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TWI700292B - 多胜肽異種多聚體之製造方法 - Google Patents

多胜肽異種多聚體之製造方法 Download PDF

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TWI700292B
TWI700292B TW103133689A TW103133689A TWI700292B TW I700292 B TWI700292 B TW I700292B TW 103133689 A TW103133689 A TW 103133689A TW 103133689 A TW103133689 A TW 103133689A TW I700292 B TWI700292 B TW I700292B
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井川智之
堅田仁
味元風太
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日商中外製藥股份有限公司
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Abstract

本發明提供，利用電荷相斥以達成Fc區域的分離之促進及/或結合之控制，將形成Fc區域界面之胺基酸的變異、及/或使重鏈CH3區域之安定性為不安定的變異導入重鏈CH3區域之複數種多胜肽的同聚多肽，在還原條件下溫育，以效率且安定地製造異種多聚體之方法。

Description

多胜肽異種多聚體之製造方法
本發明係關於多胜肽異種多聚體之製造方法及使Fc區域上的胺基酸變異以促進多胜肽異型化之多胜肽異種多聚體等。
抗體由於在血中安定性高、副作用少，已在醫藥品上受到注意(非專利文獻1、非專利文獻2)。其中亦有同時可辨認2種抗原或抗原決定基之雙特異性抗體，此等被期望標的特異性高及同時抑制多種路徑的機能(非專利文獻3)。例如已商品化之Catumaxomab係可結合在上皮細胞黏著因子之EpCAM、及在T細胞中表現的CD3之雙特異性抗體，被使用作為惡性腹水之治療藥劑。
IgG型雙特異性抗體之製造，目標雙特異性抗體所得的效率低、及由於精製的難度而難度高，但關於有效率地生產的知識已被報導(非專利文獻3)。例如，將構成含有2種可變區域的IgG之H鏈及L鏈的基因，合計4種基因導入細胞，經由共同表現而分泌的情形，會隨機地產生2種的H鏈的共價鍵以及H鏈和L鏈的非共價鍵，因此目標的雙特異性抗體的比例極低，生產效率顯著降低。其解決之技法，曾報告經由在IgG的H鏈的CH3區域進行胺基酸取代，可使H鏈為異種組合的 IgG優先分泌(專利文獻1及非專利文獻4及5)。本技法，係藉由對存在於一方之H鏈CH3區域的胺基酸側鏈取代為更大的側鏈(knob：凸起)，並對存在於另一方之H鏈CH3區域的胺基酸側鏈取代為更小的側鏈(hole：空隙)，使凸起配置在空隙內而引起促進異種H鏈之形成及抑阻同種H鏈形成的方法。同時，亦有報告在各IgG的H鏈之CH3區域導入不同電荷的方法(專利文獻2)。具體上，係經由將一方之H鏈CH3區域所存在的胺基酸取代為具有正電荷之胺基酸，將另一方之H鏈CH3區域所存在的胺基酸取代為具有負電荷之胺基酸，而引起促進異種H鏈之形成及抑阻同種H鏈形成的方法。另一方面，也有報導控制H鏈與L鏈組合的技術(非專利文獻6)。本技法係作為抗體一方的Fab，使用更換L鏈恒定區域(CL)及H鏈CH1區域者，而有效率地誘導目標H鏈與L鏈組合的技法。又除此之外，亦存在逾兩方的Fab使用共同之L鏈的技法。此係以使用共同L鏈者導入細胞之L鏈基因為1種，無需考慮H鏈與L鏈之組合而獲得雙特異性抗體。目前可經由組合異種H鏈形成技術、H鏈L鏈組合控制技術，高效率地形成雙特異性抗體。然而，仍難以完全地控制H鏈與L鏈的組合，為複雜的分子設計。再者，以共同之L鏈對2種抗原維持高親和性也有難度高的問題。
另一方面，已報導有非上述之基因重組方法，使用預先各別調製的單株抗體彼此製作雙特異性抗體的方法，稱為Fab Arm Exchange的技法。此技術係根據已知在活體內使IgG4半分子與內因性IgG4半分子交換生成雙特異性抗體 (Biospecific抗體：BiAb)的了解(非專利文獻7)所開發之技術，已報導藉由體外(in vitro)混合2種天然型人類IgG4，產生雙特異性抗體(專利文獻3)，而且在還原條件下可更高效率地使反應發生(非專利文獻8)。同時，亦發現IgG4上為其特徵的樞紐(hinge)區域之第228位及CH3區域的第409位之2處對該反應為重要的胺基酸殘基被限定，即使是IgG1，在該2處取代為IgG4型之胺基酸時，亦可與IgG4相同的效率發生反應(專利文獻4)。Fab Arm Exchange由於可僅在體外(in vitro)混合以一般方法所製作之單株抗體即可獲得目的之雙特異性抗體，因此廣用性高。然而由於半分子交換反應係隨機發生，混合2種抗體混合所獲得之雙特異性抗體，理論上為系統內存在之總抗體量的50%。為此，曾再檢討改善雙特異性抗體生成率的方法，已有報告在導入2種抗體的非對稱胺基酸變異，亦即，在一方之H鏈上的K409R之變異，以及，在另一方之H鏈上導入F405L之變異，可使反應效率大為提高，但反應效率為95%左右(專利文獻5、非專利文獻9)。由於在雙特異性抗體的效率且安定之製造上，精製之簡便性及在可能程度減低批間的不均一性為必要且不可少，因此期待開發實現更高反應效率之優良技法。
先前技術文獻 專利文獻
專利文獻1：WO/1996/027011
專利文獻2：WO/2006/106905
專利文獻3：WO/2005/062916
專利文獻4：WO/2008/119353
專利文獻5：WO/2011/131746
非專利文獻
非專利文獻1：Nat. Biotechnol., 23: 1073-1078, 2005
非專利文獻2：Eur. J. Pharm. Biopharm., 59(3): 389-396, 2005
非專利文獻3：mAbs., 4: 653-663, 2012
非專利文獻4：Protein Engineering, 9: 617-621, 1996
非專利文獻5：Nature Biotechnol., 16: 677-681, 1998
非專利文獻6：Proc. Natl. Acad. Sci., 108: 11187-11192, 2011
非專利文獻7：Immunology, 97: 693-698, 1999
非專利文獻8：Science, 317: 1554-1557, 2007
非專利文獻9：Proc. Natl. Acad. Sci., 110: 5145-5150, 2013
本發明鑑於此種狀況，目的係在提供，為了高效率且安定地製造異種多聚體，在還原狀況下促進多胜肽的異型化，獲得所欲的異種多聚體之反應效率更高之優良技法。
本發明人等，選擇具有作為可提供為異種多聚體的多胜肽之Fc區域的多胜肽，控制Fc區域之解離及締合的方 法，刻意進行研究。結果發現，藉由取代重鏈CH3區域中存在的特定之胺基酸，可在還原狀態下促進Fc區域之解離及控制其締合，與先前技術相比，可效率良好地形成所欲的異質分子。
本發明依據如此的認知，具體地提供以下之[1]至[25]項。
[1]一種異種多聚體之製造方法，其包含：a)提供具有第1抗原結合活性，且含Fc區域之第1多胜肽的同聚多肽之階段，b)提供具有與該第1抗原結合活性相異的第2抗原結合活性，且含Fc區域之第2多胜肽的同聚多肽之階段，c)在可使樞紐區域內的半胱胺酸發生雙硫鍵異構化之還原條件下，共同溫育該第1多胜肽之同聚多肽及該第2多胜肽的同聚多肽之階段，以及d)獲得含該第1及第2多胜肽的異種多聚體之階段，在前述第1及/或第2多胜肽的Fc區域所含之CH3區域中，具有與選自：(1)EU編號第356位及第439位的胺基酸殘基、(2)EU編號第357位及第370位的胺基酸殘基、(3)EU編號第399位及第409位的胺基酸殘基所示之胺基酸殘基之組的1組至3組的胺基酸殘基之同類之電荷；在前述第1多胜肽的CH3區域及前述第2多胜肽的CH3區域雙方中，在前述(1)至(3)所示之胺基酸殘基的組中同 組之胺基酸殘基各具有同類之電荷時，前述第2多胜肽的CH3區域中的該組胺基酸殘基，具有與前述第1多胜肽的CH3區域中該組胺基酸殘基相反之電荷。
[2]如[1]項中所述之製造方法，其中在[1]項之步驟a)中，包含提供與第1多胜肽形成多聚體之第3多胜肽之階段，且在步驟b)中，包含提供與第2多胜肽形成多聚體之第4多胜肽之階段。
[3]如[1]或[2]項中所述之製造方法，其中前述具有同類電荷的胺基酸殘基，係選自下列(A)或(B)任一群所含的1個以上之胺基酸殘基：(A)麩胺酸(E)、天冬胺酸(D)；(B)離胺酸(K)、精胺酸(R)、組胺酸(H)。
[4]如[1]至[3]之任一項中所述之製造方法，其中在第1及第2多胜肽中，各自具有同類電荷的胺基酸殘基之群組，係下列(1)至(4)之任一組胺基酸殘基之組：(1)EU編號第356位及第439位的胺基酸殘基、(2)EU編號第357位及第370位的胺基酸殘基、(3)EU編號第399位及第409位的胺基酸殘基、(4)(i)EU編號第399位及第409位的胺基酸殘基、及(ii)EU編號第356位及第439位的胺基酸殘基。
[5]如[1]至[4]之任一項中所述之製造方法，其中在第1及第2多胜肽中，各自具有同類電荷的胺基酸殘基之組，係下列之組的胺基酸殘基之組：(i)EU編號第399位及第409位的胺基酸殘基、及 (ii)EU編號第356位及第439位的胺基酸殘基。
[6]如[1]至[5]之任一項中所述之製造方法，其中在第1及/或第2多胜肽中，使胺基酸變異以使第1及/或第2多胜肽的CH3區域之安定性為不安定。
[7]如[1]至[6]之任一項中所述之製造方法，其中在第1及/或第2多胜肽中，使EU編號第397位及/或第392位變異。
[8]如[1]至[7]之任一項中所述之製造方法，其中第1及/或第2多胜肽的Fc區域為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4型。
[9]如[1]至[7]之任一項中所述之製造方法，其中第1及/或第2多胜肽的Fc區域為來自於小鼠之Fc區域。
[10]如[9]項中所述之製造方法，其中在前述第1及/或第2多胜肽的Fc區域所包含之CH3區域中，具有與選自：(1)EU編號第356位及第439位的胺基酸殘基、及(2)EU編號第360位及第371位的胺基酸殘基、及(3)EU編號第399位及第409位的胺基酸殘基所示之胺基酸殘基的組之1組至3組的胺基酸殘基同類之電荷；在前述第1多胜肽的CH3區域及前述第2多胜肽的CH3區域雙方中，在前述(1)至(3)所示之胺基酸殘基的組中同組之胺基酸殘基各具有同類之電荷時，前述第2多胜肽的CH3區域中的該組胺基酸殘基，具有與前述第1多胜肽的CH3區域中該組胺基酸殘基相反之電荷。
[11]一種異種多聚體之製造方法，其包含：a)提供具有第1抗原結合活性，且含Fc區域之第1多胜肽的 同聚多肽之階段，b)提供具有與該第1抗原結合活性相異的第2抗原結合活性，且含Fc區域之第2多胜肽的同聚多肽之階段，c)在可使樞紐區域內的半胱胺酸發生雙硫鍵異構化之還原條件下，共同溫育該第1多胜肽之同聚多肽及該第2多胜肽之同聚多肽之階段，以及d)獲得含第1及第2多胜肽的異種多聚體之階段，使在前述第1及/或第2多胜肽的Fc區域所含之CH3區域中的EU編號第397位及/或第392位的胺基酸殘基變異。
[12]如[1]至[11]之任一項中所述之製造方法，其中在第1及/或第2多胜肽中，使EU編號第397位為Met(M)、Phe(F)或Tyr(Y)、及/或使EU編號第392位變異為Asp(D)、Glu(E)、Thr(T)、Val(V)或Ile(I)。
[13]如[1]至[12]之任一項中所述之製造方法，其中在第1及/或第2多胜肽中，使EU編號第397位變異為Phe(F)或Tyr(Y)。
[14]如[1]至[13]之任一項中所述之製造方法，其中在第1多胜肽中，使EU編號第356位變異為Lys(K)，且使EU編號第397位變異為Phe(F)或Tyr(Y)，在第2多胜肽中，使EU編號第397位變異為Phe(F)或Tyr(Y)且使EU編號第439位變異為Glu(E)。
[15]如[1]至[14]之任一項中所述之製造方法，其中前述步驟a)及b)係以混合生產第1多胜肽的同聚多肽之細胞株與生產第2多胜肽的同聚多肽之細胞株而實施，前述步驟c)係在該培 養上清液中實施。
[16]如[1]至[15]之任一項中所述之製造方法，其中前述異種多聚體係多特異性抗體或異型Fc融合蛋白。
[17]如[1]至[16]之任一項中所述之製造方法，其中前述異種多聚體係雙特異性抗體。
[18]如[1]至[17]之任一項中所述之製造方法，其中[1]或[11]項中之步驟c)包含與還原劑之接觸。
[19]如[18]項中所述之製造方法，其中階段c)包含添加選自：麩胱甘肽、L-半胱胺酸、二硫蘇醣醇、β-硫醇二醇、TCEP及2-MEA所組成之群的作用物。
[20]如[19]項中所述之製造方法，其中階段c)包含添加選自：麩胱甘肽、2-MEA的作用物。
[21]一種異種多聚體，其係以如[1]至[20]之任一項所述之方法製造。
[22]如[21]項中所述之異種多聚體，其係雙特異性抗體。
[23]一種組成物其中包含如[21]或[22]項中所述之異種多聚體及其醫藥上容許之載體。
[24]一種異種多聚體，其係包含具有第1抗原結合活性且含第1之Fc區域的第1多胜肽、及具有與第1抗原結合活性不同之第2抗原結合活性且含第2之Fc區域的第2多胜肽的異種多聚體；將該第1多胜肽的同聚多肽及該第2多胜肽的同聚多肽，在可使樞紐區域內之半胱胺酸發生雙硫鍵異構化的還原條件下，共同溫育，獲得該異種多聚體， 在前述第1及/或第2多胜肽的Fc區域所含之CH3區域中，具有與選自：(1)EU編號第356位及第439位的胺基酸殘基、(2)EU編號第357位及第370位的胺基酸殘基、(3)EU編號第399位及第409位的胺基酸殘基所示之胺基酸殘基之組的1組至3組的胺基酸殘基同類之電荷；在前述第1多胜肽的CH3區域及前述第2多胜肽的CH3區域雙方中，在前述(1)至(3)所示之胺基酸殘基的組中，同組之胺基酸殘基各自具有同類之電荷的情形，前述第2多胜肽的CH3區域中該組的胺基酸殘基，具有與前述第1多胜肽的CH3區域中該組的胺基酸殘基相反之電荷，在前述第1及/或第2多胜肽中，使胺基酸變異以使前述第1及/或第2多胜肽的CH3區域之安定性為不安定。
[25]一種異種多聚體，其係由包含下列階段之方法所製造：a)提供具有第1抗原結合活性，且含Fc區域之第1多胜肽的同聚多肽之階段，b)提供具有與該第1抗原結合活性相異的第2抗原結合活性，且含Fc區域之第2多胜肽的同聚多肽之階段，c)在可使樞紐區域內的半胱胺酸發生雙硫鍵異構化之還原條件下，共同溫育該第1多胜肽之同聚多肽及該第2多胜肽的同聚多肽之階段，以及d)獲得含第1及第2多胜肽的異種多聚體之階段，在前述第1及/或第2多胜肽的Fc區域所含之CH3區域中， 具有與選自：(1)EU編號第356位及第439位的胺基酸殘基、(2)EU編號第357位及第370位的胺基酸殘基、(3)EU編號第399位及第409位的胺基酸殘基所示的胺基酸殘基之組的1組至3組的胺基酸殘基同類之電荷；在前述第1多胜肽的CH3區域及前述第2多胜肽的CH3區域雙方中，在前述(1)至(3)所示之胺基酸殘基的組中同組之胺基酸殘基各具有同類之電荷時，前述第2多胜肽的CH3區域中的該組胺基酸殘基，具有與前述第1多胜肽的CH3區域中該組胺基酸殘基相反之電荷，在前述第1及/或第2多胜肽中，使胺基酸變異以使前述第1及/或第2多胜肽的CH3區域之安定性為不安定。
本發明係提供經由取代存在於重鏈CH3區域的特定胺基酸，在還原狀況下可促進Fc區域的解離及控制締合，與先前技術比較，可效率良好的形成所欲的異質分子之製造方法。
經由利用本發明之方法，與先前技術比較，可提高在雙特異性抗體精製時的簡便性及盡可能地減低批間的不均一性。
本發明之異種多聚體之製造方法，其特徵為使重鏈CH3區域的胺基酸殘基變異。經由在該區域導入本發明之胺基酸殘基的變異，可促進多胜肽間的解離及締合，與先前技術比較，可效率良好地形成所欲之異種多聚體。
[第1圖]為顯示以離子交換層析法分析Fab Arm Exchange反應產物的結果之圖。圖中所示「BiAb」係精製的Bispecific抗體(雙特異性抗體)，「H54 homo」係含H54/L28之可變區域的單株抗體，「MRA homo」係含MRAH/MRAL之可變區域的單株抗體。圖中以百分比表示的數值係表示雙特異性抗體之生成率，係將對應雙特異性抗體之波峰面積，除以系統中存在之總抗體的面積，再乘以100所計算者。
[第2圖]為顯示以離子交換層析法解析Fab Arm Exchange反應產物的結果之圖。其係將MRAH-G1drP1/MRAL-k0及H54-G1drN1/L28-k0作為同聚多肽使用，顯示在3種還原條件下反應的結果之圖。圖中以百分比表示的數值係表示雙特異性抗體之生成率，係將對應雙特異性抗體之波峰面積，除以系統中存在之總抗體的面積，再乘以100所計算者。
[第3圖]係顯示在將5mM GSH作為還原劑使用時，Fab Arm Exchange中雙特異性抗體之生成率、及所使用的同聚多肽的CH3安定性之關係。圖中的「二種同聚多肽中CH3之Tm高者之值」，係指反應中所使用的二種同聚多肽中，CH3之Tm高，亦即CH3較安定的同聚多肽之CH3的Tm。
[第4圖]係顯示人類IgG1之V397周邊的立體結構(PDB code 3DO3)之圖。
[第5圖]係顯示在使用25mM之2MEA作為還原劑時，Fab Arm Exchange中雙特異性抗體之生成率、及所使用的同聚多肽 的CH3安定性之關係。圖中的「二種同聚多肽中CH3之Tm高者之值」，係指反應中所使用的二種同聚多肽中，CH3之Tm高，亦即CH3較安定的同聚多肽之CH3的Tm。
[第6圖]係顯示以離子交換層析法解析Fab Arm Exchange反應產物的結果之圖。其係顯示使用MRAH-G1dP17/MRAL-k0及H54-G1dN17/L28-k0作為同聚多肽，在不同的反應時間反應的結果之圖。圖中以百分比表示的數值係表示雙特異性抗體之生成率，係將對應雙特異性抗體之波峰面積，除以系統中存在之總抗體的面積，再乘以100所計算者。
[第7圖]係顯示以離子交換層析法解析Fab Arm Exchange反應產物的結果之圖。其係使用MRAH-G1mrP1/MRAL-k0及H54-G1mrN1/L28-k0作為同聚多肽，在細胞培養上清液中反應的結果之圖。圖中以百分比表示的數值係表示雙特異性抗體之生成率，係將對應雙特異性抗體之波峰面積，除以系統中存在之總抗體的面積，再乘以100所計算者。
[第8圖]係顯示小鼠IgG1之CH3定域的相互作用之界面周邊的立體結構(PDB code 1IGY)之圖。
[第9圖]係顯示以CE-IEF解析小鼠IgG型Fab Arm Exchange反應產物的結果之圖。圖中以百分比表示的數值係表示雙特異性抗體之生成率，係將對應雙特異性抗體之波峰面積，除以系統中存在之總抗體的面積，再乘以100所計算者。
[第10圖]係比較抗人類磷脂醯肌醇蛋白聚醣-3(glypican-3)/抗人類CD3雙特異性抗體的細胞毒性之圖。第10-1圖係使用人類IgG型Fab Arm Exchange，第10-2圖係使 用小鼠IgG型Fab Arm Exchange，所製作之雙特異性抗體與以CrossMab技術製作的雙特異性抗體做比較。
[第11圖]係顯示以人類IgG型Fab Arm Exchange所製作之抗人類磷脂醯肌醇蛋白聚醣-3(glypican-3)/抗人類CD3雙特異性抗體及以Knobs-into-Holes技術所製作的雙特異性抗體，在正常小鼠中的血中濃度之變動之圖。
[第12圖]係顯示以小鼠IgG型Fab Arm Exchange所製作之抗人類IL-6受體抗體及具有天然型小鼠IgG1序列的抗人類IL-6受體抗體之血中濃度的變動之圖。
發明之實施形態
本發明係關於在還原條件下，為了促進具有第1抗原結合活性的多胜肽及具有與該第1抗原結合活性不同之第2抗原結合活性的多胜肽之各同聚多肽解離、控制異型體締合，透過使重鏈CH3區域的胺基酸殘基變異，製造所欲的異種多聚體之方法。再者，本發明亦關於選擇所欲之異種多聚體的方法。
用辭的定義
本發明中之「多胜肽」，係指在胺基酸序列中含重鏈Fc區域之多胜肽(含Fc區域的多胜肽)及蛋白質(含Fc區域的蛋白質)。又通常為來自於生物的多胜肽，但並無特別限定，亦可為例如由人工設計的序列所構成的多胜肽。亦可為天然的多胜肽、或合成的多胜肽、重組的多胜肽等。再者，上述多胜肽的片段亦包含於本發明之多胜肽。
本發明中，「抗體」係指為天然的或部分或完全的合成所製造的免疫球蛋白。抗體可由其天然存在的血漿及血清等天然資源及產生抗體的融合瘤細胞之培養上清液分離獲得，或以基因重組等技法部分或完全合成而獲得。抗體之例可舉如免疫球蛋白之同型及其同型的亞型。人類之免疫球蛋白，已知有：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM的9種類別(class)(isotype)。小鼠之免疫球蛋白，已知有：IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3的4種類別。本發明之抗體中，此類同型中人類之免疫球蛋白可包含：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，小鼠之免疫球蛋白可包含：IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3。而以小鼠之免疫球蛋白以IgG1較佳。人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3、人類IgG4之恒定區域，雖然因基因多型而有的複數種同種異型(allotype)序列已記載於Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication,No.91-3242中，但本發明中可為其任意者。特別是人類IgG1序列，EU編號所示第356至358位的胺基酸序列可為DEL亦可為EEM。又，人類Igκ(Kappa)恒定區域及人類Igλ(Lambda)恒定區域，雖然因基因多型而有的複數種同種異型(allotype)序列已記載於Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication,No.91-3242中，但本發明中可為其任意者。
「Fc區域」的用辭，包含天然序列Fc區域及變異型Fc區域，係使用於定義免疫球蛋白重鏈之C末端區域。即使尚不知免疫球蛋白重鏈之Fc區域的界面是否變異，但係指抗體分子中樞紐區域或其部分由CH2、CH3定域(domain)所構 成的區域。通常，係定義為人類IgG重鏈Fc區域由位在Cys226位置的胺基酸殘基推展至Fc區域之羧基末端為止，但並不限定於此。免疫球蛋白之Fc區域，包含2個恒定區域CH2及CH3。人類IgG Fc區域之「CH2」定域通常由胺基酸231推展至胺基酸340為止。「CH3」定域，係由Fc區域中之羧基末端推展至CH2定域為止。亦即，由IgG的胺基酸341推展至約胺基酸447為止。
Fc區域，可使用IgG單株抗體等經過胃蛋白酶(pepsin)等蛋白質分解酶部分分解之後，再經由蛋白質A(protein A)或鏈球菌G蛋白(protein G)管柱吸附的分畫(fraction)再溶出而可獲得。該蛋白質分解酶只要可經由適當地設定pH等酵素的反應條件而限制性分解全長抗體產生Fab及F(ab')2者即可，並無特別之限定，可例舉如胃蛋白酶及木瓜蛋白酶等。
變異處之編號，係採用EU編號(Kabat E.A.et al.,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,NIH)。
本發明中多胜肽的「締合(association)」，換言之係指如2個以上的多胜肽區域相互作用之狀態。
本發明中之「控制締合」，係指控制在所欲之締合狀態，更具體言之，即指控制多胜肽間不易形成不欲之締合(較好為具有相同胺基酸序列的多胜肽彼此的締合)。
本發明中之「界面(interface)」，通常係指締合(相互作用)時之締合面，形成界面的胺基酸殘基通常係指包含在提供該締合的多胜肽區域之1個或多個胺基酸殘基，較佳為在 締合時接近而相互作用所相關之胺基酸殘基。該相互作用具體地包含締合時接近的胺基酸殘基彼此形成的氫鍵、靜電相互作用、鹽橋之情形等。
本發明中多胜肽之「同聚多肽」，係指具有相同胺基酸序列的多胜肽彼此締合的狀態。
本發明中多胜肽之「異型體」，係指第1多胜肽與在胺基酸序列中與第1多胜肽至少1個胺基酸殘基不同的第2多胜肽締合之狀態。
本發明中多胜肽之「解離」，係指在多胜肽同聚多肽中，由2個以上的多胜肽締合之狀態，分離為各多胜肽單體的狀態。
本發明中之「異種多聚體(heteromultimer)」，係指由複數種多胜肽所構成，且該多胜肽可互相締合的蛋白質之多聚體。更詳細言之，「異種多聚體」係具有至少第1多胜肽及第2多胜肽，在此第2多胜肽係胺基酸序列中與第1多胜肽至少1個胺基酸殘基不同的分子。又雖無特別限定，該異種多聚體以具有對至少2種不同的配體、抗原、受體、或基質等具有抗原結合活性者為佳。該異種多聚體，除由第1及第2多胜肽所形成之「異種2聚體」之外，亦可再存在別種的多胜肽。亦即，本發明之「異種多聚體」，不限為異種2聚體，亦包含如異種3聚體、異種4聚體等。
本發明之包含第1多胜肽、第2多胜肽、及1個或2個第3多胜肽的多胜肽多聚體中，第1多胜肽及第2多胜肽可各自與第3多胜肽形成多聚體(2聚體)。又形成的2聚體 彼此可形成多聚體(4聚體)。2個第3多胜肽可具有完全相同的胺基酸序列(亦可對相同抗原具有結合活性)。或者亦可為相同胺基酸序列，同時具有2種以上的活性(例如，亦可對2種以上不同抗原具有結合活性)。又，在第3多胜肽為1個之情形，第3多胜肽可與第1多胜肽或第2多胜肽任一方形成2聚體，而形成多胜肽多聚體。
本發明的多胜肽多聚體中，以第1多胜肽與第2多胜肽對不同抗原具有結合活性者為佳。另一方面，第3多胜肽亦可為具有與第1多胜肽及第2多胜肽任一方或雙方對相同的抗原具有結合活性的多胜肽。或者，亦可為具有與第1多胜肽及第2多胜肽對不同的抗原具有結合活性之多胜肽。
或者，本發明的多胜肽多聚體亦可為包含第1多胜肽、第2多胜肽、第3多胜肽、及第4多胜肽之多胜肽多聚體。如此的多胜肽多聚體中，第1多胜肽及第2多胜肽各自可與第3多胜肽及第4多胜肽形成多聚體(2聚體)。例如，第1多胜肽與第3多胜肽、第2多胜肽與第4多胜肽之間，可經由形成雙硫鍵，而形成2聚體。
本發明的多胜肽多聚體中，以第1多胜肽及第2多胜肽對不同抗原具有結合活性者為佳。另一方面，第3多胜肽亦可為對與第1多胜肽及第2多胜肽之任一方或雙方相同的抗原具有結合活性的多胜肽。或者，亦可為與第1多胜肽及第2多胜肽對不同抗原具有結合活性的多胜肽。又第4多胜肽亦可為對與第1多胜肽及第2多胜肽之任一方相同的抗原具有結合活性的多胜肽。或者，亦可為與第1多胜肽及第2多胜肽對不同抗原 具有結合活性的多胜肽。
本發明中之「異種多聚體」為雙特異性抗體時，例如在第1多胜肽及第2多胜肽各自為含有對抗原A之抗體重鏈胺基酸序列的多胜肽、含有對抗原B之抗體重鏈胺基酸序列的多胜肽之情形，第3多胜肽可為含有對抗原A之抗體輕鏈胺基酸序列的多胜肽，第4多胜肽可為含有對抗原B之抗體輕鏈胺基酸序列的多胜肽， 本發明中「具有抗原結合活性的多胜肽」，係指對抗體重鏈或輕鏈之可變區域、受體、受體與Fc區域之融合胜肽、支架(Scaffold)及此等之片段等、抗原、配體等蛋白質及胜肽具有可結合定域(區域)之具有5個胺基酸以上長度的胜肽及蛋白質。亦即，具有抗原結合活性的多胜肽，可包含抗體可變區域、受體、受體與Fc區域之融合胜肽、支架(Scaffold)或此等之片段的胺基酸序列。
作為支架(Scaffold)，只要是可與至少1種抗原結合的立體結構安定之多胜肽，任何多胜肽皆可使用。該類多胜肽，可例舉如：抗體可變區域片段、纖維結合蛋白(Fibronectin)、蛋白質A定域(Protein A domain)、LDL受體A定域、運載蛋白(lipocalin)等，及Nygren人等(Current Opinion in Structural Biology,7：463-469(1997)、Journal of Immunol.Methods,209：3-28(2004))、Binz人等(Nature Biotech.,23：1257-1266(2005))、Hosse人等(Protein Science,15：14-27(2006))中所載之分子，但並不限定於此。
抗體可變區域、受體、受體與Fc區域之融合胜肽、支架 (Scaffold)及此等之片段的取得方法為本技術領域者所周知。也可使用包含區域之胺基酸序列及抗體輕鏈恒定區域之胺基酸序列的多胜肽。
本發明中之「還原條件」，係指在重鏈樞紐區域內形成重鏈間雙硫鍵之半胱胺酸殘基，經氧化而還原的狀態的可能性高的條件或環境，較佳指可能在重鏈間的樞紐區域內的半胱胺酸發生雙硫鍵的異構化之條件或環境，特別宜指在樞紐區域外的半胱胺酸不發生雙硫鍵的特異性異構化(亦即，保持重鏈與輕鏈間的雙硫鍵)，但可能在重鏈樞紐區域內的半胱胺酸發生雙硫鍵異構化之條件或環境。例如，本發明中，還原條件下，使含有Fc區域的第一多胜肽之同聚多肽與含有Fc區域的第二多胜肽共同溫育的時間，可由本技術領域之人士適當設定。
本發明中「還原劑」，係指可在其環境中使分子還原的化合物，亦即，指在其環境中使分子更還原的狀態，以及正改變為更還原狀態之化合物。還原劑經由提供電子而作用，藉此，在還原基質後，其本身成為氧化狀態。因此，還原劑係提供電子之作用物。還原劑之例，可包含：二硫蘇醣醇(DTT)、硫醇二醇、半胱胺酸、硫代乙醇酸、半胱胺(2-硫氫乙胺：2-MEA)、麩胱甘肽(GSH)、TCEP(三(2-羧乙基)膦)及氫硼化鈉。
本發明中「重鏈間雙硫鍵之異構化」，係指不同重鏈中所含之半胱胺酸間的雙硫鍵的交換，亦即雙硫鍵之重組。
「形成雙硫鍵」係指存在於1個或2個多胜肽中 之2個半胱胺酸之間形成共價鍵的過程，該鍵可以圖表示為「-S-S-」。
「雙硫鍵之還原」係指經由切斷雙硫鍵，產生2個硫氫基(-SH基)的過程。
本發明中「FcγR」或「FcgR」係指Fcγ受體，即指可結合於IgG1、IgG2、IgG3、IgG4單株抗體的Fc區域之受體，亦指實質上Fcγ受體基因譯碼(code)的蛋白質家族(family)的任意成員(member)。在人類中，該家族(family)可例舉如：含同型(isoform)FcγRIa、FcγRIb及FcγRIc之FcγRI(CD64)；含同型體FcγR Ⅱ a(含同種異型(allotype)H131(H型)及R131(R型))、FcγR Ⅱ b(含FcγR Ⅱ b-1及FcγR Ⅱ b-2)及FcγR Ⅱ c之FcγR Ⅱ(CD32)；及含同型FcγR Ⅲ a(含同種異型(allotype)V158及F158)及FcγR Ⅲ b(含同種異型(a11otype)FcγR Ⅲ b-NA1及FcγR Ⅲ b-NA2)之FcγR Ⅲ(CD16)；及任何尚未發現之人類FcγR類或FcγR同型(isotype)或同種異型(allotype)。FcγR包含來自人、小鼠、大鼠、兔子及猴子者，但不限定於此，來自於任何生物均可。小鼠FcγR類也包含如FcγRI(CD64)、FcγR Ⅱ(CD32)、FcγR Ⅲ(CD16)及FcγR Ⅲ-2(CD16-2)、FcγR Ⅳ及任何尚未發現之小鼠FcγR類或FcγR同型或同種異型(allotype)。
經由利用胺基酸殘基之電荷相斥的變異之製造異種多聚體的製造方法
上述方法之較佳態樣中，本發明，係對可形成2種以上多聚體的異種多聚體，為了促進第1及第2多胜肽的同聚多肽的 解離，控制形成1種以上多聚體的多胜肽之間的締合，使形成多胜肽間界面的胺基酸殘基變異，製造所欲之多胜肽的異型體之方法。
又，本發明之具有第1抗原結合活性的多胜肽及具有第2抗原結合活性的多胜肽，可包含抗體重鏈恒定區域之胺基酸序列或抗體Fc區域的胺基酸序列。抗體Fc區域或抗體重鏈恒定區域之胺基酸序列，例如人類IgG型恒定區域或Fc區域的胺基酸序列，但並不限定於此。IgG型恒定區域或Fc區域，可為天然型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4之同型任一者。或者也可以是此等的變異體。Fc區域EU編號第447位的離胺酸及EU編號第446位的甘胺酸，也可藉由將譯碼此等的核酸進行基因重組操作而去除。
又，本發明之具有第3抗原結合活性的多胜肽及具有第4抗原結合活性的多胜肽，可包含抗體輕鏈恒定區域之胺基酸序列。抗體輕鏈恒定區域之胺基酸序列，可例如人類kappa、人類lambda型恒定區域之胺基酸序列，但並不限定於此。或者也可以是此等的變異體。
又，本發明之具有抗原結合活性的多胜肽可包含抗體可變區域之胺基酸序列(例如：CDR1、CDR2、CDR3、FR1、FR2、FR3、FR4之胺基酸序列)。
又，本發明之控制多胜肽間的解離及/或締合的方法之較佳態樣，例如如在重鏈恒定區域之界面導入電荷相斥以抑制重鏈彼此締合的方法。在重鏈恒定區域之界面所接觸的胺基酸殘基，可例如對應CH3區域的第356位與第439位、第 357位與第370位、第399位與第409位的區域。在重鏈恒定區域以EU編號表示。
如後述之實施例所示，在使此等胺基酸殘基變異時，可經由實施本發明之方法，控制多胜肽間的重鏈解離及/或締合，優先獲得所欲的異種多聚體。亦即，較佳實施態樣中，本發明提供：含2種以上重鏈Fc區域的抗體及含Fc區域的蛋白質(例如：IgG型抗體、minibody(Alt M.et al.,FEBS Letters,1999；454：90-94)、免疫黏著蛋白(非專利文獻2)等)，且在第1重鏈Fc區域中選自下列(1)至(3)所示的胺基酸殘基之組的1組至3組之胺基酸殘基具有同類電荷的多胜肽。
(1)EU編號第356位及第439位的胺基酸殘基
(2)EU編號第357位及第370位的胺基酸殘基
(3)EU編號第399位及第409位的胺基酸殘基
再者，本發明亦提供，選自與上述第1重鏈Fc區域不同的第2重鏈Fc區域之前述(1)至(3)所示的胺基酸殘基之組的1組至3組之胺基酸殘基，且與選自前述第1重鏈Fc區域中前述(1)至(3)所示的胺基酸殘基之組中具有同類之電荷的組之相同位置的胺基酸殘基，為具有與前述第1重鏈Fc區域中的胺基酸殘基相反電荷的多胜肽。
上述多胜肽中，「具有電荷之胺基酸殘基」，以如選自以下(a)或(b)任一群中所含的胺基酸殘基為佳。
(a)麩胺酸(E)、天冬胺酸(D)；(b)離胺酸(K)、精胺酸(R)、組胺酸(H)。
上述多胜肽中，「具有同類電荷」，意指如2個以 上之胺基酸殘基任一者具有上述(a)或(b)之任一群所含的胺基酸殘基。「具有相反電荷」，意指如在2個以上胺基酸殘基中之至少1個胺基酸殘基具有上述(a)或(b)之任一群中所含的胺基酸殘基的情形，其餘之胺基酸殘基具有不同群所含的胺基酸殘基。
較佳之實施態樣中，上述多胜肽，第1重鏈CH3區域與第2重鏈CH3區域亦可經由雙硫鍵交聯。
本發明中之「締合界面控制變異」，例如以下的變異：(1)第1重鏈Fc區域中EU編號第356位之Asp(D)，變異為Lys(K)、Arg(R)或His(H)，及第2重鏈Fc區域中EU編號第439位之Lys(K)，變異為Glu(E)或Asp(D)；(2)第1重鏈Fc區域中EU編號第357位之Glu(E)，變異為Lys(K)、Arg(R)或His(H)，及第2重鏈Fc區域中EU編號第370位之Lys(K)，變異為Glu(E)或Asp(D)；(3)第1重鏈Fc區域中EU編號第399位之Asp(D)，變異為Lys(K)、Arg(R)或His(H)，及第2重鏈Fc區域中EU編號第409位之Lys(K)，變異為Glu(E)或Asp(D)。
本發明非限定之一實施態樣，為關於小鼠異種多聚體的製造方法之控制多胜肽間之解離及/或締合的方法之較佳態樣，該方法例如在重鏈恒定區域之界面導入電荷的相斥而控制重鏈彼此締合的方法。該方法中，作為在重鏈恒定區域之界面接觸的胺基酸殘基，可舉如相對於CH3區域中第356位與第439位、第360位與第371位、第399位與第409位的區 域。在重鏈恒定區域係以EU編號表示。
如後述實施例所示，經由使此等來自於小鼠的CH3區域中之胺基酸殘基變異，經由實施本發明之方法，可控制多胜肽間重鏈之解離及/或締合，優先獲得所欲的異種多聚體。亦即，在較佳之實施態樣中，本發明提供含2種以上重鏈Fc區域的抗體及含Fc區域的蛋白質(例如：IgG型抗體、minibody(Alt M.et al.,FEBS Letters,1999；454：90-94)、免疫黏著蛋白(非專利文獻2)等)，且在第1重鏈Fc區域中選自下列(1)至(3)所示的胺基酸殘基之組的1組至3組之胺基酸殘基具有同類電荷的多胜肽。
(1)EU編號第356位及第439位的胺基酸殘基
(2)EU編號第360位及第371位的胺基酸殘基
(3)EU編號第399位及第409位的胺基酸殘基
再者，本發明提供，在與上述第1重鏈Fc區域不同的第2重鏈Fc區域中選自前述(1)至(3)所示的胺基酸殘基之組的1組至3組之胺基酸殘基，且在前述第1重鏈Fc區域中在與前述(1)至(3)所示的胺基酸殘基之組中具有同類電荷的組之相同位置的胺基酸殘基，為具有與前述第1重鏈Fc區域中的胺基酸殘基相反電荷的多胜肽。
上述多胜肽中，「具有電荷之胺基酸殘基」，例如選自以下(a)或(b)任一之群中所含的胺基酸殘基為佳。
(a)麩胺酸(E)、天冬胺酸(D)；(b)離胺酸(K)、精胺酸(R)、組胺酸(H)。
上述多胜肽中，「具有同類電荷」，意指如2個以 上胺基酸殘基任一者具有上述(a)或(b)之任一群中所含的胺基酸殘基。「具有相反電荷」，意指如在2個以上的胺基酸殘基中之至少1個胺基酸殘基具有上述(a)或(b)之任一群所含的胺基酸殘基時，其餘之胺基酸殘基具有不同群所含的胺基酸殘基。
較佳之實施態樣中，上述多胜肽，第1重鏈CH3區域與第2重鏈CH3區域亦可經由雙硫鍵交聯。
本發明中之「締合界面控制變異」，可舉如以下的變異：(1)第1重鏈Fc區域中EU編號第356位之Asp(D)，變異為Lys(K)、Arg(R)或His(H)，及第2重鏈Fc區域中EU編號第439位之Lys(K)，變異為Glu(E)或Asp(D)；(2)第1重鏈Fc區域中EU編號第360位之Glu(E)，變異為Lys(K)、Arg(R)或His(H)，及第2重鏈Fc區域中EU編號第371位之Lys(K)，變異為Glu(E)或Asp(D)；(3)第1重鏈Fc區域中EU編號第399位之Asp(D)，變異為Lys(K)、Arg(R)或His(H)，及第2重鏈Fc區域中EU編號第409位之Lys(K)，變異為Glu(E)或Asp(D)。
本發明中提供「變異」的胺基酸殘基，並不限於多胜肽恒定區域之胺基酸殘基。本領域技術者，對於多胜肽變異體或異種多聚體，可經由使用市售的軟體之同源模擬等，尋得形成界面的胺基酸殘基，提供該部位的胺基酸殘基變異以控制締合。
本發明之方法中胺基酸殘基的「變異」，具體地， 係指將原先之胺基酸殘基取代為其他之胺基酸殘基、使原先之胺基酸殘基缺失、加入新胺基酸殘基等，較佳指將原先之胺基酸殘基取代為其他之胺基酸殘基。
經由使第397位及/或第392位變異的製造異種多聚體之製造方法
本發明之控制多胜肽間解離及/或締合的方法之較佳態樣，該方法係以在重鏈Fc區域導入胺基酸殘基變異以使重鏈CH3區域的安定性變得不安定之方法。該方法，亦可再包含任意地導入利用上述電荷相斥等控制界面相關的胺基酸變異之步驟。
本發明中「CH3區域之安定性不安定」，係指在Fc區域的胺基酸殘基增加至少1以上的變異之多胜肽的同聚多肽，與未變異的多胜肽之同聚多肽相比，變得容易分離為各多胜肽單體的狀態。
本發明中「CH3區域之安定性不安定」，宜為在CH3區域的胺基酸殘基導入變異而使pH7.4的重鏈CH3區域之熱變性半解離溫度(Tm)為72.5℃以下、72.0℃以下、71.5℃以下、71.0℃以下、70.5℃以下之狀態，較佳為在CH3區域的胺基酸殘基導入變異而使pH7.4的重鏈CH3區域之熱變性半解離溫度(Tm)為70.4℃以下、70.3℃以下、70.2℃以下、70.1。℃以下、70.0℃以下、69.9℃以下、69.8℃以下、69.7℃以下、69.6℃以下、69.5℃以下、69.0℃以下、68.5℃以下、68.0℃以下、67.5℃以下之狀態。
例如重鏈CH3區域的Tm，可以本說明書參考例3 中所載的方法測定，測定中所使用的緩衝液等可適當地選擇。
本發明之控制多胜肽間的解離及/或締合的方法之較佳態樣，該方法，係以在重鏈CH3區域EU編號第397位及/或第392位導入胺基酸殘基的變異為特徵之方法。該方法，亦可包含任意地，再導入利用上述電荷相斥等控制界面相關的胺基酸變異之步驟。
本發明之非限定之一態樣為，在控制來自於小鼠的多胜肽間的解離及/或締合的方法中，可導入重鏈CH3區域EU編號第397位及/或第392位之變異。該方法亦可再包含任意地導入利用上述電荷相斥等控制界面相關的胺基酸變異之步驟。
在第397位導入變異的胺基酸殘基，以變異為側鏈體積大之胺基酸或側鏈分支型的胺基酸為佳。
在第392胺基酸導入變異的胺基酸殘基，以變異為具有負電荷之胺基酸，且為側鏈體積大之胺基酸或側鏈分支型之胺基酸為佳。
本發明中「側鏈體積大之胺基酸」，例如：Met(M)、Phe(F)、Tyr(Y)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Trp(W)、Arg(R)、His(H)、Glu(E)、Lys(K)、Gln(Q)、Asp(D)、Asn(N)、Cys(C)、Thr(T)等，宜為Met(M)、Phe(F)、Thr(T)及Tyr(Y)等。
本發明中「側鏈分支型之胺基酸」，可例舉如：Val(V)、Ile(I)、Leu(L)，宜為Val(V)及Ile(I)。
本發明中「具有負電荷之胺基酸」，可例舉如：Asp (D)及Glu(E)。
本發明中「異種多聚體」，可舉多特異性抗體及異種融合蛋白質等。
本發明之非限定一態樣，為提供增強對FcγR之結合的異種多聚體之胺基酸變異。較佳之胺基酸變異部位，可舉如EU編號第397位的胺基酸的變異，但並不限定於此。在第397位導入變異的胺基酸殘基宜為變異為側鏈體積大之胺基酸或側鏈分支型之胺基酸者。
本發明中，更佳之多特異性抗體，例如：IgG型、scFv-IgG、Tandem scFv-Fc、DVD-Ig、微型雙功能抗體(Diabody)-Fc、單鏈微型雙功能抗體(Single chain Diabody)-Fc、IgG-scFv、sVD-IgG、Tandemab、scFv輕鏈C-端融合、三特異性C-端融合、三特異性N-端融合、IgG-Fab等(Bispecific Antibodies：Roland E.Kontermann,2011：WO/2010/034441：WO/2010/145792)。
本發明中，「抗體」的用語係以最廣義的意思來使用，只要可顯示所欲的生物學上之活性，包含單株抗體、多株抗體、抗體變異體(嵌合抗體、人型化抗體、小分子化抗體(含抗體片段)、多特異性抗體等)。而且，本發明中之「抗體」也可為多胜肽或異種多聚體任一者。較佳的抗體為單株抗體、嵌合抗體、人型化抗體、及抗體片段等的小分子化抗體。本發明中，在此等抗體獲得(製備)之時，可適宜使用本發明之解離及/或締合的方法。
提供本發明方法之較佳多胜肽或異種多聚體可舉 如具有抗體重鏈可變區域及輕鏈可變區域的多胜肽或異種多聚體。又較佳為，本發明之較佳態樣可舉例如在本發明之多胜肽或異種多聚體包含2種以上之重鏈可變區域及2種以上之輕鏈可變區域時，控制該多胜肽或異種多聚體的解離及/或締合的方法。
本發明具有抗原結合活性之多胜肽可包含抗體重鏈之胺基酸序列或輕鏈之胺基酸序列。更具體言之，具有第1抗原結合活性的多胜肽及具有第2抗原結合活性的多胜肽，可含抗體重鏈之胺基酸序列，具有第3抗原結合活性的多胜肽及具有第4抗原結合活性的多胜肽，可含抗體輕鏈之胺基酸序列。
又，在目的之多胜肽多聚體，第1多胜肽與第3多胜肽形成二聚體，第2多胜肽與第4多胜肽形成二聚體，而且此等二聚體彼此形成多具體之四聚體的情形時，本發明之多胜肽多聚體，可使用例如具有第1及第2抗原結合活性的多胜肽為含抗體重鏈胺基酸序列之多胜肽，具有第3及第4抗原結合活性的多胜肽為含抗體輕鏈胺基酸序列之多胜肽的多胜肽多聚體。
本發明中，較佳例如多特異性抗體為雙特異性抗體。
亦即，本發明之較佳態樣中，本發明關於如對於由2種重鏈(本發明中多胜肽多聚體的第1多胜肽及第2多胜肽)、及2種輕鏈(本發明中多胜肽多聚體的第3多胜肽及第4多胜肽)所構成之雙特異性抗體，控制解離及/或締合之方法。
本發明之較佳態樣之「雙特異性抗體」再更詳細言之，即上述「第1多胜肽及第2多胜肽」係指形成抗體的2 個重鏈(H鏈)中一方的H鏈(第1之H鏈)、及與該H鏈不同的另一方的H鏈(第2之H鏈)。亦即，可以2個H鏈中的任意一方為第1之H鏈，另一方為第2之H鏈。相同地，「第3多胜肽及第4多胜肽」係指形成雙特異性抗體的2個輕鏈(L鏈)中的一方的L鏈(第1之L鏈)、及與該L鏈不同的另一方的L鏈(第2之L鏈)，可以2個L鏈中任意之一方為第1之L鏈，另一方為第2之L鏈。通常，第1之L鏈及第1之H鏈係來自於辨認一抗原(或抗原決定基)的同一抗體，第2之L鏈及第2之H鏈亦來自於辨認一抗原(或抗原決定基)的同一抗體。此處，稱呼由第1之H鏈、L鏈所形成的L鏈-H鏈對為第1對(或第1之HL分子)，由第2之H鏈、L鏈所形成的L鏈-H鏈對為第2對(或第2之HL分子)。第1對及第2對所辨識的抗原可相同，但宜為辨認不同的抗原決定基。此情形下，第1對及第2對的H鏈及L鏈具有互相不同的胺基酸序列者為佳。在第1對及第2對辨認不同的抗原決定基的情形，該第1對及第2對亦可辨認完全不同的抗原，亦可辨認同一抗原上的不同部位(不同的抗原決定基)(如在抗原為異體受體的情形，多特異性抗體可辨認構成異體受體的不同之定域，或者，在抗原為單體的情形，多特異性抗體辨認單體抗原的多個位置)。通常，此類分子為與2個抗原結合，惟亦可對其以上(如3種)之抗原具有專一性。又，亦可為一方辨認蛋白質、胜肽、基因、糖等抗原，另一方可辨認放射性物質、化學療法藥劑、來自細胞的毒素等的細胞毒性物質等。但，在考慮希望製作具有以特定之H鏈及L鏈的組合所形成的對的抗體之情形 時，亦可任意地決定該特定之H鏈及L鏈作為第1對及第2對。
本發明中之「融合蛋白」，係指2個以上之相同或實質上類似的蛋白質分子經由Ig樞紐區域之胺基酸序列的連接序列(linker)接合的蛋白質。在說明含有超過1種的蛋白質之融合蛋白的情形時，使用「異質」的字頭。例如「異質融合蛋白」，係含有與1個以上其餘的蛋白質不同的1個以上的蛋白質同時接合的2個以上的蛋白質。
本發明中之「抗體」，包含經由取代、缺失、加入及/或插入、或者嵌合化、人型化等，使上述抗體的胺基酸變異者。胺基酸之取代、缺失、加入及/或插入、以及人型化、嵌合化等的胺基酸序列之變異，可以本領域技術人士公知方法進行。相同地，本發明中之抗體作為重組抗體製作之時所利用的抗體之可變區域及恒定區域，亦可經由胺基酸之取代、缺失、加入及/或插入、或者嵌合化及人型化等，使該胺基酸序列變異。
本發明中之抗體，可為小鼠抗體、人類抗體、大鼠抗體、兔子抗體、山羊抗體、駱駝抗體等來自於任何動物的抗體。再者，如嵌合抗體，其中亦可為取代人型化抗體等的胺基酸序列的變異抗體。而且，亦可為結合各種分子之抗體修飾物、抗體片段、小分子抗體等所有抗體。
「嵌合抗體」，係組合來自於不同動物之序列所製作的抗體。例如可舉如由小鼠抗體之重鏈、輕鏈的可變(V)區域與人類抗體之重鏈、輕鏈的恒定(C)區域所構成之抗體。 嵌合抗體之製作為公知，舉例如將編碼抗體V區域之DNA，連結在編碼人類抗體C區域之DNA上，將其組入表現載體並導入宿主而生產，獲得嵌合抗體。
「人型化抗體」，係稱為重構(reshape)人類抗體，係以來自於人類以外的哺乳動物的抗體，將如小鼠抗體之互補決定區(CDR，complementarity determining region)移接在人類抗體之CDR者。確認CDR的方法係公知(Kabat et al.,Sequence of Proteins of Immunological Interest(1987)；National Institute of Health,Bethesda,Md.、Chothia et al.,Nature(1989)；342：877)。又，其一般之基因重組技法亦為公知(參考歐洲專利申請公開編號EP 125023號公報、WO/96/02576號公報)。因此根據公知方法，例如確定小鼠抗體之CDR，取得編碼該CDR與人類抗體架構區(framework region：FR)連接之抗體的DNA，藉由使用通常的表現載體之系統，生產人型化抗體。如此之DNA，可製作含具有CDR及FR雙方的末端區域重疊之部分的數個寡核苷酸作為引子使用，經由PCR法合成(參考WO/98/13388號公報中所載之方法)。經由CDR所連接的人類抗體之FR，可選擇使CDR形成良好的抗原結合部位。視需要，也可以使抗體的可變區域的FR胺基酸變異以使重構人類抗體之CDR形成適當之抗原結合部位(Sato et al.,Cancer Res.(1993)；53：851-6)。可變異之FR中的胺基酸殘基，包含直接、非共價鍵鍵結抗原的部分(Amit et al.,Science(1986)；233：747-53)、影響或作用CDR構造的部分(Chothia et al.,J.Mol.Biol.(1987)；196：901-17) 及VH-VL相互作用的相關部分(EP 239400號專利公報)。
在本發明中抗體為嵌合抗體或人型化抗體的情形，此類抗體之C區域，宜使用來自於人類抗體者。例如H鏈可使用Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4，L鏈可使用Cκ、Cλ。而且，為了改善抗體或其生產之安定性，人類抗體C區域亦可視其需要加以修飾。本發明中之嵌合抗體宜由來自於人類以外的哺乳動物之可變區域、與來自於人類抗體的恒定區域所形成。另一方面，人型化抗體宜由來自於人類以外的哺乳動物之抗體的CDR、與來自於人類抗體的FR及C區域所形成。來自於人類抗體的恒定區域，具有在IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA、IgD及IgE等之同型之固有的胺基酸序列。本發明之人型化抗體所使用之恒定區域，也可為屬於某同型的抗體的恒定區域。宜為使用人類IgG之恒定區域，但不限定於此。又，人型化抗體所利用之來自於人類抗體的FR亦無特別之限定，可為屬於某同型之抗體者。
本發明中之嵌合抗體及人型化抗體的可變區域及恒定區域，只要可顯示原抗體的結合特異性，亦可經過缺失、取代、插入及/或加入等而被變異。
利用來自於人類的嵌合抗體及人型化抗體，由於降低在人類體內的抗原性，推論可在以治療目的等而投予人類的情形時為有效。
與改變等電點之技術等的組合
本發明之更佳態樣，可經由將改變多胜肽之等電點(pI值)的胺基酸變異，導入本發明之多胜肽，而以更高純度且有效率 地精製或製造具有目標第1至第4多胜肽的多胜肽多聚體(WO/2007/114325、US 2013 0171095)。為了促進多胜肽締合所導入的胺基酸變異，可使用記載在Protein Eng.,1996；Jul.9(7)：617-21、Protein Eng.Des.Sel.,2010；Apr.23(4),195-202、J.Biol.Chem.,2010；Jun.18,285(25)：19637-46、WO/2009/080254、US 20130195849中，經由重鏈恒定區域之CH3定域的變異而使含有2種重鏈恒定區域的多胜肽異締合化的方法，及記載於WO/2009/080251、WO/2009/080252、WO/2009/080253，促進重鏈及輕鏈的特定組合的締合化之方法等。
與標的組織特異性之抗原結合分子相關的技術之組合
本發明之非限定之實施態樣，例如從與標的組織特異性存在的分子有濃度依賴的抗原解離、締結合的抗體技術(WO/2013/180200)之組合。
與其他恒定區域及/或可變區域變異技術之組合
本發明非限定之實施態樣，例如與目的在增強對FcγR之結合而使恒定區域變異之技術(WO/2013/047752)的組合。
本發明與其他恒定區域變異技術之其他組合的態樣，例如與控制對補體結合的技術之組合。該補體，只要是形成補體遞變(cascade)的多胜肽，任何補體成分皆可使用，但是補體宜例如與調理素(opsonin)結合相關的Clq、C1r或Cls之補體成分。對Fc區域的補體之結合活性較天然型Fc區域對補體之結合活性為高的Fc區域，可經由使天然型Fc區域之胺 基酸變異而製作。此處所謂之天然型Fc區域，係指人類IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4所示的Fc區域。對Fc區域補體之結合活性，是否較天然型Fc區域對補體之結合活性為高，可使用FACS、ELISA等公知的免疫學方法適當實施。Fc區域的「胺基酸之變異」或「變異胺基酸」，係包含使起始Fc區域的胺基酸序列變異為不同之胺基酸序列者。只要起始Fc區域之修飾變異體在pH中性範圍可結合在補體者，任何Fc區域皆可作為起始定域。又，已增加變異的Fc區域作為起始Fc區域而又再增加變異的Fc區域，亦可作為本發明之Fc區域而適宜使用。起始Fc區域，可指多胜肽之本身、含起始Fc區域之組成物、或編碼起始Fc區域之胺基酸序列。起始Fc區域，可包含經由在抗體之項中大致說明的重組所產生的公知的IgG抗體之Fc區域。起始Fc區域之來源，並無限定，但可由任意非人類動物的生物或人類獲得。該任意之生物，宜選自如小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、沙鼠、貓、兔子、犬、山羊、綿羊、牛、馬、駱駝、及非靈長類的生物為佳。其他態樣中，起始Fc區域可由長尾猴、絨猿、恆河獼猴、黑猩猩、或人類取得。較佳地，起始Fc區域由人類IgG1取得，但不限定於特定之IgG類別。此亦意指，可將人類IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4之Fc區域作為起始Fc區域適宜使用。同樣，本說明書中，亦意指，可將前述之任意生物的IgG之任意類別(class)或亞型(subcalss)的Fc區域，較佳作為起始Fc區域使用。天然存在的Ig G的變異體或加工型之例，可舉如公知文獻(Curr.Opin.Biotechnol.(2009)；20(6)：685-91、Curr.Opin.Immunol.(2008)；20(4)： 460-470、Protein Eng.Des.Sel.(2010)；23(4)：195-202、WO/2009/086320、WO/2008/092117、WO/2007/041635、及WO/2006/105338)中所載者，但並不限定於此。
胺基酸之變異，只要具有對補體的結合活性、或提高對補體的結合活性，任何位置的胺基酸變異均可。抗原結合分子，在人類Fc區域為包含人類IgG1的Fc區域的情形時，對補體的結合可為包含較人類IgG1的起始Fc區域的結合活性更增強的效果之變異。使對補體結合活性變異的胺基酸，例如Duncan人等(Nature(1988)；332：738-740)、Tao人等(J.Exp.Med.(1993)；178：661-667)、Brekke人等(Eur.J.Immunol.(1994)；24：2542-2547)、Xu人等(Immunol.(1993)；150：152A)、WO/1994/029351、WO/2000/042072及WO/2011/091078等中所報告的對C1q的結合活性變異之Fc區域的胺基酸。
作為此類使對C1q結合活性增強的變異的可能的胺基酸，可舉如選自EU編號所示第231位至第238位、第318位至第337位的至少1個以上的胺基酸。該胺基酸之非限定之一例，可舉如選自第235位、第237位、第267位、第268位、第276位、第318位、第320位、第322位、第324位、第327位、第331位、及第333位所成之群的至少1個以上的胺基酸。經由這些胺基酸的變異，使IgG型免疫球蛋白Fc區域對補體的結合增強。
特別較佳的變異為，例如Fc區域EU編號所示之：第267位之胺基酸為Glu、第268位之胺基酸為Phe或Tyr任一者、 第276位之胺基酸為Arg、第324位之胺基酸為Thr、第327位之胺基酸為Gly、第331位之胺基酸為Pro、或第333位之胺基酸為Ala、Asp、Gly、Ser或Val任一者。又，變異的胺基酸數目沒有特別限定，可單一處的胺基酸變異，亦可任意組合這些的二處以上的胺基酸變異。
本發明與其他恒定區域變異技術的其他組合之態樣，可舉如在酸性pH的FcRn結合增強變異Fc技術(WO/2002/060919、WO/2004/035752、WO/2000/042072)、在中性pH的FcRn結合增強變異Fc技術(WO/2011/122011、WO/2012/133782)、抑制型Fcγ受體選擇性結合增強技術(WO/2012/115241、WO/2013/125667)、活性型Fcγ受體選擇性結合增強技術(ADCC活性增強技術)、(WO/2013/002362)、降低對Rheumatoid factor的結合活性技術(WO/2013/046704)等的與抗體變異技術之組合。
本發明與可變區域變異技術的非限定組合之態樣，例如pH依賴性抗體(WO/2009/125825)、鈣關聯性抗體(WO/2012/073992)等的變異技術之組合。
抗體庫、免疫及融合瘤之製作
本發明之方法中編碼導入變異前的抗體(本說明書中，有時單記載為「本發明之抗體」)之H鏈或L鏈的基因可使用已知之序列，又也可以本領域技術者公知方法獲得。例如，可由抗體庫獲得，亦可由產生單株抗體之融合瘤選殖編碼抗體的基 因獲得。
關於抗體庫，已有多個抗體庫為公知，又抗體庫之製作方法亦為公知，因此本領域技術人士可以取得適當的抗體庫。例如：噬菌體抗體庫方面，可參考Clackson et al.,Nature,1991；352：624-8、Marks et al.,J.Mol.Biol.,1991；222：581-97、Waterhouse et al.,Nucleic Acids Res.,1993；21：2265-6、Griffiths et al.,EMBO J.,1994；13：3245-60、Vaughan et al.,Nature Biotechnology,1996；14：309-14、及特表平20-504970號公報等之文獻。其他，亦可使用以真核細胞作為資料庫的方法(WO/95/15393號簡報)及核醣體表現法等公知的方法。再者，使用人類抗體庫，經由淘選(panning)獲得人類抗體的技術也是已知。例如，將人類抗體的可變區域作為單股抗體(scFv)，經由噬菌體表現法在在噬菌體表面表現時，可篩選與抗原結合的噬菌體。經過分析所篩選的噬菌體基因，可確定編碼與抗原結合的人類抗體的可變區域之DNA序列。與抗原結合的scFv之DNA序列為明確時，將該序列製作適當的表現載體，獲得人類抗體。此類方法已為一般所習知，可參考WO/92/01047、WO/92/20791、WO/93/06213、WO/93/11236、WO/93/19172、WO/95/01438、WO/95/15388。
由融合瘤獲得編碼抗體的基因的方法，基本上可使用一般公知技術，將所欲抗原或表現所欲抗原之細胞作為致敏抗原，將其以通常免疫方法免疫，將獲得的免疫細胞以通常的細胞融合法與公知的親代細胞融合，經由通常的篩選法，篩選單株抗體的抗體產生細胞(融合瘤)，之後由所獲得之融合 瘤的mRNA以反轉錄酶合成抗體可變區域(V區域)的cDNA，再將與編碼所欲抗體恒定區域(C區域)之DNA連接而獲得。
更具體言之，雖然不特別以下列之例做限定，但用於獲得編碼上述H鏈及L鏈之抗體基因的致敏抗原，包含致免疫性的完全抗原、及含不顯示致免疫性的半抗原之不完全抗原兩者。例如，可使用目的蛋白質的全長蛋白質或部分之胜肽等。其他，已知多醣類、核酸、脂質等所構成之物質可為抗原，本發明之抗體的抗原非特別限定者。抗原之調製，可以本領域技術者公知方法進行，例如可以使用桿狀病毒的方法(如WO/98/46777等)等進行操作。融合瘤之製作，例如可以Milstein人等之方法(G.Kohler and C.Milstein,Methods Enzymol.,1981；73：3-46)等進行操作。在抗原之致免疫性低的情形，可與白蛋白等具致免疫性的大分子結合，進行免疫。又，亦可視需要以抗原與其他分子結合而為可溶性抗原。在使用如受體之跨膜分子作為抗原的情形，可使用受體細胞外範圍部分作為片段，在細胞表面上表現跨膜分子的細胞作為免疫原使用。
抗體產生細胞可以上述適當之致敏抗原使動物免疫而獲得。或者，亦可以產生抗體之淋巴球在體外(in vitro)免疫而形成抗體產生細胞。免疫之動物可使用各種哺乳動物，一般使用囓齒目、兔形目、靈長目動物。例如小鼠、大鼠、天竺鼠等囓齒目，兔子等兔形目，長尾猴、恆河獼猴、阿拉伯狒狒、黑猩猩等之猿猴等靈長目動物。其他，已知含人類抗體基因基因庫之轉殖動物，也可使用此類動物獲得人類抗體(參考 WO/96/34096；Mendez et al.,Nat.Genet.,1997；15：146-56)。除了使用此類轉殖動物，也可以如在體外(in vitro)以表現所欲之抗體或所欲之抗原的細胞使人類淋巴球致敏，經由使致敏淋巴球與如U266之人類骨髓瘤細胞融合，可獲得具有與抗原結合活性的所欲人類抗體(參考專利特公平1-59878號公報)。又，以所欲抗原使具有人類抗體基因全部基因庫的轉殖動物免疫，可獲得所欲之人類抗體(參考WO/93/12227、WO/92/03918、WO/94/02602、WO/96/34096、WO/96/33735)。
動物之免疫作用，可將受致敏抗原以磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)或生理食鹽水等適當稀釋、懸浮，視需要混合佐劑乳化後，注射動物腹腔內或皮下注射。之後，宜以每日數次投予混合於弗洛德氏不完全佐劑的受致敏抗原投藥4~21天。產生抗體之確定，可以貫用方法測定動物血清中目標的抗體力價。
融合瘤可由以所欲抗原免疫的動物或淋巴球所獲得之抗體產生細胞，使用慣用的融合劑(如聚乙二醇)與骨髓瘤細胞融合而製成(Goding：Monoclonal Antibodies,Principles and Practice,Academic Press,1986：59-103)。視需要培養/增殖融合瘤細胞，經由免疫沉澱法、放射性免疫分析法(RIA)、酵素免疫吸附分析法(ELISA)等公知分析法測定由該融合瘤細胞產生之抗體的結合特異性。之後，視需要，產生已測定的目的特異性、親和性或活性之抗體的融合瘤細胞，可以限數稀釋法等技法進行次選殖。
接著，可從融合瘤細胞或產生抗體細胞(致敏淋 巴球等)，使用特異性結合於抗體的探針(如與編碼抗體恒定區域之序列互補的寡核苷酸等)，選殖編碼被篩選抗體的基因。又，亦可從mRNA經由RT-PCR選殖。免疫球蛋白，可分類為IgA、IgD、IgE、IgG及IgM之5個不同類別(class)。而且，這些類別又可再分為數個亞型(同型)(如IgG-1、IgG-2、IgG-3、及IgG-4；IgA-1及IgA-2等)。本發明中抗體之製造所使用的H鏈及L鏈，可為來自於屬於這些之任一類別及亞型的抗體，沒有特別限定，但以IgG特佳。
此處，亦可以基因工程之技法使編碼H鏈及L鏈之基因變異。例如，對於小鼠抗體、大鼠抗體、兔子抗體、天竺鼠抗體、綿羊抗體、駱駝抗體等抗體，可以降低對人類的異種抗原性等為目的，適宜地製作人工變異的基因重組抗體如嵌合抗體、人型化抗體等。嵌合抗體係由人類以外之哺乳動物，如小鼠抗體之H鏈、L鏈的可變區域，與人類抗體之H鏈、L鏈的恒定區域所構成之抗體，將編碼小鼠抗體可變區域之DNA與編碼人類抗體恒定區域之DNA連接，將其導入表現載體，導入宿主生產而獲得。人型化抗體，亦稱為重構(reshape)人類抗體，可以連結來自於人類以外的哺乳動物如小鼠抗體的互補決定區(CDR，complementary determining region)所設計的DNA序列，以末端部具有重疊部分製作的數個寡核苷酸經由PCR法合成。將所得之DNA連接於編碼人類抗體恒定區域之DNA，之後載入表現載體，將其導入宿主生產後製得(參考EP 239400、WO/96/02576)。經由CDR連接之人類抗體FR，可選擇互補決定區形成良好的抗原結合部位者。視需要，亦可 使抗體可變區域架構區的胺基酸變異，以使重構人類抗體之互補決定區形成適當的抗原結合部位(K.Sato et al.,Cancer Res.1993；53：851-856)。
上述之人型化以外，亦可考慮進行變異以改善與抗原之結合性等的抗體生物學上之特性。此類變異可以部位特異性突然變異法(參考如Kunkel(1985),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82：488)、PCR變異、片段致變等方法進行。一般而言，生物學上特性改善的抗體變異體具有相對於原抗體可變區域之胺基酸序列70%以上，較佳80%以上，更佳90%以上(如95%以上、97%、98%、99%等)之胺基酸序列相同性及/或類似性。本說明書中，序列之相同性及/或類似性，係定義為依照需要取序列相同性最大值而將序列整列化，及導入空隙(gap)後，與原抗體殘基相同(同樣之殘基)或類似(依一般胺基酸側鏈之特性分類為相同群組的胺基酸殘基)的胺基酸殘基之比例。通常，天然胺基酸殘基，依其側鏈之性質分類為：(1)疏水性：丙胺酸、異白胺酸、正白胺酸、纈胺酸、甲硫胺酸及白胺酸；(2)中性親水性：天冬醯胺酸、麩醯胺酸、半胱胺酸、蘇胺酸及絲胺酸；(3)酸性：天冬胺酸及麩胺酸；(4)鹼性：精胺酸、組胺酸及離胺酸；(5)鏈配向所影響之殘基：甘胺酸及脯胺酸；及(6)芳香族性：酪胺酸、色胺酸及苯丙胺酸之群組。
通常，H鏈及L鏈可變區域中所存在的全部6個互補決定區(高可變區域；CDR)相互作用，形成抗體之抗原結合部位。即使其中一個可變區域，亦較包含全部結合部位者 為低親和性，雖然已知有辨識、結合抗體的能力。因此，本發明之編碼H鏈及L鏈的抗體基因，可經由該抗體，所編碼的多胜肽可維持與所欲抗原的結合性，可編碼含H鏈及L鏈各抗原結合部位的片段部分。
多胜肽之活性及抗原之例示
藉由利用本發明之控制解離及/或締合的方法，可以有效率地製作如具有活性的抗體或多胜肽。該活性例如：結合活性、中和活性、細胞毒性、致效劑活性、拮抗劑活性、酵素活性等。致效劑活性為，經由抗體結合在受體等的抗原，在細胞內傳導訊息等，誘導任何生理上之活性變化的活性。作為生理上之活性，例如：增殖活性、存活活性、分化活性、轉錄活性、膜運送活性、結合活性、蛋白質分解活性、磷酸化/脫磷酸化活性、氧化還原活性、轉移活性、核酸分解活性、脫水活性、誘導細胞死滅活性、誘導細胞凋亡活性等，但不限定於此。
又根據本發明之方法，可以有效率地製作辨識所欲之抗原或與所欲受體結合的抗體或多胜肽。
本說明書中之抗原並無特別之限定，可為任何抗原。抗原之例，以如：配體(細胞激素、趨化細胞激素等)、受體、癌抗原、MHC抗原、分化抗原、免疫球蛋白及部分含免疫球蛋白之免疫複合體較佳。
細胞素之例，可舉如：介白素1至18、群落促進因子(G-CSF、M-CSF、GM-CSF等)、干擾素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ等)、生長因子(EGF、FGF、IGF、NGF、PDGF、TGF、HGF等)、腫瘤壞死因子(TNF-α、TNF-β)、淋巴毒素、促紅血球 生成素、瘦體素、SCF、TPO、MCAF、BMP。
趨化細胞激素之例，可舉如：CCL1至CCL28等之CC趨化細胞激素、CXCL1至CXCL17等之CXC趨化細胞激素、XCL1至XCL2等之C趨化細胞激素、CX3CL1等之CX3C趨化細胞激素。
受體之例，可舉如造血生長因子受體家族、細胞素受體家族、蛋白質酪胺酸激酶型受體家族、絲胺酸/蘇胺酸激酶型受體家族、TNF受體家族、鏈球菌G蛋白共軛型受體家族、GPI錨定蛋白型受體家族、酪胺酸磷酸酶型受體家族、細胞黏著因子家族、激素受體族家等的受體族類所述的受體等。這些受體家族所屬的受體、及其相關之特徵已記載於多篇文獻，例如：Cooke BA.,King RJB.,van der Molen HJ.ed.,New Comprehensive Biochemistry, Vol. 18B："Hormones and Their Actions, Part Ⅱ" pp.1-46(1988),Elsevier Science Publishers BV,Patthy(Cell(1990)；61(1)：13-14)、Ullrich人等(Cell(1990)；61(2)：203-212)、Massagué(Cell(1992)；69(6)：1067-1070)、Miyajima人等(Annu.Rev.Immunol.(1992)；10：295-331)、Taga人等(FASEB J.(1992)；6：3387-3396)、Fantl人等(Annu.Rev.Biochem.(1993)；62：453-481)、Smith人等(Cell(1994)；76(6)：959-963)、FlowerDR.(Biochim.Biophys.Acta(1999)；1422(3)：207-234)等。
上述受體家族所屬之具體受體例，例如：人類或小鼠促紅血球生成素(EPO)受體(Blood(1990)；76(1)：31-35、Cell(1989)；57(2)：277-285)、人類或小鼠顆粒球群落促進因子 (G-CSF)受體(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)；87(22)：8702-8706、mG-CSFR，Cell(1990)；61(2)：341-350)、人類或小鼠血小板生長激素(TPO)受體(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)；89(12)：5640-5644、EMBO J.(1993)；12(7)：2645-53)、人類或小鼠胰島素受體(Nature(1985)；313(6005)：756-761)、人類或小鼠Flt-3配體受體(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1994)；91(2)：459-463)、人類或小鼠血小板衍生生長因子(PDGF)受體(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)；85(10)：3435-3439)、人類或小鼠干擾素(IFN)-α、-β受體(Cell(1990)；60(2)：225-234及Cell(1994)；77(3)：391-400)、人類或小鼠瘦體素受體、人類或小鼠生長激素(GH)受體、人類或小鼠介白素(IL)-10受體、人類或小鼠類胰島素生長因子(IGF)-I受體、人類或小鼠白血病抑制因子(LIF)受體、人類或小鼠睫狀節神經營養因子(CNTF)受體等為較佳例示。
癌抗原係伴隨細胞之惡性轉形所表現的抗原，又稱為腫瘤特異性抗原。又，細胞癌化時在細胞表面及蛋白質分子上出現的異常糖鏈亦為癌抗原，稱為癌糖鏈抗原。癌抗原例如上述受體屬於GPI錨定蛋白型受體家族、始自於肝癌的數種癌中表現之GPC3(Int.J.Cancer(2003)；103(4)：455-65)、始自肺癌的數種癌中表現之EpCAM(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989)；86(1)：27-31)、CA19-9、CA15-3、SSEA-1系列(SLX)等。
MHC抗原，主要分類為MHC class I抗原及MHC class Ⅱ抗原，MHC class I抗原中，包含HLA-A、-B、-C、-E、 -F、-G、-H，MHC class Ⅱ抗原中，包含HLA-DR、-DQ、-DP。
分化抗原，可包含CD1、CD2、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15s、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD23、CD25、CD28、D29、CD30、CD32、CD33、CD34、CD35、CD38、CD40、CD41a、CD41b、CD42a、CD42b、CD43、CD44、CD45、CD45RO、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD51、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD64、CD69、CD71、CD73、CD95、CD102、CD106、CD122、CD126、CDw130。
免疫球蛋白包含IgA、IgM、IgD、IgG、IgE。又免疫複合體包含至少免疫球蛋白任一種之成分。
其他之抗原可舉如下述之分子：17-IA、4-1BB、4Dc、6-酮-PGF1a、8-異-PGF2a、8-氧代-dG、A1腺嘌呤核苷受體、A33、ACE、ACE-2、活化素、活化素A、活化素AB、活化素B、活化素C、活化素RIA、活化素RIA ALK-2、活化素RIBALK-4、活化素R Ⅱ A、活化素R Ⅱ B、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、黏膜血管定位因子(addressin)、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、α-1-抗胰蛋白酶、α-V/β-1受體致效劑、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、防禦素(artemin)、抗Id、ASPARTIC、心房利尿鈉肽、av/b3整合素、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B淋巴球促進因子(Blys)、BACE、BACE-1、 Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2、BMP-2a、BMP-3(造骨素(osteogenin))、BMP-4、BMP-2b、BMP-5、BMP-6Vgr-1、BMP-7(OP-1)、BMP-8(BMP-8a、OP-2)、BMPR、BMPR-IA(ALK-3)、BMPR-IB(ALK-6)、BRK-2、RPK-1、BMPR-Ⅱ(BRK-3)、BMP、b-NGF、BOK、鈴蟾素、骨由來神經營養因子、BPDE、BPDE-DNA、BTC、補體因子(C3)、C3a、C4、C10、CA125、CAD-8、降血鈣素、cAMP、癌胚胎抗原(CEA)、癌相關抗原、組織蛋白酶A、組織蛋白酶B、組織蛋白酶C/DPPI、組織蛋白酶D、組織蛋白酶E、組織蛋白酶H、組織蛋白酶L、組織蛋白酶O、組織蛋白酶S、組織蛋白酶V、組織蛋白酶X/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33(p67蛋白質)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80(B7-1)、CD89、CD95、 CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉毒桿菌毒素、產氣莢膜芽胞桿菌毒素、CKb8-1、CLC、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、COX、C-Ret、CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CL1、CX3CR1、CXCL、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、細胞角蛋白腫瘤相關抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、補體調控因子(Decay accelerating factor)、des(1-3)-IGF-I(腦IGF-1)、Dhh、長葉毛地黃苷、DNAM-1、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR(ErbB-1)、EMA、EMMPRIN、ENA、內皮素受體、抑制腦啡肽酶、eNOS、Eot、伊紅趨素、EpCAM、激活腦蛋白B2/EphB4、EPO、ERCC、E-選滯蛋白、ET-1、凝血因子-Ⅱ a、凝血凝血因子-Ⅶ、凝血因子-Ⅷ c、凝血因子-Ⅸ、人類纖維母細胞活化蛋白(FAP)、Fas、FcR1、FEN-1、帶鐵蛋白、EGF、EGF-19、EGF-2、EGF-3、EGF-8、EGFR、EGFR-3、血纖維蛋白、FL、FLIP、Flt-3、Flt-4、濾泡促進激素、趨化因子fractalkine、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14、CDMP-1)、GDF-6(BMP-13、CDMP-2)、GDF-7(BMP-12、CDMP-3)、GDF-8(肌肉生長抑制素)、GDF-9、GDF-15 (MIC-1)、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-1、GFR-α1、GFR-α2、GFR-α3、GITR、胰高血糖激素、Glut4、醣蛋白Ⅱ b/Ⅲ a(GP Ⅱ b/Ⅲ a)、GM-CSF、gp130、gp72、GRO、生長激素分泌激素、不完全抗原(NP-cap或NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCMVgB表面膜醣蛋白、HCMV gH表面膜醣蛋白、HCMV UL、造血生長因子(HGF)、Hep B gp120、乙醯肝素酶、Her2、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)、單純疱疹病毒(HSV)gB醣蛋白、HSV gD醣蛋白、HGFA、高分子量惡性黑色素細胞瘤相關抗原(HMW-MAA)、HIV gp120、HIV Ⅲ B gp120 V3環狀序列、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HRG、Hrk、人類心肌肌凝蛋白、人類細胞巨大病毒(HCMV)、人類生長激素(HGH)、HVEM、I-309、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA受體、IgE、IGF、IGF結合蛋白、IGF-1R、IGFBP、IGF-I、IGF-Ⅱ、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-23、干擾素(INF)-α、INF-β、INF-γ、抑制素、iNOS、胰島素A鏈、胰島素B鏈、類胰島素生長因子1、整合素α2、整合素α3、整合素α4、整合素α4/β1、整合素α4/β7、整合素α5(αV)、整合素α5/β1、整合素α5/β3、整合素α6、整合素β1、整合素β2、整合素γ、IP-10、I-TAC、JE、胰舒血管素2、胰舒血管素5、胰舒血管素6、胰舒血管素11、胰舒血管素12、胰舒血管素14、胰舒血管素15、胰舒血管素L1、胰舒血管素L2、胰舒血管素L3、胰舒血管素L4、KC、KDR、角質細胞生長因子 (KGF)、層連結蛋白5、LAMP、LAP、LAP(TGF-1)、潛在TGF-1、潛在TGF-1 bp1、LBP、LDGF、LECT2、lefty、路易士-Y抗原、路易士-Y相關抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-選擇素、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面、黃體成長激素、淋巴毒素β受體、Mac-1、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、金屬蛋白酶、MGDF受體、MGMT、MHC(HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP-1-α、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、黏液素(Muc1)、MUC18、慕氏管抑制物、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-C黏合蛋白、NCA 90、NCAM、NCAM、腦啡肽酶(neprilysin)、神經營養因子(neurotrophin)-3、-4、或-6、神經營養蛋白(neurturin)、神經生長因子(NGF)、NGFR、NGF-β、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG、OPN、OSM、OX40L、OX40R、p150、p95、PADPr、副甲狀腺激素、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-細胞黏附蛋白、PCNA、PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盤鹼性磷酸酶(PLAP)、PLGF、PLP、PP14、前胰島素、前鬆弛素、人類C蛋白、PS、PSA、PSCA、攝護腺專一性膜抗原(PSMA)、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、鬆弛素A鏈、鬆弛素B鏈、腎激素、呼吸道融合病毒(RSV)F、 RSV Fgp、Ret、類風濕性因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、SERINE、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-Ⅱ、TACE、TACI、TAG-72(腫瘤相關醣蛋白-72)、TARC、TCA-3、T細胞受體(如T細胞受體α/β)、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睪丸類PLAP鹼性磷酸酶、TfR、TGF、TGF-α、TGF-β、TGF-β Pan Specific、TGF-β RI(ALK-5)、TGF-β R Ⅱ、TGF-β R Ⅱ b、TGF-βR Ⅲ、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、凝血酶、胸腺Ck-1、促甲狀腺激素、Tie、TIMP、TIQ、組織因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-α、TNF-αβ、TNF-β2、TNFc、TNF-RI、TNF-R Ⅱ、TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2、DR4)、THFRSF10B(TRAIL R2 DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1、LIT、TRID)、TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2、TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R、TRANCE R)、TNFRSF11B(OPG OCIF、TR1)、TNFRSF12(TWEAK R FN14)、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFF R)、TNFRSF14(HVEM ATAR、HveA、LIGHT R、TR2)、TNFRSF16(NGFR p75NTR)、TNFRSF17(BCMA)、TNFRSF18(GITR AITR)、TNFRSF19(TROY TAJ、TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSF1A(TNF RI CD120a、p55-60)、TNFRSF1B(TNF R Ⅱ CD120b、p75-80)、TNFRSF26(TNF RH3)、TNFRSF3(LTbR TNF R Ⅲ、TNFC R)、TNFRSF4(OX40 ACT35、TXGP1 R)、TNFRSF5(CD40 p50)、TNFRSF6(Fas Apo-1、APT1、 CD95)、TNFRSF6B(DcR3 M68、TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1BB CD137、ILA)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRST23(DcTRAIL R1 TNFRH1)、TNFRSF25(DR3 Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF10(TRAIL Apo-2配體、TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANK配體ODF、OPG配體)、TNFSF12(TWEAK Apo-3配體、DR3配體)、TNFSF13(APRIL TALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEM配體、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITR配體AITR配體、TL6)、TNFSF1A(TNF-a連結蛋白(Conectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC、p33)、TNFSF4(OX40配體gp34、TXGP1)、TNFSF5(CD40配體CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP)、TNFSF6(Fas配體Apo-1配體、APT1配體)、TNFSF7(CD27配體CD70)、TNFSF8(CD30配體CD153)、TNFSF9(4-1BB配體CD137配體)、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、轉鐵蛋白受體、TRF、Trk、TROP-2、TSG、TSLP、腫瘤相關抗原CA125、腫瘤相關抗原表現病毒Y相關碳水化合物、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-鈣黏蛋白、VE-鈣黏蛋白-2、VEFGR-1(flt-1)、VEGF、VEGFR、VEGFR-3(flt-4)、VEGI、VIM、病毒抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR整合素、韋伯氏因子(von Willebrand factor)、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、 WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、HMGB1、IgA、Aβ、CD81、CD97、CD98、DDR1、DKK1、EREG、Hsp90、IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、氧化LDL、PCSK9、前胰舒血管素(prekallikrein)、RON、TMEM16F、SOD1、染色顆粒素(Chromogranin)A、染色顆粒素B、tau、VAP1、高分子激肽原、IL-31、IL-31R、Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、EPCR、C1、C1q、C1r、C1s、C2、C2a、C2b、C3、C3a、C3b、C4、C4a、C4b、C5、C5a、C5b、C6、C7、C8、C9、補體因子B、補體因子D、補體因子H、血清滅菌蛋白(properdin)、骨硬化素(sclerostin)、血纖維蛋白原(fibrinogen)、血纖維蛋白(fibrin)、凝血酶原(prothrombin)、凝血酶(thrombin)、組織因子、凝血因子V、凝血因子Va、凝血因子Ⅶ、凝血因子Ⅶ a、凝血因子Ⅷ、凝血因子Ⅷa、凝血因子Ⅸ、凝血因子Ⅸ a、凝血因子X、凝血因子X a、凝血因子X I、凝血因子X I a、凝血因子X Ⅱ、凝血因子X Ⅱ a、凝血因子X Ⅲ、凝血因子X Ⅲ a、TFP1、抗凝血酶Ⅲ、EPCR、人類凝血酶調節素、TAPI、tPA、纖維蛋白溶酶原(plasminogen)、纖維蛋白溶酶(plasmin)、PAI-1、PAI-2、GPC3、多配體聚醣(syndecan)-1、多配體聚醣-2、多配體聚醣-3、多配體聚醣-4、LPA、SIP以及激素及生長因子之受體。
再者，本發明之非限定之一實施態樣，雙特異性抗體的一個特異性，以癌抗原為標的，另一特異性以CTL (Cytotoxic T lymphocyte)所表現的抗原，如CD3及TNFRSF(Tumor Necrosis Factor Receptor Super Family)，為標的，但不限此組合。TNFRSF之例，可舉如TNFRSF9(CD137)、TNFRSF5(CD40)及TNFRSF4(OX40)等等。
核酸之變異
又，本發明之製造方法之其他實施態樣中，本發明提供異種多聚體的製造方法，其係以控制多胜肽間之解離及/或締合而於形成多胜肽間界面之胺基酸殘基(如EU編號第356位及第439位、第357位及第370位、及第399位及第409位之胺基酸殘基)、及/或含EU編號第397位及/或第392位之胺基酸殘基具有變異之異種多聚體的製造方法，包含：(a)以控制多胜肽間之解離及/或締合，而將編碼形成該多胜肽間界面等的胺基酸殘基之核酸從原核酸變異之步驟、(b)以表現該多胜肽而培養具有該核酸的宿主細胞之步驟、(c)從該宿主細胞之培養物回收該多胜肽之步驟、及(d)在還原條件下，溫育各多胜肽，回收所欲多胜肽的異型體之步驟。
又，包含利用本發明上述控制解離及/或締合的方法，以抑阻多胜肽間的締合，而使編碼形成該多胜肽間界面等之胺基酸殘基的核酸由原始核酸變異之步驟的方法，也是本發明之上述製造方法的較佳態樣之一。
本發明之上述方法中「使核酸變異」，係指對應本發明中經由「變異」所導入之胺基酸殘基而使核酸變異。更具體言之，係指對於編碼原始(變異前)胺基酸殘基的核酸，使經由變異所導入之編碼胺基酸殘基的核酸變異。通常，為形成 編碼目的胺基酸殘基之密碼子(codon)，對原先的核酸，進行插入、缺失或取代至少一個鹼基的基因操作或變異處理。亦即，將編碼原始胺基酸殘基的密碼子，經由變異所導入之編碼胺基酸殘基的密碼子而被取代。如此核酸之變異，可使用本領域技術者公知技術，例如特定部位致變法、PCR變異導入法等適當地實施。
又，本發明中之核酸，通常擔載(插入)在適當之載體上，導入宿主細胞。該載體只要可安定地保留插入的核酸，無特別之限定，例如使用大腸菌為宿主者，較佳使用pBluescript載體(Stratagene公司製造)等做為選殖用載體，但可使用市售之各種載體。在生產本發明多胜肽的目的中使用載體之情形，特別以表現載體為有用。表現載體只要是可在試管內、大腸菌內、培養細胞內、生物個體內表現多胜肽的載體，沒有特別之限定，例如在試管內表現時，以pBEST載體(Promega公司製造)、為大腸菌時，以pET載體(Invitrogen公司製造)、為培養細胞時，以pME18S-FL3載體(GenBank Accession No.AB009864)、為生物個體時，以pME18S載體(Mol.Cell Biol.,8：466-472(1988))等為佳。將本發明之DNA插入載體，可以常法，如在限制酶部位使用連接酶反應進行(Current Protocol in Molecular Biology,edit.Ausubel et al.(1987),Publish,John Wiley & Sons,Section：11.4-11.11)。
上述宿主細胞並無特別之限定，可依照目的使用各種宿主細胞。做為表現多胜肽之細胞，可例舉如細菌細胞(如：鏈球菌、葡萄球菌、大腸菌、鏈黴菌、枯草菌)、真菌 細胞(如：酵母、麴菌)、昆蟲細胞(如：果蠅S2細胞株、秋夜盜蛾SF9細胞株)、動物細胞(如：CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes人類黑色素瘤細胞)及植物細胞。將載體導入宿主細胞，可以如：磷酸鈣沉澱法、電脈衝穿孔法(Current Protocol in Molecular Biology,edit.Ausubel et al.(1987),Publish,John Wiley & Sons,Section：9.1-9.9)、脂質體轉染法(GIBCO-BRL公司製造)、顯微微量注射法等一般習知之方法進行。
為使宿主細胞中表現的多胜肽分泌至小胞體的內腔、細胞胞膜區間、或細胞外之環境，亦可在目的之多胜肽中載入適當的分泌訊息序列。這些訊息序列對目的之多胜肽可為內因性，亦可為異種訊息。
上述製造方法中多胜肽的回收，在本發明的多胜肽分泌在培養液中的情形，可回收培養液。在本發明的多胜肽於細胞內產生的情形，可先將該細胞溶解，之後回收多胜肽。
由重組的細胞培養物回收、精製本發明的多胜肽，可使用包括硫酸銨或乙醇沉澱、酸萃取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水性相互作用層析、親和層析、羥磷灰石層析及凝集蛋白層析的一般習知之方法。
本發明之非限定之實施樣態，可舉如培養各產生第一及第二多胜肽之同聚多肽的各細胞株，再以該培養上清液精製後之精製抗體引發FAE(Fab Arm Exchange)反應的方法；培養各產生第一及第二多胜肽之同聚多肽的各細胞株，但不精製而混合該培養上清液，再於混合培養上清液中引發FAE反 應，之後再精製之方法；混合培養產生第一多胜肽之同聚多肽的細胞株及產生第二多胜肽之同聚多肽的細胞株，再以該培養上清液精製後之精製抗體引發FAE反應之方法；混合培養產生第一多胜肽之同聚多肽的細胞株及產生第二多胜肽之同聚多肽的細胞株，再於該培養上清液中引發FAE反應，之後予以精製之方法。
本發明，非限定之實施樣態，提供異種多聚體之製造方法，包含以下a)至c)之步驟：a)混合產生第一多胜肽之同聚多肽的細胞株及產生第二多胜肽之同聚多肽的細胞株之階段，b)在該培養上清液中，使樞紐區域內之半胱胺酸發生雙硫鍵之異構化，而共同溫育該第1多胜肽之同聚多肽及該第2多胜肽之同聚多肽之階段，以及c)製得含第1及第2多胜肽的異種多聚體之階段。
本發明，非限定之實施樣態，提供異種多聚體之製造方法，包含以下a)至c)之步驟：a)培養各產生第一及第二多胜肽之同聚多肽的細胞株之階段，b)混合各細胞株之培養上清液，使樞紐區域內之半胱胺酸發生雙硫鍵之異構化，而共同溫浴該第一多胜肽之同聚多肽及該第二多胜肽之同聚多肽之階段，以及c)製得含第一及第二多胜肽之異種多聚體之階段。
篩選所欲之異種多聚體的方法
再者本發明提供篩選所欲之異種多聚體的方法。較佳之實 施態樣，該方法係包含下列階段之篩選具有所欲特性之異種多聚體的方法：a)提供第一多胜肽之組及第二多胜肽之組之階段，構成第1組的各多胜肽具有與構成第2組的各多胜肽不同的標的特異性，且構成第1及第2組的各多胜肽，含有利用上述電荷相斥控制界面所相關的胺基酸變異及/或使CH3區域之安定性為不安定的胺基酸變異之階段，b)在還原條件下，共同溫浴構成該第1組的各多胜肽及構成該第2組的各多胜肽，以其製作多種異種多聚體的混合物之階段，c)對於結果所得之複數種異種多聚體的混合物分析所賦予的所欲的特性之階段，以及d)篩選具有所欲特性的異種多聚體之階段。
醫藥組成物
本發明亦關於包含本發明之異種多聚體、及醫藥上容許的載體的組成物(藥劑)。
於本發明中，醫藥組成物通常係指用於疾病之治療或預防、或者檢查、診斷的藥劑。
本發明之醫藥組成物，可以本領域技術者公知的方法予以製劑化。例如，可以水或其以外的其他藥學上容許的液體之無菌溶液、或以懸浮液劑之注射劑的形態非經口使用。例如，醫藥上容許的載體或媒介體，具體言之，如滅菌水及生理食鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、界面活性劑、安定劑、香味劑、賦形劑、載劑(vehicle)、防腐劑、黏結劑 等適當組合，以一般所知製藥實施上所要求之單位用量形態混合而製劑化。此等製劑中之有效成分量，可設定在指定範圍之適當容量。
用以注射之無菌組成物可使用注射用蒸餾水之類的載劑根據通常製劑之實施作為處方。
注射用水溶液之例，可舉如含生理食鹽水、葡萄糖及其他之補助劑(如D-山梨醣醇、D-甘露醣、D-甘露醣醇、氯化鈉)等的等張溶液。亦可再併用適當之溶解助劑，例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、聚乙二醇等)、非離子性界面活性劑(縮聚山梨醇油酸酯80(TM)、HCO-50等)。
油性液可舉如麻油、大豆油，亦可併用溶解助劑之苯甲酸苯甲酯及/或苯甲醇。又亦可與緩衝劑(如磷酸鹽緩衝液及乙酸鈉緩衝液)、舒緩劑(如鹽酸普魯卡因)、安定劑(如苯甲醇及酚)、抗氧化劑調配。所調配之注射液，通常填充在適當的安瓶。
本發明之醫藥組成物，以非經口投藥投予為佳。例如注射劑型、經鼻投藥劑型、經肺投藥劑型、經皮投藥劑型等之組成物。例如：靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等全身或局部投藥。
投藥方法可依患者之年齡、症狀適當選擇。含抗體或編碼抗體之聚核苷酸的醫藥組成物之投藥量，可設定為例如每次體重每1kg為0.0001mg至1000mg的範圍。或者，以如患者每人為0.001至100000mg的投藥量，但本發明並不限定於這些數值。投藥量及投藥方法，可依患者之體重、年齡、 症狀等改變，在本領域之技術者考慮這些條件後可設定適當之投藥量及投藥方法。
本發明中，上述本發明之異種多聚體，作為對癌之治療劑或預防劑的有效成分為有用。癌包含如下，惟並不單限定於此：肺癌(包含小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及肺鱗狀上皮細胞癌)、大腸癌、直腸癌、結腸癌、乳癌、肝癌、胃癌、胰臟癌、腎臟癌、前列腺癌、卵巢癌、甲狀腺癌、膽管癌、腹膜癌、間皮細胞癌、鱗狀上皮細胞癌、子宮頸癌、子宮癌、膀胱癌、食道癌、頭頸部癌、鼻咽癌、唾液腺瘤、胸腺瘤、皮膚癌、基底細胞癌、惡性黑色素瘤、肛門癌、陰莖癌、精巢癌、Wilms氏癌、急性骨髓性白血病(包含急性前骨髓細胞白血病、急性骨髓母細胞性白血病、急性前骨髓細胞白血病、急性骨髓單核球白血病及急性單核球性白血病)、慢性骨髓性白血病、急性淋巴球性白血病、慢性淋巴球性白血病、Hodgkin氏淋巴瘤、非Hodgkin氏淋巴瘤(Burkitt氏淋巴瘤、慢性淋巴球性白血病、蕈狀肉芽腫、外套細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、瀰漫大B細胞淋巴瘤、皮膚邊緣區淋巴瘤、毛狀細胞白血病漿細胞瘤、周邊T細胞淋巴瘤及成人T細胞白血病/淋巴瘤)、Langerhan氏細胞組織球增生症、多發性骨髓瘤、骨髓增生不良症候群、腦腫瘤(包含神經膠質瘤、星狀細胞瘤、多形性神經膠質母細胞瘤、腦脊髓膜瘤及室管膜瘤)、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、骨肉瘤、Kaposi肉瘤、Ewing氏肉瘤、血管肉瘤、血管周皮細胞瘤。
又視需要，本發明之多胜肽或異種多聚體亦可與 其他醫藥成分組合後製劑。
又本發明提供包含至少以本發明的製造方法所製造之異種多聚體、或本發明的醫藥組成物之用於本發明的治療方法或預防方法之套組。該套組可預先加入藥學上容許之載體、媒介體、記載使用方法的說明書等包裝。又本發明關於含本發明之多胜肽或以本發明之製造方法所製造的多胜肽之於免疫發炎性疾病之治療劑或預防劑的製造之使用。又本發明關於用於本發明之治療方法或預防方法之本發明之多胜肽或以本發明之製造方法所製造的多胜肽。
再者本說明書中對應胺基酸的3字之表示及1字之表示係如下。
丙胺酸：Ala：A
精胺酸：Arg：R
天冬醯胺酸：Asn：N
天冬胺酸：Asp：D
半胱胺酸：Cys：C
麩醯胺酸：Gln：Q
麩胺酸：Glu：E
甘胺酸：Gly：G
組胺酸：His：H
異白胺酸：Ile：I
白胺酸：Leu：L
離胺酸：Lys：K
甲硫胺酸：Met：M
苯丙胺酸：Phe：F
脯胺酸：Pro：P
絲胺酸：Ser：S
蘇胺酸：Thr：T
色胺酸：Trp：W
酪胺酸：Tyr：Y
纈胺酸：Val：V
又，本說明書中所引用的所有先前技術文獻，均併入本說明書中作為參考。
實施例
〔實施例1〕以導入控制抗體結合界面之變異而提高Fab Arm Exchange效率的檢討
Fab Arm Exchange係以二種同聚抗體在還原劑存在下混合，所產生之四股抗體分子單臂(稱為半分子或HL分子，係由一股重鏈及一股輕鏈所構成之分子)經由再結合，產生雙特異性抗體。HL分子的再結合係隨機發生，因此理論上目的之雙特異性抗體，只可得系統中存在的總抗體量的50%。然而，二種同聚抗體在預先導入不同電荷時，所產生之HL分子彼此在再結合時，較同聚二量體化，會優先發生異聚二量體化，因此可能高效率地製作雙特異性抗體。此處，在WO/2006/106905所報導的控制在抗體CH3區域締合界面的變異(利用2種H鏈CH3區域之電荷相互作用及相斥而使其異聚締合之變異)，驗証可否提高Fab Arm Exchange之反應效率(雙特異性抗體生成率)。
抗體之H鏈可變區域使用WO/2009/125825所揭示之人類介白素6受體的抗體之H鏈可變區域WT(H)(序列編號1：後面記載為MRAH)及H54(序列編號2)。製作對該H鏈可變區域，做為抗體H鏈之恒定區域，以人類IgG1去除H鏈恒定區域C末端之Gly及LyS之具有G1d之MRAH-G1d(序列編號3)及H54-G1d(序列編號4)，以及去除人類IgG4之H鏈恒定區域C末端的Gly及Lys之具有wtG4d之MRAH-wtG4d(序列編號5)及H54-wtG4d(序列編號6)。之後，為形成IgG4型樞紐序列、CH3定域序列，對MRAH-G1d及H54-G1d，導入P228S及K409R變異製作為MRAH-G1dsr(序列編號7)、及H54-G1dsr(序列編號8)。而且做為控制締合界面的變異，製作：在MRAH-G1dsr導入D356K之MRAH-G1dsrP1(序列編號9)、在H54-G1dsr導入K439E之H54-G1dsrN1(序列編號10)、在MRAH-wtG4d導入E356K之MRAH-wtG4dP1(序列編號11)、在H54-wtG4d導入K439E之H54-wtG4dN1(序列編號12)。在H鏈可變區域為MRAH的情形，使用MRAL-k0(序列編號13)為抗體L鏈，在H54的情形使用L28-k0(序列編號14)為抗體L鏈。依照參考例1之方法表現、精製MRAH-G1dsr/MRAL-k0、H54-G1dsr/L28-k0、MRAH-G1dsrP1/MRAL-k0、H54-G1dsrN1/L28-k0、MRAH-wtG4d/MRAL-k0、H54-wtG4d/L28-k0、MRAH-wtG4dP1/MRAL-k0、H54-wtG4dN1/L28-k0。
之後，將所得的二種同聚多肽如下所示混合，根據參考例2之方法評估其反應產物。
(1)MRAH-wtG4d/MRAL-k0與H54-wtG4d/L28-k0
(2)MRAH-wtG4dP1/MRAL-k0與H54-wtG4dN1/L28-k0
(3)MRAH-G1dsr/MRAL-k0與H54-G1dsr/L28-k0
(4)MRAH-G1dsrP1/MRAL-k0與H54-G1dsrN1/L28-k0
反應條件：PBS(Sigma，pH7.4)中，[各mAb]=0.2mg/mL，[GSH(Sigma)]=0.5mM，0.05% Tween 20(Junsei)，37℃，24小時。
本檢討中所使用之二種抗體可變區域MRAH/MRAL及H54/L28，由於pI大為不同，以離子交換層析可使各同聚多肽、及生成之雙特異性抗體所對應的波峰容易地分離，而評估反應效率。第1圖係以離子交換層析法評估反應產物之結果。以未導入控制結合界面變異的MRAH-wtG4d/MRAL-k0與H54-wtG4d/L28-k0反應之wtG4d、或MRAH-G1dsr/MRAL-k0與H54-G1dsr/L28-k0反應之G1dsr的雙特異性抗體的生成率各為50.5%、52.7%。另一方面以導入控制結合界面變異的MRAH-wtG4dP1/MRAL-k0與H54-wtG4dN1/L28-k0反應之wtG4dP1/N1的雙特異性抗體的生成率為99.0%、且MRAH-G1dsrP1/MRAL-k0與H54-G1dsrN1/L28-k0反應之G1dsrP1/N1為98.5%，可知以極高之效率生成雙特異性抗體。由以上之結果，顯示以WO/2006/106905中所報導之導入控制結合界面變異導入之二種同聚多肽在還原劑存在下混合，可以極高之效率製作雙特異性抗體。
〔實施例2〕具人類天然型IgG1樞紐序列的同聚 多肽之Fab Arm Exchange
為使實施例1中樞紐區域之序列為天然型人類IgG4型，對IgG1導入P228S變異，進行Fab Arm Exchange。然而曾有報告投藥在活體內的天然型IgG4，會與內因性IgG4發生半分子交換。又報導在該原因係在樞紐區域中，位在EU編號第228位的Ser，使其為IgG1型的Pro時安定性提高，而不會在活體內發生交換(Labrijn AF et al.,Nat.Biotechnol.2009；27：767-771)。因此思考在活體內投藥時，所製作之雙特異性抗體的樞紐序列應該以226C-227P-228P-229C為佳。因此在本檢討中，經由導入控制結合界面的變異，驗証即使為天然型人類IgG1的樞紐序列亦可效率良好地發生Fab Arm Exchange。
首先，對MRAH-G1d導入K409R及D356K製作MRAH-G1drP1(序列編號15)、對H54-G1d導入K409R及K439E成為H54-G1drN1(序列編號16)。之後在H鏈可變區域為MRAH的情形，使用MRAL-k0為抗體L鏈，在H54的情形使用L28-k0為抗體L鏈，再依照參考例1之方法表現、精製MRAH-G1drP1/MRAL-k0、H54-G1drN1/L28-k0。之後，將所得的同聚多肽二種類在以下的反應條件下混合，依照參考例2之方法評量其反應產物。
反應條件：TBS(Takara，pH7.6)中，[各mAb]=0.2mg/mL，0.05% Tween 20(Junsei)，37℃，24小時。以還原劑為[GSH(Sigma)]=0.5mM或5mM或者[2-MEA(Sigma)]=25mM之3種條件檢討。
依照參考例2之方法解析反應產物之結果如第2 圖所示。在與實施例1相同的GSH(0.5mM)之條件下，雙特異性抗體的生成率為21.8%，與EU編號第228位之胺基酸殘基為Ser之情形比較，大幅降低效率。然而，在2-MEA(25mM)及GSH(5mM)之還原條件下，雙特異性抗體的生成率為99%以上。由以上之結果可知，即使樞紐序列為人類天然型IgG1序列時，導入控制結合界面的變異，以適當之還原條件亦可高效率地製作雙特異性抗體。
〔實施例3〕使用人類天然型IgG1的CH3之Fab Arm Exchange
目前為止之檢討中，對人類IgG1，經由導入使CH3成為IgG4型之K409R的變異、及控制結合界面的變異(D356K及K439E)，進行Fab Arm Exchange，均顯示可以極高效率獲得目的之雙特異性抗體。
另一方面，已知在第409位的胺基酸殘基為Arg時，抗體在酸性條件下的安定性降低(WO/2009/041613)。為了做為醫藥品的抗體製造，將抗體暴露在酸性條件下的病毒失活的步驟是必要的，此時為保持抗體之品質，希望抗體在酸性條件之安定性高。因此希望第409位的胺基酸殘基不為Arg。另一方面，使用被報導可有效率地發生Fab Arm Exchange反應之變異的K409R之變異，由於第409位的胺基酸殘基為Arg，因此在酸性條件下有安定性的問題。因此之後，對不含K409R變異的完全人類天然型之IgG1抗體，以WO/2006/106905之報告中僅有控制結合界面變異是否誘導Fab Arm Exchange進行驗證。
所檢討的控制結合界面之變異的組合如表1所示。
Figure 103133689-A0202-12-0068-14
H鏈可變區域為MRAH的情形，使用MRAL-k0為抗體L鏈，在H54的情形使用L28-k0為抗體L鏈。依照參考例1之方法表現、精製MRAH-G1dP1/MRAL-k0、H54-G1dN1/L28-k0、MRAH-G1dP3/MRAL-k0、H54-G1dN3/L28-k0、MRAH-G1dP4/MRAL-k0、H54-G1dN4/L28-k0、MRAH-G1dP5/MRAL-k0、H54-G1dN5/L28-k0、MRAH-G1dP6/MRAL-k0、H54-G1dN6/L28-k0。
之後，將所得之同聚多肽二種以如下所示的組合混合，依照參考例2之方法評估反應產物。
(1)MRAH-G1dP1/MRAL-k0與H54-G1dN1/L28-k0
(2)MRAH-G1dP3/MRAL-k0與H54-G1dN3/L28-k0
(3)MRAH-G1dP4/MRAL-k0與H54-G1dN4/L28-k0
(4)MRAH-G1dP5/MRAL-k0與H54-G1dN5/L28-k0
(5)MRAH-G1dP6/MRAL-k0與H54-G1dN6/L28-k0
反應條件：TBS(Takara，pH7.6)中，[各mAb]=0.2mg/mL，0.05% Tween 20(Junsei)，[GSH(Sigma)]=5mM，37℃，24小時。
所得之結果如表2所示。
Figure 103133689-A0202-12-0069-15
表中之「簡稱」，係表示反應中所使用的同聚多肽組合之簡稱。例如在簡稱為G1dP1/N1的情形，係表示MRAH-G1dP1/MRAL-k0與H54-G1dN1/L28-k0反應。又「使用之MoAb1的H鏈恒定區域名」，係表示含MRAH可變區域的抗體之恒定區域名，「使用之MoAb2的H鏈恒定區域名」，係表示含H54可變區域的抗體之恒定區域名。「導入之變異」，係表示對MRAH-G1d或H54-G1d導入之變異。
單方之同聚多肽導入D356K、另一方之同聚多肽導入K439E的G1dP1/N1，雙特異性抗體的生成率為1.7%。第2圖中顯示在相同反應條件下(5mM GSH)，相對於具有K409R變異及控制結合界面的變異(D356K及K439E)之G1drP1/N1的雙特異性抗體的生成率為99.3%，EU編號第409位的胺基酸殘基為Lys之G1dP1/N1反應效率大幅降低。然而，單方之同聚多肽導入控制結合界面的變異D399K、另一方之同聚多肽導入K409D的G1dP3/N3，單方之同聚多肽導入D356K/D399K、另一方之同聚多肽導入K409D/K439E的 G1dP5/N5，顯示各為93.4%、98.1%之極高的雙特異性抗體的生成率。因此顯示，不使用CH3定域為IgG4型之K409R的變異，僅以控制結合界面的變異亦可高效率地誘發Fab Arm Exchange。
其次，再對高反應效率之G1dP3/N3及G1dP5/N5，比較在3種還原條件下的反應效率。此時比較對象，係以實施例2中所使用之G1drP1/N1，及曾由Labrijn人等報導可以Fab Arm Exchange有效率地製作雙特異性抗體的變異之在一方的抗體導入K409R另一方之同聚多肽導入F405L的變異體之組合，加以驗証(Labrijn AF et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.2013；110：5145-5150)。
製作對MRAH-G1d導入K409R的MRAH-G1dr(序列編號27)、對H54-G1d導入F405L的H54-G1d1(序列編號28)。在H鏈可變區域為MRAH的情形，使用MRAL-k0為抗體L鏈，在H54的情形，使用L28-k0為抗體L鏈。依照參考例1之方法表現、精製MRAH-G1drP1/MRAL-k0、H54-G1drN1/L28-k0、MRAH-G1dP3/MRAL-k0、H54-G1dN3/L28-k0、MRAH-G1dP5/MRAL-k0、H54-G1dN5/L28-k0、MRAH-G1dr/MRAL-k0、H54-G1d1/L28-k0。
之後，以所得的同聚多肽二種以如下所示之組合混合，並依照參考例2之方法評估反應產物。
(1)MRAH-G1drP1/MRAL-k0與H54-G1drN1/L28-k0
(2)MRAH-G1dP3/MRAL-k0與H54-G1dN3/L28-k0
(3)MRAH-G1dP5/MRAL-k0與H54-G1dN5/L28-k0
(4)MRAH-G1dr/MRAL-k0與H54-G1d1/L28-k0
反應條件：TBS(Takara，pH7.6)中，[各mAb]=0.2mg/mL，0.05% Tween 20(Junsei)，37℃，24小時。以還原劑為[GSH(Sigma)]=0.5mM或5mM或者[2-MEA(Sigma)]=25mM之3種條件檢討。
所得之結果如表3所示。
Figure 103133689-A0202-12-0071-16
表中之「簡稱」，係表示反應中所使用的同聚多肽之組合之簡稱。例如在簡稱為G1dP1/N1的情形，表示MRAH-G1dP1/MRAL-k0與H54-G1dN1/L28-k0反應。又「使用之MoAb1的H鏈恒定區域名」，係表示含MRAH可變區域的抗體之恒定區域名，「使用之MoAb2的H鏈恒定區域名」，係表示含H54可變區域的抗體之恒定區域名。「導入之變異」，係 表示對MRAH-G1d或H54-G1d導入之變異。
在5mM GSH之還原條件下，以Labrijn人等所報導使用可提高既存之Fab Arm Exchange效率的變異之G1dr/1的雙特異性抗體的生成率為87.3%。此時在一方之同聚多肽導入D399K、另一方之同聚多肽導入K409D的G1dP3/N3為85.2%；在一方之同聚多肽導入D356K/D399K、另一方之同聚多肽導入K409D/K439E的G1dP5/N5為99.1%。又除了IgG4型之K409R的變異外，在一方之同聚多肽導入D356K而另一方之同聚多肽導入K439E的G1drP1/N1的雙特異性抗體的生成率為99.3%。
在25mM 2MEA之還原條件下，以Labrijn人等所報導使用可提高既存之Fab Arm Exchange效率的變異之G1dr/1的雙特異性抗體的生成率為95.6%。此時在一方之同聚多肽導入D399K、另一方之同聚多肽導入K409D的G1dP3/N3為92.8%；在一方之同聚多肽導入D356K/D399K而另一方之同聚多肽導入K409D/K439E的G1dP5/N5為100%；又除了IgG4型之K409R的變異外，在一方之同聚多肽導入D356K而另一方之同聚多肽導入K439E的G1drP1/N1的雙特異性抗體的生成率為99.7%。
在0.5mM GSH之還原條件下，使用提高既存之Fab Arm Exchange效率的變異之G1dr/1的雙特異性抗體的生成率為9.5%。此時，在一方之同聚多肽導入D399K、另一方之同聚多肽導入K409D的G1dP3/N3為4.8%；在一方之同聚多肽導入D356K/D399K而另一方之同聚多肽導入 K409D/K439E的G1dP5/N5為75.4%；又除了IgG4型之K409R變異外，在一方之同聚多肽導入D356K而另一方之同聚多肽導入K439E的G1drP1/N1之雙特異性抗體的生成率為21.8%，與其他還原條件相比，大幅降低。
由以上之結果可知，在任一反應條件下，在一方之同聚多肽導入D356K/D399K、另一方之同聚多肽導入K409D/K439E的G1dP5/N5顯示雙特異性抗體的生成率較Labrijn人等所報導之提高既存Fab Arm Exchange效率的變異為高。高雙特異性抗體生成率，實際在雙特異性抗體醫藥品之製造中極為重要，本變異與既有的變異相比，可用性高。
〔實施例4〕利用CH3定域不安定化之變異的高效率Fab Arm Exchange之開發
在目前為止之實施例中，顯示經由控制結合界面之變異，於各同聚多肽導入不同之帶電電荷，經由還原劑所產生的半分子優先與來自不同同聚多肽的半分子結合，高效率地生成雙特異性抗體。另一方面，已報導在經由Fab Arm Exchange生成雙特異性抗體之過程中，二種類的同聚多肽以還原劑分開後CH3定域解離產生半分子(HL分子)的過程係瓶頸階段(Rispens T et al.,J.Am.Chem.Soc.2011；133：10302-10311)。因此，如果可使各同聚多肽的CH3定域適度不安定化以促進CH3定域之解離時，期望以更佳效率誘發Fab Arm Exchange。此處，首先評估在如表2、表3所示之5mM GSH存在下之雙特異性抗體的生成率、及各同聚多肽與CH3定域的安定性之關係。CH3定域的安定性，依照參考例3的方法所 測定之Tm(熱變性半解離溫度)為指標。
雙特異性抗體生成率與所使用之二種類的同聚多肽中CH3的Tm值高者的關係，如第3圖所示。雙特異性抗體生成率低之G1dP1/N1及G1dP4/N4中CH3的Tm值為76℃以上的高的一方，反應效率高的G1dP5/N5、G1dP3/N3、G1drP1/N1的同聚多肽之CH3的Tm各為65.1℃、69.6℃、69.5℃。以上之結果顯示，經由Fab Arm Exchange的的Tm值抗體生成率明顯地與同聚多肽的CH3之安定性相關。又為了達成高反應效率，顯示所使用之二種類的同聚多肽中，以安定方的同聚多肽之CH3的Tm降低於70℃等而使CH3區域的安定性為不安定者較佳。此處，由於在相同條件下所測定之含天然型人類IgG1序列之MRAH-G1d/MRAL-k0的CH3區域之Tm為83.6℃，在Fab Arm Exchange中為達成高反應效率必須使來自於天然型人類IgG1的CH3區域之Tm降低如13℃以上而使CH3區域的安定性為不安定較佳。
此處之後檢討經由使所使用之CH3定域的Tm降低而是否提高雙特異性抗體生成率。做為降低CH3的安定性之變異，使用IgG2型變異的V397M。IgG2中EU編號第397位的胺基酸殘基為Met，將其導入取代為IGg1型的Val之變異，可提高CH3區域的安定性(Tm)已有報導(WO/2009/041613)。因此，對IGg1型之CH3定域，導入V397M變異時可期望使CH3區域不安定化、易於解離。
此處，對表2中雙特異性抗體生成率低之G1dP1/N1、G1dP4/N4、G1dP6/N6，雙方的同聚多肽導入V397M 變異之G1dP8/N8、G1dP9/N9、G1dP10/N10進行檢討。具體地，製作對MRAH-G1dP1、MRAH-G1dP4、MRAH-G1dP6、H54-G1dN1、H54-G1 dN4、H54-G1dN6導入V397M變異之MRAH-G1dP8(序列編號29)、MRAH-G1dP9(序列編號30)、MRAH-G1dP10(序列編號31)、H54-G1dN8(序列編號32)、H54-G1dN9(序列編號33)、H54-G1dN10(序列編號34)。在H鏈可變區域為MRAH的情形，使用MRAL-k0為抗體L鏈，在H54情形，使用L28-k0為抗體L鏈，依照參考例1之方法表現、精製MRAH-G1dP8/MRAL-k0、H54-G1dN8/L28-k0、MRAH-G1dP9/MRAL-k0、H54-G1dN9/L28-k0、MRAH-G1dP10/MRAL-k0、H54-G1dN10/L28-k0。又依照參考例3之方法測定所得抗體之Tm。
之後，將所得之同聚多肽二種類以如下所示之組合混合，並依照參考例2之方法評估反應產物。
(1)MRAH-G1dP8/MRAL-k0與H54-G1dN8/L28-k0
(2)MRAH-G1dP9/MRAL-k0與H54-G1dN9/L28-k0
(3)MRAH-G1dP10/MRAL-k0與H54-G1dN10/L28-k0
(4)MRAH-G1dr/MRAL-k0與H54-G1dl/L28-k0
反應條件：TBS(Takara，pH7.6)中，[各mAb]=0.2mg/mL，0.05% Tween 20(Junsei)，[GSH(Sigma)]=5mM，37℃，24小時。
所得之結果如表4所示。
[表4]
Figure 103133689-A0202-12-0076-17
中之「MoAb1之CH3的Tm」，係表示含有MRAH可變區域的同聚多肽之CH3的Tm，「MoAb2之CH3的Tm」，係表示含有H54可變區域的同聚多肽之CH3的Tm。
在G1dP1/N1的二同聚多肽導入V397M變異的G1dP8/N8，MoAb1之CH3的Tm降低6.6℃而為70.1℃，MoAb2降低4.2℃而為70.5℃，使雙特異性抗體由1.7%提高為73.2%。在G1dP4/N4之二同聚多肽導入V397M變異的G1dP9/N9，MoAb1之CH3的Tm降低1.5℃而為67℃，MoAb2降低5.5℃而為71℃，使雙特異性抗體由4.4%提高為67.3%。在G1dP6/N6之二同聚多肽中導入V397M變異的G1dP10/N10，MoAb2之CH3的Tm方面並無改變，但MoAb1之CH3的Tm降低2.2℃而為63.8℃，使雙特異性抗體由29.3%提高為96.9%。由以上之結果，顯示經由加入V397M變異而使同聚多肽之CH3的Tm降低，可使Fab Arm Exchange的雙特異性抗體生成率提高。又此時使用既有之提高Fab Arm Exchange效率之變異的G1dr/1之雙特異性抗體的生成率為88.1%，G1dP10/N10顯示較 此等優良的雙特異性抗體生成率。
此處，之後對具有效果之EU編號第397位的週邊，導入期望使CH3有更大不安定化效果之變異，檢討可否更提高雙特異性抗體的生成率。第4圖為使用已報導的IgG1之X射線結晶構造解析數據(PDB：3DO3)，顯示CH3定域EU編號第397位週邊。
首先，考量A鏈之D399與B鏈之K392的靜電相互作用，因此在V397M變異之外，由於K392取代為Asp或Glu可能發生兩鏈之靜電相斥，而有由於兩鏈相互作用而更不安定的可能性。又，亦期望藉由將K392取代為側鏈分支型之胺基酸因而與M397之立體障礙可使兩鏈之締合更不安定。再者，以EU編號第397位之胺基酸殘基取代為體積更大之胺基酸，亦可期望較V397M變異可更抑制CH3之締合。基於如上之觀點，以MRAH-G1dP1及H54-G1dN1為主體，重新製作如表5所示之7種抗體H鏈基因。
Figure 103133689-A0202-12-0077-18
在H鏈可變區域為MRAH的情形，使用MRAL-k0 為抗體L鏈，為H54的情形，使用L28-k0為抗體L鏈。依照參考例1之方法表現、精製：MRAH-G1dP14/MRAL-k0、H54-G1dN14/L28-k0、MRAH-G1dP15/MRAL-k0、H54-G1dN15/L28-k0、MRAH-G1dP16/MRAL-k0、H54-G1dN16/L28-k0、MRAH-G1dP17/MRAL-k0、H54-G1dN17/L28-k0、MRAH-G1dP18/MRAL-k0、H54-G1dN18/L28-k0、MRAH-G1dP19/MRAL-k0、H54-G1dN19/L28-k0、MRAH-G1dP20/MRAL-k0、H54-G1dN20/L28-k0。又依照參考例3之方法測定所得抗體之Tm。
之後，將所得之同聚多肽二種類以如下所示之組合混合，依照參考例2之方法評估反應產物。
(1)MRAH-G1dP14/MRAL-k0與H54-G1dN14/L28-k0
(2)MRAH-G1dP15/MRAL-k0與H54-G1dN15/L28-k0
(3)MRAH-G1dP16/MRAL-k0與H54-G1dN16/L28-k0
(4)MRAH-G1dP17/MRAL-k0與H54-G1dN17/L28-k0
(5)MRAH-G1dP18/MRAL-k0與H54-G1dN18/L28-k0
(6)MRAH-G1dP19/MRAL-k0與H54-G1dN19/L28-k0
(7)MRAH-G1dP20/MRAL-k0與H54-G1dN20/L28-k0
(8)MRAH-G1dr/MRAL-k0與H54-G1dl/L28-k0
(9)MRAH-G1dP1/MRAL-k0與H54-G1dN1/L28-k0
(10)MRAH-G1dP8/MRAL-k0與H54-G1dN8/L28-k0
反應條件：TBS(Takara，pH7.6)中，[各mAb]=0.2mg/mL，0.05% Tween 20(Junsei)，[2-MEA(Sigma)]=25mM，37℃， 24小時。所得之結果如表6所示。
Figure 103133689-A0202-12-0079-19
相對於在G1dP1/N1之同聚多肽的兩者中導入V397M變異的G1dP8/N8，雙特異性抗體為73.2%，在其兩鏈中導入K392D的G1dP14/N14為96.5%，導入K392E的G1dP15/N15為96.9%，導入K392T的G1dP18/N18為98.9%，雙特異性抗體生成率提高。又對於G1dP1/N1，以導入V397F取代V397M的G1dP16/N16為96.5%，導入V397Y的G1dP17/N17為98%，雙特異性抗體生成率亦較V397M提高。推測此是因為，相對於含V397M的G1dP8/N8之MoAb1及MoAb2之CH3的Tm各為70.1℃及70.5℃，在G1dP16/N16為69.1℃及69.7℃，在G1dP17/N17為69.2℃及69.8℃，同聚多肽CH3定域之相互作用較目標V397M變異減弱，容易解離所致。此時使用既存之Fab Arm Exchange效率提高的變異之 G1dr/1的雙特異性抗體生成率為91.7%，G1dP14/N14、G1dP15/N15、G1dP16/N16、G1dP17/N17、G1dP18/N18顯示較此等優良的雙特異性抗體生成率。
在考慮醫藥品製造上之應用性時，雙特異性抗體生成率較既存的Fab Arm Exchange效率提高的變異高，異元成分少的G1dP16/N16(D356K/V397F及V397F/K439E)及G1dP17/N17(D356K/V397Y及V397Y/K439E)極為有用。
又，表3及表6所檢討之變異體的CH3安定性與使用25mM之2MEA為還原劑時的雙特異性抗體生成率之關係如第5圖所示。如第5圖所示，所使用之同聚多肽的CH3安定性與Fab Arm Exchange中之效率明顯相關，如所使用之二種同聚多肽中CH3安定性高的同聚多肽的Tm下降為70℃等，使CH3區域之安定性不安定，而達成高雙特異性抗體生成率。
〔實施例5〕反應時間之檢討
使用實施例4中發現之G1dP17/N17，檢討反應時間與反應效率之關係。
反應條件：TBS(Takara，pH7.6)中，[各mAb]=1.0mg/mL，[2-MEA(Sigma)]=25mM，37℃，全量為50μL。
在90分鐘、3小時、24小時時添加冷卻至4℃之25mM MES緩衝液(pH5.0)450μL，再保存於4℃，停止反應。然後依照參考例2之方法評量反應效率(第6圖)。
如第6圖所示，G1dP17/N17的雙特異性抗體生成率，在25mM 2-MEA存在下，90分鐘時為94.6%，3小時時為95.2%，24小時時為97.4%，90分鐘之反應時間為約95%。 由該結果可知，與在單方之鏈上導入K409R變異、另一方之單鏈導入F405L變異的G1dr/1之雙特異性抗體生成率相比(表6)，顯示非常高之反應效率。
〔實施例6〕顯示高效率Fab Arm Exchange的變異體對人類FcgR及人類FcRn之結合評估
對於實施例4中顯示高效率FAE效率的變異體G1dP17/N17，實施對人類FcgR及人類FcRn之結合評估。首先，依照參考例5之方法實施含天然型IgG1序列之MRAH-G1d/MRAL-k0及Fab Arm Exchange後之變異體MRAH-G1dP17/MRAL-k0//H54-G1dN17/L28-k0與人類FcRn的結合。對人類FcRn結合之解析結果如表7所示。
Figure 103133689-A0202-12-0081-20
由表7所示之結果可知，以Fab Arm Exchange製作之變異體MRAH-G1dP17/MRAL-k0//H54-G1dN17/L28-k0，對人類FcRn具有與天然型IgG1同等之結合活性。
其次，依照參考例4之方法評估對人類FcgR的結合活性。此處除了對於含天然型IgG1序列之MRAH-G1d/MRAL-k0、經過Fab Arm Exchange後之變異體MRAH-G1dP17/MRAL-k0//H54-G1dN17/L28-k0以外，一併對Fab Arm Exchange反應前之2種變異體 (MRAH-G1dP17/MRAL-k0及H54-G1dN17/L28-k0)及去除使CH3定域不安定化之變異的V397Y之2種同聚多肽(MRAH-G1dP1/MRAL-k0及H54-G1dN1/L28-k0)加以評估。表8中所示之KD fold hFcgRIa、KD fold hFcgR Ⅱ aR、KD fold hFcgR Ⅱ aH、KD fold hFcgR Ⅱ b、KD fold hFcgR Ⅲ aV，係G1d對各FcgR在以KD為1時各變異體的相對結合活性之值。
Figure 103133689-A0202-12-0083-21
與天然型比較，經過Fab Arm Exchange後的變異體G1dP17/N17，對hFcgRIa之結合提高1.1倍、對hFcgR Ⅱ aR之結合提高2.7倍、對hFcgR Ⅱ aH之結合提高2.3倍、對hFcgR Ⅱ b之結合提高2.5倍、對hFcgR Ⅲ aV之結合提高2.5倍。此處可知，導入使CH3定域不安定化之V397Y前的同聚多肽G1dP1及G1dN1對FcgR均與天然型相同，又導入V397Y的同聚多肽(G1dP17及G1dN17)，由於對各FcgR之結合被增強，因此經由V397Y變異使對hFcgR的結合被增強。
由以上之結果，顯示實現高Fab Arm Exchange效率之G1dP17/N17，與天然型比較，無損於對人類FcRn、人類FcgR的結合。
〔實施例7〕培養上清液中的Fab Arm Exchange之檢討
以Fab Arm Exchange製造雙特異性抗體，預想將二種同聚多肽各別培養、精製後，進行Fab Arm Exchange，但如培養上清液中發生反應，則省略精製同聚多肽的階段為大優點。此時於培養上清液中以二種類的同聚多肽與還原劑共同混合，驗証是否可高效率發生Fab Arm Exchange。
首先，分別製作MRAH-G1d及H54-G1d第356位胺基酸殘基取代為E、第358位胺基酸殘基置換為M之MRAH-G1m(序列編號49)、H54-G1m(序列編號50)。其次，製作對MRAH-G1m導入E356K及K409R之MRAH-G1mrP1(序列編號51)、對H54-G1m導入K439E及K409R之H54-G1mrN1(序列編號52)。在H鏈可變區域為MRAH的情形使用 MRAL-k0為抗體L鏈，在H54的情形使用L28-k0為抗體L鏈。依照參考例1之方法表現、精製MRAH-G1mrP1/MRAL-k0、H54-G1mrN1/L28-k0。
又將FreeStyle 293細胞(Invitrogen公司)在FreeStyle 293 Expression medium中培養後，離心回收上清液，經過0.22μm濾膜過濾者做為Mock CM使用於Fab Arm Exchange。
反應條件：Mock CM(pH7.6)中，[各mAb]=1.0mg/mL，[2-MEA(Sigma)]=25mM，37℃，90分鐘。
反應後之反應溶液中添加rProtein A Sepharose Fast Flow(GE Healthcare公司)精製後，依照參考例2之方法評估反應效率(第7圖)。
如第7圖所示可知，即使在培養上清液中，在25mM 2-MEA存在下，於37℃下、反應90分鐘以98%以上的反應效率生成雙特異性抗體。
〔實施例8〕小鼠IgG1之Fab Arm Exchange的開發
在目前為止之實施例中，顯示在人類IgG1或人類IgG4效率良好地引發Fab Arm Exchange。其次，驗証小鼠IgG1是否同樣可經由Fab Arm Exchange生成雙特異性抗體。
由已報導之結晶構造(Harris LJ et al.,J.Mol.Biol.1998；275：861-872)，可推測EU編號第399位的D與第409位的K提供CH3定域之鏈間的相互作用(第8圖)。此時對該部位導入用於促進人類IgG1同樣異元二聚體化的電荷，驗証是否可 引發Fab Arm Exchange。
在抗體H鏈可變區域，使用WO/2009/125825所揭示對人類介白素6的受體之抗體的H鏈可變區域WT(H)(序列編號1：以下以MRAH記載)及H54(序列編號2)。對於此等H鏈可變區域，製作具有小鼠IgG1之H鏈恒.定區域MRAH-mIgG1(序列編號53)及H54-mIgG1(序列編號54)作為抗體H鏈恒定區域。並且作為控制結合界面之變異，製作在MRAH-mIgG1中導入D399K之MRAH-mIgG1mP3(序列編號55)、導入D399R之MRAH-mIgG1mP4(序列編號56)，在H54-mIgG1中導入K409D之H54-mIgG1mN3(序列編號57)、導入K409E之H54-mIgG1mN4(序列編號58)。製作含小鼠κ鏈恒定區域序列的MRAL-mk1(序列編號59)及L28-mk1(序列編號60)作為L鏈，在H鏈可變區域為MRAH的情形使用MRAL-mk1為抗體L鏈，在H54的情形使用L28-mk1為抗體L鏈。依照參考例1的方法表現、精製：MRAH-mIgG1mP3/MRAL-mk1、MRAH-mIgG1mP4/MRAL-mk1、H54-mIgG1mN3/L28-mk1、H54-mIgG1mN4/L28-mk1。
其次，以下之組合實施Fab Arm Exchange。
(1)MRAH-mIgG1mP3/MRAL-mk1與H54-mIgG1mN3/L28-mk1
(2)MRAH-mIgG1mP4/MRAL-mk1與H54-mIgG1mN4/L28-mk1
反應條件：TBS(Takara，pH7.6)中，[各mAb]=2mg/mL， [2-MEA(Sigma)]=25mM，37℃，19小時。
反應後，依照參考例5的方法以CE-IEF決定反應效率(第9圖)。
其結果，確認在MRAH-mIgG1mP3/MRAL-mk1與H54-mIgG1mN3/L28-mk1反應的情形為89.2%、在MRAH-mIgG1mP4/MRAL-mk1與H54-mIgG1mN4/L28-mk1反應的情形為89.9%皆以高效率生成雙特異性抗體。與使用人類IgG1或人類IgG4的Fab Arm Exchange相比，反應效率若干下降者，預料是因為在小鼠IgG1的樞紐區域的雙硫鍵存在三股，較人類IgG1或人類IgG4的樞紐區域，二股重鏈更強力地結合所致(Harris LJ et al.,J.Mol.Biol.1998；275：861-872)。
〔實施例9〕以小鼠IgG1經Fab Arm Exchange所製作之雙特異性抗體對小鼠FcgR及小鼠FcRn之結合活性的評估
評估依照參考例4-3，以小鼠IgG型經Fab Arm Exchange所製作的2種雙特異性抗體(MRAH-mIgG1mP3/MRAL-mk1//H54-mIgG1mN3/L28-mk1及MRAH-mIgG1mP4/MRAL-mk1//H54-mIgG1mN4/L28-mk1)對小鼠FcgR及小鼠FcRn之結合。又依照參考例1製作MRAH-mIgG1/MRAL-mk1，作為比較對象來測定。測定結果如表9所示。
[表9]
Figure 103133689-A0202-12-0088-22
結果所有製作之二種雙特異性抗體均顯示與天然型mIgG1相同之結合輪廓(profile)。具體言之，在mFcgRI及mFcgR Ⅳ不結合，對mFcgR Ⅱ、及mFcgR Ⅲ，與天然型mIgG1相比，顯示1.2倍的結合活性。
其次依照參考例4-4評估對mFcRn之結合，結果如表10所示。
Figure 103133689-A0202-12-0088-23
結果所製作之二種雙特異性抗體均對mFcRn顯示維持與天然型mIgG1同等之結合。
〔實施例10〕細胞毒性之測定
以Fab Arm Exchange製作之人類IgG型雙特異性抗體、小鼠IgG型雙特異性抗體，是否可保持與以既有技法所製作的雙特異性抗體相等之機能，以測定抗人類磷脂醯肌醇蛋白聚醣-3及抗人類CD3的雙特異性抗體之細胞毒性加以評估。首先 作為控制組，依照Schaefer人等所報告之CrossMab技術(Proc.Natl.Acad.Sci.2011；108：11187-11192)製作具人類IgG4恒定區域的抗人類GPC3/抗人類CD3雙特異性抗體。以CrossMab技術所製作之主體分子為WO/2012/073985號公報中所記載之對人類GPC3之Fab的VH定域及VL定域之分子被取代之分子。又在抗體H鏈恒定區域中，為了促進異型結合，使用Knobs-into-Holes技術。Knobs-into-Holes技術係將存在於一H鏈CH3區域中的胺基酸側鏈取代為較大的側鏈(Knobs：突起)，在存在另一H鏈CH3區域中的胺基酸側鏈取代為較小的側鏈(hole：空隙)，以在空隙內配置突起而促進H鏈之異元二聚體化，以效率地獲得目的異元二聚體化抗體的技術(Nature,1994；372：379-383)。又，作為減弱對FcgR之結合的變異，使用WO/2011/108714中所載之變異。具體言之，導入在EU編號第234位、第235位、第297位之胺基酸殘基取代為Ala之變異。自抗體H鏈C末端去除EU編號第446位之Gly及第447位之Lys，對此為了使抗體表現後易於精製，在抗人類GPC3端H鏈C末端加入組胺酸標記(His-tag)，在抗人類CD3端H鏈C末端加入FLAG標記(FLAG-tag)。製作導入上述變異之抗人類GPC3端H鏈之GC33(2)H-G4dKnHS(序列編號61)。又製作做為抗人類CD3端H鏈之rCE115H-G4dHLFS(序列編號62)。抗體L鏈使用GC33(2)L-k0(序列編號63)作為抗人類GPC3端，使用rCE115L-k0(序列編號64)作為抗人類CD3端。這些抗體之表現依照參考例1在FreeStyle293細胞暫時性表現。獲得之培養上清液加入 MabSelect SuRe管柱(GE Healthcare公司)中，在沖洗該管柱後，進行以50mM乙酸的溶出。將含有抗體之分層(fraction)加入HisTrap HP管柱(GE Healthcare公司)或Ni Sepharose FF管柱(GE Healthcare公司)中，在沖洗該管柱後，進行以咪唑的溶出。含抗體之分層(fraction)經過超限制過濾膜濃縮後，將濃縮液加入Superdex 200管柱(GE Healthcare公司)中，回收僅該溶出液之單體抗體，獲得精製抗體GPC3 ERY22-rCE115。
其次，經由Fab Arm Exchange製作具有人類IgG1型、人類IgG4型、小鼠IgG1型之恒定區域、可變區域為抗人類GPC3/抗人類CD3的雙特異性抗體。在人類IgG1型及人類IgG4型的H鏈恒定區域中，製作對於包含Fab Arm Exchange用之變異的G1dP17、G1dN17、G1drP1、G1drN1、G4dP1、G4dN1，導入EU編號第235位胺基酸殘基取代為Arg、第239位胺基酸殘基取代為Lys之變異做為FcgR結合降低變異之F760P17、F760N17、F760G1drP1、F760G1drN1、F760G4dP1、F760G4dN1。在小鼠IgG1型的H鏈恒定區域中，製作對實施例8中所使用之mIgG1mP4、mIgG1mN4導入EU編號第235位、第239位之胺基酸殘基取代為Lys之變異作為FcgR結合降低變異之mF18mP4、mF18mN4。製作可變區域使用WO/2012/073985號公報中所記載之抗人類GPC3序列之H0000-F760N17(序列編號65)、H0000-F760G1drN1(序列編號66)、H0000-F760G4dN1(序列編號67)、H0000-mF18mN4(序列編號68)。另一方面，製作rCE115H-F760P17(序列編 號69)、rCE115H-F760G1drP1(序列編號70)、rCE115H-F760G4dP1(序列編號71)、rCE115H-mF18mP4(序列編號72)作為人類CD3端之H鏈。作為人類IgG1型及人類IgG4型抗體L鏈，共同使用GL4-k0(序列編號79)作為抗人類GPC3側，使用rCE115L-k0(序列編號64)作為抗人類CD3側。又，作為小鼠IgG1型抗體L鏈，使用GL4-mk1(序列編號80)作為抗人類GPC3側，使用rCE115L-mk1(序列編號81)作為抗人類CD3側。依照參考例1的方法表現、精製此等同聚多肽，獲得：rCE115H-F760P17/rCE115L-k0、H0000-F760N17/GL4-k0、rCE115H-F760G1drP1/rCE115L-k0、H0000-F760G1drN1/GL4-k0、rCE115H-F760G4dP1/rCE115L-k0、H0000-F760G4dN1/GL4-k0、rCE115H-mF18mP4/rCE115L-mk1、H0000-mF18mP4/GL4-mk1。
其次，將所得之同聚多肽二種類以如下所示之組合混合，發生FAE反應。
(1)rCE115H-F760P17/rCE115L-k0與H0000-F760N17/GL4-k0
(2)rCE115H-F760G1drP1/rCE115L-k0與H0000-F760G1drN1/GL4-k0
(3)rCE115H-F760G4dP1/rCE115L-k0與H0000-F760G4dN1/GL4-k0
(4)rCE115H-mF18mP4/rCE115L-mk1與H0000-mF18mP4/GL4-mk1
反應條件：TBS(Takara，pH7.6)中，[各mAb]=0.36mg/mL，[2-MEA(Sigma)]=25mM，37℃，18小時。
反應後之產物經過PBS透析，用以評估細胞毒性。
細胞毒性之評量係以參考例6中所載之方法實施。結果如第10-1圖、第10-2圖所示。
如第10-1圖所示，以Fab Arm Exchange製作之人類IgG1型及人類IgG4型的雙特異性抗體均顯示與以既有之雙特異性抗體製作技術所製作的控制組抗體(GPC3 ERY22-rCE115)之相等細胞毒性。又如第10-2圖所示，以Fab Arm Exchange製作之小鼠IgG型雙特異性抗體亦顯示與以既有之雙特異性抗體製作技術所製作的控制組抗體(GPC3 ERY22-rCE115)之相等細胞毒性。
〔實施例11〕正常小鼠之PK試驗
(11-1)使用正常小鼠之體內(in vivo)試驗
對於以Fab Arm Exchange所製作之人類IgG型及小鼠IgG型之抗體是否與以既有技法所製作的抗體顯示同等的血中濃度變化，使用正常小鼠以體內(in vivo)試驗評估。
作為人類IgG型抗體，以人類IgG型Fab Arm Exchange製作3種抗人類磷脂醯肌醇蛋白聚醣-3/抗人類CD3雙特異性抗體：TR-GldrP1/N1、TR-GldP17/N17、TR-G4dP1/N1。又做為控制組抗體，可變區域與上述相同具有抗人類磷脂醯肌醇蛋白聚醣-3/抗人類CD3，作為恒定區域，使用對於MRAH-G1d(序列編號3)的EU編號第118位之Ala開始的恒定區域G1d及MRAH-wtG4d(序列編號5)之EU編號第118位之Ala開 始的恒定區域wtG4d而且將第228位之胺基酸殘基由Ser取代為Pro的IgG1型樞紐之G4d，導入Knobs-into-Holes變異(Nature,1994：372：379-383)所製作之雙特異性抗體TR-GldKiH、TR-G4dKiH。此處恒定區域名G1dKiH及G4dKiH，表示對恒定區域G1d或G4d導入Knob變異(第349位胺基酸殘基取代為Cys、第366位胺基酸殘基取代為Trp之變異)之Knob鏈，及對G1d或G4d導入Hole變異(第356位胺基酸殘基取代為Cys、第366位胺基酸殘基取代為Ser、第368位胺基酸殘基取代為Ala、第407位胺基酸殘基取代為Val之變異)之Hole鏈，以各Knob鏈與Hole鏈組合表現的恒定區域。
另一方面，製作對於作為小鼠IgG型抗體，係具有WO/2009/125825中所載之抗人類IL-6受體的抗體之H鏈可變區域的H237序列、恒定區域為天然型mIgG1序列的H237-mIgG1(序列編號73)，導入Fab Arm Exchange用變異之H237-mIgG1mP3(序列編號74)、H237-mIgG1mN3(序列編號75)、H237-mIgG1mP4(序列編號76)、H237-mIgG1mN4(序列編號77)。抗體L鏈係使用抗人類IL-6受體L鏈可變區域之L104序列之由此等與小鼠κ鏈恒定區域的mk1所構成的L104-mk1(序列編號：78)。依照考例1之方法表現，獲得H237-mIgG1mP3/L104-mk1、H237-mIgG1mN3/L104-mk1、H237-mIgG1mP4/L104-mk1、H237-mIgG1mN4/L104-mk1。使用所得之同聚多肽進行Fab Arm Exchange，獲得SA-mIgG1mP3/mN3(H237-mIgG1mP3/L104-mk1與H237-mIgG1mN3/L104-mk1之組合)、SA-mIgG1mP4/mN4 (H237-mIgG1mP4/L104-mk1與H237-mIgG1mN4/L104-mk1之組合)。又控制組抗體使用以H237-mIgG1及L104-mk1所表現的SA-mIgG1。
Fab Arm Exchange皆以下述反應條件進行，反應後經過PBS透析使用於體內(in vivo)試驗。
反應條件：TBS(Takara，pH7.6)中，[各mAb]=0.225mg/mL，[2-MEA(Sigma)]=25mM，37℃，17小時。
對正常小鼠(C57BL/6J mouse，Charles River日本公司)，投予人類IgG型抗人類磷脂醯肌醇蛋白聚醣-3/抗人類CD3雙特異性抗體(TR-G1dKiH、TR-G1drP1/N1、TR-G1dP17/N17、TR-G4dKiH、TR-G4dP1/N1)、抗人類IL-6受體的小鼠抗體(SA-mIgG1、SA-mIgG1mP3/mN3及SA-mIgG1mP4/mN4)後，評估各抗體之體內動態。抗體係調製為0.1mg/mL以10mL/kg投予尾靜脈。在投予抗體後經過5分鐘、2小時、1日、2日、3日、7日、14日、21日、28日後，由該小鼠進行採血。所採取之血液立即以4℃、15,000rpm離心15分鐘分離，得到血漿。分離之血漿，至實施測定為止，保存於設定為-20℃以下之冷凍庫中。
(11-2)以ECLIA法測定血漿中雙特異性抗體濃度
小鼠血漿中的雙特異性抗體之濃度以ECLIA法測定。首先，將可溶型人類磷脂醯肌醇蛋白聚醣-3分注於MULTI-ARRAY 96孔盤(Meso Scale Discovery公司)，於4℃下經過靜置1晚，製成可溶型人類磷脂醯肌醇蛋白聚醣-3固相化盤。調製血漿中所含雙特異性抗體之濃度為200、100、50、 25、12.5、6.25、3.125ng/mL的標準曲線試樣與稀釋100倍以上的小鼠血漿測定試樣。這些標準曲線試樣及血漿測定試樣100μL分注於各孔的可溶型人類磷脂醯肌醇蛋白聚醣-3固相化盤在室溫下攪拌2小時。接著，以對抗人類CD3抗體的兔子型個體基因型(idiotype)抗體在室溫下攪拌1小時。然後，以Anti-Rabbit IgG-Sulfotag antibody(Meso Scale Discovery 公司)在室溫下反應1小時，添加Read Buffer T(Meso Scale Discovery公司)後，以SECTOR Imager 2400(Meso Scale Discovery公司)測定發光。小鼠血漿中的抗體濃度使用解析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices公司)根據標準曲線之發光訊號計算。其結果如第11圖所示。PK參數係如表11所示。由第11圖及表11所示之結果可知，以人類IgG型Fab Arm Exchange製作之雙特異性抗體均顯示與以既有之雙特異性抗體製作技術Knobs-into-Holes技術所製作的控制組抗體有同等的血中濃度變化。
Figure 103133689-A0202-12-0095-24
(11-3)以ELISA法測定血漿中抗人類IL-6受體的小鼠抗體濃度
小鼠血漿中的抗人類IL-6受體之小鼠抗體濃度以ELISA 法測定。首先，將可溶型人類IL-6受體分注於Nunc-Immuno Plate，MaxiSoup(Nalge Nunc International公司)中，並在4℃下靜置1晚製作可溶型人類IL-6受體固相化盤。調製含血漿中濃度為2.50、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039μg/mL之抗人類IL-6受體之小鼠抗體的標準曲線試樣及稀釋100倍以上的小鼠血漿測定試樣。將這些標準曲線試樣及血漿測定試樣100μL分注於各孔之可溶型人類IL-6受體固相化微量盤在室溫下攪拌2小時。其後使用抗小鼠IgG-過氧化酶抗體(SIGMA公司)在室溫下反應2小時的反應液之顯色反應以TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories公司)做為基質進行。添加1N-硫酸(Showa Chemical公司)使反應停止，以微盤分析儀測定各孔之反應液對450nm之吸光度。小鼠血漿中之抗體濃度係由標準曲線之吸光度以解析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices公司)計算。結果如第12圖所示，其抗體參數係如表12所示。由第12圖及表12所示之結果可知，小鼠IgG型Fab Arm Exchange製作之抗體，明顯與具有天然型mIgG1序列的控制組抗體，顯示同等的血中濃度變化。
Figure 103133689-A0202-12-0096-25
〔參考例1〕抗體之表現載體的製作及抗體的表現 及精製
編碼抗體H鏈及L鏈的鹼基序列的全長基因之合成，係使用Assemble PCR等，以本領域技術人士公知的方法製作。胺基酸的導入使用PCR等本本領域技術人士公知的方法製作。所得的質體片段插入動物細胞的表現載體中，製作成H鏈表現載體及L鏈表現載體。所製得的表現載體之鹼基序列以本領域技術人士公知的方法確定。將所製作之質體，暫時性導入人類胚胎腎臟癌細胞由來之HEK293H株(Invitrogen公司)、或FreeStyle 293細胞(Invitrogen公司)，進行抗體表現。回收所獲得之培養上清液後，通過0.22μm濾膜MILLEX(R)-GV(Millipore公司)、或0.45μm濾膜MILLEX(R)-GV(Millipore公司)，獲得培養上清液。從所得之培養上清液，使用rProtein A Sepharose Fast Flow(GE Healthcare公司)或Protein G Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare公司)，以本本領域技術人士公知的方法，精製抗體。精製抗體的濃度，使用分光光度計測定280nm之吸光度，所得之值以PACE等之方法所計算的吸光係數，計算出抗體濃度(Protein Science,1995；4：2411-2423)。
〔參考例2〕以離子交換層析法之雙特異性抗體生成率之評估
在使用Priminence UFLC(島津製作所公司)之離子交換層析法的精製法中，評估各試樣的分離。移動相使用25mM MES緩衝液、pH5.0及含500mM氯化鈉的25mM MES緩衝液、pH5.0，管柱使用ProPac WCX-10(Thermo Scientific公 司)，再以2液混合梯度法分離雙特異性抗體。以215nm波長實施數據的取得，使用Empower 2(Waters公司)評估溶出的結果。
雙特異性抗體生成率(%)，係將雙特異性抗體之面積值除以存在系統中之總抗體的面積值，再乘以100之值。在單方同聚多肽之回收率不佳時，則以另一方同聚多肽之面積的2倍值與雙特異性抗體之面積值相加的值作為總抗體之面積值來計算。
〔參考例3〕Tm之測定
CH3定域之Tm的測定，使用Rotor-gene Q(QIAGENE公司)以本領域技術人士公知方法進行。即將抗體濃度0.1mg/mL、SYPRO orange濃度10×濃度混合之試樣由30度昇溫至99度，每0.4度測定螢光強度(激發波長470nm，螢光波長555nm)。測定在PBS(Sigma公司，pH7.4)中進行。分析使用Rotor-gene Q series software進行，以螢光強度的一次微分所求出的彎曲點為Tm。MRAH之Tm係利用CH2為70℃附近、Fab為95℃附近，求出CH3定域之Tm，H54之Tm係利用CH2為70℃附近、Fab為90℃附近求出CH3定域之Tm。
〔參考例4〕SPR之相互作用之分析
(4-1)FcγR之調製方法及變異抗體與FcγR相互作用之解析方法
FcγR之細胞外定域以下述方法調製。首先以本領域技術人士公知方法實施FcγR細胞外定域基因之合成。此時，各FcγR序列係依據NCBI中所登錄之資料製作。具體地，對於FcγRI 係依據NCBI登錄編號NM_000566.3之序列，對於FcγR Ⅱ a係依據NCBI登錄編號NM_001136219.1之序列，FcγR Ⅱ b係依據NCBI登錄編號NM_004001.3之序列，FcγR Ⅲ a係依據NCBI登錄編號NM_001127593.1之序列，FcγR Ⅲ b係依據NCBI登錄編號NM_000570.3之序列製作，在C末端上加上His標記。又FcγR Ⅱ a、FcγR Ⅲ a、FcγR Ⅲ b已知為多型，對於多型部位，在FcγR Ⅱ a可以參考J.Exp.Med.,1990；172：19-25，在FcγR Ⅲ a可以J.Clin.Invest.1997；100(5)：1059-1070，在FcγR Ⅲ b可以J.Clin.Invest.1989；84：1688-1691來製作。
所得的基因片段插入動物細胞表現載體中，製作成表現載體。所製作的表現載體，暫時性地導入人類胚胎腎臟癌細胞由來之FreeStyle 293細胞(Invitrogen公司)，表現目的蛋白質。進行培養，回收所得之培養上清液後，通過0.22μm濾膜，獲得培養上清液。所得之培養上清液原則上以下四步驟精製。第1步驟實施陽離子交換管柱層析(SP Sepharose FF)、第2步驟為對His標記之親和管柱層析(HisTrap HP)、第3步驟為膠體過濾層析(Superdex 200)、第4步驟為無菌過濾。但，對於FcγRI，第1步驟係使用Q Sepharose FF實施陰離子交換管柱層析。精製之蛋白質使用分光光度計測定280nm下之吸光度，所得之值以PACE等之方法所計算的吸光係數，計算精製蛋白質之濃度(Protein Science 1995：4：2411-2423)。
使用Biacore T100(GE Healthcare公司)、Biacore T200(GE Healthcare公司)、Biacore A100、Biacore 4000，進行各變異抗體與上述調製之Fcγ受體的相互作用解析。作為移 動緩衝液(running buffer)，使用HBS-EP+(GE Healthcare公司)，測定溫度為25℃。使用在Series S Sensor Chip CM5(GE Healthcare公司)或Series S Sensor Chip CM4(GE Healthcare公司)上以胺偶合法固定抗原胜肽、蛋白A(Thermo Scientific公司)、蛋白A/G(Thermo Scientific公司)、蛋白L(ACTIGEN或BioVision公司)的晶片，或對Series SSensor Chip SA(certified)(GE Healthcare公司)預先生物素(biotin)化之抗原胜肽相互作用、固定之晶片。
在這些感測晶片上捕獲目的抗體，與移動緩衝液稀釋的Fcγ受體相互作用，測定對抗體之結合量，進行抗體間的比較。但是，Fcγ受體之結合量係依賴於捕獲的抗體量，因此比較Fcγ受體的結合量除以各抗體捕獲量之修正值。又，與10mM甘胺酸-HC1在pH1.5反應，洗淨感測晶片上所捕獲的抗體，使感測晶片再生而重複使用。
又，為了計算各變異抗體對FcγR的KD值，速度原理的分析依照以下的方法實施。首先，捕獲上述感測晶片上的目的抗體，與移動緩衝液稀釋的Fcγ受體相互作用，對所獲得的感應圖以Biacore Evaluation Software整合調整(global fitting)所測定之結果為1：1之Langmuir binding model，計算結合速度常數ka(L/mol/s)、解離速度常數kd(1/s)，由該值計算解離常數KD(mol/L)。
(4-2)FcRn之調製方法及變異抗體與FcRn相互作用之解析方法
FcRn係FcRn與β2型微球蛋白的複合體。依照已公開之 人類FcRn基因序列調製寡DNA基因庫(J.Exp.Med.1994,Dec.1；180(6)：2377-81)。編碼全基因之DNA片段係使用所調製之基因庫及作為模版的人類cDNA(Human Placenta Marathon-Ready cDNA，Clontech公司)以PCR調製。所得之DNA片段為模版，編碼含訊息區域(Met1至Leu290)的細胞外定域之DNA片段經PCR擴增，插入哺乳動物細胞的表現載體。同樣地，依照已公開之人類β2型微球蛋白基因序列(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，99(26)：16899-16903(2002))調製寡DNA基因庫。編碼全基因之DNA片段係使用所調製之基因庫及作為模版之人類cDNA(Human Placenta Marathon-Ready cDNA，Clontech公司)，以PCR調製。使用所獲得之DNA片段為模版，將編碼含訊息區域(Met1至Met119)的全蛋白質之DNA片段以PCR擴增，插入哺乳動物細胞的表現載體。
可溶型人類FcRn以下述順序表現。以表現人類FcRn(序列編號：30)及β2型微球蛋白(序列編號：31)所建構之質體，使用PEI(Polyscience公司)的脂質體轉染法，導入人類胚胎腎臟癌細胞由來之HEK293H株(Invitrogen公司)細胞。回收所得的培養上清液，使用IgG Sepharose 6 Fast Flow(Amersham Biosciences公司)精製後再使用HiTrap Q HP(GE Healthcare公司)(J.Immunol.2002,Nov.1；169(9)：5171-80)進一步地精製FcRn。
作為使用Biacore之評估抗體與FcRn相互作用之測定系統，已報導有J.Immunol.2009；182(12)：7663-71所記載在感測晶片上固定化抗體的人類FeRn作為分析物之系統。為了該 目的，如參考例4所載調製人類FeRn。使用本系統，進行在pH6.0及pH7.4的Fv4-IgG1、Fv4-IgG1-v1及Fv4-IgG1-v2對人類FeRn結合活性(解離常數KD)的評估。試驗物之抗體直接固定在Series S感測晶片CM5上提供試驗。對感測晶片的抗體之固定化，使用50mmol/L磷酸鈉/150mmol/L NaCl、0.05%(v/v%)界面活性劑P20、pH6.0作為移動緩衝液，使用胺偶合套組依照製造廠之操作書以固定化量500 RU為標準實施。
移動緩衝液係使用50mmol/L磷酸鈉/150mmol/LNaCl、0.05%界面活性劑P20、pH6.0，或以50mmol/L磷酸鈉/150mmol/L NaCl、0.05%界面活性劑P20，pH7.4，使用製成之感測晶片進行實施。測定全部在25℃下進行。人類FcRn稀釋液與移動緩衝液(作為對照溶液)以流速5μL/min注入10分鐘，使感測晶片上的抗體與人類FcRn相互作用。之後以流速5μL/min流入移動緩衝液1分鐘，觀察FcRn的解離後，以流速30μL/min注入20mmol/L Tris-HCl/150mmol/L NaCl、pH8.1、15秒，重複兩次，使感測晶片再生。
又，用於計算各變異體對FcRn之KD值之速度理論的解析，係依照以下方法實施。首先，在上述感測晶片上捕獲目的抗體，使移動緩衝液稀釋的FcRn相互作用，對所獲得的感應圖以Biacore Evaluation Software整合調整，所測定之結果為1：1之Langmuir binding model，計算結合速度常數ka(L/mol/s)、解離速度常數kd(1/s)，由該值計算解離常數KD(mol/L)。
(4-3)mFcγR之調製方法及變異抗體與mFcγR相互作用之解析方法
小鼠FcγR之細胞外定域係以下述方法調製。首先FcγR細胞外定域基因之合成係以本領域技術人士公知方法實施。此時，各FcγR序列係依據在NCBI中登錄之資料製作。具體地，mFcγRI係依據NCBI參考序列：NP_034316.1，mFcγR Ⅱ以NCBI參考序列：NP_034317.1，mFcγR Ⅲ以NCBI參考序列：NP_034318.2，mFcγ Ⅳ以NCBI參考序列：NP_653142.2之序列製作，於C末端加上His標記。
將所得的基因片段插入動物細胞的表現載體中，製作成表現載體。所製作的表現載體，暫時性地導入人類胚胎腎臟癌細胞由來之FreeStyle 293細胞(Invitrogen公司)，以表現目的蛋白質。在回收獲得之培養上清液後，通過0.22μm濾膜可製得培養上清液。所得之培養上清液原則上以下四步驟精製。第1步驟實施離子交換管柱層析法、第2步驟為對His標記之親和管柱層析法(HisTrap HP)、第3步驟為膠體管柱層析法(Superdex 200)、第4步驟為無菌過濾。第1步驟之離子交換管柱層析法，mFcγRI係使用Q Sepharose HP，mFcγR Ⅱ及mFcγ Ⅳ係使用SP Sepharose FF，mFcγR Ⅲ係使用SP Sepharose HP。又在第3步驟以後所使用之溶劑為D-PBS(-)，但在mFcγR Ⅲ使用含0.1M精胺酸之D-PBS(-)。精製之蛋白質使用分光光度計測定280nm下之吸光度，所得之值以PACE等之方法所計算的吸光係數計算精製蛋白質之濃度(Protein Science 1995；4：2411-2423)。
使用Biacore T100(GE Healthcare公司)、Biacore T200(GE Healthcare公司)、Biacore A100、Biacore 4000，進行各變異抗體與上述中調製之Fcγ受體的相互作用之解析。移動緩衝液係使用HBS-EP+(GE Healthcare公司)，測定溫度為25℃。使用於Series SSensor Chip CM5(GE Healthcare公司)或Series S Sensor Chip CM4(GE Healthcare公司)上以胺偶合法固定抗原胜肽、蛋白A(Thermo Scientific公司)、蛋白A/G(Thermo Scientific公司)、蛋白L(ACTIGEN或BioVision公司)的晶片，或對Series S Sensor Chip SA(certified)(GE Healthcare公司)以預先生物素化之抗原胜肽相互作用而固定之晶片。
在這些感測晶片上捕獲目的抗體，使與移動緩衝液稀釋的mFcγR相互作用，測定對抗體之結合量，進行抗體間的比較。但是，mFcγR之結合量係依賴捕獲之抗體量，因此比較mFcγR的結合量除以各抗體之捕獲量之修正值。又，與10mM甘胺酸-HCl、pH1.5反應，洗淨感測晶片上所捕獲的抗體，使感測晶片再生而重複使用。
又，用於計算各變異抗體對FcγR的KD值之速度原理解析依照以下方法實施。首先，在上述感測晶片上捕獲目的抗體，與以移動緩衝液稀釋的mFcγR相互作用，所獲得的感應圖以Biacore Evaluation Software整合調整測定之結果為1：1之Langmuir binding model，計算結合速度常數ka(L/mol/s)、解離速度常數kd(1/s)，由該值計算解離常數KD(mol/L)。
(4-4)mFcRn之調製方法及變異抗體與mFcRn相互作用之解析方法
使用Biacore T100、Biacore T200、Biacore A100、Biacore 4000(GE Healthcare公司)，進行小鼠FcRn與抗體之速度原理解析。在感測晶片CM4(GE Healthcare公司)上以胺偶合法固定適當量之蛋白L(ACTIGEN公司)，在其上捕獲目的抗體。其次，注入FcRn稀釋液與移動緩衝液(作為對照溶液)，使感測晶片上捕獲之抗體與小鼠FcRn相互作用。移動緩衝液係使用50mmol/L磷酸鈉、150mmol/L NaCl、0.05%(w/v)Tween 20、pH6.0，FcRn的稀釋使用各緩衝液。晶片之再生係使用10mmol/L甘胺酸-HCl、pH1.5。測定均在25℃下實施。 由測定所得之感測圖，計算動態常數的結合速度常數ka(L/Ms)、及解離速度常數kd(1/s)，依據該值計算各抗體對小鼠FcRn的KD(M)。各常數之計算係使用Biacore Evaluation Software(GE Healthcare公司)。
〔參考例5〕CE-IEF
CE-IEF之測定，係使用PA800 Plus(Beckman Coulter公司)同業公知方法進行。兩性電解質(Pharmalyte)係廣範圍地以5至8及8至10.5等量混合，以pI range 5至10.5進行分析。使用4mg/mL之抗體溶液分析，結果以32 karat software(Beckman Coulter公司)解析。雙特異性抗體生成率(%)使用雙特異性抗體之面積值除以系統中存在的總抗體面積值，再乘以100之值。
〔參考例6〕細胞毒性之測定
(6-1)人類週邊血單核淋巴球(PBMC)溶液之調製
使用預先加入100μL之1,000單位/mL肝抗血凝素(heparin)溶液(Novo Heparin注5千單位，Novo Nordisk公司)的注射器，由健康之志願者(成人)末梢採血50mL。以PBS(-)稀釋2倍後4等分的末梢血，加入預先加入15mL之Ficoll-Paque PLUS進行離心操作之Leucosep淋巴球分離管(Cat.No.227290，Greiner Bio-one公司)。在該分離管離心分離(2,150rpm，10分鐘，室溫)後，分取單核淋巴球分層(fraction)。以含10%FBS之Dulbecco's Modified Eagle's Medium(SIGMA公司，以下稱為10%FBS/D-MEM)洗淨單核淋巴球分層之細胞1次後，該細胞以10%FBS/D-MEM調製其細胞密度為4×106/mL。如此調製之細胞溶液作為人類PBMC溶液，提供之後試驗使用。
(6-2)細胞毒性之測定
細胞毒性使用xCELLigence同步細胞影像分析儀(Roche Diagnostics日本公司)評估細胞增殖抑制率。標的細胞使用以SK-HEP-1細胞株強制表現人類GPC3建構之SK-pca13a細胞株。將SK-pca13a細胞株由培養盤剝離，以形成1×104cells/well以100μL/well播種於E-Plate 96(Roche Diagnostics日本公司)微量盤，使用xCELLigence同步細胞影像分析儀開始測定活細胞。次日，自xCELLigence同步細胞影像分析儀取出微量盤，並在該微量盤中添加50μL以調為各種濃度(0.004、0.04、0.4、4μg/mL)之各種抗體。於室溫下反應15分鐘之後加入(6-1)中所調製之人類PBMC溶液50μL(2×104cells/well)，將該微 量盤裝入xCELLigence同步細胞影像分析儀中，開始測定活細胞。反應在5%二氧化碳氣體、37℃條件下進行，以添加人類PBMC經72小時後之Cell Index值，以下式求出細胞增殖抑制率(%)。又計算中所使用之Cell Index值，使用以抗體添加時刻前之Cell Index值為1而予以標準化之後的數值。
細胞增生抑制率(%)=(A-B)×100/(A-1)
A表示未添加抗體之孔中Cell Index值的平均值(僅標的細胞與人類PBMC)，B為各孔中Cell Index值之平均值。
產業上利用之可能性
根據本發明之方法，可在還原條件下，以較先前技術更高之效率製作雙特異性抗體。
<110> 中外製藥股份有限公司CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA
<120> 多胜肽異種多聚體之製造方法
<130> C1-A1307-TW
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<170> PatentIn version 3.5
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工合成序列
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<213> 人工序列
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Figure 103133689-A0202-12-0111-31
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 25
Figure 103133689-A0202-12-0163-97
Figure 103133689-A0202-12-0164-98
Figure 103133689-A0202-12-0165-99
Figure 103133689-A0202-12-0166-100
<210> 26
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 26
Figure 103133689-A0202-12-0166-101
Figure 103133689-A0202-12-0167-102
Figure 103133689-A0202-12-0168-103
<210> 27
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 27
Figure 103133689-A0202-12-0168-104
Figure 103133689-A0202-12-0169-105
Figure 103133689-A0202-12-0170-106
Figure 103133689-A0202-12-0171-107
<210> 28
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 28
Figure 103133689-A0202-12-0171-108
Figure 103133689-A0202-12-0172-109
Figure 103133689-A0202-12-0173-110
<210> 29
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 29
Figure 103133689-A0202-12-0174-111
Figure 103133689-A0202-12-0175-112
Figure 103133689-A0202-12-0176-113
<210> 30
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 30
Figure 103133689-A0202-12-0176-114
Figure 103133689-A0202-12-0177-115
Figure 103133689-A0202-12-0178-116
<210> 31
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 31
Figure 103133689-A0202-12-0179-117
Figure 103133689-A0202-12-0180-118
Figure 103133689-A0202-12-0181-119
<210> 32
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 32
Figure 103133689-A0202-12-0181-120
Figure 103133689-A0202-12-0182-121
Figure 103133689-A0202-12-0183-122
<210> 33
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 33
Figure 103133689-A0202-12-0184-123
Figure 103133689-A0202-12-0185-124
Figure 103133689-A0202-12-0186-125
<210> 34
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 34
Figure 103133689-A0202-12-0186-126
Figure 103133689-A0202-12-0187-127
Figure 103133689-A0202-12-0188-128
Figure 103133689-A0202-12-0189-129
<210> 35
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 35
Figure 103133689-A0202-12-0189-130
Figure 103133689-A0202-12-0190-131
Figure 103133689-A0202-12-0191-133
<210> 36
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 36
Figure 103133689-A0202-12-0191-134
Figure 103133689-A0202-12-0192-135
Figure 103133689-A0202-12-0193-136
Figure 103133689-A0202-12-0194-137
<210> 37
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 37
Figure 103133689-A0202-12-0194-138
Figure 103133689-A0202-12-0195-139
Figure 103133689-A0202-12-0196-140
<210> 38
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 38
Figure 103133689-A0202-12-0196-141
Figure 103133689-A0202-12-0197-142
Figure 103133689-A0202-12-0198-143
Figure 103133689-A0202-12-0199-144
<210> 39
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 39
Figure 103133689-A0202-12-0199-145
Figure 103133689-A0202-12-0200-146
Figure 103133689-A0202-12-0201-147
<210> 40
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 40
Figure 103133689-A0202-12-0202-148
Figure 103133689-A0202-12-0203-149
Figure 103133689-A0202-12-0204-150
<210> 41
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 41
Figure 103133689-A0202-12-0204-151
Figure 103133689-A0202-12-0205-152
Figure 103133689-A0202-12-0206-153
<210> 42
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 42
Figure 103133689-A0202-12-0207-154
Figure 103133689-A0202-12-0208-155
Figure 103133689-A0202-12-0209-156
<210> 43
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 43
Figure 103133689-A0202-12-0209-157
Figure 103133689-A0202-12-0210-158
Figure 103133689-A0202-12-0211-159
<210> 44
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 44
Figure 103133689-A0202-12-0212-160
Figure 103133689-A0202-12-0213-161
Figure 103133689-A0202-12-0214-162
<210> 45
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 45
Figure 103133689-A0202-12-0214-163
Figure 103133689-A0202-12-0215-164
Figure 103133689-A0202-12-0216-165
<210> 46
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 46
Figure 103133689-A0202-12-0217-166
Figure 103133689-A0202-12-0218-167
Figure 103133689-A0202-12-0219-168
<210> 47
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 47
Figure 103133689-A0202-12-0219-169
Figure 103133689-A0202-12-0220-170
Figure 103133689-A0202-12-0221-171
Figure 103133689-A0202-12-0222-172
<210> 48
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 48
Figure 103133689-A0202-12-0222-173
Figure 103133689-A0202-12-0223-174
Figure 103133689-A0202-12-0224-175
<210> 49
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 49
Figure 103133689-A0202-12-0224-176
Figure 103133689-A0202-12-0225-177
Figure 103133689-A0202-12-0226-178
Figure 103133689-A0202-12-0227-179
<210> 50
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 50
Figure 103133689-A0202-12-0227-180
Figure 103133689-A0202-12-0228-181
Figure 103133689-A0202-12-0229-182
<210> 51
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 51
Figure 103133689-A0202-12-0229-183
Figure 103133689-A0202-12-0230-184
Figure 103133689-A0202-12-0231-185
Figure 103133689-A0202-12-0232-186
<210> 52
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 52
Figure 103133689-A0202-12-0232-187
Figure 103133689-A0202-12-0233-188
Figure 103133689-A0202-12-0234-189
<210> 53
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 53
Figure 103133689-A0202-12-0235-190
Figure 103133689-A0202-12-0236-191
Figure 103133689-A0202-12-0237-192
<210> 54
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 54
Figure 103133689-A0202-12-0237-193
Figure 103133689-A0202-12-0238-194
Figure 103133689-A0202-12-0239-195
<210> 55
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 55
Figure 103133689-A0202-12-0240-196
Figure 103133689-A0202-12-0241-197
Figure 103133689-A0202-12-0242-198
<210> 56
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 56
Figure 103133689-A0202-12-0242-199
Figure 103133689-A0202-12-0243-200
Figure 103133689-A0202-12-0244-201
<210> 57
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 57
Figure 103133689-A0202-12-0245-202
Figure 103133689-A0202-12-0246-203
Figure 103133689-A0202-12-0247-204
<210> 58
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 58
Figure 103133689-A0202-12-0247-205
Figure 103133689-A0202-12-0248-206
Figure 103133689-A0202-12-0249-207
Figure 103133689-A0202-12-0250-208
<210> 59
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 59
Figure 103133689-A0202-12-0250-209
Figure 103133689-A0202-12-0251-210
<210> 60
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 60
Figure 103133689-A0202-12-0251-211
Figure 103133689-A0202-12-0252-212
<210> 61
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 61
Figure 103133689-A0202-12-0253-213
Figure 103133689-A0202-12-0254-214
Figure 103133689-A0202-12-0255-215
<210> 62
<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 62
Figure 103133689-A0202-12-0255-216
Figure 103133689-A0202-12-0256-217
Figure 103133689-A0202-12-0257-218
<210> 63
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 63
Figure 103133689-A0202-12-0258-219
Figure 103133689-A0202-12-0259-220
<210> 64
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 64
Figure 103133689-A0202-12-0259-221
Figure 103133689-A0202-12-0260-222
<210> 65
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 65
Figure 103133689-A0202-12-0260-223
Figure 103133689-A0202-12-0261-224
Figure 103133689-A0202-12-0262-225
Figure 103133689-A0202-12-0263-227
<210> 66
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 66
Figure 103133689-A0202-12-0263-228
Figure 103133689-A0202-12-0264-229
Figure 103133689-A0202-12-0265-230
<210> 67
<211> 440
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 67
Figure 103133689-A0202-12-0266-231
Figure 103133689-A0202-12-0267-232
Figure 103133689-A0202-12-0268-233
<210> 68
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 68
Figure 103133689-A0202-12-0268-234
Figure 103133689-A0202-12-0269-235
Figure 103133689-A0202-12-0270-237
<210> 69
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 69
Figure 103133689-A0202-12-0271-238
Figure 103133689-A0202-12-0272-239
Figure 103133689-A0202-12-0273-240
<210> 70
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 70
Figure 103133689-A0202-12-0273-241
Figure 103133689-A0202-12-0274-242
Figure 103133689-A0202-12-0275-243
Figure 103133689-A0202-12-0276-244
<210> 71
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 71
Figure 103133689-A0202-12-0276-245
Figure 103133689-A0202-12-0277-246
Figure 103133689-A0202-12-0278-247
<210> 72
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 72
Figure 103133689-A0202-12-0278-248
Figure 103133689-A0202-12-0279-249
Figure 103133689-A0202-12-0280-250
Figure 103133689-A0202-12-0281-251
<210> 73
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 73
Figure 103133689-A0202-12-0281-252
Figure 103133689-A0202-12-0282-253
Figure 103133689-A0202-12-0283-254
<210> 74
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 74
Figure 103133689-A0202-12-0284-255
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Figure 103133689-A0202-12-0286-257
<210> 75
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 75
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Figure 103133689-A0202-12-0287-259
Figure 103133689-A0202-12-0288-260
<210> 76
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 76
Figure 103133689-A0202-12-0289-261
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工合成序列
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<210> 78
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工合成序列
<400> 78
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Figure 103133689-A0202-12-0295-268
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 79
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Figure 103133689-A0202-12-0296-270
<210> 80
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 80
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<212> PRT
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<223> 人工合成序列
<400> 81
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Figure 103133689-A0202-12-0299-275

Claims (22)

  1. 一種異種多聚體之製造方法，其包含：a)提供具有第1抗原結合活性，且含Fc區域之第1多胜肽的同聚多肽之階段，b)提供具有與該第1抗原結合活性相異的第2抗原結合活性，且含Fc區域之第2多胜肽的同聚多肽之階段，c)在可使樞紐區域內的半胱胺酸發生雙硫鍵異構化之還原條件下，共同溫育該第1多胜肽之同聚多肽及該第2多胜肽的同聚多肽之階段，以及d)獲得含該第1及第2多胜肽的異種多聚體之階段，在前述第1及/或第2多胜肽的Fc區域所含之CH3區域中，具有與選自：(1)EU編號第356位及第439位的胺基酸殘基、(2)EU編號第357位及第370位的胺基酸殘基、及(3)EU編號第399位及第409位的胺基酸殘基所示之胺基酸殘基之組的1組至3組的胺基酸殘基同類之電荷；在前述第1多胜肽的CH3區域及前述第2多胜肽的CH3區域雙方中，在前述(1)至(3)所示之胺基酸殘基的組中同組之胺基酸殘基各具有同類之電荷時，前述第2多胜肽的CH3區域中的該組胺基酸殘基，具有與前述第1多胜肽的CH3區域中該組胺基酸殘基相反之電荷，且在該第1及第2多胜肽中，使EU編號第397位的胺基酸變異，且該EU編號第397位變異為Met(M)、Phe(F)或Tyr(Y)。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之製造方法，其中在如申請專利範圍第1項所述之階段a)中，包含提供與第1多胜肽形成多聚體之第3多胜肽之階段，且在階段b)中，包含提供與第2多胜肽形成多聚體之第4多胜肽之階段。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之製造方法，其中前述具有同類電荷的胺基酸殘基，係選自下列(A)或(B)任一群所含的1個以上之胺基酸殘基：(A)麩胺酸(E)、天冬胺酸(D)；(B)離胺酸(K)、精胺酸(R)、組胺酸(H)。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之製造方法，其中在該第1及第2多胜肽中，各自具有同類電荷的胺基酸殘基之組，係下列(1)至(4)任一組之胺基酸殘基之組：(1)EU編號第356位及第439位的胺基酸殘基、(2)EU編號第357位及第370位的胺基酸殘基、(3)EU編號第399位及第409位的胺基酸殘基、(4)(i)EU編號第399位及第409位的胺基酸殘基、以及(ii)EU編號第356位及第439位的胺基酸殘基。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之製造方法，其中在該第1及第2多胜肽中，各自具有同類電荷的胺基酸殘基之組，係下列之組的胺基酸殘基之組：(i)EU編號第399位及第409位的胺基酸殘基、及(ii)EU編號第356位及第439位的胺基酸殘基。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之製造方法，其中在該第1及/或第2多胜肽中，使胺基酸變異以使該第1及/或第2多胜 肽的CH3區域之安定性變為不安定。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之製造方法，其中在該第1及第2多胜肽中，使EU編號第397位的胺基酸變異。
  8. 如申請專利範圍第6項所述之製造方法，其中在該第1及第2多胜肽中，使EU編號第392位的胺基酸變異。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之製造方法，其中該第1及/或第2多胜肽的Fc區域為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4型。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之製造方法，其中該第1及/或第2多胜肽的Fc區域為來自於小鼠的Fc區域。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之製造方法，其中在前述第1及/或第2多胜肽的Fc區域所包含之CH3區域中，具有與選自：(1)EU編號第356位及第439位的胺基酸殘基、及(2)EU編號第399位及第409位的胺基酸殘基所示之胺基酸殘基的組之1組至2組的胺基酸殘基同類之電荷；在前述第1多胜肽的CH3區域及前述第2多胜肽的CH3區域雙方中，在前述(1)至(2)所示之胺基酸殘基的組中同組之胺基酸殘基各具有同類之電荷時，前述第2多胜肽的CH3區域中的該組胺基酸殘基，具有與前述第1多胜肽的CH3區域中該組胺基酸殘基相反之電荷。
  12. 一種異種多聚體之製造方法，其包含：a)提供具有第1抗原結合活性，且含Fc區域之第1多胜肽的同聚多肽之階段， b)提供具有與該第1抗原結合活性相異的第2抗原結合活性，且含Fc區域之第2多胜肽的同聚多肽之階段，c)在可使樞紐區域內的半胱胺酸發生雙硫鍵異構化之還原條件下，共同溫育該第1多胜肽之同聚多肽及該第2多胜肽之同聚多肽之階段，以及d)獲得含第1及第2多胜肽的異種多聚體之階段，使在前述第1及第2多胜肽的Fc區域所含之CH3區域中的EU編號第397位的胺基酸殘基變異，且該EU編號第397位變異為Met(M)、Phe(F)或Tyr(Y)。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之製造方法，其中在該第1及/或第2多胜肽中，使EU編號第392位的胺基酸變異。
  14. 如申請專利範圍第1、12或13項所述之製造方法，其中在該第1及第2多胜肽中，EU編號第392位變異為Asp(D)、Glu(E)、Thr(T)、Val(V)或Ile(I)。
  15. 如申請專利範圍第1、12或13項所述之製造方法，其中在該第1及/或第2多胜肽中，使EU編號第397位變異為Phe(F)或Tyr(Y)。
  16. 如申請專利範圍第1、12或13項所述之製造方法，其中在該第1多胜肽中，使EU編號第356位變異為Lys(K)，且使EU編號第397位變異為Phe(F)或Tyr(Y)，在該第2多胜肽中，使EU編號第397位變異為Phe(F)或Tyr(Y)，且使EU編號第439位變異為Glu(E)。
  17. 如申請專利範圍第1、12或13項所述之製造方法，其中前 述階段a)及b)係以混合生產第一多胜肽的同聚多肽之細胞株與生產第二多胜肽的同聚多肽之細胞株而實施，前述階段c)係在該培養上清液中實施。
  18. 如申請專利範圍第1、12或13項所述之製造方法，其中前述異種多聚體係多特異性抗體或異型Fc融合蛋白。
  19. 如申請專利範圍第1、12或13項所述之製造方法，其中前述異種多聚體係雙特異性抗體。
  20. 如申請專利範圍第1、12或13項所述之製造方法，其中階段c)包含與還原劑之接觸。
  21. 如申請專利範圍第20項所述之製造方法，其中該階段c)包含添加選自：麩胱甘肽、L-半胱胺酸、二硫蘇醣醇、β-硫醇二醇、TCEP及2-MEA所組成之群的作用物。
  22. 如申請專利範圍第21項所述之製造方法，其中該階段c)包含添加選自：麩胱甘肽、2-MEA的作用物。
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