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KR20100118606A - Ｒｇｍ ａ 단백질에 대한 모노클로날 항체 및 이의 용도 - Google Patents

Ｒｇｍ ａ 단백질에 대한 모노클로날 항체 및 이의 용도 Download PDF

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KR20100118606A
KR20100118606A KR1020107021295A KR20107021295A KR20100118606A KR 20100118606 A KR20100118606 A KR 20100118606A KR 1020107021295 A KR1020107021295 A KR 1020107021295A KR 20107021295 A KR20107021295 A KR 20107021295A KR 20100118606 A KR20100118606 A KR 20100118606A
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rgm
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KR101681910B1 (ko
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베른하르트 카. 뮐러
마르틴 슈미트
이브 에이치. 바로우
메리 알. 레디
충-밍 셰
필립 디. 바드웰
Original Assignee
애보트 게엠베하 운트 콤파니 카게
아보트 러보러터리즈
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Publication date
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Abstract

본 발명은 RGM A 단백질에 결합하고 중화시키는 분리된 단백질, 특히 모노클로날 항체에 관한 것이다. 구체적으로, 이 항체는 RGA A의 이의 수용체 및/또는 공동수용체에 대한 결합을 저해하는 능력이 있다. 이러한 본 발명의 항체 또는 이의 일부는, 예를 들어 다발성 경화증, 포유동물의 뇌 외상, 척수 손상, 졸중, 신경변성 질환 및 정신분열증을 비롯한, 이에 국한되지 않는 장애를 앓고 있는 사람에서 RGM A를 검출하고 RGM A 활성을 저해하는데 유용하다.

Description

ＲＧＭ Ａ 단백질에 대한 모노클로날 항체 및 이의 용도{Monoclonal antibodies against the RGM A protein and uses thereof}
본 출원은 RGM A-결합 단백질, 특히 RGM A에 결합하는 능력이 있고 RGM A 수용체 및 다른 RGM A 결합 단백질에 대한 RGM 단백질의 결합을 차단하여 RGM A의 기능을 중화시키는 모노클로날 항체 및 구체적으로 이의 CDR 이식된, 사람화된 형태에 관한 것이다. 이러한 항체들은 다발성 경화증, 포유동물의 뇌 외상, 척수 손상, 졸중, 신경변성 질환 및 정신분열증을 비롯하여, 이에 국한되지 않는 여러 상태들의 치료에 유용할 수 있다.
포유동물의 중추신경계(CNS) 내 신경변성 질환 후, 염증 공격 후 또는 손상 후 축삭 재생은 거의 항상 불가능하고; 그 결과는 CNS 내의 신경 섬유가 재생하는 고유 능력, 및 병변이나 상해 부위의 미세환경에 위치하고 재성장 및 이에 따른 손상된 섬유관의 재생을 활성적으로 방해하는, CNS 내의 저해 인자 사이의 균형에 의존적이다.
희소돌기아교세포에 의해 생성된 CNS 미엘린 및 병변 흉터는 시험관내뿐 아니라 생체내에서도 성장 원뿔 붕괴 및 신경돌기 성장 저해를 유발하여 축삭 재성장의 직접 저해를 초래하는, 초기 손상에서 축삭 성장에 가장 관련이 있는 비허용 구조물이라는 것은 입증되어 있다. CNS 미엘린 및 흉터 조직에 주요 저해 인자인 RGM 단백질은 확인되어 있다(Monnier et al.,Nature 419: 392 - 395, 2002; Schwab et al., Arch. Neurol.62: 1561-8, 2005a; Schwab et al. Eur. J. Neurosci. 21:1569-76, 2005 b; Hata et al. J. Cell Biol.173:47-58, 2006; for reviews see: Mueller et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 361: 1513-29, 2006; Yamashita et al. Curr. Opin. Neurobiol. 17: 29-34, 2007). RGM 단백질은 뇌 외상 또는 허혈성 발작으로 죽어가는 사람의 상해 또는 병변 부위에서 상향조절되고(Schwab et al., Arch. Neurol. 62: 1561-8, 2005a), 척수 손상을 입은 래트의 병변 부위에서 상향조절된다(Schwab et al. Eur. J. Neurosci. 21:1569-76, 2005 b; Hata et al. J. Cell Biol.173:47-58, 2006, 고찰 문헌 참조: Mueller et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 361: 1513-29, 2006; Yamashita et al. Curr. Opin. Neurobiol. 17: 29-34, 2007). 또한, 다발성 경화증 환자 및 건강한 사람으로부터 얻은 임상 시료를 이용한 첫 데이터는 사람 RGM A가 MS를 앓고 있는 환자의 뇌척수액에서 상향조절된 것을 시사했다(데이터는 미제시).
RGM A-특이적 폴리클로날 항체의 재생-촉진능을 평가하기 위해, 흉관 레벨 9/10에서 척수의 약 60%가 절제된, 중등도 내지 중증인 척수 손상 모델에 항체들을 투여했다. 조직 검사 결과, 상기 병변은 피질척수로의 등쪽 및 가쪽 섬유를 모두 절단한 것으로 나타났다. RGM A-특이적 폴리클로날 항체를 2주 동안 펌프를 통해 국소적으로 제공한 결과, 장거리에서 손상된 신경 섬유의 재생이 유도되었다(Hata et al., J.Cell.Biol. 173: 47-58, 2006).
수많은 신경 섬유는 병변 부위를 넘어서 신장하고, 가장 긴 섬유는 병변보다 10mm 이상 넘게 재생하는 반면, 대조용 항체-처리된 동물에서는 병변 말단에서 재생 섬유가 전혀 발견되지 않았다. 항-RGM A 처리된 래트의 기능적 회복은 대조용 항체 처리된 척수 손상 래트에 비해 훨씬 증진되어, RGM A가 축삭 상해 또는 신경 섬유 손상을 특징으로 하는 징후들에서 회복을 자극하는 중요한 표적이고 강력한 신경재생 저해제임을 증명한다(Hata et al., J. Cell Biol. 173:47-58, 2006; Kyoto et al. Brain Res. 1186: 74-86, 2007). 또한, 기능-차단성 폴리클로날 항체에 의한 RGM A 단배질의 중화는 척수 손상된 래트에서 손상된 신경 섬유의 재성장을 자극할 뿐만 아니라 시냅스 형성도 증진시켜 손상된 신경회로의 재형성 또는 복구를 가능하게 했다(Kyoto et al. Brain Res. 1186: 74-86, 2007).
rgm 유전자 패밀리는 3개의 다른 유전자를 포함하고, 이 중 2개는 rgm a 및 b로, 포유동물 CNS에서 발현되어 RGM A 및 RGM B 단백질을 발생시키는 반면, 제3 멤버인 rgm c는 말초에서 발현되고(Mueller et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 361: 1513-29, 2006), 여기서 RGM C는 철 대사에 중요한 역할을 한다. 시험관내에서, RGM A는 RGM 수용체로 확인되어 있는 네오제닌(Neogenin)에 결합하여 신경돌기 성장을 저해한다(Rajagopalan et al. Nat Cell Biol.: 6(8), 756-62, 2004). 네오제닌은 네트린-결합 단백질로 처음 소개되었다(Keino-Masu et al. Cell, 87(2):175-85, 1996). 이것은 네오제닌 또는 이의 근연성 수용체 DCC(결장직장암에서 결실됨)에 대한 네트린-1의 결합이 신경돌기 성장을 저해하기 보다는 자극하는 것으로 보고되어 있기 때문에 중요한 발견이다(Braisted et al. J. Neurosci. 20: 5792-801, 2000). 따라서, RGM A의 차단은 네오제닌이 이의 신경돌기 성장-자극 리간드 네트린에 결합할 수 있게 하여 RGM-매개의 성장 저해를 면제시킨다. 이러한 관찰에 기초한, RGM A의 중화는 사람 척수 손상 모델에서 네오제닌을 중화시키는 것보다 우수한 것으로 추정될 수 있다. 네오제닌에 대한 RGM A의 결합 및 신경돌기 성장 저해의 유도 외에도, RGM A 또는 B의 골 형태형성 단백질 BMP-2 및 BMP-4에 대한 결합은 성공적인 신경재생 및 기능 회복에 대한 다른 장애를 나타낼 수 있다(Mueller et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 361: 1513-29, 2006).
이에, 당해 기술분야에는 RGM A에 결합할 수 있는 개량 항체, 바람직하게는 RGM A를 차단하고 RGM A와 이의 수용체 및/또는 결합 단백질, 즉 네오제닌 및 BMP-2, BMP-4 사이의 상호작용을 방해하는 모노클로날 항체가 필요한 실정이다.
본 발명은 (a) RGM A의 이의 수용체 네오제닌 및 골 형태형성 단백질 2 및 4(BMP-2 및 BMP-4)에 대한 결합을 선택적으로 저해하는, RGM A에 대항하는 중화성 모노클로날 항체의 생성, 및 (b) 골 형태형성 단백질 2 및 4(BMP-2 및 BMP-4)에 대한 RGM A의 결합을 선택적으로 저해하는 RGM A에 대항하는 중화성 모노클로날 항체의 생성을 제공한다. 본 발명의 중화성 모노클로날 항체는 손상 또는 상해를 입은 신경 섬유의 재성장 및 재생 신경 섬유의 기능성 시냅스의 형성을 자극할 것으로 예상되는데, 그 이유는 뉴런 세포가 콜라겐 I과 같은 허용성 기질보다 RGM A 기질로 이동하여 이 기질에서 증식하는 것을 선호하는 조건 하에서 본 발명의 중화성 모노클로날 항체 중 하나가 RGM A의 저해 성질을 변환시키는 것으로 나타나기 때문이다. 또한, 이 항체는 시신경 손상된 생체내 래트 모델에서 장거리 재생을 유도할 수 있고, 또한 병변이 있는 재생성 신경 섬유의 재미엘린화를 증진시킨다.
따라서, 본 발명의 중화성 모노클로날 항체는 손상 및 염증이 있는 사람 CNS에서, 예컨대 다발성경화증, 급성척수손상 후, 뇌외상 또는 신경변성 질환, 예컨대 헌팅턴병, 파킨슨병, 알츠하이머병에서 상해를 입거나 파손된 뉴런 연결부의 재성장 및 뉴런 재생을 촉진하는 것으로 생각된다.
제1 관점에 따라, 본 발명은 각각 표면 플라즈몬 공명으로 측정한 바에 의하면, 1 x 10-7 M 이하의 KD, 1 x 10-2 s-1 이하의 koff 속도 상수로 사람 RGM A(hRGM A)로부터 해리하는 결합 단백질을 제공한다.
제2 관점에 따라, 본 발명은 상기 속도론적 특징을 나타내는 결합 단백질의 예로서, 예컨대 이하 실시예 3에 예시된 바와 같은 Ntera 뉴런 성장 분석과 같은 표준 시험관내 분석에서 측정된 바와 같이 사람 RGM A에 결합하고 사람 RGM A의 신경돌기 성장 저해 활성을 중화시키는 결합 단백질에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 다음과 같은 추가 기능적 특성 중 적어도 하나를 보유하는 전술한 결합 단백질에 관한 것이다:
래트 RGM A에 대한 결합,
사람 RGM C에 대한 결합, 및
래트 RGM C에 대한 결합.
특히, 본 명세서에 기술된 결합 단백질은 이의 수용체 중 적어도 하나에 결합하는 RGM의 능력을 조절한다.
이러한 결합 단백질은 특히 사람 RGM A의 수용체 결합 단백질에 결합한다. RGM A의 N- 및 C-말단 수용체 결합 도메인은 확인되어 있다. 본 발명의 결합 단백질의 특정 양태는 N-말단 hRGM A 단편, 예컨대 47-168과 수용체 분자, 예컨대 네오제닌 및 BMP-4 사이의 결합 저해로 예증되는 것처럼 RGM A의 N-말단 수용체 결합 도메인에 결합한다. 상기 N-말단 hRGM A 단편은 총 길이가 약 30 내지 약 150개 아미노산 잔기 또는 약 30 내지 약 122개 아미노산 잔기일 수 있다. 한 예로, 본 명세서에 기술된 바와 같은 hRGM A의 단편 0(N-말단 잔기 47-168에 대응함) 또는 이보다 짧은 임의의 수용체 결합 단편을 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
특히, 상기 결합 단백질은 다음과 같은 상호작용 중 적어도 하나는 조절, 바람직하게는 저해한다:
사람 BMP-4에 대한 사람 RGM A의 결합,
사람 네오제닌에 대한 hRGM A의 결합,
사람 네오제닌에 대한 hRGM C의 결합,
사람 BMP-2에 대한 사람 RGM A의 결합.
특정 양태에 따르면, 본 명세서에 정의된 바와 같은 결합 단백질은 사람화된 항체이다.
전술한 바와 같은 결합 단백질은 항원 결합 도메인을 보유할 수 있고, 이 결합 단백질은 RGM 분자의 에피토프에 결합할 수 있으며, 상기 항원 결합 도메인은 다음 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함한다:
GTTPDY(서열번호 59),
FQATHDPLT(서열번호 62),
ARRNEYYGSSFFDY(서열번호 65),
LQGYIPPRT(서열번호 68) 및
상기 서열 중 하나와 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 변형된 CDR 아미노산 서열. 다른 양태에서, 본 발명은 항원 결합 도메인을 포함하고 RGM 분자의 에피토프에 결합할 수 있는 결합 단백질로, 상기 항원 결합 도메인이 다음 서열들로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 함유하는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 것인 결합 단백질에 관한 것이다:
GTTPDY(서열번호 59),
FQATHDPLT(서열번호 62),
ARRNEYYGSSFFDY(서열번호 65),
LQGYIPPRT(서열번호 68) 및
상기 서열 중 하나와 적어도 50%의 서열 동일성, 예컨대 상기 서열 중 하나와 적어도 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% 동일성을 갖는 변형된 CDR 아미노산 서열.
예컨대, 상기 결합 단백질은 상기 CDR 중 2개, 예컨대 서열번호 59와 62; 또는 서열번호 65와 68을 포함할 수 있고, 이 CDR 중 적어도 하나는 상기 서열들 중 하나와 서열 동일성이 적어도 50%, 예컨대 적어도 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% 동일성으로 변형될 수 있다.
상기 결합 단백질은 추가로 서열번호 57, 58, 60, 61, 63, 64, 66, 67 및 이 서열들 중 하나와 적어도 50%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% 동일성을 갖는 변형된 CDR 아미노산 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 결합 단백질은 적어도 하나의 CDR이
Figure pct00001
로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것이 제공된다.
특정 양태에서, 상기 결합 단백질은
Figure pct00002
로 이루어진 가변 도메인 CDR 세트
또는 3개의 CDR 중 적어도 하나가 모 서열과 적어도 50%, 예컨대 적어도 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95%의 동일성을 갖는 변형된 CDR 아미노산 서열인 가변 도메인 세트
로 이루어진 가변 도메인 CDR 세트 중에서 선택되는 적어도 3개의 CDR을 포함한다.
특히, 앞에서 언급한 각 변형은 단일 또는 다중 아미노산 부가, 결실, 또는 특히 치환 또는 이의 조합에 의해 생성될 수 있다.
다른 양태에서, 결합 단백질은 적어도 2개의 가변 도메인 CDR 세트를 포함한다.
특히, 상기 적어도 2개의 가변 도메인 CDR 세트는
VH 5F9 세트 및 VL 5F9 세트; 및
VH 8D1 세트 및 VL 8D1 세트
로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이다.
본 발명에 따른 결합 단백질은 추가로 사람 수용체 프레임워크(human acceptor framework)를 함유한다.
상기 사람 수용체 프레임워크는 서열번호 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 및 33으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 서열을 함유할 수 있다.
본 발명의 결합 단백질은 특히
(1) 각 세트가 JH3(서열번호 18), JH4(서열번호 19), JH6(서열번호 20) 중에서 선택되는 추가 프레임워크 서열과 결합되어 있는, VH3-48 세트(서열번호 15, 16 및 17), VH3-33 세트(서열번호 21, 22 및 23), VH3-23 세트(서열번호 24, 25 및 26)로 이루어진 그룹 중에서 선택되거나,
(2) 각 세트가 JK2(서열번호 2) 중에서 선택되는 추가 프레임워크 서열과 결합되어 있는 A18 세트(서열번호 27, 28 및 29), A17 세트(서열번호 31, 32 및 33)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 프레임워크 서열의 적어도 하나의 세트를 포함할 수 있다.
특정 양태에 따르면, 전술한 양태들 중 어느 하나의 결합 단백질은 서열번호 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 및 43 중에서 선택되는 적어도 하나의 CDR-이식된 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열번호 44, 45 및 46 중에서 선택되는 적어도 하나의 CDR-이식된 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
더 구체적으로, 본 발명의 결합 단백질은 2개의 가변 도메인을 포함하고, 이 2개의 가변 도메인이 다음 중에서 선택되는 아미노산 서열을 보유한다:
서열번호 35 및 44; 36 및 44; 37 및 44; 38 및 44; 39 및 44; 40 및 44; 41 및 44; 42 및 44; 43 및 44;
서열번호 35 및 45; 36 및 45; 37 및 45; 38 및 45; 39 및 45; 40 및 45; 41 및 45; 42 및 45; 43 및 45;
서열번호 35 및 46; 36 및 46; 37 및 46; 38 및 46; 39 및 46; 40 및 46; 41 및 46; 42 및 46; 43 및 46.
본 발명의 다른 양태에서, 상기 결합 단백질의 사람 수용체 프레임워크는 주요 잔기에 적어도 하나의 프레임워크 영역 아미노산 치환을 포함하고, 이 주요 잔기가
CDR에 인접한 잔기;
글리코실화 부위 잔기;
희귀 잔기;
RGM 에피토프와 상호작용할 수 있는 잔기;
CDR과 상호작용할 수 있는 잔기;
표준(canonical) 잔기;
중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 사이의 접촉 잔기;
버니어(Vernier) 구역 내의 잔기;
파라글루타메이트를 형성할 수 있는 N-말단 잔기; 및
초티아(Chothia)-정의된 가변 중쇄 CDR1과 카벳(Kabat) 정의된 제1 중쇄 프레임워크 사이에 중첩하는 영역 내의 잔기
로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
특히, 상기 주요 잔기는
(중쇄 서열 위치): 1, 5, 37, 48, 49, 88, 98
(경쇄 서열 위치): 2, 4, 41, 51
로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
특정 양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 컨센서스(consensus) 사람 가변 도메인이거나, 이 도메인을 포함한다.
본 발명의 결합 단백질의 다른 양태에 따르면, 사람 수용체 프레임워크는 적어도 하나의 프레임워크 영역 아미노산 치환을 포함하고, 이 프레임워크의 아미노산 서열이 상기 사람 수용체 프레임워크 서열과 65% 이상, 예컨대 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일하고 상기 사람 수용체 프레임워크와 동일한 아미노산 잔기를 70개 이상, 예컨대 75개, 80개 또는 85개 이상 포함한다.
특정 양태에 따르면, 본 발명의 결합 단백질은
서열번호 47, 48, 49, 50; (VH 도메인)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고/되거나
서열번호 51, 52, 53 및 54 (VL 도메인)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 프레임워크 돌연변이된 가변 도메인을 포함한다.
구체적으로, 상기 결합 단백질은 2개의 선택적으로 프레임워크 돌연변이된 가변 도메인을 포함하고, 이 2개의 가변 도메인이 다음으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 보유한다:
서열번호 47 및 44; 47 및 45; 47 및 46; 47 및 51; 47 및 52; 47 및 53; 47 및 54;
서열번호 48 및 44; 48 및 45; 48 및 46; 48 및 51; 48 및 52; 48 및 53; 48 및 54;
서열번호 49 및 44; 49 및 45; 49 및 46; 49 및 51; 49 및 52; 49 및 53; 49 및 54;
서열번호 50 및 44; 50 및 45; 50 및 46; 50 및 51; 50 및 52; 50 및 53; 50 및 54.
여기에 기술된 바와 같은 본 발명의 결합 단백질은 RGM 분자 중에서 선택되는 적어도 하나의 표적에 결합할 수 있다.
구체적으로, 결합 단백질은 사람 RGM A 및 경우에 따라 사람 기원 또는 사이노몰거스 원숭이, 래트, 병아리, 개구리 및 어류 기원의 적어도 하나의 추가 RGM 분자에 결합할 수 있다.
예를 들어, 결합 단백질은 추가로 래트 RGM A, 사람 RGM C 및/또는 래트 RGM C에 결합할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 결합 단백질은 앞에서 정의한 바와 같은 RGM 분자 중에서 선택되는 표적의 생물학적 기능을 조절할 수 있는, 특히 중화 또는 저해할 수 있다.
특히, 본 발명의 결합 단백질은 수용체, 예컨대 네오제닌, BMP, 예컨대 BMP-2 및 BMP-4 중 적어도 하나에 결합하는 RGM의 능력을 조절, 특히 저해한다.
예컨대, 상기 결합 단백질은 다음 상호작용 중 적어도 하나를 조절, 특히 감소시키고, 바람직하게는 저해한다:
사람 BMP-4에 대한 사람 RGM A의 결합,
사람 네오제닌에 대한 hRGM A의 결합,
사람 네오제닌에 대한 hRGM C의 결합,
사람 BMP-2에 대한 사람 RGM A의 결합.
또한, 다른 조합의 기능적 특징을 보유하고, 그 결과 본 명세서에 개시된 바와 같은 다른 기능성 프로필을 나타내는 결합 단백질도 본 발명의 범위에 속한다. 이러한 프로필의 비제한적 예는 다음과 같다:
Figure pct00003
예를 들어, 프로필 1은 본 발명에서 제공하는 항체 5F9 및 본 명세서에 기술된 이의 유도체들에 부합하는 것이다.
예를 들어, 프로필 2는 본 발명에서 제공하는 항체 8D1 및 본 명세서에 기술된 이의 유도체들에 부합하는 것이다.
구체적으로, 본 발명의 결합 단백질은 RGM, 특히 RGM A의 적어도 하나의 생물학적 활성을 저해할 수 있고, 상기 RGM A는 사람, 사이노몰거스 원숭이, 래트, 병아리, 개구리 및 어류 중에서 선택되는 것이다.
다른 양태에 따르면, 본 발명의 결합 단백질은 다음과 같은 속도론적 특징 중 하나 이상을 보유한다:
(a) 표면 플라스몬 공명으로 측정한 바에 의하면, 적어도 약 102M-1s-1; 적어도 약 103M-1s-1; 적어도 약 104M-1s-1; 적어도 약 105M-1s-1; 적어도 약 106M-1s-1; 및 적어도 약 107M-1s- 1으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 상기 표적에 대한 온 속도 상수(on rate constant)(kon);
(b) 표면 플라스몬 공명으로 측정한 바에 의하면, 약 10-2s-1 이하; 약 10-3s-1 이하; 약 10-4s-1 이하; 약 10-5s-1 이하; 및 약 10-6s-1 이하로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 상기 표적에 대한 오프 속도 상수(off rate constant)(koff); 또는
(c) 약 10-7M 이하; 약 10-8M 이하; 약 10-9M 이하; 약 10-10M 이하; 약 10-11M 이하; 약 10-12M 이하; 및 약 10-13M 이하로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 상기 표적에 대한 해리 상수(KD).
추가 관점에 따르면, 본 발명은 전술한 결합 단백질을 포함하고, 추가로 링커 폴리펩타이드 또는 면역글로불린 불변 도메인을 포함하는 항체 작제물을 제공한다.
이러한 본 발명의 항체 작제물 또는 결합 단백질은 다음으로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다: 면역글로불린 분자, 모노클로날 항체, 키메라 항체, CDR-이식된 항체, 사람화된 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 이황화 결합된 Fv, scFv, 단일 도메인 항체, 디아바디(diabody), 다중특이적 항체, 이중 특이적(dual specific) 항체, 이중 가변 도메인 면역글로불린, 및 이특이적(bispecific) 항체.
본 발명에 따른 항체 작제물에서, 상기 결합 단백질은 다음으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 중쇄 면역글로불린 불변 도메인을 포함한다:
사람 IgM 불변 도메인,
사람 IgG1 불변 도메인,
사람 IgG2 불변 도메인,
사람 IgG3 불변 도메인,
사람 IgG4 불변 도메인,
사람 IgE 불변 도메인,
사람 IgD 불변 도메인,
사람 IgA1 불변 도메인,
사람 IgA2 불변 도메인,
사람 IgY 불변 도메인 및
이들에 상응하는 돌연변이된 불변 도메인.
특히, 본 발명에 따른 항체 작제물은 서열번호 11, 12, 13 및 14로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 불변 도메인을 포함한다.
다른 관점에 따르면, 본 발명은 본 명세서에 기술된 항체 작제물을 함유하고, 추가로 면역부착 분자, 조영제, 치료제 및 세포독성제로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 제제를 함유하고, 각 제제가 상기 결합 단백질에 접합되어 있는, 예컨대 공유 결합되어 있는 항체 접합체를 제공한다.
예를 들어, 상기 제제는 방사선표지, 효소, 형광 표지, 발광 표지, 생물발광 표지, 자성 표지 및 비오틴으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 조영제이다. 구체적으로, 상기 조영제는 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho 및 153Sm으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방사선표지이다.
예를 들어, 상기 제제는 항대사물질, 알킬화제, 항생제, 성장인자, 사이토킨, 항-혈관형성제, 항-유사분열제, 안트라사이클린, 독소 및 아폽토시스제로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 치료제 또는 세포독성제이다.
다른 양태에 따르면, 본 명세서에 기술된 바와 같은 본 발명의 상기 결합제는 사람 글리코실화 패턴을 보유한다.
또한, 본 발명에 따른 결합 단백질, 항체 작제물 및 항체 접합체는 결정(결정형)으로 존재하고 바람직하게는 생물학적 활성을 보유하는 것으로 존재할 수 있다.
특히, 상기 결정은 무담체(carrier-free) 약제학적 제어 방출 결정이다. 이러한 결정형의 측면에서, 결합 단백질, 항체 작제물 또는 항체 접합체는 이에 대응하는 가용성 대응물보다 생체내 반감기가 더 긴 것일 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 결합 단백질의 아미노산 서열, 항체 작제물의 아미노산 서열 및 항체 접합체의 아미노산 서열을 암호화하는 분리된 핵산을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같은 분리된 핵산을 함유하는 벡터에 관한 것이다. 구체적으로, 벡터는 pcDNA, pTT, pTT3, pEFBOS, pBV, pJV, pHybE 및 pBJ로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
또한, 본 발명은 상기 벡터를 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다. 특히, 상기 숙주 세포는 원핵생물 세포, 예컨대 이.콜라이(E. coli); 또는 진핵생물 세포이고, 원생생물 세포, 동물 세포, 식물 세포 및 진균 세포로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다. 특히, 상기 진핵생물 세포는 포유동물 세포, 조류 세포 및 곤충 세포로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 동물 세포이다. 상기 숙주 세포는 HEK 세포, CHO 세포, COS 세포 및 효모 세포 중에서 선택되는 것이 바람직하다. 효모 세포는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있고, 상기 곤충 세포는 Sf9 세포일 수 있다.
또한, 본 발명은 RGM에 결합할 수 있는 결합 단백질을 생산하기에 충분한 조건 하에 배양 배지에서 본 명세서에 기재된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하여, RGM에 결합할 수 있는 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 생산된 단백질에 관한 것이다.
또한, 본 발명은
(a) 본 명세서에 정의된 바와 같은 결정화된 산물 단백질 및 성분을 포함하는 제형; 및
(b) 적어도 하나의 중합체 담체
를 포함하는, 결합 단백질 방출용 조성물을 제공한다.
상기 중합체 담체는 폴리(아크릴산), 폴리(시아노아크릴레이트), 폴리(아미노산), 폴리(무수물), 폴리(뎁시펩타이드), 폴리(에스테르), 폴리(락트산), 폴리(락트산-코-글리콜산) 또는 PLGA, 폴리(b-하이드록시부티레이트), 폴리(카프로락톤), 폴리(디옥사논); 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(하이드록시프로필) 메타크릴아미드, 폴리[(오르가노)포스파젠], 폴리(오르토 에스테르), 폴리(비닐 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 말레산 무수물-알킬 비닐 에테르 공중합체, 플루로닉 폴리올, 알부민, 알기네이트, 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 콜라겐, 피브린, 젤라틴, 히알루론산, 올리고사카라이드, 글리카미노글리칸, 황산화된 폴리사카라이드, 이들의 혼합물 및 공중합체로 이루어진 그룹 중 하나 이상 중에서 선택되는 중합체일 수 있다.
상기 성분은 알부민, 수크로오스, 트레할로스, 락티톨, 젤라틴, 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다.
다른 관점에 따르면, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 조성물의 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 포유동물의 치료방법을 제공한다.
다른 관점에 따르면, 본 발명은 산물(특히, 본 명세서에 정의된 바와 같은 결합 단백질, 작제물 또는 접합체) 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
이러한 약제학적으로 허용되는 담체는 결합 단백질의 흡수 또는 분산을 증가시키는데 유용한 애주번트로 작용할 수 있다.
예컨대, 상기 애주번트는 히알루로니다제이다.
다른 양태에 따르면, 상기 약제는 RGM 활성이 유해한 장애를 치료하는 추가 치료제를 하나 이상 추가로 포함한다. 예를 들어, 상기 제제는 치료제, 조영제, 세포독성제, 혈관형성 저해제; 키나제 저해제; 공동-자극 분자 차단제; 부착 분자 차단제; 항-사이토킨 항체 또는 이의 기능성 단편; 메토트렉세이트; 사이클로스포린; 라파마이신; FK506; 검출가능한 표지 또는 리포터; TNF 길항물질; 항류마티스제; 근육 이완제, 마약, 비스테로이드성 항염증 약물(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항미생물제, 항건선제, 코르티코스테로이드, 동화대사 스테로이드, 에리트로포이에틴, 면역화제, 면역글로불린, 면역억제제, 성장호르몬, 호르몬 대체 약물, 방사능약제, 항우울제, 항정신병제, 자극제, 천식약, 베타 작용제, 흡입 스테로이드, 에피네프린 또는 유사체, 사이토킨 및 사이토킨 길항물질로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
또한, 본 발명은 적어도 하나의 사람 RGM A 활성이 감소되도록 적어도 하나의 산물과 사람 RGM A를 접촉시키는 것을 포함하여 사람 RGM A 활성을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 산물(특히, 전술한 바와 같은 결합 단백질, 작제물 또는 접합체)을 피검체에게 투여하는 단계를 포함하여, 치료를 요하는 피검체에서 네오제닌(Neogenin) 수용체에 대한 hRGM A 결합을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 산물(특히, 전술한 바와 같은 결합 단백질, 작제물 또는 접합체)을 피검체에게 투여하는 단계를 포함하여, 치료를 요하는 피검체에서 골 형태형성 단백질-2 및 골 형태형성 단백질-4(BMP-2 및 BMP-4)에 대한 hRGM A 결합을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 산물(특히, 전술한 바와 같은 결합 단백질, 작제물 또는 접합체)을 단독으로 또는 다른 치료제와 함께 투여하는 단계를 포함하여, RGM A 활성과 관련이 있는 장애에 대해 피검체를 치료하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 산물(특히, 전술한 바와 같은 결합 단백질, 작제물 또는 접합체)을 단독으로 또는 다른 치료제와 함께 피검체에게 투여하는 단계를 포함하여, RGM A 활성이 유해한 장애를 앓고 있는 피검체에서 RGM A 활성을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
상기 장애는 근위축측삭경화증, 상완신경얼기 손상, 뇌손상, 예컨대 외상성 뇌손상, 뇌성마비, 길랑바레, 백색질형성장애, 다발성경화증, 회색질척수염 후, 스피나 비피다(Spina Bifida), 척수 손상, 척추 근육 위축, 척수 종양, 졸중, 횡단 척수염; 치매, 노인성 치매, 경증 인지 장애, 알츠하이머-관련 치매, 헌팅톤 무도병, 지연성이상운동증, 운동과다증, 조증, 파킨슨병, 스틸-리차드(steel-Richard) 증후군, 다운 증후군, 중증 근육무력증, 신경 외상, 혈관 아밀로이드증, 아밀로이드증성 뇌 출혈 I, 뇌 염증, 급성 혼돈 장애, 근위축측삭경화증, 녹내장 및 알츠하이머병을 포함하는 그룹 중에서 선택되는 신경계 질환을 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 특정 관점은 이하에 기술한다:
hRGM A 단백질의 적어도 하나의 에피토프와 특이적으로 상호작용하는 분리된 결합 단백질;
모노클로날 중화 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 상기 분리된 단백질;
VH 및 VL 도메인을 포함하는 상기 항원 결합 단편;
수용체에 결합하는 hRGM A의 능력을 감소시키는 상기 중화 항체;
hRGM A 생물학적 활성을 저해할 수 있는 상기 중화 항체;
사람, 사이노몰거스 원숭이, 래트, 병아리, 개구리 및 어류 중에서 선택되는 RGM A 수용체를 인식하는 상기 항체;
서열번호 2의 아미노산 서열과 90% 상동성을 공유하는 RGM A 단백질을 인식하는 상기 항체;
RGM A 단백질이 서열번호 1의 핵산 서열과 90% 상동성을 공유하는 핵산에 의해 암호화되는 상기 항체;
서열번호 9 또는 34의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH 영역) 또는 이 VH 영역의 사람화된, 경우에 따라 추가로 돌연변이된 형태를 포함하는 서열과 적어도 90%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 상기 항체;
서열번호 10의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL 영역) 또는 이 VL 영역의 사람화된, 경우에 따라 추가로 돌연변이된 형태를 포함하는 서열과 적어도 90%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 상기 항체;
항체가 글리코실화되어 있는 hRGM A에 결합하는 상기 항체;
마우스 항체, 사람화된 항체, 완전한 사람 항체, 키메라 항체, 사람화된 항체의 항원 결합 단편 또는 키메라 항체의 항원 결합 단편인, 항체 또는 항원 결합 단편;
Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편 및 Fv 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 항원 결합 단편인 상기 항체 또는 항원 결합 단편;
본 명세서에 기술된 하이브리도마 세포에 의해 분비되고 hRGM A의 적어도 하나의 에피토프에 특이적으로 결합하는 상기 모노클로날 항체;
상기 결합이 수용체와 hRGM A의 상호작용의 불활성화를 초래하는 상기 모노클로날 항체;
hRGM A의 적어도 하나의 에피토프에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 상기 하이브리도마 세포주;
사람, 마우스 래트, 양, 돼지, 소, 염소 및 말 하이브리도마로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 상기 하이브리도마 세포주;
상기 결합이 hRGM A의 불활성화를 초래하는 상기 모노클로날 항체;
hRGM A의 적어도 하나의 에피토프에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 상기 하이브리도마 세포주;
사람, 마우스, 래트, 양, 돼지, 소, 염소 및 말 하이브리도마로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 상기 하이브리도마 세포주;
다음과 같은 특징으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 특징을 보유하는, 상기 모노클로날 중화 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
a) nM 범위 이하의 친화성으로 포유동물 RGM A에 결합함;
b) 신경돌기 성장 분석에서 μM, nM 또는 그 이하의 효능으로 시험관내 RGM A 활성을 기능적으로 길항작용함;
c) 시신경 압궤(crush) 모델에서 생체내 성장을 유도함;
d) 척수 손상 모델에서 생체내 성장을 유도함;
e) 손상된 신경 섬유의 재생 성장의 증진에 의해 생체내 실험적 척수 손상을 경감시킴; 또는
f) 시냅스 형성의 촉진에 의해 생체내 실험적 척수 손상을 경감시킴;
상기 모노클로날 중화 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 분리된 핵산;
상기 분리된 핵산을 포함하는 벡터;
pcDNA; pTT; pTT3; pEFBOS; pBV; pJV; pHybE 및 pBJ로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 상기 벡터;
원생생물 세포, 동물 세포, 식물 세포 및 진균 세포로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포;
동물 세포가 HEK293, CHO 및 COS로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 포유동물 세포인 상기 숙주 세포;
숙주 세포가 진핵생물 세포인, 제24항에 따른 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포;
hRGM A에 결합하는 결합 단백질을 생산하기에 충분한 조건 하에 배양 배지에서 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하여, hRGM A에 결합하는 결합 단백질의 생산 방법;
상기 모노클로날 항체 또는 항원 결합 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물;
상기 항체를 피검체에게 투여하는 단계를 포함하여, 치료를 요하는 피검체에서 네오제닌 수용체에 대한 hRGM A의 결합을 감소시키는 방법;
상기 항체를 피검체에게 투여하는 단계를 포함하여, 치료를 요하는 피검체에서 골 형태형성 단백질-2 및 골 형태형성 단백질-4(BMP-2 및 BMP-4)에 대한 hRGM A 결합을 감소시키는 방법;
상기 항체를 단독으로 또는 다른 치료제와 함께 투여하는 단계를 포함하여, RGM A 활성과 관련이 있는 장애에 대해 피검체를 치료하는 방법;
피검체에게 상기 항체를 단독으로 또는 다른 치료제와 함께 투여하는 것을 포함하여, RGM A 활성이 유해한 장애를 앓고 있는 피검체에서 RGM A 활성을 감소시키는 방법;
서열번호 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 및 43 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 VH 영역을 포함하는 상기 항체;
서열번호 44, 45 및 46 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 VL 영역을 포함하는 상기 항체;
VH 또는 VL 서열에 추가로 1 내지 5개의 돌연변이에 의해 변형된 상기 항체;
상기 돌연변이가 프레임워크 백 돌연변이 및 버니어 및 VH/VL 계면 잔기의 돌연변이 중에서 선택되는 상기 항체;
본 명세서에 개시된 서열번호 34에 대한 임의의 교시 또는 언급은 마찬가지로 서열번호 9에도 적용된다.
도 1A는 ELISA 분석에서 hRGM A에 대한 모노클로날 항체 결합성을 도시한 것이다.
도 1B는 HEK 293 세포에서 발현된 hRGM A에 대한 모노클로날 항체 결합성을 도시한 것이다.
도 1C는 HEK 293 세포에서 발현된 래트 RGM A에 대한 모노클로날 항체 결합성을 도시한 것이다.
도 2는 전체 길이 RGM A의 네오제닌에 대한 결합성을 나타낸다. MAB 5F9는 전체 길이, fc-커플링된 hRGM A의 네오제닌에 대한 결합을 저해한다.
도 3은 전체 길이 RGM A의 BMP-4에 대한 결합성을 도시한 것이다. MAB 5F9는 BMP-4에 대한 fc-커플링된 전체 길이 hRGM A 단편(47-422)의 결합을 저해한다.
도 4는 BMP-4에 대한 RGM A 단편 0의 결합성을 도시한 것이다. MAB 5F9는 BMP-4에 대한 fc-커플링된 hRGM A 단편 0(47-168)의 결합을 저해한다.
도 5는 BMP-2에 대한 전체 길이 RGM A 결합성을 도시한 것이다. MAB 5F9는 BMP-2에 대한 fc-커플링된 전체 길이 hRGM A 단편(47-422)의 결합을 저해한다.
도 6은 NTera 세포 신경돌기 성장 분석에서 RGM A 단편의 mAb5F9 중화를 나타내는 여러 현미경사진이다. MAB 5F9는 사람 Ntera 응집물을 이용한 신경돌기 성장 분석에서 fc-접합된 강력한 hRGM A 저해제 단편의 성장 저해활성을 중화시킨다. A. 대조 배양, 라미닌에서 Ntera 뉴런의 성장, B. 라미닌-hRGM A 단편(47-168) 기질에서, C - E. 0.1 ㎍/ml MAB 5F9(C.), 1 ㎍/ml MAB 5F9(D.), 10 ㎍/ml MAB 5F9(E.)의 존재 하에 라미닌-hRGM A 단편(47-168) 기질에서.
도 7은 NTera 2 분석 결과의 정량적 분석을 나타낸다. MAB 5F9는 사람 Ntera 응집물을 이용한 신경돌기 성장 분석에서 fc-접합된 강력한 hRGM A 저해제 단편(단편 0, 47-168)의 성장 저해 활성을 용량-의존적으로 중화시킨다.
도 8은 SH-SY5Y 선조(stripe) 분석의 정량 분석 결과이다. MAB 5F9는 선조 막 카펫에서 사람 SH-SY5Y 뉴런 세포의 전체 길이 사람 RGM A로 이루어진 선조에 의해 유도된 반발력을 중화시킨다. AMB 5F9의 부재(A) 또는 저농도 MAB의 존재 하에, SH-SY5Y 뉴런은 RGM A 선조를 우선적으로 회피한다. 이러한 행동은 MAB 5F9의 농도를 증가시킴으로써 반전된다(B 내지 D). MAB 최고 농도(10 ㎍/ml)(E)에서, SH-SY5Y 뉴런은 콜라겐 I 선조에 비해 RGM A 선조에 대해 강한 선호성을 나타낸다.
도 9는 mAB 5F9 및 8D1 결합 특성을 정량적 분석한 결과이다. MAB 5F9 및 8D1은 hRGM A-네오제닌, hRGM A-BMP-2 및 hRGM A-BMP-4 결합 분석에서 다른 농도로 평가된다.
도 10은 SH-SY5Y 화학주성 분석에서 사람화된 5F9 항체(h5F9.21, h5F9.23, h5F9.25)의 hRGM A 화학반발 활성에 대한 중화 활성을 나타낸다.
도 11은 시신경 손상의 동물 모델에서 국소 5F9 적용의 생체내 신경재생 활성을 나타낸다. MAB 5F9의 국소 적용은 RGM A를 중화시키고 시신경 압궤의 래트 동물 모델에서 상해를 입은 시신경 축삭의 재생 성장을 자극한다. 5F9 처리된 동물(A)에서, 많은 GAP-43 양성 섬유는 래트 RGM A에 결합하지 않는 대조용 MAB 8D1(B)과 대조적으로 압궤 부위 이상으로 뻗어나간다.
도 12A 및 도 12B는 시신경 손상의 동물 모델에서 국소 5F9 적용의 정량 분석 결과이다. (A) 대조용 MAB 8D1과 달리 5F9는 재생성 GAP-43 양성 섬유의 수를 크게 증가시켰다. 5F9으로 처리된 동물에서는 거리 200㎛, 400㎛ 및 600㎛에서 훨씬 많은 섬유(p<0.05)가 관찰되었고, 1200㎛에서는 섬유가 대조용 동물이 아닌 5F9-처리된 동물에서만 발견되었다. (B) 5F9는 대조용 항체 8D1 및 비히클 대조군 PBS와 비교했을 때 시신경 병변 부위에서 GAP-43 양성 영역을 크게 증가시켰다. 재생 성장의 면적(GAP-43 양성 면적)은 Axiovision 소프트웨어(Zeiss)를 이용하여 측정했다.
도 13은 시신경 손상의 동물 모델에서 전신 5F9 적용의 생체내 신경재생 활성 결과이다. 동물은 0일 및 21일에 각각 2mg/kg 및 10mg/kg의 5F9로 처리했다. 항체 또는 비히클은 복강내 또는 정맥내로 제공했다. 래트 시신경의 합성 이미지. 5F9 처리된 동물(A)에서, 많은 GAP-43 양성 섬유는 PBS로 처리된 대조 동물(B)과 반대로 압궤 부위 너머로 뻗어나간다. 압궤 부위는 왼쪽 가장자리에 위치하고, 재생 섬유는 GAP-43에 대한 항체로 염색된다. PBS 동물과 달리 5F9-처리된 동물에서는 많은 섬유가 시신경의 상부 및 하부 테두리에서 관찰된다.
도 14A 및 도 14B는 시신경 손상의 동물 모델에서 전신 5F9 적용의 정량 분석 결과이다.
도 15는 시신경 손상의 동물 모델에서 전신 5F9 적용의 생체내 재미엘린화 활성을 나타낸다. 동물은 0일 및 21일에 각각 2mg/kg 및 10mg/kg의 5F9로 처리했다. 항체 또는 비히클은 복강내 또는 정맥내로 제공했다. 래트 시신경의 합성 이미지. 미엘린화는 미엘린 마커 미엘린 염기성 단백질 MBP에 대해 유도된 항체를 이용하여 가시화한다. 압궤 부위는 합성 신경의 중간에 위치하고 이 부위는 비히클 처리된 대조 동물(A 및 B)에는 없다. 5F9 처리된 동물(C 및 D)에서, 많은 MBP-양성 구조는 시신경의 중간 영역(압궤 중심)에서 관찰된다.
도 16은 시신경 손상의 동물 모델에서 전신 5F9 적용의 재미엘린화에 미치는 정량적 효과를 나타낸다.
본 발명은 RGM A 결합 단백질, 더 구체적으로 RGM A에 결합하는 모노클로날 RGM A 항체, 특히 사람화된 모노클로날 RGM A 항체 또는 이의 항원결합부를 기술한다. 본 출원의 다양한 관점은 항체 및 항체 단편, 이의 약제학적 조성물, 뿐만 아니라 이러한 항체 및 단편을 제조하기 위한 핵산, 재조합 발현 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 사람 RGM A를 검출하고; 사람 RGM 및/또는 사람 RGM A 활성을 생체내 또는 시험관내에서 중화시키고, 유전자 발현을 조절하기 위해 본 출원의 항체를 이용하는 방법도 본 발명에 포함된다.
1. 일반적 정의
본 명세서에 다른 정의가 없는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학적, 기술적 용어들은 당업자가 일반적으로 이해하고 있는 의미를 나타낸다. 이 용어들의 의미 및 범위는 분명해야 하지만, 임의의 잠재적 모호성이 있는 경우, 여기에 제시된 정의가 임의의 사전적 또는 외부 정의보다 우선권이 있다. 또한, 문맥에서 달리 필요한 것이 아니면, 단수 용어들은 복수를 포함하고, 복수 용어는 단수를 포함할 것이다. 본 출원에서, "또는"의 사용은 다른 언급이 없는 한 "및/또는"을 의미한다. 또한, "포함하는", 뿐 아니라 다른 형태, "포함한다" 및 "포함했다"란 용어의 사용은 비제한적인 것이다. 또한, "요소" 또는 "구성성분"와 같은 용어는 다른 구체적인 언급이 없는 한, 한 단위를 함유하는 요소 및 구성성분은 물론 하나 이상의 서브단위를 함유하는 요소 및 구성성분도 포괄한다.
일반적으로, 본 명세서에 기술된 세포 및 조직 배양, 분자생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 하이브리드화의 기술 및 이와 관련하여 사용된 용어는 당업계에 공지되고 일반적으로 사용되는 것이다. 본 발명의 방법 및 기술은 당업계에 공지되고 다른 언급이 없는 한 본 명세서를 통해 인용되고 논의된 각종 일반 문헌 및 더 구체적인 참고문헌에 기술된 바와 같은 종래 방법에 따라 일반적으로 수행된다. 효소 반응 및 정제 기술은 당업계에서 통상적으로 실행되거나 본 명세서에 기술된 바와 같이, 제조자의 사용설명서에 따라 수행한다. 본 명세서에 기술된 분석 화학, 합성 유기 화학 및 의학 및 약제 화학의 실험적 절차 및 기술, 및 이와 관련하여 사용된 술어들은 당업계에 공지되고 일반적으로 사용된다. 화학 합성, 화학 분석, 약제학적 제조, 제형 및 전달 및 환자의 치료에는 표준 기술이 사용된다.
본 발명을 더 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위해, 선택한 용어들의 정의는 다음과 같다.
본 명세서에 사용된 "폴리펩타이드"란 용어는 아미노산의 임의의 중합체 사슬을 의미한다. "펩타이드" 및 "단백질"이란 용어는 폴리펩타이드란 용어와 호환 사용되며, 역시 아미노산의 중합체 사슬을 의미한다. "폴리펩타이드"란 용어는 천연 또는 합성 단백질, 단백질 단편 및 단백질 서열의 폴리펩타이드 유사체를 포괄한다. 폴리펩타이드는 단량체성 또는 중합체성일 수 있다.
"분리된 단백질" 또는 "분리된 폴리펩타이드"란 용어는 유도 기원 또는 근원으로 인해 자연 상태에서 동반하는 자연 관련 성분과 관련되어 있지 않고; 동종 유래의 다른 단백질이 실질적으로 없으며; 다른 종의 세포에 의해 발현되고; 또는 자연에서 발생하지 않는 단백질 또는 폴리펩타이드이다. 따라서, 자연 기원의 세포와 다른 세포계에서 합성되거나 화학 합성된 폴리펩타이드는 자연 관련 구성성분으로부터 "분리된" 것일 것이다. 또한, 단백질은 당업계에 공지된 단백질 정제 기술을 이용해 분리에 의해 자연 관련 성분이 실질적으로 제거된 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된 "회수하는"이란 용어는 폴리펩타이드와 같은 화학 종을, 당업계에 공지된 단백질 정제 기술의 사용과 같은 분리에 의해 자연 관련 구성성분이 실질적으로 없게 하는 과정을 의미한다.
본 명세서에 사용된 "사람 RGM A"(약어 hRGM A)란 용어는 450개의 아미노산을 보유한 글리코실포스파티딜-이노시톨(gpi)-정착된 당단백질을 의미하는 것으로, 지세 도법의 개발 중에 신경돌기 성장 기피제 또는 신경돌기 성장 저해제로 처음 소개되었다(Stahl et al. Neuron 5: 735-43, 1990; Mueller, in Molecular Basis of Axon Growth and Nerve Pattern Formation, Edited by H. Fujisawa, Japan Scientific Societies Press, 215-229, 1997). rgm 유전자 패밀리는 3가지 다른 유전자를 포함하고, 이 중 2가지인 rgm a 및 b는 포유동물의 CNS에서 발현되는 반면, 제3 멤버인 rgm c는 말초에서 발현되고(Mueller et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 361: 1513-29, 2006), 여기서 철 대사에 중요한 역할을 한다. 사람 RGM 단백질은 서열 동일성이 43% - 50%이고; 사람 및 래트 RGM A의 아미노산 상동성은 89%이다. 사람 RGM 단백질은 다른 어떠한 공지의 단백질과도 유의적인 서열 상동성이 없다. 이 단백질은 RGD 영역을 함유하는 프롤린-풍부 단백질이고 폰빌레브란트 인자 도메인과 구조적 상동성이 있고, 미지의 프로테아제에 의해 N-말단 아미노산 168에서 절단되어 기능적 활성 단백질을 생산한다(Mueller et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 361: 1513-29, 2006).
시험관내에서, RGM A는 RGM 수용체로 확인되어 있는 네오제닌(Neogenin)에 결합하여 피코몰 농도에서 신경돌기 성장을 저해한다(Rajagopalan et al. Nat Cell Biol.: 6(8), 756-62, 2004). 네오제닌은 네트린-결합 단백질로 처음 소개되었지만(Keino-Masu et al. Cell, 87(2):175-85, 1996). 네트린에 대한 친화성(Kd 2nM)는 RGM에 대한 친화성(Kd 0.2nM)보다 한 등급 낮다(Rajagopalan et al. Nat Cell Biol.: 6(8), 756-62, 2004). 이것은 네오제닌 또는 이의 근연성 수용체 DCC(결장직장암에서 결실됨)에 대한 네트린-1의 결합이 신경돌기 성장을 저해하기 보다는 자극하는 것으로 보고되어 있기 때문에 중요한 발견이다(Braisted et al. J. Neurosci. 20: 5792-801, 2000).
네오제닌에 대한 RGM A의 결합 및 신경돌기 성장 저해의 유도 외에도, RGM A 또는 B의 골 형태형성 단백질 BMP-2 및 BMP-4에 대한 결합은 성공적인 신경재생 및 기능 회복에 대한 다른 장애를 나타낼 수 있다(Mueller et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 361: 1513-29, 2006). 이 두 클래스의 단백질(네오제닌 및 BMP)은 2가지 완전 다른 독립된 시그널 전달 경로를 통해 RGM A의 신경돌기 성장 저해 시그널을 전달하는 것으로 보고되어 있다. 일반적으로, 상기 BMP 단백질의 발현은 성인 CNS의 대부분의 영역에서 비교적 낮지만, 일부 BMP(예: BMP-2, BMP-6, BMP-7)의 발현 및 축적의 급증은 손상 및 발작에 대한 반응으로 보고되어 있다(Lai et al., Neuroreport 8: 2691-94, 1997; Martinez et al. Brain Res. 894:1-11, 2001; Hall and Miller, J. Neurosci. Res. 76: 1-8, 2004; Setoguchi et al., Exp. Neurol. 189: 33-44, 2004). 또한, 다발성 경화증 모델에서, 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 모델에서, BMP-4, BMP-6 및 BMP-7은 마우스 척수에서 상향조절되었다(Ara et al., J. Neurosci. Res. 86: 125-35, 2008). BMP-2는 세포 표면 RGM A, BMP-수용체 I 및 II에 결합하고 직접 LIM-키나제를 활성화시켜 신경돌기 성장을 저해하는 것으로 보고되었고(Matsuura et al. Biochem Biophys Res Commun., 360: 868-73, 2007), 이에 따라 RGM A-BMP-2 상호작용의 차단이 CNS 손상 후 기능성 회복을 더욱 증가시킬 것으로 예상된다.
전술한 바와 같이, 척수 손상된 래트 및 뇌손상된 사람은 손상 부위에 세포 RGM의 대량 축적을 나타내고, 척수 병변 부위에서 래트의 RGM A 염색패턴은 사람의 범 RGM 항체 염색과 매우 유사하여, 사람의 범 RGM 염색대부분이 RGM B 국재화가 아닌 RGM A 국재화와 관련이 있다는 것을 시사한다(Schwab et al., Arch. Neurol. 62: 1561-8, 2005a; Schwab et al., Eur. J. Neurosci. 21: 1569-76, 2005 b; Hata et al., J. Cell Biol. 173: 47-58, 2006). 건강한 사람 뇌에서, 범 RGM 염색(RGM A & B 면역반응성)은 백색질 섬유, 희소돌기아교세포, 몇몇 뉴런의 세포체(perikarya), 일부 혈관 평활근 및 몇몇 내피 세포에서 검출되었다. 성상세포의 염색은 관찰되지 않았다. 건강한 성인 뇌의 RGM 염색 패턴은 성숙 래트 척수에서 관찰되는 염색 패턴과 매우 유사하다(Schwab et al., Eur. J. Neurosci. 21: 1569-76, 2005 b; Hata et al. J. Cell Biol. 173-47-58, 2006).
뇌 및 척수 손상 시에 병변 부위에서 RGM A의 축적을 기초로 하고 이의 세포 신경돌기 성장 저해 활성으로 인해, 상기 단백질은 신경돌기 성장 저해 활성을 발휘할 것이고, 사람 RGM A의 적어도 하나의 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 항원결합 단편에 의한 중화는 손상된 신경 섬유의 재성장을 증진시키고 신경 섬유 손상 및 RGM 축적을 특징으로 하는 징후들에서 기능 회복을 증진시킬 수 있을 것으로 예상된다.
다른 언급이 없는 한, "RGM A"는 또한 마우스 또는 래트와 같은 설치류 등의 다른 종에서 분리 또는 수득된 RGM A 분자를 포괄하고; 구체적으로 래트 유래의 분자는 여기서 "래트 RGM A"로 지칭한다.
RGM A 관련 분자의 서열 목록
단백질 서열 식별번호 설명
hRGM A 서열번호 2
서열번호 1		 사람 RGM A 단백질 서열
사람 RGM A 뉴클레오타이드 서열
hRGM A 서열번호 4
서열번호 3		 사람 RGM A-fc 단백질 서열
사람 RGM A-fc 뉴클레오타이드 서열
hRGM A 서열번호 6
서열번호 5		 사람 RGM A 경쇄-fc 단백질 서열
사람 RGM A 경쇄-fc 뉴클레오타이드 서열
래트 RGM A 서열번호 8
서열번호 7		 래트 RGM A 단백질 서열
래트 RGM A 뉴클레오타이드 서열
본 명세서에 사용된 "생물학적 활성"은 본 명세서에 정의된 바와 같은 RGM A의 모든 고유의 생물학적 성질을 의미한다.
항체, 단백질 또는 펩타이드와 제2 화학 종 간의 상호작용과 관련하여 본 명세서에 사용된 "특이적 결합하는" 또는 "특이적으로 결합하는"이란 용어는 이 상호작용이 화학 종 상의 특정 구조(예: 이하에 정의되는 "항원 결정인자" 또는 "에피토프")의 존재에 의존적임을 의미하고; 예컨대 항체는 일반적으로 단백질이 아닌 단백질의 특정 구조를 인식하여 여기에 결합한다. 항체가 에피토프 "A"에 특이적이면, 표지화된 "A"와 항체를 함유하는 반응물에서 에피토프 A(또는 유리의 표지 미부착된 A) 함유 분자의 존재는 항체에 결합된 표지화된 A의 양을 감소시킬 것이다.
본 명세서에 사용된 "항체"란 용어는 광범하게는 4개의 폴리펩타이드 사슬, 즉 2개의 중쇄(H)와 2개의 경쇄(L), 또는 이의 임의의 기능성 단편, 돌연변이체, 변형체 또는 유도체를 포함하고, Ig 분자의 필수적인 에피토프 결합 특징을 보유하는 임의의 면역글로불린(Ig) 분자를 의미한다. 상기 항체의 돌연변이체, 변형체 또는 유도체 형태는 당업계에 공지되어 있다. 이의 구체예는 이하에 논의되지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 항체는 분자와 특이적으로 반응하여 항체에 분자를 결합시킬 수 있다면 분자에 "결합할 수 있는"이라고 한다.
본 명세서에 사용된 "모노클로날 항체"는 여러 항체의 혼합물을 함유하는 "폴리클로날" 항체 제조물과 대조적으로, 공동 중쇄 및 공통 경쇄 아미노산 서열을 공유하는 항체 분자의 제조물을 의미하는 것이다. 모노클로날 항체는 파지, 세균, 효모 또는 리보솜 디스플레이와 같은 몇몇 신기술뿐만 아니라 하이브리도마-유래의 항체(예: 표준 쾰러 및 밀스타인(Kohler and Milstein) 하이브리도마 방법론((1975) Nature 256: 495-497)로 예시되는 고전 방법으로 생산할 수 있다.
전체 길이 항체에서, 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(HCVR 또는 VH로 약칭) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(LCVR 또는 VL로 약칭) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 다시 상보성 결정 영역(CDR)이라 불리는 초가변성 영역과 이 영역 사이에 산재해 있는 프레임워크 영역(FR)이라 불리는 더 보존적인 영역으로 세분될 수 있다. 각 VH 및 VL은 3개의 CDR과 4개의 FR로 이루어져 있고 이들은 N-말단에서 C-말단까지 하기의 순서로 배열되어 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 면역글로불린 분자는 임의의 종류(예: IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 항체의 "항원결합부" 또는 "항원결합 단편"(단순히 "항체부" 또는 "항체 단편")은 항원(예: hRGM A)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 의미한다. 항체의 항원결합 기능은 전체 길이 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다는 것은 밝혀져 있다. 이러한 항체의 구체예는 추가로 2종 이상의 다른 항원에 특이적으로 결합하는 이특이성(bispecific), 이중 특이성(dual specific) 또는 다특이성(multi-specific) 형태일 수 있다. 항체의 "항원결합부"란 용어에 포함되는 결합 단편의 예로는 (i) Fab 단편, 즉, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 즉, 디설파이드 브릿지를 통해 힌지 영역에서 서로 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (v) 단일 가변 도메인을 포함하는 dAb 단편(Ward ed al., (1989) Nature 341 :544-546, Winter et al., PCT 공개번호 WO 90/05144 A1, 본원에 참고인용됨); 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인, 즉, VL 및 VH가 별도의 유전자에 의해 암호화될지라도 이들은 재조합 방법을 이용해 합성 링커로 결합시킴으로써 VL 영역과 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성한 단일 단백질로 제조할 수 있다(단일쇄 Fv (ScFv)로서 공지됨; Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 참조). 또한, 이러한 단일쇄 항체는 항체의 "항원결합부"란 용어에 포함되는 것으로 생각한다. "디아바디(diabody)"와 같은 단일쇄 항체의 다른 형태도 또한 여기에 포함된다. 디아바디는 2가, 이특이적 항체로, 여기서 VH 및 VL 도메인은 단일 폴리펩타이드 쇄에서 발현되지만, 동일 사슬 상의 두 도메인 간에 쌍을 형성할 정도로 매우 짧은 링커를 사용하여, 도메인들이 다른 사슬의 상보성 도메인과 쌍을 이루게 하고 2개의 항원 결합 부위를 생성한다(참조: 예를 들어, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123). 이러한 항체 결합부는 당업계에 공지되어 있다(Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag, New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5).
본 명세서에 사용된 "항체 작제물"이란 용어는 링커 폴리펩타이드 또는 면역글로불린 불변 도메인에 연결된 본 발명의 하나 이상의 항원결합부를 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. 링커 폴리펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 연합된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하며 하나 이상의 항원결합부를 연결하는데 사용된다. 이러한 링커 폴리펩타이드는 당업계에 공지되어 있다(예: Holliger, P., et al.(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R.J., et al.(1994) Structure 2: 1121-1123). 면역글로불린 불변 도메인은 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인을 의미한다. 사람 IgG 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있고 표 2에 나타낸다.
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추가로, 본 발명의 항체 또는 이의 항원결합부는 당해 항체 또는 항체부와 하나 이상의 추가의 단백질 또는 펩타이드와의 공유 또는 비공유 연합에 의해 형성된 대형 면역부착 분자의 일부일 수 있다. 당해 면역부착 분자의 예로는 사량체 scFv 분자를 제조하기 위한 스트렙타비딘 코어 영역의 이용(Kipriyanov, S. M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) 및 2가 및 비오틴 부착된 scFv 분자를 제조하기 위한 시스테인 잔기, 마커 펩타이드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그의 이용(Kipriyanov, S.M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31 :1047-1058)을 포함한다. 항체부, 예컨대 Fab 및 F(ab')2 단편은 종래 기술, 예컨대 각각 전체 항체의 파파인 또는 펩신 분해를 이용하여 전체 항체로부터 제조할 수 있다. 또한, 항체, 항체부 및 면역부착 분자는 본 명세서에 기술된 바와 같은 표준 재조합 DNA 기술을 이용해 수득할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "분리된 항체"는 다른 항원 특이성을 가진 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 언급하려고 한다(예: hRGM A에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 hRGM A 외에 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다). 하지만, hRGM A에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 다른 종 유래의 RGM A와 같은 다른 항원에 대해 교차반응성을 나타낼 수 있다. 또한, 분리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없는 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "사람 항체"는 가변 및 불변 영역이 사람 배선의 면역글로불린 서열로부터 유래하는 가변 및 불변 영역을 보유하는 항체를 포함하려 한다. 본 발명의 사람 항체는 예를 들어 CDR에 및 특히 CDR3에 사람 배선 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이 유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 함유할 수 있다. 하지만, 본 명세서에 사용된 "사람 항체"란 용어는 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 배선에서 유래된 CDR 서열이 사람 프레임워크 서열 위에 이식된 항체를 포함하려는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 "재조합 사람 항체"란 용어는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 모든 사람 항체, 예컨대 숙주 세포에 형질감염된 재조합 발현 벡터를 이용해 발현된 항체(이하 상세히 설명됨), 재조합, 조합적 사람 항체 라이브러리로부터 분리된 항체(Hoogenboom H.R., (1997) TIB Tech. 15:62-70; Azzazy H., and Highsmith W.E.,(2002) Clin. Biochem. 35: 425-445; Gavilondo J.V., and Larrick J.W.(2002) Bio Techniques 29: 128-145; Hoogenboom H., and Chames P.(2000) Immunology Today 21: 371-378), 사람 면역글로불린 유전자를 위해 형질전환된 동물 (예를 들어, 마우스)로부터 분리된 항체 [참조: Taylor, L.D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann S-A., and Green L.L.(2002) Current Opinion in Biotechnology 13: 594-597; Little M. et al.(2000) Immunology Today 21: 364-370)], 또는 사람 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열에 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 항체를 포함하고자 한다. 상기 재조합 사람 항체는 사람 배선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는다. 하지만, 특정 양태에서, 상기 재조합 사람 항체는 시험관내 돌연변이유발법으로 처리되고(또는 사람 Ig 서열에 돌연변이성인 동물이 사용되면, 생체내 체세포 돌연변이유발법), 이에 따라 재조합 항체의 VH 영역과 VL 영역의 아미노산 서열은 사람 배선 VH 및 VL 서열에서 유래되고 이와 관련이 있지만 생체내 사람 항체 배선 레퍼토리에는 자연적으로 존재하지 않는 서열이다.
용어 "키메라 항체"는 하나의 종 기원의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역에 대한 서열 및 또 다른 종 기원의 불변 영역 서열을 포함하는 항체를 언급하고, 예를 들어, 쥐 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 사람 불변 영역에 연결된 항체가 있다. 이러한 키메라 항체는 재조합 분자생물학 기술을 통해 생산되거나 또는 함께 물리적으로 접합시킬 수 있다.
용어 "CDR-이식 항체"는 하나의 종 기원의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만 여기서, VH 및/또는 VL의 CDR 영역의 하나 이상의 서열이 또 다른 종의 CDR 서열로 대체된 항체를 의미하고, 예를 들어, 쥐의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖지만 여기서 쥐 CDR(예를 들어, CDR3) 하나 이상이 사람 CDR 서열로 대체된 항체가 있다.
용어 "카벳(Kabat) 넘버링", "카벳 정의" 및 "카벳 표지화"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 당업계에서 인지되는 당해 용해는 항체 또는 이의 항원결합부의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서 기타 아미노산 잔기보다 더 가변성(즉, 초가변성)인 아미노산 잔기를 넘버링하는 시스템을 의미한다(참조: Kabat er al. (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190:382-391 and Kabat, E. A., et al.(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH 공개번호 91-3242). 중쇄 가변 영역에 대해, 초가변 영역은 CDR1에서 아미노산 31번 내지 35번의 범위이고 CDR2에 대해서는 아미노산 50번 내지 65번의 범위이고 CDR3에 대해서는 아미노산 95번 내지 102번의 범위이다. 경쇄 가변 영역에 대해, 초가변 영역은 CDR1에 대해 아미노산 24번 내지 34번의 범위이고, CDR2에 대해서는 아미노산 50번 내지 56번의 범위이고 CDR3에 대해서는 아미노산 89번 내지 97번의 범위이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "수용체" 및 "수용체 항체"는 하나 이상의 프레임워크 영역의 아미노산 서열 중 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 100%를 제공하거나 이를 암호화하는 항체 또는 핵산 서열을 의미한다. 몇몇 양태에서, 용어 "수용체"는 불변 영역(들)을 제공하거나 암호화하는 항체 아미노산 또는 핵산 서열을 언급한다. 또 다른 양태에서, 용어 "수용체"는 하나 이상의 프레임워크 영역 및 불변 영역(들)을 제공하거나 암호화하는 항체 아미노산 또는 핵산 서열을 언급한다. 특정 양태에서, 용어 "수용체"는 하나 이상의 프레임워크 영역의 아미노산 서열의 80% 이상, 바람직하게 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 100%를 제공하거나 암호화하는 사람 항체 아미노산 또는 핵산 서열을 언급한다. 당해 양태에 따라, 수용체는 사람 항체의 하나 이상의 특정 위치에 존재하지 않는 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 10개 이상의 아미노산 잔기를 함유할 수 있다. 수용체 프레임워크 영역 및/또는 수용체 불변 영역(들)은 예를 들어, 배선 항체 유전자, 성숙 항체 유전자, 기능성 항체(예를 들어, 당업계에 널리 공지된 항체, 개발중인 항체 또는 시판중인 항체)로부터 유래하거나 수득된 것일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "CDR"은 항체 가변 서열내의 상보성 결정 영역을 언급한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 각각에 대해서 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 지정된 3개의 CDR이 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "CDR 세트"는 항원과 결합할 수 있는 단일 가변 영역에 존재하는 3개 CDR 그룹을 의미한다. 이들 CDR의 정확한 경계는 상이한 시스템에 따라 다르게 정의되었다. 카벳(Kabat)에 의해 기술된 시스템(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) 및 (1991))은 항체의 임의의 가변 영역에 적용될 수 있는 명확한 잔기 넘버링 시스템을 제공하고 3개의 CDR을 한정하는 정확한 잔기 경계선을 제공한다. 이들 CDR은 카벳 CDR로서 언급될 수 있다. 문헌[Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) 및 Chothia et al., Nature 342:877-883 (1989)]에서는 카벳 CDR내에서 특정 하위부분(subportion)이 거의 동일한 펩타이드 프레임워크 형태를 취하고 있다고 밝혔지만 아미노산 서열에 있어서 상당한 다양성이 있다. 이들 하위부분은 L1, L2 및 L3 또는 H1, H2 및 H3으로서 지정되었고, 여기서, "L" 및 "H"는 각각 경쇄 및 중쇄 영역을 지칭한다. 이들 영역은 카벳 CDR과 중복하는 경계선을 갖는 초티아(Chothia) CDR로서 지칭될 수 있다. 카벳 CDR과 중복하는 CDR을 한정하는 또 다른 경계선은 문헌[참조: Padlan, FASEB J. 9:133-139 (1995) 및 MacCallum, J Mol Biol 262(5):732-45 (1996)]에 기재되었다. 또 다른 CDR 경계선 정의가 엄격히 상기 시스템중 하나를 따르지는 않지만 카벳 CDR과 중복할 것이고 이들은 특정 잔기 또는 잔기 그룹 또는 심지어 전체 CDR이 항원 결합에 상당한 영향을 주지 않는다는 예측 또는 실험적 발견 측면에서 단축되거나 연장될 수 있다. 본원에 사용된 방법은 당해 시임의의 시스템에 따라 한정된 CDR을 사용할 수 있지만 바람직한 양태는 카벳 또는 초티아 한정된 CDR이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "표준(canonical)" 잔기는 둘다 본원에 참조로서 인용되는 문헌[참조: Chothia et al. (J. Mol. Biol. 196:901-907 (1987); Chothia et al., J. Mol. Biol. 227:799 (1992)]에 의해 정의된 바와 같은 특정 표준 CDR 구조를 한정하는 CDR 또는 프레임워크에서의 잔기를 언급한다. 초티아 등에 따르면, 많은 항체의 CDR의 중요한 부분은 거의 동일한 펩타이드 골격 형태를 갖지만 아미노산 잔기 수준에서는 큰 다양성이 있다. 각각의 표준 구조는 주로 루프를 형성하는 아미노산 잔기의 연속 절편에 대한 특정 세트의 펩타이드 골격 비틀림 각을 특정한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "공여체" 및 "공여 항체"는 하나 이상의 CDR을 제공하는 항체를 언급한다. 바람직한 양태에서, 공여 항체는 골격 영역이 수득되거나 유래된 항체와는 상이한 종 기원의 항체이다. 사람화된 항체와 관련하여, 용어 "공여 항체"는 하나 이상의 CDR을 제공하는 비사람 항체를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프레임워크" 또는 "프레임워크 서열"은 가변 영역에서 CDR을 제외한 나머지 서열을 의미한다. CDR 서열의 정확한 정의가 상이한 시스템을 사용하여 결정할 수 있기 때문에 프레임워크 서열의 의미는 상응하게 다르게 해석된다. 6개의 CDR(경쇄의 CDR-L1 , -L2, 및 -L3 및 중쇄의 CDR-H1, -H2, 및 -H3)은 또한 경쇄 및 중쇄 상에서 프레임워크 영역을 각각의 쇄상에서 4개의 하위영역(FR1, FR2, FR3 및 FR4)으로 나누고, 여기서 CDR1은 FR1과 FR2 사이에 위치하고 CDR2는 FR2와 FR3 사이에 위치하고, CDR3은 FR3과 FR4 사이에 위치한다. FR1, FR2, FR3 또는 FR4로서 특정 하위영역을 특정하는 것 없이, 기타 영역에 의해 언급되는 프레임워크 영역은 단일의 천연적으로 존재하는 면역글로불린 쇄내에서 조합된 FR들을 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같이, FR은 4개의 하위영역 중 하나를 나타내고 FR들은 골격 영역을 구성하는 4개의 하위영역중 2개 이상을 나타낸다.
사람 중쇄 및 경쇄 수용체 서열은 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 한 양태에서, 사람 중쇄 및 경쇄 수용체 서열은 표 3과 표 4에 기술된 서열 중에서 선택된다. 이 표들에는 사람 프레임워크 서열 FR1 내지 FR4의 여러 조합이 기술된다.
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Figure pct00006
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "배선 항체 유전자" 또는 "유전자 단편"은 특정 면역글로불린의 발현을 위해 유전자 재배열 및 돌연변이를 유도하는 성숙 과정이 진행되지 않은 비림프구 세포에 의해 암호화된 면역글로불린 서열을 의미한다(참조: 예를 들어, Shapiro et al., Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200 (2002); Marchalonis et al., Adv Exp Med Biol. 484:13-30 (2001)). 본 발명의 다양한 양태에 의해 제공된 장점 중 하나는 배선 항체 유전자가 성숙한 항체 유전자보다 종에 속하는 개체들에 특징적인 필수 아미노산 서열 구조를 보존할 가능성이 높고, 이에 따라서 당해 종에 치료요법적으로 사용되는 경우 이종 근원으로서 인지될 가능성이 적다는 인식에 기초를 둔다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "주요" 잔기는 항체, 특히 사람화된 항체의 결합 특이성 및/또는 친화성에 대해 보다 영향을 미치는 가변 영역내 특정 잔기를 의미한다. 주요 잔기는 하기의 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: CDR에 인접한 잔기, 잠재적 글리코실화 부위(N- 또는 O-글리코실화 부위일 수 있는), 희귀 잔기, 항원과 상호작용할 수 있는 잔기, CDR과 상호작용할 수 있는 잔기, 표준 잔기, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역간의 접촉 잔기, 버니어 구역내 잔기 및 가변 중쇄 CDR1의 초티아 정의와 제1 중쇄 프레임워크의 카벳 정의 사이에 중첩하는 영역내 잔기.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "사람화된 항체"는 일반적으로 비-사람 종(예: 마우스) 유래의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만, 이 VH 및/또는 VL 서열 중 적어도 일부가 더욱 "사람 같은", 즉 사람 배선 가변 서열과 더욱 유사한 서열이 되도록 변경된 항체를 의미한다. 사람화된 항체의 한 종류는 CDR-이식 항체로, 여기서 사람 CDR 서열은 비-사람 VH 및 VL 서열에 도입되어 대응하는 비-사람 CDR 서열을 교체한다.
구체적으로, 본 명세서에 사용된 "사람화된 항체"란 용어는 목적하는 항원과 면역특이적으로 결합하고 실질적으로 사람 항체의 아미노산 서열을 갖는 프레임워크(FR) 영역 및 실질적으로 비-사람 항체의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 변형체, 유도체, 유사체 또는 이의 단편을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, CDR과 관련하여 사용된 용어 "실질적으로"는 비-사람 항체 CDR의 아미노산 서열과 50, 55, 60, 65, 70, 75 또는 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR을 의미한다. 사람화된 항체는 모든 CDR 영역 또는 실질적으로 모든 CDR 영역이 비-사람 면역글로불린(즉, 공여 항체)의 서열에 상응하고 모든 프레임워크 영역 또는 실질적으로 모든 프레임워크 영역이 사람 면역글로불린 컨센서스 서열 영역인 실질적으로 하나 이상 및 전형적으로 2개의 가변 도메인(Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv) 모두를 포함한다. 바람직하게, 사람화된 항체는 또한 전형적으로 사람 면역글로불린의 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부(Fc)와 같은 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부(Fc)를 포함한다. 몇몇 양태에서, 사람화된 항체는 적어도 중쇄의 가변 도메인 뿐만 아니라 경쇄 둘다를 포함한다. 항체는 또한 중쇄의 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 CH4 영역을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 사람화된 항체는 단지 사람화된 경쇄를 포함한다. 몇몇 양태에서, 사람화된 항체는 단지 사람화된 중쇄를 포함한다. 특정 양태에서, 사람화된 항체는 단지 경쇄 및/또는 사람화된 중쇄의 사람화된 가변 도메인을 포함한다.
사람화된 항체는 IgY, IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 비롯한 임의의 클래스의 면역글로불린 및 임의의 이소타입, 예컨대 제한없이, IgA1, IgA2, IgG1, lgG2, lgG3 및 lgG4 중에서 선택될 수 있다. 사람화된 항체는 1 이상의 클래스 또는 이소타입 유래의 서열을 포함할 수 있고, 특정 불변 도메인은 당업계에 공지된 기술을 이용하여 원하는 작용인자 기능을 최적화하도록 선택할 수 있다.
사람화된 항체의 프레임워크 및 CDR 영역은 모 서열에 정확하게 상응할 필요는 없고, 예를 들어 공여 항체 CDR 또는 컨센서스 프레임워크는 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환, 삽입 및/또는 결실에 의해 돌연변이되어 당해 부위에서 CDR 또는 프레임워크 잔기가 공여 항체 또는 컨센서스 프레임워크에 상응하지 않게 될 수 있다. 바람직한 양태에서, 당해 돌연변이는 광범위하지 않다. 통상적으로, 사람화된 항체 잔기의 50, 55, 60, 65, 70, 75 또는 80% 이상, 바람직하게 85% 이상, 보다 바람직하게 90% 이상, 및 가장 바람직하게 95% 이상이 모 FR 및 CDR 서열 잔기에 상응할 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "컨센서스 프레임워크"는 컨센서스 면역글로불린 서열에서 프레임워크 영역을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "컨센서스 면역글로불린 서열"은 관련 면역글로불린 서열 계열에서 가장 흔하게 나타나는 아미노산(또는 뉴클레오타이드)로부터 형성된 서열을 의미한다(참조: Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987). 면역글로불린 계열에서, 컨센서스 서열내에 각각의 위치는 당해 계열내 당해 위치에서 가장 흔하게 나타나는 아미노산이 차지한다. 2개의 아미노산이 종종 균등하게 나타나는 경우, 어느 하나가 컨센서스 서열에 포함될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "버니어" 영역은 문헌[Foote and Winter (1992, J. Mol. Biol. 224:487-499, 본원에 참조로서 인용됨]에 기재된 바와 같이 CDR 구조를 조정하고 항원에 대한 일치(fit)를 세부 조정할 수 있는 프레임워크 잔기의 서브세트를 언급한다. 버니어 구역 잔기는 CDR을 지탱하는 층을 형성하고 CDR의 구조 및 항체의 친화성에 영향을 줄 수 있다.
본 명세서에 사용된 RGM 수용체 중 하나에 대한 RGM의 "결합 저해"란 용어는 수용체 결합 활성의 부분적인(예컨대, 약 20%, 40%, 60%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상) 또는 완전한 감소를 포괄한다. 이러한 "결합 저해"는 당업계에서 이용가능한 임의의 적당한 방법, 바람직하게는 ELISA 기반의 결합 분석과 같은 본 명세서에 예시된 바와 같은 임의의 방법으로 측정할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "중화성"이란 용어는 결합 단백질이 표적 단백질에 특이적으로 결합할 때 표적 단백질의 생물학적 활성의 중화를 의미한다. 중화성은 표적에 상기 결합 단백질이 여러 방식으로 결합한 결과일 수 있다. 예를 들어, 중화성은 표적 분자에 대한 수용체 결합에 영향을 미치지 않는 표적 영역에 결합 단백질이 결합함으로써 나타날 수 있다. 대안적으로, 결합 단백질의 결합은 표적에 대한 수용체 결합을 차단시킬 수 있고, 이러한 차단은 결과적으로 표적 단백질 활성을 중화시킨다. 이러한 각각의 여러 기전이 본 발명에 따라 나타날 수 있다. 중화성 결합 단백질은 hRGM A에 대한 결합이 hRGM A의 생물학적 활성을 중화시키는 중화 항체인 것이 바람직하다. 중화성 결합 단백질은 hRGM A에 결합하여 hRGM A의 생물학적 활성을 적어도 약 20%, 40%, 60%, 80%, 85% 또는 그 이상 감소시키는 것이 바람직하다. 중화성 결합 단백질에 의한 hRGM A의 생물학적 활성의 중화는 당업계에 공지된 hRGM A 생물학적 활성의 하나 이상의 지시인자를 측정하여 평가할 수 있다. 예를 들어, hRGM A의 중화는 Ntera 뉴런 성장 분석에서 저해를 반전시킨다(이하, 실시예 3 참조). Ntera 신경돌기 성장 분석은 신경돌기 성장의 저해를 다룬다. 저해성 RGM A 단백질 또는 단편의 부재 및 성장-자극 기질 라미닌의 존재 하에, 뉴런 NTera 응집물은 성장 신경돌기의 광범하고 치밀한 네트워크를 나타낸다. RGM A 또는 RGM A 단편은 신경돌기 성장을 저해하여, 신경돌기의 길이 및 수를 감소시킨다. 기능-차단성 RGM A 길항물질 또는 MAB, 예컨대 mAb 5F9는 분화된 사람 NTera 뉴런 응집물을 이용한 신경돌기 성장 분석에서 사람 RGM A 단백질의 강력한 fc-접합된 hRGM A 경쇄단편(아미노산 47-168)의 신경돌기 성장 저해 활성을 중화시켜, 신경돌기 길이 및 수의 강한 증가를 초래했다.
본 명세서에 사용된 "중화성 모노클로날 항체"는 특정 항원에 결합 후에 이 항원의 천연 리간드의 결합과 경쟁하여 저해할 수 있는, 항체 분자의 제조물을 의미하려는 것이다. 본 출원의 특정 양태에서, 본 발명의 중화 항체는 네오제닌 및/또는 BMP-2 및/또는 BMP-4에 결합하고, RGM A 생물학적 활성 또는 기능을 방해하기 위해 RGM A와 경쟁할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 중화 항체는 RGM A와 결합할 수 있고 네오제닌 및/또는 BMP-2 및/또는 BMP-4에 대한 결합을 방해할 수 있고 RGM A 생물학적 활성 또는 기능을 방해할 수 있다. "활성"이란 용어는 항원에 대한 항체의 결합 특이성/친화성, 예컨대 RGM A 항원에 결합하는 항-hRGM A 항체의 결합 특이성/친화성 및/또는 항체의 중화 효능, 예컨대 이하 실험 섹션에서 기술되는 바와 같은 hRGM A-네오제닌 결합 분석, hRGM A-BMP-2 결합 분석 또는 hRGM A-BMP-4 결합 분석에서 측정된 바와 같은 hRGM A에 대한 결합이 hRGM A의 생물학적 활성을 저해하는 항-hRGM A 항체의 중화 효능과 같은 활성을 포함한다.
RGM A의 생물학적 활성은 세포 이동을 조절하는 것으로 설명될 수 있다. 세포 이동의 구체 예는 RGM A 단백질에 의해 방해 또는 저해되는 신경돌기 성장이다. 또한, RGM 단백질은 BMP-단백질의 활성을 조절하는 것으로 밝혀져 있다. 여기에 공개된 예들은 한 측면으로 BMP-경로에서 RGM 단백질의 상승작용성 강화 활성 및 철 대사, 골 및 연골 재생의 조절과 CNS에서 재미엘린화 및 재생에 중요한 BMP-경로에서 RGM 단백질의 저해 활성을 설명한다.
용어 "에피토프" 또는 "항원 결정인자"는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 폴리펩타이드 결정인자를 포함한다. 특정 양태에서, 에피토프 결정인자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐과 같은 분자의 화학적 활성 표면 배합을 포함하고 특정 양태에서, 특이적 3차원 구조 특징 및/또는 특이적 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합되는 항원 영역이다. 특정 양태에서, 항체는 이것이 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물에서 이의 표적 항원을 우선적으로 인지하는 경우 항원에 특이적으로 결합하는 것이라 한다.
본 명세서에 사용된 "표면 플라스몬 공명"이란 용어는 예컨대 BIAcore 시스템(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ)을 이용하여 바이오센서 매트릭스 내의 단백질 농도의 변경을 검출하여 실시간 생물특이성 상호작용을 분석할 수 있게 하는 광학적 현상을 의미한다. 추가 설명에는 문헌[Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26; Jonsson, U. et al.(1991) Biotechniques 11: 620-627; Johnsson, B., et al.(1995) J.Mol.Recognit. 8: 125-131; 및 Johnnson, B., et al.(1991) Anal. Biochem. 198: 268-277]을 참조한다.
본 명세서에 사용된 용어 "kon"은 당업계에 공지된 바와 같이 항체/항원 복합체를 형성하기 위해 항원에 항체가 결합하는 온 속도 상수(on rate constant)를 의미하고자 한다.
본 명세서에 사용된 용어 "koff"는 당업계에 공지된 바와 같이 항체/항원 복합체로부터 항체가 해리하는 오프 속도 상수(off rate constant)를 의미하고자 한다.
본 명세서에 사용된 "kd"란 용어는 당업계에 공지된 바와 같이 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 의미하고자 한다.
본 명세서에 사용된 "표지화된 결합 단백질"이란 용어는 결합 단백질을 확인할 수 있도록 혼입된 표지를 보유한 단백질을 의미한다. 표지는 검출가능한 마커, 예컨대 마킹된 아비딘(예: 광학 또는 비색 방법에 의해 검출할 수 있는 형광 마커 또는 효소 활성을 함유하는 스트렙타비딘)에 의해 검출될 수 있는 비오티닐 잔기의 폴리펩타이드에 대한 부착 또는 방사선표지된 아미노산의 혼입이 바람직하다. 폴리펩타이드용 표지의 예로는 다음을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다: 방사성동위원소 또는 방사성핵종(예: 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho 또는 153Sm); 형광 표지(예: FITC, 로다민, 란타나이드 인광물질), 효소 표지(예: 양고추냉이 퍼옥시다제, 루시퍼라제, 알칼리성 포스파타제); 화학발광 마커; 비오티닐 기; 2차 리포터(예: 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체의 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그)에 의해 인식되는 소정의 폴리펩타이드 에피토프; 및 자성 제제, 예컨대 가돌리늄 킬레이트.
"항체 접합체"란 용어는 치료제 또는 세포독성제와 같은 제2 화학 잔기에 화학적으로 결합된 항체와 같은 결합 단백질을 의미한다. 여기에 사용된 "제제"란 용어는 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대분자 또는 생물학적 물질로부터 제조된 추출물을 의미한다. 치료제 또는 세포독성제는 백일해 독소, 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미토잔트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 퓨로마이신 및 이의 유사체 및 동족체를 포함하는 것이 바람직하고, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 "결정" 및 "결정화된"이란 용어는 결정 형태로 존재하는 항체 또는 이의 항원결합부를 의미한다. 결정은 고체 상태인 물질의 한 형태로, 무정형 고체 상태 또는 액정 상태와 같은 다른 형태와 상이하다. 결정은 원자, 이온, 분자(예: 항체와 같은 단백질) 또는 분자 어셈블리(예: 항원/항체 복합체)의 규칙적이고 반복적인 3차원 배열로 구성된다. 이러한 3차원 배열은 당해 분야에 잘 알려진 특정 수학적 관계에 따라 배열된다. 결정에서 반복되는 기본 단위 또는 빌딩 블록은 비대칭 단위라 불린다. 주어진 명백한 결정학적 대칭에 일치하는 배열에서 비대칭 단위의 반복은 결정의 "단위 셀"을 제공한다. 3차원 전부에서 규칙적인 해독에 의해 단위 셀의 반복은 결정을 제공한다[Giege, R. and Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ea., pp. 20 1-16, Oxford University Press, New York, New York(1999)].
본원에서 언급되는 바와 같은 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 2종 이상의 뉴클레오타이드, 즉 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시뉴클레오타이드 또는 어느 한 종류의 뉴클레오타이드의 변형된 형태의 중합체 형태를 의미한다. 이 용어는 일본쇄 및 이본쇄 형태의 DNA를 포함하지만 바람직하게는 이본쇄 DNA이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "분리된 폴리뉴클레오타이드"는 그 기원으로 인해, "분리된 폴리뉴클레오타이드"가 자연에서 함께 발견되는 폴리뉴클레오타이드 일부 또는 전부와 결합되어 있지 않거나; 자연에서 결합되지 않은 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 결합되어 있거나; 또는 더 긴 서열의 일부로서 자연에서 발생되지 않는 폴리뉴클레오타이드(예: 게놈, cDNA 또는 합성 기원이거나 이의 일부 조합의 폴리뉴클레오타이드)를 의미할 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 이것이 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미하려는 것이다. 한가지 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 연결될 수 있는 환형 이본쇄 DNA를 의미하는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이고 여기서, 추가의 DNA 절편은 바이러스 게놈에 연결될수 있다. 특정 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포에서 자가 복제할 수 있다(예를 들어, 세균 복제 오리진을 갖는 세균 벡터 및 에피좀 포유동물 벡터). 기타 벡터(예를 들어, 비-에피좀 포유동물 벡터)는 숙주 세포로의 도입시 숙주 세포의 게놈내로 통합될 수 있고 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 이들이 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 단순히 "발현 벡터")라 한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 사용하는 발현 벡터는 흔히 플라스미드 형태이다. 본원 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 가장 흔하게 사용되는 벡터 형태이기 때문에 상호교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 기타 형태의 발현 벡터, 예를 들어, 동등한 기능을 제공하는 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결손형 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스)를 포함하고자 한다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 기재된 구성성분들이 이들의 의도된 방식으로 기능하도록 하는 관계에 있는 배치 상태를 언급한다. 암호화 서열에 "작동가능하게 연결된" 조절 서열은 암호화 서열이 조절 서열과 상용성인 조건 하에서 발현이 달성될 수 있도록 연결되어 있다. "작동가능하게 연결된" 서열은 당해의 유전자와 인접성인 발현 조절 서열 및 당해 유전자를 조절하기 위해 원거리에서 또는 트랜스로 작용하는 발현 조절 서열을 모두 포함한다. 본 명세서에 사용된 "발현 조절 서열"이란 용어는 이들이 연결된 암호화 서열의 발현 및 프로세싱에 영향을 미치는데 필수적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 발현 조절 서열은 적당한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 효과적인 RNA 프로세싱 시그널, 예컨대 스플라이싱 및 폴리아데닐화 시그널; 세포질 mRNA를 안정시키는 서열; 해독 효율을 증강시키는 서열(즉, 코작(Kozak) 컨센서스 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 필요하면 단백질 배출을 증진시키는 서열을 포함한다. 이러한 조절 서열의 본성은 숙주 유기체에 따라 달라지고; 원핵생물에서, 이러한 조절 서열은 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 전사 종결 서열을 포함하고; 진핵생물에서 이러한 조절 서열은 일반적으로 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. "조절 서열"이란 용어는 그 존재가 발현 및 프로세싱에 필수적인 성분을 포함하려는 것으로, 존재가 유익한 추가 구성성분, 예컨대 리더 서열 및 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다.
본원에 정의된 바와 같은 "형질전환"은 외인성 DNA가 숙주 세포로 진입되는 임의의 과정을 의미한다. 형질전환은 당업계에 널리 공지된 다양한 방법을 사용하여 천연 또는 인공 조건하에 수행할 수 있다. 형질전환은 외래 핵산 서열을 원핵 또는 진핵 숙주 세포로 삽입하기 위한 임의의 공지된 방법에 의존할 수 있다. 당해 방법은 형질전환되는 숙주 세포를 기초로 선별되고 바이러스 감염, 전기천공, 리포펙션(lipofection) 및 입자 포격을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 당해 "형질전환된" 세포는 삽입된 DNA가 자가 복제 플라스미드로서 또는 숙주 염색체의 일부로서 복제할 수 있는 안정하게 형질전환된 세포를 포함한다. 이들은 또한 제된 시간 동안 삽입된 DNA 또는 RNA를 일시적으로 발현하는 세포를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "재조합 숙주 세포"(또는 단순히 "숙주 세포")는 외인성 DNA가 도입된 세포를 의미하고자 한다. 이러한 용어는 특정 피검체 세포뿐만 아니라 당해 세포의 자손을 의미하려는 것으로 이해해야만 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후속 세대에서 특정 변형이 일어날 수 있기 때문에 당해 자손은 사실 모세포와 동일할 수는 없지만 여전히 본원에 사용된 바와 같은 용어의 범위 내에 포함된다. 바람직하게 숙주 세포는 임의의 생명체로부터 선택되는 원핵생물 및 진핵생물의 세포를 포함한다. 바람직한 진핵생물 세포는 원생생물, 진균류, 식물 및 동물 세포를 포함한다. 가장 바람직하게 숙주 세포는 원핵생물 세포주 이.콜라이; 포유동물 세포주 CHO, HEK 293 및 COS; 곤충 세포주 Sf9; 및 진균 세포 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
표준 기술은 재조합 DNA, 올리고뉴클레오타이드 합성 및 조직 배양 및 형질전환(예를 들어, 전기천공, 리포펙션)에 사용될 수 있다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조업자의 지침에 따라 또는 당업계에서 일반적으로 수행되는 바와 같이 또는 본원에 기술된 바와 같이 수행할 수 있다. 이전의 기술 및 과정은 일반적으로 당업계에 널리 공지된 통상적인 방법에 따라 및 본원 명세서에 전반에 걸쳐 인용되고 논의된 다양한 일반적 보다 구체적인 참조문헌에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다. 임의의 목적을 위해 본원에 참조로서 인용되는 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]을 참조한다.
당업계에 공지된 바와 같고 본원에 사용된 바와 같이 "돌연변이성 유기체"는 돌연변이유전자를 포함하는 세포를 갖는 유기체를 언급하고, 여기서, 유기체(또는 유기체의 선조)에 도입된 돌연변이유전자는 유기체에서 천연적으로 발현되지 않는 폴리펩타이드를 발현한다. "돌연변이유전자"는 돌연변이유전자 유기체가 발생하는 세포의 게놈으로 안정하게 작동가능하게 통합되어 돌연변이 유기체의 하나 이상의 세포 종류 또는 조직에서 암호화된 유전자 생성물의 발현을 유도하는 DNA 작제물이다.
"조절한다(regulate)" 및 "조절한다(modulate)"란 용어는 호환 사용되고, 본 명세서에 사용되듯이 당해 분자의 활성(예: hRGM A의 생물학적 활성)을 변화 또는 변경시키는 것을 의미하는 것이다. 조절은 당해 분자의 특정 활성 또는 기능의 크기를 증가 또는 감소시키는 것일 수 있다. 분자의 활성 또는 기능의 예로는 결합 특성, 효소 활성, 세포 수용체 활성화 및 시그널 전달을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.
이에 대응하게, 본 명세서에 사용된 "조절인자"란 용어는 당해 분자의 활성 또는 기능(예: hRGM A의 생물학적 활성)을 변화 또는 변경시킬 수 있는 화합물이다. 예를 들어, 조절인자는 조절인자의 부재 하에 관찰되는 활성 또는 기능의 크기와 비교했을 때 분자의 특정 활성 또는 기능의 크기를 증가 또는 감소시킬 수 있다. 본 명세서에 사용된 "작용물질"이란 용어는 당해 분자와 접촉했을 때 작용물질의 부재 하에 관찰되는 활성 또는 기능의 크기에 비해 분자의 특정 활성 또는 기능의 크기를 증가시키는 조절인자를 의미한다. 당해의 특정 작용물질은 hRGM A 폴리펩타이드 또는 hRGM A에 결합하는 폴리펩타이드, 핵산, 탄수화물 또는 임의의 다른 분자를 포함할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 명세서에 사용된 "길항물질"이란 용어는 당해 분자와 접촉했을 때 길항물질의 부재 하에 관찰되는 활성 또는 기능의 크기에 비해 분자의 특정 활성 또는 기능의 크기를 감소시키는 조절인자를 의미한다. 길항물질의 예로는 단백질, 펩타이드, 항체, 펩티바디(peptibody), 탄수화물 또는 작은 유기 분자를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 펩티바디는 예컨대 WO 01/83525에 기술되어 있다.
당해의 특정 길항물질은 hRGM A의 생물학적 또는 면역학적 활성을 차단하거나 조절하는 것을 포함한다. hRGM A의 길항물질은 hRGM A에 결합하는 단백질, 핵산, 탄수화물 또는 임의의 다른 분자, 예컨대 RGM A 분자와 상호작용하는 모노클로날 항체를 포함할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. RGM A와의 상호작용은 다른 리간드/세포막 성분의 결합 및 중화를 초래할 수 있고, 다중 질병에 대해 작용하는 첨가제 또는 상승제로 유용할 수 있음이 주목되어야 한다.
본 명세서에 사용된 "유효량"이란 용어는 장애 또는 이의 하나 이상의 증상의 중증도 및/또는 기간을 감소시키거나 호전시키기에 충분하거나, 장애의 진행을 방지하거나, 장애의 퇴화를 유발하거나, 장애와 관련이 있는 하나 이상의 증상의 재발, 발달, 개시 또는 진행을 방지하거나, 장애를 검출하거나, 또는 다른 치료(예: 예방제 또는 치료제)의 예방 또는 치료 효과(들)를 증진 또는 향상시키기에 충분한 치료의 양을 의미한다.
본 명세서에 사용된 "시료"란 용어는 광범위한 의미로 사용된다. 본 명세서에 사용된 "생물학적 시료"는 임의의 양의 생물 또는 예전 생물 유래의 물질을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 생물에는 사람, 마우스, 래트, 원숭이, 개, 토끼 및 다른 동물을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 물질에는 혈액, 혈청, 소변, 활액, 세포, 기관, 조직, 골수, 림프절 및 비장을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.
2. hRGM A에 결합하는 폴리펩타이드
본 출원의 주요 양태는 RGM A 단백질 중 적어도 하나의 에피토프에 특이적으로 결합하는 분리된 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함한다. RGM A 단백질의 적어도 하나의 에피토프에 특이적으로 결합하는 분리된 단백질 또는 폴리펩타이드는 RGM A의 이의 수용체 네오제닌 및/또는 골 형태형성 단백질 2 및 4(BMP-2, BMP-4)에 대한 결합을 저해할 수 있다.
본 출원의 가장 바람직한 양태는 RGM A 또는 이의 항원결합부 또는 단편에 결합하는 항체를 포함한다.
본 발명의 항-RGM A 항체는 예컨대 이하에 기술되거나 당업계에 공지된 여러 가지 시험관내 분석 및 생체내 분석 중 어느 하나로 평가했을 때, RGM A 활성을 감소 또는 중화시키는 능력이 큰 것이 바람직하다.
본 출원은 가장 바람직하게는 수용체 네오제닌 및 골 형태형성 단백질 2 및 4(BMP-2, BMP-4)에 대한 RGM A의 결합을 선택적으로 방해하는 RGM A에 대한 중화성 모노클로날 항체 및 공동수용체 골 형태형성 단백질 2 및 4(BMP-2, BMP-4)에 대한 RGM A의 결합을 선택적으로 방해하는 RGM A에 대한 중화성 모노클로날 항체의 생성을 포함한다.
본 출원의 모노클로날 중화 항체는 사람 항체 또는 사람화된 항체인 것이 바람직하다. "사람 항체"란 용어는 사람 배선 면역글로불린 서열에 상응하거나 또는 이로부터 유도된 가변 영역과 불변 영역을 보유하는 항체를 의미한다(예: Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH 공개번호 91-3242, 1991). 하지만, 본 출원의 사람 항체는 사람 배선 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기(예: 시험관내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 예컨대 CDR에, 특히 CDR3에 포함할 수 있다.
다양한 양태에서, 항체는 재조합 항체 또는 모노클로날 항체이다. 가장 바람직한 본 발명의 중화 항체는 여기서 mAb5F9 및 mAb8D1로 불리는 항체, 이의 기능성 항체 단편이고, mAb5F9 및 mAb8D1과 성질이 동등한, 예컨대 해리 속도가 낮고 중화능이 큰, RGM A에 대한 높은 친화성 결합을 나타내는 다른 항체 및 기능성 항체 단편도 본 발명의 일부로 간주한다. 본 발명의 항-RGM A 항체의 면역원성 RGM A 폴리펩타이드 또는 이의 단편에 대한 결합 친화성 및 해리 속도는 당업계에 공지된 임의의 방법으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 결합 친화성은 경쟁적 ELISA, c RIA, BIAcore 또는 KinExA 기술로 측정할 수 있다. 또한, 해리 속도는 BIAcore 또는 KinExA 기술로 측정할 수 있다. 결합 친화성 및 해리 속도는 BIAcore 등을 이용해 표면 플라스몬 공명으로 측정한다.
본 출원의 바람직한 모노클로날 항체 중 하나인 mAb5F9 항체는 서열번호 9 또는 34의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH 영역) 및 서열번호 10의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL 영역)을 포함하는 서열과 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
또한, 본 출원의 RGM A와 상호작용하는 분리된 모노클로날 항체는 항체 또는 이의 항원결합부가 하나 이상의 탄수화물 잔기를 포함하는 글리코실화된 결합 단백질일 수 있다. 초기 생체내 단백질 생산은 해독후 변형으로 알려진 추가 프로세싱을 겪을 수 있다. 구체적으로, 당(글리코실) 잔기는 글리코실화로 알려진 과정인 효소적 첨가될 수 있다. 수득되는 공유 결합된 올리고사카라이드 측쇄를 보유하는 단백질은 글리코실화된 단백질 또는 당단백질로 알려져 있다. 단백질 글리코실화는 당해 단백질의 아미노산 서열뿐 아니라, 이 단백질이 발현되는 숙주 세포에 의존한다. 다른 유기체는 다른 글리코실화 효소(예: 글리코실트랜스퍼라제 및 글리코시다제)를 생산할 수 있고 이용할 수 있는 기질(뉴클레오타이드 당)이 다르다. 이러한 요인으로 인해, 단백질 글리코실화 패턴 및 글리코실 잔기의 조성은 특정 단백질이 발현되는 숙주계에 따라 달라질 수 있다. 본 발명에 유용한 글리코실 잔기는 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스, 푸코오스, n-아세틸글루코사민 및 시알산을 포함할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 글리코실화된 결합 단백질은 글리코실화 패턴이 사람이도록 글리코실 잔기를 포함하는 것이 바람직하다.
본 출원의 항체는 중쇄 불변 영역, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM, IgY 또는 IgD 불변 영역을 포함한다. 또한, 항체는 경쇄 불변 영역, 카파 경쇄 불변 영역 또는 람다 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 항체는 카파 경쇄 불변 영역을 포함하는 것이 바람직하다. 대안적으로, 항체부는 예컨대 Fab 단편 또는 단일쇄 Fv 단편일 수 있다. 항체 효과기의 기능을 변경시키기 위한 Fc 부 내의 아미노산 잔기의 대체는 당업계에 알려져 있다(Winter, et al. 미국 특허 5,648,260; 5,624,821). 항체의 Fc 부는 여러 중요한 효과기 기능, 예컨대 사이토킨 유도, ADCC, 식세포작용, 보체 의존적 세포독성(CDC) 및 항체 및 항원-항체 복합체의 반감기/제거율을 매개한다. 몇몇 경우에, 이러한 효과기 기능은 치료 항체에 바람직하지만, 다른 경우에는 치료 대상에 따라 불필요하거나 심지어 유해할 수도 있다. 특정 사람 IgG 이소타입, 특히 IgG1 및 IgG3은 각각 FcγR 및 보체 C1q에 결합을 통해 ADCC 및 CDC를 매개한다. 신생아의 Fc 수용체(FcRn)는 항체의 혈행 반감기를 결정하는 중요한 성분이다. 또 다른 양태에서, 항체의 불변 영역, 예컨대 항체의 Fc 영역에서는 적어도 하나의 아미노산 잔기가 대체되어 항체의 효과기 기능이 변경된다.
3. 항- hRGM A 항체의 생산
3.1 개요
본 출원의 항체는 적당한 숙주(예: 척추동물, 예컨대 사람, 마우스, 래트, 양, 염소, 돼지, 소, 말, 파충류, 어류, 양서류 및 조류, 파충류 및 어류의 알)의 면역화로 생산할 수 있다. 본 출원의 항체를 생산하기 위해, 본 발명의 면역원성 RGM A 폴리펩타이드 또는 이의 단편으로 숙주를 면역화한다. "면역화"란 용어는 면역 레퍼토리가 자연의 유전자 미변경 유기체에 존재하는 것인지 또는 돌연변이 유기체, 예컨대 합성 사람 면역 레퍼토리를 디스플레이하도록 변형된 유기체에 존재하는지에 관계없이 항원을 면역 레퍼토리에 제공하는 과정을 의미한다. 이와 유사하게, "면역원성 제조물"은 항원의 면역원성을 증진시키는 애주번트 또는 다른 첨가제를 함유하는 항원의 제형이다.
동물의 면역화는 당업계에 공지된 임의의 방법으로 수행할 수 있다[예컨대, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990 참조]. 비-사람 동물, 예컨대 마우스, 래트, 양, 염소, 돼지, 소 및 말을 면역화하는 방법은 당업계에 공지되어 있다[예컨대, Harlow and Lane 및 미국 특허 5,994,619 참조]. 바람직한 양태에서, RGM A 항원은 면역 반응을 자극하기 위해 애주번트와 함께 투여한다. 이러한 애주번트로는 완전 프로인트 애주번트, 불완전 프로인트 애주번트, RIBI(뮤라밀 디펩타이드) 또는 ISCOM(면역자극 복합체)을 포함한다. 이러한 애주번트는 폴리펩타이드를 국소 침적물 중에 격리시켜 빠른 분산으로부터 보호하거나, 또는 대식세포에 화학주성인 인자 및 면역계의 다른 성분을 분비하도록 숙주를 자극하는 물질을 함유할 수 있다. 폴리펩타이드가 투여되고 있다면, 면역화 스케줄은 수주 동안 전개되는 폴리펩타이드의 2회 이상의 투여를 수반하는 것이 바람직하다.
동물 숙주는 완전 세포 또는 붕괴 세포의 세포막과 관련된 항원으로 면역화되고, 본 출원의 항체는 본 발명의 면역원성 폴리펩타이드에 결합하는 것으로 확인하는 것이 고찰된다. 동물 숙주를 항원으로 면역화한 후, 항체는 그 동물로부터 수득할 수 있다. 항체-함유 혈청은 동물로부터 채혈하거나 희생시켜 수득한다. 혈청은 동물로부터 수득한 대로 사용할 수 있고, 이 혈청으로부터 면역글로불린 분획을 수득할 수도 있으며, 또는 혈청으로부터 항체를 정제할 수도 있다. 이러한 방식으로 수득한 혈청 또는 면역글로불린은 폴리클로날이어서, 불균일한 어레이의 성질을 보유한다.
3.2 하이브리도마 기술을 이용한 항- RGM A 모노클로날 항체
모노클로날 항체는 당업계에 공지된 다양한 기술, 예컨대 하이브리도마의 이용, 재조합체 및 파지 디스플레이 기술, 또는 이의 조합 등으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 당업계에 공지되고 예컨대 문헌[Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed., 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier, N.Y., 1981)(이 문헌들은 전문이 참고인용됨)]에 교시된 것을 비롯한 하이브리도마 기술을 이용해 생산할 수 있다. 본 명세서에 사용된 "모노클로날 항체"란 용어는 하이브리도마 기술을 통해 생산에 제한되지 않는다. "모노클로날 항체"란 용어는 이것이 생산되는 방법이 아닌, 단일 클론, 예컨대 임의의 진핵생물, 원핵생물 또는 파지 클론에서 유래되는 항체를 의미한다.
하이브리도마 기술을 이용하여 특정 항체를 생산 및 선별하는 방법은 통상적이고 당업계에 공지되어 있다. 한 양태에서, 본 발명은 모노클로날 항체를 생산하는 방법뿐만 아니라, 본 발명의 항체를 분비하는 하이브리도마 세포를 배양하는 단계를 포함하되, 여기서 하이브리도마가 바람직하게는 본 발명의 항원으로 면역화된 마우스로부터 분리된 비장세포를 골수종 세포와 융합시킨 뒤, 융합으로부터 수득되는 하이브리도마를 본 발명의 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 항체를 분비하는 하이브리도마 클론에 대해 선별함으로써 생산되는 하이브리도마인 방법에 의해 생산되는 항체를 제공한다. 간략히 말하면, 마우스는 RGM A 항원으로 면역화할 수 있다. 바람직한 양태에서, RGM A 항원은 면역 반응을 자극하는 애주번트와 함께 투여한다. 이러한 애주번트로는 완전 또는 불완전 프로인트 애주번트, RIBI(뮤라밀 디펩타이드) 또는 ISCOM(면역자극 복합체)을 포함한다. 이러한 애주번트는 폴리펩타이드를 국소 침적물 중에 격리시켜 빠른 분산으로부터 보호하거나, 또는 대식세포에 화학주성인 인자 및 면역계의 다른 성분을 분비하도록 숙주를 자극하는 물질을 함유할 수 있다. 폴리펩타이드가 투여되고 있다면, 면역화 스케줄은 수주 동안 전개되는 폴리펩타이드의 2회 이상의 투여를 수반하는 것이 바람직하다.
면역 반응이 검출되면, 예컨대 항원 RGM A에 특이적인 항체가 마우스 혈청에서 검출되면, 마우스 비장을 수확하여 비장세포를 분리했다. 그 다음, 비장세포를 공지의 기술에 따라 임의의 적당한 골수종 세포, 예컨대 ATCC에서 입수가능한 세포주 SP20 유래의 세포 등에 융합시킨다. 하이브리도마를 선택하고 한계희석법으로 클로닝한다. 그 다음, 하이브리도마 클론을 RGM A에 결합할 수 있는 항체를 분비하는 세포에 대해 당업계에 공지된 방법으로 분석한다. 일반적으로 다량의 항체를 함유하는 복수액은 양성 하이브리도마 클론으로 마우스를 면역화하여 수득할 수 있다.
다른 양태에서, 항체-생산성 무한증식화된 하이브리도마는 면역화된 동물로부터 제조할 수 있다. 면역화 후, 동물을 희생시키고 비장계 B 세포를 당업계에 공지된 바와 같이 무한증식화된 골수종 세포에 융합시킨다[예컨대, Harlow and Lane, 상기 문헌 참조]. 바람직한 양태에 따르면, 골수종 세포는 면역글로불린 폴리펩타이드를 분비하지 않는다(비분비성 세포주). 융합 및 항생제 선택 후, 하이브리도마는 RGM A 또는 이의 일부, 또는 RGM A를 발현하는 세포를 이용하여 선별한다. 바람직한 양태에서, 초기 선별은 효소-결합된 면역분석법(ELISA) 또는 방사능면역분석법(RIA), 바람직하게는 ELISA를 이용하여 수행한다. ELISA 선별의 한 예는 참고인용된 WO 00/37504에 제공되어 있다.
항-RGM A 항체 생산 하이브리도마는 선발하여 클로닝한 뒤, 바람직한 특성, 예컨대 왕성한 하이브리도마 성장, 높은 항체 생산 및 바람직한 항체 특성(이하에 논의됨) 등에 대해 선별한다. 하이브리도마는 동계 동물, 면역계가 부족한 동물, 예컨대 누드 마우스의 생체내에서 또는 시험관내 세포 배양물에서 배양 및 증폭될 수 있다. 하이브리도마를 선택, 클로닝 및 증폭시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
바람직한 양태에서, 하이브리도마는 전술한 바와 같은 마우스 하이브리도마이다. 다른 바람직한 양태에서, 하이브리도마는 비-사람, 마우스외 종, 예컨대 래트, 양, 돼지 염소, 소 또는 말에서 생산된다. 다른 양태에서, 하이브리도마는 사람 하이브리도마로, 사람의 비분비성 골수종을 항-RGM A 항체를 발현하는 사람 세포와 융합시킨 것이다.
특정 에피토프를 인식하는 항체 단편은 공지의 기술로 생산할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 Fab 및 F(ab')2 단편은 파파인(Fab 단편 생산) 또는 펩신(Fab'2 단편 생산)과 같은 효소를 이용한 면역글로불린 분자의 단백분해 절단에 의해 생산될 수 있다. F(ab')2 단편은 가변 영역, 경쇄 불변 영역 및 중쇄의 CH1 도메인을 함유한다.
3.3 SLAM 을 이용한 항- RGM A 모노클로날 항체
본 발명의 다른 관점에서, 재조합 항체는 미국 특허 5,627,052, PCT 공개번호 WO 92/02551 및 문헌[Babcock, J.S. et al.(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7843-7848]에 기술된 바와 같이, 선택 림프구 항체 방법(SLAM)과 같은 당업계에서 언급된 절차를 이용하여 분리된 단일 림프구로부터 수득한다. 이 방법에서, 당해의 항체를 분비하는 단일 세포, 예컨대 전술한 면역화된 동물 중 어느 하나로부터 유래된 림프구는 항원-특이적 용혈 플라크 분석법을 이용하여 선별하고, 이 분석법에서 항원 RGM A, RGM A의 서브유닛 또는 이의 단편은 비오틴과 같은 링커를 이용해 양 적혈구 세포에 커플링되고 RGM A에 대해 특이성이 있는 항체를 분비하는 단일 세포를 확인하는데 사용된다. 당해 항체 분비성 세포의 확인 후, 이 세포로부터 역전사효소-PCR에 의해 중쇄 및 경쇄 가변 영역 cDNA를 획득하고, 이러한 가변 영역을 적당한 면역글로불린 불변 영역(예: 사람 불변 영역)의 환경에서, 포유동물 숙주 세포, 예컨대 COS 또는 CHO 세포에서 발현시킬 수 있다. 생체내 선택된 하이브리도마로부터 유래된, 증폭된 면역글로불린 서열로 형질감염된 숙주 세포는 그 다음 형질감염된 세포를 패닝(panning)하여 RGM A에 대한 항체를 발현하는 세포를 분리하는 처리 등에 의해 시험관내에서 추가 분석 및 선택을 받을 수 있다. 증폭된 면역글로불린 서열은 다시 시험관내에서, 예컨대 PCT 공개번호 WO 97/29131 및 PCT 공개번호 WO 00/56772에 기술된 바와 같은 시험관내 친화성 성숙 방법 등으로 조작될 수 있다.
3.4 돌연변이 동물을 이용한 항- RGM A 모노클로날 항체
본 발명의 다른 양태에서, 항체는 사람 면역글로불린 유전자좌의 일부 또는 전부를 포함하는 비-사람 동물을 RGM A 항원으로 면역화시켜 생산한다. 바람직한 양태에서, 비-사람 동물은 마우스 항체 생산 결손성이고 사람 면역글로불린 유전자좌의 큰 단편을 포함하는 유전자조작된 마우스 균주인 제노마우스(XENOMOUSE) 돌연변이 마우스이다. 예컨대, 문헌[Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994) 및 미국 특허 5,916,771, 5,939,598, 5,985,615, 5,998,209, 6,075,181, 6,091,001, 6,114,598 및 6,130,364]을 참조한다. 또한, WO 91/10741(1991.7.25 공개), WO 94/02602(1994.2.3 공개), WO 96/34096 및 WO 96/33735(둘 다 1996.10.31 공개), WO 98/16654(1998.4.23 공개), WO 98/24893(1998.6.11 공개), WO 98/50433(1998.11.12 공개), WO 99/45031(1999.9.10 공개), WO 99/53049(1999.10.21 공개), WO 00/09560(2000.2.24 공개) 및 WO 00/037504(2000.6.29 공개)도 참조한다. 제노마우스 돌연변이 마우스는 성인계 사람의 완전 사람 항체 레퍼토리를 생산하고, 항원-특이적 사람 Mab를 생성한다. 제노마우스 돌연변이 마우스는 사람 중쇄 유전자좌와 x 경쇄 유전자좌로 이루어진 메가염기 크기의 배선 형태 YAC 단편의 도입을 통해 사람 항체 레퍼토리의 약 80%를 함유한다[Mendez et al., Nature Genetics 15: 145-156(1997), Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188: 483-495(1998), 모든 개시내용이 참고 인용됨].
3.5 재조합 항체 라이브러리를 이용한 항- RGM A 모노클로날 항체
또한, 본 발명의 항체 제조에는 원하는 항체 라이브러리를 선별하여 결합 특이성을 가진 항체를 확인하는 시험관내 방법이 사용될 수 있다. 이러한 재조합 항체 라이브러리의 선별 방법은 당업계에 공지되어 있고, 문헌[예컨대 Ladner et al. 미국 특허 5,223,409; Kang et al . PCT 공개번호 WO 92/18619; Dower et al . PCT 공개번호 WO 91/17271; Winter et al . PCT 공개번호 WO 92/20791; Markland et al . PCT 공개번호 WO 92/15679; Breitling et al . PCT 공개번호 WO 93/01288; McCafferty et al . PCT 공개번호 WO 92/01047; Garrard et al . PCT 공개번호 WO 92/09690; Fuchs et al . (1991) Bio / Technology 9:1370-1372; Hay et al . (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al . (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al ., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al . (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al . (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al . (1991) Nature 352:624-628; Gram et al . (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio / Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al . (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; 및 Barbas et al . (1991) PNAS 88:7978-7982, US 특허출원 공개 20030186374, 및 PCT 공개번호 WO 97/29131(각 내용은 본 발명에 참고인용됨)]에 기술된 방법을 포함한다.
재조합 항체 라이브러리는 RGM A 또는 RGM A의 일부로 면역화된 피검체로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 재조합 항체 라이브러리는 순수 피검체, 즉 RGM A로 면역화되지 않은 피검체 유래, 예를 들어 사람 RGM A로 면역화된 적이 없는 사람 피검체 유래의 사람 항체 라이브러리일 수 있다. 본 발명의 항체는 사람 RGM A를 함유하는 펩타이드로 재조합 항체 라이브러리를 선별하여 RGM A를 인식하는 항체를 선택한다. 이러한 선별과 선택을 수행하는 방법은 이전 문단의 참고문헌에 기술된 것처럼 당업계에 공지되어 있다. hRGM A에 대해 특별한 결합 친화성을 가진 본 발명의 항체, 예컨대 특정 koff 속도 상수로 사람 RGM A로부터 해리하는 항체를 선택하기 위해, 당업계에 공지된 방법인 표면 플라스몬 공명을 이용하여 원하는 koff 속도 상수를 가진 항체를 선택할 수 있다. hRGM A에 대한 특별한 중화 활성을 가진 본 발명의 항체를 선택하기 위해, 예컨대 hRGM A 활성의 저해를 평가하는 당업계에 공지된 특별한 IC50 표준 방법 등을 사용할 수 있다.
한 관점에서, 본 발명은 사람 RGM A에 결합하는 분리된 항체 또는 이의 항원결합부에 관한 것이다. 항체는 중화 항체인 것이 바람직하다. 다양한 양태에서, 항체는 재조합 항체 또는 모노클로날 항체이다.
예를 들어, 본 발명의 항체는 당업계에 공지된 다양한 파지 디스플레이 방법으로도 생성할 수 있다. 파지 디스플레이 방법에서 기능성 항체 도메인은 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 운반하는 파지 입자의 표면에서 디스플레이된다. 특히, 이러한 파지는 레터포리 또는 조합 항체 라이브러리(예: 사람 또는 쥐)로부터 발현된 항원-결합 도메인을 디스플레이하는데 이용될 수 있다. 당해의 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 발현하는 파지는 항원, 예컨대 표지화된 항원 또는 고상 표면이나 비드에 결합되거나 포획된 항원을 이용하여 선택하거나 확인할 수 있다. 이러한 방법에 사용된 파지는 일반적으로 Fab, Fv 또는 디설파이드 안정화된 Fv 항체 도메인이 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질 중 어느 하나에 재조합 융합되어 있는, 파지로부터 발현된 fd 및 M13 결합 도메인을 포함하는 사상(filamentous) 파지이다. 본 발명의 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 파지 디스플레이 방법의 예는 문헌[Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); PCT 출원번호 PCT/GB91/01134; PCT 공개번호 WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; 및 미국 ㅌ특허번호 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780, 225; 5,658,727; 5,733,743 및 5,969,108; 각 문헌은 전문이 참고인용됨]에 개시된 것을 포함한다.
상기 문헌들에 기술된 바와 같이, 파지 선택 후, 파지 유래의 항체 암호화 영역을 분리하여 사람 항체를 포함하는 전체 항체 또는 임의의 다른 바람직한 항원 결합 단편을 생성하는데 사용하고, 이하에 상세히 기술되는 바와 같은 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 세균을 비롯한 임의의 바람직한 숙주에서 발현시킬 수 있다. 예를 들어, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을 재조합 생산하는 기술은 당업계에 공지된 방법, 예컨대 문헌[PCT 공개번호 WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6):864-869 (1992); 및 Sawai et al., AJRI 34:26-34 (1995); 및 Better et al., Science 240:1041-1043 (1988) (이 문헌들은 전문이 참고인용된다)]에 개시된 방법을 이용할 수 있다. 단일쇄 Fv 및 항체를 생산하는데 사용될 수 있는 기술의 예는 미국 특허 4,946,778 및 5,258,498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); 및 Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988)에 기술된 것을 포함한다.
파지 디스플레이에 의해 재조합 항체 라이브러리를 선별하는 방법의 대안으로, 대형 조합 라이브러리를 선별하는 당업계에 공지된 여타 방법을 이용하여 본 발명의 이중 특이성 항체를 확인할 수 있다. 대체 발현계의 한 종류는 문헌[PCT 공개번호 WO 98/31700(Szostak 및 Roberts), 및 Roberts, R.W. and Szostak, J.W. (1997) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 94:12297-12302]에 기술된 바와 같이 재조합 항체 라이브러리가 RNA-단백질 융합체로 발현되는 것이다. 이러한 계에서, 공유 융합체는 펩타이딜 수용체 항생제인 퓨로마이신을 3' 말단에서 운반하는 합성 mRNA의 시험관내 해독에 의해 암호화되는 펩타이드 또는 단백질과 mRNA 사이의 융합체로 생성된다. 따라서, 특정 mRNA는 복합 mRNA 혼합물(예: 조합 라이브러리)로부터 항체와 같은 암호화된 펩타이드 또는 단백질, 또는 이의 일부의 성질, 예컨대 이중 특이성 항원에 대한 항체 또는 이의 일부의 결합 등에 기초하여 농축시킬 수 있다. 이러한 라이브러리의 선별로부터 회수된 항체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 전술한 바와 같은 재조합 수단(예: 포유동물 숙주 세포)에 의해 발현될 수 있고, 더욱이 본래 선택된 서열(들)에 돌연변이가 도입된 mRNA-펩타이드 융합체의 추가 선별, 또는 전술한 바와 같은 재조합 항체의 시험관내 친화성 성숙의 다른 방법 등에 의해 추가 친화성 성숙으로 처리될 수 있다.
다른 시도로, 본 발명의 항체는 또한 당업계에 공지된 효모 디스플레이 방법을 이용해 생성할 수 있다. 효모 디스플레이 방법에서, 효모 세포 벽에 항체 도메인을 테더링(tethering)하고 효모 표면에서 디스플레이하기 위해 유전자 방법을 이용한다. 특히, 이러한 효모는 레퍼토리 또는 조합 항체 라이브러리(예: 사람 또는 쥐)로부터 발현된 항원-결합 도메인을 디스플레이하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 항체를 제조하는데 이용될 수 있는 효모 디스플레이 방법의 예는 본원에 참고인용된 미국 특허 6,699,658(Wittrup, et al.)에 개시된 방법을 포함한다.
4. 본 발명의 특정 재조합 RGM A 항체의 생산
본 발명의 항체는 당업계에 공지된 많은 기술 중 임의의 기술로 생산할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 발현 벡터(들)가 표준 기술에 의해 숙주 세포에 형질감염된, 숙주 세포로부터의 발현이 있다. "형질감염"이란 용어의 다양한 형태는 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에 외인성 DNA를 도입시키는데 흔히 사용되는 광범한 기술, 예컨대 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포괄하고자 한다. 본 발명의 항체는 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포 중 어느 하나에서 발현하는 것이 가능하지만, 진핵생물 세포(특히 포유동물 세포)가 원핵생물 세포보다 적절히 폴딩된 면역학적 활성 항체를 어셈블리하고 분비할 가능성이 크기 때문에 진핵생물 세포에서의 항체 발현이 바람직하고, 특히 포유동물 숙주 세포에서의 항체 발현이 가장 바람직하다.
이러한 본 발명의 재조합 항체를 발현하는데 바람직한 포유동물 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO 세포)[예컨대, 문헌(R.J. Kaufman and P.A. Sharp (1982) Mol. Biol . 159:601-621)에 기술된 바와 같이, DHFR 선택성 마커와 함께 사용된 문헌(Urlaub and Chasin, (1980) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 77:4216-4220)에 기술된 dhfr- CHO 세포 포함), NS0 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 항체 유전자를 발현하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포에 도입되면, 이 숙주 세포를 이 숙주 세포에서 항체를 발현하기에 충분한 시간 동안, 또는 더욱 바람직하게는 숙주 세포가 증식된 배양 배지로 항체를 분비하기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양하여 항체를 생산한다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 이용해 배양 배지로부터 회수할 수 있다.
또한, 숙주 세포는 Fab 단편 또는 scFv 분자와 같은 기능성 항체 단편을 생산하는데 이용할 수 있다. 이러한 절차 상의 변화는 본 발명의 범위 내인 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 본 발명의 항체의 경쇄 및/또는 중쇄 중 어느 하나의 기능성 단편을 암호화하는 DNA로 숙주 세포를 형질감염시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 당해 항원에 결합하는데 필요하지 않은 경쇄 및 중쇄 중 어느 하나 또는 둘 모두를 암호화하는 DNA의 일부 또는 전부를 제거하기 위해 재조합 DNA 기술을 이용할 수도 있다. 이러한 절두형 DNA 분자로부터 발현된 분자도 본 발명의 항체에 포함된다. 또한, 본 발명의 항체를 표준 화학적 가교 방법에 의해 제2 항체에 가교결합하여, 한 중쇄와 한 경쇄가 본 발명의 항체이고 다른 중쇄 및 경쇄가 당해 항원 외의 다른 항원에 특이적인 이기능성 항체를 생산할 수도 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원결합부의 바람직한 재조합 발현계에서, 항체 중쇄 및 항체 경쇄를 모두 암호화하는 재조합 발현 벡터는 인산칼슘-매개의 형질감염에 의해 dhfr- CHO 세포 내로 도입된다. 재조합 발현 벡터 내에서, 항체 중쇄 및 경쇄 유전자는 각각 CMV 인헨서/AdMLP 프로모터 조절 인자에 작동가능하게 연결되어 유전자의 높은 전사 수준을 유도한다. 또한, 재조합 발현 벡터는 메토트렉세이트 선택/증폭을 이용하여 상기 벡터로 형질감염된 CHO 세포의 선택을 가능하게 하는 DHFR 유전자를 운반한다. 선택된 형질감염 숙주 세포는 항체 중쇄 및 경쇄의 발현을 허용하도록 배양하고 이 배양 배지로부터 완전한 항체를 회수한다. 재조합 발현 벡터를 제조하고 숙주 세포를 형질감염시키며, 형질감염체를 선택하고, 숙주 세포를 배양하고 배양 배지로부터 항체를 회수하기 위해 표준 분자생물학 기술을 이용한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 항체가 합성될 때까지 적당한 배양 배지에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하여 본 발명의 재조합 항체를 합성하는 방법을 제공한다. 이 방법은 추가로 배양 배지로부터 재조합 항체를 분리하는 단계를 포함한다.
4.1 항 RGM A 항체
표 5는 본 발명의 바람직한 항-hRGM A 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열 목록이다.
Figure pct00007
상기 분리된 항-RGM A 항체 CDR 서열은 본 발명에 따라 분리된 RGM A 결합 단백질의 신규 패밀리를 구축한다. hRGM A에 관하여 바람직한 RGM A 결합 및/또는 중화 활성을 가진 본 발명의 CDR을 생성하고 선택하기 위해, 본 발명의 결합 단백질을 생성하고 이 결합 단백질의 RGM A 결합 및/또는 중화 특성을 평가하는 당업계에 공지된 표준 방법을 이용할 수 있고, 그 예로는 본 명세서에 상세하게 기술된 것을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.
4.2 항 RGM A 키메라 항체
키메라 항체는 항체의 여러 부분이 다른 동물 종에서 유래한 분자로, 예컨대 쥐 모노클로날 항체 유래의 가변 영역과 사람 면역글로불린 불변 영역을 보유하는 항체가 있다. 키메라 항체를 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있다[Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202; U.S. Pat. Nos. 5,807,715; 4,816,567; 및 4,816,397, 모두 전문이 참고인용됨]. 또한, 적당한 항원 특이성이 있는 마우스 항체 분자 유래의 유전자를 적당한 생물학적 활성의 사람 항체 분자 유래의 유전자와 함께 스플라이싱하여 "키메라 항체"를 생산하기 위해 개발된 기술(Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454, 전문이 참고인용됨)이 사용될 수 있다.
한 양태에서, 본 발명의 키메라 항체는 본 명세서에 기술된 쥐 모노클로날 항 사람 RGM A 항체의 중쇄 불변 영역을 사람 IgG1 불변 영역으로 교체하여 생산한다.
4.3 항 RGM A CDR 이식 항체
본 발명의 CDR-이식 항체는 VH 및/또는 VL의 CDR 영역 중 하나 이상이 본 발명의 쥐 항체와 같은 비-사람 CDR 서열로 교체된, 사람 항체 유래의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 임의의 사람 항체 유래의 프레임워크 서열은 CDR 이식용 주형으로 작용할 수 있다. 하지만, 이러한 프레임워크 위에 직쇄 교체는 종종 항원에 대한 결합 친화성의 일부 상실을 초래하기도 한다. 사람 항체가 원조 쥐 항체에 대해 상동성이 클수록 사람 프레임워크와 쥐 CDR의 조합으로 인해 친화성을 감소시킬 수 있는 CDR의 비틀림이 초래될 가능성은 더 적다. 따라서, CDR로부터 떨어진 쥐 가변 프레임워크를 교체하기 위해 선택한 사람 가변 프레임워크는 쥐 항체 가변 영역 프레임워크와 적어도 65%의 서열 동일성인 것이 바람직하다. CDR로부터 떨어진 사람 및 쥐 가변 영역은 적어도 70%의 서열 동일성인 것이 더욱 바람직하다. CDR로부터 떨어진 사람 및 쥐 가변 영역은 서열 동일성이 75% 이상인 것이 더 더욱 바람직하다. CDR로부터 떨어진 사람 및 쥐 가변 영역은 서열 동일성이 적어도 80%인 것이 가장 바람직하다. CDR 이식 항체를 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(Jones et al., Nature 321: 522-525(1986); 미국 특허 5,225,539). 특정 양태에서, 본 발명은 표 6에 기술된 바와 같은 VH 및/또는 VL 사슬을 보유한 CDR 이식 항체를 제공한다.
Figure pct00008
Figure pct00009
mAb 5F9 유래의 CDR 서열은 진하게 표시했다. 특정 프레임워크 서열(FR1 내지 FR4)에는 해당 서열번호를 표시하여 참조된다(표 3 및 4 참조).
4.4 항 RGM A 사람화된 항체
사람화된 항체는 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)이 비-사람 종 유래이고 프레임워크 영역은 사람 면역글로불린 분자 유래인, 원하는 항원에 결합하는 비-사람 종의 항체 유래의 항체 분자이다. 공지된 사람 Ig 서열은 다음 웹사이트들과 문헌에 개시되어 있다[예컨대, www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html; www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html; www.whfreeman.com/immunology/CH- 05/kuby05.htm; www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/m- ikeimages.html; www.antibodyresource.com/; mcb.harvard.edu/BioLinks/Immuno- logy.html.www.immunologylink.com/; pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.- html; www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html- ; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www.m.ehime-u.acjp/.about.yasuhito-/Elisa.html; www.biodesign.com/table.asp; www.icnet.uk/axp/facs/davies/lin-ks.html; www.biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html; www.isac-net.org/sites_geo.html; aximtl.imt.uni-marburg.de/.about.rek/AEP- Start.html; baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html; www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/pu- blic/INTRO.html; www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; imgt.cnusc.fr:8104/; www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www.unizh.ch/.about.honegger/AHOsem- inar/Slide01.html; www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/h- umanisation/TAHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc.cam.ac.uk/.abo- ut.fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html; www.jerini.de/frroducts.htm; www.patents.ibm.com/ibm.html. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983), 각각 본 발명에 참고인용됨]. 이와 같이 입수된 서열들은 면역원성을 감소시키거나, 또는 결합성, 친화성, 온-속도, 오프-속도, 화합성, 특이성, 반감기 또는 당업계에 공지된 바와 같은 임의의 다른 적당한 특성을 감소, 증진 또는 변성시키는데 사용할 수 있다.
사람 프레임워크 영역에 존재하는 프레임워크 잔기는 항원 결합을 변경, 바람직하게는 증진시키기 위해 CDR 공여 항체 유래의 대응 잔기로 치환될 수 있다. 이러한 프레임워크 치환은 당업계에 공지된 방법, 예컨대 항원 결합에 중요한 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 CDR과 프레임워크 잔기의 상호작용의 모델링 및 특정 위치들에 존재하는 이상 프레임워크 잔기을 확인하기 위한 서열 비교를 통해 확인한다(예컨대, Queen et al., 미국 특허 5,585,089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988), 전문이 참고인용됨). 3차원 면역글로불린 모델은 흔히 이용가능하고 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램도 이용가능하다. 이러한 디스플레이의 조사는 후보 면역글로불린 서열의 기능에 잔기들의 가능한 역할을 분석할 수 있게 하고, 즉 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이러한 방식으로, 원하는 항체 특성, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 친화성 증가가 달성되도록 컨센서스 및 입수 서열들로부터 FR 잔기를 선택 및 조합할 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 영향을 미치는데 직접적으로 가장 실질적으로 관여한다. 항체는 다음 문헌들에 기술된 바와 같은 당업계에 공지된 다양한 기술을 이용하여 사람화될 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다: Jones et al., Nature 321:522 (1986); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al. , PNAS 91:969-973 (1994); PCT 공개번호 WO 91/09967, PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246, EP 592,106; EP 519,596, EP 239,400, 미국 특허번호 5,565,332, 5,723,323, 5,976,862, 5,824,514, 5,817,483, 5814476, 5763192, 5723323, 5,766886, 5,714,352, 6,204,023, 6,180,370, 5,693,762, 5,530,101, 5,585,089, 5,225,539; 4,816,567[각각 전문이 참고인용됨, 여기에 인용된 참고문헌도 포함].
5. 본 발명의 항체의 추가 양태
5.1 융합 항체 및 면역어드헤신( immunoadhesin )
본 발명은 또한 본 발명의 RGM A 항체 전부 또는 일부와 여기에 연결된 다른 폴리펩타이드를 포함하는 융합 항체 또는 면역어드헤신이 제조될 수 있음을 예시한다. 일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드에는 RGM A 항체의 가변 영역만이 연결된다. 다른 양태에서, 본 발명의 RGM A 항체의 VH 도메인은 제1 폴리펩타이드에 연결되고, 항체의 VL 도메인은 VH 도메인과 VL 도메인이 서로 상호작용하여 항체 결합 부위를 형성하게 하는 방식으로 제1 폴리펩타이드와 연합하는 제2 폴리펩타이드에 연결된다. 다른 양태에서, VH 도메인은 VH 도메인과 VL 도메인이 서로 상호작용할 수 있게 하는 링커에 의해 VL 도메인으로부터 분리되어 있다(이하, 단일쇄 항체 참조). VH-링커-VL 항체는 그 다음 당해의 폴리펩타이드에 연결된다. 융합 항체는 RGM A를 발현하는 세포 또는 조직으로 폴리펩타이드를 유도하는데 유용하다. 당해의 폴리펩타이드는 치료제, 예컨대 독소이거나, 또는 진단제, 예컨대 양고추냉이 퍼옥시다제와 같이 쉽게 가시화될 수 있는 효소일 수 있다. 또한, 융합 항체는 2개(또는 그 이상)의 단일쇄 항체가 서로 연결되어 생성될 수 있다. 이것은 단일 폴리펩타이드 사슬 위에 2가 또는 다가 항체를 생성하고자 하는 경우, 또는 이특이성 항체를 생성하고자 하는 경우에 유용하다.
한 양태는 본 발명의 항체 또는 항체부가 다른 기능성 분자(예: 다른 펩타이드 또는 단백질)에 연결되거나 유도체화된 표지화된 결합 단백질을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 표지화된 결합 단백질은 본 발명의 항체 또는 항체부를 (화학적 결합, 유전자 융합, 비공유 결합 등에 의해) 하나 이상의 다른 분자 실체, 예컨대 핵산, 다른 항체(예: 이특이성 항체 또는 디아바디), 검출가능한 제제, 세포독성제, 약제 및/또는 다른 분자(예: 스트렙타비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그)의 연합을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩타이드 등에 기능적으로 연결시켜 유도할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체부가 유도체화될 수 있는 유용한 검출성 제제는 형광 화합물을 포함한다. 형광 검출성 제제의 예로는 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 5-디메틸아민-1-나프탈렌설포닐 클로라이드, 피코에리트린 등을 포함한다. 또한, 항체는 검출성 효소, 예컨대 알칼리성 포스파타제, 양고추냉이 퍼옥시다제, 글루코스 옥시다제 등으로 유도체화될 수 있다. 항체가 검출성 효소로 유도체화되면, 효소가 이용하여 검출성 반응 산물을 생산하는 추가 시약을 첨가하여 검출한다. 예를 들어, 검출성 제제인 양고추냉이 퍼옥시다제가 존재하면, 과산화수소 및 디아미노벤지딘의 첨가는 검출가능한 유색 반응 산물을 야기한다. 또한, 항체는 핵산, 비오틴으로 유도체화될 수 있고 아비딘 또는 스트렙타비딘 결합의 간접 측정을 통해 검출할 수 있다.
5.2 단일쇄 항체
본 발명은 본 발명의 면역원성 RGM A에 결합하는 단일쇄 항체(scFv)를 포함한다. scFv를 생산하기 위해, VH- 및 VL-암호화 DNA를 가요성 링커를 암호화하는 DNA, 예컨대 아미노산 서열(Gly4-Ser)을 암호화하는 DNA에 작동가능하게 연결시켜, 가요성 링커에 의해 VL 및 VH 영역이 연합된, 인접한 단일쇄 단백질로 VH 서열과 VL 서열을 발현시킬 수 있다(예컨대, Bird et al. (1988) Science 242:423-42 6; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; McCafferty et al., 30 Nature (1990) 34 8: 552-554 참조). 단일쇄 항체는 단일 VH 및 VL만이 사용되면 일가, 2개의 VH와 VL이 사용되면 2가, 2개 이상의 VH와 VL이 사용되면 다가일 수 있다. 링커를 통해 커플링된 2개의 상기 scFv 단편은 "디아바디"라 불리며, 이 역시 본 발명에 포함된다.
5.3 이특이성 항체
본 발명은 또한 하나의 특이성이 본 발명의 면역원성 RGM A 폴리펩타이드에 대한 것인, 이특이성 항체 또는 이의 항원결합부를 포함한다. 예를 들어, 이특이성 항체는 특이적으로 하나의 결합 도메인을 통해 본 발명의 면역원성 RGM A 폴리펩타이드에 결합하고 제2 결합 도메인을 통해 제2 분자에 결합하는 항체로 생성될 수 있다. 또한, 하나보다 많은 VH와 VL을 함유하는 단일쇄 항체는 본 발명의 면역원성 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하고 신경돌기 돌출 및 성장 저해 및 미엘린 매개 성장 원추 붕괴의 약화와 관련이 있는 다른 분자에 결합하는 항체로 생성될 수 있다. 이러한 이특이성 항체는 예컨대 문헌[Fanger et al. Immunol Methods 4: 72-81 (1994) 및 Wright and Harris, 20 (상기 문헌 설명 참조)]에 공지된 기술을 이용하여 생성할 수 있다.
일부 양태에서, 이특이적 항체는 본 발명의 항체 유래의 가변 영역을 하나 이상 사용하여 제조한다. 다른 양태에서, 이특이성 항체는 상기 항체 유래의 CDR 영역을 하나 이상 사용하여 제조한다.
5.4 유도체화되고 표지화된 항체
본 발명의 항체 또는 이의 항원결합 단편은 유도체화되거나 다른 분자(예: 다른 펩타이드 또는 단백질)에 연결될 수 있다. 일반적으로, 항체 또는 항원결합 단편은 유도체화 또는 표지화에 의해 본 발명의 면역원성 폴리펩타이드에 대한 결합이 역영향을 받지 않을 정도로 유도체화된다.
예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항체부는 하나 이상의 다른 분자 실체, 예컨대 다른 항체(예: 이특이성 항체 또는 디아바디), 검출 시약, 세포독성제, 약제 및/또는 다른 분자(스트렙타비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그)와 항체 또는 항원결합 단편의 연합을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩타이드에 기능적으로 연결(화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유 연합 등)될 수 있다. 또한, 항체 또는 이의 항원결합부는 하나 이상의 다른 또는 여러 단백질 또는 펩타이드와 항체 또는 항체부의 공유 또는 비공유 연합에 의해 형성된, 더 큰 면역부착 분자의 일부일 수 있다. 이러한 면역부착 분자의 예는 4량체 scFv 분자를 제조하기 위한 스트렙타비딘 코어 영역의 이용(Kipriyanov et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) 및 2가의 비오틴화된 scFv 분자를 제조하기 위한 시스테인 잔기, 마커 펩타이드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그의 이용(Kipriyanov et al. (1994) Molecular Immunology 31:1047-1058)을 포함한다. 항체부, 예컨대 Fab 및 F(ab')2 단편은 전체 항체를 파파인 또는 펩신으로 각각 분해하는 등의 통상의 기술을 이용해 완전 항체로부터 제조할 수 있다. 또한, 항체, 항체부 및 면역부착 분자는 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 수득할 수 있다.
유도체화된 항체는 2 이상의 항체(동일 종류 또는 다른 종류의 항체, 예컨대 이특이성 항체를 생성하는 것)를 가교결합시켜 생산할 수 있다. 적당한 가교제로는 2가지 상이한 반응성 기가 적당한 스페이서(예: m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스테르)에 의해 분리된 이종이작용기성 또는 동종이작용기성(예: 디석신이미딜 수베레이트)인 가교제를 포함한다. 이러한 링커들은 피어스 케미컬 컴패니(Pierce Chemical Company, Rockford, III)에서 입수할 수 있다.
또한, 유도체화된 항체는 표지화된 항체일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항체부를 유도체화할 수 있는 검출 제제는 형광 화합물, 예컨대 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 5-디메틸아민-1-나프탈렌설포닐 클로라이드, 피코에리트린, 란타나이드 인광물질 등이다. 항체는 또한 검출에 유용한 효소, 예컨대 양고추냉이 퍼옥시다제, 갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리성 포스파타제, 글루코오스옥시다제 등으로 표지화될 수 있다. 검출성 효소로 표지화된 양태에서, 항체는 효소가 이용하여 검출성 반응 산물을 생산하는 추가 시약을 첨가하여 검출한다. 예를 들어, 과산화수소 및 디아미노벤지딘과 양고추냉이 퍼옥시다제이다. 또한, 항체는 비오틴으로 표지화될 수 있고, 아비딘 또는 스트렙타비딘 결합의 간접 측정을 통해 검출할 수 있다. 또한, 항체는 제2 리포터(예: 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체의 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프: 태그)에 의해 인식되는 소정의 폴리펩타이드 에피토프로 표지화될 수 있다. RGM A 항체 또는 이의 항원 단편은 방사선표지화된 아미노산으로 표지화될 수 있다. 방사선표지는 진단용 및 치료용으로 사용될 수 있다. 방사선표지화된 RGM A 항체는 예컨대 피검체 중의 RGM A 수용체 수준을 측정하기 위해 진단용으로 사용할 수 있다. 또한, 방사선표지화된 RGM A 항체는 척수 손상을 치료하기 위해 치료용으로 사용할 수 있다.
폴리펩타이드용 표지의 예로는 다음을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다: 방사성동위원소 또는 방사성핵종(예: 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho 또는 153Sm). RGM A 항체 또는 이의 항원 단편은 또한 화학 기, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 메틸 또는 에틸 기 또는 탄수화물 기로 유도체화될 수 있다. 이러한 기들은 항체의 생물학적 특성을 향상시키는데, 예컨대 혈청 반감기 증가 또는 조직 결합을 증가시키는데 유용할 수 있다. 또한, 폴리펩타이드용 표지는 PCR로 검출하거나 유전자 발현을 증진시키기 위한 DNA와 같은 핵산, 또는 RGM A-보유 세포 또는 조직에서 유전자 발현을 억제하는 siRNA를 포함할 수 있다.
RGM A 항체의 클래스 및 서브클래스는 당업계에 공지된 임의의 방법으로 측정할 수 있다. 일반적으로, 항체의 클래스 및 서브클래스는 항체의 특정 클래스 및 서브클래스에 특이적인 항체를 이용하여 결정할 수 있다. 이러한 항체는 시중에서 입수가능하다. 클래스 및 서브클래스는 ELISA, 웨스턴 블롯 및 다른 기술을 통해 결정할 수 있다. 대안적으로, 클래스 및 서브클래스는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 도메인 전부 또는 일부를 서열분석하는 단계, 이 아미노산 서열과 공지된 각종 클래스 및 서브클래스의 면역글로불린의 아미노산 서열과 비교하는 단계, 및 항체의 클래스 및 서브클래스를 결정하는 단계를 통해 결정할 수 있다.
5.5 이중 가변 도메인 면역글로불린
본 명세서에 사용된 이중 가변 도메인(DVD) 결합 단백질 또는 면역글로불린은 2 이상의 항원 결합 부위를 함유하는 결합 단백질이고 다가 결합 단백질, 예컨대 2가 및 4가인 단백질이다. 본 명세서에 사용된 "다가 결합 단백질"이란 용어는 2 이상의 항원 결합 부위를 함유하는 결합 단백질을 의미한다. 다가 결합 단백질은 항원결합부위가 2개 이상이도록 유전자조작되는 것이 바람직하고, 일반적으로 자연발생의 항체가 아니다. "다특이성 결합 단백질"이란 용어는 2 이상의 관련 또는 무관련 표적에 결합할 수 있는 결합 단백질을 의미한다. 이러한 DVD는 하나의 항원에 결합할 수 있는 단일특이성 또는 2 이상의 항원에 결합할 수 있는 다특이성일 수 있다. 2개의 중쇄 DVD 폴리펩타이드와 2개의 경쇄 DVD 폴리펩타이드를 함유하는 DVD 결합 단백질은 DVD Ig이라 부른다. DVD Ig의 절반은 각각 중쇄 DVD 폴리펩타이드, 경쇄 DVD 폴리펩타이드 및 2개의 항원결합부위를 포함한다. 각 결합 부위는 항원결합 부위마다 항원 결합에 관여하는 CDR이 총 6개인 중쇄 가변 도메인과 경쇄 가변 도메인을 포함한다. DVD 결합 단백질 및 DVD 결합 단백질의 제조방법은 참고인용된 미국 특허출원번호 11/507,050에 개시되어 있다. 본 발명은 RGM A에 결합할 수 있는 결합 단백질을 함유하는 DVD 결합 단백질을 포함하고자 한다. DVD 결합 단백질은 RGM A와 제2 표적에 결합할 수 있는 것이 바람직하다. 제2 표적은 항 염증성 MAB 활성(IL-1, IL-6, IL-8, IL-11, IL-12,IL-17, IL-18, IL-23, TNF 알파/베타, IFN-베타, 감마, LIF, OSM, CNTF, PF-4, 혈소판 염기성 단백질(PBP), NAP-2, 베타-TG, MIP-1, MCP2/3, RANTES, 림포탁틴, 수송-중재 단백질(인슐린 수용체, 트랜스페린 수용체, 트롬빈 수용체, 렙틴 수용체, LDL 수용체), 또는 다른 신경재생 MAB(NgR, Lingo, p75, CSPG (예: NG-2, 뉴로칸(neurocan), 브레비칸(brevican), 버시칸(versican), 어그리칸(aggrecan)), 히알루론산, mAG, 테나신(tenascin), NI-35, NI-250, IMP, 퍼레칸(perlecan), 뉴로칸(neurocan), 포스파칸(phosphacan), nogo-A, OMGP, Sema4D, Sema 3A, 에프린 B3, 에프린 A2, 에프린 A5, MAG, EphA4, 플렉신 B1, TROY, wnts, ryk rec., BMP-2, BMP-4, BMP-7), 신경보호 MAB 활성(EGF, EGFR, Sema 3), 항-아밀로이드 베타 MAB(예: m266, 3D6 (바피뉴주마브(bapineuzumab)), 항-글로불로머 MABs 7C6), CNS 위치한 수용체 및 트랜스포터(세로토닌 수용체, 도파민 수용체, DAT, Asc-1, GlyT1)로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
5.6 이중 특이성 항체
또한, 본 출원은 "이중 특이성 항체" 기술을 소개한다. 이중 특이성 항체는 작용물질, 길항물질 또는 이 둘의 다른 조합으로 작용할 수 있다. 이중 특이성 항체는 VH 쇄는 제1 항원에 결합하고 VL 쇄는 다른 항원에 결합하는 항체로, WO 2008082651에 예시되어 있다.
5.7 결정화된 항체
본 발명은 다른 양태로 결정화된 결합 단백질을 제공한다. 본 명세서에 사용된 "결정화된"이란 용어는 결정 형태로 존재하는 항체 또는 이의 항원결합부를 의미한다. 결정은 고체 상태인 물질의 한 형태로, 무정형 고체 상태 또는 액정 상태와 같은 다른 형태와 상이하다. 결정은 원자, 이온, 분자(예: 항체와 같은 단백질) 또는 분자 어셈블리(예: 항원/항체 복합체)의 규칙적이고 반복적인 3차원 배열로 구성된다. 이러한 3차원 배열은 당해 분야에 잘 알려진 특정 수학적 관계에 따라 배열된다. 결정에서 반복되는 기본 단위 또는 빌딩 블록은 비대칭 단위라 불린다. 주어진 명백한 결정학적 대칭에 일치하는 배열에서 비대칭 단위의 반복은 결정의 "단위 셀"을 제공한다. 3차원 전부에서 규칙적인 해독에 의해 단위 셀의 반복은 결정을 제공한다[Giege, R. and Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ea., pp. 20 1-16, Oxford University Press, New York, New York(1999)].
본 출원은 본 명세서에 개시된 바와 같은 완전 RGM A 항체 및 이의 단편의 결정, 그리고 이러한 결정을 함유하는 제형 및 조성물을 기술한다. 한 양태에서, 결정화된 결합 단백질은 결합 단백질의 가용성 대응물보다 생체내 반감기가 더 길다. 다른 양태에서, 결합 단백질은 결정화 후 생물학적 활성을 유지한다.
본 발명의 결정화된 결합 단백질은 참고인용된 WO 02072636에 개시된 바와 같이 당업계에 공지된 방법에 따라 생산할 수 있다.
5.8 글리코실화된 항체
본 발명의 다른 양태는 항체 또는 이의 항원결합부가 하나 이상의 탄수화물 잔기를 함유하는 글리코실화된 결합 단백질을 제공한다. 초기 생체내 단백질 생산은 해독후 변형으로 알려진 추가 프로세싱을 받을 수 있다. 구체적으로, 당(글리코실) 잔기는 글리코실화로 알려진 과정인 효소적 첨가될 수 있다. 수득되는 공유 결합된 올리고사카라이드 측쇄를 보유하는 단백질은 글리코실화된 단백질 또는 당단백질로 알려져 있다. 항체는 Fc 도메인은 물론 가변 도메인에 하나 이상의 탄수화물 잔기를 보유하는 당단백질이다. Fc 도메인 내의 탄수화물 잔기는 Fc 도메인의 효과기 기능에 중요한 영향을 미치고 항체의 항원 결합 또는 반감기에 최소 영향을 미친다(R. Jefferis, Biotechnol. Prog. 21(2005), pp. 11-16). 이에 반해, 가변 도메인의 글리코실화는 항체의 항원 결합 활성에 영향을 미칠 수 있다. 가변 도메인의 글리코실화는 아마도 입체 방해로 인해 항체 결합 친화성에 좋지 않은 영향을 미칠 수 있고(Co, M.S., et al., Mol. Immunol. (1993) 30: 1361-1367), 또는 항원에 대한 친화성을 증가시킬 수 있다(Wallick, S.C., et al., Exp. Med. (1988) 168:1099-1109; Wright, A., et al., EMBO J. (1991) 10:2717 2723).
본 발명의 한 관점은 결합 단백질의 O-결합 또는 N-결합 글리코실화 부위가 돌연변이된, 글리코실화 부위 돌연변이체의 생성에 관한 것이다. 당업자는 이러한 돌연변이체를 공지된 표준 기술로 생성할 수 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 생물학적 활성은 유지하지만 결합 활성은 증가 또는 감소한 글리코실화 부위 돌연변이체이다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원결합부의 글리코실화는 변형된다. 예를 들어, 비글리코실화된 항체가 제조될 수 있다(즉, 글리코실화 결실 항체). 글리코실화는 예를 들어 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시키도록 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어 항체 서열 내의 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경시켜 실행할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역의 글리코실화 부위를 제거하여 그 부위의 글리코실화를 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 이러한 비글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시킬 수 있다. 이러한 시도는 각 전문이 참고인용된 PCR 공개번호 WO 2003 016466 A2, 및 미국 특허 5,714,350 및 6,350,861에 더 상세하게 기술되어 있다.
또한, 또는 대안적으로, 본 발명의 변형 항체는 글리코실화 종류가 변경된 항체, 예컨대 감소량의 푸코실 잔기를 보유하는 저푸코실화된 항체 또는 양분형 GlcNAc 구조가 증가된 항체로 제조될 수 있다. 이와 같은 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증되었다. 이러한 탄수화물 변형은 예컨대 변경된 글리코실화 기전을 가진 숙주 세포에서 항체를 발현시키는 방법 등으로 실행할 수 있다. 글리코실화 기전이 변경된 세포는 당업계에 기술되어 있고 본 발명의 재조합 항체를 발현하기 위해 숙주 세포로 사용되어, 글리코실화가 변경된 항체를 생산할 수 있다. 예컨대 문헌[Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, 및 유럽특허 EP 1,176,195; PCT 공보 WO 03/035835; WO 99/54342 80]을 참조한다(각 문헌은 전문이 참고인용된다).
단백질 글리코실화는 당해 단백질의 아미노산 서열 및 단백질이 발현되는 숙주 세포에 의존적이다. 다른 유기체는 다른 글리코실화 효소(예: 글리코실트랜스퍼라제 및 글리코시다제)를 생산할 수 있고 이용할 수 있는 기질(뉴클레오타이드 당)이 다르다. 이러한 요인으로 인해, 단백질 글리코실화 패턴 및 글리코실 잔기의 조성은 특정 단백질이 발현되는 숙주계에 따라 달라질 수 있다. 본 발명에 유용한 글리코실 잔기는 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스, 푸코오스, n-아세틸글루코사민 및 시알산을 포함할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 글리코실화된 결합 단백질은 글리코실화 패턴이 사람이도록 글리코실 잔기를 포함하는 것이 바람직하다.
당업자에게는 다른 단백질 글리코실화가 다른 단백질 특성을 초래할 수 있는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 효모와 같은 미생물 숙주에서 생산되고 효모 내인성 경로를 이용하여 글리코실화된 치료 단백질의 효능은, CHO 세포주와 같은 포유동물 세포에서 발현된 동일 단백질의 효능에 비해 감소될 수 있다. 이러한 당단백질은 사람 중에서 면역원성일 수 있고, 투여 후 생체내에서 감소된 반감기를 나타낼 수 있다. 사람 및 다른 동물 중의 특정 수용체는 특정 글리코실 잔기를 인식하여 혈류로부터 그 단백질의 신속한 제거를 촉진할 수 있다. 다른 부작용으로는 단백질 폴딩, 가용성, 프로테아제에 대한 민감성, 트래피킹(trafficking), 수송, 구획화, 분비, 다른 단백질 또는 인자들에 의한 인식, 항원성 또는 알러지유발성의 변화를 포함할 수 있다. 따라서, 진료의사는 특정한 글리코실화 패턴과 조성의 치료 단백질, 예컨대 사람 세포에서 또는 의도한 피검 동물의 종-특이적 세포에서 생산된 것과 동일하거나 적어도 유사한 글리코실화 조성 및 패턴의 치료 단백질을 선호할 수 있다.
숙주 세포의 단백질과 다른 글리코실화 단백질의 발현은 이종의 글리코실화 효소를 발현하는 숙주 세포를 유전자 변형시켜 달성할 수 있다. 당업계에 공지된 기술을 사용하여 진료의사는 사람 단백질 글리코실화를 나타내는 항체 또는 이의 항원결합부를 생성할 수 있다. 예를 들어, 효모 균주는 비자연 발생의 글리코실화 효소를 발현하도록 유전자 변형되었고, 이러한 효모 균주에서 생산된 글리코실화된 단백질(당단백질)은 동물 세포, 특히 사람 세포에서와 동일한 단백질 글리코실화를 나타낸다(미국 특허 출원 2004 0018590 및 2002 0137134, 및 PCT 공개번호 WO 2005100584 A2).
또한, 당업자라면 다양한 글리코실화 효소를 발현하도록 유전자조작된 숙주 세포의 라이브러리를 사용하여, 이 라이브러리의 구성 숙주 세포가 글리코실화 변형 패턴을 가진 당해의 단백질을 생산하도록 함으로써 당해의 단백질을 발현시킬 수 있음을 이해하고 있을 것이다. 진료의사는 그 다음 특별한 새로운 글리코실화 패턴을 가진 당해의 단백질을 선택하고 분리할 수 있다. 특별히 선택된 새로운 글리코실화 패턴을 가진 단백질은 증진 또는 변경된 생물학적 성질을 나타내는 것이 바람직하다.
5.9 항- 이디오타입 항체
결합 단백질 외에, 본 발명은 또한 이러한 본 발명의 결합 단백질에 특이적인 항-이디오타입(항-Id) 항체에 관한 것이다. 항-Id 항체는 다른 항체의 항원결합 영역과 일반적으로 연합된 독특한 결정인자를 인식하는 항체이다. 항-Id는 동물을 결합 단백질 또는 이의 CDR 함유 영역으로 면역화시켜 제조할 수 있다. 면역화된 동물은 면역화 항체의 이디오타입 결정인자를 인식하고 이에 반응하여 항-Id 항체를 생산할 것이다. 또한, 항-Id 항체는 "면역원"으로 사용되어 또 다른 동물에서 면역반응을 유도하여 소위 항-항-Id 항체를 생산할 수 있다.
6. 항체의 용도
사람 RGM A에 결합하는 능력이 주어지면, 본 발명의 중화 항체 또는 이의 일부는 통상적인 면역분석법, 예컨대 효소계 면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(RIA), 또는 조직 면역조직화학을 이용하여 사람 RGM A(예: 혈청 또는 혈장과 같은 생물학적 시료에서)를 검출하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 생물학적 시료를 본 발명의 항체 또는 항체부와 접촉시키는 단계 및 사람 RGM A에 결합된 항체(또는 항체부) 또는 미결합된 항체(또는 항체부)를 검출하여 생물학적 시료 중의 사람 RGM A를 검출하는 단계를 포함하여, 생물학적 시료 중의 사람 RGM A를 검출하는 방법을 제공한다. 항체는 결합 또는 미결합 항체의 검출을 용이하게 하기 위해 검출가능한 물질로 직접 또는 간접적으로 표지화될 수 있다. 검출가능한 적당한 물질로는 다양한 효소, 보결분자단, 형광 물질, 발광 물질 및 방사능활성 물질을 포함한다. 적당한 효소의 예로는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하며; 적당한 보결분자단 복합체의 예로는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴이 있고; 적당한 형광 물질의 예로는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하고; 발광 물질의 예로는 루미놀을 포함하고; 적당한 방사능활성 물질의 예로는 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho, 153Sm을 포함한다.
본 발명의 항체 및 항체부는 시험관내 및 생체내에서 사람 RGM A 활성을 중화시킬 수 있다. 따라서, 이러한 본 발명의 항체 및 항체부는 수용체 네오제닌, BMP-2 및/또는 BMP-4에 대한 RGM A의 결합을 저해하는데 사용되어, 산출되는 활성을 저해할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 피검체에서, 유리하게는 RGM A 산출 활성이 유해한 질병 또는 장애를 앓고 있는 피검체로부터 RGM A 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 모노클로날 항체의 이용을 통해, 네오제닌, 및/또는 BMP-2 및/또는 BMP-4에 대한 RGM A 결합을 방해하여, 상기 질환 또는 장애를 앓고 있는 피검체에서 RGM A 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 항체, 특히 본 명세서에 개시된 사람화된 항체는 치료 목적으로 사람 피검체에게 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 수의용으로 또는 사람 질환의 동물 모델로서 항체가 결합할 수 있는 RGM A를 발현하는 비-사람 포유동물에게 투여할 수 있다. 이와 관련하여, 동물 모델은 본 발명의 항체의 치료 효능을 평가하는데 유용할 수 있다(예컨대 투약량 및 투여 시간 과정의 검사).
본 명세서에 사용된 바와 같이, "RGM A 활성이 유해한 장애"란 용어는 이 장애를 앓고 있는 피검체에서 RGM A의 존재 또는 이로부터 산출되는 활성이 이 장애의 병태생리에 책임이 있거나 장애의 악화에 기여하는 요인인 것으로 밝혀졌거나 또는 의심되는 질환 및 여타 장애를 포함하고자 한다. 따라서, RGM A 활성이 유해한 장애는 RGM A 활성의 감소가 이 장애의 증상 및/또는 진행을 경감시키는 것으로 생각되는 장애이다. 본 발명의 항체로 치료될 수 있는 장애의 비제한적 예는 이하 본 발명의 항체의 약제학적 조성물에 관한 섹션에서 논하는 장애를 포함한다.
RGM A는 마비를 초래하는 신경변성 또는 신경변성 과정의 저해와 관련이 있는 신경계 질환을 수반하는 다양한 질환과 관련된 병리에 중요한 역할을 하는 것으로 인식되어 있다. 그 예로는 치매, 노인성 치매, 경증 인지 장애, 알츠하이머-관련 치매, 헌팅톤 무도병, 지연성이상운동증, 운동과다증, 조증, 파킨슨병, 스틸-리차드(Steel-Richard) 증후군, 다운 증후군, 중증 근육무력증, 신경 외상, 혈관 아밀로이드증, 아밀로이드증성 뇌 출혈 I, 뇌 염증, 프리드리히 실조, 급성 혼돈 장애, 녹내장, 알츠하이머병, 근위축측삭경화증, 상완신경얼기 손상, 뇌손상, 예컨대 외상성 뇌손상, 뇌성마비, 길랑바레, 백색질형성장애, 다발성경화증, 회색질척수염 후, 스피나 비피다(Spina Bifida), 척수 손상, 척추 근육 위축, 척수 종양, 졸중 및 횡단 척수염을 포함한다.
또한, 앞에서 논한 바와 같이, 전술한 파트너들 중 어느 하나 간에 이중 특이성 항체 또는 DVD 면역글로불린은 유용할 수 있다. 전술한 바와 같은 이러한 항체 제조물은 알츠하이머병, 파킨슨병, 척수 손상, 외상성 뇌 손상, 다발성경화증, 말초신경 손상, 정신분열증, 우울, 불안뿐 아니라 임의의 성형성 및 신경돌기 성장 및 앞에서 언급한 신경독성 관련 질환을 치료하는데 유용할 수 있다.
본 발명의 항체는 펩타이드와 조합되어 막관통 전달을 허용함으로써, 세포내 표적 단백질의 표적화를 포함할 수 있다. 이러한 펩타이드 서열은 tat, 안테나페디아, 폴리-아르기닌, 몇몇 항미생물성 펩타이드를 포함할 수 있고, 이에 국한되지는 않는다. 이러한 펩타이드들은 세포 원형질막을 비롯한 막, 뿐만 아니라 혈액-뇌-장벽, 위 점막, 뇌막 등을 비롯한 상피 및 내피 막을 통한 전이를 가능하게 할 수 있다.
또한, 본 발명의 항체 또는 항체부는 앞 문단에서 논한 바와 같이 RGM A 활성이 연관된 장애를 치료하는데 유용한 하나 이상의 추가 소분자 치료제와 함께 투여될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원결합부는 단독으로 사용되거나 또는 추가 제제, 예컨대 치료제와 함께 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 하고, 상기 추가 제제는 의도한 목적에 따라 당업자라면 선택할 수 있는 것이다. 예를 들어, 추가 제제는 본 발명의 항체에 의해 치료되는 질환 또는 상태를 치료하는데 유용한 것으로 당업계에 인식된 치료제일 수 있다. 또한, 추가 제제는 치료 조성물에 유익한 속성을 부여하는 제제, 예컨대 조성물의 점도에 영향을 미치는 제제일 수 있다.
7. 약제학적 조성물
또한, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 항원결합부 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 치료, 관리 또는 호전시키는데 및/또는 연구하는데 사용된다. 특정 양태에서, 조성물은 본 발명의 하나 이상의 항체를 포함한다. 다른 양태에서, 약제학적 조성물은 본 발명의 하나 이상의 항체와 RGM A 활성이 유해한 장애를 치료하기 위한 본 발명의 항체 외에 다른 하나 이상의 예방제 또는 치료제를 포함한다. 예방제 또는 치료제는 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 치료, 관리 또는 호전시키는데 유용한 것으로 공지되거나, 사용되어 왔거나, 또는 현재 사용되고 있는 것이 바람직하다. 이러한 양태에 따르면, 조성물은 추가로 담체, 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 및 항체부는 피검체에게 투여하기에 적합한 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다. 일반적으로, 약제학적 조성물은 본 발명의 항체 또는 항체부와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 명세서에 사용된 "약제학적으로 허용되는 담체"는 생리학적으로 융화성인 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항세균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수지연제 등을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예로는 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 중 하나 이상, 뿐만 아니라 이의 배합물을 포함한다. 많은 경우에 등장제, 예컨대 당, 다가알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 약제학적으로 허용되는 담체는 추가로 항체 또는 항체부의 효과 또는 저장수명을 증가시키는 습윤화제 또는 유화제, 보존제 또는 완충액과 같은 보조 물질을 소량으로 포함할 수 있다.
다양한 전달 시스템이 알려져 있으며, 본 발명의 하나 이상의 항체 또는 본 발명의 하나 이상의 항체와 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 관리, 치료 또는 호전시키는데 유용한 예방제 또는 치료제의 배합물을 투여하는데 사용될 수 있으며, 그 예로는 리포좀으로의 캡슐화, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 항체 또는 항체 단편을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체-매개의 세포내이입(예컨대, Wu and Wu, J.Biol.Chem. 262: 4429-4432(1987)), 레트로바이러스 또는 다른 벡터의 일부로서 핵산의 작제 등이 있다. 본 발명의 예방제 또는 치료제를 투여하는 방법은 비경구 투여(예: 피내, 근육내, 복강내, 정맥내 및 피하), 경막외 투여, 종양내 투여 및 점막 투여(예: 비내 및 구강 경로)를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, 폐 투여는, 에컨대 흡입기 또는 분무기의 사용, 및 에어로졸화제를 이용한 제형을 이용할 수 있다. 그 예는 본원에 전문이 참고인용되는 문헌[미국 특허 6, 019,968, 5,985, 320, 5,985,309, 5,934, 272, 5,874,064, 5,855,913, 5,290, 540, 및 4,880,078; 및 PCT 공개번호 WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, 및 WO 99/66903]을 참고한다. 한 양태에서, 본 발명의 항체, 병용 요법 또는 본 발명의 조성물은 Alkermes AIR® 폐 약물 전달 기술(Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.)로 투여한다. 특정 양태에서, 본 발명의 예방제 또는 치료제는 근육내, 정맥내, 종양내, 구강, 비내, 폐 또는 피하로 투여된다. 예방제 또는 치료제는 통상적인 임의의 경로, 예컨대 주입 또는 일시 주사로, 상피 또는 점막피부 내층(예: 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소 투여일 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명의 예방제 또는 치료제는 치료를 요하는 부위에 국소적으로 투여하는 것이 바람직할 것이며; 이는 예컨대 국소 주입, 주사, 또는 다른 이식체에 의해 달성될 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니며, 상기 이식체는 다공성 또는 비다공성 물질로, 막 및 매트릭스, 예컨대 시알라스틱(sialastic) 막, 중합체, 섬유성 매트릭스(예: Tisseel®) 또는 콜라겐 매트릭스를 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 하나 이상의 항체 길항물질의 유효량은 장애 또는 이의 증상을 예방, 치료, 관리 및/또는 호전시키기 위해 피검체의 환부에 국소적으로 투여한다. 다른 양태에서, 본 발명의 하나 이상의 항체의 유효량은 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 치료, 관리 및/또는 호전시키기 위해 피검체에게 본 발명의 항체 외에 다른 하나 이상의 치료제(예: 하나 이상의 예방제 또는 치료제)의 유효량과 함께 환부에 국소적으로 투여한다.
다른 양태에서, 예방제 또는 치료제는 제어 방출 또는 지속 방출 시스템으로 전달할 수 있다. 한 양태에서는 조절 또는 지속 방출을 달성하기 위해 펌프를 사용할 수 있다(예: Langer, 상기 문헌설명 참조; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). 다른 양태에서는 중합체 물질이 본 발명의 치료제의 조절 또는 지속 방출을 달성하기 위해 사용될 수 있다(예컨대, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; 또한 Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105); 미국 특허 5,679,377; 미국 특허 5, 916,597; 미국 특허 5,912,015; 미국 특허 5,989,463; 미국 특허 5,128,326; PCT 공개번호 WO 99/15154; 및 PCT 공개번호 WO 99/20253 참조). 지속 방출 제형에 사용되는 중합체의 예로는 폴리(2-하이드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리글리콜라이드(PLG), 폴리안하이드라이드, 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알콜), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리락타이드(PLA), 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)(PLGA) 및 폴리오르토에스테르가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 바람직한 양태에서, 지속 방출 제형에 사용된 중합체는 불활성이고 침출성 불순물이 없으며, 보관 시 안정하고, 멸균성이고 생체분해성이다. 다른 양태에서, 조절 또는 지속 방출 시스템은 예방 또는 치료 표적 부근에 처치되어, 전신 용량의 일부만을 필요로 할 수 있다(예컨대, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, 상기 문헌 참조, vol. 2, pp. 115-138 (1984)).
제어 방출 시스템은 레인저(Langer)가 문헌(1990, Science 249:1527-1533)에서 논하고 있다. 당업자에게 공지된 임의의 기술은 본 발명의 하나 이상의 치료제를 함유하는 지속 방출 제형을 생산하는데 사용할 수 있다. 예컨대, 미국 특허 4,526, 938, PCT 공개번호 WO 91/05548, PCT 공개번호 WO 96/20698, Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy &Oncology 39:179-189, Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long- Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science &Technology 50:372-397, Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, 및 Lam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760 (각 문헌은 전문이 참고인용되었다)을 참고한다.
본 발명의 조성물이 예방제 또는 치료제를 암호화하는 핵산인 특정 양태에서, 핵산은 이를 적당한 핵산 발현 벡터의 일부로서 작제하고, 레트로바이러스 벡터를 이용하거나(미국 특허 4,980,286 참조), 또는 직접 주사, 또는 마이크로입자 포격(예: 유전자 총; Biolistic, Dupont)의 이용 또는 지질이나 세포-표면 수용체 또는 형질감염제로의 코팅, 또는 핵에 유입되는 것으로 알려진 호메오박스-유사 펩타이드에 결합시켜 투여(예: Joliot et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Scis. USA 88: 1864-1868)하는 등에 의해 세포내가 되도록 투여함으로써, 생체내 투여하여 암호화된 예방제 또는 치료제의 발현을 촉진할 수 있다. 대안적으로, 핵산은 새포내 도입한 뒤, 상동 재조합에 의해 발현을 위해 숙주 세포 DNA 내로 혼입시킬 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 의도한 투여 경로에 융화성이도록 조제한다. 투여 경로의 예로는 비경구, 예컨대 정맥내, 피내, 피하, 구강, 비내(예: 흡입), 경피(예: 국소), 경점막 및 직장 투여를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 특정 양태에서, 조성물은 통상의 절차에 따라 사람에게 정맥내, 피하, 근육내, 구강, 비내 또는 표면 투여하기 위해 조정된 약제학적 조성물로 조제한다. 일반적으로, 정맥내 투여용 조성물은 멸균 등장 수성 완충액 중의 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 추가로 용해제 및 주사 부위에 통증을 경감시키기 위한 리그노캄과 같은 국소 마취제를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물이 표면 투여되어야 한다면, 조성물은 연고, 크림, 경피 패치, 로션, 젤, 샴푸, 스프레이, 에어로졸, 용액, 유탁액 또는 다른 당업자에게 공지된 형태로 조제될 수 있다[예컨대, Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995) 참조]. 분무할 수 없는 표면 투약 형태에는 표면 투여에 융화성인 하나 이상의 부형제 또는 담체를 함유하고 동적 점도가 바람직하게는 물보다 큰 점성 내지 반고체 또는 고체 형태가 일반적으로 사용된다. 적당한 제형으로는, 용액, 현탁액, 유탁액, 크림, 연고, 분말, 도찰제(liniment), 고약 등이 있으나, 이에 국한되지 않으며, 이는 필요하다면 멸균되거나 삼투압과 같은 각종 성질에 영향을 미치는 보조제(예: 보존제, 안정제, 함습제, 완충액 또는 염)와 혼합된다. 다른 적당한 표면 투약 형태로는 활성 성분이, 바람직학게는 고체 또는 액체 불활성 담체와 함께 가압 휘발성 물질(예: 기체 분사제, 예컨대 프레온)과의 혼합물로 또는 압축병에 포장된 분무가능한 에어로졸 제제를 포함한다. 보습제 또는 습윤제도 필요하다면 약제학적 조성물 및 투약 형태에 첨가될 수 있다. 이러한 추가 성분의 예는 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 방법이 조성물의 비내 투여를 포함한다면, 이 조성물은 에어로졸 형태, 스프레이, 미스트 또는 점적제 형태로 조제될 수 있다. 특히, 본 발명에 따라 사용되는 예방제 또는 치료제는 압축 팩이나 분무기로부터 적당한 분사제(예: 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적당한 기체)를 이용하여 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 가압 에어로졸인 경우, 투약 단위는 계측량을 전달하는 밸브를 제공하여 측정할 수 있다. 흡입기 또는 취입기에 사용되는 캡슐 및 카트리지(예컨대 젤라틴으로 구성됨)는 화합물의 분말 혼합물 및 락토스 또는 전분과 같은 적당한 분말 베이스를 함유하도록 조제할 수 있다.
본 발명의 방법이 경구 투여를 포함한다면, 조성물은 정제, 캡슐, 카셰, 젤캡, 용액, 현탁액 등의 형태로 경구 투여용으로 조제될 수 있다. 정제 또는 캡슐은 약제학적으로 허용되는 부형제, 예컨대 결합제(예: 예비젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스); 충진제(예: 락토오스, 미세결정형 셀룰로오스 또는 제2 인산칼슘); 윤활제(예: 마그네슘 스테아레이트, 탈크 또는 실리카); 붕해제(예: 감자 전분 또는 나트륨 전분 글리콜레이트); 또는 함습제(예: 나트륨 라우릴 설페이트)를 이용하여 통상의 수단으로 제조할 수 있다. 정제는 당업계에 공지된 방법으로 코팅할 수 있다. 경구 투여용 액체 제제는 용액, 시럽 또는 현탁액 형태일 수 있으나, 이에 국한되지 않고, 또는 사용 전에 물이나 다른 적당한 비히클로 구성하는데 사용되는 건조 산물로 제공될 수도 있다. 이러한 액체 제제는 현탁제(예: 소르비톨 시럽, 셀룰로오스 유도체 또는 수소화된 식용 지방); 유화제(예: 레시틴 또는 아카시아); 비수성 비히클(예: 아몬드유, 유성 에스테르, 에틸 알콜 또는 분별화된 식물성유); 및 보존제(예: 메틸 또는 프로필 p-하이드록시벤조에이트 또는 소르브산)와 같은 약제학적으로 허용되는 첨가제를 이용하여 통상의 수단으로 제조할 수 있다. 이 제제는 또한 완충액 염, 향미제, 착색제 및 감미제를 적당한 경우 함유할 수 있다. 경구 투여용 제제는 예방제 또는 치료제(들)의 서방형, 제어 방출형 또는 지속 방출형으로 적당히 조제할 수 있다.
본 발명의 방법은 에어로졸화 제제와 함께 조제된 조성물의 폐 투여, 예컨대 흡입기 또는 분무기에 의한 폐 투여를 포함할 수 있다. 예컨대, 미국 특허 6,019, 968, 5,985,320, 5,985,309, 5,934,272, 5,874,064, 5,855,913, 5,290,540, 및 4,880,078; 및 PCT 공개번호 WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 및 WO 99/66903(각 문헌은 전문이 참고인용된다)을 참고한다. 특정 양태에서, 본 발명의 항체, 병용 요법 및/또는 본 발명의 조성물은 Alkermes AIR® 폐 약물 전달 기술(Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.)을 이용해 투여한다.
본 발명의 방법은 주사(예: 일시 주사 또는 연속 주입)에 의한 비경구 투여용으로 조제한 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 주사용 제형은 보존제가 첨가되어 단위 투약 형태(예: 앰플 또는 다용량 용기)로 제공될 수 있다. 이 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중에 현탁액, 용액 또는 유탁액과 같은 형태를 취할 수 있고, 현탁화제, 안정제 및/또는 분산제와 같은 조제용 제제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 사용 전에 적당한 비히클(예: 멸균 발열원제거 수)로 구성되는 분말 형태일 수 있다. 본 발명의 방법은 추가로 데포(depot) 제제로 조제된 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 이러한 장기 작용성 제형은 이식(예: 피하 또는 근육내) 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어 조성물은 적당한 중합체 또는 소수성 물질(예: 허용성 오일 중의 유탁액으로서) 또는 이온교환수지를 이용하여 조제하거나, 난용성 유도체(예: 난용성 염)로 조제될 수 있다.
본 발명의 방법은 중성 형태 또는 염 형태로 조제된 조성물의 투여를 포함한다. 약제학적으로 허용되는 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등에서 유래된 음이온과 같은 음이온으로 형성된 염 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화제2철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등에서 유래된 양이온과 같은 양이온으로 형성된 염을 포함한다.
일반적으로, 조성물의 성분들은 별도로 공급되거나 함께 혼합되어 단위 투약 형태, 예컨대 활성 제제의 양을 표시한 앰플이나 사셋과 같은 밀봉 용기 중의 무수 농축물 또는 건조 동결 분말로 공급된다. 투여 방식이 주입이라면, 조성물은 멸균 약제학적 등급 수 또는 식염수를 함유하는 주입 병에 분배될 수 있다. 투여 방식이 주사라면, 투여 전에 성분들을 혼합할 수 있도록 주사용 멸균수 또는 식염수 앰플을 구비할 수 있다.
특히, 본 발명은 본 발명의 약제학적 조성물 또는 하나 이상의 예방제 또는 치료제를 제제의 양을 표시한 앰플 또는 사셋과 같은 밀봉 용기에 포장하여 제공한다. 한 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물 또는 하나 이상의 예방제 또는 치료제는 건조 멸균, 동결건조된 분말 또는 무수 농축물로서 밀봉 용기에 담아 공급되며, 피검체에게 투여하기에 적당한 농도로 복원(예: 물이나 식염수를 이용하여)될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물 또는 하나 이상의 예방제 또는 치료제는 바람직하게는 적어도 5mg, 더욱 바람직하게는 적어도 10mg, 적어도 15mg, 적어도 25mg, 적어도 35mg, 적어도 45mg, 적어도 50mg, 적어도 75mg, 또는 적어도 100mg의 단위 투약량으로 밀봉 용기에 건조 멸균 동결건조된 분말로서 공급된다. 본 발명의 동결건조된 예방제 또는 치료제 또는 약제학적 조성물은 원 용기에 2℃ 내지 8℃ 사이에서 보관될 수 있고, 본 발명의 예방제 또는 치료제, 또는 약제학적 조성물은 복원된 후 1주 내에, 바람직하게는 5일 내에, 72시간 내에, 48시간 내에, 24시간 내에, 12시간 내에, 6시간 내에, 5시간 내에, 3시간 내에 또는 1시간 내에 투여되어야 한다. 대안적 양태에서, 본 발명의 하나 이상의 예방제 또는 치료제 또는 약제학적 조성물은 제제의 양과 농도를 표시한 밀봉 용기에 액체 형태로 공급된다. 투여 조성물의 액체 형태는 바람직하게는 적어도 0.25mg/ml, 더욱 바람직하게는 적어도 0.5mg/ml, 적어도 1mg/ml, 적어도 2.5mg/ml, 적어도 5mg/ml, 적어도 8mg/ml, 적어도 10mg/ml, 적어도 15mg/ml, 적어도 25mg/ml, 적어도 50mg/ml, 적어도 75mg/ml 또는 적어도 100mg/ml로 밀봉 용기에 공급된다. 액체 형태는 원 용기에 2℃ 내지 8℃ 사이에서 보관되어야 한다.
본 발명의 항체 및 항체부는 비경구 투여에 적합한 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다. 이 항체 또는 항체부는 0.1 내지 250mg/ml 항체를 함유하는 주사가능 용액으로 제조되는 것이 바람직하다. 주사가능 용액은 플린트 또는 호박색 바이엘, 앰플 또는 예비충진된 주사기에 액체 또는 동결건조된 투약 형태로 구성될 수 있다. 완충액은 L-히스티딘(1-50mM), 경우에 따라 5-10mM, pH 5.0 내지 7.0(최적으로는 pH 6.0)일 수 있다. 다른 적당한 완충액은 석신산나트륨, 시트르산나트륨, 인산나트륨 또는 인산칼륨을 포함하나, 이에 국한되지는 않는다. 염화나트륨은 0-300mM(최적으로는 150mM, 액체 투약 형태에서) 농도로 용액의 독성을 개질시키기 위해 사용될 수 있다. 동결방지제는 동결건조 투약 형태에 포함될 수 있고, 주로 0-10% 수크로오스(최적은 0.5-1.0%)를 포함한다. 다른 적당한 동결방지제로는 트레할로스 및 락토오스를 포함한다. 충전제는 동결건조 투약 형태에 포함될 수 있고, 주로 1-10% 만니톨(최적은 2-4%)이다. 안정제는 액체 및 동결건조 투약 형태 모두에 사용될 수 있고, 주로 1-50mM L-메티오닌(최적은 5-10mM)이다. 다른 적당한 충전제는 글리신, 아르기닌을 포함하고, 0-0.05% 폴리소르베이트-80(최적은 0.005-0.01%)으로 포함될 수 있다. 추가 계면활성제는 폴리소르베이트 20 및 BRIJ 계면활성제를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 비경구 투여용 주사가능 용액으로 제조된 본 발명의 항체 및 항체부를 포함하는 약제학적 조성물은 또한 애주번트로 유용한 제제, 예컨대 치료 단백질(예: 항체)의 흡수 또는 분산을 증가시키는데 사용되는 제제를 포함할 수 있다. 특히 유용한 애주번트는 히알루로니다제, 예컨대 Hylenex®(재조합 사람 히알루로니다제)이다. 주사가능 용액에 히알루로니다제의 첨가는 비경구 투여 후, 특히 피하 투여 후 사람의 생체이용율을 향상시킨다. 또한, 주사 부위 용량을 증대(즉, 1ml 이상)시키고, 통증과 불안을 감소시키며, 주사 부위 반응의 발생빈도를 최소화할 수 있다(참고인용된 WO 2004078140, US2006104968 참조).
본 발명의 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 그 예로는 액체, 반고체 및 고체 투약 형태, 예를 들어 액체 용액(예: 주사가능 및 주입가능 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 환제, 분말, 리포좀 및 좌약을 포함한다. 바람직한 형태는 의도한 투여 방식 및 치료 적용에 따라 달라진다. 일반적으로 바람직한 조성물은 주사가능 용액 또는 주입가능 용액의 형태, 예컨대 다른 항체로 사람을 수동 면역화하는데 사용되는 것과 유사한 조성물 형태이다. 바람직한 투여 방식은 비경구(예: 정맥내, 피하, 복강내, 근육내) 방식이다. 바람직한 양태에서, 항체는 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여한다. 다른 바람직한 양태에서, 항체는 근육내 또는 피하 주사로 투여한다.
치료 조성물은 일반적으로 제조 및 보관 조건 하에 멸균성이고 안정해야 한다. 조성물은 용액, 마이크로유탁액, 분산액, 리포좀이나 또는 고농도 약물에 적합한 다른 정렬된 구조로 조제할 수 있다. 멸균 주사가능 용액은 필요한 양의 활성 화합물(즉, 항체 또는 항체부)을 필요하다면 위에서 열거한 성분 중 하나 또는 여러 성분과 함께 적당한 용매에 혼입시킨 뒤, 여과 멸균하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질과 위에서 열거한 다른 필요 성분을 함유하는 멸균 비히클에 활성 화합물을 혼입시켜 제조한다. 멸균 주사가능 용액을 제조하기 위한 멸균 동결건조 분말의 경우, 바람직한 제조방법은 사전 멸균여과된 용액으로부터 활성성분 + 임의의 바람직한 추가 성분의 분말을 생산하는 진공 건조 및 분무 건조이다. 용액의 적당한 유동성은 예컨대 레시틴과 같은 코팅을 이용하고, 분산액의 경우에는 필요한 입자 크기를 유지시키고, 계면활성제를 사용하여 유지시킬 수 있다. 주사가능 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예컨대 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 첨가하여 유도할 수 있다.
본 발명의 항체 및 항체부는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 투여할 수 있지만, 많은 치료 용도에서 바람직한 투여 경로/방식은 피하 주사, 정맥내 주사 또는 주입이다. 당업자라면 이해할 수 있듯이, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 특정 양태에서, 활성 화합물은 화합물이 빠르게 방출하지 않게 하는 담체로 제조될 수 있고, 그 예로는 제어 방출 제형, 구체적으로 이식체, 경피 패치 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템이 있다. 생체분해성, 생체융화성 중합체가 사용될 수 있고, 그 예로는 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 있다. 이러한 제형을 제조하는 다수의 방법은 특허되어 있거나 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 예컨대, 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참고한다.
특정 양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체부는 예를 들어 불활성 희석제 또는 동화성 식용 담체를 이용하여 경구 투여할 수 있다. 화합물(및 필요한 경우 다른 성분)은 또한 경질 또는 연질 외피의 젤라틴 캡슐에 봉입되거나 정제로 압축되거나 또는 피검체의 식이에 직접 첨가될 수 있다. 경구 치료 투여 시, 화합물은 부형제와 혼합되고 섭취 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여 외에 다른 방식으로 본 발명의 화합물을 투여하기 위해, 화합물은 불활성화 방지 물질로 코팅하거나 불활성화 방지 물질과 함께 공동투여하는 것이 필요할 수 있다.
또한, 보충 활성 화합물을 조성물에 첨가할 수도 있다. 특정 양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체부는 RGM A 활성이 유해한 장애를 치료하는데 유용한 하나 이상의 추가 치료제와 함께 공동조제되고/되거나 공동투여되기도 한다. 예를 들어, 본 발명의 항-RGM A 항체 또는 항체부는 다른 표적에 결합하는 하나 이상의 추가 항체(예: 사이토킨에 결합하거나 세포 표면 분자에 결합하는 항체)와 공동조제 및/또는 공동투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 하나 이상의 항체는 전술한 치료제 중 2종 이상과 함께 사용될 수 있다. 이러한 병용 요법은 투여되는 치료제의 투약량을 낮추기 위해 이용할 수 있어, 다양한 단독요법과 관련이 있는 가능한 독성 또는 합병증을 피할 수 있어 유리하다.
특정 양태에서, RGM A에 대한 항체 또는 이의 단편은 당업계에 공지된 반감기 확장 비히클에 연결된다. 이러한 비히클로는 Fc 도메인, 폴리에틸렌글리콜 및 덱스트란이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 비히클은 문헌[예컨대, 미국 특허출원 일련번호 09/428,082 및 PCT 공개번호 WO 99/25044(모든 목적에서 참고인용됨)]에 기술되어 있다.
특정 양태에서, 본 발명의 항체 또는 본 발명의 다른 예방제 또는 치료제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열은 유전자 요법으로 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 치료, 예방, 관리 또는 호전시키기 위해 투여한다. 유전자 요법은 발현된 또는 발현성 핵산을 피검체에게 투여하여 수행하는 치료법을 의미한다. 이러한 양태의 본 발명에서, 핵산은 예방 또는 치료 효과를 매개하는 본 발명의 암호화된 항체 또는 예방제 또는 치료제를 생산한다.
당업계에서 이용가능한 유전자 요법에 대한 모든 방법이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 유전자 요법에 대해 일반적인 검토를 하기 위해서는, 문헌[Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, Science 260:926- 932 (1993); 및 Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIBTECH 11(5):155-215]을 참조한다. 사용될 수 있는 재조합 DNA 기술에 대한 당업계에 공지된 방법은 문헌[Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, NY (1993); 및 Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)]에 기술되어 있다. 유전자 요법의 다양한 방법에 대한 상세한 설명은 참고인용된 US 2005 0042664 A1에 개시되어 있다.
RGM A는 앞에서 언급한 다양한 질병과 관련이 있는 병리에 중요한 역할을 한다. RGM A와 RGM 단백질은 외상성 뇌손상을 앓고 있는 사람의 병변 부위(Schwab et al., Arch. Neurol. 62: 1561-8, 2005a)에서, 졸중-손상된 사람 뇌의 코어 영역 및 경색된 경계영역(Schwab et al., Arch. Neurol. 62: 1561-8, 2005a)에서, 파킨슨병을 앓고 있는 환자의 흑색질(Bossers et al. Brain Pathology vol. 19 : 91-107, 2008)에서 상향조절되는 것으로 기술되어 있다. 따라서, RGM A 항체는 뇌 졸중, 외상성 뇌 손상, 파킨슨 병, 알츠하이머병 및 사람 신경계의 다른 신경변성 장애를 조합 치료하는데 적당한 제제이다. 졸중 환자에서 처음 3시간 내의 현행 치료는 응혈 용해를 위한 조직 플라스미노겐 활성인자의 전달(Liang et al. Arch. Neurol. 65: 1429-33, 2008)로 이루어지고, 이러한 치료는 주로 다른 치료 시도 및 더 더욱 확장된 치료 창을 제공하는 RGM A 항체 전달과 병용될 수 있다. 알츠하이머병인 경우, RGMA 항체와 병용되는 약물은 승인된 인지 증진제인 도네페질, 메만틴이 가능하고, 이러한 시도는 진행성 신경병리를 크게 감속시킬 것이다. 인슐린의 비내 전달은 주의 및 기억에 양성 영향을 미치는 바(Hanson and Frey, BMC Neurosci. 9: S5, 2008), RGM A 항체의 가능한 투여 경로로서 혈액-뇌-장벽을 우회할 수 있다. 파킨슨병(PD) 환자에서 현행 치료는 주로 도파민제, 예컨대 레보도파, 도파민 전구약물(Khor and Hsu, Curr. Clin. Pharmacol. 2:234-43, 2007), 리피니롤, 비-에르골리닉 도파민 작용제(Jost et al., J.Neurol. 255 Suppl. 5: 60-63, 2008), 모노아민 옥시다제 B 저해제 라사길린 및 세레길린(Elmer and Bertoni, Expert Opin. Pharmacother. 9: 2759-72, 2008)에 기초한다. 이 약물들은 조기 및 경증 PD에 유익한 효과가 있음에도 불구하고, 이 약물들 중 어떠한 약물도 흑색질 및 관련 피질하 및 피질 뇌 부위의 진행성 변성을 방지할 수 없고, 이에 따라 재생-자극 RGM A 항체와의 병용 요법이 상기 질환의 과정을 지연시킬 수 있다.
항산화제, 라디칼 스캐빈저, 항경련 약물, 예컨대 페니토인 또는 빈혈약 에리트로포에틴인 임의의 신경보호제는 재생촉진성 RGM A 항체와의 병용 요법에 적합하여 신경보호제의 일반적으로 매우 짧은 치료요법적 치료 창을 확장시킨다.
본 발명의 항체 및 항체부는 상기 질환을 앓고 있는 사람을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원결합부는 단독으로 또는 추가 제제, 예컨대 치료제와 함께 사용될 수 있는 이해되어야 하고, 상기 추가 제제는 당업자라면 의도된 목적에 맞게 선택할 수 있다. 예를 들어, 추가 제제는 본 발명의 항체로 치료되는 질환 또는 상태를 치료하는데 유용한 것으로 당업계에 인식되어 있는 치료제일 수 있다. 또한, 추가 제제는 치료 조성물에 유익한 속성을 부여하는 제제, 예컨대 조성물의 점도에 영향을 미치는 제제일 수 있다.
또한, 본 발명에 포함되어야 하는 배합물은 의도된 목적에 유용한 배합물인 것으로 이해되어야 한다. 앞에 제시한 제제들은 목적에 따라 예시적인 것이며 제한하려는 것이 아니다. 본 발명의 일부인 배합물은 본 발명의 항체와 앞의 목록 중에서 선택되는 적어도 하나의 추가 제제일 수 있다. 또한, 배합물은 형성된 조성물이 의도한 기능을 수행할 수 있을 정도의 배합이면 하나보다 많은 추가 제제, 예컨대 2종 또는 3종의 추가 제제를 포함할 수도 있다.
본 발명의 항체 또는 항체부와 병용될 수 있는 다발성 경화증 치료제의 비제한적 예로는, 코르티코스테로이드(corticosteroids); 프레드니솔론(prednisolone); 메틸프레드니솔론(methylprednisolone); 아자티오프린(azathioprine); 사이클로포스파미드(cyclophosphamide); 사이클로스포린(cyclosporine); 메토트렉세이트(methotrexate); 4-아미노피리딘; 티자니딘(tizanidine); 인터페론-β1a(Avonex; Biogen); 인터페론-β1b(Betaseron; Chiron/Berlex); 인터페론 α-n3) (Interferon Sciences/Fujimoto), 인터페론-α (Alfa Wassermann/J&J), 인터페론 β1A-IF (Serono/Inhale Therapeutics), 페그인터페론 α 2b (Enzon/Schering-Plough), 코폴리머 1 (Cop-1; Copaxone; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); 고압 산소; 정맥내 면역글로불린; 클라드리빈; 다른 사람 사이토킨 또는 성장 인자에 대한 항체 또는 그에 대한 길항물질 및 수용체, 예컨대 TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-23, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, 및 PDGF를 포함한다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원결합부는 세포표면분자에 대한 항체, 예컨대 CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 또는 이들의 리간드와 병용될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원결합부는 제제, 예컨대 메토트렉세이트, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코페놀레이트 모페틸, 레플루노마이드, NSAID, 예컨대 이부프로펜, 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니솔론, 포스포디에스테라제 저해제, 아데노신 작용물질, 항트롬빈제, 보체 저해제, 아드레날린성 제제, 염증촉진성 사이토킨, 예컨대 TNFα 또는 IL-1에 의한 시그널링을 방해하는 제제(예: IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나제 저해제), IL-1β 변환 효소 저해제, TACE 저해제, T-세포 시그널링 저해제, 예컨대 키나제 저해제, 메탈로프로테이나제 저해제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 안지오텐신 변환 효소 저해제, 가용성 사이토킨 수용체 및 이의 유도체(예: 가용성 p55 또는 p75 TNF 수용체, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R) 및 항염증성 사이토킨(예: IL-4, IL-10, IL-13 및 TGFβ)과 병용할 수 있다.
항체 또는 이의 항원결합부와 병용할 수 있는 다발성 경화증의 바람직한 치료제로는 예컨대 인터페론-β, 예컨대 IFNβ1a 및 IFNβ1b; 코팍손, 코르티코스테로이드, 카스파제 저해제, 예컨대 카스파제-1 저해제, IL-1 저해제, TNF 저해제 및 CD40 리간드 및 CD80에 대한 항체가 포함된다.
또한, 본 발명의 항체 또는 이의 항원결합부는 알레투주마브, 드로나비놀, 유니메드, 대클리주마브, 미토잔트론, 잘리프로덴 염산염, 팜프리딘, 글라티라머 아세테이트, 나탈리주마브, 신나비돌, a-이뮤노킨 NNSO3, ABR-215062, AnergiX.MS, 케모킨 수용체 길항물질, BBR-2778, 칼라구알린, CPI-1189, LEM(리포좀 캡슐화된 미토잔트론), THC.CBD(카나비노이드 작용물질) MBP-8298, 메소프람(PDE4 저해제), MNA-715, 항-IL-6 수용체 항체, 뉴로박스, 피르페니돈 알로트랩 1258(RDP-1258), sTNF-R1, 탈람파넬, 테리플루노미드, TGF-베타2, 티플리모티드, VLA-4 길항물질(예컨대, TR-14035, VLA4 Ultrahaler, Antegran-ELAN/Biogen), 인터페론 감마 길항물질, IL-4 작용물질과 병용할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 항체 또는 항체부의 "치료학적 유효량" 또는 "예방학적 유효량"을 포함할 수 있다. "치료학적 유효량"은 원하는 치료 결과를 달성하는데 필요한 투약량에서 필요한 시간 기간 동안의 효과적인 양을 의미한다. 항체 또는 항체부의 치료학적 유효량은 당업자에 의해 결정될 수 있고, 질병 상태, 연령, 성별 및 개체의 체중, 및 개체에서 항체 또는 항체부가 원하는 반응을 유인하는 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 치료학적 유효량은 또한 치료학적 유익 효과가 항체 또는 항체부의 임의의 독성 또는 유해 효과를 능가하는 것이다."예방학적 유효량"은 원하는 예방 효과를 달성하는데 효과적인 양, 투약량 및 필요한 시간 동안을 의미한다. 일반적으로, 예방 용량은 질병 전이나 초기에 피검체에게 사용되기 때문에, 예방학적 유효량은 치료학적 유효량보다 적을 것이다.
투약 요법은 원하는 최적 반응(예: 치료학적 또는 예방학적 반응)을 제공하도록 조정할 수 있다. 예를 들어, 단일 일시 투여할 수도 있고, 여러 분할 용량은 경시적으로 투여할 수도 있으며, 또는 치료 상황의 위급에 따라 제시된 바와 같이 비례적으로 감소 또는 증가시킬 수도 있다. 특히 투여 용이 및 투약량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투약 단위 형태로 조제하는 것이 유리하다. 본 명세서에 사용된 투약 단위 형태는 치료할 포유동물 피검체에게 단위 투약량으로서 적합한 물리적 분리 단위를 의미한다; 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 연계하여 원하는 치료 효과를 생산하는 것으로 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투약 단위 형태의 세부사항은 (a) 활성 화합물 고유의 특징 및 달성해야 하는 특별한 치료 또는 예방 효과, 및 (b) 개체의 민감성을 치료하기 위한 상기 활성 화합물을 배합하는 기술에 고유한 한계에 의해 조정되고 직접 좌우된다.
본 발명의 항체 또는 항체부의 치료학적 또는 예방학적 유효량에 대한 예시적인, 비제한적 범위는 0.1-20 mg/kg, 더욱 바람직하게는 1-10 mg/kg이다. 투약량 값은 경감되어야 하는 상태의 종류 및 중증도에 따라 달라질 수 있다는 것을 유념해야 한다. 또한, 임의의 특정 피검체에서 구체적인 투약 요법은 개체의 필요와 조성물을 투여하거나 투여를 감독하는 사람의 전문적인 판단에 따라 경시적으로 조정되어야 하고 본 명세서에 제시된 투약량 범위는 단지 예시적인 것으로, 청구하는 조성물의 범위 또는 실행을 제한하려는 것이 아니라는 것이 이해되어야 한다.
당업자에게는 본 명세서에 기술한 본 발명의 방법의 다른 적당한 변형 및 수정이 명백하며, 본 발명의 범위 또는 본 명세서에 개시된 양태를 벗어나지 않고 적당한 등가물을 이용하여 제조할 수 있다는 것을 잘 알고 있을 것이다. 이제 본 발명을 상세하게 설명했지만, 이하 예시적 목적으로 포함되는, 본 발명을 제한하려는 것이 아닌 다음 실시예를 참조로 하면 더 분명하게 이해될 것이다.
실시예 :
방법
다음 방법들은 이하 실시예 섹션에서 사용된 실험 절차를 상세하게 설명한 것이다.
(i) 직접 결합 ELISA 플레이트는 카보네이트 완충액 중에 2 ㎍/ml 농도의 hRGM A(R&D)로 코팅했다. 이 웰을 그 다음 2% 차단 용액(Bio-Rad)으로 실온에서 1시간 동안 차단했다. 비오틴화된 항체는 플레이트 아래쪽으로 0.1% BSA/PBS에 1:5 희석비로 연속 희석하고 실온에서 1시간 동안 항온처리했다. 검출 시약은 0.1% BSA/PBS 중에 1:10,000 희석율의 스트렙타비딘-HRP였다. 검출은 TMB 시약으로 수행했고, 이 반응은 2N H2SO4로 정지시켰으며, 450nM에서 OD를 판독했다.
(ii) FACS 분석. hRGM A를 과발현하는 HEK293 세포 또는 래트RGM A를 과발현하는 BAF3 세포의 안정한 형질감염체는 0.1% BSA/PBS 완충액에서 표지화되지 않은 5F9 또는 8D1 MAB로 4℃에서 15분 이상 염색 처리했다. 검출은 마우스 항-래트 IgG PE 항체로 수행했다.
(iii) hRGM A - 네오제닌 결합 분석에서 MAB 5F9를 평가하기 위한 고상 ELISA 분석
ELISA 플레이트(Immuno Plate Cert. Maxi Sorb. F96 NUNC, 439454)는 2.5 ㎍/ml 농도의 His-태그화된 사람 네오제닌 단백질의 세포외 도메인(스톡 용액의 농도: 30 ㎍/ml)으로 37℃에서 1시간 동안 코팅했다. 항온처리 후, 미결합 네오제닌은 0.02% Tween 20을 함유하는 PBS로 3회 세척 단계로 제거했다. 네오제닌-코팅된 플레이트의 차단은 3% 소혈청 알부민(BSA), PBS, Tween 20(0.02%) 차단 용액을 웰당 200 ㎕씩 첨가하여 수행했다. 37℃에서 1시간 동안 항온처리한 후, 차단 용액은 제거하고, 항체와 함께 또는 항체 없이 사람 fc 태그와 접합된 RGM A 단편 또는 전체 길이의 단백질을 첨가했다. 몇몇 실험에서, 항체는 fc-접합된 hRGM A 단백질과 실온에서 1시간 동안 예비항온처리했다. 네오제닌-코팅된 플레이트는 항체 존재 또는 부재 하에 hRGM A와 37℃에서 1시간 동안 항온처리했다. PBS-Tween 20(0.02%)을 이용한 3회의 세척 단계 후, 플레이트는 비오틴-표지화된 항-사람 fc 항체(1 mg/ml, 0.6% BSA, 0.02% Tween 20을 함유하는 PBS로 1:200 비율로 희석)(Jackson ImmunoResearch 카탈로그 번호: 709-065-149)와 37℃에서 1시간 동안 항온처리했다. 미결합 항체는 PBS-Tween 20(0.02%)로 3회 세척하여 제거했다. 비오틴-표지화된 항-fc 항체의 결합을 가시화하기 위해, 0.6% BSA, 0.02% Tween 20을 함유하는 PBS로 1:5000의 비로 희석한 스트렙타비딘-퍼옥시다제(Roche, cat.# 11089153001)로 이루어진 복합체를 첨가한 뒤, 37℃에서 1시간 동안 항온처리했다. 미결합된 퍼옥시다제-복합체는 3회 연속 세척 단계(PBS-Tween 20, 0.02%)로 제거한 뒤, 퍼옥시다제 기질(Immuno Pure TMB, Pierce # 34021)을 첨가했다. 기질 반응은 웰에 첨가한 후 1-30분 후 2.5M H2SO4로 정지시켰다. 플레이트 분석은 Anthos 광도계로 450nm의 파장에서 수행했다(OD 측정).
(iv) hRGM A - BMP-4 결합 분석에서 MAB 5F9를 평가하기 위한 고상 ELISA 분석
ELISA 분석(Immuno Plate Cert. Maxi Sorb. F96 NUNC, 439454)은 2.5 ㎍/ml 농도의 재조합 사람 BMP-4 단백질(R&D Systems, #314-BP, Lot # BEM316061)을 함유하는 용액으로 37℃에서 1시간 동안 코팅했다. 항온처리 후, 미결합 BMP-4는 0.02% Tween 20을 함유하는 PBS로 3회 세척 단계로 제거했다. BMP-4 코팅된 플레이트의 차단은 3% 소혈청 알부민(BSA), PBS, Tween 20(0.02%) 차단 용액을 웰당 200 ㎕씩 첨가하여 수행했다. 37℃에서 1시간 동안 항온처리한 후, 차단 용액은 제거하고, 항체와 함께 또는 항체 없이 사람 fc 태그와 접합된 RGM A 단편 또는 전체 길이의 단백질을 첨가했다. 몇몇 실험에서, 항체는 fc-접합된 hRGM A 단백질과 실온에서 1시간 동안 예비항온처리했다. BMP-4 코팅된 플레이트는 항체 존재 또는 부재 하에 hRGM A와 37℃에서 1시간 동안 항온처리했다. PBS-Tween 20(0.02%)을 이용한 3회의 세척 단계 후, 플레이트는 비오틴-표지화된 항-사람 fc 항체(1 mg/ml, 0.6% BSA, 0.02% Tween 20을 함유하는 PBS로 1:200 비율로 희석)(Jackson ImmunoResearch 카탈로그 번호: 709-065-149)와 37℃에서 1시간 동안 항온처리했다. 미결합 항체는 PBS-Tween 20(0.02%)로 3회 세척하여 제거했다. 비오틴-표지화된 항-fc 항체의 결합을 가시화하기 위해, 0.6% BSA, 0.02% Tween 20을 함유하는 PBS로 1:5000의 비로 희석한 스트렙타비딘-퍼옥시다제(Roche, cat.# 11089153001)로 이루어진 복합체를 첨가한 뒤, 37℃에서 1시간 동안 항온처리했다. 미결합된 퍼옥시다제-복합체는 3회 연속 세척 단계(PBS-Tween 20, 0.02%)로 제거한 뒤, 퍼옥시다제 기질(Immuno Pure TMB, Pierce # 34021)을 첨가했다. 기질 반응은 웰에 첨가한 후 1-30분 후 2.5M H2SO4로 정지시켰다. 플레이트 분석은 Anthos 광도계로 450nm의 파장에서 수행했다(OD 측정).
(v) hRGM A - BMP-2 결합 분석에서 MBA 5F9를 평가하기 위한 고상 ELISA 분석
ELISA 분석(Immuno Plate Cert. Maxi Sorb. F96 NUNC, 439454)은 2.5 ㎍/ml 농도의 재조합 사람 BMP-2 단백질(R&D Systems, #355-BM, Lot # MSA04)을 함유하는 용액으로 37℃에서 1시간 동안 코팅했다. 항온처리 후, 미결합 BMP-2는 0.02% Tween 20을 함유하는 PBS로 3회 세척 단계로 제거했다. BMP-2 코팅된 플레이트의 차단은 3% 소혈청 알부민(BSA), PBS, Tween 20(0.02%) 차단 용액을 웰당 200 ㎕씩 첨가하여 수행했다. 37℃에서 1시간 동안 항온처리한 후, 차단 용액은 제거하고, 항체와 함께 또는 항체 없이 사람 fc 태그와 접합된 RGM A 단편 또는 전체 길이의 단백질을 첨가했다. 몇몇 실험에서, 항체는 fc-접합된 hRGM A 단백질과 실온에서 1시간 동안 예비항온처리했다. BMP-2 코팅된 플레이트는 항체 존재 또는 부재 하에 hRGM A와 37℃에서 1시간 동안 항온처리했다. PBS-Tween 20(0.02%)을 이용한 3회의 세척 단계 후, 플레이트는 비오틴-표지화된 항-사람 fc 항체(1 mg/ml, 0.6% BSA, 0.02% Tween 20을 함유하는 PBS로 1:200 비율로 희석)(Jackson ImmunoResearch 카탈로그 번호: 709-065-149)와 37℃에서 1시간 동안 항온처리했다. 미결합 항체는 PBS-Tween 20(0.02%)으로 3회 세척하여 제거했다. 비오틴-표지화된 항-fc 항체의 결합을 가시화하기 위해, 0.6% BSA, 0.02% Tween 20을 함유하는 PBS로 1:5000의 비로 희석한 스트렙타비딘-퍼옥시다제(Roche, cat.# 11089153001)로 이루어진 복합체를 첨가한 뒤, 37℃에서 1시간 동안 항온처리했다. 미결합된 퍼옥시다제-복합체는 3회 연속 세척 단계(PBS-Tween 20, 0.02%)로 제거한 뒤, 퍼옥시다제 기질(Immuno Pure TMB, Pierce # 34021)을 첨가했다. 기질 반응은 웰에 첨가한 후 1-30분 후 2.5M H2SO4로 정지시켰다. 플레이트 분석은 Anthos 광도계로 450nm의 파장에서 수행했다(OD 측정).
(vi) Ntera-2 세포 배양
사람 Ntera-2 세포는 DMSZ(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig)에서 수득했다. 미분화 Ntera-2 세포의 스톡 동결물을 10% 소 태아 혈청(FBS; JRH Bioscience, Kansas, USA) 및 5% 말 혈청(HS; Sigma, Germany)을 함유하는 DMEM 배지에서 해동시켰다. 세포는 80% 융합성에 이를 때까지 배양 플라스크(Greiner, Germany)에서 증식시켰다.
뉴런 분화를 위해, Ntera-2 세포는 분화 배지(10% FBS, 5% HS, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 레틴산 10μM을 함유하는 DMEM 배지)에 2.5x106 세포/175㎠의 밀도로 접종했다. 세포는 3주 동안 분화시키고, 배지는 주당 2회 교환했다.
분화 후, 세포는 트립신-EDTA로 떼어내고, 1:6의 비로 분할했다. 48시간 후 뉴런 세포를 기저 세포로부터 가볍게 두드려 분리했다. 제거된 세포는 새 배지에서 응집시키기 위해 새 진탕 배양 플라스크(Corning, USA)로 이동시켰다. 분화된 Ntera-2 세포는 B27(Gibco), 글루타민(Gibco) 및 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 Neurobasal 배지(Gibco)에서 완만한 수평 진탕 조건 하에 37℃, 24시간 동안 응집시켰다. Ntera-2 응집물은 24웰 플레이트에 커버슬립당 약 20-30 응집물의 밀도로 접종했다. 폴리-리신 예비코팅된 커버슬립은 라미닌(20 ㎍/ml, Sigma), 및 10㎍/ml 농도의 재조합 fc-커플링된 사람 RGM A 단편 #786(아미노산 47-168)으로 코팅했다. 접종 후, 배양물은 5F9 MAB로 처리하고, 다른 3가지 농도(0.1 ㎍/ml; 1 ㎍/ml; 10 ㎍/ml)로 배양 배지에 첨가하고, 이후 Neurobasal 배지에서 37℃ 하에 24시간 동안 항온처리했다. 응집물은 그 다음 4% 파라포름알데하이드(2시간, 실온)로 고정시키고, PBS 중의 0.1% Triton X-100을 첨가하여(20분, 실온) 투과성이 되게 했다. 형광 염색을 위해 배양물은 1% BSA를 함유하는 PBS로 실온에서 1시간 동안 차단했다. 차단 후, Ntera 세포는 β-튜불린 이소타입 3(클론 SDL3D10, Sigma # T8660)에 대한 마우스 모노클로날 항체와 실온에서 2시간 동안 항온배양했다. 미결합된 항체는 3회 세척 단계(각각 5-15분)로 제거하고, Ntera 세포는 PBS/0.5% BSA 및 0.5 ㎍/ml 비스벤즈이미드에 1:350 배로 희석한 Cy-3 접합된 당나귀 항마우스 항체(Jackson ImmunoResearch Lot 62597)와 항온배양했다. 1시간 항온배양한 후, 배양물을 3회 세척하여 미결합된 2차 항체를 제거했다. 형광 검경을 위해, 커버슬립을 Fluoromount G(Southern Biotech, Eching)에 매립시켰다.
Ntera-2 응집물의 이미지는 Zeiss Axiovert 200 형광현미경으로 획득하고 배양물의 성장은 사내 이미지 획득 분석 시스템을 이용해 자동 분석했다. 성장의 자동 분석은 Image Pro Plus 4.5로 수행했고, 데이터의 통계 분석은 Graph Pad Prism 4로 수행했다. 성장은 사람 RGM A 단편 #786의 부재 하에 증식된 대조 배양물에 대해 표준화했다.
(vii) SH-SY5Y 배양
SH-SY5Y 세포(ATCC, CRL-2266)는 전이성 뇌 종양 유래의 사람 신경모세포종이다. 이 세포는 50% Earle's Balanced Salt Solution(Invitrogen Life Technologies, Cat. # 24010-043) 및 50% F12(Ham) Nutrient Mix + GlutaMAX-1(Invitrogen Life Technologies, Cat. # 31765-027)로 이루어진 배지에서 증식시켰다. 이 배지에 열불활성화된 10% 소 태아 혈청(FCS, JRH Biosciences, Kansas Cat. # 12107-1000M), 1% NEAA(MEM 비필수 아미노산 용액(Sigma-Aldrich Cat. # M1745), 및 1% 페니실린(10,000 U/ml)/스트렙토마이신(10,000 ㎍/ml)(Invitrogen Life Technologies, Cat. #15140-122)을 추가로 보충했다. 뉴런 분화 및 뉴런 증식 과정을 자극하기 위해, SH-SY5Y 세포는 10 μM 레틴산(RA, Sigma-Aldrich Cat. # R2625-050MG)을 보충한 배지에서 수일동안 배양했다. 분화된 SH-SY5Y 세포는 조직 배양 플라스크에서 증식시키고 조심스럽게 트립신처리하여 분리하고 RGM A 단백질 또는 이의 단편과 콜라겐 I을 선조 패턴으로 코팅한 유리 커버슬립 위에 도말했다.
(viii) 선조 유리 커버슬립의 제조
유리 커버슬립에서의 선조 분석의 변법은 종래 기술된 방식(Knoell et al. Nature Protocols 2: 1216-1224, 2007)과 약간 다른 방식으로 수행하고, 이하에 정리했다.
정제 단백질로 이루어진 선조(stripe)를 만들기 위한 멸균 실리콘 매트릭스를 매트릭스의 거친 면이 위를 향하게 하여 페트리 접시의 표면에 압착했다. 이 매트릭스 위에 에탄올 세척한 깨끗한 커버슬립을 적층하고 매트릭스의 모서리는 커버슬립의 이면에 잉크 볼 포인트 펜으로 표시했다. 이 커버슬립이 적층된 매트릭스는 조심스럽게 뒤집어 커버슬립이 페트리 접시의 바닥을 향하게 했다. Fc-접합된 전체 길의 저해성 RGM A 또는 이의 fc-단편 또는 재조합 사람 RGM A(R&D Systems Cat. #2459 RM)는 FITC-표지화된 항-마우스 항체(Fab-특이적 염소 항-마우스 IgG, Sigma-Aldrich Cat. #F-4018) 10㎕와 혼합하여 RGM A 선조를 가시화했다. 해밀톤 주사기를 이용해, RGM A-FITC 항체 용액 50 ㎕를 유입 채널을 통해 조심스럽게 주입했다. 과량의 유체는 배출 채널을 통해 매트릭스에서 이탈시키고 크리넥스 천으로 제거했다. 매트릭스-커버슬립을 37℃에서 2시간 동안 항온처리한 후, 1차 코팅 용액(RGM A 함유)은 PBS 100 ㎕로 세척해냈다. 다음 단계로, RGM A 선조를 보유한 커버슬립을 24웰 플레이트로 이동시키고, 500 ㎕ 콜라겐 I(래트 꼬리 콜라겐 I, Becton Dickinson Biosciences Cat. # 354236)로 코팅하여 RGM A 선조 사이의 빈 공간을 채우고 37℃에서 2시간 동안 항온처리했다. 마지막에 커버슬립 위에 RGM A와 콜라겐 I의 선조가 교대로 형성되었다. 항온처리 후, 비결합된 콜라겐 I은 3회의 세척 단계로 PBS로 세척하고 분화된 SH-SY5Y 세포를 커버슬립 위에 도말했다. 패턴화된 기질 위에서 SH-SY5Y 세포의 항온배양은 사람 RGM A에 대해 지향성인 모노클로날 항체의 존재 또는 부재 하에 37℃에서 20 내지 24시간 동안 지속했다.
면역형광 분석을 위해 세포는 4% 파라포름알데하이드로 실온에서 2시간 동안 또는 4℃에서 밤새 고정시키고, 0.1% Triton X-100을 함유하는 PBS와 실온에서 10-20분 동안 항온처리하여 투과성이 되게 했다. 3% BSA로 60분 동안 차단한 후, 세포를 1차 항체(모노클로날 항-β-튜불린 이소타입 3 클론 SDL 3D10, Sigma-Aldrich Cat. # T8660)와 실온에서 2시간 동안 항온처리하고, 수회 세척 후, 0.1% BSA 함유 PBS로 희석한 2차 항체(Cy-3 당나귀 항마우스 JacksonImmuno Research Lot: 62597)와 1시간 동안 항온처리했다. 핵은 비스벤즈이미드 H33258(Riedel-De-Haen, Cat. # A-0207)을 이용해 대비염색했다. 세포는 마지막으로 Fluoromount G(Southern Biotechnology Associates Inc.: Cat. # 010001)에 매립시켰다. 세포는 Axioplan2 형광 현미경(Zeiss)으로 분석했다.
(ix) 재조합 항 RGMA 항체의 작제 및 발현
래트 항-사람 RGMA 모노클로날 항체 5F9 및 8D1의 중쇄 가변 영역의 cDNA 단편을 암호화하는 DNA는 2개의 힌지(hinge)-영역 아미노산 돌연변이를 함유하는 사람 IgG1 불변 영역을 함유하는 pHybE 발현 벡터에 세균에서 상동 재조합을 통해 클로닝했다. 상기 돌연변이는 위치 234와 235(EU 넘버링, Lund et al., 1991, J.Immunol., 147: 2657)에서 류신이 알라닌으로 변화한 것이다. 5F9 및 8D1 모노클로날 항체의 경쇄 가변 영역은 사람 카파 불변 영역을 함유하는 pHybE 벡터에 클로닝했다. pHyb-E 벡터의 예에는 pHybE-hCk, 및 pHybE-hCg1,z,non-a를 포함한다(미국 특허출원 일련번호 61/021,282 참조). 전체 길이의 항체는 pHybE 발현 플라스미드에 연결된 키메릭 중쇄 및 경쇄 cDNA를 공동형질감염시켜 293E 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 재조합 항체를 함유하는 세포 상청액은 프로테인 A 세파로스 크로마토그래피로 정제하고 결합된 항체는 산 완충액을 첨가하여 용출시켰다. 항체를 중화시키고 PBS 내로 투석했다. 정제된 항-사람 RGMA 모노클로날 항체는 그 다음 실시예 1에 기술된 ELISA 및 실시예 7에 기술된 경쟁적 ELISA로 RGMA에 결합하는 능력에 대해 검사했다.
실시예 1: 항 사람 RGMA 모노클로날 항체의 생성
항 사람 RGMA 래트 모노클로날 항체는 다음과 같이 수득했다:
실시예 1A: 사람 RGMA 항원을 이용한 래트의 면역화
완전 프로인트 애주번트(Sigma)와 혼합한 재조합 정제된 사람 RGMA(R&D Systems Cat# 2459-RM lot MRH02511A) 25 ㎍을 6 내지 8주령의 할란 스프라그 돌리(Harlan Sprague Dawley) 래트 4마리에게 1일째 피하 주사했다. 21일, 42일 및 63일에, 불완전 프로인트 애주번트(Sigma)와 혼합한 재조합 정제된 사람 RGMA 25 ㎍을 같은 4마리의 할란 스프라그 돌리 래트에게 피하 주사했다. 144일째, 또는 165일째 래트에게 10 ㎍의 재조합 정제된 사람 RGMA를 정맥내 주사했다.
실시예 1B: 하이브리도마의 생성
실시예 1.2.A에 기술된 면역화된 래트에서 수득한 비장세포를 SP2/O- 세포와 쾰러와 밀스타인(Kohler, G. and Milstein 1975, Nature, 256:495)에 의해 확립된 방법에 따라 2:1의 비율로 융합시켜 하이브리도마를 수득했다. 융합 산물은 96웰 플레이트에 담긴 아자세린과 하이포잔틴을 함유하는 선택 배지에서 웰당 1.5x 105 비장 세포의 밀도로 평판배양했다. 융합 후 7 내지 10일 후에, 하이브리도마 콜로니가 육안으로 관찰되었다. 하이브리도마 콜로니를 함유하는 각 웰의 상청액을 사람 RGMA에 대한 항체의 존재에 대해 직접 ELISA(실시예 2 참조)로 검사했다. ELISA 양성 세포주는 사람 및/또는 래트 RGMA를 발현하는 안정한 HEK293 형질감염 세포에 대하여 FACS로 검사했다. 래트 하이브리도마 세포주는 이어서 래트 RGMA와 교차반응성에 대해 직접 ELISA로 검사하고 HuRGMA 47-168 융합 단백질에 대한 ELISA 결합을 검사했다.
항 RGMA 래트 모노클로날 항체의 결합
명칭 직접 ELISA rHuRGMA FACS HEK293 - rhRGMA 직접 ELISA rRatRGMA 직접 ELISA hRGMA 47-168/ HuIgGFc
ML68-8D1 ○ ○ × ○
ML69-5F9 ○ ○ ○ ○
실시예 2: mAb 5F9 및 8 D1 의 직접 ELISA 결합
도 1A에 제시된 것처럼, MAB 5F9 및 8D1은 상기 (i) 섹션에 기술된 바와 같은 유사한 역가로 hRGM A에 결합한다. 또한, MAB 5F9는 ELISA에서 래트 RGM A에 결합하는 것으로 관찰되었고, 이에 반해 8D1은 래트 RGM A에는 결합할 수 없었다(데이터는 미제시). 도 1B는 MAB 5F9 및 8D1이 hRGM A를 과발현하는 HEK293 세포에 결합하는 것을 FACS로 나타낸 것이다. 도 1C는 8D1이 아닌 5F9가 래트RGM A를 과발현하는 BAF3 세포에 결합할 수 있음을 FACS로 나타낸 것이다. FACS는 섹션 (ii)에 기술된 바와 같이 수행했다.
고상 ELISA 분석은 경쟁적 hRGM A-네오제닌 결합분석에서 MAB 5F9 결합을 평가하는데 사용했다. ELISA 플레이트는 본 출원의 섹션 (iii)에 기술된 바와 같이 제조하여 사용했다. hRGM A는 0.5 ㎍/ml 농도로 첨가하고 5F9 항체와 함께 37℃에서 1시간 동안 항온처리했다. MAB 5F9는 다음과 같은 농도로 사용했다: 1.25 ㎍/ml; 0.63 ㎍/ml; 0.32 ㎍/ml; 0.16 ㎍/ml; 0.08 ㎍/ml; 0.04 ㎍/ml; 0.02 ㎍/ml; 0.01 ㎍/ml. hRGM A의 결합은 비오틴-표지화된 항-fc 항체 및 스트렙타비딘-퍼옥시다제 복합체를 이용하여 가시화했다. 플레이트는 Anthos 광도계를 이용해 450nm 파장에서 분석했다(OD 측정). 도 2에 제시된 바와 같이, 3개의 최고 항체 농도는 네오제닌에 대한 전체 길이의 사람 RGM A의 결합을 용량의존적으로 저해했다.
또한, 고상 ELISA 분석은 경쟁적 hRGM A-BMP-4 결합 분석에서 MAB 5F9를 평가하는데 사용했다. ELISA 플레이트는 본 출원의 섹션 (iv)에 기술된 바와 같이 제조하여 사용했다. hRGM A는 0.5 ㎍/ml 농도로 첨가하고 5F9 항체와 함께 37℃에서 1시간 동안 항온처리했다. MAB 5F9는 다음과 같은 농도로 사용했다: 1.25 ㎍/ml; 0.63 ㎍/ml; 0.32 ㎍/ml; 0.16 ㎍/ml; 0.08 ㎍/ml; 0.04 ㎍/ml; 0.02 ㎍/ml; 0.01 ㎍/ml. hRGM A의 결합은 비오틴-표지화된 항-fc 항체 및 스트렙타비딘-퍼옥시다제 복합체를 이용하여 가시화했다. 플레이트는 Anthos 광도계를 이용해 450nm 파장에서 분석했다(OD 측정). 도 3에 제시된 바와 같이, 4개의 최고 항체 농도는 BMP-4에 대한 전체 길이의 사람 RGM A의 결합을 용량의존적으로 저해했다.
또한, 고상 ELISA 분석은 BMP-4에 대한 단편 0(47-168) hRGM의 MAB 5F9 결합 저해를 평가하는데 사용했다. ELISA 플레이트는 2.5 ㎍/ml 농도의 사람 재조합 BMP-4 단백질로 37℃에서 1시간 동안 코팅했다. hRGM A 경쇄(단편 0, 47-168)는 0.5 ㎍/ml 농도로 첨가하고 5F9 항체와 함께 37℃에서 1시간 동안 항온처리했다. MAB 5F9는 다음과 같은 농도로 사용했다: 1.25 ㎍/ml; 0.63 ㎍/ml; 0.32 ㎍/ml; 0.16 ㎍/ml; 0.08 ㎍/ml; 0.04 ㎍/ml; 0.02 ㎍/ml; 0.01 ㎍/ml. hRGM A의 결합은 비오틴-표지화된 항-fc 항체 및 스트렙타비딘-퍼옥시다제 복합체를 이용하여 가시화했다. 플레이트는 Anthos 광도계를 이용해 450nm 파장에서 분석했다(OD 측정). 도 4는 항체 농도 1.25 ㎍/ml, 0.63 ㎍/ml 및 0.32 ㎍/ml가 BMP-4에 대한 사람 RGM A 경쇄의 결합을 용량의존적으로 저해한다는 것을 묘사한다.
또한, 고상 ELISA 분석은 경쟁적 hRGM A-BMP-2 결합 분석에서 MAB 5F9 결합을 평가하는데 사용했다. ELISA 플레이트는 본 출원의 섹션 (v)에 기술된 바와 같이 제조하여 사용했다. 전체 길이 hRGM A는 0.5 ㎍/ml 농도로 첨가하고 5F9 항체와 함께 37℃에서 1시간 동안 항온처리했다. MAB 5F9는 다음과 같은 농도로 사용했다: 5 ㎍/ml; 2.5 ㎍/ml; 1.25 ㎍/ml; 0.63 ㎍/ml; 0.32 ㎍/ml; 0.16 ㎍/ml. hRGM A의 결합은 비오틴-표지화된 항-fc 항체 및 스트렙타비딘-퍼옥시다제 복합체를 이용하여 가시화했다. 플레이트는 Anthos 광도계를 이용해 450nm 파장에서 분석했다(OD 측정). 도 5는 항체 농도 5 ㎍/ml, 2.5 ㎍/ml, 1.25 ㎍/ml, 0.63 ㎍/ml이 BMP-2에 대한 전체 길이의 사람 RGM A의 결합을 저해한다는 것을 묘사한다.
또한, 고상 ELISA 분석은 hRGM A-네오제닌, hRGM A-BMP-2 및 hRGM A-BMP-4 결합 분석에서 MAB 5F9 및 8D1을 평가하는데 사용했다(도 9). 기술한 바와 같이, ELISA 플레이트는 2.5 ㎍/ml의 His-태그화된 사람 네오제닌 단백질의 세포외 도메인 또는 2.5 ㎍/ml의 BMP-2 또는 BMP-4를 이용하여 37℃에서 1시간 동안 코팅했다. 전체 길이의 fc-접합된 hRGM A는 0.5 ㎍/ml의 농도로 첨가하고 항체와 함께 37℃에서 1시간 동안 항온처리했다. MAB 5F9 및 8D1은 다음과 같은 농도로 사용했다: 5 ㎍/ml; 2.5 ㎍/ml; 1.25 ㎍/ml; 0.63 ㎍/ml; 0.32 ㎍/ml; 0.16 ㎍/ml; 0.8 ㎍/ml. hRGM A의 결합은 비오틴-표지화된 항-fc 항체 및 스트렙타비딘-퍼옥시다제 복합체를 이용하여 가시화했다. 플레이트는 Anthos 광도계를 이용해 450nm 파장에서 분석했다(OD 측정). 도 9에 제시된 바와 같이, 래트 모노클로날 항체 8D1은 사람 RGM A의 BMP-2 및 BMP-4에 대한 결합을 저해하거나 감소시키지만 네오제닌에 대한 결합은 저해할 수 없다.
실시예 3. 분화된 사람 NTera 뉴런 응집물을 이용한 신경돌기 성장 분석에서 mAb 5F9 활성
Ntera 세포는 본 출원의 방법 섹션 (vi)에 기술된 바와 같이 수득하여 배양했다. mAb 5F9는 분화된 사람 NTera 뉴런의 응집물을 이용한 신경돌기 성장 분석에서 사람 RGM A 단백질의 강력한 fc-접합된 경쇄(아미노산 47-168)의 신경돌기 성장 저해 활성을 저해했다. 도 6에 제시된 것처럼, 저해성 RGM A 단백질 또는 단편의 부재 및 성장-자극성 기질 라미닌의 존재 하에, 뉴런의 NTera 응집물은 성장성 신경돌기의 광대하고 치밀한 망구조를 보여준다(A). 또한, 도 6에는 hRGM A 경쇄의 존재는 hRGM A 단편의 강력한 저해 활성을 입증하는 NTera 신경돌기의 수, 밀도 및 길이를 급감시킨다. 응집물에 남은 몇몇 신경돌기는 짧고 단단하게 다발화되어 있다(B). 도 6의 파트 C-E는 배양물에 첨가된 MAB 5F9의 증가 농도가 hRGM A 경쇄 단편의 신경돌기-성장 저해 활성을 용량 의존적으로 중화시키거나 억제한다는 것을 보여준다. MAB 농도가 증가할수록, NTera 뉴런 응집물의 성장은 RGM A 저해제(C: 0.1 ㎍/ml MAB 5F9; D: 1㎍/ml MAB 5F9; E: 10㎍/ml MAB 5F9)의 존재에도 불구하고 완전하게 회복된다.
사람 NTera 응집물을 이용한 신경돌기 성장 분석에서 MAB 5F9의 중화 활성에 대한 정량 분석은 사람 RGM A 단백질의 강력한 fc-접합된 경쇄 저해 단편(아미노산 47-168)을 검사하기 위해 수행했다. 배양물의 성장은 응집물을 비스벤즈이미드로 염색하고 이어서 사진촬영하여 자동으로 분석했다. 염색은 성장 신경돌기가 아닌 응집물만을 표시했다. 하지만, 이들은 β3-튜불린에 대한 항체 및 형광물질-표지화된 2차 항체에는 염색되었다. 신경돌기 성장은 응집물 및 이의 돌기의 β3-튜불린 염색 영역으로부터 세포체 영역을 감하여 측정되는 지수인 신경돌기 성장 지수를 계산하여 자동 측정되었다. 이 인자는 그 다음 문헌[Lingoret al. J. Neurochme. 103: 181-189, 2007]에 기술된 바와 같이 세포체 영역으로 나누었다. 도 7은 사람 Ntera 응집물을 이용한 신경돌기 성장 분석에서 fc-접합된 강력한 hRGM A 저해제 단편(단편 0, 47-168; 10㎍)의 성장 저해 활성을 용량 의존적으로(0.1-10.0㎍) 중화시킨다는 것을 보여준다.
실시예 4. hRGM A/콜라겐 I 선조에서 mAb 5F9 활성
SH-SY5Y 세포는 본 발명의 섹션 (vii)에 기술된 바와 같이 배양하여 사용했다. RGM A 및 콜라겐 I로 선조화된 유리 커버슬립은 본 발명의 섹션 (viii)에 기술된 바와 같이 제조했다. hRGM A/콜라겐 I 및 콜라겐 I의 교대 선조를 보유한 카펫은 문헌[Knoell et al. Nature Protocols 2: 1216-1224, 2007]에 기술된 프로토콜에 따르는 실험을 위해 준비했다. 5F9 MAB의 부재 시(A), 뉴런 SH-SY5Y 세포는 이 세포의 90% 이상이 hRGM A 선조보다 콜라겐 I 선조를 선호하는, 콜라겐 I 선조에 대한 분명한 선호성을 나타낸다. MAB 5F9의 농도가 증가하면, 뉴런 SH-SY5Y 세포는 콜라겐 I 선조보다 hRGM A 선조를 선호한다(B-E). 사용된 최고 MAB 농도(E)에서 SH-SY5Y 뉴런은 콜라겐 I 선조에 비해 hRGM A 선조에 대해 강한 선호성을 나타낸다(도 8 참조). 이것은 유인 활성에서 RGM A의 저해 본질을 변형시킨 것인 바, 5F9 MAB의 독특한 특징인 것으로 해석될 수 있다. 5F9의 증가 농도의 존재 하에, 뉴런 세포는 콜라겐 I과 같은 허용성 기질이 아닌 RGM A 기질로 이동하여 그 위에서 성장하는 것을 선호한다. 이러한 독특한 특징은 종래 모노클로날 항체에 대해서 기술된 적이 없는 것이다.
실시예 5: CDR -이식 항체의 작제
당업계에 공지된 표준 방법을 적용하여 모노클로날 항체 5F9의 VH 및 VL 쇄의 CDR 서열(이하 표 5 참조)을 다른 사람 중쇄 및 경쇄 수용체 서열에 이식시킨다. VH 및 VL 서열을 본 발명의 모노클로날 항체 5F9의 VH 및 VL 서열과 정렬시켜, 다음과 같은 공지의 사람 서열을 선택했다:
a) 중쇄 수용체 서열을 작제하기 위해 VH3-48, VH3-33 및 VH3-23뿐만 아니라 인접 서열 hJH3, hJH4 및 hJH6(상기 표 3);
b) 경쇄 수용체 서열을 작제하기 위해 A17 및 A18뿐만 아니라 hJK2(상기 표 4).
5F9의 대응하는 VH 및 VL CDR을 상기 수용체 서열에 이식시켜, 다음과 같은 CDR 이식된, 사람화된 변형 VH 및 VL 서열을 제조했다(또한, 상기 표 6 참조): VH 5F9.1-GL, VH 5F9.2-GL, VH 5F9.3-GL, VH 5F9.4-GL, VH 5F9.5-GL, VH 5F9.6-GL, VH 5F9.7-GL, 및 VH 5F9.8-GL; VL 5F9.1-GL, VL 5F9.2-GL, 및 VL 5F9.3-GL.
실시예 6: CDR -이식 항체에서 프레임워크 역 돌연변이의 작제
사람화된 항체 프레임워크 역 돌연변이를 생성하기 위해, 실시예 5에 따라 제조한 CDR-이식 항체 서열에 가변 도메인의 신생 합성 및/또는 돌연변이유발성 프라이머 및 PCR, 및 당업계에 공지된 방법을 이용하여 돌연변이를 도입시킨다. 다음과 같이 각 CDR-이식체마다 다른 조합의 역돌연변이 및 다른 돌연변이를 작제한다.
중쇄 VH 5F9.1-GL, VH 5F9.2-GL 및 VH 5F9.3-GL에 대해서는 다음 버니어 및 VH/VL 계면 잔기 중 하나 이상을 다음과 같이 역돌연변이시킨다: V37→I, V48→I, S49→G 및/또는 R98→K.
중쇄 VH 5F9.4-GL, VH 5F9.5-GL 및 VH 5F9.6-GL에 대해서는 다음 버니어 및 VH/VL 계면 잔기 중 하나 이상을 다음과 같이 역돌연변이시킨다: V37→I, V48→I, A49→G, R98→K.
중쇄 VH 5F9.7-GL, VH 5F9.8-GL 및 VH 5F9.9-GL에 대해서는 다음 버니어 및 VH/VL 계면 잔기 중 하나 이상을 다음과 같이 역돌연변이시킨다: V37→I, V48→I, S49→G.
추가 돌연변이로는 다음을 포함한다:
중쇄 VH 5F9.1-GL, VH 5F9.2-GL 및 VH 5F9.3-GL에 대해: D88→A,
중쇄 VH 5F9.4-GL, VH 5F9.5-GL 및 VH 5F9.6-GL에 대해: Q1→E 및
중쇄 VH 5F9.7-GL, VH 5F9.8-GL 및 VH 5F9.9-GL에 대해: L5→V.
경쇄 VL 5F9.1-GL에 대해서는 다음 버니어 및 VH/VL 계면 잔기 중 하나 이상을 다음과 같이 역돌연변이시킨다: I2→V, M4→L, Y41→F.
경쇄 VL 5F9.2-GL에 대해서는 다음 버니어 및 VH/VL 계면 잔기 중 하나 이상을 다음과 같이 역돌연변이시킨다: M4→L, R51→L.
경쇄 VL 5F9.3-GL에 대해서는 다음 버니어 및 VH/VL 계면 잔기 중 하나 이상을 다음과 같이 역돌연변이시킨다: M4→L, Y41→F.
실시예 7: 재조합 사람화된 항 RGMA 항체의 작제 및 발현
중쇄 및 경쇄 함유 프레임워크 역 돌연변이를 수용한 pHybE 발현 벡터로 293-6E 세포에 공동형질감염시켜 상기 섹션 ix에 기술된 바와 같이 전체 길이의 사람화된 항체를 일시적으로 생산했다. 실시예 5에 따라 제조된 바와 같이 CDR-이식 항체 서열에 돌연변이는 가변 도메인의 신생 합성 및/또는 돌연변이유발성 프라이머 및 PCR, 및 당업계에 공지된 방법을 이용하여 도입시켰다. 사람화된 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 표 8에 개시한다.
구체적으로, 중쇄에서:
VH 5F9.1, VH 5F9.5 및 VH 5F9.9는 Q1→E 돌연변이를 보유한 VH 5F9.4-GL을 함유한다.
VH 5F9.2, VH 5F9.6, VH 5F9.10, VH 5F9.19, VH 5F9.20, VH 5F9.21 및 VH 5F9.22는 Q1→E 돌연변이 및 다음 버니어 및 VH/VL 계면 잔기 역돌연변이 V37→I, V48→I, A49→G, R98→K를 보유하는 VH 5F9.4-GL을 함유한다.
VH 5F9.3, VH 5F9.7 및 VH 5F9.11은 L5→V 돌연변이를 보유하는 VH 5F9.7-GL을 함유한다. VH 5F9.4, VH 5F9.8, VH 5F9.12, VH 5F9.23, VH 5F9.24, VH 5F9.25 및 VH 5F9.26은 L5→V 돌연변이 및 다음 버니어 및 VH/VL 계면 잔기 역돌연변이 V37→I, V48→I, S49→G를 보유하는 VH 5F9.7-GL을 함유한다.
경쇄에 대해:
VL 5F9.1, VL 5F9.2, VL 5F9.3 및 VL 5F9.4는 VL 5F9.1-GL과 동일하다.
VL 5F9.5, VL 5F9.6, VL 5F9.7 및 VL 5F9.8은 VL 5F9.2-GL과 동일하다.
VL 5F9.9, VL 5F9.10, VL 5F9.11 및 VL 5F9.12는 VL 5F9.3-GL과 동일하다.
VL 5F9.19 및 VL 5F9.23은 다음 버니어 및 VH/VL 계면 잔기 역돌연변이 M4→L, R51→L을 보유하는 VL 5F9.2-GL을 함유한다. VL 5F9.20 및 VL 5F9.24는 다음 버니어 및 VH/VL 계면 잔기 역돌연변이 M4→L을 보유하는 VL 5F9.2-GL을 함유한다.
VL 5F9.21 및 VL 5F9.25는 다음 버니어 및 VH/VL 계면 잔기 역돌연변이 M4→L, Y41→F를 보유하는 VL 5F9.3-GL을 함유한다. VL 5F9.22 및 VL 5F9.26은 다음 버니어 및 VH/VL 계면 잔기 역돌연변이 M4→L을 보유하는 VL 5F9.3-GL을 함유한다.
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
실시예 8: 경쟁적 ELISA 를 이용한 사람화된 5F9 항체의 특성분석
ELISA 플레이트(Costar 3369)는 0.2M 나트륨 카보네이트-바이카보네이트 완충액 중의 0.25 ㎍/ml hRGMA 용액 50 ㎕/웰로 4℃에서 밤새 코팅하고, 세척 완충액(0.1% Tween 20을 함유하는 PBS)으로 세척한 뒤, PBS 중의 2% 탈지분유 200 ㎕/웰로 실온에서 1시간 동안 차단시켰다. 세척 완충액으로 세척한 후, 비오틴화된 키메릭 5F9(0.1 ㎍/ml 최종 농도)과 표지화되지 않은 경쟁인자 검사 항체(최종 농도 50㎍/ml에서 시작해서 5배 연속 희석함)를 ELSIA 완충액 50㎕/웰에서 혼합한 혼합물을 이반복으로 첨가했다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 항온처리하고 세척 완충액으로 세척한 후, 결합된 항체는 ELISA 완충액 중의 HRP-접합된 스트렙타비딘(Fitzgerald) 1:10,000 희석물 100㎕/웰로 검출했다. 실온에서 1시간 동안 항온처리하고 세척 완충액으로 세척한 후, 발색은 TMB 완충액(Zymed) 100 ㎕/웰을 첨가하여 수행했다. 실온에서 15분 동안 항온처리한 후, 발색은 1N 염산 50 ㎕/웰을 첨가하여 정지시켰다. 흡광도는 490nm에서 판독했다.
표 9는 컴퓨터 소프트웨어 GraphPad Prism(GraphPad Software Inc., San Diego, CA)을 이용하여 수득한 사람화된 5F9 항체의 IC50 값을 나타낸 것이다.
Figure pct00014
실시예 9: BIACORE 기술을 이용한 키메릭 및 사람화된 항체의 친화성 측정
BIACORE 분석(BIACORE, Inc., Piscataway, NJ)은 온-, 오프-속도 상수의 속도론적 측정으로 항체의 친화성을 측정한다. 재조합 정제된 사람 RGMA에 대한 항체의 결합은 Biacore® 3000 기구(Biacore® AB, Uppsala, Sweden)와 전개 완충액 HBS-EP(10mM HEPES, pH 7.4, 150mM NaCl, 3mM EDTA 및 0.005% 계면활성제 P20)를 25℃에서 이용하여 표면 플라스몬 공명에 근거한 측정으로 측정했다. 모든 화학물질은 Biacore® AB(Uppsala, Sweden)로부터 수득했다. 10mM 아세트산나트륨(pH 4.5)으로 희석한 염소 항-사람 IgG, (Fcγ), 단편 특이적 폴리클로날 항체(Pierce Biotechnology Inc, Rockford, IL) 약 5000 RU는 25㎍/ml로 표준 아민 커플링 키트를 제조자의 지시와 절차에 따라 사용하여 CM5 연구등급의 바이오센서 칩을 따라 직접 고정시켰다. 바이오센서 표면 상의 미반응 잔기는 에탄올아민으로 차단시켰다. 유동 셀 2 및 4의 변형된 카르복시메틸 덱스트란 표면을 반응 표면으로 사용했다. 유동 셀 1 및 3에 염소 항-사람 IgG 없는 미변형 카르복시메틸 덱스트란은 참조 표면으로 사용했다. 염소 항-사람 IgG 특이적 반응 표면을 따라 포획을 위해 정제된 항체를 HEPES 완충 식염수에 희석했다. 리간드(25 ㎍/ml)로서 포획되는 사람 항체를 반응 매트릭스 위로 5 ㎕/분의 유속으로 주입했다. 결합 및 해리 속도 상수 kon (단위 M-1s-1) 및 koff(단위 s-1)는 25 ㎕/분의 연속 유속 하에 측정했다. 속도 상수는 0.39 - 50 nM 범위의 10가지 다른 항원 농도에서 속도론적 결합을 측정하여 수득했다. 속도론적 분석을 위해, 1:1 Langmuir 결합 모델 유래의 속도 방정식을 Biaevaluation 4.0.1 소프트웨어를 이용해 총 8가지 주입물(글로벌 핏 분석 이용)의 결합 상 및 해리 상에 동시에 적용했다. 그 다음, 사람화된 항체와 재조합 정제된 사람 RGMA 간에 반응의 평형 해리 상수(단위 M)는 식 KD = koff/kon을 통해 속도론적 속도 상수로부터 계산하여 수득했다.
[표 9]
Figure pct00015
실시예 10: 사람화된 5F9 항체는 뉴런 SH - SY5Y 화학주성 분석에서 사람 RGM A의 화학반발 활성을 중화시킨다.
화학주성 분석은 화학유인 또는 화학반발 활성을 발휘할 수 있는 확산 인자에 대한 반응으로 세포의 화학주성 행동을 측정한다. RGM A는 막 결합형(접촉 의존적 반발) 및 가용성 확산 형태(화학반발)로 작용하는 단백질로 기술되어 있고, 이에 hRGM A 화학주성 분석으로 평가해왔다. 이를 위해, RGM 수용체 네오제닌을 운반하는 RGM A-민감성 사람 신경모세포종 세포 SH-SY5Y를 이용했다(Schaffar et al. J.Neurochemistry:107: 418-431, 2008). SH-SY5Y 세포는 10% 소 태아 혈청 및 1% 비필수 아미노산(MEM-NEAA)이 보충된 Earle's 평형 염 용액/F12(EBSS/F12) 배지에서 증식시켰다. 신경돌기 성장을 유도하기 위해 세포는 10μM 레틴산(RA)이 보충된 배지에서 배양했다. 5 내지 6시간 후, 세포는 트립신처리하고 24웰 보이든 챔버(BD Falcon 351185, HTS Multiwell System)에 플레이팅하여 계수했다. 각 웰의 내부 원에 세포 현탁액 500㎕(1x105 세포에 해당)를 첨가했다. 이 내부 원은 소공 직경이 8㎛인 PET 막으로 각 웰의 큰 외원과 분리된다. 이 외원에 배지 +/- RGM A +/- 항체 600㎕를 피펫으로 주입하고 세포를 멀티웰 보이든 챔버에서 37℃ 하에 밤새 배양했다. 항온배양 후, 배지는 흡인해 낸 다음 고정제(2% 파라포름알데하이드)를 교체 투입했다. 고정은 실온에서 2시간 지속했고, PBS로 수회 세척한 후, 0.1% Triton-X-100을 함유하는 PBS를 이용하여 투과성화를 수행했다(15분, 실온). 세포의 염색은 암실에서 Alexa Fluor 488 Phalloidin 1:100(Invitrogen A12379) 및 비스벤즈이미드(H332456) 1:100의 용액에서 1시간 동안 항온배양하여 수행했다. PBS로 2회 세척한 후, 배양물에 PBS를 채우고, 파라필름으로 밀봉한 뒤, 형광현미경(Zeiss Axiovert) 분석을 위해 암실에 보관했다.
hRGM A의 부재 하에 세포는 막 소공을 통해 이동하여 고정화 및 염색 후에 계수할 수 있다. 막 바닥에 부착된 세포들만이 계수되는데, 그 이유는 이 세포들이 PET 막을 통해 이동한 것이기 때문이다. 막 윗면에 있는 세포는 고정화 절차 전에 조심스럽게 제거했다. 이러한 화학주성 분석은 hRGM A의 존재가 막을 통해 이동하는 SH-HY5Y 세포의 수를 80% 이상까지 크게 감소시킨다는 것을 증명했다. 래트 모노클로날 5F9, 키메릭 사람-래트 5F9 및 사람화된 5F9는 많은 수의 세포가 막 바닥에서 발견되는 것으로 분명해지듯이, 10 ㎍/ml에서 hRGM A의 화학반발 활성을 부분적으로 또는 완전하게 중화시켰으나, 이소타입 대조군인 래트 모노클로날 항체(p21)는 그렇지 못했다(도 10).
실시예 11: 5F9는 래트 시신경 손상 모델에서 압궤된 상해를 입은 시신경 축삭의 재생을 유도한다.
시신경 압궤(또는 시신경 손상) 모델은 시신경 섬유의 재생을 자극하고 망막 신경절 세포의 집단 세포사를 감소시키는 다양한 물질을 검사하는 동물 모델을 제공한다.
이 실험은 찰스 리버(D) 레보러토리즈(Germany)에서 입수한 성숙 비스타 래트 및 성숙 수컷 스프라그 돌리에서 수행했다. 이 동물들은 자유롭게 음식과 물을 섭취하면서 12:12시간 명/암 주기로 한 우리에서 사육했다. 시신경 압궤는 최소 전방 수술로 왼쪽 눈에만 항상 수행한다. 이것은 시신경 손상의 최소 침습성 방법이며, 사람 전방 시각 수술 방법에 따라 본 발명자들에 의해 개발되었다. 수술 처리 전 및 중에 동물은 세보플루란(Abbott GmbH Co. & KG, Delkenheim, Germany)으로 흡입 마취로 마취시키고 사지를 고정하기 위해 조클램프 및 접착 테이프를 이용해 작업대에 고정시킨다. 체온 저하를 막기 위해 동물을 가열 패드 위에 올려놓는다. 래트 시신경의 전방 압궤 수술을 위해, 왼쪽 눈에서 조심스럽게 인대와 연결 조직을 제거한다. 제1 단계로, 눈의 외측 코너에서 인접 조직의 미세수술 절단(2-3mm)을 수행했다. 그 다음, 시신경은 핀셋을 이용하여 다치지 않게 눈 근육과 눈물샘을 측면으로 이동시켜 노출시켰다. 다음 단계로, 수막을 미세가위로 세로로 개열하여 시신경을 노출시켰다.
결과적으로, 눈의 이동성이 높아지고 눈의 좌우 회전 및 남은 시신경으로의 접근이 가능해진다. 이 시신경을 핀셋을 이용해 20-30초 동안 고정된 최대 압력을 제공해 눈 뒤로 약 1 내지 3mm 손상시킨다. 눈으로 혈관 공급이 훼손되지 않도록 특별한 주의가 필요하다.
항체 및 완충 용액의 국소 투여
시신경의 압궤 손상 후, 수컷 스프라그 돌리 래트에게 5F9 항체(n=10마리), 8D1 대조 항체(n=10마리) 또는 비히클 대조군 PBS(n=10마리)를 국소 처리했다. 실험자들은 다른 처리 그룹에 대해 맹검 실험을 수행했다. 국소 항체 적용을 위해, 작은 젤폼 조각(길이: 2.5mm, 폭: 2.5mm, 높이: 2.5mm)을 10mg/ml 항체 용액 20 ㎕ 또는 PBS 20 ㎕에 침지시키고, 시신경 병변 부위 가까이에 두었다. 최소 침습성 수술 및 항체 적용 후, 동물은 움직이기 시작할 때까지 체온을 조절하기 위해 온열 장치 위에 놓은 깨끗한 우리의 종이 타월 위에 두었다. 세균 감염 및 공막의 건조를 피하기 위해 눈 위에 항생제(Gentamytrex, Dr. Mann Pharma)를 함유하는 연고를 적용했다. 수술 후 통증 치료를 위해 수술 직후와 그 다음 3일 기간 동안 매일 2회씩 카프로펜(Rimadyl, 5mg/kg, Pfizer GmbH, Karlsruhe)을 복강내 적용했다. 수술 직후와 다음 날까지 몇 시간마다 규칙적으로 동물을 관찰하고 관리하여 모든 동물이 생존하고 마취와 수술로부터 회복될 수 있게 했다. 수술 및 항체/비히클 적용 후 5주 후에 동물을 과용량의 나르코렌(40-60mg/kg)으로 마취한 뒤, 심장에 4% 파라포름알데하이드 용액을 주사하여 관류시켰다. 시신경을 분리하여 실온에서 1시간 동안 4% 파라포름알데하이드 용액으로 옮겨 조직이 적당히 고정되도록 했다. 고정후, 래트 시신경은 30% 수크로오스 용액(4℃)에 밤새 보관했다. 다음날, 시신경은 Tissue Tek에 매립시키고 동결한 뒤, Cryostat를 이용해 두께 16㎛의 세로 절편을 수득했다.
면역염색을 위해 시신경 절편을 저온(-20℃) 아세톤(10분)으로 고정시키고, Tris 완충 식염수(TBS, Fluka 93312)로 3x(5분) 세척한 뒤, 5% 소 혈청 알부민 및 1% Triton-X-100을 함유하는 TBS(30분)로 실온에서 차단 및 투과성화시켰다. 잔류 BSA 및 세제는 TBS 세척 단계(각각 5분)로 2회 제거했다. 절편은 5% BSA/TBS 용액에 1:100으로 희석한 폴리클로날 토끼 항-GAP-43 항체(Abcam, ab7562)와 실온에서 1시간 동안 항온처리했다. TBS, 0.1% Tween으로 3회 세척 후, 절편을 세포 핵의 가시화를 위해 1:100 희석율의 비스벤즈이미드(H33258, 50㎍/ml)를 함유하는 5% BSA/TBS으로 1:1000으로 희석한 Alexa Fluor 488-접합된 염소 항-토끼 2차 항체(Moelcular Probes A 11034)로 실온에서 1시간 동안 항온처리했다. 매립 전에, 염색된 절편은 TBS 0,1% Tween(각 단계당 5분) 및 증류수로 3회 세척했다. 절편은 Fluoromount G에 매립하고 커버슬립을 덮은 후 현미경 증거자료를 위해 암실에 보관했다.
염색된 세로 절편의 Zeiss 형광 현미경 이미지(도 11)는 Zeiss Axiovison 소프트웨어로 보관했다. 각 신경의 단일 영상을 띄워 포토샵 이미지 분석 소프트웨어(Adobe)로 분석했다. 정량 분석은 시신경의 합성 이미지를 이용해 2가지 다른 방식으로 수행했다. 병변 부위의 GAP-43 양성 면적은 Axiovision 소프트웨어를 이용해 측정했다(도 12B). 이러한 1차 정량 분석과 무관하게 단일 재생 섬유(GAP-43 양성)는 4개의 다른 영역, 즉 압궤 부위 상에 0-200 ㎛, 200-400 ㎛, 400-600㎛ 및 600-1200㎛ 범위에서 계수했다. 데이터 분석과 데이터의 통계적 평가는 Graphpad Prism 소프트웨어의 도움을 받아 수행했다(도 12A).
항체 및 완충 용액의 전신 투여
전신 항체 전달을 위해, 수컷 위스타 래트에게 5F9 항체(n=10마리) 또는 비히클 대조군 PBS(n=10마리)를 전신(복강내, ip 또는 정맥내, iv)로 처리했다. 동물에게 2회 주사했고, 주사는 신경 압궤를 유도한 직후 0일째 및 압궤 후 21일째에 실시했다. 제공한 항체 용량은 0일에 2mg/kg, 21일에 10mg/kg이었다. 압궤 손상 후 5주 후에 동물을 희생시키고 조직 분리, 절편 제조, 염색 및 정량 분석을 전술한 바와 같이 수행했다. 앞에서와 같이, 실험자는 2가지 다른 처리 그룹에 대해 알지 못했다. 래트 시신경의 합성 이미지는 도 13에 제시했다. 5F9 처리 동물(A)에서는 압궤 부위 상에 다수의 GAP-43 양성 섬유가 뻗어있고, 이에 반해 PBS 처리된 대조 동물(B)에서는 그렇지 않았다. 압궤 부위는 왼쪽 가장자리에 위치하고 재생 섬유는 GAP-43에 대한 항체로 염색되었다. 5F9-처리된 동물에서는 PBS 동물과 달리 시신경의 상부 및 하부 둘레에서 많은 섬유가 관찰되었다.
비히클 대조군 PBS와 달리 5F9는 재생 GAP-43 양성 섬유의 수를 크게 증가시켰다. 300 ㎛ 내지 1800 ㎛ 거리에서는 비히클 처리된 동물에서보다 5F9 처리된 동물에서 훨씬 많은 섬유(p<0.001)가 발견되었다. 동물을 0일과 21일에 각각 2mg/kg 및 10mg/kg의 5F9로 처리했다. 항체 또는 비히클은 복강내 또는 정맥내로 제공했다. 그룹당 9마리를 분석하여 데이터를 수득했다. 동물마다 3개의 연속 냉동미세절단기 절편을 분석했다(도 14A).
두번째 실험에서는 수컷 위스타 래트를 시신경 손상 후 5F9 항체(n=10마리), 8D1 대조 항체(n=10마리) 또는 비히클 대조군 PBS(n=10마리)로 전신(iv)으로 처리했다. 2주에 한번씩 래트에서 항체 2mg/kg을 정맥내로 제공하고 주사는 시신경 압궤 후 즉시 시작했다. 모든 래트에게 4회 주사하고 압궤 손상 후 5주째 안락사시켰다. 실험자들은 맹검 실험하고 조직 처리 및 정량 분석을 전술한 바와 같이 수행했다. 비히클 대조군 PBS와 달리 5F9는 재생성 GAP-43 양성 섬유의 수를 크게 증가시켰다. 비히클 또는 대조 항체 처리된 동물과 달리 5F9 처리된 동물에서는 200 ㎛ 내지 1400 ㎛ 거리에서 유의적으로 많은 섬유(p<0.001)가 관찰되었다. 동물에게 0일부터 4주 동안 매주 1회씩 5F9(2mg/kg/용량), 대조 항체 8D1(2mg/kg/용량) 또는 PBS를 정맥내 처리했다(도 14B).
실시예 11: 5F9는 시신경 손상된 래트 모델에서 압궤 상해를 입은 시신경 축삭의 재미엘린화를 유도한다.
희소돌기아교세포 및 미엘린의 마커는 미엘린-염기성 단백질(MBP)이다. MBP에 대해 유도된 항체는 여러 처리 그룹에서 재수초화에 차이가 나타나는지의 문제를 해결하는데 사용되었다. 재수초화 과정을 가시화하기 위해 전신 처리된 동물의 시신경 절편을 저온(-20℃) 아세톤(10분)으로 고정시키고, Tris 완충 식염수(TBS, Fluka 93312)로 3x 세척(5분)한 뒤, 5% 소 혈청 알부민과 1% Triton-X-100을 함유하는 TBS(30분)로 실온에서 차단 및 투과성화시켰다. 잔류 BSA 및 세제는 TBS 세척 단계(각각 5분)로 2회 제거했다. 절편은 5% BSA/TBS 용액에 1:50으로 희석한 폴리클로날 토끼 항-MBP 항체(Abcam, ab2404)와 4℃에서 3시간 또는 밤새 항온처리했다. TBS, 0.1% Tween으로 3회 세척 후, 절편을 세포 핵의 가시화를 위해 1:100 희석율의 비스벤즈이미드(H33258, 50㎍/ml)를 함유하는 5% BSA/TBS로 1:1000으로 희석한 Alexa Fluor 488-접합된 염소 항-토끼 2차 항체(Moelcular Probes A 11034)로 실온에서 1시간 동안 항온처리했다. 매립 전에, 염색된 절편은 TBS 0,1% Tween(각 단계당 5분) 및 증류수로 3회 세척했다. 절편은 Fluoromount G에 매립하고 커버슬립을 덮은 후 현미경 증거자료를 위해 암실에 보관했다.
염색된 세로 절편의 Zeiss 형광 현미경 이미지는 Zeiss Axiovison 소프트웨어로 보관했다. 각 신경의 단일 영상을 띄워 포토샵 이미지 분석 소프트웨어(Adobe)로 분석했다. 정량 분석은 시신경의 합성 이미지를 이용해 2가지 다른 방식으로 수행했다. 병변 부위의 MBP-양성 면적은 Axiovision 소프트웨어를 이용해 측정했다. 데이터 분석과 데이터의 통계적 평가는 Graphpad Prism 소프트웨어의 도움을 받아 수행했다.
동물은 0일과 21일에 각각 2mg/kg 및 10mg/kg의 5F9로 처리했다. 항체 또는 비히클은 복강내 또는 정맥내로 제공했다.
래트 시신경의 합성 이미지
미엘린화는 미엘린 마커인 미엘린 염기성 단백질 MBP에 대해 지향성인 항체를 이용하여 가시화한다. 압궤 부위는 합성 신경의 중간에 위치하고 이 영역은 비히클 처리된 대조 동물(A 및 B)에는 없다. 5F9 처리된 동물(C 및 D)에서 많은 MBP 양성 구조는 시신경의 중간 영역(압궤 중심)에서 관찰된다(도 15).
미엘린화는 미엘린 마커인 미엘린 염기성 단백질 MBP에 대하여 지향성인 항체를 이용하여 가시화한다. MBP 면적은 Zeiss Axiovison 소프트웨어로 측정했다. M1과 M2는 2가지 독립 측정값이고, M은 측정된 MPB-양성 면적의 평균이다. 5F9는 유의적으로(비히클 대조군에 대해 p<0.001) 시신경 압궤 부위의 MBP 면적을 3.5배 증가시킨다(도 16).
<110> Abbott GmbH & Co. KG Abbott Laboratories <120> Monoclonal antibodies against the RGM A protein and uses thereof <130> M/49229-PCT <150> US 61/032,707 <151> 2008-02-29 <150> US 61/090,743 <151> 2008-08-21 <160> 68 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1353 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1353) <400> 1 atg cag ccg cca agg gag agg cta gtg gta aca ggc cga gct gga tgg 48 Met Gln Pro Pro Arg Glu Arg Leu Val Val Thr Gly Arg Ala Gly Trp 1 5 10 15 atg ggt atg ggg aga ggg gca gga cgt tca gcc ctg gga ttc tgg ccg 96 Met Gly Met Gly Arg Gly Ala Gly Arg Ser Ala Leu Gly Phe Trp Pro 20 25 30 acc ctc gcc ttc ctt ctc tgc agc ttc ccc gca gcc acc tcc ccg tgc 144 Thr Leu Ala Phe Leu Leu Cys Ser Phe Pro Ala Ala Thr Ser Pro Cys 35 40 45 aag atc ctc aag tgc aac tct gag ttc tgg agc gcc acg tcg ggc agc 192 Lys Ile Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala Thr Ser Gly Ser 50 55 60 cac gcc cca gcc tca gac gac acc ccc gag ttc tgt gca gcc ttg cgc 240 His Ala Pro Ala Ser Asp Asp Thr Pro Glu Phe Cys Ala Ala Leu 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gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag 672 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 210 215 220 gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg 720 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 225 230 235 240 tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat 768 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 245 250 255 ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc 816 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 260 265 270 atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag 864 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 275 280 285 gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc 912 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 290 295 300 agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg 960 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 305 310 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Cys 50 55 60 Ala Ala Leu Arg Ser Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr 65 70 75 80 Cys Arg Gly Asp Leu Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp 85 90 95 Leu Met Ser Gln His Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gln Pro 100 105 110 Arg Leu Arg Thr Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Asp 115 120 125 Ser Pro Glu Ile Cys His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala 130 135 140 Thr Pro Asn Tyr Thr His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Leu Asn Ser Ala 145 150 155 160 Asp Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 165 170 175 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 180 185 190 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 195 200 205 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 210 215 220 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 225 230 235 240 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 245 250 255 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 260 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Lys Leu Gly Thr Glu Leu Gly Ser Thr Ser Pro Val Trp Trp Asn Ser 35 40 45 gca gat atc aca agt ttg tac aaa aaa gca ggc tcc ccg tgc aag atc 192 Ala Asp Ile Thr Ser Leu Tyr Lys Lys Ala Gly Ser Pro Cys Lys Ile 50 55 60 ctc aag tgc aac tct gag ttc tgg agc gcc acg tcg tca ggc agc cac 240 Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala Thr Ser Ser Gly Ser His 65 70 75 80 gcc cct gcc tct gac gac gtg ccc gag ttc tgt gct gcc ctg cgc acc 288 Ala Pro Ala Ser Asp Asp Val Pro Glu Phe Cys Ala Ala Leu Arg Thr 85 90 95 tac gcc ctg tgc acg cga cgg aca gcc cgc acc tgc cgg ggc gac ctg 336 Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr Cys Arg Gly Asp Leu 100 105 110 gct tac cac tcg gct gtc cat ggc ata gag gac ctc atg agc cag cac 384 Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp Leu Met Ser Gln His 115 120 125 aac tgc tcc aag gat ggc ccc acc tca cag cct cga gtg cgc acg ctc 432 Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gln Pro Arg Val Arg Thr Leu 130 135 140 ccg cca gct ggg gac agc cag gag cgc tca gat agc ccc gag atc tgc 480 Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Asp Ser Pro Glu Ile Cys 145 150 155 160 cac tat gag aag agt ttc cac aag cac tca gct gcc ccc aac tac act 528 His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala Ala Pro Asn Tyr Thr 165 170 175 cac tgc ggc ctc ttt ggg gac cca cac ctc agg act ttc aca gac cac 576 His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Pro His Leu Arg Thr Phe Thr Asp His 180 185 190 ttc cag aca tgt aag gtg caa ggc gct tgg cct ctc atc gac aat aat 624 Phe Gln Thr Cys Lys Val Gln Gly Ala Trp Pro Leu Ile Asp Asn Asn 195 200 205 tac ctg aac gtg cag gtc acc aat aca cct gtg ctg ccc ggc tct gcc 672 Tyr Leu Asn Val Gln Val Thr Asn Thr Pro Val Leu Pro Gly Ser Ala 210 215 220 gcc act gcc acc agc aag ctc acc atc atc ttc aag aac ttc caa gag 720 Ala Thr Ala Thr Ser Lys Leu Thr Ile Ile Phe Lys Asn Phe Gln Glu 225 230 235 240 tgt gtg gac cag aaa gta tac caa gcc gag atg gac gag ctt ccg tcc 768 Cys Val Asp Gln Lys Val Tyr Gln Ala Glu Met Asp Glu Leu Pro Ser 245 250 255 gcc ttt gcc gat ggc tcc aaa aac ggt gga gat aaa cac gga gcc aac 816 Ala Phe Ala Asp Gly Ser Lys Asn Gly Gly Asp Lys His Gly Ala Asn 260 265 270 agc ctg aag atc aca gag aag gtg tca ggc cag cac gtg gag atc cag 864 Ser Leu Lys Ile Thr Glu Lys Val Ser Gly Gln His Val Glu Ile Gln 275 280 285 gcc aag tac atc ggc acc acc atc gtg gtg aga cag gtg ggc cgc tac 912 Ala Lys Tyr Ile Gly Thr Thr Ile Val Val Arg Gln Val Gly Arg Tyr 290 295 300 ctg acc ttc gcc gtc cgg atg ccc gag gag gta gtc aac gcc gtg gag 960 Leu Thr Phe Ala Val Arg Met Pro Glu Glu Val Val Asn Ala Val Glu 305 310 315 320 gac cgt gac agc caa ggc ctc tac ctc tgc ctg cgg ggc tgc ccg ctc 1008 Asp Arg Asp Ser Gln Gly Leu Tyr Leu Cys Leu Arg Gly Cys Pro Leu 325 330 335 aac cag cag atc gac ttc cag gct ttc cgt gcc aac gcc gag agc cct 1056 Asn Gln Gln Ile Asp Phe Gln Ala Phe Arg Ala Asn Ala Glu Ser Pro 340 345 350 cgc agg cca gca gct gcc agc ccc tct cct gtg gtc ccc gag aca ttt 1104 Arg Arg Pro Ala Ala Ala Ser Pro Ser Pro Val Val Pro Glu Thr Phe 355 360 365 ccg tac gag aca gct gtg gcc aag tgc aaa gag aag ctg cct gta gaa 1152 Pro Tyr Glu Thr Ala Val Ala Lys Cys Lys Glu Lys Leu Pro Val Glu 370 375 380 gac ttg tac tac cag gcc tgt gtc ttc gac ctc ctc acg act ggc gac 1200 Asp Leu Tyr Tyr Gln Ala Cys Val Phe Asp Leu Leu Thr Thr Gly Asp 385 390 395 400 gtg aac ttc acg ctg gcc gcc tac tat gct ttg gag gat ggc aag atg 1248 Val Asn Phe Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Ala Leu Glu Asp Gly Lys Met 405 410 415 ctc cac tcc aac aag gac aag cta cac ctg ttt gaa agg act cgg gag 1296 Leu His Ser Asn Lys Asp Lys Leu His Leu Phe Glu Arg Thr Arg Glu 420 425 430 ctg cct gac cca gct ttc ttg tac aaa gtg gtg ata tcc agc aca gtg 1344 Leu Pro Asp Pro Ala Phe Leu Tyr Lys Val Val Ile Ser Ser Thr Val 435 440 445 gcg gcc gct cga gga ggg ccc gaa caa aaa ctc atc tca gaa gag gat 1392 Ala Ala Ala Arg Gly Gly Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp 450 455 460 ctg aat agc gcc gtc gac cat cat cat cat cat cat tga 1431 Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His 465 470 475 <210> 8 <211> 476 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 8 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr 20 25 30 Lys Leu Gly Thr Glu Leu Gly Ser Thr Ser Pro Val Trp Trp Asn Ser 35 40 45 Ala Asp Ile Thr Ser Leu Tyr Lys Lys Ala Gly Ser Pro Cys Lys Ile 50 55 60 Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala Thr Ser Ser Gly Ser His 65 70 75 80 Ala Pro Ala Ser Asp Asp Val Pro Glu Phe Cys Ala Ala Leu Arg Thr 85 90 95 Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr Cys Arg Gly Asp Leu 100 105 110 Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp Leu Met Ser Gln His 115 120 125 Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gln Pro Arg Val Arg Thr Leu 130 135 140 Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Asp Ser Pro Glu Ile Cys 145 150 155 160 His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala Ala Pro Asn Tyr Thr 165 170 175 His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Pro His Leu Arg Thr Phe Thr Asp His 180 185 190 Phe Gln Thr Cys Lys Val Gln Gly Ala Trp Pro Leu Ile Asp Asn Asn 195 200 205 Tyr Leu Asn Val Gln Val Thr Asn Thr Pro Val Leu Pro Gly Ser Ala 210 215 220 Ala Thr Ala Thr Ser Lys Leu Thr Ile Ile Phe Lys Asn Phe Gln Glu 225 230 235 240 Cys Val Asp Gln Lys Val Tyr Gln Ala Glu Met Asp Glu Leu Pro Ser 245 250 255 Ala Phe Ala Asp Gly Ser Lys Asn Gly Gly Asp Lys His Gly Ala Asn 260 265 270 Ser Leu Lys Ile Thr Glu Lys Val Ser Gly Gln His Val Glu Ile Gln 275 280 285 Ala Lys Tyr Ile Gly Thr Thr Ile Val Val Arg Gln Val Gly Arg Tyr 290 295 300 Leu Thr Phe Ala Val Arg Met Pro Glu Glu Val Val Asn Ala Val Glu 305 310 315 320 Asp Arg Asp Ser Gln Gly Leu Tyr Leu Cys Leu Arg Gly Cys Pro Leu 325 330 335 Asn Gln Gln Ile Asp Phe Gln Ala Phe Arg Ala Asn Ala Glu Ser Pro 340 345 350 Arg Arg Pro Ala Ala Ala Ser Pro Ser Pro Val Val Pro Glu Thr Phe 355 360 365 Pro Tyr Glu Thr Ala Val Ala Lys Cys Lys Glu Lys Leu Pro Val Glu 370 375 380 Asp Leu Tyr Tyr Gln Ala Cys Val Phe Asp Leu Leu Thr Thr Gly Asp 385 390 395 400 Val Asn Phe Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Ala Leu Glu Asp Gly Lys Met 405 410 415 Leu His Ser Asn Lys Asp Lys Leu His Leu Phe Glu Arg Thr Arg Glu 420 425 430 Leu Pro Asp Pro Ala Phe Leu Tyr Lys Val Val Ile Ser Ser Thr Val 435 440 445 Ala Ala Ala Arg Gly Gly Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp 450 455 460 Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His 465 470 475 <210> 9 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH 5F9 <220> <221> misc_feature <222> (62)..(62) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Xaa Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 113 <212> 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Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 21 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH3-33/JH6 FR! <400> 21 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 22 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH3-33/JH6 FR2 <400> 22 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 1 5 10 <210> 23 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH3-33/JH6 FR3 <400> 23 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 24 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH3-23/JH3 FR1 <400> 24 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 25 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH3-23/JH3 FR2 <400> 25 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10 <210> 26 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH3-23/JH3 FR3 <400> 26 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys 20 25 30 <210> 27 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> A18/JK2 FR1 <400> 27 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys 20 <210> 28 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> A18/JK2 FR2 <400> 28 Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 29 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> A18/JK2 FR3 <400> 29 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> A18/JK2 FR4 <400> 30 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 1 5 10 <210> 31 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> A17/JK2 FR1 <400> 31 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys 20 <210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> A17/JK2 FR2 <400> 32 Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 33 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> A17/JK2 FR3 <400> 33 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 34 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH 5F9 <400> 34 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 35 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH 5F9.1-GL <400> 35 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 36 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH 5F9.2-GL <400> 36 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 37 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH 5F9.3-GL <400> 37 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 38 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH 5F9.4-GL <400> 38 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 39 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH 5F9.5-GL <400> 39 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 40 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH 5F9.6-GL <400> 40 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 41 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH 5F9.7-GL <400> 41 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 42 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH 5F9.8-GL <400> 42 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 43 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH 5F9.9-GL <400> 43 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 44 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL 5F9.1-GL <400> 44 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Tyr Thr Phe Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala 85 90 95 Thr His Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 45 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL 5F9.2-GL <400> 45 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Tyr Thr Phe Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala 85 90 95 Thr His Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 46 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL 5F9.3-GL <400> 46 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Tyr Thr Phe Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala 85 90 95 Thr His Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 47 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH h5F9.1 <400> 47 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 48 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH h5F9.2 <400> 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 49 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH h5F9.3 <400> 49 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 50 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH h5F9.4 <400> 50 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 51 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL h5F9.19 <400> 51 Asp Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Tyr Thr Phe Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala 85 90 95 Thr His Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 52 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL h5F9.20 <400> 52 Asp Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Tyr Thr Phe Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala 85 90 95 Thr His Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 53 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL h5F9.21 <400> 53 Asp Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Tyr Thr Phe Leu Glu Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala 85 90 95 Thr His Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 54 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL h5F9.22 <400> 54 Asp Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Tyr Thr Phe Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala 85 90 95 Thr His Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 55 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH 8D1 <400> 55 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Ile Pro Tyr Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Asn Glu Tyr Tyr Gly Ser Ser Phe Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 56 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL 8D1 <400> 56 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Glu 1 5 10 15 Glu Ile Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Asp Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Arg Leu Gln Ile 65 70 75 80 Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly Tyr Ile Pro Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 57 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH 5F9 CDR H1 <400> 57 Asn Tyr Gly Met Asn 1 5 <210> 58 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH 5F9 CDR-H2 <400> 58 Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 59 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH 5F9 CDR-H3 <400> 59 Gly Thr Thr Pro Asp Tyr 1 5 <210> 60 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL 5F9 CDR-L1 <400> 60 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Tyr Ser Asp Gly Tyr Thr Phe Leu Glu 1 5 10 15 <210> 61 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL 5F9 CDR-L2 <400> 61 Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL 5F9 CDR-L3 <400> 62 Phe Gln Ala Thr His Asp Pro Leu Thr 1 5 <210> 63 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH 8D1 CDR-H1 <400> 63 Ser Tyr Val Met His 1 5 <210> 64 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH 8D1 CDR-H2 <400> 64 Tyr Ile Ile Pro Tyr Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 65 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH 8D1 CDR-H3 <400> 65 Ala Arg Arg Asn Glu Tyr Tyr Gly Ser Ser Phe Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 66 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL 8D1 CDR-L1 <400> 66 Gln Ala Ser Gln Asp Ile Asp Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 67 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL 8D1 CDR-L2 <400> 67 Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp 1 5 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL 8D1 CDR-L3 <400> 68 Leu Gln Gly Tyr Ile Pro Pro Arg Thr 1 5

Claims (91)

1x10-7 M 이하의 KD 및 1x10-2s-1 이하의 koff 속도 상수(둘 다 표면 플라스몬 공명에 의해 측정됨)로 사람 RGM A로부터 해리하는 결합 단백질.
표준 시험관내 분석으로 측정한 바에 의하면 사람 RGM A에 결합하고 사람 RGM A의 신경돌기 성장 저해 활성을 중화시키는 결합 단백질.
제1항 또는 제2항에 있어서, 하기의 추가적인 기능적 특징 중 적어도 하나를 갖는 결합 단백질:
래트 RGM A에 결합함,
사람 RGM C에 결합함, 및
래트 RGM C에 결합함.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 RGM의 수용체들 중 적어도 하나에 결합하는 RGM의 능력을 조절하는 결합 단백질.
제4항에 있어서, 상기 결합 단백질이 사람 RGM A의 수용체 결합 도메인과 상호작용하는 결합 단백질.
제4항에 있어서, 상기 결합 단백질이 하기의 상호작용 중 적어도 하나를 조절하는 결합 단백질:
사람 BMP-4에 대한 사람 RGM A의 결합,
사람 네오제닌(Neogenin)에 대한 hRGM A의 결합,
사람 네오제닌에 대한 hRGM C의 결합,
사람 BMP-2에 대한 사람 RGM A의 결합.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 사람화된 항체인 결합 단백질.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 도메인을 포함하는 결합 단백질로서, 상기 결합 단백질이 RGM 분자의 에피토프에 결합할 수 있고, 상기 항원 결합 도메인이
GTTPDY(서열번호 59),
FQATHDPLT(서열번호 62),
ARRNEYYGSSFFDY(서열번호 65),
LQGYIPPRT(서열번호 68) 및
상기 서열 중 하나와 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 변형된 CDR 아미노산 서열
로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 결합 단백질.
항원 결합 도메인을 포함하는 결합 단백질로서, 상기 결합 단백질이 RGM 분자의 에피토프에 결합할 수 있고, 상기 항원 결합 도메인이
GTTPDY(서열번호 59),
FQATHDPLT(서열번호 62),
ARRNEYYGSSFFDY(서열번호 65),
LQGYIPPRT(서열번호 68) 및
상기 서열 중 하나와 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 변형된 CDR 아미노산 서열
로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 결합 단백질.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 57, 58, 60, 61, 63, 64, 66, 67 및 상기 서열들 중 하나와 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 변형된 CDR 아미노산 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 추가로 포함하는 결합 단백질.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 CDR이
Figure pct00016

로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 결합 단백질.
제11항에 있어서,
Figure pct00017

로 이루어진 가변 도메인 CDR 세트
또는 3개의 CDR 중 적어도 하나가 모 서열과 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 변형된 CDR 아미노산 서열인 가변 도메인 세트
중에서 선택되는 적어도 3개의 CDR을 포함하는 결합 단백질.
제12항에 있어서, 적어도 2개의 가변 도메인 CDR 세트를 포함하는 결합 단백질.
제13항에 있어서, 상기 적어도 2개의 가변 도메인 CDR 세트가
VH 5F9 세트 및 VL 5F9 세트; 및
VH 8D1 세트 및 VL 8D1 세트
로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 결합 단백질.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 수용체 프레임워크(human acceptor framework)를 추가로 포함하는 결합 단백질.
제15항에 있어서, 상기 사람 수용체 프레임워크가 서열번호 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 및 33으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하는 결합 단백질.
제16항에 있어서, 각 세트가 JH3(서열번호 18), JH4(서열번호 19), JH6(서열번호 20) 중에서 선택되는 추가 프레임워크 서열과 결합되어 있는, VH3-48 세트(서열번호 15, 16 및 17), VH3-33 세트(서열번호 21, 22 및 23), VH3-23 세트(서열번호 24, 25 및 26)로 이루어진 그룹 중에서 선택되거나,
각 세트가 JK2(서열번호 2) 중에서 선택되는 추가 프레임워크 서열과 결합되어 있는, A18 세트(서열번호 27, 28 및 29), A17 세트(서열번호 31, 32 및 33)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는
프레임워크 서열의 세트를 포함하는 결합 단백질.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 및 43 중에서 선택되는 적어도 하나의 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열번호 44, 45 및 46 중에서 선택되는 적어도 하나의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 결합 단백질.
제18항에 있어서, 상기 결합 단백질이 2개의 가변 도메인을 포함하고, 상기 2개의 가변 도메인이
서열번호 35 및 44; 36 및 44; 37 및 44; 38 및 44; 39 및 44; 40 및 44; 41 및 44; 42 및 44; 43 및 44;
서열번호 35 및 45; 36 및 45; 37 및 45; 38 및 45; 39 및 45; 40 및 45; 41 및 45; 42 및 45; 43 및 45;
서열번호 35 및 46; 36 및 46; 37 및 46; 38 및 46; 39 및 46; 40 및 46; 41 및 46; 42 및 46; 43 및 46
중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 결합 단백질.
제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사람 수용체 프레임워크가 주요 잔기에 적어도 하나의 프레임워크 영역 아미노산 치환을 포함하고, 상기 주요 잔기가
CDR에 인접한 잔기;
글리코실화 부위 잔기;
희귀 잔기;
RGM 에피토프와 상호작용할 수 있는 잔기;
CDR과 상호작용할 수 있는 잔기;
표준(canonical) 잔기;
중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 사이의 접촉 잔기;
버니어(Vernier) 구역 내의 잔기;
파라글루타메이트를 형성할 수 있는 N-말단 잔기; 및
초티아(Chothia)-정의된 가변 중쇄 CDR1과 카벳(Kabat) 정의된 제1 중쇄 프레임워크 사이에 중첩하는 영역 내의 잔기
로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 결합 단백질.
제20항에 있어서, 상기 주요 잔기가
(중쇄 서열 위치): 1, 5, 37, 48, 49, 88, 98
(경쇄 서열 위치): 2, 4, 41, 51
로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 결합 단백질.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 컨센서스(consensus) 사람 가변 도메인인 결합 단백질.
제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사람 수용체 프레임워크가 적어도 하나의 프레임워크 영역 아미노산 치환을 포함하고, 상기 프레임워크의 아미노산 서열이 상기 사람 수용체 프레임워크 서열과 65% 이상 동일하고 상기 사람 수용체 프레임워크와 동일한 아미노산 잔기를 70개 이상 포함하는 결합 단백질.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
서열번호 47, 48, 49, 50;
서열번호 51, 52, 53 및 54
로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 (프레임워크 돌연변이된) 가변 도메인을 포함하는 결합 단백질.
제24항에 있어서, 상기 결합 단백질이 2개의 가변 도메인을 포함하고, 상기 2개의 가변 도메인이
서열번호 47 및 44; 47 및 45; 47 및 46; 47 및 51; 47 및 52; 47 및 53; 47 및 54;
서열번호 48 및 44; 48 및 45; 48 및 46; 48 및 51; 48 및 52; 48 및 53; 48 및 54;
서열번호 49 및 44; 49 및 45; 49 및 46; 49 및 51; 49 및 52; 49 및 53; 49 및 54;
서열번호 50 및 44; 50 및 45; 50 및 46; 50 및 51; 50 및 52; 50 및 53; 50 및 54
로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 결합 단백질.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, RGM 분자 중에서 선택되는 표적에 결합할 수 있는 결합 단백질.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 RGM A에 결합할 수 있는 결합 단백질.
제27항에 있어서, 하기의 추가적인 기능적 특징 중 적어도 하나를 갖는 결합 단백질:
래트 RGM A에 결합함,
사람 RGM C에 결합함,
래트 RGM C에 결합함.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, RGM 분자 중에서 선택되는 표적의 생물학적 기능을 조절할 수 있는 결합 단백질.
제29항에 있어서, RGM의 수용체들 중 적어도 하나에 결합하는 RGM의 능력을 조절하는 결합 단백질.
제30항에 있어서, 하기의 상호작용 중 적어도 하나를 조절하는 결합 단백질:
사람 BMP-4에 대한 사람 RGM A의 결합,
사람 네오제닌에 대한 hRGM A의 결합,
사람 네오제닌에 대한 hRGM C의 결합,
사람 BMP-2에 대한 사람 RGM A의 결합.
제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, RGM 생물학적 활성을 저해할 수 있는 결합 단백질.
제32항에 있어서, RGM 분자가 RGM A인 결합 단백질.
제33항에 있어서, RGM A가 사람, 사이노몰거스 원숭이, 래트, 병아리, 개구리 및 어류 중에서 선택되는 결합 단백질.
제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이, 표면 플라스몬 공명으로 측정한 바에 의하면, 적어도 약 102M-1s-1; 적어도 약 103M-1s-1; 적어도 약 104M-1s-1; 적어도 약 105M-1s-1; 적어도 약 106M-1s-1; 및 적어도 약 107M-1s- 1으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 상기 표적에 대한 온 속도 상수(on rate constant)(kon)를 갖는 결합 단백질.
제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이, 플라스몬 공명으로 측정한 바에 의하면, 약 10-2s-1 이하; 약 10-3s-1 이하; 약 10-4s-1 이하; 약 10-5s-1 이하; 및 약 10-6s-1 이하로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 상기 표적에 대한 오프 속도 상수(off rate constant)(koff)를 갖는 결합 단백질.
제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이, 약 10-7M 이하; 약 10-8M 이하; 약 10-9M 이하; 약 10-10M 이하; 약 10-11M 이하; 약 10-12M 이하; 및 약 10-13M 이하로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 상기 표적에 대한 해리 상수(KD)를 갖는 결합 단백질.
제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질을 포함하고, 링커 폴리펩타이드 또는 면역글로불린 불변 도메인을 추가로 포함하는 항체 작제물.
제38항에 있어서, 상기 결합 단백질이
면역글로불린 분자,
모노클로날 항체,
키메라 항체,
CDR-이식된 항체,
사람화된 항체,
Fab,
Fab',
F(ab')2,
Fv,
이황화 결합된 Fv,
scFv,
단일 도메인 항체,
디아바디(diabody),
다중특이적 항체,
이중 특이적(dual specific) 항체,
이중 가변 도메인 면역글로불린, 및
이특이적(bispecific) 항체
로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 항체 작제물.
제38항 또는 제39항에 있어서, 상기 결합 단백질이
사람 IgM 불변 도메인,
사람 IgG1 불변 도메인,
사람 IgG2 불변 도메인,
사람 IgG3 불변 도메인,
사람 IgG4 불변 도메인,
사람 IgE 불변 도메인,
사람 IgD 불변 도메인,
사람 IgA1 불변 도메인,
사람 IgA2 불변 도메인,
사람 IgY 불변 도메인 및
이들에 상응하는 돌연변이된 도메인
으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 중쇄 면역글로불린 불변 도메인을 포함하는 항체 작제물.
제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 11, 12, 13 및 14로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 불변 도메인을 포함하는 항체 작제물.
제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 항체 작제물을 포함하고, 면역부착 분자, 조영제, 치료제 및 세포독성제로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 제제를 추가로 포함하는 항체 접합체.
제42항에 있어서, 상기 제제가 방사선표지, 효소, 형광 표지, 발광 표지, 생물발광 표지, 자성 표지 및 비오틴으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 조영제인 항체 접합체.
제43항에 있어서, 상기 조영제가 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho 및 153Sm으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방사선표지인 항체 접합체.
제43항에 있어서, 상기 제제가 항대사물질, 알킬화제, 항생제, 성장인자, 사이토킨, 항-혈관형성제, 항-유사분열제, 안트라사이클린, 독소 및 아폽토시스제로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 치료제 또는 세포독성제인 항체 접합체.
제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 사람 글리코실화 패턴을 보유하는 항체 작제물.
제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 사람 글리코실화 패턴을 보유하는 항체 접합체.
제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 결정으로서 존재하는 결합 단백질.
제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 결정으로서 존재하는 항체 작제물.
제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 작제물이 결정으로서 존재하는 항체 접합체.
제48항에 있어서, 상기 결정이 무담체(carrier-free) 약제학적 제어 방출 결정인 결합 단백질.
제49항에 있어서, 상기 결정이 무담체 약제학적 제어 방출 결정인 항체 작제물.
제50항에 있어서, 상기 결정이 무담체 약제학적 제어 방출 결정인 항체 접합체.
제48항에 있어서, 상기 결합 단백질의 가용성 대응물보다 생체내 반감기가 더 긴 결합 단백질.
제49항에 있어서, 상기 항체 작제물의 가용성 대응물보다 생체내 반감기가 더 긴 항체 작제물.
제50항에 있어서, 상기 항체 접합체의 가용성 대응물보다 생체내 반감기가 더 긴 항체 접합체.
제48항에 있어서, 생물학적 활성을 유지하는 결합 단백질.
제49항에 있어서, 생물학적 활성을 유지하는 항체 작제물.
제50항에 있어서, 생물학적 활성을 유지하는 항체 접합체.
제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 분리된 핵산.
제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 항체 작제물의 아미노산 서열을 암호화하는 분리된 핵산.
제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 항체 접합체의 아미노산 서열을 암호화하는 분리된 핵산.
제60항 내지 제62항 중 어느 한 항에 따른 분리된 핵산을 포함하는 벡터.
제63항에 있어서, pcDNA, pTT, pTT3, pEFBOS, pBV, pJV, pHybE 및 pBJ로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 벡터.
제63항 또는 제64항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제65항에 있어서, 원핵생물 세포인 숙주 세포.
제66항에 있어서, 이.콜라이(E. coli)인 숙주 세포.
제67항에 있어서, 진핵생물 세포인 숙주 세포.
제68항에 있어서, 상기 진핵생물 세포가 원생생물 세포, 동물 세포, 식물 세포 및 진균 세포로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 숙주 세포.
제69항에 있어서, 상기 진핵생물 세포가 포유동물 세포, 조류 세포 및 곤충 세포로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 동물 세포인 숙주 세포.
제69항에 있어서, HEK 세포, CHO 세포, COS 세포 및 효모 세포 중에서 선택되는 숙주 세포.
제71항에 있어서, 상기 효모 세포가 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)인 숙주 세포.
제70항에 있어서, 곤충 Sf9 세포인 숙주 세포.
RGM에 결합할 수 있는 결합 단백질을 생산하기에 충분한 조건 하에 배양 배지에서 제65항 내지 제73항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포를 배양함을 포함하여, RGM에 결합할 수 있는 단백질을 생산하는 방법.
제74항의 방법에 따라 생산된 단백질.
(a) 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 따른 결정화된 산물 단백질 및 성분을 포함하는 제형; 및
(b) 적어도 하나의 중합체 담체
를 포함하는, 결합 단백질 방출용 조성물.
제76항에 있어서, 상기 중합체 담체가 폴리(아크릴산), 폴리(시아노아크릴레이트), 폴리(아미노산), 폴리(무수물), 폴리(뎁시펩타이드), 폴리(에스테르), 폴리(락트산), 폴리(락트산-코-글리콜산) 또는 PLGA, 폴리(b-하이드록시부티레이트), 폴리(카프로락톤), 폴리(디옥사논); 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(하이드록시프로필) 메타크릴아미드, 폴리[(오르가노)포스파젠], 폴리(오르토 에스테르), 폴리(비닐 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 말레산 무수물-알킬 비닐 에테르 공중합체, 플루로닉 폴리올, 알부민, 알기네이트, 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 콜라겐, 피브린, 젤라틴, 히알루론산, 올리고사카라이드, 글리카미노글리칸, 황산화된 폴리사카라이드, 이들의 혼합물 및 공중합체로 이루어진 그룹 중 하나 이상 중에서 선택되는 중합체인 조성물.
제76항에 있어서, 상기 성분이 알부민, 수크로오스, 트레할로스, 락티톨, 젤라틴, 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 조성물.
제77항 또는 제78항에 따른 조성물의 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 포유동물의 치료방법.
제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 따른 산물, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
제80항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 담체가 상기 결합 단백질의 흡수 또는 분산을 증가시키는데 유용한 애주번트로서 작용하는 약제학적 조성물.
제81항에 있어서, 상기 애주번트가 히알루로니다제인 약제학적 조성물.
제82항에 있어서, RGM 활성이 유해한 장애를 치료하기 위한 추가 치료제를 하나 이상 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
제83항에 있어서, 상기 추가 제제가 치료제, 조영제, 세포독성제, 혈관형성 저해제; 키나제 저해제; 공동-자극 분자 차단제; 부착 분자 차단제; 항-사이토킨 항체 또는 이의 기능성 단편; 메토트렉세이트; 사이클로스포린; 라파마이신; FK506; 검출가능한 표지 또는 리포터; TNF 길항물질; 항류마티스제; 근육 이완제, 마약, 비스테로이드성 항염증 약물(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항미생물제, 항건선제, 코르티코스테로이드, 동화대사 스테로이드, 에리트로포이에틴, 면역화제, 면역글로불린, 면역억제제, 성장호르몬, 호르몬 대체 약물, 방사능약제, 항우울제, 항정신병제, 자극제, 천식약, 베타 작용제, 흡입 스테로이드, 에피네프린 또는 유사체, 사이토킨 및 사이토킨 길항물질로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 약제학적 조성물.
사람 RGM A 활성이 감소되도록 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 따른 산물과 사람 RGM A를 접촉시킴을 포함하여, 사람 RGM A 활성을 감소시키는 방법.
제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 따른 산물을 피검체에게 투여하는 단계를 포함하여, 치료를 요하는 피검체에서 네오제닌 수용체에 대한 hRGM A 결합을 감소시키는 방법.
제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 따른 산물을 피검체에게 투여하는 단계를 포함하여, 치료를 요하는 피검체에서 골 형태형성 단백질-2 및 골 형태형성 단백질-4(BMP-2 및 BMP-4)에 대한 hRGM A 결합을 감소시키는 방법.
제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 따른 산물을 단독으로 또는 다른 치료제와 함께 투여하는 단계를 포함하여, RGM A 활성과 관련이 있는 장애에 대해 피검체를 치료하는 방법.
제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 따른 산물을 단독으로 또는 다른 치료제와 함께 피검체에게 투여하는 단계를 포함하여, RGM A 활성이 유해한 장애를 앓고 있는 피검체에서 RGM A 활성을 감소시키는 방법.
제89항에 있어서, 상기 장애가 근위축측삭경화증, 상완신경얼기 손상, 뇌손상, 예컨대 외상성 뇌손상, 뇌성마비, 길랑바레, 백색질형성장애, 다발성경화증, 회색질척수염 후, 스피나 비피다(Spina Bifida), 척수 손상, 척추 근육 위축, 척수 종양, 졸중, 횡단 척수염; 치매, 노인성 치매, 경증 인지 장애, 알츠하이머-관련 치매, 헌팅톤 무도병, 지연성이상운동증, 운동과다증, 조증, 파킨슨병, 스틸-리차드(steel-Richard) 증후군, 다운 증후군, 중증 근육무력증, 신경 외상, 혈관 아밀로이드증, 아밀로이드증성 뇌 출혈 I, 뇌 염증, 급성 혼돈 장애, 근위축측삭경화증, 녹내장 및 알츠하이머병을 포함하는 그룹 중에서 선택되는 신경계 질환을 포함하는 방법.
제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질의 분리된 CDR.
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