SE502324C2 - Administreringssystem för farmakologiskt aktiva medel som är inkapslade i skyddande proteinoidmikrosfärer - Google Patents

Description

so2ås24 2 medlet och som hittills representerar det mest framgångsrika tillvägagångssättet. Exempelvis är användningen av liposomer som innehåller heparin beskriven i den amerikanska patentskrif- ten 4 239 754, och flera undersökningar har inriktats på använd- ningen av liposomer som innehåller insulin, t ex Patel et al, FEBS Letters, gg, 60 (1976) och Hashimoto et al, Endocrinol.

Japan gg, 337 (1979). Trots dessa prov som visar en begränsad användbarhet är användningen av liposomer fortfarande i ut- vecklingsstadiet, och det finns fortskridande problem, inklu- sive dålig stabilitet och otillräcklig lagringsbeständighet.

Således kvarstår ett behov av förbättrade sätt att komma fram till frigöringen av aktiva farmakologiska medel i krop- pen och särskilt av mera tillfredsställande sätt för oral administrering av farmakologiska medel som är labila med av- seende på betingelser i det gastrointestinala området.

Föreliggande uppfinning har till ändamål att åstadkomma ett förbättrat-sätt att frige ett farmakologiskt medel i fysio- logiskt aktiv form vid ett såsom mål valt kroppsorgan eller en kroppsvätska. Ett annat ändamål med uppfinningen är att åstad- komma ett förbättrat administreringssystem för enteral admiminst- rering av farmakologiska medel som i sig själva passerar lång- samt eller inte alls den gastrointestinala väggen och/eller är känsliga för kemisk klyvning medelst syror och enzymer i det gastrointestinala området. Det är ett närmare ändamål att åstadkomma ett sådant administreringssystem, i vilket det ak- tiva farmakologiska medlet är inkapslat i ett skyddsmaterial som i sig självt är farmakologiskt oskadligt, som inte ändrar de fysiologiska och biologiska egenskaperna hos det aktiva medlet, som skyddar det aktiva medlet från de skadliga beting- elserna i det gastrointestinala området och som försvinner eller frigör det aktiva medlet i blodströmmen eller det aktu- ella målet. Det är ytterligare ett speciellt ändamål med upp- finningen att åstadkomma en sådan kombination av aktivt medel och skyddsmaterial som är tillräckligt lipofil och har liten partikelstorlek så att den kan passera snabbt genom den gast- rointestinala slemhinnan och som lätt kan tillverkas i bety- dande mängd.

Ytterligare ändamål med uppfinningen är att tillhandahålla sätt att åstadkomma dylika administreringssystem och att ad- 502 324 3 ministrera desamma till djur. Det är ett speciellt ändamål att tillhandahålla effektiva medel för oral administrering av insulin till däggdjursdiabetiker.

Det har visat sig att dessa ändamål och andra fördelar, vilka kommer att bli uppenbara ur denna beskrivning, uppnås medelst den nedan beskrivna uppfinningen.

Generellt sett är en aspekt av denna uppfinning ett ad- ministreringssystem för ett aktivt farmakologiskt medel som innefattar nämnda medel inneslutet eller inkapslat i proteinoid- mikrosfärer. En¿andra generell aspekt av uppfinningen är ett sätt att inkapsla ett aktivt farmakologiskt medel, vilket sätt innefattar att man blandar nämnda aktiva medel med en farmaceutiskt acceptabel vätska och bringar nämnda bland- ning i kontakt med en proteinoid som samverkar med blandningen under bildande av ihåliga mikrosfärer. En tredje generell as- pekt av uppfinningen är ett sätt att som mål uppsätta fri- givningen av ett farmakologiskt aktivt medel i ett djur, vilket sätt innefattar att man till nämnda djur administrerar en effektiv mängd av nämnda aktiva medel inkapslat i proteinoid- mikrosfärer, vilka mikrosfärer är stabila i förhållande till de påträffade betingelserna under vandring från införings- punkten i nämnda djur till ett såsom mål valt frigivningsom- råde och är instabila vid nämnda zon.

Proteinoider, som bildar skyddskapslarna enligt denna upp- finning, har beskrivits såsom syntetiska polypeptider, efter- som de är av människan framställda kondensationspolymerer som bildas genom slumpvis eller riktad hopsättning av naturliga eller syntetiska aminosyror och/eller små peptidkedjor. Sedan man under den senare delen av 50-talet upptäckt att linjära polykondensat av blandade naturliga aminosyror kunde samverka med vatten under bildande av ihåliga mikrosfärer har protein- oider utgjort föremålet för omfattande undersökningar av li- vets uppkomst. En utmärkt genomgång av dessa undersökningar, ävensom omfattande bibliografier, finns i S.W. Fox och K.

Dose, Molecular Evolution and the Origin of Life, Marcel Dekker, Inc., New York (1977), vilken beskrivning införlivas här genom hänvisning.

Såsom ett resultat av dessa undersökningar och andra un- so2f324 4 dersökningar har en betydande kunskap samlats gällande fram- ställning av och egenskaperna hos proteinoider och proteinoid- mikrosfärer. Exempelvis är det känt att proteinoider härrörande från de naturliga alfa-aminosyrorna (de som påträffas i anima- liska eller vegetabiliska grönsaksproteiner), ävensom de som införlivar andra naturligt förekommande material (såsom poly- nukleotider, fosforsyra, järn och kalcium) är icke-toxiska.

Det har också visat sig att inklusion i polymeren av ett stö- kiometriskt överskott av sur di- eller polykarboxyl-aminosyra resulterar i envsur proteinoid som är olöslig i en sur omgiv- ning och löslig i en basisk omgivning, medan inklusion av ett överskott av basisk diamino- eller polyaminomonomer resulte- rar i en basisk proteinoid som är löslig i ett surt medium och olöslig vid högt pH. Dessa löslighetsegenskaper kan vara mycket fint avstämda. På likartat sätt kan storleken hos mik- rosfärerna som bildas genom att proteinoider bringas i kontakt med vatten eller annan vätska regleras inom ett intervall av från mindre än en halv um till ca tio um eller mera genom att man förändrar en mängd fysikaliska eller kemiska parametrar, såsom pH, osmolaritet eller salthalt hos vätskan. Det har också iakttagits att proteinoiderna är mycket mer motstånds- kraftiga än proteiner mot klyvning medelst matsmältningsenzy- mer.

Föreliggande uppfinning har sin grund i upptäckten att ett farmakologiskt aktivt medel kan inkapslas i proteinoid- mikrosfärer helt enkelt genom att man löser eller suspenderar ett sådant medel i en farmaceutiskt acceptabel vätska, såsom vatten eller dimetylsulfoxid, som samverkar med nämnda pro- teinoid under bildande av mikrosfärer.

Det har också upptäckts att sådan inkapsling inte ändrar de farmakologiska egenskaperna hos det aktiva medlet och att mikrosfärer som är försedda med aktivt medel och som har dia- metrar som är mindre än ca 10 um är tillräckligt små för att lätt passera igenom den gastrointestinala slemhinnan och inträda i blodströmmen. Det föredragna intervallet för snabb diffu- sion uppgår till mellan ca 0,5 till ca 5,0 um, eftersom mind- re storlekar har något mindre stabilitet och inkluderar rela- tivt litet aktivt medel medan större storlekar diffunderar mindre väl. Partiklar mellan ca 5,0 och ca 10 pm är emeller- 502 324 5 tid användbara i blandning med partiklar inom det föredragna intervallet, eftersom deras långsammare diffusion resulterar i förlängd frigivning av det aktiva medlet.

Genom att man skräddarsyr både löslighetsegenskaperna hos en sur proteinoid och partikelstorleken hos mikrosfärerna på känt sätt har det visat sig möjligt att åstadkomma mikrosfärer som är försedda med aktivt medel och som är stabila i munnen (normalt pH från ca 4 till ca 6,8), som snabbt passerar genom munnens slemhinna in i blodströmmen och som friger det aktiva medlet i blodet¿(normalt pH från ca 7,35 till ca 7,45). Sådana system är lämpliga före sublingual administrering av sådana farmakologiska medel som humana och bovina tillväxthormoner, interferon eller interleukin-II.

På likartat sätt är det möjligt att framställa lätt diffun- derbara mikrosfärer från sura proteinoider, vilka är stabila i den i hög grad sura magen (normalt pH från ca 2 till ca 6) men som löser sig i det nära neutrala blodet. Sådana system är lämpliga för oral administrering av peptidhormoner, såsom insulin eller heparin, vilka annars snabbt skulle förstöras i magen. De är också lämpliga för att skydda magen från gastriska irritationsmedel, såsom aspirin. När sådana mikrosfärer som innehåller aspirin ges oralt passerar de genom magväggen och friger aspirinet i blodströmmen betydligt snabbare än konven- tionellt, enteralt överdraget aspirin, vilket först måste passera magen och sedan måste inträda i blodströmmen genom tarmväggen först när den enterala överdragningen har lösts.

Det är också möjligt att framställa system ur basiska proteinoider som är stabila i det svagt basiska nedre matsmält- ningsområdet (normalt pH ca 8) men som friger aktivt medel i blodet. Sådana system är lämpliga för administrering av såda- na farmakologiska medel som kalciumregulatorer och redoxbär- system för dopamin eller gamma-aminosmörsyra.

Förutom dessa enteralt administrerade system är det möj- ligt att bilda ett i det närmaste neutralt protenoidmikro- sfärsystem som är stabilt i blodströmmen men som friger sitt innehåll av farmakologiskt medel såsom gensvar på det såsom mål valda organets omgivning, såsom ett högre eller 502 324 6 lägre pH eller närvaron av ett bestämt enzym. Sådana i det närmaste neutrala system måste införas intravenöst såvida in- te mikrosfärerna är tillräckligt små för att inkapslas i större proteinoidmikrosfärer som kan diffundera genom den gastrointestinala slemhinnan och som är stabila tills de når blodströmmen.

Ehuru vilket som helst farmakologiskt medel kan inkapslas i proteinoidmikrosfärer är det uppenbarligen av särskilt värde för skydd av sådana medel som annars skulle förstöras eller göras mindre effektiva av betingelser som påträffas i djur- kroppen innan det når sin målzon.

Exempel 1 nedan åskådliggör framställningen av en sur termal proteinoid som samverkar med en vattenlösning av ett farmakologiskt aktivt medel för att inkapsla och skydda nämn- da medel i ihåliga mikrosfärer. Dessa mikrosfärer har stabili- tet i närvaro av matsmältningsenzymerna och syran i magen och, eftersom de huvudsakligen har en diameter mindre än 5,0 um, passerar de lätt genom magväggen in i den svagt basiska blod- strömmen där de löses och friger det farmakologiska medlet.

Exempel la En omrörd blandning av 52,3 g asparaginsyra (0,4 mol), 42 g argininhydroklorid (0,2 mol), 26 g isoleucin (0,2 mol) och 50 ml glycerol upphettas under kväve till 160°C med gasutveck- ling. Temperaturen hålls därefter vid 155°C under 23 timmar, varefter blandningen kyls till rumstemperatur, extraheras med 200 ml 10 viktprocentig natriumvätekarbonat i vattenlösning och extraktet dialyseras genom ett kollodiummembran mot destille- rat vatten under 26 timmar, varvid vattnet byts var sjätte timme. Innehållet i dialysrören indunstas därefter till torr- het vid 50°C under vakuum så att man erhåller ett glasartat fast, surt proteinoidmaterial som mals till ett fint pulver.

Exempel lb Trettiofem mg av denna pulverformiga proteinoid sätts till en blandning av 50 mg grisinsulinkristaller i 2 ml destillerat vatten, varefter blandningen får stå i rumstemperatur tills mikrosfärer har bildats. De insulinbärande mikrosfärerna åt- skiljs genom filtrering, tvättas med ättiksyra i vatten med pH 5,4 samt suspenderas ånyo i 2 ml ättiksyra i vatten med pH 502 324 7 5,4. Mikroskopisk undersökning av denna suspension avslöjar stabila mikrosfärer som i huvudsak har en diameter mellan 0,1 och 5,0 um. När en del av suspensionen neutraliseras till pH 7,4 med koncentrerad ammoniumhydroxid blir upplösning av mik- rosfärerna omedelbart tydlig.

' Exempel lc Var och en av tre vuxna vita råttor med normala blodglykos- nivåer ges en dos av 0,35 ml av den insulinbärande mikrosfär- suspensionen enligt Exempel lb med hjälp av en spruta som in- förs genom munnen och ned i magen. Efter doseringen visar vart och ett av dessa djur en betydande minskning i blodgly- kos mätt i blodprov tagna från svansen.

Ehuru ihåliga mikrosfärer, som är lämpliga för inkapsling av farmakologiska medel, kan framställas av proteinoider härrö- rande från en enda sur eller basisk aminosyra och så litet som en annan aminosyra ger en större mångfald olika komponentamino- syror ofta större utbyten av mikrosfärer med lika storlek inom det önskvärda diameterintervallet 0,5 till 5,0 pm. Exempel 2 åskådliggör effektiviteten, då det gäller att åstadkomma en hypoglykemisk effekt i däggdjur genom att oralt administrera insulin inkapslat i en proteinoid härrörande från 18 olika aminosyror.

Exempel 2a En 250 ml filterkolv innehållande 10 g vattenfri dl-glutamin- syra och 10 g vattenfri dl-asparaginsyra under kväve upphettas i ett oljebad vid ca 200°C tills innehållet har smält. Till detta sätts 5 g av en vattenfri ekvimolär blandning av de 16 neutrala och basiska aminosyror som finns i animaliskt protein, dvs alanin, arginin, asparagin, cystein, glycin, histadin, leucin, lysin, metionin, fenylalanin, prolin, serin, treonin, tyrosin, tryptofan och valin. Den resulterande blandningen omrörs med en glasstav och hålls vid 200°C under kväve i tre timmar. Efter avkylning extraheras den bärnstensfärgade pro- dukten med en mättad vattenlösning av natriumvätekarbonat, varefter den resulterande lösningen utsätts för dialys genom ett kollodiummembran mot destillerat vatten vid rumstempera- tur i 24 timmar, varvid vattnet byts var sjätte timme. Inne- hållet i dialysrören surgörs därefter till pH 5,4 med kon- centrerad ättiksyra och centrifugeras. Sedan den överliggande 502 324 8 vätskan har kastats bort tvättas de olösliga fasta ämnena med vattenhaltig ättiksyra med pH 5,4 och centrifugeras på nytt.

Denna tvättvätska kastas också bort, och den fasta proteinoid- produkten får torka över kiselgel över natten och mals däref- ter till ett fint pulver med mortel och mortelstöt.

' Exempel 2b En blandning av 50 mg grisinsulinkristaller i 2 ml destillerat vatten sätts till 35 mg av den torra pulverformiga protenoi- den enligt Exempel 2a, varefter blandningen får stå 1 rums- temperatur tills'mikrosfärer har bildats. Blandningen centri- fugeras därefter under 15 minuter. Sedan den överliggande vätskan har kastats bort tvättas de återstående mikrosfärerna en gång med vattenhaltig ättiksyra med pH 5,4 vid rumstempe- ratur och centrifugeras under ytterligare 15 minuter. Den överliggande vätskan kastas bort på nytt, och de insulin- bärande proteinoidmikrosfärerna suspenderas ånyo i 2 ml vatten- haltig ättiksyra med pH 5,4. Mikroskopisk undersökning av suspensionen visar att mikrosfärerna huvudsakligen har en dia- meter mellan 0,5 och 5,0 um.

Exempel 2c Tolv vita hanråttor, var och en med vikten ca 500 g och med en normal blodglukosnivå, delas slumpvis upp i fyra grup- per omfattande tre individer vardera för att demonstrera den fysiologiska verkan av oral administrering av en vattenhaltig suspension av insulinbärande proteinoidmikrosfärer framställ- da i enlighet med förloppet enligt Exempel 2b ovan. Mellan 0,35 och 0,5 ml av denna vattenhaltiga suspension av mikro- sfärer förs genom en slang ned i magen i varje råtta i grupp 1. Råttorna i grupp 2 tillförs mellan 1,5 och 1,7 ml av sus- pensionen på likartat sätt. Råttorna i grupp 3 tillförs 1,0 ml destillerat vatten på likartat sätt. Råttorna i grupp 4 tillförs 25,0 mg grisinsulin i 1,0 ml destillerat vatten på likartat sätt. Både före och under experimentet får alla dju- ren fri tillgång till vatten och sin normala föda. Blodglukos- nivåerna mäts på prov som tas ut från svansen vid givna inter- vall efter behandlingen, och gruppgenomsnitten upptecknas i Tabell 1 såsom milligram glukos per deciliter blod (mg/dl). 502 324 9 Tabell 1 Genomsnittlig blodglukos (mg/dl) För- Grupp dosering 30 min 1 t 1,5 t 2 t 2,5 t 3 t Ett 135 85 88 66 44 27 - Två - - - - - 49 - Tre 120 - - - - 119 - Fyra 113 120 120 124 120 - 116 Grupp 4 t ,6 t 12 t 24 t 36 t 48 t Ett ae ' - las 119 122 - Två 58 - 80 125 125 122 Tre 122 - - 119 124 - Fyra lll 123 - - - - Det framgårwklart av data i tabell 1 att insulin administ- reras oralt på ett fysiologiskt meningsfullt och aktivt sätt med sura proteinoidmikrosfärer. I alla djur som får insulin- haltiga mikrosfärer återgår blodglukosnivàn till föradminist- ringsnivàn utan någon iakttagen ogynnsam effekt. Det bör obser- veras att administrering av större doser insulinhaltiga mikro- sfärer till djuren i grupp 2 förefaller att öka verkningens varaktighet i stället för verkningens storlek. Det bör också observeras att den orala administreringen av betydligt stör- re doser per enhet kroppsvikt oskyddat gris- eller bovint in- sulin åt laboratoriedjur och människor inte ger någon detek- terbar minskning av blodglukosnivåer.

På likartat sätt effektiva insulinbärande proteinoidmikro- sfärer kan framställas genom att en torr pulverformig sur proteinoid, såsom de enligt Exempel la eller 2a, bringas i kontakt med insulin som är suspenderat eller löst i ett stort antal farmaceutiskt acceptabla vätskor, inklusive vattenlös- ningar av etanol, isopropanol, terpenol, dimetylsulfoxid, stärkelse, Tweens 80 och cyklodextran.

Exempel 3 åskådliggör ett särskilt föredraget sätt att framställa insulinbärande proteinoidmikrosfärer som tillför- litligt ger stora utbyten av mikrosfärer som faller inom det önskade diameterintervallet 0,5 till 5,0 pm och som är lätt- lösliga vid pH hos det såsom mål uppställda blodet. 502 324 10 Exempel 3a En kolv innehållande 2 viktdelar vattenfri 1-glutaminsyra under en kväveström upphettas i ett oljebad vid ca l75°C tills innehållet har smält. Till detta sätts 2 viktdelar vat- tenfri 1-asparaginsyra och en viktdel av en vattenfri ekvimo- lär blandning av de 16 neutrala och basiska aminosyrorna som finns i djurprotein. Den resulterande blandningen rörs om med en glasstav och hålls vid l75°C under kväve i tre timmar.

Efter kylning extraheras den mörkt bärnstensfärgade produkten med en mättad lösning av natriumvätekarbonat i vatten, varjämte extraktet dialyseras genom ett kollodiummembran mot destille- rat vatten vid rumstemperatur i ca 24 timmar, varvid vattnet byts ut var 4:e timme. Hela innehållet i dialysrören torkas därefter under vakuum vid 65°C, och resterande fast material mals till ett fint pulver med mortel och mortelstöt.

Exempel 3b En vattenlösning av proteinoid framställs genom att man blan- dar 35 mg av pulvret i Exempel 3a per ml vatten, justerar pH till 7,4 med en koncentrerad lösning av natriumvätekarbonat i vatten och avlägsnar eventuella olösliga material medelst filtrering. En volymdel av denna från fasta ämnen fria lös- ning av proteinoid injiceras därefter snabbt i en lika stor volym av nyframställd 25 mg/ml-lösning grisinsulin i vatten- haltig ättiksyra med pH 2,25. Blandningen, som har ett pH på ca 3,5, rörs om i ett isbad under 15 minuter och filtreras så att de insulinbärande mikrosfärerna avskiljs från filtratet som kastas bort. Efter tvättning två gånger med vattenhaltig ättiksyra med pH 3,5 suspenderas mikrosfärerna ånyo i 10 vo- lymdelar vattenhaltig ättiksyra med pH 3,5. Mikroskopisk un- dersökning av en del av denna suspension visar ett stort utbyte av mikrosfärer som har en diameter av huvudsakligen mellan 0,5 och 5,0 um och som löser sig snabbt när suspensio- nen neutraliseras till pH 7,4 genom tillsättning av en kon- centrerad lösning av natriumvätekarbonat i vatten.

I följande Exempel 4 betecknas doser av den insulinbäran- de mikrosfärsuspensionen i exempel 3b som "insulinfyllda mikro- sfärer". Mikrosfärer som inte innehåller något inkapslat in- sulin framställs genom att förloppet enligt Exempel 3b upp- repas, bortsett från att insulinet utelämnas under bildandet 502 324 ll av mikrosfärerna och mikrosfärerna suspenderas 1 en 2,5 mg/ml lösning av grisinsulin 1 destillerat vatten 1 stället för 1 utspädd ättiksyra. Doser av den resulterande suspensionen som inte innehåller insulin i mikrosfärerna betecknas såsom "mikrosfärer med externt insulin". Doser av enbart 2,5 mg/ml- lösningen av grisinsulin betecknas såsom "rått insulin".

Exempel 4 Tolv vita hanråttor, var och en med vikten ca 500 g och med en normal blodglukosnivå, uppdelas godtyckligt i två grup- per om vardera pre djur och en tredje grupp om sex djur. De tre djuren i grupp A ges de insulinfyllda mikrosfärerna genom slang och de tre djuren 1 grupp B ges på likartat sätt mikro- sfärerna med externt insulin. De sex djuren i grupp C mottar på likartat sätt det råa insulinet. Alla doser är 1 ml/500 g kroppsvikt och alla djuren undersöks med avseende på blodglu- kos omedelbart före doseringen och 1 intervall därefter. Den genomsnittliga blodglukosnivån för djuren 1 varje grupp är visad 1 Tabell 2.

Tabell 2 Blodglukos (mg/dl) 1 råttor Tid (timmar) Grupp (Behandling) A B C Insulinfyllda Mikrosfärer med mikrosfärer externt insulin Rått insulin 0 109,7 92 92,7 0,5 54,7 89,3 95,5 l 59 84,3 98,2 2 50 80,7 95,8 3 57,7 86,7 86,2 4 64,7 84 91 6 76 83,7 89,8 8 65,7 88,7 91 l2 81,7 92,3 92 24 94,3 95,7 92 Dessa experiment visar ingen nämnvärd inverkan på blod- glukosnivåerna av vare sig det råa insulinet eller mikro- sfärerna med externt insulin. I motsats till detta ger de in- sulinfyllda mikrosfärerna en toppminskning på ca 50% och en 502 324 12 verkan med lång varaktighet. Detta visar att de sura protenoid- mikrosfärerna inte har någon inverkan på blodglukosnivåerna och att de endast skyddar det inkapslade insulinet från den fientliga omgivningen i magen och därigenom gör det möjligt för nämnda inkapslade insulin att inträda i blodströmmen i fysiologiskt aktiv form.

Exempel 5a Diabetes mellitis induceras i råttor vägande ca 300 g genom att var och en ges en intravenös injektion streptozotocin på 75 mg/kg kroppsvikp. Tio råttor som man har konstaterat konsek- vent visar höga blodglukosnivåer, polyuria och polydipsia och måste få kvarstå på subkutana injektioner av grisinsulin, väljs för detta ändamål.

Exempel 5b Tre av de diabetiska råttorna tillförs medelst slang ca 1 ml av vattensuspensionen av grisinsulinbärande sura proteinoid- mikrosfärer enligt exempel 3b. En fjärde diabetisk råtta har 3 ml av suspensionen i 50 ml kranvatten placerad i sin vat- tenflaska, och denna råtta självadministrerar sin dos. Ingen av råttorna ges föda under 12 timmar före dosgivningen. I al- la råttorna medför den orala administreringen av det mikroin- kapslade insulinet en betydande och förlängd minskning i blodglukosnivåer.

Exempel 5c De återstående sex diabetiska råttorna uppdelas godtyckligt i tre grupper om vardera två djur. Djuren i den första gruppen ges via slang 1 ml av vattensuspensionen av grisinsulin- bärande sura proteinoidmikrosfärer i Exempel 3b. Djuren i de andra och tredje grupperna får subkutana injektioner av 0,25 mg (6,5 IE) resp 0,125 mg (3,25 IE) grisinsulin. Blodglukos- mätningar utförs på alla djuren omedelbart före doseringen och i intervall därefter. Djurgrupperna får byta två gånger med intervall av en vecka, varigenom alla djuren får var och en av insulinbehandlingarna. Den genomsnittliga minskningen från baslinjens blodglukosnivåer för varje behandling är vi- sad i Tabell 3. 502 324 13 Tabell 3 Procentuell minskning från blodglukos vid baslinjen i råttor Insulinbehandling Tid (h) efter dosering 0,5 1 1,5 2 3 4 6 8 12 24 48 Mikrosfärer oralt 29 38 45 44 48 50 51 40 37 24 -27 0,25 mg subkutant 28 55 72 77 84 79 34 4 3 -7 -5 0,125 mg subkutant 5 17 27 45 47 29 8 -8 -8 -8 -8 av den oralt ad- ministrerade dosen av insulinfyllda mikrosfärer på diabetiska råttor är jämförbar med en subkutan injektion av 0,125 mg in- sulin och att effekten varar betydligt längre än den som åstad Dessa resultat visar att toppeffekten kommes av antingen en subkutan injektion på 0,125 mg eller en sådan på 0,25 mg.

Exempel 6 En ml av vattensuspensionen av grisinsulinbärande sura prote- noidmikrosfärer i Exempel 3b införs via slang i magen på var och en av tre vuxna marsvin med en vikt av ca 800 g. Blodprov tas omedelbart innan och i intervall efter administrering av dosen.

Blodproven från marsvin nr 1 undersöks med avseende på blodglukos, vilken sjunker från nivån 160 mg/dl före dosering till 42 mg/dl på en halvtimme och till 25 mg/dl på 1,5 timmar, där den kvarstår under ytterligare 1,5 timmar, vid vilken tid- punkt symtom på insulinchock iakttas och djuret upplivas ge- nom oralt administrerad glukos.

Blodproven från marsvinen nr 2 och nr 3 undersöks med av- seende på grisinsulin med radioimmunoanalyssatser som mark- nadsförs av Cambridge Medical Diagnostics. Denna metod, som gör en åtskillnad mellan grisinsulin och marsvininsulin, vi- sar att grisinsulinets nivå i blodet hos båda marsvinen nr 2 och nr 3 före doseringen är noll. I marsvinet nr 2 når kon- centrationen sin topp vid 250 mikrogram/ml en och en halv timme efter den orala administreringen av mikrosfärerna, och i marsvinet nr 3 nås en topp vid 240 mikrogram/ml på fyra tim- mar.

Dessa experiment visar att det oralt administrerade gris- insulinet har en kraftig hypoglykemisk effekt på ett marsvin, att det verkligen inträder i blodströmmen och att dess admi- 502 324 14 nistrering inte endast stimulerar den produktion av marsvins- insulin som åstadkommes av djuret.

Exempel 7a Förfarandet enligt Exempel 3b upprepas, bortsett från att de insulinfyllda mikrosfärerna suspenderas i vattenhaltig ättik- syra med pH lika med 2,25 i stället för 3,5. En förseglad li- ten flaska med denna suspension förvaras i rumstemperatur under 23 dygn.

Exempel 7b Aktiviteten hos,det på detta sätt åldrade inkapslade insuli- net undersöks genom att suspensionen administreras medelst slang till magarna hos vuxna råttor som inte har fått föda under 8 timmar, varpå blodglukosnivåerna mäts i intervall ef- ter doseringen. Resultaten är visade i Tabell 4.

Tabell 4 Blodglukos (mg/dl) Råtta nr vikt'(g) dos (ml) Tid efter dosering (h) 0 0,5 1,0 1,5 2,0 3,0 40 398 0,40 64 49 44 34 33 35 41 415 0,42 79 89 35 82 80 80 42 479 0,48 79 50 34 37 37 49 Normalt kan insulin i lösning förväntas bli försämrat inom några få dagar, även då det kyls. Storleken hos blod- sockerminskningen i alla dessa råttor och den förlängda ef- fekten som visas av råttorna nr 40 och 42 anger att insulin- lösningsstabiliteten förbättras genom inkapsling i sura pro- teinoidmikrosfärer.

Exempel 7c Den åldrade suspensionen av inkapslat insulin tillsätts till humant serum, och med tillämpning av en räkneteknik med en hemocytometer av standardlaboratorietyp räknas antalet mikro- sfärer omedelbart efter blandning samt i intervall därefter.

Tabell 5 visar antalet mikrosfärer som kan iakttas såsom en funktion av tiden.

Tabell 5 Upplösning av mikrosfärer i humant serum Tid (minuter) 0 3 30 60 Mikrosfärer (x 1000) 78 50 19 9 502 324 15 Dessa data visar att insulinbärande sura proteinoidmikro- sfärer som har förblivit intakta efter 23 dygns exponering vid rumstemperatur för vattenhaltig ättiksyra med pH 2,25 fortfarande upplöses snabbt i humant serum som är i det när- maste neutralt.

Exempel 8a En vattenlösning av heparin innehållande 250 mg/ml heparin inställs till pH 4,5 genom tillsats av koncentrerad ättik- syra. Till detta sätts 35 mg/ml av den torra pulverformiga sura proteinoidén enligt exempel Ba, varefter blandningen får stå vid rumstemperatur tills mikrosfärer har bildats. En vo- lymdel av blandningen centrifugeras därefter, och sedan den överliggande vätskan har kastats bort tvättas de heparinbä- rande mikrosfärerna med vattenhaltig ättiksyra med pH 4,5, varefter de filtreras och åter suspenderas i vattenhaltig ättiksyra med pH 4,5, vilken suspension görs upp till en volymdel. Mikroskopisk undersökning visar att mikrosfärerna huvudsakligen ligger inom intervallet från ca 0,1 till ca 5 um i diameter, varvid huvuddelen ligger mellan 1 och 2 um.

Exempel Bb Sju vita hanráttor, av vilka var och en väger ca 600 g, ges ingen föda under 12 timmar innan experimentet påbörjas. Rät- tan nr 1 får ingen behandling. Råttan nr 2 får en intravenös injektion av 250 mg heparin i en ml destillerat vatten. I ma- gen på var och en av råttorna nr 3 - 7 införes direkt medelst slang vattensuspensionen av heparinbärande mikrosfärer enligt Exempel Ba. Verkan av heparin fastställs med användning av testet Activated Partial Thromboplastin Time (APTT). Detta test mäter tiden som krävs för att en provdel serum som tas ur svansvenen skall bilda en fibrinklump. Resultaten för var- je råtta vid skilda tidpunkter efter doseringen är visade i Tabell 6. 5102 324 16 Tabell 6 Tid fram till koagulering i APTT-testet (s) Heparin- För- Ràtta nr behandling dosering 1 h 2 h 3 h 4 h 24 h 1 Ingen 28 26 27 - - - 2 IV 25 54 >300 - - - 3 Mikro- 24 35 >300 - - - sfärer 4 " 26 35 59 118 >300 21 5 " 29 41 63 106 248 26 6 " 'I 25 37 66 121 >300 23 7 " 24 31 62 lll >300 37 I alla djur som mottar heparinbärande mikrosfärer ökar koaguleringstiden till en nivå som är jämförbar som den som uppträder efter_en intravenös injicering av heparin. Det står klart från dessa data att heparin avges till blodströmmen på ett fysiologiskt meningsfullt och aktivt sätt då det är in- kapslat i sura proteinoidmikrosfärer och administreras oralt.

Det bör observeras att den orala administrationen av mycket större doser per enhet kroppsvikt oskyddat heparin som ges åt laboratoriedjur och människor inte ger upphov till någon detekterbar ökning i koaguleringstid.

Exempel 9a En vattenlösning av fysostigmin som innehåller 50 mg/ml fyso- stigmin justeras till pH 5 genom tillsättning av koncentrerad ättiksyra. Till en volym av denna lösning sätts 100 mg per ml av den torra, pulverformiga sura proteinoiden i Exempel 3a, varefter blandningen får stå vid rumstemperatur tills mikro- sfärer har bildats. Den filtreras därefter och tvättas tre gånger med vattenhaltig ättiksyra med pH 5, varefter de av- kilda mikrosfärerna åter suspenderas i en volym ättiksyra med pH 5. Mikroskopisk undersökning visar att de suspenderade mikrosfärerna huvudsakligen har diametern 0,5-5,0 um.

Exempel 9b vardera av två normala råttor med en vikt av ca 360 g ges me- delst slang 3 ml av suspensionen av fysostigminbärande mikro- sfärer. Inom 30 minuter efter doseringen har båda djuren dött, och de visar båda förstorad lever och peritoneal blödning. 502 324 17 Dessa dödliga orala doseringar av mikroinkapslat fysostigmin beräknas uppgå till mindre än en procent av LD5o-oraldoseringen av oskyddat fysostigmin i råttor.

Förutom de speciella farmakologiska medlen som är visade i de ovannämnda exemplen för frigivning i blodströmmen i fy- siologiskt aktiv form när de administreras oralt inuti skyd- dande sura proteinoidmikrosfärer, är nämnda mikrosfäradminist- reringssystem på likartat sätt effektivt med en stor mångfald andra medel som är labila i magmiljön, inklusive nitroglycerol, salkpoliovaccin,frubellavaccin och hepatit (B)-vaccin. Det finns emellertid många andra farmakologiska medel som skulle kunna påverkas på ett skadligt sätt t o m av de milda sura betingelserna som påträffas under inkapsling i sura proteinoid- mikrosfärer.

Följande experiment demonstrerar förmågan hos en basisk proteinoid att bilda mikrosfärer som inkapslar och skyddar ett sådant extremt syrakänsligt farmakologiskt medel, ett do- paminderivat, från den fientliga miljön.i det gastrointesti- nala området samt avger nämnda medel till cirkulationssystemet, varifrån det genomtränger hjärnans blodbarriär och frigör do- pamin i hjärnan. Dopaminderivatet som används i detta experi- ment är PR-21, som är en proprietär komposition av acylerat dopamin bundet till en redoxbärare av typ reducerad dihydro- pyridin/pyridiniumsalt som utvecklades av Pharmatek, Inc. och som är beskriven 1 det amerikanska patentet 4 479 932. Den oskyddade PR-21-kompositionen är instabil överallt i det gastro- intestinala området och är särskilt känslig för sura betingel- ser. Vid intravenös injicering i råttor kan betydande mängder av den deacylerade kvaternära prekursorn av dopamin uppmä- tas i den homogeniserade råtthjärnan medelst metoden enligt Bodir och Farog, Journal of Medicinal Chemistry, gå, 528 (1983).

Exempel 10a En med kväve täckt blandning av två viktdelar arginin, två vikt- delar lysin och en viktdel av en ekvimolär blandning av de 16 neutrala och sura aminosyror som finns i djurprotein om- rörs och upphettas vid l80°C under 3 timmar. Den kylda reak- tionsblandningen extraheras med vattenhaltig ättiksyra med pH 2,25 och extraktet dialyseras genom ett kollodiummembran mot en 5021324 18 stor volym destillerat vatten vid rumstemperatur under 48 timmar, varvid vattnet byts var sjätte timme. Innehållet i dialysrören upphettas därefter under vakuum vid 65°C och ger därvid en torr, pulverformig, basisk proteinoid. När den är suspenderad i en måttligt till starkt alkalisk vätskemiljö bildar denna pulverformiga proteinoid spontant ihåliga mikro- sfärer som är stabila i den nämnda miljön men som löses vid det i det närmaste neutrala pH-värdet hos blod.

Exempel l0b En volymdel av en etanollösning av PR-21 (360 mg/ml) späds ut med en lika stor volym destillerat vatten, och lösningens pH justeras till 8 genom tillsättning av mättat vattenhaltig enba- sisk kaliumfosfatbuffert. En del av denna buffrade lösning, som innehåller 180 mg/ml PR-21, ställs åt sidan, och doser av densamma kommer_nedan att betecknas såsom "oskyddad PR-21". Återstoden av den buffrade lösningen blandas med 25 mg/ml av den torra, pulverformiga, basiska proteinoiden i Exempel 10a och kyls i ett isbad tills mikrosfärer har bildats. Doser av den resulterande suspensionen, i vilken mikrosfärerna har en diameter av huvudsakligen 0,1 till 5 u, benämnes nedan "mikroinkapslad PR-21".

Exempel l0c Två råttor som väger ca 500 g (råttorna DA-1 och DA-2) sövs ned, tomtarmen dras ut, och sfinktern knyts ihop för att hindra tillbakaflöde till magen. Två ml mikroinkapslad PR-21 injice- ras därefter i tomtarmen hos vardera råttan. Två likartade jämförelsråttor (råttorna DA-5 och DA-6) behandlas på likartat sätt, men injiceras i tomtarmen med 2 ml oskyddad PR-21. Slut- ligen injiceras två likartade jämförelseråttor (råttorna DA-3 och DA-4) intravenöst med 2 ml oskyddad PR-21. Tabell 7 visar mängden deacylerad kvaternär prekursor av dopamin som kan de- tekteras i de homogeniserade hjärnorna hos de sex råttorna. 502 324 19 Tabell 7 Kvaternär dopaminprekursor i råtthjärnor Råtta nr Behandling Prekursor (mikrogram/g) DA-1 Tarminjicering, 1 mikroinkapslad PR-21 - DA-2 Tarminjicering, 10 mikroinkapslad PR-21 DA-3 IV injicering, 3 oskyddad PR-21 DA-4 IV injicering 4,5 oskyddad PR-21 DA-5 Tarminjicering 0 oskyddad PR-21 DA-6 Tarminjicering 0 oskyddad PR-21 Dessa resultat visar förmågan hos basiska proteinoidmikro- sfärer att inkapsla och skydda ett dopaminderivat från mat- smältningsenzymerna och den basiska miljön i tarmen åvensom det förhållandet att sådana mikrosfärer transporteras tvärs igenom tarmväggen in i den i det närmaste neutrala blodströmmen när det inkapslade dopaminderivatet friges. För framgångsrik oral administrering av dylikt inkapslat farmakologiskt medel måste de för syra känsliga basiska proteinoidmikrosfärerna skyddas då de genomlöper munnen och magen. Detta kan med för- del utföras medelst en konventionell enteral beläggning som inte upplöses förrän den når tarmen.

Exempel 12 En omrörd blandning av 2 moldelar vattenfri glutaminsyra, 2 moldelar lysin och 1 moldel av en ekvimolär blandning av neutrala aminosyror (alanin, glycin, leucin, fenylalanin, prolin, tyrosin och valin) upphettas under kväve vid 170°C i fyra timmar. Den kylda reaktionsprodukten extraheras med vattenhaltig ättiksyra med pH 2,25, och extraktet dialyseras genom ett kollodiummembran mot destillerat vatten i 24 timmar, varvid vattnet byts var 4:e timme. Innehållet i dialysrören avdunstas till torrhet vid 65°C under vakuum, och det fasta resterande materialet mals till ett fint pulver. Vid tillsätt- ning till en vattenlösning eller -suspension av ett farmako- logiskt medel med pH 7,4 bildar denna neutrala, pulverformiga 502*324 20 proteinoid spontant en stor mängd ihåliga mikrosfärer som in- kapslar ifrågavarande lösning eller suspension.

Dessa mikrosfärer är stabila 1 humant serum men upplöses snabbt i vattenhaltig syra med pH 2,5 för frigivning av sitt innehåll. Då dessa neutrala proteinoidmikrosfärer destabili- seras genom exponering för reducerat pH, såsom den som påträf- fas vid inneslutning i makrofager, är de lämpade för intra- venös administrering av ett farmakologiskt medel, såsom azido- tymidin, som i oskyddad form snabbt absorberas av många kropps- vävnader och celler som inte gjorts till mål och även av de såsom mål angivna makrofagerna.

Det torde vara uppenbart för fackmannen att en mångfald ändringar och modifikationer kan göras 1 de åskådliggörande utföringsformerna av uppfinningen vilka har beskrivits ovan utan att detta innebär någon avvikelse från uppfinningstanken såsom den är uttryckt i de bifogade patentkraven.

Claims (14)

502 324 21 PATENTKRAV

1. Komposition, k ä n n e t e c k n a d därav, att den innefattar ett farmakologiskt aktivt medel inkapslat i proteinoidmikrosfärer som huvudsakligen har en diameter som är mindre än ca 10 pm och som är bildade av polykondensat av blandade aminosyror framställda genom upphettníng.

2. Komposition enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d därav, att nämnda polykondensat är surt och att nämnda mikrosfärer är stabila mot syror och enzymer i munnen.

3. Komposition enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d därav, att nämnda polykondensat är basiskt och att nämnda mikrosfärer är stabila i det svagt basiska nedre matsmält- ningsområdet.

4. U. Komposition enligt krav 3, k ä n n e t e'c k n a d därav, att nämnda farmakologiska medel är ett dopaminredox- bärarsystem.

5. Komposition enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d därav, att nämnda polykondensat är surt och att nämnda mikrosfärer är stabila mot syror och enzymer i magen.

6. Komposition enligt krav 5, k ä n n e t e c k n a d därav, att nämnda farmakologiska medel är insulin.

7. Komposition enligt krav 5, k ä n n e t e c k n a d därav, att nämnda farmakologiska medel är heparin.

8. Komposition enligt krav 5, k ä n n e t e c k n a d därav, att nämnda Farmakologiska medel är fysostigmin.

9. Komposition enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d därav, att nämnda polykondensat är neutralt och att nämnda mikrosfärer är stabila i blodströmmen och är instabila vid sänkt pH.

10. Komposition enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d därav. att nämnda mikrosfärer huvudsakligen har en diameter från ca 0,5 till ca 5,0 ym.

11. Komposition enligt krav 1, vari nämnda mikrosfärer är stabila i åtminstone ett segment av det gastrointestinala området, är instabila i blodströmmen och lätt passerar genom de gastrointestinala slemhinnorna och friger nämnda aktiva medel i blodströmmen i fysiologiskt aktiv form. šoà 324 22

12. Sätt att mikroinkapsla ett farmakologiskt aktivt medel i mikrosfärer för målriktad frigivning inom ett utvalt pH- intervall, k ä n n e t e c k n a t därav, att en bland- ning av nämnda medel med en farmaceutiskt acceptabel vätska bildas, varvid nämnda blandning har ett pH utanför nämnda - utvalda intervall, och att nämnda blandning bringas i kon- takt med proteinoider bildade av polykondensat av blandade aminosyror som är framställda genom upphettning och som är lösliga inom nämnda utvalda pH-intervall och olösliga i nämnda blandning under bildande av mikrosfärer med diametrar som huvudsakligen har en diameter som är mindre än ca 10 pm innehållande det aktiva medlet.

13. Sätt enligt krav 12, k ä n n e t e c k n a t därav, att nämnda farmaceutiskt acceptabla vätska är vatten.

14. Sätt enligt krav 12, k ä n n e t e c k n a t därav, att det inkluderar preliminär rening av nämnda polykondensat genom blandning av dessa med vatten som har ett pH inom nämnda utvalda intervall och separation av den resulterande vattenlösningen av nämnda polykondensat från ett eventuellt olösligt material.