JPH08507683A - エステラーゼおよびバイオトランスフォーメーションにこれを使用する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 オフィオストマ（Ophiostoma）種またはセラトシスティス（Ceratocystis）種の微生物、または該微生物より得られる酵素活性を有する物質を、バイオトランスフォーメーション反応において、酸またはアルコールのひとつのエナンチオマーを、そのエステルであるエナンチオマー混合物より得るための立体特異的試薬として使用する方法。

Description

【発明の詳細な説明】 エステラーゼおよびバイオトランスフォーメーションにこれを使用する方法発明の分野 本発明はエステラーゼおよびバイオトランスフォーメーション（biotransfor- mation）におけるその使用法に関する。発明の背景 多くの化合物はキラルであるが、通常の化学合成において得られるそのラセミ 体から実質的に純粋なエナンチオマーを得ることが望まれる場合が多い。かかる キラルな化合物には様々な２-アリールプロピオン酸を含み、これらは抗炎症剤 としてよく知られている。例えばイブプロフェン、ナプロキセンおよびケトプロ フェンが挙げられる。現在ではこれらの治療効果は（Ｓ）-エナンチオマーに起 因することが証明されている。 （Ｒ）-エナンチオマーを含まない（Ｓ）-エナンチオマーを得る方法がいくつ か知られている。これらの方法には非対称キラル合成およびさまざまなキラルア ミンとともに作成したジアステレオマー塩の化学量結晶によるような化学分割法 を含む。 これらとは異なるアプローチには生触媒を２-アリールプロピオン酸の選択的 加水分解に用いる、生触媒法がある。正しい立体特異性を認識し得る生触媒を用 いれば、一方のエナンチオマーの未反応エステルと、もう一方のエナンチオマー の酸生成物が反応混合物として得られる。生成物の分離と回収は、比較的容易で ある。未反応エステルはラセミ化してさらなる反応に使用することができ、これ によってラセミ体である基質をほとんど完全に要求される単一のエナンチオマー 生成物へと転換することができる。 ＥＰ-Ａ-０２２７０７８は、いくつかの市販の微生物の細胞外リパーゼを、か かる生触媒による分割に使用する方法を開示する。一般に、しかしながら多くの 酵素が必要とされ、反応には２〜６日間かかる。かかる反応はしたがって高くつ く。最も好ましい酵素粉であると同定されたのは、カンディダ・シリンドラセア エ（Candida cylindraceae）（カンディダ・ルゴーサ（Candida rugosa）とも言 われる）である；しかしながら、ＥＰ-Ａ-０４０７０３３には、この試料は低い 活性しか有さないことおよび、複数のエステラーゼ活性を有する酵素を含有して いたことが示されている。さらに、ケトプロフェンを高いｅｅにて得ようとする には、この試料を精製する必要があった。 ＥＰ-Ａ-０２３３６５６はエステラーゼ遺伝子をバチルス・タイ（Bacillus t hai ）から単離、精製することを開示する。この酵素はナプロキセンおよびイブ プロフェンのエチルおよびメチルエステルを選択的に加水分解して、それぞれの 化合物の（Ｓ）-酸とする。この酵素のクローニングによって酵素の副活性が少 なくなり、高いｅｅの生成物が得られる。 ＷＯ-Ａ-９３２３５４７はナプロキセンエステルを選択的に加水分解するエス テラーゼを産生するいくつかの株を開示する。最も適した株はゾフィーラ・ラテ ィプス（Zopfiella latipes）であり、このエステラーゼからエステラーゼをク ローン化している。 ＷＯ-Ａ-９３１４１８９はトリコスポロン種（Trichosporon sp.）の微生物を 開示する。これはエチルケトプロフェンの（Ｓ）-エナンチオマーを選択的に加 水分解して、（Ｓ）-酸生成物を９０％以上のｅｅにて産生する。このバイオト ランスフォーメーションを司る酵素は細胞内酵素である。セルフリー状態で安定 な酵素を得ることは困難なことが示されている、遺伝子クローニングまたは古典 的な変異誘発によって生触媒の活性を増加させるのは困難である。 経済的なバイオトランスフォーメーションにとっては、酵素のコストを下げる ことが重要であり、このためにクローニング法を用いるべきである。ＥＰ-Ａ-０ ２３３６５６において、野生型バチルス内エステラーゼの特異的な比活性は非常 に低かった；したがって、この酵素をクローニングし、高度に発現させたとして も生触媒のコストは依然として高いものである。 本発明の目的は、エステルに対して良好な活性を示し、高いｅｅの酸生成物を もたらし、そしてクローニングおよび、例えば大腸菌内に高度に発現させるのに 適しており、このため触媒のコストを最小に抑えることのできる生触媒を提供す ることである。発明の要旨 驚くべきことに、様々なソースから取った微生物のスクリーニングによって、 アスコミセート（ascomycete）のオフィオストマ・ノボーウルミ（Ophiostoma n ovo -ulmi）（セラトシスティス・ウルミ（Ceratocystis ulmi）とも呼ばれる） が所望の活性を有する細胞内加水分解酵素を産生することがわかった。さらなる 試験によって、この酵素はＷＯ-Ａ-９３１４１８９とは異なり安定なセルフリー 活性が得られることが示され、このためクローニングおよびセルフリーのバイオ トランスフォーメーションに好適に用いられることがわかった。オフィオストマ ・ノボ-ウルミはドイツ楡病を引き起こす植物の病原菌として知られている。こ れはオフォストマ・ウルミの毒性の少ない株に非常に近く、およびオフィオスト マ・ピセア（O.piceae）にも類似していることが知られている。 本発明の基礎となる発明の後、立体特異的エステラーゼ活性がオフィストマ・ ウルミ（セラトシスティス・ウルミ（Ceratocystis ulmi）とも呼ばれる）内お よびオフィオストマ・ピセア（同様にセラトシスティス・ピセア（Ceratocystis piceae）とも呼ばれる）内のオフィオストマ・ノボ-ウルミ以外の株、および米 国、ヨーロッパ、中東およびウズベキスタン内のさまざまな場所から集めた単離 物内に存在することが認められた。さらに、イギリス、サリー、エグハムのＩＭ Ｉからセラトシスティス種の他の株を得、活性のスクリーニングを行った。その 結果活性が発見されたのは、セラトシスティス・コロナタ（C．coronata）（例 えばIMI 176533）、セラトシスティス・イプス（C．ips）（例えばIMI 212114） 、セラトシスティス・テトロッピ（C．tetroppi）（例えばIMI 212117）、セラ トシスティス・カイニー（C.cainii）（例えばIMI 176523）、セラトシスティス ・アルボレア（C．arborea）（例えばIMI 176529）およびセラトシスティス・ス テノセラス（C．stenoceras）（例えばIMI 268494）であった。これより、世界 中の様々な場所から幅広く集めて来た別のセラトシスティス株に幅広く活性が発 現しているようである。 最初に単離した株をスクリーニングしたものをＡＪ３と名付けた。この株をブ ダペスト条約の下、ＩＭＩへ１９９３年２月１５日に寄託し、ＩＭＩ３５６０５ ０の識別番号を得た。この株は立体特異的な活性の良好な例となる；しかしなが ら、様々な関連株の広い範囲に活性が認められるため、本発明の範囲はこの特定 の微生物株に限定されない。本発明はまた、かかる微生物からいずれかの適当な 方法により単離される酵素活性の使用法に関する。活性は例えば酵素それ自身、 または活性配列を有する融合タンパク質として入手できる。発明の説明 本発明は、オフィオストマ種の微生物、およびナプロキセンのごとき２-アリ ールアルカノイックアシッドエチルエステルのラセミ体を立体特異的に加水分解 させて、実質的に（Ｓ）-エナンチオマー豊富な、例えば９３〜９６％またはそ れ以上のエナンチオマー過剰である酸を得、（Ｒ）-エナンチオマーの豊富なエ ステルを残させるのに用い得る該微生物の酵素活性に関する。 他の基質にはアルコール官能基がキラルである化合物を含む。例えば２-メト キシシクロヘキサノールとアルカノイックアシッドとのエステルである。本発明 の新規なエステラーゼはこのように広範囲に適用できるが、いずれかの基質に適 用した場合のその効果は簡単な試験で調べることができる。基質の性質に基づい て、（Ｒ）-または（Ｓ）-酸もしくはアルコールエナンチオマーが（Ｓ）-もし くは（Ｒ）-残存エステルとの混合物としてそれぞれ得られる。 反応は該エステルのエナンチオマーがどのような比率で混合された混合物であ っても成し得るが、通常はラセミ体の混合物である。反応は好ましくはｐＨ８〜 １１、より好ましくはｐＨ９.５〜１０.５、最も好ましくは約ｐＨ１０.０にて 行う。溶媒としては例えばシクロヘキサンのごとき有機溶媒を用いればよい。 開示された生触媒は、エナンチオマー純度の高いキラルなアルコール、酸また はエステル類を製造するのに好適に用いられる。標準的な化学的操作を所望の生 成物を単離、分取し、可能な場合には不要なエナンチオマーを再利用するために ラセミ化するのに用いればよい。バイオトランスフォーメーションによって生成 する酸またはアルコールが所望の立体化学特性を有する場合には、通常５０％以 下が転換した時点でバイオトランスフォーメーションを止めて、加水分解生成物 の最大エナンチオマー純度を確保する。残存するエステルが所望の立体化学特性 を有する場合には、バイオトランスフォーメーションを転換が５０％以上となる ように行う。実際、基質のエステルに対し入手し得る生触媒が低いエナンチオマ ー特異性しか有さないものである場合、一般に不要である方の立体構造を有する エステルを優先的に加水分解する生触媒を選択して、残存エステルを所望の生成 物として回収するのが好ましい。この方法によれば、バイオトランスフォーメー ションの採用によって得られるエステル生成物のエナンチオマー過剰度（enanti omeric excess）（ee）を、５０％以上変換することによって上げることができ る。かかる方法は当業者に知られているが、通常使用されているものと反対の立 体特異性を有する生触媒を用いることにより、明らかな利点がある。実施例３に 示したように、本発明に開示したエステラーゼは好ましい立体特異的活性を有す るばかりでなく、広い範囲の市販の酵素に対して反対の特異性を示す。 本発明は加水分解反応を触媒する非固定化生触媒に関して開示してきた。しか しながら、バイオトランスフォーメーションをここに記載したエステラーゼのご とき加水分解酵素を用いて行うには、当業者に知られている多くの代替方法があ る。即ち、現在ではいずれかの方法によって酵素を固定化することによりいくら かの経済的利益が得られる場合のあることが確立されており、酵素の回収、再利 用に有用であり、ある場合には安定性が良好になる。低い水位の反応条件下にお いても同様に、かかる生体酵素を合成、エステル交換またはエステル内反応に用 いることができる。この考え方は、従来からの方法の開発と最適化のための手法 である。 以下の実施例により発明を説明する。実施例１ 以下の培地を用いて生物を増殖させた： （NH₄）₂SO₄（g/l） 0.5 MgSO₄・7H₂O（g/l） 0.25 CaCl₂・2H₂O（g/l） 0.1 KH₂PO₄（g/l） 8.0 イースト抽出液（g/l） 10.0 グルコース（g/l） 5.0 痕跡性元素溶液（μl/1） 100 ｐＨ（NaOHであわせる） 6.5 使用した痕跡性元素溶液の組成は以下の通りである： CaCl₂・2H₂O（g/l） 3.57 ZnO（g/l） 2.0 CuCl₂・2H₂O（g/l） 0.85 Na₂MoO₄・2H₂O（g/l） 4.8 MnCl₂・4H₂O（g/l） 2.0 FeCl₃・6H₂O（g/l） 5.4 H₃BO₄（g/l） 0.3 CoCl₂・6H₂O（g/l） 2.4 HCl（ml/l） 250 ＡＪ３細胞を１リットル容の振とうフラスコ内の培地１００ｍｌへ接種した。 この培養物を３０℃で４８時間、振とうしながら増殖させた。その後１０ｍｌの 培養物を、１リットル容の振とうフラスコ内の９０ｍｌの新たな培地へ移し、こ のフラスコ内容物をさらに８時間、３０℃で振とう培養した。このフラスコ内容 物を５ｇ/ｌのグルコースおよび０.５ｍｌ/ｌのシリコーン/ＰＰＧベース-抗起 泡剤（ＸＦＯ３７１、イワンホー・ケミカルズ、アメリカ合衆国イリノイ州）を 添加した１.５リットルの培地を投入した２.８リットル容の研究用発酵槽へ接種 した。この発酵槽を４８時間、攪拌および通気をしながら、ＤＯＴ＞５０％空気 飽和を維持し、温度を３０℃、ｐＨを６.０にそれぞれ調整しつつ稼働させた。 発酵の完了時に細胞を遠心分離により回収し、細胞のペレットを１０％ｗ/ｖ （細胞湿重量に対して）となるように溶菌緩衝液、すなわち０.１Ｍの炭酸ナト リウムの５％トリトンＸ-１００水溶液に再懸濁した。溶菌は８℃にて一晩振と うしながら行い、その後酵素活性を有する溶菌液を遠心分離によって細胞残渣か ら分取した。分析をはじめる前に溶菌液を溶菌緩衝液にて５０％に希釈した。 エチルナプロキセン（エチル６-メトキシ-α-メチル-２-ナフタレンアセテー ト）のラセミ体を１９ｍｇ/ｍｌとなるよう、シクロヘキサンヘ溶解した。この 溶液２ｍｌを５ｍｌの調製した粗酵素溶液とガラス製バイアル内で混合し、２３ ℃にて７２時間振とうしながら反応させた。 ７２時間後、反応混合物の水相を分析したところナプロキセンの蓄積量が２. ７６ｍｇ/ｍｌであり、約４０％が変換された量であった。ナプロキセンのエナ ンチオマー純度をＨＰＬＣ分析により調べたところ、（Ｓ）-エナンチオマーに ついて９３％のｅｅ（エナンチオマー過剰）であることが認められた（純度９６ .５％に匹敵する）。実施例２ この実施例は立体特異的エステラーゼをＡＪ３からの単離物からクローニング する方法およびその生成物の使用法を説明する。ポリ（Ａ）⁺ｍ-ＲＮＡの単離 フィルターを通したＡＪ３菌糸体１０ｇを液体窒素の元で細かい粉末へと砕い た。全ゲノムＲＮＡを菌糸体の粉砕物より、酸グアニジニウムチオシアネート- フェノール-クロロホルム抽出法によって単離した（詳細はコムクディンスキー とサッチ（Chomczynski & Sacchi）のアナル・バイオケム（Anal．Biochem.）16 2 :156-159（1987）に記載されている）。この方法によって８.７６ｍｇ/ｍｌの 全ゲノムＲＮＡが得られ、２６０：２８０ｎｍ比は１.７０４であった。 ポリ（Ａ）⁺ｍ-ＲＮＡを全ゲノムＲＮＡよりオリゴ（ｄＴ）-セルロースを用 いたアフィニティークロマトグラフィーにより単離した（詳細はサンブルック（ Sambrook）ら、「モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル 」第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（1989年） 参照）。詳しくは、０.５ｇのオリゴ（ｄＴ）-セルロースを１０ｍｌの０.１Ｍ ＮａＯＨ内に再懸濁させ、得られたスラリー１ｍｌを２.５ｍｌの滅菌使い捨 てシリンジ筒へ注入した。封入された土台の体積を0.８ｍｌとした。１０.５ｍ ｇの全ゲノムＲＮＡを平衡化したオリゴ（ｄＴ）-セルロースへと結合させた。 ゲノムＲＮＡをこのカラムより、過剰の体積のカラム用バッファーにて溶出させ た。進行を分光 化学の手法によってモニターすべく、溶出物を２６０ｎｍで分析した。２６０ｎ ｍで検出し得る吸収が認められなくなった時点でポリ（Ａ）⁺を適当な溶出バッ ファーで溶出させた。溶出の進行は分光化学によってモニターした。試料を集め 、オリゴ（ｄＴ）-セルロースカラムヘ再度かけ、溶出を再び行った。最終試料 には８５μｇ/ｍｌの高純度ポリ（Ａ）⁺ｍ-ＲＮＡが含まれていた。ｃ-ＤＮＡライブラリーの調製 ｃ-ＤＮＡライブラリーはＺＡＰ-ｃＤＮＡ合成キット（ストラタジェン・リミ テッド、アメリカ合衆国カリフォルニア、ラ・ジョラ）を用いて構築した。８. ５μｇのポリ（Ａ）⁺ｍ-ＲＮＡを用いて操作を開始した。第１および第２の合成 の効率をオートラジオグラフィーによって分析した。セファクリルＳ-４００を 用いたスピンカラムゲル濾過クロマトグラフィーに続いて、大きさで分けられた ｃ-ＤＮＡ試料をエチジウムブロミド-注入アガロースにて定量した；１０ｎｇ/ μｌを越える値が測定された。高分子量のｃ-ＤＮＡ試料をｕｎｉ-ＺＡＰ ＸＲ ベクター内につなぎ、次いで大腸菌ＸＬ１-ブルーＭＲＦ'内へギガパック１１パ ッケージング・エキストラクツ（ストラタジェン・リミテッド）を用いてパッケ ージした。得られたｃ-ＤＮＡライブラリーの力価は、１.６３×１０¹⁰プラーク 形成ユニット（ｐｆｕ）/ｍｌであった。ｃ-ＤＮＡライブラリーのエステラーゼ活性スクリーニング １５０ｍｍＮＺＹ寒天プレート上で培養した場合、大腸菌ＸＬＩ-ブルーＭＲ Ｆ'に対して５０,０００ｐｆｕを得るのに十分な組換えファージを用いた。１. ２×１０⁶個の組換えファージを誘導条件下（例えば２.５ｍＭのＩＰＴＧ存在下 ）において変異させた。エステラーゼ活性を有するファージを０.１％（ｗ/ｖ） Ｓ（＋）ケトプロフェンエチルエステル含有アガロースの上掛け（over lay）を 用いてスクリーニングした。エステラーゼ活性はほとんど水に溶けないエチルエ ステルが水溶性ケトプロフェン酸に転化することによって示される。一晩、２４ ℃にてインキュベーションしたところ、８個の不連続なクリアランスゾーンが認 められた。このクリアランスゾーンに関係しているプラークを抜き取り、当該箇 所のファージを回収した。エステラーゼ陽性ファージを、大腸菌ＸＬ１-ブルー Ｍ ＲＦ'内で再度増幅させ、力価を測定し、エステラーゼ活性のスクリーニングを 、基質上掛け法およびＨＰＬＣを用いて行った。Ｕｎｉ-Ｚａｐ-ＸＲからの組換えｐ-ブルースクリプトのインビボ切り出し Ｕｎｉ-Ｚａｐ-ＸＲベクター内に位置している組換えｐ-ブルースクリプトフ ァージミドを、エクスアシスト（ExAssist）/ＳＯＬＲシステム（ストラタジェ ン・リミテッド）を用いて切り出した。６２個の組換えファージミドを切り出し 、大腸菌ＳＯＬＲ内に安定に受け継がせた。これらの組換え大腸菌のすべてにつ いて、基質上掛け法を用いてエステラーゼ活性を調べ、陽性であることを確認し た。コロニーの直径に対する基質クリアランスゾーンの直径の比較によって、株 番号４７および６２がさらなる研究の対象として重要であることが判明し、これ らをそれそれＣＳ４７およびＣＳ６２と名付けた。組換えプラスミドの制限酵素地図 ４００ｍｌのＬＢ＋アンピシリン（５０μｇ/ｍｌ）培地にて培養した組換え 大腸菌ＸＬ１-ブルーＭＲＦ'の株ＣＳ４７およびＣＳ６２を増殖させた。プラス ミド（それぞれｐＣＳ４７およびｐＣＳ６２と名付けた）をホルムズとキングレ イ（Holmes & Quingley）のアナル・バイオケム114:193（1981））の方法によっ てこれらの株から調製し、ＣｓＣｌ-エチジウムブロマイド密度勾配による超遠 心によって精製した。これらのプラスミドを、市販の様々な制限酵素を用い、そ れぞれの販売者の条件に基づいて消化した。フラグメントの大きさをアガロース ゲル電気泳動によって評価し、異なるアガロース濃度のゲルを用いてフラグメン トの大きさを確認した。制限消化の結果を図１に示した。５'末端においてｐＣ Ｓ４７がｐＣＳ６２より約２００塩基対分短いことは特筆すべきことである。組換え株の増殖 組換えＣＳ６２株を、１リットルの振とうフラスコに入れた５０μｇ/ｍｌの アンピシリンを含有するＬＢ培地１００ｍｌ内へ接種した。これを１５時間、３ ７℃、３００ｒｐｍにて振とうしなから（オービタル・シェイカー、行程２５ｍ ｍ）インキュベートした。次いで、２.８リットル容の実験用発酵槽へ入れた１. ５リットルの培地内へこの培養物を１％接種した。培地には以下の組成のものを 用いた： トリプトン（ユニパス・リミテッド（Unipath Ltd.）、英国ハンプシャー ） 12.0g/l イースト抽出物（ユニパス・リミテッド） 24.0g/l グリセロール 4.0ml/l KH₂PO₄ 2.3g/l K₂HPO₄・3H₂O 16.4g/l 温度を２５℃に保ち、１０％リン酸を必要に応じて自動的に添加してｐＨを７ に保ち、攪拌の調節によって溶解酸素張力が飽和空気量の５０％以上となるよう にした。０.７５リットル/分の通気速度を用いた。菌の増殖は、培養物を適当に 希釈した試料の５２０ｎｍにおける吸収の、ブランク培地の吸収に対する比によ ってモニターした。吸収比が０.９となったとき、ＩＰＴＧ（イソプロピル-β- チオガラクトシド）を２４０μｇ/ｍｌとなるように添加した。 ２４時間発酵槽内で増殖させた後、細胞を遠心分離によって回収し、使用時ま で−２０℃で保存した。組換え株の使用 上述のごとく増殖させ、保存しているＣＳ６２の細胞を用いてエチルナプロキ センの加水分解に使用するための酵素を得た。細胞を１０％（ｗ/ｖ）となるよ う０.１Ｍの炭酸ナトリウム（ｐＨ１０）内へ再懸濁し、４℃の条件下、１０分 間の超音波処理（１０秒間オン、１０秒間オフのサイクル）にて溶菌させた。酵 素を含む溶菌物を次いで遠心分離してセルフリー上清液を得た。 エチルナプロキセンのラセミ体をシクロヘキサンへ、濃度が１００ｇ/ｌとな るように溶解した。この溶液２００μｌを１ｍｌの酵素溶液に加え、１時間、２ ５℃にて振とうした。相を分離し、水相を分析してナプロキセンの蓄積を調べた （逆相ＨＰＬＣによる）。ナプロキセン５.３ｇ/ｌ（約２６％の変換）が蓄積さ れているのが認められた。分析によって（Ｓ）-エナンチオマーに対してｅｅが ９５％以上であることがわかった（（Ｒ）-エナンチオマーは少なすぎて測定不 可能であった）。 大腸菌ＳＯＬＲ（宿主、非組換え株）からの酵素抽出物を用いるバイオトラン スフォーメーションの分析では、エステルに対する活性が認められなかった。実施例３ 細胞（実施例２のごとく増殖させた細胞）を５％（ｗ/ｖ）となるよう、１０ ０ｍＭトリス（ｐＨ８）へ再懸濁し、振幅２０μｍの超音波処理（１０秒間オン 、１０秒間オフのサイクル）をソニプレップ１５０（Soniprep 150）を用いて１ ５分間かけて溶菌させた。溶菌物の遠心分離により細胞の残滓を除き、上清をバ イオトランスフォーメーションに用いた。 １０ｇの２-メトキシシクロヘキサノールのブチレートエステルのラセミ体を １００ｍｌの１００ｍＭトリス（ｐＨ８）内へ投入し、マグネチックスターラー にて攪拌した。上記ＣＳ６２の溶液２０ｍｌをここへ添加した。バイオトランス フォーメーションの温度を２５℃に調整し、ｐＨを１ＭのＮａＯＨによって８. ０に調整した。試料を取り、２-メトキシシクロヘキサノールの生成をモニター した。試料１ｍｌにＮａＣｌを飽和濃度となるよう添加し、次いで１×５体積の トルエン内へ抽出した。トルエン層を取り、ＭｇＳＯ₄を添加して乾燥させた。 次いで試料をＧＣにて分析した。０.２５μｍのフィルムを有する１５ｍＤＢ-５ カラムを用い、ヘリウムを担体として５５.２ＫＰａ、オーブン温度１分目６０ ℃、１５０℃まで１０℃/分の速度で上昇、その後は１５０℃の温度を保つ条件 下で分析を行った。 得られた２-メトキシシクロヘキサノールのｅｅを、トリフルオロ酢酸無水物 （ＴＦＡＡ）による誘導体化に続いて測定した。２０μｌのＴＦＡＡを１ｍｌの トルエン抽出試料へ添加し、これを室温で３０分間静置した。ジアステレオマー を３０ｍのＧＴＡカラム（キラルデックス（Chraldex））、９６ｋＰａ、ヘリウ ム担体およびオーブン温度１００℃を用いたＧＣにて分割した。 ４１時間の反応後、基質の４４％が変換しており、２-メトキシシクロヘキサ ノールの（Ｓ）-エナンチオマーに関するｅｅは９６％であった。 本発明の生触媒の立体特異的活性はめったに無いものである考えられる。１２ 個の市販のリパーゼ/エステラーゼを上記の基質に試してみたところ、いずれも （Ｓ）-エナンチオマーに対するかかる特異性を示さなかった。ブタ膵臓リパー ゼ、リゾフス・アールヒジウス（Rizopus arrhizius）、リゾフス・デルマール （Rizopus delemar）、ムコール・ミエハイ（Mucor miehei）、アスペルギルス ・ニガー（Aspergillus niger）、ペニシリウム・シクロピウム（Penicillium c yclopium ）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）か ら得られる市販のリパーゼ/エステラーゼはすべて（Ｒ）-エナンチオマーに対し て特異性を有したが、カンディダ・シリンドラカエ（Candida cylindracae）、 ムコール・ジャワニクス（Mucor javanicus）およびコレステロールエステラー ゼは立体特異性を示さなかった。ペニシリン・ルージェフォーチ（Penicillin r oguefortii ）およびカンディダ・リポリティカ（Candida lipolytica）から得ら れる他の試料は、２-メトキシシクロヘキサノールのブチレートエステルのラセ ミ体の分割に対して活性が非常に少なかった。従って上述の触媒については（Ｓ ）-エナンチオマーの加水分解に高い特異性を有するものは無い。本発明の酵素 は、（Ｓ）-エナンチオマーをアルコールとして、基質を５０％以上変換をさせ ることなく得ることができるという点において、非常に有用である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/14 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 9/18 Ｃ１２Ｒ 1:645） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ウィズドム、リチャード・アンソニー イギリス、ケンブリッジシャー、シービー ４・４エヌピー、インピングトン、ステー ション・ロード79番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． オフィオストマ（Ophiostoma）種またはセラトシスティス（Ceratocyst is ）種の微生物、または該生物から誘導される酵素活性を有する物質を立体特異 的エステラーゼとして、（Ｓ）-ケトプロフェン以外のキラルな酸、アルコール またはエステルのエナンチオマーのひとつを、該酸およびアルコールから誘導さ れるエステルのエナンチオマー混合物から調製するために使用する方法。 ２．微生物または該物質が、エチルナプロキセンのラセミ体と立体選択的に反 応し、その１５〜２５％の変換した時点において（Ｓ）-ナプロキセンに関する エナンチオマー過剰度が少なくとも９３％である、請求項１記載の方法。 ３． 微生物がオフィオストマ・ノボーウルミ（Ophiostoma novo-ulmi）ＩＭ Ｉ３５６０５０から得られる性質を有する、請求項１または２記載の方法。 ４． エステルがケトプロフェン以外の２-アリールアルカノイックアシッド である、請求項１記載の方法。 ５． （Ｓ）-ナプロキセンをそのエチルエステルのラセミ体から製造するた めのものである、請求項４記載の方法。 ６． アルコールがキラルである、請求項１から３いずれかに記載の方法。 ７． 反応をｐＨ８から１１にて行う、請求項１から６いずれかに記載の方法 。 ８． 反応をｐＨ９.５から１０.５にて行う、請求項１から７いずれかに記載 の方法。 ９． ケトプロフェンのバイオトランスフォーメーション以外の用途に用いら れる、オフィオストマ・ノボーウルミ（Ophiostoma novo-ulmi）ＩＭＩ３５６０ ５０から得られる性質を有する微生物または、該微生物より誘導される立体選択 性エステラーゼ活性を有する物質。