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WO2009084369A1 - Ｈｉｖ－１抗原の検出用試薬及び検出方法 - Google Patents

Ｈｉｖ－１抗原の検出用試薬及び検出方法 Download PDF

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Publication number
WO2009084369A1
WO2009084369A1 PCT/JP2008/072068 JP2008072068W WO2009084369A1 WO 2009084369 A1 WO2009084369 A1 WO 2009084369A1 JP 2008072068 W JP2008072068 W JP 2008072068W WO 2009084369 A1 WO2009084369 A1 WO 2009084369A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
antigen
hiv
reagent
solid phase
Prior art date
Application number
PCT/JP2008/072068
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Miki Miyaji
Taku Ohki
Original Assignee
Sysmex Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sysmex Corporation filed Critical Sysmex Corporation
Priority to CN200880122734.XA priority Critical patent/CN101910843A/zh
Priority to US12/745,834 priority patent/US20100261156A1/en
Priority to EP08866532A priority patent/EP2239575A4/en
Priority to JP2009547966A priority patent/JPWO2009084369A1/ja
Publication of WO2009084369A1 publication Critical patent/WO2009084369A1/ja

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G01N33/56988—HIV or HTLV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
    • C07K16/1045—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV

Definitions

  • the present invention relates to reagents and methods for detecting HIV-1 p24 antigen.
  • AIDS Acquired immunodeficiency syndrome
  • HIV human immunodeficiency virus
  • diagnosis of AIDS is performed by detecting HIV antibodies in blood.
  • antibody titers do not rise in the blood at the beginning of HIV infection. Therefore, testing methods that detect HIV antibodies may miss early HIV-infected patients.
  • HIV-1 p24 antigen a method for detecting the p24 core protein of the type 1 HIV virus exhibiting stable antigenicity (hereinafter referred to as "HIV-1 p24 antigen").
  • Conventionally known methods include sandwich immunoassay methods described, for example, in US Pat. No. 5,173,399 (Patent Document 1), US Pat. No. 4,983,529 (Patent Document 2), US Pat. No. 6,432,633 (Patent Document 3), and the like. It is. U.S. Pat. No. 5,173,399 U.S. Pat. No. 4,983,529 U.S. Pat. No. 6,432,633
  • HIV antigen in blood requires high sensitivity because HIV antigen is contained only in a small amount in blood.
  • mouse monoclonal antibodies are used as antibodies for detecting HIV-1 p24 antigen. Therefore, when the sample contains human anti-mouse antibody (HAMA), the mouse monoclonal antibody contained as a reagent may react with HAMA in the sample to give a false positive result.
  • HAMA human anti-mouse antibody
  • an object of the present invention is to provide a reagent capable of detecting a false positive by HAMA and detecting HIV-1 p24 antigen with high sensitivity and a method thereof.
  • the present inventors 1) It was found that HIV-1 p24 antigen can be detected with high sensitivity by a sandwich immunoassay method using human monoclonal antibodies; and 2) false positives can be reduced even for specimens containing HAMA by using human monoclonal antibodies. , Completed the present invention.
  • the present invention (1) A first antibody in which a first human monoclonal antibody that recognizes HIV-1 p24 antigen is labeled with a labeling substance, a solid phase, and a substance that can bind to the solid phase recognizes HIV-1 p24 antigen A reagent for detecting HIV antigen comprising a second antibody conjugated to two human monoclonal antibodies; (2) The HIV antigen detection agent according to (1), comprising a first reagent containing the first antibody, a second reagent containing particles as the solid phase, and a third reagent containing the second antibody.
  • the HIV antigen detection reagent according to (2) further comprising a fourth reagent, wherein the labeling substance is an enzyme, and a substrate of the enzyme; (4) The HIV antigen detection reagent according to any one of (1) to (3), wherein the solid phase holds avidin or streptavidin and the substance capable of binding to the solid phase is biotin; (5) The HIV antigen detection reagent according to any one of (1) to (4), wherein the solid phase is a magnetic particle; (6) The HIV-1 p24 antigen contained in the sample and the first antibody labeled with the first human monoclonal antibody that recognizes the HIV-1 p24 antigen with the labeling substance, and the substance capable of binding to the solid phase HIV-1 HIV antigen detection that forms a complex with a second antibody bound to a second human monoclonal antibody that recognizes p24 antigen on a solid phase and detects HIV antigen based on the labeled substance contained in this complex Method; (7) mixing the antigen and the first antibody, mixing the mixture obtained
  • the method for detecting HIV antigen according to (6) which comprises the step of detecting an antigen; (9) A first mixing step of mixing the antigen and the first antibody, a second mixing step of mixing the mixture obtained in the first mixing step and the second antibody, and a second mixing step Mixing the prepared mixture with the particles as the solid phase to form the complex on the particles, and HIV based on the labeling substance contained in the complex formed on the particles.
  • the method for detecting HIV antigen according to (6) which comprises the step of detecting an antigen; (10) A mixture obtained in a first mixing step of mixing the antigen and the first antibody, a second mixing step of mixing particles as the solid phase, and the second antibody, and a first mixing step And the mixture obtained in the second mixing step to form the complex on the particle, and HIV based on the labeling substance contained in the complex formed on the particle.
  • the method for detecting HIV antigen according to (6) which comprises the step of detecting an antigen;
  • the method comprises the step of mixing the labeling substance with an enzyme and a substrate of the enzyme and the complex formed on the particles, and the detection step is based on the reaction between the enzyme and the substrate.
  • the HIV antigen detection method according to any one of (7) to (10), which detects an antigen; (12) The HIV antigen detection method according to (11), wherein the substrate is a luminescent substrate or a chromogenic substrate, and the detection step detects an HIV antigen by detecting luminescence or coloring generated by the reaction of the enzyme and the substrate. Method; (13) The HIV antigen detection method according to any one of (6) to (12), wherein the solid phase is a magnetic particle.
  • the reagent and method for detecting HIV antigens of the present invention detect HIV antigens using human monoclonal antibodies. Therefore, false positive results can be reduced even for specimens containing HAMA.
  • HIV-1 p24 antigen can be detected with higher sensitivity than conventional methods. Thus, the amount of sample required for detection of HIV antigen can be reduced. In addition, highly accurate results can be provided without sample pretreatment. Therefore, the complexity of the inspection can be reduced.
  • the figure which represented notionally the reagent for HIV antigen detection which contains a 1st reagent, a 2nd reagent, and a 3rd reagent of this invention is shown.
  • the figure which represented the reaction of the HIV antigen detection method of this invention notionally was shown.
  • the reagent for detecting HIV antigen of the present invention comprises: a first antibody in which a first human monoclonal antibody that recognizes HIV-1 p24 antigen is labeled with a labeling substance, a solid phase, and a substance capable of binding to the solid phase; And a second antibody conjugated to a second human monoclonal antibody that recognizes 1 p24 antigen.
  • the reagent for HIV antigen detection of the present invention comprises a reagent kit composed of a single reagent and a plurality of reagents.
  • the first antibody, the solid phase and the second antibody may be contained in separate reagents.
  • any two or all of the first antibody, the solid phase, and the second antibody may be contained in the same reagent.
  • a reagent kit including a reagent containing a first antibody and another reagent containing a solid phase and a second antibody.
  • the second antibody in the second reagent may be bound to the solid phase.
  • reagents comprising all of the first antibody, the solid phase, and the second antibody.
  • the second antibody in the reagent may be bound to the solid phase.
  • a reagent kit comprising a first antibody, a solid phase and a second antibody in separate reagents is preferable.
  • the solid phase contained in the reagent include particles described later. That is, a reagent kit including a first reagent containing the first antibody, a second reagent containing particles as the solid phase, and a third reagent containing the second antibody is preferable.
  • FIG. 1 shows a schematic view of the first reagent, the second reagent and the third reagent of the reagent kit.
  • the first reagent contains a first antibody
  • the second reagent contains particles as a solid phase
  • the third reagent contains a second antibody.
  • the first and second human monoclonal antibodies that recognize the HIV-1 p24 antigen used in the present invention are not particularly limited as long as they are human monoclonal antibodies that can recognize the HIV-1 p24 antigen.
  • the class of antibody is not particularly limited, and includes IgG, IgM and the like.
  • the antibody may be a fragment of an antibody and a derivative thereof as long as it can recognize HIV-1 p24 antigen. Fragments of antibodies include Fab fragments, F (ab ') 2 fragments, Fab' fragments, sFv fragments and the like. These fragments can be obtained, for example, by treating the antibody according to known methods such as pepsin treatment.
  • Human monoclonal antibodies that recognize the HIV-1 p24 antigen can be obtained by methods known to those skilled in the art. For example, (1) Fusion of lymphocytes of a patient infected with HIV with mouse myeloma cells. Next, hybridomas producing a desired monoclonal antibody are selected. And a method of obtaining an antibody by being produced by a selected hybridoma; (2) A method for obtaining an antibody of interest by immunizing a mammal capable of producing human immunoglobulin (eg, XENOMOUSE®) with HIV-1 p24 antigen; (3) Epstein-Barr virus is infected to B lymphocytes collected from the blood of HIV-infected patients. Next, B lymphocytes producing an antibody of interest are screened.
  • human immunoglobulin eg, XENOMOUSE®
  • a method of obtaining a target antibody by introducing the target antibody-producing gene obtained by cloning the screened B lymphocytes into mammalian cells such as CHO (Chinese hamster ovary) cells; Etc. They can also be obtained as commercial products.
  • mammalian cells such as CHO (Chinese hamster ovary) cells; Etc. They can also be obtained as commercial products.
  • a human monoclonal antibody obtained from Biomaric (BioMARIC, Belgium) as the above first and second human monoclonal antibodies.
  • the above first and second human monoclonal antibodies are each an antibody capable of recognizing different sites (epitopes) of an antigen.
  • the first antibody described above is labeled with a detectable labeling substance.
  • the labeling substance is not particularly limited as long as it is a labeling substance that can be used in a conventional immunoassay.
  • enzymes include alkaline phosphatase, peroxidase, glucose oxidase, tyrosinase, acid phosphatase and the like.
  • Fluorescent substances include fluorescein isothiocyanate (FITC), green fluorescent protein (GFP), luciferin and the like.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • GFP green fluorescent protein
  • luciferin As radioactive isotopes, 125 I, 14 C, 32 P and the like can be mentioned.
  • the above-mentioned labeling substance is preferably an enzyme, particularly preferably alkaline phosphatase (ALP).
  • the method for labeling the first human monoclonal antibody with a labeling substance is not particularly limited as long as it is a method commonly used in the art.
  • a method is known in which the above-mentioned labeling substance is bound to an antibody using a thiol group (-SH group) in the antibody.
  • the above-mentioned antibody can be labeled with a labeling substance by reacting the above-mentioned labeling substance into which a functional group capable of reacting with a thiol group such as a maleimide group is introduced with the first human monoclonal antibody.
  • the second antibody described above is capable of binding to a solid phase.
  • the binding between the second antibody and the solid phase is a substance capable of binding to the solid phase of the second antibody (hereinafter sometimes referred to as "a substance for solid phase binding"), a binding substance retained on the solid phase, and Preferably by the bond between
  • the solid phase binding substance and the binding substance described above are not particularly limited as long as they are a combination of substances that can specifically bind under the conditions under which the detection method of HIV-1 p24 antigen is performed. Examples of these combinations include biotin and avidin or streptavidin, hapten and anti-hapten antibodies, nickel and histidine tag, glutathione and glutathione-S-transferase, and the like. Examples of haptens and anti-hapten antibodies include dinitrophenol (DNP) and anti-DNP antibodies.
  • DNP dinitrophenol
  • the binding of the second antibody to the solid phase is preferably by biotin-avidin binding or biotin-streptavidin binding. Therefore, the combination of the substance for solid phase binding and the binding substance is preferably a combination of biotin and avidin or biotin and streptavidin.
  • the combination of the substance for solid phase binding and the binding substance is not particularly limited as long as it is selected from the combination of the above-mentioned substances capable of specifically binding.
  • the substance for solid phase binding contains biotin
  • the binding substance is avidin or streptavidin.
  • the solid phase binding substance comprises avidin or streptavidin
  • the binding substance is biotin.
  • the substance for solid phase binding comprises biotin and the binding substance is avidin or streptavidin.
  • the second antibody is an antibody to which biotin is bound
  • the solid phase is a solid phase on which avidin or streptavidin is retained.
  • the magnetic particle binding substance can be bound to the second human monoclonal antibody by using a functional group having reactivity with a primary amino group (—NH 2 group) or a thiol group in the antibody.
  • the functional group having reactivity with the primary amino group includes a succinimide group (NHS group) and the like.
  • a functional group having reactivity with a thiol group a maleimide group and the like can be mentioned.
  • the above-mentioned solid phase material is not particularly limited as long as it is a common solid phase material used for immunoassay.
  • Polymer materials such as copolymer, polyvinylidene difluoride (PVDF), silicone, etc .; agarose; gelatin; red blood cells; inorganic materials such as silica gel, glass, inert alumina, magnetic material, etc. One or more of these may be combined.
  • the form of the solid phase is not particularly limited as long as it is the form of a normal solid phase used for immunoassay.
  • a normal solid phase used for immunoassay For example, microtiter plates, test tubes, particles and the like can be mentioned.
  • particles are preferable as the solid phase contained in the reagent. If the solid phase is a particle, it can be easily contained in the reagent.
  • the particles include magnetic particles, latex, red blood cells, gelatin particles and the like.
  • the above-mentioned binding substance may be directly retained on the solid phase. Also, it may be held by a substance previously coated on the surface of the solid phase.
  • the binding substance can be retained on the solid phase by being chemically bonded to the hydrophilic group.
  • the binding substance can be held on the solid phase by binding the substance to the substance using chemical bonding or intermolecular force.
  • Magnetic particles are particles that contain magnetic particles as a base material. Such magnetic particles are known in the art. As a base material, for example, one using Fe 2 O 3 and / or Fe 3 O 4 , cobalt, nickel, ferrite, magnetite or the like is known.
  • a base material for example, one using Fe 2 O 3 and / or Fe 3 O 4 , cobalt, nickel, ferrite, magnetite or the like is known.
  • As preferred magnetic particles (1) Magnetic particles in which the surface of the magnetic particles is coated with a polymer, protein or the like; (2) Magnetic particles in which carboxyl groups are exposed from the surface of magnetic particles; (3) Magnetic particles having a configuration in which a substrate having magnetism is dispersed in a resin; Etc. These magnetic particles can easily hold the above-mentioned binding substance.
  • Magnetic particles hold avidin or streptavidin magnetic particles having carboxyl groups exposed on the surface can be used to hold avidin or streptavidin in the magnetic particles by a chemical reaction. More specifically, in the presence of a dehydrating condensing agent such as a water-soluble carbodiimide, an amino group in a molecule of avidin or streptavidin is reacted with a carboxyl group exposed on the surface of a particle body to form an amide bond. Thus, avidin or streptavidin can be retained on the magnetic particles.
  • a dehydrating condensing agent such as a water-soluble carbodiimide
  • avidin or streptavidin may be held on a solid phase by binding to the substance by using a chemical bond or an intermolecular force. it can.
  • avidin or streptavidin is supported on the resin by being bound to the resin by using a chemical bond or an intermolecular force.
  • the HIV detection reagent of the present invention may contain, in addition to the first antibody, the solid phase and the second antibody, other components that do not interfere with and / or facilitate detection of HIV-1 p24 antigen detection.
  • Other components include surfactants, preservatives, serum proteins and the like.
  • each reagent constituting the reagent kit is Other ingredients as described above can be included.
  • the reagent for detecting HIV of the present invention may be in the form of a liquid in which the first antibody, the particles as the solid phase and the second antibody are suspended or dissolved in an appropriate solvent together with the other components described above.
  • the liquid may be made solid by treatment such as lyophilization.
  • the HIV detection reagent of the present invention is a liquid.
  • a reagent kit including a first reagent containing a first antibody, a second reagent containing particles as a solid phase, and a third reagent containing a second antibody, the first reagent, the second reagent and the third Reagent kits in which all of the reagents are liquid are preferred.
  • a suitable solvent is not particularly limited as long as it does not interfere with the detection of HIV-1 p24 antigen.
  • PBS phosphate buffered saline
  • TAA triethanolamine hydrochloride buffer
  • Tris-HCl Tris-HCl
  • the pH of the first reagent, the second reagent and the third reagent is preferably about 6.0 to 10.0.
  • the above first and second antibodies depend on the type of antibody used, they are preferably present in excess with respect to the antigen which can be contained in the sample when it reacts with the antigen. . That is, the concentration of the first and second antibodies in the reaction with the antigen may be preferably 0.01 to 10 ⁇ g / ml, more preferably 0.1 to 5 ⁇ g / ml.
  • the HIV detection reagent preferably contains 0.1 to 20 mg / ml, more preferably 1 to 10 mg / ml of magnetic particles. Is preferred.
  • the reagent for detecting HIV of the present invention is preferably a reagent kit having another reagent containing a substrate for the enzyme.
  • the fourth reagent containing a substrate for the enzyme It is preferable to further include.
  • substrates for the enzymes conventionally known chemiluminescent substrates, luminescent substrates such as bioluminescent substrates, and chromogenic substrates can be used according to the enzymes exemplified as the above-mentioned labeling substances.
  • examples of the substrate include AMPPD (registered trademark) (3- (2'-spiroadamantane) -4-methoxy-4- (3 "-phosphoryloxy) phenyl-1 , 2-Dioxetane), CDP-star (registered trademark) (4-chloro-3- (methoxyspiro ⁇ 1,2-dioxetane-3,2 ′-(5′-chloro) tricyclo [3.3.1.1] 3,7 ] decane ⁇ -4-yl) phenyl phosphate disodium), CSPD (registered trademark) (3- (4-methoxyspiro ⁇ 1,2-dioxetane-3,2- (5′-chloro) tricyclo [3 3.3.1.1 Chemiluminescent substrates such as 3,7 ] decan ⁇ -4-yl) phenyl phosphate (disodium phosphate); p-nitro
  • the HIV detection reagent of the present invention can further include a washing solution.
  • a washing solution for example, in the case of a reagent kit including a first reagent containing a first antibody, a second reagent containing particles as a solid phase, and a third reagent containing a second antibody, it may further contain a washing solution as another reagent.
  • the washing solution is preferably a buffer having a pH of about 6.0 to 10.0, and examples thereof include 2- [N-morpholino] ethanesulfonic acid buffer (MES), phosphate buffered saline (PBS) and the like.
  • MES 2- [N-morpholino] ethanesulfonic acid buffer
  • PBS phosphate buffered saline
  • the present invention also provides a method for detecting HIV-1 p24 antigen (hereinafter, also simply referred to as “detection method”).
  • the detection method of the present invention comprises the HIV-1 p24 antigen contained in the sample, the first antibody in which the first human monoclonal antibody that recognizes the HIV-1 p24 antigen is labeled with a labeling substance, and the HIV-1 p24 antigen.
  • the second human monoclonal antibody is complexed with a second antibody bound to a substance capable of binding to a solid phase on a solid phase, and an HIV antigen is detected based on the labeled substance contained in the complex.
  • a target antigen (HIV-1 p24 antigen) is formed using a sandwich method based on an antigen-antibody reaction of a first antibody and an antigen, and a second antibody and an antigen formed on a solid phase. If it can detect, it will not be limited in particular.
  • a detection method using a reagent kit including a first reagent containing a first antibody, a second reagent containing particles as a solid phase, and a third reagent containing a second antibody, HIV-1
  • the sample that may contain the p24 antigen, the first reagent, the second reagent, and the third reagent may be mixed in any order.
  • the detection method of the present invention preferably comprises the step of first mixing the HIV-1 p24 antigen and the first antibody.
  • the antigen and the first antibody are brought into contact to form a complex consisting of the HIV-1 p24 antigen and the first antibody.
  • a complex comprising the HIV-1 p24 antigen, the first antibody and the second antibody is formed on the solid phase, and the HIV antigen is detected based on the labeling substance contained in the complex.
  • Detecting the HIV antigen in this order can detect the target antigen with higher sensitivity.
  • a diagram conceptually showing the case of capturing HIV antigens with the first and second antibodies in this order is shown in FIG.
  • a preferred detection method is (A) mixing the HIV-1 p24 antigen and the first reagent to form a complex consisting of the HIV-1 p24 antigen and the first antibody; (B) forming the complex formed in step (a) into particles as a solid phase contained in the second reagent using the second antibody contained in the third reagent, (C) detecting the labeled substance of the first antibody of the complex formed on the particles in the step (b).
  • This detection method makes it possible to detect HIV antigens with higher sensitivity.
  • the mixture obtained in the mixing step contains a complex consisting of a first antibody-antigen (hereinafter sometimes referred to as "first antibody-antigen complex").
  • first antibody-antigen complex simultaneously contacts the second antibody and the particles.
  • the second antibody is bound to the complex to form a first antibody-antigen-second antibody complex (hereinafter sometimes referred to as "first antibody-antigen-second antibody complex").
  • first antibody-antigen-second antibody complex Combine with particles.
  • the second antibody binds to the particle and then binds to the first antibody-antigen complex.
  • a first antibody-antigen-second antibody complex is formed on the particle.
  • the second antibody After mixing the mixture obtained in the mixing step and the particles as the solid phase, the second antibody is mixed: In the case of (2), the first antibody-antigen complex in the mixture first contacts the particles. The first antibody-antigen complex has no binding site for the particle. Thus, the first antibody-antigen complex does not bind to the particle. The second antibody is then contacted with the antigen-first antibody complex and the particles. Thus, the second antibody binds to the particle after binding to the antigen-first antibody complex to form a first antibody-antigen-second antibody complex. Alternatively, the second antibody binds to the particle and then binds to the antigen-first antibody complex. As a result, a first antibody-antigen-second antibody complex is formed on the particles.
  • the particles as the solid phase are mixed:
  • the first antibody-antigen complex in the mixture is first contacted with the second antibody.
  • a first antibody-antigen-second antibody complex is formed.
  • the first antibody-antigen-second antibody complex contacts the particles.
  • the particles are bound to the first antibody-antigen-second antibody complex.
  • a first antibody-antigen-second antibody complex is formed on the particle.
  • the mixture obtained by mixing the particles as the solid phase and the second antibody is mixed with the mixture obtained in the mixing step:
  • the second antibody and the particles come in contact with each other.
  • the second antibody binds to the particle.
  • the first antibody-antigen complex in the mixture is then contacted with the second antibody bound to the particle.
  • the second antibody bound to the particle is bound to the first antibody-antigen complex.
  • a first antibody-antigen-second antibody complex is formed on the particle.
  • the first antibody-antigen-second antibody complex is formed after the second antibody not bound to the particles binds to the antigen-first antibody complex to form a first antibody-antigen-second antibody complex.
  • the first antibody-antigen-second antibody complex is formed.
  • the body may be formed on particles.
  • step (b) ) Is (B1) It is carried out by mixing the complex formed in step (a), the second reagent and the third reagent, or (B2) After mixing the complex formed in the step (a) and the second reagent, it may be carried out by mixing the third reagent, (B3) After the complex formed in step (a) and the third reagent are mixed, the second reagent is mixed or (b4) after the second reagent and the third reagent are mixed , By mixing the complex formed in step (a).
  • step (B1) When mixing the complex formed in step (a), the second reagent and the third reagent:
  • the antigen-first antibody complex formed in step (a) simultaneously contacts the second antibody in the third reagent and the particles in the second reagent. This allows the second antibody to bind to the particle after binding to the antigen-first antibody complex to form a first antibody-antigen-second antibody complex.
  • the second antibody binds to the particle and then binds to the antigen-first antibody complex.
  • a first antibody-antigen-second antibody complex can be formed on the particle.
  • step (B2) When mixing the third reagent after mixing the complex formed in step (a) and the second reagent:
  • the antigen-first antibody complex formed in step (a) is contacted with the particles in the second reagent.
  • the first antibody and the antigen have no binding site for the particle.
  • the antigen-first antibody complex does not bind to the particles.
  • the second antibody contained in the third reagent is brought into contact with the antigen-first antibody complex and the particles.
  • the second antibody binds to the antigen-first antibody complex to form a first antibody-antigen-second antibody complex, and then binds to the particle.
  • the second antibody binds to the particle and then binds to the antigen-first antibody complex.
  • a first antibody-antigen-second antibody complex can be formed on the particle.
  • step (B3) When mixing the second reagent after mixing the complex formed in step (a) and the third reagent:
  • the antigen-first antibody complex formed in step (a) is brought into contact with the second antibody in the third reagent. Thereby, a first antibody-antigen-second antibody complex is formed. Thereafter, the particles contained in the second reagent are brought into contact with the first antibody-antigen-second antibody complex. As a result, a first antibody-antigen-second antibody complex can be formed on the particle.
  • step (B4) When mixing the complex formed in step (a) after mixing the second reagent and the third reagent: By contacting the second antibody in the third reagent with the particles in the second reagent, all or a part of the second antibody binds to the particles. Then, the antigen-first antibody complex formed in step (a) is mixed with a mixture of a second reagent and a third reagent. Thereby, the second antibody bound to the particle binds to the complex to form a first antibody-antigen-second antibody complex on the particle. Alternatively, a second antibody not bound to the particle binds to the antigen-first antibody complex to form a first antibody-antigen-second antibody complex, and the complex binds to the particle. As a result, a first antibody-antigen-second antibody complex can be formed on the particle.
  • the above first and second antibodies are preferably reacted in excess amount with an antigen which may be contained in the sample, although it depends on the type of antibody used. That is, the concentration of the first and second antibodies in the reaction with the antigen may be preferably 0.01 to 10 ⁇ g / ml, more preferably 0.1 to 5 ⁇ g / ml.
  • the above-described HIV detection reagent preferably contains the first and second antibodies at a concentration that can provide such an amount of antibody.
  • the magnetic particles are preferably present at a concentration of preferably 0.1 to 20 mg / ml, more preferably 1 to 10 mg 10 / ml.
  • the method of detecting the HIV antigen based on the above-mentioned labeling substance can be appropriately selected according to the type of the labeling substance. That is, when the labeling substance is a radioactive isotope, a method of detecting radioactivity using a conventionally known device such as, for example, a scintillation counter can be used. When the labeling substance is a fluorescent substance, a method of detecting fluorescence using a conventionally known device such as a luminometer can be used.
  • the above-mentioned labeling substance is an enzyme, and the method is a method of detecting luminescence or coloring obtained by reacting the enzyme with a substrate for the enzyme in the above-mentioned fourth reagent.
  • the detection of light emission or color development can be performed using a conventionally known device such as a spectrophotometer or a luminometer.
  • the above-mentioned detection method further includes the step of mixing the substrate of the enzyme and the first antibody-antigen-second antibody complex formed on the particles.
  • the detection step detects an HIV antigen based on the reaction between the enzyme and the substrate.
  • the substrate include the above-mentioned luminescent substrate and chromogenic substrate.
  • an HIV antigen can be detected by detecting luminescence or coloring generated by the reaction of an enzyme with the substrate.
  • detection is a concept including measurement. Similar to the detection of the standard substance, the measurement of the labeling substance can also be performed using a conventionally known device, depending on the type of the labeling substance. The measured values can also be used to quantify the amount of HIV-1 p24 antigen in the sample by means of a standard curve obtained from a solution containing known concentrations of HIV-1 p24 antigen.
  • ALP Alkaline Phosphatase
  • ALP-labeled anti-p24 human monoclonal antibody was obtained by reacting another anti-p24 human monoclonal antibody with ALP-maleimide prepared according to a known method.
  • the HIV-1 p24 antigen was measured by the sandwich immunoassay method in the following three types of measurement procedures.
  • the antibody is antibody buffer (0.1 M MES (2-morpholinoethanesulfonic acid) (pH 6.0), 1% bovine serum albumin, 0.15 M NaCl, 0.1% sodium azide) Used to dilute.
  • Measurement procedure 1 1) 50 ⁇ L of ALP-labeled anti-p24 monoclonal antibody or ALP-labeled anti-p24 Faba (0.1 U / mL) as a first antibody labeled with a labeling substance in a reaction vessel, HIV-1 p24 antigen solution as a sample (concentration 0 Alternatively, 50 ⁇ L of 325 pg / mL (manufactured by Biomaric) was aliquoted and reacted at 42 ° C. for 2 minutes. 2) 30 ⁇ L of streptavidin magnetic particles (average particle 2 ⁇ m, 5 mg / mL in 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5)) were added and reacted at 42 ° C.
  • Measurement procedure 2 1) 50 ⁇ L of biotin-labeled anti-p24 human monoclonal antibody (0.8 ⁇ g / mL) as a second antibody capable of binding to magnetic particles, and HIV-1 p24 antigen solution as a sample (concentration: 0 or 325 pg / mL) in a reaction vessel ) 50 ⁇ L was aliquoted and reacted at 42 ° C for 2 minutes. 2) 30 ⁇ L of streptavidin magnetic particles (average particle 2 ⁇ m, 5 mg / mL in 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5)) were added and reacted at 42 ° C. for 2.5 minutes.
  • Measurement procedure 3 1) 50 ⁇ L of biotin-labeled anti-p24 monoclonal antibody (0.8 ⁇ g / mL) as a second antibody capable of binding to magnetic particles, and HIV-1 p24 antigen solution as a sample (concentration: 0 or 325 pg / mL) in a reaction vessel 50 ⁇ L was aliquoted and reacted at 42 ° C. for 2 minutes. 2) Streptavidin magnetic particles (average particle 2 ⁇ m, 5 mg / mL in 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5)) 30 ⁇ L were added, reacted at 42 ° C. for 2.5 minutes, and then magnetically separated.
  • Example 1 Using the biotin-labeled anti-p24 antigen human monoclonal antibody (0.8 ⁇ g / mL) prepared in (1) above and the ALP-labeled anti-p24 antigen human monoclonal antibody prepared in (3) above, according to measurement procedure 1 It measured.
  • Comparative Example 1 Measurement using the biotin-labeled anti-p24 mouse monoclonal antibody (0.8, 4.0, 8.0 ⁇ g / mL) prepared in (2) above instead of the biotin-labeled anti-p24 antigen human monoclonal antibody of Example 1 The measurement was performed according to Procedure 1.
  • the S / N in HIV-1 p24 antigen measurement is higher than the anti-p24 mouse monoclonal antibody when the amount of antibody used is equivalent (0.8 ⁇ g / mL) It can be seen that the ratio and specific signal are nearly five times higher. Also, even at 4.0 ⁇ g / mL, where the anti-p24 mouse monoclonal antibody shows the highest specific signal, the specific signal was 1/2 or less, so HIV-1 p24 with high sensitivity when using the anti-p24 human monoclonal antibody. It can be seen that the antigen can be detected.
  • Example 2 The same antibody as in Example 1, that is, the biotin-labeled p24 human monoclonal antibody prepared in (1) above, and the ALP-labeled anti-p24 human monoclonal antibody prepared in (3) above (hereinafter referred to as "IgG-ALP") The measurement was performed in measurement procedure 1 using IgG-ALP.
  • Example 3 The measurement was performed in measurement procedure 2 using the same antibody as in Example 2.
  • Example 4 Using the same antibody as in Example 2, measurement was performed in measurement procedure 3.
  • Example 5 Measurement was performed in accordance with measurement procedure 1 using ALP-labeled anti-p24 Fab '(Fab'-ALP) prepared in (4) above instead of the ALP-labeled anti-p24 human monoclonal antibody of Example 2.
  • Example 6 Using the same antibody as in Example 5, measurement was performed in measurement procedure 2.
  • Example 7 Using the same antibody as in Example 5, the measurement was performed in measurement procedure 3.
  • Example 8 and Comparative Example 2 ALP-labeled anti-p24 antigen human monoclonal antibody prepared in (4) above as the first antibody, and biotin-labeled anti-p24 antigen human monoclonal antibody (0.8 ⁇ g) prepared in (1) above as the second antibody
  • the HIV-1 p24 antigen was detected according to the measurement procedure 1 using (mL) and the commercially available HIV seroconversion panel sample HIV-1 Seroconversion Panel BB (PRB 952) (BBI) as a sample .
  • Example 8 The results of detection of HIV antigen based on the procedure of Example 8 are shown in Table 4.
  • Comparative Example 2 Lumipulse I was measured using the commercially available reagent for detecting HIV-1 p24 antigen, Lumipulse I HIV-1 p24 (registered trademark, manufactured by Fujirebio Co., Ltd.), and the above HIV seroconversion panel sample was measured. The results described in the package insert of HIV-1 p24 are shown.
  • Lumipulse I HIV-1 p24 uses an anti-p24 antigen mouse monoclonal antibody as an antibody for detecting HIV-1 p24 antigen.
  • an operation of adding a sample processing solution containing polyoxyethylene octylphenyl ether as a surfactant to the sample and stirring is performed.
  • HIV-1 p24 antigen was detected in Lumipulse I HIV-1 p24 on day 10 after the first blood collection.
  • HIV-1 p24 antigen can be detected 7 days after the first blood collection. That is, detection of HIV antigen using the anti-p24 human monoclonal antibody of the present invention of the present invention can detect HIV-1 p24 antigen as early as 3 days than Lumipulse I HIV-1 p24.
  • the HIV-1 p24 antigen can be detected with high sensitivity without the pretreatment of the sample as Lumipulse I HIV-1 p24.

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Abstract

　本発明は、ＨＩＶ－１　ｐ２４抗原を認識する第１のヒトモノクローナル抗体を標識物質で標識した第１抗体と、固相と、前記固相に結合可能な物質をＨＩＶ－１　ｐ２４抗原を認識する第２のヒトモノクローナル抗体に結合させた第２抗体と、を含有するＨＩＶ抗原検出用試薬を提供する。

Description

ＨＩＶ－１抗原の検出用試薬及び検出方法
　本発明は、ＨＩＶ－１　ｐ２４抗原の検出用試薬及び検出方法に関する。
　後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染することにより引き起こされる疾患である。従来、ＡＩＤＳの診断は、血液中のＨＩＶ抗体を検出することで行われている。しかし、ＨＩＶ感染初期の血液中では抗体価が上がらない空白期間が存在する。そのため、ＨＩＶ抗体を検出する検査方法では、初期のＨＩＶ感染患者を見逃す可能性がある。
　このような問題点を解決するために、血液中のＨＩＶ抗原を検出する方法が知られている。また、安定な抗原性を示す１型ＨＩＶウイルスのｐ２４コアタンパク質（以下、「ＨＩＶ－１　ｐ２４抗原」という）を検出する方法も知られている。従来公知の方法は、例えば米国特許第５１７３３９９号公報（特許文献１）、米国特許第４９８３５２９号公報（特許文献２）、米国特許第６４３２６３３号公報（特許文献３）などに記載されるサンドイッチイムノアッセイ方法である。
米国特許第５１７３３９９号公報 米国特許第４９８３５２９号公報 米国特許第６４３２６３３号公報
　血液中のＨＩＶ抗原の検出は、ＨＩＶ抗原が血液中に微量しか含まれていないので、高い感度が要求される。また、従来のイムノアッセイ方法では、ＨＩＶ－１　ｐ２４抗原を検出するための抗体としてマウスモノクローナル抗体が用いられている。よって、検体がヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）を含む場合、試薬として含まれるマウスモノクローナル抗体と、検体中のＨＡＭＡとが反応して、偽陽性の結果を与える可能性がある。
　そこで、本発明は、ＨＡＭＡによる偽陽性を低減できるとともに、高感度にＨＩＶ－１　ｐ２４抗原を検出できる試薬及びその方法を提供することを目的とする。
　本発明者等は、
１）ヒトモノクローナル抗体を用いるサンドイッチイムノアッセイ法により、ＨＩＶ－１　ｐ２４抗原を高感度に検出できること；及び
２）ヒトモノクローナル抗体を用いることにより、ＨＡＭＡを含む検体であっても偽陽性を低減できること
を見出し、本発明を完成した。
　よって、本発明は、
（１）ＨＩＶ－１　ｐ２４抗原を認識する第１のヒトモノクローナル抗体を標識物質で標識した第１抗体と、固相と、前記固相に結合可能な物質をＨＩＶ－１　ｐ２４抗原を認識する第２のヒトモノクローナル抗体に結合させた第２抗体と、を含有するＨＩＶ抗原検出用試薬；
（２）前記第１抗体を含む第１試薬と、前記固相としての粒子を含む第２試薬と、前記第２抗体を含む第３試薬とを備えた（１）に記載のＨＩＶ抗原検出用試薬；
（３）前記標識物質が酵素であり、この酵素の基質を含む第４試薬をさらに備えた（２）に記載のＨＩＶ抗原検出用試薬；
（４）前記固相がアビジンまたはストレプトアビジンを保持し、前記固相に結合可能な物質がビオチンである、（１）～（３）の何れか１に記載のＨＩＶ抗原検出用試薬；
（５）前記固相が、磁性粒子である、（１）～（４）の何れか１に記載のＨＩＶ抗原検出用試薬；
（６）検体に含まれるＨＩＶ－１　ｐ２４抗原と、ＨＩＶ－１　ｐ２４抗原を認識する第１のヒトモノクローナル抗体を標識物質で標識した第１抗体と、固相に結合可能な物質をＨＩＶ－１　ｐ２４抗原を認識する第２のヒトモノクローナル抗体に結合させた第２抗体との複合体を固相上に形成し、この複合体に含まれる前記標識物質に基づいてＨＩＶ抗原を検出するＨＩＶ抗原検出方法；
（７）前記抗原と、前記第１抗体とを混合する工程、前記混合工程で得られた混合物と、前記固相としての粒子と、前記第２抗体とを混合し、前記粒子上に前記複合体を形成する工程、および前記粒子上に形成された前記複合体に含まれる、前記標識物質に基づいてＨＩＶ抗原を検出する工程からなる（６）に記載のＨＩＶ抗原検出方法；
（８）前記抗原と、前記第１抗体とを混合する第１混合工程、第１混合工程で得られた混合物と、前記固相としての粒子とを混合する第２混合工程、第２混合工程で得られた混合物と、前記第２抗体とを混合し、前記粒子上に前記複合体を形成する工程、および前記粒子上に形成された前記複合体に含まれる、前記標識物質に基づいてＨＩＶ抗原を検出する工程からなる（６）に記載のＨＩＶ抗原検出方法；
（９）前記抗原と、前記第１抗体とを混合する第１混合工程、第１混合工程で得られた混合物と、前記第２抗体とを混合する第２混合工程、第２混合工程で得られた混合物と、前記固相としての粒子とを混合し、前記粒子上に前記複合体を形成する工程、および前記粒子上に形成された前記複合体に含まれる、前記標識物質に基づいてＨＩＶ抗原を検出する工程からなる（６）に記載のＨＩＶ抗原検出方法；
（１０）前記抗原と、前記第１抗体とを混合する第１混合工程、前記固相としての粒子と、前記第２抗体とを混合する第２混合工程、第１混合工程で得られた混合物と、第２混合工程で得られた混合物とを混合し、前記粒子上に前記複合体を形成する工程、および前記粒子上に形成された前記複合体に含まれる、前記標識物質に基づいてＨＩＶ抗原を検出する工程からなる（６）に記載のＨＩＶ抗原検出方法；
（１１）前記標識物質が酵素であり、この酵素の基質と、前記粒子上に形成された前記複合体とを混合する工程を備え、前記検出工程は前記酵素と前記基質の反応に基づいてＨＩＶ抗原を検出する（７）～（１０）の何れか１に記載のＨＩＶ抗原検出方法；
（１２）前記基質が、発光基質または発色基質であり、前記検出工程は前記酵素と前記基質の反応によって生じる発光または発色を検出することによりＨＩＶ抗原を検出する（１１）に記載のＨＩＶ抗原検出方法；
（１３）前記固相が、磁性粒子である、（６）～（１２）の何れか１に記載のＨＩＶ抗原検出方法
を提供する。
　本発明のＨＩＶ抗原の検出用試薬及び検出方法は、ヒトモノクローナル抗体を用いてＨＩＶ抗原を検出する。そのため、ＨＡＭＡを含む検体であっても偽陽性の結果を低減できる。また、従来の方法に比べてより高感度にＨＩＶ－１　ｐ２４抗原を検出することができる。よって、ＨＩＶ抗原の検出に必要な検体の量を低減できる。さらに、検体の前処理を行わなくても高精度の結果を提供できる。よって、検査の煩雑さを低減できる。
本発明の、第１試薬、第２試薬及び第３試薬を含むＨＩＶ抗原検出用試薬を概念的に表した図を示す。 本発明のＨＩＶ抗原検出方法の反応を概念的に表した図を示す。
　本発明のＨＩＶ抗原検出用試薬は、ＨＩＶ－１　ｐ２４抗原を認識する第１のヒトモノクローナル抗体を標識物質で標識した第１抗体と、固相と、前記固相に結合可能な物質をＨＩＶ－１　ｐ２４抗原を認識する第２のヒトモノクローナル抗体に結合させた第２抗体と、を含有する。本発明のＨＩＶ抗原検出用試薬は、単一の試薬及び複数の試薬から構成される試薬キットを含む。本発明のＨＩＶ抗原検出用試薬において、第１抗体、固相、及び第２抗体は、それぞれ別々の試薬に含まれていてもよい。また、第１抗体、固相、及び第２抗体のいずれか二つ、又はそれら全てが、同一の試薬に含まれていてもよい。例えば、第１抗体を含む試薬と、固相及び第２抗体を含む別の試薬とを含む試薬キットが挙げられる。この場合、第２試薬中の第２抗体は、固相に結合していてもよい。また、第１抗体、固相、及び第２抗体を全て含む試薬も挙げられる。この場合も、試薬中の第２抗体は、固相に結合していてもよい。
　本発明のＨＩＶ抗原検出用試薬としては、第１抗体、固相及び第２抗体を、別々の試薬に含む、試薬キットが好ましい。ここで、試薬に含まれる固相としては、後述する粒子が挙げられる。すなわち、前記第１抗体を含む第１試薬と、前記固相としての粒子を含む第２試薬と、前記第２抗体を含む第３試薬とを含む試薬キットが好ましい。
　図１に、該試薬キットの第１試薬、第２試薬及び第３試薬の模式図を示す。第１試薬には第１抗体、第２試薬には固相としての粒子、及び第３試薬に第２抗体がそれぞれ含まれている。
　本発明において用いられる、ＨＩＶ－１　ｐ２４抗原を認識する第１及び第２のヒトモノクローナル抗体は、ＨＩＶ－１　ｐ２４抗原を認識できるヒトモノクローナル抗体であれば、特に限定されない。抗体のクラスは特に限定されず、ＩｇＧ、ＩｇＭなどを含む。該抗体は、ＨＩＶ－１　ｐ２４抗原を認識できるのであれば、抗体のフラグメント及びその誘導体であってもよい。抗体のフラグメントとしては、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、ｓＦｖフラグメントなどが挙げられる。これらのフラグメントは、例えばペプシン処理のような従来公知の方法により抗体を処理することにより得ることができる。
　ＨＩＶ－１　ｐ２４抗原を認識するヒトモノクローナル抗体は、当業者に公知の方法により得ることができる。例えば、
　（１）ＨＩＶに感染した患者のリンパ球と、マウスミエローマ細胞とを融合させる。次に、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する。そして、選択されたハイブリドーマにより産生させることにより抗体を得る方法；
　（２）ヒト型免疫グロブリンを産生できる哺乳動物（例えばXENOMOUSE（登録商標））をＨＩＶ－１　ｐ２４抗原で免疫することにより目的の抗体を得る方法；
　（３）ＨＩＶ感染患者の血液から採取したＢリンパ球にエプスタイン－バーウイルスを感染させる。次に、目的の抗体を産生するＢリンパ球をスクリーニングする。そして、スクリーニングされたＢリンパ球をクローニングすることにより得られる、目的抗体産生遺伝子をＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞などの哺乳動物細胞に導入して、目的抗体を得る方法；
などが挙げられる。また、市販品として入手することもできる。具体例としては、Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 86, pp.1624-1628, 1989に記載されているＨＩＶ－１　ｐ２４抗原を認識するヒトモノクローナル抗体や、バイオマリック社（BioMARIC、ベルギー）から入手できるＨＩＶ－１　ｐ２４抗原を認識するヒトモノクローナル抗体などが挙げられる。
　本発明においては、上記の第１及び第２のヒトモノクローナル抗体として、バイオマリック社（BioMARIC、ベルギー）から入手されるヒトモノクローナル抗体を用いることが好ましい。
　上記の第１及び第２のヒトモノクローナル抗体は、それぞれ、抗原の異なる部位（エピトープ）を認識できる抗体である。
　上記の第１抗体は、検出可能な標識物質で標識されている。該標識物質は、通常の免疫測定法において用い得る標識物質であれば特に限定されない。例えば、酵素、蛍光物質、放射性同位元素などが挙げられる。
　酵素としては、例えばアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェリンなどが挙げられる。放射性同位元素としては、125Ｉ、14Ｃ、32Ｐなどが挙げられる。
　上記の標識物質は酵素が好ましく、特に好ましくはアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）である。
　第１のヒトモノクローナル抗体を標識物質で標識する方法は、当該分野で通常用いられている方法であれば特に限定されない。例えば、抗体中のチオール基（－ＳＨ基）を用いて上記の標識物質を抗体と結合させる方法が知られている。具体的には、チオール基と反応できる官能基、例えばマレイミド基を導入した上記の標識物質を、第１のヒトモノクローナル抗体と反応させることにより、上記の抗体を標識物質で標識できる。
　上記の第２抗体は、固相に結合可能である。第２抗体と固相との間の結合は、第２抗体の固相に結合可能な物質（以下、「固相結合用物質」という場合がある）と、固相に保持された結合物質との間の結合によるものが好ましい。
　上記の固相結合用物質と結合物質は、ＨＩＶ－１　ｐ２４抗原の検出方法が行われる条件下で、特異的に結合できる物質の組み合わせであれば特に限定されない。これらの組み合わせとしては、例えばビオチンとアビジン又はストレプトアビジン、ハプテンと抗ハプテン抗体、ニッケルとヒスチジンタグ、グルタチオンとグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼなどが挙げられる。ハプテンと抗ハプテン抗体としては、例えばジニトロフェノール（ＤＮＰ）と抗ＤＮＰ抗体が挙げられる。
　上記の第２抗体と固相との結合は、ビオチン－アビジン結合又はビオチン－ストレプトアビジン結合によるものが好ましい。よって、固相結合用物質と結合物質の組み合わせは、ビオチンとアビジン又はビオチンとストレプトアビジンの組み合わせが好ましい。
　ここで、固相結合用物質と結合物質の組み合わせは、上記の特異的に結合できる物質の組み合わせから選択されればよく、特に限定されない。例えば、固相結合用物質がビオチンを含む場合、結合物質はアビジン又はストレプトアビジンである。逆に、固相結合用物質がアビジン又はストレプトアビジンを含む場合、結合物質はビオチンである。ここで、好ましくは、固相結合用物質がビオチンを含み、結合物質がアビジン又はストレプトアビジンである。言い換えると、第２抗体がビオチンを結合させた抗体であり、固相がアビジン又はストレプトアビジンを保持させた固相であることが好ましい。
　上記の固相結合用物質を第２のヒトモノクローナル抗体に結合させて、固相に結合可能な第２抗体を得る方法は、当該分野において公知である。例えば、抗体中の一級アミノ基（－ＮＨ2基）やチオール基などと反応性を有する官能基を用いて、磁性粒子結合物質を第２のヒトモノクローナル抗体に結合することができる。一級アミノ基と反応性を有する官能基としては、スクシンイミド基（ＮＨＳ基）などが挙げられる。チオール基と反応性を有する官能基としては、マレイミド基などが挙げられる。
　上記の固相の材料は、免疫測定に用いられる通常の固相の材料であれば特に限定されない。例えば、ラテックス、ゴム、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、スチレン－ブタジエン共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、スチレン－メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン－エチレングリコールジメタクリレート共重合体、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、シリコーンなどのポリマー材料；アガロース；ゼラチン；赤血球；シリカゲル、ガラス、不活性アルミナ、磁性体などの無機材料などが挙げられる。これらの１種又は２種以上を組み合わせてもよい。
　また、固相の形状としては、免疫測定に用いられる通常の固相の形状であれば特に限定されない。例えば、マイクロタイタープレート、試験管、粒子などが挙げられる。ここで、試薬に含有される固相としては、粒子が好ましい。固相が粒子であれば、容易に試薬に含有させることができる。粒子としては、磁性粒子、ラテックス、赤血球、ゼラチン粒子などが挙げられる。
　なお、上記の結合物質は、直接固相に保持されてもよい。また、固相の表面に予め被覆された物質に保持されてもよい。例えば、固相の表面がアミノ基、カルボキシル基などの親水基を有する場合、結合物質を、該親水基に化学反応により結合させることで、固相に保持させることができる。また、固相の表面がポリマーやタンパク質などの物質で被覆されている場合、結合物質を、該物質に化学結合や分子間力を用いて結合させることで、固相に保持させることができる。
　本発明の固相としては、磁性粒子が好ましい。磁性粒子は、磁性を有する粒子を基材として含む粒子である。このような磁性粒子は当該技術において公知である。基材として例えばＦｅ2Ｏ3及び／又はＦｅ3Ｏ4、コバルト、ニッケル、フェライト、マグネタイトなどを用いたものが知られている。好ましい磁性粒子として、
（１）磁性粒子の表面がポリマーやタンパク質などで被覆された磁性粒子；
（２）磁性粒子の表面からカルボキシル基が露出した磁性粒子；
（３）磁性を有する基材が樹脂中に分散した構成を有する磁性粒子；
などが挙げられる。これらの磁性粒子は、上述の結合物質を、容易に保持することができる。
　上記の結合物質を磁性粒子に保持させる方法は、当該技術分野において公知である。例えば物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、これらの組み合わせなどにより行うことができる。
　例えば、磁性粒子にアビジン又はストレプトアビジンを保持させる場合、表面にカルボキシル基が露出した磁性粒子を用い、化学反応により磁性粒子にアビジン又はストレプトアビジンを保持させることができる。より具体的には、水溶性カルボジイミドなどの脱水縮合剤の存在下に、アビジンまたはストレプトアビジンの分子中のアミノ基を、粒子本体の表面に露出するカルボキシル基に反応させてアミド結合を形成することにより、アビジン又はストレプトアビジンを磁性粒子に保持させることができる。また、磁性粒子の表面がポリマーやタンパク質などの物質で被覆されている場合、アビジンまたはストレプトアビジンを、該物質に化学結合や分子間力を用いて結合させることで、固相に保持させることができる。また、磁性を有する基材が樹脂中に分散した構成を有する磁性粒子の場合、アビジンまたはストレプトアビジンを、該樹脂に化学結合や分子間力を用いて結合させることで、固相に保持させることができる。
　本発明のＨＩＶ検出用試薬は、第１抗体、固相及び第２抗体以外に、ＨＩＶ－１ｐ２４抗原の検出を妨げない及び／又は検出を促進できるその他の成分を含むことができる。その他の成分としては、界面活性剤、保存剤、血清タンパク質などが挙げられる。例えば、第１抗体を含む第１試薬と、固相としての粒子を含む第２試薬と、第２抗体を含む第３試薬とを含む試薬キットの場合、試薬キットを構成する各々の試薬が、上記のその他の成分を含むことができる。
　本発明のＨＩＶ検出用試薬は、第１抗体、固相としての粒子及び第２抗体を、上記のその他の成分とともに適切な溶媒に懸濁又は溶解した、液体の状態であってもよい。また、該液体を凍結乾燥などの処理により固体の状態にしたものであってもよい。好ましくは、本発明のＨＩＶ検出用試薬は、液体である。例えば、第１抗体を含む第１試薬と、固相としての粒子を含む第２試薬と、第２抗体を含む第３試薬とを含む試薬キットの場合、第１試薬、第２試薬及び第３試薬の全てが、液体である試薬キットが好ましい。
　適切な溶媒としては、ＨＩＶ－１　ｐ２４抗原の検出を妨げない溶媒であれば特に限定されない。例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリエタノールアミン塩酸塩緩衝液（ＴＥＡ）、トリス塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）などを用いることができる。
　第１試薬、第２試薬及び第３試薬のｐＨは、６．０～１０．０程度が好ましい。
　上記の第１抗体及び第２抗体は、用いる抗体の種類にもよるが、これらの抗体が検体中に含まれ得る抗原と反応する際に、該抗原に対して過剰量で存在することが好ましい。すなわち、抗原と反応する際の第１及び第２抗体の濃度は、好ましくは０．０１～１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１～５μｇ／ｍｌであればよい。
　また、上記のＨＩＶ検出用試薬中の固相が磁性粒子である場合、ＨＩＶ検出用試薬は、好ましくは０．１～２０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１～１０ｍｇ／ｍｌの磁性粒子を含有することが好ましい。
　本発明のＨＩＶ検出用試薬は、上記の第１抗体を標識する標識物質が酵素である場合、該酵素に対する基質を含む別の試薬を有する、試薬キットであることが好ましい。例えば、第１抗体を含む第１試薬と、固相としての粒子を含む第２試薬と、第２抗体を含む第３試薬とを含む試薬キットの場合、該酵素に対する基質を含む第４試薬をさらに含むことが好ましい。該酵素に対する基質は、上記の標識物質として例示した酵素に応じて、従来公知の化学発光基質や生物発光基質などの発光基質、及び発色基質などを用いることができる。上記の酵素としてアルカリホスファターゼを用いる場合、基質としては、例えば、AMPPD（登録商標）（3-(2'-スピロアダマンタン)-4-メトキシ-4-(3"-ホスフォリルオキシ)フェニル-1,2-ジオキセタン）、ＣＤＰ－ｓｔａｒ（登録商標）（４－クロロ－３－（メトキシスピロ｛１，２－ジオキセタン－３，２'－（５'－クロロ）トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン｝－４－イル）フェニルリン酸２ナトリウム）、ＣＳＰＤ（登録商標）（３－（４－メトキシスピロ｛１，２－ジオキセタン－３，２－（５'－クロロ）トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン｝－４－イル）フェニルリン酸２ナトリウム）などの化学発光基質；ｐ－ニトロフェニルホスフェート、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－リン酸（ＢＣＩＰ）、４－ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ）、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）などの発色基質が挙げられる。
　本発明のＨＩＶ検出用試薬は、洗浄液をさらに含むことができる。例えば、第１抗体を含む第１試薬と、固相としての粒子を含む第２試薬と、第２抗体を含む第３試薬とを含む試薬キットの場合、別の試薬として洗浄液をさらに含むことが好ましい。該洗浄液は、ｐＨ６．０～１０．０程度の緩衝液が好ましく、２－［Ｎ－モルホリノ］エタンスルホン酸緩衝液（ＭＥＳ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などが挙げられる。
　本発明は、ＨＩＶ－１　ｐ２４抗原の検出方法（以下、単に「検出方法」ともいう）も提供する。
　本発明の検出方法は、検体に含まれるＨＩＶ－１　ｐ２４抗原と、ＨＩＶ－１　ｐ２４抗原を認識する第１のヒトモノクローナル抗体を標識物質で標識した第１抗体と、ＨＩＶ－１　ｐ２４抗原を認識する第２のヒトモノクローナル抗体に、固相に結合可能な物質を結合した第２抗体との複合体を固相上に形成し、この複合体に含まれる前記標識物質に基づいてＨＩＶ抗原を検出する。すなわち、本発明の検出方法は、第１抗体と抗原、及び固相上に形成された第２抗体と抗原の、抗原－抗体反応によるサンドイッチ法を用いて、目的抗原（ＨＩＶ－１　ｐ２４抗原）を検出することができれば、特に限定されない。
　よって、例えば、第１抗体を含む第１試薬と、固相としての粒子を含む第２試薬と、第２抗体を含む第３試薬とを含む試薬キットを用いた検出方法の場合、ＨＩＶ－１　ｐ２４抗原を含む可能性がある検体、第１試薬、第２試薬、及び第３試薬は、いずれの順序で混合してもよい。
　本発明の検出方法は、最初にＨＩＶ－１　ｐ２４抗原と第１抗体を混合する工程を行うことが好ましい。この工程により、前記抗原と第１抗体が接触し、ＨＩＶ－１　ｐ２４抗原と第１抗体とからなる複合体が形成される。次に、第２抗体を用いて、固相にＨＩＶ－１　ｐ２４抗原と第１抗体と第２抗体からなる複合体を形成し、該複合体に含まれる前記標識物質に基づいてＨＩＶ抗原を検出する。この順序でＨＩＶ抗原を検出すると、より高い感度で目的抗原を検出することができる。この順序でＨＩＶ抗原を第１及び第２抗体により捕捉する場合を概念的に表した図を、図２に示す。
　例えば、第１抗体を含む第１試薬と、固相としての粒子を含む第２試薬と、第２抗体を含む第３試薬とを含む試薬キットを用いた場合、好ましい検出方法は、
（ａ）ＨＩＶ－１　ｐ２４抗原と第１試薬とを混合して、ＨＩＶ－１　ｐ２４抗原と第１抗体とからなる複合体を形成させる工程と、
（ｂ）工程（ａ）で形成した複合体を、第３試薬に含まれる第２抗体を用いて、第２試薬に含まれる固相としての粒子に形成する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で前記粒子上に形成された前記複合体の、第１抗体の標識物質を検出する工程とを含む。この検出方法により、より高い感度でＨＩＶ抗原を検出することができる。
　抗原と第１抗体を混合する工程を行った後に行われる、上述の第２抗体を用いて、固相にＨＩＶ－１　ｐ２４抗原と第１抗体と第２抗体からなる複合体の形成としては、以下の（１）～（４）が挙げられる。
（１）混合工程で得られた混合物と、前記固相としての粒子と、前記第２抗体とを混合する：
　混合工程で得られた混合物には第１抗体－抗原からなる複合体（以下、「第１抗体－抗原複合体」という場合がある）が含まれている。（１）の場合、第１抗体－抗原複合体は、第２抗体と粒子に、同時に接触する。第２抗体は、該複合体と結合して第１抗体－抗原－第２抗体からなる複合体（以下、「第１抗体－抗原－第２抗体複合体」という場合がある）を形成した後に、粒子と結合する。又は、第２抗体は、粒子と結合した後に、第１抗体－抗原複合体と結合する。結果として、第１抗体－抗原－第２抗体複合体が粒子上に形成される。
（２）混合工程で得られた混合物と、前記固相としての粒子とを混合した後に、前記第２抗体を混合する：
　（２）の場合、混合物中の第１抗体－抗原複合体は、最初に粒子と接触する。第１抗体－抗原複合体は、粒子との結合部位を有さない。従って、第１抗体－抗原複合体は、粒子に結合しない。次いで、第２抗体を、抗原－第１抗体複合体と粒子に接触させる。これにより、第２抗体は、抗原－第１抗体複合体と結合して第１抗体－抗原－第２抗体複合体を形成した後に、粒子と結合する。又は、第２抗体は、粒子と結合した後に、抗原－第１抗体複合体と結合する。結果として、粒子上に第１抗体－抗原－第２抗体複合体が粒子上に形成される。
（３）混合工程で得られた混合物と、前記第２抗体とを混合した後に、前記固相としての粒子を混合する：
　（３）の場合、混合物中の第１抗体－抗原複合体は、最初に第２抗体と接触する。これにより、第１抗体－抗原－第２抗体複合体が形成される。その後、第１抗体－抗原－第２抗体複合体は、粒子と接触する。これにより、第１抗体－抗原－第２抗体複合体と粒子が結合する。結果として、第１抗体－抗原－第２抗体複合体が粒子上に形成される。
（４）前記固相としての粒子と前記第２抗体とを混合して得られた混合物と、混合工程で得られた混合物とを混合する：
　（４）の場合、まず、第２抗体と粒子とが接触する。これにより、第２抗体は、粒子に結合する。次いで、混合物中の第１抗体－抗原複合体と、粒子に結合した第２抗体とが接触する。これにより、粒子に結合した第２抗体と、第１抗体－抗原複合体とが結合する。結果として、第１抗体－抗原－第２抗体複合体が粒子上に形成される。また、粒子に結合していない第２抗体が、抗原－第１抗体複合体と結合して第１抗体－抗原－第２抗体複合体を形成した後に、第１抗体－抗原－第２抗体複合体が粒子上に形成される場合もある。
　なお、第１抗体を含む第１試薬と、固相としての粒子を含む第２試薬と、第２抗体を含む第３試薬とを含む試薬キットを用いた検出方法の場合、上記の工程（ｂ）は、
（ｂ１）工程（ａ）で形成した複合体と第２試薬と第３試薬とを混合することにより行われるか、
（ｂ２）工程（ａ）で形成した複合体と第２試薬とを混合した後に、第３試薬を混合することにより行われるか、
（ｂ３）工程（ａ）で形成した複合体と第３試薬とを混合した後に、第２試薬を混合することにより行われるか、又は
（ｂ４）第２試薬と第３試薬とを混合した後に、工程（ａ）で形成した複合体を混合することにより行われる。
　上記のそれぞれの場合に考えられる反応は、次のとおりである。
（ｂ１）工程（ａ）で形成した複合体と第２試薬と第３試薬とを混合させる場合：
　工程（ａ）で形成した抗原－第１抗体複合体は、第３試薬中の第２抗体と第２試薬中の粒子とに、同時に接触する。このことにより、第２抗体は、抗原－第１抗体複合体と結合して第１抗体－抗原－第２抗体複合体を形成した後に、粒子と結合する。又は、第２抗体は、粒子と結合してから抗原－第１抗体複合体と結合する。結果として、粒子上に第１抗体－抗原－第２抗体複合体を形成することができる。
（ｂ２）工程（ａ）で形成した複合体と第２試薬とを混合した後に、第３試薬を混合する場合：
　工程（ａ）で形成した抗原－第１抗体複合体を第２試薬中の粒子と接触させる。この場合、第１抗体及び抗原は、粒子との結合部位を有さない。従って、抗原－第１抗体複合体は、粒子に結合しない。次いで、第３試薬に含まれる第２抗体を、抗原－第１抗体複合体と粒子に接触させる。これにより、第２抗体は、抗原－第１抗体複合体と結合して第１抗体－抗原－第２抗体複合体を形成した後、粒子と結合する。又は、第２抗体は、粒子と結合した後、抗原－第１抗体複合体と結合する。結果として、粒子上に第１抗体－抗原－第２抗体複合体を形成することができる。
（ｂ３）工程（ａ）で形成した複合体と第３試薬とを混合した後に、第２試薬を混合する場合：
　工程（ａ）で形成した抗原－第１抗体複合体と第３試薬中の第２抗体とを接触させる。これにより、第１抗体－抗原－第２抗体複合体が形成される。その後、第２試薬に含まれる粒子を、第１抗体－抗原－第２抗体複合体に接触させる。結果として、第１抗体－抗原－第２抗体複合体を粒子上に形成することができる。
（ｂ４）第２試薬と第３試薬とを混合した後に、工程（ａ）で形成した複合体を混合する場合：
　第３試薬中の第２抗体と第２試薬中の粒子とを接触させることにより、第２抗体の全量又は一部分は、粒子に結合する。次いで、工程（ａ）で形成した抗原－第１抗体複合体を、第２試薬及び第３試薬の混合物と混合する。これにより、粒子に結合した第２抗体が該複合体と結合して、粒子上に第１抗体－抗原－第２抗体複合体を形成する。又は、粒子に結合していない第２抗体が、抗原－第１抗体複合体と結合して第１抗体－抗原－第２抗体複合体を形成し、この複合体が粒子と結合する。結果として、粒子上に第１抗体－抗原－第２抗体複合体を形成することができる。
　本発明の方法において、上記の第１抗体及び第２抗体は、用いる抗体の種類にもよるが、検体中に含まれ得る抗原に対して過剰量で反応させることが好ましい。すなわち、抗原と反応する際の第１及び第２抗体の濃度は、好ましくは０．０１～１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１～５μｇ／ｍｌであればよい。上記のＨＩＶ検出用試薬は、このような量の抗体を提供し得る濃度で第１及び第２抗体を含有することが好ましい。
　また、上記の固相が磁性粒子である場合、磁性粒子は、好ましくは０．１～２０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１～１０ｍｇ１０／ｍｌの濃度で存在することが好ましい。
　上記の標識物質に基づいてＨＩＶ抗原を検出する方法は、標識物質の種類に応じて適宜選択できる。すなわち、標識物質が放射性同位元素である場合、例えばシンチレーションカウンターなどの従来公知の装置を用いて放射能を検出する方法を用いることができる。また、標識物質が蛍光物質である場合、ルミノメータなどの従来公知の装置を用いて蛍光を検出する方法を用いることができる。好ましくは、上記の標識物質が酵素であり、該酵素を、上記の第４試薬中の酵素に対する基質と反応させて得られる発光又は発色を検出する方法である。発光又は発色の検出は、分光光度計、ルミノメータなどの従来公知の装置を用いて行うことができる。
　なお、前記標識物質が酵素の場合、上述の検出方法は、該酵素の基質と、粒子上に形成された第１抗体－抗原－第２抗体複合体とを混合する工程をさらに備える。前記検出工程は前記酵素と前記基質の反応に基づいてＨＩＶ抗原を検出する。ここで、基質としては、上述の発光基質及び発色基質が挙げられる。基質として発光基質又は発色基質を用いた場合、酵素と基質との反応により生じる、発光又は発色を検出することで、ＨＩＶ抗原を検出することができる。
　ここで、検出とは、測定も含む概念である。標準物質の検出と同様に、標識物質の測定も、標識物質の種類に応じ、従来公知の装置を使用して行うことができる。測定された値を用いて、既知の濃度のＨＩＶ－１　ｐ２４抗原を含む溶液から得られた標準曲線により、検体中のＨＩＶ－１　ｐ２４抗原の量を定量することもできる。
　以下に、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例により限定されるものではない。
　実施例１～７及び比較例１で用いた試薬の作製方法について説明する。
（１）ビオチン標識抗ｐ２４ヒトモノクローナル抗体の作製
　バイオマリック社（BioMARIC、ベルギー）より、認識部位の異なる２種類の抗ｐ２４ヒトモノクローナル抗体を入手した。入手した２種類のうちの１つの抗ｐ２４ヒトモノクローナル抗体を、公知の方法に従って調製されたビオチン－マレイミドと反応させることにより、ビオチン標識抗ｐ２４ヒトモノクローナル抗体を得た。
（２）ビオチン標識抗ｐ２４マウスモノクローナル抗体の作製
　バイオマリック社（BioMARIC、ベルギー）より、抗ｐ２４マウスモノクローナル抗体を入手した。抗ｐ２４マウスモノクローナル抗体を、公知の方法に従って調製されたビオチン－マレイミドと反応させることにより、ビオチン標識抗ｐ２４マウスモノクローナル抗体を得た。
（３）アルカリホスファターゼ（ALP）標識抗ｐ２４ヒトモノクローナル抗体の作製
　バイオマリック社（BioMARIC、ベルギー）より入手した認識部位の異なる２種類の抗ｐ２４ヒトモノクローナル抗体のうち、（１）でビオチン標識した抗体とは別の抗ｐ２４ヒトモノクローナル抗体を、公知の方法に従って調製されたALP－マレイミドと反応させることにより、ALP標識抗ｐ２４ヒトモノクローナル抗体を得た。
（４）アルカリホスファターゼ（ALP）標識抗ｐ２４Ｆａｂ’の作製
　上記（３）でALP標識するために選択した抗体と同じ抗ｐ２４ヒトモノクローナル抗体を、常法に従ってペプシン消化してＦａｂ’を調製した後、（３）と同様にALP－マレイミドと反応させることにより、ALP標識抗ｐ２４Ｆａｂ’を得た。
　下記の３種類の測定手順で、サンドイッチイムノアッセイ法により、HIV-1p24抗原の測定を行った。
　なお、以下の手順において、抗体は抗体緩衝液（０．１Ｍ　ＭＥＳ（２－モルホリノエタンスルホン酸）(pH 6.0)、１％ウシ血清アルブミン、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．１％アジ化ナトリウム）を用いて希釈した。
測定手順１
1)　反応容器に、標識物質で標識された第１抗体として、ALP標識抗ｐ２４モノクローナル抗体又はALP標識抗ｐ２４Ｆａｂ’（０．１Ｕ／ｍＬ）５０μＬと、試料としてのHIV-1p24抗原溶液（濃度０又は３２５ｐｇ／ｍＬ、バイオマリック社製）５０μＬを分注し、４２℃で２分間反応させた。
2)　ストレプトアビジン磁性粒子（平均粒子２μｍ、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.5)中に５ｍｇ／ｍＬ）３０μＬを加え、４２℃で２．５分間反応させた。
3)　磁性粒子に結合可能な第２抗体として、上記のビオチン標識抗ｐ２４ヒトモノクローナル抗体（０．８μｇ／ｍＬ）５０μＬを分注し、４２℃で２．５分間反応させた後、磁気分離した。
4)　洗浄液（０．０１Ｍ　ＭＥＳ(pH 6.5)、０．１％アジ化ナトリウム）１００～７００μＬを加えて撹拌し、磁気分離した。この洗浄操作を計４回行った。
5)　分散液（０．０１Ｍ　ＭＥＳ(pH 6.5)、０．１％アジ化ナトリウム）５０μＬを加えて撹拌し、ストレプトアビジン磁性粒子を分散した。
6)　発光基質液（CDP-Star, Applied Biosystems社）１００μＬを加えて撹拌し、４２℃で５分間反応させ、ルミノメータで発光強度を測定した。
測定手順２
1)　反応容器に、磁性粒子に結合可能な第２抗体としてのビオチン標識抗ｐ２４ヒトモノクローナル抗体（０．８μｇ／ｍＬ）５０μＬと、試料としてのHIV-1p24抗原溶液（濃度：０又は３２５ｐｇ／ｍＬ）５０μＬとを分注し、４２℃で２分間反応させた。
2)　ストレプトアビジン磁性粒子（平均粒子２μｍ、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.5)中に５ｍｇ／ｍＬ）３０μＬを加え、４２℃で２．５分間反応させた。
3)　標識物質で標識された第１抗体として、ALP標識抗ｐ２４モノクローナル抗体又はALP標識抗ｐ２４Ｆａｂ’（０．１Ｕ／ｍＬ）５０μＬを加えて、４２℃で２．５分間反応させた後、磁気分離した。
4)　洗浄液１００～７００μＬを加えて撹拌し、磁気分離した。この洗浄操作を計４回行った。
5)　分散液５０μＬを加えて撹拌し、ストレプトアビジン磁性粒子を分散した。
6)　発光基質液（CDP-Star, Applied Biosystems社）１００μＬを加えて撹拌し、４２℃で５分間反応させ、ルミノメータで発光強度を測定した。
測定手順３
1)　反応容器に、磁性粒子に結合可能な第２抗体としてのビオチン標識抗ｐ２４モノクローナル抗体（０．８μｇ／ｍＬ）５０μＬと、試料としてのHIV-1p24抗原溶液（濃度：０又は３２５ｐｇ／ｍＬ）５０μＬとを分注し、４２℃で２分間反応させた。
2) ストレプトアビジン磁性粒子（平均粒子２μｍ、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)中に５ｍｇ／ｍＬ）３０μＬを加え、４２℃で２．５分間反応させた後、磁気分離した。
3)　洗浄液１００～７００μＬを加えて撹拌し、磁気分離した。この洗浄操作を計４回行った。
4)　 標識物質で標識された第１抗体として、ALP標識抗ｐ２４モノクローナル抗体又はALP標識抗ｐ２４Ｆａｂ’（０．１Ｕ／ｍＬ）を５０μＬ加えて、４２℃で２．５分間反応させた後、磁気分離した。
5)　洗浄液１００～７００μＬを加えて撹拌し、磁気分離した。この洗浄操作を計４回行った。
6)　分散液５０μＬを加えて撹拌し、ストレプトアビジン磁性粒子を分散した。
7)　発光基質液（CDP-Star, Applied Biosystems社）１００μＬを加えて撹拌し、４２℃で５分間反応させ、ルミノメータで発光強度を測定した。
実施例１
　上記の（１）で調製したビオチン標識抗ｐ２４抗原ヒトモノクローナル抗体（０．８μg／ｍL）と、上記の（３）で調製したALP標識抗ｐ２４抗原ヒトモノクローナル抗体とを用いて、測定手順１に従って測定を行った。
比較例１
　実施例１のビオチン標識抗ｐ２４抗原ヒトモノクローナル抗体の代わりに、上記の（２）で調製したビオチン標識抗ｐ２４マウスモノクローナル抗体（０．８、４．０、８．０μｇ／ｍＬ）を用いて測定手順１に従い測定を行った。
　上記の実施例１及び比較例１で得られた結果に基づいて、HIV-1p24抗原を含む試料（抗原溶液）を用いて得られた結果（特異的シグナル）と、HIV-1p24抗原を含まない試料を用いて得られた結果（非特異的シグナル）との比（シグナル／ノイズ比；Ｓ／Ｎ比）を求めた。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　上記の結果から、本発明に従って抗ｐ２４ヒトモノクローナル抗体を用いると、抗体の使用量が同等である場合（０．８μｇ／ｍＬ）、抗ｐ２４マウスモノクローナル抗体よりもHIV-1p24抗原測定におけるＳ／Ｎ比及び特異的シグナルが５倍近く高いことがわかる。また、抗ｐ２４マウスモノクローナル抗体が最も高い特異シグナルを示す４．０μｇ／ｍＬでさえ、特異シグナルは１／２以下であったことから、抗ｐ２４ヒトモノクローナル抗体を用いると、高い感度でHIV-1p24抗原を検出できることがわかる。
実施例２
　実施例１と同様の抗体、すなわち上記の（１）で調製したビオチン標識ｐ２４ヒトモノクローナル抗体と、上記の（３）で調製したALP標識抗ｐ２４ヒトモノクローナル抗体（以下、「ＩｇＧ－ＡＬＰ」という）とを用いて、測定手順１で測定を実施した。
実施例３
　実施例２と同じ抗体を用いて、測定手順２で測定を実施した。
実施例４
　実施例２と同じ抗体を用いて、測定手順３で測定を実施した。
実施例５
　実施例２のALP標識抗ｐ２４ヒトモノクローナル抗体の代わりに、上記の（４）で調製したALP標識抗ｐ２４Ｆａｂ’（Ｆａｂ’－ＡＬＰ）を用いて測定手順１で測定を実施した。
実施例６
　実施例５と同じ抗体を用い、測定手順２で測定を実施した。
実施例７
　実施例５と同じ抗体を用い、測定手順３で測定を実施した。
　上記の実施例２～７で得られた結果に基づいて、HIV-1p24抗原を含む試料（抗原溶液）を用いて得られた結果（特異的シグナル）と、HIV-1p24抗原が存在しない試料を用いて得られた結果（非特異的シグナル）との比（シグナル／ノイズ比；Ｓ／Ｎ比）を求めた。結果を表２及び３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　上記の結果から、本発明に従って抗ｐ２４ヒトモノクローナル抗体を用いると、測定手順１～３のいずれの反応順序であっても、また、抗体がＩｇＧ－ＡＬＰ又はＦａｂ’－ＡＬＰのいずれであっても、特異シグナルが確認できることがわかる。これらの中でも測定手順１を用いた場合にＳ／Ｎ比がより高く、また、Ｆａｂ’－ＡＬＰよりもＩｇＧ－ＡＬＰを用いた方がより高い感度で抗原の検出を行うことができることもわかる。
実施例８及び比較例２
　第１抗体としての、上記の（４）で調製したALP標識抗ｐ２４抗原ヒトモノクローナル抗体と、第２抗体としての、上記の（１）で調製したビオチン標識抗ｐ２４抗原ヒトモノクローナル抗体（０．８μg／ｍL）と、試料としての、市販のＨＩＶセロコンバージョンパネル検体であるＨＩＶ－１　Ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ　Ｐａｎｅｌ　ＢＢ（ＰＲＢ９５２）（ＢＢＩ社）とを用いて、測定手順１に従ってＨＩＶ－１ ｐ２４抗原の検出を行った。
　実施例８の手順に基づいて、ＨＩＶ抗原の検出を行った結果を表４に示す。また、比較例２として、市販のＨＩＶ－１ｐ２４抗原検出用の試薬であるルミパルスＩ ＨＩＶ－１ｐ２４（登録商標、富士レビオ社製）を用いて、上記のＨＩＶセロコンバージョンパネル検体を測定した、ルミパルスＩ ＨＩＶ－１ｐ２４の添付文書に記載の結果を示す。ここで、ルミパルスＩ ＨＩＶ－１ｐ２４は、ＨＩＶ－１ ｐ２４抗原を検出するための抗体として抗ｐ２４抗原マウスモノクローナル抗体を用いている。また、ルミパルスＩ ＨＩＶ－１ｐ２４では、試料の前処理として、界面活性剤であるポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルを含む検体処理液を試料に加え攪拌する操作を行っている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４から明らかなように、ルミパルスＩ ＨＩＶ－１ｐ２４では、初回採血から１０日目でＨＩＶ－１ ｐ２４抗原が検出されている。それに対し、本発明の抗ｐ２４ヒトモノクローナル抗体を用いたＨＩＶ抗原の検出では、初回採血から７日目でＨＩＶ－１ ｐ２４抗原を検出することができる。即ち、本発明の本発明の抗ｐ２４ヒトモノクローナル抗体を用いたＨＩＶ抗原の検出は、ルミパルスＩ ＨＩＶ－１ｐ２４よりも、３日も早くＨＩＶ－１ ｐ２４抗原を検出することができる。また、本発明のＨＩＶ抗原の検出においては、ルミパルスＩ ＨＩＶ－１ｐ２４のように、試料の前処理を行わなくても、高感度にＨＩＶ－１ ｐ２４抗原を検出できることも明らかとなった。
　本出願は、２００７年１２月２８日に出願された日本国特許出願特願２００７－３４０３７０号に関し、この特許請求の範囲、明細書、図面及び要約書の全ては本明細書中に参照として組み込まれる。

Claims (13)

  1. 　ＨＩＶ－１　ｐ２４抗原を認識する第１のヒトモノクローナル抗体を標識物質で標識した第１抗体と、
    　固相と、
    　前記固相に結合可能な物質をＨＩＶ－１　ｐ２４抗原を認識する第２のヒトモノクローナル抗体に結合させた第２抗体と、
    を含有するＨＩＶ抗原検出用試薬。
  2. 　前記第１抗体を含む第１試薬と、前記固相としての粒子を含む第２試薬と、前記第２抗体を含む第３試薬とを備えた請求項１に記載のＨＩＶ抗原検出用試薬。
  3. 　前記標識物質が酵素であり、この酵素の基質を含む第４試薬をさらに備えた請求項２に記載のＨＩＶ抗原検出用試薬。
  4. 　前記固相がアビジンまたはストレプトアビジンを保持し、前記固相に結合可能な物質がビオチンである、請求項１に記載のＨＩＶ抗原検出用試薬。
  5. 　前記固相が、磁性粒子である、請求項１に記載のＨＩＶ抗原検出用試薬。
  6. 　検体に含まれるＨＩＶ－１　ｐ２４抗原と、ＨＩＶ－１　ｐ２４抗原を認識する第１のヒトモノクローナル抗体を標識物質で標識した第１抗体と、固相に結合可能な物質をＨＩＶ－１　ｐ２４抗原を認識する第２のヒトモノクローナル抗体に結合させた第２抗体との複合体を固相上に形成し、この複合体に含まれる前記標識物質に基づいてＨＩＶ抗原を検出するＨＩＶ抗原検出方法。
  7. 　前記抗原と、前記第１抗体とを混合する工程、
    　前記混合工程で得られた混合物と、前記固相としての粒子と、前記第２抗体とを混合し、前記粒子上に前記複合体を形成する工程、および
    　前記粒子上に形成された前記複合体に含まれる、前記標識物質に基づいてＨＩＶ抗原を検出する工程からなる請求項６に記載のＨＩＶ抗原検出方法。
  8. 　前記抗原と、前記第１抗体とを混合する第１混合工程、
    　第１混合工程で得られた混合物と、前記固相としての粒子とを混合する第２混合工程、
    　第２混合工程で得られた混合物と、前記第２抗体とを混合し、前記粒子上に前記複合体を形成する工程、および
    　前記粒子上に形成された前記複合体に含まれる、前記標識物質に基づいてＨＩＶ抗原を検出する工程からなる請求項６に記載のＨＩＶ抗原検出方法。
  9. 　前記抗原と、前記第１抗体とを混合する第１混合工程、
    　第１混合工程で得られた混合物と、前記第２抗体とを混合する第２混合工程、
    　第２混合工程で得られた混合物と、前記固相としての粒子とを混合し、前記粒子上に前記複合体を形成する工程、および
    　前記粒子上に形成された前記複合体に含まれる、前記標識物質に基づいてＨＩＶ抗原を検出する工程からなる請求項６に記載のＨＩＶ抗原検出方法。
  10. 　前記抗原と、前記第１抗体とを混合する第１混合工程、
    　前記固相としての粒子と、前記第２抗体とを混合する第２混合工程、
    　第１混合工程で得られた混合物と、第２混合工程で得られた混合物とを混合し、前記粒子上に前記複合体を形成する工程、および
    　前記粒子上に形成された前記複合体に含まれる、前記標識物質に基づいてＨＩＶ抗原を検出する工程からなる請求項６に記載のＨＩＶ抗原検出方法。
  11. 　前記標識物質が酵素であり、この酵素の基質と、前記粒子上に形成された前記複合体とを混合する工程を備え、前記検出工程は前記酵素と前記基質の反応に基づいてＨＩＶ抗原を検出する請求項７に記載のＨＩＶ抗原検出方法。
  12. 　前記基質が、発光基質または発色基質であり、前記検出工程は前記酵素と前記基質の反応によって生じる発光または発色を検出することによりＨＩＶ抗原を検出する請求項１１に記載のＨＩＶ抗原検出方法。
  13. 　前記固相が、磁性粒子である、請求項６に記載のＨＩＶ抗原検出方法。
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