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WO2022163605A1 - 免疫学的測定方法 - Google Patents

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Publication number
WO2022163605A1
WO2022163605A1 PCT/JP2022/002518 JP2022002518W WO2022163605A1 WO 2022163605 A1 WO2022163605 A1 WO 2022163605A1 JP 2022002518 W JP2022002518 W JP 2022002518W WO 2022163605 A1 WO2022163605 A1 WO 2022163605A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
measured
immunoassay
measurement
reagent
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/002518
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
建午 藤村
悌吾 野本
知 清水
勇輝 ▲高▼良
Original Assignee
積水メディカル株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 積水メディカル株式会社 filed Critical 積水メディカル株式会社
Priority to EP22745826.2A priority Critical patent/EP4286850A1/en
Priority to US18/273,153 priority patent/US20240302366A1/en
Priority to JP2022578386A priority patent/JPWO2022163605A1/ja
Priority to CN202280009819.7A priority patent/CN116806312A/zh
Publication of WO2022163605A1 publication Critical patent/WO2022163605A1/ja

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4716—Complement proteins, e.g. anaphylatoxin, C3a, C5a

Definitions

  • the present invention relates to an immunological measurement method.
  • it relates to an immunoassay method in which an immune reaction is performed in the presence of an anti-C3 antibody.
  • Measurement methods in the field of diagnostics include immunological measurement methods for measuring a substance to be measured present in a biological sample using an immune reaction. Since the immunological measurement method utilizes an antigen-antibody reaction, it is a measurement method with very high specificity. Biological samples contain various substances, and often contain substances called non-specific factors that cause non-specific reactions. A non-specific reaction is a phenomenon in which binding not based on a specific reaction is promoted or a specific immune reaction is hindered, which causes measurement errors. Heterophilic antibodies and rheumatoid factor (RF) have been identified as non-specific factors.
  • RF rheumatoid factor
  • Heterophilic antibody is a general term for human antibodies that exhibit reactivity with animal-derived antibodies, which are the main component of immunological measurement methods, and HAMA (human anti-mouse immunoglobulin antibody) is known as a typical example. It is Rheumatoid factors appear in patients with rheumatoid arthritis and have a property in common with HAMA in that they show reactivity to animal-derived antibodies, and both entities are known to be human immunoglobulin G and immunoglobulin M. known (Non-Patent Document 1).
  • Patent Document 1 is known as a technique for suppressing non-specific reactions in immunological measurement methods.
  • Patent Document 1 discloses a method for suppressing non-specific reactions caused by RF by pretreating a sample in advance with a sufficient amount of an animal-derived antibody capable of binding to the reaction site of human rheumatoid factor (RF).
  • Animal-derived antibodies include anti-human IgG antibodies, anti-human IgA antibodies and/or anti-human IgM antibodies.
  • Patent document 1 is a method of suppressing non-specific reactions caused by natural antibodies and RF by using anti-human IgM antibodies, anti-human IgG antibodies, and anti-human IgA antibodies. Although this method is currently being put into practical use with various reagents, the present inventors' tests have revealed that there are non-specific reactions that cannot be inhibited even by these antibodies. An object of the present invention is to suppress non-specific reactions in immunoassay methods.
  • the inventors of the present application have investigated the non-specific reaction suppressing effect of various substances, and found that the non-specific reaction can be suppressed by performing an immune reaction in the presence of an anti-C3 antibody.
  • the present invention has the following configurations. It is known that the anti-C3 antibody is used to detect a substance to be measured in an immunoassay method, but it is not known at all about its effect of suppressing non-specific reactions in immune reactions. ⁇ 1> 1.
  • ⁇ 2> The immunoassay method according to ⁇ 1>, wherein the immunoassay method is based on a homogeneous method or a heterogeneous method.
  • ⁇ 3> The immunoassay method according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the method based on the homogeneous method is a latex immunoagglutination assay method.
  • ⁇ 4> contacting the substance to be measured in the sample with the anti-C3 antibody in a solution; adding latex particles carrying a specific binding partner for the substance to be measured to the solution; optically detecting the degree of aggregation of the latex particles in the solution; The immunological measurement method according to ⁇ 3>.
  • ⁇ 5> The immunoassay method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, wherein the anti-C3 antibody is one or more selected from the group consisting of anti-iC3b antibody, anti-C3dg antibody, anti-C3d antibody and anti-C3b antibody. .
  • ⁇ 6> A method for suppressing a non-specific reaction in a method for immunologically measuring a substance to be measured in a sample, the method for suppressing a non-specific reaction characterized by performing an immune reaction in the presence of an anti-C3 antibody.
  • ⁇ 7> The non-specific reaction suppression method according to ⁇ 6>, wherein the immunoassay method is based on a homogeneous method or a heterogeneous method.
  • ⁇ 8> The non-specific reaction suppression method according to ⁇ 6> or ⁇ 7>, wherein the method based on the homogeneous method is latex immunoagglutination assay.
  • ⁇ 9> contacting the substance to be measured in the sample with the anti-C3 antibody in a solution; adding latex particles carrying a specific binding partner for the substance to be measured to the solution; optically detecting the degree of aggregation of the latex particles in the solution;
  • the method for suppressing a non-specific reaction according to ⁇ 8> comprising: ⁇ 10>
  • An immunoassay reagent containing an anti-C3 antibody ⁇ 12> The immunoassay reagent according to ⁇ 11>, wherein the immunoassay method is based on a homogeneous method or a heterogeneous method. ⁇ 13> The immunoassay reagent according to ⁇ 12>, wherein the method based on the homogeneous method is a latex immunoagglutination method. ⁇ 14> Anti-C3 antibody is any one or more selected from the group consisting of anti-iC3b antibody, anti-C3dg antibody, anti-C3d antibody and anti-C3b antibody ⁇ 11> for immunological measurement according to any one of ⁇ 13> reagent.
  • An immunoassay reagent kit containing an anti-C3 antibody containing an anti-C3 antibody.
  • Anti-C3 antibody is any one or more selected from the group consisting of anti-iC3b antibody, anti-C3dg antibody, anti-C3d antibody and anti-C3b antibody ⁇ 15> for immunological measurement according to any one of ⁇ 17> reagent.
  • the anti-C3 antibody is any one or more selected from the group consisting of an anti-iC3b antibody, an anti-C3dg antibody, an anti-C3d antibody and an anti-C3b antibody.
  • non-specific reactions due to non-specific factors contained in the sample can be suppressed by performing an immune reaction in the presence of an anti-C3 antibody, and accurate measurement can be performed. became possible.
  • the present invention has made it possible to suppress non-specific reactions that could not be suppressed even with commercially available non-specific reaction inhibitors.
  • the immunoassay method of the present invention is a method for immunologically measuring a substance to be measured in a sample, characterized by performing an immune reaction in the presence of an anti-C3 antibody.
  • a substance to be measured in a sample is immunologically measured using a specific binding partner other than the anti-C3 antibody.
  • Immunological measurement methods are further divided into homogeneous methods and heterogeneous methods.
  • the homogeneous method is a measurement method that specifically detects a reaction that proceeds with a substance to be measured in a mixed solution (reaction solution) of a sample and a reagent solution without performing B/F (bound/unbound) separation.
  • the heterogeneous method is a measurement method in which excess components not involved in the binding reaction are washed and removed by B/F separation, and then the main reaction is allowed to proceed for detection. Since the heterogeneous method involves a washing step, it has the problem that it requires many steps and requires a long time for measurement. On the other hand, the homogeneous method has the problem of being susceptible to non-specific reactions because it does not involve a washing process. This is a widely sought after method. Homogeneous methods include measurement methods using immunoagglutination (TIA) and immunochromatography (lateral flow type, flow-through type).
  • TIA immunoagglutination
  • immunochromatography lateral flow type, flow-through type
  • TIA is a method for qualitatively or quantitatively detecting an analyte in a sample based on the degree of aggregation of an immune complex formed by the cross-linking action of the analyte (substance to be measured) by a specific binding partner such as an antibody.
  • the latex immunoagglutination method (hereinafter sometimes referred to as LTIA), which uses latex particles as an insoluble carrier to amplify the agglutination signal, is suitable for optical detection and easy to automate. It is a highly versatile measurement method that is applied to various inspection items.
  • Heterogeneous methods include an ELISA method using a well-shaped plate, a chemiluminescence method, and the like.
  • the present invention can utilize any of the immunological measurement methods described above, but the homogeneous method, which is relatively susceptible to non-specific reactions, is preferable because it can be expected to receive more effects.
  • the anti-C3 antibody used for suppressing non-specific reaction in the present invention is an antibody against C3, and may be an antibody that recognizes the portion of C3 corresponding to C3d.
  • C3 is one of the complement proteins of the classical pathway and is also called ⁇ 1C globulin due to its third complement component or electrical mobility.
  • C3 is a protein with a molecular weight of 180 kDa, has a structure in which an ⁇ chain with a molecular weight of 110 kDa and a ⁇ chain with a molecular weight of 70 kDa are crosslinked by -ss- bonds, and is a central protein of the complement system.
  • the anti-C3 antibody used in the present invention may be an antibody that recognizes a portion of C3 that corresponds to C3d generated by decomposition, and in that sense, an anti-iC3b antibody, an anti-C3b antibody, an anti-C3dg antibody, or an anti-C3d antibody. can be used. Among these, an anti-C3d antibody is particularly preferred.
  • Anti-C3 antibodies used in the present invention may be polyclonal antibodies or monoclonal antibodies. Monoclonal antibodies are more preferred.
  • Anti-C3 antibodies used in the present invention it is possible to use a functional fragment of an antibody having antigen-antibody reaction activity in addition to a whole antibody molecule.
  • Anti-C3 antibodies used in the present invention are those obtained through the immunization process of general animals (mouse, goat, sheep, etc.), as well as immunogens (substances to be measured) immunized by genetic recombination technology etc. It may be an antibody (chimeric antibody, humanized antibody, fully humanized antibody, etc.) whose amino acid sequence has been changed to that of an animal species other than the animal.
  • antibody functional fragments include F (ab') 2 and Fab' fragments having antigen-antibody activity, single chain antibodies (scFv), VHH (variable domain of heavy chain of heavy chain antibody) antibodies, IgNAR ( new antigen receptor) antibodies, etc.
  • These functional fragments of antibodies can be produced by treating the antibody obtained as described above with a proteolytic enzyme (eg, pepsin, papain, etc.).
  • the functional fragment of the anti-C3 antibody may be a fragment containing a portion corresponding to C3d as described above.
  • anti-C3 antibodies also include functional fragments.
  • the antibody against C3 used in the present invention may be any one of the group consisting of anti-C3b antibody, anti-iC3b antibody, anti-C3dg antibody and anti-C3d antibody, and any two or more selected from these may be used. They can also be used in combination.
  • an antibody and “recognize” an antigen by an antibody are used synonymously, but are not limited to these examples and should be interpreted in the broadest sense. Whether or not an antibody “reacts” with an antigen (compound) can be confirmed by an antigen-immobilized ELISA method, a competitive ELISA method, a sandwich ELISA method, or the like, as well as the principle of surface plasmon resonance. can be performed by a method (SPR method) using The SPR method can be performed using equipment, sensors and reagents commercially available under the name Biacore®.
  • the antibody against C3 used in the present invention is obtained by dissolving C3 such as a commercially available human-derived C3d protein as an antigen (immunogen) in a solvent such as phosphate-buffered saline and administering this solution to an animal for immunization.
  • C3 such as a commercially available human-derived C3d protein as an antigen (immunogen)
  • a solvent such as phosphate-buffered saline
  • Immunization may be performed using an emulsion after adding an appropriate adjuvant to the solution as necessary.
  • Adjuvants include widely used adjuvants such as water-in-oil emulsions, water-in-oil-in-water emulsions, oil-in-water emulsions, liposomes, and aluminum hydroxide gels, as well as proteins and peptide substances derived from biological components. good too.
  • Freund's incomplete adjuvant or Freund's complete adjuvant can be suitably used.
  • the administration route, dosage, and administration time of the adjuvant are not particularly limited, but are preferably selected appropriately so as to enhance the desired immune response in the animal immunized with the antigen.
  • the type of animal used for immunization is also not particularly limited, but mammals are preferable. For example, mice, rats, cows, rabbits, goats, sheep, alpacas, etc. can be used, and mice or rats can be used more preferably.
  • Immunization of animals may be performed according to a general technique. For example, immunization can be performed by subcutaneously, intracutaneously, intravenously, or intraperitoneally injecting an antigen solution, preferably a mixture with an adjuvant, into an animal. . Since the immune response generally differs depending on the type and strain of the animal to be immunized, it is desirable to appropriately set the immunization schedule according to the animal used. It is preferable to repeat the antigen administration several times after the initial immunization.
  • hybridomas can be produced by extracting antibody-producing spleen cells or lymph node cells from the immunized animal and fusing them with a myeloma-derived cell line with high proliferative potential.
  • Cells with high antibody-producing ability are preferably used for cell fusion, and the myeloma-derived cell line is preferably compatible with the animal from which the antibody-producing cells to be fused are derived.
  • Cell fusion can be performed according to methods known in the art, and for example, a polyethylene glycol method, a method using Sendai virus, a method using electric current, or the like can be employed.
  • hybridomas can be grown according to conditions commonly used in the art, and desired hybridomas can be selected while confirming the properties of the antibodies to be produced.
  • Hybridoma cloning can be performed by well-known methods such as the limiting dilution method and the soft agar method.
  • hybridomas can be efficiently performed at the stage of selection, taking into account the conditions under which the antibodies to be produced are actually used for measurement. For example, an antibody obtained by immunizing an animal is reacted with C3 immobilized on a solid phase in the presence of a compound for which cross-reactivity is to be confirmed, and reactivity in the absence of the compound for which cross-reactivity is to be confirmed. Hybridomas producing the desired antibody can be more efficiently selected by comparing with . In addition, an antibody obtained by immunizing an animal is reacted with C3 immobilized on a solid phase in the presence of a biological sample-derived component, and the desired antibody is compared with the reactivity in the absence of the biological sample-derived component. It is also possible to more efficiently select hybridomas that produce antibodies of
  • the ability of the produced antibodies to bind to C3 is assayed using methods such as ELISA, RIA, and fluorescent antibody methods, and the selected hybridomas produce monoclonal antibodies with desired properties.
  • the method of mass culture is not particularly limited, for example, a method of culturing a hybridoma in an appropriate medium to produce a monoclonal antibody in the medium, or a method of injecting a hybridoma into the peritoneal cavity of a mammal to proliferate and inject the hybridoma into ascites.
  • a method of producing an antibody, etc. can be mentioned.
  • Purification of the monoclonal antibody may be performed by appropriately combining the methods for purifying antibodies from antiserum described above, such as DEAE anion exchange chromatography, affinity chromatography, ammonium sulfate fractionation, PEG fractionation, ethanol fractionation, and the like. can be done.
  • Methods for making the anti-C3 antibody exist in the immune reaction system include a method of using it as one of the components of an immunoassay reagent, and a method of adding it to a sample diluent, pretreatment solution, or the like.
  • the immunoassay reagent is a liquid reagent
  • the term "inside the immunoreaction system” refers to the liquid phase in which the sample and the liquid immunoassay reagent are mixed and immune reaction takes place.
  • the sample may be mixed with an LTIA measurement reagent containing an anti-C3 antibody, or the sample may be premixed with a pretreatment liquid containing an anti-C3 antibody and then mixed with an immunoassay reagent.
  • the sample may be mixed in advance with a pretreatment solution containing anti-C3 antibody and then dropped onto a microplate, or the sample may be mixed with a solution containing an anti-C3 antibody and a detection antibody and then mixed with a microplate.
  • the sample may be pre-mixed with a pretreatment solution containing an anti-C3 antibody and then mixed with an immunoassay reagent, or an immunoassay reagent (e.g., detection antibody or antigen, magnetic particle solution containing) may contain an anti-C3 antibody.
  • an immunoassay reagent e.g., detection antibody or antigen, magnetic particle solution containing
  • the term "within the immunoreaction system” refers to the solid phase in which the immunoreaction between the liquid sample and the binding partner is performed.
  • the sample may be mixed in advance with a pretreatment solution containing an anti-C3 antibody and then dropped onto the immunochromatographic test piece, or the anti-C3 antibody may be dried and held on the sample pad, and when the sample is dropped, the anti- The C3 antibody may be present in the reaction system by dissolving and developing the solid phase.
  • the concentration of the anti-C3 antibody does not have a strong effect on the immune reaction between the substance to be measured and the specific binding partner, and may exhibit the desired effect of suppressing non-specific reactions.
  • a person skilled in the art can appropriately set it according to the type of specimen.
  • the concentration of the anti-C3 antibody in the immune reaction system varies depending on the reagent composition of the immune reaction system, but the weight of the anti-C3 antibody with respect to 10 ⁇ L of the sample is 0.1 to 1000 ⁇ g, preferably 1.0 to 750 ⁇ g, more preferably. is 2.0 to 500 ⁇ g, more preferably 3.0 to 250 ⁇ g, most preferably 5.0 to 150 ⁇ g, but is not limited to this concentration.
  • the lower limit of the above range is preferably 10.0 ⁇ g or more, 15.0 ⁇ g or more, or 20.0 ⁇ g or more.
  • the anti-C3 antibody may be used alone, or a mixture of multiple anti-C3 antibodies, a combination of monoclonal and polyclonal antibodies, or an anti-C3 antibody bound to an insoluble carrier may be used. .
  • the combined concentration of both may be within the above concentration range.
  • the anti-C3 antibody is contained in advance in the measurement reagent of the present invention, it may be contained in advance in the measurement reagent so as to achieve the above concentration in the reaction system.
  • LTIA method (Latex immunoagglutination method (LTIA method))
  • LTIA method which is one of the immunoassay methods of the present invention.
  • Methods for measuring a substance to be measured by the LTIA method can be broadly classified into two. First, latex particles immobilized with a specific binding partner for the substance to be measured are reacted with the substance to be measured to form a sandwich-type immune complex, and the latex particles agglutinate as the immune complex is formed.
  • the second method is to add a protein or the like to which multiple substances to be measured or their analogues (including fragments thereof) are immobilized in a reagent, and to compete with the substances to be measured in the sample, Inhibits the formation of immune complexes between the substance to be measured contained in the reagent and latex particles on which a specific binding partner for the substance to be measured is immobilized, and the degree of inhibition of agglutination of the latex particles accompanying the inhibition of immune complex formation
  • This is a method for measuring a substance to be measured (antigen) from The substance to be measured and the specific binding partner for the substance to be measured can be selected arbitrarily depending on the purpose.
  • the substance to be measured is an antigen
  • antibodies such as polyclonal antibodies and monoclonal antibodies (including recombinant antibodies and functional fragments of each antibody) can be selected as specific binding partners for the substance to be measured.
  • antigens such as natural and recombinant antigens can be selected as specific binding partners for the substance to be measured.
  • the present invention can be used for any of the above methods, and specific examples include the following steps. (1) Step of contacting the substance to be measured in the sample with the anti-C3 antibody in a solution (2) After step (1), latex particles carrying a specific binding partner for the substance to be measured are added to the solution.
  • step (3) after step (2), optically detecting the degree of aggregation of the latex particles in the solution; ), the process of measuring the agglutination reaction between the substance to be measured and the latex particles without going through the washing/separation process.
  • the test substance can be measured by optically or electrochemically observing the degree of aggregation that has occurred.
  • optical observation methods include methods of measuring scattered light intensity, absorbance, or transmitted light intensity with an optical instrument (endpoint method, rate method, etc.). By comparing the measured values such as absorbance obtained by measuring the sample with the measured values such as absorbance obtained by measuring a standard substance (a sample with a known concentration of the substance to be measured), Calculate the concentration (quantitative value) of the substance to be measured.
  • the measurement of the absorbance of transmitted light, scattered light, or the like may be one-wavelength measurement or two-wavelength measurement (difference or ratio between two wavelengths).
  • the measurement wavelength is generally selected from 500 nm to 900 nm.
  • the measurement of the substance to be measured in the sample of the present invention may be performed manually or may be performed using an apparatus such as a measuring device.
  • the measuring device may be a general-purpose automatic analyzer or a dedicated measuring device (dedicated machine).
  • this measurement is preferably carried out by a method comprising a plurality of operation steps such as a two-step method (two-reagent method).
  • a specific binding partner for a substance to be measured can be immobilized and supported on latex particles by a known method such as physical adsorption method, chemical binding method, or a combination thereof.
  • a specific binding partner for the substance to be measured and latex particles are mixed and brought into contact in a solution such as a buffer, or the substance to be measured is dissolved in a buffer or the like according to known methods. This can be done by bringing a specific binding partner for the substance into contact with a carrier, or the like.
  • the chemical binding method is used, the Japanese Society of Clinical Pathology ed.
  • a specific binding partner for the substance to be measured and a carrier are combined with glutaraldehyde, carbodiimide, imidoester or maleimide.
  • a bivalent cross-linking reagent such as It can be carried out by, for example, reacting with a cross-linking reagent.
  • the synthetic polymer constituting the latex particles of the present invention is not particularly limited.
  • Hydrophilic carboxy monomer copolymers examples include styrene-methacrylic acid copolymers, styrene-acrylic acid copolymers, styrene-itaconic acid copolymers, and the like. Among them, preferred are styrene-methacrylic acid copolymer, styrene-itaconic acid copolymer, styrene and styrene-styrenesulfonate copolymer. Styrene and styrene-(meth)acrylic acid copolymers are particularly preferred.
  • specific binding partners there are multiple types of specific binding partners for specific substances carried by latex particles in order to form a sandwich.
  • one type of specific binding partner may be used.
  • the specific binding partner is a monoclonal antibody
  • multiple monoclonal antibodies with different recognition sites are used.
  • the specific binding partner is a polyclonal antibody, it may be derived from one type of antiserum, or may be derived from multiple types of antisera.
  • a monoclonal antibody and a polyclonal antibody may be used in combination.
  • a substance such as bovine serum albumin (BSA), casein, gelatin, ovalbumin or a salt thereof may be added to the surface of the latex particles.
  • Blocking treatment (masking treatment) of the carrier may be performed by treating by a known method such as contacting and covering with a protein, surfactant, skim milk powder, or the like.
  • the immunological reaction of the immunoassay method of the present invention is performed using an immunoassay reagent, and the reagent is characterized by containing the aforementioned anti-C3 antibody in addition to the main reaction component.
  • the main components of the reaction include a binding partner (other than the anti-C3 antibody) specific to the substance to be measured, and also include immunoassay particles, immunochromatographic test strips, insoluble carriers such as microplates, and the like.
  • the immunoassay reagent of the present invention contains buffers, proteins, peptides, amino acids, nucleic acids, lipids, phospholipids, sugars, inorganic salts, polymer compounds, interfaces, and Activators, other non-specific reaction inhibitors, preservatives, etc. may be contained. Buffers such as acetic acid, citric acid, phosphoric acid, tris, glycine, boric acid, carbonic acid, phthalic acid, succinic acid, maleic acid, and imidazole as components that buffer and adjust the pH, ionic strength, osmotic pressure, etc. of the sample. and Good's buffers, their sodium salts, potassium salts, calcium salts, and the like.
  • Buffers such as acetic acid, citric acid, phosphoric acid, tris, glycine, boric acid, carbonic acid, phthalic acid, succinic acid, maleic acid, and imidazole as components that buffer and adjust the pH, ionic strength
  • polymers such as polyvinylpyrrolidone and phospholipid polymers may be included as components that enhance aggregate formation.
  • concentration of the anti-C3 antibody in each constituent reagent may be contained in a form that can be adjusted to the concentration in the immune reaction system in the mixed state of the reagent and sample at the time of measurement, depending on each reagent type. different.
  • the reagent kit of the present invention is characterized by including at least an anti-C3 antibody in the kit configuration.
  • the composition of the kit includes not only reagents involved in immunoassay, but also sample diluents, sample extracts, etc.
  • the anti-C3 antibody can be added to any one or more of these.
  • the configuration of the kit includes, in addition to the above, an instruction manual and sample-collecting tools (collecting pipette, syringe, cotton swab, filtration filter, etc.). Reagent configurations for each immunoassay method will be described below.
  • Reagents are exemplified when the immunoassay is a latex immunoagglutination assay.
  • a first reagent containing an anti-C3 antibody (2) A second reagent containing latex particles carrying a specific binding partner for the substance to be measured
  • the first reagent typically contains a buffer, buffering the anti-C3 antibody
  • the concentration in the liquid may be contained in a form that can be adjusted to the preferred anti-C3 antibody concentration in the mixed state of the reagent and sample at the time of measurement, and varies depending on the reagent type.
  • the anti-C3 antibody may be contained in the second reagent in addition to the first reagent.
  • the general concentration of the anti-C3 antibody contained in the first reagent is 1 to 2000 ⁇ g/mL, preferably 5 to 1500 ⁇ g/mL, more preferably 10 to 1000 ⁇ g/mL, further preferably 15 to 500 ⁇ g. /mL, most preferably 25-500 ⁇ g/mL, but not limited to this concentration.
  • concentration of the anti-C3 antibody contained in the first reagent is 1 to 2000 ⁇ g/mL, preferably 5 to 1500 ⁇ g/mL, more preferably 10 to 1000 ⁇ g/mL, further preferably 15 to 500 ⁇ g. /mL, most preferably 25-500 ⁇ g/mL, but not limited to this concentration.
  • the anti-C3 antibody may be contained in the pretreatment solution, and the anti-C3 antibody concentration in the pretreatment solution is 1 ⁇ 2000 ⁇ g/mL, preferably 5-1500 ⁇ g/mL, more preferably 10-1000 ⁇ g/mL, even more preferably 15-500 ⁇ g/mL, most preferably 25-500 ⁇ g/mL, but not limited to this concentration .
  • Anti-C3b antibody, anti-iC3b antibody, anti-C3dg antibody and anti-C3d antibody can also be used in the same concentration range as the anti-C3 antibody.
  • the particles for immunoassay used in the present invention other than the latex particles described above, known particles can be used as long as they can carry a binding partner specific to the substance to be measured.
  • inorganic particles such as metal colloids, silica, and carbon can also be used as the immunoassay particles of the present invention.
  • the size of immunoassay particles should be determined in consideration of the optical measurement method used (e.g., nephelometric method for measuring transmitted light, nephelometric method for measuring scattered light, etc.) to obtain the desired measurement sensitivity, measurement range, etc. can be appropriately selected from the range of 0.05 to 1 ⁇ m.
  • the average particle size of 0.1 to 0.4 ⁇ m is generally used in optical measurement by an automatic analyzer, but it is not limited to this.
  • the ELISA method utilizes a combination of various antigen-antibody reactions, and finally incorporates an enzyme-labeled antigen or antibody into the reaction system to detect enzymatic activity. Enzyme activity is detected using a substrate whose absorbance spectrum changes depending on the reaction, and direct method, indirect method, sandwich method, competitive method, etc., are available depending on the combination of antigen-antibody reactions. Examples of reagents when the immunoassay method of the present invention is a sandwich ELISA method are illustrated. (a) an insoluble carrier immobilized with an antibody that reacts with the substance to be measured; (b) an antibody labeled with a labeling substance that reacts with the substance to be measured; You can choose to use it.
  • the antibody immobilized on the insoluble carrier captures the substance to be measured in the solution containing the sample and forms a complex on the insoluble carrier.
  • An antibody labeled with a labeling substance binds to the captured substance to be measured and forms a sandwich with the aforementioned complex.
  • the substance to be measured in the sample can be measured.
  • methods well known to those skilled in the art can be used without particular limitation.
  • the anti-C3 antibody used in the present invention can be present in the immune reaction system by, for example, adding it to a sample diluent or pretreatment solution, or adding it to a solution in which an antigen-antibody reaction is performed. can be done.
  • Immunochromatographic test piece When an antibody is used as a specific binding partner, on a sheet-like insoluble carrier such as a porous membrane, in the direction in which a solution containing a sample is developed, "1. Sample supply site” and "2. Site for holding labeled antibody (labeled antibody-retaining site)", and "3. site for immobilizing an antibody (capturing antibody site) for capturing a complex formed by the labeled antibody and the antibody against the substance to be measured”.
  • the sample when a predetermined amount of a sample containing at least the test piece as described above and a substance to be measured is added to the sample supply site, the sample enters the label holding site by capillary action, and the substance to be measured and the labeled antibody are separated. combine to form a complex.
  • the complex develops on the membrane and penetrates into the capture antibody site, it is captured by the antibody (capture antibody) immobilized on the membrane, forming a complex of capture antibody-substance to be measured-labeled antibody.
  • the substance to be measured is detected by detecting the label by any method (for example, in the case of a visible label such as gold colloid, its aggregate image, or in the case of an enzyme, a coloring reaction by adding a substrate).
  • the anti-C3 antibody used in the present invention can be added, for example, to a sample diluent or pretreatment solution, or contained in a sample supply site or label retention site and dried and retained. It can be present in the reaction system.
  • ⁇ Chemiluminescence method> After forming a complex by reacting the magnetic particles bound with the antigen or antibody and the substance to be measured, the unreacted substance is removed by magnetism. Furthermore, in this method, a reagent containing a labeled antibody is added, unreacted substances are removed by magnetism, a luminescent reagent is added, and the amount of luminescence is measured. A case where an enzyme is used for labeling is called a chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA method).
  • CLLIA method chemiluminescent enzyme immunoassay
  • an electrochemiluminescence immunoassay a case where a metal complex such as a ruthenium pyridine complex is used as a label and the luminescence intensity is measured by an electrochemical reaction is called an electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA method).
  • ELIA method electrochemiluminescence immunoassay
  • CLIA method chemiluminescent immunoassay
  • the anti-C3 antibody used in the present invention is present in the immune reaction system by, for example, adding it to a sample diluent or pretreatment solution, or adding it to a solution in which an antigen-antibody reaction is performed. can be done.
  • specific binding partners for the substance to be measured include proteins other than anti-C3 antibodies, peptides, amino acids, lipids, carbohydrates, nucleic acids, haptens, and the like.
  • Non-limiting examples include antibodies or antigens that can be used in immunoassays that utilize the immune response.
  • Said antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Monoclonal antibodies are more preferred.
  • the antibody may be a whole antibody molecule or a functional fragment of an antibody having antigen-antibody reaction activity.
  • antibodies such as chimeric antibodies, humanized antibodies, or fully humanized antibodies
  • antibody functional fragments include F (ab') 2 and Fab' fragments having antigen-antibody activity, single chain antibodies (scFv), VHH (variable domain of heavy chain of heavy chain antibody) antibodies, IgNAR ( new antigen receptor) antibodies, etc.
  • a proteolytic enzyme eg, pepsin, papain, etc.
  • Samples containing the substance to be measured of the present invention include, for example, human or animal blood, serum, plasma, culture supernatant, urine, cerebrospinal fluid, saliva, perspiration, ascitic fluid, cell or tissue extracts, and the like. Further, the sample in the present invention includes not only the sample itself obtained from the living body, but also the sample that has undergone pretreatment such as dilution and purification.
  • the immunoassay reagent of the present invention can use various substances contained in the sample as measurement target substances.
  • the substance to be measured may be any substance that does not react with the anti-C3 antibody used for non-specific suppression, and includes proteins, peptides, amino acids, lipids, carbohydrates, nucleic acids, haptens, etc.
  • theoretical measurement There is no particular limitation as long as it is a possible substance.
  • CRP C-reactive protein
  • Lp(a) Lp(a)
  • MMP3 matrix metalloproteinase 3
  • antiphospholipid antibody type IV collagen
  • PSA BNP
  • BNP brain natriuretic peptide
  • insulin albumin
  • cystatin C RF
  • KL-6 procalcitonin
  • FDP D-dimer
  • SF soluble fibrin
  • TAT thrombin-antithrombin III complex
  • PAI-1 phenytoin
  • phenobarbital carbamazepine
  • valproic acid theophylline
  • TARC Thymus and activation-regulated chemokine
  • sIL-2R soluble interleukin-2 receptor
  • suppressing a non-specific reaction means acting on a factor (non-specific factor) that causes the non-specific reaction in a biological sample to suppress the influence of a reaction other than an immune reaction on the measurement.
  • the present invention can suppress non-specific reactions by performing immune reactions in the presence of anti-C3 antibodies.
  • the non-specific reaction inhibitor of the present invention may contain a substance capable of inhibiting a non-specific reaction derived from a sample in an immunoassay, and contains at least an anti-C3 antibody as an active ingredient.
  • the non-specific reaction inhibitor of the present invention can use the composition containing the anti-C3 antibody in the reagent composition as it is.
  • the non-specific reaction inhibitor of the present invention includes buffers, proteins, peptides, amino acids, nucleic acids, lipids, phospholipids, saccharides, inorganic salts, polymer compounds, surfactants, as long as the effect of inhibiting non-specific reactions is not impaired. , other non-specific reaction inhibitors, preservatives and the like may be contained.
  • Example I Suppression of non-specific reaction in LTIA method: measurement of TARC
  • the following shows a test in which the concentration of TARC in samples was measured using reagents according to the LTIA method to which the anti-C3d polyclonal antibody of the present invention and other non-specific reaction inhibitors were added.
  • samples the samples (control specimens: specimens 1 to 3) showing values close to the values measured by the chemiluminescence enzyme immunoassay (CLEIA method) (Comparative Example 1) and the measurement of Comparative Example 1 exhibiting non-specific reactions Samples that greatly deviate from the values (deviation samples: samples 4 to 10) were used.
  • Measurement method 1-1 Measurement reagent HISCL (registered trademark) TARC (Sysmex Corporation) 1-2. Sample physiological saline (Otsuka saline injection), specimen (serum) 1-10 1-3. Measurement procedure Measurement was performed using HISCL (registered trademark)-5000 (Sysmex Corporation) according to the package insert of the reagent.
  • HISCL registered trademark
  • the measurement results are shown in Table 1.
  • the CLEIA method shown in Comparative Example 1 performs a B/F separation operation and has a washing step. Therefore, it was used as a comparative example because it is a measurement method that is less susceptible to non-specific reactions derived from the sample.
  • TARC antigens include CCL17, thymus and activation regulated chemokine (Shenandoah Biotechnology, Inc.), CCL17/TARC, Human (LifeSpan Biosscience, Inc.), Human TARC (CCL17) (Abeomics, Inc.). Furthermore, a combination of monoclonal antibodies capable of sandwich assay against the TARC antigen was selected by a method well known to those skilled in the art. Anti-human TARC monoclonal antibody-sensitized latex was prepared with reference to the method described in JP-A-2017-181377. 1-2. Sample Same as the sample of Comparative Example 1 1-3.
  • the first reagent and the second reagent were combined, and the TARC concentration in the sample was measured using the Hitachi automatic analyzer 3500. Specifically, 120 ⁇ L of the first reagent was added to 2.4 ⁇ L of the sample, and the mixture was incubated at 37° C. for 5 minutes, then 40 ⁇ L of the second reagent was added and stirred. The change in absorbance associated with aggregate formation was then measured for 5 minutes at a dominant wavelength of 570 nm and a sub-wavelength of 800 nm, and the absorbance change was applied to a calibration curve obtained by measuring standard substances of known concentrations to calculate the measured value. .
  • Comparative Example 3 (measurement by LTIA method: addition of HBR-1) Measurement was performed in the same manner as in Comparative Example 2, except that HBR-1 (SCANTIBODIES LABORATORY, INC.), a commercially available non-specific inhibitor, was added to the first reagent shown in Comparative Example 2 so as to be 100 ⁇ g/mL. gone. Table 1 shows the measurement results.
  • FIG. 2 shows the correlation between the measured values of Comparative Example 3 and the measured values of Comparative Example 1. As shown in FIG.
  • Example 1 Measurement by LTIA method: addition of anti-C3d polyclonal antibody
  • Measurement was performed in the same manner as in Comparative Example 2, except that anti-C3d polyclonal antibody (Bio-Rad) was added to the first reagent shown in Comparative Example 2 so as to have a concentration of 100 ⁇ g/mL.
  • Table 1 shows the measurement results.
  • 3 shows the correlation of the measured values of Example 1 with respect to the measured values of Comparative Example 1. As shown in FIG.
  • Comparative Example 3 the measured value of Specimen 3 deviated from that of Comparative Example 1. It was believed that the addition of HBR-1 caused an unwanted reaction. (2) Verification was performed on the measurement results of the deviation samples (specimen numbers 4 to 10).
  • specimen No. 4 the measured value by the CLEIA method (Comparative Example 1) was 205 pg/mL, whereas the measured value by the LTIA method (Comparative Example 2) without the addition of a non-specific reaction inhibitor was 669 pg/mL. mL, and the measured values deviated greatly.
  • the value measured by the LTIA method with HBR-1 added was 634 pg/mL, which greatly deviated from Comparative Example 1.
  • the value measured by the LTIA method (Example 1) with the addition of the anti-C3d polyclonal antibody of the present invention was 271 pg/mL, showing a tendency to approach Comparative Example 1. Similar results were obtained for specimens 5-10.
  • the presence of the anti-C3d antibody of the present invention in the immune reaction system made it possible to suppress the non-specific reaction derived from the sample. It was an unexpected result that the present invention was able to inhibit non-specific reactions that could not be inhibited by HBR-1, a commercially available non-specific reaction inhibitor.
  • the deviation samples used in this test contained RF in a wide range of concentrations, but no relationship was observed between the amount of RF and the degree of deviation between the measured values (data not shown). Therefore, it was suggested that the non-specific inhibitory effect of the anti-C3d antibody of the present invention may not be affected by the amount of RF.
  • Example II Suppression of non-specific reaction in LTIA method: measurement of sIL-2R
  • Tests in which sIL-2R concentrations in samples were measured using reagents according to the LTIA method to which the anti-C3d polyclonal antibody of the present invention and other non-specific reaction inhibitors were added are described below.
  • samples the samples (control specimens: specimens 11 to 15) showing values close to the values measured by the chemiluminescence enzyme immunoassay (CLEIA method) (Comparative Example 4) and the measurement of Comparative Example 4 exhibiting a non-specific reaction Samples that deviate greatly from the values (deviating samples: samples 16 and 17) were used.
  • Measurement method 1-1 Measurement reagent Lumipulse Presto (registered trademark) IL-2R (Fujirebio Co., Ltd.) 1-2. Sample Specimen (serum) 11-17 1-3. Measurement procedure Measurement was performed using Lumipulse (registered trademark)-L2400 (Fujirebio Co., Ltd.) according to the package insert of the reagent.
  • the measurement results are shown in Table 2.
  • the CLEIA method shown in Comparative Example 4 carries out a B/F separation operation and has a washing step. Therefore, it was used as a comparative example because it is a measurement method that is less susceptible to non-specific reactions derived from the sample.
  • [Comparative Example 5] (measurement by LTIA method: no addition of non-specific reaction inhibitor) 1. Measurement method 1-1. Measurement Reagent According to the method described in JP-A-2017-181377, the first reagent and the second reagent were prepared. 1-2. Sample Same as the sample of Comparative Example 4 1-3. Measurement procedure The first reagent and the second reagent were combined, and the sIL-2R concentration in the sample was measured using a Hitachi 7180 automated analyzer. Specifically, 120 ⁇ L of the first reagent was added to 5.6 ⁇ L of the sample, and the mixture was incubated at 37° C. for 5 minutes, then 40 ⁇ L of the second reagent was added and stirred.
  • the change in absorbance associated with aggregate formation was then measured for 5 minutes at a dominant wavelength of 570 nm and a sub-wavelength of 800 nm, and the absorbance change was applied to a calibration curve obtained by measuring standard substances of known concentrations to calculate the measured value. .
  • Example 2 Measurement by LTIA method: addition of anti-C3d polyclonal antibody
  • Measurement was performed in the same manner as in Comparative Example 5, except that anti-C3d polyclonal antibody (Bio-Rad) was added to the first reagent shown in Comparative Example 5 so as to have a concentration of 100 ⁇ g/mL.
  • Table 2 shows the measurement results.
  • the value measured by the LTIA method (Example 2) with the addition of the anti-C3d polyclonal antibody of the present invention was 409 U/mL, showing a tendency to approach Comparative Example 4. Similar results were obtained for sample 17 as well.
  • the presence of the anti-C3d antibody of the present invention in the immune reaction system made it possible to suppress the non-specific reaction derived from the sample. According to the present invention, a non-specific reaction that could not be suppressed even by HBR-1, a commercially available non-specific reaction inhibitor, was able to be suppressed. rice field.
  • Example III Suppression of non-specific reaction in ELISA method: measurement of sIL-2R
  • Tests in which sIL-2R concentrations in samples were measured using ELISA reagents to which the anti-C3d polyclonal antibody of the present invention and other non-specific reaction inhibitors were added are described below.
  • samples the samples (control specimens: specimens 18 to 22) showing values close to the values measured by the chemiluminescence enzyme immunoassay (CLEIA method) (Comparative Example 7) and the measurement of Comparative Example 7 exhibiting a non-specific reaction
  • a sample device sample: sample 23) that greatly deviated from the value was used.
  • Measurement method 1-1 Measurement reagent Lumipulse Presto (registered trademark) IL-2R (Fujirebio Co., Ltd.) 1-2. Sample Serum Specimen 18-23 1-3. Measurement procedure Measurement was performed using Lumipulse (registered trademark) L2400 (Fujirebio Co., Ltd.) according to the package insert of the measurement reagent.
  • PBST PBS containing 0.05% Tween (registered trademark) 20
  • BSA-PBST bovine serum albumin
  • Example 3 Measurement by ELISA: addition of anti-C3d polyclonal antibody
  • Measurement was performed in the same manner as in Comparative Example 8, except that an anti-C3d polyclonal antibody (Bio-Rad) was added to the specimen diluent (BSA-PBST) shown in Comparative Example 8 so as to be 100 ⁇ g/mL. rice field.
  • BSA-PBST specimen diluent
  • the measured value of the ELISA method (Example 3) with the addition of the anti-C3d polyclonal antibody of the present invention was 1338 U/mL, showing a tendency to approach that of Comparative Example 4. From this, it was found that some non-specific reactions occurring in Comparative Examples 8 and 9 can be suppressed by adding the anti-C3d polyclonal antibody. As described above, in the immunoassay method, non-specific reactions could be suppressed by allowing the anti-C3d antibody of the present invention to exist in the immune reaction system. According to the present invention, a non-specific reaction that could not be suppressed even by HBR-1, a commercially available non-specific reaction inhibitor, was able to be suppressed. rice field. It was also found that such a non-specific reaction suppressing effect is exhibited not only in the homogeneous measurement systems of Examples I and II, but also in the heterogeneous measurement system of Example III.
  • Example IV Suppression of non-specific reaction in LTIA method: measurement of sIL-2R
  • Tests in which sIL-2R concentrations in samples were measured using reagents according to the LTIA method to which the anti-C3d polyclonal antibody of the present invention and other non-specific reaction inhibitors were added are described below.
  • the samples control specimens: specimens 12, 24, 25
  • CLIA method chemiluminescence enzyme immunoassay
  • Comparative Example 10 Comparative Example 10 exhibiting a non-specific reaction Samples (deviating specimens: specimens 16 and 17) that deviate greatly from the measured value of .
  • Measurement method 1-1 Measurement reagent Lumipulse Presto (registered trademark) IL-2R (Fujirebio Co., Ltd.) 1-2. Sample Specimen (serum) 12, 16, 17, 24, 25 1-3. Measurement procedure Measurement was performed using Lumipulse (registered trademark)-L2400 (Fujirebio Co., Ltd.) according to the package insert of the reagent.
  • Comparative Example 11 (measurement by LTIA method: no addition of non-specific reaction inhibitor) 1. Measurement method 1-1. Measurement Reagents The first and second reagents prepared in Comparative Example 5 were used. 1-2. Sample Same as the sample of Comparative Example 10 1-3. Measurement Procedure Measurement was performed in the same manner as in Comparative Example 5.
  • Example 4 (Measurement by LTIA method: addition of anti-C3d polyclonal antibody)
  • anti-C3d polyclonal antibody Bio-Rad
  • Example 4-1 anti-C3d polyclonal antibody
  • Example 4-2 50 ⁇ g/mL
  • Example 4-3 100 ⁇ g/mL
  • Example 4-4 100 ⁇ g/mL
  • Example 4-4 500 ⁇ g/mL
  • Example 4-5 500 ⁇ g/mL
  • the value measured by the LTIA method (Example 4-1) with the addition of 25 ⁇ g/mL of the anti-C3d polyclonal antibody of the present invention was 352 U/mL, showing a tendency to approach Comparative Example 10.
  • the measured values of the LTIA method with the addition of 50 and 500 ⁇ g/mL of the anti-C3d polyclonal antibody of the present invention are 395 and 374 U/mL, which are comparative examples. A tendency to approach 10 was shown. Furthermore, similar results were obtained for specimen 17 as well.
  • the anti-C3d polyclonal antibody of the present invention exhibited the effect of suppressing non-specific reactions in the range of at least 25-500 ⁇ g/mL.
  • Hybridomas were screened by sandwich ELISA using anti-Complement C3d polyclonal antibody. Details of the sandwich ELISA method follow.
  • Sandwich ELISA plate preparation Anti-mouse IgG antibody is dissolved in PBS to 5 ⁇ g / mL, 50 ⁇ L of the solution is dispensed into each well of a 96-well microplate, and at room temperature It was allowed to stand for 2 hours.
  • wells with high absorbance were selected as wells containing anti-Complement C3d antibody-producing hybridomas (positive wells).
  • a commercially available mouse-derived anti-C3d monoclonal antibody manufactured by Hycult Biotech was used at a concentration of 1 ⁇ g/mL instead of the hybridoma culture supernatant.
  • Example V Suppression of non-specific reaction in LTIA method: measurement of sIL-2R
  • sIL-2R concentration in a sample was measured using the reagent according to the LTIA method to which the anti-C3d monoclonal antibody of the present invention prepared in Reference Example 1 was added will be described below.
  • the same sample as in Example IV was used as the sample.
  • Example 5 (measurement by LTIA method: addition of anti-C3d monoclonal antibody) Measurement was performed in the same manner as in Comparative Example 5 except that the five types of anti-C3d monoclonal antibodies prepared in Reference Example 1 were added to the first reagent shown in Comparative Example 5 so that each concentration was 100 ⁇ g/mL. .
  • Added clone no. is as follows.
  • Example 5-1 Clone No. S35201
  • Example 5-2 Clone No. S35202
  • Example 5-3 Clone No. S35203
  • Example 5-4 clone no. S35204 Example 5-5: Clone No. S35205. Table 5 shows the measurement results.
  • Comparative Examples 10, 11 and 12 are as described in the discussion of Example IV.
  • the anti-C3d monoclonal antibody clone No. of the present invention The value measured by the LTIA method with 100 ⁇ g/mL of S35201 added (Example 5-1) was 377 U/mL, showing a tendency to approach Comparative Example 10.
  • the anti-C3d monoclonal antibody of the present invention clone no.
  • the values measured by the LTIA method (Examples 5-2 to 5-5) in which 100 ⁇ g/mL of S35202 to S35205 were added were 339 to 368 U/mL, showing a tendency to approach Comparative Example 10.
  • similar results were obtained for specimen 17 as well.
  • the anti-C3d monoclonal antibody of the present invention exhibited an effect of suppressing non-specific reactions.
  • the anti-C3d antibody of the present invention was able to obtain the effect of suppressing the non-specific reaction originating from the sample with both the polyclonal antibody and the monoclonal antibody. Accurate measurement is extremely important in immunological measurement methods, but the significance of the present invention being able to suppress non-specific reactions that could not be suppressed even with commercially available non-specific reaction inhibitors is big.

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Abstract

本発明は免疫反応測定方法において非特異反応を抑制することを課題とする。　試料中の測定対象物質を免疫学的に測定する方法において、抗Ｃ３抗体存在下で免疫反応を行うことを特徴とする免疫学的測定方法を提供する。また、試料中の測定対象物質を免疫学的に測定する方法における非特異反応抑制方法であって、抗Ｃ３抗体存在下で免疫反応を行うことを特徴とする非特異反応抑制方法を提供する。

Description

免疫学的測定方法
　本発明は、免疫学的測定方法に関する。特に、抗Ｃ３抗体存在下で免疫反応を行う免疫学的測定方法に関する。
　診断薬分野における測定方法として、生体試料中に存在する測定対象物質を免疫反応を利用して測定する免疫学的測定方法が挙げられる。免疫学的測定方法は抗原抗体反応を利用していることから、特異性が非常に高い測定方法である。
　生体試料中には様々な物質が存在しており、いわゆる非特異因子とよばれる非特異反応の原因となる物質が含まれていることが多い。非特異反応とは、特異反応にもとづかない結合が促進されたり、特異的な免疫反応が妨げられたりする現象のことであり、測定誤差の原因となる。非特異因子としては、異好性抗体やリウマチ因子（ＲＦ）の存在が明らかとなっている。異好性抗体とは、免疫学的測定方法の主成分である動物由来抗体に対して反応性を示すヒト抗体の総称であり、ＨＡＭＡ（ヒト抗マウス免疫グロブリン抗体）が代表的なものとして知られている。リウマチ因子とは、関節リウマチ患者に出現し、動物由来抗体に対して反応性を示すという性質においてＨＡＭＡと共通しており、その実体はいずれもヒトの免疫グロブリンＧや免疫グロブリンＭであることが知られている（非特許文献１）。
　免疫学的測定方法において非特異反応を抑制する技術として例えば特許文献１が知られている。特許文献１には、予め試料をヒトリウマチ因子（ＲＦ）の反応部位に結合能を有する動物由来抗体の十分量で前処理することによりＲＦに起因する非特異反応を抑制する方法が開示されている。動物由来抗体としては抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＡ抗体及び／又は抗ヒトＩｇＭ抗体が挙げられている。
特開平０７－０１２８１８号公報
臨床化学 ;第23巻補冊175a-1～175a-10 (1994）
　特許文献１は、抗ヒトＩｇＭ抗体、抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＡ抗体によって自然抗体やＲＦに起因する非特異反応を抑制する方法である。現在、さまざまな試薬で実用化されている方法であるが、これらの抗体によってもなお、抑制できない非特異反応も存在することが、本発明者らの試験で明らかとなっていた。本発明は免疫学的測定方法における非特異反応を抑制することを課題とする。
　本願発明者らは上記課題を解決するために、様々な物質の非特異反応抑制効果を検討した結果、抗Ｃ３抗体存在下で免疫反応を行うことにより非特異反応を抑制できることを見出し、本願発明を完成するに至った。すなわち、本願発明は以下の構成を有する。
なお、抗Ｃ３抗体は、免疫学的測定方法において測定対象物質の検出に用いられることは知られているが、免疫反応における非特異反応抑効果については一切知られていない。
＜１＞
試料中の測定対象物質を免疫学的に測定する方法において、抗Ｃ３抗体存在下で免疫反応を行うことを特徴とする免疫学的測定方法。
＜２＞
免疫学的測定方法が、ホモジーニアス法またはヘテロジーニアス法に基づく方法である＜１＞に記載の免疫学的測定方法。
＜３＞
ホモジーニアス法に基づく方法が、ラテックス免疫凝集測定方法である＜１＞又は＜２＞に記載の免疫学的測定方法。
＜４＞
試料中の測定対象物質と抗Ｃ３抗体とを溶液中で接触させる工程と、
前記溶液中に測定対象物質に対する特異的結合パートナーを担持するラテックス粒子を添加する工程と、
溶液中におけるラテックス粒子の凝集度合いを光学的に検出する工程と、
を含む、＜３＞に記載の免疫学的測定方法。
＜５＞
抗Ｃ３抗体が、抗ｉＣ３ｂ抗体、抗Ｃ３ｄｇ抗体、抗Ｃ３ｄ抗体及び抗Ｃ３ｂ抗体からなる群から選ばれるいずれか１以上である＜１＞～＜４＞のいずれかに記載の免疫学的測定方法。
＜６＞
試料中の測定対象物質を免疫学的に測定する方法における非特異反応抑制方法であって、抗Ｃ３抗体存在下で免疫反応を行うことを特徴とする非特異反応抑制方法。
＜７＞
免疫学的測定方法が、ホモジーニアス法またはヘテロジーニアス法に基づく方法である＜６＞に記載の非特異反応抑制方法。
＜８＞
ホモジーニアス法に基づく方法が、ラテックス免疫凝集測法である＜６＞又は＜７＞に記載の非特異反応抑制方法。
＜９＞
試料中の測定対象物質と抗Ｃ３抗体とを溶液中で接触させる工程と、
前記溶液中に測定対象物質に対する特異的結合パートナーを担持するラテックス粒子を添加する工程と、
溶液中におけるラテックス粒子の凝集度合いを光学的に検出する工程と、
を含む、＜８＞に記載の非特異反応抑制方法。
＜１０＞
抗Ｃ３抗体が、抗ｉＣ３ｂ抗体、抗Ｃ３ｄｇ抗体、抗Ｃ３ｄ抗体及び抗Ｃ３ｂ抗体からなる群から選ばれるいずれか１以上である＜６＞～＜９＞のいずれかに記載の免疫学的測定方法。
＜１１＞
抗Ｃ３抗体を含む免疫学的測定用試薬。
＜１２＞
免疫学的測定方法が、ホモジーニアス法またはヘテロジーニアス法に基づく方法である＜１１＞に記載の免疫学的測定用試薬。
＜１３＞
ホモジーニアス法に基づく方法が、ラテックス免疫凝集法である＜１２＞に記載の免疫学的測定用試薬。
＜１４＞
抗Ｃ３抗体が、抗ｉＣ３ｂ抗体、抗Ｃ３ｄｇ抗体、抗Ｃ３ｄ抗体及び抗Ｃ３ｂ抗体からなる群から選ばれるいずれか１以上である＜１１＞～＜１３＞のいずれかに記載の免疫学的測定用試薬。
＜１５＞
抗Ｃ３抗体を含む免疫学的測定用試薬キット。
＜１６＞
免疫学的測定方法が、ホモジーニアス法またはヘテロジーニアス法に基づく方法である＜１４＞に記載の免疫学的測定用試薬キット。
＜１７＞
ホモジーニアス法にもとづく方法が、ラテックス免疫凝集法であって、以下を含む＜１６＞に記載の免疫学的測定用試薬キット。
（１）抗Ｃ３抗体を含む第１試薬
（２）測定対象物質に対する特異的結合パートナーを担持するラテックス粒子を含む第２試薬
＜１８＞
抗Ｃ３抗体が、抗ｉＣ３ｂ抗体、抗Ｃ３ｄｇ抗体、抗Ｃ３ｄ抗体及び抗Ｃ３ｂ抗体からなる群から選ばれるいずれか１以上である＜１５＞～＜１７＞のいずれかに記載の免疫学的測定用試薬。
＜１９＞
抗Ｃ３抗体を有効成分として含む、免疫学的測定方法における非特異反応抑制剤。
＜２０＞
抗Ｃ３抗体が、抗ｉＣ３ｂ抗体、抗Ｃ３ｄｇ抗体、抗Ｃ３ｄ抗体及び抗Ｃ３ｂ抗体からなる群から選ばれるいずれか１以上である＜１９＞に記載の免疫学的測定方法における非特異反応抑制剤。
　本発明によれば、免疫学的測定方法において、抗Ｃ３抗体存在下で免疫反応を行うことにより試料中に含まれる非特異因子による非特異反応を抑制することができ、正確な測定をすることが可能となった。特に、市販の非特異反応抑制剤によってもなお抑制できなかった非特異反応を本発明により抑制することが可能となった意義は大きい。
比較例１（ＣＬＥＩＡ法）の測定値に対する、比較例２（非特異反応抑制剤を添加していないＬＴＩＡ法）の測定値の相関である。 比較例１（ＣＬＥＩＡ法）の測定値に対する、比較例３（非特異反応抑制剤としてＨＢＲ－１を添加したＬＴＩＡ法）の測定値の相関である。 比較例１（ＣＬＥＩＡ法）の測定値に対する、実施例１（非特異反応抑制剤として本願発明の抗Ｃ３ｄポリクローナル抗体を添加したＬＴＩＡ法）の測定値の相関である。 補体タンパクＣ３の構造と活性化および分解を示す模式図である（補体学入門 ：基礎から臨床・測定法まで，北村肇 ，学際企画（2010.11），ｐ27の図１０より引用）。
（免疫学的測定方法）
　本発明の免疫学的測定方法は、試料中の測定対象物質を免疫学的に測定する方法において、抗Ｃ３抗体存在下で免疫反応を行うことを特徴とする方法である。換言すれば、非特異抑制剤としての抗Ｃ３抗体存在下で、試料中の測定対象物質を抗Ｃ３抗体以外の特異的結合パートナーを用いて免疫学的に測定する方法である。
　免疫学的測定方法は、さらにホモジーニアス法とヘテロジーニアス法に大別される。
　ホモジーニアス法は、試料と試薬液の混和溶液（反応液）中で測定対象物質により進行する反応をＢ／Ｆ（結合／非結合）分離を行うことなく特異的に検出する測定法であり、ヘテロジーニアス法は、Ｂ／Ｆ分離操作によって結合反応に関与しなかった余剰成分を洗浄・除去した後、主反応を進行させて検出する測定法である。
　ヘテロジーニアス法は、洗浄工程を経るため、工程が多く測定に時間を要するという課題がある一方、非特異反応物質による影響を比較的受けにくいという利点がある。これに対してホモジーニアス法は、洗浄工程を経ないため、非特異反応の影響を受けやすいという課題がある一方、工程が少なく簡便であり、測定に要する時間も短いため、臨床診断の分野で広く求められている方法である。
　ホモジーニアス法としては、免疫凝集法を利用した測定方法（ＴＩＡ）、イムノクロマトグラフィー（ラテラルフロー式、フロースルー式）が挙げられる。ＴＩＡは、抗体などの特異的結合パートナーによるアナライト（測定対象物質）の架橋作用によって形成される免疫複合体の凝集度合いに基づいて、試料中のアナライトを定性もしくは定量的に検出する方法であり、なかでも、凝集シグナルを増幅させるために不溶性担体としてラテックス粒子を用いたラテックス免疫凝集法（以下、ＬＴＩＡということがある）は光学的な検出に適しており、自動化も容易なことから、さまざまな検査項目に適用されている汎用性の高い測定方法である。
　ヘテロジーニアス法としては、ウェル状プレートを用いたＥＬＩＳＡ法、化学発光法などが挙げられる。
　本発明は、上記いずれの免疫学的測定方法も利用することができるが、非特異反応の影響を比較的受けやすいホモジーニアス法が、より効果を享受することが期待できるため好ましい。
（抗Ｃ３抗体）
　本発明において非特異反応抑制のために用いられる抗Ｃ３抗体は、Ｃ３に対する抗体であり、Ｃ３のうちＣ３ｄに対応する部分を認識する抗体であればよい。
　Ｃ３は、Classical　pathwayの補体タンパク質の１つであり、補体第３成分又は電気易動度からβ１Ｃグロブリンとも呼ばれる。Ｃ３は分子量が１８０ｋＤａのタンパク質であり、分子量１１０ｋＤａのα鎖と分子量７０ｋＤａのβ鎖が-s-s-結合で架橋された構造を有しており、補体系の中心的タンパク質である。Ｃ３は、図４に示すようにＣ３ｂ、ｉＣ３ｂを経て、Ｃ３ｄｇ、さらにはＣ３ｄへと分解される。本発明に用いられる抗Ｃ３抗体は、Ｃ３のうち分解されて生成するＣ３ｄに対応する部分を認識する抗体であればよく、その意味で抗ｉＣ３ｂ抗体、抗Ｃ３ｂ抗体、抗Ｃ３ｄｇ抗体又は抗Ｃ３ｄ抗体のいずれも用いることができる。このうちでも特に抗Ｃ３ｄ抗体が好ましい。
　本発明に用いられる抗Ｃ３抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。より好ましくは、モノクローナル抗体である。
　また、本発明に用いられる抗Ｃ３抗体としては、抗体分子全体のほかに抗原抗体反応活性を有する抗体の機能性断片を使用することも可能である。
　本発明に用いられる抗Ｃ３抗体は、一般的な動物（マウス、ヤギ、ヒツジなど）への免疫工程を経て得られたもののほか、遺伝子組換え技術等により免疫原（測定対象物質）を免疫する動物とは異なる動物種のアミノ酸配列に変化させた抗体（キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト化抗体等）であってもよい。抗体の機能性断片としては抗原抗体反応活性を有する断片であるＦ（ａｂ'）2、Ｆａｂ'や一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ＶＨＨ（variable domain of heavy chain of heavy chain antibody）抗体、ＩｇＮＡＲ　（new antigen receptor）抗体などが挙げられる。これらの抗体の機能性断片は前記のようにして得られた抗体をタンパク質分解酵素（例えば、ペプシンやパパインなど）で処理することにより製造できる。本発明において抗Ｃ３抗体の機能性断片としては、上述のようにＣ３ｄに対応する部分を含む断片であればよい。本発明において、特に断らない限りは、抗Ｃ３抗体には機能性断片も含むものとする。
　本発明に用いられるＣ３に対する抗体は、抗Ｃ３ｂ抗体、抗ｉＣ３ｂ抗体、抗Ｃ３ｄｇ抗体及び抗Ｃ３ｄ抗体からなる群のいずれか１種を用いればよく、また、これらから選ばれるいずれか２種以上を組み合わせて用いることもできる。
　本明細書において、抗体が抗原と「反応する」、抗体が抗原を「認識する」は、同義で用いられるが、これらの例示に限定されることはなく、最も広義に解釈する必要がある。抗体が抗原（化合物）と「反応する」か否かの確認は、抗原固相化ＥＬＩＳＡ法、競合ＥＬＩＳＡ法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法などにより行うことができるほか、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）の原理を利用した方法（ＳＰＲ法）などにより行うことができる。ＳＰＲ法は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）の名称で市販されている、装置、センサー、試薬類を使用して行うことができる。
　本発明に用いられるＣ３に対する抗体は、抗原（免疫原）として市販のヒト由来Ｃ３ｄ蛋白質などのＣ３をリン酸緩衝生理食塩水などの溶媒に溶解し、この溶液を動物に投与して免疫することにより製造できる。必要に応じて前記溶液に適宜のアジュバントを添加した後、エマルジョンを用いて免疫を行ってもよい。アジュバントとしては、油中水型乳剤、水中油中水型乳剤、水中油型乳剤、リポソーム、水酸化アルミニウムゲルなどの汎用されるアジュバントのほか、生体成分由来のタンパク質やペプチド性物質などを用いてもよい。例えば、フロイントの不完全アジュバント又はフロイントの完全アジュバントなどを好適に用いることができる。アジュバントの投与経路、投与量、投与時期は特に限定されないが、抗原を免疫する動物において所望の免疫応答を増強できるように適宜選択することが望ましい。
　免疫に用いる動物の種類も特に限定されないが、哺乳動物が好ましく、例えばマウス、ラット、ウシ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、アルパカなどを用いることができ、より好ましくはマウス又はラットを用いることができる。動物の免疫は、一般的な手法に従って行えばよく、例えば、抗原の溶液、好ましくはアジュバントとの混合物を動物の皮下、皮内、静脈、又は腹腔内に注射することにより免疫を行うことができる。免疫応答は、一般的に免疫される動物の種類及び系統によって異なるので、免疫スケジュールは使用される動物に応じて適宜設定することが望ましい。抗原投与は最初の免疫後に何回か繰り返し行うことが好ましい。
　モノクローナル抗体を得るために、引き続き以下の操作が行われるがそれに限定されることはなく、モノクローナル抗体それ自体の製造方法については当業界で周知されており、かつ汎用されているので当業者は前記の抗原を用いることによって本発明の免疫学的分析方法において使用される抗体を容易に製造することが可能である（例えばＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８８） 第６章などを参照のこと）。
　最終免疫後、免疫した動物から抗体産生細胞である脾臓細胞あるいはリンパ節細胞を摘出し、高い増殖能を有する骨髄腫由来の細胞株と細胞融合することによりハイブリドーマを作製することができる。細胞融合には抗体産生能（質・量）が高い細胞を用いることが好ましく、また骨髄腫由来の細胞株は融合する抗体産生細胞の由来する動物と適合性があることが好ましい。細胞融合は、当該分野で公知の方法に従って行うことができるが、例えば、ポリエチレングリコール法、センダイウイルスを用いた方法、電流を利用する方法などを採用することができる。得られたハイブリドーマは当業界で汎用の条件に従って増殖させることができ、産生される抗体の性質を確認しつつ所望のハイブリドーマを選択することができる。ハイブリドーマのクローニングは、例えば限界希釈法や軟寒天法などの周知の方法により行うことが可能である。
　ハイブリドーマの選択は、産生される抗体が実際の測定に用いられる条件を考慮し、選択の段階で効率的に行うこともできる。例えば、動物に免疫して得られた抗体を、交差反応性を確認したい化合物の存在下、固相に固定化したＣ３と反応させ、交差反応性を確認したい化合物の非存在下での反応性と比較することにより所望の抗体を産生するハイブリドーマをより効率よく選抜することができる。また、動物に免疫して得られた抗体を、生物試料由来成分の存在下、固相に固定化したＣ３と反応させ、生物試料由来成分の非存在下での反応性と比較することにより所望の抗体を産生するハイブリドーマをより効率よく選択することもできる。
　クローニング工程後、産生される抗体とＣ３との結合能をＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法などの方法を用いてアッセイすることにより、選択されたハイブリドーマが所望の性質を有するモノクローナル抗体を産生するか否かを確認することができる。
　前記のようにして選別されたハイブリドーマを大量培養することにより、所望の特性を有するモノクローナル抗体を製造することができる。大量培養の方法は特に限定されないが、例えば、ハイブリドーマを適宜の培地中で培養してモノクローナル抗体を培地中に産生させる方法や、哺乳動物の腹腔内にハイブリドーマを注射して増殖させ、腹水中に抗体を産生させる方法などを挙げることができる。モノクローナル抗体の精製は、先述した抗血清からの抗体の精製法、例えばＤＥＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法などを適宜組み合わせて行うことができる。
　抗Ｃ３抗体を免疫反応系内に存在させる方法としては、免疫測定試薬の試薬構成の１つとして用いる方法、試料の希釈液や前処理液等に添加する方法が挙げられる。
　免疫反応系内とは、例えば免疫測定試薬が液状試薬の場合は、試料と液状免疫測定試薬が混合され免疫反応が行われる液相をいう。
　例えば、ＬＴＩＡ法の場合、試料を抗Ｃ３抗体を含むＬＴＩＡ測定試薬に混合してもよいし、試料を抗Ｃ３抗体を含む前処理液とあらかじめ混合した後に免疫測定試薬と混合しても良い。
　また、ＥＬＩＳＡ法の場合、試料を抗Ｃ３抗体を含む前処理液とあらかじめ混合した後にマイクロプレートに滴下しても良いし、試料を抗Ｃ３抗体と検出用抗体を含む溶液と混合した後にマイクロプレートに滴下しても良い。
　また、化学発光法試薬の場合も、試料を抗Ｃ３抗体を含む前処理液とあらかじめ混合した後に免疫測定試薬と混合しても良いし、免疫測定試薬（例えば、検出用抗体もしくは抗原、磁性粒子を含む溶液）に抗Ｃ３抗体が含まれていてもよい。
　さらにまた、イムノクロマトグラフィー法などの固相で免疫反応が行われる場合は、免疫反応系内とは、液状試料と結合性パートナーの免疫反応が行われる固相をいう。この場合、試料を抗Ｃ３抗体を含む前処理液とあらかじめ混合した後にイムノクロマト試験片に滴下してもよいし、抗Ｃ３抗体をサンプルパッド上に乾燥保持しておき、試料を滴下した際に抗Ｃ３抗体が溶解されて固相を展開することで反応系に存在する状態になっても良い。
　本発明において、抗Ｃ３抗体の濃度は、測定対象物質と特異的結合パートナーとの免疫反応に強い影響を及ぼさず、所望の非特異反応抑制効果を発揮できる濃度であればよく、測定対象物質や検体の種類に応じて適宜当業者が設定できる。免疫反応系内における抗Ｃ３抗体の濃度としては、免疫反応系の試薬構成によっても異なるが、検体１０μＬに対する抗Ｃ３抗体の重量として、０．１～１０００μｇ、好ましくは１．０～７５０μｇ、より好ましくは２．０～５００μｇ、さらに好ましくは３．０～２５０μｇ、最も好ましくは５．０～１５０μｇであるが、この濃度に限ることはない。例えば、５．０～１２０μｇ、５．０～１１０μｇ、５．０～１００μｇ、５．０～８０μｇ、５．０～６０μｇ、５．０～５０μｇが好ましい場合もある。また、上記範囲の下限としては１０．０μｇ以上、１５．０μｇ以上、２０．０μｇ以上が好ましい場合もある。
　抗Ｃ３抗体は単独で用いてもよいし、複数の抗Ｃ３抗体の混合物でもよく、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体を併用してもよいし、不溶性担体に結合された抗Ｃ３抗体を使用してもよい。また、複数種の抗Ｃ３抗体を併用する場合には、両者を併せた濃度が上記の濃度範囲であればよい。
　本発明の測定試薬中にあらかじめ抗Ｃ３抗体を含有させる場合には、上記の反応系内における濃度になるようにあらかじめ測定試薬中に含有させればよい。
（ラテックス免疫凝集法（ＬＴＩＡ法））
　本発明の免疫学的測定方法の１つであるＬＴＩＡ法について説明する。ＬＴＩＡ法により測定対象物質を測定する方法は、大きく二つに大別することができる。
　一つ目は、測定対象物質に対する特異的結合パートナーを固定化したラテックス粒子と、測定対象物質とを反応させ、サンドイッチ型の免疫複合体を形成させ、免疫複合体形成に伴う当該ラテックス粒子の凝集の程度から測定対象物質を測定する方法である。　
　二つ目は、試薬中に複数の測定対象物質又はその類縁体（これらの断片を含む）を固定化した蛋白質等を添加しておき、これらと試料中の測定対象物質とを競合させて、試薬中に含まれる測定対象物質と測定対象物質に対する特異的結合パートナーを固定化したラテックス粒子との免疫複合体の形成を阻害し、免疫複合体の形成阻害に伴う当該ラテックス粒子の凝集阻害の程度から測定対象物質（抗原）を測定する方法である。
　測定対象物質と測定対象物質に対する特異的結合パートナーは、目的に応じて任意の物質を選択することができる。例えば、測定対象物質が抗原であれば、測定対象物質に対する特異的結合パートナーとしてポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（組換え型抗体および各抗体の機能性断片を含む）などの抗体を選択することができる。測定対象物質が抗体であれば、測定対象物質に対する特異的結合パートナーとして天然型および組換え型抗原などの抗原を選択することができる。本願発明は上記いずれの方法にも用いることができ、具体的には、以下の工程が例示される。
（１）試料中の測定対象物質と抗Ｃ３抗体とを溶液中で接触させる工程
（２）（１）工程の後に、前記溶液中に測定対象物質に対する特異的結合パートナーを担持するラテックス粒子を添加する工程
（３）（２）の工程の後に、溶液中におけるラテックス粒子の凝集度合いを光学的に検出する工程
　ここで、（３）の工程は、「（２）の工程の途中、あるいは（２）の工程の後に、洗浄・分離工程を経ることなく当該測定対象物質と当該ラテックス粒子の凝集反応を測定する工程」であることを意味する。
　ＬＴＩＡ法としては、生じた凝集の程度を光学的あるいは電気化学的に観察することにより被検物質を測定できる。光学的に観察する方法としては、散乱光強度、吸光度、又は透過光強度を光学機器で測定する方法（エンドポイント法、レート法等）が挙げられる。 試料を測定して得た吸光度等の測定値を、標準物質（測定対象物質の濃度が既知の試料）を測定して得た吸光度等の測定値と比較して、試料中に含まれていた測定対象物質の濃度（定量値）を算出する。なお、透過光又は散乱光などの吸光度等の測定は、１波長測定であっても、又は２波長測定（２つの波長による差又は比）であってもよい。測定波長は、５００ｎｍから９００ｎｍの中から選ばれるのが一般的である。
  本発明の試料中の測定対象物質の測定は、用手法により行ってもよいし、又は測定装置等の装置を用いて行ってもよい。測定装置は、汎用自動分析装置であっても、専用の測定装置（専用機）であってもよい。また、この測定は、２ステップ法（２試薬法）等の複数の操作ステップにより行う方法によって実施することが好ましい。
（特異的結合パートナーを担持したラテックス粒子）
  測定対象物質に対する特異的結合パートナーは、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法によりラテックス粒子に固定化して担持させることができる。
  物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、測定対象物質に対する特異的結合パートナーと、ラテックス粒子とを、緩衝液等の溶液中で混合し接触させたり、又は緩衝液等に溶解した測定対象物質に対する特異的結合パートナーを、担体に接触させたりすること等により行うことができる。
  また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号  臨床検査のためのイムノアッセイ－技術と応用－」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質IV」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、測定対象物質に対する特異的結合パートナーと、担体とを、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、測定対象物質に対する特異的結合パートナーと、担体の、それぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と前記の二価性の架橋試薬とを反応させること等により行うことができる。
　本発明のラテックス粒子を構成する合成高分子としては特に限定はないが、例えば、ポリスチレン、スチレン－スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、イタコン酸重合体、スチレン－親水性カルボキシモノマー共重合体：例えば、スチレン－メタクリル酸共重合体、スチレン－アクリル酸共重合体、スチレン－イタコン酸共重合体等が挙げられる。その中で、好ましくはスチレン－メタクリル酸共重合体、スチレン－イタコン酸共重合体、スチレンおよびスチレン－スチレンスルホン酸塩共重合体である。特に好ましくは、スチレン及びスチレン－（メタ）アクリル酸共重合体である。
　ラテックス粒子が担持する特定物質に対する特異的結合パートナーは、サンドイッチを形成するために複数種類であることが好ましい。特定物質に抗体認識部位が複数存在する場合は、特異的結合パートナーは一種類でも良い。例えば、特異的結合パートナーがモノクローナル抗体の場合には、認識部位の異なる複数のモノクローナル抗体を用いる。また、例えば、特異的結合パートナーがポリクローナル抗体の場合には、１種の抗血清由来のポリクローナル抗体でもよいし、複数種の抗血清由来のものでもよい。また、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体を組み合わせて用いてもよい。
  なお、ラテックス粒子の自然凝集や、非特異的反応等を抑制するために処理を行う必要があれば、ラテックス粒子の表面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミン若しくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、担体のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。
（免疫学的測定用試薬）
　本発明の免疫学的測定方法の免疫反応は、免疫学的測定用試薬を用いて行われ、当該試薬には、反応主成分の他に、前述の抗Ｃ３抗体を含むことを特徴とする。反応の主成分としては、測定対象物質に特異的な結合パートナー（抗Ｃ３抗体以外）が含まれ、他に免疫測定用粒子、イムノクロマト試験片、マイクロプレートなどの不溶性担体等が挙げられる。
　本発明の免疫学的測定用試薬中には、その非特異的反応抑制効果を妨げない範囲でバッファー、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、脂質、リン脂質、糖類、無機塩、高分子化合物、界面活性剤、その他の非特異的反応抑制剤、防腐剤等を含有させてもよい。試料のｐＨ、イオン強度、浸透圧などを緩衝、調整する成分として、例えば、酢酸、クエン酸、リン酸、トリス、グリシン、ホウ酸、炭酸、フタル酸、コハク酸、マレイン酸、イミダゾールなどの緩衝液、及びグッドの緩衝液や、それらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩などを含んでも良い。また凝集形成を増強する成分としてポリビニルピロリドン、リン脂質ポリマーなどの高分子を含んでも良い。
　抗Ｃ３抗体の各構成試薬中における濃度は、測定時である、試薬と試料の混合状態において前記免疫反応系内の濃度に調整しうるような形態で含まれていればよく、各試薬型により異なる。
(試薬キット)
　本発明の試薬キットは、キット構成に少なくとも抗Ｃ３抗体を含むことを特徴とする。キット構成としては、免疫測定に関わる試薬のほか、試料希釈液、試料抽出液などが挙げられるが、本発明において抗Ｃ３抗体はこれらのいずれか１つ、あるいは２つ以上に加えることができる。キットの構成は、上記のほかに、使用説明書、試料採取用具（採取ピペット、シリンジ、綿棒、ろ過フィルターなど）が挙げられる。
　以下、各免疫測定方法を採用する試薬構成についてそれぞれ説明する。
＜ラテックス免疫凝集測定法＞
　免疫学的測定法がラテックス免疫凝集測定法である場合の試薬（ＬＴＩＡ試薬）を例示する。
（１）抗Ｃ３抗体を含む第１試薬
（２）測定対象物質に対する特異的結合パートナーを担持するラテックス粒子を含む第２試薬
　第１試薬は典型的には緩衝液を含み、抗Ｃ３抗体の緩衝液中における濃度は、測定時である、試薬と試料の混合状態において前記好ましい抗Ｃ３抗体濃度に調整しうるような形態で含まれていればよく、各試薬型により異なる。抗Ｃ３抗体は第１試薬のほかに第２試薬に含まれていてもよい。
　ＬＴＩＡ試薬において、一般的な第１試薬に含まれる抗Ｃ３抗体の濃度としては、１～２０００μｇ／ｍＬ、好ましくは５～１５００μｇ／ｍＬ、より好ましくは１０～１０００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１５～５００μｇ／ｍＬ、最も好ましくは２５～５００μｇ／ｍＬであるが、この濃度に限ることはない。
　また、ＬＴＩＡ法に供する前に、検体に検体希釈液や前処理液等を添加する場合、抗Ｃ３抗体は前処理液に含まれていても良く、前処理液中の抗Ｃ３抗体濃度は１～２０００μｇ／ｍＬ、好ましくは５～１５００μｇ／ｍＬ、より好ましくは１０～１０００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１５～５００μｇ／ｍＬ、最も好ましくは２５～５００μｇ／ｍＬであるが、この濃度に限ることはない。
　抗Ｃ３ｂ抗体、抗ｉＣ３ｂ抗体、抗Ｃ３ｄｇ抗体及び抗Ｃ３ｄ抗体についても上記抗Ｃ３抗体と同様の濃度範囲で用いることができる。
　本発明に用いられる免疫測定用粒子は、上記のラテックス粒子以外にも測定対象物質に対して特異的な結合パートナーを担持できるものであれば公知の粒子を使用できる。例えば、金属コロイド、シリカ、カーボン等の無機物粒子も、本発明の免疫測定用粒子として用いることができる。
　免疫測定用粒子のサイズは、使用する光学的測定法（例えば、透過光を測定する比濁法、散乱光を測定する比朧法など）を考慮し、所望の測定感度、測定範囲などが得られるよう、０．０５～１μｍの範囲から適宜選択することができる。なお、自動分析装置における光学的測定においては平均粒子径０．１～０．４μｍが汎用されているが、これに限定されない。
＜ＥＬＩＳＡ法＞
　ＥＬＩＳＡ法とは、種々の抗原抗体反応の組合せを利用し、最終的には酵素標識した抗原あるいは抗体を反応系に組込んで、酵素活性を検出する方法である。酵素活性の検出には、反応によって吸光スペクトルが変化する基質が用いられ、抗原抗体反応の組合せによって直接法、間接法、サンドイッチ法、競合法などが挙げられる。
　本発明の免疫学的測定法がサンドイッチＥＬＩＳＡ法である場合の試薬を例示する。
（ａ）測定対象物質と反応する抗体を固定化した不溶性担体
（ｂ）標識物質で標識され、測定対象物質と反応する抗体
　（ａ）の不溶性担体としては、プレートが好ましく、標識物質は、適宜選択して使用できる。不溶性担体に固定化された抗体は、試料を含む溶液中の測定対象物質を捕捉し、不溶性担体上で複合体を形成する。標識物質で標識された抗体は、前記捕捉された測定対象物質に結合して前述の複合体とサンドイッチを形成する。標識物質に応じた方法により標識物質の量を測定することにより、試料中の測定対象物質を測定することができる。抗体の不溶性担体への固定化の方法、抗体と標識物質との結合方法など、具体的な方法は、当業者に周知の方法を特に制限なく使用することができる。
　本ＥＬＩＳＡ法において、本発明に用いられる抗Ｃ３抗体は、例えば、試料希釈液や前処理液等に添加したり、抗原抗体反応を行う溶液中に添加することで、免疫反応系に存在させることができる。
＜イムノクロマトグラフィー法＞
　本発明の免疫学的測定法がイムノクロマトグラフィー法である場合の試薬構成（試験片構成）について説明する。
　イムノクロマト試験片；
　特異的結合パートナーとして抗体を用いた場合、多孔性メンブレンなどのシート状の不溶性担体上に、試料を含む溶液の展開方向に順に「１．試料供給部位」、「２．標識抗体を保持する部位（標識抗体保持部位）」、「３．標識抗体と測定対象物質に対する抗体により形成された複合体を捕捉するための抗体を固定化する部位（捕捉抗体部位）」を具備した試験片である。
　イムノクロマトグラフィー法では、上記のような試験片を少なくとも含み、測定対象物質を含む試料を試料供給部位に所定量添加すると、試料は毛細管現象により標識保持部位に侵入し、測定対象物質と標識抗体とが結合して複合体を形成する。該複合体は、メンブレンを展開し、捕捉抗体部位に侵入すると、メンブレンに固定化された抗体（捕捉抗体）に捕捉され、捕捉抗体－測定対象物質－標識抗体の複合体が形成される。そして標識を任意の方法（例えば、金コロイドなど可視化可能な標識の場合にはその凝集像、酵素の場合には、基質を添加することによる発色反応）で検出することで、測定対象物質を検出することができる。
　本イムノクロマトグラフィー法において、本発明に用いられる抗Ｃ３抗体は、例えば、試料希釈液や前処理液等に添加したり、試料供給部位や標識保持部位に含有させて乾燥保持させておくことで、反応系内に存在させることができる。
＜化学発光法＞
　抗原又は抗体を結合した磁性粒子と測定対象物質を反応させ複合体を形成した後、磁気により未反応物質を除去する。さらに標識抗体を含む試薬を添加し、磁気により未反応物質を除去した後、発光試薬を添加し発光量を測定する方法である。標識に酵素を用いた場合を化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法：Chemiluminescent enzyme immunoassay）という。また、標識にルテニウムピリジン錯体等の金属錯体を用いて電気化学反応により発光強度を測定する場合を電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ法：Electro chemiluminescence immunoassay）という。また、標識に化学発光性物質を用いた場合を化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ法：Chemiluminescent immunoassay）という。
　本発明の免疫学的測定法がＣＬＥＩＡ法である場合の試薬を例示する。
（ａ）測定対象物質と反応する抗体(又は抗原)を固定化した磁性粒子
（ｂ）酵素標識され、測定対象物質と反応する抗体（又は抗原）
（ｃ）発光試薬
　磁性粒子に固定化された抗体は、試料を含む溶液中の測定対象物質を捕捉し、複合体を形成する。酵素標識物質で標識された抗体は、前記捕捉された測定対象物質に結合して前述の複合体とサンドイッチを形成する。酵素標識物質と発光試薬を反応させて発光量を測定することにより、試料中の測定対象物質を測定することができる。
　本ＣＬＥＩＡ法において、本発明に用いられる抗Ｃ３抗体は、例えば、試料希釈液や前処理液等に添加したり、抗原抗体反応を行う溶液中に添加することで、免疫反応系に存在させることができる。
（特異的結合パートナー）
　本発明において、測定対象物質に対する特異的結合パートナーとしては、抗Ｃ３抗体以外のタンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質、核酸、ハプテンなどが挙げられ、分子量の高低および天然、合成といった由来に特に制限はないが、免疫反応を利用する免疫学的測定法に使用され得る抗体または抗原が挙げられる。
　前記抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。より好ましくは、モノクローナル抗体である。
　本発明において抗体としては、抗体分子全体のほかに抗原抗体反応活性を有する抗体の機能性断片を使用することも可能である。一般的な動物（マウス、ヤギ、ヒツジなど）への免疫工程を経て得られたもののほか、遺伝子組換え技術等により免疫原（測定対象物質）を免疫する動物とは異なる動物種のアミノ酸配列に変化させた抗体（キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト化抗体等）であってもよい。抗体の機能性断片としては抗原抗体反応活性を有する断片であるＦ（ａｂ'）2、Ｆａｂ'や一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ＶＨＨ（variable domain of heavy chain of heavy chain antibody）抗体、ＩｇＮＡＲ（new antigen receptor）抗体などが挙げられる。これらの抗体の機能性断片は前記のようにして得られた抗体をタンパク質分解酵素（例えば、ペプシンやパパインなど）で処理することにより製造できる。 
（試料）
　本発明の測定対象物質を含む試料としては、例えばヒト又は動物の血液、血清、血漿、培養上清、尿、髄液、唾液、汗、腹水、又は細胞あるいは組織の抽出液等が挙げられる。　　
　また、本発明における試料は、生体から得られた試料そのもののほかに、希釈、精製などの前処理を行った試料も含まれる。
（測定対象物質）
　本発明の免疫測定試薬は、前記試料に含有される種々の物質を測定対象物質とすることができる。測定対象物質としては、非特異抑制のために用いられる抗Ｃ３抗体と反応しない物質であればよく、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質、核酸、ハプテンなどが挙げられるが、理論的に測定可能な物質であれば特に制限はない。例えばＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）、Ｌｐ（ａ）、ＭＭＰ３（マトリクスメタロプロテイナーゼ３）、抗リン脂質抗体、ＩＶ型コラーゲン、ＰＳＡ、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）、インスリン、アルブミン、シスタチンＣ、ＲＦ（リウマチ因子）、ＫＬ－６、プロカルシトニン、ＦＤＰ、Ｄダイマー、ＳＦ（可溶性フィブリン）、ＴＡＴ（トロンビン－アンチトロンビンＩＩＩ複合体）、ＰＡＩ－１や、フェニトイン、フェノバルビタール、カルバマゼピン、バルプロ酸、テオフィリン、ＴＡＲＣ（Ｔｈｙｍｕｓ　ａｎｄ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）, ｓＩＬ－２Ｒ（可溶性インターロイキン－２受容体）などが挙げられる。
（非特異反応の抑制方法）
　生体試料中に含まれる何らかの成分により、測定対象物質に対する特異的結合パートナーを固定化した免疫測定用粒子に生じるべきでない凝集が生じたり（正の測定誤差）、あるいは生じるべき凝集が生じなかったり（負の測定誤差）することがしばしば発生する。これらは非特異的反応と呼ばれ、様々な測定誤差の原因となることが知られている。
　本発明において、非特異反応を抑制するとは、生体試料中の上記の非特異反応を生じさせる因子（非特異因子）に働きかけ、免疫反応以外の反応による測定への影響を抑制することをいう。本発明は抗Ｃ３抗体存在下で免疫反応を行うことにより、非特異反応を抑制することができる。
（非特異反応抑制剤）
　本発明の非特異反応抑制剤は、免疫学的測定法における試料に由来する非特異反応を抑制可能な物質を含んでいればよく、少なくとも抗Ｃ３抗体を有効成分として含む。本発明の非特異反応抑制剤は、上記試薬構成中の抗Ｃ３抗体を含む構成をそのまま使用することができる。本発明の非特異反応抑制剤には、その非特異的反応抑制効果を妨げない範囲でバッファー、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、脂質、リン脂質、糖類、無機塩、高分子化合物、界面活性剤、その他の非特異的反応抑制剤、防腐剤等を含有させてもよい。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
[実施例Ｉ：ＬＴＩＡ法における非特異反応抑制：ＴＡＲＣの測定]
　以下に、本願発明の抗Ｃ３ｄポリクロ―ナル抗体及びその他の非特異反応抑制剤を添加したＬＴＩＡ法による試薬を用いて、試料中のＴＡＲＣ濃度測定を行った試験について示す。なお、試料としては化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）による測定値（比較例１）と近い値を示す試料（対照検体：検体１～３）と、非特異反応を呈し比較例１の測定値から大きく乖離する試料（乖離検体：検体４～１０）を用いた。
 [比較例１]（ＣＬＥＩＡ法による測定)
１．測定方法
１－１．測定試薬
　ＨＩＳＣＬ(登録商標)ＴＡＲＣ（シスメックス株式会社）
１－２．試料
　生理食塩液（大塚生食注）、検体（血清）１－１０
１－３．測定手順
　ＨＩＳＣＬ(登録商標) －５０００（シスメックス株式会社）にて、前記試薬の添付文書に従い測定を行った。
２．測定結果
　測定結果を表１に示した。
　本比較例１で示すＣＬＥＩＡ法は、Ｂ／Ｆ分離操作を実施し、洗浄工程を有する。このため、試料に由来する非特異反応の影響を受けにくい測定方法であることから、比較例として用いた。
[比較例２]（ＬＴＩＡ法による測定：非特異反応抑制剤の添加なし）
１．測定方法
１－１．測定試薬
　以下に示す、第１試薬、第２試薬からなる、ＬＴＩＡ測定試薬を調製した。
（１）第１試薬
　１００ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）
　５００ｍＭ　ＮａＣｌ
　０．５％　ＢＳＡ　
（２）第２試薬
　抗ヒトＴＡＲＣモノクローナル抗体感作ラテックス（２種類）
　５ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）
　なお、抗ヒトＴＡＲＣモノクローナル抗体は、市販のＴＡＲＣ抗原を使用し、当業者周知の方法にて取得した。市販のTARC抗原としては、CCL17, thymus and activation regulated chemokine（Shenandoah Biotechnology,Inc.）、CCL17/TARC, Human（LifeSpan Biosscience,Inc.）、Human TARC (CCL17)（Abeomics,Inc.）が挙げられる。さらに、ＴＡＲＣ抗原に対してサンドイッチ測定が可能であるモノクローナル抗体の組み合わせを、当業者周知の方法にて選定した。抗ヒトＴＡＲＣモノクローナル抗体感作ラテックスは、特開２０１７－１８１３７７記載の方法を参考に調製した。
１－２．試料
　比較例１の試料に同じ
１－３．測定手順
　第１試薬と第２試薬を組み合わせ、日立自動分析装置３５００を用いて、試料中のＴＡＲＣ濃度を測定した。具体的には、試料２．４μＬに第１試薬１２０μＬを加えて３７℃で５分間保温した後、第２試薬４０μＬを加えて攪拌した。凝集形成に伴う吸光度変化を、その後５分間にわたり、主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定し、その吸光度変化量を濃度既知の標準物質を測定して得られる検量線にあてはめ、測定値を算出した。
２．測定結果
　測定結果を表１に示した。また、比較例１の測定値に対する本比較例２の測定値の相関を図１に示した。
[比較例３]（ＬＴＩＡ法による測定：ＨＢＲ－１添加）
　比較例２で示した第１試薬に、市販の非特異抑制剤であるＨＢＲ－１（ＳＣＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ，ＩＮＣ.）を１００μｇ／ｍＬとなるよう添加したほかは比較例２と同一の方法で測定を行った。測定結果を表１に示した。また、比較例１の測定値に対する本比較例３の測定値の相関を図２に示した。
[実施例１]（ＬＴＩＡ法による測定：抗Ｃ３ｄポリクロ―ナル抗体添加）
　比較例２で示した第１試薬に、抗Ｃ３ｄポリクロ―ナル抗体（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を１００μｇ／ｍＬとなるよう添加したほかは比較例２と同一の方法で測定を行った。測定結果を表１に示した。また、比較例１の測定値に対する本実施例１の測定値の相関を図３に示した。　 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（結果と考察）
　比較例１～３、実施例１及び参考例１の結果から本願発明の効果について考察を行った
（１）対照検体（検体番号１～３）の測定結果について検証を行った。
　対照検体では、ＣＬＥＩＡ法の測定値（比較例１）と、非特異反応抑制剤を添加していないＬＴＩＡ法の測定値（比較例２）は概ね同等であった。また、本願発明の抗Ｃ３ｄポリクロ―ナル抗体を添加したＬＴＩＡ法の測定値（実施例１）も、比較例１、２と概ね同等であった。従って、抗Ｃ３ｄポリクロ―ナル抗体の添加は、非特異反応を呈しない検体の測定値に対して影響を与えないことがわかった。なお、比較例３では、検体３において、比較例１に対して測定値が乖離した。ＨＢＲ－１を添加することにより、望まない反応が生じると考えられた。
（２）乖離検体（検体番号４～１０）の測定結果について検証を行った。
　検体番号４では、ＣＬＥＩＡ法の測定値（比較例１）が２０５ｐｇ／ｍＬであったのに対して、非特異反応抑制剤を添加していないＬＴＩＡ法の測定値（比較例２）は６６９ｐｇ／ｍＬとなり、測定値が大きく乖離した。さらにＨＢＲ－１を添加したＬＴＩＡ法の測定値（比較例３）は６３４ｐｇ／ｍＬであり、比較例１に対して大きく乖離した。一方、本願発明の抗Ｃ３ｄポリクロ―ナル抗体を添加したＬＴＩＡ法の測定値（実施例１）は２７１ｐｇ／ｍＬとなり、比較例１に近づく傾向を示した。検体５～１０においても同様の結果が得られた。
　以上より、免疫測定方法において、本願発明の抗Ｃ３ｄ抗体を免疫反応系内に存在させることにより、試料に由来する非特異反応を抑制することができた。本発明によって、市販の非特異反応抑制剤であるＨＢＲ－１によっても抑制できないような非特異反応を抑制できたことは予想外の結果であった。
　なお、本試験に用いた乖離検体はＲＦが広範囲の濃度で含まれる検体であったが、ＲＦの多寡と測定値の乖離度に関連性は見られなかった（データ示さず）。したがって、本願発明の抗Ｃ３ｄ抗体による非特異抑制効果は、ＲＦの多寡によって影響を受けない可能性が示唆された。
[実施例II：ＬＴＩＡ法における非特異反応抑制：ｓＩＬ－２Ｒの測定]
　以下に、本願発明の抗Ｃ３ｄポリクロ―ナル抗体及びその他の非特異反応抑制剤を添加したＬＴＩＡ法による試薬を用いて、試料中のｓＩＬ－２Ｒ濃度測定を行った試験について示す。なお、試料としては化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）による測定値（比較例４）と近い値を示す試料（対照検体：検体１１～１５）と、非特異反応を呈し比較例４の測定値から大きく乖離する試料（乖離検体：検体１６、１７）を用いた。
 [比較例４]（ＣＬＥＩＡ法による測定)
１．測定方法
１－１．測定試薬
　ルミパルスプレスト(登録商標)ＩＬ－２Ｒ（富士レビオ株式会社）
１－２．試料
　検体（血清）１１－１７
１－３．測定手順
　ルミパルス(登録商標) －Ｌ２４００（富士レビオ株式会社）にて、前記試薬の添付文書に従い測定を行った。
２．測定結果
　測定結果を表２に示した。
　本比較例４で示すＣＬＥＩＡ法は、Ｂ／Ｆ分離操作を実施し、洗浄工程を有する。このため、試料に由来する非特異反応の影響を受けにくい測定方法であることから、比較例として用いた。
[比較例５]（ＬＴＩＡ法による測定：非特異反応抑制剤の添加なし）
１．測定方法
１－１．測定試薬
　特開２０１７－１８１３７７記載の方法に従い、第１試薬と第２試薬を調製した。
１－２．試料
　比較例４の試料に同じ
１－３．測定手順
 　第１試薬と第２試薬を組み合わせ、日立７１８０形自動分析装置を用いて、試料中のｓＩＬ－２Ｒ濃度を測定した。具体的には、試料５．６μＬに第１試薬１２０μＬを加えて３７℃で５分間保温した後、第２試薬４０μＬを加えて攪拌した。凝集形成に伴う吸光度変化を、その後５分間にわたり、主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定し、その吸光度変化量を濃度既知の標準物質を測定して得られる検量線にあてはめ、測定値を算出した。
２．測定結果
　測定結果を表２に示した。
[比較例６]（ＬＴＩＡ法による測定：ＨＢＲ－１添加）
　比較例５で示した第１試薬に、ＨＢＲ－１（ＳＣＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ，ＩＮＣ.）を１００μｇ／ｍＬとなるよう添加したほかは比較例５と同一の方法で測定を行った。測定結果を表２に示した。
[実施例２]（ＬＴＩＡ法による測定：抗Ｃ３ｄポリクロ―ナル抗体添加）
　比較例５で示した第１試薬に、抗Ｃ３ｄポリクロ―ナル抗体（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を１００μｇ／ｍＬとなるよう添加したほかは比較例５と同一の方法で測定を行った。測定結果を表２に示した。　 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（結果と考察）
　比較例４～６、実施例２の結果から本願発明の効果について考察を行った。
（１）対照検体（検体番号１１～１５）の測定結果について検証を行った。
　対照検体では、ＣＬＥＩＡ法の測定値（比較例４）と、非特異反応抑制剤を添加していないＬＴＩＡ法の測定値（比較例５）は概ね同等であった。また、本願発明の抗Ｃ３ｄポリクロ―ナル抗体を添加したＬＴＩＡ法の測定値（実施例２）も、比較例４、５と概ね同等であった。従って、抗Ｃ３ｄポリクロ―ナル抗体の添加は、非特異反応を呈しない検体の測定値に対して影響を与えないことがわかった。
（２）乖離検体（検体番号１６、１７）の測定結果について検証を行った。
　検体番号１６では、ＣＬＥＩＡ法の測定値（比較例４）が３４６Ｕ／ｍＬであったのに対して、非特異反応抑制剤を添加していないＬＴＩＡ法の測定値（比較例５）は１４０１Ｕ／ｍＬとなり、測定値が大きく乖離した。さらにＨＢＲ－１を添加したＬＴＩＡ法の測定値（比較例５）は１２１６Ｕ／ｍＬであり、比較例４に対して大きく乖離した。　　
　一方、本願発明の抗Ｃ３ｄポリクロ―ナル抗体を添加したＬＴＩＡ法の測定値（実施例２）は４０９Ｕ／ｍＬとなり、比較例４に近づく傾向を示した。検体１７においても同様の結果が得られた。
　以上より、免疫測定方法において、本願発明の抗Ｃ３ｄ抗体を免疫反応系内に存在させることにより、試料に由来する非特異反応を抑制することができた。本発明によって、市販の非特異反応抑制剤であるＨＢＲ－１によっても抑制できないような非特異反応を抑制できたことから、本発明の抗Ｃ３ｄ抗体による非特異抑制効果は予想外の結果であった。
[実施例III：ＥＬＩＳＡ法における非特異反応抑制：sＩＬ－２Ｒの測定]
　以下に、本願発明の抗Ｃ３ｄポリクロ―ナル抗体及びその他の非特異反応抑制剤を添加したＥＬＩＳＡ法による試薬を用いて、試料中のｓＩＬ－２Ｒ濃度測定を行った試験について示す。なお、試料としては化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）による測定値（比較例７）と近い値を示す試料（対照検体：検体１８～２２）と、非特異反応を呈し比較例７の測定値から大きく乖離する試料（乖離検体：検体２３）を用いた。
[比較例７](ＣＬＥＩＡ法による測定)
１．測定方法
１－１．測定試薬
　ルミパルスプレスト(登録商標) ＩＬ－２Ｒ（富士レビオ株式会社）
１－２．試料
　血清検体１８－２３
１－３．測定手順
　ルミパルス(登録商標) Ｌ２４００（富士レビオ株式会社）にて、前記測定試薬の添付文書に従い測定を行った。
２．測定結果
　測定結果を表３に示した。
[比較例８](ＥＬＩＳＡによる測定：非特異反応抑制剤の添加なし)
１．測定方法
１－１．試料
　比較例７の試料に同じ
１－２．測定手順　
　比較例５で使用した抗体と同一の抗体を用いた。
　抗ｓＩＬ－２Ｒモノクローナル抗体を１０μｇ／ｍＬになるよう、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２；以下、ＰＢＳという）に溶解し、該溶解液１００μＬを９６穴マイクロプレートの各ウェルに分注して、４℃で１晩静置した。
　前記各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳ（以下、ＰＢＳＴという）４００μＬで３回洗浄した後、１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳＴ（以下、ＢＳＡ－ＰＢＳＴという）２００μＬを加え、室温で１時間ブロッキングを行った。これをＥＬＩＳＡ用プレートとした。
　前記ＥＬＩＳＡ用プレートの各ウェルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、検体希釈液（ＢＳＡ－ＰＢＳＴ）で４０倍に希釈した試料１００μＬを前記各ウェルに添加し、室温で１時間静置した。前記各ウェルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ＢＳＡ－ＰＢＳＴで０．５０μg/mLに希釈したビオチン標識抗ｓＩＬ－２Ｒモノクローナル抗体を、１００μＬを前記各ウェルに分注し、室温で１時間静置した。前記各ウェルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ＢＳＡ－ＰＢＳＴで０．２０μg/mLに希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジン(ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社) を１００μＬ前記各ウェルに分注し、室温で３０分間静置した。前記各ウェルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、０．２％オルトフェニレンジアミン及び０．０２％過酸化水素を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０μＬを加え、室温で１０分間放置後、４．５Ｎ硫酸５０μＬを加えて酵素反応を停止させ、波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
　キャリブレーターとして濃度既知の標準物質を使用し、被検試料中のｓＩＬ－２Ｒ値を算出した。測定結果を表２に示した。
 [比較例９] (ＥＬＩＳＡによる測定：ＨＢＲ－１添加)
　比較例８で示した検体希釈液（ＢＳＡ－ＰＢＳＴ）に、ＨＢＲ－１（ＳＣＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ，ＩＮＣ.）を１００μｇ／ｍＬとなるよう添加したほかは比較例８と同一の方法で測定を行った。測定結果を表２に示した。
[実施例３] (ＥＬＩＳＡによる測定：抗Ｃ３ｄポリクロ―ナル抗体添加)
　比較例８で示した検体希釈液（ＢＳＡ－ＰＢＳＴ）に、抗Ｃ３ｄポリクロ―ナル抗体（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を１００μｇ／ｍＬとなるよう添加したほかは比較例８と同一の方法で測定を行った。測定結果を表３に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（結果と考察）
　比較例７～９、実施例３の結果から本願発明の効果について考察を行った。
（１）対照検体（検体番号１８～２２）の測定結果について検証を行った。
　対照検体では、ＣＬＥＩＡ法の測定値（比較例７）と、非特異反応抑制剤を添加していないＥＬＩＳＡ法の測定値（比較例８）は概ね同等であった。また、本願発明の抗Ｃ３ｄポリクロ―ナル抗体を添加したＬＴＩＡ法の測定値（実施例３）も、比較例７，８と概ね同等であった。従って、抗Ｃ３ｄポリクロ―ナル抗体の添加は、非特異反応を呈しない検体の測定値に対して影響を与えないことがわかった。
（２）乖離検体（検体番号２３）の測定結果について検証を行った。
　検体番号２３では、ＣＬＥＩＡ法の測定値（比較例７）が１５３４Ｕ／ｍＬであったのに対して、非特異反応抑制剤を添加していないＥＬＩＳＡ法の測定値（比較例８）は２１３２Ｕ／ｍＬとなり、測定値が大きく乖離した。さらにＨＢＲ－１を添加したＥＬＩＳＡ法の測定値（比較例９）は２１５５Ｕ／ｍＬであり、比較例７に対して大きく乖離した。
　これに対し、本願発明の抗Ｃ３ｄポリクロ―ナル抗体を添加したＥＬＩＳＡ法の測定値（実施例３）は１３３８Ｕ／ｍＬとなり、比較例４に近づく傾向を示した。このことから、比較例８、９で生じていた何らかの非特異反応を抗Ｃ３ｄポリクロ―ナル抗体を添加することにより抑制できることがわかった。
　以上より、免疫測定方法において、本願発明の抗Ｃ３ｄ抗体を免疫反応系内に存在させることにより、非特異反応を抑制することができた。本発明によって、市販の非特異反応抑制剤であるＨＢＲ－１によっても抑制できないような非特異反応を抑制できたことから、本発明の抗Ｃ３ｄ抗体による非特異抑制効果は予想外の結果であった。そして、このような非特異反応抑制効果は、実施例Ｉ、IIのホモジーニアスな測定系に限らず、実施例IIIのヘテロジーニアスな測定系でも効果を示すことがわかった。
[実施例IV：ＬＴＩＡ法における非特異反応抑制：ｓＩＬ－２Ｒの測定]
　以下に、本願発明の抗Ｃ３ｄポリクロ―ナル抗体及びその他の非特異反応抑制剤を添加したＬＴＩＡ法による試薬を用いて、試料中のｓＩＬ－２Ｒ濃度測定を行った試験について示す。なお、試料としては化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）による測定値（比較例１０）と近い値を示す試料（対照検体：検体１２、２４、２５）と、非特異反応を呈し比較例１０の測定値から大きく乖離する試料（乖離検体：検体１６、１７）を用いた。
 [比較例１０]（ＣＬＥＩＡ法による測定)
１．測定方法
１－１．測定試薬
　ルミパルスプレスト(登録商標)ＩＬ－２Ｒ（富士レビオ株式会社）
１－２．試料
　検体（血清）１２、１６、１７、２４、２５
１－３．測定手順
　ルミパルス(登録商標) －Ｌ２４００（富士レビオ株式会社）にて、前記試薬の添付文書に従い測定を行った。
２．測定結果
　測定結果を表４に示した。
[比較例１１]（ＬＴＩＡ法による測定：非特異反応抑制剤の添加なし）
１．測定方法
１－１．測定試薬
　比較例５で調製した第１試薬と第２試薬を使用した。
１－２．試料
　比較例１０の試料に同じ
１－３．測定手順
 　比較例５と同一の方法で測定を行った。
２．測定結果
測定結果を表４に示した。
[比較例１２]（ＬＴＩＡ法による測定：ＨＢＲ－１添加）
　比較例６と同一の試薬を使用した。測定結果を表４に示した。
[実施例４]（ＬＴＩＡ法による測定：抗Ｃ３ｄポリクロ―ナル抗体添加）
　比較例５で示した第１試薬に、抗Ｃ３ｄポリクロ―ナル抗体（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を２５μｇ／ｍＬ（実施例４－１）、５０μｇ／ｍＬ（実施例４－２）、１００μｇ／ｍＬ（実施例４－３）、２００μｇ／ｍＬ（実施例４－４）、５００μｇ／ｍＬ（実施例４－５）となるよう添加したほかは比較例５と同一の方法で測定を行った。測定結果を表４に示した。　 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（結果と考察）
　比較例１０～１２、実施例４－１～４－５の結果から本願発明の効果について考察を行った。
（１）対照検体（検体番号１２、２４、２５）の測定結果について検証を行った。
　対照検体では、ＣＬＥＩＡ法の測定値（比較例１０）と、非特異反応抑制剤を添加していないＬＴＩＡ法の測定値（比較例１１）、は概ね同等であった。また、本願発明の抗Ｃ３ｄポリクロ―ナル抗体を添加したＬＴＩＡ法の測定値（実施例４－１～４－５）も、比較例１０、１１と概ね同等であった。従って、抗Ｃ３ｄポリクロ―ナル抗体の添加は、非特異反応を呈しない検体の測定値に対して影響を与えないことがわかった。
（２）乖離検体（検体番号１６、１７）の測定結果について検証を行った。
　検体番号１６では、ＣＬＥＩＡ法の測定値（比較例１０）が３４６Ｕ／ｍＬであったのに対して、非特異反応抑制剤を添加していないＬＴＩＡ法の測定値（比較例１１）は１４１９Ｕ／ｍＬとなり、測定値が大きく乖離した。さらにＨＢＲ－１を添加したＬＴＩＡ法の測定値（比較例１２）は１２１６Ｕ／ｍＬであり、比較例１０に対して大きく乖離した。一方、本願発明の抗Ｃ３ｄポリクロ―ナル抗体を２５μｇ／ｍＬ添加したＬＴＩＡ法の測定値（実施例４－１）は３５２Ｕ／ｍＬとなり、比較例１０に近づく傾向を示した。同様に、本願発明の抗Ｃ３ｄポリクロ―ナル抗体を５０及び５００μｇ／ｍＬ添加したＬＴＩＡ法の測定値（実施例４－２及び４－５）では、測定値は３９５及び３７４Ｕ／ｍＬとなり、比較例１０に近づく傾向を示した。さらに、検体１７においても同様の結果が得られた。本願発明の抗Ｃ３ｄポリクロ―ナル抗体は、少なくとも２５～５００μｇ／ｍＬの範囲で、非特異反応を抑制する効果を示した。
[参考例１]（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　Ｃ３ｄ特異的なモノクローナル抗体の製造）
１．材料
（１）フロイント完全アジュバント：富士フィルム和光純薬製, ０１４―０９５４１
（２）フロイント不完全アジュバント：富士フィルム和光純薬製,０１１―０９５５１
（３）ミエローマ細胞（ＳＰ２／Ｏ）
（４）ＲＰＭＩ１６４０, ＧｌｕｔａＭＡＸ：ＧＩＢＣＯ社製，６１８７０－０３６
（５）Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ （ＦＢＳ）：ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ　ＩＮＤＵＳＴＲＩＥＳ社製，０４－００１－１Ａ
（６）ＨＡＴ 培地：コスモバイオ社製，１６２１３００４
（７）９６穴プレート：ＮＵＮＣ,１６７００８
（８）ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ　＆　Ｌ）：Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社 製，１０３１－０５
（９）Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｃ３ｄ， ｈｕｍａｎ：Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製，２０４８７０
（１０）Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　Ｃ３ｄ　Ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＬｉｆｅＳｐａｎ　ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社製，　ＬＳ―Ｃ１４７２２０
（１１）Ｂｉｏｔｉｎ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ―ＮＨ２：Ｄｏｊｉｎｄｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製，ＬＫ０３
（１２）Ｃ３ｄ，Ｈｕｍａｎ，ｃｌｏｎｅ　３：Ｈｙｃｕｌｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製，　ＨＭ２１９８
２．ヒト由来Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　Ｃ３ｄに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
（２－１）動物への免疫
　免疫原として、市販のヒト由来Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｃ３ｄ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いた。１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２；以下、ＰＢＳという）で希釈した免疫原とフロイント完全アジュバントを等量ずつ混合して調製したエマルジョンを用い、Ｂａｌｂ／ｃＡＪｃｌマウスに１匹あたり２０μｇを注射した。さらに、２回目以降はフロイント不完全アジュバントを用い、１匹あたり１０μｇの注射を、２週間の間隔で４回（初回免疫合わせて計５回）繰り返した。尾部静脈より採血して得た抗血清中の抗体価を、後述する抗原固相化ＥＬＩＳＡ法にて測定した。
（２－２）免疫動物血清中抗体価の評価（抗原固相化ＥＬＩＳＡ法）
　前記免疫動物血清中のＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　Ｃ３ｄに対する抗体の存在を、免疫原を固相化したＥＬＩＳＡ法（抗原固相化ＥＬＩＳＡ法）で確認した。抗原固相化ＥＬＩＳＡ法の詳細は以下である。
（２－２－１）抗原固相化ＥＬＩＳＡ用プレートの作製
　免疫原であるＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　Ｃ３ｄを０．５μｇ／ｍＬになるよう、ＰＢＳに溶解し、該溶解液５０μＬを９６穴マイクロプレートの各ウェルに分注して、室温で2時間静置した。
　前記各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳ（以下、ＰＢＳＴという）４００μＬで３回洗浄した後、１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳＴ（以下、ＢＳＡ－ＰＢＳＴという）１００μＬを加え、室温で１時間ブロッキングを行った。これをＥＬＩＳＡ用プレートとした。
（２－２－２）抗原固相化ＥＬＩＳＡ法
　前記ＥＬＩＳＡ用プレートの各ウェルからＢＳＡ－ＰＢＳＴを除去した後、ＢＳＡ－ＰＢＳＴで段階希釈した免疫動物抗血清及び非免疫動物血清５０μＬを前記各ウェルに添加し、室温で１時間静置した。前記各ウェルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ＢＳＡ－ＰＢＳＴで９５００倍希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）を５０μＬ前記各ウェルに分注し、室温で１時間静置した。前記各ウェルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、０．２％オルトフェニレンジアミン及び０．０２％過酸化水素を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０μＬを加え、室温で１０分間放置後、１．５Ｎ硫酸５０μＬを加えて酵素反応を停止させ、波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。測定の結果、抗体価の上昇を確認したマウスから、脾臓及びリンパ節を摘出して、脾臓及びリンパ節由来細胞を調製し、細胞融合に用いた。
（２－３）細胞融合
　前記脾臓由来細胞もしくはリンパ節由来細胞のいずれかとミエローマ細胞を細胞数で1対１の割合で混合し、電気パルス法により細胞融合した。該融合させた細胞をＨＡＴ培地に懸濁し、ＣＯ２インキュベータ内で３７℃、５％ＣＯ２にて８日間培養して、融合細胞（ハイブリドーマ）を得た。　
（２－４）ハイブリドーマの選別（サンドウィッチＥＬＩＳＡ法）
　抗Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　Ｃ３ｄポリクローナル抗体を用いたサンドウィッチＥＬＩＳＡにより、ハイブリドーマを選別した。サンドウィッチＥＬＩＳＡ法の詳細は以下である。
（２－４－１）サンドウィッチＥＬＩＳＡ用プレートの作製
　抗マウスＩｇＧ抗体を５μｇ／ｍＬになるよう、ＰＢＳに溶解し、該溶解液５０μＬを９６穴マイクロプレートの各ウェルに分注して、室温で２時間静置した。
　前記各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳ（以下、ＰＢＳＴという）４００μＬで３回洗浄した後、１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳＴ（以下、ＢＳＡ－ＰＢＳＴという）１００μＬを加え、室温で１時間ブロッキングを行った。これをＥＬＩＳＡ用プレートとした。
（２－４－２）サンドウィッチＥＬＩＳＡ法
　前記ＥＬＩＳＡ用プレートの各ウェルからＢＳＡ－ＰＢＳＴを除去した後、ハイブリドーマ培養上清を各ウェルに添加し、室温で１時間静置した。前記各ウェルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ＢＳＡ－ＰＢＳＴで５０ｎｇ／ｍＬに希釈したＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　Ｃ３ｄを５０μＬ各ウェルに分注し、室温で１時間静置した。前記各ウェルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ＢＳＡ－ＰＢＳＴで０．８μｇ／ｍＬに希釈した、ビオチン標識化キット（Ｄｏｊｉｎｄｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いてビオチン標識した抗Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎ　Ｃ３ｄポリクローナル抗体（ＬｉｆｅＳｐａｎ　ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社製）を５０μＬ各ウェルに分注し、室温で１時間静置した。前記各ウェルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ＢＳＡ－ＰＢＳＴで０．２μｇ／ｍＬに希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジンを５０μＬ前記各ウェルに分注し、室温で３０分静置した。前記各ウェルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、０．２％オルトフェニレンジアミン及び０．０２％過酸化水素を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０μＬを加え、室温で１０分間放置後、１．５Ｎ硫酸５０μＬを加えて酵素反応を停止させ、波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。測定の結果、吸光度の高いウェルを抗Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　Ｃ３ｄ抗体産生ハイブリドーマの存在するウェル（陽性ウェル）として選択した。なお、ポジティブコントロールとして、ハイブリドーマ培養上清のかわりに市販のマウス由来抗Ｃ３ｄモノクローナル抗体（Ｈｙｃｕｌｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を１μｇ／ｍＬの濃度で使用した。
（２－５）クローニング
　（２－４）で選択された抗Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　Ｃ３ｄ抗体産生株ハイブリドーマを用いて、ハイブリドーマの単クローン化とモノクローナル抗体の精製を行った。クローン化は定法（限界希釈法）で行い、上述のサンドウィッチＥＬＩＳＡ法と同様の方法で陽性ウェルを選別し、最終的に５種のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得た。当該ハイブリドーマＳ３５２０Ｘ（Ｘ＝１～５）が産生するモノクローナル抗体を、それぞれＳ３５２０Ｘ抗体と称した。
[実施例V：ＬＴＩＡ法における非特異反応抑制：ｓＩＬ－２Ｒの測定]
　以下に、参考例１で作製した本願発明の抗Ｃ３ｄモノクロ―ナル抗体を添加したＬＴＩＡ法による試薬を用いて、試料中のｓＩＬ－２Ｒ濃度測定を行った試験について示す。試料は、実施例IVと同一試料を用いた。
[実施例５]（ＬＴＩＡ法による測定：抗Ｃ３ｄモノクロ―ナル抗体添加）
　比較例５で示した第１試薬に、参考例１で作製した５種類の抗Ｃ３ｄモノクロ―ナル抗体をそれぞれ１００μｇ／ｍＬとなるよう添加したほかは比較例５と同一の方法で測定を行った。添加したクローンＮｏ．は以下の通りである。実施例５－１：クローンＮｏ．Ｓ３５２０１、実施例５－２：クローンＮｏ．Ｓ３５２０２、実施例５－３：クローンＮｏ．Ｓ３５２０３、実施例５－４クローンＮｏ．Ｓ３５２０４、実施例５－５：クローンＮｏ．Ｓ３５２０５。測定結果を表５に示した。　 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（結果と考察）
　比較例１０～１２、実施例５－１～５－５の結果から本願発明の効果について考察を行った。
（１）対照検体（検体番号１２、２４、２５）の測定結果について検証を行った。
　比較例１０，１１の測定結果については実施例IVの考察で述べたとおりである。また、本願発明の抗Ｃ３ｄモノクロ―ナル抗体を添加したＬＴＩＡ法の測定値（実施例５－１～５－５）も、比較例１０、１１と概ね同等であった。従って、抗Ｃ３ｄモノクロ―ナル抗体の添加は、非特異反応を呈しない検体の測定値に対して影響を与えないことがわかった。
（２）乖離検体（検体番号１６、１７）の測定結果について検証を行った。
　比較例１０、１１、１２の測定結果については実施例IVの考察で述べたとおりである。一方、本願発明の抗Ｃ３ｄモノクロ―ナル抗体クローンＮｏ．Ｓ３５２０１を１００μｇ／ｍＬ添加したＬＴＩＡ法の測定値（実施例５－１）は３７７Ｕ／ｍＬとなり、比較例１０に近づく傾向を示した。同様に、本願発明の抗Ｃ３ｄモノクロ―ナル抗体、クローンＮｏ．Ｓ３５２０２～Ｓ３５２０５を１００μｇ／ｍＬ添加したＬＴＩＡ法の測定値（実施例５－２～５－５）では、測定値は３３９～３６８Ｕ／ｍＬとなり、比較例１０に近づく傾向を示した。さらに、検体１７においても同様の結果が得られた。本願発明の抗Ｃ３ｄモノクロ―ナル抗体は非特異反応を抑制する効果を示した。
　以上より、本願発明の抗Ｃ３ｄ抗体が試料に由来する非特異反応を抑制する効果は、ポリクロ―ナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでも得ることができた。免疫学的測定方法において正確な測定をおこなうことは極めて重要であるが、市販の非特異反応抑制剤によってもなお抑制できなかった非特異反応を本発明により抑制することが可能となった意義は大きい。
　本発明により、抗Ｃ３抗体存在下で免疫反応を行うことにより試料中に非特異因子が含まれている場合でも正確な免疫測定方法を実現することが可能となった。

Claims (20)

  1. 試料中の測定対象物質を免疫学的に測定する方法において、抗Ｃ３抗体存在下で免疫反応を行うことを特徴とする免疫学的測定方法。
  2. 免疫学的測定方法が、ホモジーニアス法またはヘテロジーニアス法に基づく方法である請求項１に記載の免疫学的測定方法。
  3. ホモジーニアス法に基づく方法が、ラテックス免疫凝集測定方法である請求項１又は２に記載の免疫学的測定方法。
  4. 試料中の測定対象物質と抗Ｃ３抗体とを溶液中で接触させる工程と、
    前記溶液中に測定対象物質に対する特異的結合パートナーを担持するラテックス粒子を添加する工程と、
    溶液中におけるラテックス粒子の凝集度合いを光学的に検出する工程と、
    を含む、請求項３に記載の免疫学的測定方法。
  5. 抗Ｃ３抗体が、抗ｉＣ３ｂ抗体、抗Ｃ３ｄｇ抗体、抗Ｃ３ｄ抗体及び抗Ｃ３ｂ抗体からなる群から選ばれるいずれか１以上である請求項１～４のいずれかに記載の免疫学的測定方法。
  6. 試料中の測定対象物質を免疫学的に測定する方法における非特異反応抑制方法であって、抗Ｃ３抗体存在下で免疫反応を行うことを特徴とする非特異反応抑制方法。
  7. 免疫学的測定方法が、ホモジーニアス法またはヘテロジーニアス法に基づく方法である請求項６に記載の非特異反応抑制方法。
  8. ホモジーニアス法に基づく方法が、ラテックス免疫凝集測法である請求項６又は７に記載の非特異反応抑制方法。
  9. 試料中の測定対象物質と抗Ｃ３抗体とを溶液中で接触させる工程と、
    前記溶液中に測定対象物質に対する特異的結合パートナーを担持するラテックス粒子を添加する工程と、
    溶液中におけるラテックス粒子の凝集度合いを光学的に検出する工程と、
    を含む、請求項８に記載の非特異反応抑制方法。
  10. 抗Ｃ３抗体が、抗ｉＣ３ｂ抗体、抗Ｃ３ｄｇ抗体、抗Ｃ３ｄ抗体及び抗Ｃ３ｂ抗体からなる群から選ばれるいずれか１以上である請求項６～９のいずれかに記載の免疫学的測定方法。
  11. 抗Ｃ３抗体を含む免疫学的測定用試薬。
  12. 免疫学的測定方法が、ホモジーニアス法またはヘテロジーニアス法に基づく方法である請求項１１に記載の免疫学的測定用試薬。
  13. ホモジーニアス法に基づく方法が、ラテックス免疫凝集法である請求項１２に記載の免疫学的測定用試薬。
  14. 抗Ｃ３抗体が、抗ｉＣ３ｂ抗体、抗Ｃ３ｄｇ抗体、抗Ｃ３ｄ抗体及び抗Ｃ３ｂ抗体からなる群から選ばれるいずれか１以上である請求項１１～１３のいずれかに記載の免疫学的測定用試薬。
  15. 抗Ｃ３抗体を含む免疫学的測定用試薬キット。
  16. 免疫学的測定方法が、ホモジーニアス法またはヘテロジーニアス法に基づく方法である請求項１４に記載の免疫学的測定用試薬キット。
  17. ホモジーニアス法にもとづく方法が、ラテックス免疫凝集法であって、以下を含む請求項１６に記載の免疫学的測定用試薬キット。
    （１）抗Ｃ３抗体を含む第１試薬
    （２）測定対象物質に対する特異的結合パートナーを担持するラテックス粒子を含む第２試薬
  18. 抗Ｃ３抗体が、抗ｉＣ３ｂ抗体、抗Ｃ３ｄｇ抗体、抗Ｃ３ｄ抗体及び抗Ｃ３ｂ抗体からなる群から選ばれるいずれか１以上である請求項１５～１７のいずれかに記載の免疫学的測定用試薬。
  19. 抗Ｃ３抗体を有効成分として含む、免疫学的測定方法における非特異反応抑制剤。
  20. 抗Ｃ３抗体が、抗ｉＣ３ｂ抗体、抗Ｃ３ｄｇ抗体、抗Ｃ３ｄ抗体及び抗Ｃ３ｂ抗体からなる群から選ばれるいずれか１以上である請求項１９に記載の免疫学的測定方法における非特異反応抑制剤。
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