NL7807532A

NL7807532A - Metaal-immunotest.

Info

Publication number: NL7807532A
Application number: NL7807532A
Authority: NL
Original assignee: Akzo Nv
Priority date: 1978-07-13
Filing date: 1978-07-13
Publication date: 1980-01-15
Also published as: ES482488A1; PT69900A; EP0007654B1; AU530217B2; DE2962333D1; FI77120C; DK159799C; US4313734A; AU4883479A; CA1135183A; DK295679A; IL57722A0; ZA793276B; ATE786T1; PH16420A; IE48467B1; IE791315L; GR73524B; EP0007654A1; IL57722A

Description

i* 1 -^¾ OA/7622-015 Douma >"

Akzo N.V. te Arnhem Titel: Metaal-Immunotest

De uitvinding heeft betrekking op een methode voor de kwalitatieve, en kwantitatieve bepaling van een immunologische component, zoals een hapteen, antigeen of anti-lichaam, in een waterig medium onder gebruikmaking van 5 de immunologische reactiviteit van dergelijke componenten ten opzichte van elkaar.

Er is een groot aantal immunochemische methoden bekend, waarbij de aanwezigheid van een bepaalde immunologische component kwalitatief en/of kwantitatief wordt 10 vastgesteld onder gebruikmaking van de onderlinge reacties tussen dergelijke componenten, zoals de reactie tussen antigeen en de daartegen gerichte antistof of antilichaam.

Bij de bestudering van dergelijke reacties voor 15 het aantonen en/of bepalen van de gewenste component kan men gebruik maken van hulpmiddelen, bijvoorbeeld fysische hulpmiddelen zoals een electronenmicroscoop, of men kan gebruik maken van een .reagens, dat voorzien is van een merkstof of label, die bepaald resp. aangetoond 20 kan worden in een lagere concentratie dan het gevormde immunocomplex zelf.

Als voorbeelden van de eerste categorie van immunochemische'technieken kunnen worden genoemd de in 1948 door Ouchterlony ontwikkelde immunodiffusie, 25. de daarop in 1953 door Grabar ontwikkelde variant, immuno-electroforese, en de door Mancini in 1965 ontwikkelde radiale immunodiffusie.

De immunodiffusie techniek bestaat hierin, dat men een dunne agarlaag aanbrengt op een glazen plaat, 30 waarna in de gel twee gaten worden gemaakt op enige afstand van elkaar. De testvloeistof met antigeen wordt gebracht in één der gaten, en een antiserum in het andere.

^ 7807532 \ / ' - 2 - ,, fc

Door diffusie van beide stoffen in de gel ontmoeten deze elkaar en vormen een zichtbare precipitatielijn. Alhoewel deze methode tamelijk eenvoudig is, heeft deze een aantal nadelen, met name, dat de diffusie 5 vrij lang duurt en dat de resultaten gewoonlijk slechts een kwalitatieve indicatie geven. Ook de andere immuno-chemische technieken hebben hun bezwaren, die behalve specifieke nadelen, in het algemeen bestaan uit een te lange tijdsduur van de test, een geringe gevoeligheid, 10 en/of het verkrijgen van slechts kwalitatieve aanwijzingen.

Naast deze niet-gelabelde immunochemische technieken is er in de loop der jaren een aantal gelabelde technieken ontwikkeld, waartoe kunnen worden genoemd 15 de haemagglutinatie test, waarbij één der componenten wordt gehecht aan het oppervlak van erythrocyten; de techniek van immunofluorescentie, waarbij één der componenten wordt gemerkt met een fluorescerende verbinding (fluorofoor); de door Yalow en Berson 20 rondom 1959 ontwikkelde radio-immunologische bepaling, waarbij in plaats van een fluorofoor een radio-actief atoom of radio-actieve groep als merkstof wordt toegepast; en de meest recente techniek van enzym-immunologische bepaling, waarover in 1971 de eerste publi-25 caties verschenen van twee onafhankelijk van elkaar werkende groepen, nl. de Zweedse onderzoekers Engvall en Perlmann en de Nederlanders Schuurs en van Weemen. Laatstgenoemde bepaling is in principe analoog aan de bekende radio-immunologische bepalingen met dit 30 verschil, dat in plaats van een radio-actieve merking een enzym als label wordt toegepast.

De veelvuldig toegepaste radio-immunologische bepaling heeft ontegenzeggelijk grote verdiensten, maar er kleven toch een aantal belangrijke bezwaren 35 aan deze methode, zoals de risicofactor vanwege het werken met radio-actief materiaal, de hoge kosten van „ 7807532 r\ \

V

A

- 3 - < reagentia en apparatuur, de korte houdbaarheid van radio-actief gelabelde reagentia, en de vereiste, dat slechts gekwalificeerd personeel deze bepalingen kan verrichten.

5 De enzym-immunologische bepalingsmethode bezit deze nadelen niet, maar niettemin is hét gewenst, dat nieuwe bepalingstechnieken worden ontwikkeld, die nog gevoeliger zijn, sneller kunnen worden uitgevoerd, gemakkelijker geautomatiseerd kunnen worden, en/of 10 die bepalingen van meerdere immunocomponenten tegelijkertijd mogelijk maken.

De uitvinding nu heeft betrekking op een immunologische bepalingsmethode, die daardoor gekenmerkt is, dat bij de immunochemische reactie tussen de te bepalen, 15 en aan het waterige testmedium toe te voegen immunologische componenten een metaalgemerkte component wordt toegepast, verkregen doör deeltjes vèn een sol van een metaal of metaalverbinding direct of indirect te koppelen of te adsorberen aan de betreffende immunologische component, 20 waarbij na afloop van de immunochemische reactie, eventueel na scheiding van de gebonden en de vrije metaalgemerkte component, de aard en/of de hoeveelheid van het metaal in de gebonden en/of de vrije fractie wordt bepaald met de daarvoor in het algemeen bekende methoden, 25 welke bepaling een kwalitatieve respectievelijk een kwantitatieve aanduiding geeft van de te bepalen immunologische component.

Waar hierna in de tekst de term "metaalsol deeltjes" wordt gebruikt, wordt hieronder verstaan 30 deeltjes van een sol, bestaande uit een metaal of een metaalverbinding. ..

Het gebruik van metaalsol deeltjes, in het bijzonder die van goudsolen, welke aan de oppervlakte bedekt zijn met antilichamen, voor het vaststellen 35 van de verdeling van een antigeen over een celoppervlak door middel van raster—electronenmicroscopie is reeds f' 78 07 5 3 2 Λ \ - 4 - . *.· *' .

een aantal jaren geleden beschreven (zie artikel van M. Horisberger in Experientia, pp. 1147-1149, van 15 October 1975), maar de toepassing van metaalsol deeltjes als label voor een immunologische component 5 voor een in vitro kwalitatieve en kwantitatieve

bepaling van immunologische componenten, zoals haptenen, antigenen en antilichamen, in een waterig testmedium is niet eerder beschreven, en is verrassenderWijze mogelijk gebleken. I

10 De volgens de uitvinding ontwikkelde metaal- immunochemische techniek is niet alleen gevoeliger dan de bekende radio-, en enzymimmuno technieken, maar maakt het bovendien mogelijk simultaan meerdere immunologische componenten in het zelfde testmedium aan te 15 tonen en te bepalen door toepassing van verschillende metaal-labels.

De metaalsolen kunnen zijn van metalen, of metaalverbindingen, zoals metaaloxyden, metaalhydroxyden of metaalzouten. Als voorbeelden kunnen worden genoemd 20 de metalen of metaalverbindingen van goud, zilver, ijzer, nikkel, aluminium, chroom, lood, arseen, vanadium, kwik, mangaan, en in het algemeen al die metalen, die gemakkelijk met behulp van de bekende technieken aan te tonen zijn.

25 Solen van metalen zijn bijv. die van zilver, goud en platina. Solen van metaalverbindingen zijn bijv. die van zilverjodide, ijzeroxyde, aluminium-hydroxyde, chroomhydroxyde, vanadiumoxyde, ijzer-hydroxyde, arseensulfide, mangaanhydroxyde, en kwik-30 sulfide.

Bij voorkeur worden metalen of metaalverbindingen gebruikt, die in het testmedium niet voorkomen, en daarvan in het bijzonder die, die met een gekozen techniek in een zo laag mogelijke concentratie aan te 35 tonen zijn.

78 07 5 32 • > - 5 -

De als label toe te passen metaalsol deeltjes kunnen op een groot aantal, volgens op zich zelf bekende methoden bereid worden. Voor de bereiding van een goudsol wordt bijvoorbeeld verwezen naar een 5 artikel van G. Frens in Natural physical Science 241, 20 (1973).

De metaalsol deeltjes dragen een lading, hetgeen een stabiliserend effect oplevert door onderlinge afstoting. Door toevoeging van voornamelijk sterke 10 electrolyten wordt het ladingspatroon gewijzigd, waardoor samenklonteren en uitvlokking optreedt. Dit kan worden voorkomen door de deeltjes te omhullen door macromoleculen met polaire groepen, zoals eiwitten, polyethyleenglycolen, polymere carbohydraten, poly-15 vinylalcoholen, e.d.

Als beschermende eiwitten kunnen worden toegepast antigenen, antilichamen en anti-antilichamen of immunochemisch actieve brokstukken daarvan, of haptenen, welke laatstgenoemden gekoppeld zijn aan immuno-20 chemisch inerte, beschermende macromoleculen, hetgeen direct resulteert in metaalsol deeltjes gelabelde immuno-componenten.

Het verdient echter de voorkeur voor de omhulling van de metaalsol deeltjes niet uitsluitend immuno-25 componenten toe te passen, omdat daardoor wel een stabiliserend effect wordt verkregen, maar de immunochemische reactiviteit geringer is dan verwacht mocht worden, waarschijnlijk door sterische hindering. Het is dan ook van voordeel gebleken de omhulling slechts gedeeltelijk 30 uit te voeren met een immunocomponent, en de omhulling te completeren met een ander beschermend, doch immunochemisch inert materiaal, zoals inerte eiwitten, bijvoorbeeld albumine, een polyetheenglycol of een ander polair macromolecuul. Als omhullend materiaal kan ook 35 worden toegepast protein A of verwante eiwitten, die reactiviteit bezitten t.o.v. het Fc gedeelte van anti- ?8 0 7 5 3 2 \ * - 6 - * * ' , lichamen. Na de omhulling van de metaalsol deeltjes door protein A kan een verdere omhulling tot stand worden gebracht met een gewenst antilichaam.

Een andere mogelijkheid bestaat hierin, dat men 5 de metaalsol deeltjes eerst omhult met een inert hydrophiel polymeer of co-polymeer, waarna vervolgens door adsorptie of via covalente bindingen de immunologische component wordt gekoppeld aan het omhullende materiaal.

10 De na omhulling verkregen bolletjes kunnen een enkel metaalsol deeltje bevatten, maar het is ook mogelijk, dat het polymeer meerdere metaalsol deeltjes omsluit.

De omhulling van de metaalsol deeltjes door het 15 inerte polymeer kan op twee manieren plaats vinden, en wel door de metaalsol in contact te brengen met het polymeer, ofwel door het metaalsol te brengen in een milieu van een monomeer, respectievelijk verschillende monomeren, en deze laatste in situ te 20 laten polymeriseren resp. te co-polymeriseren. De polymerisatie kan op gang worden gebracht onder invloed van straling, of door toevoeging van initiatoren, zoals een persulfaat.

De omhulling van een metaalsol deeltje door poly-25 merisatie van het monomere medium, waarin zich het deeltje bevindt, onder invloed van een anorganische initiator zoals een persulfaat, stuit op practische moeilijkheden, omdat de sol bij toevoeging van een dergelijke initiator uitvlokt. Gevonden werd nu, dat 30 een dergelijke omhulling toch mogelijk is door de metaalsol deeltjes eerst te beschermen, daarna de beschermde deeltjes in het monomere medium te brengen en daarna pas de polymerisatie te initiëren. Als beschermend materiaal komen de hiervoor eerder genoemde 35 verbindingen in aanmerking.

\ \ <7807532 ♦ .-7-

De metaalsol deeltjes gelabelde immunocomponenten worden toegepast als reagens, gewoonlijk in combinatie met andere reagentia, voor het aantonen en kwantificeren van haptenen, antigeneri en antilichamen in een 5 waterig testmedium, waarvoor allerlei immunochemische technieken, zoals in gebruik bij- radio-immuno testen en enzym-immuno testen, in aanmerking komen.

De uitvinding heeft derhalve ook betrekking op testkitten, te gebruiken bij dergelijke immuno-10 chemische technieken, die als belangrijkste component bevatten een metaal-gelabelde immunocomponent, bestaande uit een metaalsol, waarvan de deeltjes ofwel direct omhuld zijn door de gewenste immunocomponent, ofwel door een inert polymeer, waaraan de immuno-15 component is gekoppeld of geadsorbeerd.

Eén van de gebruikelijke immunochemische technieken is de competitieve immunotest, die toegepast kan worden voor het aantonen en bepalen van iedere immunocomponent. Voor het aantonen van bijvoorbeeld 20 een bepaald antigeen bestaat deze methode hierin, dat men een testmonster, bevattende een onbekende hoeveelheid antigeen, in contact brengt met ofwel een bepaalde hoeveelheid van het betreffende metaal-gelabelde antigeen en een onoplosbaar gemaakt anti-25 lichaam, gericht tegen dit antigeen, ofwel een bepaalde hoeveelheid onoplosbaar gemaakt antigeen en een metaal-gelabeld antilichaam gericht tegen dit antigeen.

Na afloop van de reactie wordt de aard en/of 30 de hoeveelheid van het metaal bepaald in de gebonden of vrije fractie, hetgeen een kwalitatieve respectievelijk een kwantitatieve aanduiding geeft voor het te bepalen antigeen. Mutatis mutandis geldt een analoge methodiek voor de bepaling van andere immunocomponenten.

35 Veelvuldig toegepast zijn ook de zgn. Sandwich- technieken, die zich ook in het bijzonder lenen voor f 7807532 * i'' 4 - 8 - het gebruik van een metaal-gelabelde component volgens de uitvinding. Volgens deze technieken wordt een immunologische component, bijvoorbeeld een antilichaam in het geval een antigeen moet worden bepaald, onoplos-5 baar gemaakt door deze te koppelen aan een vaste drager. Deze vaste drager is bijvoorbeeld de binnenzijde van het reactievat, waarin de immunochemische reactie wordt uitgevoerd. Na een eerste incubatie, eventueel gevolgd door een wasstap, vindt een tweede incubatie plaats met 10 een metaal-gelabeld antilichaam, waarna het metaal wordt bepaald in de gebonden of de vrije fase.

Naast de hiervoor genoemde technieken bestaan er talloze andere immunochemische technieken, waarbij de metaal-gelabelde immunocomponent als reagens kan 15 worden toegepast. De onderhavige uitvinding maakt het ook mogelijk verschillende haptenen, antigenen, anti-lichamen, of combinaties daarvan tegelijkertijd in één testmonster aan te tonen, door voor elk der aan te tonen componenten een immunocomponent als reagens 20 toe te passen, die gelabeld is met een verschillend metaalsol deeltje.

De meting van de aard en/of de concentratie van het metaal in een bepaalde fase van het reactiemengsel kan op talloze, volgens op zich zelf bekende technieken 25 plaats vinden. Als voorbeelden daarvan worden genoemd de colorimetrische bepaling, waarbij gebruik gemaakt wordt van de eigenschap, dat metaalsolen sterk gekleurde dispersies zijn, die bovendien van kleur veranderen bij fysisch-chemische wijzigingen; de visuele 30 methode, die vaak voor kwalitatieve bepalingen reeds toepasbaar is, gezien het hiervoor genoemde feit, dat metaalsolen gekleurd zijn; het gebruik van vlam emissie spectrofotometrie of een andere plasma emissie spec-trofotometrische methode, die een simultane bepaling 35 mogelijk maakt, en de zeer gevoelige methode van vlamloze atomaire absorptie spectrofotometrie.

7 Aj) 7 5 3 2 \ - 9 -

De uitvinding wordt aan de hand van de volgende voorbeelden nader toegelicht.

Voorbeeld I

5 Colorimetrische bepaling van menselijk placenta lactogeen (HPL) d.m.v. met gouddeeltjes gelabelde antilichamen uit een konijne anti HPL serum.

1.1. Bereiding van het goudsol 500 ml van een 1% (w/v) chloorgoudzuur (HAuCl^) 10 in gedestilleerd water wordt in een bekerglas van 800 ml verhit tot koken. Bij de kokende oplossing wordt 3,5 ml van een 1% (w/v) oplossing van trinatriumcitraat in gedestilleerd water gebracht, waairna men het na blauw-kleuring donkerrood geworden goudsol nog 15 minuten 15 laat doorkoken. Na afkoelen tot kamertemperatuur wordt het aldus verkregen rode goudsol in een maatkolf aangevuld tot 500 ml met gedestilleerd water. Het op deze wijze verkregen goudsol bestaat uit gouddeeltjes met afmetingen tussen 45 en 70 nm, hetgeen door electronen-20 microscopisch onderzoek is vastgesteld. Een op deze wijze bereid goudsol heeft een pH =3,45 + 0,07 en een lichtabsorptie maximum bij 536 nm terwijl =1,15 + 0,03.

1.2. Bereiding van konijne anti HPL sera

Anti HPL sera werden gemaakt door konijnen in te 25 spuiten met een HPL oplossing volgens het onderstaande schema.

methode van HPT opgelost in

g injecteren 0,9% w/v NaCl met CFA

1 intramusculair 100 0,5 ml 0,5 ml 30 15 " 200 0,5 ml 0,5 ml 29 " 400 0,5 ml 0,5 ml 43 intraveneus 200 1,0 ml 50 bloedmonster voor de bepaling van de titer van 35 het antiserum in een EIA test.

78 07 5 22 é - 10 - *' .

De konijnen werden ontbloed als de titer van het antiserum in een EIA HPL test groter was dan 1:5000. Indien dit niet het geval was kregen de konijnen een additionele injectie van 200 μg HPL in 1,0 ml 0,9% w/v 5 NaCl (intraveneus) en werd de titer van het antiserum opnieuw bepaald 7 dagen na deze injectie. De antisera werden opgeslagen bij -25 °C of drooggevroren en daarna opgeslagen bij -25 °C als een droog poeder.

1.3. Bereiding van de anti HPL immuunglobuline-oplossing 10 uit het konijne anti HPL serum.

Hiertoe wordt 600 mg drooggevroren konijne anti HPL serum opgelost in 7,5 ml van een 0,9% (w/v) NaCl-oplossing. Hieraan wordt toegevoegd 10 ml 18% (w/v) Na2S0^-oplossing in gedestilleerd water, waarna er nog 15 1,35 g vast Na2S04 aan wordt toegevoegd. De verkregen troebele vloeistof laat men gedurende 1 uur staan in een centrifugebuis, waarna de vloeistof wordt gecentrifugeerd bij 25.000 N/kg gedurende 10 minuten. De bovenstaande vloeistof wordt afgezogen en het residu wordt 20 geredispergeerd in 20 ml van een 18% (w/v) Na2SO^- oplossing in gedestilleerd water. Deze procedure wordt nog tweemaal herhaald.

Na de laatste maal centrifugeren en afzuigen van de bovenstaande vloeistof wordt het residu opgelost 25 in 20 ml van een 0,9% (w/v) NaCl-oplossing in gedestilleerd water. Deze oplossing wordt gedialyseerd tegen 6 liter dialyse vloeistof bestaande uit een 0,03% (w/v) NaCl-oplossing in gedestilleerd water, welke op pH = 7,0 is gebracht met een oplossing van 0,2 mol K^COg in 1 1 30 gedestilleerd water. Er wordt gedurende 16 uur bij 4 °C gedialyseerd, waarna de gedialyseerde vloeistof wordt gecentrifugeerd bij 160.000 N/kg gedurende 20 minuten.

De immuunglobuline-oplossing wordt opgeslagen in flacons van 1 ml bij een temperatuur van -20 °C.

35 Het immuunglobuline gehalte wordt bepaald door 1 cm van een 10 maal verdunde immuunglobuline-oplossing &260 nm Q78 07 5 32 \ -\ -lien A^ScTnm meten met een spectrophotometer. Het immuunglobuline gehalte G in mg/ml kan dan worden berekend met de formule G = 10 h [(1,45 * )- τ 7 280 nm (0>75 - 5 1.4. Bereiding van het qouddeeltie-konijne anti HPL· immuunglobuline coniuqaat.

500 ml van het op de onder 1.1. beschreven wijze bereide goudsol wordt op pH = 7,0 gebracht met behulp van een oplossing van 0,2 mol K^CO^ in 1 1 gedestil-10 leerd water. Aan 25 ml van dit geneutralizeerde goudsol wordt onder goed roeren druppelsgewijs 0,5 ml van de konijne anti HPL immuunglobuline-oplossing, met een gehalte van 125 μg immuunglobuline per ml, toegevoegd waarna men het sol 10 minuten laat incuberen. Eveneens 15 onder goed roeren wordt hierna 0,5 ml van een 5% (w/v) runderserum albumine (BSA) oplossing in een 5 mmol NaCl/1 oplossing in gedestilleerd water, welke op pH = 7,0 gebracht is met een 0,2 mol I^CO^ oplossing in 1 1 water 20 Het op deze wijze verkregen gouddeeltje-konijne anti HPL immuunglobuline conjugaat wordt gecentrifugeerd bij 25.000 N/kg gedurende 10 minuten, waarna de bovenstaande vloeistof wordt afgezogen. De rode pellet bestaande uit het conjugaat wordt opgenomen in een dus-25 danig volume (ca. 23 ml) 0,01 mol/1 trometamol, op pH = 7,4 gebracht met 0,01 mol/1 HC1 In gedestilleerd water (0,01 mol/1 TRIS/HC1 buffer pH = 7,4), dat de uiteindelijke A^gmnm = 1,00 is.

1.5. Coaten van Microelisa^ platen met konijne anti 30 HPL immuunqlobulinen

Hiertoe wordt een konijne anti HPL immuunglobuline-oplossing gemaakt met een gehalte van 25 μg immuunglobuline per ml, in een oplossing van 0,04 mol ^2^0^ per liter, op pH = 7,4 gebracht met een oplossing van 35 0,04 mol NaH2pO^ per liter, beide in gedestilleerd water, waaraan 0,01% w/v Merthiolaat is toegevoegd.

Λ 'V " 7807532 * - 12 - (R)

In iedere put van de Microelisa plaat wordt 0. 1.ml van bovenstaande immuunglobuline-oplossing toegevoegd, waarna men de plaat 16 uur laat incuberen bij 0 a 4 °C. Hierna wordt in iedere put 0,1 ml 2% (w/v) 5 BSA oplossing in een 0,04 mol/1 fosfaatbuffer pH = 7,4 waaraan is toegevoegd 0,01% Merthiolaat, gepipetteerd.

Hierna laat men het geheel nog 30 minuten incuberen bij (R) kamertemperatuur. De putten van de Microelisa platen worden nu leeg gezogen en 3 maal gewassen met gedes-10 tilleerd water, waarna ze bij -20 °C worden bewaard tot gebruik.

1.6. Test protocol voor HPL bepaling met gouddeeltje koniine anti HPL immuunqlobuline conjuqaat.

1.6. a. Bepalen van een standaardcurve voor HPL

15 Voor HPL werd een standaardcurve opgesteld volgens het onderstaande protocol.

1. Pipetteer in een putje van een met konijne anti HPL

(R) immuunglobuline gecoate Microelisa plaat 0,1 ml standaard oplossing HPL en incubeer 2 uur bij kamer-20 temperatuur.

2. Zuig het putje leeg en was de put met 0,1 ml 0,01 mol/1 TRIS/HC1 buffer pH - 7,4.

3. Pipetteer in de put 0,1 ml gouddeeltje konijne anti HPL immuunglobuline conjugaat = 1,00) en incubeer 25 gedurende een nacht bij kamertemperatuur.

4. Zuig het putje leeg en was de put met 0,3 ml 0,01 mol/1 TRIS/HCl/NaCl-buffer pH = 7,4.

5. Pipetteer in de put 0,1 ml 0,1 mol/1 HCl-oplossing in water en laat dit gedurende een half uur op een 30 schudapparaat inwerken.

6. Meet nu met een klein volume spectrophotometer de licht absorptie bij 536 nm.

De resultaten van de bepaling van een standaardcurve 35 staan vermeld in onderstaande tabel.

. 78 07 5 3 2 \

V

- 13 - * 1 cm HPL concentratie in na afloop job nm standaardoplossing ng/ml van de test O 0,030 0,2 0,030 5 0,8 0,060 3,2 0,106 12,5 0,136 50 0,188 200 0,220 10 Het oplosmedium voor de HPL standaardoplossing is 0,04 mol/1 fosfaatbuffer + 0,1% BSA + 0,9% NaCl pH = 7,4.

1.6. b. Bepaling van HPL in het serum van zwangere vrouwen.

Het serum van zwangeren werd zodanig verdund dat 15 het HPL gehalte binnen een range van 5 t/m 80 ng/ml lag.

De verdunningsvloeistof voor de sera was 0,04 mol/1 fosfaatbuffer pH = 7,4 + 0,1% w/v BSA + 0,9% w/v NaCl.

Met behulp van het testprotocol beschreven onder 1.6. a. werd het HPL gehalte van de verdunde sera bepaald 20 aan de hand van de opgestelde standaardcurve. Na correctie voor de verdunningsfactor werden de volgende resultaten gevonden.

serum HPL gehalte EIA test HPL gehalte MIA

25 A 4,5+0,5 μg/ml 4+1 μg/ml B 3,2+0,4 μg/ml 3,5 + 0,8 μg/ml C 0,7+0,1 μg/ml 1+0,3 μg/ml © 7807532 Λ Λ τ - 14 - ** .

Voorbeeld II

Bepaling van HPL d.m.v. met gouddeeltjes gelabelde antilichamen en atomaire absorptie spectrophotometrie.

(R) 2.1. Bereiding reagentia en gecoate Microelisa_platen.

5 De bereidingswijze van het gouddeeltje konijne (R) anti HPL immuunglobuline conjugaat en de Microelisa platen gecoat met konijne anti HPL immuunglobuline was hetzelfde als beschreven in voorbeeld I.

2.2. Test protocol

10 Voor het opstellen van een standaardcurve voor HPL

werd een verdunningsreeks voor HPL gemaakt van achtereenvolgens 1, 10, 100 en 1000 ng/ml en een blanco. Het oplosmedium voor HPL was 0,04 mol/1 fosfaatbuffer pH = 7,4 waaraan was toegevoegd 0,1% (w/v) BSA en o,9% (w/v) NaCl. 15 1. Pipetteer in het putje van de gecoate Microelisa plaat 0,1 ml standaard HPL oplossing en laat gedurende 2 uur bij kamertemperatuur incuberen.

2. Zuig het putje leeg en was het putje met 0,1 ml 0,02 mol/1 TRIS/HCl-buffer pH * 7,4.

20 3. Pipetteer in het putje 0,1 ml van het gouddeeltje 1 cm anti HPL antilichaam conjugaat (A^g nm = 1,00) en laat dit gedurende de nacht (ca. 16 uur) incuberen.

4. Zuig het putje leeg en was het putje met 0,02 mol/1 TRIS/buffer pH = 7,4.

25 5. Pipetteer in het putje 0,1 ml 0,1 mol/1 HC1 en laat dit onder schudden op een schudmachine gedurende een half uur inwerken.

6. Meet nu met één van een klein volume injector voorziene vlam atomaire absorptie spectrophotometer de 30 piekwaarde van de lichtabsorptie bij 242,8 nm.

Een typerend voorbeeld van een op deze wijze verkregen standaardcurve staat in onderstaande tabel.

35 ; 7807532 I 1 f--s 4» - 15 - HPL concentratie in piekwaarde licht absorptie bij standaardoplossing 242,8 nm na afloop van de test 0 ng/ml 0,020 1 ng/ml 0,040 5 10 ng/ml 0,160 100 ng/ml 0,200 1000 ng/ml 0,220

Voorbeeld III

10 Visuele detectie van Hepatitis Bs antigeen (HBsAg) d.m.v. gouddeeltje schaap anti HBs immuunglobuline conjugaat.

3.1. Bereiding van het qoudsol Zie voorbeeld 1.1.

3.2. Bereiding van schape anti HBsAg sera 15 Schapen werden ingespoten met gezuiverd HBsAg oplossing.

3.3. Bereiding van de schape anti HBsAg immuunglobuline oplossing

Aan 10 ml schape anti HBsAg serum wordt 1,4 g vast 20 ^250^ toegevoegd. Nadat al het natriumsulfaat is opgelost laat men de troebele vloeistof 1 uur bij kamertemperatuur staan. Hierna wordt de vloeistof gecentrifugeerd bij 25.000 N/kg gedurende 10 minuten. De bovenstaande vloeistof wordt afgezogen en het residu wordt geredispergeerd in 25 10 ml 14% w/v Na2S0^ oplossing in gedestilleerd water.

Deze procedure wordt nog 2 x herhaald.

Na de laatste maal centrifugeren en afzuigen van de bovenstaande vloeistof wordt de pellet opgelost in 10 ml van een 0,9% w/v NaCl oplossing in gedestilleerd water.

30 Deze oplossing wordt gedialyseerd tegen 6 liter van een 0,03% w/v NaCl oplossing in gedestilleerd water, op pH = 7,0 gebracht met een oplossing van 0,2 mol/1 i^CO^·

Er wordt gedurende 16 uur gedialyseerd bij 4 °C, waarna de 'gedialyseerde vloeistof gedurende 20 minuten wordt 35 gecentrifugeerd bij 160.000 N/kg.

/ ^ 7807532 - 16 - * '

De immuunglobuline-oplossing wordt in porties van 1 ml opgeslagen in flacons bij -20 °C. Het immuun-globuline gehalte wordt bepaald met de reeds eerder beschreven methode.

5 3.4. Bereiding van het gouddeeltje schape anti HBsAq immuunglobuline coniuqaat

De bereiding van het conjugaat is identiek met de bereidingswijze beschreven in voorbeeld I punt 4 met als wijziging dat i.p.v. de konijne anti HPL immuun- 10 globuline-oplossing een verdunde oplossing (ook 125 ng immuunglobuline per ml) van de schape anti HBsAg immuunglobuline-oplossing werd gebruikt.

(R) 3.5. Coaten van Microelisa platen met schape anti HBsAq immuunqlobulinen -- 15 De coating van Microelisa platen met schape anti HBsAg immuunglobulinen geschiedde op dezelfde wijze als beschreven in voorbeeld I punt 5, waarbij in plaats van een konijne anti HPL immuunglobuline-oplossing de schape anti HBsAg immuunglobuline-20 oplossing werd gebruikt. Per plaat werden een tiental controleputjes opgenomen welke werden gecoat met een immuunglobuline-oplossing uit menselijk serum, dat negatief was in de volgende testen.

- Hepanosticon en Hepanostica 25 - Monosticon - Rheumanosticon - Immunodiffusie tegen normaal schape serum - EIA voor anti-HBs.

3.6. Testprotocol voor visueel afleesbare test voor HBsAq 30 1. Pipetteer 0,1 ml van het monster in een put van de gecoate Microelisa plaat en incubeer 2 uur bij 37 °C.

2. Was iedere put 3 x met 0,3 ml 0,02 mol/1 TRIS/HCl-buffer pH - 7,4.

3. Pipetteer in de put 0,1 ml gouddeeltje schape anti 35 HBsAg conjugaat (Α,-^ς nm = 1,00) en incubeer gedurende \een nachi bij kamertemperatuur.

7807532 - 17 - » - 4. Zuig 't putje leeg en was de put 3 x met 0,3 ml 0,01 mol/1 TRIS/HCl/NaCl-buffer pH = 7,4.

5. Pipetteer in de put 0,1 ml 0,1 mol/1 HCl-oplossing in gedestilleerd water en laat dit gedurende een 5 half uur op een schudapparaat inwerken.

6. Beoordeel visueel de kleur van de op vloeistof in de put en vergelijk met de aanwezige controle-putten.

Sera, welke sterk positief reageerden in de Hepanostica-10 test waren in 't algemeen bij 8-voudige verdunning visueel nog te onderscheiden van de blanco's.

Voorbeeld IV

Bepaling van testosteron met behulp van een zilver-15 deeltje testosteron-lla-succinyl runderserumalbumine-conjugaat.

4.1. Bereiding van het zilversol 8,5 ml van een 1% w/v AgNO^-oplossing in gedestilleerd water wordt verdund met 486,5 ml gedestilleerd water, en 20 hieraan wordt toegevoegd 5,0 ml van een 1% w/v oplossing van trinatriumcitraat.21^0 in gedestilleerd water. Bij kamertemperatuur en onder goed roeren met een magnetische roerder wordt aan deze oplossing 40,0 ml van een 1% w/v oplossing van hydrazine in gedestilleerd water toegevoegd.

25 Binnen 60 seconden ontstaat een grijs-geel-groenig zilversol met een sterke Tijndal verstrooiing. Na 10-voudige verdunning met gedestilleerd water was de pH = 8,85 en had het sol een licht absorptie van λ 1 cm λ q A,-,, = 0,83.

416 nm 30 20 ml van het onverdunde sol werd gedurende 10 minuten gecentrifugeerd bij 25.000 N/kg. 15 ml van de bovenstaande vloeistof wordt afgezogen en vervangen door 15 ml van een 0,01% w/v trinatriumcitraat.21^0-oplossing in gedestilleerd water (pH = 6,88).

35 Deze wassing wordt nog 2 x herhaald. Na de laatste keer aanvullen tot 20 ml met de 0,0J% w/v natriumcitraat- O 7807532 %

V

* Sr - 18 - oplossing had het sol na viermaal verdunnen met gedestilleerd water de volgende eigenschappenί λΑ = 416 nm max =1,12 416 nm ’ 5 pH 7,0

4.2. Bereiding van testosteron-llg-hemisuccinaat-BSA

40 mg testosteron-lla-hemisuccinaat wordt opgelost in 2 ml dimethylformamide (DMF) en daarna afgekoeld tot -15 °C.

10 140 mg runderserumalbumine wordt opgelost in 3 ml gedestilleerd water, waarna er 1 druppel 4N NaOH en 2 ml DMF aan wordt toegevoegd. Afkoelen tot -15 °C.

Aan de steroidoplossing wordt nu 12,5 μΐ N-methyl-morpholine en 12,5 μΐ isobutylchloorformiaat toege-15 voegd. Na 3 minuten wordt deze oplossing toegevoegd aan de BSA-oplossing. Na 1 uur roeren'bij -15 °C en 3 uur bij 0 °C wordt de oplossing overgebracht in een dialyse slang en gedurende de nacht gedialyseerd tegen stromend leidingwater. Het dialysaat wordt, 20 eventueel na centrifugeren over een Sephadex G25 kolom geleid en de eiwitfractie wordt opgevangen en droog-gevroren.

4.3. Bereiding van antisera voor Testeron Konijnen werden geïmmuniseerd door inspuiting 25 met 1,25 mg testosteron-lla-hemisuccinyl-BSA, opgelost in 2,5 ml fysiologisch zout en 2,5 ml compleet Freunds adjuvans (1 ml i.m. 3 x tussentijd 1 week). Hierna werden ze i.v. ingespoten met 1 ml van een oplossing van 1,25 mg testosteron-lla-hemisuccinyl-BSA in 5 ml 30 fysiologisch zout.

Dit spuitschema werd herhaald tot de titer van het antiserum voldoende was. De konijnen werden ont-bloed en de sera opgeslagen bij -20 °C tot gebruik.

35 '\ 7807532 * - 19 - 4.4. Bereiding van polystyreen buisjes gecoat met konijne immuunqlobulinen tegen testosteron Een konijne anti testosteron immuunglobuline-oplossing wordt gemaakt door uitzouten met 18% w/v 5 Na2SO^ zoals beschreven in voorbeeld I punt 2.

De gedialyseerde immuunglobuline-oplossing wordt verdund (tot een concentratie van 1 μg immuunglobuline/ml) met een buffer bestaande uit 0,1 mol/1 Na^PO^.^O, 6% w/v sucrose op pH = 7,4 gebracht met 4 mol/1 NaOH.

10 In iedere polystyreen buis van 3 ml wordt 1 ml van de immuunglobuline-oplossing gepipetteerd en overnacht geincubeerd bij kamertemperatuur. Daarna worden de buizen leeggezogen en gevuld met 1 ml 1% w/v BSA oplossing in bovengenoemde buffer. Na twee uur worden 15 de buizen leeggezogen en 3 x gewassen met 3 ml gedestilleerd water. De buizen worden goed drooggezogen en overnacht verder gedroogd boven silicagel. Hierna worden de buizen verpakt in porties van 25 stuks en een zakje silicagel in een aluminiumfolie en opgeslagen 20 bij 4 °C.

4.5. Bereiding van zilverdeeltle-testosteron-llg-hemi- succinyl-BSA-conjuqaat 20 ml van het zilversol, bereid zoals beschreven in 4.1., werd verdund met 80 ml 0,03% w/v NaCl en op 25 pH = 7,0 gebracht met 0,01 mol/1 NaOH-oplossing in gedestilleerd water. =1,08.

Aan 15 ml van dit sol wordt onder goed roeren met een magnetische roerder, druppelsgewijs toegevoegd 3 ml van een oplossing van 175 pg testosteron-lla-30 hemisuccinyl-BSA per ml in 0,03% w/v NaCl op pH = 7,0 met 0,01 mol/1 NaOH.

Men laat ca. 10 minuten incuberen waarna er 2 ml 1% w/v Carbowax 20M-oplossing in 0,03% w/v NaCl op pH = 7,0 met 0,01 mol/1 NaOH aan wordt toegevoegd. Het 35 ruwe conjugaat wordt vervolgens gewassen door 10 ml' te centrifugeren bij 25.000 N/kg gedurende 20 minuten.

\ t fC'\ 7807532 i' , - 20 - 9 ml supernatant wordt nu afgezogen en vervangen door 9 ml wasvloeistof bestaande uit een l°/oo w/v Carbowax 20M-oplossing in 0,03% w/v NaCl op pH = 7,0 gebracht met 0,01 mol/1 NaOH opgelost in gedestilleerd water.

5 Na 3 x wassen wordt nogmaals gecentrifugeerd waarna de bovenstaande vloeistof wordt afgezogen. Het residu wordt geredispergeerd in 0,02 mol/1 fosfaatbuffer pH = 7,4. De conjugaatoplossing heeft nu een pH van 7,4 en Α^21 nm = 1,08. De gewassen conjugaten opslaan 10 bij 4 °C tot gebruik.

4.6. Testprotocol voor de bepaling van testosteron met het zilverdeeltie-testosteron-llg-hemisuccinyl-BSA-conjuqaat 1. Pipetteer 1 ml monster een met konijne anti- 15 testosteron immuunglobulinen gecoate polystyreen buis en laat 2 uur incuberen bij kamertemperatuur.

2. Zuig de buis leeg en was 3 x met 2 ml 0,02 mol/1 fosfaatbuffer pH = 7,0.

3. Pipetteer in de buis 1 ml van het zilverdeeltje 20 testosteron-lla-hemisuccinyl-BSA-conjugaat 1 cm AToi = 1,08 en incubeer gedurende 16 uur.

421 nm 4. Zuig de buis nu leeg en was met 2 ml 0,02 mol/1 fosfaatbuffer pH = 7.

5. Pipetteer in de buis 1 ml 0,1 mol/1 HCl-oplossing 25 in gedestilleerd water en laat dit gedurende een half uur inwerken.

1 cm 6. Meet hierna van de vloeistof in de buis At„n 421 nm 4.7. Resultaten

Met behulp van een standaardcurve werden test-30 media colorimetrisch bepaald, waarbij hoeveelheden testosteron konden worden aangetoond van 0,5 ng/ml en hoger.

\ 7807532 m - 21 -

Voorbeeld V

Bepaling van de titer van menselijke anti Rubella sera 5.1. Bereiding van het Rubella antigeen.

200 ml van een gastheercel (BHK 21C3 van 't Rijks 5 Instituut voor Volksgezondheid RIV) suspensie in kweek- 5 medium (concentratie 10 levende cellen per ml) wordt 2 in een rolfles (oppervlakte 490 cm ) gebracht. De cel-kweek wordt 16 tot 20 uur bewaard bij 37 °C. Hierna wordt het kweekmedium verwijderd en wordt de cellaag 10 2 maal gewassen met 20 ml fosfaat gebufferde NaCl- oplossing (PBS). Hierna wordt 10 ml virus-suspensie (virustype M33 RIV) 1:100 verdund met PBS in de fles gebracht, waarna ca. 2½ uur bij 37 °c wordt geincubeerd.

Nu wordt 100 ml onderhoudsmedium toegevoegd waarna 15 de kweek wordt bewaard bij 37 °C. Na minimaal 64 uur en maximaal 136 uur, afhankelijk van de beoordeling van het cytopathologisch effect, wordt de geincubeerde monolayer geïnfecteerde cellen geoogst. Het onderhoudsmedium wordt verwijderd en de monolaag cellen wordt 20 1 maal gewassen met 20 ml PBS. De cellen worden van de wand los gemaakt d.m.v. steriele glasparels, opgenomen in 90 ml PBS en ingevroren bij -20 °C.

Na ontdooien wordt aan 90 ml celsuspensie 10 ml 1 mol/1 glycine-oplossing, op pH = 9,0 gebracht met 25 vast NaOH, toegevoegd en wordt het geheel gedurende 6 uur bij 37 °C goed gemengd. De celsuspensie wordt nu gedurende 30 minuten geultrasoneerd onder koelen met ijs en vervolgens gecentrifugeerd bij 4 °C, 30.000 N/kg gedurende 30 minuten. De Rubella virus 30 bevattende supernatant wordt verzameld en geïnactiveerd door achtereenvolgens toe te voegen .* 1 op 100 volumedelen 1 mol/1 NaOH-oplossing in gedest. water 1 op 100 volumedelen vers bereide 10% β-propiolaction-oplossing in gedest. water.

35 Men laat de vloeistof 48 uur staan bij 4 °C, waarna ze |^j)wordt gecentrifugeerd gedurende 30 minuten bij 30.000 N/kg V 8 0 7 5 3 2 * % tr - 22 - *’ * .

en 4 °C. De supernatant is de Rubella virus bevattende vloeistof, welke zonodig bij -20 °C kan worden opgeslagen tot gebruik.

(R) 5.2. Coaten van Microelisa -platen met Rubella antiqeen 5 De Rubella antigeenoplossing, bereid zoals be schreven in 5.1., wordt 1:100 verdund met een 0,05 mol/1 carbonaatbuffer pH = 9.6. In ieder putje van de Microelisa-plaat wordt 100 μΐ van deze verdunde Rubella antigeen-oplossing gepipetteerd en men laat dit gedurende 10 16 uur incuberen bij 4 °C. De putjes van de Microelisa^- plaat worden nu leeg gezogen en 3 maal gewassen met 300 μΐ 0,05 mol/1 fosfaatbuffer pH = 7,4, waaraan is toegevoegd 0,9% (w/v) NaCl en 0,05% (w/v) Tween 20.

5.3. Bereiding van SGhape-anti-menselijk-immuunqlobuline-15 oplossingen

Normaal menselijk serum wordt uitgezouten met 14% (w/v) Na2S0^, hetwelk in kleine porties in vaste vorm wordt toegevoegd. Na 1 uur staan bij kamertemperatuur wordt de troebele vloeistof gecentrifugeerd bij 20 25.000 N/kg gedurende 10 minuten. De bovenstaande vloei stof wordt afgezogen, waarna het residu wordt gewassen met een 14% (w/v) Na2S0^-oplossing in gedestilleerd water. Na centrifugeren en afzuigen van de bovenstaande vloeistof wordt het residu opgelost in 0,9% (w/v) Na<jl, 25 waarna de immuunglobuline-oplossing 48 uur wordt gedialy-seerd tegen 0,9% (w/v) NaCl bij 4 °C. Hierna wordt het immuunglobuline-gehalte bepaald via de methode.

Schapen werden geimmuriizeerd met een verdunde oplossing 30 van deze menselijk immuunglobuline-oplossing, volgens onderstaand schema: V 78 07 5 3 2 V' \ - 23 - dag 1 0,5 mg menselijk immuunglobuline opgelost in 0,5 ml fysiologische zoutoplossing, waaraan is toegevoegd 0,5 ml compleet Freunds adjuvans. Injectie: intramusculair.

5 dag 14 1,0 mg menselijk immuunglobuline opgelost in 0,5 ml fysiologische zoutoplossing, waaraan is toegevoegd 0,5 ml incompleet Freunds adjuvans. Injectie: intramusculair.

dag 28 2,0 mg menselijk immuunglobuline opgelost in 10 0,5 ml fysiologische zoutoplossing, waaraan is toegevoegd incompleet Freunds adjuvans.

Injectie: intramusculair.

dag 42 1,0 mg menselijk immuunglobuline opgelost in 1,0 ml fysiologische zoutoplossing.

15 Injectie: intraveneus, dag 56 Bloedafname.

De immuunglobuline-frakties werden uit de schape-anti-menselijk-immuunglobulinesera uitgezouten met 20 behulp van de boven beschreven 14% (w/v) Na2S0^ methode. Na de derde maal wassen werd het residu opgelost in 0,9% w/v NaCl waarna de immuunglobuline-oplossing werd gedialyseerd tegen een 0,03% w/v NaCl-oplossing in gedestilleerd water op pH = 7,0 gebracht met 0,2 mol/1 25 K2C03 °P9el°st in gedestilleerd water.

Na centrifugering van deze gedialyseerde schape-anti-menselijk-immuunglobuline-oplossing gedurende 15 minuten bij 160.000 N/kg, werd het immuunglobuline- gehalte bepaald met de A^Onm’ ^ΘΟ^ηπι methode· 30 5.4, Bereiding van het qouddeeltje-schape-antl-menselijk immuunglobuline-conjugaat

Het goudsol werd bereid volgens de methode beschreven in 1.1. en het conjugaat werd bereid analoog aan de methode beschreven onder 1.4., waarbij in dit 35 geval de onder 5.3. bereide schape-immuunglobuline- oplossing werd gebruikt, met een immuunglobuline-gehalte 7807532 j . .

- 24 - » van 125 μς per ml.

5.5. Testprotokol

Het monster menselijk serum wordt 1:25 verdund met 0,2 mol/1 Trometamol/HCl/NaCl buffer pH = 7,4 5 waaraan is toegevoegd 0,05% (w/v) Tween 20.

1. Per putje wordt 100 μΐ verdund menselijk serum gepipetteerd en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geincubeerd.

2. Het putje wordt leeg gezogen en 3 maal gewassen 10 met 300 μΐ 0,2 mol/1 Trometamol/HCl/NaCl buffer pH = 7,4 «waaraan is toegevoegd 0,05% (w/v) Tween 20.

3. In de put wordt nu 100 μΐ gouddeeltje-schape-anti-menselijk immuunglobuline conjugaat (A536mnm = 1>°°) gepipetteerd en men laat gedurende 16 uur incuberen 15 bij kamertemperatuur.

4. Het putje wordt leeg gezogen en 3 maal gewassen met 300 μΐ 0,01 mol/1 Trometamol/HCl/NaCl buffer pH = 7,4 waaraan is toegevoegd 0,05% (w/v) Tween 20.

5. Pipetteer in de put 100 μΐ 0,1 mol/1 HCl opgelost 20 in gedestilleerd water en laat dit gedurende een half uur op een schudapparaat inwerken.

6. Meet hierna met een klein volume spectrophotometer de lichtabsorptie bij 536 nm.

5.6. Resultaten 25 Voor sera met een HAI titer van 512 werd een A^s^nm gemeten van ca. 0,230, terwijl er verder een redelijke lineaire correlatie gevonden werd tussen de HAI titer van de onderzochte menselijke sera en de Ajjjgg™ m“Waarden, verkregen volgens de boven be-30 schreven test.

/ 78 07 5 3 2 \

Claims

1. Werkwijze voor de bepaling van een immunologische component, zoals een hapteen, antigeen of antilichaam, in een waterig testmonster onder gebruikmaking van de immunologische reactiviteit van dergelijke componenten t.o.v. elkaar, met het kenmerk, dat bij de immuno-chemische reactie tussen de te bepalen en aan het testmonster toegevoegde immunologische componenten een gemerkte component wordt toegepast, verkregen door deeltjes van een sol van een metaal of metaalverbinding direct of indirect te koppelen of te adsorberen aan de gewenste immunologische component, waarbij na afloop van de reactie, eventueel na scheiding van de gebonden en de vrije gemerkte component, in één dezer fracties de aard en/of de hoeveelheid van het metaal wordt bepaald met de daarvoor bekende methoden, welke bepaling een kwalitatieve respectievelijk een kwantitatieve aanduiding geeft van de te bepalen immunologische component.

2. Werkwijze volgens conclusie 1 met het kenmerk, dat de gemerkte component wordt verkregen door aan een metaalsol toe te voegen een bepaalde hoeveelheid van de te merken immunologische component, welke laatste de soldeeltjes geheel of gedeeltelijk omhult, waarna desgewenst een verdere omhulling kan plaats vinden met een immunologisch inert polair macromolecuul.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 met het kenmerk, dat de gemerkte component wordt verkregen door aan een metaalsol toe te voegen één of meer immunologisch inerte hydrophiele macromoleculen, die de metaaldeeltjes omhullen, waarna door adsorptie of via covalente bindingen de immunologische component wordt gekoppeld aan het omhullende materiaal. o 78 07 5 3 2 - 26 -

4. Werkwijze volgens conclusie 1 met het kenmerk, dat de gemerkte component wordt verkregen door een metaalsol te brengen in een milieu van monomeren, deze laatsten in situ te laten polymeriseren, resp. co-polymeriseren, waardoor omhulling van de metaal-deeltjes volgt, en vervolgens de immunologische component te adsorberen of covalent te koppelen aan het polymere materiaal.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat de metaalsol deeltjes eerst worden beschermd door een hydrophiel macromolecuul, waarna (co-)polymerisatie onder invloed van een anorganische initiator plaats vindt.

6. Werkwijze volgens één of meer der voorafgaande conclusies, met het kenmerk, dat als soldeeltjes worden toegepast goud, zilver of platina of een verbinding van deze metalen.

7. Testkit, te gebruiken bij de bepaling van een immuno-component in een waterig medium, bevattende: a) een metaal-gelabelde immunocömponent, bestaande uit een metaalsol, waarvan de deeltjes ofwel direct omhuld zijn door de gewenste immunocomponent, ofwel door een inert polymeer, waaraan de immunocomponent is gekoppeld; b) overige reagentia. Ö7807532 V 3