CN102549016B - 免疫球蛋白fc多肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有非糖基化抗体Fc结构域的多肽的方法和组合物。在某些实施方案中，与天然Fc结构域相比，具有非糖基化Fc结构域的多肽包含一个或更多个替换。此外，一些实施方案涉及结合一些Fc受体但不结合其它受体的Fc结构域。例如，提供具有非糖基化Fc结构域的多肽，所述非糖基化Fc结构域以糖基化Fc结构域结合水平2倍之内的水平选择性结合FcγRI，但是对其它Fc受体的结合显著降低。此外，本发明提供使用具有修饰的非糖基化Fc结构域和第二非Fc结合结构域的多肽促进抗体依赖性细胞介导毒性(ADCC)的方法和组合物，所述的第二非Fc结合结构域可以是抗体的抗原结合区或者非抗原结合区。一些实施方案涉及具有此类多肽的抗体，其可以具有相同或者不同的非Fc结合结构域。

Description

免疫球蛋白FC多肽

发明背景

本申请要求于2009年6月30日提出的美国申请号61/221,999的优选权，其全部公开明确地以其全文而无任何放弃的通过参考并入本文。

技术领域

本发明一般涉及蛋白质工程领域。更加具体而言，其涉及用于筛选在细菌中表达的组合抗体Fc文库的改良方法和组合物。

背景技术

当前的重组治疗抗体销售超过100亿美元/年并且预计每年增长20.9％，到2010年计划增长至250亿美元/年。单克隆抗体(mAbs)包括当前临床上的大多数重组蛋白，其中位于世界各地的公司资助超过150个正在研究的产品(Pavlou和Belsey，2005)。至于治疗焦点，mAb市场主要集中于肿瘤学和关节炎、免疫和炎症性病症并且这些治疗领域内的产品将持续成为在整个预测阶段内的关键生长驱动力。总的来说，遗传工程化mAbs一般比小分子药物具有更高的FDA批准成功可能性。至少50个生物工程公司和所有的主要制药公司实施活性抗体开发项目。

用于mABs分离和生产的最初方法由Milstein和Kohler于1975年首次报导(Kohler and Milstein，1975)，并且它包括小鼠淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合，得到小鼠杂交瘤。治疗性的鼠mAbs在二十世纪八十年代早期进入临床研究；然而，但是缺乏有效性和因为患者产生人抗小鼠抗体(HAMA)而快速清除的问题变得明显。这些问题以及与技术相关的时间和成本消耗变成了发展mAb生产技术的驱动力。聚合酶链式反应(PCR)促进了直接从免疫动物淋巴细胞克隆单克隆抗体基因和片段抗体组合文库在细菌中的表达(Orlandi等，1989)。后来的文库完全通过体外克隆技术使用具有重排互补决定区3(CDR3)的天然基因产生(Griffiths和Duncan，1998；Hoogenboom等，1998)。结果，具有目的特异性的抗体片段的分离不再依赖于相应抗原的免疫原性。此外，合成的组合文库中的抗原特异性范围比从免疫小鼠产生的一组杂交瘤的抗原特异性范围大。这些优点促进了开发针对许多种独特抗原，包括小分子化合物(半抗原)(Hoogenboom和Winter，1992)、分子复合体(Chames等，2000)、不稳定的化合物(Kjaer等，1998)和细胞表面蛋白质(Desai等，1998)的抗体片段。

在微生物细胞中，通过流式细胞术开展展示筛选。具体而言，锚定周质表达(Anchored周质ic Expression，APEx)基于将抗体片段锚定在大肠杆菌内膜的周质面，然后破坏外膜，与荧光标记的靶孵育并分选原生质球(美国专利7,094,571)。APEx用于抗体片段的亲和性成熟(Harvey等，2004；Harvey等，2006)。在一个研究中，在仅两轮的筛选后得到了超过200倍的亲和性改善。

抗体治疗潜能背后的一个重要机制是抗体募集免疫细胞至靶抗原(或细胞)的能力。因此，抗体的Fc区对于募集免疫细胞和抗体依赖的细胞毒性(ADCC)是至关重要的。具体而言，由抗体引起的ADCC反应的性质依赖于Fc区与位于许多细胞类型表面上的受体(FcR)之间的相互作用。人包括5种不同种类的Fc受体。在另外的单元型中，属于特定种类的不同FcR的遗传变体是已知的。抗体与FcR的结合决定着募集其它免疫细胞和所募集细胞类型的能力。因此，工程改造可募集仅某些种类细胞的抗体的能力对于治疗是极其重要的。

然而，据发明人所知，先前已经使用哺乳动物表达的IgG分子开展了改造Fc结构域的尝试。哺乳动物抗体是糖基化的。碳水化合物链连接至Fc区并且改变蛋白质的构象并且使得抗体能够结合至FcR。与此相比，由细菌产生的非糖基化的抗体不能够结合至FcR并且因此不能够引起ADCC。希望的是，改造能够引起ADCC的非糖基化抗体并且，因此从源于细菌表达的低生产成本受益。

第二并且最重要的是，具有工程改造Fc区的哺乳动物抗体表现出对特定的目的FcR的结合增加，而且它们仍能够以正常亲和性结合其它FcR。因此，虽然此类抗体对于由免疫系统天然产生的分子具有更大的选择性，但是它们仍然可以介导不希望的免疫反应。

虽然如此，目前可以利用的所有高通量抗体抗体筛选技术均依赖于抗体片段的微生物表达。已经描述了在文库构建和筛选中使用抗体片段而不是完整或者全长IgG相对于在微生物中表达长得多的IgG具有局限性。之前从来没有使用微生物如细菌或酵母表达或者筛选IgG文库。结果，对结合蛋白质的抗原的分离唯一使用更小的且容易产生的抗体片段开展。一旦分离后，然后此类抗体片段必须融合至表达全长免疫球蛋白的载体，反过来载体优先在哺乳动物细胞诸如CHO细胞中表达。

大肠杆菌的的细胞质少，这不适合具有二硫键的蛋白质的折叠，具有二硫键的蛋白质以未折叠的或者不正确折叠的状态积累(Baneyx和Mujacic，2004)。与细胞质相比，大肠杆菌的周质维持在氧化状态，这使得可以形成蛋白质二硫键。值得注意的是，已经成功地采用周质表达用于表达抗体片段，诸如Fv、scFv、Fab或者F(ab′)2(Kipriyanov和Little，1999)。这些片段可以相对快速地大量产生，并且保留了抗原结合活性。然而，由于抗体片段缺乏Fc结构域，它们不能够结合FcRn受体并被快速清除；因此，它们仅偶尔适宜用作治疗蛋白质(Knight等，1995)。直到最近，全长抗体仅可以在大肠杆菌中表达成为不溶解的聚集物，然后体外重折叠(Boss等，1984；Cabilly等，1984)。显然，这种方法不适合抗体文库的高通量筛选，因为使用当前的技术不能够将数百万或者数千万的抗体逐一重折叠。进一步的问题是，由于大肠杆菌表达的抗体没有被糖基化，所以它们不能够结合补体因子1q(C1q)或者Fc和许多其它Fc受体。然而，非糖基化的Fc结构域可以有效地结合新生儿Fc受体(FcRn)。因此，细菌表达的非糖基化抗体的确表现出与人细胞中产生的完全糖基化的IgG相似的血清持久性和药代动力学。虽然如此，由于非糖基化的抗体不能够引起补体活化并且不能够介导免疫细胞诸如巨噬细胞的募集，因此它们先前不能有效地用于许多治疗应用。

此外，一些研究已经报导，Fc结构域与一些Fc受体的结合可以具有激活效应，而其它一些则具有抑制效应(Boruchov等.2005；Kalergis等，2002)。不同的FcγR效应器功能包括抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、细胞因子释放、吞噬作用和成熟作用。经工程改造具有选择性效应器功能的Fc结构域可以提供生理益处。

发明内容

本公开提供涉及结合Fc受体的非糖基化抗体Fc结构域的化合物和方法。

在一些实施方案中，涉及包含具有来自抗体的非糖基化Fc结构域(“抗体Fc结构域”)的多肽的组合物。在另外的实施方案中，非糖基化Fc结构域是野生型Fc结构域的变体，以致于变异使得Fc结构域可以特异性结合至一种或者更多种Fc受体。在一些实施方案中，具有非糖基化Fc结构域变体的多肽能够仅结合具有糖基化形式野生型Fc结构域(“糖基化野生型Fc结构域”)可以结合的Fc受体的亚组。在特定的实施方案中，具有非糖基化Fc结构域变体的多肽可特异性地结合FcγRI；在一些情况中，其亲和性或者结合能力在具有糖基化野生型Fc结构域多肽的2倍之内。在其它的实施方案中，另外地或者备选地，具有非糖基化Fc结构域变体的多肽与具有糖基化野生型Fc结构域的多肽相比具有显著降低的亲和性或者结合能力(50倍或者更大的降低)。在某些实施方案中，具有非糖基化Fc结构域变体的多肽具有显著降低的结合FcγRIIb的亲和性或者能力。可预期与具有糖基化野生型Fc结构域的多肽相比，多肽具有相当的(2倍之内)对FcγRI的亲和性或者结合能力，以及显著降低的对FcγRIIB的亲和性或者结合能力。

如本文所使用，术语“亲和性”指两种试剂可逆性结合的平衡常数并且表示为Kd。结合结构域与其靶的亲和性可以，例如，从大约100纳摩尔(nM)至大约0.1nM，从大约100nM至大约1皮摩尔(pM)，或者从大约100nM至大约1飞摩尔(fM)；备选地，亲和性可以在100nM和1nM之间或者在0.1nM和10nM之间。此外，考虑了当两种试剂之间的亲和性在上面讨论的亲和性范围之内时试剂特异性结合。

抗体Fc结构域可以是IgA、IgM、IgE、IgD或者IgG抗体或其变体的Fc结构域。在某些实施方案中，结构域是IgG抗体Fc结构域，诸如IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4抗体Fc结构域。此外，抗体Fc结构域可以限定为人Fc结构域，在这种情况下，Fc结构域特异性结合一种或者更多种人Fc受体。在某些方面中，Fc结构域可以是IgG1 Fc结构域，诸如抗HER2抗体的Fc结构域，更加具体而言是曲妥珠单抗的Fc结构域。在一些实施方案中考虑了整个多肽是非糖基化的，或者在其它实施方案中考虑了仅多肽的一部分是非糖基化的，如Fc结构域。还考虑了，多肽除了包含Fc结构域之外，还可包含一个或者更多个来自抗体的区域。多肽可包含来自抗体的抗原结合结构域。此外，多个多肽可以形成抗体或者抗体样蛋白质。

在一些实施方案中，涉及包含能够结合人FcR多肽的非糖基化抗体Fc结构域的多肽，其中Fc结构域包含特定的氨基酸替换。在一些实施方案中，涉及多个氨基酸替换。在另外的实施方案中，涉及相对于野生型Fc结构域有直至8个氨基酸替换。在人Fc结构域中的替换中，实施方案包括具有这样的人Fc结构域的多肽，所述人Fc结构域在氨基酸382和428位具有氨基酸替换并且在下列任意氨基酸中具有至少一个额外替换：224、241、251、266、269、276、279、286、295、297、300、315、325、328、330、331、332、338、340、341、348、369、378、382、392、424、426、428和/或434。在一些情况中，特别考虑了，that the人Fc结构域的氨基酸329是野生型序列，即脯氨酸。在一些实施方案中，多肽在氨基酸382具有人Fc结构域替换，即缬氨酸(V)替换谷氨酸(E)(E382V)。在本文中采用对于氨基酸的常规单字母缩写。在另外的实施方案中，多肽具有在氨基酸428位的人Fc结构域替换，其为异亮氨酸(M428I)。在一些情况中，多肽在人Fc结构域的氨基酸382和氨基酸428位均具有替换，在氨基酸382位为缬氨酸(E382V)，在氨基酸428位为异亮氨酸(M428I)。在一些实施方案中，多肽在人Fc结构域的氨基酸328位具有替换，其为色氨酸(L328W)。在另外的实施方案中，多肽在人Fc结构域的氨基酸332位具有替换，其为酪氨酸(I332Y)。其它多肽包括至少在人Fc结构域的氨基酸328和332位具有替换的那些多肽。氨基酸328位的替换可以是色氨酸(L328W)并且氨基酸332位的替换可以是酪氨酸(I332Y)。在另外的实施方案中，多肽在人Fc结构域的氨基酸341位具有替换，在更多实施方案中其为缬氨酸(G341V)。更多实施方案涉及在人Fc结构域382和428位具有替换并且在结构域上的下列位置具有至少一个额外替换的多肽：H224R/Y、F241L、K251F、V266M、E269K、N276D、V279M、N286D、Q295R、N297D、Y300C、N315D、N325S、L328W、A330V/E/I、P331A/S/E、I332Y、K338I/R、K340N/Q、G341V、V348M、V369A、A378D、K392E、S424L、S426I或N434S/D。在一些实施方案中考虑了多个额外替换。

在一些实施方案中，多肽具有在氨基酸382和428位具有替换并且还在CH2上部区域具有至少一个额外替换的非糖基化人Fc结构域。一些实施方案涉及在CH2上部区域的下列部分中的氨基酸上具有至少一个额外的人Fc结构域替换的多肽：234L-239S；264V-268H；297N-299T；或者328L-332I。

在更多的实施方案中，多肽不具有额外的人Fc结构域替换G341V和/或K338R。然而，在其它情况中，Fc结构域可以具有G341V替换和选自下列组的至少一个其它替换：H224Y、F241L、E269K、N276D、N286D、Y300C、N325S、K338R、V348M、V369A、K392E、S424L和N434D/S。在一些实施方案中，Fc结构域具有选自该组的多个其它替换。多肽可具有包括K338R替换的Fc结构域替换。

在一些实施方案中涉及具有这样的人Fc结构域的多肽，所述人Fc结构域具有选自下列的一组替换：a)K338R和G341V；b)N297D、N315D和K340N；c)K340N；d)K338I和K340N；e)K340Q和A378D；f)N325S和K340N；g)H224Y、E269K、N325S和G341V；h)G341V和K392E；i)K338R、G341V、S424L和N434D；j)F241L和G341V；k)G341V；l)N276D和G341V；m)G341V和V369A；n)N286D、G341V和N434S；o)N325S和G341V；p)Y300C和G341V；q)G341V和V348M；r)E382V和M428I；s)V266M；t)A330V、P331A和Q295R；u)A330E、P331E和V279M；v)A330E和P331E；w)A330E、P331V和S426T；x)A330E和P331V；y)A330I和P331E；z)A330E；aa)P331S；和bb)A330V、P331S、H224R和L251F。在一些实施方案中考虑了可包括非人Fc结构域的额外的多肽，在这种情况中，可以在相应氨基酸位进行所述替换。

实施方案涉及具有能够特异性结合一种或更多种人FcR多肽的非糖基化Fc结构域的多肽。在一些实施方案中，非糖基化Fc结构域已经进行如此的突变，以致于其可以结合FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa、FcγRIIIb或FcαRI中的一种或更多种。考虑了与这些特定人FcR多肽中的一种或者更多种的结合为对于糖基化Fc区所观察到结合的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或者100％(或者可从它们推导出的任何范围)之内，或者相对于野生型糖基化Fc结构域，结合改变(增加或者降低)至少或至多50％、60％、70％、80％、90％或100％(或者可从它们推导出的任何范围)。备选地，在具有突变的的非糖基化Fc结构域的多肽与具有糖基化的和野生型Fc结构域的多肽之间的相对结合能力可以表示为X-倍数的差异(增加或者降低)。例如，可以是至少或至多至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或者10倍的差异，或者可从它们推导出的任何范围。

在一些实施方案中，具有突变的非糖基化Fc结构域的多肽能够特异性结合FcγRI多肽。在一些情况中，其以具有糖基化和野生型Fc结构域的多肽结合水平的2倍之内的水平结合。在其它的实施方案中，结合水平在糖基化和野生型Fc结构域的至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或者10倍之内。例如，在本文所述的实施方案中，对于Fc受体与或者具有非糖基化Fc结构域变体的多肽或者具有糖基化和野生型Fc结构域的多肽的K_D数值在至少2倍或者3倍之内。在一些实施方案中，与具有非糖基化野生型抗体Fc结构域的多肽相比，多肽在pH依赖的FcRn结合方面具有至少2倍的降低。

在一些实施方案中，本文所述的多肽可包括连接体。在更多的实施方案中，连接体是可缀合的连接体。在一些实施方案中，多肽包含来自抗体的Fc结构域。其可包含来自抗体的其他区域，如另一结合结构域。在某些实施方案中，另外的结合结构域不是FcR结合结构域。在一些实施方案中，其还包含来自抗体的抗原结合位点或者结构域。这将包括来自抗体的所有或者部分可变区。在其它的实施方案中，多肽包含来自抗体的Fc结构域但是不包含为非FcR结合结构域的另一结合结构域。在一些实施方案中，非Fc结合区不是抗体的抗原结合位点，但特异性结合细胞表面蛋白。在一些情况中，非Fc结合区识别的细胞表面蛋白是受体。在一些实施方案中，细胞表面受体是酪氨酸激酶。在另外的实施方案中，多肽具有能够结合多种酪氨酸激酶受体的非Fc结合区。在一些实施方案中，此种非Fc结合区能够结合VEGF受体、PDGF受体、EGFR受体、ErbB-2受体、EGF受体、HGF受体和其它Src样酪氨酸激酶受体或其组合中的一种或多种。还特别考虑了，多肽具有识别这些受体酪氨酸激酶中一种或者更多种的抗原结合区。

其他多肽包括具有能够结合FcRγI多肽的非糖基化Fc结构域和第二结合结构域的那些多肽，其中第二结合结构域能够特异性结合细胞表面分子。在一些实施方案中，第二结合结构域是抗体的抗原结合结构域(“抗体抗原结合结构域”)。在一些情况中，第二结合结构域不是抗体抗原结合结构域。在一些实施方案中，第二结合结构域能够特异性结合其为蛋白质类分子的细胞表面分子。第二结合结构域可以是细胞表面受体的配体或者可以是细胞表面配体的受体。

实施方案还考虑了编码本文所述任意多肽的核酸。核酸可以是分离的和/或重组的。其可以是分离的和/或重组的核酸片段。在一些实施方案中，核酸是DNA，而在其他实施方案中核酸是RNA。在某些实施方案中，核酸是DNA片段。在其它的实施方案中，核酸是能够表达这样的任意多肽的表达载体，所述的任意多肽具有特异性结合人FcR多肽的带有一个或更多个替换的Fc结合结构域。核酸可编码一种或更多种上述多肽，所述多肽取决于多肽如何产生而可以是糖基化的或者不是糖基化的。

在一些实施方案中，涉及编码具有能够特异性结合人FcR多肽的Fc结构域的多肽的核酸。核酸可置于可表达多肽，特别是非糖基化形式多肽的宿主细胞中。宿主细胞可以是原核细胞，诸如细菌细胞。备选地，宿主细胞可以是真核细胞，诸如哺乳动物细胞。在一些实施方案中，宿主细把包含第一表达载体，虽然它还可以包含第二表达载体。由于一些抗体由多个多肽组成，所以考虑了表达这些多肽的宿主细胞。例如，在一些实施方案中，考虑了包括第二表达载体的宿主细胞，所述第二表达载体编码包含免疫球蛋白轻链的多肽。

在一些实施方案中，涉及宿主细胞群体，其中群体包含表达不同Fc结构域的多肽的多种宿主细胞。考虑了任何两个不同Fc结构域的氨基酸序列之间的同一性差异小于20％、15％、10％、5％或更小。

在一些实施方案中，涉及产生本文所述多肽(具有非糖基化Fc区的多肽)的方法以及使用它们的方法。就本文所述的任何多肽而言可使用任何这些方法。

在一些实施方案中，涉及用于制备非糖基化多肽的方法，包括：a)得到能够表达非糖基化抗体的宿主细胞，所述非糖基化抗体包含能够结合FcR多肽的Fc结构域，其中Fc结构域包含氨基酸382和428位的氨基酸替换并且在下列任意氨基酸中具有至少一个额外替换：224、241、251、266、269、276、279、286、295、297、300、315、325、328、330、331、332、338、340、341、348、369、378、382、392、424、426、428和/或434；b)在促进非糖基化抗体表达的情况下培养宿主细胞；和，c)从宿主细胞纯化表达的抗体。在一些实施方案中，宿主细胞是原核细胞，诸如细菌细胞。在其它的实施方案中，宿主细胞是真核细胞并且多肽包含N297D替换。在更多的实施方案中，方法包括从上清液收集表达的抗体，这可以在纯化之前进行。

在一些实施方案中，方法包括从上清液纯化抗体。这可包括将上清液经过滤、HPLC、阴离子或阳离子交换、高效液相色谱(HPLC)、亲和层析或其组合纯化抗体。在一些实施方案中，方法包括使用能结合IgG Fc区的葡萄球菌蛋白A的亲和层析。其他纯化方法是本领域普通技术人员众所周知的。

其他实施方案涉及用于诱导受试者内免疫反应的方法。可以在此种方法中使用具有能够结合FcR多肽的非糖基化Fc结构域的多肽。在某些实施方案中，向受试者开处或者施用非糖基化的并且具有能结合FcγRI多肽的Fc结构域的抗体。备选地，方法可包括用此种抗体治疗受试者。可以使用本文所述的任何多肽。某些实施方案涉及具有非糖基化人Fc结构域的多肽，所述非糖基化人Fc结构域包含在氨基酸382和428位的氨基酸替换并且在下列任意氨基酸中具有至少一个额外替换：224、241、251、266、269、276、279、286、295、297、300、315、325、328、330、331、332、338、340、341、348、369、378、382、392、424、426、428和/或434。

在一些实施方案中，非糖基化多肽或者抗体能够特异性结合活化FcR多肽，活化FcR多肽指活化一种或者更多种免疫细胞的FcR多肽。活化多肽包括FcγRI、IIa、IIIa、IIb和IIIc。FcγRIIb是抑制性FcR多肽。在更多的实施方案中，非糖基化多肽或者抗体不再以与糖基化的、野生型Fc结构域可比的水平结合抑制性FcR多肽。在特定的实施方案中，非糖基化多肽或者抗体特异性结合FcγRI多肽。在更多的实施方案中，非糖基化多肽或者抗体具有降低的结合FcγRIIb多肽的能力，其中其亲和性比糖基化的、野生型形式的多肽或抗体小至少50倍。在某些实施方案中，非糖基化抗体是非糖基化形式的治疗抗体，所述治疗抗体指用于治疗或者处置疾病或病症的抗体。本文所述的任何抗体或者多肽，包括上面所述的那些，可以用于实施用于诱导免疫反应的方法。治疗抗体的实例是曲妥珠单抗。

在一些实施方案中，涉及诱导针对表达所靶向细胞表面多肽的靶细胞的树突细胞(DC)介导的细胞杀伤的方法，包括：a)使靶细胞与包含i)能够至少特异性结合树突细胞活化FcR的突变的和非糖基化Fc结构域和ii)结合所靶向细胞表面多肽的第二结合结构域的多肽接触；和b)在促进杀死靶细胞的情况下将靶细胞与树突细胞接触。在一些实施方案中，活化FcR是FcγRI多肽。在另外的实施方案中，具有非糖基化Fc结构域的多肽以与具有糖基化野生型Fc结构域的多肽相比降低的水平特异性结合FcγRIIB多肽。在一些实施方案中，多肽具有这样的Fc结构域，所述Fc结构域包含在下列氨基酸位的至少一个氨基酸替换：224、241、251、266、269、276、279、286、295、297、300、315、325、328、330、331、332、340、348、369、378、382、392、424、426、428和/或434。另外的多肽在上面以及本申请通篇讨论。在一些实施方案中，靶细胞是癌细胞。因此，考虑了在抗体治疗中使用非糖基化的和突变的Fc结构域代替糖基化的和野生型Fc结构域治疗癌症的方法。涉及使用糖基化和野生型Fc结构域的抗体对其他疾病或者病症的治疗，可以类似地使用本文所述的非糖基化的和Fc变体多肽实施。

其它实施方案涉及用于筛选具有结合一种或者更多种特异性FcR多肽的Fc结构域的非糖基化多肽的方法，包括：a)得到一群革兰氏阴性细菌细胞，该群细胞在它们的周质中表达包含Fc结构域的非糖基化多肽，其中群体表达多种不同的Fc结构域；b)使细菌细胞与第一FcR多肽在使得FcR多肽与非糖基化Fc结构域之间接触的条件下接触，其中FcR多肽是FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa、FcγRIIIb或者FcαRI；和，c)基于非糖基化Fc结构域与第一FcR多肽的结合选择至少一种细菌细胞。方法还包括从选择的细菌细胞鉴定或分离非糖基化多肽。同样，方法可包括确定所选择细菌细胞中的非糖基化多肽是否能结合其它FcR多肽。在一些实施方案中，确定所选择细菌细胞中的非糖基化多肽是否能结合其他FcR多肽包括以第二FcR多肽重复步骤a)-c)，以确定非糖基化多肽是否还结合第二FcR多肽。考虑了步骤a)-c)可以两种以上不同FcR多肽重复。在一些实施方案中，非糖基化多肽结合多种FcR多肽。

在一些实施方案中，方法包括其为大肠杆菌细胞的细菌细胞。在另外的实施方案中，Fc结构域是IgG、IgA或IgE Fc结构域。在更多的实施方案中，革兰氏阴性细菌细胞群体包含编码多种非糖基化Fc结构域的多种核酸。在一些情况中，多种核酸还编码与多种非糖基化Fc结构域融合的膜分泌信号。膜分泌信号可以是PelB或者DsbA。另外，非糖基化Fc结构域可以包括铰链区、CH2区和CH3区。在某些实施方案中，非糖基化多肽包含真核FcR结构域。在一些实施方案中，涉及具有特异性结合表1中一种多肽的Fc结构域的多肽。在某些实施方案中，Fc结构域结合人FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa、FcγRIIIb、FcαRI或者C1q。在其它的实施方案中，相对于糖基化的和野生型形式的Fc结构域，其具有降低的对FcγRIIb的结合亲和性。特定的方法公开于WO 2008/137475中，其通过参考并入本文。

其它实施方案涉及用于优化Fc结合一种或更多种具有Fc结构域的非糖基化多肽的特异性FcR多肽的方法，包括：a)得到一群革兰氏阴性细菌细胞，该群细胞在它们的周质中表达包含Fc结构域的非糖基化多肽，其中群体表达表达不同突变的Fc结构域的不同多肽；b)使细菌细胞与第一FcR多肽在使得FcR多肽与非糖基化Fc结构域之间接触的条件下接触，其中FcR多肽是FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa、FcγRIIIb或者FcαRI；和c)基于非糖基化Fc结构域与第一FcR多肽的结合选择至少一种细菌细胞。上面讨论的任何实施方案可以用于实施这些方法。

就本文所述的任何其它方法或者组合物而言，可以用于本发明方法和/或组合物背景下讨论的任何其它实施方案。因此，关于一种方法或者组合物的实施方案也可以应用于本发明的其它方法和组合物中。

如本文所使用，关于核酸的术语“编码”或者“编码的”用于使本领域技术人员容易理解，然而这些术语可以分别与“包含”或者“包含的”互换使用。

如本说明书中所使用，“a”或者“an”意思是指一或者一以上。如权利要求书中所使用，当与词语“包含的”结合使用时，词语“a”或“an”意思是指一或一以上。

在权利要求书中术语“或者”的使用用于指“和/或”，除非明确表明是指仅备选方案，或者备选方案是相互排斥的，虽然本公开支持“或者”指仅备选方案和“和/或”的定义。如本文所使用，“另一”意思是指至少第二或者更多。

在本申请通篇中，术语“大约”用于数值包括用于确定数值的仪器、方法的内在误差变化，或者研究受试者当中存在的变化。

根据下面的详细描述本发明的其它目标、特征和优势将变得显而易见。然而，应当理解，详细的描述和特定的实施例虽然表明了本发明的优选实施方案，但是仅以例证方式给出，因为根据该详细描述对于本领域技术人员而言处于本发明精神和范围内的多种改变和修改将是显而易见的。

附图说明

下列附图构成了本说明书的一部分并且之所以包括下列附图是为了进一步证明本发明的某些方面。参照这些附图中的一个或者更多个并结合本文给出的特定实施方案的详细描述可以更好地理解本发明。

图1以糖基化IgG1Fc的3D结构表示的分离的非糖基化Fc5的突变点(382E和428M)(PBD码：1FC1)。

图2在糖基化IgG晶体结构上表示的CH3结构域中的两个β片层，包括β-片层C中的382E和β-片层C中的428M。(PBD码：1FC1)。

图3用于工程改造非糖基化Fc5结构域的易错PCR文库。

图4来自不同轮分选的以FcγRIa-FITC标记的原生质球的荧光直方图。

图5表现出对FcγRIa比对Fc5具有更高亲和性的分离的Fc突变体克隆的DNA序列。对于以FcγRIa标记的各个克隆的平均荧光数值在括号中显示。

图6在糖基化IgG1Fc的3D结构上表示的分离的非糖基化Fc601-619的突变点(PBD码：1FC1)。

图7对于以30nM FcγRIa-FITC标记的野生型Fc、Fc5和Fc601的原生质球的荧光直方图。M：平均荧光强度。

图8在糖基化IgG1Fc的3D结构上表示的分离的非糖基化Fc 601的突变点(K338R、G341V、E382V、M428I)(PBD码：1FC1)。

图9质粒pSTJ4-赫赛汀IgG1图谱。

图10通过对于结合FcγRIa的BIACore分析所确定的非糖基化曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-Fc5、曲妥珠单抗-Fc601和糖基化曲妥珠单抗的动力学速率和平衡解离常数。

图11对于曲妥珠单抗抗体与FcγRIIa-GST结合的ELISA测定。

图12对于曲妥珠单抗抗体与FcγRIIb-GST结合的ELISA测定。

图13对于曲妥珠单抗抗体与FcγRIIIa结合的ELISA测定。

图14对于在pH 7.4和6.0下与FcRn进行pH依赖性结合的ELISA测定。板以非糖基化曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-Fc5、曲妥珠单抗-Fc601或者商业化的糖基化曲妥珠单抗包被并且使用抗GST-HRP抗体确定FcRn的结合。

图15对FcγRIa比对Fc5具有更高亲和性和pH依赖性FcRn结合的文库。

图16用于构建CH2上部区域随机化的4个亚文库的基因装配PCR。

图17表现出对FcγRIa比对Fc5具有更高亲和性的分离的Fc突变体克隆的DNA序列。对于以FcγRIa标记的各个克隆的平均荧光数值在括号中显示。

图18Fc701-709中突变总结。

图19以1nM FcγRIa-FITC标记的野生型Fc、Fc5、Fc701和Fc702的原生质球细胞的荧光直方图。M：平均荧光强度。

图20以1nM FcγRIa-FITC标记的野生型Fc、Fc5、Fc601和Fc701原生质球细胞的荧光直方图。M：平均荧光强度。

图21在糖基化IgG1Fc的3D结构上表示的分离的非糖基化Fc5的突变点(382E和428M)(PBD码：1FC1)。

图22通过对于结合FcγRI的BIACore分析所确定的非糖基化曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-Fc5、曲妥珠单抗-Fc601、曲妥珠单抗-Fc701和糖基化曲妥珠单抗的动力学速率和平衡解离常数。

图23对于在pH 7.4和6.0下进行pH依赖性结合FcRn的ELISA测定。板以非糖基化曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-Fc5、曲妥珠单抗-Fc601、曲妥珠单抗-Fc701或者商业化的糖基化曲妥珠单抗包被并且使用抗GST-HRP抗体确定FcRn的结合。

图24共价锚定的全长IgG展示系统。

图25在双质粒共价锚定的全长IgG展示系统和双顺反子系统之间的FACS信号的比较。或者使用双质粒的锚定全长IgG展示系统或者使用双顺反子全长IgG展示系统表达曲妥珠单抗全长IgG。M：平均荧光强度。原生质球与30nMFcγRI-FITC探针孵育以便检测。

图26在双质粒共价锚定全长IgG展示系统和双顺反子系统之间FACS信号比较。或者使用双质粒锚定全长IgG展示系统或者双顺反子全长IgG展示系统表达曲妥珠单抗全长IgG。M：平均荧光强度。原生质球与30nM FcγRIIa-GST孵育并以多克隆抗GST-FITC(1∶200)探针标记以便检测。

图27使用双质粒的共价锚定全长IgG展示系统和双顺反子系统的曲妥珠单抗全长IgG的FACS分析。表达曲妥珠单抗全长IgG的原生质球与30nMFcγRI-FITC探针孵育以便检测。M：平均荧光强度。

图28使用双质粒的共价锚定全长IgG展示系统和双顺反子系统的曲妥珠单抗全长IgG的FACS分析。表达曲妥珠单抗全长IgG的原生质球与30nMFcγRIIa-GST孵育并且用多克隆抗GST-FITC(1∶200)探针孵育以便检测。M：平均荧光强度。

图29文库CH2上部区域随机化的文库。

图30使用PBMC作为效应器细胞和使用SkBr3作为靶细胞的ADCC测定。*，P＜0.05。

图31使用mDCs作为效应器细胞和使用SkBr3作为靶细胞的ADCC测定。*，P＜0.05；**，P＜0.01。

具体实施方式

发明人先前克服了当前免疫治疗技术在提供能够结合Fc受体多肽的非糖基化抗体Fc结构域中的数个主要问题。已经开发出具有工程化特征的另外的Fc结构域。虽然提供了关于Fc文库和筛选方法的信息，但是在下面描述更多的实施方案和优势。

I.周质表达

在一些实施方案中，包含抗体Fc结构域的多肽可以在革兰氏阴性细菌周质空间中表达。此外，在一些方面中，抗体Fc结构域可以锚定在内膜的周质面上。例如，Fc结构域可以与跨膜或者膜结合多肽直接融合，或者可以与跨膜或者膜结合多肽相互作用(例如通过蛋白质-蛋白质相互作用)。此种技术可以称作“锚定周质表达”或者“APEx”。

周质区室包含于革兰氏阴性细胞的内膜与外膜之间(见例如Oliver，1996)。作为亚细胞区室，周质区室的大小、形状和内容物伴随着细胞的生长和分裂而变化。在肽聚糖杂聚物框架内是密集环境的周质蛋白质和较少的水，赋予区室凝胶样的稠度(Hobot等，1984；van Wielink和Duine，1990)。取决于距外膜的距离、其形成支撑细胞形状的胞壁质球囊的闭合以及渗透性溶解的抵抗，肽聚糖以不同程度聚合。

外膜(见Nikaido，1996)由磷脂类、孔蛋白和伸向外界基质的脂多糖(LPS)构成。外膜完整性的分子基础在于LPS结合二价阳离子(Mg²⁺和Ca²⁺)的能力和通过静电彼此连接在膜上形成高序准晶体的有序“瓦屋顶”的能力(Labischinski等，1985)。膜形成非常严格的通透性屏障、允许小于约650Da的分子经过孔蛋白通过(Burman等，1972；Decad和Nikaido，1976)。大的充满水的孔蛋白通道主要负责允许单糖和二糖、离子和氨基酸自由通过进入周质区室(Nikaido和Nakae，1979；Nikaido和Vaara，1985)。因为分子进入周质具有如此严格的生理调节，乍一看大配体(即大约650Da的排斥界限)可以在筛选方法中采用是不可思议的。然而，发明人已经证明，大于2000Da大小的配体可以扩散进入周质中，而不破坏周质膜。如下文所述，可以对细菌细胞进行一种或者更多种处理，由此使外膜渗透性更大来辅助此种扩散。

用于在周质空间中表达多肽并且特别是抗体的方法在本领域中是已知的，例如见美国专利7,094,571和美国专利公布20030180937和20030219870，每一文献通过参考并入本文。在一些情况中，本发明的革兰氏阴性细菌细胞可以限定为大肠杆菌细胞。此外，在一些方面中，革兰氏阴性细菌细胞可以限定为遗传工程改造的细菌细胞，诸如大肠杆菌Jude-1株。

II.外膜的透化

在一些实施方案中，涉及破坏、透化或者去除细菌外膜的方法是本领域众所周知的，例如，见美国专利7,094,571。例如，在细菌细胞与FcR多肽接触之前，用高渗条件、物理应力、溶菌酶、EDTA、消化酶、破坏外膜的化学试剂、通过以噬菌体感染细菌或者上述方法的组合处理细菌细胞的外膜。因此，在一些情况中，外膜可以通过溶菌酶和EDTA处理来破坏。此外，在某些实施方案中，细菌外膜可以完全去除。

在一个实施方案中，采用用于增加外膜对一种或者更多种标记配体通透性的方法。这使得可以筛选标记配体的进入，否则标记的配体不能够跨过外膜。然而，某些种类的分子，例如大于650Da排斥界限的疏水性抗生素类本身可扩散通过细菌外膜，而不依赖于膜孔蛋白(Farmer等，1999)。这样做实际上是该过程可将膜透化(Jouenne和Junter，1990)。此种机制已经被用于以多粘菌素B九肽体内选择性标记细胞质膜蛋白的周质环(Wada等，1999)。同样，某些长链磷酸盐聚合物(100Pi)似乎完全绕过外膜的正常分子筛活性(Rao和Torriani，1988)。

已经鉴定出导致配体透过进入周质而不损失活力或者所表达蛋白质不从细胞释放的条件，但是本发明将在无需保持外膜的情况下开展。如本文中所证明，Fc结构域表达或锚定在周质空间内的候选结合蛋白，消除了对维持外膜(作为防止结合蛋白从细胞外漏的屏障)以检测标记配体的需要。结果，表达锚定至细胞质膜外面(周质面)的结合蛋白的细胞可以简单地通过具有部分透化膜或者几乎完全去除外膜的细胞与荧光标记的配体溶液孵育而进行荧光标记。

不同菌株细菌宿主的外膜通透性在很大程度上变化。先前已经证明，缺乏组蛋白样蛋白质会因为OmpF过表达而引起通透性增加，结果导致对于OmpF翻译的负向调节mRNA的数量降低(Painbeni等，1997)。同样，DNA复制和染色体分离依赖于复制体与内膜的直接接触，内膜本身与外膜在很多点接触。对于文库筛选应用的优选宿主是大肠杆菌ABLEC株，另外其具有降低质粒拷贝数的突变。

诸如高渗胁迫的处理可以显著改善标记。已知许多试剂，包括钙离子(Bukau等，1985)和甚至Tris缓冲液(Irvin等，1981)改变外膜通透性。此外，噬菌体感染刺激标记过程。丝状噬菌体内膜蛋白pIII和大多聚体外膜蛋白pIV均可改变膜通透性(Boeke等，1982)，其中已知pIV中的突变体改善在正常情况下所排斥的麦芽糊精的进入(Marciano等，1999)。使用包括菌株、盐和噬菌体的正确组合的本发明技术，可以达到高程度的通透性(Daugherty等，1999)。然后，可以容易地将包含结合至荧光标记配体的锚定或周质相关多肽的细胞从表达结合蛋白的细胞分离，而无需使用流式细胞术或者其它相关技术对于标记配体的亲和性。然而，在一些情况中，希望使用破坏性更小的技术以维持细胞的活力。在这方面，EDTA和溶菌酶处理也是有用的。

III.抗体结合性多肽

在某些方面，涉及用于鉴定对抗体结合性多肽诸如Fc受体具有特异亲和性的抗体Fc结构域的方法。在一些实施方案中，Fc结构域经工程改造以结合一种或者更多种特异性Fc受体。另外地或者备选地，Fc结构域可以工程改造以致于其特异性地结合一种或者更多种特异性Fc受体。

在某些实施方案中，涉及包含已经相对于天然或者野生型蛋白质进行修饰的蛋白质类分子的组合物。

在一些实施方案中，蛋白质类化合物已经缺失了氨基酸残基；在其它的实施方案中，蛋白质类化合物的氨基酸残基已经被替代，而在又一实施方案中，在蛋白质类化合物中进行了氨基酸残基的缺失和替代两者。此外，蛋白质类化合物可包括包含一种以上多肽实体的氨基酸分子。如本文所使用，“蛋白质类分子”、“蛋白质类组合物”、“蛋白质类化合物”、“蛋白质类链”或者“蛋白质类材料”通常指，但不限于，大于约200个氨基酸的蛋白质或者从基因翻译的全长内源序列；100个氨基酸或者更大的多肽；和/或3至100个氨基酸的肽。上面描述的所有的“蛋白质类”术语在本文中可以互换使用；然而，特别考虑了，实施方案可以局限于特定类型的蛋白质类化合物，诸如多肽。此外，这些术语同样可以应用于融合蛋白质或者蛋白质缀合物。蛋白质可以包括一种以上的多肽。例如，IgG抗体具有两个重链多肽和两个轻链多肽，通过二硫键将它们彼此连接起来。

如本文所使用，“不同的Fc结构域”可以定义为与另一Fc有少至1个氨基酸差异的结构域。用于产生不同抗体Fc结构域文库或者编码抗体的核酸的方法在本领域中众所周知并且在本文中举例说明。例如，在一些情况中，如在本文中所例证，Fc结构域可以通过易错PCR扩增。此外，在某些情况下，多种抗体Fc结构域可以包含已经随机化的一串(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)氨基酸。在某些情况下，可将Fc结构域经工程改造进行特定突变。例如，在一些方面中，正常情况下在抗体Fc结构域中被糖基化的残基可以突变。此外，在某些方面，正常情况下糖基化的残基(或者邻近残基)可以用作插入1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸的位点。氨基酸插入可以在对应于IgG1Fc(SEQ ID NO：2)氨基酸384的残基或者附近进行。在又一种情况中，根据本发明的革兰氏阴性细菌群体可以定义为包含至少约1×10³，1×10⁴，1×10⁵，1×10⁶，1×10⁷，1×10⁸或者更多不同抗体Fc结构域。在一些特定情况中，革兰氏阴性细菌细胞群体可以通过包括下列步骤的方法产生：(a)制备编码多种不同抗体Fc结构域的多种核酸；和(b)以所述核酸转化革兰氏阴性细菌群体，其中革兰氏阴性细菌包含表达在周质中的多种抗体Fc结构域。

许多种抗体结合结构域(例如FcR多肽)是本领域已知的并且可以在本发明方法和组合物中使用。例如，在一些方面中，FcR可以对Ig的特定类型或者亚型具有特异性，诸如IgA、IgM、IgE或者IgG(例如IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或者IgG4)。因此，在一些实施方案中，抗体结合结构域可以限定为IgG结合结构域。FcR多肽可包含真核的、原核的或者合成的FcR结构域。例如，抗体Fc-结合结构域可以限定为哺乳动物的、细菌的或者合成的结合结构域。用于在本发明中使用的一些Fc-结合结构域包括但不限于来自表1多肽之一的结合结构域。例如，Fc结合多肽可以由FCGR2A、FCGR2B、FCGR2C、FCGR3A、FCGR3B、FCGR1A、Fcgr1、FCGR2、FCGR2、Fcgr2、Fcgr2、FCGR3、FCGR3、Fcgr3、FCGR3、Fcgr3、FCGRT、mrp4、spa或者spg基因编码。优选地，用于根据本发明使用的FcR多肽可以是来自人FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa、FcγRIIIb、FcαRI或C1q的Fc结合区。

在本发明的又一实施方案中，Fc多肽可以锚定至革兰氏阴性细菌的内膜。用于将多肽锚定至革兰氏阴性细菌内膜的方法和组合物已经在先前描述(美国专利7,094,571和美国专利公布20050260736)。因此，在一些方面中，Fc结构域可以融合至与细菌内膜结合或者整合入细菌内膜的多肽。此种融合蛋白质可以包括与Fc结构域的N末端或者C末端融合，并且在一些情况中可以在膜锚定多肽与Fc结构域之间包括额外的连接体氨基酸。在某些特定的情况中，膜锚定多肽可以是又大肠杆菌NlpA基因编码的前6个氨基酸，来自大肠杆菌内膜蛋白的一个或者更多个跨膜α-螺旋，丝状噬菌体的基因III蛋白质或其片段，或者内膜脂蛋白或其片段。因此，作为实例，膜锚定多肽可以是内膜脂蛋白或其片段，诸如来自AraH、MglC、MalF、MalG、MalC、MalD、RbsC、RbsC、ArtM、ArtQ、GlnP、ProW、HisM、HisQ、LivH、LivM、LivA、LivE、DppB、DppC、OppB、AmiC、AmiD、BtuC、ThuD、FecC、FecD、FecR、FepD、NikB、NikC、CysT、CysW、UgpA、UgpE、PstA、PstC、PotB、PotC、PotH、Pod、ModB、NosY、PhnM、LacY、SecY、TolC、Dsb、B、DsbD、TouB、TatC、CheY、TraB、ExbD、ExbB或者Aas。

技术人员将理解，基于它们与FcR相互作用(结合)而选择细胞的方法在本领域中众所周知。例如，FcR可以固定在柱或者珠上(例如磁珠)并且通过重复洗涤珠(例如磁分离)或者柱分离与FcR结合的细菌细胞。此外，在一些方面中，靶配体可以用例如荧光体、放射性同位素或者酶标记。因此，在一些情况中，细菌细胞可以通过检测所结合FcR上的标记来选择。例如，荧光团可以用于使用荧光激活细胞分选(FACS)来选择细胞。此外，在一些方面中，细菌细胞可以基于两种或者更多种FcR多肽的结合或者不结合来选择。例如，可以选择表现出结合两种FcR多肽的抗体的细菌，其中使用每一FcR进行连续地选择细菌。相反，在某些方面，可以选择表现出结合一种FcR(诸如包含第一标记的FcR)但不结合第二FcR(例如包含第二标记)的抗体Fc结构域的细菌。前述方法可以用于，例如，鉴定结合特异性FcR但不结合第二特异性FcR的抗体Fc结构域。

在某些实施方案中，至少一种蛋白质类分子的大小可以包括，但不限于，大约或者至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000个或者更多个氨基分子残基，和可从其推导出的任何范围。化合物可包括来自SEQ ID NO：2(人IgG Fc多肽)或者来自SEQID NO 4-31的上述数量的连续氨基酸，并且它们可以进一步地与SEQ ID NO：2或者SEQ ID NO：4-31中的任何序列具有百分比同一性或者同源性(下面讨论)。考虑了，对于SEQ ID NO：2的实施方案可以使用本文所述的任何其它氨基酸序列，并且根据情况反之亦然。

如本文所使用，“氨基分子”指任何氨基酸、氨基酸衍生物或者本领域普通技术人员已知的氨基酸模拟物。在某些实施方案中，蛋白质类分子的残基是连续的，没有任何非氨基分子打断氨基分子残基序列。在其它的实施方案中，序列可以包含一个或者一个以上非氨基分子部分。在特定的实施方案中，蛋白质类分子的残基序列可以被一个或者更多个非氨基分子部分打断。

A.修饰的蛋白质和多肽

实施方案涉及修饰的蛋白质和多肽，特别是表现出与非修饰形式具有可比性的至少一种功能活性的修饰蛋白质或多肽，然而，修饰的蛋白质或者多肽拥有超过非修饰形式的额外的优势，诸如引起ADCC，更容易或者更廉价生产，较少地引起副作用，和/或具有更佳或者更长的有效性或生物利用率。因此，当本申请提到“修饰蛋白质”或者“修饰多肽”的功能或者活性时，本领域普通技术人员将理解这包括例如这样的蛋白质或多肽，1)表现出与未修饰蛋白质或者多肽具有至少一种相同的活性或者具有至少一种相同的特异性，但是具有不同水平的另一活性或者特异性；和2)拥有优于未修饰蛋白质或者多肽的额外的优势。活性的测定可以使用本领域技术人员熟悉的，特别是关于蛋白质活性的测定法实现，并且可以包括例如为了比较的目的使用天然和/或重组形式的修饰的或者未修饰的蛋白质或者多肽。特别考虑了，关于“修饰蛋白质”的实施方案可以使用“修饰多肽”实施，并且反之亦然。除了本文讨论的修饰的蛋白质和多肽之外，实施方案可以包括WO 2008/137475中描述的结构域、多肽和蛋白质，该文献明确地通过参考并入本文。

修饰的蛋白质可以具有氨基酸缺失和/或替换；因此，具有缺失的蛋白质、具有替换的蛋白质，和具有缺失和替换的蛋白质是修饰的蛋白质。在一些实施方案中，这些修饰的蛋白质还可以包括氨基酸插入或者添加，诸如在融合蛋白中或者具有连体体的蛋白质中。“修饰的缺失的蛋白质”缺乏一个或者更多个天然蛋白质残基，但是具有天然蛋白质的特异性和/或活性。“修饰的缺失的蛋白质”还可以具有降低的免疫原性或者抗原性。修饰的缺失的蛋白质的实例是这样的一种蛋白质，即其缺失至少一个抗原区的氨基酸残基，抗原区即决定在特定生物体，诸如修饰蛋白质可能会施用的生物体类型中抗原性的蛋白质区域。

替换或替代变体有代表性地包括在蛋白质内的一个或更多个位点一种氨基酸与另一种氨基酸的交换，并且可以经设计以调节多肽的一种或更多种特性，特别是其效应器功能和/或生物利用率。替换可以是保守的或者不是保守的，保守的即一个氨基酸用另一相似形状和电荷的氨基酸替换。保守替换是本领域众所周知的并且包括例如如下变化：丙氨酸至丝氨酸；精氨酸至赖氨酸；天冬酰胺至谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸至谷氨酸；半胱氨酸至丝氨酸；谷氨酰胺至天冬酰胺；谷氨酸至天冬氨酸；甘氨酸至脯氨酸；组氨酸至天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸至亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸至缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸至精氨酸；甲硫氨酸至亮氨酸或异亮氨酸；苯基丙氨酸至酪氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸至苏氨酸；苏氨酸至丝氨酸；色氨酸至酪氨酸；酪氨酸至色氨酸或苯丙氨酸；以及缬氨酸至异亮氨酸或亮氨酸。

除了缺失或替换外，修饰的蛋白质可以具有残基插入，其有代表性地包括在多肽中加入至少一个残基。这可以包括插入靶向肽或多肽或者只是信号残基。末端添加，称作融合蛋白在下面讨论。

术语“生物功能等效”在本领域中很容易理解并且在本文中进一步详细定义。因此，包括了具有约70％和约80％之间，或者约81％和约90％之间，或者甚至约91％和约99％之间的与天然多肽氨基酸同一或者功能等效氨基酸的序列，前提是维持了蛋白质的生物学活性。修饰的蛋白质可以与其天然相似物在生物功能上等效。

还应当理解，氨基酸和核酸序列可以包括额外的残基，诸如额外的N-末端或者C-末端氨基酸或者5′或者3′序列，并且在本质上仍然如在本文所公开的序列之一所述，只要序列满足了上述标准即可，包括就蛋白质表达而言维持了蛋白质的生物学活性。末端序列的添加特别应用于核酸序列，核酸序列例如可以包括编码区5′或3′部分的不同的非编码侧翼或者可以包括不同的内部序列，即已知基因内存在的内含子。

下面是基于改变蛋白质氨基酸以产生等效或者甚至改善的、第二代分子的讨论。例如，某些氨基酸可以替换蛋白质结构中的其它氨基酸，而具有或不具有相当大的与结构例如作用物分子结合位点的相互作用结合能力的损失。由于限定蛋白质生物学功能活性的是该蛋白质的相互作用能力和性质，所以可以在蛋白质序列中并且在其DNA编码序列中进行某些氨基酸替换，尽管如此仍产生具有相似特性的蛋白质。因此发明人考虑了，可以对基因的DNA序列进行多种改变而不会造成它们的生物学有效性或者活性相当大的损失，如下面所讨论。如果满足下列“同源性标准”之一，则蛋白质类分子与第二蛋白质类分子具有“同源性”或者认为是“同源的”：1)蛋白质类分子与第二蛋白质类分子在同一位置具有至少30％的序列同一性；2)在第二蛋白质类分子内的相同位置上具有一些序列同一性，并且如本文所述，对于第二蛋白质类分子，在非相同的残基上，至少30％的残基为保守性的差异；或者3)至少30％的蛋白质类分子与第二蛋白质类分子具有序列同一性，但是在相同残基之间可能具有非相同的残基缺口。如本文所使用，术语“同源的”可以同样地应用于蛋白质类分子的区域，而不是整个分子。如果术语“同源性”或者“同源的”通过数量限定，例如“50％同源性”或者“50％同源的”，则对于1)、2)和3)的同源性标准调整为从“至少30％”至“至少50％”。因此考虑了，在两个蛋白质类分子或者蛋白质类分子的部分之间存在至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的同源性。

备选地，修饰的多肽可以表征为与未修饰多肽或者与本文公开的任何多肽，包括SEQ ID NO：2或者SEQ ID NO：4-31中的任何序列具有一定的同一性百分数。两个蛋白质类分子或者蛋白质类分子的部分之间的同一性百分数可以是至多或者至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或者可从它们推导出的任何范围)。考虑了，上面讨论的同一性百分数与多肽特定区域与多肽未修饰区域的比较有关。例如，多肽可包含修饰的或者突变的Fc结构域，其可以基于修饰的或者突变的Fc结构域与来自同一物种的非修饰的或者突变的Fc结构域的氨基酸序列同一性进行表征。表征为例如与未修饰Fc结构域具有90％同一性的修饰的或者突变的人Fc结构域意思是指，在该结构域中有90％的氨基酸与未修饰人Fc结构域(SEQ IDNO：2)的氨基酸相同。

在产生此类改变中，可以考虑氨基酸的亲疏水性指数。在本领域中普遍理解亲疏水性氨基酸指数对赋予蛋白质的相互作用的生物学功能上的重要性(Kyte和Doolittle，1982)。一般认为，氨基酸的相对亲疏水性特征有利于所得到蛋白质的二级结构，其反过来限定了蛋白质与其他分子例如酶、作用物、受体、DNA、抗体、抗原等等的相互作用。

本领域中还理解，可以基于亲水性有效地产生相似氨基酸的替换。美国专利4,554,101，通过参考并入本文，描述了如通过邻近氨基酸的亲水性所决定的蛋白质的最大局部平均亲水性与蛋白质的生物学特性相关。如在美国专利4,554,101中所详细描述，对氨基酸残基指定下列亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯基丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。

应当理解，氨基酸可以替换具有相似亲水性值的另一氨基酸，而仍然产生生物学上等效的和免疫学上等效的蛋白质。在此类改变中，优选其亲水性值在±2之内的氨基酸替换，特别优选亲水性值在±1之内的那些氨基酸替换，并且更加特别优选其亲水性值在±0.5之内的那些氨基酸替换。

如上面所大概描述，氨基酸替换通常基于氨基酸侧链取代物的相对相似性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等等。考虑具有多种前述特征的示例性替换是本领域技术人员众所周知的并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。

结合Fc结构域的多种Fc受体是本领域众所周知的并且一些受体实例列于下表1中。

表1：选择的FcR多肽

如上所述，多肽可以包含能够结合FcR多肽的非糖基化抗体Fc结构域。在一些方面中，非糖基化Fc结构域可以进一步限定为在生理条件下对FcR多肽具有特异性亲和性。例如，Fc结构域在生理条件下具有约10^-6M至约10^-9M的平衡解离常数。此外，在一些方面中，非糖基化Fc结构域可以限定为相对于野生型序列，诸如人野生型序列包含一个或者更多个氨基酸取代或者插入。

制备此种多肽的方法包括在WO 2008/137475中讨论的那些，该文献通过参考并入本文。人们可以备选地通过遗传工程技术直接制备此类多肽，例如，通过向已知的Fc背景中引入所选择的氨基酸替换或者插入，其中插入或者替换为非糖基化Fc区提供了改善的FcR结合能力。发明人已经鉴定出为实现此种改善的FcR结合特别优选的替换是在Fc结构域位置331、382和/或428上的那些替换(例如，见Nagaoka和Akaike 2003；诸如美国专利公布US20060173170中所示的人IgG Fc结构域序列的P331、E382和/或M428，通过参考并入本文)，并且更加优选的是定义为P331L、E382V、M428I或M428L的一个或者更多个替换。

除了在下表5和6中描述的替换之外，多肽可以具有包括Fc结构域426、229、322、350、361、372、442、402、224、430、238、436、310、313、384、372、380或者331中，诸如人IgG Fc结构域S426、C229、K322、T350、N361、F372、S442、G402、H224、E430、P238、Y436、H310、W313、N384、F372、E380或者P331中的一个或更多个替代，其中特别优选的实例是a)E382和M428；b)N361、E382和M428；c)N361、F372、E382和M428；d)H310、K322、T350、E382、S426和S442；e)C229R、E382和M428；f)W313和M428；g)E382、N384和M428；h)E380、E382和N384；i)N361、E382和M428；j)E382、M428和Y436；k)P238、E382、S426、M428和E430；l)E380、E382、N384、S426、M428和E430；m)E382、S426、M428和E430；n)H224、E382、S426、M428和E430；o)P331；p)S239、I253、Q347、E382；q)E382、G402和M428；以及r)E382、P331和M428。特别的替换包括a)E382V和M428I；b)E382V；c)N361D、E382V和M428I；d)N361D、F372L、E382V和M428I；e)H310Y、K322R、T350A、E382V、S426T和S442P；f)C229R、E382V和M428I；g)W313R和M428I；h)E382T、N384D和M428I；i)E380R、E382M和N384E；j)N361S、E382V和M428I；k)E382V、M428I和Y436A；l)P238S、E382V、S426V、M428L和E430H；m)E380D、E382V、N384R、S426V、M428L和E430D；n)E382V、S426I、M428L和E430S；o)H224R、E382V、S426T、M428S和E430P；p)P331L；q)S239L、I253T、Q347L、E382V；r)E382V、G402D和M428I；以及s)E382V、P331L和M428I。

当向Fc结构域中插入额外的氨基酸时，Fc结构域中存在多个插入点，提供了改善的FcR结合能力。考虑了5至15个氨基酸的插入。在一些实施方案中，插入了10个氨基酸，例如在Fc结构域诸如人IgG Fc结构域的氨基酸N297和S298之间。在该位置的特定的插入(以及替换)包括a)RTETPVYMVM(SEQID NO：79)；b)WQVFNKYTKP(SEQ ID NO：80)；c)LGDGSPCKAN(SEQ IDNO：81)；d)EVPLVWMWVS(SEQ ID NO：82)以及F241L和K326E；和e)EQWGSQFGCG(SEQ ID NO：83)以及V282A。

Fc结构域可以是在对应于IgG Fc结构域E382的氨基酸残基上包含氨基酸替换的人IgG Fc。此外，非糖基化Fc结构域可以在邻近对应于IgG Fc结构域E382的氨基酸残基处包含氨基酸序列插入(例如大约1至5个氨基酸)。因此，在一些特定方面中，Fc结构域可包含在E382位的疏水氨基酸替换，例如E至V的替换。此外，在一些方面中，本发明的Fc结构域可以在对应于人IgG Fc的M428(例如M428至I)、S426、C229、H310、K322、T350、N361、F372或者S442的残基包含氨基酸替换。在某些特定的实施方案中，非糖基化Fc结构域可包含对应于在WO 2008/137475中所述的Fc11中发现的那些氨基酸替换，其通过参考并入本文。因此，在极其特别的情况中，非糖基化Fc结构域可包含氨基酸序列SEQ ID NO：2(Fc5)。

在一些实施方案中，非糖基化Fc结构域包含对FcR诸如人FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa、FcγRIIIb、FcαRI或C1q的特异性结合亲和性。因此，在一些方面中，本发明的非糖基化Fc结构域定义为对FcγRIa具有特异性亲和性的Fc结构域。此外，此种Fc结构域可以定义为对于FcγRIa结合在生理条件下具有大约10^-6M至大约10^-9M的平衡解离常数。

B.修饰的抗体和具有异源区的蛋白质类化合物

实施方案涉及可包括来自一种以上天然存在或者天然多肽或蛋白质的氨基酸序列的蛋白质类化合物。上面讨论的实施方案考虑在该部分中应用，并且反之亦然。例如，修饰的抗体是包含具有抗原结合结构域的修饰Fc结构域的修饰抗体。此外，抗体可具有两个不同的抗原结合区，诸如在两个重链的每一个上的不同区域。备选地或者另外地，在一些实施方案中，涉及包含多个异源性肽和/或多肽的多肽(“异源性”意思是指它们不是衍生自同一多肽)。例如，蛋白质类化合物或者分子可包括不形成抗体的、具有蛋白质结合区的修饰的Fc结构域。在一些实施方案中，涉及包含结合细胞表面受体的、带有蛋白质结合区的修饰Fc结构域的多肽。包含多个功能结构域的这些蛋白质类分子可以是两个或者更多个结构域彼此化学缀合，或者其可以是由一个核酸分子编码的两个或更多个多肽的融合蛋白。考虑了蛋白质或多肽可包括两个或者更多个异源多肽的全部或部分。

因此，多个多肽的蛋白质类化合物可以由全部或部分的第一多肽和全部或部分的第二多肽、第三个多肽、第四个多肽、第五个多肽、第六个多肽、第七个多肽、第八个多肽、第九个多肽、第十个多肽或者更多个多肽组成。

具有抗原结合结构域的多肽或蛋白质(包括抗体)或者抗体区域和非糖基化Fc结构域可以针对任何抗原或表位使用，所述抗原或表位包括但不限于属于下列靶标的蛋白质、亚基、结构域、模体和/或表位：17-IA、4-1BB、4Dc、6-酮-PGFla、8-异-PGF2a、8-氧代-dG、A1腺苷受体、A33、ACE、ACE-2、激活蛋白、激活蛋白A、激活蛋白AB、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白RIA、激活蛋白RIA ALK-2、激活蛋白RIB ALK-4、激活蛋白RIIA、激活蛋白RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、地址素、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、α-1-抗胰蛋白酶、α-V/β-1拮抗剂、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、Artemin、anti-Id、ASPARTIC、心房利尿钠因子、av/b3整联蛋白、Ax1、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-淋巴细胞刺激因子(BlyS)、BACE、BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2BMP-2a、BMP-3成骨素、BMP-4BMP-2b、BMP-5、BMP-6Vgr-1、BMP-7(OP-1)、BMP-8(BMP-8a、OP-2)、BMPR、BMPR-IA(ALK-3)、BMPR-IB(ALK-6)、BRK-2、RPK-1、BMPR-II(BRK-3)、BMPs、b-NGF、BOK、铃蟾肽、骨衍生的神经营养因子、BPDE、BPDE-DNA、BTC、补体因子3(C3)、C3a、C4、C5、C5a、C10、CA125、CAD-8、降钙素、cAMP、癌胚抗原(CEA)、癌相关抗原、组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C/DPPI、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、组织蛋白酶O、组织蛋白酶S、组织蛋白酶V、组织蛋白酶X/ZIP、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33(p67蛋白)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80(B7-1)、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉毒梭菌毒素、产气荚膜梭菌毒素、CKb8-1、CLC、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、COX、C-Ret、CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CL1、CX3CR1、CXCL、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、细胞角蛋白肿瘤相关抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、衰变加速因子、des(1-3)-IGF-I(脑IGF-1)、Dhh、地高辛、DNAM-1、DNA酶、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR(ErbB-1)、EMA、EMMPRIN、ENA、内皮缩血管肽受体、脑啡肽酶、eNOS、Eot、嗜酸性粒细胞趋化因子1、EpCAM、肝配蛋白B2/EphB4、EPO、ERCC、E-选择素、ET-1、因子IIa、因子VII、因子VIIIc、因子IX、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、Fas、FcR1、FEN-1、铁蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、血纤蛋白、FL、FLIP、Flt-3、Flt-4、促卵泡激素、Fractalkine、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas 6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14、CDMP-1)、GDF-6(BMP-13、CDMP-2)、GDF-7(BMP-12、CDMP-3)、GDF-8(Myostatin)、GDF-9、GDF-15(MIC-1)、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-1、GFR-α1、GFR-α2、GFR-α3、GITR、胰高血糖素、Glut 4、糖蛋白IIb/IIIa(GP IIb/IIIa)、GM-CSF、gp130、gp72、GRO、生长激素释放因子、Hapten(NP-cap or NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCMVgB包膜糖蛋白、HCMV)gH包膜糖蛋白、HCMV UL、造血生长因子(HGF)、Hep B gp120、类肝素酶、Her2、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)、单纯疱疹病毒(HSV)gB糖蛋白、HSV gD糖蛋白、HGFA、高分子量黑素瘤相关抗原(HMW-MM)、HIV gp120、HIV IIIB gp120 V3环、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HRG、Hrk、人心脏肌球蛋白、人巨细胞病毒(HCMV)、人生长激素(HGH)、HVEM、I-309、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA受体、IgE、IGF、IGF结合蛋白、IGF-1R、IGFBP、IGF-I、IGF-II、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-23、干扰素(INF)-α、INF-β、INF-γ、抑制素、iNOS、胰岛素A-链、胰岛素B-链、胰岛素样生长因子1、整联蛋白α2、整联蛋白α3、整联蛋白α4、整联蛋白α4/β1、整联蛋白α4/β7、整联蛋白α5(αV)、整联蛋白α5/β1、整联蛋白α5/β3、整联蛋白α6、整联蛋白β1、整联蛋白β2、干扰素γ、IP-10、I-TAC、JE、激肽释放酶2、激肽释放酶5、激肽释放酶6、激肽释放酶11、激肽释放酶12、激肽释放酶14、激肽释放酶15、激肽释放酶L1、激肽释放酶L2、激肽释放酶L3、激肽释放酶L4、KC、KDR、角质形成细胞生长因子(KGF)、层粘连蛋白5、LAMP、LAP、LAP(TGF-1)、Latent TGF-1、Latent TGF-1 bp1、LBP、LDGF、LECT2、Lefty、Lewis-Y抗原、Lewis-Y相关抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-选择素、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面活性物质、黄体生成素、淋巴毒素β受体、Mac-1、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、METALLOPROTEASES、MGDF受体、MGMT、MHC(HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP-1-α、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、黏蛋白(Muc1)、MUC18、苗勒抑制物质、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-钙黏着蛋白、NCA 90、NCAM、NCAM、中性溶酶、神经营养蛋白-3、-4或-6、Neurturin、神经生长因子(NGF)、NGFR、NGF-β、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG、OPN、OSM、OX40L、OX40R、p150、p95、PADPr、甲状旁腺激素、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-钙黏着蛋白、PCNA、PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盘1碱性磷酸酶(PLAP)、PIGF、PLP、PP14、胰岛素原、Prorelaxin、蛋白质C、PS、PSA、PSCA、前列腺特异膜抗原(PSMA)、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、松弛素A-链、松弛素B-链、肾素、呼吸道合胞病毒(RSV)F、RSV Fgp、Ret、风湿样因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、丝氨酸、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、TAG-72(中瘤相关糖蛋白-72)、TARC、TCA-3、T-细胞受体(例如T-细胞受体α/β)、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睾丸PLAP样碱性磷酸酶、TfR、TGF、TGF-α、TGF-β、TGF-βPan特异性的、TGF-βRI(ALK-5)、TGF-βRII、TGF-βRIIb、TGF-βRIII、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、凝血酶、胸腺Ck-1、甲状腺刺激激素、Tie、TIMP、TIQ、组织因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-α、TNF-αβ、TNF-β2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2、DR4)、TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1、LIT、TRID)、TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2、TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R、TRANCE R)、TNFRSF11B(OPG OCIF、TR1)、TNFRSF12(TWEAK R FN14)、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFF R)、TNFRSF14(HVEM ATAR、HveA、LIGHT R、TR2)、TNFRSF16(NGFR p75NTR)、TNFRSF17(BCMA)、TNFRSF18(GITRAITR)、TNFRSF19(TROY TAJ、TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSF1A(TNF RI CD120a、p55-60)、TNFRSF1B(TNF RII CD120b、p75-80)、TNFRSF26(TNFRH3)、TNFRSF3(LTbR TNF RIII、TNFC R)、TNFRSF4(OX40 ACT35、TXGP1 R)、TNFRSF5(CD40 p50)、TNFRSF6(Fas Apo-1、APT1、CD95)、TNFRSF6B(DcR3 M68、TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1BB CD137、ILA)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRST23(DcTRAIL R1 TNFRH1)、TNFRSF25(DR3Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF10(TRAIL  Apo-2配体、TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANK配体ODF、OPG配体)、TNFSF12(TWEAK Apo-3配体、DR3配体)、TNFSF13(APRIL TALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEM  配体、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITR配体AITR配体、TL6)、TNFSF1A(TNF-aConectin、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC、p33)、TNFSF4(OX40配体gp34、TXGP1)、TNFSF5(CD40配体CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP)、TNFSF6(Fas配体Apo-1配体、APT1配体)、TNFSF7(CD27配体CD70)、TNFSF8(CD30配体CD153)、TNFSF9(4-1BB配体CD137配体)、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、转移受体、TRF、Trk、TROP-2、TSG、TSLP、肿瘤相关抗原CA 125、表达肿瘤相关抗原的Lewis Y相关碳水化合物、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、Uro激酶、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-钙黏着蛋白、VE-钙黏着蛋白-2、VEFGR-1(flt-1)、VEGF、VEGFR、VEGFR-3(fit-4)、VEGI、VIM、病毒抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR整联蛋白、von Willebrands因子、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、和激素和生长因子的受体。在一些实施方案中，多肽或者蛋白质具有对一种或者更多种细胞表面肿瘤抗原特异性的抗原结合结构域。可以使用方法和组合物靶向肿瘤细胞以便引发ADCC。

Fc结构域可以结合FcR，然而，考虑了ADCC不但可以通过包含Fc结构域多肽上的抗原结合结构域控制，而且还可以通过其它一些蛋白质结构域控制。因此，实施方案涉及Fc结构域和异源的非抗原结合结构域。在某些实施方案中，非抗原结合结构域结合至细胞表面。因此，这些试剂需要与能够结合至特异靶细胞的试剂/蛋白质进行化学缀合或者融合。实施方案还包括将全部或部分的非糖基化Fc结构域与全部或部分的表2中所列任何蛋白质邻接。考虑了实施方案包括，但不限于，在表2和本说明书中提供的实例。

表2

可以使用受体的配体去靶向在其表面上表达配体的受体的细胞。配体还包括例如CD95配体、TRAIL、TNF(诸如TNF-α或者TNF-β)、生长因子，包括上面讨论的那些，诸如VEGF和细胞因子，诸如干扰素或者白细胞介素及其变体。

还考虑了具有多个结构域的实施方案，诸如包含VEGF受体1(Flt-1)的第二细胞外结构域与VEGF受体2(KDR/FIK-1)的第三个结构域和IgG Fc区的VEGF Trap融合蛋白。

1.融合物和缀合蛋白

特定类型的插入变体是融合蛋白质。该分子通常具有在N末端或者C末端连接至全部或部分的第二多肽的全部或者相当大部分的天然分子。

实施方案还涉及连接至至少一种试剂以形成修饰的蛋白质或者多肽的缀合多肽，诸如翻译的蛋白质、多肽和肽。为了提高分子作为诊断或者治疗剂的有效性，其常规的连接至或者共价结合至或者复合至少一种所希望的分子或者部分。此种分子或者部分可以是，但不限于，至少一种效应器或者报告子分子。效应器分子包含具有所希望活性，例如细胞毒性活性的分子。连接至抗体的效应器分子的非限定性实例包括毒素、抗肿瘤剂、治疗酶、放射性标记的核苷酸、抗病毒剂、螯合剂、细胞因子、生长因子、和寡核苷酸或多核苷酸。与之相比，报告子分子定义为可以使用测定法检测的任何部分。缀合至抗体的报告子分子的非限定性实例包括酶、放射性标记、半抗原、荧光标记、荧光分子、化学发光分子、生色团、发光分子、光亲和性分子、色粒或配体，诸如生物素。

具有足够选择性、特异性或者亲和性的任何抗体可以用作抗体缀合物的基础。此类特性可以使用本领域技术人员已知的常规免疫学筛选方法学进行评价。抗体分子中结合生物学活性分子的位点除了标准的抗原结合位点之外，还包括位于可变结构域内的可结合病原体、B细胞超抗原、T细胞共受体CD4和HIV-1包膜的位点(Sasso等，1989；Shorki等，1991；Silvermann等，1995；Cleary等，1994；Lenert等，1990；Berberian等，1993；Kreier等，1991)。此外，可变结构域参与抗体自身结合(Kang等，1988)，并且包含被抗抗体识别的表位(独特型)(Kohler等，1989)。

抗体缀合物的某些实例是其中抗体连接至可检测标记的那些缀合物。“可检测标记”是由于它们的特异性功能特性、和/或化学特性而可以被检测的化合物和/或元素，对它们的使用使得可以检测与它们连接的抗体，和/或如果需要可以进一步定量。另一个此类实例是包含连接至细胞毒性剂或者抗细胞剂的抗体的缀合物的形成，并且可以称作“免疫毒素”。

氨基酸，例如可选择性切割的连接体、合成的连接体或者其它氨基酸序列可以用于分离蛋白质类部分。

C.蛋白质纯化

虽然一些实施方案涉及重组蛋白，但是实施方案可以涉及用于纯化蛋白质，包括修饰蛋白质和重组蛋白的方法和过程。通常，这些技术在一个水平上包括将细胞环境粗分级分离成多肽和非多肽部分。将多肽与其他蛋白质分离之后，可以使用色谱和电泳技术将目的多肽进一步纯化以达到部分或者完全的纯化(或者纯化至同质性)。特别适宜于制备的分析方法是离子交换层析、排阻层析；聚丙烯酰胺凝胶电泳；等电聚焦。纯化肽的特别有效的方法是快速蛋白质液相层析或者甚至HPLC。此外，开展此类技术的条件会影响所纯化分子的特性，诸如功能活性。

某些方面涉及所编码蛋白质或肽的纯化，并且在特定的实施方案中，涉及所编码蛋白质或肽的基本纯化。术语“纯化的蛋白质或肽”如本文所使用，旨在指可从其它成分分离的成分，其中蛋白质或肽被纯化至相对于其天然可得到的状态的任何程度。因此，纯化的蛋白质或肽还指与其天然所存在环境分离的蛋白质或肽。“基本上纯化的”蛋白质或肽。

通常，“纯化的”指已经进行分级分离以去除多种其他成分的蛋白质或肽，并且蛋白质或肽成分基本上保留了其所表达的生物学活性。当使用术语“基本上纯化的”，该术语将指其中蛋白质或肽形成组合物主要成分的组合物，例如构成组合物中蛋白质的约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.2％、约99.4％、约99.6％、约99.8％、约99.9％或更高。

依据本公开，定量蛋白质或肽纯化程度的多种方法是本领域技术人员已知的。这些方法包括例如检测活性级分的特异性活性，或者通过SDA/PAGE分子评价级分内多肽的量。评价级分纯度的优选方法是计算级分的特异性活性，将其与最初提取物的特异性活性比较，并且因此计算纯化程度，在本文中评价为“纯化倍数”。当然，用于表示活性数量的实际单位将依赖于所选择的纯化后的特定测定技术以及所表达的蛋白质或肽是否表现出可检测的活性。

适用于蛋白质纯化的多种技术将是本领域技术人员众所周知的。这些技术包括例如适用硫酸铵、PEG、抗体等的沉淀或者通过加热变性，然后离心；层析步骤，诸如离子交换、凝胶过滤、反相、羟磷灰石和亲和层析；等电聚焦；凝胶电泳；以及此类技术和其他技术的组合。如本领域通常已知，据信开展多种纯化步骤的顺序可以改变，或者某些步骤可以省略，并且仍然为制备基本上纯化的蛋白质或肽的适宜方法。

一般不需要蛋白质或肽总是以最纯化状态提供。实际上，在某些实施方案中考虑了纯化程度差的产品将具有实用性。可以通过使用较少的纯化步骤组合，或者通过使用同一大体纯化方案的不同形式实现部分纯化。例如，将会理解使用HPLC仪器开展的阳离子交换柱层析通常比使用低压力层析系统产生更大“倍数”的纯化。表现出较低程度相对纯化的方法将在蛋白质产物的总回收率或者保留所表达蛋白质的活性方面具有优势。

已知随着SDS/PAGE条件的不同多肽的迁移会改变，有事明显改变(Capaldi等，1977)。因此将会理解在不同的电泳条件下，纯化的或者部分纯化的表达产物的表观分子量将不同。

还考虑与方法和组合物相组合使用肽标签。标签利用了两个多肽之间的相互作用。参与相互作用的一个多肽的一部分可以用作标签。例如，谷胱甘肽S转移酶(GST)结合区可以用作标签，以致于可以使用谷胱甘肽珠富级包含GST标签的化合物。可以使用被抗体或者T细胞受体识别的氨基酸区的表位标签。标签可以由有效连接至编码修饰蛋白质的核酸片段的核酸片段编码，以致于由核酸分子编码融合蛋白。其它适宜的融合蛋白是使用β-半乳糖苷酶、遍在蛋白、六聚组氨酸(6×His)等的那些。

IV.抗体Fc文库

将与实施方案联合使用用于产生多种多样抗体Fc结构域和/或包含此类结构域的抗体的技术实例，将采用与美国专利5,824,520中所述的用于表达免疫球蛋白重链文库的那些技术相似的技术。先前采用的Fc文库在WO 2008/137475中讨论，其明确地通过参考并入本文。

V.筛选抗体Fc结构域

实施方案涉及用于鉴定能够结合特定FcR的分子的方法。它们在本文中以及在PCT申请WO 2008/137475中描述，其全文明确地通过参考并入本文。筛选的结合多肽将包含多种候选Fc结构域的大文库，或者备选地，可以包含经肉眼针对认为使Fc结构域更有可能结合靶配体的结构属性选择的特定种类的Fc结构域(例如工程改造的点突变年或者氨基酸插入)。在一个实施方案中，候选结合蛋白是完整的抗体，或者包含Fc结构域的其片段或部分。

为了鉴定能够结合靶配体的候选Fc结构域，可以开展如下步骤：提供表达不同抗体Fc结构域的一群革兰氏阴性细菌细胞；将细菌或者噬菌体与能够接触抗体的至少第一标记的或者固定化的靶配体(FcR多肽)混合，和鉴定表达能够结合靶配体的分子的至少第一细菌。

在上述方法的一些方面中，抗体Fc结构域与标记的FcR多肽之间的结合将阻止抗体Fc结构域扩散出细菌细胞。在该种方式，标记配体的分子可保留在包含透化外膜的细菌周质中。备选地，可以去除周质，由于显示Fc结构域与内膜结合，由此Fc结构域将导致结合的候选分子滞留。然后，标记可用于分离表达能够结合FcR多肽的结合多肽的细胞，并且以这种方式，分离编码Fc结构域多肽的基因。然后使用体内或间接体内表达方法大量产生能结合靶配体的分子，然后用于任何希望的应用，例如，用于诊断或者治疗应用。此外，应当理解，所鉴定的分离的抗体Fc结构域可以用于构建包含抗原结合结构域的抗体片段或者全长抗体。

在更多的实施方案中，用于产生本发明细菌的方法可包括至少两轮选择(步骤c)，其中将在第一轮选择中得到的细菌细胞的亚群进行基于候选抗体Fc结构域与FcR结合的至少第二轮选择。此外，在一些方面中，在第一轮选择中得到的细菌细胞亚群可以在第二轮选择之前在许可条件下生长(以扩大细胞总数)。因此，在一些方面中，方法可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或者更多轮选择。此外，在一些方面中，从每一轮选择得到的细菌细胞亚群将在随后一轮选择之前在许可条件下生长。在一轮或者更多轮选择之后分离的细胞可进行额外几轮的诱变。在一些情况中，可在去除未与抗体结合的FcR多肽之后开展选择。此外，在一些情况中，可以通过调节包含展示抗体的细菌的溶液的pH、盐浓度或者温度修改选择的严格性。因此，在一些方面中，优选本发明细菌细胞在诸如约25℃的亚生理温度下生长。

在仍进一步的方面中，产生根据本发明的细菌细胞的方法可以进一步地定义为产生编码结合至少第一FcR的Fc结构域的核酸序列的方法。因此，通过本文方法产生的细菌细胞可以用于克隆编码对FcR多肽具有特异亲和性的Fc结构域的核酸序列。通过例如PCR从细胞分离和扩增此类核酸的方法是本领域众所周知的并且在下面进一步描述。因此，通过上述方法产生的核酸序列作为本发明的一部分。此外，此种序列可以在细胞中表达以产生对FcR具有特异性亲和性的Fc结构域。因此，在一些方面中，本发明提供用于产生对FcR具有特异亲和性的Fc结构域的方法。此外，本发明包括通过本发明方法产生的抗体Fc结构域。然而，应当理解，通过此种筛选产生的抗体Fc结构域可以与对特定靶配体具有亲和性的抗体可变区组合，并且这些抗体也作为本发明的一部分。

A.Fc结构域编码序列的克隆

抗体Fc或其他结合蛋白的结合亲和性可以通过例如Munson和Pollard(1980)的Scatchard分析确定。备选地，结合亲和性可以通过表面等离子共振或者用于确定蛋白质：蛋白质相互作用动力学和平衡常数的其他任何已知方法确定。在鉴定出产生具有所希望特异性、亲和性和/或活性分子的细菌细胞之后，可以克隆相应的编码序列。以这种方式，可以使用常规方法(例如通过使用能够特异性结合编码抗体或者结合蛋白的基因的寡核苷酸探针)分离编码分子的DNA并测序。

一旦分离抗体Fc结构域DNA之后，可将其置入表达载体中，然后将表达载体转染进入宿主细胞中，诸如细菌中。还可以通过例如加入人重链和轻链可变结构域的序列，或者通过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽编码序列的全部或部分共价连接，将DNA进行修饰。以这种方式，制备具有所希望结合特异性的“嵌合”或者“杂合”结合蛋白。例如，所鉴定的抗体Fc结构域可与治疗多肽或者毒素融合，并用于靶向表达特定FcR的细胞(体外或体内)。

还可以使用合成蛋白质化学中的已知方法，包括涉及交联剂的那些方法，体外制备嵌合或者杂合Fc结构域。例如，可以使用二硫化物交换反应或者通过形成硫醚键构建靶向毒素。用于此目的的适宜试剂包括亚氨基硫醇盐和甲基-4-巯基丁酰亚氨酸酯。

本领域的技术人员应当理解，可以从有活力的细胞或者无活力的细胞克隆核酸。在无活力细胞情况下，例如，希望使用例如PCR扩增克隆的DNA。这还可以使用进一步生长或者不生长的活细胞开展。

B.标记配体

在一个实施方案中，分离对标记的FcR多肽具有亲和性的Fc结构域。根据本发明通过将革兰氏阴性细菌的周质膜透化处理和/或去除，可以筛选有可能任何大小的标记配体。在不去除周质膜的情况下，有代表性的优选的是标记的配体大小小于50,000Da以便允许配体有效扩散跨过细菌周质膜。

如上面所标明，有代表性地是希望提供已经以一种或者更多种可检测试剂标记的FcR多肽。这可以通过例如将配体与至少一种可检测试剂连接形成缀合物实现。例如，常规情况是连接或者共价结合或者复合至少一种可检测分子或部分。“标记”或者“可检测标记”是由于它们的特异性功能特性、和/或化学特性而可以被检测的化合物和/或元素，对它们的使用使得可以检测与它们连接的配体，和/或如果需要可以进一步定量。可以使用的标记实例包括，但不限于酶、放射性标记、半抗原、荧光标记、荧光分子、化学发光分子、生色团、发光分子、光亲和性分子、色粒或配体，诸如生物素。

在本发明的一个实施方案中，使用视觉上可检测的标志物，以致于可针对标记开展对细胞的自动筛选。具体而言，荧光标记是有益的，因为它们使得可以使用流式细胞术分离表达所希望结合蛋白或抗体的细胞。可使用合适仪器通过显色检测的试剂实例是本领域已知的，它们连接至希望配体的方法也如此(见例如美国专利5,021,236；4,938,948；和4,472,509，每一美国专利通过参考并入本文)。此类试剂可以包括顺磁离子；放射性同位素；荧光染料；NMR-可检测物质和用于X-射线成像的物质。

另一种类型的FcR缀合物是其中配体连接至当与生色底物接触时产生有颜色的产物的第二结合分子和/或酶(酶标签)。此类酶的实例包括尿素酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶或葡萄糖氧化酶。在此类情况中，希望所选择的细胞仍然是有活力的。优选的第二结合配体是生物素和/或抗生物素蛋白和链亲和素化合物。此类标记的用途是本领域技术人员众所周知的并且描述于例如美国专利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241中；每一美国专利通过参考并入本文。

还可以使用包含叠氮基的分子通过由低强度紫外光产生的活性氮宾中间体而与蛋白质形成共价键(Potter和Haley，1983)。具体而言，嘌呤核苷酸的2-和8-叠氮基类似物已经用作位点定向光探针以鉴定粗细胞提取物中的结合核苷酸的蛋白质(Owens和Haley，1987；Atherton等，1985)。2-和8-叠氮基核苷酸还可以用作将纯化蛋白质的核苷酸结合结构域作图(Khatoon等，1989；King等，1989；以及Dholakia等，1989)并且可以用作配体结合试剂。

标记可以通过本领域技术人员众所周知的任何技术开展。例如，可以通过将配体与所希望的标记和化学氧化剂诸如次氯酸钠或者酶促氧化剂诸如乳过氧化物酶接触来标记FcR多肽。类似地，可以使用配体交换方法。备选地，可使用直接标记技术，例如通过将标记、还原剂诸如SNCl₂、缓冲溶液诸如邻苯二甲酸钠-钾溶液和配体孵育。还可以使用配体上的中间功能基，例如，在二乙三胺五乙酸(DTPA)或者乙二胺四乙酸(EDTA)存在下将标记连接至配体。

用于将配体与其缀合物部分连接或者结合的其他方法在本领域中也是已知的。一些连接方法包括使用有机螯合剂，诸如二乙三胺五乙酸(DTPA)；二乙二胺四乙酸(ethylenetriaminetetraacetic acid)；N-氯对甲苯磺酰胺；和/或四氯-3α-6α-二苯基甘脲-3连接至配体(美国专利4,472,509和4,938,948，每一美国专利通过参考并入本文)。FcR多肽还可以在偶联剂诸如戊二醛或高碘酸盐存在下与酶反应。可以在这些偶联剂存在下或者通过与异硫氰酸酯反应制备具有荧光素标志物的缀合物。在美国专利4,938,948中，使用单克隆抗体实现乳腺肿瘤成像，并且使用交联剂诸如对羟基苯甲亚胺酸甲酯或者N-琥珀酰亚胺基-3-(4-羟基苯基)丙酸酯将可检测成像部分结合至抗体。在仍进一步的方面中，FcR多肽可以融合至报告蛋白质，诸如上面所述的酶或者荧光蛋白。

以适宜的荧光配体特异性标记周质表达蛋白质的能力除了用于文库筛选之外，还有其他应用。用荧光配体进行特异性标记和流式细胞术可用于监测蛋白质生产过程中Fc结构域的产生。

一旦分离出Fc结构域，希望将Fc结构域与至少一种试剂连接以形成缀合物增强该分子的效用。例如，为了提高Fc结构域或者抗体分子作为诊断或者治疗剂的有效性，常规情况下连接至或者共价结合至或者复合至至少一种所希望的分子或部分。此种分子或部分可以是，但不限于，至少一种效应器分子或者报告子分子。效应器分子包括具有所希望活性，例如细胞毒性活性的分子。可以与抗体连接的效应器分子的非限定性实例包括毒素、抗肿瘤试剂、治疗酶、放射性标记的核苷酸、抗病毒试剂、螯合剂、细胞因子、省长因子和寡核苷酸或多核苷酸。与之相比，报告子分子定义为可以使用测定法检测的任何部分。标记此种分子的技术是本领域技术人员已知的并且已经在上文描述。

然后，标记的结合蛋白，诸如已经根据本发明制备的Fc结构域还可以用于例如用于结合、纯化、去除、定量和/或通常检测生物学成分，诸如一种或多种蛋白质、一种或多种多肽或者一种或多种肽的免疫检测方法中。一些免疫监测方法包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定、荧光免疫测定、化学发光测定、生物发光测定和Western印迹，仅举此几种。多种有用的免疫检测方法的步骤已经在科学文献中描述，诸如例如Doolittle和Ben-Zeev，1999；Gulbis和Galand，1993；以及De Jager R等，1993，每一文献通过参考并入本文。此类技术包括结合测定，诸如本领域中已知的多种类型的酶联免疫吸附测定(ELISA)和/或放射免疫测定(RIA)。

可以与制备的新鲜冷冻的和/或福尔马林固定的、石蜡包埋的组织块相联合使用Fc结构域分子，包括抗体，用于免疫组织化学(IHC)研究。从这些特定样本制备组织块的方法已经成功地用于先前对多种预后因子的IHC研究中，和/或是本领域技术人员众所周知的(Abbondanzo等，1990)。

VI.使用流式细胞术的自动化筛选

在本发明的一个实施方案中，荧光激活细胞分选(FACS)筛选技术或者其它自动化流式细胞计数技术可用于有效分离包含结合Fc结构域的标记配体的细菌细胞。开展流式细胞术的仪器是本领域技术人员已知的并且对公众而言是商业上可以得到的。此类仪器的实例包括来自Becton Dickinson(Foster City，加利福尼亚)的FACS Star Plus、FACScan和FACSort仪器、来自Coulter Epics Division(Hialeah，Fla.)的Epics C和来自Cytomation(Colorado Springs，Co)的MOFLO^TM。

流式细胞计术技术通常涉及分离液体样品中的细胞或者其它颗粒物。有代表性地，流式细胞术的目的是分析所分离颗粒的一种或者更多种特性，例如，标记配体或者其它分子的存在。流式细胞术的基础步骤包括指导流动样品经过仪器，以致于液体流经过传感区。颗粒将每次有一个经过传感器并且基于大小、折射、光散射、不透明性、粗糙度、形状荧光等分类。

快速定量分析证明在生物医学研究和医学中是有用的。仪器允许以每秒数千个细胞的速度对细胞特性进行定量化多参数分析。这些仪器提供了将细胞类型进行区分的能力。数据常常显示为所测量变量的一维(直方图)或者二维(轮廓图，散布图)频率分布。多参数数据文件的分区涉及连续使用交互的一维或二维图形学程序。

用于快速细胞检测的多参数流式细胞计数数据的定量分析包括两个阶段：细胞种类表征和样品处理。通常，细胞种类表征过程将细胞特征划分为目的细胞与非目的细胞。因此，在样品加工中，每一细胞根据其所处区域而归类为两个类别之一。细胞种类分析是极其重要的，因为只有得到适当的细胞特性才能预期高的检测性能。

流式细胞术不但能够分析细胞，而且还能分选细胞。在美国专利3,826,364中，公开了物理性分离颗粒，例如功能差异的细胞类型的仪器。在该仪器中，激光提供光照，通过适宜的镜头或者镜头系统将激光聚焦在颗粒流上，以致于从其中的颗粒产生高度集中的散射。此外，高强度源照明定向在颗粒流上，以将流中的颗粒激发出荧光。流中的某些颗粒可以选择性地带上电荷，然后通过将它们偏离进入指定容器而分离。该种分离的典型形式是通过荧光标记的抗体，其用于标记一种或者更多种细胞类型以便分离。

流式细胞术方法的其它实例将包括，但不限于，美国专利号4,284,412；4,989,977；4,498,766；5,478,722；4,857,451；4,774,189；4,767,206；4,714,682；5,160,974；和4,661,913中描述的那些，每一公开明确地通过参考并入本文。

对于本发明，流式细胞术的重要方面是连续开展多轮筛选。细胞可以从起始一轮分选分离，并且立即再次进入流式细胞仪中，并再次筛选以增加筛选的严格性。本领域技术人员已知的另一优势是使用流式细胞术可以回收非活力细胞。由于流式细胞术基本上是颗粒分选技术，细胞生长或者增殖的能力不是必需的。从此类非活力细胞回收核酸的技术在本领域中众所周知并且可以包括，例如，使用模板依赖性扩增技术，包括PCR。

VII.使用流式细胞术的自动筛选

在本发明的某些实施方案中，基于核酸的表达系统可以用于表达重组蛋白。例如，本发明的一个实施方案涉及以抗体Fc结构域，或优选多个不同Fc结构域的编码序列转化革兰氏阴性细菌。

VIII.基于核酸的表达系统

在本发明的某些实施方案中，基于核酸的表达系统可以用于表达重组蛋白。例如，本发明的一个实施方案涉及以抗体Fc结构域，或优选多个不同Fc结构域的编码序列转化革兰氏阴性细菌。

A.核酸递送方法

本发明的某些方面可包括将核酸递送至靶细胞(例如革兰氏阴性细菌)。例如，细菌宿主细胞可以用编码能够潜在结合FcR的候选Fc结构域的核酸转化。在本发明的特定实施方案中，希望靶向表达至细菌的周质。真核宿主细胞的转化同样可以用于鉴定为能够结合靶配体的多种候选分子的表达。

用于递送核酸以转化细胞的适宜方法认为可以包括实际上可将核酸(例如DNA)引入到此种细胞内或者甚至其细胞器内的任何方法。此类方法包括，但不限于，DNA直接递送例如通过注射(美国专利5,994,624，5,981,274，5,945,100，5,780,448，5,736,524，5,702,932，5,656,610，5,589,466和5,580,859，每一美国专利通过参考并入本文)，包括微注射(Harland和Weintraub，1985；美国专利5,789,215，通过参考并入本文)；通过电穿孔(美国专利5,384,253，通过参考并入本文)；通过磷酸钙沉淀(Graham和Van Der Eb，1973；Chen和Okayama，1987；Rippe等，1990)；通过使用DEAE-葡聚糖然后通过聚乙二醇(Gopal，1985)；通过直接的声波加载(Fechheimer等，1987)；通过脂质体介导的转染(Nicolau和Sene，1982；Fraley等，1979；Nicolau等，1987；Wong等，1980；Kaneda等，1989；Kato等，1991)；通过微粒轰击(PCT申请号WO 94/09699和95/06128；美国专利5,610,042；5,322,783；5,563,055；5,550,318；5,538,877和5,538,880，并且每一参考文献通过参考并入本文)；或者通过使用碳化硅纤维搅拌(Kaeppler等，1990；美国专利5,302,523和5,464,765，每一文献通过参考并入本文)；通过脱水/抑制介导DNA摄入(Potrykus等，1985)。通过这些技术的应用，细胞可以稳定或者瞬时转化。

B.载体

载体可以在本发明中用于例如以编码候选Fc结构域的核酸序列转化革兰氏阴性细菌，人们希望筛选所述候选Fc结构域结合靶FcR的能力。在本发明的一个实施方案中，编码靶多肽的核酸序列的整个异质的“文库”可以引入到一群细菌中，由此可以筛选整个文库。术语“载体”用于向其中已插入核酸序列的运载核酸分子，用于引入到其可以复制的细胞中。核酸序列可以是“外源的”或者“异源的”，这意味着对于载体将引入其中的细胞而言是外来的，或者序列与细胞中的序列同源但是在宿主细胞核酸中的位置不是序列通常所存在的位置。载体包括质粒、粘粒和病毒(例如噬菌体)。本领域技术人员可通过标准重组技术构建载体，其描述于Maniatis等，1988和Ausubel等，1994中，该两篇文献通过参考并入本文。

术语“表达载体”指包含编码能够被转录的至少部分基因产物的核酸序列的载体。在一些情况中，RNA分子翻译成蛋白质、多肽或肽。表达载体可包含多种“控制序列”，控制序列指对于有效连接的编码序列在特定宿主生物体内的转录和可能的翻译所必需的核酸序列。除了控制转录和翻译的控制序列之外，载体和表达载体可包含还起着其它功能并在下面描述的核酸序列。

1.启动子和增强子

“启动子”是控制转录起始和转录速率的核酸序列区域的控制序列。其可包含遗传元件，在所述遗传元件处调节蛋白和分子可结合诸如RNA聚合物和其它转录因子。短语“有效放置的”、“有效连接的”“处于控制下”和“处于转录控制下”意思是指启动子相对于核酸序列处于正确的功能位置和/或方向以控制该序列的转录起始和/或表达。启动子可以与或不与“增强子”联合使用，增强子指参与核酸序列转录活化的顺式作用调节序列。

启动子可以是与基因或者序列天然相关的启动子，其可以通过分离位于编码片段和/或外显子上游的5′非编码序列得到。此种启动子被称为“内源的”。类似地，增强子可以是与核酸序列天然相关的、位于该序列下游或上游的增强子。备选地，通过将编码核酸片段置于重组或者异源启动子控制下获得某些优势，所述重组或异源启动子指正常情况下与天然环境中的核酸序列不相关的启动子。重组或异源增强子同样指正常情况下与天然环境中的核酸序列不相关的增强子。此类启动子或增强子可包括其它基因的启动子或增强子，和从任何其它原核细胞分离的启动子或增强子，和非“天然存在的”启动子或增强子，即包含不同转录调节区的不同元件和/或改变表达的突变。除了通过合成产生启动子和增强子的核酸序列之外，可以使用重组克隆和/或核酸扩增技术，包括pCR^TM与本公开的组合物相结合产生序列(见美国专利4,683,202，美国专利5,928,906，每一美国专利通过参考并入本文)。

自然地，重要的是采用有效指导DNA片段在选择用于表达的细胞类型中表达的启动子和/或增强子。可以在本发明中使用的此种启动子的一个实例是大肠杆菌阿拉伯糖或T7启动子。分子生物学领域技术人员普遍熟悉用于蛋白质表达的启动子、增强子和细胞类型组合的使用，例如，见Sambrook等.(1989)，通过参考并入本文。采用的启动子可以是组成型的、组织特异的、可诱导的和/或在适宜条件下可用于指导所引入DNA片段高水平表达，这在重组蛋白和/或肽的大规模生产中具有优势。启动子可以是异源的或者内源的。

2.起始信号和内部核糖体结合位点

对于编码序列的有效翻译还需要特异的起始信号。这些信号包括ATG起始信号或毗邻序列。可能需要提供外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域普通技术人员能够容易地确定并提供必需的信号。众所周知，起始密码子必需与所希望编码序列的读码框为“框内的”以保证整个插入序列的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或者合成的。表达的有效性可以通过包含适当的转录增强元件增强。

3.多克隆位点

载体可以包括多克隆位点(MCS)，其是包含多个限制酶位点的核酸区，任何限制酶位点可以与标准重组技术相结合使用以消化载体(见Carbonelli等，1999，Levenson等，1998，以及Cocea，1997，通过参考并入本文)。“限制酶消化”指用仅在核酸分子内特定位置起作用的酶催化断裂核酸分子。这些限制酶当中许多是商业上可以得到的。本领域技术人员了解此类酶的使用。经常地，使用在MCS内切割的限制酶将载体线性化或者片段化以便使外源序列能够与载体连接。“连接”指在两个核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程，其可以彼此连续或不连续。涉及限制酶和连接反应的技术是重组技术领域技术人员众所周知的。

4.终止信号

根据本发明制备的载体或者构建体通常将包含至少一个终止信号。“终止信号”或者“终止子”由参与RNA转录物被RNA聚合酶特异性终止的DNA序列构成。因此，在某些实施方案中，考虑了停止RNA转录物产生的终止信号。终止子在体内是必需的以达到所希望的信使水平。

考虑在本发明中使用的终止子包括本文所述的或者本领域普通技术人员已知的任何已知终止子，包括但不限于，例如，rhp依赖性或者rho不依赖性终止子。在某些实施方案中，终止信号可能是缺乏可转录或者可翻译序列，例如由于序列截断。

5.复制起点

为了在宿主细胞中扩增载体，载体可包含一个或更多个复制位点起点(常常称作“ori”)，它是起始复制的特定核酸序列。

6.选择标记和筛选标记

在本发明的某些实施方案中，可以通过在表达载体中包含标记来体外或体内鉴定包含本发明核酸构建体的细胞。此类标记将赋予细胞可辨别的改变，这使得可以容易地鉴定包含表达载体的细胞。通常，选择标记是赋予可以用于选择的特性的标记。阳性选择标记是其中标记的存在可以用于选择的标记，而阴性选择标记是其中标记的存在阻止选择的标记。阳性选择标记的实例是药物抗性标记。

通常包含药物选择标记有助于克隆和鉴定转化体，例如，赋予抵抗新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、博莱霉素和组氨醇的基因是有用的选择标记。除了赋予允许基于条件的实现而辨别转化体的表型的标记之外，还考虑了标记，包括筛选标记的其它表型，例如其基础是比色分析的GFP。备选地，可利用筛选酶，诸如氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员还已知可能与FACS分析相联合如何利用免疫学标记。认为所使用的标记不重要，只要其能够与编码基因产物的核酸同时表达即可。选择标记和筛选标记的更多的实例是本领域技术人员众所周知的。

C.宿主细胞

在表达异源核酸序列的情况中，“宿主细胞”指原核细胞，并且其包括能够复制载体和/或表达由载体编码的异源基因的任何可转化生物体。宿主细胞可以并且已经用作载体的接受者。宿主细胞可以被“转染”或者“转化”，转染或转化指通过该过程异源核酸被转移或者引入到宿主细胞内的过程。转化的细胞包括最初的受试者细胞及其后代。

在本发明的特定实施方案中，宿主细胞是革兰氏阴性细菌细胞。这些细菌适宜在本发明中使用，因为它们在内膜和外膜之间具有周质空间，和特别是在周质和细胞质之间的上述内膜，其也被称作细胞质膜。照此，具有此种周质空间的任何其它细胞可以在本发明中使用。可以在本发明中使用的革兰氏阴性细菌的实例包括，但不限于，大肠杆菌、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、弗氏志贺菌(Shigella flexneri)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、百日咳杆菌(Bordotella pertussi)、梨火疫菌(Erwinia amylovora)、根瘤菌属某种(Rhizobiumsp)。革兰氏阴性细菌细胞还进一步定义为已经用融合多肽的编码序列转化的细菌细胞，所述融合多肽包含能够结合所选择配体的候选结合多肽。多肽锚定在细胞质膜的外侧面，面向周质空间，并且可包含抗体编码序列或者另一序列。表达多肽的一个方法是向多肽连接一个能引起此种指导表达的前导序列。

众多的原核细胞系和培养物可用作宿主细胞，并且它们可以通过美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection，ATCC)得到，美国典型培养物保藏中心是起着活的培养物和遗传物质档案馆作用的机构(www.atcc.org)。合适的宿主可以基于载体主链和所希望的结果由本领域技术人员确定。质粒或者粘粒，例如，可以进入到用于许多种载体复制的原核生物宿主细胞中。用作用于载体复制和/或表达的宿主细胞的细菌细胞包括DH5α、JM109和KC8，以及许多商业上可以利用的细菌宿主，诸如感受态细胞和Solopack^TM Gold细胞(La Jolla)。备选地，细菌细胞诸如大肠杆菌LE392可以用作噬菌体的宿主细胞。

来自多种细胞类型和生物体的许多宿主细胞是可以得到的并且是本领域技术人员已知的。类似地，病毒载体可以与原核宿主细胞，特别是允许载体复制或表达的原核宿主细胞结合使用。一些载体会采用允许其在原核细胞和真核细胞两者中复制和/或表达的控制序列。本领域技术人员将理解培养所有上述宿主细胞以维持它们并且允许载体复制的条件。还理解和已知的是允许大规模生产载体以及生产由载体编码的核酸以及它们的关联多肽、蛋白质或肽的技术和条件。

D.表达系统

存在众多的包含至少部分或者全部上述组成成分的表达系统。此类系统可以用于，例如，生产根据本发明鉴定的能够结合特定配体的多肽产物。基于原核生物的系统可以在本发明中使用以产生核酸序列，或者它们的关联多肽、蛋白质和肽。许多此类系统是商业性可得的且是处处可得的。表达系统的其它实例包括包含强的原核生物启动子诸如T7、Tac、Trc、BAD、lambda pL、四环素或Lac启动子的载体、pET表达系统和大肠杆菌表达系统。

E.候选结合蛋白质和抗体

在某些实施方案中，抗体Fc结构域在细胞质中或者在宿主细菌细胞的周质空间中表达。通过此类Fc结构域的异质群体表达，可以鉴定对靶配体(FcR)具有高亲和性的那些多肽。然后，所鉴定的Fc结构域可以用于多种诊断或者治疗应用中，如本文所述。

如本文所使用，术语“Fc结构域”旨在概括性地指任何免疫球蛋白的Fc区，诸如IgG、IgM、IgA、IgD或者IgE Fc。制备和使用多种基于抗体的构建体和片段的技术在本领域中众所周知。制备和表征抗体的方法在本领域中也是众所周知的(见例如Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988；通过参考并入本文)。

一旦鉴定出对靶配体具有亲和性的抗体，可以根据需要使用过滤、离心和多种层析方法，诸如HPLC或亲和层析纯化Fc结构域。备选地，Fc结构域或者多肽和肽更加普遍地使用自动肽合成仪合成。

IX.实施例

包括下列实施例以例证本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当意识到，在下面实施例中公开的技术代表着本发明人公开的在实施本发明中良好工作的技术，并且因此可以认为构成了优选的实施方式。然而，根据本公开，本领域技术人员将意识到，可以在不脱离本发明精神和范围的情况下对所公开的特定实施方案进行诸多修改而仍得到相同或者类似的结果。

实施例1：用于工程改造Fc5的组合文库构建

在本研究中使用的所有质粒和引物描述于表3和表4中。为了筛选表现出对FcγRI的结合亲和性比先前分离的Fc片段(Fc5，包含氨基酸替换E328V/M428I)(图1和2)更高的IgG1Fc片段，通过易错PCR对Fc5基因进行随机诱变。使用模板pPelBFLAG-Fc5和由Integrated DNA Technologies(Coralville，IA)合成的两条引物(STJ#196和STJ#197)开展标准的易错PCR方法(Fromant等，1995)。将扩增的PCR片段连接入SfiI消化的pPelBFLAG中。所得到的质粒转化进入大肠杆菌Jude-1(F′[Tn10(Tet^r)proAB⁺lacI^qΔ(lacZ)M15]mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)80dlacZΔM15ΔlacX74 deoR recA1 ara D139Δ(araleu)7697 galU galK rpsL endA1 nupG)中(Kawarasaki等，2003)。基于随机选择的20个文库克隆的序列，文库为7×10⁸个个体转化体，其中每一基因的错误率为0.264％(图3)。

实施例2：原生质球和对Fc5亲和性成熟的高通量流式细胞术筛选

将在含2％(wt/vol)葡萄糖并添加氯霉素(50μg/ml)的Terrific肉汤(BectonDickinson Diagnostic Systems Difco^TM，Sparks，MD)中于37℃下以250转/分摇动过夜培养的文库细胞，在包含0.5M海藻糖(Fisher Scientific，Fair Lawn，NJ)和氯霉素(40μg/ml)的新鲜TB培养基中以1∶50稀释。在于37℃下以250转/分摇动3小时然后在25℃下冷却20分钟后，使用1mM异丙基-1-硫代-β-D-吡喃型半乳糖苷(IPTG)诱导Fc片段表达。在于25℃下培养5小时后，通过离心收获4.5ml的培养肉汤并且在1ml冷的10mM Tris-HCl(pH 8.0)中洗涤两次。在重悬于1ml冷的STE溶液(0.5M蔗糖，10mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH8.0)中后，将细胞于37℃下摇动混合培养30分钟，以12,000×g离心1分钟得到沉淀并且在1ml冷的溶液A(0.5M蔗糖，20mM MgCl2，10mM MOPS，pH 6.8)中洗涤沉淀。洗涤后的细胞在含1mg/ml鸡卵溶菌酶的1ml溶液A中于37℃培养15分钟。在以12,000×g离心1分钟后，将所得到的原生质球沉淀重悬于1ml的冷PBS中。

对于文库筛选，使用FITC蛋白质标记试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)以FITC标记重组糖基化FcγRIa/CD64细胞外结构域(R&D Systems，Minneapolis，MN)。在标记反应之后，FITC标记FcγRI对人IgG Fc的亲和性通过ELISA证实，与BSA包被孔相比，在Fc糖基化的人IgG-Fc包被孔中表现出高的荧光。原生质球以30nM FcγRI-FITC标记。在后续轮次的分选中，使用降低浓度的FcγRIa-FITC(对于第2、3、4轮分选分别为10、3和1nM)标记原生质球。通过配备有用于激发的488nm氩激光器的MoFlo(Dako Cytomation，Fort Collins，CO)分选超过4×10⁸个原生质球。在每一轮中，由于FcγRIa-FITC结合而显示出最高荧光的顶端3％的群体，通过最初分选之后即刻进行的分选和再分选而分离。

通过使用2种特异性引物(STJ#16和STJ#220)的PCR扩增得到原生质球中的Fc基因，使用SfiI限制酶位点连接入pPelBFLAG-Fc中，并且转化入电感受态大肠杆菌Jude-1细胞。在包含氯霉素的的培养基中选择所得到的转化体然后生长，如上制备原生质球用于下一轮的分选。随着分选轮次的进行高荧光克隆被富级(图4)。在第5轮分选之后，分离了显示出比Fc5荧光更高的19个克隆(图5)。除了多余的突变之外，所有的突变均位于三个不同的区域内，包括与FcγRIa直接接触的上位CH2部分，位于CH2和CH3结构域界面的连接体区，和可有助于Fc片段构象改变以便结合FcγRIa的CH3区(图6)。最高荧光克隆是Fc601，它在Fc5(E382V/M428I)中具有2个额外的突变(K338R，G341V)(图7和8)。

实施例3：表现出对FcγRIa结合的亲和性比Fc5更高的所选择克隆的序列

Fc5(核酸序列#2和蛋白质序列#2)在野生型IgG1-Fc序列(核酸序列#1和蛋白质序列#1)中具有2个突变(E382V和M428I)。表现出对FcγRIa的亲和性比Fc5更高的工程改造的Fc突变体在Fc5的序列中具有替换突变。分离的Fc突变体Fc601-Fc619(蛋白质序列#3～#21)载Fc5的序列中具有替换突变。分离的突变体总结于表5中。

实施例4：全长IgG1-Fc601的产生和纯化

曲妥珠单抗(赫赛汀^TM)已经在临床上用于治疗过表达HER2/neu(Erb2)的乳腺转移癌(Sergina和Moasser，2007)。对于转移癌的清除，曲妥珠单抗抗体识别HER2/neu(Erb2)并且与免疫细胞的表面FcγR相互作用产生抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，这对于治疗作用是基本的效应作用机制(Lazar等，2006；Sergina和Moasser，2007)。经工程改造对FcγR具有高亲和性的Fc片段基因整合入全长曲妥珠单抗抗体中。为了构建pSTJ4-赫赛汀IgG1，通过使用全基因合成方法使用寡核苷酸引物重叠延伸PCR合成了大肠杆菌密码子优化(Hoover和Lubkowski，2002)的人源化4D5(抗p185HER2抗体)V_L和V_H结构域，所述寡核苷酸引物分别为用于V_L的12种寡核苷酸引物，包括2种外引物(STJ#302和STJ#313)和10种内引物(STJ#303-312)，对于V_H的14种引物，包括2种外引物(STJ#314和STJ#327)和12种内引物(STJ#315-326)。对于V_L使用NcoI/NotI限制性内切核酸酶位点并且对于V_H使用NheI/HindIII限制性内切核酸酶位点将扩增的V_L和V_H连接入pMAZ360-M18.1-Hum-IgG1中产生pSTJ4-赫赛汀IgG1。对于pSTJ4-赫赛汀-Fc2a-IgG1和pSTJ4-赫赛汀-Fc5-IgG1，使用引物(STJ#290和STJ#291)和模板pPelBFLAG-Fc5或pPelBFLAG-Fc601扩增Fc5和Fc2a突变体基因，连接入使用SalI/EcoRV消化的pSTJ4-赫赛汀IgG1中。对于在大肠杆菌双顺反子质粒中制备型生产非糖基化曲妥珠单抗和曲妥珠单抗-Fc5和曲妥珠单抗-Fc601，构建了pSTJ4-赫赛汀-IgG1、pSTJ4-赫赛汀-Fc5-IgG1和pSTJ4-赫赛汀-Fc601-IgG1。这些质粒处于具有与重链和轻链两者融合的PelB前导肽的双顺反子操纵子中lac启动子控制下(图9)。

在将质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)(EMD Chemicals，Gibbstown，NJ)中之后，细胞在LB复合培养基中生长过夜，然后在R/2培养基(Jeong和Lee，2003)中培养过夜两次以便适应，R/2培养基组成如下：2g(NH₄)₂HPO₄、6.75gKH₂PO₄、0.93g柠檬酸H₂O、0.34g MgSO₄、20g葡萄糖、0.05g氨苄青霉素和5ml溶解在2N HCl中的痕量金属溶解(每升10g FeSO₄-7H₂O、2.25gZnSO₄-7H₂O、1g CuSO₄-5H₂O、0.35g MnSO₄-H₂O、0.23g Na₂B₄O₇-10H₂O、1.5g CaCl₂和0.1g(NH₄)₆Mo₇O₂₄)。携带pSTJ4-赫赛汀-IgG1、pSTJ4-赫赛汀-IgG1-Fc5或者pSTJ4-赫赛汀-IgG1-Fc601的大肠杆菌BL21(DE3)在含120mlR/2培养基的500mL带挡板烧瓶中于30℃下以250转/分培养8小时，然后接种在含1.2L R/2培养基的3.3L BioFlo 310发酵罐中(New Brunswick ScientificCo.，Edison，NJ)。使用恒pH葡萄糖流加策略于30℃开展补料分批发酵。当需要时，通过从100转/分至1000转/分的渐增搅拌速度，从1至3SLPM(每分钟标准流体)的空气流速和从0至1.5SLPM的纯氧流速的自动级联控制，将溶解氧(DO)浓度维持在40％的空气饱和度。最初pH调整至6.8，并且当降低至小于6.75时通过加入30％(v/v)氢氧化铵控制，并且当增加至大于6.9时通过提供补料溶液(700g/L葡萄糖和10g/L MgSO47H2O；在诱导前)和(500g/L葡萄糖、10g/L MgSO47H2O和100g/L酵母提取物；在诱导后)控制。当OD600达到100时，培养温度降低至25℃并且30分钟后，使用1mM异丙基-1-硫代-β-D-吡喃型半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白质表达。在7小时后当OD₆₀₀为～130-140时收获培养肉汤。非糖基化四聚体IgG的产率为大约40mg/L。

通过11,000×g离心30分钟收获细胞并且悬浮于1.2L包含100mM Tris、10mM EDTA(pH 7.4)并添加有4mg溶菌酶(每g干细胞重量)和1mM PMSF的溶液中。通过将悬浮溶液于30℃下以250转/分摇动培养16小时释放周质蛋白。在14,000×g离心30分钟后，上清液与聚乙烯亚胺(MP Biomedical，Solon，OH)混合至终浓度0.2％(w/v)，再次以14,000×g离心30分钟，并且经0.2μm滤膜过滤。澄清的滤液与在20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)中预平衡的固定化蛋白A琼脂糖树脂混合并于4℃下孵育16小时。在用200ml 20mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)和200ml 40mM柠檬酸钠(pH 5.0)洗涤后，使用15ml 0.1M甘氨酸(pH 3.0)将野生型非糖基化曲妥珠单抗、非糖基化曲妥珠单抗-Fc5和非糖基化曲妥珠单抗-Fc601从树脂上洗脱，并且立即用1M Tris(pH 8.0)溶液中和。洗脱的样品通过经10kDa MW截止膜的超滤浓缩并且将截留物应用至经PBS(pH 7.4)冲洗的Superdex 200凝胶过滤柱上。

实施例5：非糖基化曲妥珠单抗-Fc601对Fc受体的亲和性

通过将糖基化曲妥珠单抗(临床级，Fox Chase Cancer Center Pharmacy)、非糖基化曲妥珠单抗和非糖基化曲妥珠单抗-Fc5、非糖基化曲妥珠单抗-Fc601逐一固定在CM-5传感器芯片上，测量完全装配的非糖基化曲妥珠单抗抗体对FcγRIa的亲和性。将HBS-EP(10mM HEPES pH 7.4，150mM NaCl，3.4mMEDTA，和0.005％P20表面活性剂)缓冲液中的可溶性单体FcγRIa以30μl/分的流速注射60秒，解离时间300秒。通过单次注射100mM柠檬酸，pH 3.0进行配体再生。可溶性单体FcγRIa与糖基化曲妥珠单抗、非糖基化曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-Fc5和曲妥珠单抗-Fc601的亲和性如下得到，即通过一式两份以0、25、50、100、200nM的浓度以30μl/分的流速向固定化的糖基化曲妥珠单抗、曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-Fc5和曲妥珠单抗Fc601注射可溶性FcγRIa 60秒。通过一式两份以0、200、300、400、500和600nM的浓度以30μl/分的流速向固定化的非糖基化曲妥珠单抗注射FcγRIa 60秒得到FcγRIa对野生型非糖基化曲妥珠单抗的亲和性。零浓度时的结合曲线作为空白被扣除。通过将平衡反应与通过BIA评定3.0软件提供的稳态亲和性模型拟合确定平衡解离常数(KD)。如图10中所示，曲妥珠单抗-Fc601以与商业级别的来自CHO细胞的糖基化曲妥珠单抗相似的亲和性结合FcγRIa，并且与野生型非糖基化曲妥珠单抗相比亲和性增加超过130倍。

通过ELISA分析纯化IgG对于FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa细胞外结构域的亲和性。50μl的4μg/ml非糖基化曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-Fc5或者从大肠杆菌纯化的曲妥珠单抗-Fc601、糖基化的IgG曲妥珠单抗在0.05M Na₂CO₃(pH9.6)缓冲液中稀释并且用于于4℃下包被96孔聚苯乙烯ELISA孔(Corning，Corning，NY)16小时。在以1×PBS(pH 7.4)，0.5％BSA室温封闭2小时后，将板用包含0.05％Tween20的PBS洗涤4次，并且用系列稀释的FcγRIIa、C末端融合至GST的FcγRIIb(Berntzen等，2005)、FcγRIIIa(R&D Systems，Minneapolis，MN)室温孵育1小时。在用相同的缓冲液洗涤4次后，对于FcγRIIa和FcγRIIb加入1∶5,000稀释的抗GST抗体HRP缀合物(Amersham Pharmacia，Piscataway，NJ)或者对于FcγRIIIa加入1∶10,000稀释的抗聚组氨酸抗体HRP缀合物(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，并且如先前所述将板洗涤并显色(Mazor等，2007)。为了确定在pH 7.4下IgG与FcRn的结合，将如先前所述与包含1∶5,000稀释的抗GST-HRP的PBS(pH 7.4)室温预孵育1小时的2μg/ml FcRn(Andersen等，2006)加入至用曲妥珠单抗包被的板中。为了评价在pH 6.0下的结合，如上开展ELISA，例外的是将20mM MES加入至洗涤缓冲液和样品稀释缓冲液中并将pH调整至6.0。如所预期，非糖基化曲妥珠单抗表现出对FcγRIIa或FcγRIIb(对于GST融合的FcγRIIa和FcγRIIb分别为EC₅₀≥1000倍和高于100倍，图3C和3D)(图11和图12)、FcγRIIIa(图13)具有低亲和性。曲妥珠单抗-Fc601抗体表现出对FcγRIIb的亲和性稍微更高。新生儿FcRn受体与CH2结构域和CH3结构域界面的结合负责IgG在胞浆中的内体再循环(Ghetie和Ward，2000)。曲妥珠单抗-Fc5的确显示出其对新生儿FcRn的pH依赖性结合(在pH 6.0下以高亲和性结合并且在pH 7.4下以低亲和性结合)。然而，曲妥珠单抗-Fc601表现出在pH 6.0下对FcRn的结合亲和性低得多(图14)。

实施例6：对FcγRIa比对Fc5亲和性更高并且pH依赖性FcRn结合的文库 的构建

在微酸性pH条件下人FcRn对人IgG具有高亲和性并且在中性或者碱性pH下具有低亲和性(Ober等，2004a；Ober等，2004b；Raghavan和Bjorkman，1996；Rodewald，1976)。FcRn结合位点位于CH2和CH3结构域界面处，与葡萄球菌蛋白A(SpA)结合位点相似(Kim等，1994；Shields等，2001)。Fc601显示与Fc5相比具有改善的FcγRIa结合亲和性。然而，Fc601在IgG1低位CH2区内的两个额外突变(K338R，G341V)破坏了pH依赖的FcRn结合，这对于通过允许所胞饮的IgG在酸化内体中产生强的IgG-FcRn复合体以便跨过血管内皮细胞膜再循环进入血液，而不是在溶酶体内降解，来调节血清IgG浓度是至关重要的(Ghetie和Ward，2000)。

为了分离显示对FcγRIa的亲和性比Fc5更高并且保留了pH依赖性FcRn结合的工程改造Fc片段，构建了在CH2上部区域包含随机氨基酸的新组合文库。文库由4个亚文库组成。CH2上部区域的4个部分(234L-239S、264V-268H、297N-299T、328L-332I)(Kabat等，1991)使用NNS简并密码子被随机氨基酸替换(图15和16)。对于第一亚文库，使用引物(STJ#465和STJ#220)和模板pPelBFLAG-Fc5扩增DNA片段。使用引物STJ#473将PCR扩增片段的N末端序列延伸产生在34L-239S区有5个氨基酸被随机氨基酸替换的亚文库。使用通过引物(STJ#467和STJ#220)扩增的DNA片段和通过引物(STJ#473和STJ#468)扩增的DNA片段的基因装配PCR产物产生对于264V-268H为随机化的5个氨基酸残基的第二亚文库。使用相同的PCR模板质粒pPelBFLAG-Fc5并且使用引物对(STJ#473/STJ#470和STJ#469/STJ#220)产生297N-299T随机化的第三个亚文库并且使用引物对(STJ#473/STJ#470和STJ#469/STJ#220)产生第四个亚文库(328L-332I)。基于可能突变的数量，来自5个氨基酸残基随机化的3个亚文库(234L-239S；264V-268H；328L-332I)的相同量的DNA与203/205倍数量的来自3个氨基酸残基随机化的第3个亚文库(297N-299T)的DNA混合。将3个亚文库的每一个亚克隆入SfiI消化的pPelBFLAG中。所得到的质粒转化进入大肠杆菌Jude-1(F′[Tn10(Tet^r)proAB⁺lacI^qΔ(lacZ)M15]mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)80dlacZΔM15 ΔlacX74 deoR recA1 araD139 Δ(araleu)7697 galU galK rpsL endA1 nupG)中(Kawarasaki等，2003)。

实施例7：表现出对FcγRIa的亲和性比Fc5更高和pH依赖性FcRn结合的 Fc突变体的筛选

通过实施例2中所述的方法将由4个亚文库组成的文库细胞转变成原生质球。通过装备氩激光器的MoFlo流式细胞仪(Dako Cytomation，Fort Collins，CO)分选超过4×10⁸个原生质球。在室温标记10nM(对于第2轮为3nM，对于第3轮为1nM，对于第4轮为0.3nM)FcγRIa-FITC 1小时之后，通过选择性门控分选由于FcγRIa-FITC结合而显示最高荧光强度的群体顶部3％的原生质球。在最初分选之后，将收集的原生质球立即进行再分选。通过PCR使用两种特异性引物(STJ#16和STJ#220)扩增Fc编码基因并且连接进入SfiI消化的pPelBFLAG质粒中。将连接混合物转化进入大肠杆菌Jude-1中。在包含氯霉素的培养基上选择的转化体如上培养、制备原生质球并分选。在第4轮分选之后，分离8个表现出比Fc5荧光更高的各个克隆(图17)。所有克隆具有在L328W和I332Y突变中的共有序列突变。同样，氨基酸残基329P高度保守，表明了特定的氨基酸残基在FcγRIa结合中的关键性作用(图18)。最高荧光克隆是Fc701，其在328L-332I区具有L328W、A330V、P331A、I332Y突变并且具有另一额外的Q295R突变(图19-21)。

实施例8：从上位CH2随机化文库筛选的表现出对FcγRIa具有高亲和性结 合的所选择克隆的序列

表现出对FcγRIa的亲和性比Fc5更高的工程改造的Fc突变体在Fc5序列中具有替换突变。分离的Fc突变体Fc701-Fc708(蛋白质序列#22～#29)在Fc5序列中具有突变。表现出对FcγRI的亲和性比Fc5更高的分离的突变体总结于表6中。

实施例9：全长曲妥珠单抗-Fc701 IgG1的表征

使用补料分批发酵产生全长曲妥珠单抗-Fc701IgG1，并且使用蛋白质A亲和层析纯化，接着通过凝胶过滤层析纯化，如实施例4中所述。为了得到全长曲妥珠单抗-Fc701对FcγRIa结合的动力学速率常数，使用胺偶联方法将纯化的曲妥珠单抗-Fc701固定化在CM5传感器芯片上。使用在实施例5中描述的条件分析曲妥珠单抗-Fc701与FcγRIa之间的相互作用。曲妥珠单抗-Fc701以与曲妥珠单抗Fc601相似的亲和性结合FcγRIa(图22)。使用ELISA在pH 6.0和pH7.4下分析pH依赖性FcRn结合，如实施例5中所述。如所预期，所有的曲妥珠单抗抗体，包括曲妥珠单抗-Fc701，显示出在中性pH 7.4时对FcRn没有显著的结合亲和性。另一方面，曲妥珠单抗Fc701表现出在pH 6.0下对FcRn的结合亲和性比野生型非糖基化或者糖基化曲妥珠单抗抗体更高(图23)。

表4.本研究中使用的引物

表5.赋予对FcγRI的亲和性比Fc5更高的Fc中的突变

表6.从CH2上部区域随机化文库分离的赋予对FcγRI的亲和性比Fc5更高的突变

实施例10：用于共价锚定全长IgG展示系统的质粒的详细构建

将PCR扩增并且SfiI消化的编码人IgG1-Fc片段、人IgG1重链铰链区、CH2区和CH3区的Fc基因(GeneBank登录号AF237583)亚克隆进入SfiI消化的pPelBFLAG产生pPelBFLAG-Fc。通过将XbaI-HindIII消化的来自pMoPac1-FLAG-M18的NlpA融合的M18scFv基因连接进入用相同的内切核酸酶消化的pBAD30-KmR中得到pBADNlpAHis-M18。通过引物(STJ#475和STJ#476)和模板pSTJ4-赫赛汀IgG1扩增的曲妥珠单抗VL-Ck用SfiI消化并连接进入用SfiI消化的pBADNlpAHis-M18中产生pBADNlpA-VL-Ck-His。使用引物(STJ#16和STJ#340)和模板(pSTJ4-赫赛汀IgG1)扩增PelB前导肽融合的曲妥珠单抗VL-Ck，通过XbaI/HindIII内切核酸酶消化并连接进入用相同的内切核酸酶消化的pBAD-NlpA-VL-Ck-His中，产生pBADPelB-VL-Ck。将通过引物(STJ#70和STJ#332)和模板(pBADPelB-VL-Ck)扩增的PCR片段用XbaI消化并连接进入使用相同的内切核酸酶消化的pBADNlpA-VL-Ck-His构建pBADPelB-VL-Ck-NlpA-VL-Ck-His。分别对于pPelB-赫赛汀(H)-FLAG、pPelB-赫赛汀(H)-Fc5-FLAG和pPelB-赫赛汀(H)-Fc2a-FLAG使用引物(STJ#474和STJ#67)和模板pSTJ4-赫赛汀IgG1扩增曲妥珠单抗重链。Fc2a是通过CH2上部区域内两个突变(S298G/T299A)对于FcγRII结合进行优化的非糖基化抗体变体；已经报导包含IgG的Fc2a表现出与那些糖基化抗体可比的FcγRIIa结合和效应器功能(Sazinsky等，2008)。对于正确装配的、同二聚体野生型Fc和Fc2a在大肠杆菌周质空间内的表达，构建质粒pDsbA-Fc-FLAG和pDsbA-Fc2a-FLAG用于通过DsbA信号肽将Fc输出。PCR扩增的片段用SfiI消化，连接进入用相同的内切核酸酶消化的pPelBFLAG中，以产生pPelB-赫赛汀(H)-FLAG、pPelB-赫赛汀(H)-Fc5-FLAG和pPelB-赫赛汀(H)-Fc2a-FLAG。

表7和8总结在实施例10-14中所使用的质粒和引物。

实施例11：对于共价锚定全长IgG展示系统的原生质球制备和FACS分 析以便工程改造IgG重链

为了使用细菌全长IgG展示系统用于文库筛选，应该考虑4个因素。首先，IgG重链和轻链必须良好表达。第二，重链和轻链应该在大肠杆菌中良好组装。第三，结合配体能够接近细菌细胞内的全长IgG。最后，第四，在文库筛选过程中所展示全长IgG的锚定应该是强壮的。

两个质粒共表达质粒用于稳定共价锚定全长IgG(图24)。pBADPelB-VL-Ck-NlpA-VL-Ck-His质粒使得能够表达NlpA前导肽融合的IgG轻链(VL-Ck)和PelB前导肽融合的IgG轻链(VL-Ck)。因此，一部分轻链锚定在内膜的周质侧，在内膜上轻链与重链结合产生四聚体全长IgG。pPelB-赫赛汀(H)-FLAG是处于lac启动子控制下的编码IgG重链的高拷贝数质粒。质粒pBADPelB-VL-Ck-NlpA-VL-Ck-His与pPelB-赫赛汀(H)-FLAG、pPelB-赫赛汀(H)-Fc5-FLAG或pPelB-赫赛汀(H)-Fc2a-FLAG(分别对于野生型曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-Fc5或曲妥珠单抗-Fc2a)一起转化进入大肠杆菌Jude-1(F′[Tn10(Tet^r)proAB⁺lacI^qΔ(lacZ)M15]mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)80dlacZΔM15ΔlacX74deoR recA1 araD139Δ(ara leu)7697 galU galK rpsL endA1 nupG)(Kawarasaki等，2003)中。转化的大肠杆菌细胞在含2％(wt/vol)葡萄糖并添加氯霉素(50μg/ml)和卡那霉素(50g/ml)的Terrific肉汤(Becton Dickinson Diagnostic SystemsDifco^TM，Sparks，MD)中于37℃以250转/分摇动培养过夜。

过夜培养的细胞在125ml锥形瓶中的含氯霉素(50μg/ml)和卡那霉素(50g/ml)的新鲜7ml TB培养基中以1∶100稀释。在以250转/分摇动下于37℃培养2小时并且在25℃下冷却20分钟之后，使用1mM异丙基-1-硫代-D-吡喃型半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白质表达。IPTG诱导20小时后，通过离心收获6ml的培养肉汤并且在1ml冷的10mM Tris-HCl(pH 8.0)中洗涤两次。在重悬于1ml冷的STE溶液(0.5M蔗糖，10mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH 8.0)后，于37℃下旋转混合培养细胞30分钟，通过12,000×g离心1分钟将细胞沉淀并且在1ml冷的溶液A(0.5M蔗糖，20mM MgCl2，10mM MOPS，pH 6.8)中洗涤。洗涤的细胞与含1mg/ml鸡卵溶菌酶的1ml溶液A于37℃孵育15分钟。在以12,000×g离心1分钟后，所得到的原生质球沉淀重悬于1ml冷PBS中。300μl原生质球进一步在700μl PBS中稀释并用30nM FcγRI-FITC标记以分析FcγRIa的结合。为了用FACS分析FcγRIIa结合，原生质球与90nM C末端融合至GST的FcγRIIa(Berntzen等，2005)孵育，在1ml PBS中洗涤，并用在1ml PBS中1∶200稀释的多克隆山羊抗GST-FITC(Abcam，Cambridge，MA)标记。在于黑暗条件下于25℃强力摇动孵育1小时后，通过12,000×g离心1分钟将混合物沉淀并重悬于1ml PBS中。荧光标记的原生质球在2.5ml PBS中稀释并且在BDFACSCalibur(BD Bioscience，San Jose，CA)上分析。

实施例12：FACS分析

对于使用FACS分选方法基于门孔选择性荧光和散布区的亲和性成熟，需要得到与阴性对照相比具有低变异系数(CV＝[标准差/平均值]×100)的可区别的高或低荧光信号。对于双质粒共价锚定全长IgG展示系统的荧光与对于双顺反子质粒pSTJ4-赫赛汀IgG、pSTJ4-赫赛汀-IgG1-Fc5或pSTJ4-赫赛汀-IgG1-Fc2a的荧光进行比较。

比较了表达内膜锚定(通过NlpA-VL-Ck多肽)野生型全长IgG曲妥珠单抗的原生质球与从双顺反子载体系统(Mazor等，2007)表达可溶性IgG的原生质球的荧光谱。当用FcγRIa-FITC标记时，双质粒锚定全长IgG展示系统清楚地显示出极大改善信号强度和CV值。使用在TB中于12℃或25℃下培养的细胞测试对于锚定全长IgG展示系统的荧光信号。从于25℃下培养的、使用双质粒共价锚定全长IgG展示系统展示曲妥珠单抗-Fc5的细胞产生的原生质球表现出，当用FcγRI-FITC标记时，与表达野生型曲妥珠单抗的原生质球相比，具有高得多的荧光和改善的CV(图25)。同样，在FACS分析以测定原生质球对FcγRIIa-GST的亲和性中(图26)，在TB中于25℃培养的双质粒共价锚定全长IgG展示系统显示出令人惊讶地改善的信号强度和CV，这提供了用于全长IgG有效地亲和性成熟的选择性展示系统(图27和图28)。

实施例13：用于IgG Fc工程改造的易错PCR文库的构建

通过标准的易错PCR(Fromant等，1995)使用野生型Fc作为模板并使用两种引物(STJ#196和STJ#197)构建锚定IgG内CH2-CH3区的易错PCR文库。对于易错PCR文库，将扩增的PCR片段使用SfiI限制性位点连接入pPelBFLAG中。使用引物(STJ#479和STJ#67)扩增文库Fc片段。对于具有随机化Fc区的曲妥珠单抗重链(VH-CH1-铰链-CH2-CH3)文库，使用引物(STJ#474和STJ#480)从模板pSTJ4-赫赛汀IgG扩增VH-CH1片段。使用引物(STJ#474和STJ#67)从铰链-CH2-CH3区和VH-CH1区2个片段进行基因装配PCR，产生随机化Fc区的曲妥珠单抗重链(VH-CH1-铰链-CH2-CH3)文库。将基因装配PCR片段使用SfiI限制位点连接入pPelBFLAG中。将所得到的质粒转化进入大肠杆菌Jude-1(F′[Tn10(Tet^r)proAB⁺lacI^qΔ(lacZ)M15]mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)80dlacZΔM15ΔlacX74 deoR recA1 araD139Δ(ara leu)7697 galU galKrpsL endA1nupG)(Kawarasaki等，2003)中。文库由9.2×10⁸个个体转化体组成，基于对随机选择的20个文库克隆的测序每一基因的错误率为0.49％。

实施例14：用于IgG Fc工程改造的CH2上部区域随机化文库的构建

这些文库由4个亚文库组成。CH2上部区域的4个部分(234L-239S、264V-268H、297N-299T、328L-332I)(Kabat等，1991)使用NNS简并密码子被随机氨基酸替换(图29)。对于第一亚文库，使用引物(STJ#465和STJ#220)和模板pPelBFLAG-Fc扩增DNA片段。使用引物STJ#473将5’序列延伸产生在34L-239S区有5个氨基酸被随机氨基酸替换的亚文库。使用通过引物(STJ#467和STJ#220)扩增的DNA片段和通过引物(STJ#473和STJ#468)扩增的DNA片段的基因装配PCR产物产生对于264V-268H为随机化的5个氨基酸残基的第二亚文库。使用相同的PCR模板质粒pPelBFLAG-Fc5并且使用引物对(STJ#473/STJ#470和STJ#469/STJ#220)产生297N-299T随机化的第三个亚文库并且使用引物对(STJ#473/STJ#470和STJ#469/STJ#220)产生第四个亚文库(328L-332I)。基于可能突变的数量，来自5个氨基酸残基随机化的3个亚文库(234L-239S；264V-268H；328L-332I)的相同量的DNA与203/205倍数量的来自3个氨基酸残基随机化的第3个亚文库(297N-299T)的DNA混合。将3个亚文库的每一个亚克隆入SfiI消化的pPelBFLAG中。对于CH2上部区域随机化的曲妥珠单抗重链(VH-CH1-铰链-CH2-CH3)文库，使用引物(STJ#474和STJ#480)从模板pSTJ4-赫赛汀IgG扩增VH1-CH1片段。使用引物(STJ#474和STJ#67)从铰链-CH2-CH3区和VH1-CH1区2个片段进行基因装配PCR，产生随机化CH2上部区域的曲妥珠单抗重链(VH-CH1-铰链-CH2-CH3)文库。将基因装配PCR片段使用SfiI限制位点连接入pPelBFLAG中。将所得到的质粒转化进入大肠杆菌Jude-1中。基于随机选择的20个文库克隆的序列，构建的文库大小超过3×10⁸个转化体。

表7.本研究中使用的质粒

表8.本研究中使用的引物

实施例15：用于抗体依赖性细胞毒性测定的人单核细胞衍生的树突细胞 (mDC)的分离和分化

血沉棕黄层(Gulf Coast Blood Center，Galveston，TX)以1∶1的体积加入至histopaque溶液(Sigma)中，避免内容物混合。血液-histopaque溶液于23℃在无离心制动情况下以1600转/分离心30分钟。按照梯度离心分离外周血单核细胞层，并且用洗涤缓冲液(PBS，2.5％胎牛血清(FBS)，1mM乙二胺四乙酸(EDTA))通过离心洗涤2次。然后将细胞重悬于Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM，Cambrex)中，并加入至24孔板中并于37℃下培养2小时以允许单核细胞粘附至板上。有代表性地，来自50ml体积血液的PBMC重悬于24ml IMDM中，并以1ml/孔铺板。然后将培养基和未粘附细胞吸出并将粘附细胞用洗涤缓冲液洗涤5次。然后将细胞以1ml/孔重悬于包含IMDM(Cambrex)、10％FBS和200ng/ml白细胞介素-4(IL-4，R&D systems)和200ng/ml粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，R&D systems)重组细胞因子的生长培养基中。另外的IL-4和GM-CSF在第2和5天以每种200ng/ml加入，不更换培养基。使用抗DC特异性表面标志物CD11c的荧光抗体(eBioscience)进行染色并通过流式细胞仪测量DC分化。

实施例16：抗体依赖性细胞的细胞毒性(ACCC)测定

表达高水平Her2的乳腺癌细胞系SkBr3用作ADCC测定的靶。细胞用同位素Na⁵¹CrO₄(Perkin Elmer Life Sciences)以100uCi/10⁶个细胞于37℃下标记1小时。然后将细胞用PBS洗涤两次并且重悬于含glutamax的Roswell ParkMemorial Institute培养基-1640(RPMI)中，并以10⁴个细胞/孔加入到96孔板中。非糖基化野生型曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-Fc5和曲妥珠单抗-Fc601(如实施例4中所述制备)和糖基化曲妥珠单抗(Clinical grade，Genentech)以及相关对照加入至一式三份孔内的靶细胞中并于37℃孵育1小时。然后将板以2000转/分离心1分钟并用PBS洗涤。将效应器细胞，或者完全分化的mDC(第7天)或者新鲜分离的PBMC，重悬于RPMI，2％低IgG FBS(Invitrogen)，250ng/10⁶细胞的脂多糖(LPS)中，并以不同的比率加入到孔中。靶细胞和mDC在37℃下孵育24小时。然后在液体闪烁计数器中对于铬51测量细胞培养基中的同位素水平。靶细胞与SDS的孵育用作最大裂解的阳性对照并且无效应器细胞的孵育用作背景裂解。当mDC用作效应器细胞时，非糖基化曲妥珠单抗-Fc5和曲妥珠单抗-601显示非常高水平的ADCC并且糖基化的曲妥珠单抗诱导非常低的ADCC(图31)。推测这是因为Fc-601和Fc-5仅结合FcγRI并且不结合也在单核细胞衍生的DC表面上表达的抑制剂受体FcγRIIb。在另一方面，赫赛汀表现出结合所有的FcγR受体，包括FcγRIIb，并且与后者受体的结合可能抑制靶细胞活化和杀伤。使用PBMC作为效应器细胞证明，可以结合所有Fc受体并可以活化NK细胞的糖基化曲妥珠单抗具有高的ADCC。与之相比，非糖基化曲妥珠单抗-Fc5和曲妥珠单抗-601显示具有低的ADCC(图30)。

***

根据本公开，本文公开和要求专利保护的所有方法可以在无需过度实验的情况下建立并实施。虽然本发明的组合物和方法已经以优选实施方案的方式描述，但是本领域技术人员显而易见，可以对本文所述方法、方法的步骤以及方法步骤的顺序进行修改而不脱离本发明概念、精神和范围。具体而言，显而易见，化学上和生理上均相关的某些试剂可以替代本文所述的试剂而达到相同或者相似的结果。对本领域技术人员而言显而易见的所有这些相似替代和修改认为处于由后附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念内。

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Claims (15)

1.包含能够结合人FcR多肽的非糖基化人IgG1 Fc结构域的抗体或者抗体片段，其中该Fc结构域包含氨基酸382和氨基酸428位的氨基酸替换E382V和M428I与选自以下的一组额外替换：a)K338R和G341V；b)H224Y、E269K、N325S和G341V；c)G341V和K392E；d)K338R、G341V、S424L和N434D；e)F241L和G341V；f)G341V；g)N276D和G341V；h)G341V和V369A；i)N286D、G341V和N434S；j)N325S和G341V；k)Y300C和G341V；l)G341V和V348M；m)L328W、A330V、P331A、I332Y和Q295R；n)L328W、A330E、P331E、I332Y和V279M；o)L328W、A330E、P331E和I332Y；p)L328W、A330E、P331V、I332Y和S426T；q)L328W、A330E、P331V和I332Y；r)L328W、A330I、P331E和I332Y；s)L328W、A330E和I332Y；t)L328W、P331S和I332Y；和y)L328W、A330V、P331S、I332Y、H224R和L251F。

2.权利要求1的抗体或者抗体片段，其中Fc结构域能够结合人FcγRI多肽。

3.权利要求1的抗体或者抗体片段，还包含可缀合的连接体，其中所述一组额外替换是f)G341V。

4.权利要求1的抗体或者抗体片段，还包含非FcR结合结构域，其中所述一组额外替换是f)G341V。

5.权利要求4的抗体或者抗体片段，其中所述非FcR结合结构域是抗体的抗原结合位点。

6.权利要求4的抗体或者抗体片段，其中所述非FcR结合结构域不是抗体的抗原结合位点。

7.权利要求6的抗体或者抗体片段，其中所述非FcR结合结构域结合细胞表面蛋白。

8.权利要求7的抗体或者抗体片段，其中所述细胞表面蛋白是受体。

9.权利要求8的抗体或者抗体片段，其中所述受体是酪氨酸激酶。

10.权利要求9的抗体或者抗体片段，其中所述非FcR结合结构域结合多个酪氨酸激酶受体。

11.编码权利要求1-10中任一项的任一抗体或者抗体片段的核酸。

12.包含权利要求11的核酸的宿主细胞。

13.用于制备非糖基化抗体的体外方法，包括:

a)获得能够表达非糖基化抗体的宿主细胞，所述非糖基化抗体包含能结合FcR多肽的人IgG1 Fc结构域，其中所述Fc结构域包含氨基酸382和428位的氨基酸替换E382V和M428I与选自以下的一组额外替换：a)K338R和G341V；b)H224Y、E269K、N325S和G341V；c)G341V和K392E；d)K338R、G341V、S424L和N434D；e)F241L和G341V；f)G341V；g)N276D和G341V；h)G341V和V369A；i)N286D、G341V和N434S；j)N325S和G341V；k)Y300C和G341V；l)G341V和V348M；m)L328W、A330V、P331A、I332Y和Q295R；n)L328W、A330E、P331E、I332Y和V279M；o)L328W、A330E、P331E和I332Y；p)L328W、A330E、P331V、I332Y和S426T；q)L328W、A330E、P331V和I332Y；r)L328W、A330I、P331E和I332Y；s)L328W、A330E和I332Y；t)L328W、P331S和I332Y；和y)L328W、A330V、P331S、I332Y、H224R和L251F；

b)在促进非糖基化抗体表达的情况下培养宿主细胞；和，

c)从所述宿主细胞纯化表达的抗体。

14.权利要求13的方法，其中Fc结构域能够结合人FcγRI多肽。

15.一种抗体在制备用于在受试者中诱导免疫反应的药物中的用途，其中所述抗体未被糖基化并且包含根据权利要求1-10任一项所定义的Fc结构域。