[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

MX2012006073A - Evento 416 de ariloaxialcanoato dioxigenasa, lineas de soja transgenica relacionadas y su identificacion especifica del evento. - Google Patents

Evento 416 de ariloaxialcanoato dioxigenasa, lineas de soja transgenica relacionadas y su identificacion especifica del evento.

Info

Publication number
MX2012006073A
MX2012006073A MX2012006073A MX2012006073A MX2012006073A MX 2012006073 A MX2012006073 A MX 2012006073A MX 2012006073 A MX2012006073 A MX 2012006073A MX 2012006073 A MX2012006073 A MX 2012006073A MX 2012006073 A MX2012006073 A MX 2012006073A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
soybean
seq
dna
plant
das
Prior art date
Application number
MX2012006073A
Other languages
English (en)
Other versions
MX341974B (es
Inventor
Yunxing Cory Cui
Greg Gilles
Terry Wright
Nathan Vanopdorp
Ning Zhou
Thom Hoffman
Julissa Colon
Ricardo Barns
Yonghe Bai
Original Assignee
Dow Agrosciences Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dow Agrosciences Llc filed Critical Dow Agrosciences Llc
Publication of MX2012006073A publication Critical patent/MX2012006073A/es
Publication of MX341974B publication Critical patent/MX341974B/es

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/06—Processes for producing mutations, e.g. treatment with chemicals or with radiation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/12—Processes for modifying agronomic input traits, e.g. crop yield
    • A01H1/122—Processes for modifying agronomic input traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • A01H1/123—Processes for modifying agronomic input traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/10—Seeds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/54—Leguminosae or Fabaceae, e.g. soybean, alfalfa or peanut
    • A01H6/542—Glycine max [soybean]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Catching Or Destruction (AREA)
  • Seeds, Soups, And Other Foods (AREA)
  • Beans For Foods Or Fodder (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

La presente invención se refiere al evento de soja AAD-12 (Glycine max) designado DAS-68416-4 que se depositó en la American Type Culture Collection (ATCC) con número de acceso PTA-10442 y su progenie derivada; otros aspectos de la invención comprenden las plantas de la progenie, las sojas, semillas y/o partes regenerables de las plantas y semillas y la progenie de un evento de soja DAS-68416-4, así como a comida o productos alimenticios preparados de cualquiera de ellos.

Description

EVENTO 416 DE ARILOAXIALCANOATO DIOXIGENASA. LÍNEAS DE SOJA TRANSGÉNICA RELACIONADAS Y SU IDENTIFICACIÓN ESPECÍFICA DEL EVENTO ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El gen aad-12 (originalmente de Delftia acidovorans) codifica la proteína de ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD-12). El rasgo confiere tolerancia a ácido 2,4-diclorofenoxiacético, por ejemplo, y a herbicidas de piridiloxiacetato. El gen aad-12, en sí, para la tolerancia a herbicidas en plantas se reveló por primera vez en el documento WO 2007/053482.
La expresión de genes heterólogos o extranjeros en plantas es influenciada por el lugar en que se inserta el gen extraño en el cromosoma. Esto se puede deber a la estructura de la cromatina (por ejemplo, heterocromatina) o la proximidad de elementos de regulación transcripcional (por ejemplo, mejoradores) cercanos al sitio de integración (Weising et al., Ann. Rev. Genet 22:421-477, 1988), por ejemplo. El mismo gen en el mismo tipo de planta transgénica (u otro organismo) puede exhibir una amplia variación en el nivel de expresión entre diferentes eventos. También puede haber diferencias en patrones espaciales o temporales de expresión. Por ejemplo, las diferencias en la expresión relativa de un transgén en diversos tejidos vegetales pueden no corresponder a los patrones esperados de elementos de regulación transcripcional presentes en el constructo génico introducido.
De esta manera, a menudo se crean y controlan grandes cantidades de eventos a fin de identificar un evento que expresa un gen introducido de interés en un nivel satisfactorio para un fin dado. Para fines comerciales, es común producir cientos a miles de diferentes eventos y controlar estos eventos para un evento individual que tiene niveles de expresión y patrones de transgenes. Un evento que tiene niveles y/o patrones de expresión de transgenes deseado es de utilidad para introgresar el transgén en otros antecedentes genéticos por cruzamiento sexual usando métodos de cría convencionales. La progenie de tales cruzas mantiene las características de la expresión del transgén del transformante original. Esta estrategia se usa para asegurar una expresión génica confiable en una cantidad de variedades que se adaptan bien a las condiciones de crecimiento locales.
La solicitud de patente U. S. 20090130071 se refiere a un evento de soja MON87701 y a métodos de detección. Las solicitudes de patente U. S. 20090036308 y 20080051288 se refieren a un evento de soja 3560.4.3.5 y a métodos de detección. La solicitud de patente U. S. 20080312082 se refiere a un evento de soja DP-305423-1 y métodos de detección. La solicitud de patente U. S. 20060282915 se refiere a un evento de soja MON89788 y métodos de detección.
Las sojas AAD-12 que tienen el evento específico descrito en la presente no se han descrito previamente.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al evento de soja AAD-12 (Glycine max) designado DAS-68416-4 que se depositó en la American Type Culture Collection (ATCC) con número de acceso PTA-10442 y su progenie derivada. Otros aspectos de la invención comprenden las plantas de la progenie, las sojas, semillas y/o partes regenerables de las plantas y semillas y la progenie de un evento de soja DAS-68416-4, así como a comida o productos alimenticios preparados de cualquiera de ellos. La invención también incluye partes de plantas de un evento de soja DAS-68416-4 que incluyen, pero sin limitación, polen, óvulo, flores, brotes, raíces y hojas y núcleos de células vegetativas, células de polen y células de huevos. La invención también se refiere a plantas de soja que tienen tolerancia a herbicidas fenoxiauxínicos y/o de ariloxialcanoato, nuevas composiciones genéticas de un evento de soja DAS-68416-4 y aspectos del rendimiento agronómico de plantas de soja que comprenden un evento de soja DAS-68416-4.
La presente invención se refiere en parte a cruzamiento de plantas y a plantas tolerantes a herbicidas. Esta invención incluye un nuevo evento de transformación de aad-12 en plantas de soja que comprende una secuencia de polinucleótidos, tal como se describe en la presente, insertada en un sitio específico dentro del genoma de una célula de soja.
En algunas realizaciones, dicho evento/secuencia de polinucleótidos puede ser "agrupada" con otras características, entre las que se encuentran, por ejemplo, otro u otros genes de tolerancia a herbicidas y/o proteínas inhibidoras de insectos. No obstante, la invención objeto de la presente incluye plantas con el evento único, de acuerdo con lo descrito en la presente. En una realización particular de la invención, uno o más rasgos tolerantes a herbicida se apilan con el evento de soja DAS-68416-4 con propósitos de controlar varias malezas y hierbas resistentes a los herbicidas (por ejemplo, malezas resistentes al glifosato).
En forma adicional, la invención objeto de la presente provee ensayos para detectar la presencia del evento objeto de la presente en una muestra (de soja, por ejemplo). Los ensayos se puede basar en la secuencia de ADN del constructo recombinante, insertado en el genoma de la soja y en las secuencias genómicas flanqueantes del sitio de inserción. También se proveen kits y condiciones útiles para la realización de los ensayos.
De esta manera, la invención objeto se refiere en parte a la clonación y el análisis de las secuencias de ADN de un inserto entero de aad-12 y a sus regiones de borde (en líneas de soja transgénicas). Estas secuencias son exclusivas. Sobre la base de estas secuencias de inserto y de borde, se generaron cebadores específicos de eventos. El análisis de PCR demostró que estos eventos se pueden identificar por análisis de los amplicones de PCR generados con estos grupos de cebadores específicos de eventos. De esta manera, este y otros procedimientos relacionados se pueden usar para identificar únicamente líneas de soja que comprenden el evento de la invención objeto.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra un mapa de plásmido de pDAB4468.
La Figura 2 muestra un diagrama de ADN genómico del evento de soja, en el que DAS-68416-4 se digirió con EcoRV o Pvu II y se usó para generar librerías GENOMEWALKER™ correspondientes que se usaron como plantillas para amplificar las secuencias de ADN blanco.
La Figura 3 representa las ubicaciones del cebador para confirmar la secuencia de longitud total del evento de soja DAS-68416-4 de los bordes 5' a 3'.
La Figura 4 representa las ubicaciones del cebador para confirmar la secuencia de longitud total del evento de soja DAS-68416-4 de los bordes 5' a 3'.
La Figura 5 representa las ubicaciones del cebador para confirmar la secuencia del sitio de inserción del evento de soja AAD-12 DAS-68416-4.
La Figura 6 muestra niveles de expresión a través del ciclo de vida de la planta.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS SEQ ID NO:1 provee secuencias de inserto y flanqueantes para el evento de soja objeto DAS-68416-4.
SEQ ID NOs:2-28 son cebadores tal como se describen en la presente.
SEQ ID NOs:29 y 30 son marcadores SNP flaqueantes BARC-019093-03299 y BARC-044607-08736, tal como se describen en la presente.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en parte a cruza de plantas y a plantas tolerantes a herbicidas. Esta invención incluye nuevos eventos de transformación de plantas de soja que comprenden secuencias de polinucleótidos objeto aad-12, tal como se describen en la presente, insertadas en un sitio específico del genoma de una célula de soja. En algunas realizaciones, dicha secuencia de polinucleótidos se puede "apilar" con otros rasgos (tales como otros genes de tolerancia a herbicidas y/o genes que codifican proteínas inhibidoras de insectos, por ejemplo. Sin embargo, la invención objeto incluye plantas que tienen un evento individual, tal como se describe en la presente.
Adicionalmente, la invención objeto provee ensayos para detectar la presencia del evento objeto en una muestra. Los aspectos de la invención objeto incluyen métodos de diseño y/o producción de cualquier molécula de ácido nucleico de diagnóstico ejemplificada o sugerida en la presente, en particular aquellas basadas total o parcialmente en las secuencias flanqueantes objeto.
Más específicamente, la invención objeto se refiere en parte a un evento de soja transgénico DAS-68416-4, líneas de plantas que comprenden estos eventos y clonación y análisis de las secuencias de ADN de este inserto, y/o sus regiones de borde. Las líneas de plantas de la invención objeto se pueden detectar usando las secuencias descritas y sugeridas en la presente.
En algunas realizaciones, la presente invención se refiere a líneas de soja que toleran herbicidas y a su identificación. La invención objeto de la presente se refiere, en parte, a la detección de la presencia del evento objeto de la presente con el fin de determinar si la progenie de una cruza sexual contiene el evento en cuestión. Además, se incluye un método para detectar el evento y resulta útil, por ejemplo, para cumplir con las reglamentaciones que exigen la aprobación previa a la comercialización y el etiquetado de alimentos derivados, por ejemplo, de plantas de cultivos recombinantes. Es posible detectar la presencia del evento objeto por cualquier método de detección de ácidos nucleicos bien conocido tales como reacción de polimerasa en cadena (PCR) o hibridación de ADN usando sondas de ácido nucleico. Se trata una PCR específica de eventos, por ejemplo, en Windels et al. (Med. Fac. Landbouww, Univ. Gent 64/5b:459462, 1999). Se refiere a la identificación de un evento de soja tolerante a glifosato 40-3-2 por PCR usando un grupo de cebadores que tensan la unión entre el inserto y el ADN flanqueante. Más específicamente, un cebador incluía la secuencia del inserto y un segundo cebador incluía la secuencia del ADN flanqueante.
La soja se modificó con la inserción del gen aad-12, derivado de Delñia acidovorans, que codifica la proteína de ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD-12). El rasgo confiere tolerancia a ácido 2,4-diclorofenoxiacético y herbicidas de piridiloxiacetato y se puede usar como un marcador seleccionare durante la transformación de las plantas y en criaderos.
Más específicamente, se describe en la presente el evento de AAD-12 pDAB4468-0416 y su selección y caracterización para la estabilidad y la expresión a niveles de la planta entera y niveles moleculares de generación en generación.
El gen sintético objeto de la presente (aad-12) utilizado de acuerdo con la invención objeto de la presente fue derivado de Delftia acidovorans y codifica una enzima capaz de desactivar varios herbicidas con un resto ariloxialcanoato, que incluye fenoxi-auxina (por ejemplo, 2,4-D, MCPA), así como también piridiloxi-auxinas (por ejemplo, fluoxipir, triclopir). El gen aad-12, activado por activadores atUbUO, fue introducido en la línea de soja Maverick a través de técnicas Agrobacterium tumefaciens. Las plantas T0 transgénicas se autopolinizaron durante 4-6 generaciones. En paralelo, el gen aad-12 también se introgresó en variedades de soja de élite. Todos los eventos transgénicos fueron caracterizados durante 4-5 generaciones en criaderos contenidos y regulados y en instalaciones de laboratorio.
Se secuenciaron y caracterizaron ambos extremos de la inserción del evento pDAB4468-0416. Se desarrollaron ensayos específicos de eventos. Se mapeó también sobre el genoma de soja (cromosoma de soja 4); se describen marcadores SNP flanqueantes en la presente como SEQ ID NOS: 29 y 30. El evento se introgresó en otras líneas de élite. El evento provee tolerancia a 2,4-D y glufosinato.
Conducido por el promotor atUbftO, más de 100 eventos de soja AAD12 T1 Maverick se generaron por medio de técnicas con Agrobacterium tumefaciens. El evento pDAB4468-0416 se seleccionó a través de una selección de linaje individual de cinco generaciones autopolinizadas y pocas generaciones retrocruzadas. Era morfológicamente normal y era tolerante a 2240 g ae/ha de pulverización de 2,4-D en V3 a través de cada generación autopolinizada. El evento se heredó como un gen dominado individual y tenía segregaciones normales de Mendel en generaciones autopolinizadas y también generaciones retrocruzadas.
Se halló que el evento pDAB4468-0416 tiene una integración individual con una unidad de transcripción vegetal de longitud total (PTU). No había secuencia génica resistente a antibióticos hallada de la estructura del vector y ningún gen silenciador detectado a través de varias generaciones en el estado homocigota y heterocigota del gen aad-12. El gen aad-12 se expresó en niveles esperados que llevaron a los niveles de tolerancias a 2,4-D. El evento expresaba el gen aad- 12 establemente a lo largo de generaciones y entre linajes hermanos dentro de una generación dada.
Como se aludió en la sección de los antecedentes, la introducción y integración de un transgén en un genoma vegetal incluye algunos eventos aleatorios (de ello, el nombre de "evento" para una inserción dada que se expresa). Es decir, con muchas técnicas de transformación tal como transformación de Agrobacterium, la "pistola génica" y WHISKERS, no se puede pronosticar dónde se insertará un transgén en el genoma. Así, la identificación del ADN genómico vegetal flanqueante a ambos lados del inserto puede ser importante para identificar una planta que tiene un evento de inserción dado. Por ejemplo, se pueden diseñar cebadores de PCR que generar un amplicón de PCR a través de la región de unión del inserto y el genoma huésped. Este amplicón de PCR se puede usar para identificar un tipo único distinto de evento de inserción.
"Eventos" son eventos originalmente aleatorios, como parte de esta descripción se depositaron al menos 2500 semillas de una línea de soja que comprende el evento y se pusieron a disposición del público sin restricción (pero se sometieron al derecho de patentes), con la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110. El depósito se designó depósito ATCC N.° PTA-10442. Se depositaron 25 viales de semillas de Glycine max (evento de AAD-12 pDAB4468-0416) a nombre de Dow AgroSciences LLC el 22 de octubre de 2009. El depósito se ensayó el 2 de noviembre de 2009 y en esa fecha, las semillas eran viables. Este depósito se realizó y se mantendrá de acuerdo y en los términos del Tratado de Budapest respecto de los depósitos de semillas a los fines del procedimiento de patentes. El depósito se mantendrá sin restricción en el depósito de ATCC, que es un depósito público, durante un período de 30 años o 5 años después de la solicitud más reciente o para la vida efectiva de la patente, que es más larga y se reemplazará si se torna inviable durante ese período.
Las semillas depositadas son parte de la invención objeto. Claramente, las plantas de soja se pueden cultivar a partir de estas semillas y estas plantas son parte de la invención objeto. La invención objeto también se refiere a secuencias de ADN contenidas en estas plantas de soja que son de utilidad para detectar estas plantas y su progenie. Los métodos de detección y los kits de la invención objeto se pueden dirigir para identificar uno, dos o tres de estos eventos, según la última finalidad del ensayo.
En la presente, se proveen definiciones y ejemplos para colaborar en la descripción de la presente invención y guiar a los expertos en el arte para poner en práctica la invención. A menos que se lo indique de otra manera, los términos deben entenderse de acuerdo al uso convencional de los expertos en el arte relevante. Se emplea la nomenclatura para las bases de ADN de la forma establecida en 37 CFR §1.822.
De la forma utilizada en la presente, el término "progenie" indica la descendencia de cualquier generación de una planta madre que comprenda el evento de soja AAD-12 DAS-68416-4.
Un "evento" transgénico es producido por transformación de células de una planta con ADN heterólogo, es decir, un constructo de ácido nucleico que incluye un transgén en cuestión, la regeneración de una población de plantas que resulta de la inserción del transgén en un genoma de la planta, y la selección de una planta en particular caracterizada por la inserción en una ubicación del genoma especial. El término "evento" hace referencia al transformante original y a la progenie del transformante que incluye el ADN heterólogo. El término "evento" también hace referencia a la progenie producida por un cruzamiento sexual entre el transformante y otra variedad que incluye ADN genómico/transgénico. Incluso después de un retrocruzamiento repetido con un progenitor recurrente, el ADN de transgenes insertados y ADN genómico flanqueante (ADN genómico/de transgenes) desde el progenitor transformado está presente en la progenie de la cruza en la misma ubicación cromosómica. El término "evento" también hace referencia al ADN del transformante original y a la progenie del mismo que comprende el ADN insertado y la secuencia genómica flanqueante inmediatamente adyacente al ADN insertado que se esperaría fuera transferido a una progenie que reciba el ADN insertado incluyendo el transgén en cuestión como resultado de una cruza sexual de una línea parenteral que incluye el ADN insertado (por ejemplo, el transformante original y la progenie resultante de autofecundación) y una línea parenteral que no contenga el ADN insertado.
Una "secuencia de unión" abarca el punto en el que el ADN insertado en el genoma es vinculado con el ADN desde el genoma nativo de la soja que flanquea el punto de inserción, la identificación o la detección de una o las otras secuencias de unión en el material genético de la planta que es suficientemente diagnóstico para el evento. Se incluyen las secuencias de ADN que abarcan las inserciones en los eventos de soja descriptos en la presente y longitudes similares de ADN flanqueante. En la presente, se proveen ejemplos específicos de dichas secuencias de diagnóstico; no obstante, otras secuencias que se superponen con las uniones de las inserciones, o las uniones de las inserciones y la secuencia genómica, también son de diagnóstico y podrían ser utilizadas de acuerdo con la invención objeto de la presente.
La invención objeto de la presente se refiere a la identificación de dichas secuencias flanqueantes, de unión y de inserción. Los cebadores de PCR relacionados y los amplicones están incluidos en la invención. De acuerdo con la invención objeto de la presente, los métodos de análisis de PCR que emplean amplicones que abarcan ADN insertado, y sus límites pueden ser utilizados para detectar o identificar variedades de soja transgénica comercializada de las líneas de soja transgénica de propiedad exclusiva.
Durante el proceso de introducir un inserto en el genoma de las células de plantas, no es poco común que ocurran algunas supresiones u otras alteraciones del inserto y/o flanqueo genómico. De esta manerael segmento relevante de la secuencia plásmida provisto en la presente puede comprender algunas variaciones menores. Lo mismo podría ser cierto para las secuiencias flanqueantes provistas en la presente descripción. De esta manera, una planta que comprende un polinucleótido que tiene agunos rangos de identidad con las secuencias flanqueantes y/o de inserto objeto, está dentro del alcance de la invención objeto. La identicad con la secuencia de la presente invención puede ser una secuencia de polinucleótido que tiene al menos una identidad de secuencia de 65%, más preferiblemente al menos una identidad de secuencia de 70%, más preferiblemente al menos una identidad de secuencia de 75%, más preferiblemente al menos una identidad de 80%, y más preferiblemente al menos una identidad de secuencia de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% con una secuencia ejemplificada o descrita en la presente descripción. La hibridación y condiciones de hibridación según se provporcionan aquí, se puede usar para definir las plantas y secuencias de polinucleótido de la invención objeto. La secuencia de las secuencias flanqueantes más la secuencia de incerto puede estar confirmada en referencia con la semilla depositada.
Todas las secuencias de cada uno de estos insertos, junto con las porciones de las secuencias flanqueantes respectivas, son provistas en la presente como SEQ ID NO: 1. Las coordenadas de las secuencias de inserto y flanqueantes para este evento respecto de la SEQ ID NO: 1 (10.212 pares base en total) se encuentran en el cuadro 1. Esto se trata con mayor detalle, por ejemplo, en el Ejemplo 3.
CUADRO 1 Numeración de residuo respecto de la SEQ ID NO: 1, de las secuencias de inserto v flanqueantes para el Evento DAS-68416-4 Flanqueante 5' De inserción Flanqueante 3' N.° de residuo 1-2730 2731-9121 9122-10,212 (SEQ: 1 ): longitud (bp): 2.730 bp 6.391 bp 1.091 bp Estas secuencias (en particular, las secuencias flanqueantes) son exclusivas. Sobre la base de estas secuencias de inserción y de borde, se generaron cebadores específicos de eventos. El análisis de PCR demostró que estas líneas de soja se pueden identificar en distintos genotipos de soja por análisis de amplicones de PCR generados con estos grupos de cebadores específicos de eventos. De esta manera, estos y otros procedimientos se pueden usar para identificar exclusivamente estas líneas de soja. Las secuencias identificadas en la presente son exclusivas.
Las técnicas de detección de la invención objeto de la presente son especialmente útiles junto con el cultivo de plantas, con el fin de determinar qué plantas de la progenie comprenden un evento dado, después de que una planta progenitora que comprenda un evento en cuestión sea cruzada con otra línea de plantas en un esfuerzo por impartir una o más características adicionales en cuestión en la progenie. Estos métodos de análisis de PCR benefician los programas de cultivo de soja así como también el control de calidad, en especial, para semillas de soja transgénicas comercializadas. Ahora también pueden producirse y utilizarse kits de detección de PCR para estas líneas de soja transgénica. Asimismo, puede beneficiar el registro y la administración del producto.
Por otra parte, se pueden usar secuencias flanqueantes/genómicas de soja para identificar específicamente la ubicación genómica de cada inserto. Esta información se puede usar para preparar sistemas de marcadores moleculares específicos de cada evento. Esto puede emplearse para estrategias de cultivos acelerados y para establecer datos de vinculación.
Además, la información de secuencias flanqueantes puede ser utilizada para estudiar y caracterizar procedimientos de integración de transgenes, características de sitio de integración genómica, clasificación de eventos, estabilidad de transgenes y sus secuencias flanqueantes, y expresión de genes (en especial, relacionado con el silenciamiento de genes, los patrones de metilación de transgenes, efectos de posición y elementos relacionados con la expresión potencial como ser MARS (regiones de anclaje de matriz), y similares).
A la luz de toda la descripción objeto, quedará claro que la invención objeto incluye semillas disponibles bajo el depósito ATCC N.° PTA-10442. La invención objeto también incluye una planta de soja resistente a herbicidas cultivada de una semilla depositada en ATCC con el número de acceso PTA-10442. La invención objeto también incluye partes de dicha planta tales como hojas, muestras de tejidos, semillas producidas por dicha planta, polen y similares.
Además, la invención objeto incluye plantas descendientes y/o progenie de plantas cultivadas de la semilla depositada, con preferencia, una planta de soja resistente a herbicida, en donde dicha planta tiene un genoma que comprende una secuencia de unión de ADN genómico de tipo salvaje detectable/ADN de inserto, tal como se describe en la presente. Tal como se usa en la presente, el término "soja" implica Glycine max e incluye todas sus variedades que se pueden criar con una planta de soja.
Esta invención también incluye procesos de preparación de cruzas que usa una planta de la invención objeto como al menos una progenitora. Por ejemplo, la invención objeto incluye una planta híbrida Fi que tiene como uno o ambos progenitores cualquiera de las plantas ejemplificadas en la presente. También está dentro de la invención objeto la semilla producida por estos híbridos Fi de la invención objeto. Esta invención incluye un método para producir una semilla híbrida Fi cruzando una planta ejemplificada con una planta diferente (por ejemplo, progenitor en cruza) y recolectando la semilla híbrida resultante. La invención objeto incluye una planta ejemplificada que es un progenitor femenino o un progenitor masculino. Las características de las plantas resultantes se pueden mejorar por consideración cuidadosa de las plantas progenitoras.
Una planta de soja que tolera los herbicidas puede ser producida por un primer cruzamiento sexual de una primera planta de soja parenteral que consiste en una planta de soja que se desarrolla a partir de una semilla de una cualquiera de las líneas referidas en la presente, y una segunda planta de soja parenteral, lo cual produce una pluralidad de plantas de primera progenie; y luego, por la selección de una planta de primera progenie que resista a un herbicida (o que procese al menos uno de los eventos de la invención objeto de la presente); y la autofecundación de la planta de primera progenie, lo cual produce una pluralidad de plantas de segunda progenie; y luego, la selección a partir de las plantas de segunda progenie, de una planta que sea resistente a un herbicida (o que posea al menos uno de los eventos de la invención objeto de la presente). Estos pasos pueden incluir, además, el retrocruzamiento de la planta de primera progenie o la planta de segunda progenie con la segunda planta de soja parenteral o una tercera planta de soja parenteral. Luego, puede plantarse un cultivo de soja que comprende semillas de la invención objeto de la presente, o su progenie.
Así mismo, cabe destacar que también pueden cruzarse dos plantas transgénicas diferentes para producir descendencia que contenga dos genes exógenos, agregados, de segregación independiente. La autofecundación de una progenie apropiada puede producir plantas que sean homocigotas para ambos genes exógenos agregados. También se contempla el retrocruzamiento con una planta parenteral y el cruzamiento con una planta no transgénica, como la propagación vegetativa. En el arte, se conocen otros métodos de cruzamiento comúnmente utilizados para diferentes características y cultivos. La producción por retrocruzamiento ha sido utilizada para transferir genes respecto de una característica altamente heredable, de simple herencia. La fuente de la característica a ser transferida es denominada progenitor donante. Se espera que la planta resultante presente los atributos del progenitor recurrente (por ejemplo, el cultivar) y la característica conveniente transferida desde el progenitor donante. Después de la cruza inicial, los individuos que procesan el fenotipo del progenitor donante son seleccionados y cruzados repetidas veces (retrocruzamiento) con el progenitor recurrente. Se espera que el progenitor resultante presente los atributos del progenitor recurrente (por ejemplo, el cultivar) y la característica conveniente transferida desde el progenitor donante.
Las moléculas de ADN de la presente invención se pueden emplear como marcadores moleculares en un método de cruzamiento asistido por marcadores (MAB). Las moléculas de ADN de la presente invención pueden ser empleadas con otros métodos (como ser marcadores AFLP, marcadores RFLP, marcadores RAPD, SNPs y SSRs) que identifican características útiles desde el punto de vista agronómico genéticamente vinculadas, de acuerdo con lo conocido en el arte. La característica de resistencia a un herbicida puede rastrearse en la progenie de una cruza con una planta de soja de la invención objeto de la presente (o su progenie y otro cultivar de soja o variedad) mediante el uso de métodos MAB, Las moléculas de ADN son marcadores para esta característica, y los métodos MAB que resultan conocidos en el arte también pueden ser empleados para realizar un seguimiento de la o las características de resistencia a un herbicida en plantas de soja donde al menos una línea de soja de la invención objeto de la presente, o su progenie, fuera un progenitor o ancestro. Los métodos de la presente invención pueden ser empleados para identificar cualquier variedad de soja que presente el evento objeto de la presente.
Los métodos de la invención objeto de la presente incluyen un método para producir una planta de soja que tolere un herbicida donde dicho método comprende el cruzamiento con una planta de la invención objeto de la presente. Más específicamente, dichos métodos pueden comprender el cruzamiento de dos plantas de la invención objeto de la presente, o una planta de la invención objeto de la presente y cualquier otra planta. Los método preferidos comprenden, además, la selección de la progenie de dicho cruzamiento mediante el análisis de dicha progenie para un evento que puede detectarse de acuerdo con la invención objeto de la presente. Por ejemplo, la invención objeto de la presente puede ser utilizada para rastrear el evento objeto de la presente a través de ciclos de cruzamiento con plantas que comprenden otras características convenientes, como ser características agronómicas como ser las que son puestas a prueba en la presente en sus diversos ejemplos. Las plantas que comprenden el evento objeto de la presente y la característica conveniente pueden ser detectadas, identificadas, seleccionadas y rápidamente utilizadas, por ejemplo, en otros cruzamientos. La característica/evento objeto de la presente también pueden ser combinados por cruzamiento, y pueden ser rastreados de acuerdo con la invención objeto de la presente, con una o más características de resistencia a un insecto y/o con otras características de tolerancia a un herbicida. Una realización preferida de esto último es una planta que comprende el evento objeto de la presente combinada con un gen que codifique la resistencia al herbicida dicamba.
Así, la invención objeto puede combinarse, por ejemplo, con características que codifiquen la resistencia al glifosato (por ejemplo, una planta resistente o EPSPS, GOX, GAT bacterial), resistencia al glufosinato (por ejemplo, Pat, Bar), resistencia al herbicida inhibidor de acetolactato sintasa (ALS) (por ejemplo, imidazoles [como ser ¡mazetapir], sulfonilureas, triazolopirimidina sulfonanilida, pirmidiniltiobenzoatos, y otros químicos [Csr1, SurA, et al.]), resistencia al bromoxinil (por ejemplo, Bxn), resistencia a inhibidores de enzima HPPD (4-hidroxifenil-piruvato-dioxigenasa), resistencia a inhibidores de fitoeno desaturasa (PDS), resistencia a herbicidas inhibidores de fotosistema II (por ejemplo, psbA), resistencia a herbicidas inhibidores de fotosistema I, resistencia a herbicidas inhibidores de protoporfirinogen oxidasa IX (PPO) (por ejemplo PPO-1), resistencia a herbicidas de fenilurea (por ejemplo, CYP76B1), enzimas degradantes de Dicamba (referirse, por ejemplo, al documento US 20030135879), y otros podrían estar agrupados solos o en múltiples combinaciones de forma de proveer la capacidad de controlar o evitar con efectividad los cambios de malezas y/o la resistencia a cualquier herbicida de las clases arriba mencionadas.
Respecto de los herbicidas adicionales, algunos inhibidores preferidos de ALS (también conocidos como AHAS) incluyen las triazolopirimidina sulfonanilidas (como ser cloransulametilo, diclosulam, florasulam, flumetsulam, metosulam y penoxsulam), pirimidiniltiobenzoatos (como ser bispiribac y piritiobac), y flucarbazona. Entre algunos inhibidores de HPPD preferidos se encuentran la mesotriona, isoxaflutol y la sulcotriona. Algunos inhibidores de PPO preferidos incluyen flumiclorac, flumioxazina, flufenpir, piraflufeno, flutiacet, butafenacilo, carfentrazona, sulfentrazona y los éteres difenílicos (como ser acifluorfeno, fomesafeno, lactofeno y oxifluorfeno).
En forma adicional, el AAD-12 solo o junto con una o más características de HTC adicionales puede ser agrupado con una o más características adicionales de entrada (por ejemplo, resistencia a insectos, resistencia fúngica, o tolerancia a la tensión, et al.) o de salida (por ejemplo, un mayor rendimiento, mejor perfil oleoso, mejor calidad de fibra, et al.). De esta forma, la invención objeto de la presente puede ser utilizada para proveer un paquete agronómico completo de calidad de cultivo mejorada con la capacidad de controlar en forma flexible y con una buena relación costo-beneficio de cualquier cantidad de plagas agronómicas.
La enzima AAD-12 objeto de la presente permite una expresión transgénica que da como resultado la tolerancia a combinaciones de herbicidas que controlarían casi todas las malezas y hierbas latifoliadas. AAD-12 puede servir de excelente característica para cultivos tolerantes a herbicidas (HTC) para ser unida a otras características de HTC (por ejemplo resistencia al glifosato, resistencia al glufosinato, resistencia a la imidazolinona, resistencia al bromixinilo, et al.) y características de resistencia a insectos (CryIF, CryIAb, Cry 34/45, et al.) por ejemplo. En forma adicional, AAD-12 puede servir de marcador susceptible de ser seleccionado para colaborar en la selección de transformantes primarios de plantas creadas por ingeniería genética con un segundo gen o grupo de genes.
El gen AAD-12 de la invención objeto también provee resistencia a compuestos que se convierten en herbicidas de fenoxiacetato auxina (por ejemplo, 2,4-DB, MCPB, etc.). El resto de ácido butírico presente en el herbicida 2,4-DB se convierte a través de ß-oxidación en el ácido 2,4-diclorofenoxiacético fitotóxico. Del mismo modo, MCPB se convierte por ß-oxidación en el MCPA fitotóxico. Los herbicidas de ácido butanoico son en sí no herbicidas. Se convierten en su respectivo ácido por ß-oxidación en plantas susceptibles, y es la forma de ácido acético del herbicida que es fitotóxica. Las plantas incapaces de una rápida ß-oxidación no son dañadas por los herbicidas de ácido butanoico. Sin embargo, las plantas que son capaces de una rápida ß-oxidación y pueden convertir el herbicida de ácido butanoico en la forma acética se protegen posteriormente con AAD-12.
Los métodos de aplicación de herbicidas se conocen en la técnica. Estas aplicaciones pueden incluir mezclas en tanque de más de un herbicida.
Algunos herbicidas preferidos para usar de acuerdo con la invención objeto incluyen herbicida de fenoxiauxina tales como 2,4-D; 2,4-DB; MCPA; MCPB. Ellos se pueden apilar con uno o varios genes de tolerancia a herbicidas adicionales y un correspondiente herbicida (por ejemplo, glifosato y/o glufosinato). Se pueden usar uno, dos, tres o más herbicidas en combinaciones ventajosas que serían obvias para un experto en la técnica que tiene el beneficio de la descripción objeto. Uno o varios de los herbicidas objeto se pueden aplicar al campo/al área antes de plantarlos con las semillas de la invención objeto. Estas aplicaciones pueden ser dentro de un lapso de 14 días, por ejemplo, de plantado. También se pueden aplicar uno o varios de los herbecidos objeto en el plantado y/o después del plantado, pero antes de la emergencia. Uno o varios de los herbicidas objeto también se pueden aplicar al suelo (para controlar las malezas) o sobre la parte superior de las malezas y/o plantas transgénicas de la invención objeto. Los herbicidas objeto se pueden rotar o usar en combinación, por ejemplo, para controlar o evitar malezas que pueden ser tolerantes a un herbicida pero no a otro. Se pueden usar diversos tiempos de aplicación para los tres tipos objeto de herbicidas en distintos modos, tal como se conoce en la técnica. La invención objeto también se puede usar para controlar voluntarios. Ver la solicitud presentada actualmente intitulada "CONTROL OF AAD DICOT VOLUNTEERS IN MONOCOT CROPS" [Control de voluntarios dicotiledóneos AAD en cultivos monocotiledóneos].
Las características de HTC de la invención objeto de la presente pueden ser empleadas en combinaciones nuevas con otras características de HTC (entre las que se incluyen, pero sin que la enumeración sea taxativa, la tolerancia al glifosato). Estas combinaciones de características dan origen a nuevos métodos para controlar las especies de malezas (y similares), debido a la resistencia recientemente adquirida o tolerancia inherente a los herbicidas (por ejemplo, glifosato). De esta manera, además de las características de HTC, nuevos métodos para controlar malezas mediante el uso de herbicidas, para los que se creó una tolerancia al herbicida a través de dicha enzima en cultivos transgénicos, se encuentran dentro del alcance de la invención.
En forma adicional, prevalecen los cultivos tolerantes al glifosato que se desarrollan en todo el mundo. Muchas veces, en la rotación con otros cultivos tolerantes al glifosato, el control de voluntarios resistentes al glifosato puede ser difícil en los cultivos de rotación. De esta manera, el uso de características transgénicas objeto de la presente, agrupadas o transformadas en forma individual en cultivos, provee una herramienta para controlar otros cultivos voluntarios de HTC.
Una planta preferida o una semilla de la invención objeto comprende en su genoma la secuencias de inserto, tal como se identifican en la presente, junto con al menos 20-500 o más nucleótidos flanqueantes contiguas a ambos lados del inserto, tal como se identifican en la presente. A menos que se lo indique de otra manera, las menciones a secuencias flanqueantes hacen referencia a aquellas identificadas con respecto a la SEQ ID NO: 1 (referirse al cuadro 1 ). Nuevamente, SEQ ID NO: 1 incluye el ADN heterólogo insertado en el transformante original y secuencias genómicas flanqueantes ilustrativas inmediatamente adyacentes al ADN insertado. Podría esperarse que la totalidad o parte de estas secuencias flanqueantes sean transferidas a la progenie que recibe el ADN insertado como resultado de un cruzamiento sexual de una línea parental que incluye el evento.
La invención objeto incluye cultivos tisulares de células regenerables de una planta de la invención objeto. También está incluida una planta regenerada de tal cultivo tisular, en particular donde dicha planta es capaz de expresar todas las propiedades morfológicas y fisiológicas de una variedad ejemplificada. Las plantas preferidas de la invención objeto tienen todas las características fisiológicas y morfológicas de una planta cultivada de la semilla depositada. Esta invención también comprende la progenie de tal semilla y semilla que posee los rasgos de calidad de interés.
Las manipulaciones (tales como mutación, también transfección y también cría) de plantas o semillas o sus partes, pueden conducir a la creación de lo que se denominan variedades "esencialmente derivadas". La International Union for the Protection of New Varieties of Plants (UPOV) proveyó la siguiente guía para determinar si una variedad se derivó esencialmente de una variedad protegida: [A] la variedad se considerará esencialmente derivada de otra variedad ("la variedad inicial") cuando (i) se deriva predominantemente de la variedad inicial o de una variedad que en sí se deriva predominantemente de la variedad inicial, mientras retiene la expresión de las características esenciales que resultan del genotipo o la combinación de genotipos de la variedad inicial; (ii) se puede distinguir claramente de la variedad inicial; y (iii) excepto por las diferencias que resultan del acto de derivación, concuerda con la variedad inicial en la expresión de las características esenciales qe resultan del genotipo o la combinación de genotipos de la variedad inicial.
UPOV, Sixth Meeting with International Organizations, Ginebra, 40 de octubre de 1992; documento preparado por la Oficina de la Unión.
De la forma utilizada en la presente, el término "línea" hace referencia a un grupo de plantas que muestran un poco o ninguna variación genética entre los individuos en al menos una característica. Dichas líneas pueden ser creadas por varias generaciones de autopolinización y selección, o propagación vegetativa a partir de un único progenitor mediante el uso de técnicas de cultivo de tejido o células.
De acuerdo con lo utilizado en la presente, los términos "cultivar" y "variedad" son sinónimos y hacen referencia a una línea que es empleada para producción comercial.
El término "estabilidad" o "estable" significa que, respecto del componente dado, el componente es mantenido de generación en generación y, de preferencia, al menos tres (3) generaciones básicamente en el mismo nivel, por ejemplo, de preferencia ± 15%, de mayor preferencia ± 10%, siendo el más preferido de ± 5%. La estabilidad puede verse afectada por la temperatura, la ubicación, la tensión y el momento en que se planta. La comparación de generaciones posteriores en condiciones de campo debe producir el componente en una forma similar.
La expresión "de uso comercial" es definida como una planta de gran vigor y alta fertilidad, de manera que los cultivos puedan ser generados por los productores mediante el uso de equipos agropecuarios convencionales, y pueda extraerse el aceite de la semilla con los componentes descriptos a través del uso de equipos de trituración y extracción convencionales. Para que el rendimiento sea de uso comercial, según su medición por peso en semillas, contenido de aceite y aceite total producido por hectárea, debe encontrarse dentro del 15% del rendimiento promedio de una variedad de cañóla comercial comparable de otra manera sin las características de primera calidad desarrolladas en la misma región.
La expresión "selecta desde el punto de vista agronómico" significa que una línea cuenta con características agronómicas convenientes como ser rendimiento, madurez, resistencia conveniente, y similares, además de la resistencia a insectos debido al o los eventos objeto de la presente. Las características agronómicas, tomadas en forma individual o en cualquier combinación, de la manera establecida en los Ejemplos, más abajo, en una planta que comprende un evento de la invención objeto de la presente, se encuentran dentro del alcance de la invención objeto de la presente. Cualquiera o la totalidad de estas características agronómicas y puntos de datos pueden ser empleados para identificar dichas plantas, ya sea como un punto o en uno o en ambos extremos de una variedad de características empleadas para definir dichas plantas.
Tal como reconocerá un experto en la técnica a la luz de esta descripción, las realizaciones preferidas de kits de detección, por ejemplo, pueden incluir sondas y/o cebadores dirigidos y/o que comprenden "secuencias de unión" o "secuencias de transición" (en donde la secuencia flanqueante genómica de soja satisface la secuencia de inserto). Por ejemplo, esto incluye sondas de polinucleótidos, cebadores y/o amplicones diseñados para identificar una o ambas secuencias de unión (en donde el inserto satisface la secuencia flanqueante), tal como se inca en el cuadro 1. Un diseño común consiste en tener un cebador que hibride en la región flanqueante y un cebador que hibride en el inserto. Estos cebadores tienen cada uno una longitud de aproximadamente al menos ~15 residuos. Con esta disposición, los cebadores se pueden usar para generar/amplificar un amplicón detectable que indica la presencia de un evento de la invención objeto. Estos cebadores se pueden usar para generar un amplicón que extiende (e incluye) una secuencia de unión tal como se indicó con anterioridad.
El o los cebadores que "anotan un tanto" en la secuencia flanqueante no están típicamente creados para hibridarse más allá de alrededor de 200 bases o más allá de la unión. De esta forma, los cebadores flanqueantes típicos estarían diseñados para comprender al menos 15 residuos de cualquier cadena dentro de las 200 bases en las secuencias flanqueantes a partir del comienzo del inserto. Es decir que los cebadores que comprenden una secuencia de un tamaño apropiado a partir de residuos (o hibridándose en ellos) -2530-2730 y/o -9122-9322 de la SEQ ID NO: 1 se encuentran dentro del alcance de la invención objeto de la presente. Los cebadores del inserto pueden ser creados, de otra forma, en cualquier lugar en el inserto, pero los residuos -2731-2931 y -8921-9121 pueden ser utilizados, por ejemplo, en forma no exclusiva para dicho diseño de cebador.
El experto en el arte también puede reconocer que los cebadores y las sondas pueden ser creados para hibridarse, según una variedad de condiciones de PCR y/o de hibridación estándar, en un segmento de la SEQ ID NO: 1 (o el complemento), y sus complementos, donde el cebador o la sonda no es perfectamente complementario con la secuencia ejemplificada. Es decir que puede tolerarse cierto grado de falta de correspondencia. Para un cebador nucleótido de aproximadamente 20, por ejemplo, lo típico es que uno o dos o más nucleotidos no necesiten unirse con la cadena opuesta si la base que no se corresponde es interna o en el extremo del cebador que es opuesto al amplicón A continuación, se proveen varias condiciones de hibridación apropiadas. También pueden emplearse en sondas, análogos de nucleotidos sintéticos como ser inosina. Las sondas de ácido péptido nucleico (PNA), así como también las sondas de ADN y ARN, también pueden ser utilizadas. Lo importante es que dichas sondas y dichos cebadores son de diagnóstico para (permitir identificar y distinguir en forma unívoca) la presencia de un evento de la invención objeto de la presente.
Se debe observar que se pueden producir errores en la amplificación por PCR que pueden resultar, por ejemplo, en errores menores de secuenciación. Es decir, a menos que se indique otra cosa, las secuencias enumeradas en la presente se determinaron generando amplicones largos de ADN genómicos de soja y luego clonando y secuenciando los amplicones. No es inusual hallar ligeras diferencias y menores discrepancias en las secuencias generadas y determinadas de esta manera, dadas las diversas rondas de amplificación que son necesarias para generar suficientes amplicones para la secuenciación de ADN genómicos. Un experto en la técnica reconocerá y notará que cualquier ajuste necesario debido a estos tipos de errores o discrepancias de secuenciación comunes está dentro del alcance de la invención objeto.
También se ha de observar que no es poco común para algunas secuencias genómicas que sean suprimidas, por ejemplo, cuando se inserta una secuencia durante la creación de un evento. De esta forma, pueden aparecer algunas diferencias entre las secuencias flanqueantes objeto y secuencias genómicas enumeradas, por ejemplo, en GENBANK.
Los componentes del "inserto" son ilustrados en las Figuras y se tratan con mayor detalle más abajo en los Ejemplos. Las secuencias de polinucleótido de ADN de estos componentes, o fragmentos de los mismos, pueden ser empleadas como sondas o cebadores de ADN en los métodos de la presente invención.
En algunas realizaciones de la invención, se proveen composiciones y métodos para detectar la presencia de la región de inserción de transgenes/genómica, en plantas y semillas y similares, a partir de una planta de soja. Se proveen secuencias de ADN que comprenden la secuencia de unión de la región transgénica objeto/genómica de inserción provista en la presente (entre residuos 2730-2731 y 9121-9122 de SEQ ID NO:1), así como también los segmentos de ellas, y los complementos de las secuencias ejemplificadas y cualquier segmento de ellas. La secuencia de unión de la región de inserción extiende la unión entre el ADN heterólogo insertado en el genoma y el ADN de la célula de soja que flanquea el sitio de inserción. Estas secuencias pueden ser diagnósticas para el evento dado.
Sobre la base de estas secuencias de inserto y de borde, se pueden generar cebadores específicos de eventos. El análisis de PCR demostró que las líneas de soja de la invención objeto se pueden identificar en diferentes genotipos de soja por análisis de los amplicones de PCR generados con estos grupos de cebadores específicos de eventos. Estos y otros procedimientos relacionados se pueden usar para identificar exclusivamente estas líneas de soja. De esta manera, los amplicones de PCR derivados de tales pares de cebadores son exclusivos y se pueden usar para identificar estas líneas de soja.
En algunas realizaciones, las secuencias de ADN que comprenden un fragmento contiguo de la región de inserción de transgenes/genómica nueva son un aspecto de esta invención. Se incluyen las secuencias de ADN que comprenden una longitud suficiente de polinucleótidos de la secuencia de inserción de transgenes y una longitud suficiente de polinucleótidos de la secuencia genómica de la soja a partir de una o más de las tres (3) plantas de soja arriba mencionadas y/o secuencias que resultan útiles como secuencias de cebador para la producción de un diagnóstico del producto de amplicón para una o más de estas plantas de soja.
Las realizaciones relacionadas pertenecen a secuencias de ADN que comprenden al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 5, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, o más nucleótidos contiguos de una porción de transgenes de una secuencia de ADN identificada en la presente (como ser la SEQ ID NO: 1 y sus segmentos), o sus complementos, y una longitud similar de la secuencia de ADN de soja flanqueante a partir de estas secuencias, o sus complementos. Dichas secuencias son útiles como cebadores de ADN en métodos de amplificación de ADN. Los amplicones producidos mediante el uso de estos cebadores son de diagnóstico para cualquiera de los eventos de soja mencionados en la presente. Por lo tanto, la invención también incluye los amplicones producidos por dichos cebadores de ADN y cebadores homólogos.
Esta invención también incluye métodos para detectar la presencia de ADN, en una muestra, que corresponde al evento de soja mencionado en la presente. Dichos métodos pueden comprender: (a) poner en contacto la muestra que comprende ADN con un conjunto de cebadores que, cuando se los utiliza en una reacción de amplificación de ácido nucleico con ADN a partir de al menos uno de estos eventos de soja, produce un amplicón que es de diagnóstico para dicho o dichos eventos; (b) llevar a cabo una reacción de amplificación de ácido nucleico, lo que produce el amplicón; y (c) detectar el amplicón.
Entre otros métodos de detección de la invención objeto de la presente se incluye un método para detectar la presencia de un ADN, en una muestra, correspondiente a al menos uno de dichos eventos, donde dicho método comprende: (a) poner en contacto la muestra que comprende ADN con una sonda que se híbrida bajo condiciones de hibridación restrictivas con el ADN de al menos uno de dichos eventos de soja y que no se híbrida bajo condiciones de hibridación restrictivas con una planta de soja control (ADN que no se corresponde con el evento en cuestión); (b) someter la muestra y la sonda a condiciones de hibridación restrictivas; y (c) detectar la hibridación de la sonda en el ADN.
En otras realizaciones, la invención objeto de la presente incluye métodos para producir una planta de soja que comprende el evento aad-12de la invención objeto de la presente, donde dicho método comprende los pasos de: (a) cruzar sexualmente una primera línea de soja parental (que comprende un cásete de expresión de la presente invención, que le confiere dicha característica de resistencia al herbicida a las plantas de dicha línea), y una segunda línea de soja parental (que carece de esta característica de tolerancia al herbicida), lo cual produce una pluralidad de plantas de progenie; y (b) seleccionar una planta de progenie mediante el uso de marcadores moleculares. Dichos métodos pueden comprender, en forma opcional, el otro paso de retrocruzamiento de la planta de progenie con la segunda línea de soja parental para producir una planta de soja de cruzamiento puro que comprende dicha característica de tolerancia a insectos.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proveen métodos de determinación de la cigosidad de progenie de una cruza con uno cualquiera (o más) de dichos tres eventos. Dichos métodos pueden comprender poner en contacto una muestra, que comprenda ADN de soja, con un conjunto de cebadores de la invención objeto de la presente. Dichos cebadores, al ser utilizados en una reacción de amplificación de ácido nucleico con ADN genómico a partir de al menos uno de dichos eventos de soja, producen un primer amplicón que es de diagnóstico para al menos uno de dichos eventos de soja. Dichos métodos comprenden, además, llevar a cabo una reacción de amplificación de ácido nucleico, lo que produce el primer amplicón; detectar el primer amplicón; y poner en contacto la muestra que comprende ADN de soja con dicho conjunto de cebadores, que al ser utilizados en una reacción de amplificación de ácido nucleico con ADN genómico a partir de plantas de soja, produce un segundo amplicón que comprende el ADN genómico de soja nativo homólogo a la región genómica de soja; y llevar a cabo una reacción de amplificación de ácido nucleico, lo que produce el segundo amplicón. Los métodos comprenden, además, detectar el segundo amplicón y comparar el primero y el segundo amplicones en una muestra, donde la presencia de ambos amplicones indica que la muestra es heterocigótica para la inserción de transgenes.
Se pueden desarrollar kits de detección de ADN que emplean las composiciones divulgados en la presente y los métodos conocidos en el arte de la detección de ADN. Los kits resultan útiles para la identificación del ADN del evento de soja objeto de la presente en una muestra y pueden ser aplicados a métodos para el cruzamiento de plantas de soja que contengan este ADN. Los kits contienen secuencias de ADN homologas o complementarias a los amplicones, por ejemplo, divulgados en la presente, o a las secuencias de ADN homologas o complementarias al ADN contenido en los elementos genéticos de transgenes de los eventos objeto de la presente. Estas secuencias de ADN pueden ser utilizadas en reacciones de amplificación de ADN o como sondas en un método de hibridación de ADN. Los kits también pueden contener los reactivos y los materiales necesarios para llevar a cabo el método de detección.
Una "sonda" es una molécula de ácido nucleico aislada que está unida a una etiqueta detectable convencional o molécula informante (como ser un isótopo radioactivo, ligando, agente quimioluminiscente o enzima). Una sonda como esta es complementaria a una cadena de ácido nucleico blanco, en el caso de la presente invención, respecto de una cadena de ADN genómico a partir de uno de dichos eventos de soja, ya sea a partir de una planta de soja o de una muestra que incluya ADN del evento. Las sondas de acuerdo con la presente invención incluyen no solo ácidos desoxirribonucleicos o ribonucleicos sino también poliamidas y otro tipo de materiales de sonda que se unen en forma específica a una secuencia de ADN blanco y pueden ser utilizadas para detectar la presencia de esa secuencia de ADN blanco.
Los "cebadores" son ácidos nucleicos aislados/sintetizados que son templados a una cadena de ADN blanco complementaria mediante la hibridación de ácido nucleico para formar un híbrido entre el cebador y la cadena de ADN blanco, luego ampliada a lo largo de la cadena de ADN blanco por una polimerasa, por ejemplo, una ADN polimerasa. Los pares de cebadores de la presente invención hacen referencia a su uso para la amplificación de una secuencia de ácido nucleico blanco, por ejemplo, por medio de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) u otros métodos de amplificación de ácido nucleico convencionales.
Las sondas y los cebadores, en general, tienen una longitud de 5, 6,7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,20,21,22, 23,24,25, 26,27,28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261 , 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281 , 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291 , 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301 , 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351 , 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361 , 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371 , 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381 , 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391 , 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401 , 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 41 1 , 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421 , 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431 , 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441 , 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451 , 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461 , 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471 , 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481 , 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491 , 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 ó 500 polinucleótidos o más. Dichas sondas y cebadores se hibridan en especial con una secuencia blanco según condiciones de hibridación de alta rigurosidad. De preferencia, las sondas y los cebadores de acuerdo con la presente invención cuentan con una similitud de secuencia completa con la secuencia blanco, aunque las sondas que difieren de la secuencia blanco y retienen la capacidad de hibridación en secuencias blanco pueden ser creadas por métodos convencionales.
Los métodos para preparar y utilizar las sondas y los cebadores son descriptos, por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2o edición, vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. Los pares de PCR-cebador pueden derivar de una secuencia conocida, por ejemplo, mediante el uso de programas de computación destinados a ese fin.
Los cebadores y las sondas que se basan en el ADN flanqueante y secuencias de inserción divulgados en el presente pueden ser empleados para confirmar (y, de ser necesario, para corregir) las secuencias divulgadas mediante métodos convencionales, por ejemplo, mediante la nueva clonación y secuenciación de dichas secuencias.
Los cebadores y las sondas de ácido nucleico de la presente invención se hibridan según condiciones restrictivas a una secuencia de ADN blanco. Puede emplearse cualquier método de amplificación o hibridación de ácido nucleico convencional para identificar la presencia de ADN a partir de un evento transgénico en una muestra. Las moléculas de ácido nucleico o sus fragmentos son capaces de hibridarse es particular con otras moléculas de ácido nucleico según determinadas circunstancias. De acuerdo con lo utilizado en la presente, se considera que dos moléculas de ácido nucleico son capaces de hibridarse en particular entre sí si las dos moléculas son capaces de formar una estructura de ácido nucleico de cadena doble, antiparalela. Se considera que una molécula de ácido nucleico es el "complemento" de otra molécula de ácido nucleico si muestran una complementariedad total. De la forma utilizada en la presente, se considera que las moléculas muestran una "complementariedad total" cuando cada nucleótido de una de las moléculas es complementario con un nucleótido de la otra. Se considera que dos moléculas son "mínimamente complementarias" si pueden hibridarse entre sí con la suficiente estabilidad como para permitirles permanecer templadas entre sí según al menos condiciones convencionales de "baja rigurosidad". De forma similar, se considera que las moléculas son "complementarias" si pueden hibridarse entre sí con la suficiente estabilidad como para permitirles permanecer templadas entre sí según condiciones convencionales de "alta rigurosidad". Las condiciones de rigurosidad convencionales son descriptas por Sambrook er a/., 1989. Por lo tanto, resultan permisibles las desviaciones de una complementariedad total, siempre que dichas desviaciones no imposibiliten por completo la capacidad de las moléculas de formar una estructura de cadena doble. Con el fin de que una molécula de ácido nucleico sirva como cebador o sonda, necesita solo ser lo suficientemente complementaria en secuencia de manera de permitir formar una estructura de cadena doble estable según las concentraciones de sales y solventes particulares empleadas.
De acuerdo con lo utilizado en la presente, una secuencia sustancialmente homologa es una secuencia de ácido nucleico que se híbrida en especial con el componente de la secuencia de ácido nucleico con la que es comparada según las condiciones de alta rigurosidad. La expresión "condiciones de rigurosidad" es definida en términos funcionales respecto de la hibridación de una sonda de ácido nucleico con un ácido nucleico blanco (es decir, con una secuencia de ácido nucleico en particular de interés) mediante el procedimiento de hibridación específico analizado en Sambrook et al., 1989, en 9.52-9.55. Referirse asimismo a Sambrook et al., 1989 en 9.47-9.52 y 9.56-9.58. En consecuencia, las secuencias nucleótidas de la invención pueden ser empleadas por su capacidad de formar, de manera selectiva, moléculas dobles con tramos complementarios de fragmentos de ADN.
Según la aplicación prevista, puede utilizarse una variedad de condiciones de hibridación para lograr diversos grados de selectividad de sonda respecto de la secuencia blanco. Para aplicaciones que requieren de una alta selectividad, se emplearán típicamente, condiciones relativamente restrictivas para formar los híbridos, por ejemplo, se seleccionarán condiciones de alta temperatura y/o bajas sales, como las provistas por NaCI entre aproximadamente 0.02 M y aproximadamente 0.15 M a temperaturas de alrededor de entre 50 °C y alrededor de 70 °C. Por ejemplo, las condiciones restrictivas podrían involucrar el lavado del filtro de hibridación al menos dos veces con un tampón de lavado de alta rigurosidad (0.2X SSC, 0.1 % SDS, 65 °C). Los expertos en el arte conocen las condiciones restrictivas apropiadas que promueven la hibridación de ADN, por ejemplo, 6,0X de cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C, seguido de un lavado de 2,0X de SSC a 50 °C. Por ejemplo, la concentración de sal en el paso de lavado puede ser seleccionada entre una baja rigurosidad de alrededor de 2.0X de SSC a 50 °C y una alta rigurosidad de alrededor de 0.2 de SSC a 50 °C. Además, la temperatura en el paso de lavado puede ser aumentada desde condiciones de baja rigurosidad a temperatura ambiente, a alrededor de 22 °C, hasta condiciones de alta rigurosidad a alrededor de 65 °C. Tanto la temperatura como la sal pueden variar, o bien puede mantenerse constante la temperatura o la concentración de sal mientras cambia la otra variable. Dichas condiciones selectivas toleran un poco de la falta de correspondencia, de presentarse, entre la sonda y la cadena blanco o plantilla. La detección de secuencias de ADN a través de hibridación resulta conocida para los expertos en el arte, y las enseñanzas de las patentes estadounidenses números 4.965.188 y 5.176.995 ilustran los métodos de análisis de hibridación.
En una realización particularmente preferida, un ácido nucleico de la presente invención se hibridará de manera específica con uno o más de los cebadores (o amplicones u otras secuencias) ejemplificados o sugeridos en la presente, incluso componentes y fragmentos de ellos, según condiciones de alta rigurosidad. En un aspecto de la presente invención, una molécula de ácido nucleico marcador de la presente invención tiene la secuencia de ácido nucleico de la forma establecida en la presente en una de las secuencias ejemplificadas, o sus componentes y/o fragmentos.
En otro aspecto de la presente invención, una molécula de ácido nucleico marcador de la presente invención comparte entre 80% y 100% o entre 90% y 100% de la identidad de secuencia con dichas secuencias de ácido nucleico. En otro aspecto de la presente invención, una molécula de ácido nucleico marcador de la presente invención comparte entre 95% y 100% de la identidad de secuencia con dicha secuencia. Dichas secuencias pueden ser empleadas como marcadores en métodos de fitomejoramiento para identificar la progenie de entrecruzamientos genéticos. La hibridación de la sonda con la molécula de ADN blanco puede ser detectada mediante cualquier cantidad de métodos conocidos para los expertos en el arte; entre ellos, se encuentran los siguientes, sin que la enumeración sea taxativa: etiquetas fluorescentes, etiquetas radioactivas, etiquetas basadas en anticuerpos y etiquetas quimioluminiscentes.
Respecto de la amplificación de una secuencia de ácido nucleico blanco (por ejemplo, por PCR), mediante el uso de un par de cebadores de amplificación en particular, las "condiciones de rigurosidad" son condiciones que permiten que el par de cebadores se hibriden solo con la secuencia de ácido nucleico a la que solo un cebador con la secuencia de tipo salvaje correspondiente (o su complemento) estaría unido y de preferencia, daría un producto de amplificación único, el amplicón.
La expresión "específico para (una secuencia blanco)" indica que una sonda o un cebador se híbrida según condiciones de hibridación restrictivas solo con la secuencia blanco en una muestra que comprende la secuencia blanco.
De la forma empleada en la presente, la expresión "ADN amplificado" o el término "amplicón" hace referencia al producto de la amplificación de ácido nucleico de una secuencia de ácido nucleico blanco que es parte de una plantilla de ácido nucleico. Por ejemplo, para determinar si la planta de soja que resulta de una cruza sexual contiene ADN genómico del evento transgénico a partir de la planta de soja de la presente invención, el ADN extraído de una muestra de tejido vegetal de soja puede ser sometido al método de amplificación de ácido nucleico mediante el uso de un par de cebadores que incluye un cebador derivado de una secuencia flanqueante en el genoma de la planta adyacente al sitio de inserción del ADN heterólogo insertado, y un segundo cebador derivado del ADN heterólogo insertado para producir un amplicón que es de diagnóstico para la presencia del ADN del evento. El amplicón tiene una longitud y una secuencia que también es de diagnóstico para el evento. El amplicón puede variar de longitud desde una longitud combinada de los pares de cebadores más un par de base nucleótida, y/o la longitud combinada de los pares de cebadores más aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 44, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261 , 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271 , 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281 , 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341 , 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351 , 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361 , 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371 , 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381 , 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391 , 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401 , 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 41 1 , 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421 , 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431 , 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441 , 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451 , 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461 , 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471 , 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481 , 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491 , 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, o 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, o más pares de base nucleótida (más o menos cualquiera de los aumentos mencionados con anterioridad). En forma alternativa, un par de cebadores puede derivar de una secuencia flanqueante a ambos lados del ADN insertado de manera de producir un amplicón que incluya la secuencia de nucleótido de inserción total. Puede colocarse un miembro de un par de cebadores derivados de la secuencia fitogenómica a una distancia de la secuencia de ADN insertada. Esta distancia puede variar de un par de base nucleótida hasta alrededor de veinte mil (20.000) pares de base nucleótida. El uso del término "amplicón" excluye específicamente los dímeros de cebador que pueden formarse en la reacción de amplificación térmica del ADN.
La amplificación del ácido nucleico puede lograrse por medio de cualquiera de los diversos métodos de amplificación de ácido nucleico conocidos en el arte, incluso la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En el arte, se conoce una variedad de métodos de amplificación y son descriptos, interalia, en las patentes estadounidenses números 4.683.195 y 4.683.202. Se han desarrollado métodos de amplificación de PCR para amplificar hasta 22 kb de ADN genómico. Estos métodos, así como también otros conocidos en el arte de la amplificación de ADN pueden ser empleados en la práctica de la presente invención. La secuencia de la secuencia genómica flanqueante o inserto de ADN de transgenes heterologo a partir de un evento de soja objeto de la presente puede ser verificada (y corregida, de ser necesario) mediante la amplificación de dichas secuencias a partir del evento a través del uso de cebadores derivados de las secuencias provistas en la presente seguido de la secuenciación de ADN estándar del amplicón de PCR o del ADN clonado.
El amplicón producido por estos métodos puede ser detectado mediante una pluralidad de técnicas. Un método conocido para detectar amplicones de ADN es el de electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio. Otro de dichos métodos es el Genetic Bit Analysis donde se diseña un oligonucleótido de ADN que superpone ambas secuencias, la de ADN genómico flanqueante adyacente y la de ADN insertado. El oligonucleótido es inmovilizado en cubetas de una placa de microcavidades. Después de la PCR de la región de interés (mediante el uso de un cebador en la secuencia insertada y uno en la secuencia genómica flanqueante adyacente), puede hibridarse un producto de PCR de cadena única con el oligonucleótido inmovilizado y sirve como plantilla para una reacción de extensión de base única mediante el uso de una ADN polimerasa con etiqueta ddNTPs específica para la base que se espera a continuación. La lectura puede ser fluorescente o basada en ELISA. Una señal indica la presencia de la secuencia de inserción/flanqueante debido a una amplificación exitosa, hibridación y extensión de base única.
Otro método es la técnica de pirosecuenciación descrito por Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000). En este método, se diseña un oligonucleótido que superpone el ADN genómico adyacente y la unión de ADN de inserto. El oligonucleótido se híbrida en el producto de PCR monocatenario de la región de interés (un cebador en la secuencia insertada y uno en la secuencia genómíca flanqueante) y se incuba en presencia de una ADN polimerasa, ATP, sulfurilasa, luciferasa, apirasa, adenosina 5' fosfosulfato y luciferina. Se añaden DNTP de modo individual y la incorporación da como resultado una ligera señal que se mide. Una ligera señal indica la presencia de la secuencia de inserción/flanqueo de transgenes debido a una amplificación, hibridación y extensión de bases simples o múltiples existosas.
La polarización fluorescente es otro método que se puede usar para detectar un amplicón de la presente invención. Según este método, se diseña un oligonucleótido que superpone la unión flanqueante genómica y de ADN insertado. El oligonucleótido se híbrida en el producto de PCR monocatenario de la región de interés (un cebador en el ADN insertado y uno en la secuencia de ADN genómica flanqueante) y se incuba en presencia de una ADN polimerasa y un ddNTP rotulado fluorescente. La extensión de bases individuales da como resultado la incorporación del ddNTP. La incorporación se puede medir como un cambio en la polarización usando un fluorómetro. Un cambio en la polarización indica la presencia de la secuencia de inserción/flanqueo de transgenes debido a una amplificación, hibridación y extensión de bases individuales exitosas.
TAQMAN (PE Applied Biosystems, Foster City, Calif.) es un método de detección y cuantificación de la presencia de una secuencia de ADN. Brevemente, se diseña una sonda dé oligonucleótido FRET que superpone la unión flanqueante genómica y de ADN de inserto. La sonda FRET y los cebadores de PCR (un cebador en la secuencia de ADN de inserto y uno en la secuencia genómica flanqueante) se ciclan en presencia de una polimerasa termoestable y dNTP. Durante la amplificación específica, la Taq ADN polimerasa limpia y libera el resto fluorescente del resto de neutralización en la sonda FRET. Una señal fluorescente indica la presencia de la secuencia flanqueante/de inserto de transgén debido a una amplificación y una hibridación exitosas.
Se describieron balizas moleculares para usar en la detección de secuencias. Brevemente, se diseña una sonda de oligonucleótido FRET que superpone la unión genómica flanqueante y de ADN de inserto. La estructura exclusiva de la sonda FRET resulta en ella que contiene una estructura secundaria que mantiene cercanos los restos fluorescentes y de neutralización. La sonda FRET y los cebadores de PCR (un cebador en la secuencia de ADN de inserto y uno en la secuencia genómica flanqueante) se ciclan en presencia de una polimerasa termoestable y dNTP. Después de la amplificación por PCR exitosa, la hibridación de la sonda FRET en la secuencia blanco da como resultado la eliminación de la estructura secundaria de sonda y la separación espacial de los restos fluorescentes y de neutralización. Resulta una señal fluorescente. Una señal fluorescente indica la presencia de la secuencia genómica flanqueante/de inserto de transgén debido a una amplificación y una hibridación exitosas.
Habiendo descrito una ubicación en el genoma de la soja que es excelente para una inserción, la invención objeto también comprende una semilla de soja y/o una planta de soja que comprende al menos un inserto no aad12 en la proximidad general de esta ubicación genómica. Una opción consiste en sustituir un inserto diferente en lugar del inserto de aad-12 ejemplificado en la presente. En este sentido general, la recombinación homologa blanco, por ejemplo, se puede usar de acuerdo con la invención objeto. Este tipo de tecnología es el objeto de, por ejemplo, el documento WO 03/080809 A2 y la correspondiente solicitud U.S. publicada (documento US 20030232410). De esta manera, la invención objeto incluye plantas y células vegetales que comprenden un inserto heterólogo (en lugar de o con multicopias de aad-12), flanqueados por todas o una parte reconocible de las secuencias flanqueantes identificadas en la presente (por ejemplo, residuoss 1-2730 y 9122-10,212 de SEQ ID NO:1 ). Una copia adicional (o copias adicionales) de un gen aad-12 también se podrían dirigir para la inserción de esta o estas formas.
Los métodos para integrar una secuencia de polinucleótidos dentro de un sitio cromosómico específico de una célula vegetal por medio de recombinación homologa se describieron en la técnica. Por ejemplo, la integración específica de sitio tal como se describe en la publicación de solicitud de patente U. S. N.° 2009/01 11 188 A1 describe el uso de recombinasas o integrasas para mediar la introducción de una secuencia de polinucleótido donante en un blanco cromosómico. Además, la solicitud de patente internacional N.° WO 2008/021207 describe la recombinación homologa mediada por dedos de zinc para integrar una o varias secuencias de polinucleótidos donantes dentro de ubicaciones específicas del genoma. El uso de recombinasas tales como FLP/FRT según se describe en la patente U. S. N.° 6.720.475 o CRE/LOX como se describe en la patente U. S. N.° 5.658.772 se puede utilizar para integrar una secuencia de polinucleótidos en un sitio cromosómico específico. Finalmente, el uso de meganucleasas para lograr polinucleótidos donantes en una ubicación cromosómica específica se describió en Puchta et al., PNAS USA 93 (1996) pp. 5055-5060.
Otros métodos diversos para la integración específica de sitio dentro de células vegetales se conocen en general y son aplicables (Kumar et al., Trands in Plant Sci. 6(4) (2001 ) pp. 155-159). Por otra parte, los sistemas de recombinación específicos de sitio que se identificaron en varios organismos procariotas y eucariotas inferiores se pueden aplicar para usar en plantas. Los ejemplos de tales sistemas incluyen, pero sin limitación: el sistema de R/RS recombinasa del plásmido pSR1 de la levadura Zigosaccharomyces rouxii (Araki et al. (1985) J. Mol. Biol. 182: 191-203), y el sistema Gin/gix de fago Mu (Maeser y Kahlmann (1991 ) Mol. Gen. Genet. 230: 170-176).
En algunas realizaciones de la presente invención, puede ser deseable integrar o apilar nuevos transgenes en la proximidad de un evento transgénico existente. El evento transgénico se puede considerar un locus genómico preferido que se seleccionó en base a características únicas como sitio de inserción individual, segregación mendeliana normal y expresión estable, y una superior combinación de eficacia, que incluye tolerancia a herbicidas y rendimiento agronómico en y a través de múltiples ubicaciones ambientales. Los transgenes recién integrados deberán mantener las características de expresión transgénica en los transformantes existentes. Más aún, el desarrollo de ensayos para la detección y confirmación del evento recién integrado se superaría ya que las secuencias genómicas flanqueantes y la ubicación cromosómica del evento recién integrado ya fueron identificados. Finalmente, la integración de un nuevo transgén en una ubicación cromosómica que está unida con un transgén existente agilizaría la ¡ntrogresión de los transgenes en otros antecedentes genéticos por cruzamiento sexual usando métodos de cría convencionales.
En algunas realizaciones de la presente invención, puede ser deseable eliminar secuencias de polinucleótidos de un evento transgénico. Por ejemplo, la eliminación transgénica tal como se describe en la solicitud de patente U. S. provisional N.° 61/297.628 describe el uso de nucleasas de dedos de zinc para remover una secuencia de polinucleótidos, que consiste en un cásete de expresión génica, de un evento transgénico cromosómicamente integrado. La secuencia de polinucleótidos que se elimina puede ser un marcador seleccionare. Después del corte y la eliminación de una secuencia de polinucleótidos, el evento transgénico modificado puede ser redirigido por la inserción de una secuencia de polinucleótidos. El corte de una secuencia de polinucleótidos y posterior redireccionamiento del evento transgénico modificado provee ventajas tales como el reuso de un marcador seleccionable o la capacidad de superar cambios involuntarios en el transcriptoma de la planta que resulta de la expresión de genes específicos.
La invención objeto describe en la presente un sitio específico en el cromosoma 4 en el genoma de soja que es excelente para la inserción de ácidos nucleicos heterólogos. También se describe un marcador molecular 5', un marcador molecular 3', una secuencia flanqueante 5' y una secuencia flanqueante 3' de utilidad en la identificación de la ubicación de un sitio blanco en el cromosoma 4. Así, la invención objeto provee métodos para introducir ácidos nucleicos heterólogos de interés en este sitio blanco establecido o en la vecindad de este sitio blanco. La invención objeto también comprende una semilla de soja y/o una planta de soja que comprende cualquier secuencia de nucleótidos heteróloga insertada en el sitio blanco descrito o en la vecindad general de tal sitio. Una opción para llevar a cabo esta integración blanco es cortar y/o sustituir un inserto diferente en lugar del cásete de expresión pat ejemplificado en la presente. En este sentido general, la recombinación homóloga dirigida, por ejemplo y sin limitación, se puede usar de acuerdo con la invención objeto.
Tal como se usa en la presente, gen, evento o "apliamiento" de rasgos es la combinación de rasgos deseados en una línea transgénica. Los criadores de plantas apilan rasgos transgénicos haciendo cruzas entre progenitores que tienen cada uno un rasgo deseado y luego identificando los descendientes que tienen los dos rasgos deseados. Otra forma de apilar genes es transfiriendo dos o más genes en el núcleo celular de una planta al mismo tiempo durante la transformación. Otra forma de apilar genes es por retransformación de una planta transgénica con otro gen de interés. Por ejemplo, el apilado de genes se puede usar para combinar dos o más rasgos diferentes, incluyendo, por ejemplo, dos o más rasgos de insectos diferentes, rasgos de resistencia a insectos y rasgos de resistencia a enfermedades, dos o más rasgos de resistencia a herbicidas y/o rasgos de resistencia a insectos y rasgos de resistencia a herbicidas. El uso de un marcador seleccionable además de un gen de interés también se puede considerar apilamiento de genes.
"Recombinación homologa" se refiere a una reacción entre cualquier par de secuencias de nucleótidos que tienen sitios correspondientes que contienen una secuencia de nucleótidos similar a través de la que las dos secuencias de nucleótidos pueden interactuar (recombinarse) para formar una nueva secuencia de ADN recombinante. Los sitios de secuencias de nucleótidos similares se mencionan cada uno en la presente como una "secuencia de homología". En general, la frecuencia de recombinación homologa aumenta cuando la longitud de la secuencia homologa aumenta. De esta manera, mientras la recombinación homologa puede producirse entre dos secuencias de nucleótidos que son menos que idénticas, la frecuencia de recombinación (o eficacia) declina cuando la divergencia entre las dos secuencias aumenta. La recombinación se puede llevar a cabo usando una secuencia de homología en cada una de las moléculas donantes y blanco, generando así un producto de recombinación "de cruza individual". De modo alternativo, dos secuencias de homología se pueden ubicar en cada una de las secuencias de nucleótidos blanco y donantes. La recombinación entre dos secuencias de homología en el donante con dos secuencias de homología en el blanco genera un producto de recombinación de "cruza doble". Si las secuencias de homología en la molécula donante flanquean una secuencia que debe ser manipulada (por ejemplo, una secuencia de interés), la recombinación de cruza doble con la molécula blanco resultará en un producto de recombinación en donde la secuencia de interés reemplaza a una secuencia de ADN que originalmente estaba entre las secuencias de homología en la molécula blanco. El intercambio de secuencia de ADN entre el blanco y el donante a través de un evento de recombinación de cruza doble se denomina "reemplazo de secuencias".
Todas las patentes, solicitudes de patentes, solicitudes provisorias y publicaciones mencionadas o citadas en la presente son incorporadas a modo de referencia en su totalidad siempre que no sean contradictorias con las enseñanzas explícitas de esta memoria.
Los siguientes ejemplos son incluidos para ilustrar procedimientos para poner en práctica la invención y demostrar ciertas realizaciones preferidas de la invención. Estos ejemplos no deben ser interpretados como limitativos. Los expertos en el arte sabrán apreciar que las técnicas divulgadas en los siguiente ejemplos representan abordajes específicos empleados para ilustrar modos preferidos para esta práctica. No obstante, los expertos en el arte deben apreciar, a la luz de la presente divulgación, que pueden realizarse muchos cambios en estas realizaciones específicas mientras se continúan obteniendo resultados similares sin alejarse del espíritu ni del alcance de la invención. A menos que se lo indique de otra manera, todos los porcentajes son en peso y todas las proporciones de mezcla solvente son en volumen a menos que se lo especifique de otra forma.
Se emplean las siguientes abreviaturas, a menos que se lo indique de otra manera.
AAD-12 ariloxialcanoato dioxigenasa-1 bp par de bases °C grados Celsius ADN ácido desoxirribonucleico DIG digoxigenina EDTA ácido etilendiamintetraacético kb kilobase M9 microgramo ML microlitro mi mililitro M masa molar OLP sonda de superposición PCR reacción en cadena de polimerasa PTU unidad de transcripción en plantas SDS dodecilsulfato sódico SOP procedimiento estándar de operación SSC una solución tampón que contiene una mezcla de cloruro de sodio y citrato de sodio, pH 7,0 TBE una solución tampón que contiene una mezcla de base Tris, ácido bórico y EDTA, pH 8,3 V voltios EJEMPLOS EJEMPLO 1 Transformación y selección del evento de soja aad-12 DAS-68416-4 Se generó soja (Glycine max) transgénica evento DAS-68416-4 mediante transformación mediada por Agrobacteríum de explantes de nodulos cotiledóneos de soja. La cepa de Agrobacteríum desarmada EHA101 (Hood et al., 2006), que lleva el vector binario pDAB4468 (Figura 1) con el marcador seleccionare (pat) y el gen de interés (aad-12) dentro de la región de ADN de cadena T, fue utilizada para iniciar la transformación.
La transformación mediada por Agrobacteríum se llevó a cabo mediante la utilización de un procedimiento modificado de Zeng et al. (Zeng et al., 2004). En pocas palabras, unas semillas de soja (cv Maverick) fueron dejadas germinar sobre una medio basal y se aislaron nodulos cotiledóneos y se los infectó con Agrobacteríum. Los medios para la iniciación de los brotes, el alargamiento de los brotes y para echar raíces, fueron complementados con cefotaxima, timentina y vancomicina para la remoción del Agrobacterium. Se empleó la selección por glufosinato para inhibir el desarrollo de los brotes no transformados. Los brotes seleccionados fueron transferidos a un medio para echar raíces a efectos de desarrollar las raíces, después de lo cual se los transfirió a una mezcla de suelos para la aclimatación de las plántulas.
Las hojuelas terminales de plántulas seleccionadas fueron pintadas de a hojas con glufosinato a efectos de clasificar/seleccionar los transformantes putativos. Las plántulas clasificadas seleccionadas fueron transferidas al invernadero, se les permitió aclimatarse, y después de lo cual se pintaron sus hojas con glufosinato a efectos de reconfirmar la tolerancia y para ser tenidas en cuenta como transformantes putativos. Se tomaron muestras de las plantas clasificadas seleccionadas y se llevaron a cabo análisis moleculares para confirmar el gen del marcador seleccionable y/o el gen de interés. A las plantas T0 se le permitió autofertilizarse en el invernadero de manera de obtener semillas TL Las plantas Ti fueron retrocultivadas selectivamente e introgresadas en germoplasma élite (Maverick). Este evento, el Evento soja DAS-68416-4, fue generado a partir de un aislado transformado independiente. Se seleccionó el evento sobre la base de sus características, únicas en su clase, tal como un sitio de inserción individual, segregación mendeliana normal y expresión estable, y una combinación superior de eficacia, lo que incluye una tolerancia a los herbicidas y una performance agronómica en amplios antecedentes genotípicos y a través de múltiples emplazamientos ambientales.
Los siguientes ejemplos contienen los datos que se utilizaron para caracterizare! evento de soja DAS-68416-4.
EJEMPLO 2 Caracterización del evento de soia DAS-68416-4 vía Southern Blot Se utilizó el análisis Southern blot para establecer el patrón de integración del evento de soja DAS-68418^4. Estos experimentos generaron datos que demostraron la integración e integridad del transgén aad-12 dentro del genoma de la soja. El evento de soja DAS-68418-4 se caracteriza como un evento de longitud completa, de integración simple, que contiene una única copia del aad-12 PTU del plásmido pDAB4468.
Los datos del Southern blot sugirieron que un fragmento de cadena T de pDAB4468 T se insertó en el genoma del evento de soja DAS-68418-4. Se llevaron a cabo análisis detallados de Southern blot para lo cual se utilizó una sonda específica para el gen aad-12, contenido en la región de integración de cadena T de pDAB4468, y enzimas de restricción descriptivas que tienen sitios de desdoblamiento situados dentro del plásmido y que producen fragmentos hibridantes internos con respecto al plásmido o fragmentos que abarcan la unión o empalme del plásmido con ADN genómico de la soja (fragmentos de borde). Los pesos moleculares indicados a partir de la hibridación Southern para la combinación de la enzima de restricción y la sonda, fueron únicos en su género para el evento, y establecieron sus patrones de identificación. Estos análisis también mostraron que los fragmentos de plásmido se habían insertado en ADN genómico de soja sin reordenamientos del 12 PTU.
EJEMPLO 2.1 Recolección de muestras de hojas de soja y aislamiento de ADN Genómico (gADN) Se extrajo ADN genómico de tejido de hojas cosechadas de plantas de soja individuales que contienen evento de soja DAS-68416- . Además, se aisló gADN a partir de una muestra de soja convencional, Maverick, que contiene el antecedente genético representativo de la cepa de sustancia, en ausencia del gen aad-12.
Se extrajo ADN genómico individual a partir de tejido de hojas liofilizadas de acuerdo con el método CTAB estándar. Después de la extracción, se cuantificó el ADN por espectrofluorometría para lo cual se utilizó el reactivo Pico Green (Invitrogen, Carlsbad, CA). Seguidamente se visualizó el ADN sobre un gel de agarosa para confirmar los valores obtenidos mediante el análisis Pico Green y para determinar la calidad del ADN.
EJEMPLO 2.2 Digestión y separación del ADN Para la caracterización molecular por Southern blot del evento de soja DAS-68416-4, se digirieron 10 microgramos (10 µg) de ADN genómico. El ADN genómica del evento de soja DAS-68416-4 y de sepa de soja no transgénica Maverick fueron digeridos mediante la adición de aproximadamente cinco unidades de enzima de restricción seleccionada por \¡g de ADN y el correspondiente tampón de reacción a cada muestra de ADN. Cada muestra fue sometida a incubación a aproximadamente 37°C durante la noche. Las enzimas de restricción Spel, Kpn\, y Pací fueron utilizados individualmente para los digestos (New England Biolabs, Ipswich, MA). Además, se preparó una muestra de control de hibridación positiva mediante la combinación de ADN de plásmido, pDAB4468, con ADN genómico de la variedad de soja no transgénica, Maverick. El cóctel de ADN de plásmido / ADN genómico fue digerido mediante los mismos procedimientos y enzimas de restricción que las muestras de ensayo. Después de haberse incubado las digestiones durante la noche, se añadió NaCI hasta una concentración final de 0.1 M, y las muestras de ADN digeridas se precipitaron con isopropanol. La pella de ADN precipitado fue resuspendida en 20 ul de tampón de carga 1X (azul de bromofenol al 0.1 %, EDTA 100 mM, glicerol al 50%, Tris pH 7,5 10 mM). Seguidamente las muestras de ADN y los marcadores de tamaño molecular fueron sometidos a electroforesis mediante geles de agarosa al 0.85% con tampón 0.4 X TAE. (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) a 35 voltios durante aproximadamente 18-22 horas para lograr la separación de los fragmentos. Los geles fueron teñidos con bromuro de etidio (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se visualizó el ADN bajo luz ultravioleta (UV).
EJEMPLO 2.3 Tratamiento de membrana de transferencia Southern Se llevó a cabo el análisis Southern blot como se describe en Severson et al. (1997). Después de la separación electroforética y visualización de los fragmentos de ADN bajo luz UV, los geles fueron sumergidos en una solución desnaturalizante (NaOH 150 mM, EDTA 3 mM) durante aproximadamente 20 minutos después de lo cual se los transfirió a una solución neutralizante (NaP04 150 mM, pH 7,8) durante por lo menos 20 minutos. Se llevó a cabo la transferencia Southern sobre membrana de nylon (Roche Diagnostics, Indianápolis, IN) durante la noche para lo cual se utilizó un sistema de mecha con tampón de transferencia (pirofosfato de sodio 25 mM, pH 10). Después de la transferencia se ligó el ADN a la membrana mediante cocción de la membrana a 65°C durante aproximadamente dos horas. Este proceso permitió obtener membranas Southern blot listas para la hibridación.
EJEMPLO 2.4 Etiquetado e hibridación de sondas de ADN Los fragmentos de ADN ligados a la membrana de nylon fueron detectados mediante una sonda etiquetada. La sonda utilizada en este experimento fue generada mediante amplificación por PCR para lo cual se utilizaron cebadores con respecto a una región de nucleótidos específica del plásmido pDAB4468. El fragmento de PCR amplificado fue aislado y purificado a partir de un gel de agarosa y fue utilizado como una plantilla para una sonda de hibridación. La sonda de hibridación de Southern blot fue etiquetada con nucleótido a32P-específico mediante un cebado aleatorio, para lo cual se utilizaron las perlas GE Healthcare READY-TO-GO™ DNA Labeling Beads (GE Healthcare, Piscataway, NJ) siguiéndose las instrucciones del fabricante, y se verificó mediante microcolumnas de PROBEQUANT™ G-50 (Amersham/Pharmacia, Piscataway, New Jersey, USA). En el cuadro 2 se describe la sonda utilizada para este experimento. La prehibridación se llevó a cabo a 65 °C durante cuatro horas para lo cual se utilizó tampón de hibridación (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Seguidamente se decantó la solución de prehibridación y se la reemplazó con una solución de hibridación que contiene una cantidad deseada de sonda específica que ha sido desnaturalizada por ebullición en agua durante cinco minutos. La mezcla de hibridación/sonda fue sometida a incubación con la membrana de nylon durante la noche a 65 °C.
Después de la hibridación se lavó la membrana a 65 °C en tampón de lavado (fosfato de sodio 10 mM, pirofosfato de sodio 2,5 mM, EDTA 0.5 M, SDS al 0.1 %, ajustar el pH a 7,8 con ácido fosfórico) durante 20 minutos, tres veces. Los filtros lavados fueron expuestos a una pantalla de Phosphorimager para efectuar autoradiografías, y las imágenes fueron escaneadas. La cantidad y el tamaño de las bandas detectadas fueron documentados para la sonda. Además, se utilizó un marcador de pesos moleculares para determinar el tamaño de los fragmentos de hibridación sobre los Southern blots.
CUADRO 2 Posición y longitud de las sondas utilizadas en el análisis Southern EJEMPLO 2.5 Resultados de Southern Blot En el cuadro 3 se indican los tamaños previstos y observados de los fragmentos con un digesto y sonda particular, sobre la base de los sitios conocidos de enzimas de restricción del aaó-M PTU. Los tamaños previstos de los fragmentos se basan en el mapa plásmido de Pdab4468 (figura 1 ) y los tamaños observados de los fragmentos se aproximaron desde estos análisis y se basan en los tamaños indicados de los fragmentos del Marcador de Peso Molecular de ADN etiquetados con a32P.
Se identificaron dos tipos de fragmentos a partir de estos digestos: fragmentos internos donde sitios de encima conocidos flanquean la región de la sonda y se hallan completamente contenidos dentro de la región de inserción del 12 PTU, y fragmentos de borde donde hay un sitio de enzima conocido situado en uno de los extremos de la región de sonda y se prevé un segundo sitio en el genoma de soja. Los tamaños de los fragmentos de borde varían para cada evento por cuanto, en la mayoría de los casos, los sitios de integración de los fragmentos de ADN eran únicos para cada evento. Los fragmentos de borde proveen un medio para situar un sitio de restricción de enzima con respecto al ADN integrado y para evaluar la cantidad de inserciones den ADN. Los análisis Southern blot completados sobre tres generaciones de soja que contiene el Evento DAS-68416- permitieron obtener datos que sugieren que un aacf-12 de baja copia, intacto, del plásmido pDAB4468 se había insertado en el genoma de soja del evento de soja DAS-68416-4.
CUADRO 3 Fragmentos de hibridación previstos y observados en el análisis Southern Blot. 1.
Las enzimas de restricción Spel y Kpn\ contienen sitios de restricción únicos en el plásmido pDAB4468. Subsiguientemente se seleccionaron estas enzimas para caracterizar el gen aad-12 insertado en el evento de soja DAS-68416-4. Se predijo que los fragmentos de borde de >5,436 bp o de >5,383 bp hibridarían con la sonda gen aad-12 gene después de digesto Spel y Kpn\ respectivamente (Cuadro 3). Se observaron bandas de hibridación de aad-12 individuales de ~1 ,2000 bp y de ~16,000 bp cuando se utilizaron Spel y CPU, respectivamente. La hibridación de la sonda en forma de bandas con este tamaño sugiere la presencia de un único sitio de inserción para el gen aad-12 gene en el genoma de soja del evento de soja DAS-68416^4. Se seleccionó la enzima de restricción Pací para liberar un fragmento de 2,904 bp que contiene la unidad de transcripción de planta aad-12 (PTU, promotor/gen/terminador) (Cuadro 3). El fragmento predicho de 2,904 bp se observó con la sonda de gen aad-12 después de de gestión con Pací. Los resultados obtenidos con la digestión de la totalidad de las tres enzimas de la muestra de DAS-68416-4 seguido por la hibridación de sonda de gen aad-12 indicaron que en el genoma de soja del evento de soja DAS-684 6-4 se había insertado una copia simple de un aad-12 PTU intacto del plásmido pDAB4468.
EJEMPLO 2.6.
Ausencia de secuencias de estructura medular Para supervisar la presencia o ausencia del gen de resistencia a la espectinomicina en el evento de soja DAS-68416-4, se llevó a cabo un ensayo PCR múltiple. El experimento había sido diseñado para detectar cinco regiones diferentes de la secuencia codificadora del gen de la resistencia a la espectinomicina y una región de 407 bp en la secuencia de gen endógeno de lecitina de soja (GenBank ID No: K00821 M30884) a título de control interno. Además se incluyen los controles siguientes: (i) un control positivo con el ADN de plásmido que lleva el gen de la resistencia a la espectinomicina añadido al ADN genómica o de la soja no transformada; (ii) un control negativo que incluye el uso de ADN genómico a partir de soja no transformada, Maverick; e (iii) un ensayo en blanco sin ADN genómico.
Se aisló ADN genómico de soja mediante el método CTAB, y se cuantificó mediante Pico Green. La concentración de ADN de cada muestra se normalizó a 100 ng/ul. Se llevaron a cabo las reacciones de PCR mediante la utilización de secuencias cebadoras específicas para la secuencia codificadora del gen de la resistencia contra la espectinomicina y la secuencia del gen lecitina. Se analizaron las reacciones cargando 20 µ? de producto de PCR por muestra sobre E-gel al 2%.
La presencia de múltiples amplicones (franjas o bandas de 100 bp, 150 bp, y 407 bp) sobre el E-gel indicarían que el evento de soja DAS-68416-4 contenía la secuencia codificadora del gen de la resistencia a la espectinomicina (se prevén bandas amplificadas de 100 bp y 150 bp para las secuencias codificadoras del gen de la resistencia contra la espectinomicina). Si solamente se halla presente el amplicón de 407 bp, correspondiente a la secuencia del gen lecitina de control interno, esto indica que el evento de soja DAS-68416-4 no contiene una secuencia codificadora del gen de la resistencia a la espectinomicina.
Las muestras de ADN del evento de soja DAS-68416-4 no amplificaron fragmentos de 100 bp ni de 150 bp. Solamente se amplificó el fragmento de 407 bp. Sin embargo, los fragmentos de amplificación de 100 bp, 150bp, y 407 bp se hallaban presentes en el control positivo donde se añadió ADN plásmido portador del gen de la resistencia a la espectinomicina al ADN genómica de soja. El control negativo que contiene DNA de una soja no transformada amplificó un único fragmento de 407 bp. Finalmente, las reacciones que no contenían ningún ADN genómico no produjeron ningún fragmento de amplificación. Como tal, no se detectó ninguna secuencia codificadora de la resistencia contra la espectinomicina en el evento de soja DAS- 68416-4.
EJEMPLO 3 Clonación y caracterización de secuencias de ADN en la regiones de borde de inserto v flanqueante del evento de soja DAS-68416-4 Para caracterizar y describir el sitio de inserción genómico, se determinó la secuencia de las regiones de borde de inserto de ADN de cadena T y de ADN flanqueante genómico del evento de soja DAS-68416-4. En total se confirmaron 10,212 bp de la secuencia genómica del evento de soja DAS-68416-4, lo que comprendía 2,730 bp de secuencia de borde flanqueante 5', 1 ,091 bp de secuencia de borde flanqueante 3', y 6,391 bp de inserto de cadena T (SEQ ID NO:1 ). El análisis de las secuencias permitió verificar que el evento de soja DAS-68416-4 contiene una copia individual de un transgén intacto que contiene el elemento MAR, el cásete de expresión aad-12, y el cásete de expresión pat sin variación de secuencia desde el inserto de cadena T previsto.
La amplificación de PCR basada en el inserto evento de soja DAS-68416-4 y secuencia de borde validó que las regiones de borde se habían originado en soja y que las regiones de empalme podían utilizarse para la identificación específica del evento de soja DAS-68416-4. El análisis de la secuencia que abarca las regiones de empalme, inclusive la secuencias de borde flanqueantes, no identificó ningún marco de lectura abierto nuevo (ORF >= 150 codones) resultantes de la inserción de la cadena T. Además, el sitio de inserción de cadena T se caracterizó mediante la clonación de un fragmento genómico correspondiente a la región de las secuencias de bordes flanqueantes identificadas del genoma de soja no transgénica. La comparación entre el evento de soja DAS-68416-4 y la secuencia genómica de tipo salvaje reveló una supresión de 55 bp desde el lugar original y una inserción de 9 bp en el empalme de integración 3' del Evento. En términos generales, la caracterización de la secuencia del inserto y de borde del evento de soja DAS-68416-4 indicó que había una copia individual intacta de la cadena T presente en el genoma de soja.
EJEMPLO 3.1 Extracción y cuantificación de ADN genómico Se extrajo ADN genómico de tejidos de hojas liofilizadas o recién molidas para lo cual se utilizó un método CTAB modificado. Después de la extracción del ADN genómico, se disolvieron muestras de ADN en TE 1X (Tris pH 8, 0. 10 mM, EDTA 1 m ) (Fluka, Sigma, St. Louis, MO) y se cuantificó mediante el método Pico Green siguiéndose las instrucciones del fabricante (Molecular Probes, Eugene, OR). Para el análisis de PCR, se diluyeron muestras de ADN con agua apta para biología molecular (5 PRIME, Gaithersburg, MD) de manera obtener una concentración de 10-100 ng/pL.
EJEMPLO 3.2 Cebadores de PCR En el cuadro 4 se enumeran las secuencias de cebadores que se utilizaron para clonar y confirmar el inserto de ADN y las regiones de borde flanqueantes del evento de soja DAS-68416-4, habiéndose marcado las posiciones y descripciones en la Figura 2. Todos los cebadores fueron sintetizados por Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA). Se disolvieron los cebadores en agua (5 PRIME, Gaithersburg, MD) hasta obtener una concentración de 100 µ? para la solución madre y se diluyó con agua hasta una concentración de 10 µ? para la solución de trabajo.
CUADRO 4 Condiciones para GENOMEWALKER del evento de soja DAS-68416-4 para amplificar las regiones de borde flanqueantes CUADRO 5 Condiciones para amplificación PCR estándar de las regiones de borde y secuencias específicas de eventos en el evento de soja DAS-68416-4 CUADRO 6 Descripción de cebadores para los amplicones 1-4 para inserto de cadena T CUADRO 7 Mezcla de PCR para amplificación por PCR estándar de las regiones de borde v secuencias específicas de eventos en el evento de soja DAS- 68416-4 EJEMPLO 3.3 Paseo Genomico El Kit GENOMEWALKER™ Universal Kit (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA) fue utilizado para clonar las regiones de borde flanqueantes 5' y 3' del inserto de cadena T pDAB4468 para el evento de soja DAS-68416-4, siguiéndose las instrucciones del fabricante. Aproximadamente 2 µ9 de ADN genómico del evento de soja DAS-68416^ fueron digeridos durante la noche con EcoRV y Pwvll (Figura 2). Los digestos de ADN fueron purificados mediante la utilización de DNA CLEAN & CONCENTRATOR™-25 (ZY O Research, Orange, CA) seguido por ligación a adaptadores de GENOMEWALKER™ de manera de construir bibliotecas de constructos GENOMEWALKER™. Se utilizó cada biblioteca de GENOMEWALKER™ como una plantilla de ADN para amplificación primaria de PCR con cebador adaptador AP1 (provisto en el kit) y un cebador específico para constructo ES_LEnd03 o ES_PATEnd03 (Cuadro 4). A continuación se utilizó un microlitro (1 pL) de dilución 1 :25 de reacción primaria de PCR como templado para la amplificación secundaria de PCR con el cebador adaptador anidado AP2 provisto en el kit y un cebador anidado específico para constructo ES_LEnd04 o ES_PATEnd04 (Cuadros 4, 7, y Figura 2).
EJEMPLO 3,4 PCR convencional Se utilizó PCR estándar para clonar y confirmar la secuencia de inserto y de borde del evento de soja DAS-68416-4. Se utilizó TaKaRa LA TAQ™ (Takara Bio Inc, Shiga, Japan), HOTSTARTAQ™ DNA Polymerase (Qiagen, Valencia, CA), HIGH FIDELITY™ PCR Kit (Roche Diagnostics, Inc), o el EASY-A™ High Fidelity Polymerase Kit (Stratagene, LaJolla, CA) para la amplificación por PCR convencional, de acuerdo con los procedimientos recomendados por el fabricante. Las condiciones específicas para PCR y las descripciones de los amplicones han sido enumeradas en las Cuadros 5, 6, y 7.
EJEMPLO 3.S Detección del producto de la PCR. su purificación, subclonación de los productos de PCR y secuenciación Se inspeccionaron los productos de PCR mediante electroforesis, para lo cual se utilizó E-GEL ® al 1 ,2 ó 2 % (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con las instrucciones que acompañan al producto. Se estimó el tamaño del fragmento por comparación con los marcadores de ADN. En caso de necesidad, los fragmentos de PCR fueron purificados mediante extirpación de los fragmentos a partir de un gel de agarosa al 1 % en 1 TBE (Tris Borato, 89 mM, EDTA 2mM, pH 8,3) teñido con bromuro de etidio, para lo cual se utilizó el QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA).
Los fragmentos de PCR fueron subclonados en el vector PCR®4-TOPO® , utilizándose el TOPO TA CLONING® KIT para secuenciar (Invitrogen, Carlsbad, CA), y siguiéndose las instrucciones que acompañan al producto. Específicamente, dos a cinco microlitros de la reacción de clonación TOPO® fueron transformados en células TOP 10 químicamente competentes de One Shot, siguiéndose las instrucciones del fabricante. Los fragmentos clonados fueron verificados mediante minipreparación del ADN de plásmido (QIAprep Spin Miniprep Kit, Qiagen, CA) seguida por digestión de restricción con EcoRI o mediante PCR de colonia directo gracias a la utilización de cebadores T3 y T7. Seguidamente se entregaron a terceros ADN de plásmido o material madre de colonias seleccionadas, para su secuenciado.
Después de la subclonación, se secuenciaron inicialmente los productos de PCR objetivos putativos para confirmar que se habían clonado los fragmentos de ADN previstos. Las colonias que contenían los fragmentos de ADN previstos fueron seleccionadas para completar el secuenciado de longitud completa de doble cadena mediante paseo de cebadores. La totalidad del secuenciado fue efectuado por Cogenics (Houston, TX).
Se completó el ensamble final de las secuencias de inserto y de borde mediante la utilización de software de SEQUENCHER® (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI). Se llevó a cabo la anotación de las secuencias de borde del inserto y de sus bordes flanqueantes del evento de soja DAS-68416-4, para lo cual se utilizó el Vector NTI (Versión 10 y 1 1 , Invitrogen, Carlsbad, CA).
Se llevó a cabo la búsqueda de homología mediante el uso del programa BLAST por comparación con la base de datos de nucleótidos no redundantes de GenBank. Se llevó a cabo el análisis de ORF (Open reading frame, marco de lectura abierto) mediante la utilización de Vector NTI (Versión 1 1 , Invitrogen) a efectos de identificar los ORFs (>= 150 codones) en las secuencias completas de inserto y de bordes flanqueantes del evento de soja DAS-68416-4, y el lugar original de la cepa de soja Maverick de tipo salvaje.
EJEMPLO 3.6 Secuencia de borde extremo 5' Se amplificó un fragmento de ADN de cada biblioteca de Eventos de Soja DAS-68416-4 GENO EWALKER™, para lo cual se utilizó el conjunto de cebadores específicos anidados para el extremo 5' del transgén. Se observó un fragmento de -1 ,8 kb de la biblioteca EcoRV GENOMEWALKER™ y un fragmento de ~ 3 kb de la biblioteca Pvull GENOMEWALKER™ Estos fragmentos fueron clonados en el vector PCR®4-TOPO® vector. Se eligieron aleatoriamente cinco clones de la biblioteca a efectos del secuenciado de extremos para generar datos de secuencias de nucleótidos. Los clones que contienen las secuencias de ambos observadores de PCR fueron seleccionados para obtener las secuencias completas mediante paseo de cebadores. Los análisis de las secuencias revelaron que el clon amplificado a partir de la biblioteca de evento de soja DAS-68416^ EcoRV GENOMEWALKER™ contenía un fragmento de ADN de 1 ,744 bp y que el clon amplificado a partir de la biblioteca de Eventos de soja DAS-68416^1 Pvull GENOMEWALKER™ contenía un fragmento de ADN de 3,047 bp. Los análisis de las secuencias revelaron que el fragmento de ADN obtenido a partir de la biblioteca de EcoRV GENOMEWALKER™ se superponía con el fragmento de ADN obtenido a partir del clon de la biblioteca de Pvull GENOMEWALKER™ en regiones entre el cebador ES_LEnd04 y el sitio EcoRV. La totalidad de estos fragmentos de ADN contenían el empalme extremo 5' del borde B de cadena T en el transgén, lo que indica que habían sido amplificados a partir de la misma región del inserto transgén extremo 5' y su borde flanqueante en el evento de soja DAS-68416-4. La secuencia genómica de soja de 2,730 bp demostró no tener homologías significativas con las secuencias en GenBank.
EJEMPLO 3.7 Secuencia de borde extremo 3' Se amplificó un fragmento de ADN con un tamaño de aproximadamente 1 ,3 kb a partir de la biblioteca de evento de soja DAS-68416-4 EcoRV GENOMEWALKER™ mediante la utilización del conjunto de cebadores específicos anidados para el extremo 3' del transgén. Seguidamente se clonó el fragmento de ADN en un vector PCR®4-TOPO®. Se seleccionaron aleatoriamente cinco clones para el secuenciado de sus extremos. La totalidad de los cinco clones contenían las secuencias tanto del Cebador AP2 como del Cebador ES_PATEnd04. El secuenciado completo de estos clones resultó en un fragmento de ADN de consenso de 1 ,359 bp. El análisis de las secuencias reveló que el fragmento de 1 ,359 bp contenía un fragmento de 268 bp procedente de la región extrema 3' del Borde A de cadena T y un fragmento de 1 ,091 bp procedente del ADN genómica de soja. La búsqueda con BLAST no identificó ninguna homología significativa entre esta secuencia de soja de 1 ,091 bp soja DNA y las secuencias en el GenBank.
EJEMPLO 3.8 Inserto de ADN y secuencia del empalme El inserto de ADN y las regiones de borde flanqueantes fueron clonados a partir del evento de soja DAS-68416- mediante la utilización de métodos basados en PCR como arriba descrito. Las secuencias de borde flanqueantes 5' y 3' y la secuencia de transgén prevista fueron utilizadas por diseñar los cebadores de PCR enumerados en el cuadro 6. En total, se clonaron y secuenciaron cuatro fragmentos superpuestos de ADN (Amplicón 1 de 978 bp, Amplicón 2 de 2,414 bp, Amplicón 3 de 1 ,834 bp, y Amplicón 4 de 1 ,705 bp) (Figura 3). Se ensambló la totalidad de la secuencia de borde de inserto y flanqueantes sobre la base de una secuencia de superposición entre los cuatro fragmentos. El análisis de la secuencia final ensamblado confirmó la presencia de un fragmento de 6,391 bp derivado del transgén de pDAB4468, y no se encontraron cambios de la secuencia de ADN insertado en comparación con la secuencia prevista para el plásmido pDAB4468.
EJEMPLO 3.9 Confirmación de secuencias genómica de soja Para conservar el sitio de inserción del transgén evento de soja DAS-68416-4 en el genoma de soja, se llevó a cabo el PCR con diferentes pares de cebadores (Figura 4 y Cuadro 5). El ADN genómico del evento de soja DAS-68416-4 y otras cepas de soja transgénicas o no transgénicas fue utilizado como templados. Por lo tanto, para confirmar que las secuencias de borde de extremo 5' son correctas, se utilizaron dos cebadores aad-12 específicos, por ejemplo AIILEnd05 y AIILEnd06, y dos cebadores diseñados de acuerdo con la secuencia de borde de extremo 5', designadas 16LEndG01 y 16LEndG02, para amplificar el segmento de ADN que abarca la secuencia de borde de gen aad-12 al extremo 5'. De manera similar, para conservar la secuencia de extremo 3', se utilizaron un cebador pat específico, por ejemplo PAT-End06, y dos cebadores diseñados de acuerdo con la secuencia de borde de extremo 3', designados 16PATG01 y 16PATG02, para amplificar segmentos de ADN que abarcan la secuencia de borde gen pat al extremo 3'. Los fragmentos de ADN del tamaño predicho fueron amplificados solamente desde el ADN genómico del evento de soja DAS-68416-4 con cada par de cebadores, a razón de un cebador situado en el borde flanqueante del evento de soja DAS-68416-4 y un cebador específico de transgenes, pero no de muestras de ADN de otras cepas de soja transgénicas ni de control no transgénico. Los resultados indican que la secuencias de borde 5' y 3' borde son las secuencias de borde flanqueantes de cadena T en el evento de soja DAS-68416-4.
Para conformar más aún la inserción de ADN en el genoma de soja, se completó una amplificación por PCR que abarcaba las dos secuencias de soja. Dos cebadores diseñados de acuerdo con la secuencia de borde de extremo 5', 16LEndG03 y 16LEndG04, y dos cebadores para la secuencia de borde de extremo 3', 16PATG03 y 16PATG04, fueron utilizados para amplificar segmentos de ADN que contienen la totalidad del transgén, la secuencia de borde de extremo 5', y la secuencia de borde 3'. Como se preveía, la amplificación por PCR con el par de cebadores de 16LEndG03 y 16PATG03 amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 9 kb del ADN genómico del evento de soja DAS-68416-4 y un fragmento de 2,7 kb de ADN de los controles soja no transgénicos y otras cepas de soja transgénicas. De manera similar, las reacciones de PCR completadas con el par de cebadores de 16LEndG04 y 16PATG04 produjeron un fragmento de ADN de aproximadamente 9 kb procedente de la muestra del evento de soja DAS-68416-4 y un fragmento de ADN de 2,8 kb procedente de todos las otras cepas de control de soja, de manera correspondiente. Se observó que había una débil banda o franja con un tamaño de aproximadamente 6 kb visible en todos las muestras de soja excepto el evento de soja DAS-68416-4 cuando se utilizaron ambos pares de cebadores para el PCR, lo que sugiere que esta débil franja resultó de una amplificación no específica en el genoma de soja con este par de cebadores.
EJEMPLO 3.10 Confirmación de secuencias qenómica de soja Se clonaron y amplificaron los fragmentos de ADN amplificados de 2,7 kb y 2,8 kb, mediante la utilización el par de cebadores de 16LEndG03 y 16PATG03 o el par de cebadores de 16LEndG04 y 16PATG04, a partir de de la cepa de soja averick. Se hicieron concordar sus secuencias entre sí y se las alineó con las secuencias de borde clonadas 5' y 3' del evento de soja DAS-68416-4. Esto demostró que la secuencia de ADN clonada contenía el lugar donde la cadena T de pDAB4468 se había integrado en el evento de soja DAS-68416-4. El análisis de alineación también reveló una supresión de 55 bp desde el lugar original y una inserción de 9 bp en el empalme de integración 3' (Figura 5). No se identificaron marcos de lectura abiertos (>/=450 bp, 150 aa) en la región de soja genómica del lugar original que se había clonado.
EJEMPLO 4 Caracterización genómica con marcadores de SNP flanqueantes de evento de soja DAS-68416-4 Para caracterizar y describir el sitio de inserción genómico, se determinaron secuencias marcadoras situadas en proximidad del inserto. Se utilizó un panel de marcadores polimórficos de SNP (Single Nucleotide Polymorphism) para identificar y mapear la localización de los transgenes. El evento de soja DAS-68416-42 está situado a 1 19,6 cM sobre el cromosoma 4. Esta ubicación se halla entre los dos marcadores de SNP flanqueantes SNP, BARC-044607-08736 y BARC-019093-03299. Más específicamente, la ubicación del transgén fue mapeada a 1 ,3 cM (480 kb) desde el marcador de SNP, BARC-019093-03299.
EJEMPLO 4.1 BLAST con secuencias de regiones de borde flanqueantes Se utilizaron las secuencias de región de borde flanqueantes para el evento de soja DAS-68416-4 (SEQ ID NO:1) para efectuar el BLAST la secuencia de genoma de soja completa. Los resultados de BLAST mostraron que ambas secuencias de borde del evento de soja DAS-68416-4 estaban situadas sobre el cromosoma 4 (Gm04) que es el grupo de enlace C1.
EJEMPLO 4.2 Mapeo de SNP y resultados de BLAST Sobre la base de BLAST con secuencias de borde y mapeo, se asignó el Evento al cromosoma 4. Como tal, se seleccionaron diez marcadores de SNP para los mapas de enlace genéticos de la soja. Estos marcadores de SNP están asociados con el grupo de enlace C1 que corresponde al cromosoma 4. Se utilizaron las secuencias de SNP para aplicar el BLAST a la secuencia de genoma de soja completa a efectos de determinar las condiciones físicas del inserto de cadena T para el evento de soja DAS-68416-4.
EJEMPLO 4.3 Resultados del marcador de SNP Se mapea el evento de soja DAS-68416-4 a 1 19,6 cM sobre el cromosoma 4. Los dos marcadores de SNP flanqueantes son BARC-044607-08736 y BARC-019093-03299. El transgén está distanciado en 1 ,3 cM (480 kb) con respecto al Marcador de SNP, BARC-019093-03299, a aproximadamente 1 19,6 cM entre los marcadores de SNP, BARC-044607-08736 (SEQ IN NO: 30) y BARC-019093-03299.
EJEMPLO 5 Caracterización de la proteína AAD-12 en el evento de soja DAS- 68416-4 Se caracterizaron las propiedades bioquímicas de la proteína AAD-12 recombinante derivada del evento de soja DAS-68416-4, transgénico. Se utilizó ELISA (enzyme-linked immunosorbentassay) cuantitativo, electroforesis de gel dodecilsulfato de sodio poliacrilamida (SDS-PAGE, teñido con azul de Coomassie y métodos para la detección de glicoproteína), y western blot, por ejemplo, para caracterizar las propiedades bioquímicas de la proteína y para confirmar la expresión de la proteína AAD-12.
EJEMPLO 5.1 Expresión de la proteína AAD-12 en tejidos de plantas Se determinaron niveles de proteína AAD-12 en el evento de soja DAS-68416- . Se midió la proteína soluble extraíble AAD-12 mediante la utilización de un método ELISA cuantitativo en la hoja de soja.
Se aislaron muestras de tejidos de soja a partir de las plantas de ensayo y se las preparó para el análisis de expresión. Se extrajo la proteína AAD-12 a partir de tejidos de plantas de soja con una solución salina tamponada con fosfato que contiene el detergente Tween-20 (PBST) que contiene BSA (Bovine Serum Albumin) al 0.5%. Se centrifugó el tejido de planta, se reunió el material sobrenadante acuoso, se diluyó con tampón adecuado en la medida de lo necesario, y se analizó mediante la utilización de un kir ELISA de AAD-12 en un formato sándwich. Se utilizó el kit siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante.
Se llevó a cabo el análisis de detección para investigar la estabilidad de la expresión y la heredabilidad tanto verticalmente (entre generaciones) como horizontalmente (entre cepas) en el evento de soja DAS-68416-4. En la generación T5 del evento de soja DAS-68416-4 la expresión era estable (no había segregación) y coherente a través de todas las cepas (Figura 6) Se llevaron a cabo estudios sobre el nivel de la expresión en diversas etapas de la planta sobre el Evento de Soja, DAS-68416-4 en pre V3, post V3, pre R2, y post R2. Los valores de expresión fueron similares para todos los tratamientos rociados así como para las parcelas rociadas y sin rociar con el herbicida 2,4-D. Se aplicó un coeficiente de rociado 2 X (2,240 gm ae/ha de 2,4-D), y no se observó ninguna lesión sobre las plantas en ningún momento del estudio. La expresión promedia a través de todas las cepas en la etapa pre v3 de la planta era de 300 ug/cm2. Después de rociar 2,4-D, la expresión se mantuvo estable con un valor promedio de 400 ug/cm2 a través de las cepas. En el momento en que las sojas llegaron a pre R2, la expresión promedia había decaído ligeramente a un valor promedio de 200 ug/cm2. Después de rociar el 2,4-D la expresión post R2 habia vuelto al promedio anterior de 400 ug/cm2. Véase la Figura 6.
EJEMPLO 5.2 Expresión de la proteína AAD-12 en los tejidos de planta Se llevó a cabo un estudio adicional de la expresión en el campo en seis lugares en Estados Unidos y Canadá durante el año 2008. Se ensayaron cuatro tratamientos para el evento de soja DAS-68416 4 (sin rociar, rociado con 2,4-D, rociado con glufosinato, o rociado tanto con 2,4-D como con glufosinato). Las muestras de tejidos de las plantas incluían hojas, semillas, raíces y forraje. Se recolectaron tejidos de hoja en la etapa V5 y V10, y se recolectaron raíces y forraje en la etapa R3 del desarrollo. Se recolectó grano en la etapa R8 del desarrollo (Gaska, 2006). Se midió la proteína AAD-12 soluble extraíble mediante la utilización de un método ELISA validado como arriba descrito en el Ejemplo 5,1. Los niveles de proteína AAD-12 para todos los tipos de tejidos se calcularon sobre una base ng/mg en seco.
En el cuadro 8 se muestra un resumen de las concentraciones de la proteína AAD-12 (promediada a través de los lugares) en las diversas matrices de soja. Los valores promedios de la expresión se hallaban en un intervalo de 15,5 ng/mg peso seco en la etapa R3 de las raíces a 66,1 ng/mg en la etapa V5 del tejido de las hojas. Los valores de expresión fueron similares para todos los tratamientos rociados así como también para las parcelas rociadas y sin rociar con los herbicidas 2,4-D y glufosinato. No se detectó proteína AAD-12 en los tejidos de control a través de los seis lugares.
CUADRO 8 Síntesis de niveles de proteína AAD-12 en tejidos recolectados de evento de soja DAS-68416-4 producidos en los EE.UU. v Canadá durante el año 2008.
Soja AAD-12 ng/mg tejido peso seco Tejido Treatment Media Std. Dev. Intervalo V5 Hoja DAS-68416-4 No pulverizado 51.4 25.2 26.4 - 97.7 DAS-68416-4 + Glufosinato 50.6 23.7 28.0 - 94.0 DAS-68416-4 + 2,4-D 51.7 25.4 27.2 - 101 DAS-68416-4 + Glufosinato y 2,4-D 66.1 37.8 25.1 - 165 V10 DAS-68416-4 No pulverizado 54.0 20.9 29.8 - 90.9 DAS-68416-4 + Glufosinato 56.1 22.0 25.1 - 92.0 Hoja DAS-68416-4 + 2,4-D 55.2 20.6 30.8 - 91.8 DAS-68416-4 + Glufosinato y 2,4-D 57.1 23.0 32.0 - 95.2 Raíz DAS-68416-4 No pulverizado 17.1 5.68 8.80 - 27.6 DAS-68416-4 + Glufosinato 15.5 4.58 6.30 - 23.1 DAS-68416-4 + 2,4-D 16.0 6.64 3.16 - 27.9 DAS-68416-4 + Glufosinato y 2,4-D 16.7 6.81 1.84 - 26.5 Forraje DAS-68416-4 No pulverizado 41.1 25.7 5.70 - 91.2 DAS-68416-4 + Glufosinato 39.4 24.5 5.49 - 88.0 DAS-68416-4 + 2,4-D 40.6 25.6 5.02 - 88.0 DAS-68416-4 + Glufosinato y 2,4-D 39.7 22.4 4.96 - 69.6 Grano DAS-68416-4 No pulverizado 16.5 3.55 9.40 - 21.9 DAS-68416-4 + Glufosinato 16.9 3.15 11.9 - 22.7 DAS-68416-4 + 2,4-0 16.5 3.78 9.71 - 22.0 DAS-68416-4 + Glufosinato y 2,4-D 16.2 3.62 9.91 - 23.4 EJEMPLO 5.3 SDS PAGE v análisis de Western Blot para la proteína AAD-12 Se extrajo proteína AAD-12 de tejido de hoja liofilizado de evento de soja DAS-68416-4 en un tampón basado en PBST (Phosphate Buffered Saline with 0.05% Tween 20, pH 7,4. Solución salina tamponada con fosfato con Tween al 0.05%, pH 7,4), con estabilizantes añadidos, y se reunieron las proteínas solubles mediante centrifugación. Se filtró el material sobrenadante y se permitió a las proteínas solubles ligarse a perlas de Phenyl Sepharose (PS) (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Después de 1 hora de incubación se lavaron las perlas de PS con PBST y las proteínas ligadas se eluyeron con agua Milli-Q. Se añadió cloruro de sodio a efectos de incrementar la conductividad, y se cargaron las proteínas PS-purificadas en una columna de inmunoafinidad anti— AAD-12 que había sido conjugada con un anticuerpo policlonal específico con respecto a AAD-12. Se reunieron las proteínas no ligadas de la columna, y se lavó la columna extensivamente con PBS (solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4) prehelado. Las proteínas ligadas fueron eluidas de la columna con un tampón NaSCN 3,5 M, Tris 50 mM, pH 8, 0, y se examinó mediante SDS-PAGE y western blotting. Se utilizó el mismo protocolo para aislar proteína de tejido de hoja de la cepa de soja de control Maverick. El Maverick no contiene el gen aad-12 pero tiene un antecedente genético representativo de plantas de evento de soja DAS-68416-4.
Se mezclaron tejido de hoja de planta liofilizada del evento de soja DAS-68416- y Maverick con tampón PBST que contiene coctel inhibidor de proteasa a aproximadamente 2,0% (Sigma, St. Louis, MO) y se extrajo la proteína mediante molienda con bolitas esféricas de cojinete en una trituradora Geno-Grinder. Se centrifugaron las muestras, y los materiales sobrenadantes fueron mezclados con tampón de muestra Laemmli, calentados y brevemente centrifugados. Se cargaron las muestras directamente en un gel de Bio-Rad Criterion SDS-PAGE. El estándar de referencia positivo, proteína AAD-12 derivado de microbio, también se incluyó en la mezcla con tampón de muestra, y se cargó sobre el gel. Se llevó a cabo la electroforesis con tampón Tris/glicina/SDS (Bio-Rad, Hercules, CA). Después de la electroforesis, se cortó el gel en mitades, tiñéndose una mitad con tinte Pierce GelCode Blue protein, y la otra mitad del gel fue sometida a electro-blot sobre una membrana de nitrocelulosa. La membrana de nitrocelulosa fue seguidamente sondeada con un anticuerpo policlonal de conejo específico para AAD-12. Para visualizar las franjas inmunorreactivas se utilizó un substrato quimioluminiscente.
En el AAD-12 derivado de microbio, la banda principal de proteína, tal como se visualiza en el gel de SDS-PAGE teñido con Coomassie, era de aproximadamente 32 kDa. Como se preveía, la proteína AAD-12 derivada de la planta correspondiente era idéntica en tamaño a la proteína derivada de microbio. Como podía predecirse, las fracciones purificadas de la planta contenían una cantidad menor de impurezas no inmunorreactivas además de la proteína AAD-12. Las proteínas copurificadas fueron retenidas de manera similar sobre la columna debido a débiles interacciones con la matriz de la columna (Williams, et. al., 2006, Kennedy y Barnes, 1983 y Holroyde et al., 1976).
El AAD-12 derivado de microbio y el extracto de tejido de planta DAS-68416-4 mostraron una señal positiva del tamaño previsto sobre el Western blot mediante la utilización del anticuerpo poli clonal AAD-12. En el análisis western blot de AAD-12, no se observaron proteínas inmunorreactivas en el extracto Maverick de control, y no se vieron proteínas de tamaños alternativos (agregados o productos de degradación) en las muestras obtenidas de la planta transgénica. El anticuerpo monoclonal si detectó una pequeña cantidad del dímero AAD-12 en la proteína derivada de microbio. Estos resultados se suman a la evidencia de que la proteína AAD-12 se expresa en la soja.
EJEMPLO 6 Análisis de detección por metilación, de evento de soja DAS-68416-4 vía Southern Blot Los transgenes introducidos pueden experimentar un silenciado después de su integración en el genoma de la planta. Es posible inhibir la expresión del transgén a nivel transcripcional y/o a nivel postranscripcional. El silenciado transcripcional del gen ha sido objeto de informes que lo asocian con la metilación del transgén, su promotor y otras secuencias relevantes (Stem et al, 1997). Para detectar la metilación en secuencias específicas, en un método se utilizan enzimas de restricción sensibles a la metilación, para digerir ADN seguido por análisis Southern blot de los productos de ADN. Cuando se metilan sitios de restricción específicos de enzimas, las enzimas no desdoblan el ADN. La metilación de los sitios de restricción tiene como resultado fragmentos de ADN de peso molecular superior que son detectables en Southern blots. El análisis de metilación basado en Southern-blot fue llevado a cabo a efectos de determinar el status de metilación del inserto de cadena T para el evento de soja DAS-68416-4. Se llevó a cabo este ensayo mediante la utilización de sondas específicas con respecto al gen aaó-\ 2 y su promotor y dos enzimas de restricción sensibles a la metilación. No se detectó metilación del cásete de expresión aad-12.
EJEMPLO 6.1 Recolección de muestras de hojas de soja e aislación de ADN genómico (gADN) Se preparó ADN genómico a partir de hoja de las plantas individuales del evento de soja DAS-68416-4 y de cepa de soja no transgénica Maverick. Se aisló ADN genómico a partir de muestras de hoja liofilizadas, mediante la utilización de un método de CTAB tradicional. Después de la extracción se cuantificó el ADN mediante la utilización de reactivo Pico Green (Invitrogen, Carlsbad, CA).
EJEMPLO 6.2 Digestión de ADN y separación Para la caracterización molecular del ADN, se digirieron diez microgramos (10 µg) de ADN genómico del evento de soja DAS-68416-4 y de cepa de soja no transgénica Maverick mediante la adición de aproximadamente cinco unidades de enzima de restricción seleccionada por pg de ASN y el correspondiente tampón de reacción a cada muestra de ADN. Cada muestra fue incubada aproximadamente 37°C durante la noche. Se utilizaron las enzimas de restricción Ac/'l y Hyp188\\\ para los digestos (New England Biolabs, Ipswich, MA). Se digirió ADN de la soja no transgénica Maverick mediante la utilización de los mismos procedimientos y enzimas de restricción que las muestras de ensayo, para que sirvan como un control negativo. Las muestras de ADN digeridas fueron precipitadas con isopropanol después de la adición de NaCI hasta lograr una concentración final de 0, 1 M y fueron suspendidas en 20 ul de tampón de carga 1X (azul de bromo fenol al 0,1 %. EDTA 100 mM, glicerol al 50%, Tris pH 7,5 10 mM). Las muestras de ADN y los marcadores de tamaño molecular fueron seguidamente sometidos a electroforesis mediante geles de agarosa al 0.85% con tampón TAE 0.4X (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) a 35 voltios durante aproximadamente 18-22 horas para lograr la separación de los fragmentos. Se tiñeron los geles con bromuro de etidio (Invitrogen, Carisbad, CA) y se visualizó el ADN bajo luz ultravioleta (UV).
EJEMPLO 6.3 Transferencia de membrana Southern y tratamiento de membrana Se llevó a cabo el análisis Southern blot como descrito por Severson et al., (1997). En pocas palabras, después de separación electroforética y de visualización de los fragmentos de ADN bajo luz ultravioleta, se expusieron los geles a una solución de desnaturalización (NaOH (150 mM, EDTA 3 mM) durante aproximadamente 20 minutos seguido por solución neutralizante (NaP04 150 mM, pH 7,8) durante por lo menos 20 minutos. Se llevó a cabo la transferencia Southern durante la noche sobre membranas de nylon (Roche Diagnostics, Indianápolis, IN) mediante la utilización de un sistema de mecha con tampón de transferencia (pirofosfato de sodio 25 mM, pH 10). Después de la transferencia se hornearon las membranas a 65 °C durante aproximadamente dos horas. Este proceso tuvo como resultado membranas Southern blot listas para la hibridación.
EJEMPLO 6.4 Etiquetado e hibridación de sondas de ADN Los fragmentos de ADN ligadas a las membrana de nylon fueron detectadas mediante la utilización de una sonda etiquetada Se generaron las sondas en forma de fragmentos de PCR amplificados con cebadores específicos del plásmido pDAB4468. Estos fragmentos amplificados por PCR fueron extirpados y purificados a partir del gel de agarosa. Los fragmentos purificados de ADN fueron utilizados como plantillas para preparar sondas de hibridación. Las sondas de hibridación fueron etiquetadas con nucleótido específico para a32P-y cebado aleatorio mediante la utilización de perlas GE Healthcare READY-TO-GO™ DNA Labeling Beads (GE Healthcare, Piscataway, NJ) siguiéndose las instrucciones del fabricante, y se purificaron mediante microcolumnas de PROBEQUANT™ G-50 (Amersham/Pharmacia, Piscataway, New Jersey, USA). En el cuadro 9 se describe una lista de sondas utilizadas para el estudio.
La prehibridación y la hibridación fueron llevadas a cabo a 65 °C durante cuatro horas y durante la noche, respectivamente, para lo cual se utilizó el tampón de hibridación (Sigma, St. Louis, MO). Después de la hibridación se lavó la membrana a 65 °C en tampón de lavado (fosfato de sodio 10 mM, pirofosfato de sodio 2,5 mM, EDTA 0.5 mM, SDS al 0, 1 %, ajusfar el pH a 7,9 con ácido fosfórico) durante 20 minutos tres veces. Los filtros lavados fueron expuestos a una pantalla de phosphorimager para su autorradiografía, y las imágenes fueron escaneadas.
CUADRO 9 Ubicación y longitud de las sondas utilizadas en el análisis Southern.
EJEMPLO 6.5 Despojamiento de la sonda Las sondas de ADN fueron retiradas o despojadas de los blots de membrana después de haberse obtenido los datos de hibridación Southern, y fue posible reutilizar los blots de membrana para hibridación con una sonda de ADN diferente. En pocas palabras, se lavaron los blots de membrana después de su exposición, en solución de regeneración 1 (NaOH 30 mM, Na2EDTA 1 mM) a la temperatura ambiente durante diez minutos y en solución de regeneración 2 (NaPO4 5 mM, Na2EDTA 1 mM, SDS al 0,1% SDS) a 65°C durante 30 minutos. Seguidamente se lavaron brevemente los blots de membrana en SSC 2X, y estaban listos para su hibridación con otra sonda de ADN. Los blots de membrana fueron expuestos a una pantalla de Phosphorimager para su autorradiografía a efectos de asegurar que todas las sondas de ADN habían sido retiradas antes de pasar a la hibridación siguiente.
EJEMPLO 6.6 Resultados de Southern Blot En este estudio se utilizaron enzimas de restricción sensibles a la metilación Aci\ y Hyp188\\\ para determinar el status de metilación del gen aad-12 gene y de su promotor AtUbil 0. En el cuadro 10 se indican los tamaños previstos para los fragmentos con un digesto y sonda en particular, sobre la base de los sitios conocidos de enzima de restricción de la cadena T DNA de pDAB4468. La detección de fragmentos de mayor peso molecular sobre el Southern blot indicaría la metilación de citosina en la secuencia de reconocimiento de los sitios de restricción de las enzimas Acft y Hyp188\\\. Como tal, la metilación resultaría en la incapacidad de las enzimas de restricción para digerir el ADN genómico.
Se utilizaron las enzimas de restricción Aci\ y Hyp188\\\ para examinar el status de metilación del gen aad-12. Se observaron bandas o franjas de hibridación con el tamaño previsto, mediante la utilización de la sonda aad-12. Estos datos sugieren que no se presentó ninguna metilación en el sitio de reconocimiento de Aci\ y Hyp 188\ II en el evento de soja DAS-68416-4. De manera similar, se detectaron bandas o franjas con el peso molecular predicho en las muestras de ADN del evento de soja DAS-68416-4 digerido con Hyp188\\\, gracias a la utilización de la sonda AtUbil 0. Estos datos indican que el sitio de reconocimiento no fue metilado en la secuencia del promotor aad-M .
CUADRO 10 Fragmentos de hibridación previstos v observados en análisis de transferencia Southern EJEMPLO 7 Datos agronómicos Se llevaron a cabo ensayos agronómicos con el evento de soja DAS-68416-4 como parte de un estudio de composición 2008 en 6 lugares de los Estados Unidos y Canadá, y también, en un estudio separado realizado en 2009 en aproximadamente 26 lugares de los Estados Unidos. Estos estudios compararon las sojas del evento DAS-68416-4 (con y sin los herbicidas 2,4-D y/o glufosinato) con su control cuasiisogénico no transgénico (Maverick). Los resultados demostraron que los parámetros agronómicos eran tan buenos como el espectro obtenido para líneas de soja convencionales.
EJEMPLO 7.1 Generación de datos agronómicos de 2008 Se llevó a cabo un estudio agronómico con la soja del evento DAS-68416-4 y un control no transgénico (var. Maverick) en 2008 en seis (6) lugares, a saber lowa, Illinois, Indiana, Nebraska y Ontario, Canadá (2 lugares). Se evaluaron los determinantes agronómicos, incluso el recuento de densidad/población, vigor de los plantines/plantas, altura de la planta, alojamiento, incidencia de enfermedades, daño provocado por insectos y días restantes hasta la floración, para investigar la equivalencia de la soja del evento DAS-68416-4 (con y sin tratamientos con herbicida) en comparación con la línea de control Maverick. Este estudio es referido como Experimento 1.
Se plantaron las semillas de soja de prueba y control en surcos a razón de aproximadamente 1 12 semillas por cada 25 pies (7,62 m) con un espacio libre de un surco de alrededor de 30 pulgadas (75 cm). En cada lugar, se establecieron tres (3) parcelas replicadas de cada tratamiento, donde cada parcela consta de surcos de 2-25 pies (0.60-7,62 m). Se dispusieron las parcelas en un diseño de bloque completo de tipo aleatorio (RCB), con una aleatorización única en cada sitio. Se rodeó cada parcela de soja con dos surcos de una soja no transgénica de madurez similar. Se rodeó todo el sitio de prueba con un mínimo de 10 pies (3,04 m) de una soja no transgénica de madurez relativa similar.
Se aplicaron tratamientos herbicidas con un volumen de pulverización de 187 L/ha (20 galones por acre). Estas aplicaciones fueron diseñadas para replicar prácticas comerciales de la tasa máxima de la etiqueta. Se aplicó 2,4-D como tres (3) aplicaciones extraordinarias de difusión para un total estacional de 3 Ib ae/A. Se realizaron aplicaciones individuales de 1.0 Ib ae A (1 ,120 gr/ha) en las etapas previa a la aparición y desarrollo V4 y R2 aproximadamente. Se aplicó glufosinato en forma de dos (2) aplicaciones extraordinarias de difusión para un total estacional de 0.74 Ib ai/A (828 gr ai/ha). Se realizaron aplicaciones individuales de 0.33 Ib ai/A y 0.41 ai/A (374 y 454 gr ai/ha) en etapas de desarrollo V6 y R1 aproximadamente.
Se llevó a cabo un análisis de varianza a través de los sitios de campo para los datos agronómicos mediante el uso de un modelo mixto (SAS versión 8; SAS Institute 1999). El ingreso fue considerado un efecto fijo, la ubicación, el bloque dentro del lugar, la ubicación por cada entrada y la entrada por cada bloque dentro del lugar fueron designados como efectos aleatorios. Se calculó la importancia de un efecto del tratamiento general mediante una Prueba de Fisher. Se realizaron contrastes de pares entre el control y la soja del evento DAS-68416-4 sin pulverizar, el evento de soja DAS-68416-4 pulverizado con glufosinato (evento de soja DAS-68416-4 + glufosinato), evento de soja DAS-68416-4 pulverizado con 2,4-D (evento de soja DAS-68416-4 + 2,4-D) y evento de soja DAS-68416-4 pulverizado con las entradas transgénicas tanto de glufosinato como de 2,4-D (evento de soja DAS-68416-4 + ambos) mediante el uso de pruebas f. También se calcularon valores P ajustados mediante el uso de la tasa de falso descubrimiento (FDR) para controlar la multiplicidad (Benjamini y Hochberg, 1995).
CUADRO 11 Parámetros agronómicos evaluados en el experimento 1 Tiempo de la Descripci ¡ón de los Característica evaluación datos Escala Población temprana VC-V2 Cantidad de plantas Recuento real por cada parcela que emergen en surcos de cada parcela Vigor de los plantines VC-V2 Estimado visual del Escala de 1-10 sobre la base vigor promedio de las del desarrollo de las sojas no plantas emergentes transformadas por cada parcela 10 = equivalencia de desarrollo con no transformadas 9 = el buen estado de la planta es el 90% en comparación con no transformadas, etc.
Vigor/daño de la Después de las Daño por las Escala de 1-10 sobre la base planta aplicaciones de aplicaciones de del desarrollo de las sojas no herbicida posteriores a herbicida transformadas su aparición 10 = equivalencia de desarrollo con no transformadas 9 = el buen estado de la planta es el 90% en comparación con no transformadas, etc.
Altura de la planta R6 aprox. Altura desde la Altura en cm superficie del suelo (promedio de 10 plantas por hasta el extremo cada parcela) superior de la hoja más alta al extenderla con la mano Alojamiento R8 aprox. Estimado visual de la Estimado visual en una escala gravedad del de 0% a 100% sobre la base alojamiento de la cantidad de plantas alojadas Población final R8 aprox. La cantidad de plantas Recuento real por cada que permanecen en parcela, incluso las plantas surcos de cada retiradas durante un muestreo parcela previo Recuento de densidad R8 Número de plantas en final una sección medida de surco.
Días hata la floración Número de días a Días partir del plantado hasta que 50% de las plantas se encuentran en R1 Se llevó a cabo un análisis de los datos agronómicos reunidos del control, del evento de soja DAS-68416-4 sin pulverizar, del evento de soja DAS-68416-4 + 2,4-D, del evento de soja DAS-68416-4 + glufosinato, y del evento de soja DAS-68416-4 + ambos herbicidas. No se observaron diferencias estadísticas significativas para el recuento de densidad, población temprana, vigor de los plantines, daño posterior a la aplicación, alojamiento, recuento de densidad final o días restantes hasta la floración (Cuadro 12). En cuanto a la altura, se observó una prueba t de pares significativa entre el control y el evento de soja DAS-68416-4 + 2,4-D pulverizador. No obstante, no se observó un efecto del tratamiento general significativo, las diferencias fueron muy pequeñas entre el tratamiento del evento de soja DAS-68416-4 y el control, y las diferencias no fueron compartidas entre los diferentes tratamientos del evento de soja DAS-68416-4. Sobre la base de estos resultados, el evento de soja DAS-68416-4 resultó agronómicamente equivalente al control no transgénico cuasiisogénico.
CUADRO 12 Análisis de las características agronómicas a partir del Experimento 1 Sin Glufosinato 2,4-D Ambos Efecto general pulverizar pulverizado pulverizado pulverizados del tratamiento (valor P," (valor P, (valor P, (valor P, Analito (Pr>F)' Control P aj.)' P aj.) P aj.) P aj.) Recuento de densidad 0.774 170 172 175 173 175 (0.709, (0.311 , (0.476, (cantidad de plantas) 0.824) 0.575) 0.672) (0.269, 0.575) (cantidad de plantas) (0.770, (0.335, (0.817, (0,127, 0.575) 0.840) 0.575) 0.853) Días restantes hasta la floración' 0.452 49.0 49.5 49.4 48.7 49.2 de la prueba t. c Valores P ajustados mediante el uso del procedimiento de la tasa de falso descubrimiento (FDR). d Escala de 0% a 100%; (recuento de densidad dividido por la cantidad de semillas plantadas) •100. e Estimado visual en escala de 1 a 10; 10 = equivalente de desarrollo respecto de las plantas no transformadas. f Estimado visual en escala de 0% a 100%; 0% = sin daño.
' La cantidad de días desde el momento de la plantación hasta la floración.
Los valores P destacados son significativos (<0.05).
EJEMPLO 7.2 Generación de los datos agronómicos de 2009 Se llevó a cabo un estudio agronómico con la soja del evento DAS-68416-4 y un control no transgénico (var. Maverick) en 2009 en veintiséis (26) lugares en lowa, Arkansas, lowa, Illinois, Indiana, Maryland, Missouri, Nebraska y Ohio (Cuadro 12). Se evaluaron los determinantes agronómicos, incluso el recuento de densidad/población, vigor de los plantines/plantas, altura de la planta, alojamiento, incidencia de enfermedades, daño provocado por insectos y días restantes hasta la floración, para investigar la equivalencia de las sojas del evento de soja DAS-68416-4 (con y sin tratamientos con herbicida) con el control (Cuadro 13).
CUADRO 13 Datos reunidos en ensayos agronómicos y de campo, 2009 la Unidades Característica evaluación Descripción informadas Prueba* Aparición VC-V2 Recuento de densidad en una sección % B de 1 metro de surco dividido por la cantidad de semillas plantadas por metro Vigor de los V1 - V3 Vigor general de los plantines de 1 (bajo) a B plantines 10 (alto) Daño visual Posterior a la 1 día del daño visual posterior a la % S aplicación aplicación del herbicida en la etapa V3 Daño visual Posterior a la 7 días del daño visual posterior a la % S aplicación aplicación del herbicida en la etapa V3 Daño visual Posteriora la 14 días del daño visual posterior a la % S aplicación aplicación del herbicida en la etapa V3 Días hasta la Cantidad de días desde la plantación días B floración hasta que el 50% de las plantas se encuentra en R1 Recuento de R2 Cantidad de plantas en una sección de B densidad un metro de surco Daño visual Posterior a la 1 día del daño visual posterior a la % S aplicación aplicación del herbicida en la etapa R2 R2 Daño visual Posterior a la 7 días del daño visual posterior a la % S aplicación aplicación del herbicida en la etapa R2 R2 Daño visual Posterior a la 14 días del daño visual posterior a la % S aplicación aplicación del herbicida en la etapa R2 R2 Incidencia de ~R6 Nota oportunista sobre cualquier % B enfermedades enfermedad que se presentara en un lugar Daño provocado ~R6 Nota oportunista sobre cualquier daño % B por insectos provocado por insectos que se presentara en un lugar Altura de la R8 Altura final de la parcela en R8 cm B planta Madurez R8 Cantidad de días desde la plantación días B hasta que el 95% de las plantas de la parcela alcanzara su color de madurez Alojamiento R8 Grado de alojamiento en una parcela 1 (ninguno) - B 5 (fijo) Rendimiento R8 Peso de la semilla producida por la bu/acre B parcela Peso de 100 R8 Peso de 100 semillas tomadas en gr B semillas forma aleatoria de la parcela cosechada * B - Pruebas pulverizadas y sin pulverizar, S - pruebas pulverizadas solamente Un diseño de bloque completo aleatorizado se usó para los ensayos. Las entradas eran evento de soja DAS-68416-4, una línea de control Maverick y líneas de soja no transgénicas disponibles en comercios. La semilla de soja de ensayo, de control y de referencia se plantaron con una tasa de sembrado de aproximadamente 112 semillas por fila con espacio entre filas de aproximadamente 30 pulgadas (75 cm). En cada sitio, se establecieron 4 parcelas de replicación de cada tratamiento, en donde cada parcela consistía en filas de 2-25 pies. Cada parcela de soja estaba bordeada por 2 filas de una soja no transgénica (Maverick). Todo el sitio de ensayo se rodeó con un mínimo de 4 filas (o 10 pies) de soja no transgénica (Maverick). Se aplicaron insectos, malezas y prácticas de control de enfermedades para producir un cultivo agronómicamente aceptable.
Los tratamientos herbicidas se aplicaron para replicar las prácticas comerciales con índice de rotulación máximo. Los tratamientos consistían en un control sin pulverización y aplicaciones de herbicidas de 2,4-D, glufosinato, 2,4-D/glufosinato aplicados en los estadios de crecimiento especificados. Para las aplicaciones de 2,4-D, el herbicida se aplicó con un índice de 1.0 Ib ae /A (1 ,120 g ae/ha) en los estadios de crecimiento V4 y R2. Para los tratamientos de glufosinato, se realizaron aplicaciones a plantas en los estadios de crecimiento V4 y V6-R2. Para ambas aplicaciones, se aplicó glufosinato con un índice de 0.33 Ib ai/A (374 g ai/ha) y 0.41 Ib ai/A (454 g ai/ha) para las aplicaciones de V4 y V6-R2, respectivamente. Las entradas para ambas aplicaciones de herbicida eran el evento de soja DAS-68416-4 y los controles que incluían Maverick no transgénica. Se esperaba que las parcelas de Maverick murieran después de la aplicación del herbicida.
Se realizó análisis de varianza a través de los sitios de campo respecto de los datos agronómicos usando un modelo mixto (SAS versión 8; SAS Institute 1999). La entrada se consideró un efecto fijo, y la ubicación, el bloque dentro de la ubicación, entrada por ubicación y entrada por bloque dentro de la ubicación se designaron como efectos aleatorios. El análisis en ubicaciones individuales se realizó de una manera análoga con una entrada como un efecto fijo, y el bloque y la entrada por bloque, como efectos aleatorios. Los datos no se redondearon para el análisis estadístico. Se declararon las diferencias significativas en un nivel de confianza del 95%, y se estimó la significancia de un efecto de tratamiento general usando una prueba F. Se realizaron pares de contraste entre entradas transgénicas de AAD-12 (no pulverizado), AAD-12 pulverizado con glufosinato (AAD-12 + glufosinato), AAD-12 pulverizado con 2 ,4-D (AAD-12 + 2,4-D) y AAD-12 pulverizado tanto con glufosinato como con 2,4-D (AAD-12 + 2,4-D + glufosinato) y la entrada de control usando pruebas T.
Debido a la gran cantidad de contrastes hechos en este estudio, la multiplicidad era un ítem. La multiplicidad es un ítem cuando se realizaron una gran cantidad de comparaciones en un estudio individual para buscar efectos inesperados. En estas condiciones, la probabilidad de diferencias falsamente declaradas en base a valores p de comparación es muy alta (1 -0.95cantldad de comparaciones^ Ef| este estud¡0 nubo cuatro comparaciones poranalito (16 tipos de observación analizados para agronomía), dando como resultado 64 comparaciones para agronomía. En consecuencia, la probabilidad de declarar una o varias diferencias falsas sobre la base de valores p no ajustados era del 99% para agronomía (1-0.9564).
Se realizó un análisis de los datos agronómicos recolectados de las entradas de control, AAD-12 sin pulverizar, AAD-12 + glufosinato, AAD-12 + 2,4-D, y AAD-12 + 2,4-D + glufosinato. Para el análisis a través de la ubicación (Cuadro 14), no se observaron diferencias estadísticamente significativas para el vigor de las plántulas, la población final, el vigor/lesión de la planta (V4, R1 ), hospedaje, incidencia de la enfermedad, daños causados por insectos, días hasta la floración, días hasta la madurez, cantidad de vainas, cantidad de semillas, rendimiento y altura de la planta. Para el recuento estable y la población precoz, se observó una prueba t de a pared significativa entre la entrada de control y AAD-12 + glufosinato, pero no estaba acompañada por un significativo efecto de tratamiento general o valor p ajustado por FDR. Para el vigor/lesión de la planta (R2), se observaron significativas pruebas t de a pared y un efecto de tratamiento general significativo entre las entradas de control y tanto AAD-12 + glufosinato como AAD-12 + 2,4-D + glufosinato, pero no estaban acompañadas por un significativo valor p ajustado por FDR. Los resultados medios para todas estas variables también estaban dentro del rango hallado para las líneas de referencia ensayadas en este estudio.
CUADRO 14 Síntesis de los resultados de características agronómicas 2009 a través de las ubicaciones Medición agronómica Efecto Isolina AAD-12 AAD-12 + AAD-12 AAD-12 + 2,4-D Rango de (unidades) de trat media ± no pulv. Glufosinato + + Glufosinato referencia gen D.E. media ± media ± D.E. 2,4-D media ± D.E. [Min - Máx] (% de plantas emergidas) 2.3 2.3 [59.8 - 93] 2.3 [66 - 94.6] [63- [66.7 - (0.010,0.322) [55- (0.463, 0.905) 93.3] 92.4] 94.6] (0.127, (0.221, 0.559) 0.683) Vigor de la plántula - VC- 0.931 10 ±0.3 9 ±0.3 10 ±0.3 10 ±0.3 9 ±0.3 [8-10] V2 [7-10] [8-10] [8-10] [7-10] [7-10] (estimado visual de vigor; (0.623, (0.806, 0.919) (1.000, (0.462, 0.905) escala de 1-10, 0,905) 1.000) 10 = equivalente a no transformado) Población final - R8 0.250 152 ± 150 ± 19 145 ± 19 149 ± 19 153 ± 19 [5 - 203] (cantidad de plantas que 19 [9-196] [8-201] [14- [0-201] quedan en la parcela) [15- (0.659, (0070, 0.559) 198] (0.778, 0.905) 10 = equivalente a no transformado) Vigor/lesión de la planta - 0.201 10 ±0.2 10 ±0.2 10 ±0.2 10 ±0.2 10±0.2 [8-10] R1 [8-10] [9-10] [8-10] [9-10] [8-10] (Estimado visual de vigor; (0.725, (0.124, 0.559) (0.725, (0.276, 0.769) escala de 1-10, 0.905) 0.905) 10 = equivalente a no transformado) Vigor/lesión de la planta - 0.036 10 ±0.1 10 ±0.1 10±0.1 10 ±0.1 10± 0.1 [8-10] R2 [8-10] [9-10] [9-10] [8-10] [8-10] (Estimado visual de vigor; (0.762, (0.042, 0.559) (0.763, (0.036, 0.559) escala de 1-10, 0.905) 0.905) 10 = equivalente a no transformado) Hospedaje - R8 0.514 6±5 5±5 7±5 7±5 7±5 [0-20] (escala del 0-100%, [0 - 50] [0 - 50] [0 - 50] [0 - 60] [0-60] estimado visual en base a la (0.605, (0.354, 0.853) (0.522, (0.348, 0.853) cantidad de plantas huésped) 0,905) 0.905) Incidencia de enfermedad - R6 0.078 9±4 8±4 9±4 10 ±4 7±4 [0-25] (escala del 0-100%- [0-40] [0-40] [0-40] [0-40] [0 - 30] estimado visual de la enfermedad) (0.673, (0.833, (0.295, (0.061. 0.905) 0.919) .0:787).... 0.559) Daño causado por los insectos - 0.762 5±3 5±3 6±3 6±3 6±3 [0 - 30] R6 [0 - 30] [0-20] [0-30] [0 - 30] [0 - 30] (escala del 0-100% - (0.718, (0.425, (0.360, (0.235, estimado visual del daño causado 0.905) 0.905) 0.853) 0.683) por insectos) Altura de la planta 0.518 90 ±9 89 ±9 88 ±9 89 ±9 90 ±9 [32-140] (altura de la planta en cm [27- 140] [30-142] [21 - 142] [46-140] [48- 155] de 10 plantas por parcela) (0.620, (0.214, (0.767, (0.645, 0.905) 0.683) 0.905) 0.905) Días hasta la floración 0.441 958.8 ± 946.3 ± 962.9 ± 958.7 ± 962 ± [835.1 - (unidades de calor cuando el 50% de 30.9 30.9 30.9 30.9 30.9 1074] las plantas alcanza la floración) [835.1 - [835.1 - [859.7 - [835.1 - [835.1 - 1056] 1056] 1074] 1056] 1056] (0.203. (0.672, (0.987, (0.744, 0.683) 0.905) 1,000) 0.905) Dias hasta la madurez 0.124 2063.3 ± 2063.9 ± 2070.3 ± 2063.5 ± 2069.2 ± [1696- (unidades de calor cuando el 50% de 69.1 69.1 69.1 69.1 69.1 2290.8] las plantas alcanzan la madurez [1696- [1696- [1696- [1696 - [1696- fisiológica) 2272.4] 2272.4] 2272.4] 2272.4] 2272.4] (0.869, (0.052, (0.969, (0.098, 0.943) 0.559) 1,000) 0.559) Cantidad de vainas 0.356 254 ± 41 249 ± 41 273 ± 41 261 ± 41 258 ± 41 [107- (cantidad de vainas en 5 plantas) [137- [159- [155- [144- [154- 562] 460] 460] 490] 461] 440] (0.691, (0.123, (0.527, (0.747, 0.905) 0.559) 0.905) 0.905) Cantidad de semillas 0.324 642 ± 92 698 ± 92 704 ± 92 693 ± 92 667 ± 92 [321 - (cantidad de semillas en 5 plantas) [254- [406- [420- [472- [443- 1221] 1289] 1256] 1330] 1114] 1109] (0.102, (0.072, (0.136, (0.443, 0.559) 0.559) 0.559) 0.9O5) Rendimiento 0.742 2730 ± 2800 ± 2680 ± 2700 ± 2800 ± [1360- (gramos de semilla cosechada de la 310 310 310 310 310 4600] parcela entera) [1900- [1700- [1860- [1750- [1950- 4500] 4400] 4300] 4700] 4800] (0.503, (0.696, (0.829, (0.527, 0.905) 0.905) 0.919) 0,905) La unidad de medición no se convirtió antes del análisis.
Efecto de tratamiento general estimado usando una prueba F. 0 Comparación con el control usando pruebas t (valor P); los valores P ajustados (P aj.) usando un procedimiento de tasa de descubrimiento de falsedad (FDR); los valores P < 0.05 se consideraron significativos.
EJEMPLO 7.3 Evaluaciones ecológicas Se monitorearon los ensayos de campo del evento de soja DAS-68416-4 y fueron observados por personal familiar con las prácticas del cultivo de la soja (productores, administradores de campos, ingenieros agrónomos, encargados del campo). El personal que llevó a cabo las pruebas de campo monitoreó en forma visual la incidencia de las plagas y de las enfermedades de las plantas en los ejemplares del evento de soja DAS-68416-4 comparándolos con las variedades de soja convencionales en los mismos ensayos. Como parte del Experimento 1 descripto en el Ejemplo 7,1 , se calificó el daño provocado por enfermedades e insectos otorgándole una calificación numérica de 0% a 100%, siendo el 0% el daño debido a la incidencia de la enfermedad o la resistencia del insecto. El cuadro 15 muestra los resultados en los 6 lugares descriptos en el experimento 1.
CUADRO 15 Análisis de la incidencia de enfermedades y daño provocado por insectos a partir del Experimento 1 Sin Glufos¡nat2,4-D Ambos Efecto general pulverizar pulverizad pulverizado pulverizados del tratamiento (valor P,b (valor P, (valor P, (valor P, Analito (Pr>F)a Control P aj.)c aj.) aj.) P aj.) Enfermedad 0.422 13.1 12.6 11.8 11.1 10.1 Incidencia (%)e (0.803, (0.456, (0.251 , (0.091 , 0.575) 0.853) .....Mil) 0.575) Daño provocado por insectos6 ' 0.332 24.1 21.8 22.1 22.3 20.9 (0.140, (0.204, (0.236, (0.044, 0.575) 0.575) 0.575) 0.575) a Efecto del tratamiento general estimado mediante el uso de la prueba de Fisher.
Comparación de los tratamientos pulverizados y no pulverizados con el control mediante el uso de la prueba f. 0 Valores P ajustados mediante el uso del procedimiento de la tasa de falso descubrimiento (FDR). ' Estimado visual en escala de 0% a 100%; 0% = sin daño.
No se observaron diferencias estadísticas significativas para la incidencia de enfermedades. En cuanto al daño provocado por insectos, se observó una prueba t de pares significativa entre el control y el evento de soja DAS-68416-4 + ambos herbicidas. No obstante, no se observó un efecto del tratamiento general significativo, la diferencia entre el tratamiento del evento de soja DAS-68416-4 y el control fue muy pequeña, y las diferencias no fueron compartidas entre los diferentes tratamientos del evento de soja DAS-68416-4.
Asimismo, las observaciones ecológicas fueron realizadas desde todos los ensayos de campo notificados USDA APHIS realizados entre 2006 y 2009. La incidencia de enfermedades y la presencia de insectos en los ensayos de plantas del evento de soja DAS-68416-4 fueron registradas y se examinaron las diferencias de incidencia o respuesta de las plantas del evento de soja DAS- 68416-4 en comparación con el control convencional. En todos los casos, no se observaron diferencias en ninguno de los ensayos de plantas del evento de soja DAS-68416^4 en comparación con los controles convencionales. Los factores de estrés de enfermedades e insectos observados en los ensayos del evento de soja DAS-68416-4 y sojas convencionales se encuentran descritos en el cuadro 16. Estas observaciones apoyan la conclusión de que la respuesta del evento de soja DAS-68416-4 respecto de los factores de estrés ecológicos no difiere de la de la soja convencional.
CUADRO 16 Factores de estrés de enfermedades e insectos observados en ensayos de DAS-68416-4 y soia convencional.
EJEMPLO 7.4 Evaluaciones de germinación y latericia Los cambios en las características de latencia fueron evaluadas mediante la observación de la germinación de la semilla del evento de soja DAS-68416-4 en comparación con el comparador isogénico próximo según condiciones templadas y frías.
Para la prueba de germinación templada, se colocaron semillas de soja del evento DAS-68416-4 y de soja de control en 25 platos en placas de Petri que contenían bases de germinación saturadas con agua, a las que se les escurrió el exceso de agua. Se colocaron las placas a 25 °C y se las mantuvo bajo estas condiciones durante 5 días. Se prepararon dieciséis (16) placas (400 semillas) por cada hilera. Transcurridos los cinco días, se registró la cantidad de semillas sin germinar.
Para la prueba de germinación fría, se plantaron las semillas a razón de 100 semillas por cada semiplano relleno con tierra para macetas. Fueron regados con insuficiente agua y se los mantuvo a 10 °C durante 7 días seguido de una exposición a 25 °C durante 5 días, transcurridos los cuales se registró la cantidad de semillas sin germinar.
Se analizaron los datos de cada una de las pruebas mediante el análisis de varianza (ANOVA) utilizando un diseño completamente aleatorizado con cuatro réplicas de 100 semillas por cada réplica. Se transformaron los datos mediante el uso del arcoseno de la raíz cuadrada de la cantidad de semillas germinadas divididas por 100 para su análisis estadístico. El porcentaje de la germinación se encuentra resumido en el cuadro 17.
CUADRO 17 Germinación de las semillas del evento de soja DAS-68416-4 según Réplica Prueba Línea 1 2 3 4 Media templada DAS-68416^ 97 100 99 100 99.0 templada Control 100 100 99 97 99.0 fría DAS-68416-4 92 92 92 89 91.3 fría Control 98 88 98 96 95.0 No existieron diferencias significativas en la germinación entre la semilla del evento de soja DAS-68416-4 y la semilla de soja control ya sea en los experimentos de germinación templada o fría (Pr > F = 1.0 y 0,13, respectivamente). Estos resultados indican que las características de latencia de las semillas permanecieron intactas en el evento de soja DAS-68416-4.
EJEMPLO 7.5 Resumen de las características agronómicas, de enfermedades, plagas y germinación Los datos agronómicos que evalúan las características del desarrollo de las plantas en toda la temporada de crecimiento demuestran la equivalencia del evento de soja DAS-68416-4 con la soja no transgénica convencional. El desarrollo de la planta y las características fenotípicas, la respuesta a los factores de estrés ecológicos de acuerdo con lo indicado por la susceptibilidad a la presión por insectos y enfermedades y las características de germinación y latencia permanecieron intactas entre las plantas del evento de soja DAS-68416-4 y las sojas convencionales en los diversos entornos. Por lo tanto, estos datos apoyan la conclusión de que las características agronómicas, de enfermedades y plagas del evento de soja DAS-68416-4 no son significativamente diferentes de las de las sojas convencionales, y no hay ninguna indicación de que las sojas del evento de soja DAS-68416-4 presente un riesgo de plaga mayor.
Benjamini, Y., Hochberg, Y. (1995) Cómo controlar la tasa de falso descubrimiento: un abordaje práctico y eficaz a las pruebas múltiples ("Controlling the false discovery rate: A practical and powerful approach to múltiple testing"). J. Royal Statistical Soc. B, 57:289-300.
EJEMPLO 8 Composición de grano y forraje Se llevó a cabo un análisis de composición sobre forraje y grano de soja para investigar la equivalencia entre el evento de soja DAS-68416-4 (pulverizado con 2,4-D, glufosinato, 2,4-D + glufosinato, o sin pulverizar con 2,4-D o glufosinato) y soja convencional. Se llevaron a cabo los ensayos en seis (6) sitios ubicados dentro de las principales regiones productoras de soja de los Estados Unidos y Canadá mediante el uso de líneas de semillas con y sin el evento de soja DAS-68416-4. Los sitios de prueba representan regiones de diversas prácticas agronómicas y condiciones ambientales y fueron los mismos lugares empleados para expresión de proteínas descriptos en el Ejemplo 7,1 (referirse al análisis y agronomía del Experimento 1 ). Los ensayos se llevaron a cabo en lowa, Illinois, Indiana, Nebraska y Ontario, Canadá (2 sitios).
Las muestras de granos y forraje de soja fueron analizadas respecto del contenido de nutrientes con una variedad de pruebas. Los análisis llevados a cabo para el forraje incluían proteína, grasa, ceniza, humedad, hidratos de carbono, fibra detergente ácido (ADF), fibra detergente neutro (NDF), calcio y fósforo. Los análisis llevados a cabo para el grano incluían proximales (ceniza, cantidad total de grasas, humedad, proteína, colesterol, hidratos de carbono), fibra, minerales, aminoácidos, ácido grasos, vitaminas, antinutrientes.
Los resultados del análisis nutricional para el forraje y el grano de soja fueron comparados con valores informados en la literatura. El análisis de varianza también fue llevado a cabo en el campo mediante el uso de un modelo mixto. El ingreso fue considerado un efecto fijo, y la ubicación, el bloque dentro del lugar y la ubicación por cada entrada fueron designados como efectos aleatorios. Se calculó la importancia de un efecto del tratamiento general mediante una Prueba de Fisher. Se realizaron contrastes de pares entre el evento de soja DAS-68416-4 (sin pulverizar AAD-12; sin pulverizar con 2,4-D o glufosinato), evento de soja DAS-68416-4 pulverizado con glufosinato (evento de soja DAS-68416-4 + glufosinato), evento de soja DAS-68416-4 pulverizado con 2,4-D (evento de soja DAS-68416-4 + 2,4-D), y evento de soja DAS-68416-4 pulverizado con glufosinato y con entradas transgénicas de 2,4-D (evento de soja DAS-68416-4 + ambos), y la entrada de control mediante el uso de pruebas t.
Debido a la gran cantidad de contrastes realizados en este estudio, la multiplicidad fue un problema. La multiplicidad es un problema cuando se hace una gran cantidad de comparaciones en un solo estudio para buscar efectos no esperados. Según estas condiciones, la probabilidad de declarar diferencias falsas sobre la base de valores p en el sentido de la comparación es muy alta (1- 0 95cantidad de comparaciones) £n ^ estud¡0 nabía cuatr0 (4) comparaciones por cada analito (75 analitos cuantificados), lo que dio como resultado 300 comparaciones realizadas en el análisis de composición en el sitio. Por lo tanto, la probabilidad de declarar una o más diferencias falsas sobre la base de valores p no ajustados fue de >99,99%.
Un método para justificar la multiplicidad es el de ajustar los valores p con el fin de controlar la tasa de error en el sentido del experimento (la probabilidad de que todas las diferencias declaradas sean significativas), pero cuando se realizan muchas comparaciones en un estudio, la capacidad de detectar efectos específicos se ve reducida en forma significativa. Una alternativa con mucha mayor efectividad es la de ajustar los valores p con el fin de controlar la probabilidad de que cada diferencia declarada sea significativa. Esto puede lograrse mediante el uso de los procedimientos de la tasa de falso descubrimiento (FDR) (Benjamini y Hochberg, 1995). Por lo tanto, se ajustaron los valores p mediante el uso de FDR para mejorar la discriminación de verdaderas diferencias entre los tratamientos a partir de efectos aleatorios (positivos falsos).
EJEMPLO 8.1 Análisis de composición del forraje de soja Se llevó a cabo un análisis de proteína, grasa, ceniza, humedad, hidratos de carbono, fibra detergente ácido (ADF), fibra detergente neutro (NDF), calcio y fósforo en muestras de forraje de soja a partir del control, del evento de soja sin pulverizar DAS-68416-4, del evento de soja DAS-68416-4 + glufosinato, del evento de soja DAS-68416-4 + 2,4-D y del evento de soja DAS-68416-4 + ambos herbicidas. El cuadro 18 muestra un resumen de los resultados de todos los sitios.
No se observaron diferencias estadísticas en el análisis de sitios entre las entradas de control y las transgénicas respecto de proteína, grasa, ceniza, humedad, hidratos de carbono, ADF, NDF, calcio o fósforo. Loa valores promedio de la ceniza en los sitios para el evento de soja DAS-68416-4 + glufosinato y el evento de soja DAS-68416-4 + ambos herbicidas se encontraban fuera del ámbito de la literatura dado que se trataba del valor NDF para el evento de soja DAS-68416-4 + glufosinato y el evento de soja DAS-68416-4 + 2,4-D. Los valores de ADF para todos los tratamientos incluso el control no transgénico también se encontraban fuera de los valores de la literatura. Los valores promedio no resultaron significativamente diferentes entre el control no transgénico y ninguna entrada transgénica respecto de ninguna composición proximal, tipo de fibra o minerales en el forraje. Sobre la base de estos constituyentes de la composición, el forraje de la soja del evento de soja DAS-68416-4 resultó sustancialmente equivalente al del control no transgénico cuasiisogénico.
CUADRO 18 Resumen del análisis de la composición proximal. fibras v minerales del forraje de soja (% en peso en seco) Efecto general Sin Glufosinato 2,4-D Ambos Valores de del pulverizar pulverizado pulverizado pulverizados la tratamiento (valor P,° (valor P, (valor P, (valor P, Analito literatura8 (Pr F)b Control JL3L1 P aj ) P_§Li Composición proximal Proteína 11 ,2-24,7 0.805 19,1 19,0 19,4 18,9 18,6 (0.881 , 4, 0.860) __ __ 0.930) (0.666, 0.819) (0.74 (0.441 , 0.634) Grasas 1 ,30-5,1 0.046 4,11 4,46 3,66 4,17 3,74 de 59,8-74,7 0.675 66,2 66,5 65,9 66,7 65,3 carbono (0.830, (0.739, 0.860) (0.641 , 0.808) (0.366, 0.564) 0.902) Fibra Detergent 32,0- 0.967 30.2 30.4 30.6 29,7 30.7 e ácido 38,0 Fibra (0.904, (0.797, (0.746, (0.740, 0.860) (ADF) 0.936) 0.875) 0.860) Detergent 34,0- 0.375 34,4 34,7 33,1 32,0 34,5 e neutro 40.0 Fibra (0.877, (0.397, (0,135, (0.948, 0.962) (NDF) 0.930) 0.596) 0.297) Minerales Calcio NR 0.246 1 ,39 1 ,36 1 ,40 1 ,38 1 ,43 (0.361 , (0.664, (0.842, (0,178, 0.352) 0.560) 0.819) 0.908) Fósforo NR 0.957 0.263 0.266 0.269 0.266 0.265 NR = no reportados Los valores promedio resaltados se encuentran fuera del ámbito de la literatura informada.
Los valores P destacados son significativos (<0.05).
EJEMPLO 8.2 Análisis de composición del grano de soja EJEMPLO 8.2.1 Composición proximal y fibra Se llevó a cabo un análisis de proteína, grasa, ceniza, humedad, colesterol, hidratos de carbono, ADF, NDF y fibra dietaria total en muestras de grano de soja a partir del control, del evento de soja sin pulverizar DAS-68416-4, del evento de soja DAS-68416-4 + glufosinato, del evento de soja DAS-68416-4 + 2,4-D y del evento de soja DAS-68416-4 + ambos herbicidas. El cuadro 19 muestra un resumen de los resultados de todos los sitios.
No se observaron diferencias estadísticas en el análisis de los sitios entre el control las entradas transgénicas para grasa, ADF o fibra dietaria total. No obstante, la ADF resultó ligeramente más alta que lo mencionado en la literatura para el evento de soja DAS^68416-4 + la entrada 2,4-D.
Los niveles de proteína fueron significativamente diferentes en el análisis de los sitios sobre la base del valor P sin ajustar para el evento de soja sin pulverizar DAS-68416-4 + 2,4-D, y el evento de soja DAS-68416-4 + ambos herbicidas en comparación con el control. No obstante, después del ajuste de FDR, solo el valor P para el evento de soja DAS-68416-4 + 2,4-D fue significativo, y los valores de proteína promedio generales para todos los tratamientos se encontraron dentro de los valores informados por la literatura, lo que indica que las diferencias no eran significativas desde el punto de vista biológico.
Se observó un valor p sin ajustar significativo en el análisis de los sitios de la ceniza entre el control y tratamiento del evento de soja DAS-68416-4 pulverizado con 2,4-D, pero no se observó ningún efecto del tratamiento en general ni valor P ajustado. Asimismo, los valores de la ceniza se encontraban dentro de los valores de la literatura informada, lo que indica que las diferencias no eran significativas desde el punto de vista biológico.
Los niveles de humedad fueron significativamente diferentes en el análisis de los sitios sobre la base del valor P sin ajustar para el evento de soja sin pulverizar DAS-68416-4 + 2,4-D, y el evento de soja DAS-68416-4 + ambos herbicidas en comparación con el control. No obstante, el efecto del tratamiento en general no fue significativo para la humedad, solo el tratamiento del evento de soja DAS-684 6-4 + 2,4-D presentó un valor P ajustado de FDR significativo, y los niveles de humedad media para todos los tratamientos se encontraron dentro de los rangos mencionados por la literatura. Esto indica que las diferencias no eran significativas desde el punto de vista biológico.
Los valores de colesterol fueron todos inferiores al límite de cuantificación (<LOQ) y no se informaron valores de la literatura.
Los niveles de hidratos de carbono fueron significativamente diferentes en el análisis de los sitios sobre la base del valor P sin ajustar para el evento de soja sin pulverizar DAS-68416-4 + glufosinato, y el evento de soja DAS-68416-4 + 2,4-D en comparación con el control. No obstante, solo el tratamiento del evento de soja DAS-68416-4 + 2,4-D resultó ser significativamente diferente del control sobre la base del valor P ajustado de FDR y todas las medias del tratamiento se encontraban dentro de los valores informados por la literatura, lo que indica la equivalencia con la soja no transgénica.
Los niveles de NDF fueron significativamente diferentes en el análisis de los sitios sobre la base del valor P sin ajustar para el evento de soja DAS-68416— 4 + glufosinato en comparación con el control, pero esto no se vio acompañado por un valor P ajustado significativo ni un efecto general del tratamiento. Los valores de los sitios de NDF resultaron ligeramente mayores que los valores informados por la literatura para el evento de soja DAS-68416-4 + glufosinato y el evento de soja DAS-68416-4 + entradas de 2,4-D, pero las diferencias fueron del <9% en comparación con el control cuasiisogénico no transgénico.
Sobre la base de estos constituyentes de la composición, el grano de soja del evento de soja DAS-68416-4 resultó sustancialmente equivalente al de la soja no transgénica.
CUADRO 19 Resumen del análisis de la composición proximal y fibras del grano de soja (% en peso en seco) Efecto Ambos general Sin Glufosinato 2,4-D pulverizado Valores de del pulverizar pulverizado pulverizado s la tratamiento (valor P,c (valor P, (valor P, (valor P, Ana lito literatura8 (Pr>F)b Control P )d P aJ.) P aj.) P aj.) Composición proximal Proteína 32.0-45.5 0.004 39.2 38.3 38.8 37.8 38.5 (0.009, (0.186, (0.0003, (0.035, 0.051) 0.360) 0.009) 0.122) Grasas 8.10-24.7 0.105 17.1 17.1 16.6 16.7 17.2 (0.877, (0.059, (0,142, (0.674, 0.930) 0,169) 0.305) 0.819) Ceniza 3.89-6.99 0.315 4.92 5.04 5.04 5.10 5.07 (0.176, (0.175, (0.048, (0.099, 0.351) 0.351) 0.145) 0.240) Humedad 4.70-34.4 0.066 14.9 14.1 14.3 13.7 14.0 (% en peso (0.047, (0,122, (0.006, (0.037, fresco) 0.143) 0.276) 0.043) 0.124) Colesterol NR NA < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ Hidratos de 29.6-50.2 0.010 38.8 39.6 39.6 40.3 carbono 39.3 (0.046, (0.044, (0.001 , (0.241 , 0.143) 0.138) 0.011) 0.432) Fibra Detergente 7.81-18.6 0.561 17.8 17.6 18.0 18.8 18.1 ácido (0.899, (0.466, (0.286, dietaria (0.897, 0.936) 0.936) 0.653) 0.482) a Rango combinado. b Efecto del tratamiento general estimado mediante el uso de una prueba de Fisher. 0 Comparación de los tratamientos transgénicos con el control mediante el uso de pruebas f. d Valores P ajustados mediante el uso del procedimiento de la tasa de falso descubrimiento (FDR).
NA = el análisis estadístico no fue realizado dado que la mayoría de los datos era <LOQ.
NR = no reportados Los valores promedio resaltados se encuentran fuera del ámbito de la literatura informada.
Los valores P destacados son significativos (<0.05).
EJEMPLO 8.2.2 Minerales Se llevó a cabo un análisis de calcio, cromo, cobre, yodo, hierro, magnesio, manganeso, molibdeno, fósforo, potasio, selenio, sodio y cinc en muestras de grano de soja a partir del control, del evento de soja sin pulverizar DAS-68416-4, del evento de soja DAS-68416-4 + glufosinato, del evento de soja DAS-68416-4 + 2,4-D y del evento de soja DAS-68416-4 + ambos herbicidas. El cuadro 20 muestra un resumen de los resultados de todos los sitios.
No se observaron diferencias estadísticas en el análisis de los sitios entre el control y las entradas transgénicas sobre la base del valor P sin ajusfar para el cromo, cobre, yodo, hierro, manganeso, molibdeno, fósforo, selenio y sodio (no detectado).
El calcio tenía una diferencia significativa en el análisis de los sitios sobre la base del valor P sin ajustar para el evento de soja DAS-68416-4 + 2,4-D pero esto no estuvo asociado con un valor P ajustado de FDR ni con un efecto general del tratamiento, y todas las medias del tratamiento se encontraron dentro del rango presentado por la literatura, lo que indica que la diferencia no era significativa desde el punto de vista biológico.
Los niveles de magnesio resultaron significativamente diferentes en el análisis de los sitios para el evento de soja DAS-68416-4 + ambos herbicidas y el evento de soja DAS-68416-4 + glufosinato comparado con el control sobre la base de los valores P no ajustados y ajustados, respectivamente, pero el efecto general del tratamiento no fue significativo. Los valores promedio del magnesio en los sitios resultaron ligeramente más bajos que los valores informados por la literatura, pero las diferencias fueron pequeñas (<3%) en comparación con el control y todas las entradas del evento de soja DAS-684 6-4 estuvieron más próximas a los valores de la literatura en comparación con el control.
Todas las entradas del evento de soja DAS-68416-4 presentaron valores de potasio significativamente más altos en comparación con el control en el análisis de los sitios. No obstante, las diferencias resultaron pequeñas (<5%) en comparación con el control, y todas las entradas del evento de soja DAS-68416-4 estuvieron más próximas al rango de la literatura en comparación con el control.
Una diferencia en los niveles de cinc resultó significativa en el análisis de los sitios sobre la base del valor P sin ajustar para el evento de soja DAS-68416-4 + ambos herbicidas; no obstante, esto no se vio acompañado por un valor P ajustado de FDR ni un efecto general del tratamiento significativos, y la diferencia fue pequeña (<4%).
Sobre la base de estos constituyentes de la composición, el grano de soja del evento de soja DAS-68416-4 resultó sustancialmente equivalente al de la soja no transgénica.
CUADRO 20 Resumen del análisis mineral del grano de soja (mg/100 qr de peso en seco) Efecto Ambos general Sin Glufosinato 2,4-D pulverizado Valores de del pulverizar pulverizado pulverizado s la tratamiento (valor P,c (valor P, (valor P, (valor P, Analito literatura8 (Pr>F)b Control P aj.)d P aj.) P aj.) P aj.) Calcio 117-307 0.102 256 265 264 274 269 (0.437, (0.020, (0,143, (0.021 , 0.634) 0.087) 0.305) 0.088) Manganes NR 0.984 2.56 2.60 2.60 2.58 2.59 0 (0.608, (0.618, (0.781 , (0.698, 0.796) 0.799) 0.873) 0.831) olibdeno NR 0.845 2165 2557 2462 2563 2284 (0.353, (0.479, (0.346, (0.722, (PPb) 0.552) 0.665) 0.551) 0.853) Fósforo 507-935 0.675 583 589 599 596 594 (0.630, (0,191 , (0.272, (0.349, 0.804) 0.363) 0.469) 0.551) Potasio 1868-2316 0.0005 1801 1876 1882 1883 1864 (0.0003, (0.0001 , (0.0001 , (0.001 , 0.009) 0.006) 0.006) 0.019) Selenio NR 0.490 490 523 520) 511 418 (0.626, (0.659, (0.758, (0.280, (PPb) 0.802) 0.819) 0.861) 0.475) Sodio NR NA 20.9 < LOQ 17,3 19,7 14,1 Cinc NR 0.096 5.06 5.07 5.19 5.21 5.25 (0.868, (0,117, (0.074, (0.027, 0.926) 0.268) 0.197) 0.105) Rango combinado.
Efecto del tratamiento general estimado mediante el uso de una prueba de Fisher. c Comparación de los tratamientos transgénicos con el control mediante el uso de pruebas t. d Valores P ajustados mediante el uso del procedimiento de la tasa de falso descubrimiento (FDR).
NR = no reportados NA = el análisis estadístico no fue realizado dado que la mayoría de los datos era <LOQ. Los valores promedio resaltados se encuentran fuera del ámbito de la literatura informada. Los valores P destacados son significativos (<0.05).
EJEMPLO 8.2.3 Aminoácidos Se llevó a cabo un análisis de los siguientes aminoácidos: alanina, arginina, ácido aspártico, cistina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina; en muestras de grano de soja a partir del control, del evento de soja sin pulverizar DAS-68416-4, del evento de soja DAS-68416-4 + glufosinato, del evento de soja DAS-68416-4 + 2,4-D y del evento de soja DAS-68416-4 + ambos herbicidas. El cuadro 21 muestra un resumen de los resultados de todos los sitios.
No se observaron diferencias estadísticas entre el control y las entradas transgénicas para cistina, metionina, prolina, tirosina ni triptófano. El nivel de isoleucina para el evento de soja DAS-68416-4 + 2,4-D fue significativamente diferente del control sobre la base del valor P sin ajustar, pero esto no estuvo acompañado de un valor P ajustado de FDR significativo ni de un efecto general del tratamiento significativo. Los niveles de los 12 aminoácidos restantes resultaron ligeramente más bajos (<7%) para dos o más de las entradas del evento de soja DAS-68416-4 en comparación con el control, pero todas estuvieron dentro del rango de la literatura para la soja no transgénica. Todos los aminoácidos para todas las entradas resultaron dentro de los rangos presentados por la literatura, lo que indica que las diferencias no fueron significativas desde el punto de vista biológico. Sobre la base de estos constituyentes de la composición, el grano de soja del evento de soja DAS-68416-4 resultó sustancialmente equivalente al de la soja no transgénica.
CUADRO 21 Resumen del análisis de los aminoácidos del grano de soja (% en peso en seco) Efecto Ambos general Sin Glufosinato 2,4-D pulverizado del pulverizar pulverizado pulverizado s Valores de la tratamiento (valor P,c (valor P, (valor P, (valor P, Analito literatura" (Pr>F) Control P aj.)d P aj.) P aj.) P aj.) Alanina 1.51-2.10 0.003 1.74 1.70 1.70 1.69 1.71 tn CHA n nR7\ ??? n i aw (0.0004, (0.027, Prolina 1.69-2.28 0.374 1.91 1.85 1.88 1.87 1.87 (0.059, (0.400, (0,155, (0.240, 0.169) 0.597) 0.324) 0.432) Serina 1.11-2.48 0.063 1.99 1.95 1.95 1.91 1.93 (0.082, (0.115, (0.006, (0.021 , 0.210) 0.268) 0.043) 0.088) Treonina 1.14-1.89 0.001 1.62 1.57 1.58 1.55 1.57 (0.002, (0.008, (<0.0001 , (0.002, 0.020) 0.048) 0.006) 0.022) Triptófan 0.36-0.67 0.330 0.43 0.43 0.43 0.43 0.42 0 (0.593, (0.981 , (0.904, (0.095, 0.787) 0.981) 0.936) 0.235) Tirosina 1.02-1.61 0.449 1.36 1.34 1.35 1.33 1.33 (0.275, (0.517, (0.096, (0,153, 0.471) 0.708) 0.235) 0.321) Valina 1.50-2.44 0.159 1.97 1.92 1.94 1.92 1.95 (0.032, (0.279, (0.038, (0.346, 0.116) 0.475) 0.124) 0.551) á Rango combinado. b Efecto del tratamiento general estimado mediante el uso de una prueba de Fisher. c Comparación de los tratamientos transgénicos con el control mediante el uso de pruebas t. d Valores P ajustados mediante el uso del procedimiento de la tasa de falso descubrimiento (FDR).
Los valores promedio resaltados se encuentran fuera del ámbito de la literatura informada.
Los valores P destacados son significativos (<0.05).
EJEMPLO 8.2.4 Ácidos grasos Se llevó a cabo un análisis de 22 ácidos grasos en muestras de grano de soja a partir del control, del evento de soja sin pulverizar DAS-68416-4, del evento de soja DAS-68416-4 + glufosinato, del evento de soja DAS-68416-4 + 2,4-D y del evento de soja DAS-68416-4 + ambos herbicidas. El cuadro 22 muestra un resumen de los resultados de todos los sitios.
Se analizaron los ácidos grasos 10:0 cáprico, 15:0 pentadecanoico, 15:1 pentadecenoico, 20:3 eicosatrienoico, 20:4 araqu¡dónico, 8:0 caprílico, 12:0 láurico, 14:0 mirístico, 14:1 miristoleico, 17:1 heptadecenoico, 18:3 gama linolénico y 20:2 eicosadienoico, y los resultados fueron <LOQ. Los ácidos grasos 16:0 palmítico, 17:0 heptdecanoico y 20:1 eicosenoico no resultaron ser significativamente diferentes entre el control y las entradas de AAD-12, aunque los valores del eicosenoico fueron más bajos que los valores informados por la literatura para AAD-12 + glufosinatoy AAD-12 + ambos herbicidas. No obstante, las diferencias fueron pequeñas (<5%) en comparación con el control.
El nivel de ácido palmitoleico 16:1 fue significativamente diferente entre el control y el evento de soja DAS-68416-4 sin pulverizar, el evento de soja DAS-68416-4 + glufosinato, el evento de soja DAS-68416-4 + 2,4-D y el evento de soja DAS-68416-4 + ambos herbicidas sobre la base de valores P sin ajustar. No obstante, solo la entrada del evento de soja sin pulverizar DAS-68416-4 presentó un valor P ajustado de FDR que era significativo para el ácido palmitoleico 16:1. El valor del ácido palmitoleico 16:1 de los sitios resultó más bajo para este tratamiento en comparación con los valores informados por la literatura, pero la diferencia era pequeña (<13%) en comparación con el control cuaslisogénico.
El nivel de ácido esteárico 18:0 era significativamente diferente entre el control y el evento de soja sin pulverizar y pulverizado DAS-68416-4 + glufosinato, sobre la base de valores P sin ajustar. No obstante, no se observaron diferencias significativas sobre la base de los valores P ajustados ni el efecto general del tratamiento, y todas las entradas se encontraron dentro de los valores informados por la literatura, lo que indica la equivalencia con la soja no transgénica.
El nivel de ácido oleico 18:1 fue significativamente diferente entre el control y el evento de soja DAS-68416-4 sin pulverizar, el evento de soja DAS-68416-4 + glufosinato, el evento de soja DAS-68416-4 + 2,4-D y el evento de soja DAS-68416-4 + ambos herbicidas. No obstante, los niveles de ácido oleico 18:1 estaban dentro de los valores informados por la literatura para todos los tratamientos, lo que indica la equivalencia con la soja no transgénica.
El nivel de ácido linoleico 18:2 era significativamente diferente entre el control y el evento de soja sin pulverizar y pulverizado DAS-68416-4 + 2,4-D, sobre la base de valores P sin ajustar. No obstante, no se observaron diferencias significativas en los valores P ajustados ni en el efecto general del tratamiento, y los niveles de ácido linoleico 18:2 se encontraron dentro de los valores informados por la literatura para todos los tratamientos, lo que indica la equivalencia con la soja no transgénica.
Los niveles de ácido linolénico 18:3 fueron significativamente diferentes entre cada una de las entradas del evento de soja DAS-68416-4 y el control sobre la base de los valores P sin ajustar, y los valores P ajustados también fueron significativos entre el evento de soja sin pulverizar DAS-68416-4 y el tratamiento del evento de soja DAS-68416-4 + ambos herbicidas en comparación con el control. No están disponibles valores en la literatura para el ácido linolénico 18:3; sin embargo, las diferencias entre el evento de soja DAS-68416-4 y el tratamiento de control fueron pequeñas (<6%).
El nivel del ácido araquídico 20:0 resultó significativamente diferente entre el control y el evento de soja sin pulverizar DAS-68416-4, el evento de soja DAS-68416-4 + glufosinato, el evento de soja DAS-68416-4 + 2,4-D, el evento de soja DAS-68416-4 + ambos herbicidas sobre la base de valores P sin ajusfar, y el ácido araquídico 20:0 también presentó diferencias significativas en el análisis de los sitios en el valor P ajustado para el evento de soja sin pulverizar DAS-68416-4 + los tratamientos de glufosinato. No obstante, los niveles de ácido araquídico 20:0 estaban dentro de los valores informados por la literatura para todos los tratamientos, lo que indica la equivalencia con la soja no transgénica.
El nivel del ácido behénico 22:0 resultó significativamente diferente entre el control y el evento de soja sin pulverizar DAS-68416-4 + glufosinato, el evento de soja DAS-68416-4 + 2,4-D, el evento de soja DAS-68416-4 + ambos herbicidas sobre la base de valores P sin ajustar, y el ácido behénico 22:0 también presentó una diferencia significativa en el análisis de los sitios en el valor P ajustado para el evento de soja DAS-68416-4 + glufosinato. No obstante, no existe un efecto general del tratamiento significativo, y los niveles de ácido behénico 22:0 se encontraban dentro de los valores informados por la literatura para todos los tratamientos, lo que indica la equivalencia con la soja no transgénica.
De los 22 ácidos grasos investigados, las cuatro (4) entradas del evento de soja DAS-68416-4 fueron incapaces de ser distinguidas en términos estadísticos a partir del control o dentro de los valores de la literatura para 21 de los ácidos grasos. En un caso (evento de soja sin pulverizar DAS-68416-4; ácido palmitoleico 16,1 ), el valor resultó estar ligeramente por debajo de los valores mínimos de la literatura y diferentes en términos estadísticos a partir del control (<13% más bajo), no obstante, los tres (3) tratamientos pulverizados se encontraron dentro del rango de la literatura. Sobre la base de estos constituyentes de la composición, el grano de soja del evento de soja DAS-68416-4 resultó sustancialmente equivalente al de la soja no transgénica.
CUADRO 22 Resumen del análisis de los ácidos grasos del grano de soja í% de ácidos grasos totales) Glufosinato 2,4-D Ambos Efecto general Sin pulverizar pulverizado pulverizado pulverizados Valores de la del tratamiento (valor P,c (valor P, (valor P, (valor P, Á. mirístico 14:0 0.07-0.24 NA <LOQ < LOQ < LOQ <LOQ <LOQ Á. miristoleico 14:1 0.12-0.13 NA <LOQ < LOQ <LOQ <LOQ <LOQ Á. pentadecanoico 15:0 NR NA <LOQ < LOQ LOQ <LOQ < LOQ Á. pentadecenoico 15:1 NR NA <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ Á. palmltico 16:0 9.55-15.77 0.607 10.1 10.0 9.78 9.94 9.85 (0.625, 0.802) (0.148, 0.313) (0.455, 0.644) (0.249, 0.441) A. palmitoleíco 16:1 0.09-O.19 0.029 0.097 0.085 0.088 0.087 0.089 (0.003, 0.028) (0.038, 0.124) (0.027, O! 105) (0.029, 0.109) A. heptadecanoico 17:0 0.09-0.15 0.640 0.111 0.114 0.113 0.114 0.113 (0.162, 0.336) (0.331,0.539) (0.239, 0.432) (0.296, 0.493) A. heptadecenoico 17:1 0.07-O.09 NA <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ < LOQ A. esteárico 18:0 2.70-5.88 0.136 4.28 4.03 3.98 4.05 4.06 (0.048, 0.145) (0.018, 0.081) (0.060, 0.169) (0.073, 0.196) A. oleico 18:1 14.3-32.2 0.010 21.8 19.8 19.5 19.9 19.9 (0.004, 0.033) (0.001,0017) (0.006, 0.043) (0.006, 0.043) A. linoleico 18:2 42.3-58.8 0.145 50.3 52.5 51.9 52.6 52.0 (0.030, 0.109) (0,116, 0.268) (0.024, 0.095) (0.087, 0.222) Á. Y-linolénico 18:3 3.00-12.52 NA <LOQ < LOQ < LOQ <LOQ <LOQ A. linolénico 18:3 NR 0.022 7.83 8.23 8.15 8.10 8.21 (0.003, 0.031) (0.016, 0.073) (0.034, 0,119) (0.004, 0.034) A. araquídico 20:0 0,16-0.48 0.023 0.307 0.284 0.282 0.285 0.287 (0.007, 0.045) (0.004, 0.033) (0.009, 0.052) (0.014, 0.067) A. eicosenoico 20:1 0,14-0.35 0.683 0.143 0.140 0.136 0.141 0.138 (0.582, 0.779) (0.201,0.380) (0.794, 0.875) (0.327, 0.538) A. eicosadienoico 20:2 O.08-O.25 NA <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ A. eicosatrienoico 20:3 NR NA <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ A. araquidónico 20:4 NR NA <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ A. behénico 22:0 0.28-0.60 0.053 0.305 0.288 0.285 0.288 0.288 (0.023, 0.095) (0.008, 0.048) (0.020, 0.087) (0.020, 0.087) 8 Rango combinado. b Efecto del tratamiento general estimado mediante el uso de una prueba de Fisher. c Comparación de los tratamientos transgénicos con el control mediante el uso de pruebas t. ú Valores P ajustados mediante el uso del procedimiento de la tasa de falso descubrimiento (FDR).
NA = el análisis estadístico no fue realizado dado que la mayoría de los datos era <LOQ.
NR = no reportados Los valores promedio resaltados se encuentran fuera del ámbito de la literatura informada.
Los valores P destacados son significativos (<0.05).
EJEMPLO 8.2.5 Vitaminas Se llevó a cabo un análisis de vitaminas en muestras de grano de soja a partir del control, del evento de soja sin pulverizar DAS-68416-4, del evento de soja DAS-68416-4 + glufosinato, del evento de soja DAS-68416-4 + 2,4-D y del evento de soja DAS-68416-4 + ambos herbicidas. El cuadro 23 muestra un resumen de los resultados de todos los sitios.
No se encontraron valores en la literatura para beta-tocoferol, delta-tocoferol, gama-tocoferol, vitamina A, vitamina B5, vitamina B6, vitamina B12, vitamina C, vitamina D y niacina en granos de soja. El beta-tocoferol, la vitamina A, la vitamina B12 y la vitamina D todas eran <LOQ. No se observaron diferencias entre el control, AAD-12 sin pulverizar y AAD-12 tratado para vitamina B1 , vitamina B2, vitamina B6, vitamina C, vitamina E ni niacina. De esas vitaminas con rangos disponibles en la literatura, todos los tratamientos se encontraron dentro de estos rangos con la excepción de la vitamina B2, donde los valores excedieron el rango para todos los tratamientos, incluso el control cuasüsogénico.
Los niveles de delta-tocoferoles fueron significativamente diferentes entre el control y el evento de soja DAS-68416-4 + glufosinato y el evento de soja DAS-68416-4 + entradas de 2,4-D sobre la base de valores P sin ajustar. No obstante, esto no se vio acompañado de un valor P ajustado significativo ni de un efecto general del tratamiento significativo. El gama-tocoferol era significativamente diferente entre el control y el evento de soja sin pulverizar y pulverizado DAS-68416-4 + entradas de 24-D, sobre la base de valores P sin ajustar y ajustados. No obstante, el gama-tocoferol era <11 % más alto para los tratamientos del evento de soja DAS-68416-4 en comparación con el control cuasüsogénico.
Los niveles de vitamina B5 resultaron significativamente diferentes entre el control y el evento de soja DAS-68416-4 + entrada de glufosinato sobre la base del valor P ajustado. No obstante, esto no se vio acompañado de un efecto general del tratamiento significativo.
El ácido fólico fue significativamente diferente entre el control y el evento de soja DAS-68416-4 sin pulverizar + 2,4-D y el evento de soja DAS-68416-4 + ambos herbicidas sobre la base de valores P sin ajustar. El ácido fólico también presentó diferencias significativas en los valores P ajustados para dos de las entradas del evento de soja DAS-68416-4 en comparación con el control. No obstante, los niveles de ácido fólico se encontraron dentro de los valores informados por la literatura para todos los tratamientos y las entradas del evento de soja DAS-68416-4 difirieron del control cuasüsogénico en un <9%, lo que indica la equivalencia con la soja no transgénica.
Sobre la base de estos constituyentes de la composición, el grano de soja del evento de soja DAS-68416-4 resultó sustancialmente equivalente al de la soja no transgénica.
CUADRO 23 Resumen del análisis de vitaminas del grano de soja (mg/kg de peso en seco).
Efecto general Glufosinato Ambos Ambos Valores de del Sin pulverizar pulverizado pulverizados pulverizados la tratamiento (valor P,c (valor P, (valor P, (valor P, Analito literatura3 (Pr>F)b Control P aj.)d P aj.) P aj.) P aj.) Beta caroteno NR NA < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ (Vitamina A) Vitamina B1 1.01-2.54 0.560 2.10 2.14 1.94 1.97 2.14 (Tiamina) (0.809, 0.886) (0.312, 0.517) (0.414, 0.615) (0.787, 0.873) Vitamina B2 1.90-3.21 0.994 4.49 4.52 4.60 4.52 4.55 (Riboflavina) (0.933, 0.952) (0.677, 0.819) (0.922, 0.948) (0.817, 0.891) Vitamina B3 NR 0.211 27.4 25.3 25.4 26.9 26.7 (Niacina) (0.060, 0.169) (0.076, 0.201 ) (0.698, 0.831 ) (0.513, 0.708) Vitamina B5 NR 0.183 15.1 14.9 14.2 14.5 14.3 (Ácido pantoténico) (0.601 , 0.794) (0.041 , 0.134) (0,170, 0.350) (0.065, 0.178) Vitamina B6 NR 0.788 5.50 5.51 5.40 5.40 5.39 (Piridoxina) (0.929, 0.951 ) (0.439, 0.634) (0.451 , 0.642) (0.420, 0.620) Vitamina B12 NR NA < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ Vitamina C NR 0.338 84.1 79.6 85.4 82.5 83.5 (0,126, 0.281 ) (0.639, 0.808) (0.580, 0.779) (0.838, 0.907) Vitamina D NR NA < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ Vitamina E 1.90-61.7 0.182 14.8 15.1 14.5 15.9) 14.3) (Alfa tocoferol) (0.762, 0.863) (0.61 1 , 0.796) (0,137, 0.301 ) (0.439, 0.634) Beta tocoferol NR NA < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ Delta tocoferol NR 0.095 92.6 95.1 96.5 97.1 94.5 (0.142, 0.305) (0.030, 0.109) (0.013, 0.067) (0.257, 0.446) Gama tocoferol NR 0.0004 153 164 158 169 157 (0.002, 0.021) (0.117, 0.268) (0.0005, 0.006) (0.174, 0.351) Acido fólico 2.39-4.71 0.006 3.70 3.49 3.56 3.38 3.48 (0.011 , 0.060) (0.078, 0.203) (0.0004, 0.009) (0.008, 0.048) Rango combinado. b Efecto del tratamiento general estimado mediante el uso de una prueba de Fisher. c Comparación de los tratamientos transgénicos con el control mediante el uso de pruebas f.
" Valores P ajustados mediante el uso del procedimiento de la tasa de falso descubrimiento (FDR).
NR = no reportados NA = el análisis estadístico no fue realizado dado que la mayoría de los datos era <LOQ.
Los valores promedio resaltados se encuentran fuera del ámbito de la literatura informada.
Los valores P destacados son significativos (<0.05).
EJEMPLO 8.2.5 Isoflavonas Se llevó a cabo un análisis de isoflavonas en muestras de grano de soja a partir del control, del evento de soja sin pulverizar DAS-68416-4, del evento de soja DAS-68416-4 + glufosinato, del evento de soja DAS-68416-4 + 2,4-D y del evento de soja DAS-68416-4 + ambos herbicidas. El cuadro 24 muestra un resumen de los resultados de todos los sitios.
Los resultados de la genisteína y la gliciteína se encontraron por debajo de LOQ para las muestras tratadas. Los niveles de diadzeína resultaron significativamente diferentes entre el control y el evento de soja DAS-68416-4 + las entradas de ambos herbicidas sobre la base de los valores P sin ajusfar y ajustados. No obstante, el efecto general del tratamiento no fue significativo. Aunque no existen valores informados por la literatura, el evento de soja DAS-68416-4 + el tratamiento de ambos herbicidas difirió en <9% del control cuasiisogénico. Los niveles de genistina resultaron significativamente diferentes entre el control y el evento de soja DAS-68416-4 + las entradas de ambos herbicidas sobre la base de los valores P sin ajustar y ajustados. No obstante, el efecto general del tratamiento no fue significativo. Los valores de la genistina para todos los tratamientos fueron más altos que los valores informados por la literatura, pero los tratamientos del evento de soja DAS-68416-4 difirieron en <9% en comparación con el control cuasiisogénico. Los niveles de glicitina resultaron significativamente diferentes entre el control y el evento de soja DAS-68416-4 + ambos herbicidas sobre la base de los valores P sin ajustar y ajustados. Si bien no existieron valores informados por la literatura para la glicitina, todas las entradas del evento de soja DAS-68416-4 fueron del <13% en comparación con la entrada cuasiisogénica.
Sobre la base de estos constituyentes de la composición, el grano de soja del evento de soja DAS-68416-4 resultó sustancialmente equivalente al de la soja no transgénica.
CUADRO 24 Resumen del análisis de isoflavonas del grano de soja íuq/qr) Efecto general Sin Glufosinato Am os Ambos Valores de del pulverizar pulverizado pulverizado pulverizados la tratamiento (valor P,c (valor P, (valor P, (valor P, Analito literatura" (Pr>F) Control P aj.)d P aj.) aj.) aj.) Daidzelna 60.0-2454 NA 19.2 31.2 14.8 13.0 < LOQ Daidzina NR 0.068 1085 1103 1112 1128 1179 Glicitelna 15,3-1070 NA < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ Glicitina NR 0.032 253 267 270 268 285 NR = no reportados Los valores promedio resaltados se encuentran fuera del ámbito de la literatura informada.
Los valores P destacados son significativos (<0.05).
EJEMPLO 8.2.5 Antinutrientes Se llevó a cabo un análisis de antinutrientes en muestras de grano de soja a partir del control, del evento de soja sin pulverizar DAS-68416-4, del evento de soja DAS-68416-4 + glufosinato, del evento de soja DAS-68416-4 + 2,4-D y del evento de soja DAS-68416-4 + ambos herbicidas. El cuadro 25 muestra un resumen de los resultados de todos los sitios.
No se observaron diferencias estadísticas entre el control y las entradas transgénicas para lectina, ácido fitico o inhibidor de tripsina. Estos tres (3) antinutrientes también se encontraban dentro de los rangos de la literatura, lo que indica la equivalencia con la soja no transgénica.
La rafinosa resultó significativamente más baja (<10%) para el evento de soja DAS-68416-4 + tratamiento de glufosinato en comparación con el control sobre la base de valores P sin ajustar. La rafinosa no fue significativamente diferente en el análisis de los sitios sobre la base del valor P ajustado o el efecto general del tratamiento. Los niveles de rafinosa también estaban dentro de los valores informados por la literatura para todos los tratamientos, lo que indica la equivalencia con la soja no transgénica.
La estaquiosa resultó significativamente diferente entre el control y el evento de soja DAS-68416-4 + entrada de glufosinato sobre la base del valor P sin ajustar. Los niveles de estaquiosa no fueron significativamente diferentes en el análisis de los sitios sobre la base del valor P ajustado o el efecto general del tratamiento. Los niveles de estaquiosa también estaban dentro de los valores informados por la literatura para todos los tratamientos, lo que indica la equivalencia con la soja no transgénica.
Los análisis de antinutrientes para la lectina, ácido fitico, rafinosa, estaquiosa y el inhibidor de tripsina se encontraban todos dentro de los valores informados por la literatura, y las dos diferencias significativas sobre la base de los valores P sin ajustar presentaron niveles más bajos de a nti nutrientes para los tratamientos del evento de soja DAS-68416-4 en comparación con el control.
Sobre la base de estos constituyentes de la composición, el grano de soja del evento de soja DAS-68416-4 resultó sustancialmente equivalente al de la soja no transgénica.
CUADRO 25 Resumen del análisis de los antinutrientes del grano de soia f% en peso en seco) Efecto Valores general Sin Glufosinato 2,4-D Ambos de la del pulverizar pulverizado pulverizado pulverizados literatura tratamiento (valor P,° (valor P, (valor P, (valor P, a Analito (Pr>F)b Control P aj.)d P aj.) P aj.) P aj.) Lectina 0.11-9.04 0.552 2.18 2.74 2.84 2.98 3.09 " Efecto del tratamiento general estimado mediante el uso de una prueba de Fisher. c Comparación de los tratamientos transgénicos con el control mediante el uso de pruebas f. d Valores P ajustados mediante el uso del procedimiento de la tasa de falso descubrimiento (FDR).
Los valores promedio resaltados se encuentran fuera del ámbito de la literatura informada.
Los valores P destacados son significativos (<0.05).
EJEMPLO 8.3 Resumen de la composición de grano y forraje La composición del evento de soja DAS-68416-4 fue incapaz de ser distinguida en términos estadísticos a partir de la línea cuasiisogénica, difirió en un <13% de la línea cuasiisogénica o se encontró dentro del rango de la literatura para la soja no transgénica. De esta forma, se descubrió que el evento de soja DAS-68416-4 era sustancialmente equivalente a la soja no transgénica. Las parcelas de los resultados de la composición no indican ninguna diferencia en la composición relacionada con el tratamiento significativa desde el punto de vista biológico entre el evento de soja sin pulverizar DAS-68416-4, el evento de soja DAS-68416-4 + glufosinato, el evento de soja DAS-68416-4 + 2,4-D y el evento de soja DAS-68416-4 + la línea se soja y la línea de soja de control. En conclusión, el evento de soja sin pulverizar DAS-68416-4, el evento de soja DAS-68416-4 + glufosinato, el evento de soja DAS-68416-4 + 2,4-D y el evento de soja DAS-68416-4 + los resultados de la composición confirman la equivalencia del evento de soja DAS-68416-4 y la soja convencional.
EJEMPLO 9 Aplicaciones de quema preplanta (Preplant Burndown) y ensayos de pre- emergencia Este ejemplo provee ejemplos específicos de nuevos usos de herbicidas que se hacen posibles mediante la presente invención.
Las aplicaciones de herbicidas de quema preplanta tienen como objetivo matar malezas que emergieron durante el invierno o en la primavera temprana antes de la plantación de un cultivar dado. Típicamente estas aplicaciones se aplican en un sistema de manejo sin volteo o de volteo reducido donde la remoción física de malezas no se completa antes del plantado. Por lo tanto, un programa de herbicidas debe controlar un amplio espectro de malezas de hoja ancha y angosta presentes al momento de plantar.
Glifosato, gramoxona, y glufosinato son ejemplos de herbicidas no-selectivos, no-residuales utilizados ampliamente para aplicaciones de quema preplanta. Algunas malezas, sin embargo, son difíciles de controlar a esta altura de la temporada debido a uno o más de lo siguiente: insensibilidad inherente de las especies de malezas o biotipo al herbicida, maleza de tamaño relativamente grande de malezas anuales de invierno, y condiciones de clima frío que limitan la toma y actividad del herbicida. Hay disponibles varias opciones de herbicidas para mezclar y aumentar el espectro y actividad sobre las malezas cuando los herbicidas no-selectivos son débiles. Un ejemplo sería aplicaciones de mezclas de 2,4-D con glifosato para asistir en el control de Conyza canadensis (horseweed). El glifosato puede usarse de 420 to 1680 g ae/ha, más típicamente 560 a 840 g ae/ha, para el control de quema preplanta de la mayoría de las malezas presentes; sin embargo, pueden aplicarse 280 - 1 120 g ae/ha de 2,4-D para ayudar al control de muchas especies de malezas de hoja ancha, (por ej., horseweed). 2,4-D es un herbicida de elección porque es efectivo sobre un muy amplio rango de malezas de hoja ancha, es efectivo aún a bajas temperaturas y extremadamente barato. Sin embargo, si el cultivo que se plantará es una dicotiledónea sensible, el residuo de 2,4-D en el suelo (aunque tiene una vida corta) pueden impactar negativamente en el cultivo. Los cultivos que contienen un gen aad-12 son tolerantes al 2,4-D y no son imopactados negativamente por los residuos de 2,4-D en el suelo. La flexibilidad aumentada y el costo reducido de las mezclas (o premezclas comerciales) mejorarán las opciones para el control de malezas y aumentarán la robustez de las aplicaciones de quema en ¡mpartantes situaciones de volteo reducido o sin volteo.
Las aplicaciones de preemergencia de 2,4-D amina se aplican a velocidades de 1120, 2240, 4480 g ae/ha a 7 días, 15 días o 30 días antes del plantado de soja conteniendo el gen aad-12 (Evento DAS-68416-4) y la soja control. Las aplicaciones de preemergencia se realizan utilizando procedimientos reconocidos en el arte sobre parcelas que se encuuentran localizadas geográficamente en distintas ubicaciones. Las parcelas tratadas con herbicida se comparan con parcelas no tratadas para proporcionar una evaluación adecuada del crecimiento temprano y de emergencia. Después del plantado y de las aplicaciones de 2,4-D a 7, 15 or 30 días antes del plantado, se mide el daño de la soja conteniendo el gen aad-12 (Evento DAS-68416-4) y de la soja control. Los resultados de la evaluación a campo indican que la soja que contiene el gen aad-12 (Evento DAS-68416-4) proporciona tolerancia robusta de los tratamientos de preemergencia de 2,4-D herbicida a 7, 15, o 30 días antes del preplantado.
Estos ejemplos son unas pocas de las muchas opciones que están disponibles. Los expertos en el arte del control de malezas notarán una variedad de otras aplicaciones incluyendo, pero sin limitarse a gramoxona + 2,4-D o glufosinato + 2,4-D utilizando los productos descriptos en las etiquetas federales de herbicidas (CPR, 2003) y los usos descriptos en Agriliance Crop Protection Guide (2003), por ejemplo. Las personas normalmente versadas en la materia también reconocerán que el ejemplo anterior puede aplicarse a cualquier planta sensible a 2,4-D-sensitive (u otro herbicida fenoxi auxina) que sería protegido por el gen AAD-12 si se lo transforma de manera estable.
Las plantas de soja DAS-68416-4 son tolerantes al herbicida 2,4-D. Este ejemplo informa la caracterización de la tolerancia a herbicida de la soja DAS-68416-4 bajo condición de campo libre. Las plantas de soja DAS-68416-4 se evaluaron para determinar la tolerancia al herbicida 2,4-D en ensayos de campo libre llevados a cabo en los Estados Unidos. Para las plantas de soja DAS-68416-4, los índices máximos de aplicación propuestos serán 1 120 g ae/ha para 2,4-D. Los datos explicados más abajo indican que las plantas de soja DAS-68416-4 proveen tolerancia aceptable a índices de al menos cuatro veces estos índices de uso máximos propuestos.
La eficacia de la soja DAS-68416-4 para la detoxificación de 2,4-D y la subsiguiente protección del daño causado por este compuesto se caracterizó en estudios de campo libre. Se diseñaron ensayos para evaluar la tolerancia de preemergencia a 2,4-D. Los ensayos de preemergencia se llevaron a cabo como un diseño en bloque completo al azar. Las unidades experimentales consistían de parcelas de dos filas para ensayos de preemergencia, aproximadamente 3 m de longitud y todos los ensayos contenían tres réplicas. Todas las aplicaciones de herbicida se realizaron con un equipo de atomización para parcela pequeña de gas presurizado suministrando aproximadamente 140 - 190 l/ha de volumen de atomización. La formulación de 2,4-D usado fue una sal de dimetilamonio de 456 g ae/litro. Se tomaron índices de daño visual aproximadamente 7 días después de la emergencia del cultivo. Los índices se tomaron sobre una escala 0 a 100 que refleja una composición visual de todos los síntomas de daño observados en todas las plantas en una parcela, con 0 = sin daño al comparar con parcelas no tratadas y 100 = muerte de todas las plantas.
Los ensayos de preemergencia consistieron en 1 120, 2240 y 4480 g ae/ha aplicados luego de la plantación pero antes de la emergencia del cultivo. La información con respecto a los ensayos de preemergencia se presenta en el cuadro 26.
CUADRO 26 Información del sitio y tratamiento para ensayos de tolerancia a 2,4-D en preemergencia Fecha Fecha Precipit.
Ensayo de de (día DAS Tipo de % plantac aplicac luego de Cant.. No. Ciudad Estado suelo Ph OM ión ión la api.) (cm) DCR08 Rose- 20/05/2 23/05/2 23 mount N ADOBE 6.9 4.3 008 008 5.0 0.3 DMS08 ARENO29/05/2 29/05/2 28 Fowler IN SO C. L. 5.8 .4 008 008 1.0 5.6 JSR08 Green- ADOBE 09/05/2 09/05/2 03 ville MS LODOSO 7.8 2.0 008 008 1.0 0.6 En resumen, se llevaron a cabo evaluaciones de campo de la tolerancia a 2,4-D. Se llevaron a cabo estudios de examinación de la respuesta de plantas de soja DAS-68416-4 y plantas de soja Maverick no transformadas a aplicaciones de 2,4-D amina preemergencia en localidades de Mississippi, Indiana y Minnesota. Se promediaron las tres localidades, la aplicación de preemergencia de 2,4-D amina a DAS-68416-4 dio como resultado un daño <2% sin tener en cuenta el índice de aplicación (Cuadro 27). Los mismos tratamientos causaron un daño del 34 al 60% en Maverick no transformadas. El daño de las aplicaciones de preemergencia de 2,4-D consistió en pérdida de posición y reducción en el crecimiento.
CUADRO 27 Tolerancia de la soia DAS-68416-4 a aplicaciones de preemergencia de 2.4-D. ae/ha = equivalente ácido/hectárea b Estadio de aplicación en términos de desarrollo del crecimiento de la planta de soja. c Medios dentro de cada columna seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes tal como se determinó por los métodos de probabilidad máxima restringida para modelos mixtos y ensayo Tukey, o para datos no equilibrados, ensayo Tukey-Kramer HSD (0.05). ns indica sin diferencias significativas.
EJEMPLO 10 Métodos de control de malezas v hierbas resistentes al glifosato mediante el uso de un qlifosato Gen de torelancia + Evento soja DAS-68416-4 en combinación El glifosato se usa de manera extensa porque controla un amplio espectro de especies de maleza y de hoja ancha. Sin embargo, el uso repetido de glifosato en GTCs y en aplicaciones que no son de cultivo ha, y continuará para, seleccionar cambios de malezas para especies naturalmente más tolerantes o biotipos resistentes al glifosato. La mezcla en tanque de más de un herbicida usada en tasas eficaces que ofrecen control de las mismas especies pero que tienen diferentes modos de acción se recomienda para la mayoría de las estrategias de resistencia al herbicida como un método para retrazar la aparición de malezas resistentes. El apilado del evento de AAD-12 416con una característica de torelancia al glifosato (y/o con otras características de tolerancia a herbicidas) puede proveer un mecanismo que permite el control de especies dicotiledóneas de malezas resistentes al glifosato en GTCs al habilitar el uso de glifosato, fenoxi-auxina(s) (por ejemplo 2,4-D) y herbicidas de piridiloxiacetatos auxina (por ejemplo triclopir) selectivamente en el mismo cultivo. La aplicación de estos herbicidas pude ser simultánea en una mezcla de tanque que comprende dos o más herbicidas de diferentes modos de acción; la aplicación individual de una composición de herbicida individual en aplicaciones secuenciales como preplanta, preemergencia o postemergencia y cronometraje dividido de aplicaciones que varía de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 3 meses; o alternativamente, cualquier combinación de cualquier número de herbicidas que representan cada tipo de químico se puede aplicar en cualquier cronometraje dentro de aproximadamente 7 meses de plantado el cultivo hasta la cosecha del cultivo (o el intervalo de precosecha para el herbicida individual, cualquiera que sea el más corto).
Es importante tener flexibilidad al controlar un amplio espectro de malezas de pasto y hoja ancha en términos de cronometraje de aplicación, tasa de herbicidas individuales y la habilidad para controlar malezas difíciles o resistentes. La aplicación de glifosato a un cultivo con un gen resistente al glifosato/apilado de evento de AAD-12 416 puede variar de aproximadamente 250-2500 g ae/ha; herbicida(s) (uno o más) fenoxi-auxina se puede aplicar de aproximadamente 25-4000 g ae/ha; y herbicida(s) (uno o más) de piridiloxiacetatos auxina se pueden aplicar de 25-2000 g ae/ha. La(s)s combinación(es) óptima(s) y el cronometraje de esta(s) aplicación(es) dependerán en particular de la situación, especies y ambiente, y se determinarán mejor por medio de una persona experta en la técnica de control de malezas y que tenga el beneficio de la descripción objetivo.
La amplia mayoría hectáreas de algodón, cañóla, maíz y soja plantadas en Norteamérica contiene una característica de tolerancia al glifosato (GT), y la adopción del maíz está creciendo. Los cultivos GT adicionales (por ejemplo, trigo, arroz, caña de azúcar y césped) han estado en desarrollo pero a la fecha no se han lanzado comercialmente.
Muchas otras especies resistentes al glifosato están en etapa experimental a desarrollo (por ejemplo, alfalfa, caña de azúcar, girasol, remolacha, chícharos, zanahoria, pepino, lechuga, cebolla, fresa, jitomate y tabaco; especies de silvicultura como álamo y liquidámbar; y especies hortícolas como caléndula, petunia y begoñas; isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm, 2005 en la Red Mundial de Información). GTC son herramientas valiosas para la amplitud vertical de maleza de manera controlada y costeable provista por este sistema. Sin embargo, la utilidad de glifosato como un tratamiento base ahora estándar está seleccionando malezas resistentes a glifosato. Además, las malezas para las que el glifosato es inherentemente menos eficaz están cambiando a las especies predominantes en campos en donde sólo se practican programas químicos de sólo glifosato. Al apilar el Evento de AAD-12 416 con una característica GT, ya sea por cruza convencional o de manera conjunta como un evento de transformación novedoso, se puede mejorar la eficacia en el control de malezas, flexibilidad y capacidad de manejar cambios de maleza y el desarrollo de resistencia a herbicidas. Al transformar cultivos con el Evento de AAD-12416, los cultivos monocotiledóneos tendrán un margen mayor de seguridad a fenoxi o piridiloxi auxina y las fenoxi auxinas se pueden aplicar selectivamente a cultivos dicotiledóneos. Se pueden contemplar varios escenarios para opciones mejoradas de control de malezas en donde el Evento de AAD-12 416 y una característica GT se apilen en cualquier especie de cultivo monocotiledóneo o dicotiledóneo: a) Se puede aplicar glifosato a una tasa de aplicación post- emergente estándar (420 a 2160 g ae/ha, preferiblemente 560 a 840 g ae/ha) para el control de la mayoría de especies de maleza de pasto y hoja ancha. Para el control de malezas de hoja ancha resistentes a glifosato como Conyza canadensis o malezas inherentemente difíciles de controlar con glifosato (por ejemplo, Commelina spp, Ipomoea spp, etc), 280-2240 g ae/ha (preferiblemente 560-1 120 g ae/ha) se puede aplicar 2,4-D de manera consecutiva, mezclada en tanque o como una premezcla con glifosato para proveer control efectivo. Para triclopir, las tasas de aplicación normalmente oscilan de 70-1 120 g ae/ha, típicamente 140-420 g ae/ha. Para fluroxipir, las tasas de aplicación normalmente oscilan de 35-560 g ae/ha, preferiblemente 70-280 g ae/ha. b) Actualmente, las tasas para glifosato aplicadas a GTC generalmente oscilan de 560 a 2240 g ae/ha por tiempo de aplicación. El glifosato es más eficaz en especies de pasto que en especies de maleza de hoja ancha. El evento de AAD-12 416 + características GT apiladas permitiría tasas de glifosato efectivas para pasto (105-840 g ae/ha, preferiblemente 210-420 g ae/ha). Se podría aplicar entonces 2,4-D (a 280-2240 g ae/ha, preferiblemente 560-1 120 g ae/ha) de manera consecutiva, mezclada en tanque o como una premezcla con tasas de glifosato efectivas para pasto para proveer el control de maleza de hoja ancha necesario. Triclopir y fluroxipir en las tasas antes mencionadas son componentes aceptables en el régimen de tratamiento. La baja tasa de glifosato también provee algún beneficio en el control de maleza de hoja ancha; sin embargo, el control primario sería de 2,4-D, triclopir o fluroxipir.
Un experto en la técnica de control de malezas reconocerá que el uso de uno o más herbicidas de ariloxi auxina comerciales sólo o en combinación (consecutiva o independiente) es posible mediante transformación del Evento de AAD-12 416 en cultivos. Las tasas específicas de otros herbicidas representativos de estas químicas se pueden determinar por medio de las etiquetas del herbicida compiladas en el libro de CPR (Referencia de Protección de Cultivos) o compilación similar, etiquetas compiladas en línea (por ejemplo, cdms.net/manuf/manuf.asp), o cualquier guía comercial o académica para protección de cultivos tal como la Guía de Protección de Cultivo de Agriliance (2005). Cada herbicida alternativo con la capacidad de ser usado en HTC mediante el Evento de AAD-12416, ya sea usado sólo, mezclada en tanque o de manera consecutiva, está considerado dentro del alcance de esta invención LISTA DE REFERENCIAS Severson, David W {Genomic Mapping Techniques, capítulo 26, RFLP analysis of insect genomes) Stam M., Mol. J.N.M. y Kooter J.M., (1997) "The Silence of Genes in Transgenic Plants" Annals of Botany 79: 3±12, 1997 Hood, E.E.; Helmer, G.L.; Fraley, R.T.; Chilton, M.-D. The Hypervirulence of Agrobacterium tumefaciens A281 Is Encoded in a Región of pTiBo542 Outside of T-DNA, Journal of Bacteriology, 1986 f 68(3): 1291-1301 .
Zeng, P.; Vadnais, D.A.; Zhang, Z.¡ Polacco, J.C. Refined glufosinato selection in Agrobacterium-med ated transformation of soybean [Glycine max (L) Merrill], Plant Cell Reports 2004 22:478-482

Claims (37)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1. Una planta de soja transgénica que comprende un genoma, dicho genoma comprende la SEQ ID NO:1.
2. Una semilla de soja que comprende un genoma que comprende el evento de AAD-12 pDAB4468-0416 tal como se presenta en una semilla representativa depositada en la American Type Culture Collection (ATCC) con el número de acceso PTA-10442.
3. Una semilla de soja que comprende un genoma, dicho genoma comprende la SEQ ID NO:1.
4. Una planta de soja producida por crecimiento de la semilla de la reivindicación 2, dicha planta comprende la SEQ ID NO: 1.
5. Una planta de progenie de la planta de soja de la reivindicación 4, dicha planta de progenie comprende el evento de AAD-12 pDAB4468-0416.
6. Una planta de progenie tolerante a herbicidas de la planta de soja de la reivindicación 1 , dicha planta de progenie comprende la SEQ ID ??. .
7. Una planta de soja transgénica que comprende un inserto de transgén en un sitio blanco cromosómico de soja ubicado en el cromosoma 4 entre los marcadores SNP de la SEQ ID NO:29 y la SEQ ID NO:30, en donde el sitio blanco comprende un ácido nucleico heterólogo.
8. Un método de preparación de una planta de soja transgénica que comprende la inserción de un ácido nucleico heterólogo en una posición en el cromosoma 4 entre marcadores SNP de la SEQ ID NO:29 y la SEQ ID NO:30, en donde el sitio blanco comprende un ácido nucleico heterólogo.
9. Una parte de la planta de la reivindicación 4, en donde dicha parte está seleccionada del grupo que consiste en polen, óvulo, flores, cápsulas, hilachas, brotes, raíces y hojas, dicha parte comprende la SEQ ID NO:1.
10. Una planta de soja transgénica que comprende un inserto de transgén en o flanqueado por, una secuencia genómica seleccionada del grupo que consiste en residuos 1-2730 de la SEQ ID NO:1 y residuos 9122-10,212 de la SEQ ID NO:1.
1 1. Una molécula de polinucleótido aislado, en donde dicha molécula comprende al menos 15 nucleótidos y mantiene la hibridación en condiciones rigurosas de lavado con una secuencia de ácidos nucleicos seleccionados del grupo que consiste en residuos 1-2730 de la SEQ ID NO:1 y residuos 9122-10,212 de la SEQ ID NO:1.
12. Un polinucleótido aislado, en donde dicho polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NOs:2-28.
13. Un polinucleótido aislado que híbrida en condiciones rigurosas de lavado con una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en residuos 2720 a 2740 de la SEQ ID NO: , residuos 91 2 a 9 32 de la SEQ ID NO:1 , y sus complementos.
14. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque el polinucleótido es un amplicón generado por la reacción de polimerasa en cadena.
15. Un polinucleótido que comprende la SEQ ID NO:1.
16. Un método de producción de polinucleótidos de la reivindicación 15.
17. Un método de inserción de un transgén en un segmento de ADN de un genoma de soja, dicho segmento de ADN comprende un extremo 5' que comprende residuos 1-2730 de la SEQ ID NO:1 y un extremo 3' que comprende residuos 9122-10,212 de la SEQ ID NO:1.
18. Un método de cruza de un planta de soja, dicho método comprende la cruza de una primera planta de soja que comprende la SEQ ID NO: 1 con una segunda planta de soja para producir una tercera planta de soja que comprende un genoma, y ensayo de dicha tercera planta de soja para la presencia de la SEQ ID NO:1 en dicho genoma.
19. Un método de introgresión de un rasgo de tolerancia a herbicidas en una planta de soja, dicho método comprende la cruza de una primera planta de soja que comprende la SEQ ID NO:1 con una segunda planta de soja para producir una tercera planta de soja que comprende un genoma, y ensayo de dicha tercera planta de soja para la presencia de la SEQ ID NO: 1 en dicho genoma.
20. Un método de control de malezas, en donde dicho método comprende aplicar un herbicida de ariloxialcanoato en un campo, dicho campo comprende una planta de la reivindicación 1.
21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el herbicida está seleccionado del grupo que consiste en 2,4-D; 2,4-DB; MCPA; y MCPB.
22. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el método comprende aplicar un segundo herbicida a dicho campo.
23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque dicho segundo herbicida está seleccionado del grupo que consiste en glifosato y dicamba.
24. Un método de control de malezas, dicho método comprende aplicar un herbicida de ariloxialcanoato a un campo, y plantar una semilla de la reivindicación 3 en dicho campo en un lapso de 14 días haber aplicado del herbicida.
25. Un método de detección de un evento de soja en una muestra que comprende ADN de soja, en donde dicho método comprende poner en contacto dicha muestra con al menos un polinucleótido que es diagnóstico para el evento de AAD-12 pDAB4468-0416 tal como se presenta en una semilla representativa depositada en American Type Culture Collection (ATCC) con el número de acceso PTA-10442.
26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque comprende poner en contacto dicha muestra con; a. un primer cebador que se une con una secuencia flanqueante seleccionada del grupo que consiste en residuos 1-2730 de la SEQ ID NO:1 , residuos 9122-10,212 de la SEQ ID NO:1 , y sus complementos; y b. un segundo cebador que se une con una secuencia de inserto que comprende los residuos 2731-9121 de la SEQ ID NO:1 o su complemento; sometiendo dicha muestra a una reacción de polimerasa en cadena; y ensayando un amplicón generado entre dichos cebadores.
27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque dichos cebadores están seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NOs:2-7.
28. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque dicho polinucleótido comprende al menos 30 nucleótidos e híbrida en condiciones rigurosas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los residuos 2720 a 2740 de la SEQ ID NO:1 , los residuos 9112 a 9132 de la SEQ ID NO: 1 , y sus complementos; en donde dicho método también comprende someter dicha muestra y dicho polinucleótido a condiciones rigurosas de hibridación; y ensayar dicha muestra para hibridación de dicho polinucleótido a dicho ADN.
29. Un kit de detección de ADN que comprende un primer cebador y un segundo cebador de acuerdo con la reivindicación 27.
30. Un kit de detección de ADN para realizar el método de la reivindicación 28.
31. Un kit de detección de ADN que comprende un polinucleótido, en donde dicho polinucleótido comprende al menos 30 nucleótidos e híbrida en condiciones rigurosas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los residuos 2720 a 2740 de la SEQ ID NO:1 , los residuos 91 12 a 9132 de la SEQ ID NO:1 , y sus complementos.
32. - El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el método se usa para tratar o prevenir malezas resistentes a herbicidas.
33. - El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el herbizida se aplican antes de plantar dicha planta.
34.- Un método para controlar malezas resistentes al glifosato en un área que comprende al menos una planta de la reivindicación 1 , en donde dicha planta además comprende una característica de tolerancia al glifosato, y dicho método comprende aplicar un heroicidad de ariloxialcanoato a al menos una porción de dicha área.
35.- El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque el herbicida es un fenoxi-auxina.
36.- El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque el herbicida se aplica desde una mezcla de tanque con glifosato.
37.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque al menos una de las malezas es un volutario resistente al glifosato de una especie diferente a dicha planta.
MX2012006073A 2009-11-24 2010-11-24 Evento 416 de ariloaxialcanoato dioxigenasa, lineas de soja transgenica relacionadas y su identificacion especifica del evento. MX341974B (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US26395009P 2009-11-24 2009-11-24
PCT/US2010/058001 WO2011066384A1 (en) 2009-11-24 2010-11-24 Aad-12 event 416, related transgenic soybean lines, and event-specific identification thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
MX2012006073A true MX2012006073A (es) 2012-06-19
MX341974B MX341974B (es) 2016-09-07

Family

ID=44066903

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2012006073A MX341974B (es) 2009-11-24 2010-11-24 Evento 416 de ariloaxialcanoato dioxigenasa, lineas de soja transgenica relacionadas y su identificacion especifica del evento.

Country Status (20)

Country Link
US (1) US9944944B2 (es)
EP (1) EP2503871B1 (es)
JP (2) JP6261863B2 (es)
KR (1) KR101906605B1 (es)
CN (2) CN104928256A (es)
AR (6) AR079149A1 (es)
AU (1) AU2010324752B2 (es)
BR (1) BR112012012511A2 (es)
CA (1) CA2781375C (es)
CL (1) CL2012001341A1 (es)
CO (1) CO6640202A2 (es)
HK (1) HK1176516A1 (es)
IL (1) IL219933A (es)
IN (1) IN2012DN04843A (es)
MX (1) MX341974B (es)
RU (1) RU2603252C2 (es)
UA (3) UA112408C2 (es)
UY (1) UY33059A (es)
WO (1) WO2011066384A1 (es)
ZA (1) ZA201203766B (es)

Families Citing this family (330)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3241430B1 (en) * 2005-10-28 2020-08-26 Dow AgroSciences LLC Novel herbicide resistance genes
IN2012DN04901A (es) * 2009-11-24 2015-09-25 Dow Agrosciences Llc
BR112013012966A2 (pt) 2010-11-29 2016-08-23 Bayer Ip Gmbh iminas alfa, beta - insaturadas
EP2460407A1 (de) 2010-12-01 2012-06-06 Bayer CropScience AG Wirkstoffkombinationen umfassend Pyridylethylbenzamide und weitere Wirkstoffe
MX2013005356A (es) 2010-12-01 2013-07-05 Bayer Ip Gmbh Uso de fluopyram para combatir nematodos en cultivos.
KR102031625B1 (ko) 2010-12-03 2019-10-21 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 스태킹된 제초제 내성 이벤트 ８２６４.４４.０６.１, 관련된 트랜스제닉 대두 계통, 및 이의 검출
WO2012075429A1 (en) 2010-12-03 2012-06-07 Dow Agrosciences Llc Stacked herbicide tolerance event 8291.45.36.2, related transgenic soybean lines, and detection thereof
UY33860A (es) * 2011-01-07 2012-08-31 Dow Agrosciences Llc Tolerancia aumentada de plantas habilitadas por dht a herbicidas auxínicos resultante de diferencias de porciones en estructuras moleculares del herbicida
JP2014513061A (ja) 2011-03-10 2014-05-29 バイエル・インテレクチユアル・プロパテイー・ゲー・エム・ベー・ハー 処理された種子の種子安全性を保護するためのリポキト−オリゴ糖化合物の使用
WO2012126938A2 (en) 2011-03-23 2012-09-27 Bayer Cropscience Ag Active compound combinations
BR112013025871A2 (pt) 2011-04-08 2016-07-26 Bayer Ip Gmbh composto de fórmula (i) e sua utilização, composição para o controle dos fungos nocivos fitopatogênicos, método para o controle de fungos fitopatogênicos das culturas e processo para a produção das composições
EP2699093B1 (en) 2011-04-22 2015-11-04 Bayer Intellectual Property GmbH Active compound combinations comprising a carboximide derivative and a fungicidal compound
EP2709983B1 (en) 2011-05-18 2018-04-18 Syngenta Participations AG Insecticidal compounds based on arylthioacetamide derivatives
AR086587A1 (es) 2011-05-31 2014-01-08 Syngenta Participations Ag Compuestos insecticidas
PL2720543T3 (pl) 2011-06-14 2019-03-29 Bayer Cropscience Ag Zastosowanie związku enaminokarbonylowego w kombinacji ze środkiem kontroli biologicznej
TW201317353A (zh) * 2011-07-13 2013-05-01 Dow Agrosciences Llc 具疊加除草劑耐受性之品件８２６４．４２．３２．１，相關基因轉殖大豆品系以及測定該品件的方法
BR102012019434B1 (pt) 2011-07-26 2021-11-09 Dow Agrosciences Llc Métodos de controle de pestes, de insetos, molécula e sequência de dna diagnóstica para o evento de soja 9582.814.19.1
CN103732567A (zh) 2011-08-22 2014-04-16 先正达参股股份有限公司 作为杀虫化合物的二氢呋喃衍生物
WO2013026724A1 (en) 2011-08-22 2013-02-28 Syngenta Participations Ag Dihydrofuran derivatives as insecticidal compounds
CN103981149A (zh) 2011-08-22 2014-08-13 拜尔作物科学公司 修饰植物基因组的方法和手段
EP2748155B1 (en) 2011-08-25 2017-12-20 Syngenta Participations AG Isoxazoline derivatives as insecticidal compounds
WO2013026695A1 (en) 2011-08-25 2013-02-28 Syngenta Participations Ag Isoxazoline derivatives as insecticidal compounds
WO2013026929A1 (en) 2011-08-25 2013-02-28 Syngenta Participations Ag Dihydropyrrole derivatives as insecticidal compounds
EP2561759A1 (en) 2011-08-26 2013-02-27 Bayer Cropscience AG Fluoroalkyl-substituted 2-amidobenzimidazoles and their effect on plant growth
MX347562B (es) 2011-09-12 2017-05-03 Bayer Ip Gmbh Derivados fungicidas de 3-fenil[(heterociclilmetoxi)imino]metil}-1 ,2,4-oxadiazol-5(4h)-ona sustituidos en 4.
EP2755969B1 (en) 2011-09-13 2017-01-18 Syngenta Participations AG Isothiazoline derivatives as insecticidal compounds
AU2012307321B2 (en) 2011-09-16 2016-07-14 Bayer Intellectual Property Gmbh Use of acylsulfonamides for improving plant yield
US20140302991A1 (en) 2011-09-16 2014-10-09 Bayer Intellectual Property Gmbh Use of phenylpyrazolin-3-carboxylates for improving plant yield
CN103917097A (zh) 2011-09-16 2014-07-09 拜耳知识产权有限责任公司 5-苯基-或5-苄基-2-异噁唑啉-3-甲酸酯用于改善植物产量的用途
BR112014007847A2 (pt) 2011-10-03 2017-04-18 Syngenta Participations Ag derivados de isoxazolina como compostos inseticidas
UA115132C2 (uk) 2011-10-04 2017-09-25 Байєр Інтелекчуал Проперті Гмбх Спосіб боротьби з грибами та ооміцетами шляхом інгібування гена сахаропіндегідрогенази
UY34396A (es) * 2011-10-18 2013-05-31 Dow Agrosciences Llc Materiales y métodos para la detección del gen dioxigenasa ariloxialcanoato (aad-12) en las plantas
KR20140102238A (ko) 2011-11-21 2014-08-21 바이엘 인텔렉쳐 프로퍼티 게엠베하 살진균제 n-[(트리치환실릴)메틸]-카르복사미드 유도체
CN105906567B (zh) 2011-11-30 2019-01-22 拜耳知识产权有限责任公司 杀真菌的n-二环烷基和n-三环烷基(硫代)羧酰胺衍生物
IN2014CN04325A (es) 2011-12-19 2015-09-04 Bayer Cropscience Ag
EP2797895B1 (en) 2011-12-29 2015-08-05 Bayer Intellectual Property GmbH Fungicidal 3-[(1,3-thiazol-4-ylmethoxyimino)(phenyl)methyl]-2-substituted-1,2,4-oxadiazol-5(2h)-one derivatives
WO2013098147A1 (en) 2011-12-29 2013-07-04 Bayer Intellectual Property Gmbh Fungicidal 3-[(pyridin-2-ylmethoxyimino)(phenyl)methyl]-2-substituted-1,2,4-oxadiazol-5(2h)-one derivatives
HUE052982T2 (hu) * 2012-01-23 2021-05-28 Dow Agrosciences Llc Gyomirtótoleráns PDAB4468.19.10.3 gyapotesemény
BR102013001692A2 (pt) 2012-01-23 2019-01-08 Dow Agrosciences Llc evento de algodão tolerante a herbicida pdab4468.18.07.1
CN104507314B (zh) 2012-01-25 2018-01-09 拜耳知识产权有限责任公司 含有氟吡菌酰胺芽孢杆菌和生物防治剂的活性化合物结合物
US20150011389A1 (en) 2012-01-25 2015-01-08 Bayer Intellectual Property Gmbh Active Compound Combinations Containing Fluopyram and Biological Control Agent
BR122019010641B1 (pt) 2012-02-27 2020-12-22 Bayer Intellectual Property Gmbh combinação, método para controle de fungos fitopatogênicos prejudiciais e uso da referida combinação
WO2013135674A1 (en) 2012-03-12 2013-09-19 Syngenta Participations Ag Insecticidal 2-aryl-acetamide compounds
WO2013139949A1 (en) 2012-03-23 2013-09-26 Bayer Intellectual Property Gmbh Compositions comprising a strigolactame compound for enhanced plant growth and yield
EP2836489B1 (en) 2012-04-12 2016-06-29 Bayer Cropscience AG N-acyl-2-(cyclo) alkylpyrrolidines and piperidines useful as fungicides
EP2838363A1 (en) 2012-04-20 2015-02-25 Bayer Cropscience AG N-cycloalkyl-n-[(trisubstitutedsilylphenyl)methylene]-(thio)carboxamide derivatives
EP2838893B1 (en) 2012-04-20 2019-03-13 Bayer Cropscience AG N-cycloalkyl-n-[(heterocyclylphenyl)methylene]-(thio)carboxamide derivatives
EP2662362A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG Pyrazole indanyl carboxamides
EP2662360A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG 5-Halogenopyrazole indanyl carboxamides
WO2013167545A1 (en) 2012-05-09 2013-11-14 Bayer Cropscience Ag Pyrazole indanyl carboxamides
EP2662363A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG 5-Halogenopyrazole biphenylcarboxamides
EP2662370A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG 5-Halogenopyrazole benzofuranyl carboxamides
CN104364236B (zh) 2012-05-09 2018-01-16 拜尔农作物科学股份公司 5‑卤代吡唑二氢茚基甲酰胺
EP2662364A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG Pyrazole tetrahydronaphthyl carboxamides
EP2662361A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG Pyrazol indanyl carboxamides
US10995342B2 (en) 2012-05-11 2021-05-04 Wisconsin Alumni Research Foundation Rhg1 mediated resistance to soybean cyst nematode
AR091104A1 (es) 2012-05-22 2015-01-14 Bayer Cropscience Ag Combinaciones de compuestos activos que comprenden un derivado lipo-quitooligosacarido y un compuesto nematicida, insecticida o fungicida
WO2013178649A1 (en) 2012-05-30 2013-12-05 Bayer Cropscience Ag Compositions comprising a biological control agent and a fungicide from the group consisting of inhibitors of the respiratory chain at complex i or ii.
PT2854547T (pt) 2012-05-30 2018-11-16 Bayer Cropscience Ag Composição que compreende um agente de controlo biológico e trifloxistrobina
NZ702162A (en) 2012-05-30 2016-11-25 Bayer Cropscience Ag Compositions comprising a biological control agent and an insecticide
EP2854549B1 (en) 2012-05-30 2018-08-01 Bayer Cropscience AG Composition comprising a biological control agent and fluopicolide
AR091200A1 (es) 2012-05-30 2015-01-21 Bayer Cropscience Ag Composicion que comprende un agente de control biologico y un fungicida
TR201816272T4 (tr) 2012-05-30 2018-11-21 Bayer Cropscience Ag Bir biyolojik kontrol ajanı ve flopikolid içeren bileşim.
CN104507317B (zh) 2012-05-30 2019-11-15 拜尔农作物科学股份公司 包含生物防治剂和杀真菌剂的组合物、及其用途、试剂盒
CN104507311A (zh) 2012-05-30 2015-04-08 拜尔农作物科学股份公司 包含生物防治剂和杀虫剂的组合物
TW201410148A (zh) * 2012-06-07 2014-03-16 Dow Agrosciences Llc 促進２，４－ｄ抗性作物產量的方法
UA122197C2 (uk) 2012-06-25 2020-10-12 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Трансгенна рослина сої, яка має стійкість до глюфосинату і підвищену стійкість до комах
WO2014001120A1 (en) 2012-06-25 2014-01-03 Syngenta Participations Ag Isothiazole derivatives as insecticidal compounds
JP2015528017A (ja) 2012-07-31 2015-09-24 バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト 殺有害生物性テルペン混合物及び殺虫剤を含んでいる組成物
WO2014019951A1 (en) 2012-08-03 2014-02-06 Syngenta Participations Ag Methods of controlling insects
EP2887808B1 (en) 2012-08-24 2019-04-24 Syngenta Participations AG Methods for controlling wireworms
BR112015003630A2 (pt) 2012-08-24 2017-07-04 Syngenta Participations Ag métodos de controle de insetos
US9474279B2 (en) 2012-08-24 2016-10-25 Syngenta Participations Ag Methods of controlling insects
EP3683307A3 (en) 2012-09-14 2020-07-29 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Hppd variants and methods of use
WO2014056985A1 (en) 2012-10-10 2014-04-17 Syngenta Participations Ag Pesticidal mixtures
EP2719280A1 (en) 2012-10-11 2014-04-16 Bayer CropScience AG Use of N-phenylethylpyrazole carboxamide derivatives or salts thereof for resistance management of phytopathogenic fungi
CA2888600C (en) 2012-10-19 2021-08-10 Bayer Cropscience Ag Active compound combinations comprising carboxamide derivatives
ES2665320T3 (es) 2012-10-19 2018-04-25 Bayer Cropscience Ag Procedimiento de tratamiento de plantas contra hongos resistentes a fungicidas usando derivados de carboxamida o de tiocarboxamida
CN104735985B (zh) 2012-10-19 2018-10-16 拜尔农科股份公司 使用羧酰胺或硫代羧酰胺衍生物增强植物中对非生物胁迫的耐受性的方法
WO2014060518A1 (en) 2012-10-19 2014-04-24 Bayer Cropscience Ag Method of plant growth promotion using carboxamide derivatives
WO2014079935A1 (en) 2012-11-21 2014-05-30 Syngenta Participations Ag Insecticidal compounds based on arylthioacetamide derivatives
EP2735231A1 (en) 2012-11-23 2014-05-28 Bayer CropScience AG Active compound combinations
CN104994736B (zh) 2012-11-30 2018-02-06 拜耳作物科学股份公司 二元农药和杀真菌混合物
EP2925137A1 (en) 2012-11-30 2015-10-07 Bayer CropScience AG Binary fungicidal or pesticidal mixture
EP2925134B1 (en) 2012-11-30 2019-12-25 Bayer CropScience AG Ternary fungicidal mixtures
UA116222C2 (uk) 2012-11-30 2018-02-26 Байєр Кропсайєнс Акцієнгезелльшафт Потрійні фунгіцидні і пестицидні суміші
EP2925136A2 (en) 2012-11-30 2015-10-07 Bayer CropScience AG Binary fungicidal mixtures
WO2014086753A2 (en) 2012-12-03 2014-06-12 Bayer Cropscience Ag Composition comprising biological control agents
WO2014086758A2 (en) 2012-12-03 2014-06-12 Bayer Cropscience Ag Composition comprising a biological control agent and an insecticide
ES2667555T3 (es) 2012-12-03 2018-05-11 Bayer Cropscience Ag Composición que comprende un agente de control biológico y un insecticida
BR112015012702A2 (pt) 2012-12-03 2017-07-11 Bayer Cropscience Ag composição que compreende um agente de controle biológico e um fungicida
BR112015012789A2 (pt) 2012-12-03 2017-07-11 Bayer Cropscience Ag composição que compreende um agente de controle biológico e um inseticida
US20150305348A1 (en) 2012-12-03 2015-10-29 Bayer Cropscience Ag Composition comprising biological control agents
JP2015535532A (ja) 2012-12-03 2015-12-14 バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト 生物農薬および殺菌剤を含む組成物
US9763454B2 (en) 2012-12-03 2017-09-19 Bayer Cropscience Ag Composition comprising a biological control agent and a fungicide
WO2014090765A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 Bayer Cropscience Ag Use of 1-[2-fluoro-4-methyl-5-(2,2,2-trifluoroethylsulfinyl)phenyl]-5-amino-3-trifluoromethyl)-1 h-1,2,4 tfia zole for controlling nematodes in nematode-resistant crops
AR093996A1 (es) 2012-12-18 2015-07-01 Bayer Cropscience Ag Combinaciones bactericidas y fungicidas binarias
US9428459B2 (en) 2012-12-19 2016-08-30 Bayer Cropscience Ag Difluoromethyl-nicotinic- tetrahydronaphtyl carboxamides
EP2953465A1 (en) 2013-02-11 2015-12-16 Bayer Cropscience LP Compositions comprising a streptomyces-based biological control agent and a fungicide
MX2015010304A (es) 2013-02-11 2015-11-18 Bayer Cropscience Lp Composiciones que comprenden un agente de control biologico y un insecticida.
US20140302986A1 (en) 2013-02-11 2014-10-09 Bayer Cropscience Lp Compositions comprising a streptomyces-based biological control agent and another biological control agent
WO2014131837A1 (en) 2013-02-28 2014-09-04 Syngenta Participations Ag Isoxaline derivatives for use in cotton plants
CN110172466A (zh) 2013-03-07 2019-08-27 巴斯夫农业解决方案种子美国有限责任公司 毒素基因及其使用方法
BR112015026235A2 (pt) 2013-04-19 2017-10-10 Bayer Cropscience Ag método para melhorar a utilização do potencial de produção de plantas transgênicas envolvendo a aplicação de um derivado de ftaldiamida
KR20150144779A (ko) 2013-04-19 2015-12-28 바이엘 크롭사이언스 악티엔게젤샤프트 살충성 또는 농약성 2성분 혼합물
WO2014177514A1 (en) 2013-04-30 2014-11-06 Bayer Cropscience Ag Nematicidal n-substituted phenethylcarboxamides
TW201507722A (zh) 2013-04-30 2015-03-01 Bayer Cropscience Ag 做為殺線蟲劑及殺體內寄生蟲劑的ｎ－（２－鹵素－２－苯乙基）－羧醯胺類
BR112015031235A2 (pt) 2013-06-26 2017-07-25 Bayer Cropscience Ag derivados de n-cicloalquil-n-[(biciclil-fenil)metileno]-(tio)carboxamida
CN105980395A (zh) 2013-11-04 2016-09-28 美国陶氏益农公司 最优大豆座位
TWI672378B (zh) * 2013-11-04 2019-09-21 陶氏農業科學公司 最適大豆基因座（一）
AU2014341927B2 (en) 2013-11-04 2017-12-14 Corteva Agriscience Llc Optimal maize loci
JP6633532B2 (ja) 2013-11-04 2020-01-22 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー 最適なトウモロコシ遺伝子座
RU2685723C1 (ru) 2013-12-05 2019-04-23 Байер Кропсайенс Акциенгезелльшафт Производные n-циклоалкил-n-{ [2-(1-замещенный циклоалкил)фенил]метилен} -(тио)карбоксамида
TW201607929A (zh) 2013-12-05 2016-03-01 拜耳作物科學公司 Ｎ－環烷基－ｎ－｛［２－（１－經取代環烷基）苯基］亞甲基｝－（硫代）甲醯胺衍生物
EP2885970A1 (en) 2013-12-21 2015-06-24 Bayer CropScience AG Fungicide compositions comprising compound I, at least one succinate dehydrogenase (SDH) inhibitor and at least one triazole fungicide
CA2942171C (en) 2014-03-11 2023-05-09 Bayer Cropscience Lp Hppd variants and methods of use
WO2015160618A1 (en) 2014-04-16 2015-10-22 Bayer Cropscience Lp Compositions comprising ningnanmycin and a biological control agent
WO2015160619A1 (en) 2014-04-16 2015-10-22 Bayer Cropscience Lp Compositions comprising ningnanmycin and a fungicide
WO2015160620A1 (en) 2014-04-16 2015-10-22 Bayer Cropscience Lp Compositions comprising ningnanmycin and an insecticide
BR112017022000A2 (pt) 2015-04-13 2018-07-03 Bayer Cropscience Ag derivados de n-cicloalquil-n-(biheterocicliletileno)-(tio)carboxamida.
EP3097782A1 (en) 2015-05-29 2016-11-30 Bayer CropScience Aktiengesellschaft Methods for controlling phytopathogenic nematodes by combination of fluopyram and biological control agents
AU2016319093B2 (en) 2015-09-11 2022-11-03 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC HPPD variants and methods of use
US20180258438A1 (en) * 2015-11-06 2018-09-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Generation of complex trait loci in soybean and methods of use
US20190159451A1 (en) 2016-07-29 2019-05-30 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Active compound combinations and methods to protect the propagation material of plants
EP3544991A1 (en) 2016-11-23 2019-10-02 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Axmi669 and axmi991 toxin genes and methods for their use
US20190322631A1 (en) 2016-12-19 2019-10-24 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
US11555202B2 (en) 2016-12-22 2023-01-17 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Elite event EE-GM5 and methods and kits for identifying such event in biological samples
JP2020503020A (ja) 2016-12-22 2020-01-30 ビーエーエスエフ アグリカルチュラル ソリューションズ シード ユーエス エルエルシー エリートイベントｅｅ−ｇｍ４ならびに生物学的試料中でそのようなイベントを同定するための方法およびキット
KR20190095411A (ko) 2016-12-22 2019-08-14 바스프 아그리컬쳐럴 솔루션즈 시드 유에스 엘엘씨 선충 해충의 방제를 위한 ｃｒｙ１４의 용도
CA3049775A1 (en) 2017-01-18 2018-07-26 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Bp005 toxin gene and methods for its use
BR112019014720A2 (pt) 2017-01-18 2020-04-07 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC métodos para conferir resistência a doença em uma planta e para aumentar o rendimento em uma planta
WO2018153730A1 (en) 2017-02-21 2018-08-30 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
BR112019018056A2 (pt) 2017-03-07 2020-08-11 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC molécula de ácido nucleico recombinante, cassete de expressão, célula hospedeira, plantas, sementes transgênicas, polipeptídeo recombinante, métodos para conferir tolerância e para controlar ervas daninhas, produto de utilidade e uso da sequência de nucleotídeos
CA3056347A1 (en) 2017-04-07 2018-10-11 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
WO2018188962A1 (en) 2017-04-11 2018-10-18 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
US20200163332A1 (en) 2017-04-21 2020-05-28 Bayer Cropscience Lp Method of improving crop safety
WO2018202491A1 (en) 2017-05-04 2018-11-08 Basf Se Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
CN110621669A (zh) 2017-05-04 2019-12-27 巴斯夫欧洲公司 防除植物病原性真菌的取代5-卤代烷基-5-羟基异噁唑类
WO2018219797A1 (en) 2017-06-02 2018-12-06 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
EP3642187A1 (en) 2017-06-19 2020-04-29 Basf Se 2-[[5-(trifluoromethyl)-1,2,4-oxadiazol-3-yl]aryloxy](thio)acetamides for combating phytopathogenic fungi
WO2019025250A1 (en) 2017-08-04 2019-02-07 Basf Se SUBSTITUTED TRIFLUOROMETHYLOXADIAZOLES FOR COMBATING PHYTOPATHOGENIC FUNGI
WO2019038042A1 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Basf Se SUBSTITUTED TRIFLUOROMETHYLOXADIAZOLES FOR THE CONTROL OF PHYTOPATHOGENIC FUNGI
WO2019052932A1 (en) 2017-09-18 2019-03-21 Basf Se SUBSTITUTED TRIFLUOROMETHYLOXADIAZOLES FOR COMBATING PHYTOPATHOGENIC FUNGI
WO2019068811A1 (en) 2017-10-06 2019-04-11 Bayer Aktiengesellschaft COMPOSITIONS COMPRISING FLUOPYRAM AND TIOXAZAFENE
WO2019083808A1 (en) 2017-10-24 2019-05-02 Basf Se IMPROVING HERBICIDE TOLERANCE AGAINST HPPD INHIBITORS BY REGULATION OF PUTATIVE REDUCED 4-HYDROXYPHENYLPYRUVATE REDUCES IN SOYBEANS
US11279944B2 (en) 2017-10-24 2022-03-22 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Of herbicide tolerance to 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD) inhibitors by down-regulation of HPPD expression in soybean
WO2019101511A1 (en) 2017-11-23 2019-05-31 Basf Se Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
US11834466B2 (en) 2017-11-30 2023-12-05 5Metis, Inc. Benzoxaborole compounds and formulations thereof
WO2019121143A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Basf Se Substituted cyclopropyl derivatives
WO2019137995A1 (en) 2018-01-11 2019-07-18 Basf Se Novel pyridazine compounds for controlling invertebrate pests
CN111669972A (zh) 2018-01-29 2020-09-15 巴斯夫农业公司 新农业化学制剂
WO2019154665A1 (en) 2018-02-07 2019-08-15 Basf Se New pyridine carboxamides
JP2021512887A (ja) 2018-02-07 2021-05-20 ビーエイエスエフ・ソシエタス・エウロパエアＢａｓｆ Ｓｅ 新規ピリジンカルボキサミド
BR112020016805A2 (pt) 2018-03-01 2020-12-15 BASF Agro B.V. Composições fungicidas, métodos para controlar fungos nocivos fitopatogênicos, para melhorar a saúde de plantas e para a proteção de material de propagação vegetal, material de propagação vegetal e uso
WO2019219464A1 (en) 2018-05-15 2019-11-21 Basf Se Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
WO2019224092A1 (en) 2018-05-22 2019-11-28 Basf Se Pesticidally active c15-derivatives of ginkgolides
WO2019233863A1 (de) 2018-06-04 2019-12-12 Bayer Aktiengesellschaft Herbizid wirksame bizyklische benzoylpyrazole
BR112021003037A2 (pt) 2018-08-18 2021-05-11 Boragen, Inc. formas sólidas de benzoxaborol substituído e composições do mesmo
EP3613736A1 (en) 2018-08-22 2020-02-26 Basf Se Substituted glutarimide derivatives
EP3628158A1 (en) 2018-09-28 2020-04-01 Basf Se Pesticidal mixture comprising a mesoionic compound and a biopesticide
JP7443357B2 (ja) 2018-10-23 2024-03-05 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 三環式の殺有害生物化合物
EP3643705A1 (en) 2018-10-24 2020-04-29 Basf Se Pesticidal compounds
EP3670501A1 (en) 2018-12-17 2020-06-24 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole compounds as fungicides
BR112021011492A2 (pt) 2019-01-11 2021-08-31 Basf Se Forma b cristalina, 1-(1,2-dimetilpropil)-n-etil-5-metil-n-piridazin-4-ilpirazol-4-carboxamida sólida, formulações de proteção vegetal, líquido de pulverização aquoso, uso da forma b cristalina, métodos de combate ou controle de pragas invertebradas e de proteção de safras
EP3696177A1 (en) 2019-02-12 2020-08-19 Basf Se Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests
EP3965575A1 (en) 2019-05-10 2022-03-16 Bayer CropScience LP Active compound combinations
CN110095613A (zh) * 2019-05-27 2019-08-06 武汉上成生物科技有限公司 一种快速检测转基因植物中cp4-epsps的方法
EP3769623A1 (en) 2019-07-22 2021-01-27 Basf Se Mesoionic imidazolium compounds and derivatives for combating animal pests
CN113923987B (zh) 2019-05-29 2024-10-01 巴斯夫欧洲公司 用于防除动物害虫的介离子咪唑鎓化合物和衍生物
WO2020244970A1 (en) 2019-06-06 2020-12-10 Basf Se New carbocyclic pyridine carboxamides
WO2020244969A1 (en) 2019-06-06 2020-12-10 Basf Se Pyridine derivatives and their use as fungicides
AU2020286573A1 (en) 2019-06-06 2021-12-23 Basf Se Fungicidal n-(pyrid-3-yl)carboxamides
EP3766879A1 (en) 2019-07-19 2021-01-20 Basf Se Pesticidal pyrazole derivatives
JP2022541612A (ja) 2019-07-22 2022-09-26 バイエル、アクチエンゲゼルシャフト 殺虫剤としての５－アミノ置換ピラゾールおよびトリアゾール
KR20220038402A (ko) 2019-07-23 2022-03-28 바이엘 악티엔게젤샤프트 살충제로서의 신규 헤테로아릴-트리아졸 화합물
JP2022541807A (ja) 2019-07-23 2022-09-27 バイエル・アクチエンゲゼルシヤフト 殺有害生物剤としての新規なヘテロアリール－トリアゾール化合物
WO2021022069A1 (en) 2019-08-01 2021-02-04 Bayer Cropscience Lp Method of improving cold stress tolerance and crop safety
EP3701796A1 (en) 2019-08-08 2020-09-02 Bayer AG Active compound combinations
EP4034656A1 (en) 2019-09-26 2022-08-03 Bayer Aktiengesellschaft Rnai-mediated pest control
WO2021063735A1 (en) 2019-10-02 2021-04-08 Basf Se New bicyclic pyridine derivatives
WO2021063736A1 (en) 2019-10-02 2021-04-08 Basf Se Bicyclic pyridine derivatives
US20220361492A1 (en) 2019-10-02 2022-11-17 Bayer Aktiengesellschaft Active compound combinations comprising fatty acids
UY38911A (es) 2019-10-09 2021-05-31 Bayer Ag Compuestos de heteroarilo-triazol como pesticidas, formulaciones, usos y métodos de uso de los mismos
KR20220079905A (ko) 2019-10-09 2022-06-14 바이엘 악티엔게젤샤프트 살충제로서의 신규 헤테로아릴-트리아졸 화합물
JP2023501978A (ja) 2019-11-07 2023-01-20 バイエル・アクチエンゲゼルシヤフト 動物害虫駆除用の置換スルホニルアミド
WO2021097162A1 (en) 2019-11-13 2021-05-20 Bayer Cropscience Lp Beneficial combinations with paenibacillus
WO2021099271A1 (en) 2019-11-18 2021-05-27 Bayer Aktiengesellschaft Active compound combinations comprising fatty acids
TW202134226A (zh) 2019-11-18 2021-09-16 德商拜耳廠股份有限公司 作為殺蟲劑之新穎雜芳基-三唑化合物
TW202136248A (zh) 2019-11-25 2021-10-01 德商拜耳廠股份有限公司 作為殺蟲劑之新穎雜芳基-三唑化合物
MX2022009333A (es) 2020-01-31 2022-10-07 Pairwise Plants Services Inc Supresion de la respuesta de evasion de la sombra en las plantas.
KR20220143072A (ko) 2020-02-18 2022-10-24 바이엘 악티엔게젤샤프트 살충제로서의 헤테로아릴-트리아졸 화합물
EP3708565A1 (en) 2020-03-04 2020-09-16 Bayer AG Pyrimidinyloxyphenylamidines and the use thereof as fungicides
WO2021209490A1 (en) 2020-04-16 2021-10-21 Bayer Aktiengesellschaft Cyclaminephenylaminoquinolines as fungicides
CA3180157A1 (en) 2020-04-16 2021-10-21 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for controlling meristem size for crop improvement
KR20230007398A (ko) 2020-04-21 2023-01-12 바이엘 악티엔게젤샤프트 해충 방제제로서 2-(헤트)아릴-치환된 축합 헤테로시클릭 유도체
EP4143167B1 (en) 2020-04-28 2024-05-15 Basf Se Pesticidal compounds
EP3903583A1 (en) 2020-04-28 2021-11-03 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors iii
EP3903584A1 (en) 2020-04-28 2021-11-03 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors iv
EP3903582A1 (en) 2020-04-28 2021-11-03 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors ii
EP3903581A1 (en) 2020-04-28 2021-11-03 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors i
TW202208347A (zh) 2020-05-06 2022-03-01 德商拜耳廠股份有限公司 作為殺蟲劑之新穎雜芳基三唑化合物
JP2023538713A (ja) 2020-05-06 2023-09-11 バイエル、アクチエンゲゼルシャフト 殺真菌性化合物としてのピリジン（チオ）アミド
CN115605462A (zh) 2020-05-12 2023-01-13 拜耳公司（De） 作为杀真菌化合物的三嗪和嘧啶(硫代)酰胺
EP3909950A1 (en) 2020-05-13 2021-11-17 Basf Se Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests
BR112022023550A2 (pt) 2020-05-19 2023-01-03 Bayer Cropscience Ag (tio)amidas azabicíclicas como compostos fungicidas
WO2021247477A1 (en) 2020-06-02 2021-12-09 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for controlling meristem size for crop improvement
US20230278994A1 (en) 2020-06-04 2023-09-07 Bayer Aktiengesellschaft Heterocyclyl pyrimidines and triazines as novel fungicides
EP3945089A1 (en) 2020-07-31 2022-02-02 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors v
CA3186659A1 (en) 2020-06-10 2021-12-16 Bayer Aktiengesellschaft Azabicyclyl-substituted heterocycles as fungicides
WO2021249800A1 (en) 2020-06-10 2021-12-16 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole compounds as fungicides
UY39278A (es) 2020-06-17 2022-01-31 Pairwise Plants Services Inc Métodos para el control del tamaño del meristemo para la mejora de cultivos
EP4167738A1 (en) 2020-06-18 2023-04-26 Bayer Aktiengesellschaft Composition for use in agriculture
KR20230026388A (ko) 2020-06-18 2023-02-24 바이엘 악티엔게젤샤프트 작물 보호를 위한 살진균제로서의 3-(피리다진-4-일)-5,6-디히드로-4h-1,2,4-옥사디아진 유도체
BR112022025692A2 (pt) 2020-06-19 2023-02-28 Bayer Ag 1,3,4-oxadiazóis e seus derivados como fungicidas
UY39275A (es) 2020-06-19 2022-01-31 Bayer Ag 1,3,4-oxadiazol pirimidinas como fungicidas, procesos e intermediarios para su preparación, métodos de uso y usos de los mismos
WO2021255089A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 Bayer Aktiengesellschaft 1,3,4-oxadiazole pyrimidines and 1,3,4-oxadiazole pyridines as fungicides
UY39276A (es) 2020-06-19 2022-01-31 Bayer Ag Uso de compuestos de 1,3,4–oxadiazol–2–ilpirimidina para controlar microorganismos fitopatógenos, métodos de uso y composiciones.
EP3929189A1 (en) 2020-06-25 2021-12-29 Bayer Animal Health GmbH Novel heteroaryl-substituted pyrazine derivatives as pesticides
BR112022026904A2 (pt) 2020-07-02 2023-01-24 Bayer Ag Derivados de heterocicleno como agentes de controle de pragas
EP3960727A1 (en) 2020-08-28 2022-03-02 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors vi
EP3939961A1 (en) 2020-07-16 2022-01-19 Basf Se Strobilurin type compounds and their use for combating phytopathogenic fungi
WO2022017836A1 (en) 2020-07-20 2022-01-27 BASF Agro B.V. Fungicidal compositions comprising (r)-2-[4-(4-chlorophenoxy)-2-(trifluoromethyl)phenyl]-1- (1,2,4-triazol-1-yl)propan-2-ol
US20240011043A1 (en) 2020-07-31 2024-01-11 Inari Agriculture Technology, Inc. Generation of plants with improved transgenic loci by genome editing
BR112023001845A2 (pt) * 2020-07-31 2023-02-23 Inari Agriculture Tech Inc Célula de planta de soja transgênica, planta e parte de planta de soja transgênica, métodos de obtenção de uma população a granel de sementes endogâmicas e de semente de soja híbrida, molécula de dna, produto de planta de soja transgênica processado, amostra biológica, molécula de ácido nucleico adaptada para detecção de dna genômico, método para detectar uma célula de planta de soja, método de excisão do lócus transgênico inht26 do genoma da célula de planta de soja
EP3970494A1 (en) 2020-09-21 2022-03-23 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors viii
WO2022033991A1 (de) 2020-08-13 2022-02-17 Bayer Aktiengesellschaft 5-amino substituierte triazole als schädlingsbekämpfungsmittel
CA3190181A1 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Yunxing Cory Cui Yield improvement
WO2022053453A1 (de) 2020-09-09 2022-03-17 Bayer Aktiengesellschaft Azolcarboxamide als schädlingsbekämpfungsmittel
WO2022058327A1 (en) 2020-09-15 2022-03-24 Bayer Aktiengesellschaft Substituted ureas and derivatives as new antifungal agents
EP3974414A1 (de) 2020-09-25 2022-03-30 Bayer AG 5-amino substituierte pyrazole und triazole als schädlingsbekämpfungsmittel
WO2022089969A1 (en) 2020-10-27 2022-05-05 BASF Agro B.V. Compositions comprising mefentrifluconazole
WO2022090069A1 (en) 2020-11-02 2022-05-05 Basf Se Compositions comprising mefenpyr-diethyl
WO2022090071A1 (en) 2020-11-02 2022-05-05 Basf Se Use of mefenpyr-diethyl for controlling phytopathogenic fungi
CN112375838B (zh) * 2020-11-19 2024-06-28 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 一种转基因甘蔗scag2的t-dna侧翼序列及其转化事件特异性鉴定方法
CN112391490B (zh) * 2020-11-19 2024-06-28 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 一种转基因甘蔗事件scag5的外源插入片段侧翼序列及其品系特异性检测方法
WO2022106304A1 (en) 2020-11-23 2022-05-27 BASF Agro B.V. Compositions comprising mefentrifluconazole
CA3201212A1 (en) 2020-12-14 2022-06-23 Rizwan Shabbir SHAIKH Sulfoximine pesticides
EP3915971A1 (en) 2020-12-16 2021-12-01 Bayer Aktiengesellschaft Phenyl-s(o)n-phenylamidines and the use thereof as fungicides
WO2022129188A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Bayer Aktiengesellschaft 1,2,4-oxadiazol-3-yl pyrimidines as fungicides
WO2022129196A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Bayer Aktiengesellschaft Heterobicycle substituted 1,2,4-oxadiazoles as fungicides
WO2022129190A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Bayer Aktiengesellschaft (hetero)aryl substituted 1,2,4-oxadiazoles as fungicides
CN116669554A (zh) 2020-12-18 2023-08-29 拜耳公司 使用Dhodh抑制剂来防治作物中的抗性植物病原性真菌
EP4036083A1 (de) 2021-02-02 2022-08-03 Bayer Aktiengesellschaft 5-oxy substituierte hetereozyklen, als schädlingsbekämpfungsmittel
EP4043444A1 (en) 2021-02-11 2022-08-17 Basf Se Substituted isoxazoline derivatives
BR112023015909A2 (pt) 2021-02-11 2023-11-21 Monsanto Technology Llc Métodos e composições para modificar níveis de citocinina oxidase em plantas
US20220380792A1 (en) 2021-02-25 2022-12-01 Pairwise Plants Services, Inc Methods and compositions for modifying root architecture in plants
BR112023019788A2 (pt) 2021-03-30 2023-11-07 Bayer Ag 3-(hetero)aril-5-clorodifluorometil-1,2,4-oxadiazol como fungicida
BR112023019400A2 (pt) 2021-03-30 2023-12-05 Bayer Ag 3-(hetero)aril-5-clorodifluorometil-1,2,4-oxadiazol como fungicida
CN117479836A (zh) 2021-05-03 2024-01-30 巴斯夫欧洲公司 提高农药微生物的农药有效性的添加剂
EP4334315A1 (en) 2021-05-06 2024-03-13 Bayer Aktiengesellschaft Alkylamide substituted, annulated imidazoles and use thereof as insecticides
WO2022238391A1 (de) 2021-05-12 2022-11-17 Bayer Aktiengesellschaft 2-(het)aryl-substituierte kondensierte heterocyclen-derivate als schädlingsbekämpfungsmittel
EP4091451A1 (en) 2021-05-17 2022-11-23 BASF Agro B.V. Compositions comprising mefentrifluconazole
KR20240008857A (ko) 2021-05-18 2024-01-19 바스프 에스이 살진균제로서의 신규한 치환된 피리딘
CN117355520A (zh) 2021-05-18 2024-01-05 巴斯夫欧洲公司 用作杀真菌剂的新型取代喹啉类
WO2022243111A1 (en) 2021-05-18 2022-11-24 Basf Se New substituted pyridines as fungicides
EP4355764A1 (en) 2021-06-14 2024-04-24 Basf Se Yield improvement by gene combinations
MX2023014775A (es) 2021-06-17 2024-01-15 Pairwise Plants Services Inc Modificacion de factores de transcripcion de la familia de factores reguladores del crecimiento en soja.
UY39827A (es) 2021-06-24 2023-01-31 Pairwise Plants Services Inc Modificación de genes de ubiquitina ligasa e3 hect para mejorar los rasgos de rendimiento
MX2023014883A (es) 2021-07-01 2024-02-12 Pairwise Plants Services Inc Metodos y composiciones para mejorar el desarrollo del sistema radicular.
EP4119547A1 (en) 2021-07-12 2023-01-18 Basf Se Triazole compounds for the control of invertebrate pests
WO2023011957A1 (en) 2021-08-02 2023-02-09 Basf Se (3-quinolyl)-quinazoline
JP2024528144A (ja) 2021-08-02 2024-07-26 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア （３－ピリジル）－キナゾリン
CN118076742A (zh) 2021-08-12 2024-05-24 成对植物服务股份有限公司 修饰油菜素内酯受体基因以改善产量性状
JP2024529148A (ja) 2021-08-13 2024-08-01 バイエル、アクチエンゲゼルシャフト 活性化合物組合せおよびこれらを含む抗真菌剤組成物
EP4388110A1 (en) 2021-08-17 2024-06-26 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying cytokinin receptor histidine kinase genes in plants
EP4140986A1 (en) 2021-08-23 2023-03-01 Basf Se Pyrazine compounds for the control of invertebrate pests
CA3229873A1 (en) 2021-08-25 2023-03-02 Bayer Aktiengesellschaft Novel pyrazinyl-triazole compounds as pesticides
EP4140995A1 (en) 2021-08-27 2023-03-01 Basf Se Pyrazine compounds for the control of invertebrate pests
CA3230167A1 (en) 2021-08-30 2023-03-09 Pairwise Plants Services, Inc. Modification of ubiquitin binding peptidase genes in plants for yield trait improvement
EP4144739A1 (de) 2021-09-02 2023-03-08 Bayer Aktiengesellschaft Anellierte pyrazole als schädlingsbekämpfungsmittel
AR126938A1 (es) 2021-09-02 2023-11-29 Pairwise Plants Services Inc Métodos y composiciones para mejorar la arquitectura de las plantas y los rasgos de rendimiento
EP4151631A1 (en) 2021-09-20 2023-03-22 Basf Se Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests
CA3232804A1 (en) 2021-09-21 2023-03-30 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for reducing pod shatter in canola
EP4413127A1 (en) 2021-10-04 2024-08-14 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for improving floret fertility and seed yield
EP4413022A2 (en) 2021-10-07 2024-08-14 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for improving floret fertility and seed yield
WO2023072670A1 (en) 2021-10-28 2023-05-04 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors x
WO2023072671A1 (en) 2021-10-28 2023-05-04 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors ix
EP4426677A1 (en) 2021-11-03 2024-09-11 Bayer Aktiengesellschaft Bis(hetero)aryl thioether (thio)amides as fungicidal compounds
EP4441049A1 (en) 2021-11-30 2024-10-09 Bayer Aktiengesellschaft Bis(hetero)aryl thioether oxadiazines as fungicidal compounds
EP4194453A1 (en) 2021-12-08 2023-06-14 Basf Se Pyrazine compounds for the control of invertebrate pests
AR127904A1 (es) 2021-12-09 2024-03-06 Pairwise Plants Services Inc Métodos para mejorar la fertilidad de floretes y el rendimiento de semillas
EP4198033A1 (en) 2021-12-14 2023-06-21 Basf Se Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests
EP4198023A1 (en) 2021-12-16 2023-06-21 Basf Se Pesticidally active thiosemicarbazone compounds
AR128372A1 (es) 2022-01-31 2024-04-24 Pairwise Plants Services Inc Supresión de la respuesta de evitación de la sombra en las plantas
WO2023148028A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 Globachem Nv Methods and compositions for controlling pests
WO2023148036A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 Globachem Nv Methods and compositions for controlling pests in soybean
WO2023156402A1 (en) 2022-02-17 2023-08-24 Basf Se Pesticidally active thiosemicarbazone compounds
CN118715324A (zh) 2022-02-18 2024-09-27 巴斯夫欧洲公司 香豆素合成及其用途
MX2024010647A (es) 2022-03-02 2024-09-06 Pairwise Plants Services Inc Modificacion de genes del receptor de brasinoesteroides para mejorar rasgos de rendimiento.
EP4238971A1 (en) 2022-03-02 2023-09-06 Basf Se Substituted isoxazoline derivatives
AU2023243430A1 (en) 2022-03-31 2024-10-24 Pairwise Plants Services, Inc. Early flowering rosaceae plants with improved characteristics.
US20230357789A1 (en) 2022-04-07 2023-11-09 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving resistance to fusarium head blight
US20230383305A1 (en) 2022-04-21 2023-11-30 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving yield traits
US20230348922A1 (en) 2022-05-02 2023-11-02 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for enhancing yield and disease resistance
AU2023264210A1 (en) 2022-05-03 2024-10-31 Bayer Aktiengesellschaft Use of (5s)-3-[3-(3-chloro-2-fluorophenoxy)-6-methylpyridazin-4-yl]-5-(2-chloro-4-methylbenzyl)-5,6-dihydro-4h-1,2,4-oxadiazine for controlling unwanted microorganisms
WO2023213670A1 (en) 2022-05-03 2023-11-09 Bayer Aktiengesellschaft Crystalline forms of (5s)-3-[3-(3-chloro-2-fluorophenoxy)-6-methylpyridazin-4-yl]-5-(2-chloro-4-methylbenzyl)-5,6-dihydro-4h-1,2,4-oxadiazine
WO2023215809A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying root architecture and/or improving plant yield traits
AR129709A1 (es) 2022-06-27 2024-09-18 Pairwise Plants Services Inc Métodos y composiciones para modificar el escape a la sombra en plantas
AR129749A1 (es) 2022-06-29 2024-09-25 Pairwise Plants Services Inc Métodos y composiciones para controlar el tamaño del meristemo para el mejoramiento de cultivos
US20240002873A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement
WO2024018016A1 (en) 2022-07-21 2024-01-25 Syngenta Crop Protection Ag Crystalline forms of 1,2,4-oxadiazole fungicides
WO2024028243A1 (en) 2022-08-02 2024-02-08 Basf Se Pyrazolo pesticidal compounds
US20240043857A1 (en) 2022-08-04 2024-02-08 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving yield traits
US20240060081A1 (en) 2022-08-11 2024-02-22 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement
WO2024033374A1 (en) 2022-08-11 2024-02-15 Syngenta Crop Protection Ag Novel arylcarboxamide or arylthioamide compounds
US20240090466A1 (en) 2022-09-08 2024-03-21 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving yield characteristics in plants
EP4342885A1 (en) 2022-09-20 2024-03-27 Basf Se N-(3-(aminomethyl)-phenyl)-5-(4-phenyl)-5-(trifluoromethyl)-4,5-dihydroisoxazol-3-amine derivatives and similar compounds as pesticides
WO2024068517A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Bayer Aktiengesellschaft 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide
WO2024068518A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Bayer Aktiengesellschaft 3-heteroaryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide
WO2024068519A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Bayer Aktiengesellschaft 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide
WO2024068520A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Bayer Aktiengesellschaft 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide
EP4295688A1 (en) 2022-09-28 2023-12-27 Bayer Aktiengesellschaft Active compound combination
GB202214202D0 (en) 2022-09-28 2022-11-09 Syngenta Crop Protection Ag Agricultural methods
GB202214203D0 (en) 2022-09-28 2022-11-09 Syngenta Crop Protection Ag Fungicidal compositions
EP4361126A1 (en) 2022-10-24 2024-05-01 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors xv
WO2024100069A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal pyridine derivatives
WO2024104823A1 (en) 2022-11-16 2024-05-23 Basf Se New substituted tetrahydrobenzoxazepine
WO2024104815A1 (en) 2022-11-16 2024-05-23 Basf Se Substituted benzodiazepines as fungicides
WO2024104822A1 (en) 2022-11-16 2024-05-23 Basf Se Substituted tetrahydrobenzodiazepine as fungicides
WO2024104818A1 (en) 2022-11-16 2024-05-23 Basf Se Substituted benzodiazepines as fungicides
EP4385326A1 (en) 2022-12-15 2024-06-19 Kimitec Biogorup Biopesticide composition and method for controlling and treating broad spectrum of pests and diseases in plants
WO2024137438A2 (en) 2022-12-19 2024-06-27 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Insect toxin genes and methods for their use
EP4389210A1 (en) 2022-12-21 2024-06-26 Basf Se Heteroaryl compounds for the control of invertebrate pests
WO2024165343A1 (en) 2023-02-08 2024-08-15 Basf Se New substituted quinoline compounds for combatitng phytopathogenic fungi
WO2024173622A1 (en) 2023-02-16 2024-08-22 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying shade avoidance in plants
US20240294933A1 (en) 2023-03-02 2024-09-05 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying shade avoidance in plants
US20240301438A1 (en) 2023-03-09 2024-09-12 Pairwise Plants Services, Inc. Modification of brassinosteroid signaling pathway genes for improving yield traits in plants
WO2024194038A1 (en) 2023-03-17 2024-09-26 Basf Se Substituted pyridyl/pyrazidyl dihydrobenzothiazepine compounds for combatting phytopathogenic fungi
EP4455137A1 (en) 2023-04-24 2024-10-30 Basf Se Pyrimidine compounds for the control of invertebrate pests
WO2024223034A1 (en) 2023-04-26 2024-10-31 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors xvi

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5658772A (en) 1989-12-22 1997-08-19 E. I. Du Pont De Nemours And Company Site-specific recombination of DNA in plant cells
US6235974B1 (en) 1996-12-05 2001-05-22 Cornell Research Foundation, Inc. Hypersensitive response induced resistance in plants by seed treatment with a hypersensitive response elicitor
US7105724B2 (en) 1997-04-04 2006-09-12 Board Of Regents Of University Of Nebraska Methods and materials for making and using transgenic dicamba-degrading organisms
US6245974B1 (en) * 1997-08-06 2001-06-12 North Carolina State University Matrix attachment regions
US6720475B1 (en) 1997-11-18 2004-04-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Modified nucleic acid sequence encoding FLP recombinase
US20060127889A1 (en) * 2000-07-25 2006-06-15 Dotson Stanton B Method for assessing transgene expression and copy number
US20040016025A1 (en) 2001-09-26 2004-01-22 Paul Budworth Rice promoters for regulation of plant expression
EP2298901B2 (en) 2004-04-30 2017-04-26 Dow AgroSciences LLC Novel herbicide resistance genes
US7402428B2 (en) * 2004-09-22 2008-07-22 Arborgen, Llc Modification of plant lignin content
PT1827078E (pt) * 2004-12-21 2014-05-26 Monsanto Technology Llc Plantas transgénicas com características agronómicas melhoradas
CA2596332A1 (en) * 2005-02-04 2006-08-10 Dow Agrosciences, Llc Anti-t cell and autoantigen treatment of autoimmune disease
AP2693A (en) * 2005-05-27 2013-07-16 Monsanto Technology Llc Soybean event MON89788 and methods for detection thereof
EP3241430B1 (en) * 2005-10-28 2020-08-26 Dow AgroSciences LLC Novel herbicide resistance genes
US7855326B2 (en) * 2006-06-06 2010-12-21 Monsanto Technology Llc Methods for weed control using plants having dicamba-degrading enzymatic activity
US7951995B2 (en) * 2006-06-28 2011-05-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean event 3560.4.3.5 and compositions and methods for the identification and detection thereof
CA2660485C (en) 2006-08-11 2016-04-12 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger nuclease-mediated homologous recombination
DK2412812T3 (en) 2006-12-14 2015-05-26 Dow Agrosciences Llc Optimized non-canonical zinc finger proteins
MX2009006437A (es) * 2006-12-22 2009-06-26 Basf Plant Science Gmbh Promotores inducibles por nematodos de gen peroxidasa y metodos de uso.
AR066520A1 (es) * 2007-05-09 2009-08-26 Dow Agrosciences Llc Nuevos genes de resistencia a herbicidas
RU2351121C1 (ru) * 2007-09-17 2009-04-10 Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской Академии наук Способ получения трансгенных однодольных растений
WO2011066382A1 (en) * 2009-11-24 2011-06-03 Dow Agrosciences Llc Control of aad dicot volunteers in monocot crops
IN2012DN04901A (es) 2009-11-24 2015-09-25 Dow Agrosciences Llc
BR112012012494A2 (pt) * 2009-11-24 2020-11-03 Dow Agrosciences Llc detecção de evento de soja aad-12 416

Also Published As

Publication number Publication date
HK1176516A1 (zh) 2013-08-02
AR079149A1 (es) 2011-12-28
EP2503871B1 (en) 2017-06-14
US20130324408A1 (en) 2013-12-05
WO2011066384A1 (en) 2011-06-03
AR108409A2 (es) 2018-08-15
JP2016198097A (ja) 2016-12-01
CN102711444A (zh) 2012-10-03
KR101906605B1 (ko) 2018-10-10
CL2012001341A1 (es) 2012-10-05
JP6262284B2 (ja) 2018-01-17
ZA201203766B (en) 2013-01-30
MX341974B (es) 2016-09-07
AR108405A2 (es) 2018-08-15
UY33059A (es) 2011-06-30
AU2010324752B2 (en) 2016-04-21
IN2012DN04843A (es) 2015-09-25
UA109644C2 (uk) 2015-09-25
UA112408C2 (uk) 2016-09-12
AR108408A2 (es) 2018-08-15
EP2503871A1 (en) 2012-10-03
EP2503871A4 (en) 2013-04-24
RU2603252C2 (ru) 2016-11-27
KR20120102719A (ko) 2012-09-18
CA2781375A1 (en) 2011-06-03
RU2012126077A (ru) 2013-12-27
IL219933A0 (en) 2012-07-31
UA113610C2 (xx) 2017-02-27
IL219933A (en) 2016-07-31
JP6261863B2 (ja) 2018-01-17
BR112012012511A2 (pt) 2015-09-15
AR108406A2 (es) 2018-08-15
CN104928256A (zh) 2015-09-23
CA2781375C (en) 2020-05-05
US9944944B2 (en) 2018-04-17
JP2013511985A (ja) 2013-04-11
AU2010324752A1 (en) 2012-06-07
AR108407A2 (es) 2018-08-15
CO6640202A2 (es) 2013-03-22
CN102711444B (zh) 2015-08-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2010324752B2 (en) AAD-12 event 416, related transgenic soybean lines, and event-specific identification thereof
US20240147996A1 (en) Stacked herbicide tolerance event 8264.44.06.1, related transgenic soybean lines, and detection thereof
RU2636021C2 (ru) Линии трансгенной сои, генетическое событие 8264.42.32.1, устойчивое к гербицидам с пакетированными генами на его основе, и их детектирование
KR101787776B1 (ko) Ａａｄ-１ 이벤트 ｄａｓ-４０２７８-９, 관련 트랜스제닉 옥수수 식물주, 및 그의 이벤트-특이적 확인
KR101899619B1 (ko) Aad-1 식물에 관련된 잡초 방제 방법 및 식재-전 및/또는 발아-전 제초제 적용
NZ615200B2 (en) Methods of weed control involving aad-1 plants, and re-plant and/or pre-emergence herbicide applications

Legal Events

Date Code Title Description
FG Grant or registration