RU2181772C2 - Синтез гамма-линоленовой кислоты под действием дельта-6-десатуразы - Google Patents
Синтез гамма-линоленовой кислоты под действием дельта-6-десатуразы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2181772C2 RU2181772C2 RU97112919/13A RU97112919A RU2181772C2 RU 2181772 C2 RU2181772 C2 RU 2181772C2 RU 97112919/13 A RU97112919/13 A RU 97112919/13A RU 97112919 A RU97112919 A RU 97112919A RU 2181772 C2 RU2181772 C2 RU 2181772C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- desaturase
- gamma
- plant
- linolenic acid
- acid
- Prior art date
Links
- 108010037138 Linoleoyl-CoA Desaturase Proteins 0.000 title claims abstract description 102
- 102100034544 Acyl-CoA 6-desaturase Human genes 0.000 title claims abstract description 81
- 235000020664 gamma-linolenic acid Nutrition 0.000 title claims description 77
- VZCCETWTMQHEPK-QNEBEIHSSA-N gamma-linolenic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC(O)=O VZCCETWTMQHEPK-QNEBEIHSSA-N 0.000 title claims description 71
- VZCCETWTMQHEPK-UHFFFAOYSA-N gamma-Linolensaeure Natural products CCCCCC=CCC=CCC=CCCCCC(O)=O VZCCETWTMQHEPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 65
- 229960002733 gamolenic acid Drugs 0.000 title claims description 65
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title abstract description 11
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 53
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 28
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 27
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 67
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 38
- 235000007689 Borago officinalis Nutrition 0.000 claims description 30
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 claims description 30
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims description 30
- 241000192584 Synechocystis Species 0.000 claims description 23
- 241000192542 Anabaena Species 0.000 claims description 22
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 17
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 10
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 claims description 8
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 claims description 8
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 claims description 7
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 claims description 7
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 claims description 7
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 7
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 7
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 7
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 7
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 7
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 claims description 7
- LGHXTTIAZFVCCU-SSVNFBSYSA-N (2E,4E,6E,8E)-octadeca-2,4,6,8-tetraenoic acid Chemical compound CCCCCCCCC\C=C\C=C\C=C\C=C\C(O)=O LGHXTTIAZFVCCU-SSVNFBSYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 4
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 claims description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 4
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims description 4
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 3
- 240000004355 Borago officinalis Species 0.000 claims description 2
- 101710202365 Napin Proteins 0.000 claims description 2
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 claims 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 abstract description 24
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 abstract description 24
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 abstract description 24
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 abstract description 23
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 abstract description 15
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 abstract description 15
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 abstract description 14
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 abstract description 10
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract description 9
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 abstract description 5
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 abstract description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 abstract 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 abstract 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 51
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 37
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 34
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 31
- 241001072256 Boraginaceae Species 0.000 description 29
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 29
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 235000019387 fatty acid methyl ester Nutrition 0.000 description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 13
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 13
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 12
- 238000001030 gas--liquid chromatography Methods 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 241000192707 Synechococcus Species 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 8
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 7
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N (9Z,12Z)-9,10,12,13-tetratritiooctadeca-9,12-dienoic acid Chemical compound C(CCCCCCC\C(=C(/C\C(=C(/CCCCC)\[3H])\[3H])\[3H])\[3H])(=O)O OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 101000833492 Homo sapiens Jouberin Proteins 0.000 description 5
- 101000651236 Homo sapiens NCK-interacting protein with SH3 domain Proteins 0.000 description 5
- 102100024407 Jouberin Human genes 0.000 description 5
- 241001625930 Luria Species 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N alpha-linolenic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N 0.000 description 5
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 4
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 4
- 210000002729 polyribosome Anatomy 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 4
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 3
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710129170 Extensin Proteins 0.000 description 3
- 239000004165 Methyl ester of fatty acids Substances 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 description 3
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 229960004488 linolenic acid Drugs 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 235000020777 polyunsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 2
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- ZYJWXPONROMNOE-HZJYTTRNSA-N (8z,11z)-heptadeca-8,11-dienoic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCC(O)=O ZYJWXPONROMNOE-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 1
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 1
- HXKWSTRRCHTUEC-UHFFFAOYSA-N 2,4-Dichlorophenoxyaceticacid Chemical compound OC(=O)C(Cl)OC1=CC=C(Cl)C=C1 HXKWSTRRCHTUEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000016444 Benign adult familial myoclonic epilepsy Diseases 0.000 description 1
- OMPJBNCRMGITSC-UHFFFAOYSA-N Benzoylperoxide Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(=O)OOC(=O)C1=CC=CC=C1 OMPJBNCRMGITSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 1
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000235575 Mortierella Species 0.000 description 1
- 241000219925 Oenothera Species 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 108010029182 Pectin lyase Proteins 0.000 description 1
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 1
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 235000001537 Ribes X gardonianum Nutrition 0.000 description 1
- 235000001535 Ribes X utile Nutrition 0.000 description 1
- 235000016919 Ribes petraeum Nutrition 0.000 description 1
- 244000281247 Ribes rubrum Species 0.000 description 1
- 235000002355 Ribes spicatum Nutrition 0.000 description 1
- 108010016634 Seed Storage Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108700029229 Transcriptional Regulatory Elements Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000306 component Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 208000016427 familial adult myoclonic epilepsy Diseases 0.000 description 1
- -1 fatty acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 235000021323 fish oil Nutrition 0.000 description 1
- ZGNITFSDLCMLGI-UHFFFAOYSA-N flubendiamide Chemical compound CC1=CC(C(F)(C(F)(F)F)C(F)(F)F)=CC=C1NC(=O)C1=CC=CC(I)=C1C(=O)NC(C)(C)CS(C)(=O)=O ZGNITFSDLCMLGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012041 food component Nutrition 0.000 description 1
- 239000005428 food component Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 238000011331 genomic analysis Methods 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940049918 linoleate Drugs 0.000 description 1
- 229960004232 linoleic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 230000003234 polygenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 230000037425 regulation of transcription Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000003014 reinforcing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 235000021003 saturated fats Nutrition 0.000 description 1
- 230000005562 seed maturation Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021081 unsaturated fats Nutrition 0.000 description 1
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
- C12N9/0083—Miscellaneous (1.14.99)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6409—Fatty acids
- C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6436—Fatty acid esters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6436—Fatty acid esters
- C12P7/6445—Glycerides
- C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
- C12Y114/19—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with oxidation of a pair of donors resulting in the reduction of molecular oxygen to two molecules of water (1.14.19)
- C12Y114/19003—Linoleoyl-CoA desaturase (1.14.19.3)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение предназначено для использования в селекции растений. С помощью нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент Δ6-десатуразу, трансформируют растения. Указанная трансформация способствует увеличенному превращению линолевой кислоты в γ-линоленовую и октадекатетраеновую кислоты. Это позволяет обогатить пищевые растения ненасыщенными жирными кислотами, в том числе арахидоновой кислотой. Одновременно изменение метаболизма в растении за счет перераспределения продуцирования различных жирных кислот придает такому растению устойчивость к холоду. 12 с. и 13 з.п. ф-лы, 10 ил., 4 табл.
Description
Линолевая кислота (18: 2)(LA) превращается в гамма-линоленовую кислоту (18:3)(GLA) под действием такого фермента, как Δ6-десатураза. Когда этот фермент или кодирующую его нуклеиновую кислоту вводят в клетки, синтезирующие линолевую кислоту, образуется гамма-линоленовая кислота. Настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, содержащим ген Δ6-десатуразы. Более конкретно, в объем этого изобретения входят нуклеиновые кислоты, содержащие промоторы, кодирующие области и терминальные области генов Δ6-десатуразы. Настоящее изобретение далее относится к рекомбинантным конструкциям, содержащим кодирующую область Δ6-десатуразы в функциональном сочетании с разнородными регуляторными последовательностями. Нуклеиновые кислоты и рекомбинантные конструкции по данному изобретению полезны для получения гамма-линоленовой кислоты в трансгенных организмах.
Ненасыщенные жирные кислоты, такие как линолевая кислота (C18Δ9,12) и α-линоленовая кислота (C18Δ9,12,15), являются важными пищевыми компонентами, которые не могут быть синтезированы в организме позвоночных животных, так как клетки позвоночных животных могут создавать двойные связи в Δ9-положении жирных кислот, но не могут создавать дополнительные двойные связи между двойной связью в Δ9-положении и метильным концом цепи жирной кислоты. Поскольку они являются предшественниками других продуктов, линолевая и α-линоленовая кислоты являются важными жирными кислотами, источником которых обычно являются растения. В организме млекопитающих линолевая кислота превращается в γ-линоленовую кислоту (GLA, C18Δ6,9,12), которая в свою очередь превращается в арахидоновую кислоту (20:4), особенно важную жирную кислоту, так как она является основным предшественником большинства простагландинов.
Линолевая кислота вследствие конечного превращения в гамма-линоленовую кислоту и арахидоновую кислоту удовлетворяет потребности организма в гамма-линоленовой кислоте и арахидоновой кислоте. Однако существует определенная зависимость между потреблением насыщенных жиров и вероятностью возникновения гиперхолестеринемии, атеросклероза и других клинических нарушений, которые влекут за собой ишемическую болезнь сердца, в то время как потребление ненасыщенных жиров способствует снижению содержания холестерина в крови и уменьшению вероятности заболевания атеросклерозом. Терапевтические преимущества пищевой гамма-линоленовой кислоты, вероятно, связаны с тем, что эта кислота является предшественником арахидоновой кислоты и, таким образом, способствует синтезу простагландина. Поэтому гораздо полезнее включать в рацион питания ненасыщенную гамма-линоленовую кислоту, чем линолевую кислоту. Однако гамма-линоленовая кислота отсутствует практически во всех возделываемых сельскохозяйственных культурах.
Линолевая кислота превращается в гамма-линоленовую кислоту под действием такого фермента, как Δ6-десатураза. Δ6-Десатураза, фермент из более чем 350 аминокислот, имеет мембраносвязывающую область и активный центр для десатурации жирных кислот. Если этот фермент ввести в клетки, которые эндогенно синтезируют линолевую кислоту, а не гамма-линоленовую кислоту, то происходит образование гамма-линоленовой кислоты. Настоящее изобретение, предусматривая ген, кодирующий Δ6-десатуразу, позволяет получить трансгенные организмы, которые содержат функциональную Δ6-десатуразу и синтезируют гамма-линоленовую кислоту. Помимо возможности синтеза гамма-линоленовой кислоты в больших количествах настоящим изобретением предусматриваются новые пищевые источники гамма-линоленовой кислоты.
Настоящее изобретение включает выделенные гены Δ6-десатуразы. В частности, выделенные гены содержат промоторы Δ6-десатуразы, кодирующие области и терминальные области.
Настоящее изобретение далее включает экспрессирующие векторы, содержащие промотор Δ6-десатуразы, кодирующую область и терминальные области.
Следующим аспектом данного изобретения являются экспрессирующие векторы, содержащие кодирующую область Δ6-десатуразы в функциональном сочетании с разнородными регуляторными областями, то есть с элементами, не выделяемыми из гена Δ6-десатуразы.
Настоящим изобретением предусматриваются также клетки и организмы, содержащие векторы по данному изобретению, и потомство таких организмов.
Очередным аспектом настоящего изобретения предусматривается выделенная бактериальная Δ6-десатураза. Предусматривается также выделенная растительная Δ6-десатураза.
Еще одним аспектом данного изобретения является способ получения растений с более высоким содержанием гамма-линоленовой кислоты.
Настоящим изобретением предусматривается также способ получения холодоустойчивых растений.
На фиг. 1 изображены профили водорастворимости для выведенных аминокислотных последовательностей Δ6-десатуразы Synechocystis (часть А) и Δ12-десатуразы (часть В). Предполагаемые области, пронизывающие мембрану, обозначены сплошными линиями. Гидрофобный индекс высчитан для окна, вмещающего 19 аминокислотных остатков [Kyte, et al. (1982) J. Molec. Biol. 157].
На фиг. 2 изображены профили газожидкостной хроматографии для Anabaena дикого типа (часть А) и трансгенного типа (часть В).
На фиг.3 дано схематическое изображение карт космид cSy75, cSyl3 и cSy7 с перекрывающимися областями и субклонами. Исходные области субклонов cSy75. cSy75-3,5 и cSy7 обозначены пунктирными диагональными линиями. Инактивированные сайты рестрикции указаны в скобках.
На фиг. 4 изображены профили газожидкостной хроматографии для табака дикого типа (часть А) и трансгенного типа (часть В).
На фиг.5А изображена ДНК-последовательность кДНК Δ6-десатуразы, выделенной из бурачника.
На фиг. 5В изображена белковая последовательность открытой рамки считывания в кДНК Δ6-десатуразы, выделенная из бурачника. Показаны три аминокислотных элемента, характерных для десатураз, которые в порядке следования представляют собой липидный блок, металлический блок 1 (metal box I) и металлический блок 2 (metal box 2).
На фиг. 6 изображена дендрограмма, показывающая сходство Δ6-десатуразы бурачника с другими мембраносвязанными десатуразами. Аминокислотная последовательность Δ6-десатуразы бурачника сравнивается с десатуразами других известных типов на основании данных, приведенных в Gene Works (IntelliGenetics). Числовые данные соответствуют относительным филогенетическим расстояниям между сравниваемыми подгруппами.
На фиг.7 представлена карта рестрикции 221.Δ6.NOS и 121.Δ6.NOS. На карте рестрикции 221. Δ6.NOS остальной части плазмиды является рВI221, а на карте рестрикции 121.Δ6.NOS остальной частью плазмиды является рВI121.
На фиг.8 изображены профили газожидкостной хроматографии для мнимотрансфецированных (часть А) и трасфецированных 221.Δ6.NOS (часть В) клеток моркови. Показаны положения, соответствующие 18:2, 18:3α и 18:3γ (GLA).
На фиг.9 изображены профили газожидкостной хроматографии для нетрансформированного табачного листа (часть А) и табачного листа, трансформированного 121.Δ6.NOS. Показаны положения 18:2, 18:3α, 18:3γ (GLA) и 18:4.
На фиг. 10 изображены профили газожидкостной хроматографии для нетрансформированных семян табака (часть А) и семян табака, трансформированных 121. Δ6.NOS. Показаны положения 18:2, 18:3α, 18:3γ (GLA).
В объем настоящего изобретения входят выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие Δ6-десатуразу. Для идентификации нуклеиновой кислоты, кодирующей Δ6-десатуразу, из организма, синтезирующего гамма-линоленовую кислоту, выделяют ДНК. Указанным организмом может быть, например, животная клетка, некоторые грибы (например, Mortierella), некоторые бактерии (например, Synechocystis) и некоторые растения (бурачник, Oenotherа, смородина). Геномную ДНК можно выделить с помощью различных методов, хорошо известных специалистам в этой области, например, с помощью метода, описанного Самбруком и др. (Sambrook et al.) (1989) в справочнике Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, NY. Выделенную ДНК делят на фрагменты с помощью физических методов или ферментативного расщепления и клонируют в соответствующем векторе, например бактериофаге или космидном векторе, в соответствии с любым хорошо известным методом из целого ряда методов, представленных в справочных материалах, таких как справочник Самбрука и др. (1989). Особое внимание в этом изобретении уделено экспрессирующим векторам, содержащим ДНК по настоящему изобретению. ДНК, кодирующую Δ6-десатуразу, можно идентифицировать посредством анализа приобретения функции. Вектор, содержащий фрагментарную ДНК, переносят, например, путем инфицирования, трансконъюгирования, трансфекции в организм-хозяин, который синтезирует линолевую кислоту, а не гамма-линоленовую кислоту. Используемый в этом описании изобретения термин "трансформация" означает включение посторонней ДНК в клетку-хозяин. Методы введения рекомбинантной ДНК в организм-хозяин известны специалистам в этой области, и с ними можно ознакомиться, например, в справочнике Самбрука и др.(1989). Синтез гамма-линоленовой кислоты этими организмами (то есть приобретение функции) определяют, например, газовой хроматографией или другими методами, известными специалистам в этой области. Организмы, которые стали синтезировать гамма-линоленовую кислоту, то есть приобрели новую функцию в результате введения вектора, определяются как экспрессирующие ДНК, кодирующую Δ6-десатуразу, причем указанную ДНК выделяют из организмов. Выделенную ДНК можно снова разделить на фрагменты, клонировать в экспрессирующих векторах и функционально исследовать с помощью вышеуказанных методов с целью более точного определения ДНК, кодирующей Δ6-десатуразу.
В качестве примера, иллюстрирующего настоящее изобретение, случайную ДНК выделяют из цианобактерии Synechocystis. входящей в Коллекцию культур Пастера (РСС) 6803 и Американскую коллекцию типовых культур (АТСС) 27184, клонируют в космидном векторе и вводят путем трансконъюгирования в штамм цианобактерий Anabaena РСС 7120, АТСС 27893, не синтезирующих гамма-линоленовой кислоты. Синтез гамма-линоленовой кислоты из линолевой кислоты Anabaena контролируют посредством газовой хроматографии, после чего выделяют соответствующий фрагмент ДНК.
Выделенную ДНК секвенируют с помощью методов, хорошо известных специалистам в этой области, которые описаны, например, в справочнике Самбрука и др. (1989).
В соответствии с настоящим изобретением выделяют молекулы ДНК, содержащие гены Δ6-десатуразы. В частности, из цианобактерий Synechocystis была выделена ДНК длиной 3,588 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.), содержащая ген Δ6-десатуразы. Была определена нуклеотидная последовательность ДНК длиной 3,588 т.п.н., которая представлена в последовательности с индификационным No 1. Открытые рамки считывания, определяющие потенциальные кодирующие области, находятся в нуклеотидах с 317 по 1507 и в нуклеотидах с 2002 по 3081. Чтобы установить нуклеотиды, имеющие непосредственное отношение к кодированию Δ6-десатуразы, фрагмент ДНК длиной 3,588 т.п.н., который определяет активность Δ6-десатуразы, расщепляют на два подфрагмента, каждый из которых содержит только одну открытую рамку считывания. Фрагмент ORF1 содержит нуклеотиды с 1 по 1704, а фрагмент ORF2 содержит нуклеотиды с 1705 по 3588. Каждый фрагмент субклонируют в прямой и обратной ориентации в конъюгированном экспрессирующем векторе (АМ542, Wolk et al.[1984] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1561), который содержит промотор карбоксилазы цианобактерий. Полученные конструкции (то есть ORF1(F), ORF1(R), ORF2(F) и ORF2(R) конъюгируют со штаммом Anabaena дикого типа РСС 7120 с помощью стандартных методов (см. , например, Wolk et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81. 1561). Коньюгированные клетки штамма Anabaena идентифицированы в виде зеленых колоний NeoR на коричневом фоне погибающих неконъюгированных клеток после выращивания в течение двух недель на селективной среде (стандартные минеральные среды BG11N, содержащие 30 мкг/мл неомицина в соответствии с описанием Rippka et al., (1979) J.Gen Microbiol. 111, 1). Зеленые колонии выделяют и выращивают в селективных жидких средах (BG11N+15 мкг/мл неомицина). Липиды экстрагируют стандартными методами (например, по методу Dahmar et al. (1989) Journal of American Oil Chemical Society 66, 543) из полученных трансконъюгантов, содержащих конструкции ORF1 и ORF2 с прямой и обратной ориентацией. Для сравнения липиды экстрагируют также из других культур Anabaena и Synechocystis. Метиловые эфиры жирных кислот анализируют посредством газожидкостной хроматографии, например, с использованием газожидкостного хроматографа Тrасоr-560, оборудованного ионизационным детектором с водородным пламенем и капиллярной колонкой. Результаты газожидкостной хроматографии приведены в таблице 1.
Как показывает газожидкостная хроматография, штамм Anabaеna, не синтезирующий гамма-линоленовую кислоту, приобретает функцию синтеза гамма-линоленовой кислоты, когда путем трансконъюгирования в него вводят конструкцию, содержащую ORF2 с прямой ориентацией. Трансконъюгаты, содержащие конструкции с ORF2 с обратной ориентацией относительно промотора карбоксилазы, или ORF1 с любой ориентацией, не синтезируют гамма-линоленовой кислоты. Этот анализ показывает, что только одна открытая рамка считывания (ORF2) во фрагменте 1884 комплементарной пары гетероциклических оснований ДНК кодирует 
десатуразу. Фрагмент 1884 комплементарной пары гетероциклических оснований ДНК представлен в виде последовательностей с идентификационным No.3. Это подтверждается полным сходством профилей водорастворимости у Δ6-десатуразы и Δ12-десатуразы [Wada et al. (1990) Nature 347], как показано на фиг.1, (А) и (В).
Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением из бурачника (Borago officinalis) можно выделить кДНК, содержащую ген Δ6-десатуразы. Была определена нуклеотидная последовательность кДНК длиной 1,685 тысячи пар нуклеотидов (т.п.н.), которая представлена на фиг.5А (последовательность с индентификационным No.4). Инициирующий кодон ATG и терминирующий кодон подчеркнуты. Аминокислотная последовательность, соответствующая открытой рамке считывания в Δ6-десатуразе бурачника, представлена на фиг.5В (последовательность с идентификационным No. 5).
Выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие Δ6-десатуразу, можно идентифицировать в других организмах, синтезирующих гамма-линоленовую кислоту, с помощью анализа приобретения функции, описанного выше, или с помощью методов гибридизации нуклеиновых кислот с использованием выделенной нуклеиновой кислоты, которая кодирует Synechocystis или Δ6-десатуразу бурачника в виде зонда гибридизации. Методы клонирования генома и кДНК хорошо известны специалистам в этой области, и настоящим изобретением предполагается их применение. Зонд гибридизации может содержать всю последовательность ДНК, описываемую как последовательность с идентификационным No.1 или последовательность с идентификационным No.4, либо рестрикционный фрагмент или другой фрагмент ДНК, включающий олигонуклеотидный зонд. Методы клонирования гомологичных генов путем перекрестной гибридизации известны специалистам в этой области, и с ними можно ознакомиться, например, в работе Самбрука (1989) и Белца и др. (Beltz et al.) (1983)Methods in Enzymology 100, 266.
В соответствии с другим методом идентификации гена Δ6-десатуразы в организме, синтезирующем гамма-линоленовую кислоту, создают библиотеку кДНК из поли-A+PHK, выделенной из полисомной РНК. Чтобы удалить многочисленные экспрессируемые гены из популяции кДНК, кДНК или их фрагменты, соответствующие многочисленным генам кДНК, используют в виде зондов гибридизации для библиотеки кДНК. Негибридизирующиеся зоны удаляют, полученные бактериальные колонии используют для инокуляции жидких культур и секвенируют. Например, чтобы удалить другие кДНК запасного белка семян из библиотеки кДНК, полученной из полисомной РНК бурачника, типы кДНК, соответствующие сильно экспрессированным запасным белкам семян, сначала гибридизируют с библиотекой кДНК. "Выделенную" библиотеку ДНК затем используют для получения меток экспрессированных последовательностей (ETSs), которые применяют для сканирования базы данных, такой как GenBank, с целью идентификации потенциальных десатураторов.
Трансгенные организмы, которые приобретают функцию синтеза гамма-линоленовой кислоты в результате введения ДНК, кодирующей Δ-десатуразу, также приобретают функцию синтеза октадекатетраеновой кислоты (18:4Δ6,9,12,15). Октадекатетраеновая кислота обычно присутствует в рыбьем жире и в некоторых видах растений семейства Boraginaceae (Craig et al.[1964] J.Amer. Oil Chem. Soc.41,209-211; Gross et al. [1976] Can.J.Plant Sci.56,659-664). В трансгенных организмах по настоящему изобретению октадекатетраеновая кислота образуется в результате дальнейшей десатурации α-линоленовой кислоты под действием Δ6-десатуразы или десатурации гамма-линоленовой кислоты под действием Δ12-десатуразы.
359 аминокислот, кодируемых ORF2, то есть открытой рамкой считывания, кодирующей Δ6-десатуразу Synechocystis, представлены в виде последовательности с индентификационным No. 2. Открытая рамка считывания, кодирующая Δ6-десатуразу бурачника, представлена в последовательности с идентификационным No. 5. Настоящее изобретение далее включает другие нуклеотидные последовательности, которые кодируют аминокислоты последовательности с идентификационным No.2 и в последовательности с идентификационным No.5. Специалисты в этой области могут легко идентифицировать такие последовательности, которые появляются, например, в результате вырожденности генетического кода. Кроме того, специалисты в этой области с помощью описанного выше анализа приобретения функции могут определить более мелкие субфрагменты фрагментов, содержащих открытые рамки считывания, которые кодируют Δ6-десатуразу.
Настоящее изобретение включает любой такой полипептидный фрагмент Δ6-десатуразы и нуклеиновых кислот, которые сохраняют активности в отношении превращения линолевой кислоты в гамма-линоленовую кислоту.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по данному изобретению, или более мелкий фрагмент, содержащий промотор, кодирующую последовательность и терминальную область гена Δ6-десатуразы переносят в организм, например, цианобактерий, у которых промотор Δ6-десатуразы и терминальные области являются функциональными. Поэтому данным изобретением предусматриваются организмы, синтезирующие рекомбинантную Δ6-десатуразу. Еще одним аспектом данного изобретения является выделенная Δ6-десатураза, которую можно выделить в чистом виде из рекомбинантных организмов с помощью стандартных методов очистки белков (Например, см. Ausubel et al. [1987] Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates, New York).
Векторы, содержащие ДНК, кодирующую Δ6-десатуразу, также входят в объем настоящего изобретения. Специалистам в этой области должно быть понятно, что можно сконструировать соответствующие векторы, вызывающие экспрессию кодирующей последовательности Δ6-десатуразы в ряде организмов. Наиболее предпочтительными являются реплицируемые экспрессирующие векторы. Описываемые здесь реплицируемыми экспрессирующими векторами являются молекулы ДНК или РНК, созданные для контролируемой экспрессии требуемого гена, то есть гена Δ6-десатуразы. Этими
векторами предпочтительно являются плазмиды, бактериофаги, космиды или вирусы. Настоящим изобретением предполагается применение шаттл-векторов, например, описанных Волком и др. (Wolk et al.) (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1561-1565 и Бастосом и др. (Bustos et al.) (1991) J. Bacteriol. 174, 7525-7533. Самбрук и др. (1989), Goeddel, ed (1990) Methods in Enzymology 185 Academic Press, и Perbal (1988) A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons, Inc., дают подробный обзор векторов, в которые можно вводить и экспрессировать нуклеиновую кислоту, кодирующую данную Δ6-десатуразу. Такие векторы содержат также последовательности нуклеиновых кислот, которые могут влиять на экспрессию нуклеиновых кислот, кодирующих Δ6-десатуразу. Элементы последовательности, способные вызывать экспрессию генного продукта, включают промоторы, энхансеры, предшествующие активирующие последовательности, сигналы терминации транскрипции и сайты полиаденилирования. Настоящим изобретением предусматриваются как конститутивные, так и тканеспецифичные промоторы. Для трансформации растительных клеток особый интерес представляет промотор 35S вируса мозаичной болезни цветной капусты (CaMV) и промоторы, активизируемые во время созревания семян растений. Все эти промоторы и элементы, регулирующие транскрипцию, в отдельности или в сочетании рассматриваются с целью их использования в данных реплицирующих векторах и известны специалистам в этой области. Промотор CaMV 355 описывается, например, Restrepo et al. (1990) Plant Cell 2, 987. В объем настоящего изобретения входят также генетически сконструированные и мутированные регуляторные последовательности.
векторами предпочтительно являются плазмиды, бактериофаги, космиды или вирусы. Настоящим изобретением предполагается применение шаттл-векторов, например, описанных Волком и др. (Wolk et al.) (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1561-1565 и Бастосом и др. (Bustos et al.) (1991) J. Bacteriol. 174, 7525-7533. Самбрук и др. (1989), Goeddel, ed (1990) Methods in Enzymology 185 Academic Press, и Perbal (1988) A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons, Inc., дают подробный обзор векторов, в которые можно вводить и экспрессировать нуклеиновую кислоту, кодирующую данную Δ6-десатуразу. Такие векторы содержат также последовательности нуклеиновых кислот, которые могут влиять на экспрессию нуклеиновых кислот, кодирующих Δ6-десатуразу. Элементы последовательности, способные вызывать экспрессию генного продукта, включают промоторы, энхансеры, предшествующие активирующие последовательности, сигналы терминации транскрипции и сайты полиаденилирования. Настоящим изобретением предусматриваются как конститутивные, так и тканеспецифичные промоторы. Для трансформации растительных клеток особый интерес представляет промотор 35S вируса мозаичной болезни цветной капусты (CaMV) и промоторы, активизируемые во время созревания семян растений. Все эти промоторы и элементы, регулирующие транскрипцию, в отдельности или в сочетании рассматриваются с целью их использования в данных реплицирующих векторах и известны специалистам в этой области. Промотор CaMV 355 описывается, например, Restrepo et al. (1990) Plant Cell 2, 987. В объем настоящего изобретения входят также генетически сконструированные и мутированные регуляторные последовательности.
Специалисты в этой области способны определить векторы и регуляторные элементы, пригодные для экспрессии в определенной клетке-хозяине. Например, для экспрессии Δ6-десатуразы в цианобактериях пригоден вектор, содержащий промотор из гена, кодирующего карбоксилазу вида Anabaena, функционально связанную с кодирующей областью Δ6-десатуразы и далее функционально связанную с сигналом терминации вида Synechocystis. Термин "функционально связанный" в этом контексте означает, что промоторные и терминаторные последовательности обеспечивают эффективную регуляцию транскрипции. В качестве другого примера можно привести вектор, пригодный для экспрессии Δ6-десатуразы в трансгенных растениях, который может содержать характерную для семян промоторную последовательность, выделяемую из гелиантинина, напина или глицинина, функционально связанных с кодирующей областью Δ6-десатуразы и далее функционально связанных с сигналом терминации семени или сигналом терминации нопалинсинтазы. Еще одним примером может служить вектор, служащий для экспрессии Δ6-десатуразы в растениях, который может содержать конститутивный промотор или тканеспецифичный промотор, функционально связанный с кодирующей областью Δ6-десатуразы и далее функционально связанный с конститутивным или тканеспецифичным терминатором или сигналом терминации нопалинсинтазы.
В частности, такие регуляторные элементы, как гелиантинин, описываемые в одновременно рассматриваемой заявке на патент США No.682354, поданной 8 апреля 1991 г., которая включена в это описание изобретения в качестве ссылки, являются промоторными элементами, служащими для экспрессии Δ6-десатуразы по настоящему изобретению.
Модификации рассматриваемых нуклеотидных последовательностей или регуляторных элементов, выполняющих здесь функции, входят в объем данного изобретения. Такие модификации включают вставки, замены и делеции, в частности замены, которые отражают вырожденность генетического кода.
Стандартные методы конструирования гибридных векторов хорошо известны специалистам в этой области и описываются в приводимых ссылочных материалах, таких как справочник Самбрука и др. (1989), или в любом из множества руководств по лабораторным исследованиям, которые относятся к технологии получения рекомбинантной ДНК и имеют широкое применение. Существует целый ряд способов, предназначенных для лигирования фрагментов ДНК, выбор которых зависит от характера концов фрагментов ДНК. Кроме того, в объем настоящего изобретения входят гибридные векторы, в которые включены элементы нуклеотидной последовательности, облегчающие клонирование, экспрессию или процессинг, например последовательности, кодирующие сигнальные пептиды, последовательности, кодирующие KDEL, которая необходима для удерживания белков в эндоплазматическом ретикулуме, или последовательности, кодирующие транзитные пептиды, которые направляют Δ6-десатуразу в хлоропласт. Такие последовательности известны специалистам в этой области. Оптимизированный транзитный пептид описывается, например, Van len Broeck et al. (1985) Nature 313, 358. Прокариотические и эукариотические сигнальные последовательности описываются, например, Michelis et al. (1982) Ann. Rev. Microbiol. 36, 425.
Дальнейшим аспектом настоящего изобретения предусматриваются организмы, неявляющиеся цианобактериями или растениями, которые содержат ДНК, кодирующую Δ6-десатуразу по данному изобретению. Трансгенными организмами, входящими в обьем настоящего изобретения, являются бактерии, цианобактерии, грибы, растения и животные. Выделенную ДНК по настоящему изобретению можно ввести в клетку-хозяин с помощью известных методов, например инфицирования, трансфекции, трансформации и трансконъюгирования. Методы переноса ДНК по настоящему изобретению в такие организмы широко известны и описываются в справочных материалах, таких как работа Самбрука и др. (1989).
Известны разнообразные методы трансформации растений. Ген Δ6-десатуразы можно ввести в растения с помощью процедуры-регенерации листового диска, описанной Horsch et al. (1985) Science 227, 1229. Можно использовать другие методы трансформации, такие как культивирование протопласта (Horsch et al. (1984) Science 223, 496; DeBlock et al. (1984) EMBO J. 2. 2143; Barton et al. (1983) Cell 32, 1033), которые также входят в объем данного изобретения. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения растения трансформируют с помощью векторов, выделенных из Agrobacterium. Однако существуют другие методы, позволяющие ввести гены Δ6-десатуразы по настоящему изобретению в растительные клетки. Такие альтернативные методы включают биобаллистические способы (Klein et al. (1987) Nature 327, 70), электропорацию, опосредованный химическими веществами ввод ДНК и использование вирусов или пыльцы в качестве векторов.
При необходимости в случае применения метода трансформации гены Δ6-десатуразы по настоящему изобретению можно ввести в растительный трансформирующий вектор, например бинарный вектор, описанный Bevan (1984) Nucleic Acids Res,12, 8111.
Растительные трансформирующие векторы можно получить путем изменения натуральной системы переноса гена Agrobacterium tumefaciens. Природная система включает плазмиды, индуцирующие образование опухолей (Ti) и содержащие большой сегмент, известный как Т-ДНК, который переносится в трансформированные растения. Другой сегмент Ti-плазмиды, vir область, имеет непосредственное отношение к переносу Т-ДНК. Область Т-ДНК ограничена концевыми повторами. В модифицированных бинарных векторах удалены гены, индуцирующие образование опухолей, и функции vir области используются для переноса чужеродной ДНК, ограниченной граничными последовательностями Т-ДНК. Т-область содержит также селективный маркер для устойчивости к антибиотикам и множественный сайт клонирования, предназначенный для ввода последовательностей для переноса. Такие сконструированные штаммы известны как "обезвреженные" ("disarmed") штаммы A. tumefaciens и обеспечивают эффективную трансформацию последовательностей, ограниченных Т-областью, в ядерные геномы растений.
Листовые диски со стерилизованной поверхностью инокулируют "обезвреженным" видом A. tumefaciens, содержащим чужеродную ДНК, культивируют в течение двух дней, а затем переносят на среду, содержащую антибиотик. Трансформированные проростки выбирают после укоренения в среде, содержащей соответствующий антибиотик, переносят в почву и регенерируют.
Другим аспектом настоящего изобретения предусматриваются трансгенные растения или потомство этих растений, содержащее ДНК по данному изобретению. В объем настоящего изобретения входят как однодольные, так и двудольные растения. Растительные клетки трансформируют выделенной ДНК, кодирующей Δ6-десатуразу, с помощью любого из описанных выше методов трансформации растений. Трансформированную растительную клетку, обычно в культуре каллусных тканей или на листовом диске, регенерируют в полностью трансгенном растении с помощь методов, хорошо известных специалистам в этой области (например, Horsch et al. (1985) Science 227, 1129). В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения трансгенным растением является подсолнечник, paпс (oie seed rape), кукуруза, табак, арахис или соя. Поскольку потомство трансформированных растений наследует ДНК, кодирующую Δ6-десатуразу, семена или черенки трансформированных растений используют для сохранения линии трансгенных растений.
Настоящим изобретением далее предусматривается способ получения трансгенных растений с повышенным содержанием гамма-линоленовой кислоты. Этот способ включает введение ДНК, кодирующей Δ6-десатуразу, в растительные клетки с низким содержанием или полным отсутствием гамма-линоленовой кислоты, которые содержат линолевую кислоту, и регенерацию растений с повышенным содержанием гамма-линоленовой кислоты из трансгенных клеток. В частности, такие широко распространенные сельскохозяйственные культуры, как соя, рапс, кукуруза, арахис и табак, рассматриваются в качестве трансгенных организмов, но не ограничиваются ими.
Настоящим изобретением далее предусматривается способ получения трансгенных организмов, содержащих гамма-линоленовую кислоту. Этот способ включает введение ДНК, кодирующей Δ6-десатуразу, в организмы с низким содержанием или полным отсутствием гамма-линоленовой кислоты, но содержащие линолевую кислоту. В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения предусматривается способ, который включает введение одного или нескольких экспрессирующих векторов, содержащих ДНК, кодирующую Δ12-десатуразу и Δ6-десатуразу, в организмы, не содержащие ни гамма-линоленовой кислоты, ни линолевой кислоты. В соответствии с этим способом у организмов, не содержащих ни линолевой кислоты, ни гамма-линоленовой кислоты, вызывают синтез линолевой кислоты путем экспрессии Δ12-десатуразы, после чего синтезируют гамма-линоленовую кислоту в результате экспрессии Δ6-десатуразы. Экспрессирующие векторы, содержащие ДНК, кодирующую Δ12-десатуразу или Δ12-десатуразу и Δ6-десатуразу, можно получить с помощью методов рекомбинантных ДНК, известных специалистам в этой области (Sambrook et al. 1989), и с помощью последовательности Δ12-десатуразы, опубликованной в научной литературе (Wada et al. [1990] Nature (London) 347, 200-203). Кроме того, настоящее изобретение позволило установить, что нуклеотиды 2002-3081 последовательности с идентификационным No.1 кодируют Δ12-десатуразу цианобактерий. Поэтому эту последовательность можно использовать для получения целевых экспрессирующих векторов. В частности, такие широко распространенные сельскохозяйственные культуры, как подсолнечник, соя, рапс, кукуруза, арахис и табак, рассматриваются в качестве трансгенных организмов, но не ограничиваются ими.
Настоящее изобретение далее относится к способу повышения холодоустойчивости растений. Чувствительность к охлаждению может быть связана с фазовым переносом липидов в клеточных мембранах. Температура фазового переноса зависит от степени ненасыщенности жирных кислот в липидах мембраны, поэтому увеличение степени ненасыщенности, например, путем введения Δ6-десатуразы с целью превращения линолевой кислоты в гамма-линоленовую кислоту, может сделать растение холодоустойчивым или понизить чувствительность к охлаждению. Поэтому настоящим изобретением предусматривается введение ДНК, кодирующей Δ6-десатуразу, в растительные клетки и регенерация растений с повышенной холодоустойчивостью из указанных трансформированных растительных клеток. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения такими растениями являются подсолнечник, соя, рапс, кукуруза, арахис или табак.
Настоящее изобретение далее проиллюстрировано следующими примерами.
ПРИМЕР 1
Штаммы и условия культивирования
Synechocystis (РСС 6803, АТСС 27184), Anabaena (PCC 7120, АТСС 27893 и Synechoccus (PCC 7942, АТСС 33912) выращивают фотоавтотрофическим путем при 30oС в среде BG11N+(Rippka et al.[1979] J. Gen. Microbiol. 111. 1-61) под светом ламп накаливания (60 μE.m-2.S-1). Отбирают космиды и плазмиды и культивируют их в штамме Escherichia соli DH5α в среде Луриа, дополненной антибиотиками в стандартных концентрациях, как описано в работе Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring, New York.
Штаммы и условия культивирования
Synechocystis (РСС 6803, АТСС 27184), Anabaena (PCC 7120, АТСС 27893 и Synechoccus (PCC 7942, АТСС 33912) выращивают фотоавтотрофическим путем при 30oС в среде BG11N+(Rippka et al.[1979] J. Gen. Microbiol. 111. 1-61) под светом ламп накаливания (60 μE.m-2.S-1). Отбирают космиды и плазмиды и культивируют их в штамме Escherichia соli DH5α в среде Луриа, дополненной антибиотиками в стандартных концентрациях, как описано в работе Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring, New York.
ПРИМЕР 2
Создание геномной библиотеки космид штамма Synechocystis
Всю геномную ДНК, полученную из штамма Synechocystis (PCC 6803) частично расщепляют с помощью Sau3A и фракцинируют в градиенте концентрации сахарозы (Ausubel et al. [1987] Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York). Фракции, содержащие фрагменты ДНК длиной от 30 до 40 т.п.н. отбирают и лигируют в дефосфорилированный сайт BamHI космидного вектора, pDUCA7 (Bui-kema et al. [1991] J. Bacteriol. 173. 1879-1885). Лигированную ДНК упаковывают in vitro, как описано Ausubel et al. (1987), и упакованный фаг культивируют в культуре E. соli DH5α, содержащей плазмиду pRL528 клетки-помощника синтеза метилазы AvaI и Есо4711, как это описано Buikema et al. (1991). Произвольно выделяют в общей сложности 1152 колонии и помещают отдельно на двенадцать 96-луночных титрационных микропланшетов.
Создание геномной библиотеки космид штамма Synechocystis
Всю геномную ДНК, полученную из штамма Synechocystis (PCC 6803) частично расщепляют с помощью Sau3A и фракцинируют в градиенте концентрации сахарозы (Ausubel et al. [1987] Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York). Фракции, содержащие фрагменты ДНК длиной от 30 до 40 т.п.н. отбирают и лигируют в дефосфорилированный сайт BamHI космидного вектора, pDUCA7 (Bui-kema et al. [1991] J. Bacteriol. 173. 1879-1885). Лигированную ДНК упаковывают in vitro, как описано Ausubel et al. (1987), и упакованный фаг культивируют в культуре E. соli DH5α, содержащей плазмиду pRL528 клетки-помощника синтеза метилазы AvaI и Есо4711, как это описано Buikema et al. (1991). Произвольно выделяют в общей сложности 1152 колонии и помещают отдельно на двенадцать 96-луночных титрационных микропланшетов.
ПРИМЕР 3
Экспрессия гамма-линоленовой кислоты в Anabaena с приобретением функции
Anabaena (PCC 7120), нитевидные цианобактерии, не имеют гамма-линоленовой кислоты, но содержат значительные количества линолевой кислоты, предшественника гамма-линоленовой кислоты (фигура 2; таблица 2). Библиотеку космид Synechocystis, описанную в примере 2, конъюгируют в Anabaena (PCC 7120) с целью идентификации трансконъюгантов, синтезирующих гамма-линоленовую кислоту. Клетки Anabaena выращивают до полулогарифмической фазы в жидкой среде BG11N+ и повторно суспендируют в такой же среде до конечной концентрации, равной примерно 1х109 клеткам на мл. Культуру Е. coli RP4 в полулогарифмической фазе (Burkard et al. [1979] J. Gen. Microbiol.114, 341-348), выращенную в среде Луриа, содержащей ампициллин, промывают и вновь суспендируют в свежей среде Луриа. После этого Anabaena и RP4 смешивают и равномерно распределяют по планшетам со средой BG11N+, содержащей 5% среды Луриа. Геномную библиотеку космид помещают на планшеты со средой Луриа, содержащие 50 мкг/мл канамицина и 17,5 мкг/мл хлорамфеникола, повторяя эту процедуру дважды, а затем помещают на планшеты со средой BG11N+, содержащей Anabaena и RР4. После инкубации в течение 24 ч при 30oС вводят подслой из 30 мкг/мл неомицина; и продолжают инкубацию при 30oС до появления трансконъюгатов. Отдельные трансконъюгаты отделяют после конъюгирования и выращивают в 2 мл жидкой среды BG11N+ с 15 мкг/мл неомицина. Метиловые эфиры жирных кислот получают из культур дикого типа и культур, содержащих пулы из десяти трансконъюгатов, выполняя следующую процедуру. Дикие и трансгенные цианобактериальные культуры отделяют центрифугированием и дважды промывают дистиллированной водой. Метиловые эфиры жирных кислот экстрагируют из этих культур, как это описано в работе Dahmer et al. (989) J.Amer. Oil. Chem. Soc.66, 543-548, и анализируют посредством газожидкостной хроматографии с помощью хроматографа Тrасоr-560, оборудованного ионизационным детектором с водородным пламенем и капиллярной колонкой (30мх0,25 мм связанного FSOT Superox II, Alltech Associates Inc. , IL). Для идентификации жирных кислот служат значения времени удержания и кохроматографии эталонов (предоставленных компанией Sigma Chemical Co. ). Средний состав жирных кислот определяют в виде отношений пиковой области каждой С 18 жирной кислоты, нормализованной в отношении внутреннего эталона.
Экспрессия гамма-линоленовой кислоты в Anabaena с приобретением функции
Anabaena (PCC 7120), нитевидные цианобактерии, не имеют гамма-линоленовой кислоты, но содержат значительные количества линолевой кислоты, предшественника гамма-линоленовой кислоты (фигура 2; таблица 2). Библиотеку космид Synechocystis, описанную в примере 2, конъюгируют в Anabaena (PCC 7120) с целью идентификации трансконъюгантов, синтезирующих гамма-линоленовую кислоту. Клетки Anabaena выращивают до полулогарифмической фазы в жидкой среде BG11N+ и повторно суспендируют в такой же среде до конечной концентрации, равной примерно 1х109 клеткам на мл. Культуру Е. coli RP4 в полулогарифмической фазе (Burkard et al. [1979] J. Gen. Microbiol.114, 341-348), выращенную в среде Луриа, содержащей ампициллин, промывают и вновь суспендируют в свежей среде Луриа. После этого Anabaena и RP4 смешивают и равномерно распределяют по планшетам со средой BG11N+, содержащей 5% среды Луриа. Геномную библиотеку космид помещают на планшеты со средой Луриа, содержащие 50 мкг/мл канамицина и 17,5 мкг/мл хлорамфеникола, повторяя эту процедуру дважды, а затем помещают на планшеты со средой BG11N+, содержащей Anabaena и RР4. После инкубации в течение 24 ч при 30oС вводят подслой из 30 мкг/мл неомицина; и продолжают инкубацию при 30oС до появления трансконъюгатов. Отдельные трансконъюгаты отделяют после конъюгирования и выращивают в 2 мл жидкой среды BG11N+ с 15 мкг/мл неомицина. Метиловые эфиры жирных кислот получают из культур дикого типа и культур, содержащих пулы из десяти трансконъюгатов, выполняя следующую процедуру. Дикие и трансгенные цианобактериальные культуры отделяют центрифугированием и дважды промывают дистиллированной водой. Метиловые эфиры жирных кислот экстрагируют из этих культур, как это описано в работе Dahmer et al. (989) J.Amer. Oil. Chem. Soc.66, 543-548, и анализируют посредством газожидкостной хроматографии с помощью хроматографа Тrасоr-560, оборудованного ионизационным детектором с водородным пламенем и капиллярной колонкой (30мх0,25 мм связанного FSOT Superox II, Alltech Associates Inc. , IL). Для идентификации жирных кислот служат значения времени удержания и кохроматографии эталонов (предоставленных компанией Sigma Chemical Co. ). Средний состав жирных кислот определяют в виде отношений пиковой области каждой С 18 жирной кислоты, нормализованной в отношении внутреннего эталона.
Типичные профили газожидкостной хроматографии показаны на фиг.2. На этой фигуре изображены метиловые эфиры С18 жирных кислот. Пики идентифицируют путем сравнения значений времени элюирования с известными эталонами метиловых эфиров жирных кислот и подтверждают путем газовой хроматографии и масс-спектрометрии. На фиг.2А показаны результаты газожидкостной хроматографии жирных кислот Anabaena дикого типа. Стрелкой показано время миграции гамма-линоленовой кислоты. На фиг. 2В изображен профиль хроматографии жирных кислот трансконъюгатов Anabaena с pAM542+1.8F. Выявлено два пула, синтезирующих гамма-линоленовую кислоту (из 25 пулов, представляющих 250 трансконъюгатов). Отдельные трансконъюгаты каждого пула, давшего положительные результаты в отношении гамма-линоленовой кислоты, анализируют на синтез гамма-линоленовой кислоты; определяют два независимых трансконъюгата, AS13 и AS75, по одному из каждого пула, которые синтезируют значительные количества гамма-линоленовой кислоты и содержат космиды, cSyl3 и cSy75 (фигура 3). Перекрывающиеся космиды образуют область длиной примерно 7,5 т.п.н. Фрагмент NheI длиной 3,5 т.п.н. космиды cSy75 вновь клонируют в векторе pDUCA7 и переносят в Anabaena, в результате чего имеет место экспрессия гамма-линоленовой кислоты с приобретением функции (таблица 2).
Два субфрагмента NheI/Hind III (1,8 и 1,7 т.п.н.) из фрагмента NheI длиной 3,5 т.п.н. космиды cSy75-3,5 субклонируют в "pBLUESCRIPT" (Stratagene) (фигура 3) с целью секвенирования. Используют стандартные методы молекулярной биологии, описанные Maniatis et al. (1982) и Ausubel et а1. (1987). Дидезоксисиквенирование (Sanger et al. [1977] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467) плазмиды pBSl, 8 выполняют с помощью "секвеназы" (United States Biochemical) в отношении обеих цепей, используя специальные олигонуклеотидные затравки, синтезированные лабораторией прогрессивных технологий синтеза ДНК (Биологический факультет. Техасский университет). Анализ последовательности ДНК производят с помощью программного обеспечения GCG (Мадисон, шт. Винсконсин) в соответствии с описанием Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res.12, 387-395.
Субфрагменты Nhe I/HindIII переносят в конъюгальный экспрессирующий вектор АМ542 с прямой и обратной ориентацией в отношении промотора, представляющего собой карбоксилазу цианобактерий, и вводят в Anabaena путем конъюгирования. Трансконъюгаты, содержащие фрагмент длиной 1,8 т.п.н. с прямой ориентацией (АМ542-1,8F), позволяют получить значительные количества гамма-линоленовой кислоты и октадекатетраеновой кислоты (фигура 2; таблица 2). Трансконъюгаты, содержащие другие конструкции, а также обратно ориентированный фрагмент длиной 1,8 т.п.н. или прямо и обратно ориентированный фрагмент длиной 1,7 т.п.н., не синтезируют гамма-линоленовую кислоту на детектируемых уровнях (таблица 2).
На фигуре 2 профиль С18 жирной кислоты экстракта из Anabaena дикого типа (фигура 2А) сравнивается с профилем Anabaena трансгенного типа, содержащим фрагмент космиды cSy75-3,5 длиной 1,8 т.п.н. с прямой ориентацией (фигура 2В). Газожидкостная хроматография метиловых эфиров жирных кислот, полученных из фрагмента АМ542-1,8А, позволила выявить пик со временем удержания, идентичным такому же показателю у подлинного эталона гамма-линоленовой кислоты. Анализ этого пика посредством газовой хроматографии и масс-спектрометрии (GC-MS) подтвердил наличие аналогичной картины фрагментации по массе, что и в контрольной пробе гамма-линоленовой кислоты. Аnаbаеnа трансгенного типа с измененными уровнями полиненасыщенных жирных кислот аналогичен дикому типу по скорости роста и морфологии.
ПРИМЕР 4
Трансформация Synechococcus генами Δ6 и Δ12 десатуразы
Третью космиду, cSy7, содержащую ген Δ12-десатуразы, выделяют путем скрининга геномной библиотеки Synechocystis олигонуклеотидом, синтезированным из опубликованной в литературе последовательности гена Δ12-десатуразы Synechocystis (Wada et al. [1990] Nature (London) 347, 200-203). В этой космиде идентифицируют фрагмент AvaI длиной 1,7 т. п. н. , содержащий ген Δ12-десатуразы и используют его в качестве зонда для демонстрации того, что космида cSyl3 помимо гена Δ6-десатуразы содержит также ген Δ12-десатуразы (фигура 3). Геномный анализ по методу саузерн-блоттинга далее показывает, что гены как Δ6-, так и Δ12-десатуразы уникальны в геноме Synechocystis в том отношении, что оба функциональных гена, имеющих отношение к десатурации С18 жирных кислот, близко связаны в геноме Synechocystis.
Трансформация Synechococcus генами Δ6 и Δ12 десатуразы
Третью космиду, cSy7, содержащую ген Δ12-десатуразы, выделяют путем скрининга геномной библиотеки Synechocystis олигонуклеотидом, синтезированным из опубликованной в литературе последовательности гена Δ12-десатуразы Synechocystis (Wada et al. [1990] Nature (London) 347, 200-203). В этой космиде идентифицируют фрагмент AvaI длиной 1,7 т. п. н. , содержащий ген Δ12-десатуразы и используют его в качестве зонда для демонстрации того, что космида cSyl3 помимо гена Δ6-десатуразы содержит также ген Δ12-десатуразы (фигура 3). Геномный анализ по методу саузерн-блоттинга далее показывает, что гены как Δ6-, так и Δ12-десатуразы уникальны в геноме Synechocystis в том отношении, что оба функциональных гена, имеющих отношение к десатурации С18 жирных кислот, близко связаны в геноме Synechocystis.
Одноклеточные цианобактерии Synechococcus (PCC 7942) не имеют ни ленолевой кислоты, ни гамма-линоленовой кислоты (3). Гены Δ12- и Δ6-десатуразы клонируют отдельно и вместе в шаттл-векторе рАМ854 (Bustos et al. [1991] J. Bacteriol. 174, 7525-7533), который содержит последовательности, необходимые для интеграции чужеродной ДНК в геном Synechococcus (Golden et al. [1987] Methods in Enzvmol. 153, 215-231). Synechococcus трансформируют этими генными конструкциями и отбирают колонии, трансформируют этими генными конструкциями и отбирают колонии. Метиловые эфиры жирных кислот экстрагируют из Synechococcus трансгенного типа и анализируют посредством газожидкостной хроматографии.
В таблице 2 показано, что основными жирными кислотами Synechococcus дикого типа являются стеариновая кислота (18:0) и олеиновая кислота (18:1). Цианобактерии Synechococcus, трансформированные рАМ854-Δ12, помимо основных жирных кислот ситезируют линолевую кислоту (18:2). Трансформанты, полученные с помощью рАМ854- Δ6 и Δ12, синтезируют как линолеат, так и гамма-линоленовую кислоту (таблица 1). Эти результаты свидетельствуют о том, что цианобактерии Synechococcus, содержащие гены Δ12- и Δ6-десатуразы, способны создавать вторую двойную связь в Δ12-положении и третью двойную связь в Δ6-положении С18 жирных кислот. Однако у трансформанта, содержащего рАМ854- Δ6, не обнаружено изменений в составе жирных кислот, что указывает на то, что при отсутствии субстрата, синтезируемого Δ12-десатуразой, Δ6-десатураза не проявляет активности. Этот эксперемент далее подтверждает, что фрагмент NheI/Hind III длиной 1,8 т.п.н. (фигура 3) содержит как кодирующую, так и промоторную области гена Δ6-десатуразы Synechocystis. Цианобактерии Synechococcus трансгенного типа с измененными уровнями полиненасыщенных жирных кислот аналогичны дикому типу по скорости роста и морфологии.
ПРИМЕР 5
Нуклеотидная последовательность Δ6-десатуразы
Определяют нуклеотидную последовательность фрагмента cSy75-3,5 длиной 1,8 т. п.н. Идентифицируют открытую рамку считывания, кодирующую полипептид 359 аминокислот (фигура 4). С помощью анализа на водорастворимость Кайта-Дулитла (Kyte et al. [1982] J.Mol. Biol. 157, 105-132) идентифицируют две области гидрофобных аминокислот, которые могут представлять трансмембранные домены (фигура 1А): кроме того, профиль водорастворимости Δ6-десатуразы аналогичен Δ12-десатуразы (1В; Wada et al.) и 9-десатураз (Thiede et al. [1986] J. Biol. Chem. 261, 13230-13235). Однако сходство последовательностей между Δ6- и Δ12-десатуразой Synechocystis составляет менее 40% на уровне нуклеотидов и примерно 18% на уровне аминокислот.
Нуклеотидная последовательность Δ6-десатуразы
Определяют нуклеотидную последовательность фрагмента cSy75-3,5 длиной 1,8 т. п.н. Идентифицируют открытую рамку считывания, кодирующую полипептид 359 аминокислот (фигура 4). С помощью анализа на водорастворимость Кайта-Дулитла (Kyte et al. [1982] J.Mol. Biol. 157, 105-132) идентифицируют две области гидрофобных аминокислот, которые могут представлять трансмембранные домены (фигура 1А): кроме того, профиль водорастворимости Δ6-десатуразы аналогичен Δ12-десатуразы (1В; Wada et al.) и 9-десатураз (Thiede et al. [1986] J. Biol. Chem. 261, 13230-13235). Однако сходство последовательностей между Δ6- и Δ12-десатуразой Synechocystis составляет менее 40% на уровне нуклеотидов и примерно 18% на уровне аминокислот.
ПРИМЕР 6
Перенос
десатуразы цианобактерий в табак
Ген Δ6-десатуразы цианобактерий активируют в растительном экспрессирующем векторе и переносят в табак с помощью методов переноса генов, опосредственного Agrobacterium. Для гарантии того, что перенесенная десатураза должным образом экспрессирована в листьях и развивающихся семенах и что продукт гена десатуразы введен в эндоплазматический ретикулум или хлоропласт, конструируют различные полигенные экспрессирующие кластеры с открытой рамкой считывания Δ-десатуразы Synechocystis. Компоненты этих кластеров включают: (i) промотор 35S или семяспеци-фичный промотор, полученный из гена гелиантинина подсолнечника, с целью экспрессии гена Δ6-десатуразы во всех тканях растения или только в развивающихся семенах, (ii) предполагаемый сигнальный пептид из гена экстенсина моркови или гена гелиантинина подсолнечника для введения вновь синтезированной Δ6-десатуразы в эндоплазматический ретикулум (ЕВ), (iii) сигнальную последовательность сохранения полости эндоплазматического ретикулума (KDEL) у СООН-конца открытой рамки считывания Δ6-десатуразы и (iv) оптимизированный транзитный пептид, служащий для ввода Δ6-десатуразы в хлоропласт. Промотор 35S является производным pRTL2, описанным Restrepo et al. Последовательность оптимизированного транзитного пептида описана Van de Broeck et al. (1985). Сигнальный пептид экстенсина моркови описан Chen et al. (1985) EMBO J.9, 2145.
Перенос
Ген Δ6-десатуразы цианобактерий активируют в растительном экспрессирующем векторе и переносят в табак с помощью методов переноса генов, опосредственного Agrobacterium. Для гарантии того, что перенесенная десатураза должным образом экспрессирована в листьях и развивающихся семенах и что продукт гена десатуразы введен в эндоплазматический ретикулум или хлоропласт, конструируют различные полигенные экспрессирующие кластеры с открытой рамкой считывания Δ-десатуразы Synechocystis. Компоненты этих кластеров включают: (i) промотор 35S или семяспеци-фичный промотор, полученный из гена гелиантинина подсолнечника, с целью экспрессии гена Δ6-десатуразы во всех тканях растения или только в развивающихся семенах, (ii) предполагаемый сигнальный пептид из гена экстенсина моркови или гена гелиантинина подсолнечника для введения вновь синтезированной Δ6-десатуразы в эндоплазматический ретикулум (ЕВ), (iii) сигнальную последовательность сохранения полости эндоплазматического ретикулума (KDEL) у СООН-конца открытой рамки считывания Δ6-десатуразы и (iv) оптимизированный транзитный пептид, служащий для ввода Δ6-десатуразы в хлоропласт. Промотор 35S является производным pRTL2, описанным Restrepo et al. Последовательность оптимизированного транзитного пептида описана Van de Broeck et al. (1985). Сигнальный пептид экстенсина моркови описан Chen et al. (1985) EMBO J.9, 2145.
Получают трансгенные растения табака, содержащие рекомбинантный ген десатуразы цианобактерий, представляющий собой ген Δ6-десатуразы Synechocystis, связанный с последовательностью сохранения эндоплазматического ретикулума (KDEL) и сигнальным пептидом экстенсина, стимулируемого промотором CaMV 35S. Амплификации геномной ДНК трансгенного табака, образуемые в результате полимеразной цепной реакции, показывают, что ген Δ6-десатуразы включен в геном табака. Метиловые эфиры жирных кислот, полученные из листьев этих трансгенных растений табака, экстрагируют и анализируют посредством газожидкостной хроматографии. Эти трансгенные растения табака накапливают значительные количества гамма-линоленовой кислоты (фигура 4). На фигуре 4 показаны метиловые эфиры жирных кислот, выявленные газожидкостной хроматографией. Пики идентифицированы путем сравнения времени элюирования с известными эталонами метиловых эфиров жирных кислот. Таким образом, цианобактериальные гены, участвующие в обмене жирных кислот, можно использовать для генерации трансгенных растений с измененными составами жирных кислот.
ПРИМЕР 7. Создание библиотеки кДНК бурачника.
Мембраносвязанные полирибосомы выделяют из семян бурачника через 12 дней после опыления в соответствии с протоколом, разработанным для гороха Латкинсом (Latkins) и Девисом (Davies) (1975 Plant Phys. 55:749-756). РНК экстрагируют из полирибосом по методу, описанному Мехлером (Mechler) (1987 Methods in Enzymology 152:241-248. Academic Press).
Поли-А+ РНК выделяют из РНК мембраносвязанных полирибосом, используя гранулы Oligotex-dT (Qiagen). Соответствующую кДНК получают, используя набор для синтеза кДНК ZAP фирмы Stratagene. Библиотеку кДНК создают в векторе ламбда ZAP II (Stratagene), используя набор для синтеза вектора ламбда ZAP II. Первичную библиотеку упаковывают в упаковочный экстракт Gigapack II Gold (Stratagene). Эту библиотеку используют для синтеза меток экспрессированных последовательностей (EST) и последовательности, соответствующие этим меткам, используют для сканирования базы данных GenBank.
ПРИМЕР 8. Протокол гибридизации.
Зонды гибридизации для скрининга библиотеки кДНК бурачника получают путем синтеза случайной праймированной ДНК, описанного Ausubel et al. (1994 Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, N.Y.), при этом они соответствуют ранее идентифицированной кДНК экспрессированного запасного белка семян. Невключенные нуклеотиды удаляют в осадительной колонке G-50 (Boehringer Manheim). Зонд денатурируют для гибридизации путем кипячения на водяной бане в течение 5 минут с последующим быстрым охлаждением на льду. Фильтры для гибридизации предварительно гибридизируют при 60oС в течение 2-4 ч в растворе для предгибридизации (6-кратный раствор хлорида и цитрата натрия (SSC) [Maniatis et al. 1984 Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory] , содержащий 1-кратный раствор Денхартса, 0,05% пиро-фосфата натрия, 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося). Денатурированный зонд добавляют в раствор гибридизации (6-кратный раствор хлорида и цитрата натрия, 1-кратный раствор Денхарта, 0,05% пирофосфата натрия, 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося) и инкубируют, перемешивая при 60oС в течение ночи. Фильтры промывают в 4-, 2-и 1-кратных растворах SET по 15 мин в каждом при 60oС. 20-кратный исходный раствор SET состоит из 3 моль NaCl, 0,4 моль трис-основания, 20 ммоль Nа2ЭДТК-2Н2O. 4-кратный промывочный раствор SET состоит из 4-кратного раствора SET, 12,5 ммоль РO4, рН 6,8 и 0,2% додецилсульфата натрия. 2-кратный промывочный раствор SET состоит из 2-кратного раствора SET, 12,5 ммоль РO4, рН 6,8 и 0,2% додецилсульфата натрия. 1-кратный промывочный раствор SET состоит из 1-кратного раствора SET, 12,5 ммоль НO4, рН 6,8 и 0,2% додецилсульфата натрия. Фильтры сушат на воздухе, а затем подвергают воздействию рентгеновской пленки в течение 24 ч с использованием усиливающих экранов при температуре -80oС.
ПРИМЕР 9. Произвольное секвенирование кДНК, выделенных из библиотеки мембраносвязанных полисом семян бурачника (через 12 дней после опыления)
Библиотеку кДНК бурачника пассируют на чашках с низкой плотностью (500 бпяшкообразующих единиц на 150 мм чашках Петри). Наиболее распространенные кДНК запасного белка семян вычленяют путем скрининга с использованием ранее идентифицированных соответствующих кДНК. Негибридизирующие бляшки вырезают, используя процедуру вырезания и реагенты фирмы Stratagene. Полученные бактериальные колонии используют для инокуляции жидких культур и секвенируют либо вручную, либо с помощью автоматического секвенатора ABI. Каждую кДНК секвенируют один раз и метят последовательности, состоящие из 200-300 пар оснований. Все секвенирование выполняют по методу циклического секвенирования (Epicentre). Получено более 300 меток экспрессированных последовательностей. Каждую метку последовательности сравнивают с базой данных GenBank с помощью компьютерной программы BLASTX и идентифицируют ряд генов липидного обмена, включая Δ6-десатуразу.
Библиотеку кДНК бурачника пассируют на чашках с низкой плотностью (500 бпяшкообразующих единиц на 150 мм чашках Петри). Наиболее распространенные кДНК запасного белка семян вычленяют путем скрининга с использованием ранее идентифицированных соответствующих кДНК. Негибридизирующие бляшки вырезают, используя процедуру вырезания и реагенты фирмы Stratagene. Полученные бактериальные колонии используют для инокуляции жидких культур и секвенируют либо вручную, либо с помощью автоматического секвенатора ABI. Каждую кДНК секвенируют один раз и метят последовательности, состоящие из 200-300 пар оснований. Все секвенирование выполняют по методу циклического секвенирования (Epicentre). Получено более 300 меток экспрессированных последовательностей. Каждую метку последовательности сравнивают с базой данных GenBank с помощью компьютерной программы BLASTX и идентифицируют ряд генов липидного обмена, включая Δ6-десатуразу.
Поиски в базе данных с использованием клона кДНК, обозначенного mbp-65, с помощью программы BLASTX и базы данных Gem-Bank привели к выявлению значительной совместимости с Δ6-десатуразой Synechocystis. Однако установлено, что этот клон не является полной кДНК. Полную кДНК выделяют, используя mbp-65 для скрининга библиотеки мембраносвязанных полисом бурачника. Определяют последовательность выделенной кДНК (фиг. 5A, последовательность с идентификационным No.4) и белковую последовательность открытой рамки считывания (фиг. 5В, последовательность с идентификационным No.5) сравнивают с другими известными десатуразами, используя программу сравнительного анализа первичной структуры белков Geneworks ((IntelligGenetics) фиг.2). Этот анализ показывает, что данная кДНК является геном Δ6-десатуразы бурачника.
Будучи схожей с известными десатуразами других растений, Δ6-десатураза бурачника имеет определенные отличия, показанные на дендрограмме, изображенной на фиг. 6. Кроме того, сравнение аминокислотных последовательностей, характерных для десатураз, в частности тех, которые участвуют в связывании металлов (металлический блок 1 и металлический блок 2), позволяет выявить различия, существующие между Δ6-десатуразой бурачника и десатуразами других растений (таблица 3).
Δ6-Десатураза бурачника отличается от цианобактериальной формы не только всей последовательностью (фиг.6), но также и липидным блоком, металлическим блоком 1 и металлическим блоком 2 аминокислотных частей (таблица 3). Как показано в таблице 3, все три части являются новыми в последовательности. Только металлический блок 2 Δ6-десатуразы бурачника имеет некоторое сходство с металлическим блоком 2 Δ6-десатуразы Synechocystis.
Помимо этого, Δ6-десатураза бурачника отличается также от другого гена десатуразы бурачника, Δ12-десатуразы. Р1-81 является полной кДНК, которая идентифицирована на основе анализа меток экспрессированных последовательностей, и демонстрирует большое сходство с Δ12-десатуразой Arabidopsos (Fad 2).
Сравнение липидного блока, металлического блока 1 и металлического блока 2 аминокислотных частей (таблица 3) у Δ6- и Δ12-десатураз бурачника показывает, что в этих областях имеет место незначительная степень подобия. Расположение этих двух последовательностей на дендрограмме, изображенной на фиг.6, показывает, насколько далеки эти два гена друг от друга.
ПРИМЕР 10. Конструкция 222.1Δ6NOS для переходной экспрессии.
Вектор рВ1221 (Jefferson et al. 1987 EMBO J. 6:3901-3907) получают для лигирования расщеплением с помощью BamHI EcoICR I (Promega), что позволяет вырезать кодирующую область GUS, не повреждая промотор 35S и терминатор NOS. кДНК Δ6-десатуразы бурачника вырезают из плазмиды Блюскрипта (Stratagene) путем расщепления с помощью BamHI XhoI. Конец XhoI дефосфолируют, используя фрагмент Кленова. Этот фрагмент затем клонируют в сайтах BamHI/EcoICR I вектора рВI221, получая 221.Δ6NOS (фиг. 7). В 221.Δ6NOS стальной частью (скелетом) рестрикционной карты, изображенной на фиг.7, является вектор рВ1221.
ПРИМЕР 11. Конструкция 121.Δ6.NOS для стабильной трансформации.
Вектор pBI121 (Jefferson et al. 1987 EMBO J.6:3901-3907) получают для лигирования расщеплением с помощью BamHI и EcoICR I (Promega), что позволяет вырезать кодирующую область GUS, не повреждая промотор 35S и терминатор NOS. кДНК Δ6-десатуразы бурачника вырезают из плазмиды Блюскрипта (Stratagene) путем расщепления с помощью BamHI и XhoI. Конец XhoI дефосфолируют, используя фрагмент Кленова. Этот фрагмент затем клонируют в сайтах BamHI/EcoICR I вектора pBI121, получая 121.Δ6NOS (фиг.7). В 121.Δ6NOS остальной частью (скелетом) рестрикционной карты, изображенной на фиг.7, является вектор pBI121.
ПРИМЕР 12. Переходная экспрессия.
Всю работу, связанную с протопластами, выполняют в стерильном вытяжном шкафу. Один мл упакованных клеток суспензии моркови расщепляют в 30 мл плазмолизующего раствора (25 г/л КС1, 3,5 г/л CaCl2-H2O, 10 ммоль MES, рН 5,6 и 0,2 моль маннитола) с 1% целлюлозы, 0,1% пектолиазы и 0,1% дрейсалазы в течение ночи в темноте при комнатной температуре. Высвобожденные протопласты фильтруют через сито с отверстиями 150 μm и гранулируют центрифугированием (100хг, 5 мин), после чего дважды промывают в плазмирующем растворе. Протопласты подсчитывают в двухкамерном гемоцитомере. ДНК трансфецируют в протопласты путем обработки полиэтиленгликолем в соответствии с описанием Нунберга и Томаса (Nunberg and Tomas, 1993, Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology. B.R. Glick and J.E. Thompson, eds., pp.241-248), используя 106 протопластов и 50-70 мкг плазмидной ДНК (221.Δ6.NOS). Протопласты культивируют, встряхивая, в 5 мл MS-среды, дополненной 0,2 моль маннитола и 3 мкл 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты, в темноте в течение 48 ч
ПРИМЕР 13. Стабильная трансформация табака.
ПРИМЕР 13. Стабильная трансформация табака.
Конструкцию на основе плазмидного вектора 121.Δ6.NOS используют для трансформации табака (Nicotiana tabacum cv. xanthi) посредством Agrobacterium в соответствии со стандартными процедурами (Horsh et al., 1985, Science 227: 1229-1231; Bogue et al., 1990 Mol. Genet. 221: 49-57) за исключением того, что исходные трансформанты выбирают на 100 мкг/мл канамицина.
ПРИМЕР 14. Получение и анализ метиловых эфиров жирных кислот (FAME).
Ткани, взятые из трансфецированных протопластов и трансформированных растений табака, замораживают в жидком азоте и лиофилизуют в течение ночи. Метиловые эфиры жирных кислот получают в соответствии со способом, описанным Дагмером и др. (Dahmer et al., 1989, J. Amer. Oil Chem. Soc. 66: 543-548). В некоторых случаях растворитель снова выпаривают и метиловые эфиры жирных кислот еще раз суспендируют в этилацетате и один раз экстрагируют деионизированной водой для удаления водорастворимых загрязняющих примесей. Метиловые эфиры жирных кислот анализируют посредством газовой хромотографии на колонке J & W Scientific DB-wax (длина 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, пленка толщиной 0,25 мкм).
Пример анализа переходного состояния приведен на фиг.8, который позволяет выявить совокупность из трех независимых трансфекций. Добавление кДНК Δ6-десатуразы бурачника соответствует появлению гамма-линоленовой кислоты, которая является одним из возможных продуктов Δ6-десатуразы.
На фигурах 9 и 10 изображены профили газовой хроматографии эфиров жирных кислот, выделенных соответственно из тканей листа и семени контрольных и трансформированных растений табака. На фигуре 9А изображен профиль ткани листа табака дикого типа (xanthi); на фигуре 9В изображен профиль ткани листа табака, трансформированного с помощью Δ6-десатуразы бурачника при транскрипционной регуляции, осуществляемой промотором 35S CaMV (pBI 121Δ6NOS). Пики соответствуют 18:2, 18:3γ (гамма-линоленовая кислота), 18:3α и 18: 4 (октадеканоновая кислота). На фигуре 10А показан профиль газовой хроматографии семян табака дикого типа; на фигуре 10В изображен профиль ткани семени растения табака, трансформированного с помощью pBI 121Δ6NOS. Пики соответствуют 18:2, 18:3γ (гамма-линоленовая кислота) и 18:3α.
Относительное распределение C18 жирных кислот в контрольных и трансгенных семенах табака показано в таблице 4.
Относительное распределение C18 жирных кислот в контрольных и трансгенных семенах табака показано в таблице 4.
Приведенные результаты показывают, что гамма-линоленовая кислота включена в триацилглицериды из семян трансгенного табака, содержащего Δ6-десатуразу бурачника.
Claims (25)
1. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая дельта-6-десатуразу из Borago officinalis, которая содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 4.
2. Выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует дельта-6-десатуразу, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID No: 5.
3. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 1 или 2.
4. Вектор по п. 3, встроенный в клетку.
5. Вектор по п. 4, отличающийся тем, что указанная клетка является животной, бактериальной, растительной или грибковой клеткой.
6. Экспрессирующий вектор, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту по п. 1 или 2, которая функционально связана с промотором и необязательно с сигналом терминации, обеспечивающим экспрессию указанной выделенной нуклеиновой кислоты.
7. Экспрессирующий вектор по п. 6, отличающийся тем, что промотором является промотор дельта-6-десатуразы, промотор карбоксилазы Anabaena, промотор гелиантинина, промотор глицинина, промотор напина, промотор 35S из СаMV или тканеспецифичный промотор гелиантинина.
8. Экспрессирующий вектор по п. 6, отличающийся тем, что промотор является конститутивным или тканеспецифичным.
9. Экспрессирующий вектор по п. 6, отличающийся тем, что сигналом терминации является сигнал терминации Synechocystis, сигнал терминации нопалинсинтазы или сигнал терминации семени.
10. Экспрессирующий вектор по любому из пп. 6-9, встроенный в клетку.
11. Экспрессирующий вектор по п. 10, отличающийся тем, что указанная клетка является животной, бактериальной, растительной или грибковой клеткой.
12. Способ получения растения с повышенным содержанием гамма-линоленовой кислоты (GLA), который включает (а) трансформацию растительной клетки выделенной нуклеиновой кислотой по п. 1 или 2 и (b) регенерацию растения с повышенным содержанием гамма-линоленовой кислоты (GLA) из указанной растительной клетки.
13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что указанным растением является подсолнечник, соя, кукуруза, табак, арахис, морковь или маслиничный рапс.
14. Способ получения растения с повышенным содержанием гамма-линоленовой кислоты (GLA), который включает (а) трансформацию растительной клетки вектором по любому из пп. 3,6-9 и (b) регенерацию растения с повышенным содержанием гамма-линоленовой кислоты (GLA) из указанной растительной клетки.
15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что указанным растением является подсолнечник, соя, кукуруза, табак, арахис, морковь или маслиничный рапс.
16. Способ индукции получения гамма-линоленовой кислоты (GLA) в организме с низким содержанием или полным отсутствием гамма-линоленовой кислоты, который включает трансформацию указанного организма выделенной нуклеиновой кислотой по п. 1 или 2.
17. Способ индукции получения гамма-линоленовой кислоты (GLA) в организме с низким содержанием или полным отсутствием гамма-линоленовой кислоты, который включает трансформацию указанного организма вектором по любому из пп. 3, 6-9.
18. Способ индукции получения гамма-линоленовой кислоты (GLA) в организме с низким содержанием или полным отсутствием гамма-линоленовой кислоты и ленолевой кислоты (LA), который включает трансформацию указанного организма выделенной нуклеиновой кислотой по п. 1 или 2 и выделенной нуклеиновой кислотой, кодирующей дельта-12-десатуразу.
19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанная выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая дельта-6-десатуразу, содержит нуклеотиды 44-1390 SEQ ID No: 4.
20. Способ индукции получения октадекатетраеновой кислоты в организме с низким содержанием или полным отсутствием гамма-линоленовой кислоты, который включает трансформацию указанного организма выделенной нуклеиновой кислотой по п. 1 или 2.
21. Способ по п. 20, отличающийся тем, что указанным организмом является бактерия, грибок, растение или животное.
22. Способ индукции получения октадекатетраеновой кислоты в организме с низким содержанием или полным отсутствием гамма-линоленовой кислоты, который включает трансформацию указанного организма вектором по любому из пп. 3, 6-9.
23. Способ по п. 22, отличающийся тем, что указанным организмом является бактерия, грибок, растение или животное.
24. Способ получения растения с повышенной холодоустойчивостью, который включает (а) трансформацию растительной клетки выделенной нуклеиновой кислотой по п. 1 или 2 и (b) регенерацию указанного растения с повышенной холодоустойчивостью из указанных трансформированной растительной клетки.
25. Способ по п. 24, отличающийся тем, что указанным растением является подсолнечник, соя, кукуруза, табак, арахис, морковь или маслиничный рапс.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/366,779 US5614393A (en) | 1991-10-10 | 1994-12-30 | Production of γ-linolenic acid by a Δ6-desaturase |
| US08/366,779 | 1994-12-30 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU97112919A RU97112919A (ru) | 1999-06-20 |
| RU2181772C2 true RU2181772C2 (ru) | 2002-04-27 |
Family
ID=23444458
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU97112919/13A RU2181772C2 (ru) | 1994-12-30 | 1995-12-28 | Синтез гамма-линоленовой кислоты под действием дельта-6-десатуразы |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5614393A (ru) |
| EP (1) | EP0801680B1 (ru) |
| JP (2) | JP4422211B2 (ru) |
| CN (1) | CN1117864C (ru) |
| AR (1) | AR000582A1 (ru) |
| AU (1) | AU707061B2 (ru) |
| BR (1) | BR9510411A (ru) |
| CA (1) | CA2207906C (ru) |
| DE (1) | DE69535064T2 (ru) |
| ES (1) | ES2262146T3 (ru) |
| RO (1) | RO121387B1 (ru) |
| RU (1) | RU2181772C2 (ru) |
| UA (1) | UA61880C2 (ru) |
| WO (1) | WO1996021022A2 (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2469092C2 (ru) * | 2006-05-17 | 2012-12-10 | Е.И.Дюпон Де Немур Энд Компани | Дельта-5-десатураза и ее применение для получения полиненасыщенных жирных кислот |
| US10336789B2 (en) | 2013-08-07 | 2019-07-02 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Peptides capable of reactivating p53 mutants |
| US11230578B2 (en) | 2016-02-04 | 2022-01-25 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Peptides and use of same in the treatment of diseases, disorders or conditions associated with a mutant P53 |
Families Citing this family (103)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090077692A1 (en) * | 1991-10-10 | 2009-03-19 | Thomas Terry L | Production of gamma linolenic acid by a delta6-desaturase |
| US5614393A (en) * | 1991-10-10 | 1997-03-25 | Rhone-Poulenc Agrochimie | Production of γ-linolenic acid by a Δ6-desaturase |
| US20070130654A1 (en) * | 1991-10-10 | 2007-06-07 | Thomas Terry L | Production of gamma linolenic acid by a delta6-desaturase |
| US7109392B1 (en) | 1996-10-09 | 2006-09-19 | Cargill, Incorporated | Methods for increasing oleic acid content in seeds from transgenic plants containing a mutant delta 12 desaturase |
| US5959175A (en) * | 1997-04-09 | 1999-09-28 | Thomas; Terry L. | Sunflower albumin 5' regulatory region for the modification of plant seed lipid composition |
| US5977436A (en) * | 1997-04-09 | 1999-11-02 | Rhone Poulenc Agrochimie | Oleosin 5' regulatory region for the modification of plant seed lipid composition |
| US7745694B1 (en) | 1997-04-11 | 2010-06-29 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for synthesis of long chain polyunsaturated fatty acids in plants |
| US5972664A (en) * | 1997-04-11 | 1999-10-26 | Abbott Laboratories | Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids |
| AU720677B2 (en) * | 1997-04-11 | 2000-06-08 | Abbott Laboratories | Methods and compositions for synthesis of long chain polyunsaturated fatty acids in plants |
| US5968809A (en) * | 1997-04-11 | 1999-10-19 | Abbot Laboratories | Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids |
| US6051754A (en) * | 1997-04-11 | 2000-04-18 | Abbott Laboratories | Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids in plants |
| US6075183A (en) * | 1997-04-11 | 2000-06-13 | Abbott Laboratories | Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids in plants |
| US6100450A (en) * | 1997-10-22 | 2000-08-08 | Rhone-Poulenc Agrochimie | Seed specific promoters based on arabidopsis genes |
| GB9724783D0 (en) * | 1997-11-24 | 1998-01-21 | Inst Arable Crops Research | Novel polypeptides |
| AU761152B2 (en) * | 1998-03-17 | 2003-05-29 | Cargill Incorporated | Genes for mutant microsomal delta-12 fatty acid desaturases and related enzymes from plants |
| US6635806B1 (en) * | 1998-05-14 | 2003-10-21 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for expression of transgenes in plants |
| CA2329159A1 (en) * | 1998-05-29 | 1999-12-02 | Bruce Kelder | Compositions and methods for the synthesis of fatty acids, their derivatives and downstream products |
| EP1895009A1 (en) * | 1998-06-12 | 2008-03-05 | Calgene LLC | Polyunsaturated fatty acids in plants |
| DE19828850A1 (de) * | 1998-06-27 | 1999-12-30 | Gvs Ges Fuer Erwerb Und Verwer | Sphingolipid-Desaturase |
| CA2339084C (en) * | 1998-08-04 | 2013-01-08 | Cargill, Incorporated | Plant fatty acid desaturase promoters |
| AU1097900A (en) * | 1998-10-05 | 2000-04-26 | Abbott Laboratories | Delta 6 and delta 12 desaturases and modified fatty acid biosynthesis and products produced therefrom |
| CA2346006A1 (en) * | 1998-10-09 | 2000-04-20 | Merck & Co., Inc. | Delta 6 fatty acid desaturase |
| WO2000032790A2 (en) * | 1998-12-03 | 2000-06-08 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Membrane-bound desaturases |
| US6864077B1 (en) | 1998-12-03 | 2005-03-08 | Edgar B. Cahoon | Membrane-bound desaturases |
| US6825017B1 (en) | 1998-12-07 | 2004-11-30 | Washington State University Research Foundation | Desaturases and methods of using them for synthesis of polyunsaturated fatty acids |
| NZ512656A (en) * | 1998-12-07 | 2003-09-26 | Univ Washington | Desaturases and methods of using them for synthesis of polyunsaturated fatty acids |
| US8791327B2 (en) | 1998-12-07 | 2014-07-29 | Washington State University Research Foundation | Desaturases and methods of using them for synthesis of polyunsaturated fatty acids |
| AU3001400A (en) | 1999-02-26 | 2000-09-14 | Monsanto Company | Process for separating a triglyceride comprising a docosahexaenoic acid residue from a mixture of triglycerides |
| DE50013231D1 (de) * | 1999-06-07 | 2006-09-07 | Basf Plant Science Gmbh | Delta6-acetylenase und delta6-desaturase aus ceratodon purpureus |
| AU776417B2 (en) * | 1999-07-06 | 2004-09-09 | Basf Plant Science Gmbh | Plants expressing delta6-desaturase genes and oils from these plants containing pufas and method for producing unsaturated fatty acids |
| DE10030976A1 (de) | 2000-06-30 | 2002-01-10 | Basf Ag | DELTA6-Desaturasegene exprimierende Pflanzen und PUFAS enthaltende Öle aus diesen Pflanzen und ein Verfahren zur Herstellung ungesättigter Fettsäuren |
| AU6350300A (en) * | 1999-07-13 | 2001-01-30 | Dow Chemical Company, The | Method for chemical analysis of biological material |
| DE50015025D1 (de) * | 1999-09-10 | 2008-04-17 | Nutrinova Gmbh | Nukleinsäure aus tetrahymena kodierend fuer eine delta 6-desaturase, ihre herstellung und verwendung |
| CA2301158A1 (en) * | 2000-03-24 | 2001-09-24 | Stephen J. Allen | Screening methods for compounds useful for modulating lipid metabolism in disease |
| JP4071622B2 (ja) | 2000-09-28 | 2008-04-02 | バイオリジナル フード アンド サイエンス コーポレーション | 脂肪酸不飽和化酵素ファミリーのメンバーであるｆａｄ４、ｆａｄ５、ｆａｄ５−２およびｆａｄ６、ならびにそれらの使用方法 |
| DE10102337A1 (de) * | 2001-01-19 | 2002-07-25 | Basf Plant Science Gmbh | Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren, neue Biosynthesegene sowie neue pflanzliche Expressionskonstrukte |
| BR0306883A (pt) * | 2002-01-30 | 2004-12-07 | Basf Plant Science Gmbh | ácido nucléico isolado, sequências de ácido nucléico isolado e de aminoácido, construção de gene, vetor, organismo, processo para a produção de pufas, óleo, lipìdeo ou ácido graxo ou uma fração destes, composição de óleo, lipìdeo ou de ácido graxo, e, uso da mesma |
| US7211656B2 (en) * | 2002-01-30 | 2007-05-01 | Abbott Laboratories | Desaturase genes, enzymes encoded thereby, and uses thereof |
| GB2385852A (en) * | 2002-02-27 | 2003-09-03 | Rothamsted Ex Station | Delta 6-desaturases from Primulaceae |
| DE10219203A1 (de) | 2002-04-29 | 2003-11-13 | Basf Plant Science Gmbh | Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in Pflanzen |
| EP2216405A1 (en) | 2002-05-03 | 2010-08-11 | Monsanto Technology LLC | Speed specific USP promoters for expressing genes in plants |
| US7078234B2 (en) | 2002-12-18 | 2006-07-18 | Monsanto Technology Llc | Maize embryo-specific promoter compositions and methods for use thereof |
| ES2525212T3 (es) * | 2002-12-19 | 2014-12-19 | University Of Bristol | Procedimiento novedoso de producción de ácidos grasos poliinsaturados |
| ATE517984T1 (de) * | 2003-02-27 | 2011-08-15 | Basf Plant Science Gmbh | Verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren |
| CN1836045B (zh) | 2003-03-28 | 2012-05-09 | 孟山都技术有限公司 | 用于早期种子发育的新型植物启动子 |
| CA2868312A1 (en) | 2003-03-31 | 2004-10-14 | University Of Bristol | Novel plant acyltransferases specific for long-chained, multiply unsaturated fatty acids |
| EP1613744B1 (de) * | 2003-04-08 | 2015-09-09 | BASF Plant Science GmbH | Delta-4-desaturasen aus euglena gracilis, exprimierende pflanzen und pufa enthaltende öle |
| AU2003252958A1 (en) * | 2003-07-31 | 2005-02-25 | The University Of York | Fatty acid biosynthesis 3 |
| US11952581B2 (en) | 2003-08-01 | 2024-04-09 | Basf Plant Science Gmbh | Process for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms |
| PT2166069T (pt) * | 2003-08-01 | 2016-09-13 | Basf Plant Science Gmbh | Método de produção de ácidos gordos polinsaturados em organismos transgénicos |
| DK1656449T3 (da) | 2003-08-21 | 2009-06-02 | Monsanto Technology Llc | Fedtsyredesaturaser fra primula |
| CA2450000A1 (en) | 2003-12-18 | 2005-06-18 | Alberta Research Council Inc. | Method of creating plants with reduced level of saturated fatty acid in seed oil |
| JP4567047B2 (ja) | 2004-02-27 | 2010-10-20 | ビーエーエスエフ プラント サイエンス ゲーエムベーハー | トランスジェニック植物における多価不飽和脂肪酸の製造方法 |
| WO2005083053A2 (de) | 2004-02-27 | 2005-09-09 | Basf Plant Science Gmbh | Verfahren zur herstellung von ungesättigten omega-3-fettsäuren in transgenen organismen |
| US20050220901A1 (en) * | 2004-03-22 | 2005-10-06 | Huttenbauer Samuel Jr | Methods of pharmaceutical separation from plants |
| EP2902021B1 (en) | 2004-04-16 | 2018-11-14 | Monsanto Technology LLC | Expression of fatty acid desaturases in corn |
| ES2715640T3 (es) * | 2004-04-22 | 2019-06-05 | Commw Scient Ind Res Org | Síntesis de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga por células recombinantes |
| CN102559364B (zh) | 2004-04-22 | 2016-08-17 | 联邦科学技术研究组织 | 用重组细胞合成长链多不饱和脂肪酸 |
| US7364883B2 (en) | 2004-05-07 | 2008-04-29 | Yeastern Biotech Co., Ltd. | Process for producing poly-unsaturated fatty acids by oleaginous yeasts |
| EP1831025B1 (en) * | 2004-12-17 | 2008-05-07 | Agfa Graphics Nv | Ink circulation system for inkjet printing |
| DE102004063326A1 (de) * | 2004-12-23 | 2006-07-06 | Basf Plant Science Gmbh | Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in transgenen Organismen |
| EP1856264B1 (en) | 2005-02-26 | 2014-07-23 | BASF Plant Science GmbH | Expression cassettes for seed-preferential expression in plants |
| DE102005013779A1 (de) | 2005-03-22 | 2006-09-28 | Basf Plant Science Gmbh | Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten C20- und C22-Fettsäuren mit mindestens vier Doppelbindungen in transgenen Pflanzen |
| WO2006133983A1 (en) | 2005-04-19 | 2006-12-21 | Basf Plant Science Gmbh | Starchy-endosperm and/or germinating embryo-specific expression in mono-cotyledonous plants |
| US7902423B2 (en) | 2005-04-20 | 2011-03-08 | Basf Plant Science Gmbh | Expression cassettes for seed-preferential expression that utilize the promoter from a flax tonoplast intrinsic protein gene |
| CA2607263A1 (en) | 2005-05-10 | 2006-11-16 | Basf Plant Science Gmbh | Expression cassettes for seed-preferential expression in plants |
| EP1885862B1 (en) * | 2005-05-23 | 2015-07-29 | Arcadia Biosciences Inc. | Safflower with elevated gamma-linolenic acid |
| DE102005038036A1 (de) | 2005-08-09 | 2007-02-15 | Basf Plant Science Gmbh | Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure und/oder Eicosapentaensäure in transgenen Nutzpflanzen |
| GB2431158A (en) | 2005-10-13 | 2007-04-18 | Rothamsted Res Ltd | Process for the production of arachidonic and/or eicosapentaenoic acid |
| DE102005052551A1 (de) * | 2005-11-02 | 2007-05-16 | Rothamsted Res Harpenden | Verfahren zur Herstellung von y-Linolensäure und/oder Stearidonsäure in transgenen Brassicaceae und Linaceae |
| EP1806398A1 (en) * | 2006-01-04 | 2007-07-11 | Monsanto S.A.S. | Fad-2 mutants and high oleic plants |
| GB0603160D0 (en) | 2006-02-16 | 2006-03-29 | Rothamsted Res Ltd | Nucleic acid |
| AR059376A1 (es) | 2006-02-21 | 2008-03-26 | Basf Plant Science Gmbh | Procedimiento para la produccion de acidos grasos poliinsaturados |
| US8629195B2 (en) | 2006-04-08 | 2014-01-14 | Bayer Materialscience Ag | Production of polyurethane foams |
| PT2041275E (pt) | 2006-07-19 | 2011-08-18 | Monsanto Technology Llc | Dessaturases de ácidos gordos derivadas de tetraselmis suecica |
| WO2008022963A2 (en) * | 2006-08-24 | 2008-02-28 | Basf Plant Science Gmbh | Isolation and characterization of a novel pythium omega 3 desaturase with specificity to all omega 6 fatty acids longer than 18 carbon chains |
| EP2059588A4 (en) | 2006-08-29 | 2010-07-28 | Commw Scient Ind Res Org | FATTY ACID SYNTHESIS |
| CA2665336C (en) | 2006-10-06 | 2016-01-05 | Basf Plant Science Gmbh | Process for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms |
| AU2008214568B2 (en) | 2007-02-16 | 2013-04-18 | Basf Plant Science Gmbh | Nucleic acid sequences for regulation of embryo-specific expression in monocotyledonous plants |
| WO2009016208A2 (de) * | 2007-07-31 | 2009-02-05 | Basf Plant Science Gmbh | Elongasen und verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren in transgenen organismen |
| US20100263088A1 (en) * | 2007-12-14 | 2010-10-14 | Basf Plant Science Gmbh | Promoters From Brassica Napus For Seed Specific Gene Expression |
| EP2281051B1 (en) * | 2008-04-30 | 2015-03-11 | Rothamsted Research Limited | Desaturase and method for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms |
| EP2826864B1 (en) | 2008-07-01 | 2018-04-18 | BASF Plant Science GmbH | Promoters from Brassica napus for seed specific gene expression |
| DE112009002048T5 (de) | 2008-08-26 | 2012-01-26 | Basf Plant Science Gmbh | Nukleinsäure, die Desaturasen kodieren, und modifiziertes Planzenöl |
| JP6068800B2 (ja) | 2008-11-18 | 2017-01-25 | コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガナイゼーション | オメガ−３脂肪酸を産生するための酵素および方法 |
| PL2376638T3 (pl) | 2008-12-12 | 2014-01-31 | Basf Plant Science Gmbh | Desaturazy oraz sposób wytwarzania wielonienasyconych kwasów tłuszczowych w organizmach transgenicznych |
| CA2758824A1 (en) | 2009-04-17 | 2010-10-21 | Basf Plant Science Company Gmbh | Plant promoter operable in endosperm and uses thereof |
| CA2756146C (en) | 2009-04-22 | 2018-12-04 | Basf Plant Science Company Gmbh | Whole seed specific promoter |
| EP2821492A3 (en) | 2009-05-13 | 2015-04-08 | BASF Plant Science Company GmbH | Acyltransferases and uses thereof in fatty acid production |
| CA2766858A1 (en) | 2009-07-10 | 2011-01-13 | Basf Plant Science Company Gmbh | Expression cassettes for endosperm-specific expression in plants |
| CA3037072C (en) | 2009-07-17 | 2022-07-26 | Basf Plant Science Company Gmbh | Novel fatty acid desaturases and elongases and uses thereof |
| WO2011067712A1 (en) | 2009-12-03 | 2011-06-09 | Basf Plant Science Company Gmbh | Expression cassettes for embryo-specific expression in plants |
| NO2585603T3 (ru) | 2010-06-25 | 2018-05-19 | ||
| CN102250928A (zh) * | 2011-04-07 | 2011-11-23 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | Δ-6脂肪酸脱氢酶突变基因及其表达载体和应用 |
| ES2769448T3 (es) | 2012-04-12 | 2020-06-25 | Rothamsted Res Limited | Producción de ácidos grasos poliinsaturados omega-3 de cadena larga |
| CN104853596B (zh) | 2012-06-15 | 2018-10-09 | 联邦科学技术研究组织 | 在植物细胞中产生长链多不饱和脂肪酸 |
| KR101437605B1 (ko) * | 2012-06-29 | 2014-09-15 | 대한민국 | 형질 전환된 유채를 제조하는 방법 |
| GB201217524D0 (en) | 2012-10-01 | 2012-11-14 | Rothamsted Res Ltd | Recombinant organisms |
| KR102386838B1 (ko) | 2013-12-18 | 2022-04-15 | 커먼웰쓰 사이언티픽 앤 인더스트리알 리서치 오거니제이션 | 장쇄 다중불포화 지방산을 포함하는 지질 |
| CN105219789B (zh) | 2014-06-27 | 2023-04-07 | 联邦科学技术研究组织 | 包含二十二碳五烯酸的提取的植物脂质 |
| FR3053052B1 (fr) | 2016-06-28 | 2021-02-12 | Fermentalg | Microalgue modifiee pour une production enrichie en tag |
| CN112048460B (zh) * | 2020-08-07 | 2023-06-16 | 中国科学院水生生物研究所 | 工程化细鞘丝藻及其生产gla的应用 |
| GB2629695A (en) * | 2021-12-16 | 2024-11-06 | Bioriginal Food & Science Corp | Plants with enhanced gamma linolenic acid production |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4736866B1 (en) * | 1984-06-22 | 1988-04-12 | Transgenic non-human mammals | |
| NZ221259A (en) * | 1986-07-31 | 1990-05-28 | Calgene Inc | Seed specific transcriptional regulation |
| BR9007159A (pt) * | 1989-02-24 | 1991-12-10 | Monsanto Co | Genes sinteticos de plantas e processo para a preparacao dos mesmos |
| US5260379A (en) * | 1991-09-13 | 1993-11-09 | Eastman Kodak Company | Polyester blends with improved processability |
| PH31293A (en) * | 1991-10-10 | 1998-07-06 | Rhone Poulenc Agrochimie | Production of y-linolenic acid by a delta6-desaturage. |
| US5614393A (en) * | 1991-10-10 | 1997-03-25 | Rhone-Poulenc Agrochimie | Production of γ-linolenic acid by a Δ6-desaturase |
| WO1994018337A1 (en) * | 1993-02-05 | 1994-08-18 | Monsanto Company | Altered linolenic and linoleic acid content in plants |
-
1994
- 1994-12-30 US US08/366,779 patent/US5614393A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-12-28 RU RU97112919/13A patent/RU2181772C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-12-28 WO PCT/IB1995/001167 patent/WO1996021022A2/en active IP Right Grant
- 1995-12-28 ES ES95944464T patent/ES2262146T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-28 RO RO97-01202A patent/RO121387B1/ro unknown
- 1995-12-28 DE DE69535064T patent/DE69535064T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-28 UA UA97063197A patent/UA61880C2/uk unknown
- 1995-12-28 JP JP52082796A patent/JP4422211B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1995-12-28 AR AR33486195A patent/AR000582A1/es active IP Right Grant
- 1995-12-28 CA CA002207906A patent/CA2207906C/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-28 AU AU46735/96A patent/AU707061B2/en not_active Ceased
- 1995-12-28 BR BR9510411A patent/BR9510411A/pt not_active IP Right Cessation
- 1995-12-28 EP EP95944464A patent/EP0801680B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-28 CN CN95197728A patent/CN1117864C/zh not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-01-28 US US08/789,936 patent/US5789220A/en not_active Expired - Lifetime
-
2007
- 2007-08-01 JP JP2007201265A patent/JP2007330267A/ja not_active Withdrawn
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| СОЯ. М.: Колос, 1984. * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2469092C2 (ru) * | 2006-05-17 | 2012-12-10 | Е.И.Дюпон Де Немур Энд Компани | Дельта-5-десатураза и ее применение для получения полиненасыщенных жирных кислот |
| US10336789B2 (en) | 2013-08-07 | 2019-07-02 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Peptides capable of reactivating p53 mutants |
| RU2693487C2 (ru) * | 2013-08-07 | 2019-07-03 | Йеда Ресеарч Энд Девелопмент Ко. Лтд. | Пептиды, способные реактивировать мутанты р53 |
| US10550152B2 (en) | 2013-08-07 | 2020-02-04 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Peptides capable of reactivating p53 mutants |
| RU2721423C2 (ru) * | 2013-08-07 | 2020-05-19 | Йеда Ресеарч Энд Девелопмент Ко. Лтд. | Пептиды, способные реактивировать мутанты р53 |
| US11028127B2 (en) | 2013-08-07 | 2021-06-08 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Peptides capable of reactivating p53 mutants |
| US11230578B2 (en) | 2016-02-04 | 2022-01-25 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Peptides and use of same in the treatment of diseases, disorders or conditions associated with a mutant P53 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5614393A (en) | 1997-03-25 |
| AU707061B2 (en) | 1999-07-01 |
| JPH10511848A (ja) | 1998-11-17 |
| WO1996021022A3 (en) | 1996-09-12 |
| RO121387B1 (ro) | 2007-04-30 |
| JP2007330267A (ja) | 2007-12-27 |
| DE69535064D1 (de) | 2006-07-27 |
| JP4422211B2 (ja) | 2010-02-24 |
| ES2262146T3 (es) | 2006-11-16 |
| CA2207906C (en) | 2009-12-01 |
| EP0801680A2 (en) | 1997-10-22 |
| AR000582A1 (es) | 1997-07-10 |
| AU4673596A (en) | 1996-07-24 |
| DE69535064T2 (de) | 2006-12-07 |
| BR9510411A (pt) | 1998-05-19 |
| WO1996021022A2 (en) | 1996-07-11 |
| CN1177379A (zh) | 1998-03-25 |
| EP0801680B1 (en) | 2006-06-14 |
| CN1117864C (zh) | 2003-08-13 |
| CA2207906A1 (en) | 1996-07-11 |
| US5789220A (en) | 1998-08-04 |
| UA61880C2 (en) | 2003-12-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2181772C2 (ru) | Синтез гамма-линоленовой кислоты под действием дельта-6-десатуразы | |
| US5663068A (en) | Cyanobacterial Δ6-desaturase | |
| US7189894B2 (en) | Production of gamma linolenic acid by a Δ6-desaturase | |
| EP1206558B1 (en) | Plants with modified polyunsaturated fatty acids | |
| US6495738B1 (en) | Modification of fatty acid composition in plants by expression of a fungal acyl-CoA desaturase | |
| US20020042933A1 (en) | Omega-3 fatty acid desaturase | |
| US7282623B2 (en) | Production of gamma linolenic acid by a Δ 6-desaturase | |
| US20070130654A1 (en) | Production of gamma linolenic acid by a delta6-desaturase | |
| US20090077692A1 (en) | Production of gamma linolenic acid by a delta6-desaturase | |
| CA2816177C (en) | Desaturase introns and method of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids | |
| EP1908843A1 (en) | Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20101116 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20131229 |