RU2152996C2 - Фрагмент днк (варианты), вектор, способ получения растения, способ индуцирования продукции гамма-линоленовой кислоты (варианты), способ индуцирования продукции октадекатетраеновой кислоты и дельта-6-десатураза цианобактерий - Google Patents
Фрагмент днк (варианты), вектор, способ получения растения, способ индуцирования продукции гамма-линоленовой кислоты (варианты), способ индуцирования продукции октадекатетраеновой кислоты и дельта-6-десатураза цианобактерий Download PDFInfo
- Publication number
- RU2152996C2 RU2152996C2 RU94030816/13A RU94030816A RU2152996C2 RU 2152996 C2 RU2152996 C2 RU 2152996C2 RU 94030816/13 A RU94030816/13 A RU 94030816/13A RU 94030816 A RU94030816 A RU 94030816A RU 2152996 C2 RU2152996 C2 RU 2152996C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- desaturase
- gla
- plant
- delta
- acid
- Prior art date
Links
- 108010037138 Linoleoyl-CoA Desaturase Proteins 0.000 title claims abstract description 83
- 235000020664 gamma-linolenic acid Nutrition 0.000 title claims abstract description 72
- VZCCETWTMQHEPK-UHFFFAOYSA-N gamma-Linolensaeure Natural products CCCCCC=CCC=CCC=CCCCCC(O)=O VZCCETWTMQHEPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 68
- VZCCETWTMQHEPK-QNEBEIHSSA-N gamma-linolenic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC(O)=O VZCCETWTMQHEPK-QNEBEIHSSA-N 0.000 title claims abstract description 67
- 229960002733 gamolenic acid Drugs 0.000 title claims abstract description 66
- 102100034544 Acyl-CoA 6-desaturase Human genes 0.000 title claims abstract description 63
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims description 37
- LGHXTTIAZFVCCU-SSVNFBSYSA-N (2E,4E,6E,8E)-octadeca-2,4,6,8-tetraenoic acid Chemical compound CCCCCCCCC\C=C\C=C\C=C\C=C\C(O)=O LGHXTTIAZFVCCU-SSVNFBSYSA-N 0.000 title claims description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 title description 4
- 241001464430 Cyanobacterium Species 0.000 title description 2
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 15
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 claims abstract description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 55
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 28
- 241000192542 Anabaena Species 0.000 claims description 26
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 18
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 17
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 17
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 claims description 14
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims description 14
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 14
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 claims description 9
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 8
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 claims description 7
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 claims description 7
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 7
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 6
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 claims description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 claims description 5
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 3
- 101710202365 Napin Proteins 0.000 claims description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 2
- 229940098330 gamma linoleic acid Drugs 0.000 claims 2
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 claims 1
- 240000000385 Brassica napus var. napus Species 0.000 claims 1
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 claims 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 claims 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims 1
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 abstract description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 abstract description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 abstract description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 27
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 20
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 20
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 20
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 17
- 241000192584 Synechocystis Species 0.000 description 16
- 238000001030 gas--liquid chromatography Methods 0.000 description 15
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 241000192707 Synechococcus Species 0.000 description 9
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 8
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- 235000019387 fatty acid methyl ester Nutrition 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 101000833492 Homo sapiens Jouberin Proteins 0.000 description 5
- 101000651236 Homo sapiens NCK-interacting protein with SH3 domain Proteins 0.000 description 5
- 102100024407 Jouberin Human genes 0.000 description 5
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N alpha-linolenic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N 0.000 description 5
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 4
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 4
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 description 4
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 4
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 4
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 4
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 3
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 101710129170 Extensin Proteins 0.000 description 3
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 3
- -1 Methyl fatty acid esters Chemical class 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 3
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 3
- 125000005313 fatty acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 2
- 241001072256 Boraginaceae Species 0.000 description 2
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 2
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 235000004626 essential fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229960004488 linolenic acid Drugs 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 235000020777 polyunsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N (9Z,12Z)-9,10,12,13-tetratritiooctadeca-9,12-dienoic acid Chemical compound C(CCCCCCC\C(=C(/C\C(=C(/CCCCC)\[3H])\[3H])\[3H])\[3H])(=O)O OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N 0.000 description 1
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- OMPJBNCRMGITSC-UHFFFAOYSA-N Benzoylperoxide Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(=O)OOC(=O)C1=CC=CC=C1 OMPJBNCRMGITSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000007689 Borago officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 102100034543 Fatty acid desaturase 3 Human genes 0.000 description 1
- 108010087894 Fatty acid desaturases Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000235575 Mortierella Species 0.000 description 1
- 241000219925 Oenothera Species 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102000055027 Protein Methyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108700040121 Protein Methyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 235000001537 Ribes X gardonianum Nutrition 0.000 description 1
- 235000001535 Ribes X utile Nutrition 0.000 description 1
- 235000016919 Ribes petraeum Nutrition 0.000 description 1
- 244000281247 Ribes rubrum Species 0.000 description 1
- 235000002355 Ribes spicatum Nutrition 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000192581 Synechocystis sp. Species 0.000 description 1
- 108700029229 Transcriptional Regulatory Elements Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 108010011713 delta-15 desaturase Proteins 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 235000021323 fish oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 229940049918 linoleate Drugs 0.000 description 1
- 230000010874 maintenance of protein location Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000007003 mineral medium Substances 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000003234 polygenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000003660 reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 235000021003 saturated fats Nutrition 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000005562 seed maturation Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 208000033692 susceptibility to 1 coronary heart disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 235000021081 unsaturated fats Nutrition 0.000 description 1
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
- C12N9/0083—Miscellaneous (1.14.99)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6409—Fatty acids
- C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6436—Fatty acid esters
- C12P7/6445—Glycerides
- C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
- C12Y114/19—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with oxidation of a pair of donors resulting in the reduction of molecular oxygen to two molecules of water (1.14.19)
- C12Y114/19003—Linoleoyl-CoA desaturase (1.14.19.3)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/82—Proteins from microorganisms
- Y10S530/825—Bacteria
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Fats And Perfumes (AREA)
Abstract
Изобретение может быть использовано в селекции растений. Введение в растение нуклеотидной последовательности, кодирующей фермент дельта-6-десатуразы, приводит к изменению обмена веществ в тканях растения, выражающемуся в повышении выработки в них гамма-линоленовой кислоты за счет превращения линолевой кислоты. 9 с. и 1 з.п. ф-лы, 2 табл., 7 ил.
Description
Линолевая кислота (18:2) (LA) может быть превращена в γ-линоленовую кислоту (18: 3) (GLA) посредством фермента Δ6- -десатуразы. Если этот фермент или нуклеиновую кислоту, кодирующую этот фермент, перенести в LA-продуцирующие клетки, то будет продуцироваться GLA.
Настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, содержащей ген Δ6-десатуразы. В частности, указанная нуклеиновая кислота включает в себя промотор, кодирующую область и область терминации гена Δ6-десатуразы. Кроме того, настоящее изобретение относится к рекомбинантным конструкциям, содержащим область, кодирующую Δ6-десатуразу, в функциональной комбинации с гетерологическими регуляторными последовательностями. Нуклеиновые кислоты и рекомбинантные конструкции настоящего изобретения могут быть использованы для продуцирования GLA в трансгенных организмах.
Ненасыщенные жирные кислоты, такие как линолевая кислота (C18Δ9,12) и α-линоленовая кислота (C18Δ9,12,15), представляют собой незаменимые составные компоненты пищи, и не могут быть синтезированы позвоночными, поскольку клетки позвоночных могут вводить двойные связи в Δ9-положение жирных кислот, но при этом они не могут вводить дополнительные двойные связи между двойной связью Δ9 и метиловым концом цепи жирной кислоты. Поскольку линолевая и α-линоленовая кислоты являются предшественниками других продуктов, то эти кислоты относят к незаменимым жирным кислотам, которые обычно получают из растительных источников. В организме млекопитающего линолевая кислота превращается в γ-линоленовую кислоту (GLA, C18Δ6,9,17), которая, в свою очередь, может быть превращена в арахидоновую кислоту (20:4), играющую особо важную роль в организме млекопитающего, поскольку она является главным предшественником большинства простагландинов.
Продукты питания, в состав которых входит линолевая кислота, обычно удовлетворяют потребность организма в GLA и арахидоновой кислоте, поскольку GLA и арахидоновая кислота являются метаболитами линолевой кислоты. Однако было установлено, что имеется определенная зависимость между потреблением насыщенных жиров и повышенным риском для здоровья, связанным с такими нарушениями в организме, как гиперхолестеринемия, атеросклероз и другие расстройства химического баланса организма, которые коррелируют с его восприимчивостью к ишемической болезни сердца; тогда как потребление ненасыщенных жиров ассоциируется с понижением концентрации холестерина в крови и со снижением риска заболевания атеросклерозом. Положительный терапевтический эффект, связанный с присутствием GLA в пище, очевидно, обусловлен тем, что GLA, будучи предшественником арахидоновой кислоты, вносит свой вклад в синтез простагландина. В соответствии с этим употребление в пищу большего количества ненасыщенной GLA, вместо линолевой кислоты, оказывает благоприятное воздействие на здоровье организма. Однако, фактически, ни в одной из возделываемых сельскохозяйственных культур GLA не присутствует.
В организме линолевая кислота превращается в GLA с помощью фермента Δ6-десатуразы. Δ6-Десатураза, которая представляет собой фермент, состоящий примерно из 359 аминокислот, имеет связанную с мембраной область и активный сайт десатурации жирных кислот. При перенесении указанного фермента в клетки, эндогенно продуцирующие линолевую кислоту, но не продуцирующие GLA, эти клетки приобретают способность продуцировать GLA. В соответствии с настоящим изобретением, выделение гена, кодирующего Δ6-десатуразу, дает возможность получить трансгенные организмы, которые содержат функциональную Δ6-десатуразу и обладают способностью продуцировать GLA. Кроме того, настоящее изобретение, позволяющее продуцировать большие количества GLA, открывает новые возможности для получения ценных пищевых продуктов, являющихся источниками GLA.
Настоящее изобретение относится к выделенному гену Δ6-десатуразы. В частности, указанный выделенный ген включает в себя промоторную область Δ6-десатуразы, ее кодирующую область и область терминации.
Настоящее изобретение также относится к экспрессирующим векторам, содержащим промотор, кодирующую область и область терминации Δ6-десатуразы.
Кроме того, настоящее изобретение относится к экспрессирующим векторам, содержащим кодирующую область Δ6-десатуразы в функциональной комбинации с гетерологическими регуляторными областями, то есть элементами, не происходящими от гена Δ 6-десатуразы.
Настоящее изобретение также относится к клеткам и организмам, содержащим векторы настоящего изобретения, и к потомству указанных организмов.
Кроме того, настоящее изобретение относится к выделенной бактериальной Δ6-десатуразе, а также к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей бактериальную Δ6-десатуразу.
Настоящее изобретение также относится к способу получения растений с повышенным содержанием гамма-линоленовой кислоты (GLA), предусматривающему трансформацию клетки растения с помощью выделенной нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, и регистрацию растения с повышенным содержанием GLA из указанной клетки растения.
Настоящее изобретение также относится к способу продуцирования растений, обладающих устойчивостью к низким температурам.
На фиг. 1 представлены профили гидрофобности и гидрофильности выведенных аминокислотных последовательностей Δ6-десатуразы Synechocystis (фиг. 1A) и десатуразы Δ12 Synechocystis (фиг. 1B). Предполагаемые мембранные области показаны сплошными отрезками. Показатель гидрофобности вычисляли для фрагмента из 19 аминокислотных остатков (Kyte и др., 1982, J. Moles. Biol. 157).
На фиг. 2 представлены профили газожидкостной хроматографии Anabaena дикого типа (фиг. 2А) и трасгенной Anabaena (фиг. 2B).
На фиг. 3 схематически представлены карты космид csy 75, csy 13 и csy 7 с перекрывающимися областями и субклонами. Происхождение субклонов csy 75, csy 75 - 3,5 и csy 7 показаны диагональными пунктирными линиями. Сайты рестрикции, которые были инактивированы, указаны в скобках.
На фиг. 4 представлены профили газожидкостной хроматографии, относящиеся к растению табака дикого типа (фиг. 4A) и трансгенному растению табака (фиг. 4B).
Настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей Δ6-десатуразу. Для идентификации нуклеиновой кислоты, кодирующей Δ6-десатуразу, из организма, который продуцирует GLA, выделяли ДНК. Таким организмом может быть, например, клетка животного, некоторые грибки (такие, как Mortierella), некоторые бактерии (такие, как Synechocystis), либо некоторые растения (бурачник, ослинник (Oenothera), смородина). Выделение геномной ДНК может быть осуществлено различными методами, хорошо известными специалистам, и описанными, например, Сэмбруком и др. (1989) в "Molecular cloning : A. Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY. Выделенную ДНК подвергали фрагментации с использованием физических методов или путем ферментного переваривания и клонировали в соответствующий вектор, например, фазовый или космидный вектор, с помощью любого из хорошо известных способов, описанных, например, Сэмбруком и др. (1989). В настоящей заявке рассматриваются векторы экспрессии, содержащие ДНК настоящего изобретения, ДНК, кодирующая Δ6-десатуразу, может быть идентифицирована посредством функционального анализа. Вектор, содержащий фрагментированную ДНК, переносят, например, путем инфекции, трансконъюгирования, трансфекции, в организм хозяина, который продуцирует линолевую кислоту, но не гамма-линоленовую кислоту (GLA). Используемый в настоящем описании термин "трансформация" означает, в основном, введение чужеродной ДНК в клетку-хозяина. Введение рекомбинантной ДНК в организм хозяина может быть осуществлено любым из хорошо известных традиционных методов, описание которых приводится, например, в работе Сэмбрука и др. (1989). Продуцирование GLA указанными организмами (т.е., приобретение ими этой функции) оценивают с помощью газовой хроматографии или другими традиционными методами, хорошо известными специалистам. Организмы, наделенные способностью продуцировать GLA, т.е. обладающие этой функцией благодаря введению им вышеуказанного вектора, идентифицируют как организмы, экспрессирующие ДНК, которая кодирует Δ6-десатуразу; и после такой идентификации указанную ДНК выделяют из этих организмов. Выведенная ДНК может быть снова подвергнута фрагментации, клонированию в векторы экспрессии, и функциональной оценке с использованием вышеуказанных процедур в целях более конкретной характеристики ДНК, кодирующей Δ6-десатуразу.
В качестве иллюстрации настоящего изобретения могут служить следующие процедуры: "случайную" ДНК выделяют из цианобактерии Synechocystis [Пастеровская коллекция культур (РСС) 6803, Американская коллекция типовых культур (АТСС) 27184]; клонируют в космидный вектор; и путем трансконъюгирования вводят в штамм РСС 7120, АТСС 27893 цианобактерии Anabaena. Продуцирование GLA из линолевой кислоты Anabaena контролируют с помощью газовой хроматографии, а соответствующий ДНК-фрагмент выделяют.
Выделенную ДНК секвенируют стандартными способами, хорошо известными специалистам, и описанными, например, Сэмбруком и др. (1989).
В соответствии с настоящим изобретением, была выделена ДНК, содержащая ген Δ6-десатуразы. Более конкретно, из цианобактерии Synechocystis было выделено 3,588 тыс. пар оснований (kb) ДНК, содержащей ген Δ6-десатуразы. Была определена нуклеотидная последовательность указанной 3,588 kb-ДНК, представленная в SEQ ID N 1. Открытые рамки считывания, определяющие потенциальные кодирующие области, находятся на участке от нуклеотида 317 до нуклеотида 1507 и от нуклеотида 2002 до нуклеотида 3081. Для идентификации нуклеотидов, ответственных за кодирование Δ6-десатуразы, 3,588 kb-фрагмент, несущий Δ6-десатуразную активность, расщепляли на два субфрагмента, каждый из которых содержал лишь одну открытую рамку считывания. Фрагмент ORF1 содержал нуклеотиды 1 - 1704, а фрагмент ORF2 содержал нуклеотиды 1705 - 3588. Каждый фрагмент субклонировали как в прямой, так и в обратной ориентации в конъюгированный вектор экспрессии (AM 542, Wolk и др., 1984 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81,1581), который содержал промотор карбоксилазы цианобактерии. Полученные конструкции (т.е., ORF1(F), ORF1(R), ORF2(F) и (ORF2(R)) конъюгировали в штамм дикого типа PCC 7120 Anabaena стандартными методами (например, Wolk и др. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1561). Конъюгированные клетки Anabaena идентифицировали как зеленые колонии NeoR на коричневом фоне погибших неконъюгированных клеток через две недели после их культивирования на селективных средах (стандартная минеральная среда BGIIN + 30 мкг/мл неомицина, согласно Rippka и др., (1979) J. Gen. Microbiol. III, I). Эти зеленые колонии отбирали и культивировали на жидкой среде (BGIIN + 15 мкг/мл неомицина). Из полученных трансконъюгантов, содержащих конструкции с прямо и обратно ориентированными ORF1 и ORF2, экстрагировали липиды с использованием стандартной техники (например, Dahmer и др. (1989) Journal of American Oil chemical Society 66, 543). Для сравнения, липиды также экстрагировали из культур Anabaena и Syneehocystis дикого типа. Метиловые сложные эфиры жирной кислоты анализировали с помощью газожидкостной хроматографии (ГЖХ), используя, например, газожидкостный хроматограф Tracor-560, снабженный пламенно-ионизационным детектором (где источником ионизации является водородное пламя), и капиллярной колонкой. Результаты ГЖХ - анализа приводятся в таблице 1.
Как показал ГЖХ-анализ, Anabaena, не продуцирующая GLA, приобретает способность к GLA-продуцированию после введения в нее конструкции, содержащей ORF2 в прямой ориентации, посредством трансконъюгирования. Трансконъюганты, содержащие конструкции с ORF2 в обратной ориентации по отношению к промотору карбоксилазы, и конструкции с ORF1 в обеих ориентациях, не обнаруживали продуцирования GLA. Это свидетельствует о том, что лишь одна открытая рамка считывания (ORF2), находящаяся в 1884 п.о. - фрагмента, кодирует Δ6-десатуразу. Этот 1884 п. о. - фрагмент показан на SEQID N 3. Этот факт полностью подтверждается идентичностью профилей гидрофильности и гидрофобности между Δ6-десатуразой и Δ12-десатуразой (Wada и др., 1990, Nature 347), как показано на фиг. 1A и 1B, соответственно.
Выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие Δ6-десатуразу, могут быть идентифицированы из других GLA-продуцирующих организмов с помощью функциональных анализов, описанных выше, либо с помощью техники гибридизации нуклеиновой кислоты, где в качестве гибридизационного зонда используется выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует Δ6-десатуразу Anabaena. Методы клонирования кДНК и геномной ДНК хорошо известны специалистам и могут быть использованы в целях настоящего изобретения. Гибридизационный зонд может содержать полную ДНК-последовательность, представленную в SEQ ID N 1, либо ее рестракционный фрагмент, либо какой-нибудь другой фрагмент ДНК, например олигонуклеотидный зонд. Методы клонирования гомологичных генов посредством перекрестной гибридизации известны каждому специалисту и описаны, например, Sambrook (1989) и Beltz и др. [(1983) Methods in Enzymology 100, 226].
Трансгенные организмы, наделенные способностью к GLA-продуцированию путем введения им ДНК, кодирующей Δ-десатуразу, приобретают также способность продуцировать октадекатетраеновую кислоту (18:4 Δ6,9,12,15). Обычно, октадекатетраеновая кислота присутствует в рыбьем жире и в некоторых видах растений семейства Boraginaceae (Craig et al. 1874 J. Amer. Oil Chem Soc. 41, 209-211; Cross et al., 1976 Can. J. Plant Sci. 56, 659-664). В трансгенных организмах настоящего изобретения октадекатетраеновая кислота образуется в результате последующей десатурации α-линоленовой кислоты, опосредованной Δ6-десатуразой, либо десатурации GLA, опосредованной Δ 15-десатуразой.
На SEQ ID N 2 показаны 359 аминокислот, кодируемых открытой рамкой считывания ORF2, т.е., открытой рамкой считывания, кодирующий Δ6-десатуразу. В рамках настоящего изобретения также рассматриваются и другие олигонуклеотидные последовательности, которые кодируют аминокислоты в SEQ ID N 2. Идентификация последовательностей, которые, например, являются результатом вырожденности генетического кода, может быть осуществлена любым специалистом. Кроме того, с помощью функционального анализа, описанного выше, любой специалист может определить более мелкие субфрагменты из 1884 п.о. - фрагмента, содержащего ORF2, которая кодирует Δ6-десатуразу.
В настоящем описании рассматриваются любой из указанных полипептидных фрагментов Δ6-десатуразы и нуклеиновые кислоты, которые сохраняют способность к превращению LA в GLA.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение, вектор, включающий в себя либо 1884 п.о. - фрагмент, либо более мелкий фрагмент, содержащий промотор, кодирующую последовательность, и область терминации гена Δ6-десатуразы, переносят в организм, например цианобактерию, где промотор и область терминации Δ6-десатуразы являются функциональными. В соответствии с этим настоящее изобретение относится к организмам, продуцирующим рекомбинантную Δ6-десатуразу. В еще одном варианте своего осуществления, настоящее изобретение относится к выделенной Δ6-десатуразе, которая может быть очищена из рекомбинантных организмов стандартными методами, обычно используемыми для очистки белков. (См., например, Ausubel и др., [1987] Current Protocols in Molecular Biology, Grun, Publishing - Associates. New York).
Настоящее изобретение также относится к векторам, содержащим ДНК, которые кодируют Δ6-десатуразу. Каждому специалисту ясно, что могут быть сконструированы соответствующие векторы для непосредственной экспрессии последовательности, кодирующей Δ6-десатуразу, в ряде организмов. Особенно предпочтительными являются реплицируемые векторы экспрессии. Реплицируемые векторы экспрессии, описываемые в настоящей заявке, представляют собой ДНК- или РНК-молекулы, сконструированные для регулируемой экспрессии нужного гена, т. е. гена Δ6-десатуразы. Предпочтительными векторами являются плазмиды, бактериофаги, космиды или вирусы. В соответствии с настоящим изобретением могут быть также использованы челночные векторы, описанные Wolk и др. [(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1561-1565], и Bustos и др., [(1991) J. Bacteriol. 174, 7525-7533]. Детальный обзор вектора, в который может быть введена и экспрессирована нуклеиновая кислота, кодирующая Δ6-десатуразу настоящего изобретения, приводится в работах Sambrook (1989), Goeddel, ed. (1990) Methods in Enrymology 185 Academic Press, and Perbal (1988) A Practical Guide to Molecular Cloning Johm Wiley se Sons, Jnc. Указанные векторы также содержат нуклеиновокислотные последовательности, которые могут осуществлять экспрессию нуклеиновых кислот, кодирующих Δ6-десатуразу. Элементами последовательности, способными осуществлять экспрессию генного продукта, являются промоторы, элементы энхансера, расположенные "выше по течению" активирующие последовательности, сигналы терминации транскрипции, и сайты полиаденилирования. При этом могут быть использованы как конститутивный (т.е., нерегулируемый), так и тканеспецифический промоторы. В отношении трансформации растительных клеток, особый интерес представляют промотор 35 S вируса мозаики цветной капусты (CaMV) и промоторы, регулируемые в процессе созревания семян растения. Все указанные промоторы и элементы, регулирующие транскрипцию, взятые отдельно или в сочетании друг с другом, могут быть использованы в реплицируемых векторах экспрессии настоящего изобретения, и хорошо известны специалистам. Например, промотор 35 S описан Restrepo и др. (1990) (Plant Cell, 2, 987). В настоящем описании также рассматриваются генетически сконструированные и мутированные регуляторные последовательности.
Выбор векторов и регуляторных элементов, подходящих для экспрессии в конкретных клетках-хозяевах, может быть осуществлен любым специалистом. Например, для экспозиции Δ6-десатуразы в цианобактерии, подходящим является вектор, содержащий промотор от гена, кодирующего карбоксилазу Anabaena, и правильно присоединенный к области, кодирующей Δ6-десатуразу, а также правильно присоединенный к сигналу терминации, происходящему от Syneehocystis. Термин "правильно присоединенный" в контексте настоящего описания означает, что присоединенные промоторные и терминаторные последовательности эффективно осуществляют свои функции регуляции транскрипции. Еще одним примером вектора, подходящего для экспрессии Δ6-десатуразы в трансгенных растениях, может служить вектор, содержащий семяспецифический промотор, происходящий от гена гелиантинина, напина или глицина, и правильно присоединенный к области, кодирующий Δ6-десатуразу, а также к области сигнала терминации, происходящего из семян, или сигнала терминации нопалин-синтазы.
В частности, регуляторные элементы гелиантинина раскрываются в одновременно рассматриваемой заявке на патент США рег. N 682354 (поданной 8 апреля 1991, и вводимой в настоящее описание посредством ссылки), где они рассматриваются как промоторные элементы, под контролем которых осуществляется экспрессия Δ6-десатуразы настоящего изобретения.
Однако модификации нуклеотидных последовательностей и регуляторных элементов, раскрываемых в настоящей заявке, и сохраняющих свои основные функции, не выходят за рамки объема настоящего изобретения. Такими модификациями являются инсерции, замещения и делеции, а предпочтительно замещения, которые отражают вырожденность генетического кода.
Стандартная техника конструирования таких гибридных векторов хорошо известна каждому специалисту и описана в работах Сэмбрука и др. (1989), либо в любом из многочисленных пособий по лабораторным исследованиям, относящихся к технике рекомбинантных ДНК. Для осуществления лигирования фрагментов ДНК также имеется ряд стандартных методик, выбор которых зависит от природы концов ДНК-фрагментов. Кроме того, настоящее изобретение также предусматривает введение в гибридные векторы других элементов нуклеотидной последовательности, которые облегчают клонирование, экспрессию или процессинг, например, последовательности, кодирующие сигнальные пептиды; последовательность, кодирующая KDEL, и необходимая для удерживания белков в эндоплазматическом ретикулуме; или последовательности, кодирующие транзитные пептиды, которые направляют Δ6-десатуразу в хлоропласт. Все указанные последовательности хорошо известны каждому специалисту. Оптимизированный транзитный пептид описан, например, Van den Broeck и др., (1985) Nature 313, 358. Прокариотические и эукариотические сигнальные последовательности раскрываются, например, Michaelis и др. (1982), Ann. Rev. Microbiol. 36, 425.
В другом варианте своего осуществления, настоящее изобретение относится к организмам, которые не являются цианобактериями и которые содержат ДНК, кодирующую Δ6-десатуразу настоящего изобретения. В соответствии с настоящим изобретением трансгенными организмами могут быть бактерии, цианобактерии, грибки, растения и животные. Выделенная ДНК настоящего изобретения может быть введена в организм хозяина любыми стандартными методами, например путем инфицирования, трансфекции, трансформации или трансконъюгирования. Техника перенесения ДНК настоящего изобретения в указанные организмы хорошо известна специалистам и описана в литературе, например, Сэмбруком и др. (1989).
Существуют различные методы трансформации растений, хорошо известные специалистам. Ген Δ6-десатуразы может быть введен в растения с использованием процедуры трансформации дисков листьев с последующей регенерацией растения из этих листьев, которая описана Horsсh и др. (1985) Science 227, 1229. В настоящем изобретении могут быть также использованы другие методы трансформации, такие как культивирование протопластов (Horsch et al (1984) Science 223, 496; Deblock et al., (1984) EMBO J. 2, 2143; Barton et al. (1983) Cell 32, 1033). В предпочтительном варианте настоящего изобретения растения могут быть трансформированы с помощью векторов, происходящих от Agrobaeterium. Однако для введения гена Δ6-десатуразы настоящего изобретения в растительные клетки могут быть использованы и другие методы. Такими альтернативными методами могут быть биологические методы (Klein и др. (1987) Natyre 327, 70), электропорация, химически индуцированное внедрение ДНК, а также использование вирусов или пыльцы в качестве векторов.
В методе трансформации, если это необходимо, ген Δ6-десатуразы настоящего изобретения может быть введен в растение-трансформирующий вектор, например в бинарный вектор, описанный Bevan (1984) Nucleic Acids Res 12, 8111. Растение-трансформирующие векторы могут быть получены путем модификации натуральной системы переноса гена, происходящей от Agrobacterium tumefaciens. Указанная натуральная система включает в себя крупные Ti (опухоль-индуцирующие)-плазмиды, содержащие крупный сегмент, известный как Т-ДНК, который переносят в трансформируемое растение. Другой сегмент Ti-плазмиды, а именно Vir-область, является ответственным за перенос Т-ДНК. По краям указанной Т-ДНК-области находятся концевые повторы. В модифицированных бинарных векторах опухоль-индуцирующие гены были делетированы, а функции Vir-области были использованы для переноса чужеродной ДНК, окаймленной концевыми последовательностями Т-ДНК. Т-область также содержит маркер, селектируемый на резистентность к антибиотику, и сайт многократного клонирования для инсерции последовательностей, предназначенных для переноса. Сконструированные таким образом штаммы известны как "обезвреженные" штаммы A. tumefaciens, и используются для эффективной трансформации последовательностей, фланкированных Т-областью, в нуклеарные геномы растений.
Диски листьев со стерилизованной поверхностью инокулируют штаммом A. tumefaciens, содержащим "обезвреженную" чужеродную ДНК; культивируют два дня, а затем переносят в среду, содержащую антибиотик. Трансформированные проростки отбирают после образования корней в среде, содержащей соответствующий антибиотик, переносят в почву и регенерируют.
В другом варианте своего осуществления, настоящее изобретение относится к трансгенным растениям или их потомству, содержащим выделенную ДНК настоящего изобретения. В целях настоящего изобретения могут быть использованы как однодольные растения, так и двудольные растения. Растительные клетки трансформируют посредством выделенной ДНК, кодирующей Δ\6-десатуразу, с использованием любого из описанных выше методов трансформации растения. Трансформированные растительные клетки, обычно, в каллюсной культуре или диске листьев, регенерируют в цельное трансгенное растение традиционными методами, хорошо известными специалистам (например, Horsсh и др., 1985. Science, 227, 1129). В предпочтительном варианте настоящего изобретения трансгенным растением является подсолнечник, масличный рапс, кукуруза (маис), табак, арахис или соя. Поскольку потомство трансформированных растений наследует ДНК, кодирующую Δ6-десатуразу, то для сохранения линии трансгенного растения используются семена или черенки.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения трансгенных растений с повышенным содержанием GLA. Этот способ предусматривает введение ДНК, кодирующей Δ 6-десатуразу, в клетки растений, содержащие низкие уровни GLA или вообще не содержащие GLA, но при этом содержащие LA; и регенерацию растений с повышенным содержанием GLA из трансгенных клеток. В частности, в качестве трансгенных организмов могут быть использованы коммерчески культивированные культурные растения, примерами которых, не ограничивающими, однако, объема изобретения, являются подсолнечник, соя, масличный рапс, маис, арахис и табак.
Настоящее изобретение также относится к способу получения трансгенных организмов, содержащих GLA. Этот способ предусматривает введение ДНК, кодирующей Δ6-десатуразу, в организм, который содержит очень низкие уровни GLA или вовсе не содержит GLA, но содержит LA. В другом варианте осуществления настоящего изобретения этот способ предусматривает введение одного или нескольких векторов экспрессии, которые содержат ДНК, кодирующую Δ12-десатуразу, и Δ6-десатуразу, в организмы с недостаточностью GLA и LA. В соответствии с этим, в организмах с недостаточным содержанием LA и GLA стимулируют продуцирование LA посредством экспрессии Δ12-десатуразы, а затем генерируют GLA посредством экспрессии Δ6-десатуразы. Векторы экспрессии, содержащие ДНК, которая кодирует Δ12-десатуразу, или Δ12-десатуразу и Δ6-десатуразу, могут быть сконструированы методами с использованием технологии рекомбинантных ДНК, хорошо известной специалистам (Sambrook и др., 1989), и уже описанной последовательности Δ12-десатуразы (Wada и др., 1990, Nature (London) 347, 200-203). Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением было установлено, что нуклеотиды 2002-3081 последовательности SEQ ID N 1 кодируют Δ12-десатуразу цианобактерии. Поэтому указанная последовательность может быть использована для конструирования нужных векторов экспрессии. В частности, в качестве трансгенных организмов могут быть использованы коммерчески возделываемые культурные растения, примерами которых являются, не ограничивая при этом объема изобретения, подсолнечник, соя, масличный рапс, маис, арахис и табак.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу продуцирования растений, устойчивых к низким температурам. Чувствительность к холоду может быть обусловлена фазовым переходом липидов в клеточных мембранах. Температура фазового перехода зависит от степени ненасыщенности жирных кислот в мембранных липидах, а поэтому индуцирование или повышение холодоустойчивости растения может быть осуществлено путем увеличения уровня ненасыщенности, например, посредством введения Δ6-десатуразы в целях превращения LA в GLA. В соответствии с этим способ настоящего изобретения предусматривает введение ДНК, кодирующей Δ6-десатуразу, в клетку растения; и регенерацию растения с повышенной устойчивостью к низким температурам из указанной трансформированной клетки растения. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанным растением является подсолнечник, соя, масличный рапс, кукуруза (маис), арахис или табак.
Настоящее изобретение проиллюстрировано нижеприведенными примерами.
Пример 1
Штаммы и условия культивирования
Synechocystis (PCC 6803, ATCC 27184), Anabaena (PCC 7120, ATCC 27893) и Syneehococcus ( PCC 7942, ATCC 33912) культивировали в условиях фотоавтотрофии при 30oC в BGIIN + среда Rippka (Rippka и др., 1979, J. Gen. Microbiol. III, 1-61) при освещении ламп накаливания (60 мкЭ • м-2 • с-1). Космиды и плазмиды подвергали селекции и культивированию в штамме DH5 α Escherichia coli на LB-среде, дополненной антибиотиками при стандартных концентрациях, указанных в работе Maniatis et al, (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring, New York.
Штаммы и условия культивирования
Synechocystis (PCC 6803, ATCC 27184), Anabaena (PCC 7120, ATCC 27893) и Syneehococcus ( PCC 7942, ATCC 33912) культивировали в условиях фотоавтотрофии при 30oC в BGIIN + среда Rippka (Rippka и др., 1979, J. Gen. Microbiol. III, 1-61) при освещении ламп накаливания (60 мкЭ • м-2 • с-1). Космиды и плазмиды подвергали селекции и культивированию в штамме DH5 α Escherichia coli на LB-среде, дополненной антибиотиками при стандартных концентрациях, указанных в работе Maniatis et al, (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring, New York.
Пример 2
Конструирование космидной геномной библиотеки из Syneсhocystis
Полную геномную ДНК из Synechocystis (PCC 6803) частично переваривали ферментом Sau 3A и фракционировали на градиенте сахарозы (Ausubel и др., 1987, Current Protocols in Molecular Biology Creene Publish-, ing Associates and Wiley Interscience, New York). Фракции, содержащие 30-40 kb-ДНК-фрагменты, отбирали и лигировали в дефосфорилированный Bam H1-сайт космидного вектора, pDUCA 7 (Buikema и др., 1991, J. Bacteriol. 173, 1879-1885). Лигированную ДНК упаковывали in vitro, как описано Ausubel и др. (1987), и упакованный фаг размножали в DH5 α E. coli содержащем хелперную плазмиду, кодирующую Aval - Eco 4711-метилазу, а именно плазмиду pPL 528, описанную Buikema и др. (1991). Всего произвольно было выделено 1152 колоний, которые поддерживали отдельно в двенадцати 96-луночных планшетах для микротитрования.
Конструирование космидной геномной библиотеки из Syneсhocystis
Полную геномную ДНК из Synechocystis (PCC 6803) частично переваривали ферментом Sau 3A и фракционировали на градиенте сахарозы (Ausubel и др., 1987, Current Protocols in Molecular Biology Creene Publish-, ing Associates and Wiley Interscience, New York). Фракции, содержащие 30-40 kb-ДНК-фрагменты, отбирали и лигировали в дефосфорилированный Bam H1-сайт космидного вектора, pDUCA 7 (Buikema и др., 1991, J. Bacteriol. 173, 1879-1885). Лигированную ДНК упаковывали in vitro, как описано Ausubel и др. (1987), и упакованный фаг размножали в DH5 α E. coli содержащем хелперную плазмиду, кодирующую Aval - Eco 4711-метилазу, а именно плазмиду pPL 528, описанную Buikema и др. (1991). Всего произвольно было выделено 1152 колоний, которые поддерживали отдельно в двенадцати 96-луночных планшетах для микротитрования.
Пример 3
Индуцирование способности к экспрессии GLA в Anabaena
Anabaena (PCC 7120), которая представляет собой нитевидную цианобактерию, не содержит GLA, но содержит значительное количество линолевой кислоты, являющейся предшественником GLA (фиг. 2, табл. 2). Synechocystis - космидную библиотеку, описанную в примере 2, конъюгировали с Anabaena (PCC 7120) для идентификации трансконъюгантов, продуцирующих GLA. Клетки Anabaena культивировали до середины логарифмического роста в BGIIN + жидкая среда и ресуспендировали в той же самой среде до конечной концентрации, составляющей приблизительно 2 x 108 кл/мл. Культуру RP4 E. coli, находящуюся в средней фазе логарифмического роста (Burkardt et al, 1979, J. Gen. Microbiol 114, 341-348), культивировали в LB-среде, содержащей ампициллин, а затем промывали и ресуспендировали в свежей LB-среде. После этого Anabaena и RP4 смешивали, и равномерно распределяли по (BGIIN+)-чашкам, содержащим 5% LB. Космидную геномную библиотеку перепечатывали (т.е. пересевали) в LB-чашки, содержащие 50 мкг/мл канамицина и 17,5 мкг/мл хлорамфеникола, а затем пятнами наносили на (BGIIN +)-чашки, содержащие Anabaena и RP4. После 24-часового инкубирования при 30oC вводили 30 мкг/мл неомицина и инкубировали при 30oC до тех пор, пока не появятся трансконъюганты.
Индуцирование способности к экспрессии GLA в Anabaena
Anabaena (PCC 7120), которая представляет собой нитевидную цианобактерию, не содержит GLA, но содержит значительное количество линолевой кислоты, являющейся предшественником GLA (фиг. 2, табл. 2). Synechocystis - космидную библиотеку, описанную в примере 2, конъюгировали с Anabaena (PCC 7120) для идентификации трансконъюгантов, продуцирующих GLA. Клетки Anabaena культивировали до середины логарифмического роста в BGIIN + жидкая среда и ресуспендировали в той же самой среде до конечной концентрации, составляющей приблизительно 2 x 108 кл/мл. Культуру RP4 E. coli, находящуюся в средней фазе логарифмического роста (Burkardt et al, 1979, J. Gen. Microbiol 114, 341-348), культивировали в LB-среде, содержащей ампициллин, а затем промывали и ресуспендировали в свежей LB-среде. После этого Anabaena и RP4 смешивали, и равномерно распределяли по (BGIIN+)-чашкам, содержащим 5% LB. Космидную геномную библиотеку перепечатывали (т.е. пересевали) в LB-чашки, содержащие 50 мкг/мл канамицина и 17,5 мкг/мл хлорамфеникола, а затем пятнами наносили на (BGIIN +)-чашки, содержащие Anabaena и RP4. После 24-часового инкубирования при 30oC вводили 30 мкг/мл неомицина и инкубировали при 30oC до тех пор, пока не появятся трансконъюганты.
Отдельные трансконъюганты были выделены после конъюгирования и культивирования в 2 мл BGIIN + жидкая среда с 15 мкг/мл неомицина. Метиловые сложные эфиры жирных кислот получали из культур дикого типа и культур, содержащих пулы 10 трансконъюгантов, следующим образом. Культуры дикого типа и трансгенные цианобактериальные культуры собирали путем центрифугирования и дважды промывали дистиллированной водой. Из этих культур в соответствии с описанием Dahmer и др. (1989) (J. Amer. Oil Chem. Soc. 66, 543-548) экстрагировали сложные метиловые эфиры жирных кислот и анализировали с помощью газожидкостной хроматографии (ГЖХ), используя хроматограф Tracor-560, снабженный детектором, где источником ионизации является водородное пламя, и капиллярной колонкой (30 м x 0,25 мм, связанной с PSOT Superox 11, Alltech Associates Jnc IL). Для идентификации жирных кислот использовали время удерживания и кохроматографию стандартов (полученных от Sigma Chemical Co). Средний состав жирных кислот определяли как отношение площади пика каждой C18-жирной кислоты, нормализованной по отношению к внутреннему стандарту.
Характерные GLA-профили представлены на фиг. 2, где показаны сложные метиловые эфиры C18-жирных кислот. Пики были идентифицированы путем сравнения времен элюирования известными стандартами метиловых сложных эфиров жирных кислот, и подтверждены с помощью хроматогазовой масс-спектрометрии. Фиг. 2A иллюстрирует ГЖХ-анализ жирных кислот Anabaena дикого типа. Стрелкой показано время перемещения GLA. Фиг. 2B иллюстрирует ГЖХ-профиль жирных кислот трансконъюгантов Anabaena с pAM542 + 1,8F. Было идентифицировано, что два GLA-продуцирующих пула (из 25 пулов, представляющих 250 трансконъюгантов), продуцируют GLA. Отдельные трансконъюганты каждого GLA-положительного пула были проанализированы на продуцирование GLA; при этом было идентифицировано, что два независимых трансконъюганта, AS13 и AS75 (по одному от каждого пула) экспрессировали значимые уровни GLA и содержали космиды csy 13 и csy 75, соответственно (фиг. 3). Эти космиды перекрываются в области, длиной примерно 7,5 kb. Nhe I-фрагмент с 3,5 kb космиды csy 75 субклонировали в вектор pDUCA7 и переносили в Anabaena, в результате чего Anabaena приобретала способность экспрессировать GLA (табл. 2).
Два Nhe I / Hind III-субфрагмента (1,8 и 1,7 kb) 3,5 kb - фрагмента csy 75-3,5 субклонировали в вектор "p BLUESCRIPT" (Stratagene) (фиг. 3) для секвенирования. При этом использовали стандартную технику, обычно используемую в молекулярной биологии и описанную Maniatis и др. (1982) и Ausubel и др. (1987). Дидезокси-секвенирование (Sanger и др., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467) pBS 1,8 осуществляли с использованием секвеназы ("SEQUENASA", United States Biochemical) (по обеим цепям) и специфических олигонуклеотидных праймеров, синтезированных в Advanced DNA Technologies Laboratory (Biology Department, Texas A. X. M. University). Анализы ДНК-последовательностей проводили с использованием программного обеспечения GCG (Madison, WI), как описано Devereux и др. (1984, Nucleic Acids Res 12, 387-395).
Оба Nhe I / Hind III-субфрагмента переносили в конъюгированный вектор экспрессии, AM542, как в прямой, так и в обратной ориентациях по отношению к промотору цианобактериальной карбоксилазы, и путем конъюгирования вводили в Anabaena. Трансконъюганты, содержащие 1,8 kb-фрагмент в прямой ориентации (AM542-1,8F), продуцировали значительные количества GLA и октадекатетраеновой кислоты (фиг. 2, табл. 2). Трансконъюганты, содержащие другие конструкции, либо 1,8-kb-фрагмент в обратной ориентации, либо 1,7 kb-фрагмент в прямой и обратной ориентации, не продуцировали обнаружимых уровней GLA (табл. 2).
На фиг. 2 сравниваются профили C18-жирных кислот экстракта из Anabaena дикого типа (фиг. 2A) с профилями трансгенной Anabaena, содержащей 1,8 kb-фрагмент csy-75-3,5 в прямой ориентации (фиг. 2B). ГЖХ-анализ метиловых сложных эфиров жирных кислот от AM542-1,8F обнаруживал пик со временем удерживания, равным времени удерживания для аутентичного стандарта. Анализ этого пика с помощью газовой хроматографии - масс-спектрометрии (ГХ-МС) подтвердил, что он имеет тот же тип масс-фрагментации, что и эталонный образец GLA. По скорости роста и морфологии трансгенные Anabaena с измененными уровнями полиненасыщенных жирных кислот и Anabaena дикого типа были идентичными.
Пример 4
Трансформация Synechococcus с использованием генов Δ6- и Δ12-десатуразы
Третью космиду, csy 7, которая содержала ген Δ12-десатуразы, выделяли путем скрининга Synechocystis - геномной библиотеки с использованием олигонуклеотида, синтезированного из известной последовательности гена Δ12-десатуразы Synechocystis (Wada и др., 1990, Nature (London) 347, 200-203). 1,7 kb-Aval-фрагмент из этой космиды, содержащей ген Δ12-десатуразы, был идентифицирован и использован в качестве зонда для иллюстрации того факта, что csy 13 содержит не только ген Δ6-десатуразы, но и также ген Δ12-десатуразы (фиг. 3). Кроме того, геномный блот-анализ по Саузерну показал, что оба гена (Δ6- и Δ12-десатуразы) являются уникальными в геноме Syneehocystis, так, что оба эти функциональные гена, участвующие в десатурации C18-жирных кислот, являются тесно связанными в геноме Synechocystis.
Трансформация Synechococcus с использованием генов Δ6- и Δ12-десатуразы
Третью космиду, csy 7, которая содержала ген Δ12-десатуразы, выделяли путем скрининга Synechocystis - геномной библиотеки с использованием олигонуклеотида, синтезированного из известной последовательности гена Δ12-десатуразы Synechocystis (Wada и др., 1990, Nature (London) 347, 200-203). 1,7 kb-Aval-фрагмент из этой космиды, содержащей ген Δ12-десатуразы, был идентифицирован и использован в качестве зонда для иллюстрации того факта, что csy 13 содержит не только ген Δ6-десатуразы, но и также ген Δ12-десатуразы (фиг. 3). Кроме того, геномный блот-анализ по Саузерну показал, что оба гена (Δ6- и Δ12-десатуразы) являются уникальными в геноме Syneehocystis, так, что оба эти функциональные гена, участвующие в десатурации C18-жирных кислот, являются тесно связанными в геноме Synechocystis.
Одноклеточная цианобактерия Synechocystis (PCC 7942) не содержит ни линолевой кислоты, ни GLA (3). Гены Δ12- и Δ6-десатуразы были клонированы как отдельно, так и вместе, в челночный вектор pAM854 (Bustos и др., 1991, J. Bacteriol. 174, 7525-7633), который содержит последовательности, необходимые для интеграции чужеродной ДНК в геном Synechococcus (Golden и др., 1987, Methods in Enzymol, 153, 215-231). Synechococcus трансформировали с использованием указанных генных конструкций, и колонии отбирали путем селекции. Из трансгенной Synechococcus экстрагировали метиловые сложные эфиры жирных кислот и анализировали их с помощью газожидкостной хроматографии.
Как видно из табл. 2, основными жирными кислотами Synechococcus дикого типа являются стеариновая кислота (18:0) и олеиновая кислота (18:1). Помимо основных жирных кислот, Synechococcus, трансформированная с помощью pAM854 Δ12, экспрессировала линолевую кислоту (18:2). pAM854- Δ6- и - Δ12-трансформанты продуцировали линолеат и GLA (табл. 1), Полученные результаты показали, что Synechococcus содержащая оба гена Δ12- и Δ6-десатуразы, приобрела способность к введению второй двойной связи в Δ12-положение и третьей двойной связи в Δ6-положение C18-жирных кислот. Однако в трансформантах, содержащих pAM854- Δ6, изменения в составе жирных кислот не наблюдалось, что указывает на то, что при отсутствии субстрата, синтезированного посредством Δ12-десатуразы, Δ6-десатураза является активной. Кроме того, этот эксперимент подтвердил тот факт, что 1,8 kb-Nhe I / Hind 111-фрагмент (фиг. 3) содержит как кодирующую, так и промоторную области гена Δ6-десатуразы Synechocystis. По своим скорости роста и морфологии, Synechococcus дикого типа и трансгенная Synechococcus с измененными уровнями полиненасыщенных жирных кислот являются идентичными.
Пример 5
Нуклеотидная последовательность Δ6-десатуразы
Определяли нуклеотидную последовательность 1,8 kb-фрагмента csy 75-3,5, включающего в себя функциональный ген Δ6-десатуразы. Идентифицировали открытую рамку считывания, кодирующую полипептид в 359 аминокислот (фиг. 4). С помощью гидрофобно-липофильного анализа по методу Kyte-Doolittle (Kyte и др. , 1982, J. Mol. Biol 157, 105-132) были идентифицированы две области гидрофобных аминокислот, которые должны представлять трансмембранные домены (фиг. 1A); и, кроме того, было установлено, что профиль гидрофобности и гидрофильности Δ6-десатуразы аналогичен профилю Δ 12-десатуразы (фиг. 1B; Wada и др. ) и Δ 9-десатураз (Thiede и др., 1986, J. Biol. Chem. 261, 13230-13235). Однако сходство между последовательностями Δ6- и Δ12-десатураз Synechocystis составляет менее чем 40% для нуклеотидных последовательностей и приблизительно 18% для аминокислотных последовательностей.
Нуклеотидная последовательность Δ6-десатуразы
Определяли нуклеотидную последовательность 1,8 kb-фрагмента csy 75-3,5, включающего в себя функциональный ген Δ6-десатуразы. Идентифицировали открытую рамку считывания, кодирующую полипептид в 359 аминокислот (фиг. 4). С помощью гидрофобно-липофильного анализа по методу Kyte-Doolittle (Kyte и др. , 1982, J. Mol. Biol 157, 105-132) были идентифицированы две области гидрофобных аминокислот, которые должны представлять трансмембранные домены (фиг. 1A); и, кроме того, было установлено, что профиль гидрофобности и гидрофильности Δ6-десатуразы аналогичен профилю Δ 12-десатуразы (фиг. 1B; Wada и др. ) и Δ 9-десатураз (Thiede и др., 1986, J. Biol. Chem. 261, 13230-13235). Однако сходство между последовательностями Δ6- и Δ12-десатураз Synechocystis составляет менее чем 40% для нуклеотидных последовательностей и приблизительно 18% для аминокислотных последовательностей.
Пример 6
Перенос гена цианобактериальной Δ6-десатуразы в растение табака
Ген Δ6-десатуразы цианобактерии вводили в растительный вектор экспрессии и переносили в табак, используя технику Agrobacterium - опосредованного переноса гена. Для обеспечения соответствующей экспрессии перенесенного гена десатуразы в листьях и прорастающих семенах растений, а также направленной доставки продукта гена десатуразы в эндоскопический ретикулум или хлоропласт, конструировали различные полигенные экспрессирующие кластеры, содержащие открытую рамку считывания (ORF) Δ-десатуразы Synechocystis. Эти кластеры имели следующие компоненты: (I) промотор 35S или семя-специфический промотор, происходящий от гена гелиантинина подсолнечника для контроля экспрессии гена Δ6-десатуразы во всех тканях растения или только в прорастающих семенах, соответственно; (II) предполагаемый сигнальный пептид, происходящий либо от гена экстенсина моркови, либо от гена гелиантинина подсолнечника для доставки вновь синтезированной Δ6-десатуразы в эндоплазматический ретикулум (ER); (III) сигнальная последовательность у COOH-конца ORF Δ6-десатуразы для удерживания белков в полости ER (KDEL); и (IV) оптимизированный транспортный пептид для доставки Δ6-десатуразы в хлоропласт. Промотор 35S происходит от pPTL2, описанной Restrepo и др. (1990). Последовательность оптимизированного транспортного пептида описана Van de Broeck и др. (1985). Сигнальный пептид экстенсина моркови описан Chen и др. (1985, EMBO J, 9, 2145).
Перенос гена цианобактериальной Δ6-десатуразы в растение табака
Ген Δ6-десатуразы цианобактерии вводили в растительный вектор экспрессии и переносили в табак, используя технику Agrobacterium - опосредованного переноса гена. Для обеспечения соответствующей экспрессии перенесенного гена десатуразы в листьях и прорастающих семенах растений, а также направленной доставки продукта гена десатуразы в эндоскопический ретикулум или хлоропласт, конструировали различные полигенные экспрессирующие кластеры, содержащие открытую рамку считывания (ORF) Δ-десатуразы Synechocystis. Эти кластеры имели следующие компоненты: (I) промотор 35S или семя-специфический промотор, происходящий от гена гелиантинина подсолнечника для контроля экспрессии гена Δ6-десатуразы во всех тканях растения или только в прорастающих семенах, соответственно; (II) предполагаемый сигнальный пептид, происходящий либо от гена экстенсина моркови, либо от гена гелиантинина подсолнечника для доставки вновь синтезированной Δ6-десатуразы в эндоплазматический ретикулум (ER); (III) сигнальная последовательность у COOH-конца ORF Δ6-десатуразы для удерживания белков в полости ER (KDEL); и (IV) оптимизированный транспортный пептид для доставки Δ6-десатуразы в хлоропласт. Промотор 35S происходит от pPTL2, описанной Restrepo и др. (1990). Последовательность оптимизированного транспортного пептида описана Van de Broeck и др. (1985). Сигнальный пептид экстенсина моркови описан Chen и др. (1985, EMBO J, 9, 2145).
Были продуцированы трансгенные растения табака, содержащие химерный ген десатуразы цианобактерии, состоящий из гена Δ6-десатуразы Synechocystis, сшитого с последовательностью, ответственной за удержание белков в эндоплазматическом ретикулуме (KDEL), и сигнальным пептидом экстенсина под контролем промотора CaMV 35S. PCR-амплификация геномной ДНК трансгенного табака свидетельствовала о том, что ген Δ6-десатуразы был введен в геном табака. Метиловые сложные эфиры жирных кислот листьев указанных трансгенных растений табака были экстрагированы и проанализированы с помощью газожидкостной хроматографии (ГЖХ). Эти трансгенные растения табака аккумулировали значительное количество GLA (фиг. 4). На фиг. 4 показаны ГЖХ-профили метиловых сложных эфиров жирных кислот. Пики были идентифицированы путем сравнения времен элюции с известными стандартами метиловых сложных эфиров жирных кислот. В соответствии с вышеуказанным, гены цианобактерий, ответственные за метаболизм жирных кислот, могут быть использованы для генерирования трансгенных растений с измененным составом жирных кислот.
Claims (10)
1. Фрагмент выделенной ДНК, кодирующий дельта-6-десатуразу цианобактерий, содержащий нуклеотидную последовательность SEQID N 3 или последовательность SEQID N 3, имеющую вставки, замещения или делеции, при которых сохраняется дельта-6-десатуразная активность, или последовательность, содержащая нуклеотиды 317-1507 из SEQID N 1.
2. Фрагмент ДНК, кодирующий дельта-6-десатуразу, имеющий аминокислотную последовательность SEQID N 2.
3. Вектор, содержащий в направлении 5' - 3' промотор, выбранный из группы, состоящей из промотора дельта-6-десатуразы, промотора карбоксилазы Anabaena, промотора гелиантинина, промотора глицинина и промотора напина, операбельно связанный с фрагментом ДНК по п.1 или 2, операбельно связанным с сигналом терминации, выбранным из группы, состоящей из сигнала терминации Synechcystis, сигнала терминации нопалинсинтазы и семяспецифического сигнала терминации.
4. Способ получения растения с повышенным содержанием гамма-линоленовой кислоты (GLA), предусматривающий а) трансформацию клетки растения фрагментом ДНК по п.1 или 2 или вектором по п.3; б) регенерацию растения с повышенным содержанием GLA из указанной клетки растения.
5. Способ индуцирования продукции гамма-линоленовой кислоты (GLA) в бактериях или растении с дефицитом или отсутствием GLA, предусматривающий трансформацию указанного организма фрагментом ДНК по п.1 или 2 или вектором по п.3.
6. Способ индуцирования продукции гамма-линоленовой кислоты (GLA) в организме с дефицитом или отсутствием GLA и линолевой кислоты (LA), предусматривающий трансформацию указанного организма фрагментом ДНК по п.1 или 2 или вектором по п. 3 и изолированной нуклеиновой кислотой, кодирующей дельта-12-десатуразу.
7. Способ индуцирования продукции гамма-линоленовой кислоты (GLA) в организме с дефицитом или отсутствием GLA и линолевой кислоты (LA), предусматривающий трансформацию указанного организма, по меньшей мере, одним вектором экспрессии по п.3 и изолированной нуклеиновой кислотой, кодирующей дельта-12-десатуразу.
8. Способ по п.7, в котором указанное растение является подсолнечником, соей, кукурузой, табаком, арахисом или рапсом.
9. Способ индуцирования продукции октадекатетраеновой кислоты в бактериях или растении с дефицитом или отсутствием гамма-линоленовой кислоты, предусматривающий трансформацию указанной бактерии или растения с помощью фрагмента ДНК по п.1 или 2.
10. Дельта-6-десатураза цианобактерий, имеющая последовательность SEQID N 2.
Приоритет по пунктам:
10.10.91 - по пп.1 - 5 и 10;
08.01.92 - по пп.6 - 9.
10.10.91 - по пп.1 - 5 и 10;
08.01.92 - по пп.6 - 9.
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US77447591A | 1991-10-10 | 1991-10-10 | |
| US774,475 | 1991-10-10 | ||
| US774475 | 1991-10-10 | ||
| US81791992A | 1992-01-08 | 1992-01-08 | |
| US817919 | 1992-01-08 | ||
| US817,919 | 1992-01-08 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU94030816A RU94030816A (ru) | 1996-03-27 |
| RU2152996C2 true RU2152996C2 (ru) | 2000-07-20 |
Family
ID=27118889
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU94030816/13A RU2152996C2 (ru) | 1991-10-10 | 1992-10-13 | Фрагмент днк (варианты), вектор, способ получения растения, способ индуцирования продукции гамма-линоленовой кислоты (варианты), способ индуцирования продукции октадекатетраеновой кислоты и дельта-6-десатураза цианобактерий |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5552306A (ru) |
| EP (1) | EP0666918B1 (ru) |
| JP (1) | JP3537434B2 (ru) |
| KR (1) | KR100316068B1 (ru) |
| CN (2) | CN1053469C (ru) |
| AT (1) | ATE284961T1 (ru) |
| AU (1) | AU667848B2 (ru) |
| BG (1) | BG61791B1 (ru) |
| BR (1) | BR9206613A (ru) |
| CA (1) | CA2120629C (ru) |
| CZ (1) | CZ285471B6 (ru) |
| DE (1) | DE69233459T2 (ru) |
| DK (1) | DK0666918T3 (ru) |
| ES (1) | ES2231767T3 (ru) |
| HU (1) | HU217328B (ru) |
| IL (1) | IL103407A (ru) |
| MX (1) | MX9205820A (ru) |
| NZ (1) | NZ244685A (ru) |
| PH (1) | PH31293A (ru) |
| RO (1) | RO113256B1 (ru) |
| RU (1) | RU2152996C2 (ru) |
| UA (1) | UA43314C2 (ru) |
| WO (1) | WO1993006712A1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2484137C2 (ru) * | 2006-01-04 | 2013-06-10 | Монсанто С.А.С. | Мутанты fad-2 и высокоолеиновые растения |
Families Citing this family (118)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070130654A1 (en) * | 1991-10-10 | 2007-06-07 | Thomas Terry L | Production of gamma linolenic acid by a delta6-desaturase |
| US5614393A (en) * | 1991-10-10 | 1997-03-25 | Rhone-Poulenc Agrochimie | Production of γ-linolenic acid by a Δ6-desaturase |
| US6372965B1 (en) | 1992-11-17 | 2002-04-16 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and hydroxylases from plants |
| US6872872B1 (en) | 1992-11-17 | 2005-03-29 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and related enzymes from plants |
| WO1994018337A1 (en) * | 1993-02-05 | 1994-08-18 | Monsanto Company | Altered linolenic and linoleic acid content in plants |
| US5639645A (en) * | 1993-09-22 | 1997-06-17 | Mitsubishi Corporation | Recombinant Δ9 desaturase and a gene encoding the same |
| US6310194B1 (en) * | 1994-09-26 | 2001-10-30 | Carnegie Institution Of Washington | Plant fatty acid hydroxylases |
| US5965793A (en) | 1995-09-20 | 1999-10-12 | Monsanto Company, Inc. | Strong early seed-specific gene regulatory region |
| US5959175A (en) * | 1997-04-09 | 1999-09-28 | Thomas; Terry L. | Sunflower albumin 5' regulatory region for the modification of plant seed lipid composition |
| US5977436A (en) * | 1997-04-09 | 1999-11-02 | Rhone Poulenc Agrochimie | Oleosin 5' regulatory region for the modification of plant seed lipid composition |
| AU720677B2 (en) * | 1997-04-11 | 2000-06-08 | Abbott Laboratories | Methods and compositions for synthesis of long chain polyunsaturated fatty acids in plants |
| US7745694B1 (en) | 1997-04-11 | 2010-06-29 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for synthesis of long chain polyunsaturated fatty acids in plants |
| US6432684B1 (en) | 1997-04-11 | 2002-08-13 | Abbott Laboratories | Human desaturase gene and uses thereof |
| US6428990B1 (en) | 1997-04-11 | 2002-08-06 | Abbott Laboratories | Human desaturase gene and uses thereof |
| US6051754A (en) * | 1997-04-11 | 2000-04-18 | Abbott Laboratories | Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids in plants |
| US5968809A (en) * | 1997-04-11 | 1999-10-19 | Abbot Laboratories | Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids |
| US6075183A (en) * | 1997-04-11 | 2000-06-13 | Abbott Laboratories | Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids in plants |
| US5972664A (en) * | 1997-04-11 | 1999-10-26 | Abbott Laboratories | Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids |
| US6080911A (en) * | 1997-04-15 | 2000-06-27 | Ohio University | Mice models of growth hormone insensitivity |
| CN100482797C (zh) * | 1997-04-15 | 2009-04-29 | 联邦科学和工业研究组织 | 植物脂肪酸环氧化酶及其用途 |
| US6100450A (en) * | 1997-10-22 | 2000-08-08 | Rhone-Poulenc Agrochimie | Seed specific promoters based on arabidopsis genes |
| CA2329159A1 (en) * | 1998-05-29 | 1999-12-02 | Bruce Kelder | Compositions and methods for the synthesis of fatty acids, their derivatives and downstream products |
| EP1895009A1 (en) * | 1998-06-12 | 2008-03-05 | Calgene LLC | Polyunsaturated fatty acids in plants |
| US20030163845A1 (en) * | 1998-09-02 | 2003-08-28 | Pradip Mukerji | Elongase genes and uses thereof |
| US6677145B2 (en) | 1998-09-02 | 2004-01-13 | Abbott Laboratories | Elongase genes and uses thereof |
| US6403349B1 (en) | 1998-09-02 | 2002-06-11 | Abbott Laboratories | Elongase gene and uses thereof |
| US6913916B1 (en) | 1998-09-02 | 2005-07-05 | Abbott Laboratories | Elongase genes and uses thereof |
| DE50013231D1 (de) | 1999-06-07 | 2006-09-07 | Basf Plant Science Gmbh | Delta6-acetylenase und delta6-desaturase aus ceratodon purpureus |
| DE10030976A1 (de) | 2000-06-30 | 2002-01-10 | Basf Ag | DELTA6-Desaturasegene exprimierende Pflanzen und PUFAS enthaltende Öle aus diesen Pflanzen und ein Verfahren zur Herstellung ungesättigter Fettsäuren |
| US7070970B2 (en) | 1999-08-23 | 2006-07-04 | Abbott Laboratories | Elongase genes and uses thereof |
| GB9929897D0 (en) * | 1999-12-18 | 2000-02-09 | Slabas Antoni R | Improvements in or relating to conjugated fatty acids and related compounds |
| FR2803592A1 (fr) | 2000-01-06 | 2001-07-13 | Aventis Cropscience Sa | Nouveaux derives de l'acide 3-hydroxypicolinique, leur procede de preparation et compositions fongicides les contenant. |
| FR2810994B1 (fr) * | 2000-06-30 | 2004-03-12 | Biogemma Fr | Acides nucleiques codant pour une phosphatase vegetale de type mipp a activite phytasique et applications |
| EP1197550A3 (en) * | 2000-08-25 | 2002-11-20 | Pfizer Products Inc. | Methods and compositions for diagnosing and treating disorders involving angiogenesis |
| JP4071622B2 (ja) | 2000-09-28 | 2008-04-02 | バイオリジナル フード アンド サイエンス コーポレーション | 脂肪酸不飽和化酵素ファミリーのメンバーであるｆａｄ４、ｆａｄ５、ｆａｄ５−２およびｆａｄ６、ならびにそれらの使用方法 |
| FR2815969B1 (fr) | 2000-10-30 | 2004-12-10 | Aventis Cropscience Sa | Plantes tolerantes aux herbicides par contournement de voie metabolique |
| DE10102337A1 (de) | 2001-01-19 | 2002-07-25 | Basf Plant Science Gmbh | Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren, neue Biosynthesegene sowie neue pflanzliche Expressionskonstrukte |
| AU2002309482B2 (en) * | 2001-01-25 | 2007-08-30 | Abbott Laboratories | Desaturase genes and uses thereof |
| US6635451B2 (en) * | 2001-01-25 | 2003-10-21 | Abbott Laboratories | Desaturase genes and uses thereof |
| US7045683B2 (en) | 2001-05-04 | 2006-05-16 | Abbott Laboratories | Δ4-desaturase genes and uses thereof |
| EP1392278A4 (en) * | 2001-05-14 | 2005-05-04 | Martek Biosciences Corp | PRODUCTION AND USE OF A LIPID-RICH POLAR FRACTION CONTAINING STEARIDONIC ACID AND GAMMA-LINOLENIC ACID EXTRACTED FROM SEEDS AND MICROORGANISMS |
| EP2255668A3 (en) * | 2001-05-14 | 2012-04-04 | Martek Biosciences Corporation | Production and Use of a Polar Lipid-Rich Fraction Containing Omega-3 and/or Omega-6 Highly Unsaturated Fatty Acids from Microbes, Genetically Modified Plant Seeds and Marine Organisms |
| US7211656B2 (en) * | 2002-01-30 | 2007-05-01 | Abbott Laboratories | Desaturase genes, enzymes encoded thereby, and uses thereof |
| BR0306883A (pt) | 2002-01-30 | 2004-12-07 | Basf Plant Science Gmbh | ácido nucléico isolado, sequências de ácido nucléico isolado e de aminoácido, construção de gene, vetor, organismo, processo para a produção de pufas, óleo, lipìdeo ou ácido graxo ou uma fração destes, composição de óleo, lipìdeo ou de ácido graxo, e, uso da mesma |
| GB2385852A (en) | 2002-02-27 | 2003-09-03 | Rothamsted Ex Station | Delta 6-desaturases from Primulaceae |
| WO2005024017A1 (en) * | 2002-03-15 | 2005-03-17 | Monsanto Technology Llc | Nucleic acid molecules associated with oil in plants |
| DE10219203A1 (de) | 2002-04-29 | 2003-11-13 | Basf Plant Science Gmbh | Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in Pflanzen |
| EP2216405A1 (en) | 2002-05-03 | 2010-08-11 | Monsanto Technology LLC | Speed specific USP promoters for expressing genes in plants |
| FR2848064B1 (fr) * | 2002-12-06 | 2006-01-13 | Bayer Cropscience Sa | Plantes legumineuses transplastomiques fertiles |
| FR2848570B1 (fr) | 2002-12-12 | 2005-04-01 | Bayer Cropscience Sa | Cassette d'expression codant pour une 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (epsps) et plantes tolerantes aux herbicides la contenant |
| US7078234B2 (en) | 2002-12-18 | 2006-07-18 | Monsanto Technology Llc | Maize embryo-specific promoter compositions and methods for use thereof |
| ES2525212T3 (es) | 2002-12-19 | 2014-12-19 | University Of Bristol | Procedimiento novedoso de producción de ácidos grasos poliinsaturados |
| ATE517984T1 (de) | 2003-02-27 | 2011-08-15 | Basf Plant Science Gmbh | Verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren |
| CN1836045B (zh) | 2003-03-28 | 2012-05-09 | 孟山都技术有限公司 | 用于早期种子发育的新型植物启动子 |
| CA2868312A1 (en) | 2003-03-31 | 2004-10-14 | University Of Bristol | Novel plant acyltransferases specific for long-chained, multiply unsaturated fatty acids |
| EP1613744B1 (de) | 2003-04-08 | 2015-09-09 | BASF Plant Science GmbH | Delta-4-desaturasen aus euglena gracilis, exprimierende pflanzen und pufa enthaltende öle |
| US11952581B2 (en) | 2003-08-01 | 2024-04-09 | Basf Plant Science Gmbh | Process for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms |
| PT2166069T (pt) | 2003-08-01 | 2016-09-13 | Basf Plant Science Gmbh | Método de produção de ácidos gordos polinsaturados em organismos transgénicos |
| DK1656449T3 (da) | 2003-08-21 | 2009-06-02 | Monsanto Technology Llc | Fedtsyredesaturaser fra primula |
| CA2450000A1 (en) * | 2003-12-18 | 2005-06-18 | Alberta Research Council Inc. | Method of creating plants with reduced level of saturated fatty acid in seed oil |
| JP4567047B2 (ja) | 2004-02-27 | 2010-10-20 | ビーエーエスエフ プラント サイエンス ゲーエムベーハー | トランスジェニック植物における多価不飽和脂肪酸の製造方法 |
| WO2005083053A2 (de) | 2004-02-27 | 2005-09-09 | Basf Plant Science Gmbh | Verfahren zur herstellung von ungesättigten omega-3-fettsäuren in transgenen organismen |
| US20050220901A1 (en) * | 2004-03-22 | 2005-10-06 | Huttenbauer Samuel Jr | Methods of pharmaceutical separation from plants |
| EP2902021B1 (en) | 2004-04-16 | 2018-11-14 | Monsanto Technology LLC | Expression of fatty acid desaturases in corn |
| ES2715640T3 (es) | 2004-04-22 | 2019-06-05 | Commw Scient Ind Res Org | Síntesis de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga por células recombinantes |
| CN102559364B (zh) | 2004-04-22 | 2016-08-17 | 联邦科学技术研究组织 | 用重组细胞合成长链多不饱和脂肪酸 |
| US7138391B2 (en) * | 2004-08-09 | 2006-11-21 | Silverbrook Research Pty Ltd | Hydrophilizable and hydrophilic cyanine dyes |
| US7456270B2 (en) * | 2004-09-01 | 2008-11-25 | Abbott Laboratories | Δ6-desaturase genes and uses thereof |
| EP1856264B1 (en) | 2005-02-26 | 2014-07-23 | BASF Plant Science GmbH | Expression cassettes for seed-preferential expression in plants |
| DE102005013779A1 (de) | 2005-03-22 | 2006-09-28 | Basf Plant Science Gmbh | Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten C20- und C22-Fettsäuren mit mindestens vier Doppelbindungen in transgenen Pflanzen |
| WO2006133983A1 (en) | 2005-04-19 | 2006-12-21 | Basf Plant Science Gmbh | Starchy-endosperm and/or germinating embryo-specific expression in mono-cotyledonous plants |
| US7902423B2 (en) | 2005-04-20 | 2011-03-08 | Basf Plant Science Gmbh | Expression cassettes for seed-preferential expression that utilize the promoter from a flax tonoplast intrinsic protein gene |
| CA2607263A1 (en) | 2005-05-10 | 2006-11-16 | Basf Plant Science Gmbh | Expression cassettes for seed-preferential expression in plants |
| EP1885862B1 (en) | 2005-05-23 | 2015-07-29 | Arcadia Biosciences Inc. | Safflower with elevated gamma-linolenic acid |
| DE102005038036A1 (de) | 2005-08-09 | 2007-02-15 | Basf Plant Science Gmbh | Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure und/oder Eicosapentaensäure in transgenen Nutzpflanzen |
| GB2431158A (en) | 2005-10-13 | 2007-04-18 | Rothamsted Res Ltd | Process for the production of arachidonic and/or eicosapentaenoic acid |
| DE102005052551A1 (de) | 2005-11-02 | 2007-05-16 | Rothamsted Res Harpenden | Verfahren zur Herstellung von y-Linolensäure und/oder Stearidonsäure in transgenen Brassicaceae und Linaceae |
| GB0603160D0 (en) | 2006-02-16 | 2006-03-29 | Rothamsted Res Ltd | Nucleic acid |
| AR059376A1 (es) | 2006-02-21 | 2008-03-26 | Basf Plant Science Gmbh | Procedimiento para la produccion de acidos grasos poliinsaturados |
| US8629195B2 (en) | 2006-04-08 | 2014-01-14 | Bayer Materialscience Ag | Production of polyurethane foams |
| PT2041275E (pt) | 2006-07-19 | 2011-08-18 | Monsanto Technology Llc | Dessaturases de ácidos gordos derivadas de tetraselmis suecica |
| WO2008022963A2 (en) | 2006-08-24 | 2008-02-28 | Basf Plant Science Gmbh | Isolation and characterization of a novel pythium omega 3 desaturase with specificity to all omega 6 fatty acids longer than 18 carbon chains |
| EP2059588A4 (en) | 2006-08-29 | 2010-07-28 | Commw Scient Ind Res Org | FATTY ACID SYNTHESIS |
| CA2665336C (en) | 2006-10-06 | 2016-01-05 | Basf Plant Science Gmbh | Process for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms |
| AU2008214568B2 (en) | 2007-02-16 | 2013-04-18 | Basf Plant Science Gmbh | Nucleic acid sequences for regulation of embryo-specific expression in monocotyledonous plants |
| WO2008151149A2 (en) | 2007-06-01 | 2008-12-11 | Solazyme, Inc. | Production of oil in microorganisms |
| WO2009016208A2 (de) | 2007-07-31 | 2009-02-05 | Basf Plant Science Gmbh | Elongasen und verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren in transgenen organismen |
| US20130323801A1 (en) * | 2007-11-01 | 2013-12-05 | Wake Forest University School Of Medicine | Compositions, Methods, and Kits for Polyunsaturated Fatty Acids from Microalgae |
| US20100263088A1 (en) | 2007-12-14 | 2010-10-14 | Basf Plant Science Gmbh | Promoters From Brassica Napus For Seed Specific Gene Expression |
| EP2281051B1 (en) | 2008-04-30 | 2015-03-11 | Rothamsted Research Limited | Desaturase and method for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms |
| EP2826864B1 (en) | 2008-07-01 | 2018-04-18 | BASF Plant Science GmbH | Promoters from Brassica napus for seed specific gene expression |
| DE112009002048T5 (de) | 2008-08-26 | 2012-01-26 | Basf Plant Science Gmbh | Nukleinsäure, die Desaturasen kodieren, und modifiziertes Planzenöl |
| JP6068800B2 (ja) | 2008-11-18 | 2017-01-25 | コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガナイゼーション | オメガ−３脂肪酸を産生するための酵素および方法 |
| US7883882B2 (en) | 2008-11-28 | 2011-02-08 | Solazyme, Inc. | Renewable chemical production from novel fatty acid feedstocks |
| PL2376638T3 (pl) | 2008-12-12 | 2014-01-31 | Basf Plant Science Gmbh | Desaturazy oraz sposób wytwarzania wielonienasyconych kwasów tłuszczowych w organizmach transgenicznych |
| AR074941A1 (es) | 2009-01-07 | 2011-02-23 | Bayer Cropscience Sa | Plantas transplastomicas exentas de marcador de seleccion |
| CA2758824A1 (en) | 2009-04-17 | 2010-10-21 | Basf Plant Science Company Gmbh | Plant promoter operable in endosperm and uses thereof |
| CA2756146C (en) | 2009-04-22 | 2018-12-04 | Basf Plant Science Company Gmbh | Whole seed specific promoter |
| EP2821492A3 (en) | 2009-05-13 | 2015-04-08 | BASF Plant Science Company GmbH | Acyltransferases and uses thereof in fatty acid production |
| CA2766858A1 (en) | 2009-07-10 | 2011-01-13 | Basf Plant Science Company Gmbh | Expression cassettes for endosperm-specific expression in plants |
| US8188335B2 (en) | 2009-07-17 | 2012-05-29 | Abbott Laboratories | Δ9-elongase for production of polyunsaturated fatty acid-enriched oils |
| WO2011067712A1 (en) | 2009-12-03 | 2011-06-09 | Basf Plant Science Company Gmbh | Expression cassettes for embryo-specific expression in plants |
| US20120311743A1 (en) | 2010-02-02 | 2012-12-06 | Bayer Cropscience Ag | Soybean transformation using hppd inhibitors as selection agents |
| SG10201504187YA (en) | 2010-05-28 | 2015-06-29 | Solazyme Inc | Tailored oils produced from recombinant heterotrophic microorganisms |
| NO2585603T3 (ru) | 2010-06-25 | 2018-05-19 | ||
| CN103282473A (zh) | 2010-11-03 | 2013-09-04 | 索拉兹米公司 | 具有降低倾点的微生物油、从其中产生的介电流体、以及相关方法 |
| MX351063B (es) | 2011-02-02 | 2017-09-29 | Terravia Holdings Inc | Aceites adaptados producidos a partir de microorganismos oleaginosos recombinantes. |
| ES2769448T3 (es) | 2012-04-12 | 2020-06-25 | Rothamsted Res Limited | Producción de ácidos grasos poliinsaturados omega-3 de cadena larga |
| US9719114B2 (en) | 2012-04-18 | 2017-08-01 | Terravia Holdings, Inc. | Tailored oils |
| JP6499577B2 (ja) | 2012-04-18 | 2019-04-10 | テラヴィア ホールディングス， インコーポレイテッド | 調整油 |
| CN104853596B (zh) | 2012-06-15 | 2018-10-09 | 联邦科学技术研究组织 | 在植物细胞中产生长链多不饱和脂肪酸 |
| GB201217524D0 (en) | 2012-10-01 | 2012-11-14 | Rothamsted Res Ltd | Recombinant organisms |
| EP2993993A2 (en) * | 2013-04-26 | 2016-03-16 | Solazyme, Inc. | Low polyunsaturated fatty acid oils and uses thereof |
| SG10201802834YA (en) | 2013-10-04 | 2018-05-30 | Terravia Holdings Inc | Tailored oils |
| KR102386838B1 (ko) | 2013-12-18 | 2022-04-15 | 커먼웰쓰 사이언티픽 앤 인더스트리알 리서치 오거니제이션 | 장쇄 다중불포화 지방산을 포함하는 지질 |
| CN105219789B (zh) | 2014-06-27 | 2023-04-07 | 联邦科学技术研究组织 | 包含二十二碳五烯酸的提取的植物脂质 |
| ES2764273T3 (es) | 2014-07-10 | 2020-06-02 | Corbion Biotech Inc | Nuevos genes de cetoacil ACP sintasa y uso de los mismos |
| KR102054762B1 (ko) | 2018-03-06 | 2020-01-22 | 대한민국(관리청: 특허청장, 승계청: 농촌진흥청장) | 갈고리 흰오징어 유래의 지방산 사슬연장효소 유전자 및 이의 용도 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4736866B1 (en) * | 1984-06-22 | 1988-04-12 | Transgenic non-human mammals | |
| NZ221259A (en) * | 1986-07-31 | 1990-05-28 | Calgene Inc | Seed specific transcriptional regulation |
| ZA888155B (en) * | 1987-11-04 | 1989-07-26 | Merrell Dow Pharma | Fluorinated arachidonic acid derivatives |
| BR9007159A (pt) * | 1989-02-24 | 1991-12-10 | Monsanto Co | Genes sinteticos de plantas e processo para a preparacao dos mesmos |
| CA2077896C (en) * | 1990-03-16 | 2008-02-19 | Gregory A. Thompson | Plant desaturases - compositions and uses |
-
1992
- 1992-10-07 PH PH45060A patent/PH31293A/en unknown
- 1992-10-09 IL IL10340792A patent/IL103407A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-10-09 MX MX9205820A patent/MX9205820A/es not_active IP Right Cessation
- 1992-10-09 NZ NZ244685A patent/NZ244685A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-10-10 CN CN92113085A patent/CN1053469C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-13 CZ CZ94817A patent/CZ285471B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-10-13 BR BR9206613A patent/BR9206613A/pt not_active Application Discontinuation
- 1992-10-13 UA UA94005172A patent/UA43314C2/ru unknown
- 1992-10-13 HU HU9401007A patent/HU217328B/hu not_active IP Right Cessation
- 1992-10-13 DK DK92922205T patent/DK0666918T3/da active
- 1992-10-13 JP JP50724393A patent/JP3537434B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1992-10-13 DE DE69233459T patent/DE69233459T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-13 AU AU28812/92A patent/AU667848B2/en not_active Expired
- 1992-10-13 EP EP92922205A patent/EP0666918B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-13 KR KR1019940701152A patent/KR100316068B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-10-13 AT AT92922205T patent/ATE284961T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-10-13 WO PCT/US1992/008746 patent/WO1993006712A1/en active IP Right Grant
- 1992-10-13 CA CA002120629A patent/CA2120629C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-13 RO RO94-00585A patent/RO113256B1/ro unknown
- 1992-10-13 ES ES92922205T patent/ES2231767T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-13 RU RU94030816/13A patent/RU2152996C2/ru active
-
1994
- 1994-04-05 BG BG98695A patent/BG61791B1/bg unknown
- 1994-09-14 US US08/307,382 patent/US5552306A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-06-07 US US08/473,508 patent/US5689050A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-07 US US08/478,727 patent/US5663068A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-03-21 CN CN97104566A patent/CN1121499C/zh not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Биохимия растений. Пер. с англ. под ред. Кретовича В.Л., М., Мир, 1968. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2484137C2 (ru) * | 2006-01-04 | 2013-06-10 | Монсанто С.А.С. | Мутанты fad-2 и высокоолеиновые растения |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2152996C2 (ru) | Фрагмент днк (варианты), вектор, способ получения растения, способ индуцирования продукции гамма-линоленовой кислоты (варианты), способ индуцирования продукции октадекатетраеновой кислоты и дельта-6-десатураза цианобактерий | |
| RU2181772C2 (ru) | Синтез гамма-линоленовой кислоты под действием дельта-6-десатуразы | |
| US6355861B1 (en) | Production of gamma linolenic acid by a Δ6-desaturase | |
| US20020042933A1 (en) | Omega-3 fatty acid desaturase | |
| US7615364B2 (en) | Polypeptide having activity of unsaturating W3-fatty acid, polynucleotide coding for the polypeptide and use thereof | |
| US6683232B1 (en) | Production of γ linolenic acid by a Δ6-desaturase | |
| WO2007113608A1 (en) | Production of polyunsaturated fatty acids in brassica using novel delta-6-desaturase | |
| CA2608848C (en) | Fad4, fad5, fad5-2, and fad6, novel fatty acid desaturase family members and uses thereof | |
| US20090077692A1 (en) | Production of gamma linolenic acid by a delta6-desaturase |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20101116 |