CH671155A5

CH671155A5 -

Info

Publication number: CH671155A5
Application number: CH1446/88A
Authority: CH
Inventors: Solomon S Steiner; Robert Rosen
Original assignee: Clinical Technologies Ass
Priority date: 1986-08-18
Filing date: 1987-08-14
Publication date: 1989-08-15
Also published as: EP0318512B1; NO881664D0; AU610083B2; GB2217201A; US4925673A; AU7875287A; GB2217201B; SE8900542D0; NO178055B; SE502324C2; GB8830377D0; EP0545913B1; JP2876058B2; WO1988001213A1; CA1323305C; JPH02500669A; EP0545913A1; NL8720442A; NO178055C; NO881664L

Description

DESCRIPTION

La présente invention concerne des agents pharmacologiquement actifs qui sont encapsulés dans des microsphères protéinoïdes protectrices et l'administration de ces agents à des animaux homéo-thermes. Elle concerne en particulier des microsphères administrées par voie orale et contenant des agents pharmacologiques qui, autrement, seraient désactivés dans l'appareil gastro-intestinal.

Les modes d'administration d'agents pharmaceutiques et thérapeutiques dont on dispose sont souvent gravement limités par des barrières chimiques ou physiques ou physico-chimiques qui sont imposées par le corps. Ainsi, l'administration orale d'un grand nombre de ces agents serait le procédé généralement choisi, n'étaient les nombreuses barrières que ces agents rencontrent sur leur route.

Des conditions gastro-intestinales de pH défavorable, la présence de puissantes enzymes digestives, les propriétés de perméabilité des membranes et tissus gastro-intestinaux et d'autres facteurs jouent tous des rôles importants pour déterminer la possibilité d'une administration orale des agents actifs en direction de leurs cibles. Parmi , les nombreux agents pharmacologiques dont on sait qu'ils sont négativement affectés ou rendus inefficaces lorsqu'on les administre par voie orale, on peut citer les Polypeptides et protéines biologique-ment actifs, comme l'insuline. Ces agents sont rapidement détruits dans l'estomac par hydrolyse acide et, dans l'estomac comme dans l'appareil gastro-intestinal inférieur, par des enzymes capables de cliver les liaisons peptidiques; en outre, ils passent difficilement ou pas du tout à travers la paroi gastro-intestinale.

Un grand nombre d'efforts se sont concentrés sur la modification ou l'isolement des conditions délétères dans l'appareil gastro-intestinal pour qu'un agent pharmacologique, qui autrement serait labile, puisse être absorbé à travers la paroi de l'estomac ou de l'intestin et sous une forme pharmacologiquement active. La recherche dans ces domaines s'est dirigée principalement dans trois directions; la co-administration d'adjuvants, comme les résorcinols et les agents ten-sio-actifs non ioniques, oléyléther de polyoxyéthylène et n-hexa-décylpolyéthylèneéther; la coadministration d'inhibiteurs enzyma-tiques, comme l'inhibiteur de la trypsine pancréatique, le diisoprop-ylfluorophosphate (DFP) et le trasylol, et l'utilisation de liposomes, comme des émulsions eau-dans-huile-dans-eau qui fournissent une couche protectrice de lipides autour de l'agent pharmacologique incorporé et qui représentent à l'heure actuelle la méthode la plus fructueuse. Ainsi, l'utilisation de liposomes contenant de l'héparine est décrite dans le brevet américain N" 4 239 754 et plusieurs études ont été consacrées à l'utilisation de liposomes contenant de l'insuline [par exemple Patel et coll., «FEBS Letters», 62,60 (1976), et Hashimoto et coll., «Endocrino!. Japan.», 26, 337 (1979)]. En dépit de ces preuves de leur caractère opératoire limité, l'utilisation de liposomes en est toujours au stade de développement et ceux-ci posent toujours des problèmes, y compris une mauvaise stabilité et une durée de conservation insuffisante.

On a donc toujours besoin d'un moyen amélioré de cibler la libération d'agents pharmacologiques actifs dans le corps et en particulier d'un moyen plus satisfaisant pour l'administration orale d'agents pharmacologiques qui sont labiles aux conditions de l'appareil gastro-intestinal.

L'invention a pour but de fournir un moyen amélioré pour libérer un agent pharmacologique sous forme physiologiquement active dans un organe ou fluide corporel cible.

L'invention a encore pour but de fournir un système d'administration perfectionné pour l'administration entérique d'agents pharmacologiques qui, par eux-mêmes, passent lentement ou pas du tout à travers la paroi gastro-intestinale et/ou peuvent subir un clivage chimique par les acides et enzymes de l'appareil gastro-intestinal.

Un but spécifique est de fournir un tel système d'administration dans lequel l'agent pharmacologique actif est encapsulé dans une matière protectrice qui est elle-même inoffensive, qui n'altère pas les propriétés physiologiques et biologiques de l'agent actif, qui protège l'agent actif contre les conditions délétères de l'appareil gastro-intestinal et qui disparaît ou libère l'agent actif dans les courants sanguins ou autres cibles.

L'invention a encore pour but spécifique de fournir une telle combinaison d'agents actifs et de matière protectrice qui soit suffisamment lipophile et de faible taille particulaire pour passer rapidement à travers la muqueuse gastro-intestinale et qui soit simple à préparer en grand.

D'autres buts de l'invention consistent à fournir des procédés de production de tels systèmes d'administration et à les administrer à des animaux. Un but spécifique est de fournir un moyen efficace pour l'administration orale d'insuline à des mammifères diabétiques.

On a trouvé que ces buts et d'autres avantages, qui apparaîtront d'après la présente description, sont atteints par l'invention décrite ci-dessous.

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Au sens large, un aspect de l'invention est un système d'administration d'un agent pharmacologique actif comprenant ledit agent inclus ou encapsulé dans des microsphères de protéinoïdes.

Un second aspect large de l'invention est un procédé pour encapsuler un agent pharmacologique actif dans lequel on mélange ledit agent actif avec un liquide pharmaceutiquement acceptable et on met en contact ledit mélange avec un protéinoïde qui interagit avec ledit mélange pour former des microsphères creuses.

Un troisième aspect large de l'invention est un procédé pour cibler la libération d'un agent pharmacologiquement actif dans un animal, procédé dans lequel on administre audit animal une quantité efficace dudit agent actif encapsulé dans des microsphères de protéinoïdes, lesdites microsphères étant stables aux conditions rencontrées pendant la migration à partir du point d'introduction dans ledit animal vers une zone de libération ciblée et qui sont instables dans ladite zone.

Les protéinoïdes, qui forment les capsules protectrices de l'invention, ont été décrits comme étant des polypeptides artificiels, car ce sont des polymères de condensation de la main de l'homme produits par assemblage aléatoire ou dirigé d'acides aminés naturels ou synthétiques et/ou de petites chaînes peptidiques. Après la découverte, vers la fin des années cinquante, selon laquelle les polymères de condensation linéaire d'acides aminés naturels mixtes pouvaient interagir avec de l'eau pour former des microsphères creuses, les protéinoïdes ont fait l'objet de recherches poussées sur l'origine de la vie.

Un excellent examen de ces recherches avec d'abondantes bibliographies se trouve dans Fox, S.W. et Dose, K-, «Molecular Evolution and the Origin of Life», Marcel Dekker, Inc., New York (1977), ici mentionné à titre de référence.

A la suite de ces études, ainsi que d'autres, un grand nombre de connaissances ont été accumulées concernant la préparation et les propriétés des protéinoïdes et des microsphères de protéinoïdes. Ainsi, on sait que les protéinoïdes dérivés d'acides a-aminés naturels (ceux que l'on trouve dans les protéines animales ou végétales), ainsi que ceux qui incorporent d'autres matières que l'on trouve dans la nature (comme les polynucléotides, l'acide phosphorique, le fer et le calcium), sont non toxiques. On a également trouvé que l'inclusion dans le polymère d'un excès stœchiométrique d'acides aminés di- ou polycarboxyliques acides aboutit à un protéinoïde acide qui est insoluble dans un environnement acide et soluble dans un environnement basique, tandis que l'inclusion d'un excès de diamino- ou poly-aminomonomère basique aboutit à un protéinoïde basique qui est soluble en milieu acide et insoluble à pH élevé. Ces caractéristiques de solubilité peuvent être très finement ajustées. De même, la taille des microsphères formées par mise en contact des protéinoïdes avec l'eau ou un autre liquide peut être réglée dans un intervalle allant de moins d'environ 0,5 à environ 10 microns ou plus en manipulant divers paramètres physiques ou chimiques, comme le pH, l'osmola-rité ou la teneur en sel du liquide. On a également observé que les protéinoïdes sont beaucoup plus résistants que les protéines au clivage par enzymes digestives. L'invention provient de la découverte selon laquelle on peut encapsuler un agent pharmacologiquement actif dans des microsphères de protéinoïdes simplement en dissolvant ou en mettant en suspension cet agent dans un liquide pharmaceutiquement acceptable, comme l'eau ou le diméthylsulfoxyde qui interagit avec ce protéinoïde pour former des microsphères.

On a également découvert qu'une telle encapsulation n'altère pas les propriétés pharmacologiques de l'agent actif et que les microsphères portant l'agent actif et ayant des diamètres inférieurs à environ 10 microns sont suffisamment petites pour passer facilement à travers la muqueuse gastro-intestinale et pénétrer dans le courant sanguin. L'intervalle préféré pour une diffusion rapide est d'environ 0,5 à environ 5,0 microns, car les tailles inférieures présentent une stabilité un peu moindre et incorporent relativement peu d'agents actifs et les tailles supérieures diffusent moins facilement. Cependant, les particules allant d'environ 5,0 à environ 10 microns sont utiles mélangées avec celles de l'intervalle préféré, car leur diffusion plus lente aboutit à une libération prolongée de l'agent actif.

En ajustant aussi bien des caractéristiques de solubilité d'un protéinoïde acide que la taille particulaire des microsphères par des moyens connus, on a trouvé qu'il est possible de produire des micro-sphères portant un agent actif qui sont stables dans la bouche (pH normal d'environ 4 à environ 6,8), qui passent rapidement à travers la muqueuse de la bouche dans le courant sanguin et qui libèrent l'agent actif dans le sang (pH normal allant d'environ 7,35 à environ 7,45). Ces systèmes conviennent pour l'administration sublinguale d'agents pharmacologiques comme l'hormone de croissance humaine ou bovine, l'interféron ou l'interleukine II.

De même, il est possible de produire des microsphères facilement diffusables à partir de protéinoïdes acides qui sont stables dans l'estomac très acide (pH normal allant d'environ 2 à environ 6), mais ' qui se dissolvent dans le sang presque neutre. Ces systèmes conviennent pour l'administration orale d'hormones peptidiques comme l'insuline ou l'héparine qui, autrement, seraient rapidement détruites dans l'estomac. Ils conviennent également pour protéger l'estomac contre les agents irritants gastriques, comme l'aspirine. Lorsqu'on administre par voie orale des microsphères contenant une telle aspirine, elles passent à travers la paroi de l'estomac et libèrent l'aspirine dans le courant sanguin beaucoup plus rapidement que l'aspirine à revêtement entérique classique, laquelle doit tout d'abord traverser l'estomac, puis pénétrer dans le courant sanguin à travers la paroi intestinale seulement après que le revêtement entérique s'est dissous.

Il est également possible de produire des systèmes à partir de protéinoïdes basiques qui sont stables dans l'appareil digestif inférieur faiblement basique (pH normal d'environ 8), mais qui libèrent l'agent actif dans le sang. Ces systèmes conviennent pour l'administration d'agents pharmacologiques comme des régulateurs de calcium et des systèmes-supports redox pour la dopamine ou l'acide y-aminobutyrique.

Outre ces systèmes à libération par administration entérique, il est également possible de produire un système de microsphères de protéinoïdes presque neutres qui est stable dans le courant sanguin, mais qui libère son contenu d'agents pharmacologiques en réponse à l'environnement de l'organe cible, comme un pH supérieur ou inférieur ou la présence d'une enzyme spécifique. Ces systèmes presque neutres doivent être introduits par voie intraveineuse, à moins que les microsphères ne soient suffisamment faibles pour être encapsulées dans des microsphères de protéinoïdes plus grandes qui peuvent diffuser à travers la muqueuse gastro-intestinale et qui sont stables jusqu'à ce qu'elles atteignent le courant sanguin.

Bien qu'on puisse encapsuler n'importe quel agent pharmacologique dans des microsphères de protéinoïdes, cela est naturellement particulièrement intéressant pour la production de tels agents qui, autrement, seraient détruits ou rendus moins efficaces par les conditions que l'on rencontre dans le corps animal avant qu'ils n'atteignent leur zone cible.

L'exemple 1 ci-dessous précise la préparation d'un protéinoïde thermique acide qui interagit avec une solution aqueuse d'un agent pharmacologiquement actif pour encapsuler et protéger cet agent dans des microsphères creuses. Ces microsphères présentent une stabilité en présence des enzymes digestifs et de l'acide de l'estomac et, ayant de manière prédominante un diamètre inférieur à 5,0 microns, passent facilement à travers la paroi stomacale dans le courant sanguin faiblement basique, où elles se dissolvent et libèrent l'agent pharmacologique.

Exemple la:

On chauffe sous azote à 160° C avec dégagement de gaz un mélange agité de 52,3 g d'acide aspartique (0,4 mole), 42 g de chlorhydrate d'arginine (0,2 mole), 26 g d'isoleucine (0,2 mole) et 50 ml de glycérol. On maintient alors la température à 155° C pendant 23 heures, après quoi on refroidit le mélange à la température ambiante, on extrait avec 200 ml de bicarbonate de sodium aqueux à 10% en poids, et on dialyse l'extrait à travers une membrane de col-lodion contre de l'eau distillée pendant 26 heures, l'eau étant

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changée toutes les 6 heures. On fait alors évaporer jusqu'à siccité à 50° C sous vide le contenu des tubes de dialyse pour donner une matière protéinoïde acide solide vitreuse, que l'on broie en une poudre fine.

Exemple 1b:

On ajoute 35 mg de ce protéinoïde en poudre à un mélange de 50 mg de cristaux d'insuline de porc dans 2 ml d'eau distillée et on laisse reposer le mélange à la température ambiante jusqu'à ce que des microsphères se soient formées. On sépare par filtration les microsphères portant l'insuline, on lave avec de l'acide acétique aqueux à pH 5,4, puis on remet en suspension dans 2 ml d'acide acétique aqueux à pH 5,4. L'examen microscopique de cette suspension révèle des microsphères stables dont le diamètre est surtout compris entre 0,1 et 5,0 microns. Lorsqu'une fraction de la suspension est neutralisée à pH 7,4 avec de l'hydroxyde d'ammonium concentré, la dissolution des microsphères est immédiatement évidente.

Exemple le:

On administre à 3 rats blancs adultes ayant des niveaux normaux de glucose sanguin une dose de 0,35 ml de suspension de microsphères portant l'insuline de l'exemple 2b au moyen d'une seringue insérée à travers la bouche jusque dans l'estomac. Après administration, chacun de ces animaux présente une réduction significative du glucose sanguin, mesurée dans des échantillons de sang prélevés dans la queue.

Bien que les microsphères creuses appropriées pour encapsuler des agents pharmacologiques puissent être formées à partir de protéinoïdes provenant d'un seul acide aminé acide ou basique et d'un seul autre acide aminé, une plus grande diversité de composants acides aminés produit souvent des rendements supérieurs de microsphères de taille uniforme dans l'intervalle de diamètre désiré de 0,5 à 5,0 microns. L'exemple 2 présente l'efficacité, dans la production d'un effet hypoglycémique chez les mammifères, de l'administration orale d'insuline encapsulée dans un protéinoïde provenant de 18 acides aminés différents.

Exemple 2a:

On chauffe un ballon de filtration de 250 ml contenant 10 g d'acide dl-glutamique anhydre et 10 g d'acide dl-aspartique anhydre sous azote dans un bain d'huile à environ 200° C jusqu'à ce que son contenu ait fondu. A cela on ajoute 5 g d'un mélange équimolaire anhydre des 16 acides aminés neutres et basiques que l'on trouve dans les protéines animales, à savoir alanine, arginine, asparagine, cystéine, glycine, histidine, leucine, lysine, méthionine, phényl-alanine, proline, sérine, thréonine, tyrosine, tryptophane et valine.

On agite le mélange résultant avec une baguette de verre et on le maintient à 200° C sous azote pendant 3 heures. Après refroidissement, on extrait le produit ambré avec une solution aqueuse saturée de bicarbonate de sodium et on dialyse la solution résultante à s travers une membrane de collodion contre de l'eau distillée à la température ambiante pendant 24 heures, l'eau étant changée toutes les 6 heures. On acidifie alors le contenu des tubes de dialyse à pH 5,4 avec de l'acide acétique concentré et on centrifuge. Après avoir jeté le liquide surnageant, on lave les fractions solides insolubles avec de io l'acide acétique aqueux à pH 5,4 et on centrifuge à nouveau. On jette également ce liquide de lavage et on sèche le produit protéinoïde soluble sur gel de silice pendant la nuit, puis on le broie en une poudre fine avec un mortier et un pilon.

I5 Exemple 2b:

On ajoute un mélange de 50 mg de cristaux d'insuline de porc dans 2 ml d'eau distillée à 35 mg du protéinoïde en poudre sèche de l'exemple 2a et on laisse le mélange reposer à la température ambiante jusqu'à ce que des microsphères se soient formées. On cen-20 trifuge alors le mélange pendant 15 minutes. Après avoir jeté le liquide surnageant, on lave une fois les microsphères restantes avec de l'acide acétique aqueux à pH 5,4 à la température ambiante et on centrifuge pendant encore 15 minutes. On jette à nouveau le liquide surnageant et on remet en suspension les microsphères de protéinoï-25 des portant de l'insuline dans 2 ml d'acide acétique aqueux à pH 5,4. L'examen microscopique de la suspension montre que les microsphères ont surtout un diamètre compris entre 0,5 et 5,0 microns.

Exemple 2c:

30 On répartit au hasard 12 rats blancs mâles pesant chacun approximativement 500 g et ayant un niveau normal de glucose sanguin entre 4 groupes de 3 individus pour mettre en évidence l'efficacité physiologique de l'administration orale d'une suspension aqueuse de microsphères de protéinoïdes portant de l'insuline pro-35 duite selon le procédé de l'exemple 2b ci-dessus. On administre entre 0,35 et 0,5 ml de cette suspension aqueuse de microsphères par gavage dans l'estomac de chaque rat du groupe 1. De même, on administre entre 1,5 et 1,7 ml de la suspension aux rats du groupe 2. Les rats du groupe 3 reçoivent 1,0 ml d'eau distillée administrée de 40 la même manière. Les rats du groupe 4 reçoivent de la même manière 25,0 g d'insuline de porc dans 1,0 ml d'eau distillée. Avant et pendant l'expérience, on laisse à tous les animaux accès libre à l'eau et à leur nourriture normale. On mesure les niveaux de glucose sanguin sur des échantillons prélevés dans la queue à des intervalles 45 précis après traitement et on enregistre les moyennes de groupes au tableau 1 en milligrammes de glucose par décilitre de sang (mg/dl).

Tableau 1 Moyenne du glucose sanguin (mg/dl)

Groupe

Prédose

30 min lh

1,5 h

2h

2,5 h

3 h

4 h

6 h

12 h

24 h

36 h

48 h un

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Il est clair, d'après les données du tableau 1, que l'insuline est libérée de manière physiologiquement significative et active par la voie orale avec les microsphères de protéinoïdes acides. Chez tous les animaux recevant des microsphères contenant de l'insuline, le niveau de glucose sanguin retourne au niveau antérieur à l'administration sans aucun effet nocif observé. Il faut noter que l'administration de doses plus importantes de microsphères contenant de l'insuline aux animaux du groupe 2 semble accroître la durée de l'action plutôt que l'amplitude de l'effet. Il faut également noter que l'administration orale de doses beaucoup plus importantes par unité de poids corporel d'insulines de porc ou de bœuf non protégées à des 60 animaux de laboratoire et à des êtres humains ne produit pas de réduction détectable des niveaux de glucose sanguin.

On peut produire des microsphères de protéinoïdes portant de l'insuline tout aussi efficaces en mettant en contact un protéinoïde acide en poudre sèche comme ceux des exemples 1 à 2a, avec de l'in-« suline en suspension ou dissoute dans une grande variété de liquides pharmaceutiquement acceptables, y compris les solutions aqueuses d'éthanol, isopropanol, terpénol, diméthylsulfoxyde, amidon, Tween 80 et cyclodextran.

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L'exemple 3 présente un procédé particulièrement apprécié de production de microsphères de protéinoïdes portant de l'insuline qui produit de façon fiable des rendements élevés de microsphères tombant dans l'intervalle de diamètres souhaitable de 0,5 à 5,0 microns et qui sont facilement solubles au pH du sang cible.

Exemple 3a:

On chauffe un ballon contenant 2 parties en poids d'acide 1-glutamique anhydre sous un courant d'azote, dans un bain d'huile à environ 175° C jusqu'à ce que le contenu ait fondu. A cela on ajoute 2 parties en poids d'acide 1-aspartique anhydre et 1 partie en poids d'un mélange équimolaire anhydre des 16 acides aminés neutres et basiques que l'on trouve dans les protéines animales. On agite le mélange résultant avec une baguette de verre et on le maintient à 175° C sous azote pendant 3 heures. Après refroidissement, on extrait le produit ambre foncé avec du bicarbonate de sodium aqueux saturé et on dialyse l'extrait à travers une membrane de col-lodion contre de l'eau distillée à la température ambiante pendant 24 heures, l'eau étant changée toutes les 4 heures. On sèche alors tout le contenu des tubes de dialyse sous vide à 65° et on broie les solides résiduels en une poudre fine avec un mortier et un pilon.

Exemple 3b:

On produit une solution aqueuse de protéinoïde en mélangeant 35 mg de la poudre de l'exemple 3a par ml d'eau, en ajustant le pH à 7,4 avec du bicarbonate de sodium aqueux concentré et en enlevant les matières insolubles éventuellement restantes par filtration. On injecte alors rapidement une partie en volume de cette solution dépourvue de solides de protéinoïde dans un volume égal d'une solution à 25 mg/ml fraîchement préparée d'insuline de porc dans de l'acide acétique aqueux à pH 2,25. On agite le mélange, qui a un pH d'environ 3,5, dans un bain glacé pendant 15 minutes et on filtre pour séparer les microsphères portant l'insuline du filtrat que l'on jette. Après avoir lavé 2 fois avec de l'acide acétique aqueux à pH 3,5, on remet en suspension les microsphères dans 10 parties en volume d'acide acétique aqueux à pH 3,5. L'examen microscopique d'une fraction de cette suspension montre un rendement élevé des microsphères, qui ont un diamètre compris de façon prédominante entre 0,5 et 5,0 microns et qui se dissolvent rapidement alors que l'on neutralise la suspension à pH 7,4 par addition de bicarbonate de sodium aqueux conentré.

Dans l'exemple 4 ci-dessous, les doses de suspension des microsphères portant l'insuline de l'exemple 3b sont appelées «microsphères remplies d'insuline». On produit des microsphères qui ne contiennent pas d'insuline encapsulée en répétant le procédé de l'exemple 3b, sauf qu'on omet l'insuline pendant la formation des microsphères et qu'on met les microsphères en suspension dans une solution à 2,5 mg/ml d'insuline de porc dans l'eau distillée, plutôt que dans l'acide acétique dilué. Les doses de la suspension résultante, qui ne contiennent pas d'insuline dans les microsphères, sont appelées «microsphères à insuline externe». Les doses de la solution à 2,5 mg/ml d'insuline de porc seule sont appelées «insuline brute».

Exemple 4:

On répartit arbitrairement 12 rats blancs mâles pesant chacun environ 500 g et ayant un niveau normal de glucose sanguin entre 2 groupes de 3 animaux et un troisième groupe de 6 animaux. On administre aux 3 animaux du groupe A les microsphères remplies d'insuline par gavage et on administre de même aux 3 animaux du groupe B les microsphères à insuline externe. De même, les 6 animaux du groupe C reçoivent l'insuline brute. Toutes les doses sont de 1 ml/500 g de poids corporel et tous les animaux sont examinés pour déterminer le glucose sanguin immédiatement avant l'administration et ensuite à des intervalles déterminés. Le niveau moyen de glucose sanguin pour les animaux de chaque groupe est présenté au tableau 2.

Tableau 2

Glucose sanguin (mgjdl) dans les groupes de rats (traitement)

Durée

(h)

A

(microsphères remplies d'insuline)

B

(microsphères à insuline externe)

C

(insuline brute)

0

109,7

92

92,7

5

54,7

89,3

95,5

1

59

84,3

98,2

2

50

80,7

95,8

3

57,7

86,7

86,2

4

64,7

84

91

6

76

83,7

89,8

8

65,7

88,7

91

12

81,7

92,3

92

24

94,3

95,7

92

Ces expériences ne montrent pas d'effet significatif sur le niveau de glucose sanguin de l'insuline brute ni de microsphères à insuline externe. En revanche, les microsphères remplies d'insuline produisent une réduction de pic d'environ 50% et un effet de longue durée. Cela montre que les microsphères de protéinoïdes acides n'ont pas d'effets sur les niveaux de glucose sanguin et qu'elles ne protègent que l'insuline encapsulée contre l'environnement hostile de l'estomac, permettant ainsi à cette insuline encapsulée de pénétrer dans le courant sanguin sous une forme physiologiquement active.

Exemple 5a:

On induit un diabète sucré chez des rats pesant environ 300 g en administrant à chacun d'entre eux une injection intraveineuse à 75 mg/kg de poids corporel de streptozotocine. On choisit pour cette expérience 10 rats dont on observe qu'ils présentent de manière constante des niveaux élevés de glucose sanguin, une polyurée et une polydypsie et doivent être maintenus par des injections sous-cuta-nées d'insuline de porc.

Exemple 5b:

On administre à 3 des rats diabétiques, par gavage, environ 1 ml de la suspension aqueuse d'insuline de porc portant des microsphères de protéinoïde acide de l'exemple 3b. Au quatrième rat diabétique, on ajoute 3 ml de la suspension dans 50 ml d'eau du robinet dans son récipient d'alimentation en eau, et ce rat s'auto-administre sa dose. On prive de nourriture tous les rats 12 heures avant l'administration. Chez tous les sujets, l'administration orale de l'insuline microencapsulée produit une réduction significative et prolongée des niveaux de glucose sanguin.

Exemple 5c:

On répartit arbitrairement les 6 rats diabétiques restants en 3 groupes de 2 animaux. On administre aux animaux du premier groupe, par gavage, 1 ml de la suspension aqueuse de microsphères de protéinoïde acide portant l'insuline de porc de l'exemple 3b. Les animaux des second et troisième groupes reçoivent des injections sous-cutanées de 0,25 mg (6,5 Ul) et 0,125 mg (3,25 UI), respectivement, d'insuline de porc. Les mesures du glucose sanguin sont faites sur tous les animaux immédiatement avant l'administration et à certains intervalles ensuite. On intervertit 2 fois les groupes d'animaux à des intervalles d'une semaine, si bien que tous les animaux reçoivent chacun des traitements à l'insuline. Le niveau moyen de diminution en pourcentage à partir du niveau de base du glucose sanguin pour chaque traitement est présenté au tableau 3.

(Tableau en tête de la colonne suivante)

Ces résultats montrent que le pic de l'effet de la dose administrée par voie orale de microsphères remplies d'insuline sur les rats diabétiques est comparable à une injection sous-cutanée de 0,125 mg d'insuline et que la durée de l'effet est significativement plus longue que celle produite par une injection sous-cutanée de 0,125 mg ou de 0,25 mg.

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Tableau 3

% de diminution à partir du glucose sanguin de base chez le rat s

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Exemple 7c:

On ajoute la suspension vieillie d'insuline encapsulée à du sérum humain et, en employant une technique standard de laboratoire de comptage à l'hémocytomètre, on compte le nombre de microsphères immédiatement après mélange et à des intervalles déterminés ensuite. Le tableau 5 montre le nombre de microsphères observable en fonction du temps.

Tableau 5

Dissolution des microsphères dans le sérum humain

Traitement

Durée (h) après administration

0,5

1

1,5

2

3

4

6

8

12

24

48

microsphères

(voie orale)

29

38

45

44

48

50

51

40

37

24

-27

0,25 mg SC

28

55

72

77

84

79

34

4

3

- 7

- 5

0,125 mg SC

5

17

27

45

47

29

8

- 8

Exemple 6:

On administre 1 ml de la suspension aqueuse de microsphères de protéinoïde acide portant l'insuline de porc de l'exemple 3b, par gavage, dans l'estomac de 3 cobayes adultes pesant environ 800 g. On prélève des échantillons de sang immédiatement avant et à des intervalles déterminés après l'administration de la dose.

On teste dans les échantillons de sang du cobaye N° 1 le glucose sanguin, qui baisse d'un niveau de prédosage de 160 mg/dl à 42 mg/dl en une demi-heure, et à 25 mg/dl en une heure et demie, où il reste pendant encore une heure et demie, moment auquel on observe des symptômes de choc insulinique et l'on ranime l'animal avec du glucose administré par voie orale.

On teste dans les échantillons de sang des cobayes N° 2 et N° 3 l'insuline de porc avec des nécessaires de radio-immunodosage qui sont vendus par Cambridge Médical Diagnostic. Ce procédé, qui distingue entre l'insuline de porc et l'insuline de cobaye, montre que le niveau de prédosage de l'insuline de porc dans le sang des 2 cobayes N° 2 et N° 3 est égal à 0. Chez le cobaye N° 2, on atteint les pics de concentration à 250 |xg/ml une heure et une heure et demie après l'administration orale de microsphères et, chez le cobaye N° 3, un pic de 240 ng/ml au bout de 4 heures.

Ces expériences montrent que l'insuline de porc administrée par voie orale a un puissant effet hypoglycémique chez le cobaye, qu'elle pénètre effectivement le courant sanguin et que son administration ne stimule pas simplement la production d'insuline de cobaye par l'animal.

Exemple 7a:

On répète le procédé de l'exemple 3b, sauf qu'on met en suspension les microsphères remplies d'insuline dans de l'acide acétique aqueux ayant un pH de 2,25, plutôt que 3,5. On conserve un flacon scellé de cette suspension à la température ambiante pendant 23 jours.

Exemple 7b:

On teste l'activité de l'insuline encapsulée ainsi vieillie en administrant la suspension, par gavage, dans l'estomac de rats adultes qui ont été privés de nourriture pendant 8 heures, puis en mesurant les niveaux de glucose sanguin à des intervalles déterminés après administration. Les résultats sont présentés au tableau 4.

Durée (min)

0

3

30

60

Microsphères ( x 1000)

78

50

19

9

15 Ces données montrent que les microsphères de protéinoïdes acides portant l'insuline qui sont restées intactes au bout de 23 jours d'exposition à la température ambiante de l'acide acétique aqueux à pH 2,25 se dissolvent toujours rapidement dans du sérum humain presque neutre.

20

Exemple 8a:

On ajuste une solution aqueuse d'héparine contenant 250 mg/ml d'héparine à pH 4,5 par addition d'acide acétique concentré. A cela on ajoute 35 mg/ml du protéinoïde acide en poudre sèche de l'exem-25 pie 3a et on laisse reposer le mélange à la température ambiante jusqu'à ce que des microsphères se soient formées. On centrifuge alors une partie en volume du mélange et, après avoir jeté le liquide surnageant, on lave les microsphères portant l'héparine avec de l'acide acétique aqueux à pH 4,5, on filtre et on remet en suspension 30 dans de l'acide acétique aqueux à pH 4,5, la suspension étant complétée jusqu'à une partie en volume. L'examen microscopique révèle que les microsphères sont surtout dans l'intervalle allant de 0,1 à 5 microns de diamètre, la majorité étant comprise entre 1 et 2 microns.

35

Exemple 8b:

On prive de nourriture 7 rats blancs mâles pesant chacun environ 600 g pendant 12 heures avant le début de l'expérience. Le rat N° 1 ne reçoit pas de traitement. Le rat N° 2 reçoit une injection intravei-40 neuse de 250 mg d'héparine dans 1 ml d'eau distillée. Chacun des rats N°s 3-7 a 1 ml de la suspension aqueuse de microsphères portant de l'héparine de l'exemple 8a introduit directement dans l'estomac par gavage. On détermine l'effet de l'héparine en utilisant le test du temps de prothrombine partielle activée [Activated Partial Throm-45 boplastin Time (APTT)]. Ce test mesure le temps nécessaire pour qu'un échantillon de sérum prélevé dans la veine caudale forme un caillot de fibrine. Les résultats pour chaque rat à divers moments après administration sont présentés au tableau 6.

50

Tableau 6

Durée de coagulation dans le test APTT (s)

55

60

Tableau 4 Glucose sanguin (mg/dl)

Poids Durée après administration (h) 0_ 0,5 1,0 1,5 2,0 3,0

40 398 0,40 64 49 44 34 33 35

41 415 0,42 79 89 35 82 80 80

42 479 0,48 79 50 34 37 37 49

Rat N°

Héparine traitement

Prédose lh

2 h

3 h

4h

24 h

1

28

26

27

2

IV

25

54

>300

—

3

microsphères

24

35

>300

—

4

microsphères

26

35

59

118

>300

21

5

microsphères

29

41

63

106-

248

26

6

microsphères

25

37

66

121

>300

23

7

microsphères

24

31

62

111

>300

37

Normalement, on peut s'attendre que l'insuline en solution se dégradera en quelques jours, même lorsqu'elle est mise au réfrigérateur. L'amplitude de la réduction du sucre sanguin chez tous ces rats et l'effet prolongé que présentent les rats Nos 40 et 42 indiquent que la stabilité de la solution d'insuline est améliorée par l'encapsulage dans les microsphères de protéinoïdes acides.

Chez tous les animaux qui reçoivent des microsphères portant de l'héparine, le temps de coagulation s'accroît à un niveau comparable à celui que l'on observe après une injection intraveineuse d'héparine.

65 II est clair, d'après ces données, que l'héparine est libérée dans le courant sanguin d'une manière physiologiquement significative et active lorsqu'elle est encapsulée dans des microsphères de protéinoïdes acides et administrée par voie orale. Il faut noter que l'adminis

7

671155

tration orale de doses beaucoup plus grandes par unité de poids corporel d'héparine non protégée à des animaux de laboratoire et à des hommes ne produit pas d'augmentation détectable du temps de coagulation.

Exemple 9a:

On ajuste à pH 5 une solution aqueuse de physostigmine contenant 50 mg/ml de physostigmine par addition d'acide acétique concentré. A un volume de cette solution on ajoute 100 mg/ml du protéinoïde acide en poudre sèche de l'exemple 3a et on laisse reposer le mélange à la température ambiante jusqu'à ce que des microsphères se soient formées. On filtre alors, on lave 3 fois avec de l'acide acétique aqueux à pH 5 et on remet en suspension les microsphères séparées dans 1 volume d'acide acétique à pH 5. L'examen microscopique révèle que les microsphères en suspension ont surtout un diamètre de 0,5 à 5,0 microns.

Exemple 9b:

On administre à 2 rats normaux pesant chacun environ 360 g, par gavage, 3 ml de la suspension de microsphères portant la physostigmine. Au bout de 30 minutes après l'administration, les 2 animaux sont morts et l'un et l'autre présentent une hémorragie hépatique et péritonéale accrue. On calcule que ces doses orales létales de physostigmine microencapsulées sont inférieures à 1% de la dose orale DL50 de physostigmine non protégée chez le rat.

Outre les agents pharmacologiques spécifiques dont les exemples qui précèdent montrent qu'ils sont libérés dans le courant sanguin sous forme physiologiquement active lorsqu'on les administre par voie orale dans des microsphères de protéinoïdes acides protectrices, ce système de libération par microsphères est de même efficace avec une grande variété d'autres agents qui sont labiles dans l'environnement de l'estomac, y compris la nitroglycérine, le vaccin contre la poliomyélite de Salk, le vaccin contre la rubéole et le vaccin contre l'hépatite B. Il existe, cependant, un grand nombre d'autres agents pharmacologiques qui pourraient être négativement affectés même par les conditions faiblement acides que l'on rencontre pendant l'encapsulage dans les microsphères de protéinoïdes acides.

Les expériences ci-dessous montrent l'aptitude d'un protéinoïde basique à former des microsphères qui encapsulent et protègent un agent pharmacologique extrêmement sensible aux acides, un dérivé de dopamine, contre l'environnement hostile de l'appareil gastrointestinal, ainsi qu'à libérer cet agent dans le système circulatoire, d'où il pénètre la barrière hémato-encéphalique et libère la dopa-mine dans le cerveau. Le dérivé de dopamine employé dans cette expérience est le PR-21, qui est une composition déposée de dopamine acylée liée à un support redox de type dihydropyridine réduite/ sel de pyridinium qui a été mis au point par Pharmatek, Inc., et est décrit dans le brevet américain N° 4479 932. La composition de PR-21 non protégée est instable dans tout l'appareil gastro-intestinal et est particulièrement sensible aux conditions acides. Lorsqu'on l'injecte par voie intraveineuse à des rats, on peut mesurer des quantités significatives du précurseur quaternaire désacylé de dopamine dans le cerveau du rat homogénéisé par le procédé de Bodir et Farog, «Journal of Médicinal Chemistry», 26, 528 (1983).

Exemple 10a:

On agite et on chauffe à 180° C pendant 3 heures un mélange balayé par de l'azote de 2 parties en poids d'arginine, 2 parties en poids de lysine et 1 partie en poids d'un mélange équimolaire des 16 acides aminés neutres et acides que l'on trouve dans les protéines animales. On extrait le mélange réactionnel refroidi avec de l'acide acétique aqueux à pH 2,25 et on dialyse l'extrait à travers une membrane de collodion contre un grand volume d'eau distillée à la température ambiante pendant 48 heures, l'eau étant changée toutes les 6 heures. On chauffe alors le contenu des tubes de dialyse sous vide à 65° C pour donner un protéinoïde basique en poudre sèche. Lorsqu'on le met en suspension dans un environnement liquide modérément à fortement alcalin, ce protéinoïde en poudre forme spontanément des microsphères creuses qui sont stables dans cet environnement, mais qui se dissolvent au pH presque neutre du sang.

Exemple 10b:

On dilue une partie en volume d'une solution éthanolique de PR-21 (360 mg/ml) avec un volume égal d'eau distillée et on ajuste le pH de la solution à 8 par addition d'un tampon au phosphate de potassium monobasique aqueux saturé. On met de côté une fraction de cette solution tamponnée, qui contient 180 mg/ml de PR-21, et les doses de cette solution sont appelées «PR-21 non protégé».

On mélange le reste de la solution tamponnée avec 25 mg/ml du protéinoïde basique en poudre sèche de l'exemple 10a et on refroidit dans un bain de glace jusqu'à ce que des microsphères se soient formées. Les doses de la suspension résultante, dans laquelle les microsphères ont de manière prédominante un diamètre de 0,1 à 5 microns, sont appelées ci-dessous «PR-21 microencapsulé».

Exemple 10c:

On anesthésie 2 rats pesant environ 500 g (rats DA-1 et DA-2), on dégage le jéjunum et on ligature le sphincter pour empêcher tout retour dans l'estomac. On injecte alors dans le jéjunum des 2 rats 2 ml de PR-21 microencapsulé. On prépare de même 2 rats témoins similaires (rats DA-5 et DA-6), mais on leur injecte dans le jéjunum 2 ml de PR-21 non protégé. Enfin, on injecte par voie intraveineuse à 2 rats témoins Similaires (rats DA-3 et DA-4) 2 ml de PR-21 non protégé. Le tableau 7 montre la quantité de précurseur quaternaire désacylé de dopamine qui est détectable dans le cerveau homogénéisé des 6 sujets.

Tableau 7

Précurseur quaternaire de la dopamine dans le cerveau de rat

Rat

Traitement

Précurseur

N°

(ng)

DA-1

injection intestinale PR-21 microencapsulé

1

DA-2

injection intestinale PR-21 microencapsulé

10

DA-3

injection IV PR-21 non protégé

3

DA-4

injection IV PR-21 non protégé

4,5

DA-5

injection intestinale PR-21 non protégé

0

DA-6

injection intestinale PR-21 non protégé

0

Ces résultats montrent l'aptitude des microsphères de protéinoïdes basiques à encapsuler et protéger un dérivé de dopamine contre les enzymes digestives et l'environnement basique de l'intestin, ainsi que le fait que ces microsphères sont transportées à travers la paroi intestinale dans le courant sanguin neutre proche où le dérivé de dopamine encapsulé est libéré. Pour avoir une bonne libération orale de cet agent pharmacologique encapsulé, les microsphères de protéinoïdes basiques sensibles aux acides doivent être protégées lorsqu'elles traversent la bouche et l'estomac. Cela s'effectue avantageusement avec un revêtement entérique classique qui ne se dissout pas avant d'atteindre l'intestin.

Exemple 12:

On chauffe sous azote à 170° C pendant 4 heures un mélange agité de 2 parties molaires d'acide glutamique anhydre, 2 parties molaires de lysine et une partie molaire d'un mélange équimolaire d'acides aminés neutres (alanine, glycine, leucine, phénylalanine, proline, tyrosine et valine). On extrait le produit réactionnel refroidi avec de l'acide acétique aqueux à pH 2,25 et on dialyse l'extrait à travers une membrane de collodion contre de l'eau distillée pendant 24 heures, l'eau étant changée toutes les 4 heures. On fait évaporer le

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

671155

8

contenu des tubes de dialyse à 65° C sous vide et on broie les solides résiduels en une poudre fine. Lorsqu'on l'ajoute à une solution ou suspension aqueuse à pH 7,4 d'un agent pharmacologique, ce protéinoïde en poudre neutre forme spontanément une profusion de microsphères creuses qui encapsulent cette solution ou suspension. 5

Ces microsphères sont stables dans le sérum humain, mais se dissolvent rapidement dans l'acide aqueux à pH 2,5 pour libérer leur contenu. Etant déstabilisées par l'exposition à un pH réduit, tel qu'on en rencontre lorsqu'elles se trouvent absorbées par les macrophages, ces microsphères de protéinoïdes neutres conviennent pour l'administration intraveineuse d'un agent pharmacologique, comme l'azidothymidine qui, sous forme non protégée, est rapidement absorbé par de nombreux tissus et cellules corporels non cibles, ainsi que par les macrophages cibles.

Il apparaît au spécialiste que l'on peut apporter de nombreux changements et modifications dans les modes de réalisation précisant l'invention décrite ci-dessus sans s'écarter de l'esprit ni de la portée de l'invention tels qu'exposés dans les revendications.

R

Claims

671155

REVENDICATIONS

1. Composition comprenant un agent pharmacologiquement actif encapsulé dans des microsphères de protéinoïdes.
2. Composition de la revendication 1, dans laquelle lesdites microsphères sont stables dans au moins un segment de l'appareil gastro-intestinal, sont instables dans le courant sanguin et ont, de manière prédominante, un diamètre inférieur à environ 10 microns de manière à passer facilement à travers la muqueuse gastro-intestinale.
3. Composition de la revendication 2, dans laquelle ledit protéi-noïde est acide et lesdites microsphères sont stables vis-à-vis des acides et des enzymes de la bouche.
4. Composition de la revendication 2, dans laquelle ledit protéi-noïde est basique et lesdites microsphères sont stables dans le gros intestin.
5. Composition de la revendication 4, où ledit agent pharmaco-logique est un système-support redox de dopamine.
6. Composition de la revendication 2, dans laquelle ledit protêi-noïde est acide et lesdites microsphères sont stables vis-à-vis des acides et des enzymes de l'estomac.
7. Composition de la revendication 6, dans laquelle ledit agent pharmacologique est l'insuline.
8. Composition de la revendication 6, dans laquelle ledit agent pharmacologique est l'héparine.
9. Composition de la revendication 6, dans laquelle ledit agent pharmacologique est la physostigmine.
10. Composition de la revendication 1, dans laquelle ledit protéi-noîde est neutre et lesdites microsphères sont stables dans le courant sanguin et sont instables à un pH réduit.
11. Composition de la revendication 1, dans laquelle lesdites microsphères ont, de manière prédominante, un diamètre allant d'environ 0,5 à environ 5,0 microns.
12. Procédé de production d'une composition de la revendication 1 pour une libération ciblée dans un intervalle de pH choisi, dans lequel on forme un mélange dudit agent avec un liquide phar-maceutiquement acceptable, ledit mélange ayant un pH situé en dehors dudit intervalle choisi, et l'on met en contact ledit mélange avec un protéinoïde qui est soluble dans ledit intervalle de pH choisi et insoluble dans ledit mélange.
13. Procédé de la revendication 12, dans lequel ledit liquide pharmaceutiquement acceptable est l'eau.
14. Procédé de la revendication 12, comprenant une purification préliminaire dudit protéinoïde par mélange avec de l'eau ayant un pH compris dans ledit intervalle choisi et par séparation de la solution aqueuse résultante dudit protéinoïde d'avec toute matière insoluble éventuellement présente.
15. Procédé de la revendication 12, dans lequel ledit agent pharmacologiquement actif est l'insuline, dans lequel ledit liquide pharmaceutiquement acceptable est l'eau et dans lequel ledit protéinoïde est un polymère de condensation thermique, dérivé d'environ 2 parties d'acide aspartique et d'environ 1 partie d'acide a-aminé neutre ou basique.