DK175724B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af avermectiner og stammer dertil - Google Patents

Description

DK 175724 B1

Den foreliggende opfindelse angår stammer af Streptomyces avermitilis, der mangler forgrenet aminosyre transamina-seaktivitet og/eller forgrenet 2-oxosyre dehydrogenaseak-tivitet, fremgangsmåder til fremstilling af disse S.

5 avermitilis og anvendelse af S. avermitilis til fremstilling af naturlige og ikke-naturlige avermectiner.

U.S. patentskrifterne 4,310,519 og 4,429,042 beskriver avermectiner, der er et kompleks af beslægtede midler med 10 kraftig antiparasitisk virkning samt disses fremstilling ved aerob fermentering af stammer af Streptomyces avermitilis, nemlig S. avermitilis ATCC nr. 31267, 31271 og 31272. De sidste to stammer repræsenterer henholdsvis et frosset hætteglas og et lyophiliseret rør af en kultur 15 opnået ved ultraviolet bestråling af S. avermitilis ATCC 31267.

EP-A-214,731, der er publiceret 18.3.1987, og som svarer til U.S. patent ansøgning no. 886,867 indleveret 20 16.7.1986, beskriver et antal forbindelser, der i det følgende betegnes ikke-naturlige avermectiner, og som er beslægtet med de naturlige eller kendte avermectiner, men udviser en ny substituentgruppe i 25-stillingen samt en fremgangsmåde til fremstilling af disse forbindelser ved 25 fermentering af en avermectinproducerende organisme i nærvær af'visse nærmere angivne carboxylsyrer eller derivater eller precursorer derfor. De anvendte S. avermitilis organismer til fremstilling af de nye C-25 substituerede avermectiner er S. avermitilis ATCC 31267, 31271, 30 31272 og NCIB 12121. Den sidstnævnte organisme , beskre

vet i EP-A-214,731, er afledt af S. avermitilis ATCC

I DK 175724 B1 I

i 2 I

I 31271. Den giver forøget udbytte af de nye C-25 substitu- H

I erede avermectiner, og den dyrkes i et halv-defineret me- H

I dium. Hver af stammerne ATCC 31267, 31271, 31272 og NCIB I

I 12121 kan også foruden det nye C-25 substituerede derivat ' H

I 5 producere varierende mængder af de kendte eller naturlige H

I avermectiner, hvori C-25 substituenten er isopropyl eller H

(S)-sec-butyl (1-methylpropyl). I

Carbonskelettet i avermectinerne, illustreret ved formel H

10 (I) nedenfor, er afledt af acetater og propionater og C-

I 25 substituenten i naturlige avermectiner fra L-isoleucin H

I (R=(S)-sec-butyl) eller L-valin (R=isopropyl) [Fisher and I

I Mrozik, "Macrolide Antibiotics", Academic Press (1984) I

Ch. 14].

I 15 I

I Ved "kendte" eller "naturlige" avectiner menes avermecti- I

I ner produceret af S. avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271 I

I og ATCC 31272, hvori substituenten i 25-stillingen er en- H

H ten isopropyl eller (S)-sec-butyl(1-methylpropyl). Aver- H

20 mectiner, hvori substituenten i 25-stillingen er forskel- H

H lig fra isopropyl eller sec-butyl (S-form), betegnes her I

I nye eller ikke-naturlige avermectiner. I

Stammerne af S. avermitilis, der er omtalt i de ovennævn- I

H 25 te U.S. patentskrifter, danner en klasse af forbindelser, H

I der generisk betegnes C-076. Klassen omfatter otte for- H

skellige, men nært beslægtede forbindelser, der betegnes I

I C-076 Ala, Alb, A2a, A2b, Bla, Blb, B2a og B2b. "a"- I

I serien af forbindelserne refererer til de naturlige aver- I

H 30 mectiner, hvori 25-substituenten er (S)-sec-butyl og "b"- I

serien til forbindelser, hvori 25-substituenten er I

3 DK 175724 B1 isopropyl. Betegnelserne "A" og "B" refererer til aver-mectiner, hvori 5-substituenten er henholdsvis methoxy eller hydroxy. Endelige refererer tallet "1" til avermec-tiner, hvori der en dobbeltbinding i 22-23 stillingen, og 5 tallet "2" refererer til avermectiner, der har hydrogen i 22-stillingen og hydroxy 23-stillingen.

I nærværende ansøgning anvendes ikke sådanne identificerende betegnelser, hvad angår 25-substituenten i de ikke-10 naturlige avermectiner. Betegnelserne Al, A2, Bl og B2 er bevaret og henviser til. ikke-naturlige avermectiner, der udviser de strukturelle træk svarende til de naturlige avermectiner som nævnt ovenfor.

15 Generationer af mutanter, der mangler dehydrogenase-aktivitet overfor forgrenede α-ketosyrer som beskrevet for Bacillus subtilis, Willecke and Pardee, J. Biol.

Chem. 246, 5264-72 (1971) and Pseudomonas putida, Martin et al., J. Bacteriology, 115 198-204 (1973), men ikke for 20 Streptomyces.

S. avermitilis Agly-1, en mutantstamme, som i det væsentlige kun producerer avermectin-aglyconerne Ala og A2a, er beskrevet af Schulman et al., J. Antibiot. 38(11), 1494-25 1498 (1985). Der beskrives også fermentering af S. aver mitilis Agly-1 i nærvær af sinefungin, som forårsagede forøget dannelse af avermectin aglycon B-komponenter.

Endvidere resulterede S. avermitilis 08 en højtydende stamme ved fremstilling af avermectiner, når den fermen-30 teredes i nærvær af sinefungin som inhibitor for 0-methyl-transferaser i dannelse af avermectiner, der mang- ___

I DK 175724 B1 I

I I

I lede O-methylgrupper på aglyconet ved C-5 og i oleandro- I

I se-disaccharid-delen. I

I U.S. patentskrift nr. 4,378,353 beskriver forbindelser I

I 5 beslægtet med C-076 og disses fremstilling ved dyrkning I

I af MA-5218, en mutantstamme af S. avermitilis ATCC 31272, I

som er opnået ud fra denne ved ultraviolet bestråling. I

I Mutanten identificeres som ATCC 31780. De C-076 beslægte- I

I de forbindelser dannet af denne mutant mangler C-076 fu- I

10 ran-ringen. Yderligere er, i visse af de beskrevne for- I

I bindeiser, den ene eller begge oleandrose-sukkergrupperne I

I spaltet, mens gruppen i 5-stillingen i andre af forbin- I

I delserne vil oxidere til en ketogruppe. I

15 Tre klasser af O-methyltransferase-mutanter af S. avermi- I

tilis, som producerer avermectiner, der mangler O- ' I

methylgrupper, er beskrevet af Ruby et al., 6th Interna- I

tional Symposium on the "Biology of Actinomycetes", 1 I

H Debrecen, Hungary, August 26-30 (1985) og af Schulman et I

20 al., Antimicorbial Agents and Chemotherapy 31, 744-7 I

(1987). Den første klasse producerer primært B- I

avermectiner p.g.a. deres manglende evne til at methylere I

C-5-hydroxylgruppen i den macrocycliske lactonring. Den I

anden klasse producerer 3’-0, 3"-0-bis-demethyl- I

25 avermectiner (avermectiner, der mangler O-methyl- I

H subsituenten i 3-stillingen i begge oleandrose- I

H monosaccharidresterne), og som betegnes demethylavermec- I

H tiner. Den tredje klasse er ude af stand til ,at methylere I

H i nogen stilling. I

I

Schulman et al., Fed. Proc. 44, 931 (1985) beskriver for- I

I I

I DK 175724 B1 øget produktion af B-avermectiner ved fermentering af S. ! avermitilis i nærvær af forbindelser såsom sinefungin, s-adenosylethionin og s-adenosylhomocystein, der inhibirer i methyleringen af C-5 hydroxygruppen i aglycon-delen 5 p.g.a. enzymet avermectin B-O-methyltransferase. Strepto-myces avermitilis mutanter, der mangler O-methyltrans-ferase-aktivitet og producerer forøgede mængder af avermectin B-komponenter, er også beskrevet af Schulman et al., i Antimicrobial Agents Chemotherapy 29, 620-624 10 (1986).

Mutagenese af S. avermitilis fører til mutanter, der mangler dehydrogenase-aktivitet over for forgrenede 2-oxosyrer eller transamainase-aktivitet over for forgrene-15 de aminosyrer.Mutagenese af de således dannede enkeltblokerede mutanter fører til mutanter, der mangler såvel dehydrogenase-aktivitet over for forgrenede 2-oxosyrer som transaminase-aktivitet over for forgrenede aminosyrer. Mutanterne har ikke længere evnen til at danne signifi-20 kante mængder af naturlige avermectiner i fravær af tilsatte forbindelser RCOOH, hvor R er isopropyl eller (S) — sec-butyl, eller af en forbindelse, der kan opdannes til RCOOH under fermenteringsprocessen. Det har imidlertid overraskende og uventet vist sig, at mutanterne produce-25 rer naturlige og ikke-naturlige avermectiner, når de fer- I

menteres i nærvær af en tilsat forbindelse RCOOH, hvori R er isopropyl eller (S)-sec-butyl eller andre nedenfor beskrevne forbindelser, eller i nærvær af en precurser for RCOOH. Det er endnu mere overraskende, at de heri be-30 skrevne mutanter, der kun mangler dehydrogenase-aktivitet : over for forgrenede 2-oxosyrer, og som er ude af stand

I DK 175724 B1 I

I 6 I

til at nedbryde L-isoleucin eller L-valin, er i stand til I

at assimilere et stort antal forbindelser til avermectin- I

I biosyntesen under dannelse af ikke-naturlige avermecti- I

ner, der er fri for tilstedeværelse af naturlige avermec- I

I 5 tiner. I

Næsten lige så overraskende er den erkendelse, at de heri I

beskrevne mutanter med manglende transaminase-aktivitet I

over for forgrenede aminosyrer, og som er ude af stand I

I 10 til at nedbryde L-isoleucin, L-leucin eller L-valin, og I

som har disse tre aminosyrer som vækstkrav, også er i I

stand til at assimilere andre forbindelser under dannelse I

af ikke-naturlige avermectiner, der er fri for tilstede- I

værelse af naturlige avermectiner. I

I 15 I

De naturlige avermectiner dannes som nævnt som en kom- I

pleks blanding af otte forskellige, men nært beslægtede I

forbindelser. Jvf. formel(I), hvor R=isopropyl og (S)- I

sec-butyl. De naturlige avermectiner dannes som nævnt i I

20 form af en kompleks blanding af otte forskellige, men I

nært beslægtede forbindelser, jvf. formel (I), hvor I

R=isopropyl og (S)-sec-butyl. Selv om de er isoleret i i I

det væsentlige ren form {jvf. U.S. patentskrift nr. I

4,429,042), så er metologien mildt sagt besværlig. Frem- I

25 stillingen af ikke-naturlige avermectiner ved fremgangs- I

måden ifølge EP-A-214,731 kan også føre til nogle af de I

naturlige avermectiner i varierende mængder p.g.a. til- I

stedeværelsen af forgrenet 2-oxosyre-dehydrogenasen og I

H aminosyrerne L-valin og L-isoleucin i cellerne fra den S. I

30 avermitilis mikroorganisme, der anvendtes ved fremstil- I

H lingen. I

7 DK 175724 B1

Evnen til at vælge mellem at producere enten naturlige eller ikke-naturlige avermectiner for at minimere antallet og kompleksiteten af forbindelserne og derved forøge 5 renheden af en udvalgt avermectin og således simplificere separationsprocesserne er et ønskværdigt mål.

S. avermitilis-stammer, der mangler dehydrogenase-aktivitet over for forgrenede 2-oxosyrer eller transami-10 nase-aktivitet over for forgrenede aminosyrer, dannes ved I

mutation af avermectinproducerende stammer af S. avermi-tilis og især ved mutation af S. avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271, ATCC 31272 eller NCIB 12121. Yderligere mute-ring af enhver af disse mangelfulde stammer fører til 15 stammer, der mangler begge aktiviteter. Mutanterne er ude af stand til at syntetisere de naturlige avermectiner, medmindre der tilsættes fedtsyre eller en precursor for denne, der indeholder en isopropyl eller sec-butyl isform) -gruppe, sættes til mediet, hvori mutanterne fermen-20 teres. De er i stand til at producere naturlige og ikke-naturlige avermectiner, når de fermenteres under vandige aerobe betingelser i et næringsmedium, der indeholder en passende aktiverende syre eller forbindelse, der kan omdannes hertil, under fermenteringsprocessen.

25

De mutanter;· der udmærker sig ved mangel på dehydrogena-se-aktivitet over for forgrenede 2-oxosyrer, isoleres fra de mutageniserede kolonier på basis af et 14C02assay. Ved denne procedure indicerer fraværet af 14C02udvikling fra 30 en permeabiliseret koloni fra et substrat af [14C-l]-2- i oxoisocapronsyre eller [14C-1]-2-oxo-3-methylvaleriane-

I DK 175724 B1 I

I I

I syre eller (14C-l]-2-oxo-3-methylsmørsyre fraværet af de- I

I hydrogenase-aktivitet over for forgrenede 2-oxosyrer. I

I Mutanterne, der udmærker sig ved fravær af aminosyre- I

I 5 transaminase-aktivitet, vælges fra de mutageniserede ko- I

I lonier på basis af disses manglende evne til at vokse på I

I et medium, der mangler L-isoleucin, L-leucin og L-valin. I

I I praksis overføres enkeltkolonier dyrket på et M9-salte I

glucose-baseret agarmedium suppleret med alle de indivi- I

I 10 duelle aminosyrer, der findes i den såkaldte casaminosy- I

re, til et tilsvarende medium, der dog mangler L- I

isoleucin, L-leucin og L-valin. De heri beskrevne mutan- I

H ter, der kun mangler transferase-aktivitet over for for- I

H grenede aminosyrer, er i stand til at udnytte 2-oxosyrer I

15 som precursorer ved fremstilling af avermectiner. I

Det var overraskende og uventet, at de heri beskrevne mu- I

tanter, der mangler dehydrogenase-aktivitet over for for- I

grenede 2-oxosyrer og/eller transaminaseaktiviteter over I

20 for forgrenede aminosyrer, bevarede evnen til at produce- I

re avermectiner, især ikke-naturlige avermectiner. Mutan- I

H ternes manglende evne til at producere de naturlige fede I

H acyl-coensym A derivater, når de dyrkes på sædvanlige me- I

H dier, kunne have været en letal mutation, hvis membranin- I

25 tegreteten afhang af sådanne derivater, eller hvis 2- I

oxosyreakkumulering hos den førstnævnte mutant førte til I

cytotoxicitet. Endvidere kunne ingen af mutanterne for- I

ventes at være i stand til at syntetisere acetyl-CoA og I

H propionyl-CoA fra L-isoleucin-og L-valin-nedbrydende me- I

H 30 tabolisme, eftersom det kræver de enzymaktiviteter, som I

mutanterne mangler. De ovennævnte krav til disse acyl-CoA I

I I

I i DK 175724 B1 | ^ | derivater til avermectin-biosyntese fører til en forventning om, at mutanterne ville være kraftigt påvirket med hensyn til produktion af ikke-naturlige avermectiner, hvilket overraskende viste sig ikke at være tilfældet.

Manglen på dehydrogenase-aktivitet over for forgrenede 2-oxosyrer hos de omhandlede mutanter resulterede i en forhindring af syntesen af forgrenet fedtsyre-acyl CoA ved nedbrydning af L-isoleucin, L-leucin og L-valin og dermed 10 syntesen af naturlige avermectiner. På samme måde udviser de forgrenede aminosyre-transaminase-negative mutanter af 5. avermitilis også denne karakteristiske mangel på forgrenet fedtsyre-acyl CoA syntese og derfor en manglende evne til at producere de naturlige avermectiner. Denne I

15 mangel på fedtsyre-acyl CoA skyldes to forhold. For det I

første er sådanne transaminase-negative mutanter ikke i I

stand til at syntetisere forgrenede 2-oxosyrer fra iso- I

leucin, leucin og valin tilført fra mediet via den norma- I

le transamineringsvej. For det andet forebygges dannelsen I

20 af forgrenede 2-oxosyrer i disse transaminasemutanter ved I

den cellulære forgrenet aminosyre-biosyntese af den nød- I

vendige inkludering af disse aminosyrer i dyrkningsmediet I

for fermenteringen. Tilstedeværelsen af disse aminosyrer * I

forebygger iværksættelse af denne biosyntese (og dannelse I

25 af de intermediære 2-oxosyrer) ved velkendte enzymrepres- I

sions-mekanismer og feed-back inhibering af disse amino- I

syre-slutprodukter ved biosyntesen. Utilgængeligheden af I

disse 2-oxosyrer, der er substrater for det aktive for- I

grenet 2-oxosyre-dehydrogenaseenzym, forebygger effektivt I

30 syntesen af forgrenet fedtsyre-acyl CoA. Den foreliggende i I

opfindelse omfatter således anvendelsen af sådanne 2- I

10 I

DK 175724 B1

oxosyre-dehydrogenasen-negative og transaminase-negative I

mutanter samt mutanter, hvori både forgrenet transamina- I

se-negative og 2-oxosyre-dehydrogenase-negative mutatio- I

ner er kombineret. I

5

Den foreliggende opfindelse omfatter også enhver organis- I

me, uafhængigt af dennes udseende eller fysiologiske op- I

førsel, som kan udvikles ved hjælp af transformation, I

Itransduktion, genetisk rekombination eller andre geneti- I

10 ske fremgangsmåder, ved anvendelse af en nucleinsyre el- I

ler et tilsvarende materiale fra de heri beskrevne arter, når den har opnået det karakteristika, som de beskrevne I

mutanter udviser.

15 Betegnelserne "avermectin" eller "avermectiner" anvendes heri som refererende til forbindelser med formel (I) nedenfor, men hvori 25-substituenten (R) kan være en hvilken som helst gruppe, der kan assimileres i denne stilling af S. avermitilis-stammerne ifølge opfindelsen.

De heri beskrevne mutanter er særdeles værdifulde ved produktion af ikke-naturlige avermectiner ved de beskrevne og eksemplificerede fremgangsmåder. De er særligt værdifulde til fremstilling af de foretrukne avermectiner, 25 d.v.s. forbindelser, hvori C-25 substituenten er C4-C6 cycloalkyl eller cycloalkenyl, evt. substitueret med én Ci-C4-alkylgruppe; 1-methylthioethyl eller en 5- eller 6-leddet oxygen- eller svovlholdig heterocyclisk gruppe, især 3-thienyl eller 3-furyl.

Mutation af et avermectinproducerende medlem af arten - --Γ^— I DK 175724 B1

Streptomyces avermitilis udføres på i og for sig kendt måde under anvendelse af et hvilket som helst af en række mutagene midler, omfattende UV-bestråling, røntgenbestråling, N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin, ethyl-5 methansulfonat, salpetersyrling og nitrogen-sennepsolier, f.eks. N-methyl-bis- {2-chlorethyl)amin eller tilsvarende behandlinger. Mutagenesen kan gennemføres på sporer eller på en vegativ kultur af S. avermitilis, der er i stand til at producere naturlige avermectiner, f.eks. S. aver-10 mitilis ATCC 312.72.

Ved at følge procedurer, der er velkendte for fagmanden, selekteres mutageniserede kolonier for mangel på dehydro-genase-aktivitet over for forgrenede 2-oxosyrer på basis 15 af et biokemisk assay, der muliggør en screening af et stort antal tilfældigt mutageniserede bakteriekolonier for 14C02 dannelse fra [14C-1]-2-oxosyrer Tabor et al., J.

Bact. 128, 485-486, 1976).

20 Denne metodologi omfatter dyrkning af mutantkolonierne i brøndene i en microtiterplade på et passende næringsmedium, permeabilisering af cellerne med toluen efterfulgt af tilsætning af {!4C-1]-2-oxosyren (f.eks. 2-oxoiso-capronsyre) til hver brønd og undersøgelse af atmosfæren 25 over fermenteringerne for 14C02. Alternativt kan [14C-1]- 2-oxo-3-methylvalerianesyre eller [14C-1]-i-2^oxo-3-methyl-smørsyre anvendes i stedet for [14C-1]-2-oxo-isocapron-syre. Dannelse af 14C02undersøges bekvemt ved at placere fugtig Ba (OH) 2-mættet filtrerpapir over de enkelte brønde 30 til opfangning af eventuel frigivet 14C02 og bestemmelse af Ba14C03 i påkommende tilfælde ved autoradiografi. Mu-

I DK 175724 B1 I

I 12 I

I tanter, der mangler dehydrogenase-aktivitet over for for- I

I grenede 2-oxosyrer, giver autoradiogrammer, der minder om I

I autoradiogrammerne for upåvirkede kontroller, d.v.s. at I

I der ikke dannes Ba14CC>3 af mutanterne. I

I 5 I

De således opnåede mutanter underkastes yderligere muta- I

I genese under anvendelse af et hvilket som helst af oven- I

I nævnte mutagene midler. De mutageniserede kolonier selek- I

I teres for mangel på transferase-aktivitet over for for- I

I 10 grenede aminosyrer på basis af deres manglende evne til I

I at vokse på M9-glucose-minimale plader, undtagen i nærvær I

af L-isoleucin, L-leucin og L-valin (ILV). Alle disse tre I

I aminosyrer skal være til stede, for at der kan ske vækst. I

I Det er yderligere påvist, at de transaminase-negative mu- I

I 15 tanter ikke vokser på medier, der suppleres med alle de I

tre ketosyrer, der tjener som substrater for transamina- I

sereaktionerne. Et enkelt transaminaseenzym katalyserer I

således transaminering af hver af de tre ketosyrer (2- I

oxo-3-methylvalerianesyre, 2-oxo-isocapronsyre, 2-oxo- I

20 isovalerianesyre). I

De dobbelt-blokerede mutanter, som mangler både dehydro- I

H genase-aktivitet over for forgrenede 2-oxosyrer og tran- I

H saminase-aktivitet over for forgrenede aminosyrer, er af I

25 særlig interesse eftersom sandsynligheden for, at de om- I

dannes til kulturer, der producerer de naturlige avermec- I

H tiner, er ekstremt lav. De enkeltblokerede mutanter kan I

under visse omstændigheder omdannes til kulturer, der I

ville producere naturlige avermectiner. I

B 30 I

H Foruden dannelsen af ønskede alleler af en given mikroor- I

I DK 175724 B1 ganismestamme ved mutagenese, muliggør protoplastfusion indføring af ønskværdige alleler, der er produceret eller indentificeret hos én stamme, i kromosomet hos en anden stamme. F.eks. kan en stamme af S. avermitilis, der mang-5 ler dehydrogenase-aktivitet over for forgrenede 2-oxosyrer og transaminase-aktivitet over for forgrenede aminosyrer, ved protoplast-fusion med en S. avermitilis stamme, der udviser de nævnte aktiviteter, danne en stamme af S. avermitilis, der kun mangler transaminase-10 aktivitet over for forgrenede aminosyrer. Som det er vel- i kendt for fagmanden, muliggør protoplast-fusions-teknologi en kombination af ønskvaerdige alleler fra forskellige selektionslinier i en enkelt stamme. Den heri beskrevne S. avermitilis JC-923 (ATCC 53669), der er en 15 stamme, som mangler transaminase-aktivitet over for forgrenede aminosyrer, blev fremstillet ved denne teknologi.

De morphologiske og dyrkningsmæssige karakteristika for de omhandlede mutanter er generelt som beskrevet i U.S.

20 patentskrift nr. 4,429,042. De adskillende karakteristika for de omhandlede mutanter er deres mangel på dehydrogenase-aktivitet over for forgrenede 2-oxosyrer og/eller transaminase-aktivitet over for forgrenede aminosyrer, hvilke karakteristika bestemmes som beskrevet nedenfor.

25 Manglen på disse aktiviteter resulterer i, at disse mutanter 'ikke kan producere de naturlige avermectinér, når de dyrkes på et defineret medium, der i det væsentlige er fri for fedtsyrer RCOOH, hvori R er isopropyl eller (S)-sec-butyl eller forbindelser, der kan omdannes til sådan-30 ne RCOOH ved fermentering. En taksonomisk undersøgelse gennemført af ATCC bekræftede, at karakteristika for de I DK 175724 B1 !

I to mutantstammer 1-3 og HL-026, der blev udvalgt ved det I

I ovennævnte 14C02 assay, udviser et nært slægtskab til ka- I

I rakteristika for moderstammen ATCC 31272 beskrevet i U.S. I

I patentskrift nr. 4,429,042, dog med visse undtagelser. I

I 5 Mutantstamme 1-3 (ATCC 53567) danner væsentligt færre I

I sporekæder end ATCC 31272, og mutantstamme HL-026 (ATCC I

I 53568) er praktisk talt fri for luftmycelium og sporer I

I med de meget få sporekæder, som den producerer, er af I

I samme karakter som for ATCC 31272. Mutant HL-026 udviser I

I 10 endvidere en tvivlsom evne til at udnytte raffinose som I

I den eneste karbonkilde, mens ATCC 31272 og mutant 1-3 er I

I i stand til at udnytte raffinose. (Ved eksperimenter gen- I

I nemført af ansøgeren synes raffinose ikke at understøtte I

væksten af nogle af disse stammer). Yderligere karakteri- I

I 15 stikum for mutant HL-026 var, at den dannede mindre mela- I

ninpigment end de to andre stammer og især, at den over- I

hovedet ikke dannede pigment på tyrosin-agar. I modsæt- I

I ning til beskrivelsen af ATCC 31272 i U.S. patentskrift I

4,429,042 kunne der ikke detekteres vækst af mutanterne I

20 eller af ATCC 31272 med saccharose som eneste carbonkil- I

de. Mutant 1-3 og HL-026 mangler kun dehydrogenase- I

aktivitet over for forgrenede 2-oxosyrer. Den dobbelt- I

I blokerede mutant PGS-119 (ATCC 53670), opnået ved yderli- I

gere mutagenese af mutant 1-3 (ATCC 53567) og JC-923 I

25 (ATCC 53669) opnået ved protoplast-fusion, udviser en I

taksonomisk r’elation til ATCC 31272,-der svarer til mu- I

tantstamme 1-3. I

H Streptomyces avermitilis-stammerne 1-3, HL-026, PGS-119 I

30 og JC-923 er deponeret i overensstemmelse med Budapest I

traktaten ved the American Type Culture Collection, Rock- I

DK 175724 B1 15 ) i ville, Maryland. De har fået deponeringsbetegnelserne Streptomyces avermitilis ATCC 53567, ATCC 53568, ATCC 53670 og ATCC 53669. Deponeringerne vil blive holdt tilgængelige under nærværende ansøgnings løbetid, og alle 5 restriktioner på tilgængeligheden vil blive ophævet ved meddelelse af patent.

Hver af stammerne S. avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271, ATCC 31272 og NCIB 12121 producerer de naturlige avermec-10 tiner med den almene formel,

Pj 22r^VCH3

Il lI) H OBjl CH3 OR3 ! hvor den brudte linie i 22-23 stillingen repræsenterer en 15 fakultativ dobbeltbinding; R1 er hydroxy, og er kun til stede, når der ikke findes en dobbeltbinding.

20 R2 betegner 4 ’ - (a-L-oleandrosyl) -or-L-oleandrosyloxy med

I DK 175724 B1 I

I I

I formlen I

I CH- . CH- ' I

I y~\ I

I . ch30 ch3o I

I 5 hvori R3 er hydrogen eller methyl; og I

R er isopropyl eller (S)-sec-butyl. U.S. patentskrift nr. I

4,285,963 beskriver en avermectin med formel (I), hvor I

25-stillingen er substitueret med en methyl- og en

10 ethylgruppe, R1 er hydroxy og R3 er methyl. I

I de ikke-naturlige avermectiner, der omtales i nærværen- I

de ansøgning, betegner R en substituent, der er forskel- I

H lig fra isopropyl eller (S)-sec-botyl og er nærmere defi- I

15 neret nedenfor. I

De forbindelser, der er essentielle for udnyttelse af I

formel (I) forbindelser i biosyntesen, forekommer i cel- I

lerne hos S. avermitilis. Disse forbindelser, L-valin, L- I

20 leucin og- L-isoleucin antages at indgå i biosyntesen af I

avermectiner via omdannelse til 2-oxosyrer og decarboxy- I

lering af syren forårsaget af forgrenet 2-oxosyre- I

dehydrogenase, samtidig med kobling af produktet til I

coenzym A. Deres tilstedeværelse forårsager den samtidige I

H 25 dannelse af både isopropyl- og (S)-sec-botyl forbindelser I

I DK 175724 B1 med formel (I) . Dette giver selvfølgelig anledning til problemer ved separering af isopropyl-fra (S)-sec-botyl derivaterne.

5 Når de fermenteres i et næringsmedium, der indeholder den passende initiatorforbindelse, danner mutanterne ifølge opfindelsen en forbindelse med formel (I) eller som oftest en blanding af to eller flere forbindelser med formel (I), hvor R svarer til den anvendte initiatorforbin-10 delse. Der kan dannes op til fire produkter, der bekvemt betegnes R-avermectin Al, A2, Bl og B2 ifølge de betegnelser, der anvendes i U.S. patentskrift nr. 4,429,042. R-gruppen refererer naturligvis til C-25 substituenten; når f.eks. R er cyclopentyl, er de fire mulige avermecti-15 ner:

Trivialnavn R1 R3 cyclopentyl- 20 avermectin Al dobbeltbinding CH3 cyclopentyl- avermectin A2 hydroxy CH3 25 cyclopentyl-

avermectin Bl dobbeltbinding H

cyclopentyl-

avermectin B2 hydroxy H

30 de ikke-naturlige avermectiner er C-25 substituenten

PDK 175724 B1 I

S)-sec- I

igen er I

emstil- I

bI (I), I

ved en I

!S ved I

og 4"- I

ilyloxy I

med et I

methyl- I

ming i I

rbenzen I

beskyt- I

ndelse. I

ktions- I

:t nr. I

emstil- I

er CH3 I

at be- I

skyttet I

Lyse af I

yre til I

nne re- I

=t til- I

reakti- I

ft nr. I

I DK 175724 B1

Forbindelser med formel (I), hvori R1 er K og dobbeltbindingen er fraværende, kan fremstilles ud fra den tilsvarende forbindelse, hvori dobbeltbindingen er til stede og 5 R1 er fraværende, ved selektiv katalytisk hydrogenering under anvendelse af en passende katalysator. F.eks. kan reduktionen gennemføres under anvendelse af tris-(triphenylphosphin)rhodium (I) chlorid som beskrevet i EP-A 0001689, eller det tilsvarende U.S. patentskrift nr.

10 4,199,569.

Forbindelserne med formel (I), hvori R2 er H, kan fremstilles ud fra de tilsvarende forbindelser, hvori R2 er 4 ' - (or-L-oleandrosyl) -oc-L-oleandrosyloxy ved fjernelse af 15 4 ’ - (cx-L-oleandrosyl) -a-L-oleandrosegruppen ved mild hy drolyse med en syre i et vandigt organisk opløsningsmiddel til dannelse af aglyconen, der har en hydroxygruppe i 13-stillingen; denne halogeneres derpå, f.eks. ved omsætning med et benzensulfonylhalogenid til dannelse af 13-20 deoxy-13-halogen-derivatet, der endelig reduceres selektivt, f.eks. med tributyltinhydrid. For at undgå uønskede bireaktioner er det ønskeligt at beskytte andre tilsted-værende hydroxygrupper, f.eks. ved anvendelse af en tert-butyldimethylsilylgruppe. Denne kan let fjernes efter ha-25 logenerings- eller reduktionstrinnet ved behandling med methanol indeholdende en ringe mængde syre. Alle 'disse behandlingstrin samt de passende reagenser og reaktionsbetingelser er beskrevet i EP-A-0002615.

30 De forbindelser, der kan udnyttes af de omhandlede S. avermi tilis-stammer til biosyntese af naturlige og ikke-

I DK 175724 B1 I

I 20 I

I naturlige avermectiner, er forbindelser med formlen (II- I

I A) I

I R-COOH (II-A) I

I 5 også omfattende forbindelser, der kan omdannes til (II-A) I

I under fermenteringsprocessen. Sådanne forbindelser beteg- I

I nes "grundforbindelser". I formel (II-A) betegner R en _- I

I forgrenet gruppe, hvori der på det carbon-atom, hvortil - I

COOH gruppen er bundet, også er bundet mindst to andre I

I 10 atomer eller grupper, forskellig fra hydrogen. Denne de- I

finition omfatter naturligvis mættede og umættede I

I acykliske og cykliske grupper, der eventuelt kan indehol- I

H de et svolv- eller oxygen-heteroatom som et led i den I

acykliske kæde eller cykliske ring. I

I 15 I

Nærmere bestemt kan R, der ender med at være C-25 substi- I

tuenten, være α-forgrenet C3-C8 alkyl, alkenyl, alkynyl, I

alkoxyalkyl eller alkylthioalkyl; Cs-Cs cycloalkylalkyl, I

H hvori alkylgruppen er α-forgrenet C2-C5alkyl; C3-C8 I

20 cocloalkyl eller C5-C8 cycloalkenyl, der alle eventuelt I

kan være substitueret med methylen eller en eller flere I

H C1-C4 alkylgrupper eller halogenatomer (fluor, chlor, iod I

eller brom) eller en 3-6 leddet oxygen- eller svovlholdig I

heterocyklisk ring, der kan være mættet eller helt eller I

H 25 delvis umættet, og som eventuelt kan være substitueret I

H med en eller flere Ci-C4alkylgrupper elier halogenatomer. I

H Forbindelser, der kan omdannes til RCOOH, d.v.s. precur- I

H sorer for fermenteringsprocessen, er forbindelser med I

30 formel (II-B), hvori R har den ovenfor angivne betydning: I

21 DK 175724 B1 R-(CH2)n-Z (II-B) n er O, 2, 4 eller 6; og Z er -CH2OH, -CH2NH2, -COOR5eller -CONHR6, hvori R5 er H eller (Ci-e) alkyl; R6 er hydrogen, 5 (Ci_4)alkyl eller en aminosyrerest, især af asparaginsyre, glutaminsyre og methionin, f.eks. -CH(COOH)CH2COOH, CH(COOH) <CH2)2COOH eller -CH (COOH) (CH2) 2SCH3.

Ved S. avermitilis-stammer, der kun er deficient med hen-10 syn til transaminase-aktivitet over for forgrenede aminosyrer, kan 2-oxosyrer også tjene som precursorer. For sådanne stammer kan syre med formlen (II-C) R-CO-Z (II-C) 15 hvor R og Z har den ovenfor anførte betydning, også udnyttes af S. avermitilis ved biosyntese af avermectiner.

Også omfattet af opfindelsen er de isomere former af for-20 bindeiser med formel (II-A) samt forbindelser, der kan omdannes dertil under fermenteringsprocessen samt de isomere avermectiner ved C-25 stillingen, resulterende fra deres anvendelse ved den her beskrevne proces.

25 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen gennemføres ved aerob : fermentering af en stamme af S. avermitilis, der mangler ! dehydrogenase-aktivitet over for forgrenede 2-oxosyrer og/eller transaminase-aktivitet over for forgrenede aminosyrer, i et vandigt næringsmedium omfattende en assimi-30 lerbar kilde for nitrogen, carbon og uorganiske salte samt en forbindelse med formel RCOOH være en forbindelse,

I DK 175724 B1 I

I 22 i

der kan omdannes til en sådan, d.v.s. en precursor, under I

I fermenteringen. Syren eller forbindelsen, der kan omdan- H

I nes til en syre, tilsættes fermenteringsmediet enten på I

I inoculeringstidspunktet eller mellemrum under fermente-

I 5 ringen. Når der anvendes en transaminase-negativ mutant, I

I skal mediet indeholde L-isoleucin, L-leucin og L-valin, I

for at der kan ske vækst af mutanten. Produktionen af I

I avermectinforbindelserne kan overvåges ved at fjerne prø- I

I ver fra fermenteringen, ekstrahere med et organisk opløs- I

10 ningsmiddel og følge tilsynekomsten af produktet ved H

I chromatografi, f.eks. i anvendelse af HPLC. Inkuberingen

I fortsættes, indtil udbyttet af produktet er maksimeret, i I

I reglen i en periode på 4-15 dage. I

H 15 En foretrukken mængde af hver tilsætning af grundforbin- I

I delsen (carboxylsyre eller forbindelse, der kan omdannes

I til en sådan) er på 0,05-3,0 g/1. Grundforbindelsen kan I

tilsættes kontinuerligt, periodevis eller på én gang til I

I fermenteringsmediet. Syren RCOOH tilsættes som fri syre I

20 eller som salt, f.eks. natrium-, lithium- eller ammonium- I

saltet eller som en forbindelse, der kan omdannes til sy-

ren som defineret ovenfor. Hvis syren er et fast stof, I

opløses den fortrinsvis i et passende opløsningsmiddel

H såsom vand eller {C1-4) alkoholer. I

I 25 I

De medier, der anvendes til fermenteringen kan, især-når I

H C-25 substituenten skal være isopropyl eller (S)-sec- I

butyl, være konventionelle medier indeholdende assimiler- I

bare kilder for carbon, nitrogen og sporelementer. Når C- I

30 25 substituenten skal være en ikke-naturlig gruppe, I

d.v.s. forskellig fra isopropyl eller (S)-sec-butyl, an- I

I DK 175724 B1 vendes der et fermenteringsmedium, hvori de valgte ingredienser mangler eller som kun indeholder minimale mængder grundforbindelse, hvori R-delen er isopropyl eller (S) — sec-butyl.

Efter fermentering i en periode på adskillige dage, for- j

trinsvis ved 24-33 °C, centrifugeres eller filtreres fermenteringsvæsken og myceliekagen ekstraheres, fortrinsvis med acetone eller methanol. Ekstrakten koncentreres, og 10 det ønskede produkt ekstraheres med et vand-ublandbart I

organisk opløsningsmiddel, såsom methylen-chlorid, ethy- I

lacetat, chloroform, butanol eller methyl-isobutylketon. I

Solvent ekstrakten koncentreres, og råproduktet renses I

yderligere om nødvendigt ved chromatography, f.eks. ved I

15 præparativ reverse phase HPLC. I

Produktet opnås i reglen som en blanding af forbindelser I

med formel (I), hvori R2 er 41 -(a-L-oleandrosyl)-α-L- I

oleandrosyloxy, R1 er OH og dobbeltbindingen er fraværen- I

20 de, eller R1 er fraværende og dobbeltbindingen er til I

stede, idet R3 så er H eller CH3. Forholdet kan imidler- I

tid variere med den anvendte mutant og grundforbindelse I

samt reaktionsbetingelserne. I

25 Kilden for R-gruppen, d.v.s. hvorvidt den tilføres direk- I

te med RCOOH eller dannes ud fra en af ovennævnte precur- I

sorer eller fra en hvilken som helst precursor, er uden I

betydning for avermectinproduktionen. Det kritiske krav I

for produktion ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er, I

30 at den ønskede R-gruppe kan gøres tilgængelig for S. I

avermitilis-stammer ifølge opfindelsen ved fermenterings- I

fDK 175724 B1

ølgende: I

I I

DK 175724 B1 * 25 lithium-3-methylcyclobutancarboxylat 3- fluorcyclobutancarboxylatsyre lithium-3-methylencyclobutancarboxylat 2-methyl-4-methylthiosmørsyre 5 tetrahydrothiopyran-4-carboxylsyre cyclobutylmethylamin ethyl-cyclobutancarboxylat 4- hydroxymethylcyclopenten 2-(3-thiophencarbonyl)propionsyre-ethyl-ester 10 (S)-2-methylpentancarboxylsyre (R)-2-methylpentancarboxylsyre O-methyltransferasemutanterne kan opnås ud fra de ovenfor beskrevne mutanter, der er dehydrogenase-negative over 15 for forgrenede 2-oxosyrer og/eller transaminase-negative over for forgrenede aminosyrer. Mutanter, der udviser en mutation i den ene eller begge de nævnte aktiviteter, kan kombineres med den ene eller begge O-methyltransferase-mutationerne og give stammer af S. avermitilis som, når 20 der tilføres RCOOH-forbindelser eller forbindelser, der kan omdannes dertil under fermenteringsprocessen, primært vil producere B-avermectiner, demethyl-avermectiner eller demethylavermectin B forbindelser. Disse mutanter kan opnås ved mutagenese af de heri beskrevne mutanter, som 25 mange af de nævnte dehydrogenase- og/eller transaminase-aktiviteter- ved hjælp af ultraviolet lys og/eller kemiske mutage midler, såsom N-methyl-N-nitrosourethan, nitroso-guanidin, ethylmethansulfonat eller andre midler, f.eks. som nævnt ovenfor. Alternativt kan dehydrogenase-positive 30 og/eller transaminase-positive mutanter, som mangler den ene eller begge O-methyltransferaserne, muteres ved be-

I DK 175724 B1 I

H

Η

I I

I 26 I

H

I handling med UV-lys eller et mutagent middel til dehydro-

I genase-negative eller transaminase-negative mutanter. I

De ikke-naturlige avermectiner, der dannes af sådanne mu- I

I 5 tanter, er kendetegnet ved tilstedeværelsen af hydro-

I xygrupper i C-5 stillingen i aglycon-delen og/eller C-3’ I

I og/eller C-3"-stillingerne i oleandrose-delen. I

I De ovennævnte mutanter er identificeret i henhold til j I

H 10 Schulman et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, I

I 29, 620-624 (1986). De er anvendelige til samme formål og I

på samme måde som de kendte avermectiner. I

Alternativt kan forøgede mængder af B-avermectiner, også I

15 omfattende sådanne, som mangler methylgrupper på I

H oleandrose-disaccharid-delen, fremstilles ved fermente- I

I ring af de omhandlede mutanter, der mangler de nævnte de- I

I hydrogenase og/eller transaminase-aktiviteter, i nærvær I

af forbindelser, såsom sinefungin, S-adenosylethionin el- I

20 ler S-adenosylhomocystein, der hæmmer O-methyltrans- I

ferase-aktiviteten. I

De omhandlede forbindelser er særdeles aktive antiparasi- I

tiske midler, der har særlig anvendelighed som anthelmin- I

25 tica, ectoparasiticider, insecticider og acaricider. For- I

- bindeiserne er således effektive ved rbehandling af en I

række tilstande forårsaget af endoparasitter, omfattende I

især helminthiasis, der hyppigst forårsages af en gruppe I

H af parasitiske orme, der benævnes nematoder, og som kan I

30 forårsage alvorlige økonomiske tab ved avl af svin, får, I

heste og kvæg, ligesom de kan påvirke husdyr og fjerkræ. I

I DK 175724 B1 |

Forbindelserne er også virksomme over for andre nemato-der, der påvirker forskellige dyrearter, såsom Dirofila-ria hos hunde og forskellige parasitter, der kan inficere mennesker, omfattende gastro-intestinale parasitter, så-5 som Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trin-

chinella, Capillaria, Trichuris og Entezobius samt para- I

sitter, der findes i blodet eller andre væv og organer, I

såsom filarier og de extraintestinale stadier af Strongy- I

loides og Trichinella, I

Forbindelserne er også af værdi ved behandling af ectopa- I

rasitinfektioner især forårsaget af arthropode ectopara- I

sitter hos dyr og fugle, såsom mider, mitter, lus, lop- I

per, spyfluer, bidende insekter og migrerende to-vingede I

15 larver, der kan angribe kvæg og heste. I

Forbindelserne er også insekticide over for husskadedyr, I

såsom kakkerlakker, tøjmøl, klaner samt stuefluer, lige- I

som de er anvendelige over for skadedyr i lagret korn og I

20 landbrugsplanter, såsom edderkopmider, aphider, kålorme I

og over for migrerende orthopteraner, såsom græshopper. I

Forbindelserne med formel (I) kan angives i en passende I

formulering i afhængighed af den påtænkte specifikke an- I

25 vendelse og arten af det værtsdyr, der skal behandles og I

den involverede parasit eller insekt. Til anvendelse som I

anthelmintica kan forbindelserne indgives oralt i form af I

en kapsel, bolus, tablet eller flydende medicin, eller I

alternativt kan de indgives ved injektion eller som im- I

30 plantat. Sådanne formuleringer kan fremstilles på konven- I

tionel måde i overensstemmelse med standard veterinær I

l I

SDK 175724 B1 :ter frem-d et pas-asrer, der og/ eller magnesium es ved at opløsning ar og ligstilles i Ide andre r glucose >se formu-den akti-Les, typen »gemsvægt.

) mg/kg af eller se-tilfreds-jligheder, ceret, og :efoderet, lcentreret t normale I af land-:øj tnings-l overens- 29 DK 175724 B1

Produktion af forgrenet 2-oxosyre-dehydrogen3se-deficient 5. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) 5 Trin 1. S. avermitilis ATCC 31272 dyrkedes som et confluent tæppe på New Patch Agar Medium i 12 dage ved 30 °C. Mediet omfattede:

V-8 juice* 200 mL

10 CaC03 3 g

Agar 15 g

H20 til 1000 mL

Næringsvæske 1,0 g/L

Natriumacetat 3H20 1,4 g/L

15 Isolvalericanesyre 50 mg/L

Isosmørsyre 50 mg/L

2-methylsmørsyre 50 mg/L

Isoleucin 250 mg/L

Leucin 250 mg/L

20 Valin 250 mg/L

Sporelementopløsning1 1 ml/L

*En blanding af 8 grønsagsjuicer (tomat, gulerod, selleri, bede, persille, salat, have-brøndkarse og spinat) 25 plus salt, ascorbinsyre, citronsyre og naturlige aromaer. Forhandlet af Campbell Soup Company, Camden, USA.

Sammensætning af sporelementopløsning:

I I

I DK 175724 B1 ! I

I I

I 30 I

I FeCl3,6H20 2,7 g I

I MnS04,H20 4,2 I

I CuS04,5H20 0,5 I

I CaCl2 11,0 Γ I

I 5 H3BO3 0,62 I

I CoCl2,6H20 0,24 I

I ZnCl2 0,68 I

I Na2Mo04 0,24 I

I 10 opløses i 1 L 0,1 N saltsyre. I

Sporer blev høstet fra tre sådanne skåle og suspenderet i I

I 20 ml 0,05M tris-maleinsyre-puffer, pH 9,0. I

I 15 Trin 2. 10 ml af sporesuspensionen sattes til en ampul

indeholdende 10 ml N-methyl-N1-nitro-N-nitrosoguanidin I

(NTG) . Ampullen blev inkuberet og rystet ved 28 °C i 60 I

minutter og sporerne derpå vasket rigeligt med 1% NaCl- I

I opløsning. I

I 20 I

Trin 3. De vaskede sporer blev suspenderet i 1% NaCl- ! I

opløsning og blandet med et lige så stort volumen 80% I

ethylenglycol. Denne suspension blev gemt ved -20 °C og I

anvendt som kilde til celler, som skal sigtes for mutan- I

25 ter. Den gav tilnærmelsesvis 104 kolonier/ml, når den I

spirede. I

I I

H Denne spore lagersuspension blev spredt på YPD-plader til I

H opnåelse af omkring 100 kolonier pr. plade {YPD-medium I

30 omfatter 10 g/L hver af gærekstrakt, Bacto peptone* og I

H dextrose og 15 g/L Bacto agar*, indstillet til pH 6,9 før I

I i 31 DK 175724 B1 autoklavering). Ingredienserne mærket med en stjerne kan skaffes fra Difco Laboratories, Detroit, Michigan 48238, USA.

5 Trin 4. Enkelte kolonier blev optaget fra pladerne efter 2-3 ugers vækst ved 28 °C og anbragt i individuelle huller på en standard 96 hullers mikrotiterplade. Desuden blev en lille mængde af kolonien udsået på frisk agarmedium for at tjene som kilde til levedygtige celler, hvor 10 mutanter identificeres.

Trin 5. Til hvert hul sattes omkring 75 pL af et flydende M9-salt-medium indeholdende 1% glucose, 0,1% "casaminosy-rer" og 0,01% hver af isovalerianesyrer, isosmørsyrer og 15 2-methylsmørsyrer. Efter flere dages inkubation ved 28 °C bliver cellerne prøvet for tilstedeværelsen af forgrenet-kæde-2-oxosyrer-dehydrogenase. (Hver liter M9-salt-medium omfatter 6 g Na2HP4, 3 g KH2P04, 0,5 g NaCl og 1 g NH4C1.

Mediet autoklaveres, og der tilsættes aseptisk 1 mL ste-20 riliseret 1M MgS04-opløsning og 1 mL 0,1M CaCl2- opløsning).

Trin 6. Der blev fremstillet en mikrosuspenstion af 5% toluen i M9-salt-medium ved en kort ultralydbehandling af 25 den ublandbare blanding. Til 25 mL af denne suspension sattes 1,2 mL af en opløsning indeholdende [14C-l]-2-oxoisocapronsyre, 2,5 mCi/mL og 10,0 mCi/pmol. 50 pL af denne samlede blanding sattes til hvert af hullerne i mi-krotiterpladerne indeholdende kolonier, som skulle prø-30 ves.

I DK 175724 B1 I

I 32 I

I Trin 7. Det fra hvert hul producerede 14C02 blev indfanget I

I og visualiseret ved den procedure, der er beskrevet af I

I Tabor et al., J. Bacteriol. 128 485-486 (1976) med titlen I

I "Convenient Method for Detecting 14CC>2 in Multiple Sam- I

I 5 pies: Application to Rapid Screening for Mutants". Mutan- I

I ter, som mangler aktiv forgrenet-kæde-2-oxosyre-dehydro- I

I genase, producerer intet Ba14CC>3 udover det, som iagttages I

I for kontrollerne. I

I 10 En mere raffineret metode, som forbedrer kontrasten mel- I

lem en positiv prøvning for 14CC>2, indiceret ved en mørk I

I plet på autoradiogrammet som resultat af Ba14CC>3-dannelse I

I og en negativ prøvning indiceret ved ingen plet eller en I

I meget lys plet, omfatter den følgende modificerede sigt- I

H 15 ning. I

Enkelte kolonier (se trin 4 ovenfor) blev opsamlet fra I

agarmediet efter 7-14 dages vækst (hellere end 2-3 uger) I

I og prøvet direkte ved trin 6 og 7 ovenfor. Trin 5 i den I

I 20 ovenstående procedure udelades. I

En endnu mere raffineret prøvningsmetode, som er af kvan- I

titativ art, hvad angår 14CC>2-frigørelse, omfatter dyrk- I

I ning af mutanterne detekteret ved de ovenstående sigtnin- I

I 25 ger på et egnet medium omfattende M9-salt-medium med 1% I

I -glucose og 0,1% "Syncasa-bcaa" (en syntetisk blanding af I

I L-aminosyrer med den passende sammensætning af kommerci- I

I elle casaminosyrer, men uden tilstedeværelsen af L-valin, I

L-isoleucin og L-leucin, se nedenfor). I

I 30 I

Efter vækst til høj celletæthed blev cellerne vasket i I

I DK 175724 B1

M9-salt-medium og resuspenderet i koldt M9-salt-medium indeholdende 1% toluen, sotn var blevet ultralydbehandlet til dannelse af en mælkehvid dispersion af toluenet. Cel-le/puffer/toluen-suspensionen blev inkuberet i 40 minut-5 ter ved 30 °C for at permeabilisere cellerne. De permea- I

biliserede celler blev derpå vasket i M9-salt-medium og I

endelig resuspenderet i en femtedel af det oprindelige j I

volumen af M9-medium-puffer. Der anvendtes 180 pL af den- I

ne suspension pr. prøvning. I

Et reaktionsvolumen på 300 pL indeholdt de toluenbehand- I

lede celler, thiaminpyrophosphat (TPP) , 0,4 mM; coenzym Δ I

(CoA), 0,11 mM; nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD), I

0,68 mM, dithiothreitol (STT), 2,6 mM; MgCl2, 4,1 mM; I

15 Tris-HCl, 60 mM, pH 7,5; og [14C-1]-or-ketoisocaproat, I

6000 tæll./min. pr. pmol. Tællingseffektiviteten var 73%. I

Reaktionen blev udført i 15 mL scintillationampuller in- I

deholdende et 2 x 2 cm Whatman No. 4 papir-kvadrat pres- I

set ind i ampullens skruehætte. Papirer indeholdt 30 pL 1 I

20 M "Hyamine Hydroxide" (1 M opløsning methylbenzenthonium- I

hydroxid i methanol; forhandlet af Sigma Chemical Co., I

St. Louis, MO 63178, USA), som opfanger 14C02 udviklet ved I

reaktionen. Efter inkubation i to timer neddyppes papi- I

rerne i 10 ml Beckman Aquasom II Universal LSC I

25 {væskescintillationstæller) forhandlet af New England I

Nuclear Research Products, 'Boston, MA 02118, og radioak- I

tiviteten måles i en væskescintillationstæller efter I

equilibrering i dette opløsningsmiddel i 4 timer eller I

mere. En blindkontrolreaktion (d.v.s. uden celler) giver I

30 ca. 50-300 tæll./min. I

I DK 175724 B1 I 34 I Mutant 1-3 og andre ligesom den gav tællinger, som var I mindre end eller lig med blindkontrolreaktionen, medens udgangsstammen gav tællinger flere gange højere end H blindkontrolværdien.

I 5 I Isolering af HL-026 derivat (ATCC 53568) af S. Avermiti- lis 1-3 (ATCC 53567) S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) blev udstrøget på 10 agarplader. Der viste sig en relativt høj frekvens af spontane varianter, hvoraf nogle manglede luftmycelium efter 4 dages inkubation ved 30 °C. Flere sådanne varian- ter blev isoleret og prøvet for deres evne til at produ- H cere ikke naturlige avermectiner, når de blev gæret i ΑΡΗ 15 5-medium, hvortil der var sat cyclopentacarboxylsyre. Fra H isolaterne, hvoraf mange producerede ikke-naturlige aver- H mectiner frie for naturlige avermectiner, blev en stamme, H som blev højere titere af avermectiner ved kobleforsøg H end dens udgangsstamme S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567), 20 til identifikationsnummeret HL-026 (ATCC 53568).

H Produktion_af_forgrenet-2-oxo-syre-dehydrogenease- H deficient og forgrenet-aminosyre-transaminase-deficient H 5. avermitilis PGS-119 (ATCC 53670 I 25

Trin 1. Ca. 100 mg S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567), dyr— ket på en frisk SAMM-agar-plade i 4 dage, blev indkodet i en 300 mL kolbe indeholdende 50 mL SCM-medium (pH 7,2).

Kolben blev derpå rystet ved 200 omdr./min og 30 °C i 24 30 timer (slut pH = 8,2).

I DK 175724 B1 35

Trin 2, Koblen blev fjernet fra rysteren, og 10 ml af hele væsken centrifugeret i et sterilt glas i 5 minutter ved 2.000 omdr./min. Cellerne blev derpå resuspenderet i 50 mL SCM-medium i sterile 300 mL Erlenmeyer-kolber, og 5 kolberne rystet på en roterende ryster i 2 timer ved 30

Trin 3. De 10 mL af suspensionen blev anbragt i et ste- I

rilt glas. I

Trin 4. Ethylmethansulfonat (250 pL) sattes til glasset I

(i et veludluftet stinkskab), indholdet blev grundigt I

blandet og derpå hældt i en steril 300 mL kolbe, og kol I

ben blev rystet i en roterende ryster i 3 timer ved 30 I

15 °C. I

Trin 5. Frisk sterilt SCM-medium (40 mL) sattes til kol- I

ben, og rystningen fortsattes i ialt 70 timer vedv30 °C. I

20 Trin 6. Kolben blev udtaget, og indholdet centrifugeret I

ved 8000 omdr./min i 10 minutter ved 20 °C. Cellerne blev I

vasket ved resuspendering i SCM-medium, centrifugeret I

igen og resuspenderet i 10 mL SCM-medium. I

25 Trin 7. Cellerne blev fjernet og prøvet via replikaud- I

pladning (ca. 150 kolonier/plade, for deres evne til at I

vogte på M9/glucose-minimalplader i nærvær og fravær af I

L-leucin, L-isoleucin, L-valin og kombinationer af hver I

af de nævnte aminosyrer. Mutantcellerne af interesse vok- I

30 sede kun på medier suppleret med L-leucin, L-isoleucin og I

L-valin. Disse derivater af S. avermitilis 1-3 (ATCC I

I DK 175724 B1 I

I 36 I

I 53567), dificiente med hensyn forgrenet-aminosyre- I

I transaminase-aktivitet, voksede heller ikke på medier I

I suppleret med en eller flere af de tre 2-oxosyrer (2- I

I oxoisocapronsyre, 2-oxo-3-methylvalerianesyre og 2- , I

I 5 oxoisovalerianesyre), der tjener som forstadier til L- I

I leucin, L-isoleucin og L-valin. Denne opførsel er fuld- I

I stændig modsat opførslen af S. avermitilis 1-3 (ATCC I

I 53567), som voksede godt på sådanne medier. Således kata- I

lyserer et enkelt transaminase-enzym transaminering af de I

10 nævnte 2-oxosyrer. I

I SCM-medium I

I Gærautolysat 10 g/L I I

Oksekødekstrakt 5 g/L I

15 Enzymatisk hydrolysat I

af casein 10 g/L I

I 1 M MgS04 3 g/L I

I 1M K2HP04; pH 7,0 (HC1) 100 g/L I

20 SAMM-agar-plade I

I I

Na2HP04 6,0 I

KH2P04 3,0 I

NaCl 0,5 I

25 NH4C1 1,0 I

' 1M MgS04 -1,0 I

0,1M CaCl2 1,0 I

H Dextrose 8,0 I

H Casaminosyre 20,0 I

30 Agar 20,0 I

DK 175724 B1 37

Sammensætning af "Syncasa - bcaa", 100 gange koncentrat

g/L

L-alanin 3 5 L-arginin 4 L-asparaginsyre 6 L-cystin 1 L-glutaminsyre 20 glycin 1 10 L-histidin 2 L-lysin 7 L-methionin 3 L-phenylalanin 6 L-prolin 10 15 L-serin 6 L-threonin 4 L-tyrosin 4 L-tryptophan 1 20 Blandingen indstillet til pH 7 og sterilfiltreres. 1 vo lumen koncentrat sættes til 99 voluminer medium for at opnå standard-anvendelseskoncentrationer.

S. avermitilis JC-923 (ATCC 53669) ved protoplast-fusion 25 af en spectinomycin-resistent stamme af S. avermitilis ATCC 31272 og S-. PGS 119 (ATCC 53670) i

S. avermitilis ATCC 31272, specitinomycin-resistent, er en spontan mutan af S. avermitilis ATCC 31272. Den blev 30 isoleret fra populationer af vegetative mycelier af ATCC 31272 spredt ud på AS-1 agarplader indeholdende 50 pg/mL

i i

38 I

DK 175724 B1 I

spectinomycin. Sporer af mutanten spiret på rigt medium ^ I

er resistente over for 50 pg/mL spectinomycin i modsæt- j I

ning til sporer af den isogeniske udgangsstamme, som ikke I

spirer under disse betingelser. Denne dominante selekter- I

5 bare markør blev anvendt med held til at isolere forgre- I

net-amino-transaminase-deficiente isolater af ATCC 31272. I

ÅS-l-agar I

(Rigt udpladningsmedium for Streptomyces) I

Gærekstrakt 1 g I

L-alanin 0,2 g H

L-arginin 0,2 g H

L-asparagin 0,5 g H

15 Opløsningsstivelse 5 g . I

NaCl 25 g I

Na2S04 10 g I

Agar 20 g I

Destilleret IL I

20 I

Der indstilles til pH 7,5, autoklaveret i 15 minutter ved

121 °C, og 30-35 mL hældes i sterile plastik petriskåle H

(100 x 15 mm). I

25 PROCEDURER TIL FREMBRINGELSE AF LEVEDYGTIGE PROTOPLASTE- I

RAF STREPTOMYCES AVERMITILIS STAMMER I

A. Sporer som podemedier I

30 1. Sporepræparater blev fremstillet ved standprocedurer, H

antallet af levedygtige bedømt ved udpladning af fortyn- I

I DK 175724 B1 dinger på spiringsagar, og aliquoter frosset ved -70 °C i 40% glycerol.

2. Før anvendelsen blev sporerlageropslæmningerne centri-5 fugeret ved 1000 x g i 10 minutter og resuspenderet i et

lige så stort volumen 0,85% saltopløsning. I

3. Ca. 107 sporer blev indpodet i 30 mL modificeret gæ- I

rekstrakt/maltekstrakt-væske (YEME)-medium indeholdende I

10 0,5% glycin (se nedenfor) i en 300 mL kolbe med 3 eller 4 I

prelplader. I

B. Frosne ultralydbehandlede mycelier som podemedier I

15 1. Myceliekulturer af PGS-119 blev dyrket i Trypticase- I

soja-væske (TSB) til en turbiditet på 2-9 ved 600 nm. I

Kulturen blev homogeniseret 10 gange med en vævshomogeni- I

sator af glas. I

20 2. De homogeniserede mycelier blev fortyndet dobbelt op i I

TSB, og 20 mL sattes til et sterilt polypropylencentrifu- I

geglas. En ultrasonisk sonde blev neddyppet til en dybde I

af 1-2 cm i væsken, og prøven blev ultralydbehandlet ved I

50% intensitet i 10 sekunder. Ultralydbehandlingen dis- I

25 pergerede myceliemasserne i enkelte eller dobbelte celle- I

enheder, som frembragte hurtig eksponentiel vækst, når de I

blev underdyrket. I

3. Ultralydbehandlede myceliepræprater blev fortyndet til I

30 en endelig koncentration på 40% glycerol, pippeteret ind I

i ampuller og frosset ved -70 °C. I

I DK 175724 B1 I

I 40 I

Η I

I

I I

Η I

4. Aliquoter blev optøet ved stuetemperatur som nødven- I

I digt for at pode i YEME-medium som i trin A.3 ovenfor. I

5 C. Kolonier på agarmedium som podemedier I

I 1.6 modne kolonier af PGS-119 voksende på TSA eller YPD- I

I 2-agar blev indført med et øje i 200 pL sterilt vand i et I

mikrocentrifugeglas. I

10 I

2. Mycelieblandingen blev homogeniseret med en éngangs- I

støder. I

3. De homogeniserede kolonier sattes til YEME-medium som I

15 i trin A.3 ovenfor. I

D. Fremstilling af protoplaster ud fra mycelier dyrket i I

I glycin I

H 20 1. Kulturer blev inkuberet i et rystet vandbad ved 29 °C I

på indstilling 8 i ca. 65 timer. I

2. Mycelierne blev iagttaget mikroskopisk under 40X fase I

2 forstørrelse og høstet i et polypropylencentrifugeglas I

25 ved omkring 1475 x g i 10 minutter ved 20 °C.

3. Supernatantopløsningen blev smidt væk, og myceliepil-len blev resuspenderet i 10 mL protoplast-(P)-puf fer (se nedenfor). Pillen blev homogeniseret 5-10 gange med en 30 vævshomogenisator for at dispergere klumper.

DK 175724 B1 41 . 4. Prøven blev centrifugeret ved ca. 1.000 x g i 10 minutter. Supernatantopløsningen blev smidt væk, og pillen forsigtigt resuspenderet i 10 mL P-puffer.

5 5. Vaskningstrinnet ovenfor blev gentaget.

6. Myceliepillen blev resuspenderet i 10 mL af en 1,0 mg/mL frisk lysozymopløsning i P-puffer, som var blevet sterilfiltreret ved passage igennem et 0,22 pm filter.

10 7. Mycelieblandingen blev inkuberet i et vandbad ved 37 °C med forsigt rystning i 60 minutter. Prøverne blev resuspenderet i lysozymopløsningen for hver 15 minutter. Prøverne blev iagttaget mikroskopisk under 4 0X fase- 15 belysning for tilstedeværelse af protoplaster.

8. Myceliepræparater blev udrevet 3 gange med en 5 mL pipette for at befri protoplaster fra deres cellevægge.

20 9. Præparater blev filtreret igennem glasuld eller ikke- absorberende bomuld.

10. Protoplasterne blev sedimenteret ved centrifugering ved ca. 1.000 x g i 7 minutter, forsigtigt resuspenderet 25 i 5 mL P-puffer og iagttaget under 40X-fase-forstørrelse.

11. Protoplasterne blev sedimenteret som ovenfor og resuspenderet i 1,0 mL P-puffer. Fortyndinger af denne suspension blev foretaget i P-puffer og destilleret vand 30 og udpladet på regenerationsmedium. Kolonier, som opstod ud fra protoplastpræparater fortyndes i destilleret vand,

I DK 175724 B1 I

I 42 I

I antoges at være afledt fra ufuldstændigt eller ikke- I

I protoplastede mycelieenheder. I

I 12. Protoplaster blev frosset på is i 200-300 pL aliquo- I

I 5 ter ved -70 °C. De blev fjernet fra isen 18-24 timer se- I

I nere. I

I FUSION AF PROTOPLASTER MED POLYETHYLENGLYCOL (PEG) 1.000 I

10 1. Alle de her beskrevne forsøg blev gennemført med et I

I enkelt parti af PEG 1000 (Sigma Chemical Co., St. Louis, I

I MO 63178, U.S.A.), som kun frembragte lidt tilsyneladende I

toxicitet i vore hænder. I

15 2. 1,0 g aliquoter af PEG blev autoklaveret i glasampul- I

ler, der tilsattes 1,0 mL P-puffer, og PEG'en blev opløst I

ved opvarmning af ampullen til 55 °C, eller PEG'en blev I

I vejet, opløst i P-puffer og sterilfiltreret lige før I

brug. PEG-opløsningerne blev anvendt ved stuetemperatur. I

I 20 I

3. Protoplaster blev frisk fremstillet eller optøet hur- I

tigt fra -70 °C lagre under rindende vand. Tilnærmelses- I

vis lige store antal af protoplaster af hver genotype I

blev pipetteret forsigtigt ind i et polycarbonatcentrifu- I

H 25 geglas. For frisk fremstillede protoplastpræparater blev I

H turbiditeter målt, og flere forskellige koncentrationer I

blev sammensmeltet. Voluminet i hvert glas blev indstil- I

I let til 5,0 mL med P-puffer. I

30 4. Fusionsblandingen blev centrifugeret ved ca. 1000 x g I

i 7 minutter. I

DK 175724 B1 43 5. Supernatantopløsningen blev dekanteret forsigtigt. Protoplastpillen blev forsigtigt resuspenderet til et endeligt volumen på 200 pL med P-puffer.

5 6. 800 pL 50% PEG-opløsning sattes hurtigt til fusionsblandingen. Præparatet blev blandet ved at blive trukket op i en Pasteur-pipette og udstødt igen. Fusionsblandingen blev inkuberet i 2 minutter ved stuetemperatur. Der 10 tilsattes 9 mL P-puffer for at fortynde PEG-opløsningen. j

Yderligere fusioner blev gennemført i række, således at inkubationsintervallerne var nøjagtige.

1. Fusionsblandingerne blev centrifugeret som i trin 4 15 ovenfor, supernatantopløsningen dekanteret forsigtigt, og i de sammensmeltede vaskede protoplaster blev resuspenderet i 1,0 mL P-puffer.

8.. Fusionsblandingen blev rækkefortyndet 10_1 og 10~2 i P-20 puffer.

9. Fusioner af hver stamme alene blev gennemført ved hvert forsøg og udpladet som kontroller.

25 10. Fortyndinger af hvert protoplastpræparat {levedygtige tællinger) bl’ev udpladet for at bestemme antal levende regeneranter af hver stamme, der blev anvendt ved fusionsproceduren .

I DK 175724 B1 I

I 44 I

I I

I i I

REGENERATION AF PROTOPLASTER I

I il I ι i

1. Protoplastsuspensioner, fusionsblandinger eller selv- j I

I fusioner blev fortyndet passende i P-puffer og udpladet i | 5 100 pL aliquoter på regenerationsagarmedier under anven- |

I delse af forsigtig spredningsteknik. Spredning af de sam- I

mensmeltede protoplaster i overlag af blød agar forbedre- I

de ikke væsentligt deres generation. I

I 10 2. Hvor det var passende, anvendtes proceduren beskrevet I

i D.ll ovenfor. I

3. Regenerationspladerne blev inkuberet med den rigtige I

H side opad i lukkede plastikposer ved 29-30 °C og ca. 95% I

15 fugtighed. I

4. I tilfælde af protoplastfusioner, hvorved spectinomy- I

cin-resistens var anvendt som en dominant selecterbar I

markør, blev regenerende protoplaster efter 18 timer I

20 overhældt med 3,5 mL 100 pg/mL spectinomycin i blød agar I

(se nedenfor) autoklaveret og tilsat ved <45 °C. i I

5. Protoplasterne blev inkuberet i 7-10 dage. I

25 VÆKSTMEDIER, REGENERATIONSMEDIER OG PROTOPLAST-PUFFER I

Komplet regenerationsmedium I

H (Modificeret efter Hopwood et al., 1985. Genetic Manipu- I

H 30 lation of Streptomyces: A laboratory Manual, side 235) I

I DK 175724 B1

Stamopløsning

Sucrose 205 g K2S04 0,25 g 5 MgCl2.6H20 10,12 g

Glucose 10 g

Difco Casaminosyrer 0,1 g

Difco gærekstrakt 5,0 g

Difco havremel agar 3,0 g 10 Difco Bacto Agar 22,0 g

Destilleret vand g.s. 955 mL

Autoklaveres i 25 minutter ved 121 °C.

Efter autoklavering tilsættes sterile opløsninger af:

KH2P04 (0,5%) 10 mL

CaCl2.2H20 5 mL

L-prolin (20%) 15 mL

MES-puffer (1,0 M) 10 mL

20 Sporelementpoløsning1 2,0 mL

NaOH (IN) 3,0 mL

Indstillet til pH 6,5; volumen bringes op på 1 L.

ί

Sporelementopløsning (pr. L): 25

ZnCl2 4 0 mg

FeCl3.6H20 200 mg

CuC12.2H20 10 mg

MnCl2.4H20 10 mg 30 NaB4C>7.10H2O 10 mg (NH4) 6Μθ7θ24.4H20 10 mg I DK 175724 B1 I 46

I Overlag af blød agar med spectinomycin I

I Komplet regenerationsmedium som ovenfor undtagen: I

I 5

Agar 4,10 g I

Der autoklaveres som ovenfor, afkøles til 55 °C, og til- I

sættes 100 mg spectinomycin. Aliquoter på 5 mL fyldes i I

10 kulturglas med hætte og afkøles. De autoklaveres igen li- I

ge før brug. I

Modificeret protoplast-(P)-puffer I

15 Stamopløsning: I

Sucrose 205 g I

I K2S04 0,25 g I

MgCl2.6H20 2,02 g I

20 Destilleret vand 977 mL I

H Autoklaveres i 25 minutter ved 121 °C I

H Efter autoklavering tilsættes sterile opløsninger af: I

25 KH2P04 (0,5%) 1 mL

Sporelementopløsning* 2 mL I

H CaCl2.2H20 (3, 68%) 10 mL I

H MES-puffer (1,0 M) 10 mL I

Indstillet til pH 6,5; volumen bringes op på 1 L. I

I 30

* Opløsning som ovenfor. I

DK 175724 B1 ! 47

Modificeret qærekstrakt/maltekstrakt-(YEME)-medium

Stamopløsning 5

Difco gærekstrakt 3 g

Difco Bacto pepton 5 g

Difco Bacto maltekstrakt-væske 3 g 10 Glucose 10 g

Sucrose 300 g

Destilleret vand g.s. 973 mL

Autoklaveres i 25 minutter ved 121 °C.

15 Efter autoklavering tilsættes sterile opløsninger af:

MgCl2.6H20 (2,5M) 2 mL

Glycin (20%) 25 mL

Volumen indstilles til 1 L.

20

BESKRIVELSE AF TEGNINGERNE

Fig. 1: UV-detektering (240 nm) overfor tid (min) af HPLC kromogram af opløsningsmiddelfraktion fra opløsningsmid-25 delekstraktion af S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) celler efter vækst på fedtsyrefrit medium (WPM SynA 40:40). Maksimet ved 13.12 er oligomycin A.

Fig. 2: UV-detektering (240 nm) af HPLC kromogram af op-30 løsningsmiddelfraktion fra opløsningsmiddelekstraktion af S. avermitilis MA4848 (ATCC 31272) celler efter vækst på

I DK 175724 B1 I

I 48 I

I fedtsyrefrit medium (WPM SynA 40:40). Produkterne er na-

I turlige avermectiner. I

I Fig. 3: UV-detektering (240 nm) af HPLC kromogram af op- I

I 5 løsningsmiddelfraktion fra opløsningsmiddelekstraktion af I

I S. avemitilis 1-3 (ATCC 53567) celler efter vækst påme- ' I

I dium indeholdende cyclopentancarboxylsyre (se eksempel I

Bl). I

I 10 De vedføjede figurer er nøjagtige detekteringer af HPLC- I

I kurver for de angivne forbindelser. I

Sammensætningerne af medier anvendt i de følgende eksem- I

I pier er angivet nedenfor. Alle molekyvægtsbestemmelser I

H 15 blev opnået ved hurtig-atom-bombardements-massespektro- I

metri gennemført på et VG Model 7070E masse-spektrometer I

H under anvendelse af en prøvematrix af triethylenglycol I

H med fast natriumchlorid. (M + Na)+ blev bestemt. Elek- I

tronstråle-massespektrometri blev gennemført under anven- I

I 20 delse af et VG Model 7070F massespektrometer til at give I

m/e-værdier. Kun værdier for hovedfragmenterne er opteg- I

net. I

AS-7-medium I

I 25 I

I £/L I

Fortyndet stivelse a 20 I

I "Ardamin pH"b 5 I

I "Pharmamedia"c 15 I

I 30 CaC03 2 I

49 DK 175724 B1 a Fremstillet ved hydrolyse af stivelse med a-amylase fra Bacillus licheniformis (forhandlet af Novo Enzymes, Wilton, CT, U.S.A.) under handelsnavnet "Termamyl") til et dextrose-ækvivalent på 40% 5%.

5 b Fra Yeast Products, Inc., Clifton, NJ 07012, U.S.A.

c Fra Traders Protein, Memphis, TN 38108, U.S.A.

10

Indstilles til pH 7,2 med NaOH.

AS-5-medium

15 a/L

Fortyndet stivelse a 80 "Ardamin pH” 5 K2HP04 1 20 MgS04.7H20 1

NaCl 1

CaC03 7

FeS04.7H20 0,01

MnCl2.7H20 0,001 25 ZnS04.7H20 0,001

"P-2000" (skumdæmper) 1 ml/L

Indstilles til pH 6,9 med 25% NaOH-opløsning.

50 I

DK 175724 B1 I

WPM Syn A 40:40 I

g/L destilleret H2O I

Fortyndet stivelse 40 I

5 Opløselig kartoffelstivelse 40 H

Glutaminsyre 1,0 I

Arginin 0,168 H

Cystin 0,084 , I

Histidin 0,069 I

10 Leucin 0,798 I

Lysin 0,297 I

Methionin 0,108 I

Phenylalanin 0,168 I

Threonin 0,174 H

15 Tryptophan 0,048 I

Tyrosin 0,192 I

k2hpo4 1,0 I

MgS04-7H20 1,0

NaCl 1,0 I

20 CaC03 3,5 I

FeS04.7H20 0,01 I

MnCl2.4H20 0,001 I

ZnS04.7H20 0,001 I

25 I

pH indstilles til 6,8-7,0, og der omrøres i 30 minutter H

ved 121 °C I

I DK 175724 B1 i i WPM Syn B 40:40 q/L destilleret H20 Fortyndet stivelse 40 5 Opløselig kartoffelstivelse 40

Glutaminsyre 0,390

Arginin 0,168

Cystin 0,084

Histidin 0,069 10 Lysin HC1 0,297

Methionin 0,108

Phenylalanin 0,168

Threonin 0,174 I

Tryptophan 0,048 I

15 Tyrosin 0,192 I

K2HP04 1 I

MgS04.7H20 1 I

NaCl 1 I

CaC03 3, 5 I

20 FeS04.7H20 0, 01 I

MnCl2.4H20 0,001 I

ZnS04.7H20 0,001 I

pH indstilles til 6,8-7,0, og der omrøres i 30 minutter I

’ 25 ved 121 °C I

Almene højydelses-væskekromatografi-(HPLC)-procedurer I

Mobile fase: I

30 I

150 mL vand I

SDK 175724 B1

lents, Fullerton, I

kolbe og bringes kolbe og bringes fremstilling af .ilsat 800 yL mo- :r uden at forstyr- 53 DK 175724 B1 re pillen.

3. Tilsæt 100 pL HPLC-vand til pillen og hvirvl blandingen for at dispergere 4. Tilsæt 2 mL fortyndingsmiddel (D) og blandt godt 5 5. Filtrer blandingen og kør på HPLC.

De naturlige avermectiner blev underkastet denne HPLC-kromatografi-procedure, og retentionstiden af toppene af de individuelle avermectiner blev divideret med den iagt-10 tagende retentionstid for det tilstedeværende oligomycin A, der tjener som intern standard for en given HPLC-bestemmelse. Oligomycin A iagttages næsten altid ved HPLC som biprodukt af S. avermitilis forgæringer, og er det eneste produkt, der ses på HPLC produceret af de her be-15 skrevne mutanter, når de dyrkes i et medium frit for syrer RCOOH, hvor R har den tidligere angivne betydning, eller i medium frit for forbindelser, der er konvertible til syrer med formlen RCOOH, hvor R har den tidligere angivne betydning. Typisk er retentionstiden for oligomycin 20 A 12,5-14 minutter. Forholdet mellem retentionstiderne (RT) giver en mere signifikant basis for sammenligning af identiteten af udbytterne af avermectinprodukter. Den almene rækkefølge af forekomsten af avermectinprodukterne på HPLC er B2, A2, Bl og Al (fig. 2).

25

I DK 175724 B1 I

I I

I Naturligt RT/RT I

I avermectin (oligomycin A) I

I B2b 0,70 I

I 5 B2a 0,84 I

I A2b 0,90

I A2a 1,09 I

I Blb 1,40 I

Bla 1,83

I 10 Alb 1,83 I

I Ala 2,42

I Ikke-naturligt RT/RT I

I avermectin (oligomycin A) I

I 15 I

I cyclopentyl B2 0,94 I

I cyclopentyl A2 1,23 I

I cyclopentyl Bl 1,99 I

I cyclopentyl Al 2,62 I

I I

I Forholdene blev bestemt ud fra fig. 2 for de naturlige I

I avermectiner (bemærk at Bla og Alb er uadskilte) og ud I

fra fig. 3 for de ikke-naturlige avermectiner. Reten-

tionstiderne. varierer 1-2 minutter på forskellige dage, I

I 25 idet oligomycin A almindeligvis forekommer nær ved 12,5- I

I 14 minutter. I 1

I de følgende eksempler blev avermectinerne bestemt ved ! I

den ovenfor beskrevne HPLC-procedure. I

I 30 I

55 DK 175724 B1 EKSEMPEL 1

Cyclopentyl-avermectin A2 5 S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) blev dyrket ved 28-30 °C i AS-7-medium med rystning i 24 timer. En 5 mL portion blev anvendt til at pode en 500 mL kolbe indeholdende 100 mL AS-7-medium, og inkubationen udførtes under de samme betingelser i 24 timer. 1 mL af denne kultur anvendtes 10 til at pode AP-5-medium (40 mL i en 300 mL kolbe), hvortil der 24 timer senere sattes 0,4 g/L cyclopentancarbo-xylsyre (natriumsalt). Produktkolberne blev kørt med rystning ved 28-30 °C. Efter 240 timer var der produceret 35 mg/L cyclopentyl-avermectin A2, medens den tilsvarende 15 titer af naturligt A2a var 0. Der blev også produceret andre cyclopentyl-avermectiner.

EKSEMPEL 2 20 Cyclopentyl-avermectin Ά2

En frossen ampul med S. avermitilis HL-026 (ATCC 53568) blev anvendt til at pode 100 mL AS-7-medium i en 500 mL kolbe. Vækst ledsagede inkubation ved 28-30 °C med ryst-25 ning i 24 timer. En 1 mL aliquot blev anvendt til at pode to yderligere 500 mL kolber indeholdende 100 mL AS-7-medium, og de til sidstnævnte kolber blev efter 18 timers inkubation anvendt til at pode 10 liter AP-5-medium (mindre NaCl). Efter 24 timers inkubation ved 28 °C sattes I

30 0,4 g/L cyclopentancarboxylsyre til mediet. Omrøringen 1 var sådan, at opløst oxygen blev holdt over 20% af mæt-

I DK 175724 B1 I

I 56 I

I ning. Cyclopentyl A2 titerne ved 120, 168, 216, 264 og I

I 312 timer var henholdsvis 16, 40, 65, 88 og 110 mg/L. I I

I modsætning hertil var titeren af det tilsvarende naturli- I

I ge avermectin A2a 0 (dvs. ikke detekterbar) i disse prø- I

I 5 ver. I

I EKSEMPEL 3 I

Cyclopentyl-avermectin A2 I

I 10 I

I Ved dette forsøg var produktionsmediet beriget, og der I

foretoges flere tilsætninger af cyclopentancarboxylsyre I

for at forøge cyclopentyl-avermectin-titerne. Betingel- I

H serne for inoculum-udvikling og gæring var de samme som I

I 15 dem, der er beskrevet i eksempel 2, undtagen de følgende: I

der blev inkluderet yderligere 5 g/L "Ardamine pH" (til I

ialt 10 g/L) i AF-5-mediet, og der tilsattes 0,4, 0,2 og I

0,2 g/L cyclopentancarboxylsyre ved henholdsvis 30, 172 I

I og 220 timer. Titerne af cyclopentyl-avermectin A2 var I

I 20 1,2, 11, 78, 137 og 214 mg/L ved henholdsvis 120, 168, I

I 216, 264 og 312 timer. I

EKSEMPEL 4 I

25 Cyclopentyl-avermectiner I

H En frossen ampul med S. avermitilis HL-026 (ATCC 53568) I

H blev anvendt til at pode 100 mL AS-7-medium i en 500 mL I

kolbe med prelplader, som blev inkuberet i 24-28 timer I

H 30 ved 28-30 °C. Derpå anvendtes 1 mL af denne kultur til at I

pode en 300 mL kolbe indeholdende 40 mL AP-5-medium (min- I

I DK 175724 B1

dre NaCl, men plus 0,6 g/L glutaminsyre). Efter 96 timers inkubation ved 28-30 °C med rystning tilsattes 0,4 g/L cyclopentancarboxylsyre (natriumsalt). HPLC-kromatografi af en 216 timers prøve viste, at der var cyclopentyl-5 avermectiner B2, A2, Bl og Al tilstede med retentionsti- I

der på henholdsvis 12,32, 15,86, 25,28 og 32,95 minutter. I

EKSEMPEL 5 I

10 Cyclopentyl-avermectin A2 I

S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) og S. avermitilis HL-026 I

(ATCC 53568) blev dyrket under identiske betingelser. Der I

anvendtes 3 medier (AP-5, WPM Syn A 40:40 og WPM Syn B I

15 40:40). En frossen kultur af hver organisme blev anvendt I

til at pode 100 mL AS-7-medium i 500 mL kolber med I

prelplader, som derefter blev inkuberet i 24-26 timer ved I

28-30 °C. Derpå blev 1 mL af hver kultur anvendt til at I

pode 300 mL kolber, som hver indeholdt 40 mL af et af de I

20 tre medier. Der kørtes duplikater af hver kolbe. Efter 24 I

timers inkubation ved 28 med rystning modtog hver kol- I

be 0,4 g/L cyclopentancarboxylsyre (natrium salt), og ef- I

ter ialt 192 timers inkubation blev titerne af hovedpro- I

duktet, cylopentyl-avermectin A2, bestemt (Tabel I). I

25 I

PDK 175724 B1 , undta-:e efter :yclohe-HPLC-itiderne ar hen- j ~ I DK 175724 B1 59 EKSEMPEL 7 3-Cyclohexyl-avermectiner

5 Der blev arbejdet som beskrevet i eksempel 4, undtagen at I

der tilsattes 0,2 g/L 3-cyclohexancarboxylsyre efter 96 I

timer i stedet for cyclopentancarboxylsyre. Flere cyclo- I

hexenyl-avermectiner blev identificeret på HPLC- I

kromatogrammet af en 312 timers prøve. Deres reten- I

10 tionstider er henholdsvis 12,88 (B2), 16,39 (A2), I

27,37/28,36 (Bl-isomere) 35,80/37,13 (Al-isomere) min. I

EKSEMPEL 8 I

15 3-Thienyl-avermectiner I

Der blev arbejdet som beskrevet i eksempel 4, undtagen at I

der tilsattes 0,05 g/L thiophen-3-carboxylsyre efter 96 I

timer i stedet for cyclopentancarboxylsyre. 4 3-thienyl- I

20 avermectiner blev identificeret på HPLC-kromatogrammet af I

en 312 timers prøve. Retentionstiderne for 3-thienyl- I

avermectiner B2, A2, Bl og Al var henholdsvis 6,96, 8,76, I

13,8 og 23,5 min. I

25 EKSEMPEL 9 I

1-methylthioethyl-avermectiner I

Der blev arbejdet som beskrevet i eksempel 4, undtagen at I

30 der tilsattes 0,4 og 0,2 g/L 2-methylthiopropionsyre ef- I

ter henholdsvis 24 og 96 timer i stedet for cyclopentan- I

I DK 175724 B1

Η I

I 60

I carboxylsyre. 2 1-methylthioethyl-avermectiner blev iden- I

tificeret på HPLC-kromatogrammet af en 240 timers prøve. I

I Retentionstiderne for 3-thienyl-avermectiner A2 og Bl var I

henholdsvis 9,30 og 13,06 min. Toppen med en anslået re- I

I 5 tentionstid på omkring 7,2 min, som fremkommer på den I

I forreste skulder af 7,557 min toppen, antages at være B2- I

forbindelsen, og Al-forbindelsen antages at være under I

17,22 min toppen. I

I 10 EKSEMPEL 10 I

2-pentyl-avermectiner I

Der blev arbejdet som beskrevet i eksempel 4, undtagen at I

15 der tilsattes 0,2 g/L 2-methylvalerianesyre efter 96 ti- I

H mer i stedet for cyclopentancarboxylsyre. 4 2-pentyl- I

avermectiner blev identificeret på HPLC-kromatogrammet af I

en 312 timers prøve. Retentionstiderne for 2-pentyl- I

avermectin B2, A2, Bl og Al var henholdsvis 12,88, 16,58, I

20 31,90 og 41,92 min. I

EKSEMPEL 11

H l-methyl-3-butenyl-avermectiner I

I 25

Der blev arbejdet som beskrevet i eksempel 4, undtagen at I

der tilsattes 0,2 g/L 2-methyl-4-pentensyre efter 96 ti- I

mer i stedet for cyclopentancarboxylsyre. 4 l-methyl-3- I

butenyl-avermectiner blev identificeret på HPLC- I

30 kromatogrammet af en 312 timers prøve. Retentionstiderne I

i DK 175724 B1 61 for l-methyl-3-butenyl-avermectin B2, A2, Bl og Al var henholdsvis 11,13, 14,"78, 22,10 og 28,92 min.

EKSEMPEL 12 i 5 1-methyl-l-butenyl-avermectiner

Der blev arbejdet som beskrevet i eksempel 4, undtagen at der tilsattes 0,2 g/L 2-methyl-2-pentensyre efter 96 ti-10 mer i stedet for cyclopentancarboxylsyre. 4 l-methyl-2-butenyl-avermectiner blev identificeret på HPLC-kromatogrammet af en 312 timers prøve. Retentionstiderne for 1-methyl-l-butenyl-avermectin B2, A2, Bl og Al var henholdsvis 11,59, 14,93, 25,29 og 33,18 min.

15 EKSEMPEL 13 1 2 3 4 dette eksempel påvises anvendelsen af mutanten til at 2

fremstille de naturlige avermectiner afledt fra L-valin i 20 fravær af avermectinerne afledt fra L-isoleucin. Indholdet af en frossen ampul med S. avermitilis 1-3 {ATCC

3 53567) blev overført til en 500 mL kolbe med prelplader indeholdende 100 mL AS-7-medium. Efter tilnærmelsesvis 1 dag ved 28-30 °C med rystning (ca. 200 omdr./min) anvend-25 tes 1 mL af kulturen til at pode 40 mL WPM Syn A 40:40 i en 300 mL kolbe, som derefter blev inkuberet ved 28-30 °C i 24 timer under rystning. Ved dette tidspunkt tilsattes 4 mL af en sterilfiltreret opløsning af isosmørsyre (neutraliseret til pH 6-7 med NaOH), 4 mg/mL, og inkubationen 30 fortsattes som ovenfor i ialt 8 dage. HPLC-analyse viste 4 hovedtoppe, (udover oligomycin). (Ved lignende forsøg

I DK 175724 B1 I

I 62 I

med 2-methylsmørsyre i stedet for isosmørsyre sås de kom- I

I plementære 4 toppe af avermectiner afledt fra L- I

isoleucin). I

I 5 EKSEMPEL 14 | I

I i l

I Proceduren fra eksempel 1 blev gentaget, men under anven- I

I delse af de nedenfor anførte grundforbindelser i stedet | I for cyclopentancarboxylsyre. De avermectiner (forbindel- | I 10 ser med formlen I, hvori R2 er oleandrose-disaccharid- | I delen, og R, R1 og R3 er som vist), der blev identifice- | I ret fra en given forgæring, er også anført. | DK 175724 B1 i tO r- a\ r- co ro Or-t

<C tT>f—Ι^'Γ'-ΟΝ CM VO OD lD

CM oo ro iH <y o lD ro r^ro C ^ * - * - * * .. ^ *

•H^rOCNJCMCMfH OJ CM ΓΟ CM ,-H

O < >1 e O CD^r^iiOrOiiO^DOO ιΠ ir) C7> r* σ\ a> vd <r σ\ ^ p*· in 04cvj •h ^rvor-vot-ioina^uo »ho *—I » » · »* ·. «·, k ·> >. h ^

^ CM fH»—4 »H iH t—I iH r*H CM CN rH

E-*

CC Γ-ΟΓΟτΗ τΓ in ro vD in ro ro O

v. co σ\ ro cm es o m ro mo cm r~· ro E-> γμ o *h o vd r- σ» cm uo cri γμ r-

Pi « * » „ * v k ^ ^ k

rHf-< *-H O O o t—I ·—1 rH i-H O

U

X

p co *«r uo oo o vd in m *0 m o oo cm^dovo vo 0 æ o> r* r-* <n in N » * ^ >»>.«.«. «.

Cu CD Ή O O O O O o—i ri «—f O

ri m ^ £ >> >* u CO rj < C <u tn >, rH 0) o

^ II *H i—I I -H

CM C -I U >, .-H >, n .C

r—< I 0) >. >t U >i U I U

>rc x ι u c x a x .h ία; o<MrHso)(ua)ai> injj Λΐ >r λ α jc sz λ j:

CCIC OCMOOOOOU

U O) *HQ)3rHrHrHrHrH0) C α U-HU-iuuoUUg ® i >ix:i >,>>,>,>,1

a ·μ· uunuouuUrH

0) u >1 0) m m Ή >, >1 o> <n X u o) Q) φ >H 0) O >1 Sh 0> H a> kl >i ki 0> .Ω m >, u >, u >, x > MVl *-H Øl >ι M >r CO O Cl) 0) >i 10 >^HO)nrHW-HXlc

in co u X>WU>,rH>,klO

Hdic 0>:>,>,χ>,κιπ.Η 0) C 0) Xioinxoxooa TJIOI VXIUOXIOXII o C -H <Bki>i,Qki,QkirHki •H kl I O HJ X kl Id - kl (0 I α .Qou cuorouiouco

d-HC ieiJ3UCUCV-<H

oioo) xcNkic<ociox.c lw > α 0)1 <0 CO u <0 u 0) u

0) *—I iH .CCUUGXQ..C^H

•H >1 > 00)C30)0)0)0>r xjxiæ <Hx;. ioi3n.fix;-Hj3 iouu oanoooouu U0)0) >1 O 3rHrH<—IrH ί>ΐφ in έ 6 U HUouuuui dll 1 .C I >, >. >c >, I l

O cm cm HunuciuumcM

Ur c •rH <1) J3 in

kl H rH om n*rini£>r-codOiH

PS ^ ^

Uj Ό m o in o in ·«- CN CS»

I DK 175724 B1 I

H '1 H < cd

ro H

.^4 r-< H

I Z * M I

H g ^«^(Ot^VOr^^CVO V£) Η H

OiS'aOO'OTJOOO'DO H

.η οαιαιαιαίφφυια; 2 2 H .Eeeeeeee ε e

x λ: H

IOC0(0C0(O<^M(A <0 V) £_, ·Η ·Η Ή ·Η ·Η ·Η *»*4 *Η ♦·"* ·Η ^Β Η S 0>4JPPPPPPP> 4-> Ρ Η \ ro c c c c C c c c c c

B ν£>Φθ)Φ(ΐ)α)α)φ(ΐ> φ φ H

£É ».ΌΌΌΌΌΌΌΌ-Ό-Ό

^ O *ri -Η -Η ·Η -Η ·Η ·Η *H ·Η *H

Η I

^B Η ^Β 3 <η ^Β Ό ro ^Β Ο U”) Η Du QQ Ο

I

Η CD t—i η η I

Η «Η >ι ιΡ Μ >ι Ή >i*Hf—I »-4 Η C 1 X C Ρ G Ρ Ρ Ρ ^Β coo;roa»<uD<DD3 3 ΓΟ Η Η ι α ι χ ο, λ ο- .Q Λ λ Η ^Β c^cocoooooo ο c Η («η (DHHHHHH Η Φ Η .Ηυ-πυυυυυυ u ή J" £ λ IS ^ Is ^ «C Η Ϊ5υ.υυυυυυυ υ ρ Η Η ^Β Η ό 10 ε Η C > Φ ή ή ο Η φ to χ: α> ρ c ο >ι ι X Η ^Β μ ρ Φ u >< Φ C X — Ρ Η ^Β >, c Τ3 >1 to 4-) 4D Ο «Η Φ (oo>H(oc?ac ^> υ a)^ao3COOp-HPCc ^Β <η>,θ*Ρθ·ΗθΡ6<0θ Φ Η

rH Χι—I >ι Ή CL ·—I Qrfffl ΟΧ -C

ojouxcloui'HCp a

TI O >i O O >ι*0Φ O

^B CVjUXJPClUIXIPO -H H

^B .^j m ιΗ Si Q, ·—I «—I «-Η P 3 Ή X ^B

ft (J >1 flj Η ^ N (D i) ^ P I

u ,cu>>pxpeop(u i

0 <0 P C X C P CrH^ZJPfO

^B £ i a> <D φ φ φ a> > υ x >1 ^ p

^B <Dcl4=x:o.£a-u>tO(oi(O

-η <d & a o o>iO 5 u-h c<nc ^B O.CXO’H^X'H.OlOOlO - dj Q. O *H U O O O O Ή >»*H Ή ·Η

jj Q V( ' £ >i >i S Ή U CL O* I

u jc, >ii ><i >! p » ^ p p H

O^j^rororoxrootDcgCLQlQ,

H

-Η φ H

μ ,_| Oj (ft t ιΛ 'β f*“ 0D (Τι O «Η Μ H

H QQ),-H rH *—I »—i ιΗι-4ί-4τ^Γν)(Ν CM

Η Ό H

ίο O K5 O lO I

T- T- CM CSJ

I DK 175724 B1 ^ <r vo *£ CM rH ro m tn cm u < O ro to O' cm •Ή ON «—* •H ·» ·*

O - i—< i—I

w tu Φ ro

É-« CM

OC >· Η ΐί) ON tD CD

"s ♦—I os ro o ro H o rH n*· cm o fM ** » *»

ti »H T-l O fH rH

JJ

X

D <M CM fO CM

Ό rH oo <o o o cd co tn cd u o, ^ „ “i fr* ffl o o o o >1 o

i to o' -H

rr\ Ή >1 w υ I FH ^ I > ™ Ή >, >, 1 υ i i > i α o,

ι-l C rH I _| o O

>> O) ·-* >1 CNJ >iH H

·*= ·£ ^ λ ι ί=αα C- H) c Μ *J C jj 0 Ο 2>α>3<υα>α)<Η-Η ε α ·« ε·η gu υ ιι ι ι .c ι > >, Ή CM CS) ιΛ 4-> γΗΟ υ φ

U

0> >, η <η Η <η >, -η χ >1 ο X Λ ® ο μ u . S3 ια >, ι Η U I (η 0) C <0 0) ι c r-ί «15 U tj c» 10 >, 1 ή a c >1 i α x w o 0) wc o o

Ό M [ Ή Q> 14 ,Q

c α >. s: o. u ° · 1 x α o <o

S3 Ή Φ , u O O 01 U

UUHCX1-HOUC

Ή O W Q* Wjj u W Q. H

<0 4-> O -U 4-» 4J η O

^4>i30)34)<D^^i we^E'wggvfo n I *0 I i <D >>

O rH O <M CM lO rH υ U

lu

H

•Η Φ X> co Ή·—ICO ΤΓ lOVD r- CD ι

OCDCMCMCMCMCMCM I

lu Ό

H

lo o m j I

DK 175724 B1 I

66 I

Andre fysiske-kemiske data for visse af de ovennævnte I

forbindelser er angivet nedenfor. I

Forbin- I

5 delse Fysiske-kemiske data I

6 (A2) hvidt pulver; snip. 135-140 °C; molekylvægt = I

I 925; m/e 596, 454,321, 303, 275, 237, 219, I

I : 10 209, 191, 179, 167, 145, 127, 113, 111, 95 I

I og 87. I

I 6 (Al) hvidt pulver; smp. 120-124 °C; molekylvægt = I

907; m/e 578, 303, 275, 257, 219, 191, 167, I

I 15 145, 127, 113, 111, 95 og 87. I

6 (B2) hvidt pulver; smp. 110-112 °C; molekylvægt = I

I 911; m/e 321, 303, 261, 257, 237, 219, 209, I

H . 191, 179, 167, 145, 127, 113, 111, 95 og 87. I

I 20 I

6 (Bl) hvidt pulver; smp. 135-138 °C; molekylvægt = I

I 893; m/e 303, 261, 257, 219, 191, 167, 145, I

127, 113, 111, 95 og 87. I I

25 « 8 (A2) hvidt pulver; smp. 112-117 °C; molekylvægt = I

I 953; m/e 624, 482, 349, 349, 331, 275, 265, 247, 237, 219, 207, 195, 179, 145, 127, 113, 111, 95 og 87.

I DK 175724 B1

Forbindelse Fysiske-kemiske data 5 10 (A2) hvidt pulver; smp. 131-135 °C; molekylvægt = j 951 m/e 624, 480, 347, 329, 275, 263, 245, j 235, 217, 205, 193, 179, 145, 127, 113, 111, | 95 og 87.

10 12 (A2) hvidt pulver; smp. 167 °C; molekylvægt = 953; m/e 349, 331, 275, 265, 257, 247, 237, 219, 195, 145, 127, 113, 95 og 87. s

EKSEMPEL 15 I

15 I

Udvinding af cyclopentyl-avermectin A2 I

Dette eksempel anføres for at vise en udvindingsproces I

for de A2-lignende avermectiner, som dannes ud fra cyclo- I

20 pentancarboxylsyre-forstadiet. Hel væske (fra en forgæ- I

ring mage til dem i eksempel 2) blev filtreret, og myce- I

liecellemassen blev ekstraheret to gange med acetone (3 I

voluminer). Acetoneekstrakten blev koncentreret til en I

vandig olie, olien blev ekstraheret med methylenchlorid, I

25 og methylenchloridopløsningen blev koncentreret til en I

mørkebrun olie. Den mørkebrune olie blev derpå opløst i I

methanol/vand (4:1), og den resulterende opløsning eks- I

traheret med hexan for at fjerne fedtsyrer/lipider. Ind- I

dampning af methanol/vand-opløsningen gav en lysebrun I

30 olie indeholdende tilnærmelsesvis 10 vægt-% cyclopentyl- I

avermectin A2. Den rå avermectinolie blev derpå fortyndet I

I DK 175724 B1 I 68

I med chloroform (3 mL CHCI3 pr. g olie), der tilsattes ak- I

I tiv kul (0,35 g/g olie) og silicagel (1 g/g olie), og I

blandingen blev omrørt i 1 time og derpå filtreret. I

Filtratet blev koncentreret, og den resulterende olie I

I 5 blev fortyndet med isopropylether (1 mL isopropylether I

I pr. g olie). Den resulterende opløsning blev derpå grad- I

I vis dryppet ned i et stort volumen hexan (25 mL hexan/g | I

I olie), hvorpå der udfældedes et hvidt råt avermectinpul- I

I ver. Den første mængde blev isoleret ved filtrering, og I

I 10 filtratet blev derpå afkølet til omkring 5 °C for at ud- fælde en anden mængde.

I De rå mængder blev yderligere forarbejdet ved præparativ højydelses-væskekromatografi til opnåelse af renset pro- 15 dukt. Det rå materiale blev opløst (4,1 mL opløsningsmid- del pr. g råt pulver) i 25:25:25:50:0,125 isopropy- B lether/CH3CN/ethylacetat/hexan/eddikesyre. Prøver blev injiceret på en 41,4 mm x 25 cm præparativ silicakolonne B og elueret med det ovennævnte opløsningsmiddel med en B 20 strømningshastighed på 30 ml/min, og den produktholdige B top blev opsamlet. De opsamlede fraktioner blev koncen- B treret og fortyndet med methanol/vand (86:14), således at B en 1 mL indeholdt tilnærmelsesvis 50 mg produkt. Prøver B blev derpå injiceret på en præparativ Cie-kolonne (sammen H 25 dimensioner som silicakolonnen) og elueret ved en strøm- ningshastighed på 18-20 mL/min med methanol/vand (275 mL vand fyldt op til 2 liter med methanol. Fraktionerne blev igen koncentreret og sendt over den præparative Cj.8~ kolonne en anden gang. Inddampning af de produktholdige 30 fraktioner til tørhed gav det rene i overskriften angivne produkt.

DK 175724 B1 69

Det tilsvarende cyclopentyl-avermectin B2, Al og Bl udvindes ved opsamling af de passende fraktioner fra de ovenfor beskrevne HPLC-trin.

5 EKSEMPEL 16 i i S. avermectilis JC 923 (ATCC 53669) mycelium fra et YPD- i 2-agar-medium blev anvendt til at pode 50 mL AS-7-medium 10 i en 300 mL kolbe med prelplader, som blev holdt under omrystning (220 omdr./min) ved 30 °C i 2 4 timer. Der-påblev hver af to 300 mL kolber (uden prelplader) indeholdende 50 mL AP-5-medium podet med 1 mL af kulturen.

Den ene kolbe indeholdt 2-methylsmørsyre (0,1%) og den 15 anden 2-methylsmørsyre. Forgæringen blev udført ved 30 °C i 11 dage med rystning. Hver kolbes indhold blev oparbejdet på den samme måde. Hele væsken blev ekstraheret med det firedobbelte volumen af acetonitril/methanol (810:75). Efter kraftig rystning for at fremme antibioti-20 kumekstraktion fra cellerne, blev den klarede supernatant analyseret via HPLC for avermectiner. Når der ikke var tilsat noget fedtsyreforstadium, blev der ikke fundet nogen detekterbare avermectiner ("a"-type) (følsomhed _0,20 mg/L). I nærvær af 2-methylsmørsyre måltes avermectinerne 25 B2a, A2a, Bla, Ala til henholdsvis 0,5, 1,3, 1,4 og 1,1 mg/L.

EKSEMPEL 17 ~ ! 30 Der udførtes AP-5-produktionsgæringer af S. avermitilis JC 923 (ATCC 53669) ud fra AS-7-dyrkede podemedier som i

I DK 175724 B1 I

I 70 I

I eksempel 16. Forstadieforbindelsen 2-methylsmørsyre var I

I tilstede i en koncentration på 0,05%. I dette tilfælde I

gav den usupplerede kontrolgæring (intet fedtsyreforsta- I

I dium) værdier på 0,3, 0,9, <0,2 og <0,2 ml/L for avermec- I

5 tinerne B2a, A2a, Bla og Ala, medens resultaterne fra de I

fedtsyre-supplerede forgæringer var henholdsvis 2,8, 5,0, I

I 4,5 og 2,3 mg/L. I

I I

H

EKSEMPEL 18 I

I I

I Der udførtes AP-5-produktionsgæringer af S. avermitilis I

I JC 923 (ATCC 53669) ud fra AS-7-dyrkede podemedier som i I

I eksempel 17. I dette eksempel tilsattes 2-methylsmørsyre I

i en koncentration på 0,05% 48 timer efter podningen af I

15 AP-5-mediet, og cellerne blev høstet ved filtrering, ve- I

jet (våd vægt) og ekstraheret med et firedobbelt volumen I

af ekstraktionsopløsningsmiddel. Dette koncentreringstrin I

I muliggjorde større sensitivitet ved avermectintiter- j I

målinger i forhold til de tidligere tilfælde, hvorved he- ' I

20 le væsker blev direkte ekstraheret. I dette eksempel blev I

der bestemt niveauer af B2aa, A2a, Bla, Ala på2,5, 8,5, I

4,5 og 3,5 mg/L for den 2-methylsmørsyre-supplerede for- I

gæring sammenlignet med værdier på 0,3, 0,3, 0,3 og 0,1 I

for den usupplerede kontrol. Disse sidstnævnte lave ni- I

25 vauer skyldes antageligvis lave niveauer af endogene I

fedtsyreforbindelser i det rå AP-5-produktionsmedium. I

I EKSEMPEL 19 | -

30 Der udførtes forgæringer som i eksempel 18, undtagen at I

der anvendtes cyclopentancarboxylsyre i en koncentration I

I DK 175724 B1 på 0,045% i stedet for 2-methylsmørsyren. Cyclopentyl-avermectin A2 blev bestemt at være tilstede i en koncentration på 4 mg/L.

i 5 EKSEMPEL 20 \ Gæringer (16) af S. avermitilis PGS-119 (ATCC 53670) udførtes i 50 mL AP-5-medium i 300 mL kolber (ingen prelplader) inkuberet ved 30 °C. Mediet blev kodet med 1 10 mL af en 24 timers kultur af stammen i AS-7-medium, inku- i i bation ved 30 °C, 50 mL medium i 300 mL kolber med j

prelplader. Efter 66 timers vækst i AP-5-mediet tilsattes I

i isosmørsyre i en koncentration på 0,1% til 8 af kolberne. !

Under anvendelse af oparbejdningsproceduren fra eksempel i 15 16 gav disse supplerede kolber koncentrationer af B2b, A2b, Blb og Alb på (gennemsnit af to forsøg) henholdsvis 5,6, 45, 45 og 68 mg/L. De usupplerede kulturer gav vær- i dier på henholdsvis 0,5, 4,0, 4,5 og 8,5 mg/L. Desuden fandtes for den sidstnævnte forgærings vedkommende værdi-20 er på henholdsvis 1,1, 1,1, ubestemt og <0,2 mg/L for de tilsvarende B2a, A2a, Bla og Ala avermectiner.

EKSEMPEL 21 25 Der udførtes fire AP-5-gæringer af S. avermitilis PGS-119 (ATCC 53670) i 2 mL kulturer i plastikglas (15 mL) . Podemedier blev fremstillet som beskrevet i eksempel 20 i AS-7-medium ved 30 °C under omrystning af glassene holdt i en hældning på 300. Fedtsyreforstadiet cyclohexancarbo-30 xylsyre (CHC) sattes til 2 af glassene i en koncentration på 0,045% 96 timer efter AP-5-podningen. 400 timer efter

I DK 175724 B1 I

I 72 I

I AP-5-podningen med 0,05 mL af AS-7-kulturen sattes 8 mL I

I ekstrationsopløsningsmiddel (acetonitril/methanol I

(810:75)) til hvert glas, og avermectintitere blev be- I

I stemt i supernatanterne ved HPLC-analyse som beskrevet i I

I 5 teksten. For avermectinerne CHC-B2, CHC-A2, CHC-B1, CHC- I

I Al, A2b, Blb, Alb, A2b og Ala, var koncentrationerne lig I

I med (gennemsnit af to glas) henholdsvis 3,5, 6,2, 3,0, I

I 1,4, 0,2, 0,2, 0,4, 0,2, <0,2 mg/L. De tilsvarende værdi- I

er for de to forgæringsglas, som ikke modtog nogen for- I

I 10 stadiesyre, var henholdsvis <0,2, <0,2, <0,2, <0,2, 4,2, I

I 2,9, 9,3, 1,2, 0,3 mg/L. Alle andre naturlige avermecti- I

ner var i hovedsagen udetekterbare. I

Claims (16)

1. Streptomyces avermitilis stamme, kendetegnet ved, at den mangler en af eller begge de følgende 5 aktiviteter: forgrenet-2-oxosyre-dehydrogenase karakterise- i ret ved manglende evne hos permeabiliserede celler deraf til at producere 14C02 ud fra tilsat [14C-l]-2-oxoisocapronsyre, og 10 forgrenet-aminosyre-transaminase karakteriseret ved manglende evne til at vokse på medier, som mangler L-isoleucin, L-leucin og L-valin.

2. Stamme ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 15 den mangler forgrenet-2-oxosyre-dehydrogenase-aktivitet karakteriseret ved manglende evne hos permeabiliserede celler deraf til at producere 14C02 ud fra tilsat [14C-1] -2-oxoisocapronsyre.

3. Stamme ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den har identificeriseringsegenskaberne af ATCC 53567 eller ATCC 53568.

4. Stamme ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 25 den mangler forgrenet-aminosyre-transaminase-aktivitet karakteriseret ved manglende evne til at vokse på medier, som mangler L-isoleucin, L-leucin og L-valin. I DK 175724 B1 I I 74 I

5. Stamme ifølge krav 1, kendetegnet ved, at I den har identificeringsegenskaberne af ATCC 53669 eller I I ATCC 53670. I

56. Stamme ifølge krav 1, kendetegnet ved, mang- I lende evne til at producere substans C-076 ved gæring i I I et vandigt næringsmedium omfattende en assimilerbar kilde I I til carbon, nitrogen og uorganiske salte under aerobe be- I tingelser, når mediet er i det væsentlige frit for en sy- I 10 re med formlen I I R-COOH, I I Eller en forbindelse som kan omdannes til nævnte syre af I I 15 S. avermitilis, hvori R betyder isopropyl eller (S)-sec- I I butyl, men er i stand til at producere C-076 ved gæring i I I et sådant medium, hvor nævnte medium indeholder en syre I med formlen RCOOH, eller en forbindelse som kan omdannes I til nvænte. syre af S. avermi tilis, hvor R er isopropyl el- I I 20 ler (S)-sec-butyl. I

7. Stamme ifølge krav 6, kendetegnet ved, at I den er ATCC 53567, ATCC 53568, ATCC 53669 eller ATCC I 53670. I I 25 I

8. Fremgangsmåde til fremstilling af en avermectin, k e η I I detegnet ved, at fremgangsmåden omfatter aerob I forgæring med en Stréptomyces avermitilis stamme, som I mangler en eller begge af forgrenet 2-oxosyre dehydroge- ’ I 30 naseaktivitet og forgrenet aminosyre transaminaseaktivi- I tet ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 7, et I ___ —— s DK 175724 B1 ! vandigt næringsmedium omfattende en assimilerbar kilde til nitrogen, carbon og uorganiske salte og en forbindel- ί se, som kan udnyttes i biosyntesen af en avermectin.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at forbindelsen, som kan udnyttes i biosyntesen af | en avermectin, er en syre med formlen i i R-COOH 10 hvori R er forskellig fra isopropyl eller (S)-sec-butyl, eller en forbindelse, som kan omdannes til den nævnte syre af S. avermitilis.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at S. avermitilis har identificeringsegenskaberne af ATCC 53567, ATCC 53568, ATCC 53669 eller ATCC 53670.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet 20 ved, at forbindelsen har formlen R'-C00H hvori R' betyder en or-forgrenet gruppe, hvori det car-25 bonatom, som er knyttet til -C00H, også er knyttet til ' mindst to andre atomer eller grupper forskellige fra hydrogen, eller er en forbindelse, som kan omdannes til den nævnte forbindelse under gæringsprocessen. i 30 12. Fremgangsmåde ifølge krav 11 kendetegnet ved, at R' betyder en α-forgrenet (C3-C8) alkyl-, alke- I DK 175724 B1 I I 76 I I nyl-, alkynyl-, alkoxyalkyl- eller alkylthioalkyl-gruppe, I I en (C5-Ce) cycloalkylalkyl-gruppe, hvori alkylgruppen er I I en α-forgrenet (C2-C5)alkylgruppe, eller en (C3- I C8)cycloalkyl- eller (Cj-Ce)cycloalkenylgruppe, hvilke I I 5 grupper eventuelt kan være substitueret med methylen el- I I ler en eller flere (C1-C4) alkylgrupper eller halogenato- I I mer, eller en 3- til 6-leddet oxygen- eller svovlholdig I heterocyclisk ring, som kan være mættet eller helt eller I delvis umættet, og som eventuelt er substitueret med en I I 10 eller flere (C1-C4)alkylgrupper eller halogenatomer eller I en forbindelse som kan konverteres til den nævnte forbin- I delse under gæringsprocessen. I il m

13. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet I 15 ved, at forbindelsen, som kan omdannes til R'COOH, er I I R'-(CH2)n-Z I hvori R' har den ovenfor angivne betydning, n er 0, 2, 4 I 20 eller 6, og Z er -CH20H, -CHO, -COOR5, -CH2NH2 eller I -CONHR6, hvor R5 er H eller (Ci-e)alkyl, R6 er hydrogen, I (Ci_4) alkyl, -CH (COOH) CH2C00H, -CH (COOH) (CH2) COOH eller - I H CH (COOH) (CH2) 2SCH3, eller når stammen af S. avermitilis I kun mangler forgrenet-aminosyre-transaminase-aktivitet, ! I H 25 kan forbindelsen R'-CO-Z omdannes til substrat R'COOH. I

14. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet I H ved, at R' er I H cyclobutyl I 30 cyclopentyl I cyclohexyl I DK 175724 B1 cycloheptyl 2- metnylcyclopropyi 3- cyclohexenyl 1-cyclopentenyl 5 1-cyclohexenyl 3- methylcyclohexyl (cis/trans) 4- methylencyclohexyl 3-methylcyclobutyl 3-methylencyclobutyl 10 3-cyclopentenyl 1- cyclopropylethyl 3-fluorcyclobutyl 4,4-difluorcyclohexyl isopropyl 15 sec-butyl 2- pentyl 2,3-dimethylpropyl 2-hexyl 2-pent-4-enyl 20 2-methylthioethyl 5- 2-methylpentyl R-2-methylpentyl 2- thienyl i 3- thienyl 25 4-tetrahydropyranyl 3-furyl 2- chiorthienyl 3- tetrahydrothienyl 4- methylthio-2-butyl 30 4-tetrahydrothiopyranyl 4-methoxy-2-butyl eller : I DK 175724 B1 I I I I 4-methylthio-2-butyl. I

15. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet I I ved, at R' er cyclopentyl, cyclohexyl eller thienyl. I I 5 i

16. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet I I ved, at R, når den er en α-forgrenet (C3-Ce) alkylgruppe, I ikke er isopropyl eller (S)-sec-butyl I I 10 17. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet I I ved, at stammen af S. avermitilis er S. avermitilis ATCC I I 53567, ATCC 53568, ATCC 53669 eller ATCC 53670. I

18. Stamme af slægten Streptomyces kendetegnet I I 15 ved, at den ikke producerer noget C-076 under fermente- I ring i et vandigt næringsmedium omfattende en assimlier- I I bar kilde til carbon, nitrogen og uorganiske salte under ' I I aerobe betingelser, når mediet i det væsentlige er frit I I for en syre af formlen I I 20 I I R-COOH, I Eller en forbindelse som kan omdannes til den nævnte syre I I af S. avermitilis, hvor R er isopropyl eller (S-)-sec- I I 25 butyl men er i stand til at producere C-076 ved fermente- " I I ring i det nævnte medium, når mediet indeholder en syre I I af formlen RCOOH, eller en forbindelse, som kan omdannes I I til syren af S. avermitilis, hvor R er isopropyl eller I (S)-sec-butyl, hvor nævnte stamme kan opnås ved en frem- I 30 gangsmåde som omfatter at mutere Streptomyces avermitilis I ATCC 31271, ATCC 31272 eller mutanter deraf og udvælge I DK 175724 B1 stammer som er karakteriseret ved manglende evne hos per-meabiliserede celler deraf til at producere 14C02 ud fra tilsat [14C-1]-2-oxoisocapronsyre og/eller manglende evne til at vokse på medier, som mangler L-isoleucin, L-leucin 5 og L-valin.