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WO2010150521A1 - 培養器材、培養シート、及び細胞培養方法 - Google Patents

培養器材、培養シート、及び細胞培養方法 Download PDF

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Publication number
WO2010150521A1
WO2010150521A1 PCT/JP2010/004145 JP2010004145W WO2010150521A1 WO 2010150521 A1 WO2010150521 A1 WO 2010150521A1 JP 2010004145 W JP2010004145 W JP 2010004145W WO 2010150521 A1 WO2010150521 A1 WO 2010150521A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
culture
region
sheet
protrusions
cell
Prior art date
Application number
PCT/JP2010/004145
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
高橋亮介
久田明子
園田浩
齊藤拓
Original Assignee
株式会社日立製作所
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP2009148680A external-priority patent/JP5730472B2/ja
Priority claimed from JP2010107331A external-priority patent/JP5730499B2/ja
Application filed by 株式会社日立製作所 filed Critical 株式会社日立製作所
Priority to US13/379,416 priority Critical patent/US9394514B2/en
Priority to KR1020147013020A priority patent/KR20140069360A/ko
Priority to KR1020137030552A priority patent/KR20130133094A/ko
Priority to KR1020117030767A priority patent/KR101512878B1/ko
Priority to EP10791844.3A priority patent/EP2447354B1/en
Priority to KR1020147013022A priority patent/KR101454580B1/ko
Priority to CN201080028089.2A priority patent/CN102803466B/zh
Publication of WO2010150521A1 publication Critical patent/WO2010150521A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/08—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing artificial tissue or for ex-vivo cultivation of tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/06—Plates; Walls; Drawers; Multilayer plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0062—General methods for three-dimensional culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2535/00—Supports or coatings for cell culture characterised by topography
    • C12N2535/10—Patterned coating

Definitions

  • the present invention relates to a technique for cultivating animal and plant cells using a culture device to form a spherical tissue (three-dimensional tissue) and a single-layered tissue (two-dimensional planar tissue).
  • Non-patent Document 1 Non-patent Document 1
  • a culture sheet (nano pillar sheet) formed on a sheet surface in which ultra-fine uniform protrusions are regularly arranged has been developed.
  • the three-dimensional structure is highly peelable from the equipment (Patent Document 1), and there is a problem that it is lost during the medium exchange process.
  • Patent Document 1 since the diameter of the formed three-dimensional structure cannot be controlled, the size is not uniform, and the performance of each three-dimensional structure varies. As a practical forming method, Still immature.
  • a technique in which a microcavity structure is provided in a culture device and one three-dimensional tissue is formed per cavity has been developed (Patent Document 2, Non-Patent Document 2).
  • a cell adhesion region and a cell non-adhesion region are defined by applying an adhesive substance to a predetermined region near the center of the bottom of the cavity, and the cavity itself is rotated by a rotary drive device or the like to perform rotation culture.
  • the cultured cells are held near the center of the bottom surface of the cavity, which is a cell adhesion region.
  • Non-patent Document 3 This nanopillar culture sheet is intended to control the diameter of the formed spheroids by making the surface of the device to which cells adhere to have a three-dimensional uneven structure.
  • JP 2005-312343 A Japanese Unexamined Patent Publication No. 2006-121991
  • An object of the present invention is to form a three-dimensional tissue having a uniform diameter without applying a chemical substance on the surface of a culture device, and further to hold the three-dimensional tissue in a target position,
  • An object of the present invention is to provide a culture device and a cell culture method using the same.
  • the present invention has a culture region, a plurality of protrusions are formed in the culture region, and a partition higher than the protrusions is formed around the culture region. I will provide a.
  • a culture device for culturing cells a plurality of culture regions, a plurality of protrusions formed in each culture region, and a partition that divides each culture region are higher than the protrusions
  • a culture device comprising a culture sheet provided with a partition having a height and a culture sheet holding part for holding the culture sheet is provided.
  • a cell culture method using a culture device a plurality of culture regions having a plurality of protrusions inside and a partition higher than the protrusions are provided around the method.
  • a cell culture sheet in which tissue is held at a target position within an area defined by a partition.
  • a culture device for culturing cells comprising a culture sheet and a culture sheet holding part for holding the culture sheet, wherein the culture sheet has a plurality of protrusions.
  • a culture device having a culture region including a first region that is formed and a second region in which the protrusion is not formed and partitioning the culture region and having a partition with a height higher than the protrusion is provided.
  • the size of the plurality of three-dimensional tissues formed for each limited region is uniform, uniform, and effective for cell assays.
  • the three-dimensional structure is held at a target position in a limited area called a partition. Furthermore, a two-dimensional planar structure can be formed according to the purpose. The same effect is expected for a two-dimensional planar structure.
  • FIG. 4 is a partially enlarged view and an end view of the culture equipment in the first embodiment, showing an enlarged view of EE and FF, and an end view taken along the line GG. It is a figure which shows the external appearance perspective view and bottom view of the culture equipment in a 2nd Example. It is a figure which shows the upper side figure of the culture equipment in a 2nd Example, and an up-and-down side view.
  • FIG. 4 is a partial enlarged view and a partial sectional view of a culture device in a second embodiment, showing an AA, BB partial enlarged view, a CC, DD partial enlarged view, and an HH sectional view.
  • FIG. It is the elements on larger scale and the end view of the culture equipment in the 2nd example, it is the figure which shows the EE, FF partial enlarged view and the GG line end view. It is a figure which shows the hole structure in a culture sheet and a culture sheet concerning the 5th, 6th Example. It is a figure which shows the hole structure in a culture sheet and a culture sheet concerning the 5th, 6th Example.
  • Example 1 shows an example in which a culture sheet is applied to a chamber slide that is a culture sheet holding member.
  • a culture sheet a sheet having a partition structure for forming the culture region in the present invention and having a plurality of protrusions formed in the partition structure with respect to the conventional nanopillar sheet is referred to as a culture sheet.
  • the culture sheet is made of a material that does not adversely affect cells, and in this example, is made of polystyrene. However, it goes without saying that the material is not limited to polystyrene.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a scanning electron micrograph of the culture sheet 100 prepared in this example.
  • a hole constituted by a plurality of partition structures 102 existing per culture sheet.
  • the inside of the hole 101 constitutes a culture region in a cell tissue forming unit.
  • the plurality of protrusions 102 held on the bottom surface of the hole 101 includes a plurality of minute protrusions 103 (hereinafter also referred to as protrusions, pillars, and nanopillars).
  • the diameter of the hole 101 is a hole diameter 105.
  • the hole 101 provided with the partition wall 102 and the plurality of protrusions 103 formed inside the hole 101 are integrally formed of the same material.
  • the hole 101 is not limited to a round shape, and may be another shape such as a square shape.
  • the hole 101 having the partition wall 102 and the plurality of protrusions 103 formed inside the hole 101 are integrally formed as a culture sheet 100 with a single material that does not adversely affect the cells.
  • the cells can be grown without adhering foreign substances to the cells. Furthermore, since the cells grow in the individual partitions, it becomes possible to form cells of a uniform size.
  • the cell movement which is the ability that the cell originally holds, is promoted and grown by the movement, thereby causing disturbance (such as rotation culture) Cell culture that maintains cell activity is possible without the influence of stress.
  • an adhesive component may be mixed inside the culture region, which may adversely affect the produced cells.
  • the inner diameter of the hole 101 is a very small area diameter at a cell forming level, it is quite difficult to weld without damaging the partition and protrusion while forming the target cell area. If the partition or protrusion is damaged or deformed, unnecessary stress may be applied to the cell during the cell formation process or the movement of the cell itself may be obstructed.
  • the hole bottom surface 104, the partition wall 102, and the protrusion 103 constituting the hole 101 forming the culture region are integrally formed.
  • integrally forming in this way it is possible to perform culture that eliminates the influence of unnecessary components other than those necessary for cell culture, which is preferable.
  • the pillar diameter is the diameter of the tip of the protrusion (106 in the figure).
  • the pillar pitch refers to the distance from the center of the protrusion tip to the center of the adjacent protrusion tip (107 in the figure).
  • the pillar height refers to the height from the tip to the bottom of the nanopillar (108 in FIG. 2).
  • pillar diameters, pillar pitches, and pillar heights were 2.0 ⁇ m, 4.0 ⁇ m, and 1.0 ⁇ m, respectively.
  • other culture sheets may be used.
  • the height of the partition structure is 70 ⁇ m.
  • the height is not limited to this value, and may be preferably a height that does not allow the formed cells to get over the partition.
  • the culture sheet 100 in this example is produced by the method described below.
  • a 400- ⁇ m-thick polystyrene mold having a circular hole with a diameter of 200 ⁇ m and a depth of 70 ⁇ m arranged in a square shape and micro-holes with a diameter of 2.0 ⁇ m and a depth of 1.0 ⁇ m formed on the bottom surface at a pitch of 4.0 ⁇ m.
  • the film was pressed at 135 ° C. and a pressure of 2 MPa. After cooling to room temperature, it is taken out from the press device, and the mold is peeled from the polystyrene film, whereby a culture sheet having a plurality of holes having a hole diameter of 200 ⁇ m and having a plurality of protrusions on the bottom surface can be produced.
  • the mold material is a silicon wafer, and a mold release treatment is performed in advance with a fluorine-based mold release agent in order to prevent adhesion with the polystyrene film during the production of the culture sheet.
  • the mold material is a silicon wafer, but other metal molds may also be used.
  • the culture sheet 100 thus produced by integral molding using a single material is cut into a 2 cm square in this example, and a surgical adhesive 110 is applied to the glass bottom surface of the chamber slide 109.
  • the chamber slide 109 to which the culture sheet 100 is affixed is produced by bonding them together.
  • reference numeral 109a denotes a frame for dividing each culture sheet 100.
  • the frame 109a is formed of, for example, a plastic material.
  • the shape of the frame body such as the frame 109a is not limited to a rectangular shape, and may be other shapes such as a round shape.
  • FIGS. 13A to 13C show an overall configuration diagram and a cross-sectional view of the main part of a chamber slide to which the culture sheet of this example is attached.
  • FIG. 13A is an external perspective view, a top view, and a top and bottom side view of a culture device in the present example. Since the form of the left and right side views is clear from the perspective view, the illustration is omitted.
  • FIG. 13B is a partially enlarged view, showing a partially enlarged view of AA and BB and a partially enlarged view of CC and DD.
  • FIG. 13C is a partially enlarged view and an end view, and shows an EE, FF partially enlarged view, and a GG line end view.
  • the article shown in FIGS. 13A to 13C is a culture material (culture container) for culturing cells of humans, animals, plants, and the like, and includes a culture sheet 100 and a holding portion (chamber slide) 109 for holding the culture sheet 100.
  • a plurality of partition portions 102 are formed on the surface of the culture sheet 100 and are provided on the inner bottom surface of a cylindrical hole portion 109 a formed in the holding portion 109.
  • a culture region having a plurality of fine protrusions 103 is formed inside the partition.
  • a target cell to be cultured is added to the inside of the hole 109a so as to be added to the sheet surface forming the culture region in the partition part 102, the target cell is held by the plurality of fine protrusions 103 and cultured. Will be.
  • FIG. 4A is a bottom view of the frame body 111 constituting the multi-well plate.
  • the frame body 111 as a culture sheet holding member is formed with a cylindrical hole portion 111a having a total of 24 holes of 4 holes in a column and 6 holes in a row in a width of about 125 mm, a length of about 80 mm, and a height of about 20 mm.
  • the material is polystyrene.
  • the number of holes formed in the frame body is normally selected from 6 holes to 1536 holes depending on the application, the number of holes in this frame body is not limited to 24 holes.
  • the material of the frame is not limited to polystyrene.
  • the frame body 111 and the culture sheet 100 are joined by ultrasonic welding.
  • a film fixing protrusion 112 is formed on the bottom surface of the frame body 111. Is processed. Second, a rib structure 113 is provided to weld the culture sheet with ultrasonic waves.
  • FIGS. 4B and 4C are cross-sectional views taken along lines B-B ′ and A-A ′ of FIG. Moreover, the hole 114 of the same diameter is provided in the culture sheet so that the fixing protrusion for film may fit in the same position when both are piled up. Subsequently, the frame and the culture sheet 100 are bonded together by ultrasonic welding.
  • FIG. 5 The process is shown in FIG. First, the film fixing projections of the frame and the holes of the culture sheet are aligned and overlapped ((a) of FIG. 5). Subsequently, ultrasonic waves are generated from the culture sheet side from the ultrasonic oscillator through a converter, a booster, and further a horn, and both are welded ((b) of FIG. 5).
  • a horn is a device that welds by applying ultrasonic waves of appropriate energy to appropriate positions, and a dedicated device designed to generate ultrasonic waves appropriately along the position of the rib structure was used.
  • Reference numeral 115 shows a top view of the plate thus manufactured.
  • the frame and the culture sheet were joined using ultrasonic welding, but it goes without saying that this method is not limitative.
  • Ultrasonic welding can realize the formation of plates without the presence of organic substances such as adhesives that affect cells, so there is no adverse effect on cells, not only toxicity and metabolism tests in the new drug development process, but also tissues for regenerative medicine Needless to say, it is a useful culture sheet that can also be applied in formation.
  • a plurality of rib structures are provided at the bottom of the frame 109a, and welding with the culture sheet 100 is performed using the rib structures.
  • the culture equipment can be produced by the same joining method as in FIG.
  • a plurality of holes 101 are formed in the culture sheet 100 formed on the bottom surface of the frame body 111, and a plurality of protrusions configured on the bottom surface 104 of the hole include a plurality of protrusions.
  • the diameter of the hole 101 is a hole diameter 105.
  • the hole 101 provided with the partition wall 102 and the plurality of protrusions 103 formed inside the hole 101 are integrally formed of the same material.
  • the hole 101 is not limited to a round shape, and may be another shape such as a square shape.
  • the hole 101 provided with the partition wall 102 and the plurality of protrusions 103 formed inside the hole 101 are integrally formed as a culture sheet, Cells can be grown in the culture process without adhesion of foreign substances to the cells.
  • an adhesive component may be mixed inside the culture region, which may adversely affect the produced cells.
  • the inner diameter of the hole 101 is a very small region at the cell formation level, it is quite difficult to weld without damaging the partition and protrusion while forming the target cell region. . If the partition or protrusion is damaged or deformed, unnecessary stress may be applied to the cell during the cell formation process or the movement of the cell itself may be obstructed.
  • the hole 101 and the protrusion 103 forming the culture region are integrally formed.
  • FIG. 14A to FIG. 14D an overall configuration diagram and a cross-sectional view of the main part of a multiwell plate with a culture sheet of this example are shown.
  • FIG. 14A shows an external perspective view and a bottom view of the culture equipment in this example.
  • FIG. 14B shows a top view and top and bottom side views of the culture equipment.
  • FIG. 14C is a partially enlarged view and a partially sectional view, showing an AA and BB partially enlarged view, a CC and DD partially enlarged view, and a HH sectional view.
  • FIG. 14D is a partially enlarged view and an end view, and shows an enlarged view of EE and FF, and an end view taken along the line GG.
  • the article shown in FIGS. 14A to 14D is a culture material (culture container) for culturing cells of humans, animals, plants, and the like, and includes a culture sheet 100 and a holding portion (frame body) 111 that holds the culture sheet 100. It is composed of
  • a plurality of holes 101 are formed on the surface of the culture sheet 100, and are provided on the inner bottom surface of a cylindrical hole portion 111a formed in the holding portion.
  • a culture region having a plurality of fine protrusions 103 is formed inside the partition.
  • the target cell to be cultured is added to the inside of the hole 111a so as to be added to the sheet surface forming the culture region in the hole 101, the target cell is cultured while being held by the plurality of fine protrusions 103. Will be.
  • the culture equipment of this example shows an example in which the culture sheet is welded from the back surface of the frame body 111, and the frame body 111 and the culture sheet 100 that are the holding parts are welded via the joint portion 1112. .
  • the joint 1112 is provided outside the hole 111a, and the culture region is not affected by the welding.
  • the frame body 111 has a quadrangular shape, and at least one of the four vertices is cut.
  • this cut surface 1113 By forming this cut surface 1113, there is an effect that it becomes easy for the operator who performs culture to specify the position of the equipment hole. It goes without saying that the cut surface is not essential and may be omitted.
  • the culture equipment is also provided with a non-slip 1111 so that an operator can prevent the equipment from being swung or dropped unexpectedly during the work.
  • Example 3 shows an application example to tissue culture of cells using the culture equipment prepared in Examples 1 and 2.
  • the construction of three-dimensional tissues that reflect biological functions is in demand for various evaluations using cells instead of animal experiments.
  • induced pluripotent stem cells Induced pluripotent stem cells: iPS cells
  • embryonic stem cells Embryonic stem cells: ES cells
  • a technique for easily constructing a three-dimensional tissue is also desired in the field of regenerative medicine. From such a background, an example of forming a three-dimensional tissue using a chamber slide is shown here, but the essential part of cell culture is not particularly changed even in a multiwell plate. In the present embodiment, an example using rat hepatocytes is shown, but it can be applied to various animal and plant cell types as described above, and the cell types are not particularly limited.
  • Preparation of hepatocytes follows the in situ collagenase perfusion method. Details are as follows. Fisher 344 male rats (7-10 weeks old) are laparotomized under pentobarbital anesthesia, a catheter is inserted into the portal vein, and preperfusion fluid (Ca 2+ and Mg 2+ free, Hanks solution containing EGTA) is injected. To do.
  • the lower vena cava below the liver is incised to release blood.
  • the chest cavity is opened, the inferior vena cava entering the right atrium is incised, and the inferior vena cava below the liver is stopped and perfusion is performed. After confirming that blood removal from the liver is sufficient, stop perfusion. Replace the perfusate with the collagenase solution and perform perfusion.
  • perfusion is performed using Hank's solution containing 0.05% collagenase, but this is not restrictive. After confirming that the intercellular tissue has been digested by collagenase, the perfusion is stopped. The liver is cut off, minced in cold Hanks solution, and dispersed to cells by pipetting. The undigested tissue is then removed by gauze filtration. The cell suspension is centrifuged several times at 50G for 1 minute to remove non-parenchymal cells. The injured hepatocytes are then removed by centrifugation at 500 G for 5 minutes using isotonic Percoll solution.
  • the survival rate of the obtained hepatocytes is measured by trypan blue exclusion method, and hepatocytes having a survival rate of 85% or more are used for culture.
  • hepatocytes having a survival rate of 85% or more are used for the culture, but it is needless to say that the conditions are not necessarily limited thereto.
  • the preparation of hepatocytes is not necessarily limited to the in situ collagenase perfusion method.
  • FIG. 6 shows a flowchart of the culture using the hepatocytes obtained in this way.
  • type I collagen 116 is applied to the chamber slide type culture sheet prepared in Example 1.
  • 1-1.5 mL of a diluted solution obtained by diluting type I collagen dissolved in a weakly acidic solution with sterilized water to a predetermined concentration is added to the above-mentioned chamber slide ((a) in the figure).
  • a decompression operation is performed ((b) in the figure).
  • the decompression operation is performed at 0.04 atm or less using the decompression vessel 117 and the decompression pump 118.
  • the decompression time is not particularly limited, but is performed for 10 minutes in this embodiment.
  • the apparatus configuration used for decompression is not particularly limited.
  • the range of the predetermined concentration of the diluent is from 100 (ng / ml) to 10 ( ⁇ g / ml). Although not necessarily limited to the range, the range is suitable for forming a spherical three-dimensional structure. Finally, excess type I collagen is removed and PBS ( ⁇ ) 119 is added ((c) in the figure). This operation is performed three times to wash away excess type I collagen.
  • Hepatocytes 120 prepared by the in situ collagenase perfusion method as described above are suspended in the medium 121 and seeded on an NP sheet coated with type I collagen prepared as described above (FIG. (D)).
  • the medium is not particularly limited, but Williams E medium containing a medium containing serum (FCS), insulin, and dexamethasone (hereinafter, medium (including 10% FCS)) is used. In this example, Williams E medium containing 10% FCS, 8.6 nM insulin, 255 nM dexamethasone is used.
  • culture is started using a CO 2 incubator under conditions of 5% CO 2 and 37 ° C. After 18 hours or longer, the first medium change is performed, and thereafter the medium is changed every 24 hours.
  • the medium used for culturing after 18 hours after seeding is not particularly limited, but in this example, a medium obtained by removing FCS from a medium (including 10% FCS) (hereinafter, medium (excluding FCS)) is used. Use.
  • the seeding density of hepatocytes is 1 ⁇ 10 5 cells / ml in this example, but is not limited to this concentration.
  • the culture sheet 100 used for the culture has a pillar height, a pillar diameter, and a pillar pitch of 1.0 ⁇ m, 2.0 ⁇ m, and 4.0 ⁇ m, respectively, but is not limited to this value.
  • the concentration of type I collagen added to the culture sheet is 100 (ng / ml) in the present embodiment, but other concentrations may be used. Depending on cell conditions, spheroids may be formed even at concentrations other than this concentration.
  • a three-dimensional tissue 122 is formed ((e) in the figure).
  • FIG. 7 shows a photograph of the results of actual culture of hepatocytes using the above culture sheet having a hole diameter of 200 ⁇ m.
  • a spherical three-dimensional tissue with such a uniform size was formed by static culture without applying any special chemical substance to the surface of the culture sheet and with less stress on the cells. This is an effective culture method for cell assays and the like because it is considered that the activity of cells originally retained is not lost.
  • FIG. 8 shows a modified example of the above-described culture sheet 100 as Example 4.
  • the culture sheet 123 surrounds the first arrangement pattern 125a with the second arrangement pattern 125b, as shown in FIG. 5A, in the arrangement pattern of the protrusions that cause the difference in cell migration and adhesion.
  • An example in which a three-dimensional structure or a two-dimensional planar structure is formed on the first array pattern 125a (for example, near the center of the hole) by arranging in two stages as described above will be shown.
  • the second array pattern 125b is arranged in two stages so as to be surrounded by the first array pattern 125a.
  • An example is shown in which a three-dimensional structure or a two-dimensional planar structure is formed on the hole edge.
  • Reference numeral 124 denotes a hole as in the previous embodiment. The dotted line indicates the boundary of the pattern.
  • pillar patterns protrusion arrangement patterns
  • FIG. 9 11 kinds of arrangement patterns were exemplified.
  • FIGS. 10A and 10B An example of hepatocytes cultured under these pillar patterns is shown in FIGS. 10A and 10B.
  • FIG. 10A is a diagram showing a state of cells when culturing is performed using the culture sheet 100 having a pitch twice as large as the pillar diameter.
  • the pillar diameter is 0.18 ⁇ m, 0.5 ⁇ m, and 1.0 ⁇ m, a non-spherical flat structure is adhered to the bottom of the device, while at 2.0 ⁇ m and 5.0 ⁇ m, the device is spherical. A three-dimensional structure was formed.
  • the 2.0 ⁇ m device was more stable because the cells were adhered to the device. That is, with respect to cell adhesion, it can be seen that the larger the pillar diameter, the lower the adhesion and the more the cell migration is promoted.
  • FIG. 10B is a diagram showing the results of collecting the numbers of three-dimensional tissues (spheroids) of hepatocytes formed with sheets at each pillar diameter for each diameter formed.
  • the sheet area is 4 cm 2 (2 cm ⁇ 2 cm).
  • the pillar diameter is preferably In the case of a 2.0 ⁇ m device, it can be seen that the number of cells of that size is the most suitable.
  • the pillar diameter is 2.0 ⁇ m in order to form cells having a diameter of 50-100 microns.
  • the present invention is not limited to this. It was found that many cells having a stable shape were formed in the pillar diameter as compared with a flat state in which no pillar was formed. As described above, the form of the cells or the tissue formed from the cells or the adhesiveness to the device can be freely changed by the difference in the pillar pattern.
  • the second array pattern having a large pillar diameter (pillar pitch) is surrounded by the second array pattern having a small pillar diameter (pillar pitch).
  • FIG. 11 (a) shows a culture sheet 130 which is a modified example in which the heights of the nanopillars are gradually changed.
  • the presence of the pillar has an effect of holding the cell in the center.
  • the culture sheet 131 in FIG. 5B it is possible to promote the above-described effect by providing a difference in the pillar diameter even in the inclination.
  • the height is changed stepwise so that the slope is smooth, but a configuration may be adopted in which the height is changed sequentially in a staircase pattern.
  • a plurality of holes gather to form the culture surface (square shape for chamber slides, round shape for plates).
  • the three-dimensional structure is formed at the edge. That is, despite the fact that a three-dimensional tissue is formed at the center of the culture surface, the amount of medium in the portion increases due to surface tension at the marginal part, the oxygen supply amount decreases, or high water pressure is applied. There is a possibility that a three-dimensional structure may not be formed.
  • culture sheets 132 and 133 having a hole structure only at the center of the culture surface as shown in FIGS. 12 (a) and 12 (b) may be produced.
  • FIG. 15A, FIG. 15B, and FIG. 15C show the culture sheet of the fifth example.
  • the spheroid which is a three-dimensional tissue with a uniform diameter, is held at the center of the culture region corresponding to the first region, and can be held at the target position.
  • protrusions are arranged in the vicinity of the center in the culture region, but it is not always necessary to include the center, and it goes without saying that the protrusions may be arranged in a desired region in the culture region.
  • a substantially rhombic projection region is formed, it is needless to say that it may be circular, square, or polygonal.
  • the culture sheet 150 was applied to a chamber slide as a culture sheet holding member.
  • the partition wall 152 which is a partition structure on the culture sheet.
  • the pillar height, pillar diameter, pillar pitch are 1.0 ⁇ m, 2.0 ⁇ m, and 4.0 ⁇ m, respectively.
  • FIG. 15A is a schematic diagram of a scanning electron micrograph of the culture sheet 150 prepared in this example, and at the same time, one structure of a hole 151 constituted by a plurality of partition structures 152 existing per culture sheet. Indicates.
  • the inside of the hole 101 constitutes a culture region in a cell tissue forming unit as in the above-described embodiment.
  • the plurality of protrusions 153 held on the bottom surface of the hole 151 are composed of a plurality of minute protrusions.
  • the diameter of the hole 151 is a hole diameter 155.
  • the hole 151 provided with the partition wall 152 and the plurality of protrusions 153 formed inside the hole 151 are integrally formed of the same material.
  • the hole 151 is not limited to a round shape, and may be another shape such as a square shape, as in the above-described embodiment.
  • the culture sheet 150 is made of a material that does not adversely affect the cells, and is made of polystyrene in this example. However, it goes without saying that the material is not limited to polystyrene.
  • the hole 151 having the partition wall 152 and the plurality of protrusions 153 formed inside the hole 151 are integrally formed as the culture sheet 150 with a single material that does not adversely affect the cells.
  • the cells can be grown without adhering foreign substances to the cells. Furthermore, since the cells grow in the individual partitions, it becomes possible to form cells of a uniform size.
  • the cell movement which is the ability originally held by the cell, is promoted and grown by the movement, thereby causing stress due to rotational culture or the like.
  • the cell culture can be performed while maintaining the cell activity without the influence of the disturbance.
  • the hole bottom surface 154, the partition wall 152, and the protrusion 153 constituting the hole 151 forming the culture region are integrally formed.
  • the height of the partition wall 152 that is a partition structure is, for example, 70 ⁇ m.
  • the height is not limited to this value, and may be preferably a height that does not allow the formed cells to get over the partition.
  • the culture sheet 150 in this embodiment is manufactured by the same method as in the first embodiment, detailed description of the manufacturing method is omitted here.
  • a chamber slide 109 to which the culture sheet 150 is affixed as shown in FIG. 3 can be produced, and the overall configuration and the cross-section of the main part are the same as those in FIGS. 13A, 13B, and 13C. Needless to say, the chamber slide can be obtained, and the description thereof is omitted here.
  • Example 6 is an example showing a configuration of a multi-well plate with a culture sheet 150 using the culture sheet 150 described in the fifth example, and a production example thereof.
  • the structure of the multi-well plate and the manufacturing example thereof have been described in detail with reference to FIG. 4 and FIG. 5.
  • the basic structure is the same except that the culture sheet 150 is used instead of the culture sheet 100 used in the second embodiment.
  • the second embodiment is the same as the second embodiment.
  • FIG. 4 is a bottom view of the frame body 111 constituting the multi-well plate.
  • the frame body 111 as a culture sheet holding member is formed with a cylindrical hole portion 111a having a total of 24 holes of 4 holes in a column and 6 holes in a row in a width of about 125 mm, a length of about 80 mm, and a height of about 20 mm.
  • the material is polystyrene.
  • the number of holes formed in the frame body is normally selected from 6 holes to 1536 holes depending on the application, the number of holes in this frame body is not limited to 24 holes.
  • the material of the frame is not limited to polystyrene.
  • the frame body 111 and the culture sheet 150 of FIG. 15A are joined by ultrasonic welding.
  • the following processing and configuration are the same as those in the second embodiment.
  • a plurality of holes 151 are formed in the culture sheet 150 described with reference to FIG. 15A instead of the culture sheet 100 formed on the bottom surface of the frame 111 in the culture equipment thus created.
  • the plurality of configured protrusions includes a plurality of minute protrusions 153.
  • the diameter of the hole 151 is a hole diameter 155.
  • the hole 151 provided with the partition wall 152 and the plurality of protrusions 153 formed inside the hole 151 are integrally formed of the same material.
  • the hole 151 is not limited to a round shape, and may be another shape such as a square shape.
  • the hole 151 provided with the partition wall 152 and the plurality of protrusions 153 formed inside the hole 151 are integrally formed as a culture sheet, Cells can be grown in the culture process without adhesion of foreign substances to the cells. Furthermore, since the cells grow in the individual partitions, it becomes possible to form cells of a uniform size. In addition, since a plurality of protrusions are provided inside the enclosed partition, it promotes cell movement, which is the ability that cells originally hold, and grows by the movement, thereby causing disturbance (stress) due to rotation culture etc. Thus, cell culture that maintains cell activity is possible.
  • the hole 151 forming the culture region and the plurality of protrusions 153 are integrally formed.
  • integrally forming in this way it is possible to perform culture that eliminates the influence of unnecessary components other than those necessary for cell culture, which is preferable.
  • FIGS. 14A, 14B, 14C, and 14D Since the overall configuration diagram and cross-sectional view of the main part of the multiwell plate with culture sheet of this example are as shown in FIGS. 14A, 14B, 14C, and 14D as in Example 2, the description thereof is omitted here. To do.
  • Example 3 an example of application to cell tissue culture using the culture apparatus prepared in Examples 1 and 2 was shown. The difference between the present Example and Example 3 is that the culture sheet 100 is different. Instead, the culture equipment using the culture sheet 150 is used. The other points are the same in description, and the description is omitted here.
  • FIG. 18 shows the results of measuring the distance between the center of the hole 151 and the center of the spheroid using three kinds of sheets of the whole nanopillar in the hole 151, the pillar area 80 ⁇ m, and the pillar area 20 ⁇ m.
  • the horizontal axis indicates the spheroid width ( ⁇ m)
  • the vertical axis indicates the spheroid center distance ( ⁇ m).
  • the present invention is extremely useful as a technique for culturing animal and plant cells using a culture device to form a spherical tissue (three-dimensional tissue) and a single-layered tissue (two-dimensional planar tissue).

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Abstract

培養器材表面に化学物質を塗布することなく、直径の揃った三次元組織を形成さ せる技術を可能にする培養シートを提供する。培養器材の培養シート上に、複数のホールが形成され、各々のホールの底面である培養面には、細胞の接着性や遊走性を制御できるナノピラーが形成される。各ホールの培養面は、仕切り壁を設けた構造とし、内部のナノピラーを、各ホールの中心付近に形成することにより、播種された細胞の相互作用を制限し、形成される細胞の三次元構造の大きさを均一にすることが可能となる。

Description

培養器材、培養シート、及び細胞培養方法
　本発明は、培養器材を用いて動植物細胞を培養し、細胞の球状組織（三次元組織）、および単層組織（二次元平面組織）を形成する技術に関する。
　医薬品開発プロセスにおいて、動物実験に代わり、細胞を利用したイン・ビトロ（in vitro）アッセイが求められている。特に、薬剤候補物質のスクリーニング、毒性・代謝試験に応用する動きが活発になっている。
　このような背景のもと、従来の動物実験に代わる、細胞を利用した代替法のアプローチは盛んに試みられてきたが、臨床反応を予測するには限界があるものが多い。これは、これらの培養法では、細胞が実際の生体内の構造を模擬した構造を取っていないためであると考えられている（非特許文献１）。したがって、より生体に近い機能を発揮する三次元組織の構築がこれまでに試みられており、さまざまな細胞種で三次元組織を形成することに成功している。
　細胞の三次元組織を形成させるための器材として、極微細な均一突起が規則的に配列されたシート表面に形成された培養のためのシート（ナノピラーシート）が開発されているが、形成された三次元組織は、器材からの剥離性が高く（特許文献１）、培地交換の過程で失われるという問題がある。また形成された三次元組織の直径を制御することができないため、大きさが均一ではなく、それぞれの三次元組織の性能がばらつく、といった問題点をはらんでおり、実用的な形成法としては依然未熟である。
　そこで、培養器材に微小なキャビティ構造を設けて、そのキャビティあたりにひとつの三次元組織を形成させる技術（細胞組織体マイクロチップ）がこれまでに開発されている（特許文献２、非特許文献２）。本技術ではキャビティ底面の中央付近に対し、接着性を有する物質を所定領域に塗布することにより、細胞接着領域と細胞非接着領域を規定し、キャビティそのものを回転駆動装置等により回転させ、回転培養を実行することで細胞接着領域たるキャビティ底面の中央付近に培養細胞が保持されることを特徴としている。
　また、本発明者等は、直径の揃ったスフェロイド形成を目的とし、ナノピラー培養シートの検討を進めている（非特許文献３）。このナノピラー培養シートは、細胞が接着する器材表面を３次元的は凸凹構造とすることにより、形成されるスフェロイドの直径を制御しようとするものである。
特開2005-312343号公報 特開2006-121991号公報
"The Use of 3-D Cultures for High-Throughput Screening: The Multicellular Spheroid Model"Leoni A. Kunz-Schughart, James P. Freyer, Ferdinand Hofstaedter, and Reinhard Ebner　J Biomol Screen, 9: 273-285 (2004) "Orderly arrangement of hepatocyte spheroids on a microfabricated chip." J Fukuda and K Nakazawa Tissue Eng, 11:1254-62 (2005) "Formation of Hepatocyte Spheroids with Structural Polarity and Functional Bile Canaliculi Using Nanopillar Sheets." R Takahashi, H Sonoda, Y Tabata and A Hisada, Tissue Eng Part A, 1-45 (Mar 4, 2010)
　このような特長を持つ細胞組織体マイクロチップであるが、細胞を器材表面の特定部分に強制的に接着させるために、器材表面に化学的に合成された物質を塗布して細胞接着領域と細胞非接着領域を規定しなければならず、これによりいくつかの課題が挙げられる。
　まず、塗布されたこれらの化学物質は細胞の成育に悪影響を及ぼす可能性があるばかりでなく、この操作は極微小な領域に化学物質を塗布ないし接着する必要があることから非常に煩雑な作業となり、製造コストもかかる。
　また、播種された細胞が非接着領域に落ち込んだ場合、培養時の培地交換の際に培地と共に破棄され失われることが必至であり、効率的な培養方法とは言い難い。さらに接着領域に落ち込んだ細胞が回転培養により強制的に組織を形成させられるため、細胞に対するストレスがかかり活性の低下を招くことが懸念されている。
　一方、従来のナノピラーシートにおいても、器材面上で細胞運動を制御することが困難であり、形成される三次元組織の大きさ・直径を制御することができても、形成された三次元組織を目的の場所に保持させることができない。
　本発明の目的は、培養器材の表面に化学物質を塗布することなく、直径の揃った三次元組織を形成し、さらに三次元組織を目的の位置に保持させることを可能にする、培養シート、培養器材、及びそれを用いた細胞培養方法を提供することにある。
　上記の目的を達成するため、本発明においては、培養領域を有し、培養領域内に複数の突起が形成され、培養領域の周囲に培養領域を仕切る、突起よりも高い仕切りが形成された構成を提供する。
　また、上記の目的を達成するため、本発明においては、細胞を培養する培養器材として、複数の培養領域と、培養領域各々に形成された複数の突起と、培養領域各々を仕切る、突起より高い高さを有する仕切りを備えた培養シートと、この培養シートを保持する培養シート保持部とを備えた培養器材を提供する。
　更に、上記の目的を達成するため、本発明においては、培養器材を用いた細胞培養方法として、その内部に複数の突起を有し、その周囲に突起より高い仕切りを有する培養領域を複数備えた培養シートを用い、これら複数の培養領域に培養対象の細胞を播種することにより、培養領域各々で細胞の三次元組織を形成させる細胞培養方法を提供する。
　また更に、上記の目的を達成するため、本発明においては、複数の培養領域と、培養領域に形成される複数の突起と、培養領域各々を仕切る、突起より高さの高い仕切りを備え、各培養領域内に第一と第二の領域と有し、第一の領域における突起の幅、直径あるいはピッチと、第二の領域における突起の幅、直径あるいはピッチとが異なり、形成される三次元組織が仕切りによって限定された領域内の目的の位置に保持される、細胞の培養シートを提供する。
　更にまた、上記の目的を達成するため、本発明においては、細胞を培養する培養器材であって、培養シートと、培養シートを保持する培養シート保持部とを備え、培養シートは突起が複数形成された第一の領域と、該突起が形成されていない第二の領域とを含む培養領域を有し、培養領域を仕切る、突起よりも高い高さの仕切りが形成されている培養器材を提供する。
　本発明を適用することによって、単一素材のみを用い、細胞本来の機能である細胞運動を促して活性を維持したままストレスの少ない環境下での三次元組織形成を実現することができる。
　また、仕切りという限定領域を同一素材で一体的に設けることにより、その限定領域内に播種された細胞が全て一つの三次元組織形成に関わることになり、非常に効率的な培養方法であるばかりではなく、それぞれの限定領域毎に形成された複数の三次元組織の大きさが均一で、均質であり、細胞アッセイに有効であることが期待される。
　更に、三次元組織が仕切りという限定領域内の目的の位置に保持されることが期待される。更に、目的に応じて二次元平面組織を形成させることも可能である。二次元平面組織に対しても同様の効果が期待される。
第１の実施例に係わる、培養シートと培養シート内のホール構造を示す図である。 第１の実施例に係わる、ナノピラー構造を示す図である。 第１の実施例に係わる、培養シートを貼付したチャンバースライドを示す図である。 第２の実施例に係わる、プレート枠体の構成を示す図である。 第２の実施例に係わる、プレートと培養シートの超音波溶着フローを説明するための図である。 第３の実施例に係わる、肝細胞培養のフローチャートを示す図である。 第３の実施例に係わる、肝細胞培養フローによる培養シートによる肝細胞三次元組織写真を示す図である。 第４の実施例に係わる、二段階、多段階ナノピラー培養シートを示す図である。 各実施例のナノピラーの配列パターンの種類を示す図である。 図９に示したピラー径が異なる培養シートを使用した場合の細胞培養結果(細胞の様子)を示す図である。 図９に示したピラー径が異なる培養シートを使用した場合の細胞培養結果(形成細胞数)を示す図である。 培養シートの実施例の変形例である、傾斜ナノピラー培養シートを示す図である。 培養シートの実施例の変形例である、表面張力回避パターン培養シートの１ウェルを示す図である。 第１の実施例における培養器材の外観斜視図、上面図、上下側面図を示す図である。 第１の実施例における培養器材の部分拡大図であり、Ａ－Ａ，Ｂ－Ｂ部分拡大図と、Ｃ－Ｃ，Ｄ－Ｄ部分拡大図を示す図である。 第１の実施例における培養器材の部分拡大図、及び端面図であり、Ｅ－Ｅ，Ｆ－Ｆ部分拡大図、Ｇ－Ｇ線端面図を示す図である。 第２の実施例における培養器材の外観斜視図、底面図を示す図である。 第２の実施例における培養器材の上面図、上下側面図を示す図である。 第２の実施例における培養器材の部分拡大図、部分断面図であり、Ａ－Ａ，Ｂ－Ｂ部分拡大図と、Ｃ－Ｃ，Ｄ－Ｄ部分拡大図と、Ｈ－Ｈ断面図を示す図である。 第２の実施例における培養器材の部分拡大図、及び端面図であり、Ｅ－Ｅ，Ｆ－Ｆ部分拡大図、Ｇ－Ｇ線端面図を示す図である。 第５、６の実施例に係わる、培養シートと培養シート内のホール構造を示す図である。 第５、６の実施例に係わる、培養シートと培養シート内のホール構造を示す図である。 第５、６の実施例に係わる、培養シートと培養シート内のホール構造を示す図である。 第７の実施例に係わる、肝細胞培養フローによる培養シートによる肝細胞三次元組織写真を示す図である。 第７の実施例に係わる、肝細胞培養フローによる培養シートによる肝細胞三次元組織写真を示す図である。 第７の実施例に係わる、肝細胞培養フローによる培養シートによる肝細胞三次元組織の中心とホール構造との中心の間の距離を示す図である。
　以下、培養シートを用いて細胞を培養し、細胞塊である三次元組織、あるいは二次元平面組織の形成方法を実現するための最良の形態について、図面を用いて詳細に説明する。
　実施例１では、培養シートを培養シート保持部材であるチャンバースライドに適用した例を示す。以降、従来のナノピラーシートに対し、本発明における培養領域を形成する仕切り構造を有し、当該仕切構造の内部に突起物が複数形成されたシートを培養シートと記す。当該培養シートは細胞に悪影響の無い材質で形成され、本例では、ポリスチレンとしている。ただし、材質はポリスチレンに限らないことは云うまでもない。
　図１は本実施例で作成した培養シート１００の走査型電子顕微鏡写真の模式図である。
また同時に、培養シート１枚あたりに複数個存在する仕切り構造１０２により構成された孔１０１（以下、ホール）の一つの構造を示す。当該ホール１０１の内部が細胞組織形成単位での培養領域を構成する。
　ホール１０１の底面に保持されている複数の突起物１０２は、複数の微小突起物１０３（以下、突起、ピラー、ナノピラーともいう）からなる。また、このホール１０１の直径をホール径１０５とする。当該培養シート１００において、上記の仕切壁１０２を具備するホール１０１と、当該ホール１０１の内部に形成されている複数の突起１０３とは同一材料で一体的に形成されている。なお、このホール１０１は、丸型形状に限定されるものでなく、四角形状等他の形状であっても良い。
　このように細胞に悪影響の無い単一材料で、仕切壁１０２を具備したホール１０１と当該ホール１０１の内部に形成されている複数の突起１０３とが一体的に培養シート１００として形成されることにより、培養工程において細胞に異物が接着することなく細胞を成長させることができる。さらに個々の仕切内において細胞が成長するため、均一な大きさの細胞を形成させることが可能となる。
　また、囲み配置された仕切壁１０２の内部に複数の突起を設けているので、細胞が本来保持している能力である細胞運動を促し、当該運動により成長することで、回転培養等による外乱(ストレス)の影響なく、細胞活性を維持した細胞培養が可能となる。
　これらホール１０１と突起集合体１０３とを別体として培養領域を形成しようとすると、それらの接着、溶着による接合が必要となる。
　例えばこれらを接着接合した場合には、培養領域の内部に接着剤成分が混入し、生成細胞に悪影響を及ぼす可能性がある。また溶着接合では、ホール１０１の内径が細胞形成レベルの極微小領域径のため、目的とする細胞領域を形成しつつ、仕切、突起に損傷を与えずに溶着することはかなり困難である。当該仕切や突起に損傷、変形があると、細胞形成過程において細胞に不要なストレスを与えたり、細胞自身の運動に障害となる可能性がある。
　従って、培養領域を形成するホール１０１を構成するホール底面１０４、仕切り壁１０２および突起１０３とは一体的に形成されていることが望ましい。このように一体的に形成されることにより、細胞培養に必要な成分以外の不要成分の影響を排除した培養を実行することが可能となり好適である。
　次に、突起１０３の拡大図を図２に示す。ピラー径とは突起物先端部の直径を示す（同図の１０６）。ピラーピッチとは、突起物先端部の中心から、隣り合う突起物先端部の中心までの距離を示す（同図の１０７）。ピラー高さとは、ナノピラーの先端部から底部までの高さを示す（図２の１０８）。
　本実施例では、ピラー径、ピラーピッチ、ピラー高さはそれぞれ２．０μｍ、４．０μｍ、１．０μｍのものを使用したが、後述するように、これら以外の培養シートであっても構わない。本実施例では仕切り構造の高さは７０μｍであるが、この値に限らず、好適には形成される細胞が仕切りを乗り越えない程度の高さであれば良い。
　本実施例における培養シート１００は以下に述べる方法で作製する。
　直径２００μｍ、深さ７０μｍの円形の孔が正方配置され、その底面に直径２．０μｍ、深さ１．０μｍの微細孔が４．０μｍピッチで形成された金型を、４００μｍの厚さのポリスチレンフィルムに１３５℃、圧力２ＭＰａでプレスした。室温に冷却後にプレス装置より取り出し、金型をポリスチレンフィルムから剥離することにより、ホール径が２００μｍのホールを複数保持し、その底面に複数の突起を有した培養シートが作製できる。
　ここで型材はシリコンウェハであり、培養シート作製時におけるポリスチレンフィルムとの接着を防止するため、フッ素系の離型剤により離型処理を予め施している。本実施例では型材をシリコンウェハとしたが、その他金属材料等の金型であっても構わない。
　図３に示すように、このように単一素材で一体成型により作製された培養シート１００を、本例では２ｃｍ角にカットして、チャンバースライド１０９のガラス底面に手術用接着剤１１０を塗布して接着させることにより、培養シート１００が貼付されたチャンバースライド１０９を作製している。なお、図３において、１０９ａは各培養シート１００を区分ける枠を示す。この枠１０９ａは例えばプラスチック材などで形成される。なお、この枠１０９ａ等の枠体の形状は、四角形状に限らず、丸型形状等他の形状であっても良い。
　図１３Ａ－図１３Ｃにおいて、本自実施例の培養シートが貼付されたチャンバースライドの全体構成図及び要部断面図として示す。
　図１３Ａは本実施例における培養器材の外観斜視図、上面図、上下側面図である。左右側面図は斜視図よりその形態が明らかであるため図示を省略する。
  図１３Ｂは部分拡大図であり、Ａ－Ａ，Ｂ－Ｂ部分拡大図と、Ｃ－Ｃ，Ｄ－Ｄ部分拡大図を示すものである。
  図１３Ｃは部分拡大図、及び端面図であり、Ｅ－Ｅ，Ｆ－Ｆ部分拡大図、Ｇ－Ｇ線端面図を示すものである。
　図１３Ａ－図１３Ｃにおいて示される当該物品は、人や動物や植物などの細胞を培養する培養其材（培養容器）で、培養シート１００と培養シート１００を保持する保持部(チャンバースライド)１０９とから構成されており、培養シート１００の表面には複数の仕切り部１０２が形成されており、保持部１０９に形成された筒状の穴部１０９ａの内部底面に設けられている。
　更にその仕切り部の内部には複数の微細な突起部１０３を有する培養領域が夫々形成されている。仕切り部１０２内の培養領域を形成するシート面に添加されるように、培養する目的細胞を穴部１０９ａ内に対して添加すると、複数の微細な突起部１０３に保持されて当該目的細胞が培養されることになる。
　次に、第２の実施例を図４、図５に従い説明する。実施例２では培養シート付マルチウェルプレートの構成、及びその作製例を示す。図４の(a)はマルチウェルプレートを構成する枠体１１１の底面図である。培養シート保持部材である枠体１１１は、横幅約１２５ｍｍ、縦約８０ｍｍ、高さ約２０ｍｍの中に縦列に４穴、横列に６穴の計２４穴の筒状の穴部１１１ａが成型されたものである。素材はポリスチレンを用いている。
　枠体に形成される穴の数は、通常６穴から１５３６穴まで、用途によって使い分けるため、この枠体も穴の数は２４穴に限定されない。また枠体の素材もポリスチレンに限定されるものではない。
　当該培養器材の作製では、枠体１１１と培養シート１００を超音波溶着により接合させる。
　枠体１１１には予め、以下の処理を施しておく。まず一つ目は、枠体１１１と培養シート１００を溶着させる際に与える超音波の振動で細胞培養シートとプレートがずれてしまうのを防ぐ目的で、枠体１１１の底面にフィルム固定用突起１１２を加工する。二つ目は、培養シートを超音波で溶着させるためにリブ構造１１３を設けておく。
　図４の(b)、(c)は図４の(a)のＢ－Ｂ’、Ａ－Ａ’それぞれの断面図を示す。また、両者を重ねた際の同じ位置に、フィルム用固定突起が嵌るように培養シートに同じ径の穴１１４を設けておく。続いてこの枠体と培養シート１００を超音波溶着により接着する。
　その工程を図５に示す。まず枠体のフィルム固定用突起と培養シートの穴を合わせて、両者を重ねる（図５の（a））。続いて、超音波発振器から、コンバータ、ブースタ、さらにはホーンを介して培養シート側から超音波を発生させ、両者を溶着する（図５の（b））。ホーンとは、適切な位置に適切なエネルギーの超音波を当てて溶着させる装置であり、リブ構造の位置に沿って適切に超音波が発生されるように設計した専用装置を作製して使用した。１１５は、このようにして作製されたプレートの上面図を示している。
　本実施例では超音波溶着を用いて枠体と培養シートを接合したがこの方法に限定されないことは言うまでもない。超音波溶着では細胞に影響を与える接着剤のような有機物の介在ないしにプレート化が実現できるため、細胞に対する悪影響がなく、新薬開発プロセスにおける毒性・代謝試験のみならず、再生医療向けの組織体形成においても適用可能な有用な培養シートであることは言うまでもない。
　尚、実施例１において例示した図３のチャンバースライド形状の培養器材においても、枠１０９ａの底部にリブ構造を複数個設け、当該リブ構造により培養シート１００との溶着を行うことで、本実施例と同様の接合方法による培養器材を作成できることは言うまでもない。
　このようにして作成された培養器材において、枠体１１１の底面に形成された培養シート１００には、複数のホール１０１が形成され、当該ホール底面１０４に構成されている複数の突起物は、複数の微小突起物１０３（以下、突起、ピラー、ナノピラーともいう）からなる。また、このホール１０１の直径をホール径１０５とする。当該培養シート１００において、上記の仕切壁１０２を具備したホール１０１と、当該ホール１０１の内部に形成されている複数の突起１０３とは同一材料で一体的に形成されている。なお、このホール１０１は、丸型形状に限定されるものでなく、四角形状等他の形状であっても良い。
　このように細胞に悪影響の無い単一材料で、仕切壁１０２を具備したホール１０１と当該ホール１０１の内部に形成されている複数の突起１０３とが一体的に培養シートとして形成されることにより、培養工程において細胞に異物が接着することなく細胞を成長させることができる。
　さらに個々の仕切内において細胞が成長するため、均一な大きさの細胞を形成させることが可能となる。
　また、囲み配置された仕切の内部に複数の突起を設けているので、細胞が本来保持している能力である細胞運動を促し、当該運動により成長することで、回転培養等による外乱(ストレス)の影響なく、細胞活性を維持した細胞培養が可能となる。
　これらホール１０１と突起集合体１０３とを別体として培養領域を形成しようとすると、それらの接着、溶着による接合が必要となる。例えば接着で接合した場合には、培養領域の内部に接着剤成分が混入し、生成細胞に悪影響を及ぼす可能性がある。
　また、溶着しようとすると、ホール１０１内部の径が細胞形成レベルの極微小領域のため、目的とする細胞領域を形成しつつ、仕切、突起に損傷を与えずに溶着することはかなり困難である。当該仕切や突起に損傷、変形があると、細胞形成過程において細胞に不要なストレスを与えたり、細胞自身の運動に障害となる可能性がある。
　従って、培養領域を形成するホール１０１と突起１０３とは一体的に形成されていることが望ましい。このように一体的に形成されることにより、細胞培養に必要な成分以外の不要成分の影響を排除した培養を行うことが可能となり好適である。
　ここで図１４Ａ～図１４Ｄにおいて、本実施例の培養シート付マルチウェルプレートの全体構成図及び要部断面図を示す。
　図１４Ａは本実施例における培養器材の外観斜視図、底面図を示すものである。
  図１４Ｂは培養器材の上面図、上下側面図を示すものである。ここで、左右側面図は外観斜視図よりその形態が明らかであるため、図示省略する。
  図１４Ｃは部分拡大図、部分断面図であり、Ａ－Ａ，Ｂ－Ｂ部分拡大図と、Ｃ－Ｃ，Ｄ－Ｄ部分拡大図と、Ｈ－Ｈ断面図を示すものである。
  図１４Ｄは部分拡大図、及び端面図であり、Ｅ－Ｅ，Ｆ－Ｆ部分拡大図、Ｇ－Ｇ線端面図を示すものである。
　図１４Ａ－図１４Ｄにおいて示される当該物品は、人や動物や植物などの細胞を培養する培養其材（培養容器）で、培養シート１００と培養シート１００を保持する保持部（枠体）１１１とから構成されている。
　培養シート１００の表面には複数のホール１０１が形成されており、保持部に形成された筒状の穴部１１１ａの内部底面に設けられている。
　更にその仕切り部の内部には複数の微細な突起部１０３を有する培養領域が夫々形成されている。ホール１０１内の培養領域を形成するシート面に添加されるように、培養する目的細胞を穴部１１１ａ内に対して添加すると、複数の微細な突起部１０３に保持されて当該目的細胞が培養されることになる。
　また、本例の培養器材は、枠体１１１の裏面から培養シートが溶着される例を示しており、保持部である枠体１１１と培養シート１００とは接合部１１１２を介して溶着されている。
  当該接合部１１１２は穴部１１１ａの外部に設けられており、培養領域にはその溶着の影響がない。
　したがって、本例では溶着を例示したが、当該接合方法に限らず、他の接合方法によっても培養領域自体に接合による影響を及ぼすことはないため、他の接合方法を採用することも可能である。
　さらに、本例の器材は、当該枠体１１１が四角状の形態を成しており、その４つの頂点の内、少なくとも１点がカットされている。このカット面１１１３が形成されていることにより、培養を行う作業者が器材穴部の位置を特定しやすくなるという効果がある。
  カット面は必須ではなく、無くても良いことは云うまでもない。当該培養器材にはまた、滑止め１１１１が形成されており、作業中、作業者が不意に当該器材を揺動、落下等を防ぐことが出来る。
　実施例３では実施例１および２で作製した培養器材を利用した細胞の組織培養への適用例を示す。新薬開発において、生体機能を反映する三次元組織の構築は、動物実験に代わる細胞を利用した様々な評価に対して需要がある。
　また、人工多能性幹細胞（Induced pluripotent stem cells：iPS細胞）や胚性幹細胞（Embryonic stem cells：ＥＳ細胞）を培養して目的の細胞に分化させる前には、三次元組織を形成しなければならないことから、再生医療分野においても三次元組織を簡便に構築する技術が望まれている。このような背景から、ここでは特にチャンバースライドを用いた三次元組織を形成させる例を示すが、マルチウェルプレートであっても細胞培養の本質的な部分は特に変わるところはない。本実施例ではラット肝細胞を用いた例を示すが、上述のように様々な動植物の細胞種に適用可能であり、特に細胞種は限定されない。
　肝細胞の調製は、インサイチュ(in situ)コラゲナーゼかん流法にしたがう。詳しくは以下の通りである。Ｆｉｓｈｅｒ３４４系雄ラット（７～１０週齢）を、ペントバルビタール麻酔下で開腹し、門脈にカテーテルを挿入して前かん流液（Ｃａ２＋とＭｇ２＋不含，ＥＧＴＡを含むハンクス液）を注入する。
　同時に肝臓下部の下大静脈を切開して血液を放出させる。次に胸腔を開き、右心房に入る下大静脈を切開し、肝臓下部の下大静脈をかん止で止めてかん流を行なう。肝臓からの脱血が十分になされたことを確認した後にかん流を止める。かん流液をコラゲナーゼ溶液に換えて、かん流を行う。
　本実施例では０．０５％コラゲナーゼを含むハンクス液を用いてかん流を行うが、この限りではない。細胞間組織がコラゲナーゼにより消化されたことを確認した後、かん流を止める。肝臓を切り離し、冷したハンクス液中で細切りし、ピペッティングにより細胞まで分散する。次いでガーゼろ過により未消化の組織を除去する。細胞懸濁液は、５０Ｇ、１分の遠心分離を数回繰り返して非実質細胞を除去する。次いで等張パーコール液を使用して５００Ｇ、５分の遠心分離で傷害のある肝細胞を除去する。得られた肝細胞の生存率はトリパンブルー排除法で計測し、生存率８５％以上の肝細胞を培養に使用する。ここでは、生存率８５％以上の肝細胞を培養に使用するが、必ずしも当該条件に限られるものではないことはいうまでもない。また、肝細胞の調製は必ずしもin situコラゲナーゼかん流法に限られるものではない。
　このようにして得られた肝細胞を用いた培養のフローチャートを図６に示す。
　図６のフローにおいて、まず、実施例１で作製したチャンバースライドタイプの培養シートに、Ｉ型コラーゲン１１６を塗布する。弱酸性溶液に溶解しているＩ型コラーゲンを所定の濃度まで滅菌水で希釈した希釈液の１－１．５ｍＬを上述のチャンバースライドに添加する（同図(a)）。次に、添加したＩ型コラーゲンをナノピラーシート１００に完全に吸着させるため、減圧操作を施す（同図(b)）。減圧操作は、減圧用容器１１７と減圧ポンプ１１８を用い、０．０４気圧以下で行う。減圧時間は特に限定されるものではないが、本実施例では１０分間行う。減圧に用いる装置構成は特に限定するものではない。ここで希釈液の所定濃度の範囲は１００（ｎｇ／ｍｌ）以上１０（μｇ／ｍｌ）以下である。必ずしも当該範囲に限定されるものではないが、当該は球状の三次元組織が形成されるのに好適な範囲である。最後に、余剰のＩ型コラーゲンを除き、ＰＢＳ（－）１１９を加える（同図(c)）。この操作を３回行い、余剰のＩ型コラーゲンを洗浄する。
　上述の通りin situコラゲナーゼかん流法により調製した肝細胞１２０を培地１２１に懸濁し、同じく上述の通り準備したＩ型コラーゲンを塗布したＮＰシートに播種する（同図(d)）。培地は特に限定されるものではないが、血清（ＦＣＳ）、インシュリン、デキザメタゾンを含んだ培地（以下、培地（１０％ＦＣＳ含む））を含むウィリアムズＥ培地を用いる。本実施例では、特に１０％ＦＣＳ、８．６ｎＭインシュリン、２５５ｎＭデキザメタゾンを含んだウィリアムズＥ培地を用いる。播種後、ＣＯ２インキュベータを用いて５％ＣＯ２、３７℃の条件下で培養を開始し、１８時間以上経過した後に、最初の培地交換を行い、以降２４時間毎に培地交換を行う。播種後１８時間目以降の培養に用いる培地は特に限定されるものではないが、本実施例では、培地（１０％ＦＣＳ含む）からＦＣＳを除いた培地（以下、培地（ＦＣＳ含まず））を用いる。
　また、肝細胞の播種密度は、本実施例では１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌとしたが、この濃度に限定されない。ここで、培養に用いる培養シート１００は、ピラー高さ、ピラー径、ピラーピッチがそれぞれ１．０μｍ、２．０μｍ、４．０μｍのものを用いたが、この値に限らない。
　また、培養シートに添加するＩ型コラーゲンの濃度は、本実施例では１００（ｎｇ／ｍｌ）としたがこれ以外の濃度であっても構わない。細胞の条件によってはこの濃度以外の濃度であってもスフェロイドが形成されるものもある。計９６時間培養し、三次元組織１２２が形成される（同図(e)）。ホール径が２００μｍの上述の培養シートを用いて実際に肝細胞を培養した結果の写真を図７に示す。
　図７から明らかなように、培養シート表面に特別な化学物質の塗布無しで、かつ細胞にとってストレスの少ない静置培養より、このように大きさの揃った球状の三次元組織が形成された。これは、本来保持している細胞の活性を失わせることがないと考えられるため、細胞アッセイ等に有効な培養方法である。
　図８に実施例４として、上述した培養シート１００の実施例の変形例を示す。まず、培養シート１２３は細胞の遊走性、接着性の違いをもたらす突起物の配列パターンを同図の(a)のように、第一の配列パターン１２５aの周囲を第二の配列パターン１２５ｂで囲うように二段階に配置することにより、第一の配列パターン１２５a上（例えばホールの中心近傍）に三次元組織あるいは二次元平面組織を形成させる例を示す。
　また逆に、同図の(ｂ)のように、第二の配列パターン１２５ｂの周囲を第一の配列パターン１２５aで囲うように二段階に配置することにより、第二の配列パターン１２５ｂ上（例えばホール辺縁部）に三次元組織あるいは二次元平面組織を形成させる例を示す。なお、１２４は先の実施例同様、ホールを示す。点線は、パターンの境界を示している。
　またホール１２４内の中央部に限らず、同図の(c)の培養シート１２６のように配置することにより、例えば４箇所の第一の配列パターン１２７ａを第二の配列パターン１２７ｂで囲むことで、第一の配列パターン１２７ｂ上に大きさの揃った組織を形成させることもできる。このように、ピラー径、ピラーピッチ、配置パターンの組み合わせは、目的に応じて最適なパターンを配置し、培養することが可能となる。同様に、同図の(d)は、配列パターンを多段階パターン１２９ｃ、１２９ｂ、１２９aとした培養シート１２８を示す。
　続いて、図９を用いて、上述してきた実施例における突起物の配列パターン(以下、ピラーパターン)の種類を説明する。図９に示すように、１１種の配列パターンを例示した。同図より明らかなように、ピラー径とピラーピッチがそれぞれ０．１８～２０．０μｍ、０．３６～４０．０μｍの１１種であるが、これに限定されるものではない。これらのピラーパターンの下で培養した肝細胞の一例を図１０Ａ、１０Ｂに示した。
　尚、ピラーパターンの無いフラット平面下での培養では、培養途中における培地交換の際に多数の細胞が培地と共に排出されてしまうため、所望とする培養細胞を効果的に取得することはできない。このため、図１０Ａでは図示をしていない。
　図１０Ａはピラー径に対して２倍のピッチの培養シート１００を用いて培養を行ったときの細胞の様子を示す図である。この結果、ピラー径が０．１８μｍ、０．５μｍ、１．０μｍにおいては、球状ではない平坦な組織が器材底面に接着している一方、２．０μｍ、５．０μｍでは器材に対して球状をした三次元組織が形成されていた。
　また２．０μｍ、５．０μｍの器材において形成された球状細胞について比較してみると、２．０μｍ器材の方が、細胞が器材に接着しており、安定な状態であることが分かった。即ち、細胞接着性に関しては、ピラー径が大きいほど、低接着性を示し、細胞による移動が促進されていることがわかる。
　図１０Ｂでは、各ピラー径におけるシートで形成された肝細胞の３次元組織（スフェロイド：spheroid）の数について、その形成される直径毎に纏めた結果を示す図である。シート面積は４平方ｃｍ(２ｃｍ×２ｃｍ)である。
　肝細胞の三次元組織においては、創薬分野における動物実験に替わる薬剤スクリーニング，毒性・代謝試験を目的とした細胞アッセイにおいて、５０－１００ミクロン径である細胞が好ましく、本例においてはピラー径が２．０μｍ器材の場合において当該サイズの細胞形成数が最も多く好適であることがわかる。
　しかし、上記の検討の下では、５０－１００ミクロン径である細胞を形成するためにピラー径が２．０μｍの場合が好ましいとしたが、これに限るものではなく、本検討において使用した全てのピラー径において、ピラーの形成されていないフラットな状態に比して、形状の安定した細胞が数多く形成されることがわかった。このように、ピラーパターンの違いにより、自在に細胞、あるいは細胞から形成される組織の形態、あるいは器材への接着性を変化させることができる。
　上述の結果を応用し、図８の実施例４で説明したように、ピラー径(ピラーピッチ)の小さい第一の配列パターンの周囲を、ピラー径(ピラーピッチ)の大きい第二の配列パターンで囲うように二段階で配置したり、あるいは多段階に配置することにより、細胞接着性及び細胞自身の運動特性を利用して、ホール内の目的の位置に、目的の形状の組織を形成させることが可能になる。
　また、同一サイズのピラー径をもつナノピラーの高さを、ホールの辺縁部から中心部に向かって下げていくことにより、傾斜するように段階的に高さに差異を設けて、重力により中心部に集めるように細胞の運動を促し、組織を形成させることも可能である。図１１の(a)に段階的にナノピラーの高さに差異を設けた変形例である培養シート１３０を示した。この際、通常のＵ字型の培養容器と異なり、ピラーが存在することにより、細胞が中央に保持される効果がある。さらに、同図の（ｂ）の培養シート１３１のように、傾斜の中でもピラー直径に違いを設けて、上述の効果を促進させることも可能となる。
　図１１の変形例では、傾斜が滑らかになるように段階的に高さを変化させているが、階段状に順次高さに変化を持たせる構成としてもよい。
　また、複数のホールが集合して培養面を形成するが（チャンバースライドの場合は四角形状、プレートの場合は丸型形状）、培養する際には表面張力の影響により、培養面中央部と辺縁部では三次元組織のでき方に違いが生じる。すなわち、培養面中央部では三次元組織が形成されているにもかかわらず、辺縁部では表面張力により当該部分の培地量が増え、酸素供給量が低下し、あるいは高い水圧がかかるといった理由により、三次元組織が形成されない事態が生じる可能性がある。この現象を回避するために、図１２の(a)、(b)に示すような培養面の中央部にのみホール構造を保持した培養シート１３２、１３３を作製するようにしてもよい。
　このように培養シートを形成することにより、培養効率が高く、かつ製造負荷の少ない培養器材を達成することが出来る。
　図１５Ａ，図１５Ｂ、図１５Ｃに第５の実施例の培養シートを示した。実施例５は、図８の実施例４で示された種々の変形例のうち、第一の配列パターン１２５ａがフラット構造で、ホールの中心部にのみ突起が配列されているパターンの培養シートを用いる場合に対応している。すなわち、本実施例においては、培養領域各々が、第一の領域と、それを囲む第二の領域からなり、第一の領域にのみ突起を配列し、第二の領域には突起を形成しない構造の培養シートとすることにより、直径の揃った三次元組織であるスフェロイドが第一の領域に対応する、培養領域の中心部に保持されることにより、目的の位置に保持させることができる。
　ここでは培養領域内の中心近傍に突起を配列した例を示すが、必ずしも中心を含む必要は無く、培養領域内の所望とする領域に突起を配列させれば良いことは云うまでもない。また、略ひし形状の突起領域を形成する例を示すが、円形、四角形、多角形状であっても良いことは云うまでもない。
　図１５Ａに示すように、培養シート１５０を培養シート保持部材であるチャンバースライドに適用した。本実施例では、培養シート上の仕切り構造である仕切り壁１５２によって仕切られた各ホール１５１内に、ピラー高さ、ピラー径、ピラーピッチがそれぞれ１．０μｍ、２．０μｍ、４．０μｍで、突起部集合体１５３の直径が８０μｍ，および２０μｍの培養シート１５０を用いた。
　図１５Ａは本実施例で作成した培養シート１５０の走査型電子顕微鏡写真の模式図であり、また同時に、培養シート１枚あたりに複数個存在する仕切り構造１５２により構成されたホール１５１の一つの構造を示す。当該ホール１０１の内部が細胞組織形成単位での培養領域を構成することは、上述した実施例と同様である。ホール１５１の底面に保持されている複数の突起物１５３は、複数の微小突起物からなる。また、このホール１５１の直径をホール径１５５とする。当該培養シート１５０において、上記の仕切壁１５２を具備するホール１５１と、当該ホール１５１の内部に形成されている複数の突起１５３とは同一材料で一体的に形成されている。なお、このホール１５１は、丸型形状に限定されるものでなく、四角形状等他の形状であっても良いことは上述した実施例と同様である。
　図１５Ｂ，および図１５Ｃのそれぞれの図において、１５６と１５８はホールを、１５７，１５９は突起物集合体を示している。なお、当該培養シート１５０は細胞に悪影響の無い材質で形成され、本例では、ポリスチレンとしている。ただし、材質はポリスチレンに限らないことは云うまでもない。
　このように細胞に悪影響の無い単一材料で、仕切壁１５２を具備したホール１５１と当該ホール１５１の内部に形成されている複数の突起１５３とが一体的に培養シート１５０として形成されることにより、培養工程において細胞に異物が接着することなく細胞を成長させることができる。さらに個々の仕切内において細胞が成長するため、均一な大きさの細胞を形成させることが可能となる。
　また、囲み配置された仕切壁１５２の内部に複数の突起を設けているので、細胞が本来保持している能力である細胞運動を促し、当該運動により成長することで、回転培養等によるストレスなどの外乱の影響なく、細胞活性を維持した細胞培養が可能となる。
　これらホール１５１と突起集合体１５３とを別体として培養領域を形成しようとすると、それらの接着、溶着による接合が必要となる。例えばこれらを接着接合した場合には、培養領域の内部に接着剤成分が混入し、生成細胞に悪影響を及ぼす可能性がある。また溶着接合では、ホール１５１の内径が細胞形成レベルの極微小領域径のため、目的とする細胞領域を形成しつつ、仕切、突起に損傷を与えずに溶着することはかなり困難である。当該仕切や突起に損傷、変形があると、細胞形成過程において細胞に不要なストレスを与えたり、細胞自身の運動に障害となる可能性がある。
　従って、本実施例においても、培養領域を形成するホール１５１を構成するホール底面１５４、仕切り壁１５２および突起１５３とは一体的に形成されていることが望ましい。このように一体的に形成されることにより、細胞培養に必要な成分以外の不要成分の影響を排除した培養を実行することが可能となり好適である。
　なお、本実施例における突起１５３の拡大図は、図２を用いて説明した実施例１の突起と同様な構造を有するため、ここでは説明を省略する。本実施例では仕切り構造である仕切り壁１５２の高さは、例えば７０μｍであるが、この値に限らず、好適には形成される細胞が仕切りを乗り越えない程度の高さであれば良い。また、本実施例における培養シート１５０は第１の実施例と同様の方法で作製されるので、ここでは作製法の詳細な説明は省略する。
　さらに、本実施例においても、図３に示すような、培養シート１５０が貼付されたチャンバースライド１０９を作製することができ、図１３Ａ、図１３Ｂ、図１３Ｃと同様の全体構成及び要部断面を有するチャンバースライド得ることができることは言うまでもなく、ここでは説明を省略する。
　次に、第６の実施例を図４、図５を用いて説明する。実施例６では第５の実施例で説明した培養シート１５０を用いた、培養シート１５０付きのマルチウェルプレートの構成、及びその作製例を示す実施例である。マルチウェルプレートの構成とその作製例は、図４図５で詳細に説明したが、本実施例においては、実施例２で用いた培養シート１００に代わり、培養シート１５０を使う点以外は、基本的に実施例２と同様である。
　図４の(a)はマルチウェルプレートを構成する枠体１１１の底面図である。培養シート保持部材である枠体１１１は、横幅約１２５ｍｍ、縦約８０ｍｍ、高さ約２０ｍｍの中に縦列に４穴、横列に６穴の計２４穴の筒状の穴部１１１ａが成型されたものである。素材はポリスチレンを用いている。
　枠体に形成される穴の数は、通常６穴から１５３６穴まで、用途によって使い分けるため、この枠体も穴の数は２４穴に限定されない。また枠体の素材もポリスチレンに限定されるものではない。
　当該培養器材の作製では、枠体１１１と、図１５Ａの培養シート１５０を超音波溶着により接合させる。以下の処理と構成等は実施例２と同様である。
　このようにして作成された培養器材において、枠体１１１の底面に形成された培養シート１００に代わる、図１５Ａで説明した培養シート１５０には、複数のホール１５１が形成され、当該ホール底面１５４に構成されている複数の突起物は、複数の微小突起物１５３からなる。また、このホール１５１の直径をホール径１５５とする。当該培養シート１５０において、上記の仕切壁１５２を具備したホール１５１と、当該ホール１５１の内部に形成されている複数の突起１５３とは同一材料で一体的に形成されている。なお、このホール１５１は、丸型形状に限定されるものでなく、四角形状等他の形状であっても良い。
　このように細胞に悪影響の無い単一材料で、仕切壁１５２を具備したホール１５１と当該ホール１５１の内部に形成されている複数の突起１５３とが一体的に培養シートとして形成されることにより、培養工程において細胞に異物が接着することなく細胞を成長させることができる。さらに個々の仕切内において細胞が成長するため、均一な大きさの細胞を形成させることが可能となる。また、囲み配置された仕切の内部に複数の突起を設けているので、細胞が本来保持している能力である細胞運動を促し、当該運動により成長することで、回転培養等による外乱(ストレス)の影響なく、細胞活性を維持した細胞培養が可能となる。
　上述のとおり、本実施例においても、培養領域を形成するホール１５１と複数の突起１５３とは一体的に形成されていることが望ましい。このように一体的に形成されることにより、細胞培養に必要な成分以外の不要成分の影響を排除した培養を実行することが可能となり好適である。
　本実施例の培養シート付マルチウェルプレートの全体構成図及び要部断面図も、実施例２と同様、図１４Ａ、図１４Ｂ、図１４Ｃ、図１４Ｄに示す通りとなるので、ここでは説明を省略する。
　続いて、第７の実施例として、実施例５および６で作製した培養器材を利用した細胞の組織培養への適用例を説明する。先に、実施例３として、実施例１および２で作製した培養器材を利用した細胞の組織培養への適用例を示したが、本実施例と実施例３の相違点は、培養シート１００に代わり培養シート１５０を使った培養器材を用いる点にある。それ以外の点は、説明が共通するのでここでは説明を省略することとする。
　また、このようにして得られた培養器材を用いた培養のフローチャートも、培養シート１５０を用いる点以外は、図６に示す培養フローと全く同一であることは言うまでもない。
　図１６、図１７、図１８を用いて、本実施例の培養器材を用いた培養の結果について説明する。本実施例における、ホール１５１の中心部にピラー幅２．０μｍのナノピラーが直径８０μｍの円状に配列された培養シート１５０では、図１６に示すように、直径の揃ったスフェロイド１６０がホール１５６の中心部に保持されている。また、図１７に示すように、ホール１５８の中心部に、同じサイズのナノピラーが直径２０μｍの円状に配列された培養シート１５０では、スフェロイドが中心部に保持されなかった。
　以上の結果から明らかなように、培養シート表面に特別な化学物質の塗布無しで、かつ細胞にとってストレスの少ない静置培養より、このように大きさの揃った球状の三次元組織が形成された。これは、本来保持している細胞の活性を失わせることがないと考えられるため、細胞アッセイ等に有効な培養方法である。
　図１８に、ホール１５１内全面ナノピラー、ピラーエリア８０μｍ、ピラーエリア２０μｍの３種類のシートを用いて、ホール１５１の中心とスフェロイドの中心の間の距離を測定した結果を示す。同図において、横軸は、スフェロイドの幅（μｍ）、縦軸はスフェロイドの中心間距離（μｍ）を示す。同図が示すように、他の２種類に比べて、ピラーエリア８０μｍのシートで明らかにスフェロイドがホールの中心部保持されていることが分かる。このように、ホール直径と中心部のナノピラーエリアを適切にすると、大きさの揃ったスフェロイドがホールの中心部に保持されることが明らかとなった。
　本発明は、培養器材を用いて動植物細胞を培養し、細胞の球状組織（三次元組織）、および単層組織（二次元平面組織）を形成する技術として極めて有用である。
100,123,126,128,130,131,132,133,150…培養シート
101,124,151,156,158…ホール
102,152…仕切り壁
103,153,157,159…突起物/突起物集合体
104,154…ホール底面
105,155…ホール径
106…ピラー径
107…ピラーピッチ
108…ピラー高さ
109…チャンバースライド
110…手術用接着剤
111…枠体
111a…枠体に形成された穴部
112…フィルム固定用突起
113…リブ構造
114…培養シート穴
115…細胞培養プレート
116…Ｉ型コラーゲン溶液
117…減圧用容器
118…減圧用ポンプ
119…洗浄用生理食塩水（ＰＢＳ（－））
120…培地
121…肝細胞
122…肝細胞スフェロイド
125a,125b,127a,127b,129a,129b,129c…突起物配列パターン
1111…滑止め部
1112…接合部
1113…カット面。

Claims (23)

  1. 細胞を培養する培養器材であって、
    培養シートと、前記培養シートを保持する培養シート保持部とを備え、
    前記培養シートは培養領域を有し、前記培養領域内に複数の突起が形成され、前記培養領域を仕切る、前記突起よりも高い仕切りが形成されている、
    ことを特徴とする培養器材。
  2. 請求項１に記載の培養器材であって、
    前記培養シートを囲む枠を少なくとも一つ有する、
    ことを特徴とする培養器材。
  3. 請求項２に記載の培養器材であって、
    前記枠は、前記培養シート保持部に当接されている、
    ことを特徴とする培養器材。
  4. 請求項１に記載の培養器材であって、
    前記シート保持部は、少なくとも一つの穴部を有し、前記穴部の底面に前記培養シートが構成されている、
    ことを特徴とする培養器材。
  5. 請求項４に記載の培養器材であって、
    前記シート保持部は、その底部に突部が形成され、当該突部と、前記培養シートが溶着されている、
    ことを特徴とする培養器材。
  6. 請求項２に記載の培養器材であって、
    前記枠は四角形状もしくは丸型形状である、
    ことを特徴とする培養器材。
  7. 請求項４に記載の培養器材であって、
    前記穴部は四角形状もしくは丸型形状である、
    ことを特徴とする培養器材。
  8. 請求項１に記載の培養器材であって、
    前記培養シートは、前記培養領域を複数有する、
    ことを特徴とする培養器材。
  9. 請求項１に記載の培養器材であって、
    前記培養領域内に第一の領域と第二の領域とを有し、前記第一の領域における前記突起の幅/直径と、前記第二の領域における前記突起の幅/直径とが異なる、
    ことを特徴とする培養器材。
  10. 請求項１に記載の培養器材であって、
    前記突起の幅/直径が多段階である、
    ことを特徴とする培養器材。
  11. 請求項１に記載の培養器材であって、
    前記培養領域内に第一の領域と第二の領域とを有し、前記第一の領域における前記突起のピッチと、前記第二の領域における前記突起のピッチとが異なる、
    ことを特徴とする培養器材。
  12. 請求項１に記載の培養器材であって、
    複数の前記突起のピッチが多段階である、
    ことを特徴とする培養器材。
  13. 　請求項１に記載の培養器材の、前記培養領域内の複数の突起において、当該領域内の第一の領域における突起の高さと、第二の領域における突起の高さとが異なることを特徴とする培養器材。
  14. 請求項１に記載の培養器材であって、
    前記突起の高さが多段階に構成された、
    ことを特徴とする培養器材。
  15. 細胞を培養する培養シートであって、
    複数の培養領域と、
    前記培養領域各々に形成された複数の突起と、
    前記培養領域各々を仕切る、前記突起より高い高さを有する仕切りを備えた、
    ことを特徴とする培養シート。
  16. 請求項１５に記載の培養シートであって、
    前記培養領域は、第一の領域と第二の領域を有し、前記第一の領域における前記突起の幅/直径と、前記第二の領域における前記突起の幅/直径とが異なる、
    ことを特徴とする培養シート。
  17. 請求項１５に記載の培養シートであって、
    前記培養領域は、第一の領域と第二の領域を有し、前記第一の領域における前記突起のピッチと、前記第二の領域における前記突起のピッチとが異なる、
    ことを特徴とする培養シート。
  18. 培養器材を用いた細胞培養方法であって、
    前記培養器材は、その内部に複数の突起を有し、その周囲に前記突起より高い仕切りを有する培養領域が複数形成された培養シートを備え、
    複数の前記培養領域各々に培養対象の細胞を播種することにより、前記培養領域各々で前記細胞の三次元組織を形成する、
    ことを特徴とする細胞培養方法。
  19. 請求項１８に記載の細胞培養方法であって、
    前記細胞は胚性肝細胞、iPS細胞、および肝細胞を含む、
    ことを特徴とする細胞培養方法
  20. 請求項１８に記載の細胞培養方法であって、
    前記培養器材は、前記培養シートを囲む枠体を有する、
    ことを特徴とする細胞培養方法。
  21. 請求項１に記載の培養器材であって、
    前記培養シートにおける前記仕切り及び複数の前記突起は、同一素材で一体的に形成されていることを特徴とする培養器材。
  22. 請求項１５に記載の培養シートであって、
    前記仕切り及び複数の前記突起は、同一素材で一体的に形成されていることを特徴とする培養シート。
  23. 請求項１８に記載の細胞培養方法であって、
    前記培養シートにおける前記仕切り及び複数の前記突起は、同一素材で一体的に形成されていることを特徴とする細胞培養方法。
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