KR20020066507A

KR20020066507A - 항생제를 이용한 인공간 시스템

Info

Publication number: KR20020066507A
Application number: KR1020010006729A
Authority: KR
Inventors: 이종원; 윤호철; 임선하; 송동익; 김양일
Original assignee: 이종원
Priority date: 2001-02-12
Filing date: 2001-02-12
Publication date: 2002-08-19

Abstract

본 발명은 본 발명은 간기능 연구를 위한 실험모델로 사용될 수 있도록, 기계적 강도가 강화되고, 항생제를 이용하여 배양된 간세포를 포함하고, 동물의 혈장이 관류될 수 있는 체외순환형 인공간 시스템에 관한 것이다. 본 발명의 인공간 시스템은 크리스탈 비드로 충진된 유입비드층; 유입비드층 상부에 인접하여, 기계적 강도가 보강되고, 항생제를 처리하여 배양된 젤 비드형 간세포로 충진된 간세포층; 간세포층 상부에 인접하고, 크리스탈 비드로 충진된 유출비드층; 및, 유입비드층, 간세포층 및 유출비드층을 감싸는 워터재킷을 포함한다. 본 발명의 인공간 시스템은 실제 간과 거의 유사한 기능을 수행할 수 있고, 실제적으로 동물의 체외순환 시스템에 연결시킬 수 있으므로, 간기능의 연구에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

항생제를 이용한 인공간 시스템{Bio-artificial Liver System Employing Anti-biotics}

본 발명은 항생제를 이용한 인공간 시스템에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 간기능 연구를 위한 실험모델로 사용될 수 있도록, 항생제를 이용하여 배양된 간세포를 포함하며, 기계적 강도가 강화되고, 동물의 혈장이 관류될 수 있는 체외순환형 인공간 시스템에 관한 것이다.

간은 탄수화물의 대사, 단백질과 요소의 합성, 약물의 생 변환, 노폐물의 제거, 아미노산과 지방의 대사, 호르몬의 균형유지 등 매우 다양한 기능을 수행하는 장기이기 때문에, 간기능에 대한 많은 연구가 진행되고 있다. 그러나, 다양한 간기능 많큼 다양한 간질환이 보고되어 있으며, 이들 질환의 발생원인 조차 정확히알려져 있지 않은 실정이다. 이는 간의 조직학적 특성에 기인하는데, 간은 각종 손상에 대비하여 충분한 예비기능을 비축하고 있어, 환자의 자각증상이 나타나는 경우에는 이미 회복이 불가능할 정도로 간이 손상된 상태이므로, 질환의 발생원인을 정확히 추정할 수 없기 때문이다.

한편, 간은 복잡한 기능으로 인하여 아직까지는 인공장기로 개발이 불가능한 것으로 알려져 있어, 간질환의 초기진단이 실패한 경우, 약물치료 또는 간이식 방법으로 간기능을 회복시키고 있다. 이 중, 약물치료의 성공률은 희박하나, 간이식 방법의 경우 60 내지 80%의 회복률을 나타내고 있다. 그러나, 간이식 방법은 장기 수여자가 제한되어 있다는 명백한 한계를 극복할 수 없으므로, 새로운 간질환의 치료방법이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

간질환의 정확한 발병원인 및 발병기작조차 정확히 규명되지 않은 지금, 간질환의 치료를 위하여는 무엇보다도 간기능의 정확한 기능의 연구가 선행되어야 할 것으로 판단되지만, 현재까지 확립된 간세포의 배양 수준에서는 생체내에서 작용하는 간기능의 연구가 불가능하므로, 이를 연구하기 위한 실험모델의 개발이 요구되었으나, 아직까지는 별다른 연구결과가 알려져 있지 않은 실정이다.

따라서, 간기능 연구를 위한 실험모델을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

이에, 본 발명자들은 간기능 연구를 위한 실험모델을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 배양된 간세포를 미세캡슐로 감싸고, 이를 다시 키토산 등으로 코팅하여, 기계적인 강도를 보강한 젤 비드 형태의 간세포에 항생제를 처리하여 배양한 후, 배양된 간세포를 포함하고, 동물의 혈액이 관류되는 체외순환형 인공간 시스템을 사용할 경우, 간기능을 좀 더 정확히 연구할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명은 간기능 연구를 위하여, 항생제를 이용한 인공간 시스템을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 항생제를 이용한 인공간 시스템의 개략도이다.

도 2는 시간경과에 따른 암모니아 농도의 변화를 나타내는 그래프이다.

본 발명의 항생제를 이용한 인공간 시스템은 크리스탈 비드로 충진된 유입비드층; 유입비드층 상부에 인접하여, 기계적 강도가 보강되고, 항생제를 처리하여 배양된 젤 비드형 간세포로 충진된 간세포층; 간세포층 상부에 인접하고, 크리스탈 비드로 충진된 유출비드층; 및, 전기 유입비드층, 간세포층 및 유출비드층을 감싸는 워터재킷을 포함한다.

도 1은 본 발명의 인공간 시스템의 개략도이다. 도 1에서 보듯이, 혈장이 유입되는 유입비드층이 최하단부에 위치하고, 유입비드층의 상부에 젤 비드형 간세포가 충진된 간세포층이 위치하며, 간세포층의 상부에 혈장이 유출되는 유출비드층이 위치하고 있다. 또한, 유입비드층, 간세포층 및 유출비드층을 감싸는 형태로 워터재킷이 위치한다. 이때, 유입비드층과 간세포층 및 유출비드층과 간세포층은비드가 유출되지 않을 정도의 구멍이 있는 분리판으로 두 층을 분리함이 바람직하다. 또한, 유입비드층은 간세포층에 혈장을 골고루 공급하는 역할을 하고, 유출비드층은 간세포층에서 반응된 혈장의 부분적인 정체를 방지하는 역할을 하며, 워터재킷은 인공간 시스템이 체내와 동일한 온도(37℃)를 유지하도록 보조하는 역할을 한다.

젤 비드형 간세포는 먼저 면역반응을 억제시키기 위하여, 미세캡슐 제조기(drop generator)를 이용하여 알긴산 캡슐로 감싸고, 기계적 강도를 보강하기 위하여, 키토산으로 코팅한 다음, 포신 혈장(porcine serum)으로 코팅하여 젤 비드(gel bead)의 형태로 작제한다. 세포를 알긴산 캡슐로 감싸는 방법은 미세캡슐제조기로 각 세포를 알긴산 캡슐로 감싸고, 이들을 염화칼슘 또는 염화바륨용액에서 중합시켜서, 각 알긴산 캡슐이 중합된 미세캡슐을 제조하는 것으로서, 이미 1980년대에 개발된 기술이다. 최근에는, 제조된 미세캡슐의 생체적응도를 향상시키기 위하여, 외부를 폴리리신(poly-L-lysine) 또는 모노메톡시 폴리에틸렌글리콜(monomethoxy polyethylene glycol, MPEG)로 처리하는 방법이 많이 사용되고 있다. 그러나, 이처럼 제조된 세포는 생체 적응도가 우수하지만. 기계적인 강도가 매우 약하여, 혈장을 빠른 속도로 관류시키는 본 발명의 인공간 시스템에 적용할 수 없었으므로, 이들의 기계적인 강도를 보강하였다. 즉, 알긴산 캡슐이 중합된 미세캡슐을 폴리리신 또는 MPEG로 처리하는 방법 대신에, 유사한 생체적응도를 나타내며, 기계적인 강도가 우수한 고분자물질인 키토산으로 코팅하고, 포신 혈장으로 코팅하여 젤 비드의 형태로 작제한 다음, 저산소 상태에서 생존성을향상시키기 위하여, 항생제를 처리한 배양액을 관류하며 배양한 후, 인공간 시스템에 적용한다. 이때, 사용될 수 있는 항생제로는 제네티신, 네오마이신, 젠타마이신, 테트라싸이클린, 미노싸이클린, 독시싸이클린, 옥시테트라싸이클린, 클로람페니콜, 레보플록사신, 오플록사신 또는 시프록사신을 사용할 수 있고, 바람직하게는 0.1 내지 1000㎍/㎖의 농도로 처리한다.

이처럼 제작된 항생제를 이용한 인공간 시스템을 이용하여, 암모니아의 분해효과를 측정한 결과, 내재된 간세포에 의하여 암모니아가 효과적으로 분해됨을 확인할 수 있었고, 이들을 동물의 순환계와 직접적으로 연결시킬 수 있음을 알 수 있었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 지닌 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 항생제를 이용한 인공간 시스템의 제작

실시예 1-1: 간세포의 분리 및 가공

돼지로 부터 적출된 간에 0.05%(v/v) 콜라겐분해효소(collagenase type Ⅳ)를 처리하고, 스크래퍼(scraper)로 간세포를 분리한 다음, 4℃로 냉각시켰다. 이어, 살균된 철망(지름 1mm)으로 결체조직과 분해되지 않은 간세포를 분리하고, 125㎛의 나이론 망을 사용하여 단일 간세포만으로 구성된 간세포 현탁액을 수득하였다. 이를 50 ×g로 5분간 원심분리하여, 손상된 세포 등을 분리하고, 침전된 세포를 4℃로 냉각된 인산완충염용액(PBS)으로 3번 세척하였다. 최종적으로, 얻은 간세포를 10×DMEM(10% FBS,100Unit Penicillin /Streptomycin)을 함유한 1.5% 알긴산용액 350㎖에 현탁시켰다. 이어, 간세포가 혼합된 알긴산 용액을 미세캡슐 제조기(air flow rate 2.5ℓ/min, needle 22G)로 135mM CaCl₂용액에 분사하여, 구형의 미세캡슐(평균지름: 500㎛)을 작제하였다. 그런 다음, CaCl₂용액을 제거하고, 0.9%(w/v) NaCl₂용액으로 세척하여 남아있는 CaCl₂용액을 완전히 제거한 다음, 미세캡슐의 기계적인 강도를 보강하기 위하여 0.5%(w/v) 키토산(chitosan) 용액으로 5분간 코팅하고, 포신 혈장으로 코팅하여 젤 비드 형태의 간세포를 제조하였다.

실시예 1-2: 항생제를 이용한 인공간 시스템의 제작

전기 실시예 1-1에서 제조된 젤 비드 형태의 간세포를 유입비드층, 유출비드층, 유입비드층과 유출비드층사이의 공간 및 워터재킷이 구비된 내경 70mm, 높이 210mm의 유리 컬럼(column)의 유입비드층과 유출비드층사이의 공간에 충진하고, 10㎍/㎖의 농도로 제네티신이 함유된 3000㎖의 배양액을 0.1ℓ/min의 속도로 관류시키면서, 90%(v/v) O₂,5%(v/v) CO₂, 37℃조건에서 30시간 동안 배양하여 인공간 시스템을 제작하였다.

비교실시예 1: 항생제를 이용하지 않은 인공간 시스템의 제작

인공간 배양시 제네티신을 함유하지 않은 배양액을 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 1-2와 동일한 방법으로 인공간 시스템을 제작하였다.

실시예 2: 인공간 시스템의 성능측정

전기 제작된 인공간 시스템의 성능을 평가하기 위하여, 암모니아의 분해능을 측정하였다. 암모니아는 아미노산의 대사산물로 간기능이 정상일때는 요소합성회로에 의해 요소로 배설되나 간부전에서 더 이상 암모니아를 대사시킬 능력이 없으면 혈장농도가 증가되고 결국 중독증세, 특히 중추신경계의 중독증세를 보인다.

전기 제작된 인공간 시스템에 간세포의 독성제거 활성을 측정하기 위해서, 실시예 1-2 및 비교실시예 1에서 제작된 인공간 시스템에 각각 1mM의 농도로 암모니아를 주입한 다음, 0, 0.5, 2, 3 및 5시간 후의 암모니아 농도를 자동분석기(Kodak EKtachem 500 anaylzer, Kodak, Japan)로 측정하였다(참조: 도2). 도 2는 시간경과에 따른 암모니아 농도의 변화를 나타내는 그래프로서, (●)는 비교실시예 1의 인공간 시스템에 주입된 암모니아의 농도변화를 나타내고, (○)는 혈장내에 기본적으로 존재하는 암모니아의 농도를 나타내며, (■)는 실시예 1-2의 인공간 시스템에 주입된 암모니아의 농도변화를 나타낸다. 도 2에서 보듯이, 시간의 경과에 따라 암모니아의 농도가 감소하고, 제네티신을 처리하여 배양한 인공간 시스템의 처리효율이 더욱 우수함을 알 수 있었으며, 아울러 본 발명의 인공간 시스템으로 간의 기능을 시뮬레이션할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 3: 인공간 시스템의 생체적용

30kg의 암돼지를 실험하기 전날은 물만 주었다. 수술 당일, 돼지에게 케탈라(Ketalar, dissociative anesthetics) 50mg을 돼지의 둔부에 근육 주사한 후, 수술대위에 고정시켰다. 이어, 귀의 정맥내로 넘부탈(Nembutal, pentobarbital, hypnotic-anesthetic) 40mg을 주사하고, 삽관튜브(intubation tube)를 기관지 내로 삽관한 다음, 마취기를 연결하여 O₂(2L/min), N₂O(2L/min) 및 플로탄(fluothane, 0.4L/min)을 공급하였다. 그런 다음, 우내경정맥(right internal jugular vein)에 이중도뇨관(dual-lumen catheter, 11.5Fr x19.5cm MAHUKAR, Quinton Instrument Co.)을 삽입하고, 그중 한곳으로 수액(normal saline)을 주입하며, 근이완제 2ml를 초회에 주입하고, 다음은 돼지가 움직일때마다 2ml씩 주입하였다. 또한, 우대퇴동맥(right femoral artery)을 통해 장치한 동맥모니터장치를　통해서　혈압, 심박 등을 검사하였다.

돼지의 복부를 정중 절개하고, 간문맥과 간십이지장 인대를 노출시킨 다음, 담즙관을 분리시켰다. 이어, 간동맥을 절단하여 봉합하고, 간문맥에 붙어 있는 각종 조직을 제거한 다음, 간문맥을 상측부에서 자르고, 잘려진 원위부를 봉합하여, 간조직으로 혈액의 흐름을 차단하였다. 수술이 끝난 돼지에게 헤파린 100U/kg을 투여하고, 우내경정맥에 삽입된 이중도뇨관을 체외 순환시스템과 연결시켰다. 이중 도뇨관의 정맥관을 통해 50ml/min의 속도로 혈장분리기(plasma seperator, Plasauto 2500, Asahi Medical Co., U.S.A.)로 혈액을 유입시킨 후, 혈구와 혈장을 분리하여, 혈구는 이중도뇨관의 동맥관을 통해 다시 돼지로 주입시키고, 혈장은 혈장전이조에 수집한 다음, 수집된 혈장을 400ml/min의 속도로 실시예 1-2에서 제작한 인공간 시스템에 주입하고, 인공간 시스템을 통과한 혈장은 또 다른 혈장전이조에 수집한 후, 15ml/min의 속도로 돼지에 주입시켰다.

이처럼 조작된 돼지는 약 30일간 생존하였는 바, 본 발명의 인공간 시스템이 직접적인 간기능의 연구에 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 본 발명은 간기능 연구를 위한 실험모델로 사용될 수 있도록, 기계적 강도가 강화되고, 항생제를 이용하여 배양된 간세포를 포함하고, 동물의 혈장이 관류될 수 있는 체외순환형 인공간시스템을 제공한다. 본 발명의 인공간 시스템은 크리스탈 비드로 충진된 유입비드층; 유입비드층 상부에 인접하여, 기계적 강도가 보강되고, 항생제를 처리하여 배양된 젤 비드형 간세포로 충진된 간세포층; 간세포층 상부에 인접하고, 크리스탈 비드로 충진된 유출비드층; 및, 유입비드층, 간세포층 및 유출비드층을 감싸는 워터재킷을 포함한다. 본 발명의 인공간 시스템은 실제 간과 거의 유사한 기능을 수행할 수 있고, 실제적으로 동물의 체외순환 시스템에 연결시킬 수 있으므로, 간기능의 연구에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Claims

크리스탈 비드로 충진된 유입비드층; 유입비드층 상부에 인접하여, 기계적 강도가 보강되고, 항생제를 처리하여 배양된 젤 비드형 간세포로 충진된 간세포층; 간세포층 상부에 인접하고, 크리스탈 비드로 충진된 유출비드층; 및, 유입비드층, 간세포층 및 유출비드층을 감싸는 워터재킷을 포함하는 항생제를 이용한 인공간 시스템.
제 1항에 있어서,

유입비드층과 간세포층사이 및 유출비드층과 간세포층사이는 다공성의

분리판으로 분리되는 것을 특징으로 하는

항생제를 이용한 인공간 시스템.
제 1항에 있어서,

젤 비드형 간세포는 분리된 간세포를 알긴산 캡슐로 감싸고, 키토산으

로 코팅한 다음, 포신 혈장(porcine serum)으로 코팅하여 작제하고,

항생제가 포함된 배양액으로 배양하는 것을 특징으로 하는

항생제를 이용한 인공간 시스템.
제 3항에 있어서,

항생제는 제네티신, 네오마이신, 젠타마이신, 테트라싸이클린, 미노싸

이클린, 독시싸이클린, 옥시테트라싸이클린, 클로람페니콜, 레보플록

사신, 오플록사신 또는 시프록사신인 것을 특징으로 하는

항생제를 이용한 인공간 시스템.
제 3항에 있어서,

항생제의 처리농도는 0.1 내지 1000㎍/㎖인 것을 특징으로 하는

항생제를 이용한 인공간 시스템.