RU2096460C1 - Способ получения s-(+)-2,2-диметилциклопропанкарбоксамида, штаммы бактерий comamonas acidovorans, pseudomonas sp., bacterium sp., предназначенные для получения s-(+)-2,2-диметилциклопропанкарбоксамида (варианты) - Google Patents
Способ получения s-(+)-2,2-диметилциклопропанкарбоксамида, штаммы бактерий comamonas acidovorans, pseudomonas sp., bacterium sp., предназначенные для получения s-(+)-2,2-диметилциклопропанкарбоксамида (варианты) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2096460C1 RU2096460C1 SU925010867A SU5010867A RU2096460C1 RU 2096460 C1 RU2096460 C1 RU 2096460C1 SU 925010867 A SU925010867 A SU 925010867A SU 5010867 A SU5010867 A SU 5010867A RU 2096460 C1 RU2096460 C1 RU 2096460C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dmcpca
- bacteria
- dsm
- preparing
- dimethylcyclopropanecarboxamide
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
- C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/38—Pseudomonas
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/874—Pseudomonas
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
Использование: биотехнология. Сущность изобретения: описывается новый микробиологический способ получения S-(+)-2,2-диметилциклопропанкарбоксамида. Для этого способа селекционированы и выделены новые микроорганизмы, которые способны в рацемическом 2,2-диметилциклопропанкарбоксамиде R-(-)-2,2-диметилциклопропанкарбоксамид биотрансформировать в R-(-)-2,2-диметилциклопропанкарбоновую кислоту. Этот способ затем можно осуществлять либо с помощью этих микроорганизмов, либо с помощью бесклеточных ферментов из этих микроорганизмов. 5 с. и 6 з.п. ф-лы, 10 табл.
Description
Изобретение относится к области биотрансформации, в частности к новому способу получения оптически активного S-(+)-2,2-диметилциклопропанкарбоксамида, причем в рацемическом R,S-(±-2,2-диметилциклопропанкарбоксамиде R-(-)-2,2-диметилциклопропанкарбоксамид биотрансформируется в R-(-)-2,2-диметилциклопропанкарбоновую кислоту, и при этом выделяется желательный S-(+)-2,2-диметилциклопропанкарбоксамид.
В последующем 2,2-диметилциклопропанкарбоксамид сокращенно обозначается как 2,2-ДМЦПКА, а 2,2-диметилциклопропанкарбоновая кислота как 2,2-ДМЦПКК.
Оптически чистый S-(+)-2,2-ДМЦПКА служит в качестве исходного материала для получения ингибитора дегидропептидазы циластатина, который в терапии используется вместе с антибиотиками по-немногу, соответственно карбопенемного типа, чтобы препятствовать дезактивации антибиотиков в почках благодаря ренальной дегидропептидазе (см. европейский патент 048301).
До сих пор известны только химические способы получения S-(+)-2,2-ДМЦПКА. Эти способы имеют тот недостаток, что они дорогостоящие и протекают через несколько стадий (европейский патент 155779).
Задача настоящего изобретения состояла в том, чтобы разработать биотехнологический способ, с помощью которого, исходя из легко получающегося рацемического R, S-(±)-2,2-ДМЦПКА, в одну стадию можно получать желательный изомер высокой чистоты.
Эта задача решается с помощью нового способа и с помощью новых штаммов бактерий.
Предлагаемые согласно изобретению бактерии способны в рацемическом R, S-(±)-2,2-ДМЦПКА биотрансформировать R-(-)-2,2-ДМЦПКА в R-(-)-2,2-ДМЦПКК, причем выделяется оптически активный S-(+)-2,2-ДМЦПКА.
Эти бактерии можно выделять, например, из почвенных проб, ила или сточных вод при помощи традиционных микробиологических способов.
Для получения S-(+)-2,2-ДМЦПКА можно применять все бактерии, которые используют в качестве субстрата R-(-)-ДМЦПКА.
Их получают по следующему селекционному методу:
а) бактерии, которые используют в качестве N-источника 2,2-ДМЦПКА, в виде рацемата или его оптических изомеров и в присутствии C-источника, выращивают обычным образом;
б) из выращенных культур затем отбирают те, которые стабильны и используют 2,2-ДМЦПКА в виде рацемата или его оптических изомеров в качестве единственного источника азота.
а) бактерии, которые используют в качестве N-источника 2,2-ДМЦПКА, в виде рацемата или его оптических изомеров и в присутствии C-источника, выращивают обычным образом;
б) из выращенных культур затем отбирают те, которые стабильны и используют 2,2-ДМЦПКА в виде рацемата или его оптических изомеров в качестве единственного источника азота.
Целесообразно проводить селекцию бактерий, которые акцептируют R-(-)-2,2-ДМЦПКА в качестве N-источника.
В качестве C-источника бактерии могут использовать, например, сахар, сахароспирты, карбоновые кислоты или спирты. Из сахаров можно использовать, например, фруктозу или глюкозу. Из сахароспиртов эритрит, маннит или сорбит. В качестве карбоновых кислот можно применять моно-, ди- или трикарбоновые кислоты, как, например, уксусная кислота, малоновая кислота или лимонная кислота. В качестве спиртов одно-двух- или трехатомные спирты, как, например, этанол, гликоли или глицерин. Предпочтительно в качестве C-источника используется трехатомный спирт глицерин.
Целесообразно, чтобы C/N соотношение в селекционной среде находилось в области 5:1 10:1.
В качестве селекционной среды можно использовать известные в мире специалистов среды для отбора, например среда с минеральными солями, описанная у Kulla et al. Arch. Microbiol. 135, 1 7, 1983.
Предпочтительными бактериями, которые растут с помощью рацемата 2,2-ДМЦПКА или его оптических изомеров, в качестве N-источника и в присутствии C-источника, являются:
Comamonas acidovorans A: 18 (DSM N 6315), Comamonas acidovorans TG 308 (DSM N 6552), Pseudomonas sp. NSAK:42 (DSM N 6433) и бактерии Bacterium sp. VIII: II (DSM N 6316) (Corynebacterium aquaticum), а также их потомки и мутанты.
Comamonas acidovorans A: 18 (DSM N 6315), Comamonas acidovorans TG 308 (DSM N 6552), Pseudomonas sp. NSAK:42 (DSM N 6433) и бактерии Bacterium sp. VIII: II (DSM N 6316) (Corynebacterium aquaticum), а также их потомки и мутанты.
Штаммы DSM NN 6315 и 6316 с 29.1.1991, штамм DSM N 6433 с 25.3.1991 и штамм DSM N 6552 с 6.4.1991 хранятся в немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур ГмбХ, Mascherodeweg 1B, D-330, Braunschweig.
Научное описание Comamonas acidovorans A:18 (DSM N 6315).
Бактерия Comamonas acidovorans A:18 (DSM N 6315) имеет типичные для бактерий рода Comamonas признаки, а именно является грам-отрицательной; морфологические признаки: форма клеток в виде палочек с полярными жгутиками, культуральные признаки: рост при 37oC, а также другие признаки: в качестве субстрата использует ацетат, адипат и капрат.
Табл. 1 10 поясняют изобретение.
API 20NE _→ Cs.acidovorans 99,0%
Научное описание Comamonas acidovorans TG 308 (DSM N 6552):
Бактерия Comamonas acidovorans TG 308 (DSM N 6552) имеет типичные для микроорганизмов рода Comamonas признаки, а именно является грам-отрицательной; морфологические признаки: форма клеток в виде палочек; культуральные признаки: оптимальный рост при температуре 37oC, а также другие признаки: способность к понижению нитрата и ассимиляции глюконата.
Научное описание Comamonas acidovorans TG 308 (DSM N 6552):
Бактерия Comamonas acidovorans TG 308 (DSM N 6552) имеет типичные для микроорганизмов рода Comamonas признаки, а именно является грам-отрицательной; морфологические признаки: форма клеток в виде палочек; культуральные признаки: оптимальный рост при температуре 37oC, а также другие признаки: способность к понижению нитрата и ассимиляции глюконата.
Научное описание Pseudomonas sp. NSAK:42 (DSM N 6433):
Бактерия Pseudomonas sp. NSAK (DSM N 6433) имеет типичные для микроорганизмов рода Pseudomonas признаки, является грам-отрицательной; морфологические признаки: форма клеток в виде палочек; культуральные признаки: оптимальный рост при температуре 37oC, а также другие признаки: в качестве субстрата использует гликолят, лактат или лавулинат.
Бактерия Pseudomonas sp. NSAK (DSM N 6433) имеет типичные для микроорганизмов рода Pseudomonas признаки, является грам-отрицательной; морфологические признаки: форма клеток в виде палочек; культуральные признаки: оптимальный рост при температуре 37oC, а также другие признаки: в качестве субстрата использует гликолят, лактат или лавулинат.
Научное описание Bacterium sp. VIII:II (Corynebacterium aquaticum) (DSM N 6316):
Микроорганизм Bacterium sp. VIII:II (Corynebacterium aquaticum) (DSM N 6316) имеет типичные для микроорганизмов рода Corynebacterium признаки, а именно является грам-положительным; морфологиеские признаки: неравномерные палочки; а также другие признаки: неполярные липиды.
Микроорганизм Bacterium sp. VIII:II (Corynebacterium aquaticum) (DSM N 6316) имеет типичные для микроорганизмов рода Corynebacterium признаки, а именно является грам-положительным; морфологиеские признаки: неравномерные палочки; а также другие признаки: неполярные липиды.
Дополнительные свойства штамма DSM 6316:
Характеристика: грам-положительные, неравномерные палочки, аэробный рост
Подвижность: +
Споры: -
Каталаза: +
Мезо-диаминопимелиновая кислота в стенке клеток: нет
Пептидогликан тип B2γ, [L-Dab] D-Glu-D-Dab
Полярные липиды: DPG, PG, G1, G2
Изопреноиды: МК-10 (28%), МК-11 (17%)
Основные компоненты в клеточных жирных кислотах: ai-15:0, ai-17:0, i-16: 0
Примечание: было произведено выделение фрагментов 16S pDHK. Результаты представлены в приложенной таблице. Согласно результатам штамм VIII-II однозначно относится к виду Corynebacterium aquaticum. Однако скорее всего речь идет о новом виде, который должен быть описан.
Характеристика: грам-положительные, неравномерные палочки, аэробный рост
Подвижность: +
Споры: -
Каталаза: +
Мезо-диаминопимелиновая кислота в стенке клеток: нет
Пептидогликан тип B2γ, [L-Dab] D-Glu-D-Dab
Полярные липиды: DPG, PG, G1, G2
Изопреноиды: МК-10 (28%), МК-11 (17%)
Основные компоненты в клеточных жирных кислотах: ai-15:0, ai-17:0, i-16: 0
Примечание: было произведено выделение фрагментов 16S pDHK. Результаты представлены в приложенной таблице. Согласно результатам штамм VIII-II однозначно относится к виду Corynebacterium aquaticum. Однако скорее всего речь идет о новом виде, который должен быть описан.
Сходство последовательности pDHK штамма DSM 6316 с другими актиномицетами, имеющими пептидогликан группы B (Group B-Peptidoglycan) (табл. 7).
Предкультура
Обычно по способу селекции получают среду для культивирования этих бактерий, которую затем инфицируют культурами этих бактерий.
Обычно по способу селекции получают среду для культивирования этих бактерий, которую затем инфицируют культурами этих бактерий.
Эту предкультуру можно выращивать (культивировать) в тех же самых средах, с таким же C/N-соотношением и с такими же соединениями в качестве C-источника, как и в способе селекции.
Предпочтительно среда для культивирования имеет либо состав, указанный в табл. 9, либо состав, который указан в табл. 10, с или без содержания универсального пептона.
В качестве N-источника для предкультуры можно применять следующие N-источники; предпочтительно в качестве N-источника используется соль аммония, как, например, сульфат аммония.
Целесообразно, чтобы pH при культивировании составляло 4 10 при температуре 20 40oC.
После культивирования, как правило, в течение 10 100 ч бактерии индуцируются и подготавливаются для биотрансформации.
Индукция
Обычно с помощью полученной культуры инфицируется индукционная среда, которая вплоть до N-источника имеет такой же состав, как и среда для культивирования.
Обычно с помощью полученной культуры инфицируется индукционная среда, которая вплоть до N-источника имеет такой же состав, как и среда для культивирования.
Целесообразно, чтобы среда для индукции содержала активные ферменты микроорганизмов 2,2-ДМЦПКА в виде рацемата или его оптических изомеров, которые могут служить как в качестве N-источника, так и в качестве индуктора ферментов.
Однако в качестве индукторов возможны также другие соединения, как, например, циклопропанкарбоксамид, капролактам, бензамид, циклогексан-карбоксамид, амид никотиновой кислоты или амид кротоновой кислоты. Индукцию осуществляют 0,05 0,15 мас. предпочтительно 0,1 0,15 мас. 2,2-ДМЦПКА в форме рацемата или его оптически активных изомеров. После обычной продолжительности индукции 15 18 ч бактерии можно выделять, например, путем центрифугирования или ультрафильтрации и затем снова суспендировать в среде, описанной в заявленном способе.
Биотрансформация
Собственно способ получения S-(+)-2,2-ДМЦПКА согласно изобретению осуществляется таким образом, что в рацемическом R,S-(±)-2,2-ДМЦПКА R-(-)-2,2-ДМЦПКА биотрансформируется в R-(-)-2,2-ДМЦПКК, причем выделяется оптически активный S-(+)-2,2-ДМЦПКА, и его изолируют.
Собственно способ получения S-(+)-2,2-ДМЦПКА согласно изобретению осуществляется таким образом, что в рацемическом R,S-(±)-2,2-ДМЦПКА R-(-)-2,2-ДМЦПКА биотрансформируется в R-(-)-2,2-ДМЦПКК, причем выделяется оптически активный S-(+)-2,2-ДМЦПКА, и его изолируют.
Рацемический R,S-(±)-2,2-ДМЦПКА можно получать, например, химически или ферментативно из нитрила R,S-(±)-2,2-диметилциклопропанкарбоновой кислоты.
Целесообразно осуществлять биотрансформацию либо с помощью бактерий, либо с помощью ферментов в несодержащей клеток системе.
Ферменты для бесклеточной системы можно получать путем обычного разрушения клеток бактерий. Для этой цели можно применять, например, ультразвуковой, French-Press- или лизоцимный методы. Эти бесклеточные ферменты затем можно иммобилизовать на пригодном носителе.
Для способа особенно пригодны бактерии вида Comamonas acidovorans A:18 (DSM N 6315), Comamonas acidovorans TG 308 (DSM N 6552), Pseudomonas sp. NSAK:42 (DSM N 6433) и вида Bacterium sp. VIII:II (Corynebacterium aquaticum) (DSM N 6316), их потомки и мутанты, а также другие бактерии, которые отбираются описанным здесь способом. Также пригодны ферменты из этих бактерий.
Предпочтительно способ осуществляется либо с находящимися в состоянии покоя клетками бактерий (не растущие клетки), которым не нужен никакой источник углерода и азота, либо с ферментами в бесклеточной системе, причем эти ферменты получаются как описано выше, например, путем разрушения индуцированных бактерий.
Целесообразно, чтобы среда содержала рацемический 2,2-ДМЦПКА в количестве 0,2 5 мас. предпочтительно 0,2 2 мас.
В качестве среды могут служить обычные среды, как, например, низкомолекулярный фосфатный буфер, вышеописанная среда с неорганическими солями или HEPES-буфер (N-2-гидроксиэтилпиперазин-2'-этансульфоновая кислота).
Предпочтительно способ осуществляется в низкомолекулярном фосфатном буфере.
Значение pH среды может быть в области 6 11, предпочтительно 6,5 10.
Целесообразно осуществлять биотрансформацию при температуре 15-55oC, предпочтительно при 20 40oC.
После обычной продолжительности превращения 1 30 ч, предпочтительно 5 -25 ч, R-(-)-2,2-ДМЦПКА полностью превращается в соответствующую кислоту, причем выделяется оптически чистый S-(+)-2,2-ДМЦПКА.
Таким образом, полученный S-(+)-2,2-ДМЦПКА затем можно изолировать, например, путем экстракции, электродиализа или благодаря высушиванию.
Пример 1
Изоляция и селекция бактерий с помощью R-(-)-2,2-ДМЦПКА-гидролазы
К размельченным образцам из почвы (1 г) добавляют изотонический раствор хлорида натрия (9 мл) и все оставляют стоять в течение примерно 5 мин. После этого надосадочную жидкость (0,5 мл) пересевают в среду с неорганической солью (25 мл) (Kulla et. al. Arch. Microbiol. 135, 1 7, 1983), которая содержит глицерин и R,S-(±)-ДМЦПКА в C/N-соотношении 5:1. Затем эту культуру инкубируют вплоть до образования смешанной культуры, которая может использовать R,S-(±)-2,2-ДМЦПКА в качестве N-источника.
Изоляция и селекция бактерий с помощью R-(-)-2,2-ДМЦПКА-гидролазы
К размельченным образцам из почвы (1 г) добавляют изотонический раствор хлорида натрия (9 мл) и все оставляют стоять в течение примерно 5 мин. После этого надосадочную жидкость (0,5 мл) пересевают в среду с неорганической солью (25 мл) (Kulla et. al. Arch. Microbiol. 135, 1 7, 1983), которая содержит глицерин и R,S-(±)-ДМЦПКА в C/N-соотношении 5:1. Затем эту культуру инкубируют вплоть до образования смешанной культуры, которая может использовать R,S-(±)-2,2-ДМЦПКА в качестве N-источника.
Чистые культуры этих бактерий получают при помощи традиционных микробиологических способов.
Полученные таким образом штаммы бактерий затем испытывают на их рост на агаровых пластинках на R,S-(±)-2,2-ДМЦПКА, S-(+)-2,2-ДМЦПКА и R-(-)-2,2-ДМЦПКА, чтобы исключить нежелательные штаммы, одинаково быстро растущие на обоих изомерах [R-(-)-2,2-ДМЦПКА и S-(+)-2,2-ДМЦПКА]
Остальные штаммы испытывают далее. Ими затем засевают среду для культивирования. Полученные в этой предкультуре бактерии переводят в среду из неорганических солей и после этого испытывают на их способность селективно использовать R-(-)-2,2-ДМЦПКА в качестве единственного N-источника, причем надосадочную жидкость исследуют с помощью GC на образование R-(-)-2,2-ДМЦПКК и на обогащение S-(+)-2,2-ДМЦПКК.
Остальные штаммы испытывают далее. Ими затем засевают среду для культивирования. Полученные в этой предкультуре бактерии переводят в среду из неорганических солей и после этого испытывают на их способность селективно использовать R-(-)-2,2-ДМЦПКА в качестве единственного N-источника, причем надосадочную жидкость исследуют с помощью GC на образование R-(-)-2,2-ДМЦПКК и на обогащение S-(+)-2,2-ДМЦПКК.
Пример 2
Определение активности R-(-)-2,2-ДМЦПКА-гидролазы
Для определения активности гидролазы в суспензии бактерий устанавливают оптическую плотность 0,5 при 650 нм. В качестве среды служит фосфатный буфер (10 ммоль), pH 7,0, с 0,2 мас. R,S-2,2-ДМЦПКА. Эту суспензию инкубируют в течение 3 ч при 30oC и при встряхивании. Выделившийся за счет гидролилазы NH4 + или R-(-)-2,2-ДМЦПКК измеряют и активность выражают в виде граммов превращенного R-(-)-2,2-ДМЦПКА (л/ч) оптическая плотность при 650 нм, предполагая, что 1а ммоль образовавшегося NH4 + равен 1 ммолю превращенного R-(-)-2,2-ДМЦПКА.
Определение активности R-(-)-2,2-ДМЦПКА-гидролазы
Для определения активности гидролазы в суспензии бактерий устанавливают оптическую плотность 0,5 при 650 нм. В качестве среды служит фосфатный буфер (10 ммоль), pH 7,0, с 0,2 мас. R,S-2,2-ДМЦПКА. Эту суспензию инкубируют в течение 3 ч при 30oC и при встряхивании. Выделившийся за счет гидролилазы NH4 + или R-(-)-2,2-ДМЦПКК измеряют и активность выражают в виде граммов превращенного R-(-)-2,2-ДМЦПКА (л/ч) оптическая плотность при 650 нм, предполагая, что 1а ммоль образовавшегося NH4 + равен 1 ммолю превращенного R-(-)-2,2-ДМЦПКА.
Пример 3
Получение S-(+)-2,2-ДМЦПКА
Comamonas acidovorans A:18 культивируют на агаровых пластинах в среде из неорганических солей, с глицерином в качестве C-источника и сульфатом аммония в качестве N-источника в течение 2 дней при 30oC. Состав этой среды из неорганических солей указан в табл. 10. С помощью этих, выращенных на агаровых пластинах бактерий засевают среду для культивирования такого же состава и инкубируют 2 дня при 30oC.
Получение S-(+)-2,2-ДМЦПКА
Comamonas acidovorans A:18 культивируют на агаровых пластинах в среде из неорганических солей, с глицерином в качестве C-источника и сульфатом аммония в качестве N-источника в течение 2 дней при 30oC. Состав этой среды из неорганических солей указан в табл. 10. С помощью этих, выращенных на агаровых пластинах бактерий засевают среду для культивирования такого же состава и инкубируют 2 дня при 30oC.
Такую же среду из неорганических солей с Na2SO4 вместо (NH4)2SO4 (100 мл), содержащую 0,2 мас. глицерина и 0,15 мас. R,S-(±)-2,2-ДМЦПКА, засевают с помощью 5 мл этой культуры для индукции и инкубируют в течение 45 ч при 30oC. Затем клетки собирают путем центрифугирования и обрабатывают 0,9%-ным раствором NaCl.
После суспендирования клеток в 10 мМ фосфатом буфере (800 мл), pH 7,0, устанавливают оптическую плотность при 650 нм, равную 1,3, и добавляют 2 мас. R, S-(±)-2,2-ДМЦПКА. После инкубирования в течение примерно 25 ч при 37oC R-(-)-2,2-ДМЦПКА полностью превращается в R-(-)-2,2-ДМЦПКК, что соответствует оптической чистоте (ее) 100% и аналитически измеренному выходу S-(+)-2,2-ДМЦПКА 46,7% За протеканием реакции следят, руководствуясь выделением NH4 + и GC-анализом надосадочной жидкости.
После отделения путем центрифугирования клеток в недосадочной жидкости устанавливают pH-значение 9,5 и продукт выделяют путем экстракции с помощью этилацетата.
Пример 4
Аналогичным образом, как и в примере 1, выделяют микроорганизм Bacterium sp. VIII:II (Corynebacterium aquaticum).
Аналогичным образом, как и в примере 1, выделяют микроорганизм Bacterium sp. VIII:II (Corynebacterium aquaticum).
Длительность предкультивирования в случае этих бактерий составляет 4 дня и продолжительность индукции 3 дня при прочих равных условиях, как в примере 3.
В противоположность примеру 3, биотрансформация этой бактерии осуществляется с помощью 0,2 мас. R,S-(±)-2,2-ДМЦПКА, причем активность гидролазы определялась до 0,13 г/л/ч/ОП650 нм.
Пример 5
Аналогичным образом, как и в примере 1, выделяют Pseudomonas sp. NSAK:42 (DSM N 6433). Длительность культивирования составляет 2 дня, продолжительность индукции составляет 18 ч, при прочих равных условиях, как в примере 3, за исключением того, что индукционная среда содержит 1 мас. глицерина (вместо 0,2 мас. ) и дополнительно еще 0,3 мас. универсального пептона (Merck).
Аналогичным образом, как и в примере 1, выделяют Pseudomonas sp. NSAK:42 (DSM N 6433). Длительность культивирования составляет 2 дня, продолжительность индукции составляет 18 ч, при прочих равных условиях, как в примере 3, за исключением того, что индукционная среда содержит 1 мас. глицерина (вместо 0,2 мас. ) и дополнительно еще 0,3 мас. универсального пептона (Merck).
Биотрансформация осуществляется с помощью 0,2 мас. R,S-(±)-2,2-ДМЦПКА, причем активность гидролазы определяется до 0,34 г/л/ч/ОП650 нм.
Пример 6
Comamonas acidovorans TG 308 (DSM N 6552) культивируют в течение 2 дней при 30oC в комплексной среде (4 мл) "Nutrient Broth" (Oxoid Ltd. Великобритания). С помощью этих бактерий засевают среду из неорганических солей (табл. 10) и инкубируют 2 дня при 30oC.
Comamonas acidovorans TG 308 (DSM N 6552) культивируют в течение 2 дней при 30oC в комплексной среде (4 мл) "Nutrient Broth" (Oxoid Ltd. Великобритания). С помощью этих бактерий засевают среду из неорганических солей (табл. 10) и инкубируют 2 дня при 30oC.
Затем собирают клетки соответственно примеру 3.
В противоположность примеру 3 биотрансформация осуществляется в 10 мМ HEPES-буфера (pH 7,0) с 0,5 мас. R,S-(±)-2,2-ДМЦПКА при прочих равных условиях, как и в примере 3.
После инкубации в течение 4,5 ч при 37oC R-(-)-2,2-ДМЦПКА полностью превращается в R-(-)-2,2-ДМЦПКК, что соответствует аналитически измеряемому выходу S-(+)-2,2-ДМЦПКА 45,5% и оптической чистоте (ее) 99,0%
Пример 7
Получение S-(+)-2,2-ДМЦПКА с помощью ферментов в несодержащей клеток (бесклеточной) системе
После индукции клетки Comamonas acidovorans A:18 концентрируют до оптической плотности при 650 нм 210 до 95 мл в HEPES-буфере (10 мМ, pH 7,0). Затем клетки разрушают French-процессом под давлением 1200 бар, двукратно, для того, чтобы получить несодержащий клеток ферментный экстракт, затем все центрифугируют при 20000 об/мин в течение 20 мин.
Пример 7
Получение S-(+)-2,2-ДМЦПКА с помощью ферментов в несодержащей клеток (бесклеточной) системе
После индукции клетки Comamonas acidovorans A:18 концентрируют до оптической плотности при 650 нм 210 до 95 мл в HEPES-буфере (10 мМ, pH 7,0). Затем клетки разрушают French-процессом под давлением 1200 бар, двукратно, для того, чтобы получить несодержащий клеток ферментный экстракт, затем все центрифугируют при 20000 об/мин в течение 20 мин.
В этом, не содержащем клеток ферментном экстракте определяют количество протеинов (измеряя по методу Бредфорда) до 39,3 мг протеина/мл.
Для определения активности этих, не содержащих клеток, ферментов 20 мкл (примерно 0,8 мг протеина) экстракта фермента обрабатывают (растворяют) в 4 мл фосфатного буфера (10 мМ, pH 7,0), содержащего 0,2 мас. R,S-(±)-2,2-ДМЦПКА, и инкубируют при 30oC. При этом в несодержащем клеток экстракте 2,5 г R-(-)-2,2-ДМЦПКА/ч/г протеина (3,64 мкмоль/мин/г протеина) превращается в соответствующую кислоту.
Пример 8
Получение S-(+)-2,2-ДМЦПКА с помощью иммобилизированных клеток
После индукции (соответственно примеру 3) собирают клетки Comamonas acidovorans A: 18. Эти клетки иммобилизуют благодаря обработке полиэтиленимином с глутаровым альдегидом (соответственно патенту Чехословакии 251111). Иммобилизированный биокатализатор имеет активность 1,6 мкмоль/мин•г сухого веса. Сухой вес биокатализатора соответствует 32% мокрого веса.
Получение S-(+)-2,2-ДМЦПКА с помощью иммобилизированных клеток
После индукции (соответственно примеру 3) собирают клетки Comamonas acidovorans A: 18. Эти клетки иммобилизуют благодаря обработке полиэтиленимином с глутаровым альдегидом (соответственно патенту Чехословакии 251111). Иммобилизированный биокатализатор имеет активность 1,6 мкмоль/мин•г сухого веса. Сухой вес биокатализатора соответствует 32% мокрого веса.
Затем биокатализатор (с 55 г мокрого веса) суспендируют в 800 мл борной кислоты (10 мМ, pH 9,0) с 16 г R,S-(±)-2,2-ДМЦПКА.
После времени инкубации 68,8 ч при 37oC и при скорости перемешивания 200 об/мин R-(-)-2,2-ДМЦПКА полностью превращается в R-(-)-2,2-ДМЦПКК, что соответствует оптической чистоте (ее) 98,2% и аналитически измеряемому выходу S-(+)-2,2-ДМЦПКА 40%
Claims (11)
1. Способ получения S-(+)-2,2-диметилциклопропанкарбоксамида, отличающийся тем, что рацемический R,S-(±)-2,2-диметилциклопропанкарбоксамид вводят во взаимодействие с бактериями, использующими в качестве субстрата R-(-)-диметилциклокарбоксамид, или гидролитическим ферментом, выделенным из бактерий, до получения R-(-)-2,2-диметилциклопропанкарбоновой кислоты и оптически активного S-(+)-2,2-диметилциклопропанкарбоксамида с его последующим выделением.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что взаимодействие осуществляют в среде, содержащей рацемический 2,2-диметилциклопропанкарбоксамид в количестве 0,2 5 мас.
3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что взаимодействие осуществляют при значении pH 6 11 и при температуре 15 55oС.
4. Способ по пп. 1 3, отличающийся тем, что в качестве микроорганизма используют штамм бактерий Comamonas acidovorans DSM N 6315.
5. Способ по пп. 1 3, отличающийся тем, что в качестве микроорганизма используют штамм бактерий Comamonas acidovorans DSM N 6552.
6. Способ по пп. 1 3, отличающийся тем, что в качестве микроорганизма используют штамм бактерий Pseudomonas sp. DSM N 6433.
7. Способ по пп. 1 3, отличающийся тем, что в качестве микроорганизма используют штамм бактерий Bacterium sp. (Corynebacterium aquaticum) DSM N 6316.
8. Штамм бактерий Comamonas acidovoraus DSM N 6315, предназначенный для получения S-(+)-2,2-диметилциклопропанкарбоксамида.
9. Штамм бактерий Comamonas acidovorans DSM N 6552, предназначенный для получения S-(+)-2,2-диметилциклопропанкарбоксамида.
10. Штамм бактерий Pseudomonas sp. DSM N 6433, предназначенный для получения S-(+)-2,2-диметилциклопропанкарбоксамида.
11. Штамм бактерий Bacterium sp. (Corynebacterium aquaticum) DSM N 6316, предназначенный для получения S-(+)-2,2-диметилциклопропанкарбоксамида.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH67891 | 1991-03-06 | ||
| CH678/91 | 1991-03-06 | ||
| CH1854/91 | 1991-06-24 | ||
| CH185491 | 1991-06-24 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2096460C1 true RU2096460C1 (ru) | 1997-11-20 |
Family
ID=25685343
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU925010867A RU2096460C1 (ru) | 1991-03-06 | 1992-01-30 | Способ получения s-(+)-2,2-диметилциклопропанкарбоксамида, штаммы бактерий comamonas acidovorans, pseudomonas sp., bacterium sp., предназначенные для получения s-(+)-2,2-диметилциклопропанкарбоксамида (варианты) |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5273903A (ru) |
| EP (1) | EP0502525B1 (ru) |
| JP (1) | JP3249566B2 (ru) |
| AT (1) | ATE139800T1 (ru) |
| CA (1) | CA2062281C (ru) |
| CZ (1) | CZ279306B6 (ru) |
| DE (1) | DE59206633D1 (ru) |
| DK (1) | DK0502525T3 (ru) |
| ES (1) | ES2088512T3 (ru) |
| HU (1) | HU214125B (ru) |
| IE (1) | IE74179B1 (ru) |
| IL (1) | IL101129A (ru) |
| MX (1) | MX9200910A (ru) |
| PL (1) | PL168885B1 (ru) |
| RO (1) | RO113663B1 (ru) |
| RU (1) | RU2096460C1 (ru) |
| SK (1) | SK279053B6 (ru) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE172248T1 (de) * | 1991-07-26 | 1998-10-15 | Lonza Ag | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von s-(+)-2,2-dimethylcyclopropancarboxamid mittels mikroorganismen |
| KR100441137B1 (ko) * | 2001-11-22 | 2004-07-21 | 동국제약 주식회사 | 키랄 2,2-디메틸시클로프로판카르복실의 유도체의 제조방법 |
| KR100511534B1 (ko) * | 2002-07-05 | 2005-08-31 | 임광민 | 아미드 화합물의 새로운 제조방법 |
| DE10260456A1 (de) * | 2002-12-18 | 2004-07-08 | Ufz-Umweltforschungszentrum Leipzig-Halle Gmbh | Mutanten des Bakterienstammes Delftia acidovorans MC1 und deren Verwendung zur Produktion von hochreinen R-Enantiomeren von 2-Phenoxypropionsäure-Derivaten |
| CN100345974C (zh) * | 2005-11-24 | 2007-10-31 | 浙江工业大学 | S－(+)－2,2－二甲基环丙甲酰胺的微生物制备方法 |
| KR100650797B1 (ko) | 2005-12-12 | 2006-11-27 | (주)케미코월드 | 광학활성 사이클로프로판 카복사미드의 제조방법 |
| KR100654923B1 (ko) | 2005-12-15 | 2006-12-06 | (주)씨엘에스랩 | 고순도의 광학활성아미드를 연속적으로 제조하는 방법 |
| CN100547067C (zh) * | 2007-08-10 | 2009-10-07 | 浙江工业大学 | 表皮短杆菌zjb-07021及其在制备(s)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺中的应用 |
| CN111621541A (zh) * | 2019-02-27 | 2020-09-04 | 上海艾美晶生物科技有限公司 | 使用电渗析技术拆分光学异构体的方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2511867A (en) * | 1949-12-19 | 1950-06-20 | Method fob separating enantiomers | |
| EP0048301A1 (en) * | 1980-09-24 | 1982-03-31 | Merck & Co. Inc. | 2-(Cyclopropane-carboxamido)-2-alkenoic acids, their esters and salts, and antibacterial compositions comprising the same and a thienamycin-type compound |
| DE3569725D1 (en) * | 1984-02-28 | 1989-06-01 | Sumitomo Chemical Co | A method for the optical purification of an optically active 2,2-dimethylcyclopropanecarboxylic acid amide |
| WO1987006269A1 (en) * | 1986-04-16 | 1987-10-22 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Process for preparing optically active cyclopropanecarboxylic acids |
-
1992
- 1992-01-30 RU SU925010867A patent/RU2096460C1/ru active
- 1992-03-02 IE IE920669A patent/IE74179B1/en not_active IP Right Cessation
- 1992-03-03 US US07/845,034 patent/US5273903A/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-03 MX MX9200910A patent/MX9200910A/es unknown
- 1992-03-03 IL IL10112992A patent/IL101129A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-03-04 CA CA002062281A patent/CA2062281C/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-03-05 PL PL92293716A patent/PL168885B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1992-03-05 AT AT92103780T patent/ATE139800T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-03-05 ES ES92103780T patent/ES2088512T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-05 RO RO92-200261A patent/RO113663B1/ro unknown
- 1992-03-05 HU HU9200744A patent/HU214125B/hu not_active IP Right Cessation
- 1992-03-05 DE DE59206633T patent/DE59206633D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-03-05 CZ CS92662A patent/CZ279306B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-03-05 EP EP92103780A patent/EP0502525B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-05 DK DK92103780.0T patent/DK0502525T3/da active
- 1992-03-05 SK SK662-92A patent/SK279053B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1992-03-06 JP JP04999792A patent/JP3249566B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1992-10-28 US US07/969,713 patent/US5360731A/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| EP, заявка, 0048301, кл. C 07 C 149/243, 1985. EP, заявка, 0155779, кл. C 07 C 103/19, 1986. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0502525A1 (de) | 1992-09-09 |
| HUT64587A (en) | 1994-01-28 |
| DK0502525T3 (da) | 1996-07-29 |
| MX9200910A (es) | 1994-03-31 |
| EP0502525B1 (de) | 1996-06-26 |
| HU214125B (en) | 1997-12-29 |
| PL293716A1 (en) | 1992-12-28 |
| ES2088512T3 (es) | 1996-08-16 |
| CA2062281A1 (en) | 1992-09-07 |
| CS66292A3 (en) | 1992-09-16 |
| US5273903A (en) | 1993-12-28 |
| RO113663B1 (ro) | 1998-09-30 |
| PL168885B1 (pl) | 1996-04-30 |
| DE59206633D1 (de) | 1996-08-01 |
| SK279053B6 (sk) | 1998-06-03 |
| US5360731A (en) | 1994-11-01 |
| HU9200744D0 (en) | 1992-05-28 |
| CA2062281C (en) | 2000-07-11 |
| IL101129A0 (en) | 1992-11-15 |
| JP3249566B2 (ja) | 2002-01-21 |
| IE74179B1 (en) | 1997-07-16 |
| IL101129A (en) | 1996-05-14 |
| CZ279306B6 (cs) | 1995-04-12 |
| JPH0576391A (ja) | 1993-03-30 |
| ATE139800T1 (de) | 1996-07-15 |
| IE920669A1 (en) | 1992-09-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SU1512488A3 (ru) | Способ получени амида | |
| RU2053300C1 (ru) | Штамм бактерий rhodococcus rhodochrous - продуцент нитрилгидратазы | |
| JPS5982090A (ja) | ガンマ−デカラクトンの製造方法 | |
| RU2096460C1 (ru) | Способ получения s-(+)-2,2-диметилциклопропанкарбоксамида, штаммы бактерий comamonas acidovorans, pseudomonas sp., bacterium sp., предназначенные для получения s-(+)-2,2-диметилциклопропанкарбоксамида (варианты) | |
| JP2793812B2 (ja) | イブプロフェンの製造方法 | |
| CS224624B2 (en) | Method for producing 2,5-diketo-d-gluconic acid or its salts | |
| JPH066069B2 (ja) | （十）‐トランス‐シクロプロパンカルボン酸の製造方法 | |
| JP3694065B2 (ja) | 環状Ｓ−α−アミノカルボン酸およびＲ−α−アミノカルボキサミドの生物工学的製造方法 | |
| DE69738080T2 (de) | Biokatalysatoren mit amin-acylase aktivität | |
| JPH04304892A (ja) | グリシンの生物学的製造法 | |
| JP2698936B2 (ja) | Ｒ（‐）―マンデル酸誘導体の製造法 | |
| US5206162A (en) | Process for making D-aminoacylase | |
| KR880002315B1 (ko) | 히아론산과 스트렙토 키나제를 동시에 생산하기 위한 스트렙토코커스속 미생물의 배양방법 | |
| KR100260837B1 (ko) | 광학활성 카본산 및 그 거울상 이성체 에스테르의 제조방법 | |
| SU1449581A1 (ru) | Штамм бактерий ALcaLIGeNeS paRaDoxUS - продуцент катехол-1,2-оксигеназы | |
| US4416987A (en) | Method of synthesizing proteins from methanol | |
| RU2179582C2 (ru) | Питательная среда для выделения патогенных энтеробактерий | |
| Plachý et al. | Production of L-aspartic acid from fumaric acid by Alcaligenes metalcaligenes CCEB 312 | |
| JPH08507683A (ja) | エステラーゼおよびバイオトランスフォーメーションにこれを使用する方法 | |
| SU1310427A1 (ru) | Штамм @ @ ВКМ В-1458-продуцент лизин-2-монооксигеназы | |
| SU1151217A3 (ru) | Способ получени холестеринэстеразы | |
| RU2157841C1 (ru) | Штамм бактерий aсetobacter pasterianus абз-2 гкм визр n 102 для окисления углеводородов нефти и нефтепродуктов | |
| SU1161551A1 (ru) | Штамм @ @ 2-82-продуцент пектат-лиазы | |
| SU960256A1 (ru) | Штамм eRWINIa саRотоVоRа МЛ-1-продуцент транс-элиминазы | |
| SU767196A1 (ru) | Способ выращивани продуцентов литических ферментов |