PT94065B - Processo de producao de um acido nucleico conservado e de um receptor codificado pelo referido acido - Google Patents

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

Referência......Cruzada......a Pedidos......de.......Patente......relacionados presente pedido é uma continuação em parte dos pedidos de patente copendentes número de série 353 235, com o mesmo título e depositado em 16 de Maio de 1989 e número de série 353 241, com o mesmo título e depositado em 17 de Maio de 1989, cujas descrições são aqui incorporadas como referência.

Campo......da.......invenção presente invento refere-se a um processo para isolar um gene codificando um receptor possuindo uma actividade pré-seleccionada.

Antecedentes

Os fenómenos de ligação entre ligandos e receptores desempenham muitos papeis cruciais em sistemas biológicos. Exemplos destes fenómenos são, a ligação de moléculas de oxigénio à desoxi-hemoglobina, para formar a oxi-hemoglobina, e a ligação de um substrato a uma enzima, que actua no referido substrato, tal como a ligação entre uma proteína e uma protease, tal como a trípsína, Exemplos adicionais de fenómeηos de 1igação biológicos incluem, ainda, a ligação de um antigénio a um anticorpo e a ligação do componente de complemento C3 ao, assim chamado, receptor CRI.

Crê-se também que muitas drogas e outros agentes terapêuticos estão também dependentes de fenómenos de ligação. Por exemplo, referiu-se que os opiáceos, tais como a. morfina, se ligam a receptores específicos rio cérebro, Referiu-se que os agonistas e antagonistas de opiáceos competem com drogas, tais como a morfina, por esses sítios de ligação.

Os ligandos, como drogas produzidas pelo homem, tal como a morfina e os seus derivados, e os que estão'naturalmente presentes em sistemas biológicos, tais como as endorfinas e as hormonas, ligam-se a receptores que estão, naturalmente, presen.....

tes em sistemas biológicos e serão aqui tratados em conjunto. Esta ligação pode conduzir a um número de fenómenos biológicos, incluindo, particularmente, a hidrólise de ligações amida e éster, quando as proteínas são hidrolisadas nos polipéptidos constituintes por uma enzima, tal como a tripsina ou a papaina, ou quando uma gordura é clivada em glicerina e em três ácidos

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carboxílicos, respectivamente. Adicionalmente, esta ligação pode conduzir à formação de ligações amida e éster na formação de proteínas e de gorduras, bem como à formação de ligações carbono-carbono e carbono-azoto.

Um exemplo de um sistema produtor de receptores em vertebrados é o sistema imunológico. 0 sistema imunológico de um mamífero é um dos sistemas biológicos mais versáteis onde, se podem produzir, provavelmente, mais do que 1,0x10'' especificidades de receptor, na forma ds anticorpos. De facto, grande parte da pesquisa biológica e médica, contemporânea, é dirigida no sentido de identificar este reportório. Durante a última década, tem-se verificado um aumento dramático na capacidade de aproveitar os efeitos de um vasto reportório imunológico. 0 desenvolvimento da. metodologia do hibridoma, por Kohler e Milstein, tem tornado possível produzir anticorpos monoclonais, i.e., uma composição de moléculas de anticorpos de especificidade única a partir do repertório de anticorpos i nduz idos durante uma imuno-resposta.

Infelizmente, os métodos actuais para gerar anticorpos monoclonais não são capazes de pesquisar eficientemente toda a resposta de anticorpos induzida por um imunogénio particular. Num animal individual existem, pelo menos, 5-10000 clones de células B, diferentes, capazes de gerar anticorpos únicos, em relação a pequenos imunogénios relativamente rígidos, tais como, por exemplo, o dinitrofenol. Adicionalmente, devido ao processo ds mutação somática, que se verifica durante a geração da diversidade de anticorpos, pode ser gerado um número essencialmente ilimitado de moléculas de anticorpos únicos,. Em contraste com este vasto potencial para anticorpos diferentes, com as actuais metodologias de hibridoma obtêm-se apenas algumas centenas de anticorpos monoclonais, diferentes, por fusão,,

Outras dificuldades na produção de anticorpos monoclonais, com a metodologia do hibridoma, incluem a instabilidade genética e a baixa capacidade de produção de culturas de hibridoma,, Um dos meios pelo qual a arte tem tentado ultrapassar estes dois últimos problemas, tem sido clonar os genes produtores de imunoglobulina,

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de um hibridoma particular de interesse, num sistema de expressão procar iótico. Ve r, por exemplo, R o b i nson et al, Pub 1 icação PCT n2. W0 89/0099; Winter et al., Patente Europeia n2„ 0239400;

Reading, Patente dos E.U.A. nô. 4 714 681; e Cabilly et al., Patente Europeia nô. 0125023,

Verificou-se, recentemente, que o repertório imunológico dos vertebrados contém genes que codificam imunoglobulinas com a c t i v i d a d e catai í t i c a. Tramo n t ano et a 1., Sei»., 234:1566-1570 (1986); Pollack et al., Sei., 234:1570-1573 (1986); Janda et al., Sci_.„, 231-1188-Í191 (1988); e Janda et al., Sei.. , 244:437-440 (1989), A presença de, ou a capacidade de induzir o repertório a produzir, moléculas de anticorpos capazes de catalisar uma reacção química, i.e», de actuarem como enzimas, tinha sido, previamente, postulada, quase há 20 anos, por W. P, Jencks em Catalysls.......in......Chemistry and......Enzymo1ogy, McGraw-Hill, N.Y. (1969),

Crê-se que, uma das razões pela qual a arte não conseguiu •isolar, mais cedo, anticorpos catalíticos do reportório imunolõgico, e o facto de não conseguir isolar, até à data, muitos destes anticorpos, mesmo após as descobertas actuais, resulta da incapacidade de testar uma grande porção do reportório quando à actividade desejada. Crê-se que outra razão é a tendência das técnicas de ensaio actualmente disponíveis, tais como a técnica de hibridoma, em relação à produção de anticorpos de afinidade elevada concebidos para participação no processo de neutralização, em oposição à catálise,

Breve......sumário daInvenção presente invento proporciona um novo método para o ensaio de uma maior porção, de um reportório de genes conservados, codificando receptores, quanto à presença de receptores com uma actividade pré-seleccionada, do que tem, até agora, sido possível, ultrapassando deste modo os inconvenientes anteriorment© mencionados da técnica de hibridoma,.

Numa concretização sintetiza-se uma biblioteca de genes co nservados, cod i fi ca ndo receptores co ntendo uma por ção substancial do reportório de genes conservados, codificando

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-6receptores. Em concretizações preferidas, a biblioteca de genes conservados, codificando receptores , contém, pelo menos, cerca de 1CP, preferivelmente, pelo menos, cerca de 10^ e, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 10^b genes, codificando receptores, diferentes.

ft biblioteca de genes pode ser sintetizada por qualquer um de dois métodos, dependendo do material de partida.

Quando o material de partida é uma pluralidade de genes codificando receptores, o repertório é sujeito a duas reacções de extensão com iniciador, distintas. A primeira reacção de extensão com iniciador usa um primeiro iniciador de síntese de polinucleótido capaz de iniciar a primeira reacção, por hibridação com uma sequência de nucleótidos conservada (partilhada, por uma pluralidade de genes) no reportório. A extensão do primeiro iniciador produz complementos de homólogos, codificando receptores, conservados, diferentes (cadeias de ácido nucleico, comp1ementar dos genes ηo reportório).

A segunda reacção de extensão com iniciador produz, usando os complementos como modelo, uma pluralidade de homólogos de ADN conservados, codificando receptores, diferentes,. A segunda reacção de extensão com iniciador usa um segundo iniciador de síntese de polinucleótido que é capaz de iniciar a segunda reacção por hibridação com uma sequência de nucleótidos conservada entre uma pluralidade de complementos,.

Quando o material de partida ê urna pluralidade de c o i η p1emen tos dos genes conservados, codifica ndo receptores, sujeita-se o reportório à segunda reacção de extensão com iniciador, descrita acima,. Claro que, se estão presentes tanto um reportório de genes conservados codificando receptores, como os seus complementos, podem-se usar ambas as aproximações, em combinação.

Um homólogo de ADN conservado, codificando um receptor, i.e., um gene codificando um receptor capaz de se ligar a um ligando pré-seleccionado, é depois segregado da biblioteca, para produzir o gene isolado» Tipicamente, isto é realizado ligando

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-7operativamente, para expressão, uma pluralidade de homólogos de ADN conservados, diferentes, codificando um receptor, da biblioteca, a um vector de expressão. Os vectores de expressão de receptor assim produzidos, são introduzidos numa população de células hospedeiras compatíveis, i.e., células capazes de exprimir um gene ligado, operativamente, ao vector para expressão. Os transformantes são cultivados sob condições adequadas para a expressão do receptor codificado pelo homólogo de ADN codificando o receptor. Os transformantes são clonados e testados quando à expressão de um receptor que se liga a um ligando pré-seleccionado. Podem-se usar quaisquer dos métodos adequados, conhecidos na arte, para detectar a ligação de um ligando a um receptor. Um transformante exprimindo a actividade desejada é, depois, segregado da população para produzir o gene isolado.

Noutra concretização, o presente invento contempla uma biblioteca de genes compreendendo uma mistura isolada de, pelo menos, cerca de 10·^, preferivelmente, pelo menos, cerca de 10^ e, mais preferivelmente, pelo menos ÍO⁵ homólogos de ADN conservados, codificando receptores, uma pluralidade dos quais pai ti lha um determinante antigénico conservado. Preferivelmente, os homólogos estão presentes num meio adequado para manipulação in vitro, tal como· agua , solução salina tamponada com fosfato e semelhantes, que mantêm a actividade biológica dos homólogos.:

É também contemplado um receptor com uma actividade pré-seleccionada, preferivelmente, actividade catalítica, produzido por um processo do presente invento, preferivelmente, um monómero ou um dimero, tal como aqui se descreve..

Breve......descrição......dos_Desenhos

Nos desenhos, que constituem parte da presente descrição: Figura............1 Ilustra um diagrama esquemático da molécula de imunoglofoulina mostrando as principais características estruturais. A área, dentro dum círculo, na cadeia pesada representa a região variável (Vp), um polipeptido contendo uma porção biologicamente activa (ligação a ligando) dessa região e

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um gene codificando esse polipéptido, produzidos pelos processos do presente invento,, As sequências L03, L35, L47 e L48 não p u d e r a m s e r c 1 a s s i f i ca d a s e m q u a i s q u er s u b g r u p os p r e d e f i n i d o s,,

Figura............2 A É um esquema em diagrama de uma cadeia H da IgG humana (subclasse IgGl). A numeração é do terminal N, à esquerda, para o terminal C, à direita. iS de notar a presença de quatro domínios, contendo, cada um, uma ligação dissulfureto (S-S) intracadeia, englobando aproximadamente 60 resíduos aminoácidos. 0 símbolo CHO representa carbo-hidrato. A região V da cadeia pesada (H) (Vq) assemelha-se à região por possuir três CDR hipervariáveis (não mos tr ados).

Figura............2B É um esquema em diagrama de uma cadeia K humana (Painel 1). A numeração é do terminal N, à esquerda, para o terminal C, à. direita. É de notar a ligação dissulfureto (S-S) intracadeia, englobando, aproximadamente, o mesmo número de resíduos aminoácidos nos domínios V[_ e C| . 0 Painel 2 mostra as localizações das regiões determinantes da complementaridade (CDR) no domínio Vj_„ Os segmentos fora das CDR são os segmentos da e s t r u t u r â (f r a m e w o r k).

Figura............3 Ilustra as sequências de aminoácidos das regiões

Vq de 19 anticorpos monoclonais de ratinho, com especificidade para a fosforilcolina. A designação HP indica que a proteína é o produto de um hibridoma. 0 restante são proteínas de mieloma. (De Gearhart et al., Nature, 291=29, 1981),,

Figura......4 Ilustra os resultados obtidos da amplificação, por

PCR, de ARNm, obtido a partir do baço de um ratinho, imunizado com FITC,. As faixas R17-R24 correspondem a reacções de amplifica.....

ção com iniciadores 5’ únicos (2-9, Tabela 1) e com o iniciador 3’ (12, Tabela 1), R16 representa a reacção, por PCR, com o iniciador 5’ contendo inosina (10, Tabela 1) e com o iniciador 3’ (12, Tabela 1),, 2 e R9 são os controlos de amplificação; o controlo 2 envolve a amplificação de Vq a partir de um plasmideo (PLR2) s R9 representa a amplificação das regiões constantes de ARNm de baço, usando iniciadores 11 e 13 (Tabela 1)

Figura............5 As sequências de nucleótidos são clones da

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SCR0285P biblioteca de ADMc das regiões Vp, amplificadas por PCR, em Lambda ZAP. Estão aqui indicadas 110 bases N-terminais e os nucleótidos sublinhados representam a CDRl (região determinante de complementaridade).

c o d i f i c a n d ο V p Shine-Dalgarno,

Figura......6 Mostra-se a sequência da inserção de ADN sintética inserida no Lambda ZAP para produzir os vectores de expressão Lambda Zap II Vp (Painel A) e Lambda Zap (Painel B). As várias caracteristicas para este vector exprimir os homólogos de ADM © Vl, incluem, o sítio de ligação de ribossoma uma sequência lider para dirigir a proteína expressa para o periplasma, tal como é descrito por Mouva et al., .l·...............Biol,..............Chern,, , 255s27, 1980, e vários sítios de enzimas de restrição usados para ligar operativamente os homólogos Vp e V| ao vector de expressão. A sequência do vector de expressão de Vp contém, também, uma sequência curta de ácido nucleico que codifica aminoácidos que se encontram, tipicamente, na cadeia ρesada das r egi õ©s var iáv©is (esque1eto de Vp). Es t© esque1eto de Vp está, imediatamente, a montante e na cadeia de leitura correcfca, tal como os homólogos de ADN de Vp que estão ligados operativamente nos sítios Xho I e Spe I. Os homólogos de ADM de Vp estão ligados operativamente na sequência Vp (Painel B) nos sítios das enzimas de restrição Nco I e Spe I e, assim, a região de esqueleto de Vp é deleccionada quando os 'homólogos de ADN de Vp são ligados operativamente no vector de Vj

Figura......7 Mostram-se as caracteristicas principais do vector de expressão bacteriano Lambda Zap II Vp (vector de expressão de Vp). Mostra-se, no topo, a sequência de ADM sintética da Figura 6, conjuntamente com o promotor de polimerase T3 do Lambda Zap II,. Mostra-se a orientação da inserção no Lambda . Zap II,. Os homólogos de ADN de Vp estão inseridos nos sítios das enzimas de restrição Xho I e Spe I. 0 ADN d© Vp está inserido nos sítios Xho I © Sp© I e a leitura por transcrição produ2 o decapéptido epitopo (tag) que está localizado, imediatamente, 3’ em relação aos sítios de clonação.

Figura......8 Mostram-se as caracteristicas principais do vector

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-lOde expressão bacteriana Lambda Zap II V|_ (vector de expressão de Vç), Mostra-se, no topo, a sequência sintética da Figura 6, conjuntamente com o promotor de polimera.se T3 do Lambda Zap II. Mostra-se a orientação da inserção no Lambda Zap II. Os homólogos de ADN de Vp estão inseridos no fagomídeo que é produzido pelo protocolo de excisão in vivo descrito por Short et al«, Nucleic

Acids............Res, 16:7583-7600, 1988. Os homólogos de ADN de V|_ estão inseridos nos sitios de clonação Nco I e Spe I do fagomídeo,.

Figura............9 Representa-se um vector de expressão bactériana modificado Lambda Zap II Este vector é construído inserindo esta sequência de ADN sintética,

TGAATTCTAAACTAGTCGCCAAGGAGACA6TCATAATGAA

TCGAAÇTTAAGATTT6ATCAGCGGTTCCTCTGTCAGTATTACTT

ATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTC6CTG

TATGGATAACGGATGCCGTCGGCG.ACCTAACAATAATGAGCGAC

CCCAACCAGCCATGGCCGAGCTCGTCAGTTCTAGAGTTAAGCGGCCG

GGGTTGGTCGGTfiCCGGCTCGAGCAGTCAAGATCTCAATTCGCCGGCAGCT no Lambda Zap II que tinha sido digerido com as enzimas de restrição Sac I e Xho I. Esta sequência contém a sequência Shine-Dalgarno (sítio de ligação de ribossoma), a sequência líder para dirigir a proteína expressa para o periplasma e a sequência de ácido nucleico apropriada para permitir que os homólogos de ADN de Vp se liguem operativamente nos sítios das enzimas de restrição Sac I e Xba I proporcionados por este vector.

Figura.............10 Representa-se a sequência do segmento de ADN sintético inserido no Lambda Zap II para produzir o vector de expressão lambda V|_II. Mostram-se as várias características e os vários sítios de reconhecimento de endonucleases de restrição.

Figura.............11 Mostram-se os vectores para a expressão de Vp e de V|~, separadamente ou em combinação. Mostram-se os vários componentes essenciais destes vectores. 0 vector de cadeia leve, ou vector de expressão de Vj_, pode ser combinado com o vector de expressão de Vq para produzir um vector de combinação contendo o V|„l e o Vp, ligados, operativamente, para expressão, ao mesmo

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promotor ,.

Figura.......12 Mostram-se as proteínas marcadas, imunoprecipitadas a par tir de E......coli, contendo um homólogo de ADN de V|„> e de

Vp„ Na faixa 1, mostram-se as proteínas residuais, imunoprecipitadas a partir de E, coli, que não contêm um homólogo de ADN de

Vpj ou de Vp„ A faixa 2 contém a proteína imunoprecipitada a partir de E. coli contendo apenas um homólogo de ADN de V^. Nas faixas 3 s 4, mostra-se a co-migração de uma proteína Vp e de uma proteína Vç, imunoprecipitadas a partir de E. coli, contendo os homólogos de ADN de Vp e de Vp. Na faixa 5 demonstra-se a presença da proteína Vp e da proteína Vp, expressas a partir dos homólogos de ADN de Vp e de Vp, pelas duas espécies de proteína distinguíveis, A faixa 5 contém as proteínas residuais imunoprecipitadas por anticorpos anti-E, coli presentes no fluido ascítico do ratinho.

Figura...........15 Mostram-se as fórmulas do análogo do estado de transição (fórmula 1) que induz os anticorpos para hidrólise do substrato de carhoxamida (fórmula 2). 0 composto ds fórmula 1, contendo um espaçador de glutarilo e um apêndice ligante de N-hidroxissuccinimida, é a forma usada para acoplar o hapteno (fórmula 1) aos transportadores de proteína KLH '·& BSA, enquanto que o composto de fórmula 3 é o inibidor. A funcionalidade de fosfonamidato é uma mimetização das características estereoelectrónicas do estado de transição da hidrólise da ligação amida.

Figura............14 Ilustra-se a amplificação, por PCR, das regiões

Fd e kappa de ARNm de baço de um ratinho imunizado com NPN. A amplificação foi realizada como se descreve no Exemplo 17, usando híbridos de ADNc/ARN obtidos por transcrição inversa do ARNm com iniciador específico para amplificação das sequências de cadeia leve (Tabela 2) ou de cadeia pesada (Tabela 1), As faixas F1-F8 representam o produto de reacçSes de amplificação da cadeia pesada com cada um dos oito iniciadores 5’ (iniciadores 2-9, Tabela 1) e com o iniciador 3’ único (iniciador 15, Tabela 2). Nas faixas F9-F13 mostram-se as amplificações da cadeia leve (k) com os iniciadores 5’ (iniciadores 3-6, e 12, respectivamente,

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-12Tabela 2) e com o iniciador 3’ apropriado (iniciador 13, Tabela 2). Em todas as faixas pode-se observar urna banda de 700 pb indicando a amplificação bem sucedida das regiões Fd e k.

Figura.............15 Ilustra-se a pesquisa das bibliotecas de fago para determinar a ligação de antigénio, de acordo com o Exemplo 1SC. Testaram-se colheitas de placas, em duplicado, de bibliotecas de expressão de Fab (filtros A, B), da cadeia pesada (filtros E, F) e da cadeia leve (filtros G, !!) contra BSA marcado com 125γ conjugado com NPN para uma densidade de, aproximadamente, 30 000 placas por prato. Os filtros C e D ilustram a pesquisa secundária, em duplicado, de um teste positivo de um filtro primário A (setas) tal como se discute no texto,.

A pesquisa utilizou métodos, de colheita das placas, convencionais. As células Azuis XL1 infectadas com fago, foram incubadas em pratos de 150 mm, durante 4 h a 37ÔC, e induziu-se a expressão de proteína cobrindo os pratos com filtros de nitroceiulose embebidos em tiogalactosido de isopropilo 10 mM (IPTG) e incubando os pratos a 25ÔC durante 3 h. Obtiveram-se filtros em duplicado durante uma segunda incubação empregando as mesmas condições,. Os filtros foram então bloqueados numa solução de 1¾ de BSA em PBS, durante 1 h antes da incubação, com agitação, a 25ÔC durante 1 h, com uma solução de BSA, marcada com conjugada com NPN (2xí0⁶ cpm ml*¹? concentração de BSA 0,1

M; aproximadamente 15 NPN por molécula de BSA) em 1¾ de BSA em PBS. 0 fundo foi reduzido por pré-centrifugação de uma solução de reserva de BSA radiomarcada, a 100 000 x g durante 15 minutos, e pré-incubação de soluções com colheitas de placas de pratos contendo bactérias injectadas com um fago sem inserção,, Após a marcação, lavaram-se os filtros, repetidamente com PBS/0,05¾ de Tween 20 antes do desenvolvimento de autorradiografias durante a no ite.

Figura.............16 Ilustra-se a especificidade da ligação de antigénio, tal como se mostra por inibição competitiva, de acordo com o Exemplo 18C. As colheitas dos filtros de placas positivas foram expostas a ^-^^I-SSA-NPN na presença de concentrações

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SCR0285P crescentes do NPN inibidor.

Neste estudo mancharam-se um número de fagos correlacionados com a ligação de NPN, como na figura 15 (cerca de 100 partículas por mancha) directamente nos tapetes bacterianos. 0 prato foi depois coberto com um filtro embebido em IPTG e incubado durante 19 h a 25SC„ 0 filtro foi depois bloqueado sm 1% de BSA em PBS, antes da incubação em ^^I-BSA-NPN, como se descreveu anteriormente na Figura 15, com a excepção da inclusão de quantidades variáveis de NPN na solução de marcação,. As outras condições e procedimentos foram como na Figura 15. Na figura mostram-se os resultados, em duplicado, para um fago de afinidade moderada. Para quatro outros fagos obtiveram-se resultados similares, com algumas diferenças nas gamas de concentração de inibidor eficazes.

Figura.............17 Ilustra-se a caracterização de uma. proteína de ligação de antigénio de acordo com o Exemplo 18D. 0 sobrenadante bacteriano, purificado parcialmente, concentrado de um clone, ligando NPN, foi separado por filtração em gel e aplicaram-se aliquotas de cada fracção a placas de microtítulo revestidas com

BSA-NPN. A adição, quer dos anticorpos anti-decapéptido (------) quer dos anticorpos anti-cadeia kappa (-), conjugados com fosfatas© alcalina, foi seguida pelo desenvolvimento de cor. A seta indica a posição de eluição de um fragmento Fab conhecido. Os resultados mostram que a ligação de antigénio é uma propriedade de uma proteína de 50 kD contendo ambas as cadeias pesada e leve,.

Recolheram-se placas simples de dois clones NPN-positivos (Figura 15) e excisou-se o plasmideo contendo as inserções de cadeia leve e de cadeia pesada. Inocularam-se culturas de 500 ml em caldo L, com 3 ml de uma cultura saturada contendo os plasmideos excisados, e incubaram-se durante 4 h a 372C. A síntese ds proteínas foi induzida pela adição de IPTG até uma concentração final de 1 mM e as culturas foram incubadas durante 10 h a 252C,, Concentraram-se 200 ml de sobrenadante de células até 2 ml e aplicaram-se a uma coluna TSK-G4000. Testaram-se

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aliquotas d© 50 μΐ das fracções eluídas por ELISA.

Para a análise ELISA, revestiram-se placas de microtítulo com BSA-NPIM, com 1 u.g/ml, adicionaram-se amostras de 50 μ.1 misturadas com 50 μΐ de PBS-Tween 20 (0,05%)~BSA (0,1 %) e incubaram-se as placas durante 2 h a 25ÔC. Após lavagem com PBS-Tween 20-BSA, adicionaram-se 50 μ.1 de concentrações apropriadas de um anticorpo de ratinho anti-decapéptido (20) e um anticorpo de cabra anti-cadeia 1 eve kappa de ratinho (Souther η Biotech) conjugado com fosfatase alcalina e incubou-se durante 2 h a 252C. Após lavagem adicionaram-se 50 μ.1 de fosfato de p-nitrofenilo (1 mg/ml em tris 0,lM, pH 9,5 contendo MgClo 50 mH) e incubaram-se as placas durante 15-30 minutos antes da leitura do valor de DO a 405 nm „

Figura............1.8 Ilustra-se a sequência do inserido de ADM sintático, inserida no Lambda Zap II Vpi para produzir o vector cl© expressão de Vjq seleccionável (painel A) e no Lambda Zap II Vj_

II, de acordo com o Exemplo 17 para produzir o vector de expressão 7|_ seleccionável (painel 13),.

EiSura.......19 (A) Mo painel A mostram-se as características principais do veetor de sxpr e s s ã o de Vj_ seleccionáve 1. Na parte superio 1 * mostram-se as características da sequência de ADM sintético da Figura 18A conjuntamente com o promotor de polimerase T3 do Lambda Zap II. Mostra-se a orientação do inserido no Lambda Zap II. Os homólogos de ADN de estão inseridos nos sítios das enzimas de restrição Xho I e Spe I., 0s homólogos de ADN de estão inseridos nos sítios Xho I e Spe I e a leitura por transcrição produz o epítopo de decapéptido (tag) que está localizado imediatamente 3’ em relação aos sítios de clonação.

(13) Mostram-se as características principais do vector de expressão bacteriano Lambda Zap II Vp (vector de expressão de V_H), Ma parte superior mostra-se a sequência de ADM sintético conjuntamente com o promotor de polimerase T3 do Lambda Zap II.

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Mostra-se a orientação do inserido no Lambda Zap II. Os homólogos de ADN de Vj„i estão inseridos nos sítios de enzimas de restrição Xho T e Spe I. 0 ADM de está inserido nos sítios Xho I e Spe I e a leitura por transcrição produz o epítopo de decapéptido (tag) que está localizado imediatamente 3’ em relação aos sítios d© clonaçio„

Figura......20 Mostra-se um dos vectores para a expressão de Vp e de Vp em combinação. Mostram-se os vários componentes essenciais destes vectores. Mostra-se o marcador seleccionável (sup F)„

Descrição......detalhada......da......Invenção

A« DEFINIÇÕES

Nucleótidos é uma unidade monomérica de ADN e de ARN consistindo de uma unidade de açúcar (pentose), um fosfato e uma base heterociclica azotada. A base está ligada à unidade açúcar através do carbono glicosidico (carbono 1’ da pentose) e essa combinação de base e de açúcar é um nucleósido. Quando o nucleósido contém um grupo fosfato ligado à posição 3’ ou 5’ da pentose, é designado por nucleótido.

Par.......de bases (pb): é uma associação de adenina (A) com timina. (T), ou de citosina (C) com guanina (G) numa molécula de ADN de cadeia dupla,, No ARN a timina é substituída por uracilo (U).

Ácido Nucleico: ê um polímero de nucleótidos, quer de cadeia simples, quer de cadeia dupla,,

Gene: é um ácido nucleico cuja sequência de nucleótidos codifica um ARN ou um polipéptido. Um gene pode ser, quer ARN quer ADN.

Bases........................cornp 1 eme n tar es: são nucleótidos que, normalmente, se emparelham quando o ADN ou o ARN adopta uma configuração de cadeia dupla.

Sequência de nucleótidos......co_mpiementar,: é uma sequência

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SCR0285P d© nucleótidos numa, molécula de ADN ou de ARN de cadeia simples que é suficientemente complementar com a de outra cadeia simples para se hibridar especificamente com essa outra cadeia com consequente ligação de hidrogénio.

Conservada: uma sequência de nucleótidos é conservada em relação a uma sequência (de referência) prê-seleccionada se se hibridar não aleatoriamente com um complemento exacto da sequência pré-seleccionada.

Hlbridação: é o emparelhamento de sequências de nucleótidos (cadeias de ácido nucleico), substancialmente complementares, para formar um duplex ou um heteroduplex pelo estabelecimento de ligações de hidrogénio entre pares de bases complementares, ê uma interacção especifica, i.e., não aleatória, entre dois polinucleótidos complementares que pode ser competitivamente inibida.

A n á 1 o g o d e N. u c 1 e ó t i d o: é um nucleótido de purina ou de pirimidina que difere estruturalmente de A, T, G, C ou U, mas que é suficientemente similar para substituir o nucleótido normal numa molécula de ácido nucleico.

Homólogo ......de...........ADN: é um ácido nucleico possuindo uma sequência de nucleótidos conservada, pré-seleccionada, e uma sequência codificando um receptor capaz de se ligar a um ligando pré-seleccionado.

Anticorpo: o termo anticorpo, nas suas várias formas gramaticais, é aqui usado para designar moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente activas de moléculas de imunoglobulina, i.e., moléculas que contêm um sítio ds combinação de anticorpos ou paratopo. Exemplos de moléculas de anticorpos são as moléculas de imunoglobulina intactas, moléculas de imunoglobulina substancialmente intactas e porções de uma molécula de imunoglobulina, incluindo as porções conhecidas na arte por Fafo, Fato’, F(ab’)2 ^e F(v)„

Sítio............de............combinação...........de.........anticorpos: um sítio de combinação de anticorpos é a porção estrutural de uma molécula de

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anticorpo, constituída por uma região variável ds cadeia pesada e de cadeia leve e por uma região hipervariável, que se liga ©specificamente (imunorreage com) um antigénio. 0 termo imunorreagir, nas suas várias formas, significa a ligação específica entre uma molécula contendo um determinante antigénico e uma molécula contendo um sítio de combinação de anticorpos, tal como uma molécula de anticorpo inteira ou urna sua porção.

Anticorpo......monoclonal a expressão anticorpo monoclonal, nas suas várias formas gramaticais, refere~se a uma população de moléculas de anticorpo que contém apenas uma espécie de sítio de combinação de anticorpos , capas; de imunorreagir com um antigénio particular,. Um anticorpo monoclonal apresenta assim, tipicamente, uma afinidade de ligação única para qualquer antigénio com o qual imunorreage. Deste modo, um monoclonal pode conter uma molécula de anticorpo pluralidade de sítios de combinação de anticorpos, imunoespecífico de um antigénio diferente, p.e., um monoclonal biespecifico

B. PROCESSOS presente invento contempla um processo de isolamento, de entre um reportôrio de genes conservados, de um gene codificando um receptor possuindo uma actividade pré-seleccionada, preferivelmente, uma actividade catalítica,, 0 receptor pode ser um polipéptido, uma molécula de ARN, tal como um ARN de transferência, um ARN apresentando actividade enzimática, e semelhantes. Preferivelmente, o receptor será um polipéptido capaz de se ligar a um ligando, tal como uma enzima, uma molécula, de anticorpo ou uma sua porção imunologicamente activa, um receptor celular ou uma proteína de adesão celular, codificada por um dos membros de uma família de genes conservados, i.e., genes contendo uma sequência de nucleótidos conservada de pelo menos cerca de 10 núcleo ti dos de comprimento,,

Exemplos de famílias de genes conservados são os que codificam as imunoglobulinas, os antigênios, do complexo de histocompatibilidade principal, da classe I ou II, receptores de anticorpo com uma cada um anticorpo

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-18™ linfocitos, integrinas e semelhantes.

Um gene pode ser identificado como pertencendo a um reportório de genes conservados usando vários métodos. Por exemplo, pode-se usar um gene isolado como sonda de hibridação, sob condições pouco rigorosas, para detectar outros membros do reportório de genes conservados, presentes no ADN genómico, u s a n d o o s m s t o d o s d e s c r i t o s p o r 8 o u t h e r n, J „........Μ o 1... BI o 1, 98:50 3 (1975),, Se o gene usado como sonda de hibridação se híbrida com múltiplos fragmentos de endonucleases de restrição esse gene é um membro de uma família de genes conservados.

I ui u i i o g 1 o b u 1 i i i a s

As imunoglobulinas, ou moléculas de anticorpos são uma grande família de moléculas que inclui vários tipos de moléculas tais como IgD, IgG, IgA, IgM e IgE. A molécula de anticorpo é constituída, tipicamente, por duas cadeias, pesada (H) e leve (L), com uma região variável (V) e uma região constante (C) presentes em cada cadeia,, Várias regiões diferentes de uma imu ηog1obu1ina con têm seq u ê ncias c o n s e rvadas úteis par a isolamento d© um reportório cie imunoglobulina. Resultados extensivos de sequenciação de aminoácidos e de ácidos nucleicos apresentando exemplos de sequências conservadas, foram compilados para moléculas de imunoglobulinas por Kabat et al., em Sequences .of............Proteins............of......Immunological........Interest, National Institutes of

Health, Bethesda, MD, 1987,,

A região c, da cadeia H, define o tipo de imunoglobulina p a r t i c u 1. a r .. D e s t e modo, a se 1 e c çã o de seque n c i as co nse r v a d a s, t a 1 como aqui se definem, da região C da cadeia H, resulta na preparação de um reportório de genes de imunoglobulina possuindo membros do tipo de imunoglobulina da região C seleccionada.

A região V das cadeias H ou L compreende, tipicamente, quatro regiões de estrutura (framework)) (FR), cada uma contendo graus relativamente menores de variabilidade, que inclui comprimentos de sequências conservadas. 0 uso de sequências conservadas das regiões de estrutura (framework) FR1 e FR4 (região J) da cadeia é um exemplo de uma concretização

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preferida e é aqui descrito nos Exemplos. As regiões de estrutura (framework) são, tipicamente, conservadas através de vários ou de todos os tipos de imunoglobulina e, assim, as sequências conservadas aí contidas são particu1armente adequadas para a preparação de repertórios com vários tipos de imunoglobu.....

i na,

Complexo......de......Histocompatibilidade.....Principal complexo de histocompatibilidade principal (MHC) é um grande locus genético que codifica uma extensa família de proteínas que inclui várias classes de moléculas designadas por moléculas MHC da classe I, da classe II ou da classe III. Paul et al,, em Fundamental.......Immunology, Raven Press, NY, pp. 303-378 (1984).

As moléculas MHC da classe I são um grupo polimórfico de antigénios de transplantação representando uma família conservada na qual o antigénio é constituído por uma cadeia pesada e por uma cadeia leve não codificada no MHC. A cadeia pesada inclui várias regiões, designadas por regiões N, Cl, C2, de membrana e citoplásmica. As sequências conservadas úteis no presente invento encontram-se, principalmente, nas regiões N, Cl e C2 e são identificadas como sequências contínuas de resíduos invariantes em Kabat et al., supra.

As moléculas MHC da classe II compreendem uma família conservada de antigénios polimórficos que participam na imuno.....

-resposta e que compreendem uma cadeia alfa e uma cadeia beta. Os genes que codificam a cadeia alfa e beta incluem, cada um, várias regiões que contêm sequências conservadas, adequadas para a produção dos repertórios das cadeias alfa s beta da classe II de MHC. Exemplos de sequências de nucleótidos conservadas incluem as que codificam os resíduos aminoácidos 26-30 da região Al, os resíduos 161-170 da região A2 e os resíduos 195-206 da região de membrana, todas da cadeia alfa. Estão também presentes sequências conservadas nas regiões S31., B2 e de membrama, da cadeia beta, nas sequências de nucleótidos que codificam os resíduos aminoácidos 41-45, 150-162 e 200-209, respectivamente.

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ReceptoresdeLinfócito.....e An ti génios de......Superfície Celular

Os linfócitos contêm várias famílias de proteínas nas suas superfícies celulares, incluindo o receptor de células T. o antigénio Thy-l e numerosos antigénios. de superfície de células T, incluindo os antigénios definidos pelos anticorpos monoclonais 0KT4 <leu3), 0KUT5/8 (leu 2), 0KUT3, 0KUT1 (leu 1), OKT 11 (leu5), 0KT6 e 0KT9. Paul, supra nas págs. 458-479.

A designação receptor de células T é um termo usado para uma família de moléculas de ligação de antigénios que se encontram na superfície das células T. 0 receptor de células T, como família, exibe especificidade de ligação polimórfica similar à das imunoglobulinas, na sua diversidade. 0 receptor de células T maduras é constituído por cadeias alfa e beta, cada uma possuindo uma região variável V e uma região constante (C). As semelhanças que o receptor de células T têm em relação às imunoglobulinas em organização genética e em função, mostra que o receptor de células T contém regiões de sequência conservada. Lai et al., Naturs, 331»543-546 (1988).

Exemplos de sequências conservadas incluem as que codificam os resíduos aminoácidos 84-90 da cadeia alfa, os resíduos aminoácidos 107-115 da cadeia beta, © os resíduos aminoácidos 91-95 e 111-116 da cadeia gama. Kabat et al., suprap. 279. Integrinas......ê......Adesinas

As proteínas adesivas envolvidas na ligação de células são membros de uma grande família de proteínas relacionadas, designadas por integrinas. As integrinas são heterodimeros constituídos por uma subunidade beta e por uma subunidade alfa,. Membros da família da integrina incluem o receptor de plaquetas de glicoproteinas da superfície celular GpIIb-IIIa, o receptor de vibronectina (VnR), o receptor de fibronectina (FnR) e os receptores de adesão de leucócitos LFA-1, Mac~l, Mo~l e 60.3. Roushahti et al., Science, 238^491-497 (1987). Os dados das sequências de ácidos nucleicos e de proteínas existem regiões de sequências conservadas nos demonstram que membros destas famílias, particularmente entre a cadeia beta de GpIIb-IIIa, VnR

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-21e FnR e entre a subunidade alfa de VnR, Mac-1, LFA-l, FnR e

GpIIb-IIIa. Suzuki et a 1., Proc,Na11..Acad,Sei.........USA, 83:8614-8618, 19865 Ginsberg et al., J...............Biol..............Chem.262:5437-5440,

1.987»

A discussão seguinte ilustra o processo do presente invento a p1icado ao i s o 1 a m e nto de um gene codi fi cando um r ecep tor , conservado, do repertório do gene da imunoglobulina. Esta discussão não deve ser tomada como limitativa, mas sim como aplicação ilustrativa dos princípios que podem ser usados para isolar um gene de qualquer família de genes conservados, codificando receptores relacionados funcionalmente.

Geralmente, o processo combina os elementos seguintes:

1. Isolamento de ácidos nucleicos contendo uma porção substancial do reportório imunológico.

2. Preparação de iniciadores de polinucleótido para a clonação de segmentos de polinucleótido contendo os genes das regiões Vp e/ou Vp de imunoglobulina.

3. Preparação de uma biblioteca, de genes contendo uma. pluralidade de genes Vp e Vj_ diferentes, a partir do reportório,

4. Expressão dos polipéptidos Vp e/ou V|~ num hospedeiro adequado, incluindo hospedeiros procarióticos e eucarióticos, quer separadamente, quer na mesma célula, e quer no mesmo quer em vectores de expressão diferentes,

5. Pesquisa dos polipéptidos expressos quanto a uma actividade pré-seleccionada, e a segregação de uma combinação ds genes codificando Vp e/ou Vg_? identificada pelo processo de pesquisa,

Um receptor produzido pelo presente invento assume uma cot)formação possuindo um sitio de ligação específica., tal como é evidenciado pela sua capacidade para ser inibido competitivamente, de um ligando pré-seleccionado ou predeterminado tal como um antigénio, um substrato enzimático e similares. Numa concretização, um receptor do presente invento é um polipéptido que se

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liga a um ligando que forma um sitio de ligação com antigénio que se liga, especificamente, a um antigénio pré-seleccionado para formar um complexo possuindo uma ligação suficientemente forte entre o antigénio e o sítio de ligação para o complexo a ser isolado. Quando o receptor é um polipéptido que se liga a um antigénio a sua afinidade ou avidez, é geralmente, superior a 10™' M”í, mais usualmente, superior a 10^ e, preferivelmente superior a 10^s Μ~- ί·„

Numa outra concretização, um receptor do presente invento liga-se a um substrato e catalisa a formação de um produto a partir do substrato. Embora a topologia do sítio de ligação de ligando de um receptor catalítico seja, provavelmente, mais importante, para a sua actividade pré-seleccionada, do que a sua afinidade (constante de associação ou pKa) pelo substrato, os presentes receptores catalíticos têm uma constante de associação para o substrato pré-seleccionado geralmente superior a 1CP M“í, mais usualmente, superior a 10⁵ M ¹ ou 10⁶ e, preferivelmente, superior a 10? M-l ,.

Preferivelmente, o receptor produzido pelo presente invento, é heterodimérico e, deste modo, é constituído, normalmente, por duas cadeias diferentes de polipéptido, que em conjunto assumem uma conformação possuindo uma afinidade de ligação ou uma constante de associação para o ligando pré-seleccionado que é diferente, preferivelmente, superior a afinidade ou à. constante de associação de qualquer dos polipéptidos sozinho, i.e., os monómeros ... Uma ou ambas as cadeias de polipéptido diferentes são derivadas da região variável das cadeias leve e pesada de uma imunoglobulina. Tipicamente, os polipéptidos compreendendo as regiões variáveis leve (Vl) e pesada (Vp) são utilizados conjuntamente para ligação do ligando pré-seleccionado

Um receptor produzido pelo presente invento pode ser activo na forma monomêrica bem como em formas multiméricas, quer homoméricas, quer heter omér icas, pref er ivelmente.. heter odimêr icas, Um polipéptido Vp e V|_ de ligação a ligandos produzido pelo

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-23presente invento pode ser vantajosamente combinado num heterodimero (molécula de anticorpo) para modular a actividade de qualquer um dos polipéptidos ou para produzir uma actividade ún ica do h &ter odímero. Os po1ipéptidos de 1 i gação a 1i ga ndo, individuais, serão designados por e Vç © o heterodimero será designado por um Fv.

Contudo, será de notar que um polipéptido de ligação Vq pode conter, para além do Vpj, substancialmente toda ou uma porção da região constante da cadeia pesada. Um polipéptido de ligação Vp pode conter, para além do Vp, substancialmente toda ou uma porção da região constante da cadeia leve. Um heterodimero constituído por um polipéptido de ligação Vp], contendo uma porção da região constante da cadeia pesada, e por um polipéptido de ligação V| , contendo substancialmente toda a região constante da cadeia leve, é designado por fragmento Fab. A produção de Fab pode ser vantajosa em algumas situações, em virtude das sequências adicionais da região constante contidas num Fab, em comparação com um Fy, poderem estabilizar a interacção Vp e V| . Esta estabilização pode fazer com que o Fab tenha uma maior afinidade pelo antigénio. Adicionalmente, o Fab é mais vulgarmente usado na arte e, assim, existem mais anticorpos disponíveis, comercialmente, que reconhecem especificamente um Fab,.

s p o 1 i p é p t i d os i n d i v i d u a i s V ρ e V |_ t e r ã o, g e r a 1 m e n t e, me η o s do que 125 resíduos aminoácidos, mais usualmente, menos do que cerca de 120 resíduos aminoácidos, enquanto que terão, normalmente, mais do que 60 resíduos aminoácidos, usualmente, mais do que cerca de 95 resíduos aminoácidos, mais usualmente, mais do que cerca de 100 resíduos aminoácidos» Preferivelmente, o Vq terá entre cerca de 110 e cerca de 125 resíduos aminoácidos de comprimento, enquanto que o Vp terá entre cerca de 95 ε cerca de 115 resíduos aminoácidos de comprimento»

As sequências de resíduos aminoácidos variarão, d e p e n d e n d o d o i d i o t i p o p a r t i c u 1 a r e η v o 1 v i d o. existirão, pelo menos, duas cisteínas separadas por 60 a 75 resíduos aminoácidos e ligadas por grandemente, Usualmente de cerca de uma ligação

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-24dissulfuretoOs polipéptidos produzidos pelo presente invento serão normal mente, cópias substanciais cie idiotipos das regiões variáveis das cadeias pesada e/ou leve de imunoglofoulina© mas, em algumas situações, um polipéptido pode conter mutações aleatórias nas sequências dos resíduos aminoácidos de modo a melhorar vantajosamente a actividade desejada,.

Em algumas situações, é desejável proporcionar uma ligação cruzada covalente dos polipéptidos Vp e V^, que pode ser realizada proporcionando resíduos cisteina no terminal carboxilo. 0 polipéptido será preparado, normalmente, sem as regiões constantes da imunoglofoulina, mas contudo, pode-se incluir uma pequena porção da região J como resultado da selecção vantajosa dos iniciadores de síntese de ADN. A região D será normalmente, incluída na cópia do V_H .·

Noutras situações é desejável proporcionar um ligante de peptido para ligar o Vj_ ® P«ra formar uma proteína de ligação a antigénio, de cadeia simples, contendo um Vp e um V_L. Esta proteína de ligação a antigénio, de cadeia simples, seria sintetizada como uma única cadeia de proteína,. Estas proteínas de ligação a antigénio, de cadeia simples, foram descritas por Bird st al., Science, 242:423-426 (1988). A concepção de regiões de ligantes de peptido adequadas é descrita por Rofoert Landner na Patente dos E.U.A. n2. 4 704 692.

Este ligante de peptido pode ser concebido como parte das sequências de ácido nucleico contidas no vector de expressão,. As sequências de ácido nucleico codificando um ligando de peptido estariam entre os homólogos de ADN de Vp e Vp e os sítios de endonuclease de restrição usados para ligar operativamente os homólogos de ADN de Vp e Vp ao vector de expressão,,

Este ligante de peptido pode também ser sequências de ácido nucleico que são parte dos polinucleótido, usados para preparar as várias codificado por iniciadores de bibliotecas de genes,, A sequência de ácido nucleico codificando o ligante de peptido pode ser construída por ácidos nucleicos ligados a um dos iniciadores ou a sequência de ácidos nucleicos codificando o

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ligante de polipéptido pode ser obtido a partir de sequências de ácido nucleico que estão ligadas a vários iniciadores de polipéptido usados para criar as bibliotecas de genes.

Tipicamente, a região do terminal C dos polipéptido® V|_j e Vp terá uma maior variedade de sequências do que a do terminal IM e, com base na presente estratégia, pode ser ainda modificada para permitir uma variação das cadeias e Vj de ocorrência natural, Pode-se usar um polinucleótido sintético para variar um ou mais aminoácidos numa região hipervariável.

¹· Isolamento......do......Reportório

Para preparar uma composição de ácidos nucleicos contendo uma porção substancial do reportório de genes imunológico, ê necessária uma fonte de genes codificando os polipéptido® Vp ©/ou V|_„ Preferivelmente, a fonte será uma população heterogénea ds células produtoras de anticorpos, i.e., linfócitos 13 (células B), preferivelmente, células 13 rearranjadas tais como as que se encontram na circulação ou no baço de um vertebrado,. (As células B rearranjadas são aquelas nas quais ocorreu a translocação do gene da imunoglobulina, i.e., o rearranjo, tal como é evidenciado pela presença, na célula, ds ARNm com os transcritos das regiões V, D e J do gene da, imunoglobulina aí localizados, de um modo adjacente)..

Em alguns casos é desejável fazer tender o reportório para u m a a c t i v i d a de pré-selecciona d a, p o r e x e m p 1 o, u s a n cl o, como f o n t ® de ácido nucleico, células (células fonte) de vertebrados em qualquer um de vários estados de idade, saúde e resposta imunológica. Por exemplo, a imunização repetida de um animal saudável antes da colheita de células 13 rearranjadas, resulta na obtenção de um reportório enriquecido em material genético produzindo um polipéptido, que se liga a ligando®, de elevada afinidade, Inversamente, a colheita de células B rearranjadas de um animal saudável, cujo sistema imunológico não foi recentemente desafiado, resulta na produção de um reportório que não está vocacionado em relação ã produção de polipéptidos Vp e/ou Vp de elevada afinidade.

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Será de notar que quanto maior for a heterogeneidade genética da população ds células a partir das quais ss obtêm os ácidos nucleicos, maior será a diversidade do reportório imunológico que ficará disponível para pesquisa, de acordo com o método do presente invento. Assim, as células ds diferentes indivíduos, particularmente, de indivíduos possuindo uma diferença de idade imunologicamente significativa, e as células de indivíduos de diferentes estirpes, raças ou. espécies, podem ser* vantajosamente combinadas para aumentar a heterogeneidade do reportório.

Assim, numa concretização preferida, as células de fonte são ds um com um procura obtidas a partir ds um vertebrado, preferivelmente, mamífero, que foi imunizado ou parcialmente imunizado ligando antigênico (antigénio) contra o qual se actividade, i.e., um ligando pré-seleccionado. A imunização pode ser realizada de um modo convencional. Pode-se ir analisando o título de anticorpos no animal, para determinar o estado de imunização desejado, estado este que corresponde à quantidade enriquecimento ou ds inclinação do reportório desejado, animais parcialmente imunizados recebem apenas, tipicamente, imunização e as células são colhidas dos animais logo após detectar uma resposta,. Os animais totalmente imunizados apresentam um título de pico, que é atingido com uma ou mais injecçóes repetidas do antigénio no mamífero hospedeiro, normalmente com intervalos de 2 a 3 semanas. Usualmente, três a cinco dias após o último desafio, o baço é removido e o reportório genético dos esplenocitos, cerca de 90¾ dos quais são células B ê isolado usando procedimentos convencionais.

Protocola.......in......Molecular........Biology, Ausubel st al», eds., John Wiley & Sons, NY. Os ácidos nucleicos codificando os polipéptidos Vjq e v'i podem ser obtidos a partir de células produzindo IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM, muito preferivelmente, de células produzindo IgM ds

Os uma se rearranjadas. Ver Current

Os processos para a preparação de fragmentos de ADM genómico, a partir dos quais os genes das regiões variáveis de imunoglobulina podem ser clonados como uma população diversa, são

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-27á/bem conhecidos na arte,. Ver, por exemplo, Herrmann et al. ,

He ishods.............lQ......Enzymol „ , 152:180-183, (1987); Friseh a u f, MethodsIn

Enzymol„, 152:183-190 (1987); Frischauf, Methods.............In......... E n z y m ο 1,

152:190-199 (1987); e DiLe 11 a et a 1., Methods1..Q Enzymol, 152:199-212 (1987).. (Os ensinamentos das referências aqui citadas são aqui incorporados como referência).

reportório de genes desejado pode ser isolado, quer a partir do material genómico contendo o gene exprimindo a região variável quer a partir do ARN mensageiro (ARNm) que representa um transcrito da região variável,. A dificuldade em usar o ADN genómico de outras células, que não os linfócitos B não rearranjados, está em justapor as sequências codificando a região v a r i á v e 1, q u a n do as sequência s e s t ã o se p a r a d as p o r i n t r õ © s. 0 ( s) fragmento(s) de ARN contendo os exóes apropriados tem(têm) de ser isolado(s), os intróes excisados e os exões depois reunidos, na ordem adequada e na orientação adequada. Para a maior parte isto será difícil, pelo que a técnica alternativa usando células 8 rearranjadas será o método preferido, porque as regiões dos genes de imunoglobulina C, D e J foram translocadas para se tornarem adjacentes, de modo que a sequência é contínua (isenta de intrões) para as regiões variáveis completas.

Quando se usa ARNm as células serão lisadas sob condições de inibição da rifoonuclease. Numa concretização, o primeiro passo consiste em isolar o ARNm celular total, por hibridação com uma coluna de oligo-dT-celulose. A presença de ARNm codificando os polipéptidos de cadeia pesada e/ou leve pode, depois, ser avaliada por hibridação, com cadeias simples de ADN, dos genes apropriados. Convenientemente, as sequências codificando a porção constante do V^ e do V| podem ser usadas como sondas ds polinucleótido, sequências estas que podem ser obtidas a partir de fontes disponíveis. Ver, por exemplo, Early e Hood, Qenetic Englneerlng., Setlow e Hollaender, eds,, Vol. 3, PIenum

Publishing Corporation, New York, (1981), páginas 157-188; e

Kabat et a1., 3equences__of.............Immunological_____________Interest, National

Institutes of Health, Bethesda, MD, (1987). Em concretizações preferidas, a preparação contendo o ARNm celular total é.

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-28primeiramente, enriquecida em ARNm codificando Vq e/ou Vj „ Tipicamente, o enriquecimento é realizado sujeitando a preparação de ARNm total, ou o seu produto de ARNm parcialmente purifiçado, a uma reacção de extensão de iniciador empregando um iniciador d© síntese de poli nucleó t ido do presente invento,,

2. Preparação......de.......iniciadores de polinucleótido termo polinucleótido, tal como é aqui usado em referência a iniciadores, sondas e fragmentos ou segmentos de ácido nucleico, a serem sintetizados por extensão do iniciador, refere-se a uma molécula constituída por dois ou mais desoxirribonucleótidos ou ribonucleótidos, preferivelmente mais do que 3,. 0 seu tamanho exacto dependerá de muitos factores, que por sua vez dependem das condições finais de uso,, termo iniciador, tal como é aqui usado, refere-se a um polinucleótido, quer purificado a partir de um digerido de restrição de ácido nucleico quer produzido sinteticamente, que © capaz de actuar como ponto de início de síntese quando colocado sob condições nas quais se induz a síntese de um produto de extensão de iniciador, que é complementar a uma cadeia de ácido nucleico, i.e,, na presença de nucleótidos e de um agente para polimerização, tal como ADN-polimerase, transcriptase inversa e similares, e a uma temperatura e a um pH adequados. Preferivelmente, o iniciador é de cadeia simples, para uma eficiência máxima mas, alternativamente, pode ser de cadeia dupla,. Se for de cadeia dupla, o iniciador é tratado, em primeiro lugar, para separar as suas cadeias, antes de ser usado para preparar produtos de extensão. Preferivelmente, o iniciador é um polidesoxirribonucleótido. □ iniciador tem de ser suficientemente longo para iniciar a síntese de produtos de extensão na presença dos agentes para a polimerização„ Os comprimentos exactos dos iniciadores dependerão de muitos factores, incluindo a temperatura e a fonte de iniciador,. Por exemplo, dependendo da complexidade da sequência desejada, o iniciador de polinucleótido contém, tipicamente, 15 a 25, ou mais, polinucleótidos, ainda qu© possa conter menos nucleótidos. As moléculas iniciadoras curtas

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-29requerem, geralmente, temperaturas mais frias para formar complexos híbridos suficientemente estáveis com o molde.

Os iniciadores aqui usados são seleccionados para serem •substancialmente complementares com as diferentes cadeias de cada sequência específica a ser sintetizada ou amplificada. Isto significa que o iniciador tem de ser suficientemente complementar para se hibridar não aleatoriamente com a sua cadeia molde respectiva, Deste modo, a sequência de iniciador pode não reflectir a sequência exacta do molde. Por exemplo, um fragmento de nucleótidos não complementares pode estar ligado à extremidade 5’ do iniciador, sendo o restante da sequência de iniciador substancialmente complementar com a cadeia. Estes fragmentos não complementares codificam, tipicamente, um sítio de restrição de endonuclease. Alternativamente, bases não complementares ou sequências mais compridas podem ser intercaladas no iniciador, desde que a sequência de iniciador tenha complementar idade suficiente com a sequência da cadeia a ser sintetizada ou amplificada, para com ela se hibridar não aleatoriamente & formar, assim, um produto de extensão nas condições de síntese de po 1 i n uc 1 eó t i dos,,

Os iniciadores de polinucleótidos podem ser preparados usando qualquer método adequado, tal como, por exemplo, os métodos do fosfotriêster ou do fosfodiéster; ver Narang et al..

Meth.........Enzymol», 68 = 90, (1979)5 Patente dos E.U.A. NS. 4 356 270;

e Brown et al., Meth.........EnzymoK., 68 = 109, (1979).

A escolha de uma sequência de nucleótidos ds iniciador depende ds factores tais como a distância,no. ácido nucleico da região codificando o receptor desejado, o seu sítio de hibridação no ácido nucleico, em relação a. qualquer segundo iniciador a. ser usado, o número de genes no repertório com os quais se vai hibridar © similares.

Por exemplo, para produzir homólogos de ADN, codificando Vp, por extensão de iniciador, a sequência de nucleótidos de um iniciador é seleccionada para se hibridar com uma pluralidade de genes da cadeia pesada de imunoglobulina num sítio substancialJ

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-30mente adjacente a uma região de codificação de Vp de modo a obter uma sequência de nucleótidos codificando um polipéptido funcional (capaz de se ligar). Para se hibridar com uma pl uralidade de cadeias de ácido nucleico codificando Vp diferentes, o iniciador tem de ser um complemento substancial de uma sequência de nucleótidos conservada entre as diferentes cadeias. Estes sítios incluem sequências de nucleótidos na região constante, qualquer das regiões de estrutura (framework) da região variável, preferivelmente, a terceira região de estrutura, a região líder, a região promotora, a região J e similares.

Se se pretende produzir os homólogos de ADN, codificando Vp e codificando Vp, por amplificação de reacção em cadeia com polimerase (PCR), têm de se usar dois iniciadores para cada cadeia de codificação de ácido nucleico a ser amplificada. 0 primeiro iniciador torna-se parte da cadeia nonsense (menos ou complementar) e hibrida-se com uma sequência de nucleótidos conservada entre as cadeias Vp (mais) no repertório. Para produzir homólogos de ADN codificando Vp, os primeiros iniciadores são, deste modo, escolhidos para se hibridarem com (i.e., serem complementares com) regiões conservadas na região J, na região CHI, na região de articulação, na região CH2, ou na região CH3 de genes de imunoglobulina e similares, Para produzir um homólogo de ADN codificando Vp, os primeiros iniciadores são escolhidos para se hibridarem com (i.e., serem complementares com) uma região conservada na região J ou na região constante de genes de cadeia leve de imunoglobulina e similares,. Os segundos iniciadores tornam-se parte da cadeia (mais) de codificação e hibridam-se com uma sequência de nucleótidos conservada entre as cadeias menos. Para produzir os homólogos de ADN codificando Vp, os segundos iniciadores são, deste modo, escolhidos para se hibridarem com uma sequência d® nucleótidos conservada na extremidade 5’ do gene de imunoglobulina codificando Vp, tal como na área codificando a região lider ou a primeira região de estrutura (framework). Será de notar que, na amplificação de ambos os homólogos de ADN codificando Vp e Vp, a sequência de nucleótidos 5’ conservada do segundo iniciador, pode ser

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complementar de uma sequência adicionada exogenamente usando a desoxinucleotidilo-terminal-transferase tal como é descrito por

Loh et al., Sei. Vol 243:217-220 (1989). Um ou ambos os primeiros e segundos iniciadores podem conter uma sequência de nucleótidos definindo um sítio de reconhecimento de endonuclease. 0 sitio pode ser heterólogo do gene de imunoglobulina a ser amplificado e, tipicamente, aparece na. extremidade 5’ ou próximo da. extremidade 5’ do iniciador.

Os iniciadores do presente invento podem também conter uma sequência ds promotor de ARN-polimerase dependente de ADN ou o seu complemento. Ver, por exemplo, Krieg et al., NucleicAcids

Re search , 12:7057-70 (1984); Studier et a 1., J Μ o 1. Blol,, ,

189:113-130 (1986); e Molecular.......Cloning: A...........Laboratory............Manual

Sacond............Edition, Maniatis et al., eds., Cold Spring Harbor,

MY (1939).

Quando se usa um iniciador contendo um promotor de ARN-polimerass dependente ds ADN, hibrida-se o iniciador com a cadeia de polinucleótido a ser amplificada e completa-se a segunda cadeia de polinucleótido do promotor de ARN-polimerase dependente de ADN usando um agente de indução tal como ADN-ρο li mera.se

I de E..........coli. ou o fragmento Klenow de ADN-polimerase de E.„..............coli.

polinucleótido é amplificado por alternancia entre a produção de um polinucleótido de ARN e de um polinucleótido de ADN,,

3. Preparação......de.......uma biblioteca de......genes

A estratégia usada para a clonação i.e., para reproduzir, substancialmente, os genes Vp e/ou V|_ contidos no* reportôrio isolado, dependerá, como ê bem conhecido na arte, do tipo, complexidade e pureza dos ácidos nucleicos que constituem o reportôrio,, Outros factores dependerão de se pretender ou não amplificar ou mutar os genes,,

Numa estratégia, o objectivo é clonar os genes codificando 7p ' e/ou V| de um reportôrio constituído por cadeias de codificação de polinucleótido, tais como ARNm e/ou a cadeia de sentido (sense strand) de ADN genómico. Se o reportôrio está na forma de ADN genómico de cadeia dupla, usualmente, é em primeiro

J

026

SCR0285P *

-32lugar desnaturado, tipicamente, por fusão em cadeias simples. 0 repertório é sujeito a uma primeira reacção de extensão primária por tratamento (contacto) do reportório com um primeiro polinucleótido iniciador de síntese possuindo uma sequência de nucleótidos pré-seleccionada. 0 primeiro iniciador é capaz de iniciar a primeira reacção de extensão de iniciador, por híbridação com uma sequência de nucleótidos, preferivelmente, com pelo menos cerca de 10 nucleótidos de comprimento e, mais preferivelmente, com pelo menos cerca de 20 nucleótidos de comprimento, conservada no repertório. 0 primeiro iniciador é por vezes aqui designado por iniciador de sentido (sense primer) porque se hibrida com a cadeia de codificação ou de sentido de um ácido nucleico. Adicionalmente, o segundo iniciador é por vezes aqui designado como iniciador anti-sentido(anfi-sense primer) porque se hibrida com uma cadeia, de não codificação ou anti-sentido de um ácido nucleico, i.e., uma cadeia complementar de uma cadeia de codificação.

A extensão do primeiro iniciador é realizada misturando quantidade reportório, pr i me iro in ici ador, predeterminada, com preferivelmente, com preferivelmente, uma sua os ácidos nucleicos do uma sua quantidade predeterminada, para, formar uma mistura reaccional de extensão do primeiro iniciador. A mistura é mantida sob condições de síntese de polinucleótidos, por um período de tempo, que é, tipicamente, predeterminado, suficiente para a formação de um produto de reacção de extensão do primeiro iniciador, produzindo-se assim uma pluralidade de complementos de homólogos de ADN codificando Vp diferentes» Os complementos são então sujeitos a uma segunda, reacção de extensão de iniciador por tratamento com um segundo polinucleótido iniciador de síntese possuindo uma sequência de nucleótidos pré™ -seleccionada. 0 segundo iniciador é capaz de iniciar a segunda reacção por hibridação com uma sequência de nucleótidos, preferivelmente com pelo menos cerca de 10 nucleótidos de comprimento e, mais preferivelmente, com pelo menos cerca de 20 nucleótidos de comprimento, conservada entre uma pluralidade de diferentes complementes de genes codificando Vjq, tais como os

J

026 SOR0285P

-33“ produzidos, por exemplo, pela primeira reacção de extensão de iniciador. Isto é realizado misturando o segundo iniciador, preferivelmente uma sua quantidade predeterminada, com os ácidos nuclsicos complementares, preferivelmente, com uma sua quantidade predeterminada, para formar uma mistura reaccional de extensão do segundo iniciador. A mistura é mantida sob condições de síntese de polinucleótidos por um período de tempo, que ê, tipicamente, predeterminado, suficiente para a formação de um produto da reacção de extensão do primeiro iniciador, produzindo-se assim uma biblioteca de genes contendo uma pluralidade de homólogos de ADN, codificando Vj„i s/ou Vl_, diferentes»

Pode-se usar, em cada amplificação, uma pluralidade de primeiros iniciadores e/ou uma pluralidade de segundos iniciadores, ou um par individual de primeiro e de segundo iniciador. Em qualquer dos casos, os produtos de amplificação de amplificações usando as mesmas ou diferentes combinações de primeiro e de segundo iniciadores, podem ser combinados para aumentar a diversidade da biblioteca de genes.

Numa outra estratégia, o objectivo é clonar os genes codificando Vp e/ou V|__ de um reportório proporcionando um complemento de polinucleótido do reportório, tal como a cadeia anti-sentido d® ADN genómico ou o polinucleótido produzido sujeitando o ARNm a uma reacção de transcriptase inversa. Os métodos para produzir estes complementos são bem conhecidos na arte» 0 complemento é sujeito a uma reacção de extensão de iniciador, similar à reacção de extensão do segundo iniciador, descrita acima, i.e., uma reacção de extensão de iniciador usando um polinucleótido iniciador de síntese capaz de s® hibridar com uma sequência de nucleótidosconservada entre uma pluralidade de comprimentos de genes codificando Vpi diferentes.

A reacção de extensão de iniciador é realizada usando qualquer método adequado. Geralmente, realiza-se numa solução aquosa tamponada, preferivelmente, a um pH de 7-9, muito preferivelmente,de cerca de 8. Preferivelmente, mistura-se um excesso molar (para ácido nucleico genómico, usualmente,cerca de

026

SCR028SP

3410⁶=1, de iniciador:molde) do iniciador com o tampão, contendo a cadeia de molde. Prefere-se um grande excesso molar para melhorar a eficiência do processo.

Os trifosfatos de desoxirribonucleótído dATP, dCTP, dOTP e dTTP são, também, misturados com a mistura reaccional de extensão de iniciador (síntese de polinucleótidos) em quantidades adequadas s a solução resultante é aquecida a cerca de 9Q2C-1002C, durante cerca, de 1 a 10 minutos, preferivelmente, de 1 a 4 minutos. Após este período de aquecimento, deixa-se a solução arrefecer até à temperatura ambiente, que é preferível para a hibridação do iniciador.. À mistura arrefecida adiciona-se um agente apropriado, para induzir ou catalisar a reacção de extensão do iniciador, s deixa-se a reacção ocorrer sob condições conhecidas na arte, A reacção de síntese pode ocorrer a uma temperatura compreendida entre a temperatura ambiente e uma temperatura acima da qual o agente indutor já não funciona eficazmente,, Assim, por exemplo, se se usa ADN-polimerase como agente indutor, a temperatura não é, ©m geral superior a cerca de 402C, agente indutor pode ser qualquer composto ou sistema que funcionará para realizar a síntese de produtos de extensão de iniciador, incluindo enzimas. Enzimas adequadas para este propósito incluem, por exemplo, a ADN-polimerase de E..........coli, o fragmento Klenow de ADN-polimerase I de E.......coli, a ADN-polimerase

T4, outras ADN-polímerases disponíveis, a transcriptase inversa, e outras enzimas, incluindo enzimas estáveis ao calor, que facilitarão a combinação dos nucleótidos de uma. maneira adequada para formar os produtos de extensão de iniciador que são complementares com cada cadeia de ácido nucleico, Geralmente, a síntese será iniciada na extremidade 3’ de cada iniciador e prosseguirá na direcção 5’, ao longo da cadeia molde, até a síntese terminar, produzindo-se moléculas de comprimentos diferentes, Podem existir agentes indutores, contudo, que iniciem a síntese na extremidade 5’ e que prossigam na direcção anterior, usando o mesmo processo como se descreveu acima»

agente indutor pode ser também um composto ou sistema, que funcionará para realizar a síntese de produtos de extensão de iniciadores de ARN, incluindo as enzimas,. Em concretizações preferidas, o agente indutor pode ser uma ARN-polimerase dependente de ADN, tal como ARN-polimerase T7, ARN-polimerase T3 ou ARN-polimerase 8P6. Estas polimerases produzem um polinucleótido de ARN complementar. A elevada velocidade de regeneração (turn-over) da ARN polímeras© amplifica o polinucleótido de partida, tal como foi descrito por Chamberliri et al», The Enzymes, ed., P. Boyer, PP. 87-108, Academic Press, New York (1982). Outra vantagem da ARN-polimerase T7 consiste em se pode em introduzir mutações na síntese de polinucleótido, substituindo uma porção do ADNc por um ou mais oligodesoxinucleótidos (polinucleótidos) e transcrevendo directamente o molde, parcialmente desajustado tal como anteriormente -fbi descrito por Joyce et al., Nucleic......Acld Research, 17:711-722 (1989).

Se o agente indutor é uma ARN-polimerase dependente de ADN e, deste modo, incorpora trifosfatos de ribonucleótido, misturam-se quantidades suficientes de ATP, CTP, CTP e UTP com a mistura reaccional de extensão de iniciador e a solução resultante é tratada como se descreveu acima.

A cadeia acabada de sintetizar e a sua cadeia de ácido nucleico complementar formam uma molécula de cadeia dupla que pode ser usada nos passos seguintes do processo.

Pode-se usar, vantajosamente, a reacção de extensão do primeiro e/ou do segundo iniciador para incorporar, no receptor, um epitopo pré-seleceionado, útil na detecção e/ou isolamento, irnunológicos, de um receptor. Isto é realizado usando um primeiro e/ou segundo polinucleótido iniciador de síntese ou um vector de expressão, para incorporar uma sequência de resíduos aminoàcidos predeterminada na sequência de resíduos aminoàcidos do receptor.

Após produzir os homólogos de ADN codificando Vq e/ou V[ , para uma pluralidade de genes codificando Vq e/ou V|~ diferentes no repertório, tipicamente, os homólogos são amplificados. Enquanto que os homólogos de ADN codificando ^e/°^u V|,„ podem ser

026 8CR0285P

36amplificados por técnicas clássicas, tais como a incorporação num v e ctor de replicação autónoma, prefere-se amplificar em primeiro lugar os homólogos de ADN, sujeitando-os a uma reacção em cadeia com polimera.se (PCR) antes de os inserir num vector. De facto, em estratégias preferidas as reacções de extensão do primeiro e/ou segundo iniciador, usadas para produzir a biblioteca de genes, são as reacções de extensão do primeiro e do segundo inciador na reacção em cadeia com polímeras©.

A PCR é realizada, tipicamente, por ciclos i.e., realizando, simultaneamente, numa mistura, as reacçóes de extensão do primeiro e do segundo iniciador acima descritas, cada ciclo compreendendo a síntese de polinucleótidos seguida da desnaturação dos polinucleótidos de cadeia dupla formados. C)s métodos e os sistemas para amplificar um homólogo de ADN são descritos nas Patentes dos E.U.A. n2. 4 683 195 e n2. 4 683 202, ambas de Mullís et al..

Em concretizações amplificação, apenas se preferidas para cada usa um par de primeiro e reacção de de segundo iniciadores,, amplificação diferentes, iniciadores

Combinam-se depois obtidos de uma cada uma, usando diferentes.

os produtos pluralidade de uma pluralidade de reacção de amplif icaçoes de pares de

Contudo, o presente invento contempla também a produção de um homólogo de ADN por co-amplificação (usando dois pares de iniciadores) e amplificação multiplex (usando até cerca de 8, 9 ou 10 pares de iniciadores).

Os homólogos de ADN, codificando Vp e V|_, produzidos por amplificação de PCR estão, tipicamente, na forma de cadeia dupla e possuem, numa posição contígua ou adjacente a cada um dos seus terminais, uma sequência de nucleótidos definindo um sítio de restrição de ertdonuclease. A digestão dos homólogos de ADN, codificando Vp e Vp, possuindo sítios de restrição nos seus terminais ou próximo dos seus terminais, com uma ou mais endonucleases apropriadas resulta na produção de homólogos com terminais coesivos de especificidade predeterminada.

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-37Em concretizações preferidas, o processo de POR é usado, não apenas para amplificar os homólogos de ADN codificando Vp e/ou Vp da biblioteca, mas também, para induzir mutações na biblioteca e proporcionar assim uma biblioteca possuindo uma maior heterogeneidade. Em primeiro lugar, será de notar que o processo de PCR é, ele próprio, inerentemente, mutagénico, devido a urna variedade de factores bem conhecidos na arte. Em segundo lugar, para além da mutação, induzindo variações, descrita na Patente dos E.U.A. nS. 4 683 195 anteriormente referenciada, podem-se usar outras variações de PCR induzindo mutações. Por exemplo, a mistura reaccional de PCR, i.e., as misturas reaccionais combinadas de extensão do primeiro e do segundo iniciador, podem ser formadas com diferentes quantidades de um ou mais dos nucleótidos a serem incorporados no produto de extensão. Sob estas condições, a reacção de PCR prossegue para, produzir substituições de nucleótidos no produto de extensão como resultado da escassez de uma base particular. Similarmente, podem-se incorporar quantidades molares dos nucleótidos aproximadamente iguais, na mistura reaccional de PCR inicial, numa quantidade para desempenhar eficientemente, um número X de ciclos e, depois, para submeter a mistura a um número de ciclos em excesso de X, tal como, por exemplo, 2X. Alternativamente, as mutações podem ser induzidas durante a reacção de PCR incorporando, na. mistura reaccional, derivados de nucleótido, tais como inosina, que não se encontram, normalmente, nos ácidos nucleicos do reportório que está a ser amplificado. Durante a amplificação subsequente in vivo, o derivado de nucleótido será substituído por um nucleótido substituto induzindo uma mutação pontual.

4· Expressão......de......homólogos......de.....ADN......de......Vp e/ou......de......Vp

Os homólogos de ADN, codificando Vp e/ou Vp, contidos na biblioteca produzida pelo método acima descrito podem ser ligados operativamente a um vector para amplificação e/ou expressão»

Tal . como é aqui usado, o termo vector refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar, entre diferentes ambientes genéticos, outro ácido nucleico ao qual foi operativa71 026

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-38rnente ligada.,. Um tipo de vector preferido é um epissoma, i.e., uma molécula de ácido nucleico capaz de replicação extra-cromossómica, Os vectores preferidos são aqueles que são capazes de replicação autónoma e/ou expressão de ácidos nucleicos aos quais estão ligados. Os vectores capazes de dirigir a expressão de genes aos quais estão operativamente ligados são aqui designados por vectores de expressão.

escolha do vector ao qual o homólogo de ADN. codificando e/ou Vp está operativamente ligado depende, direetamente, como ê bem conhecido na arte, das propriedades funcionais desejadas, p.e., de replicação ou de expressão de proteína, e da célula hospedeira a ser transformada, sendo estas limitações inerentes à arte de construir moléculas de ADN recombinante.

Em concretizações preferidas, o vector utilizado inclui um replicão procariótico, i.e., uma sequência de ADN possuindo a capacidade de dirigir a replicação autónoma e a manutenção da molécula de ADN recombinante extra-cromossomicamente numa célula hospedeira procariótiea, tal como uma célula hospedeira baeteriana, com ela transformada. Estes replicões são bem conhecidos na arte. Adicionalmente, essas concretizações que incluem um replicão procariótico incluem também um gene cuja expressão confere uma vantagem selectiva, tal como resistência a drogas, a um hospedeiro bacteriano com ele transformado. Genes bacterianos, de resistência a drogas, típicos, incluem os que conferem resistência ã ampicilina ou à tetraciclina.

Os vectores que incluem um replicão procariótico podem também incluir um promotor procariótico capaz de dirigir a expressão (transcrição e tradução) dos homólogos codificando e/ou Vl numa célula hospedeira baeteriana , tal como E................coli, com ele transformada. Um promotor é um elemento de controlo de expressão, formado por uma sequência de ADN, que permite que a ligação de ARN-polimerase e a transcrição ocorram. As sequências de promotor compatíveis com hospedeiros bacterianos são, tipicamente, fornecidas em vectores plasmideo, contendo sítios de restrição convenientes para inserção de um segmento de ADN, do

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-39presente invento,. Exemplos típioos destes plasmídeos vectores incluem pUC8, pUC9, pBR322 e pBR329, disponíveis nos BioRad Laboratories, (Richmond, CA, E.U.A.) e pPL e pKK223, disponíveis de Pharmacia, (Piscataway, NJ, E.U.A»).

Podem-se também usar vectores de expressão compatíveis com células eucarióticas, preferivelmente, os compatíveis com células de vertebrados. Os vectores de expressão de células eucarióticas são bem conhecidos na arte e estão disponíveis em várias fontes comerciais. Tipicamente, estes vectores são fornecidos contendo os sítios de restrição convenientes para inserção dos homólogos de ADN desejados. Exemplos típicos destes vectores incluem pSVL e pKSV-10 (Pharmacia), pBPVrl/PML2d (International Biotechnologies, Inc.), e pTDTl (ATCC, NS„ 31255).

Em concretizações preferidas, os vectores de expressão de células eucarióticas incluem um marcador de seleeção que é eficaz numa célula eucariótica, preferivelmente, um marcador de seleeção de resistência a drogas. Um marcador de resistência a drogas preferido é o gene cuja expressão resulta na resistência à neomicina, i„e„, o gene da nsomicina-fosfotransferase (neo). Southern et al., J.......Mol. Appl.........Genet., 1*. 327-341 (1982).

É também contemplado o uso de vectores de expressão retrovirais para exprimir os genes dos homólogos de ADN codificando V|_j e/ou Vl» Tal como é aqui usado, o termo vector de expressão retroviral refere-se a uma molécula, de ADN que inclui uma sequência de promotor derivada da região de repetição terminal longa (LTR) de um genoma de retrovirus.

Em concretizações preferidas o vector de expressão é, tipicamente, um preferivelmente, vector de incompetente expressão retroviral que é, na replicação em células eucarióticas. A construção e o uso de vectores retrovirais foi descrita por Sorge et al,. , Mol. Cel..........Biol., 4::1730-1737 (1984).

Uma variedade de operativamente ADM í métodos foi desenvolvida para ligar vectores, via terminais coesivos complementares„ Por exemplo, os terminais coesivos complementares podem ser ligados por engenharia genética aos homólogos de ADN

026

SCR0285P

-4.0-

codificando Vp e/ou Vg, durante a reacção de extensão de iniciador, pelo uso de um polinucleótido iniciador de síntese, apropriadamente concebido, como anteriormente se discutiu, 0 vector, e se necessário o homólogo de ADN, é clivado com uma endonuclea.se de restrição para produzir terminais complementares dos do homólogo de ADN, Os terminais coesivos, complementares do vector ε do homólogo de ADN são, depois, ligados operativamente para produzir uma molécula d<

(unidos) unitária.

ADN de cadeia dupla preferidas, os homólogos de ADN diversas bibliotecas são combinados aleatoriamente in vitro para expressão policistrónica a partir dos vectores individuais, Isto é, produz-se uma população diversa de vectores de expressão de ADN de cadeia dupla, na qual cada vector exprime, sob o controlo de um único promotor, um homólogo de ADN codificando Vq e um homólogo de ADN codificando V(_, sendo a diversidade da população o resultado de diferentes combinações

Em concretizações codificando Vp e V[_ de de ADN codificando Vq e/ou V|_„ A combinação aleatória in vitro pode ser realizada usando dois vectores de expressão, distintos um do outro, pela localização, em cada um deles de um sítio de restrição comum a ambos. Preferivelmente, os de homólogos são ADN de cadeia dupla linear, tal como um vector vectores derivado vector,

-ligante, i.e,., 5’ terminal (a montante em relação à direcção de expressão) em relação ao poli-ligante, mas 3’ terminal (a jusante em relação à direcção de expressão). No segundo vector, o poli-ligante está localizado entre um promotor e o sítio de restrição, i.e,., o sítio de restrição está localizado 3’ terminal em relação ao poli-ligante, e o poli-ligante está localizado 3’ do Lambda Zap, tal como aqui se descreve, o sítio está localizado entre um promotor y

No primeiro e um politerminal em relação ao promotor.

Em concretizações preferidas, cada um dos vectores define uma sequência de nucleótidos codificando uma ligação de ribossoma e um líder, estando a sequência localizada entre o promotor e o poli-ligante, mas a jusante (3’ terminal) do sítio de restrição partilhado, se esse sítio está entre o promotor e o poli-ligante.

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Λ_/-41uma sequencia sequência tag

São também preferidos os vectores contendo um codão' de paragem a jusante do poli-ligante, mas a montante de qualquer sítio de restrição partilhado, se esse sítio está a jusante do poli·™ “ligante. 0 primeiro e/ou o segundo vector podem definir também de nucleótidos codificando um péptido tag. A está localizada, tipicamente a jusante do poli™

-ligante mas a montante de qualquer codão de paragem que possa estar presente. Em concretizações preferidas, os vectores contêm marcadores selsecionáveis de modo a que a presença de uma porção desse vector, i.e., de um braço lambda particular, possa ser seleccionada a favor ou seleccionado contra. Os marcadores seleccionáveis típicos são bem conhecidos dos peritos na arte» Exemplos destes marcadores incluem genes de resistência a antibióticos, marcadores seleccionáveis geneticamente, supressores de mutação, tais como supressores âmbar e similares. Os marcadores seleccionáveis estão localizados, tipicamente, a montante do promotor e/ou a jusante do segundo sítio de restrição» Em concretizações preferidas, um marcador seleccionável está localizado a montante do promotor no primeiro vector contendo os homólogos de ADN. codificando Vp„ Um segundo marcador seleccionável está localizado a jusante do segundo sítio de restrição no vector contendo os homólogos de ADN codificando Vç. Este segundo marcador seleccionável pode ser o mesmo ou diferente do primeiro, desde que, quando os vectores codificando Vp e os vectores codificando V|_m são combinados aleatoriamente através do primeiro sítio de restrição, os vectores resultantes contendo Vp e V|~ e ambos os marcadores seleccionáveis, possam ser seleccionados»

Tipicamente, o poli-ligante é uma sequência de nucleótidos que define um ou mais, preferivelmente, pelo menos dois, sítios de restrição, cada um único do vector e, preferivelmente, não partilhado pelo outro vector, i.e., se está presente no primeiro vector, não está presente no segundo vector. Os sítios de restrição do poli-ligante estão orientados de modo a permitir a ligação de homólogos de ADN codificando Vp ou Vp no vector na mesma cadeia de leitura que qualquer sequência líder, tag ou de

J

codão de paragem, presente»

A combinação aleatória é realizada ligando homólogos de ADN codificando no primeiro vector, tipicamente, num sitio ou em sítios de restrição no poli-ligante. Similarmente, os homólogos de ADN codificando V|~ são ligados no segundo vector, criando-se assim duas populações diversas de vectores de expressão. Não importa qual é o tipo de homólogo de 'ADN, i.e., Vjq ou que se liga a qual vector» mas prefere-se, por exemplo, que todos os homólogos de ADN codificando Vj~j estejam ligados, quer ao primeiro, quer ao segundo vector e que todos os homólogos de ADN codificando V|__ estejam ligados ao outro, do primeiro ou do segundo vector. Os membros de ambas as populações são depois clivados com uma endonuclease no sítio de restrição partilhado, tipicamente, digerindo ambas as populações com a mesma enzima» 0 produto resultante é duas populações diversas de fragmentos de restrição cujos membros de uma têm terminais coesivos complementares com os terminais coesivos dos membros da outra. Os fragmentos de restrição das duas populações são ligados aleatoriamente uns aos outros, i.e», realiza-se uma ligação, interpopulação, aleatória, para produzir uma população diversa de vectores, possuindo, cada um, um homólogo de ADN codificando V^ e codificando Vj~ na mesma cadeia de leitura e sob o controlo do promotor do segundo vector» Claro que se podem efectuar recombinações subsequentes por clivagem no sítio de restrição partilhado, que é, tipicamente, formado de novo, por ligação de membros das duas populações, seguida de re-ligações subsequentes»

A construção resultante é depois introduzida num hospedeiro apropriado para proporcionar amplificação s/ou expressão dos homólogos de ADN codificando Vq e/ou V^, quer separadamente, quer em combinação» Quando co-expressos no mesmo organismo, quer no mesmo, quer em vectores diferentes, produz-se um Fv funcionalmente activo. Quando se exprimem os polipéptidos e V|~ em organismos diferentes, os polipéptidos respectivos são isolados e depois combinados num meio apropriado para formar um Fv. Os hospedeiros celulares nos quais se introduziu uma construção contendo homólogo de ADN codificando Vq e/ou V|_, são aqui

-4371 026

SCR0285P referidos tes..

xZcomo tendo sido transformados ou como transformamA célula hospedeira pode ser quer procariótica quer eucariótica. As células bacterianas são células hospedeiras procarióticas preferidas e, tipicamente, são uma estirpe de E.

coli tal como, por exemplo, E.........coli da estirpe DH5 disponível nos

Bethesda Research Laboratories, Inc., Bethesda, MD, E.U.A.. As células hospedeiras procarióticas preferidas incluem células de levedura e de mamífero, preferivelmente, células de vertebrado tais como as de linhas de células de ratinho, de ratazana, de macaco ou humanas.

A transformação de hospedeiros célulãraapropriadas com uma molécula de ADN recomfoinante do presente invento é realizada por métodos que, tipicamente, dependem do tipo de vector usado. Em relação à transformação de células hospedeiras procarióticas.

ver por exemplo.

Cohen al

Proc.Natl Acad,....................Sei.,

USA, 69:2110 (1972); Laboratory............Manual., e Maniatis et al Cold Spririg Harfoor

Molecular Clonings A

NY, E.U.A., (1982). Em relação à transformação de células de vertebrado com vectores retrovirais contendo ADNr, ver, por exemplo, Sorge et al., Mol.

Ce 11, Bi0.1,,.., 4:1730-1737 (1984); Gr ah am et a 1. , Viro.1...,., 52:456 (1973); e Wigler et al., Proc.Natl,.......Acad........Sei.. USA, 76:1373-1376 (1976).

5. Pesquisa......paradeterminar......a expressão......de......polipéptidos......Vp e/ou.....Vi células transformadas com sucesso.

i.e..

as células

As contendo um homólogo de ADN codificando Vp e/ou Vp, ligado operativamente a um vector, podem ser identificadas por qualquer técnica adequada, bem conhecida para a detecção da ligação de um receptor a um ligando ou para detectar a presença polinucleótido codificando o receptor, preferivelmente, sítio aetivo,, Os ensaios de detecção preferidos incluem onde a ligação do ligando pelo receptor produz um detectável, quer directa, quer indirectamente. Estes de o

um eu aqueles sinal sinais incluem, por exemplo, a produção de um complexo, a formação de um

J

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SCR0285P

produto de reacção catalítica, a libertação ou a incorporação de energia e similares.. Por exemplo, podem-se clonar células de uma população sujeita a transformação com um dado ADNr para produzir colónias monoclonais. As células que formam essas colónias podem ser colhidas, lisadas e pode-se examinar o seu conteúdo em ADN quanto à presença do ADNr usando um método tal como o descrito por Southern, J........Mol.......Biol„ 98:7503 (1975) ou Berent et al.,

Bioteçh. 3:208 (1985).

Para além de pesquisar directamente homólogo de ADN codificando Vp e/ou Vp, a sucedida pode ser confirmada por métodos a presença de um transformação bem imunológicas bem

Vp e/ou Vp Por exemplo, terem sido conhecidos, especialmente, quando os polipéptidos produzidos contêm um epítopo pré-seleccionado„ testam-se amostras de células, suspeitas de transformadas, quanto à presença do epítopo pré-seleccionado, usando um anticorpo contra o epítopo»

6. Bibliotecas......de genes......codificando......Vp......e/ou......Vp presente invento contempla uma biblioteca de genes, preferivelmente, produzida por uma reacção de extensão de iniciador ou por uma combinação de reacções de extensão de iniciadores, tal como aqui se descreve, contendo pelo menos cerca de IO³, preferivelmente, pelo menos cerca de 10⁴ e, mais preferivelmente, pelo menos, cerca de 10^ homólogos de ADN diferentes codificando Vp e/ou Vp» Os homólogos estão, preferivelmente, numa forma isolada, isto é, substancialmente isenta de materiais tais como, por exemplo, agentes e/ou substratos de reacção de extensão, de iniciador, de segmentos de ADN genómico e similares»

Em concretizações preferidas, uma porção substancial dos homólogos presentes na biblioteca estão ligados operativamente a um vector, preferivelmente, ligados operativamente para expressão a um vector de expressão.

Preferivelmente, os homólogos estão presentes num meio adequado para, manipulação in vi tro., tal como água, água contendo sais tamponantes e similares. 0 meio deverá ser compatível com a

J

026 SCR02Q5P

-45manutenção da actividade biológica dos homólogos. Adicionalmente, os homólogos deverão estar presentes numa concentração suficiente para permitir a transformação de uma célula hospedeira com eles compatível, com frequências razoáveis.

Prefere-se, ainda, que os homólogos estejam presentes em células hospedeiras transformadas com eles compatíveis,

D- Vectores de expressão presente invento contempla também vários vectores de expressão úteis na realização inter alia dos processos do presente invento, Cada um dos vectores de expressão é um novo derivado do Lambda Zap.

- Lambda.......Z ap.......II

Lambda Zap 11 é preparado substituindo o gene Lambda S do vector Lambda Zap pelo gene Lambda 8 do vector Lambda gtlO, tal como se descreve no Exemplo 6,

2. Lambda.......Zap.......11 Vp

Lambda Zap II Vq é preparado inserindo as sequências ADN. sintético, ilustradas na Figura 6A, no vector Lambda Zap nucleótidos inserida ligação de ribossoma d s

II acima descrito, A sequência de proporciona, vantajosamente, um sítio (sequência de Shins-Dalgarno) para permitir a imitação adequada da tradução de ARNm em proteína, e uma sequência lider para dirigir eficazmente a proteína traduzida para o periplasma, A preparação do Lambda Zap II Vj.-i ® descrita, com mais detalhe, no Exemplo 9, e as suas características são ilustradas nas figuras 6A e 7.

3. Lambda......Zap.....II......V_L □ Lambda Zap II V| é preparado como s© descreve no Exemplo 12 inserindo, no Lambda Zap II, a sequência de ADN sintético, ilustrada na Figura 6B. As características importantes do Lambda Zap II Vi estão ilustradas na Figura 8»

J

026 8CR0285P

46Exemplo sintético

4. Lambda Zap.......II......V|__ II

Lambda Zap II V|_ II é preparado como se descreve 11, inserindo, no Lambda Zap II, a sequência de , ilustrada na Figura 10.

no

ADN

Os vectores acima descritos são compatíveis com hospedeiros

E...............colii.e.., podem exprimir, para secreção para o periplasma, proteínas codificadas por genes aos quais foram ligados operativamente para expressão.

Exemplos

Pretende-se que os exemplos seguintes ilustrem mas não limitem o âmbito do presente invento.

1“ Sslecçao......de......polinucleótidos

As sequências de nucleótidos codificando CDR’s de proteína de imunoglobulina são altamente variáveis. Contudo, existem várias regiões ds sequências conservadas que flanqueam os domínios Vq. Por exemplo, contêm sequências de nucleótidos substancialmente conservadas, i.e., sequências que se ' hibridarão com a mesma .sequência de iniciador. Deste modo, construiram-se polinucleótidos iniciadores de síntese (amplificação) que se hibridam com as sequências conservadas e que incorporam sítios de restrição, no homólogo de ADN produzido, que são adequados para ligar, operativamente, os fragmentos de ADN sintetizados a um vector. Mais especificamente, inseriram-se os homólogos de ADN no vector Lambda Zap 11 (Stratagene Cloning System, San Diego, CA, E.U.A.) nos sítios Xho I e EcoR I. Para amplificação dos domínios Vj„i, o iniciador 3’ (iniciador 12 da Tabela 1) foi concebido para ser complementar com o ARNm na região Jq. Em todos os casos, os iniciadores 5’ (iniciadores 1-10, Tabela 1) foram escolhidos para serem complementares com a primeira cadeia de ADNc na região do terminal N conservada (cadeia anti-sentido). Inicialmente a amplificação foi realizada com uma mistura de 32 iniciadores (iniciador 1, Tabela 1) que eram degenerados em cinco posições. 0 ARNm de hibridoma pôde ser amplificado com iniciadores mistos,

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mas as tentativas iniciais para amplificar o ARNm d® baço conduziram a resultados variáveis. Deste modo, compararam-se várias alternativas de amplificação usando os iniciadores 5’ mistos.

A primeira alternativa consistiu em construir múltiplos iniciadores únicos, oito dos quais se mostram na Tabela 1, correspondentes aos membros individuais do lote de iniciadores mistos. Os iniciadores individuais 2-9 da Tabela construídos incorporando qualquer dos dois nucleótidos em três das cinco posiçóes degeneradas.

foram possíveis

A segunda alternativa consistiu em construir um iniciador contendo inosina (iniciador 10, (Tabela 1) em quatro das posiçóes variáveis com base no trabalho, publicado, de Takahashi, et al., .Proc...........Natl.Acad.........Sei........(U.S...A,J., 82:1931-1935, (1985) e Ohtsuka et al., J...........Biol........Chem., 260: 2605-2608, (1985),. Este iniciador tem a vantagem de não ser degenerado e, ao mesmo tempo, minimiza os efeitos negativos de não ajustamento nas posiçóes não conservadas, tal como discutido por Martin et al., Nuc..........Aclds

Res., 13:8927 (1985). Contudo, não se sabia se a presença de nucleótidos de inosina resultaria na incorporação de sequências não desejadas nas regiões Vp elonadas. Deste modo, a inosina não foi incluída na única posição que permanece nos fragmentos amplificados após a clivagem dos sítios de restrição. Como resultado, a inosina não estava presente na inserção clonada.

Conceberam-se iniciadores de amplificação Vp, adicionais, incluindo o iniciador 3’ único para serem complementares com uma porção do primeiro domínio da região constante do ARNm de cadeia pesada gama 1 (iniciadores 15 e 16, Tabela 1). Estes iniciadores produzirão homólogos de ADM contendo polinucleótidos, codificando aminoáeidos dos domínios Vp e da primeira região constante, da cadeia pesada. Estes homólogos de ADN podem, deste modo,ser usados para produzir fragmentos Fab em vez de um Fy» concebidos classe de

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Contemplam-se iniciadores 3’ adicionais, únicos, para se hibridarem com regiões similares de outra cadeia pesada de imunoglobulinas tais como IgM,

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7.1 026

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Contemplam-se também os iniciadores 3’ que se hibridam com uma região especifica de uma classe específica de região constante CH^ e que são adaptados para transferir os domínios Vp amplificados usando este iniciador para um vector de expressão capaz de exprimir esses domínios Vp com uma classe diferente de região constante de cadeia pesada e leve.

Como controlo para amplificação, a partir de ARNm de baço ou de hibridoma, constru-iu-se um conjunto de iniciadores que se hibridam com uma região altamente conservada rio gene de cadeia pesada, da região constante de IgG. 0 iniciador 5’ (iniciador 11, Tabela 1) é complementar do ADNc na região Cp2 enquanto que o iniciador 3’ (iniciador 13, Tabela 1) é complementar com o ARNm na região Cp3. Crê-se que não existiam desajustamentos entre estes iniciadores e os seus moldes.

As sequências de nucleótidos codificando as CDR de Vp altamente variáveis. Contudo, existem várias regiões conservadas que flanqueiam os as regiões Jp, estrutura líder/promotor Vp. Deste modo, construiram-se iniciadores amplificação que se hibridam com as sequências conservadas incorporam sítios de restrição sequências incluindo domínios CDR de (framework) Vp a clonação sao de

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de que permitem fragmentos amplificados no vector pBluescript SK-, cortado com Nco I e Spe I. Para amplificação dos domínios CDR de Vp, o iniciador 3’ (iniciador 14 na Tabela 1) foi concebido para ser complementar com o ARNm nas regiões Jp. 0 iniciador 5^a (iniciador 15, Tabela 1) foi escolhido para ser complementar do ADN da primeira cadeia na região do terminal N conservada (cadeia anti-sentido)„

Concebeu-se um segundo conjunto de iniciadores de amplificação para amplificação dos domínios CDR Vp, iniciadores 5’ (iniciadores 1-8 na Tabela 2), para serem complementares com o ADNc da primeira cadeia na região do terminal N conservada. Estes iniciadores introduziram também um sítio de endonuclease de restrição Sac 1 para permitir que o homólogo de ADN de Vp fosse clonado no vector de expressão Vp II» O iniciador 3’ de

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-49amplificação de Vp (iniciador 9 na Tabela 2) foi concebido para ser complementar com o ARNm nas regiões Jp ® para introduzir o sítio de endonuclease de restrição Xba I requerido para inserir o homólogo de ADN de Vç no vector de expressão II (Figura a).

Conceberam-se ad i c i o na i s, par s. kappa ou lambda iniciadores 3’ de amplificação de Vp se hibridarem com a região constante do ARNm (iniciadores 10 e 11 na Tabela 2). Estes iniciadores permitem que se produza um homólogo de ADN, contendo sequências de polinucleótidos codificando os aminoáeidos da região constante da cadeia kappa ou lambda. Estes iniciadores tornam possível produzir um fragmento Fab em vez de um Fy.

Pelo menos na Tabela 2, mostram-se os iniciadores usados para a amplificação de sequências de cadeia leve kappa, para construção de Fab. A amplificação com estes iniciadores foi realizada em 5 reacções separadas, cada uma contendo um dos iniciadores 5’ (iniciadores 3-6 e 12) e um dos iniciadores 3’ (iniciador 13),. 0 iniciador 3’ restante (iniciador 9) foi usado para construir fragmentos Fy. Os iniciadores 5’ contêm um sítio de restrição Sac I e os iniciadores 3’ contêm um sítio de restrição Xba I.

Pelo menos na Tabela 1, mostram-se os iniciadores usados para amplificação de fragmentos Fd de cadeia pesada, para a construção de Fab, A amplificação foi realizada em oito reacções separadas, cada uma contendo um dos iniciadores 5’ (iniciadores 2-9) e um dos iniciadores 3’ (iniciador 15), Os iniciadores 5’ restantes foram usados para a amplificação numa única reacção e são, quer um iniciador degenerado (iniciador 1) quer um iniciador que incorpora inosina em quatro posições degeneradas (iniciador 10, Tabela 1, e iniciadores 17 e 18, Tabela 2). 0 iniciador 3’ restante (iniciador 14, Tabela 2) foi usado para construir fragmentos Fy,. Muitos dos iniciadores 5^? incorporam um sítio Xho 1, e os iniciadores 3’ incorporam um sítio de restrição Spe 1.

Na Tabela 2 mostram-se os iniciadores de amplificação de Vjq concebidos para amplificar regiões variáveis de cadeia pesada humanas. Um dos iniciadores 5’ de cadeia pesada contém resíduos

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-50J£r ^^^***J)|I* inosina em posiçSes de nucleótidos degeneradas permitindo que um único iniciador se hibride com um grande número de sequências de região variável. Ma Tabela 2 mostram-se também os iniciadores concebidos para se hibridarem com as sequências da região constante de vários ARNm de IgG.

Na Tabela 2 mostram-se também os iniciadores de amplificação de Vp concebidos para amplificar regiões variáveis, de cadeia leve, humanas, de ambos os isotipos lambda e kappa.

Todos os iniciadores © polinucleótidos sintéticos aqui usados e que se mostram nas Tabelas 1-4 ou foram adquiridos no Research Genetics em Huntsville, Alabama, E.U.A. ou foram sintetizados num sintetizador de ADN da Applied Biosystems, modelo 3S1A, usando as instruções do fabricante,

SEGUEM-SE TABELAS 1 e 2

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-562,. Produção de.....um......reportório......codificando......Vq......enriquecido............em proteínas.....que......se.......ligam......ao.....FITC isotioclanato de fluoresceína (FITO) foi seleccionado como ligando para a ligação a receptor. Decidiu-se ainda enriquecer, por imunização, o reportório de genes imunológicos, i.e„, repertórios receptores hemocianina de genes codificando Vq e Vq, em genes codificando anti-FITC. Isto foi realizado ligando FITC a de lapa Fissurella( KLH) usando as técnicas descritas em Antibodies......A......Laboratory......Manual.. Harlow e Lowe, eds., Cold

Spririg Harfoor, NY, E.U.A. (1988), Resumidamente, adicionaram-se 10 miligramas (mg) de hemocianina de lapa Fissurela e 0,5 mg de FITC a 1 ml de tampão contendo carbonato de sódio 0,1 M a pH 9,6, e agitou-se durante 18 a 24 horas a 4 graus 0 (42C). 0 FITC não ligado foi removido por filtração de gel através de Sephadex 0-25.

Preparou-se o

KLH-FITC para injecção de conjugado de ratinhos adicionando 100 ug do conjugado a 250 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS), Adicionou-se igual volume de adjuvante de Freund completo e emulsionou-se toda a solução durante 5 minutos» Injectou-se um ratinho 129 Θχχψ com 300 ul da emulsão» As injecções foram administradas subeutaneaments, em vários locais, usando uma agulha calibre 21. Duas semanas mais tarde administrou-se uma segunda imunização com KLH-FITC. Esta injecção foi preparada como se segue. Diluiram-se 50 ng de KLH-FITC em 250 u.1 de PBS e com esta solução de KLH-FITC misturou-se injectado urna agulha ratinho f ox um volume igual de alúmem.

intraperitonealmente com 500 u.1 da solução, usando calibre 23, Um mês mais tarde, aos ratinhos, foi administrada uma injecção final de 50 wg do conjugado KLH-FITC diluídos até 200 wl em PBS» Esta injecção foi administrada intravenosamente, na veia lateral da cauda, usando uma agulha de calibre 30. Cinco dias após esta injecção final os ratinhos foram, sacrificados e isolou-se o ARN celular total dos seus baços.

Cultivou-se o hibridoma PCP 8D11, produzindo um anticorpo imuno-específico para o éster de fosfonato, em meio DMEM (Qibco

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Laboratories Granei Island, New York, E.U.A.) contendo 10 por cento de soro de vitelo fetal, suplementado com penicilina e estreptomieina» Recolheram-se cerca de 5x10® células de hibridorna e lavaram-se duas vezes em solução salina tamponada com fosfato. 0 ARN celular total foi preparado a partir destas células de hibridorna isoladas.

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3- Preparação de.....um......reportório.....de.....genes codificando......Vjq

ARN celular total foi preparado a partir do baço de único ratinho imunizado com KLH-FITC, como se descreveu Exemplo 2, usando os métodos de preparação de ARN descritos

Chomczynski et a1., Anal........giochem, 162:156-159 (1987) usando instruções do fabricante e o conjunto experimental isolamento de ARN, produzido por Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA. Resumidamente, imediatamente após a remoção do baço do imunizado, o tecido foi homogeneizado em 10 ml de desnaturante, contendo isotiocianato de guanina 4,0 citrato de sódio (0,25 N) a pH 7,0 e 2-mercaptoetanol 0,1 usando um homogeneizador de vidro. Com o baço homogeneizado misturou-se 1 ml de solução de acetato de sódio a uma comcentração de 2 M a pH 4,0. Com a solução desnaturante, contendo o baço homogeneizado, misturou-se também um ml de fenol que tinha sido previamente saturado com H2O. A este homogeneizado adicionaram-se 2 ml de uma mistura de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1 v/v).

Agitou-se vigorosamente o homogeneizado durante dez segundos © manteve-se em gelo durante 15 minutos,. 0 homogeneizado foi depois transferido para um tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml, de parede espessa (Fisher Scientific Company, Pittsburg, solução foi centrifugada a 10 000 x g durante 42C» A fase aquosa superior, contendo ARN,' transferida para um tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml, novo, e misturada com um volume igual de álcool isopropílico. Esta solução foi mantida a -202C durante pelo menos uma hora para precipitar o ARN. A solução contendo o ARN precipitado foi centrifugada a 10 000 x g durante vinte minutos a 42C, 0 ARN celular total sedimentado foi recolhido e dissolvido em 3 ml da solução desnaturante descrita acima. Ao ARN celular total.

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ressuspendido, adicionaram-se 3 ml de álcool isopropílico e agitou-se vigorosamente. Esta solução foi mantida a -202C durante pelo menos 1 hora, para precipitar o ARN. A solução, contendo o ARN precipitado, foi centrifugada a 10 000 x g durante dez minutos a 420. 0 ARN sedimentado foi lavado uma vez com uma solução contendo etanol a 75¾. 0 ARN sedimentado foi seco sob vácuo, durante 15 minutos, e depois suspenso de novo em H2O tratada com pirocarbonato de dimetilo (DEPC), (H2O-DEPC).

ARN mensageiro (ARNm) enriquecido em sequências contendo tractos poli A longos foi preparado a partir do ARN celular total usando métodos descri tos em Molecular.............Cloning...........A_.........Laboratory

Manual, Maniatis et al., eds», Cold Spring Harbor, NY, E.U.A. (1982). Resumidamente, ressuspendeu-se metade do ARN total, isolado a partir do baço de um único ratinho imunizado, em um ml de H2O-DEPC e manteve-se a. 652C durante cinco minutos» Ao ARN em suspensão adicionou-se um ml de tampão com uma carga de sais duas vezes mais elevada, consistindo de Tris-HCl 100 mM, cloreto d© sódio 1 M, ácido etilenodiaminatetraacético dissódico (EDTA) 2,0 mM a pH 7,5 e 0,2¾ de dodecilsulfato de sódio (SDS) e deixou-se a mistura arrefecer até à temperatura ambiente. Depois, aplicou-se a mistura a uma coluna de oligo-dT (Tipo 2 ou Tipo 3 da Collaborative Research) que tinha sido previamente preparada lavando o oligo-dT com uma solução contendo hidróxido de sódio 0,1 M e EDTA 5 mM e, depois, equilibrando a coluna com H20-DEPC» 0 eluido foi recolhido num tubo esterilizado de polipropileno e aplicado de novo à mesma coluna após aquecimento do eluido durante 5 minutos a 6520. A coluna de oligo-dT foi depois lavada com 2 ml de tampão com uma elevada carga de sais consistindo de Tris-HCl 50 mM a pH 7,5, cloreto de sódio 500 mM, EDTA 1 mM a pH 7,5 e 0,1¾ de SDS. A coluna de oligo-dT foi depois lavada com 2 ml de um tampão de médio teor em sais 1 X consistindo de Tris-HCl 50 mM a pH 7,5, cloreto de sódio 100 mM, EDTA 1 mM e 0,1¾ de SDS» 0 ARN mensageiro foi eluido da coluna de oligo-dT com 1 ml de tampão consistindo de Tris-HCl 10 mM a pH 7,5, EDTA 1 mM a pH 7,5 e 0,05¾ de SDS. 0 ARN mensageiro foi purificado por extracção desta solução com fenol/clorofórmio, seguida por uma extracção simples com

J

026 8CR0285P

-59clorofórmio a 100¾. 0 ARN mensageiro foi concentrado pitação em etanol, e ressuspendido em H2O-DEPC»

por prsci0 ARN mensageiro isolado pelo processo anterior contém uma pluralidade de polinucleótidos codificando V[~j diferentes, i.e., mais do que cerca de 10^ genes codificando diferentes.

4- Preparaçãode um......polinucleótido......çodifiçando.......um único......Vj^

Os polinucleótidos codificando um único V|q foram isolados de acordo com o Exemplo 3 com a excepção de o ARN celular total ter sido extraído de células de hibridoma monoclonais preparadas no Exemplo 2. Os polinucleótidos isolados deste modo codificam um único Vpp

5. Preparação......de Homólogo de......ADN.

Na preparação para amplificação por PCR, o ARNm, preparado de acordo com os exemplos anteriores, foi usado como molde para a síntese de ADNc por uma reacção de extensão de iniciador. Tipicamente, numa mistura reaccional de transcrição de 50 ul, em primeiro lugar, hibridaram-se (temperaram-se) 5-10 ng de ARNm de baço ou de hibridoma em água, com 500 ng (50,0 pmole) do iniciador 3’ de Vp (iniciador 12, Tabela 1) a 6520, durante 5 minutos. Subsequentemente, ajustou-se a mistura até uma concentração 1,5 mM de dATP, dCTP, dGTP e dTTP, 40 mM de Tris-HCI a pH 8,0_r8 mM de MgCl2, 50 mM de NaCl e 2 mM de espermidina. Adicionou-se transcriptase inversa de vírus de leucemia Moloney-Murina (Stratagene Cloning Systems), 26 unidades e manteve-se a solução durante 1 hora a 372C.

A amplificação por POR foi realizada num meio reaccional de 100 μ.1 contendo os produtos de reacção da transcriptase inversa (aproximadamente, 5 ng do híbrido ADNc/ARN), 300 ng de iniciador 3’ de V|j (iniciador 12 da Tabela 1), 300 ng de cada um dos iniciadores 5^? de (iniciadores 2-10 da Tabela 1), 200 mM de uma mistura de dNTP, 50 mM de KOI, 10 mM de Tris-HCI pH 8,3, 15 mM de MgCl2, 0,1¾ de gelatina e 2 unidades de ADN-polimerase Taq. A mistura foi espalhada conjuntamente com óleo mineral e

J

026 SCR0285P

envolveu desnaturação a 92SC durante 1 minuto, têmpera a 5220 durante 2 minutos e síntese ds polinucleótidos por extensão de iniciador (elongação) a 7220 durante 1,5 minutos» As amostras contendo homólogo de ADN codificando Vp amplificado foram extractadas duas vezes com fenol/clorofórmio, uma vez com clorofórmio, precipitadas com etanol e armazenadas a -7020 num meio 10 mM em Tris-HCl, (pH 7,5) e 1 mM em EDTA»

Como se mostra na Figura 3, faixas R17-R24.

usando iniciadores 5’ únicos (2-9, Tabela 1) conseguiu-se a síntese e a amplificação, eficientes, do homólogo de ADN codificando Vp a partir de ARNm de baço» Observa-se o ADNc amplificado (homólogo de ADN codificando Vp) como uma banda principal com o tamanho esperado (360 pb). As intensidades do polinucleótido, codificando Vp, amplificado, em fragmento de cada reacção, parecem ser similares, indicando que todos estes iniciadores são.

na iniciaçao da de de o

aproximadamente, igualmente eficientes amplificação» 0 rendimento e a qualidade da amplificação com estes iniciadores eram reprodutíveis» iniciador contendo inosina sintetizou também homólogos ADN, codificando Vp, amplificador, a partir de ARNm de baço, um modo reprodutível , conduzindo à produção do fragmento com tamanho esperado, de uma intensidade similar à de outros ADNc amplificados (Figura 4, faixa R16). Este resultado indicou que a presença de inosina permite também a síntese e a amplificação eficientes do homólogo de ADN, indicando claramente quão úteis são estes iniciadores na geração de uma pluralidade de homólogos de ADN codificando Vp» Os produtos de amplificação obtidos a partir dos iniciadores da região constante (iniciadores 11 e 13, Tabela 1) foram mais intensos indicando que a amplificação foi mais eficiente, possivelmente, em virtude de um maior grau de homologia entre o molde e os iniciadores (Figura 4, faixa R9). Com base nestes resultados, construiu-se uma biblioteca de genes codificando Vp a partir dos produtos de oito amplificações, cada uma realizada com um iniciador 5’ diferente» Misturaram-se porções iguais dos produtos de cada reacção de extensão de inici71 026

SCR0285P

-61ador e usou-se depois o produto misto para gerar uma de vectores contendo homólogos de ADN codificando Vq biblioteca

Os homólogos de ADN do Vç foram preparados a partir do ARNm purificado preparado como descrito acima, Ma preparação para amplificação por PCR, o ARNm preparado, de acordo com os exemplos acima, foi usado como molde para a síntese de ADNc. Tipicamente, numa mistura reaccional de transcrição de 50 pl, temperaram-se, em primeiro lugar 5-10 wg de ARNm de hibridoma ou de baço, em água, com 300 ng (50,0 pmole) do iniciador 3’ de (iniciador 14, Tabela 1), a 65ÔC durante cinco minutos. Subsequentemente ajustou-se a mistura a uma concentração 1,5 mH de dATP, dCTP, dGTP e dTTP, 40 mM de Tris-HCl a pH 8,0, 8 mM de MgCl₂, 50 mH de NaCl e 2 mM de espermidina. Adicionaram-se 26 unidades de transcriptase inversa de vírus de leucemia Moloney-Murina (Stratagene Cloning Systems) © manteve-se a solução durante 1

hora a 372C,	A amplificação por	PCR foi realizada numa	mistura
reaccional de	100	pl contendo,	aproximadamente, 5 pg	do	híbrido
de ADNc/ARN,	produzido como	se descreveu acima,	300	ng do
iniciador 3’	de	(iniciador 14 da. Tabela 1),	300	ng do
iniciador 5’	de	Vç (iniciador	15 da Tabela 1), 200	mM	de uma
mistura de dNTP,	50 mM de KC1,	10 mM de Tris-HCl, pH	8,3	, 15 mM

de MgCl₂, 0,1¾ de gelatina e 2 unidades de ADN-polimerase Taq. A mistura reaccional foi espalhada conjuntamente com óleo mineral e submetida a 40 ciclos de amplificação. Cada ciclo de amplificação envolveu desnaturação a 922C durante 1 minuto, têmpera a 5220 durante 2 minutos e elongação a 722C durante 1,5 minutos. As amostras amplificadas foram extractâdas duas vezes com fenol/clorofórmio, uma vez com clorofórmio, precipitadas em etanol e foram armazenadas a -7020' num meio 10 mM em Tris-HCl a pH 7,5 e 1 mM em EDTA,

6. Inserção de......Homólogos de ADN......em......vectores

Na preparação para clonação de uma biblioteca enriquecida em sequências de Vq, digeriram-se produtos amplificados por POR (2,5 mg/30 pl de meio 150 mM em NaCl, 8 mM em Tris-HCl (pH 7,5) 6 mM em MgSOq, 1 mM em DTT, 200 mg/ml de albumina de soro de bovino

026

SCR0285P

e EcoR I (10 U) e purificaram~se num gel de agarose a 1¾. Em experiências de elonação, que requereram uma mistura dos produtos das reacções de amplificação ul, concentração amplificação mas electroforese em (50 após Após PCR ,

ADN.

combinaram-se volumes iguais de 1-10 ug) de cada mistura reaccional, antes da digestão de restrição, gel do ARNm de baço, amplificado por digerido, excisou-se a região do gel contendo fragmentos de de, aproximadamente, 350 pb, electroeluiu-se para uma membrana de diálise, precípitou-se em etanol e ressuspendeu-se em meio 10 mM em Tris-HCl, pH 7,5 e 1 mM em EDTA, até uma concentração de 10 ng/wl. Ligaram-se, depois, quantidades equimolares do inserido, de um dia para o outro, a 52C, a 1 ug de vector Lambda Zap(^R) 11 (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, E.U.A.) previamente cortado por EcoR 1 e Xho 1» Uma porção da mistura de ligação (1 ul) foi empacotada durante 2 horas à temperatura ambiente usando extracto de empacotamento Sigapack Gold (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, E.U.A.) e o material empacotado foi colocado, em placa, em células hospedeiras Azuis XLl. Determinou-se que a biblioteca consistia em 2x10^ homólogos de Vp com menos do que 30¾ de produto residual não recomfoinante» do as sítios de capacidade fagomídeo permitindo o vector usado acima, o Lambda Zap 11, é um derivado que mantém todas incluindo 6

Lambda Zap original (ATCC # 40 298) características do Lambda Zap original, elonação únicos, expressão de proteínas de fusão, e a de excisar rapidamente o inserido na forma de um (Bluescript SK-) mas não tem a mutação SAM 100, crescimento em muitas estirpes Mão-Sup E, incluindo a Azul XLl. 0 Lambda Zap II foi construído como se descreve em Short et al.,

Nucleic............Acids......Res..., 16:7583-7600,

1988, mas substituindo o gene (pb)

Lambda 8 contido num fragmento de ADN de 4254 pares de bases produzido pela digestão do Lambda Zap com a enzima de restrição NcrT. Ests fragmento de ADN, de 4254 pb, foi substituído pelo fragmento de ADN de 4254 pb contendo o gene Lambda 8, isolado a partir do Lambda gtlO (ATCC $ 40 179), após digestão do vector com a enzima de restrição Ncol. 0 fragmento de ADN de 4254 pb,

026

SCR0285P

-63isolado a partir do lambda gt.10, foi ligado no vector Lambda Zap original, usando ADN-ligase T4 s protocolos convencionais, para estes procedimentos, descritos em Current Protocole.......in............Molecular

Biology, Ausubel et al., eds,., John Wiley and Sons, NY, E.U.A., 1987,.

Na preparação de clonação de uma biblioteca enriquecida em sequências Vj , digeriram-se 2 wg de produtos amplificados por PCR (2,5 mg/30 μ.1 ds meio 150 mM em NaCl, 8 mM em Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM em Mg804, 1 mM em DTT, 200 mg/ml de BSA) a 372C, com as enzimas de restrição Nco I (30 unidades) e Spe I (45 unidades). Os produtos amplificados por PCR digeridos foram purificados num gel de agarose a 1%, usando a técnica de electroeluição convencional descrita em Μ o 1 e cu 1 a r C lo ni n g......A Laboratory...........Manual,

Maniatis et al., eds,,, Cold Spring Harbor, NY, E.U.A. (1982). Resumidamente, após electroeluição em gel de produto amplificado por PCR digerido, excisou-se a região do gel contendo o fragmento de ADN, codificando Vp, com o tamanho apropriado, electroeluiu-se para uma membrana de diálise, precipitou-se com etanol e ressuspencteu-se, até uma concentração final de 10 ng por ml, numa solução contendo 10 mM de Tris-HCl, a um pH de 7,5 e 1 mM de EDTA.

Ligou-se uma quantidade molar igual de ADN, representando uma pluralidade de homólogos de ADN, codificando Vj~, diferentes, a um vector fagomideo pBluescript SK- que tinha sido previamente cortado com Nco I e Spe IUma porção da mistura de ligação foi transformada, usando as instruções do fabricante, em células competentes Epicuian......Coli Azuis XL1 (Stratagene Cloning Systems),

La Jolla, CA). Determinou-se que a biblioteca transformante consistia de 1,2 x 10^ unidades formando colónias/wg de homólogos de V_L, com menos do que 3¾ de produto residual não recombinante.

· Sequenciação________de........plasmídeos...........da............biblioteca............de..............ADNc codificando Vq

Para analisar os clones de fago Lambda Zap II, os clones foram excisados do Lambda Zap para plasmídeos, de acordo com as instruções do fabricante (Stratagene Cloning Systems, La Jolla,

026

SCR0285P “64“

CA, E.U.A.). Resumidamente, as placas de fago foram nucleadas em pratos de agar e transferidas para tubos de microcentrifugadora estéreis, contendo, 500 nl de um tampão 50 mM de Tris-HCl, a pH 7,5, 100 mM de NaCl, 10 mM de MgS04, e 0,01¾ de gelatina e 20 u.1 de clorofórmio.

Para as exeisões incubaram-se 200 pl da reserva de fago, 200 U.1 de células Azuis XL1 (A&00 = 1,00) e 1 u.l de fago auxiliar R408 (1 x 10^· ufp/ml), a 3720 durante 15 minutos. Os plasmideos excisados foram infectados em células Azuis XL1 e colocados em pratos de LB, contendo ampicilina. 0 ADN de cadeia dupla foi preparado a partir de células contendo o fagomideo de acordo com os métodos decritos por Holmes et al., Anal. Biochem., 114:193, (1981). Os clones foram, em primeiro lugar, pesquisados, relativamente às inserções de ADN, por digestão de restrição, quer com Pvu II, quer com Bgl 1 e os clones contendo o inserido putativo foram sequenciados, usando transcriptase inversa, de acordo com o método geral descrito por Sanger et al., Proc„Natl.

Acad...............Sei.,..........USA, 74:5463-5467, (1977) e com as modificações, específicas deste método, fornecidas nas instruções do fabricante no conjunto experimental de sequenciação com transcriptase inversa, AMV, usando ^^S-dATP, de Stratagene Cloning Systems, La

Jolla, CA, E.U.A..

Caracterização.....do......reportório......de......Yh......clonado

Os produtos amplificados que foram digeridos com Xho I e com EcoR I e clonados no Lambda ZAP, resultaram numa biblioteca de ADNc com 9,0 x 10^ ufp. De modo a confirmar que a biblioteca consistia de uma população diversa de homólogos de ADN codificando Vq, as 120 bases do terminal N de 18 clones, seleccionados ao acaso da biblioteca, foram excisadas e sequenciadas (Figura 5). Para determinar se os clones tinham origem no gene de Vq, as sequências clonadas foram comparadas com sequências de Vq e com sequências de V|~, conhecidas.. Os clones exibiram uma homologia de 80 a 90¾ com sequências com origem em cadeias pesadas conhecidas e uma pequena homologia com sequências com origem em cadeias leves, quando comparadas com as sequências

026

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-65disponíveis em Sequenoes of.......Proteins of.............Immunological..............Interest por Kabot et al,, 4th ed», U.S» Dept,. of Health and Human Sciences, (1987). Isto demonstra que a biblioteca foi enriquecida na sequência Vp desejada, de preferência relativamente a outras sequências tais corno as sequências de cadeia leve»

A diversidade da população foi determinada classificando os clones sequenciados em subgrupos pré-definidos (Figura 5)» As sequências de Vp de ratinho são classificadas em onze subgrupos (Figura 5), As sequências de Vp de ratinho são classificadas em onze subgrupos [I (A,13,), II (A,B,C), III (A,I3,C,D) V (A,13)] com base nas sequências de aminoáeidos da estrutura descritas em

Seque ......of......Pr o teins......of Immunological........Interest por Kabot et al.,

4th ed,, U.S. Dept. of Health and Human Sciences, (1987); Dildrop, Immunolqgy Today, 5:84, (1984); e Brodeur et al., Fur„

J...............Immunol,, 14; 922, (1984), A classificação dos clones sequenciados demonstrou que a biblioteca de ADNc continha sequências de Vp de, pelo menos, 7 subgrupos diferentes,, Adicionalmente, uma comparação, par a par, da homologia entre os clones sequenciados mostrou que não existiam duas sequências idênticas em todas as posições, sugerindo que a população é variada, na medida em que é possível caracterizá-la por análise e sequência»

Seis dos clones (L 36-50, Figura 5) pertencem à subclasse III B e tinham sequências de nucleótidos muito similares. Isto pode reflectir uma preponderância de ARNm derivado de um ou de vários genes variáveis relacionados em baço estimulado, mas os resultados não permitem põr de parte a possibilidade de uma tendência no processo de amplificação» . Construção.....do......vector.......de......expressão......de......Yp critério principal usado na escolha de um sistema de vector foi a necessidade de gerar o maior número de fragmentos Fab que pudesse ser pesquisado directamente. 0 lambda de bacteriofago foi seleccionado como vector de expressão por três razões» A primeira, é que o empacotamento in vitro do ADN de fago é o método mais eficiente de re-introduzir ADN nas células de

026

SCR0285P —66— hospedeiro, A segunda razão, é que é possível detectar a expressão de proteína ao nível de placas de fago simples. Por último, a pesquisa de bibliotecas de fago envolve, tipicamente, menos dificuldade com a ligação não específica. A alternativa, os vectores de clonaçao de plasmícteo são apenas vantajosos na. análise de clones após terem sido identificados» Esta vantagem não se perde no presente sistema devido ao uso do lambda Zap, permitindo, deste modo, a excisao de um plasmídeo contendo as inserções exprimindo a cadeia pesada, a cadeia leve ou o Fab.

Para exprimir a pluralidade de homólogos de ADN codificando um Vp numa célula hospedeira de E.........coli, construiu-se um vector que colocou os homólogos de ADN codificando o Vp na cadeia de leitura apropriada, forneceu urn sítio de ligação a ríbossomas tal como se descreve em Shine et al., Nature, 254:34, 1975, forneceu uma sequência líder para dirigir a proteína expressa para o espaço periplasmático, forneceu uma sequência de polinucleótidos que codificava um epítopo conhecido (epítopo tag) e forneceu também um polinucleótido que codificava uma proteína espaçadora entre o homólogo de ADN codificando Vp & o polinucleótido codificando o epítopo tag. Construiu-se uma sequência de ADN sintético, contendo todos os polinucleótidos e as características anteriores, concebendo segmentos de polinucleótidos de cadeia simples de 20-40 bases que se hibridam, umas com as outras, e formam a sequência de ADN sintético de cadeia dupla que se mostra na Figura 6. Na Tabela 3 mostram-se os polinucleótidos, de cadeia simples, individuais (N^-N^)Os polinucleótidos 2, 3, 9-4’, 11, 10-5’, 6, 7 e 8 foram quinasados adicionando 1 wl de cada polinucleótido (0,1 wg/wl) e 20 unidades de polinucleótido-quinase Tq a. uma solução contendo 70 mM de Tris-HCl, a pH 7,6, 10 mM de MgCl₂, 5 mM de DTT, 10 mM de 2 ME e 500 microgramas por ml de BSA. A solução foi mantida a 37SC durante 30 minutos e a reacção foi parada mantendo a solução a 6520 durante 10 minutos. Adicionaram-se os dois polinucleótidos restantes, 20 ng de polinucleótidos NI e de polinucleótidos N12, à solução reaccional de quinase, conjuntamente com um volume 1/10 de uma solução contendo 20,0 mM de Tris-HCl, a pH 7,4, 2,0 mM de

026

SCR0285P

-67MgCl2 8 50,0 mM de NaCl. Esta solução foi aquecida até 702C durante 5 minutos e deixou-se arrefecer até a temperatura ambiente, aproximadamente, 2520, durante 1,5 horas num copo de 500 ml de água. Durante este período de tempo todos os 10 polinucleótidos se ligaram para formar o inserido de ADM sintético, de cadeia dupla, que se mostra na Figura 6A. Os polinucleótidos individuais foram ligados covalentemente uns aos outros, para estabilizar o inserido de ADN sintético, adicionando 40 μ.1 da mistura reaccional anterior a uma solução contendo 50 rriM de Tris-HCl, a pH 7,5, 7 mM de MgCl2, 1 mM de DTT, 1 mM de trifosfato de adenosina ATP e 10 unidades de ADN-ligase T4. Esta solução foi mantida a 37ÔC durante 30 minutos e, depois, a ADN-ligase T4 foi desactivada mantendo a solução a 6520 durante 10 minutos. Os polinucleótidos restantes foram quinasados misturando 52 wl da mistura reaccional anterior, 4 μ.1 de uma solução contendo 10 mM de ATP e 5 unidades de polinucleótido-quinase T4. Esta solução foi mantida a 372C durante 30 minutos e, depois, a polinucleótido-quinase T4 foi desactivada mantendo a solução a 652C durante 10 minutos. 0 inserido de ADN sintético, completo, foi ligado directamente num vector lambda Zap II que tinha sido previamente digerido com as enzimas de restrição Not I e Xho I. A mistura de ligação foi empacotada, de acordo com as instruções do fabricante, usando extracto de empacotamento Oigapack II Gold disponível dos Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, E.U.A.. A mistura de ligação empacotada foi colocada em placa em células Azuis XL1 (Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA, E.U.A.). As placas de lambda Zap II individuais foram nucleadas e os inseridos foram excisados de acordo com o protocolo de excisão in vivo fornecido pelo fabricante, Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, E.U.A.. Este protocolo de excisão in vivo move o inserido clonado do vector lambda Zap II para um vector de plasmídeo para permitir a fácil manipulação e sequenciação. A exactidão dos passos de clonação anteriores foi confirmada por sequenciação do inserido usando o método do didesoxido de Sanger descrito em Sanger et al., Proc........Natl. Acad........Sei..........USA. 74:5463-5467, (1977) e usando as instruções do fabricante no conjunto de sequenciação de ^O'⁵S-ATP de transcriptase inversa, AMV, de

026

SCR0285P

-68“

Stratagene, Cloning Systems, La Jolla, CA, E.U.A»« A sequência do vector de expressão de Vp resultante é mostrada na Figura 6A e na Figura 7.

Nl)

N2)

N3)

N4)

N5)

Nó)

N7)

N8) N9-4) NU) N12) N10-5)

Tabela......3

5’ GGCCGCAAATTCTATTTCAAGGAGACAGTCAT 3’

5’ AATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATT 3³ 5’ GTTATTACTCGCTGCCCAACCAGCCATGGCCC 3’

5’ AGGTGAAACTGCTCGAGAATTCTAGACTAGGTTAATAG 3³ 5’ TCGACTATTAACTAGTCTAGAATTCTCGAG 3³ 5’ CAGTTTCACCTGGGCCATGGCTGGTTGGG 3’

5³ CAGCGAGTAATAACAATCCAGCGGCTGCCGTAGGCAATAG 3³ 5’ GTATTTCATTATGACTGTCTCCTTGAAATftGAATTTGC 3³ 5³ AGGT6AAACTGCTCGAGATTTCTAGACTAGTTACCCGTAC 3³ 5³ GACGTTCCGGACTACGGTTCTTAATAGAATTCG 3³ 5’ TCGACGAATTCTATTAAGAACCGTAGTC 3³ 5’ CGGAACGTCGTACGGGTAACTAGTCTAGAAATCTCGAG 3’

10- Construção......do......vector.......de expressão......de......V|_

Para exprimir a pluralidade de polinucleótidos codificando um Vl numa célula hospedeira de E........coli, construiu-se um vector, que colocou o polinucleótido codificando o V|_ na cadeia de leitura apropriado, forneceu um sítio de ligação a ribossomas tal como se descreve em Shine et al,., Na fure, 254:34, (1975), forneceu uma sequência líder que dirige a proteína expressa para o espaço periplasmático e forneceu também um polinucleótido, que codificava uma proteína espaçadora, entre o polinucleótido de νγ e o polinucleótido codificando o epítopo tag» Construiu-se uma sequência de ADN sintética contendo todos os polinucleótidos e as caracteristicas anteriores, concebendo segmentos de polinucleótidos de cadeia simples com 20-40 bases que se hibridam uns com os outros e que formam a sequência de ADN sintético, de cadeia dupla, que se mostra na Figura 613» Na Tabela 3 mostram-se os polinucleótidos, de cadeia simples, individuais (N^-Ng).

Os polinucleótidos N2, N3, N4, N6, N7 s N8 foram quinasados adicionando 1 ul de cada polinucleótido e 20 unidades de

026 SCR023SP

-69polinucleótido-quinase T4 a uma solução contendo 70 mM de Tris-HCl, a pH 7,6, 10 mM de MgCl₂, 5 mM de DTT, 10 mM de 2 ME e 500 microgramas por ml de BSA„ A solução foi mantida a 37ÔC durante 30 minutos e a reacção foi parada mantendo a solução a 652C durante 10 minutos. Os dois polinucleótidos restantes, 20 ng de polinucleótido® 1Μ1 e de polinucleótido® N5, foram adicionados á solução reaccional de quinase, conjuntamente com um volume 1/10 de uma solução contendo 20,0 mM de Tris-HCl, a pH 7,4, 2,0 mM de MgCl2 ® 50,0 mM de NaCl. Esta solução foi aquecida a 7020 durante 5 minutos e deixou-se arrefecer até à temperatura ambiente, aproximadamente 2520, durante 1,5 horas, num copo de 500 ml de água,. Durante este período de tempo todos os polinucleótidos se ligaram para formar o inserido de ADN sintético de cadeia dupla,. 0s polinucleótidos individuais foram ligados covalentemente, uns aos outros, para estabilizar o inserido de ADN sintético.

uma solução 1 mM de DTT, foi adicionando 40 ul da mistura reaccional anterior a contendo 50 μ,Μ de Tris-HCl, a pH 7,5, 7 rnM de MgCl₂ 1 mM de ATP e 10 unidades de ADN ligase T4„ Esta solução mantida a 372C durante 30 minutos e, depois, a ADN-ligase T4 desactivada mantendo a solução a 6520 durante 10 minutos,, foi

Os da mM polinucleótidos restantes foram quinasados misturando 52 ul mistura reaccional anterior, 4 ul de uma solução contendo 10 de ATP e 5 unidades de polinucleótido-quinase T4. Esta solução foi mantida a 3720 durante 30 minutos e, depois, a polinucleótido-quinase T4 foi desactivada mantendo a solução a 6520 durante 10 minutos,. 0 inserido de ADN sintético, completo, foi ligado directamente num vector lambda Zap II que tinha sido previamente digerido com as enzimas de restrição Not 1 e Xho 1. A mistura de ligação foi empacotada, de acordo com as instruções do fabricante, usando um extracto de empacotamento Gigapack II Gold, disponível no Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, E„U.A.. „ A mistura de ligação empacotada foi colocada em placa em células X.L1 Azuis (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, E„U„A.)„ As placas de lambda Zap II individuais foram nucleatías e os inseridos foram excisados de acordo com o protocolo de excisão, in vivo-, fornecido pelo fabricante, Strategene Cloning Systems, La Jolla, CA, E.U.A., e descrito em Short et al., Nucleic............Acids

026

SCR0285P

-70™

Res., 16:7583-7600, 1988. Este protocolo de ©xcisão in vivo move o inserido clonado do vector lambda 7ap XI para um vector de fagomídeo, para permitir a fácil manipulação © sequenciação, e produz também a versão de fagomídeo dos vectores de expressão de V|_. A exactidão dos passos de clonação anteriores foi confirmada por sequenciação do inserido usando o método do didesóxido de

S a n g e r descrito por Sanger et a 1., Proc. Natl. Acad,,..............Suai...............USA,

74:5463-5467, (1977) e usando as instruções do fabricante no conjunto de sequenciação, de ~^S-dATP de transcriptase inversa, AMV, de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, E.U.A.. Na Figura 6 e na Figura 8 mostra-se a sequência do vector de expressão de V|_ resultante.

vector de expressão de V^, usado para construir a biblioteca de V|_, foi o fagomídeo, produzido para permitir a determinação do ADN do vector de expressão de V[_. 0 fagomídeo foi produzido, como acima se descreve, detalhadamente, pelo processo de excisão in vivo a partir do vector de expressão Lambda Zap (Figura 8). A versão de fagomídeo deste vector foi usada devido ao sítio de enzima poder, assim, ser de restrição Nco I ser único, nesta versão, usado para ligar operativamente os homólogos de

ADN	de Vj
	11«
	Para
vL>	numa
que	colo
leitura

Construção......do......vector.....de......expressão Vi......II.

•opriada, forneceu um svtxo de ligaçao a ribossomas, como é descrito por Shine et al., Nature, 254:34, 1975, forneceu a sequência líder do gene Pel B, que tinha sido usada previament© com sucesso para segregar fragmentos Fab em E„ coli por Lei et al., J..........Bac., 169:4379 (1987) e Better et al., Science, 240:1041 (1988), e forneceu, também, um polinucleótido contendo um sítio de endonuclease de restrição para clonação. Construiu-se uma sequência de ADN sintético, contendo todos os polinucleótidos e car ac terá, s t i cas anteriores, concebendo segmentos de polinucleótidos de cadeia simples de 20-60 bases que se hibridam

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SCR0285P

-7170 mM de 5 mM de e 500 & solução foi uns com os outros e formam a sequência de ADN sintética de cadeia dupla que se mostra· na Figura 10. Na Tabela 4 mostra-se a sequência de cada um dos polinucleótidos, ds cadeia simples individuais (01-08) na sequência de ADN sintético de cadeia dupla,.

Os polinucleótidos 02, 03, 04, 05, 06 e 07 foram quinasados adicionando 1 wl (0,1 wg/wl) de cada polinucleótido e 20 unidades de polinucleótido-quinase T4 a uma solução contendo

Tris-HCl, a pH 7,6, 10 mM de cloreto de magnésio (Mgd.2), ditiotreitol (DTT), 10 mM de 2-mercaptoetanol (2 ME) microgramas por ml de albumina de soro de bovino mantida a 372C durante 30 minutos e a reacção foi parada mantendo a solução a 652C durante 10 minutos. Adicionaram-se 20 ng de cada um dos dois polinucleótidos restantes, 01 e 08, à solução reaccional de quinase anterior, conjuntamente com um volume 1/10 de uma solução contendo 20,0 mM de Tris-HCl, a pH 7,4, 2,0 mM ds

MgC1.2 e 15,0 mM de cloreto de sódio (NaCl), Esta solução foi aquecida até 702C durante 5 minutos e deixou-se arrefecer até à temperatura ambiente, aproximadamente 2S2C, durante 1,5 horas num copo de 500 ml de água. Durante este período de tempo todos os 8 polinucleótidos se ligaram para formar o inserido de ADN sintético, que se mostra, na Figura 9» Os polinucleótidos individuais foram ligados, covalentemsnte, uns aos outros, para estabilizar o inserido de ADN sintético, adicionando 40 wl mistura reaccional anterior a uma solução contendo 50 mM Tris-HCl, a pH 7,5, 7 mM de MgCl_2í 1 mM de DTT, 1 mM de ATP e unidades de ADN-ligase T4. Esta solução foi mantida a durante 30 minutos e, depois, desactivou-se mantendo a solução a 6520 durante 10 minutos restantes foram quinasados misturando 52 wl da mistura reaccional anterior, 4 wl de uma solução contendo 10 mM de ATP e 5 unidades de polinucleótido-quinase T4„ Esta solução foi mantida durante 30 minutos e, depois, a polinucleótido-quinase mantendo a solução a 652C durante 10 minutos. 0 ADN sintético, completo, foi ligado dírectamente num /'l ·£» de 10 37SC a ADN™liga.se 14 Os polipeptidos a 37SC T4 foi desactivada inserido de vector Lambda Zap 11 que tinha sido previamente digerido com os

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SCR0285P

enzimas de restrição Not I e Xho I. A mistura de ligação empacotada, de acordo com as instruções do fabricante, usando extracto de empacotamento Gigapack II Gold, disponível Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, E.U.A.. A mistura ligação empacotada foi colocada em placa em células Azuis (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, E.U.A»), As placas foi um da de

XL1

Lambda Zap II individuais foram nuoleadas © os inseridos foram excisados de acordo com o protocolo de excisão in vivo, fornecido pelo fabricante, Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, E.U.A.. Este protocolo de excisão in vivo move o inserido clonado do vector Lambda Zap II para um vector de plasmídeo para permitir a fácil manipulação e sequenciação. A exactidao dos passos de clonação anteriores foi confirmada pela sequenciação do inserido, usando as instruções do fabricante, no conjunto de sequenciação de (jg transcriptase inversa, AMV, da Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, E.U.A», Na Figura 9 s na Figura 11 mostra-se a sequência do vector de expressão de V|__ II, resultante.

TABELA 4

01)	5’
02)
03)	5’
04)	5’
05)	tz >
06)	53
07)	5’
08)	5’

12,

TGAATTCTAAACTAGTCGCCAAG6AGACAGTCAT

AATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATT 3’ GTTATTACTCGCTGCCCAACCAGCCATGGCC 3’ GAGCTCGTCAGTTCTAGAGTTAAGCGGCCG 3’ GTATTTCATTATGACTGTCTCCTTGGCGACTAGTTTAGAATTCAAGCT 3’

CAGCGAGTAATAACAATCCAGCGGCTGCCGTAGGCAATAG 3^:

TGACGAGCTCGGCCATGGCTGGTTGGG 3’ TCGACGGCCGCTTAACTCTAGAAC 3’

Construção......da.....Biblioteca......de Vq.....±......,Y.l

Para preparar uma biblioteca de expressão enriquecida nas sequências de Vq, prepararam-se homólogos de ADN enriquecidos em sequências de Vq, de acordo com o Exemplo 6, usando o mesmo conjunto de iniciadores 5’ mas com o iniciador 12A (Tabela 1) como iniciador 3’. Estes homólogos foram depois digeridos com os enzimas de restrição Xho 1 e Spe 1 e purificados num gel de

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SCR0285P

-73agarose a 1Λ, usando a técnica de electroeluição padrão descrita em Molecular.......Cloning......A......Laboratory Manual, Maniatis et al., eds.,

Cold Spring Harbor, NY, E.U.A, (1982)« Estes homólogos de ADN de Vp preparados foram depois inseridos directamente no vector de expressão de Vp que tinha sido previamente digerido com Xho 1 e Spe 1.

A mistura de ligação contendo os homólogos de ADN de Vp foi empacotada de acordo com as especificações do fabricante, usando o Extracto de Empacotamento Gigapack Cold II (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, E.U.A.). As bibliotecas ds expressão estavam então prontas para serem colocadas em placa em células XL1 Azuis,

Para preparar uma biblioteca enriquecida em sequências de Vp, prepararam-se produtos, amplificados por PCR, enriquecidos em sequências de Vp, de acordo com o Exemplo 6. Estes homólogos de ADN de Vp foram digeridos com os enzimas de restrição Nco I e Spe I. Os homólogos de ADN de Vp digeridos foram purificados num gel de agarose a 1¾ usando técnicas de electroeluição convencionais d e s c r i t as em Molecular.......Cl o n i n g.„. A.....Laboratory Manual, Maniatis e t al,, eds., Cold Spring Harbor, NY, E.U.A. (1982). Os homólogos de ADN de Vp preparados foram inseridos, directamente, no vector de expressão de Vp que tinha sido previamente digerido com os enzimas de restrição Nco 1 e Spe I, Usou-se a mistura de ligação, contendo os homólogos de ADM de Vp, para transformar células competentes XL-1 azuis usando as instruções do fabricante (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, E.U.A.),.

13. Inserção......dos Homólogos de ADMcodificandoV| novector de......expressão......de......Vp

Na preparação, para clonação, de uma biblioteca enriquecida em sequências de Vp, digeriram-se os produtos amplificados por PCR (2,5 pg/30 μ.1 de meio contendo 150 mM ds NaCl, 8 mM de Tris-HC1 (pH 7,5), 6 mM de MgS0₄, 1 mM de DTT, 200 ng/ml de BSA) a 372C, com os enzimas de restrição Sac 1 (125 unidades) e Xfoa I (125 unidades) e purificaram-se num gel de agarose a 1¾. Nas experiências de clonação que requereram uma mistura dos produtos

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SCR0285P

-74das reacções de amplificação, combinaram-se volumes iguais (50 wl, concentração de 1-10 ug) de cada mistura reaccional, após a amplificação mas antes da disgestão de restrição. Após eleetroforese em gel do ARNm de baço, amplificado por PCR, digerido, a região do gel, contendo fragmentos de ADN de aproximadamente 350 pb, foi excisada, electroeluída para uma membrana de diálise, precipitada com etanol e ressuspendida numa solução de TE contendo 10 mM de Tris-HCl, pH 7,5, e 1 mM de EDTA, até uma concentração final de 50 ng/u.1.

vector de ADN de expressão de V(_ H foi preparado para clonação, misturando 100 ug deste ADN, com uma solução contendo

250 unidades de cada uma das endonucleases de restrição Sac I

Xba I (ambas da Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, E.U.A.) e um tampão recomendado pelo fabricante»

Esta solução foi mantida a 37ÔC durante 1,5 horas. A solução foi aquecida e n d onuclsases a 6520, durante 15 minutos,, para desactivar as de restrição. A solução foi arrefecida até 302C e misturaram-se, com a solução, 25 unidades de fosfatase desactivãvel pelo calor (HKI (Epicenter, Madison, WI) e CaC1.2, de acordo com as especificações do fabricante. Esta solução foi mantida a 302C durante 1 hora. 0 ADN foi purificado, extraindo a solução com uma mistura de fenol e de clorofórmio seguindo-se a precipitação com etanol, 0 vector de expressão V[_ II estava agora pron.to para ligação aos homólogos de ADN de Vj_, exemplos anteriores.

preparados nos

Os homólogos de ADN/ enriquecidos em sequências V^, foram preparados de acordo com o Exemplo 5 mas usando um iniciador 5’ de cadeia leve e um iniciador 3’ de cadeia leve, que se mostram na Tabela 2. As reacções de amplificação individuais foram realizadas usando cada um dos iniciadores 5’ de cadeia leve em combinação com o iniciador 3’ de cadeia leve. Estas misturas reaccionais separadas, contendo homólogo de foram misturadas e digeridas com as endonucleases de restrição Sac I e Xba I, de acordo com o Exemplo 6. Os homólogos de V|~ fo^am purificados, num gel de agarose a 1¾ usando a técnica de electroeluição

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SCR0285P

c ο η ν eηci o na1 descrito ©m Molecular Cloning A......Laboratory Manual,

Maniatis et al., eds., Cold Spring Harbor, NY, E.U.A. (1982). Estes homólogos de ADN de Vq preparados foram depois inseridos, directamente, no vector de expressão \<j_ 11, clivado com Sac 1 ---- Xba 1, que foi preparado anteriormente, ligando 3 moles de inseridos de homólogo de ADN de Vq, com cada mole do

vector de expressão	vL	II, de um dí	a para o outro,	a 520..
Obtiveram-se 3,0 x	105	unidades	formando placas	, após
empacotamento do ADN	com	Gigapack 11	Bold (Stratagene	Cloning
Systems, La Jolla, CA,	E.U	»A.) e 50¾ er	am recombinantes.

Combinação........aleatória......dos......homólogos......de......ADN......de.....Vq............e............de

Vi no......Mesmo vector.....de.....expressão

A biblioteca de expressão de Vq II, preparada no Exemplo 13, foi amplificada e prepararam-se 500 ug de ADN de fago, da biblioteca de expressão de Vq II, a partir da reserva de fago amplificado, usando os procedimentos descritos em Molecular

Cloning“.......A......Laboratory.....Manual, Maniatis et al., eds., Cold Spring

Harbor, NY, E.U.A» (1982). Mantiveram-se 50 wg deste ADN de fago, da biblioteca de expressão de Vç II, numa solução contendo 100 unidades da endonuclease de restrição MLuI (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, E.U.A.) em 200 wl de um tampão fornecido pelo fabricante de endonuclease, durante 1,5 horas a 372C. A solução foi depois extraída com uma mistura de fenol e de clorofórmio,. 0 ADN foi depois precipitado em etanol e re-suspendido em 100 wl de água. Misturou-se esta solução com 100 unidades da endonuclease de restrição EcoR I (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, E.U.A.), num volume final de 200 wl de tampão, contendo os componentes especificados pelo fabricante. Esta solução foi mantida a 3720 durante 1,5 horas e a solução foi depois extraída com uma mistura de fenol e de clorofórmio. 0 ADN foi precipitado em etanol e re-suspendido em TE.

A biblioteca de expressão de Vq preparada no Exemplo 12 foi amplificada e prepararam-se 500 wg de ADN de fago, da biblioteca de expressão de Vq, usando os métodos descritos acima.

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SCRQ235P

-76Mantiveram~se 50 ug do ADM de fago, da biblioteca de expressão de V l~l, numa solução contendo 100 unidades da endonuclease de restrição Hind III (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, E.U.A.), em 200 μ.1 de um tampão, fornecido pelo fabricante de endonuclease, durante 1,5 horas a 3720» A solução foi depois extraída com uma mistura de fenol e de clorofórmio saturada com Tris-HCl 0,1 M a pH 7,5. 0 ADN foi depois precipitado em etanol e re-suspendido em 100 μΐ de água. Esta solução foi misturada com 100 unidades da endonuclease de restrição EcoR I (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, E.U.A.) até um volume final de 200 μ.1 de tampão, contendo os componentes especificados pelo fabricante, Esta solução foi mantida a 372C durante 1,5 horas e a solução foi depois extraída com uma mistura de fenol e de clorofórmio. 0 ADN foi precipitado em etanol e re-suspendido em TE»

Ligaram-se as bibliotecas de expressão de Vq e de Vç 11, digeridas com endonuclease de restrição. A mistura reaccional de ligação consistia de 1 p.g de Vf_j e de 1 pg de ADM de biblioteca de fago de Vç 11, num meio reaccional de 10 μ.1, usando os reagentes fornecidos num conjunto experimental de ligação adquirido na Stratagene Cloning Systems (La Jolla, Califórnia, E.U.A.). Após ligação durante 16 h a 42C, empacotou-se 1 wl do ADN de fago, ligado, com extracto de empacotamento Gigapack Gold II e colocou-se em placarem células XL 1 Azuis preparadas de acordo com as instruções do fabricante. Usou-se uma porção dos 3 x 10^& clones obtidos, para determinar a eficácia da combinação. Na Eigura 11 mostra-se o vector de expressão de e Vç resultante.

Os clones contendo ambos os vectores de V|..i e V_L foram excisados do fago para o pBluescript usando o protocolo de excisão in vitro descrito por Short et al., Nucleic............Acid

Research, 16:7583-7600 (1988). Os clones escolhidos para excisão exprimiram o decapéptido tag e não clivaram o X-gal na presença de 2 mM de IPTG, permanecendo assim brancos. Os clones com estas características representavam 30¾ da biblioteca. Tal como se determinou por análise de restrição, 50¾ dos clones escolhidos para excisão continham um Vj_i e um V^- Uma vez que aproximadamente 30¾ dos clones na biblioteca de Vq exprimiram o decapéptido tag e

026

SCR0285

-7750¾ dos clones na biblioteca de Vp 11 continham u.ma sequência Vp, concluiu-se que não mais do que 15¾ dos clones na biblioteca combinada conteriam ambos os clones Vj~| e Vp. 0 número real obtido foi de 15¾ da biblioteca, indicando que o processo de combinação era muito eficiente.

15» Segregação............dos............homólogos de......ADN.....de............uma proteína............de

Ãiaação...a.......um......antigénio......V_H

Para segregar os clones individuais contendo os homólogos de ADN, que codificam uma proteína de ligação a um antigénio V^, determinou-se o título da biblioteca de expressão de Vp, preparada de acordo com o Exemplo 11,. Esta titulação da biblioteca foi realizada usando métodos bem conhecidos dos peritos na arte,. Resumidamente, realizaram-se séries de diluições da biblioteca para um tampão contendo 100 mM de NaCl, 50 mM de Tris-HCl, a pH 7,5, e 10 mM de MgSO^ Adicionaram-se 10 ul de cada diluição a 200 ul de células de E...............coli em crescimento exponencial e mantiveram-se a 37SC durante 15 minutos, para permitir a absorção do fago pelas células bacterianas, com 3 ml de ágar de topo consistindo de 5 g/1 de NaCl, 2 g/1 de Mg804, 5 g/1 de extracto de levedura, 10 g/1 de NZ amina (hidrolisado de caseína) e 0,7¾ de agarose fundida a 502C» 0 fago, as bactérias e o ágar d© topo, foram misturados e depois distribuídos equitativamente sobre a superfície de um prato de ágar bacteria.no pré-aquecido (5 g/1 de NaCl, 2 g/1 de MgSC^, 5 g/1 ds extracto de levedura, 10 g/1 de NZ amina (hidrolisado de caseína) e 15 g/1 de ágar Dífco). Os pratos foram mantidos a 372C, durante 12 a 24 horas, período de tempo durante o qual as placas lambda se desenvolveram na camada bacteriana. As placas lambda foram contadas para determinar o número total de unidades formando placas por ml, na biblioteca original» fo biblioteca de expressão titulada foi depois colocada em prato de modo a prepararem-se filtros réplicas da biblioteca. Os filtros réplicas serão depois usados para segregar os clones individuais na biblioteca que exprimem as proteínas de ligação a antigénios de interesse» Resumidamente, adicionou-se um volume da

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SCR0285P

78biblioteca titulada, ds modo a tsrem-ss 20 000 placas por prato de 150 mililitros, a 600 μ.1 de células de E. coli em crescimento exponencial, e manteve-se a 3720 durante 15 minutos, para permitir a absorção do fago nas células bacterianas,. Depois, misturaram-se 7,5 ml de ágar de topo com a solução contendo as células bacterianas e distribui-se, equitativamente, o fago absorvido e toda a mistura, sobre a superfície de um prato de ágar bacteriano prê-aquecido. Este processo foi repetido, um número de vezes suficiente, para colocar em prato um número total de placas pelo menos igual à dimensão da biblioteca. Estes pratos foram depois mantidos a 3720 durante 5 horas. Estes pratos foram depois sobrepostos com filtros de nitrocelulose, que tinham sido pré-tratados com uma solução contendo 10 mM de isopropil-beta-D-tiogalactopiranosido (IPTG) e mantiveram-ss a 3720 durante 4 horas. A orientação dos filtros de nitrocelulose em relação ao prato foi marcada fazendo um buraco com uma agulha, mergulhada em prova de água, através do filtro e nos pratos d© contendo mono1aurato filtro, que durante n i t r o celulose f o r a rn tinta à bactérias em vários pontos. Os filtros de nitrocelulose foram removidos com fórcepes e lavados uma vez com uma solução de TBST 20 mM de Tris-HCl, a pH 7,5, 150 mM de NaCl e 0,05¾ de de polioxietileno-~sorbita.no (Tween 20). Um segundo tinha também sido embebido numa solução contendo 10 mM de IPTG, foi reaplicado nos pratos de bactérias para produzir filtros duplicados. Os filtros foram, adicionalmente, lavados com uma solução fresca de TBST, durante 15 minutos. Os filtros foram depois colocados numa solução bloqueante, consistindo de 20 mM de Tris-HCl a pH 7,5, 150 mM de MaCl e 1¾ de BSA e agitaram-se, hora, à temperatura ambiente. Os filtros de transferidos para uma solução bloqueante fresca, contendo uma diluição 1 para 500 do anticorpo primário, e agitou-se suavemente, durante pelo menos 1 hora, a temperatura ambiente. Depois, os filtros foram agitados na solução contendo o anticorpo primário, os filtros foram lavados 3 a 5 vezes em TBST, durante 5 minutos de cada vez, para remover o anticorpo primário residual não ligado. Os filtros foram transferidos para uma solução contendo solução bloqueante fresca e uma diluição de 1 para SOO a 1 para 1 000 de anticorpo secundário conjugado com

026 SOR0285P

fosfatase alcalina. Os filtros foram agitados suavemente, na solução, durante pelo menos 1 hora, à temperatura ambiente. Os filtros foram lavados 3 a 4 vezes numa solução de TBST, durante pelo menos 5 minutos de cada vez, para remover qualquer anticorpo secundário residual não ligado. Os filtros foram lavados uma vez numa solução contendo 20 mM de Tris-HCl, a pH 7,5, e 150 mM de NaCl. Os filtros foram removidos desta solução e o excesso de humidade foi removido com papel de filtro. A cor foi desenvolvida colocando o filtro numa solução contendo 100 mM de Tris-HCl, a pH 9,5, 100 mM de NaCl, 5 mM de MgCl2, 0,3 mg/ml de nitro Azul ds Tstrazólio (NBT) e 0,15 mg/ml fosfato de 5-foromo-4~cloro-3-indolilo (BCIP) durante, pelo menos, 30 minutos à temperatura ambiente. A solução de desenvolvimento de cor residual, foi removida por lavagem do filtro com uma solução contendo 20 mM de Tris-HCl, a pH 7,5, e 150 mM de NaCl. 0 filtro foi depois colocado numa solução de paragem consistindo de 20 mM de Tris-HC1, a pH 2,9, e 1 mM de EDTft. 0 desenvolvimento de uma corpúrpura intensa indica um resultado positivo. Os filtros são usados para localizar a placa de fago que produziu a proteína desejada. Essa placa de fago é segragada e depois cultivada para a n á 1 i s e a d i c i o n a 1,

Usaram-se várias combinações, diferentes, de anticorpos primários e de anticorpos secundários. A primeira combinação com um anticorpo primário imunoespecifico de um decapéptido, que apenas será expresso se a. proteína de ligação ao antigénio Vq for expressa na. cadeia de leitura apropriada, para permitir a leitura através da tradução, para incluir o epitopo de decapéptido ligado covalentemente à proteína de ligação ao antigénio Vq» Este epitopo de decapéptido e um anticorpo imunoespecifico deste epitopo de decapéptido foram descritos por Green et al., Ce11

28:477 (1982) e Nismann et al», Proc.........Nat.........Acad...............Sei..............U-S.A.

80:4949 (1983). Na Figura 11 mostra-se a sequência do decapépti do reconhecido, Um equivalente funcional do anticorpo monoclonal, que é imunoespecifico do decapéptido, pode ser preparado de acordo com os métodos de Green et al», e de Nismann et al.. 0 anticorpo secundário usado com este anticorpo primário era uma

026

SCR0285P

IgG de cabra anti-ratinho (Fisher Scientific). Este anticorpo é imunoespecifico da região constante da IgG de ratinho e não reconhece qualquer porção da região variável de cadeia pesada.. Esta combinação particular de anticorpos primários e secundários, quando usada de acordo com o protocolo anterior, determinou que entre 25¾ e 30¾ dos clones exprimiam o decapéptido e, deste modo, assumiu-se que estes clones exprimiam também uma proteína de ligação ao antigénio Vp.

Noutra combinação usou-se o anticorpo monoclonal de ratinho anti-decapéptido, como anticorpo primário e, como anticorpo secundário usou-se uma Ig de cabra anti-ratinho, purificada por afinidade, disponível comercialmente como parte de um conjunto de imuno-ensaio picoBlue da Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, E.U.A,,, Esta combinação resultou num grande número de clones falsos positivos porque o anticorpo secundário imunorreagiu também com o Vp da cadeia pesada. Deste modo, este .anticorpo reagiu com todos os clones, exprimindo qualquer proteína Vp, e esta combinação de anticorpos primários e secundários não detectou especificamente clones com o polinucleótido de Vp na cadeia de leitura apropriada, permitindo assim a expressão do decapéptido.

secundários,

Usam-se várias combinações de anticorpos primários e onde o anticorpo primário está conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITS) e assim a imunoespecificidade do anticorpo não é importante, porque o anticorpo é conjugado com o antigénio pré-seleccionado (FITC) e é esse antigénio que se deverá ligar às proteínas de ligação ao antigénio Vp produzidas pelos clones na biblioteca de expressão. Após este anticorpo primário ter sido ligado em virtude de ser o anticorpo monoclonal de ratinho p2 5764 (ATCC # HB-9505) conjugado com FITC. 0 anticorpo secundário usado com este anticorpo primário é uma lg^ de cabra anti-ratinho (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, E.U.A.) conjugado com fosfatas© alcalina, usando o método descrito Antibodies............A..........Laboratory............Manual, Har1ow and Low

Springing Harbor, NY, E.U.A. (1988). Se particular, na biblioteca de expressão de Vp em eds., Cold um clone exprime urna '1 >

026

SCR0285P proteína de ligação de Vq que se liga ao FITC acoplado, d© um modo covalente ao anticorpo primário, o anticorpo secundário liga-se ©specif icamente e, quando desenvolvida, a fosfatas© alcalina provoca a formação de uma cor púrpura distinta.

A segunda combinação de anticorpos do tipo usa um anticorpo primário que é IgG de coelho anti-humana (Fisher Scientific Pittsburg, PA) conjugada com FITC,, 0 anticorpo secundário, usado com este anticorpo primário é uma IgS de cabra anti-eoelho conjugada, com fosfatas© alcalina, usando os métodos descritos em

Antíbodíes..................A......La bo r at o r y......Manual, H a r 1 o w and Lane, eds., Cold

Spring Harbor, MY, E.U.A. (1988),, Se um clone particular na. biblioteca de expressão de Vq, exprime uma proteína de ligação de Vq que se liga ao FITC conjugado com o anticorpo primário, o anticorpo secundário liga-se, especificamente e.

quando desenvolvida, a fosfatase alcalina provoca a formação de uma cor p úrpura d i st i n ta„ de ao

Outro anticorpo primário foi o anticorpo monoclonal ratinho p2 5764 (ATCC # HB-9505) conjugado com FITC e ¹²⁵I anticorpo será ligado, por quaisquer das proteínas de ligação antigénio Vq, expressas. Depois, uma vez que o anticorpo está também marcado com faz-se um autorradiograma do filtro, em vez de usar um anticorpo secundário que está conjugado com fosfatase alcalina,, Esta produção directa de um autorradiograma permite a segregação dos clones na biblioteca que exprimem uma proteína, de ligação a um antigénio Vq, de interesse,,

16. Segregação......de......homólogos.....de......ADN para......um.....Vqe......para umVq que formam Fy......de.....ligação......a.....antigénio

Para segregar os clones individuais contendo os homólogos de ADN que codificam um Vq e um V|_ que formam um Fy que se liga a um antigénio, titulou-se a biblioteca de expressão de Vq e de Vq, de acordo com o Exemplo 15. A biblioteca de expressão, titulada, foi depois pesquisada quanto à presença do decapéptido tag expresso com o Vq, usando os métodos descritos no Exemplo 15. 0 ADN foi então preparado, a partir dos clones, para exprimir o decapéptido tag. Este ADN foi digerido com a endonuclease de restrição Pvu

026

SCR02S5P

Έ2

11, determinar se (Í5S L&S clones continham, também, um homólogo de ADN de Vq. A migração mais lenta de um fragmento de endonuclease de restrição Pvu II indicou que o clone particular continha ambos os homólogos d® ADN de Vq e de Vq.

Os clones contendo ambos os homólogos de ADM de Vq e de Vj , foram analisados para determinar se estes clones produziam uma molécula de proteína Fy reunida, a partir dos homólogos de ADN de Vq e de Vq.

fragmento de proteína Fy, produzido em clones contendo Vq e Vq, foi visualizado por imunoprecipitação de proteína radiomarcada expressa nos clones,, Inoculou-se uma cultura de 50 ml de caldo LB (5 g/1 de extracto de levedura, 10 g/1 de triptona © 10 g/1 de NaCl, a pH 7,0), contendo 100 pg/pl de ampicilina, com E.........coli compreendendo um plasmideo contendo um Vq e um V|_ . A cultura foi mantida a 3720, com agitação, até a densidade óptica, medida a 550 nm ser de 0,5. A cultura, foi centrifugada a 3 000 x g, durante 10 minutos, e depois ressuspendeu-se em 50 ml de meio M9 (6 g/1 de Na₂HP0₄, 3 g/1 de KH₂PQ₄, 0,5 g/1 de NaCl, 1 g/1 de NH₄C1, 2 g/1 de glucose, 2 mM de MgS0₄, 0,1 mM de CaCl₂) suplementado com aminoácido sem metionina ou cisteina. Esta solução mantida

3720 durante adicionaram-se 0,5 mCi de ^5g _na forma de H o ,

100 e depois (New England

Nuclear, Boston, MA, E.U.A.) e a solução foi ainda mantida a 372C durante 2 horas adicionais. A solução foi depois centrifugadsa a 3 000 x g e rejeitou-se o sobrenadante. 0 sedimento de células bacterianas resultante foi congelado e descongelado e, c ressuspendeu-se numa solução contendo 40 mM de Tris, pH 8,0 mM de sacarose,1 mM de EDTA,, A solução foi centrifugada a 10 000 x g durante 10 minutos e rejeitou-se o sedimento resultante» 0 sobrenadante foi misturado com 10 iul de anticorpo monoclonal anti-decapéptido e mantido durante 30-90 minutos em gelo,. Misturaram-se 40 μΐ de proteéna 0, acoplada a

Sephaross (Pharmacia, Piscataway, NJ, E.U.A,.) com a pérolas de solução, e manteve-se esta solução durante 30 minutos em gel para permitir a formação de um imunoprecipitado» A 10 000 x g durante 10 minutos e solução foi centrifugada a re-suspendeu-se o sedimento

resultante em 1 ml de uma solução contendo 100 mM de Tris-HCl, a pH 7,5, e centrifugou-se a 10 000 x g durante 10 minutos. Repetiu-se este procedimento duas vezes. 0 sedimento imunoprecipitado resultante foi carregado num gel, PhastQel Homogenous 20 (Pharmacia, Piscataway, NY, E.U.A.)„ de acordo com as instruções do fabricante. 0 gel foi seco e usado para a exposição de filme de raios X.

Ma Figura 12, mostra-se o autorradiograma resultante,, Pode-se observar a presença de moléculas de Fy reunidas pela presença de V'l que foi imunoprecipi tado pois estava ligado ao Vq-decapéptido tag reconhecido pelo anticorpo precipitante.

17. Construção......de......expressão......de......Vp e......de V|_......seleccionável

A. Construção............do plasmídeo.....de expressão.........de..........Gene 5 mutante

Mostrou-se que o gene 8 do fago lambda de bactéria está dírectamente envolvido na lise tal como é descrito por Reader et al., Virology, 43:607-622 (1971),, 0 geris S codifica um polipéptido de 107 aminoáeidos que é responsável por um acontecimento letal na membrana citoplásmica que permite a libertação do produto do gene R para o periplasma da célula onde degrada o peptidoglicano tal como é descrito por Garrett et al.,

J,..............Virology, 44:886-892 (1982),, 0 mutanfce de gene 8 dominante (S-|oo SAM 5) é uma mutação que se verificou que interfere com & formação do canal de membrama de proteína 8 normal evitando assim a lise de célula,, Ver Raab et al. , J. Mol. Biol., 199:95-105 (1988). Este gene 8 mutante é dominante' porque, quando é expresso, mesmo na presença da proteína S do tipo selvagem, evita a lise da célula bacteriana. A mutação dominante 8χοθ ®ΑΜ 5 contém também uma mutação âmbar e, deste modo, requer a expressão de um ARNt supressor na célula bacteriana de modo a produzir-se a proteína S mutante,. Adicional mente esta mutação âmbar permite o crescimento de bactérias contendo a construção do gene 8 mutante sem lise porque sem este ARNt de supressão âmbar não se produz proteína do gene 8 funcional,, gene 8 dominante do Lambda Zap, Sam 5, foi isolado usando

026

SCR0285P

-84&. reacção em cadeia com polímeras©„ Resumidamente o ADN de Sam 5 de Lambda Zap foi isolado usando os métodos descritos em

Molecular.............Cloning:........A......Laboratory Manual, Mania tis et al., eds.., ,

Cold Spring Harbor, NY (1982). Misturou-se o ADN de Sam 5 de Lambda Zap, 0,1 ug, com um tampão contendo 150 ng de iniciadores RG15 (Tabela 5) e 150 ng de iniciador PR16 (Tabela 5), 0,25 mM de cada um de dTTP, dCTP, dGTP e-dATP (dNTP), 50 mM ds KC1, 10 mM de Tris-HCl a pH 8,3, 15 mM ds MgCl₂ e 0,15¾ de gelatina estéril. A solução resultante foi aquecida a 91SC durante cinco minutos, e depois foi colocada num banho de água, a 542C durante 5 minutos,, Adicionaram-se 0,5 microlitros de polímeras© Taq (Perkin Elmer-Cetus, Norwalk, CT) e a solução foi espalhada com uma camada de óleo mineral.

A solução foi depois colocada num DMA Thermal Cycler (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT) e submetida às condições de tempo e temperatura seguintes: (1) 722C durante 2 minutos para permitir a extensão de iniciador, (2) 912C durante 1 minuto para desnaturar por calor o ADN duplex e (3) 54ÔC durante 2 minutos para permitir a hibridação dos ácidos nucleicos de cadeia simples. Submeteu-se a mesma solução a ciclos adicionais dos passos (1), (2) e (3), num total de trinta ciclos, ds acordo com as instruções do fabricante» A solução, depois de submetida aos ciclos, foi então mantida a 722C durante 10 minutos e armazenada, a 42C até ser usada»

Digeriu-se o ADN do gene 8 mutante, produzido pela reacção em cadeia com polímeras© anterior, com as endonucleases ds restrição Hind III e Bgl II» Resumidamente, purificou-se metade do produto da reacção em cadeia com polímeras®, produzido acima, por extracção com fenol seguida de precipitação com etanol. 0 ADN foi depois misturado com uma. solução contendo 100 rnM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl, a pH 7,7, 19 mM de MgCl₂, 1 mM de DTT, 100 ug/ml de BSA, 20 unidades de Hind III e 10 unidades de Bgl II» Esta solução foi mantida a 372C durante 1 hora. A eficiência desta digestão com endonucleases d© restrição foi determinada por electrofores© em gel de acordo com os métodos descritos em Currsnt.............Protocole........in......Molecular........Biology., Ausubel et al., eds.,

71. 026

SCR0285P

-85John Wiley and Sons, NY (1987).,

Digeriu-se metade do produto da reacção em cadeia com polímeras©, com as endonucleasses de restrição Sau 3A e Bgl II,, Resumidamentemisturou-se o ADN. com um tampão contendo 100 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl a pH 7,7, 10 mM de MgCl₂, 1 mM de DTT, 100 wg/ml de albumina de soro de bovino (BSA), 10 unidades de Sau 3A e 10 unidades de Bgl II (Stratagene, La Jolla, CA),, Esta solução foi mantida a 372C durante 1 hora,, A eficiência desta digestão com endonucleases de restrição foi determinada por e 1 e c t r o f o r e s e e m gel ,,

Isolou-se e purificou-se o predominante resultante, bandas com, aproximadamente 500 pares de bases, em geles de agarose, de acordo com os procedimentos descritos em Molecular.............Cloning:..............A

Lafeorator.y..Ms.nual, Maniatís et a 1., eds., Cold Spring Harbor , NY (1982),, 0 ADN foi purificado, a partir das fatias de agarose, por electroeluição de acordo com os métodos descritos em Molecular

Cloning:........A Laboratory......Manual, Maniatis et al., eds., Cold Spring

Harbor, NY (1982),, 0 ADN electroeluído foi purificado por extracção com fenol seguida de precipitação em etanol» gene (Stratagene) endo nuc1©ases

S mutante foi inserido no pBluescript KS-sque tinha sido previamente digerido com as de restrição Hind III e BamH I» Resumidamente, o pBluescript K8+ foi misturado com um tampão contendo 100 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl, a pH 7,7, 10 mM de MgCl₂, 1 mM de DTT, 100 wg/ml de BSA, 40 unidades de Bam Hl e 40 unidades de Hind III (Statagene). Esta solução foi mantida a 372C durante uma hora» A solução contendo o pBluescript KS+ foi depois ajustada a pH 8,0 pela adição de Tris-HCl a pH 8,0 até uma concentração final de 0,1 Μ» A esta solução adicionaram-se 5 unidades de fosfatas© alcalina intestinal de vitelo (Stratagene) e manteve-se a solução a 3720 durante 30 minutos» A fosfatas© alcalina de intestino de vitelo foi depois desactivada mantendo a solução a 652C durante 10 minutos» 0 pBluescript K8+ foi então purificado por extracção com fenol seguida por precipitação em etanol» 0 pBluescript KS+ limpo de endonuclease de restrição foi depois re-suspendido numa

026

SCR0285P

-86solução contendo 10 mM de Tris-HCl a pH 8,0 s 1 mM de EDTA.

gene 8 mutante foi inserido (ligado) rio vector pBluescri.pt preparado anteriormente por digestão com as endonucleases de restrição Hind III e BamH 1. Resumidamente, misturou-se 1 μΐ de vector pBluescript, que tinha sido previamente cortado com Hind III e BamH .1, com 1 μΐ do inserido de gene S mutante preparado acima, 1 μ.1 de um tampão contendo 0,66 M de Tris-HCl a pH 7,5, 50 mM de MgClg ,50 mM de Ditiotreitol (DTT) e 1 μΐ de uma solução contendo 10 mM de ATP e 0,5 μ.1 (4 unidades) de ADN-liga.se T4 (Stratagene). Esta solução foi mantida a 37SC durante 1 hora.

Usou-se a mistura de ligação para transformar células Azuis XL1 (Stratagene) de acordo com as instruções do.fabricante.

A exactidão dos passos de clonação anter ionssé confirmada por sequenciação de ADN»

B“ Construção......do......vector.......de......expressão de......Vp seleccionâvel

Para adicionar a capacidade de seleccionar, contra a expressão, os vectores não contendo homólogos de ADN codificando o Vp, inseriu-se um gene de ARNt supressor rio vector de expressão de Vp preparado no Exemplo 9. 0 vector de expressão de Vp seleccionável foi preparado inserindo uma sequência de ADN sintético, contendo o gene de ARNt supressor e a sequência de ADN codificando o decapéptido tag, no vector de expressão de Vp preparado no Exemplo 9 que tinha sido previamente clivado com as endonucleases de restrição Xho I e Eco RI»

Construiu-se uma sequência de ADN sintético, contendo o gene de ARNt supressor e a sequência de polinucleótidos codificando o decapéptido tag, concebendo segmentos de polimucleótidos de cadeia simples de 20-40 bases que se hibridarão uns com os outros e formarão a sequência de ADN sintético de cadeia dupla que se mostra na Figura ISA,. Na Tabela 5 mostram-se os polinucleótidos de cadeia simples individuais.

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Os polinucleótidos 926, 927, 928, 929, 930, 931, AB23 e 971 foram quinasados adicionando 1,0 μ.1 de cada polinucleótido (0,1 wg/wl) e 20 unidades de polinucleótido-quinase T4 a uma solução contendo 70 mM de Tris-HCl a pH 7,6, 10 mM de MgCl2_? 5 mM de DTT, 10 mM de 2ME, 500 microgramas por ml de B8A. A solução foi mantida a 372C durante 30 minutos e a. reacção foi parada mantendo a solução a 652C durante 10 minutos»

Os polínucleótidos requeridos foram temperados ' (annealed) para formar a sequência de ADN sintético que se mostra na Figura ISA» Resumidamente misturaram-se as soluções de polínucleótidos seguintes com um volume 1/10 de uma solução contendo 20,0 mM de Tris-HCl, a pH 7,4, 2,0 mM de MgClg e 50,0 mM de NaCl; 5 wl de soluções 2,,5 wg/ml, separadas, contendo os polínucleótidos quinasados 926, 927, 928, 929, 930 e 931; 4 wl de soluções 2,0 wg/ml, separadas, contendo o polinucleótido AB24 não quinasado o polinucleótido AB23 quinasado; 2 wl de soluções 1,0 wg/ml separadas, contendo o polinucleótido 971 quinasado e polinucleótido 970 não quinasado»

Durante

Esta deixou-se de água» polínucleótidos se s in tético q ue se individuais foram solução foi aquecida a 702c durante 5 minutos e arrefecer a 40.2C durante 1,5 horas num copo de 500 ml este período de tempo todos os 10 ligaram para formar o inserido de ADN mostra na Figura 18A. Os polínucleótidos ligados covalentemente uns aos outros para estabilizar o inserido de ADN sintético misturando toda a mistura reaccional anterior (46,6 wl) com uma solução contendo 50 mM de Tris-HCl, a pH 7,5, 7 mM de MgCl2, 1 mM de DDT, 1 mM de trifosfato de adenosina (ATP) e 10 unidades de ADN-ligase T4, para formar uma mistura reaccional de ligação» Esta mistura foi mantida a 372C durante 1 hora e depois desactivou-se a ADN-ligase T4 mantendo a solução a 652C durante 15 minutos» Os polínucleótidos restantes foram quinasados misturando toda a mistura reaccional da reacção de ligação anterior, 6 wl de uma

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SCR0285P

-89solução contendo 10 rnM de ATP e 5 unidades de polinucleótido-quinase T4„ Esta solução foi mantida a 3720 durante 30 minutos e, depois, a polinucleótido-quinase T4 foi desactivada mantendo a solução a 6520 durante 10 minutos. 0 inserido de ADN completo (Figura. 18A) estava pronto para ligação ao expressão de Vq (Figura 7) que tinha sido previamente com as endonucleases de restrição Xho I e Eco RI» sintético vector de í digerido

	0 vector	de expressão d	e Vj.„l (Figura	7) foi digerido	com
endo n ucleases	de restrição	Xho I e Eco	RI, de acordo	com	as
recomendações	do fabricante.	Resumidamente, misturaram-S'	e 50	wg
do	vector de	expressão de V	H (33,5 ul).	225 unidades de	Xho	1
(Str	“atagsne) e	150 unidades d	e Eco RI (Str	•atagene), com um tam	pão
de	endonuclea;	se de restrição	universal consistindo de 50	mM	de
Tris	s-HCl a pH	7,7, 10 mM de	MgCl2, 50 mM	de NaCl e 100 ug/ml	de
BSA	para formar uma mistura	de digestão.	A mistura de	diges	tão
foi	mantida a ‘	372C durante 2	horas,
	Ajustou-se a mistura de	digestão a pH 8,0, adiciona	ndo	uma

solução de 1,0 M de Tris-HCl, a pH 8,0, até uma concentração final de 0,1 M» A esta solução adicionaram-se 2,5 unidades de fosfatas© alcalina de intestino de vitelo e a solução resultante foi mantida a 3720 durante 30 minutos. A fosfatase alcalina de intestino de vitelo foi desactivada mantendo a solução a 6520 durante 10 minutos. 0 ADN de vector de expressão de foi depois purificado por extraeçao com fenol s precipitação em etanol. 0 ADN de vector de expressão de , clivado com endonuclease de restrição foi depois re-suspendido em 50 ul de uma solução contendo 10 mM de Tris-HCl a pH 8,0 e 1 mM de EDTA.

inserido de ADN sintético preparado acima foi inserido no vector de expressão de clivado com endonuclease de restrição» Resumidamente, misturaram-se 1 ug de vector de expressão de Vjq clivado com Xho I e Eco RI, 2 u.1 de inserido de ADN sintético (0,5 ug) e 0,5 ul (4 unidades) de ADN ligase T4 (Stratagene);, com

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SCR0285P

urna solução contendo 66 mM de Tris-HCl, a pH 7,6, 5,0 mM de MgCl2, 5,0 mM de DTT e 1,0 mM de ATP para formar uma mistura de ligação. A mistura de ligação foi mantida a 3720 durante 2 horas. A mistura de ligação foi depois empacotada, de acordo com as instruções do fabricante, usado extracto de empacotamento Oigapack II Sold disponível na Stratagene., A mistura de ligação empacotada foi depois colocada em placa em células XL1 Azuis (Stratagene).

As placas de fago lambda individuais foram seleccionadas, para sequenciação de ADN, seleccionando as placas individuais que se hibridaram com os polinucleótidos contidos no inserido de ADN sintético, de acordo com o método descrito em Current.............Protocols in......Molecular........Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons,

NY (1987),. Na Figura 19A mostra-se o vector de expressão de seleccionável.

C. Construção......do......vector.......de......expressão......de......V_L......selecçionáyel

Para adicionar a capacidade de seleccionar, contra a expressão, os vectores não contendo homólogos de ADN codificando o V| , inseriu-se um gene de ARNt supressor no vector ds expressão de Vp preparado no Exemplo 11. 0 vector de expressão de Vp seleccionável foi preparado _f inserindo uma sequência de ADN sintético, contendo o gene de ARNt supressor, no vector de expressão de Vp preparado no Exemplo 11, que tinha sido previamente clivado com, as endonucleases de restrição Sac I e Xfoa I.

Construiu-se uma sequência de ADN sintético, contendo o gene de ARNt supressor, concebendo segmentos de polinucleótido de cadeia simples, contendo 20-40 pares de bases, que se hibridarão uns com os outros e formação a sequência de ADN sintético de cadeia dupla que se mostra na Figura 1813. Na Tabela 5 mostram-se os polinucleótidos de cadeia simples individuais.

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-91Os polinucleótidos 926, 927, 928, 929, 930, 972 e 975 foram quinasados adicionando 1,0 ul de cada polinucleótido (0,1 ug/ul) e 20 unidades de polinucleótido-quinase T4 a uma solução contendo 70 mM de Tris-HCl a pH 7,6, 10 mM de MgCl2_? 5 mM de DTT, 10 mM ds 2ME, e 100 ug/ml de B8A,. A solução foi mantida a 372C durante 30 minutos e a reacção foi parada mantendo a solução a 652C durante 10 minutos»

Os polinucleótidos requeridos foram ligados para formar a sequência de ADN sintético que se mostra na Figura 1813, Resumidamente misturaram-se as soluções de polinucleótidos seguintes com um volume 1/10 de uma solução contendo 20,0 mM de Tris-HCl, a pH 7,4, 2,0 mM de MgCl^ e 50,0 mM de NaCl? 5 ul de soluções 2,5 ug/ml, separadas, contendo os polinucleótidos 926, 927, 928, 929, 930 e 931 quinasados? 2 ul de soluções 2,0 ug/ml, separadas, contendo os polinucleótidos 974 e 973 não quinasados, e os polinucleótidos 972 e 975 quinasados» de água» Durante este polinucleótidos se ligaram

Esta solução foi aquecida a 70SC durante 5 minutos e deixou-se arrefecer até 402C durante 1,5 horas num copo de 500 ul período de tempo todos os 10 para formar o inserido de ADN sintético de cadeia dupla que se mostra na Figura 18B» Os polinucleótidos individuais foram ligados covalentemente uns aos outros, para estabilizar o inserido de ADN sintético, misturando toda a mistura reaccional anterior (42,2 ul) com uma solução contendo 50 mM de Tris-HCl, a pH 7,5, 7 mM de MgCl2, 1 mM de DTT, 1 mM de trifosfato de adenosina (ATP) e 10 unidades de ADN ligase T4 para formar uma mistura reaccional de ligação» Esta mistura foi mantida a 372C durante 1 hora s depois desaetivou-se a ADN-lígase T4 mantendo a solução a 652C durante 15 minutos,, Os polinucleótidos restantes foram quinasados misturando toda a mistura reaccional da reacção de ligação, 5 ul de uma solução contendo 10 mM de ATP e 5 unidades de polinucleótido-quinase T4„ Esta solução foi mantida a 37SC durante 30 minutos e, depois, a

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-92polinucleótido-quinase T4 foi desactivada mantendo a solução a 6520 durante 10 minutos. 0 inserido de ADN sintético completo (Figura 1813) estava pronto para ligação ao vector de expressão de Vp (Figura 9) que tinha sido previamente digerido com endonucleases de restrição Sac I e Xba I.

as vector de expressão de Vp (Figura 9) foi digerido com endonucleases de de acordo com misturaram-se 50

3$ wg

I de restrição Sac I e Xba 1, recomendaçoes do fabricante. Resumi damente , do vector de expressão d® Vp (30,5 pl), 50 unidades de Sac (Stratagene) e 50 unidades de Xba 1 (Stratagene)com um tampão endonuclease de restrição universal consistindo de 10 mM de Tris-HC1, a pH 7,7, 10 mM de MgClç, 100 mM de NaCl e 100 pg/ml de BSA, para formar uma mistura de digestão,. A mistura de digestão foi mantida a 372C durante 2 horas.

A mistura de digestão foi depois ajustada até pH 8,0 pela adição d® uma solução de 1,0 M de Tris-HCI, a pH 8,0 até uma concentração final de 0,1 Μ. A esta solução adicionaram-se 2,5 unidades de fosfatas® alcalina de intestino de vitelo (Stratagene) e a solução resultante foi mantida a 372C durante 30 minutos. A fosfatas® alcalina de intestino- de vitelo foi desactivada mantendo a solução a 652C durante 10 minutos. 0 ADN de vector de expressão ds Vp foi depois purificado por extracção com fenol seguido de precipitação em etanol. 0 ADN de vector de expressão de Vp clivado com endonuclease de restrição foi re-suspendido em 50 pl de uma solução contendo 10 mM de Tris-HCI, a pH 8,0, e 1 mM de EDTA.

inserido de ADN sintético preparado acima foi inserido no vector de expressão de Vp clivado com endonuclease de restrição. Resumidamente, misturaram-se 1 ug de vector de expressão de Vp, clivado com Sac 1 e Xba I, 2 pl de inserido de ADN sintético (0,5 pg) e 0,5 pl (4 unidades) de ADN-ligase T4 (Stratagene), com uma 'solução contendo 66 mM de Tris-HCI, a pH 7,6, 5,0 mM de Μ9ΌΙ2, 5,0 mM de DTT e 1,0 mM de ATP para formar uma mistura de ligação. A mistura de ligação foi mantida a 372C durante 2 horas. A mistura de ligação foi empacotada, de acordo com as instruções do

026 8CR0285P fabricante, disponível colocada em usando extracto de empacotamente Gigapack II Gold, da Stratagene. A mistura, de ligação empacotada foi placa em células azuis XL1 (Stratagene).

As placas de fago lambda individuais foram seleccionadas para sequenciação de ADN por determinação das placas que se hibridavam com polinucleótidos contidos no inserido de ADN sintético de acordo com os métodos descritos em Molecular

Cl 2D..Í.I!.S„”........A......Laboratory......Manual, Maniatis et a 1. , eds., Cold Spring

Harbor, NY (1989). Na Figura 19B mostra-se o vector de expressão de Vl seleccionável,.

D. Construção......do......vector.......de......expressão......de......Vl......e......de......Vp| seleccionável vector de expressão de Vp preparado no Exemplo 17B é modificado de modo a não conter quaisquer sítios de endonuclease de restrição Xho I ou Spe I. Esta modificação deste vector é realizada usando um conjunto de polinucleótidos e de métodos similar aos métodos descritos no Exemplo 17B.

vector de expressão de Vl preparado no Exemplo 17C é modificado de modo a não conter quaisquer sítios de endonuclease de restrição Sac I ou Xba I, Esta modificação do vector de expressão de Vç é realizada usando um conjunto de polinucleótidos e de métodos, bem conhecidos na arte e similares aos métodos descritos no Exemplo 17C. 0 vector de expressão de Vl modificado ε o vector de expressão de Vl são combinados para produzir um vector de expressão de Vl e de V|q seleccionável,. Resumidamente, o vector de expressão de Vq modificado é digerido com as endonucleases de restrição Eco RI e Hind III, usando a.s condições recomendadas pelo fabricante, e é digerido com as endonucleases de restrição Eco RI e Mlu I. Os vectores de expressão de Vq e de Vl clivados com endonucleases de restrição são ligados um ao outro usando técnicas convencionais para, formar um vector de expressão de V_H e de Vl seleccionável que ss mostra na Figura 20,, vector de expressão de Vp| e de Vl contêm dois genes de ARNt supressor, um é substituído pelo homólogo de ADN de V|-j e o

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SCR0285P

-94outro é substituído pelo homólogo de ADN de V|_ ,, Deste modo, quando o vector contém ambos os homólogos de ADN de Vq e de Vj , o vector não contém um gene de ARNt supressor permitindo que o vector contendo Vq e Vq produza placas de fago sob as condiçSes de selecção apropriadas

E - .......Inserção......dos......Homólogos.....de......ADN.......nos......vectores......de expressão de......ADN......seleccionâvel

Os homólogos de ADN codificando o Vq e/ou o Vq preparados no Exemplo 5 são inseridos no vector de expressão de Vq e de Vj , no vector de expressão de Vq ou no vector de expressão de Vq, usando os sítios de endonuclease de restrição proporcionados Tipicamente, os homólogos de ADN codificando o Vq são inseridos nos sítios proporcionados de endonucleases de restrição Xho I e Sp© I (Figura 20) usando procedimentos convencionais,, Tipicamente, os homólogos de ADN codificando o Vq são inseridos nos sítios de endonuclease de restrição proporcionados (Figura 20) „ Deste modo, dependendo do vector de expressão particular seleccionado, os processos aqui descritos produzem um vector de expressão contendo um homólogo de ADN. codificando Vq, sozinho, um homólogo de ADN codificando Vq sozinho, ou um homólogo de ADN codificando um Vq e um Vq.

Os homólogos de ADN codificando Vq podem ser inseridos no vector de expressão, em primeiro lugar, seguindo-se a inserção dos homólogos de ADN de Vq. Alternativamente,, os homólogos de ADN codificando Vq podem ser inseridos em primeiro lugar seguindo-se os homólogos codificando Vq, Qualquer ordem de inserção permite a recombinação aleatória de uma biblioteca de homólogos de ADN codificando Vq com uma biblioteca de homólogos de.ADN codificando Vq, Após os homólogos de Vq terem sido inseridos no vector de expressão de Vq + Vq, o vector de expressão pode ser cultivado para produzir mais vector de expressão contendo Vq» Os homólogos de ADN codificando Vq podem ser depois inseridos no vector de expressão de Vq e de Vq. Qualquer destes procedimentos permitirá a produção de uma grande biblioteca combinatória.

026

SCR0285P

F · Selecção............de.....fago......contendo......homólogo......de......ADN deVp e/ou.....de Vj_

Emprega-se um sistema de selecção forte de modo a reduzir o número de vectores de expressão presentes na biblioteca final que não contém homólogos de ADN de Vp e/ou de Vp, 0 sistema de selecção combina a. mutação do gene S lambda dominante com o ARNt supressor que está presente nos vectores de expressão de Vp e/ou de Vp. Quando o ARNt supressor está presente no vector de expressão, a proteína 8 lambda mutante é produzida evitando a lise da célula infectada e evitando, deste modo, a formação de uma placa de fago,. Quando um homólogo de ADN substitui o ARNt supressor, o vector de expressão pode produzir uma placa de fago. De modo a detectar um Vp e/ou um Vp, o vector de expressão de Vp e/ou de Vp tem de produzir uma placa de fago porque, sem a produção de placa? n.ão existem Vp e Vp expressos suficientes para detectar usando ensaios quer imunológícos quer de ligação. Deste modo, os fagos que não contem um Vp e/ou um Vp não serão detectados» Para realizar esta selecção, as células bacterianas de hospedeiro apropriado, contendo o plasmídeo de gene S mutante, produzido no Exemplo 17A, são infectadas com a. biblioteca de vector de expressão desejada. Apenas os vectores de expressão sem genes de ARNt supressor, os vectores de expressão contendo homólogos de ADN, produzem placas de fago.

18,

Geração............de...........uma.........grande___________blbl ioteca reportório......ds.......imunoglobulina......em.....fago combinatória do

Nas Figuras 7 e 9 apresentam-se em diagrama., vectores adequados para expressão de sequências de Vp, Vp, Fv e Fab.. Como previamente se discutiu, os vectores foram construídos, por modificações do Lambda Zap, por inserção de oligonucleótidos sintéticos no sítio c o n c eb i d o s p ar a serem restrição Not I e EcoR e de expressão. Como colocação d© sítios de bacteriofago, é a c de clonação múltiplo. Os vectores foram anti-simétricos em relação aos sítios de 1 que flamqueiam as sequências de clonação a seguir se descreve?, esta assimetria na restrição num vector linear, tal como o aracteristica essencial que permite a

026 8CR0285P

combinação de uma biblioteca, exprimindo cadeias leves, com uma exprimindo cadeias pesadas, para construir bibliotecas de expressão de Fab combinatórias, 0 Lambda Zap II Vl II (Figura 9) é concebido para servir como vector de clonação para fragmentos de cadeia leve @ o Lambda Zap II Vh (figura 7) é concebido para servir como vector de clonação, para sequências de cadeia pesada no passo inicial de construção da biblioteca,. Estes vectores são construídos para clonarem, eficientemente, os produtos de amplificação por PCR com sítios de restrição específicos incorporados em cada extremidade.

A Amplificação por........PCR.....de......Fragmentos......de anticorpo

A amplificação por PCR de ARNm isolado de células de baço com oligonucleótidos, que incorporam sítios de restrição nas extremidades do produto amplificado, pode ser usada para clonar e exprimir sequências de cadeia pesada, incluindo sequências de cadeia Fd e kappa. Os iniciadores de oligonucleótido usados para estas amplificações são apresentados nas Tabelas 1 e 2, Os iniciadores são iguais aos que foram usados com sucesso, no Exemplo 5, para amplificação de sequências Vjq- 0 conjunto de iniciadores 5’ para a amplificação da cadeia pesada foi idêntico ao previamente usado para amplificar Vq e os usados para .amplificação da cadeia leve foram escolhidos com base em princípios similares, Sastry et al., Proc........Natl.........Acad........Sei ..............USA.,

G : 5728 (1989) e 0 r landi et al., Proc.»........Natl,,..............Acad. .....Sc i , USA ,

8G:3833 (1989). Os iniciadores 3’ únicos das sequências de cadeia pesada (IgGl) © leve (k) foram escolhidos para incluir as cistfôinas envolvidas na formação da ligação dissulfurefco cadeia pesada - cadeia leve. Nesta, fase não se construiu qualquer iniciador para amplificar as cadeias leves lambda, uma vez que constituem apenas uma pequena fraeção de anticorpos murinos. Adicionalmente, os fragmentos Fv foram construídos usando um iniciador 3’, que é complementar com o ARNm da região J (de reunião) (aminoácido 128), e um conjunto de iniciadores 5’ únicos, que são complementares com o ADNc da primeira cadeia na região do terminal N conservada da proteína processada. As sequências de reconhecimento de endonuclease de restrição são

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SCR0285P

-97Incorporadas nos iniciadores, para permitir fragmento amplificado num vector de fago lambda leitura predeterminada, para expressão.

numa cadeia de

B- Construção da.......Biblioteca

A construção de uma biblioteca combinatória foi realizada em dois passos,, No primeiro passo, as bibliotecas da cadeia pesada © leve foram construídas em Lambda Zap 11 Vq e Lambda Zap II Vp 11, respectivamente. No segundo passo, estas duas bibliotecas foram combinadas nos sítios EcoR I anti-simétrieos presentes em cada vector,, Este procedimento resultou numa biblioteca de clones cada um dos quais co-exprime potencialmente uma cadeia pesada e uma cadeia leve. As combinações reais são aleatórias e não reflectem, necessariamente, as combinações presentes na população de células B no animal original,. Usou-se o vector de expressão Lambda Zap II Vq para criar uma biblioteca de sequências de cadeia pesada a partir do ADN obtido por amplificação por PCR de ARNm isolado a partir do baço de um ratinho 129 S^_x + , previamente imunizado com fosforamídato de p-nitrofenilo (NPN), antigénio 1, de acordo com a fórmula I (Figura 13) conjugado com hemocianina de lapa Fissurela (KLH). 0 conjugado NPN-KLH foi preparado por mistura de 250 wl de uma solução contendo 2,5 mg de NPN de acordo com a fórmula 1 (Figura 13) em dimetilformamida, com 750 wl de uma solução contendo 2 mg de KLH em tampão de fosfato de sódio 0,01 M (pH 7,2). As duas soluções foram misturadas por adição lenta da solução de NPN à solução de KLH, mantendo a solução de KLH agitada com uma barra de agitação rotativa. Depois, a mistura foi mantida a 42C durante 1 hora com a mesma agitação para permitir o prosseguimento da conjugação,. 0 conjugado NPN-KLH foi isolado do NPN e da KLH não conjugados por filtração em gel através de Sephadex Θ-25,. 0 conjugado de NPN-KLH isolado foi usado em imunizações de ratinho como se descreve no Exemplo 2.

ARNm de baço, resultante das imunizações anteriores, foi isolado e usado para criar uma biblioteca principal de sequências de gene Vq usando o vector de expressão Lambda Zap II Vq„ A biblioteca principal contém 1,3 x 10& ufp e foi pesquisada quanto

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SCR0285P â expressão do decapéptido tag, para determinar a percentagem de clones exprimindo sequências Fd. A sequência deste péptido apenas fica em cadeia, para, expressão após a elonação de um fragmento Fd (ou V_H) no vector» Pelo menos 80¾ dos clones na biblioteca exprimem fragmentos Fd, com base na imunodetecçáo do decapéptido tag..

A biblioteca da cadeia leve foi construída da mesma forma que a da cadeia, pesada e verificou-se que contém 2 x 10^ membros. Um ensaio das placas, usando um anticorpo anti-cadeia kappa indicou que 60¾ da biblioteca continha inseridos de cadeia leve expressos» Esta percentagem relativamente pequena de inseridos resultou, provavelmente, da desfosforilação incompleta do vector após clivagem com Sac I e Xba I„

Uma vez obtidas, as duas bibliotecas foram usadas para construir uma biblioteca combinatória, pelo seu cruzamento no lugar, cadeia 1, as de

Mlu contendo as

De um modo sítio EcoR I» Para realizar o cruzamento, em' primeiro purificou-se o ADN de cada biblioteca» A biblioteca leve foi clivada com endonuclease de restrição extremidades 5’ resultantes foram desfosforiladas e o produto foi digerido com EcoR .1» Este processo clivou o braço esquerdo do vector em vários bocados, mas o braço direito, sequências de cadeia leve, permaneceu intacto, paralelo, o ADN da biblioteca de cadeia leve foi clivado com Hind III, desfosforilado e clivado com EcoR 1, destruindo o braço direito mas deixando o braço esquerdo, contendo as sequências de cadeia pesada, intacto» Os ADN assim preparados foram então combinados e ligados» Após a ligação, apenas os clones que resultaram da. combinação de um braço direito de clones, contendo a cadeia leve, com um braço esquerdo de clones, contendo a cadeia pesada, reconstituíram com fago viável» Após ligação e empacotamento, obtiveram-se 2,5 x 10? clones» Estes constituem a biblioteca de expressão de Fab combinatória que foi pesquisada para identificar clones possuindo afinidade por NPN, Para determinar fragmentos duplicado a frequência dos clones de. fago que co-exprimem de cadeia leve e pesada, testaram-se amostras os das bibliotecas de cadeia leve, de cadeia pesada e

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..99.

cadeia leve e pesada. Neste estudo de, aproximadamente, 500 fagos recombinantes, aproximadamente 60¾ co-exprimiram proteínas de cadeia leve e pesada.

C- Ligação......de......antigénio

Analisaram-se todas as três bibliotecas, de cadeia leve, de cadeia pesada e Fab, para determinar se continham fago recombinante que exprimia fragmentos de anticorpo que se ligavam ao NPN. Num procedimento típico colocaram-se 30 000 fagos em prato e ensaiaram-se amostras em duplicado, com nítrocelulose, para determinar a ligação a NPN acoplado a BSA marcado com (Figura. 15). Ensaios em duplicado de 80 000 fagos recombinantes, da biblioteca de cadeia leve, e um número similar da biblioteca de cadeia pesada, não identificaram quaisquer clones que se ligavam ao antigénio. Em contraste, o ensaio de um número similar de clones da biblioteca de expressão de Fab identificou muitas placas de fago que se ligavam ao NPN (Figura 15). Esta observação indica que, sob condições nas quais muitas cadeias pesadas, em combinação com cadeias leves, se ligam ao antigénio, as mesmas cadeias pesada e leve, sozinhas, não o fazem. Deste modo, no caso cio NPN, crê-se que existem muitas cadeias pesadas e leves que apenas se ligam ao antigénio quando estão combinadas, respectivamente, com cadeias leves e pesadas específicas.

Para determinar a capacidade para pesquisar grandes números de clones e para obter uma estimativa mais quantitativa da frequência de clones de ligação a antigénio, na biblioteca combinatória, pesquisaram-se um milhão de placas de fago e identificaram-se aproximadamente 100 clones que se ligavam ao antigénio. Para seis clones que se pensava que se ligavam ao NPN, uma região do prato contendo os positivos e aproximadamente 20 placas de bacteriofago circundantes foi nucleada, colocada de novo em prato e pesquisada com amostras em duplicado (Figura 15). Como se esperava, aproximadamente um em vinte fagos ligava-se, espeeifieamente, ao antigénio» Os núcleos das regiões do fago em prato, que se pensava serem negativos, não deram resultados

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-100positivos quando foram colocados de novo em placa,,

Para determinar a especificidade da interacção antigénio anticorpo, a ligação de antigénio competiu com antigénio livre não marcado, como se mostra na Figura 16. Os estudos de competição mostraram que os clones individuais podiam ser distinguidos com base na afinidade pelo antigénio. A concentração de haptenos livres rquerida para a inibição completa da ligação variou entre 10-100 x 10^ M sugerindo que os fragmentos Fab expressos tinham constantes de ligação na gama dos nanomolares.

D» Composição dos.....clones......e dos seus......produtos......expressos

Na preparação para caracterização dos produtos de proteína capazes de se ligarem ao NPN, como se descreve no Exemplo 18C, um plasmídeo contendo os genes da cadeia pesada e leve foi excisado a partir da placa de bacteriofago nucleada apropriada usando fago auxiliar N13mp8„ Determinação do mapa do plasmídeo excisado demonstrou um padrão de restrição consistente, com a incorporação de sequências de cadeia pesada e leve. Os produtos de proteína de um dos clones foram analisados por ELISA e por manchas Western, para estabelecer a composição da proteína de ligação ao NPN. Concentrou-se um sobrenadante bacteriano, após a indução por ΙΡΤΘ, e submeteu-se a filtração em gel. Reuniram-se as fracções com peso molecular na gama de 40-60 kD, concentraram-se e submeteram-se a uma separação, por filtração em gel, adicional. Como se ilustra na Figura 17, e análise ELISA das fracções eluentes demonstrou que a ligação de NPN estava associada a uma proteína de peso molecular de cerca, de 50 kD, cuja detecção imunológica mostrou que continha ambas as cadeias leve e pesada. Uma mancha Western (que não se mostra) de uma preparação de sobrenadante bacteriano concentrado, sob condições não redutoras, foi desenvolvida com anticorpo anti-decapéptido Esta revelou uma banda de proteína, com um peso molecular de 50 kD. Tomados em conjunto, estes resultados são consistentes com o facto da ligação ds NPN ser uma função de fragmentos Fab nos quais as cadeias pesada e leve estão ligadas de um modo covalente..

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-101E.. Comparação......das......propriedades......do......reportório Invivo versus biblioteca......combinatória de fago

Neste exemplo preparou-se uma biblioteca relativamente restrita, porque apenas se usou um número limitado de iniciadores para a amplificação por PCR de sequências Fd. Espera-se que a biblioteca contenha apenas clones exprimindo sequências kappa/gama 1. Contudo, esta não é uma limitação inerente do método.: uma vez que ss podem adicionar iniciadores adicionais para amplificar qualquer classe ou subclasse de anticorpo,, Apesar desta restrição, foi possível isolar um grande número de clones de ligação a antigénios.

Uma questão central que resulta deste trabalho é a de como uma biblioteca de fago, preparada como aqui se descreve, se compara, com o reportório de anticorpos in vivo em termos de tamanho, caracterxsticos de diversidade e facilidade de acesso.

tamanho de reportório de anticorpos de mamífero @ difícil de avaliar mas é muitas vezes proposto um número de ordem de 10⁶-10⁸ especificidades de antigênio diferentes. Com algumas das reservas que a seguir se discutem, pode-se construir facilmente uma biblioteca de fago deste tamanho, ou maior, por uma modificação do corrente método,. De facto, uma vez construída uma biblioteca combinatória inicial, as cadeias pesadas ε leves podem ser rearranjadas, para obter bibliotecas com números excepci o na1mente gra ndes.

Em princípio, espera-se que as características de diversidade do reportório nativo (não imunizado), in vivo e da biblioteca de fago correspondente sejam similares, pelo facto de envolverem ambas uma combinação aleatória de cadeias leves e pesadas., Contudo, existem diferentes factores que actuarão para restringir a diversidade expressa por um reportório in vivo e pela biblioteca de fago, Por exemplo, uma modificação fisiológica tal como a tolerância, restringirá a expressão de certas especificidades antigénicas do reportório in vivo, mas estas especificidades podem ainda aparecer na biblioteca de fago. Por outro lado, uma tendência no processo de clonação pode introduzir

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restrições na diversidade da biblioteca de fago. Por exemplo, pode-se esperar que a representação de ARN para as sequências expressas por células B estimuladas predomine sobre as de células não estimuladas devido a níveis de expressão mais elevados» Tecidos de diferentes fontes (p„e„, sangue periférico, medula óssea ou nódulos linfáticos regionais) e diferentes iniciadores de PCR (p.e», os que se espera que amplifiquem diferentes classes de anticorpos) podem resultar em bibliotecas com características de diversidade diferentes.

Outra diferença entre o repertório in vivo e a biblioteca de biblioteca reportório maturadas, fago consiste no facto de os anticorpos, isolados a partir do primeiro, poderem ter sido beneficiados por maturação por afinidade, devido a mutações somáticas após a combinação das cadeias pesadas e leves, enquanto que o segundo combina, aleatoriamente as cadeias pesadas e leves maturadas» Numa dada de fago suficientemente grande, derivada de um in vivo particular, as cadeias leves e pesadas, originais, recombinar-se-ão» Contudo, uma vez que um dos potenciais benefícios desta nova tecnologia é o de obviar a necessidade de imunização pela geração de uma única biblioteca de fago genérica, altamente diversa, seria útil ter métodos para optimizar as sequências para compensar a ausência de mutação somática e de selecção clonal. Pelos processos do presente invento ficam facilmente disponíveis três procedimentos» Em primeiro lugar, a mutagénese de saturação pode ser realizada nas CDR e os Fab resultantes podem ser testados para determinar a função aumentada... Em segundo lugar, podem-se recombinar uma cadeia pesada ou uma cadeia leve dum clone, que se liga a um antigénio, com as bibliotecas, inteiras, de cadeia leve ou pesada, respectivamente, num procedimento idêntico ao usado para construir a biblioteca combinatória.» Em terceiro lugar, podem-se realizar ciclos iterativos dos dois procedimentos anteriores para optimizar adicionalmente a afinidade ou as propriedades catalíticas da imunoglobulina» Será de notar que os dois últimos procedimentos não são permitidos na selecção clonal de células B, o que sugere que os métodos aqui descritos podem realmente

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-103aumentar a capacidade de identificar

acesso é a terceira área onde tem interesse comparar o repertório de anticorpos in vivo e a biblioteca de fago,. Em termos práticos a biblioteca de fago tem um acesso muito mais fácil.. Os métodos de ensaio permitem pesquisar, pelo menos, 50 000 clones por prato de modo que, por dia, se podem examinar facilmente 10⁶ anticorpos. Este factor, por si só, deverá encorajar a substituição da tecnologia do hibridoma pelos métodos que aqui se descrevem. Os métodos de ensaio mais poderosos utilizam a selecção que pode ser realizada incorporando marcadores seleccionáveis no antigénio, tais como grupos desactivação relacionadas rejeitáveis necessários para a replicação de estirpes bacteriana® auxotróficas ou substituintes tóxicos susceptíveis de catalítica. Existem também outras vantagens com o facto de apenas se poder ter acesso ao repertório ds anticorpos in vivo, através de uma imunização que é uma selecção com base na afinidade de ligação, A biblioteca de fago não está restringida de um modo similar. Por exemplo, o único método geral para identificar anticorpos com propriedades catalíticas tem sido por pré-selecção, com base na afinidade do anticorpo por um análogo do estado de transição. Estas restrições não se aplicam à biblioteca in vivo onde a catálise pode, em princípio, ser avaliada dírectamente, A capacidade para testar dírectamente grandes números de anticorpos, quanto à' sua. função, pode permitir a selecção de catalisadores em reacções onde não está bem definido um mecanismo ou onde a síntese do análogo do estado de transição é difícil» A determinação de catálise, dírectamente, elimina & inclinação do procedimento de pesquisa para certos mecanismos de reacção pejorativos para um análogo sintético e, deste modo, é possível para uma. dada transformação química, a exploração simultânea de múltiplos percursos reaccionais .·.

Os processos aqui apresentados descrevem a geração de. fragmentos Fab que são claramente diferentes, num certo número d© aspectos, dos anticorpos intactos (inteiros). Existe indubitavelmente uma perda ou afinidade quando se têm ligantes, d©

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-104antigénio, de Fab, monovalentes, mas isto pode ser compensado por selecção de ligantes adequadamente fortes. Para um certo número de aplicações tais como agentes de diagnóstico e biosensores, pode ser preferível ter fragmentos monovalentes. Para aplicações requerendo funções de efector Fc, já existe a tecnologia para a extensão do gene da cadeia pesada e expressão do anticorpo inteiro glicosilado em células de mamífero.

As ideias aqui apresentadas dirigem-se às questões fulcrais na identificação e avaliação de anticorpos. É agora possível construir e pesquisar, pelo menos, três ordens de grandeza, mais clones com mono-especificidades do que era anteriormente possível,. As aplicações potenciais do processo deverão englobar a investigação básica e as ciências aplicadas.

Pretende-se que a descrição anterior seja ilustrativa e não limitativa da presente invenção. Podem-se efectuar numerosas variações e modificações sem sair do verdadeiro espírito e âmbito do presente invento,.

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-105»

Claims (44)

1. R.......E.......I.......V.......I.......N......D.......1.......0......A......Ç......O......E......S

   1 -- Processo para a produção de um ácido nucleico conservado que codifica um receptor, de um reportório de genes conservados que codificam receptores, caracterizado por compreender:

   (a) a síntese d© uma biblioteca de genes conservados que codificam receptores, contendo uma pluralidade de homólogos de ADN diferentes que codificam o receptor por.

   (i) separação das cadeias de um reportório de genes conservados codificando o receptor, o referido reportório compreendendo ácidos nucleicos de cadeia dupla, contendo, cada um, uma cadeia codificando o receptor, temperada (annealed) com uma cadeia complementar» (ii) tratamento das referidas cadeias separadas, sob condições adequadas, para amplificação, por reacção em cadeia com polimerase, com primeiros e segundos iniciadores de síntese de polinucleótidos, possuindo, cada um dos referidos primeiros iniciadores, uma sequência de nucleótidos, capaz de se hibridar com uma sequência conservada entre as referidas cadeias codificando receptor, e possuindo, cada um dos referidos segundos iniciadores, uma sequência de nucleótidos capaz de se hibridar com uma sequência conservada entre as referidas sequências complementares, sendo os referidos iniciadores, capazes de iniciar a amplificação de uma pluralidade de homólogos d© ADN diferentes, codificando o receptor, do referido reportório de genes que codificam receptores, produzindo o referido tratamento, a referida biblioteca de genes conservada codificando receptores»
2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido ácido nucleico conservado, codificando receptor, codificar um Vp, por os referidos genes conservados codificando receptores serem genes codificando Vp e por os referidos homólogos de ADM codificando receptor serem homólogos de ADN codificando Vp.
3. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o referido primeiro iniciador de síntese de polinucleótidos

   71 026

   SCR0285P se hibridar com uma sequência de nucleótidos de imunoglobulina Jp ou da região conservada da região variável (framework).
4. 4 ™ Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o referido segundo iniciador da síntese de polinucleótidos se hibridar com uma região conservada da região variável framework, de comando ou promotora de um gene da imunoglobulina

   V_H· por

   - Processo de acordo com a reivindicação 2. empreender, adicionalmente, a segregação.

   caracterizado a partir da referida biblioteca codificando o Vp, '^c'^e um homólogo de ADN codif cando o Vp, o qual codifica um receptor de especificidade predeterminada.
5. 6 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a referida segregação compreender:

   (a) a ligação operativa, para expressão de cada um de uma pluralidade, dos referidos homólogos de ADN, codificando o Vp, diferentes, a um vector de expressão, formando-se assim uma pluralidade de vectores de expressão de Vp, diferentes;

   (b) a transformação de uma população de células hospedeiras, compatíveis com o referido vector de expressão, com uma pluralidade dos referidos vectores diferentes, para produzir uma população hospedeiras, cujos membros contem os expressão de Vp;

   de expressão de Vp, transformada de células refer idos vec tor es de (c) a cultura, da referida população transformada sob condições de expressão dos receptores codificados, pelos referidos homólogos de ADN codificando o Vp;

   farmada, referido (d) a análise dos membros da referida população transquanto à expressão de um receptor capaz de se ligar ao ligando pré-seleccionado, idsntificando-se assim os transformantes contendo o referido homólogo de ADN codificando o vwi (e) a segregação de um transformante identificado, do

   71 026 3CR0285P

   -107 passo (d), a partir da referida população, produzindo-se assim o referido ácido nucleico, conservado codificando o Vq»
6. 7 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o referido gene isolado codificar um receptor catalítico.
7. 8 · Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por as referidas células hospedeiras exprimirem uma molécula de Vq e por os referidos transformantes identificados exprimirem um Fy, que se liga ao referido ligando pré-seleccionado.
8. 9 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por todos os membros da referida população de células hospedeiras exprimirem o mesmo V(_ pré-seleccionado e por os referidos transformantes identificados exprimirem um Fy que se liga ao r ef er i do 1 i ga rido pr é-se 1 ecc i o nado.
9. 10 ~ Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o referido receptor conter um epítopo pré-selecionado, codificado quer por qualquer dos referidos iniciadores quer pelo referido vector de expressão,.
10. 11 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o referido vector de expressão ser um epissoma, um fago ou um plasmideo compreendendo um gene marcador seleccionável.
11. 12 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido ácido nucleico, conservado, que codifica receptores, codificar um Vq, por os referidos genes conservados, que codificam receptores, serem genes codificando o Vq e por os referidos homólogos de ADN, que codificam receptores, serem homólogos de ADN que codificam o Vq.
12. 13 - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por compreender, adicionalmente, a segregação, a partir da referida biblioteca que codifica o Vq, de um homólogo de ADN codificando o Vq, o qual codifica um V| capaz de modular a afinidade de ligação de um Vq pré-seleccionado»
13. 14 Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por a referida segregação compreender=

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    -108 (a) a ligação operativa a um vector, para expressão, de uma porção dos homólogos de ADN codificando o V|__ produzidos de modo a formar um vector d© expressão de Vi ;

    (b) a transformação de uma população de células hospedeiras compatíveis, capazes de exprimir o referido receptor 'pré-seleccionado, com uma pluralidade dos referidos vectores de expressão de V[j (c) a cultura da referida população transformada sob condições de expressão tanto do polipéptido, codificado pelo referido homólogo de ADN que codifica o Vç como do referido receptor pré-seleccionado, para produzir um Fyj e (d) a segregação, a partir da referida cultura, de um transformante que produz um Fy, o qual possui uma afinidade de ligação a um ligando, ligado pelo referido receptor pré-seleccionado, que é diferente da do referido polipéptido de ligação ao ligando pré-seleccionado, sozinho, isolando-se assim o referido ácido nucleico conservado codificando o Vq.
14. 15 - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o referido primeiro iniciador de síntese de polinucleótidos se hibridar com uma sequência de nucleótidos de imunoglobulina ou da região da cadeia (framework).
15. 16 - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o segundo iniciador de síntese de polinucleótidos se hibridar com uma região da cadeia de comando ou promotora de um gene de imunoglobulina
16. 17 - Processo de acordo com a reivindicação do por o referido Fy ser catalítico,,

    12, caracteriza
17. 18 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida síntese ser realizada usando uma pluralidade de primeiros iniciadores diferentes» pOi'
18. 19 - Processo de acordo com a reivindicação a referida síntese ser realizada, usando uma

    1, caracter iz ado p 1 u r a 1 i d a d e. d e segundos iniciadores diferentes.

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    10920 Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida síntese ser realizada usando uma pluralidade de diferentes primeiros iniciadores de síntese de polinucleótidos e uma pluralidade de diferentes segundos iniciadores de síntese de p o 1 i n u c 1 e ó t i d o s „
19. 21 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o passo (a) ser realizado várias vezes, usando, de cada vez, um reportório diferente de genes conservados codificando receptores e misturando, cada uma, das bibliotecas de genes conservados, codificando receptores, produzidas de cada vez»
20. 22 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por as referidas moléculas de vector de expressão serem moléculas de vector de expressão de ADN linear»
21. 23 -- Processo de acordo com do por as referidas moléculas linear serem moléculas de vector
22. 24 Processo de acordo com do por as referidas moléculas moléculas de Vp Zap II Lambda,.

    a reivindicação 22, caracterizade vector de expressão de ADN de fago,.

    a reivindicação 23, caracterizade vector de fago lambda serem
23. 25...... Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por incluir, adicionalmente, a ligação operativa de um gene codificando o V[_ às referidas moléculas de vector de fago»

    Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por o referido homólogo ds ADN codificando o Vp e o referido gene codificando o V|~_ serem ligados operativamente às referidas moléculas de vector de fago numa orientação para expressão dicistrónica»
24. 27 - Processo para a produção de um receptor catalítico, caracterizado por compreender:

    (a) a ligação operativa, para expressão, de um gene isolado de acordo com a reivindicação 7 a um vector de expressão adequada, para formar um vector de expressão Vp;

    (b) a transformação de uma célula hospedeira compatível

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    110 com o referido vector de expressão, para produzir um t r a n s f o r m a n t e í (c) cultura do referido transformante, expressão do receptor catalítico codificado homólogo de ADN codificando o Vq, produzindo-se receptor catalítico na referida cultura; © sob condições de pelo referido assim o referido (d) a recuperação, referido receptor catalítico,.

    a partir da referida cultura.

    do
25. 28 - Processo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por a referida célula hospedeira conter um gene codificando o Vl, ó qual exprime um Vl capaz de modular a actividade catalítica CiO referido receptor catalítico produzido, e por o referido rceptor catalítico produzido estar presente como parte de um Fy que compreende o referido receptor e o referido Vl»
26. 29 - Processo de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por o referido gene isolado e o referido gene codificando o Vl serem ligados operativamente, para expressão, ao mesmo vector de expressão.
27. 30 - Processo para a produção de um vector de co-expressão isolado, capaz de exprimir um primeiro e um segundo polipéptidos a partir de um primeiro e de um segundo genes, respectivos, sendo os referidos primeiro e segundo polipéptidos capazes de formar um de especificidade predeterminada, •eceptor heterodimérico caracteri zado por compreender:

    (a) a síntese de uma biblioteca de genes codificando o primeiro polipéptido, contendo uma pluralidade de homólogos de ADN diferentes, codificando o primeiro polipéptido, por:

    (i) separação das cadeias de um reportório de genes codificando o primeiro polipéptido, compreendendo o referido reportório ácidos nucleicos de cadeia dupla, contendo, cada um, uma cadeia codificando o primeiro polipéptido, temperada com uma cadeia complementar;

    (ii) tratamento das referidas cadeias separadas,

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    -111 sob condições adequadas para amplificação, por reacção em cadeia com polimera.se, com primeiros e segundos iniciadores de síntese de polinucleótidos, possuindo, cada u.m dos referidos primeiros iniciadores, urna sequência de nucleótidos, capaz de se hibridar com uma sequência conservada entre as referidas cadeias codificando o primeiro polipéptido e possuindo, cada um, dos referidos segundos iniciadores, uma sequência de nucleótidos capaz de se hibridar com uma sequência conservada entre as refridas cadeias complementares, sendo os referidos iniciadores capazes de iniciar a amplificação de uma pluralidade de homólogos de ADN diferentes, codificando o primeiro polipéptido, a partir do referido reportório de genes codificando o primeiro polipéptido, produzindo, o referido tratamento, a referida biblioteca de genes codificando o primeiro polipéptido;

    (b) a síntese de uma biblioteca de genes, codificando o segundo polipéptido, contendo uma pluralidade de homólogos ds ADN diferentes, codificando o segundo polipéptido, por:

    (i) separação das cadeias de um reportório de genes, codificando o segundo polipéptido, compreendendo o referido reportório ácidos nucleicos.de cadeia dupla, contendo, cada um, uma cadeia codificando o segundo polipéptido, temperada com uma segunda cadeia complementar;

    (ii) tratamento das referidas cadeias separadas, sob condições adequadas para amplificação, por reacção em cadeia com polimera.se, com terceiros © quartos iniciadores de síntese de polinucleótidos possuindo, cada um dos referidos terceiros iniciadores, uma sequência de nucleótidos capaz ds se hibridar com uma sequência conservada entre as referidas cadeias codificando o segundo polipéptido, e possuindo, cada um dos referidos quartos iniciadores, uma sequência de nucleótidos correspondente a uma sequência conservada entre as referidas segundas cadeias complementares, sendo os referidos iniciadores capazes de iniciar a amplificação de uma pluralidade de homólogos de ADN diferentes, codificando o segundo polipéptido a partir do referido reportório de genes codificando o segundo polipéptido,

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    -112- produzindo o referido tratamento, a referida biblioteca de genes codificando o segundo polipéptido;

    (c) a formação de uma biblioteca diversa de vectores de co-expressão por tratamento de moléculas de vector de expressão adaptadas para ligação aos homólogos de ADN, codificando o primeiro polipéptido e o segundo polipéptido, dos passos (a)(ii) e (b)(ii), respectivamente, com uma pluralidade diversa de referidos homólogos de ADN codificando o primeiro polipéptido & com uma pluralidade diversa de referidos homólogos de ADN codificando o segundo polipéptido, sob condições adequadas para a ligação de ADN, para produzir uma pluralidade de vectores de co-expressão diferentes, sendo, cada um dos referidos vectores de co-expressão diferentes, capaz de exprimir uma molécula, de receptor heterodimérica compreendendo uma combinação de primeiros e segundos polipéptidos que é diferente da combinação de primeiros e segundos polipéptidos que formam moléculas de receptor heterodimêricas, expressas por qualquer outro dos referidos vectores de co-expressão diferentes; e (d) a segregação, a. partir da referida diversa de vectores de co-expressão, de um vector de biblioteca co ão capaz de exprimir um anticorpo de expecificidade predeterminada,.
28. 31 - Processo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por as referidas moléculas de vector de expressão serem moléculas de vector de expressão de ADN linear,.

    Processo de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por as referidas moléculas de vector de expressão de ADN linear serem moléculas de vector de fago.
29. 33 - Processo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por o referido primeiro polipéptido ser um Vp.
30. 34 - Processo de acordo com a reivindicação 33, caracterizado por o referido segundo polipéptido ser um Vp,.
31. 35 - Processo para a produção de um anticorpo monoclonal de especificidade predeterminada, caracterizado por compreender:

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    D

    W I ··. ’<«/ Αλ UJ «Μ·¹ I •113

    Vq, contendo uma pluralidade de homólogos de ADN diferentes codificando o Vq, por:

    (i) separação das cadeias de um reportório de genes codificando o Vq, compreendendo o referido reportório ácidos nucleicos de cadeia dupla, contendo, cada um, uma cadeia codificando o Vq, temperada com uma cadeia complementar>

    (ii) tratamento das referidas cadeias separadas, sob condições adequadas para amplificação, por reacção em cadeia com polimerase, com primeiros e segundos iniciadores de síntese de polinucleótidos possuindo, cada um dos referidos primeiros iniciadores, uma sequência de nucleótidos capaz de se hibridar com uma sequência conservada entre as referidas cadeias codificando o Vq e possuindo, cada um dos referidos segundos iniciadores, uma sequência de nucleótidos capaz de se hibridar com uma sequência conservada entre as referidas cadeias complementares, sendo, cada um dos referidos iniciadores, capaz de iniciar a amplificação de uma pluralidade ds homólogos de ADN diferentes codificando o Vq, a partir do referido reportório de genes codificando o Vq, produzindo, o referido tratamento, a referida biblioteca de genes codificando o Vq3 (b) a síntese de uma biblioteca de genes codificando um Vq contendo uma pluralidade de homólogos de ADN diferentes, codificando o Vq, pors (i) separação das cadeias de um reportório de genes codificando o Vq, compreendendo o referido reportório ácidos nucleicos de cadeia dupla contendo, cada um, uma cadeia c o d i f i c a n cl ο ο V q t empe r a d a c o m uma cadeia c o m p 1 e m e n t a r;

    (ii) tratamento das referidas cadeias separadas, sob condições adequadas para amplificação, por reacção em cadeia com polimerase, com terceiros e quartos iniciadores de síntese de polinucleótidos possuindo, cada um dos referidos terceiros iniciadores, uma. sequência de nucleótidos capaz de se hibridar referidas cadeias seauência conservada entre as com urna

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    -114 - Jrf***T^ codificando o Vp, e possuindo, cada um dos referidos quartos iniciadores uma sequência de nucleótidos correspondente a uma sequência conservada entre as referidas cadeias complementares, sendo os referidos iniciadores capazes de iniciar a amplificação de uma pluralidade de homólogos de ADN diferentes codificando o Vp, a partir do referido reportório de genes codificando o Vp, produzindo, o referido aquecimento, a referida biblioteca de genes codificando o Vp;

    (c) a formação de uma biblioteca diversa de vectores de co-expressão por tratamento de moléculas de vector de expressão adaptadas para ligação aos homólogos de ADN codificando o Vp e o Vp dos passos (a)(ii) e respectivamente, com uma pluralidade diversa de referidos homólogos de ADN codificando o Vp e com uma pluralidade diversa de referidos homólogos de ADN codificando o Vp, sob condições adequadas para a ligação de ADN. para produzir uma pluralidade de vectores de co-expressão diferentes, sendo, cada um dos referidos vectores de co™ -expressão diferentes, capaz de exprimir uma molécula. de anticorpo compreendendo uma combinação de polipéptidos Vp e Vp que © diferente da combinação de polipéptidos Vp e Vp que formam moléculas de anticorpos expressa por qualquer outro dos referidos vectores de co-expressão diferentes;

    (d) a transformação de uma população de células hospedeiras, compatíveis com os referidos vectores de co-expressão, com uma pluralidade de referidos vectores de co-expressão diferentes para produzir uma população transformada;

    (e) a cultura da referida população transformada sob condições de .expressão das moléculas de anticorpo codifiçadas pelos referidos homólogos de ADN codificando o Vp © o Vpj (f) a pesquisa, dos membros da referida população transformada, quanto à. expressão de uma molécula de anticorpo capaz de se ligar a um ligando pré-seleccionado; identifiçando-se, deste modo, um transformante capaz de produzir o referido a n t i c o r p o m ο η o c 1 o n a 1; e

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    -1.1.5(g) a recolha, a partir de uma cultura referido transformante identificado do passo (f), de anticorpo produzidas pela referida cultura, monoclonal do das moléculas produzindo-se assim o referido anticorpo monoclonal.
32. 36 - Processo de acordo com a reivindicação 35, caracteri2ado por o referido anticorpo monoclonal ser catalítico.
33. 37 - Processo para a produção de uma biblioteca de genes co nservados codi fi ca ndo receptores, carac teri zado por compreender:

    (a) a síntese de uma pluralidade de homólogos de ADN diferentes, conservados, codif içando-receptores, por:

    (i) sujeição, do referido reportório de genes conservados codificando receptores, a uma primeira reacção de extensão de iniciador utilizando um primeiro iniciador de síntese de polinucleótidos capaz de iniciar a referida primeira, reacção, por hibridação, com uma sequência de nucleõtidos conservada no referido reportório, produzindo-se assim uma pluralidade de complementos de homólogos de ADN diferentes, codificando receptores, e sujeição dos referidos complementos a uma segunda reacção de extensão de iniciador usando um segundo iniciador de síntese de polinucleótidos capaz de iniciar a referida segunda reacção por hibridação com uma sequência de nucleótidos conservada entre os referidos complementos, produzindo-se assim uma pluralidade de homólogos de ADN diferentes codificando receptores, ou (ii) sujeição, de um complemento de um reportório de genes conservados, codificando receptores a uma terceira reacção de extensão de iniciador, utilizando um terceiro iniciador de síntese de polinucleótidos capaz de iniciar a referida terceira, reacção de extensão de iniciador, por hibridação, com uma sequência de nucleótidos conservada entre os referidos complementos; e (b) a ligação operativa, para expressão de uma pluralidade de homólogos de ADN diferentes, codificando

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    11 6receptores, a um vector para formar uma pluralidade de vectores de expressão de receptores diferentes.
34. 38 - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por os referidos, primeiro, segundo e terceiro, iniciadores de síntese de polinucleótidos codificarem um sítio de reconhecimento de endonuclease de restrição predeterminado.
35. 39 - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por o referido gene codificando receptores codificar um Vq.
36. 40 - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracteriza do por o referido gene codificando receptores codificar um Vq.
37. 41. - Processo de acordo com as reivindicações 39 ou 40, caracterizado por o referido primeiro iniciador de síntese · de polinucleótidos se hibridar com urna sequência de nucleótidos da região de cadeia.
38. 42 - Processo de acordo com a reivindicação 39, caracterizado por o referido primeiro iniciador de síntese de polinucleótidos se hibridar com uma sequência de nucleótidos da- região de cadeia 3 ,
39. 43 - Processo de acordo com a reivindicação 39 ou 40, caracterizado por o referido primeiro iniciador de síntese de polinucleótidos se hibridar com uma sequência de nucleótidos da região Jq.
40. 44 ~ Processo de acordo com a reivindicação 39, caracterizado por o referido primeiro iniciador de síntese de polinucleótidos se hibridar com uma sequência de nucleótidos da região de articulação.
41. 45 - Processo de acordo com a reivindicação 39 ou 40, caracterizado por o referido primeiro iniciador de síntese de polinucleótidos se hibridar com uma sequência de nucleótidos da r e g i ã o c o n s t a n t e.
42. 46 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por as referidas células hospedeiras exprimirem uma pluralidade d© moléculas Vq diferentes, e por os referidos transformantes

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    -117identifiçados exprimirem um Fab que se liga ao referido ligando p r ê - s e 1 e c c i o n a d o.
43. 47 Processo de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por as referidas moléculas de vectores de expressão serem moléculas de vectores de expressão de ADN linear.
44. 48 - Processo de acordo com a reivindicação 47, caracteriza do por as referidas moléculas de vector de expressão de ADN linear serem moléculas de vector ds fago.