FI90087B - Foerfarande foer framstaellning av avermektiner samt vid detta foerfarande anvaendbara streptomyces avermitilis -stammar - Google Patents
Foerfarande foer framstaellning av avermektiner samt vid detta foerfarande anvaendbara streptomyces avermitilis -stammar Download PDFInfo
- Publication number
- FI90087B FI90087B FI880279A FI880279A FI90087B FI 90087 B FI90087 B FI 90087B FI 880279 A FI880279 A FI 880279A FI 880279 A FI880279 A FI 880279A FI 90087 B FI90087 B FI 90087B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- atcc
- branched
- acid
- avermitilis
- avermectins
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/01—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing oxygen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
- A01N43/90—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having two or more relevant hetero rings, condensed among themselves or with a common carbocyclic ring system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/10—Anthelmintics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
- C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
- C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin
- C12P19/623—Avermectin; Milbemycin; Ivermectin; C-076
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/465—Streptomyces
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
1 90087
Menetelmä avermektiinien valmistamiseksi, sekä siinä tarvittavat Streptomyces avermitilis -kannat i
Esillä oleva keksintö koskee Streptomyces avermi-5 tilis -kantoja, joilta puuttuu haarautuneiden aminohappojen transaminaasiaktiivisuus ja/tai haarautuneen 2-oksi-hapon dehydrogenaasiaktiivisuus ja menetelmiä luonnollisten ja ei-luonnollisten avermektiinien tuottamiseksi näiden S. avermitilis -kantojen avulla.
10 US-patenttijulkaisuissa 4 310 519 ja 4 429 042 ku vataan avermektiinejä, tehokkaiden parasiittien vastaisten aineiden kokonaisuutta, sekä näiden tuottamista Streptomyces avermitilis -kantojen, so. S. avermitilisin ATCC 31 267, 31 271 ja 31 272, aerobisen fermentoinnin avulla.
15 Viimeksi mainitut kaksi kantaa ovat pakastetussa putkessa ja vastaavasti lyofilisoidussa putkessa ja kummatkin on aikaansaatu ultraviolettisäteilyttämällä S. avermitilisia ATCC 31 267.
16.7.1986 jätettyä US-patenttihakemusta 886 867 20 vastaavassa EP-julkaisussa 214 731, julkaistu 18.3.1987, esitetään useita luonnollisten tai tunnettujen avermektiinien sukulaisyhdisteitä (tästedes ei-luonnolliset avermek-tiinit), joissa on uusi ryhmä asemassa 25, sekä menetelmää näiden tuottamiseksi fermentoimalla avermektiinia tuotta-25 vaa organismia määrättyjen, määritettyjen karboksyylihap-pojen tai näiden johdannaisten tai prekursoreiden läsnäollessa. Sanottujen uusien, 25-substituoitujen avermektiinien tuottamisessa käytetyt S. avermitilis -organismit ovat S. avermitilis ATCC 31 267, 31 271, 31 272 ja NCIB 12 30 121. Viimeksi mainittu, EP-julkaisussa 214 731 kuvattu organismi on johdettu kannasta S. avermitilis ATCC 31 271. Tämä antaa parannetun saannon uutta, C-25-substituoitua avermektiiniä, kun sitä viljellään puolisynteettisellä alustalla. Sekä ATCC 31 267, 31 271, 31 272 että NCIB 12 35 121 voivat myös uuden, C-25-substituoidun johdannaisen 2 9 o 9 8 7 lisäksi tuottaa vaihtelevia määriä tunnettua, tai luonnollista, avermektiiniä, jossa 25-ryhmä on isopropyyli tai (S)-sek-butyyli (1-metyyli-propyyli).
Avermektiinien hiilirunko [esitetty alla olevassa 5 kaavassa (I)] on johdettu asetaateista ja propionaateista ja luonnollisten avermektiinien C-25 substituentti L-iso-leusiinista [R on (S)-sek-butyyli)] tai L-valiinista (R on isopropyyli) [Fisher ja Mrozik, "Macrolide Antibiotics", Academic Press (1984) luku 14].
10 "Tunnetuilla" tai "luonnollisilla" avermektiineillä tarkoitetaan S. avermitilis -kantojen ATCC 31 267, ATCC 31 271 ja ATCC 31 272 tuottamia avermektiinejä, joissa subs-tituenttiryhmä 25-asemassa on joko isopropyyli tai (S)-sek-butyyli (1-metyyli-propyyli). Avermektiinit, joissa 15 25-aseman substituentti on muu kuin isopropyyli tai sek-butyyli (S-muoto), kutsutaan tästedes uusiksi tai ei-luon-nollisiksi avermektiineiksi.
Yllä mainituissa US-patenteissa esitetyt S. avermitilis -kannat tuottavat ryhmän aineita, jota niissä kutsu-20 taan yleisnimellä C-076. Tässä ryhmässä on kahdeksan erillistä mutta läheisesti toisiinsa liittyvää yhdistettä, C-076 Ala, Alb, A2a, A2b, Bla, Blb, B2a ja B2b. Yhdisteiden "a"-sarjat ovat luonnollisia avermektiinejä, joissa 25-substituentti on (S)-sek-butyyli ja "b"-sarjat ovat 25 avermektiinit, joissa 25-substituentti on isopropyyli. Merkintä "A" ja "B" tarkoittaa avermektiiniä, jossa 5-substituentti on metoksi tai vastaavasti hydroksi. Lopuksi numero "1" tarkoittaa avermektiiniä, jossa 22 - 23-asemas-sa on kaksoissidos; ja numero "2" avermektiiniä, jossa 22-30 asemassa on vety ja 23-asemassa on hydroksi.
Tässä selitysosassa ei käytetä tämänkaltaisia tunnisteita luonnollisten avermektiinien 25-substituentin suhteen. Tunnisteet Ai, A2, B1 ja B2 esiintyvät ja tarkoittavat ei-luonnollisia, joilla on yllä mainittuja luon-35 nollisia avermektiinejä vastaavat rakenteelliset ominaisuudet.
3 y O - 8 7
Bacillus subtilisilla [Willecke ja Pardee, J. Biol. Chem. 246 (1971) 5264 - 5272] ja Pseudomonas putidalla [Martin et ai., J. Bacteriology, 115 (1973) 198 - 204] on raportoitu mutanttien muodostumista, joilta haarautuneen 5 alfa-ketohapon dehydrogenaasiaktiivisuus puuttuu, muttei
Steptomyces i11a.
Schulman et ai., J. Antibiot. 38(11) (1985) 1494 -1498, on esittänyt mutanttikannan, S. avermitilis Agly-1, joka tuottaa käytännöllisesti katsoen vain aglykoniaver-10 mektiinejä Ala ja A2a. On myös esitetty S. avermitilis Agly-1 -kannan fermentointia sinefungiinin läsnäollessa, jolloin aglykoniavermektiini-B-yhdisteiden tuotanto lisääntyi. Samaten runsaasti avermektiinejä tuottavan S. avermitilis 08 -kannan fermentointi O-metyylitransfe-15 raasin inhibiittorin, sinefungiinin, läsnäollessa tuotti avermektiinejä, joista O-metyyliryhmät puuttuivat aglyko-nien C-5 -asemasta ja oleandroosin disakkaridiosasta.
US-patentti 4 378 353 esittää C-076 -sukulaisyhdis-teitä sekä näiden valmistamista viljelemällä S. avermiti-20 lis ATCC 31 272:n mutanttikantaa MA-5 218:aa, joka saadaan säteilyttämällä UV-valolla. Mutanttia kutsutaan ATCC 31 780:ksi. Tämän mutanttikannan tuottamista C076:n sukulais-yhdisteistä puuttuu C-076:n furaanirengas. Lisäksi joissakin esitetyissä yhdisteissä joko toinen tai molemmat 25 oleandroosisokeriosat on pilkottu, kun taas toisissa 5-aseman ryhmä on hapetettu ketoryhmäksi.
Ruby et ai., 6th International Symposium on the "Biology of Actinomycetes", Debrecen, Unkari, 26. - 30.8. 1985, ja Schulman et ai., Antimicrobial Agents and Chemo-30 therapy 31 (1987) 744 - 747, ovat esittäneet kolme ryhmää S. avermitilisin O-metyylitransferaasimutantteja, jotka tuottavat avermektiinejä, joista O-metyyliryhmät puuttu vat. Ensimmäinen ryhmä tuottaa pääosin B-avermektiinejä, koska nämä eivät pysty metyloimaan makrosyklisen laktoni-35 renkaan C-5-hydroksyyliä. Toinen ryhmä tuottaa 3'-0,3"-0- 4 9 0 0 8 7 bis-demetyyliavermektiinejä (avermektiinejä, joiden kummastakin oleandroosimonosakkaridijäännöksestä puuttuu 0-metyyli-substituentti 3-asemassa), joita kutsutaan deme-tyyliavermektiineiksi. Kolmas ryhmä ei pysty metyloimaan 5 missään asemassa.
Julkaisussa Schulman et ai.. Fed. Proc. 44 (1985) 931 esitetään parannettu B-avermektiinituotanto fermentoi-malla S. avermitilis -kantaa sinefungiinin, S-adenosyyli-tioniinin ja S-adenosyylihomokysteiinin kaltaisten yhdis-10 teiden läsnäollessa, jotka inhiboivat aglykooniryhmän C-5-hydroksiryhmän metylointia avermektiinin B-O-metyyli-transferaasientsyymin avulla. Steptomyces avermitilis -mutantteja, joilta O-metyylitransferaasiaktiivisuus puuttuu ja jotka tuottavat kohonneita määriä B-avermektiini-15 yhdisteitä on myös esitetty julkaisussa Schulman et ai., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 29 (1986) 620 - 624).
Myös suomalaisessa patenttihakemusjulkaisussa 863 065 ja suomalaisessapatenttijulkaisussa 57 781 kuvataan 20 menetelmiä luonnollisten avermektiinien ja avermektiini- johdannaisten valmistamiseksi.
Esillä oleva keksintö koskee Streptomyces avermitilis -kantaa, ATCC 53 670, jolta puuttuu haarautuneen 2-oksihapon dehydrogenaasi- ja haarautuneen aminohapon . 25 transaminaasiaktiivisuus, Streptomyces avermitilis -kan taa, ATCC 53 567 tai 53 568, jolta puuttuu haarautuneen 2-oksihapon dehydrogenaasiaktiivisuus, sekä Streptomyces avermitilis -kantaa ATCC 53 669, jolta puuttuu haarautuneen aminohapon transaminaasiaktiivisuus.
30 Keksinnön mukaiset mutantit, joilta puuttuu haarau tuneen 2-oksihapon dehydrogenaasiaktiivisuus tai haarautuneen aminohapon transaminaasiaktiivisuus, saadaan S. aver-mitilisista. Mutagenoimalla täten tuotettuja yksittäis-blokattuja mutantteja saadaan mutantteja, joilta puuttuu 35 sekä haarautuneen 2-oksihapon dehydrogenaasiaktiivisuus 5 :> 0 0 8 7 että haarautuneen aminohapon transaminaasiaktiivisuus. Näillä mutanteilla ei enää ole kykyä tuottaa huomattavia määriä luonnollisia avermektiinejä lisätyn R-COOH-yhdis-teen, jossa R on isopropyyli tai (S)-sek-butyyli, tai fer-5 mentointiprosessin aikana R-COOH:ksi muuttuvan yhdisteen puuttuessa. Yllättävästi ja odottamattomasti on kuitenkin todettu, että nämä mutantit tuottavat luonnollisia ja ei-luonnollisia avermektiinejä, jos fermentointi suoritetaan lisätyn R-COOH-yhdisteen, jossa R on isopropyyli tai (S)-10 sek-butyyli, tai R-COOH-yhdisteen prekursorin läsnäolles sa. On vielä yllättävämpää, että tässä esitetyt mutantit, joilta puuttuu vain haarautuneen 2-oksihapon dehydrogenaa-siaktiivuus, ja jotka eivät pysty hajoittamaan L-isoleu-siinia tai L-valiinia, pystyvät assimiloimaan laajan yh~ 15 disteryhmän avermektiinien biosynteesireittiin, jolloin muodostuu ei-luonnollisia avermektiinejä, joiden seassa ei ole luonnollisia avermektiinejä.
Vähintään yhtä yllättävä on löytö, että tässä esitetyt mutantit, joilta puuttuu haarautuneen aminohapon 20 transaminaasiaktiivisuus ja jotka eivät pysty hajoittamaan L-isoleusiinia, L-leusiinia tai L-valiinia ja jotka vaativat näitä kolmea aminohappoa kasvaakseen, pystyvät assimiloimaan muita yhdisteitä tuottaakseen ei-luonnollisia avermektiinejä, joiden seassa ei ole luonnollisia 25 avermektiinejä.
Luonnolliset avermektiinit tuotetaan, kuten on mainittu, kompleksisena kahdeksan erillisen mutta läheisesti toisiinsa liittyvän yhdisteen seoksena; kaava I, R on isopropyyli ja ( S)-sek-butyyli. Vaikka niitä onkin saatu tal-30 teen pääosin puhtaissa muodoissa (katso US-patentti 4 429 042), tämä menetelmä on parhaimmillaankin työläs. Ei-luon-nollisten avermektiinien tuottaminen EP-julkaisun 214 731 mukaista menetelmää käyttäen voi myös johtaa joidenkin luonnollisten avermektiinien muodostumiseen vaihtelevina - 35 määrinä, mikä johtuu haarautuneen 2-oksihapon dehydroge- 6 -9087 naasin ja L-valiinin ja L-isoleusiinin läsnäolosta tuottamisessa käytetyn S. avermitilis -mikro-organismin solussa.
Mahdollisuus valita, tuotetaanko luonnollisia tai 5 ei-luonnollisia avermektiinejä, jolloin tuotteiden määrä ja kompleksisuus minimoidaan ja täten nostetaan valitun avermektiinin puhtautta, jolloin erotusmenetelmät yksinkertaistuvat, on haluttu päämäärä.
S-avertimilis -kantoja, joilta puuttuu haarautuneen 10 2-oksihapon dehydrogenaasiaktiivisuus tai haarautuneen aminohapon transaminaasiaktiivisuus, tuotetaan mutatoimal-la avermektiiniä tuottavia S. avermitilis -kantoja ja erityisesti mutatoimalla S. avermitilis -kantoja ATCC 31 267, ATCC 31 271, ATCC 31 272 tai NCIB 12 121. Mutatoimalla 15 edelleen jokin sanotuista negatiivisista kannoista saadaan kantoja joista molemmat aktiivisuudet puuttuvat. Mutantit eivät pysty syntetisoimaan luonnollisia avermektiinejä, paitsi jos fermentointialustaan lisätään rasvahappoa tai sen prekursoria, jossa on isopropyyli tai sek-butyyli 20 (S-muoto). Ne pystyvät tuottamaan luonnollisia ja ei-luonnollisia avermektiinejä, jos niitä fermentoidaan aerobisissa olosuhteissa vesipohjaisessa viljelyalustassa, jossa on asianomainen lähtöhappo tai fermentointiprosessissa täksi muuttuva yhdiste.
25 Mutantit, joille haarautuneen 2-oksihapon dehydro- genaasiaktiivisuuden puute on tunnusomaista, voidaan eristää mutagenoiduista pesäkkeistä 14C02-menetelmää käyttäen. Tässä menetelmässä 14C02:n muodostumisen puute permeabili-soidussa pesäkkeessä substraatin ollessa [14C-1]-2-oksi-30 isokapronihappoa tai [ 14C—1]-2-oksi-3-metyylivaleriaana-happoa tai [14C-1]-2-oksi-3-metyylivoihappoa on osoitus haarautuneen 2-oksihapon dehydrogenaasin puutteesta.
Ne mutantit, joille aminohappotransaminaasiaktiivi-suuden puute on tunnusomaista, voidaan valikoida mutage-'35 noiduista pesäkkeistä sen perusteella, etteivät ne pysty Ο ;"ι Q 7 7 - ' Z- / kasvamaan L-isoleusiinia, L-leusiinia ja L-valiinia sisältämättömällä alustalla. Käytännössä yksittäisiä M9-suola-glukoosipohjaisella, kaikilla kasaminohapossa olevilla yksittäisillä aminohapoilla rikastetulla agar-alustalla 5 kasvavia pesäkkeitä siirretään vastaavalle alustalle, josta L-isoleusiini, L-leusiini ja L-valiini puuttuvat. Tässä esitetyt mutantit, joilta puuttuu vain haarautuneen aminohapon transferaasiaktiivisuus, pystyvät käyttämään 2-oksi-happoja prekursoreina tuottaessaan avermektiinejä.
10 Yllättävää ja odottamatonta oli se, että tässä esi tetyt mutantit, joista haarautuneen 2-oksihapon dehydroge-naasiaktiivisuus ja/tai haarautuneen aminohapon transami-naasiaktiivisuus puuttuvat, säilyttivät kyvyn tuottaa avermektiinejä, erityisesti ei-luonnollisia avermektiine-15 jä. Mutanttien kyvyttömyys tuottaa luonnollisia rasva-asyylikoentsyymi-A-johdannaisia, kun niitä viljellään tavanomaisilla alustoilla, olisi voinut muodostua letaalik-si mutaatioksi, mikäli membraanien koskemattomuus olisi riippuvainen sanotuista johdannaisista tai jos mutaation 20 aiheuttama 2-oksihapon akkumuloituminen johtaisi sytotok-sisuuteen. Ei myöskään ollut odotettavissa, että kumpikaan mutantti olisi pystynyt syntetisoimaan asetyyli-CoA:ta ja propionyyli-CoA:ta L-isoleusiinista ja L-valiinista degra-datiivisen metabolian avulla, koska tämä vaatii entsyymi-.25 aktiivisuutta, joka mutanteilta puuttuu. Näiden asyyli-CoA-johdannaisten yllä mainittu tarve avermektiinibiosyn-teesissä johti siihen olettamukseen, että mutantit olisivat pahasti toimintakyvyttömiä ei-luonnollisten avermek-tiinien tuotannon suhteen, mikä yllättävästi ei kuitenkaan 30 pitänyt paikkaansa.
Keksinnön mukaisten mutanttien haarautuneen 2-oksihapon dehydrogenaasiaktiivisuuden puute johtaa siihen, että haarautuneen rasva-asyyli-CoA:n synteesi L-isoleusii-nin, L-leusiinin ja L-valiinin hajotuksessa estyy, jol-35 loin myös luonnollisten avermektiinien synteesi estyy.
β 90087
Samaten haarautuneen aminohapon transaminaasinegatiivisil-la S. avermitilis -mutanteilla on myös tämän haarautuneen rasva-asyyli-CoA:n synteesin puute, eivätkä ne siksi pysty tuottamaan luonnollisia avermektiinejä. Rasva-asyyli-CoA:n 5 puutteeseen on kaksi syytä. Ensiksi, tämänkaltaiset trans-aminaasinegatiiviset mutantit eivät pysty syntetisoimaan haarautuneita 2-oksihappoja alustassa olevasta isoleusii-nista, leusiinista ja valiinista käyttäen normaalia trans-aminaatiotietä. Toiseksi, haarautuneen 2-oksihapon tuotan-10 to solun haarautuneen aminohapon biosynteettistä tietä käyttäen on näissä transaminaasimutanteissa estynyt, koska näitä aminohappoja on lisättävä fermentoinnin kasvatus-alustaan. Näiden aminohappojen läsnäolo estää tämän bio-synteettisen reitin käyttöä (ja täten välituotteen, 2-ok-15 sihapon, tuottamista) aminohappolopputuotteiden välityk sellä hyvin tunnettujen entsyymirepressiomekanismien ja takaisinkytketyn inhibition kautta. Näiden 2-oksihappojen, jotka ovat aktiivisten, haarautuneiden, 2-oksihappojen de-hydrogenaasientsyymien substraatteja, puuttuminen estää 20 tehokkaasti haarautuneen rasva-asyyli-CoA:n synteesiä.
Täten esillä oleva keksintö käsittää myös tämänkaltaisten 2-oksihappodehydrogenaasinegatiivisten ja transaminaasine-gatiivisten mutanttien käytön, sekä sellaisten mutanttien käytön, joissa on sekä transaminaasinegatiivinen että 2-. 25 oksihappodehydrogenaasinegatiivinen mutaatio.
Käsitteitä "avermektiini" tai "avermektiinit" käytetään tässä tarkoittaen kaavan I mukaisia yhdisteitä, joissa 25-substituentti (R) voi olla ryhmä, jota esillä olevan keksinnön mukainen S. avermitilis assimiloi sano-30 tussa asemassa.
Esillä olevan keksinnön mukaiset mutantit ovat hyvin arvokkaita ei-luonnollisten avermektiinien tuottamisessa käyttäen tässä esitettyjä ja kuvattuja menetelmiä. Ne ovat erityisen arvokkaita, kun tuotetaan haluttuja 35 avermektiinejä, s.o. yhdisteitä, joissa C-25-substituentti 9 90087 on C1.4-alkyyliryhmällä mahdollisesti substituoitu C4.6-syk-loalkyyli tai sykloalkenyyli, 1-metyylitioetyyli tai 5-tai 6-atominen happea tai rikkiä sisältävä heterosyklinen ryhmä, erityisesti 3-tienyyli tai 3-furyyli.
5 Streptomyces avermitilis -lajin avermektiiniä tuottavan organismin mutaatio suoritetaan tunnettujen menetelmien mukaisesti käyttäen mitä tahansa useista mahdollisista mutaation aiheuttajista, kuten UV-säteilytys, röntgensäteilytys, N-metyyli-N'-nitrosoguanidiini, etyyli-10 metaanisulfonaatti, typpihapoke ja typpisinapit, kuten N-metyyli-bis-(2-kloorietyyliJämiini, tai vastaavia käsittelyjä. Mutageneesi voidaan suorittaa käyttäen itiöitä tai vegetatiivisia S. avermitilis -viljelmiä, jotka pystyvät tuottamaan luonnollisia avermektiinejä, esim. S. avermiti-15 lisiä ATCC 31 272.
Käyttäen menetelmiä, jotka alan asiantuntijat hyvin tuntevat, mutagenoidut pesäkkeet valikoidaan haarautuneen 2- oksihappodehydrogenaasin puutteen perusteella käyttäen biokemiallista testimenetelmää, joka mahdollistaa suuren, 20 sattumanvaraisesti mutagenoidun bakteeripesäkemäärän seu lonnan [14C-1]-2-oksihapoista peräisin olevan 14C02-tuotan-non suhteen [Tabor et ai., J. Bact. 128 (1976) 485 - 486].
Menetelmässä mutanttipesäkkeitä viljellään mikro-tiitterilevyn kuopissa sopivassa ravintoalustassa, solut .25 permeabilisoidaan tolueenilla, minkä jälkeen lisätään [14C-1]-2-oksihappoa (esim. 2-oksi-isokapronihappoa) jokaiseen kuoppaan ja tarkistetaan mahdollinen 14C02:n fer-mentointi. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää [14C-1]-2-oksi- 3- metyylivaleriaanahappoa tai [14C-1]-2-oksi-3-metyylivoi- 30 happoa [14C-1]-2-oksi-isokapronihapon tilalla. 14C02-muo- dostuminen voidaan yksinkertaisesti tarkistaa sijoittamalla kostea, Ba(0H)2:lla kyllästetty suodatinpaperi jokaisen kuopan yläpuolelle, jotta mahdollisesti vapautunut 14C02 jää sen alle, ja mahdollinen Ba14C03 detektoidaan autora-35 diografian avulla. Mutantit, joilta haarautuneen 2-oksi- 10 90087 hapon dehydrogenaasiaktiivisuus puuttuu, antavat autora-diogrammin joka vastaa tyhjäkontrollin autoradiogrammia; s. o. mutant it eivät tuota Ba14C03:a.
Täten saadut mutantit alistetaan toiseen mutagenee-5 siin, käyttäen mitä tahansa yllä mainittua mutaation aiheuttajaa. Mutatoidut pesäkkeet valikoidaan haarautuneen aminohapon transaminaasiaktiivisuuden puuttumisen suhteen sen perusteella, etteivät ne pysty kasvamaan minimi-M9/ glukoosi-maljoilla, paitsi L-isoleusiinin, L-leusiinin ja 10 L-valiinin (ILV) läsnäollessa. Kasvuun vaaditaan kaikki kolme aminohappoa. Lisäksi on osoitettu, että sanotut transaminaasinegatiiviset mutantit eivät kasva alustalla, johon on lisätty kaikki kolme ketohappoa, jotka toimivat transaminaasireaktioiden substraatteina. Yksi ainoa 15 transaminaasientsyymi siis katalysoi kolmen ketohapon (2-oksi-3-metyylivaleriaanahapon, 2-oksi-isokapronihapon, 2-oksi-isovaleriaanahapon) transaminaation.
Kaksoisblokatut mutantit, joilta puuttuu sekä haarautuneen 2-oksihapon dehydrogenaasiaktiivisuus että haa-20 rautuneen aminohapon transaminaasiaktiivisuus, ovat erityisen mielenkiintoisia, koska todennäköisyys, että ne muuttuvat takaisin luonnollisia avermektiinejä tuottaviksi viljelmiksi, on erittäin pieni. Yksittäisblokatut mutantit voivat määrätyissä olosuhteissa muuttua takaisin luonnol-25 lisiä avermektiinejä tuottaviksi viljelmiksi.
Protoplastifuusio mahdollistaa mutageneesin avulla haluttujen, määrätyn mikro-organismilajin alleelien tuottamisen lisäksi sen, että toisessa lajissa tuotetut/tun-nistetut halutut alleelit voidaan viedä toisen lajin kro-30 mosomiin. Esimerkiksi haarautuneen 2-oksihapon dehydro- genaasin ja haarautuneen aminohapon transaminaasin suhteen negatiivisesta S. avermitilis -kannasta voidaan pro-toplastifuusion avulla yllä mainitut aktiivisuudet omaavan toisen S. avermitilis -kannan kanssa muodostaa 35 S. avermitilis -kanta, jolta puuttuu vain haarautuneen aminohapon transaminaasin aktiivisuus. Kuten alan asian- n 9G087 tuntija tietää, protoplastifuusiotekniikka mahdollistaa eri valintalinjojen edullisten alleelien yhdistelyn yhteen kantaan. Tässä esitetty haarautuneen aminohapon transami-naasin suhteen negatiivinen S. avermitilis -kanta JC-923 5 (ATCC 53 669) tuotettiin tätä tekniikkaa käyttäen.
Esillä olevan keksinnön mukaisten mutanttien morfologia ja viljelyominaisuudet ovat yleisesti ottaen US-patentissa 4 429 042 esitetyt. Esillä olevan keksinnön mukaisten mutanttien tunnusomainen ominaisuus on haarautu-10 neen 2-oksihapon dehydrogenaasiaktiivisuuden ja/tai haarautuneen aminohapon transaminaasiaktiivisuuden puuttuminen, joka ominaisuus määritetään, kuten tässä esitetään. Sanottujen aktiivisuuksien puuttuminen johtaa siihen, etteivät mutantit pysty tuottamaan luonnollisia aver-15 mektiinejä, kun niitä viljellään määrätyllä alustalla, josta pääosiltaan puuttuu rasvahapot R-COOH, joissa R on isopropyyli tai (S)-sek-butyyli, tai yhdisteet, joista fermentoinnin avulla muodostuu R-COOH. American Type Culture Collection -talletuslaitoksen suorittama taksonominen 20 tutkimus vahvisti, että molemmat yllä mainitun 14C02-testin avulla valikoidut mutanttikannat, 1-3 ja HL-026, ovat erittäin läheistä sukua US-patentissa 4 429 042 esitetylle alkuperäiselle ATCC 31 272 -kannalle, mutta muutamia eroavuuksia löytyy. Täten mutanttikanta 1-3 (ATCC 53 567) muo-25 dostaa harvempia itiöketjuja kuin ATCC 31 272, ja mutant-tikannasta HL-026 (ATCC 53 568) puuttuu lähes kokonaan il-mamyseeli ja itiöt, mutta ne hyvin harvat itiöketjut, joita se muodostaa, ovat verrannollisia ATCC 31 272:n muodostamiin itiöketjuihin. Mutantti HL-026:11a on myös hyvin : 30 kyseenalainen kyky käyttää hyväkseen raffinoosia ainoana hiililähteenä, kun taas ATCC 31 272 -kanta ja mutanttikanta 1-3 pystyvät hyödyntämään raffinoosia ainoana hiililähteenä. (Keksinnön tekijöiden suorittamissa kokeissa raffi-noosi ei ylläpitänyt minkään kannan kasvua). Lisäksi mu-35 tanttikannan HL-026 ominaisuuksia on, että se tuottaa vähemmän melaniinipigmenttia kuin kaksi muuta kantaa eikä i2 90087 tuota sitä ollenkaan tyrosiini-agarilla. Päin vastoin kuin US-patentissa 4 429 042 ATCC 31 272:n suhteen esitettiin, mutanttien tai ATCC 31 272:n kasvua ei pystytty toteamaan käytettäessä sakkaroosia ainoana hiililähteenä. Mutantit 5 1-3 ja HL-026 ovat negatiivisia vain haarautuneen 2-oksi- hapon dehydrogenaasiaktiivisuuden suhteen. Kaksoisnegatii-vinen mutantti PGS-119 (ATCC 53 670), joka tuotettiin mu-tagenoimalla mutantti 1-3 (ATCC 53 567) uudestaan, ja JC-923 (ATCC 53 669), joka saatiin protoplastifuusion avulla, 10 liittyvät taksonomisesti ATCC 31 272:een samalla tavalla kuin mutanttikanta 1-3.
Streptomyces avermitilis -kannat 1-3, HL-026, PGS-119 ja JC-923 on tallennettu Budapestin sopimuksen mukaisesti American Type Culture Collection -talletuslaitok-15 seen, Rockville, Maryland, USA, tunnettuun talletuslaitokseen, jossa tallennettujen kantojen pysyvyys on taattu ja josta ne ovat yleisesti saatavina, mikäli tämän hakemuksen perusteella myönnetään patenttisuoja. Niille annettiin tunnisteet Streptomyces avermitilis ATCC 53 567, ATCC 53 20 568, ATCC 53 670 ja ATCC 53 669.
Kukin S. avermitilis -kanta ATCC 31 267, ATCC 31 271, ATCC 31 272 ja NCIB 12 121 tuottaa luonnollisia aver-mektiinejä, joilla on kaava - 25 R1
TT j*(r^R
H 1 (1)
30 H c U. 0 S
]| 0H| ch3 or3 35 i3 90087 joissa katkoviiva 22 - 23-asemassa edustaa mahdollista kaksoissidosta; R1 on hydroksi ja läsnä vain, josa kaksoissidosta ei ole; 5 R2 on 4'-(α-L-oleandrosyyli)-α-L-oleandrosyylioksi, jolla on kaava ch3 ch3
10 )"V
HO—( )-0 -( J O
ch3o ch3o 15 R3 on vety tai metyyli; ja R on isopropyyli tai (S)-sek-butyyli. US-patentissa 4 285 963 esitetään kaavan I mukainen avermektiini, jossa 25-asemassa on metyyli- ja etyyliryhmä; R1 on hydroksi ja R3 on metyyli.
20 Ei-luonnollisissa avermektiineissä, joihin tässä viitataan, R on muu substituentti kuin isopropyyli tai (S)sek-butyyli alla esitetyn määritelmän mukaisesti.
Kaavan I mukaisten yhdisteiden biosynteesissä tarvittavat yhdisteet ovat olemassa S. avermitilis -solussa.
25 Näiden yhdisteiden, L-valiinin, L-leusiinin ja L-isoleu-siinin, uskotaan joutuvan avermektiinien biosynteesiin 2-oksihapoksi muuttumisen ja haarautuneen 2-oksihapon de-hydrogenaasin katalysoiman dekarboksyloinnin kautta, jolloin tuote liitetään koentsyymi A:hän. Niiden läsnäolo 30 vastaa kaavan I mukaisten isopropyyli- ja (S )-sek-butyy-liyhdisteiden samanaikaisesta muodostumisesta. Tämä aiheuttaa tietenkin ongelmia isopropyylijohdannaisten erottamisessa (S )-sek-butyyli-johdannaisista.
35 i4 9 G O 8 7
Niinpä esillä oleva keksintö koskee menetelmää avermektiinien valmistamiseksi, joilla on kaava R1 CH3 2 J25
R
n | (I) 10 Ιί <^°
U ohI
CHT
15 * 3 jossa katkoviiva asemassa 22 - 23 edustaa mahdollista kaksoissidosta; R1 on hydroksi ja on läsnä vain, jos kaksoissidosta 20 ei ole; R2 on 4' -(α-L-oleandrosyyli )-ct-L-oleandrosyylioksi, jolla on kaava CH3 ch3 25 V- o V—o H 0——° ——0 ch3o ch3o 30 R3 on vety tai metyyli; ja R on α-haarautunut C3_8-alkyyli, -alkenyyli, -al-koksialkyyli tai -alkyylitioalkyyliryhmä; Cs.8-sykloalkyyli-alkyyliryhmä, jossa alkyyliryhmä on α-haarautunut C2_5-al- 35 kyyliryhmä; C3.8-sykloalkyyli- tai C5_8-sykloalkenyyliryhmä, joista kumpi tahansa voi mahdollisesti olla substituoitu 15 90087 metyleenillä tai yhdellä tai useammalla C1.4-alkyyliryhmällä tai halogeeniatomilla; tai 3 - 6-jäseninen, happea tai rikkiä sisältävä heterosyklinen rengas, joka voi olla tyydyttynyt tai täysin tyydyttymätön ja joka mahdollisesti 5 voi olla substituoitu yhdellä tai useammalla C^-alkyyli-ryhmällä, jolloin menetelmälle on tunnusomaista, että fer-mentoidaan aerobisissa olosuhteissa Streptomyces avermiti-lis -kantaa, josta puuttuu haarautuneen 2-oksihapon dehyd-rogenaasiaktiivisuus tai haarautuneen aminohapon transami-10 naasiaktiivisuus tai molemmat entsyymiaktiivisuudet, vesipohjaisessa kasvatusalustassa, jossa on assimiloitavaa typpilähdettä, hiililähdettä ja epäorgaanisia suoloja sekä yhdistettä, jolla on kaava R-COOH, tai yhdistettä, jonka Streptomyces avermitilis pystyy muuttamaan mainituksi ha-15 poksi, jolloin R on edellä määritelty.
Kun esillä olevan keksinnön mukaiset mutantit fer-mentoidaan asianmukaisia lähtöyhdisteitä sisältävällä alustalla, ne tuottavat kaavan I mukaisia yhdisteitä tai useimmiten ne muodostavat seosta, joka sisältää kahta tai 20 useampaa kaavan I mukaista yhdistettä, jossa R vastaa käytettyä lähtöyhdistettä. Täten voidaan tuottaa jopa neljä lopputuotetta, joita tarkoituksenmukaisesti ja yksinkertaisesti kutsutaan R-avermektiineiksi AI, A2, B1 ja B2 US-patentin 4 429 042 mukaista kuvausta käyttäen. "R"-ryhmä 25 viittaa tietenkin C-25-substituenttiin. Esimerkiksi, kun R on syklopentyyli, mahdolliset neljä avermektiiniä ovat:
Triviaalinimi E2 syklopentyyli- kaksoissidos CH~
30 avermektiini AI
syklopentyyli- hydroksi CH^ avermektiini A2
35 syklopentyyli- kaksoissidos H
avermektiini B1
syklopentyyli- hydroksi H
avermektiini B2 40 16 90087
Ei-luonnollisissa avermektiineissä kaavan I mukainen C-25-substituentti "R" on muu kuin isopropyyli tai (S)-sek-butyyli.
Kaavan I mukaisia yhdisteitä, joissa on kaksois-5 sidos ja OH-ryhmä puuttuu, voitaisiin vaihtoehtoisesti valmistaa dehydratoimalla vastaava kaavan I mukainen yhdiste, jossa R1 on OH ja josta kaksoissidos puuttuu. Reaktio suoritetaan siten, että hydroksiryhmät asemissa 5 ja 4" ensin suojataan selektiivisesti, esim. t-butyylidime-10 tyylisilyylioksiasetyylijohdannaisina, ja saatetaan sitten reagoimaan tiokarbonyylihalogenidin, kuten 4-metyylifenok-sitiokarbonyylikloridin kanssa, ja suoritetaan dehydra-tointi kuumentamalla liuottimessa, jonka kiehumispiste on korkea, esim. triklooribentseenissä. Lopuksi tuotteesta 15 poistetaan suojaus, jolloin saadaan tyydyttämätön yhdiste. Nämä vaiheet ja siihen soveltuvat reagenssit ja reaktio-olosuhteet on kuvattu US-patentissa 4 328 335.
Kaavan I mukaisia yhdisteitä, joissa R3 on H, voitaisiin myös valmistaa vastaavasta yhdisteestä, jossa R3 20 on CH3 käyttäen demetylointia. Tämä reaktio suoritetaan käsittelemällä 5-metoksiyhdistettä tai sen sopivaa suojattua johdannaista elohopea-asetaatilla ja hydrolysoimalla saatu 3-asetoksienolieetteri laimennetulla hapolla, jolloin saadaan 5-ketoyhdiste. Tämä pelkistetään tämän jäl-25 keen käyttäen esim. natriumboorihydridiä, jolloin saadaan 5-hydroksijohdannainen. Näiden vaiheiden sopivat reagenssit ja reaktio-olosuhteet on esitetty US-patentissa 4 423 209.
Kaavan I mukaisia yhdisteitä, joissa R1 on H ja kak-30 soissidos puuttuu, voidaan valmistaa vastaavasta yhdisteestä, jossa on kaksoissidos ja josta R1 puuttuu, selektiivisen katalyyttisen hydrogenoinnin avulla käyttäen sopivaa katalyyttiä. Pelkistys voidaan esimerkiksi suorittaa käyttäen tris-(trifenyylifosfiini)rodium(I)kloridia kuten 35 EP-julkaisussa 0 001 689 ja sitä vastaavassa 22.4.1980 myönnetyssä US-patentissa 4 199 569 on esitetty.
17 90087
Kaavan I mukaiset yhdisteet, joissa R2 on H, valmistetaan yhdisteistä, joissa R2 on 41-(α-L-oleandrosyyli)-L-oleandrosyylioksi, poistamalla 4'-(α-L-oleandrosyyli)-α-L-oleandroosiryhmä miedon happohydrolyysin avulla vesi-5 pohjaisessa orgaanisessa liuottimessa, jolloin saadaan 13-asemassaan hydroksiryhmän omaava aglykoni; tämä halogenoi-daan esimerkiksi antamalla reagoida bentseenisulfonyyliha-logenidin kanssa, jolloin saadaan 13-deoksi-13-halogeeni-johdannainen, joka lopuksi pelkistetään selektiivisesti 10 esimerkiksi tributyylitinahydridillä. Jotta vältetään ei-toivottuja sivureaktioita, on suojaus hyvä suorittaa kaikille mahdollisille hydroksiryhmille, esimerkiksi käyttäen tert-butyylidimetyylisilyyliryhmää. Tämä poistetaan sitten yksinkertaisesti halogenoinnin tai pelkistysvaiheen jäl-15 keen käsittelemällä metanolilla, jossa on hivenen happoa. Kaikki nämä vaiheet ja vastaavat reagenssit ja reaktio-olosuhteet niiden suorittamiseksi on esitetty EP-julkai-sussa 0 002 615.
Esillä olevan keksinnön mukaiset S. avermitilis 20 -kannat pystyvät hyödyntämään luonnollisten tai ei-luon-nollisten avermektiinien biosynteesissä yhdisteitä, joilla on kaava R-COOH (II-A), 25 jossa R on edellä määritelty, sekä yhdisteitä, jotka voidaan muuttaa II-A-yhdisteiksi fermentointiprosessin aikana. Sanottuja yhdisteitä kutsutaan tässä "lähtöyhdisteik-si".
30 Edullisia muutettavissa olevia yhdisteitä, so. pre- kursoreita, fermentointiprosessissa ovat yhdisteet, joilla on kaava K - ( CU, )„-Z ( 11 -B ) 35 18 90 087 jossa R on edellä määritelty; n on 0 tai 2; ja Z on -CH2OH, -CHO tai -COOR5, jolloin R5 on vety tai C^-alkyyli.
Siinä tapauksessa, että S. avermitilis -kannoista puuttuu vain haarautuneen aminohapon transaminaasi, myös 5 2-oksihapot voivat toimia prekursoreina. Tällöin sanotut S. avermitilis -kannat pystyvät hyödyntämään happoja, joilla on kaava R-CO-Z (II-C), 10 jossa R ja Z ovat, kuten yllä määritettiin, avermektiinien biosynteesissä.
Myös kaavan II-A mukaisten yhdisteiden isomeerimuo-dot sekä yhdisteet, jotka voidaan muuttaa näiksi isomeeri-15 muodoiksi fermentointiprosessin aikana, kuuluvat kaavan piiriin.
Esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä suoritetaan fermentoimalla aerobisesti S. avermitilis -kantaa, jolta puuttuu haarautuneen 2-oksihapon dehydrogenaasiak-20 tiivisuus ja/tai haarautuneen aminohapon transaminaasiak-tiivisuus, vesipohjaisessa ravintoalustassa, joka sisältää assimiloitavaa typpeä, hiiltä, epäorgaanista suolaa ja kaavan R-COOH mukaista yhdistettä tai sanotuksi yhdisteeksi fermentoinnin aikana muuttuvaa yhdistettä (so. prekur-25 soria). Happo tai hapoksi muuttuva yhdiste lisätään fer-mentointiin joko inokuloinnin yhteydessä tai määräajoin fermentoinnin aikana. Kun käytetään transaminaasinegatii-vista mutanttia, alustan on sisällettävä L-isoleusiinia, L-leusiinia ja L-valiinia, jotta mutantti kasvaisi. Aver-30 mektiiniyhdisteiden muodostumista voidaan seurata ottamalla näytteitä fermentoinnista, uuttamalla orgaanisella liuottimena ja seuraamalla tuotteen ilmentymistä kromato-grafian avulla, esimerkiksi käyttäen korkeapainenestekro-matografiaa. Inkuboidaan, kunnes tuotteen saanto on maksi-- 35 moitu, yleensä noin 4-15 vuorokautta.
19 90087 Lähtöyhdistettä (karboksyylihappoa tai karboksyy-lihapoksi muuttuvaa yhdistettä) lisätään joka kerta edullisesti noin 0,05 - 3,0 g litraa kohden. Lähtöyhdistettä voidaan lisätä fermentointiin jatkuvasti, jaksoittain tai 5 kaikki kerrallaan. Happoa (R-COOH) lisätään sellaisenaan tai suolana, kuten natrium-, litium- tai ammoniumsuolana, tai yhdisteenä, joka on muutettavissa hapoksi, kuten yllä määritettiin. Jos happo on kiinteässä muodossa se liuotetaan edullisesti sopivaan liuottimeen, kuten veteen tai 10 C^-alkoholiin.
Fermentoinnissa käytetty alusta voi olla tavanomainen alusta, jossa on assimiloitavaa hiiltä, typpeä ja hivenaineita, erityisesti kun C-25-substituentti on isopro-pyyli tai (S)-sek-butyyli. Kun C-25-substituentti on ei-15 luonnollinen ryhmä, so. ei ole isopropyyli tai (S)-sek- butyyli, fermentointialustan on oltava sellainen, että valitut aineosat eivät sisällä ollenkaan tai sisältävät vain vähäisiä määriä lähtöyhdisteitä, joissa R-ryhmä on isopropyyli tai (S)-sek-butyyli.
20 Kun fermentointia on jatkettu useita vuorokausia lämpötilassa, joka edullisesti on suuruusluokkaa 24 -33 °C, fermentointiliuos sentrifugoidaan tai suodatetaan ja myseelikakku uutetaan edullisesti asetonilla tai me-tanolilla. Liuotinuutos väkevöidään ja haluttu tuote uute-25 taan tämän jälkeen veteen sekoittumattomalla orgaanisella liuottimena, kuten metyleenikloridilla, etyyliasetaatilla, kloroformilla, butanolilla tai metyyli-isobutyylike-tonilla. Liuotinuutos väkevöidään ja raakatuote puhdistetaan vielä tarvittaessa kromatografiän avulla, esimerkiksi 30 preparatiivisella käänteisfaasi-HPLC -kromatografiällä.
Tuote saadaan yleensä seoksena, jossa on kaavan I mukaisia yhdisteitä, joissa R2 on 4'-(α-L-oleandrosyyli)-α-L-oleandrosyylioksi, R1 on OH ja kaksoissidos puuttuu tai R1 puuttuu, jolloin esiintyy kaksoissidos ja joissa R3 on 35 H tai CH3; suhteet voivat kuitenkin vaihdella käytetystä 20 90087 mutantista ja lähtöyhdisteestä sekä käytetyistä olosuhteista riippuen.
R-ryhmän lähteet ovat samantekeviä avermektiinien muodostumiselle, s.o. ei ole väliä tuleeko se suoraan 5 R-COOH:sta tai muodostuuko se yllä mainitusta prekursoris-ta. Esillä olevan keksinnön mukaisen menetelmän kriittinen vaatimus niiden muodostumiselle on se, että haluttu R-ryhmä on fermentointiprosessin aikana esillä olevan keksinnön mukaisen S. avermitilis -kannan saatavilla.
10 Sopivia yhdisteitä ovat: 2,3-dimetyylivoihappo 2-metyyliheksaanihappo 2-metyylipent-4-eenihappo 2- syklopropyyli-propionihappo 15 4,4-difluorisykloheksaanikarboksyylihapon litiumsuola 4-metyleenisykloheksaanikarboksyylihappo 3- metyylisykkloheksaanikarboksyylihappo (cis/trans) 1-syklopenteenikarboksyylihappo 1- syklohekseenikarboksyylihappo 20 tetrahydropyraani-4-karboksyylihappo tiofeeni-2-karboksyylihappo 3-furaanihappo 2- klooritiofeeni-4-karboksyylihappo svklobutaanikarboksyylihappo 25 syklopentaanikarboksyylihappo sykloheksaanikarboksyylihappo sykloheptaanikarboksyylihappo 2- metyylisyklopropaanikarboksyylihappo 3- syklohekseeni-l-karboksyylihappo 30 2-metyylitiopropionihappo 2- metyyli-4-metoksivoihappo tiofeeni-3-karboksyylihappo hydroksimetyylisyklopentaani 3- tiofeenikarboksialdehydi .35 3-sykloheksyylipropionihappo 21 90087 3-syklopentyylipropionihappo hydroksimetyylisyklobutaani tetrahydrotiofeeni-3-karboksyylihappo 3-syklopentyy1i-1-propanoli 5 3-metyylisyklobutaanikarboksyylihapon litiumsuola 3-fluorisyklobutaanikarboksyylihappo 3- metyleenisyklobutaanikarboksyylihapon litiumsuola 2-metyyli-4-metyylitiovoihappo tetrahydrotiopyraani-4-karboksyylihappo 10 syklobutyylimetyyliamiini etyylisyklobutaanikarboksylaatti 4- hydroksimetyylisyklopenteeni 2-(3-tiofeenikarbonyyli)propionihapon etyyliesteri (S)-2-metyylipentaanihappo 15 (R)-2-metyylipentaanihappo O-metyyylitransferaasimutantteja voidaan johtaa tässä esitetyistä haarautuneen 2-oksihapon dehydrogenaasi-negatiivisista mutanteista ja/tai haarautuneen aminohapon transaminaasinegatiivisistä mutanteista. Mutantit, joissa 20 on mutaatio haarautuneen 2-oksihapon dehydrogenaasin ak tiivisuuksissa ja/tai haarautuneen aminohapon transaminaa-sin aktiivisuuksissa, yhdistetään yhteen tai useampaan 0-metyylitransferaasimutanttiin, jolloin saadaan S. avermi-tilis -kantoja, jotka tuottavat pääosiltaan B-avermektii-25 nejä, demetyyliavermektiinejä tai demetyyliavermektiini- B-yhdisteitä, kun niille syötetään R-COOH-yhdisteitä tai R-COOH-yhdisteiksi muuttuvia yhdisteitä fermentointipro-sessin aikana. Sanotut mutantit saadaan mutagenoimalla tässä esitettyjä mutantteja, joilta puuttuu haarautuneen 30 2-oksihapon dehydrogenaasiaktiivisuus ja/tai haarautuneen aminohapon transaminaasiaktiivisuus, käyttäen UV-valoa ja/tai kemiallisia mutageeneja, kuten N-metyyli-N-nitroso-uretaania, nitrosoguanidiiniä, etyylimetaanisulfonaattia tai muuta yllä esitettyä ainetta. Vaihtoehtoisesti haarau-35 tuneen 2-oksihapon dehydrogenaasipositiivista mutanttia 22 90087 ja/tai haarautuneen aminohapon trans-aminaasipositiivista mutanttia, josta puuttuu toinen tai molemmat O-metyyli-transferaasit, voidaan mutatoida UV-valokäsittelyllä tai mutagenoivalla aineella, jolloin saadaan haarautuneen 2-5 oksihapon dehydrogenaasinegatiivisia ja/tai haarautuneen aminohapon transaminaasinegatiivisia mutantteja.
Tämänkaltaisten mutanttien tuottamia ei-luonnolli-sia avermektiinejä karakterisoi se, että niillä on hydrok-siryhmiä aglykoniosan C-5-asemassa ja/tai oleandroosiosien 10 C-3'- ja/tai C-3"-asemissa.
Yllä kuvatut mutantit tunnistetaan julkaisussa Schulman et ai., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 29 (1986) 620 - 624, esitetyn menetelmän mukaisesti. Ne ovat käyttökelpoisia samoihin tarkoituksiin ja samalla tavalla 15 kuin tunnetut avermektiinit.
Vaihtoehtoisesti suuria määriä B-avermektiinejä, myöskin niitä, joista metyyliryhmät puuttuvat oleandroosi-disakkaridiosasta, tuotetaan fermentoimalla esillä olevan keksinnön mukaisia mutantteja, joilta aktiivinen haarautu-20 neen 2-oksihapon dehydrogenaasiaktiivisuus ja/tai haarau tuneen aminohapon transaminaasiaktiivisuus puuttuu, sine-fungiinin, S-adenosyylietioniinin tai S-adenosyylihomokys-teiinin kaltaisen O-metyylitransferaasiaktiivisuutta inhiboivan aineen läsnäollessa.
25 Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistetut yh disteet ovat hyvin aktiivisia parasiittien vastaisia aineita, joiden käyttökelpoisuus on erityisen hyvä matolääk-keenä, ulkoloisten myrkkynä, hyönteismyrkkynä ja punkkien tuhoaineena.
30 Täten yhdisteet ovat tehokkaita hoidettaessa eri laisia sisäloisten aiheuttamia tauteja, kuten erityisesti matotautia, jota yleensä aiheuttaa ryhmä parasiittisia sukkulamatoja ja joka voi aiheuttaa suurtakin taloudellista tappiota sika-, lammas-, hevos- ja karjataloudessa sekä 35 voi myös aiheuttaa tauteja kotieläimille ja linnuille.
23 90087
Yhdisteet ovat myös tehokkaita muita sukkulamatoja vastaan, jotka tartuttavat eri eläinlajeja, kuten esimerkiksi Dirofilaria koirilla, ja erilaiset ihmisiä tartuttuvat parasiitit, kuten suolistoparasiitit Ancylostoma, Necator, 5 Ascaris, Strongyloides, Trinchinella, Capillaria, Trichu-ris, Enterobius ja verestä ja muista kudoksista löydetyt parasiitit, kuten rihmamadot ja suoliston ulkoiset Strongyloides- ja Trichinella-muodot.
Yhdisteet ovat myös arvokkaita ulkoloisten aiheutit) taemien infektioiden hoidossa, erityisesti eläinten ja lintujen niveljalkaisia ulkoloisia, kuten puutiaisia, punkkeja, täitä, kärpäsiä, raatokärpäsiä, purevia hyönteisiä sekä karjaa ja hevosia tartuttavia liikkuvia kärpästoukkia vastaan.
15 Yhdisteet ovat myös aktiivisia hyönteismyrkkyjä kotitalouksien tuhoeläimiä, kuten torakkaa, koita, turkis-kuoriaista ja huonekärpästä vastaan, ja niitä voidaan käyttää varastoidun viljan viljelykasvien tuholaisia, kuten kirvoja, lehtitäitä, toukkia ja liikkuvia suorasiipi-20 siä, kuten heinäsirkkoja, vastaan.
Kaavan I mukaisia yhdisteitä annetaan määrättyyn käyttötarkoitukseen ja määrätylle hoidettavalle isäntä-eläinlajille tai kyseessä olevalle loiselle tai hyönteiselle soveltuvana formulaationa. Matolääkkeenä yhdisteet 25 voidaan antaa oraalisesti kapselina, boluksena, tablettina tai nestemäisenä pakkolääkityksenä, tai ne voidaan vaihtoehtoisesti antaa ruiskeena tai siirrännäisenä. Tämänkaltaiset formulaatiot valmistetaan käyttäen tavanomaisia menetelmiä tavanomaisia eläinlääketieteellistä käytäntöä 30 noudattaen. Täten kapselit, bolukset tai tabletit voidaan valmistaa sekoittamalla aktiivinen aineosa sopivaan hienojakoiseen laimentavaan aineeseen tai kantajaan, joka lisäksi sisältää hajottavaa ainetta ja/tai sitovaa ainetta, kuten tärkkelystä, laktoosia, talkkia, magnesiumstearaat-35 tia, jne. Nestemäinen pakkolääkitysformulaatio voidaan 24 90087 valmistaa dispergoimalla aktiivinen ainesosa vesipohjaiseen liuokseen yhdessä dispergoivan tai kosteuttavan aineen ja muun kanssa, ja injisoitavat formulaatiot voidaan valmistaa steriileinä liuoksina, joissa voi olla muitakin 5 aineita, kuten esimerkiksi tarpeellinen määrä suolaa tai glukoosia, jotta liuoksesta tulee isotooninen vereen nähden. Nämä formulaatiot vaihtelevat aktiivisen ainesosan painon suhteen riippuen hoidettavasta isäntäeläinlajista, injektion voimakkuudesta ja tyypistä sekä isäntäorganismin 10 ruumiinpainosta. Oraalisesti annettuna noin 0,001 - 10 mg/kg eläimen painoa yksittäisannoksena tai jaettuna annoksina noin 1-5 vuorokauden aikana, on yleensä tyydyttävä annos, mutta tietenkin voi esiintyä tilanteita, joissa korkeammat tai matalammat annosrajat ovat tarpeellisia. 15 Vaihtoehtoisesti yhdisteet voidaan antaa sekoitet tuna eläimen ruokaan ja tätä tarkoitusta varten voidaan valmistaa ruokaan lisättävä tiiviste tai ns. premix, jota sekoitetaan eläimen normaaliin ruokaan.
Hyönteismyrkkynä tai maataloustuholaismyrkkynä yh-20 disteet käytetään sumutuksena, pölynä, emulsiona tai vastaavana, tavanomaista maataloudellista käytäntöä noudattaen.
S. avermitilis -kannan 1-3 (ATCC 53 567). josta puuttuu haarautuneen 2-oksihapon dehydroqenaasi. 25 tuottaminen 1. vaihe: S. avermitilisia ATCC 31 272, kasvatettiin yhtenäiseksi matoksi New Patch Agar -alustalla 12 vuorokautta 30 °C:ssa. Alustan koostumus oli: V-8 vihannesmehu* 200 ml 30 CaCOg 3 g
Agar 15 g H20 ad 1000 ml ravintoliemi 1,0 g/1 natriumasetaatti·3H20 1,4 g/1 .35 isovaleriaanahappo 50 mg/1 25 90087 isovoihappo 50 mg/1 2-metyylivoihappo 50 mg/1 isoleusiini 250 mg/1 leusiini 250 mg/1 5 vallini 250 mg/1 hivenaineliuos** 1 ml/1 ♦kahdeksan vihannesmehun seos (tomaatti, porkkana, selleri, sokerijuurikas, persilja, salaatti, vesikrassi ja pinaatti) + suolaa, askorbiinihappoa, sitruunahappoa ja 10 luonnollisia makuaineita. Saatavana Campbell Soup Company -yhtiöstä, Camden, NJ.
** Hivenaineliuoksen koostumus:
FeCl3-6H20 2,7 g
MnS04-H20 4,2 15 CuS04*5H20 0,5
CaCl2 11,0 H3B03 0,62
CoCl2-6H20 0,24
ZnCl2 0,68 20 Na2Mo04 0,24
Yllä olevat aineet liuotetaan 1 litraan 0,1 N HCl:a.
Kolmelta maljalta kerättiin itiöitä, jotka suspen-doitiin 20 ml:aan 0,05 M tris-malonihappopuskuria, pH 9,0. 25 Vaihe 2: 10 ml itiösuspensiota lisättiin putkeen, jossa oli 10 mg N-metyyli-N'-nitro-N-nitrosoguanidiinia (NTG). Putkea inkuboitiin ja ravisteltiin 28 °C:ssa 60 min ja itiöt pestiin runsaassa, l-%:isessa NaCl-liuoksessa. Vaihe 3: Pestyt itiöt suspendoitiin l-%:iseen 30 NaCl:iin ja sekoitettiin samaan tilavuuteen 80-%:ista ety-leeniglykolia. Tätä suspensiota säilytettiin -20 °C:ssa ja käytettiin solulähteenä kun mutantit seulottiin. Idätettäessä saatiin noin 104 pesäkettä/ml.
Itiökanta levitettiin YPD-maljoille siten, että - 35 saatiin noin 100 pesäkettä maljaa kohden (YPD-alusta si- 26 90 08 7 sältää 10 g/1 hiivauutetta, Bacto-peptonia* ja dekstroo-sia; sekä 15 g/1 Bacto-agaria*, pH säädettiin arvoon 6,9 ennen autoklavointia). Tähdellä merkityt ainesosat ovat kaupallisesti saatavina: Difco Laboratories -yhtiöstä, 5 Detroit, Michigan 48 238, USA.
Vaihe 4: Yksittäisiä pesäkkeitä poimittiin maljoilta 2 - 3 viikon kasvatuksen jälkeen 28 °C:ssa ja siirrettiin tavanomaisen, 96-kuoppaisen mikrotiitterilevyn omiin kuoppiin. Pieni osa jokaista pesäkettä siirrettiin myös 10 tuoreelle agar-alustalle käytettäväksi solulähteenä, kun mutantteja tunnistetaan.
Vaihe 5: Jokaiseen kuoppaan lisättiin noin 75 mik-rolitraa nestemäistä M9-suola-alustaa, joka sisälsi 1 % glukoosia, 0,1 % kasaminohappoja ja 0,01 % sekä isovaleri-15 aanahappoa, isovoihappoa että 2-metyylivoihappoa. Inkuboi-tiin useita vuorokausia 28 °C:ssa, minkä jälkeen solut testattiin haarautuneen 2-oksihapon dehydrogenaasin suhteen. (M9-suola-alusta sisälsi 6 g NaH2P04:a, 3 g KH2P04:a, 0,5 g NaClra ja 1 g NH4Cl:a litraa kohden. Alusta autokla-20 voitiin ja 1 ml steriloitua, 1 M MgS04 ja 1 ml steriloitua 0,1 M CaCl2:a lisättiin aseptisesti).
Vaihe 6: Valmistettiin 5-%:isen tolueenin mikrosus-pensio M9-suola-alustassa sonikoimalla sekoittumatonta seosta nopeasti. 25 ml:aan tätä suspensiota lisättiin 25 1,2 ml [14C-1]-2-oksi-isokapronihappoa, 2,5 pCi/ml ja 10,0 pCi/pmol, sisältävää liuosta. 50 mikrolitraa tätä liuosta lisättiin jokaiseen mikrotiitterilevyn kuoppaan, jossa testattavat solut olivat.
Vaihe 7: Jokaisessa kuopassa muodostunut 14C02 sul-30 jettiin talteen ja visualisoitiin julkaisussa Tabor et ai., J. Bacteriol. 128 (1976) 485 - 486, "Convenient Method for Detecting 14C02 in Multiple Samples: Application to Rapid Screening for Mutants", esitettyä menetelmää käyt-täen. Mutantit, joilta aktiivinen haarautuneen 2-ok-35 sihapon dehydrogenaasi puuttuu, eivät tuota Ba14C03 sen enempää kuin kontrollitkaan.
27 90087
Kehittyneempi menetelmä, jossa ero radiogrammissa Ba14C03:n muodostumisesta johtuvana tummana läikkänä näkyvän 14C02 -positiivisen testin ja negatiivisen testin, jossa ei näy läikkää tai näkyy erittäin heikko läikkä, muo-5 dosstuu seuraavasta modifioidusta seulonnasta.
Yksittäisiä pesäkkeitä (katso vaihe 4 yllä) poimittiin 7-14 vuorokauden kasvatuksen jälkeen (ei 2 - 3 viikon kasvatuksen jälkeen, kuten yllä, ja ne testattiin suoraan kuten vaiheissa 6 ja 7 yllä). Yllä olevan menetelmän 10 vaihe 5 jätettiin pois.
Vieläkin kehittyneempi menetelmä, joka on luonteeltaan kvantitatiivinen vapautuneen 14C02:n suhteen, on seu-raava: Yllä esitetyssä seulonnassa tunnistettuja mutantte-ja kasvatettiin sopivalla alustalla, joka koostui M9-suo-15 la-alustasta johon oli lisätty 1 % glukoosia ja 0,1 % "Syncasa-bcaa" -tuotetta (synteettinen L-aminohappojen seos, jonka koostumus vastaa kaupallisesti saatavia kas-aminohappoja mutta L-valiini, L-isoleusiini ja L-leusiini puuttuvat, katso alla).
20 Kasvatettiin korkeaan solutiheyteen, minkä jälkeen solut pestiin M9-suola-alustalla ja suspendoitiin uuteen kylmään l-%:iseen tolueenia sisältävään M9-suola-alustaan, jota oli sonikoitu, kunnes saatiin maidonvalkea tolueeni-dispesio. Solu/puskuri/tolueenisuspensiota inkuboitiin 25 40 min 30 °C:ssa, jotta solut tulivat läpäiseviksi. Per- meabilisoidut solut pestiin tämän jälkeen M9-suola-alus-talla ja otettiin lopuksi viidesosaan alkuperäistä tilavuutta olevaan M9-alustapuskuriin. Testiä kohden käytettiin 180 mikrolitraa tätä puskuria.
30 300 pl:n reaktiotilavuus sisälsi toluenisoidut so lut, 0,4 mM tiamiinipyrofosfaattia (TPP); 0,11 mM koent-syymi A:ta (CoA); 0,68 mM nikotiiniamiiniadeniinidinuk-leodia (NAD), 2,6 mM ditiotreitolia (DTT); 4,1 mM MgCl2:a; 60 mM Tris-HCl:a; pH 7,5; ja [14C-l]-a-keto-isokaproaattia, 35 6 000 cpm, pCi/pmol. Laskennan tehokkuus oli 73 %. Reaktio suoritettiin 15 ml;n tuikelaskentaputkissa, joiden kierre- 28 90087 korkkeihin oli painettu 2x2 cm:n Whatman nro 4 -paperi-neliöitä. Paperissa oli 30 mikrolitraa 1 M hyamiinihydrok-sidia (1 M metyylibentsetoniumhydroksidia metanolissa; saatavana Sigma Chemical Co -yhtiöstä. St. Louis, MO 63 5 178, USA), joka sitoo reaktiossa vapautuvan 14C02:n. Kahden tunnin inkuboinnin jälkeen paperit upotettiin 10 ml:aan Beckman Aquasol II -tuikenestettä (yleistuikeneste), joka saadaan kaupallisesti New England Nuclear Research Products -yhtiöstä, Boston, MA 02118, USA) ja annettiin tasa-10 painoittua neljän tai useamman tunnin ajan tässä nesteessä, minkä jälkeen radioaktiivisuus määritettiin neste-tuikelaskijassa. Tyhjäkontrollireaktio (s.o. - ei soluja) antoi noin 50 - 300 cpm.
Mutantti 1-3 ja muuta vastaavat antoivat cpm-luke-15 mia, jotka olivat pienempiä tai samaa suuruusluokkaa kuin tyhjäkontrolli, kun taas alkuperäiskannan arvot olivat useita kertoja korkeampia kuin tyhjäarvot.
S. avermitilis I-3:sta (ATCC 53 567) johdetun H-026 -kannan (ATCC 53 568) eristäminen 20 S. avermitilisia 1-3 (ATCC 53 567) levitettiin ra- vintoagarmaljoille. Spontaaneja variantteja esiintyi suhteellisen suurella tiheydellä, joistakin puuttui ilmamy-seeli neljän päivän inkubaation jälkeen 30 °C:ssa. Useita tämänkaltaisia variantteja eristettiin ja niiden kykyä 25 tuottaa ei-luonnollisia avermektiinejä fermentoinnin aika na AP-5-alustassa, johon oli lisätty syklopentaanikarbok-syylihappoa, testattiin. Monet isolaatit tuottivat ei-luonnollisia avermektiinejä ilman luonnollisia avermektiinejä, ja näistä valittiin yksi kanta, joka tuotti kor-30 keampia avermektiinitiittereitä pullokasvatuksissa verrat tuna alkuperäiskantaan S. avermitilis 1-3 (ATCC 53 567) ja jonka tunnistuskoodiksi annettiin HL-026 (ATCC 53 568).
S. avermitilis -kannan PGS-119 (ATCC 53 670), jolta puuttuu haarautuneen 2-oksihapon dehydrogenaasi ja haa-35 rautuneen aminohapon transaminaasi. tuottaminen
Vaihe 1: Noin 100 mg 4 vuorokautta tuoreella 29 9 0 0 8 7 SAMM-agarmaljalla kasvatettua S. avermitilisia 1-3 (ATCC 53 567) inokuloitiin 300 ml:n pulloon, jossa oli SCM-alus-taa (pH 7,2). Pulloa ravisteltiin kierrosnopeudella 200 RPM 30 °C:ssa 24 tuntia (loppu-pH = 8,2).
5 Vaihe 2: Pullo poistettiin ravistelijasta ja 10 ml kasvatuslientä sentrifugoitiin steriileissä putkissa kierrosnopeudella 200 RPM 5 min. Solut suspendoitiin tämän jälkeen 50 ml:aan SCM-alustaa steriileissä 300 ml:n Erlen-meyer-pulloissa, ja pulloja ravisteltiin pyörivällä ravis-10 telijalla 2 tuntia 30 °C:ssa.
Vaihe 3: 10 ml suspensiota siirrettiin steriiliin putkeen.
Vaihe 4: Putkeen lisättiin 250 μΐ etyylimetaanisul-fonaattia (hyvin ilmastoidussa vetokaapissa), sekoitettiin 15 hyvin ja kaadettiin steriiliin 300 ml:n pulloon, ja pulloa pyöritettiin ravistelijassa 3 tuntia 30 °C:ssa.
Vaihe 5: Pulloon lisättiin tuoretta, steriiliä SCM-alustaa (40 ml) ja ravistelua jatkettiin yhteensä 70 tuntia 30 °C:ssa.
20 Vaihe 6: Pullo poistettiin ja sisältö sentrifu goitiin pohjaan kierrosnopeudella 8 000 RPM, 10 min, 20 °C:ssa. Solut pestiin suspendoimalla uudestaan SMC-liuokseen, sentrifugoitiin taas pohjaan ja suspendoitiin 10 ml:aan SCM-liuosta.
25 Vaihe 7: Solut poistettiin ja kopiomaljauksella, noin 150 pesäkettä/malja, testattiin niiden kykyä kasvaa M9/glukoosi-minimimaljoilla L-leusiinin, L-isoleusiinin ja L-valiinin läsnäollessa, näiden aminohappojen eri yhdistelmissä, sekä niiden puuttuessa. Halutut mutanttisolut 30 kasvoivat vain alustalla, jossa oli sekä L-leusiinia, L-isoleusiinia että L-valiinia. Nämä S. avermitilis 1-3 (ATCC 53 567) -johdannaiset, joilta puuttui haarautuneen aminohapon transaminaasiaktiivisuus, eivät myöskään pystyneet kasvamaan alustalla, johon oli lisätty yksi tai 35 useampia 2-oksihappoja (2-oksi-isokapronihappo; 2-oksi-3-metyylivaleriaanahappo ja 2-oksi-isovaleriaanahappo), joka 30 '30087 toimii L-leusiinin, L-isoleusiini ja L-valiinin prekurso-rina. Tämä käyttäytyminen on täysin vastakkainen verrattuna S. avermitilis 1-3 (ATCC 53 567) -kantaan, joka kas-voi hyvin tällaisilla alustoilla. Siten yksi ainoa trans-5 aminaasientsyymi katalysoi sanottujen 2-oksihappojen transaminaation.
SCM-alusta
Hiivan autolysaattori 10 g/1
Lihauute 5 g/1 10 Kaseiinin entsymaattinen hydrolysaatti 10 g/1 1 M MgS04 3 g/1 1 M KHP04; pH 7,0 (HC1) 100 g/1 SAMM-aqarmali a q/1 15 NaoHP0. 6,0 2 4 khpo4 3,0
NaCl 0,5 NH4C1 1,0 1 M MgS04 1,0 20 IM CaCl2 1,0
Dekstroosi 8,0
Kasaminohappoja 20,0
Agar 20,0 25 "Svncasa-bcaa":n koostumus. 100-kertainen väkevyys g/i L-alaniini 3 L-arginiini 4 L-asparagiinihappo 6 30 L-kysteiini 1 L-glutamiinihappo 20 glysiini 1 L-histidiini 2 L-lysiini 7 : 35 L-metioniini 3 L-fenyylialaniini 6 3i 90087 L-proliini 10 L-seriini 6 L-treoniini 4 L-tyrosiini 4 5 L-tryptofaani 1
Seoksen pH säädetään arvoon 7 ja seos steriilisuo-datettiin. Yksi tilavuus tiivistettä lisätään 99 tilavuuteen kasvatusliuosta, jolloin saadaan tavanomainen käyttö-väkevyys .
10 S. avermitilis JC-923 -kannan (ATCC 53 669) tuotta minen spektinomysiiniresistentin S. avermitilis -kannan ATCC 31 272 ia S. avermitilis -kannan PGS-119 (ATCC 53 670) protoplastifuusion avulla
Spektinomysiiniresistentti S. avermitilis ATCC 31 15 272 on S. avermitilis ATCC 31 272:n spontaani mutantti.
Se eristettiin ATCC 31 272:n vegatatiivisesta myseelipo-pulaatiosta ja levitettiin AS-l-agarmaljoille, joissa oli 50 pg/ml spektinomysiiniä. Ne mutantti-itiöt, jotka alkavat kasvaa rikkaalla alustalla, ovat resistenttejä 20 50 pg/ml:lle spektinomysiiniä, verrattuna isogeeniseen alkuperäiskantaan, joka ei kasva näissä olosuhteissa. Tätä dominoivaa, selektoitavissa olevaa merkkiominaisuutta käytettiin hyvin toimivana menetelmänä, kun eristettiin ATCC 31 272:n haarautuneen aminohappotransaminaasin suhteen 25 negatiiviset isolaatit.
AS-l-aqar (Rikas maliausalusta Streptomyces-kannoille) Hiivauute 1 g L-alaniini 0,2 g 30 L-arginiini 0,2 g L-asparagiini 0,5 g
Liukeneva tärkkelys 5 g
NaCl2 25 g
Na2S04 10 g : 35 Agar 20 g
Tislattu vesi 1 litra 32 90087 pH säädettiin arvoon 7,5. Autoklavoitiin 15 min 121 °C:ssa. Kaadettiin 30 - 35 ml steriileihin, muovisiin petri-maljoihin (100/15 mm).
Menetelmä Streptomvces avermitilis -kantojen elä-5 vien protoplastien tuottamiseksi A. Inokulointi itiöillä 1. Itiövalmisteet tuotettiin tavanomaisia menetelmiä käyttäen, elävien itiöiden määrä arvioitiin maljaamal-la eri laimennuksia kasvatusagarille ja valmisteet pakas- 10 tettiin pieninä määrinä -70 °C:seen 40-%:isessa glyserolissa.
2. Ennen käyttöä itiökannat sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 1 000 g, 10 min ja resuspendoitiin samaan tilavuuteen 0,85-%:ista fysiologista suolaliuosta.
15 3. Noin 107 itiötä inokuloitiin 30 ml:aan muunnet tua hiivauute-mallasuute-lientä (YEME), jossa oli 0,5 % glysiiniä (katso alla) 300 ml:n pulloon, jossa on kolme tai neljä väliseinää.
B. Inokulointi pakastetulla, sonikoidulla mvseelil- 20 lä 1. PGS-119:n myseeliviljelmiä kasvatettiin Trypti-case Soy Broth -liemessä (TSB), kunnes sameuden arvo oli 2 - 9 mitattuna 600 nm:ssä. Viljelmää homogenoitiin 10 kertaa lasisella kudosjauhajalla.
• 25 2. Homogenoitu myseeli laimennettiin kaksinkertai sesti TSB:llä ja 20 ml lisättiin steriiliin polypropylee-nisentrifuugiputkeen. Ultraäänisondi upotettiin nesteeseen 1-2 cm:n syvyyteen, ja näytettä sonikoitiin 50 %:n intensiteetillä 10 sekuntia. Sonikointi hajoitti myseeli- 30 massan yksittäisiksi soluiksi tai kaksisoluyksiköiksi, jolloin viljelyssä saavutetaan nopeasti eksponentiaalinen kasvuvaihe.
3. Sonikoidut myseelivalmisteet laimennettiin lopulliseen konsentraatioon 40 % glyserolia, pipetoitiin 35 putkiin ja pakastettiin -70 °C:seen.
33 90087 4. Pieniä määriä näytteitä sulatettiin huoneenlämpöisiksi inokulointia varten YEME-alustaan, kuten yllä esitetyssä vaiheessa A.3.
C. Pesäkeinokulointi aoar-alustalla 5 1. Kuusi kypsää, TSA- tai YPD-2-agarilla kasvatet tua PGS-119-pesäkettä siirrettiin silmukalla 200 μΐ steriiliä vettä sisältävään mikrosentrifuugiputkeen.
2. Myseeliseos homogenoitiin kertakäyttösurvimella.
3. Homogenoidut pesäkkeet lisättiin YEME-alustaan 10 kuten yllä vaiheessa A.3.
D. Protoplastien valmistus qlvsiinissä kasvatetusta mvseelistä 1. Viljelmiä inkuboitiin ravistelevassa vesihauteessa, asento 8, 29 °C:ssa noin 65 tuntia.
15 2. Myseeli tutkittiin mikroskoopin alla 40X 2-faasi -suurennuksella ja kerättiin polypropyleenisentrifuugiput-keen kiihtyvyydellä noin 1 475 g, 10 min, 20 °C:ssa.
3. Supernatanttiliuos poistettiin ja myseelisakka resuspendoitiin 10 ml:aan Protoplast (P) -puskuria. Sakka 20 homogenoitiin 5-10 kertaa kudosjauhajalla erillisiksi rykelmiksi.
4. Näytettä sentrifugoitiin kiihtyvyydellä noin 1 000 g, 10 min. Supernatanttiliuos poistettiin ja solu-pallo resuspendoitiin varovaisesti 100 ml:aan P-puskuria. 25 5. Yllä esitetty pesuvaihe toistettiin.
6. Myseelipallo suspendoitiin 10 ml:aan tuoretta lysotsyymiliuosta, 1,0 mg/ml P-puskurissa, joka oli ste-riilisuodatettu 0,22 pm:n suodattimen läpi.
7. Myseeliseos inkuboitiin vesihauteessa 37 °C:ssa 30 ravistellen varovaisesti 60 min. Näytteet resuspendoitiin lysotsyymiliuokseen joka 15. minuutti. Näytteet tutkittiin mahdollisten protoplastien suhteen mikroskooppisesti 40X faasivalaistuksella.
8. Myseelivalmisteet tri turoiti in kolme kertaa 5 35 ml:n pipetillä, jotta protoplastit vapautuisivat solusei- nistään.
34 9 0087 9. Valmisteet suodatettiin lasivillan tai inertin puuvillan läpi.
10. Protoplastit sedimentoitiin sentrifugoimalla kiihtyvyydellä noin 1 000 g, 7 min, resuspendoitiin varo- 5 vaisesti 5 ml:aan P-puskuria, ja tutkittiin 40X faasisuu-rennuksella.
11. Protoplastit sedimentoitiin kuten yllä ja resuspendoitiin 1,0 ml:aan P-puskuria. Tämä suspensio laimennettiin P-puskuriin ja tislattuun veteen ja maljattiin 10 regenerointialustalle. Mahdolliset tislattuun veteen laimennetuista protoplastivalmisteista saadut pesäkkeet katsottiin olevan peräisin myseeliyksiköistä, joista ei ollut kokonaan tai ollenkaan muodostunut protoplasteja.
12. Protoplastit jäähdytettiin jäällä 200 - 300 15 μ1:η näytteinä -70 °C:ssa. Ne poistettiin jäältä noin 18 - 24 tuntia myöhemmin.
Protoplastifuusio polyetvleeniqlvkolin (PEG) 1 000 avulla
1. Kaikki tässä esitetyt kokeet tehtiin samalla PEG
20 1 000 -erällä (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63 178, USA), jonka toksisuus oli huomattavan pieni näissä kokeissa.
2. Yhden (1,0) gramman PEG-erät autoklavoitiin lasiputkissa, 1,0 ml P-puskuria lisättiin ja PEG liuotettiin 25 kuumentamalla putket 55 °C:seen tai PEG punnittiin, liuotettiin P-puskuriin ja steriilisuodatettiin ennen käyttöä. PEG-liuokset käytettiin huoneenlämmössä.
3. Valmistettiin uudet protoplastit tai sulatettiin nopeasti juoksevan veden alla -70 °C:seen pakastetut pro- 30 toplastit. Suurin piirtein sama määrä eri geenityyppien protoplasteja pipetoitiin varovaisesti polykarbonaatti-sentrifuugiputkiin. Vastavalmistettujen protoplastien sameus määritettiin ja fuusio suoritettiin useissa eri kon-sentraatioissa. Jokaisen putken tilavuus säädettiin P-pus-35 kurin avulla 5,0 ml:ksi.
35 9 0 0 8 7 4. Fuusioseoksia sentrifugoitiin kiihtyvyydellä noin 1 000 g, 7 min.
5. Supernatanttiliuos dekantoitiin varovaisesti. Protoplastipallo resuspendoitiin varovaisesti P-puskuriin 5 lopulliseen, 200 pl:n tilavuuteen.
6. Fuusioseokseen lisättiin nopeasti 800 μΐ 50- %:ista PEG-liuosta. Valmisteet sekoitettiin pasteur-pipetin avulla. Fuusiota inkuboitiin 2 min huoneenlämmössä. Lisättiin 9 ml P-puskuria PEG:n laimentamiseksi. Suo- 10 ritettiin lisää fuusioita sarjassa, jotta inkubointiaika-välit saatiin oikeiksi.
7. Fuusioseokset sentrifugoitiin kuten vaiheessa 4 yllä, supernatanttiliuos dekantoitiin varovaisesti ja fuusioidut, pestyt protoplastit resuspendoitiin 1,0 ml:aan 15 P-puskuria.
8. Fuusioseos laimennettiin sarjassa 10'1 ja 10'2 P-puskuriin.
9. Jokaisen kannan fuusio suoritettiin erikseen jokaisessa kokeessa, ja maljattiin kontrolleiksi.
20 10. Jokainen protoplastivalmiste (viable counts) laimennettiin ja maljattiin, jotta voitiin määrittää fuu-siomenetelmässä käytettyjen elävien organismien määrä.
Protoplastireqeneraatio 1. Protoplastisuspensiot, fuusioseokset tai itse- 25 fuusiot laimennettiin sopivasti P-puskuriin ja maljattiin 100 μ1:η määriä regenerointiagar-alustalle käyttäen hellävaraista levitystekniikkaa. Fuusioitujen protoplastien levittäminen soft-agar-pintaan ei huomattavasti parantanut regenerointia.
30 2. Yllä vaiheessa D.ll esitettyä menetelmää käytet tiin silloin, kun se soveltui.
3. Regenerointimaljoja inkuboitiin oikea puoli ylöspäin suljetuissa muovipusseissa 29 - 30 °C:ssa ja noin 95 %:n kosteudessa.
35 36 90087 4. Niissä protoplastifuusioissa, joissa spektino-mysiiniresistenssiä käytettiin dominoivana merkkiominaisuutena, regeneroitujen protoplastien päälle kaadettiin 18 tunnin jälkeen 3,5 ml autoklavoitua, 100 pg/ml spektinomy- 5 siiniä sisältävää soft-agaria (katso alla) <45 °C:ssa.
5. Protoplastit inkuboitiin 7-10 vuorokautta. Kasvatusalusta, reqenerointialusta ia protoplasti- puskuri Täydellinen reqenerointialusta 10 (Modifioitu julkaisusta Hopwood et ai., 1985. Gene tic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual, s. 235)
Perusliuos:
Sakkaroosia 205,0 g 15 K2S04 0,25 g
MgCl2-6H20 10,12 g
Glukoosi 10,00 g
Difcon kasaminohapot 0,1 g
Difcon hiivauute 5,0 g 20 Difcon Oatmeal-agar 3,0 g
Difcon Bacto-agar 22,0 g
Tislattu vesi ad 955,0 ml
Autoklavoitiin 25 min 121 °C:ssa. Autoklavoinnin jälkeen lisättiin steriiliä kantaliuosta: 25 KH2P04 (0'5 %) 10'° ml
CaCl2-2H20 5,0 ml L-proliini (20 %) 15,0 ml MES-puskuri (1,0 M) 10,0 ml
Hivenaineliuos* 2,0 ml 30 NaOH (IN) 3,0 ml pH säädettiin arvoon 6,5; tilavuus säädettiin 1 litraksi.
* Hivenaineliuos (litraa kohden)
ZnC2 40 mg 35 FeC3»6H20 200 mg 37 90087
CuCl2‘2H20 10 mg
MnC]-2 10 mg
Na2B4O7-10H20 10 mg 5 (ΝΗ4)6Μο7024·4Η20 10 mg
Spektinomvsiini-soft-aqar-päällvste Vastaa yllä esitettyä täydellistä regenerointialus-taa paitsi seuraavassa kohdin:
Agar 4,10 g 10 Autoklavoidaan kuten yllä. Jäähdytetään 55 °C:seen. Lisätään 100 mg spektinomysiiniä. Jaetaan 5 ml: n eriin suljettuihin viljelyputkiin. Jäähdytetään. Autoklavoidaan uudestaan juuri ennen käyttöä.
Modifioitu protoplasti (P) puskuri 15 Perusliuos: sakkaroosia 205,0 g K2S04 0,25 g
MgCl2-6H20 2,02 g
Tislattu vesi ad 977 ml 20 Autoklavoidaan 25 min 121 “C:ssa. Autoklavoinnin jälkeen lisätään seuraavia steriilejä kantaliuoksia tässä järjestyksessä: KH2P04 (0,5%) 1,0 ml
Hivenaineliuos* 2,0 ml 25 CaCl2-2H20 (3,68 %) 10,0 ml MES-puskuri (1,0 M) 10,0 ml pH säädetään arvoon 6,5; tilavuus säädetään 1 litraksi .
*Hivenaineliuosresepti esitetty yllä.
: 30 Modifioitu hiivauute-mallasuute-alusta (YEME)
Perusliuos:
Difcon hiivauute 3 g
Difcon Bacto-peptoni 5 g
Difcon Bacto-mallasuuteliemi 3 g 35 Glukoosi 10 g 38 9 0 0 87
Sakkaroosi 300 g
Tislattu vesi ad 973 g
Autoklavoidaan 25 min 121 °C:ssa. Autoklavoinnin jälkeen lisätään: 5 MgCl2*6H20 (2,5 M) 2 ml
Glysiini (20 %) 25 ml
Tilavuus säädetään 1 litraksi.
Kuvien selitykset
Kuvio 1: HPLC-kromatografian liuotinfraktioiden UV-10 seuranta (240 nm) ajan funktiona (min); liuotinuutetut rasvahappoa sisältämättömällä alustalla (WPM Syn A 40:40) kasvatetut S. avermitilis 1-3 (ATCC 53 567) -solut. Huippu kohdassa 13,12 vastaa oligomysiini A:ta.
Kuvio 2: HPLC-kromatografian liuotinfraktioiden UV-15 seuranta (240 nm); liuotinuutetut rasvahappoa sisältämättömällä alustalla (WPM Syn A 40:40) kasvatetut S. avermitilis MA4848 (ATCC 31 272) -solut. Tuotteet ovat luonnollisia avermektiinejä.
Kuvio 3: HPLC-kromatografian liuotinfraktioiden UV-20 seuranta (240 nm); liuotinuutetut syklopentyylikarboksyy-lihappoa sisältävällä alustalla (katso esimerkki 1) kasvatetut S. avermitilis 1-3 (ATCC 53 567) -solut.
Liitteenä olevat kuviot ovat esitettyjen yhdisteiden autenttisia HPLC-käyriä.
25 Seuraavissa esimerkeissä käytetyjen alustojen koos tumus esitetään alla. Kaikki molekyylipainot määritettiin nopea atomipommitus-massaspektrometrisesti VG-mallisella 7070E-massaspektrometrillä käyttäen trietyleeniglykolista ja kiinteästä natriumkloridista muodostuvaa näytematrii-30 siä. (M + Na*) määritettiin. Elektroni-isku-massaspektomet-ria suoritettiin käyttäen VG-mallista 7070F-massaspektro-metriä, jolla saatiin m/e-arvot. Vain pääfragmenttien arvot tallennettiin.
. 35 39 9 Π O 8 7 AS-7-alusta q/1 ohennettua tärkkelystä3 20
Ardamine pH*3 5
Q
Pharmamedia 15 5 CaC03 2 a
Valmistetaan hydrolysoimalla tärkkelystä Bacillus licheniformisin a-amylaasilla (saatavana kaupallisesti Nove Enzymes -yhtiöstä, Wilton, CT, USA, kauppanimellä 10 "Termamyl") dekstroosi-ekvivalenttiin 40 % ± 5 %.
^ Yeast Products, Inc., Clifton, NJ 07012, USA. c Traders Protein, Memphis, TN 38 108, USA. pH säädettiin arvoon 7,2 NaOHrlla.
15 AP-5-alusta q/1 ohennettu tärkkelys 80
Ardamiini pH 5 K-HPO, 1 2 4
MgS04·7H20 1 20 NaCl 1
CaC3 7
FeS04*7H20 0,01
MnCl2*7H20 0,001
ZnS04*7H20 0,001 25 P-2 000 (vaahdonesto) 1 ml/1 pH säädetään arvoon 6,9 lisäämällä 25-%:ista
NaOH:a.
WPM Svn A 40:40 q/1 tislattua H20 30 ohennettu tärkkelys 40 liukeneva perunatärkkelys 40 glutamiinihappo 1,0 arginiini 0,168 kystiini 0,084 ... 35 histidiini 0,069 4° ') O 0 8 7 leusiini 0,798 lysiini 0,297 metioniini 0,108 fenyylialaniini 0,168 5 treoniini 0,174 tryptofaani 0,048 tyrosiini 0,192 k2hpo4 1,0
MgS04-7H20 1,0 10 NaCl 1,0
CaC03 3,5
FeS04-7H20 0,01 Μπ012·4Η20 0,001
ZnS04-7H20 0,001 15 pH säädettiin arvoon 6,8 - 7,0, sekoitettiin 30 min 121 °C:ssa.
WPM Svn B 40:40 g/1 tislattua vettä liukeneva perunatärkkelys 40 20 ohennettu tärkkelys 40 glutamiinihappo 0,390 arginiini 0,168 kystiini 0,084 histidiini 0,069 25 lysiini HC1 0,297 metioniini 0,108 fenyylialaniini 0,168 treoniini 0,174 tryptofaani 0,048 30 tyrosiini 0,192 k2hp4o 1
MgS04-7H20 1
NaCl 1
CaC0~ 3,5 4i 90 08 7
FeSO„·7Ho0 0,01
MnCl2*4H20 0,001
ZnS04*7H20 0,001 pH säädettiin arvoon 6,8 - 7,0, sekoitettiin 30 min 5 121 eC:ssa.
Yleisiä korkeapainenestekromatoqrafia (HPLC) -mene- telmiä
Liikkuva faasi: 150 ml vettä 10 70 ml asetonitriiliä tilavuus säädetään 1 litraksi metanolilla
Pylväs:
Ultrasphere ODS 25 cm (Beckman Instruments, Fullerton, CA 92 634 - 3 100, USA) 15 nopeus: 0,75 ml/min detektio: UV, 240 nm vaimennus: melkein 6 Näytelaimennusliuos (D): 35 ml asetonitriiliä + 390 ml metanolia 20 Standardit: 1. punnittiin 0,5 mg avermektiini A2A:ta 10 ml:n pulloon ja säädettiin tilavuus metanolilla 2. punnittiin 0,5 mg testituotetta 10 pulloon ja säädettiin tilavuus metanolilla 25 1 ja 2 ovat standardikantaliuoksia; standardikäyttöliuok- sia varten: otettiin 100 μΐ (l):tä ja 100 (2):ta putkeen, lisättiin 800 μΐ liikkuvaa faasia Näytteet: 30 1. otetaan 1 ml hyvin ravisteltua lientä; sentrifu- goidaan pohjaan 2. poistetaan mahdollisimman paljon supernatanttia vahingoittamatta pellettiä 3. lisätään 100 μΐ HPLC-vettä pellettiin ja disper- 35 goidaan sekoittaen vortex-laitteella 42 ; 0 0 8 7 4. lisätään 2 ml laimenninta (D) ja sekoitetaan hyvin 5. Suodatetaan ja ajetaan HPLC.
Luonnolliset avermektiinit alistettiin tähän HPLC-5 kromatografiamenetelmään ja yksittäisten avermektiini- huippujen retentioajat jaettiin oligomysiini A:n retentio-ajalla, joka toimi sisäisenä standardina jokaisessa HPLC-määrityksessä. Oligomysiini A: ta esiintyy melkein aina HPLC:ssä S. avermitilis -fermentointien sivutuotteena, ja 10 on ainoa HPLC:ssä näkyvä tässä esitettyjen mutanttien tuote, jos ne viljellään R-COOH-vapaassa alustassa, tai alustassa, josta puuttuu kaavan R-COOH mukaisiksi hapoiksi muutettavia yhdisteitä, jolloin R on kuten tässä määritetty. Tavallisesti oligomysiini A:n retentioaika on 12,5 -15 14 min. Retentioaikojen (RT) suhde antaa paremman pohjan avermektiinituotteiden luonteen ja saannon vertauksille. Yleensä avermektiinituotteet esiintyvät HPLCrssä seuraa-vassa järjestyksessä B2, A2, B1 ja AI (kuvio 2). Luonnolliset avermektiinit RT/RT (oligomysiini A) 20 B2b 0,70 B2a 0,84 A2b 0,90 A2a 1,09
Blb 1,40 25 Bla 1,83
Alb 1,83
Ala 2,42
Ei-luonnolliset avermektiinit RT/RT (oligomysiini A) syklopentyyli-B2 0,94 30 syklopentyyli-A2 1,23 syklopentyyli-Bl 1,99 syklopentyyli-Al 2,62
Suhteet määritettiin luonnollisille avermektiineil-le kuvion 2 perusteella (huomaa että Bla ja Alb eivät ole 35 erottuneet) ja ei-luonnollisille avermektiineille kuvion 3 43 9 Π O 8 7 perusteella. Retentioajat vaihtelevat 1-2 min päivästä toiseen, jolloin oligomysiini A yleensä esiintyy noin 12,5 - 14 min:n kohdalla.
Seuraavissa esimerkeissä avermektiinit määritettiin 5 yllä esitettyä HPLC-menetelmää käyttäen.
Esimerkki 1
Svklopentvvliavermektiini A2 S. avermitilis -kantaa 1-3 (ATCC 53 567) viljeltiin 28 - 30 °C:ssa 24 tuntia AS-7-alustalla ravistellen. Ino-10 kulointiin käytettiin 5 ml:n näytettä 500 ml:n pulloa kohden, jossa oli 100 ml AS-7-alustaa ja viljelmää inkuboi-tiin samoissa olosuhteissa 24 tuntia; 1 ml tätä viljelmää käytettiin AP-5 -alustan inokulointiin (40 ml 300 ml:n pullossa) johon 24 tuntia myöhemmin lisättiin 0,4 g/1 syk-15 lopentaanikarboksyylihappoa (natriumsuolana). Tuotantopul- loja ravisteltiin 28 - 30 “C:ssa. Inkuboitiin 240 tuntia, minkä jälkeen oli tuotettu 35 mg/1 syklopentyyliavermek-tiiniä A2, kun vastaavan luonnollisen avermektiinin tiit-teri oli 0. Muitakin syklopentyyliavermektiinejä oli tuo-20 tettu.
Esimerkki 2
Svklopentvvliavermektiini A2 Käytettiin jäähdytettyä S. avermitilis HL-026 -kantaa (ATCC 53 568) sisältävää putkea, ja inokuloitiin 25 100 ml AS-7-alustaan 500 ml:n pullossa. Kasvatettiin inku- boiden 28 - 30 °C:ssa ravistelleen 24 tuntia. Käytettiin 1 ml näytteitä inokuloimaan vielä kaksi 500 ml:n pulloa lisää, joissa oli 100 ml AS-7-alustaa, ja näitä pulloja inkuboitiin 18 tuntia, minkä jälkeen ne käytettiin 10 lit-30 ran AP-5-alustan (vähemmän NaCl:a) inokulointiin. Inkuboi tiin 24 tuntia 28 °C:ssa, minkä jälkeen alustaan lisättiin 0,4 g/1 syklopentaanikarboksyylihappoa. Ravisteltiin niin, että liuenneen hapen osapaine oli yli 20 %. Syklopentyyli-A2:n tiitterit 120, 168, 216, 264 ja 312 tunnin jälkeen 35 olivat 16, 40, 65, 88 ja vastaavasti 110 mg/1. Vertailuna 44 ') 0 087 vastaavan luonnollisen avermektiinin A2a tiitteri oli 0 (s.o. ei määritettävissä) näissä näytteissä.
Esimerkki 3
Syklopentvyliavermektiini A2 5 Tässä esimerkissä tuotantoalasta oli rikastettu, ja syklopentaanikarboksyylihapon lisäys tehtiin useassa erässä, jotta syklopentyyliavermektiinin tiitteri nousisi. Ym-pin kasvatuksen ja fermentoinnin olosuhteet olivat kuten esimerkissä 2 esitettiin seuraavalla erolla: AP-5-alus- 10 taan lisättiin 5 g/1 Ardamine pH -tuotetta (lopullinen määrä siis 10 g/1) ja syklopentaanikarboksyylihappoa lisättiin 0,4, 0,2 ja 0,2 g/1 30,172 ja vastaavasti 220 tunnin jälkeen. Syklopentyyliavermektiinin A2 tiitterit olivat 1,2, 11, 78, 137 ja 214 mg/1 120, 168, 216, 264 ja 15 vastaavasti 312 tunnin jälkeen.
Esimerkki 4
Syklopentvvli-avermektiinit Käytettiin jäähdytettyä S. avermitilis HL-026 -kantaa (ATCC 53 568) sisältävää putkea, jolla inokuloi-20 tiin 100 ml AS-7-alustaa 500 ml:n väliseinällisessä pullossa ja viljelmää inkuboitiin 28 - 30 °C:ssa 24 - 28 tuntia. Käytettiin 1 ml tätä viljelmää inokuloimaan 300 ml:n pullo, jossa oli 40 ml AP-5-alustaa (vähemmän NaCl:ia mutta 0,6 g/1 glutamiinihappoa lisätty). Inkuboitiin 96 tun-25 tia 28 - 30 °C:ssa ravistelleen, minkä jälkeen lisättiin 0,4 g/1 syklopentaanikarboksyylihappoa (natriumsuolana). HPLC-kromatografiällä 216 tunnin jälkeen otetusta näytteestä osoitettiin syklopentyyliavermektiinejä B2, A2, B1 ja AI retentioajoilla 12,32, 15,86, 25,28 ja vastaavasti 30 32,96 min.
Esimerkki 5
Syklopentvyliavermektiini A2
Tässä esimerkissä kasvatettiin S. avermitilis -kantoja 1-3 (ATCC 53 567) ja HL-026 (ATCC 53 568) ident-35 tisissä olosuhteissa. Käytettiin kolme alustaa (AP-5, WPM
45 90087
Syn A 40:40 ja WPM Syn B 40:40). Käytettiin jokaisen organismin pakastettua viljelmää inokuloimaan 100 ml AS-7-alusta 500 ml:n väliseinällisissä pulloissa, joita tämän jälkeen inkuboitiin 24 - 26 tuntia 28 - 30 °C:ssa. Jokai-5 sesta viljelmästä käytettiin 1 ml inokuloimaan 300 ml:n pulloja, joissa oli 40 ml yllä mainittua alustaa. Jokaisella kasvatuksella oli rinnakkaispullo. Inkuboitiin 24 tuntia 28 °C:ssa ravistellen, minkä jälkeen jokaiseen pulloon lisättiin 0,4 g/1 syklopentyylikarboksyylihappoa 10 (natriumsuolana) ja yhteensä 192 tunnin inkubaation jäl keen määritettiin päätuotteen, syklopentyyliavermektiinin A2 tiitteri (taulukko I).
Taulukko I
15 Syklopentyyli- avermektiini
Kasvatusliemi S. avermitilis -kanta A2 mq/1_ AP-5 ATCC 53 567 29 ATCC 53 568 67 20 WPM Syn A 40:40 ATCC 53 567 35 ATCC 53 568 115 WPM Syn B 40:40 ATCC 53 567 38 ATCC 53 568 36 25 Esimerkki 6
Svkloheksvvliavermektiinit Tässä esimerkissä lisättiin 96 tunnin jälkeen 0,2 g/1 sykloheksaanikarboksyylihappoa syklopentaanikar-boksyylihapon tilalla, kaikki muut olosuhteet olivat kuten 30 esimerkissä 4 esitettiin. HPLC-kromatografiällä tunnistettiin neljä sykloheksyyliavermektiiniä 240 tunnin näytteestä. Sykloheksyyliavermektiinien B2, A2, B1 ja AI retentio-ajat olivat 14,84, 19,26, 31,46 ja vastaavasti 41,14 min.
. 35 46 90 087
Esimerkki 7 3-svkloheksenvvliavermektiinit Tässä esimerkissä lisättiin 96 tunnin jälkeen 0,2 g/1 3-syklohekseenikarboksyylihappoa syklopentaanikar-5 boksyylihapon tilalla, kaikki muut olosuhteet olivat kuten esimerkissä 4 esitettiin. HPLC-kromatografiällä tunnistettiin useita sykloheksenyyliavermektiinejä 312 tunnin näytteestä. Niiden retentioajat olivat 12,88 (B2), 16,39 (A2), 27,37/28,36 (B1 isomeerit) ja 35,80/37,13 (AI iso-10 meerit) min.
Esimerkki 8 3-tienvvliavermektiinit Tässä esimerkissä lisättiin 96 tunnin jälkeen 0,05 g/1 tiofeeni-3-karboksyylihappoa syklopentaanikarbok-15 syylihapon tilalla, kaikki muut olosuhteet olivat kuten esimerkissä 4 esitettiin. HPLC-kromatografiällä tunnistettiin neljä 3-tienyyliavermektiiniä 312 tunnin näytteestä.
3-tienyyliavermektiinien B2, A2, B1 ja AI retentioajat olivat 6,96, 8,76, 13,8 ja vastaavasti 23,5 min.
20 Esimerkki 9 1- metvvlitioetvvliavermektiinit Tässä esimerkissä lisättiin 24 ja 96 tunnin jälkeen 0,4 ja 0,2 g/1 2-metyylitiopropionihappoa syklopentaani-karboksyylihapon tilalla, kaikki muut olosuhteet olivat 25 kuten esimerkissä 4 esitettiin. HPLC-kromatografiällä tunnistettiin kaksi 1-metyylitioetyyliavermektiiniä 240 tunnin näytteestä. 3-tienyyliavermektiinien A2 ja B1 retentioajat olivat 9,30 ja vastaavasti 13,06 min. Huippu, jonka retentioaika oli 7,2 minuuttia ja joka esiintyi 7,557 30 minuutin huipun etureunalla tulkittiin B2-yhdisteeksi ja Al-yhdisteen uskotaan olevan 17,22 minuutin huipun alla.
Esimerkki 10 2- pentvvliavermektiinit Tässä esimerkissä lisättiin 96 tunnin jälkeen 35 0,2 g/1 2-metyylivaleriaanahappoa syklopentaanikarboksyy- 47 :) G 0 87 lihapon tilalla, kaikki muut olosuhteet olivat kuten esimerkissä 4 esitettiin. HPLC-kromatografiällä tunnistettiin neljä 2-pentyyliavermektiiniä 312 tunnin näytteestä. 2-pentyyliavermektiinien B2, A2, B1 ja AI retentioajat oli-5 vat 12,88, 16,58, 31,90 ja vastaavasti 41,92 min.
Esimerkki 11 l-metvvli-3-butenvvliavermektiinit Tässä esimerkissä lisättiin 96 tunnin jälkeen 0,2 g/1 2-metyyli-4-penteenihappoa syklopentaanikarboksyy-10 lihapon tilalla, kaikki muut olosuhteet olivat kuten esimerkissä 4 esitettiin. HPLC-kromatografiällä tunnistettiin neljä l-metyyli-3-butenyyliavermektiiniä 312 tunnin näytteestä. l-metyyli-3-butenyyliavermektiinien B2, A2, B1 ja Ai retentioajat olivat 11,13, 14,78, 22,10 ja vastaavasti 15 28,92 min.
Esimerkki 12 l-metvvli-1-butenwliavermektiinit Tässä esimerkissä lisättiin 96 tunnin jälkeen 0,2 g/1 2-metyyli-2-penteenihappoa syklopentaanikarboksyy-20 lihapon tilalla, kaikki muut olosuhteet olivat kuten esimerkissä 4 esitettiin. HPLC-kromatografiällä tunnistettiin neljä 1-metyyli-l-butenyyliavermektiiniä 312 tunnin näytteestä. 1-metyyli-l-butenyyliavermektiinien B2, A2, B1 ja AI retentioajat olivat 11,59, 14,93, 25,29 ja vastaavasti .. 25 33,18 min.
Esimerkki 13 Tässä esimerkissä esitetään mutantin käyttöä luonnollisten, L-valiinista johdettujen avermektiinien tuottamiseksi L-isoleusiinista johdettujen avermektiinien puut-30 tuessa. Pakastetun S. avermitilis -kantaa 1-3 (ATCC 53 567) sisältävän putken sisältö siirrettiin 500 ml:n vä- liseinälliseen pulloon, jossa oli 100 ml AS-7-alustaa. Noin yhden vuorokauden ravistelun (noin 200 rpm) jälkeen 28 - 30° C:ssa otettiin 1 ml:n näyte ja inokuloitiin sil-35 lä 40 ml WPM Syn A 40:40 -alusta 300 ml:n pullossa, jora 48 .)0087 tämän jälkeen inkuboitiin 28 - 30 °C:ssa 24 tuntia ravistellen. Tämän aikana lisättiin 4 ml steriilisuodatettua isovoihappoliuosta (4 mg/ml, neutraloitu pH-arvoon 6-7 NaOHrlla) ja inkubaatiota jatkettiin kuten yllä yhteensä 5 8 vuorokautta. HPLC-analyysissä löytyi neljä päähuippua (oligomysiinin lisäksi). (Samankaltaisissa kokeissa, joissa isovoihappo korvattiin 2-metyylivoihapolla, näkyivät L-isoleusiinista johtuvat vastaavat neljä avermektiinihuip-pua.
10 Esimerkki 14
Esimerkissä 1 esitetty menetelmä toistettiin, mutta syklopentaanikarboksyylihappo korvattiin alla luetelluilla lähtöyhdisteillä. Määrätyssä fermentoinnissa tunnistetut avermektiinit (kaavan I mukaiset yhdisteet, joissa R2 on 15 oleandroosidisakkaridiosa ja R, R1 ja R3 ovat kuten esitetään) luetellaan myös alla.
49 90 0 87 in t''· ιο cr\ σ' co <r> oh in rH rr o ch o >i ooin ,h cn Nn h -¾1 ° m co c^ co
CO CN CN CN Ή CN CO CN rH
< c^^'J'in co in O co in in
CO O' co co ^ o' ^ o in CN CN
•H Tf CO [N VO rH O 10 O' in Ή O
G H ' ' *· r
-H COl CN rH >H rH rH rH Η Ή CN CN >H
*H
CO
>1 ε O oocoih m <n cd m co co o
D> 00 O' CO CN O O ^ en Ό CN CN CO
H CNOrHO cOC^O> CN in σ> (N tN
(\J ». »»vs. ss··* * s s s. «·
O <| iH rH rH iH OO^ *H *H iH »H O
•w' e->
Di \ co O' in ooocom in
E-1 in O 00 CN VO o CO CD
OJ co σ' in σ> cn ^ in • * CN « * ' >-vvv »
0) CQl Ή Ο Ο Ο ο Ο Ή rH rH O
P 0 0
E-ι -H
«H I
b-i r-1 ·Η -Η ·Η I
I H rH rH rH I O
HI C‘H Η >η ΪΝ J>i CO H
H CN 0) rH >1 >1 >i tH I -P
iHI CO Ν-ΗίΝ+J CO -P CO -H
>, C X >ι Η -M C X a X rH
Id) 0) I >( O 0) Q) 0) φ >1
CN -P £ CN>iX) a £ £ JG -H >1-H
I C O IHO O O O OrH+JrH
•P 0) rH-HCOH rH I-H rH rH>i<D>i c a * η <d 4h * * x x * >ι ε ϊν
Q) I >1 >i -H I >i >1 >1 >t >i C I -P
K| a 'Φ C0 >i -P CO co CO CO CO in H) H HI
o III
O a I -H -H -H
0< O-ι I Ή Ή I—I f-H
a (0 I ·Η H >1 >1 >1 I
«j .c * h sh>i>i>iIh i
jC H O >1 >iC0C0C0<0-H
CO C .Ω Sh CO * * * * G
cot-icn * ο ο ο ι o
co cu m * oxixixirH-H
(01*0 .Q Η Η Η i a
-H -Η Λ H <0 (U <0 ·Η O
Hl C H O <0 * * * G H
Φ +j ίο to a * -π -η -π o)o a one co *a-H c c c ω a o P (0 0) CO I (0 G CO (0 ¢0 10 a Ή
C0> a * O CN £ (0 (0 ¢0 ¢0 *(0+J
•Η -Η -H Q) a I -H «J -P to pi Q) £ -H
TirHrH x: a ή c -p c * a jc -h .h x;>i>i oiuccog Q) to a) o h >, >·ΝίΝ 01 Ο Λ a £ £ Η >ι ΪΗ
O -P -P * ·Η 0) 0 H OO OO OO OO *>1 -PO
p o) a) >< h mas na h a h a h a >1 co <d a £ ε ε co >, o a'p * a * a * a * a mx εa :(0 I I I >1 -H (0 I >i<0 >i (0 >i (0 >i (0 10 I <0 J CN CN rH CO -P.CC0 CO £ CO £ (il £ (il £ CO £ OI £ 0)
P
CO
H
Ό
£ O rH
Jmihcn co τίΐηνο in co σ> rH rn -o 30 0 87
CO
CO
co rH *.
<1 Ή C σ>
VO
H O
C H *.
rl CQl «H
•rl
CO
I1
O ON
CT en
•rl VO (N VO l> VO
rl N · i—I CO vOvO
O <1 o e e e e
C C C -H -H -H -H e C
„ -H -H -H 3 3 3 3 -rl -rl £ 3 3 3XXXX0 3
02 X X X XX
\ ON (0 (0 (0 (0 ΕΗοοιοίοιοΕεεεαιο 02 m. e ε ε <0 ro to to ε ε <Ν * <ο (0 to to to to to to ro ·· CQI o to m ιο to to
P
o 3 ε*
Ή *H Ή -H
»H »H rH ·Η «H ·Η ‘H »H
Ή 5*1 Ή H H i—( rH
7* ^ 7* >i >i >i >i >i >i
i*C S* CP CP-P-P
I 0) I 0)0)30)333
co a co x a x a x x x IOIOOOOOOO
C H (h H H rH rH rH r—j r~H
Q> * a).*.*.*.*.*.*.* Ή >1 -rl >1 >1 >, >, >1 >1 >1 021 4-> tn-p to to to to toto to
•H
I I e I Ή ·Η Ή
H CC -H
ή i o o i ε i
O Ή -r| O (0 O
>1 h i aan -Hioo m x -h o o λ; i ^ -ri p a >i to ρ ρ S>h >iC ro a o m x a a to i >i ro j* ro
X *H O ·Η -rl -rl -r| -P (0 Ή X
P h X H h rH r-H Q) *rH i—| -rl m2 b h ί* b >· e 3 p >v e
S 10 >1 >1 >1 >, -H X -P >, O
P I P X to P -P -P rHOlOP-H
o) co o) -ri x e φ e >iH(0ca -hi ε e to ο) ε ro -h >1 j* ,η x o 'o -h -h -h o) -h £ a -H an +j >i >v o p £2 C C0C (1) Ό O O to-rl 00 3 CO CO -H Q, >0) .V (0 MH >1 rH rH ^C-HCX-H.*.* —
O 0)0 0(0 O X *0 Λ20 0(0 X (0 O -HO >1-H
p mh a p p -no) tn a ts a pro >.a rn >, χ ton x oa ό e ΡΌ toa toa op too x >, ρ — :(0-Hro >id) IH 1(0 1(0 >1 3 lp iPP(0 l>i p x x a co (o co x cox xx toa to o.* esc 0)
P
CO
•H
Ό X es co ^ in vd c^ co οι o ή
;^·*Η rH rH rH rH rH rH rH (N (N
5i 90087 00^ ΙΏ CM rH 00
LTO LO CM
I—I v *. v
<| CM H CM
— 00 Λ
< CM H
CT> rH
•rl **
C rH rH tH
•rl CQI •rl CO >
E
O vo >h in σ> vo oo tj) cm co σ' oo o ro 'vr
•rl H CM O H O' CM O
rH CM - - v
O rtJI G t—I rH i-H o rH rH
---' Ή 3
Eh X OH
OS CM OH 00 O
\ Φ rH CO 00 CO
EH B CO CO U0 os φ - - o cm co o o o ·· mi
<D
P
O I
3 I -H CM I
Eh OH I 0
H Ph G H H
X >i 0) X H
"H Pi I *H i>H rH
H CO CM -P CO Pi pi *H I *rH *rl *rH Qj pi H -H C rHr-H H -H 0
I Ph H CD Ph Pi Ph H G
OO Ph Pi μ Pi Pi Ph Ph a
I μ Pi C G μ μ Pi O
C Φ α Φ 3 Φ -G (Dan
Φ E O a Uh E H E O
H I tH I I I pH I iH Pi
+J rHdOM CM in Pi rH a CO
mi
O O I
Λα h
tH I a I rH
(0 Ή Φ *H pi X C Λ C Ph •rl (0 -H I (0 (0
. rH G (0 C CM (0 JC
uo φ h a φ I a o φ -μ ο φ η ο λ μ μ g o i co go μ oca aa cm φ a a a φ rito oa I o φ a o a μ c η ίο μ a μ Φ ηφ ·η φ ι o .* λ c a ο λ .* .c c μ 00 -Η Ρη-Η φ (0 Η ·Η Ρη·Η Φ ιο — a co η α λ μπ coh φ rl I Ο Ή Ph ·Η Η Ή Ή Pt a
Ό CM tl rH Pi rH C H Pi rl Pi O
Λ laitto Ph φ Ph co Pito g > h-h >iX Pi φ Pi* PiJic a o h-h μο μ g μο μο oo μ PiH φλ Φ 3 φλ φλ πα Λ Pi Pi EG Ε Η EG EG a «0 μ Ph I Φ I I ΙΦΙΦΡιΦ
J φ G h ji CM CM inp; μ .* co .G
Φ μ
CO
•rl Ό Λ cm oo ^ invo es co
Ph OM CM OM CM CM CM CM
52 9 O u 8 7
Muita fysikaalis-kemiallisia tietoja annetaan alla olevassa taulukossa joidenkin yllä esitettyjen yhdisteiden kohdalla.
Yhdiste Fvsikaalis-kemiallinen tieto 5 6 (A2) valkoinen jauhe; sp. 135 - 140 °C.; mole- kyylipaino = 925; m/e 596, 454, 321, 303, 275, 237, 219, 209, 191, 179, 167, 145, 127, 113, 111, 95 ja 87.
10 6 (AI) valkoinen jauhe; sp. 120 - 124 °C.; mole- kyylipaino = 907; m/e 578, 303, 275, 257, 219, 191, 167, 145, 127, 113, 111, 95 ja 87.
15 6 (B2) valkoinen jauhe; sp. 110 - 112 °C.; mole- kyylipaino = 911; m/e 321, 303, 261, 257, 237, 219, 209, 191, 179, 167, 145, 127, 113, 111, 95 ja 87.
20 6 (Bl) valkoinen jauhe; sp. 135 - 138 °C.; mole- kyylipaino = 893; m/e 303, 261, 257, 219, 191, 167, 145, 127, 113, 111, 95 ja 87.
8 (A2) valkoinen jauhe; sp. 112 - 117 °C.; mole- 25 kyylipaino = 953; m/e 624, 482, 349, 331, 275, 265, 247, 237, 219, 207, 195, 179, 145, 127, 113, 111, 95 ja 87.
10 (A2) valkoinen jauhe; sp. 131 - 135 °C.; mole- 30 kyylipaino = 951; m/e 624, 480, 347, 329, 275, 263, 245, 235, 217, 205, 193, 179, 145, 127, 113, 111, 95 ja 87.
12 (A2) valkoinen jauhe; sp. 167 °C.; molekyyli- 35 paino = 953; m/e 349, 331, 275, 265, 257, 247, 237, 219, 195, 145, 127, 113, 95 ja 87.
53 90087
Esimerkki 15
Svklopentvvliavermektiinin A2 talteenotto Tässä esimerkissä kuvataan syklopentaanikarboksyy-lihappoprekursorista muodostettujen A2-tapaisten avermek-5 tiinien talteenottomenetelmää. Kasvatusliemi (saatu esimerkin 2 mukaisesta fermentoinnista) suodatettiin ja my-seelisolumassa uutettiin kaksi kertaa asetonilla (3-ker-tainen tilavuus). Asetonifaasit väkevöitiin vesipohjaiseksi öljyksi, öljy uutettiin metyleenikloridilla ja mety-10 leenikloridiliuos väkevöitiin tummanruskeaksi öljyksi.
Tummanruskea öljy liuotettiin metanoli/vesi-seokseen (4:1) ja saatu liuos uutettiin heksaanilla rasvahappojen/lipidien poistamiseksi. Metanolin/veden haihdutus antoi vaaleanruskean öljyn, jossa oli noin 10 % (p/p) syklopentyy-15 liavermektiiniä A2. Raaka avermektiiniöljy laimennettiin tämän jälkeen kloroformilla (3 ml CHCl3:a grammaan öljyä), aktiivihiiltä (0,35 g/g öljyä) ja piigeeliä (1 g/g öljyä) lisättiin, ja seosta ravisteltiin tunnin ajan, minkä jälkeen se suodatettiin. Suodos väkevöitiin ja saatu öljy 20 laimennettiin isopropyylieetterillä (1 ml IPE:ä grammaan öljyä). Saatu liuos tiputettiin hiljalleen suureen tilavuuteen heksaania (25 ml heksaania/g öljyä), minkä jälkeen valkoinen raaka-avermektiinijauhe saostui. Ensimmäinen saalis erotettiin suodattamalla ja suodos jäähdytettiin 25 noin 5 °C:seen, jolloin toinen saalis saostui.
Raakatuotteet käsiteltiin vielä preparatiivisella HPLC-kromatografiällä, jolloin saatiin puhdistettu tuote. Raakatuotteet liuotettiin 25/25/25/50/0,125 IPE/CH3CN/etyy-liasetaatti/heksaani/etikkahappo-seokseen (4,1 ml liuotin-30 ta grammaan raakajauhetta). Näytteet injisoitiin 41,4 mm x .. 25 cm:n preparatiiviseen piidioksidipylvääseen ja eluoi- tiin yllä mainitulla liuottimena nopeudelle 30 ml/min, ja tuotetta sisältävä huippu otettiin talteen. Kerätyt fraktiot väkevöitiin ja laimennettiin Me0H/H20:lla (85/14) si-35 ten, että 1 ml:ssa oli noin 50 mg tuotetta. Näytteet ruis- 54 9 0 0 8 7 kiitettiin tämän jälkeen C-18-preparatiiviseen pylvääseen (samat mitat kun piidioksidipylväällä) ja eluoitiin nopeudella 18 - 20 ml/min Me0H/H20:lla (275 ml H20/2 litraa metanolia). Fraktiot väkevöitiin taas ja kaadettiin taas 5 kerran C-18 prep-pylvääseen. Tuotetta sisältävän fraktion haihduttaminen kuivaksi antoi puhtaan halutun tuotteen.
Vastaavat syklopentyyliavermektiinit B2, AI ja B1 saadaan keräämällä vastaavat fraktiot yllä esitetyissä HPLC-vaiheissa.
10 Esimerkki 16 S. avermitilis -kannan JC 923 (ATCC 53 669) YPD-2-agar-alustalla kasvatettua myseeliä käytettiin inokuloi-maan 50 ml AS-7-alusta 300 ml:n väliseinällisessä pullossa, jota ravisteltiin (220 rpm) 30 °C:ssa 24 tuntia. Tämän 15 jälkeen inokuloitiin kaksi 300 ml: n pulloa (ei väliseiniä), joissa oli 50 ml AP-5-alustaa, 1 ml:lla yllä mainittua viljelmää. Toisessa pullossa oli 2-metyylivoihap-poa (0,1 %) ja toisessa ei. Fermentointi suoritettiin 30 °C:ssa 11 päivää ravistellen. Molempien pullojen sisäl-20 tö käsiteltiin samalla tavalla. Kasvatusliemi uutettiin nelinkertaisella tilavuudella asetonitriili/metanoli-seos-ta (810:75). Ravisteltiin voimakkaasti antibiootin uuton soluista parantamiseksi, minkä jälkeen kirkastettu super-natantti analysoitiin HPLC:llä avermektiinien suhteen. Kun -25 rasvahappoja ei alunperin lisätty, ei myöskään löydetty määritettävissä olevia avermektiinejä (tyyppiä "a") (herkkyys < 0,20 mg/1). 2-metyylibutyyrihapon läsnäollessa määritettiin avermektiinejä B2a, A2a, Bla ja Ala 0,5, 1,3, 1,4 ja vastaavasti 1,1 mg/1.
30 Esimerkki 17 Tässä esimerkissä suoritettiin AP-5:ssä S. avermitilis -kannan JC 923 (ATCC 53 669) tuotantofermentointi käyttäen AS-7-ymppiä kuten esimerkissä 16. Lähtöyhdistet-tä, 2-metyylivoihappoa, oli 0,05 %. Tässä tapauksessa ri-35 kastamaton kontrollifermentointi (ei rasvahappolisäystä) 55 90087 antoi seuraavat arvot avermektiineille B2a, A2a, Bla ja Ala: 0,3, 0,9, < 0,2 ja < 0,2 mg/1, kun taas rasvahapolla rikastetun fermentoinnin arvot olivat 2,8, 5,0, 4,5 ja vastaavasti 2,3 mg/1.
5 Esimerkki 18 Tässä esimerkissä suoritettiin AP-5:ssä S. avermi-tilis -kannan JC 923 (ATCC 53 669) tuotantofermentointi käyttäen AS-7-ymppiä kuten esimerkissä 17. Tässä esimerkissä lisättiin 2-metyylivoihappoa 0,05 %:n konsentraa-10 tiossa 48 tuntia AP-alustan inokulaation jälkeen, ja solut otettiin talteen suodattamalla, punnittiin (märkäpaino) ja uutettiin nelinkertaisella ylimäärällä uutosliuotinta. Tämä väkevöintivaihe antoi suuremman herkkyyden avermek-tiinen tiitterin määrittämisessä edellisiin tapauksiin 15 verrattuna, jossa alkuperäinen kasvatusliemi uutettiin.
Esillä olevassa esimerkissä B2a-, A2a-, Bla- ja Ala-tasot olivat 2,5, 8,5, 4,5 ja 3,5 mg/1 2-metyylibutyyrihappori-kastetussa fermentoinnissa verrattuna rikastamattoman fermentoinnin arvoihin 0,3, 0,3, 0,3 ja 0,1. Nämä jälkimmäi-20 set, alhaiset arvot johtuvat ilmeisesti AP-5-raaka-alu-stan endogeenisten rasvahappoyhdisteiden alhaisesta tasosta.
Esimerkki 19
Fermentoinnit suoritettiin kuten esimerkissä 18, 25 sillä erolla, että 0,045 %:nen 2-metyylivoihappo korvattiin syklopentaanikarboksyylihapolla. Syklopentyyliaver-mektiini A2:n konsentraatioksi mitattiin 4 mg/1.
Esimerkki 20 S. avermitilis -kannan PGS-119 (ATCC 53 670) fer-30 mentoinnit (16 kpl) suoritettiin 50 ml:ssa AP-5-alustaa 300 ml:n pulloissa (ei väliseiniä) 30 °C:ssa. Alusta ino-kuloitiin 1 ml :11a AS-7-alusta 24 tuntia viljelyllä kannalla, 50 ml alustaa inkuboitiin 30 °C:ssa 300 ml:n väli-seinällisissä pulloissa. Kasvatettiin 66 tuntia ΛΡ-5 35 -alustassa ja lisättiin 0,1 % isovoihappoa kahdeksaan pui- 56 9 0 087 loon. Käyttäen esimerkin 16 mukaista puhdistusmenetelmää, näiden pullojen B2b, A2b, Blb ja Alb saannot olivat (kahden kokeen keskiarvona) 5,6, 45, 45 ja vastaavasti 68 mg/1. Rikastamattomat viljelmät antoivat 0,5, 4,0, 4,5 ja 5 <8,5 mg/1. Lisäksi viimeksi mainituissa fermentoinneissa määritettiin vastaavien avermektiinien B2a, A2a, Bla ja Ala arvoiksi 1,1, 1,1, määrittämätön ja < 0,2 mg/1.
Esimerkki 21 Tässä esimerkissä suoritettiin neljä S. avermiti-10 lis -kannan PGS-119 (ATCC 53 670) AP-5 fermentointia 2 ml:n viljelminä muovisissa putkissa (15 ml). Ympit valmistettiin kuten esimerkissä 20 AS-7-alustassa, 30 °C:ssa ravistellen putkia 30°:een kulmassa. Rasvahappoprekurso-ria, sykloheksaanbikarboksyylihappoa lisättiin kahteen 15 putkeen 0,045 %:n konsentraationa 96 tuntia AP-5-inokulaa-tion jälkeen. Inkuboitiin 400 tuntia AP-5-inokuloinnin jälkeen (inokuloitiin 0,05 ml:11a AS-7-viljelmää), lisättiin 8 ml liotinta (asetonitriili/metanoli-seosta 810:75) ja avermektiinitiitterit määritettiin supernatanteista 20 HPLC-analyysilla kuten tekstissä kuvattiin. Avermektiinien CHC-B2, CHC-A2, CHC-B1, CHC-A1, A2b, Blb, Alb, A2b ja Ala konsentraatiot vastasivat arvoja (kahden putken keskiarvoina) 3,5, 6,2, 30, 1,4, 0,2, 0,2, 0,4, 0,2 ja vastaavasti < 0,2 mg/1. Vastaavat arvot niille kahdelle putkelle, 25 joihin ei lisätty prekursoria, olivat < 0,2, < 0,2, < 0,2, < 0,2, 4,2, 2,9, 9,3, 1,2, 0,3 mg/1. Kaikki muut luon nolliset avermektiinit olivat määrittämättömissä.
Claims (9)
1. Streptomyces avermitilis, AT CC 53 670, jolta puuttuu haarautuneen 2-oksihapon dehydrogenaasi- ja haa- 5 rautuneen aminohapon transaminaasiaktiivisuus.
2. Streptomyces avermitilis, ATCC 53 567 tai ATCC 53 568, jolta puuttuu haarautuneen 2-oksihapon dehydroge-naasiaktiivisuus.
3. Streptomyces avermitilis, ATCC 53 669, jolta 10 puuttuu haarautuneen aminohapon transaminaasiaktiivisuus.
4. Menetelmä avermektiinin valmistamiseksi, jolla on kaava R1 15. fH3 X tt°^r <n H>c oXT || OH] 20 rrX 0_-T^ch3 OR3 jossa 25 katkoviiva asemassa 22 - 23 edustaa mahdollista kaksoissidosta; R1 on hydroksi ja on läsnä vain, jos kaksoissidosta ei ole; R2 on 4'-(α-L-oleandrosyyli)-α-L-oleandrosyylioksi, 30 jolla on kaava ch3 ch3 V- o V-o HO—( V-0—{ V-0 ; ch3o ch3o 58 ) η ο δ 7 R3 on vety tai metyyli; ja R on α-haarautunut C3_8-alkyyli, -alkenyyli, -al-koksialkyyli tai -alkyylitioalkyyliryhmä; C5_8-sykloalkyyli-alkyyliryhmä, jossa alkyyliryhmä on α-haarautunut C2_5-al-5 kyyliryhmä; C3_8-sykloalkyyli- tai C5_8-sykloalkenyyliryhmä, joista kumpi tahansa voi mahdollisesti olla substituoitu metyleenillä tai yhdellä tai useammalla C1.4-alkyyliryhmällä tai halogeeniatomilla; tai 3 - 6-jäseninen, happea tai rikkiä sisältävä heterosyklinen rengas, joka voi olla tyy-10 dyttynyt tai täysin tyydyttymätön ja joka mahdollisesti voi olla substituoitu yhdellä tai useammalla C1.4-alkyyli-ryhmällä, tunnettu siitä, että fermentoidaan aerobisissa olosuhteissa Streptomyces avermitilis -kantaa, josta puuttuu haarautuneen 2-oksihapon dehydrogenaasiak-15 tiivisuus tai haarautuneen aminohapon transaminaasiaktii- visuus tai molemmat entsyymiaktiivisuudet, vesipohjaisessa kasvatusalustassa, jossa on assimiloitavaa typpilähdettä, hiililähdettä ja epäorgaanisia suoloja sekä yhdistettä, jolla on kaava R-COOH, tai yhdistettä, jonka Streptomyces 20 avermitilis pystyy muuttamaan mainituksi hapoksi, jolloin R on edellä määritelty.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R on muu kuin isopropyyli tai (S)-sek-butyyli.
6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään S. avermitilis -kantaa ATCC 53 567, ATCC 53 568, ATCC 53 669 tai ATCC 53 670 tai niiden jälkeläistä.
7. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että yhdisteeksi R-COOH muutettavissa oleva yhdiste on R-(CH2)n-Z, jossa R on edellä määritelty; n on 0 tai 2; ja Z on -CH20H, -CHO tai -C00R5, jolloin R5 on vety tai CW)-alkyyli, tai kun Streptomyces avermitilis -kannalta puuttuu vain haarautuneen aminohapon 35 transaminaasiaktiivisuus, yhdisteeksi R-COOH muutettavissa 59 .) π O 8 7 oleva yhdiste on R-CO-Z, jossa R ja Z ovat edellä määritelty j ä.
8. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R on syklobutyyli, syklopen- 5 tyyli, sykloheksyyli, sykloheptyyli, 3-sykloheksenyyli, 1-sykloheksenyyli, 4,4-difluorisykloheksyyli, isopropyy-li, sek-butyyli, 2-tienyyli, 3-tienyyli, 4-tetrahydropyra-nyyli, 3-furyyli, 3-tetrahydrotienyyli, 4-tetrahydro-tiopyranyyli, 4-metoksi-2-butyyli, 1-metyylitioetyyli, 10 2-pentyyli, l-metyyli-3-butenyyli, 1-metyyli-l-butenyyli, 4-penten-2-yyli, sykloheksen-l-yyli, 1-metyylisyklopropyy-li, 2-penten-2-yyli, 2-furyyli, 5-metyylitien-2-yli, syk-lopropyyli tai 3-tietanyyli.
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että R on syklopentyyli, sykloheksyyli tai tienyyli. 60 9 0 0 8 7
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US651287A | 1987-01-23 | 1987-01-23 | |
US651287 | 1987-01-23 | ||
US10782587A | 1987-10-13 | 1987-10-13 | |
US10782587 | 1987-10-13 |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI880279A0 FI880279A0 (fi) | 1988-01-22 |
FI880279A FI880279A (fi) | 1988-07-24 |
FI90087B true FI90087B (fi) | 1993-09-15 |
FI90087C FI90087C (fi) | 1993-12-27 |
Family
ID=26675723
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI880279A FI90087C (fi) | 1987-01-23 | 1988-01-22 | Foerfarande foer framstaellning av avermektiner samt vid detta foerfarande anvaendbara streptomyces avermitilis -stammar |
Country Status (26)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0284176B1 (fi) |
JP (1) | JPH0817694B2 (fi) |
KR (1) | KR900007937B1 (fi) |
CN (1) | CN1065277C (fi) |
AP (1) | AP53A (fi) |
AR (1) | AR244344A1 (fi) |
AU (1) | AU636709B2 (fi) |
BG (1) | BG48572A3 (fi) |
CA (1) | CA1338141C (fi) |
CZ (1) | CZ290312B6 (fi) |
DE (1) | DE3883408T2 (fi) |
DK (1) | DK175724B1 (fi) |
EG (1) | EG18796A (fi) |
ES (1) | ES2058244T3 (fi) |
FI (1) | FI90087C (fi) |
HU (1) | HU203130B (fi) |
IE (1) | IE62467B1 (fi) |
IL (1) | IL85119A (fi) |
MA (1) | MA21161A1 (fi) |
MX (1) | MX169293B (fi) |
MY (1) | MY102581A (fi) |
NO (2) | NO172447C (fi) |
NZ (1) | NZ223270A (fi) |
PT (1) | PT86582B (fi) |
RU (1) | RU2096462C1 (fi) |
YU (2) | YU47877B (fi) |
Families Citing this family (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ATE89604T1 (de) * | 1987-10-23 | 1993-06-15 | Pfizer | Verfahren zur herstellung von aglykonen von avermectin und sie enthaltende kulturen. |
GB8807280D0 (en) * | 1988-03-26 | 1988-04-27 | Pfizer Ltd | Antiparasitic agents |
GB8809232D0 (en) * | 1988-04-19 | 1988-05-25 | Pfizer Ltd | Antiparasitic agents |
GB8811036D0 (en) * | 1988-05-10 | 1988-06-15 | Glaxo Group Ltd | Chemical compounds |
US5057499A (en) * | 1989-06-02 | 1991-10-15 | Merck & Co. Inc. | Avermectin derivatives |
US5030622A (en) * | 1989-06-02 | 1991-07-09 | Merck & Co., Inc. | Avermectin derivatives |
NZ238521A (en) * | 1990-06-22 | 1992-12-23 | Merck & Co Inc | Process for the conversion of avermectin glycone to avermectin mono- and disaccharides by fermentation with streptomyces avermitilis ma6078 |
NZ240128A (en) * | 1990-10-15 | 1994-01-26 | Merck & Co Inc | Production of 13-beta and 5-beta ivermectin monoglucopyranosides from |
US5250422A (en) * | 1990-10-15 | 1993-10-05 | Merck & Co., Inc. | Biotransformation process for the production of invermectin derivatives |
US6103504A (en) * | 1992-03-25 | 2000-08-15 | Pfizer Inc. | Process for production of avermectins and cultures therefor |
US5292647A (en) * | 1992-11-30 | 1994-03-08 | Eli Lilly And Company | Strain of streptomyces for producing avermectins and processes therewith |
CN1038330C (zh) * | 1993-07-05 | 1998-05-13 | 塞泰克斯公司 | 阿弗麦菌素的生产与分离 |
ES2204914T3 (es) * | 1993-07-30 | 2004-05-01 | Pfizer Inc. | Genes que codifican el complejo alfa cetoacido deshidrogenasa de cadena ramificada de streptomyces avermitilis. |
US5466102A (en) | 1993-12-16 | 1995-11-14 | Kennametal Inc. | System for coupling machine tools |
GB9716567D0 (en) * | 1997-08-05 | 1997-10-08 | Pfizer | Process |
GB9825402D0 (en) | 1998-11-19 | 1999-01-13 | Pfizer Ltd | Antiparasitic formulations |
ATE514337T1 (de) | 2001-09-17 | 2011-07-15 | Lilly Co Eli | Pestizide formulierungen |
CN101560535B (zh) * | 2009-05-26 | 2012-05-23 | 浙江升华拜克生物股份有限公司 | 一种基于代谢参数our补糖发酵生产阿维菌素工艺 |
EP2490697A1 (en) | 2009-10-19 | 2012-08-29 | Intervet International B.V. | Method and formulation for the control of parasites |
RU2454420C1 (ru) * | 2011-03-31 | 2012-06-27 | Автономная Некоммерческая Организация "Научно-Исследовательский Центр Биотехнологии Антибиотиков И Других Биологически Активных Веществ "Биоан" | Цитотоксические полусинтетические производные макролидного антибиотика олигомицина а и способ их получения |
CN104877925B (zh) * | 2014-02-28 | 2018-05-25 | 中国科学院沈阳应用生态研究所 | 一种异壁放线菌和三种新的抗真菌maclafungins类化合物及其制备和应用 |
CN116602242B (zh) * | 2023-05-08 | 2024-01-23 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 一种提高反季鱼苗成活率的方法 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE434277B (sv) | 1976-04-19 | 1984-07-16 | Merck & Co Inc | Sett att framstella nya antihelmintiskt verkande foreningar genom odling av streptomyces avermitilis |
US4429042A (en) | 1978-09-08 | 1984-01-31 | Merck & Co., Inc. | Strain of Streptomyces for producing antiparasitic compounds |
NZ204074A (en) * | 1982-05-10 | 1986-05-09 | Merck & Co Inc | Synergistic compositions containing avermectins |
NZ207655A (en) * | 1983-04-07 | 1986-09-10 | Merck & Co Inc | Synergistic veterinary compositions containing an avermectin compound and clorsulon |
NZ210505A (en) * | 1983-12-22 | 1988-06-30 | Merck & Co Inc | Parasiticidal compositions containing avermectin or milbemycin derivatives |
US4579864A (en) * | 1984-06-11 | 1986-04-01 | Merck & Co., Inc. | Avermectin and milbemycin 13-keto, 13-imino and 13-amino derivatives |
ES8800986A1 (es) * | 1985-07-27 | 1987-12-01 | Pfizer | Un procedimiento para la produccion de un nuevo derivado de avermectina |
GB8606120D0 (en) * | 1986-03-12 | 1986-04-16 | Glaxo Group Ltd | Process |
EP0240274A3 (en) * | 1986-04-03 | 1990-03-14 | Merck & Co. Inc. | Avermectins as growth promotant agents |
-
1988
- 1988-01-18 ES ES88300353T patent/ES2058244T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-01-18 DE DE88300353T patent/DE3883408T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-01-18 BG BG082655A patent/BG48572A3/xx unknown
- 1988-01-18 IL IL85119A patent/IL85119A/xx not_active IP Right Cessation
- 1988-01-18 EP EP88300353A patent/EP0284176B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-01-19 MA MA21398A patent/MA21161A1/fr unknown
- 1988-01-21 YU YU10988A patent/YU47877B/sh unknown
- 1988-01-21 CA CA000556996A patent/CA1338141C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-01-21 PT PT86582A patent/PT86582B/pt unknown
- 1988-01-21 CZ CS1988408A patent/CZ290312B6/cs unknown
- 1988-01-22 AR AR88309889A patent/AR244344A1/es active
- 1988-01-22 NZ NZ223270A patent/NZ223270A/en unknown
- 1988-01-22 RU SU884355097A patent/RU2096462C1/ru active
- 1988-01-22 NO NO880262A patent/NO172447C/no not_active IP Right Cessation
- 1988-01-22 AP APAP/P/1988/000077A patent/AP53A/en active
- 1988-01-22 CN CN88100373A patent/CN1065277C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1988-01-22 FI FI880279A patent/FI90087C/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-01-22 NO NO880261A patent/NO172446C/no not_active IP Right Cessation
- 1988-01-22 MX MX026651A patent/MX169293B/es unknown
- 1988-01-22 HU HU88259A patent/HU203130B/hu unknown
- 1988-01-22 DK DK198800286A patent/DK175724B1/da not_active IP Right Cessation
- 1988-01-22 IE IE15988A patent/IE62467B1/en not_active IP Right Cessation
- 1988-01-22 KR KR1019880000469A patent/KR900007937B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-01-22 JP JP63012461A patent/JPH0817694B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-01-25 MY MYPI88000058A patent/MY102581A/en unknown
- 1988-02-21 EG EG3488A patent/EG18796A/xx active
-
1990
- 1990-05-21 YU YU99090A patent/YU47886B/sh unknown
-
1991
- 1991-02-15 AU AU71113/91A patent/AU636709B2/en not_active Expired
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
FI90087B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av avermektiner samt vid detta foerfarande anvaendbara streptomyces avermitilis -stammar | |
US5077278A (en) | Non-natural demethylavermectins compositions and method of use | |
FI90088B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av b-avermektiner och vid foerfarandet anvaendbar odling | |
US5583015A (en) | Process for production of avermectins | |
US5234831A (en) | Cultures for production of B avermectins | |
EP0313297B1 (en) | Process for production of avermectin aglycones and cultures therefor | |
US5240850A (en) | Cultures for production of avermectin aglycones | |
US5525506A (en) | Process for production of avermectins and cultures therefor | |
US5387509A (en) | Ethylated avermectins | |
US6103504A (en) | Process for production of avermectins and cultures therefor |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
FG | Patent granted |
Owner name: PFIZER INC |
|
BB | Publication of examined application | ||
FG | Patent granted |
Owner name: PFIZER INC. |
|
MA | Patent expired |