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ES2624547T3 - Anticuerpos anti il 6, composiciones, métodos y usos - Google Patents

Anticuerpos anti il 6, composiciones, métodos y usos Download PDF

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ES2624547T3
ES2624547T3 ES10179049.1T ES10179049T ES2624547T3 ES 2624547 T3 ES2624547 T3 ES 2624547T3 ES 10179049 T ES10179049 T ES 10179049T ES 2624547 T3 ES2624547 T3 ES 2624547T3
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ES
Spain
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antibody
human
variant
cells
antibodies
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
ES10179049.1T
Other languages
English (en)
Inventor
Jill Giles-Komar
David Knight
David Peritt
Mohit Trikha
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Janssen Biotech Inc
Original Assignee
Janssen Biotech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Application filed by Janssen Biotech Inc filed Critical Janssen Biotech Inc
Application granted granted Critical
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Abstract

Un anticuerpo híbrido, humanizado o CDR injertado o fragmento de anticuerpo capaz de inhibir la IL-6 humana que comprende regiones determinantes complementarias (CDR) de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 y 6 derivado de un anticuerpo anti-IL-6 monoclonal murino CLB-8 y una región constante derivada de uno o más anticuerpos humanos, en donde dicho anticuerpo híbrido, humanizado o CDR injertado o fragmento de anticuerpo se une a IL-6 con una afinidad (Kd) de al menos 10-9 M.

Description

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Anticuerpos anti iL-6, composiciones, metodos y usos Descripcion
ANTECEDENTES DE LA INVENCION CAMPO DE LA INVENCION
La presente invencion se refiere a anticuerpos, incluidas variantes o porciones especificadas, especfficas para al menos una protefna interleucina-6 (IL-6 tambien conocida como interferon p2) o fragmento de la misma, as^ como los acidos nucleicos que codifican tales anticuerpos anti-IL-6, acidos nucleicos complementarios, vectores, celulas hospedadoras y metodos para crear y utilizar los mismos, incluidos dispositivos, administracion y formulaciones terapeuticas.
ANTECEDENTES DE LA TECNICA
La interleucina-6 (IL-6) es una citocina pro-inflamatoria que es producida por muchos tipos diferentes de celulas. In vivo, las celulas endoteliales, los fibroblastos y los monocitos estimulados representan las principales fuentes de IL-6. Otras celulas tales como macrofagos, linfocitos T y B, granulocitos, queratinocitos, mastocitos, osteoblastos, condrocitos, celulas gliales y celulas del musculo liso tambien producen IL-6 tras ser estimulados (Kishimoto, T., Blood 74:1-10 (1989) y Kurihara, N. et al., J. Immunology 144:4226-4230 (1990)). Varias celulas tumorales tambien producen iL-6 (Smith, P.C. et al. Cytokine and Growth Factor Reviews 12:33-40 (2001)) y, recientemente, se ha indicado que IL-6 es un factor pronostico de la evolucion del cancer de prostata (Nakashima, J. et al. Clinical Cancer Research 6:2702-2706 (2000)). La produccion de IL-6 puede ser regulada por la propia IL-6 y dependiendo del tipo de celula, la IL-6 puede estimular o inhibir su propia sfntesis.
La IL-6 puede unirse al receptor de IL-6 expresado en monocitos perifericos, linfocitos T y linfocitos B activados por mitogenos, y determinados tumores (Ishimi, Y. et al., J. Immunology 145:3297-3303 (1990)). El receptor de IL-6 tiene al menos dos componentes diferentes y esta compuesto por una cadena alfa denominada gp80 que es responsable de la union de IL-6 y una cadena beta denominada gp130 que es necesaria para la transduccion de senales (Adebanjo, O. et al., J. Cell Biology 142:1347-1356 (1998) y Poli, V. et al., EMBO 13:1189-1196 (1994)). La familia de citocinas que incluye IL-6, LIF, oncostatina M, lL-11, CNTF y CT-1, todas senalizan a traves de gp130 despues de la union a sus receptores afines. Ademas, todos los miembros de la familia de citocinas IL-6 pueden inducir la expresion hepatica de protefnas de fase aguda (Bellido, T. et al., J. Clin. Investigation 97:431-437 (1996)). 87908790.
Existen al menos dos funciones biologicas principales de la IL-6: la mediacion de las protefnas de fase aguda y actuar como factor de diferenciacion y activacion (Avvisti, G. et al., Baillieres Clinical Hematology 8:815-829 (1995) y Poli, V. et al., EMBO 13:1189-1196 (1994)). Las protefnas de fase aguda son conocidas por regular las respuestas inmunitarias, intervenir en la inflamacion y desempenar un papel en la remodelacion tisular. Como factor de diferenciacion y activacion, IL-6 induce la diferenciacion y secrecion de anticuerpos de los linfocitos B, induce la diferenciacion de linfocitos T a linfocitos T citotoxicos, activa los factores de senalizacion celular y promueve la hematopoyesis (Ishimi, Y. et al., J. Immunology 145:3297-3303 (1990)). IL-6 esta implicada de manera destacada en muchos procesos y funciones corporales crfticas. Como resultado, pueden potenciarse, suprimirse o impedirse los procesos fisiologicos, incluidos el metabolismo oseo, la transformacion neoplasica y las respuestas inflamatoria e inmunitaria, manipulando la actividad biologica de la IL-6 in vivo por medio de un anticuerpo (Adebanjo, O. et al., J. Cell Biology 142:1347-1356 (1998)).
Aunque la IL-6 esta implicada en muchas vfas, los ratones knockout para IL-6 tienen un fenotipo normal, son viables y fertiles, y estos animales presentan una ligera disminucion del numero de linfocitos T y una disminucion de la respuesta de protefnas de fase aguda a la lesion tisular (Kopf M et al., Impaired immune and acute-phase responses in interleukin-6-deficient mice, Nature; 368 (6469):339-42, 1994). Por el contrario, los ratones transgenicos que sobreexpresan IL-6 desarrollan una enfermedad neurologica tal como neurodegeneracion, astrocitosis, vasculogenesis cerebral, y estos ratones no desarrollan una barrera hematoencefalica (Campbell et al., Neurologic Disease Induced in Transgenic Mice by Cerebral Overexpression of Interleukin 6 PNAS 90: 10061-10065, 1993).
Estudios recientes han indicado que un Mab contra la IL-6 puede inhibir el crecimiento in vivo de tumores de prostata (Smith, P.C. y Keller, E.T., The Prostate en prensa y Okamoto, M. et al., Cancer Research 57:141-146 (1997) y el carcinoma renal (Weissglas, M. et al., The Journal of Urology 153:554-557 (1995)). Ademas de un efecto directo sobre el crecimiento tumoral, el bloqueo de la produccion de IL-6 puede tambien quimio-sensibilizar y potenciar la eficacia citotoxica (Smith, P.C. et al. Cytokine and Growth Factor Reviews 12:33-40 (2001)). Colectivamente, la literatura nos ensena que el bloqueo de la actividad de IL-6 puede inhibir la degradacion osea, el crecimiento tumoral y la caquexia por cancer.
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La inmunoterapia pasiva que emplea anticuerpos policlonales no humanos (por ejemplo, antisueros) o anticuerpos monoclonales (Mab) y fragmentos de los mismos (por ejemplo, productos de digestion proteolftica de los mismos) son posibles agentes terapeuticos que estan siendo desarrollados como tratamientos para diversas enfermedades. Sin embargo, se sabe que los anticuerpos compuestos por porciones no humanas provocan una respuesta inmunitaria cuando se administran a los seres humanos. Esta respuesta inmunitaria hace que la administracion repetida de anticuerpos resulte a menudo inadecuada para el tratamiento y puede dar lugar a la eliminacion mediada por inmunocomplejos de los anticuerpos de la circulacion, reduciendo asf el beneficio terapeutico para los pacientes. Los ejemplos de afecciones que pueden atribuirse a la administracion repetida de anticuerpos compuestos por porciones no humanas son la enfermedad del suero y la anafilaxia.
En un intento de evitar estos y otros problemas, se han aplicado varios enfoques, incluidos la quimerizacion y la "humanizacion" para reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos/fragmentos de los mismos. Estos enfoques han producido anticuerpos con inmunogenicidad reducida. Estos anticuerpos son sustancialmente de origen humano, no siendo de origen humano solo las regiones determinantes de complementariedad (CDR) y determinados restos de la region estructural que influyen en la conformacion de las CDR. Por lo tanto, los anticuerpos monoclonales humanizados o humanos novedosos son especialmente utiles en solitario o en combinacion con moleculas existentes para usos inmunoterapeuticos.
Por consiguiente, existe la necesidad de proporcionar anticuerpos humanos o hfbridos neutralizantes de alta afinidad contra la IL-6, o fragmentos de los mismos, que superen uno mas de estos problemas, asf como mejoras sobre los anticuerpos conocidos o fragmentos de los mismos para su uso en la prevencion, el tratamiento, la mejora o el diagnostico de las afecciones relacionadas con la IL-6.
Los anticuerpos murinos monocolonales contra la IL-6 producidos a partir de una lfnea celular de hibridoma se conocen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. 5.618.700 y en la patente de EE.UU. 6.086.874. La patente de EE.UU. 5.856.135 describe anticuerpos humanos reformados contra la IL-6 humana derivados de un anticuerpo monoclonal de raton SK2 en el que las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la region variable del anticuerpo de raton SK2 se trasplantan a la region variable de un anticuerpo humano y se unen a la region constante de un anticuerpo humano.
Se han descrito y categorizado otros anticuerpos monoclonales murinos como neutralizantes, es decir, que evitan la union al receptor, o no neutralizantes (Brakenhoff et al., J. Immunol. (1990) (145:561). Entre este conjunto de anticuerpos, los anticuerpos monoclonales neutralizantes contra IL-6 pueden dividirse en dos grupos; y los supuestos epftopos en la molecula de IL-6 pueden denominarse Sitio I y Sitio II. El Sitio I evita la union a la gp80 (IL6R) y por lo tanto evita la activacion de gp130. El epftopo Sitio I se caracterizo adicionalmente por comprender regiones de las porciones amino terminal y carboxilo terminal de la molecula de IL-6. Los ligantes del Sitio II evitan la activacion de gp130 y por lo tanto pueden reconocer un epftopo conformacional implicado en la senalizacion.
En van Zaanen et al., British Journal of Haematology (1998) (783-790) se analiza un anticuerpo hfbrido para IL-6. Se conoce un anticuerpo monoclonal para IL-6 murino denominado CLB-6/8 o CLB-8, que tiene una alta afinidad por IL-6 y se une al epftopo Sitio I (Brakenhoff et al supra), pero no se conocen los dominios de union al antfgeno (regiones CDR) de este anticuerpo. Sin embargo, como se ha descrito anteriormente, el anticuerpo murino es altamente inmunogenico en los seres humanos y por lo tanto su valor terapeutico es limitado. Existe por tanto una continua necesidad de anticuerpos contra IL-6 que presenten alta afinidad y un perfil farmaceutico favorable.
RESUMEN DE LA INVENCION
La presente invencion proporciona un anticuerpo hfbrido, humanizado o CDR injertado o fragmento de anticuerpo capaz de inhibir la IL-6 humana que comprende regiones determinantes complementarias (CDR) de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 y 6 derivado de un anticuerpo anti-IL-6 monoclonal murino CLB 8 y una region constante derivada de una o mas anticuerpos humanos, en donde dicho anticuerpo hfbrido, humanizado o CDR injertado o fragmento de anticuerpo se une a IL-6 con una afinidad (Kd) de al menos 10-9 M.
La invencion tambien proporciona un anticuerpo hfbrido, humanizado o CDR injertado anti-IL-6 aislado o porcion especffica o variante, que comrpende una region variable murina y una constante humana en donde dicho anticuerpo o porcion especffica o variente se une especfficamente a al menos un epftopo que comprende al menos 1-6 de los aminoacidos Gln29-Leu34 de IL-6 humano, en donde dicho anticuerpo o porcion especffica o variante se une a IL-6 con una afinidad de al menos 10-9 M.
La invencion tambien proporciona una molecula de acido nucleico aislado que comprende un polinucleotido que codifica el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invencion.
La invencion tambien proporciona un vector y una celula hospedadora que comprende el acido nucleico de la invencion.
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La invencion tambien proporciona un metodo para producir al menos un fragmento o anticuerpo anti-IL-6, que comprende traducir un acido nucleico de la invencion, en condiciones in vitro, in vivo o in situ, de manera que el fragmento o anticuerpo anti-IL-6 se exprese en cantidades detectables o recuperables.
La invencion tambien proporciona una composicion de anticuerpo anti-IL-6 o composicion de porcion especffica o variante, que comprende un anticuerpo anti-IL-6 o porcion especffica o variante de acuerdo con la invencion.
La invencion tambien proporciona un dispositivo medico, que comprende al menos un anticuerpo anti-IL-6 o porcion especffica o variante de acuerdo con la invencion, en donde dicho dispositivo es adecuado para poner en contacto o administrar al menos un anticuerpo anti-IL-6 o porcion especffica o variante por la menos un modo seleccionado de intravenoso, intracular, bolo, subcutaneo, respiratorio, inhalacion, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal o transdermico.
La invencion tambien proporciona una formulacion que comprende al menos un anticuerpo anti-IL-6 o porcion especffica o variante de acuerdo con la invencion, y al menos uno seleccionado de agua esteril, agua tamponada esteril o al menos un conservante seleccionado del grupo que consiste de fenol, m-cresol, p-cresol, o- cresol, clorocresol, alcohol bencflico, nitrito fenilmercurico, fenoxietanol, formaldehfdo, clorobutanol, cloruro de magnesio, alquilparabeno, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, deshidroacetato sodico y timerosal, o mezclas de los mismos, en un diluyente acuoso.
La invencion tambien proporciona un artfculo de fabricacion para el uso farmaceutico humano, que comprende material de envasado y un contenedor que comprende una solucion o una forma liofilizada de al menos un anticuerpo anti-IL-6 o porcion especffica o variante de acuerdo con la invencion.
La invencion tambien proporciona al menos un anticuerpo anti-IL-6 o porcion especffica o variante de acuerdo con la invencion, que comprende proporionar una celula hospedadora o animal transgenico o planta transgenica o celula vegetal capaz de expresar en cantidades recuperables dicho anticuerpo o porcion especffica o variante.
La invencion tambien proporciona un animal transgenico no humano o planta que expresa al menos un anticuerpo de acuerdo con la invencion.
Los anticuerpos incluyen aquellos anticuerpos hfbridos, humanizados y/o con injerto de CDR que inhiben competitivamente la union in vivo a la IL-6 humana del CLB-8 murino anti-IL-6, el CLB-8 anti-IL-6 hfbrido, o un anticuerpo que tenga substancialmente las mismas caracterfsticas de union, asf como fragmentos y regiones del mismo.
Los anticuerpos descritos en el presente documento se unen a epftopos reconocidos por CLB-8 y cCLB-8, que se incluyen en el epftopo Sitio I tal como describen Brackenhoff et al. (supra). Los metodos preferentes para determinar la afinidad y especificidad del anticuerpo monoclonal por inhibicion competitiva pueden encontrarse en Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1988). Al menos un anticuerpo descrito en el presente documento se une a al menos un epftopo especificado especffico para la protefna IL-6 humana, subunidad, fragmento, porcion, o cualquier combinacion de las mismas, al que se une el anticuerpo monoclonal CLB-8. El epftopo puede comprender al menos una region de union al anticuerpo al que se une el anticuerpo CLB-8, epftopo que esta compuesto preferentemente por al menos 1-5 aminoacidos de al menos una porcion del mismo, tales como, pero no limitados a, al menos un dominio funcional, extracelular, soluble, hidrofilo, externo o citoplasmico de la protefna IL-6 humana, o cualquier porcion de la misma.
En el presente documento se describe un anticuerpo cCLB-8 anti-IL-6 de mamffero aislado, que comprende al menos una region variable que comprende la SEC ID N°: 7 u 8 y las secuencias de acidos nucleicos que las codifican (SEC ID N°: 15 o 16).
En el presente documento tambien se describe un anticuerpo cCLB-8 anti-IL-6 de mamffero aislado, que comprende (i) la totalidad de las secuencias de aminoacidos de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la cadena pesada segun las SEQ ID N°: 1, 2 y 3 y las secuencias de acidos nucleicos que las codifican (SEQ ID N°: 9-11), o (ii) todas las secuencias de aminoacidos de las CDR de la cadena ligera de las SEQ ID N°: 4, 5 y 6 y las secuencias de acidos nucleicos que las codifican (SEQ ID N°: 12-14).
En el presente documento tambien se describe un anticuerpo cCLB-8 anti-IL-6 de mamffero aislado, que comprende al menos una CDR de la cadena pesada o de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de al menos una de las SEC ID N°: 1, 2, 3, 4, 5 o 6 y las secuencias de acidos nucleicos que las codifican (SEQ ID N°: 9-14).
En el presente documento tambien se describe un anticuerpo cCLB-8 anti-IL-6 hfbrido, humanizado o con
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injerto de CDR de mamffero aislado, que comprende al menos una CDR humana, en el que el anticuerpo se une especfficamente a al menos un epftopo que comprende al menos 1-3 aminoacidos del epftopo de la IL-6 humana al que se une el anticuerpo CLB-8.
El al menos un anticuerpo puede unirse adicionalmente de manera opcional a IL-6 con una afinidad (Kd) de al menos 10-9 M, preferentemente al menos 10-10 M, y/o neutralizar sustancialmente al menos una actividad de al menos una protefna IL-6. En una forma de realizacion preferente, el anticuerpo se une a IL-6 con una afinidad (Kd) de al menos 1 x 10-11 M, preferentemente 5 x 10-11 neutraliza la IL-6 humana.
En el presente documento tambien se describen moleculas aisladas de acidos nucleicos que comprenden, complementarias a, o que hibridan con, un polinucleotido que codifica los anticuerpos anti-IL-6 especfficos anteriormente mencionados, que comprenden al menos un dominio, porcion, secuencia especificada o variante de los mismos. La presente invencion proporciona adicionalmente vectores recombinantes que comprenden moleculas de acido nucleico de anticuerpo anti-IL-6 de las celulas hospedadoras de la invencion que contienen tales acidos nucleicos y/o vectores recombinantes, asf como metodos de fabricacion y/o uso de tales acidos nucleicos de anticuerpo, vectores y/o celulas hospedadoras. Por lo tanto, la invencion comprende un acido nucleico aislado que codifica un anticuerpo cCLB-8 anti-IL-6 de la invencion; un vector del acido nucleico aislado que comprende el acido nucleico aislado, y/o una celula hospedadora procariota o eucariota que comprende el acido nucleico aislado. La celula hospedadora puede ser opcionalmente al menos una seleccionada de entre COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, celulas de mieloma o de linfoma, o cualquier celula derivada, inmortalizada o transformada de las mismas. Tambien se proporciona un metodo para producir al menos un anticuerpo cCLB-8 anti-IL-6 de la invencion, que comprende traducir el acido nucleico que codifica el anticuerpo en condiciones in vitro, in vivo o in situ, de manera que el anticuerpo para IL-6 se exprese en cantidades detectables o recuperables.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-idiotipo para IL-6 contra al menos un anticuerpo anti-IL-6 cCLB-8 de la presente invencion. El anticuerpo anti-idiotipo incluye cualquier molecula que contiene peptido o protefna que comprende al menos una porcion de una molecula de inmunoglobulina, tal como, pero no limitada a, al menos una region determinante de complementariedad (CDR) de una cadena pesada o ligera o una porcion de union a ligando de la misma, una region variable de la cadena pesada o de la cadena ligera, una region constante de la cadena pesada o de la cadena ligera, una region estructural, o cualquier porcion de las mismas, que pueda incorporarse en un anticuerpo anti-idiotipo contra el anticuerpo de la presente invencion. Un anticuerpo anti-idiotipo puede incluir o derivarse de cualquier mamffero, tal como, pero no limitado a un ser humano, un raton, un conejo, un roedor, un primate, y similares.
En el presente documento tambien se describen moleculas aisladas de acidos nucleicos que comprenden, complementarias a, o que hibridan con, un polinucleotido que codifica al menos un anticuerpo anti-idiotipo para IL-6, que comprende al menos una porcion, dominio o secuencia especificada, o variante de las mismas, y vectores recombinantes que comprenden dichas moleculas de acido nucleico que codifican el anticuerpo anti-idiotipo para IL-6, celulas hospedadoras que contienen tales acidos nucleicos y/o vectores recombinantes, asf como metodos de fabricacion y/o uso de tales acidos nucleicos de anticuerpo anti-idiotipo, vectores y/o celulas hospedadoras.
La presente invencion tambien proporciona al menos un metodo para expresar al menos un anticuerpo anti-IL-6 anteriormente mencionado, en una celula hospedadora, que comprende cultivar una celula hospedadora como se describe en el presente documento en condiciones en las que al menos un anticuerpo anti-IL-6 se expresa en cantidades detectables y/o recuperables.
Tambien se proporciona un metodo para producir al menos un anticuerpo anti-IL-6 aislado de la presente invencion, que comprende proporcionar un animal transgenico o una planta transgenica o celula vegetal capaz de expresar el anticuerpo en cantidades recuperables. En la presente invencion se proporciona adicionalmente al menos un anticuerpo anti-IL-6 producido mediante el metodo anterior.
La presente invencion tambien proporciona al menos una composicion que comprende (a) un anticuerpo y/o acido nucleico que codifica el anticuerpo cCLB-8 anti-IL-6 aislado de la invencion; y (b) un vehfculo o diluyente adecuado. El vehfculo o diluyente puede ser opcionalmente farmaceuticamente aceptable, de acuerdo con los vehfculos o diluyentes conocidos. La composicion puede comprender adicionalmente de manera opcional al menos una composicion, protefna o compuesto adicional.
La presente invencion proporciona adicionalmente al menos una composicion o anticuerpo cCLB-8 anti-IL-6, para administrar una cantidad terapeuticamente eficaz para modular o tratar al menos una afeccion relacionada con IL-6 en una celula, tejido, organo, animal o paciente, y/o, antes de, despues de, o durante una afeccion relacionada, como se conoce en la tecnica y/o como se describe en el presente documento. En el presente documento se describe un metodo para diagnosticar o tratar una afeccion relacionada con IL-6 en una celula, tejido, organo o animal, que comprende poner en contacto o administrar una composicion que comprende una cantidad eficaz del menos un anticuerpo cCLB-8 anti-IL-6 aislado de la invencion, con o a, la celula, tejido, organo o animal. El
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metodo puede comprender adicionalmente de manera opcional el uso de una cantidad eficaz de 0,001 mg/kg-50 mg/kg de las celulas, tejido, organo o animal. El metodo puede comprender adicionalmente de manera opcional utilizar la puesta en contacto o la administracion por al menos una via seleccionada de entre parenteral, subcutanea, intramuscular, intravenosa, intraarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitaria, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, intracolonica, intracervical, intragastrica, intrahepatica, intramiocardica, intraosteal, intrapelvica, intrapericardica, intraperitoneal, intrapleural, intraprostatica, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretiniana, intraespinal, intrasinovial, intratoracica, intrauterina, intravesical, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal, transdermica o por bolo. El metodo puede comprender adicionalmente de manera opcional la administracion, antes, al mismo tiempo, o despues de la administracion o la puesta en contacto del anticuerpo, de al menos una composicion que comprenda una cantidad eficaz de al menos un compuesto o protefna seleccionada de entre al menos uno de un indicador o marcador detectable, un antagonista de TNF, un antirreumatico, un relajante muscular, un narcotico, un farmaco antiinflamatorio no esteroideo (NSAID), un analgesico, un anestesico, un sedante, un anestesico local, un bloqueador neuromsucular, un antimicrobiano, un antipsoriasico, un corticosteroide, un esteroide anabolico, una epoetina, una vacunacion, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona de crecimiento, un farmaco de sustitucion hormonal, un radiofarmaco, un antidepresivo, un antipsicotico, un estimulante, un medicamento para el asma, un beta agonista, un esteroide inhalado, una epinefrina o analogo de la misma, un agente citotoxico u otro agente anticanceroso, un antimetabolito tal como metotrexato, un agente antiproliferativo, una citocina o un antagonista de citocinas.
La presente invencion proporciona adicionalmente al menos un anticuerpo cCLB-8 anti-IL-6 para el diagnostico de al menos una afeccion relacionada con IL-6 en una celula, tejido, organo, animal o paciente y/o, antes de, despues de, o durante una afeccion relacionada, como se conoce en la tecnica y/o como se describe en el presente documento.
La presente invencion tambien proporciona al menos una composicion o dispositivo que comprende al menos un anticuerpo anti-IL-6, segun la presente invencion.
Tambien se proporciona una composicion que comprende un anticuerpo de la invencion y al menos un vehfculo o diluyente farmaceuticamente aceptable. La composicion puede comprender adicionalmente de manera opcional una cantidad eficaz de al menos un compuesto o protefna seleccionada de entre al menos uno de un indicador o marcador detectable, un agente citotoxico u otro agente anticanceroso, un antimetabolito tal como metotrexato, un agente antiproliferativo, una citocina, o un antagonista de citocinas, un antagonista de TNF, un antirreumatico, un relajante muscular, un narcotico, un farmaco antiinflamatorio no esteroideo (NSAID), un analgesico, un anestesico, un sedante, un anestesico local, una bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano, un antipsoriasico, un corticosteroide, un esteroide anabolico, una epoetina, una vacunacion, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona de crecimiento, un farmaco de sustitucion hormonal, un radiofarmaco, un antidepresivo, un antipsicotico, un estimulante, un medicamento para el asma, un beta agonista, un esteroide inhalado, una epinefrina o analogo.
Tambien se proporciona un dispositivo medico, que comprende al menos un anticuerpo anti-IL-6 de la invencion, en el que el dispositivo es adecuado para poner en contacto o administrar el al menos un anticuerpo anti-IL-6 por al menos una via seleccionada de entre parenteral, subcutanea, intramuscular, intravenosa, intraarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitaria, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, intracolonica, intracervical, intragastrica, intrahepatica, intramiocardica, intraosteal, intrapelvica, intrapericardica, intraperitoneal, intrapleural, intraprostatica, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretiniana, intraespinal, intrasinovial, intratoracica, intrauterina, intravesical, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal, transdermica o por bolo.
Tambien se proporciona un artfculo de fabricacion para uso diagnostico o farmaceutico en seres humanos, que comprende material de envasado y un recipiente que comprende una solucion o una forma liofilizada de al menos un anticuerpo anti-IL-6 de la presente invencion. El artfculo de fabricacion puede comprender opcionalmente disponer del recipiente como un componente de un sistema o dispositivo de administracion parenteral, subcutanea, intramuscular, intravenosa, intraarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitaria, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, intracolonica, intracervical, intragastrica, intrahepatica, intramiocardica, intraosteal, intrapelvica, intrapericardica, intraperitoneal, intrapleural, intraprostatica, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretiniana, intraespinal, intrasinovial, intratoracica, intrauterina, intravesical, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal, transdermica o por bolo.
DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Figura 1: Grafico que muestra la union de cCLB8 a la IL-6 recombinante humana.
Figura 2: Grafico que muestra la inhibicion de la secrecion de IgM mu mediada por IL-6 de las celulas
SKW6.4 por cCLB8.
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Figura 3: Grafico que muestra la inhibicion de la produccion de MCP-1 mediada por IL-6 por cCLB8.
Figura 4: Imagen de una transferencia de Western que muestra la inhibicion por cCLB8 de la senalizacion de IL-6 en celulas THP-1 de leucemia monocftica humana.
Figura 5: Grafico que muestra la inhibicion por cCLB8 de la produccion de amiloide A serico inducida por IL-6 de las celulas HepG2.
Figura 6: Grafico que muestra la capacidad de cCLB8 para neutralizar la proliferacion celular inducida por rhIL-6.
Figura 7: Grafico que muestra la reduccion relativa de la perdida de peso corporal del hospedador en ratones portadores de tumores humanos tratados con anticuerpos anti-IL-6 humana y anti-IL-6 de raton.
La Figura 8A-G: Grafico que muestra los perfiles del estudio de inhibicion serica de 7 anticuerpos anti-idiotipo.
Figura 9: Grafico que muestra la inhibicion de la union de cCLB8 a la IL-6 humana por los Mab anti-id (anticuerpos monoclonales anti-idiotipo).
Figura 10: Grafico que muestra la union del anti-id a cCLB-8 previamente unido a IL-6 humana. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Citas
Las siguientes referencias son pertinentes: Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2a edicion, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow y Lane, Antibodies: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001).
Codigos de aminoacidos
Los aminoacidos que componen los anticuerpos anti-IL-6 de la presente invencion suelen estar abreviados. Las denominaciones de aminoacidos pueden indicarse denominando al aminoacido por su codigo de una sola letra, su codigo de tres letras, nombre, o codon(es) de tres nucleotidos como se entiende bien en la tecnica (vease Alberts, B., et al., Molecular Biology of The Cell, Tercera Ed., Garland Publishing, Inc., Nueva York, 1994).
Definiciones
Tal como se utiliza en el presente documento, un "anticuerpo cCLB-8 anti-interleucina-6", "anticuerpo cCLB-8 anti-IL-6", "porcion de anticuerpo cCLB-8 anti-IL-6" o "fragmento de anticuerpo cCLB-8 anti-IL-6" y/o "variante de anticuerpo cCLB-8 anti-IL-6" y similares incluye cualquier peptido o protefna que contiene una molecula que comprende al menos una porcion de una molecula de inmunoglobulina, que contiene al menos una region determinante de complementariedad (CDR) de una cadena pesada o ligera o una porcion de union a ligando de la misma derivada del anticuerpo monoclonal CLB-8 murino en combinacion con una region variable de la cadena pesada o de la cadena ligera, una region constante de la cadena pesada o de la cadena ligera, una region estructural, o cualquier porcion de las mismas, de origen no murino, preferentemente de origen humano, que puede incorporarse en un anticuerpo de la presente invencion. Tal anticuerpo es capaz de modular, disminuir, antagonizar, mitigar, aliviar, bloquear, inhibir, anular y/o interferir con al menos la union o una actividad de IL-6, o con la union o actividad del receptor de IL-6, in vitro, in situ y/o in vivo. Como ejemplo no limitativo, una variante, porcion especificada o anticuerpo anti-IL-6 adecuado de la presente invencion puede unirse con alta afinidad a un epftopo inhibidor y/o neutralizante de la IL-6 humana reconocido por el anticuerpo monoclonal CLB-8. Una variante, porcion especificada o anticuerpo anti-IL-6 adecuado tambien puede influir opcionalmente en al menos una de entre la funcion o actividad de IL-6, tal como, pero no limitada a, la sfntesis de ARN, ADN o protefnas, la liberacion de IL-6, la senalizacion del receptor de IL-6, la escision de IL-6 de membrana, la actividad de IL-6, la produccion y/o sfntesis de IL-6.
El termino "anticuerpo" pretende abarcar adicionalmente anticuerpos, fragmentos de digestion, porciones especificadas y variantes de los mismos, que incluye mimeticos de anticuerpo o comprende porciones de anticuerpos que imitan la estructura y/o funcion de un anticuerpo o fragmento especificado o porcion del mismo, incluidos anticuerpos monocatenarios y fragmentos de los mismos; conteniendo cada uno al menos una CDR derivada del anticuerpo monoclonal CLB-8. Los fragmentos funcionales incluyen fragmentos de union al antfgeno que se unen a la IL-6 de mamffero. Por ejemplo, la invencion abarca fragmentos de anticuerpos capaces de unirse a
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IL-6 o a porciones de la misma, incluidos, pero no limitados a fragmentos Fab (por ejemplo, mediante digestion con papafna), Fab' (por ejemplo, mediante digestion con pepsina y reduccion parcial) y F(ab')2 (por ejemplo, mediante digestion con pepsina), facb (por ejemplo, mediante digestion con plasmina), pFc' (por ejemplo, mediante digestion con pepsina o plasmina), Fd (por ejemplo, mediante digestion con pepsina, reduccion parcial y reagregacion), Fv o scFv (por ejemplo, mediante tecnicas de biologfa molecular) (vease, por ejemplo, Colligan, Immunology, supra).
Tales fragmentos pueden producirse mediante tecnicas recombinantes, de sfntesis o escision enzimatica, como se conoce en la tecnica y/o como se describe en el presente documento. Los anticuerpos tambien pueden producirse en diversas formas truncadas utilizando genes de anticuerpos en los que se han introducido uno o mas codones de terminacion cadena arriba del sitio de terminacion natural. Por ejemplo, puede disenarse un gen de combinacion que codifica una porcion de la cadena pesada de F(ab')2 para que incluya secuencias de ADN que codifican el dominio CHi y/o la region bisagra de la cadena pesada. Las diversas porciones de anticuerpos pueden unirse entre si qufmicamente mediante tecnicas convencionales, o pueden prepararse como una protefna contigua mediante tecnicas de ingenierfa genetica.
Tal como se utilizan en el presente documento, anticuerpos "hfbridos" o anticuerpos "humanizados" o "con injerto de CDR" incluyen cualquier combinacion de las CDR murinas descritas en el presente documento con una o mas protefnas o peptidos derivados de un anticuerpo no murino, preferentemente humano. Se proporcionan anticuerpos hfbridos o humanizados en los que las CDR se derivan del anticuerpo CLB-8 murino capaz de unirse a la IL-6 humana y al menos una porcion, o el resto del anticuerpo se deriva de uno o mas anticuerpos humanos. Por lo tanto, la parte humana del anticuerpo puede incluir la region estructural, los dominios Cl, Ch (por ejemplo, Ch1, Ch2, Ch3), las regiones bisagra, (Vl, Vh)) que son sustancialmente no inmunogenicas en los seres humanos. Las regiones del anticuerpo que se derivan de anticuerpos humanos no necesitan tener el 100% de identidad con los anticuerpos humanos. En una forma de realizacion preferente, se conservan tantos restos de aminoacidos humanos como sea posible a fin de que la inmunogenicidad sea insignificante, pero pueden modificarse los restos humanos segun sea necesario para soportar el sitio de union al antfgeno formado por las CDR maximizando a la vez la humanizacion del anticuerpo. Tales cambios o variaciones reducen o conservan opcional y preferentemente la inmunogenicidad en los seres humanos u otras especies con respecto a los anticuerpos no modificados. Hay que senalar que un anticuerpo humanizado puede ser producido por un animal no humano o una celula procariota o eucariota que sea capaz de expresar genes de la inmunoglobulina humana funcionalmente reordenados (por ejemplo, la cadena pesada y/o la cadena ligera). Ademas, cuando el anticuerpo es un anticuerpo monocatenario, puede comprender un peptido conector que no se encuentra en los anticuerpos humanos naturales. Por ejemplo, un Fv puede comprender un peptido conector, tal como de entre dos y aproximadamente ocho restos de glicina u otros restos de aminoacidos, que conecte la region variable de la cadena pesada y la region variable de la cadena ligera. Se considera que tales peptidos conectores son de origen humano.
Anticuerpos de la presente invencion
Segun la presente invencion, el anticuerpo cCLB-8 anti-IL-6 comprende un anticuerpo en el que las regiones variables se derivan del anticuerpo CLB-8 murino capaces de unirse a e inhibir la funcion de la IL-6 humana y las regiones constantes del anticuerpo se derivan de uno o mas anticuerpos humanos. En algunos anticuerpos descritos en el presente documento, la region variable o las CDR derivadas del anticuerpo CLB-8 murino tienen preferentemente de aproximadamente un 90% a aproximadamente el 100% de identidad con la region variable o las CDR del anticuerpo CLB-8 murino, aunque se contempla cualquier modificacion y todas ellas, incluidas sustituciones, inserciones y deleciones, siempre que el anticuerpo hfbrido mantenga la capacidad de unirse a e inhibir la IL-6. Las regiones de los anticuerpos hfbridos, humanizados o con injerto de cDr que se derivan de anticuerpos humanos no necesitan tener el 100% de identidad con los anticuerpos humanos. En una forma de realizacion preferente, se conservan tantos restos de aminoacidos humanos como sea posible con el fin de que la inmunogenicidad sea insignificante, pero los restos humanos, en particular los restos de la region estructural, se sustituyen segun sea necesario y como se ilustra mas adelante en el presente documento segun la presente invencion. Tales modificaciones como se describen en el presente documento son necesarias para soportar el sitio de union al antfgeno formado por las CDR, maximizando a la vez la humanizacion del anticuerpo.
El anticuerpo monoclonal CLB-8 murino contra la IL-6 humana es conocido en la tecnica (Brakenhoff et al., supra), pero hasta ahora no se han descrito las regiones CDR de este anticuerpo. Por primera vez, en el presente documento se describen anticuerpos hfbridos, humanizados o con injerto de CDR derivados de las regiones CDR del anticuerpo monoclonal CLB-8 murino y metodos para preparar tales anticuerpos. Segun la presente invencion, en el Ejemplo 2 se proporcionan el ADNc (SEC ID N°: 15) y las secuencias de aminoacidos de la cadena pesada (SEC ID N°: 7) de la cadena pesada del CLB-8 murino. El ADNc y la secuencia de aminoacidos deducida de la cadena ligera del CLB-8 murino (SEC ID N° 8) tambien se proporcionan en el Ejemplo 2 (SEC ID N°: 16). Cada una de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contiene tres CDR que se combinan para formar el sitio de union al antfgeno. Las tres CDR estan rodeadas por cuatro regiones FR que funcionan principalmente para soportar las CDR. Las secuencias de las CDR dentro de las secuencias de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera pueden identificarse mediante la alineacion asistida por ordenador segun Kabat et al. (1987), en Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4a ed., United States Department of Health and Human Services, U.S.
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Government Printing Office, Washington, D.C., o mediante modelizacion molecular de las regiones variables, por ejemplo utilizando el programa ENCAD como describe Levitt (1983) J. Mol. Biol. 168:595.
En una forma de realizacion preferente, las CDR se derivan del anticuerpo monoclonal murino CLB-8. Las CDR de la cadena pesada preferentes tienen las siguientes secuencias:
CDR1 SFAMS (SEQ ID N°: 1)
CDR2 EISSGGSYTYYPDTVTG (SEQ ID N°: 2)
CDR3 GLWGYYALDY (SEQ ID N°: 3)
Las CDR de la cadena ligera preferentes tienen las siguientes secuencias:
CDR1 SASSSVSYMY (SEQ. ID N°: 4)
CDR2 DTSNLAS (SEQ. ID N°: 5)
CDR3 QQWSGYPYT (SEQ. ID N°: 6)
Las secuencias de las CDR del anticuerpo CLB-8 murino, pueden modificarse mediante inserciones, sustituciones y deleciones en la medida en que el anticuerpo con injerto de CDR mantenga la capacidad de unirse a e inhibir la IL-6 humana. El experto en la materia puede determinar el mantenimiento de esta actividad realizando los ensayos funcionales que se describen mas adelante en el presente documento. Las CDR pueden tener, por ejemplo, de aproximadamente un 50% a aproximadamente el 100% de homologfa con las CDR de las SEC ID N°: 1-6. En una forma de realizacion preferente, las CDR tienen de aproximadamente un 80% a aproximadamente el 100% de homologfa con las cDr de las SEC ID N°: 1-6. En una forma de realizacion mas preferente, las CDR tienen de aproximadamente un 90% a aproximadamente el 100% de homologfa con las CDR de las SEC ID N°: 1-6. En la forma de realizacion mas preferente, las CDR tienen aproximadamente el 100% de homologfa con las CDR de las SEC ID N°: 1-6.
Como alternativa, toda la region variable de la cadena pesada y la region variable de la cadena ligera del anticuerpo CLB-8 murino como se expone en el Ejemplo 2 (SEQ ID N° 7 y 8) puede combinarse con las regiones constantes y estructural humanas para formar el anticuerpo hfbrido cCLB-8 de la presente invencion.
Los genes humanos que codifican las regiones constantes (C) de los anticuerpos hfbridos, fragmentos y regiones de la presente invencion pueden derivarse de una genoteca de hfgado fetal humano, mediante metodos conocidos. Los genes de la region C humana pueden derivarse de cualquier celula humana, incluidas las que expresan y producen inmunoglobulinas humanas. La region Ch humana puede derivarse de cualquiera de las clases o isotipos conocidos de la cadenas H humanas, incluidos gamma, p, a, 6, £, y subtipos de las mismas, tales como G1, G2, G3 y G4. Puesto que el isotipo de la cadena H es responsable de las diversas funciones efectoras de un anticuerpo, la eleccion de la region Ch sera guiada por las funciones efectoras deseadas, tales como fijacion del complemento o la actividad en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Preferentemente, la region Ch se deriva de gamma 1 (IgG1).
La region Cl humana puede derivarse de cualquiera de los dos isotipos de la cadena L humana, kappa o lambda, preferentemente kappa.
Los genes que codifican las regiones C de inmunoglobulina humana se obtienen de celulas humanas mediante tecnicas de clonacion convencionales (Sambrook, et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edicion, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) y Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology (1987-1993)). Los genes de la region C humana estan facilmente disponibles a partir de clones conocidos que contienen genes que representan las dos clases de cadena L, las cinco clases de cadena H y las subclases de las mismas. Pueden prepararse fragmentos de anticuerpos hfbridos, tales como F(ab')2 y Fab, disenando un gen recombinado de la cadena H apropiadamente truncado. Por ejemplo, un gen recombinado que codifica una porcion de la cadena H de un fragmento F(ab')2 incluira secuencias de ADN que codifican el dominio CH1 y la region bisagra de la cadena H, seguido de un codon de terminacion de la traduccion para producir la molecula truncada.
Generalmente, en un ejemplo, las regiones, fragmentos y anticuerpos hfbridos de la presente invencion se producen clonando segmentos de ADN que codifican las regiones de union al antfgeno de la cadena H y L del anticuerpo especffico anti-IL-6 CLB-8, y uniendo estos segmentos de ADN a segmentos de ADN que codifican las regiones Ch y Cl, respectivamente, para producir genes recombinados que codifican inmunoglobulinas.
Por lo tanto, en una forma de realizacion preferente, se crea un gen recombinado fusionado que comprende un primer segmento de ADN que codifica al menos la region de union al antfgeno de origen no humano, tal como una region V funcionalmente reordenada con segmento de union (J), unido a un segundo segmento de ADN que codifica al menos una parte de una region C humana.
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Las secuencias de las regiones variables del anticuerpo CLB-8 murino, pueden modificarse mediante inserciones, sustituciones y deleciones en la medida en que el anticuerpo hnbrido mantenga la capacidad de unirse a e inhibir la IL-6 humana. El experto en la materia puede determinar el mantenimiento de esta actividad realizando los ensayos funcionales que se describen mas adelante en el presente documento. Las regiones variables pueden tener, por ejemplo, de aproximadamente un 50% a aproximadamente el 100% de homologfa con las regiones variables de las SEC ID N°: 7-8. En una forma de realizacion preferente, las regiones variables tienen de aproximadamente un 80% a aproximadamente el 100% de homologfa con las regiones variables de las SEC ID N°: 7-8. En una forma de realizacion mas preferente, las regiones variables tienen de aproximadamente un 90% a aproximadamente el 100% de homologfa con las regiones variables de las SEC iD N°: 7-8. En la forma de realizacion mas preferente, las regiones variables tienen aproximadamente el 100% de homologfa con las CDR de las SEC ID N°: 1-6.
Por razones practicas, en el presente documento se ha adoptado el esquema de numeracion de Kabat et al., Los restos se indican mediante guiones o numeros minusculos segun sea necesario para adaptar las presentes secuencias a la secuencia numerada de Kabat convencional.
En el caso de un anticuerpo humanizado o con injerto de CDR en el que la region CDR del anticuerpo CLB-8 se combina con una region humana, pueden conservarse los restos en la region FR que sean idiosincrasicos del anticuerpo original, por ejemplo, CLB-8. Tambien pueden conservarse los restos que hayan demostrado ser cnticos en la humanizacion de otros anticuerpos. Las anteriores directrices se siguen en la medida necesaria para soportar el sitio de union al antfgeno formado por las CDR maximizando a la vez la humanizacion del anticuerpo.
En el Ejemplo 2 que se presenta mas adelante se muestran la secuencia de aminoacidos de una region variable de la cadena pesada representativa derivada del anticuerpo monoclonal murino CLB-8 y un anticuerpo humano.
En el Ejemplo 2 tambien se muestran la secuencia de aminoacidos de una region variable de la cadena ligera hubrida representativa derivada del anticuerpo monoclonal murino CLB-8 y un anticuerpo humano.
Se ha demostrado, segun la presente invencion, que un anticuerpo hnbrido que contiene las regiones variables del anticuerpo CLB-8 murino es tan eficaz como el anticuerpo monoclonal murino CLB-8 en la union a IL-6.
Pueden utilizarse metodos para obtener por ingeniena genetica o humanizar anticuerpos humanos o no humanos y son bien conocidos en la tecnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado u obtenido por ingeniena genetica tiene uno o mas restos de aminoacidos procedentes de una fuente que es no humana, por ejemplo, pero no limitada a raton, rata, conejo, primate no humano u otro mairnfero. Estos restos de aminoacidos humanos suelen denominarse restos "de importacion", que por lo general se toman de un dominio variable, constate u otro domino "de importacion" de una secuencia humana conocida. Las secuencias de Ig humana conocidas se describen, por ejemplo, en www.ncbi.nim.nih.gov/entrez/query.fcgi;www.atcc.org/phage/hdb.html;
www.sciquest.com/; www.abcam.com/;www.antibodyresource.com/onlinecomp.html;
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www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/ public/INTRO.html;
www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; imgt.cnusc.fr:8104/; www.biochem.ucl.ac.uk/~martin/abs/index.html;antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www.unizh.ch/~honegger/AHOseminar/Slide01.html;
www.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s/; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm;
www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/TAHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html;
www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc.cam.ac.uk/~fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html;
www.jerini.de/fr_products.htm;
www.patents.ibm.com/ibm.html; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983).
Pueden utilizarse tales secuencias importadas para reducir la inmunogenicidad o reducir, mejorar o modificar la union, afinidad, velocidad de asociacion, velocidad de disociacion, avidez, especificidad, semivida, o cualquier otra caractenstica adecuada, como se conoce en la tecnica. Generalmente se mantienen parte o la totalidad de las secuencias de CDR humanas o no humanas mientras que las secuencias no humanas de las regiones variable y constante se reemplazan con aminoacidos humanos o de otro tipo. Los anticuerpos tambien pueden humanizarse opcionalmente conservando una alta afinidad por el antfgeno y otras propiedades biologicas favorables. Para alcanzar este objetivo, los anticuerpos humanizados pueden prepararse opcionalmente mediante un proceso de analisis de las secuencias originales y diversos productos humanizados conceptuales utilizando
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modelos tridimensionales de las secuencias original y humanizada. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulinas estan comunmente disponibles y son familiares para los expertos en la materia. Existen programas informaticos que ilustran y presentan estructuras conformacionales tridimensionales probables de las secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. Un examen de estas presentaciones permite analizar la probable funcion de los restos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el analisis de restos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antfgeno. De esta manera, pueden seleccionarse y combinarse restos de FR a partir de secuencias de importacion y consenso de manera que se consiga la caracterfstica deseada del anticuerpo, tal como el aumento de afinidad por el antfgeno o los antfgenos diana. En general, los restos de la CDR influyen directamente y muy sustancialmente en la union al antfgeno. La humanizacion u obtencion por ingenierfa genetica de anticuerpos puede realizarse mediante cualquier metodo conocido, tales como, pero no limitados a, los descritos en Winter (Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), patentes de EE.UU. N°: 5723323, 5976862, 5824514, 5817483, 5814476, 5763192, 5723323, 5,766886, 5714352, 6204023, 6180370, 5693762, 5530101, 5585089, 5225539; 4816567, documentos PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246.
La region constante humana del anticuerpo hfbrido de la invencion puede ser de cualquier clase (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD, etc.) o isotipo y puede comprender una cadena ligera kappa o lambda. En una forma de realizacion, la region constante humana comprende un fragmento definido o cadena pesada de IgG, por ejemplo, al menos uno de los isotipos IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En otra forma de realizacion, el anticuerpo humano anti-IL-6 humana comprende una cadena pesada de IgG1 y una cadena ligera de IgG1 K. Los anticuerpos anti-IL-6 aislados de la presente invencion comprenden las secuencias de aminoacidos de anticuerpo descritas en el presente documento codificadas por cualquier polinucleotido adecuado, asf como. Preferentemente, el anticuerpo o fragmento de union al antfgeno se une a la IL-6 humana y, con ello neutraliza parcial o sustancialmente al menos una actividad biologica de la protefna. El anticuerpo cCLB-8, o variante o porcion especificada del mismo, neutraliza preferentemente parcial o sustancialmente al menos una actividad biologica de al menos un fragmento o protefna IL-6 y de ese modo inhibe las actividades mediadas a traves de la union de la IL-6 al receptor de IL-6 o a traves de otros mecanismos mediados por o dependientes de IL-6. Tal como se utiliza en el presente documento, la expresion "anticuerpo neutralizante" se refiere a un anticuerpo que puede inhibir una actividad dependiente de IL-6 aproximadamente un 20%-120%, preferentemente al menos aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% o mas dependiendo del ensayo. La capacidad de un anticuerpo anti-IL-6 para inhibir una actividad dependiente de IL-6 se evalua preferentemente mediante al menos un ensayo de receptor o protefna IL-6 adecuado, tal como se describe en el presente documento y/o como se conoce en la tecnica.
Al menos un anticuerpo de la invencion se une a al menos un epftopo especificado especffico para al menos una subunidad, fragmento, porcion, protefna IL-6 o cualquier combinacion de las mismas a las que se une el anticuerpo CLB-8. El al menos un epftopo puede comprender al menos una region de union al anticuerpo que comprenda al menos una porcion de la protefna, epftopo que esta compuesto preferentemente por al menos una porcion extracelular, soluble, hidrofila, externa o citoplasmica de la protefna. Generalmente, el fragmento de union al antfgeno o anticuerpo humano descrito en el presente documento comprendera una region de union al antfgeno que comprenda al menos una region determinante de complementariedad humana (CDR1, CDR2 y CDR3) de las SEQ ID N° 1, 2 y 3 o variante de al menos una region variable de la cadena pesada y al menos una region determinante de complementariedad humana (CDR4, CDR5 y CDR6) (SEQ ID N° 4, 5 y 6) o variante de al menos una region variable de la cadena ligera. Como ejemplo no limitativo, el anticuerpo o variante o porcion de union al antfgeno puede comprender al menos una de las CDR3 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEC ID N°: 3, y/o una CDR3 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEC ID N°: 6. En una forma de realizacion concreta, el anticuerpo o fragmento de union al antfgeno puede tener una region de union al antfgeno que comprenda al menos una porcion de al menos una CDR de la cadena pesada (es decir, CDR1, CDR2 y/o CDR3) con la secuencia de aminoacidos de las CDR correspondientes 1, 2 y/o 3 (por ejemplo, SEQ ID N°: 1, 2 y/o 3). En otra forma de realizacion concreta, el anticuerpo o variante o porcion de union al antfgeno puede tener una region de union al antfgeno que comprenda al menos una porcion de al menos una CDR de la cadena ligera (es decir, CDR4, CDR5 y/o CDR6) con la secuencia de aminoacidos de las correspondientes CDR 4, 5 y/o 6 (por ejemplo, SEQ ID N°: 4, 5 y/o 6). En una forma de realizacion preferente, las tres cDr de la cadena pesada y las tres CDR de la cadena ligera del anticuerpo o fragmento de union al antfgeno tienen la secuencia de aminoacidos de la correspondiente CDR de al menos uno de entre mAb cCLB8, Mab hfbrido anti-IL-6, como se describe en el presente documento. Tales anticuerpos pueden prepararse uniendo qufmicamente entre sf las diversas porciones (por ejemplo, CDR, region estructural) del anticuerpo mediante tecnicas convencionales, preparando y expresando una (es decir, una o mas) molecula de acido nucleico que codifica el anticuerpo mediante tecnicas convencionales de la tecnologfa de ADN recombinante o haciendo uso de cualquier otro metodo adecuado y utilizando cualquiera de los posibles codones redundantes que dara como resultado la expresion de un polipeptido, por ejemplo, la SEC ID N°: 15 o 16.
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Pueden prepararse anticuerpos que se unen a la IL-6 humana y que comprenden las regiones CDR o la region variable de la cadena pesada o ligera definidas utilizando metodos adecuados, tales como presentacion en fagos (Katsube, Y., et al., Int. J. Mol. Med., 1 (5):863-868 (1998)) o metodos que emplean animales transgenicos, como se conoce en la tecnica y/o como se describe en el presente documento. Por ejemplo, el anticuerpo, porcion especificada o variante puede expresarse utilizando el acido nucleico codificante o porcion del mismo en una celula hospedadora adecuada.
Como se ha indicado, en el presente documento tambien se describen anticuerpos, fragmentos de union al antfgeno, cadenas de inmunoglobulinas y CDR que comprenden aminoacidos en una secuencia que es sustancialmente igual a una secuencia de aminoacidos descrita en el presente documento. Tales anticuerpos anti-IL-6 pueden incluir una o mas sustituciones, delaciones o adiciones de aminoacidos, ya sea a partir de mutaciones naturales o manipulacion humana, tal como se especifica en el presente documento. Preferentemente, tales anticuerpos o fragmentos de union al antfgeno y anticuerpos que comprenden tales cadenas o CDR pueden unirse a la IL-6 humana con alta afinidad (por ejemplo, Kd inferior o igual a aproximadamente 10"9 M). Las secuencias de aminoacidos que son sustancialmente iguales a las secuencias descritas en el presente documento incluyen secuencias que comprenden sustituciones conservadoras de aminoacidos, asf como deleciones y/o inserciones de aminoacidos. Sustitucion conservadora de aminoacidos se refiere a la sustitucion de un primer aminoacido por un segundo aminoacido que tiene propiedades qufmicas y/o ffsicas (por ejemplo, carga, estructura, polaridad, hidrofobia/hidrofilia) similares a las del primer aminoacido. Las sustituciones conservadoras incluyen la sustitucion de un aminoacido por otro dentro de los siguientes grupos: lisina (K), arginina (R) e histidina (H); aspartato (D) y glutamato (E); asparagina (N), glutamina (Q), serina (S), treonina (T), tirosina (Y), K, R, H, D y E; alanina (A), valina (V), leucina (L), isoleucina (I), prolina (P), fenilalanina (F), triptofano (W), metionina (M), cistefna (C) y glicina (G), F, W e Y; C, S y T.
Por supuesto, el numero de sustituciones de aminoacidos que haga un experto en la materia depende de muchos factores, incluidos los descritos anteriormente. En terminos generales, el numero de sustituciones, inserciones o deleciones de aminoacidos para cualquier variante, fragmento o anticuerpo anti-IL-6 determinado no sera superior a 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, tal como 1-30 o cualquier intervalo o valor en el mismo, tal como se especifica en el presente documento.
Los aminoacidos en un anticuerpo anti-IL-6 de la presente invencion que son esenciales para la funcion pueden identificarse mediante metodos conocidos en la tecnica, tales como mutagenesis dirigida o mutagenesis mediante alanina (por ejemplo, Ausubel, supra, capftulos 8, 15; Cunningham y Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). Este ultimo procedimiento introduce mutaciones unicas de alanina en cada resto de la molecula. A continuacion se ensayan las moleculas mutantes resultantes para determinar su actividad biologica, tal como, pero no limitada a, al menos, una actividad de neutralizacion de IL-6. Los sitios que son crfticos para la union de los anticuerpos tambien pueden identificarse mediante analisis estructural tal como cristalizacion, resonancia magnetica nuclear o marcaje por fotoafinidad (Smith, et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992) y de Vos, et al., Science 255:306-312 (1992)).
Los anticuerpos anti-IL-6 descritos en el presente documento pueden incluir, pero no se limitan a, al menos una porcion, secuencia o combinacion seleccionada de entre 5 y todos los aminoacidos contiguos de al menos una de las SEQ ID N°: 1,2, 3, 4, 5, 6.
Un anticuerpo anti-IL-6 puede comprender adicionalmente de manera opcional un polipeptido de al menos uno de 70%-100% de los aminoacidos contiguos de al menos una de las SEQ ID N°: 7, 8.
En una forma de realizacion descrita en el presente documento, la secuencia de aminoacidos de una cadena de inmunoglobulina, o porcion de la misma (por ejemplo, la region variable, CDR) tiene aproximadamente un 70%-99% de identidad (por ejemplo, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o cualquier intervalo o valor en los mismos) con la secuencia de aminoacidos de la cadena correspondiente de al menos una de las SEC ID N°: 7, 8. Por ejemplo, puede compararse la secuencia de aminoacidos de una region variable de la cadena ligera con la secuencia de la SEC ID N°: 8, o puede compararse la secuencia de aminoacidos de una CDR3 de la cadena pesada con la SEC ID N°: 7. Preferentemente, se determina un 70%-99% de identidad de aminoacidos (es decir, un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o cualquier intervalo o valor en los mismos) mediante un algoritmo informatico adecuado, como se conoce en la tecnica.
En las SEC ID N°: 7, 8 se proporcionan secuencias de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera ejemplares. Los anticuerpos de la presente invencion, o variantes especfficas de los mismos, pueden comprender multitud de restos de aminoacidos contiguos de un anticuerpo de la presente invencion, en los que ese numero se selecciona del grupo de numeros enteros que consiste en 10%-100% del numero de restos contiguos en un anticuerpo anti-IL-6. Opcionalmente, esta subsecuencia de aminoacidos contiguos es de al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 o mas aminoacidos de longitud, o cualquier intervalo o valor en el mismo. Ademas, el numero de tales
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subsecuencias puede ser cualquier numero entero seleccionado del grupo que consiste en 1 a 20, tal como al menos 2, 3, 4 o 5.
Como entenderan los expertos, la presente invencion incluye al menos un anticuerpo biologicamente activo de la presente invencion. Los anticuerpos biologicamente activos tienen una actividad especffica de al menos un 20%, 30% o 40%, y preferentemente de al menos un 50%, 60% o 70%, y lo mas preferentemente de al menos un 80%, 90% o 95%-100% de la del anticuerpo natural (no sintetico), endogeno o relacionado y conocido. Los metodos para ensayar y cuantificar las medidas de actividad enzimatica y especificidad por el sustrato, son bien conocidos por los expertos en la materia.
En el presente documento tambien se describen fragmentos de union al antfgeno y anticuerpos humanos, como se describe en el presente documento, que se modifican mediante la union covalente de un resto organico. Tal modificacion puede producir un anticuerpo o fragmento de union al antfgeno con propiedades farmacocineticas mejoradas (por ejemplo, aumento de la semivida en suero in vivo). El resto organico puede ser un grupo acido graso, un grupo ester de acido graso o un grupo polimerico hidrofilo lineal o ramificado. En formas de realizacion concretas, el grupo polimerico hidrofilo puede tener un peso molecular de aproximadamente 800 a aproximadamente 120.000 Daltons y puede ser un polialcanoglicol (por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol (PPG)), polfmero de hidratos de carbono, polfmero de aminoacidos o polivinil pirrolidona, y el grupo acido graso o ester de acido graso puede comprender de aproximadamente ocho a aproximadamente cuarenta atomos de carbono.
Los fragmentos de union al antfgeno y anticuerpos modificados pueden comprender uno o mas restos organicos que estan unidos covalentemente, directa o indirectamente, al anticuerpo. Cada resto organico que esta unido a un anticuerpo o fragmento de union al antfgeno puede ser independientemente un grupo polimerico hidrofilo, un grupo acido graso o un grupo ester de acido graso. Como se utiliza en el presente documento, la expresion "acido graso" abarca acidos monocarboxflicos y acidos dicarboxflicos. Un "grupo polimerico hidrofilo", tal como se utiliza la expresion en el presente documento, se refiere a un polfmero organico que es mas soluble en agua que en octano. Por ejemplo, la polilisina es mas soluble en agua que en octano. Por lo tanto, en el presente documento se describe un anticuerpo modificado mediante la union covalente de polilisina. Los polfmeros hidrofilos adecuados para modificar anticuerpos pueden ser lineales o ramificados e incluyen, por ejemplo, polialcalenglicoles (por ejemplo, PEG, monometoxi-polietilenglicol (mPEG), PPG y similares), hidratos de carbono (por ejemplo, dextrano, celulosa, oligosacaridos, polisacaridos y similares), polfmeros de aminoacidos hidrofilos (por ejemplo, polilisina, poliarginina, poliaspartato y similares), oxidos de polialcano (por ejemplo, oxido de polietileno, oxido de polipropileno y similares) y polivinilpirrolidona. Preferentemente, el polfmero hidrofilo que modifica el anticuerpo tiene un peso molecular de aproximadamente 800 a aproximadamente 150.000 Daltons como una entidad molecular separada. Por ejemplo pueden utilizarse PEG5.000 y PEG20.000, en los que el subfndice es el peso molecular medio del polfmero en Daltons. El grupo polimerico hidrofilo puede sustituirse con uno a aproximadamente seis grupos alquilo, acido graso o ester de acido graso. Pueden prepararse polfmeros hidrofilos que se sustituyen con un grupo acido graso o ester de acido graso empleando metodos adecuados. Por ejemplo, puede acoplarse un polfmero que comprende un grupo amino a un carboxilato del acido graso o ester de acido graso, y puede acoplarse un carboxilato activado (por ejemplo, activado con N,N-carbonil-diimidazol) en un acido graso o ester de acido graso a un grupo hidroxilo en un polfmero.
Los acidos grasos y esteres de acidos grasos adecuados para modificar los anticuerpos pueden ser saturados o pueden contener una o mas unidades de insaturacion. Los acidos grasos que son adecuados para modificar los anticuerpos de la invencion incluyen, por ejemplo, n-dodecanoato (C12, laurato), N-tetradecanoato (C14, miristato), N-octadecanoato (C18, estearato), N-eicosanoato (C20, araquidato), n-docosanoato (C22, behenato), n-triaoctanoato (C30), n-tetraoctanoato (C40), cis-A9-octadecanoato (C18, oleato), todos los
cis-A5,8,11,14-eicosatetraenoato (C20, araquidonato), acido octanodioico, acido tetradecanodioico, acido octadecanodioico, acido docosanedioico, y similares. Los esteres de acidos grasos adecuados incluyen monoesteres de acidos dicarboxflicos que comprenden un grupo alquilo inferior lineal o ramificado. El grupo alquilo inferior puede comprender de uno a aproximadamente doce, preferentemente de uno a aproximadamente seis atomos de carbono.
Los fragmentos de union al antfgeno y anticuerpos humanos modificados pueden prepararse utilizando metodos adecuados, tales como por reaccion con uno o mas agentes de modificacion. Un "agente de modificacion", tal como se utiliza la expresion en el presente documento, se refiere a un grupo organico adecuado (por ejemplo, polfmero hidrofilo, un acido graso, un ester de acido graso) que comprende un grupo de activacion. Un "grupo de activacion" es un resto qufmico o grupo funcional que puede, en condiciones apropiadas, reaccionar con un segundo grupo qufmico formando de este modo un enlace covalente entre el agente de modificacion y el segundo grupo qufmico. Por ejemplo, los grupos de activacion que reaccionan con amina incluyen grupos electrofilos tales como tosilato, mesilato, halo (cloro, bromo, fluoro, yodo), esteres de N-hidroxisuccinimidilo (NHS), y similares. Los grupos de activacion que pueden reaccionar con tioles incluyen, por ejemplo, maleimida, yodoacetilo, acriloiolo, disulfuros de piridilo, tiol del acido 5-tiol-2-nitrobenzoico (TNB-tiol), y similares. Puede acoplarse un grupo funcional aldehfdo a moleculas que contienen amina o hidrazida, y un grupo azida puede reaccionar con un grupo fosforo trivalente para formar enlaces fosforamidato o fosforimida. Los metodos adecuados para introducir grupos de activacion en moleculas son conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic
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Press: San Diego, CA (1996)). Puede unirse un grupo de activacion directamente al grupo organico (por ejemplo, polfmero hidrofilo, acido graso, ester de acido graso), o a traves de un resto conector, por ejemplo, un grupo divalente C1-C12 en el que uno o mas atomos de carbono pueden ser sustituidos por un heteroatomo tal como oxfgeno, nitrogeno o azufre. Los restos conectores adecuados incluyen, por ejemplo, tetraetilenglicol, -(CH2)3-, -NH-(CH2)6-NH-, -(CH2)2-NH- y -CH2-O-CH2-CH2-O-CH2- CH2-O-CH-NH-. Pueden producirse agentes de modificacion que comprendan un resto de conector, por ejemplo, haciendo reaccionar una mono-Boc-alquildiamina (por ejemplo, mono-Boc-etilendiamina, mono-Boc-diaminohexano) con un acido graso en presencia de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) para formar un enlace amida entre la amina libre y el carboxilato de acido graso. El grupo protector Boc puede eliminarse del producto mediante tratamiento con acido trifluoroacetico (TFA) para exponer una amina primaria que pueda acoplarse a otro carboxilato tal como se describe, o puede hacerse reaccionar con anhfdrido maleico y ciclarse el producto resultante para producir un derivado maleimido activado del acido graso. (Vease, por ejemplo, Thompson, et al., documento WO 92/16221).
Los anticuerpos modificados pueden producirse haciendo reaccionar un fragmento de union al antfgeno o anticuerpo humano con un agente de modificacion. Por ejemplo, los restos organicos pueden unirse al anticuerpo de manera no especffica de sitio empleando un agente de modificacion que reaccione con amina, por ejemplo, un ester NHS de PEG. Tambien pueden prepararse fragmentos de union al antfgeno o anticuerpos humanos modificados reduciendo los enlaces disulfuro (por ejemplo, enlaces disulfuro intracatenarios) de un anticuerpo o fragmento de union al antfgeno. A continuacion, el fragmento de union al antfgeno o anticuerpo reducido puede hacerse reaccionar con un agente de modificacion que reaccione con tiol para producir el anticuerpo modificado. Pueden prepararse fragmentos de union al antfgeno y anticuerpos humanos modificados que comprendan un resto organico que se una a sitios especfficos de un anticuerpo de la presente invencion utilizando metodos adecuados, tales como proteolisis inversa (Fisch et al., Bioconjugate Chem., 3:147-153 (1992); Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5:411-417 (1994); Kumaran et al., Protein Sci. 6(10):2233-2241 (1997); Itoh et al., Bioorg. Chem., 24(1): 59-68 (1996); Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56(4):456-463 (1997)), y los metodos descritos en Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996).
Los anticuerpos de la invencion pueden unirse a la IL-6 humana con un amplio intervalo de afinidades (Kd). En una forma de realizacion preferente, al menos un mAb humano de la presente invencion puede unirse opcionalmente a la IL-6 humana con alta afinidad. Por ejemplo, un mAb puede unirse a la IL-6 humana con una Kd igual o inferior a aproximadamente 10-7 M, tal como, pero no limitado a, 0,1-9,9 (o cualquier intervalo o valor en el mismo) X 10-7, 10, 10'9,10'10, 10-11, 10-12, 10'13 o cualquier intervalo o valor en los mismos.
La afinidad o avidez de un anticuerpo por un antfgeno puede determinarse experimentalmente utilizando cualquier metodo adecuado. (Vease, por ejemplo, Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions", en Fundamental Immunology, Paul, W.E., Ed., Raven Press: Nueva York, Ny (1984); Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman and Company: Nueva York, NY (1992), y los metodos descritos en el presente documento). La afinidad medida de una interaccion concreta anticuerpo-antfgeno puede variar si se mide en diferentes condiciones (por ejemplo, concentracion salina, pH). Por lo tanto, las mediciones de afinidad y otros parametros de union al antfgeno (por ejemplo, Kd, Ka, Kd) se realizan preferentemente con soluciones normalizadas de anticuerpo y antfgeno, y un tampon normalizado, tal como el tampon descrito en el presente documento.
Los anticuerpos cCLB-8 anti-IL-6 utiles en los metodos y composiciones de la presente invencion se caracterizan por una alta afinidad de union a IL-6 y, opcional y preferentemente por tener baja toxicidad. En concreto, un anticuerpo, fragmento especificado o variante de la invencion, en el que los componentes individuales, tales como la region variable, la region constante y la region estructural, de manera individual y/o colectiva, opcional y preferentemente posean baja inmunogenicidad, es util en la presente invencion. Los anticuerpos que pueden utilizarse en la invencion se caracterizan opcionalmente por su capacidad para tratar a pacientes durante perfodos prolongados con un alivio medible de los sfntomas y toxicidad baja y/o aceptable. La baja o aceptable inmunogenicidad y/o la alta afinidad, asf como otras propiedades adecuadas, pueden contribuir a los resultados terapeuticos obtenidos. "Baja inmunogenicidad" se define en el presente documento como el aumento significativo de las respuestas HAHA, HACA o HAMA en menos de aproximadamente un 75%, o preferentemente en menos de aproximadamente un 50% de los pacientes tratados y/o el aumento de tftulos bajos en el paciente tratado (menos de aproximadamente 300, preferentemente menos de aproximadamente 100, medido con un inmunoensayo enzimatico de doble antfgeno) (Elliott et al., Lancet 344:1125-1127 (1994)).
Cuando el cCLB8 se compara con otros anticuerpos especfficos para IL-6 CLB.IL-6/14 y CLB.IL-6/16, pueden observarse las distintas caracterfsticas de afinidad del anticuerpo y especificidad del epftopo. El cCLB8, un anticuerpo que se une a IL-6 y normalmente bloquea la interaccion entre la IL-6 y su receptor, puede inhibir casi el 100% de la funcion de IL-6 como se ilustra en el bioensayo de proliferacion de celulas 7TD1 dependiente de IL-6 y el ensayo basado en Luminex de union de IL-6 al receptor de IL-6. Por el contrario, el CLB.IL-6/16, un anticuerpo que se une a IL-6 pero neutraliza mediante impedimento esterico la interaccion entre el complejo IL-6/IL-6R y el componente de senalizacion gp130, puede inhibir solo un 62% de la biotina-IL-6 unida. Por ultimo, un anticuerpo que se une a IL-6 pero no interfiere con su actividad biologica, como en CLB.IL-6/14, no presenta ninguna inhibicion de la biotina-IL-6 que se une a sIL-6R/gp80 en fase solida.
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Tambien pueden utilizarse anticuerpos biespecfficos, heteroespecfficos, heteroconjugados o similares que sean anticuerpos monoclonales humanizados con especificidades de union para al menos dos antfgenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de union es para al menos una protefna IL-6, la otra es para cualquier otro antfgeno. Los metodos para crear anticuerpos biespecfficos son conocidos en la tecnica. Tradicionalmente, la produccion recombinante de anticuerpos biespecfficos se basa en la co-expresion de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, en la que las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milstein y Cuello, Nature 305:537 (1983)). Debido a la mezcla aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una posible mezcla de 10 moleculas de anticuerpo diferentes, de las cuales solo una tiene la estructura biespecffica correcta. La purificacion de la molecula correcta, que suele hacerse mediante etapas de cromatograffa de afinidad, es bastante engorrosa, y los rendimientos de producto son bajos. Se describen procedimientos similares, por ejemplo, en el documento WO 93/08829, las patentes de Estados Unidos N° 6.210.668, 6.193.967, 6.132.992, 6.106.833, 6.060.285, 6.037.453, 6.010.902, 5.989.530, 5.959.084, 5.959.083, 5.932.448, 5.833.985, 5.821.333, 5.807.706, 5.643.759, 5.601.819, 5.582.996, 5.496.549, 4.676.980, los documentos WO 91/00360, WO 92/00373, EP 03089, Traunecker et al., EMBO J. 10:3655 (1991), Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986).
Moleculas de acido nucleico
Utilizando la informacion proporcionada en el presente documento, tal como las secuencias de nucleotidos que codifican al menos el 70%-100% de los aminoacidos contiguos de al menos una de las SEQ ID N°: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, fragmentos especificados, variantes o secuencias de consenso de los mismos, o un vector depositado que comprende al menos una de estas secuencias, puede obtenerse una molecula de acido nucleico que codifica al menos un anticuerpo anti-IL-6 cCLB-8 utilizando los metodos descritos en el presente documento o como se conoce en la tecnica.
Las moleculas de acido nucleico de la presente invencion pueden estar en forma de ARN, tal como ARNm, ARNnh, ARNt o cualquier otra forma, o en forma de ADN, incluido, pero no limitado a, ADNc y ADN genomico obtenido por clonacion o producido sinteticamente, o cualquier combinacion de los mismos. El ADN puede ser tricatenario, bicatenario o monocatenario, o cualquier combinacion de los mismos. Cualquier porcion de al menos una cadena del ADN o ARN puede ser la cadena codificante, tambien conocida como cadena sentido, o puede ser la cadena no codificante, tambien conocida como cadena antisentido.
Las moleculas aisladas de acido nucleico descritas en el presente documento pueden incluir moleculas de acido nucleico que comprenden un marco de lectura abierto (ORF), opcionalmente con uno o mas intrones, por ejemplo, pero no limitados a, al menos una porcion especffica de al menos una CDR, como CDR1, CDR2 y/o CDR3 de al menos una cadena pesada (por ejemplo, SEQ ID N°: 1-3) o cadena ligera (por ejemplo, SEQ ID N°: 4-6); moleculas de acido nucleico que comprenden la secuencia codificante para un anticuerpo anti-IL-6 o region variable (por ejemplo, SEQ ID N°: 15 o 16); y moleculas de acido nucleico que comprenden una secuencia de nucleotidos sustancialmente diferente de las descritas anteriormente pero que, debido a la degeneracion del codigo genetico, todavfa codifican al menos un anticuerpo anti-IL-6 como se describe en el presente documento y/o como se conoce en la tecnica. Por supuesto, el codigo genetico es bien conocido en la tecnica. Por lo tanto, serfa rutinario para un experto en la materia generar tales variantes degeneradas de acidos nucleicos que codifican los anticuerpos anti-IL-6 especfficos de la presente invencion. Vease, por ejemplo, Ausubel, et al., supra, y tales variantes de acidos nucleicos quedan incluidas en la presente invencion. Los ejemplos no limitativos de moleculas aisladas de acido nucleico incluyen las SEQ ID N°: 9-16; correspondientes a ejemplos no limitativos de un acido nucleico que codifica, respectivamente, la CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC, CDR3 de LC, la region variable de HC y la region variable de LC.
Como se indica en el presente documento, las moleculas de acido nucleico de la presente invencion que comprenden un acido nucleico que codifica un anticuerpo anti-IL-6 de la invencion pueden incluir, pero no se limitan a, las que codifican la secuencia de aminoacidos de un fragmento de anticuerpo, solo; la secuencia codificante para el anticuerpo entero o una porcion del mismo; la secuencia codificante para un anticuerpo, fragmento o porcion, asf como secuencias adicionales, tales como la secuencia codificante de al menos un peptido de fusion o lfder senal, con o sin las secuencias codificantes adicionales mencionadas anteriormente, tales como al menos un intron, junto con secuencias no codificantes adicionales, incluidas pero no limitadas a, secuencias 5' y 3' no codificantes, tales como las secuencias transcritas no traducidas que juegan un papel en la transcripcion, el procesamiento de ARNm, incluidas las senales de ayuste y poliadenilacion (por ejemplo, union al ribosoma y estabilidad del ARNm); una secuencia codificante adicional que codifica aminoacidos adicionales, tales como los que proporcionan funcionalidades adicionales. Por lo tanto, puede fusionarse la secuencia que codifica un anticuerpo a una secuencia marcadora, tal como una secuencia que codifica un peptido que facilita la purificacion del anticuerpo fusionado que comprende una porcion o fragmento de anticuerpo.
Polinucleotidos que hibridan selectivamente con un polinucleotido como se describe en el presente documento
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En el presente documento tambien se describen acidos nucleicos aislados que hibridan en condiciones de hibridacion selectiva con un polinucleotido descrito en el presente documento. Por lo tanto, estos polinucleotidos pueden utilizarse para aislar, detectar y/o cuantificar acidos nucleicos que comprenden tales polinucleotidos. Por ejemplo, estos polinucleotidos pueden utilizarse para identificar, aislar, o amplificar clones de longitud parcial o completa en una genoteca depositada. En algunas formas de realizacion, los polinucleotidos son secuencias de ADNc o genomico aisladas, o bien complementarias de, un ADNc de una genoteca de acidos nucleicos humanos o de mamffero.
Preferentemente, la genoteca de ADNc comprende al menos un 80% de secuencias de longitud completa, preferentemente al menos un 85% o un 90% de secuencias de longitud completa, y mas preferentemente al menos un 95% de secuencias de longitud completa. Las genotecas de ADNc pueden normalizarse para aumentar la representacion de secuencias raras. Por lo general, pero no exclusivamente, se emplean condiciones de hibridacion de rigurosidad baja o moderada con secuencias que tienen una identidad de secuencia reducida con relacion a las secuencias complementarias. Opcionalmente pueden emplearse condiciones de rigurosidad moderada y alta para las secuencias de mayor identidad. Las condiciones de baja rigurosidad permiten la hibridacion selectiva de secuencias que tienen aproximadamente un 70% de identidad de secuencia y pueden emplearse para identificar las secuencias paralogas u ortologas.
Opcionalmente, los polinucleotidos codificaran al menos una porcion de un anticuerpo codificado por los polinucleotidos descritos en el presente documento. Los polinucleotidos abarcan secuencias de acidos nucleicos que pueden emplearse para la hibridacion selectiva con un polinucleotido que codifica un anticuerpo de la presente invencion. Vease, por ejemplo, Ausubel, supra; Colligan, supra.
Construccion de acidos nucleicos
Los acidos nucleicos aislados de la presente invencion pueden crearse utilizando (a) metodos recombinantes, (b) tecnicas de sfntesis, (c) tecnicas de purificacion, o combinaciones de las mismas, como se conoce bien en la tecnica.
Los acidos nucleicos pueden comprender convenientemente secuencias ademas de un polinucleotido de la presente invencion. Por ejemplo, puede insertarse en el acido nucleico un sitio de clonacion multiple que comprenda uno o mas sitios de restriccion de endonucleasas para ayudar a aislar el polinucleotido. Ademas, pueden insertarse secuencias traducibles para ayudar a aislar el polinucleotido traducido de la presente invencion. Por ejemplo, una secuencia marcadora de hexa-histidina proporciona un medio conveniente para purificar las protefnas de la presente invencion. El acido nucleico de la presente invencion - sin incluir la secuencia codificante - es opcionalmente un vector, adaptador o conector para clonar y/o expresar un polinucleotido de la presente invencion.
Pueden anadirse a tales secuencias de clonacion y/o expresion secuencias adicionales para optimizar su funcion en la clonacion y/o expresion, para ayudar a aislar el polinucleotido, o para mejorar la introduccion del polinucleotido en una celula. El uso de vectores de clonacion, vectores de expresion, adaptadores y conectores es bien conocido en la tecnica. (Vease, por ejemplo, Ausubel, supra, o Sambrook, supra)
Metodos recombinantes para la construccion de acidos nucleicos
Las composiciones de acidos nucleicos aislados de la presente invencion, tales como ARN, ADNc, ADN genomico, o cualquier combinacion de los mismos, pueden obtenerse a partir de fuentes biologicas utilizando multitud de metodologfas de clonacion conocidos por los expertos en la materia. En algunas formas de realizacion, se utilizan sondas de oligonucleotidos que hibridan selectivamente, en condiciones rigurosas, con los polinucleotidos de la presente invencion para identificar la secuencia deseada en una genoteca de ADN genomico o de ADNc. El aislamiento de ARN, y la construccion de genotecas de ADNg o de ADNc, es bien conocido por los expertos habituales en la tecnica. (Vease, por ejemplo, Ausubel, supra, o Sambrook, supra)
Cribado de acidos nucleicos y metodos de aislamiento
Puede cribarse una genoteca de ADNg o de ADNc utilizando una sonda en base a la secuencia de un polinucleotido de la presente invencion, tales como los descritos en el presente documento. Pueden utilizarse sondas que hibriden con secuencias de ADNc o ADN genomico para aislar genes homologos en el mismo organismo o en organismos diferentes. Los expertos en la materia entenderan que pueden emplearse en el ensayo diversos grados de rigurosidad de hibridacion, y que pueden ser rigurosos tanto la hibridacion como el medio de lavado. A medida que las condiciones de hibridacion se vuelven mas rigurosas, debe haber un mayor grado de complementariedad entre la sonda y la diana para que se produzca la formacion del duplex. El grado de rigurosidad puede controlarse mediante uno o mas de entre la temperatura, la fuerza ionica, el pH y la presencia de un disolvente parcialmente desnaturalizante tal como formamida. Por ejemplo, la rigurosidad de la hibridacion se modifica convenientemente cambiando la polaridad de la solucion de reaccionante a traves de, por ejemplo, la
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manipulacion de la concentracion de formamida dentro del intervalo de 0% a 50%. El grado de complementariedad (identidad de secuencia) necesario para la union detectable variara segun la rigurosidad del medio de hibridacion y/o del medio de lavado. El grado de complementariedad sera de manera optima del 100%, o del 70%-100%, o cualquier intervalo o valor en el mismo. Sin embargo, debe entenderse que las variaciones minoritarias en la secuencia de las sondas y cebadores pueden ser compensadas reduciendo la rigurosidad de la hibridacion y/o del medio de lavado.
Los metodos de amplificacion de ARN o ADN son bien conocidos en la tecnica y pueden utilizarse segun la presente invencion sin experimentacion indebida, en base a la ensenanza y la orientacion presentadas en el presente documento.
Los metodos conocidos de amplificacion de ADN o ARN incluyen, pero no se limitan a, reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) y procesos de amplificacion relacionados (veanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N° 4.683.195, 4.683.202, 4.800.159, 4.965.188, de Mullis, et al.; 4.795.699 y 4.921.794 de Tabor, et al.; 5.142.033 de Innis; 5.122.464 de Wilson, et al.; 5.091.310 de Innis; 5.066.584 de Gyllensten, et al.; 4.889.818 de Gelfand, et al.; 4.994.370 de Silver, et al.; 4.766.067 de Biswas; 4.656.134 de Ringold) y amplificacion mediada por ARN que utiliza ARN antisentido con respecto a la secuencia diana como molde para la sfntesis de ADN bicatenario (patente de EE.UU. N° 5.130.238 de Malek, et al., con el nombre comercial NASBA). (Vease, por ejemplo, Ausubel, supra; O Sambrook, supra).
Por ejemplo, puede utilizarse la tecnologfa de reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar las secuencias de polinucleotidos de la presente invencion y los genes relacionados directamente de genotecas de ADNc o ADN genomico. La PCR y otros metodos de amplificacion in vitro tambien pueden ser utiles, por ejemplo, para clonar secuencias de acidos nucleicos que codifican protefnas que seran expresadas, para generar acidos nucleicos que se utilizaran como sondas para detectar la presencia del ARNm deseado en las muestras, para la secuenciacion de acidos nucleicos, o para otros fines. Se encuentran ejemplos de tecnicas suficientes para dirigir a los expertos a traves de los metodos de amplificacion in vitro en Berger, supra, Sambrook, supra, y Ausubel, supra, asf como Mullis, et al., patente de EE.UU. N° 4.683.202 (1987); e Innis, et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, CA (1990). Los kits disponibles en el mercado para la amplificacion genomica por PCR son conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, el kit Advantage-GC Genomic PCR (Clontech). Ademas, por ejemplo, puede utilizarse la protefna del gen 32 de T4 (Boehringer Mannheim) para mejorar el rendimiento de los productos de PCR largos.
Metodos de sfntesis para construir acidos nucleicos
Los acidos nucleicos aislados de la presente invencion tambien pueden prepararse por sfntesis qufmica directa mediante metodos conocidos (vease, por ejemplo, Ausubel, et al., supra). La sfntesis qufmica produce generalmente un oligonucleotido monocatenario, que puede convertirse en ADN bicatenario mediante hibridacion con una secuencia complementaria, o mediante polimerizacion con una ADN polimerasa utilizando la cadena sencilla como molde. Un experto en la materia reconocera que mientras que la sfntesis qufmica de ADN puede limitarse a secuencias de aproximadamente 100 o mas bases, pueden obtenerse secuencias mas largas mediante la ligacion de secuencias mas cortas.
Casetes de expresion recombinantes
La presente invencion proporciona adicionalmente casetes de expresion recombinantes que comprenden un acido nucleico de la presente invencion. Puede utilizarse una secuencia de acidos nucleicos de la presente invencion, por ejemplo, una secuencia de ADNc o genomico que codifique un anticuerpo de la presente invencion, para construir un casete de expresion recombinante que puede introducirse en al menos una celula hospedadora deseada. Un casete de expresion recombinante comprendera por lo general un polinucleotido de la presente invencion unido operativamente a secuencias reguladoras de inicio de la transcripcion que dirigiran la transcripcion del polinucleotido en la celula hospedadora prevista. Pueden emplearse promotores heterologos y no heterologos (es decir, endogenos) para dirigir la expresion de los acidos nucleicos de la presente invencion.
En algunas formas de realizacion, los acidos nucleicos aislados que sirven como promotor, potenciador u otros elementos pueden introducirse en la posicion apropiada (cadena arriba, cadena abajo o en el intron) de una forma no heterologa de un polinucleotido de la presente invencion para aumentar o disminuir la expresion de un polinucleotido de la presente invencion. Por ejemplo, los promotores endogenos pueden modificarse in vivo o in vitro mediante mutacion, delecion y/o sustitucion.
Vectores y celulas hospedadoras
La presente invencion tambien se refiere a vectores que incluyen moleculas aisladas de acido nucleico de la presente invencion, celulas hospedadoras que se obtienen por ingenierfa genetica con los vectores recombinantes, y la produccion de al menos un anticuerpo anti-IL-6 mediante tecnicas recombinantes, como es bien
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Los polinucleotidos pueden unirse opcionalmente a un vector que contiene un marcador seleccionable para la propagacion en un hospedador. Generalmente, se introduce un vector plasmido en un precipitado, tal como un precipitado de fosfato de calcio, o en un complejo con un lfpido cargado. Si el vector es un virus, puede empaquetarse in vitro utilizando una lfnea celular de empaquetamiento apropiada y a continuacion transducirse a las celulas hospedadoras.
El inserto de ADN debe unirse operativamente a un promotor apropiado. Los constructos de expresion contendran adicionalmente sitios para la iniciacion de la transcripcion, la terminacion y, en la region transcrita, un sitio de union al ribosoma para la traduccion. La porcion codificante de los transcritos maduros expresados por los constructos incluira preferentemente una iniciacion de la traduccion al principio y un codon de terminacion (por ejemplo, UAA, UGA o UAG) situado apropiadamente al final del ARNm que se traducira, siendo preferentes UAA y UAG para la expresion de celulas eucariotas o de mamffero.
Los vectores de expresion incluiran, preferentemente aunque opcionalmente, al menos un marcador seleccionable. Tales marcadores incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, resistencia a metotrexato (MTX), dihidrofolato reductasa (DHFR, patentes de EE.UU. N° 4.399.216, 4.634.665, 4.656.134, 4.956.288, 5.149.636, 5.179.017), ampicilina, neomicina (G418), acido micofenolico o glutamina sintetasa (GS, patentes de EE.UU. N° 5.122.464, 5.770.359, 5.827.739) para el cultivo de celulas eucariotas, y genes de resistencia a tetraciclina o ampicilina para el cultivo en E. coli y otras bacterias u organismos procariotas. Las condiciones y medios de cultivo apropiados para las celulas hospedadoras anteriormente descritas son conocidas en la tecnica. Los vectores adecuados resultaran evidentes para el experto en la material. La introduccion de un constructo vector en una celula hospedadora puede efectuarse mediante transfeccion con fosfato de calcio, transfeccion mediada por DEAE-dextrano, transfeccion mediada por lfpidos cationicos, electroporacion, transduccion, infeccion u otros metodos conocidos. Tales metodos estan descritos en la tecnica, tal como Sambrook, supra, capftulos 1-4 y 16-18; Ausubel, supra, capftulos 1, 9, 13, 15, 16.
Al menos un anticuerpo de la presente invencion puede expresarse en una forma modificada, tal como una protefna de fusion, y puede incluir no solo senales de secrecion, sino tambien regiones funcionales heterologas adicionales. Por ejemplo, puede anadirse una region de aminoacidos adicionales, particularmente aminoacidos cargados, al extremo N-terminal de un anticuerpo para mejorar la estabilidad y persistencia en la celula hospedadora, durante la purificacion, o durante la posterior manipulacion y almacenamiento. Ademas, pueden anadirse restos peptfdicos a un anticuerpo de la presente invencion para facilitar la purificacion. Tales regiones pueden eliminarse antes de la preparacion final de un anticuerpo o al menos un fragmento del mismo. Tales metodos estan descritos en muchos manuales de laboratorio convencionales, tales como Sambrook, supra, capftulos 17.29-17.42 y 18.1-18.74; Ausubel, supra, capftulos 16, 17 y 18.
Los expertos en la materia son conocedores de los numerosos sistemas de expresion disponibles para la expresion de un acido nucleico que codifique una protefna de la presente invencion.
Como alternativa, los acidos nucleicos de la presente invencion pueden expresarse en una celula hospedadora mediante su activacion (por manipulacion) en una celula hospedadora que contiene ADN endogeno que codifica un anticuerpo de la presente invencion. Tales metodos son bien conocidos en la tecnica, por ejemplo, como se describe en las patentes de EE.UU. N° 5.580.734, 5.641.670, 5.733.746 y 5.733.761.
Las celulas de mamffero ejemplifican cultivos celulares utiles para la produccion de los anticuerpos, porciones especificadas o variantes de los mismos. Los sistemas de celulas de mamffero suelen estar en forma de monocapas de celulas aunque tambien pueden utilizarse biorreactores o suspensiones de celulas de mamffero. Se han desarrollado en la tecnica varias lfneas celulares hospedadoras adecuadas capaces de expresar protefnas glucosiladas intactas, e incluyen las lfneas celulares COS-1 (por ejemplo, ATCC CRL 1650), COS-7 (por ejemplo, ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21 (por ejemplo, ATCC CRL-10), CHO (por ejemplo, ATCC CRL 1610) y BSC-1 (por ejemplo, ATCC CRL-26), celulas Cos-7, celulas CHO, celulas hep G2, p3x63Ag8.653, SP2/0-GA14, celulas 293, celulas HeLa y similares, que pueden adquirirse facilmente en, por ejemplo, la Coleccion Americana de Cultivos Tipo, Manassas, Va (
www.atcc.org). Las celulas hospedadoras preferentes incluyen celulas de origen linfoide, tales como celulas de mieloma y linfoma. Son celulas hospedadoras especialmente preferentes las celulas P3X63Ag8.653 (numero de referencia de la ATCC CRL-1580) y las celulas SP2/0-Ag14 (numero de referencia de la ATCC CRL-1851). En una forma de realizacion especialmente preferente, la celula recombinante es una celula SP2/0-Ag14 o una P3X63Ab8.653.
Los vectores de expresion para estas celulas pueden incluir una o mas de las siguientes secuencias de control de expresion, tales como, pero no limitadas a, un origen de replicacion, un promotor (por ejemplo, promotores temprano o tardfo de SV40, el promotor de CMV (patentes de EE.UU. N° 5.168.062, 5.385.839), un promotor tk de HSV, un promotor pgk (fosfoglicerato quinasa), un promotor EF-1 alfa (patente de EE.UU. N° 5.266.491), al menos un promotor de inmunoglobulina humana; un potenciador, y/o sitios de procesamiento de la informacion, tales como
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sitios de union a ribosomas, sitios de corte y empalme de ARN, sitios de poliadenilacion (por ejemplo, un sitio de adicion de poli A del antfgeno T grande de SV40), y secuencias terminadoras de la transcripcion. Vease, por ejemplo, Ausubel et al., supra; Sambrook, et al., supra. Otras celulas utiles para la produccion de los acidos nucleicos o protemas de la presente invencion se conocen y/o estan disponibles, por ejemplo, en el catalogo de lmeas celulares e hibridomas de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (
www.atcc.org) u otras fuentes comerciales o conocidas.
Cuando se emplean celulas hospedadoras eucariotas, por lo general se incorporan en el vector secuencias terminadoras de la transcripcion o de poliadenilacion. Un ejemplo de una secuencia terminadora es la secuencia de poliadenilacion del gen de la hormona bovina de crecimiento. Tambien pueden incluirse secuencias para un corte y empalme preciso del transcrito. Un ejemplo de una secuencia de corte y empalme es el intron VP1 de SV40 (Sprague, et al., J. Virol. 45:773-781 (1983)). Ademas, pueden incorporarse en el vector secuencias genicas para controlar la replicacion en la celula hospedadora, como se conoce en la tecnica.
Produccion de un anticuerpo
Al menos un anticuerpo anti-IL-6 de la presente invencion puede ser opcionalmente producido por una lmea celular, una lmea celular mixta, una celula inmortalizada o poblacion clonal de celulas inmortalizadas, como es bien conocido en la tecnica. Vease, por ejemplo, Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edicion, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow y Lane, Antibodies: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001).
En un enfoque, se produce un hibridoma por fusion de una lmea celular inmortal adecuada (por ejemplo, una lmea celular de mieloma tal como, pero no limitada a, Sp2/0, SP2/0-Ag14, NSO, NS1, NS2, AE-1, L.5, >243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A, o similares, o heteromielomas, productos de fusion de los mismos, o cualquier celula o celula de fusion derivada de los mismos, o cualquier otra lmea celular adecuada como se conoce en la tecnica (vease, por ejemplo, www.atcc.org,
www.lifetech.com, y similares), con celulas productoras de anticuerpos, tales como, pero no limitadas a, celulas de bazo clonadas o aisladas, de sangre periferica, linfaticas, de la amfgdala, u otras celulas que contengan linfocitos B o celulas inmunitarias, o cualquier otra tipo de celula que exprese secuencias de CDR o de la region estructural o constante o variable de la cadena pesada o ligera, ya sea como acido nucleico endogeno o heterologo, como ADN recombinante o endogeno, viral, bacteriano, de algas, procariota, de anfibios, de insectos, de reptiles, de peces, de marnffero, de roedor, equino, ovino, de cabra, de oveja, de primates, eucariota, genomico, ADNc, ADNr, ARN o ADN mitocondrial, ARN o aDn de cloroplastos, ARNnh, ARNm, ARNt, monocatenario, bicatenario o tricatenario, hibridado, y similares, o cualquier combinacion de los mismos. Vease, por ejemplo, Ausubel, supra, y Colligan, Immunology, supra, capttulo 2.
Tambien puede utilizarse cualquier otra celula hospedadora adecuada para expresar el acido nucleico heterologo o endogeno que codifica un anticuerpo, fragmento especificado o variante del mismo, de la presente invencion. Las celulas fusionadas (hibridomas) o celulas recombinantes pueden aislarse utilizando condiciones de cultivo selectivas u otros metodos conocidos adecuados, y clonarse por dilucion limitante o separacion de celulas u otros metodos conocidos. Las celulas que producen anticuerpos con la especificidad deseada pueden seleccionarse mediante un ensayo adecuado (por ejemplo, ELISA).
Los anticuerpos de la presente invencion tambien pueden prepararse utilizando al menos un acido nucleico que codifica un anticuerpo anti-IL-6 para proporcionar animales o mairnferos transgenicos, tales como cabras, vacas, caballos, ovejas, y similares, que produzcan tales anticuerpos en su leche. Pueden proporcionarse tales animales utilizando metodos conocidos. Vease, por ejemplo, pero sin limitarse a, las patentes de EE.UU. N° 5.827.690, 5.849.992, 4.873.316, 5.849.992, 5.994.616, 5.565.362, 5.304.489, y similares.
Los anticuerpos de la presente invencion pueden prepararse adicionalmente utilizando al menos un acido nucleico que codifica un anticuerpo anti-IL-6 para proporcionar plantas y celulas vegetales cultivadas transgenicas (por ejemplo, pero no limitadas a, tabaco y mafz) que produzcan tales anticuerpos, porciones especificadas o variantes en las partes de la planta o en celulas cultivadas de las mismas. Como ejemplo no limitativo, se han utilizado con exito hojas de tabaco transgenico que expresan protemas recombinantes para proporcionar grandes cantidades de protemas recombinantes, por ejemplo, utilizando un promotor inducible. Vease, por ejemplo, Cramer et al., Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95-118 (1999) y las referencias citadas en el mismo. Ademas, se ha utilizado mafz transgenico para expresar protemas de mai^ero a niveles de produccion comercial, con actividades biologicas equivalentes a las producidas en otros sistemas recombinantes o purificadas a partir de fuentes naturales. Vease, por ejemplo, Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. 464:127-147 (1999) y las referencias citadas en el mismo, tambien se han producido anticuerpos en grandes cantidades a partir de semillas de plantas transgenicas, incluidos fragmentos de anticuerpos, tales como anticuerpos monocatenarios (scFv), incluidas las semillas de tabaco y tuberculos de patata. Vease, por ejemplo, Conrad et al., Plant Mol. Biol. 38:101-109 (1998) y las referencias citadas
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en el mismo. Por lo tanto, los anticuerpos de la presente invencion tambien pueden producirse utilizando plantas transgenicas, segun metodos conocidos. Vease tambien, por ejemplo, Fischer et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 30:99-108 (oct., 1999), Ma et al., Trends Biotechnol. 13:522-7 (1995); Ma et al., Plant Physiol. 109:341-6 (1995); Whitelam et al., Biochem. Soc. Trans. 22:940-944 (1994), y referencias citadas en los mismos.
Purificacion de un anticuerpo
Puede recuperarse y purificarse un anticuerpo anti-IL-6 a partir de cultivos de celulas recombinantes mediante metodos bien conocidos, incluidos, pero no limitados a, purificacion con protefna A, precipitacion con etanol o sulfato de amonio, extraccion de acidos, cromatograffa de intercambio anionico o cationico, cromatograffa en fosfocelulosa, cromatograffa de interaccion hidrofoba, cromatograffa de afinidad, cromatograffa en hidroxiapatita y cromatograffa en lectina. Tambien puede emplearse para la purificacion la cromatograffa lfquida de alto rendimiento ("HPLC"). Vease, por ejemplo, Colligan, Current Protocols in Immunology, o Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001), por ejemplo, los capftulos 1,4, 6, 8, 9, 10.
Los anticuerpos de la presente invencion incluyen productos purificados naturalmente, productos de procedimientos de sfntesis qufmica, y productos producidos mediante tecnicas recombinantes a partir de un hospedador eucariota, incluidas, por ejemplo, las celulas de levadura, de plantas superiores, de insectos y de mamfferos. Dependiendo del hospedador empleado en un procedimiento de produccion recombinante, el anticuerpo de la presente invencion puede estar glicosilado o puede no estar glicosilado, siendo preferente que este glicosilado. Tales metodos se describen en muchos manuales de laboratorio convencionales, tales como Sambrook, supra, secciones 17.37-17.42; Ausubel, supra, capftulos 10, 12, 13, 16, 18 y 20, Colligan, Protein Science, supra, capftulos 12-14.
Clonacion y expresion del anticuerpo para IL-6 en celulas de mamffero
Un vector de expresion de mamffero tfpico contiene al menos un elemento promotor, que interviene en la iniciacion de la transcripcion del ARNm, la secuencia codificante del anticuerpo, y las senales requeridas para la terminacion de la transcripcion y la poliadenilacion del transcrito. Los elementos adicionales incluyen potenciadores, secuencias de Kozak y secuencias intermedias flanqueadas por sitios donadores y aceptores de corte y empalme del ARN. Puede conseguirse una transcripcion altamente eficaz con los promotores temprano y tardfo de SV40, las repeticiones terminales largas (LTR) de retrovirus, por ejemplo, RSV, HTLVI, HIVI y el promotor temprano del citomegalovirus (CMV). Sin embargo, tambien pueden utilizarse elementos celulares (por ejemplo, el promotor de la actina humana). Los vectores de expresion adecuados para su uso en la practica de la presente invencion incluyen, por ejemplo, vectores tales como pIRES1neo, pRetro-Off, pRetro-On, PLXSN o pLNCX (Clonetech Labs, Palo Alto, CA), pADNc3.1 (+/-), pcDNA/Zeo (+/-) o pcDNA3.1/Hygro (+/-) (Invitrogen), PSVL y pMsG (Pharmacia, Uppsala, Suecia), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) y pBC12MI (ATCC 67109). Las celulas hospedadoras de mamffero que podrfan utilizarse incluyen celulas HeLa 293, H9 y Jurkat humanas, celulas NIH3T3 y C127 de raton, celulas Cos 1, Cos 7 y CV 1, celulas QC1-3 de codorniz, celulas L de raton y celulas de ovario de hamster chino (CHO).
Como alternativa, el gen puede expresarse en lfneas celulares estables que contengan el gen integrado en un cromosoma. La co-transfeccion con un marcador seleccionable tal como dhfr, gpt, neomicina o higromicina permite la identificacion y el aislamiento de las celulas transfectadas.
El gen transfectado tambien puede amplificarse para que exprese grandes cantidades del anticuerpo codificado. El marcador DHFR (dihidrofolato reductasa) es util para desarrollar lfneas celulares que porten varios cientos o incluso varios miles de copias del gen de interes. Otro marcador de seleccion util es la enzima glutamina sintasa (GS) (Murphy, et al., Biochem J. 227:277-279 (1991); Bebbington, et al., Bio/Technology 10:169-175 (1992)). Utilizando estos marcadores, se cultivan las celulas de mamffero en medio selectivo y se seleccionan las celulas que tengan la mayor resistencia. Estas lfneas celulares contienen el gen o los genes amplificados integrados en un cromosoma. Para la produccion de anticuerpos suelen utilizarse celulas de ovario de hamster chino (CHO) y NSO.
Los vectores de expresion pC1 y pC4 contienen el promotor fuerte (LTR) del virus del sarcoma de Rous (Cullen, et al., Molec. Celula. Biol. 5:438-447 (1985)) ademas de un fragmento del potenciador de CMV (Boshart, et al., Cell, 41:521-530 (1985)). Los sitios de clonacion multiple, por ejemplo, con los sitios de escision de enzimas de restriccion BamHI, XbaI y Asp718, facilitan la clonacion del gen de interes. Los vectores contienen ademas el intron 3', la senal de poliadenilacion y de terminacion del gen de la preproinsulina de rata.
Clonacion y expresion en celulas CHO
El vector pC4 se utiliza para la expresion del anticuerpo para IL-6. El plasmido pC4 es un derivado del plasmido pSV2-dhfr (ATCC con N° de referencia 37146). El plasmido contiene el gen DHFR de raton bajo el control del promotor temprano de SV40. Pueden seleccionarse celulas de ovario de hamster chino u otras celulas que carecen de actividad dihidrofolato que se transfectan con estos plasmidos cultivando las celulas en un medio
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selectivo (por ejemplo, alfa minus MEM, Life Technologies, Gaithersburg, MD) complementado con el agente quimioterapeutico metotrexato. La amplificacion de los genes DHFR en celulas resistentes a metotrexato (MTX) ha sido bien documentada (vease, por ejemplo, F.W. Alt, et al., J. Biol. Chem. 253:1357-1370 (1978); J.L. Hamlin y C. Ma, Biochem et Biophys. Acta 1097:107-143 (1990); y M. J. Page y M. A. Sydenham, Biotechnology 9:64-68 (1991)). Las celulas cultivadas en concentraciones crecientes de MTX desarrollan resistencia al farmaco por sobreproduccion de la enzima diana, DHFR, como resultado de la amplificacion del gen DHFR. Si se une un segundo gen al gen de la DHFR, normalmente se co-amplifica y se sobreexpresa. Es conocido en la tecnica que puede utilizarse este enfoque para desarrollar lfneas celulares que porten mas de 1.000 copias del gen o de los genes amplificados. Posteriormente, cuando se retira el metotrexato, se obtienen lfneas celulares que contienen el gen amplificado integrado en uno o mas cromosomas de la celula hospedadora.
El plasmido pC4 contiene para expresar el gen de interes el promotor fuerte de la repeticion terminal larga (LTR) del virus del sarcoma de Rous (Cullen, et al., Molec. Cell. Biol. 5:438-447 (1985)) mas un fragmento aislado del potenciador del gen temprano inmediato de citomegalovirus (CMV) humano (Boshart, et al., Cell, 41:521-530 (1985)). Cadena abajo del promotor se encuentran los sitios de escision de enzimas de restriccion BamHI, Xbal y Asp718 que permiten la integracion de los genes. Detras de estos sitios de clonacion el plasmido contiene el intron 3' y el sitio de poliadenilacion del gen de la preproinsulina de rata. Tambien pueden utilizarse otros promotores de alta eficacia para la expresion, por ejemplo, el promotor de b-actina humana, los promotores temprano o tardfo de SV40 o las repeticiones terminales largas de otros retrovirus, por ejemplo, VIH y hTlVI. Pueden utilizarse los sistemas de expresion genica Tet-Off y Tet-On de Clontech y sistemas similares para expresar la IL-6 de manera regulada en celulas de mamffero (M. Gossen, y H. Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. eE.UU. 89:5547-5551 (1992)). Para la poliadenilacion del ARNm pueden utilizarse tambien otras senales, por ejemplo, de genes de la globina o la hormona de crecimiento humana. Tambien pueden seleccionarse lfneas celulares estables que porten un gen de interes integrado en los cromosomas tras la co-transfeccion con un marcador seleccionable tal como gpt, G418 o higromicina. Es ventajoso utilizar mas de un marcador seleccionable al principio, por ejemplo, G418 y metotrexato.
El plasmido pC4 se digiere con enzimas de restriccion y a continuacion se desfosforila utilizando fosfatasa intestinal de ternero mediante procedimientos conocidos en la tecnica. A continuacion se afsla el vector de un gel de agarosa al 1%.
Se utiliza la secuencia de ADN que codifica el anticuerpo para IL-6 completo, por ejemplo, como se presenta en las SEQ ID N°: 7 y 8, correspondientes a las regiones variables de la HC y la LC de un anticuerpo para IL-6 de la presente invencion, segun las etapas de metodo conocidas. En este constructo tambien se utiliza acido nucleico aislado que codifica una region constante humana adecuada (es decir, regiones HC y LC).
A continuacion, el vector desfosforilado y el ADN que codifica la region variable y constante aislados se ligan con ADN ligasa de T4. A continuacion se transforman celulas XL-1 Blue o HB101 de E. coli y se identifican las bacterias que contienen el fragmento insertado en el plasmido pC4 utilizando, por ejemplo, el analisis de enzimas de restriccion.
Para la transfeccion se utilizan celulas de ovario de hamster chino (CHO) que carecen de un gen DHFR activo. Se cotransfectan 5 pg del plasmido de expresion pC4 con 0,5 pg del plasmido pSV2-neo utilizando lipofectina. El plasmido pSV2-neo contiene un marcador seleccionable dominante, el gen neo de Tn5 que codifica una enzima que confiere resistencia frente a un grupo de antibioticos incluido G418. Se siembran las celulas en alfa minus MEM complementado con 1 pg/ml de G418. Despues de 2 dfas, se tratan las celulas con tripsina y se siembran en placas de clonacion de hibridoma (Greiner, Alemania) en alfa minus MEM complementado con 10 ng/ml, 25 ng/ml o 50 ng/ml de metotrexato mas 1 pg/ml de G418. Despues de aproximadamente 10-14 dfas, se tratan los clones individuales con tripsina y a continuacion se siembran en placas de Petri de 6 pocillos o matraces de 10 ml utilizando diferentes concentraciones de metotrexato (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM). A continuacion, los clones que crecen a las concentraciones mas altas de metotrexato se transfieren a nuevas placas de 6 pocillos que contienen concentraciones aun mas altas de metotrexato (1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM). Se repite el mismo procedimiento hasta que se obtienen clones que crecen a una concentracion entre 100 mM-200 mM. Se analiza la expresion del producto genico deseado, por ejemplo, mediante SDS-PAGE y transferencia de Western o mediante analisis de HPLC de fase inversa.
Anticuerpos anti-idiotipo contra la composicion de anticuerpo anti-IL-6
Ademas de anticuerpos anti-IL-6 monoclonales o hfbridos, en el presente documento se describe un anticuerpo antiidiotfpico (anti-Id) especffico para tales anticuerpos de la invencion. Un anticuerpo anti-Id es un anticuerpo que reconoce determinantes unicos asociados generalmente con la region de union al antfgeno de otro anticuerpo. El anti-Id puede prepararse inmunizando a un animal de la misma especie y tipo genetico (por ejemplo cepa de raton) como fuente del anticuerpo Id con el anticuerpo o que contiene una region CDR del mismo. El animal inmunizado reconocera y respondera a los determinantes idiotfpicos del anticuerpo inmunizante y producira un anticuerpo anti-Id. El anticuerpo anti-Id tambien puede utilizarse como "inmunogeno" para inducir una respuesta inmunitaria en otro animal mas, produciendo un denominado anticuerpo anti-anti-Id.
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La presente invencion tambien proporciona al menos una composicion de un anticuerpo anti-IL-6 que comprende un anticuerpo de la invencion que se proporciona en una forma, mezcla o composicion de origen no natural. Tales composiciones comprenden composiciones de origen no natural que comprenden al menos una o dos variantes especificadas, fragmentos, dominios o variantes delecionadas en el extremo C-terminal y/o N-terminal, de longitud completa, de la secuencia de aminoacidos del anticuerpo anti-IL-6 seleccionados del grupo que consiste en el 70%-100% de los aminoacidos contiguos de las SEQ ID N°: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o variantes, dominios o fragmentos especificados de los mismos. Las composiciones de anticuerpo anti-IL-6 preferentes incluyen al menos una o dos variantes, dominios o fragmentos, de longitud completa, como al menos una CDR o LBR que contiene porciones de la secuencia del anticuerpo anti-IL-6 del 70%-100% de las SEQ ID N°: 1, 2, 3, 4, 5, 6, o variantes, dominios o fragmentos especificados de las mismas. Otras composiciones preferentes comprenden el 40%-99% de al menos uno de 70%-100% de las SEQ ID N°: 1, 2, 3, 4, 5, 6, o variantes, dominios o fragmentos especificados de las mismas. Tales porcentajes de composicion son en peso, volumen, concentracion, molaridad o molalidad como soluciones lfquidas o secas, mezclas, suspension, emulsiones o coloides, como se conoce en la tecnica o como se describe en el presente documento.
Las composiciones de anticuerpo anti-IL-6 de la presente invencion pueden comprender adicionalmente al menos una de cualquier cantidad adecuada y eficaz de una composicion o composicion farmaceutica que comprenda al menos un anticuerpo anti-IL-6 a una celula, tejido, organo, animal o paciente que necesite tal modulacion, tratamiento o terapia, que opcionalmente comprende adicionalmente al menos uno seleccionado de al menos un antagonista de TNF (por ejemplo, pero no limitado a un anticuerpo o fragmento contra TNF, un fragmento receptor o de TNF soluble, protefnas de fusion de los mismos, o un antagonista de TNF de molecula pequena), un antirreumatico (por ejemplo, metotrexato, auranofina, aurotioglucosa, azatioprina, etanercept, tiomalato de oro sodio, sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida, sulfasalazina), un relajante muscular, un narcotico, un farmaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE), un analgesico, un anestesico, un sedante, un anestesico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano (por ejemplo, aminoglucosido, un antifungico, un antiparasitario, un antiviral, un carbapenem, cefalosporina, una flurorquinolona, un macrolido, una penicilina, una sulfonamida, una tetraciclina, otro antimicrobiano), un antipsoriasico, un corticosteroide, un esteroide anabolico, un agente relacionado con la diabetes, un mineral, un producto nutricional, un agente tiroideo, una vitamina, una hormona relacionada con calcio, un antidiarreico, un antitusivo, un antiemetico, un antiulceroso, un laxante, un anticoagulante, un epoetina (por ejemplo, epoetina alfa), un filgrastim (por ejemplo, G-CSF, Neupogen), un sargramostim (GM-CSF, Leukine), una vacunacion, una inmunoglobulina, un inmunosupresor (por ejemplo, basiliximab, ciclosporina, daclizumab), una hormona de crecimiento, un medicamento de reemplazo hormonal, un modulador del receptor de estrogenos, un midriatico, un cicloplejico, un agente alquilante, un antimetabolito, un antimitotico, un radiofarmaco, un antidepresivo, un antimanfaco, un antipsicotico, un ansiolftico, un hipnotico, un simpaticomimetico, un estimulante, donepezilo, tacrina, un medicamento para el asma, un beta agonista, un esteroide inhalado, un inhibidor de leucotrienos, una metilxantina, un cromolina, una epinefrina o analogo, dornasa alfa (Pulmozyme), una citocina o un antagonista de citocinas. Los ejemplos no limitativos de tales citocinas incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de IL-1 a IL-23. Las dosis adecuadas son bien conocidas en la tecnica. Vease, por ejemplo, Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2a edicion, Appleton y Lange, Stamford, CT (2000). PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000).
Tales agentes antiinfecciosos o anticancerosos tambien pueden incluir moleculas de toxina que se asocian, se unen, se formulan conjuntamente o se administran conjuntamente con al menos un anticuerpo de la presente invencion. La toxina puede actuar opcionalmente para destruir selectivamente el tejido o la celula patologica. La celula patologica puede ser una celula cancerosa u otra celula. Tales toxinas pueden ser, pero no se limitan a, un fragmento de toxina o toxina recombinante o purificada que comprende al menos un dominio citotoxico funcional de la toxina, por ejemplo, seleccionada de entre al menos una de ricina, toxina de la difteria, una toxina de veneno o una toxina bacteriana. El termino toxina tambien incluye endotoxinas y exotoxinas producidas por cualquier virus o bacteria de origen natural, mutante o recombinante que puedan causar cualquier estado patologico en seres humanos y otros mamfferos, incluido el choque toxico, que puede causar la muerte. Tales toxinas pueden incluir, pero no se limitan a, enterotoxina labil al calor (LT) de E. coli enterotoxigenica, enterotoxina estable al calor (ST), citotoxina de Shigella, enterotoxinas de Aeromonas, toxina-1 del sfndrome de choque toxico (TSST-1), enterotoxina estafilococica A (SEA), B (SEB) o C (SEC), enterotoxinas estreptococicas y similares. Tales bacterias incluyen, pero no se limitan a, cepas de una especie de E. coli enterotoxigenica (ETEC), E. coli enterohemorragica (por ejemplo, cepas del serotipo 0157:H7), especies de Staphylococcus (por ejemplo, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes), especies de Shigella (por ejemplo, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii y Shigella sonnei), especies de Salmonella (por ejemplo, Salmonella typhi, Salmonella cholerae-suis, Salmonella enteritidis), especies de Clostridium (por ejemplo, Clostridium perfringens, Clostridium dificile, Clostridium botulinum), especies de Campylobacter (por ejemplo, Campylobacter jejuni, Campylobacter fetus), especies de Helicobacter (por ejemplo, Helicobacter pylori), especies de Aeromonas (por ejemplo, Aeromonas sobria, Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae), Pleisomonas shigelloides, Yersina enterocolitica, especies de Vibrio (por ejemplo, Vibrio cholerae, Vibrio parahemolyticus), especies de Klebsiella, Pseudomonas aeruginosa y estreptococos. Vease, por ejemplo, Stein, ed.,
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INTERNAL MEDICINE, 3a ed., pags. 1-13, Little, Brown and Co., Boston, (1990), Evans et al., eds., Bacterial Infections of Humans: Epidemiology and Control, 2a. ed., pags. 239-254, Plenum Medical Book Co., Nueva York (1991); Mandell et al., Principles and Practice of Infectious Diseases, 3a ed., Churchill Livingstone, Nueva York (1990); Berkow et al., eds., The Merck Manual, 16a edicion, Merck y Co., Rahway, Nueva Jersey, 1992; Wood et al., FEMS Microbiology Immunology, 76:121-134 (1991); Marrack et al., Science, 248:705-711 (1990).
Las combinaciones, composiciones o compuestos de anticuerpo anti-IL-6 de la presente invencion pueden comprender adicionalmente al menos uno de cualquier auxiliar adecuado, tal como, pero no limitado a, diluyente, aglutinante, estabilizador, tampones, sales, disolventes lipofilos, conservante, adyuvante o similares. Resultan preferentes los auxiliares farmaceuticamente aceptables. Los ejemplos no limitativos y los metodos de preparacion de tales soluciones esteriles son bien conocidos en la tecnica, tales como, pero limitados a, Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edicion, Mack Publishing Co. (Easton, PA) 1990. Pueden seleccionarse de manera rutinaria vehfculos farmaceuticamente aceptables que sean adecuados para el modo de administracion, la solubilidad y/o la estabilidad de la composicion de anticuerpo anti-IL-6, fragmento o variante como es bien conocido en la tecnica o como se describe en el presente documento.
Los excipientes y aditivos farmaceuticos utiles en la presente composicion incluyen, pero no se limitan a protefnas, peptidos, aminoacidos, lfpidos e hidratos de carbono (por ejemplo, azucares, incluidos monosacaridos, di-, tri-, tetra- y oligosacaridos; azucares derivatizados tales como alditoles, acidos aldonicos, azucares esterificados y similares; y polisacaridos o polfmeros de azucar), que pueden estar presentes solos o en combinacion, que comprenden en solitario o en combinacion un 1%-99,99% en peso o volumen. Los excipientes proteicos ejemplares incluyen albumina de suero, tal como albumina de suero humano (HSA), albumina humana recombinante (rHA), gelatina, casefna, y similares. Los componentes representativos de aminoacido/anticuerpo, que tambien pueden actuar en una capacidad de tamponamiento, incluyen alanina, glicina, arginina, betafna, histidina, acido glutamico, acido aspartico, cistefna, lisina, leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilalanina, aspartamo, y similares. Un aminoacido preferente es la glicina.
Los excipientes de hidratos de carbono adecuados para su uso en la invencion incluyen, por ejemplo, monosacaridos tales como fructosa, maltosa, galactosa, glucosa, D-manosa, sorbosa, y similares; disacaridos, tales como lactosa, sacarosa, trehalosa, celobiosa, y similares; polisacaridos, tales como rafinosa, melecitosa, maltodextrinas, dextranos, almidones, y similares; y alditoles, tales como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol sorbitol (glucitol), mioinositol y similares. Los excipientes de hidratos de carbono preferentes para su uso en la presente invencion son manitol, trehalosa y rafinosa.
Las composiciones de anticuerpo anti-IL-6 tambien pueden incluir un tampon o un agente de ajuste del pH; por lo general, el tampon es una sal preparada a partir de un acido o base organica. Los tampones representativos incluyen sales de acidos organicos tales como sales de acido cftrico, acido ascorbico, acido gluconico, acido carbonico, acido tartarico, acido succfnico, acido acetico o acido ftalico; Tris, clorhidrato de trometamina, o tampones de fosfato. Los tampones preferentes para su uso en las presentes composiciones son sales de acidos organicos tales como citrato.
Ademas, las composiciones de anticuerpo anti-IL-6 de la invencion pueden incluir excipientes/aditivos polimericos tales como polivinilpirrolidonas, ficoles (un azucar polimerico), dextratos (por ejemplo, ciclodextrinas, tales como 2-hidroxipropil-p-ciclodextrina), polietilenglicoles, saborizantes, antimicrobianos, edulcorantes, antioxidantes, agentes antiestaticos, tensioactivos (por ejemplo, polisorbatos tales como "TWEEN 20" y "TWEEN 80"), lfpidos (por ejemplo, fosfolfpidos, acidos grasos), esteroides (por ejemplo, colesterol), y quelantes (por ejemplo, EDTA).
Estos y otros aditivos y/o excipientes farmaceuticos conocidos adecuados para su uso en las composiciones de anticuerpo anti-IL-6, porcion o variante, segun la invencion son conocidos en la tecnica, por ejemplo, como se enumera en "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19a ed., Williams & Williams, (1995), y en "Physician's Desk Reference", 52a ed., Medical Economics, MontVale, NJ (1998). Los materiales excipientes o vehfculos preferentes son hidratos de carbono (por ejemplo, sacaridos y alditoles) y tampones (por ejemplo, citrato) o agentes polimericos.
Formulaciones
Como se ha indicado anteriormente, la invencion proporciona formulaciones estables, que son preferentemente un tampon de fosfato con solucion salina o una sal elegida, asf como formulaciones y soluciones conservadas que contienen un conservante asf como formulaciones conservadas multiuso adecuadas para uso farmaceutico o veterinario, que comprenden al menos un anticuerpo anti-IL-6 en una formulacion farmaceuticamente aceptable. Las formulaciones conservadas contienen al menos un conservante conocido u opcionalmente seleccionado del grupo que consiste en al menos un fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bencflico, nitrito fenilmercurico, fenoxietanol, formaldehfdo, clorobutanol, cloruro de magnesio (por ejemplo, hexahidrato), alquilparabeno (metilo, etilo, propilo, butilo y similares), cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio,
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deshidroacetato de sodio y timerosal, o mezclas de los mismos en un diluyente acuoso. Puede utilizarse cualquier mezcla o concentracion adecuada como se conoce en la tecnica, tal como 0,001%-5%, o cualquier intervalo o valor en el mismo, tal como, pero no limitado a 0,001; 0,003; 0,005; 0,009; 0,01; 0,02; 0,03; 0,05; 0,09; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4,; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0; 1,1; 1,2; 1,3; 1,4; 1,5; 1,6; 1,7; 1,8; 1,9; 2,0; 2,1; 2,2; 2,3; 2,4; 2,5; 2,6; 2,7; 2,8; 2,9; 3,0; 3,1; 3,2; 3,3; 3,4; 3,5; 3,6; 3,7; 3,8; 3,9; 4,0; 4,3; 4,5; 4,6; 4,7; 4,8; 4,9, o cualquier intervalo o valor en el mismo. Los ejemplos no limitativos incluyen, sin conservante, m-cresol al 0,1%-2% (por ejemplo, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,9%, 1,0%), alcohol bencflico al 0,1%-3% (por ejemplo, 0,5%, 0,9%, 1,1,%, 1,5%, 1,9%, 2,0%, 2,5%), timerosal al 0,001%-0,5% (por ejemplo, 0,005%, 0,01%), fenol al 0,001%-2,0% (por ejemplo, 0,05%, 0,25%, 0,28%, 0,5%, 0,9%, 1,0%), alquilparabeno(s) al 0,0005%-1,0% (por ejemplo, 0,00075%, 0,0009%, 0,001%, 0,002%, 0,005%, 0,0075%, 0,009%, 0,01%, 0,02%, 0,05%, 0,075%, 0,09%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,5%, 0,75%, 0,9%, 1,0%), y similares.
Como se ha indicado anteriormente, la invencion proporciona un artfculo de fabricacion, que comprende material de envasado y al menos un vial que comprende una solucion de al menos un anticuerpo anti-IL-6 con los conservantes y/o tampones prescritos, opcionalmente en un diluyente acuoso, en el que dicho material de envasado comprende una etiqueta que indica que tal solucion puede mantenerse durante un perfodo de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 horas o superior. La invencion comprende adicionalmente un artfculo de fabricacion, que comprende material de envasado, un primer vial que comprende, liofilizado, al menos un anticuerpo anti-IL-6, y un segundo vial que comprende un diluyente acuoso de tampon o conservante prescrito, en el que dicho material de envasado comprende una etiqueta que indica a un paciente como reconstituir el al menos un anticuerpo anti-IL-6 en el diluyente acuoso para formar una solucion que puede mantenerse durante un perfodo de veinticuatro horas o mas.
El al menos un anticuerpo anti-IL-6 utilizado segun la presente invencion puede producirse por medios recombinantes, incluidos a partir de celulas de mamffero o preparaciones transgenicas, o puede purificarse a partir de otras fuentes biologicas, como se describe en el presente documento o como se conoce en la tecnica.
El intervalo de al menos un anticuerpo anti-IL-6 en el producto de la presente invencion incluye cantidades que producen tras la reconstitucion, si se encuentran en un sistema humedo/seco, concentraciones de aproximadamente 1,0 pg/ml a aproximadamente 1.000 mg/ml, aunque son posibles concentraciones inferiores y superiores y dependen del vehfculo de administracion previsto, por ejemplo, las formulaciones en solucion diferiran de los metodos por microbomba o bomba osmotica, o por via pulmonar, por via transmucosa o por parche transdermico.
Preferentemente, el diluyente acuoso comprende adicionalmente de manera opcional un conservante farmaceuticamente aceptable. Los conservantes preferentes incluyen los seleccionados del grupo que consiste en fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bencflico, alquilparabeno (metilo, etilo, propilo, butilo y similares), cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, deshidroacetato de sodio y timerosal, o mezclas de los mismos. La concentracion de conservante utilizado en la formulacion es una concentracion suficiente para producir un efecto antimicrobiano. Tales concentraciones dependen del conservante seleccionado y son determinados facilmente por el experto en la materia.
Pueden anadirse opcional y preferentemente al diluyente otros excipientes, por ejemplo, agentes isotonicos, tampones, antioxidantes, potenciadores de conservantes. Comunmente se utiliza un agente de isotonicidad, tal como glicerina, a concentraciones conocidas. Se anade preferentemente un tampon fisiologicamente tolerado para proporcionar un mejor control del pH. Las formulaciones pueden cubrir un amplio intervalo de pH, tal como de aproximadamente pH 4 a aproximadamente pH 10, e intervalos preferentes de aproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 9, y el intervalo mas preferente de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 8,0. Preferentemente, las formulaciones de la presente invencion tienen un pH entre aproximadamente 6,8 y aproximadamente 7,8. Los tampones preferentes incluyen tampones de fosfato, lo mas preferentemente fosfato de sodio, especialmente solucion salina tamponada con fosfato (PBS).
Para reducir la agregacion, pueden anadirse opcionalmente a las formulaciones o composiciones otros aditivos, tales como solubilizantes farmaceuticamente aceptables como Tween 20 (polioxietileno (20) monolaurato de sorbitan), Tween 40 (polioxietileno (20) monopalmitato de sorbitan), Tween 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitan), Pluronic F68 (copolfmeros de bloque de polioxietileno polioxipropileno), y PEG (polietilenglicol) o tensioactivos no ionicos tales como polisorbato 20 u 80 o poloxamero 184 o 188, polioles de Pluronic®, otros copolfmeros de bloque y quelantes tales como EDTA y EGTA. Estos aditivos son especialmente utiles si para administrar la formulacion se utiliza una bomba o recipiente de plastico. La presencia de un tensioactivo farmaceuticamente aceptable mitiga la propension de la protefna a agregarse.
Las formulaciones de la presente invencion pueden prepararse mediante un proceso que comprende mezclar al menos un anticuerpo anti-IL-6 y un conservante seleccionado del grupo que consiste en fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bencflico, alquilparabeno (metilo, etilo, propilo, butilo y similares), cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, deshidroacetato de sodio y timerosal o mezclas de los mismos en un diluyente acuoso. La mezcla del al menos un anticuerpo anti-IL-6 y conservante en un diluyente acuoso se lleva a cabo
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utilizando procedimientos de disolucion y mezclado convencionales. Para preparar una formulacion adecuada, por ejemplo, se combina una cantidad medida de al menos un anticuerpo anti-IL-6 en solucion tamponada con el conservante deseado en una solucion tamponada en cantidades suficientes para proporcionar la protefna y el conservante a las concentraciones deseadas. Un experto habitual en la tecnica reconocera las variaciones de este proceso. Por ejemplo, el orden en el que se anaden los componentes, si se utilizan aditivos adicionales, la temperatura y el pH a los que se prepara la formulacion, son factores que pueden optimizarse para la concentracion y los medios de administracion utilizados.
Las formulaciones reivindicadas pueden proporcionarse a pacientes como soluciones transparentes o como viales dobles que comprenden un vial de liofilizado de al menos un anticuerpo anti-IL-6 que se reconstituye con un segundo vial que contiene agua, un conservante y/o excipientes, preferentemente un tampon de fosfato y/o solucion salina y una sal elegida, en un diluyente acuoso. El vial de solucion individual o el vial doble que requiere la reconstitucion pueden reutilizarse multiples veces y pueden ser suficientes para un solo ciclo o multiples ciclos de tratamiento del paciente y por lo tanto pueden proporcionan un regimen de tratamiento mas conveniente que el disponible actualmente.
Los artfculos de fabricacion reivindicados en el presente documento son utiles para la administracion durante un perfodo comprendido entre el uso inmediato y las veinticuatro horas o mas. Por consiguiente, los artfculos de fabricacion reivindicados en el presente documento ofrecen ventajas significativas para el paciente. Las formulaciones de la invencion pueden almacenarse opcionalmente de forma segura a temperaturas de aproximadamente 2°C a aproximadamente 40°C y conservar la actividad biologica de la protefna durante periodos de tiempo prolongados, permitiendo por tanto una etiqueta en el paquete que indique que la solucion puede mantenerse y/o utilizarse durante un periodo de 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 o 96 horas o mas. Si se utiliza un diluyente conservado, tal etiqueta puede incluir el uso hasta 1-12 meses, medio ano, un ano y medio y/o dos anos.
Las soluciones de al menos un anticuerpo anti-IL-6 de la invencion pueden prepararse mediante un proceso que comprende mezclar al menos un anticuerpo en un diluyente acuoso. La mezcla se realiza utilizando procedimientos de disolucion y mezcla convencionales. Para preparar un diluyente adecuado, por ejemplo, se combina una cantidad medida de al menos un anticuerpo en agua o tampon en cantidades suficientes para proporcionar la protefna y opcionalmente un conservante o tampon a las concentraciones deseadas. Un experto habitual en la tecnica reconocera las variaciones de este proceso. Por ejemplo, el orden en el que se anaden los componentes, si se utilizan aditivos adicionales, la temperatura y el pH a los que se prepara la formulacion, son factores que pueden optimizarse para la concentracion y los medios de administracion utilizados.
Los productos reivindicados pueden proporcionarse a los pacientes como soluciones transparentes o como viales dobles que comprenden un vial de liofilizado de al menos un anticuerpo anti-IL-6 que se reconstituye con un segundo vial que contiene el diluyente acuoso. El vial de solucion individual o el vial doble que requiere reconstitucion pueden reutilizarse multiples veces y pueden ser suficientes para un solo ciclo o multiples ciclos de tratamiento del paciente y por lo tanto proporcionan un regimen de tratamiento mas conveniente que el disponible actualmente.
Los productos reivindicados pueden proporcionarse indirectamente a los pacientes proporcionando a las farmacias, clfnicas u otras instituciones e instalaciones de este tipo, soluciones transparentes o viales dobles que comprenden un vial de liofilizado de al menos un anticuerpo anti-IL-6 que se reconstituye con un segundo vial que contiene el diluyente acuoso. La solucion transparente en este caso puede ser de hasta un litro o incluso de mayor tamano, proporcionando un deposito grande desde el cual puedan recuperarse, una o multiples veces, porciones mas pequenas de la al menos una solucion de anticuerpo para transferirse a viales mas pequenos y ser proporcionada por la farmacia o la clfnica a sus clientes y/o pacientes.
Los dispositivos reconocidos que comprenden estos sistemas de viales individuales incluyen los dispositivos de inyector de pluma para la administracion de una solucion tal como los BD Pen, BD Autojector®, Humaject®, NovoPen®, B-D®Pen, Autopen® y OptiPen®, GenotropinPen®, Genotronorm Pen®, Humatro Pen®, RecoPen®, Roferon Pen®, Biojector®, iject®, J-tip Needle-Free Injector®, Intraject®, Medi-Ject®, por ejemplo, como los fabricados o desarrollados por Becton Dickensen (Franklin Lakes, NJ,
www.bectondickenson.com), Disetronic (Burgdorf, Suiza,
www.disetronic.com; Bioject, Portland, Oregon (
www.bioject.com); National Medical Products, Weston Medical (Peterborough, Reino Unido,
www.weston-medical.com), Medi-Ject Corp (Minneapolis, MN,
www.mediject.com). Los dispositivos reconocidos que comprenden un sistema de vial doble incluyen los sistemas de inyector de pluma para reconstituir un farmaco liofilizado en un cartucho para la administracion de la solucion reconstituida, tales como la HumatroPen®.
Los productos reivindicados en el presente documento incluyen material de envasado. El material de envasado ofrece, ademas de la informacion requerida por los organismos reguladores, las condiciones en las que puede utilizarse el producto. El material de envasado de la presente invencion proporciona instrucciones al paciente para reconstituir el al menos un anticuerpo anti-IL-6 en el diluyente acuoso para formar una solucion y para utilizar la solucion durante un perfodo de 2-24 horas o mas para el producto humedo/seco de dos viales. Para el producto en
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solucion de un solo vial, la etiqueta indica que tal solucion puede utilizarse durante un periodo de 2-24 horas o mas. Los productos reivindicados en el presente documento son utiles para el uso del producto farmaceutico en seres humanos.
Las formulaciones de la presente invencion pueden prepararse mediante un proceso que comprende mezclar al menos un anticuerpo anti-IL-6 y un tampon seleccionado, preferentemente un tampon de fosfato que contiene solucion salina o una sal elegida. La mezcla del al menos un anticuerpo y un tampon en un diluyente acuoso se lleva a cabo utilizando procedimientos de disolucion y mezcla convencionales. Para preparar una formulacion adecuada, por ejemplo, se combina una cantidad medida de al menos un anticuerpo en agua o tampon con el agente de tamponamiento deseado en agua en cantidades suficientes para proporcionar la protefna y el tampon a las concentraciones deseadas. Un experto habitual en la tecnica reconocera las variaciones de este proceso. Por ejemplo, el orden en el que se anaden los componentes, si se utilizan aditivos adicionales, la temperatura y el pH a los que se prepara la formulacion, son factores que pueden optimizarse para la concentracion y los medios de administracion utilizados.
Las formulaciones estables o conservadas reivindicadas pueden proporcionarse a los pacientes como soluciones transparentes o como viales dobles que comprenden un vial de liofilizado de al menos un anticuerpo anti-IL-6 que se reconstituye con un segundo vial que contiene un conservante o tampon y excipientes en un diluyente acuoso. El vial de solucion individual o el vial doble que requiere reconstitucion pueden reutilizarse multiples veces y pueden ser suficientes para un solo ciclo o multiples ciclos de tratamiento del paciente y por lo tanto proporcionan un regimen de tratamiento mas conveniente que el disponible actualmente.
Puede administrarse a un paciente al menos un anticuerpo anti-IL-6, en las soluciones o formulaciones estables o conservadas descritas en el presente documento, por medio de diversos metodos de administracion, incluidos la inyeccion SC o IM; por via transdermica, pulmonar, transmucosa, por implante, bomba osmotica, cartucho, microbomba u otros medios que el experto en la materia entiende y como es bien conocido en la tecnica.
Aplicaciones Terapeuticas
La IL-6, debido a su actividad pleiotropica, esta implicada en la patologfa de diversas enfermedades. Por lo tanto, resultana deseable utilizar un anticuerpo hfbrido o humano contra la IL-6 neutralizante de alta afinidad, en enfermedades relacionadas con la IL-6 tales como el cancer, la caquexia, el lupus eritematoso sistemico, la artritis reumatoide, la osteoporosis, el traumatismo cerebral, el edema cerebral, la depresion y la insuficiencia cardiaca congestiva. Puede utilizarse cCLB8 o cualquier derivado de este mAb incluidos los hfbridos o humanizados, o fragmentos, para aliviar el dolor de huesos, inhibir el crecimiento de tumores tales como renal, de prostata, de mama, de pulmon, el cancer de colon, el melanoma y el mieloma multiple, los trastornos linfoproliferativos y otras enfermedades en las que se ha implicado la IL-6. Este anticuerpo puede utilizarse como agente unico o en combinacion con otros agentes terapeuticos. Ademas, este Mab puede utilizarse como quimiosensibilizador, por lo cual puede aumentar la eficacia terapeutica de los agentes citotoxicos. Este anticuerpo puede utilizarse como radiosensibilizador, por lo cual puede mejorar la eficacia de la radiacion. Tambien puede utilizarse en combinacion con otros inmunomoduladores tumorales tales como IL-2, IL-12 y/o IFN alfa.
Por lo tanto, la presente invencion tambien proporciona un metodo para modular o tratar al menos una enfermedad relacionada con IL-6 en una celula, tejido, organo, animal o paciente, como se conoce en la tecnica o como se describe en el presente documento, utilizando al menos un anticuerpo anti-IL-6 de la presente invencion.
Se sabe que la IL-6 aumenta la proliferacion, la diferenciacion y la supervivencia de las celulas plasmaticas malignas en el mieloma multiple (MM) a traves de un mecanismo autocrino o paracrino que implica la inhibicion de la apoptosis de las celulas malignas. El MM es un trastorno maligno incurable de las celulas plasmaticas, en el que se ha postulado que el bloqueo de la IL-6 es un tratamiento eficaz (Anderson et al., Multiple Myeloma: New Insights and Therapeutic Approaches. Hematology: 147-165, 2000). La IL-6 tambien tiene un efecto tumorigenico en el carcinoma de celulas basales en el que las celulas transfectadas con IL-6 mostraron una mayor velocidad de crecimiento del tumor por supresion de la apoptosis y la promocion promoviendo activamente (Jee et al., Overexpression of interleukin-6 in human basal cell carcinoma cell lines increases anti-apoptotic activity and tumorigenic potency. Oncogene, vol. 20, N° 2 pags. 198-208, 2001). La IL-6 tambien puede promover la resistencia de las celulas de cancer de mama frente a la quimioterapia mediante la induccion de la expresion del gen mdr1 (vfas de la metalotionefna y mdr1) (Conze et al., Autocrine Production of Interleukin 6 Causes Multidrug Resistance in Breast Cancer Cells. Cancer Res 61: 8851-8858, 2001).
La capacidad de la IL-6 para intervenir en la supervivencia de las celulas tumorales y la evolucion de la enfermedad fue confirmada por los efectos inhibidores de un mAb anti-IL-6 sobre el crecimiento del tumor tanto in vitro como in vivo. Se informo que el bloqueo de la IL-6 puede inhibir el crecimiento de tumores cerebrales humanos (glioblastoma) in vitro (Goswami et al., Interleukin-6-mediated autocrine growth promotion in human glioblastoma multiforme cell line U87MG. J Neurochem 71: 1837-1845, 1998). Utilizando el mismo enfoque, se demostro que la inyeccion del anticuerpo anti-IL-6 CLB8 murino prolongaba la supervivencia de ratones portadores de tumores
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humanos (Mauray et al., Epstein-Barr virus-dependent lymphoproliferative disease: critical role of IL-6. Eur J Immunol; 30(7):2065-73, 2000). Tambien se informo que el anticuerpo anti-IL-6 mCLB8 inducfa la regresion del crecimiento de tumores de carcinoma renal humano y disminufa las concentraciones de calcio en suero en ratones desnudos (Weisglass et al., The role of interleukin-6 in the induction of hypercalcemia in renal cell carcinoma transplanted into nude mice. Endocrinology 138(5):1879-8,1995). El anticuerpo CLB-8 tambien inducfa la regresion de xenoinjertos de tumor de prostata humano resistente a hormonas establecido, en ratones (Smith et al. 2001). El anticuerpo monoclonal anti-interleucina-6 induce la regresion de xenoinjertos de cancer de prostata humano en ratones desnudos (Smith y Keller, Prostate; 48(1):47-53).
La IL-6 tambien puede ser un factor pronostico y un marcador de tumores malignos. En el carcinoma de celulas renales (CCR) se informo que los niveles elevados de IL-6 se correlacionaban con la metastasis tumoral y finalmente con un mal pronostico y una baja supervivencia (Jean-Yves Blay et al. 1992). Ademas, en el CCR, los niveles sericos elevados de IL-6 se asocian con una pobre respuesta al tratamiento con IL-2 (Fumagalli et al. 1999. Pretreatment serum markers and lymphocyte response to interleukin-2 therapy. Br J Cancer 80(3-4):407-11) y se correlacionaban con el grado de toxicidad asociada a IL-2 (Capuron et al. 2001. Association between immune activation and early depressive symptoms in cancer patients treated with interleukin-2-based therapy. Psychoneuroendocrinology; 26(8):797-808).
Los niveles elevados de IL-6 tambien se correlacionan con un mal pronostico y presencia de enfermedad metastasica en el cancer de mama (Kurebayashi 2000 y Benoy 2002. Regulation of interleukin-6 secretion from breast cancer cells and its clinical implications. Breast Cancer; 7(2):124-9. Serum interleukin 6, plasma VEGF, serum VEGF, and VEGF platelet load in breast cancer patients. Clin Breast Cancer; 2(4):311-5).
Existe la hipotesis de que la IL-6 es un factor causante de la morbilidad asociada a cancer, tal como la astenia/caquexia y la resorcion osea. Se descubrio que la caquexia (Cahlin et al. 2000) y la resorcion osea (posterior hipercalcemia) (Sandhu et al. 1999) inducidas por el tumor estaban disminuidas en ratones knockout para IL-6. La depresion asociada al cancer, y el edema cerebral como consecuencia de tumores cerebrales tambien se ha asociado con niveles elevados de IL-6 (Musselman et al. 2001). El anti-anticuerpo anti-IL-6 cCLB8 de la invencion tambien inhibfa la caquexia inducida por melanoma humano y carcinoma de prostata humano en ratones desnudos.
Experiencia cifnica con agentes anti-IL-6
Se han llevado a cabo varios ensayos clfnicos que utilizan anticuerpos monoclonales contra la IL-6 en multiples enfermedades como la leucemia de celulas plasmaticas, el mieloma multiple, el trastorno proliferativo de los linfocitos B, la artritis reumatoide, el carcinoma renal y el linfoma asociado al SIDA.
Un estudio de Fase I de aumento escalonado de la dosis con el anticuerpo cCLB-8 anti-IL-6 de la presente invencion para el tratamiento de pacientes resistentes con mieloma multiple en estadio avanzado (N=12), demostro que algunos pacientes presentaban estabilizacion de la enfermedad. Despues de la interrupcion del tratamiento hubo una aceleracion en el aumento de los niveles de protefna M, lo que sugerfa un rebrote de la enfermedad despues de la retirada del tratamiento. El anticuerpo cCLB-8 anti-IL-6 inhibe la libre circulacion de IL-6. Lo que es mas importante, no se observo toxicidad (excepto trombocitopenia transitoria en dos pacientes con tratamiento previo intenso) ni reacciones alergicas. La protefna C-reactiva (CRP) se redujo por debajo del nivel de deteccion en todos los pacientes. El anticuerpo cCLB-8 anti-IL-6 demostro una larga semivida en circulacion de 17,8 dfas, y no se observo ninguna respuesta inmunitaria de anticuerpos anti-hfbridos humanos (HACA) (van Zaanen et al. 1998). La administracion de cNtO 328 no provoco cambios en la presion sangufnea, el pulso, la temperatura, la hemoglobina, las funciones del hfgado y las funciones renales. Excepto por la trombocitopenia transitoria en dos pacientes con tratamiento previo intenso, no se observaron reacciones alergicas o de toxicidad, y no se observo respuesta inmunitaria de anticuerpos anti-hfbridos humanos (HACA). Tres pacientes desarrollaron complicaciones relacionadas con la infeccion durante el tratamiento, sin embargo, era poco probable una posible relacion con el anticuerpo cCLB-8 anti-IL-6 debido a que las complicaciones infecciosas son comunes en el mieloma multiple en fase terminal y son una causa importante de muerte. Ademas, los tres pacientes fueron capaces de responder a la infeccion incluso en presencia de anticuerpo cCLB-8 anti-IL-6, lo que sugiere que la terapia anti-IL-6 no es capaz de bloquear la IL-6 durante la infeccion. No se registraron muertes asociadas al tratamiento. En conclusion, los resultados de este estudio sugieren que el anticuerpo cCLB-8 anti-IL-6 era seguro en pacientes con mieloma multiple.
Por lo tanto, en el presente documento se describe un metodo para modular o tratar al menos una enfermedad maligna en una celula, tejido, organo, animal o paciente, incluidas, pero no limitadas a, al menos una de entre: mieloma multiple, leucemia, leucemia aguda, leucemia linfoblastica aguda (LLA), LLA de linfocitos B, linfocitos T o FAB, leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia mielocftica cronica (LMC), leucemia linfocftica cronica (LLC), leucemia de celulas pilosas, sfndrome mielodisplasico (SMD), un linfoma, enfermedad de Hodgkin, un linfoma maligno, linfoma no-Hodgkin, linfoma de Burkitt, sarcoma de Kaposi, carcinoma colorrectal, carcinoma de celulas renales, carcinoma pancreatico, carcinoma prostatico, carcinoma nasofarfngeo, histiocitosis maligna, sfndrome paraneoplasico/hipercalcemia por malignidad, tumores solidos, adenocarcinomas, sarcomas, melanoma maligno, hemangioma, enfermedad metastasica, resorcion osea asociada a cancer, dolor oseo asociado a cancer; la
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supresion de metastasis cancerosas; la mejora de la caquexia por cancer; y el tratamiento de enfermedades inflamatorias tal como la glomerulonefritis proliferativa mesangial y similares. Opcionalmente puede utilizarse un metodo de este tipo en combinacion con, mediante la administracion antes, al mismo tiempo o despues de la administracion de tal anticuerpo para IL-6, radioterapia, un antiangiogenico, un agente quimioterapeutico, un inhibidor de transferasa de farnesilo o similares.
En el presente documento tambien se describe un metodo para modular o tratar al menos una enfermedad relacionada con la inmunidad mediada por IL-6, en una celula, tejido, organo, animal o paciente, incluidas, pero no limitadas a, al menos una de entre artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis reumatoide juvenil sistemica, artritis psoriasica, espondilitis anquilosante, ulcera gastrica, artropatfas seronegativas, artrosis, enfermedad inflamatoria intestinal, colitis ulcerosa, lupus eritematoso sistemico, sfndrome antifosfolfpido, iridociclitis/uveftis/neuritis optica, fibrosis pulmonar idiopatica, vasculitis sistemica/granulomatosis de Wegener, sarcoidosis, orquitis/procedimientos de reversion de la vasectomfa, enfermedades alergicas/atopicas, asma, rinitis alergica, eczema, dermatitis alergica de contacto, conjuntivitis alergica, neumonitis por hipersensibilidad, trasplantes, rechazo de organos trasplantados, enfermedad de injerto contra hospedador, sfndrome de respuesta inflamatoria sistemica, sfndrome septico, sepsis por gram positivos, sepsis por gram negativos, sepsis con cultivo negativo, sepsis fungica, fiebre neutropenica, urosepsis, meningococcemia, traumatismo/hemorragia, quemaduras, exposicion a radiacion ionizante, pancreatitis aguda, sfndrome de dificultad respiratoria del adulto, hepatitis alcoholica, patologfas inflamatorias cronicas, sarcoidosis, patologfa de Crohn, anemia de celulas falciformes, diabetes, nefrosis, enfermedades atopicas, reacciones de hipersensibilidad, rinitis alergica, fiebre del heno, rinitis perenne, conjuntivitis, endometriosis, asma, urticaria, anafilaxis sistemica, dermatitis, anemia perniciosa, enfermedad hemolftica, trombocitopenia, rechazo de injerto de cualquier organo o tejido rechazo de trasplante de rinon, rechazo de trasplante de corazon, rechazo de trasplante de hfgado, rechazo de trasplante de pancreas, rechazo de trasplante de pulmon, rechazo de trasplante de medula osea (BMT), rechazo de aloinjerto de piel, rechazo de trasplante de cartflago, rechazo de injerto de hueso, rechazo de trasplante de intestino delgado, rechazo de implante de timo fetal, rechazo de trasplante de paratiroides, rechazo de xenoinjerto de cualquier organo o tejido, rechazo de aloinjerto, reacciones de hipersibilidad antirreceptor, enfermedad de Graves, enfermedad de Raynoud, diabetes de tipo B insulinorresistente, miastenia grave, citotoxicidad mediada por anticuerpos, reacciones de hipersensibilidad de tipo III, lupus eritematoso sistemico, sfndrome POEMS (sfndrome de polineuropatfa, organomegalia, endocrinopatfa, gammapatfa monoclonal y de cambios en la piel), polineuropatfa, organomegalia, endocrinopatfa, gammapatfa monoclonal, sfndrome de cambios en la piel, sfndrome antifosfolipfdico, penfigo, esclerodermia, enfermedad mixta del tejido conectivo, enfermedad idiopatica de Addison, diabetes mellitus, hepatitis activa cronica, cirrosis biliar primaria, vitiligo, vasculitis, sfndrome de cardiotomfa post-IM, hipersensibilidad de tipo IV, dermatitis de contacto, neumonitis por hipersensibilidad, granulomas debidos a organismos intracelulares, sensibilidad a farmacos, metabolico/idiopatico, enfermedad de Wilson, hemocromatosis, deficiencia de alfa-1-antitripsina, retinopatfa diabetica, tiroiditis de Hashimoto, osteoporosis, evaluacion del eje hipotalamico-pituitario-adrenal, cirrosis biliar primaria, tiroiditis, encefalomielitis, caquexia, fibrosis qufstica, enfermedad pulmonar cronica neonatal, enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC), linfohistiocitosis hematofagocftica familiar, afecciones dermatologicas, psoriasis, alopecia, sfndrome nefrotico, nefritis, nefritis glomerular, insuficiencia renal aguda, hemodialisis, uremia, toxicidad, preeclampsia, tratamiento con okt3, terapia anti-CD3, tratamiento con citocinas, quimioterapia, radioterapia (por ejemplo, incluida pero no limitada a, astenia, anemia, caquexia, y similares), intoxicacion cronica por salicilatos, apnea del sueno, obesidad, insuficiencia cardfaca, sinusitis, enfermedad inflamatoria intestinal, y similares. Vease, por ejemplo, Merck Manual, 12a y 17a ediciones, Merck & Company, Rahway, NJ (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), Pharmacotherapy Handbook, Wells et al., Eds., 2a edicion, Appleton y Lange, Stamford, Conn. (1998, 2000).
En el presente documento tambien se describe un metodo para modular o tratar al menos una enfermedad infecciosa en una celula, tejido, organo, animal o paciente, incluida, pero no limitada a, al menos una de entre: infeccion bacteriana aguda o cronica, procesos infecciosos o parasitarios agudos y cronicos, incluidos infecciones bacterianas, vfricas y fungicas, infeccion por VIH/neuropatfa, meningitis, hepatitis (A, B o C, o similares) por VIH, artritis septica, peritonitis, neumonfa, epiglotitis, E. coli 0157:H7, sfndrome uremico hemolftico/purpura trombocitopenica trombolftica, malaria, fiebre hemorragica del dengue, leishmaniasis, lepra, sfndrome de choque toxico, miositis estreptococica, gangrena gaseosa, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium intracellulare, neumonfa por Pneumocystis carinii, enfermedad inflamatoria pelvica, orquitis/epididimitis, legionela, enfermedad de Lyme, gripe A, virus de Epstein-Barr, sfndrome hemofagocftico asociado a virus, encefalitis viral/meningitis aseptica, y similares.
Cualquiera de tales metodos puede comprender opcionalmente administrar una cantidad eficaz de al menos una composicion o composicion farmaceutica que comprenda al menos un anticuerpo anti-IL-6 a una celula, tejido, organo, animal o paciente que necesite tal modulacion, tratamiento o terapia. Las indicaciones para el tratamiento con la terapia anti-IL-6 se describen en las siguientes referencias. Van Snick, "Interleukin-6: An Overview", Ann. Rev. Immunol., 8:253-278 (1990); Campbell et al., "Essential Role for Interferon-gamma. And Interleukin-6 in Autoimmune Insulin-Dependent Diabetes in NOD/Wehi Mice", J. Clin. Invest., 87:739-742 (1991); Heinrich et al., "Interleukin-6 Monoclonal Antibody Therapy for a Patient with Plasma Cell Leukemia", Blood, 78(5):1198-1204 (1991); Starnes et al., "Anti-IL-6 Monoclonal Antibodies Protect Against Lethal Escherichia coli Infection and Lethal Tumor Necrosis Factor-alpha. Challenge in Mice", J. Immunol., 145(12):4185-4191 (1990);
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Strassman et al., "Evidence for the Involvement of Interleukin 6 in Experimental Cancer Cachexia", J. Clin. Invest., 89:1681-1684 (1992).
Cualquier metodo descrito en el presente documento puede comprender la administracion de una cantidad eficaz de una composicion o composicion farmaceutica que comprenda al menos un anticuerpo anti-IL-6 a una celula, tejido, organo, animal o paciente que necesite tal modulacion, tratamiento o terapia. Un metodo de este tipo puede comprender adicionalmente de manera opcional la co-administracion o la terapia de combinacion para tratar tales enfermedades inmunitarias o enfermedades malignas, en el que la administracion de dicho al menos un anticuerpo anti-IL-6, porcion especificada o variante del mismo, comprende adicionalmente administrar, antes, al mismo tiempo, y/o despues, al menos uno seleccionado de entre al menos un antagonista de TNF (por ejemplo, pero no limitado a un anticuerpo o fragmento contra TNF, un fragmento o receptor de TNF soluble, protefnas de fusion de los mismos, o un antagonista de TNF de molecula pequena), un fragmento o anticuerpo para IL-18, un antagonista de IL-18 de molecula pequena o una protefna de union al receptor de IL-18, un fragmento o anticuerpo para IL-1 (incluidas IL-1 alfa e IL-1 beta), un antagonista del receptor de IL-1 soluble, un antirreumatico (por ejemplo, metotrexato, auranofina, aurotioglucosa, azatioprina, etanercept, tiomalato de oro sodio, sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida, sulfasalazina, radioterapia, un antiangiogenico, un agente quimioterapeutico, talidomida, un relajante muscular, un narcotico, un farmaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE), un analgesico, un anestesico, un sedante, un anestesico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano (por ejemplo, aminoglucosido, un antifungico, un antiparasitario, un antiviral, un carbapenem, cefalosporina, una flurorquinolona, un macrolido, una penicilina, una sulfonamida, una tetraciclina, otro antimicrobiano), un antipsoriasico, un corticosteroide, un esteroide anabolico, un agente relacionado con la diabetes, un mineral, un producto nutricional, un agente tiroideo, una vitamina, una hormona relacionada con calcio, un epoetina (por ejemplo, epoetina alfa), un filgrastim (por ejemplo, G-CSF, Neupogen), un sargramostim (GM-CSF, Leukine), una vacunacion, una inmunoglobulina, un inmunosupresor (por ejemplo, basiliximab, ciclosporina, daclizumab), una hormona de crecimiento, un farmaco de reemplazo hormonal, un modulador del receptor de estrogenos, un midriatico, un cicloplejico, un agente alquilante, un antimetabolito, un antimitotico, un radiofarmaco, un antidepresivo, un antimanfaco, un antipsicotico, un ansiolftico, un hipnotico, un simpaticomimetico, un estimulante, donepezilo, tacrina, un medicamento para el asma, un beta agonista, un esteroide inhalado, un inhibidor de leucotrienos, una metilxantina, una cromolina, una epinefrina o analogo, dornasa alfa (Pulmozyme), una citocina o un antagonista de citocinas. Las dosis adecuadas son bien conocidas en la tecnica. Vease, por ejemplo, Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2a edicion, Appleton y Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000).
Los antagonistas de TNF adecuados para las composiciones, la terapia de combinacion, la co-administracion, y/o los dispositivos de la presente invencion (que comprenden adicionalmente al menos un anticuerpo, porcion especificada y variante del mismo, de la presente invencion), incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos anti-TNF, fragmentos de union al antfgeno de los mismos, y moleculas receptoras que se unen especfficamente a TNF; compuestos que previenen y/o inhiben la sfntesis de TNF, la liberacion de TNF o su accion sobre las celulas diana, tales como talidomida, tenidap, inhibidores de la fosfodiesterasa (por ejemplo, pentoxifilina y rolipram), agonistas del receptor de adenosina A2b y potenciadores del receptor de adenosina A2b; compuestos que previenen y/o inhiben la senalizacion de receptor de TNF, tales como los inhibidores de protefnas quinasa activadas por mitogeno (MAP); compuestos que bloquean y/o inhiben la escision de TNF de membrana, tales como inhibidores de metaloproteinasas; compuestos que bloquean y/o inhiben la actividad de TNF, tales como la enzima convertidora de la angiotensina (ACE) (por ejemplo, captopril); y compuestos que bloquean y/o inhiben la produccion de TNF y/o la sfntesis, tales como inhibidores de MAP quinasas.
Tratamientos terapeuticos.
Cualquier metodo descrito en el presente documento puede comprender un metodo para tratar un trastorno mediado por iL-6, que comprende administrar una cantidad eficaz de una composicion o composicion farmaceutica que comprenda al menos un anticuerpo anti-IL-6 a una celula, tejido, organo, animal o paciente que necesite tal modulacion, tratamiento o terapia. Un metodo de este tipo puede comprender adicionalmente de manera opcional la co-administracion o terapia de combinacion para el tratamiento de tales enfermedades inmunitarias, en el que la administracion de dicho al menos un anticuerpo anti-IL-6, porcion especificada o variante del mismo, comprende adicionalmente administrar, antes, al mismo tiempo y/o despues, al menos un agente como se ha descrito anteriormente.
Por lo general, el tratamiento de los estados patologicos se efectua administrando una cantidad o dosis eficaz de al menos una composicion de un anticuerpo anti-IL-6 que suma, en promedio, un intervalo de al menos aproximadamente 0,01 a 500 miligramos de al menos un anticuerpo anti-IL-6 por kilogramo de peso del paciente por dosis, y preferentemente de al menos aproximadamente 0,1 a 100 miligramos de anticuerpo/kilogramo de peso del paciente por administracion unica o multiple, dependiendo de la actividad especffica de contenido en la composicion. Como alternativa, la concentracion serica eficaz puede comprender 0,1 pg/ml-5.000 pg/ml de concentracion serica por administracion simple o multiple. Los medicos conocen las dosis adecuadas y, por supuesto, dependeran de la patologfa concreta, la actividad especffica de la composicion que se administra y el paciente concreto sometido a
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tratamiento. En algunos casos, para alcanzar la cantidad terapeutica deseada, puede ser necesario proporcionar una administracion repetida, es decir, administraciones individuales repetidas de una dosis medida o supervisada concreta, en la que se repitan las administraciones individuales hasta que se logre el efecto o la dosis diaria deseada.
Las dosis preferentes pueden incluir opcionalmente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38,
39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 y/o
100-500 mg/kg/administracion, o cualquier intervalo, valor o fraccion de los mismos, o para lograr una concentracion serica de 0,1, 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5, 2,9, 3,0, 3,5, 3,9, 4,0, 4,5, 4,9, 5,0, 5,5, 5,9, 6,0, 6,5, 6,9, 7,0,
7.5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5, 10,9, 11, 11,5, 11,9, 20, 12,5, 12,9, 13,0, 13,5, 13,9, 14,0, 14,5, 4,9, 5,0, 5,5,, 5,9, 6,0, 6,5, 6,9, 7,0, 7,5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5, 10,9, 11, 11,5, 11,9, 12, 12,5, 12,9, 13,0,
13.5, 13,9, 14, 14,5, 15, 15,5, 15,9, 16, 16,5, 16,9, 17, 17,5, 17,9, 18, 18,5, 18,9, 19, 19,5, 19,9, 20, 20,5, 20,9, 21,
22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100, 200, 300, 400, 500, 600,
700, 800, 900, 1.000, 1.500, 2.000, 2.500, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500 y/o 5.000 pg/ml de concentracion serica por administracion unica o multiple, o cualquier intervalo, valor o fraccion de los mismos.
Como alternativa, la dosis administrada puede variar dependiendo de factores conocidos, tales como las caracterfsticas farmacodinamicas del agente concreto y su modo y via de administracion; la edad, la salud y el peso del receptor; la naturaleza y el alcance de los sfntomas, la clase de tratamiento concurrente, la frecuencia del tratamiento y el efecto deseado. Por lo general, una dosificacion de ingrediente activo puede ser de aproximadamente 0,1 a 100 miligramos por kilogramo de peso corporal. Por lo general es eficaz una cantidad de 0,1 a 50 miligramos por kilogramo, y preferentemente de 0,1 a 10 miligramos por kilogramo por administracion o en forma de liberacion sostenida para obtener los resultados deseados.
Como un ejemplo no limitativo, el tratamiento de seres humanos o animales puede proporcionarse como una dosificacion de sola vez o periodica de al menos un anticuerpo de la presente invencion de 0,1 mg/kg a 100 mg/kg, tal como 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/kg, al dfa, en al menos uno de los dfas 1, 2, 3, 4, 5, 6,
7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38,
39 o 40, o como alternativa o adicionalmente, en al menos una de la semana 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44,
45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 o 52, o como alternativa o adicionalmente, en al menos uno de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 anos, o cualquier combinacion de los mismos, utilizando dosis unicas, de infusion o repetidas.
Las formas de dosificacion (composicion) adecuadas para la administracion interna contienen generalmente de aproximadamente 0,1 miligramo a aproximadamente 500 miligramos de ingrediente activo por unidad o recipiente. En estas composiciones farmaceuticas el ingrediente activo estara presente por lo comun en una cantidad de aproximadamente un 0,5%- 99,999% en peso en base al peso total de la composicion.
Formulaciones y administracion parenterales
Para la administracion parenteral, el anticuerpo puede formularse como una solucion, suspension, emulsion o polvo liofilizado en asociacion, o proporcionado por separado, con un vehfculo parenteral farmaceuticamente aceptable. Ejemplos de tales vehfculos son agua, solucion salina, solucion de Ringer, solucion de dextrosa y albumina de suero humano al 1%-10%. Tambien pueden utilizarse liposomas y vehfculos no acuosos tales como aceites no volatiles. El vehfculo o polvo liofilizado puede contener aditivos que mantengan la isotonicidad (por ejemplo, cloruro de sodio, manitol) y la estabilidad qufmica (por ejemplo, tampones y conservantes). La formulacion se esteriliza mediante tecnicas conocidas o adecuadas.
Los vehfculos farmaceuticos adecuados se describen en la edicion mas reciente de Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, un texto de referencia habitual en este campo.
Las formulaciones para la administracion parenteral pueden contener como excipientes comunes agua esteril o solucion salina, polialquilenglicoles tales como polietilenglicol, aceites de origen vegetal, naftalenos hidrogenados y similares. Pueden prepararse suspensiones acuosas u oleosas para inyeccion utilizando un emulsionante o humidificador apropiado y un agente de suspension, segun metodos conocidos. Los agentes para inyeccion pueden ser un agente de dilucion no toxico no administrable por via oral, tal como una solucion acuosa o una suspension o solucion inyectable esteril en un disolvente. Como vehfculo o disolvente utilizable, se admiten agua, solucion de Ringer, solucion salina isotonica, etc.; como disolvente comun, o disolvente en suspension, puede utilizarse aceite no volatil esteril. Para ello, puede utilizarse cualquier tipo de acido graso y aceite no volatil, incluidos acidos grasos o aceites grasos naturales o sinteticos o semisinteticos; mono- di- o trigliceridos naturales o sinteticos o semisinteticos. La administracion parenteral se conoce en la tecnica e incluye, pero no se limita a, los medios
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convencionales de inyeccion, un dispositivo de inyeccion sin aguja con gas presurizado como se describe en la patente de EE.UU. N° 5.851.198, y un dispositivo perforador con laser como se describe en la patente de EE.UU. N° 5.839.446.
Administracion alternativa
Un anticuerpo anti-IL-6 puede administrate por via parenteral, subcutanea, intramuscular, intravenosa, intraarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitaria, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, intracolonica, intracervical, intragastrica, intrahepatica, intramiocardica, intraosteal, intrapelvica, intrapericardica, intraperitoneal, intrapleural, intraprostatica, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretiniana, intraespinal, intrasinovial, intratoracica, intrauterina, intravesical, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal, transdermica o por bolo. Puede prepararse al menos una composicion de un anticuerpo anti-IL-6 para su uso para la administracion parenteral (subcutanea, intramuscular o intravenosa) o cualquier otra administracion particularmente en forma de soluciones o suspensiones lfquidas; para su uso en la administracion vaginal o rectal particularmente en formas semisolidas tales como, pero no limitadas a, cremas y supositorios; para la administracion bucal o sublingual tal como, pero no limitada a, en forma de comprimidos o capsulas; o por via intranasal tal como, pero no limitada a, en forma de polvos, aerosoles o gotas nasales o determinados agentes; o por via transdermica, tal como sin limitarse a un gel, pomada, locion, suspension o sistema de administracion mediante parche con potenciadores qufmicos tales como dimetilsulfoxido para modificar la estructura de la piel o para aumentar la concentracion de farmaco en el parche transdermico (Junginger, et al. en "Drug Permeation Enhancement"; Hsieh, D.S., Eds., pags. 59-90 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1994), o con agentes oxidantes que permiten la aplicacion de formulaciones que contienen protefnas y peptidos sobre la piel (documento WO 98/53847), o aplicaciones de campos electricos para crear vfas de transporte transitorias tal como electroporacion, o para aumentar la movilidad de los farmacos cargados a traves de la piel tal como iontoforesis, o aplicacion de ultrasonidos tal como sonoforesis (patentes de EE.UU. N° 4.309.989 y 4.767.402).
Administracion pulmonar/nasal
Para la administracion pulmonar, preferentemente se administra al menos una composicion de anticuerpo anti-IL-6 en un tamano de partfcula eficaz para alcanzar las vfas respiratorias inferiores de los pulmones o los senos paranasales. Puede administrarse un anticuerpo anti-IL-6 mediante cualquiera de diversos dispositivos nasales o de inhalacion conocidos en la tecnica para la administracion de un agente terapeutico por inhalacion. Estos dispositivos capaces de depositar formulaciones en aerosol en la cavidad sinusal o en los alveolos de un paciente incluyen nebulizadores, generadores de polvo seco, pulverizadores, inhaladores de dosis medida, y similares. Tambien se conocen en la tecnica otros dispositivos adecuados para dirigir la administracion pulmonar o nasal de anticuerpos. Todos estos dispositivos pueden hacer uso de formulaciones adecuadas para la administracion para dispersar el anticuerpo en un aerosol. Tales aerosoles pueden estar compuestos por cualquiera de las soluciones (tanto acuosa como no acuosa) o partfculas solidas. Los inhaladores de dosis medida como el inhalador de dosis medida Ventolin®, utilizan por lo general un gas propulsor y requieren el accionamiento durante la inspiracion (veanse, por ejemplo, los documentos WO 94/16970, WO 98/35888). Los inhaladores de polvo seco como Turbuhaler™ (Astra), Rotahaler® (Glaxo), Discus® (Glaxo), inhalador Spiros™ (Dura), dispositivos comercializados por Inhale Therapeutics y el inhalador de polvo Spinhaler® (Fisons), utilizan el accionamiento por la respiracion de un polvo mixto (EE.UU. 4.668.218 Astra, EP 237507 Astra, WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552 Dura, EE.UU. 5.458.135 Inhale, WO 94/06498 Fisons). Los nebulizadores como AERx™ de Aradigm, el nebulizador Ultravent® (Mallinckrodt), y el nebulizador Acorn II® (Marquest Medical Products) (EE.UU. 5.404.871 Aradigm, WO 97/22376), producen aerosoles a partir de soluciones, mientras que los inhaladores de dosis medida, inhaladores de polvo seco, etc. generan aerosoles de partfculas pequenas. Estos ejemplos especfficos de dispositivos de inhalacion disponibles en el mercado pretenden ser representativos de los dispositivos especfficos adecuados para esta practica, y no pretenden ser limitativos. Preferentemente, una composicion que comprende al menos un anticuerpo anti-IL-6 se administra mediante un inhalador de polvo seco o un pulverizador. Hay varias caracterfsticas deseables de un dispositivo de inhalacion para la administracion de al menos un anticuerpo de la presente invencion. Por ejemplo, la administracion mediante el dispositivo de inhalacion es ventajosamente fiable, reproducible y precisa. El dispositivo de inhalacion puede administrar opcionalmente partfculas secas pequenas, por ejemplo, inferiores a aproximadamente 10 pm, preferentemente de aproximadamente 1 pm-5 pm, para una buena respirabilidad.
Administracion de composiciones de anticuerpo para IL-6 como aerosol
Puede producirse un aerosol que incluya la protefna de la composicion de anticuerpo para IL-6 forzando una suspension o solucion de al menos un anticuerpo anti-IL-6 a traves de una boquilla a presion. Pueden elegirse la configuracion y el tamano de la boquilla, la presion aplicada, y la velocidad de alimentacion de lfquido para conseguir el tamano de partfcula y la salida deseada. Puede producirse un electrospray, por ejemplo, mediante un campo electrico en conexion con un capilar o boquilla de alimentacion. Ventajosamente, las partfculas de al menos una protefna de la composicion de anticuerpo anti-IL-6 administradas por un pulverizador tienen un tamano de partfcula inferior a aproximadamente 10 pm, preferentemente en el intervalo comprendido entre aproximadamente 1 pm a aproximadamente 5 pm, y lo mas preferentemente de aproximadamente 2 pm a aproximadamente 3 pm.
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Las formulaciones de al menos una protefna de la composicion de anticuerpo anti-IL-6 adecuadas para su uso con un pulverizador incluyen por lo general la protefna de la composicion de anticuerpo en una solucion acuosa a una concentracion de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 100 mg de al menos una protefna de la composicion de anticuerpo anti-IL-6 por ml de solucion o en mg/g, o cualquier intervalo o valor en el mismo, por ejemplo, pero no limitado a, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/ml o mg/g. La formulacion puede incluir agentes tales como un excipiente, un tampon, un agente de isotonicidad, un conservante, un tensioactivo y, preferentemente, zinc. La formulacion tambien puede incluir un excipiente o agente para la estabilizacion de la protefna de la composicion de anticuerpo, tal como un tampon, un agente reductor, una protefna en bruto o un hidrato de carbono. Las protefnas en bruto utiles en la formulacion de las protefnas de composicion de anticuerpo incluyen albumina, protamina, o similares. Los hidratos de carbono tfpicos utiles en la formulacion de las protefnas de composicion de anticuerpo incluyen sacarosa, manitol, lactosa, trehalosa, glucosa, o similares. La formulacion de protefna de la composicion de anticuerpo tambien puede incluir un tensioactivo, que puede reducir o prevenir la agregacion inducida por la superficie de la protefna de la composicion de anticuerpo causada por la atomizacion de la solucion al formar un aerosol. Pueden emplearse diversos tensioactivos convencionales, tales como alcoholes y esteres de acidos grasos de polioxietileno, y esteres de acidos grasos de polioxietilensorbitol. Las cantidades variaran generalmente entre un 0,001% y un 14% en peso de la formulacion. Los tensioactivos especialmente preferentes para estos fines son monooleato de polioxietilensorbitan, polisorbato 80, polisorbato 20, o similares. Tambien pueden incluirse en la formulacion agentes adicionales conocidos en la tecnica para la formulacion de una protefna tal como los anticuerpos para IL-6, o porciones especificadas o variantes.
Administracion de composiciones de anticuerpo para IL-6 mediante un nebulizador
La protefna de la composicion de anticuerpo puede administrarse mediante un nebulizador, tal como un nebulizador de chorro o un nebulizador ultrasonico. Por lo general, en un nebulizador de chorro, se utiliza una fuente de aire comprimido para crear un chorro de aire a alta velocidad a traves de un orificio. A medida que el gas se expande mas alla de la boquilla, se crea una region de baja presion, que arrastra una solucion de protefna de la composicion de anticuerpo a traves de un tubo capilar conectado a un deposito de lfquido. La corriente de lfquido desde el tubo capilar se cizalla en gotitas y filamentos inestables a medida que sale del tubo, creando el aerosol. Puede emplearse una variedad de configuraciones, caudales y tipos de deflectores para conseguir las caracterfsticas de rendimiento deseadas de un determinado nebulizador de chorro. En un nebulizador ultrasonico, se utiliza energfa electrica de alta frecuencia para crear energfa mecanica de vibracion, empleando por lo general un transductor piezoelectrico. Esta energfa se transmite a la formulacion de protefna de la composicion de anticuerpo directamente o a traves de un lfquido de acoplamiento, creando un aerosol que incluye la protefna de la composicion de anticuerpo. Ventajosamente, las partfculas de protefna de la composicion de anticuerpo administradas por un nebulizador tienen un tamano de partfcula inferior a aproximadamente 10 pm, preferentemente en el intervalo comprendido entre aproximadamente 1 pm y aproximadamente 5 pm, y los mas preferentemente entre aproximadamente 2 pm y aproximadamente 3 pm.
Las formulaciones de al menos un anticuerpo anti-IL-6 adecuadas para su uso con un nebulizador, ya sea de chorro o ultrasonico, incluyen por lo general una concentracion de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 100 mg de al menos una protefna anticuerpo anti-IL-6 por ml de solucion. La formulacion puede incluir agentes tales como un excipiente, un tampon, un agente de isotonicidad, un conservante, un tensioactivo, y, preferentemente, zinc. La formulacion tambien puede incluir un excipiente o agente para la estabilizacion de la al menos una protefna de la composicion de anticuerpo anti-IL-6, tal como un tampon, un agente reductor, una protefna en bruto, o un hidrato de carbono. Las protefnas en bruto utiles en la formulacion de al menos una protefna de la composicion de anticuerpo anti-IL-6 incluyen albumina, protamina, o similares. Los hidratos de carbono tfpicos utiles en la formulacion de al menos un anticuerpo anti-IL-6 incluyen sacarosa, manitol, lactosa, trehalosa, glucosa, o similares. La formulacion de al menos un anticuerpo anti-IL-6 tambien puede incluir un tensioactivo, que puede reducir o prevenir la agregacion inducida por la superficie del al menos un anticuerpo anti-IL-6 causada por la atomizacion de la solucion al formarse un aerosol. Pueden emplearse diversos tensioactivos convencionales, tales como alcoholes y esteres de acidos grasos de polioxietileno, y esteres de acidos grasos de polioxietilensorbitol. Las cantidades variaran generalmente entre un 0,001% y un 4% en peso de la formulacion. Los tensioactivos especialmente preferentes para estos fines son monooleato de polioxietilensorbitan, polisorbato 80, polisorbato 20, o similares. Tambien pueden incluirse en la formulacion agentes adicionales conocidos en la tecnica para la formulacion de una protefna tal como la protefna anticuerpo.
Administracion de composiciones de anticuerpo para IL-6 mediante un inhalador de dosis medida
En un inhalador de dosis medida (MDI), un propelente, al menos un anticuerpo anti-IL-6, y cualquier excipiente u otros aditivos estan contenidos en un recipiente como una mezcla que incluye un gas comprimido licuado. El accionamiento de la valvula dosificadora libera la mezcla en forma de aerosol, que contiene preferentemente partfculas en el intervalo de tamano inferior a aproximadamente 10 pm, preferentemente de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 5 pm, y lo mas preferentemente de aproximadamente 2 pm a
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aproximadamente 3 pm. El tamano de partfcula de aerosol deseado puede obtenerse empleando una formulacion de protefna de la composicion de anticuerpo producida mediante diversos metodos conocidos por los expertos en la materia, incluidos molienda por chorro, secado por pulverizacion, condensacion de punto crftico, o similares. Los inhaladores de dosis medida preferentes incluyen los fabricados por 3M o Glaxo y el empleo de un propelente de hidrofluorocarbono.
Las formulaciones de al menos un anticuerpo anti-IL-6 para su uso con un dispositivo inhalador de dosis medida incluiran generalmente un polvo finamente dividido que contiene al menos un anticuerpo anti-IL-6 como suspension en un medio no acuoso, por ejemplo, suspendido en un propelente con la ayuda de un tensioactivo. El propelente puede ser cualquier material convencional empleado para este fin, tal como clorofluorocarbono, un hidroclorofluorocarbono, un hidrofluorocarbono o un hidrocarburo, incluidos triclorofluorometano, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol y 1,1,1,2-tetrafluoroetano, HFA-134a (hidrofluoroalcano-134a), HFA-227 (hidrofluoroalcano-227), o similares. Preferentemente, el propelente es un hidrofluorocarbono. Puede elegirse el tensioactivo para que estabilice el al menos un anticuerpo anti-IL-6 como suspension en el propelente, para proteger el agente activo frente a la degradacion qufmica, y similares. Los tensioactivos adecuados incluyen trioleato de sorbitan, lecitina de soja, acido oleico, o similares. En algunos casos resultan preferentes los aerosoles en solucion que utilizan disolventes tales como etanol. Tambien pueden incluirse en la formulacion agentes adicionales conocidos en la tecnica para la formulacion de una protefna tal como la protefna.
Un experto en la materia reconocera que los metodos pueden conseguirse mediante la administracion pulmonar de al menos una composicion de anticuerpo anti-IL-6 por medio de dispositivos no descritos en el presente documento.
Formulaciones y administracion orales
Las formulaciones para la administracion oral se basan en la co-administracion de adyuvantes (por ejemplo, resorcinoles y tensioactivos no ionicos tales como polioxietilen oleil eter y n-hexadecil polietilen eter) para aumentar artificialmente la permeabilidad de las paredes intestinales, asf como la co-administracion de inhibidores enzimaticos (por ejemplo, inhibidores de la tripsina pancreatica, diisopropil fluorofosfato (DFF) y trasilol) para inhibir la degradacion enzimatica. Puede mezclarse el compuesto integrante activo de la forma de dosificacion de tipo solido para la administracion oral con al menos un aditivo, incluido sacarosa, lactosa, celulosa, manitol, trehalosa, rafinosa, maltitol, dextrano, almidones, agar, arginatos, quitinas, quitosanos, pectinas, goma de tragacanto, goma arabiga, gelatina, colageno, casefna, albumina, polfmeros sinteticos o semisinteticos y glicerido. Estas formas de dosificacion tambien pueden contener otro(s) tipo(s) de aditivos, por ejemplo, un diluyente inactivo, un lubricante tal como estearato de magnesio, parabeno, un conservante tal como acido sorbico, acido ascorbico, alfa-tocoferol, un antioxidante tal como cistefna, un disgregante, un aglutinante, un espesante, un agente tampon, un edulcorante, un saporffero, un aromatizante, etc.
Los comprimidos y pfldoras pueden procesarse adicionalmente en preparaciones con cubierta enterica. Las preparaciones lfquidas para la administracion oral incluyen preparaciones en solucion, suspension, elixir, jarabe, y emulsion, y permitidos para su uso medico. Estas preparaciones pueden contener agentes diluyentes inactivos utilizados por lo comun en dicho campo, por ejemplo, agua. Tambien se han descrito los liposomas como sistemas de transporte de farmacos para la insulina y la heparina (patente de EE.UU N° 4.239.754). Mas recientemente, se han utilizado microesferas de polfmeros artificiales de aminoacidos mixtos (proteinoides) para transportar productos farmaceuticos (patente de EE.UU N° 4.925.673). Ademas, los compuestos transportadores descritos en la patente de EE.UU. N° 5.879.681 y en la patente de EE.UU. N° 5.5871.753 se utilizan para administrar agentes biologicamente activos por via oral son conocidos en la tecnica.
Formulaciones y administracion por via mucosa
Para la absorcion a traves de las superficies mucosas, las composiciones y los metodos de administracion de al menos un anticuerpo anti-IL-6 incluyen una emulsion que comprende una pluralidad de partfculas submicrometricas, una macromolecula mucoadhesiva, un peptido bioactivo y una fase continua acuosa, que promueve la absorcion a traves de las superficies mucosas consiguiendo la mucoadhesion de las partfculas de emulsion (patente de EE.UU. N° 5.514.670). Las superficies mucosas adecuadas para la aplicacion de las emulsiones de la presente invencion pueden incluir las vfas de administracion por la cornea, conjuntival, bucal, sublingual, nasal, vaginal, pulmonar, estomacal, intestinal y rectal. Las formulaciones para la administracion vaginal o rectal, por ejemplo, supositorios, pueden contener como excipientes, por ejemplo, polialquilenglicoles, vaselina, manteca de cacao, y similares. Las formulaciones para la administracion intranasal pueden ser solidas y contener como excipientes, por ejemplo, lactosa o pueden ser soluciones acuosas u oleosas de gotas nasales. Para la administracion bucal, los excipientes incluyen azucares, estearato de calcio, estearato de magnesio, almidon pregelatinizado, y similares (patente de EE.UU. N° 5.849.695).
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Para la administracion transdermica, el al menos un anticuerpo anti-IL-6 se encapsula en un dispositivo de transporte tal como un liposoma o nanopartfculas, micropartfculas, microcapsulas o microesferas polimericas (conocidas colectivamente como micropartfculas a menos que se indique lo contrario). Se conocen varios dispositivos adecuados, incluidas las micropartfculas hechas de polfmeros sinteticos, tales como acidos polihidroxilados tal como el acido polilactico, acido poliglicolico y copoUmeros de los mismos, poliortoesteres, polianh^dridos y polifosfacenos, y polfmeros naturales tales como colageno, poliaminoacidos, albumina y otras protemas, alginato y otros polisacaridos, y combinaciones de los mismos (patente de EE.UU. N° 5.814.599).
Formulaciones y administracion prolongada
A veces puede ser deseable administrar los compuestos de la presente invencion al sujeto durante penodos prolongados de tiempo, por ejemplo, durante penodos de una semana a un ano a partir de una sola administracion. Pueden utilizarse diversas formas de dosificacion mediante implantes o depot, de liberacion lenta. Por ejemplo, una forma de dosificacion puede contener una sal no toxica farmaceuticamente aceptable de los compuestos que tenga un bajo grado de solubilidad en los fluidos corporales, por ejemplo, (a) una sal de adicion de acido con un acido polibasico tal como acido fosforico, acido sulfurico, acido cftrico, acido tartarico, acido tanico, acido pamoico, acido algmico, acido poliglutamico, acidos naftalen mono- o di-sulfonicos, acido poligalacturonico, y similares; (b) una sal con un cation metalico polivalente tal como zinc, calcio, bismuto, bario, magnesio, aluminio, cobre, cobalto, mquel, cadmio y similares, o con un cation organico formado a partir de por ejemplo, N,N'-dibencil-etilendiamina o etilendiamina; o (c) combinaciones de (a) y (b), por ejemplo, una sal de tanato de zinc. Ademas, los compuestos de la presente invencion o, preferentemente, una sal relativamente insoluble tal como las que se acaban de describir, pueden formularse en un gel, por ejemplo, un gel de monoestearato de aluminio con, por ejemplo, aceite de sesamo, adecuado para inyeccion. Las sales especialmente preferentes son sales de zinc, sales de tanato de zinc, sales de pamoato, y similares. Otro tipo de formulacion depot de liberacion lenta para inyeccion contendna el compuesto o sal dispersada para encapsularse en un polfmero no antigenico y no toxico, de degradacion lenta, tal como un polfmero de acido polilactico/acido poliglicolico, por ejemplo, como se describe en la patente de EE.UU. N° 3.773.919. Los compuestos o, preferentemente, las sales relativamente insolubles tales como las descritas anteriormente tambien pueden formularse en microgranulos de Silastic de matriz de colesterol, especialmente para el uso en animales. En la literatura se conocen formulaciones depot o de implante de liberacion lenta adicionales por ejemplo, liposomas con gas o lfquido (patentes de EE.UU. N° 5.770.222 y "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J.R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978).
Abreviaturas
BSA - albumina de suero bovino
EIA - inmunoensayo enzimatico
FBS - suero fetal bovino
H2O2 - peroxido de hidrogeno
HRP - peroxidasa de rabano
Ig - inmunoglobulina
IL-6 - interleucina-6
IP - intraperitoneal
IV - intravenoso
Mab - anticuerpo monoclonal
OD - densidad optica
OPD - diclorhidrato de o-fenilendiamina
PEG - polietilenglicol
PSA - penicilina, estreptomicina, anfotericina
RT - temperatura ambiente
SQ - subcutaneo
v/v - volumen por volumen
p/v - peso por volumen
EJEMPLO I: GENERACION DE MAB CLB8 MURINO
Immunization
El hibridoma que da como resultado la anticuerpo CLB-IL6-8 murino se derivo de una fusion realizada en un laboratorio del Dr. Lucien Aarden, Central Laboratory of the Netherlands Red Cross Transfusion Service (CLB) como se ha informado (Brackenhoff et al., J. Immunol. (1990) 145:561-568).
Se inmunizaron, por via intramuscular (IM), ratones hembra Balb/c de ocho semanas de edad obtenidos de animales reproductores libres de los patogenos especificados del CLB, con 10 pg de interleucina-6 recombinante
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(rIL-6) (CLB) purificada emulsionada en adyuvante completo de Freund. Se llevaron a cabo tres inyecciones IM posteriores, cada una de ellas con 10 pg de rIL-6 en adyuvante incompleto de Freund, a intervalos de 4-8 semanas.
Fusion celular
Cuatro dfas despues de la ultima inyeccion IM de refuerzo, se sacrifico un raton; se le retiro el bazo y se pico finamente. Se obtuvo una suspension de celulas individuales en solucion salina equilibrada de Earle ambiental. Se lavaron y contaron las celulas. Se llevo a cabo una fusion en una relacion 1:3 de celulas de bazo viables respecto a celulas de mieloma murino (SP2/0-Ag14) en presencia de polietilenglicol al 42% (p/v) en medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM). Se establecio la pareja de fusion no secretora de Ig SP2/0 a partir de un banco de celulas mantenido en el CLB. Despues de la fusion, se resuspendieron las celulas en IMDM complementado con suero fetal bovino al 5%, 50 pM de penicilina/estreptomicina, 2-mercaptoetanol 5x10-5 M (2-ME) y HAT (hipoxantina 6x10-4 M, aminopterina 6,5x10-7 M, timidina 6,4x10-5 M). La proliferacion de estos hibridomas inmediatamente despues de la fusion es dependiente de IL-6, por lo tanto, se anadieron al medio de seleccion 100 U/ml de IL-6 murina purificada (Van Smick, Bruselas). A continuacion se distribuyen las celulas fusionadas en placas de 96 pocillos a 1x105 celulas/pocillo de 100 pl.
Caracterizacion primaria de hibridomas anti-IL-6 murinos
Los hfbridos secretores de anti-IL-6 se seleccionaron mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y un radioinmunoensayo (RIA) (Brackenhoff et al (1990) 145:561-568). Se empleo un ELISA en fase solida para el cribado de los anticuerpos monoclonales especfficos para la IL-6 humana. Se recubrieron placas de fondo plano (Dynatech), 100 pl/pocillo, con rIL-6 purificado (0,5 pg/ml) durante toda la noche a temperatura ambiente en tampon de fosfato salino (PBS). Se lavaron las placas con PBS, Tween 20 al 0,02% (v/v) (PBS/Tween) y se incubaron con diluciones 1:2 de sobrenadantes de cultivo en PBS/Tween complementado con gelatina al 0,2% (PTG) durante 2 horas a temperatura ambiente. Despues del lavado, se incubaron las placas con monoclonal de rata anti-cadena ligera kappa de raton 226 (Einstein University, NY) conjugado con peroxidasa de rabano en PTG (2 pg/ml) durante 1 hora. Se lavaron las placas y se detecto la peroxidasa unida con 100 pl/pocillo de 3,5,3,5, tetrametilbencidina/peroxido de hidrogeno al 0,003% en acetato de sodio 0,1-M, pH 5,5. Se detuvo la reaccion coloreada con H2SO4 2M y se leyeron las placas a 450 nM en un lector Multiscan de Titertek. Se eligieron los pocillos que dieron una OD positiva.
Tambien se empleo un RIA en fase solida para el cribado de hibridomas anti-IL-6. Se acoplaron anticuerpos de cabra anti-Ig murina con sefarosa CL-4B activada con bromuro de cianogeno (Pharmacia). Se lavo la sefarosa y se resuspendio a 10 mg/ml en PBS, Tween 20 al 0,1%, azida de sodio al 0,1%. Se anadieron los sobrenadantes de hibridoma a perlas de sefarosa en presencia de aproximadamente 20.000 recuentos/minuto de 125I-rIL-6 (CLB) durante 6 horas con mezcla constante. Se lavaron exhaustivamente las perlas en PBS/Tween y se contaron en un contador gamma. Se eligieron los pocillos que dieron las actividades especfficas mas altas.
Los hibridomas que fueron positivos en ambos sistemas de ensayo se establecieron y subclonaron dos veces a diluciones limitantes en ImDm complementado con 2x10-5 M 2-ME y SFB al 5% (IMDM completo). Se selecciono el subclon CLB-IL6-8 independiente de IL-6 y se mantuvo en IMDM completo. Los cultivos madre dieron negativo para micoplasma utilizando una tincion de Hoescht indirecta despues de 4 dfas de cultivo en celulas diana Vero76. La determinacion del isotipo del sobrenadante por medio del kit de isotipo de anticuerpo monoclonal de raton Innogenetics Line ImmunoAssay (INNO-LIA) dio un solo isotipo IgG1 kappa murino. Esta determinacion de isotipo se confirmo mediante un EIA de captura.
El hibridoma murino y la lfnea celular se produjo asf, CLBIL-6/8 se denomino CLB 8. Se quimerizo y se caracterizo adicionalmente como se describe a continuacion.
EJEMPLO 2: QUIMERIZACION Y SECUENCIACION
Clonacion y expresion de los genes de la region variable de cCLB8
Se aislo el ADN genomico del hibridoma murino C143A que segrega un anticuerpo monoclonal murino especffico para la IL-6 humana.
Para la cadena ligera, se digirio el ADN con la endonucleasa de restriccion Hind III y se sometio a electroforesis a traves de un gel de agarosa al 0,8%. Se corto la porcion del gel que contenfa fragmentos de ADN de aproximadamente 3,4 kb de longitud, y se eluyo el ADN. Se ligaron los fragmentos en el vector 8charon27, y se empaquetaron en partfculas de bacteriofago. Para la cadena pesada, se digirio el ADN con la endonucleasa de restriccion Eco RI y se sometio a electroforesis a traves de un gel de agarosa al 0,8%. Se corto la porcion del gel que contenfa fragmentos de ADN de aproximadamente 3,6 kb de longitud, y se eluyo el ADN. Se ligaron los fragmentos en el vector 8gt10, y se empaquetaron en partfculas de bacteriofago.
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Se sembraron bibliotecas de bacteriofagos de cadena pesada y ligera en E. coli, y se cultivaron durante toda la noche. Las placas se transfirieron a filtros de nitrocelulosa y se hibridaron con fragmentos de ADN marcado con 32P correspondientes a secuencias de Jk murina (cadena ligera) o Jh murina. Se identificaron las placas positivas y se purificaron en placa. Se aislo el ADN de los fagos y se aislaron los insertos Hind III (cadena ligera) o Eco RI (cadena pesada) y se clonaron en vectores de expresion de inmunoglobulina.
Se utilizaron plasmidos de expresion de la cadena pesada y ligera para cotransfectar celulas SP2/0, y se aplico seleccion con acido micofenolico. Se identificaron y subclonaron los clones individuales que producfan el anticuerpo hfbrido para asegurar la monoclonalidad y para generar productores superiores.
Se ensayo el anticuerpo purificado a partir de lfneas celulares individuales para determinar la capacidad de neutralizacion en un ensayo de proliferacion de celulas B9 dependiente de IL-6. El anticuerpo hfbrido se denomina CLB8 o cCLB8 a lo largo de toda la presente solicitud.
Region variable de la cadena pesada de cCLB8
E
V Q L V E S G G K L L K P G G 5 L K L
GAG
GTG CAA CTG GTG GAA. TCT GGA GGA AAA TTA CTG AAG CCT GGA GGG TCC CTG AAA CTC
S
C A A S c- F T F S 5 F A M S W F R Q
S
TCC
TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AGT AGC TTT GCC ATG TCT TGG TTT CGC CAG CDR TCT 1
PEKRLEWVA EISSGGSYTYY CCA GAG AAG AGG CTG GAG TGG GTC GCA GAA ATT AGT AGT GGT GGG AGT TAC ACC TAC TAT
CDR 2
P D T V T G RFTI SRDNAKNTLY CCT GAC ACT GTG ACG GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT GCC AAG AAC ACC CTG TAC
LEMSSLRSEDTAMYYCAR G____L
CTG GAA ATG AGC AGT CTG AGG TCT GAG GAC ACG GCC ATG TAT TAT TGT GCA AGG GGT TTA
WGYYALDY WGQGTSVTVSS TGG GGG TAC TAT GCT CTT GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA
CDR 3
Region variable de la cadena Ligera de cCLB8
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QIVLIQSPAIMSASPGEKVT CAA ATT GTT CTC ATA CAG TCT CCA GCA ATC ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAG AAG GTC ACC
M T C SASSSVSY MYWYQQKPG
ATG ACC TGC AGT GCC AGC TCA AGT GTA AGT TAC ATG TAC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA
CDR 1
SSPRLLIY D T S W L A $ G V P V R
TCC TCC CCC AGA CTC CTG ATT TAT GAC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCT GTT
CGC
CDR 2
FSGSGSGTSYSLTISRMEAE TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC CGA ATG GAG GCT GAG
D A A T Y Y C QQWSGYPYT F G G G
GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG CAG TGG AGT GGT TAC CCA TAC ACG TTC GGA GGG GGG
CUR 3
T K L E IK
ACC AAG CTG GAA ATA AAA
EJEMPLO 3. MEDIDA DE LA UNION DE cCLB8 A LA IL-6 HUMANA MEDIANTE EIA EN FASE SOLIDA
Se utilizo un EIA en fase solida para evaluar las caracterfsticas de union del Mab cCLB8 a la IL-6 humana. En resumen, se recubrieron las placas con IL-6 humana recombinante (RDI) a 1 pg/ml en PBS durante toda la noche a 4°C. Despues del lavado en solucion salina 0,15 M que contenfa Tween 20 al 0,02% (v/v), se bloquearon los pocillos con BSA al 1% (p/v) en PBS, 200 pl/pocillo durante 1 hora a RT. Se incubo el anticuerpo purificado en diluciones dobles en serie a partir de una concentracion inicial de 5 pg/ml durante 1 hora a 37°C. Se lavo la placa y a continuacion se hibrido con 50 pl/pocillo de anticuerpo de cabra anti-IgG humana marcado con HRP (Tago) diluida 1:20.000 en PBS-BSA al 1% durante 1 hora a RT. Se lavo de nuevo la placa y se anadieron 100 pl/pocillo de la solucion de sustrato citrato-fosfato (acido cftrico 0,1 M y fosfato de sodio 0,2 M, H2O2 al 0,01% y 1 mg/ml de OPD) durante 15 minutos a RT. A continuacion se anadio solucion de parada (acido sulfurico 4N) a 25 pl/pocillo y se cuantifico la absorcion a 490 nm utilizando un fotometro de placa automatizado. La figura 1 muestra la union de cCLB8 a IL-6 medida como OD 490 nm que demuestra que cCLB8 se une a la IL-6 humana recombinante de una forma dependiente de la concentracion.
EJEMPLO 4. ENSAYOS DE NEUTRALIZACION IN VITRO
El bloqueo de IL-6 por cCLB8 inhibe la secrecidn de IgMy MCP-1
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Se evaluo el anticuerpo monoclonal hfbrido cCLB8 en dos formatos de bioensayo simple para determinar su bioactividad neutralizante sobre la secrecion inducida por IL-6 de la IgM humana y la quimiocina MCP-1. En estos estudios se utilizaron dos lfneas celulares humanas. La lfnea celular SKW6.4 se derivo originalmente de un linfoma de Burkitt de linfocitos B transformados por EBV y que segrega IgM soluble en respuesta a la IL-6. La lfnea celular U937 es monoblastica, comprometida con la diferenciacion de monocitos y se aislo originalmente de un paciente con linfoma histiocftico difuso. Las celulas U937 secretan MCP-1 en respuesta a la IL-6. Se evaluo la inhibicion por cCLB8 de estas bioactividades concretas, ya que podfan supervisarse facilmente utilizando un formato de EIA. Antes del ensayo, se privo a las celulas de suero durante toda la noche y a continuacion se cultivaron al dfa siguiente en solitario, con IL-6 o con IL-6 preincubada con diversas concentraciones de anticuerpo o un anticuerpo de control negativo. A las 72 horas de incubacion, ser recogieron los sobrenadantes y se utilizaron en EIA especfficos para IgM y para MCP-1. Los resultados, como se muestra en las figuras 2 y 3, demuestran que cCLB8 inhibe significativamente la secrecion de IgM y MCP-1 mediada por IL-6 in vitro.
En el experimento representado en la figura 2, se recubrieron placas de EIA con anticuerpo de cabra anti- IgM humana, Fc5p, especffico de fragmento, en tampon carbonato 10 mM, pH 9,6 durante toda la noche a 4°C. Se lavaron las placas con solucion salina 0,15 M con Tween 20 al 0,02% v/v y se bloquearon con PBS/BSA al 1% p/v durante 1 hora. Se anadio el sobrenadante del cultivo celular en diluciones dobles en serie. Despues de la incubacion y posteriores lavados con Tween al 0,02%, solucion salina 0,15 M, se hibrido la placa con anticuerpo de cabra anti-IgM humana especffico de cadena p, marcado con HRP. A continuacion se anadio el sustrato OPD y siguiendo el desarrollo del color, se leyo la OD a 490 nm. Los datos indican que cCLB8, pero no el mAb hfbrido de control negativo emparejado por isotipo, inhibe la secrecion de IgM mu.
En el experimento representado en la figura 3, se recubrieron placas de EIA con anticuerpo de cabra anti-MCP-1 humana en tampon carbonato 10 mM, pH 9,6 durante toda la noche a 4°C. Se lavaron las placas con solucion salina 0,15 M con Tween 20 al 0,02% v/v y se bloquearon con PBS/BSA al 1% p/v durante 1 hora. Se anadio el sobrenadante del cultivo celular en diluciones dobles en serie. Despues de una incubacion de dos horas y posteriores lavados con Tween al 0,02%, solucion salina 0,15 M, se hibrido la placa con anticuerpo anti-MCP-1 humana biotinilado segun las instrucciones del fabricante. Se lavaron las placas de nuevo y se anadio estreptavidina marcada con HRP durante 1 hora. Se realizo el desarrollo de color con sustrato TMB. Se leyo la OD a 450. Los datos indican que cCLB8, pero no cK931, inhibe la produccion de MCP-1 mediada por IL-6.
Neutralizacion de la fosforilacion de STAT3 mediada por IL-6.
El receptor de IL-6 consiste en una subunidad de union de 80 kD, IL6Ra y la subunidad de transduccion de senales, gp130. IL-6 se une a la subunidad IL6Ra e inicia la asociacion de IL6Ra y gp130 que da como resultado un receptor de alta afinidad y la transduccion de senales. IL6Ra tambien existe en una forma soluble. IL6 puede unirse a la IL6R soluble (sIL6R) y el complejo puede actuar sobre las celulas que expresan gp130. Se ha demostrado que IL6 activa la STAT3. Se utilizo una lfnea celular humana de leucemia monocftica aguda, THP-1, para demostrar la inhibicion de la fosforilacion de STAT3 por cCLB8. Se estimularon las celulas con (IL6 + sIL6R) +/- cCLB8 o un anticuerpo irrelevante (K931) como control negativo. Se inmunoprecipitaron los lisados celulares con anti-STAT3, se resolvieron las muestras en SDS-PAGE al 7,5% y se transfirieron a una membrana Hybond-P, seguido de transferencia de Western utilizando antifosfotirosina-HRP. Para la deteccion se utilizo ECLplus.
Los datos representados en la Figura 4 demuestran que cCLB8 puede inhibir la fosforilacion de STAT3 cuando a) se permite que se una a rhIL6 antes de la adicion de sIL6R, b) se permite que se una a sIL6R antes de la adicion de rhIL6, o c) cuando se permite que rhIL6 se una a sIL6R antes de la adicion de cCLB8 y celulas. Se incubaron celulas THP-1 en medios sin suero durante 16 horas, se rasparon de los matraces y se resuspendieron en 0,5 ml de medio. Calles 2-6, se incubo IL6 +/- anticuerpo durante 15 minutos, a continuacion, se anadio sIL6R y se incubo durante 15 minutos. Se anadieron las celulas y se incubaron 15 minutos mas. Calle 7, se incubo IL6 con sIL6R durante 15 minutos, a continuacion, se anadio CLB-IL6 y se incubaron durante 15 minutos. Se anadieron las celulas y se incubo 15 minutos mas. Las muestras se inmunoprecipitaron con anti-STAT3 [1 pg/ml], se resuspendieron en tampon de muestra de Laemmli y se resolvieron en SDS-PAGE al 7,5% y se transfirieron a Hybond-P. La membrana se incubo con anti-fosfotirosina-HRP.
cCLB8 inhibe la produccion de amiloide A serico
IL-1p es un potente inductor de la produccion de amiloide A serico (SAA) de celulas HepG2 de hepatoma humano en presencia de IL-6 humana (Smith y McDonald, Clin. Exp. Immunol. 90:293-9 (1992)). Por lo tanto, se ensayo el Mab cCLB8 para determinar su capacidad para inhibir la produccion de SAA inducida por IL-1 p/IL-6 de estas celulas. En resumen, se sembraron celulas HepG2 a 2,25 x 105/pocillo durante 24 horas. Se preincubaron IL-6 (100 ng/ml, RDI) e IL-6sR (200 ng/ml, S&D) durante 30 minutos, y se mezclaron con IL-1 p (1 ng/ml, R&D). Se diluyeron en serie el Mab cCLB8 y un Mab de control de isotipo negativo (cSF25) y a continuacion se preincubaron con la mezcla anteriormente indicada durante 30 minutos mas.
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Para los resultados experimentales mostrados en la figura 5, se preincubaron diluciones en serie de cCLB8 o cSF25 (un Mab irrelevante emparejado por isotipo) con IL-6SR e IL-1p y a continuacion se cultivaron con celulas HepG2 durante 24 horas. A continuacion se analizo el sobrenadante celular para determinar los niveles de produccion de amiloide A serico mediante ELISA (kit Human SAA ELISA, Biosource, realizado segun las instrucciones del fabricante). Las barras de error indican el EEM de las muestras duplicadas. Los datos de la figura 5 indican que cCLB8 era capaz de inhibir la produccion de SAA inducida por IL-1 p/IL-6 de celulas HepG2 de una forma dependiente de la dosis.
inhibition por Mab cCLB8 de la proliferation celular inducida por IL-6
Se induce la proliferacion de la lfnea celular de mieloma B murino, 7TD1 en presencia de IL-6. Para demostrar la capacidad del Mab cCLB8 para neutralizar la actividad de IL-6, se incubaron las celulas a 37°C durante 72 horas en IMDM que contenfa FBS al 10% y 0,5 ng/ml de IL-6 humana recombinante (R&D Systems), y con diluciones en serie de Mab cCLB8 o un Mab de control negativo 17-1A. Se midio la proliferacion celular mediante un ensayo de luminiscencia de ATP (ATPLite, Packard Bioscience) que se correlaciona directamente con el numero de celulas.
Los datos mostrados en la figura 6 demuestran que la IL-6 estimula espectacularmente la proliferacion de las celulas 7TD1 y cCLB8 inhibe esta proliferacion celular de una forma dependiente de la concentracion con una CE50 de 7,2 ng/ml. Las barras de error indican el EEM de las muestras duplicadas. El sfmbolo * representa la proliferacion de las celulas en ausencia de rIL-6.
EJEMPLO 5: MAPEO DE EPITOPOS
Se han caracterizado los epftopos de varios mAb anti-IL-6 neutralizantes, incluido CLB8, utilizando la union de anticuerpos a protefna mutantes IL-6 humanas como se describe en (Brakenhoff, J. et al. (1990) J. Immunology 145:561-568). Se prepararon mutantes con delecion amino-terminal y carboxilo-terminal y se analizo el panel de anticuerpos contra iL-6 mediante experimentos de competicion de anticuerpos. En base a los estudios de competicion, se dividieron los Mab neutralizantes en 2 grupos (I y II). En este metodo, los restos incluidos en el epftopo de un determinado Mab se definen por su incapacidad para reconocer las correspondientes variantes por sustitucion de aminoacidos individuales especfficas de sitio de la protefna antigenica. CLB.IL-6/8 se mapeo al sitio I en la molecula IL-6 humana que esta compuesta por aminoacidos Gln29-Leu34 muy cerca del extremo carboxilo terminal de la molecula. Estudios adicionales (Kalai, M, et al., Eur. J. Biochem. 249, 690-700 (1997)) demostraron que CLB.IL-6/8 reconocfa restos de aminoacidos cruciales para la union de IL-6 a IL-6R (gp80). Estos estudios tambien indicaban que su epftopo cubre los extremos del bucle AB y de las regiones de helice D de la molecula de IL-6.
EJEMPLO 6: CARACTERIZACION IN VIVO
El tratamiento con los Mab anti-IL-6 humana (cCLB8) y anti-IL-6 de raton retrasa la caquexia por cancer
Se inocularon celulas de melanoma humano (A375S2) en ratones desnudos hembra y se inicio el tratamiento con Mab el mismo dfa. Se inyectaron los anticuerpos por via intraperitoneal a una dosis de 10 mg/kg (2 veces por semana) y se utilizo C57 (anti-CMV) como mAb de control. Se utilizo la combinacion de cCLB8 (anti-IL-6 humana) y MP520F3 (Mab contra IL-6 de raton, R&D Systems) para crear un bloqueo combinado que inhibfa significativamente la perdida de peso de los animales portadores de tumores de melanoma humano en comparacion con los animales tratados con el anticuerpo de control C57 (Figura 7). El tratamiento con anticuerpos no tuvo efecto sobre el crecimiento del tumor o el peso final del tumor. Estos hallazgos indican que la IL-6 participa en la perdida de peso del animal inducida por el tumor, y el bloqueo de la IL-6 puede retrasar la caquexia por cancer en este modelo.
Figura 7. El bloqueo combinado de IL-6 humana y de raton (mAb anti-IL6 cCLB8 y mAb anti-IL6 MP520F3) da como resultado una inhibicion significativa de la perdida de peso del animal. La perdida de peso del animal corregida en el eje Y es (peso del animal-peso del tumor al final del estudio) menos el peso del animal al inicio del estudio. Cada barra es la media de los datos de al menos 14 animales/grupo y las barras de error indican la desviacion estandar. Un analisis de la prueba de la t de dos colas indico que el grupo de anti-IL-6 inhibfa significativamente la perdida de peso corporal con p = 0,007.
EJEMPLO 7: MEDICIONES DE AFINIDAD
Se obtuvieron de BIAcore, un BIAcore 2000, un chip sensor CM-5 (superficie de oro en el chip cubierto con una matriz de dextrano carboximetilado), HBS (HEPES 10 mM con NaCl 0,15 M, 3,4 EDTA mM, y tensioactivo P20 al 0,05% a pH 7,4), reactivos de acoplamiento de amina (N-hidroxisuccinamida (NHS), N-etil-N'-(3-metilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y HCl de etanolamina 1M) y se prepararon segun las instrucciones del fabricante. El anticuerpo anti-Fc humano (cabra anti-IgG humana Jackson AffiniPure, Fc, Cat # 109-005-098, Lote# 48646,) se adquirio de Jackson ImmunoResearch.
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El anticuerpo monoclonal IgG CLB8 hfbrido (Lote # PD1F03) en 5 ml de cloruro de sodio 0,15 M, fosfato de sodio 0,01 M, pH 7,2, estaba fabricado por Centocor. La IL-6 humana recombinante (Lote # A1197111) se adquirio de R&D Systems.
Se diluyo un anticuerpo anti-Fc humano (1,8 mg/ml) a una concentracion de 50 pg/ml en tampon de NaOAc (10 mM, pH 4,8) y se acoplo a la matriz de dextrano carboximetilado de un chip sensor CM-5 utilizando la qufmica de acoplamiento de amina del fabricante, como se describe en el manual de los sistemas BIAcore. Utilizando el asistente de preparacion de la superficie para alcanzar 10.000 RU, los grupos carboxilo en las superficies del sensor se activaron primero con NHS/eDc, seguido de la adicion del anticuerpo anti-Fc humano. Se bloquearon los grupos activados restantes inyectando etanolamina 1M. Se acoplo individualmente cada una de las celulas de flujo. Empleando estas condiciones, se prepararon las superficies de las cuatro celulas de flujo que contenfan 7.554-9.571 unidades de resonancia (RU) de anticuerpo anti-Fc humano. En los experimentos preliminares, se determino que tres inyecciones (15 ul a 30 pl/min) de H3PO4 100 mM/CHAPS al 0,05% eliminaban de manera eficaz la inmunoglobulina unida y conservaban la capacidad de union del anticuerpo anti-Fc humano inmovilizado.
Se realizaron dos experimentos en el BIAcore 2000 a 25°C y a un caudal de 30 pl/minuto. Se disolvio el cCLB8 en HBS a 5 ug/ml. Se disolvio el analito, IL-6, en HBS a 0,25 pg/ml, 0,125 pg/ml, 0,062 pg/ml, 0,031 pg/ml y 0,015 pg/ml. Se hizo fluir una cantidad establecida de anticuerpo a lo largo de su respectiva celula de flujo seguido de inyecciones de 30 pl de cada concentracion de IL-6 a 30 pl/min (fase de asociacion) y un flujo de tampon durante 800 segundos sin interrupcion (fase de disociacion). Se regenero la superficie del chip mediante tres inyecciones secuenciales de 15 pl cada una con H3PO4 100 mM/CHAPS al 0,05%. Las inyecciones de HBS sirven de referencia (sensograma en blanco) para la sustraccion de los indices de refraccion en bruto para su analisis. Utilizando el modelo 1:1 en el BIAanalysis 3,0, se realizo un ajuste local para la disociacion (kd, [s-1] y para la asociacion (ka, [M-1s-1 ]) y se calculo (kd/ka) la constante de disociacion (Kd, [M]).
El analisis se realizo utilizando BIAevaluation version 3.0. Las constantes cineticas se derivaron de los datos del sensograma ajustando las curvas experimentales a las ecuaciones de velocidad derivadas de los modelos del mecanismo de interaccion. Un analisis global utilizando un modelo de union 1:1 con ajuste local de RUmax, se determinaron la ka, kd, Kd (Tabla 1).
Tabla 1: Mediciones de afinidad para el Mab cCLB8 mediante Biacore
Muestra
ka (m-'s-')(x10°) kd (s') (x10-5) Kd(M) (x10-11) Chi2
cCLB8
1,1 6,2 5,7 0,111
cCLB8
0,37 5,2 14 0,236
EJEMPLO 8: ANTICUERPOS ANTI-IDIOTIPO
El desarrollo de sistemas de ensayo eficaces (inmunohistoqufmica y deteccion en suero) para cCLB8 requiere el uso de anticuerpos antiidiotipicos. Por lo tanto, se inmunizan ratones Balb/c con cCLB8 para generar anticuerpos antiidiotipicos contra cCLB8 que pueden utilizarse como sondas farmacocineticos en ensayos inmunohistoqufmicos y de deteccion en suero.
Inmunizacion
Se inmunizaron cinco ratones Balb/c (Charles River Laboratories) de 6-7 semanas de edad durante un periodo de 12 semanas con cCLB8 (Centocor, PD1F03) proporcionado a 50 pg IP y 25 pg SC. Cada raton recibio inyecciones IP y SC. Las inyecciones se dieron a intervalos de 2 semanas durante todo el regimen de inmunizacion. Se emulsion el material de inyeccion administrado IP con un volumen igual de adyuvante de Freund (Sigma). La primera inyeccion IP utilizo adyuvante completo de Freund en un volumen total de 200 pl. Las inyecciones IP posteriores contenfan adyuvante incompleto de Freund. El material de inyeccion administrado SC se diluyo en PBS y se dividio entre dos sitios de inyeccion a 100 pl/sitio. Se sangraron los ratones los dfas 0, 21, 47 y 77. Se recogio sangre de los ratones anestesiados mediante puncion retroorbital, y se recogio el suero para la determinacion de tftulos mediante EIA en fase solida para cCLB8. Tres semanas despues del final del protocolo de inmunizacion, el Raton #1 recibio una inyeccion final IV de refuerzo de 100 pg de cCLB8 diluido en 125 pl de PBS.
Generacion de anticuerpos monoclonales antiidiotipicos cCLB8 de raton
Una fusion utilizando un bazo de raton Balb/c inmunizado con cCLB8 dio como resultado la identificacion de 7 anticuerpos anti-id especfficos para cCLB8 mediante EIA. Se demostro que los 7 anticuerpos anti-id no se unfan a otros anticuerpos hfbridos raton/humano tales como C207A, C128A, C168J, C116J, C300A y C301A. Seis de los siete anticuerpos eran del isotipo IgGlK y un anticuerpo era IgG2bK. La Tabla 1 resume los resultados de la fusion. Cabe senalar que se alcanzo un tftulo maximo en suero de 1:800 en el raton despues de 47 dfas y se mantuvo
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constante durante el tiempo que duro la inmunizacion. Determinacion del isotipo
Se logro la determinacion del isotipo de los anticuerpos mediante el kit Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (Life Technologies) en formato de tira reactiva. Se incubo una mezcla de tampon de dilucion, sobrenadante de hibridoma y conjugado de rata anti-raton durante toda la noche a RT con agitacion en tubos que contenfan tiras recubiertas previamente con diversos isotipos de anticuerpo murino de captura. Se retiraron las tiras de los tubos, se aclararon suavemente en dhhO y se determinaron los isotipos.
Tabla 1. Propiedades de los anticuerpos monoclonales antiidiotfpicos para cCLB8 de raton
Codigo C
Isotipo
C433A
IgG1 k
C434A
IgG1 k
C435A
IgG1 k
C436A
IgG2bK
C437A
IgG1 k
C438A
IgG1 k
C439A
IgG1 k
Ensayos de inhibicion serica
Se determino el efecto del suero humano normal combinado (NHS) sobre la capacidad de los 7 anticuerpos anti-id para unirse a cCLB8. Se incubaron las diluciones dobles en serie de los Mab anti-Id partiendo de 50 pg/ml en presencia de NHS al 0%, 0,5%, 5% y 50% durante 30 minutos a 37°C. Se transfirieron las mezclas a placas recubiertas con cCLB8 y se incubaron durante 30 minutos a 37°C. A continuacion, se lavaron las placas, se hibridaron con anticuerpo de cabra anti-IgG de raton Fc*HRP. A ninguno de los Mab anti-Id se le impidio la union a cCLB8 mediante NHS al 0% y al 0,5%. Tres Mab (C433A, C435A y C437A) presentaron inhibicion parcial de la union por NHS al 5%. Todos excepto C434A y C436A se vieron influidos significativamente por una concentracion de NHS del 50% (Figuras 8 A-G).
Inhibicion de la union de cCLB8 a HuIL-6 por los Mab anti-id
Se evaluo la capacidad de los 7 anticuerpos anti-Id para inhibir la union de cCLB8 a HuIL-6. Estudios de EIA anteriores demostraron que cCLB8 se une muy debilmente a placas recubiertas con HuIL-6. Dos Mab (C435A y C437A) a concentraciones 6-25 veces superiores demostraron una inhibicion practicamente completa de la union de cCLB8 a HuIL-6. C434A expresaba un efecto inhibidor para cCLB8 solamente a una cantidad 25 veces superior. Los dos anticuerpos que mejor inhibfan la union de cCLB8 a HuIL-6 fueron C436A y C439A. Estos dos anticuerpos fueron capaces de inhibir completamente la union de cCLB8 en un intervalo de concentraciones 3 a 25 veces superior. C433A y C438A no presentaron actividad inhibidora (Figura 9). Este ensayo confirmo los resultados obtenidos en un estudio preliminar.
Union de anticuerpos anti-id a cCLB8 previamente unido a HuIL-6
Se examino la capacidad de los 7 anticuerpos anti-id para unirse a cCLB8 que estaba previamente unido a HuIL-6. Se incubo cCLB8 a 10 pg/ml en placas con HuIL-6 durante 30 minutos a 37°C. Se lavaron las placas y a continuacion se incubaron con diluciones triples en serie de los mAb anti-id partiendo de 10 pg/ml durante 30 minutos a 37°C. Se lavaron las placas y a continuacion se hibridaron con anticuerpo de cabra anti-Ig de raton Fc*HRP. Al igual que en los estudios preliminares, C436A y C438A fueron los unicos anticuerpos capaces de unirse cCLB8 que estaba previamente unido a HuIL-6. La figura 10 ilustra las capacidades de union de los 7 anticuerpos anti-id para cCLB8 que estaba previamente unido a HuIL-6.
En resumen, se produjeron siete anticuerpos antiidiotfpicos monoclonales a partir de la fusion de celulas de mieloma murino y celulas de bazo de un raton Balb/c inmunizado con anticuerpo hfbrido anti-IL-6 humana (cCLB8). Cinco de los anticuerpos anti-id (C434A, C435A, C436A, C437A y C439A) eran capaces de bloquear la union de cCLB8 HuIL-6. Dos anticuerpos (C436A y C438A) posefan la capacidad de unirse a cCLB8 que estaba previamente unido a HuIL-6 y dos anticuerpos (C434A y C436A) no se vieron practicamente influidos en su union a cCLB8 por ninguna concentracion de NHS ensayada. Los amplios perfiles de union de estos anticuerpos antiidiotfpicos cCLB8 hacen de algunos de ellos posibles candidatos para su uso como sondas farmacocineticas en los ensayos inmunohistoqufmicos y de deteccion en suero.
Resultara evidente que la invencion puede ponerse en practica de un modo diferente al descrito particularmente en la descripcion y los ejemplos anteriores.
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LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Centocor Inc.
<120> Anticuerpos Anti-IL-6, Composiciones, Metodos y usos
<130> P055093EP
<140> EP <141> 2002-10-26
<150> US 60/332743 <151> 2001-11-14
<160> 16
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1 <211>6 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 1
Ser Ser Phe Ala Met Ser 1 5
<210>2 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus
<400>2
Glu lie Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr val Thr 15 10 15
Gly
<210>3 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus
<400>3
Gly Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr 15 10
<210>4 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus
<400>4
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Ser Ala Ser Ser Ser val Ser Tyr Met Tyr 15 10
<210>5 <211>7 <212> PRT <213> Mus musculus
<400>5
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5
<210>6 <211>9 <212> PRT <213> Mus musculus
<400>6
Gin Gin Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr 1 5
<210>7 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus
<400>7

Glu Val Gin Leu val Glu Ser Gly Gly Lys Leu Leu Lys Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe ser Ser Phe 20 25 30

Ala Met Ser Trp Phe Arg Gin Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Glu lie Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60

Thr Gly Arg Phe Thr lie ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Ser val Thr Val Ser Ser 115
<210>8 <211> 106
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<400>8

Gin lie val Leu lie Gin Ser Pro Ala lie Met Ser Ala Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Lys val Thr Met Thr Cys Ser Ala ser Ser Ser val Ser Tyr Met 20 25 30

Tyr Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu lie Tyr 35 40 45

Asp Thr ser Asn Leu Ala ser Gly val Pro val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Thr ser Tyr Ser Leu Thr lie Ser Arg Met Glu Ala Glu 65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105
<210>9 <211> 18 <212>ADN <213> Mus musculus
<400>9
agtagctttg ccatgtct 18
<210> 10 <211> 51 <212>ADN <213> Mus musculus
<400> 10
gaaattagta gtggtgggag ttacacctac tatcctgaca ctgtgacggg c 51
<210> 11 <211> 30 <212>ADN <213> Mus musculus
<400> 11
ggtttatggg ggtactatgc tcttgactac 30
<210> 12 <211> 30 <212>ADN <213> Mus musculus
<400> 12
agtgccagct caagtgtaag ttacatgtac 30
<210> 13 <211> 21 <212>ADN
5
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<400> 13
gacacatcca acctggcttc t 21
<210> 14 <211> 27 <212>ADN <213> Mus musculus
<400> 14
cagcagtgga gtggttaccc atacacg 27
<210> 15 <211> 357 <212>ADN <213> Mus musculus
<400> 15

gaggtgcaac tggtggaatc tggaggaaaa ttactgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctttgcca tgtcttggtt tcgccagtct 120

ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcagaa attagtagtg gtgggagtta cacctactat 180

cctgacactg tgacgggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240

ctggaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt attattgtgc aaggggttta 300

tgggggtact atgctcttga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctca 357
<210> 16 <211> 318 <212>ADN <213> Mus musculus
<400> 16

caaattgttc tcatacagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60

atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgtact ggtaccagca gaagccagga 120

tcctccccca gactcctgat ttatgacaca tccaacctgg cttctggagt ccctgttcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagccgaat ggaggctgag 240

gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtggttacc catacacgtt cggagggggg 300 accaagctgg aaataaaa 318

Claims (17)

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    Reivindicaciones
    1. Un anticuerpo hfbrido, humanizado o CDR injertado o fragmento de anticuerpo capaz de inhibir la IL-6 humana que comprende regiones determinantes complementarias (CDR) de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 y 6 derivado de un anticuerpo anti-IL-6 monoclonal murino CLB-8 y una region constante derivada de uno o mas anticuerpos humanos, en donde dicho anticuerpo hfbrido, humanizado o CDR injertado o fragmento de anticuerpo se une a IL-6 con una afinidad (Kd) de al menos 10-9 M.
  2. 2. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicacion 1 que neutraliza al menos una actividad de IL-6, como al menos una actividad seleccionada del grupo consistente de inhibicion de secrecion de IgM mu de celulas SKW6.4, inhibicion de IL-6 mediada por la produccion de MCP-1, inhibicion de senalizacion de IL-6 en celulas de leucemia monocfticas humanas THP-1, inhibicion de produccion de suero amiloide A inducido por IL-6 de celulas HepG2, e inhibicion de proliferacion celular inducida por rhIL-6.
  3. 3. Un anticuerpo hfbrido, humanizado o CDR injertado anti-IL-6 aislado o porcion especffica o variante, que comprende una region murina variable y constante humana, en donde dicho anticuerpo o porcion especffica o variante se une especfficamente a al menos un epftopo que comprende al menos 3 de los aminoacidos Gln29-Leu34 de IL-6 humana, en donde dicho anticuerpo o porcion especffica o variante se une a IL-6 con una afinidad de al menos 10-9 M.
  4. 4. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicacion 3 que neutraliza al menos una actividad de IL-6, como al menos una actividad seleccionada del grupo consistente de inhibicion de secrecion de IFN-gamma inducida por IL-6, inhibicion de citotoxicidad de celulas LAK, inhibicion de transcripcion de ARN, gamma IFN, inhibicion de celulas IFN gamma CD3+ intracelular, y expresion de CD95.
  5. 5. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 que se une a IL-6 con una afinidad (Kd) de al menos 10-10 M o al menos 10-11 M.
  6. 6. Una molecula de acido nucleico aislado que comprende un polinucleotido que codifica el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
  7. 7. Un vector, que comprende un acido nucleico de acuerdo con la reivindicacion 6, en donde dicho vector opcionalmente:
    (i) comprende al menos un promotor seleccionado del grupo consistente de un promotor de SV490 tardfo o temprano, un promotor de CMV, un promotor de HSV tk, un promotor de pgk (fosfoglicerato quinasa), un promotor de inmunoglobulina humana o un promotor de EF-1 alfa; o
    (ii) comprende al menos un gen de seleccion o porcion del mismo seleccionado de al menos uno de metotrexato (MTX), protefna fluorescente verde (GFP), dihidrofolato reductasa (DHFR), neomicina (G418) o glutamina sintetasa (GS).
  8. 8. Una celula hospedadora que comprende un acido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicacion 6, en donde dicha celula hospedadora es una celula COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, de mieloma o de linfoma, o cualquier celula derivada, inmortalizada o transformada de las mismas.
  9. 9. Un metodo para producir al menos un anticuerpo anti-IL-6 o porcion especffica o variante, que comprende traducir un acido nucleico segun la reivindicacion 6, en condiciones in vitro, in vivo o in situ, de manera que el anticuerpo anti-IL-6 o porcion especffica o variante se exprese en cantidades detectables o recuperables, en donde dicho metodo comprende opcionalmente mezclar el al menos un anticuerpo anti-IL-6 o porcion especffica o variante en al menos un tampon que contiene solucion salina o una sal.
  10. 10. Una composicion de anticuerpo anti-IL-6 o composicion de porcion especffica o variante, que comprende un anticuerpo anti-IL-6 o porcion especffica o variante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, y un vehfculo o diluyente, en donde dicha composicion de anticuerpo anti-IL-6 o porcion especffica o variante comprende opcionalmente al menos un compuesto o protefna seleccionado de al menos uno de un antagonista de TNF, un antirreumatico, un relajante muscular, un narcotico, un farmaco antiinflamatorio no esteroideo (SNAP), un analgesico, un anestesico, un sedante, un anestesico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano, un antipsoriasico, un corticosteroide, un esteroide anabolico, un mineral, una sustancia nutricional, una vitamina, una hormona relacionada con el calcio, un antidiarreico, un antitusivo, un antiemetico, un antiulceroso, un laxante, un anticoagulante, una epoetina, un filgrastim, un sargramostim, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona de crecimiento, un farmaco de sustitucion hormonal, un modulador del receptor de estrogenos, un midriatico, un cicloplejico, un agente alquilante, un antimetabolito, un antimitotico, un radiofarmaco, un antidepresivo, un antimanfaco, un antipsicotico, un ansiolftico, un hipnotico, un simpaticomimetico, donepezilo, tacrina, un medicamento para el asma, un beta agonista, un esteroide inhalado, un inhibidor de leucotrienos, una metilxantina, una cromolina, una epinefrina, dornasa alfa y una citocina.
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  11. 11. Un anticuerpo anti-IL-6 o porcion especffica o variante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para su uso en terapia de una celula, tejido, organo o animal.
  12. 12. El anticuerpo anti-IL-6 de la reivindicacion 11, en donde:
    (i) dicho animal es un primate, un mono o un humano;
    (ii) dicho anticuerpo es adecuado para el contacto o administracion a 0,001-50 mg/kilogramo de dichas celulas, tejido, organo o animal;
    (iii) dicho anticuerpo es adecuado para el contacto o administracion a 0,0001-50 mg/kilogramo de dichas celulas, tejido, organo o animal;
    (iv) dicho anticuerpo es adecuado para el contacto o administracion a 0,01-50 mg/kilogramo de dichas celulas, tejido, organo o animal;
    (v) dicho anticuerpo anti-IL-6 o porcion especffica o variante es adecuado para el contacto o administracion por al menos un modo seleccionado de intravenoso, intramuscular, bolo, subcutaneo, respiratorio, inhalacion, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal o transdermico; o
    (vi) dicho uso comprende ademas el uso de, antes, concurrentemente o despues de dicho anticuerpo anti-IL- 6 o porcion especffica o variante, al menos una composicion que comprende una cantidad terapeuticamente efectiva de al menos un compuesto o protefna seleccionado de al menos uno de un antagonista de TNF, un antirreumatico, un relajante muscular, un narcotico, un farmaco antiinflamatorio no esteroideo (SNAP), un analgesico, un anestesico, un sedante, un anestesico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano, un antipsoriasico, un corticosteroide, un esteroide anabolico, un mineral, una sustancia nutricional, una vitamina, una hormona relacionada con el calcio, un antidiarreico, un antitusivo, un antiemetico, un antiulceroso, un laxante, un anticoagulante, una epoetina, un filgrastim, un sargramostim, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona de crecimiento, un farmaco de sustitucion hormonal, un modulador del receptor de estrogenos, un midriatico, un cicloplejico, un agente alquilante, un antimetabolito, un antimitotico, un radiofarmaco, un antidepresivo, un antimanfaco, un antipsicotico, un ansiolftico, un hipnotico, un simpaticomimetico, donepezilo, tacrina, un medicamento para el asma, un beta agonista, un esteroide inhalado, un inhibidor de leucotrienos, una metilxantina, una cromolina, una epinefrina, dornasa alfa y una citocina.
  13. 13. Un dispositivo medico, que comprende al menos un anticuerpo anti-IL-6 o porcion especffica o variante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dicho dispositivo es adecuado para poner en contacto o administrar dicho al menos un anticuerpo anti-IL-6 o porcion especffica o variante por al menos un modo seleccionado de intravenoso, intramuscular, bolo, subcutaneo, respiratorio, inhalacion, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal o transdermico.
  14. 14. Una formulacion que comprende al menos un anticuerpo anti-IL-6 o porcion especffica o variante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, y al menos uno seleccionado de agua esteril, agua tamponada esteril, o al menos un conservante seleccionado del grupo consistente de fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bencflico, nitrito fenilmercurico, fenoxietanol, formaldehfdo, clorobutanol, cloruro de magnesio, alquilparabeno, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, deshidroacetato de sodio y timerosal, o mezclas de los mismos, en un diluyente acuoso, en donde opcionalmente:
    (i) la concentracion del anticuerpo anti-IL-6 o porcion especffica o variante es de alrededor de 0,1 mg/ml a alrededor de 100 mg/ml;
    (ii) la formulacion comprende ademas un agente de isotonicidad;
    (iii) la formulacion comprende ademas un tampon fisiologicamente aceptable;
    (iv) el anticuerpo anti-IL-6 o porcion especffica o variante esta en una forma liofilizada; o
    (v) el anticuerpo anti-IL-6 o porcion especffica o variante esta en un primer contenedor, y un segundo contenedor opcional comprende agua esteril, agua tamponada esteril, o al menos un conservante seleccionado del grupo consistente de fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bencflico, nitrito fenilmercurico, fenoxietanol, formaldehfdo, clorobutanol, cloruro de magnesio, alquilparabeno, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, deshidroacetato de sodio y timerosal, o mezclas de los mismos, en un diluyente acuoso, en donde opcionalmente: (a) la concentracion del anticuerpo anti-IL-6 o porcion especffica o variante se reconstituye a una concentracion de alrededor de 0,1 mg/ml a alrededor de 500 mg/ml; (b) la formulacion comprende ademas un agente de isotonicidad; o (c) la formulacion comprende ademas un tampon fisiologicamente aceptable.
  15. 15. Un artfculo de fabricacion para uso farmaceutico humano, que comprende material de envase y un contenedor que comprende una solucion o una forma liofilizada de al menos un anticuerpo anti-IL-6 o porcion especffica o variante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde opcionalmente:
    (i) dicho contenedor es un contenedor de vidrio o plastico que tiene un tope para la administracion multi-uso;
    (ii) dicho contenedor es un envase blister, capaz de ser perforado y usado por via intravenosa, intramuscular, bolo, intraperitoneal, subcutanea, respiratoria, inhalacion, nasal, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal,
    subdermica o transdermica;
    (iii) dicho contenedor es un componente de un dispositivo o sistema intravenoso, intramuscular, bolo, intraperitoneal, subcutaneo, respiratorio, inhalacion, nasal, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal, subdermico o transdermico; o
    5 (iv) dicho contenedor es un componente de un inyector o dispositivo inyector de pluma o sistema para
    intravenoso, intramuscular, bolo, intraperitoneal, subcutaneo, respiratorio, inhalacion, nasal, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal, subdermico o transdermico.
  16. 16. Un metodo para producir al menos un anticuerpo anti-IL-6 o porcion especffica o variante de acuerdo con 10 cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende proporcionar una celula hospedadora o animal transgenico o
    planta transgenica o celula vegetal capaz de expresar en cantidades recuperables dicho anticuerpo o porcion especffica o variante, en donde:
    (i) dicha celula hospedadora es una celula mamffera, una celula vegetal o una celula de levadura; o 15 (ii) dicho animal transgenico es un mamffero como una cabra, una vaca, una oveja, un caballo, y un primate
    no humano.
  17. 17. Un animal o planta transgenico no humano que expresa al menos un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
    20
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