchten von C. diphtheriae verwendet wurde.
In einem anderen bevorzugten Aspekt ist der Hefeextrakt die alleinige Quelle für alle essentiellen Aminosäuren im Fermentationsmedium. Während einige Aminosäuren wie z. B. β-Alanin oder L-Cystein getrennt voneinander als Teil der Wachstumsfaktoren hinzugefügt werden können, kann der Hefeextrakt alle Aminosäuren bereitstellen, die für das Wachstum von C. diphtheriae benötigt werden und vermindert so die Anzahl von Bestandteilen, die für die Herstellung des Fermentationsmediums verwendet werden sowie die Gesamtkosten für die Bereitstellung eines chemisch definierten Mediums.
In einer noch weiteren Ausführungsform kann anstelle der Verwendung von Hefeextrakt die Stickstoffquelle des Fermentationsmediums ausgewählt werden aus einem Reis-Weizen-Pepton, einem Reispepton, einem Weizenpepton, einem Sojapepton, einem Baumwollpepton, einem Bohnenpepton und einem Tomatenpepton. In einigen Ausführungsformen umfasst das Fermentationsmedium jedoch kein Sojapepton.
Kohlenstoffquelle
Es wurden unterschiedliche Kohlenstoffquellen zur Anzüchtung von C. diphtheriae verwendet, einschließlich Glucose und Glycerol. Die Zugabe einer separaten Kohlenstoffquelle ist nicht unbedingt erforderlich, wenn eine Kohlenstoff-enthaltende Stickstoffquelle verwendet wird (C. diphtheriae kann Kohlenstoff von Aminosäuren assimilieren), jedoch sind die Wachstumsraten während der Fermentation wesentlich höher, wenn eine zusätzliche Kohlenstoffquelle anwesend ist.
Im Allgemeinen ist die Ausbeute an Toxin, die während der Kultivierung erhalten werden kann, umso größer, je höher die Konzentration der Kohlenstoffquelle ist. Dennoch können hohe Konzentrationen von Monosacchariden wie Glucose aufgrund der erhöhten Osmolarität des Mediums Probleme verursachen. Um größtmögliche Mengen einer Kohlenstoffquelle für ein optimales Wachstum von C. diphtheriae unter Fermentationsbedingungen bereitzustellen wird deshalb die Verwendung eines Disaccharids im Fermentationsmedium bevorzugt.
In einer Ausführungsform umfasst das Fermentationsmedium mindestens 0,08 M eines Disaccharids als Kohlenstoffquelle. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Fermentationsmedium zwischen 0,08 und 0,16 M eines Disaccharids als Kohlenstoffquelle. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Fermentationsmedium zwischen 0,1 und 0,15 M eines Disaccharids als Kohlenstoffquelle. In einer spezifischen Ausführungsform ist die Konzentration des Disaccharids in dem erfindungsgemäßen Fermentationsmedium etwa 0,15 M.
Verschiedene Disaccharide können im Fermentationsmedium und im Verfahren zur Herstellung des Fermentationsmediums verwendet werden. Geeignete Disaccharide umfassen Saccharose, Lactulose, Maltose, Trehalose und Cellobiose. In einer spezifischen Ausführungsform ist das Disaccharid des Fermentationsmediums ein reduzierendes Disaccharid, wie Cellobiose oder Maltose. In einer spezifischen Ausführungsform ist das Disaccharid Maltose.
Hervorragende Ausbeuten an Toxin wurden erhalten, wenn C. diphtheriae in einem Fermentationsmedium angezüchtet wurde, das mit 50 g/L Maltose supplementiert war.
Phosphor
Phosphor in Form von Phosphat ist ein wichtiger Bestandteil vieler Biomoleküle. Beispielsweise enthalten DNA, RNA und die Phospholipide, die die Zellmembran bilden, Phosphat. Deshalb ist Phosphor ein wichtiger Bestandteil des erfindungsgemäßen Fermentationsmediums. Wenn Hefeextrakt als Stickstoffquelle verwendet wird, ist die Zugabe von Phosphor zu dem Fermentationsmedium eigentlich nicht notwendig, weil Hefeextrakt genügend Quellen von Phosphat in Form von z. B. Nukleotiden oder Phospholipiden enthält.
Wachstumsfaktoren
Während des schnellen Wachstums von C. diphtheriae im Fermenter können bestimmte Bestandteile der Fermentation für das Wachstum limitierend werden. Durch Zusatz dieser Bestandteile zum Fermentationsmedium kann die Ausbeute an Diphtherie-Toxin weiter verbessert werden. Deshalb werden diese Bestandteile allgemein als ”Wachstumsfaktoren” bezeichnet.
Geeignete Wachstumsfaktoren umfassen Magnesium, Kupfer, Zink, Mangan, Pimelinsäure, Nikotinsäure und β-Alanin. In einigen Ausführungsformen wird das Magnesium in Form von MgSO₄·7H₂O bereitgestellt, Kupfer wird in Form von CuSO₄·5H₂O bereitgestellt, Zink wird in Form von ZnSO₄·7H₂O bereitgestellt, und Mangan wird in Form von MnCl₂·4H₂O bereitgestellt.
Eisenquelle
Hohe Eisenkonzentrationen in einem Kulturmedium inhibieren die Expression des Diphtherie-Toxins während des Wachstums vom C. diphtheriae. Deshalb ist das Entfernen von überschüssigem Eisen aus dem Medium notwendig, um eine Toxinproduktion mit hoher Ausbeute während der Fermentation von C. diphtheriae zu erreichen. Verfahren zur Entreicherung des Kulturmediums an Eisen sind dem Fachmann, hinreichend bekannt, z. B. wie es in Stainer & Scholte beschrieben wird [11].
Wenn der Gehalt an Eisen zu gering ist, wird das Wachstum von C. diphtheriae jedoch negativ beeinflusst. Nach der Entreicherung an Eisen sollte ein Fermentationsmedium deshalb immer noch eine Eisenquelle während des Wachstums bereitstellen, aber nicht in Mengen, die die Produktion des Diphtherie-Toxins verhindern. Die Hauptquelle von Eisen in dem Fermentationsmedium kann aus dem Material stammen, das als Stickstoffquelle verwendet wird und üblicherweise tierischen Ursprungs ist. Wenn ein Hefeextrakt als Stickstoffquelle verwendet wird, kann er an Eisen entreichert sein, um die Eisenkonzentration auf eine Menge zu verringern, die eine Produktion von Diphtherie-Toxin mit hoher Ausbeute während der Fermentation ermöglicht. Wenn der Eisengehalt jedoch so niedrig ist, dass das bakterielle Wachstum inhibiert wird (z. B. nach einer vollständigen Entreicherung), dann muss dem Fermentationsmedium Eisen zugesetzt werden, um das Wachstum von C. diphtheriae zu unterstützen.
In einer Ausführungsform umfasst das Fermentationsmedium ein Salz von Fe(III). Ein Beispiel für ein Salz von Fe(III) ist Ammonium-Eisen-Citrat (ammonium ferric citrate). In einem anderen Aspekt umfasst das Fermentationsmedium ein Salz von Fe(II). Ein Beispiel für ein Salz von Fe(II) ist Eisensulfat-Heptahydrat. In einer Ausführungsform ist die anfängliche Fe(II)- oder Fe(III)-Konzentration in dem Fermentationsmedium zwischen 1,5 μM und 30 μM. In einer anderen Ausführungsform ist die anfängliche Fe(II)- oder Fe(III)-Konzentration in dem Fermentationsmedium zwischen 3–15 μM. In einer noch weiteren Ausführungsform ist die anfängliche Fe(II)- oder Fe(III)-Konzentration in dem Fermentationsmedium zwischen 5–13 μM. In einer spezifischen Ausführungsform ist die anfängliche Fe(II)- oder Fe(III)-Konzentration in dem Fermentationsmedium zwischen 10–14 μM.
Um das Vorhandensein einer ausreichenden Menge an Eisen während des Fermentationsprozesses zu gewährleisten, ohne dass Konzentrationen erreicht werden, die die Toxinproduktion inhibieren, wird normalerweise ein Eisenzusatz als Formulierung mit verzögerter Freisetzung (slow-release formulation) zugegeben. Dementsprechend wird dem Fermentationsmedium in einer spezifischen Ausführungsform eine Eisen-Formulierung mit verzögerter Freisetzung zugesetzt. Eine Eisenformulierung mit verzögerter Freisetzung als Zusatz zu dem Fermentationsmedium kann hergestellt werden, indem man dem Fermentationsmedium vor dessen Verwendung eine Ammonium-Eisen-Citratlösung und eine Phosphatlösung zugibt und das Eisen durch Zugabe einer Kalziumchlorid-Lösung präzipitiert. Dies führt zur Bildung eines gelartigen Präzipitats, das während des Fermentationsprozesses langsam Eisen in das Fermentationsmedium ausscheidet. Andere Möglichkeiten, um eine Eisenformulierung mit verzögerter Freisetzung zu gewinnen, sind dem Fachmann hinreichend bekannt und werden von der Erfindung eingeschlossen.
Arten von Medium
Fermentationsmedien können als flüssiges Medium hergestellt oder als festes Medium werden. Alternative dazu kann das Fermentationsmedium als getrockneter Pulver hergestellt werden. In einer Ausführungsform kann festes Medium hergestellt werden, indem man Agar zu einem flüssigen Medium zugefügt. Ein erfindungsgemäß hergestelltes festes Medium kann besonders nützlich bei der Herstellung einer Stammsaatkulturbank von C. diphtheriae sein. Die Stammsaatkultur kann zur Herstellung einer Arbeitssaatkultur verwendet werden. Die Arbeitssaatkultur kann wiederum zur Inokulation des erfindungsgemäßen Fermentationsmediums verwendet werden, um große Mengen an C. diphtheriae bei der Herstellung von Diphtherie-Toxin zur Verwendung in Impfstoffen zu erhalten.
Medienzubereitung
In einem Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Fermentationsmediums. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Fermentationsmediums die Zugabe einer Stickstoffquelle und einer Kohlenstoffquelle zu Wasser (oder einer anderen wässrigen Flüssigkeit). Abhängig vom Eisengehalt der als Stickstoffquelle verwendeten Materialien kann das Verfahren auch die Zugabe eines Eisenzusatzes umfassen. Ferner kann das Verfahren die Zugabe von Wachstumsfaktoren und Phosphor umfassen.
In einer anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Fermentationsmediums das Lösen eines Hefeextrakts in Wasser, das Entreichern des Hefeextrakts an Eisen und die Zugabe eines Disaccharids in einer finalen Konzentration von mindestens 0,08 M (siehe oben).
In einer noch anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Fermentationsmediums, bei dem man einen Hefeextrakt in Wasser löst, den Hefeextrakt an Eisen entreichert und ein Salz von Fe(II) oder Fe(III) zugibt. Das Salz von Fe(II) oder Fe(III) kann so zugegeben werden, dass sich eine Eisenformulierung mit verzögerter Freisetzung bildet (siehe oben).
In einer weiteren Ausführungsform kann ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Fermentationsmediums einen Ultrafiltrationsschritt eines Hefeextrakts umfassen.
In einer noch weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Fermentationsmediums, bei dem man einen Hefeextrakt mit geringem Mannan-Anteil herstellt und den Hefeextrakt in Wasser löst.
Jedes der oben beschriebenen Verfahren kann miteinander kombiniert werden, um das erfindungsgemäße Fermentationsmedium herzustellen. Beispielsweise kann das Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Fermentationsmediums neben dem Lösen des Hefeextrakts in Wasser, dem Entreichern des Hefeextrakts an Eisen und der Zugabe von zwischen 0,08 M und 0,16 M eines Disaccharids zusätzlich auch einen oder mehrere Ultrafiltrationsschritte umfassen. Alternativ oder zusätzlich dazu kann dem Fermentationsmedium vor seiner Verwendung ein Salz von Fe(II) oder Fe(III) zugegeben werden.
Verwendungen der Medien
Die Fermentationsmedien können in einem Verfahren zum Anzüchten von C. diphtheriae verwendet werden, bei dem man einen Stamm von C. diphtheriae in einem erfindungsgemäßen Fermentationsmedium kultiviert.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren zum Anzüchten von C. diphtheriae die Inokulation des erfindungsgemäßen Fermentationsmediums mit einer Arbeitssaatkultur, die frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs ist und ohne die Verwendung von Bestandteilen tierischen Ursprungs hergestellt wurde. In der am stärksten bevorzugten Ausführungsform wird der gesamte Prozess von der Erzeugung einer Stammsaatkulturbank über die Herstellung einer Arbeitssaatkultur bis zum Anzüchten von C. diphtheriae im Fermentationsmedium in Abwesenheit von Bestandteilen tierischen Ursprungs durchgeführt. In einer anderen Ausführungsform wurden die Stammsaatkulturbank und die Arbeitssaatkultur durch herkömmliche Verfahren unter Verwendung eines Fermentationsmedium hergestellt, das Bestandteile tierischen Ursprungs enthält, wobei jedoch die Fermentation von C. diphtheriae in einem Medium durchgeführt wird, das frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs ist.
C. diphtheriae wird unter aeroben Bedingungen kultiviert. Eine ausreichende Belüftung ist wichtig, um hohe Wachstumsraten zu erzielen. Eine ausreichende Belüftung wird z. B. durch Bewegen bei 580 bis 620 UpM in einem 300 L Vortex-Fermenter erreicht. Druckluft kann dem Fermenter mit einer Rate von 60 L/min zugefügt werden. Ein Antischaummittel, wie beispielsweise ein aktives Silikon-Polymer (z. B. Antischaum A), kann zugefügt werden, um die durch die Bewegung verursachte Schaumbildung zu verhindern.
Die industrielle Fermentation von C. diphtheriae hat in der Vergangenheit keine hohen Ausbeuten an Diphtherie-Toxin hervorgebracht, wenn ein Fermentationsmedium verwendet wurde, das Bestandteile tierischen Ursprungs enthielt. Literaturstelle 3 offenbart, dass das Anzüchten von C. diphtheriae in 100 mL eines Fermentationsmediums, das frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs war und Hefeextrakt als Stickstoffquelle umfasste, nur 60 Lf/ml Diphtherie-Toxin erbrachte. Literaturstelle 4 züchtete C. diphtheriae in 240 L eines Fermentationsmediums, das frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs war und Hefeextrakt sowie alle 20 essentiellen Aminosäuren als Stickstoffquelle umfasste und maximal nur 100 Lf/ml Diphtherie-Toxin erbrachte. In Literaturstelle 5 erbrachten 200 mL eines Fermentationsmediums, das frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs war und Reis-Weizen-Pepton als hauptsächliche Stickstoffquelle enthielt, nicht mehr als 118 Lf/ml Diphtherie-Toxin. Wenn Hefeextrakt anstelle von Reis-Weizen-Pepton verwendet wurde, war die Konzentration mit 59 Lf/ml sogar noch geringer.
Im Gegensatz dazu ist das erfindungsgemäße Fermentationsmedium besonders zum Anzüchten von C. diphtheriae geeignet, um eine Konzentration des Diphtherie-Toxins (oder eines Derivats) von mindestens 140 Lf/ml zu erhalten. Es können routinemäßig Toxinkonzentration von mindestens 200 Lf/ml erzielt werden. In einigen Ausführungsformen übersteigt die Konzentration des Diphtherie-Toxins oder des Derivats im Fermentationsmedium 200 Lf/ml und ist gleich oder größer als 250 Lf/ml.
Demzufolge betrifft die Erfindung in einem Aspekt auch ein Verfahren zur Herstellung von Diphtherie-Toxin oder eines Derivats davon im industriellen Maßstab und in hoher Ausbeute. Ein solches Verfahren umfasst die Kultivierung eines Stamms von C. diphtheriae in 100 L oder mehr eines Fermentationsmediums, das frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs ist, das Anzüchten der Kultur um eine Konzentration des Toxins (oder des Derivats) von mindestens 140 Lf/ml in dem Fermentationsmedium bereitzustellen, und die Abtrennung des Diphtherie-Toxins oder des Derivats vom Fermentationsmedium. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein solches Verfahren für die Herstellung eines Diphtherie-Toxins verwendet, das für die Produktion humaner Impfstoffe geeignet ist. In einer anderen Ausführungsform wird das Verfahren zur Herstellung eines Derivats des Diphtherie-Toxins, z. B. einer Mutante des Diphtherie-Toxins wie z. B. CRM197 verwendet.
In einigen Ausführungsformen werden erfindungsgemäß Volumen von mindestens 100 L des Fermentationsmediums verwendet. Zum Beispiel kann das Volumen des Fermentationsmediums mindestens 200 L, mindestens 250 L, mindestens 300 L, mindestens 500 L oder mindestens 600 L betragen. Diese Volumen im industriellen Maßstab sind für die Produktion humaner Impfstoffe geeignet.
In einer besonderen Ausführungsform erbringt das erfindungsgemäße Verfahren eine Konzentration von mindestens 140 Lf/ml des Diphtherie-Toxins oder des Derivats in dem Fermentationsmedium. Beispielsweise kann ein Verfahren der Erfindung eine Konzentration von mindestens 150 Lf/ml, von mindestens 200 Lf/ml, oder von mindestens 250 Lf/ml des Diphtherie-Toxins oder des Derivats in dem Fermentationsmedium ergeben.
In einer speziellen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Diphtherie-Toxins oder eines Derivats davon, bei dem man einen Stamm von Corynebacterium diphtheriae, der ein Diphtherie-Toxin oder ein Derivat davon exprimiert, in dem erfindungsgemäßen Fermentationsmedium anzüchtet und das Diphtherie-Toxin oder Derivat von dem Fermentationsmedium abtrennt.
In einer spezifischen Ausführungsform kann das Abtrennung der Bakterien von dem Fermentationsmedium, welches das Diphtherie-Toxin oder das Derivat umfasst, mittels Zentrifugation erreicht werden. In einer anderen Ausführungsform kann die Trennung der Bakterien von dem Fermentationsmedium, welches das Diphtherie-Toxin oder das Derivat umfasst, durch Filtration erreicht werden. Beispielsweise kann das Fermentationsmedium, welches das Diphtherie-Toxin oder das Derivat enthält, durch Filtration sterilisiert werden. In einigen Ausführungsformen werden Zentrifugation und Filtration kombiniert angewendet, um die Bakterien von dem Fermentationsmedium, welches das Diphtherie-Toxin oder Derivat davon enthält, abzutrennen. In einer besonderen Ausführungsform wird die Trennung mittels Zentrifugation vor Filtersterilisation des Fermentationsmediums, welches das Diphtherie-Toxin oder das Derivat enthält, durchgeführt. In einer Ausführungsform ist der für die Filtersterilisation verwendete Filter nicht in der Lage, Fasern freizusetzen. In einer anderen Ausführungsform umfasst der zur Filtersterilisation verwendete Filter eine Membran mit einer Porengröße, die 0,22 μm oder weniger entspricht. In einer weiteren Ausführungsform wird ein Konservierungsmittel, bei dem es sich nicht um Phenol handelt, zu dem filtersterilisierten Fermentationsmedium, welches das Diphtherie-Toxin oder das Derivat enthält, gegeben. In einer bevorzugten Ausführungsform wird dem Fermentationsmedium, welches das Diphtherie-Toxin oder das Derivat enthält, kein Konservierungsmittel zugegeben.
Toxin-Aufreinigung
In einem spezifischen Aspekt der Erfindung wird das zur Herstellung des Diphtherie-Toxoids verwendete Diphtherie-Toxin vor dem Detoxifizierungsschritt aufgereinigt. Die Reinigung des Diphtherie-Toxins vor der Toxoid-Bildung verringert die Vernetzung von Bestandteilen, die aus dem Fermentationsmedium erhalten werden (z. B. Proteine und/oder Peptide), mit dem Diphtherie-Toxin während der Behandlung mit Formaldehyd. Die Vernetzung von Bestandteilen des Mediums ist unvorteilhaft, weil dies zu einem weniger homogenen Produkt führt, was zu Problemen während der Qualitätskontrolle führen kann, und weil auch die Möglichkeit besteht, dass Allergene in das Toxoid eingeschlossen werden. Die Aufreinigung des Diphtherie-Toxins vor der Detoxifizierung verringert oder beseitigt diese Nachteile. Die Vermeidung von Bestandteilen tierischen Ursprungs im Fermentationsmedium kombiniert mit der Aufreinigung vor der Detoxifizierung führt zu einem wirksamen Toxoid mit sehr hoher Reinheit. Selbst wenn eine Aufreinigung vor der Detoxifizierung vorgenommen wurde [8], werden immer noch Restbestandteile tierischen Ursprungs im Fermentationsmedium von C. diphtheriae während der Toxoid-Bildung mit dem Toxin vernetzt, selbst wenn solche vernetzten Materialien mittels herkömmlicher analytischer Assays nicht leicht zu entdecken sind.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist das für Herstellung des Diphtherie-Toxoids verwendete Diphtherie-Toxin zu mindestens 85% rein. In einer spezifischen Ausführungsform ist das für die Herstellung des Diphtherie-Toxoids verwendete Diphtherie-Toxin zu mindestens 90% rein. In einer weiteren spezifischen Ausführungsform ist das für Herstellung des Diphtherie-Toxoids verwendete Diphtherie-Toxin zu mindestens 95% rein.
In einer Ausführungsform hat das für die Herstellung des erfindungsgemäßen Diphtherie-Toxoids verwendete Diphtherie-Toxin eine Reinheit von mehr als 1500 Lf/mg Stickstoff. In einer besonderen Ausführungsform hat das für die Herstellung des Diphtherie-Toxoids verwendete Diphtherie-Toxin eine Reinheit von mehr als 2000 Lf/mg Stickstoff. In einer weiteren spezifischen Ausführungsform hat das für Herstellung des Diphtherie-Toxoids verwendete Diphtherie-Toxin eine Reinheit von mehr als 2100 Lf/mg Stickstoff. In einer weiteren spezifischen Ausführungsform hat das für Herstellung des Diphtherie-Toxoids verwendete Diphtherie-Toxin eine Reinheit von mehr als 2700 Lf/mg Stickstoff.
Das Diphtherie-Toxin oder Derivat kann auf unterschiedliche dem Fachmann bekannte Arten aus dem Fermentationsmedium aufgereinigt werden. In einer Ausführungsform wird die Aufreinigung mittels eines Verfahrens durchgeführt, das eine Ammoniumsulfat-Präzipitation umfasst. In einer besonderen Ausführungsform wird die Aufreinigung des Diphtherie-Toxins oder Derivats aus dem Fermentationsmedium mittels eines Verfahrens durchgeführt, das eine Anionen-Austausch-Chromatographie umfasst, im Idealfall ohne weitere nachgeschaltete Chromatographieschritte. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Aufreinigungsverfahren einen oder mehrere Ultrafiltrationsschritte.
In einem weiteren Aspekt wird das nach der Aufreinigung erhaltene Bulk-Diphtherie-Toxin filtersterilisiert und mittels Diafiltration konzentriert. Diese Schritte ermöglichen eine Lagerung des Bulk-Diphtherie-Toxins vor der Detoxifizierung ohne Degradation aufgrund von mikrobieller Verunreinigung und Verlust der Aktivität. Die Konzentrierung des Bulk-Materials hat den zusätzlichen Vorteil, dass weniger Kaltlagerplatz benötigt werden, was zu Energieeinsparungen führt.
Diphtherie-Toxin und Derivate davon
Die vorliegende Erfindung ist durch einen Verweis auf ”Diphtherie-Toxin oder ein Derivat davon” definiert. Diese Derivate sind immunologisch kreuzreaktiv mit Diphtherie-Toxin, d. h. wenn es an ein Meerschweinchen verabreicht wird, erzeugt das Derivat Antikörper, die mit dem Diphtherie-Toxin kreuzreagieren. Viele dieser Derivate sind im Stand der Technik bekannt und werden oft als nummerierte ”CRM”-Proteine bezeichnet (cross-reactive material; kreuzreagierendes Material), z. B. CRM9, CRM45, CRM102, CRM103, CRM107 [6]. Üblicherweise sind diese Derivate Mutanten von Diphtherie-Toxin, die sich vom Wildtyp-Toxin lediglich durch ein paar (z. B. 1, 2, 3, 4, oder 5) Aminosäure-Mutationen unterscheiden (Insertionen von einzelnen Aminosäuren, Substitutionen oder Deletionen), wobei allerdings auch Trunkierungsmutanten sind bekannt sind (z. B. CRM45). Diese Mutationen können in der A- und/oder B-Untereinheit des reifen Toxins sein (die A-Untereinheit ist für die enzymatische Aktivität des Toxins verantwortlich, wobei die B-Untereinheit für die Bindung an die Ziel-Wirtszellen verantwortlich ist).
Soweit die Erfindung ein Diphtherie-Toxin betrifft, ist das bevorzugte Derivat CRM197 [12, 13], bei dem der Wildtyp-Rest Gly-52 in der A-Untereinheit durch Glutamat ersetzt wird, was zu einem Verlust der Aktivität der NAD:EF2-ADP-Ribosyltransferase des Toxins führt. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Erfindung allerdings eher für die Herstellung eines Diphtherie-Toxins verwendet (was anschließend zum Toxoid umgewandelt werden kann) als für die Herstellung eines Derivats des Diphtherie-Toxins, so dass insoweit die Bezugnahme auf Derivate des Diphtherie-Toxins zu ignorieren wäre.
Detoxifizierung
In einem Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Detoxifizierung eines Diphtherie-Toxins zur Herstellung eines Diphtherie-Toxoids. In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Diphtherie-Toxoids bereit, bei dem man (i) eine Kultur von einem Stamm von C. diphtheriae, der ein Diphtherie-Toxin exprimiert, in einem Fermentationsmedium anzüchtet, das frei ist von Bestandteilen tierischen Ursprungs, (ii) das Diphtherie-Toxin aus dem Fermentationsmedium aufreinigt, um ein gereinigtes Diphtherie-Toxin zu erhalten, (iii) Formaldehyd zu dem gereinigten Diphtherie-Toxin gibt, und (iv) das gereinigte Diphtherie-Toxin in Anwesenheit von Formaldehyd inkubiert, um das Diphtherie-Toxoid zu erhalten.
Nicht-toxische Derivate des Diphtherie-Toxins (z. B. CRM197) können ebenfalls einer ”Detoxifizierung” unterzogen werden, obwohl unter solchen Umständen die Vernetzung mit Formaldehyd im Allgemeinen der Stabilisierung des Proteins dienen soll und nicht der Entfernung einer toxischen Aktivität.
In einer Ausführungsform umfasst das Fermentationsmedium Hefeextrakt. In einer spezifischen Ausführungsform ist der Hefeextrakt die einzige Quelle für alle essentiellen Aminosäuren. In einer weiteren Ausführungsform ist das Fermentationsmedium das erfindungsgemäße Fermentationsmedium.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Diphtherie-Toxoids, bei dem man (i) einen Stamm von C. diphtheriae, der ein Diphtherie-Toxin oder ein Derivat davon exprimiert, in einem Fermentationsmedium anzüchtet, (ii) das Diphtherie-Toxin oder das Derivat von dem Fermentationsmedium abtrennt, um eine Diphtherie-Toxin-Lösung zu erhalten, (iii) ein Diphtherie-Toxin-Konzentrat aus der Diphtherie-Toxin-Lösung herstellt, (iv) ein Amid oder Formaldehyd zu dem Konzentrat gibt, und (v) das Konzentrat in Gegenwart eines Amids oder Formaldehyd inkubiert, um das Diphtherie-Toxoid zu erhalten.
Toxin-Konzentration
Die Konzentration des Diphtherie-Toxins oder des Derivats während der Detoxifizierung ist von besonderer Bedeutung, um ein zielgerichtetes und effizientes, industrielles Verfahren bereitzustellen, das große Mengen an Diphtherie-Toxoid für die Impfstoff-Herstellung produziert. Aus Sicherheitsgründen wird die Detoxifizierung mit Formaldehyd im Allgemeinen über einen Zeitraum von 6 Wochen durchgeführt. Durch die großen Volumina während der Detoxifizierung wird zusätzlicher Lagerraum benötigt. Darüber hinaus wird die Detoxifizierung bei 36 ± 2°C in einem Inkubator durchgeführt. Dadurch wird bei Verwendung kleinerer Volumina die während der Detoxifizierung verwendete Energie dramatisch reduziert. Je höher die Konzentration des Diphtherie-Toxins oder des Derivats während des Detoxifizierungsschritts ist, desto kleiner kann das für die Detoxifizierung verwendete Volumen sein. Eine 20-fache Verringerung des Volumens aufgrund einer Aufkonzentrierung bedeutet, dass das Diphtherie-Toxin oder das Derivat aus einem 300 L Inkubator leicht in einer 20 L Flasche behandelt werden kann. Dementsprechend wird das nach der Aufreinigung erhaltene, gereinigte Bulk-Diphtherie-Toxin vorzugsweise vor der Detoxifizierung aufkonzentriert.
In einer Ausführungsform ist die Konzentration des Diphtherie-Toxins oder des Derivats in dem Konzentrat mindestens 20-mal höher als die Konzentration des Diphtherie-Toxins oder des Derivats in dem finalen Fermentationsmedium. In einer anderen Ausführungsform ist die Konzentration mindestens 25-mal höher, z. B. mindestens 30-mal höher oder mindestens 35-mal höher.
In einer besonderen Ausführungsform ist die Konzentration des Diphtherie-Toxins oder des Derivats in dem detoxifizierten Konzentrat mindestens 2000 LF/ml. In einer weiteren spezifischen Ausführungsform ist die Konzentration mindestens 3000 Lf/ml. In einer besonderen Ausführungsform beträgt die Konzentration mindestens 5000 Lf/ml.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Ausgangsmaterial des Detoxifizierungsverfahrens (d. h. das Diphtherie-Toxin oder das Derivat davon) erhalten, indem man eine Kultur von einem Stamm von Corynebacterium diphtheriae, der ein Diphtherie-Toxin exprimiert, in einem Fermentationsmedium anzüchtet, das frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs ist, und das z. B. Hefeextrakt umfasst (wie das erfindungsgemäße Fermentationsmedium).
Amid-Konzentration
Die Einbeziehung eines Amids während der Detoxifizierung mit Formaldehyd kann die Vernetzung des Diphtherie-Toxins, bei der multimere Komplexe entstehen, verhindern. Dennoch benötigen höhere Konzentrationen eines Amids im Allgemeinen auch höhere Konzentrationen an Formaldehyd. Aufgrund der Toxizität von Formaldehyd werden geringere Konzentrationen des Amids während der Toxoid-Bildung bevorzugt, da dies zur Verwendung von weniger Formaldehyd führt und damit zu weniger giftigen Abfall während der Impfstoff-Herstellung.
In einer Ausführungsform beträgt die für die Detoxifizierung zugegebene Konzentration des Amids nicht mehr als 0,1 M. In einer weiteren Ausführungsform beträgt die Konzentration nicht mehr als 0,05 M. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegt die für die Detoxifizierung verwendete Konzentration des Amids im Bereich von 0,025 M und 0,1 M. In einer spezifischen Ausführungsform beträgt die Konzentration 0,025 M.
In einer besonderen Ausführungsform ist das Amid eine Aminosäure wie Glycin oder Lysin. Vorzugsweise ist es Lysin.
Es wurde herausgefunden, dass die Verwendung von 0,025 M Lysin in Kombination mit 1% Formaldehyd die Bildung von multimeren Komplexen verringert und zu einer besonders bevorzugten Diphtherie-Toxoid-Zusammensetzung führt, in der die überwiegende Menge des Diphtherie-Toxoids in monomerer Form vorliegt.
Formaldehyd-Konzentration
Um Nebenwirkungen aufgrund der Toxizität des Diphtherie-Toxins während der Impfung zu vermeiden, wird die Toxizität zerstört, z. B. durch Inkubation des Diphtherie-Toxin-Konzentrats in Gegenwart von Formaldehyd. Wenn zu hohe Konzentrationen an Formaldehyd verwendet werden, kann der mit dem Bulk-Diphtherie-Toxoid hergestellte finale Impfstoff Formaldehyd-Mengen aufweisen, die für die Verwendung bei Menschen nicht akzeptabel sind. Deshalb sind nur spezifische Bereiche der Formaldehyd-Konzentration für die Herstellung des Bulk-Diphtherie-Toxoids, welches für die Verwendung bei der Herstellung von humanem Impfstoff geeignet ist, akzeptabel. In einer Ausführungsform ist die für die Detoxifizierung verwendete Konzentration an Formaldehyd im Bereich von 0,5% und 1%. In einer anderen Ausführungsform ist die Konzentration im Bereich von 0,75% und 1%. In einer spezifischen Ausführungsform ist die finale Konzentration an Formaldehyd etwa 1%.
Es wurde herausgefunden, dass 1% Formaldehyd ausreicht, um die Toxizität des Diphtherie-Toxins bei einer Konzentration von mindestens 2000 Lf/mL zu zerstören. Selbst bei Konzentrationen von 5000 Lf/mL Diphtherie-Toxin wurde keine erneute Toxifizierung nach 6 Wochen Lagerung bei 37°C beobachtet.
Basierend auf diesen Ergebnissen können die Amid-Konzentrationen pro Lf Diphtherie-Toxin und die Formaldehyd-Konzentrationen pro Lf Diphtherie-Toxin errechnet werden. In einer spezifischeren Ausführungsform bezieht sich daher die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung eines Diphtherie-Toxoids, bei dem man eine Lösung eines Diphtherie-Toxins bei einer Konzentration von mindestens 2000 Lf/ml herstellt; nicht mehr als 5 nmol eines Amids pro Lf des Diphtherie-Toxins und zwischen 40 und 55 nmol Formaldehyd pro Lf des Diphtherie-Toxins zu der Lösung gibt, und resultierende Lösung inkubiert, um das Diphtherie-Toxoid zu erhalten.
Das Formaldehyd für die Detoxifizierung wird üblicherweise in Form von Formalin verwendet, d. h. als wässrige Lösung. Das Formalin kann eine gesättigte wässrige Lösung sein, die etwa 40 Vol% Formaldehyd enthält. Formalin kann ferner eine kleine Menge an Stabilisatoren umfassen, wie Methanol, um die Oxidation und die Polymerisation zu begrenzen.
Weitere Verarbeitungsschritte
Ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Diphtherie-Toxoids kann ferner einen oder mehrere Filtersterilisationsschritt(e) umfassen. In einer Ausführungsform wird das für die Detoxifizierung verwendete Diphtherie-Toxin-Konzentrat vor der Zugabe von Formaldehyd filtersterilisiert. In einer anderen Ausführungsform wird das aus dem Detoxifizierungsverfahren gewonnene Diphtherie-Toxoid filtersterilisiert. In einer weiteren Ausführungsform werden sowohl das Diphtherie-Toxin-Konzentrat als auch das Diphtherie-Toxoid filtersterilisiert. Die Anwendung von einem oder mehreren Filtersterilisationsschritt(en) während der Herstellung des Diphtherie-Toxoids hat den Vorteil, dass auf die Verwendung eines Konservierungsmittels zur Vermeidung von kontaminierendem Bakterienwachstum verzichtet werden kann. Die Vermeidung eines Konservierungsmittels kann Nebenwirkungen verhindern, die durch das Konservierungsmittel verursacht werden, wenn ein Impfstoff, der ein erfindungsgemäßes Diphtherie-Toxoid enthält, an einen Menschen verabreicht wird. Wenn ein Konservierungsmittel dem Diphtherie-Toxoid für die Lagerung zugegeben wird, dann wird ein Konservierungsmittel bevorzugt, bei dem es sich nicht um Phenol handelt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird dem Diphtherie-Toxoid kein Konservierungsmittel zugefügt.
In einer Ausführungsform kann das Verfahren zur Herstellung des Diphtherie-Toxoids ferner einen Partikel-Filtrationsschritt umfassen.
In einer weiteren Ausführungsform kann das Verfahren ferner einen Schritt der Aufkonzentrierung des Diphtherie-Toxoids für die Lagerung umfassen. Hohe Proteinkonzentrationen während der Lagerung werden bevorzugt, weil dadurch ein geringerer Abbau des Bulk-Diphtherie-Toxoids erreicht wird, als wenn das Bulk-Diphtherie-Toxoid in gelöster Form gelagert wird. In einer spezifischen Ausführungsform wird die Aufkonzentrierung durch eine Diafiltration durchgeführt. In einer besonderen Ausführungsform ist die finale Konzentration von Diphtherie-Toxoid für die Lagerung 10.000 Lf/mL. Folglich stellt die Erfindung auch ein Verfahren für die Lagerung eines Diphtherie-Toxoids in konzentrierter wässriger Form (z. B. für eine Dauer von mindestens einer Woche, mindestens einem Monat, oder mindestens drei Monaten) bereit, wobei die Konzentration des Diphtherie-Toxoids mindestens 5000 Lf/mL, z. B. mindestens 7,500 Lf/mL, mindestens 10.000 Lf/ml, usw. beträgt.
In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren zur Herstellung des Diphtherie-Toxoids ferner einen Schritt, bei dem der pH der resultierenden Diphtherie-Toxoid-Lösung auf zwischen 6,0 und 8,0 eingestellt wird. Bei diesem pH ist das Diphtherie-Toxoid stabil und für die Verabreichung an Menschen geeignet. In einer spezifischen Ausführungsform wird der pH der finalen Diphtherie-Toxoid-Lösung auf 7,2–7,8 eingestellt. In einer noch spezifischeren Ausführungsform wird der pH der finalen Diphtherie-Toxoid-Lösung auf 7,5 eingestellt.
Diphtherie-Toxoid-Zusammensetzungen
Die Anwendung eines wie vorliegend offenbarten Verfahrens zur Detoxifizierung eines Diphtherie-Toxins oder Derivats resultiert in der Bereitstellung eines Diphtherie-Toxoids, das eine höhere Reinheit aufweist als im Stand der Technik hergestellte Toxoide. Insbesondere ist das mittels der erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Diphtherie-Toxoid frei von Formaldehydvernetzten Bestandteilen tierischen Ursprungs. Die Vermeidung von Bestandteilen tierischen Ursprungs im Fermentationsmedium und im Detoxifizierungsverfahren bedeutet, dass das Endmaterial absolut frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs ist, sodass während der Toxoid-Bildung keine solche Bestandteil kovalent mit dem Toxin vernetzt werden können, während die Toxoide aus dem Stand der Technik, die nach Wachstum in Medien, die Bestandteile tierischen Ursprungs enthielten, hergestellt wurden, unweigerlich auch vernetzte Bestandteile tierischen Ursprungs enthalten, selbst wenn diese mit herkömmlichen analytischen Assays nicht leicht zu entdecken sein können. Folglich sind die erfindungsgemäßen Toxoide vorteilhaft, da sie eine homogene Zusammensetzung aufweisen, die frei von Materialien, wie z. B. Prionen, usw., ist.
In einer besonderen Ausführungsform stellt ein Verfahren zur Herstellung eines Diphtherie-Toxins oder eines Derivats ein Diphtherie-Toxoid bereit, dass mindestens 90% rein ist (d. h. das Diphtherie-Toxoid macht mindestens 90 Gew.-% des Proteins im gereinigten Material aus, wie z. B. anhand der Peakflächen einer HPLC-Analyse bestimmt). In einer weiteren spezifischen Ausführungsform führt ein Verfahren zur Detoxifizierung eines hier offenbarten Diphtherie-Toxins oder eines Derivats zu einem Diphtherie-Toxoid, das mindestens zu 95% rein ist. In einer weiteren spezifischen Ausführungsform führt das Verfahren zur Detoxifizierung eines hier offenbarten Diphtherie-Toxins oder eines Derivats zu einem Diphtherie-Toxin, das Hefebestandteile in so geringen Mengen umfasst, dass diese nicht ausreichen, um eine allergische Reaktion auszulösen.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst die aus dem erfindungsgemäßen Detoxifizierungsprozess resultierende Diphtherie-Toxoid-Lösung nicht mehr als 0,2 g/L freies Formaldehyd (d. h. Formaldehyd in Lösung, das keine Vernetzungen mit Proteinen ausgebildet hat). In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die aus dem erfindungsgemäßen Detoxifizierungsprozess resultierende Diphtherie-Toxoid-Lösung zwischen 0,1 und 0,15 g/L freies Formaldehyd.
In einer weiteren Ausführungsform führt ein Verfahren zur Detoxifizierung eines Diphtherie-Toxins oder eines Derivats zu einem Toxoid mit mehr als 1500 Lf/mg Stickstoff. Dementsprechend kann eine bevorzugte, aus dem erfindungsgemäßen Detoxifizierungsprozess resultierende Diphtherie-Toxoid-Lösung mehr als 1500 Lf/ml Stickstoff umfassen. In einer spezifischen Ausführungsform kann die aus dem erfindungsgemäßen Detoxifizierungsprozess resultierende Diphtherie-Toxoid-Lösung mehr als 2000 Lf/mg Stickstoff umfassen. In einer besonderen Ausführungsform umfasst die aus dem erfindungsgemäßen Detoxifizierungsprozess resultierende Diphtherie-Toxoid-Lösung mehr als 2100 Lf/mg Stickstoff. In einer weiteren spezifischen Ausführungsform umfasst die aus dem erfindungsgemäßen Detoxifizierungsprozess resultierende Diphtherie-Toxoid-Lösung mehr als 2700 Lf/mg Stickstoff.
Die Erfindung betrifft ferner Kombinationen jeglicher der hier offenbarten Verfahren. Beispielsweise kann ein Verfahren zur Bereitstellung eines Diphtherie-Toxins oder eines Derivats davon, das die Kultivierung eines Stamms von C. diphtheriae in dem erfindungsgemäßen Fermentationsmedium umfasst, mit einem wie vorliegend offenbarten Verfahren zur Herstellung eines Diphtherie-Toxoids kombiniert werden. Die Kombination dieser Verfahren ist besonders vorteilhaft, da ein industrielles Produktionsverfahren mit hoher Ausbeute zur Bereitstellung eines stark gereinigten, definierten Diphtherie-Toxoids erhalten wird, ohne dass bei dem Verfahren Bestandteile tierischen Ursprungs verwendet werden müssen.
In einer weiteren Ausführungsform bezieht ich die Erfindung auf ein Diphtherie-Toxoid, wobei das Diphtherie-Toxoid ein Monomer:Dimer-Verhältnis im Bereich von 3:1 bis 8:1 aufweist, und einen isoelektrischen Punkt im Bereich von 4,0 bis 5,0. In einer Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Diphtherie-Toxin Hefebestandteile in so geringen Mengen, dass keine allergische Reaktion ausgelöst wird, wobei aber in einer anderen Ausführungsform das erfindungsgemäße Diphtherie-Toxoid im Wesentlichen frei sowohl von Bestandteilen tierischen Ursprungs als auch von Hefebestandteilen ist. In einer besonderen Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Diphtherie-Toxoid frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs. In einer weitern Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Diphtherie-Toxoid weniger als 0,001 g/L freies Formaldehyd. In einer noch weiteren Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Diphtherie-Toxoid weniger als 0,0001 g/L freies Formaldehyd. In einer spezifischen Ausführungsform ist das Diphtherie-Toxoid frei von nachweisbaren Mengen von restlichem, freiem Formaldehyd.
In einer Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ein Diphtherie-Toxoid sowohl in monomerer als auch in dimerer Form, wobei mindestens 80% des Diphtherie-Toxoids in monomerer Form vorliegt, und wobei die Zusammensetzung frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs ist.
In einem Aspekt betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung, die als Impfstoff für die Anwendung beim Menschen geeignet ist, und ein Diphtherie-Toxoid umfasst, das frei von Formaldehyd-vernetzten Bestandteilen tierischen Ursprungs ist, wobei die Zusammensetzung eine Potenz von mindestens 30 IU pro Einheitsdosis (unit dose) aufweist. In einem spezifischen Aspekt weist eine erfindungsgemäße Zusammensetzung ein Monomer:Dimer-Verhältnis des Diphtherie-Toxoids im Bereich von 3:1 bis 8:1 auf, wobei das in der Zusammensetzung enthaltene Diphtherie-Toxoid einen isoelektrischen Punkt im Bereich von 4,0 bis 5,0 hat. In einer weiteren besonderen Ausführungsform umfasst eine erfindungsgemäße Zusammensetzung das Diphtherie-Toxoid sowohl in monomerer als auch in dimerer Form, und wobei mindestens 70% des Diphtherie-Toxoids in monomerer Form vorliegen. In einigen Ausführungsformen umfasst eine erfindungsgemäße Zusammensetzung mindestens ein protektives Antigen eines Erregers, bei dem es sich nicht um Corynebacterium diphtheriae handelt. Das protektive Antigen kann ausgewählt sein aus Oberflächen-Antigen von Hepatitis B-Virus, Tetanus-Antigen, Pertussis-Antigen, Hib-Antigen, Meningokokken-Antigen, Pneumokokken-Antigen und IPV-Antigen.
Impfstoff-Zusammensetzungen
Die Erfindung umfasst auch Impfstoff-Zusammensetzungen, die ein erfindungsgemäßes Diphtherie-Toxoid umfassen, oder die unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Diphtherie-Toxoids hergestellt wurden. In diesen Zusammensetzungen sollte die Potenz des Diphtherie-Toxoids bei mindestens 25 IU/Dosis liegen, z. B. bei mindestens 50 IU/Dosis.
Die Impfstoff-Zusammensetzungen werden im Allgemeinen Kombinationsimpfstoffe sein, d. h. sie enthalten mindestens ein protektives Antigen von einem Erreger, bei dem es sich nicht um C. diphtheriae handelt. Das/die zusätzliche(n) protektive(n) Antigen(e) kann/können viral und/oder bakteriell sein. Typische bakterielle Erreger umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Clostridium tetani, Bordetella pertussis, Haemophilus influenzae Typ B, Neisseria meningitidis, einschließlich der Serogruppen A, B, C, W135 und/oder Y; und Streptococcus pneumoniae, einschließlich der Serotypen 6B, 14, 19F, und 23F. Typische virale Erreger umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Poliovirus, Hepatitis A-Virus, Masern-Virus, Mumps-Virus, Röteln-Virus und Varicella-Zoster-Virus.
Tetanus
Clostridium tetani verursacht Tetanus. Das Tetanus-Toxin kann behandelt werden, um ein protektives Toxoid zu erhalten. Die Toxoide werden in Tetanus-Impfstoffen verwendet und ausführlicher in Kapitel 27 von Literaturstelle 1 beschrieben. Dementsprechend kann ein erfindungsgemäßer Kombinationsimpfstoff ein Tetanus-Toxoid umfassen. Bevorzugte Tetanus-Toxoide sind solche, die durch Formaldehydbehandlung hergestellt wurden. Die Tetanus-Toxoide können erhalten werden, indem man C. tenani in einem Wachstumsmedium anzüchtet (z. B. in Latham-Medium, das von bovinem Casein erhalten wurde), und anschließend eine Formaldehyd-Behandlung, eine Ultrafiltration und eine Präzipitation durchführt. Das Material kann dann mit einem Verfahren behandelt werden, das Sterilfiltration und/oder Dialyse umfasst.
Mengen von Tetanus-Toxoid können als ”Lf”-Einheiten ausgedrückt werden (siehe unten), die als Menge an Toxoid definiert sind, welche, wenn es mit einer Internationalen Einheit Antitoxin gemischt wird, eine optimal ausflockende Mischung ergibt [68]. Das NIBSC stellt ”The First International Reference Reagent for Tetanus Toxoid For Flocculation Test” [14] bereit, der 1000 LF pro Ampulle beinhaltet, und durch den Messungen kalibriert werden können.
Die immunisierende Potenz des Tetanus-Toxoids wird in Internationalen Einheiten (international units; IU) gemessen, und diese wird bestimmt, indem man den Schutz, der durch eine Zusammensetzung in Labortieren (üblicherweise Meerschweinchen) bereitgestellt wird, mit einem Kontrollimpfstoff vergleicht, z. B. durch Verwendung des NIBSC ”Tetanus Toxoid Adsorbed Third International Standard 2000” [15, 16], der 469 IU pro Ampulle enthält. Die Potenz von Tetanus-Toxoid in der Zusammensetzung der Erfindung sollte mindestens 35 IU pro Dosis sein, z. B. mindestens 70 IU/ml.
Pertussis
Bordetella pertussis verursacht Keuchhusten. Pertussis-Antigene in Impfstoffen sind entweder zellulär (ganze Zelle, in Form von inaktivierten B. pertussis-Zellen; ”wP”) oder azellulär (”aP”). Demzufolge kann ein erfindungsgemäßer Kombinationsimpfstoff ein zelluläres Pertussis-Antigen oder ein azelluläres Pertussis-Antigen umfassen.
Die Herstellung von zellulären Pertussis-Antigenen ist gut dokumentiert (siehe z. B. Kapitel 21 von Literaturstelle 1), z. B. kann es durch Hitzeinaktivierung einer Phase I-Kultur von B. Pertussis erhalten werden. Wenn azelluläre Antigenen verwendet werden, sind eins, zwei oder (vorzugsweise) drei der folgenden Antigene enthalten: (1) detoxifiziertes Pertussis-Toxin (Pertussis-Toxoid, oder ”PT”), (2) filamentöses Hämagglutinin (”FHA”), (3) Pertactin (auch bekannt als das ”69-KiloDalton Protein der äußeren Membran”). Diese drei Antigene werden vorzugsweise durch Isolierung aus einer B. pertussis Kultur, die in modifiziertem Stainer-Scholte-Flüssigmedium angezüchtet wurde, hergestellt. PT und FHA können von der Fermentationsbrühe isoliert werden (z. B. durch Adsorption an ein Hydroxyapatit-Gel), während Pertactin mittels Hitzebehandlung und Flockung (z. B. unter Verwendung von Bariumchlorid) aus den Zellen extrahiert werden kann. Die Antigene können in aufeinanderfolgenden Chromatographie- und/oder Präzipitationsschritten gereinigt werden. PT und FHA können durch hydrophobe Chromatographie, Affinitätschromatographie und Größenausschlusschromatographie gereinigt werden. Pertactin kann mittels Ionenaustausch-Chromatographie, hydrophobe Chromatographie und Größenausschlusschromatographie aufgereinigt werden. FHA und Pertactin können erfindungsgemäß vor der Verwendung mit Formaldehyd behandelt werden. PT ist vorzugsweise durch Behandlung mit Formaldehyd und/oder Glutaraldehyd detoxifiziert. Als Alternative zu diesem chemischen Detoxifizierungsverfahren kann das PT auch ein mutiertes PT sein, bei dem die enzymatische Aktivität durch Mutagenese [17] reduziert wurde, wobei aber eine Detoxifizierung mittels chemischer Behandlung üblicher ist.
Die Mengen von wP-Antigenen können in Internationalen Einheiten (IU) ausgedrückt werden gemessen. Beispielsweise liefert das NIBSC den ”Third International Standard For Pertussis” [18], der 46 IU pro Ampulle enthält. Jede Ampulle enthält den gefriergetrockneten Rest von 2,0 ml Aliquot einer wässrigen Lösung, die 10 L bakterielle Suspension umfasste (äquivalent zu 180 Trübungseinheiten bezogen auf den U. S. Opacity Standards), und die mit acht Litern M/15 Sorensen-Puffer pH 7,0 verdünnt war. Als Alternative zum IU-System wird auch die Einheit ”OU” (Trübungseinheit, ”opacity unit”.) verwendet (z. B. können 4 OU etwa 1 IU sein). Die Konzentration des wP-Antigens in einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung beträgt üblicherweise mindestens 8 IU/ml, z. B. 4 IU/Dosis.
Die Mengen von aP-Antigenen werden üblicherweise in μg ausgedrückt. Die Konzentration von PT in einem Impfstoff ist üblicherweise 5 μg/ml, 16 μg/ml, 20 μg/ml oder 50 μg/ml. Die Konzentration von FHA in einem Impfstoff ist üblicherweise 10 μg/ml, 16 μg/ml oder 50 μg/ml. Die Konzentration von Pertactin in einem Impfstoff ist üblicherweise 5 μg/ml, 6 μg/ml, oder 16 μg/ml.
Hib
Haemophilus influenzae Typ B (”Hib”) verursacht bakterielle Meningitis. Hib-Impfstoffe basieren normalerweise auf dem Kapselsaccharid-Antigen (z. B. Kapitel 14 von Lit. 1), dessen Herstellung gut dokumentiert ist (z. B. Lit. 19 bis 28). Die H. influenzae-Bakterien können in Abwesenheit von Bestandteilen tierischen Ursprungs kultiviert werden. Das Hib-Saccharid wird an ein Trägerprotein konjugiert, um seine Immunogenität zu verbessern, besonders bei Kindern. Typische Trägerproteine in diesen Konjugaten sind Tetanus-Toxoid, Diphtherie-Toxoid, das CRM197-Derivat des Diphtherie-Toxins oder ein Proteinkomplex der äußeren Membran von Meningokokken der Serogruppe B. Daher kann ein erfindungsgemäßer Kombinationsimpfstoff ein Hib-Kapselsaccharid umfassen, das an ein Trägerprotein konjugiert ist.
Tetanus-Toxoid ist der bevorzugte Träger, wie es in dem Produkt verwendet wird, das üblicherweise ”PRP-T” genannt wird. PRP-T kann hergestellt werden, indem man ein Hib-Kapsel-Polysaccharid mit Cyanbromid aktiviert, das aktivierte Saccharid an einen Adipinsäure-Linker koppelt (wie z. B. (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid), üblicherweise das Hydrochloridsalz), und anschließend die Linker-Saccharid-Einheit mit einem Tetanus-Toxoid-Trägerprotein reagieren lässt. Der Saccharid-Teil des Konjugats kann ein Polyribosylribitolphosphat (PRP) vollständiger Länger umfassen, wie es ausgehend von Hib-Bakterien hergestellt wird, und/oder Fragmente von PRP vollständiger Länge. Konjugate mit einem Saccharid:Protein-Verhältnis (w/w) von zwischen 1:5 (d. h. überschüssiges Protein) und 5:1 (d. h. überschüssiges Saccharid) können verwendet werden, z. B. Verhältnisse zwischen 1:2 und 5:1 und Verhältnisse zwischen 1:1,25 und 1:2,5. In bevorzugten Impfstoffen ist das Gewichtsverhältnis von Saccharid zu Trägerprotein jedoch zwischen 1:2,5 und 1:3,5. In Impfstoffen, in denen Tetanus-Toxoid sowohl als Antigen als auch als Trägerprotein vorhanden ist, beträgt das Gewichtsverhältnis von Saccharid zu Trägerprotein in dem Konjugat zwischen 1:0,3 und 1:2 [29]. Die Verabreichung des Hib-Konjugats führt vorzugsweise zu einer Anti-PRP-Antikörper-Konzentration von ≥0,15 μg/ml und stärker bevorzugt von ≥1 μg/ml, wobei es sich bei diesen um die Standard-Antwort-Schwellenwerte handelt.
Die Mengen von Hib-Antigenen werden üblicherweise in μg Saccharid ausgedrückt. Die Konzentration des Saccharids in einem Impfstoff liegt üblicherweise zwischen 10–30 μg/ml, z. B. 20 μg/ml.
Meningococcus
Neisseria meningitidis verursacht bakterielle Meningitis. Basierend auf dem Kapsel-Polysaccharid des Organismus wurden zahlreiche Serogruppen von N. meningitidis identifiziert, einschließlich A, B, C, H, I, K, L, 29E, W135, X, Y & Z. Die N. meningitidis-Bakterien können in Abwesenheit von Bestandteilen tierischen Ursprungs angezüchtet werden. Die am häufigsten mit Krankheit assoziierten Serogruppen sind A, B, C, W135 und Y. Derzeitige Impfstoffe gegen die Serogruppen A, C, W135 und Y basieren auf den Kapselsaccharid-Antigenen, wobei aber dieser Ansatz für Serogruppe B nicht geeignet ist, und daher werden stattdessen Protein-Antigene oder Vesikel der äußeren Membran verwendet [30]. Die Kapselsaccharide werden an Trägerproteine konjugiert, um die Immunogenität zu erhöhen. Typische Trägerproteine sind Tetanus-Toxoid (wie im NIMENRIX^TM-Produkt), Diphtherie-Toxoid (wie im MENACTRA^TM-Produkt), und das CRM197-Derivat des Diphtherie-Toxins (wie im MENVEO^TM-Produkt). Dementsprechend kann ein erfindungsgemäßer Kombinationsimpfstoff ein oder mehrere (z. B. 2, 3 oder 4) Kapselsaccharide umfassen, die an ein Trägerprotein konjugiert sind, und die ausgewählt sind aus: (1) N. meningitidis Serogruppe A; (2) N. meningitidis Serogruppe C; (3) N. meningitidis Serogruppe W135 und/oder N. meningitidis Serogruppe Y.
Der Saccharid-Anteil des Konjugats kann ein Saccharid vollständiger Länge umfassen, wie es ausgehend von Meningokokken hergestellt wird, und/oder Fragmente davon. Saccharide der Serogruppe C können entweder von OAc⁺ Stämmen oder von OAc^– Stämmen hergestellt werden. Für Saccharide der Serogruppe A sind vorzugsweise mindestens 50% (z. B. mindestens 60%, 70%, 80%, 90%, 95% oder mehr) der Mannosamin-Reste an der C-3-Position O-acetyliert. Meningokokken-Konjugate mit einem Saccharid:Protein-Verhältnis (w/w) von zwischen 1:10 (d. h. überschüssiges Protein) und 10:1 (d. h. überschüssiges Saccharid) können verwendet werden, z. B. Verhältnisse zwischen 1:5 und 5:1, zwischen 1:2,5 und 2,5:1 oder zwischen 1:1,25 und 1,25:1. Die Verabreichung des Konjugats führt vorzugsweise zu einer mindestens 4-fachen, und vorzugsweise mindestens 8-fachen Erhöhung des Titers im Serum-Bakterizidie-Assay (SBA) für die relevante Serogruppe. SBA-Titer können mit Baby-Kaninchen-Komplement oder mit humanem Komplement gemessen werden [31].
Die Mengen von Meningokokken-Antigenen werden üblicherweise in μg Saccharid ausgedrückt. Die Konzentration des Saccharids in einem Impfstoff liegt normalerweise zwischen 5–30 μg/ml pro Serogruppe, z. B. bei 10 μg/ml oder 20 μg/ml.
Pneumococcus
Streptococcus pneumoniae verursacht bakterielle Meningitis. Wie bei Hib und Meningococcus basieren die derzeitigen Impfstoffe auf Kapselsacchariden. Die S. pneumoniae-Bakterien können in Abwesenheit von Bestandteilen tierischen Ursprungs angezüchtet werden. Daher kann ein erfindungsgemäßer Kombinationsimpfstoff Pneumokokken-Kapselsaccharid umfassen, das an ein Trägerprotein konjugiert ist.
Vorzugsweise werden Saccharide von mehr als einem Serotypen von S. pneumoniae eingebracht, und insbesondere mindestens die Serotypen 6B, 14, 19F und 23F. Zusätzliche Serotypen werden vorzugsweise ausgewählt aus: 1, 3, 4, 5, 7F, 9V und 18C. Beispielsweise werden Mischungen aus Polysacchariden von 23 verschiedenen Serotypen verbreitet verwendet, wie auch Konjugat-Impfstoffe mit Polysacchariden aus 5 bis 11 verschiedenen Serotypen [32]. Beispielsweise enthält PREVNAR^TM [33] konjugierte Saccharide von sieben Serotypen (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F und 23F) und SYNFLORIX^TM enthält konjugierte Saccharide von zehn Serotypen (1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F und 23F). Die Saccharide sind vorzugsweise an Trägerproteine konjugiert [z. B. Lit. 34 bis 36]. Typische Trägerproteine sind Tetanus-Toxoid, Diphtherie-Toxoid, das DRM197-Derivat des Diphtherie-Toxins und Protein D von H. influenzae. Die Saccharide in dem Produkt PREVNAR^TM sind durch reduktive Aminierung einzeln an CRM197 konjugiert, mit 2 μg von jedem Saccharid pro 0,5 ml Dosis (4 μg von Serotyp 6B). SYNFLORIX^TM verwendet drei unterschiedliche Trägerproteine und eine Mischung von verschiedenen Saccharid-Mengen für die verschiedenen Serogruppen.
Die Mengen von Pneumokokken-Antigenen werden üblicherweise in μg des Saccharids ausgedrückt. Die Konzentration eines Pneumokokken-Konjugats, gemessen als Saccharid, beträgt normalerweise zwischen 2 und 20 μg/ml für jeden Serotyp.
Hepatitis B-Virus
Hepatitis B-Virus (HBV) ist eine Ursache für virale Hepatitis. Das HBV-Virion besteht aus einem inneren Kern, der von einer äußeren Poteinhülle oder Kapsid umgeben ist, und der virale Kern enthält das virale DNA-Genom. Der Hauptbestandteil des Kapsids ist ein Protein, das als HBV-Oberflächenprotein oder gebräuchlicher als ”HBsAg” bekannt ist, und üblicherweise ein Polypeptid aus 226 Aminosäuren mit einem molekularen Gewicht von ~24 kDa ist. Alle existierende Hepatitis B-Impfstoffe enthalten HBsAg, und wenn dieses Antigen an einen gewöhnlichen Menschen, der geimpft werden soll, verabreicht wird, dann stimuliert es die Bildung von Anti-HBsAg-Antikörpern, die gegen eine HBV-Infektion schützen. Daher kann ein erfindungsgemäßer Kombinationsimpfstoff HBsAg umfassen.
Zur Impfstoff-Herstellung kann HBsAg auf zwei Arten hergestellt werden. Das erste Verfahren umfasst die Aufreinigung des Antigens in partikulärer Form aus dem Plasma chronischer Hepatitis B-Trägern, da große Mengen von HBsAg in der Leber synthetisiert werden und während einer HBV-Infektion in den Blutkreislauf freigesetzt werden. Das zweite Verfahren umfasst die Expression des Proteins mittels rekombinanter DNA-Methoden. HBsAg zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren sollte rekombinant in Hefezellen exprimiert sein. Geeignete Hefen umfassen Saccharomyces- (wie S. cerevisiae), Hanensula- (wie H. polymorpha) oder Pichia-Wirte. Die Hefen können in Abwesenheit von Bestandteilen tierischen Ursprungs angezüchtet werden.
Im Gegensatz zu nativem HBsAg (d. h. wie in dem aus Plasma aufgereinigten Produkt) ist das in der Hefe exprimierte HBsAg im Allgemeinen nicht glykosyliert, und dies ist die am stärksten bevorzugte Form von HBsAg für die erfindungsgemäße Verwendung. In Hefe exprimiertes HBsAg ist stark immunogen und kann ohne Risiko einer Kontamination des Blutprodukts hergestellt werden. Viele Verfahren zur Aufreinigung von HBsAg aus rekombinanter Hefe sind im Stand der Technik bekannt.
Das HBsAg wird im Allgemeinen in Form von im Wesentlichen sphärischen Partikeln vorliegen (durchschnittlicher Durchmesser von etwa 20 nm), die eine Lipid-Matrix enthalten, welche Phospholipide umfasst. In Hefe exprimierte HBsAg-Partikel können Phosphatidylinositol enthalten, das in nativen HBV-Virionen nicht zu finden ist. Die Partikel können auch eine nicht-toxische Menge an LPS enthalten, um das Immunsystem zu stimulieren [37]. Die Partikel können ein nicht-ionisches Tensid zurückhalten (z. B. Polysorbat 20), wenn dies während des Aufschlusses der Hefe verwendet wurde [38].
Das HBsAg stammt vorzugsweise vom HBV-Subtypen adw2.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Aufreinigung von HBsAg umfasst nach Aufschluss der Zellen: Ultrafiltration, Größenausschluss-Chromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie, Ultrazentrifugation, Entsalzung, und Sterilfiltration. Lysate können nach dem Aufschluss der Zellen präzipitiert werden (z. B. unter Verwendung eines Polyethylenglykols), wobei HBsAg in der Lösung verbleibt, bereit für die Ultrafiltration.
Nach der Aufreinigung kann das HBsAg einer Dialyse unterzogen werden (z. B. mit Cystein), die verwendet werden kann, um sämtliche Quecksilber-Konservierungsmittel zu entfernen, wie z. B. Thimerosal, das während der Zubereitung von HBsAg benutzt worden sein könnte [39].
Die Mengen von HBsAg werden üblicherweise in Mikrogramm ausgedrückt. Die Konzentration von HBsAg in einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung ist vorzugsweise weniger als 60 μg/ml, z. B. ≤55 μg/ml, ≤50 μg/ml, ≤45 μg/ml, ≤40 μg/ml, usw. Eine Konzentration von etwa 20 μg/ml ist üblich, z. B. 10 μg pro Dosis.
Poliovirus
Poliovirus verursacht Poliomyelitis. Inaktivierter Poliovirus-Impfstoff (IPV), der in Kapitel 24 von Literaturstelle 1 genauer offenbart wird, ist seit mehreren Jahren bekannt. Daher kann ein erfindungsgemäßer Kombinationsimpfstoff ein inaktiviertes Poliovirus-Antigen umfassen.
Poliovirus kann in Zellkultur angezüchtet werden, und eine bevorzugte Kultur verwendet eine Vero-Zelllinie, die von einer Affenniere abgeleitet ist. Vero-Zellen können leicht in Mikroträgern angezüchtet werden. Nach dem Wachstum können Virionen unter Verwendung von Verfahren wie Ultrafiltration, Diafiltration, und Chromatographie aufgereinigt werden. Wenn tierische (und insbesondere bovine) Materialien bei der Kultur von Zellen verwendet werden, dann sollten sie aus Quellen erhalten werden, die frei von transmissiblen spongiformen Enzephalopathien (TSEs) und insbesondere frei von boviner spongiformer Enzephalopathie (BSE) sind. Vorzugsweise werden Polioviren in Zellen angezüchtet, die in einem Medium kultiviert werden, das frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs ist.
Vor der Verabreichung an Menschen müssen die Polioviren inaktiviert werden, und dies kann durch Behandlung mit Formaldehyd erreicht werden. Poliomyelitis kann durch einen von drei Typen von Poliovirus verursacht sein. Die drei Typen sind ähnlich und verursachen identische Symptome, aber sie sind antigenetisch sehr unterschiedlich, und eine Infektion durch einen Typen schützt nicht gegen eine Infektion durch andere. Daher ist es bevorzugt, im Rahmen der Erfindung drei Poliovirus-Antigene zu verwenden: Poliovirus Typ 1 (z. B. Mahoney-Stamm), Poliovirus Typ 2 (z. B. MEF-1-Stamm) und Poliovirus Typ 3 (z. B. Saukett-Stamm). Die Viren werden vorzugsweise einzeln angezüchtet, gereinigt und inaktiviert, und anschließend werden sie kombiniert, um eine trivalente Bulk-Mischung für die erfindungsgemäße Verwendung zu bilden. Die Mengen von IPV werden normalerweise in ”DU”-Einheiten ausgedrückt (die ”D-Antigen-Einheit” [40]). Es ist bevorzugt, zwischen 1–100 DU pro polioviralem Typ pro Dosis zu verwenden, z. B. etwa 40 DU vom Poliovirus Typ 1, etwa 8 DU vom Poliovirus Typ 2 und etwa 32 DU vom Poliovirus Typ 3 (es ist aber auch möglich, geringere Dosen als diese zu verwenden [41,42], z. B. 10–20 DU für Typ 1, 2–4 DU für Typ 2 und 8–20 DU für Typ 3.
Wenn ein IPV-Bestandteil verwendet wird und die Polioviren auf Vero-Zellen angezüchtet wurden, dann enthält eine Impfstoff-Zusammensetzung vorzugsweise weniger als 10 ng/ml, vorzugsweise ≤1 ng/ml, z. B. ≤500 pg/ml oder ≤50 pg/ml an DNA von Vero-Zellen, z. B. weniger als 10 ng/ml an DNA von Vero-Zellen die ≥50 Basenpaare lang ist.
Herstellung eines Kombinationsimpfstoffs
Antigene Bestandteile dieser Erreger zur Verwendung in Impfstoffen werden üblicherweise mit abgekürzten Namen bezeichnet: ”D” für Diphtherie-Toxoid, ”T” für Tetanus-Toxoid, ”P” für Pertussis-Antigene, wobei ”Pa” azellulär ist (z. B. mindestens PT, FHA und Pertactin umfassend) und ”Pw” zellulär ist; ”Hib” für konjugiertes Kapselsaccharid von H. influenzae; ”MenA”, ”MenB”, ”MenC”, ”MenW”, und ”MenY” für die entsprechenden Meningokokken Serogruppen, getrennt voneinander an Trägerproteine konjugiert; ”IPV” für 3-valentes inaktiviertes Poliovirus und ”Spn” für Pneumococcus.
Die folgenden Kombinationsimpfstoffe sind bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung, wobei der ”D”-Bestandteil ein wie vorliegend offenbartes Diphtherie-Toxoid ist:

– D, T, HBsAg
– D, T, Pw, HBsAg
– D, T, Pw, HBsAg, Hib
– D, T, Pw, HBsAg, Hib, MenA, MenC
– D, T, Pw, HBsAg, Hib, MenA, MenC, MenW135
– D, T, Pw, HBsAg, Hib, MenA, MenC, MenY
– D, T, Pw, HBsAg, Hib, MenA, MenC, MenW135, MenY
– D, T, Pa, HBsAg
– D, T, Pa, Hib
– D, T, Pa, HBsAg, Hib
– D, T, Pa, HBsAg, IPV
– D, T, Pa, HBsAg, IPV, Hib
– D, T, Pa, HBsAg, IPV, Hib, Spn
– D, T, Pa, HBsAg, IPV, Hib, MenC, MenA
– D, T, Pa, HBsAg, IPV, Hib, MenC, MenY
– D, T, Pa, HBsAg, IPV, Hib, MenC, MenW135
– D, T, Pa, HBsAg, IPV, Hib, MenC, MenA, MenW135, MenY

Diese Kombinationsimpfstoffe können aus den oben genannten Antigenen bestehen oder sie können ferner Antigene von zusätzlichen Erregern enthalten. Sie können daher getrennt voneinander oder als Bestandteile weiterer Impfstoffe verwendet werden.
Wenn antigenische Bestandteile zur Herstellung von multivalenten Zusammensetzungen kombiniert werden, können die Antigene einzeln zugefügt werden, oder sie können vorgemischt werden. Wenn ein Kombinationsimpfstoff D- und T-Antigene und zusätzliche Antigene umfasst, wird vorzugsweise ein vorgemischter D-T-Bestandteil bei der Herstellung des Kombinationsimpfstoffs verwendet. Dieser bivalente Bestandteil kann mit weiteren Antigenen kombiniert werden. Wenn D-, T- und Pw-Antigene verwendet werden, wird vorzugsweise ein vorgemischter D-T-Pw-Bestandteil verwendet, der dann zur Herstellung des Kombinationsimpfstoffs benutzt wird.
Wenn eine D-T-Mischung verwendet wird, ist das Verhältnis von Diphtherie-Toxoid zu Tetanus-Toxoid in der Mischung im Allgemeinen zwischen 2:1 und 3:1 (gemessen in Lf-Einheiten), vorzu.gsweise zwischen 2,4:1 und 2,6:1, z. B. vorzugsweise 2,5:1.
Trägerproteine für Konjugate
Konjugierte Saccharid-Antigene umfassen Trägerproteine, an die das Saccharid kovalent gekoppelt ist, entweder direkt oder über einen Linker. Allgemeine Informationen zu Konjugationsmethoden können in Lit. 28 gefunden werden.
Zahlreiche Proteine sind zur Verwendung als Träger bekannt, und bevorzugte Trägerproteine sind bakterielle Toxoide, wie beispielsweise Diphtherie-Toxoid (z. B. erfindungsgemäß hergestellt) oder Tetanus-Toxoid. Andere geeignete Trägerproteine umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, die CRM197-Mutante des Diphtherie-Toxins [43, 44], das Protein der äußeren Membran von N. meningitidis [45], synthetische Peptide [46, 47], Hitzeschockproteine [48, 49], Pertussis-Proteine [50, 51], Zytokine [52], Lymphokine [52], Hormone [52], Wachstumsfaktoren [52], künstliche Proteine, die mehrere humane CD4⁺ T-Zell-Epitope von verschiedenen, von Erregern abgeleiteten Antigenen umfassen [53], wie z. B. N19 [54], Protein D von H. influenzae [55,56], Pneumokokken-Oberflächen-Antigen PspA [57], Pneumolysin [58], Eisen-Aufnahme-Proteine [59], Toxin A und B von C. difficile [60], Proteine von S. agalactiae [61], usw.
Die Anbindung eines Saccharids an einen Träger erfolgt vorzugsweise über eine -NH₂ Gruppe, z. B. in der Nebenkette eines Lysin-Rests oder eines Arginin-Rests in einem Trägerprotein. Die Bindung an -SH Gruppen (z. B. in der Nebenkette eines Cysteins) ist ebenfalls möglich.
Konjugate mit einem Saccharid:Protein-Verhältnis (w/w) von zwischen 1:5 (d. h. überschüssiges Protein) und 5:1 (d. h. überschüssiges Saccharid) sind bevorzugt.
Die Zusammensetzungen können eine geringe Menge an freiem Träger beinhalten. Ungeachtet jedes Trägers, der als separates Antigen enthalten ist, sollte die Menge an unkonjugiertem Träger vorzugsweise nicht mehr als 5% des gesamten Trägerproteins in der Zusammensetzung als Ganzes ausmachen, und stärker bevorzugt weniger als 2 Gew.-%.
Wie beim SYNFLORIX^TM-Produkt ist es möglich, mehr als eine Art von Trägerprotein in eine Zusammensetzung aufzunehmen, z. B. um das Risiko einer Trägersuppression zu verringern.
Die Mengen an Konjugaten werden im Allgemeinen als Masse an Saccharid angegeben (d. h. die Dosis des Konjugats als ganzes (d. h. Träger + Saccharid) ist größer als die angegebene Dosis), um Variationen aufgrund der Wahl des Trägers zu vermeiden.
Adjuvantien
Die erfindungsgemäßen Impfstoffe werden im Allgemeinen ein Adjuvans umfassen. Das gebräuchlichste Adjuvans für die Einbringung ist ein Aluminiumsalz, wie z. B. ein Aluminium-Hydroxid und/oder ein Aluminiumphosphat. Antigene in einem Kombinationsimpfstoff können (teilweise oder vollständig) an Aluminiumsalze adsorbiert sein.
Die im Allgemeinen als ”Aluminium-Hydroxid” bekannten Adjuvantien sind üblicherweise Aluminium-Oxyhydroxid-Salze, die normalerweise zumindest teilweise kristallin sind. Aluminium-Oxyhydroxid, das durch die Formel AlO(OH) wiedergegeben werden kann, kann von anderen Aluminiumverbindungen, wie z. B. Aluminium-Hydroxid Al(OH)₃, durch Infrarot (IR)-Spektroskopie unterschieden werden, insbesondere durch die Anwesenheit einer Adsorptionsbande bei 1070 cm^–1 und einer starken Schulter bei 3090–3100 cm^–1 (Kapitel 9 von Lit. 62). Der Grad an Kristallisation eines Aluminium-Hydroxid-Adjuvans wird durch die Breite der Beugungsbande bei halber Höhe (WHH) widergespiegelt, wobei schwach kristalline Partikel eine größere Linienverbreiterung aufgrund der kleineren Kristallitgröße zeigen. Der Bereich der Oberfläche vergrößert sich, wenn die WHH sich erhöht, und es wurde beobachtet, dass Adjuvantien mit einem höheren WHH-Wert eine bessere Kapazität für die Antigen-Adsorption aufweisen. Eine fibröse Morphologie (wie z. B. in Transmissions-Elektronen-Mikrographen beobachten) ist für Aluminium-Hydroxid-Adjuvantien üblich, z. B. mit Nadel-ähnlichen Partikeln mit einem Durchmesser von etwa 2 nm. Der pI-Wert von Aluminium-Hydroxid-Adjuvantien ist üblicherweise etwa 11, d. h. das Antigen selbst hat eine positive Oberflächenladung bei physiologischem pH. Adsorptionskapazitäten von zwischen 1,8–2,6 mg Protein pro mg Al⁺ ⁺⁺ bei pH 7,4 wurden für Aluminium-Hydroxid-Adjuvantien beobachtet.
Die üblicherweise als ”Aluminiumphosphat” bekannten Adjuvantien sind normalerweise Aluminium-Hydroxyphosphate, die oftmals auch eine geringe Menge an Sulfat enthalten (d. h. Aluminium-Hydroxyphosphat-Sulfat). Sie können mittels Präzipitation erhalten werden, und die Reaktionsbedingungen und Konzentrationen während der Präzipitation beeinflussen den Grad der Substitution von Hydroxyl durch Phosphat in dem Salz. Hydroxyphosphate haben im Allgemeinen ein molares PO₄/Al-Verhältnis von zwischen 0,3 und 1,2. Hydroxyphosphate können von strengem AlPO₄ durch das Vorhandensein von Hydroxylgruppen unterschieden werden. Beispielsweise verweist eine Bande im IR-Spektrum bei 3164 cm^–1 (z. B. bei Erhitzen auf 200°C) auf das Vorhandensein von strukturellen Hydroxylen (Kapitel 9 von Lit. 62). Das molare PO₄/Al³ ⁺-Verhältnis eines Aluminiumphosphat-Adjuvans ist im Allgemeinen zwischen 0,3 und 1,2, vorzugsweise zwischen 0,8 und 1,2, und stärker bevorzugt 0,95 ± 0,1. Das Aluminiumphosphat wird im Allgemeinen amorph sein, insbesondere für Hydroxyphosphat-Salze. Ein typisches Adjuvans ist amorphes Aluminium-Hydroxyphosphat mit einem molaren PO₄/Al-Verhältnis zwischen 0,84 und 0,92, eingeschlossen bei 0,6 mg Al³ ⁺/ml. Das Aluminiumphosphat wird im Allgemeinen partikelförmig sein (z. B. Plättchen-ähnliche Morphologie, wie man es in Transmissions-Elektronen-Mikrographen beobachtet werden kann, mit primären Partikeln im Bereich von 50 nm). Übliche Durchmesser der Partikel liegen im Bereich von 0,5–20 μm (z. B. etwa 5–10 μm) nach Antigen-Adsorption. Es wurden Adsorptionskapazitäten von zwischen 0,7–1,5 mg Protein pro mg Al⁺ ⁺⁺ bei pH 7,4 für Aluminiumphosphat-Adjuvantien beobachtet.
Der PZC von Aluminiumphosphat steht in einer umgekehrten Relation zu dem Grad an Substitution von Hydroxyl durch Phosphat, und dieser Substitutionsgrad kann variieren, abhängig von den Reaktionsbedingungen und der Konzentration von Reaktanden, die zur Herstellung des Salzes durch Präzipitation verwendet werden. Der PZC wird durch Veränderung der Konzentration von freien Phosphat-Ionen in der Lösung (mehr Phosphat = stärker saurer PZC) oder durch Zugabe eines Puffers, wie z. B. eines Histidin-Puffers (macht PZV basischer), geändert. Ein erfindungsgemäß verwendetes Aluminiumphosphat wird im Allgemeinen einen PZC von zwischen 4,0 und 7,0 aufweisen, stärker bevorzugt zwischen 5,0 und 6,5, z. B. etwa 5,7.
Die Konzentration an Al⁺ ⁺⁺ in einer Zusammensetzung für die Verabreichung an einen Patienten ist vorzugsweise weniger als 10 mg/ml, z. B. ≤5 mg/ml, ≤4 mg/ml, ≤3 mg/ml, ≤2 mg/ml, ≤1 mg/ml, usw. Ein bevorzugter Bereich von Al⁺ ⁺⁺ in einer Zusammensetzung der Erfindung ist zwischen 0,3 und 1 mg/ml oder zwischen 0,3–0,5 mg/ml. Ein Maximum von 0,85 mg/Dosis ist üblich.
In einer Ausführungsform ist das Diphtherie-Toxoid an ein Aluminiumsalz-Adjuvans adsorbiert, z. B. adsorbiert an ein Aluminium-Hydroxid-Adjuvans.
In einem Kombinationsimpfstoff, der ein Tetanus-Toxoid umfasst, kann das Tetanus-Toxoid an ein Aluminium-Hydroxid-Adjuvans adsorbiert sein, wobei dies aber nicht erforderlich ist (z. B. kann eine Adsorption von zwischen 0–10% des gesamten Tetanus-Toxoids verwendet werden).
In einem Kombinationsimpfstoff, der ein Gesamtzell-Pertussis-Antigen umfasst, wird das wP-Antigen vorzugsweise mit einem Aluminium-Hydroxid-Adjuvans und/oder einem Aluminiumphosphat-Adjuvans kombiniert.
In einem Kombinationsimpfstoff, der azelluläre(s) Pertussis-Antigen(e) umfasst, kann/können das/die Pertussis-Antigen(e) an ein oder mehrere Aluminiumsalz-Adjuvantien adsorbiert sein, oder sie können in einem nicht-adsorbierten Zustand zugegeben werden. Wenn Pertactin in einer Zusammensetzung vorhanden ist, dann wird es vorzugsweise an ein Aluminium-Hydroxid-Adjuvans adsorbiert, bevor es in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird. PT und FHA können an ein Aluminium-Hydroxid-Adjuvans oder an Aluminiumphosphat adsorbiert werden, bevor sie in einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. In bevorzugten Ausführungsformen werden PT, FHA und Pertactin getrennt voneinander an ein Aluminiumhydroxid voradsorbiert, bevor sie in einem Verfahren der Erfindung verwendet werden.
In einem Kombinationsimpfstoff, der Hib-Antigene und ein Aluminiumsalz umfasst, kann das Hib-Konjugat adsorbiert oder nicht adsorbiert vorliegen (z. B. adsorbiert an ein Aluminiumphosphat-Adjuvans [63]). Diese Art von Adsorption ist besonders nützlich bei Impfstoffen, die D-T-Pw-Hib-HBsAg-Antigene umfassen. Andere konjugierte Antigene (z. B. Meningococcus, Pneumococcus) können auf ähnliche Weise an ein Aluminiumsalz (z. B. ein Phosphat) adsorbiert werden, oder sie können nicht adsorbiert vorliegen [64].
IPV-Antigene werden üblicherweise vor der Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren nicht an ein Adjuvans adsorbiert, aber sie können später an Aluminium-Adjuvanz/Aluminium-Adjuvantien adsorbiert werden, das/die von anderen Bestandteilen stammt/stammen.
In einem Kombinationsimpfstoff, der HBsAg umfasst, kann das HBsAg unter Verwendung der in Lit. 65 beschriebenen Verfahren an ein Aluminiumphosphat adsorbiert werden. Die Adsorption an Aluminiumphosphat ist mit dem bekannten ENGERIX-B^TM-Produkt vergleichbar (bei dem HBsAg an ein Aluminiumhydroxid adsorbiert ist). Wie in Literaturstelle [66] beschrieben wird, kann Aluminiumphosphat ein besseres Adjuvans für HBsAg sein als Aluminiumhydroxid.
Wenn ein Verfahren der Erfindung einen Bestandteil verwendet, bei dem Diphtherie- und Tetanus-Toxoide vor deren Kombination mit HBsAg vermischt wurden, enthält diese D-T-Mischung vorzugsweise ein Aluminiumhydroxid-Adjuvans, an das sowohl die D- als auch die T-Antigene adsorbiert sind.
Wenn ein Verfahren der Erfindung einen Bestandteil verwendet, bei dem Diphtherie-Toxoid, Tetanus-Toxoid und ein Gesamtzell-Pertussis-Antigen vor deren Kombination mit HBsAg vermischt wurden, dann enthält diese D-T-Pw-Mischung vorzugsweise sowohl ein Aluminiumhydroxid-Adjuvans, an das die D- und die T-Antigene adsorbiert sind, als auch ein Aluminiumphosphat-Adjuvans.
Wenn ein Adjuvans in einen erfindungsgemäßen Impfstoff eingebracht wird, kann es zu unterschiedlichen Zeitpunkten zugefügt werden. Antigene können vor der Verwendung bei der Herstellung der Kombinationsimpfstoffe mit Adjuvantien kombiniert werden (z. B. kann eine bivalente D-T-Mischung vor der Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren an ein oder mehrere Aluminiumsalz-Ajuvantien adsorbiert werden), aber es ist auch möglich, das Adjuvans zuzugeben, nachdem die Antigene gemischt wurden, oder eine Sequenz von Antigenen zu einem Adjuvans zu geben (z. B. beginnend mit einem wässrigen Adjuvans, anschließend Zugabe der Antigene, entweder einzeln oder vorgemischt).
Weitere nicht-antigenische Bestandteile
Erfindungsgemäße Impfstoff-Zusammensetzungen können Träger, Hilfsstoffe, Puffer, usw. umfassen.
Um die Tonizität zu kontrollieren, kann eine Zusammensetzung ein physiologisches Salz umfassen, wie z. B. ein Natriumsalz. Natriumchlorid (NaCl) wird bevorzugt, welches in einer Menge von zwischen 1 und 20 mg/ml vorhanden sein kann. In einer besonderen Ausführungsform ist die Natriumsalzkonzentration zwischen 8 und 9 mg/ml (z. B. etwa 8,5 mg/ml).
Die Zusammensetzungen werden im Allgemeinen eine Osmolarität zwischen 200 mOsm/kg aufweisen, vorzugsweise zwischen 240–360 mOsm/kg, und stärker bevorzugt im Bereich zwischen 280–320 mOsm/kg.
Es wurde zuvor berichtet, dass die Osmolarität keinen Einfluss auf die durch die Impfung verursachten Schmerzen hat [67]; es ist allerdings dennoch bevorzugt, die Osmolarität in diesem Bereich zu halten.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können einen oder mehrere Puffer enthalten. Übliche Puffer umfassen: einen Phosphatpuffer, einen Tris-Puffer, einen Borat-Puffer, einen Succinat-Puffer, einen Histidin-Puffer, oder einen Citrat-Puffer. Puffer werden üblicherweise in einem Bereich von 5–20 mM enthalten sein.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können ein oder mehrere Konservierungsmittel beinhalten, aber in einigen Ausführungsformen sind die Zusammensetzungen frei von Konservierungsmitteln. Bevorzugte Zusammensetzungen sind üblicherweise im Wesentlichen frei von Quecksilber-Konservierungsmitteln (z. B. Thimerosal); sie enthalten z. B. weniger als 0,1 μg/ml Quecksilber und vorzugsweise enthalten sie kein nachweisbares Quecksilber. Dies wird normalerweise erreicht werden, indem das Quecksilber-Konservierungsmittel aus einer Antigen-Zubereitung vor deren Zugabe zu dem erfindungsgemäßen Verfahren entfernt wird, oder dadurch, dass die Verwendung von Thimerosal während der Herstellung der für die Zusammensetzung benötigten Bestandteile vermieden wird. Allerdings ist das Vorhandensein von Restmengen an Quecksilber-Konservierungsmitteln kaum vermeidbar, wenn ein Bestandteil (insbesondere HBsAg) vor der Verwendung in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung mit einem solchen Konservierungsmittel behandelt wurde. Zur Sicherheit ist es jedoch bevorzugt, dass die finale Zusammensetzung weniger als etwa 25 ng/ml Quecksilber enthält.
In einigen Ausführungsformen umfasst die Zusammensetzung, die das erfindungsgemäße Diphtherie-Toxoid enthält, ein Konservierungsmittel, bei dem es sich nicht um Phenol handelt. In einer Ausführungsform ist das Konservierungsmittel Natrium-Thimerfonat. In einer anderen Ausführungsform ist das Konservierungsmittel 2-Phenoxyethanol (2-PE). Wenn 2-PE verwendet wird, ist es vorzugsweise in einer Menge von (a) zwischen 2,5 mg und 3,5 mg (z. B. etwa 3 mg) pro 100 Lf Diphtherie-Toxoid vorhanden und/oder (b) zwischen 7 mg und 8 mg (z. B. etwa 7,5 mg) pro 100 Lf an Tetanus-Toxoid. Eine 2-PE-Konzentration von zwischen 3 g/l und 8 g/l (z. B. zwischen 4–6 g/l oder etwa 5 g/l) in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung ist bevorzugt. In einer besonderen Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße Zusammensetzung 167 Lf Diphtherie-Toxoid; 67 Lf Tetanus-Toxoid; 5 mg 2-PE.
Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung kann im Wesentlichen frei von Tensiden sein. Insbesondere kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung im Wesentlichen frei von Polysorbat 80 sein, z. B. enthält sie weniger als 0,1 μg/ml von Polysorbat 80 und vorzugsweise enthält sie kein nachweisbares Polysorbat 80. Wenn eine Zusammensetzung allerdings HBsAg umfasst, wird sie normalerweise Polysorbat 20 enthalten, z. B. wenn sie beim Aufschluss der Hefe verwendet wurde [38].
Der pH der erfindungsgemäßen Zusammensetzung wird im Allgemeinen zwischen 5,0 und 7,5 sein, und noch üblicher zwischen 5,0 und 6,0 für eine optimale Stabilität, oder, wenn ein Diphtherie-Toxoid und/oder ein Tetanus-Toxoid vorhanden ist, zwischen 6,0 und 7,0. Ein Verfahren der Erfindung kann daher einen Schritt umfassen, bei dem der pH-Wert des Bulk-Impfstoffs vor der Verpackung eingestellt wird.
Die Zusammensetzungen der Erfindung sind vorzugsweise nicht pyrogen, d. h. sie enthalten < 1 EU (Endotoxin-Einheit, ein Standardmaß; 1 EU entspricht 0,2 ng FDA Referenzstandard Endotoxin EC-2 ”RSE”) pro Dosis, und vorzugsweise < 0,1 EU pro Dosis.
Die Zusammensetzungen der Erfindung sind vorzugsweise glutenfrei.
Die Zusammensetzungen der Erfindung sind vorzugsweise steril.
Die Zusammensetzungen der Erfindung liegen vorzugsweise in einer wässrigen Form vor. Während der Herstellung erfolgt die Verdünnung der Antigene, die die gewünschten finalen Konzentrationen bereitstellen soll, vorzugsweise mit WFI (Wasser zur Injektion).
Restmaterial von einzelnen Antigen-Bestandteilen kann ebenfalls noch in nachweisbaren Mengen in der finalen erfindungsgemäßen Impfstoff-Zusammensetzung vorhanden sein. Wenn beispielsweise Formaldehyd verwendet wird, um die Toxoide von Diphtherie, Tetanus und Pertussis herzustellen, dann kann das finale Impfstoffprodukt Spuren an Formaldehyd aufweisen (z. B. weniger als 10 μg/ml, vorzugsweise <5 μg/ml). Medien oder Stabilisatoren können während der Poliovirus-Herstellung verwendet worden sein (z. B. Medium 199), und diese können bis in den fertigen Impfstoff gelangen. Auf ähnliche Weise können freie Aminosäuren (z. B. Alanin, Arginin, Aspartat, Cystein und/oder Cystin, Glutamat, Glutamin, Glycin, Histidin, Prolin und/oder Hydroxyprolin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin und/oder Valin), Vitamine (z. B. Cholin, Ascorbat, usw.) Dinatriumphosphat, Monokaliumphosphat, Kalzium, Glucose, Adeninsulfat, Phenolrot, Natriumacetat, Kaliumchlorid, usw., können in dem finalen Impfstoff in einer Menge von jeweils ≤ 100 μg/ml, vorzugsweise < 10 μg/ml verbleiben. Andere Bestandteile von Antigen-Zubereitungen, wie z. B. Neomycin ((z. B. Neomycinsulfat, insbesondere vom IPV-Bestandteil), Polymyxin B (z. B. Polymyxin B-Sulfat, insbesondere vom IPV-Bestandteil) usw. können ebenfalls in Subnanogramm-Mengen pro Dosis vorhanden sein. Ein weiterer möglicher Bestandteil des finalen Impfstoffs, der aus den Antigen-Zubereitungen hervorgeht, entsteht dadurch, dass die Antigene nicht vollständig aufgereinigt werden. Kleine Mengen an Proteinen und/oder genomischer DNA von B. pertussis, C. diphtheriae, C. tetani und S. cerevisiae können daher vorhanden sein. Um die Mengen dieser Restbestandteile zu minimieren, werden die Antigenzubereitungen vorzugsweise behandelt, um diese zu entfernen, bevor die Antigene in einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.
Verpackung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
Die Erfindung stellt Bulk-Material bereit, das zur Verpackung in einzelne Dosen geeignet ist, die dann zur Verabreichung an Patienten verteilt werden können. Die oben erwähnten Konzentrationen sind üblicherweise Konzentrationen in der fertig verpackten Dosis, und dementsprechend können die Konzentrationen im Bulk-Impfstoff höher sein (z. B. um dann auf die Endkonzentrationen verdünnt zu werden).
Humane intramuskuläre Impfstoffe werden im Allgemeinen als einzelne Dosierungsvolumen von 0,5 ml verabreicht. Die Verfahren der Erfindung können daher einen Schritt umfassen, bei dem man eine 0,5 ml Probe der Mischung entnimmt und in einen Behälter verpackt. Es sollte verständlich sein, dass Verweise auf Dosen von 0,5 ml eine normale Schwankung von z. B. 0,5 ml ± 0,05 ml umfassen. Für Mehr-Dosen-Situationen werden mehrere Dosismengen entnommen und zusammen in einen einzelnen Behälter verpackt, z. B. 5 ml für einen Mehr-Dosen-Behälter mit 10-Dosen (oder 5,5 ml mit 10% Überfüllung).
Die Verfahren der Erfindung können einen Schritt umfassen, bei dem der Impfstoff in einen Behälter für die Verwendung verpackt wird. Geeignete Behälter umfassen Fläschchen und Einwegspritzen (vorzugsweise sterile).
Wenn eine erfindungsgemäße Zusammensetzung in Fläschchen verpackt wird, sind diese vorzugsweise aus Glas oder Plastikmaterial gefertigt. Das Fläschchen wird vorzugsweise sterilisiert, bevor die Zusammensetzung eingebracht wird. Um Probleme mit Patienten zu vermeiden, die auf Latex empfindlich reagieren, werden die Fläschchen vorzugsweise mit einem latexfreien Verschluss versiegelt. Das Fläschchen kann eine einzelne Dosis des Impfstoffs umfassen oder es kann mehr als eine Dosis enthalten (ein ”Mehr-Dosen-Fläschchen”), z. B. 10 Dosen. Wenn ein Mehr-Dosen-Fläschchen verwendet wird, sollte jede Dosis mit einer sterilen Nadel unter streng aseptischen Bedingungen entnommen werden, wobei darauf Acht gegeben wird, dass eine Kontamination des Fläschchen-Inhalts vermieden wird. Bevorzugte Fläschchen sind aus farblosem Glas hergestellt.
Das Fläschchen kann über einen Aufsatz verfügen (z. B. ein Luer-Lock), der so angepasst ist, dass eine vorgefüllte Spritze in den Aufsatz eingeführt werden kann, der Inhalt der Spritze in das Fläschchen abgegeben werden kann (z. B. um lyophilisiertes Material darin zu rekonstituieren), und der Inhalt des Fläschchens wieder zurück in die Spritze gezogen werden kann. Nachdem die Spritze aus dem Fläschchen entfernt wurde, kann eine Nadel aufgesetzt werden, und die Zusammensetzung kann an einen Patienten verabreicht werden. Der Aufsatz ist vorzugsweise in einer Versiegelung oder Abdeckung lokalisiert, so dass die Versiegelung oder Abdeckung entfernt werden muss, bevor der Aufsatz ereicht werden kann.
Wenn die Zusammensetzung in eine Spritze gefüllt wird, dann wird diese Spritze normalerweise keine Nadel aufweisen, die daran angebracht ist, es kann jedoch eine separate Nadel zum Zusammensetzen und Verwenden mit der Spritze bereitgestellt werden. Sicherheitsnadeln sind bevorzugt. 1-inch 23-Gauge, 1-inch 25-Gauge und 5/8-inch 25-Gauge Nadeln sind üblich. Die Spritzen können mit Abzieh-Etiketten versehen sein, auf denen die Chargennummer und das Verfallsdatum des Inhalts aufgedruckt sein können, um die Bestandsführung zu erleichtern. Der Kolben in der Spritze hat vorzugsweise einen Stopper, um ein versehentliches Entfernen des Kolbens während des Aufziehens zu verhindern. Die Spritzen können einen Latexgummiaufsatz und/oder einen Kolben aufweisen. Einwegspritzen enthalten eine einzelne Dosis des Impfstoffs. Die Spritze wird im Allgemeinen einen Verschlussdeckel haben, um den Verschluss zu versiegeln bevor die Nadel angebracht wird, und die Verschlusskappe ist vorzugsweise aus Butylgummi. Wenn die Spritze und die Nadel getrennt voneinander verpackt werden, dann ist die Nadel vorzugsweise mit einem Butylgummischutz ausgestattet. Graues Butylgummi ist bevorzugt. Bevorzugte Spritzen sind solche, die unter dem Namen ”Tip-Lok^TM” vertrieben werden.
Wenn ein Glasbehälter verwendet wird (z. B. eine Spritze oder ein Fläschchen), dann ist es bevorzugt, dass der Behälter aus Borsilikatglas gefertigt ist, und nicht aus Natron-Kalziumoxidglas.
Nachdem eine Zusammensetzung in einen Behälter verpackt wurde, kann dieser Behälter für den Vertrieb in eine Box verpackt werden, z. B. in einen Karton, und die Box wird dann mit Details des Impfstoffs beschriftet, z. B. mit dem Handelsname, einer Liste der im Impfstoff enthaltenen Antigene, (z. B. ”Hepatitis B rekombinant”, usw.), den verwendeten den Behälter (z. B. ”vorgefüllte Einwegspritzen Tip-Lok” oder ”10 × 0,5 Einzeldosen-Fläschchen”), der Dosis (z. B. ”jedes enthält eine 0,5 ml Dosis”), Warnhinweisen (z. B. ”nur für den Gebrauch bei Erwachsenen” oder ”nur zum Gebrauch bei Kindern”), einem Verfallsdatum, einer Indikation, einer Patentnummer, usw. Jede Box kann mehr als einen verpackten Impfstoff enthalten, z. B. fünf oder zehn verpackte Impfstoffe (insbesondere für Fläschchen). Wenn der Impfstoff in einer Spritze enthalten ist, dann kann das Paket ein Foto der Spritze zeigen.
Der Impfstoff kann zusammen (z. B. in derselben Box) mit einem Beipackzettel verpackt sein, der Details zum Impfstoff enthält, z. B. Instruktionen zur Verabreichung, Details zu den enthaltenen Antigenen, usw. Die Instruktionen können auch Warnhinweise enthalten, z. B. dass eine Lösung Adrenalin bereitgehalten werden soll, falls eine anaphylaktische Reaktion nach der Impfung auftritt, usw.
Ein verpackter Impfstoff wird vorzugsweise bei zwischen 2°C und 8°C gelagert. Er sollte nicht eingefroren werden.
Impfstoffe können während der Herstellung in vollständig flüssiger Form bereitgestellt werden (d. h. alle antigenischen Bestandteile liegen in wässriger Lösung oder in Suspension vor), oder sie können in einer Form hergestellt werden, bei der einige Bestandteile in flüssiger Form vorliegen und andere in lyophilisierter Form. Folglich kann ein finaler Impfstoff bei Bedarf hergestellt werden, indem man zwei Bestandteile vermischt: (a) einen ersten Bestandteil, der wässrige Antigene umfasst; und (b) einen zweiten Bestandteil, der lyophilisierte Antigene umfasst. Die beiden Bestandteile liegen vorzugsweise in zwei getrennten Behältern vor (z. B. Fläschchen und/oder Spritzen), und die Erfindung stellt ein Kit bereit, das die Bestandteile (a) und (b) umfasst. Dieses Format ist besonders nützlich bei Impfstoffen, die einen Konjugat-Bestandteil umfassen, insbesondere Hib- und/oder Meningokokken- und/oder Pneumokokken-Konjugate, da diese in lyophilisierter Form stabiler sein können (wohingegen D-, T-, P- und HBsAg-Bestandteile vorzugsweise in flüssiger Form vorliegen). Die Konjugate können vor der erfindungsgemäßen Verwendung lyophilisiert werden. Weitere Bestandteile können vor der Gefriertrocknung hinzugefügt werden, z. B. als Stabilisatoren. Bevorzugte Stabilisatoren umfassen Lactose, Saccharose, und Mannitol, wie auch Mischungen derselben, z. B. Lactose/Saccharose-Mischungen, Saccharose/Mannitol-Mischungen, usw. Der finale Impfstoff kann dementsprechend Lactose und/oder Saccharose umfassen. Die Verwendung von Saccharose/Mannitol kann den Trocknungsprozess beschleunigen.
So stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Kombinationsimpfstoffs in zwei Behältern bereit, bei dem man:

– wie oben beschrieben einen wässrigen Kombinationsimpfstoff herstellt, wobei jedoch das Antigen oder die Antigene kein konjugiertes Kapselsaccharid-Antigen umfassen;
– den wässrigen Kombinationsimpfstoff in einen ersten Behälter verpackt (z. B. in eine Spritze),
– ein konjugiertes Kapselsaccharid-Antigen in lyophilisierter Form herstellt;
– das lyophilisierte Antigen in einen zweiten Behälter verpackt (z. B. in ein Fläschchen); und
– den ersten und den zweiten Behälters in ein Kit verpackt.

Das Kit kann anschließend an Ärzte vertrieben werden.
Verfahren zur Behandlung und Verabreichung des Impfstoffs
Die Zusammensetzungen der Erfindung sind für die Verabreichung an humane Patienten geeignet, und die Erfindung stellt ein Verfahren bereit, das die Immunantwort in einem Patienten erhöht, und das den Schritt der Verabreichung einer Zusammensetzung der Erfindung an einen Patienten umfasst. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen werden vorzugsweise an Patienten in einer Dosis von 0,5 ml verabreicht (wie oben erläutert).
Die Erfindung stellt ferner eine erfindungsgemäße Zusammensetzung zur Verwendung in der Medizin bereit. Die Erfindung stellt ferner eine erfindungsgemäße Zusammensetzung zur Vermeidung mindestens einer Infektion mit C. diphtheriae bereit. Die Zusammensetzungen der Erfindung sind vorzugsweise Impfstoffe für die Verwendung bei der Vermeidung und/oder Behandlung von mindestens einer Infektion mit C. diphtheriae.
Die Erfindung stellt wie vorliegend beschrieben ferner die Verwendung von antigenischen Bestandteilen bereit (einschließlich der erfindungsgemäßen Diphtherie-Toxoide), die bei der Herstellung eines Impfstoffs verwendet werden.
Damit eine vollständige Wirksamkeit erreicht wird, umfasst ein üblicher Plan für eine primäre Immunisierung bei einem Kind normalerweise die Verabreichung von mehr als einer Dosis. So können z. B. Dosen bei 0 & 6 Monaten (Zeitpunkt 0 ist die erste Dosis); bei 0, 1, 2 & 6 Monaten; am Tag 0, Tag 21 und dann eine dritte Dosis zwischen 6 & 12 Monaten; bei 2, 4 & 6 Monaten; bei 3, 4 & 5 Monaten; bei 6, 10 & 14 Wochen; oder bei 0, 1, 2, 6 & 12 Monaten.
Die Zusammensetzungen können auch als Auffrischungsdosen verwendet werden, z. B. bei Kindern im zweiten Lebensjahr.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können als intramuskuläre Injektion verabreicht werden, z. B. in den Arm oder in das Bein.
Erfindungsgemäß hergestellte Impfstoffe können gleichzeitig als ein getrennter Impfstoff an Patienten verabreicht werden, z. B. gleichzeitig mit einem Pneumokokken-Konjugat-Impfstoff wie Prevnar^TM, gleichzeitig mit einem Influenza-Impfstoff, gleichzeitig mit einem Rotavirus-Impfstoff, gleichzeitig mit einem MMR-Impfstoff, usw.
Wenn die Zusammensetzungen der Erfindung ein auf Aluminium basierendes Adjuvans umfassen, kann es zu einer Ablagerung der Bestandteile während der Lagerung kommen. Die Zusammensetzung sollte deshalb vor der Verabreichung an einen Patienten geschüttelt werden. Die geschüttelte Zusammensetzung wird eine trübe weiße Suspension sein.
Quantitative Einheiten zur Messung von Diphtherie-Toxoid
Die Mengen an Diphtherie-Toxin und/oder Toxoid in einer Zusammensetzung werden im Allgemeinen in der ”Lf”-Einheit gemessen (”Flockungseinheiten” oder die ”Limes-Flockungsdosis” oder der ”Grenzwert der Flockung”), die definiert ist als die Menge an Toxin/Toxoid, das, wenn es mit einer Internationalen Einheit Antitoxin vermischt wird, eine optimale Flockungsmischung ergibt [68, 69]. Das NIBSC stellt z. B. ”Diphtherie-Toxoid, einfach” [70] bereit, welches 300 LF pro Ampulle enthält, und ferner ”The 1st International Reference Reagent For Diphtheria Toxoid For Flocculation Test” [71], das 900 LF pro Ampulle umfasst. Die Konzentration an Diphtherie-Toxin oder -Toxoid in der Zusammensetzung können leicht unter Verwendung eines Flockungsassays bestimmt werden, wobei ein Vergleich mit Referenzmaterial erfolgt, das gegen solche Referenz-Reagentien kalibriert ist.
Die Reinheit einer Proteinzubereitung kann durch das Verhältnis von spezifischem Protein zum Gesamtprotein ausgedrückt werden. Die Reinheit des Diphtherie-Toxins/-Toxoids in der Zusammensetzung wird im Allgemeinen in Einheiten von LF Diphtherie-Toxoid pro Einheit Masse des Proteinstickstoffs (nicht dialysierbar) ausgedrückt. Beispielsweise kann ein sehr reines Toxin/Toxoid eine Reinheit von mehr als 1700 Lf/mg haben, was darauf verweist, dass das meiste oder das gesamte Protein in der Zusammensetzung Diphtherie-Toxin/Toxoid ist [72].
Die immunisierende Potenz von Diphtherie-Toxoid in einer Zusammensetzung wird im Allgemeinen in Internationalen Einheiten (IU) ausgedrückt. Die Potenz kann gemessen werden, indem der Schutz, der durch eine Zusammensetzung bei Labortieren (üblicherweise Meerschweinchen) erzielt wurde, mit einem Referenzimpfstoff verglichen wird, der in IU-Einheiten kalibriert wurde. Das NIBSC stellt den ”Diphtheria Toxoid Adsorbed Third International Standard 1999” [73, 74] bereit, der 160 IU pro Fläschchen umfasst und zur Kalibrierung solcher Assays geeignet ist.
Ein Assay mit drei Verdünnungsschritten kann zur Bestimmung der Potenz der erfindungsgemäßen Zusammensetzung verwendet werden. Nach der Immunisierung werden die Meerschweinchen ausgeblutet oder mit Erreger in Kontakt gebracht, entweder subkutan oder intradermal. In einer alternativen Ausführungsform werden Mäuse anstelle von Meerschweinchen verwendet. Wenn Meerschweinchen oder Mäuse ausgeblutet werden, werden die Antitoxin-Mengen der einzelnen Tiere mittels Toxin-Neutralisationstests unter Verwendung von serologischen Verfahren in vivo oder in vitro titriert, welche an Impfstoffen validiert wurde, die hinsichtlich ihrer Art den getesteten Impfstoffen entsprechen. In einer Ausführungsform werden Diphtherie-Toxoide, die in Fermentationsmedium angezüchtet wurden, welches Bestandteile tierischen Ursprungs umfasste, zur Validation verwendet. Die Potenz der erfindungsgemäßen Zusammensetzung wird unter Verwendung geeigneter statistischer Verfahren berechnet. Für Assays mit drei Verdünnungsschritten sind die Grenzen für das 95%-Konfidenzintervalls der geschätzten Potenz innerhalb von 50–200% der geschätzten Potenz, es sei denn die untere Grenze des 95%-Konfidenzintervalls der geschätzten Potenz ist größer als 30 IU pro humaner Einzeldosis. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Potenz der erfindungsgemäßen Zusammensetzung mindestens 30 IU pro Einzeldosis. Wenn Tests mit einer Verdünnung angewendet werden, erweist sich die Potenz des Testimpfstoffs als signifikant größer als 30 IU pro humaner Dosis.
Allgemeines
Der Ausdruck ”umfassen” erstreckt sich auf ”beinhalten” und auch ”bestehen aus”, z. B. kann eine Zusammensetzung, die X ”umfasst” ausschließlich aus X bestehen oder etwas Zusätzliches enthalten, z. B. X + Y.
Der Ausdruck ”im Wesentlichen” schließt ”vollständig” nicht aus, z. B. kann eine Zusammensetzung, die ”im Wesentlichen frei” von Y ist, vollständig frei von Y sein. Wenn nötig kann der Begriff ”im Wesentlichen” bei der Definition der Erfindung weggelassen werden.
Das Wort ”etwa” bedeutet in Bezug auf einen numerischen Wert x z. B. x ± 10%.
Soweit nicht besonders erwähnt, erfordert ein Verfahren, bei dem zwei oder mehrere Bestandteile miteinander vermischt werden, keine spezifische Reihenfolge des Mischens. Dementsprechend können die Bestandteile in beliebiger Reihenfolge gemischt werden. Wenn drei Bestandteile vorhanden sind, können zwei Bestandteile miteinander kombiniert werden, und anschließend kann diese Kombination mit dem dritten Bestandteil vermischt werden, usw.
Wenn ein Antigen als an ein Adjuvans ”adsorbiert” beschrieben wird, ist es bevorzugt, dass mindestens 50% (Gewichts-%) dieses Antigens adsorbiert sind, z. B. 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, oder mehr. Es ist bevorzugt, dass das Diphtherie-Toxoid und HBsAb beide zu mindestens 90% adsorbiert sind, und idealerweise sind diese vollständig, d. h. keines ist nach der Zentrifugation im Überstand nachweisbar.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1: Flussdiagramm eines Fermentationsverfahrens gemäß der Erfindung
2: Chromatogramme der Diphtherie-Toxin-Lösung vor und nach Anionenaustausch-Chromatographie.
3: Chromatogramme der Diphtherie-Toxin-Lösung vor und nach Konzentration/Diafiltration.
4: Gel einer elektrischen Fokussierung für Proben Nrn. 1, 7, 15, 41, 47 und 55 im Vergleich zu Proben, die mit herkömmlichen Verfahren hergestellt wurden, bei denen das unaufbereitete Diphtherie-Toxin vor der Aufreinigung detoxifiziert wird.
5: Gel einer elektrischen Fokussierung für Proben Nrn. 1, 3, 9, 15, 41, 43, 49 und 55.
6: Gel einer elektrischen Fokussierung für Proben Nrn. 5, 25, 45, 11, 51, 17, 37 und 57.
7: Gel einer elektrischen Fokussierung für Proben Nrn. 7, 27, 47, 13, 53, 19, 39 und 59.
8: Gel einer elektrischen Fokussierung für Proben Nrn. 21, 23, 29, 31, 33 und 35 im Vergleich zu Toxin vor der Detoxifizierung, gepuffert bei pH 7 (Bahn 2) oder pH 8 (Bahn 9).
9: Chromatogramm von Proben mit einer Anfangskonzentration an Diphtherie-Toxin von 500 Lf/ml nach der Detoxifizierung mit 1% Formalin in Abwesenheit von Lysin oder in Gegenwart von 0,025 M Lysin.
10: Chromatogramm von Proben mit einer Anfangskonzentration an Diphtherie-Toxin von 2000 Lf/ml nach der Detoxifizierung mit 1% Formalin in Abwesenheit von Lysin oder in Gegenwart von 0,025 M Lysin.
11: Chromatogramm von Proben mit einer Anfangskonzentration an Diphtherie-Toxin von 5000 Lf/ml nach der Detoxifizierung mit 1% Formalin in Abwesenheit von Lysin oder in Gegenwart von 0,025 M Lysin.
12: Flussdiagramm eines Reinigungs- und Detoxifizierungsverfahrens gemäß der Erfindung.
AUSFÜHRUNGSARTEN DER ERFINDUNG
Beispiel 1: Herstellung einer an Eisen entreicherten Hefeextraktlösung
PTK Hefeextrakt wurde von der Ohly GmbH (Deutschland) erhalten und mittels eines Verfahrens aus Literaturstelle 11, das wie in den folgenden Abschnitten erläutert modifiziert wurde, an Eisen entreichert.
Durch Auflösung des kommerziell erhältlichen PTK Hefeextrakts in Wasser wurde eine Lösung hergestellt. Die Hefeextraktlösung wurde dann auf 60°C erhitzt, und es wurden Na₂HPO₄·H₂O und KH₂PO₄ zugegeben. Der pH der Lösung wurde durch Zugabe von Natriumhydroxid auf 9,3 eingestellt. Die Lösung wurde weiter auf 79°C erhitzt, und es wurde eine CaCl₂-Lösung zugegeben. Anschließend wurde die Lösung auf 85°C erhitzt und für 10 Min. inkubiert. Danach wurde die Hefeextraktlösung über 3 Stunden auf 25°C gekühlt.

Sämtliches Präzipitat, das sich gebildet hatte, wurde durch Zentrifugation entfernt. Der pH der an Eisen entreicherten Hefeextraktlösung wurde durch Zugabe von Essigsäure auf 8,4 eingestellt. Die Lösung wurde einer Ultrafiltration unterzogen und anschließend in einem Autoklaven für 90 Min bei 134°C sterilisiert. Die finale Zusammensetzung der an Eisen entreicherten Hefeextraktlösung wird in Tabelle 1 zusammengefasst. Tabelle 1: Zusammensetzung der an Eisen entreicherten Hefeextraktlösung

Bestandteil	Menge
PTK Hefeextrakt	102,48 g
Na₂HPO₄·2H₂O	5,02 g
KH₂PO₄	1,33 g
CaCl₂·2H₂O	4,21 g
Natriumhydroxid-Lösung	31,10 ml
Essigsäure-Lösung (100%)	13,96 ml
Wasser	Ad 1000 ml

Beispiel 2: Herstellung des Fermentationsmediums

Um das Fermentationsmedium herzustellen wurden dem an Eisen entreicherten Hefeextrakt in Wasser gelöstes Maltose-Monohydrat, Natriumlactat-Lösung, Wachstumsfaktor-Lösung, Wasser und L-Cystein-Lösung in der aufgeführten Reihenfolge zugefügt. In einem weiteren Schritt wurde Ammonium-Fe(III)-Citratlösung und Phosphatlösung (ebenfalls in der aufgeführten Reihenfolge) zugegeben. Die weitere Zugabe von Kalziumchloridlösung führte zur Präzipitation des Eisens und zur Bildung eines Eisen-enthaltenden Gels, welches das Eisen während des Bakterienwachstums langsam in das Fermentationsmedium abgab, ohne die Toxinproduktion zu inhibieren. In einem abschließenden Schritt wurde der pH des Fermentationsmediums durch Zugabe von 20% Essigsäurelösung oder 10% Ammoniumlösung, je nach Bedarf, auf 7,3 eingestellt. Die Zusammensetzung der Wachstumsfaktor-Lösung ist in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2: Zusammensetzung der Wachstumsfaktor-Lösung

Bestandteil	Menge
MgSO₄·7H₂O	225 g
β-Alanin	2,3 g
Pimelinsäure	150 mg
Nikotinsäure	4,6 g
CuSO₄·5H₂O	500 mg
ZnSO₄·7H₂O	500 mg
MnCl₂·4H₂O	240 mg
HCl 25%	2,6 ml
Wasser	Ad 1000 ml

Die finale Zusammensetzung des Fermentationsmediums ist in Tabelle 3 gezeigt. Nachdem alle Bestandteile zugefügt worden waren, wurde das Fermentationsmedium in einem Autoklaven für 90 Min bei 134°C sterilisiert. Das autoklavierte Fermentationsmedium wurde filtersterilisiert und bei 2°C bis 10°C gelagert. Tabelle 3: Bestandteilen des Fermentationsmediums

Bestandteil	Menge
PTK Hefeextrakt	34,38 g
Na₂HPO₄·2H₂O	1684,13 mg
KH₂PO₄	497,48 mg
CaCl₂·2H₂O	2,13 g
Natriumhydroxid-Lösung	10,43 ml
Essigsäure-Lösung (100%)	4,69 ml
Maltose-Monohydrat	49,68 g
Natriumlactat-Lösung	2,07 ml
MgSO₄·7H₂O	1,8 g
β-Alanin	18,41 mg
Pimelinsäure	1,20 mg
Nikotinsäure	36,83 mg
CuSO₄·5H₂O	4,00 mg
ZnSO₄·7H₂O	4,00 mg
MnCl₂·4H₂O	1,92 mg
HCl 25%	0,70 ml
L-Cystein-Lösung	280,19 mg
Ammonium Fe(III)-Citrat-Lösung	3,23 mg
K₂HPO₄·3H₂O	201,48 mg
Wasser	Ad 1000 ml

Beispiel 3: Herstellung von unbehandeltem Diphtherie-Toxin
Das Fermentationsmedium wurde mit Corynebacterium diphtheriae mit einer Arbeitssaatkultur inokuliert, um eine Vorkultur zu erhalten. Sowohl die Arbeitssaatkultur als auch das Stammsaatkultur wurden unter Verwendung des oben beschriebenen Fermentationsmediums hergestellt.
Ein Fermenter mit einer Gesamtkapazität von 300 L wurde mit Fermentationsmedium gefüllt und die Vorkultur wurde in das Fermentationsmedium verdünnt, um die Hauptkultur herzustellen. Die Hauptkultur wurde bei 36°C bei 560 UpM für 20 Stunden inkubiert. Danach wurde die Inkubation bei 620 UpM für weitere 24 Stunden fortgesetzt. Das Fermentationsverfahren erbrachte Diphtherie-Toxin in einer Konzentration von 200 LF/ml bis 250 LF/ml.
Das Kulturmedium wurde mittels Zentrifugation von den Bakterien getrennt, und der Kulturüberstand wurde durch eine Filterkaskade geleitet, die mit einem 0,5 μm Filter beginnt und mit einem 0,2 μm Filter endet. Dann wurde Citratpuffer zu der resultierenden unbehandelten Diphtherie-Toxin-Lösung hinzugefügt und auf eine finale Konzentration an Citrat von 5 mM eingestellt. Die Lösung wurde mittels Diafiltration gegen 5 Volumen 5 mM Citrat pH 6,5 unter Verwendung einer regenerierten Zellulose-Membran mit einem Ausschluss von 30 kDa konzentriert. Dies reduzierte das Volumen von etwa 300 L auf 50 L. Die zurückgehaltene, aufkonzentrierte Diphtherie-Toxin-Lösung wurde durch einen 0,2 μm Filter geleitet. Die resultierende sterile, auf konzentrierte Diphtherie-Toxin-Lösung wurde als ”Diphtherie-Toxin-Konzentrat 1” bezeichnet und bis zur weiteren Verwendung gelagert.
Vor der Aufreinigung wurde ein Pufferaustausch vorgenommen. Das Diphtherie-Toxin-Konzentrat 1 wurde gegen 5 Volumen 25 mM Tris-Puffer pH 7,5 unter Verwendung einer regenerierten Zellulose-Membran mit einem Ausschluss von 30 kDa diafiltiert. Die Tris-gepufferte Lösung wurde mittels Z-Kohlenstoff-Filtration filtriert und durch einen 0,2 μm Filter geleitet. Die resultierende sterile, Tris-gepufferte Diphtherie-Toxin-Lösung wurde als ”Diphtherie-Toxin-Konzentrat 2” bezeichnet.
Ein Flussdiagramm des in Beispiel 3 beschriebenen Verfahrens ist in 1 dargestellt.
Beispiel 4: Aufreinigung des unbehandelten Diphtherie-Toxins
Um das unbehandelte Diphtherie-Toxin, das in einem wie oben im vorhergehenden Beispiel beschriebenem Fermentationsmedium hergestellt wurde, weiter aufzureinigen, wurde eine Anionenaustausch-Chromatographie verwendet. 50 L Ausbeute konnten reproduzierbar unter Verwendung des unten beschriebenen Verfahrens gereinigt werden.
Das Diphtherie-Toxin-Konzentrat wurde auf eine Factogel-EMD-TMAE-Anionenaustausch-Gelmatrix-Säule geladen, die von Merck Chemicals erhalten wurde. Das gereinigte Diphtherie-Toxin wurde mit 25 mM Tris/90 mM NaCl-Puffer pH 7,5 eluiert. 80% des auf die Säule geladenen Proteins konnten durch einen einfachen Elutionsschritt einem mit NaCl-Puffer wieder gewonnen werden. Das Anfangsvolumen von 50 L an unbehandelter Diphtherie-Toxin-Lösung wurde auf 10 L gereinigte Diphtherie-Toxin-Lösung verringert. Das Eluat von der Anionenaustausch-Chromatographie-Säule war zu über 85% rein. Ein repräsentatives Chromatogramm der Diphtherie-Toxin-Lösung vor Beladung auf und nach Elution von der Anionenaustausch-Chromatographie-Säule wird in 2 gezeigt.
Anschließend wurde das Eluat in 0,1 M Natriumphosphat pH 7,5 diafiltriert, um eine stärker konzentrierte und gepufferte Diphtherie-Toxin-Lösung mit einer Reinheit von mehr als 90% zu erhalten. Ein repräsentatives Chromatogramm der Diphtherie-Toxin-Lösung vor und nach Diafiltration ist in 3 gezeigt.
Beispiel 5: Herstellung geeigneter Detoxifizierungsbedingungen
Das vorliegende Beispiel beschreibt Experimente zur Bestimmung von Detoxifizierungsbedingungen, die ein irreversibel detoxifiziertes Diphtherie-Toxin (das so genannte Diphtherie-Toxoid) bereitstellen, das nach 6 Wochen Lagerung bei 37°C keine erneute Toxifizierung zeigt.
Das in Beispiel 4 hergestellte, gereinigte Diphtherie-Toxin wurde gegen PBS bei pH 7,0, 7,5 und 8,0 dialysiert. Die Toxinkonzentration wurde mittels Trübungsassay und Flockungsassay bestimmt. Die Ergebnisse beider Assays werden in Tabelle 4 zusammengefasst. Tabelle 4: Ergebnisse des Trübungs- und Flockungsassays

pH Trübungsassay [Lf/mL] Flockungsassay [Lf/mL]

7,0 1528 1071

7,5 1564 1071

8,0 3728 2500
A. Bestimmung geeigneter Formaldehyd- und Lysinkonzentrationen

Für jeden pH wurde Diphtherie-Toxin, entsprechend 500 Lf/mL, mit einer bestimmten Menge von 1 M Lysin gemischt (pH angepasst und steril filtriert), um 5 ml Proben zu erhalten mit 0 M, 0,025 M, 0,05 M und 0,1 M Lysin zu erhalten. Die Detoxifizierung wurde durch die Zugabe von 12,5 μl (0,25%) Formaldehyd (FA) 40% für 2, 3 oder 4 Tage durchgeführt. Insgesamt wurden 30 Formylierungsbedingungen in Doppelansätzen untersucht (siehe Tabelle 5). Tabelle 5: Experimenteller Aufbau und Probenbezeichnung

Lysin-Konzentration	pH 7,0		pH 7,5		pH 8,0		Formalingehalt
0 M	1	2	21	22	41	42	0,50%
0,025 M	3	4	23	24	43	44	0,50%
	5	6	25	26	45	46	0,75%
	7	8	27	28	47	48	1,00%
0,05 M	9	10	29	30	49	50	0,50%
	11	12	31	32	51	52	0,75%
	13	14	33	34	53	54	1,00%
0,1 M	15	16	35	36	55	56	0,50%
	17	18	37	38	57	58	0,75%
	19	20	39	40	59	60	1,00%

Die 60 Proben wurden bei 37°C ohne Bewegung für 6 Wochen gelagert und anschließend mit vier Wechseln mittels eines Slide-A-Lyzers (mit einem Molekulargewichtsausschuss von 10,000) gegen 1 L NaCl-Lösung (8,5 g/L NaCl) dialysiert und steril filtriert. Alle analytischen Messungen (siehe unten) wurden an diesem Material durchgeführt.
Erneute Toxifizierung
Basierend auf den Ergebnissen eines Diphtherie-Trübungsassays wurde jede Probe mit NaCl-Lösung (8,5 g/L NaCl) auf 50 Lf/ml (pädiatrischer Impfstoff) bzw. 3 Lf/ml (Erwachsenen-Impfstoff) verdünnt und bei 37°C für weitere 6 Wochen gelagert. Nach 3 und 6 Wochen wurde ein Verozellen-Test durchgeführt, um die Toxizität der Diphtherie-Toxin-Zubereitung zu bestimmen.
Verozellen-Test
Um das Vorhandensein von restlichem Diphtherie-Toxin nach der Toxifizierung sowie nach dem Retoxifizierungszeitraum zu bestimmen, wurde ein Verozellen-Test entwickelt. Verozellen wurden mit verschiedenen Probenverdünnungen für 72 Stunden inkubiert. Anschließend wurde die Lebensfähigkeit der Zellen mikroskopisch untersucht und mittels eines 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium-Bromid (MTT)-Assays quantifiziert. MTT wird zu in lebenden Zellen zu lilafarbenem Formazan. Alternativ dazu wurde Kristallviolett zu der Verozellen-Kultur zugefügt, um tote Zellen nachzuweisen. Der Metabolismus der Verozellen wurde durch weniger als 0,001 mLf/ml Toxin inhibiert.
Es konnte weder nach der Detoxifizierung noch während der 3 und 6 und Wochen der Retoxifizierungsbedingungen Toxin nachgewiesen werden. Es kann festgestellt werden, dass alle getesteten Formylierungsbedingungen, selbst diejenigen ohne Lysin, ein irreversibles Toxoid erzeugten.
Um die Wirksamkeit der verschiedenen Detoxifizierungsbedingungen zu unterscheiden, wurde eine Reihe weiterer analytischer Verfahren angewendet.
Aminosäure-Analyse
In nicht-hydrolysierten Proben Nrn. 3, 5, 7, 9, 13, 15, 19 und 47 wurde kein nachweisbares Lysin entdeckt, was darauf verweist, dass die Dialyse sehr wirksam war. Der Lysingehalt nach der Dialyse wurde nicht bestimmt.
HPLC-SEC
Eine Größenausschluss-Chromatographie (SEC) mittels von TSK 3000 SWXL-Säulen wurde durchgeführt, um die molekulare Gewichtverteilung der Toxoide zu prüfen. Die Chromatogramme sahen für alle Proben sehr ähnlich aus mit einem Haupt-Monomer-Peak (83–95%), der nach etwa 19 Min. eluierte, und einem kleineren Dimer-Peak (5–17%) bei 17 Min.

In Übereinstimmung mit der Literatur führte die FA-Behandlung zu lediglich kleinen Mengen an Diphtherie-Dimeren. Neben den Ähnlichkeiten wurden aber auch kleinere Unterschiede in den Retentionszeiten und dem Grad der Dimerisierung beobachtet (siehe Tabellen 6 und 7). Im Allgemeinen führten höhere FA-Konzentrationen und geringere Lysin-Konzentrationen zu geringeren Retentionszeiten des Hauptpeaks, was einem höheren molekularen Gewicht des Monomers entsprach. Das bedeutet: je stärker die FA-Behandlung, umso höher ist der Grad an Formylierung. Tabelle 6: HPLC-SEC/Retentionszeit des Hauptpeaks [Min., fett]

Lysin Konzentration	pH 7,0		pH 7,5		pH 8,0		Formalingehalt
0 M	1	2 19,65	21	22 19,50	41	42 19,43	0,50%
0,025 M	3	4 19,37	23	24 19,36	43	44 19,37	0,50%
	5	6 19,23	25	26 19,32	45	46 19,23	0,75%
	7	8 19,47	27	28 19,08	47	48 19,12	1,00%
0,05 M	9	10 19,40	29	30 19,33	49	50 19,40	0,50%
	11	12 19,35	31	32 19,27	51	52 19,37	0,75%
	13	14 19,13	33	34 19,20	53	54 19,22	1,00%
0,1 M	15	16 19,72	35	36 19,67	55	56 19,62	0,50%
	17	18 19,65	37	38 19,50	57	58 19,58	0,75%
	19	20 19,47	39	40 19,37	59	60 19,52	1,00%

Tabelle 7: HPLC-SEC/Grad an Dimerisierung [%, fett]

Lysin Konzentration	pH 7,0		pH 7,5		pH 8,0		Formalingehalt
0 M	1	2 12,2	21	22 13,6	41	42 13,0	0,50%
0,025 M	3	4 9,4	23	24 11,0	43	44 9,2	0,50%
	5	6 9,8	25	26 8,7	45	46 7,7	0,75%
	7	8 8,6	27	28 7,6	47	48 7,9	1,00%
0,05 M	9	10 10,2	29	30 11,0	49	50 7,2	0,50%
	11	12 9,6	31	32 9,2	51	52 5,7	0,75%
	13	14 8,9	33	34 9,3	53	54 4,4	1,00%
0,1 M	15	16 10,7	35	36 16,6	55	56 9,8	0,50%
	17	18 9,4	37	38 13,5	57	58 9,4	0,75%
	19	20 9,2	39	40 9,5	59	60 7,6	1,00%

Der Einfluss von Lysin war aufgrund der größeren Variation dieses Parameters deutlicher als der von FA. In dem getesteten Bereich schien der pH keinen Einfluss zu haben.
Proben, denen Lysin fehlte, verhielten sich nicht gemäß den allgemeinen Tendenzen. Sie zeigten längere Elutionszeiten und höhere Mengen an Dimeren im Vergleich zu denen mit 0,025 M Lysin. In Gegenwart von Lysin erzeugt FA vorzugsweise N-Hydroxymethyliertes Lysin. Dieses Zwischenprodukt scheint eine bessere Reaktivität mit dem Toxin aufzuweisen als FA alleine, was die bessere Formylierung und die verringerte Dimerisierung erklärt.
Bei Betrachtung der Proben Nr. 2, 3, 7, 15 und 47 auf einer Superdex 200 HR-Säule zeigten sich die gleichen Tendenzen. Die Formylierung funktionierte mit 1% FA 40% und 0,025 M Lysin am besten.
IEF
Eine isoelektrische Fokussierung (IEF) wurde verwendet, um das Ausmaß der FA-Behandlung zu bewerten. Da FA mit positiv geladenen Aminosäuregruppen reagiert, werden saure Gruppen bedeutender. Infolgedessen sinkt der pI-Wert.

Die ausgewählten Proben Nrn. 1, 7, 15, 41, 47 und 55 wurden getestet (siehe 4). Da ein ziemlich großer Unterschied im chromatographischen Verhalten deutlich wurde, wurden alle 30 Proben auf ihren pI-Wert hin untersucht (siehe 5–8). Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Tabelle 8 zusammengefasst. Tabelle 8: pI-Bereich von verschiedenen Diphtherie-Toxoiden

Probenbeschreibung	pI-Bereich
Toxoide aus herkömmlicher Herstellung	4,8–3,5
Neue Detoxifizierung, ohne Lysin	4,8–4,0
Neue Detoxifizierung, mit 0,025 M Lysin	5,0–4,1
Neue Detoxifizierung, mit 0,05 M Lysin	5,2–4,3
Neue Detoxifizierung, mit 0,1 M Lysin	5,4–4,4
CRM, Potenztest nicht bestanden	5,4–4,6

Je stärker die FA-Behandlung angewandt wurde (durch hohe FA-Konzentrationen und geringe Lysin-Konzentrationen erreicht), umso niedriger war der pI-Wert, was mit theoretischen Überlegungen übereinstimmte. Der Einfluss von Lysin war wiederum deutlicher als der von FA, und es wurde keine pH-Abhängigkeit beobachtet.
Alle Proben, die kein Lysin oder nur 0,025 M Lysin enthielten, zeigten einen pI-Bereich, der mit dem von Toxoiden aus herkömmlichen Herstellungsverfahren, bei denen das unbehandelte Diphtherie-Toxin erst detoxifiziert wird, bevor das Toxoid aufgereinigt wird, vergleichbar war. Nur ihr Bereich war kleiner, was eventuell die höhere Reinheit des Anfangsmaterials widerspiegelt.
Höhere Lysin-Konzentrationen führten jedoch zu einem geringeren Grad an Formylierung. Das Muster des pI-Werts ähnelte dem einer misslungenen CRM-Probe, was die Vermutung aufkommen ließ, dass Proben mit einem hohen pI-Wert den Potenztest nicht bestehen könnten.
Schlussfolgerung
In dem untersuchten Bereich waren alle Diphtherie-Toxin-Proben detoxifiziert und zeigten nach 6 Wochen Lagerung bei 37°C keine erneute Toxifizierung. Sowohl HPLC- als auch IEF-Untersuchungen ergaben, dass Formylierung am besten mit 1% FA 40% und 0,025 M Lysin funktionierte.
Obwohl auch Proben ohne Lysin gleichermaßen gut detoxifiziert waren, scheint eine geringe Menge an Lysin vorteilhaft zu sein, um nur einen geringen Grad an Dimerisierung zu erreichen.
B. Festlegung von geeigneten Diphtherie-Toxin-Konzentrationen und Detoxifizierungszeit

Sowohl die Detoxifizierung bei höheren Toxin-Konzentrationen (500–5000 Lf) als auch bei längeren Detoxifizierungszeit (14, 28 und 42 Tage) wurden untersucht. Gereinigtes Diphtherie-Toxin-Konzentrat (12500 Lf/ml, 20 mmol/L) wurden in 0,1 mol/L Phosphat-Puffer verdünnt und mittels Filtration sterilisiert. Die finale Toxin-Konzentration und die Zusammensetzung der Probe sind in Tabelle 9 gezeigt. Tabelle 9: Zusammensetzung der Proben 1–12

Probe Nr.	Diphtherie-Toxin [Lf/mL]	Lysin [M]	Formalin [%]
1	500	0	1
2	2000	0	1
3	5000	0	1
4	500	0,025	1
5	1000	0,025	1
6	2000	0,025	1
7	3000	0,025	1
8	5000	0,025	1
9	2000	0,025	2
10	2000	0,050	2
11	2000	0,025	4
12	2000	0,100	4

Für jede Probe wurde ein Volumen von 100 mL vorbereitet. 2, 4 und 6 Wochen nach der Zugabe von Formaldehyd wurden 5 mL jeder Probe entnommen, dialysiert (mit Ausnahme bei der Bestimmung der Konzentration an freiem Formaldehyd) und analysiert.

Die Ergebnisse des Trübungstests nach 12, 28 und 42 Tagen sind in Tabelle 10 gezeigt. Tabelle 10: Ergebnisse des Trübungstests nach der Dialyse

Probe Nr.	Theoretischer Wert [Lf/mL]	14 Tage [Lf/mL]	28 Tage [Lf/mL]	42 Tage [Lf/mL]
1	500	216	276	244
2	2000	1454	1354	1196
3	5000	4493	3014	3058
4	500	492	478	374
5	1000	1097	1066	946
6	2000	2236	2016	2035
7	3000	3089	3170	2860
8	5000	5158	5980	5736
9	2000	2080	1939	2285
10	2000	2028	2184	2215
11	2000	1830	1716	1716
12	2000	2010	1792	1980

Die Proben, die mit Formaldehyd und Lysin detoxifiziert worden waren, zeigten keinen Verlust der Aktivität (LF/ml), nicht mal nach 42 Tagen. Proben ohne Lysin zeigten geringere Lf/mL-Werte als vergleichbare Proben mit Lysin. Der größte Aktivitätsverlust trat nach 14 Tagen auf. Nach 28 und 42 Tagen nahm die Aktivität nur geringfügig ab.

Alle Proben wurden mit dem oben beschriebenen Verozellen-Test auf eine Resttoxizität untersucht und mit gereinigtem Toxin und einem Standard verglichen. Die Proben ergaben ED₅₀-Werte zwischen 100 und 300 Lf/mL, die 10^–5 bis 10^–6 mal höher sind als die Werte für die Toxins. Mittels herkömmlicher Verfahren hergestelltes Diphtherie-Toxoid liefert Werte zwischen 50–500 Lf/mL. Es wurde keine Zeitabhängigkeit des Detoxifizierungsverfahrens beobachtet. Es scheint, als ob die Detoxifizierung nach 14 Tagen abgeschlossen war. Die Ergebnisse des Verozellen-Assays für die Proben 1–12 sind in Tabelle 11 zusammengefasst. Tabelle 11: Ergebnisse des Toxizitäts-Assays bei Verwendung von Verozellen

	14 Tage 50% Wert [Lf/mL]	28 Tage 50% Wert [Lf/mL]	42 Tage 50% Wert [Lf/mL]
1	167,20	146,74	238,44
2	187,19	192,86	174,16
3	391,50	176,66	260,2
4	138,66	122,95	135,03
5	203,20	165,04	200,06
6	206,27	140,82	241,65
7	231,74	200,30	259,97
8	217,26	196,18	308,04
9	149,81	184,65	306,23
10	128,67	167,13	231,52
11	164,14	151,70	239,53
12	116,40	128,29	190,53
Standard	0,00031	0,00017	0,00071
Standard	0,00045	0,00162	0,00041
Toxin	0,00055	0,00665	0,01234
Toxin	0,00168	0,00682	0,00046

Dieses Ergebnis wird auch durch die Ergebnisse gestützt, die nach Bestimmung von freiem Formaldehyd erhalten wurden. Nach 14 Tagen Detoxifizierung zeigten alle Proben eine geringere Konzentration an freiem Formaldehyd als die ursprüngliche Konzentration, wobei jedoch im Verlauf der folgenden 30 Tage kein weiteres Formaldehyd verbraucht wurde. Die Ergebnisse des Assays zur Bestimmung der Konzentration an freiem Formaldehyd in den Proben 1–12 vor Dialyse sind in Tabelle 12 zusammengefasst. Tabelle 12: Konzentration an freiem Formaldehyd

	Theoretischer Anfangswert	14 Tage [g/l]	28 Tage [g/l]	42 Tage [g/l]
1	3,8	3,6	3,0	3,6
2	3,8	3,5	2,9	3,4
3	3,8	3,2	2,7	3,3
4	3,8	2,4	1,9	2,0
5	3,8	2,3	1,9	1,9
6	3,8	2,2	1,9	1,9
7	3,8	2,4	1,8	1,8
8	3,8	2,0	1,6	1,7
9	7,6	4,8	4,2	4,4
10	7,6	3,2	3,1	2,6
11	15,2	11,9	10,7	11,7
12	15,2	7,3	6,2	6,3

Die Analyse der Proben mittels SEC zeigte ebenfalls keine weitere Reaktion nach 14 Tagen Detoxifizierung (siehe 9–11). Die SEC-Analyse zeigte eindeutig den Einfluss von höheren Toxin-Konzentrationen während der Detoxifizierung in Gegenwart und in Abwesenheit von Lysin. Je höher die Toxin-Konzentration war, desto höher war der Anteil an Dimeren und Multimeren (siehe 9–11). Die Dimer- und Multimerbildung wurde in Gegenwart und in Abwesenheit von Lysin beobachtet. Lysin inhibierte jedoch die Vernetzungsreaktion erheblich, wodurch wesentlich weniger Dimer gebildet wurden als in der Abwesenheit von Lysin (33% Dimere in Abwesenheit von Lysin vs. 10% in Anwesenheit von 0,025 mM Lysin bei 2000 LF/mL; siehe Tabelle 11, Proben 2 und 6). Der prozentuale Anteil an Dimeren in jeder der Proben 1–12 ist in Tabelle 13 gezeigt. Tabelle 13: prozentualer Anteil an Dimeren

	14 Tage Dimer [%]	28 Tage Dimer [%]	42 Tage Dimer [%]
1	9	10	12
2	28	32	33
3	51	56	58
4	2	2	2
5	5	5	5
6	10	10	10
7	14	14	15
8	23	23	24
9	9	9	10
10	9	8	8
11	9	10	10
12	9	9	9

Bei Anschluss eines Lichtstreudetektors an die SEC zur Betrachtung des molekularen Gewichts der getrennten Peaks konnte bestätigt werden, dass der Hauptpeak das Monomer mit einem Molekulargewicht von ca. 60 kDa war. Die kleineren Peaks waren Dimere von 120 kDa, und in einigen Proben konnten Trimere mit 180 kDa oder sogar Multimere nachgewiesen werden.
Beispiel 6: Potenz des mittels des neuen Verfahrens hergestellten Diphtherie-Toxoids
Potenzstudien wurden gemäß den Anforderungen der European Pharmacopoeia (1997, 3. Auflage, Council of Europe, Strasburg, Frankreich, Assay of diphtheria vaccine (adsorbed), S. 113–115), durchgeführt.
Das unbehandelte Diphtherie-Toxin wurde wie in den vorherigen Beispielen beschrieben hergestellt. Um das unbehandelte Diphtherie-Toxin weiter zu reinigen und zu detoxifizieren, wurde das in Beispiel 4 beschriebene Aufreinigungsverfahren mit dem in Beispiel 5 beschriebenen optimierten Detoxifizierungsverfahren kombiniert, was zu dem kombinierten Verfahren führte, welches in 12 dargestellt ist.
Das Diphtherie-Toxin wurde mittels Anionenaustausch-Chromatographie wie oben beschrieben gereinigt. Die Toxin-Konzentration des Eluats wurde auf 5000 Lf/mL eingestellt. Die konzentrierte Diphtherie-Toxin-Lösung wurde in Phosphat-Puffer pH 7,5 durch die Zugabe von FA (40% Lösung) in einer finalen Konzentration von 1% in Gegenwart von 0,025 M Lysin (Endkonzentration) wie in Beispiel 5 beschrieben detoxifiziert. Das erhaltene Diphtherie-Toxoid wurde verdünnt und anschließend an Aluminiumhydroxid adsorbiert. Die Zusammensetzung der finalen Impfstoffformulierungen ist in Tabelle 14 gezeigt.

Die Potenz der Impfstoffformulierungen wurde getestet. Pädiatrische Impfstoffe bestehen den Potenztest, wenn die untere Konfidenzgrenze mindestens 30 I.U./Dosis ist. Die Ergebnisse der Potenzstudien sind in Tabelle 14 gezeigt. Tabelle 14: Zusammensetzung der Impfstoffformulierungen und Daten zum Potenztest

Probe	Diphtherie-Toxin [Lf/mL]	Tetanus-Toxin [Lf/mL]	IPV	Al(OH)₃ [mg/mL]	Osmolarität [mosm/kg]	pH	Potenz [I.E./Dosis]
D-Impfstoff (pädiatrisch)	50	-	-	3,24	266	6,20	39 bestanden
D-Impfstoff (pädiatrisch)	50	-	-	3,15	267	6,40	48 bestanden
D-Impfstoff (pädiatrisch)	50	-	-	3,15	267	6,40	35 bestanden
Td-IPV (für Erwachsene)	4	10	80/16/64	1,95	290	6,86	5 bestanden
Dt-Impfstoff (pädiatrisch)	34	20	-	3,28	271	6,37	33 bestanden
DT-Konzentrat*	167	67	-	7,36	314	6,30	39 bestanden

* für den Potenztest wurde das Konzentrat auf 50 Lf/ml Diphtherie-Toxin und 30 Lf/mL Tetanus-Toxin verdünnt.

Beispiel 7: Analyse der Diphtherie-Toxoid-Zusammensetzung
Eine Zusammensetzung, die nach dem in 12 gezeigten Verfahren hergestelltes Diphtherie-Toxoid umfasst, wurde bei +2–8°C für 0, 6 und 12 Monate gelagert. Während des gesamten Herstellungsverfahrens wurden der Zusammensetzung keine Konservierungsmittel zugefügt. Nach jedem Zeitpunkt wurden Aliquots der Proben für die Potenzuntersuchung, die Reinheitsanalyse, den Flockungsassay, die HPLC-Analytik, die pH-Messung, die Toxizitäts- und Sterilitätsprüfung sowie für die chemische Analyse des Gehalts an freiem Lysin, Formaldehyd, Natriumchlorid, Sulfat und Phosphat verwendet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 15 zusammengefasst.

Zu jedem Zeitpunkt übertraf die Zusammensetzung die Anforderungen für Reinheit und Potenz erheblich. Die Restkonzentration an Formaldehyd war ebenfalls unter der erlaubten Grenze von 0,2 mg/ml. Tabelle 15: Stabilitätsdaten und Zusammensetzung

Test Items	Anforderungen	Lagerungszeit (Monate)
Test Items	Anforderungen	0	6	12
Potenz Diphtherie *e. p. (I. U./ml) 1,1-u.1	1,1 >= 2,0	10 6–15	10 8–14
Stickstoff antigenische Reinheit (Lf/mg N)	>= 1500	2710	2740	2128
Stickstoff antigenische Reinheit (Lf/mg N)/neues Verfahren	>= 1500	2865	2825	2279
Lf Gehalt (Lf)	-	10000	10000	8000
Stickstoff erster Test (mg/ml)	Berechnung von Lf/mgN und Lf	3,69	3,65	3,76
Stickstoff zweiter Test (mg/ml)/neues Verfahren	Berechnung von Lf/mgN und Lf	3,49	3,54	3,51
Lysingehalt (nmol/ml)	<= 550	555	n. t.	876
HPLC analytisch	-	erfüllt Maßg.	erfüllt Maßg.	erfüllt Maßg.
pH	7,2–7,8	7,54	7,7	7,7
Natriumchlorid (mg/ml)	8–9	7,94	8,0	7,95
Formaldehyd (mg/ml)	<= 0,2	0,100	0,143	0,163
Phosphat (μg/ml)	<= 15	<= 0,10	0,10	<= 0,10
Sulfat	nicht messbar	erfüllt Maßg.	erfüllt Maßg.	erfüllt Maßg.
Abnormale Toxizität Negativtest	gemäß Ph. Eur	erfüllt Maßg.	erfüllt Maßg.	erfüllt Maßg.
Toxizität (Überleben von 5)	5 (keine Toxizität)	5	5	5
Sterilitätstest	gemäß Ph. Eur	erfüllt Maßg.	erfüllt Maßg.	erfüllt Maßg.

e. p. = geschätzte Potenz (estimated potency)
erfüllt Maßg. = erfüllt Maßgabe (meets specification)
n. t. = nicht untersucht (not tested)
L.1 = Untergrenze-Obergrenze (lower limit-upper limit)
* = die Potenz wird als Prä-Impfstoff–Zusammensetzung wie adsorbierter Diphtherie–Impfstoff für Erwachsene bestimmt

Es wird verständlich sein, dass die Erfindung lediglich beispielhaft beschrieben wurde und dass Modifikationen gemacht werden können, solange diese sich innerhalb des Bereichs und des Grundgedanken der Erfindung bewegen.
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Claims

Verfahren zur Herstellung eines Diphtherie-Toxoids, bei dem man: (i) einen Stamm von Corynebacterium diphtheriae, der ein Diphtherie-Toxin exprimiert, in einem Fermentationsmedium anzüchtet; (ii) das Diphtherie-Toxin aus dem Fermentationsmedium abtrennt, um eine Diphtherie-Toxin-Lösung zu erhalten; (iii) aus der Diphtherie-Toxin-Lösung ein Diphtherie-Toxin-Konzentrat mit einer Konzentration des Diphtherie-Toxins von mindestens 2000 Lf/mL herstellt; (iv) zu dem Konzentrat eine Aminosäure und Formaldehyd zugibt; und (v) das Konzentrat in Gegenwart der Aminosäure und des Formaldehyds inkubiert, um das Diphtherie-Toxoid zu erhalten.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem man ferner das Diphtherie-Toxoid für die Lagerung aufkonzentriert.
Verfahren gemäß Anspruch 2, bei dem die Konzentration des Diphtherie-Toxoids mindestens 5000 Lf/mL beträgt.
Verfahren zur Herstellung eines Diphtherie-Toxoids, bei dem man: (i) einen Stamm von Corynebacterium diphtheriae, der ein Diphtherie-Toxin exprimiert, in einem Fermentationsmedium anzüchtet, vorzugsweise in einem Volumen von mindestens 100 Litern und/oder um eine Ausbeute von mindestens 140 Lf/mL Toxin/Derivat zu erhalten; (ii) das Diphtherie-Toxin aus dem Fermentationsmedium abtrennt, um eine Diphtherie-Toxin-Lösung zu erhalten; (iii) aus der Diphtherie-Toxin-Lösung ein Diphtherie-Toxin-Konzentrat herstellt, wobei die Konzentration des Diphtherie-Toxins oder des Derivats in dem Konzentrat mindestens 20-fach höher liegt als die Konzentration des Diphtherie-Toxins oder des Derivats im Fermentationsmedium, welches am Ende von Schritt (i) erhalten wird oder in der Toxin-Lösung, welche am Ende von Schritt (ii) erhalten wird; (iv) zu dem Konzentrat eine Aminosäure und Formaldehyd zugibt; und (v) das Konzentrat aus Schritt (iv) inkubiert, um das Diphtherie-Toxoid zu erhalten.
Verfahren gemäß Anspruch 4, bei dem die Konzentration des Diphtherie-Toxins oder des Derivats in dem Konzentrat in Schritt (iii) zwischen 20-fach und 36-fach höher liegt als die Konzentration des Diphtherie-Toxins oder des Derivats im Fermentationsmedium.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Konzentration der zur Detoxifizierung zugegebenen Aminosäure nicht mehr als 0,1 M beträgt.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Konzentration des zur Detoxifizierung zugegebenen Formaldehyds im Bereich von 0,5% und 1% liegt.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Fermentationsmedium frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs ist und eine Stickstoffquelle, eine Kohlenstoffquelle, einen Eisenzusatz, Phosphor und Wachstumsfaktoren umfasst, wobei die Stickstoffquelle wahlweise ein Hefeextrakt ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Diphtherie-Toxin in Schritt (ii) des Verfahrens auf mindestens 1500 Lf/mg Stickstoff aufgereinigt wird.
Formaldehyd-vernetztes Diphtherie-Toxoid, das durch das Verfahren von Anspruch 9 erhältlich ist, und das frei von Formaldehyd-vernetzten Proteinen und/oder Peptiden tierischen Ursprungs ist, eine spezifische Reinheit von mindestens 1500 Lf/mg Stickstoff aufweist, und eine Potenz von mindestens 60 IU/ml aufweist.
Zusammensetzung, die für die Impfung von Menschen geeignet ist und das Diphtherie-Toxoid von Anspruch 10 umfasst.