CN115824980A

CN115824980A - 一种检测尿液中IgG蛋白的微环谐振器及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN115824980A
Application number: CN202211494975.5A
Authority: CN
Inventors: 李秋顺; 姜涛; 辛思远; 单莹莹; 夏曙; 吴乐中
Original assignee: Shandong Qianqianruo Medical Technology Co ltd
Current assignee: Shandong Qianqianruo Medical Technology Co ltd
Priority date: 2022-11-26
Filing date: 2022-11-26
Publication date: 2023-03-21

Abstract

本发明属于分析传感技术领域，主要涉及一种检测尿液中IgG蛋白的微环谐振器的制备方法。所述微环谐振器是采用纳米生物功能膜与微环谐振器相结合的方法制备。首先选用抗免疫球蛋白G抗体、聚酰胺胺、丁二酸酐、1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐、(3‑氨基丙基)三乙氧基硅烷、N‑羟基琥珀酰亚胺等试剂，通过共价偶联的方式，在微环谐振器的谐振腔表面制备对IgG具有特异识别性能的纳米生物功能膜，再与光纤阵列进行封装制得对IgG具有特异性识别功能的微环谐振器。本发明的微环谐振器能无需标记、无放射性危害地直接检测IgG蛋白，有望在临床医学检验、医疗和生化分析领域发挥重要作用。

Description

一种检测尿液中IgG蛋白的微环谐振器及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于分析传感技术领域，涉及一种检测尿液中IgG蛋白的微环谐振器的制备方法。

背景技术

IgG也叫免疫球蛋白G，它是由浆细胞合成分泌的一类具有抗体活性的球蛋白，是抗细菌、抗毒素和抗病毒抗体的主要组成部分，是人体免疫反应的最重要的物质基础，具有抵抗病毒侵入体内的能力。而且IgG也是唯一能通过胎盘屏障的免疫球蛋白，在机体免疫防护中起着主要的作用。此外，IgG还具有调理吞噬、ADCC和结合SPA等作用。IgG升高与结缔组织病、IgG型多发性骨髓瘤、原发性单克隆丙种球蛋白血症、肝脏病、传染病、类肉瘤病等多种疾病有关，IgG降低与非IgG型多巴性骨髓瘤、重链病、轻链病、肾病综合征、恶性淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、原发性无丙种球蛋白血症、继发性免疫缺陷病等疾病有关。因此，IgG的检测能为许多疾病的诊断对相关疾病的及时治疗提供依据。尿液中IgG的检测具有无需穿刺取用血样、无痛检测、取样方便的优点，具有重要意义。

目前测定IgG的方法主要有放射免疫法、酶联免疫法、单向免疫扩散法、免疫透射比浊法、速率散射免疫比浊法、时间分辨荧光免疫分析法等，但这些方法均存在一些不足。

放射免疫法通常需要加入标记的同位素示踪物，由于同位素示踪物具有放射性，会引起辐射损伤；且该方法有时会出现交叉反应、假阳性反应。与放射免疫技术相比，虽然ELISA酶联免疫吸附法操作简便，对环境没有污染，避免了对环境和人体的危害，但实验所用的抗体一般要用酶标记，费用相对提高，且酶的纯度和反应过程容易受环境因素的影响，结果稳定性不好，及该测定方法的灵敏度不够、重复性差,易造成漏检和假阳性。

此外，虽然免疫透射比浊法操作简便，但灵敏度和精密度均不够理想，所需的抗血清量大，检测的周期较长。而散射比浊法的缺点是试剂成本较高。虽然单向免疫扩散试验操作简便,不需特殊设备，但耗时长,灵敏度较低。因此，有必要对现有检测尿液中IgG蛋白的方法和设备加以改进。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的就是针对上述检测IgG方式的不足而提供一种检测尿液中IgG蛋白的微环谐振器。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种检测尿液中IgG蛋白的微环谐振器，所述微环谐振器是通过共价键的方式将纳米生物功能膜修饰在微环谐振器的谐振腔表面；其中，

所述的纳米生物功能膜是对IgG蛋白具有特异识别性能的纳米生物功能膜。

本发明还请求上述检测尿液中IgG蛋白的微环谐振器的制备方法，具体包括如下步骤：

1)将谐振腔芯片浸入浓硫酸与双氧水中，随后冲洗、氮气吹干，再放入由3-氨基丙基三乙氧基硅烷和95％乙醇组成的混合液(体积比为1:50)中反应，经冲洗、氮气吹干后干燥，备用；

2)将经步骤1)处理后干燥的谐振腔芯片浸入10％戊二醛水溶液中，冲洗、氮气吹干，并放入聚酰胺胺溶液中搅拌，经冲洗、氮气吹干后置于丁二酸酐、三乙胺和四氢呋喃的混合液中反应，依次用四氢呋喃、乙醇、水对反应后的谐振腔芯片冲洗，并用氮气吹干，备用；

3)将经步骤2)处理的谐振腔芯片放入含有200mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和50mM的N-羟基琥珀酰亚胺的磷酸盐缓冲液中反应，经冲洗、氮气吹干后备用；

4)在经步骤3)处理得谐振腔芯片的谐振腔表面滴加抗免疫球蛋白G抗体的磷酸盐缓冲液，在4℃下孵育，偶联抗免疫球蛋白G抗体，经冲洗后加入1mg/ml的BSA溶液，室温反应，随后将所述谐振腔芯片放入微环谐振器传感系统，与光纤阵列进行封装，即得所述检测尿液中IgG蛋白的微环谐振器。

需要说明的是，所述微环谐振器的制备及检测机理如下：

首先通过亚胺键共价反应的方式在谐振腔表面制备纳米薄膜，再通过酰胺键共价反应的方式在纳米薄膜表面修饰免疫球蛋白G抗体，制得纳米生物功能膜，继而通过纳米生物功能膜表面的免疫球蛋白G抗体与IgG蛋白之间的特异性反应所引起的微环谐振器的光谱变化，来检测尿液中的IgG蛋白。

可选的，步骤1)中，所述浓硫酸与双氧水的体积比为7:3，浸入温度为60～90℃，浸泡时间为1h～3h；在由3-氨基丙基三乙氧基硅烷和95％乙醇组成的混合液中的反应时间为0.5h～4h；且干燥温度为100～130℃，干燥时间为0.5h～2h。

可选地，步骤2)中，所述浸入10％戊二醛水溶液中的时间为30min～2h，聚酰胺胺溶液中聚酰胺胺的含量为0.001mg/L～100g/L、在聚酰胺胺溶液中的搅拌时间为1h～12h；

且，丁二酸酐-三乙胺-四氢呋喃混合液中丁二酸酐的含量为0.005g～0.5g，三乙胺的含量为10μL～2mL，四氢呋喃的含量为200μL～10mL，在丁二酸酐-三乙胺-四氢呋喃混合液中的反应温度为60～130℃，反应时间为0.5～36h。

可选地，所述步骤3)中的反应时间为30min～4h，所述步骤4)中的室温反应时间为0.5h～4h。

此外，本发明还请求保护上述微环谐振器在医疗、生化分析领域中的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明提供的一种检测尿液中IgG蛋白的微环谐振器及其制备方法与应用，具有如下优异效果：

1)本发明所述的检测尿液中IgG蛋白的微环谐振器具有无需酶的标记、可以直接测量、操作简便、更快速、更灵敏的优点；且无需使用同位素标记、避免了对人体的辐射危害。

2)采用本发明所述方法制备的微环谐振器，用于检测尿液中IgG蛋白时，可以实时检测IgG蛋白的浓度变化，简化了操作步骤，有望在临床医学检验、医疗、生化分析等领域发挥巨大的作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为实施例1制备的微环谐振器在不同浓度的IgG蛋白中的响应变化曲线图。

图2为IgG蛋白浓度与实施例1制备的微环谐振器的谐振波长之间的关系图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例及说明书附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例公开了一种检测尿液中IgG蛋白的微环谐振器的制备方法。

为更好地理解本发明，下面通过以下实施例对本发明作进一步具体的阐述，但不可理解为对本发明的限定，对于本领域的技术人员根据上述发明内容所作的一些非本质的改进与调整，也视为落在本发明的保护范围内。

下面，将结合具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的说明。

实施例1

(1)将谐振腔芯片浸入体积比为7:3的浓硫酸与双氧水中在80℃下处理1小时；

(2)取出谐振腔芯片，用去离子水超声清洗15min，再用去离子水冲洗，氮气吹干；

(3)将谐振腔芯片放入0.04mL的3-氨基丙基三乙氧基硅烷和2mL的95％的乙醇溶液组成混合液(体积比为1:50)中反应3h；

(4)取出谐振腔芯片，用去离子水冲洗，氮气吹干；

(5)将谐振腔芯片在130℃条件下干燥0.5小时；

(6)将谐振腔芯片置于10％戊二醛水溶液中1小时；

(7)取出谐振腔芯片，用去离子水冲洗，氮气吹干；

(8)将谐振腔芯片放入5g/L聚酰胺胺溶液中搅拌5h；

(9)用去离子水充分冲洗谐振腔芯片，并用氮气吹干；

(10)将谐振腔芯片置于0.025g丁二酸酐、250ul三乙胺、4.75ml四氢呋喃的混合液中在100℃下反应6h；

(11)依次用四氢呋喃、乙醇、水对谐振腔芯片冲洗，并用氮气吹干；

(12)将谐振腔芯片放入含有200mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和50mM的N-羟基琥珀酰亚胺的磷酸盐缓冲液中反应30分钟；

(13)用二次去离子水对谐振腔芯片充分冲洗，并用氮气吹干；

(14)在芯片的谐振腔表面滴加3mg/mL抗免疫球蛋白G抗体的磷酸盐缓冲液，在4℃下孵育12h；

(15)用磷酸盐缓冲液对谐振腔芯片充分冲洗；

(16)加入1mg/mL的BSA溶液，室温反应1小时；

(17)用磷酸盐缓冲液对谐振腔芯片充分冲洗；

(18)将谐振腔芯片放入微环谐振器传感系统，与光纤阵列进行封装，制得可以检测尿液中IgG蛋白的微环谐振器。

测试时，依次通过微流控进样器将不同浓度的IgG蛋白浓度充入微环谐振器，并且在每一浓度的IgG蛋白与微环谐振器表面的抗免疫球蛋白G抗体反应之后用磷酸盐缓冲液冲洗，再加入下一浓度的IgG蛋白进行测试，相应的微环谐振器的响应信号和数据通过光谱仪显示和计算机读取。

图1显示了制备的微环谐振器在0.15625μg/mL与10μg/mLIgG蛋白浓度范围内的响应变化；图2是IgG蛋白浓度与微环谐振器的谐振波长之间的关系。从图1和图2可以看出，随着IgG蛋白浓度的增加，谐振波长移动的程度逐渐增加。而且在0.15625μg/mL～1.25μg/mL浓度范围内，谐振波长增加幅度较大。在1.25μg/mL～10μg/mL浓度范围内，谐振波长移动的幅度较小，表明在10μg/mL时微环谐振器结合IgG蛋白的量逐渐接近饱和。这些结果表明实施例1制作的微环谐振器性能良好，对IgG蛋白有良好的识别能力，其对IgG蛋白的检测范围为0.15625μg/mL～10μg/mL。

实施例2

(1)将谐振腔芯片浸入体积比为7:3的浓硫酸与双氧水中在70℃下处理2小时；

(3)将谐振腔芯片放入0.2mL的3-氨基丙基三乙氧基硅烷和10mL的95％的乙醇溶液组成混合液(体积比为1:50)中反应1h；

(4)取出谐振腔芯片，用去离子水冲洗，氮气吹干；

(5)将谐振腔芯片在120℃条件下干燥1小时；

(6)将谐振腔芯片置于10％戊二醛水溶液中2小时；

(7)取出谐振腔芯片，用去离子水冲洗，氮气吹干；

(8)将谐振腔芯片放入1g/L聚酰胺胺溶液中搅拌6h；

(9)用去离子水充分冲洗谐振腔芯片，并用氮气吹干；

(10)将谐振腔芯片置于0.05g丁二酸酐、600ul三乙胺、9.6ml四氢呋喃的混合液中在90℃下反应10h；

(12)将谐振腔芯片放入含有200mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和50mM的N-羟基琥珀酰亚胺的磷酸盐缓冲液中反应1小时；

(13)用二次去离子水对谐振腔芯片充分冲洗，并用氮气吹干；

(14)在芯片的谐振腔表面滴加1mg/mL抗免疫球蛋白G抗体的磷酸盐缓冲液，在4℃下孵育18h；

(15)用磷酸盐缓冲液对谐振腔芯片充分冲洗；

(16)加入1mg/mL的BSA溶液，室温反应2小时；

(17)用磷酸盐缓冲液对谐振腔芯片充分冲洗；

此外，为了进一步验证所述制备方法相较现有技术存在的优异性，发明人还进行了下述工艺参数优选实验，具体实验内容如下：

实验一：

经实验，经体积比为7∶3的H₂SO₄-H₂O₂混合液清洗后，谐振腔芯片的接触角变为5°；在3-氨基丙基三乙氧基硅烷与乙醇的混合液中浸泡10分钟干燥后接触角变为20°，浸泡20分钟取出干燥后接触角变为35°，浸泡30分钟取出干燥后接触角变为45°，浸泡1小时取出干燥后接触角变为50°，浸泡2小时、3小时、4小时取出干燥后接触角均为50°。因此，为了使3-氨基丙基三乙氧基硅烷在谐振腔芯片表面充分反应，3-氨基丙基三乙氧基硅烷与乙醇的混合液中的浸泡时间为0.5-4小时。

实验二：

经实验，浸入10％戊二醛水溶液中分别反应10分钟、20分钟、30分钟、1小时、1.5小时、2小时后，将芯片冲洗，通过在芯片表面与氢氧化铜的反应，发现10分钟的有非常少的砖红色沉淀，20分钟的砖红色沉淀增加，30min后砖红色沉淀继续增加，1小时、1.5小时、2小时的砖红色沉淀的量与30min的量基本一样。因此，谐振腔芯片在10％戊二醛水溶液中的反应时间为30min～2h。

实验三：

经实验，浓度为0.0005mg/L的聚酰胺胺溶液与谐振腔芯片反应，并经过后续的几步反应后，用于检测IgG蛋白，谐振腔的光谱不变化；而当使用浓度为0.001mg/L的聚酰胺胺溶液及后续的几步反应后，用于检测IgG蛋白时，谐振腔的光谱有微小的变化；当使用浓度为50mg/L的聚酰胺胺溶液及后续的几步反应后，用于检测IgG蛋白时，检测范围为0.325-2.5ug/ml；当使用浓度为10g/L的聚酰胺胺溶液及后续的几步反应后，用于检测IgG蛋白时，检测范围为0.325-10ug/mL；当分别使用浓度为80g/L、100g/L的聚酰胺胺溶液及后续的几步反应后，用于检测IgG蛋白时，检测范围均为0.039-250ug/mL。因此，所配制的聚酰胺胺溶液中聚酰胺胺的含量为0.001mg/L～100g/L。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种检测尿液中IgG蛋白的微环谐振器，其特征在于，所述微环谐振器是通过共价键的方式将纳米生物功能膜修饰在微环谐振器的谐振腔表面；其中，

2.一种如权利要求1所述检测尿液中IgG蛋白的微环谐振器的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

1)将谐振腔芯片浸入浓硫酸与双氧水中，随后冲洗、氮气吹干，再放入由3-氨基丙基三乙氧基硅烷和95％乙醇按照体积比1:50组成的混合液中反应，经冲洗、氮气吹干后干燥，备用；

2)将经步骤1)处理后干燥的谐振腔芯片浸入10％戊二醛水溶液中，冲洗、氮气吹干，并放入聚酰胺胺溶液中搅拌，经冲洗、氮气吹干后置于丁二酸酐-三乙胺-四氢呋喃的混合液中反应，依次用四氢呋喃、乙醇、水对反应后的谐振腔芯片冲洗，并用氮气吹干，备用；

3.根据权利要求2所述的一种检测尿液中IgG蛋白的微环谐振器的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述浓硫酸与双氧水的体积比为7:3，浸入温度为60～90℃，浸泡时间为1h～3h；在混合液中的反应时间为0.5h～4h；且干燥温度为100～130℃，干燥时间为0.5h～2h。

4.根据权利要求2所述的一种检测尿液中IgG蛋白的微环谐振器的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述浸入10％戊二醛水溶液中的时间为30min～2h，聚酰胺胺溶液中聚酰胺胺的含量为0.001mg/L～100g/L、在聚酰胺胺溶液中的搅拌时间为1h～12h；

5.根据权利要求2所述的一种检测尿液中IgG蛋白的微环谐振器的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中的反应时间为30min～4h，所述步骤4)中的室温反应时间为0.5h～4h。

6.一种如权利要求1所述检测尿液中IgG蛋白的微环谐振器或如权利要求2所述方法制备的检测尿液中IgG蛋白的微环谐振器在医疗、生化分析领域中的应用。