WO2018093069A1

WO2018093069A1 - 세포 3d 배양 방법

Info

Publication number: WO2018093069A1
Application number: PCT/KR2017/012196
Authority: WO
Inventors: 이재영; 장종욱; 박중건; 최고은
Original assignee: 광주과학기술원; 사회복지법인 삼성생명공익재단
Priority date: 2016-11-15
Filing date: 2017-10-31
Publication date: 2018-05-24

Abstract

본 발명은 알긴산을 포함하는 마이크로캡슐, 상기 마이크로캡슐의 제조방법상기 마이크로캡슐을 이용한 줄기세포의 삼차원 배양 방법 및, 상기 마이크로캡슐의 줄기세포 배양 용도에 관한 것으로, 줄기세포를 삼차원으로 배양할 수 있는 마이크로 크기의 캡슐구조를 알긴산 또는 세포외기질 유래의 펩타이드로 변형된 알긴산으로 형성하여, 일반적으로 사용되는 배양접시를 이용하는 이차원 배양에서보다 공간적, 시간적 효율성 증대, 세포 활성, 대량생산이 가능한 효율적 배양을 할 수 있다.

Description

세포 3D 배양 방법

본 발명은 알긴산을 포함하는 마이크로캡슐, 상기 마이크로캡슐의 제조방법, 상기 마이크로캡슐을 이용한 세포의 삼차원 배양 방법 및, 상기 마이크로캡슐의 세포 배양 용도에 관한 것이다.

줄기세포는 자기재생능력(self-renewal)과 분화능을 지니며, 다양한 생리활성물질(bioactive factors)를 분비하여 조직공학과 재생의학에 널리 사용되고 있다. 배아줄기세포(embryonic stem cells), 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells), 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells) 등의 다양한 줄기세포를 이용한 활발한 응용 연구가 진행되고 있다.

특히, 중간엽줄기세포는 골수, 지방 조직, 탯줄, 제대혈 등에서 분리되며, 지방세포, 골세포 또는 연골세포 등으로 분화할 수 있으며, 면역원성(immunogenicity)이 낮고 면역중재(immunomodulatory) 역할을 할 수 있다. 또한, 표면항원 중 CD73, CD90, CD105를 발현하고 CD34, CD45, CD14, CD11b, CD19, CD79a는 발현하지 않는다는 특징을 가지고 있다.

이와 같이 다양한 줄기세포가 임상연구 및 상용화되기 위해서는 줄기세포의 증식이 필수적이며, 적절한 분화능 및 활성을 유지하면서 줄기세포의 배양을 통하여 증식되어야 한다. 그러나 증식의 조건이 부적절한 경우에는 줄기세포의 느린 생장속도, 자발적 분화시작, 분화능 감소 등의 문제가 있다.

일반적으로 사용되고 있는 줄기세포 배양법은 줄기세포를 플라스틱 배양접시나 플라스크에 배양배지를 넣고 배양하는 것으로, 주로 25, 75, 150, 225 cm²의 표면적을 가진 배양접시가 사용된다. 경도가 높은 플리스틱 상에 2차원 배양으로 이루어지며, 세포의 증식 후에는 일반적으로 트립신과 같은 효소로 줄기세포를 탈착 (detachmenet)하여 회수를 하여, 계대 또는 이용을 한다.

세포치료법이나 약물전달을 비롯한 임상응용을 위해서는 대량의 세포가 필요한데, 일반적인 배양방법으로 세포를 배양할 경우 많은 양의 배양접시나 플라스크를 사용하여야 한다.

그러나, 대량의 플라스크를 사용하게 될 경우에는 많은 노동을 기할 뿐 아니라(labor intensive) 플라스크 마다 가변성을 갖게 되며, 외부인자로 인한 오염 (contamination)의 가능성이 증가하게 되어 효율성이 매우 낮아서, 일반적인 배양방법은 대량생산에 적절한 정도로 세포를 증식하기에는 상대적으로 적합하지 않을 수 있다는 평가를 받고 있다.

또한, 배양접시나 플라스크에서의 배양은 2차원인 경도의 환경에서 줄기세포를 배양하여, 실제 생체 내에서 줄기세포가 증식하는 3차원의 연성의 환경과 차이가 있어 줄기세포의 변성을 유도할 위험성이 있다.

이에 따라, 줄기세포를 효율적, 안정적으로 배양하는 방법에 관한 기술의 개발은 시급하며, 산업적, 임상적으로도 줄기세포의 증식은 매우 중요한 파급효과를 가진다.

본 발명자들은 세포를 안정적이고 고효율로 배양하면서도 스케일-업(scale-up) 할 수 있는 배양 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다.

그 결과 알긴산을 포함하는 마이크로캡슐을 이용하여 세포를 배양하는 경우, 종래 알려진 배양방법들에 비해 고밀도 배양, 역가 유지, 배양 안정성, 스케일-업의 효율성 면에서 우수한 효과가 발휘됨을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

이에, 본 발명의 목적은 알긴산을 포함하는 마이크로캡슐을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 알긴산을 포함하는 마이크로캡슐 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 알긴산 마이크로캡슐을 이용한 세포의 삼차원 배양방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 알긴산 마이크로캡슐의 세포의 배양 용도에 관한 것이다.

본 발명은 기존의 세포의 배양법이 가지는 2차원 배양에 따른, 비효율성, 느린 증식속도, 산화스트레스와 같은 외부 유해환경에 의한 세포 활성 감소 위험 등의 문제점들을 해결하고자, 세포외기질 유래의 펩타이드로 변환된 천연고분자를 이용한 생체모방형의 삼차원 마이크로캡슐에 세포를 담지하여 고밀도, 고효율로 줄기세포를 배양하고 이를 손쉽게 회수하는 방법을 개발였다.

이에, 본 발명이 달성하고자 하는 바는 알긴산 삼차원 마이크로캡슐 내부에서 세포를 고밀도로 담지하여 배양함으로써, 이때 담지 된 세포의 생장을 향상시키고 세포의 역가를 유지 및 용이하게 마이크로캡슐에서 분리 회수시킬 수 있도록 하여, 세포의 대량생산이 가능한 방법을 통해 생산 공정의 효율성을 증대시키는 것이다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 양태는 알긴산을 포함하는 세포 배양용 마이크로캡슐에 관한 것이다.

상기 알긴산은 세포외기질 유래 펩타이드로 치환되어 있는 것일 수 있다.

상기 세포외기질 유래 펩타이드는 RGD 모티프, DGEA 모티프, REDV 모티프, IKVAV 모티프, VPGVG 모티프, YIGSR 모티프, KHIFSDDSSE 모티프 일 수 있으며, 예를 RGD 모티프인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 마이크로캡슐의 평균 직경은 30 um 이상, 40 um 이상, 50 um 또는 60 um 이상인 것일 수 있다. 또한, 상기 마이크로캡슐의 평균 직경은 1000 um 이하, 900 um 이하, 850 um 이하, 800 um 이하, 750 um 이하, 700 um 이하, 650 um 이하, 600 um 이하, 550 um 이하 또는 500 um 이하인 것일 수 있다.

예를 들어, 상기 마이크로캡슐의 평균 직경은 30 내지 1000 um, 30 내지 900 um, 30 내지 850 um, 30 내지 800 um, 30 내지 7500 um, 30 내지 700 um, 30 내지 650 um, 30 내지 600 um, 30 내지 550 um, 30 내지 500 um, 40 내지 1000 um, 40 내지 900 um, 40 내지 850 um, 40 내지 800 um, 40 내지 7500 um, 40 내지 700 um, 40 내지 650 um, 40 내지 600 um, 40 내지 550 um, 40 내지 500 um, 50 내지 1000 um, 50 내지 900 um, 50 내지 850 um, 50 내지 800 um, 50 내지 7500 um, 50 내지 700 um, 50 내지 650 um, 50 내지 600 um, 50 내지 550 um, 50 내지 500 um , 60 내지 1000 um, 60 내지 900 um, 60 내지 850 um, 60 내지 800 um, 60 내지 7500 um, 60 내지 700 um, 60 내지 650 um, 60 내지 600 um, 60 내지 550 um, 60 내지 500 um 인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 세포는 줄기세포인 것일 수 있다. 상기 줄기세포는 중간엽줄기세포(Mesenchymal Stem Cell), 혈액줄기세포, 신경줄기세포, 근육줄기세포, 심근줄기세포, 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으며, 예를 들어, 중간엽줄기세포인 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태는 알긴산을 포함하는 마이크로캡슐 제조방법에 관한 것이다.

알긴산 용액을 제조하는 알긴산 용액 제조 단계;

세포 분산용액과 알긴산 용액을 혼합하는 혼합 단계;

마이크로캡슐을 형성하는 형성 단계.

상기 알긴산 용액 제조 단계는 생리식염수 또는 배지에 알긴산염 또는 세포외기질 유래의 펩타이드로 치환된 알긴산염을 첨가하여 알긴산 용액을 제조하는 것일 수 있다.

상기 알긴산 용액은 알긴산염을 0.1 내지 10 중량 %, 0.1 내지 8 중량 %, 0.1 내지 6 중량 %, 0.1 내지 4 중량 %, 0.1 내지 2 중량 %, 0.5 내지 10 중량 %, 0.5 내지 8 중량 %, 0.5 내지 6 중량 %, 0.5 내지 4 중량 %, 0.5 내지 2 중량 %, 1 내지 10 중량 %, 1 내지 8 중량 %, 1 내지 6 중량 %, 1 내지 4 중량 % 또는 1 내지 2 중량 %, 예를 들어, 1.25 중량% 포함하는 것일 수 있다. 알긴산의 농도에 따라서 같은 가교용액에서 재료의 강도를 조절할 수 있으며, 상기 범위를 벗어나 너무 높은 농도의 용액의 경우 점성이 높아 바늘이 막힐 수 있으며, 너무 낮은 농도의 경우 가도가 낮아지는 문제점이 있으나, 상기의 알긴산 용액 농도에서 안정적인 마이크로 크기의 캡슐이 제조된다.

상기 마이크로캡슐 제조방법은 알긴산 용액 제조 단계 이 후에 알긴산 용액을 필터링하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

상기 필터링은 0.2 um의 주사기 필터로 필터링하는 것일 수 있으나, 이에 한되는 것은 아니다.

상기 혼합 단계는 세포 분산용액 및 알긴산 용액을 1:0 내지 1:0의 부피, 예를 들어, 1:4의 부피로 혼합하는 것일 수 있으며, 혼합 비율에 따라 최종 세포 농도와 알긴산의 농도를 조절할 수 있다.

상기 혼합 단계에서 세포 분산액과 알긴산 용액을 혼합한 혼합 용액에 포함된 세포의 농도는 10³ 내지 10⁹ cell/mL, 10⁴ 내지 10⁹ cell/mL, 10⁵ 내지 10⁹ cell/mL, 10³ 내지 10⁸ cell/mL, 10⁴ 내지 10⁸ cell/mL, 10⁵ 내지 10⁸ cell/mL, 10³ 내지 10⁷ cell/mL, 10⁴ 내지 10⁷ cell/mL 또는 10⁵ 내지 10⁷ cell/mL인 것일 수 있으며, 예를 들어, 1.0 X 10⁶ cell/mL인 것일 수 있다. 상기 범위보다 낮은 세포 농도에서는 캡슐화 후 세포의 생리활성이 낮고 생장이 매우 늦어지며, 상기범위보다 높은 경우에는 세포를 농축하기 어려우며 캡슐화 된 세포에게 영양분을 공급하기 어렵다.

상기 세포 분산용액은 배양된 세포로부터 회수 및/또는 농축된 세포를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 형성 단계는 혼합 용액에 전압을 걸어주는 단계; 및 가교유도 용액을 첨가하는 단계;를 포함하는 것일 수 있다.

상기 전압은 1 내지 16 kV, 1 내지 14 kV, 1 내지 12 kV, 1 내지 10 kV, 2 내지 16 kV, 2 내지 14 kV, 2 내지 12 kV, 2 내지 10 kV, 4 내지 16 kV, 4 내지 14 kV, 4 내지 12 kV, 4 내지 10 kV, 6 내지 16 kV, 6 내지 14 kV, 6 내지 12 kV, 6 내지 10 kV, 8 내지 16 kV, 8 내지 14 kV, 8 내지 12 kV 또는 8 내지 10 kV, 예를 들어, 10 kV인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 가교유도 용액의 첨가는 1 내지 10 mL/h, 1 내지 9 mL/h, 1 내지 8 mL/h, 1 내지 7 mL/h, 1 내지 6 mL/h, 2 내지 10 mL/h, 2 내지 9 mL/h, 2 내지 8 mL/h, 2 내지 7 mL/h, 2 내지 6 mL/h, 3 내지 10 mL/h, 3 내지 9 mL/h, 3 내지 8 mL/h, 3 내지 7 mL/h, 3 내지 6 mL/h, 4 내지 10 mL/h, 4 내지 9 mL/h, 4 내지 8 mL/h, 4 내지 7 mL/h, 4 내지 6 mL/h, 5 내지 10 mL/h, 5 내지 9 mL/h, 5 내지 8 mL/h, 5 내지 7 mL/h 또는 5 내지 6 mL/h의 유량으로 첨가하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 6 mL/h의 유량으로 첨가하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 가교유도 용액은 염화나트륨(NaCl), 및 염화바륨(BaCl₂), 염화칼슘(CaCl₂) 또는 염화스트론튬을 포함하는 수용액일 수 있다.

상기 염화나트륨은 0.05 내지 0.3 M, 0.05 내지 0.25 M, 0.05 내지 0.2 M, 0.1 내지 0.3 M, 0.1 내지 0.25 M 또는 0.1 내지 0.2 M의 농도인 것일 수 있으며, 예를 들어, 0.15 M 농도인 것일 수 있다. 상기의 농도 범위가 생리학적으로 세포의 생장과 활성에 적합하며, 상기 농도 범위 밖의 염화나트륨 용액에서는 세포의 활성이 낮아지며 점차 사멸에 이르게 된다.

상기 염화바륨, 염화칼슘 또는 염화스트론튬은 0.01 M 내지 0.1 M, 0.01 M 내지 0.09 M, 0.01 M 내지 0.08 M, 0.01 M 내지 0.07 M, 0.01 M 내지 0.06 M, 0.01 M 내지 0.05 M, 0.01 M 내지 0.04 M 또는 0.01 M 내지 0.03 M의 농도인 것일 수 있으며, 예를 들어, 0.02 M 농도인 것일 수 있다. 가교용액의 농도에 따라서 캡슐의 강도가 달라져, 원하는 분화의 방향에 따라서 가교용액의 농도를 달리할 수 있다. 상기 범위보다 낮은 농도에서는 캡슐 생성이 어려우며, 상기 범위 보다 높은 농도에서는 세포의 생존율이 낮아진다.

상기 형성 단계는 전기방사 장비(electrospraying systems), 이멀전 분산, 스프레이 또는 미세유체 조절시스템(microfluidic systems)을 통해 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 종래 공지된 모든 방법을 이용하여 제조 가능하다.

상기 형성 단계의 전압 및 유량 조절을 통해 알긴산을 포함하는 마이크로캡슐의 평균 직경을 조절할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 양태는 다음 단계를 포함하는 줄기세포 삼차원 배양방법에 관한 것이다.

알긴산을 포함하는 줄기세포 배양용 마이크로캡슐 준비 단계;

마이크로캡슐 내부에 줄기세포를 담지하는 담지 단계; 및

줄기세포를 배양하는 배양 단계.

상기 마이크로캡슐 준비 단계와 담지 단계는 동시에 이루어질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 배양 단계는 염화나트륨(NaCl) 용액으로 마이크로캡슐을 세정하는 세정 단계 및 세포 배양액을 넣는 배양액 첨가 단계; 세포 배양접시에 옮기는 단계; 및 세포 배양기에서 배양하는 단계;를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 세포 배양액은 기본 세포배양액을 기반으로 FBS, 항생제-항균제(antibiotics-antimycotic)를 첨가한 것일 수 있으며, 예를 들어, MEM-알파 세포배양액에 10 % FBS, 1 % 항생제-항균제인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명이 지니는 효과는, 생체환경을 모사하는 세포외기질이 부착된 마이크로수화겔에 세포를 담지하여 배양을 함으로써, 세포의 고농도 배양, 빠른 증식 속도의 유도, 세포의 안정적인 역가유지, 회수의 용이성을 향상시켜, 세포의 응용연구 및 임상적용에 필요한 세포의 증식을 효율적이고 안정적으로 구현할 수 있다.

상기 마이크로캡슐을 이용하여 배양된 세포와 일반 배양법으로 배양된 세포와의 혈당 소모량, 세포의 수를 비교하여 세포의 생장속도를 비교하고, 줄기세포 마커(Stem cell marker)의 발현과 분화능 비교를 통해, 줄기세포의 역가 유지성을 시험하였고, 본 발명의 방법에 의해 효율적으로 중간엽 줄기세포를 배양할 수 있음을 규명하였다.

본 발명의 "알긴산을 포함하는 마이크로캡슐"은 알긴산 고분자를 주된 구성성분으로 포함하는 수십 내지 수백 마이크로미터의 평균 직경을 갖는 입자로서, 배양을 위한 세포가 내부에 담지된 상태의 입자를 의미하며, 편의를 위해 간단히 "알긴산 마이크로캡슐" 또는 "알긴산 캡슐"로 기재가능하고, 달리 기재하지 않는 한 모두 동일한 의미를 갖는 것으로 해석된다.

본 발명은 줄기세포를 알긴산 또는 세포외기질 유래의 펩타이드로 변형된 알긴산에 줄기세포를 담지 하는 마이크로캡슐 제조방법과 이의 줄기세포의 고농축 배양, 줄기세포 생장 속도 증대, 안정적인 활성유지, 회수에 관한 방법에 관한 것으로서 보다 상세하게는 줄기세포를 삼차원으로 배양할 수 있는 마이크로 크기의 캡슐구조를 알긴산 또는 세포외기질 유래의 펩타이드로 변형된 알긴산으로 형성하여, 일반적으로 사용되는 배양접시를 이용하는 이차원 배양에서보다 공간적, 시간적 효율성 증대, 세포 활성, 대량생산이 가능한 효율적 배양을 할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 줄기세포의 고효율 생체모사 3차원 배양의 과정 모식도이다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 알긴산 캡슐에 배양된 세포를 광학현미경으로 관찰한 사진이다.

도 3는 본 발명의 일 실시예에 따른 알긴산 캡슐에 배양된 세포를 광학현미경으로 관찰한 사진이다.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 알긴산 캡슐에 배양된 세포를 Live/dead 염색하여 관찰한 사진이다.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 일반적인 2차원 배양과 세포외기질 유래의 펩타이드로 치환된 알긴산에 담지 된 세포의 포도당 변화 및 소모량을 비교한 그래프이다.

도 6은 본 발명의 일 실시예예 따른 두 배양방법에서 회수된 세포의 수를 비교한 그래프이다.

도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 산화스트레스 하에서의 알긴산 캡슐에 담지 된 세포의 Live/dead 염색하여 관찰한 사진이다.

도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 산화스트레스 하에서의 알긴산 캡슐에 담지 된 세포의 Live/dead 염색하여 관찰한 그래프이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 세포외기질 유래의 펩타이드의 알긴산 부착

MES(2-(N-모르폴리노)에테인설폰산) 버퍼를 0.2 M로 희석한 뒤, 0.3 M 농도의 염화나트륨(NaCl)을 첨가하고 pH를 6.5로 적정하였다. 알긴산을 상기 버퍼에 1 중량%로 녹인 후, EDC(1-ethyl-3-(-3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)와 NHS(N-hydroxysulfosuccinimide) 반응을 유도하기 위해 NHS와 EDC를 1:2 몰비로 넣어주었다. 그 다음, 알긴산 1g 당, 22 umol의 펩타이드를 넣어주고 24시간 동안 저어준 뒤, 3500 Da 사이즈의 멤브레인을 이용하여 4일 간 투석을 진행한 뒤 동결건조 시켰다. 알긴산에 세포의 인테그린과 상호작용할 수 있는 세포외기질 유래의 펩타이드를 EDC/NHS 반응을 통해 화학적으로 부착하였다.

실시예 2. 줄기세포 담지된 알긴산 캡슐 제작

증류수에 1.25 중량% 농도의 알긴산염 또는 세포외기질 유래의 펩타이드 (알지닌-글라이신-아스파르트산 (RGD))로 치환된 알긴산염을 첨가하여 알긴산 용액을 제조하고, 0.2 um 사이즈의 주사기 필터를 이용하여 필터링 하였다. 그 다음, 75 cm²의 플라스틱 세포배양접시에 세포를 4,000 내지 5000/cm²으로 접종한 뒤, 90 % 정도의 면적에 세포가 증식되었을 때, 배양된 세포를 0.05% 트립신-EDTA로 처리 후 1000 rpm에서 10분간 원심 분리하여, 마지막 세포의 농도가 1.0 X 10⁶ 세포/mL이 되도록 알긴산 용액과 1:4 부피비로 혼합하여 혼합용액을 제조하였다.

그 다음, 증류수에 0.15 M 농도의 염화나트륨(NaCl)과 0.02 M 농도의 염화바륨(BaCl₂)을 첨가하여 알길산 용액의 가교유도 용액을 제조하였다.

상기 혼합용액을 전기방사 장비를 이용하여 원하는 캡슐의 크기에 따라 1 내지 16 kV의 일정한 전압을 걸어주고, 가교유도 용액에 1 내지 10 mL/h의 정한 속도로 떨어지면서 이온성 가교결합이 일어나도록 유도하여, 내부에 세포가 담지 된 수화겔 캡슐을 제조하였다.

공급된 전압과 유량(flow rate)에 따라 만들어지는 캡슐의 사이즈가 달라질 수 있으며, 500 um 보다 작은 사이즈의 캡슐이 만들어 지도록 27 G의 노즐을 이용하여 공급전압을 10 kV, 유량을 6 mL/h로 조절하였다. 상기 형성된 캡슐을 0.15 M 농도의 염화나트륨(NaCl) 용액으로 충분히 세정 후, 세포 배양액을 넣고 세포 배양접시에 옮긴 뒤 세포 배양기에서 배양하였다.

실시예 3. 배양액의 포도당 소모량 및 소모속도 비교

본 발명의 방법(실시예)과 2차원 배양(비교예)에서 세포의 생장을 비교하였다. 구체적으로, 탯줄 유래의 인간중간엽 줄기세포 또는 상기 세포를 담지한 캡슐을 75 cm²의 플라스틱 플레이트에 배양하고 각각 동일한 배지 10 mL를 넣어 처음 48시간 동안 소모량 및 소모속도를 비교하였다.

넣어준 직후의 포도당량과 시간에 따른 변화를 관찰하여, 2차원 배양에서는 처음에 세포의 유도기(lag phase)처럼 포도당량의 소모량에 큰 변화가 없었고, 약 24 시간이 지난 시점에서부터 감소경향이 나타나기 시작하였다. 그에 반해 세포를 담지한 캡슐에서는 배양액 소모가 배양이 되면서 바로 시작되는 것을 확인할 수 있었다.

줄기세포의 효과적인 배양을 위해 세포를 세포외기질 유래의 펩타이드가 부착된 알긴산으로 전기스프레잉 시스템을 이용하여 마이크로캡슐화를 진행하였다.

도 2 내지 4에서 확인할 수 있듯이, 캡슐화 전 후에 줄기세포의 생존율이 Live/dead 형광 염색을 하고, 이로부터 살아있는 세포 (녹색)와 죽은 세포 (빨간색)의 개수를 세고 통계를 내었을 때 활성을 가지는 세포의 비율이 90 %이상 유지됨을 확인 하였다.

기존의 배양플라스크에서의 2차원 배양법과는 달리 본 발명의 3차원 담지는 공간적으로 고밀도, 고효율 배양으로 세포의 대사과정을 활성화시킬 수 있다. 이에, 세포의 생장에 필수적인 배양액 내의 포도당의 농도를 관찰하여, 줄기세포의 대사과정을 비교하여, 그 결과를 도 5 및 표 1에 나타내었다.

	2D culture (비교예)	3D culture (실시예)
Total glucose consumption for 48 hours (mg/dL)	12.5 mg/dL	88.5 mg/dL

도 5에서 확인할 수 있듯이, 비교예는 접종 배양 후 초기 48시간 동안 포도당 12.5 mg/dL를 소모하였고, 실시예는 88.5 mg/dL를 소모하였으며, 실시예가 비교예에 비해 7배 정도의 빠른 포도당 소모를 보임을 확인하였다. 즉, 비교예는 48시간을 주기로 배지를 교환하여야 했으나, 실시예는 배양 배지 내 포도당이 빠르게 감소하여 약 5 내지 6시간 주기로 배양액을 교환하여야 했다.

실시예 4: 알긴산 마이크로겔에 배양된 줄기세포 회수

50 mM EDTA를 생리식염수 ((pH 7) 기반으로 제조하여 알긴산의 탈가교(decrosslinking)에 이용하였다. 줄기세포가 포함된 캡슐에 상기 EDTA 용액을 첨가하여 37도에서 3~4분간 배양하여, 알긴산 캡슐이 충분히 탈가교(decrosslinking)되는 것을 확인할 수 있었다. 이후 용액을 원심분리를 이용하여 상층액을 제거하고 줄기세포 펠렛을 용이하게 얻을 수 있었으며, 생리식염수로 몇 번 세척해 준 뒤 줄기세포를 분산하여 배양, 보관, 응용을 진행하였다.

줄기세포가 알긴산에 내부에 담지되어 있어, 일반적으로 이용되는 트립신과 같은 효소의 사용 없이 알긴산을 EDTA용액으로 간단히 탈가교(decrosslinking)시키고 세포를 회수할 수 있었다. 이때, 생리식염수로 세척하여 알긴산과 EDTA성분을 제거할 수 있었다.

실시예 5. 세포 담지 및 생장 속도

기존의 배양플라스크에서의 2차원 배양법과는 달리 본 발명의 세포외기질 펩타이드를 포함하는 수화겔 내의 3차원 담지 및 배양은 공간적으로 고밀도 배양, 세포 생장의 촉진이 가능하였다. 담지 전의 세포와 계대배양 중에 얻어진 줄기세포 수를 비교하여 세포 생장 속도와 증폭 비율을 비교하여, 그 결과를 도 6 및 표 2에 나타내었다.

	2D culture (비교예)	3D culture ( 실시예 )
Day 0(세포수 / ml)	3.0 x 10⁵	3.0 x 10⁶
Day 5(세포수 / ml)	2.4 x 10⁵	3.0 x 107

도 6 및 표 2에서 확인할 수 있듯이, 기존 배양플라스크에서의 2차원 배양은 초기 3 x 10⁵ 세포/mL의 농도로 접종하여 5일 후 약 3 x 10⁶ 세포/mL의 줄기세포를 얻을 수 있어, 2.2 일의 배가 시간(doubling time)을 보이는 것에 비해, 3차원 배양시에는 3 x 10⁶ 세포/mL의 농도로 초기배양이 가능하여 2일 후에 7 x 10⁶ 세포/mL의 줄기세포를 회수하였다. 이는, 초기 농도 기준으로 10배의 고밀도 배양이 가능한 것이며, 본 발명의 배양방법에 의해 배가 시간이 0.81 일로 2~3배 빠른 생장속도를 나타내었다.

실시예 6. 산화스트레스 환경에서의 활성 시험

알긴산 또는 세포외기질 유래의 펩타이드로 치환된 알긴산에 줄기세포를 마이크로캡슐화 한 뒤, 초기 하루 동안 일반 배양액에서 배양한 후, 과산화수소를 첨가하여 100 uM, 200 uM, 400 uM, 800 uM 등 H₂O₂ 농도가 배양액에 되도록 하여, 줄기세포를 과산화수소에 노출시키고, 24시간 뒤에 세포의 생존율을 확인하기 위해 Live/dead 염색을 하고 현미경으로 관찰하여, 그 결과를 도 7 내지 8 및 표 3에 나타내었다.

H2O2 conc. (uM)	0	100	200	400	800	1000	1500	2000
Viability (%)	99.94	99.53	9.27	96.61	77.5	78.59	64.05	53.54

도 7 내지 8 및 표 3에서 확인할 수 있듯이, 줄기세포의 배양 시, 외부환경의 변화에 따라 활성산소종과 같은 산화스트레스를 포함한 세포 활성에 악영향을 줄 수 있는 위험이 있다. 알긴산을 이용한 3차원 배양과 세포외기질 펩타이드가 부착된 알긴산의 사용으로 세포의 자가세포사멸 기작을 저감해줄 수 있는 신호를 보강하여 주어, 배양 중 줄기세포의 활성 (viability) 유지능을 향상시킬 수 있음을 확인하였다. 배양 중 과산화수소를 배양액에 첨가하여 산화스트레스 환경을 유도하였을 때에, 알긴산 또는 RGD 펩타이드가 부착된 알긴산을 이용하여 마이크로캡슐화로 배양한 줄기세포의 활성이 기존 플라스크에서 배양되는 줄기세포보다 우수한 활성 유지를 나타내었고, 세포외기질 펩타이드가 부착된 알긴산에서 배양 시 보다 우수한 결과를 나타내었다. 이는 3차원 배양, 하이드로젤의 의한 세포부분의 연성환경 구현, 국부적 고밀도 줄기세포배양, 세포외기질 펩타이드를 이용한 세포 내 활성유지 신호전달 체계의 활성화에 의한 것으로 판단된다.

Claims

알긴산을 포함하는 세포 배양용 마이크로캡슐.
제1항에 있어서, 상기 알긴산은 세포외기질 유래의 펩타이드로 치환된 것인, 세포 배양용 마이크로캡슐.
제2항에 있어서, 상기 세포외기질 유래의 펩타이드는 RGD 모티프, DGEA 모티프, REDV 모티프, IKVAV 모티프, VPGVG 모티프, YIGSR 모티프 및 KHIFSDDSSE 모티프로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 세포 배양용 마이크로캡슐.
제1항에 있어서, 상기 마이크로캡슐은 평균 직경 30 내지 1000 um인 것인, 세포 배양용 마이크로캡슐.
제1항에 있어서, 상기 세포는 줄기세포인 것인, 세포 배양용 마이크로캡슐.
제5항에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽줄기세포, 혈액줄기세포, 신경줄기세포, 근육줄기세포, 심근줄기세포, 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 줄기세포 배양용 마이크로캡슐.
제1항에 있어서, 상기 세포 배양용 마이크로캡슐은 세포를 담지하고 있는 것인, 세포 배양용 마이크로캡슐.
하기의 단계를 포함하는 알긴산을 포함하는 마이크로캡슐 제조방법:

알긴산 용액을 제조하는 알긴산 용액 제조 단계;

세포 분산용액과 알긴산 용액을 혼합하여 혼합 용액을 제조하는 혼합 단계;

마이크로캡슐을 형성하는 형성 단계.
제8항에 있어서, 상기 알긴산은 세포외기질 유래의 펩타이드로 치환된 것인, 마이크로캡슐 제조방법.
제9항에 있어서, 상기 세포외기질 유래의 펩타이드는 RGD 모티프, DGEA 모티프, REDV 모티프, IKVAV 모티프, VPGVG 모티프, YIGSR 모티프 및 KHIFSDDSSE 모티프로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 마이크로캡슐 제조방법.
제8항에 있어서, 알긴산 용액은 0.1 내지 10 중량%의 알긴산염을 포함하는 것인, 마이크로캡슐 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 혼합 용액은 세포 분산용액 및 알긴산 용액을 1:4의 부피로 혼합한 것인, 마이크로캡슐 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 혼합 용액에 포함된 세포의 농도는 1.0 X 10⁶ cell/mL인 것인, 마이크로캡슐 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 세포는 줄기세포인 것인, 마이크로캡슐 제조방법.
제14항에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽줄기세포, 혈액줄기세포, 신경줄기세포, 근육줄기세포, 심근줄기세포, 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인,
제8항에 있어서, 상기 형성 단계는 전기방사 장비(electrospraying systems), 이멀전 분산, 스프레이 또는 미세유체 조절시스템(microfluidic systems)로 수행하는 것인, 마이크로캡슐 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 마이크로캡슐은 평균 직경 30 내지 1000 um인 것인, 마이크로캡슐 제조방법.
하기의 단계를 포함하는 세포 삼차원 배양방법:

알긴산을 포함하는 세포 배양용 마이크로캡슐 준비 단계;

마이크로캡슐 내부에 세포를 담지하는 담지 단계; 및

세포를 배양하는 배양 단계.
제18항에 있어서, 상기 마이크로캡슐 준비 단계 및 담지 단계는 동시에 수행하는 것인, 세포 삼차원 배양방법.
제13항에 있어서, 상기 배양 단계는,

염화나트륨(NaCl) 용액으로 마이크로캡슐을 세정하는 세정 단계;

세포 배양액을 넣는 배양액 첨가 단계;

세포 배양접시에 옮기는 단계; 및

세포 배양기에서 배양하는 단계;

를 포함하는 것인, 세포 삼차원 배양방법.