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TW201545760A - 對抗rgm a蛋白質之單株抗體及其用途 - Google Patents

對抗rgm a蛋白質之單株抗體及其用途 Download PDF

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TW201545760A
TW201545760A TW104130646A TW104130646A TW201545760A TW 201545760 A TW201545760 A TW 201545760A TW 104130646 A TW104130646 A TW 104130646A TW 104130646 A TW104130646 A TW 104130646A TW 201545760 A TW201545760 A TW 201545760A
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TW104130646A
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Bernhard K Muller
Martin Schmidt
Eve Barlow
Mary Leddy
Chung-Ming Hsieh
Philip Bardwell
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Abbvie Deutschland
Abbvie Inc
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Abstract

本發明係關於一種經分離蛋白質，特定言之，結合且中和RGM A蛋白質之單株抗體。詳言之，該等抗體具有抑制RGM A與其受體及/或共受體結合之能力。本發明之該等抗體或其部分適用於偵測RGM A及抑制例如患有包括(但不限於)多發性硬化、哺乳動物腦外傷、脊髓損傷、中風、神經退化性疾病及精神分裂症之病症之人類的RGM A活性。

Description

對抗RGM A蛋白質之單株抗體及其用途
本申請案描述RGM A結合蛋白質，尤其單株抗體，且詳言之，其CDR移植人類化形式，其具有結合RGM A且阻止RGM蛋白質與RGM A受體及其他RGM A結合蛋白質結合且因此中和RGM A之功能的能力。該等抗體可具有治療若干病狀之效用，該等病狀包括(但不限於)多發性硬化、哺乳動物腦外傷、脊髓損傷、中風、神經退化性疾病及精神分裂症。
哺乳動物中樞神經系統(CNS)內損傷後或炎症攻擊後或神經退化性疾病後軸突再生通常不可能發生；結果係視CNS中神經纖維再生長之固有能力與CNS內定位於病變或損害部位之微環境中的抑制因子之間的平衡而定，該等抑制因子主動阻止損傷纖維束再生長且因此阻止其再生。
已確定由寡樹突神經膠質細胞產生之CNS髓鞘及病變瘢痕藉由引起活體外以及活體內生長錐萎陷及神經突生長抑制，從而導致軸突再生長直接受到抑制而成為損傷初期軸突生長之最相關非容許性結構。已鑑別出RGM蛋白質，即CNS髓鞘及瘢痕組織上之主要抑制因子(Monnier等人，Nature 419：392-395,2002；Schwab等人，Arch.Neurol.62：1561-8,2005a；Schwab等人，Eur.J.Neurosci.21：1569-76, 2005b；Hata等人，J.Cell Biol.173：47-58,2006；關於評論，請參見：Mueller等人，Philos.Trans.R.Soc.Lond.B Biol.Sci.361：1513-29,2006；Yamashita等人，Curr.Opin.Neurobiol.17：29-34,2007)。RGM蛋白質在死於腦外傷或局部缺血性損傷之人類之損害或病變部位上調(Schwab等人，Arch.Neurol.62：1561-8,2005a)且在脊髓損傷之大鼠之病變部位上調(Schwab等人，Eur.J.Neurosci.21：1569-76,2005b；Hata等人，J.Cell Biol.173：47-58,2006，關於評論，請參見：Mueller等人，Philos.Trans.R.Soc.Lond.B Biol.Sci.361：1513-29,2006；Yamashita等人，Curr.Opin.Neurobiol.17：29-34,2007)。另外，使用來自多發性硬化患者及健康人士之臨床樣品得到之第一批資料表明人類RGM A在患有MS之患者之腦脊髓液中上調(資料未展示)。
為評估RGM A特異性多株抗體之促再生潛能，在中度至重度脊髓損傷模型中投與該等抗體，其中橫切胸層面9/10處約60%之脊髓。組織學檢查揭示該病變切斷皮質脊髓束之所有背側及外側纖維。經由泵局部給予RGM A特異性多株抗體兩週會誘導損傷神經纖維之長距離再生(Hata等人，J.Cell Biol.173：47-58,2006)。
數百根神經纖維延伸穿過病變部位且最長纖維再生超出病變10mm以上，而在對照抗體治療之動物內未在病變遠端發現有再生纖維。與對照抗體治療之脊椎損傷大鼠相比，抗RGM A治療之大鼠之功能恢復明顯改進，從而證明RGM A為有效的神經再生抑制劑及刺激以軸突損害或神經纖維損傷為特徵之適應症恢復之有用標靶(Hata等人，J.Cell Biol.173：47-58,2006；Kyoto等人，Brain Res.1186：74-86,2007)。另外，用功能阻斷多株抗體中和RGM A蛋白質不僅刺激脊椎損傷大鼠之受損神經纖維再生長，且亦增強其突觸形成，從而使得受損神經元迴路能夠重新形成或復原(Kyoto等人，Brain Res.1186：74-86,2007)。
rgm基因家族涵蓋三個不同基因，其中兩個rgm a及b於哺乳動物CNS中表現，產生RGM A及RGM B蛋白質，而第三個成員rgm c於周圍表現(Mueller等人，Philos.Trans.R.Soc.Lond.B Biol.Sci.361：1513-29,2006)，其中RGM C在鐵代謝中發揮重要作用。活體外RGM A藉由與已鑑別為RGM受體之再生蛋白(Neogenin)結合來抑制神經突外生長(Rajagopalan等人，Nat Cell Biol.：6(8),756-62,2004)。再生蛋白最初描述為神經突起誘向因子(netrin)結合蛋白(Keino-Masu等人，Cell,87(2)：175-85,1996)。此為重要研究發現，因為已報導神經突起誘向因子-1與再生蛋白或其密切相關之受體DCC(結腸直腸癌中缺失)之結合將刺激而非抑制神經突生長(Braisted等人，J.Neurosci.20：5792-801,2000)。因此，阻斷RGM A將藉由使再生蛋白能夠結合其神經突生長刺激配位體神經突起誘向因子而解除RGM介導之生長抑制。基於該等觀察結果，可假定在人類脊髓損傷模型中，中和RGM A優於中和再生蛋白。除使RGM A與再生蛋白結合及誘導神經突生長抑制外，RGM A或B與骨形態發生蛋白BMP-2及BMP-4之結合亦可代表成功神經再生及功能恢復之另一障礙(Mueller等人，Philos.Trans.R.Soc.Lond.B Biol.Sci.361：1513-29,2006)。
此項技術中需要能夠結合RGM A之改進抗體，較佳阻斷RGM A且阻止RGM A與其受體及/或結合蛋白質(亦即，再生蛋白及BMP-2、BMP-4)之間的相互作用之單株抗體。
本申請案提供(a)產生選擇性抑制RGM A與其受體再生蛋白及與骨形態發生蛋白2及4(BMP-2、BMP-4)之結合的對抗RGM A之中和單株抗體，及(b)產生選擇性抑制RGM A與骨形態發生蛋白2及4(BMP-2、BMP-4)之結合的對抗RGM A之中和單株抗體。預期本發明之中和單株抗體將刺激受損傷或損害神經纖維之再生長及再生神經纖維之功能突觸之形成，此係因為本發明之中和單株抗體中之一種似乎在神經 元細胞偏好於RGM A受質上而非如膠原蛋白I(Collagen I)之容許受質上遷移且生長的條件下轉變RGM A之抑制性。另外，該抗體能夠在活體內大鼠視神經損傷模型中誘導長距離再生且其亦增強病變及再生神經纖維之髓鞘再形成。
因此，預期本發明之中和單株抗體會促進損傷及發炎人類CNS中(例如多發性硬化中；急性脊髓損傷、腦外傷後；或諸如亨廷頓舞蹈病(Huntington's chorea)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)之神經退化性疾病中)受損害或破壞之神經元連接之神經元再生及再生長。
根據一態樣，本發明提供一種以1×10-7 M或以下之KD及1×10-2 s-1或以下之koff速率常數(兩者皆由表面電漿共振測定)自人類RGM A(hRGM A)解離之結合蛋白質。
根據另一態樣，本發明係關於一種結合蛋白質，例如展示以上動力學特徵之結合蛋白質，如例如下文實例3中所例示之Ntera神經元外生長檢定之標準活體外檢定中所測定，其與人類RGM A結合且中和人類RGM A之神經突外生長抑制活性。
本發明亦係關於如以上所定義之結合蛋白質，其具有以下其他功能特徵中之至少一種：與大鼠RGM A結合，與人類RGM C結合，及與大鼠RGM C結合。
詳言之，如本文中所述之結合蛋白質調節RGM與其受體中之至少一種結合之能力。
詳言之，該等結合蛋白質與人類RGM A之受體結合結構域結合。對於RGM A，已鑑別出N-末端及C-末端受體結合結構域。如由 抑制N-末端hRGM A片段(例如47-168)與受體分子(如再生蛋白及BMP-4)之間的結合所說明，本發明之結合蛋白質之特定實施例與RGM A之N-末端受體結合結構域結合。該N-末端hRGM A片段可具有約30至約150個或約30至約122個胺基酸殘基之總長度。作為一非限定性實例，可提及如本文中所述之hRGM A之片段0(對應於N-末端殘基47-168)或任何較短受體結合片段。
詳言之，該結合蛋白質調節(較佳抑制)以下相互作用中之至少一種：人類RGM A與人類BMP-4之結合，hRGM A與人類再生蛋白之結合，hRGM C與人類再生蛋白之結合，人類RGM A與人類BMP-2之結合。
根據一特定實施例，如本文中所定義之結合蛋白質為人類化抗體。
如上所述之結合蛋白質可具有抗原結合結構域，該結合蛋白質能夠結合RGM分子之抗原決定基，該抗原結合結構域包含至少一個包含選自由以下序列組成之群之胺基酸序列的CDR：GTTPDY(SEQ ID NO：59)，FQATHDPLT(SEQ ID NO：62)，ARRNEYYGSSFFDY(SEQ ID NO：65)，LQGYIPPRT(SEQ ID NO：68)，及與該等序列中之一個具有至少50%之序列一致性的經修飾CDR胺基酸序列。在另一實施例中，本發明係關於一種包含抗原結合結構域之結合蛋白質，該結合蛋白質能夠結合RGM分子之抗原決定基，該抗原結合結構域包含至少一個包含選自由以下序列組成之群之胺基酸序列的CDR： GTTPDY(SEQ ID NO：59)，FQATHDPLT(SEQ ID NO：62)，ARRNEYYGSSFFDY(SEQ ID NO：65)，LQGYIPPRT(SEQ ID NO：68)，及與該等序列中之一個具有至少50%之序列一致性，例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%之一致性的經修飾CDR胺基酸序列。
舉例而言，該結合蛋白質可包含該等CDR中之兩個，例如SEQ ID NO：59及62；或SEQ ID NO：65及68；其中該等CDR中之至少一個可經修飾以與該等序列中之一個具有至少50%之序列一致性，例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%之一致性。
該結合蛋白質可進一步包含至少一個包含選自由以下序列組成之群之胺基酸序列的CDR：SEQ ID NO：57、58、60、61、63、64、66、67及與該等序列中之一個具有至少50%之序列一致性，例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%之一致性的經修飾CDR胺基酸序列。
在另一實施例中，提供一種結合蛋白質，其中該至少一個CDR包含選自由以下序列組成之群之胺基酸序列：
在一特定實施例中，該結合蛋白質包含至少三個選自由以下各組組成之可變結構域CDR組的CDR： 或該三個CDR中之至少一個為與親本序列具有至少50%之序列一致性，例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%之一致性的經修飾CDR胺基酸序列的可變結構域組。
詳言之，該等上文所提及之修飾中之每一個均可藉由單一或多個胺基酸之添加、缺失或尤其取代或其組合產生。
在另一實施例中，結合蛋白質包含至少兩個可變結構域CDR組。
詳言之，該至少兩個可變結構域CDR組係選自由以下各組組成之群：VH 5F9組及VL 5F9組；及VH 8D1組及VL 8D1組。
根據本發明之結合蛋白質進一步包含人類受體架構。
該人類受體架構可包含至少一個選自由以下序列組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32及33。
本發明之結合蛋白質尤其可包含至少一組架構序列，該至少一組架構序列係選自由以下各組組成之群：(1)VH3-48組(Seq ID NO：15、16及17)，VH3-33組(SEQ ID NO：21、22及23)，VH3-23組(SEQ ID NO：24、25及26)，該等組中之每一個係與選自以下序列之另一架構序列組合：JH3(SEQ ID NO：18)，JH4(SEQ ID NO：19)，JH6(SEQ ID NO：20)；或(2)選自由以下各組組成之群：A18組(SEQ ID NO：27、28及29)，A17組(SEQ ID NO：31、32及33)，該等組中之每一個係與選自JK2(SEQ ID NO：2)之另一架構序列組合。
根據特定實施例，前述主張中任一主張之結合蛋白質包含至少一個選自SEQ ID NO：35、36、37、38、39、40、41、42及43之CDR移植重鏈可變結構域及/或至少一個選自SEQ ID NO：44、45及46之CDR移植輕鏈可變結構域。
更詳言之，本發明之結合蛋白質包含兩個可變結構域之組合，其中該兩個可變結構域具有選自以下序列之胺基酸序列：SEQ ID NO：35及44；36及44；37及44；38及44；39及44；40及44；41及44；42及44；43及44；SEQ ID NO：35及45；36及45；37及45；38及45；39及45；40及45；41及45；42及45；43及45；SEQ ID NO：35及46；36及46；37及46；38及46；39及46；40及46；41及46；42及46；43及46。
在本發明之另一實施例中，該結合蛋白質之人類受體架構在關鍵殘基處包含至少一個架構區胺基酸取代，該關鍵殘基係選自由以下各殘基組成之群：鄰接CDR之殘基；糖基化位點殘基；稀有殘基；能夠與RGM抗原決定基相互作用之殘基；能夠與CDR相互作用之殘基；典型殘基；重鏈可變區與輕鏈可變區之間的接觸殘基；維尼亞區域(Vernier zone)內之殘基；能夠形成焦麩胺酸(paraglutamate)之N-末端殘基；及Chothia定義之可變重鏈CDR1與Kabat定義之第一重鏈架構之間重疊的區域中之殘基。
詳言之，該等關鍵殘基係選自由以下各殘基組成之群：(重鏈序列位置)：1、5、37、48、49、88、98，(輕鏈序列位置)：2、4、41、51。
在一特定實施例中，本發明之結合蛋白質為共同人類可變結構域或包含共同人類可變結構域。
根據本發明之結合蛋白質之另一實施例，該人類受體架構包含至少一個架構區胺基酸取代，其中架構之胺基酸序列與該人類受體架構之序列至少65%一致，例如至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致，且其包含至少70個與該人類受體架構相同之胺基酸殘基，例如至少75、80或85個殘基。
根據特定實施例，本發明之結合蛋白質包含至少一個架構突變可變結構域，其具有選自由以下序列組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：47、48、49、50；(VH結構域)，及/或選自由以下序列組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：51、52、53及54(VL結構域)。
詳言之，該結合蛋白質包含兩個視情況架構突變之可變結構域，其中該兩個可變結構域具有選自由以下序列組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：47及44；47及45；47及46；47及51；47及52；47及53；47及54；SEQ ID NO：48及44；48及45；48及46；48及51；48及52；48及53；48及54；SEQ ID NO：49及44；49及45；49及46；49及51；49及52；49及53；49及54；SEQ ID NO：50及44；50及45；50及46；50及51；50及52；50及53；50及54。
如本文中所述之本發明之結合蛋白質能夠結合至少一個選自RGM分子之標靶。
詳言之，其能夠結合人類RGM A及視情況至少一個人類來源或來源於獼猴、大鼠、雞、青蛙及魚之其他RGM分子。
舉例而言，其另外可與大鼠RGM A、人類RGM C及/或大鼠RGM C結合。
詳言之，本發明之結合蛋白質能夠調節(尤其能夠中和或抑制)選自如以上所定義之RGM分子之標靶的生物功能。
詳言之，本發明之結合蛋白質調節(尤其，抑制)RGM與例如再生蛋白及BMP(如BMP-2及BMP-4)之其受體之至少一個結合的能力。
舉例而言，該結合蛋白質調節(尤其減弱且較佳抑制)以下相互作用中之至少一種：人類RGM A與人類BMP-4之結合，hRGM A與人類再生蛋白之結合，hRGM C與人類再生蛋白之結合，人類RGM A與人類BMP-2之結合。
如本文中所揭示之具有功能特徵之不同組合且因此展示不同功能概況的結合蛋白質亦在本發明之範疇內。該等概況之非限制性實例列於下表中：
舉例而言，如本發明提供之抗體5F9及本文中所述之其衍生物符合概況1。
舉例而言，如本發明提供之抗體8D1及如本文中所揭示之其衍生物符合概況2。
詳言之，本發明之結合蛋白質能夠抑制RGM、尤其RGM A之至少一種生物活性，其中該RGM A係選自人類、獼猴、大鼠、雞、青蛙及魚。
根據另一實施例，本發明之結合蛋白質具有一或多個以下動力學特徵：
(a)如由表面電漿共振所量測，該標靶之締合速率常數(kon)係選自由以下各值組成之群：至少約102 M-1s-1、至少約103 M-1s-1、至少約104 M-1s-1、至少約105 M-1s-1、至少約106 M-1s-1及至少約107 M-1s-1。
(b)如由表面電漿共振所量測，該標靶之解離速率常數(koff)係選自由以下各值組成之群：至多約10-2 s-1、至多約10-3 s-1、至多約10-4 s-1、至多約10-5 s-1及至多約10-6 s-1；或
(c)該標靶之解離常數(KD)係選自由以下各值組成之群：至多約10-7 M、至多約10-8 M、至多約10-9 M、至多約10-10 M、至多約10-11 M、至多約10-12 M及至多10-13 M。
根據另一態樣，本發明提供一種包含上述結合蛋白質之抗體構築體，該抗體構築體進一步包含連接子多肽或免疫球蛋白恆定結構域。
本發明之該抗體構築體或結合蛋白質可選自由以下各物組成之群：免疫球蛋白分子、單株抗體、嵌合抗體、CDR移植抗體、人類化抗體、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、二硫化物連接之Fv、scFv、單結構域抗體、雙功能抗體、多特異性抗體、雙特異性抗體、雙可變結構域免疫球蛋白及雙特異性抗體。
在根據本發明之抗體構築體中，該結合蛋白質包含選自由以下各物組成之群之重鏈免疫球蛋白恆定結構域：人類IgM恆定結構域，人類IgG1恆定結構域，人類IgG2恆定結構域，人類IgG3恆定結構域，人類IgG4恆定結構域，人類IgE恆定結構域，人類IgD恆定結構域，人類IgA1恆定結構域，人類IgA2恆定結構域，人類IgY恆定結構域，及相應突變恆定結構域。
詳言之，根據本發明之抗體構築體包含具有選自由SEQ ID NO：11、12、13及14組成之群之胺基酸序列的免疫球蛋白恆定結構域。
根據另一態樣，本發明提供一種包含本文中所述之抗體構築體之抗體接合物，該抗體接合物進一步包含選自由以下各物組成之群之藥劑：免疫黏附分子、顯像劑(imaging agent)、治療劑及細胞毒性 劑，該藥劑之每一個均係接合於(例如共價結合於)該結合蛋白質。
舉例而言，該藥劑為選自由以下各物組成之群之顯像劑：放射性標記、酶、螢光標記、發光標記、生物發光標記、磁標記及生物素。詳言之，該顯像劑為選自由以下各物組成之群之放射性標記：3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho及153Sm。
舉例而言，該藥劑為選自由以下各物組成之群之治療劑或細胞毒性劑：抗代謝物、烷化劑、抗生素、生長因子、細胞激素、抗血管生成劑、抗有絲分裂劑、蒽環黴素、毒素及細胞凋亡劑。
根據另一實施例，如本文中所述之本發明之該結合蛋白質具有人類糖基化模式。
此外，根據本發明之結合蛋白質、抗體構築體及抗體接合物可以較佳保留生物活性之晶體(結晶形式)存在。
詳言之，該晶體為無載劑醫藥控釋晶體。鑒於該結晶形式，結合蛋白質、抗體構築體或抗體接合物可具有比相應可溶性對應物高之活體內半衰期。
在本發明之另一態樣中提供一種編碼如本文中所述之結合蛋白質胺基酸序列、抗體構築體胺基酸序列及抗體接合物胺基酸序列之經分離核酸。
本發明亦係關於一種包含如本文中所述之經分離核酸之載體。詳言之，載體係選自由pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV及pBJ組成之群。
本發明亦係關於一種包含該載體之宿主細胞。詳言之，該宿主細胞為原核生物細胞，例如大腸桿菌；或真核生物細胞，且可選自由原生生物細胞、動物細胞、植物細胞及真菌細胞組成之群。詳言之，該真核生物細胞為選自由哺乳動物細胞、禽類細胞及昆蟲細胞組成之群之動物細胞。該宿主細胞較佳選自HEK細胞、CHO細胞、COS細胞 及酵母細胞。酵母細胞可為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)且該昆蟲細胞可為Sf9細胞。
本發明亦提供一種產生能夠結合RGM之蛋白質之方法，該方法包含在足以產生能夠結合RGM之結合蛋白質之條件下在培養基中培養如本文中所定義之宿主細胞。
本發明亦係關於一種根據該方法所產生之蛋白質。
本發明亦提供一種釋放結合蛋白質之組合物，該組合物包含：(a)調配物，其中該調配物包含如本文中所定義之結晶產物蛋白質及成分；及(b)至少一種聚合載劑。
該聚合載劑可為選自由以下各物組成之群中之一或多者之聚合物：聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(胺基酸)、聚(酸酐)、聚(縮肽)、聚(酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)或PLGA、聚(b-羥基丁酸酯)、聚(己內酯)、聚(二氧雜環己酮)；聚(乙二醇)、聚((羥基丙基)甲基丙烯醯胺)、聚[(有機)偶磷氮]、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡咯啶酮)、順丁烯二酸酐-烷基乙烯基醚共聚物、氧化異丙烯多元醇類(pluronic polyol)、白蛋白、海藻酸酯、纖維素及纖維素衍生物、膠原蛋白、血纖蛋白、明膠、玻尿酸、寡醣、甘胺基聚糖、硫酸化多醣、其摻合物及共聚物。
該成分可選自由以下各物組成之群：白蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇、明膠、羥基丙基-β-環糊精、甲氧基聚乙二醇及聚乙二醇。
根據另一態樣，本發明提供一種治療哺乳動物之方法，其包含向哺乳動物投與有效量之如本文中所定義之組合物的步驟。
根據另一態樣，本發明提供一種醫藥組合物，其包含產物(尤其如上文所述之結合蛋白質、構築體或接合物)及醫藥學上可接受之載劑。
該醫藥學上可接受之載劑可充當適用於增加該結合蛋白質之吸收或分散之佐劑。
舉例而言，該佐劑為玻尿酸酶。
根據另一實施例，該醫藥進一步包含至少一種治療因RGM活性而受害之病症之其他治療劑。舉例而言，該藥劑係選自由以下各物組成之群：治療劑、顯像劑、細胞毒性劑、血管生成抑制劑；激酶抑制劑；共刺激分子阻斷劑；黏附分子阻斷劑；抗細胞激素抗體或其功能片段；甲胺喋呤(methotrexate)；環孢素(cyclosporin)；雷帕黴素(rapamycin)；FK506；可偵測標記或報導子(reporter)；TNF拮抗劑；抗風濕藥；肌肉鬆弛劑、麻醉劑、非類固醇消炎藥(NSAID)、止痛劑、麻醉劑、鎮靜劑、局部麻醉劑、神經肌肉阻斷劑、抗細菌劑、抗牛皮癬藥、皮質類固醇、促蛋白合成類固醇、促紅血球生成素、免疫法、免疫球蛋白、免疫抑制劑、生長激素、激素替代藥物、放射性醫藥、抗抑鬱劑、抗精神病藥、興奮劑、哮喘藥物、β激動劑、吸入性類固醇、腎上腺素或類似物、細胞激素及細胞激素拮抗劑。
本發明亦係關於一種降低人類RGM A活性之方法，其包含使人類RGM A與至少一種產物(尤其如上文所述之結合蛋白質、構築體或接合物)接觸以使至少一種人類RGM A活性降低。
本發明亦係關於一種降低有需要之個體體內hRGM A與再生蛋白受體之結合的方法，其包含向個體投與本發明之產物(尤其如上文所述之結合蛋白質、構築體或接合物)之步驟。
本發明亦係關於一種降低有需要之個體體內hRGM A與骨形態發生蛋白-2及/或骨形態發生蛋白-4(BMP-2及BMP-4)之結合的方法，其包含向個體投與本發明之產物(尤其如上文所述之結合蛋白質、構築體或接合物)之步驟。
本發明亦係關於一種治療個體之與RGM A活性相關之病症的方 法，其包含投與單獨或與其他治療劑組合之本發明之產物(尤其如上文所述之結合蛋白質、構築體或接合物)的步驟。
本發明亦係關於一種降低患有因RGM活性而受害之病症之個體的RGM A活性的方法，其包含向個體投與單獨或與其他治療劑組合之本發明之產物(尤其如上文所述之結合蛋白質、構築體或接合物)。
該病症較佳包含選自包含以下疾病之群之神經疾病：肌萎縮側索硬化、臂叢神經損傷、包括外傷性腦損傷之腦損傷、大腦性麻痹、格林-巴利疾病(Guillain Barre)、腦白質營養不良、多發性硬化、脊髓灰質炎後遺症(Post Polio)、脊椎裂、脊髓損傷、脊髓性肌萎縮(Spinal Muscle Atrophy)、脊椎腫瘤、中風、橫貫性脊髓炎(Transverse Myelitis)；癡呆、老年癡呆、輕度認知損傷、阿茲海默氏症相關性癡呆、亨廷頓舞蹈病、遲發性運動障礙、運動過度、躁狂症、帕金森氏病(Morbus Parkinson)、司迪爾-理查症候群(steel-Richard syndrome)、唐氏症候群(Down's syndrome)、重症肌無力、神經外傷、血管澱粉樣變性、出現澱粉樣變性之腦出血I、腦發炎、急性精神混亂病症、肌萎縮側索硬化、青光眼及阿茲海默氏病。
本發明之其他特定態樣描述如下：一種經分離結合蛋白質，其與hRGM A蛋白質之至少一個抗原決定基特異性相互作用；該經分離蛋白質為單株中和抗體或其抗原結合片段；該抗原結合片段包含VH及VL結構域；該中和抗體減弱hRGM A與其受體結合之能力；該中和抗體能夠抑制hRGM A生物活性；該抗體識別選自人類、獼猴、大鼠、雞、青蛙及魚之RGM A受體；該抗體識別與胺基酸序列SEQ ID NO：2共有90%同源性之RGM A 蛋白質；在該抗體中，該RGM A蛋白質係由與核酸序列SEQ ID NO：1共有90%同源性之核酸編碼；該抗體與包含包括SEQ ID NO：9或34之序列之重鏈可變區(VH區)或該VH區之視情況進一步突變之人類化形式的序列具有至少90%之胺基酸序列一致性；該抗體與包含包括SEQ ID NO：10之序列之輕鏈可變區(VL區)或該VL區之視情況進一步突變之人類化形式的序列具有至少90%之胺基酸序列一致性；該抗體與hRGM A結合，其中該抗體經糖基化；在該抗體或抗原結合片段中，該抗體或抗原結合片段為小鼠抗體、人類化抗體、完全人類抗體、嵌合抗體、人類化抗體之抗原結合片段或嵌合抗體之抗原結合片段；在該抗體或抗原結合片段中，該抗體或抗原結合片段為選自由Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段及Fv片段組成之群之抗原結合片段；該單株抗體與hRGM A之至少一個抗原決定基特異性結合，其中該單株抗體為由如本文中所述之融合瘤細胞株分泌之單株抗體；在該單株抗體中，該結合導致hRGM A與其受體之相互作用失活；該融合瘤細胞株產生與hRGM A之至少一個抗原決定基特異性結合之單株抗體；在該融合瘤細胞株中，該融合瘤係選自由人類、小鼠、大鼠、綿羊、豬、牛、山羊及馬融合瘤組成之群；在該單株抗體中，該結合導致hRGM A失活；該融合瘤細胞株產生與hRGM A之至少一個抗原決定基特異性結合之單株抗體； 在該融合瘤細胞株中，該融合瘤係選自由人類、小鼠、大鼠、綿羊、豬、牛、山羊及馬融合瘤組成之群；該單株中和抗體或其抗原結合片段具有至少一個選自由以下特徵組成之群之特徵：a)以nM範圍內或更低之親和力與哺乳動物RGM A結合；b)在神經突外生長檢定中以μM、nM或更低之功效功能性拮抗活體外RGM A活性；c)在視神經壓傷模型中活體內誘導萌發；d)在脊髓損傷模型中活體內誘導萌發；e)藉由增強損傷神經纖維再生生長來減輕活體內實驗性脊髓損傷；或f)藉由促進突觸形成來減輕活體內實驗性脊髓損傷；一種經分離核酸，其編碼該單株中和抗體或抗原結合片段；一種載體，其包含該經分離核酸；該載體係選自由pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV、pHybE及pBJ組成之群；一種宿主細胞，其經該載體轉型，其中該宿主細胞係選自由原生生物細胞、動物細胞、植物細胞及真菌細胞組成之群；在該宿主細胞中，該動物細胞為選自包含HEK293、CHO及COS之群之哺乳動物細胞；一種宿主細胞，其經根據請求項24之載體轉型，其中該宿主細胞為真核生物細胞；一種產生結合hRGM A之結合蛋白質之方法，其包含在足以產生結合hRGM A之結合蛋白質之條件下在培養基中培養宿主細胞；一種醫藥組合物，其包含該單株抗體或抗原結合部分及醫藥學上可接受之載劑； 一種降低有需要之個體之hRGM A與再生蛋白受體之結合的方法，其包含向個體投與該抗體之步驟；一種降低有需要之個體之hRGM A與骨形態發生蛋白-2及骨形態發生蛋白-4(BMP-2及BMP-4)之結合的方法，其包含向個體投與該抗體之步驟；一種治療個體之與RGM A活性相關之病症的方法，其包含投與單獨或與其他治療劑組合之該抗體之步驟；一種降低患有因RGM活性而受害之病症之個體的RGM A活性之方法，其包含向個體投與單獨或與其他治療劑組合之該抗體；該抗體包含至少一個包含選自SEQ ID NO：35、36、37、38、39、40、41、42及43之胺基酸序列之VH區；該抗體包含至少一個包含選自SEQ ID NO：44、45及46之胺基酸序列之VL區；該抗體另外在VH或VL序列中經1至5個突變修飾；在該抗體中，該等突變係選自架構回復突變以及維尼爾及VH/VL界面殘基之突變。
如本文中所揭示之對SEQ ID NO：34之任何教示或提及皆類似地適用於SEQ ID NO：9。
圖1A繪示在ELISA檢定中單株抗體與hRGM A之結合。
圖1B描繪單株抗體與於HEK 293細胞中表現之hRGM A之結合。
圖1C描繪單株抗體與於HEK 293細胞中表現之大鼠RGM A之結合。
圖2繪示全長RGM A與再生蛋白之結合。MAB 5F9抑制偶聯fc之全長hRGM A與再生蛋白之結合。
圖3描繪全長RGM A與BMP-4之結合。MAB 5F9抑制偶聯fc之全 長hRGM A片段(47-422)與BMP-4之結合。
圖4描繪RGM A片段0與BMP-4之結合。MAB 5F9抑制偶聯fc之hRGM A片段0(47-168)與BMP-4之結合。
圖5繪示全長RGM A與BMP-2之結合。MAB 5F9抑制偶聯fc之全長hRGM A片段(47-222)與BMP-2之結合。
圖6為繪示在NTera細胞神經突外生長檢定中RGM A片段之mAb5F9中和作用的顯微照片組合。MAB 5F9在利用人類Ntera聚集體之神經突生長檢定中中和接合fc之有效hRGM A抑制劑片段之外生長抑制活性。A：對照培養物，Ntera神經元於層黏連蛋白上之生長，B：於層黏連蛋白-hRGM A片段(47-168)受質上生長，C-E：在0.1μg/ml MAB 5F9(C)、1μg/ml MAB 5F9(D)、10μg/ml MAB5F9(E)存在下於層黏連蛋白-hRGM A片段(47-168)受質上生長。
圖7繪示NTera 2檢定結果之定量分析。MAB 5F9在利用人類Ntera聚集體之神經突生長檢定中劑量依賴性中和接合fc之有效hRGM A抑制劑片段(片段0，47-168)之外生長抑制活性。
圖8繪示SH-SY5Y條帶檢定之定量分析。MAB 5F9中和條帶膜層(stripe membrane carpet)中由人類SH-SY5Y神經元細胞之全長人類RGM A組成之條帶所誘導的排斥。在不存在MAB 5F9之情況下(A)或在存在低MAB濃度之情況下，SH-SY5Y神經元偏好避開RGM A條帶。藉由增加MAB 5F9之濃度(B至D)可逆轉該特性。在最高MAB濃度(10μg/ml)(E)下，SH-SYSY神經元對RGM A條帶展示比對膠原蛋白I條帶強烈之偏好。
圖9概述mAB 5F9及8D1結合特徵之定量分析。在hRGM A-再生蛋白、hRGM A-BMP-2及hRGM A-BMP-4結合檢定中評估不同濃度之MAB 5F9及8D1。
圖10繪示在SH-SY5Y趨化性檢定中針對人類化5F9抗體 (h5F9.21、h5F9.23、h5F9.25)之hRGM A化學排斥活性的中和活性。
圖11繪示在視神經損傷之動物模型中局部施用5F9之活體內神經再生活性。在視神經壓傷之大鼠動物模型中，局部施用MAB 5F9中和RGM A且刺激受損害之視神經軸突之再生生長。與不結合大鼠RGM A之對照MAB 8D1(B)相比，在5F9治療之動物(A)中，許多GAP-43陽性纖維延伸超出壓傷部位。
圖12A及圖12B繪示在視神經損傷之動物模型中局部施用5F9之定量分析。(A)5F9顯著增加再生GAP-43陽性纖維之數目，但對照MAB 8D1則不然。在經5F9治療之動物中在距離200μm、400μm及600μm處觀察到明顯較多之纖維(p<0.05)，且在1200μm處，僅在5F9治療之動物中發現纖維，而在對照動物中未發現。(B)與對照抗體8D1及媒劑對照PBS相比，5F9顯著增加視神經病變部位處之GAP-43陽性面積。使用Axiovision軟體(Zeiss)量測再生生長之面積(GAP-43陽性面積)。
圖13繪示在視神經損傷之動物模型中全身性施用5F9之活體內神經再生活性。在第0天及第21天時分別用2mg/kg及10mg/kg 5F9治療動物。經腹膜內或靜脈內給予抗體或媒劑。合成大鼠視神經之影像。與經PBS治療之對照動物(B)相比，在5F9治療之動物(A)中，許多GAP-43陽性纖維延伸超出壓傷部位。壓傷部位位於左側邊緣，且用GAP-43之抗體使再生纖維染色。在5F9治療之動物的視神經之上輪緣及下輪緣處觀察到許多纖維，但在PBS動物中未觀察到。
圖14A及圖14B繪示在視神經損傷之動物模型中全身性施用5F9之定量分析。
圖15繪示在視神經損傷之動物模型中全身性施用5F9之活體內髓鞘再形成活性。在第0天及第21天時分別用2mg/kg及10mg/kg 5F9治療動物。經腹膜內或靜脈內給予抗體或媒劑。合成大鼠視神經之影像。使用針對髓鞘標記物髓鞘鹼性蛋白MBP之抗體觀察髓鞘形成。壓 傷部位位於複合神經中間且在媒劑治療之對照動物(A及B)中無該區域。在5F9治療之動物(C及D)中，在視神經之中間區域(壓傷中心)觀察到許多MBP陽性結構。
圖16繪示在視神經損傷之動物模型中全身性施用5F9對髓鞘再形成之定量作用。
本發明描述RGM A結合蛋白質，更詳言之單株RGM A抗體，尤其人類化單株RGM A抗體或其結合RGM A之抗原結合部分。本申請案之各種態樣係關於抗體及抗體片段及其醫藥組合物，以及製備該等抗體及片段之核酸、重組表現載體及宿主細胞。本發明亦涵蓋使用本申請案之抗體偵測人類RGM A、活體內或活體外中和人類RGM及/或人類RGM A活性及調控基因表現之方法。
1.一般定義
除非本文中另作定義，否則所使用之與本發明相關之科技術語應具有一般熟習此項技術者通常所理解之含義。術語之含義及範疇應清楚，然而，在存在任何隱含歧義之情況下，本文中所提供之定義優先於任何詞典或非固有定義。另外，除非上下文另有需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。在本申請案中，除非另作說明，否則使用「或」意謂「及/或」。此外，使用術語「包括(including)」及其他形式(諸如「包括(includes)」及「包括(included)」)並不具有限制性。又，除非另外特別說明，否則諸如「元件」或「組分」之術語涵蓋包含一個單元之元件及組分及包含一個以上亞單元之元件及組分。
一般而言，所使用之與本文所述之細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學以及蛋白質及核酸化學及雜交有關之命名法及其技術為此項技術中所熟知且常用之命名法及技術。除非另 作指示，否則本發明之方法及技術通常係根據此項技術中所熟知之習知方法且如本說明書通篇所引用及論述之各種綜合性參考文獻及更具體之參考文獻所述執行。酶促反應及純化技術係根據製造商之說明書如此項技術中通常所實現或如本文中所述執行。所使用之與本文中所述之分析化學、合成有機化學及醫藥化學有關之命名法及其實驗室程序與技術為此項技術中所熟知且常用之命名法及程序與技術。化學合成、化學分析、醫藥製備、調配及傳遞以及患者之治療係使用標準技術。
本發明可較容易地理解，所選擇之術語定義如下。
如本文中所使用之術語「多肽」係指胺基酸之任何聚合鏈。術語「肽」及「蛋白質」可與術語多肽互換使用且亦指胺基酸之聚合鏈。術語「多肽」涵蓋天然或人工蛋白質、蛋白質片段及蛋白質序列之多肽類似物。多肽可為單體或聚合體。
術語「經分離蛋白質」或「經分離多肽」為由於其衍生起源或來源而不與其天然狀態中伴隨其之天然締合組分締合；大體上不含來自同一物種之其他蛋白質；由不同物種之細胞表現；或自然界中不存在之蛋白質或多肽。因此，化學合成或在不同於其天然起源之細胞之細胞系統中合成之多肽將與其天然締合組分「分離」。使用此項技術中熟知之蛋白質純化技術藉由分離亦可使蛋白質大體上不含天然締合組分。
如本文中所使用之術語「回收」係指(例如)使用此項技術中熟知之蛋白質純化技術藉由分離使諸如多肽之化學物質大體上不含天然締合組分之過程。
如本文中所使用之術語「人類RGM A」(本文中縮寫為hRGM A)係指具有450個胺基酸之糖基磷脂醯肌醇(gpi)錨定糖蛋白，其最初描述為局部解剖之突起(topographic projection)發育期間神經突生長排斥 劑或神經突生長抑制劑(Stahl等人，Neuron 5：735-43,1990；Mueller,Molecular Basis of Axon Growth and Nerve Pattern Formation,H.Fujisawa編，Japan Scientific Societies Press,215-229,1997)。rgm基因家族涵蓋三個不同基因，其中兩個rgm a及b於哺乳動物CNS中表現，而第三個成員rgm c於周圍表現(Mueller等人，Philos.Trans.R.Soc.Lond.B Biol.Sci.361：1513-29,2006)，其中其在鐵代謝中發揮重要作用。人類RGM蛋白質具有43%-50%之序列一致性；人類與大鼠RGM A之胺基酸同源性為89%。人類RGM蛋白質與任何其他已知蛋白質不共有明顯的序列同源性。其為含有RGD區之富脯胺酸蛋白質且與溫韋伯氏因子(Von-Willebrand Factor)結構域具有結構同源性且在N-末端胺基酸168處經未知蛋白酶裂解產生功能活性蛋白質(Mueller等人，Philos.Trans.R.Soc.Lond.B Biol.Sci.361：1513-29,2006)。
活體外RGM A藉由與已鑑別為RGM受體之再生蛋白結合而以皮莫耳濃度抑制神經突外生長(Rajagopalan等人，Nat Cell Biol.：6(8),756-62,2004)。再生蛋白最初描述為神經突起誘向因子(netrin)結合蛋白質(Keino-Masu等人，Cell,87(2)：175-85,1996)，但其對神經突起誘向因子之親和力(Kd為2nM)比對RGM之親和力(Kd為0.2nM)低一個數量級(Rajagopalan等人，Nat Cell Biol.：6(8),756-62,2004)。此為重要研究結果，因為已報導神經突起誘向因子-1與再生蛋白或其密切相關之受體DCC(結腸直腸癌中缺失)之結合會刺激而非抑制神經突生長(Braisted等人，J.Neurosci.20：5792-801,2000)。
除使RGM A與再生蛋白結合及誘導神經突生長抑制外，RGM A或B與骨形態發生蛋白BMP-2及BMP-4之結合亦可代表成功神經再生及功能恢復之另一障礙(Mueller等人，Philos.Trans.R.Soc.Lond.B Biol.Sci.361：1513-29,2006)。已報導該兩類蛋白質(再生蛋白及BMP)經由兩種完全不同且獨立的信號轉導途徑轉導RGM A之神經突 生長抑制信號。雖然該等BMP蛋白質之表現在成人CNS之大部分區域中通常相對較低，但已報導一些BMP(例如BMP-2、BMP-6、BMP-7)之表現及累積將應答損傷及傷害而快速增加(Lai等人，Neuroreport 8：2691-94,1997；Martinez等人，Brain Res.894：1-11,2001；Hall及Miller,J.Neurosci.Res.76：1-8,2004；Setoguchi等人，Exp.Neurol.189：33-44,2004)。另外，在多發性硬化模型(實驗性自體免疫腦脊髓炎(EAE)模型)中，BMP-4、BMP-6及BMP-7在小鼠脊髓中上調(Ara等人，J.Neurosci.Res.86：125-35,2008)。已報導BMP-2藉由與細胞表面RGM A、BMP-受體I及II結合且藉由直接活化LIM激酶來抑制神經突生長(Matsuura等人，Biochem Biophys Res Commun.,360：868-73,2007)且因此預期阻斷RGM A-BMP-2相互作用將進一步增加CNS損傷後之功能恢復。
如以上所提及，脊椎損傷之大鼠及腦損傷之人類展示細胞RGM在損傷部位之大量累積且大鼠脊椎病變部位RGM A之染色圖案與人類中之全RGM抗體染色非常類似，表明人類中全RGM染色之大部分與RGM A定位而非RGM B定位相關(Schwab等人，Arch.Neurol.62：1561-8,2005a；Schwab等人，Eur.J.Neurosci.21：1569-76,2005b；Hata等人，J.Cell Biol.173：47-58,2006)。在健康人類腦中，在白質纖維、寡樹突神經膠質細胞、少數神經元之核周體、一些血管平滑肌及少數內皮細胞上偵測到全RGM染色(RGM A及B免疫反應性)。未觀察到星形細胞染色。成年健康人類腦中之RGM染色圖案與成年大鼠脊髓中觀察到之染色圖案非常類似(Schwab等人，Eur.J.Neurosci.21：1569-76,2005b；Hata等人，J.Cell Biol.173：47-58,2006)。
基於RGM A在腦及脊髓損傷之病變部位處之累積且歸因於其細胞神經突生長抑制活性，預期該蛋白質將發揮神經突生長抑制活性，且結合人類RGM A之至少一個抗原決定基之抗體或其抗原結合片段對 其之中和作用可使得損傷神經纖維再生長增強且使以神經纖維損傷及RGM累積為特徵之適應症之功能恢復增強。
除非另作說明，否則術語「RGM A」亦涵蓋自其他物種(例如齧齒動物，如小鼠或大鼠)分離或獲得之RGM A分子；尤其大鼠源性分子在本文中稱為「大鼠RGM A。
如本文中所使用之「生物活性」係指如本文中所定義之RGM A之所有固有生物性質。
如本文中所使用，提及抗體、蛋白質或肽與第二化學物質之相互作用時之術語「特異性結合」意謂該相互作用係視該化學物質上特定結構(例如，如下文所定義之「抗原決定子」或「抗原決定基」)之存在而定；例如，抗體識別且結合特定蛋白質結構而非一般蛋白質。若抗體對抗原決定基「A」具有特異性，則在含經標記「A」及該抗體之反應中含抗原決定基A(或未經標記之游離A)之分子的存在將減少結合該抗體之經標記A的量。
如本文中所使用之術語「抗體」泛指包含四個多肽鏈(即兩個重(H)鏈及兩個輕(L)鏈)之任何免疫球蛋白(Ig)分子或其保留Ig分子之必需抗原決定基結合特徵之任何功能片段、突變體、變異體或衍生物。 該等突變體、變異體或衍生物抗體型式為此項技術中所知。其非限制性實施例論述如下。若抗體能夠與分子特異性反應，從而使分子與抗體結合，則認為其「能夠結合」分子。
如本文中所使用之「單株抗體」意欲指與含有不同抗體之混合物之「多株」抗體製劑相對，共有共同重鏈及共同輕鏈胺基酸序列之抗體分子製劑。單株抗體可由如噬菌體、細菌、酵母或核糖體呈現之若干新穎技術以及經典方法產生，例如融合瘤源性抗體(例如，由藉由諸如標準科勒及米爾斯坦(Kohler and Milstein)融合瘤方法((1975)Nature 256：495-497)之融合瘤技術製備之融合瘤分泌的抗體)。
在全長抗體中，每一重鏈包含重鏈可變區(本文中縮寫為HCVR或VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個結構域，即CH1、CH2及CH3。每一輕鏈包含輕鏈可變區(本文中縮寫為LCVR或VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個結構域CL。VH及VL區可進一步細分為散布有稱為架構區(FR)之較為保守區域的稱為互補決定區(CDR)之高變區。每一VH及VL係由三個CDR及四個FR構成，自胺基末端至羧基末端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可為任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或亞類。
如本文中所使用，術語抗體之「抗原結合部分」或「抗原結合片段」(或簡稱為「抗體部分」或「抗體片段」)係指保留與抗原(例如hRGM A)特異性結合之能力的抗體之一或多個片段。已展示抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段來執行。該等抗體實施例亦可為雙特異性(bispecific)、雙重特異性(dual specific)或多特異性型式；其與兩個或兩個以上不同抗原特異性結合。術語抗體之「抗原結合部分」內所涵蓋之結合片段的實例包括：(i)Fab片段，一種由VL、VH、CL及 CH1結構域組成之單價片段；(ii)F(ab')2片段，一種包含經由位於鉸鏈區之二硫橋連接之兩個Fab片段的二價片段；(iii)Fd片段，其係由VH及CH1結構域組成；(iv)Fv片段，其係由抗體之單一臂之VL及VH結構域組成；(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546，Winter等人，PCT公開案WO 90/05144 A1，其以引用之方式併入本文中)，其包含單一可變結構域；及(vi)經分離互補決定區(CDR)。此外，雖然Fv片段之兩個結構域VL和VH係由獨立基因編碼，但其可使用重組方法經由能將其製成單一蛋白質鏈之合成連接子連結，在該單一蛋白質鏈中VL與VH區配對形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv)；例如參見Bird等人，(1988)Science 242：423-426；及Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。該等單鏈抗體亦意欲涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」內。亦涵蓋單鏈抗體之其他形式，諸如雙功能抗體。雙功能抗體為二價雙特異性抗體，其中VH及VL結構域係於單一多肽鏈上表現，但使用過短連接子以致在同一鏈上之該兩個結構域之間不能配對，從而迫使該等結構域與另一鏈之互補結構域配對且產生兩個抗原結合位點(例如參見Holliger,P.，等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak,R.J.，等人，(1994)Structure 2：1121-1123)。該等抗體結合部分為此項技術中所知(Kontermann及Dubel編，Antibody Engineering(2001)Springer-Verlag.New York。第790頁(ISBN 3-540-41354-5))。
如本文中所使用之術語「抗體構築體」係指包含一或多個與連接多肽或免疫球蛋白恆定結構域連接之本發明之抗原結合部分的多肽。連接多肽包含兩個或兩個以上經肽鍵連結之胺基酸殘基且用於連接一或多個抗原結合部分。該等連接多肽為此項技術中所熟知(例如參見Holliger,P.，等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak,R.J.，等人，(1994)Structure 2：1121-1123)。免疫球蛋 白恆定結構域係指重鏈或輕鏈恆定結構域。人類IgG重鏈及輕鏈恆定結構域胺基酸序列為此項技術所知且呈示於表2中。
此外，抗體或其抗原結合部分可為藉由使抗體或抗體部分與一或多個其他蛋白質或肽共價或非共價締合所形成之較大免疫黏附分子的一部分。該等免疫黏附分子之實例包括使用抗生蛋白鏈菌素核心區製備四聚體scFv分子(Kipriyanov,S.M.等人，(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6：93-101)及使用半胱胺酸殘基、標記肽及C-末端聚組胺酸標籤製備經生物素標記之二價scFv分子(Kipriyanov,S.M.等 人，(1994)Mol.Immunol. 31：1047-1058)。可使用諸如全抗體之分別木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化之習知技術由全抗體製備諸如Fab及F(ab')2片段之抗體部分。此外，如本文中所述，可使用標準重組DNA技術獲得抗體、抗體部分及免疫黏附分子。
如本文中所使用之「經分離抗體」意欲指大體上不含具有不同抗原特異性之其他抗體的抗體(例如，特異性結合hRGM A之經分離抗體大體上不含特異性結合除hRGM A以外之抗原的抗體)。然而，特異性結合hRGM A之經分離抗體可與其他抗原(諸如來自其他物種之RGM A分子)具有交叉反應性(cross-reactivity)。此外，經分離抗體可大體上不含其他細胞物質及/或化學物質。
如本文中所使用之術語「人類抗體」意欲包括具有源自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區的抗體。本發明之人類抗體可(例如)在CDR中且尤其在CDR3中包括不由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如，藉由活體外隨機或位點特異性突變誘發或藉由活體內體細胞突變引入之突變)。然而，如本文中所使用之術語「人類抗體」不意欲包括源自另一哺乳動物物種(諸如小鼠)之生殖系之CDR序列已移植於人類架構序列上之抗體。
如本文中所使用之術語「重組人類抗體」意欲包括藉由重組方式製備、表現、產生或分離之所有人類抗體，諸如使用轉染至宿主細胞(下文進一步描述)中之重組表現載體表現之抗體、自重組組合人類抗體文庫分離之抗體(Hoogenboom H.R.,(1997)TIB Tech.15：62-70；Azzazy H.及Highsmith W.E.,(2002)Clin.Biochem.35：425-445；Gavilondo J.V.及Larrick J.W.(2002)BioTechniques 29：128-145；Hoogenboom H.及Chames P.(2000)Immunology Today 21：371-378)、自轉殖人類免疫球蛋白基因之動物(例如小鼠)分離之抗體(例如參見Taylor,L.D.等人，(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295；Kellermann S-A.及Green L.L.(2002)Current Opinion in Biotechnology 13：593-597；Little M.等人，(2000)Immunology Today 21：364-370)或由包括將人類免疫球蛋白基因序列與其他DNA序列拼接之任何其他方式製備、表現、產生或分離之抗體。該等重組人類抗體具有源自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區。然而，在某些實施例中，使該等重組人類抗體經受活體外突變誘發(或，當使用人類Ig序列之轉殖基因動物時，使其經受活體內體細胞突變誘發)且因此，重組抗體之VH及VL區之胺基酸序列為雖然源自人類生殖系VH及VL序列且與其相關但可能不天然存在於活體內人類抗體生殖系譜系中的序列。
術語「嵌合抗體」係指包含來自一種物種之重鏈及輕鏈可變區序列及來自另一物種之恆定區序列的抗體，例如具有與人類恆定區連接之鼠類重鏈及輕鏈可變區之抗體。嵌合抗體可經由重組分子生物學技術產生或可以物理方式接合在一起。
術語「CDR移植抗體」係指包含來自一種物種之重鏈及輕鏈可變區序列但其中VH及/或VL之一或多個CDR區之序列經另一物種之CDR序列置換的抗體，諸如具有鼠類重鏈及輕鏈可變區且其中一或多個鼠類CDR(例如CDR3)已經人類CDR序列置換之抗體。
術語「Kabat編號」、「Kabat定義」及「Kabat標記」在本文中可互換使用。此項技術認可之該等術語係指對比抗體或其抗原結合部分之重鏈及輕鏈可變區中之其他胺基酸殘基可變(亦即高變)的胺基酸殘基編號的系統(Kabat等人，(1971)Ann.NY Acad,Sci. 190：382-391及Kabat,E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH出版號：91-3242)。對於重鏈可變區，CDR1之高變區在胺基酸位置31至35範圍內，CDR2在胺基酸位置50至65範圍內，且CDR3在胺基酸位置95至102範圍內。對於輕鏈可變區，CDR1之高變區在胺基酸位置 24至34範圍內，CDR2在胺基酸位置50至56範圍內，且CDR3在胺基酸位置89至97範圍內。
如本文中所使用之術語「受體」及「受體抗體」係指提供或編碼至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或100%之一或多個架構區之胺基酸序列的抗體或核酸序列。在一些實施例中，術語「受體」係指提供或編碼恆定區之抗體胺基酸或核酸序列。在又一實施例中，術語「受體」係指提供或編碼一或多個架構區及恆定區之抗體胺基酸或核酸序列。在一特定實施例中，術語「受體」係指提供或編碼至少80%、佳至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或100%之一或多個架構區之胺基酸序列的人類抗體胺基酸或核酸序列。根據該實施例，受體可含有至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或至少10個不出現於人類抗體之一或多個特定位置之胺基酸殘基。受體架構區及/或受體恆定區可(例如)源自或獲自生殖系抗體基因、成熟抗體基因、功能抗體(例如，此項技術中熟知之抗體、處於開發中之抗體或市售抗體)。
如本文中所使用之術語「CDR」係指抗體可變序列內之互補決定區。重鏈及輕鏈可變區之每一者中存在三個CDR，每一可變區之該三個CDR指定為CDR1、CDR2及CDR3。如本文中所使用之術語「CDR組」係指存在於單一可變區中能夠結合抗原的三個CDR之群。該等CDR之確切邊界已根據不同系統不同地加以定義。Kabat所述之系統(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987)及(1991))不僅提供適用於抗體之任何可變區之明確殘基編號系統，且亦提供界定該三個CDR之確切殘基邊界。該等CDR可稱為Kabat CDR。Chothia及其同事(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917(1987)及Chothia等人，Nature 342：877-883(1989))發現Kabat CDR內之某些亞部分即使在胺基酸序列層 面上具有巨大多樣性，亦採用幾乎相同的肽主鏈構形。該等亞部分指定為L1、L2及L3或H1、H2及H3，其中「L」及「H」分別表示輕鏈區及重鏈區。該等區可稱為Chothia CDR，其具有與Kabat CDR重疊之邊界。界定與Kabat CDR重疊之CDR之其他邊界已由Padlan(FASEB J.9：133-139(1995))及MacCallum(J Mol Biol 262(5)：732-45(1996))描述。其他CDR邊界定義可能不嚴格遵循以上系統中之一個，但仍會與Kabat CDR重疊，即使根據特定殘基或殘基群或甚至整個CDR不顯著影響抗原結合之預測或實驗研究結果其可能縮短或延長。雖然本文中所用之方法可利用根據該等系統中之任一者所定義之CDR，但較佳實施例使用Kabat或Chothia定義之CDR。
如本文中所使用之術語「典型」殘基係指確定如由Chothia等人(J.Mol.Biol.196：901-907(1987)；Chothia等人，J.Mol.Biol.227：799(1992)，兩者係以引用之方式併入本文中)所定義之特定典型CDR結構之CDR或架構中的殘基。根據Chothia等人，許多抗體之CDR之重要部分即使在胺基酸序列層面上具有巨大多樣性，亦具有幾乎相同的肽主鏈構形。每一典型結構基本上指定一組使胺基酸殘基之鄰接區段形成環之肽主鏈扭轉角。
如本文中所使用之術語「供體」及「供體抗體」係指提供一或多個CDR之抗體。在一較佳實施例中，供體抗體為來自不同於獲得或得到架構區之抗體的物種之抗體。在人類化抗體之情況下，術語「供體抗體」係指提供一或多個CDR之非人類抗體。
如本文中所使用之術語「架構」或「架構序列」係指可變區減去CDR之剩餘序列。因為CDR序列之確切定義可由不同系統確定，所以架構序列之含義遵循相應的不同解釋。六個CDR(輕鏈之CDR-L1、-L2及-L3以及重鏈之CDR-H1、-H2及-H3)亦將輕鏈及重鏈上之架構區在每一鏈上分成四個亞區(FR1、FR2、FR3及FR4)，其中CDR1位於 FR1與FR2之間，CDR2位於FR2與FR3之間，且CDR3位於FR3與FR4之間。在不將特定亞區指定為FR1、FR2、FR3或FR4之情況下，架構區當以其他名稱提及時代表天然存在之單一免疫球蛋白鏈之可變區中之組合FR。如本文中所使用，FR代表四個亞區中之一個，且FRs代表構成架構區之四個亞區中之兩個或兩個以上亞區。
人類重鏈及輕鏈受體序列為此項技術中所知。在本發明之一實施例中，人類重鏈及輕鏈受體序列係選自表3及表4中描述之序列。該等表中陳述人類架構序列FR1至FR4之不同組合。
如本文中所使用，術語「生殖系抗體基因」或「基因片段」係指由尚未經歷產生基因重排及突變以表現特定免疫球蛋白之成熟過程之非淋巴細胞編碼的免疫球蛋白序列(例如參見Shapiro等人，Crit.Rev.Immunol.22(3)：183-200(2002)；Marchalonis等人，Adv Exp Med Biol.484：13-30(2001))。本發明之各實施例所提供之一個優點係基於如下認知：生殖系抗體基因比成熟抗體基因更可能保留物種中個體之必需胺基酸序列結構特徵，因此當用於治療該物種時，不太可能判別為來自外來來源。
如本文中所使用，術語「關鍵」殘基係指對抗體(尤其人類化抗體)之結合特異性及/或親和力具有較大影響的可變區內之某些殘基。 關鍵殘基包括(但不限於)以下一或多個殘基：鄰接CDR之殘基、潛在糖基化位點(可為N-或O-糖基化位點)、稀有殘基、能夠與抗原相互作用之殘基、能夠與CDR相互作用之殘基、典型殘基、重鏈可變區與輕鏈可變區之間的接觸殘基、維尼爾區域中之殘基及可變重鏈CDR1之Chothia定義與第一重鏈架構之Kabat定義之間重疊的區域中之殘基。
術語「人類化抗體」一般係指包含來自非人物種(例如小鼠)之重鏈及輕鏈可變區序列，但其中VH及/或VL序列之至少一部分已經改變而較為「擬似人類」(亦即，與人類生殖系可變序列較為類似)的抗體。一種類型之人類化抗體為CDR移植抗體，其中將人類CDR序列引入非人類VH及VL序列中以置換相應非人類CDR序列。
詳言之，如本文中所使用之術語「人類化抗體」為與所關注之抗原免疫特異性結合且包含大體上具有人類抗體之胺基酸序列之架構(FR)區及大體上具有非人類抗體之胺基酸序列之互補決定區(CDR)的抗體或其變異體、衍生物、類似物或片段。如本文中所使用，術語「大體上」在CDR之情況下係指CDR之胺基酸序列與非人類抗體CDR之胺基酸序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%或80%、較佳至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性。人類化抗體包含大體上全部至少一個且通常兩個可變結構域(Fab、Fab'、F(ab')2、FabC、Fv)，其中所有或大體上所有CDR區對應於非人類免疫球蛋白(亦即，供體抗體)之彼等CDR區且所有或大體上所有架構區為人類免疫球蛋白共同序列之彼等架構區。人類化抗體較佳亦包含免疫球蛋白恆定區(Fc)(通常為人類免疫球蛋白恆定區)之至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體含有輕鏈以及至少重鏈之可變結構域。抗體亦可包括重鏈之CH1、鉸鏈區、CH2、CH3及CH4區。在一些實施例中，人類化抗體僅含有人類化輕鏈。在一些實施例中，人類化抗體僅含有人類化重鏈。在特定實施例中，人類化抗體僅含有輕鏈 之人類化可變結構域及/或人類化重鏈。
人類化抗體可選自任何類別之免疫球蛋白，包括IgY、IgM、IgG、IgD、IgA及IgE及任何同型，包括(但不限於)IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。人類化抗體可包含一種以上類別或同型之序列，且特定恆定結構域可經選擇以使用此項技術中熟知之技術優化所需效應功能。
人類化抗體之架構區及CDR區不需要與親本序列精確對應，例如供體抗體CDR或一致架構可藉由取代、插入及/或缺失至少一個胺基酸殘基來突變誘發以致在該位點處之CDR或架構殘基不與供體抗體或一致架構對應。然而，在一較佳實施例中，該等突變不會為大範圍的。通常至少50%、55%、60%、65%、70%、75%或80%、較佳至少85%、更佳至少90%且最佳至少95%之人類化抗體殘基將與親本FR及CDR序列之殘基對應。如本文中所使用，術語「一致架構」係指一致免疫球蛋白序列中之架構區。如本文中所使用，術語「一致免疫球蛋白序列」係指由相關免疫球蛋白序列家族中最常見之胺基酸(或核苷酸)形成之序列(例如參見Winnaker,From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft,Weinheim,Germany 1987))。在免疫球蛋白家族中，共同序列中之每一位置係由該家族中在該位置處最常見之胺基酸佔據。若兩個胺基酸同等頻繁地出現，則共同序列中可包括任一個。
如本文中所使用，「維尼爾」區域係指如Foote及Winter所述之可調節CDR結構且微調與抗原之配合的架構殘基子集(1992,J.Mol.Biol.224：487-499，其係以引用之方式併入本文中)。維尼爾區域殘基形成CDR下方之層且可對CDR之結構及抗體親和力產生影響。
如本文中所使用之術語RGM與其受體中之一個之「結合的抑制」涵蓋部分(例如約20%、40%、60%、80%、85%、90%、95%或以上)或完全降低該受體結合活性。該「結合的抑制」可由此項技術中 可利用之任何合適方法、較佳由如本文中所例示之任何方法(例如基於ELISA之結合檢定)測定。
如本文中所使用，術語「中和」係指當結合蛋白質與標靶蛋白質特異性結合時，中和標靶蛋白質之生物活性。中和可為該結合蛋白質與標靶之不同方式之結合的結果。舉例而言，中和可由不影響受體與標靶分子之結合之標靶區中結合蛋白質的結合引起。或者，結合蛋白質之結合可導致受體與標靶之結合受到阻斷，該阻斷最終將中和標靶蛋白質活性。根據本發明，該等不同機制中之每一種均可發生。中和結合蛋白質較佳為中和抗體，其與hRGM A之結合引起對hRGM A之生物活性之中和。中和結合蛋白質較佳結合hRGM A且使hRGM A之生物活性降低至少約20%、40%、60%、80%、85%或以上。中和結合蛋白質對hRGM A之生物活性之中和可藉由量測此項技術中熟知之hRGM A生物活性之一或多個指標來評定。舉例而言，hRGM A之中和在Ntera神經元外生長檢定中逆轉抑制(參見下文實例3)。Ntera神經突生長檢定致力於神經突外生長之抑制。在不存在抑制性RGM A蛋白質或片段之情況下及在存在外生長刺激受質層黏連蛋白之情況下，神經元NTera聚集體展示外生長神經突之廣泛且緻密的網狀物。RGM A或RGM A片段抑制神經突外生長，從而使得神經突之長度及數目減少。功能阻斷性RGM A拮抗劑或如mAb 5F9之MAB在利用分化人類NTera神經元之聚集體之神經突生長檢定中中和人類RGM A蛋白質之有效接合fc之hRGM A輕鏈片段(胺基酸47-168)的神經突外生長抑制活性，從而使得神經突長度及數目急劇增加。
如本文中所使用之「中和單株抗體」意欲指抗體分子製劑，其在與特定抗原結合後能夠競爭且抑制該抗原之天然配位體之結合。在本申請案之一特定實施例中，本發明之中和抗體能夠與RGM A競爭與再生蛋白及/或BMP-2及/或BMP-4之結合，且阻止RGM A之生物活性 或功能。詳言之，本發明之中和抗體能夠與RGM A結合，且阻止與再生蛋白及/或BMP-2及/或BMP-4之結合，並且阻止RGM A之生物活性或功能。術語「活性」包括(例如)如以下實驗部分中所述之hRGM A-再生蛋白結合檢定、hRGM A-BMP-2結合檢定或hRGM A-BMP-4結合檢定中所測定的諸如抗體對抗原(例如，與RGM A抗原結合之抗hRGM A抗體)之結合特異性/親和力及/或抗體(例如，與hRGM A之結合抑制hRGM A之生物活性的抗hRGM A抗體)之中和效力的活性。
RGM A之生物活性可描述為調控細胞遷移。細胞遷移之一特定實例為神經突生長，該生長受RGM A蛋白質阻礙或抑制。另外，已展示RGM蛋白質調節BMP-蛋白質之活性。本文中公開之實例描述RGM蛋白質一方面對BMP途徑之協同增強活性及RGM蛋白質對BMP途徑之抑制活性，這對於鐵代謝之調控、骨及軟骨再生以及在CNS中對於髓鞘再形成及再生很重要。
術語「抗原決定基」或「抗原決定子」包括能夠與免疫球蛋白或T-細胞受體特異性結合之任何多肽決定子。在某些實施例中，抗原決定基決定子包括分子之化學活性表面基團(諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基)，且在某些實施例中，其可具有特定三維結構特徵及/或特定電荷特徵。抗原決定基為由抗體所結合之抗原之區域。在某些實施例中，當抗體在蛋白質及/或大分子之複雜混合物中優先識別其標靶抗原時，認為該抗體特異性結合抗原。
如本文中所使用之術語「表面電漿共振」係指允許藉由(例如)使用BIAcore系統(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden and Piscataway,NJ)偵測生物傳感器基質內蛋白質濃度之改變來分析即時生物特異性相互作用的光學現象。關於其他描述，請參見Jönsson,U.等人，(1993)Ann.Biol.Clin. 51：19-26；Jönsson,U.等人，(1991)Biotechniques 11：620-627；Johnsson,B.等人，(1995)J.Mol. Recognit. 8：125-131；及Johnnson,B.等人，(1991)Anal.Biochem. 198：268-277。
如本文中所使用之術語「kon」意欲指如此項技術所知之抗體與抗原締合形成抗體/抗原複合物之締合速率常數。
如本文中所使用之術語「koff」意欲指如此項技術所知之抗體自抗體/抗原複合物解離之解離速率常數。
如本文中所使用之術語「Kd」意欲指如此項技術所知之特定抗體-抗原相互作用之解離常數。
如本文中所使用之術語「經標記結合蛋白質」係指具有經併入以便提供結合蛋白質之鑑別之標記的蛋白質。標記較佳為可偵測標記物，例如經放射性標記之胺基酸之併入或與可由經標記抗生物素蛋白(例如含有可以光學或比色法偵測之螢光標記物或酶活性之抗生蛋白鏈菌素)偵測之具有生物素基部分之多肽連接。用於多肽之標記之實例包括(但不限於)以下各物：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、 14C、 35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm)；螢光標記(例如，FITC、若丹明(rhodamine)、鑭系金屬磷光體)、酶標記(例如，辣根過氧化物酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)；化學發光標記物；生物素基；由第二報導子識別之預定多肽抗原決定基(例如，白胺酸拉鏈對序列、二次抗體之結合位點、金屬結合結構域、抗原決定基標籤)；及諸如釓螯合物之磁化劑。
術語「抗體接合物」係指與諸如治療劑或細胞毒性劑之第二化學部分化學連接的諸如抗體之結合蛋白質。術語「藥劑」在本文中用於表示化合物、化合物之混合物、生物大分子或由生物材料製成之提取物。治療劑或細胞毒性劑較佳包括(但不限於)百日咳毒素(pertussis toxin)、紫杉醇(taxol)、細胞鬆弛素B(cytochalasin B)、短桿菌肽D(gramicidin D)、溴化乙錠、吐根素(emetine)、絲裂黴素 (mitomycin)、依託泊苷(etoposide)、特諾波賽(tenoposide)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、秋水仙鹼(colchicin)、阿黴素(doxorubicin)、道諾黴素(daunorubicin)、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神黴素(mithramycin)、放線菌素D(actinomycin D)、1-脫氫睪固酮、糖皮質激素、普魯卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)及嘌呤黴素以及其類似物或同系物。
如本文中所使用之術語「晶體」及「結晶」係指以晶體形式存在之抗體或其抗原結合部分。晶體為固態物質之一種形式，其不同於諸如非晶形固態或液晶態之其他形式。晶體係由原子、離子、分子(例如，諸如抗體之蛋白質)或分子組裝體(例如，抗原/抗體複合物)之規則的重複三維陣列構成。該等三維陣列係根據該領域中充分瞭解之特定數學關係排列。晶體中重複之基本單元或構建塊稱為不對稱單元。以符合已知之定義明確的晶體學對稱性之排列重複不對稱單元將提供晶體之「單位晶胞」。在所有三維中藉由正則變換重複單位晶胞將提供晶體。參見Giege,R.及Ducruix,A.Barrett,Crystallization of Nucleic Acids and Proteins,a Practical Approach，第2版，第20 1-16頁，Oxford University Press,New York,New York,(1999)。
如本文中所提及之術語「聚核苷酸」意謂兩個或兩個以上核苷酸(核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或者任一類核苷酸的經修飾形式)之聚合形式。該術語包括DNA之單鏈或雙鏈形式，但較佳為雙鏈DNA。
如本文中所使用之術語「經分離聚核苷酸」將意謂一種聚核苷酸(例如，基因組、cDNA或合成來源者，或其某種組合)，鑒於其來源，該「經分離聚核苷酸」不與在自然界中可發現「經分離聚核苷酸」之整個聚核苷酸或其一部分締合；操作性連接至在自然界中不與 其連接之聚核苷酸；或在自然界中不作為較大序列之部分存在。
如本文中所使用之術語「載體」意欲指一種能夠轉運已與其連接之另一核酸的核酸分子。一種類型之載體為「質體」，其係指可接合其他DNA區段之環狀雙鏈DNA環。另一種類型之載體為病毒載體，其中可將其他DNA區段接合至病毒基因組。某些載體能夠在引入該等載體之宿主細胞中自主複製(例如具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如，非游離型哺乳動物載體)可在引入宿主細胞之後整合至宿主細胞基因組中，且從而與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠引導其操作性連接之基因之表現。該等載體在本文中稱為「重組表現載體」(或簡稱為「表現載體」)。一般而言，適用於重組DNA技術中之表現載體通常呈質體形式。因為質體為載體之最常用形式，所以在本說明書中，「質體」與「載體」可互換使用。然而，本發明意欲包括起等效作用之諸如病毒載體(例如，複製缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)之該等其他表現載體形式。
術語「操作性連接」係指所述組分處於允許其按其預定方式作用之關係中的併接。控制序列「操作性連接」至編碼序列係以使編碼序列之表現在與控制序列相容之條件下實現的方式接合。「操作性連接」之序列包括與所關注之基因鄰接之表現控制序列以及反式作用或在一定距離處作用以控制所關注之基因的表現控制序列。如本文中所使用之術語「表現控制序列」係指實現其所接合之編碼序列之表現及加工所必需的聚核苷酸序列。表現控制序列包括適當轉錄起始、終止、啟動子及強化子序列；有效RNA加工信號，諸如拼接及聚腺苷酸化信號；使細胞質mRNA穩定之序列；提高轉譯效率之序列(亦即，Kozak共同序列)；增強蛋白質穩定性之序列；及必要時增加蛋白質分泌之序列。該等控制序列之性質視宿主生物體而不同；在原核生物 中，該等控制序列通常包括啟動子、核糖體結合位點及轉錄終止序列；在真核生物中，該等控制序列通常包括啟動子及轉錄終止序列。術語「控制序列」意欲包括存在對於表現及加工至關重要的組分，且亦可包括存在具有益處之其他組分，例如前導序列及融合搭配物序列。
如本文中所定義之「轉型」係指使外源DNA進入宿主細胞中之任何加工。轉型可使用此項技術熟知之各種方法在天然或人工條件下發生。轉型可憑藉將外來核酸序列插入原核生物或真核生物宿主細胞中之任何已知方法。該方法係根據所轉型之宿主細胞選擇且可包括(但不限於)病毒感染、電穿孔、脂質體轉染及粒子轟擊。該等「轉型」細胞包括所插入之DNA能夠作為自主複製質體或宿主染色體之部分複製的穩定轉型細胞。其亦包括在有限時間內瞬時表現所插入之DNA或RNA的細胞。
如本文中所使用之術語「重組宿主細胞」(或簡稱為「宿主細胞」)意欲指已引入外源DNA之細胞。應瞭解，該等術語不僅意欲指特定個體細胞，且亦指該細胞之子代。因為某些修飾可能因突變或環境影響而在繼代中發生，所以該子代實際上可能不與母細胞相同，但其仍包括在如本文中所使用之術語「宿主細胞」之範疇內。宿主細胞較佳包括選自生物王國之任一者之原核生物及真核生物細胞。較佳真核生物細胞包括原生生物、真菌、植物及動物細胞。宿主細胞最佳包括(但不限於)原核生物細胞株大腸桿菌；哺乳動物細胞株CHO、HEK 293及COS；昆蟲細胞株Sf9；及真菌細胞釀酒酵母。
重組DNA、寡核苷酸合成以及組織培養及轉型(例如，電穿孔、脂質體轉染)可使用標準技術。酶促反應及純化技術可根據製造商之說明書執行或者如此項技術中通常所實現或如本文中所述執行。上述技術及程序通常可根據此項技術中熟知之習知方法且如本說明書通篇 所引用及論述之各種綜合性參考文獻及更具體之參考文獻中所述執行。例如參見Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))，其以引用之方式併入本文中用於任何目的。
如此項技術所知及如本文中所使用之「轉殖基因生物體」係指具有含有轉殖基因之細胞之生物體，其中引入生物體(或生物體祖先)中之轉殖基因表現該生物體中天然不表現之多肽。「轉殖基因」為穩定且操作性整合至發育成轉殖基因生物體之細胞之基因組中，從而引導編碼基因產物於轉殖基因生物體之一或多種細胞類型或組織中之表現的DNA構築體。
術語「調控」與「調節」可互換使用，且如本文中所使用，其係指所關注之分子之活性(例如，hRGM A之生物活性)的改變或變化。調節可為所關注之分子之某一活性或功能的量值之增加或降低。分子之例示性活性及功能包括(但不限於)結合特徵、酶活性、細胞受體活化及信號轉導。
相應地，如本文中所使用之術語「調節劑」為能夠使所關注之分子之活性或功能(例如，hRGM A之生物活性)改變或變化的化合物。舉例而言，調節劑可引起分子之某一活性或功能之量值相比在不存在調節劑之情況下所觀察到之活性或功能之量值有所增加或減小。如本文中所使用之術語「激動劑」係指當與所關注之分子接觸時引起分子之某一活性或功能之量值相比在不存在激動劑的情況下所觀察到之活性或功能之量值有所增加的調節劑。所關注之特定激動劑可包括(但不限於)hRGM A多肽或與hRGM A結合之多肽、核酸、碳水化合物或任何其他分子。如本文中所使用之術語「拮抗劑」係指當與所關注之分子接觸時引起分子之某一活性或功能之量值相比在不存在拮抗劑的情況下所觀察到之活性或功能之量值有所降低的調節劑。例示性拮 抗劑包括(但不限於)蛋白質、肽、抗體、肽抗體(peptibody)、碳水化合物或小有機分子。肽抗體描述於(例如)WO 01/83525中。
所關注之特定拮抗劑包括阻斷或調節hRGM A之生物或免疫活性之拮抗劑。hRGM A之拮抗劑可包括(但不限於)與hRGM A結合之蛋白質、核酸、碳水化合物或任何其他分子，如與RGM A分子相互作用之單株抗體。應注意，與RGM A之相互作用可引起其他配位體/細胞膜組分之結合及中和，且可適用於疊加或協同作用對抗多種疾病。
如本文中所使用之術語「有效量」係指足以減小或改善病症或其一或多種症狀之嚴重程度及/或持續時間；防止病症進展；引起病症消退；防止與病症相關之一或多種症狀復發、發展、發作或進展；偵測病症，或增強或改良另一療法(例如預防劑或治療劑)之預防或治療作用的療法之量。
如本文中所使用之術語「樣品」係以其最廣泛意義使用。如本文中所使用之「生物樣品」包括(但不限於)來自活物(living thing)或先前為活物之任何量之物質。該等活物包括(但不限於)人類、小鼠、大鼠、猴、狗、兔子及其他動物。該等物質包括(但不限於)血液、血清、尿、滑液、細胞、器官、組織、骨髓、淋巴結及脾。
2.結合hRGM A之多肽
本申請案之主要實施例包含與RGM A蛋白質之至少一個抗原決定基特異性結合之經分離蛋白質或多肽。與RGM A蛋白質之至少一個抗原決定基特異性結合之經分離蛋白質或多肽能夠抑制RGM A與其受體再生蛋白及/或與骨形態發生蛋白2及4(BMP-2、BMP-4)之結合。
本申請案之最佳實施例包含與RGM A結合之抗體或其抗原結合部分或片段。
舉例而言，如由此項技術已知或下文所述之若干活體外及活體內檢定中之任一者所評定，本發明之抗RGM A抗體較佳展現高的降低 或中和RGM A活性之能力。
本申請案最佳包含選擇性阻止RGM A與其受體再生蛋白及與骨形態發生蛋白2及4(BMP-2、BMP-4)之結合的對抗RGM A之中和單株抗體，及產生選擇性阻止RGM A與其共受體骨形態發生蛋白2及4(BMP-2、BMP-4)之結合的對抗RGM A之中和單株抗體。
本申請案之單株中和抗體較佳為人類抗體或人類化抗體。術語「人類抗體」係指具有與人類生殖系免疫球蛋白序列對應或源自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區之抗體(例如參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH出版號：91-3242,1991)。然而，本申請案之人類抗體可例如在CDR中且尤其在CDR3中包括不由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如，藉由活體外隨機或位點特異性突變誘發或藉由活體內體細胞突變引入之突變)。
在各實施例中，抗體為重組抗體或單株抗體。本申請案之最佳中和抗體在本文中稱為mAb5F9及mAb8D1以及其功能性抗體片段，且預期具有與mAb5F9及mAb8D1相當之性質(諸如對RGM A之高結合親和力以及低解離動力學及高中和能力)之其他抗體及功能性抗體片段為本發明之部分。本申請案之抗RGM A抗體與免疫原性RGM A多肽或其片段之結合親和力及解離速率可由此項技術已知之任何方法測定。舉例而言，可由競爭性ELISA、c RIA、BIAcore或KinExA技術量測結合親和力。解離速率亦可由BIAcore或KinExA技術量測。結合親和力及解離速率係使用例如BIAcore藉由表面電漿共振量測。
本申請案之一種較佳單株抗體mAb5F9抗體與包含包括SEQ ID NO：9或34之序列之重鏈可變區(VH區)及包括SEQ ID NO：10之序列之輕鏈可變區(VL區)的序列具有至少90%之胺基酸序列一致性。
亦預期，與本申請案之RGM A相互作用之經分離單株抗體可為糖基化結合蛋白質，其中抗體或其抗原結合部分包含一或多個碳水化合物殘基。初期活體內蛋白質產生可經歷稱為轉譯後修飾之進一步加工。詳言之，可酶促添加糖(糖基)殘基，一種稱為糖基化之過程。所得具有共價連接之寡醣側鏈之蛋白質稱為糖基化蛋白質或醣蛋白。蛋白質糖基化視所關注之蛋白質之胺基酸序列以及表現該蛋白質之宿主細胞而定。不同生物體可產生不同糖基化酶(例如，糖基轉移酶及糖苷酶)且具有不同的可利用受質(核苷酸糖)。歸因於該等因素，蛋白質糖基化模式及糖基殘基之組成可視表現特定蛋白質之宿主系統而不同。適用於本發明之糖基殘基可包括(但不限於)葡萄糖、半乳糖、甘露糖、海藻糖、正乙醯基葡糖胺及唾液酸。糖基化結合蛋白質較佳包含糖基殘基以致糖基化模式為人類的。
本申請案之抗體包含重鏈恆定區，諸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM、IgY或IgD恆定區。此外，抗體可包含輕鏈恆定區：κ輕鏈恆定區或λ輕鏈恆定區。抗體較佳包含κ輕鏈恆定區。或者，抗體部分可為(例如)Fab片段或單鏈Fv片段。用於改變抗體效應功能之Fc部分中胺基酸殘基的置換為此項技術中所知(Winter等人，美國專利第5,648,260號、第5,624,821號)。抗體之Fc部分介導若干重要效應功能，例如細胞激素誘導、ADCC、吞噬作用、補體依賴細胞毒性(CDC)以及抗體及抗原-抗體複合物之半衰期/清除率。視治療目標而定，在一些情況下，該等效應功能合乎治療抗體之需要，但在其他情況下，可能不必要或甚至有害。某些人類IgG同型(尤其IgG1及IgG3)分別經由與FcγR及補體C1q結合來介導ADCC及CDC。新生兒Fc受體(FcRn)為測定抗體之循環半衰期之重要組分。在又一實施例中，置換抗體恆定區、例如抗體Fc區中之至少一個胺基酸殘基以致抗體之效應功能得以改變。
3.抗hRGM A抗體之產生
3.1.概述
本申請案之抗體可藉由使合適宿主(例如，脊椎動物，包括人類、小鼠、大鼠、綿羊、山羊、豬、牛、馬、爬行動物、魚類、兩棲動物；及鳥類、爬行動物及魚類之卵)免疫產生。為產生本申請案之抗體，用本發明之免疫原性RGM A多肽或其片段使宿主免疫。術語「免疫」在本文中係指將抗原呈遞至免疫譜系之過程，無論該譜系存在於天然遺傳之未改變之生物體中還是存在於包括經修飾以呈現人工人類免疫譜系之轉殖基因生物體的轉殖基因生物體中。類似地，「免疫原性製劑」為含有將增強抗原之免疫原性之佐劑或其他添加劑的抗原調配物。
動物之免疫可由此項技術已知之任何方法進行。例如參見Harlow及Lane,Antibodies：A Laboratory Manual,New York：Cold Spring Harbor Press,1990。使諸如小鼠、大鼠、綿羊、山羊、豬、牛及馬之非人類動物免疫之方法為此項技術中所熟知。例如參見Harlow及Lane及美國專利第5,994,619號。在一較佳實施例中，將RGM A抗原與佐劑一起投與來刺激免疫反應。該等佐劑包括完全或不完全弗氏佐劑(Freund's adjuvant)、RIBI(胞壁醯二肽)或ISCOM(免疫刺激複合物)。該等佐劑可藉由將多肽隔離於局部沈積物中來保護該多肽以免快速分散，或其可含有刺激宿主分泌對巨噬細胞及免疫系統之其他組分具有趨化性之因子的物質。若投與多肽，則免疫時程較佳將包括兩次或兩次以上分布在若干週內之多肽投藥。
預期用與完整或經破壞細胞之細胞膜相關之抗原使動物宿主免疫且藉由與本發明之免疫原性多肽結合來鑑別本申請案之抗體。用抗原使動物宿主免疫後，可自動物獲得抗體。藉由使動物出血或處死動物自動物獲得含抗體血清。血清可以其自動物獲得之原樣使用，可自 血清獲得免疫球蛋白部分，或可自血清純化出抗體。以此方式獲得之血清或免疫球蛋白為多株血清或免疫球蛋白，因此具有一組不同性質。
3.2 使用融合瘤技術產生抗RGM A單株抗體
單株抗體可使用此項技術已知之多種技術製備，包括使用融合瘤、重組及噬菌體呈現技術或其組合。舉例而言，可使用融合瘤技術產生單株抗體，該等融合瘤技術包括此項技術已知及例如以下文獻中所教示之技術：Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版。1988)；Hammerling，等人，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981)(該等參考文獻全文以引用之方式併入本文中)。如本文中所使用之術語「單株抗體」不限於經由融合瘤技術產生之抗體。術語「單株抗體」係指源自包括任何真核生物、原核生物或噬菌體純系之單一純系而非由產生其之方法產生的抗體。
使用融合瘤技術產生及篩選特異性抗體之方法在此項技術中為常規方法且為此項技術中所熟知。在一實施例中，本發明提供產生單株抗體之方法以及由該方法產生之抗體，該方法包含培養分泌本發明之抗體之融合瘤細胞，其中融合瘤較佳係藉由將自經本發明之抗原免疫之小鼠分離的脾細胞與骨髓瘤細胞融合且隨後篩選由分泌能夠結合本發明之多肽之抗體的融合瘤純系融合產生的融合瘤來產生。簡言之，可用RGM A抗原使小鼠免疫。在一較佳實施例中，將RGM A抗原與佐劑一起投與來刺激免疫反應。該等佐劑包括完全或不完全弗氏佐劑、RIBI(胞壁醯二肽)或ISCOM(免疫刺激複合物)。該等佐劑可藉由將多肽隔離於局部沈積物中來保護該多肽以免快速分散，或其可含有刺激宿主分泌對巨噬細胞及免疫系統之其他組分具有趨化性之因子的物質。若投與多肽，則免疫時程較佳將包括兩次或兩次以上分布在 若干週內之多肽投藥。
一旦偵測到免疫反應，例如在小鼠血清中偵測到對抗原RGM A具有特異性之抗體，即收集小鼠脾且分離脾細胞。隨後由熟知技術將脾細胞與例如可獲自ATCC之細胞株SP20之細胞的任何合適骨髓瘤細胞融合。由限制性稀釋來選擇且選殖融合瘤。隨後針對分泌能夠結合RGM A之抗體之細胞，由此項技術已知之方法檢定融合瘤純系。可藉由用陽性融合瘤純系使小鼠免疫來產生通常含有高含量抗體之腹水。
在另一實施例中，可由免疫動物製備抗體產生永生化融合瘤。免疫後，處死動物且如此項技術中所熟知，將脾B細胞與永生化骨髓瘤細胞融合。例如參見Harlow及Lane，同上文。在一較佳實施例中，骨髓瘤細胞不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌性細胞株)。融合及抗生素選擇後，使用RGM A或其部分或者表現RGM A之細胞篩選融合瘤。在一較佳實施例中，使用酶聯免疫檢定(ELISA)或放射免疫檢定(RIA)、較佳ELISA來執行初始篩選。ELISA篩選之實例提供於WO 00/37504中，該專利以引用之方式併入本文中。
選擇抗RGM A抗體產生融合瘤，加以選殖且針對包括旺盛融合瘤生長、高抗體產量及如下文將進一步論述之所需抗體特徵之所需特徵進一步篩選。融合瘤可在活體內於同系動物、缺乏免疫系統之動物(例如裸小鼠)中或在活體外於細胞培養物中培養及擴充。選擇、選殖及擴充融合瘤之方法為一般熟習此項技術者所熟知。
在一較佳實施例中，融合瘤為如上所述之小鼠融合瘤。在另一較佳實施例中，在諸如大鼠、綿羊、豬、山羊、牛或馬之非人類、非小鼠物種中產生融合瘤。在另一實施例中，融合瘤為人類融合瘤，其中將人類非分泌性骨髓瘤與表現抗RGM A抗體之人類細胞融合。
可由已知技術產生識別特異性抗原決定基之抗體片段。舉例而言，可藉由使用諸如木瓜蛋白酶(以產生Fab片段)或胃蛋白酶(以產生 F(ab')2片段)之酶蛋白水解裂解免疫球蛋白分子來產生本發明之Fab及F(ab')2片段。F(ab')2片段含有可變區、輕鏈恆定區及重鏈CHI結構域。
3.3 使用SLAM產生抗RGM A單株抗體
在本發明之另一態樣中，由單一經分離淋巴細胞使用如以下文獻中所述之此項技術中稱為選擇淋巴細胞抗體方法(SLAM)之程序產生重組抗體：美國專利第5,627,052號；PCT公開案WO 92/02551及Babcock,J.S.等人，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：7843-7848。在該方法中，使用抗原特異性溶血空斑檢定(antigen-specific hemolytic plaque assay)篩選分泌所關注之抗體之單細胞(例如，源自上述免疫動物中之任一者之淋巴細胞)，其中抗原RGM A、RGM A之亞單元或其片段係使用諸如生物素之連接子與綿羊紅細胞偶聯且用於鑑別分泌對RGM A具有特異性之抗體的單細胞。鑑別所關注之抗體分泌細胞後，藉由逆轉錄酶PCR自細胞取得重鏈及輕鏈可變區cDNA，且隨後可表現該等可變區，在適當免疫球蛋白恆定區(例如人類恆定區)之情況下，可於諸如COS或CHO細胞之哺乳動物宿主細胞中表現。隨後可例如藉由淘選經轉染細胞以分離出表現RGM A之抗體之細胞，來使經源自活體內選擇之淋巴細胞之經擴增免疫球蛋白序列轉染的宿主細胞於活體外經歷進一步分析及選擇。擴增之免疫球蛋白序列可諸如由活體外親和力成熟方法(諸如PCT公開案WO 97/29131及PCT公開案WO 00/56772中所述之方法)進一步在活體外加以處理。
3.4 使用轉殖基因動物產生抗RGM A單株抗體
在本發明之另一實施例中，藉由用RGM A抗原使包含一些或所有人類免疫球蛋白基因座之非人類動物免疫來產生抗體。在一較佳實施例中，非人類動物為XENOMOUS轉殖基因小鼠，其為包含人類免疫球蛋白基因座之大片段且小鼠抗體產生缺乏之經工程改造之小鼠品 系。例如參見Green等人，Nature Genetics 7：13-21(1994)及美國專利5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、6,114,598及6,130,364。亦參見1991年7月25日公開之WO 91/10741；1994年2月3日公開之WO 94/02602；1996年10月31日公開之WO 96/34096及WO 96/33735；1998年4月23日公開之WO 98/16654；1998年6月11日公開之WO 98/24893；1998年11月12日公開之WO 98/50433；1999年9月10日公開之WO 99/45031；1999年10月21日公開之WO 99/53049；2000年2月24日公開之WO 00 09560及2000年6月29日公開之WO 00/037504。XENOMOUSE轉殖基因小鼠產生完全人類抗體之類成年人類譜系且產生抗原特異性人類Mab。XENOMOUSE轉殖基因小鼠經由引入人類重鏈基因座及x輕鏈基因座之百萬鹼基(megabase)規模的生殖系構型YAC片段而含有約80%之人類抗體譜系。參見Mendez等人，Nature Genetics 15：146-156(1997)；Green及Jakobovits J.Exp.Med.188：483-495(1998)，其揭示內容係以引用之方式併入本文中。
3.5 使用重組抗體文庫產生抗RGM A單株抗體
亦可使用活體外方法製備本發明之抗體，其中篩選抗體文庫以鑑別具有所需結合特異性之抗體。該篩選重組抗體文庫之方法為此項技術中所熟知且包括例如以下文獻中所述之方法：Ladner等人，美國專利第5,223,409號；Kang等人，PCT公開案第WO 92/18619號；Dower等人，PCT公開案第WO 91/17271號；Winter等人，PCT公開案第WO 92/20791號；Markland等人，PCT公開案第WO 92/15679號；Breitling等人，PCT公開案第WO 93/01288號；McCafferty等人，PCT公開案第WO 92/01047號；Garrard等人，PCT公開案第WO 92/09690號；Fuchs等人，(1991)Bio/Technology 9：1370-1372；Hay等人，(1992)Hum Antibod Hybridomas 3：81-85；Huse等人，(1989)Science 246：1275-1281；McCafferty等人，Nature(1990)348：552-554；Griffiths等人，(1993)EMBO J 12：725-734；Hawkins等人，(1992)J Mol Biol 226：889-896；Clackson等人，(1991)Nature 352：624-628；Gram等人，(1992)PNAS 89：3576-3580；Garrad等人，(1991)Bio/Technology 9：1373-1377；Hoogenboom等人，(1991)Nuc Acid Res 19：4133-4137；及Barbas等人，(1991)PNAS 88：7978-7982，美國專利申請公開案20030186374及PCT公開案第WO 97/29131號，其各自之內容係以引用之方式併入本文中。
重組抗體文庫可來自經RGM A或RGM A之一部分免疫之個體。或者，重組抗體文庫可來自自然個體(亦即，尚未經RGM A免疫之個體)，諸如來自尚未經人類RGM A免疫之人類個體之人類抗體文庫。藉由用包含人類RGM A之肽篩選重組抗體文庫以藉此選擇識別RGM A之抗體來選擇本發明之抗體。進行該篩選及選擇之方法為此項技術中所熟知，諸如先前段落中之參考文獻中所述之方法。為選擇對hRGM A具有特定結合親和力之本發明之抗體，諸如以特定koff速率常數自人類RGM A解離之抗體，可使用此項技術已知之表面電漿共振方法選擇具有所需koff速率常數之抗體。為選擇對hRGM A具有特定中和活性之本發明之抗體，諸如具有特定IC50之抗體，可使用此項技術已知之評定hRGM A活性之抑制的標準方法。
在一態樣中，本發明係關於一種結合人類RGM A之經分離抗體或其抗原結合部分。抗體較佳為中和抗體。在各實施例中，抗體為重組抗體或單株抗體。
舉例而言，亦可使用此項技術已知之各種噬菌體呈現方法產生本發明之抗體。在噬菌體呈現方法中，將功能性抗體結構域呈現於載有編碼其之聚核苷酸序列之噬菌體粒子的表面上。詳言之，可利用該噬菌體呈現由譜系或組合抗體文庫(例如人類或鼠類)表現之抗原結合 結構域。可用抗原，例如使用經標記抗原或者結合至或捕獲於固體表面或珠粒之抗原，來選擇或鑑別表現結合所關注之抗原之抗原結合結構域的噬菌體。該等方法中所使用之噬菌體通常為絲狀噬菌體，其包括由Fab、Fv或二硫化物穩定之Fv抗體結構域與噬菌體基因III或基因VIII蛋白質重組融合之噬菌體表現之fd及M13結合結構域。可用於製備本發明之抗體之噬菌體呈現方法的實例包括以下文獻中所揭示之方法：Brinkman等人，J.Immunol.Methods 182：41-50(1995)；Ames等人，J.Immunol.Methods 184：177-186(1995)；Kettleborough等人，Eur.J.Immunol.24：952-958(1994)；Persic等人，Gene 187 9-18(1997)；Burton等人，Advances in Immunology 57：191-280(1994)；PCT申請案第PCT/GB91/01134號；PCT公開案WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401及美國專利第5,698,426號、第5,223,409號、第5,403,484號、第5,580,717號、第5,427,908號、第5,750,753號、第5,821,047號、第5,571,698號、第5,427,908號、第5,516,637號、第5,780,225號、第5,658,727號、第5,733,743號及第5,969,108號，其各自全部以引用之方式併入本文中。
如以上參考文獻中所述，噬菌體選擇後，可自噬菌體分離抗體編碼區且將其用於產生包括人類抗體或任何其他所需抗原結合片段之全抗體，且例如如下文詳細描述，使其於包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母及細菌之任何所需宿主中表現。舉例而言，亦可使用此項技術已知之方法使用重組產生Fab、Fab'及F(ab')2片段之技術，該等方法諸如以下文獻中所揭示之方法：PCT公開案WO 92/22324；Mullinax等人，BioTechniques 12(6)：864-869(1992)；及Sawai等人，AJRI 34：26-34(1995)；及Better等人，Science 240：1041-1043(1988)(該等參考文獻全文以引用之方式併入本文中)。可用 於產生單鏈Fv及抗體之技術之實例包括以下文獻中所述之技術：美國專利第4,946,778號及第5,258,498號；Huston等人，Methods in Enzymology 203：46-88(1991)；Shu等人，PNAS 90：7995-7999(1993)；及Skerra等人，Science 240：1038-1040(1988)。
可應用此項技術已知之篩選大型組合文庫之其他方法替代由噬菌體呈現篩選重組抗體文庫來鑑別本發明之雙重特異性抗體。一種替代性表現系統類型為如以下文獻中所述之將重組抗體文庫表現為RNA-蛋白質融合物之表現系統：Szostak及Roberts之PCT公開案第WO 98/31700號，及Roberts,R.W.及Szostak,J.W.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：12297-12302。在該系統中，產生mRNA與其藉由活體外轉譯在3'末端具有嘌呤黴素(一種肽基受體抗生素)之合成mRNA而編碼之肽或蛋白質的共價融合物。因此，可基於所編碼之肽或蛋白質(例如，抗體或其部分)之性質(諸如抗體或其部分與雙重特異性抗原之結合)，自mRNA之複雜混合物(例如，組合文庫)中富集特定mRNA。可由如上所述之重組方式(例如，於哺乳動物宿主細胞中)表現自該等文庫之篩選回收之編碼抗體或其部分之核酸序列，且此外，可藉由再進行幾輪已在最初選擇之序列中引入突變之mRNA-肽融合物的篩選或由如上所述活體外使重組抗體親和力成熟之其他方法使其經歷進一步親和力成熟。
在另一方法中，亦可使用此項技術已知之酵母呈現方法產生本發明之抗體。在酵母呈現方法中，使用基因方法將抗體結構域限於酵母細胞壁且使其呈現於酵母表面上。詳言之，可利用該酵母呈現由譜系或組合抗體文庫(例如人類或鼠類)表現之抗原結合結構域。可用於製備本發明之抗體之酵母呈現方法的實例包括Wittrup等人，美國專利第6,699,658號中所揭示之方法，該文獻係以引用之方式併入本文中。
4.本發明之特定重組RGM A抗體之產生
可由此項技術已知之大量技術中之任一者產生本發明之抗體。舉例而言，由宿主細胞表現，其中將編碼重鏈及輕鏈之表現載體藉由標準技術轉染至宿主細胞中。術語「轉染」之各種形式意欲涵蓋常用於將外源DNA引入原核生物或真核生物宿主細胞中之多種技術，例如電穿孔、磷酸鈣沈澱、DEAE-葡聚糖轉染及其類似技術。雖然有可能於原核生物或真核生物宿主細胞中表現本發明之抗體，但於真核生物細胞中表現抗體較佳且最佳於哺乳動物宿主細胞中表現，因為該等真核生物細胞(且尤其哺乳動物細胞)比原核生物細胞更有可能組裝及分泌適當摺疊且具免疫活性之抗體。
表現本發明之重組抗體之較佳哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO細胞)(包括在Urlaub及Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中描述之dhfr-CHO細胞，例如R.J.Kaufman及P.A.Sharp(1982)Mol.Biol. 159：601-621中所述，其與DHFR可選標記物一起使用)、NS0骨髓瘤細胞、COS細胞及SP2細胞。當將編碼抗體基因之重組表現載體引入哺乳動物宿主細胞中時，藉由培養宿主細胞一段足以於宿主細胞中表現抗體或更佳將抗體分泌至使宿主細胞生長之培養基中之時間來產生抗體。可使用標準蛋白質純化方法自培養基回收抗體。
亦可使用宿主細胞產生功能性抗體片段，諸如Fab片段或scFv分子。應瞭解，對於以上程序之變更係在本發明之範疇內。舉例而言，可能需要用編碼本發明抗體之輕鏈及/或重鏈之功能性片段的DNA轉染宿主細胞。亦可使用重組DNA技術來移除一些或所有編碼與所關注之抗原結合不需要之輕鏈與重鏈中之任一者或兩者的DNA。本發明抗體亦涵蓋由該等截短之DNA分子表現之分子。另外，可藉由標準化學交聯方法使本發明抗體與第二抗體交聯來產生一條重鏈及一條輕鏈為 本發明之抗體且另一條重鏈及輕鏈對除所關注之抗原以外之抗原具有特異性的雙功能抗體。
在用於重組表現本發明之抗體或其抗原結合部分之一較佳系統中，藉由磷酸鈣介導之轉染將編碼抗體重鏈與抗體輕鏈之重組表現載體引入dhfr-CHO細胞中。在重組表現載體中，抗體重鏈與輕鏈基因各自與CMV強化子/AdMLP啟動子調控元件操作性連接以驅動基因之高水準轉錄。重組表現載體亦攜有DHFR基因，其允許使用甲胺喋呤選擇/擴增來選擇已經載體轉染之CHO細胞。培養經選擇之轉型體宿主細胞以允許表現抗體重鏈及輕鏈且自培養基回收完整抗體。使用標準分子生物學技術來製備重組表現載體，轉染宿主細胞，選擇轉型體，培養宿主細胞且自培養基回收抗體。本發明進一步提供一種合成本發明重組抗體之方法，該方法係藉由在合適培養基中培養本發明之宿主細胞直至合成本發明之重組抗體。該方法可進一步包含自該培養基中分離重組抗體。
4.1 抗RGM A抗體
表5為本發明之較佳抗hRGM A抗體之VH及VL區之胺基酸序列的列表。
上述經分離抗RGM A抗體CDR序列建立根據本發明之新穎的經分離RGM A結合蛋白質家族。為產生及選擇關於hRGM A具有較佳RGM A結合及/或中和活性之本發明的CDR，可使用此項技術已知之產生本發明之結合蛋白質及評定彼等結合蛋白質之RGM A結合及/或中和特徵的標準方法，包括(但不限於)本文中特別描述之方法。
4.2 抗RGM A嵌合抗體
嵌合抗體為抗體之不同部分源自不同動物物種之分子，諸如具 有源自鼠類單株抗體之可變區及人類免疫球蛋白恆定區的抗體。產生嵌合抗體之方法為此項技術中所知。例如參見Morrison,Science 229：1202(1985)；Oi等人，BioTechniques 4：214(1986)；Gillies等人，(1989)J.Immunol.Methods 125：191-202；美國專利第5,807,715號；第4,816,567號及第4,816,397號，其全文以引用之方式併入本文中。另外，可使用開發藉由將來自具有適當抗原特異性之小鼠抗體分子之基因與來自具有適當生物活性之人類抗體分子之基因拼接在一起來產生「嵌合抗體」的技術(Morrison等人，1984,Proc.Natl.Acad.Sci.81：851-855；Neuberger等人，1984,Nature 312：604-608；Takeda等人，1985,Nature 314：452-454，其全文係以引用之方式併入本文中)。
在一實施例中，藉由用人類IgG1恆定區置換本文中所述之鼠類單株抗人類RGM A抗體之重鏈恆定區來產生本發明之嵌合抗體。
4.3 抗RGM A CDR移植抗體
本發明之CDR移植抗體包含來自人類抗體之重鏈及輕鏈可變區序列，其中VH及/或VL之一或多個CDR區經例如本發明之鼠類抗體之非人類CDR序列置換。來自任何人類抗體之架構序列均可充當CDR移植之模板。然而，該架構上之直鏈置換通常導致對抗原之結合親和力之部分喪失。人類抗體與初始鼠類抗體之同源性越高，則鼠類CDR與人類架構組合在CDR中引入會減小親和力之失真的可能性越低。因此，較佳經選擇以置換除CDR以外之鼠類可變架構之人類可變架構與鼠類抗體可變區架構具有至少65%之序列一致性。更佳人類可變區與除CDR以外之鼠類可變區具有至少70%之序列一致性。甚至更佳人類可變區與除CDR以外之鼠類可變區具有至少75%之序列一致性。最佳人類可變區與除CDR以外之鼠類可變區具有至少80%之序列一致性。產生CDR移植抗體之方法為此項技術中所知(Jones等人，Nature 321： 522-525(1986)；美國專利第5,225,539號)。在一特定實施例中，本發明提供具有如表6中所述之VH及/或VL鏈之CDR移植抗體。
源自mAb 5F9之CDR序列以黑體字母陳述。亦藉由陳述相應SEQ ID No提及特定架構序列(FR1至FR4)(亦參見表3及4)。
4.4 抗RGM A人類化抗體
人類化抗體為結合具有一或多個來自非人類物種之互補決定區(CDR)及來自人類免疫球蛋白分子之架構區之所需抗原的來自非人類物種之抗體分子。已知的人類Ig序列揭示於(例如)www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi；www.atcc.org/phage/hdb.html；www.sciquest.com/；www.abcam.com/；www.antibodyresource.com/onlinecomp.html；www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html； www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html；www.whfreeman.com/immunology/CH-05/kuby05.htm；www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html；www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/；www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/m-ikeimages.html；www.antibodyresource.com/；mcb.harvard.edu/BioLinks/Immuno-logy.html.；www.immunologylink.com/；pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.-html；www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/；www.pebio.com/pa/340913/340913.html-；www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/；www.m.ehime-u.acjp/.about.yasuhito-/Elisa.html；www.biodesign.com/table.asp；www.icnet.uk/axp/facs/davies/lin-ks.html；www.biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html；www.isac-net.org/sites_geo.html；aximtl.imt.uni-marburg.de/.about.rek/AEP-Start.html；baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html；www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/；www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/pu-blic/INTRO.html；www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html；imgt.cnusc.fr：8104/；www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html；antibody.bath.ac.uk/；abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html；www.unizh.ch/.about.honegger/AHOsem-inar/Slide01.html；www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/；www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm；www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/h-umanisation/TAHHP.html；www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html； www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html；www.cryst.bioc.cam.ac.uk/.abo-ut.fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html；www.jerini.de/fr roducts.htm；www.patents.ibm.com/ibm.html；Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Dept.Health(1983)，其各自全部以引用之方式併入本文中。該等輸入序列可用於降低免疫原性或者減小、增強或修飾結合親和力、締合速率、解離速率、親和力、特異性、半衰期或如此項技術已知之任何其他合適特徵。
可用來自CDR供體抗體之相應殘基取代人類架構區中之架構殘基以改變、較佳改良抗原結合。該等架構取代係由此項技術中熟知之方法鑑別，例如藉由建立CDR與架構殘基之相互作用模型以鑑別對抗原結合重要之架構殘基以及進行序列比較以鑑別特定位置之異常架構殘基。(例如參見，Queen等人，美國專利第5,585,089號；Riechmann等人，Nature 332：323(1988)，其全文以引用之方式併入本文中。)三維免疫球蛋白模型為常用的且為熟習此項技術者熟知。可利用說明且呈現所選擇之候選免疫球蛋白序列之可能三維構形結構之電腦程序。對該等呈現之檢查允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列起作用過程中可能的作用，亦即，分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原之能力的殘基。以此方式，可自一致及輸入序列選擇且組合FR殘基以致實現所需之抗體特徵，諸如對標靶抗原之增加之親和力。一般而言，CDR殘基直接且最大程度上涉及影響抗原結合。可使用此項技術已知之各種技術使抗體人類化，該等技術諸如(但不限於)以下文獻中所述之技術：Jones等人，Nature 321：522(1986)；Verhoeyen等人，Science 239：1534(1988)；Sims等人，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901(1987)；Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：4285(1992)；Presta等人，J.Immunol.151：2623(1993)； Padlan,Molecular Immunology 28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等人，Protein Engineering 7(6)：805-814(1994)；Roguska.等人，PNAS 91：969-973(1994)；PCT公開案WO 91/09967；PCT/：US98/16280；US96/18978；US91/09630；US91/05939；US94/01234；GB89/01334；GB91/01134；GB92/01755；WO90/14443；WO90/14424；WO90/14430；EP 229246；EP 592,106；EP 519,596；EP 239,400；美國專利第5,565,332號、第5,723,323號、第5,976,862號、第5,824,514號、第5,817,483號、第5814476號、第5763192號、第5723323號、第5,766886號、第5,714,352號、第6,204,023號、第6,180,370號、第5,693,762號、第5,530,101號、第5,585,089號、第5,225,539號、第4,816,567號，其各自全部以引用之方式併入本文中，包括其中所引用之參考文獻。
5.本發明抗體之其他實施例
5.1 融合抗體及免疫黏附素
本申請案亦描述一種可經製備的包含與另一多肽連接之本申請案之RGM A抗體的全部或一部分之融合抗體或免疫黏附素。在一些實施例中，僅RGM A抗體之可變區與多肽連接。在其他實施例中，本申請案之RGM A抗體之VH結構域與第一多肽連接，而該抗體之VL結構域與以一定方式與第一多肽締合從而允許VH與VL結構域彼此相互作用以形成抗體結合位點的第二多肽連接。在其他實施例中，經由允許VH與VL結構域彼此相互作用之連接子將VH結構域與VL結構域隔開(參見下文單鏈抗體下的內容)。隨後將VH-連接子-VL抗體與所關注之多肽連接。該融合抗體適用於將多肽引導至表現RGM A之細胞或組織。所關注之多肽可為治療劑，諸如毒素；或可為診斷劑，諸如可容易地觀察之酶，諸如辣根過氧化物酶。另外，可產生將兩個(或兩個以上)單鏈抗體彼此連接之融合抗體。若想要於單一多肽鏈上產生二 價或多價抗體或若想要產生雙特異性抗體，則其適用。
一個實施例提供一種將本申請案之抗體或抗體部分用另一功能分子(例如，另一肽或蛋白質)衍生化或與該另一功能分子連接的經標記結合蛋白質。舉例而言，本申請案之經標記結合蛋白質可藉由將本申請案之抗體或抗體部分與一或多個其他分子實體功能性連接(經由化學偶聯、基因融合、非共價締合或其他方式)來得到，該一或多個其他分子實體諸如核酸、另一抗體(例如，雙特異性抗體或雙功能抗體)、可偵測劑、細胞毒性劑、醫藥劑及/或可介導抗體或抗體部分與另一分子(諸如抗生蛋白鏈菌素核心區或聚組胺酸標籤)締合之蛋白質或肽。
可使本申請案之抗體或抗體部分衍生化之有用可偵測劑包括螢光化合物。例示性螢光可偵測劑包括螢光素、螢光異硫氰酸鹽、若丹明、5-二甲胺-1-萘磺醯氯、藻紅素及其類似物。亦可用諸如鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶及其類似酶之可偵測酶使抗體衍生化。當用可偵測酶使抗體衍生化時，藉由添加其他試劑(酶使用其來產生可偵測反應產物)對其加以偵測。舉例而言，當存在可偵測劑辣根過氧化物酶時，添加過氧化氫及二胺基聯苯胺會產生可偵測之有色反應產物。亦可用核酸、生物素使抗體衍生化，且經由間接量測抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素結合加以偵測。
5.2 單鏈抗體
本申請案包括一種結合本發明之免疫原性RGM A之單鏈抗體(scFv)。為產生scFv，將VH-及V-編碼DNA與編碼可撓性連接子(例如編碼胺基酸序列(Gly4-Ser))之DNA操作性連接以使VH及VL序列可表現為VL及VH區經由可撓性連接子連接之鄰接單鏈蛋白質(例如參見Bird等人，(1988)Science 242：423-42 6；Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty等人，30 Nature(1990)34 8：552-554)。若僅使用單一VH及VL，則單鏈抗體可為單價；或使用兩個VH及VL，則其可為二價；或若使用兩個以上VH及VL，則其可為多價。兩個經由連接子偶聯之該等scFv片段稱為「雙功能抗體」，本發明亦涵蓋該形式。
5.3 雙特異性抗體
本申請案進一步包括一種特異性係針對本申請案之免疫原性RGM A多肽的雙特異性抗體或其抗原結合片段。舉例而言，可產生經由一個結合結構域與本發明之免疫原性RGM A多肽特異性結合且經由第二結合結構域與第二分子特異性結合的雙特異性抗體。另外，可產生特異性結合本發明之免疫原性多肽且特異性結合與削弱髓鞘介導之生長錐萎陷以及神經突外生長及萌發之抑制相關的另一分子的含有一個以上VH及VL的單鏈抗體。該等雙特異性抗體可使用例如Fanger等人，Immunol Methods 4：72-81(1994)及Wright及Harris,20(同上文)之熟知技術產生。
在一些實施例中，使用一或多個來自本發明抗體之可變區製備雙特異性抗體。在另一實施例中，使用一或多個來自該抗體之CDR區製備雙特異性抗體。
5.4 經衍生化且經標記之抗體
可將本申請案之抗體或抗原結合片段用另一分子(例如，另一肽或蛋白質)衍生化或與該另一分子連接。一般而言，抗體或抗原結合片段經衍生化以致與本發明之免疫原性多肽之結合不受衍生化或標記之不利影響。
舉例而言，可將本申請案之抗體或抗體部分與一或多個其他分子實體功能性連接(經由化學偶聯、基因融合、非共價締合或其他方式)，該一或多個其他分子實體諸如另一抗體(例如，雙特異性抗體或雙功能抗體)、偵測試劑、細胞毒性劑、醫藥劑及/或可介導抗體或抗 原結合片段與另一分子(諸如抗生蛋白鏈菌素核心區或聚組胺酸標籤)之締合的蛋白質或肽。此外，抗體或其抗原結合部分可為藉由將抗體或抗體部分與一或多個其他或不同蛋白質或肽共價或非共價締合所形成之較大免疫黏附分子的部分。該等免疫黏附分子之實例包括使用抗生蛋白鏈菌素核心區製備四聚體scFv分子(Kipriyanov等人，(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6：93-101)及使用半胱胺酸殘基、標記肽及C-末端聚組胺酸標籤製備二價且經生物素標記之scFv分子(Kipriyanov等人，(1994)Molecular Immunology 31：1047-1058)。可使用諸如全抗體之分別木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化之習知技術由全抗體製備諸如Fab及F(ab')2片段之抗體部分。此外，如本文中所述，可使用標準重組DNA技術獲得抗體、抗體部分及免疫黏附分子。
衍生化抗體可藉由使兩種或兩種以上抗體(相同類型或不同類型，例如以產生雙特異性抗體)交聯產生。合適交聯劑包括具有兩個由適當間隔基隔開之不同反應性基團之異雙官能交聯劑(例如間-順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯)；或同雙官能交聯劑(例如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)。該等連接基可自Pierce Chemical Company,Rockford,Ill購得。
衍生化抗體亦可為經標記抗體。舉例而言，可使本發明之抗體或抗體部分衍生化之偵測劑為螢光化合物，包括螢光素、螢光異硫氰酸鹽、若丹明、5-二甲胺-1-萘磺醯氯、藻紅素、鑭系元素磷光體及其類似物。亦可用適用於偵測之酶標記抗體，該等酶諸如辣根過氧化物酶、半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶及其類似酶。在用可偵測酶標記之實施例中，藉由添加其他試劑(酶使用其來產生可偵測反應產物)偵測抗體。舉例而言，辣根過氧化物酶與過氧化氫及二胺基聯苯胺。亦可用生物素標記抗體且經由間接量測抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈黴素之結合偵測。亦可用由第二報導子識別之預 定多肽抗原決定基(例如白胺酸拉鏈對序列、二次抗體之結合位點、金屬結合結構域、抗原決定基標籤)標記抗體。亦可用放射性標記之胺基酸標記RGM A抗體或其抗原片段。放射性標記可用於診斷及治療目的。放射性標記之RGM A抗體可診斷性使用，例如用於測定個體之RGM A受體含量。另外，放射性標記之RGM A抗體可治療性使用以治療脊髓損傷。
用於多肽之標記之實例包括(但不限於)下列放射性同位素或放射性核素：15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho、153Sm。亦可用諸如聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基或碳水化合物基團之化學基團使RGM A抗體或其抗原片段衍生化。該等基團可適用於改進抗體之生物學特徵，例如增加血清半衰期或增加組織結合。又，用於多肽之標記可包括核酸，例如藉由PCR偵測或增強基因表現之DNA或者抑制具有RGM A之細胞或組織中之基因表現的siRNA。
RGM A抗體之類別及亞類可由此項技術中已知之任何方法確定。一般而言，可使用對特定抗體類別及亞類具特異性之抗體來確定抗體之類別及亞類。該等抗體可為市售。可由ELISA、西方墨點法(Western Blot)以及其他技術來確定類別及亞類。或者，可藉由對抗體重鏈及/或輕鏈之全部或一部分恆定結構域進行測序，將其胺基酸序列與免疫球蛋白之各種類別及亞類的已知胺基酸序列作比較且確定該等抗體之類別及亞類來確定類別及亞類。
5.5 雙可變結構域免疫球蛋白
如本文中所使用之雙可變結構域(DVD)結合蛋白質或免疫球蛋白為包含兩個或兩個以上抗原結合位點之結合蛋白質且為例如二價及四價之多價結合蛋白質。術語「多價結合蛋白質」在本說明書中用於表示包含兩個或兩個以上抗原結合位點之結合蛋白質。多價結合蛋白質較佳經工程改造成具有兩個或兩個以上抗原結合位點且其通常不為天 然存在之抗體。術語「多特異性結合蛋白質」係指能夠結合兩個或兩個以上相關或無關標靶之結合蛋白質。該等DVD可具有單特異性，亦即能夠結合一種抗原；或具有多特異性，亦即能夠結合兩個或兩個以上抗原。包含兩個重鏈DVD多肽及兩個輕鏈DVD多肽之DVD結合蛋白質稱為DVD Ig。DVD Ig之每一半包含重鏈DVD多肽及輕鏈DVD多肽以及兩個抗原結合位點。每一結合位點包含重鏈可變結構域及輕鏈可變結構域，其中每一抗原結合位點總計6個CDR參與抗原結合。DVD結合蛋白質及製備DVD結合蛋白質之方法揭示於美國專利申請案第11/507,050號中且該專利申請案以引用之方式併入本文中。預期本發明包含包括能夠結合RGM A之結合蛋白質之DVD結合蛋白質。DVD結合蛋白質較佳能夠結合RGM A及第二標靶。該第二標靶係選自由以下各物組成之群：抗發炎MAB活性劑(IL-1、IL-6、IL-8、IL-11、IL-12、IL-17、IL-18、IL-23、TNFα/β、IFN-β、IFN-γ、LIF、OSM、CNTF、PF-4、血小板鹼性蛋白(PBP)、NAP-2、β-TG、MIP-1、MCP2/3、RANTES、淋巴細胞趨化因子)、轉運介導蛋白質(胰島素受體、運鐵蛋白受體、凝血酶受體、瘦素受體(leptin receptor)、LDL受體)、其他神經再生MAB(NgR、Lingo、p75、CSPG(例如NG-2、神經蛋白聚糖(neurocan)、短蛋白聚糖(brevican)、多功能蛋白聚糖(versican)、聚集蛋白聚糖(aggrecan))、玻尿酸、mAG、固生蛋白(tenascin)、NI-35、NI-250、IMP、基底膜蛋白聚糖(perlecan)、神經蛋白聚糖、磷酸蛋白聚糖(phosphacan)、nogo-A、OMGP、Sema4D、Sema 3A、ephrin B3、ephrin A2、ephrin A5、MAG、EphA4、plexin B1、TROY、wnts、ryk rec.、BMP-2、BMP-4、BMP-7)、神經保護MAB活性劑(EGF、EGFR、Sema 3)、抗β澱粉樣MAB(例如m266、3D6(巴平珠單抗(bapineuzumab))、抗球蛋白體MAB 7C6(anti-globulomer MAB 7C6))、CNS定位受體及轉運蛋白(血清素受體、多巴 胺受體(dopamine receptor)、DAT、Asc-1、GlyT1)。
5.6 雙特異性抗體
本申請案亦描述「雙特異性抗體」技術。雙特異性抗體可充當激動劑、拮抗劑或呈不同組合之兩者。雙特異性抗體為VH鏈結合第一抗原且VL鏈結合另一抗原之抗體，如於WO2008082651中例示。
5.7 結晶抗體
本申請案之另一實施例提供一種結晶結合蛋白質。如本文中所使用之術語「結晶」係指以晶體形式存在之抗體或其抗原結合部分。晶體為固態物質之一種形式，其不同於諸如非晶形固態或液晶態之其他形式。晶體係由原子、離子、分子(例如，諸如抗體之蛋白質)或分子組裝體(例如，抗原/抗體複合物)之規則的重複三維陣列構成。該等三維陣列係根據該領域中充分瞭解之特定數學關係排列。晶體中重複之基本單元或構建塊稱為不對稱單元。以符合已知之定義明確的晶體學對稱性之排列重複不對稱單元將提供晶體之「單位晶胞」。在所有三維中藉由正則變換重複單位晶胞將提供晶體。參見Giege,R.及Ducruix,A.Barrett,Crystallization of Nucleic Acids and Proteins,a Practical Approach，第2版，第201-16頁，Oxford University Press,New York,New York,(1999)。
本申請案較佳描述如本文中所揭示之全RGM A抗體及其片段之晶體以及包含該等晶體之調配物及組合物。在一實施例中，結晶結合蛋白質具有比結合蛋白質之可溶對應物高之活體內半衰期。在另一實施例中，結合蛋白質在結晶後保留生物活性。
本發明之結晶結合蛋白質可按照此項技術已知之方法且如WO 02072636(以引用之方式併入本文中)中所揭示產生。
5.8 糖基化抗體
本發明之另一實施例提供一種抗體或其抗原結合部分包含一或 多個碳水化合物殘基之糖基化結合蛋白質。初期活體內蛋白質產生可經歷稱為轉譯後修飾之進一步加工。詳言之，可酶促添加糖(糖基)殘基，一種稱為糖基化之過程。所得具有共價連接之寡醣側鏈之蛋白質稱為糖基化蛋白質或醣蛋白。抗體為在Fc結構域以及可變結構域中具有一或多個碳水化合物殘基之醣蛋白。Fc結構域中之碳水化合物殘基對Fc結構域之效應功能具有重要影響，而對抗體之抗原結合或半衰期影響極小(R.Jefferis,Biotechnol.Prog. 21(2005)，第11-16頁)。相比之下，可變結構域之糖基化可對抗體之抗原結合活性產生影響。可變結構域之糖基化可對抗體結合親和力產生負面影響(很可能由位阻所致)(Co,M.S.等人，Mol.Immunol.(1993)30：1361-1367)，或產生增加之對抗原之親和力(Wallick,S.C.等人，Exp.Med.(1988)168：1099-1109；Wright,A.等人，EMBO J.(1991)10：2717 2723)。
本發明之一態樣係針對產生結合蛋白質之O-或N-連接糖基化位點已突變之糖基化位點突變體。熟習此項技術者可使用標準熟知技術產生該等突變體。保留生物活性但具有增加或減小之結合活性的糖基化位點突變體為本發明之另一目標。
在另一實施例中，本發明之抗體或抗原結合部分之糖基化係經修飾。舉例而言，可製備去糖基化抗體(亦即，缺乏糖基化之抗體)。糖基化可經改變以(例如)增加抗體對抗原之親和力。可藉由(例如)改變抗體序列內之一或多個糖基化位點實現該等碳水化合物修飾。舉例而言，可進行一或多個胺基酸取代，其導致消除一或多個可變區糖基化位點從而消除該位點處之糖基化。該去糖基化可增加抗體對抗原之親和力。該方法更詳細描述於PCT公開案WO 2003016466A2及美國專利第5,714,350號及第6,350,861號中，其各自全部以引用之方式併入本文中。
另外或其他，可製備具有改變之糖基化類型的本發明之經修飾 抗體，諸如海藻糖基殘基之量減少之低海藻糖基化抗體或平分型GlcNac結構增加之抗體。已證明該等改變之糖基化模式將增加抗體之ADCC能力。該等碳水化合物修飾可藉由(例如)於糖基化機構改變之宿主細胞中表現抗體來實現。糖基化機構改變之細胞已在此項技術中得以描述且可用作表現本發明之重組抗體從而產生糖基化改變之抗體的宿主細胞。例如參見Shields,R.L.等人，(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740；Umana等人，(1999)Nat.Biotech.17：176-1以及歐洲專利第EP 1,176,195號；PCT公開案WO 03/035835；WO 99/54342 80；其各自全部以引用之方式併入本文中。
蛋白質糖基化視所關注之蛋白質之胺基酸序列以及表現蛋白質之宿主細胞而定。不同生物體可產生不同糖基化酶(例如，糖基轉移酶及糖苷酶)且具有不同的可利用受質(核苷酸糖)。歸因於該等因素，蛋白質糖基化模式及糖基殘基之組成可視表現特定蛋白質之宿主系統而不同。適用於本發明之糖基殘基可包括(但不限於)葡萄糖、半乳糖、甘露糖、海藻糖、正乙醯基葡糖胺及唾液酸。糖基化結合蛋白質較佳包含糖基殘基以致糖基化模式為人類的。
熟習此項技術者已知不同蛋白質糖基化可產生不同蛋白質特徵。舉例而言，在諸如酵母之微生物宿主中產生且利用酵母內源性途徑糖基化之治療蛋白質的功效可比於諸如CHO細胞株之哺乳動物細胞中表現之相同蛋白質的功效低。該等醣蛋白亦可在人類體內具有免疫原性且在投藥後展示降低之活體內半衰期。人類及其他動物中之特定受體可識別特定糖基殘基且促進將蛋白質自血流中快速清除。其他副作用可包括蛋白質摺疊、溶解性、對蛋白酶之敏感度、運輸、轉運、區室化、分泌、由其他蛋白質或因子識別、抗原性或過敏原性的改變。因此，醫師可能偏好具有特定糖基化組成及模式(例如與人類細胞或預定個體動物之物種特異性細胞中所產生者相同或至少類似的糖 基化組成及模式)之治療蛋白質。
表現不同於宿主細胞之糖基化蛋白質的糖基化蛋白質可藉由基因修飾宿主細胞以表現異源糖基化酶來實現。使用此項技術已知之技術，醫師能產生展現人類蛋白質糖基化之抗體或其抗原結合部分。舉例而言，已對酵母菌株基因修飾以表現非天然存在之糖基化酶，以致該等酵母菌株中所產生之糖基化蛋白質(醣蛋白)展現與動物細胞(尤其人類細胞)之蛋白質糖基化相同的蛋白質糖基化(美國專利申請案20040018590及20020137134及PCT公開案WO 2005100584 A2)。
另外，熟習此項技術者應瞭解可使用經基因工程改造成表現各種糖基化酶之宿主細胞之文庫來表現所關注之蛋白質，以致該文庫之成員宿主細胞產生具有變異糖基化模式之所關注之蛋白質。醫師隨後可選擇且分離具有特定新穎的糖基化模式之所關注之蛋白質。具有經特別選擇之新穎糖基化模式之蛋白質較佳展現改進或改變之生物學性質。
5.9 抗個體基因型抗體(Anti-idiotypic antibody)
除結合蛋白質外，本發明亦係針對一種對本發明之該等結合蛋白質具有特異性之抗個體基因型(抗Id)抗體。抗Id抗體為識別通常與另一抗體之抗原結合區締合之獨特決定子的抗體。可藉由用結合蛋白質或其含CDR之區域使動物免疫來製備抗Id。經免疫動物將識別且應答免疫抗體之個體基因型決定子且產生抗Id抗體。抗Id抗體亦可用作在另一動物中誘導免疫反應之「免疫原」，從而產生所謂的抗抗Id抗體。
6.抗體之用途
鑒於本申請案之中和抗體或其部分之結合人類RGM A之能力，其可用於使用諸如酶聯免疫吸附檢定(ELISA)、放射免疫檢定(RIA)或組織免疫組織化學之習知免疫檢定偵測人類RGM A(例如，在諸如血 清或血漿之生物樣品中)。本申請案提供一種偵測生物樣品中之人類RGM A之方法，其包含使生物樣品與本發明之抗體或抗體部分接觸且偵測與人類RGM A結合之抗體(或抗體部分)或未結合抗體(或抗體部分)，由此偵測生物樣品中之人類RGM A。直接或間接用可偵測物質標記抗體以便利結合或未結合抗體之偵測。合適的可偵測物質包括各種酶、輔基、螢光物質、發光物質及放射性物質。合適酶之實例包括辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；合適輔基複合物之實例包括抗生蛋白鏈菌素/生物素及抗生物素蛋白/生物素；合適螢光物質之實例包括傘酮(umbelliferone)、螢光素、螢光異硫氰酸鹽、若丹明、二氯三嗪基胺螢光素、丹醯氯或藻紅素；發光物質之實例包括魯米諾(luminol)；且合適放射性物質之實例包括3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho、153Sm。
本申請案之抗體及抗體部分較佳能夠於活體外與活體內中和人類RGM A活性。因此，本發明之該等抗體及抗體部分可用於抑制RGM A與其受體再生蛋白、BMP-2及或BMP-4之結合，且因此抑制所得活性。
在另一實施例中，本申請案提供一種降低個體、有利地患有因產生RGM A活性而受害之疾病或病症之個體的RMG A活性的方法。本申請案提供藉由使用本申請案之單株抗體阻止RGM A與再生蛋白及/或BMP-2及/或BMP-4結合來降低患有該疾病或病症之個體之RGM A活性的方法。本申請案之抗體、尤其本文中所揭示之人類化抗體可出治療目的而向人類個體投與。此外，本申請案之抗體可向表現抗體能夠結合之RGM A的非人類哺乳動物投與以達成獸醫目的或作為人類疾病之動物模型。關於後者，該等動物模型可適用於評估本發明抗體之治療功效(例如，測試投藥之劑量及時程)。
如本文中所使用之術語「因RGM活性而受害之病症」意欲包括 已展示或懷疑患該病症之個體中RGM A或其所產生之活性的存在為造成該病症之病理生理學的原因或為促使該病症惡化之因素的疾病及其他病症。因此，因RGM活性而受害之病症為預期降低RGM A活性會減輕病症之症狀及/或進展的病症。可用本發明之抗體治療之病症的非限制性實例包括以下與本發明抗體之醫藥組合物相關之部分中所論述的彼等病症。
應認識到RGM A在與各種疾病相關之病理學中發揮重要作用，該等疾病包括與神經退化或神經再生過程受到抑制從而產生麻痹相關的神經疾病。其包括癡呆、老年癡呆、輕度認知損傷、阿茲海默氏症相關性癡呆、亨廷頓舞蹈病、遲發性運動障礙、運動過度、躁狂症、帕金森氏病、司迪爾-理查症候群、唐氏症候群、重症肌無力、神經外傷、血管澱粉樣變性、出現澱粉樣變性之腦出血I、腦發炎、弗里德賴希共濟失調(Friedrich's ataxia)、急性精神混亂病症、青光眼、阿茲海默氏病、肌萎縮側索硬化、臂叢神經損傷、包括外傷性腦損傷之腦損傷、大腦性麻痹、格林-巴利疾病、腦白質營養不良、多發性硬化、脊髓灰質炎後遺症、脊椎裂、脊髓損傷、脊髓性肌萎縮、脊椎腫瘤、中風及橫貫性脊髓炎。
另外，如先前所論述，介於上述搭配物中任一者之間的DVD免疫球蛋白或雙特異性抗體可能有用。如上所述之該等抗體製劑可適用於治療阿茲海默氏病、帕金森氏病、脊髓損傷、外傷性腦損傷、多發性硬化、周圍神經損傷、精神分裂症、抑鬱症、焦慮以及以上所列舉之任何可塑性及神經突生長及神經毒性相關疾病。
本申請案之抗體亦可與允許跨膜轉移之肽組合以包括靶向細胞內標靶蛋白質。該等肽序列可包括(但不限於)tat、觸角足(antennapedia)、聚精胺酸、一些抗微生物肽。該等肽可允許轉移穿過膜，該等膜包括細胞質膜以及上皮及內皮膜，包括血-腦屏障、腸黏 膜、腦脊膜及其他膜。
本申請案之抗體或抗體部分亦可與一或多種適用於治療如先前段落所論述之涉及RGM A活性之病症的其他小分子治療劑一起投與。應理解，本申請案之抗體或其抗原結合部分可單獨使用或與例如治療劑之另一藥劑組合使用，該另一藥劑係由熟習此項技術者選擇以用於其預定目的。舉例而言，該另一藥劑可為技術公認為適用於治療由本發明之抗體治療之疾病或病狀的治療劑。該另一藥劑亦可為賦予治療組合物有益屬性的藥劑，例如影響組合物之黏度之藥劑。
7.醫藥組合物
本發明亦提供醫藥組合物，其包含本發明之抗體或其抗原結合部分及醫藥學上可接受之載劑。包含本發明抗體之醫藥組合物用於(但不限於)診斷、偵測或監測病症；預防、治療、處理或改善病症或其一或多種症狀；及/或研究。在一特定實施例中，組合物包含一或多種本發明之抗體。在另一實施例中，醫藥組合物包含一或多種本發明之抗體及除了本發明抗體以外的一或多種可治療因RGM A活性而受害之病症之預防劑或治療劑。較佳地，已知預防劑或治療劑適用於或已用於或目前正用於預防、治療、控制或改善病症或其一或多種症狀。根據該等實施例，組合物可進一步包含載劑、稀釋劑或賦形劑。
本發明之抗體及抗體部分可併入適於投與個體之醫藥組合物中。醫藥組合物通常包含本發明之抗體或抗體部分及醫藥學上可接受之載劑。如本文中所使用之「醫藥學上可接受之載劑」包括生理學可相容之任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑以及其類似載劑。醫藥學上可接受之載劑的實例包括水、生理食鹽水、磷酸鹽緩衝之生理食鹽水、右旋糖、甘油、乙醇及其類似物中之一或多種以及其組合。在許多情況下，較佳組合物中包括等張劑，例如，糖、多元醇(諸如甘露醇、山梨醇)或氯化鈉。醫 藥學上可接受之載劑可進一步包含極少量之輔助物質，諸如濕潤劑或乳化劑、防腐劑或緩衝劑，其可增加抗體或抗體部分之存放期或效用。
多種傳遞系統為吾人所知且可用於投與一或多種本發明之抗體或者一或多種本發明之抗體與適用於預防、控制、治療或改善病症或其一或多種症狀之預防劑或治療劑的組合，例如囊封於脂質體、微粒、微膠囊中；能夠表現抗體或抗體片段之重組細胞；受體介導之吞噬作用(例如參見Wu及Wu,J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987))；構築作為反轉錄病毒或其他載體之部分之核酸等。投與本發明之預防劑或治療劑之方法包括(但不限於)非經腸投藥(例如經皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內及皮下)、硬膜外投藥、瘤內投藥及黏膜投藥(例如，鼻內及經口途徑)。另外，可例如利用吸入器或噴霧器及具有氣霧劑之調配物使用經肺投藥。例如參見美國專利第6,019,968號、第5,985,320號、第5,985,309號、第5,934,272號、第5,874,064號、第5,855,913號、第5,290,540號及第4,880,078號及PCT公開案第WO 92/19244號、第WO 97/32572號、第WO 97/44013號、第WO 98/31346號及第WO 99/66903號，其各自全部以引用之方式併入本文中。在一實施例中，使用Alkermes AIR®肺用藥物傳遞技術(Alkermes,Inc.,Cambridge,Mass.)投與本發明之抗體、組合療法或本發明之組合物。在一特定實施例中，肌肉內、靜脈內、瘤內、經口、鼻內、經肺或皮下投與本發明之預防劑或治療劑。可由任何便利途徑，例如藉由輸注或快速注射、藉由經上皮或皮膚黏膜內壁(例如口腔黏膜、直腸及腸黏膜等)吸收，來投與預防劑或治療劑且其可與其他生物活性劑一起投與。投藥可為全身或局部投藥。
在一特定實施例中，可能需要將本發明之預防劑或治療劑局部投與需要治療之區域；此可由例如(但不限於)局部輸注、注射或藉助 於植入物實現，該植入物為多孔或無孔物質，包括膜及基質，諸如矽橡膠膜(sialastic membrane)、聚合物、纖維基質(例如，Tisseel®)或膠原蛋白基質。在一實施例中，向個體之受影響區域局部投與有效量之一或多種本發明之抗體拮抗劑以預防、治療、控制及/或改善病症或其症狀。在另一實施例中，向個體之受影響區域局部投與有效量之一或多種本發明之抗體以及有效量之一或多種除本發明之抗體以外的療法(例如，一或多種預防劑或治療劑)以預防、治療、控制及/或改善病症或其一或多種症狀。
在另一實施例中，預防劑或治療劑可以控釋或持續釋放系統傳遞。在一實施例中，可使用泵實現控釋或持續釋放(參見Langer，同上文；Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：20；Buchwald等人，1980,Surgery 88：507；Saudek等人，1989,N.Engl.J.Med.321：574)。在另一實施例中，可使用聚合物質實現本發明之療法之控釋或持續釋放(例如參見Medical Applications of Controlled Release,Langer及Wise(編)，CRC Pres.,Boca Raton,Fla.(1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen及Ball(編)，Wiley,New York(1984)；Ranger及Peppas,1983,J.,Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61；亦參見Levy等人，1985,Science 228：190；During等人，1989,Ann.Neurol.25：351；Howard等人，1989,J.Neurosurg.7 1：105)；美國專利第5,679,377號；美國專利第5,916,597號；美國專利第5,912,015號；美國專利第5,989,463號；美國專利第5,128,326號；PCT公開案第WO 99/15154號；及PCT公開案第WO 99/20253號。持續釋放調配物中使用之聚合物之實例包括(但不限於)聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酸酐、聚(N-乙烯基吡咯啶酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯醯胺、聚(乙二 醇)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)及聚原酸酯。在一較佳實施例中，持續釋放調配物中使用之聚合物為惰性的、不含可浸出雜質、儲存穩定、無菌且生物可降解。在又一實施例中，控釋或持續釋放系統可鄰近預防或治療標靶置放，從而僅需要全身劑量之一部分(例如參見，Goodson,Medical Applications of Controlled Release，同上文，第2卷，第115-138頁(1984))。
控釋系統論述於Langer之綜述(1990,Science 249：1527-1533)中。可使用熟習此項技術者已知之任何技術製備包含一或多種本發明之治療劑之持續釋放調配物。例如參見美國專利第4,526,938號；PCT公開案WO 91/05548；PCT公開案WO 96/20698；Ning等人，1996,"Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39：179-189；Song等人，1995,"Antibody Mediated Lung Targeting of Long- Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50：372-397；Cleek等人，1997,"Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro.Int'l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24：853-854；及Lam等人，1997,"Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc.Int'l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24：759-760，其各自全部以引用之方式併入本文中。
在本發明組合物為編碼預防劑或治療劑之核酸的特定實施例中，可藉由將核酸構築為適當核酸表現載體之部分，且例如利用逆轉錄病毒載體(參見美國專利第4,980,286號)或藉由直接注射或利用微粒轟擊(例如基因槍；Biolistic,Dupont)或以脂質或細胞表面受體或轉染劑包覆或藉由將其與已知進入核之同源盒樣肽連接投與(例如參見 Joliot等人，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：1864-1868)將其投與以使其變為細胞內的，來活體內投與核酸以促進其所編碼之預防劑或治療劑表現。或者，可於細胞內引入核酸且將其併入宿主細胞DNA中以藉由同源重組表現。
本發明之醫藥組合物係調配成與其預定投與途徑相容。投藥途徑之實例包括(但不限於)非經腸，例如靜脈內、皮內、皮下、經口、鼻內(例如，吸入)、經皮(例如，局部)、經黏膜；及直腸投藥。在一特定實施例中，組合物係根據常規程序調配為適合於靜脈內、皮下、肌肉內、經口、鼻內或局部向人類投與之醫藥組合物。用於靜脈內投與之組合物通常為於無菌等張水性緩衝液中之溶液。必要時，組合物亦可包括增溶劑及緩解注射部位之疼痛之諸如利多卡因(lignocamne)的局部麻醉劑。
若欲局部投與本發明之組合物，則組合物可調配為軟膏、乳膏、經皮貼片、洗劑、凝膠、洗髮精、噴霧劑、氣霧劑、溶液、乳液或熟習此項技術者熟知之其他形式的形式。例如參見Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms，第19版，Mack Pub.Co.,Easton,Pa.(1995)。對於不可噴霧之局部劑型，通常使用包含與局部施用相容之載劑或一或多種賦形劑且動力黏度較佳大於水之黏稠乃至半固體或固體形式。合適調配物包括(不限於)溶液、懸浮液、乳液、乳膏、軟膏、散劑、擦劑、油膏及其類似物，必要時將其滅菌或與影響諸如滲透壓之各種性質之助劑(例如防腐劑、穩定劑、濕潤劑、緩衝液或鹽)混合。其他合適的局部劑型包括可噴霧之氣霧劑製劑，其中活性成分較佳與固體或液體惰性載劑組合以與加壓揮發性物質(例如，諸如氟利昂(freon)之氣體推進劑)之混合物之形式封裝或封裝於塑料擠瓶(squeeze bottle)中。必要時，亦可向醫藥組合物及劑型中添加增濕劑或保濕劑。該等其他成分之實 例為此項技術中所熟知。
若本發明之方法包含鼻內投與組合物，則組合物可調配成氣霧劑形式、噴霧劑、薄霧或滴液形式。詳言之，根據本發明使用之預防劑或治療劑可使用合適推進劑(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合適氣體)以來自加壓包裝或噴霧器之氣霧劑噴霧呈現形式方便地傳遞。在加壓氣霧劑之情況下，劑量單位可藉由提供閥門以傳遞計量之量來確定。可調配含有化合物與諸如乳糖或澱粉之合適粉末主劑之粉末混合物的膠囊及藥包(由例如明膠構成)用於吸入器或吹入器。
若本發明之方法包含經口投藥，則組合物可調配為經口之錠劑、膠囊、扁囊劑、膠囊錠(gelcap)、溶液、懸浮液及其類似物之形式。錠劑或膠囊可藉由習知方式用醫藥學上可接受之賦形劑製備，該等賦形劑諸如黏合劑(例如預膠凝化玉米澱粉、聚乙烯吡咯啶酮或羥基丙基甲基纖維素)、填充劑(例如乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)、潤滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石或矽石)、崩解劑(例如馬鈴薯澱粉或乙醇酸澱粉鈉)或濕潤劑(例如十二烷基硫酸鈉)。錠劑可由此項技術中熟知之方法包覆。經口投與之液體製劑可採用(但不限於)溶液、糖漿或懸浮液形式，或其可以在使用之前用水或其他合適媒劑復水之乾燥產品形式提供。該等液體製劑可藉由習知方式用醫藥學上可接受之添加劑製備，該等添加劑諸如懸浮劑(例如山梨糖醇糖漿、纖維素衍生物或氫化可食用脂肪)；乳化劑(例如卵磷脂或阿拉伯膠)；非水性媒劑(例如杏仁油、油酯(oily ester)、乙醇或分餾植物油)；及防腐劑(例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯或山梨酸)。該等製劑亦可酌情含有緩衝鹽、調味劑、著色劑及甜味劑。經口投與之製劑可經適當調配以緩釋、控釋或持續釋放預防劑或治療劑。
本發明之方法可包含例如利用吸入器或噴霧器經肺投與與氣霧 劑一起調配之組合物。例如參見美國專利第6,019,968號、第5,985,320號、第5,985,309號、第5,934,272號、第5,874,064號、第5,855,913號、第5,290,540號及第4,880,078號；及PCT公開案第WO 92/19244號、第WO 97/32572號、第WO 97/44013號、第WO 98/31346號及第WO 99/66903號，其各自全部以引用之方式併入本文中。在一特定實施例中，使用Alkermes AIR®肺用藥物傳遞技術(Alkermes,Inc.,Cambridge,Mass.)投與本發明之抗體、組合療法及/或本發明之組合物。
本發明之方法可包含藉由注射(例如，藉由快速注射或連續輸注)投與經調配用於非經腸投藥之組合物。用於注射之調配物可以添加有防腐劑之單位劑型(例如於安瓶中或於多劑量容器中)提供。組合物可採用諸如於油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液或乳液之形式且可含有諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑之調配劑。或者，活性成分可呈在使用之前用合適媒劑(例如，無菌無熱原質水)復水之粉末形式。本發明之方法可另外包含投與調配為儲槽式製劑之組合物。該等長效調配物可藉由植入(例如，皮下或肌肉內)或藉由肌肉內注射來投與。因此，例如，組合物可用合適的聚合或疏水性物質(例如，如於可接受之油中之乳液)或離子交換樹脂或微溶衍生物(例如，微溶鹽)調配。
本發明之方法涵蓋投與調配為中性或鹽形式之組合物。醫藥學上可接受之鹽包括與陰離子形成之鹽，諸如衍生自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等之鹽；及與陽離子形成之鹽，諸如衍生自氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙基胺基乙醇、組胺酸、普魯卡因(procaine)等之鹽。
組合物之成分通常單獨或以混合在一起之單位劑型(例如以乾燥凍乾粉末或無水濃縮物形式)提供於指示活性劑之量之密封容器(諸如安瓿或藥囊)中。當投藥模式為輸注時，組合物可以含有無菌醫藥級 水或生理食鹽水之輸液瓶分配。當投藥模式為注射時，可提供注射用無菌水或生理食鹽水之安瓿以便可在投藥之前混合成分。
詳言之，本發明亦提供本發明之一或多種預防劑或治療劑或者醫藥組合物係封裝於指示藥劑之量之密閉容器(諸如安瓿或藥囊)中。在一實施例中，本發明之一或多種預防劑或治療劑或者醫藥組合物係以乾燥無菌凍乾粉末或無水濃縮物形式提供於密閉容器中且其可復水(例如用水或生理食鹽水)成適當濃度以向個體投與。較佳地，本發明之一或多種預防劑或治療劑或者醫藥組合物係以乾燥無菌凍乾粉末形式以至少5mg、更佳至少10mg、至少15mg、至少25mg、至少35mg、至少45mg、至少50mg、至少75mg或至少100mg之單位劑量提供於密閉容器中。本發明之凍乾預防劑或治療劑或者醫藥組合物應在2℃與8℃之間儲存於其初始容器中，且本發明之預防劑或治療劑或者醫藥組合物應在復水後在1週內、較佳5天內、72小時內、48小時內、24小時內、12小時內、6小時內、5小時內、3小時內或1小時內投與。在一替代性實施例中，本發明之一或多種預防劑或治療劑或者醫藥組合物係以液體形式提供於指示藥劑之量及濃度之密閉容器中。所投與之組合物之液體形式較佳係以至少0.25mg/ml、更佳至少0.5mg/ml、至少1mg/ml、至少2.5mg/ml、至少5mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/kg、至少25mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml或至少100mg/ml提供於密閉容器中。液體形式應在2℃與8℃之間儲存於其最初容器中。
本發明之抗體及抗體部分可併入適於非經腸投藥之醫藥組合物中。抗體或抗體部分較佳應製備成含有0.1-250mg/ml抗體之可注射溶液。可注射溶液可由於無色或琥珀色小瓶、安瓿或預填充注射器中之液體或凍乾劑型構成。緩衝液可為L-組胺酸(1-50mM)，最佳5-10mM，pH值為5.0至7.0(最佳pH值為6.0)。其他合適緩衝液包括(但不限 於)琥珀酸鈉、檸檬酸鈉、磷酸鈉或磷酸鉀。可使用濃度為0-300mM(對於液體劑型而言，最佳為150mM)之氯化鈉改質溶液之毒性。對於凍乾劑型而言，可包括低溫保護劑，主要為0-10%蔗糖(最佳0.5-1.0%)。其他合適低溫保護劑包括海藻糖及乳糖。對於凍乾劑型而言，可包括增積劑，主要為1-10%甘露醇(最佳2-4%)。液體與凍乾劑型中均可使用穩定劑，主要為1-50mM L-甲硫胺酸(最佳5-10mM)。其他合適增積劑包括甘胺酸、精胺酸，可包括如0-0.05%聚山梨酯80(最佳0.005-0.01%)。其他界面活性劑包括(但不限於)聚山梨酸酯20及BRIJ界面活性劑。製備成用於非經腸投藥之可注射溶液的包含本發明之抗體及抗體部分之醫藥組合物可進一步包含適用作佐劑之藥劑，諸如用於增加治療蛋白質(例如，抗體)之吸收或分散的藥劑。特別適用之佐劑為玻尿酸酶，諸如Hylenex®(重組人類玻尿酸酶)。在可注射溶液中添加玻尿酸酶將在非經腸投藥、尤其皮下投藥後改進人類之生物可用性。其亦允許較高注射部位體積(亦即大於1ml)以及較少疼痛及不適，及最低注射部位反應發生率(參見WO2004078140、US 2006104968，其以引用之方式併入本文中)。
本發明之組合物可呈多種形式。該等形式包括(例如)液體、半固體及固體劑型，諸如液體溶液(例如，可注射溶液及可輸注溶液)、分散液或懸浮液、錠劑、丸劑、散劑、脂質體及栓劑。較佳之形式視預定投藥模式及治療應用而定。典型之較佳組合物呈可注射或可輸注溶液形式，諸如類似於利用其他抗體使人類被動免疫所使用之組合物的組合物。較佳投藥模式為非經腸(例如靜脈內、皮下、腹膜內、肌肉內)模式。在一較佳實施例中，藉由靜脈內輸注或注射投與抗體。在另一較佳實施例中，藉由肌肉內或皮下注射投與抗體。
治療組合物通常必須在製造及儲存條件下無菌且穩定。組合物可調配為溶液、微乳液、分散液、脂質體或適於高藥物濃度之其他有 序結構。可藉由將於適當溶劑中之所需量之活性化合物(亦即，抗體或抗體部分)與以上列舉之成分中之一種或該等成分之組合合併，接著根據需要過濾滅菌，來製備無菌可注射溶液。通常藉由將活性化合物併入無菌媒劑中來製備分散液，該無菌媒劑含有基礎分散介質及來自上文所列舉之成分之其他所需成分。在用於製備無菌可注射溶液之無菌凍乾粉末之情況下，較佳製備方法為真空乾燥及噴霧乾燥，該噴霧乾燥產生活性成分加來自其先前無菌過濾之溶液的任何其他所需成分的粉末。可(例如)藉由使用諸如卵磷脂之包衣、在分散液之情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持溶液之適當流動性。可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中包括例如單硬脂酸鹽及明膠之延遲吸收劑來達成。
雖然對於許多治療應用而言，較佳投藥途徑/模式為皮下注射、靜脈內注射或輸注，但本發明之抗體及抗體部分可由此項技術中已知之多種方法投與。如熟習此項技術者應瞭解，投藥途徑及/或投藥模式將視所需結果而變化。在某些實施例中，活性化合物可用將保護化合物以免快速釋放之載劑製備，諸如控釋調配物，包括植入物、經皮貼片及微囊封傳遞系統。可使用生物可降解、生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。製備該等調配物之許多方法均已取得專利權或通常為熟習技術者所知。例如參見Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson編，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
在某些實施例中，本發明之抗體或抗體部分可例如與惰性稀釋劑或可吸收之可食用載劑一同經口投與。該化合物(必要時與其他成份)亦可密封於硬殼或軟殼明膠膠囊中，壓成錠劑，或直接併入個體之飲食中。對於經口治療性投藥而言，可將化合物與賦形劑合併且以可攝取錠劑、經頰錠劑、片劑、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、糯米紙 囊劑及其類似物之形式使用。為經由除非經腸投藥以外之形式投與本發明之化合物，可能有必要用防止其失活之物質包覆化合物或將化合物與防止其失活之物質共投與。
亦可在組合物中併入輔助性活性化合物。在某些實施例中，將本發明之抗體或抗體部分與一或多種適用於治療因RGM A活性而受害之病症之其他治療劑共調配及/或共投與。舉例而言，可將本發明之抗RGM A抗體或抗體部分與一或多種結合其他標靶之其他抗體(例如，結合細胞激素或結合細胞表面分子之抗體)共調配及/或共投與。此外，一或多種本發明之抗體可與兩種或兩種以上上述治療劑組合使用。該等組合療法可有利地利用較低之所投與之治療劑劑量，從而避免與各種單一療法相關之可能的毒性或併發症。
在某些實施例中，將RGM A之抗體或其片段與此項技術已知之半衰期延長媒劑連接。該等媒劑包括(但不限於)Fc結構域、聚乙二醇及葡聚糖。該等媒劑描述於(例如)美國申請案第09/428,082號及公開之PCT申請案第WO 99/25044號中，其以引用之方式併入本文中用於任何目的。
在一特定實施例中，藉由基因療法投與包含編碼本發明之抗體或者本發明之另一預防劑或治療劑之核苷酸序列的核酸序列以治療、預防、控制或改善病症或其一或多種症狀。基因療法係指藉由向個體投與已表現或可表現核酸所執行之療法。在本發明之該實施例中，核酸產生介導預防或治療作用之其所編碼之本發明之抗體或者預防劑或治療劑。
根據本發明可使用此項技術中可利用之用於基因療法之任何方法。關於基因療法之方法之綜述，請參見Goldspiel等人，1993,Clinical Pharmacy 12：488-505；Wu及Wu,1991,Biotherapy 3：87-95；Tolstoshev,1993,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596； Mulligan,Science 260：926-932(1993)；及Morgan及Anderson,1993,Ann.Rev.Biochem.62：191-217；1993年5月，TIBTECH 11(5)：155-215。可使用之重組DNA技術之技術中通常已知的方法描述於Ausubel等人(編)，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley &Sons,NY(1993)；及Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY(1990)中。基因療法之各種方法之詳細描述揭示於US 20050042664 A1中，該專利係以引用之方式併入本文中。
RGM A在與如本文中以上所定義之各種疾病相關之病理學中發揮重要作用。已描述RGM A及RGM蛋白質在患有外傷性腦損傷之人類之病變部位(Schwab等人，Arch.Neurol.62：1561-8,2005a)、中風損害之人腦之梗塞性缺血半暗帶(infarcted penumbra)及核心區域中(Schwab等人，Arch.Neurol.62：1561-8,2005a)、患有帕金森氏病之患者之黑質中(Bossers等人，Brain Pathology第19卷：91-107,2008)上調。因此，RGM A抗體為用於腦中風、外傷性腦損傷、帕金森氏病、阿茲海默氏病及人類神經系統之其他神經退化性病症之組合療法的合適藥劑。在中風患者中，前三小時內之目前治療係由傳遞組織型纖溶酶原活化劑以溶解血塊組成(Liang等人，Arch.Neurol.65：1429-33,2008)，且該治療原則上可與提供不同治療方法及較遠擴展之治療窗的RGM A抗體傳遞組合。在阿茲海默氏病中，利用RGMA抗體之藥物組合可能利用核准的認知增強劑冬尼培唑(Donepezil)、美金剛(Memantine)，且該方法可顯著減慢進行性神經病理學。鼻內傳遞胰島素對注意力及記憶力具有積極作用(Hanson及Frey,BMC Neurosci.9：S5,2008)且為RGM A抗體之可能的投藥途徑，從而繞過血-腦屏障。在帕金森氏病(PD)患者中，目前治療主要基於多巴胺能劑，如多巴胺前藥左旋多巴(levodopa)(Khor及Hsu,Curr.Clin.Pharmacol.2： 234-43,2007)、非麥角靈多巴胺激動劑羅匹尼洛(ropinirole)(Jost等人，J.Neurol.255增刊5：60-63,2008)、單胺氧化酶B抑制劑雷沙吉林(Rasagiline)及司來吉蘭(Selegiline)(Elmer及Bertoni,Expert Opin.Pharmacother.9：2759-72,2008)。雖然其對於早期及輕度PD具有有益作用，但該等藥物均不能夠預防黑質以及相關腦皮層下及皮層區域之進行性退化，且因此利用刺激再生之RGM A抗體之組合療法可減慢疾病過程。
作為抗氧化劑、自由基捕獲劑、如苯妥英(Phenytoin)之抗痙攣性藥物或貧血藥物促紅血球生成素(Erythropoetin)之任何神經保護劑均適於利用促再生RGM A抗體之組合療法，從而擴展神經保護劑之通常極短之治療性治療窗。
本發明之抗體及抗體部分可用於治療患有該等疾病之人類。
應瞭解，本發明之抗體或其抗原結合部分可單獨使用或與另一藥劑(例如治療劑)組合使用，該另一藥劑係由熟習此項技術者出於其預定目的選擇。舉例而言，該另一藥劑可為技術公認為適用於治療由本發明抗體治療之疾病或病狀之治療劑。該另一藥劑亦可為賦予治療組合物有利屬性之藥劑，例如影響組合物之黏度的藥劑。
應進一步瞭解，將包括在本發明內之組合為適用於其預定目的之組合。以下陳述之藥劑係出於說明性目的且不意欲限制本發明。作為本發明之部分的組合可為本發明之抗體及至少一種選自以下清單之其他藥劑。組合亦可包括一種以上其他藥劑，例如兩種或三種其他試劑，只要該組合使得所形成之組合物可執行其預定作用即可。
可與本發明之抗體或抗體部分組合用於多發性硬化之治療劑之非限制性實例包括以下各物：皮質類固醇；潑尼松龍(prednisolone)；甲潑尼龍；硫唑嘌呤(azathioprine)；環磷醯胺；環孢素；甲胺喋呤；4-胺基吡啶；替紮尼定(tizanidine)；干擾素-β1a(AVONEX；Biogen)； 干擾素-β1b(BETASERON；Chiron/Berlex)；干擾素α-n3(Interferon Sciences/Fujimoto)；干擾素-α(Alfa Wassermann/J&J)；干擾素β1A-IF(Serono/Inhale Therapeutics)；聚乙二醇化干擾素α2b(Peginterferon α2b)(Enzon/Schering-Plough)；共聚物1(Cop-1；COPAXONE；Teva Pharmaceutical Industries,Inc.)；高壓氧；靜脈內免疫球蛋白；克拉屈濱(clabribine)；其他人類細胞激素或生長因子及其受體(例如TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-23、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF及PDGF)之抗體或拮抗劑。本發明之抗體或其抗原結合部分可與細胞表面分子(諸如CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90)或其配位體之抗體組合。本發明之抗體或其抗原結合部分亦可與以下藥劑組合：諸如甲胺喋呤、環孢素、FK506、雷帕黴素、黴酚酸嗎啉乙酯(mycophenolate mofetil)、來氟米特(leflunomide)、NSAID(例如布洛芬(ibuprofen))、皮質類固醇(諸如潑尼松龍)、磷酸二酯酶抑制劑、腺苷激動劑、抗血栓劑、補體抑制劑、腎上腺素劑、藉由諸如TNFα或IL-1之促發炎性細胞激素干擾信號轉導之藥劑(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制劑)、IL-1β轉化酶抑制劑、TACE抑制劑、T細胞信號轉導抑制劑(諸如激酶抑制劑)、金屬蛋白酶抑制劑、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、硫唑嘌呤、6-巰基嘌呤、血管收縮素轉化酶抑制劑、可溶性細胞激素受體及其衍生物(例如可溶性p55或p75 TNF受體、sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R)及抗發炎性細胞激素(例如IL-4、IL-10、IL-13及TGFβ)。
可與抗體或其抗原結合部分組合用於多發性硬化之治療劑的較佳實例包括干擾素-β(例如，IFNβ1a及IFNβ1b)；克帕松(copaxone)、皮質類固醇、卡斯蛋白酶抑制劑(caspase inhibitor)(例如卡斯蛋白酶-1抑制劑)、IL-1抑制劑、TNF抑制劑以及CD40配位體及CD80之抗體。
本發明之抗體或其抗原結合部分亦可與下列藥劑組合：諸如阿侖單抗(alemtuzumab)、屈大麻酚(dronabinol)、尤利美(Unimed)、達利珠單抗(daclizumab)、米托蒽醌(mitoxantrone)、鹽酸紮利羅登(xaliproden hydrochloride)、胺吡啶(fampridine)、乙酸格拉替美(glatiramer acetate)、那他珠單抗(natalizumab)、西納吡哆(sinnabidol)、a-免疫激素NNSO3、ABR-215062、AnergiX.MS、趨化因子受體拮抗劑、BBR-2778、卡拉胍素(calagualine)、CPI-1189、LEM(脂質體囊封之米托蒽醌)、THC.CBD(大麻鹼激動劑)MBP-8298、美索潘(mesopram)(PDE4抑制劑)、MNA-715、抗IL-6受體抗體、萘羅瓦西(neurovax)、吡非尼酮(pirfenidone)阿羅曲普1258(allotrap 1258)(RDP-1258)、sTNF-R1、他侖帕奈(talampanel)、特立氟胺(teriflunomide)、TGF-β2、替利莫肽(tiplimotide)、VLA-4拮抗劑(例如TR-14035、VLA4 Ultrahaler、Antegran-ELAN/Biogen)、干擾素γ拮抗劑、IL-4激動劑。
本發明之醫藥組合物可包括「治療有效量」或「預防有效量」之本發明抗體或抗體部分。「治療有效量」係指在必需劑量下及在必需時間內有效達成所需治療結果的量。抗體或抗體部分之治療有效劑量可由熟習此項技術者確定且可視諸如疾病狀態、個體之年齡、性別及體重以及抗體或抗體部分在個體中引起所需反應之能力之因素而變化。治療有效量亦為抗體或抗體部分之治療有益作用超過任何毒性或有害作用的量。「預防有效量」係指在必需劑量下且在必需時間內有效達成所需預防結果之量。通常，因為預防劑量係在疾病之前或在疾病早期階段時用於個體，所以預防有效量將小於治療有效量。
可調整劑量方案以提供最佳所需反應(例如治療或預防反應)。舉例而言，可投與單一大丸劑；可隨時間投與若干分次劑量；或可按治療情況之緊急需要指示按比例減小或增加劑量。出於投藥簡便性及劑 量均一性考慮，將非經腸組合物調配成單位劑型尤其有利。如本文中所使用之單位劑型係指適宜以整體劑量用於待治療之哺乳動物個體的物理離散單元；每一單元含有與所需醫藥載劑締合之經計算將產生所需治療作用之預定量的活性化合物。本發明之單位劑型的規格係由以下因素決定且直接視以下因素而定：(a)活性化合物之獨特特徵及欲達成之特定治療或預防作用；及(b)混合該活性化合物以治療個體之敏感性之技術內所固有之限制。
本發明之抗體或抗體部分的治療或預防有效量之一例示性非限制性範圍為0.1-20mg/kg，更佳為1-10mg/kg。應注意劑量值可能隨待減輕之病狀之類型及嚴重程度而變化。應進一步瞭解，對於任何特定個體而言，特定劑量方案應根據個體需要及投與或監督組合物投與之人士的專業判斷隨著時間來加以調整，且本文中所述之劑量範圍僅為例示性的，而不意欲限制所主張之組合物的範疇或實踐。
熟習此項技術者將易於瞭解，本文中所述之本發明之方法的其他合適的修改及改編顯而易見且可使用不脫離本發明之範疇之合適等效物或本文中所揭示之實施例進行。現已詳細描述了本發明，參考下列實例將更清楚理解本發明，該等實例僅出於說明之目的包括在內且不意欲限制本發明。
實例：
方法
以下方法詳細描述實例部分中所使用之實驗程序。
(i)用於碳酸鹽緩衝液中濃度為2μg/mL之hRGM A(R&D)塗佈直接結合ELISA板。隨後在室溫下將各孔用2%阻斷溶液(Bio-Rad)阻斷1小時。在板中用0.1% BSA/PBS以1：5稀釋倍數連續稀釋經生物素標記之抗體且在室溫下培育1小時。偵測試劑為抗生蛋白鏈菌素-HRP於0.1% BSA/PBS中之1：10,000稀釋液。用TMB試劑進行偵測，用2N H2SO4將 其終止且在450nM下讀取OD值。
(ii)FACS分析。在4℃下在0.1% BSA/PBS緩衝液中使HEK293細胞過表現hRGM A或BAF3細胞過表現大鼠RGM A的穩定轉染子經歷用未標記5F9或8D1 MAB進行之染色持續15分鐘以上。用小鼠抗大鼠IgG PE抗體進行偵測。
(iii)在hRGM A-再生蛋白結合檢定中評估MAB 5F9的固相ELISA檢定。
在37℃下用濃度為2.5μg/ml之His標記之人類再生蛋白蛋白質之細胞外結構域(儲備溶液之濃度：30μg/ml)塗佈ELISA板(Immuno Plate Cert.Maxi Sorb.F96 NUNC,439454)並培育1小時。培育後，用含有0.02% Tween 20之PBS獨立地洗滌三次來移除未結合再生蛋白。藉由每孔添加200μl 3%牛血清白蛋白(BSA)、PBS、Tween 20(0.02%)阻斷溶液進行再生蛋白塗佈板之阻斷。在37℃下培育1小時後，移除阻斷溶液且在存在或不存在抗體之情況下添加與人類fc標籤接合之RGM A片段或全長蛋白質。在一些實驗中，將抗體與接合fc之hRGM A蛋白質一起在室溫下預培育1小時。在存在或不存在抗體之情況下，將經再生蛋白塗佈之板與hRGM A一起在37℃下培育1小時。在用PBS-Tween 20(0.02%)洗滌三次後，將板與生物素標記之抗人類fc抗體(1mg/ml，於含有0.6% BSA、0.02% Tween 20之PBS中1：200稀釋)(Jackson ImmunoResearch，目錄號：709-065-149)一起在37℃下培育1小時。藉由用PBS-Tween 20(0.02%)洗滌三次移除未結合抗體。為觀察生物素標記之抗fc抗體之結合，添加由用含有0.6% BSA、0.02% Tween 20之PBS 1：5000稀釋之抗生蛋白鏈菌素-過氧化物酶(Roche，目錄號11089153001)組成之複合物，接著在37℃下培育1小時。連續洗滌三次(PBS-Tween 20(0.02%))移除未結合之過氧化物酶複合物，之後添加過氧化物酶受質(Immuno Pure TMB,Pierce #34021)。在將受質反 應物添加至各孔中後1-30分鐘，藉由2.5 M H2SO4將其終止。使用Anthos光度計在450nm波長下分析板(OD測定)。
(iv)在hRGM A-BMP-4結合檢定中評估MAB 5F9的固相ELISA檢定。
在37℃下用含有濃度為2.5μg/ml之重組人類BMP-4蛋白質(R&D Systems，#314-BP，批號：BEM316061)之溶液塗佈ELISA板(Immuno Plate Cert.Maxi Sorb.F96 NUNC,439454)並培育1小時。培育後，用含有0.02% Tween 20之PBS獨立地洗滌三次來移除未結合BMP-4。藉由每孔添加200μl 3%牛血清白蛋白(BSA)、PBS、Tween 20(0.02%)阻斷溶液進行BMP-4塗佈板之阻斷。在37℃下培育1小時後，移除阻斷溶液且在存在或不存在抗體之情況下添加與人類fc標籤接合之RGM A片段或全長蛋白質。在一些實驗中，將抗體與接合fc之hRGM A蛋白質一起在室溫下預培育1小時。在存在或不存在抗體之情況下，將經BMP-4塗佈之板與hRGM A一起在37℃下培育1小時。在用PBS-Tween 20(0.02%)洗滌三次後，將板與生物素標記之抗人類fc抗體(1mg/ml，於含有0.6% BSA、0.02% Tween 20之PBS中1：200稀釋)(Jackson ImmunoResearch，目錄號：709-065-149)一起在37℃下培育1小時。藉由用PBS-Tween 20(0.02%)洗滌三次來移除未結合抗體。為觀察生物素標記之抗fc抗體之結合，添加由用含有0.6% BSA、0.02% Tween 20之PBS 1：5000稀釋之抗生蛋白鏈菌素-過氧化物酶(Roche，目錄號11089153001)組成之複合物，接著在37℃下培育1小時。連續洗滌三次(PBS-Tween 20(0.02%))以移除未結合之過氧化物酶複合物，之後添加過氧化物酶受質(Immuno Pure TMB,Pierce #34021)。在將受質反應物添加至各孔中後1-30分鐘，藉由2.5 M H2SO4使其終止。使用Anthos光度計在450nm波長下分析板(OD測定)。
(v)在hRGM A-BMP-2結合檢定中評估MAB 5F9的固相ELISA檢 定。
在37℃下用含有濃度為2.5μg/ml之重組人類BMP-2蛋白質(R&D Systems，#355-BM，批號：MSA04)之溶液塗佈ELISA板(Immuno Plate Cert.Maxi Sorb.F96 NUNC,439454)並培育1小時。培育後，用含有0.02% Tween 20之PBS獨立地洗滌三次來移除未結合BMP-2。藉由每孔添加200μl 3%牛血清白蛋白(BSA)、PBS、Tween 20(0.02%)阻斷溶液進行BMP-2塗佈板之阻斷。在37℃下培育1小時後，移除阻斷溶液且在存在或不存在抗體的情況下添加與人類fc標籤接合之RGM A片段或全長蛋白質。在一些實驗中，將抗體與接合fc之hRGM A蛋白質一起在室溫下預培育1小時。在存在或不存在抗體的情況下，將經BMP-2塗佈之板與hRGM A一起在37℃下培育1小時。在用PBS-Tween 20(0.02%)洗滌三次後，將板與生物素標記之抗人類fc抗體(1mg/ml，於含有0.6% BSA、0.02% Tween 20之PBS中1：200稀釋)(Jackson ImmunoResearch，目錄號：709-065-149)一起在37℃下培育1小時。藉由用PBS-Tween 20(0.02%)洗滌三次來移除未結合抗體。為觀察生物素標記之抗fc抗體之結合，添加由用含有0.6% BSA、0.02% Tween 20之PBS 1：5000稀釋之抗生蛋白鏈菌素-過氧化物酶(Roche，目錄號11089153001)組成之複合物，接著在37℃下培育1小時。連續洗滌三次(PBS-Tween 20(0.02%))以移除未結合之過氧化物酶複合物，之後添加過氧化物酶受質(Immuno Pure TMB,Pierce #34021)。在將受質反應物添加至各孔中後1-30分鐘，藉由2.5 M H2SO4使其終止。使用Anthos光度計在450nm波長下分析板(OD測定)。
(vi)Ntera-2細胞培養
自德國微生物及細胞培養物保藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)(DMSZ，Braunschweig)獲得人類Ntera-2細胞。在含有10%胎牛血清(FBS；JRH Bioscience,Kansas, USA)及5%馬血清(HS；Sigma,Germany)之DMEM培養基中解凍未分化Ntera-2細胞之冷凍儲備物。使細胞在培養瓶(Greiner,Germany)中生長直至其達到80%長滿。
對於神經元分化，將Ntera-2細胞以2.5×106個細胞/175平方公分之密度接種於分化培養基(含有10% FBS、5% HS、1%青黴素-鏈黴素(penicillin-streptomycin)、10μM視黃酸之DMEM培養基)中。使細胞分化3週且每週更換培養基兩次。
分化後，用胰蛋白酶-EDTA使細胞脫落且以1：6之比率分裂。48小時後，藉由自底層細胞中抽取來分離神經元細胞。將移走之細胞轉移至新振盪培養瓶(Corning,USA)中以便在新培養基中聚集。使分化之Ntera-2細胞在平穩的水平振盪條件下在37℃下於補充有B27(Gibco)、麩醯胺酸(Gibco)及青黴素-鏈黴素的Neurobasal培養基(Gibco)中聚集24小時。將Ntera-2聚集體以每蓋玻片約20-30個聚集體之密度接種於24孔板中。用層黏連蛋白(20μg/ml，Sigma)及濃度為10μg/ml之重組fc偶聯人類RGM A片段#786(胺基酸47-168)塗佈經聚離胺酸預塗佈之蓋玻片。接種後，用5F9 MAB處理培養物，將其以三種不同濃度(0.1μg/ml；1μg/ml；10μg/ml)添加至培養基中且在37℃下在Neurobasal培養基中進一步培育24小時。隨後將聚集體固定於4%多聚甲醛(2小時，室溫)中且藉由添加於PBS中之0.1% Triton X-100滲透(20分鐘，室溫)。對於螢光染色，在室溫下用含有1% BSA之PBS阻斷培養物1小時。阻斷後，將Ntera細胞與對抗β-微管蛋白同型3之小鼠單株抗體(純系SDL3D10，Sigma #T8660)一起在室溫下培育2小時。藉由三個不同的洗滌步驟(每個5-15分鐘)移除未結合抗體，且將Ntera細胞與於PBS/0.5% BSA及0.5μg/ml雙苯甲醯亞胺中1：350倍稀釋之Cy-3接合驢抗小鼠抗體(Jackson ImmunoResearch批號：62597)一起培育。培育1小時後，將培養物洗滌三次以移除未結合二次抗體。對於螢光顯 微術，將蓋玻片包埋於Fluoromount G(Southern Biotech,Eching)中。
使用Zeiss Axiovert 200螢光顯微鏡擷取Ntera-2聚集體之影像且使用內部影像(in-house image)擷取及分析系統自動分析培養物之外生長。用Image Pro Plus 4.5進行外生長之自動分析且用Graph Pad Prism 4執行資料之統計分析。在不存在人類RGM A片段#786之情況下使外生長標準化以控制培養物生長。
(vii)SH-SY5Y培養。
SH-SY5Y細胞(ATCC，CRL-2266)為源自轉移性腦腫瘤之人類神經母細胞瘤細胞。使該等細胞在由50%伊氏平衡鹽溶液(Earle's Balanced Salt Solution)(Invitrogen Life Technologies，目錄號：24010-043)及50% F12(Ham)營養混合物(Nutrient Mix)+GlutaMAX-1(Invitrogen Life Technologies，目錄號：31765-027)組成之培養基中生長。該培養基進一步補充有熱失活10%胎牛血清(FCS，JRH Biosciences，Kansas目錄號：12107-1000M)、1% NEAA(MEM非必需胺基酸溶液(Sigma-Aldrich目錄號：M1745)及1%青黴素(10.000U/ml)/鏈黴素(10.000μg/ml)(Invitrogen Life Technologies，目錄號：15140-122)。為刺激神經元分化及神經元突起之生長，將SH-SY5Y細胞在補充有10μM視黃酸(RA，Sigma-Aldrich目錄號：R2625-050MG))之培養基中培養若干天。使分化之SH-SY5Y細胞在組織培養瓶中生長且藉由小心地胰蛋白酶化移出該等細胞，且將其塗於塗佈有條帶圖案之RGM A蛋白質或其片段及膠原蛋白I之玻璃蓋玻片上。
(viii)製備有條帶之玻璃蓋玻片。
以與先前描述略微不同之方式執行於玻璃蓋玻片上進行之條帶檢定之改良形式(Knoell等人，Nature Protocols 2：1216-1224,2007)且概述於下。
將用於產生由純化蛋白質組成之條帶的無菌矽基質按壓於皮氏 培養皿(petri dish)之表面上，其中基質之粗糙面朝上。將用乙醇洗滌之潔淨蓋玻片置於基質上且在蓋玻片之背面用圓珠筆標記基質之轉角。將載有蓋玻片之基質小心地倒置，其中蓋玻片面向皮氏培養皿之底部。將接合Fc之全長抑制性RGM A或其fc片段或重組人類RGM A(R&D Systems目錄號：2459 RM)與10μl FITC標記之抗小鼠抗體(Fab特異性山羊抗小鼠IgG，Sigma-Aldrich目錄號：F-4018))混合以觀察RGM A條帶。使用漢密爾頓注射器(Hamilton syringe)，經由進口通道小心地注射50μl RGM A-FITC抗體溶液。過量流體經由排出通道離開基質且用克里內克絲布(Kleenex cloth)移除。將基質-蓋玻片在37℃下培育2小時後，用100μl PBS洗除第一塗佈溶液(含有RGM A)。在下一步驟中，將具有RGM A條帶之蓋玻片轉移至24孔板中，塗佈500μl膠原蛋白I(大鼠尾膠原蛋白I，Becton Dickinson Biosciences目錄號：354236)以填充RGM A條帶之間的空白區域且在37℃下培育2小時。最後，在蓋玻片上產生RGM A與膠原蛋白I之交替條帶圖案。培育後，藉由用PBS獨立地洗滌三次以洗除未結合之膠原蛋白I且將分化之SH-SY5Y細胞塗於蓋玻片上。在37℃下，在存在或不存在針對人類RGM A之單株抗體之情況下在圖案化受質上繼續培育SH-SY5Y細胞20-24小時。
對於免疫螢光分析，在室溫下將細胞以4%多聚甲醛固定2小時或在4℃下固定隔夜，且藉由在室溫下與含有0.1% Triton X-100之PBS一起培育10-20分鐘滲透。用3% BSA阻斷60分鐘後，將細胞與初級抗體(單株抗β-微管蛋白同型3純系SDL 3D10，Sigma-Aldrich目錄號：T8660)一起在室溫下培育2小時，且若干次洗滌後，將該等細胞與於具有0.1% BSA之PBS中稀釋之二次抗體(Cy-3驢抗小鼠，JacksonImmuno Research批號：62597)一起培育1小時。使用雙苯甲醯亞胺H33258(Riedel-De-Haen目錄號：A-0207)對核進行對比染色。最 後，將細胞包埋於Fluoromount G(Southern Biotechnology Associates Inc.目錄號：010001)中。使用Axioplan2螢光顯微鏡(Zeiss)分析細胞。
(ix)構築及表現重組抗RGMA抗體
藉由於細菌中之同源重組，將編碼大鼠抗人類RGMA單株抗體5F9及8D1之重鏈可變區之cDNA片段的DNA選殖至含有人類IgG1恆定區(其含有兩個鉸鏈區胺基酸突變)之pHybE表現載體中。該等突變為位置234及235(EU編號，Lund等人，1991,J.Immunol.,147：2657)處白胺酸變為丙胺酸。將5F9及8D1單株抗體之輕鏈可變區選殖至含有人類κ恆定區之pHybE載體中。例示性pHyb-E載體pHybE-hCk及pHybE-hCg1,z,non-a(參見美國專利申請案第61/021,282號)。藉由共轉染接合至pHybE表現質體中之嵌合重鏈及輕鏈cDNA，於293E細胞中瞬時表現全長抗體。由蛋白質A瓊脂糖凝膠(Protein A Sepharose)層析純化含有重組抗體之細胞上清液，且藉由添加酸緩衝液來溶離經結合抗體。中和抗體且將其透析至PBS中。隨後由如實例1中所述之ELISA及如實例7中所述之競爭ELISA測試純化抗人類RGMA單株抗體結合RGMA之能力。
實例1：產生抗人類RGMA單株抗體
如下述獲得抗人類RGMA大鼠單株抗體：
實例1A：用人類RGMA抗原使大鼠免疫
第1天，將25微克混合有完全弗氏佐劑(Sigma)之重組純化人類RGMA(R&D Systems目錄號：2459-RM，批號MRH02511A)皮下注射至四隻6-8週齡之Harlan Sprague Dawley大鼠中。第21、42及63天，將25微克混合有不完全弗氏佐劑(Sigma)之重組純化人類RGMA皮下注射至相同的四隻Harlan Sprague Dawley大鼠中。第144天或第165天，用10μg重組純化人類RGMA靜脈內注射至大鼠中。
實例1B：產生融合瘤
根據Kohler,G.及Milstein 1975,Nature,256：495中描述之確定方法，將自實例1.2.A中描述之經免疫大鼠獲得之脾細胞與SP2/O-細胞以2：1之比率融合以產生融合瘤。以每孔1.5×105個脾細胞之密度將融合產物塗於96孔板中之含有偶氮絲胺酸及次黃嘌呤之選擇培養基中。融合後7至10天，觀察到肉眼可見之融合瘤集落。藉由直接ELISA(參見實例2)測試每孔之含有融合瘤集落之上清液中人類RGMA抗體之存在。在FACS中針對表現人類及/或大鼠RGMA之穩定轉染HEK293細胞測試ELISA陽性細胞株。隨後在直接ELISA中測試該等大鼠融合瘤細胞株與大鼠RGMA之交叉反應性及與HuRGMA 47-168融合蛋白之ELISA結合。
實例2：mAB 5F9及8D1之直接ELISA結合。
如圖1A中所示，如以上部分(i)所述，MAB 5F9及8D1以類似效價結合hRGM A。亦展示在ELISA中MAB 5F9結合大鼠RGM A，而8D1不能結合大鼠RGM A(資料未圖示)。圖1B展示在FACS中MAB 5F9及8D1結合HEK293細胞過表現hRGM A。圖1C展示在FACS中5F9能夠結合BAF3細胞過表現大鼠RGM A，但8D1不能。FACS係如部分(ii)中所述進行。
使用固相ELISA檢定在競爭性hRGM A-再生蛋白結合檢定中評估MAB 5F9結合。如本申請案之部分(iii)中所述製備且使用ELISA板。在37℃下添加濃度為0.5μg/ml之hRGM A以及5F9抗體歷時1小時。使用以下濃度之MAB 5F9：1.25μg/ml；0.63μg/ml；0.32μg/ml；0.16μg/ml；0.08μg/ml；0.04μg/ml；0.02μg/ml；0.01μg/ml。使用生物 素標記之抗fc抗體及抗生蛋白鏈菌素-過氧化物酶複合物觀察hRGM A之結合。使用Anthos光度計在450nm波長下分析板(OD測定)。如圖2中所示，三種最高抗體濃度劑量依賴性抑制全長人類RGM A與再生蛋白之結合。
亦使用固相ELISA檢定在競爭性hRGM A-BMP-4結合檢定中評估MAB 5F9。如本申請案之部分(iv)中所述製備且使用ELISA板。在37℃下添加濃度為0.5μg/ml之hRGM A以及5F9抗體歷時1小時。使用以下濃度之MAB 5F9：1.25μg/ml；0.63μg/ml；0.32μg/ml；0.16μg/ml；0.08μg/ml；0.04μg/ml；0.02μg/ml；0.01μg/ml。使用生物素標記之抗fc抗體及抗生蛋白鏈菌素-過氧化物酶複合物觀察hRGM A之結合。使用Anthos光度計在450nm波長下分析板(OD測定)。如圖3中所示，四種最高抗體濃度劑量依賴性抑制全長人類RGM A與BMP-4之結合。
亦使用固相ELISA檢定評估片段0(47-168)hRGM A與BMP-4之MAB 5F9結合抑制。在37℃下用濃度為2.5μg/ml之人類重組BMP-4蛋白質塗佈ELISA板歷時1小時。在37℃下添加濃度為0.5μg/ml之hRGM A輕鏈(片段0，47-168)以及5F9抗體並歷時1小時。使用以下濃度之MAB 5F9：1.25μg/ml；0.63μg/ml；0.32μg/ml；0.16μg/ml；0.08μg/ml；0.04μg/ml；0.02μg/ml；0.01μg/ml。使用生物素標記之抗fc抗體及抗生蛋白鏈菌素-過氧化物酶複合物觀察hRGM A之結合。使用Anthos光度計在450nm波長下分析板(OD測定)。圖4描繪1.25μg/ml、0.63μg/ml及0.32μg/ml之抗體濃度劑量依賴性抑制人類RGM A輕鏈與BMP-4之結合。
亦使用固相ELISA檢定在競爭性hRGM A-BMP-2結合檢定中評估MAB 5F9結合。如本申請案之部分(v)中所述製備且使用ELISA板。在37℃下添加濃度為0.5μg/ml之全長hRGM A以及5F9抗體歷時1小時。 使用以下濃度之MAB 5F9：5μg/ml；2.5μg/ml；1.25μg/ml；0.63μg/ml；0.32μg/ml；0.16μg/ml。使用生物素標記之抗fc抗體及抗生蛋白鏈菌素-過氧化物酶複合物觀察hRGM A之結合。使用Anthos光度計在450nm波長下分析板(OD測定)。圖5描繪抗體濃度5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.63μg/ml抑制全長人類RGM A與BMP-2之結合。
亦使用固相ELISA檢定在hRGM A-再生蛋白、hRGM A-BMP-2及hRGM A-BMP-4結合檢定中評估MAB 5F9及8D1。(圖9)如所描述，在37℃下用濃度為2.5μg/ml之His標記之人類再生蛋白蛋白質之細胞外結構域或用2.5μg/ml之BMP-2或BMP-4塗佈ELISA板歷時1小時。在37℃下添加濃度為0.5μg/ml之接合fc之全長hRGM A以及抗體歷時1小時。使用以下濃度之MAB 5F9及8D1：5μg/ml；2.5μg/ml；1.25μg/ml；0.63μg/ml；0.32μg/ml；0.16μg/ml；0.08μg/m。使用生物素標記之抗fc抗體及抗生蛋白鏈菌素-過氧化物酶複合物觀察hRGM A之結合。使用Anthos光度計在450nm波長下分析板(OD測定)。如圖9中所示，大鼠單株抗體8D1抑制或降低人類RGM A與BMP-2及與BMP-4之結合但不能抑制其與再生蛋白之結合。
實例3：利用分化人類NTera神經元之聚集體之神經突生長檢定中的mAb 5F9活性。
如本申請案之方法部分(vi)中所述獲得Ntera細胞且加以培養。在利用分化人類NTera神經元之聚集體之神經突生長檢定中，mAb 5F9中和人類RGM A蛋白質之有效fc接合輕鏈(胺基酸47-168)之神經突外生長抑制活性。如圖6中所示，在不存在抑制性RGM A蛋白質或片段之情況下及在存在外生長刺激受質層黏連蛋白之情況下，神經元NTera聚集體展示正外生長之神經突之廣泛且緻密的網狀物(A)。圖6中亦展示，hRGM A輕鏈之存在顯著減小NTera神經突之數目、密度及 長度，從而證明hRGM A片段之有效抑制活性。少數離開聚集體之神經突較短且緊密束在一起(B)。圖6之C-E部分展示添加至培養物中之濃度增加之MAB 5F9劑量依賴性中和或去阻遏hRGM A輕鏈片段之神經突生長抑制活性。隨著MAB濃度之增加，NTera神經元聚集體之外生長即使在存在RGM A抑制劑(C：0.1μg/ml MAB 5F9；D：1μg/ml MAB 5F9；E：10μg/ml MAB 5F9)之情況下亦完全恢復。
執行在利用人類NTera聚集體之神經突生長檢定中MAB 5F9之中和活性的定量分析以測試人類RGM A蛋白質之有效fc接合輕鏈抑制片段(胺基酸47-168)。藉由用雙苯甲醯亞胺染色聚集體且隨後拍照來自動分析培養物之外生長。染色僅標記聚集體而不標記外生長之神經突。然而，將該等神經突用β3-微管蛋白之抗體及經螢光體標記之二次抗體染色。藉由計算神經突外生長指數(一種藉由自聚集體及其突起之經β3-微管蛋白染色面積中減去細胞體之面積所確定的指數)自動確定神經突外生長。隨後如Lingor等人，J.Neurochem.103：181-189,2007中所述用該因子除以細胞體之面積。圖7展示MAB 5F9在利用人類Ntera聚集體之神經突生長檢定中劑量依賴性(0.1-10μg)中和接合fc之有效hRGM A抑制劑片段(片段0，47-168；10μg)之外生長抑制活性。
實例4：hRGM A/膠原蛋白I條帶中之mAb 5F9活性
如本申請案之部分(vii)中所述培養且使用SH-SY5Y細胞。如本申請案之部分(viii)中所述製備具有RGM A及膠原蛋白I條帶之玻璃蓋玻片。根據文獻(Knoell等人，Nature Protocols 2：1216-1224,2007)中所述之方案產生具有交替hRGM A/膠原蛋白I及膠原蛋白I條帶的薄層以供實驗。在不存在5F9 MAB的情況下(A)，神經元SH-SY5Y細胞展示對於膠原蛋白I條帶之明顯偏好，其中90%以上的細胞偏好膠原蛋白I條帶勝過hRGM A條帶。隨著MAB 5F9濃度之增加，神經元SH-SY5Y 細胞偏好hRGM A條帶勝過膠原蛋白I條帶(B-E)。在所使用之最高MAB濃度下(E)，SH-SY5Y神經元展示與膠原蛋白I條帶相比對於hRGM A之強烈偏好(參見圖8)。此可解釋為5F9 MAB之獨特特徵，因為其將RGM A之抑制性質轉化為引人注意之活性。在存在增加濃度之5F9之情況下，神經元細胞偏好在RGM A受質上而不是在如膠原蛋白I之容許受質上遷移且生長。之前從未描述單株抗體之該獨特特徵。
實例5：構築CDR移植抗體
藉由應用此項技術熟知之標準方法，將單株抗體5F9之VH及VL鏈之CDR序列(參見上表5)移植至不同人類重鏈及輕鏈受體序列中。基於序列VH及VL與本發明之單株抗體5F9之VH及VL序列之比對，選擇以下已知人類序列：a)用於構築重鏈受體序列之VH3-48、VH3-33及VH3-23以及連結序列hJH3、hJH4及hJH6(根據上表3)；b)用於構築輕鏈受體序列之A17及A18以及hJK2(根據上表4)。
藉由將5F9之相應VH及VL CDR移植至該等受體序列中，製備出以下CDR移植之人類化經修飾VH及VL序列(亦參見上表6)：VH 5F9.1-GL、VH 5F9.2-GL、VH 5F9.3-GL、VH 5F9.4-GL、VH 5F9.5-GL、VH 5F9.6-GL、VH 5F9.7-GL及VH 5F9.8-GL；VL 5F9.1-GL、VL 5F9.2-GL及VL 5F9.3-GL。
實例6：在CDR移植抗體中構築架構回復突變
為產生人類化抗體架構回復突變，藉由重新合成可變結構域及/或使用突變誘發引子及PCR以及此項技術熟知之方法，在如根據實例5製備之CDR移植抗體序列中引入突變。如下針對各CDR移植物構築回復突變及其他突變之不同組合。
對於重鏈VH 5F9.1-GL、VH 5F9.2-GL及VH 5F9.3-GL，如下使以下維尼爾及VH/VL界面殘基中之一或多個回復突變：V37→I、 V48→I、S49→G及/或R98→K。
對於重鏈VH 5F9.4-GL、VH 5F9.5-GL及VH 5F9.6-GL，如下使以下維尼爾及VH/VL界面殘基中之一或多個回復突變：V37→I、V48→I、A49→G、R98→K。
對於重鏈VH 5F9.7-GL、VH 5F9.8-GL及VH 5F9.9-GL，如下使以下維尼爾及VH/VL界面殘基中之一或多個回復突變：V37→I、V48→I、S49→G。
其他突變包括以下：對於重鏈VH 5F9.1-GL、VH 5F9.2-GL及VH 5F9.3-GL：D88→A，對於重鏈VH 5F9.4-GL、VH 5F9.5-GL及VH 5F9.6-GL：Q1→E；及對於重鏈VH 5F9.7-GL、VH 5F9.8-GL及VH 5F9.9-GL：L5→V。
對於輕鏈VL 5F9.1-GL，如下使以下維尼爾及VH/VL界面殘基中之一或多個回復突變：I2→V、M4→L、Y41→F。
對於輕鏈VL 5F9.2-GL，如下使以下維尼爾及VH/VL界面殘基中之一或多個回復突變：M4→L、R51→L。
對於輕鏈VL 5F9.3-GL，如下使以下維尼爾及VH/VL界面殘基中之一或多個回復突變：M4→L、Y41→F。
實例7：構築及表現重組人類化抗RGMA抗體
如以上部分ix中所述，將具有含有架構回復突變之重鏈及輕鏈之pHybE表現載體共轉染至293-6E細胞中以瞬時產生全長人類化抗體。藉由重新合成可變結構域及/或使用突變誘發引子及PCR以及此項技術熟知之方法，在如根據實例5製備之CDR移植抗體序列中引入突變。人類化抗體之VH及VL區之胺基酸序列揭示於表8中。
詳言之，對於重鏈：
VH 5F9.1、VH 5F9.5及VH 5F9.9含有具有Q1→E突變之VH 5F9.4-GL。
VH 5F9.2、VH 5F9.6、VH 5F9.10、VH 5F9.19、VH 5F9.20、VH 5F9.21及VH 5F9.22含有具有Q1→E突變及以下維尼爾及VH/VL界面殘基回復突變之VH 5F9.4-GL：V37→I、V48→I、A49→G、R98→K。
VH 5F9.3、VH 5F9.7及VH 5F9.11含有具有L5→V突變之VH 5F9.7-GL。VH 5F9.4、VH 5F9.8、VH 5F9.12、VH 5F9.23、VH 5F9.24、VH 5F9.25及VH 5F9.26含有具有L5→V突變及以下維尼爾及VH/VL界面殘基回復突變之VH 5F9.7-GL：V37→I、V48→I、S49→G。
對於輕鏈：
VL 5F9.1、VL 5F9.2、VL 5F9.3及VL 5F9.4係與VL 5F9.1-GL一致。
VL 5F9.5、VL 5F9.6、VL 5F9.7及VL 5F9.8係與VL 5F9.2-GL一致。
VL 5F9.9、VL 5F9.10、VL 5F9.11及VL 5F9.12係與VL 5F9.3-GL一致。
VL 5F9.19及VL 5F9.23含有具有以下維尼爾及VH/VL界面殘基回復突變之VL 5F9.2-GL：M4→L、R51→L。VL 5F9.20及VL 5F9.24含有具有以下維尼爾及VH/VL界面殘基回復突變之VL 5F9.2-GL：M4→L。
VL 5F9.21及VL 5F9.25含有具有以下維尼爾及VH/VL界面殘基回復突變之VL 5F9.3-GL：M4→L、Y41→F。VL 5F9.22及VL 5F9.26含有具有以下維尼爾及VH/VL界面殘基回復突變之VL 5F9.3-GL：M4→L。
實例8：使用競爭ELISA表徵人類化5F9抗體
在4℃下用每孔50μl之於0.2 M碳酸鈉-碳酸氫鈉緩衝液(pH 9.4)中之0.25μg/ml hRGMA塗佈ELISA板(Costar 3369)隔夜，用洗滌緩衝液(含有0.1% Tween 20之PBS)洗滌且在室溫下用每孔200μl之於PBS中之2%脫脂奶粉阻斷1小時。用洗滌緩衝液洗滌後，一式兩份添加經生物素標記之嵌合5F9(最終濃度為0.1μg/ml)及未經標記之競爭測試抗體(以50μg/ml之最終濃度起始且連續稀釋5倍)於每孔50μl ELISA緩衝液中之混合物。在室溫下培育板1小時且用洗滌緩衝液洗滌後，使用每孔100μl之HRP接合抗生蛋白鏈菌素(Fitzgerald)於ELISA緩衝液中之1：10,000稀釋液偵測結合抗體。在室溫下培育1小時且用洗滌緩衝液洗滌後，藉由添加每孔100μl TMB緩衝液(Zymed)執行顯色。在室溫下培育15分鐘後，藉由添加每孔50μl之1N鹽酸使顯色終止。在490nm下讀取吸光度。
表9展示使用電腦軟體GraphPad Prism(GraphPad Software Inc., San Diego,CA)獲得之人類化5F9抗體的IC50值。
實例9：使用BIACORE技術進行嵌合及人類化抗體之親和力測定
BIACORE檢定(Biacore,Inc,Piscataway,NJ)用締合速率常數、解離速率常數之動力學量測值測定抗體之親和力。藉由基於表面電漿共振之量測用Biacore® 3000儀器(Biacore® AB,Uppsala,Sweden)使用流動HBS-EP(10mM HEPES〔pH 7.4〕、150mM NaCl、3mM EDTA及0.005%界面活性劑P20)在25℃下測定抗體與重組純化人類RGMA之結合。所有化學物質均獲自Biacore® AB(Uppsala,Sweden)。根據製造商之說明書及程序使用標準胺偶聯套組將於10mM乙酸鈉(pH 4.5)中稀釋之25μg/ml之約5000RU山羊抗人類IgG(Fcγ)片段特異性多株抗體(Pierce Biotechnology Inc,Rockford,IL)直接固定於CM5研究級生物傳感器晶片上。用乙醇胺阻斷生物傳感器表面上之未反應部分。使用流動池2及4中之經修飾羧甲基葡聚糖表面作為反應表面。使用流動池1 及3中之無山羊抗人類IgG之未經修飾羧甲基葡聚糖作為參考表面。在HEPES緩衝之生理食鹽水中稀釋純化抗體以便橫過山羊抗人類IgG特異性反應表面捕獲。將作為配位體捕獲之人類抗體(25μg/ml)以5μl/min之流速注射至反應基質上。在25μl/min之連續流動速率下測定締合及解離速率常數kon(單位：M-1s-1)及koff(單位：s-1)。藉由在0.39-50nM範圍內之10種不同抗原濃度下進行動力學結合量測得出速率常數。對於動力學分析，藉由使用Biaevaluation 4.0.1軟體將自1：1朗繆爾結合模型(Langmuir binding model)得出之速率方程同時與所有八次注射之締合相及解離相擬合(使用全擬合分析)。隨後按照下式由動力學速率常數計算人類化抗體與重組純化人類RGMA之間之反應的平衡解離常數(單位：M)：KD=koff/kon。
實例10：在神經元SH-SY5Y趨化性檢定中人類化5F9抗體中和人類RGM A之化學排斥活性。
趨化性檢定量測細胞應答可發揮化學吸引或化學排斥活性之可擴散因子之趨化性特性。已描述RGM A為在膜結合型(接觸依賴型排斥)與可溶性可擴散形式(化學排斥)中起作用之蛋白質，且因此在hRGM A趨化性檢定中對其進行評估。為此目的，使用載有RGM受體再生蛋白之RGM A敏感性人類神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y(Schaffar等人，J.Neurochemistry：107：_418-431,2008)。使SH-SY5Y細胞在補充有10%胎牛血清及1%非必需胺基酸(MEM-NEAA)之伊氏平衡鹽溶液 /F12(EBSS/F12)培養基中生長。為誘導神經突外生長，在補充有10μM視黃酸(RA)的培養基中培養細胞。5-6小時後，將細胞胰蛋白酶化且計數以塗於24孔Boyden腔室(BD Falcon 351185,HTS多孔系統)中。向每孔之內圈中添加500μl細胞懸浮液(對應於1×105個細胞)。該內圈藉由孔徑為8μm之PET膜與每孔之較大外圈隔開。將600μl培養基+/- RGM A+/-抗體吸取至外圈中且將細胞在37℃下在多孔Boyden腔室中培養隔夜。培育後，抽吸培養基且用固定劑(2%多聚甲醛)更換。在室溫下繼續固定2小時且用PBS之洗滌若干次後，使用含有0.1% Triton-X-100之PBS執行滲透(15min，RT)。藉由將細胞在黑暗中在Alexa Fluor 488鬼筆環肽(Phalloidin)1：100(Invitrogen A12379)及雙苯甲醯亞胺(H332456)1：100之溶液中培育1小時來進行細胞染色。用PBS洗滌兩次後，用PBS填充培養物，由石蠟膜(parafilm)密封且於暗處儲存以用螢光顯微鏡(Zeiss Axiovert)分析。
在不存在hRGM A的情況下，細胞遷移穿過膜孔且可在固定及染色後計數。僅計數彼等附著於膜底部之細胞，因為該等細胞已遷移穿過PET膜。小心地移出膜上部上的細胞，之後進行固定程序。該趨化性檢定證明hRGM A之存在使遷移穿過膜之SH-SY5Y細胞之數目明顯降低超過80%。如在膜底部可見之較大量之細胞所表明，大鼠單株5F9、嵌合人類-大鼠5F9及人類化5F9在10μg/ml下部分或完全中和hRGM A之化學排斥活性，但同型對照大鼠單株抗體(p21)則不然。
實例11：在大鼠視神經損傷之模型中5F9誘導壓傷的受損視神經軸突再生。
視神經壓傷(或視神經損傷)模型提供測試刺激視神經纖維再生且降低視網膜神經節細胞大量細胞死亡之各種物質的動物模型。
在自Charles River(D)實驗室(Germany)獲得之成年雄性Sprague Dawley大鼠及雄性Wistar大鼠中進行實驗。將動物保持在12：12小時白 天/黑夜循環之單一籠中，且食品及水隨意取用。藉由最小前路手術始終僅在左眼執行視神經壓傷。此為視神經損傷之微創方法且係吾人根據人類前路視力手術方法開發。手術程序之前或期間，藉由使用七氟烷(Sevoflurane)(Abbott GmbH Co. & KG,Delkenheim,Germany)之吸入麻醉使動物麻醉且藉由對肢體使用夾鉗及膠帶將該等動物固定於手術台上。藉由將動物安置於加熱墊上來防止體溫下降。對於大鼠視神經之前路壓傷手術，小心地清除左眼之韌帶及結締組織。第一步，執行眼外角中之相鄰組織之顯微手術切口(2-3mm)。隨後藉由使用一對鑷子將眼肌及淚腺移到旁邊從而在不傷害視神經的情況下暴露視神經。下一步，使用顯微手術剪(microscissor)縱向打開腦脊膜以暴露視神經。
此使眼睛具有較高活動性且使眼睛能夠側旋且能夠接近其左側視神經。使用一對經設定以提供固定最高壓力達20-30秒之鑷子使眼後約1-3mm之視神經損傷。特別小心不要損害眼血管供應。
局部投與抗體及緩衝溶液
視神經壓傷後，用5F9抗體(n=10隻動物)、8D1對照抗體(n=10隻)或媒劑對照PBS(n=10隻動物)局部治療雄性Sprague Dawley大鼠。使實驗者對不同治療組不知情。對於局部抗體施用，用20μl 10mg/ml抗體溶液或20μl PBS浸泡小凝膠海綿(gelfoam)片(長：2.5mm，寬：2.5mm，高：2.5mm)且將其直接置放於視神經病變部位附近。微創手術及抗體施用後，將動物置放於安裝於控制體溫之取暖器上之潔淨籠中的紙巾上直至其開始移動。對眼施用含有抗生素(健明舒(Gentamytrex)，Dr.Mann Pharma)之軟膏以避免鞏膜細菌感染及乾澀。對於手術後疼痛療法，手術後立即腹膜內施用卡洛芬(Carprofen)(力莫敵(Rimadyl)，5mg/kg，Pfizer GmbH，Karlsruhe)且隨後每天兩次施用持續3天的時間。在手術後緊接著的若干小時內及 接下來的數天內有規律地觀察且控制動物，以確保所有動物存活且自麻醉及手術恢復。手術及抗體/媒劑施用後5週，用過量戊巴比妥(Narcoren)(40-60mg/kg)使動物麻醉且藉由向心臟注射4%多聚甲醛溶液來執行灌注。分離視神經且在室溫下將其轉移至4%多聚甲醛溶液中歷時1小時以確保組織適當固定。固定後，將大鼠視神經儲存於30%蔗糖溶液(4℃)中隔夜。第二天，將視神經包埋於Tissue Tek中，冷凍且使用Cryostat取得厚度為16μm之縱向切片。
對於免疫染色，用冷(-20℃)丙酮固定視神經切片(10min)，用Tris緩衝之生理食鹽水(TBS，Fluka 93312)洗滌3次(5min)且在室溫下用含有5%牛血清白蛋白及1% Triton-X-100之TBS阻斷並滲透(30min)。藉由用TBS獨立地洗滌兩次(每次5分鐘)來移除殘餘BSA及去污劑。將切片與於5% BSA/TBS溶液中1：100稀釋之多株兔子抗GAP-43抗體(Abcam，ab 7562)一起在室溫下培育1小時。用TBS、0.1% Tween洗滌三次後，將切片與於含有雙苯甲醯亞胺(H33258，50μg/ml)之1：100稀釋液之5% BSA/TBS中1：1000稀釋的Alexa Fluor 488接合山羊抗兔子二次抗體(Molecular Probes A11034)一起在室溫下培育1小時以觀察細胞核。包埋之前，用TBS、0.1% Tween洗滌經染色切片三次(每次5分鐘)且用蒸餾水洗滌。將切片包埋於Fluoromount G中，用蓋玻片覆蓋且於黑暗中儲存以便顯微鏡證明。
使用Zeiss螢光顯微鏡，使用Zeiss Axiovison軟體儲存經染色縱向切片之影像(圖11)。載入各神經之單一圖片以使用Photoshop影像分析軟體(Adobe)分析。使用視神經之合成影像以兩種不同的方式進行定量分析。使用Axiovision軟體量測病變部位處之GAP-43陽性面積(圖12B)。獨立於該第一定量分析，對4個不同區域中之單一再生纖維(GAP-43陽性)計數：超出壓傷部位0-200μm、200-400μm、400-600μm及600-1200μm。藉助於Graphpad Prism軟體進行資料分析及資料 之統計學評估。(圖12A)
全身投與抗體及緩衝溶液。
對於全身抗體傳遞，用5F9抗體(n=10隻動物)或用媒劑對照PBS(n=10隻動物)全身性(腹膜內，ip；或靜脈內，iv)治療雄性Wistar大鼠。對動物注射兩次且第0天時在誘導神經壓傷後立即及壓傷後第21天進行注射。給予之抗體之劑量為第0天2mg/kg及第21天10mg/kg。壓傷後5週殺死動物，且如上所述進行組織分離、切片製備、染色及定量分析。如之前所述，使實驗者對兩個不同治療組不知情。大鼠視神經之合成影像展示於圖13中。與經PBS治療之對照動物(B)相對，在5F9治療之動物(A)中，許多GAP-43陽性纖維延伸超出壓傷部位。壓傷部位位於左側邊緣，且用GAP-43之抗體將再生纖維染色。在5F9治療之動物中在視神經之上輪緣及下輪緣處觀察到許多纖維，但在PBS動物中未觀察到。
5F9顯著增加再生GAP-43陽性纖維之數目，但媒劑對照PBS則不然。在經5F9治療之動物中在300μm至1800μm之距離處可見明顯比媒劑治療之動物中多的纖維(p<0.001)。在第0天及第21天時分別用2mg/kg及10mg/kg 5F9治療動物。經腹膜內或靜脈內給予抗體或媒劑。資料係來自對每組9隻動物之分析。每隻動物，分析3塊冷凍切片。(圖14A)
在第二實驗中，在視神經損傷後用5F9抗體(n=10隻動物)、8D1對照抗體(n=10隻動物)或用媒劑對照PBS(n=10隻動物)全身性(iv)治療雄性Wistar大鼠。每週用2mg/kg靜脈內給予之抗體注射大鼠一次，且視神經壓上後立即開始注射。所有大鼠接收4次注射，且在壓傷後5週對動物實施安樂死。實驗者對治療組不知情且如之前所述進行組織加工及定量分析。5F9顯著增加再生GAP-43陽性纖維之數目，但媒劑對照PBS則不然。在經5F9治療之動物中在200μm至1400μm之距離處可 見明顯比媒劑或對照抗體治療之動物中多的纖維(p<0.001)。自第0天開始每週一次用5F9(每劑2mg/kg)、對照抗體8D1(每劑2mg/kg)或PBS經靜脈內治療動物一次歷時4週。(圖14B)
實例11：在大鼠視神經損傷之模型中5F9誘導壓傷的受損視神經軸突之髓鞘再形成
寡樹突神經膠質細胞及髓鞘之標記物為髓鞘鹼性蛋白質(MBP)。使用針對MBP之抗體解答不同治療組中髓鞘再形成是否存在不同的問題。為觀察髓鞘再形成過程，用冷(-20℃)丙酮固定經全身性治療之動物之視神經切片(10min)，用Tris緩衝之生理食鹽水(TBS，Fluka 93312)洗滌3次(5min)且在室溫下用含有5%牛血清白蛋白及1% Triton-X-100之TBS阻斷並滲透(30min)。藉由用TBS獨立地洗滌兩次(每次5分鐘)移除殘餘BSA及去污劑。將切片與於5% BSA/TBS溶液中1：50稀釋之多株兔子抗MBP抗體(Abcam，ab 2404)一起在4℃下培育3小時或隔夜。用TBS、0.1% Tween洗滌三次後，將切片與於含有雙苯甲醯亞胺(H33258，50μg/ml)之1：100稀釋液之5% BSA/TBS中1：1000稀釋的Alexa Fluor 488接合山羊抗兔子二次抗體(Molecular Probes A11034)一起在室溫下培育1小時以觀察細胞核。包埋之前，用TBS、0.1% Tween洗滌經染色切片三次(每次5分鐘)且用蒸餾水洗滌。將切片包埋於Fluoromount G中，用蓋玻片覆蓋且儲存於暗處以便顯微鏡證明。
使用Zeiss螢光顯微鏡，使用Zeiss Axiovison軟體儲存經染色縱向切片之影像。載入各神經之單一圖片以使用Photoshop影像分析軟體(Adobe)分析。使用視神經之合成影像以兩種不同的方式進行定量分析。使用Axiovision軟體量測病變部位之MBP陽性面積。藉助於Graphpad Prism軟體進行資料分析及資料之統計學評估。
在第0天及第21天時分別用2mg/kg及10mg/kg 5F9治療動物。經 腹膜內或靜脈內給予抗體或媒劑。合成大鼠視神經之影像。
使用針對髓鞘標記物髓鞘鹼性蛋白MBP之抗體觀察髓鞘形成。壓傷部位位於複合神經中間且在媒劑治療之對照動物(A及B)中無該區域。在5F9治療之動物(C及D)中，在視神經之中間區域(壓傷中心)觀察到許多MBP陽性結構。(圖15)
使用針對髓鞘標記物髓鞘鹼性蛋白MBP之抗體觀察髓鞘形成。使用Zeiss Axiovison軟體量測MBP面積。M1及M2為兩個獨立的量測值且M為所量測之MPB陽性面積之平均值。5F9使視神經壓傷部位之MBP面積顯著增加(相對媒劑對照，p<0.001)3.5倍。(圖16)
<110> 德商亞培公司
<120> 對抗RGM A蛋白質之單株抗體及其用途
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<160> 68
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<212> PRT
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<220>
<223> VL 8D1 CDR-L3
<400> 68

Claims (1)

  1. 一種結合蛋白質，其以1×10-7 M或以下之KD及1×10-2 s-1或以下之koff速率常數自人類RGM A解離，該KD及該koff速率常數皆由表面電漿共振測定。
TW104130646A 2008-02-29 2009-02-27 對抗rgm a蛋白質之單株抗體及其用途 TW201545760A (zh)

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