WO2021193682A1

WO2021193682A1 - 免疫学的分析方法及び免疫学的分析試薬キット

Info

Publication number: WO2021193682A1
Application number: PCT/JP2021/012119
Authority: WO
Inventors: 茂雄高山
Original assignee: 積水メディカル株式会社
Priority date: 2020-03-25
Filing date: 2021-03-24
Publication date: 2021-09-30
Also published as: CN115023611A; JPWO2021193682A1

Abstract

免疫学的分析方法において感度を向上させ、且つ被検出物質を正確に分析する技術を提供することを課題とする。　被検出物質を含有する可能性のある生物学的サンプルと、ポリエチレングリコール修飾抗体及び標識物質のコンジュゲートとを接触させることを含む、被検出物質の免疫学的分析方法により、前記課題を解決することができる。

Description

免疫学的分析方法及び免疫学的分析試薬キット

　本発明は、被検出物質を検出するための免疫学的分析方法及び免疫学的分析試薬キットに関する。本発明は、被検出物質を検出するための免疫学的分析方法における測定誤差低減方法にも関する。本発明は、ポリエチレングリコール修飾抗体及びルテニウム錯体のコンジュゲートの調製方法にも関する。

　生体試料中の被検出物質の量を分析する際に、被検出物質に対する抗体を用いて分析を行う免疫学的分析法が使用されることがある。免疫学的分析法の中でも、発光や蛍光を検知して試料中の被検出物質を測定する方法は、簡便かつ高感度な分析が可能であり、イムノプレートリーダなどの分析装置を使用して自動化が可能なことから、臨床検査をはじめ多くの分野で利用されている。

　発光や蛍光を検知する方法では、被検出物質の量の測定値を得る際に、生体試料を添加していないブランクの値を差し引く必要がある。しかしながら、抗体に疎水性の高い標識物質を抱合すると、標識抗体が担体に付着してしまい被検出物質の量を正確に測定できない場合があった。また、標識抗体同士が凝集することにより、被検出物質の量を正確に測定することができない場合も観察された。
　特許文献１は、解離基又は極性基を持ち、かつ抗体のアミノ基と反応し得る置換基を有する親水性化合物と抗体との結合物を、水溶性高分子化合物及び化学発光物質と結合させてなることを特徴とする化学ルミネッセント免疫定量用試薬を教示する。特許文献１では、中性ｐＨ条件下で溶解性の低い標識物質を用いる場合に、抗体に低等電点のリンカーを付加することで標識抗体の等電点を下げ、中性ｐＨ条件下の溶解性を上昇させている。しかしながら、感度を向上させるために、より多くの標識物質で標識された抗体を用いることによりさらに感度を向上させ、被検出物質の量を正確に測定する技術が求められていた。

特開昭５８－７７６６２号公報

　本発明の目的は、免疫学的分析方法において感度を向上させ、被検出物質の量及び／又は存在を正確に分析する技術を提供することである。

　本発明者らは、被検出物質の免疫学的分析方法において、被検出物質を含有する可能性のある生物学的サンプル、捕捉抗体を固定化した担体、及びポリエチレングリコール修飾抗体に標識物質をコンジュゲートした標識抗体を接触させる際に、標識抗体の凝集、標識抗体の担体への非特異的な吸着等を防止して、被検出物質を正確に分析することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明は具体的には、以下の通りである。
＜１＞　被検出物質を含有する可能性のある生物学的サンプルと、ポリエチレングリコール修飾抗体及び標識物質のコンジュゲートとを接触させること
を含む、被検出物質の免疫学的分析方法。
＜２＞　被検出物質を含有する可能性のある生物学的サンプルが、血液、血漿、及び血清及び尿からなる群から選択される１つ以上である、＜１＞に記載の免疫学的分析方法。
＜３＞　ポリエチレングリコールの重量平均分子量（ＭＷ）が、２５０～１５０００である、＜１＞又は＜２＞に記載の免疫学的分析方法。
＜４＞　標識物質が電気化学発光物質であり、免疫学的分析方法が電気化学発光法（ＥＣＬ法）である、＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の免疫学的分析方法。
＜５＞　ポリエチレングリコール修飾抗体が、ポリエチレングリコール修飾ＩｇＭ抗体又はポリエチレングリコール修飾ＩｇＧ抗体である、＜１＞～＜４＞のいずれかに記載の免疫学的分析方法。
＜６＞　抗体１分子における標識物質の結合分子数が、１０～２００である、＜１＞～＜５＞のいずれかに記載の免疫学的分析方法。
＜７＞　ポリエチレングリコール修飾抗体及び標識物質のコンジュゲート
を含む、被検出物質の免疫学的分析用試薬キット。
＜８＞　血液、血漿、及び血清からなる群から選択される１つ以上の生物学的サンプルに対して使用するための、＜７＞に記載の免疫学的分析用試薬キット。
＜９＞　ポリエチレングリコールの重量平均分子量（ＭＷ）が、２５０～１５０００である、＜７＞又は＜８＞に記載の免疫学的分析用試薬キット。
＜１０＞　標識物質が電気化学発光物質であり、免疫学的分析が電気化学発光法（ＥＣＬ法）である、＜７＞～＜９＞のいずれかに記載の免疫学的分析用試薬キット。
＜１１＞　ポリエチレングリコール修飾抗体が、ポリエチレングリコール修飾ＩｇＭ抗体又はポリエチレングリコール修飾ＩｇＧ抗体である、＜７＞～＜１０＞のいずれかに記載の免疫学的分析用試薬キット。
＜１２＞　抗体１分子における標識物質の結合分子数が、１０～２００である、＜７＞～＜１１＞のいずれかに記載の免疫学的分析用試薬キット。
＜１３＞　被検出物質を含有する可能性のある生物学的サンプルと、ポリエチレングリコール修飾抗体及び標識物質のコンジュゲートとを接触させること、
を含む、被検出物質の免疫学的分析における測定誤差低減方法。
＜１４＞　被検出物質を含有する可能性のある生物学的サンプルが、血液、血漿、及び血清からなる群から選択される１つ以上である、＜１３＞に記載の測定誤差低減方法。
＜１５＞　ポリエチレングリコールの重量平均分子量（ＭＷ）が、２５０～１５０００である、＜１３＞又は＜１４＞に記載の測定誤差低減方法。
＜１６＞　以下の工程（１）～（３）を含む、ポリエチレングリコール修飾抗体及びルテニウム錯体のコンジュゲートの調製方法
（１）抗体とルテニウム錯体とを接触させ、第一複合体を形成させる第一複合体形成工程と、
（２）ポリエチレングリコールと第一複合体とを接触させ、ポリエチレングリコール修飾抗体及びルテニウム錯体のコンジュゲートを形成させるコンジュゲート形成工程と、
（３）抗体と結合していない遊離ルテニウム錯体を除去する、遊離ルテニウム錯体除去工程。
＜１７＞　前記コンジュゲート形成工程（２）が、前記遊離ルテニウム錯体除去工程（３）の後に行われる、＜１６＞に記載のポリエチレングリコール修飾抗体及びルテニウム錯体のコンジュゲートの調製方法。
　本発明は、以下の実施形態も包含する。
（ａ）抗体が、モノクローナル抗体である、＜１＞～＜６＞のいずれかに記載の免疫学的分析方法。
（ｂ）抗体が、モノクローナル抗体である、＜７＞～＜１２＞のいずれかに記載の免疫学的分析用試薬キット。
（ｃ）抗体が、モノクローナル抗体である、＜１３＞～＜１５＞のいずれかに記載の測定誤差低減方法。
（ｄ）抗体が、モノクローナル抗体である、＜１６＞又は＜１７＞に記載のポリエチレングリコール修飾抗体及びルテニウム錯体のコンジュゲートの調製方法。

　本発明によれば、ブランク値のばらつきを低減することができる。さらに詳細には、本発明によれば、抗体１分子当たりの標識物質の結合分子数を増加させても、ブランク値のばらつき、標識抗体の担体への非特異的吸着によるブランク値の上昇、及び標識物質を介した標識抗体同士の凝集を防止することができる。したがって、本発明によれば、感度よく正確に被検出物質の量を測定することができる。

本発明の免疫学的分析方法において使用されるポリエチレングリコール修飾抗体及び標識物質のコンジュゲートの一例を示す模式図である。本発明の免疫学的分析方法の一実施形態である、ＥＣＬ法の手順及び原理を示す模式図である。

（被検出物質）
　本発明の免疫学的分析方法における被検出物質は、抗原抗体反応を利用して測定し得る、抗原となり得る物質である。本発明の免疫学的分析方法における被検出物質は、例えば以下の物質が挙げられる。
ＣＫ－ＭＢ、ＨＦＡＢＰ、トロポニン（トロポニンＩ、トロポニンＴ）、ミオグロビン等の心筋マーカー：フィブリン分解産物（例えばＤダイマー）、可溶性フィブリン、ＴＡＴ（トロンビン－アンチトロンビン複合体）、ＰＩＣ（プラスミン－プラスミンインヒビター複合体）などの凝固・線溶マーカー：酸化ＬＤＬ、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）などの循環関連マーカー：アディポネクチンなどの代謝関連マーカー：ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＡＦＰ（α－フェトプロテイン）、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、ムチン型糖タンパク質などの腫瘍マーカー：ＣＲＰ（Ｃ反応性蛋白）、ＬＲＧ（ロイシンリッチαグリコプロテイン）などの炎症関係マーカー：インフルエンザ、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス）、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）、トキソプラズマ、クラミジア、梅毒、黄色ブドウ球菌、大腸菌、プロカルシトニンなどの感染症関連マーカー。

（生物学的サンプル）
　本発明において、被検出物質を含有する可能性のある生物学的サンプルとしては、主に生体（生物）由来の物質やそれらから被検出物質を抽出した抽出液等が挙げられる。生体（生物）由来の物質としては、具体的には、血液（全血）、血清、血漿、リンパ液、尿、糞便、腹水、胸水、脳脊髄液などが挙げられる。本発明では、生物学的サンプルとして体液、特に血液（全血）、血清、血漿、及び尿からなる群から選択される１つ以上を使用することが好ましい。被検出物質を含有する可能性のある生物学的サンプルには、前記全血などから、遠心分離、ろ過、精製などの手段により分離・分画された成分、有機溶媒などにより抽出された成分、界面活性剤などにより可溶化された成分、緩衝液などにより希釈された成分、又は化学反応などにより修飾若しくは改変された成分などが含まれる。

（免疫学的分析方法）
　本発明の免疫学的分析方法としては、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬ法）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、ラテックス凝集免疫測定法（ＬＴＩＡ法）、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の免疫学的分析方法は、好ましくは電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬ法）である。
　また、本明細書中、「分析」は、被検出物質の存在の証明及び／又は定量を含むものである。また、ポリエチレングリコール修飾抗体及び標識物質のコンジュゲートをＰＥＧ修飾標識抗体と称することがある。

　電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬ法）とは、通電により標識物質を発光させ、その発光量を検出することで被検出物質の量を測定する方法を意味する。電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬ法）では、標識物質として、ルテニウム錯体を用いることができる。固相（マイクロプレート等）に電極を設置してこの電極上でラジカルを発生させることによりルテニウム錯体を励起状態にして発光させる。そして、このルテニウム錯体の発光量を検出することができる。
　第一抗体を固相抗体として用い、第一抗体とは別のエピトープを認識する第二抗体を検出抗体（標識抗体）として用いて、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬ法）を行うことができる。標識抗体として、標識物質を結合させたポリエチレングリコール修飾抗体（ＰＥＧ修飾標識抗体）を使用する。被検出物質上に同一のエピトープが複数存在する場合は固相抗体及びＰＥＧ修飾標識抗体として同一の抗体を使用することができる。不溶性担体粒子として磁性粒子、ＰＥＧ修飾標識物質としてルテニウム錯体を用いた際の測定原理は、以下のとおりである。下記は本発明の一実施形態における測定原理を示すものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
１．抗体を固相化した磁性粒子と生物学的サンプルとを接触させると、生物学的サンプル中の被検出物質が固相抗体と結合する。
２．その後、ＰＥＧ修飾標識抗体を接触させると、磁性粒子に結合した被検出物質にＰＥＧ修飾標識抗体が結合する。
３．未結合のＰＥＧ修飾標識抗体を除去した後、通電すると被検出物質に結合したＰＥＧ修飾標識抗体量に応じて発光する。この発光量を計測することにより、検体中の被検出物質の量を正確に測定する。

　免疫学的分析方法の中で、酵素標識を用いる酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）も、簡便且つ迅速に標的を測定することができて好ましい。サンドイッチＥＬＩＳＡの場合、被検出物質を認識する第一抗体（固相抗体）を固定化した不溶性担体と、標識物質で標識された第二抗体（標識抗体）とを使用する。標識抗体として、標識物質を結合させたポリエチレングリコール修飾抗体（ＰＥＧ修飾標識抗体）を使用する。使用する第一抗体が被検出物質上の複数のエピトープを認識する場合は、第一抗体を固相抗体及び標識抗体として使用することができる。不溶性担体はプレート（イムノプレート）が好ましい。
　不溶性担体に固定化された固相抗体は、生物学的サンプル中の被検出物質を捕捉し、不溶性担体上で抗体－被検出物質複合体を形成する。ＰＥＧ修飾標識抗体は、前記捕捉された被検出物質に結合して前述の抗体－被検出物質複合体とサンドイッチを形成する。標識物質に応じた方法により標識物質の量を測定することにより、試料中の被検出物質を測定することができる。抗体の不溶性担体への固定化の方法、抗体と標識物質との結合方法等、具体的な方法は、当業者に周知の方法を特に制限なく使用することができる。

　免疫学的測定方法においては抗体が結合した磁性粒子（または抗体が結合した担体）への標識抗体の非特異的な吸着により、抗原無存在下においてもシグナルが検出されてしまう場合がある。例えば、ＥＣＬ法の場合は、磁性粒子に結合した抗体と電気化学発光物質標識抗体の複合体が、抗原無存在下においても一定の割合で生じてしまい、抗原無存在下においても一定の発光が検出されてしまう場合がある。特に、標識物質が、疎水度が高いルテニウム錯体等の場合は、標識抗体の磁性粒子又は担体への非特異的な吸着による偽検出が生じやすくなる。また一般的に免疫測定系で使用されることが多いＩｇＧ抗体と比較して、ＩｇＭ抗体に関しては、ＩｇＭ抗体自体の疎水度の高さから抗体が結合した磁性粒子（または抗体が結合した担体）への非特異的な吸着により、抗原無存在下においてもシグナルが検出されてしまう可能性が高くなる。これを回避するために、ポリエチレングリコール修飾により標識抗体の親水性を上昇させる。これにより、標識抗体の磁性粒子又は担体への非特異的な吸着を抑え、ブランクの値を抑制すること、及び同一の抗原濃度を有する溶液を測定したときの測定値再現性の改善が実現できる。
　また抗体１分子当たりに結合する標識物質の量を増やすことで、検出感度を上昇させることが可能である。しかしながら、疎水度の高い標識物質を抗体に標識する際に、抗体１分子当たりに結合する標識物質の量が増加するにしたがい、標識抗体の疎水度も高くなる。すなわち、抗体１分子当たりに結合する標識物質の量が増えると、検出感度は上昇するが、ブランクの値の上昇及び再現性悪化といったデメリットが生じ得る。標識抗体をポリエチレングリコールにより修飾することで、抗体１分子当たりに結合する、疎水性の高い標識物質（例えば、ルテニウム錯体等）の量を増加させても、ブランクの値の上昇及び再現性悪化を抑制することができ、したがって、感度の向上と、ブランクの値の上昇及び再現性悪化の抑制とを実現できる。

　本発明の免疫学的分析方法において使用される抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のいずれも公知の方法に従って作製することができるが、モノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体は、例えば、被検出物質又はそのフラグメントで免疫した非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞である脾臓細胞あるいはリンパ節細胞を単離し、これを高い増殖能を有する骨髄腫由来の細胞株等と融合させてハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマが産生した抗体を精製することによって得ることができる。また、ポリクローナル抗体は、被検出物質又はそのフラグメントで免疫した動物の血清から得ることができる。フラグメントは被検出物質の部分的な断片であり、フラグメントに結合する抗体は、被検出物質を認識する。

　抗体としては、抗体分子全体のほかに抗原抗体反応活性を有する抗体のフラグメントを使用することも可能であり、前記のように動物への免疫工程を経て得られたもののほか、遺伝子組み換え技術を使用して得られるものやキメラ抗体を用いることも可能である。抗体の断片としては機能性の断片であることが好ましく、例えば、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖなどが挙げられ、これらのフラグメントは前記のようにして得られる抗体をタンパク質分解酵素（例えば、ペプシンやパパインなど）で処理すること、あるいは該抗体のＤＮＡをクローニングして大腸菌や酵母を用いた培養系で発現させることにより製造できる。

　本発明の免疫学的分析方法において使用される抗体は、被検出物質に特異的に反応する抗体であることが好ましい。「被検出物質に特異的に反応する」とは、被検出物質とは反応するが、他の物質とは実質的に反応しないことを意味する。「実質的に反応しない」の意味は後述する。

　本明細書において、被検出物質と「反応する」、被検出物質を「認識する」、被検出物質と「結合する」は、同義で用いられるが、これらの例示に限定されることはなく、最も広義に解釈する必要がある。抗体が抗原（化合物）と「反応する」か否かの確認は、抗原固相化ＥＬＩＳＡ法、競合ＥＬＩＳＡ法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法などにより行うことができるほか、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅｐｌａｓｍｏｎｒｅｓｏｎａｎｃｅ）の原理を利用した方法（ＳＰＲ法）などにより行うことができる。ＳＰＲ法は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）の名称で市販されている、装置、センサー、試薬類を使用して行うことができる。

　使用される抗体と、ある化合物が「反応しない」とは、本発明に使用される抗体がある化合物と実質的に反応しないことをいい、「実質的に反応しない」とは、例えば、上記ＳＰＲ法に基づき、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００やＴ２００を使用し、本発明に使用される抗体を固定化して測定を行った場合に、本発明に使用される抗体の反応性の増強が認められないことをいう。詳細には、抗体と化合物との反応性が、コントロール（化合物非添加）の反応性と比べて有意な差がないことをいう。上記ＳＰＲ法以外の当業者に周知の方法又は手段によっても「実質的に反応しない」ことを確認できるのはいうまでもない。

　本明細書において、「担体」とは、被検出物質に対して、被検出物質を特異的に認識する抗体等を固定している物質をいう。例えば、イムノプレート、メンブレン、ラテックス粒子、磁性粒子等の不溶性のものが挙げられるが、これらに限定されない。

（ポリエチレングリコール）
　本発明の免疫学的分析方法において用いられるポリエチレングリコール（ポリエチレングリコールを、単にＰＥＧと称することがある）は、本発明の効果が得られる限りにおいて特に限定されることはないが、重合度が２～３００のものが好ましく、より好ましくは２～２００、さらに好ましくは２～１５０、さらに好ましくは２～１００、さらに好ましくは２～５０、さらに好ましくは２～２０、さらに好ましくは２～１０、最も好ましくは４～１０である。なお、重合度とは、ＰＥＧの構造式「ＨＯ―(ＣＨ_２―ＣＨ_２―Ｏ)ｎ―Ｈ」中の「ｎ」を意味する。分岐鎖ＰＥＧの場合には、重合度とは(ＣＨ_２―ＣＨ_２―Ｏ)の全ての繰り返し単位数を示す。すなわち、分岐鎖ＰＥＧの各分岐鎖に、「(ＣＨ_２―ＣＨ_２―Ｏ)ｌ」、「(ＣＨ_２―ＣＨ_２―Ｏ)ｍ」、及び「(ＣＨ_２―ＣＨ_２―Ｏ)ｎ」が含まれる場合には、重合度はｌ＋ｍ＋ｎの合計値を意味する。
　本発明の免疫学的分析方法において用いられるＰＥＧは、重量平均分子量（ＭＷ）に換算すると、好ましくは２５０～１５０００、より好ましくは２５０～１００００、さらに好ましくは２５０～５０００、さらに好ましくは２５０～２０００、さらに好ましくは２５０～１０００である。なお、本明細書において、「２～２００」と記載する場合、その両端の値を含むものとし、この場合は２及び２００を範囲内に含むものとする。分岐型及び直鎖型のいずれのＰＥＧであってもよく、両方を含んでもよい。重量平均分子量（ＭＷ）は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ:Size Exclusion Chromatography）を用いて測定することができる。

（ポリエチレングリコール修飾抗体）
　本明細書において「ポリエチレングリコール修飾抗体」とは、ＰＥＧと接触させることにより、ＰＥＧと化学反応を起こして結合した抗体を意味する。本発明の効果が得られる限りにおいて、抗体の任意の位置で結合が生じればよく、例えば、アミノ基とＰＥＧが反応を起こして結合が生じてもよい。片側末端にＮＨＳ基を有するＰＥＧを用いて、抗体のアミノ基と反応させて結合させることが好ましい。
　本発明の免疫学的分析方法において用いられる抗体は、ポリエチレングリコール修飾抗体であり、好ましくはポリエチレングリコール修飾ＩｇＭ抗体又はポリエチレングリコール修飾ＩｇＧ抗体であり、さらに好ましくは、ポリエチレングリコール修飾ＩｇＭ抗体である。ＩｇＭ抗体は、ＩｇＧ抗体と比較すると、疎水性が強く、疎水性が強い標識物質により標識することでさらに疎水性が強くなる。ポリエチレングリコールを用いてＩｇＭ抗体を修飾することにより、疎水性が強いことによるＩｇＭ抗体同士の凝集等を効果的に防止することができる。ポリエチレングリコールによる抗体の修飾は、被検出物質を分析する直前に行ってもよく、予め作製していた抗体を用いてもよい。ポリエチレングリコール修飾抗体を用いることで、抗体と標識物質との複合体が担体等に吸着すること、又は当該複合体が凝集することを防止することができる。

（ポリエチレングリコール修飾抗体及び標識物質のコンジュゲート）
　本発明の免疫学的分析方法において用いることができるポリエチレングリコール修飾抗体及び標識物質のコンジュゲート、すなわちＰＥＧ修飾標識抗体は本発明の効果が得られる限りにおいて限定されることはないが、ポリエチレングリコール修飾抗体及びルテニウム錯体のコンジュゲートであることが好ましい。本発明の免疫学的分析方法において用いることができる、ポリエチレングリコール修飾抗体及びルテニウム錯体のコンジュゲートは、本発明の効果が得られる限りにおいて限定されないが、例えば、以下のような手順（１）～（３）を含む方法で調製することが可能である。
（１）抗体とルテニウム錯体とを接触させ、第一複合体を形成させる第一複合体形成工程と、
（２）ポリエチレングリコールと第一複合体とを接触させ、ポリエチレングリコール修飾抗体及びルテニウム錯体のコンジュゲートを形成させるコンジュゲート形成工程と、
（３）抗体と結合していない遊離ルテニウム錯体を除去する、遊離ルテニウム錯体除去工程。
　前記調製方法において、ブランク値を低減させるために、前記コンジュゲート形成工程（２）が、前記遊離ルテニウム錯体除去工程（３）の後に行われることが好ましい。他の標識物質を用いた場合でも、コンジュゲートを同様の方法で調製可能である。

　前記（１）第一複合体形成工程において、ルテニウム錯体と抗体との混合比は、ルテニウム錯体と抗体の分子数を基準として、抗体とルテニウム錯体の比率が１：１～１：２００が好ましく、１：５～１：２００がより好ましく、１：１０～１：２００がさらに好ましく、１：２０～１：２００がさらに好ましく、１：５０～１：１５０がさらに好ましい。
　前記（２）コンジュゲート形成工程において、第一複合体とポリエチレングリコールとの混合比は、第一複合体とポリエチレングリコールの分子数を基準として、第一複合体とポリエチレングリコールの比率が１：１～１：１０００、１：１～１：５００、１：５～１：５００、１：１０～１：５００、又は１：３０～１：３００であることができる。

　抗体１分子当たりに結合したルテニウム錯体の数が多い方が、検出感度が高くなる。一方で、この場合、標識物質が疎水性を示す場合には、抗体と標識物質との複合体が担体等に吸着すること、又は当該複合体が凝集することにより、被検出物質の量を正確に測定することができないこともある。しかしながら、そのような場合でも、ポリエチレングリコール修飾抗体を用いることにより、感度よく且つ正確に被検出物質を分析することが可能となる。

　本発明のポリエチレングリコール修飾抗体及び標識物質のコンジュゲートにおいて、抗体１分子当たりに結合する標識物質、好ましくはルテニウム錯体の分子数は、１～２００が好ましく、１０～２００がより好ましく、１５～２００がさらに好ましく、２０～１００がさらに好ましい。抗体への標識物質の結合は、直接結合してもよく、リンカー等を介してもよい。

（標識物質）
　本明細書において「標識物質」とは、被検出物質と直接的又は間接的に結合し、そして被検出物質を検出するためのシグナルを発生させる物質を意味する。標識物質に由来するシグナルの測定は、公知の方法に従って行えばよく、例えば、吸光度あるいは反射光の強度を測定することができる。シグナルは、目視で確認してもよく、特定の測定器を用いて確認してもよい。
　標識抗体を調製するための標識物質としては、例えば酵素、蛍光物質、電気化学発光物質、ビオチン、アビジン、放射性同位体、金コロイド粒子、又は着色ラテックスなどが挙げられる。当業者であれば、使用される抗体と標識物質に応じて、免疫学的分析方法を適宜選択することができる。電気化学発光物質とは、電気エネルギーによって励起され発光する物質であり、ルテニウム錯体及びオスミウム錯体が挙げられる。ルテニウム錯体としては、ルテニウムピリジン錯体が挙げられる。
　免疫学的分析方法として電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬ法）を用い、標識物質として、電気化学発光物質、特にルテニウム錯体を用いることが好ましい。電気化学発光物質、特にルテニウム錯体は疎水性が強い。したがって、ＥＣＬ法において、本発明の免疫学的分析方法の効果を多大に享受できる。
　本発明の免疫学的分析方法は、標識物質に由来するシグナルを測定する工程を含むことができる。該工程は、ブランク値を差し引くことを含むことができる。

（測定誤差低減）
　免疫学的測定方法においては、上記のようなブランクの値の上昇又は標識抗体の担体への付着などにより、測定値の正又は負の測定誤差が生じることが知られている。本明細書において、「測定誤差低減」とは、上記測定値の正又は負の測定誤差を、本来の測定値（真値）に近づけることをいう。

（免疫学的分析用試薬キット）
　本発明の被検出物質の免疫学的分析用試薬キットは、ポリエチレングリコール修飾抗体及び標識物質のコンジュゲート（ＰＥＧ修飾標識抗体）を含む試薬を含むものであればいずれでもよい。ＰＥＧ修飾標識抗体を含む試薬（以下、標識試薬と称することがある）における、ＰＥＧ修飾標識抗体は、標識試薬において、０．０１～１０００μｇ／ｍＬ、０．０５～２００μｇ／ｍＬ、０．１～２００μｇ／ｍＬ、０．１～１００μｇ／ｍＬ、又は０．１～２０μｇ／ｍＬの濃度であることができる。標識試薬において、ＰＥＧ修飾標識抗体は、測定系に添加すべき全ての試薬と試料の混合状態において０．１～１００μｇ／ｍＬ、特に０．１～２０μｇ／ｍＬに調整しうるような形態で含まれていることが好ましい。

　本発明の被検出物質の免疫学的分析用試薬キットは、好ましくは、標識物質で標識されていない被検出物質に対する抗体（以下、「捕捉抗体」と称することがある）が結合した担体を含む試薬（以下、捕捉試薬と称することがある）をさらに含む。捕捉抗体が結合した担体は、捕捉試薬において、０．０１～１０００ｍｇ／ｍＬ、０．０５～２００ｍｇ／ｍＬ、０．１～２００ｍｇ／ｍＬ、０．１～１００ｍｇ／ｍＬ、又は０．１～２ｍｇ／ｍＬの濃度であることができる。捕捉試薬において、捕捉抗体が結合した担体は、測定系に添加すべき全ての試薬と試料の混合状態において、０．１～１０ｍｇ／ｍＬ、特に０．１～２ｍｇ／ｍＬに調整しうるような形態で含まれていることが好ましい。

　本発明の被検出物質の免疫学的分析用試薬キットには、ほかに、標準抗原物質、精度管理用抗原試料といった、他の検査試薬、検体希釈液、及び／又は使用説明書などを含むこともできる。

　本発明の被検出物質の免疫学的分析用試薬キットにおいて、ＰＥＧ修飾標識抗体と捕捉抗体とは異なるエピトープを認識してもよく、ＰＥＧ修飾標識抗体が抗原上の複数のエピトープを認識する場合は、ＰＥＧ修飾標識抗体と捕捉抗体として同一の（すなわち同じエピトープを認識する）抗体を用いてもよい。

　ＥＣＬ法を使用する場合、本発明の被検出物質の免疫学的分析用試薬キットは、以下（Ａ）及び（Ｂ）を含むことができる。
（Ａ）ポリエチレングリコール修飾抗体と電気化学発光物質（例えば、ルテニウム錯体等）とのコンジュゲートを含む標識試薬、及び
（Ｂ）被検出物質に結合する捕捉抗体を固定化した固相。
　例えば、固相として磁性粒子を用いたキットでは、被検出物質に結合する捕捉抗体を固定化した磁性粒子に、生物学的サンプルを添加して反応させた後、試料を除去して洗浄する。続いて、ポリエチレングリコール修飾抗体と電気化学発光物質（例えば、ルテニウム錯体等）とのコンジュゲートを添加して反応させる。磁性粒子を洗浄後、電気エネルギーを加えて発光させ標識物質の発光量を測定することにより、被検出物質を分析することができる。

　サンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用する場合、本発明の被検出物質の免疫学的分析用試薬キットは、以下（Ａ）及び（Ｂ）を含むことができる。
（Ａ）ＰＥＧ修飾標識抗体を含む標識試薬
（Ｂ）捕捉抗体を固定化した不溶性担体。
　このようなキットでは、まず、被検出物質に結合する捕捉抗体を固定化した不溶性担体に生物学的サンプルを添加した後インキュベートし、試料を除去して洗浄する。次に、標識試薬を添加した後インキュベートし、基質を加えて発色させる。プレートリーダー等を用いて発色を測定することにより、被検出物質を分析することができる。

　次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、特に説明のない限り、％は質量％を意味する。また、表中の「Ru-Ab混合比」は、抗体分子数を１とした場合の、ルテニウム錯体の分子数の比率を表している。

〔調製例１〕使用した抗体の調製
　抗体として抗Ｄｕｐａｎ－２抗体、及び抗プロカルシトニン抗体を使用した。抗Ｄｕｐａｎ－２抗体は、ＩｇＭ抗体であり、抗プロカルシトニン抗体はＩｇＧ抗体である。また、これらは全てモノクローナル抗体である。
　抗Ｄｕｐａｎ－２抗体に関して、クローンＮｏ．Ｓ１９２０１Ｒを細胞培養して得られた抗Ｄｕｐａｎ－２抗体を含む培養上清を陰イオン交換及びゲルろ過クロマトグラフィーで精製し、１５０ｍＭリン酸カリウム／１５０ｍＭ　ＮａＣＬ（ｐＨ７．８）で透析後に使用した。使用時まで冷蔵保存した。
　抗プロカルシトニン抗体は、クローンＮｏ．Ｓ０２２１１およびＳ０２２０３Ｒ細胞をそれぞれＢＡＬＢ／ｃマウスに移植し腹水化を行った。それぞれの得られた抗体を含む腹水について、Ｓ０２２１１クローンから得られた腹水は陰イオン交換クロマトグラフィーにて精製した。Ｓ０２２０３Ｒクローンから得られた腹水はプロテインＧクロマトグラフィーにて精製した。精製したそれぞれの抗体は１５０ｍＭリン酸カリウム／１５０ｍＭ　ＮａＣＬ（ｐＨ７．８）で透析し、使用時まで冷蔵保存した。

〔調製例２－１〕抗Ｄｕｐａｎ－２抗体へのルテニウム錯体の結合
　精製抗体１．７３ｍｇ／ｍＬ（抗Ｄｕｐａｎ－２抗体、１５０ｍＭリン酸カリウム／１５０ｍＭ　ＮａＣＬ（ｐＨ７．８）に溶解）を２．０ｍＬ容エッペンドルフチューブに投入した。該エッペンドルフチューブに、抗体分子数とルテニウム錯体分子数との比がそれぞれ１：５、１：２０、１：５０、又は１：１００となるように、ルテニウム錯体１０ｍｇ／ｍＬ（ＤＭＳＯに溶解）を投入した。その後室温で３０分間攪拌混合した。ルテニウム錯体としては、Ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ（ＩＩ）Ｔｒｉｓ（ｂｉｐｙｒｉｄｙｌ）－ＮＨＳ　Ｅｓｔｅｒを用いた。
　遊離ルテニウム錯体のＮＨＳ基（Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド基）を過剰量のグリシンのアミノ基でブロッキングする目的で、反応後の液に、グリシンの終濃度が１００ｍＭになるように、２Ｍグリシン（蒸留水に溶解）を添加した。その後室温で２０分間混合攪拌した。
　反応後の液を１０ｍＭリン酸カリウム／１５０ｍＭ　ＮａＣＬ（ｐＨ６．０）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５カラム（ゲルのｖｏｌｕｍｅは２０ｍＬ）にアプライし、遊離ルテニウム錯体を除去した。
　溶出液のＡ２８０ｎｍの吸光度を測定し、タンパク質の吸収波長である吸光度Ａ２８０ｎｍの吸収が見られる画分を分取した。分取した画分はＭｉｃｒｏ　ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）にてタンパク質濃度を定量し、定量値より抗体分子数を算出した。またルテニウム錯体の吸収をもつＡ４５５ｎｍの吸光度を測定し、Ａ４５５ｎｍ吸光度から分取画分のルテニウム錯体分子数を算出した。算出した抗体分子数とルテニウム錯体分子数より、分取画分中のルテニウム標識抗体に対して、抗体１分子に標識されたルテニウム錯体分子数を算出した（表１）。調製したルテニウム標識抗体は、使用時まで冷蔵にて保存した。

〔調製例２－２〕抗プロカルシトニン抗体へのルテニウム錯体の結合
　Ｓ０２２１１クローンを用いた腹水より精製した抗体を標識抗体として用い、抗体分子数とルテニウム錯体分子数との比が、混合比１：２０となるように投入した以外は、抗Ｄｕｐａｎ－２抗体と同様に行った。抗体１分子当たりの結合ルテニウム錯体分子数は１０個である。

〔調製例３－１〕ルテニウム標識抗体へのＰＥＧの修飾
　片側末端がＮＨＳ化されたＰＥＧとして、重合度が４のＭＳ（ＰＥＧ）４　Ｍｅｔｈｙｌ－ＰＥＧ－ＮＨＳ－Ｅｓｔｅｒ　Ｒｅｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社製　ＭＷ：約３３０）、重合度が２４のＭＳ（ＰＥＧ）２４　Ｍｅｔｈｙｌ－ＰＥＧ－ＮＨＳ－Ｅｓｔｅｒ　Ｒｅｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社製　ＭＷ：約１２１０）、および重合度が約１７０のＡｃｒｙｌａｔｅ－ＰＥＧ７５００－ＮＨＳ（メルク社製　ａｖｅｒａｇｅ　Ｍｎ：約７５００）を用いた。使用直前に蒸留水で０．１ｍＭになるようにそれぞれのＰＥＧを溶解した。調製例２－１～調製例２－２で調製した各ルテニウム標識抗体について、溶液ｐＨを弱アルカリとするため１５０ｍＭリン酸カリウム／１５０ｍＭ　ＮａＣＬ（ｐＨ７．８）で２倍希釈した上で、２倍希釈したルテニウム標識抗体分子と各種ＰＥＧ分子について任意の比率で混合し、室温で１６時間攪拌した。遊離ルテニウム錯体のＮＨＳ基（Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド基）を過剰量のグリシンのアミノ基でブロッキングする目的で、攪拌後の溶液に２Ｍグリシン（蒸留水に溶解）を、グリシンの終濃度が１００ｍＭになる量を添加し、室温で２０分間混合攪拌した。調製したＰＥＧ修飾ルテニウム標識抗体は、使用時まで冷蔵にて保存した。
　調製したＰＥＧ修飾ルテニウム標識抗体の詳細は、以下の表２の通りである。

〔調製例３－２〕抗体へのルテニウム錯体の結合、及びルテニウム標識抗体へのＰＥＧ修飾
　抗体へのＰＥＧ修飾を行った後に遊離ルテニウム錯体の除去を行った場合の影響を検証するために、以下の手順でＰＥＧ修飾ルテニウム標識抗体を調製した。
　精製抗体１．７３ｍｇ／ｍＬ（抗Ｄｕｐａｎ－２精製ＩｇＭ抗体、１５０ｍＭリン酸カリウム／１５０ｍＭＮａＣＬ（ｐＨ７．８）に溶解）についてそれぞれ１．８４ｍｇ分、０．９２ｍｇ分、１．５ｍｇ分ずつ２．０ｍＬ容エッペンドルフチューブ（計３本）に投入した。そこにルテニウム錯体１０ｍｇ／ｍＬ（Ｍ．Ｗ１０５７、ＤＭＳＯに溶解）を抗体分子数：ルテニウム錯体分子数＝１：２０、１：５０、１：１００の比率になるようにそれぞれ４．８μＬ（抗体１．８４ｍｇに対して）、６．０μＬ（抗体０．９２ｍｇに対して）、１９．６μＬ（抗体１．５ｍｇに対して）投入し、室温で３０分間攪拌混合した。
　
　次に片側末端がＮＨＳ化されたＰＥＧが４分子連なったＭＳ（ＰＥＧ）４　Ｍｅｔｈｙｌ－ＰＥＧ－ＮＨＳ－Ｅｓｔｅｒ　Ｒｅｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社製）を使用直前に１５０ｍＭリン酸カリウム／１５０ｍＭ　ＮａＣＬ（ｐＨ７．８）で１ｍＭになるように溶解し、ルテニウム標識抗体分子数とＰＥＧ分子数の比率が１：３０となるよう混合し、室温で１時間攪拌した。遊離ルテニウム錯体及び遊離ＰＥＧのＮＨＳ基を過剰量グリシンのアミノ基でブロッキングする目的で、反応後の液に２Ｍグリシン（蒸留水に溶解）を、グリシン終濃度１００ｍＭになる量添加し、室温で２０分間混合攪拌した。
　反応後の液を１０ｍＭリン酸カリウム／１５０ｍＭ　ＮａＣＬ（ｐＨ６．０）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５カラム（ゲルのｖｏｌｕｍｅは２０ｍＬ）にアプライし、遊離ルテニウム錯体および遊離のＰＥＧを除去した。
　溶出液のＡ２８０ｎｍの吸光度を測定し、タンパク質の吸収波長である吸光度Ａ２８０ｎｍの吸収が見られる画分を分取した。分取した画分はＭｉｃｒｏ　ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）にてタンパク質の濃度を定量し、定量値より抗体分子数を算出した。またルテニウム錯体の吸収をもつＡ４５５ｎｍの吸光度を測定し、Ａ４５５ｎｍ吸光度から分取画分のルテニウム分子数を算出した。算出した抗体分子数とルテニウム錯体分子数より、分取画分中のルテニウム標識抗体に対して、抗体１分子に標識されたルテニウム錯体分子数を算出した（表３）。調製したルテニウム標識抗体は、使用時まで冷蔵にて保存した。

　調製したＰＥＧ修飾ルテニウム標識抗体の詳細は、以下の表４の通りである。

〔調製例４〕抗体結合磁性粒子の作製
　表面にＥｐｏｘｙ基を有する３μｍ径の３０ｍｇ／ｍＬ磁性粒子１ｍＬを分取し、磁石を用いて磁性粒子を集磁して溶媒を除去した。磁性粒子を洗浄する目的で１ｍＬの１５０ｍＭリン酸カリウム／１５０ｍＭ　ＮａＣＬ（ｐＨ７．８）を磁性粒子と混合攪拌した後、再び磁石を用いて集磁して溶媒を除去した。溶媒を除去した磁性粒子に１ｍＬの０．６ｍｇ／ｍＬの各精製抗体（抗Ｄｕｐａｎ－２抗体、抗プロカルシトニン抗体を１５０ｍＭリン酸カリウム／１５０ｍＭＮａＣＬ（ｐＨ７．８）に溶解）を投入し、２５℃で１７時間転倒攪拌器にて攪拌して抗体を磁性粒子へ結合させた。抗体結合磁性粒子を洗浄し使用時まで冷蔵にて保存した。

〔実施例１－１〕抗Ｄｕｐａｎ－２抗体によるＤｕｐａｎ－２の分析
（１－１）ルテニウム標識抗体液の調製
　ＰＥＧ未修飾ルテニウム標識抗Ｄｕｐａｎ－２抗体及び調製例３－１で調製した抗体Ｎｏ．２～１１の各々を、５μｇ／ｍＬになるように希釈して測定に使用した。

（１－２）抗体結合磁性粒子液の調製
　調製例４において調製した抗体結合磁性粒子を２ｍｇ／ｍＬになるように希釈して測定に使用した。

（１－３）測定装置
　電気化学発光免疫測定装置であるピコルミＩＩＩ（積水メディカル社製）にて測定を実施した。

（１－４）測定
　測定装置の所定の場所に、装置指定の容器に入れた磁性粒子液と、ルテニウム標識抗体液またはＰＥＧ修飾ルテニウム標識抗体をセットした。測定装置指定の反応用容器に、反応用溶液を６０μＬ分注し、次に測定試料を３０μＬ投入した。測定試料が入った反応用容器を測定装置の所定の場所にセットし、測定準備を完了させた。装置測定をスタートすると、測定試料が入った反応用容器に磁性粒子液２５μＬが投入され、２８℃で約５分間抗原抗体反応が行われた（第一反応）。その後、装置指定のＢＦ分離液でＢＦ分離が行われた。次にルテニウム標識抗体またはＰＥＧ修飾ルテニウム標識抗体が１００μＬ投入された、２８℃で約３分間抗原抗体反応が行われた（第二反応）。その後、装置指定のＢＦ分離液でＢＦ分離が行われ、未反応のルテニウム標識抗体又はＰＥＧ修飾ルテニウム標識抗体が除去された。反応によって生成された抗原抗体サンドイッチ複合体を、装置の所定の場所にて装置指定の発光基質（トリプロピルアミン）溶液中で電気を加え、化学発光（ＥＣＬ発光）させた。

　反応によって生成された抗原抗体サンドイッチ複合体（磁性粒子結合抗体―試料中の抗原物質―ルテニウム標識抗体（又はＰＥＧ修飾ルテニウム標識抗体））の数によってＥＣＬ発光の強度は異なり、測定試料中の抗原濃度に応じたＥＣＬ発光強度の差より抗原濃度を定量することが出来る。結果を以下の表５に示す。

　その結果、ＰＥＧ未修飾ルテニウム標識抗Ｄｕｐａｎ－２抗体を用いた測定系では抗体へのルテニウム結合数が増えるにしたがってブランクの同時再現性（ばらつき：ＣＶ）の顕著な悪化とブランク値の上昇が認められた。ＣＶが１０％以下であったのはルテニウムを抗体１分子に対して５分子標識したルテニウム標識抗体のみであった。一方、各種ＰＥＧ修飾ルテニウム標識抗Ｄｕｐａｎ－２抗体を用いた測定系では同時再現性が大きく改善していた。ルテニウムを抗体１分子に対して６７分子標識したルテニウム標識抗体（抗体Ｎｏｓ．　８－１０）においてもＣＶは１０％以下に抑えられていた。またブランクのＥＣＬ発光強度もＰＥＧ未修飾標識抗体に対して抑えられる結果が得られた。なお結合させるＰＥＧの重合度の違いによって、ブランクの同時再現性やＥＣＬ発光強度に明確な差は見られなかった。

〔実施例１－２〕ＰＥＧ結合方法の違いによる効果程度の確認試験結果
　ＰＥＧ結合方法の違いにより、ＰＥＧ修飾ルテニウム標識抗Ｄｕｐａｎ－２抗体の性能に違いが見られるかについて確認した。調製例３－１又は調製例３－２の方法で調製したＰＥＧ修飾ルテニウム標識抗Ｄｕｐａｎ－２抗体を用い、ブランクをＮ＝１０で測定し同時再現性の確認をおこなった。なお、いずれのＰＥＧ結合方法においてもルテニウム標識抗体分子とＰＥＧ分子の混合比を１：３０として抗体へのＰＥＧ結合を実施した。結果を表６に示す。

　その結果、いずれの結合方法で調製したＰＥＧ修飾ルテニウム標識抗Ｄｕｐａｎ－２抗体に関しても、ＰＥＧ未修飾ルテニウム標識抗Ｄｕｐａｎ－２抗体と比較して、ブランクの同時再現性（ばらつき：ＣＶ）の改善が認められた。しかしながら、調製方法３－１で調製したＰＥＧ修飾ルテニウム標識抗Ｄｕｐａｎ－２抗体の方が、調製方法３－２と比較して、同時再現性（ばらつき：ＣＶ）がより改善されていた。

〔実施例２－１〕ルテニウム標識抗Ｄｕｐａｎ－２抗体へのＰＥＧ混合比の違いによる効果の確認試験
　抗体へのＰＥＧの混合比の違いにより、ＰＥＧ修飾ルテニウム標識抗Ｄｕｐａｎ－２抗体の性能に違いが見られるかについて確認した。ＰＥＧの混合比としては、ルテニウム標識抗体とＰＥＧ分子数との比が１：３０又は１：３００となるように調整した。検討には調製例３－１において調製した抗体Ｎｏ．２及び３を用いた。それぞれの抗体を用いて、ブランク（Ｎ＝１０）とＤｕｐａｎ－２糖鎖配列を模した合成糖鎖を用いて作製したＤｕｐａｎ－２抗原（表７中のＳＴＤ：０．０５、０．１、０．５、１、２μｇ／ｍＬ）を測定し、各測定系での同時再現性と検出感度について確認を行った。結果を表７に示す。

　その結果、いずれのＰＥＧ修飾ルテニウム標識抗Ｄｕｐａｎ－２抗体を用いた測定系においてもブランクのＮ＝１０同時再現性に関して、ＰＥＧ未修飾ルテニウム標識抗Ｄｕｐａｎ－２抗体を用いた測定系（ＣＶ１９．１％）に対して改善（ＣＶ３．７％および７．７％）が見られた。一方、ＳＴＤのＥＣＬ発光強度を比較したところ、ルテニウム標識抗体とＰＥＧの混合比を１：３０として調製したＰＥＧ修飾ルテニウム標識抗Ｄｕｐａｎ－２抗体の方が、混合比１：３００のものに対して強いＥＣＬ発光強度が得られた。

〔実施例２－２〕ＰＥＧ修飾ルテニウム標識抗Ｄｕｐａｎ－２抗体を用いたＤｕｐａｎ－２測定系の感度試験結果
　各種ＰＥＧ修飾ルテニウム標識抗Ｄｕｐａｎ－２抗体を用いたＤｕｐａｎ－２測定系、およびＰＥＧ未修飾ルテニウム標識抗Ｄｕｐａｎ－２抗体を用いたＤｕｐａｎ－２測定系について、４例の膵癌患者血清検体およびＤｕｐａｎ－２糖鎖配列を模した合成糖鎖を用いて作製したＤｕｐａｎ－２抗原（表８及び９中のＳＴＤ：０．０２５、０．０５、０．１μｇ／ｍＬ）について測定を実施し、各測定系の検出感度について確認を行った。結果を表８及び９に示す。

　その結果、ブランク同時再現性がＣＶ１０％以下であったルテニウム標識抗体（ルテニウム５分子／抗体）を用いた測定系の発光強度に対して、同時再現性のＣＶを１０％以下に抑えつつ抗体に対してルテニウムをより多く標識することが出来たＰＥＧ修飾ルテニウム標識抗体（ルテニウム１２、２２、６７分子／抗体）を用いた測定系では、より強い発光強度を得ることが出来た。また抗体に対するルテニウム標識分子数の増加に従って、ＥＣＬ発光強度も増加していく結果が得られた。結合させるＰＥＧ種の違いとＥＣＬ発光強度の関係においては、標識するＰＥＧの重合度が少ないもの（短いＰＥＧ）程、サンプルのＥＣＬ発光強度が高くなる傾向が見られた。本試験において最も強い発光強度が得られたＰＥＧ４修飾ルテニウム標識抗体を用いた測定系では、ＰＥＧ未修飾ルテニウム標識抗体を用いた測定系に対し膵癌患者血清検体で平均１３倍、合成糖鎖で２９倍の発光強度が得られた。

〔実施例３〕プロカルシトニンの分析
（３－１）ルテニウム標識抗体液の調製
　調製例１、２－２、及び３－１において作製したルテニウム標識抗プロカルシトニン抗体及びＰＥＧ修飾ルテニウム標識抗プロカルシトニン抗体を、２０μｇ／ｍＬになるように希釈して測定に使用した。

（３－２）抗体結合磁性粒子液の調製
　調製例４において作製した抗体結合磁性粒子を１ｍｇ／ｍＬになるように希釈して測定に使用した。

（３－３）測定装置
　電気化学発光免疫測定装置であるピコルミＩＩＩ（積水メディカル社製）にて測定を実施した。

（３－４）測定
　測定装置の所定の場所に、装置指定の容器に入れた磁性粒子液と、ルテニウム標識抗体液またＰＥＧ修飾ルテニウム標識抗体をセットした。測定装置指定の反応用容器に、反応用溶液を分注し、次に測定サンプル（ブランクとしての生理食塩水）を２０μＬ投入した。測定試料が入った反応用容器を測定装置の所定の場所にセットし、測定準備を完了させた。装置測定をスタートすると、測定試料が入った反応用容器に磁性粒子液５０μＬが投入され、２８℃で約５分間抗原抗体反応が行われた（第一反応）。次にルテニウム標識抗体液またはＰＥＧ修飾ルテニウム標識抗体が５０μＬ投入され、２８℃で約３分間抗原抗体反応が行われた（第二反応）。その後、装置指定のＢＦ分離液でＢＦ分離が行われ、未反応のルテニウム標識抗体液またＰＥＧ修飾ルテニウム標識抗体が除去された。反応によって生成された抗原抗体サンドイッチ複合体を、装置の所定の場所にて装置指定の発光基質（トリプロピルアミン）溶液中で電気を加え、化学発光（ＥＣＬ発光）させた。結果を表１０に示す。

　ＰＥＧ未修飾ルテニウム標識抗プロカルシトニン抗体では、一定の割合でルテニウム標識抗体の抗体結合磁性粒子への非特異的な結合によると思われるＥＣＬ発光の異常高値（飛び値）が生じたが、ＰＥＧ修飾ルテニウム標識抗プロカルシトニン抗体を用いるとこれが抑えられた（各々のデータは記載なし）。その結果、ＰＥＧ修飾ルテニウム標識抗プロカルシトニン抗体では、ＰＥＧ未修飾ルテニウム標識抗プロカルシトニン抗体と比較して、同時再現性（ばらつき：ＣＶ）が改善された（１４％）。

　本発明の目的は、免疫学的分析方法において感度を向上させ、且つ被検出物質を正確に分析する技術を提供することである。

Claims

　被検出物質を含有する可能性のある生物学的サンプルと、ポリエチレングリコール修飾抗体及び標識物質のコンジュゲートとを接触させること
を含む、被検出物質の免疫学的分析方法。
　被検出物質を含有する可能性のある生物学的サンプルが、血液、血漿、及び血清及び尿からなる群から選択される１つ以上である、請求項１に記載の免疫学的分析方法。
　ポリエチレングリコールの重量平均分子量（ＭＷ）が、２５０～１５０００である、請求項１又は２に記載の免疫学的分析方法。
　標識物質が電気化学発光物質であり、免疫学的分析方法が電気化学発光法（ＥＣＬ法）である、請求項１～３のいずれかに記載の免疫学的分析方法。
　ポリエチレングリコール修飾抗体が、ポリエチレングリコール修飾ＩｇＭ抗体又はポリエチレングリコール修飾ＩｇＧ抗体である、請求項１～４のいずれかに記載の免疫学的分析方法。
　抗体１分子における標識物質の結合分子数が、１０～２００である、請求項１～５のいずれかに記載の免疫学的分析方法。
　ポリエチレングリコール修飾抗体及び標識物質のコンジュゲート
を含む、被検出物質の免疫学的分析用試薬キット。
　血液、血漿、及び血清からなる群から選択される１つ以上の生物学的サンプルに対して使用するための、請求項７に記載の免疫学的分析用試薬キット。
　ポリエチレングリコールの重量平均分子量（ＭＷ）が、２５０～１５０００である、請求項７又は８に記載の免疫学的分析用試薬キット。
　標識物質が電気化学発光物質であり、免疫学的分析が電気化学発光法（ＥＣＬ法）である、請求項７～９のいずれかに記載の免疫学的分析用試薬キット。
　ポリエチレングリコール修飾抗体が、ポリエチレングリコール修飾ＩｇＭ抗体又はポリエチレングリコール修飾IｇＧ抗体である、請求項７～１０のいずれかに記載の免疫学的分析用試薬キット。
　抗体１分子における標識物質の結合分子数が、１０～２００である、請求項７～１１のいずれかに記載の免疫学的分析用試薬キット。
　被検出物質を含有する可能性のある生物学的サンプルと、ポリエチレングリコール修飾抗体及び標識物質のコンジュゲートとを接触させること、
を含む、被検出物質の免疫学的分析における測定誤差低減方法。
　被検出物質を含有する可能性のある生物学的サンプルが、血液、血漿、及び血清からなる群から選択される１つ以上である、請求項１３に記載の測定誤差低減方法。
　ポリエチレングリコールの重量平均分子量（ＭＷ）が、２５０～１５０００である、請求項１３又は１４に記載の測定誤差低減方法。
　以下の工程（１）～（３）を含む、ポリエチレングリコール修飾抗体及びルテニウム錯体のコンジュゲートの調製方法
（１）抗体とルテニウム錯体とを接触させ、第一複合体を形成させる第一複合体形成工程と、
（２）ポリエチレングリコールと第一複合体とを接触させ、ポリエチレングリコール修飾抗体及びルテニウム錯体のコンジュゲートを形成させるコンジュゲート形成工程と、
（３）抗体と結合していない遊離ルテニウム錯体を除去する、遊離ルテニウム錯体除去工程。
　前記コンジュゲート形成工程（２）が、前記遊離ルテニウム錯体除去工程（３）の後に行われる、請求項１６に記載のポリエチレングリコール修飾抗体及びルテニウム錯体のコンジュゲートの調製方法。