PT100372A - Composicao detergente granular de lavandaria compreendendo ingredientes detergentes convencionais, uma celulase alcalina e polivinilpirrolidona - Google Patents

Description

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1 Composição Detergente Granular de Lavandaria compreendendo ingredientes detergentes convencionais# uma celuiase alcalina e polivinilpirrolidona" 5 Campo Técnico A presente invenção refere-se à lavagem de te eidos, são apresentadas composições detergentes de lavandaria que são especificamente projectadas para a lavagem de 3 tecidos de cor. As composições detergentes de acordo com a presente invenção mantêm a pureza das cores# especialmente apôs lavagens repetidas.

Antecedentes 15

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As composições detergentes de lavandaria são bem conhecidas: no meio# sabendo-se da utilização de polímeros de vinilpirrolidona em tais composições# como se descreve na EP 262 897 e EP 256 696. É também conhecida a utilização desses polímeros em composições detergentes especialmente projectadas para a lavagem de tecidos de cor, tal como se refere na EP-A-265 257, que descreve composições contendo um polímero de vinilpirrolidona, um polímero car-boxilado e uma carboximetil celulase; e na EP 372 291, que descreve composições detergentes constituídas por uma mistura tensio-activa específica e um polímero de vinil pirro-lidona. Mais especificamente, sabe-se que os polímeros de vinil pirrolidona actuam como inibidores da transferência de pigmentos no processo de lavagem, como se descreve na DE 28.14.287 e DE 28.14.329. Ê também conhecido o uso de enzimas em compo sições detergentes de lavandaria, incluindo celulase. Sabe--se que a celulase tem um certo efeito na manutenção das co res dos tecidos na medida em que controla a remoção de camadas dos tecidos. Este facto é descrito por exemplo, na EP 177 165. -2- 35 64.675 CM 368 Μ

Descobriu-se agora poder conseguir-se uma melhor manutenção das cores na lavagem pela utilização de uma composição detergente que inclua tanto uma polivinilpir rolidona como uma celulase; verificou-se que o efeito combinado destes dois ingredientes é surpreendentemente superior à soma dos efeitos obtidos por cada um deles, individualmente .

Sumário da Invenção

As composições da invenção são composições de detergentes de lavandaria que incluem ingredientes detergentes convencionais e que se caracterizam por incluírem uma celulase alcalina num teor no produto final que garanta o fornecimento à solução de lavagem de entre 0,005 e 40 mg/l da referida celulase e uma polivinilpirrolidona com uma massa molecular de 5000 a 1 000 000, num teor no produto final que garanta o fornecimento à solução de lavagem, de 5 a 500 mg/1 da referida polivinilpirrolidona.

Descrição Detalhada da Invenção

As composições detergentes de lavandaria da presente invenção são constituídas por ingredientes detergentes convencionais, incluindo agentes tensio-activos, a-gentes encorpantes e ingredientes menores.

Os agentes tensio-activos adequados para uso nas composições da presente invenção incluem agentes tensio -activos aniónicos, tais como os sais, solúveis em água, de alquilo benzeno sulfonatos, alquilo sulfatos, alquilo polie tóxi éter sulfatos, parafina sulfonatos, alfa-olefino sulfo natos, alfa-sulfoalquilcarboxilatos e seus ésteres, alquilo gliceril éter sulfonatos, monoglicerídeos de ácido gordo sulfatos e sulfonatos, alquil fenol polietóxil éter sulfatos, 2-acyloxi-alcano-l-sulfonatos, e betaalquiloxi sulfonatos . -3- 1 5 10 15

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Sao especialmente preferidos os alquilo ben-zeno sulfonatos com 9 a 15 átomos de carbono numa cadeia alquilo linear ou ramificada, especialmente com cerca de 11 a 13 átomos de carbono. 0s alquilo sulfatos adequados contêm desde 10 a 22 átomos de carbono na cadeia alquilo, e, especialmente, desde 12 a 18 átomos de carbono. Os alquilo polietóxi éter sulfatos contêm desde 10 a 18 átomos de carbono na cadeia alquilo, e têm uma média de 1 a 23 grupos -CH2 CH2 0- por molécula; ou, mais particularmente, contêm desde 10 a 16 átomos de carbono na cadeia alquilo e uma média de 1 a 6 grupos -CH2 CH2 -0 por molécula. Os parafina sulfonatos adequados sao essenci·· almente lineares e contêm de 8 a 24 átomos, mais especialmente, de 14 a 16 átomos de carbono. Os alfa-olefina sulfonatos intercalar: "adequados contêm entre 10 e 24 átomos de carbono, ou, mais particularmente, entre 14 e 16 átomos de carbono; os alfa-olefina sulfonatos ..." podem ser preparados por reacção com trióxido de enxofre, seguida de neutralização sob condições que façam com que quaisquer sultonas presentes sejam hidrolizadas nos correspondentes hidroxi al-· 4 cano sulfonatos. Os alfa-sulfocarboxilatos adequados contêm de 6 a 20 átomos de carbono; estão aqui incluídos não apenas os sais dos ácidos gordos alfa sulfonados mas também os seus ésteres obtidos a partir de álcoois contendo 1 a 14 á-tomos de carbono. Os alquilo gliceril éter sulfatos adequados são éteres de álcoois contendo 10 a 18 átomos de carbono, mais especialmente, os derivados de óleo de coco e sebo. Os alquilo fenol polietóxi éter sulfatos adequados têm 8 a 12 átomos de carbono na cadeia alquilo, e uma média de 1 a 6 grupos CH2CH2O- por molécula. Os 2-aciloxialcano-l-sulfona-tos adequados contêm 2 a 9 átomos de carbono no grupo acilo e 9 a 23 átomos de carbono no grupo alcano. Os beta-alquilo^ xi alcano sulfonatos adequados contêm 1 a 3 átomos de carbono no grupo alquilo e 8 a 20 átomos de carbono no grupo _4_ 35

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Os agentes tensio-activos não iónicos adequados para uso nas composições aqui apresentadas são substâncias etóxiladas de HLB 11,5-17,0/ solúveis em água, e incluem etóxilatos de álcoois primários e secundários Ciq-C2q, e Cg-10 alquilfenol etóxilatos. são exemplos preferenciais os álcoois lineares primários C14-I8, condensados com entre sete e trinta moles de óxido de etileno por molécula de álcool, como Ci4-Ci5(E)7, Cig-ig(E0)25 e, especialmente, c16—18(E0)11 ·

Outra classe de agentes tensio-activos não iónicos é constituída por compostos de alquilo glucosídeo com a formula genérica RO(CnH2n0)tZx em que Z é um grupo derivado da. glucose; R é um grupo alquilo hidrofóbico saturado que contém 12 a 18 átomos de carbono; t é de 0 a 10 e n é 2 ou 3; e x é de 1,3 a 4; os compostos incluem menos de 10% de álcool gordo não reagido e menos de 50% de alquilo de cadeia curta poliglucosídeos. Compostos deste tipo e a sua utilização em detergentes são des. critos na EP-B0070077, 0075996 e 0094118. são também adequados como agentes tensio-activos não iónicos os agentes tensio activos de poli hidroxi amidas de ácidos gordos com a fórmula

r2 - c -N - Z

II 0 R1 em que R^ é H, C^-4 hidrocarbilo, 2-hidroxietilo, 2-hidro-propilo ou uma sua mistura; R2 é C5-31 hidrocarbilo; e Z é um polihidroxihidrocarbilo contendo uma cadeia linear hidro carbilo com, pelo menos, 3 hidroxilos directamente ligados à cadeia, ou um seu derivado alcoxilado. De preferência, -5- 1 5 10 15

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64.675 CM 368 M 1.^:7 R1 é metilo, R2 é uma cadeia linear Cn-15 alquilo ou alceni lo, tal como alquilo de coco ou suas misturas, e Z é derivado de um açúcar redutor, tal como as glucose, frutose, mal tose,lactose, numa reacção de aminação redutora. Podem usar-se outros tipos de agentes tensio--activos, tais como agentes tensio-activos anfotéricos zwit-teriónicos, bem como catiónicos. Os co-agentes tensio-activos catiónicos que podem aqui ser utilizados, incluem compostos de amónia quaternária solúveis em água, sob a forma R4 R5 Rg R7 N+ X-, em que R4 é um grupo alquilo contendo 10 a 20, de preferência 12-18 átomos de carbono, e Rg, Rg e R7 são, 'cada um, Cj a C7 alquilo, de preferência metilo; X- é um anião, como por exemplo, cloreto. Exemplos destes compostos de trimetilc amónia incluem cloreto de C12-14 alquilo trimetilo amónia e methosulfato de cocalquilo trimetilo amónia. As composições da presente invenção são constituídas por 1-70% em peso de agente tensio-activo, de preferência, por 10% a 30%, e, ainda mais preferêncialmante, por 15% a 25%. Agentes encorpantes 25 30

Os encorpantes adequados para uso nesta inver ção incluem os nitrilotriacetatos, policarboxilatos, citratos, fosfatos solúveis em águà, tais como tri-polifosfatos e orto- e piro-fosfatos de sódio, e suas misturas. Os se-questrantes de iões metálicos incluem todos os agentes anteriores e ainda substâncias como a etilenodiaminatetraceta-to, os aminopolifosfonatos e uma grande variedade de outros ácidos e sais orgânicos polifuncionais, demasiado numerosos para poderem ser aqui mencionados. Veja-se a patente dos Estados Unidos da América no.3.579.454 para exemplos típicos do uso destas substâncias em várias composições de limpeza. Os ácidos orgâncios polifuncionais preferidos para utilização nesta invenção são o ácido cítrico,o ácido etilenodiami- -6- 35

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90(08 20 25 30 na tetrametileno fosfónio, e o ácido dietilenotriaminapen-tametilenofosfónico. Uma outra classe de substâncias encorpantes de detergentes úteis à presente invenção são os aluminosili-catos de sódio insolúveis. 0 encorpante de zeólito de tamanho 1-10 micron (por exemplo, zeólito A) apresentado na Patente Germânica 24 22 655 é particularmente preferido para utilização em composições com reduzido teor em fosfato. As composições aqui apresentadas podem, também, conter ácidos gordos, saturados ou insaturados, e os sabões correspondentes. Os ácidos gordos adequados, saturados ou insaturados, têm 10 a 18 átomos de carbono na cadeia alquilo, são preferidas as espécies insaturadas contendo 14 a 18 átomos de carbono na cadeia alquilo, sendo o mais preferido o ácido oleico. Os sabões correspondentes podem também ser utilizados. As composições aqui apresentadas podem também conter compostos com a fórmula genérica R-CH(C00H)CH2 (C00H), isto é, derivados de ácido succínico, em que R é c10"c20 alquilo ou alcenilo, de preferência Ci2-C16' ou em que R pode ser substituído por substituintes hidroxilo, sul fo, sulfoxi ou sulfona. Os encorpantes de succinato são de preferência, utilizados sob a forma dos seus sais solúveis em água, incluindo os sais de sódio, potássio, amónia e alcanolamó-nia. Exemplos específicos de encorpantes de succi-· nato incluem: lauril succinato, miristil succinato palmitil succinato, 2-dodecenil succinato (preferido), 2-pentadece-nil succinato, e compostos semelhantes. São também úteis como encorpantes no presente contexto os compostos descritos na Patente Norte Americana 4 663 071, isto é, misturas de tartrato de ácido monosu-ccinio e de tartrato de ácido disuccínico, com uma razão mássica de monossuccinico para disuccínico de 97:3 a 20:80, -7- 35

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20 25 30 de preferência, 95:5 a 40:60. As composições de acordo com a presente invenção são constituídas em 1% a 70% de agente encorpante, de preferência, em 30% a 60%, e, ainda mais preferencialmen te, em 40% a 50%. As composições da presente invenção são caraç terizadas por conterem uma celulase alcalina e uma polivinil pirrolidona. É esta combinação específica de ingredientes que está na origem das superiores propriedades de protecção das cores de tecidos das composições da presente invenção. Estes benefícios de protecção das cores dos tecidos são obtidos mais claramente quando os tecidos são lavados repeti-damente com as composições da presente invenção deste modo, a presente invenção engloba também um método de lavagem de tecidos em que os tecidos são lavados repetidamente com uma composição produzida de acordo com a presente invenção. A Celulase A celulase utilizável na presente invenção pode ser qualquer celulase de bactérias ou fungos, com um pH óptimo de 5 a 9,5. Descrevem-se celulases adequadas na GB-A-2 075 028; GB-A-2 095 275 e DE-OS-24 47 832. São exemplos destas celulases as celulases produzidas por uma espécie de Humicola insolens (Humicola grisea var thermoidea), particularmente pela espécie de Humicola DSM 1800, celulases produzidas por um fungo de Bacilo N ou um fundo produtor de celulase 212 pertencente ao género Aeromonas, e, ainda, celulase extraída do hepatopân-creas de um molusco marinbo (Dollabella Aurícula Solander). A celulase adicionada à composição da invenção pode encontrar-se na forma de granulado sem pó, como por exemplo, "marumes" ou "prills", ou na forma de um líquido no qual a celulose é fornecida como um concentrado de celulase em suspensão, por exemplo, num agente tensio-acti- -8- 35 1 5 10 15

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'9. fJL I99.V vo não-iónico ou dissolvido num meio aquoso. As celulases preferidas para uso nesta inven ção são caracterizadas por a referida celulase promover uma remoção de pelo menos 10% de carboximetilcelulose radioacti-va marcada e imobilizada/ de acordo com o método C14 CMC/ a uma concentração de 25X10~6%, em peso/, de proteína de celulase na solução do teste de lavagem. Outros sais orgânicos soláveis em água adequados são os ácidos homo-ou co-poliméricos ou seus sais, nos quais o ácido policarboxílico é constituído por, pelo menos, dois radicais carboxilo, separados um do outro por não mais do que dois átomos de carbono. Descrevem-se polímeros deste tipo na GB-A-1.596.756. são exemplos destes sais os poliacrilatos de MW2000-5000 e os seus copolímeros com anidrido maleico, ten do tais copolímeros uma massa molecular de 20.000 a 70.000, especialmente de cerca de 40.000.

Celnlase A actividade dos enzimas e particularmente a actividade da enzima celulase, tem sido definida para várias aplicações por diferentes métodos analíticos. Todos estes métodos tentam proporcionar uma avaliação realista do desempenho esperado sob condiçoes de utilização ou, pelo me nos, uma medição coorelacionada com o desempenho em condições de utilização. Como se especifica no Requerimento de Patente Europeia EP-A-350098, muitos dos métodos, particularmente os mais frequentemente utilizados pelos produtores de celulases, não se encontram suficientemente coorelacio-nados com o desempenho em condições de utilização da celulase em composições detergentes de lavandaria. Este facto é devido às várias outras condições de utilização para as quais estes métodos de medição de actividade foram desenvol_ vidos. 0 método descrito na EP-A-350098, foi desen- -9- 64.675 CM 368 Μ

¥ volvido para ser e para ter uma coorelação preditiva com vista ao escalonamento da actividade das celulases em composições detergentes de lavandaria.

Deste modo, a presente invenção usa o método apresentado' na EP-A-350098 para apreciação de celulases com o fim de distinguir as celulases que são úteis à presente invenção das que não satisfazem os objectivos da mesma. 0 método de apreciação, adiante referido como método C14CMC, que foi adoptado do método apresentado na EP-A-350098, pode ser descrito como segue:

Principio; 0 princípio do método C14CMC para a apreciação de celulases é a medição, a uma determinada concentração de celulase numa solução de lavagem, da remoção de car-boxi metil celulose (CMC) imobilizada de um substrato de te eido. A remoção de CMC é medida através de marcação radio-activa de alguma da CMC com carbono C14 radioactivo. A simples medição da quantidade de C14 radioactivo no substrato de tecido antes e depois do tratamento com celulase permite a avaliação da actividade da celulase.

Preparação das amostras;

Preparação da CMC : a solução de CMC radio-activa é preparada de acordo com a Tabela I. A CMC radio-activa pode ser obtida pelos métodos referidos na EP-A-350098.

Substratos de Tecidos : Os substratos de tecidos sao pedaços de algodão fino com um tamanho de 5 cm por 5 cm. Sao inoculados com 0,35 ml da solução de CMC marcada radio-activamente, no centro dos pedaços de tecido. Os pedaços de algodão são, então, secos ao ar.

Imobilização da CMC : Para imobilizar a CMC, marcado radio-activamente, nos pedaços de algodão fino, é utilizado o equipamento de medição de lavagem "Limitest -10-

64.675 CM 368 M 1 Original Haunau", fabricado por Original Haunau, Alemanha. Um frasco de metal do equipamento é cheio com 400 ml de á-gua dura (4 mmol/litro de iões Ca++). Pode usar-se um número máximo de 13 pedaços de tecido por frasco. 0 recipiente 5 é, então, incubado num ciclo de aquecimento de 20°C a 60°C, durante 40 minutos, no equipamento de medição de lavagem. Após a incubação, os pedaços de tecido são enxaguados, sob água corrente camarária, durante 1 minuto, são espremidos e deixados secar ao ar durante, pelo menos, 30 minutos. De 10 acordo com a EP-A-350098, as amostras de pedaços de tecido com a CMC radio-activa imobilizada podem, também, ser medidas como "amostras em branco", sem lavagem.

Tratamento das Amostras; 15

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Solução do teste de lavagem : A solução do teste de lavagem é preparada de acordo com a composição da Tabela II. É ajustada a um pH de 7,5. A solução do teste de lavagem é a base à qual se adiciona a amostra do teste de celulase. Deve-se ter cuidado para não diluir a solução do teste de lavagem pela adição de água até um equilíbrio de 100% antes de se ter determinado a quantidade de celulase a adicionar. A quantidade de celulase que é utilizada neste teste de apreciação e selecção deve ser a necessária para fornecer uma percentagem de 25 X 10-6 por cento, em peso, de proteína de celulase à solução do teste de lavagem (equivalente a 0,25 miligramas/litro, a 14,5°C). Procedimento de lavagem : Os pedaços de tecido assim inoculados com CMC marcado radio-activamente são então tratados num processo de simulação de lavandaria. 0 processo de lavandaria é simulado no equipamento de medição de lavagem "Linitest, OriginalHaunau", da Original Haunau, Alemanha. Coloca-se um pedaço de tecido individual num fras^ co de vidro de 20 cm^. 0 frasco é cheio com 19 ml da solução do teste de lavagem, sendo depois selado hermeticamente Colocam-se 5 frascos de vidro em cada recipiente do equipa- -11- 35 1

64.675 CM 368 M *1 125? mento de medição de lavagem. Este é cheio com água como meio detranferência de calor para a simulação de lavagem. A simulação de lavagem é conduzida como um ciclo de aquecimento de 20°C a 60°C/ durante 40 minutos. 5

Após o processamento das amostras, os frascos de vidro são submersos em água fria, sendo, subsquentemente, cada pedaço de tecido retirado do seu frasco, enxaguado num recipiente sob água corrente macia, espremido e deixado secar ao ar durante, pelo menos, 30 minutos. 10

Medições: 15

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Para medir a remoção da CMC marcada radio-ac-· tivamente utiliza-se um contador de cintilação, como, exemplo um contador de cintilação LKB 1210 Ultrabeta. Para se obterem resultados mais precidos, deve seguir-se o manual de instruções do contador de cintilação específico do equipamento utilizado. Por exemplo, para o contador de cintilação LKB 12Í0 Ultrabeta, deve seguir-se o seguinte procedimento. 0 pedaço de tecido a ser medido é colocado num rece-piente de plástico cheio com 12ml de líquido cintilador (por exemplo, cintilador 299 da Parckard). Deixa-se então estabe-lizar o pedaço de tecido durante, pelo menos, 30 minutos, 0 recipiente é depois colocado no contador de cintilação LKB 1210 Ultrabeta, obtenso-se a contagem radioactiva correspondente ao retalho de tecido. Com o objectivo de medir a quantidade de CMC que é removida unicamente por efeito de celulase, é necessário dispor-se também da medicação de um pedaço de tecido que tenha sido inoculado ao mesmo tempo, mas que tenha sido tratada na solução de teste de lavagem sem celulase. A actividj, de da celulase é então expressa como a percentagem de remoção da CMC radio-activamente marcada. A percentagem é calculada pela seguinte fórmula: % de remoção da CMC marcada

XO - XC X 100

XO -12- 35

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Mod. 71 - 20.000 e*. - 90/08 20 25 30 1 em que XO é a contagem da cintilação radioactiva de um pedaço de tecido tratado com a solução do teste de lavagem sem celulase; XC é a contagem da cintilação radioactiva de um pedaço de tecido tratado com a solução do teste de lava-5 gem contendo a celulase a ser avaliada.

Considerações Estatísticvas/ Confirmação do Procedimento:

Para se obterem resultados estatisticamente significativos, deve empregar-se a análise estatística stan-· dart. Para o exemplo apresentado, usando o contador de cintj, laçao LKB 1210 Ultrabeta, verificou-se que pode ser utilizado um tamanho de amostra de 3 pedaços de tecido para cada contagem de cintilação radioactiva.

Para se confirmar o procedimento por verifica w çao interna, recomenda-se as medições e os cálculos do "ensaio em branco", de acordo com a EP-A-350098. Isto permitirá detectar e eliminar erros.

Interpretação dos Resultados: 0 método de apreciação e escolha descrito proporciona, efectivamente um método rápido, único e seguro de identificação das celulases que satisfazem o critério de actividade da presente invenção relativamente às celulases que não fazem parte da presente invenção .

Verificou-se que uma remoção de 10¾ ou mais da CMC imobilizada, marcada radioactivamente, de acordo com o método C^4 CMC anteriormente apresentado, indica que a respectiva celulase satisfaz os requisitos da invenção. É obvio, para os especialistas da técnica, que percentagens de remoção superiores a 10% indicam uma maior actividade da celulase respectiva. Considera-se, portanto, que uma celulase que promova uma remoção acima de 25% ou, de preferência, acima de 50% da CMC marcada radioac·· tivamente, à concentração de proteína na solução do teste -13- 35

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20 25 de lavagem de acordo com o método C^4 CMC, dá indicação de um desempenho ainda melhor da celulase para utilização em detergentes de lavandaria.

Admite-se também que a utilização de concentrações mais elevadas de celulase para o método C14 CMC per mitem obter percentagens de remoção mais elevadas. Contudo, não existe nenhuma comprovada coorelação directa entre a concentração de celulase e a percentagem de remoção por ela obtida.

Tabela I: Solução de CMC marcada radiocativamente (todas as percentagens são em peso do total sa solução) CMC total 1 99,2 X 10"3% (CMC deverá ser CMC com grau de detergente, com um grau de substituição de cerca de 0,47 a cerca de 0,7

Etanol 14985,12 X 10-3% Água Desionizada 84915,68 X 10“3% Total: 100% -14- 35 1 A CMC total contém CMC não radioactiva e CMC radioactiva para gerar uma radioactividade que permita leituras suficientemente claras no contador de cintilação utilizado. Por exemplo, a CMC radioactiva pode ter uma acti -vidade de 0,7 milicurie/g e ser misturada.

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Tabela II Solução do teste de lavagem (todas as percentagens são em peso do total da solução) Ácido 0-12 alquilo ninear benzeno sulfónico 0,110% Alquilo sulfato de coco (sal TEA) 0,040% Ci2_i5 álcool etóxilato (E07) 0,100% Ácido gordo de coco 0,100% Ácido oleico 0,050% Ácido cítrico 0,010% Trietanolamina 0,040% Etanol 0,060% I Propanodiol 0,015% Hidróxido de Sódio 0,030% Formato de sódio 0,010% Protease 0,006% Água (2,5 mmol Ca++/litro), agente de parte restante ajustamento de pH (soluções de HCL ou até 100% de NaOH e celulase 35

De acordo com a presente invenção, as célula. -15- 1 5 10 15

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ses preferidas sao as descritas no Requerimento de Patente Internacional W0 91/17243. Por exemplo, uma preparação de celulase útil às composições desta invenção pode consistir, essencialmente, numa endoglucanase homogénea, que é imuno-reactiva com um anti-corpo criado contra uma celulose 43 KD altamente purificada, derivada da Humicola insolens, DSM 1800, ou que é homóloga da referida endoglucanase 43 KD. Deve assinalar-se que todas as enzimas ce-lulases, de acordo com a presente invenção, têm que obedecer aos critérios do teste de avaliação e escolha anteriormente mencionado. Contudo, no Requereimento de Patente Dinamarquesa 1159/90 estabelecem-se critérios adicionais que permitem identificar enzimas de celulase preferidas em combinação con o presente teste de avaliação e selecção. As preparações de celulase particularmente úteis às composições desta invenção são, para além do teste de avaliação e selecção,aquelas em que a componente endoglu canose exibe uma actividade de CMC endoase de, pelo menos, 50, de preferência, de, pelo menos, 60, e, em particular, de, pelo menos, cerca de 90 unidades de CMC-endoase por mg de proteína total. Mais especificamente, uma componente endoglucanase preferida exibe uma actividade de CMC endoase de, pelo menos, 100 unidades de CMC por mg de proteína total. No presente contexto, o termo "actividade CMC endoase" endoase" refere-se à actividade de endoglucanase da componente endoglucanase em termos da sua capacidade para degradar a celulose em glucose, celobiose e triose, de terminada pela diminuição de viscosidade de uma solução de carboximetil celulose (CMC) após incubação com a preparaçao de celulase desta invenção como adiante se descreve deta-lhadamente. A actividade de CMC endoase (endoglucanase) pode determinar-se a partir da diminuição da viscosidade de CMC, como se segue: Prepara-se uma solução de substrato, -16- 35 1 5 10 15

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t contendo 35 g/1 de CMC (Hercules 7 LFD) num tampão 0,1M a ph 9,0. A amostra de enzima a ser analizada é dissolvida no mesmo tampão. Misturam-se 10 ml de solução de substrato e 0,5 ml de solução de enzima e transferem-se para um viscosi-metro (por exemplo, Haake VT 181, sensor NV, 181 rpm), ter-mostatizado a 40°C. As medidas de viscosidade são tomadas logo que possível depois da mistura, e, novamente, após 30 minutos. A quantidade de enzima que, nestas condições, reduz a viscosidade a metada é definida como 1 unidade de actividç^ de de CMC endoase. Utilizou-se electroforese de gel de poliacri-lamida SDS (SDSrPAGE) e focagem isoeléctrica com proteínas marcadoras, de um modo conhecido pelos especialistas na técnica, para determinar a massa molecular e o ponto isoeléc-trico (pi), respectivamente, da componente endoglucanase na preparação de celulase útil no presente contexto. Deste modo, a massa molecular de uma componente endoglucanase específica foi determinada como sendo 43 DK. 0 ponto isoeléctri-co desta endoglucanase foi determinado como sendo de cerca de 5,1. A actividade de celobiohidrolase pode ser definida como a actividade em relação a celobiose p-nitrofeni:. A actividade é determinada como as moles de nitrofenilo libertado por minuto, a 37°C e a um pH de 7,0. Para a componente endoglucanase estudada, verificou-se não haver actividade de celobiohidrolase significativa. A comonente endoglucanase na preparação de celulase desta invenção foi inicialmente isolada através de exaustivos processos de purificação, isto é, envolvendo purificação por HPLC de fase inversa de uma mistura bruta de celulase H.insolens, de acordo com a Patente Norte Americana n®. 4 435.307. Este processo resultou, surpreendentemente, no isolamento de uma endoglucanase 43 KD como componente único com propriedades inesperadamente favoráveis, devido a uma actividade endoglucanase surpreendentemente eleva- -17- 30 1 5 10 15

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64.675 CM 368 M da.

Além do teste de àvaliação e escolha, as enzimas celulases úteis às presentes composiçoes podem ainda ser definidas como enzimas exibindo actividade endoglucana-se (seguidamente definidas como "enzimas endoglucanase"), enzimas estas que têm a sequência de amino ácidos apresentada na Listagem de Sequência ID 2 anexa,- ou as suas homólogas exibindo uma actividade endoglucanase. No presente contexto, o termo "homólogo" pre tende indicar um polipeptídeo com código de DNA que hibridi-za para a mesma sonda que o código de DNA da enzima endoglucanase com esta sequência de amino ácido, sob certas con dições específicas (tais como pré-maceração em 5 X SSC e pré-hibridização durante lh, a 40°C, numa solução de 20% formamida, solução 5XDenhardt, fosfato de sódio 50 mM, pH 6,8 e 50 ug de DNA de "sonicated thymus" desnaturado de vitelo, seguidas de hibridizaçao na mesma solução suplementada com 100 uMde ATP, durante 18h, a 40°C). 0 termo pretende incluir os derivados da sequência anteriormente mencionada obtidos por adição de um ou mais resíduos de amino ácido quer a um quer a ambos os átomos C e N terminais da sequência original; por substituição de um ou mais resíduos amino ácidos num ou mais locais da sequência original; por eliminação de um ou mais resíduos amino ácidos numa ou em ambas as extremidades da sequência original de amino ácidos ou em um ou mais locais no interior da cadeia original; ou por in serção de um ou mais resíduos amino ácidos em um ou mais lo cais da sequência original. A enzima endoglucanase aqui apresentada pode ser produzida por espécies de Humicola, tais como Humicola insolens, por exemplo a estripe DSM 1800, depositada em 1 de Outubro de 1981 no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Mascheroder Weg 1B D-3300 Braunschweig, Alemanha, de acordo com as disposições do tratado de Budapeste "Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microor- -18- 35 1 5 10 15

·*» DOO‘OS - l£ 'P°W 20 25 30

64.675 CM 368 M v/'

N

/ ganism for the Purposes of Patent Procedure" (Tratado de Budapeste, sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para efeitos de Procedimentos relativos a Patentes de Invenção). Ainda num outro aspecto/ as enzimas celula-ses óteis a esta invenção podem ser definidas, em complemen to do teste de avaliação e análise, como enzimas endogluca-nase que têm a sequência de amino ácido apresentada na listagem de sequência ID 4 anexa, ou suas homólagas (tal como anteriormente definido) exibindo actividade endoglucanase. As referidas enzimas endoglucanase podem ser produzidas por uma espécie de Fusarium, tal como Fusarium oxysporum, por exemplo a estirpe DSM 2672, depositada, em 6 de Junho de 1983, no Deutsch Sammmlung von Mikroorganismen, Mascheroder weg 1B, D-3300 Braunscfrweig, Alemanha, de acordo com as dis_ posições do Tratado de Budapeste. Por outro lado, admite-se que as endoglucana ses homólugas possam ser derivadas de outros microorganismos produtores de enzimas celulóticas, como, por exemplo, as espécies de Trichoderma, Myceliophthora, Phanerochaete, Schizophyllum, Penicillium, Asperqillus, e Geotricum contudo, para a produção industrial da preparação de celulase desta invenção, é preferível usar técnicas de recombinação de DNA ou outras técnicas envolvendo ajustamento de fermentação ou mutação dos microorganismos envolvidos, para assegurar a sobreprodução das actividades enzimáticas desejadas Estes métodos e técnicas são conhecidos no meio e podem ser facilmente executados pelos técnicos da especialidade. A componente endoglucanase pode portanto ser produzida por um método que inclua o cultivo de uma célula hospedeira, transformada com um vector DNA recombinan-te que transporta uma sequência de DNA codificando a referida componente endoglucanase ou um precursor da referida componente endoglucanase, bem como sequências de DNA codificando funções que permitam a expressão da sequência de -19- 35 1 5 10 15

Mod. 71 - 20.000 ex. -9O/0B 20 25 30

64.675 CM 368 M ^ , I“9.JI11992 DNA codificando a componente endoglucanase ou um seu precursor, num meio de cultura sob condições que permitam a expres. são da componente endoglutanase ou seu precursor e a sua recuperação a partir da cultura. As unidades de DNA constituídas por uma sequência de DNA codificando uma enzima endoglucanase com ante riormente se descreve, ou uma forma precursora da enzima, incluem as unidades de DNA com uma sequência de DNA representadas na listagem de sequência Ιϋφΐ ou ID^-3 anexa, ou uma sua modificação. São exemplos de modificações adequadas das sequências de DNA as substituições de nucleotídeos que não geram outras sequências de amino ácidos da endoglucanase, mas que correspondem à utilização do "codon" do organis. mo hospedeiro no qual é introduzido a unidade de DNA, ou substituições de nucleotáeos que efectivamente originam uma sequência de amino ácidos diferente e deste modo, possivelmente, uma diferente estrutura de proteína que pode gerar uma endoglucanase mutante com propriedades diferentes das da enzima original. Outros exemplos de modificações possíveis são a inserção de um ou mais nucleotídeos em qualquer extremidade da sequência, ou a eliminação de um ou mais nucleotídeos em qual extremidade ou no interior da sequência. As unidades de DNA codificando enzimas endoglucanase úteis a esta invenção podem ser preparadas sinteticamente por métodos standart estabelecidos como, por exemplo, através do método de fosfoamidite descrito por S.L. Beaucage e M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1981, páginas 1859-1869, ou do método descrito por Matthes et al., EMBO Journal 3, 1984, páginas 801-805. De acordo com o método de fosfoamidite, são sintetizados oligonucleotídeos, por exemplo, num sintetizador automático de DNA, sendo purificados, anelados, ligados e clonados em vectores adequados. Uma unidade de DNA codificando a enzima endoglucanase ou um precursor pode, por exemplo, ser isolada pelo estabelecimento de uma biblioteca de GDNA ou "genómica" -20- 35

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1 5 10 15

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20 25 30 de um microorganismo produtor de celulase, tal como Humicolê insolens, DSM 1800, e pela busca de clones positivos através de processos convencionais, tais como hibridização uti-lilzando oligonucleolídeos sintetizados com base na sequência toral ou parcial de amino ácidos da endoglucanase, de acordo com técnicas Standard (ver Sambrook et al., Molecular Clominq : A Laboratory Manual, 2§. edição Cold Spring Harbor, 1989), ou através da selecção dos clones que exprimem a actividade enzimática apropriada (isto é, a activida-de endoase de CMC, anteriormente definida), ou através da selecção de clones que produzam uma proteína que seja reac-tiva com um anti-corpo contra uma celulose original (endoglucanase ) . Finalmente, a unidade de DNA poderá ter uma origem mista sintética e "genémica", mista sintética e cDNA, ou mista "genémica" e cDNA, preparada por ligação de fragmentos de origem sintética, "genémica" ou cDNA (como apropriado) correspondendo os fragmentos a várias partes da unidade de DNA, de acordo com técnicas Standard. A unidade de DNA pode também ser preparada por reacção de polimerase em cadeia usando polímeros específicos, como por exemplo, se descreve na patente dos Estados Unidos da América n®.4683202 ou em R.K. Saiki et al., Science 239, 1988, páginas 487-491. Os vectores de expressão recombinante nos quais são inseridas as referidas unidades de DNA incluem qualquer vector que possa ser devidamente submetido a processos de recombinação de DNA, e a escolha do vector depende, muitas vezes, da célula hospedeira na qual deve ser introduzido. Deste modo, o vector pode ser um vector que se repliquem autonomamente, isto é, um vector que exista como uma entidade, extracromossómica, e cuja replicação é independente da replicaçao cromossómica, como, por exemplo,um plasmídeo. Em alternativa, o vector pode ser do tipo que, quando introduzido numa célula hospedeira, seja integrado no genoma da célula hospedeira e replicado conjuntamente com -21- 35 1 5 10 15

Mod. 71 - 20.000 et. - 90(08 20 25 30

64.675 CM 368 M ~2JSL19# o(s) cromossoma(s) no(s) qual(is) foi integrado. No vector, a sequência de DNA codificando a endoglucanase deve estar operacionalmente ligada a uma sequência promotora e finalizadora adequada. 0 promotor pode ser qualquer sequência de DNA que apresente actividade de transcrição na célula hospedeira escolhida/ e pode ser derivado de genes codificando proteínas quer homólogos quer heterólogas das da célula hospedeira. Os processos utilizados para ligar as sequências de DNA que codificam a endoglucanase, o promotor e o finalizador, réspectivamente, e para os inserir em vectores adequados são bem conhecidos dos técnicos da especialidade (veja-se, por exemplo, Sam-broolc et al, acima citado). As células hospedeiras que são transformadas com as unidades de DNA ou com os vectores de expressão ante riormente referidos podem, por exemplo, pertencer á espécies de Asperqillus, de preferência Asperqillvs oryzae ou Asper-qillus niqer. As células de fungos podem ser transformados por um processo envolvendo a formação de protoplastos e a transformação dos protoplastos seguida de regeneração da pa_ rede celular de um modo conhecido "per se". 0 uso de Asper-gillus como microorganismo hospedeiro é descrito na patente EP 238 023 (de Novo Industri A/S), cujo conteúdo é aqui incorporado para referência. A célula hospedeira pode também ser uma célula de levedura, como, por exemplo, uma espécie de Saccharomyces cerevisiae. Em alternativa, o organismo hospedeiro pode ser uma bactéria, em particular, espécies de Streptomyces e Bacillus, e E.Coli. A transformação de células bacteria-nas pode ser efectuada de acordo com métodos convencionais, como, por exemplo, se descreve em Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor,1989, A apreciação de sequências apropriadas de DNA e a construção de vectores pde também ser efectuada por pro cedimento Standard; veja-se Sambrook et al., anteriormente -22- 35 64.675 CM 368 Μ 4* / r --9

citado. 0 meio utilizado para cultivar as células hospedeiras transformadas pode ser qualquer meio convencional adequado para o crescimento das células hospedeiras em questão. A endoglucanase pode ser convenientemente segregada para o meio de cultura e recuperada deste por processos bem conhecidos, incluindo a separação das células do meio através de centrifugação ou filtração ou a precipitação dos componentes proteicos do meio através da utilização de um sal, tal como o sulfato de amónia, seguida de processos cro · matográficos tais como cromatografia de permuta iónica, cro matografia de afinidade, ou processos semelhantes.

Pela utilização das técnicas de recombinaçao de DNA acima indicadas, técnicas de purificação de proteínas, técnicas de fermentação ou mutação ou outras técnicas bem conhecidas no meio, é possível obter endoglucanases de elevada pureza. 0 teor, na presente composição, da celulase anteriormente descrita deve ser tal que a quantidade de pro teina enzimática prestada à solução de lavagem varie entre 0,005 e 40mg/litro de solução de lavagem, de preferência, entre 0,01 e lOmg/litro de solução de lavagem. 0 polímero de vinilpirrolidona A composição da presente invenção contém, também, uma polivinilpirrolidona com uma massa molecular de 5000 a 1 000 000, de preferência, entre 5000 e 50 000, e, ainda mais preferencialmente, de 8 000 a 15 000. 0 teor de polivinilpirrolidona nas composições da presente invenção deve ser tal que a quantidade de polivinilpirrolidona prestada à solução de lavagem se encontre entre 5 e 500 mg/1, de preferência, entre 15 e 100 mg/1, e ainda mais preferencialmente, entre 25 mg/1 e 75 mg/1.

Ingredientes Opcionais -23- 1 5 10 15

Mod. 71 -20.000 ex. - 90/08 20 30

64.675 CM 368 M '9JLW? A presente composição inclui, normalmente ingredientes opcionais que fazem em regra, parte das composições detergentes, são exemplos de tais ingredientes agentes de suspensão e antiredeposição da sujidade, abrilhantadores ópticos, argilas, lixívias, activadores de lixívias, agentes anti-espumantes, agentes anti-aglomerantes, pigmentos, perfumes e tintas, que podem ser adicionados em diferentes quantidades como se deseje. As composições da presente invenção podem ter forma líquida, pastosa ou granular, de preferência granular. As composições granulares da presente invenção podem também encontrar-se na "forma compacta", isto é, podem apre sentar uma densidade superior relativamente aos detergentes granulares convencionais; ou seja, de 550 a 950 g/1; num tal caso, a composição detergente granular desta invenção contém um menor teor de "sal de enchimento inorgânico", em comparação com os detergentes granulares convencionais; são sais de enchimento típicos os sais de metais alcalinos de sulfatos e cloretos, designadamente sulfato de sódio; os detergentes "compostos" não contêm normalmente, amis de 10% de sal de enchimento. Os detergentes líquidos e granulares convencionais são geralmente utilizados a uma concentração de cerca de 1 e 2%, em peso, no licor de lavagem, de preferência, de 1,5%, enquanto que os grânulos compactos são utilizados numa concentração de cerca de 0,5% a 1,5%, em peso de preferência, de 1%. Os exemplos seguintes ilustram a presente invenção e os benefícios inesperados de protecçio das cores obtidos com a sua utilização.

EXEMPLO I

Preparou-se a seguinte composição:

Sulfonato de alquilo benzeno linear (LAS 11% -24- 35 1

64.675 CM 368 M 5

15% 32% 4% 0,2% 5% 2%

Sulfato de alquilo Nao-iónico Citrato tri-sódio Zeólito Polímero

Agente formador de quelatos Sulfato de Sódio Silicato de sódio 10 15

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20 25

Lavou-se uma carga constituída por dois tipos de tecidos de cor (malha azul de 91% poliéster, e um te eido de flanela de 100% algodão de cor de pessego) por 10 vezes com esta composição, a uma concentração no licor de lavagem de 0,7%. No décimo ciclo de lavagem foi introduzido um tecido adicional que tingia, deixando sair a tinta para a água de lavagem. Num ensaio, este era um tecido de algodão de cor vermelha, e noutro este tecido era um tecido de algodão de cor castenha. 0 aspecto da cor na carga lavada foi então avaliado por um painel de classificação com a se guinte escala: 1. Penso ver uma diferença em relação à referência 2. Vejo, definitivamente, uma diferença em relação à referência. 3. Vejo uma grande diferença em relação à referência. 4. Vejo uma diferença como do dia para a noite em relação à referência. A composição detergente acima referida foi então suplementada, ou com PVP a 1%, ou com celulase a 0,025% ou com ambos a celulase a 0,025% e o PVP a 1%. 30 0 aspecto das cores foi novamente avaliado, como anteriormente. Os resultados sao sumarizados na tabela adiante apresentada.

Estes resultados demonstram que a acção conjunta da PVP e da celulase é inesperadamente superior à so ma das acções individuais destes dois ingredientes. -25- 35 1 5 10 . 15

Mod. 71 - 20.000 ·χ. - Ϊ0/0β 20 25 30 64.675" CM 368 Μ '2JLU59.?. \ i; §

•26· 35

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1

Exemplos II a VXI

Preparam-se as seguintes composições. a) Detergente granular compacto: exemplos II e m 5 10 15

Mo d. 71 -20.«» ex. - 90/03 20 25 30 EXEMPLOS II III Sulfato de alquilo benzeno linear 11;40 0 r- 0 T-H Sulfato de alquilo sebo 1,80 2,40 Sulfato de alquilo C45 3,00 3,10 Álcool C45 etóxilado 7 vezes 4,00 4,00 / , . Álcool de sebo etoxilado 11 vezes 1,80 1,80 Dispersante 0,07 0,1 Fluido de Silicone 0,80 0,80 Citrato Tri-SÓdico 14,00 15,00 Ácido cítrico 3,00 2,50 Zeólito 32,50 32,10 Copolímero de ácido Maleioco e ácido acrí lico 5,00 5,00 DETMPA 1,00 0,20 Celulase (proteína activa) 0,03 0,025 Alcalase/BAN 0,60 0,60 Lipase 0,36 0,40 Silicato de sódio 2,00 2,50 Sulfato de sódio 3,50 5,20 PVP 0,30 0,50 b) detergentes granulares convencioanis: exemplos IV EXEMPLOS IV V Sulfonato de alquilo benzeno C12 de sódio 6,5 8,0 Sulfato de Sódio 15,0 18,0 Zeolito A 26,0 22,0 Nitrilotriacetato de Sódio 5,0 5,0 -27- 35

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 64.675 CM 368 M P Q/ liísvmij X / EXEMPLOS IV V Celulose (proteina activa) 0,02 0f 03 0,7 PVP 0;5 TAED 3?0 3,0 Ácido bórico 4?0 - Componentes menores _ até 100 _ c)detergente líquido: exemplos VI e VII EXEMPLOS VI VII Ácido C^2-14 alquenil succínico 3,0 8,0 Ácido cítrico monohidrato 10,0 15,0 c12~15 Alquilo sulfato de sódio 8,0 8,0 Sulfato de sódio do álcool C^2~15 etoxilado 2 vezes - 3,0 Álcool Ci2~15 etoxilado 7 vezes - 8,0 Álcool Ci2-15 etoxilado 5 vezes 8.0 - (Dietileno triamino penta (ácido metileno fosfónico) 0,2 - Ácido oleico 1,8 - Efanol 4,0 4,0 Propanodiol 2,0 2,0 Protease 0 i 2 0,2 Celulase (proteina activa) 0,2 0,05 PVP 1,0 2,0 Anti-espumante 0,15 0,15 NaOH para um pH de 7,5 Água e componentes menores até 100 partes

Informação para a sequência de identificação nQl: (i) Caracteristicas da sequência (A) Comprimento: 1060 pares de bases (B) Tipo: ácido nucleico (C) Entrançamento: simples -28- 30 1 5 10 15

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20 25 30

64.675 CM 368 M >(D) Topologia: linear (ii) Tipo de Molécula : CDNA (iii) Hipotético : Nao (iv) Fonte Original (A) Organismo : Humicola insolens (B) Estirpe : DSM 1800 (ix) Caracteristicas (A) Nome/Chave : mat-peptídeo (B) Localização : 73..927 (ix) Caracteristicas (A) Nome/chave : sig-peptídeo (B) LOcalização : 10..72 (ix) Caracteristicas (A) Nome/chave : CDS (B) LOcalização : 10..927 -29- 35

/? (V 64.G75 CM 368 M

1 10 15

"vf CM o 00 IO d1 cn SJH st* cn r“d 1“H CM

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20 25 30 • α Pr 0 rH 0 a o 0 CQ 0! c rH Eh cd <c CQ 0 rH a 0 rd Eh Eh 0 > 0 < Eh 0 O «H 0 O u Dl 0 0 0 Pd 0 Sd tn ?rd 0 Pd 0 Pd 0 í 0 CU in o CD rH o O c 0 Ph Eh Eh Ui rd EH (0 rH U 0 í> 1 o Pd Eh rd 0 CU 0 Pr H α Λ 0 r—r E< rd <! !>h lu E-< rd rij E* 0 <1 <! H Eh Eh •H Eh ftí P CD > O 1h in 0 CQ Eh &1 0 ftí Cl 0 CU C >d 0 Pd 0 rd Φ 0 td Eh Ui c Hl 0 c 0 <1 V O H H CD <! 0 6t 0 CQ O 0 s 0 rd 0 Pt rií ΪΗ CM << rd Eh td <U O u < C < PI 0 0 0 > Ό o (D Eh Ui O >1 0 rd 0 CU in Eh >H 1 0 H 0 H Eh Λ CP 0 H 0 CD 0 0 0 0 r< Eh Ph 0 0 d) O u w 0 çu Eh a 0 a 0 P! 0 ί>Ί o < CQ 0 lH CQ 0 rd LO II O β in 0 c Eh Eh <C 0 0 Iti Eh 0) 1—I H O PI 1 Eh cd i—* 0 rH 0 rd 0 0 0 0 H 0 H 0 rd 0 Pd tí 0 3 0 <1 0 0 0 < 0 a <01 Eh CU 0 O PI 0 (0 0 CQ 0 β 0 p ΰ 0 I—1 0 rH c CQ < rd Hl O 0 0 c E< 0 < ·< 0 0 CQ 0 U 0 Ph Eh P 0 Pr m 0 CQ 0 CQ rd Eh CU 0 cu t—H 0 0 rH Ό u u 0 PI EH Ui Eh 0 E-i 0 CJ cu 0 Eh 0 0 cd £-4 o 0 Pd o 0 >H ird 0 H 0 Pr 0 CU CP 0 rd ϋ α Pd 0 C 0 a Eh Ui 0 0 H u CU Pd Eh Ui 0 P 0 CQ Eh cu 0 Pr tn U E< cu C 1^ Eh Λ 0 CU ^fH CQ Eh tn o Eh PI C hl Eh a Eh Ui CU CD Pr CM 0 α 1 0 h in 0 CQ 0 I—1 0 CQ E< rd i 0 >1 Eh rd < >H CD +s r—1 0 > Eh 0 0 t> Kd PI Eh cu CM < s 1 0 o 0 CQ Eh 0 0 (tí 0 M 0 >H 0 Pr 0 rd 0 0 Ph Eh 0 0 a 0 <1 F-S >< 0 P 0 a O 0 β 0 a 0 Eh CU < to r—1 C rd < CQ 0 C_> 0 PI 0 <! 0 0 0 c c 0 rd 0 a 0 β LD 0 cu CD 0 rd 0 Pd C CQ CN Eh ,β 0 0 <! Eh Eh <1 Eh a -30- 35 64.675 CM 368 M - '9. JUL. 1992 5 10 15 00 io 'tf CN O 00 co 00 00 00 CM 00 co NP -tf

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20 25 30 E-1 CU 0 (0 0 -P 0 CU O Eh 3 E-< r3 0 H Eh CU Eh ,3 CN 0 p3 ΪΓ* CU 0 <! ri! s Eh a i—1 ri! Eh E" 0 CQ 0 ui 0 CQ 0 CQ ΙΓ) 0 H 0 ri! >h ri! •i-í 0 co O 0 Eh 0 ri! PI 0 a Eh 0 rH O 3 o 0 CO 0 Ui 0 3 ri! >1 E-< (U r~ 0 i>1 <! ri! CQ 0 rd 0 PI Eh 0 ri! PI ri! ri! 0 0 O (0 0 a cn 0 >1 0 Ur 0 a o *“1 0 3 co 0 r—1 0 <U ri! CO 0 ri! Eh Eh 0 0 ri! Ui 0 ri! o (D 0 Eh rd O 0 !>ί 0 CU Eh Λ 0 H 0 H O 0 H Eh ,3 E- CU 0 0 0 ri! i—1 0 0 Eh a O ft 0 (0 Eh rd Eh 3 in 0 cu c CQ 0 rd Eh rd Eh CU 1—4 Eh rd 0 0 ri! 0 > 0 PI i-4 ri! H O a 0 3 Eh 0 Eh a 0 >Ί O ri! co < H 0 3 ri! co 0 rd 00 0 <! 0 0 0 a 0 ri! 0 0 i“1 O 3 in 3 Eh >Ί Eh >N 0 rd <! co co <1 CQ 0 rd 0 rd Eh 3 <1 <1 c ri! 0 0 0 0 0 > 0 rd 0 3 o 0 3 0 0 >~l Eh (0 0 CU 00 0 CU 0 rd 0 rd 0 > <! Ui Eh Ui 0 0 0 0 E-i (0 0 ri! 3 in Eh 3 0 o rd 0 rd 0 ,3 cn 0 3 0 rH 0 < 0 0 ri! Eh ri! Eh 0 0 0 a 0 (0 0 CU 0 )d o 0 0 3 0 H H Λ 0 :<U í—1 0 rd Eh E-i 0 ri! Eh a ri! Ui t—1 0 0 <! O Eh (U 0 0 3 0 0 in O 3 Eh H 0 Λ 0 3 0 3 CN 0 a ri! H ri! Eh ri! Eh 0 a i—1 u 3 o Eh 3 0 3 0 3 0 cu o Λ co 0 (D CU 0 CU Eh rd < E-< Eh Ui 0 PI Eh Ui ri! H 0 3 0 3 LD 0 3 0 3 0 3 < H 0 θ' ri! rd ri! rd ri! CQ O 0 <! Eh 0 0 0 0 ri! ri! o a 0 rd 0 3 o 0 rd 0 3 <! Ui 0 H ri! Í>-t cn Eh rd Eh CU 0 <j 0 ri! Eh Eh 0 > 0 PI 0 rd Eh rd 0 CO 0 rd LD Eh a 0 H 0 rd 0 >1 Eh rd O ri! CQ 0 < 0 ri! Eh 0 0 > t—1 0 ri! -31- 35 1 5 10 15

Mod. 71 -20.000 ex.-90/08 20 25 30

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20 25 30

64.675 CM 368 M 9JJL1992

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64.675 CM 368 M

Informação para a Sequência de Identificação ng. 2 (i) Caracteristicas da sequência (A) Comprimento : 305 amino-Ácidos (B) Tipo : Amino Ácido (D) Topologia : Linear (ii) Tipo de molécula : proteína 10 15

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20 25 30 -34- 35 64.675 CM 368 Μ P r. --9JJLÍ992 •α ο 5 10 1Β 20 25 30 0 m o 3 3 3 in 3 3 >η 3 H H fi O H a ο a c 0 E-* 0 CS 3 a O 3 a a 3 3 O φ co rH H Ui CG •H >1 σ> ( οι 4 ι<! 0 < < < Eh tí 3 a 3 lD φ 3 3 Ui Η μ ra M £ tH rH Í3 0 E-> < a <1 r< 0 13 υ ιο Μ H a o m Φ 3 3 ιΗ >1 3 Ui 'Cf >1 ,3 rH υ ι< E- > < u a <c Η ΜΗ Η ο tn 0 3 3 LO CG •Η (0 τ—J 3 3 £ Φ in H .3 +> rj > 1 <1 a E- ui 0 O Μ 0) ιΗ 3 3 Φ 3 3 o CG Ό (0 .3 i—! H Í3 Φ t" Η > E-i H Eh 4 O Φ (0 3 in CG Ol 3 3 a cn Ό Η Φ £3 3 H H 3 00 κ <5 UI 4 c <! < Eh W Φ 3 tn CG O 3 H Φ Ϊ3 W W 3 CM H 3 3 H II m c 4 0 1> a 0 Γΰ ο Í>1 3 Φ LD >Ί a 3 Η Μ H iH £ cn rH 01 iH υ tí (¾ O <1 a 0 <c < Μ «υ 3 ιη a a 3 Ϊ3 o a 3 ? Φ τ-Ι co 3 CG H LD 01 H 0 ίΐ) 4 1 <c Eh 0 ·< 0 W 3 3 t—í Í3 3 0 3 in 3 Φ H H H 3 01 cO Ui 3 •0 4 c 0 < a C < 0 3 CG 3 3 H 3 o 0 Μ rH >1 CG H 3 Φ co írt õ (X c 0 <1 0 £> Ui •Η Μ 3 3 LO Ui CG 3 Í3 Μ Φ Φ Φ r-l >1 Í3 rH H 0 to cn 4 ui O O rtj 0 φ μ 3 o 3 O >1 a 3 Q φ H Φ 00 H 3 rH U1 C a CO 0 Eh < tn ο 3 CG Φ 3 cn O Φ Μ CM Φ !>i A Φ 'sf 3 rH <1 1 4 H a Ui a H -Ρ «—! LO CG 1—1 Ui 3 3 Φ !Ν 3 1 >1 fC ,3 Φ £ 1 > O > i4 Eh Ui -35- 35

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20 25 30

64.675 CM 368 M

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20 25 30

64.675 CM 368 M -9.M '.1992

Informação para a Sequência de Identificação N9. (i) Caracteristicas da Sequência (A) Comprimento : 1473 pares de bases (B) Tipo : ácido nucleico (C) Entrancamento : simples (D) Topologia : Linear (ii) Tipo de Molécula : CDNA (iii) Hipotético : Nao (iv) Anti-sense : Nao (vi) Fonte original (A) Organismo : fusarium oxysporum (B) Estirpe : DSM 2672 (ix) Caracteristicas (A) Nome/chave : CDS (B) LOcalizaçio : 97..1224 3 -38- 35 5 10 15

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90Í08 20 25 30

64.675 CM 368 M

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64.675 CM 368 M LO MT CM O 00 o in o in σ m m MT MT θ' 5 10 15

Mod. 71 - 20,000 ex. - 90/08 20 25 30 E-i >1 o 0 d 0 (0 0 rH o d O H γ pd H 0 rH Eh í0 Eh (D CD 0 0 0 0 <tí 0 > 0 rd E- rM E- ft LO 0 d 0 O Eh Ά 0 H pd CG co <d rH 0 d pd CG 0 0 0 pd 0 0 0 a 0 pd E-i >1 0 d 0 d O 0 >H Eh 0 rH Pd CG 0 (D o 0 rH 0 H 0 0 c pd Eh 0 i—1 CD 0 0 0 0 d 0 rH 0 >1 Eh d in pd >1 C i—1 Eh tC 0 rH 0 rd i——I 0 rH 0 0 0 > 0 0 <d Eh 0 0 Eh cg Eh fO Eh >1 0 d Eh d O 0 >1 0 rH 0 H 0 Λ 0 rd cn Eh 0 0 << 0 0 pd Eh pd Eh rH >1 ιο 0 a 0 d 0 CD o d 0 r—1 LO 0 d 0 CD Eh Λ pd CG 0 0 Eh Eh Eh 0 Eh a pd O tí 0 0 o 0 CU 0 d 0 d pd m 0 d co Eh H 0 ,d u rd Pd pd 0 (¾ pd H pd Eh f<l Eh O H Eh u 0 CG LO 0 d 0 d E-1 rcí 0 0) pd σ Eh CD 0 w 0 > Eh 0 pd d Eh d Eh 0 Eh rcí 0 d 0 d Eh rd O 0 d 0 H <d 0 £ 0 H rH pd H 0 pd Eh Eh pd Eh 0 Pd rH 0 0 E-i d 0 d Eh rd Eh d 0 rH LO pd CG pd m 0 rH pd >1 Eh to CM < pd pd pd 0 < Eh Eh 0 t> rH O <d o 0 u Eh rd 0 CG 0 CD O £ CD 0 rd 0 rH 0 íd Eh H pd E-i pd 0 pd Eh 0 Pd H o d 0 CO in 0 (D Eh rd 0 -P <1 CG 0 >H r- Eh rd 0 H Eh CU pd pd Eh 0 Eh a 0 pd pd s u d Eh (0 Eh Í>H o Eh CG 0 CG o CD 0 Η 0 H σ 0 >H pd >H Eh 0 0 pd 0 0 Eh 0 pd rd E-i CD Eh d 0 d 0 CG to 0 CG Ei H Pd pd >H 0 o pd >t pd H Eh Eh Eh Eh Eh 0 rH pd rd o o Eh rd 0 rd 0 ft 0 O o u 0 H 0 H 0 d 0 rH CM 0 a 0 pd 0 Pd Eh Eh 0 0 rH u d lo Eh d Eh d 0 d 0 CG pd CG co 0 CD Eh CD 0 CU pd >1 pd pd Eh 0 0 d Pd 0 pd dl -40- 35 1

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64.675 CM 368 M

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20 25 30

64.675 CM 368 M ~9M Wfe "vt* CM CM o r4

o co "sf co rH CO σι in t"· rH CN CM co Γ0 MT Mt* r4 rH rH i—1 rH i—1 rH 0 0 rij O ri! Eh 0 nS 0 fí Eh (O 0 H 0 0 ri! o r-í ri! H 0 i—1 Eh rcS ri! ri! Eh 0 o ri! O 0 0 rij 0 > 0 0 0 0 0 0 Eh Eh o 0 in u Eh 0 co Eh Ui 0 Eh Eh 0 o Eh CM ri! 0 >H 0 r< Eh 0 0 o eu cn Eh Eh Eh 0 Eh 0 ri! 0 Eh Eh 0 Eh 0 Eh o CO Eh Eh O Eh rô 0 ti ri! C >1 ri! 0 rH ri! H 0 0 0 Eh E" O Eh Eh cn 0 ri! 0 0 Eh ri! 0 0 «! <! ri! O Eh Eh (ΰ 0 CS in 0 Eh 0 0 Eh 0 o W O H Eh cu LO 0 CU Eh 0 ri! ri! <! Ui 0 ri! 0 Hl cn Eh Ui 0 <! 0 0 0 0 rij ri! >H Eh o 0 s 0 Eh O 0 0 Eh 0 0 cP u Eh ri! co ri! >H ΙΉ Eh E· ri! Eh CD 0 α Ph ri! ri! Eh Eh cn ri! 0 0 Eh ri! fcn o i—1 0 >H 0 Eh 0 0 ri! ri! 0 !h Eh 0 H ri! >h ri! Eh 0 Eh O ri! 0 í> 0 0 E> Eh c ri! ri! 0 0 0 ri! o o Eh H 0 tí 0 ti ri! 0 ri! 0 o ti CM Eh (C ri! Ui ri! rH 0 0 Eh Eh <! E-i co 0 > ri! ri! 0 0 -< Eh Eh Eh ri! ri! £h 0 ri! Ui 0 Eh in 0 0 0 e! 0 0 ri! Eh ri! >H 0 CU cn 0 Eh ri! co 0 0 Eh Eh ri! Eh Ui cn 0 eu ri! ri! Eh 0 ri! ri! 0 0 Eh 0 (0 Eh Eh O 0 G Eh Eh Eh 0 O 0 H ri! >h m ri! rH rij ri! 0 ri! Eh 0 ri! Eh Eh cn 0 0 Eh Eh Eh rij 0 0 0 0 >i 0 co Eh <ΰ 0 CO in 0 Eh E< 0 0 H ri! >H 0 rH ri! CD 0 Eh Eh 0 0 0 rij Hl 0 <! <! Hl cn Eh < ri! Eh ri! 0 0 Eh IH &1 0 (0 0 Eh 0 rH 0 Eh Eh 0 0 Eh 0 H 0 CU E< rd 0 O rij 0 ri! Eh Ui 0 > Eh 0 Eh ri! < ri! Eh 0 0 < O v—1 in 0 Eh 0 Ui Eh co Eh Eh ri! ri! Eh (0 rH 0 & ri! 0 0 0 ri! ri! ri! 0 > ΓΟ ri! Eh ri! Hl Eh 0 ri! 0 EH ri! ri! Eh 0 ri! ri! ri! 0 CG Eh (0 o 0 Eh 0 Ui 0 ri! Eh 0 ri! ri! !>i 0 rH cn 0 CU ri! >1 0 0 0 ri! ri! ri! i4 0 < cn Eh Ui ri! Eh 0 ri! Eh ri! ri! < Eh 0 ri! 0 tí 0 Ά Eh r*H m 0 Eh ri! ri! rH ri! Ui 0 I—1 Mf1 0 cu ri! 0 ri! 0 <c 0 0 0 ri! 0 0 cn ri! Ui Eh Eh 0 0 < ri! ri! Eh ri! O Eh Eh Eh Eh >H rij O o ti 0 Eh 0 ri! O Λ 0 ti 0 H 0 rH CD ri! Ui Eh 0 ri! ri! ri! Eh ri! Eh 0 0 0 0 cn ri! ri! 0 Eh ri! ri! Eh Eh 0 ri! ri! Eh 0 CO Eh Ui Eh Eh 0 o in 0 0 ri! ri! O ti ri! 0 >H 0 Λ 0 Eh Γ' 0 Eh 0 c Eh ri! Hl Eh 0 ri! Eh 0 eu cn Eh Eh 0 ri! -43- 35

64.675 CM 368 M

//

Informação para a sequência de Identificação Wg.4 (i) Caracteristicas da sequência (Ά) Comprimento : 376 amino ácidos (B) Tipo : amino ácido (D) Topologia : linear (ii) Tipo de molécula : proteína 15

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/03 25 30 -44- 35 15 10 16

Mod. 7] 20.000 ex. - 90/08 20 25 30

64.675 CM 368 M

ri CQ ri S O O 0 ri ri o CU >1 CU CQ ri 00 P A rd ri co P P < a H P a rH 1Γ) CD ti H ri CO 1Γ) ri ri •P • (d >4 H ti 10 >4 σι 0 w 0 01 fc > O < > co P P co 2 rd co o O ti ri ri ti o ri •P 0 H >1 co u P !p A P 4—! 4p 0 íti c O PU c P P pd 4—1 0 2 t> ti 3 P. ti in ri ri ti ri P IO ri 0 CU CQ H pj· co co P >1 ti CM 0 H P c < Pd pd pd P > i—I P •H o a ri ri o ri ro co 0 a o P ri ri CD A CD A P 1>4 P co 'Cf c 0 Ό Ph P <1 P P <d O H pd i—1 >ί ri P ri CQ CD cu ti +> 0 H rH !p ti CQ ÍP C- A P 0 A ϋ P > < O a pd 2 a CJ Ό rd o Cn ti ri ti >4 o CQ co CQ H r—4 ri H CU P P cn >4 >4 •H • & 0) < < pd co pd 0 O P 2 ri ri in ti CU ri ri co in a ri CO cu p CM H P >1 Cri o Cri co ·· P P c H P P o 1-4 P pd ti ti k) CQ o O ti ti a Cri o a •H H cu 'd' ri P P ri P CM CQ u ri <cu < co P PU pd pd P 0 rH pd ri CD >4 ri cn ri ri ri CO >4 m & cu •ri P CD in CU 0 0 Cri P co 0 P K C <1 co P co P 0 tH 0 co ri ip ri ft >1 O ri ti P ri OJ P CU co fH Γ tH rH ti 0 ti irt P O co <1 o 0 pd í> P w in ri a ri Cri a in ri o a 0 A CU ri co P CD 00 P ri m !ti P co P c 0 pd 0 a pd O H u ί>ϊ o ri CQ Cri ri ri O Cri Cri U >1 1—I CM CU ί>Ί P co 0 o tH I-1 Ό P C co P 0 pd CO 4—4 0 0 CO 0 ri u CD LD a ri t—1 ri cn s P CU (U >1 CO CD P ti iH A rH P co co O pÇ 0 i> 0 P iH 0 tn ro ri CD o CQ ti >•4 ri ri O S-i iH cu !>i in Cri iH rH rri A co <! <1 co O O pd 0 P P i—1 -P r—1 ti o ri Cri ιο a ri 0 ri CU H ri A P CD ri 0 A co 2 c pu P 0 P cn a pd

Gly Gly Gly Vai Gly Ile Phe Asp Gly Cys Tlir Ser Glu Phe Gly Lys 145 150 155 160 -45- 35

64.675 CM 368 M

1 5 10 15

Mod. 71 - 20.000 e*. - 90/08 20 25 30 co 0 d a d o d Pd d d Pd O >1 cq rd CQ H rd 33 rd rd 33 CN o <1 0 c 0 CM 0 E-i 0 0 Eh Γ0 d 0 cu rd a 0 d m Pd 0 rd CQ t—1 l> Λ í0 CQ Pd rd 0 CU Pd to i>d 0 r—1 Cl· > <3 a < CM 0 a > i-3 u Cn o d a CQ to Pd o co O Pd cu u 0 rd CQ >1 H cu o !x Pd 33 co < τ—1 0 c ►3 < 0 CM i-3 a Eh tn a d 0 bi Pd d CQ a 0 CQ >1 Pd Pd rd O Pd cu rd >d CQ TO >d rd Eh 0 Cd c 0 < h3 c CM h3 0 !-l ra CU CQ O «3 to d (0 Pd o 0 0) rí 33 >d CM H rd rd t-H 33 O Pd co ffi Cl· h3 CM i< < 0 < Eh 0 < u CQ Pd CQ Pd LD (0 H 0 rd rd LO CU >1 Λ !>i cu 0 rd (0 Pd rd rti rH co O E-> o 0 CM <! t> a <! > CO cu o >1 CU >1 Pd Pd o iH co td CQ H r- H rd H 33 CU 0 tá H H rd 0 Cl· 0 E-1 0 CM > <1 i-3 >1 a in a Pd a Pd 0 0 Pd 0 d H CQ co CQ CU CQ 33 Pd 0 33 Pd H CD c i—! < co c E- a CM Eh a 0 >Ί CQ 0 O cu H Pd (0 0 O CQ Pd «—1 !*. Pd O i—! tti 33 rd Pd CO 33 ϋ i-3 a CM H > E-< < a CM h3 Eh Pd d d a LD CQ CQ Pd d Pd 0 Pd >H CU CQ CQ i—1 >1 >1 cu iH 33 0 33 tr* 1-3 < < CM h3 i-3 0 0 Eh 0 Eh d 3 a d CU O CQ a 0 td CQ O iH CU CQ cu 33 cn >d CQ Pd i—1 K-1 rH 0 t4 < i-3 a CM < a < k3 0 (0 cn d (0 d (ti fO 0 CQ d H 0 H CD rd rd cu Η H rd (ti Pd <1 I—! 0 < 1-3 <1 <1 CM Kl 0 > a >1 O O d tti 0 Pd Pd O to 0 CQ H Pd co CQ rd Pd CU 33 0 rd Pd 0 Cl· rH <d C a 0 Ed CM <3 a i-3 >d u d 0 CQ cu Pd CQ (0 0 CO d H H a >H 33 cu >d rd r» >t CQ 0 E-> 0 rH a 0 < CM 1-3 < α Pd (U 0 O Pd Pd d 0 a O H (D w Λ Pd i—I cu cu rd Pd ra 0 rti .-í co a a CM 0 0 0 a C 0 i> (0 a a CQ Pd LO 0 0 m Pd O 0 rM CQ Pd cu CM Pd Pd !>d 33 Pd o c c E-i U 0 CM a a i-3 Eh a 0 -46- 35 15 10 15

Mod. 71 -20.000 ex.-9OJ08 20 25 30

64.675 CM 368 M 9.JH1992 / H 3 3 ri Kl *—1 > C 0 Sh ld O 3 cu 00 5-1 ca ca cn Cd C (0 u O 3 i—i in rH <! Eh oo 0 m ftí ca LD rd >1 co i4 c iA 00 (d 5-1 *—1 CU ri < co > U co ca Λ !>i >0 Eh H) 0 (C o U CQ H 00 CU >0 <l oo cn 1-5 Ά ί>Ί in 5-1 ca r-i CU c O oo co Sh >1 Ê*i o 3 Λ r-l H co CQ Eh 0 0 00 <3 ca ca M 0 >i n u cA u Eh fA ca 3 (0 H H i—1 rH rd C CD C > o in 5-i ca CQ 3 OJ !>i I>1 Ph 00 Eh O O CQ u o (d 3 >1 >1 rH r-l O Eh oo <1 CD u ca 3 ín u 0) I-H (U ín CU C0 <! tA 00 cn >1 o 3 3 H 5-1 CQ >0 O Cd c Eh di H 5-i Sh Π3 rH >1 <3 > 0 Eh Lisboa 1 9.111992

Por THE PROCTER έ’ ,ΟρΒΕΕ COMPSNY C"' Y&gtnie OfíCíol -47- áa p^Pr'£cí6de Ιπου:;-;ο!

Cerlório - Arc® da ConcciçCo, 3, i°*7‘r09ai&S^ 35

Claims (1)

1. 5 10 15 Mod. 71 - 20.000 ex. - 90J08 20 25 30 64.675 CM 368 M -*111992 R E I Y I N PI CAÇÕES 1§. - Composição detergente granular de lavandaria compreendendo ingredientes detergentes convencionais, caracterizada por compreender uma celulase alcalina a um nível no produto acabado de forma a libertar de 0,005 a 40 mg/1 da solução de lavagem da referida celulase, e uma polivinilpirrolidona com um peso molecular compreendido entre 5000 e 100 000 a um nível no produto acabado de forma a llibertar de 5 a 500 mg/1 da referida polivinilpirrolidona na solução de lavagem. 25. - Composição detergente de lavandaria de acordo com a reivindicação 1, em que a referida celulase proporciona pelo menos 10% da remoção de carboximetilcelulo se imobilizada radioactivamente marcada de acordo com o método C14CMC a 25x10“®% em peso da proteina de celulase na solução de ensaio de lavagem, caracterizada por conter não mais do que 15% em peso de sal inorgânico de enchimento e ter uma densidade de 550 a 950 g/litro da composição. 3¾. - Composição detergente de lavandaria de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por a celulase consistir essencialemnte num componente de endoglucanase homogéneo que é imunoreactivo com um anticorpo monoclonal criado por reacçao a uma celulase parcialmente purificada de cerca destf’43KD derivada de Humicola insolens, DSM 1800, ou que é homogénea à referida endoglucanase sí 43KD. 4ã. - Composição detergente de lavandaria de acordo com as reivindicações precedentes, caracterizada por a celulase estar presente a um nível no produto acabado de forma a libertar de 0,01 mg/1 a 10 mg/l de celulase no licor de lavagem. 5^. - Composição detergente de lavandaria de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizada por a polivinilpirrolidona ter um peso molecular compreendido entre 5000 e 50000, de preferência 8000 e 15000 -48- 35 64.675 CM 368 M

   1 6^. - Composição detergente de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes caracterizada por a polivinilpirrolidona estar presente a um nível de forma a libertar de 15 mg/l a 100 mg/l de polivinilpirrolidona na solução de lavagem, de preferência de 25 mg/l a 75 mg/l. 7^. - Composição detergente de lavandaria de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada por os referidos ingredientes detergentes conver cionais consistirem em surfactantes e encorpantes. 8ã. - Composição detergente de lavandaria de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por ter uma densidade compreendida entre 550 g/l e 950 g/1. Lisboa, -9"JLfê92 15 Mod. 71 - 20.000 e*. * 90/08 20 25 30 Por THE PROCTER & GAMBLE COMPANY

   C t. VASCO ívURCUES ISW Ao«r|,e Oí oo! (

   -49- 35