CN104762260A - 脂肪间充质干细胞及其制剂的制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及脂肪间充质干细胞及其制剂的制备方法和用途。该制备方法包括：获得脂肪，预处理、酶解、离心，收集沉淀，获得脂肪间充质干细胞；培养所述脂肪间充质干细胞，当所述脂肪间充质干细胞生长至80％融合时，与EDTA-胰酶混合消化，终止消化、离心，传代培养。本发明具有以下优势：1、培养得到的干细胞纯度高；2、回收脂肪间充质干细胞培养过程中分泌出的各类因子，可以显著促进表皮细胞的增殖，表明能加快表皮细胞的新生和更替，达到显著的抗衰老效果。

Description

脂肪间充质干细胞及其制剂的制备方法和用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及脂肪间充质干细胞及其制剂的制备方法和用途。

背景技术

脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。研究发现ADSCs细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时它具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞，适宜大规模培养，对机体损伤小等优点，而且其来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植，逐渐成为近年来新的研究热点之一。目前脂肪干细胞主要运用于脂肪组织移植中的丰胸、除皱等美容行业，其在促进移植后脂肪细胞的存活率有很大的提高。另脂肪干细胞经体外大规模培养后，激活干细胞功能，促进分泌VEGF、BFGF、IGF等细胞因子.

衰老是生物随着时间的推移，自发的必然过程，它是复杂的自然现象，表现为结构和机能衰退，适应性和抵抗力减退。实质是身体各部分器官系统的功能逐渐衰退的过程。

在正常生理过程中，人体每天都有大量细胞死亡，同时伴有大量细胞的新生，以维持各种组织和器官的完整性，保证功能处于正常状态，而发挥细胞新生功能的是体内的各种干细胞。随着年龄的增长，当体内的干细胞量减少，使细胞的死亡与新生失去平衡，干细胞无法满足机体对新生细胞的需求，就会导致组织器官功能的减退、疾病发生，甚至死亡。所以及时补充体内干细胞量或激活、修复体内衰老细胞以维持体内细胞死亡与新生的平衡是抗衰老的重要途径。

目前主要采用移植植物和蛋白诱导性造血干细胞来达到抗衰老的目的。但存在如下缺点：1、诱导得到的主要是造血干细胞，在功能上局限于血液系统；2、培养得到的造血干细胞纯度在5-40％，纯度过低。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种脂肪间充质干细胞及其制剂的制备方法和用途，获得的脂肪间充质干细胞制剂，脂肪间充质干细胞纯度高达90％以上，能更好的发挥干细胞的功能，达到抗衰老目的。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种脂肪间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：获得脂肪，预处理、酶解、离心，收集沉淀，获得脂肪间充质干细胞；

步骤2：培养所述脂肪间充质干细胞，当所述脂肪间充质干细胞生长至80％融合时，弃培养液，加PBS清洗，再加EDTA-胰酶溶液消化，终止消化、离心，传代培养。

在本发明的一些具体实施方案中，脂肪间充质干细胞的制备方法步骤1中所述预处理为加PBS洗涤、离心。

优选的，离心的条件为1500rpm离心5min。

在本发明的一些具体实施方案中，脂肪间充质干细胞的制备方法步骤1中所述酶解为采用0.5％Ⅰ型胶原酶，37℃、100R消化50min；所述Ⅰ型胶原酶与所述脂肪的体积比为0.5～1:1。

在本发明的一些具体实施方案中，脂肪间充质干细胞的制备方法步骤2所述培养采用完全培养基调整细胞密度为1×10⁵cell/mL，添加1μg/mL EGF，于5％CO₂、37℃、饱和湿度为95％的条件下培养；所述完全培养基包括DMEM/F12和10％FBS。

作为优选，步骤2所述培养48h后用10mL PBS清洗，重复2次，取10mL的细胞悬液添加100uL的1ug/mL EGF，于5％CO₂、37℃、饱和湿度为95％的条件下继续培养；所述脂肪间充质干细胞的悬液与所述EGF的体积比为10:0.1。

在本发明的一些具体实施方案中，脂肪间充质干细胞的制备方法EDTA-胰酶溶液中EDTA-胰酶的浓度为0.25w/v％，所述脂肪间充质干细胞贴壁面积与EDTA-胰酶溶液的比例为：每10cm²的面积添加0.5～1ml EDTA-胰酶溶液，所述消化的时间为1～2min。

作为优选，步骤2所述终止消化具体为加FBS终止消化，FBS与所述脂肪间充质干细胞的悬液的体积比为1:10。

作为优选，步骤2所述离心为1500rpm/min离心5min。

在本发明的一些具体实施方案中，脂肪间充质干细胞的制备方法中所述传代培养具体为加入完全培养基和EGF，于5％CO₂、37℃、饱和湿度为95％的条件下培养；所述完全培养基包括DMEM/F12和10％FBS；所述细胞传代培养密度为1×10⁵cell/mL。。

本发明还提供了一种脂肪间充质干细胞制剂的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：如权利要求1至6任一项所述的制备方法获得的脂肪间充质干细胞；

步骤2：将所述脂肪间充质干细胞传代培养至P3代时，收集上清液，更换培养液；

步骤3：重复步骤2，合并上清液，超滤浓缩，冻干，获得上清液冻干粉；

步骤4：将所述脂肪间充质干细胞传代培养至P3代时，经胰酶消化，收集获得干细胞，以HClO₄溶液裂解，离心，收集上清液；

步骤5：将步骤4获得的上清液经碱液中和，离心，收集上清液；

步骤6：将步骤5获得的上清液与活性炭混合、洗涤、碱液洗脱后，调节pH值为中性，获得干细胞提取物；

步骤7：将步骤3获得的上清液冻干粉与步骤6获得的干细胞提取物混合。

作为优选，步骤3超滤采用0.45um、0.22um滤膜过滤超滤系统过滤3kd以下粒径小分子。

作为优选，步骤3获得的上清液冻干粉中，每1mg中蛋白因子的含量为0.5～0.8mg。

作为优选，步骤4中胰酶的浓度为0.25w/v％，所述脂肪间充质干细胞贴壁面积与EDTA-胰酶的比例为：每10cm²的面积添加0.5～1ml EDTA-胰酶。

作为优选，步骤4中HClO₄的质量分数为40％，HClO₄溶液与所述脂肪间充质干细胞的体积比为1:5。

作为优选，步骤4中获得干细胞的个数为1-1.2×10⁸个。

作为优选，步骤4中离心的条件为1000rpm/min-1500rpm/min离心5min。

作为优选，步骤5中碱液为KOH溶液，浓度为0.05mol/mL。

作为优选，步骤5中离心的条件为1000rpm/min-1500rpm/min离心5min。

作为优选，步骤6中干细胞提取物的浓度为5～20μg/mL。

在本发明的一些具体实施方案中，脂肪间充质干细胞制剂的制备方法步骤3获得的上清液冻干粉与步骤6获得的干细胞提取物的质量比为50～100：1。

一次分离培养，可以获得100支上清液冻干粉和100ml干细胞提取物溶液；每支冻干粉0.5-2mg，每毫升干细胞提取物溶液含干细胞提取物5-20ug，按照1支上清液冻干粉溶解1ml无菌水后再与1ml干细胞提取物溶液混合，得到的质量比为50-100:1。

作为优选，将步骤3获得的上清液冻干粉溶于无菌水，制得上清液稀释液，稀释倍数为5～10倍，上清液稀释液的浓度为0.5-2mg/ml；再与步骤6获得的干细胞提取物混合，上清液稀释液与步骤6获得的干细胞提取物的体积比优选为1:1，上清液稀释液的有效成分与步骤6获得的干细胞提取物中有效成分的质量比为5～8：1。

本发明还提供了上述脂肪间充质干细胞制剂的制备方法获得的脂肪间充质干细胞制剂。

本发明还提供了上述脂肪间充质干细胞制剂在制备抗衰老的药物、食品、保健品、化妆品中的应用。

本发明提供了一种脂肪间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：获得脂肪，预处理、酶解、离心，收集沉淀，获得脂肪间充质干细胞；培养所述脂肪间充质干细胞，当所述脂肪间充质干细胞生长至80％融合时，与EDTA-胰酶混合消化，终止消化、离心，传代培养。流程如图1所示。与现有技术相比，本发明具有以下优势：

1、培养得到的干细胞纯度高；

2、回收脂肪间充质干细胞培养过程中分泌出的各类因子，可以显著促进表皮细胞的增殖，表明能加快表皮细胞的新生和更替，达到显著的抗衰老效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示本发明提供的脂肪间充质干细胞及其制制剂的制备方法流程图；

图2示脂肪间充质干细胞流式鉴定图。

具体实施方式

本发明公开了脂肪间充质干细胞及其制剂的制备方法和用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的脂肪间充质干细胞及其制剂的制备方法和用途中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1脂肪间充质干细胞提取

1.获得脂肪溶液，4℃低温转移至实验室超净台内；

2.将脂肪组织均匀分至50mL离心管中，每管加入0.5％I型胶原酶，封口后水平前后摇晃，充分混合均匀。所述Ⅰ型胶原酶与所述脂肪的体积比为0.5～1:1。

3.转移至恒温空气摇床中，37℃、100R消化50min；用1mL移液枪头加入1mLFBS终止消化，用巴氏吸管吹匀，离心管配平后放入离心机内，1500rpm/min离心5min。

4.用巴氏吸管吸掉上清液，每管加入40mLPBS重悬细胞，取20uL细胞悬液用细胞计数仪计数，离心管配平后置于离心机内，1500rpm/min离心5min。

5.用巴氏吸管吸掉离心后上清液，根据细胞计数结果，用完全培养基(DMEM/F12+10％FBS)调整细胞密度为1×10⁵cell/mL，接种至10cm的培养皿中，每皿添加100μL的1μg/mL EGF。

6.在培养皿盖上方做好标记，转移至5％CO₂、37℃、饱和湿度为95％的细胞培养箱中培养。

实施例2脂肪间充质干细胞流式鉴定

如图2所示，从流式结果可知，脂肪间充质干细胞表面标记

CD59+CD90+CD45-HLA-DR-高达99.7％。

实施例3脂肪间充质干细胞培养

1.48h后，用巴氏吸管吸掉实施例1制得的皿内培养基，每皿加入10mL PBS清洗，重复2次。

2.接种10mL的细胞悬液至10cm的培养皿中，每皿添加100uL的1ug/mLEGF。十字摇晃培养皿5次，使细胞悬液均匀分布于培养皿中，转移至5％CO₂、37℃、饱和湿度为95％的细胞培养箱中继续培养，每天观察细胞状态并拍照。

3.细胞生长至80％融合时，倒去培养液，加10mlPBS清洗一次，加入4ml的0.25w/v％的EDTA-胰酶溶液消化1-2min。EDTA-胰酶溶液中EDTA-胰酶的浓度为0.25w/v％，所述脂肪间充质干细胞贴壁面积与EDTA-胰酶溶液的比例为：每10cm²的面积添加0.5～1ml EDTA-胰酶溶液。

4.加1mlFBS终止消化，吸取消化液至15ml离心管，1500rpm/min离心5min

5.加入完全培养基接种至10ml培养皿1-2皿，每皿添加100μL的1μg/mL EGF。

6.在培养皿盖上方做好标记，转移至5％CO₂、37℃、饱和湿度为95％的细胞培养箱中培养。

实施例4脂肪间充质干细胞制剂的制备

1.脂肪间充质干细胞制剂分两部分，上清液冻干粉部分和干细胞提取物部分

2.上清液冻干粉部分

2.1待实施例3制得的脂肪间充质干细胞培养至P3代时(15cm的皿，可由接种时的1皿扩增至P3代的16-20皿)，连续3天，每天换液，并收集上清液，可得到480-600ml上清液

2.2上清液经Sartocon slice 200切向流超滤系统浓缩过滤，制得100-150ml溶液，经冻干制得100支冻干粉，每支含蛋白因子成分0.5-2mg。

3.干细胞提取物部分

3.1接种1个15cm皿的实施例3制得的脂肪间充质干细胞，培养至P3代时，细胞经胰酶消化收集可得到1-1.2×10⁸个细胞；

3.2收集得到的干细胞以质量分数为40％的HCLO4溶液裂解，1000rpm/min-1500rpm/min离心5min，取上清液；HClO₄溶液与所述脂肪间充质干细胞的体积比为1:5。

3.3上清液以浓度为0.05mol/mL的KOH中和，1000rpm/min-1500rpm/min离心5min，取上清液；

3.4上清液与活性炭混合后，以中性双蒸水洗涤，碱性溶液洗脱，调节PH值为中性，获得干细胞提取物溶液100ml，提取物浓度为5-20μg/ml，为产品1。

4.取0.5-2mg冻干粉溶于无菌水1ml，制得产品2(冻干粉为步骤2中得到的100对冻干粉)

产品1和产品2按1:1混合，即为本发明提供的脂肪间充质干细胞制剂。

上清液稀释液与步骤6获得的干细胞提取物的体积比优选为1:1，上清液稀释液的有效成分与步骤6获得的干细胞提取物中有效成分的质量比为5～8：1。

实施例5抗衰老效果验证

人的衰老就是细胞的衰老，通过在细胞培养中，延长细胞增殖倍数和传代次数以确认其延缓衰老功效。验证方案如下：

取P1代小鼠表皮细胞数皿，消化后离心，分别接种于12皿(10cm皿，每皿5*10⁵个细胞)。分4组，每组3皿。

1组不做任何处理，常规培养；

2组添加实施例4中产品1与实施例4中产品2的比例为2:1；

3组添加实施例4中产品1与实施例4中产品2的比例为1:1；

4组添加实施例4中产品1与实施例4中产品2的比例为1:2。

分别在12h、24h每组取1皿细胞消化计数，结果如表1所示：

表1小鼠表皮细胞培养实验结果

在小鼠表皮细胞培养实验中可以看出，在组别3中获得的细胞量明显高于其他组别，P＜0.05，具有统计学意义。可见，本发明提供的脂肪间充质干细胞制剂可以促进表皮细胞的增殖，表明能加快表皮细胞的新生和更替，达到抗衰老效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种脂肪间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：获得脂肪，预处理、酶解、离心，收集沉淀，获得脂肪间充质干细胞；

步骤2：培养所述脂肪间充质干细胞，当所述脂肪间充质干细胞生长至80％融合时，弃培养液，加PBS清洗，再加EDTA-胰酶溶液消化，终止消化、离心，传代培养。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述预处理为加PBS洗涤、离心。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述酶解为采用0.5％Ⅰ型胶原酶，37℃、100R消化50min；所述Ⅰ型胶原酶与所述脂肪的体积比为0.5～1：1。

4.根据权利要求1至3任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤2所述培养采用完全培养基调整细胞密度为1×10⁵cell/mL，添加1μg/mL EGF，于5％CO₂、37℃、饱和湿度为95％的条件下培养；所述完全培养基包括DMEM/F12和10％FBS。

5.根据权利要求1至4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述EDTA-胰酶溶液中EDTA-胰酶的浓度为0.25w/v％，所述脂肪间充质干细胞贴壁面积与EDTA-胰酶溶液的比例为：每10cm²的面积添加0.5～1ml EDTA-胰酶溶液，所述消化的时间为1～2min。

6.根据权利要求1至5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述传代培养具体为加入完全培养基和EGF，于5％CO₂、37℃、饱和湿度为95％的条件下培养；所述完全培养基包括DMEM/F12和10％FBS，所述细胞传代培养接种密度为1×10⁵cell/mL。

7.一种脂肪间充质干细胞制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤

步骤1：如权利要求1至6任一项所述的制备方法获得的脂肪间充质干细胞；

步骤2：将所述脂肪间充质干细胞传代培养至P3代时，收集上清液，更换培养液；

步骤3：重复步骤2，合并上清液，超滤浓缩，冻干，获得上清液冻干粉；

步骤4：将所述脂肪间充质干细胞传代培养至P3代时，经胰酶消化，收集获得干细胞，以HClO₄溶液裂解，离心，收集上清液；

步骤5：将步骤4获得的上清液经碱液中和，离心，收集上清液；

步骤6：将步骤5获得的上清液与活性炭混合、洗涤、碱液洗脱后，调节pH值为中性，获得干细胞提取物；

步骤7：将步骤3获得的上清液冻干粉与步骤6获得的干细胞提取物混合。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤3获得的上清液冻干粉与步骤6获得的干细胞提取物的质量比为50～100：1。

9.根据权利要求8所述的脂肪间充质干细胞制剂的制备方法获得的脂肪间充质干细胞制剂。

10.根据权利要求9所述的脂肪间充质干细胞制剂在制备抗衰老的药物、食品、保健品、化妆品中的应用。