CN118604332A - 一种基于磁捕获的荧光标记免疫检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于磁捕获的荧光标记免疫检测方法，该方法包括以下步骤：分别将镧系元素纳米乳胶微球和纳米磁球偶联蛋白(抗原或抗体)；基于双水相系统原理建立多层液体体系(分为上、中、下三层)，因膜效应作用，三层溶液互不渗透，形成单室结构；磁性物质因反应容器的外部或内部施加磁场聚集于容器底部，通过紫外线照射，根据容器底部是否有荧光及荧光点灰度值获得待测样品定性和半定量检测结果。本发明使用抗原抗体免疫反应、荧光标记技术、磁捕获技术和双水相系统进行免疫检测，具有快速、准确、方便等特点。另外，通过改变纳米材料表面修饰蛋白的种类，能够实现超灵敏、单反应、多重检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于磁捕获的荧光标记免疫检测方法，具体涉及一种利用荧光标记物和磁球在磁场作用下实现免疫检测。
背景技术
免疫检测方法是利用抗原抗体的特异性反应原理为基础对某种物质进行定性或定量测定的一种方法，最初用于检测体液中的抗体、细菌毒素、病原体抗原、激素等，上世纪七十年代末开始应用于食品卫生分析检测，经过多年的努力探索，目前在医学、兽医学、畜牧学、植物学领域以及医疗、环保、食品、卫生与健康等行业得到越来越广泛的应用。已有的免疫检测技术主要包括：放射免疫分析、侧流免疫层析技术、免疫荧光技术、酶联免疫吸附法、免疫凝集试验和免疫沉淀等。
已有的免疫检测技术具有取样简单、易于使用、检测时间短(一般在15 ~ 30min)，且结果显而易见的优点。不过，这些检测方法也存在缺点：
1、放射同位素污染
放射免疫分析于1956年建立的一种体外微量分析法，它将具有高度灵敏度的放射性核元素示踪技术和特异性免疫学技术结合而建立的新方法，本方法具有灵敏度高、特异性强、精密度佳，适用范围广的优点，同时也具有放射性元素污染的风险。
2、探针不稳定性
侧流免疫层析技术是一种基于抗原抗体特异性免疫反应和纳米探针标记技术的快速检测平台，能实现复杂基质中目标分析物的定性或定量检测。其中最常见的标记材料是纳米金颗粒(Au Nanoparticles, AuNP)，但基于AuNP的检测试纸通常仅提供定性或半定量结果，并且存在颜色强度低、灵敏度差、有假阳性或假阴性以及背景干扰等缺点，另外，蛋白与AuNP的偶联主要是通过静电吸附作用，这种非共价连接方式不利于探针的稳定性和重复性。
3、基质效应
酶联免疫吸附法基于抗原与抗体的特异性反应和酶对底物显色反应的高效催化作用，以抗原和抗体作为生化反应物，对化合物、酶或蛋白质等物质进行定性和定量分析。由于抗原、抗体和酶均属于生物试剂，所以基质会影响实验中抗原抗体反应的特异性及酶的活性，从而影响检测的准确度和灵敏度。
4、背景干扰
用荧光色素标记的荧光免疫分析主要用于蛋白的示踪、定性和定量检测，传统荧光免疫分析方法的检测原理与侧流免疫层析技术或酶联免疫吸附法原理相似，只需将荧光色素标记在抗原或抗体上，根据荧光强度与待测物质的量成一定比例而实现定量。常用的荧光色素有异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明及四甲基异硫氰酸罗丹明。异硫氰酸荧光素最大激发波长为490 ~495 nm，最大发射波长530 nm，呈黄绿色荧光。四乙基罗丹明最大激发波长为570nm，最大发射波长490 ~495 nm，呈橘红色荧光。四甲基异硫氰酸罗丹明最大激发波长为550nm，最大发射波长620 nm，呈橙红色荧光，与蛋白质结合后，荧光效率降低。常用的荧光色素斯托克(Stokes)位移(吸收光谱与发射光谱之间波长差异)偏小，受本底荧光的干扰较大，检测灵敏度不高。
5、凝集反应
免疫凝集试验和免疫沉淀是利用细菌、红细胞等颗粒性抗原，与相应的抗体(或抗原)结合，在一定条件下，形成肉眼可见的凝集团块进行检测。由于凝集试验方法简单、结果直观、不需要特殊仪器，目前仍在应用。不过也存在以下问题：(1) IgG类抗体常出现不完全反应，出现假阴性；(2) 电解质浓度与pH值可引起非特异性凝集，出现假阳性；(3) 溶血、黄疸、脂血标本可干扰结果判断。
近年来，新型纳米材料标记物的研制日新月异，促进免疫检测向高灵敏度、多元化、实现定量或半定量检测方向发展，能够一改往日灵敏度偏低、检测指标单一等缺点。用于免疫检测的纳米材料主要有纳米磁球、镧系元素、上转换发光颗粒、量子点、纳米乳胶微球等。通过纳米磁球和抗体(或抗原)的结合，已经开发了一些针对常见问题的新颖有效解决方案。例如，高产量提取外泌体、通过温度敏感结构和细菌纳米磁球对某些疾病快速免疫检测等。用镧系元素纳米乳胶微球具有独特的荧光特性，如时间分辨荧光(荧光寿命长达1ms)和大stokes位移(超过200 nm)，有助于降低免疫检测过程中背景噪声，提高检测的灵敏度和准确性。纳米磁球、镧系元素和纳米乳胶微球组合应用，因其具有操作简单、快速、灵敏度高和准确等特点，在未来免疫诊断领域具有应用价值。
发明内容
为了克服上述的现有免疫检测方法的缺点，本发明的在于提供一种基于磁捕获的荧光标记免疫检测方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
(1) 一种镧系元素配合物合成，合成二异丙烷酸衍生物配体。将二苯甲酰甲烷，三正辛基氧化膦用无水乙醇溶解在烧杯中，在磁力搅拌下直至完全溶解，向溶液中滴加浓度为氢氧化钠/乙醇溶液直至pH在6.5~7.2。
(2) 镧系元素纳米乳胶微球合成，采用细乳聚合法制备羧基化聚苯乙烯荧光微球。圆底烧瓶放入装有电动搅拌器和控制反应温度的油浴锅中，圆底烧瓶加入水、十二烷基硫酸钠、苯乙烯、镧系元素配合物和丙烯酸的乳液共聚合。
混合物用氮气鼓泡除氧，在室温下搅拌20min。停止氮气除氧，将烧瓶放入油浴中，一定时间后，向反应混合物中注入溶解于过硫酸钾引发聚合。反应一定时间，打开烧瓶，将产物冷却至室温。产品通过滤纸过滤。并通过使用透析袋在去离子水中透析7天，透析后在4℃保存备用。
(3) 镧系元素纳米乳胶微球偶联蛋白(镧系元素纳米乳胶微球@蛋白)，镧系元素纳米乳胶微球表面修饰有活泼的羧基，羧基与生物分子偶联的方法是碳化二亚胺缩合法，即在中性条件下，利用水溶性的EDC，使用羧基与生物分子的氨基缩合生成酰胺键，从而实现偶联。
(4) 羧基磁球偶联蛋白(磁球@蛋白)，羧基磁球表面修饰活泼的羧基，偶联方案与方案(3)相同。
(5) 步骤(3)合成的镧系元素纳米乳胶微球@蛋白复合物与基于双水相系统原理建立三层液体体系的中层液体混匀。多层液体体系的上下层无预处理步骤。
(6) 三层液体体系的上中下层液体依次加入到透明反应容器中。
(7) 磁球@蛋白和待测样品依次加入到上层液体中，室温孵育3～5分钟。
(8) 透明反应容器的外部或内部施加磁场；磁性物质由上层液体逐渐聚集于容器底部。
(9) 通过紫外线照射，根据观察容器底部是否有荧光获得待测样品定性检测结果。
(10) 拍照获得检测结果图片，使用软件分析荧光点的灰度值，代入该方案用标准品建立的标准曲线，对待测样品进行半定量分析。
本发明的机理是：
与传统的普通油性染料合成的彩色乳胶微球、有机荧光染料合成的荧光微球、量子点合成的上转换微球等标记物相比，镧系元素纳米乳胶微球内部染色的镧系元素配合物具有长荧光寿命、发光稳定、肉眼可视等荧光特性。另外，该微球表面可被修饰进而实现微球功能化，功能化基团包括氨基、羧基等。利用镧系元素纳米乳胶微球表面羧基与蛋白偶联的方法是碳化二亚胺缩合法，即在中性条件下，利用水溶性的EDC，使羧基与蛋白的氨基缩合生成酰胺键，从而实现偶联蛋白(抗原或抗体)的目的。
纳米磁球具有如下特性：①粒径小，均一程度高，且单分散性好，纳米磁球具有很强的磁响应性，又不会因粒径太大而发生沉降，具有较大的比表面积，偶联容量大；②磁球表面具有丰富的活性基团，以便与具有生物活性的物质如生物酶、抗体等进行偶联，进而应用于酶的固定化、免疫检测等生物和医学领域；③具有超顺磁性的纳米磁球在外加磁场的存在下，磁球有较好的响应性，能迅速聚集，当撤去外加磁场时，磁球无磁性记忆，能够均匀分散，不出现聚集现象；④操作简便，在外磁场的作用下可进行磁粒的反复分离，分离过程十分简单，可省去离心、过滤等烦琐操作，节约时间；⑤磁性微粒具有一定的机械强度和化学稳定性，能耐受一定浓度的酸碱溶液和微生物的降解，其结构内的磁性物质不易被氧化，磁性微粒物理化学性质稳定，其磁性不易下降。本发明利用羧基磁球偶联蛋白(抗原或抗体)，羧基磁球表面修饰活泼的羧基，偶联方案与方案(3)相同。
基于双水相系统原理建立多层液体体系(分为上、中、下三层)，因膜效应作用，三层溶液互不渗透，形成单室结构。建立类似侧流层析技术的反应体系，利用双抗夹心法反应生成磁性复合物，在外界磁场作用下，该复合物聚集在透明反应容器底部。
通过紫外线照射，观察透明反应容器底部。有荧光，说明待测样品含目标物；没有荧光，说明待测样品不含目标物。根据荧光点的灰度值对目标物，进行半定量分析。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明使用镧系元素荧光标记技术进行抗原或抗体的检测，比传统有机荧光色素标记技术具有更强的消除背景噪声的能力，镧系元素配合物stokes位移大(超过200nm)，提高检测准确度和灵敏度。
2、与现有的侧流层析技术相比，本发明由于使用了双液相多层液体体系，具有更快的检测速度。另外，由于纳米材料(镧系元素纳米乳胶微球和纳米磁球)都具有纳米级的直径，能最大化的提供物质(包括蛋白、半合成抗原、农药、霉菌毒素等)接触面积，短时间(5分钟内)可完成抗原抗体特异性免疫反应的饱和吸附。
3、微球(镧系元素纳米乳胶微球和纳米磁球)表面的活性羧基与蛋白(抗原或抗体)的氨基缩合生成酰胺键，比胶体金试纸条的纳米金和蛋白的静电吸附更稳定，有效避免假性检测结果，提高检测准确度。
4、本发明的检测方法与传统的酶联免疫吸附法相比，双液相多层液体体系的膜效应作用可以截留某些干扰物，能够降低基质效应。
5、蛋白(抗原或抗体)的氨基与纳米颗粒(镧系元素纳米乳胶微球和纳米磁球)表面羧基生成酰胺键，修饰于纳米颗粒表面，因纳米粒比表面积大、单分散等纳米材料的特性，有效避免凝集反应的发生，降低假阳性检测结果出现的概率。
6、本发明的检测方法解决了传统免疫检测方法(如酶联免疫吸附试验)仪器设备昂贵的问题，利于在资源贫乏环境下现场快速免疫检测。本发明的检测方法无需昂贵的酶标仪，只需简单的磁场(由永磁铁或电磁铁提供均可)。磁性复合物由于磁场的存在，富集于透明反应容器底部，使用紫外线照射磁性复合物富集区，通过是否产生荧光，对待测样品给出定性检测结果。紫外线光源可以选紫外线验钞笔、LED美甲紫光烤灯、紫外线手电等便携式设备，即使在居家检测、便民检测点、畜牧养殖场等仪器设备受限的现场也能实现更经济、更快速的免疫检测。另外，通过增加纳米材料(镧系元素纳米乳胶微球和纳米磁球)表面修饰蛋白的种类，能够实现超灵敏、单反应、多重检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例技术中技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是基于磁捕获的荧光标记免疫检测方法工作原理示意图。
图2是镧系元素铕纳米乳胶微球荧光光谱图；
图3是镧系元素铕纳米乳胶微球偶联黄曲霉毒素B1单克隆抗体(EM@mAb-AFB1)扫描电镜图；
图4是羧基纳米磁球偶联黄曲霉B1单克隆抗体(M@mAb-AFB1) 扫描电镜图；
图5是磁捕获法检测黄曲霉毒素B1特异性验证结果(包括自然光和紫外照射)；
图6是磁捕获法检测黄曲霉毒素B1标准曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此，不用于限定本发明。在阅读了本发明之后，技术人员对本发明的各项等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
实施例
镧系元素铕配合物制备，包括以下步骤：
(1) 镧系元素铕配合物Eu(DBM)3(TOPO)2的制备
将9 mM二苯甲酰甲烷 (DBM)，6 mM三正辛基氧化膦 (TOPO)用30 mL无水乙醇溶解在100 mL烧杯中，在磁力搅拌下直至完全溶解，向溶液中滴加浓度为0.5 mol/L的NaOH乙醇溶液直至pH值6.5。将3 mM的氯化铕六水合物（EuCl3·6H2O）溶解在10 mL的无水乙醇中并滴加到上述混合液中，期间可观察到白色絮状沉淀产生，氯化铕六水合物(EuCl3·6H2O) 的乙醇溶液滴加结束后，搅拌6 小时，用去离子水清洗沉淀数次至清洗液无荧光。将得到的沉淀过夜真空干燥，得到淡黄色粉末状固体。
(2) 镧系元素铕配合物Eu(TTA)3phen的制备
将3 mM氯化铕六水合物（EuCl3·6H2O），9 mM 2-噻吩甲酰三氟丙酮（TTA），3 mM 1,10-邻菲咯啉（phen）与50 mL无水乙醇溶解在100 mL三口烧瓶中，在60 °C下搅拌直至完全溶解，使用0.5 mol/L的NaOH配制的乙醇混合溶液滴定上述溶液至pH值6.5，60℃加热反应4小时，静置过夜直至沉淀析出。使用布氏漏斗抽滤，其中使用乙醇和水反复洗涤至下层清洗液没有荧光。将产物在室温下真空干燥，得到粉白色固体。
实施例
细乳液聚合法对镧系元素铕羧基荧光微球的合成，包括以下步骤：
(1) 苯乙烯精制
NaOH溶液(5%, m/v)加入到分液漏斗中对苯乙烯用力摇匀，静置分层后放出下层液体并保留上层液体，如此反复洗涤3~5次后苯乙烯呈淡黄色。然后使用去离子水进行同样的操作进行洗涤3~5次，每次洗涤后使用pH试纸检测滤液酸碱性直至滤液为中性。将纯化后的苯乙烯溶液与无水氯化钙一起放入烘箱中进行真空干燥除去多余水分备用。
(2) 细乳聚合法制备镧系元素铕纳米乳胶微球
将0.015 g十二烷基硫酸钠 (SDS)，0.2 g正十六烷 (HD)，溶解在45 mL去离子水中，使用超声细胞破碎仪超声均质制备乳液，功率为500 W，工作时间为2分钟(工作3秒，暂停3秒)。同时使用5 mL苯乙烯 (St)分别溶解0.1 g步骤(1)或步骤(2)的镧系元素配合物，将该混合物滴加至上述的水溶液中，二者在60 °C下磁力搅拌混合1 小时。待冷却至室温后，使用超声细胞破碎仪超声再均质，振幅为400 W，工作时间为2分钟(工作3秒，暂停3秒)，超声期间使用冰浴降温防止单体出现自聚。超声均质得到的细乳液转移到带有冷凝管和氮气口的100 mL三口烧瓶中，加入0.1 g 过硫酸钾(KPS)和0.1 g NaHCO3，搅拌混匀的同时通入20 min氮气除氧。上述操作完成后，水浴锅升温至70 °C，将三口烧瓶转移其中，在电动搅拌器搅拌(300 r/min)条件下反应2小时，向其中滴加200 μL丙烯酸 (AA)，转速为250 r/min，继续反应8 小时，得到的产物用乙醇溶液(5%, m/v)多次清洗，尽量去除反应体系中的残留的表面活性剂，将洗涤的微球超声振荡分散，使用透析袋在去离子水中透析7天(每8小时换一次去离子水)，透析后产物置于4 °C避光保存，备用。
(3) 测定镧系元素铕纳米乳胶微球表面羧基含量
2 mL镧系元素铕纳米乳胶微球溶液 (固含量为2%)，添加40 mL去离子水进行磁力搅拌，用NaOH (1 M)溶液将其pH值滴至11，充分搅拌1小时，直至电导率值在15秒内不再发生变化。用HCl溶液(0.02 M)进行滴定直至pH值为3，期间监测pH值变化和记录电导率的变化趋势并将电导率绘制成曲线图，整个过程中电导率将呈现出先下降，再平缓，后升高的变化趋势，平台期所使用HCl溶液的体积用来计算微球样品表面的羧基含量，公式为：
式中：Va是曲线图升高区域的消耗HCl溶液的体积 (mL)，Vd是曲线图下降区域消耗HCl溶液的体积 (mL)，C为HCl溶液浓度(mol/L)，S为乳胶微球固含量，M为乳胶微球样品质量。
实施例3 基于磁捕获法的荧光标记检测黄曲霉毒素B1
(1) 镧系元素铕纳米乳胶微球偶联黄曲霉毒素B1单克隆抗体(EM@mAb-AFB1)
采用EDC活化酯法将镧系元素铕纳米乳胶微球与黄曲霉毒素B1单克隆抗体(mAb-AFB1)偶联。首先，将50 μL的羧基镧系元素铕纳米乳胶微球(固含量为1%)悬浮于1 mL MES(10 mM, pH 6.2±0.05)中，其中含有ProClin 300 (5%，w/v)。用超声振荡分散混合物，然后在15000 r/min转速下离心15分钟，弃去上清液。然后，将3.5 μL的EDC (10 mg/mL)和33μL的N-羟基丁二酰亚胺 (10 mg/mL)溶液混合，在37°C避光振荡15~30分钟。活化后，混合物在15000 r/min转速下离心10分钟，弃去上清液，加入1.5 mL 4-吗啉乙磺酸 (MES)溶液。将50 μg黄曲霉毒素B1单克隆抗体 (AFB1-mAb)与250 μL MES混合，与活化的镧系元素铕纳米乳胶微球进行偶联，于37°C以200 r/min的转速避光振荡2小时。将混合物中加入0.5 mL硼酸盐缓冲溶液（5 mM，pH 6.5±0.05）、0.05% Tween-20[其中含牛血清白蛋白(1%，m/v)和乙醇胺(0.24%，v/v)]在黑暗中于37°C振荡1 小时封闭微球表面的未结合位点。产物4°C下以15000 r/min离心10分钟，然后使用1.5 mL清洗液[含Tris(50 mM pH 8.0±0.05)、BSA(0.5%，m/v)、Tween-20(0.05%，v/v)]和ProClin 300（0.03%,w/v）洗涤两次。最终镧系元素铕纳米乳胶微球与AFB1-mAb的偶联物溶于含有NaCl(150 mM)、牛血清白蛋白 (1%，w/v)、Tween-20 (0.05%，v/v)和ProClin 300(0.03%，w/v)以及海藻糖(5%，w/v)的0.5 mL Tris缓冲液(25 mM，pH 7.2±0.05)中，超声振荡重悬置于4°C下避光保存备用。
(2) 羧基纳米磁球偶联黄曲霉B1单克隆抗体(M@mAb-AFB1)
采用EDC活化酯法将羧基纳米磁球与黄曲霉毒素B1(mAb-AFB1)单克隆抗体偶联。
首先，取50 μL的羧基纳米磁性微球(固含量为1%)，使用磁性吸附弃磁选液，再用50 μL MES(10 mM, pH 6.0)重悬。将100 μL的EDC (5 mg/mL)和50 μL NHS(5 mg/mL)与磁球涡旋混匀，用10 mM MES (pH 6.0)补充至500 μL，将混合溶液在37 °C下振荡孵育30分钟，然后磁性吸附弃磁选液，加入500 μL的AFB1-mAb (200 μg/mL, pH 6.5)。在37 °C避光反应3 小时。添加500 μL牛血清白蛋白(5%, m/v)的磷酸盐缓冲液(100 mM，pH 6.5)在37 °C下孵育30 分钟，封闭磁性微球上剩余的未结合位点，使用磁性吸附法用磷酸盐缓冲液(100 mM，pH 6.5)清洗产物三次。最后，将羧基纳米磁球偶联的黄曲霉B1单克隆抗体混合物悬浮于1 mL磷酸盐缓冲液[100 mM，pH 6.5, 含有BSA(0.5%, m/v)、Tween-20(0.05%, v/v)]中，置于4 °C备用。
(3) 磁捕获法检测AFB1
基于双水相系统原理建立三层液体体系(分为上、中、下三层)，EM@mAb-AFB1与中层的液体混匀，多层液体体系的上下层无预处理步骤。上、中、下三层液体体积分别为60 μL、60 μL和70 μL，依次加入到透明反应容器中。将一定浓度的M@mAb-AFB1和不同浓度AFB1依次添加到三层液体体系上层液体中，室温孵育3～5分钟，施加外部磁场，磁性复合物富集在透明反应容器底部。使用凝胶成像系统的紫外线照射反应容器，观察透明反应容器底部是否有荧光并拍照，作为检测结果的认定依据，根据图片荧光点的灰度值，进行半定量分析。另外，使用黄曲霉毒素M1(AFM1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)验证了该方法的检测特异性(见图5)。
Claims (16)
1.一种基于磁捕获的荧光标记免疫检测方法，其特征主要包括以下步骤：
步骤1：制备镧系元素铕配合物Eu(DBM)3(TOPO)2，避光保存备用。
2.步骤2：制备镧系元素铕配合物Eu(TTA)3phen，避光保存备用。
3.步骤3：精制聚合单体苯乙烯，置于4°C保存备用。
4.步骤4：采用细乳聚合法制备镧系元素铕纳米乳胶微球，使用透析袋在去离子水中透析7天，透析后产物置于4 °C避光保存，备用。
5.步骤5：测定镧系元素铕纳米乳胶微球表面羧基含量。
6.步骤6：采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)活化酯法将镧系元素铕纳米乳胶微球与黄曲霉毒素B1单克隆抗体(mAb-AFB1)偶联，置于4°C保存备用。
7.步骤7：采用EDC活化酯法将羧基纳米磁球与黄曲霉毒素B1 (mAb-AFB1)单克隆抗体偶联，置于4°C保存备用。
8.步骤8：磁捕获法检测AFB1，使用凝胶成像系统的紫外线照射反应容器，观察透明反应容器底部是否有荧光并拍照，作为检测结果的认定依据。另外，根据图片荧光点的灰度值，进行半定量分析。
9. 根据权利要求1所述的步骤1合成镧系元素铕配合物Eu(DBM)3(TOPO)2方法，其特征在于：使用的配体有两种，第一配体是浓度为9 mM二苯甲酰甲烷 (DBM)，第二配体是浓度为6 mM三正辛基氧化膦 (TOPO)。
10. 根据权利要求1所述的步骤2合成镧系元素铕配合物Eu(TTA)3phen方法，其特征在于：使用的配体有两种，第一配体是浓度为9 mM 2-噻吩甲酰三氟丙酮 (TTA)，第二配体是浓度为3 mM 1,10-邻菲咯啉 (phen)。
11. 根据权利要求1所述的步骤3苯乙烯精制方法，其特征在于：使用NaOH溶液(5%, m/v)作为苯乙烯试剂中阻聚剂的去除剂。
12. 根据权利要求1所述的步骤4采用细乳聚合法制备镧系元素铕纳米乳胶微球，其特征在于：超声均质制备乳液和分段式羧基修饰，在单体聚合反应2小时后，添加200 μL丙烯酸，进行乳胶微球表面功能化修饰。
13. 根据权利要求1所述的步骤5测定镧系元素铕纳米乳胶微球表面羧基含量，其特征在于：用NaOH (1 M)溶液将其pH值滴至11，用HCl溶液(0.02 M)进行滴定直至pH值为3，期间记录电导率的变化趋势并绘制曲线图，根据公式计算镧系元素铕纳米乳胶微球表面羧基含量。
14. 根据权利要求1所述的步骤6镧系元素铕纳米乳胶微球偶联黄曲霉毒素B1单克隆抗体(EM@mAb-AFB1)的制备，其特征在于：向EM@mAb-AFB1初级产物中加入0.5 mL硼酸盐缓冲溶液 (5 mM，pH 6.5±0.05)、0.05% Tween-20[其中含牛血清白蛋白(1%，m/v)和乙醇胺(0.24%，v/v)]在黑暗中于37°C振荡1小时，封闭微球表面的未结合位点。
15. 根据权利要求1所述的步骤7羧基纳米磁球偶联黄曲霉B1单克隆抗体(M@mAb-AFB1)的制备，其特征在于：添加500 μL牛血清白蛋白(5%, m/v)的磷酸盐缓冲液(100 mM，pH6.5)在37 °C下孵育30 分钟，封闭磁性微球上剩余的未结合位点，使用磁性吸附法用磷酸盐缓冲液(100 mM，pH 6.5)清洗产物三次。
16.根据权利要求1所述的步骤8磁捕获法检测AFB1，其特征在于：利用抗原抗体免疫反应、荧光标记技术、磁捕获技术和双水相系统进行免疫检测，实现定性或半定量分析。
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