NO172447B - Fremgangsmaate for fremstilling av b-avermectiner - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av B-avermectiner med Streptomyces avermitilis som mangler 0-metyltransferaseaktivitet for avermectin B og dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer.

US-patent 4.310.519 og 4.429.042 beskriver avermectinene, som utgjør et kompleks av beslektede midler med betydelig antiparasittisk aktivitet, og deres fremstilling ved aerob fermentering av stammer av Streptomyces avermitilis; nemlig S. avermitilis ATCC nr. 31267, 31271 og 31272. De to siste av de angitte stammer utgjør henholdsvis en dypfryst ampulle og et lyofilisert rør av en kultur oppnådd ved ultrafiolett bestråling av S. avermitilis ATCC 31267.

EP 214.731 av 18. mars, 1987, beskriver en rekke forbindelser (her omtalt som ikke-naturlige avermectiner) som er beslektet med de naturlige eller kjente avermectiner, men som har en ny substituentgruppe i 25-stillingen, samt en fremgangsmåte for fremstilling av disse ved fermentering av en avermectin-dannende organisme i nærvær av visse nærmere angitte karboksylsyrer, eller derivater eller forløpere derav (precursors). S. avermitilis-organismer benyttet til fremstilling av de nevnte nye C-25-substituerte avermectiner er S. avermitilis ATCC 31267, 31271, 31272 og NCIB 12121. Sistnevnte organisme, beskrevet i EP 214.731, oppnås fra S. avermitilis ATCC 31271. Denne gir forbedret utbytte av de nye C-25-substituerte avermectiner når den dyrkes i et "semi-defined" medium. Både ATCC 31267, 31271, 31272 og NCIB 12121 kan i tillegg til de nye C-25-substituerte derivater, også produsere varierende mengder av de kjente eller naturlige avermectiner, hvor 25-substituenten er isopropyl eller (S)-sek-butyl (1-metylpropyl).

Karbonskjelettet av avermectinene (vist nedenfor i formel (I)) skriver seg fra acetater og propionater, og C-25-substituenten av naturlige avermectiner fra L-isoleucin (R=(S)-sek-butyl) eller L-valin (R=isopropyl) [Fisher & Mrozik, "Macrolide Antibiotics", Academic Press (1984) Ch. 14] .

Ved "kjente" eller "naturlige" avermectiner menes de avemectiner som produseres av S. avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271 og ATCC 31272, hvor substituenten i 25-stillingen enten er isopropyl eller (S)-sek-butyl (1-metylpropyl). Avermectiner hvor substituenten i 25-stillingen er forskjellig fra isopropyl eller sek-butyl (S-form) omtales her som nye eller ikke-naturlige avermectiner.

Stammene av S. avermitilis angitt i ovennevnte US-patenter danner en klasse av substanser som der generisk er beskrevet som C-076. Klassen omfatter åtte distinkte, men nært beslektede forbindelser beskrevet som C-076 Ala, Alb, A2a, A2b, Bla, Blb, B2a og B2b. "a"-serien av forbindelser refererer til de naturlige avermectiner hvor 25-substituenten er (S)-sek-butyl, og "b<H->serien til de hvor 25-substituenten er isopropyl. Betegnelsene "A" og "B" refererer til avermectiner hvor 5-substituenten er henholdsvis metoksy eller hydroksy. Endelig, viser tallet "1" til avermectiner som i 22-23-stillingen har en dobbeltbinding; og tallet "2" til avermectiner som har et hydrogen i 22-stilling og hydroksy i 23-stilling.

I denne søknad benyttes ingen slike kjennemerker for 25-substituenten i ikke-naturlige avermectiner. Kjennemerkene Al, A2, Bl og B2 er bibeholdt for å angi ikke-naturlige avermectiner som har strukturelle trekk som korresponderer med det som ovenfor er angitt for naturlige avermectiner.

Frembringelse av mutanter som mangler dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer er beskrevet for Bacillus subtilis, Willecke & Pardee, J. Biol. Chem. 246. 5264-72

(1971) og Pseudomonas putida, Martin et al., J. Bacteriology, 115, 198-204 (1973), men ikke for Streptomyces.

S. avermitilis Agly-1, en mutant stamme som praktisk talt bare produserer avermectin aglykon Ala og A2a, er rapportert av Schulman et al., J. Antibiot. 38(11), 1494-1498 (1985). Fermentering av S. avermitilis Agly-1 i nærvær av sinefungin, som forårsaket øket produksjon av avermectin aglykon B-komponenter, er også rapportert. Likeledes resulterte S. avermitilis 08, en høytytende stamme for avermectiner, ved fermentering i nærvær av sinefungin som hemmer av O-metyl-transferaser, i produksjon av avermectiner som manglet 0-metylgrupper på aglykonet ved C-5 og i oleandrose-disakkarid-delen.

US-patent 4.378.353 beskriver C-076-relaterte forbindelser og deres fremstilling ved dyrking av MA-5218, en mutant av S. avermitilis ATCC 31272 som oppnås fra denne ved ultrafiolett bestråling. Mutanten er betegnet ATCC 31780. De C-076-relaterte forbindelsene som fremstilles av mutanten, mangler C-076-furanringen. I enkelte av de omtalte forbindelsene er én eller begge oleandrosesukker-delene dessuten avspaltet mens gruppen i 5-stilling hos andre er oksydert til en ketogruppe.

Tre klasser av O-metyltransferase-mutanter av S. avermitilis som danner avermectiner med manglende 0-metylgrupper, er beskrevet av Ruby et al., 6th International Symposium on the "Biology of Actinomycetes", Debrecen, Ungarn, august 26-30 (1985) og Schulman et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 31, 744-7 (1987). Den første klassen produserer primært B-avermectiner fordi de mangler evne til metylering av C-5 hydroksylgruppen i den makrocykliske laktonring. Den andre klassen danner 3'-0, 3"-0-bis-demetyl-avermectiner (avermectiner som mangler O-metylsubstituenten i 3-stillingen i begge oleandrose-monosakkarid-restene), og som refereres til som demetylavermectiner. Den tredje klassen er ute av stand til å metylere i noen som helst posisjon.

Schulman et al., Fed. Proe. 44., 931 (1985) beskriver øket produksjon av B-avermectiner ved fermentering av S. avermitilis i nærvær av substanser som sinefungin, S-adenosyl-etionin og S-adenosylhomocystein som hemmer avermectin-B-O-metyltransferaseenzymet i å metylere C-5 hydroksgruppen i aglykon-delen. Streptomyces avermitilis-mutanter som mangler 0-metyltransferaseaktivitet og produserer økede mengder avermectin-B-komponenter, er også beskrevet av Schulman et al., i Antimicrobial Agents and Chemotherapy 29. 620-624

(1986).

Mutagenese av S. avermitilis fører til mutanter som mangler dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer. Mutantene har ikke lenger evnen til å danne vesentlige mengder av de naturlige avermectiner når det under fermenteringsprosessen mangler tilsatt RCOOH, hvor R er isopropyl eller (S)-sek-butyl, eller en forbindelse som kan omdannes til RCOOH. Det er nå høyst overraskende funnet at mutantene danner avermectiner, naturlige og ikke-naturlige, ved fermentering i nærvær av en tilsatt forbindelse R-COOH, hvor R er isopropyl eller (S)-sek-butyl eller en annen nærmere angitt gruppe, eller i nærvær av en forløper til den nevnte RCOOH. Enda mer overraskende er det at de her beskrevne mutanter, som kun mangler dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer, og som er ute av stand til å nedbryte L-isoleucin, L-leucin eller L-valin, kan assimilere et bredt utvalg av forbindelser via avermectin-biosyntesen under produksjon av ikke-naturlige avermectiner som er fri for naturlige avermectiner.

Mutagenese av de således frembragte enkeltblokkerte mutanter fører til mutanter som mangler både dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer og 0-metyltransferaseaktivitet for avermectin B. Forbausende nok, danner disse dobbeltblokkerte mutanter i det vesentlige kun naturlige- og ikke-naturlige B-avermectiner når de dyrkes i nærvær av en tilsatt forbindelse R-COOH, hvor R er som angitt ovenfor.

Som nevnt, fremstilles de naturlige avermectiner som en kompleks blanding av åtte distinkte, men nær beslektede forbindelser; formel (I), R=isopropyl og (S)-sek-butyl. Selv om de har kunnet isoleres i tilnærmet ren form (se US-patent 4.429.042) er metodikken, i beste fall, omstendelig. B-avermectinene har i alminnelighet bedre anthelmintisk virkning enn de tilsvarende A-avermectinene. Fremstillingen av ikke-naturlige avermectiner (A og B komponenter) i henhold til fremgangsmåten beskrevet i EP 214.731, kan også danne varierende mengder av noen av de naturlige avermectiner som følge av forekomst av dehydrogenase for forgrenede 2-oksosyrer, og av aminosyrene L-valin og L-isoleucin i S. avermitilis mikroorganismenes celler og i det medium som benyttes for deres fremstilling.

Muligheten for å fremstille kun de mer bioeffektive B-komponenter av naturlige- eller ikke-naturlige avermectiner slik at antallet og kompleksisiteten av produktene reduseres og renheten av det valgte avermectin således kan økes, og separasjonsteknikken dermed forenkles, har vært et ønskelig mål.

S. avermitilis-stammer som mangler dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer, produseres ved mutasjon av avermectinproduserende stammer av S. avermitilis og spesielt ved mutasjon av S. avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271, ATCC 31272 eller NCIB 12121. Mutantene kan ikke syntetisere naturlige avermectiner uten at fettsyren, eller en forløper til denne, som har isopropyl- eller sek-butyl- (S-form) gruppen, tilsettes til fermenteringsmediet for mutantene. De er i stand til produksjon av naturlige og ikke-naturlige avermectiner ved fermentering under vandige aerobe betingelser i et næringsmedium som inneholder en passende "primer"-syre eller en forbindelse som kan omdannes til en sådan under fermenteringsprosessen.

Mutanter som er karakterisert ved deres manglende dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer, isoleres fra de muterte koloniene på basis av en <14>C02-bestemmelse. Ved denne teknikk indikerer manglende <1A>C02-utvikling i permeabiliserte celler fra et substrat av [<14>C-1]-2-oksoisokapronsyre eller [<14>C-1]-2-okso-3-metyl-valeriansyre eller av [UC-1]-2-okso-3-metyl-smørsyre at dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer mangler.

Det var overraskende og uventet at de her beskrevne mutanter som manglet dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer, bibeholdt evnen til å produsere avermectiner, spesielt ikke-naturlige avermectiner. Mutanter med manglende evne til å danne naturlige fett-acyl koenzym A-derivater ved vekst på et konvensjonelt medium, kunne ha vært en letal mutasjon dersom membranintegriteten hadde vært avhengig av de nevnte derivater, eller dersom 2-oksosyre-akkumulering av førstnevnte mutant hadde ført til cytotoksisitet. Det var dessuten ikke forventet at noen av mutantene skulle være i stand til å syntetisere acetyl-CoA og propionyl-CoA ved nedbrytende metabolisme av L-isoleucin og L-valin, idet dette fordrer de enzymaktiviter som mutantene mangler. Behovet for disse ovennevnte acyl-CoA-derivater for avermectin-biosyntese har ført til den antagelse at mutantene ved produksjon av ikke-naturlig avermectin, kunne være alvorlig svekket, noe som altså ikke var tilfellet.

Den manglende dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer i de her beskrevne mutanter, resulterer i at syntese av forgrenet-fett-acyl-CoA fra nedbrytning av L-isoleucin, L-leucin og L-valin, og derved, syntesen av naturlige avermectiner, forhindres, bortsett fra når R-COOH (hvor R er (S)-sek-butyl eller isopropyl) eller en forløper, tilsettes til fermenteringsmediet.

Videre mutering av mutanter som mangler dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer, danner mutanter som dessuten mangler O-metyltransferaseaktivitet for avermectin B. Mutanter som mangler O-metyltransferaseaktivitet for avermectin B kan ikke metylere C-5 oksygenet i avermectinenes aglykon-del. Mutanter som mangler denne virkning danner praktisk talt bare B-avermectiner ved at fremstillingen A-avermectiner forhindres.

Ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan man anvende enhver organisme, uansett forekomst eller fysiologisk oppførsel, som kan utvikles ved hjelp av transformasjon, transduksjon, genetisk rekombinasjon eller annen genetisk teknikk, ved å benytte en nukleinsyre eller ekvivalent materiale fra de her beskrevne arter som har oppnådd de karakteristiske sider ved de her beskrevne mutanter.

Uttrykket "avermectin" eller "avermectiner" refererer til forbindelser som har den senere angitte formel (I), men hvor 25-substituenten (R) kan være en hvilken som helst gruppe i denne posisjon som kan assimileres av S. avermitilis i henhold til oppfinnelsen.

De her beskrevne mutanter er meget verdifulle for fremstilling av ikke-naturlige B-avermectiner etter de fremgangsmåter som det her vil bli gitt eksempler på. De er spesielt verdifulle for fremstilling av foretrukne avermectiner, dvs. forbindelser hvor C-25-substituenten er C5-C6-cykloalkyl.

Mutering av en avermectin-produserende stamme av Stre<p>tomyces avermitilis oppnås ved kjente teknikker som benytter én av flere mutasjonsforårsakende midler, innbefattet ultrafiolett bestråling, røntgenbestråling, N-metyl-N'-nitro-N-nitroso-guanidin, etylmetansulfonat, salpetersyrling og nitrogen-sennepsgasser, f.eks. N-metylbis(2-kloretyl)amin, eller lignende. Mutagenesen kan foretas på sporer eller på en vegetativ kultur av S. avermitilis som er i stand til å produsere naturlige avermectiner, f.eks. S. avermitilis ATCC 31272.

Ved å følge fremgangsmåter som er velkjente på dette fagområdet, selekteres mutageniserte kolonier på manglende dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer, på basis av en biokjemisk metode som gjør det mulig å gjennomsøke et stort antall vilkårlig mutageniserte bakteriekolonier ved <14>C02-produksjon fra utvalgte [<14>C-1]-2-oksosyrer (Tabor et al., J. Bact. 128. 485-486, 1976).

Metodikken består i å dyrke mutantkoloniene i brønner i en mikrotiter-plate på et egnet næringsmedium, permeabilisere cellene med toluen og deretter tilsette [UC-1]-2-oksosyren (f.eks. 2-oksoisokapronsyre) til hver brønn og kontrollere den overstående atmosfære på <14>C02. Alternativt kan [UC-1] -2-okso-3-metylvaleriansyre eller [<14>C-1]-2-okso-3-metylsmørsyre benyttes i stedet for [<1>AC-1]-2-okso-isokapronsyre. Utviklingen av <14>C02 kontrolleres hensiktsmessig ved å anbringe fuktet Ba (OH) 2-mettet filtrerpapir over de enkelte brønner for å fange opp eventuelt frigjort <1A>C02 og påvise eventuelt dannet Ba14C03 ved autoradiografi. Mutanter som mangler dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer, gir autoradiogrammer som ligger nær opp til de ubehandlede (ikke-inokulerte) kontrollene; dvs. Ba<1A>C03 produseres ikke av mutantene.

De således oppnådde mutanter utsettes for videre mutagenese ved å benytte et av de ovenfor nevnte mutagener. Mutageniserte kolonier undersøkes på manglende O-metyltransferaseaktivitet for avermectin B ved kromatografi (tynnskiktskromatografi eller HPLC) etter fermentering i nærvær av tilsatt forløper (f.eks. 2-metyl-smørsyre). Avermectin A-forbindelser mangler praktisk talt fullstendig i fermenteringsbuljongen for slike mutanter.

I tillegg til dannelse av ønskede alleler av en gitt mikroorganismestamme ved mutagenese, muliggjør protoplastsammensmelting at ønskede alleler, produsert/identifisert i en stamme, overføres til kromosomet av en annen stamme. For eksempel kan én stamme av S. avermitilis som mangler dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer og 0-metyltransferaseaktivitet for avermectin B, ved protoplastsammensmelting med en S. avermitilis-stamme som har de nevnte aktiviteter, frembringe en stamme av S. avermitilis som kun mangler 0-metyltransferaseaktivitet for avermectin B. Som fagmannen vil innse muliggjør teknikken som tillater sammensmelting av protoplaster, kombinasjon av ønskelige alleler fra divergente seleksjonslinjer i en enkelt stamme.

De morfologiske og dyrkningsmessige karakteristika for mutantene som anvendes i henhold til oppfinnelsen, er generelt som beskrevet i US-patent 4.429.042. Særtrekkene ved mutantene utgjøres av deres mangel på dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer, og 0-metyltransferaseaktivitet for avermectin B, og disse karakteristika bestemmes som her beskrevet. Disse aktivitetsmangler resulterer i svikt når det gjelder mutantens evne til å produsere naturlige avermectiner ved dyrking i et definert medium som i det vesentlige er fritt for fettsyrer RCOOH, hvor R er isopropyl eller (S)-sek-butyl, eller forbindelser som kan omdannes til nevnte RCOOH under fermentering. En taksonomisk undersøkelse foretatt ved American Type Culture Collection har bekreftet at de karakteristiske trekk ved den mutante stamme 1-3, selektert ved den ovenfor angitte <14>C02-bestemmelse, er nær beslektet med opphavsstammen av ATCC 31272 beskrevet i US-patent 4.429.042, dog med visse unntak. Mutantstammen 1-3 (ATCC 53567) danner således betydelig færre sporekjeder enn ATCC 31272. I forsøk utført av søkerne, syntes raffinose ikke å opprettholde veksten av noen av disse stammer. I motsetning til hva som er angitt i beskrivelsen av ATCC 31272 i US-patent 4.429.042 har vi dessuten ikke kunnet påvise vekst av mutanten eller av ATCC 31272 med sukrose som eneste karbonkilde. Mutant 1-3 er negativ med hensyn til dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer. Den dobbelt negative mutant i henhold til oppfinnelsen, S. avermitilis 7881, som mangler dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer og 0-metyltransferaseaktivitet for avermectin B, fremstillet ved ytterligere mutagenese av mutant 1-3 (ATCC 53567), har en lignende taksonomisk relasjon til ATCC 31272 som den mutante stamme 1-3.

Streptomyces avermitilis 1-3 og 7881 er deponert i henhold til Budapest-traktaten i American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, et anerkjent depositorium som gir permanent oppbevaring og vil gi lett offentlig tilgjengelighet om denne patentsøknad innvilges. De har fått betegnelsen henholdsvis Stre<p>tomyces avermitilis ATCC 53567 og ATCC 53692.

Sålenge søknaden verserer er det deponerte materialet tilgjengelig etter tillatelse fra Commissioner of the United States Patent and Trademark Office i henhold til 37 CFR 1.14 og 35 USC 122, og i overensstemmelse med patentlovgivningen i andre land hvor søknaden er innlevert. Samtlige begrensninger i den offentlige tilgjengelighet til de deponerte mikroorganismer vil bli permanent fjernet ved patentets innvilgning.

Hver enkelt stamme av S. avermitilis ATCC 312 67, ATCC 31271, ATCC 31272 og NCIB 12121 danner de naturlige avermectinene med formel (I)

hvor den stiplede linje i 22-23-stilling utgjør en eventuell dobbeltbinding; R<1> er hydroksy og forekommer kun når dobbeltbindingen mangler; R2 er 4'-(alfa-L-oleandrosyl)-alfa-L-oleandrosyloksy med formel

R<3> er hydrogen eller metyl; og

R er isopropyl eller (S)-sek-butyl.

US-patent 4.285.963 beskriver et avermectin med formel (I) hvor 25-stillingen er substituert med en metyl- og en etyl-gruppe; R<1> er hydroksy og R3 er metyl.

I de nevnte ikke-naturlige avermectiner er R-substituenten forskjellig fra isopropyl eller (S)-sek-butyl og

som ovenfor definert.

De essensielle forbindelser som benyttes ved biosyntese av forbindelser med formel (I) forekommer i S. avermitilis-cellen og i mediet. Forbindelsene dannes ved nedbrytning av L-valin og L-isoleucin eller fra deres korresponderende 2-oksosyrer via dekarboksylering av 2-oksosyren med dehydrogenase for forgrenede 2-oksosyrer under samtidig kobling av produktet med koenzym A. Deres nærvær er ansvarlig for den samtidige dannelsen av både isopropyl- og (S)-sek-butylforbindelsene (I). Dette kompliserer selvsagt separeringen av isopropylderivatene fra (S)-sek-butyl-derivatene.

Ved fermentering i et næringsmedium som inneholder passende primer-forbindelse, danner mutantene i henhold til oppfinnelsen en forbindelse med formel (I) eller, oftest, en blanding av to eller flere forbindelser med formel (I), hvor R tilsvarer den anvendte primer-forbindelse. Inntil to produkter, hensiktsmessig betegnet R-avermectin Bl og B2, i henhold til betegnelsene benyttet i US-patent 4.429.042, kan dannes. "R-11-gruppen viser selvsagt til C-25-substituenten. Når R er cyklopentyl er for eksempel følgende to avermectiner mulige:

I de ikke-naturlige avermectiner er C-25-substituenten "R" med formel (I) forskjellig fra isopropyl eller (S)-sek-butyl .

De forbindelser som i henhold til oppfinnelsen kan utnyttes av S. avermitilis for biosyntese av naturlige og ikke-naturlige avermectiner, er forbindelser med formel (II-A) innbefattet forbindelser som kan omdannes til (II-A) under fermenteringsprosessen. Disse forbindelsene omtales her som "primer-forbindelser". I formel (II-A) er R en alfa-forgrenet gruppe og karbonatomet i denne som -COOH-gruppen er tilknyttet, er også bundet til minst to andre atomer eller grupper som er forskjellige fra hydrogen. Denne definisjonen omfatter selvsagt mettede acykliske og cykliske grupper.

Mer spesifikt, kan R, som blir C-25-substituenten, være en alfa-forgrenet C3-C8-alkylgruppe eller en C5-C8-cykloalkyl-gruppe.

Forbindelser som kan omdannes til RCOOH under fermenteringsprosessen, dvs. forløpere, er forbindelser med formel (II-B), hvor R er som ovenfor definert:

n er 0, 2, 4 eller 6; og Z er -CH20H, -CHO, -CH2NH2, -C00R<4 >eller -CONHR<5>, hvor R<4> er H eller (C^) alkyl; R<5> er hydrogen, (C1.4)alkyl eller en rest av en aminosyre, spesielt asparagin-syre, glutaminsyre og metionin, f.eks. henholdsvis -CH(C00H)CH2C00H, -CH (COOH) (CH2) 2COOH og -CH(COOH) (CH2) 2SCH3.

Innenfor rammen av denne oppfinnelse faller også anvendelse av de isomere former av formel-(II-A)-forbindelser og forbindelser som kan omdannes til slike under fermenteringsprosessen, samt fremstilling av de isomere avermectiner ved C-25 som resulterer fra anvendelse av disse i den her beskrevne prosess.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen utføres ved aerob fermentering ved 28-30°C ved hjelp av Streptom<y>ces avermitilis ATCC 53692 eller en mutant derav avledet fra utgangsstammen Streptomyces avermitilis ATCC 53567, som har tilnærmet de samme morfologiske egenskaper som utgangsstammen og som har evnen til å danne de ovennevnte avermectiner, av et vandig næringsmedium som består av en assimilerbar kilde for nitrogen, karbon og uorganiske salter og en syre med formelen R-COOH, eller en forbindelse som kan omdannes til nevnte syre under fermenteringsprosessen, hvor R er som angitt ovenfor. Syren eller forbindelsen som kan omdannes til denne, tilsettes ved inokuleringen eller til forskjellige tider under fermenteringen. Dannelsen av avermectin-produktene kan følges ved uttak av prøver fra fermentoren, ekstrahere dem med et organisk oppløsningsmiddel og vurdere produktet ved kromatografi, for eksempel høytrykks-væskekrornatografi. Inkuberingen fortsettes inntil maksimalt produktutbytte oppnås, i alminnelighet fra 4 til 15 dager.

En foretrukket tilsetningsmengde av primer-forbindelsene

(karboksylsyre eller forbindelse som kan omdannes dertil)

utgjør mellom 0,05 og 3,0 g per liter. Primer-forbindelsen kan tilsettes kontinuerlig, periodevis eller på én gang. Syren (RCOOH) tilsettes som sådan eller som et salt, f.eks. som natrium-, litium- eller ammoniumsaltet eller som en forbindelse som kan omdannes til syren. Er syren fast, oppløses den fortrinnsvis i et hensiktsmessig

oppløsningsmiddel, for eksempel vann eller (CX.A) alkoholer.

De anvendte fermenteringsmedier kan, spesielt når C-25-substituenten er isopropyl eller (S)-sek-butyl, være konvensjonelle medier som inneholder assimilerbare kilder av karbon, nitrogen og sporelementer. Når C-25-substituenten skal være en ikke-naturlig gruppe; dvs. ikke er isopropyl eller (S)-sek-butyl, utgjøres dyrkningsmediet av et medium som mangler de valgte ingredienser eller som bare inneholder minimale mengder primer-forbindelser, hvor R-delen er isopropyl eller (S)-sek-butyl.

Etter flere dagers fermentering ved en temperatur som fortrinnsvis ligger i området 24-33°C, sentrifugeres eller filtreres gjæringsvæsken, hvorpå mycelie-kaken ekstraheres med aceton eller metanol. Ekstraktet konsentreres, hvoretter det ønskede produkt ekstraheres over i et organisk oppløsningsmiddel som ikke er blandbart med vann, så som metylenklorid, etylacetat, kloroform, butanol eller metylisobutylketon. Ekstraktet konsentreres og råproduktet renses om nødvendig ved kromatografi, for eksempel ved preparativ, omvendt-fase HPLC.

Produktet oppnås i alminnelighet som en blanding av forbindelsene (I), hvor R<2> er 4'-(alfa-L-oleandrosyl)-alfa-L-oleandrosyloksy, R<1> er OH og dobbeltbindingen mangler, eller R<1 >mangler og dobbeltbindingen forekommer, og hvor R<3> er H. Forbindelser hvor R<3> er CH3 forekommer praktisk talt ikke. Blandingsforholdet for forbindelsene kan imidlertid variere med den spesielle mutant og primer-forbindelse som er benyttet, og med de anvendte betingelser.

Kilden for R-gruppen; dvs. hvorvidt den kommer direkte fra R-COOH eller dannes fra en av de nevnte forløpere, eller fra en hvilken som helst forløper, er uvesentlig for produksjonen av avermectinene. Avgjørende for deres fremstilling i henhold til oppfinnelsen, er at den ønskede R-gruppe under fermenteringsprosessen gjøres tilgjengelig for S. avermitilis-stammene i henhold til oppfinnelsen.

Egnede forbindelser innbefatter:

2,3-dimetylsmørsyre

2-metylheksansyre

cyklopentan-karboksylsyre

cykloheksan-karboksy1syre

cykloheptan-karboksylsyre

hydroksymetylcyklopentan

(S)-2-metylpentansyre

(R)-2-metylpentansyre

Tre klasser av O-metyltransferasemutanter kan oppnås fra de her beskrevne 2-oksosyre-dehydrogenase-negative mutanter. Mutanter hvor en mutasjon i aktiv 2-oksosyre-dehydrogenaseaktivitet er kombinert med én eller flere av O-metyl-transf erase-mutasj onene for å oppnå stammer av S. avermitilis som når de gis RCOOH-forbindelser eller forbindelser som kan omdannes til RCOOH under fermenteringen, danner i det vesentlige B-avermectiner, demetyl-avermectiner eller avermectiner som ikke er metylert i det hele tatt. Disse mutantene oppnås ved mutagenese av de her beskrevne mutanter som mangler dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer ved hjelp av ultrafiolett lys og/eller kjemiske mutagener så som N-metyl-N-nitroso-uretan, nitroso-guanidin eller andre midler, så som de tidligere angitte. Som et alternativ kan forgrenet-kjede 2-oksosyre-dehydrogenase-positive mutanter som mangler én eller flere av O-metyltransferasene, muteres ved behandling med UV-lys eller med et mutageniserende middel for å gi de forgrenet-kjede 2-oksosyre-dehydrogenase-negative mutanter.

De ikke-naturlige avermectiner fremstillet ved hjelp av slike mutanter, karakteriseres ved at de har hydroksygrupper i C-5-stillingen i aglykon-delen og/eller C-3' og/eller C-3"-stillingene i oleandrose-delene.

De ovenfor beskrevne mutanter identifiseres etter metodikken beskrevet av Schulman et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 29, 620-624 (1986). De kan benyttes for samme formål og på samme måte som kjente avermectiner.

Som et alternativ kan større mengder av B-avermectiner, innbefattet de som mangler metylgrupper på oleandrose-disakkarid-delen, fremstilles ved å dyrke de angitte mutanter, som mangler aktiv dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer, i nærvær av en substans, som sinefungin, S-adeno-syletionin eller S-adenosylhomocystein, som hemmer 0-metyltransferaseaktivitet.

Forbindelsene fremstillet i henhold til oppfinnelsen er meget aktive antiparasittiske midler med spesiell anvendelse som anthelmintika, ektoparasitticider, insekticider og akaricider.

Forbindelsene er således effektive ved behandling av en rekke tilstander forårsaket av endoparasitter, spesielt helminthiasis som oftest forårsakes av en gruppe parasittære ormer betegnet nematoder, og som kan forårsake alvorlige økonomiske tap av svin, sau, hest, kyr og andre husdyr, inklusivt fjærkre. Forbindelsene er også virksomme mot andre nematoder som angriper dyr, for eksempel Dirofilaria i hunder, og forskjellige parasitter som kan infisere mennesker, herunder gastrointestinale parasitter, så som Ancvlostoma. Necator, Ascaris, Strongyloides, Trinchinella. Capillaria. Trichuris. Enterobius og parasitter som forekommer i blod, vev og organer, så som filarier og ekstraintestinale stadier av Stronqyloides og Trichinella.

Forbindelsene har også betydning ved behandling av ektoparasittære infeksjoner, og særlig mot ektoparasittære artropoder, på dyr og fugl, så som blodmidd, midd, lus, lopper, spyfluer, bitende insekter og migrerende to-vingelarver, som kan angripe kveg og hester.

Forbindelsene er også insekticider med virkning overfor husholdnings-skadedyr som kakerlakker, klesmøll, museumsbiller og husfluer og mot skadeinsekter på lagret korn eller på kulturplanter, så som edderkopparter, bladlus og sommerfugl-larver, samt mot migrerende rettvinger, så som gresshopper.

Forbindelsene med formel (I) gis som et preparat egnet for den spesielt tiltenkte anvendelse, den spesielle art av vertsdyr som skal behandles og angjeldende parasitt eller insekt. For bruk som anthelmintikum kan forbindelsene gis peroralt i form av en kapsel, bolus, tablett eller flytende dose, eller alternativt, gis ved injeksjon eller som et implantat. Slike preparater fremstilles på konvensjonell måte i overensstemmelse med vanlig veterinærmedisinsk praksis. Kapsler, bolus-preparater eller tabletter kan således fremstilles ved å blande virkestoffet med et passende findelt fortynnings- eller bæremiddel som dessuten inneholder et sprengmiddel og/eller bindemiddel, så som stivelse, laktose, talk, magnesiumstearat etc. Et flytende preparat kan fremstilles ved å dispergere virkestoffet i en vandig oppløsning sammen med dispergerings- eller fuktemidler, og injiserbare preparater kan fremstilles i form av en steril oppløsning som kan inneholde andre substanser, for eksempel tilstrekkelige mengder av salter eller glukose til å gjøre oppløsningen isotonisk med blodet. Disse preparatene vil variere med hensyn til vekt av virkestoff, avhengig av arten av vertsdyr, grad og type av infeksjon og pasientens vekt. For peroral administrasjon gis i alminnelighet en dose på 0,001-10 mg per kg. legemsvekt som en enkeltdose eller som avdelte doser i 1-5 dager. Det vil imidlertid selvsagt være situasjoner hvor høyere eller lavere doseområder er indikert.

Som et alternativ, kan forbindelsene gis med dyrefo<A>ret, og i så fall kan en konsentrert fo<A>rtilsetning eller forblanding for tilblanding til det vanlige fo<A>r, fremstilles.

For bruk som insekticid og for behandling av skadegjørere i landbruket kan forbindelsene påføres som sprøytemiddel, dustepulver, emulsjoner og lignende, etter vanlig landbruks-praksis.

De angitte forbindelser oppløses i 1 liter 0,1N HC1.

Sporer ble høstet fra tre slike skåler og suspendert i

20 ml 0,05M tris-maleinsyre-buffer, pH 9,0.

Trinn 2. 10 ml av sporesuspensjonen ble tilsatt til et glass som inneholdt 10 mg N-metyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG). Glasset ble inkubert og ristet ved 28°C i 60 minutter, hvorpå sporene ble vasket grundig med 1% NaCl-oppløsning.

Trinn 3. De vaskede sporene ble suspendert i 1% NaCl og blandet med et like stort volum 80% etylenglykol. Suspensjonen ble oppbevart ved -20°C og benyttet som cellekilde for gjennom-søkning med henblikk på mutanter. Den ga ca. 10<*> kolonier/ml ved spiring.

Dette sporeforrådet ble utspredd på YPD-plater for å gi ca. 100 kolonier per plate (YPD-mediet besto av 10 g/liter av hver av gjærekstraktene, Bacto peptone<*> og dekstrose; og 15 g/liter Bacto agar<*>, justert til pH 6,9 før autoklavering) ingredienser merket med stjerne leveres av Difco Laboratories, Detroit, Michigan 48238, U.S.A.

Trinn 4. Enkeltkolonier ble overført fra plater etter 2-3 ukers vekst ved 28°C og anbragt i individuelle brønner i en standard 96-brønns mikrotiter-plate. Litt av kolonien ble også overført til et friskt agarmedium for å tjene som kilde av levedyktige celler ved mutant-identifiseringen.

Trinn 5. Til hver brønn ble det tilsatt ca. 75 /zliter av et flytende M9-saltmedium inneholdende 1% glykose, 0,1% casaminosyrer og 0,01% hver av isovalerian-, isosmør- og 2-metylsmør-syrer. Etter inkubasjon ved 28°C i flere dager, ble cellene undersøkt på nærvær av dehydrogenase for forgrenede 2-oksosyrer. (Hver liter M9-saltmedium inneholdt 6 g Na2HP04, 3 g KH2P04, 0,5 g NaCl og 1 g NH4C1. Mediet ble autoklavert, hvoretter 1 ml porsjon sterilisert IM MgS0A og 0,1M CaCl2 ble tilsatt aseptisk). Trinn 6. En mikrosuspensjon av 5% toluen i M9-saltmedium ble fremstillet ved kort ultralyd-behandling av den ikke-blandbare blanding. Til 25 ml av suspensjonen ble det tilsatt 1,2 ml av en oppløsning inneholdende [<14>C-l]-2-oksoisokapronsyre, 2,5 mikrocurie/ml og 10,0 mikrocurie/mikromol. 50 mikroliter av denne totalblanding ble tilsatt til hver brønn i mikrotiter-platen som inneholdt de kolonier som skulle måles.

Trinn 7. 1AC02 dannet i hver brønn ble fanget opp og registrert visuelt etter fremgangsmåten beskrevet av Tabor et al., J. Bacteriol. 128, 485-486 (1976) under tittelen "Convenient Method for Detecting <14>C02 in Multiple Samples: Application to Rapid Screening for Mutants". Mutanter som manglet aktiv forgrenet-kjede 2-oksosyre-dehydrogenase dannet intet Ba<14>C03 utover hva som ble observert for kontrollene.

En mer raffinert metode som forbedrer kontrasten mellom en positiv <14>C02-registrering, tilkjennegitt ved en mørk flekk på autoradiogrammet som resultat av Ba<u>C03-dannelse, og et negativt resultat angitt ved manglende flekk eller en meget svak flekk, består i følgende modifiserte utsilingsmetode.

Enkeltkolonier (se Trinn 4 ovenfor) ble overført fra agarmediet etter 7-14 dagers vekst (i stedet for etter 2-3 uker, og bestemt direkte ifølge de ovenfor angitte Trinn 6 og 7). Trinn 5 av den ovenfor angitte metode ble utelatt.

En ytterligere forbedret bestemmelsesmetode som er kvantitativ med henblikk på <u>C02-frigjøring, består i å dyrke mutantene påvist ved de ovenfor angitte utsilingsmetoder, på et egnet medium som består av et M9-saltmedium med 1% glukose, og 0,1% "Syncasa-bcaa", (en syntetisk blanding av L-aminosyrer med tilnærmet samme sammensetning som kommersielle casaminosyrer, men uten L-valin, L-isoleucin og L-leucin; se nedenfor).

Etter vekst til høy celletetthet, ble cellene vasket i M9-saltmedium og resuspendert i et kaldt M9-saltmedium inneholdende 1% toluen og som var ultralydbehandlet for å gi en melkehvit toluendispersjon. Celle/buffer/toluensuspensjonen ble inkubert i 40 minutter ved 30°C for å permeabilisere cellene. De permeabiliserte cellene ble deretter vasket i M9-saltmedium og tilslutt resuspendert i 1/5 av det opprinnelige volum M9-mediumbuffer. 180 -liter av denne suspensjon ble benyttet per bestemmelse.

Et reaksjonsvolum på 300 -liter inneholdt de tolueniserte cellene, tiaminpyrofosfat (TPP), 0,4 mmol; koenzym A (CoA), 0,11 mmol; nikotinamidadenin-dinukleotid (NAD), 0,68 mmol; ditiotreitol (DTT), 2,6 mmol; MgCl2, 4,1 mmol; tris-HCl, 60 mmol; pH 7,5; og [<1/>,C-l]-2-okso-isokaproat, 6000 cpm., mikrocurie per mikromol. Telleeffektiviteten var 73%. Reaksjonen ble utført i 15 ml scintillasjonsglass som inneholdt et 2 x 2 cm Whatman #4 papirkvadrat presset inn i glassets skrulokk. Papiret inneholdt 30 /xliter IM Hyamine Hydroxide (IM oppløsning av metylbenzetoniumhydroksyd i metanol; fra Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178, U.S.A.) som fanger opp <14>C02 utviklet under reaksjonen. Etter inkubering i 2 timer, ble papirene lagt i 10 ml Beckman Aquasol II (Universal LSC (liquid scintillation counter) fra New England Nuclear Research Products, Boston, MA 02118 U.S.A.) og radioaktiviteten målt i en væske-scintallasjons-teller etter stabilisering i oppløsningsmidlet i minst 4 timer. En blindprøve (dvs. - uten celler) ga ca. 50-300 cpm.

Mutant 1-3 og tilsvarende ga tall som var mindre enn eller lik blindprøven, mens opphavsstammen ga tall som var flere ganger høyere enn blindverdien.

Blandingen ble justert til pH 7 og sterilfiltrert. En volumdel konsentrat ble tilsatt til 99 volumdeler medium for å oppnå standard brukskonsentrasjoner.

Fremstilling av dobbeltblokkerte mutanter av S. avermitilis 7881 (ATCC 53692) med manglende

dehydrogenase for forgrenede 2-oksosyrer og

avermectin- B- O- metyltransferase

Trinn 1. S. avermitilis ATCC 53567 ble dyrket som et sammenhengende dekke på New Patch agarmedium i 12 dager ved 30°C.

Sporene fra tre slike skåler ble høstet og suspendert i 20 ml 0,05M tris-maleinsyre-buffer, pH 9,0.

Trinn 2. 10 ml av sporesuspensjonen ble tilsatt til et glass som inneholdt 10 mg N-metyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG). Glasset ble inkubert og ristet ved 28°C i 60 minutter, hvorpå sporene ble vasket grundig med 1% NaCl-oppløsning.

Trinn 3. De vaskede sporene ble suspendert i 1% NaCl og blandet med et like stort volum 80% etylenglykol. Suspensjonen ble oppbevart ved -20°C og benyttet som cellekilde for gjennom-søkning med henblikk på mutanter.

Dette sporeforrådet ble utspredd på YPD-plater for å gi ca. 100 kolonier per plate. Kolonier av den mutageniserte populasjon (nitroso-guanidin-behandlet) Streptomyces avermitilis-stammen 1-3 (ATCC 53567) ble overført til et agarmedium fremstillet på følgende måte (gram per liter): fortynnet stivelse, 80; K2HPOA, 1; MgSOA.7H20, 1; Ardamine PH, 5; CaC03, 5; P-2000, 1 ml; FeSOA.7H20, 0,01; MnCl2.4H20, 0,001; ZnSOA.7H20, 0,001; Bachto agar, 17; destillert H20 til 980 ml. pH ble justert til 7,0 med NaOH før autoklavering ved 121°C i 20 minutter. Etter autoklaveringen ble 20 ml av en steril 5% forrådsoppløsning av (±)-2-metyl-smørsyre pH 7,0, tilsatt.

Agarkulturene ble inkubert 8-12 dager ved 28°C. Celler (mycel) ble fjernet fra agaroverflaten og anbragt i 250 /uliter aceton. 25 /iliter av acetonekstraktene ble deretter avsatt på tynnskiktsplater (Analtech Silica Gel GF, pre-coated). Kromatogrammet ble utviklet i 30-40 minutter med etylacetat som oppløsningsmiddel og deretter tørket og påsprøytet 3% vanillin i etanol. Platene ble plassert i en ovn ved 100°C i 1-3 minutter, deretter påsprøytet 3% svovelsyre i etanol og igjen anbragt i en 100°C ovn i 10-15 minutter. Mutanter som manglet avermectin-B O-metyltransferase ble identifisert ved en forandring i det kromatografiske mønster; dvs. flekker som korresponderete med avermectin-B-komponenter (Rf ca. 0,54 og 0,42 for henholdsvis Bl og B2) forekom fremdeles, men flekkene som korresponderte med avermectin-A-komponentene (Rf ca. 0,69 og 58 for henholdsvis Al og A2) manglet.

Generelle høvtrykks- væskekromatografi ( HPLC) metoder Mobilfase:

150 ml vann

70 ml acetonitril

bringes til 1 liter med metanol

Kolonne:

Ultrasphere ODS 25 cm (Beckman Instruments, Fullerton, CA 92634-3100)

væskestrøm: 0,75 ml/minutt

deteksjon: UV ved 240 nm

attenuering: nær 6

Prøve-fortynningsmiddel (D):

35 ml acetonitril pluss 390 ml metanol

Standarder:

1. Innvei 0,5 mg avermectin A2A i en 10 ml målekolbe og tilsett metanol til volum-merket. 2. Innvei 0,5 mg testprodukt i en 10 ml målekolbe og tilsett metanol til volum-merket. 1 og 2 er standard-forrådsoppløsninger; for

standardoppløsninger for kromatografi:

tilsett 100 /xliter (1) og 100 /xliter (2) til prøveglass og tilsett 800 /xliter mobilfase.

Prøver:

1. Ta ut 1 ml grundig ristet buljong; sentrifugér.

2. Fjern mest mulig av supernatanten uten å forstyrre pelleten. 3. Tilsett 100 -liter HPLC-vann til pelleten og

dispergér den ved hjelp av vibrasjonsmikser.

4. Tilsett 2 ml fortynningsmiddel (D) og bland grundig.

5. Filtrér og foreta HPLC.

De naturlige avermectinene ble undersøkt kromatografisk ved HPLC etter denne metode og retensjonstiden for de enkelte avermectin-topper dividert med retensjonstiden for det forekommende oligomycin A, som tjener som indre standard ved en gitt HPLC-bestemmelse. Oligomycin A ses nesten bestandig ved HPLC som biprodukt av S. avermitilis-fermenterincrer, og er det eneste produkt som ses på kromatogrammet oppnådd ved undersøkelse av de her beskrevne mutanter når de dyrkes i et medium uten syrene RCOOH, hvor R er som definert ovenfor, eller i et medium uten forbindelser som kan omdannes til syrer med formel RCOOH, hvor R er som tidligere angitt. En typisk oligomycin A retensjonstid er 12,5-14 minutter. Forholdet mellom retensjonstider (RT) gir et mer sikkert grunnlag for sammenligning av identiteten og utbyttene av avermectin-produktene. Den generelle rekkefølge for forekomsten av avermectin-produktene på kromatogrammet er B2, A2, Bl og Al.

Bemerk at Bla og Alb ikke er separert.

Retensjonstidene varierer 1-2 minutter fra dag til dag,

Eksempel 1- 4

Avermectiner fra Streptomyces avermitilis 1- 3 ( ATCC 53567)

S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) fra en sporulert V-8 skål ble inokulert i 80 ml AS-7 medium i en 500 ml kolbe med tre skovler. Kolben ble inkubert på et roterende risteapparat ved 2 00 rpm ved 28-30°C. Etter 24 timers inkubering ble 1 ml av helbuljongen inokulert i 300 ml kolber som inneholdt 40 ml AP-5 medium. Duplikat-fermenteringer ble foretatt ved 28-30°C i nærvær av 400 ppm av hver av de nedenfor angitte primer-forbindelser, tilsatt etter 24 timer.

Etter 312 timer ble 2 ml prøver av helbuljongen blandet med 8 ml metanol:acetonitril (390:35). Etter filtrering ble 50 /uliter prøver injisert på en Beckman Ultrasphere ODS-kolonne (3,9 x 250 mm). Kolonnen ble eluert med metanol:acetonitril:vann (89:14:7) under 0,8 ml/min. og eluatet fulgt ved UV-deteksjon ved 240 nm. Retensjonstidene for de nye avermectinene er vist nedenfor.

Eksempel 5

Cykloheksyl- avermectiner fra Streptomyces avermitilis 7881

( ATCC 53692)

Et dypfryst glass av kultur S. avermitilis 7881 (ATCC 53 692) ble inokulert i 100 ml AS-7 medium i en 500 ml kolbe med tre skovler. Kolben ble inkubert på et roterende risteapparat ved 200 rpm ved 28-30°C. Etter 28 timers inkubering ble 5 ml av helbuljongen inokulert i et annet 100 ml AS-7 medium eller en 500 ml kolbe med tre skovler. Kolben ble igjen inkubert på et roterende risteapparat ved 200 rpm. ved 28-30°C. Etter 24 timers inkubering ble l ml av helbuljongen inokulert i en 300 ml kolbe som inneholdt 40 ml AP-5 medium. Kolbene ble inkubert ved 28-30°C ved 200 rpm. Etter 24 timer ble det tilsatt 400 ppm cykloheksankarboksylsyre og etter 312 timer ble prøver på 2 ml uttatt og undersøkt ved høytrykks-væskekrornatografi som beskrevet i Eksempel 1. Under disse betingelsene ble de eneste avermectin-forbindelsene som ble påvist i fermentet, eluert etter 14,84 (54,9 mg/liter) og 31,46 (32,1 mg/liter) minutter som tilsvarte henholdsvis cykloheksyl B2 og Bl.

Eksempel 6

Sek- butyl- avermectiner fra Streptomyces avermitilis 7881 ( ATCC 53692)

Fremgangsmåten i Eksempel 5 ble gjentatt, men med 400 ppm ±2-metylsmørsyre i stedet for cykloheksankarboksylsyre. Alle øvrige betingelser var som beskrevet i Eksempel 2. Kun sek-butyl -avermectin-B2 (11,60, 12,40 minutter, 63,5,

42,4 mg/liter) og sek-butyl-avermectin-Bl (23,1 minutter, 105,5 mg/liter) ble påvist i fermenteringsvæsken.

Eksempler 7- 29

Fremgangsmåten ifølge eksempel 5 ble gjentatt, men under anvendelse av 400 ppm av hver av de nedenfor angitte primer-forbindelser. Alle andre betingelser var de samme som de som er beskrevet i Eksempel 2. Retensjonstidene for de dannede avermectiner er angitt nedenfor.

Claims (4)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et B-avermectin med formel hvor den stiplede linje i 22-23-stilling utgjør en eventuell dobbeltbinding; R<1> er hydroksy og forekommer kun når dobbeltbindingen mangler; R<2> er 4'-(alfa-L-oleandrosyl)-alfa-L-oleandrosyloksy med formel R3 er hydrogen; og R er en alfa-forgrenet C3-C8-alkyl- eller en C5-C8-cykloalkylgruppe; karakterisert ved aerob fermentering ved 28-30°c ved hjelp av Stre<p>tomyces avermitilis ATCC 53692 eller en mutant derav avledet fra utgangsstammen Streptomyces avermitilis ATCC 53567, som har tilnærmet de samme morfologiske egenskaper som utgangsstammen og som har evnen til å danne de ovennevnte avermectiner, av et vandig næringsmedium som består av en assimilerbar kilde for nitrogen, karbon og uorganiske salter og en syre med formelen R-COOH, eller en forbindelse som kan omdannes til nevnte syre under fermenteringsprosessen, hvor R er som angitt ovenfor.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at R er cyklopentyl eller cykloheksyl.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at R er sek-butyl.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at S. avermitilis-stammen er S. avermitilis ATCC 53692.