KR900007937B1

KR900007937B1 - 아베르멕틴의 제조방법 및 그를 위한 배양물

Info

Publication number: KR900007937B1
Application number: KR1019880000469A
Authority: KR
Inventors: 윌리엄 하프너 에드먼드; 스코트 홀덤 켈빈; 에드워드 리 쉬-젠
Original assignee: 화이자 인코퍼레이티드; 윌리엄 데비스 훈
Priority date: 1987-01-23
Filing date: 1988-01-22
Publication date: 1990-10-23
Also published as: NO880261D0; NO880261L; AR244344A1; HU203130B; FI880279A; NO172447C; NO172447B; YU99090A; CZ290312B6; EP0284176A2; CN1065277C; CN88100373A; MX169293B; YU47886B; AU7111391A; RU2096462C1; NO880262D0; JPH0817694B2; FI90087B; AU1069788A

Abstract

내용 없음.

Description

아베르멕틴의 제조방법 및 그를 위한 배양물

제1도는 지방산이 없는 배지(WPM Syn A 40 : 40)에서 생육시킨 경우, 에스.아베르미틸리스 I-3(ATCC 53567) [기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10493, 기탁일 : 1988년 1월 9일] 세포의 용매 추출후, 시간에 대한 용매 분획의 HPLC 크로마토그래프의 Uv추적(240nm)을 나타낸 그래프이다.

제2도는 지방산이 없는 배지(WPM Syn A 40 : 40)상에서 생육시킨 경우, 에스.아베르미틸리스 MA4848(ATCC 31272)세포의 용매 추출후 용매 분획의 HPLC 크로마토그래프의 Uv 추적(240nm)을 나타낸 그래프이다.

제3도는 시클로펜틸카복실산(실시예 1 참조)을 함유하는 배지상에서 생육시킨 경우, 에스.아베르미틸리스 I-3(ATCC 53567)세포의 용매 추출후 용매 분획의 HPLC 크로마토그래프의 Uv 추적(240nm)을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 측쇄 아미노산 트랜스아미나제 활성 및/또는 2-옥소산 디하이드로게나제 활성이 결여된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis)균주, 이러한 균주의 생산방법 및 천연 및 비천연 아베르멕틴 생산을 위한 에스.아베르미틸리스의 용도에 관한 것이다.

미합중국 특허 제4,310,519호 및 제4,429,042호는 강력한 항기생충 활성이 있는 관련된 시약의 복합체인 아베르멕틴 및 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(즉, 에스.아베르미틸리스 ATCC 31267, 31271 및 31272)균주의 호기성 발효에 의한 그의 생성방법에 관해 기술하고 있다. 인용된 마지막 두개의 균주는 각각 에스.아베르미틸리스 ATCC 31267을 자외선 조사하여 수득한 배양물의 냉동 바이알 및 동결 건조된 튜브를 나타낸다.

1986년 7월 16일에 출원된 미합중국 특허원 제886,867호의 대응 출원인, 1987년 3읠 18일에 공고된 유럽 특허원 제214,731호에는 25-위치에 신규한 치환 그룹을 가진, 천연의 또는 공지된 아베르멕틴에 관련된 수종의 화합물(여기서는 비-천연 아베르멕틴으로 언급됨) 및 특정한 카복실산 또는 그의 유도체나 전구체의 존재하에 아베르멕틴 생산 미생물을 발효시켜 그를 제조하는 방법에 관해 기술되어 있다.

상기 언급한 신규한 C-25 치환된 아베르멕틴을 생성하기 위해 사용되는 에스.아베르미틸리스는 에스.아베르미틸리스 ATCC 31267, 31271, 31272 및 NCIB 12121이다. 유럽 특허 제214,731호에 기술된 후자의 미생물은 에스.아베르미틸리스 ATCC 31271로부터 유도된다. 이는 반-확정된 배지에서 배양하는 경우, 신규한 C-25 치환된 아베르멕틴을 개선된 수득율로 생산한다. 또한, ATCC 31267, 31271, 31272 및 NCIB 12121 각각은 신규한 C-25 치환된 유도체 이외에, 25-치환체가 이소프로필 또는 (S)-2급-부틸(1-메틸프로필)인 공지된 또는 천연의 아베르멕틴을 여러가지 양으로 생성할 수 있다.

아베르멕틴의 탄소 골격(하기 일반식(I)에 도시)은 아세테이트 및 프로피오네이트로부터 유도되며, 천연 아베르멕틴의 C-25 치환체는 L-이소루이신(R=(S)-2급-부틸) 또는 L-발린(R=이소프로필)으로부터 유도된다[참조 : Fisher and Mrozik, "Macrolide Antibiotics", Academic Press(1984) Ch.14]

"공지된" 또는 "천연의" 아베르멕틴은 25-위치 치환체가 이소프로필이거나 또는 (S)-2급-부틸(1-메틸프로필)인, 에스.아베르미틸리스 ATCC 31267, ATCC 3127l 및 ATCC 31272에서 생성된 아베르멕틴을 의미한다. 25-위치 치환체가 이소프로필 또는 2급-부틸(S-형태)이 아닌 아베르멕틴은 본 명세서에서 신규한 또는 비-천연의 아베르멕틴이라고 한다.

상기 언급한 미합중국 특허에서 인용된 에스.아베르미틸리스 균주는 일반적으로 C-076으로 표시되는 물질부류를 생산한다. 이 부류는 C-076 A/a, A/b, A2a, A2b, B1a, B1b, B2a 및 B2b로 표시되는 8개의 독특하지만 서로 관련이 있는 화화물로 이루어진다. 화합물의 "a" 계열은 25-치환체가 (S)-2급-부틸인 천연의 아베르멕틴을 말하고, "b" 계열은 25-치환체가 이소프로필인 화합물을 말한다. "A" 및 "B"란 표시는 5-치환체가 각각 메톡시 또는 하이도록시 아베르멕틴을 말한다.

마지막으로, 숫자 "1"은 이중결합이 22-23위치에 존재하는 아베르멕틴을 말하고; 숫자 "2"는 22위치에 수소를 갖고 23위치에 하이드록시를 함유하는 아베르멕틴을 나타낸다.

본 명세서에서는, 비-천연의 아베르멕틴의 25-치환체에 대한 그러한 기호를 사용하지 않는다. 기호 A1, A2, B1 및 B2는 상기 언급한 천연 아베르멕틴의 구조적 특성에 상응하는 구조를 갖는 비-천연 아베르멕틴을 나타내는데 사용되어 왔다.

측쇄 알파-케토산 디하이드로게나제 활성이 결여된 변이주의 생식은 스트렙토마이세스가 아닌 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에 대해서 알려져 있다[참조 : Willecke and Pardee, J.Biol.Chem.246, 5264-72(1971) and Pseudomonas Putida, Martin et al., J.Bateriology, 115 198-204(1973)].

실질적으로 아베르멕틴 아글리콘 A1a 및 A2a만을 생성하는 변이균주인 에스.아베르미틸리스 Agly-1은 문헌[Schulman et al.J.Antibiot. 38(11), 1494-1498(1985)]에 기술되어 있다. 또한 아베르멕틴 아글리콘 B성분의 생산증가의 원인이 되는, 시네펀진(sinefungin) 존재하의 에스.아베르미틸리스 Agly-1의 발효에 대해 기술하고 있다. O-메틸 트랜스퍼라제의 억제제로 사용되는 시네펀진의 존재하에 발효시키는 경우, 아베르멕틴의 고생산 균주인 에스.아베르미틸리스 08은 C-5의 아글리콘상 및 올레안드로즈 디삭카라이드 부위에서 O-메틸 그룹이 결여된 아베르멕틴을 생산한다.

미합중국 특허 제4,378,353호에는 C-076 관련 화합물 및 자외선 조사에 의해 수득된, 에스.아베르미틸리스 ATCC 31272의 변이주인 MA-5218의 배양에 의한 그의 제조방법에 관하여 기술되어 있다. 변이주는 ATCC 31780으로 명한다. 상기 변이체로부터 생산된 C-076 관련 화합물은 C-076 푸란환이 결여되어 있다. 그외에, 알려진 특정 화합물에 있어서, 올레안드로즈 당부위의 한쪽 또는 양쪽이 분해되는 반면, 다른 화합물에 있어서, 5-위치의 그룹은 케토그룹으로 산화된다.

O-메틸 그룹이 결여된 아베르멕틴을 생산하는 에스.아베르미틸리스의 O-메틸트랜스퍼라제 변이주의 세가지 부류에 대해서 문헌[Ruby et al., 6th International Symposium on the "Biology of Actinomycetes", Debrecen, Hungary, August 26-30(1985) and by Schulman et al, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 31, 744-7(1987)]에 기술되어 있다.

첫번째 부류는 마크로시클릭 락톤환의 C-5하이드록실을 메틸화하는 능력이 없기 때문에 주로 B아베르멕틴을 생산한다. 두번째 부류는 3'-O, 3"-O-비스-탈메틸아베르멕틴(양쪽 올레안드로즈 모노삭카라이드 잔기의 3-위치에서 O-메틸 치환체가 결여된 아베르멕틴)을 생산하며, 이는 데메틸아베르멕틴으로 언급된다. 세번째 부류는 어떠한 위치도 메틸화시킬 수 없다.

효소 아베르멕틴 B-O-메틸트랜스퍼라제에 의해 아글리콘 부위의 C-5하이드록시 그룹의 메틸화를 억제하는 시네펀진, S-아데노실에티오닌 및 S-아데노실호모시스테인과 같은 물질의 존재하에 에스.아베르미틸리스를 발효시켜 B아베르멕틴의 생산을 증가시키는 방법은 문헌[Schulman et al., Fed.Proc.44, 931(1985)]에 기술되어 있다.

O-메틸트랜스퍼라제가 결여되어 있고, 아베르멕틴 B성분을 증가량으로 생성하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 변이주는 또한 문헌[Schulman et al.in Antimicrobial Agents and Chemotherapy 29, 620-624(1986)]에 기술되어 있다.

에스.아베르미틸리스에서 돌연변이를 유발하면 측쇄 2-옥소산 디하이드로게나제 활성 또는 측쇄 아미노산 트랜스아미나제 활성이 결여된 변이주를 생성한다. 이와같이 생성된, 단일 차단된 변이주에서 돌연변이를 유발하면 측쇄 2-옥소산 디하이드로게나제 활성 및 측쇄 아미노산 트랜스아미나제 활성이 둘다 결여된 변이주를 생성한다. 변이체들은 화합물 RCOOH(여기에서, R은 이소프로필 또는 (S)-2급-부틸이다), 또는 발효과정중 RCOOH로 전환될 수 있는 화합물을 가하지 않은 상태에서 상당량의 천연 아베르멕틴을 생성하는 능력을 더 이상 함유하지 않는다.

그러나, 놀랍게도 이러한 변이주를 화합물 R-COOH(여기에서, R은 이소프로필 또는 (S)-2급-부틸, 또는 상기 언급된 다른 그룹), 또는 언급된 RCOOH의 전구체의 존재하에 발효시키는 경우, 천연 및 비-천연 아베르멕틴을 생상한다는 것이 발견되었다. 더우기, 측쇄 2-옥소산 디하이드로게나제 활성이 결여되고, L-이소루이신 또는 L-발린의 분해능력이 없는 상기 언급한 변이주가 각종 화합물을 아베르멕틴 생합성 경로로 동화시켜 천연 아베르멕틴이 존재하지 않는 비-천연 아베르멕틴을 생산한다는 것 또한 놀라운 사실이다.

상기 언급한 L-이소루이신, L-루이신 또는 L-발린을 분해할 수 없고, 성장을 위해서는 이 3가지 아미노산이 필요한 측쇄 아미노산 트랜스아미나제 결여 변이주가 또한 다른 화합물을 동화하여 천연 아베르멕틴이 존재하지 않는 비-천연 아베르멕틴을 생산한다는 사실 하나만으로라도 최소한 놀라운 사실이다.

언급된 천연 아베르멕틴은 8개의 독특하지만 서로 밀접하게 연관된 화합물의 복합 혼합물로서 생산된다; R이 이소프로필 및 (S)-2급-부틸인 일반식(I)의 학합물, 그들이 실질적으로 순수한 형태로 회수되는 반면[참조 : 미합중국 특허 제4,429,042호], 그 회수방법은 굉장히 힘들다. 또한, 유럽 특허 제214,731호에 기술된 방법에 따른 비-천연 아베르멕틴의 생산은, 측쇄 2-옥소산 디하이드로게나제 및 생산에 사용된 에스.아베르미틸리스 미생물 세포중의 아미노산 L-발린 및 L-이소루이신의 존재 때문에 다양한 양의 몇몇 천연 아베르멕틴을 생산하게 된다.

생성물의 수 및 복합성을 최소화하도록 천연 및 비-천연 아베르멕틴을 생산하는 선택능력, 및 그렇게 함으로써 선택된 아베르멕틴의 순도를 증가시키고 또한 분리방법을 단순화시키는 것이 요구되는 목적이다.

측쇄 2-옥소산 디하이드로게나제 활성 또는 측쇄 아미노산 트랜스아미나제 활성이 결여된 에스.아베르미틸리스 균주는 아베르멕틴의 생산 균주인 에스.아베르미틸리스의 돌연변이, 특히 에스.아베르미틸리스 ATCC 31267, ATCC 31271, ATCC 31272 또는 NCIB 12121의 돌연변이에 의해 생성된다. 언급한 결여된 균주중 하나를 더욱 돌연변이시키면 양쪽의 활성이 모두 결여된 균주를 생산할 수 있다. 변이주들은 발효가 일어나는 배지에 이소프로필 또는 2급-부틸(S-형태) 그룹을 함유하는 지방산 또는 그의 전구체를 가하지 않고서는 천연 아베르멕틴을 합성할 수 없다. 이들은 적당한 프라이머(primer)산 또는 발효과정중 그것으로 전환될 수 있는 화합물을 함유하는 영양 배지중에서, 수성 호기성 조건하에서 발효시키는 경우 천연 및 비-천연 아베르멕틴을 생산할 수 있다.

특징적으로 측쇄 2-옥소산 디하이드로게나제 활성이 결여된 그러한 변이주들은¹⁴CO₂분석을 기초로 하여 돌연변이된 콜로니로부터 분리한다. 이 과정에서, [¹⁴C-1]-2-옥소이소카프로산 또는 [¹⁴C-1]-2-옥소-3-메틸-발레르산 또는 [¹⁴C-1]-2-옥소-3-메틸 부티르산 기질로부터 침투된 콜로니에 의한¹⁴CO₂방출이 일어나지 않는 것은 측쇄 2-옥소산 디하이드로게나제 활성이 없음을 나타낸다.

특징적으로 아미노산 트랜스아미나제 활성이 결여된 그러한 변이주들은, L-이소루이신, L-루이신 및 L-발린이 없는 배지상에서 생육할 수 없는 능력을 기초로하여 돌연변이된 콜로니로부터 선별된다. 실제로, 카사미노산중에서 발견된 모든 개개의 아미노산이 보충된 M9염 글루코즈-기본 한천 배지상에서 생육하는 단일 콜로니들을 L-이소루이신, L-루이신 및 L-발린이 결여된 유사한 배지로 옮긴다.

본 명세서에서 언급된, 단지 측쇄 아미노산 트랜스퍼라제 활성만이 결여된 변이주들은 아베르멕틴의 생산을 위해 전구체로서 2-옥소산을 사용할 수 있다.

상기 언급한, 측쇄 2-옥소산 디하이드로게나제 활성 및/또는 측쇄 아미노산 트랜스아미나제 활성이 결여된 변이주들의 아베르멕틴, 특히 비-천연 아베르멕틴의 생산능력을 보유하고 있다는 것은 놀랍고도 예상밖의 일이다. 통상적인 배지상에서 생육시킬 경우 천연의 지방성 아실조효소 A 유도체 생산에 대한 변이주의 무능력은, 막의 완벽함이 언급된 유도체에 의존하거나, 또는 이전의 변이주에 의한 2-옥소산 축적이 세포내 독성이 되면 치명적인 돌연변이가 된다. 게다가, 변이주들이 가지고 있지 않은 효소의 활성을 요구하기 때문에 어떤 변이주도 L-이소루이신 및 L-발린 분해성 대사로부터 아세틸 CoA 및 프로피오닐 CoA를 합성할 수 없는 것으로 예상된다. 상기 언급한 바, 아베르멕틴의 생합성을 위한 이러한 아실 CoA 유도체의 필요성은, 변이주가 비-천연 아베르멕틴의 생산에 있어서의 심하게 손상되었음을 예측하게 하나, 놀랍게도 그러한 경우는 아니다.

상기 언급된 변이주에 있어서 측쇄 2-옥소산 디하이드로게나제 활성의 결여는 L-이소루이신, L-루이신 및 L-발린의 분해로부터 측쇄 지방성 아실 CoA 합성을 방지하고, 따라서 천연 아베르멕틴의 합성을 초래한다. 동일한 방법으로, 에스.아베르미틸리스의 측쇄 아미노산 트랜스아미나제가 결여된 변이주도 또한 측쇄 지방성 아실 CoA 합성의 특징적인 결여를 가지며, 따라서 천연 아베르멕틴의 생산능력을 상실하게 된다. 지방성 아실 CoA의 결여는 두가지 이유 때문이다.

첫째는, 그러한 트랜스아미나제-결여된 변이주들은 정상적인 아미노기 전달 경로를 거쳐 배지로부터 보충된 이소루이신, 루이신 및 발린으로부터 측쇄 2-옥소산을 합성할 수 없다.

둘째로는, 이러한 트랜스아미나제 변이주에 있어서, 세포성 측쇄 아미노산 생합성 경로에 의한 측쇄 2-옥소산 생산은 발효 성장 배지중에서 이들 아미노산의 필수적인 함유에 의해 방지된다. 이들 아미노산의 존재는 잘 알려진 효소 억제 메카니즘 및 경로의 이들 아미노산 최종 생성물에 의한 피드-백 차단에 의해 생합성 경로(및 중간체 2-옥소산의 생성)의 작동을 방지한다. 활성 측쇄 2-옥소산 디하이드로게나제 효소의 기질인 이들 2-옥소산의 무용성은 측쇄 지방성 아실 CoA 합성을 효과적으로 방지한다. 따라서, 본 발명은 2-옥소산 디하이드로게나제가 결여된 변이주 및 트랜스아미나제가 결여된 변이주의 용도를 망라하고 있고, 측쇄 트랜스아미나제 및 2-옥소산 디하이드로게나제 둘다 결여된 변이주들도 포함하고 있다.

본 발명은 또한, 외형 및 생리학적인 작용과는 무관하게 핵산 또는 상기 언급한 종들로부터 얻은 동등량의 물질을 사용하여 형질전환, 형질도입, 유전자 재결합 또는 그외의 유전학적 방법에 의해 상기 기술한 변이주들의 특징을 획득한 유기물을 함유할 수 있다.

여기서 사용되는 "아베르멕틴"이라는 용어는 하기의 일반식(I)의 화합물을 언급하는 것이며, 그 식에서 25-치환체(R)은 본 발명의 에스.아베르미틸리스에 의해, 언급한 위치에서 동화될 수 있는 그룹이다.

본 명세서에서 언급한 변이주들은 본 명세서에 기술되고 실시예에서 설명되는 방법에 의해 비-천연 아베르멕틴을 생산하는데 매우 유용하다. 변이주들은 특히, 예를들면, C-25 치환체가 C₁-C₄알킬 그룹에 의해 임의 치환된 C₄-C₆시클로알킬 또는 시클로알케닐이거나, 1-메틸티오에틸 또는 특히 3-티에닐 또는 3-푸릴과 같은 5- 또는 6-원 산소 또는 황 함유 헤테로시클릭 그룹인 바람직한 아베르멕틴의 생산에 특히 유용하다.

스트렙토마이세스 아베르미틸리스 종중에서 아베르멕틴을 생산하는 미생물의 돌연변이는, 자외선 조사, X-레이조사, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소 구아니딘, 에틸메탄 설포네이트, 아질산 및 질소 머스터드(예를들면, N-메틸비스(2-클로로에틸)아민) 또는 유사한 처리를 포함하는 다양한 돌연변이 유도체중 어떤 것을 사용하는 공지된 방법에 따라 수행된다. 돌연변이는 예를들면, 에스.아베르미틸리스 ATCC 31272와 같은 천연 아베르멕틴을 생산할 수 있는 에스.아베르미틸리스의 포자 또는 생식성 배양물상에서 유발할 수 있다.

다음의 방법은 이 방면의 숙련가들에게 공지된 것으로, [¹⁴C-1]-2-옥소산으로부터¹⁴CO₂생산을 위한 무작위로 돌연변이를 일으킨 균 콜로니를 대량 스크리닝하는 생화학적 분석 방법을 기초로 하여, 돌연변이된 콜로니중에서 측쇄 2-옥소산 디하이드로게나제가 결여된 것을 선택하는 방법이다[참조 : Tabor et al., J.Bact, 128, 485-486, 1976].

그 방법은 적당한 영양 배지상에서 마이크로타이터(microtiter)판의 웰중에서 돌연변이된 콜로니를 배양하고, 세포에 툴루엔을 투과시킨 다음 [¹⁴C-1]-2-옥소산(예를들어, 2-옥소이소카프로산)을 가하고,¹⁴CO₂를 측정하기 위해 발효물상의 대기를 검사하는 단계로 이루어진다. 그외에도, [¹⁴C-1]-2-옥소-이소카프로산 대신에 [¹⁴C-1]-2-옥소-3-메틸발레르산 또는 [¹⁴C-1]-2-옥소-3-메틸부티르산을 사용할 수 있다.¹⁴CO₂의 생산은 통상적으로, 방출되는¹⁴CO₂를 모으도록 개개의 웰위에 Ba(OH)₂포화 여과지를 놓고, Ba¹⁴CO₃가 존재하는 경우 이를 오트라디오그래피로 측정하여 검사한다. 측쇄 2-옥소산 디하이드로게나제 활성이 결여된 변이주들은 대략 블랭크 대조균의 오토라디오그램을 나타낸다 ; 즉, Ba¹⁴CO₃는 변이주에 의해 생성되지 않는다.

그렇게 해서 수득된 변이주들은 상기 언급한 돌연변이 유발제를 사용하여 계속 돌연변이를 유발시킨다. L-이소루이신, L-루이신 및 L-발린(ILV)가 없는 M9/글루코즈 미니멀판에서 배양하였을 때 실패율을 기초로 하여 돌연변이된 콜로니중에서 측쇄 아미노산 트랜스퍼라제 활성이 결여된 것을 선택한다. 3개의 아미노산은 성장하는데 꼭 필요한 것이다. 또한, 상기 언급한 트랜스아미나제가 결여된 변이주는 트랜스아미나제 반응에 기질로서 사용되는 3개의 케토산이 모두 보충된 배지에서는 자라지 않는다. 하나의 트랜스아미나제 효소는 3개의 케토산(2-옥소-3-메틸 발레르산, 2-옥소-이소카프로산, 2-옥소-이소발레르산) 각각의 아미노기 전달에 촉매로 작용한다.

측쇄 2-옥소산 디하이드로게나제 및 측쇄 아미노산 트랜스아미나제 둘다가 결여된, 이중으로 차단된 변이주의 활성은 천연 아베르멕틴을 거의 생산하지 않는 배양물로 전환할 수 있는 가능성 때문에 특히 관심의 대상이 된다. 하나에 의해서만 차단된 변이주는 어떤 환경하에서, 천연 아베르멕틴을 생산하는 배양물로 전환할 수 있다.

돌연변이에 의해 얻어지는 미생물 균주의 원하는 대립인자의 생산 이외에도, 원형질체 융합은 한 균주에서 생성된/확인된 원하는 대립인자를 다른 균주의 크로모좀 속으로 도입할 수 있다. 예를들면, 측쇄 2-옥소산 디하이드로게나제 활성 및 측쇄 아미노산 트랜스아미나제 활성이 결여된 에스.아베르미틸리스 균주는 상기 언급한 활성을 가진 에스.아베르미틸리스 균주와 함께 원형질체 융합을 시키면 오직 측쇄 아미노산 트랜스아미나제 활성만이 결여된 에스.아베르미틸리스 균주를 생산할 수 있다. 이 방면의 숙련가들이 인식하고 있는 것처럼, 원형질체 융합기술로 하나의 균주중에서 선택된 분기된 부분으로부터 원하는 대립인자를 조합할 수 있다. 본 명세서에서 언급되는 측쇄 아미노산 트랜스아미나제가 결여된 균주인 에스.아베르미틸리스 JC-923(ATCC 53669)[기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10495, 기탁일 : 1988년 1월 9일]는 이러한 기술에 의해 생산되었다.

본 발명의 변이주들의 형태학상 및 배양학상의 특징은 일반적으로 미합중국 특허 제4,429,042호에 기술되어 있다. 본 발명의 변이주의 뚜렷한 특징은 본 명세서에서 요구하는 특징으로서 측쇄 2-옥소산 디하이드로게나제 활성 및/또는 측쇄 아미노산 트랜스아미나제 활성의 결여이다. 상기 기술한 활성들의 결여는, 실제적으로 지방산 RCOOH(여기에서, R은 이소프로필 또는 (S)-2급-부틸, 또는 발효중 언급한 RCOOH로 전환될 수 있는 화합물이다)를 포함하지 않는 한정된 배지상에서 배양했을 때 변이주는 천연 아베르멕틴을 생산하지 못하게 된다. 아메리칸 타잎 컬쳐 콜렉션(Americon Type Culture Collection)에 의한 분류학적 고찰은 상기의¹⁴CO₂분석에 의해 선별된 두개의 변이균주 I -3 및 HL-026의 특징을 알 수 있고, 미합중국 특허 제4,429,042호에 기술된 1세대 ATCC 31272균주의 변이주와 밀접한 관계가 있으나, 예외는 있다. 변이균주 I-3(ATCC 53567)[기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10493, 기탁일 : 1988년 1월 9일]는 확실히 ATCC 31272보다는 적은 양의 포자 체인을 형성하고, 변이균주 HL-026(ATCC 53568)[기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10494 기탁일 : 1988년 1월 9일]은 실제적으로 기생 균사체 및 포자가 전혀 없지만, 그가 생성하는 극소량의 포자 체인은 ATCC 31272의 그것과 유사한 성질을 갖는다.

또한, 변이주 HL-026는 유일한 탄소원으로서 라피노즈를 이용하는 능력이 확실치 않고, 반면에 ATCC 31272균주 및 변이체 I -3 균주는 라피노즈를 사용할 수 있다(적용 균주에 의한 실험에 있어서, 라피노즈는 이들 균주중 어떠한 것에도 성장을 지지하지 않는다고 나타났다). 변이균주 HL-026의 또 하나의 특징은, 다른 두개의 균주보다 멜라닌 색소를 훨씬 소량으로 생산하고, 유일하게 타이로신 한천상에서 전혀 자라지 못한다. 미합중국 특허 제4,429,042호에서 ATCC 31272에 대해 기술한 바를 비교해 볼 때, 유일한 탄소원으로서 슈크로즈를 사용하면, 변이주 또는 ATCC 31272의 성장을 감지할 수 없다. 변이주 I -3 및 HL-026은 오직 측쇄 2-옥소산 디하이em로게나제 활성만이 결여되어 있다. 추가로 돌연변이를 일으켜 생산된 이중으로 결여된 변이주 PGS-119[ATCC 53670)[기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10496, 기탁일 : 1988년 l월 9일], 및 원형질체 융합에 의해 얻어진 JC-923(ATCC 53669)는 변이균주 I -3처럼 ATCC 31272와 분류학적으로 유사한 관계가 있다.

스트렙토마이세스 아베르미틸리스 I -3, HL-026, PGS-119 및 JC-923은 부다페스트 조약에 따라 로크빌리(Rockville), 마릴란드(Maryland) 소재의 어메리칸 타잎 컬쳐 콜렉션, 기탁의 영구성을 부여하기 위해 알려진 기탁기관에 기탁하고, 만일 본 출원의 특허가 인정되면 공식적으로 거기에 접근하게 된다.

이들은 각각 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 ATCC 53567, ATCC 53568, ATCC 53670 및 ATCC 53669[기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10493, KFCC-10494, KFCC-10496 및 KFCC-10495(각각), 기탁일 : 1988년 1월 9일]로 표시한다. 37 CFR 1.14 및 35 USC 122에 따라 미합중국 특허청 및 상표국의 장관에 의해 지정된 기탁기관에의 기탁은 본 출원의 계류중에 유효하고, 본 출원의 부분 출원 또는 그의 자출원이 외국 출원법에 따라 출원된 그 나라에서도 유효하다. 기탁된 미생물의 공식적으로 이용에 있어서 모든 제한은 특허가 인정될 때 제거될 것이다.

에스.아베르미틸리스 ATCC 31267, ATCC 31271, ATCC 31272 및 NCIB 12121의 각각은 천연 아베르apr틴을 생산하고, 이는 일반식(I)의 화합물이다:

상기식에서, 22-23 위치의 점선은 임의의 이중결합이고; R¹은 하이도록시이고 오직 이중결합이 없을때만 존재하며; R²는 하기 일반식의 4'-(알파-L-올레안드로실) -알파-L-올례안드로실옥시이고

R³는 수소 또는 메틸이며 ; R은 이소프로필 또는 (S)-2급-부틸이다. 미합중국 특허 제4,285,963호에 25-위치가 메틸 및 에틸그룹으로 치환되고; R¹이 하이도록시 및 R³가 메틸인 일반식(I)의 아베르멕틴에 대해 기술하고 있다.

비-천연 아베르멕틴은 R이 이소프로필 또는 (S)-2급-부틸이 아닌 치환체이고, 하기에 기술되어 있다.

일반식(I)의 화합물의 생합성에 있어서 곡 필요한 화합물은 에스.아베르미틸리스 세포중에서 생성된다. 이들 화합물, L-발린, L-루이신 및 L-이소루이신은 생성물을 CoA와 커플링시킴과 동시에 2-옥소산으로의 전환 및 측쇄 2-옥소산 디하이드로게나제에 의한 산의 탈카복실화를 거쳐 아베르멕틴의 생합성에 참여한다고 생각된다. 이들의 존재는 일반식(I)의 이소프로필 및 (S)-2급-부틸 화합물의 동시 생산을 설명한다. 이것은 (S)-2급-부틸 유도체로부터 이소프로필의 분리라는 문제를 발생시킨다.

적합한 프라이머 화합물을 함유하는 영양 배지중에서 본 발명의 변이주를 발효시키면 일반식(I)의 학합물 또는, 더 보편적으로 R이, 사용된 주요 화합물에 상응하는, 둘 또는 그 이상의 일반식(I)의 화합물의 혼합물이 생성된다. 4개의 생산물은 통상적으로 또한 관용적으로 미합중국 특허 제4,429,042호에 사용된 표시에 따라, R-아베르멕틴 A1, A2, B1 및 B2로 표시한다. "R-" 그룹은 C-25의 치환체를 말한다. 예를들어, R이 시클로펜틸인 경우 4개의 가능한 아베르멕틴은 다음과 같다.

비-천연 아베르멕틴에 있어서 일반식(I)의 C-25치환체, "R"은 이소프로필 또는 (S)-2급-부틸이 아니다.

이중결합이 존재하고 OH가 없는 일반식(I)의 학합물은 R¹이 OH이고 이중결합이 탈수반응에 의해 없어진 일반식(I)의 상응하는 화합물로부터 또한 제조할 수 있다. 반응은 우선 예를들어, t-부틸디메틸실릴옥시 아세틸 유도체와 같이 5 및 4" 위치의 하이드록시 그룹을 선택적으로 보호한 다음,(4-메틸페녹시) 티오카보닐 클로라이드와 같은 치환된 티오카보닐 할라이드와 반응시키고, 예를들어, 트리클로로벤젠과 같은 탈수반응에 영향을 주는, 끓는 점이 높은 용매중에서 가열한다. 생산물은 마지막에 탈보호되어 불포화 화합물을 수득한다. 적당한 시약 및 반응조건과 함께 이러한 과정은 미합중국 특허 제4,328,335호에 기술되어 있다.

R³가 H인 일반식(I)의 화합물은 또한 R³가 CH₃인 상응하는 화합물을 탈메틸화하여서 제조할 수 있다. 이 반응은, 5-메톡시 화합물, 또는 적당히 보호된 그의 유도체를 머큐릭 아세테이트로 처리하고, 생성된 3-아세톡시 에놀 에테르를 희산으로 탈수반응시켜 5-케토 화합물을 수득한다. 이들은, 예를들어, 나트륨 보로하이드라이드를 사용하여 환원시켜 5-하이드록시 유도체를 수득한다. 이러한 과정을 위한 적당한 시약 및 반응조건은 미합중국 특허 제4,423,209호에 기술되어 있다.

R¹이 H이고 이중결합이 없는 일반식(I)의 화합물은 이중결합이 있고 R¹이 없는 상응하는 화합물로부터, 적당한 촉매를 사용하여 선택적인 촉매 수소화 반응에 의해 제조할 수 있다. 예를들면, 환원반응은 유럽 특허원 공개공보 제0001689호 및 1980년 4월 22일에 출원된 그의 부분출원인 미합중국 특허 제4,199,569호에 기술된 바에 따라 트리스(트리페닐포스핀)로 디움(I) 클로라이드를 사용하여 수행할 수 있다.

R²가 H인 일반식(I)의 화합물은, R²가 4'-(알파-L-올레안드로실)-알파-L-올레안드로실 옥시인 상응하는 화합물로부터 수성의 유기용매중에서 산으로 온화하게 가수분해하여 4'-(알파-L-올레안드로실)-알파-L-올레안드로즈 그룹을 제거시켜 13-위치에 하이드록시 그룹을 갖는 아글리콘을 수득하고 ; 이것을, 예를들면, 벤젠 설포닐할라이드를 이용한 반응으로 할로겐화하여 13-데옥시-13-할로 유도체를 수득하고, 마지막으로 수득된 생성물을, 예를들면, 트리부틸틴 하이드라이드를 사용하여 선택적으로 환원하여 제조할 수 있다. 불필요한 부반응을 피하기 위해 존재하는 어떤 다른 하이드록시 그룹을, 예를들면, 3급-부틸 디메틸실릴 그룹을 사용하여 보호할 수 있다.

이것은 극소량의 산을 함유하는 메탄올로 처리하여 할로겐화 또는 환원반응 후에 쉽게 제거된다. 적당한 시약 및 수행하기 위한 반응조건과 함께 이 모든과정은 유럽 특허원 공개공보 제0002615호에 기술되어있다.

천연 및 비-천연 아베르멕틴의 생합성을 위한 본 발명의 에스.아베르미틸리스를 이용할 수 있는 화합물은 발효과정중 (II-A)로 전환할 수 있는 화합물을 포함한 일반식(II-A)의 화합물이다.

R-COOH (II -A)

본 명세서에서 상기의 화합물을 "프라이머 화합물"로 표시한다. 일반식(II-A)에서, R은 알파-측쇄 그룹이고, -COOH 그룹이 결합된 그의 탄소원자는 또한 수소가 아닌 두개의 다른 원자 또는 그룹에 결합되어 있다. 이러한 정의는 물론, 아시클릭 쇄 또는 시클릭환의 원으로서 황 또는 산소 헤테로원자를 함유하는 포화된 및 불포화된 아시클릭 및 시클릭 그룹을 포함한다. 특히, C-25치환체인 R은 알파-측쇄 C₃-C₈알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시알킬 또는 알킬티오알킬 그룹; 알킬 그룹이 알파-측쇄 C₂-C₅알킬 그룹인 C₅-C₈시클로알킬알킬 그룹; 임의로 메틸렌에 의해 치환되거나, 또는 하나 또는 그 이상의 C₁-C₄알킬 그룹 또는 할로 원자(플루오로, 클로로, 요오도 또는 브로모)에 의해 치환될 수 있는 C₃-C₈시클로알킬 또는C₅-C₈시클로알케닐 그룹; 또는 포화되거나, 또는 전체적으로 또는 부분적으로 불포화되고, 하나 또는 그 이상의 C₁-C₄알킬 그룹 또는 할로원자에 의해 임의로 치환될 수 있는 산소 또는 황을 포함하는 3 내지 6원환이다.

발효과정중 RCOOH로 전환될 수 있는 화합물, 예를들어, 전구체는 일반식(II-B)의 화합물이다 ;

R-(CH₂)_n-Z (II - B)

상기식에서, R은 상기 정의되고 있고; n은 0,2,4 또는 6이며; Z는 -CH₂OH, -CHO, -CH₂NH₂, -COOR⁵또는 -CONHR⁶(여기에서, R⁵는 H 또는 (C_1-6)알킬이고, R⁶는 수소, (C_1-4)알킬, 또는 아미노산의 잔기, 특히 각기 예를들면, -CH(COOH)CH₂COOH-CH(COOH)(CH₂)₂COOH 및 -CH(COOH)(CH₂)₂SCH₃인 아스파르트산, 글루탐산 및 메티오닌의 잔기이다)이다.

측쇄 아미노산 트랜스아미나제만이 결여된 에스.아베르미틸리스 균주의 경우에 있어서, 전구체로서 또한 2-옥소산을 사용한다. 그래서, 기술한 균주를 위해 R 및 Z가 상기 정의된 일반식(II-C)의 산은 아베르멕틴의 생합성을 위해 기술한 에스.아베르미틸리스를 이용할 수 있다.

R -COZ ( II -C)

본 발명은 또한 일반식(II-A)의 화합물의 이성체 형태, 및 발효과정중 전환할 수 있는 화합물, 및 본 명세서에서 기술된 방법에 의한 그들의 사용으로부터 유도된 C-25에서의 이성체 아베르멕틴을 포함한다.

본 발명의 과정은, 측쇄 2-옥소산 디하이드로게나제 활성 및/또는 측쇄 아미노산 트랜스아미나제 활성이 결여된 에스.아베르미틸리스 균주를 동화할 수 있는 질소, 탄소, 무기염의 원 및 일반식 RCOOH의 화합물, 또는 발효중 기술된 화합물로 전환할 수 있는 화합물(예를를어, 전구체)을 함유하는 수성의 영양배지중에서 호기성 발효에 의해 수행된다. 산 또는 그것으로 전환할 수 있는 화합물을 발효에 있어서 주입하는 시기에 또는 발효중 간격을 두고 가한다. 트랜스아미나제가 결여된 변이주가 사용되는 경우, 발생하는 변이주의 생육을 위해, 배지속에 L-이소루이신, L-루이신 및 L-발린을 함유시켜야 한다. 아베르멕틴의 생산은 발효로 인한 샘플의 제거에 의해 인식될 수 있고, 유기 용매로 추출한 다음, 예를들면 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피를 사용하여 생산물의 생성을 관찰한다. 생산물이 최대로 수득될 때까지 항온유지시키는데, 일반적으로 4 내지 15일이 걸린다.

프라이머 화합물(카복실산 또는 그것으로 전환할 수 있는 화합물)의 각기 부가에 대한 바람직한 수준은 리터당 0.05 및 3.0g 사이이다. 프라이머 화합물은 연속적으로, 간혈적으로 또는 발효중에 한번에 가할 수 있다. 산(RCOOH)은 그 자체로서 또는 나트륨, 리튬 또는 암모늄염과 같은 염의 형태로서, 또는 상기 정의한 바와 같이 산으로 전환할 수 있는 화합물 형태로서 가한다. 산이 만일 고체이면, 물 또는(C_1-4)알콜과 같은 적당한 용매에 용해시키는 것이 바람직하다.

발효에 사용되는 배지는, 특히 C-25 치환체가 이소프로필 또는 (S)-2급-부틸인 경우에, 동화할 수 있는 탄소, 질소 및 미량원소의 원을 함유하는 통상적인 배지이다. C-25 치환체가 비-천연 그룹인 경우; 예를들어, 이소프로필 또는 (S)-2급-부틸이 아닌 경우 발효배지는 선택된 성분이 결여되거나, 또는 R부위가 이소프로필 또는 (S)-2급-부틸인 프라이머 화합물의 소량만을 함유하는 배지중 하나이다.

바람직하게 24 내지 33℃의 온도범위에서 몇일 동안의 발효 후, 발효 육즙을 원심분리 또는 여과시키고, 균사체 덩어리를 바람직하게는 아세톤 또는 메탄올로 추출한다. 용매 추출액을 농축시키고, 원하는 생성물을 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 부탄올 또는 메틸 이소부틸 케톤과 같은 수-불혼화성 유기 용매로 추출한다. 용매 추출액을 농축시킨 다음, 조 생성물을 경우에 따라 예를들면, 역상, 고성능액체 크로마토그래피를 사용하여 더 정제한다.

생성물은 일반적으로, R²가 4'-(알파-L-올레안드로실)-알파-L-올레안드로실옥시이고, R¹이 OH이며 이중결합이 없거나, 또는 R¹이 없고 이중결합이 존재하며, R³는 H 또는 CH₃인 일반식(I)의 화합물의 혼합물로서 수득된다 ; 특별한 변이주 및 적용된 프라이머 화합물 및 사용된 조건에 따라 비율은 다양하다.

R그룹의 원은; 예를들어, R-COOH로부터 직접적으로 나오거나 또는 상기 전구체중 하나로부터, 또는 어떤 전구체로부터 생성되는 것이든 아베르멕틴의 생산에는 중요하지 않다. 아베르멕틴의 생산을 위한 본 발명의 방법중 꼭 필요한 사항은 발효공정에 있어서 본 발명의 에스.아베르미틸리스 균주에 이용할 수 있는 목적하는 R그룹이어야 한다는 것이다.

적당한 화합물은 하기와 같다; 2,3-디메틸부티르산, 2-메틸헥사노산, 2-메틸펜트-4-에노산, 2-시클로프로필 프로피온산, 4,4-디플루오로시클로헥산 카복실산 리튬염, 4-메틸렌시클로헥산 카복실산, 3-메틸시클로헥산 카복실산(시스/트란스), 1-시클로펜텐 카복실산, 1-시클로헥센 카복실산, 테트라하이드로피란-4-카복실산, 티오펜-2-카복실산, 3-푸로산, 2-클로로티오펜-4-카복실산, 시클로부탄 카복실산, 시클로펜탄 카복실산, 시클로헥산 카복실산, 시클로헵탄 카복실산, 2-메틸시클로프로판 카복실산, 3-시클로헥센-1-카복실산, 2-메틸티오프로피온산, 2-메틸-4-메톡시부티르산, 티오펜-3-카복실산, 하이도록시메틸시클로펜탄, 3-티오펜 카복스알데하이드, 3-시클로헥실프로피온산, 3-시클로펜틸프로피온산, 하이드록시메틸시클로부탄, 테트라하이드로티오펜-3-카복실산, 3-시클로펜틸-1-프로판올, 3-메틸시클로부탄 카복실산 리튬염, 3-플루오로시클로부탄 카복실산, 3-메틸렌시클로부탄 카복실산 리튬염, 2-메틸-4-메틸티오부티르산, 테트라하이드로티오피란-4-카복실산, 시클로부틸메틸아민, 에틸 시클로부탄 카복실레이트, 4-하이도록시메틸시클로펜텐, 2-(3-티오펜카보닐)프로피온산 에틸 에스테르 (S)-2-메틸펜타노산, (R)-2-메틸펜타노산.

O-메틸트랜스퍼라제 변이주는 상기-언급한 측쇄 2-옥소산 디하이드로게나제 결여된 변이주 및/또는측쇄 아미노산 트랜스아미나제 결여된 변이주로부터 수득할 수 있다. 반응성 측쇄 2-옥소산 디하이드로게나제 활성 및/또는 측쇄 아미노산 트랜스아미나제 활성에 있어서 돌연변이가 O-메틸트랜스퍼라제 돌연변이들중 하나 또는 둘과 결합된 변이주들은, RCOOH 화합물 또는 발효과정중 RCOOH로 전환할 수 있는 화합물이 공급된 경우, 주로 B 아베르멕틴을 생산하는 에스.아베르미틸리스 균주를 얻는다. 언급한 변이주는, 자외선 조사 및/또는 N-메틸-N-니트로소우레탄, 니트로소구아니딘, 에틸 메탄 설포네이트 또는 상기 열거한 것과는 다른 시약에 의해 측쇄 2-옥소산 디하이드로게나제 활성 및/또는 측쇄 아미노산 트랜스아미나제 활성이 결여된 본 명세서에서 언급한 변이주에 돌연변이를 유발시켜 수득한다. 그 외에도, O-메틸트랜스퍼라제가 하나 또는 두개가 결여된 측쇄 2-옥소산 디하이드로게나제 양성 변이주 및/또는 측쇄 아미노산 트랜스아미나제 양성 변이주는 자외선 또는 돌연변이 유발제로 처리하여 돌연변이를 유발시켜 측쇄 2-옥소산 디하이드로게나제 음성 변이주 및/또는 측쇄 아미노산 트랜스아미나제 음성 변이주를 생산할 수 있다.

그러나 변이주들에 의해 생성된 비-천연 아베르멕틴은 아글리콘 부위의 C-5위치 및/또는 올레안드로즈 부위의 C-3' 및/또는 C-3'' 위치의 하이드록시 그룹의 존재로 특징지워진다.

상기 기술한 변이주들은 문헌[Schulman et al. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 29, 620-624(1986)]에 언급된 방법론에 따라 확인된다. 동일한 목적을 위해서 또한 공지된 아베르멕틴의 동일한 방법에 대해서 이들은 유용하다.

그 외에도, 올레안드로즈 디삭카라이드 부위상에서 메틸 그룹이 결여된 것을 함유하는 B 아베르멕틴의 증가된 양은, 반응성 측쇄 2-옥소산 디하이드로게나제 및/또는 측쇄 아미노산 트랜스아미나제 활성이 결여된 본 발명의 변이주를, O-메틸트랜스퍼라제 활성을 억제하는 시네펀진, S-아데노실에티오닌 또는 S-아데노실호모시스테인과 같은 물질 존재하에 발효시켜 생산된다.

본 발명의 화합물은 구충제, 체외기생충 구제제, 살충제 및 살진드기제로서 특히 유용한 기생충 구제제로 높은 활성을 갖는다.

따라서 상기 화합물은 특히, 선충류로서 기술한 기생충군에 의해 가장 빈번히 야기되며 가축 및 가금류에 영향을 줄 뿐만 아니라 돼지, 양, 말 및 소에 있어서 심각한 경제적 손실을 야기시킬 수 있는 기생충병을 포함하는, 장내 기생충에 의해 야기되는 여러가지 병리 상태를 치료하는데 효과적이다. 상기 화합물은 예를들면 개에서의 디로필라리아(Diro filaria) 및 사람에게 영향을 끼칠 수 있는, 안사이클로스토마(Ancyclostoma), 네카토(Necator), 아스카리스(Ascaris), 스트롱길로이데스(Strongyloides), 트린치넬라(Trinchinella), 카필라리아(Kapillaria), 트리츄리스(Trichuris), 엔테로비우스(Enterobius)와 같은 위장내 기생충 및 혈액 또는 다른 조직 및 기관에서 발견되는 사상층 및 장외 단계의 스트롱길로이데스(Strongyloides) 및 트리치넬라(Trichinella)와 같은 여러가지 기생충을 포함하는, 여러가지 종류의 동물에 해를 끼치는 다른 선충류에 대해서도 효과적이다.

상기 화합물은 또한 특히, 진드기(ticks), 진드기(mites), 이, 벼룩, 검정파리, 소 및 말에 해를 끼칠 수 있는 쏘는 곤충 및 쌍시류의 이동성 애벌레와 같은 동물류 및 조류의 절족류 체외기생충을 포함하는, 체외기생충을 구제하는데 유용하다.

화합물은 또한 바퀴벌레, 옷의 나방, 양탄자의 딱정벌레 및 집파리와 같은 가정의 곤충에 대해 살충제 활성이 있을 뿐만 아니라, 거미 진드기, 진딧물, 모충과 같은 저장곡식 및 농업식물의 곤충해 및 메뚜기와 같은 이동성 진시류에 대해 유용하다.

일반식(I)의 화합물을 당면한 특유의 용도 및 기생충 또는 곤충을 포함하는 처치되는 호스트의 특별한 종에 대해 적당한 제형으로서 투여한다. 구충제로서 사용되는 화합물은 캡슐, 동물용 정제, 정제 또는 동물용 액제 형태로 경구투여하거나, 또는 주사 또는 이식하여 투여할 수 있다. 그런 제형은 표준의 수의학 실습에 따라 통상적인 방법으로 제조된다. 캡슐, 동물용 정제 또는 정제는 활성성분과 적당한 미분쇄된 희석제 또는 추가로 붕해제를 함유하는 담체 및/또는 전분, 락토오즈, 탈크, 스테아르산 마그네슘과 같은 결합제와 혼합하여 제조할 수 있다. 동물용 액제 제형은 활성성분을 수성 용액중에서 분산제 또는 습윤제 등과 함께 분산시켜 제조할 수 있고, 주사제제는 혈액과 등장의 용액을 만들기 위해, 예를 들어, 충분한 염 또는글루코오즈와 같은 다른 물질을 함유할 수 있는 멸균 용액의 형태로 제조할 수 있다. 이 제형들은 처치되는 호스트의 종, 감염의 심도 및 형태, 및 호스트의 체중에 따라 활성 화합물의 무게에 있어서 다양하다. 일반적으로 경구투여인 경우 동물의 체중 kg당 약 0.001 내지 10mg의 용량으로 한번에 투여하거나 또는 1 내지 5일에 걸쳐 나누어 투여하는 것이 좋다. 물론 용량 범위가 더 높거나 낮은 예가 있을 수 있고, 그것은 본 발명의 범위내에 있다.

화합물은 동물의 사료와 함께 투여 및 이러한 목적을 위해 농축된 먹이 첨가제 또는 미리 혼합(Premix)하여 투여할 수 있으므로 정상적인 동물먹이와 함께 혼합하여 제조할 수 있다.

살충제 및 농업 해충을 처치하기 위한 용도로서 표준 농학의 실습에 따라 화합물을 분무제, 산포제, 현탁액 등으로 적용한다.

측쇄 2-옥소산 디하이드로게나제 결핍 에스.아베르미틸리스 I-3(ATCC 53567)의 생산

단계 1

에스. 아베르미틸리스 ATCC 31272는 새로운 패취(Patch) 한천 배지상에서 30℃, 12일 동안 융합성 론(lawn)으로 배양된다. 그 배지 성분은 하기와 같다.

V -8즙^*200ml

CaCO₃3g

한천 15g

H₂O 1000m1까지 첨가

영양육즙 1.0g/l

나트륨 아세테이트(CH₃COONa·3H₂O) 1.4g/l

이소발레르산 50mg/l

이소부티르산 50mg/l

2-메틸부티르산 50mg/l

이소루이신 250mg/l

루이신 250mg/l

발린 250mg/l

최소 성분용액^**1ml/l

* V-8채소즙의(토마토, 당근, 셀러리, 사탕무우, 파슬리, 양상치, 양갓냉이 및 시금치) 혼합물에 염, 아스콜브산 및 시트르산 및 천연 향미제를 첨가한다. 엔제이. 캄덴 소재의 캄프벨 수프 회사로부터 입수(Campbell Soup Company, Camden, NJ).

** 최소 성분용액의 조성 :

FeC1₃·6H₂O 2.7g

MnSO₄·H₂O 4.2

CuSO₄·5H₂O 0.5

CaCl₂11.0

H₃BO₃0.62

COCl₂·6H₂O 0.24

ZnCl₂0.68

Na₂MoO₄0.24

0.1N HCl 1ℓ에 상기물을 용해시킨다.

포자를 3개의 이러한 플레이트로부터 수득하고 0.05M 트리스-말레산 완충액(pH 9.0) 20ml에 현탁시킨다.

단계 2

포자현탁액 10ml를 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 10mg을함유한 바이알(Vial)에 넣는다. 그 바이알을 28℃에서 60분 동안 진탕배양하고 포자를 1% NaCl 용액으로 충분히 세척한다.

단계 3

세척한 포자를 1% NaCl에 현탁시키고 동량의 80% 에틸렌글리콜과 혼합한다. 이 현탁액은 -20℃에서 저장하고 변이주를 선별하기 위한 세포원으로 사용한다. 이것은 증식시 약 10⁴콜로니/ml를 가진다.

이 포자 저장액을 YPD 플레이트에 도말하여 플레이트당 약 100개의 콜로니를 수득한다(YPD 배지는 이스트 추출물, 박로펩톤^*및 텍스토로즈를 각각 10g/l씩; 및 박토한천^*15g/l로 이루어져 있고 가압멸균 전에 pH 6.9로 조절한다). 별표한 성분은 미시간 48238 디트로이트 소재의 디프코 연구소에서 입수한다(Difco Laboratories, Detroit, Michigan 48238).

단계 4

28℃에서 2 내지 3주간 배양시킨 플레이트로부터 콜로니 하나를 따서, 표준의 96웰 마이크로타이터(microtiter) 플레이트의 각 웰에 넣는다. 또한 소량의 콜로니를 변이주를 확인할 경우 생체 세포원으로 사용하기 위하여 신선한 한천 배지에 배양시킨다.

단계 5

각 웰에 1% 글루코즈, 0.1% 카사미노산 및 각각 0.01%의 이소발레르산, 이소부티르산 및 2-메틸부티르산을 함유한 M9염 액체 배지를 약 75마이크로리터 가한다. 28℃에서 몇일 동안 배양시킨 후, 세포의 측쇄 2-옥소산 디하이드로게나제의 존재를 측정한다(M9염 배지의 1ℓ당 6g Na₂HPO₄, 3g KH₂PO₄, 0.5g NaCl 및 1g NH₄Cl이 함유되어 있다. 이 배지를 가압멸균한 후, 멸균된 1M MgSO₄및 0.1M CaCl₂를 각 1ml씩 무균상태에서 첨가한다).

단계 6

M9염 배지중에 5% 톨루엔의 마이크로 현탁액은 잘 섞이지 않는 혼합물을 간단히 음파 파쇄하여 제조한다. 이 현탁액 25ml에 [¹⁴C-1]-2-옥소-이소카프로산 2.5μCi/ml 및 10.0μCi/μmole을 함유한 용액 1.2ml를 가한다. 이 총 혼합물 50μl를 측정한 콜로니가 들어있는 마이크로타이터의 각 웰에 가한다.

단계 7

각 웰로부터 생성된¹⁴CO₂를 포획하여 문헌에[참조 : Tabor (et) (al)., J.(Bacteriol), 128, 485-486(1976)'Convenient Method for Detecting¹⁴CO₂in Multiple Samples : Application to Rapid Screening for Mutants"] 설명된 방법에 의해 시각화한다. 활성인 측쇄 2-옥소산 디하이드로게나제를 결핍한 변이주는 대조군에서 관찰된 이하로 Ba¹⁴CO₃를 생성하지 않는다.

오토래디오그램상에 Ba¹⁴CO₃형성의 결과로 흑점이 나타나는¹⁴CO 측정의 양성 및 매우 연한 점 또는 점이 나타나지 않는 음성의 비교를 개선한 좀더 명확한 방법은 하기 변형된 선별로 이루어져 있다.

7 내지 14일간 배양(2 내지 3주일 배양 및 상기 단계 6 및 7로 직접 측정하는 것보다는) 후 한천 배지로부터 콜로니 하나를(상기 단계 4 참조) 딴다. 상기 방법중 단계 5는 생략한다.

¹⁴CO₂방출과 관련하여 사실상 정량적인 훨씬 더 명확한 측정방법은 글루코즈 1% 및 "신카사-브카아"("Syncasa-bcaa" 0.1%(상품화된 카사미노산의 적당한 성분과 L-아미노산의 합성 혼합물이지만 L-발린, L-이소루이신 및 L-루이신은 없다. 하기를 참조)와 M9염 배지로 이루어진 적당한 배지상에서 상기한 선별에 의해 확인된 변이주를 배양시키는 것으로 구성된다.

고밀도의 세포로 배양시킨 후, M9염 배지에서 세포를 세척하고, 톨루엔의 우유 빛을 띤 흰색 분산액으로 생성하기 위해 음파 파쇄시킨, 1% 톨루엔을 함유한 냉각된 M9염 배지에 재현탁시킨다. 세포/완충액/톨루엔 현탁액을 투과성 세포를 만들기 위해 30℃에서 40분간 배양시킨다. 투과성 세포를 M9염 배지에서 세척한 후 최종으로 M9 배지 완충액의 초기 부피의 5분의 1에 재현탁시킨다. 측정 당 이 현탁액의 l80μl를 사용한다.

반응부피 3,000마이크로리터에는 톨루엔화된 세포, 티아민 피로포스페이트(TPP), 0.4mM; 조 효소 A(CoA), 0.11mM; 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드(NAD) 0.68mM, 디티오트레이톨(DTT) 2.6mM; MgC1₂4.1mM; 트리스-염산 60mM, 트리스-염산 60mM; pH 7.5, 및 [¹⁴C-1]-알파-케토이소카프로에이트 6,000cpm, 마이크로큐리/마이크로몰을 함유한다. 측정치의 효율은 73%이다. 반응은 바이알의 뚜껑내에 불어있는 4각의 2×2cm 와트만(Whatman) #4 종이를 함유한 15ml의 방사능 측정용(Scintillation) 바이알에서 수행한다. 이 종이는 1M 히아민 하이em록사이드(메탄올중에 메틸벤즈에토늄 하이드록사이드 1M 용액 ; 엠오 63l78 에스 티. 루이스 소재의 시그마 화학 회사로부터 구입; Sigma Chemical Co., St.Louis, Mo 63178) 30마이크로리터를 함유하고, 반응중 발생되는¹⁴CO₂를 포획한다. 2시간 배양 후, 이 종이를 베크만 아쿠아졸 II(Beckman Aquasol II; 통상적으로 LSC; liquid Scintillation Counter, 엠에이 02110 보스톤 소재의 뉴우 잉글랜드 뉴클레어 리써취 프러덕츠에서 구입; New England Nuclear Research Products, Boston, MA 02118) 10ml에 담그고, 이 용매에서 4시간 이상동안 안정시킨 후 액체 섬광 계수기(liquid scintillation counter)로 방사능을 측정한다. 기준이 되는 대조반응은(즉-세포가 없는 것) 약 50 내지 300cpm이다.

변이주 I -3 및 그와 유사한 다른 것들은 기준 대조반응과 같거나 그 이하의 측정치를 나타내는 반면 모균주는 기준 대조값보다 몇배 높은 측정치를 보인다.

에스. 아베르미틸리스 I-3(ATCC 53567)의 HL-026 유도체(ATCC 53568)의 분리

에스. 아베르미틸리스 I-3(ATCC 53567)[기탁기관 : 한국종균 협회, 기탁번호 : KFCC-10493, 기탁일 : 1988년 1월 9일]을 영양 한천 플레이트에 도말한다. 상대적으로 높은 빈도의 자연적으로 발생하는 변이주가 나타나고, 그중 몇몇은 30℃에서 4일간 배양하면 호기성 균사체가 결여된다. 그러한 몇개의 변이주를 분리하고, 시클로펜탄 카복실산이 첨가된 AP-5 배지에서 발효시켰을때 비-천연 아베르멕틴의 생산 능력을 실험한다. 분리물로부터, 많은 부분이 천연 아베르멕틴이 없는 비-천연 아베르멕틴을 생산하고, 플라스크 실험에서 그의 부모인 에스. 아베르미틸리스 I-3(ATCC 53567)보다 더 높은 타이터의 아베르멕틴을 생산하는 균주가 나타나고 이것을 숫자 HL-026(ATCC 53568)[기탁기관 : 한국종균 협회, 기탁번호 : KFCC-10494, 기탁일 : 1988년 1월 9일]로 확인한다.

측쇄 2-옥소산 디하이드로게나제 결핍 및 측쇄 아미노산 트랜스아미나제 결핍된 에스. 아베르미틸리스 PGS-119(ATCC 53670)[기탁기관 : 한국종균 협회, 기탁번호 : KFCC-10496, 기탁일 : 1988년 1월 9일]의 생산

단계 1

새로운 SAMM 한천 배지 플레이트에서 4일간 배양된 에스. 아베르미틸리스 I -3(ATCC 53567)[기탁기관 : 한국종균 협회, 기탁번호 KFCC-10493, 기탁일 : 1988년 1월 9일]의 대략 100mg을 SCM 배지(pH7.2) 50ml를 함유하는 300ml 플라스크에 주입한다. 플라스크를 30℃ 200RPM에서 24시간 진탕시킨다(최종pH=8.2).

단계 2

플라스크를 진탕기에서 제거하고 전체 육즙 10ml를 멸균된 튜브속에서 2000RPM으로 5분간 원심분리시킨다.

세포를 멸균된 300ml 엘렌마이어 플라스크중에서 SCM 배지 50ml에 재현탁시키고, 플라스크를 회전진탕기상에서 30℃에서 2시간 진탕시킨다.

단계 3

현탁액 10ml를 멸균된 튜브속에 넣는다.

단계 4

에틸메탄 설포네이트(250μl)를 튜브에 가하고(잘 환기되는 후드에서), 내용물을 철저히 혼합한 다음, 멸균된 300ml 플라스크에 붓고, 플라스크를 회전 진탕기에서 30℃로 3시간 진탕시킨다.

단계 5

새로운 멸균된 SCM 배지(40ml)를 플라스크에 가하고 30℃에서 총 70시간 계속해서 진탕시킨다.

단계 6

플라스크를 제거하고, 내용물을 8000RPM으로 하여 20℃에서 10분간 회전시킨다. 세포를 SCM 배지에서 재현탁으로 세척하고, 다시 회전시킨 다음 SCM 배지 10ml에 재현탁시킨다.

단계 7

세포를 제거하고, L-루이신, L-이소루이신, L-발린 및 언급한 아미노산중 어떤 것의 조합의 존재 및 비존재하에 M9/글루코즈 미니멀 플레이트상에서 성장하는 능력을 알아보기 위해, 약 150콜로니/플레이트의 레플리카(replica) 플레이트하여 분석한다. 원하는 변이세포는 오직 L-루이신, L-이소루이신 및 L-발린이 공급된 배지에서만 성장한다. 측쇄 아미노산 트랜스아미나제 활성이 결여된 이들 에스. 아베르미틸리스 I -3(ATCC 53567)의 유도체도 또한 L-루이신, L-이소루이신 및 L-발린의 전구체로서 이용되는 3개의 2-옥소산(2-옥소이소카프로산 ; 2-옥소-3-메틸발레르산 및 2-옥소이소발레르산)중 하나 또는 그이상이 공급된 배지상에서 성장하지 못한다. 이 작용은 그런 배지상에서 잘 성장한 에스. 아베르미틸리스 I -3(ATCC 53567)의 그것과는 완전히 반대이다. 따라서, 하나의 트랜스아미나제 효소는 언급한 2-옥소산의 아미노기 전달에서 촉매작용을 한다.

(SCM 배지)

이스트 자가분해물 10g/l

고기추출물 5g/l

^*카제인 효소 가수분해물 10g/l

1M MgSO₄3g/l

1M K₂HPO₄; pH 7.0(HCl) 100g/l

(SAMM 한천플레이트)

(g/l)

Na₂HPO₄6.0

KH₂PO₄3.0

NaCl 0.5

NH₄Cl 1.0

1M MgSO₄1.0

0.1M CaCl₂1.0

덱스트로즈 8.0

카사미노산 20.0

한천 20.0

("신카사-브카아"의 조성물 ; 100배 농도)

(그램/리터)

L-알라닌 3

L-아르기닌 4

L-아스파르트산 6

L-시스틴 1

L-글루탐산 20

글라이신 1

L-히스티딘 2

L-리신 7

L-메티오닌 3

L-페닐알라닌 6

L-프롤린 10

L-세린 6

L-트레오닌 4

L-타이로신 4

L-트립토판 1

혼합물을 pH 7로 만들고 여액을 멸균한다. 농축물의 1부(부피)를 배지의 99부(부피)에 가하여 표준 농도로 사용한다.

에스. 아베르미틸리스 ATCC 31272 및 에스. 아베르미틸리스 PGS 119(ATCC 53670)[기탁기관 : 한국종균 협회, 기탁번호 : KFCC-10496, 기탁일 : 1988년 1월 9일]의 스펙티노마이신 저항 균주의 원형질체 융합에 의한 에스. 아베르미틸리스 JC-923(ATCC 53669)[기탁기관 : 한국종균 협회, 기탁번호 : KFCC-10495, 기탁일 : 1988년 1읠 9일]

에스. 아베르미틸리스 ATCC 31272 스펙티노마이신 저항은 에스. 아베르미틸리스 ATCC 31272의 자발적인 돌연변이이다. 이것은 스펙티노마이신 50mcg/ml를 함유하는 AS-1 한천 플레이트상에 퍼진 다수의 ATCC 31272의 식물성 군사체로부터 분리한다. 영양 배지상에서 발아시킨 변이주의 포자는, 이런 조건하에서 발아하지 못하는 동인자형의 모균주의 포자와 비교할 때 스펙티노마이신 50mcg/ml에 저항한다. 이런 특출한 선별방법은 ATCC 31272의 측쇄 아미노산 트랜스아미나제-결핍 분리물을 분리하는데 성공적으로 사용된다.

AS-1 한천

(스트렙토마이세스를 위한 영양 플레이트 배지)

이스트 추출물 1g

L-알라닌 0.2g

L-아르기닌 0.2g

L-아스파라긴 0.3g

용해성 전분 5g

NaCl 25g

Na₂SO₄10g

한천 20g

증류수 1리터

pH 7.5로 맞춘다. 121℃에서 15분간 고압멸균한다. 30 내지 35ml를 멸균된 플라스틱 페트리 플레이트에 붓는다(15mm에 의해 100).

스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 생원형질체 생산방법

A. 주입용 포자

1. 포자제제는 표준 방법에 따라 제조하고, 생포자의 수는 발아 한천상의 플레이트 희석에 의해 계산되고, 40% 글리세롤 중에 -70℃에서 동결시킨다.

2. 사용하기 전에, 포자 군체를 1000g에서 10분간 원심분리시키고 0.85% 생리 식염수의 동등량 중에 재현탁시킨다.

3. 대략 107포자를 300ml 3-또는 4-차폐된(baffled)플라스크 중에 0.5% 글리신을 함유하는 변형된 이스트 추출물-맥아 추출물 육즙(YEME)배지 30ml에 주입한다.

B. 접종물로서 동결되고 음파파쇄된 균사체

1. PGS-119의 균사체 배양물은 600nm에서 혼탁도가 2내지 9가 될때까지 트립티카제 소이 브로스(Trypticase Soy Broth)(TSB)중에서 배양한다.

2. TSB에서 2배로 희석시킨 균질화시킨 균사체 20ml를 멸균된 폴리프로필렌 원심분리용 튜브에 가한다. 초음파 프로브(probe)를 액체중 1 내지 2cm깊이에 침수시키고, 샘플을 50% 강도에서 10초동안 음파파쇄시킨다. 균사체를 음파파쇄하여, 2차 배양시 빠른 속도로 급성장하여 생성되는 단독 또는 이중의 세포 단위로 분산시킨다.

3. 음파파쇄된 균사 제제는 40% 글리세롤의 최종 농도로 희석하고, 바이알 속으로 피펫팅한 다음 -70℃에서 동결시킨다.

4. 분취량을 상기 기술한 단계 A, 3에 따라 YEME배지에 주입하기 위해 상온에서 녹인다.

C. 접종물로서 한천 배지상의 콜로니

1. TSA 또는 YPD-2 한천상에서 배양된 PGS-119의 성숙한 6개의 콜로니를, 루프를 사용하여 마이크로푸그(microfuge)튜브속의 멸균수 200μl에 도입한다.

2. 균사 혼합물을 1회용 막자로 균질화한다.

3. 균질화된 콜로니를 상기 기술한 단계 A, 3에 따라 YEME배지에 가한다.

D. 글리신 중에서 배양된 균사체로부터의 원형질제제

1. 배양물을 8에 맞춘 진탕수욕중 29℃에서 약 65시간동안 배양한다.

2. 균사를 40X상 2배율 하에서 현미경으로 관찰하고 20℃ 약 1475g에서 10분동안 폴리프로필렌 원심분리용 튜브속에서 수확한다.

3. 상등액을 제거하고 균사체 펠리트(pellet)를 원형질체(P) 완충제(하기 참조) 10ml에 재현탁시킨다. 펠리트를 조직 그라인더와 5내지 10회 균질화시켜 분산덩어리로 만든다.

4. 샘플을 약 1000g에서 10분동안 원심분리시킨다. 상등액을 제거하고 펠리트를 조심스럽게 P완충제 10ml에 재현탁시킨다.

5. 상기의 세척 단계를 반복한다.

6. 균사체 펠리트를 0.22마이크론 여과지를 통해 여과-멸균된 P완충제 중에서 1.0mg/ml의 새로운 라이소자임 용액 10ml에 재현탁시킨다.

7. 균사체 혼합물을 37℃ 빙욕에서 60분간 조심스럽게 진탕하면서 배양한다. 샘플을 라이소자임 용액중에 매 15분마다 재현탁시킨다. 샘플을 원형질체의 존재확인을 위해 40X 상 하에서 현미경으로 관찰한다.

8. 균사체 제제를 5ml 피펫으로 3회 분쇄하여 그의 세포벽으로부터 원형질체를 유리시킨다.

9. 제제는 글래스 울 또는 비-탈지면으로 여과한다.

10. 원형질체는 약 1000g에서 7분동안 원심분리시켜 침전을 형성하게 하고 P완충제 5ml에 조심스럽게 재현탁시킨 다음, 40X상 배율하에서 관찰한다.

11. 원형질체는 상기와 같이 침전시키고 P완충제 1.0ml에 재현탁시킨다. 현탁액의 희석은 P완충제 및 증류수 중에서 이루어지고 재생 배지상에 펼쳐놓는다. 증류수 중에서 희석된 원형질체 제제로부더 생성된 콜로니는 불완전하거나 또는 비-원형질화된 균사체 단위로부터 유도된 것이라고 추측된다.

12. 원형질체는 -70℃에서 분취량 200 내지 300μl중에서 빙상 동결된다. 18 내지 24시간 후에 빙상으로부터 제거한다.

폴리에틸렌 글리콜(PEG) 1000으로 원형질체 융합

1. 본 명세서에 기술된 모든 실험은 실험자의 손에 거의 독성이 없는 PEG 1000의 단독 로트(lot)[제조원 : Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178]를 가지고 수행한다.

2. PEG의 1.0g 분취량을 유리 바이알 중에서 고압멸균시키고, P완충제 1.0ml를 가한 다음, PEG를 55℃로 바이알을 가열해 용해시키거나 또는 PEG의 무게를 달아 P완충제 중에서 용해시키고 사용직전에 여과-멸균한다. PEG용액은 주변온도에서 사용한다.

3. 원형질체는 신선하게 제조하거나 또는 흐르는 물중에서 -70℃ 보관용으로부터 재빨리 녹인다. 대략 각 인자형의 원형질체의 동등한 양으로 조심스럽게 폴리카보네이트 원심분리용 튜브에 피펫팅한다. 신선하게-제조된 원형질체 제제를 위해, 혼탁도를 측정하고 몇몇 다른 농도로 융합시킨다. 각 튜브의 부피는 P완충제를 가지고 5.0ml로 맞춘다.

4. 융합 혼합물을 약 1000g에서 7분간 원심분리시킨다.

5. 상등액을 주의깊게 경사시킨다. 원형질체 펠리트는 조심스럽게 재현탁시키고 P완충제를 가지고 총 부피가 200μl 되게 한다.

6. 50% PEG 800μl를 재빨리 융합 혼합물에 가한다. 제제는 파스퇴르 피펫속으로 끌어올리고 다시 배출하는 방법으로 혼합한다. 융합물을 상온에서 2분간 배양한다. P완충제 9ml를 가하여 PEG를 희석한다. 나머지 융합물을 연속해서 수행하는데 배양간격을 정확하게 한다.

7. 융합 혼합물을 단계 4처럼 원심분리시키고, 상등액을 주의깊게 경사하고, 융합되고, 세척된 원형질체를 P완충제 1.0ml에 재현탁시킨다.

8. 융합 혼합물을 연속해서 P완충제로 10^-1및 10^-2로 희석한다.

9. 각 균주 단독의 융합을 매 실험마다 수행하고, 대조군으로서 플레이트 한다.

10. 각 원형질체 제제의 희석(생균수 측정)을 플레이트하여 융합방법에 사용된 각 균주의 살아있는 재생균주의 수를 결정한다.

원형질체의 재생

1. 원형질체 현탁액, 융합 혼합물, 또는 자가-융합물을 P완충제로 적당히 희석하고 조심스러운 도말기술로 재생 한천 배지상에 100μl를 플레이트한다. 중층소프트 한천중의 융합된 원형질체의 도말은 그의 재생을 뚜렷하게 개선하지는 않는다.

2. 적망하게, D, 11에 기술된 방법을 사용한다.

3. 재생 플레이트를 29 내지 30℃ 및 습도 약 95%에서 밀폐된 플라스틱 백속에서 오른쪽이 올라가게 하여 배양한다.

4. 스펙티노마이신-저항이 독특한 선별 표시로 사용되는 원형질체 융합을 위해, 재생하는 원형질체를 100mcg/ml의 스펙티노마이신 3.5ml와 함께 고압멸균된 소프트 한천(하기 참조)중에서 중층으로 하고 45℃ 이하에서 가한다.

5. 원형질체를 7 내지 10일간 배양한다.

성장배지, 재생배지, 및 원형질체 완충제 완성된 재생배지(Hopwood, et al.1985, Genetic Manipulation of Streptomyces; A Laboratory Manual, P.235로부터 변형)

기본 용액 :

슈크로즈 205g

K₂SO₄0.25g

MgCl₂·6H₂O 10.12g

글루코즈 10g

디프코(Difco) 카사미노산 0.1g

디프코 이스트 추출물 5.0g

디프코 오트밀 한천 3.0g

디프코 박토 한천 22.0g

증류수로 955ml

121℃에서 25분간 고압멸균한다.

고압멸균후, 멸균된 스톡을 가한다 ;

KH₂PO₄(0.5%) 10ml

CaCl₂·2H₂O 5ml

L-프롤린(20%) 15ml

MES완충제(1.0M) 10ml

미량 원소 용액^*2.0ml

NaOH(1N) 3.0ml

pH 6.5로 맞추고; 부피 1ㅣ를 채운다.

* 미량 원소 용액(리터 당);

ZnCl₂40mg

FeCl₃·6H₂O 200mg

CuCl₂·2H₂O 10mg

MnCl₂·4H₂O 10mg

Na₂B₄O₇·10H₂O 10mg

(NH₄)6Mo₇O₂₄·4H₂O 10mg

스펙티노마이신 중층 소프트 한천

상기 기술한 것을 제외한 것으로서 완전한 재생배재;

한천 4.10g

상기와 같이 고압멸균한다. 55℃로 냉각한다. 스펙티노마이신 100mg을 가한다. 뚜껑이 달린 배양 튜브에 5ml를 분취한다. 냉동한다. 사용하기 직전 다시 고압멸균한다.

변형된 원형질체(P)완충제

기본 용액 :

슈크로즈 205g

K₂SO₄0.25g

MgCl₂·6H₂O 2.02g

증류수로 977ml

121℃에서 25분간 고압멸균한다.

고압멸균후, 멸균된 스톡에 가한다 ;

KH₂PO₄(0.5%) 1ml

미량 원소 용액^*2ml

CaCl₂·2H₂O(3.68%) 10ml

MES완충제(1.0M) 10ml

pH 6.5로 맞추고; 부피 1ㅣ로 한다.

* 미량 원소 용액 처방은 상기와 같다.

변형된 이스트 추출물-맥아 추출물(YEME)배지

기본 용액 ;

디프코 이스트 추출물 3g

디프코 박토-펩톤 5g

디프코 박토 맥아 추출물 육즙 3g

글루코즈 10g

슈크로즈 300g

증류수로 973ml

121℃에서 25분간 고압멸균한다.

고압멸균후, 첨가물 ;

MgCl₂·6H₂O(2.5M) 2ml

글리신(20%) 25ml

부피를 1ㅣ로 만든다.

제1도는 지방산이 없는 배지(WPM Syn A 40 : 40)에서 생육시킨 경우, 에스.아베르미틸리스 I-3(ATCC 53567)[기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10493, 기탁일 : 1988년 1월 9일]세포의 용매추출후, 시간에 대한 용매 분획의 HPLC 크로마트그래프의 UV추적(240nm)을 나타낸 그래프이다. 13.12에서의 피크는 올리고마이신 A이다.

제2도는 지방산이 없는 배지(WPM Syn A 40 : 40)상에서 생육시킨 경우, 에스.아베르미틸리스 MA4848(ATCC 31272)세포의 용매 추출후, 용매 분획의 HPLC 크로마토그래프의 UV추적(240nm)을 나타낸 그래프이다. 생물은 천연 아베르멕틴이다.

제3도는 시클로펜틸카복실산(실시예 1참조)을 함유하는 배지상에서 생육시킨 경우, 에스.아베르미틸리스 I-3(ATCC 53567)세포의 용매 추출물로부터 용매 분획의 HPLC 크로마토그래프의 UV추적(240nm)을 나타낸 그래프이다.

첨부된 도면은 지정한 화합물의 HPLC커브의 정확한 트레이싱이다.

다음의 실시예에서 사용되는 배지의 조성은 하기와 같다. 모든 분자량 결정은 고체 염화나트륨과 함께 트리에틸렌 글리콜의 샘플 마트릭스를 사용한 VG 모델 7070E 질량 스펙트로미터 상에서 수행되는 빠른 원자충격 질량 스펙트로미트리에 의해 얻어진다. (M+Na)⁺가 결정된다. 전자 충격 질량 스펙트로미트리는 VG 모델 7070F 질량 스펙트로미터를 사용하여 주요부분이 기록되는 수치를 위해 m/e치를 제공한다.

a. 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis)(노보(Novo)효소, 윌톤(Wilton), CT로부터 이용할 수 있고 상품명 "테르마밀(Termanyl)"로 시판된다)로부터 알파아밀라제에 의해 전분을 가수분해시켜 40%±5%의 텍스트로즈 등량가로 제조한다.

b. 이스트 프러덕트회사 제품(Yeast Products, Inc., Clifton, NJ 07012).

c. 트레이덜 프로테인 제품(Traders Protein., Memphis, TN 38108).

NaOH를 사용하여 pH 7.2로 맞춘다.

25% NaOH를 사용하여 pH 6.9로 한다.

pH 6.8 내지 7.0으로 맞추고 121℃에서 30분간 교반한다.

PH 6.8 내지 7.0으로 맞추고, 121℃에서 30분간 교반한다.

알반적인 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)방법

이동상 :

물 150ml

아세토니트릴 70ml

메탄올을 가하여 1티러가 되도록 함

컬럼 ; 울트라스페어(Ultrasphere ODS 25cm)

[제조원 ; Beckmann Instruments, Fullerton, CA 92634-3100]

유속 ; 0.75ml /분

측정 ; UV 240nm

희석도 ; 거의 6

샘플 희석제(D) ;

아세토니트릴 35ml에 메탄올 390ml를 더함.

표준 ;

1. 10ml 플라스크중에서 아베르멕틴 A2A 0.5mg을달아 메탄올로 상기 용량을 채운다.

2. 10ml 플라스크중에서 시험 생산물 0.5mg을 달아 메탄올로 상기 용량을 채운다. 1 및 2는 표준 스톡용액이다 ; 표준 용액으로 다음을 수행한다 ;

바이알중에 (1)번 용액 100μl 및 (2)번 용액 100μl를 넣고 이동상 800μl를 가함.

샘플 ;

1. 잘혼화된 육즙 1ml를 취해 ; 천천히 돌린다.

2. 혼탁시키는 펠리트가 가능한한 없도록 하여 충분한 상등액을 제거한다.

3. HPLC 물 100μl를 펠리트에 가하고 휘저어 혼합하여 분산시킨다.

4. 희석제(D) 2ml를 가하고 잘 혼합시킨다.

5. 동일한 여과 및 HPLC를 수행한다.

천연 아베르멕틴을 본 HPLC 크로마토그래피 방법에 따라 수행하고 각기 아베르멕틴의 피크의 체류시간은 HPLC결정의 내부 표준으로서 사용되는 올리고 마이신 A의 존재를 위해 관측되는 체류시간에 의해 나누어 진다. 올리고마이신 A는 거의 항상 에스.아베르미틸리스 발효의 부산물로서 HPLC에 의해 관측되고, R이 상기 정의되어 있는 RCOOH산이 없는 배지 또는 일반식 RCOOH의 산으로 전환할 수 있는 화합물이 없는 배지중에서 배양한 경우 상기 정의한 변이주에 의해 생산되는, HPLC상에서 오직 관찰할 수 있는 생산물이다. 전형적으로, 올리고마이신 A의 체류시간은 12.5 내지 14분아다. 체류시간의 비율(RT)은 확인비교에 있어서 중요한 기본이 되고 아베르멕틴 생산물을 생성한다. 아베르멕틴 생성물의 일반적 표출 순서는 B2, A2, B1 및 A1이다(제2도).

천연 아베르멕틴은 제2도로부터(B1a 및 A1b는 판별되지 않았음), 및 비-천연 아베르멕틴은 제3도로부터 비율은 결정된다. 올리고마이신 A가 일반적으로 거의 12.5 내지 14분에서 나타나는 동안, 체류시간은 배양일에 따라 1 내지 2분으로 다양하다.

하기 실시예에 있어서 아베르멕틴은 상기 기술한 HPLC방법에 의해 결정된다.

실시예 1

시클로펜틸 아베르멕틴 A₂

에스.아베르미틸리스 I-3(ATCC 53567)[기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10493, 기탁일 : 1988년 1월 9일]을 28 내지 30℃에서 AS-7배지중에서 진탕시키면서 24시간동안 배양한다. 5ml을 취하여 AS-7배지 100ml을 함유하는 500ml들이 플라스크에 접종시켜 동일 조건하에서 24시간동안 배양시킨다 : 상기 배양액 1ml을 취하여 AP-5배지(300ml들이 플라스크중의 40ml)에 접종시켜 24시간후에 시클로펜탄 카복실산(나트륨염)0.4g/l를 가한다. 생성물 플라스크를 28 내지 30℃에서 진탕시킨다. 240시간 이내에 시클로펜틸 아베르멕틴 A₂가 35mg/l가 생성되고 이때 상응하는 천연 A2a타이터는 0이다. 다른 시클로펜틸 아베르멕틴도 생성된다.

실시예 2

시클로펜틸 아베르멕틴 A₂

에스.아베르미틸리스 HL-026(ATCC 53568)[기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10494, 기탁일 : 1988년 1월 9일]의 냉동 바이알을 사용하여 500ml들이 플라스크 중의 AS-7배지 100ml에 접종한다. 28 내지 30℃에서 진탕시키면서 24시간동안 배양한다. 1ml분취량을 AS-7배지 100ml을 함유하는 2개의 500ml들이 플라스크에 접종하고, 18시간 동안 배양시킨 후에 이들 플라스크의 배양액을 취하여 AP-5(NaCl이보다 적다)배지 10리터에 접종한다. 28℃에서 24시간동안 배양시킨후, 시클로펜탄 카복실산 0.4g/l를 배지에 가한다. 용해된 산소가 포화농도의 20%이상 유지되도록 진탕시킨다. 120,168,216,264 및 312시간에서 시클로펜틸 A₂타이터는 각각 16,40,65,88 및 110mg/l이다. 대조적으로, 상응하는 천연 아베르멕틴 A2a타이터는 이들 샘플중에서 0이다(즉, 발견되지 않는다).

실시예 3

시클로펜틸 아베르멕틴 A₂

이 실험에서는, 생산 배지를 영양이 풍부하게 하고 시클로펜탄 카복실산을 여러배 가하여 시클로펜틸 아베르멕틴 타이터를 증가시킨다. 종균생산 및 배양조건은 다음과 같은 것을 제외하고는 실시예 2에 기술한 방법과 동일하다 : AP-5배지에 아르다민 pH(Ardamine pH) 5g/l를 더 가하고(총량이 10g/l이 되도록)시클로펜탄 카복실산 0.4,0.2 및 0.2g/l를 각각 30,172 및 220시간에 가한다. 시클로펜틸 아베르멕틴 타이터는 120,168,216,264 및 312시간에서 각각 1.2,11,78,137 및 214mg/l이다.

실시예 4

시클로펜틸 아베르멕틴

에스. 아베르미틸리스 HL-026(ATCC 53568)[기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-l0494, 기탁일 : 1988년 1월 9일]의 동결된 바이알을 사용하여 28 내지 30℃에서 24 내지 28시간동안 배양시킨 500ml차폐된 플라스크중에서 AS-7배지 100ml에 접종한다. 이 배양물 1ml를 AP-5(NaCl은 적고, 글루탐산 0.6g/l이 추가된)배지를 400ml함유하는 300ml플라스크에 접종한다. 28 내지 30℃에서 진탕하면서 96시간 배양한후 시클로펜탄 카복실산(나트륨염)을 0.4g/l가한다. 216시간 샘플의 HPLC 크로마토그래피로 시클로펜틸 아베르멕틴의 즌재하는 B2,A2,Bl 및 A1의 체류시간은 각각 12,32,15,86,25,28 및 32,96분임을 알수 있다.

실시예 5

시클로펜틸 아베르멕틴 A₂

이 실험에서는, 에스.아베르미틸리스 I-3(ATCC 53567)[기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10493, 기탁일 : 1988년 1월 9일] 및 에스.아베르미틸리스 HL-026(ATCC 53568)[기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10494, 기탁일 : 1988년 1월 9일]을 동일한 조건하에서 생육시킨다. 3개의 배지(AP-5, WPM Syn A 40 : 40 및 VPM Syn B 40 : 40)가 사용된다. 각 유기물의 동결된 배양물을 사용하여 28 내지 30℃에서 24 내지 26시간 동안 연속적으로 배양한 500ml차폐된 플라스크 중에서 AS-7배지 100ml에 접종한다. 각 배양물을 1ml를 3개의 배지중 하나를 40ml 함유하는 300ml 각 플라스크에 접종한다. 각 플라스크는 2개로 한다. 28℃에서 진탕하면서 24시간 배양한후, 시클로펜틸카복실산(나트륨염)의 0.4g/l를 각 플라스크에 가하고, 총 192시간 배양시킨후, 프라이머 생산물, 시클로펜틸 아베르멕틴 A₂의 타이터가 결정된다(표 1).

[표 1]

실시예 6

시클로헥실 아베르멕틴

이 실험에서는, 시클로펜탄 카복실산 대신에 시클로헥산 카복실산의 0.2g/l를 96시간에 가하고, 모든 다른 조건은 실시예 4와 동일하게 한다. 4개의 시클로헥실 아베르멕틴이 240시간 샘플의 HPLC 크로마토그래피상에서 확인된다. 시클로헥실 아베르멕틴 B2, A2, B1 및 A1의 체류 시간은 각각 14.84, 19.26, 31.46 및 41.14분이다.

실시예 7

3-시클로헥세닐 아베르멕틴

이 실험에서는, 시클로펜탄 카복실산 대신에 3-시클로헥센 카복실산을 96시간에 가하고, 모든 다른 조건은 실시예 4에서 기술한 것과 동일하게 한다. 몇몇 시클로헥세닐 아베르멕틴이 312시간 샘플의 HPLC 크로마토그램상에서 확인된다. 그들의 체류 시간은 각기 12.88(B2), 16.39(A2), 27.37/28.36(B1 이성체) 및 35.80/37.13(A1 이성체)분이다.

실시예 8

3-티에닐 아베르멕틴

이 실험에서는, 시클로펜탄 카복실산 대신에 티오펜-3-카복실산의 0.05g/l를 96시간에 가하고, 모든 다른 조건은 실시예 4에 기술한 것과 동일하게 한다. 4개의 3-티에닐 아베르멕틴이 312시간 샘플의 HPLC 크로마토그램상에서 확인된다. 3-티에닐 아베르멕틴 B2, A2, B1 및 A1의 체류 시간은 각각 6.96, 8.76, 13.8 및 23.5분이다.

실시예 9

1-메틸티오에틸 아베르멕틴

이 실험에서는, 시클로펜탄 카복실산 대신에 2-메틸티오프로피온산의 0.4 및 0.2g/l를 각각 24 및 96시간에 가하고, 모든 다른 조건은 실시예 4에 기술한 것과 동일하게 한다. 2개의 1-메틸티오에틸 아베르멕틴이 240시간 샘플의 HPLC 크로마토그램상에서 확인된다. 3-티에닐 아베르멕틴 A2 및 B1의 체류 시간은 각각 9.30 및 13.06분이다. 체류 시간이 7.557분 피크의 앞쪽 쇼울더상에 나타나는 약 7.2분으로 평가된 피크는 B2 화합물이고, A1 화합물은 17.22분 피크이다.

실시예 10

2-펜틸 아베르멕틴

이 실험에서는, 시클로펜탄 카복실산 대신에 2-메틸발레르산의 0.2g/l를 96시간에 가하고, 모든 다른 조건은 실시예 4에 기술한 것과 동일하게 한다. 4개의 2-펜틸 아베르멕틴은 312시간 샘플의 HPLC 크로마토그램상에서 확인된다. 2-펜틸 아베르멕틴 B2, A2, B1 및 A1의 체류 시간은 각각 12.88, 16.58, 31.90 및 41.92분이다.

실시예 11

1-메틸-3-부테닐 아베르멕틴

이 실험에서는, 시클로펜탄 카복실산 대신에 2-메틸-4-펜테노산의 0.2g/l를 96시간에 가하고, 모든 다른 조건은 실시예 4에서 기술한 바와 동일하다. 4개의 1-메틸-3-부테닐 아베르멕틴은 312시간 샘플의 HPLC 크로마토그램상에서 확인한다. 1-메틸-3-부테닐 아베르멕틴 B2, A2, B1 및 A1의 체류 시간은 각각 11.13, 14.78, 22.10 및 28.92분이다.

실시예 12

1-메틸-1-부테닐 아베르멕틴

이 실험에서는, 시클로펜탄 카복실산 대신에 2-메틸-2-펜테노산의 0.2g/l를 96시간에 가하고, 모든 다른 조건은 실시예 4에 기술한 바와 동일하게 한다. 4개의 1-메틸-1-부테닐 아베르멕틴을 312시간 샘플의 HPLC 크로마토그램상에서 확인한다. 1-메틸-1-부테닐 아베르멕틴 B2, A2, B1 및 A1의 체류 시간은 각각 11.59, 14.93, 25.29 및 33.18분이다.

실시예 13

이 실험에서는, L-이소루이신으로부터 유도된 아베르멕틴이 없이 L-발린으로부터 유도된 천연 아베르멕틴을 제조하기 위한 변이주의 사용이 설명된다. 에스.아베르미틸리스 I -3(ATCC 53567)[기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : 10493, 기탁일 : 1988년 1월 9일]을 함유하는 동결된 바이알의 내용물을 AS-7 배지100ml를 함유하는 500ml 차폐된 플라스크에 옮긴다. 대략 하루정도 28 내지 30℃에서 진탕(약 200rpm)하면서 배양한 후, 배양물 1ml를 300ml 플라스크 속의 WPM syn A 40 : 40 배지 40ml에 접종하고, 그것을 28 내지 30℃에서 진탕하면서 24시간 동안 계속해서 배양한다. 이 경우, 여과-멸균된 이소부티르산(NaOH를 사용하여 pH 6 내지 7로 중화한) 4ml, 4mg/ml를 가하고, 상기와 같이 계속해서 총 8일동안 배양한다.

HPLC 분석은 4개의 주요 피크(올리고마이신 제외)를 나타낸다.(이소부티르산 대신에 2-메틸부티르산을 사용하는 유사한 실험에서는, L-이소루이신으로부터 유도된 아베르멕틴의 보조의 4개 피크가 나타난다.)

실시예 14

실시예 1의 방법은, 시클로펜탄 카복실산 대신에 하기 리스트된 프라이머 화합물로 대치하여 반복된다. 기술된 발효로부터 확인된 아베르멕틴(R²는 올레안드로즈 디삭카라이드 부위이고, R, R¹및 R³는 상기 정의된 바와 같은 일반식(I)의 화합물)이 또한 리스트되어 있다.

상기 화합물의 확인을 위한 다른 생리-화학적 데이타는 하기와 같다.

실시예 15

시클로펜틸 아베르멕틴 A2 회수

본 실시예는 시클로펜탄카복실산 전구체로부터 형성된 A2-유사 아베르멕틴의 회수 방법을 설명하고 있다. 전체 육즙(실시예 2의 발효와 유사한 발효로부터)을 여과하고, 균사체 세포를 아세톤으로 2번 추출한다(3부피). 아세톤 추출물을 수성의 오일로 농축하고, 메틸렌 클로라이드로 추출된 오일 및 메틸렌 클로라이드 용액을 암갈색 오일로 농축한다. 암갈색 오일을 메탄올/물(4 : 1)에 용해시키고, 생성된 용액을 헥산으로 추출하여 지방산/리피드를 제거한다. 메탄올/물을 증발시켜 대략 10% 시클로펜틸 아베르멕틴 A2 W/W를 함유하는 담갈색 오일을 수득한다. 조 아베르멕틴 오일을 클로로포름(오일 g당 CHCl₃3ml)으로 희석하고, 활성탄(0.35g/오일 g) 및 실리카겔(1g/오일 g)을 가하여 활성화시킨다. 여액을 농축하고, 생성된 오일을 이소프로필 에테르(오일 g당 IPE 1ml)로 희석한다. 생성된 용액을 대량의 헥산(오일 g당 헥산 25ml)에 점적하면, 백색의 조 아베르멕틴 분말이 침강한다. 첫번째 덩어리를 여과하여 분리하고 여액을 대략 5℃로 냉각하여 두번째 덩어리를 침강분리시킨다.

조생성물을 고성능 크로마토그래피 방법을 추가실시하여 정제된 생성물을 수득한다. 조생성물을 IPE/CH₃CN/에틸 아세테이트/헥산/아세트산의 25/25/25/50/0.125중에 용해시킨다(조분말 그램당 용매 4.1ml). 샘플을 25cm 실리카 제조된 컬럼에 41.4mm로 주입하고, 상기 용매를 30ml/분으로 유출시켜 생산물-함유피크를 모은다. 모아진 분획을 농축시키고 MeOH/H₂O(86/14)로 희석하여 그것의 1ml가 대략 50mg의 생산물을 함유하도록 한다. 샘플을 C-18로 제조된 컬럼(실리카 컬럼과 동일한 크기)상에 주입하고 MeOH/H₂O(MeOH 2l에 대해 H₂O 275ml)를 18 내지 20ml/분으로 유출시킨다. 분획을 다시 농축하고 C-18로 제조된 컬럼을 두번 통과시킨다. 생산물-함유 분획을 증발건고하여 순수한 표제 생산물을 수득한다.

상응하는 시클로펜틸 아베르멕틴 B2, A1 및 B1은 상기 기술한 HPLC 단계로부터의 적당한 분획을 모아 회수한다.

실시예 16

YRD-2 한천 배지로부터의 에스.아베르미틸리스 JC 923(ATCC 53669) [기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10495, 기탁일 : 1988년 1월 9일] 균사체를 30℃에서 24시간동안 진탕(220rpm)하면서 보존된 300ml 차폐된 플라스크속의 AS-7 배지 50ml에 접종한다. 배양물 1ml를 AP-5 배지 50ml를 함유하는 2개의 300ml 플라스크(차폐되지 않은)에 각각 접종한다. 하나의 플라스크는 2-메틸부티르산(0.1%)을 함유하고 다른 하나는 2-메틸부티르산을 함유하지 않는다. 발효를 30℃에서 진탕하면서 11일동안 수행한다. 각 플라스크의 내용물을 동일한 방법으로 수행한다. 전체 육즙을 아세토니트릴 : 메탄올(810 : 75)의 4배 부피로 추출한다. 격렬하게 진탕하여 세포로부터 항생물질 추출을 촉진한 후, 등명한 상등액을 아베르멕틴의 확인을 위해 HPLC로 분석한다. 지방산 전구체가 첨가되지 않은 경우, 감지할 수 없는 아베르멕틴("a"형)이 나타난다(민감도≤0.20mg/L). 2-메틸부티르산 아베르멕틴 B2a, A2a, B1a, A1a는 각각 0.5, 1.3, 1.4 및 1.1 및 mg/L에서 측정된다.

실시예 17

이 실험에서는, 에스.아베르미틸리스 JC 923(ATCC 53669)[기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10495, 기탁일 : 1988년 1월 9일]의 AP-5 생산 발효는 실시예 16에서와 같이 AS-7에 생육 접종으로부터 제조된다. 프라이머 화합물 2-메틸부티르산은 0.05% 농도로 존재한다. 이 경우, 보충되지 않은 대조군 발효(지방산 전구체가 없는)는 아베르멕틴 B2a, A2a, B1a 및 A1a에 대해 각각, 0.3, 0.9, ＜ 0.2 및 ＜0.2mg/L이란 수치를 얻는 반면, 지방산의 보충된 발효에서는 2.8, 5.0, 4.5 및 2.3mg/L를 얻는다.

실시예 18

이 실험에서는, 에스.아베르미틸리스 JC 923(ATCC 53669)[기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10495, 기탁일 : 1988년 1월 9일]의 AP-5 생산 발효는 실시예 17에서와 같이 AS-7에 접종으로부터 제조된다. 이 실험에서는, 2-메틸부티르산을 0.05% 농도로 가하고 AP-5 배지에 접종 48시간후, 세포를 여과하여 수확하고, 칭량(습중량)한 다음, 그 중량의 4배의 추출 용매로 추출한다. 이 농도 단계는 아베르멕틴 타이터 측정에 있어서 전체 육즙을 직접 추출하는 이전의 경우보다 민감도가 더 커질 수 있다. 본 실시예에서는, 2.5, 8.5, 4.5 및 3.5mg/L의 B2a, A2a, B1a, A1a의 수치는 보충되지 않은 대조군 0.3, 0.3, 0.3 및 0.1의 수치와 비교하여 2-메틸부티르산이 보충된 발효에 대해 결정된다. 이것으로, 낮은 수치는 조 AP-5 생산 배지에 있어서 내부 지방산 화합물의 낮은 수치를 추측할 수 있다.

실시예 19

0.045% 농도의 시클로펜탄 카복실산을 2-메틸부티르산으로 대치하여 보충시키는 것을 제외하고 실시예 18과 동일하게 수행한다. 시클로펜틸아베르멕틴 A2는 4mg/L 농도로 존재한다.

실시예 20

에스.아베르미틸리스 PGS-119(ATCC 53670)[기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10496, 기탁일 : 1988년 1월 9일]의 발효(16)는 30℃에서 배양된 300ml 플라스크(차폐되지 않은)속의 AP-5 배지 50ml중에서 수행한다. 300ml 차폐된 플라스크중에서 30℃로 배양된 AS-7 배지 50ml 속의 균주의 24시간 배양물 1ml를 배지에 접종시킨다. 이소부티르산이 0.1% 농도로 존재하는 AP-5 배지에서 66시간 동안 생육된후 플라스크 8개에 가한다. 실시예 16의 공정과정으로, 이러한 보충된 플라스크에서 B2a, A2a, B1b 및 A1b의 농도(2번 실험의 평균)는 각각 5.6, 45, 45 및 68mg/L이다. 보충되지 않은 배양물은 각각, 0.5, 4.0, 4.5 및 ≤8.5mg/L이다. 그 외에도, 후의 발효에 있어서 상응하는 B2a, A2a, B1a 및 A1a 아베르멕틴의 1.1, 1.1, 미결정 및 ＜0.2mg/L이 발견되었다.

실시예 21

이 실험에서는, 에스.아베르미틸리스 PGS-119(ATCC 53670) [기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10496, 기탁일 : 1988년 1월 9일]의 4개의 AP-5 발효는 플라스틱 튜브(15ml) 속의 배양물 2ml 중에서 수행한다. 접종물은 30°경사진 형태로 진탕하면서 30℃로 유지한 튜브속의 AS-7 배지에서 실시예 20에 기술한 바에 따라 제조한다. 지방산 전구체, 시클로헥산 카복실산(CHC)을 0.045% 농도로, 2개의 튜브에 AP-5를 접종시킨 후 96시간에 가한다. AS-7 배양물 0.05ml와 함께 AP-5 접종후 400시간 경과한 다음, 추출 용매(아세토니트릴 메탄올(810 : 75))를 8ml씩 각 튜브에 가하고, 아베르멕틴 타이터를 본 명세서에서 기술한 HPLC 분석에 의한 상등액에서 결정한다. 아베르멕틴 CHC-B2, CHC-A2, CHC-B1, CHC-A1, A2b, B1b, A1b, A2b 및 A1a의 농도(두개의 튜브의 평균)는 각각, 3.5, 6.2, 3.0, 1.4, 0.2, 0.2, 0.4, 0.2, ＜0.2mg/L이다. 전구체 산이 없는 두 발효 튜브에 있어서 상응하는 수치는 각각, ＜0.2, ＜0.2, ＜0.2, ＜0.2, 4.2, 2.9, 9.3, 1.2, 0.3mg/L이다. 모든 다른 천연 아베르멕틴은 필수적으로 감지할 수 없다.

Claims

측쇄2-옥소산 디하이드로게나제 활성 및 측쇄 아미노산 트랜스아이나제 활성중 하나 또는 둘다가 결여된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis).
제1항에 있어서, 측쇄2-옥소산 디하이드로게나제 활성이 결여된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스로서, 그의 투과성을 가진 세포가 가해진[¹⁴C_-1]-2-옥소이소카프로산으로부터¹⁴CO₂를 생산하는 능력이 없음을 특징으로 하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스.
제2항에 있어서, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스가 균주 ATCC 53567 또는 ATCC 53568[기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : 각각 KFCC-10493 또는 KFCC-10494, 기탁일 : 1988년 1월 9일]인 스트렙토마이세스 아베르미틸리스.
제1항에 있어서, L-이소루이신, L-루이신 및 L-발린이 결여된 배지상에서 생육할 수 없음을 특징으로 하는, 측쇄 아미노산 트랜스아미나제가 결여된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스.
제4항에 있어서, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 ATCC 53669 또는 ATCC 53670[기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : 각각 KFCC-10495 또는 KFCC-10496, 기탁일 : 1988년 1월 9일]인 스트랩토 마이세스 아베르미틸리스.
제1항에 있어서, 동화성 탄소원, 질소 및 무기염 원을 함유하며 일반식 R-COOH(여기서, R은 이소프로필 또는 (S)-2급-부틸이다)의 산 또는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스에 의해 상기 산으로 전환될 수 있는 화합물이 거의 부재한 수성 영양배지중 호기성 조건하에 발효시키는 경우 C-076계 물질을 실질적으로 생산할 수 없으나, 상기 일반식 R-COOH의 산 또는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스에 의해 그러한 산으로 전환될 수 있는 화합물을 함유하는 상기 배지중에서 발효시키는 경우 C-076계 물질을 생산할 수 있는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스.
제6항에 있어서, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스가 균주 ATCC 53567, ATCC 53568, ATCC 53669 또는 ATCC 53670[기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : 각각 KFCC-10493, KFCC-l0494, KFCC-10495 또는 KFCC-10496, 기탁일 : 1988년 1월 9일]인 스트렙토마이세스 아베르미틸리스.
측쇄2-옥소산 디하이드로게나제 활성 및 측쇄 아미노산 트랜스아미나제 활성중 하나 또는 둘다가 결여된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주를, 동화성 질소원, 탄소원 및 무기염원 및 아베르멕틴의 생합성에 이용될 수 있는 화합물을 함유하는 수성 영양 배지상에서 호기적 발효시킴을 특징으로 하여, 아베르멕틴을 제조하는 방법.
제8항에 있어서, 아베르멕틴의 생합성에 이용될 수 있는 화합물이 일반식 R-COOH(여기서, R은 이소프로필 또는 (S)-2급-부틸이 아니다)의 산 또는 에스.아베르미틸리스에 의해 그러한 산으로 전환될수 있는 화합물인 방법.
제8항에 있어서, 에스.아베르미틸리스가 균주 ATCC 53567, ATCC 53568, ATCC 53669 또는 ATCC 53670[기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : 각각 KFCC-10493, KFCC-10494, KFCC-10495 또는 KFCC-10496, 기탁일 : 1988년 1월 9일]인 방법.
제8항에 있어서, 생합성에 이용될 수 있는 화합물이 일반식 R-COOH(여기서, R은 α-측쇄그룹이고, -COOH 그룹이 결합되어 있는 그의 탄소원자가 수소가 아닌 적어도 두개의 다른 원자 또는 그룹에 결합되어 있다)의 화합물 또는 발효과정중 그러한 화합물로 전환될 수 있는 화합물인 방법.
제11항에 있어서, 생합성에 이용될 수 있는 화합물이 R이 알파-측쇄 C₃-C₈알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시알킬 또는 알킬티오알킬그룹 : 알킬 그룹이 알파-측쇄 C₂-C₅알킬그룹인 C₅-C₈시클로알킬 알킬그룹 : 각각 메틸렌 하나 또는 그 이상의 C₁-C₄알킬 그룹 또는 할로원자에 의해 임의 치환될 수 있는 C₃-C₈시클로알킬 또는 C₅-C₈시클로알케닐 그룹 : 또는 포화되거나 전체 또는 부분적으로 불포화될 수 있으며, 하나 또는 그 이상의 C₁-C₄알킬 그룹 또는 할로원자에 의해 임의로 치환될 수 있는, 산소 또는 황을 함유하는 3원 내지 6원의 헤테로시클릭환인 화합물 또는 발효과정중 그러한 화합물로 전환될 수 있는 화합물인 방법.
제11항에 있어서, 기질 RCOOH로 전환될 수 있는 화합물이 일반식 R-(CH₂₀)_n-Z(여기서, R은 상기 정의한 바와 같고 : n은 0,2,4 또는 6이며 : Z는 -CH₂OH, -CHO, -COOR⁵, CH₂NH₂또는 CONHR⁶이고 : R⁵는 H 또는 (C_1-6)알킬이며 : R⁶는 수소, (C_1-4) -알킬, -CH(COOH)CH₂COOH, -CH(COOH)(CH₂)₂COOH 또는 -CH(COOH)(CH₂)₂SCH₃이다)의 화합물이거나, 또는 에스.아베르미틸리스 균주가 단지 측쇄 아미노산 트랜스아미나제 활성만이 결여된 경우, 기질 RCOOH로 전환될 수 있는 화합물이 R-CO-Z인 방법.
제12항에 있어서, R이 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 2-메틸시클로프로필, 3-시클로헥세닐, 1-시클로펜테닐, 1-시클로헥세닐, 3-메틸시클로헥실(시스/트란스), 4-메틸렌시클로헥실, 3-메틸시클로부틸, 3-메틸렌시클로부틸, 3-시콜로펜테닐, 1-시클로프로필에틸, 3-플루오로시클로부틸, 4,4-디플루오로시클로헥실, 이소프로필, 2급-부틸, 2-펜틸, 2,3-디메틸프로필, 2-헥실, 2-펜트-4-에닐, 2-메틸티오에틸, S-2-메틸펜틸, R-2-메틸펜틸, 2-티에닐, 3-티에닐, 4-테트라하이드로피라닐, 3-푸릴, 2-클로로티에틸, 3-테트라하이드로티에닐, 4-메틸티오-2-부틸, 4-테트라하이드로티오피라닐, 4-메톡시-2-부틸 또는 4-메틸티오-2-부틸인 방법.
제14항에 있어서, R이 시클로펜틸, 시클로헥실 또는 티에닐인 방법.
제12항에 있어서, R이 이소프로필 또는 (S)-2급-부틸이 아닌 알파-측쇄 C₃-C₈알킬 그룹인 방법.
제12항에 있어서, 에스 아베르미틸리스 균주가 에스.아베르미틸리스 ATCC 53567, ATCC 53568, ATCC 53669 또는 ATCC 53670[기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : 각각 KFCC-10493, KFCC-10494, KFCC-10495 또는 KFCC-10496, 기탁일 : 1988년 1월 9일]인 방법.