KR20230120135A - 포자 조성물, 그의 생산 및 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 포자 조성물을 제공하는 것 및 이러한 조성물을 생산하는 방법과 관련된다. 본 발명은 또한 식물 보호 제품 및 이러한 포자 조성물로부터 이익을 얻는 것 및 식물의 이익, 인근 영역으로의 병원체 방출의 감소 및 동물 또는 인간의 이익을 위한 이러한 조성물의 용도과 관련된다. 더욱이, 본 발명은 효율적인 발효 방법과 관련된다.

Description

포자 조성물, 그의 생산 및 용도

본 발명은 포자 조성물을 제공하는 것 및 이러한 조성물을 생산하는 방법과 관련된다. 본 발명은 또한 식물 보호 제품 및 이러한 포자 조성물로부터 이익을 얻는 것 및 식물의 이익, 인근 영역으로의 병원체 방출의 감소 및 동물 또는 인간의 이익을 위한 이러한 조성물의 용도와 관련된다. 더욱이, 본 발명은 효율적인 발효 방법과 관련된다.

내생포자의 형성은 여러 원핵 미생물의 생활사의 단계이다. 내생포자의 중요한 주요 속성은 이들이 전형적으로 열 처리 (전형적으로 70℃, 1024hPa에서 적어도 5분) 및 건조, 자외선 방사 및 화학적 소독과 같은 활발히 성장하는 미생물에 해로운 다른 환경 조건에 대한 휴면 세포의 저항성을 제공하는 휴면 생애 단계를 제공한다는 것이다. 포자형성 미생물은 따라서 장기간의 해로운 상태를 견딜 수 있다. 상태가 다시 유리하게 될 때, 포자형성 세포는 발아하고 활발히 성장하는 생애 단계로 변한다. 내생포자는 따라서 미생물의 저장 및 빠른 회수를 위한 특정 적용을 갖는다. 특히 내생포자는 용이한 제품 저장, 액체 질소와 같은 정교한 저장 조건이 없는 긴 저장 수명 및 미생물의 빠르고 신뢰성이 높은 회복이 요구되는 농경학 및 생명공학 제품에 사용된다. 농경학 제품에서, 예를 들어, 식물 건강에 이익이 되는 미생물이 바람직하다. 인간 영양 및 건강 관리에서, 위의 낮은 pH에 생존할 수 있는 포자의 형태의 프로바이오틱 유기체의 적용은 장에서의 표적화된 생장으로 하여금 소화 장애를 예방하도록 한다. 그러나, 이러한 제품의 저장은 저장 조건과 독립적이어야 하고 바람직하게는 심지어 37-45℃의 따듯한 온도에서 또는, 덜 바람직하게는, 햇빛에 노출되어도 제품을 저장하는 것을 허용해야 한다. 제품의 적용 시 미생물은 빠르고 신뢰성이 높게 증식하고 이들의 유익한 특성을 발휘해야 한다. 다른 제품에서, 미생물의 생존율은 요구되지 않는다. 그러나, 내생포자는 그의 표면 상에 목적하는 대사물, 예를 들어 생화학적 살충제를 구획하고 부착하는 것을 허용한다. 이러한 제품의 이점은 이들이 종래의 살충제의 과용 및 이러한 과용으로 인한 문제점, 예를 들어 토양 산성화를 피할 수 있다는 것이다. 생명공학 제품에서 신뢰성이 높은 발효가 통상적으로 요구된다. 발효는 미생물이 발효 동안 증식하고 목적하는 화합물뿐만 아니라 포자를 생산하도록, 적합한 성장 배지를 포함하는 발효조에 미생물의 분취량을 접종함으로써 시작한다. 신뢰성이 높은 접종을 달성하기 위해, 이들이 필요에 따라 증식하고 대사하는 이들의 능력을 유지하도록, 연장된 기간 동안, 접종 분취량을 저장하는 것이 필요하다.

박테리아 포자의 하나의 주요 적용은 항생제의 감소 및 대체를 포함하여, 인간 및 동물 건강을 위한 프로바이오틱 제품에서 그의 사용이다. 예를 들어, 클로스트리디움(Clostridium) 종은 인간 및 동물에 의해 소화될 수 없는 광범위한 영양을 이용할 수 있다. 예로서, 장관에 존재하는, 클로스트리디아(Clostridia)는 소화되지 않는 다당류를 전환시켜 단-쇄 지방산 (SCFA)을 생산할 수 있으며, 이는 숙주의 장관에서 용이하게 흡수되고 따라서 장 항상성에 중대한 역할을 할 수 있다 (Pingting Guo, Ke Zhang, Xi Ma and Pingli He, Clostridium species as probiotics: potentials and challenges, Journal of Animal Science and Biotechnology (2020) doi.org/10.1186/s40104-019-0402). SCFA 예컨대 부티레이트는 내강 환경을 최적화하고 장 건강을 유지하는 다수의 생리학적 기능을 조정한다. 클로스트리디아를 사용하는 건강 관리 적용을 위한 여러 유익한 형질, 예컨대 클로스트리디움 종과 항-염증 효과 및 개선된 장 면역 내성을 유도하는 장 면역계 사이의 크로스토크는 공지되어 있다. 예로서, 클로스트리디아는 마우스의 대장염 및 알레르기성 설사를 약화시키는 것으로 밝혀졌다. 다른 종 중에서, 일부 클로스트리디아는 독소발생 씨. 디피실레(C. difficile)로의 신중한 감염을 예방하는 담즙산을 생산하는 것으로 공지되어 있다. 단백질 또는 아미노산 발효 클로스트리디아의 적용은 직접적으로 및 간접적으로 장 상피 세포를 손상시킬 수 있는 암모니아의 과도한 축적을 예방할 수 있다. 클로스트리디아의 프로바이오틱 및 프리바이오틱 사용의 유익한 형질은 식이 영양뿐만 아니라 가축 영농에서의 성장 개선에서 또한 공지되었다. 특정 균주, 예컨대 클로스트리디움 에스터테티쿰(Clostridium estertheticum)은 생고기 및 가금류, 생선 및 해산물 제품에서의 보호 배양으로서 적용되었다 (Jones R, Zagorec M, Brightwell G, Tagg JR (2009) Inhibition by Lactobacillus sakei of other species in the flora of vacuum packaged raw meats during prolonged storage. Food microbiol 25:876-881).

농업에서, 박테리아 포자가 식물병원성 진균 또는 박테리아성 질환을 감소시키거나 또는 예방하는 식물 해충 방제 조성물에 사용되었다. 포자 생물학적 제제는 또한 생물 및 무생물 스트레스에 대한 식물 저항성을 개선시키고, 식물의 성장을 가속화시키고 식물, 과실 또는 콩과식물 수확 동안 수확율을 증가시키는 데 적용된다. 포자 제품은 잎, 순, 과실, 뿌리 또는 식물 번식 물질뿐만 아니라 식물이 성장할 기재에 적용되었다 (Toyota K. Bacillus-related Spore Formers: Attractive Agents for Plant Growth Promotion. Microbes Environ. 2015;30(3):205-207. doi:10.1264/jsme2.me3003rh). (Bochow, H., et al. "Use of Bacillus Subtilis as Biocontrol Agent. IV. Salt-Stress Tolerance Induction by Bacillus Subtilis FZB24 Seed Treatment in Tropical Vegetable Field Crops, and Its Mode of Action / Die Verwendung von Bacillus Subtilis zur biologischen Bekampfung. IV. Induktion einer Salzstress-Toleranz durch Applikation von Bacillus subtilis FZB24 bei tropischem Feldgemuse und sein Wirkungsmechanismus." Zeitschrift fur Pflanzenkrankheiten und Pflanzenschutz / Journal of Plant Diseases and Protection, vol. 108, no. 1, 2001, pp. 21-30. JSTOR, www.jstor.org/stable/43215378. Accessed 14 Dec. 2020). (Hashem, Abeer & Tabassum, B. & Abd_Allah, Elsayed. (2019). Bacillus subtilis: A plant-growth promoting rhizobacterium that also impacts biotic stress. Saudi Journal of Biological Sciences. 26. 10.1016/j.sjbs.2019.05.004).

더욱이, 박테리아 포자는 나노생명공학 및 건축 화학의 영역에서, 예컨대 자기-치유 콘크리트 (크랙 치유), 모르타르 안정성 및 감소된 물 투과성을 위해 적용되었다 [J.Y. Wang, H. Soens, W. Verstraete, N. De Belie, Self-healing concrete by use of microencapsulated bacterial spores, Cement and Concrete Research, Volume 56, 2014, 139-152, ISSN 0008-8846, https://doi.org/10.1016/j.cemconres.2013.11.009] [Ricca E, Cutting SM. Emerging Applications of Bacterial Spores in Nanobiotechnology. J Nanobiotechnology. 2003;1(1):6. Published 2003 Dec 15. doi:10.1186/1477-3155-1-6].

추가적으로, 박테리아 포자는 세정 제품의 영역에서, 예컨대 임상 및 가정 설정에서의 세탁물, 단단한 표면의 세정, 위생 및 냄새 제어를 위해 적용되었다 (Caselli E. Hygiene: microbial strategies to reduce pathogens and drug resistance in clinical settings. Microb Biotechnol. 2017 Sep;10(5):1079-1083. doi: 10.1111/1751-7915.12755. Epub 2017 Jul 5). 예로서, 포자가 화장품 조성물, 예컨대 피부 세정 제품 (US20070048244), 식기세척제 (WO2014/107111), 파이프 디그리서 (DE19850012), 세탁물의 악취 제어 (WO2017/157778 및 EP3430113) 또는 알레르겐 제거 (US20020182184)에 사용되었다. 포자는 또한 그의 후속 분해를 촉매하기 위해 비-생물기원 매트릭스로 삽입할 수 있다.

내생포자의 형성은 따라서 활발한 연구의 영역이다. 그러나, 포자형성의 기초가 되는 메커니즘은 미생물 사이에서 상이하다. 바실루스(Bacillus)에서, Spo0A는 고아 히스티딘 키나제 (HK), 특히 KinA 및 KinB에 의해 개시된 인산전달 시스템에 의해 인산화된다 (Spo0A_P). 후속적으로, Spo0A_P는 4개의 하류 시그마 인자 (σ^F, σ^E, σ^G, 및 σ^K)를 수반하는 포자형성 시그마 인자 캐스케이드를 개시한다. 대조적으로, 직접적으로 포스페이트 기를 Spo0A로 이동시켜, 따라서 그를 활성화시키는 인산전달 시스템은 클로스트리디아에 존재하지 않는다. 결과로서, 예비 포자형성 단계 0 조절자, 예컨대 바실루스 및 많은 파에니바실루스(Paenibacilli)에 발견된 Spo0B는 클로스트리디아에 존재하지 않는다.

더욱이, 바실루스 모델에서의 마지막 시그마 인자, σK는 클로스트리디움에서, 하나는 초기, Spo0A의 상류, 및 또 다른 하나는 후기, σG의 하류인 이중 역할을 하는 것으로 확인되었으며, 이는 바실루스에서의 그의 역할과 유사하다 [Al-Hinai MA, Jones SW, Papoutsakis ET. The Clostridium sporulation programs: diversity and preservation of endospore differentiation. Microbiol Mol Biol Rev. 2015 Mar;79(1):19-37. doi: 10.1128/MMBR.00025-14] [Tojo S, Hirooka K, Fujita Y. Expression of kinA and kinB of Bacillus subtilis, Necessary for Sporulation Initiation, Is under Positive Stringent Transcription Control, Journal of Bacteriology Mar 2013, 195 (8) 1656-1665; DOI: 10.1128/JB.02131-12].

반면에, 예로서, 비. 서브틸리스(B. subtilis)의 포자형성으로의 진입은 RapA의 제어 하에 있다. 이 포스파타제는 모든 내생포자 형성자, Spo0A의 마스터 전사 조절자의 전사를 조절하고 있고 따라서 직접적인 억제자로서 역할을 할 수 있다 [Perego M, Hanstein C, Welsh C. M., Djavakhishvili T., Glaser P., Hoch J. A. Multiple protein-aspartate phosphatases provide a mechanism for the integration of diverse signals in the control of development in B. subtilis. Cell 79, 1047-1055 (1994)]. 바실루스와 대조적으로, 파에니바실루스 종은 단일-세포 수준으로 비동시성 포자형성을 조정하는 중요한 유전자로서 포자형성 억제자 RapA가 결여되어 있다.

더욱이, 영양 기아 하에, CodY는 신속한 기하급수적인 성장에서 정지 상 및 포자형성으로의 전이를 조정하는 바실루스에서 많은 유전자의 발현을 조절한다. (Ratnayake-Lecamwasam M, Serror P, Wong KW, Sonenshein AL. Bacillus subtilis CodY represses early-stationary-phase genes by sensing GTP levels. Genes Dev. 2001;15(9):1093-1103. doi:10.1101/gad.874201). 이는 배양에서 종-간 커뮤니케이션, 분화 또는 동기화를 조정하는 ComA의 정족수-감지 활성에 의해 지원될 수 있다 (Schultz D, Wolynes PG, Ben Jacob E, Onuchic JN. Deciding fate in adverse times: sporulation and competence in Bacillus subtilis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Dec 15;106(50):21027-34. doi: 10.1073/pnas.0912185106. Epub 2009 Dec 7). 여기서 다시, 바실루스와 대조적으로, 파에니바실루스의 포자형성으로의 진입은 CodY 및 ComA가 대부분의 파에니바실루스 종에서 발견되지 않았기 때문에 상이한 메커니즘에 의존한다.

긴 시간 동안 연구의 목적임에도 불구하고, 단지 최근에 바실루스 서브틸리스에서의 내생포자가 2가지 종류, 즉 소위 초기 및 후기 포자가 있다는 것이 발견되었다. 공개문헌 [Mutlu et al., Nature Comm. 2018, 69]의 저자들은 아가로스 플레이트 상 바실루스 서브틸리스 콜로니의 포자형성 및 발아를 모니터링하였다. 이들은, 형성된 각각의 포자에 대해, 영양 하향이동 후 포자 형성에 요구되는 시간을 기록하였다. 기아의 4일 후, 포자 형성 및 포자낭으로부터의 포자의 방출이 완료되었다. 영양 상향이동이 아가로스 플레이트에 적용되었다. 저자들은 이어서 발아 및 생장에 요구되는 각각의 포자 시간을 관련시켰다. 포자 형성 및 발아 시간을 관련시킬 때, 저자들은 초기 포자가 후기 포자만큼 빠르게 2회 발아하였고 보다 높은 전체 회복 빈도를 가졌다는 것을 주목하였다. 저자들은 또한 초기 포자와 대조적으로, 후기 포자가 생장에 적합하지 않은 영양 농도에서 발아를 유도함으로써 생장으로부터 예방될 수 있다는 것을 주목하였다.

본 발명은 추가 관측에 의존한다. 본 발명자들은 놀랍게도 상이한 내생포자 군집 유형, 즉 발아 빈도 및 발아 시간이 상이한 내생포자 군집이 내생포자 형성 미생물의 모든 시험된 종에 대해 포자 형성 시간에 따라 생산된다는 것을 주목하였다. 이는 특히 문헌 [Mutlu et al.]에 의한 상기 언급된 공개문헌이 예를 들어 파에니바실루스 종에 부재하는 RapA 유전자의 기능적 발현에 의존하였기 때문에 놀라웠다. 따라서, 바실루스 서브틸리스에 확립된 특정 포자형성 메커니즘이 또한 다른 속에 존재할 것임이 예기치 않았다. 더욱이 본 발명자들은 내생포자 군집 유형 사이의 차이가 아가로스 플레이트 상 포자 형성에 제한되지 않을 뿐만 아니라 교반된 발효에서 발생한다는 것을 주목하였다. 이는 특히 교반된 발효에서 화학적 신호 및 영양의 세포-간 커뮤니케이션 구배 형성이 가능하지 않기 때문에 놀라웠다. 또한, 국부 영양 경쟁, 불리한 pH 변화 및 국부 폐기물 축적은 제어된 및 교반된 조건 하에 불가능하다. 최적 교반 조건 하에, 모든 세포는 거의 동일한 배지 조성물에 노출된다. 또한 본 발명자들에게 높은 발아 빈도 및 짧은 발아 시간을 갖는 내생포자 군집이 또한 -80℃ 내지 45℃의 온도와 같은 일반 저장 조건 하에 활성의 유의한 손실 없이 광범위하게 저장될 수 있다는 것이 놀라웠다. 이는 특히 본 발명자들이 또한 포자 안정화에 요구되는 화합물인 디피콜린산이 주로 액체 상 교반된 발효 동안 후기에 생산된다는 것을 발견하였기 때문에 놀라웠다. 따라서, 발효 동안 초기에 형성된 내생포자는 낮은 함량의 디피콜린산을 함유한다. 본 발명자들은 또한 놀랍게도 유도기의 길이 및 액체 교반된 발효에서의 대수성장기 바이오매스 생산의 종료에 도달하는 데 요구되는 시간이 사전배양의 접종을 위한 종자로서 사용된 내생포자 군집 유형에 의존하고 또한 주요 배양 단계에서 성장 및 생산성에 긍정적으로 영향을 미쳤다는 것을 관측하였다. 이는 교반된 액체 상 발효 동안 후기에 수거된 내생포자 군집이 발효 동안 초기에 형성된 모든 포자를 포함하기 때문에 놀라웠다. 따라서 후기 수거된 내생포자 군집이 적어도 발효 동안 초기에 수거된 내생포자 군집보다 뒤처지지 않을 것으로 예상되었다. 이 예상은 문헌 [Mutlu et al.]에 의한 상기 공개문헌에 의해 입증되었으며, 이는 바실루스 서브틸리스의 완전히 포자형성된 콜로니에 대한 발아 시간에서의 차이를 기재한다 - 이는, 본질적으로, 교반된 액체 상 발효에서의 모든 영양 세포의 완전한 포자형성 후 수거된 내생포자 군집에 상응할 것이다. 그리고 본 발명자들은 놀랍게도 식물에 유익한 생물살충제, 가장 특히 푸사리시딘 A, B 및 D의 함량이 초기 포자가 배양의 접종을 위한 종자로서 배타적으로 사용된 경우에 발효 동안 초기에 생산된 내생포자 군집에서 가장 높다는 것을 발견하였다.

따라서 초기 발아 및 발아된 미생물의 신속한 성장을 촉진하는 내생포자 함유 조성물을 제공하는 것이 본 발명의 목적이었다. 포자의 신속한 생장은 성능이 시기적절하고 연속적인 방식으로 유기체의 목적하는 특성 및 형질을 수득하기 위해 포자의 빠르고 신뢰성이 높은 생장에 강하게 연결된 제품과 특히 관련이 있다. 더욱이, 조성물은 일반 저장 조건 하에 안정해야 한다. 바람직하게는 조성물은 미생물의 유익한 특성, 예를 들어 인간, 동물 또는 식물을 위한 건강 이익 또는 목적하는 대사물의 생산을 유지하거나 또는 개선시켜야 한다. 본 발명은 더욱이 상응하는 생산 방법, 제품 및 그의 용도를 제공해야 한다.

본 발명은 상응하게 원핵 미생물의 정제된 포자를 포함하는 포자 조성물을 제공하며, 여기서

a) 상기 포자는 콜로니 형성에 적합한 배지 상에 플레이팅될 때 콜로니를 형성하고, 여기서 플레이팅 후 호기성 배양의 경우 72시간 및 혐기성 배양의 경우 96시간 내에 형성된 모든 이러한 콜로니 중 적어도 40%, 보다 바람직하게는 40-90%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 50-90%, 보다 바람직하게는 적어도 60%, 보다 바람직하게는 60-90%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 70-90%는 48시간 내에 형성되고/거나,

b) 포자 중 적어도 40%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 55%, 보다 바람직하게는 적어도 60%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%는 제1 포자 형성기 동안 수거된 발효로부터 수득가능하거나 또는 수득되고/거나

c) 포자당 디피콜린산의 평균 함량은 편평기까지 적합한 배지에서 발효된 포자의 디피콜린산의 평균 함량의 최대 80%, 보다 바람직하게는 20-80%, 더욱 더 바람직하게는 22-70%, 더욱 더 바람직하게는 30-65%이다.

본 발명은 또한 본 발명의 또는 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능하거나 또는 수득된 조성물로 코팅되거나 또는 주입된 식물 배양 기재를 포함하는, 식물 보호 제품을 제공한다.

또한 식물, 식물 부분 또는 식물 번식 물질이 제공되며, 여기서 물질은, 그의 표면 상에 또는 그에 주입된, 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능하거나 또는 수득된 조성물을 포함한다.

더욱이, 본 발명은 본 발명의 식물, 식물 부분 또는 식물 번식 물질 또는 본 발명의 식물 배양 기재를 포함하는 농장, 바람직하게는 재배지 또는 온실 베드를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 조성물을 포함하는 식품 또는 사료 또는 화장 제품, 바람직하게는 프로바이오틱 또는 프리바이오틱 식품, 프로바이오틱 또는 프리바이오틱 또는 사료 또는 프로바이오틱 또는 프리바이오틱 화장 제품을 제공한다.

그리고 본 발명은 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 건축 제품, 바람직하게는 광물 표면의 처리를 위한 페인트, 코트 또는 함침 조성물, 시멘트 제제, 콘크리트 또는 응결 콘크리트의 제조를 위한 첨가제를 제공한다.

더욱이, 본 발명은

1) 포자형성에 도움이 되는 배지에서 미생물을 발효시키는 단계,

2) 포자를 정제하여 조성물을 수득하는 단계

를 포함하는, 원핵 미생물의 포자를 포함하는 조성물을 생산하는 방법을 제공하며,

여기서

a) 정제는 발효 단계 1)에서 수득가능한 최대 포자 농도의 85%에 도달할 때 가장 늦게 수행되고, 보다 바람직하게는 정제는 상기 최대에 비해 1-75% 범위의 농도에 도달할 때, 보다 바람직하게는 상기 최대에 비해 10-75% 범위의 농도에 도달할 때, 보다 바람직하게는 상기 최대에 비해 20-70% 범위의 농도에 도달할 때, 보다 바람직하게는 상기 최대에 비해 30-68% 범위의 농도에 도달할 때 수행되고/거나,

b) 정제는 상기 정제된 포자가 콜로니 형성에 적합한 배지 상에 플레이팅될 때 콜로니를 형성하도록 수행되고, 여기서 플레이팅 후 호기성 배양의 경우 72시간 및 혐기성 배양의 경우 96시간 내에 형성된 모든 이러한 콜로니 중 적어도 40%, 보다 바람직하게는 40-90%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 50-90%, 보다 바람직하게는 적어도 60%, 보다 바람직하게는 60-90%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 70-90%는 48시간 내에 형성되고/거나,

c) 정제는 상기 정제된 포자 중 적어도 40%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 55%, 보다 바람직하게는 적어도 60%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%가 제1 포자 형성기 동안 수거된 발효로부터 수득가능하거나 또는 수득되도록 수행되고/거나

d) 정제는 포자당 디피콜린산의 평균 함량이 발효 단계 1)에서 최대 포자 농도에 도달할 때 생산된 포자의 디피콜린산의 평균 함량의 최대 80%일 때, 보다 바람직하게는 디피콜린산의 평균 함량이 20-80% 범위, 더욱 더 바람직하게는 22-70% 범위, 더욱 더 바람직하게는 30-65% 범위일 때 수행된다.

상응하게, 본 발명은 적합한 발효 배지를 포함하는 발효조에 본 발명의 또는 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능하거나 또는 수득된 조성물을 접종하는 단계를 포함하는 발효 방법을 제공한다.

본 발명은 더욱이 적합한 발효 배지에 본 발명의 또는 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능하거나 또는 수득된 조성물을 접종하는 단계 및 접종된 배지를 발효시키는 단계를 포함하는, 포자-형성 원핵 미생물의 발효에서, 유도기의 기간 및/또는 대수성장기의 종료에 도달할 때까지의 시간을 제어하는 방법을 제공하며, 여기서 유도기의 보다 짧은 기간 및/또는 대수성장기의 보다 빠른 종료를 위해 보다 높은 백분율의 제1 포자 형성기에 수거된 포자를 갖는 조성물이 사용되고, 유도기의 보다 긴 기간 또는 대수성장기의 보다 늦은 종료를 위해 보다 높은 백분율의 제2 포자 형성기에 수거된 포자를 갖는 조성물이 사용된다.

그리고 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 발효를 위한 접종물 샘플을 제공하는 컴퓨터-실행된 방법을 제공한다:

i) 유도기의 표적 기간 및/또는 대수성장기의 종료를 수득하는 단계,

ii) 제1 포자 형성기 및/또는 제2 포자 형성기 동안 수거된 포자의 요구되는 백분율을 계산하는 단계, 및

iii) 단계 2에서의 계산에 기반하여 하기 중 1개 이상으로부터 선택된 반응을 수행하는 단계:

(1) 계산된 비율에 가장 잘 맞는 제조용 세포 은행 샘플 수집의 접종물 샘플의 식별자의 방출,

(2) 계산된 비율에 가장 잘 맞는 제조용 세포 은행 샘플 수집의 접종물 샘플의 회수,

(3) 발효조에의 계산된 비율에 가장 잘 맞는 제조용 세포 은행 샘플 수집의 접종물 샘플의 투여, 또는

(4) 각각 초기 포자 군집 풍부화된 및 후기 포자 군집 풍부화된 스톡으로부터 추출함으로써 초기 및 후기 포자 군집의 비율을 조정함으로써 새로운 제조용 세포 은행 샘플을 혼합하는 것, 임의로 상기 혼합물을 발효조에 투여하는 것.

더욱이 본 발명에 따른 방법에서 제1 포자 형성기 동안 수거된 포자를 제공하는 단계를 포함하는, 포자-형성 원핵 미생물의 포자 발아 및/또는 영양 성장을 촉진하는 방법이 본 발명에 의해 제공되며, 여기서 바람직하게는 무기 포스페이트가 포자와 함께 또는 순차적으로 제공된다.

본 발명은 또한

a) 발효에 접종하기 위한, 또는

b) 해충 방제를 위한 및/또는 식물병원성 진균 또는 박테리아성 질환의 강도를 예방하거나, 지연시키거나, 제한하거나 또는 감소시키기 위한 및/또는 식물의 건강을 개선시키기 위한 및/또는 식물의 수확율을 증가시키기 위한 및/또는 식물 배양 영역으로부터의 식물병원성 진균 또는 박테리아 물질의 방출을 예방하거나, 지연시키거나, 제한하거나 또는 감소시키기 위한, 또는

c) 식물 보호 제품의 제조를 위한, 또는

d) 프로바이오틱 식품, 사료 또는 화장품 제제의 제조를 위한, 또는

e) 세정 제품의 제조를 위한, 바람직하게는 세정 제품의 항박테리아 또는 항진균 효과를 부여하거나, 증가시키거나 또는 연장하기 위한,

e) 콘크리트의 제조를 위한 또는 광물 표면을 페인팅하거나, 코팅하거나 또는 함침하기 위한

본 발명의 또는 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능하거나 또는 수득된 조성물의 용도를 교시한다.

또한 바람직하게는 식재 전 또는 후에, 출아 전 또는 후에, 또는 바람직하게는 미립자, 분말, 현탁액 또는 용액으로서, 해충, 식물, 그의 부분 또는 번식 물질 또는 식물이 성장할 기재를 유효량의 본 발명의 또는 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능하거나 또는 수득된 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 해충 손상으로부터의 보호를 필요로 하는 식물 또는 그의 부분을 보호하는 방법이 본 발명에 따라 제공된다.

더욱이, 본 발명은 본 발명의 또는 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능하거나 또는 수득된 조성물을 식물, 식물 부분, 종자 또는 기재에 적용하는 단계를 포함하는, 단백질 페이로드를 식물, 식물 부분, 종자 또는 성장 기재에 전달하는 방법을 제공하며, 여기서 포자는 페이로드 도메인 및 상기 포자의 표면으로의 페이로드 도메인의 전달을 위한 표적화 도메인을 포함하는 단백질을 발현하는 미생물의 것이다.

그리고 본 발명은 본 발명에 따른 특정 용도 또는 방법을 제공하며, 여기서

i) 진균 질환은 흰녹가루병, 노균병, 흰가루병, 뿌리혹병, 스클레로티니아(sclerotinia) 썩음병, 푸사리움(fusarium) 시들음병 및 썩음병, 보트리티스(botrytis) 썩음병, 탄저병, 리족토니아(rhizoctonia) 썩음병, 잘록병, 당근 무름병, 덩이줄기병, 녹병, 검은 뿌리 썩음병, 갈색윤반병, 아파노미세스(aphanomyces) 뿌리 썩음병, 아스코치타(ascochyta) 지제부 썩음병, 구미 줄기 마름병, 알테르나리아(alternaria) 잎반점병, 흑반병, 둥근무늬병, 마름역병, 점무늬병, 잎 마름병, 세프토리아(septoria) 반점병, 잎 마름병, 또는 이들의 조합으로부터 선택되고/거나,

ii) 진균 질환은 하기 분류학적 계급으로부터 선택된 미생물에 의해 초래되거나 또는 악화된다:

- 소르다리오미세테스(Sordariomycetes) 강, 보다 바람직하게는 히포크레알레스(Hypocreales) 목의 것, 보다 바람직하게는 넥트리아세아에(Nectriaceae) 과의 것, 보다 바람직하게는 푸사리움 속의 것;

- 소르다리오미세테스 강, 보다 바람직하게는 글로메렐랄레스(Glomerellales) 목의 것, 보다 바람직하게는 글로메렐라세아에(Glomerellaceae) 과의 것, 보다 바람직하게는 콜레토트리쿰(Colletotrichum) 속의 것;

- 레오티노미세테스(Leotinomycetes) 강, 보다 바람직하게는 헬로티알레스(Helotiales) 목의 것, 보다 바람직하게는 스클레로티니아세아에(Sclerotiniaceae) 과의 것, 보다 바람직하게는 보트리티스 속의 것;

- 도티데오미세테스(Dothideomycetes) 강, 보다 바람직하게는 플레오스포랄레스(Pleosporales) 목의 것, 보다 바람직하게는 플레오스포라세아에(Pleosporaceae) 과의 것, 보다 바람직하게는 알테르나리아(Alternaria) 속의 것;

- 도티데오미세테스 강, 보다 바람직하게는 플레오스포랄레스 목의 것, 보다 바람직하게는 파에오스파에리아세아에(Phaeosphaeriaceae) 과의 것, 보다 바람직하게는 파에오스파에리아(Phaeosphaeria) 속의 것;

- 도티데오미세테스 강, 보다 바람직하게는 보트리오스파에리알레스(Botryosphaeriales) 목의 것, 보다 바람직하게는 보트리오스파에리아세아에(Botryosphaeriaceae) 과의 것, 보다 바람직하게는 마크로포미나(Macrophomina) 속의 것;

- 도티데오미세테스 강, 보다 바람직하게는 카프노디알레스(Capnodiales) 목의 것, 보다 바람직하게는 미코스파에렐라세아에(Mycosphaerellaceae) 과의 것, 보다 바람직하게는 지모세프토리아(Zymoseptoria) 속의 것;

- 아그라리코미세테스(Agraricomycetes) 강, 보다 바람직하게는 칸타렐랄레스(Cantharellales) 목의 것, 보다 바람직하게는 세라토바시디아세아에(Ceratobasidiaceae) 과의 것, 보다 바람직하게는 리족토니아 또는 타나테포루스(Thanatephorus) 속의 것;

- 푹시니오미세테스(Pucciniomycetes) 강, 보다 바람직하게는 푹시니알레스(Pucciniales) 목의 것, 보다 바람직하게는 푹시니아세아에(Pucciniaceae) 과의 것, 보다 바람직하게는 우로미세스(Uromyces) 또는 푹시니아(Puccinia) 속의 것;

- 우스틸라기노미세테스(Ustilaginomycetes) 강, 보다 바람직하게는 우스틸라기날레스(Ustilaginales) 목의 것, 보다 바람직하게는 우스틸라기나세아에(Ustilaginaceae) 과의 것, 보다 바람직하게는 우스틸라고(Ustilago) 속의 것;

- 오오미코타(Oomycota) 강, 보다 바람직하게는 피티알레스(Pythiales) 목의 것, 보다 바람직하게는 피티아세아에(Pythiaceae) 과의 것, 보다 바람직하게는 피티움(Pythium) 속의 것;

- 오오미코타 강, 보다 바람직하게는 페로노스포랄레스(Peronosporales) 목의 것, 보다 바람직하게는 페로노스포라세아에(Peronosporaceae) 과의 것, 보다 바람직하게는 피토프토라(Phytophthora), 플라스모파라(Plasmopara) 또는 슈도페로노스포라(Pseudoperonospora) 속의 것.

도 1은 PX-141 배지에서 파에니바실루스 균주 균주 32를 사용하는 실시예 1에 기재된 발효 과정 동안 ml당 포자의 농도를 제시한다. 포자 수는 일회용 계수판을 사용하는 위상차 현미경에 의해 평가되었다. 포자 농도는 거의 S자형 방식으로 0에서 대략 3.5x10^9개로 증가한다. 포자 형성은, 농도 곡선의 기울기에 의해 표시된 바와 같이, 접종 후 24-30시간의 기간에서 가장 빠르고 36-42시간 및 30-36시간의 기간에서 보다 낮다.
도 2는 실시예 1에 기재된 발효에서의 시간 구간당 생산된 포자의 수를 제시한다. 막대 높이는 특정 시점에 생산된 포자의 수를 나타낸다. 각각의 샘플에서의 포자의 알짜 생산은 하기 방정식에 의해 결정되었다: NPt = Nt - Nt-1. NP = 포자의 알짜 생산, N = 포자의 수, t = 시점. 도면은 포자 형성이 접종 후 24-30시간의 기간에서 가장 빠르고 36-42시간 및 30-36시간의 기간에서 보다 낮다는 도 1의 발견을 입증한다.
도 3은 각각 30, 36, 48 또는 72시간 발효 시간에 동일한 배지에서의 이전 발효에서 수거된 10^6개의 포자로 접종된 발효 동안 바이오매스 형성의 발생 (광학 밀도에 의해 측정된 임의적인 단위)을 제시한다. 모든 발효의 바이오매스 발생은 거의 동시이고, 바이오매스 발생 곡선은 초기 유도기의 길이만큼 서로에 대해 오프셋된다. 접종물의 수거 시간이 더 늦을수록, 유도기는 더 길고 접종 후 대수성장기 성장의 종료는 더 늦다.
도 4는 각각 30, 36, 48 또는 72시간 발효 시간에 수거된 10E+6개의 포자의 접종물을 사용하여, ≥1 A.U의 바이오매스에 도달하기 위해 도 3의 발효에 요구되는 시간을 제시한다. 도 4에 도시된 시간은 유도기의 길이를 나타낸다. 접종물의 수거 시간이 더 늦을수록, 유도기는 더 길다.
도 5는 초기 접종물로서 10E+6개의 포자/ml을 사용하는 48시간 배양 시간 후 총 푸사리시딘 A, B 및 D 농도를 제시한다. 접종물에 사용된 포자 샘플은 실시예 1의 12l 규모 발효 동안 상이한 시점 후 채취되었다. 발효의 48시간 후 총 푸사리시딘 A, B 및 D 농도는 24시간 후 수거된 포자 군집으로 접종된 발효에 대해 가장 높았고 (140%, 대략 3.5g/l) 접종물 수거 시간이 증가함에 따라 대략 선형으로, 48시간에 수거된 포자 군집으로 접종된 발효의 100%로 감소하였다. 48시간 후 수거된 포자 군집으로 접종된 발효에 대해 총 푸사리시딘 농도에서의 감소는 여전히 측정가능하였으나 보다 이른 시점만큼 가파르지 않았다.
도 6은 36시간 및 56시간 발효 시간 후 수거된 포자의 포자 생장 시기를 제시한다. 콜로니 형성 단위는 ISP2 아가 플레이트 상에서 48시간 및 72시간 배양 시간 후 평가되었다. 발효 브로스 샘플에서의 영양 세포는 60℃ / 아가 플레이트 상에 100μl 샘플을 플레이팅하기 전 30분에 열 처리에 의해 사멸되었다. 36시간에 수거된 포자에 대해, 아가 플레이트 배양의 72시간 내에 관측된 모든 콜로니의 대략 77%는 배양의 48시간에 이미 명백하였다. 56시간에 수거된 포자에 대해, 배양의 72시간 내에 관측된 모든 콜로니의 대략 49%는 배양의 48시간에 이미 명백하였다.
도 7은 생존가능한 포자 역가 및 총 디피콜린산 수준 /ml 발효 브로스를 제시한다. 샘플은 실시예 4에서 수행된 발효 과정 동안 채취되었다. 디피콜린산의 농도는 발효의 대략 40시간 후 포자 형성의 속도보다 더 현저히 빠르게 증가한다.
도 8은 포자 계수에 대해 정규화된 디피콜린산 형성의 발생을 제시한다. 실시예 4의 발효에서의 단일 포자당 DPA의 비율은 DPA로서 계산되었다 [μmol / ml 발효 브로스] / 포자 계수 [수 / ml 발효 브로스]. DPA의 포자당 농도는 접종 후 40-48시간의 시간에서 가장 빠르게 증가하고, 포자당 DPA의 가장 높은 농도는 발효의 56시간에 도달되었다.
도 9는 TSB 브로스에서의 씨. 테타노모르품(C. tetanomorphum) DSM528 및 씨. 티로부티리쿰(C. tyrobutyricum) DSM1460의 실시예 9의 7일 배양으로부터 유지된 포자의 생장 시기를 제시한다. 콜로니 형성 단위는 TSB 아가 상에 100μl의 액체 배양 샘플을 플레이팅하고 48시간 및 96시간 배양 시간 후 시각적으로 계수함으로써 평가되었다. 96시간으로부터의 총 CFU 계수와 관련하여 48시간 및 96시간 배양 시간 후 발견된 CFU의 비율이 제시된다.

본 발명의 기술적 교시는 언어 수단을 사용하여, 특히 과학 및 기술 용어의 사용에 의해 본원에서 표현된다. 그러나, 통상의 기술자는 언어 수단이, 이들이 상세하고 정확할 수 있는 바와 같이, 교시를 표현하는 다수의 방식이 있기 때문에 각각의 표현이 반드시 끝나야 하므로, 각각이 반드시 모든 개념적 연결을 완전히 표현하는 데 실패한 경우에만, 오직 기술적 교시의 전체 내용에 접근할 수 있다는 것을 이해한다. 이를 염두에 두고 통상의 기술자는 본 발명의 주제가 서면 설명의 선천적인 제약에 의해, 반드시 전체를 대표하는 일부 방식으로, 본원에서 의미되거나 또는 표현된 개별적인 기술적 개념의 합이라는 것을 이해한다. 특히, 통상의 기술자는 개별적인 기술적 개념의 의미가 예를 들어 3개의 개념 또는 실시양태 A, B 및 C의 개시내용이 개념 A+B, A+C, B+C, A+B+C의 약칭 표기이도록, 기술적으로 합리적인 한 개념의 각각의 가능한 조합의 철자를 말하는 약어로서 본원에서 수행된다는 것을 이해할 것이다. 특히, 특색에 대한 폴백 위치는 수렴 대안 또는 예시화의 목록의 측면에서 본원에 기재된다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에 기재된 본 발명은 이러한 대안의 임의의 조합을 포함한다. 이러한 목록으로부터의 다소 바람직한 요소의 선택은 본 발명의 일부이고 최소 정도의 이점의 실현 또는 각각의 특색에 의해 전달된 이점에 대한 통상의 기술자의 선호도로 인한 것이다. 이러한 다수의 조합된 예시화는 본 발명의 충분히 바람직한 형태(들)를 나타낸다.

본원에 사용된 바와 같은, 단수 및 단수 형태의 용어는 내용상 달리 명백하게 지시되지 않는 한 복수형을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 용어 "핵산"의 사용은, 실용적인 방식으로, 해당 핵산 분자의 많은 카피를 임의로 포함하고; 유사하게, 용어 "프로브"는 많은 유사하거나 또는 동일한 프로브 분자를 임의로 (및 전형적으로) 포함한다. 또한 본원에 사용된 바와 같은, 단어 "포함하는" 또는 변이 예컨대 "포함한다" 또는 "포함하는"은 명시된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 포함하나, 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 배제하지 않는 것을 함축하는 것으로 이해될 것이다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "및/또는"은 연관된 열거된 항목 중 하나 이상의 임의의 및 모든 가능한 조합뿐만 아니라 대안적으로 해석되는 경우 조합의 결여 ("또는")를 지칭하고 포함한다. 용어 "포함하는"은 또한 용어 "이루어진"을 포함한다.

용어 "약"은, 측정가능한 값, 예를 들어 질량, 용량, 시간, 온도, 서열 동일성 등의 양과 관련하여 사용될 때, 명시된 값의 ± 0.1%, 0.25%, 0.5%, 0.75%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15% 또는 심지어 20%의 변이뿐만 아니라 명시된 값을 지칭한다. 따라서, 제공된 조성물이 "약 50% X"를 포함하는 것으로 기재되는 경우에, 일부 실시양태에서, 조성물이 50% X를 포함하지만 다른 실시양태에서 이는 40% 내지 60% X (즉, 50% ± 10%)의 임의의 곳을 포함할 수 있다는 것이 이해되어야 한다.

용어 "식물"은 그가 유기 물질과 관련하는 바와 같이 그의 가장 넓은 의미로 본원에 사용되고 분류학적 식물 계의 구성원인 진핵생물 유기체를 포함하는 것으로 의도되며, 그의 예는 단자엽 및 쌍자엽 식물, 관다발 식물, 채소류, 곡물, 꽃, 나무, 허브, 관목, 풀, 덩굴 식물, 양치 식물, 선류, 진균 및 조류 등뿐만 아니라, 무성 번식에 사용된 식물의 클론, 자손, 및 부분 (예를 들어 삽목물, 파이핑, 순, 근경, 지하경, 덤불, 근두, 구근, 구경, 괴경, 근경, 조직 배양물에서 생산된 식물/조직 등)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 달리 명시되지 않는 한, 용어 "식물"은 하기 중 임의의 것을 포함하는, 전체 식물, 임의의 그의 부분, 또는 식물로부터 유래된 세포 또는 조직 배양물을 지칭한다: 전체 식물, 식물 구성 요소 또는 기관 (예를 들어, 잎, 줄기, 뿌리 등), 식물 조직, 종자, 식물 세포, 및/또는 그의 자손. 식물 세포는 식물로부터 채취된 또는 식물로부터 채취된 세포로부터의 배양을 통해 유래된, 식물의 생물학적 세포이다.

본 발명의 방법에 특히 유용한 식물은 녹색식물 상과에 속하는 모든 식물, 특히 하기를 포함하는 목록으로부터 선택된 사료 또는 먹이 콩과식물, 관상용 식물, 식용 작물, 나무 또는 관목을 포함하는 단자엽 및 쌍자엽 식물을 포함한다: 에이서(Acer) 종들, 악티니디아(Actinidia) 종들, 아벨모스쿠스(Abelmoschus) 종들, 아가베 사이잘라나(Agave sisalana), 아그로피론(Agropyron) 종들, 아그로스티스 스톨로니페라(Agrostis stolonifera), 알리움(Allium) 종들, 아마란투스(Amaranthus) 종들, 암모필라 아레나리아(Ammophila arenaria), 아나나스 코모수스(Ananas comosus), 안노나(Annona) 종들, 아피움 그라베올렌스(Apium graveolens), 아라키스(Arachis) 종들, 아르토카르푸스(Artocarpus) 종들, 아스파라거스 오피시날리스(Asparagus officinalis), 아베나(Avena) 종들 (예를 들어 아베나 사티바(Avena sativa), 아베나 파투아(Avena fatua), 아베나 비잔티나(Avena byzantina), 아베나 파투아 변종 사티바, 아베나 하이브리다(Avena hybrida)), 아베르호마 카람볼라(Averrhoa carambola), 밤부사(Bambusa) 종, 베닌카사 히스피다(Benincasa hispida), 베르톨레티아 엑셀세아(Bertholletia excelsea), 베타 불가리스(Beta vulgaris), 브라시카(Brassica) 종들 (예를 들어 브라시카 나푸스(Brassica napus), 브라시카 라파(Brassica rapa) 아종 [카놀라, 유채, 순무 유채]), 카다바 파리노사(Cadaba farinosa), 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis), 칸나 인디카(Canna indica), 칸나비스 사티바(Cannabis sativa), 캅시쿰(Capsicum) 종들, 카렉스 엘라타(Carex elata), 카리카 파파야(Carica papaya), 카리싸 마크로카르파(Carissa macrocarpa), 카르야(Carya) 종들, 카르타무스 틴크토리우스(Carthamus tinctorius), 카스타네아(Castanea) 종들, 세이바 펜탄드라(Ceiba pentandra), 시코리움 엔디비아(Cichorium endivia), 신나모뭄(Cinnamomum) 종들, 시트룰루스 라나투스(Citrullus lanatus), 시트러스(Citrus) 종들, 코코스(Cocos) 종들, 코피아(Coffea) 종들, 콜로카시아 에스쿨렌타(Colocasia esculenta), 콜라(Cola) 종들, 코르코루스(Corchorus) 종, 코리안드럼 사티붐(Coriandrum sativum), 코릴루스(Corylus) 종들, 크라타에구스(Crataegus) 종들, 크로쿠스 사티부스(Crocus sativus), 쿠쿠르비타(Cucurbita) 종들, 쿠쿠미스(Cucumis) 종들, 키나라(Cynara) 종들, 다우쿠스 카로타(Daucus carota), 데스모디움(Desmodium) 종들, 디모카르푸스 론간(Dimocarpus longan), 디오스코레아(Dioscorea) 종들, 디오스피로스(Diospyros) 종들, 에키노클로아(Echinochloa) 종들, 엘라에이스(Elaeis) (예를 들어 엘라에이스 귀네엔시스(Elaeis guineensis), 엘라에이스 올레이페라(Elaeis oleifera)), 엘루신 코라카나(Eleusine coracana), 에라그로스티스 테프(Eragrostis tef), 에리안투스(Erianthus) 종, 에리오보트리야 자포니카(Eriobotrya japonica), 유칼립투스(Eucalyptus) 종, 유제니아 유니플로라(Eugenia uniflora), 파고피룸(Fagopyrum) 종들, 파구스(Fagus) 종들, 페스투카 아룬디나세아(Festuca arundinacea), 피쿠스 카리카(Ficus carica), 포르투넬라(Fortunella) 종들, 프라가리아(Fragaria) 종들, 징코 빌로바(Ginkgo biloba), 글리신(Glycine) 종들 (예를 들어 글리신 맥스(Glycine max), 소자 히스피다(Soja hispida) 또는 소자 맥스(Soja max)), 고시피움 히르수툼(Gossypium hirsutum), 헬리안투스(Helianthus) 종들 (예를 들어 헬리안투스 안누스(Helianthus annuus)), 헤메로칼리스 풀바(Hemerocallis fulva), 히비스쿠스(Hibiscus) 종들, 호르데움(Hordeum) 종들 (예를 들어 호르데움 불가레(Hordeum vulgare)), 이포모에아 바타타스(Ipomoea batatas), 주글란스(Juglans) 종들, 락투카 사티바(Lactuca sativa), 라티루스(Lathyrus) 종들, 렌스 쿨리나리스(Lens culinaris), 리눔 우시타티시뭄(Linum usitatissimum), 리치 키넨시스(Litchi chinensis), 로투스(Lotus) 종들, 루파 아쿠탄굴라(Luffa acutangula), 루피누스(Lupinus) 종들, 루줄라 실바티카(Luzula sylvatica), 리코페르시콘(Lycopersicon) 종들 (예를 들어 리코페르시콘 에스쿨렌툼(Lycopersicon esculentum), 리코페르시콘 리코페르시쿰(Lycopersicon lycopersicum), 리코페르시콘 피리포르메(Lycopersicon pyriforme)), 마크로틸로마(Macrotyloma) 종들, 말루스(Malus) 종들, 말피기아 에마르기나타(Malpighia emarginata), 맘메아 아메리카나(Mammea americana), 만기페라 인디카(Mangifera indica), 만니호트(Manihot) 종들, 마닐카라 자포타(Manilkara zapota), 메디카고 사티바(Medicago sativa), 멜릴로투스(Melilotus) 종들, 멘타(Mentha) 종들, 미스칸투스 시넨시스(Miscanthus sinensis), 모모르디카(Momordica) 종들, 모루스 니그라(Morus nigra), 무사(Musa) 종들, 니코티아나(Nicotiana) 종들, 올레아(Olea) 종들, 오푼티아(Opuntia) 종들, 오르니토푸스(Ornithopus) 종들, 오리자(Oryza) 종들 (예를 들어 오리자 사티바(Oryza sativa), 오리자 라티폴리아(Oryza latifolia)), 파니쿰 밀리아세움(Panicum miliaceum), 파니쿰 비르가툼(Panicum virgatum), 파시플로라 에둘리스(Passiflora edulis), 파스티나카 사티바(Pastinaca sativa), 펜니세툼(Pennisetum) 종, 페르세아(Persea) 종들, 페트로셀리눔 크리스품(Petroselinum crispum), 팔라리스 아룬디나세아(Phalaris arundinacea), 파세오루스(Phaseolus) 종들, 플레움 프라텐세(Phleum pratense), 포에닉스(Phoenix) 종들, 프라그미테스 오스트랄리스(Phragmites australis), 피살리스(Physalis) 종들, 피누스(Pinus) 종들, 피스타시아 베라(Pistacia vera), 피숨(Pisum) 종들, 포아(Poa) 종들, 포풀루스(Populus) 종들, 프로소피스(Prosopis) 종들, 프루누스(Prunus) 종들, 프시디움(Psidium) 종들, 푸니카 그라나툼(Punica granatum), 피루스 콤뮤니스(Pyrus communis), 퀘르쿠스(Quercus) 종들, 라파누스 사티부스(Raphanus sativus), 레움 라바르바룸(Rheum rhabarbarum), 리베스(Ribes) 종들, 리시누스 콤뮤니스(Ricinus communis), 루부스(Rubus) 종들, 사카룸(Saccharum) 종들, 살릭스(Salix) 종, 삼부쿠스(Sambucus) 종들, 세칼레 세레알레(Secale cereale), 세사뭄(Sesamum) 종들, 시나피스(Sinapis) 종, 솔라눔(Solanum) 종들 (예를 들어 솔라눔 투베로숨(Solanum tuberosum), 솔라눔 인테그리폴리움(Solanum integrifolium) 또는 솔라눔 리코페르시쿰(Solanum lycopersicum)), 소르굼 비콜로르(Sorghum bicolor), 스피나시아(Spinacia) 종들, 시지기움(Syzygium) 종들, 타게테스(Tagetes) 종들, 타마린두스 인디카(Tamarindus indica), 테오브로마 카카오(Theobroma cacao), 트리폴리움(Trifolium) 종들, 트립사쿰 닥틸로이데스(Tripsacum dactyloides), 트리티코세카레 림파우이(Triticosecale rimpaui), 트리티쿰(Triticum) 종들 (예를 들어 트리티쿰 아에스티붐(Triticum aestivum), 트리티쿰 두룸(Triticum durum), 트리티쿰 투르기둠(Triticum turgidum), 트리티쿰 히베르눔(Triticum hybernum), 트리티쿰 마차(Triticum macha), 트리티쿰 사티붐(Triticum sativum), 트리티쿰 모노코쿰(Triticum monococcum) 또는 트리티쿰 불가레(Triticum vulgare)), 트로파에올룸 미누스(Tropaeolum minus), 트로파에올룸 마주스(Tropaeolum majus), 바시니움(Vaccinium) 종들, 비시아(Vicia) 종들, 비그나(Vigna) 종들, 비올라 오도라타(Viola odorata), 비티스(Vitis) 종들, 제아 메이스(Zea mays), 지자니아 팔루스트리스(Zizania palustris), 지지푸스(Ziziphus) 종들, 아마란스, 아티초크, 아스파라거스, 브로콜리, 브뤼셀 스프라우트, 양배추, 카놀라, 당근, 콜리플라워, 샐러리, 콜라드 그린, 아마, 케일, 렌틸, 유채, 오크라, 양파, 감자, 벼, 대두, 딸기, 사탕무, 사탕수수, 해바라기, 토마토, 호박, 차 및 조류 등. 본 발명의 바람직한 실시양태에 따라, 식물은 농작물이다. 농작물의 예는 그 중에서도 대두, 해바라기, 카놀라, 알팔파, 유채, 면직물, 토마토, 감자 또는 담배를 포함한다.

본 발명에 따라, 식물은 식물 물질을 생성하기 위해 재배된다. 배양 조건은 식물을 고려하여 선택되고, 예를 들어, 온실에서의 성장, 재배지에서의 성장, 수경배양에서의 성장 및 청경 성장 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 식물 및 식물 부분, 예를 들어 종자 및 세포는 유전자 변형될 수 있다. 특히, 식물 및 그의 부분, 바람직하게는 종자 및 세포는 재조합체, 바람직하게는 트랜스제닉 또는 시스제닉일 수 있다.

본 발명은 포자 조성물을 제공한다. 본 발명에 따라, 용어 "포자" 및 "내생포자"는 상호교환적으로 사용된다. 용어는 발아가능한 포자 및 비-발아가능한 포자 둘 다, 즉 생존가능한 미생물 물질을 함유하지 않는 포자체 또는 추가 발아 또는 생장을 예방하는 유전자 변형을 포함한다. 포자체는, 예를 들어 발아를 유발하기 위한, 전형적으로 환경에 대한 반투과성 장벽으로서 작용하고 환경의 화학적 신호를 포자 내 세포 물질로 전달하는 외부 층을 포함한다. 외부 층은 전형적으로 추가로 포자외막 및 코트로 나뉘어진다. 포자 외부 층은 따라서 그 자체로 연구의 목적이고 바실루스, 클로스트리디움 (Abhyankar et al., J Proteome Res. 2013, 4507-4521) 및 파에니바실루스 (WO2020232316)에 대해 광범위하게 분석되어 왔다. 포자의 코어는 포자의 건조 중량의 최대 4-15%에 기여하는 칼슘-디피콜린산 (DPA)의 착물을 포함한다 (Church, B., Halvorson, H. Dependence of the Heat Resistance of Bacterial Endospores on their Dipicolinic Acid Content. Nature 183, 124-125 (1959). https://doi.org/10.1038/183124a0). 디피콜린산은 포자의 탈수를 초래하고 따라서 코어 내 거대분자의 열 저항성을 개선시키는 유리 물 분자에 결합하는 것으로 밝혀졌다 (I. Smith, R. Slepecky, P. Setlow, Gerhardt, P., 1989 Spore thermoresistance mechanisms. In Regulation of Procaryotic Development, edited by I. Smith, R. Slepecky, and P. Setlow, pp. 17-37, American Society for Microbiology, Washington, D.C). 또한, 칼슘-디피콜린산 착물은 핵염기 사이에 자신을 삽입하고 따라서 DNA의 안정성을 증가시킴으로써 DNA를 열 변성으로부터 보호한다 (Moeller, R., M. Raguse, G. Reitz, R. Okayasu, Z. Li, et al., 2014 Resistance of bacillus subtilis spore dna to lethal ionizing radiation damage relies primarily on spore core components and dna repair, with minor effects of oxygen radical detoxification. Applied and Environmental Microbiology 80: 104-109). 바람직하게는 용어 포자는 생존가능한, 즉 발아가능한 내생포자를 나타낸다.

포자 조성물의 포자는 원핵 미생물의 포자이다. 따라서, 본 발명은 진균 포자와 관련하지 않는다. 원핵 미생물의 바람직한 분류군은 하기 본원에 기재된다.

조성물은 여러 미생물 종의 포자를 포함할 수 있으며, 여기서 적어도 1종의 종의 포자는 본원에 기재된 바와 같은 충분한 함량의 초기 포자 군집을 포함하고, 보다 바람직하게는 2종의 종의 포자 및 가장 바람직하게는 모든 원핵 미생물의 포자는 본원에 기재된 바와 같은 충분한 함량의 각각의 초기 포자 군집을 포함한다. 본 발명은 포자 조성물 중 충분한 함량의 초기 포자 군집을 특징규명하는 특색을 상응하게 기재한다:

바람직하게는, 충분한 함량의 초기 포자 군집은 조성물의 포자가 적절한 조건 하에 콜로니 형성에 적합한 배지 상에 플레이팅될 때 콜로니를 형성하는 관측에 의해 검출될 수 있다. 이러한 성장 조건 및 고체 배지는 통상의 기술자의 일반적인 지식의 일부이다. 예를 들어, 바실루스 배양을 위한 널리 공지된 배지는 M9 최소 배지 (Harwood et al., 1990, Chemically defined growth media and supplements, p. 548. In C. R. Harwood and S. M. Cutting (ed.), Molecular biological methods for Bacillus. Wiley, Chichester, United Kingdom) 및 펩톤 고기 추출물 (Naveke et al., Einfuhrung in die mikrobiologischen Methoden, Technische Universitat Braunschweig 1982), 트립틱 소이 브로스 (TSB) 및 루리아-베르타니 (LB) (Park, C. Effect of Tryptic Soy Broth (TSB) and Luria-Bertani (LB) Medium on Production of Subtilisin CP-1 from Bacillus sp. CP-1 and Characterization of Subtilisin CP-1. Journal of Life Science (2012), 22(6), 10.5352/JLS.2012.22.6.823)이다. 플레이팅 후, 콜로니는 상이한 시간에 형성된다. 본 발명에 따라, 콜로니 형성은 균주를 플레이팅한 후 호기성 배양의 경우 72시간 (30 - 37℃) 및 혐기성 배양의 경우 96시간 (28-35℃) 동안 모니터링된다. 각각 72시간 또는 96시간 내에 관측된 모든 콜로니 중에서, 적어도 40%는 본 발명에 따른 조성물에 대해 48시간 내에 형성되었다. 바람직하게는 모든 콜로니의 최대 20%, 보다 바람직하게는 최대 10%가 48시간 후 형성될 것이다. 따라서, 72시간 또는 96시간 내에 육안에 의해 관측된 모든 콜로니의 바람직하게는 40-90%가, 적용되는 경우, 배양 후 48시간 내에 형성될 것이다. 보다 바람직하게는, 콜로니의 적어도 50%, 보다 바람직하게는 50-90%가 48시간 내에 형성될 것이다. 더욱 더 바람직하게는, 콜로니의 적어도 60%, 보다 바람직하게는 60-90%가 48시간 내에 형성될 것이다. 더욱 더 바람직하게는, 콜로니의 적어도 70%, 보다 바람직하게는 70-90%가 48시간 내에 형성될 것이다. 통상의 기술자는 발아 속도가 큰 정도로 종 특이적이라는 사실을 안다. 따라서, 콜로니는 심지어 인큐베이션의 72시간/96시간 후에도 형성할 수 있다. 그러나, 검출의 목적을 위해 초기 발아 포자 대 후기 발아 포자의 비율이 실제로 이전 포자 군집을 위해 이동된다는 것을 나타내는 것이 충분하다. 예를 들어, 실시예 10 및 도 10에 제시된 바와 같이 클로스트리디움 속에서의 상이한 균주는, 예를 들어, 파에니바실루스 균주보다 더 낮은 선천적인 성장 속도를 갖는다.

본 발명에 따른 조성물은 바람직하게는 발효, 바람직하게는 교반된 액체 상 발효로부터의 정제에 의해 수득가능하거나 또는 수득된다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 포자 조성물 중 포자의 적어도 40%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 55%, 보다 바람직하게는 적어도 60%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%는 제1 포자 형성기 동안 정제에 의해 수득가능하거나 또는 수득된다. 정제의 바람직한 방법은 이하 본원에 기재된다. 제1 포자 형성기의 종료는 전형적으로 포자 형성 속도에서의 감소에 의해 검출가능하다. 제1 포자 형성기는 이어서 보다 느린 포자 형성의 기간의 중간 지점에서 종료하는 것으로 정의된다. 그러나, 일부 발효 배지에 대해 제1 포자 형성기의 종료는 포자 형성 속도에 단독으로 기반하여 인식할 수 없다. 이러한 경우에 통상의 기술자는 검량 발효를 수행하고, 시기적절한 여러 지점에서 샘플을 채취하고 콜로니 형성 속도의 비율 및/또는 상기 기재된 바와 같은 포자당 디피콜린산의 함량을 결정할 것이다.

본 발명에 따른 조성물은 바람직하게는 포자당 디피콜린산의 평균 함량이 편평기까지 적절한 배지에서 발효된 포자의 디피콜린산의 평균 함량의 최대 80%, 보다 바람직하게는 20-80%, 더욱 더 바람직하게는 22-70%, 더욱 더 바람직하게는 30-65%이도록 디피콜린산을 포함한다. 보다 상세하게 하기 기재된 바와 같이, 포자당 디피콜린산 함량의 함량은 검량 발효 및 포자에서의 디피콜린산 함량의 측정 및 발효 동안 다양한 시간에서의 생존가능한 포자 계수에 의해 합당하게 결정된다. 포자당 디피콜린산의 최대 비율이 도달될 때, 포자당 목적하는 디피콜린산 함량이 달성될 때 발효 시간을 계산하는 것이 수월하다.

본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 조성물은 여러 이점을 제공한다. 특히, 조성물은 생존가능한 포자의 일관되고 신속한 발아 및 생장을 허용한다. 더욱이 본 발명은 보다 활성인 포자 조성물을 제조하기 위해 발효 시간을 줄이는 것을 허용한다. 이는 보다 짧은 생산 시간이 시간당 생산 능력을 증가시키기 때문에, 농업, 프로바이오틱스 및 세정 제품을 위한 포자 조성물의 산업적인 생산에서 특히 관심이다. 비록 이들이 주로 초기 포자 군집에 속하지만, 상기 조성물 중 포자가 그럼에도 불구하고 -80℃ 내지 37℃의 온도와 같은 일반 저장 조건 하에 활성의 유의한 손실 없이 광범위한 저장 동안 안정하다는 것이 본 발명의 조성물의 추가 이점이다. 파에니바실루스 포자를 포함하는 본 발명의 포자 조성물이 액체 상 발효에 접종하는 데 사용될 때 푸사리시딘의 매우 높은 생산성을 야기할 것은 또한 예기치 않았다. 본 발명의 추가 이익 및 이점은 또한 하기 실시예에 기재된다.

본 발명에 따른 포자 조성물의 포자는 정제된다. 추가로 상세하게 하기 기재된 바와 같이, 정제는 이와 같은 조성물에서의 포자 발아의 억제 또는 감소를 초래한다. 일반적으로, 포자의 정제는 각각의 미생물을 배양하는 데 사용된 발효 배지로부터 포자를 분리하는 것을 수반한다.

바람직하게는 조성물은 최대 낮은 함량의 용이하게 발효성 탄소 공급원을 포함한다. 특히 조성물의 가용성 탄소 공급원 함량은 조성물의 최대 7 중량%, 보다 바람직하게는 조성물의 0.1-4중량%인 것이 바람직하다.

더욱이, 조성물의 물 함량은 바람직하게는 액체 제제의 조성물의 최대 98중량%, 보다 바람직하게는 조성물의 80-95중량%로 조정된다. 건조 제제에서, 조성물의 물 함량은 바람직하게는 액체 제제의 조성물의 최대 10중량%, 보다 바람직하게는 조성물의 2-8중량%로 조정된다. 바람직하게는 정제는 포자의 농축을 포함하고 바람직하게는 건조, 동결건조, 균질화, 추출, 접선 유동 여과, 심층 여과, 원심분리 또는 침강분리 단계를 포함한다. 하류 프로세싱의 이러한 방법은 일반적으로 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 이들은 표준 산업 장비를 사용하고 관련 기술분야에 공지된 최소 개조 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 따라서 본 발명의 조성물이 낮은 비용으로 용이하게 생산될 수 있다는 것이 본 발명의 특정 이점이다.

상응하게 본 발명의 포자 조성물은 바람직하게는 최대 4:1, 보다 바람직하게는 3:1 내지 0.2:1의 비율로 생존가능한 세포 및 포자를 포함한다. 특정 적용에서, 발아에 요구되는 외부 계기 없이 신속한 증식을 가능하게 하는 생존가능한 세포뿐만 아니라 장기간 효능 및 제품 안정성을 허용하는 포자의 조합이 유익할 수 있다. 그러나, 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명은 주로 조성물에 포자를 제공하는 것과 관련되고, 생존가능한 세포의 존재는 따라서 본 발명에 따라 허용되나 필수적이지 않다. 더욱이, 소위 세포-무함유 제제는 세포가 결여될 수 없으나 오히려 세포를 제거하는 데 사용된 기술 (예를 들어, 원심분리의 속도)에 따라, 대체로 세포-무함유 또는 본질적으로 세포-무함유인 것이 빈번히 관측되어 왔다. 생성된 세포-무함유 제제는 건조되고/거나 식물 또는 식물 성장 배지에의 그의 적용을 돕는 구성 요소로 제제화될 수 있다. 조성물이 조성물의 포자를 생산한 원핵 미생물(들)의 세포를 포함하는, 세포의 존재를 허용할 수 있다는 것이 본 발명의 이점이다. 반면에, 본 발명의 포자 조성물은 또한 생존가능한 세포가 없는 조성물일 수 있다.

본 발명의 포자 조성물은 바람직하게는, 상기 포자에 더하여, 바람직하게는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 해충 방제제를 포함한다:

i) 살진균, 살박테리아, 살바이러스 및/또는 식물 방어 활성화제 활성을 갖는 1종 이상의 미생물 살충제,

ii) 살진균, 살박테리아, 살바이러스 및/또는 식물 방어 활성화제 활성을 갖는 1종 이상의 생화학적 살충제,

iii) 살곤충, 살진드기, 살연체동물 및/또는 살선충 활성을 갖는 1종 이상의 미생물 살충제,

iv) 살곤충, 살진드기, 살연체동물, 페로몬 및/또는 살선충 활성을 갖는 1종 이상의 생화학적 살충제,

v) 호흡 억제제, 스테롤 생합성 억제제, 핵산 합성 억제제, 세포 분열 및 세포골격 형성 또는 기능의 억제제, 아미노산 및 단백질 합성의 억제제, 신호 전달 억제제, 지질 및 막 합성 억제제, 다중 부위 작용을 갖는 억제제, 세포벽 합성 억제제, 식물 방어 유도제 및 미지의 작용 방식을 갖는 살진균제로부터 선택된 1종 이상의 살진균제.

생물살충제는 2종의 주요 부류, 미생물 및 생화학적 살충제로 나뉘어진다. 미생물 살충제는 박테리아, 진균 또는 바이러스로 이루어지고 종종 박테리아 및 진균이 생산하는 대사물을 포함한다. 곤충병원성 선충은 또한, 비록 이들이 다-세포이지만, 미생물 살충제로서 분류된다. 생화학적 살충제는 해충을 방제하거나 또는 하기 정의된 바와 같은 다른 작물 보호 용도를 제공하나, 비-독성 작용 방식을 갖는, 천연 발생 물질 또는 천연-발생 물질과 구조적으로 유사하고 기능적으로 동일한 물질 및 생물학적 공급원으로부터의 추출물 (예컨대 성장 또는 발생 조절, 유인물질, 기피제 또는 방어 활성화제 (예를 들어 유도된 저항성))이고 포유동물에게 비교적 비-독성이다. 작물 질환에 대해 사용하기 위한 생물살충제는 이미 다양한 작물에 대해 자신을 확립하였다. 예를 들어, 생물살충제는 이미 노균병 질환을 방제하는 데 중요한 역할을 한다. 이들의 이익은 하기를 포함한다: 0-일 수거-전 구간, 중등도 내지 중증 질환 압력 하에 사용하는 능력, 및 다른 등록된 살충제와 혼합물 또는 순환 프로그램으로 사용하는 능력. 여러 생물살충제가 포자 형성 원핵 미생물에 의해 생산된다는 것이 본 발명의 특정 이점이다. 따라서, 본 발명의 조성물 및 상응하는 방법은 이러한 생물살충제의 신속한 생산을 허용할 뿐만 아니라, 조성물은 유리하게 또한, 예를 들어 살진균, 살박테리아, 살바이러스 및/또는 식물 방어 활성화제 활성을 갖는 살충제가 포자의 외부 층에 부착되게 함으로써 (푸사리시딘이 그의 하나의 예임) 그 자체로 생물살충이거나, 또는 발아 후 이러한 생물살충제를 생산하는 포자의 빠르고 성공적인 발아를 지원한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 특히 원핵 미생물의 생물살충 포자를 포함하는 농업 제품의 제조를 지원한다.

따라서, 본 발명의 포자 조성물은 바람직하게는 생물살충 포자 및 임의로 추가 생물살충제를 포함한다. 많은 생물살충제는 본원에 언급된 기탁 번호 하에 기탁되었고 (접두사, 예컨대 ATCC 또는 DSM은 각각의 배양물 수집의 약어를 지칭하고, 세부 사항은 예를 들어 http://www. wfcc.info/ccinfo/collection/by_acronym/ 참조), 문헌에서 지칭되고, 등록되고/거나 상업적으로 입수가능하다: 1989년 독일 콘스탄츠에서 단리된 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) DSM 14940 및 DSM 14941의 혼합물 (예를 들어 오스트리아 소재의 바이오-펌 게엠베하(bio-ferm GmbH)로부터의 블로썸프로텍트(BlossomProtect)®에서의 출아포자), 적어도 1980년 이전에 남브라질의 밀 지역 (파수 푼두)에서 최초로 단리된 아조스피릴룸 브라실렌스(Azospirillum brasilense) Sp245 (BR 11005; 예를 들어 브라질 소재의 바스프 아그리컬쳐럴 스페셜티스 엘티디.(BASF Agricultural Specialties Ltd.)로부터의 겔픽스(GELFIX)® 잔디), 에이. 브라실렌스(A. brasilense) 균주 Ab-V5 및 Ab-V6 (예를 들어 브라질 콰트로 바하스 소재의 노보자임스 바이오아게 프로두토스 파프라 아그리컬투라 엘티디에이.(Novozymes BioAg Produtos papra Agricultura Ltda.)로부터의 아조맥스(AzoMax) 또는 브라질 소재의 심비오스-아그로(Simbiose-Agro)로부터의 심비오스-메이즈(Simbiose-Maiz)®; Plant Soil 331, 413-425, 2010), 바실루스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주 AP-188 (NRRL B-50615 및 B-50331; US 8,445,255); 일본 기쿠가와시의 공기로부터 단리된 비. 아밀로리퀘파시엔스 종들 플란타룸(plantarum) D747 (US 20130236522 A1; FERM BP 8234; 예를 들어 미국 소재의 서티스 엘엘씨(Certis LLC)로부터의 더블 니켈(Double Nickel)™ 55 WDG), 독일 브란덴부르크의 토양으로부터 단리된 비. 아밀로리퀘파시엔스 종들 플란타룸 FZB24 (또한 SB3615로 불림; DSM 96-2; J. Plant Dis. Prot. 105, 181-197, 1998; 예를 들어 미국 소재의 노보자임 바이오로지컬스, 인크.(Novozyme Biologicals, Inc.)로부터의 타에그로(Taegro)®), 독일 브란덴부르크의 토양으로부터 단리된 비. 아밀로리퀘파시엔스 아종 플란타룸 FZB42 (DSM 23117; J. Plant Dis. Prot. 105, 181-197, 1998; 예를 들어 독일 소재의 아비테프 게엠베하(AbiTEP GmbH)로부터의 리조바이탈(RhizoVital)® 42), 적어도 1988년 이전에 영국 노팅엄셔 서튼 보닝턴의 잠두로부터 단리된 비. 아밀로리퀘파시엔스 아종 플란타룸 MBI600 (또한 1430으로 불림; NRRL B 50595; US 2012/0149571 A1; 예를 들어 미국 소재의 바스프 코프.(BASF Corp.)로부터의 인테그랄(Integral)®), 1995년에 미국 캘리포니아주의 복숭아 과수원으로부터 단리된 비. 아밀로리퀘파시엔스 종들 플란타룸 QST-713 (NRRL B 21661; 예를 들어 미국 소재의 바이엘 크롭 사이언시스 엘피(Bayer Crop Science LP)로부터의 세레나데(Serenade)® 맥스), 1992년에 미국 사우스 다코다주에서 단리된 비. 아밀로리퀘파시엔스 종들 플란타룸 TJ1000 (또한 1BE로 불림; ATCC BAA-390; CA 2471555 A1; 예를 들어 미국 사우스 다코다주 워터타운 소재의 티제이 테크놀로지스(TJ Technologies)로부터의 퀵루츠(QuickRoots)™), 비. 피르무스(B. firmus) CNCM I-1582, 이스라엘의 중앙 평야 지역의 토양으로부터 단리된 모 균주 EIP-N1의 변이체 (CNCM I-1556) (WO 2009/126473, US 6,406,690; 예를 들어 미국 소재의 바이엘 크롭사이언시스 엘피로부터의 보티보(Votivo)®), 멕시코의 사과 나무 근권으로부터 단리된 비. 푸밀루스 GHA 180 (IDAC 260707-01; 예를 들어 캐나다 퀘벡 소재의 프리미어 호티컬쳐(Premier Horticulture)로부터의 프로-믹스(PRO-MIX)® BX), 적어도 1993년 이전에 에르위니아 트라케이필라(Erwinia tracheiphila)가 들끓는 오이로부터 단리된 비. 푸밀루스 INR-7 (달리 BU F22 및 BU-F33으로 지칭됨) (NRRL B-50185, NRRL B-50153; US 8,445,255), (NRRL B-50754; WO 2014/029697; 1998년에 미크로네시아 연방국 폰페이에서 수집된 토양으로부터 단리된 비. 푸밀루스 QST 2808 (NRRL B 30087; 예를 들어 미국 소재의 바이엘 크롭 사이언시스 엘피로부터의 소나타(Sonata)® 또는 발라드(Ballad)® 플러스), 비. 심플렉스(B. simplex) ABU 288 (NRRL B-50304; US 8,445,255), 북아메리카의 레드 비트 뿌리로부터 단리된 또한 UD 1022 또는 UD10-22로 불리는 비. 서브틸리스 FB17 (ATCC PTA-11857; System. Appl. Microbiol. 27, 372-379, 2004; US 2010/0260735; WO 2011/109395); 1987년에 미국 위스콘신주 에프라임의 잔디부터 채취된 토양으로부터 단리된 비. 투린기엔시스(B. thuringiensis) 아종 아이자와이(aizawai) ABTS-1857 (또한 ABG 6346으로 불림; ATCC SD-1372; 예를 들어 독일 뮌징겐 소재의 바이오파 아게(BioFa AG)로부터의 젠타리(XenTari)®), 1967년에 미국 텍사스주 브라운스빌의 병에 걸린 핑크 볼웜 흑색 유충으로부터 단리된 HD-1과 동일한 비. 티. 아종 쿠르스타키(kurstaki) ABTS-351 (ATCC SD-1275; 예를 들어 미국 일리노이주 소재의 발렌트 바이오사이언시즈(Valent BioSciences)로부터의 디펠(Dipel)® DF), 이. 사카리나(E. saccharina) 유충 사체로부터 단리된 비. 티. 아종 쿠르스타키 SB4 (NRRL B-50753; 비. 티. 아종 테네브리오니스(tenebrionis) NB-176-1, 균주 NB-125의 돌연변이체, 1982년에 갈색거저리의 죽은 번데기로부터 단리된 야생형 균주 (DSM 5480; EP 585 215 B1; 예를 들어 스위스 소재의 발렌트 바이오사이언시즈로부터의 노보도르(Novodor)®), 브베리아 바시아나(Beauveria bassiana) GHA (ATCC 74250; 예를 들어 미국 소재의 레이버램 인트. 코프.(Laverlam Int. Corp.)로부터의 보타니가드(BotaniGard)® 22WGP), 비. 바시아나 JW-1 (ATCC 74040; 예를 들어 이탈리아 소재의 씨비씨 (유럽) 에스.알.엘.(CBC (Europe) S.r.l.)로부터의 내츄랄리스(Naturalis)®), 남생이 잎벌레 콘칠록테니아 푼크타타(Conchyloctenia punctata)의 유충으로부터 단리된 비. 바시아나 PPRI 5339 (NRRL 50757), 브라질 리우 데 자네이루에서 단리된 브라디리조비움 엘카니이(Bradyrhizobium elkanii) 균주 SEMIA 5019 (또한 29W로 불림) 및 1967년에 북아메리카 단리물로 이전에 접종된 지역으로부터의 리우 그란데 도 술 주에서 단리되고 1968년부터 상업 접종물에 사용된 SEMIA 587 (Appl. Environ. Microbiol. 73(8), 2635, 2007; 예를 들어 브라질 소재의 바스프 아그리컬쳐럴 스페셜티스 엘티디.로부터의 겔픽스 5), 미국의 위스콘신주 재배지로부터 단리된 비. 자포니쿰(B. japonicum) 532c (Nitragin 61A152; Can. J. Plant. Sci. 70, 661-666, 1990; 예를 들어 캐나다 소재의 바스프 아그리컬쳐럴 스페셜티스 엘티디.로부터의 리조플로(Rhizoflo)®, 하이스틱(Histick)®, 하이코트(Hicoat)® 슈퍼), 균주 USDA 138의 비. 자포니쿰 E-109 변이체 (INTA E109, SEMIA 5085; Eur. J. Soil Biol. 45, 28-35, 2009; Biol. Fertil. Soils 47, 81-89, 2011); 문헌 [Appl. Environ. Microbiol. 73(8), 2635, 2007]으로부터 공지된 SEMIA에 기탁된 비. 자포니쿰 균주: 1992년부터 상업 접종물에 사용된 엠프라파-세르라도스(Embrapa-Cerrados)에 의해 브라질 세라도 지역의 토양으로부터 단리된 SEMIA 5079 (CPAC 15; 예를 들어 브라질 소재의 바스프 아그리컬쳐럴 스페셜티스 엘티디.로부터의 겔픽스 5 또는 애드히어(ADHERE) 60), 브라질의 엠프라파-세르라도스에 의해 실험실 조건 하에 수득되고 1992년부터 상업 접종물에 사용된, 미국에서 최초로 단리된 SEMIA 586 (CB1809)의 천연 변이체인 비. 자포니쿰 SEMIA 5080 (CPAC 7; 예를 들어 브라질 소재의 바스프 아그리컬쳐럴 스페셜티스 엘티디.로부터의 겔픽스 5 또는 애드-히어 60); 2008년에 일본 닛코의 토양으로부터 단리된 부르크홀데리아(Burkholderia) 종 A396 (NRRL B-50319; WO 2013/032693; 미국 소재의 마로네 바이오 이노베이션스, 인크.(Marrone Bio Innovations, Inc.)), 유채로부터 단리된 코니오티리움 미니탄스(Coniothyrium minitans) CON/M/91-08 (WO 1996/021358; DSM 9660; 예를 들어 독일 소재의 바이엘 크롭사이언시스 아게(Bayer CropScience AG)로부터의 콘탄스(Contans)® WG, 인터셉트(Intercept)® WG), 하핀 (알파-베타) 단백질 (Science 257, 85-88, 1992; 예를 들어 영국 소재의 플랜트 헬스 케어 피엘씨(Plant Health Care plc)로부터의 메신저(Messenger)™ 또는 HARP-N Tek), 헬리코베르파 아르미게라(Helicoverpa armigera) 핵다각체바이러스 (HearNPV) (J. Invertebrate Pathol. 107, 112-126, 2011; 예를 들어 스위스 소재의 아데르마트 바이오컨트롤(Adermatt Biocontrol)로부터의 헬리코벡스(Helicovex)®; 브라질 소재의 코퍼트(Koppert)로부터의 디플로마타(Diplomata)®; 호주 퀸즈랜드 소재의 아그바이테크 피티와이 엘티디.(AgBiTech Pty Ltd.)로부터의 비부스(Vivus)® 맥스), 헬리코베르파 제아(Helicoverpa zea) 단일 캡시드 핵다각체바이러스 (HzSNPV) (예를 들어 미국 소재의 서티스 엘엘씨로부터의 젬스타(Gemstar)®), 헬리코베르파 제아 핵다각체바이러스 ABA-NPV-U (예를 들어 호주 퀸즈랜드 소재의 아그바이테크 피티와이 엘티디.로부터의 헬리겐(Heligen)®), 헤테로라브디티스 박테리오포라(Heterorhabditis bacteriophora) (예를 들어 영국 소재의 바스프 아그리컬쳐럴 스페셜리티스 리미티드(BASF Agricultural Specialities Limited)로부터의 네마시스(Nemasys)® G), 미국 플로리다주 아포카의 기누라 상 벚나무깍지벌레로부터 단리된 이사리아 푸모소로세아(Isaria fumosorosea) 아포카-97 (ATCC 20874; Biocontrol Science Technol. 22(7), 747-761, 2012; 예를 들어 미국 소재의 서티스 엘엘씨로부터의 PFR-97™ 또는 프리페랄(PreFeRal)®), 오스트리아의 코들링 나방으로부터 단리된 또한 275 또는 V275로 불리는 메타리지움 아니소플리아에(Metarhizium anisopliae) 변종 아니소플리아에 F52 (DSM 3884, ATCC 90448; 예를 들어 캐나다 소재의 노보자임스 바이오로지컬스 바이오-아게 그룹(Novozymes Biologicals Bio-Ag Group)으로부터의 Met52®), 이스라엘 중심부의 포도로부터 단리된 메츠니코위아 프룩티콜라(Metschnikowia fructicola) 277 (US 6,994,849; NRRL Y-30752; 예를 들어 이전에 이스라엘 소재의 아그로그린(Agrogreen)으로부터의 세머(Shemer)®), 필리핀의 감염된 선충 알로부터 단리된 파에실로미세스 일라시누스(Paecilomyces ilacinus) 251 (AGAL 89/030550; WO1991/02051; Crop Protection 27, 352-361, 2008; 예를 들어 독일 소재의 바이엘 크롭사이언시스 아게로부터의 바이오액트(BioAct)® 및 미국 소재의 서티스로부터의 멜로콘(MeloCon)®), 2000년대 중반에 미국 일리노이주의 대두 재배지로부터 단리된 파스토리아 니시자와에(Pasteuria nishizawae) Pn1 (ATCC SD 5833; Federal Register 76(22), 5808, February 2, 2011; 예를 들어 미국 소재의 신젠타 크롭 프로텍션, 엘엘씨(Syngenta Crop Protection, LLC)로부터의 클라리바(Clariva)™ PN), 캐나다 앨버타의 토양으로부터 최초로 단리된 페니실리움 빌라이아에(Penicillium bilaiae) (또한 피. 빌라이이(P. bilaii)로 불림) 균주 ATCC 18309 (= ATCC 74319), ATCC 20851 및/또는 ATCC 22348 (= ATCC 74318) (Fertilizer Res. 39, 97-103, 1994; Can. J. Plant Sci. 78(1), 91-102, 1998; US 5,026,417, WO 1995/017806; 예를 들어 캐나다 소재의 노보자임스 바이오로지컬스 바이오아게 그룹으로부터의 점프 스타트(Jump Start)®, 프로바이드(Provide)®), 레이노우트리아 사칼리넨시스(Reynoutria sachalinensis) 추출물 (EP 0307510 B1; 예를 들어 미국 캘리포니아주 데이비스 소재의 마로네 바이오이노베이션스로부터의 레갈리아(Regalia)® SC 또는 독일 소재의 바이오파 아게로부터의 밀사나(Milsana)®), 스테이네르네마 카르포카프사에(Steinernema carpocapsae) (예를 들어 영국 소재의 바스프 아그리컬쳐럴 스페셜리티스 리미티드로부터의 밀레니움(Millenium)®), 에스. 펠티아에(S. feltiae) (예를 들어 미국 소재의 바이오워크스, 인크.(BioWorks, Inc.)로부터의 네마쉴드(Nemashield)®; 영국 소재의 바스프 아그리컬쳐럴 스페셜리티스 리미티드로부터의 네마시스®), 스트렙토미세스 마이크로플라부스(Streptomyces microflavus) NRRL B-50550 (WO 2014/124369; 독일 소재의 바이엘 크롭사이언시스), 또한 KRL-AG2로 불리는 티. 하르지아눔(T. harzianum) T-22 (ATCC 20847; Bio-Control 57, 687-696, 2012; 예를 들어 미국 소재의 바이오워크스 인크.로부터의 플랜트쉴드(Plantshield)® 또는 미국 오하이오주 밴 버트 소재의 어드밴스드 바이오로지컬 마케팅 인크.(Advanced Biological Marketing Inc.)로부터의 사브르엑스(SabrEx)™).

본 발명에 따른 포자 형성 미생물은 바람직하게는 피르미쿠테스(Firmicutes) 문, 바실루스, 클로스트리디아 또는 네가티비쿠테스(Negativicutes) 강,

보다 바람직하게는 바실랄레스(Bacillales), 클로스트리디알레스(Clostridiales), 써모아나에로박테랄레스(Thermoanaerobacterales), 써모세디미니박테랄레스(Thermosediminibacterales) 또는 셀레노모나달레스(Selenomonadales) 목,

보다 바람직하게는 바실라세아에(Bacillaceae), 파에니바실라세아에(Paenibacillaceae), 파스토리아세아에(Pasteuriaceae), 클로스트리디아세아에(Clostridiaceae), 펩토코카세아에(Peptococcaceae), 헬리오박테리아세아에(Heliobacteriaceae), 신트로포모나다세아에(Syntrophomonadaceae), 써모아나에로박테라세아에(Thermoanaerobacteraceae), 테피다나에로박테라세아에(Tepidanaerobacteraceae) 또는 스포로무사세아에(Sporomusaceae) 과,

보다 바람직하게는 알칼리바실루스(Alkalibacillus), 바실루스, 게오바실루스(Geobacillus), 할로바실루스(Halobacillus), 리시니바실루스(Lysinibacillus), 피스키바실루스(Piscibacillus), 테리바실루스(Terribacillus), 브레비바실루스(Brevibacillus), 파에니바실루스, 써모바실루스(Thermobacillus), 파스토리아, 클로스트리디움, 데술포토마쿨룸(Desulfotomaculum), 헬리오박테리움(Heliobacterium), 펠로스포라(Pelospora), 펠로토마쿨룸(Pelotomaculum), 칼다나에로박터(Caldanaerobacter), 무렐라(Moorella), 써모아나에로박터(Thermoanaerobacter), 테피다나에로박터(Tepidanaerobacter), 프로피오니스포라(Propionispora) 또는 스포로무사(Sporomusa) 속,

보다 바람직하게는 바실루스, 파에니바실루스 또는 클로스트리디움 속의 분류학적 계급으로부터 선택된다. 이들 분류군의 미생물은 통상의 기술자에게 공지되어 있고; 이들의 배양 방법은 이용가능하고 관련 기술분야의 통상의 기술자의 일상적인 작업의 일부를 형성한다. 상기 언급된 미생물 중 다수가, 예를 들어 관련 농업 조성물 또는 프로바이오틱스를 생산하기 위해 산업적인 관련성이 있는 것이 유리하다. 특히, 바실라세아에, 파에니바실라세아에 및 클로스트리디아세아에 과의 미생물이 관련이 있고 살진균 및/또는 살박테리아 효과를 발휘하는 것으로 공지되어 있다.

본 발명의 조성물 내에서, 특히 하기 종의 포자가 바람직하다:

파에니바실루스 종: 피. 아베카와엔시스(P. abekawaensis), 피. 아비씨(P. abyssi), 피. 아세리스(P. aceris), 피. 아세티(P. aceti), 피. 아에스투아리이(P. aestuarii), 피. 아가렉세덴스(P. agarexedens), 피. 아가리데보란스(P. agaridevorans), 피. 알바(P. alba), 피. 알비두스(P. albidus), 피. 알부스(P. albus), 피. 알기노리티쿠스(P. alginolyticus), 피. 알고리폰티콜라(P. algorifonticola), 피. 알칼리테르라에(P. alkaliterrae), 피. 알베이(P. alvei), 피. 아밀로리티쿠스(P. amylolyticus), 피. 아나에리카누스(P. anaericanus), 피. 안타르크티쿠스(P. antarcticus), 피. 안티바이오티코필라(P. antibioticophila), 피. 안트리(P. antri), 피. 아피아리에스(P. apiaries), 피. 아피아리우스(P. apiarius), 피. 아피스(P. apis), 피. 아퀴스타그니(P. aquistagni), 피. 아라키디스(P. arachidis), 피. 아르크티쿠스(P. arcticus), 피. 아사멘시스(P. assamensis), 피. 아우란티아쿠스(P. aurantiacus), 피. 아조레두센스(P. azoreducens), 피. 아조티피겐스(P. azotifigens), 피. 바에크로크다미솔리(P. baekrokdamisoli), 피. 바르시노넨시스(P. barcinonensis), 피. 바렌골트지이(P. barengoltzii), 피. 베이진겐시스(P. beijingensis), 피. 보레알리스(P. borealis), 피. 보우쉐스두르호넨시스(P. bouchesdurhonensis), 피. 보비스(P. bovis), 피. 브라실렌시스(P. brasilensis), 피. 브라시카에(P. brassicae), 피. 브리오필룸(P. bryophyllum), 피. 카에스피티스(P. caespitis), 피. 카멜리아에(P. camelliae), 피. 카메로우넨시스(P. camerounensis), 피. 캄피나센시스(P. campinasensis), 피. 카스타네아에(P. castaneae), 피. 카탈파에(P. catalpae), 피. 카토르미이(P. cathormii), 피. 카베르나에(P. cavernae), 피. 셀룰로시리티쿠스(P. cellulosilyticus), 피. 셀룰로시트로피쿠스(P. cellulositrophicus), 피. 카르타리우스(P. chartarius), 피. 키벤시스(P. chibensis), 피. 키넨시스(P. chinensis), 피. 친주엔시스(P. chinjuensis), 피. 키티노리티쿠스(P. chitinolyticus), 피. 콘드로이티누스(P. chondroitinus), 피. 중앙겐시스(P. chungangensis), 피. 시네리스(P. cineris), 피. 시솔로켄시스(P. cisolokensis), 피. 콘타미난스(P. contaminans), 피. 쿠키이(P. cookii), 피. 크라쏘스트레아에(P. crassostreae), 피. 쿠쿠미스(P. cucumis), 피. 쿠르드라노리티쿠스(P. curdlanolyticus), 피. 대전엔시스(P. daejeonensis), 피. 다카렌시스(P. dakarensis), 피. 다랑쉬엔시스(P. darangshiensis), 피. 다르위니아누스(P. darwinianus), 피. 다우시(P. dauci), 피. 덴드리티포르미스(P. dendritiformis), 피. 동도넨시스(P. dongdonensis), 피. 동해엔시스(P. donghaensis), 피. 두사넨시스(P. doosanensis), 피. 두루스(P. durus), 피. 에다피쿠스(P. edaphicus), 피. 에히멘시스(P. ehimensis), 피. 엘기이(P. elgii), 피. 엘리미(P. elymi), 피. 엔도피티쿠스(P. endophyticus), 피. 엔쉬디스(P. enshidis), 피. 에스테리솔벤스(P. esterisolvens), 피. 에테리(P. etheri), 피. 유콤미아에(P. eucommiae), 피. 파에시스(P. faecis), 피. 파비스포루스(P. favisporus), 피. 페라리우스(P. ferrarius), 피. 필리시스(P. filicis), 피. 플라겔라투스(P. flagellatus), 피. 폰티콜라(P. fonticola), 피. 포르시티아에(P. forsythiae), 피. 프리고리레시스텐스(P. frigoriresistens), 피. 푸지엔시스(P. fujiensis), 피. 푸쿠이넨시스(P. fukuinensis), 피. 간수엔시스(P. gansuensis), 피. 겔라티니리티쿠스(P. gelatinilyticus), 피. 진센가그리(P. ginsengagri), 피. 진센가르비(P. ginsengarvi), 피. 진센기후미(P. ginsengihumi), 피. 진센기테르라에(P. ginsengiterrae), 피. 글라시알리스(P. glacialis), 피. 글레바에(P. glebae), 피. 글루카노리티쿠스(P. glucanolyticus), 피. 글리카니리티쿠스(P. glycanilyticus), 피. 고릴라에(P. gorillae), 피. 그라미니스(P. graminis), 피. 그라니보란스(P. granivorans), 피. 구앙조우엔시스(P. guangzhouensis), 피. 하레나에(P. harenae), 피. 헬리안티(P. helianthi), 피. 헤메로칼리콜라(P. hemerocallicola), 피. 헤르베르티(P. herberti), 피. 히스파니쿠스(P. hispanicus), 피. 호도가엔시스(P. hodogayensis), 피. 호르데이(P. hordei), 피. 호르티(P. horti), 피. 후미쿠스(P. humicus), 피. 후나넨시스(P. hunanensis), 피. 이베타에(P. ihbetae), 피. 이후아에(P. ihuae), 피. 이후미(P. ihumii), 피. 일리노이센시스(P. illinoisensis), 피. 인술라에(P. insulae), 피. 인테스티니(P. intestini), 피. 자밀라에(P. jamilae), 피. 질룬리이(P. jilunlii), 피. 코벤시스(P. kobensis), 피. 콜레오보란스(P. koleovorans), 피. 콘쿠켄시스(P. konkukensis), 피. 콘시덴시스(P. konsidensis), 피. 코레엔시스(P. koreensis), 피. 크립벤시스(P. kribbensis), 피. 경헤엔시스(P. kyungheensis), 피. 락티스(P. lactis), 피. 라쿠스(P. lacus), 피. 라르바에(P. larvae), 피. 라우투스(P. lautus), 피. 렘나에(P. lemnae), 피. 렌티모르부스(P. lentimorbus), 피. 렌투스(P. lentus), 피. 리아오니겐시스(P. liaoningensis), 피. 리미콜라(P. limicola), 피. 루피니(P. lupini), 피. 루테우스(P. luteus), 피. 루티미네랄리스(P. lutimineralis), 피. 마세란스(P. macerans), 피. 막쿠아리엔시스(P. macquariensis), 피. 마르칸티오피토룸(P. marchantiophytorum), 피. 마리니세디미니스(P. marinisediminis), 피. 마리눔(P. marinum), 피. 마실리엔시스(P. massiliensis), 피. 마이시엔시스(P. maysiensis), 피. 메디카기니스(P. medicaginis), 피. 멘델리이(P. mendelii), 피. 메소필루스(P. mesophilus), 피. 메타놀리쿠스(P. methanolicus), 피. 모빌리스(P. mobilis), 피. 몬타니솔리(P. montanisoli), 피. 몬타니테르라에(P. montaniterrae), 피. 모토부엔시스(P. motobuensis), 피. 무실라기노수스(P. mucilaginosus), 피. 나넨시스(P. nanensis), 피. 나프탈레노보란스(P. naphthalenovorans), 피. 나수티테르미티스(P. nasutitermitis), 피. 네브라스켄시스(P. nebraskensis), 피. 네마토필루스(P. nematophilus), 피. 니코티아나에(P. nicotianae), 피. 누루키(P. nuruki), 피. 오세아니세디미니스(P. oceanisediminis), 피. 오도리페르(P. odorifer), 피. 오에노테라에(P. oenotherae), 피. 오랄리스(P. oralis), 피. 오리자에(P. oryzae), 피. 오리지솔리(P. oryzisoli), 피. 오토위이(P. ottowii), 피. 오우로피넨시스(P. ourofinensis), 피. 파불리(P. pabuli), 피. 파에오니아에(P. paeoniae), 피. 파나키후미(P. panacihumi), 피. 파나키솔리(P. panacisoli), 피. 파나시테라에(P. panaciterrae), 피. 파리디스(P. paridis), 피. 파사데넨시스(P. pasadenensis), 피. 펙티니리티쿠스(P. pectinilyticus), 피. 페오리아에(P. peoriae), 피. 페리안드라에(P. periandrae), 피. 포카엔시스(P. phocaensis), 피. 포에니시스(P. phoenicis), 피. 필로스파에라에(P. phyllosphaerae), 피. 피스코미트렐라에(P. physcomitrellae), 피. 피니(P. pini), 피. 피니후미(P. pinihumi), 피. 피니솔리(P. pinisoli), 피. 피니스트라멘티(P. pinistramenti), 피. 포케오넨시스(P. pocheonensis), 피. 폴리믹사(P. polymyxa), 피. 폴리사카로리티쿠스(P. polysaccharolyticus), 피. 포필리아에(P. popilliae), 피. 포풀리(P. populi), 피. 프로푼두스(P. profundus), 피. 프로소피디스(P. prosopidis), 피. 프로타에티아에(P. protaetiae), 피. 프로벤센시스(P. provencensis), 피. 사이크로레시스텐스(P. psychroresistens), 피. 푸에리(P. pueri), 피. 푸에르네세(P. puernese), 피. 풀데운겐시스(P. puldeungensis), 피. 푸리스파티이(P. purispatii), 피. 킹스헨기이(P. qingshengii), 피. 킨린겐시스(P. qinlingensis), 피. 퀘르쿠스(P. quercus), 피. 라디시스(P. radicis), 피. 렐릭티세사미(P. relictisesami), 피. 레시두이(P. residui), 피. 리조플라나에(P. rhizoplanae), 피. 리조리자에(P. rhizoryzae), 피. 리조스파에라에(P. rhizosphaerae), 피. 리구이(P. rigui), 피. 리파에(P. ripae), 피. 루빈판티스(P. rubinfantis), 피. 루미노콜라(P. ruminocola), 피. 사비나에(P. sabinae), 피. 사케오넨시스(P. sacheonensis), 피. 살리니카에니(P. salinicaeni), 피. 산구이니스(P. sanguinis), 피. 세디미니스(P. sediminis), 피. 세게티스(P. segetis), 피. 셀레니이(P. selenii), 피. 셀레니티레두센스(P. selenitireducens), 피. 세네갈렌시스(P. senegalensis), 피. 세네갈리마실리엔시스(P. senegalimassiliensis), 피. 세오도넨시스(P. seodonensis), 피. 셉텐트리오날리스(P. septentrionalis), 피. 세풀크리(P. sepulcri), 피. 세니안겐시스(P. shenyangensis), 피. 시라카미엔시스(P. shirakamiensis), 피. 순펜기이(P. shunpengii), 피. 시아멘시스(P. siamensis), 피. 실라게이(P. silagei), 피. 실바에(P. silvae), 피. 시노포도필리(P. sinopodophylli), 피. 솔라나세아룸(P. solanacearum), 피. 솔라니(P. solani), 피. 솔리(P. soli), 피. 손키(P. sonchi) 군, 피. 소포라에(P. sophorae), 피. 스피리투스(P. spiritus), 피. 스푸티(P. sputi), 피. 스텔리페르(P. stellifer), 피. 수손겐시스(P. susongensis), 피. 스우엔시스(P. swuensis), 피. 타이춘겐시스(P. taichungensis), 피. 타이후엔시스(P. taihuensis), 피. 타이와넨시스(P. taiwanensis), 피. 타오후아샤넨세(P. taohuashanense), 피. 타리멘시스(P. tarimensis), 피. 텔루리스(P. telluris), 피. 테피디필루스(P. tepidiphilus), 피. 테르라에(P. terrae), 피. 테르레우스(P. terreus), 피. 테리게나(P. terrigena), 피. 테즈푸렌시스(P. tezpurensis), 피. 타일란덴시스(P. thailandensis), 피. 써모아에로필루스(P. thermoaerophilus), 피. 써모필루스(P. thermophilus), 피. 티아미노리티쿠스(P. thiaminolyticus), 피. 티안무엔시스(P. tianmuensis), 피. 티베텐시스(P. tibetensis), 피. 티모넨시스(P. timonensis), 피. 트란스루센스(P. translucens), 피. 트리티시(P. tritici), 피. 트리티시솔리(P. triticisoli), 피. 투아레기(P. tuaregi), 피. 툼바에(P. tumbae), 피. 툰드라에(P. tundrae), 피. 투리센시스(P. turicensis), 피. 틸로필리(P. tylopili), 피. 티파에(P. typhae), 피. 티르피스(P. tyrfis), 피. 울리기니스(P. uliginis), 피. 우리날리스(P. urinalis), 피. 발리두스(P. validus), 피. 벨라에이(P. velaei), 피. 비니(P. vini), 피. 보르텍스(P. vortex), 피. 보르티칼리스(P. vorticalis), 피. 불네리스(P. vulneris), 피. 웬시니아에(P. wenxiniae), 피. 위트소니아에(P. whitsoniae), 피. 우포넨시스(P. wooponensis), 피. 우손겐시스(P. woosongensis), 피. 울루무키엔시스(P. wulumuqiensis), 피. 윈니이(P. wynnii), 피. 크산타니리티쿠스(P. xanthanilyticus), 피. 크산티니리티쿠스(P. xanthinilyticus), 피. 크세로테르모두란스(P. xerothermodurans), 피. 크신지안겐시스(P. xinjiangensis), 피. 크실라넥세덴스(P. xylanexedens), 피. 크실라니클라스티쿠스(P. xylaniclasticus), 피. 크실라니리티쿠스(P. xylanilyticus), 피. 크실라니솔벤스(P. xylanisolvens), 피. 얀첸겐시스(P. yanchengensis), 피. 욘기넨시스(P. yonginensis), 피. 윤나넨시스(P. yunnanensis), 피. 잔톡실리(P. zanthoxyli), 피. 제아에(P. zeae),

바람직하게는 피. 아가렉세덴스, 피. 아가리데보란스, 피. 알기노리티쿠스, 피. 알칼리테르라에, 피. 알베이, 피. 아밀로리티쿠스, 피. 아나에리카누스, 피. 안타르크티쿠스, 피. 아사멘시스, 피. 아조레두센스, 피. 바르시노넨시스, 피. 보레알리스, 피. 브라시카에, 피. 캄피나센시스, 피. 친주엔시스, 피. 키티노리티쿠스, 피. 콘드로이티누스, 피. 시네리스, 피. 쿠르드라노리티쿠스, 피. 대전엔시스, 피. 덴드리티포르미스, 피. 에히멘시스, 피. 엘기이, 피. 파비스포루스, 피. 글루카노리티쿠스, 피. 글리카니리티쿠스, 피. 그라미니스, 피. 그라니보란스, 피. 호도가엔시스, 피. 일리노이센시스, 피. 자밀라에, 피. 코벤시스, 피. 콜레오보란스, 피. 코레엔시스, 피. 크립벤시스, 피. 락티스, 피. 라르바에, 피. 라우투스, 피. 렌티모르부스, 피. 마세란스, 피. 막쿠아리엔시스, 피. 마실리엔시스, 피. 멘델리이, 피. 모토부엔시스, 피. 나프탈레노보란스, 피. 네마토필루스, 피. 오도리페르, 피. 파불리, 피. 페오리아에, 피. 포에니시스, 피. 필로스파에라에, 피. 폴리믹사, 피. 포필리아에, 피. 리조스파에라에, 피. 산구이니스, 피. 스텔리페르, 피. 타이춘겐시스, 피. 테르라에, 피. 티아미노리티쿠스, 피. 티모넨시스, 피. 틸로필리, 피. 투리센시스, 피. 발리두스, 피. 보르텍스, 피. 불네리스, 피. 윈니이, 피. 크실라니리티쿠스,

특히 바람직하게는 파에니바실루스 코레엔시스, 파에니바실루스 리조스파에라에, 파에니바실루스 폴리믹사, 파에니바실루스 아밀로리티쿠스, 파에니바실루스 테르라에, 파에니바실루스 폴리믹사 폴리믹사, 파에니바실루스 폴리믹사 플란타룸, 파에니바실루스 신규 종 에피피티쿠스(epiphyticus), 파에니바실루스 테르라에, 파에니바실루스 마세란스, 파에니바실루스 알베이, 보다 바람직하게는 파에니바실루스 폴리믹사, 파에니바실루스 폴리믹사 폴리믹사, 파에니바실루스 폴리믹사 플란타룸, 파에니바실루스 신규 종 에피피티쿠스, 파에니바실루스 테르라에, 파에니바실루스 마세란스, 파에니바실루스 알베이,

더욱 더 바람직하게는 파에니바실루스 폴리믹사, 파에니바실루스 폴리믹사 폴리믹사, 파에니바실루스 폴리믹사 플란타룸 및 파에니바실루스 테르라에.

바실루스 종: 비. 아비살리스(B. abyssalis), 비. 아칸티(B. acanthi), 비. 아시디셀레르(B. acidiceler), 비. 아시디콜라(B. acidicola), 비. 아시디프로두센스(B. acidiproducens), 비. 아시디톨레란스(B. aciditolerans), 비. 아시도풀룰리티쿠스(B. acidopullulyticus), 비. 아시도보란스(B. acidovorans), 비. 아에올리우스(B. aeolius), 비. 아에쿠오로리스(B. aequororis), 비. 아에리스(B. aeris), 비. 아에리우스(B. aerius), 비. 아에로라크티쿠스(B. aerolacticus), 비. 아에스투아리이, 비. 아이딘겐시스(B. aidingensis), 비. 아키바이(B. akibai), 비. 알칼리이눌리누스(B. alcaliinulinus), 비. 알칼로필루스(B. alcalophilus), 비. 알기콜라(B. algicola), 비. 알칼리콜라(B. alkalicola), 비. 알칼리라쿠스(B. alkalilacus), 비. 알칼리니트릴리쿠스(B. alkalinitrilicus), 비. 알칼리세디미니스(B. alkalisediminis), 비. 알칼리텔루리스(B. alkalitelluris), 비. 알칼리톨레란스(B. alkalitolerans), 비. 알칼로가야(B. alkalogaya), 비. 알티투디니스(B. altitudinis), 비. 알베아유엔시스(B. alveayuensis), 비. 아밀리엔시스(B. amiliensis), 비. 안드레에세니이(B. andreesenii), 비. 안드레라오울티이(B. andreraoultii), 비. 아포르로에우스(B. aporrhoeus), 비. 아퀴마리스(B. aquimaris), 비. 아르부티니보란스(B. arbutinivorans), 비. 아리아브하타이(B. aryabhattai), 비. 아사히이(B. asahii), 비. 아우란티아쿠스, 비. 아우스트랄리마리스(B. australimaris), 비. 아조토포르만스(B. azotoformans), 비. 박테리움(B. bacterium), 비. 바디우스(B. badius), 비. 바에크륜겐시스(B. baekryungensis), 비. 바타비엔시스(B. bataviensis), 비. 벤조에보란스(B. benzoevorans), 비. 베린겐시스(B. beringensis), 비. 베르켈레이이(B. berkeleyi), 비. 베베리드게이(B. beveridgei), 비. 빙마욘겐시스(B. bingmayongensis), 비. 보고리엔시스(B. bogoriensis), 비. 보르보리(B. borbori), 비. 보로니필루스(B. boroniphilus), 비. 부타놀리보란스(B. butanolivorans), 비. 카브리알레시이(B. cabrialesii), 비. 카카에(B. caccae), 비. 카멜리아에, 비. 캄피살리스(B. campisalis), 비. 카나베랄리우스(B. canaveralius), 비. 카파리디스(B. capparidis), 비. 카르보니필루스(B. carboniphilus), 비. 카사만센시스(B. casamancensis), 비. 카세이니리티쿠스(B. caseinilyticus), 비. 카테눌라투스(B. catenulatus), 비. 카베르나에, 비. 세셈벤시스(B. cecembensis), 비. 셀룰로시리티쿠스, 비. 카간노렌시스(B. chagannorensis), 비. 칸디가렌시스(B. chandigarhensis), 비. 케오나넨시스(B. cheonanensis), 비. 중앙겐시스, 비. 시센시스(B. ciccensis), 비. 시후엔시스(B. cihuensis), 비. 시르쿨란스(B. circulans), 비. 클라우시이(B. clausii), 비. 코아굴란스(B. coagulans), 비. 코아후일렌시스(B. coahuilensis), 비. 코흐니이(B. cohnii), 비. 콤포스티(B. composti), 비. 코니페룸(B. coniferum), 비. 코레아엔시스(B. coreaensis), 비. 크라쏘스트레아에, 비. 크레센스(B. crescens), 비. 쿠쿠미스, 비. 다카렌시스, 비. 달리엔시스(B. daliensis), 비. 다난겐시스(B. danangensis), 비. 다킨겐시스(B. daqingensis), 비. 데시시프론디스(B. decisifrondis), 비. 데콜로라티오니스(B. decolorationis), 비. 데프레스수스(B. depressus), 비. 데라미피칸스(B. deramificans), 비. 데세르티(B. deserti), 비. 디엘모엔시스(B. dielmoensis), 비. 드지벨로렌시스(B. djibelorensis), 비. 드렌텐시스(B. drentensis), 비. 엑토이니포르만스(B. ectoiniformans), 비. 에이세니아에(B. eiseniae), 비. 엔클렌시스(B. enclensis), 비. 엔돌리티쿠스(B. endolithicus), 비. 엔도피티쿠스, 비. 엔도라디시스(B. endoradicis), 비. 엔도잔톡실리쿠스(B. endozanthoxylicus), 비. 파라기니스(B. farraginis), 비. 파스티디오수스(B. fastidiosus), 비. 펭키우엔시스(B. fengqiuensis), 비. 페르멘티(B. fermenti), 비. 페라리아룸(B. ferrariarum), 비. 필라멘토수스(B. filamentosus), 비. 피르미스(B. firmis), 비. 피르무스, 비. 플라보칼다리우스(B. flavocaldarius), 비. 플렉수스(B. flexus), 비. 포라미니스(B. foraminis), 비. 포르디이(B. fordii), 비. 포르모센시스(B. formosensis), 비. 포르티스(B. fortis), 비. 프레우덴레이키이(B. freudenreichii), 비. 푸코시보란스(B. fucosivorans), 비. 푸마리올리(B. fumarioli), 비. 푸니쿨루스(B. funiculus), 비. 갈락토시디리티쿠스(B. galactosidilyticus), 비. 갈리시엔시스(B. galliciensis), 비. 기브소니이(B. gibsonii), 비. 진셍기솔리(B. ginsenggisoli), 비. 진센기후미, 비. 진센기솔리(B. ginsengisoli), 비. 글렌니이(B. glennii), 비. 글리시니페르멘탄스(B. glycinifermentans), 비. 고비엔시스(B. gobiensis), 비. 고시피이(B. gossypii), 비. 고트테일리이(B. gottheilii), 비. 그라미니스, 비. 그라나덴시스(B. granadensis), 비. 하켄사키이(B. hackensackii), 비. 하이코우엔시스(B. haikouensis), 비. 할마팔루스(B. halmapalus), 비. 할로두란스(B. halodurans), 비. 할로사카로보란스(B. halosaccharovorans), 비. 하이네시이(B. haynesii), 비. 헤미셀룰로시리티쿠스(B. hemicellulosilyticus), 비. 헤미센트로티(B. hemicentroti), 비. 헤르베르스테이넨시스(B. herbersteinensis), 비. 히사쉬이(B. hisashii), 비. 호리코쉬이(B. horikoshii), 비. 호르네키아에(B. horneckiae), 비. 호르티, 비. 후이조우엔시스(B. huizhouensis), 비. 후미(B. humi), 비. 후나넨시스, 비. 화진포엔시스(B. hwajinpoensis), 비. 이드리엔시스(B. idriensis), 비. 인디쿠스(B. indicus), 비. 인판티스(B. infantis), 비. 인페르누스(B. infernus), 비. 인테르메디우스(B. intermedius), 비. 인테스티날리스(B. intestinalis), 비. 이오카사에(B. iocasae), 비. 이사벨리아에(B. isabeliae), 비. 이스라엘리(B. israeli), 비. 제다헨시스(B. jeddahensis), 비. 제오트갈리(B. jeotgali), 비. 켁수에아에(B. kexueae), 비. 키스쿤사겐시스(B. kiskunsagensis), 비. 코키이(B. kochii), 비. 코케쉬이포르미스(B. kokeshiiformis), 비. 코레엔시스, 비. 코르렌시스(B. korlensis), 비. 크립벤시스, 비. 크룰위키아에(B. krulwichiae), 비. 콰시오르코리(B. kwashiorkori), 비. 경기엔시스(B. kyonggiensis), 비. 라시살시(B. lacisalsi), 비. 라쿠스, 비. 레헨시스(B. lehensis), 비. 렌투스, 비. 리그니니필루스(B. ligniniphilus), 비. 린디아넨시스(B. lindianensis), 비. 리토랄리스(B. litoralis), 비. 로이셀레우리아에(B. loiseleuriae), 비. 로나렌시스(B. lonarensis), 비. 롱기쿠아에시툼(B. longiquaesitum), 비. 롱기스포루스(B. longisporus), 비. 루시페렌시스(B. luciferensis), 비. 루테오루스(B. luteolus), 비. 루테우스, 비. 리코페르시시(B. lycopersici), 비. 마가테리움(B. magaterium), 비. 말리키이(B. malikii), 비. 만그로벤시스(B. mangrovensis), 비. 만그로비(B. mangrovi), 비. 만나니리티쿠스(B. mannanilyticus), 비. 마누센시스(B. manusensis), 비. 마라스미(B. marasmi), 비. 마르코레스틴크툼(B. marcorestinctum), 비. 마리니세디멘토룸(B. marinisedimentorum), 비. 마리스플라비(B. marisflavi), 비. 마리티무스(B. maritimus), 비. 마르마렌시스(B. marmarensis), 비. 마실리글라시에이(B. massiliglaciei), 비. 마실리오아노렉시우스(B. massilioanorexius), 비. 마실리오가보넨시스(B. massiliogabonensis), 비. 마실리오고릴라에(B. massiliogorillae), 비. 마실리오니게리엔시스(B. massilionigeriensis), 비. 마실리오세네갈렌시스(B. massiliosenegalensis), 비. 메디테르라네엔시스(B. mediterraneensis), 비. 메가테리움(B. megaterium), 비. 메소나에(B. mesonae), 비. 메소필룸(B. mesophilum), 비. 메소필루스, 비. 메타놀리쿠스, 비. 미스칸티(B. miscanthi), 비. 무랄리스(B. muralis), 비. 무리마르티니(B. murimartini), 비. 나카무라이(B. nakamurai), 비. 난하이이세디미니스(B. nanhaiisediminis), 비. 나트로노필루스(B. natronophilus), 비. 엔디오피쿠스(B. ndiopicus), 비. 네알소니이(B. nealsonii), 비. 네마토시다(B. nematocida), 비. 니아벤시스(B. niabensis), 비. 니아시니(B. niacini), 비. 니아메이엔시스(B. niameyensis), 비. 니트리토필루스(B. nitritophilus), 비. 노토진센기솔리(B. notoginsengisoli), 비. 노발리스(B. novalis), 비. 오브스트룩티부스(B. obstructivus), 비. 오세아니(B. oceani), 비. 오세아니세디미니스, 비. 오벤시스(B. ohbensis), 비. 오크헨시스(B. okhensis), 비. 오쿠히덴시스(B. okuhidensis), 비. 올레이보란스(B. oleivorans), 비. 올레로니우스(B. oleronius), 비. 올리바에(B. olivae), 비. 오누벤시스(B. onubensis), 비. 오리자에, 비. 오리자에코르티시스(B. oryzaecorticis), 비. 오리지솔리, 비. 오리지테르라에(B. oryziterrae), 비. 오쉬멘시스(B. oshimensis), 비. 파키스타넨시스(B. pakistanensis), 비. 파나키솔리, 비. 파나시테라에, 비. 파라플렉수스(B. paraflexus), 비. 파타고니엔시스(B. patagoniensis), 비. 페르시쿠스(B. persicus), 비. 페르바구스(B. pervagus), 비. 포카에엔시스(B. phocaeensis), 비. 피키노티이(B. pichinotyi), 비. 피스키콜라(B. piscicola), 비. 피스키스(B. piscis), 비. 플라코르티디스(B. plakortidis), 비. 포케오넨시스, 비. 폴리고니(B. polygoni), 비. 폴리마쿠스(B. polymachus), 비. 포풀리, 비. 프라에디이(B. praedii), 비. 슈달칼리필루스(B. pseudalcaliphilus), 비. 슈도피르무스(B. pseudofirmus), 비. 슈도플렉수스(B. pseudoflexus), 비. 슈도메가테리움(B. pseudomegaterium), 비. 사이크로사카로리티쿠스(B. psychrosaccharolyticus), 비. 푸밀루스, 비. 푸르가티오니레시스텐(B. purgationiresistens), 비. 킹스헨기이, 비. 라세밀락티쿠스(B. racemilacticus), 비. 리조스파에라에, 비. 리길리프로푼디(B. rigiliprofundi), 비. 루비인판티스(B. rubiinfantis), 비. 루리스(B. ruris), 비. 사펜시스(B. safensis), 비. 사가니이(B. saganii), 비. 살라세티스(B. salacetis), 비. 살라리우스(B. salarius), 비. 살리두란스(B. salidurans), 비. 살리스(B. salis), 비. 살리톨레란스(B. salitolerans), 비. 살말라야(B. salmalaya), 비. 살수스(B. salsus), 비. 세디미니스, 비. 셀레나타르세나티스(B. selenatarsenatis), 비. 세네갈렌시스, 비. 세오하에아넨시스(B. seohaeanensis), 비. 샤케엔시스(B. shacheensis), 비. 샤크클레토니이(B. shackletonii), 비. 샨돈겐시스(B. shandongensis), 비. 쉬바지이(B. shivajii), 비. 시밀리스(B. similis), 비. 심플렉스, 비. 시네살로우멘시스(B. sinesaloumensis), 비. 시랄리스(B. siralis), 비. 스미티이(B. smithii), 비. 솔라니, 비. 솔리, 비. 솔리만그로비(B. solimangrovi), 비. 솔리실바에(B. solisilvae), 비. 송클렌시스(B. songklensis), 비. 스폰기아에(B. spongiae), 비. 스포로써모두란스(B. sporothermodurans), 비. 스탐시이(B. stamsii), 비. 서브테르라네우스(B. subterraneus), 비. 스웨제이이(B. swezeyi), 비. 타에아넨시스(B. taeanensis), 비. 타이와넨시스, 비. 타마리시스(B. tamaricis), 비. 탁시(B. taxi), 비. 테르라에, 비. 테스티스(B. testis), 비. 타온히엔시스(B. thaonhiensis), 비. 써모알칼로필루스(B. thermoalkalophilus), 비. 써모아밀로리퀘파시엔스(B. thermoamyloliquefaciens), 비. 써모아밀로보란스(B. thermoamylovorans), 비. 써모코프리아에(B. thermocopriae), 비. 써모락티스(B. thermolactis), 비. 써모필루스, 비. 써모프로테오리티쿠스(B. thermoproteolyticus), 비. 써모테레스트리스(B. thermoterrestris), 비. 써모제아마이제(B. thermozeamaize), 비. 티오파란스(B. thioparans), 비. 티안무엔시스, 비. 티안쉐니이(B. tianshenii), 비. 티모넨시스, 비. 티프키랄리스(B. tipchiralis), 비. 트립옥실리콜라(B. trypoxylicola), 비. 투아레기, 비. 우룸키엔시스(B. urumqiensis), 비. 비에트나멘시스(B. vietnamensis), 비. 비니, 비. 비레티(B. vireti), 비. 비스코수스(B. viscosus), 비. 비텔리누스(B. vitellinus), 비. 와코엔시스(B. wakoensis), 비. 웨이하이엔시스(B. weihaiensis), 비. 우달리안키엔시스(B. wudalianchiensis), 비. 우이샤넨시스(B. wuyishanensis), 비. 크시아메넨시스(B. xiamenensis), 비. 시아옥시엔시스(B. xiaoxiensis), 비. 잔톡실리, 비. 제아에, 비. 장조우엔시스(B. zhangzhouensis), 비. 잔지안겐시스(B. zhanjiangensis),

바람직하게는 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 비. 메가테리움, 비. 서브틸리스, 비. 푸밀루스, 비. 피르무스, 비. 투린기엔시스, 비. 벨레젠시스(B. velezensis), 비. 리넨스(B. linens), 비. 아트로파에우스(B. atrophaeus), 비. 아밀로리퀘파시엔스, 비. 아리아브하타이, 비. 세레우스(B. cereus), 비. 아쿠아틸리스(B. aquatilis), 비. 시르쿨란스, 비. 클라우시이, 비. 스파에리쿠스(B. sphaericus), 비. 티아미노리티쿠스, 비. 모자벤시스(B. mojavensis), 비. 발리스모르티스(B. vallismortis), 비. 코아굴란스, 비. 소노렌시스(B. sonorensis), 비. 할로두란스, 비. 포케오넨시스, 비. 기브소니이, 비. 아시디셀레르, 비. 플렉수스, 비. 후나넨시스, 비. 슈도미코이데스(B. pseudomycoides), 비. 심플렉스, 비. 사펜시스, 비. 미코이데스(B. mycoides),

특히 바람직하게는 비. 아밀로리퀘파시엔스, 비. 리케니포르미스, 비. 투린기엔시스, 비. 벨레젠시스, 비. 서브틸리스 및 비. 메가테리움(B. megatherium),

더욱 더 바람직하게는 비. 아밀로리퀘파시엔스, 비. 투린기엔시스, 비. 벨레젠시스 및 비. 메가테리움. 본 발명이 바실루스 서브틸리스 포자의 관점에서 뿐만 아니라 조성물 및 이들의 생산 방법을 교시한다는 것이 본 발명의 특정 이점이다. 특히, 본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 제품, 방법 및 용도를 제공하며, 여기서 포자는 바실루스 서브틸리스 포자를 포함하지 않으나 다른 바실루스, 파에니바실루스 및/또는 클로스트리디움 포자를 포함한다.

클로스트리디움 종: 씨. 아우토에타노게눔(C. autoethanogenum), 씨. 베이제린크키이(C. beijerinckii), 씨. 부티리쿰(C. butyricum), 씨. 카르복시디보란스(C. carboxidivorans), 씨. 디스포리쿰(C. disporicum), 씨. 드라케이(C. drakei), 씨. 륭달리이(C. ljungdahlii), 씨. 클루이베리(C. kluyveri), 씨. 파스토리아눔(C. pasteurianum), 씨. 프로피오니쿰(C. propionicum), 씨. 사카로부티리쿰(C. saccharobutylicum), 씨. 사카로페르부틸아세토니쿰(C. saccharoperbutylacetonicum), 씨. 스카톨로게네스(C. scatologenes), 씨. 티로부티리쿰, 바람직하게는 씨. 부티리쿰, 씨. 파스토리아눔 및/또는 씨. 티로부티리쿰, 씨. 아에로톨레란스(C. aerotolerans), 씨. 아미노필룸(C. aminophilum), 씨. 아민발레리쿰(C. aminvalericum), 씨. 셀레레크레센스(C. celerecrescens), 씨. 아스파라그포르메(C. asparagforme), 씨. 볼테아에(C. bolteae), 씨. 클로스트리디오포르메(C. clostridioforme), 씨. 글리시르리지니리티쿰(C. glycyrrhizinilyticum), 씨. (훈가텔라) 하테와이(C. (Hungatela) hathewayi), 씨. 히스토리티쿰(C. histolyticum), 씨. 인돌리스(C. indolis), 씨. 렙툼(C. leptum), 씨. (티즈제렐라) 넥실레(C. (Tyzzerella) nexile), 씨. 페르프린겐스(C. perfringens), 씨.(에리시펠라토클로스트리디움) 라모숨(C.(Erysipelatoclostridium) ramosum), 씨. 신덴스(C. scindens), 씨. 심바이오숨(C. symbiosum), 클로스트리디움 사카로구미아(Clostridium saccharogumia), 클로스트리디움 소르델리(Clostridium sordelli), 클로스트리디움 클로스트리디오포르메, 씨. 메틸펜토숨(C. methylpentosum), 씨. 아일랜디쿰(islandicum) 및 클로스트리디아 클러스터 IV, XIVa, 및 XVIII의 모든 구성원, 특히 바람직하게는 씨. 부티리쿰.

일부 적합한 바실루스 및 파에니바실루스 균주는 하기 국제 특허 출원에 기재되고 기탁된다; 이러한 미생물의 포자 또는 그의 임의의 살충 활성 변이체는 본 발명에 따른 조성물의 포자로서 포함될 수 있다: WO2020200959: NRRL 수탁 번호 B-21661 하에 기탁된 바실루스 서브틸리스 또는 바실루스 아밀로리퀘파시엔스 QST713 또는 그의 살진균 돌연변이체. 바실루스 서브틸리스 QST713, 그의 돌연변이체, 그의 상청액, 및 그의 지질펩티드 대사물, 및 식물 병원체 및 곤충을 방제하는 이들의 사용 방법은 미국 특허 번호 6060051, 6103228, 6291426, 6417163 및 6638910에 완전히 기재되어 있다. 이들 특허에서, 균주는 AQ713으로 지칭되며, 이는 QST713과 동의어이다; WO2020102592: 바실루스 투린기엔시스 균주 NRRL B-67685, NRRL B-67687, 및 NRRL B-67688; WO2019135972: 기탁 수탁 번호 NRRL B-67533 또는 NRRL B-67534를 갖는 바실루스 메가테리움; WO2019035881: 파에니바실루스 종 NRRL B-50972, 파에니바실루스 종 NRRL B-67129, 파에니바실루스 종 NRRL B-67304, 파에니바실루스 종 NRRL B-67615, 수탁 번호 NRRL B-50421 하에 기탁된 바실루스 서브틸리스 균주 QST30002, 및 바실루스 서브틸리스 균주 NRRL B-50455; WO2018081543: ATCC 수탁 번호 PT A-123720 또는 PT A-124246 하에 기탁된 바실루스 사이크로사카로리티쿠스 균주; WO2017151742: 수탁 번호 NRRL B-21661로 지정된 바실루스 서브틸리스; WO2016106063: 바실루스 푸밀루스 NRLL B-30087; WO2013152353: CNMC 1-1582로서 기탁된 바실루스 종; WO2013016361: NRRL B-50760으로서 기탁된 바실루스 종 균주 SGI-015-F03, NRRL B-50761로서 기탁된 바실루스 종 균주 SGI-015-H06; WO2020181053: 파에니바실루스 종 NRRL B-67721, 파에니바실루스 종 NRRL B-67723, 파에니바실루스 종 NRRL B-67724, 파에니바실루스 종 NRRL B-50374; WO2020061140: 파에니바실루스 종 NRRL B-67306.

포자는 본 발명에 따라 야생형 또는 유전자 변형된 미생물로부터 유래될 수 있다. 야생형 미생물 샘플은 바람직하게는 배양물 수집에서의 유형 균주로서 기록된다. 유전자 변형은 무작위 돌연변이유발, 예를 들어 NTG 화학적 돌연변이유발, UV 조사 또는 트랜스포존 돌연변이유발에 의해, 또는 지정 돌연변이유발, 예를 들어 이종성 플라스미드의 혼입 또는 이종성 핵산과의 상동성 재조합에 의해 및/또는, 예를 들어 메가뉴클레아제, TALEN 또는 CRISPR-유형 돌연변이유발을 사용하는 부위 지정 돌연변이유발에 의해 초래될 수 있다. 예를 들어, 바실루스 및 파에니바실루스 돌연변이유발의 바람직한 방법은 WO2017117395에 기재되어 있으며, 그 전문이 본원에 포함된다.

상기 기재된 바와 같이, 조성물은 바람직하게는 1종 이상의 파에니바실루스 종, 보다 바람직하게는 파에니바실루스 알베이, 파에니바실루스 마세란스, 파에니바실루스 신규 종 에피피티쿠스, 파에니바실루스 폴리믹사, 파에니바실루스 폴리믹사 아종 폴리믹사, 파에니바실루스 폴리믹사 아종 플란타룸 또는 파에니바실루스 테르라에 중 임의의 것의 본 발명에 따른 포자를 포함하며, 여기서 파에니바실루스 종은 가장 바람직하게는 푸사리시딘 생산 균주이다. 이러한 파에니바실루스 종은, 예를 들어 점액의 형성을 감소시키고 상응하게 액체 상 발효에서의 점도를 감소시키기 위해 광범위하게 연구되고 돌연변이유발되어 왔다. 따라서, 바람직한 파에니바실루스 균주 및 이들의 제조 방법은 WO2020181053, WO2019221988, WO2016154297, WO2017137351, WO2017137353 및 WO2016020371 중 임의의 것에 추가로 기재되어 있다.

상기 표시된 바와 같이, 본 발명의 포자 조성물은 바람직하게는 1종 이상의 생물살충제를 포함하고, 이는 포자 형태로, 포자에 흡착되거나 또는 부착되거나 또는 첨가된다. 이러한 생물살충제는 바람직하게는 하기로부터 선택된다:

L1) 살진균, 살박테리아, 살바이러스 및/또는 식물 방어 활성화제 활성을 갖는 미생물 살충제: 암페로마이세스 퀴스콸리스(Ampelomyces quisqualis), 아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus), 아우레오바시디움 풀루란스, 바실루스 알티투디니스, 바실루스 아밀로리퀘파시엔스, 바실루스 리케니포르미스, 바실루스 메가테리움, 바실루스 모자벤시스, 바실루스 미코이데스, 바실루스 푸밀루스, 바실루스 심플렉스, 바실루스 솔리살시(Bacillus solisalsi), 바실루스 서브틸리스, 바실루스 서브틸리스 변종 아밀로리퀘파시엔스, 칸디다 올레오필라(Candida oleophila), 칸디다 사이토아나(Candida saitoana), 클라비박터 미시가넨시스(Clavibacter michiganensis) (박테리오파지), 코니오티리움 미니탄스, 크리포넥트리아 파라시티카(Cryphonectria parasitica), 크립토코쿠스 알비두스(Cryptococcus albidus), 딜로포스포라 알로페쿠리(Dilophosphora alopecuri), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 클로노스타키스 로세아 에프. 카테눌라타(Clonostachys rosea f. catenulata) (또한 글리오클라디움 카테눌라툼(Gliocladium catenulatum)으로 명명됨), 글리오클라디움 로세움(Gliocladium roseum), 리소박터 안티비오티쿠스(Lysobacter antibioticus), 리소박터 엔지모게네스(Lysobacter enzymogenes), 메츠니코위아 프룩티콜라, 마이크로도키움 디메룸(Microdochium dimerum), 마이크로스파에로프시스 오크라세아(Microsphaeropsis ochracea), 무스코도르 알부스(Muscodor albus), 파에니바실루스 알베이, 파에니바실루스 에피피티쿠스, 파에니바실루스 폴리믹사, 파에니바실루스 아글로메란스(Paenibacillus agglomerans), 판토에아 바간스(Pantoea vagans), 페니실리움 빌라이아에(Penicillium bilaiae), 플레비오프시스 기간테아(Phlebiopsis gigantea), 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis), 슈도모나스 플루오레스센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈도지마 플로쿨로사(Pseudozyma flocculosa), 피키아 아노말라(Pichia anomala), 피티움 올리간드룸(Pythium oligandrum), 스파에로데스 미코파라시티카(Sphaerodes mycoparasitica), 스트렙토미세스 그리세오비리디스(Streptomyces griseoviridis), 스트렙토미세스 리디쿠스(Streptomyces lydicus), 스트렙토미세스 비올라세우스니게르(Streptomyces violaceusniger), 탈라로미세스 플라부스(Talaromyces flavus), 트리코데르마 아스페렐룸(Trichoderma asperellum), 트리코데르마 아트로비리데(Trichoderma atroviride), 트리코데르마 아스페렐로이데스(Trichoderma asperelloides), 트리코데르마 페르틸레(Trichoderma fertile), 트리코데르마 감시이(Trichoderma gamsii), 트리코데르마 하르마툼(Trichoderma harmatum), 트리코데르마 하르지아눔, 트리코데르마 폴리스포룸(Trichoderma polysporum), 트리코데르마 스트로마티쿰(Trichoderma stromaticum), 트리코데르마 비렌스(Trichoderma virens), 트리코데르마 비리데(Trichoderma viride), 티풀라 파코르리자(Typhula phacorrhiza), 울로클라디움 오우데만시이(Ulocladium oudemansii), 베르티실리움 달리아(Verticillium dahlia), 쥬키니 황색 모자이크 바이러스 (비독성 균주);

L2) 살진균, 살박테리아, 살바이러스 및/또는 식물 방어 활성화제 활성을 갖는 생화학적 살충제: 키토산 (가수분해물), 푸사리시딘, 파에니세린, 파에니프로릭신, 하핀 단백질, 라미나린, 멘하덴 생선 오일, 나타마이신, 자두 폭스 바이러스 코트 단백질, 탄산수소칼륨 또는 나트륨, 레이노우트리아 사칼리넨시스 추출물, 살리실산, 티트리 오일 (멜라레우카 알테르니폴리아(Melaleuca alternifolia) 추출물);

L3) 살곤충, 살진드기, 살연체동물 및/또는 살선충 활성을 갖는 미생물 살충제: 아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter), 바실루스 세레우스, 바실루스 피르무스, 바실루스 서브틸리스, 바실루스 리케니포르미스, 바실루스 투린기엔시스, 바실루스 투린기엔시스 아종 아이자와이, 바실루스 투린기엔시스 아종 이스라엘렌시스(israelensis), 바실루스 투린기엔시스 아종 갈레리아에(galleriae), 바실루스 투린기엔시스 아종 쿠르스타키, 바실루스 투린기엔시스 아종 테네브리오니스, 브베리아 바시아나, 브베리아 브롱니아르티이(Beauveria brongniartii), 부르크홀데리아 리노젠시스(Burkholderia rinojensis), 크로모박테리움 서브트수가에(Chromobacterium subtsugae), 시디아 포모넬라(Cydia pomonella) 그라눌로바이러스 (CpGV), 크립토플레비아 류코트레타(Cryptophlebia leucotreta) 그라눌로바이러스 (CrleGV), 플라보박테리움(Flavobacterium) 종들, 헬리코베르파 아르미게라 핵다각체바이러스 (HearNPV), 헤테로라브디티스 박테리오포라, 이사리아 푸모소로세아, 레카니실리움 롱기스포룸(Lecanicillium longisporum), 레카니실리움 무스카리움(Lecanicillium muscarium), 메타리지움 아니소플리아에, 메타리지움 아니소플리아에 변종 아니소플리아에, 메타리지움 아니소플리아에 변종 아크리둠(acridum), 노무라에아 릴레이이(Nomuraea rileyi), 파에실로미세스 릴라시누스(Paecilomyces lilacinus), 파에니바실루스 포필리아에, 파스토리아 니시자와에, 파스토리아 페네트란스(Pasteuria penetrans), 파스토리아 라모사(Pasteuria ramosa), 파스토리아 토르네아(Pasteuria thornea), 파스토리아 우스가에(Pasteuria usgae), 파스마르합디티스 헤르마프로디타(Phasmarhabditis hermaphrodita), 슈도모나스 플루오레스센스, 스포도프테라 리토랄리스(Spodoptera littoralis) 핵다각체바이러스 (SpliNPV), 스테이네르네마 카르포카프사에, 스테이네르네마 펠티아에, 스테이네르네마 크라우세이(Steinernema kraussei), 스테이네르네마 리오브라베(Steinernema riobrave), 스트렙토미세스 갈부스(Streptomyces galbus), 스트렙토미세스 마이크로플라부스, 파에실로미세스 릴라시누스;

L4) 살곤충, 살진드기, 살연체동물, 페로몬 및/또는 살선충 활성을 갖는 생화학적 살충제: L-카르본, 시트랄, (E,Z)-7,9-도데카디엔-1-일 아세테이트, 에틸 포르메이트, (E,Z)-2,4-에틸 데카디에노에이트 (배 에스테르), (Z,Z,E)-7,11,13-헥사데카트리에날, 헵틸 부티레이트, 이소프로필 미리스테이트, 라바눌릴 세네시오에이트, 시스-자스몬, 2-메틸 1-부탄올, 메틸 유게놀, 메틸 자스모네이트, (E,Z)-2,13-옥타데카디엔-1-올, (E,Z)-2,13-옥타데카디엔-1-올 아세테이트, (E,Z)-3,13-옥타데카디엔-1-올, R-1-옥텐-3-올, 펜타테르마논, 포타슘 실리케이트, 소르비톨 악타노에이트, (E,Z,Z)-3,8,11-테트라데카트리에닐 아세테이트, (Z,E)-9,12-테트라데카디엔-1-일 아세테이트, Z-7-테트라데센-2-온, Z-9-테트라데센-1-일 아세테이트, Z-11-테트라데세날, Z-11-테트라데센-1-올, 아카시아 네그라(Acacia negra) 추출물, 자몽 종자 및 펄프의 추출물, 케노포디움 암브로시오이데스(Chenopodium ambrosioides) 추출물, 캣닢 오일, 님 오일, 퀼레이 추출물, 타게테스 오일;

L5) 식물 스트레스 감소, 식물 성장 조절제, 식물 성장 촉진 및/또는 수확율 증진 활성을 갖는 미생물 살충제: 아조스피릴룸 아마조넨스(Azospirillum amazonense), 아조스피릴룸 브라실렌스, 아조스피릴룸 리포페룸(Azospirillum lipoferum), 아조스피릴룸 이라켄세(Azospirillum irakense), 아조스피릴룸 할로프라에페렌스(Azospirillum halopraeferens), 브라디리조비움 엘카니이, 브라디리조비움 자포니쿰, 브라디리조비움 종들, 브라디리조비움 리아오닌겐세(Bradyrhizobium liaoningense), 브라디리조비움 루피니, 델프티아 아시도보란스(Delftia acidovorans), 글로무스 인트라라디세스(Glomus intraradices), 메조리조비움(Mesorhizobium) 종들, 메조리조비움 시세리(Mesorhizobium ciceri), 리조비움 레구미노사룸(Rhizobium leguminosarum) 생물형 파세올리(phaseoli), 리조비움 레구미노사룸 생물형 트리폴리이(trifolii), 리조비움 레구미노사룸 생물형 비시아에(viciae), 리조비움 트로피시(Rhizobium tropici), 시노리조비움 멜리로티(Sinorhizobium meliloti), 시노리조비움 메디카에(Sinorhizobium medicae);

L6) 식물 스트레스 감소, 식물 성장 조절제 및/또는 식물 수확율 증진 활성을 갖는 생화학적 살충제: 아브시스산, 알루미늄 실리케이트 (고령토), 3-데센-2-온, 포르모노넥틴, 제니스테인, 헤스페레틴, 호모브라시놀리드, 휴메이트, 메틸 자스모네이트, 시스-자스몬, 리소포스파티딜 에탄라민, 나린제닌, 중합체성 폴리히드록시산, 살리실산, 아스코필룸 노도숨(Ascophyllum nodosum) (노르웨이 켈프, 브라운 켈프) 추출물 및 에크로니아 막시마(Ecklonia maxima) (켈프) 추출물, 제올라이트 (알루미노실리케이트), 포도 종자 추출물.

적어도 1종의 파에니바실루스 균주를 포함하는 농업 용도를 위한 예시적인 조성물은 WO2020064480, WO2019012379, WO2018202737, WO2017137351, WO2017137353, WO2017093163, WO2016202656, WO2016142456, WO2016128239, WO2016071164, WO2016059240, WO2016034353, WO2016020371, WO2015180983, WO2015180985, WO2015181035, WO2015180987, WO2015181008, WO2015180999, WO2015181009, WO2015177021, WO2015104698, WO2015091967, WO2015055752, WO2015055755, WO2015055757, WO2015011615, WO2015003908, WO2014202421, WO2014147528, WO2014095932, WO2014095994, WO2014086850, WO2014086851, WO2014086853, WO2014086854, WO2014086856, WO2014086848, WO2014076663, WO2014056780, WO2014053404, WO2014053405 및 WO2014053398, WO2020131413, WO2020126980, WO2020092017, WO2020092022, WO2020065025, WO2020061140, WO2020056070, WO2020043650, WO2019222253, WO2019104173, WO2019094368, WO2019076891, WO2018026773, WO2018026774, WO2018026770, WO2017132330, WO2016018887, WO2016001125, WO2015004260, WO2014201326, WO2014201327, WO2014170364, WO2014152132, WO2014152115, WO2014127195, WO2014086752, WO2014083033, WO2013110591, WO2013110594 및 WO2012140212에 기재되어 있다. 본 발명은 특히 저장 안정한 형태로 각각의 파에니바실루스 균주의 포자를 제공하고 이러한 포자 조성물의 특히 효율적이고 빠른 생산을 허용하는 방법을 사용함으로써 이들 공개문헌의 교시를 개선시킨다.

본 발명에 따른 조성물이 적어도 1종의 푸사리시딘, 파에니세린 또는 파에니프로릭신, 바람직하게는 적어도 2종 이상의 푸사리시딘, 보다 바람직하게는 3 내지 40종, 보다 바람직하게는 조성물의 총 푸사리시딘의 적어도 50 mol%를 구성하는 2-10종의 푸사리시딘, 보다 바람직하게는 조성물의 총 푸사리시딘의 적어도 60 mol%를 구성하는 2-10종의 푸사리시딘, 보다 바람직하게는 조성물의 총 푸사리시딘의 적어도 70 mol%를 구성하는 2-10종의 푸사리시딘, 보다 바람직하게는 조성물의 총 푸사리시딘의 적어도 80 mol%를 구성하는 2-10종의 푸사리시딘을 포함하는 것이 특히 바람직하다. 각각의 경우에 1종 이상의 푸사리시딘이 푸사리시딘 A, B 또는 D 중 임의의 것을 포함하는 것이 특히 바람직하다. 바람직하게는 조성물은, 적어도 1종의 푸사리시딘에 더하여 또는 그 대신에, 수르팩틴 및/또는 이투린을 포함한다. 이러한 푸사리시딘, 수르팩틴 및 이투린은 살박테리아 및/또는 살진균 활성을 갖는 특히 효과적인 생물살충제이다. 더욱이 본원에 제시된 바와 같은 본 발명의 조성물은 이러한 푸사리시딘의 높은 수율 생산 및 농업 제품에서의 이들의 혼입을 허용한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 생물살충제로서 사용하기에 및/또는 항-진균 및/또는 항-박테리아 식물 건강 제품에 사용하기에 특히 적합하다.

포자는 전형적으로 액체 상 발효에 생산될 것이고 발효 브로스로부터, 예를 들어 농축에 의해 정제될 것이다. 발효 브로스 또는 브로스 농축물은 담체의 첨가와 함께 또는 없이 종래의 건조 공정 또는 방법, 예컨대 분무 건조, 동결 건조, 트레이 건조, 유동층 건조, 드럼 건조, 또는 증발을 사용하여 건조될 수 있다. 생성된 건조 제품은 특정 입자 크기 또는 물리적 포맷을 달성하기 위해, 예컨대 분쇄 또는 과립화에 의해 추가로 프로세싱될수 있다. 하기 기재된, 담체는 또한 건조-후 첨가될 수 있다.

본 발명에 따른 포자 조성물은 바람직하게는 안정화제 (바람직하게는: 글리세롤), 증량제, 용매, 계면활성제, 자발성 촉진제, 고체 담체, 액체 담체, 유화제, 분산제, 필름 형성제, 결빙 보호제, 발아촉진제, 증점제, 식물 성장 조절제, 무기 포스페이트, 비료, 아주반트, 지방산 및 피브릴, 당, 아미노산, 마이크로피브릴 또는 나노피브릴 구조화제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 보조제를 포함한다.

담체는 바람직하게는 충분한 저장 수명을 갖고, 바람직하게는 식물, 식물 부분에 또는 뿌리 시스템 근처 토양 부피에서 용이한 분산 또는 용해를 허용한다. 바람직하게는 담체는 양호한 수분 흡수 능력을 갖고/거나, 공정에 용이하고 럼프-형성 물질이 없고/거나, 거의-멸균이거나 또는 오토클레이빙에 의해 또는 다른 방법 (예를 들어, 감마-조사)에 의해 멸균하기에 용이하고/거나, 및/또는 양호한 pH 완충 능력을 갖는다. 종자 코팅에 사용되는 담체의 경우, 종자에의 양호한 부착이 바람직하다.

적합한 용매 및 액체 담체는 물 및 유기 용매, 예컨대 중간 내지 높은 끓는점의 미네랄 오일 분획, 예를 들어 등유, 디젤 오일; 식물성 또는 동물성 기원의 오일; 지방족, 시클릭 및 방향족 탄화수소, 예를 들어 톨루엔, 파라핀, 테트라히드로나프탈렌, 알킬화 나프탈렌; 알콜, 예를 들어 에탄올, 프로판올, 부탄올, 벤질알콜, 시클로헥산올, 글리콜; DMSO; 케톤, 예를 들어 시클로헥산온; 에스테르, 예를 들어 락테이트, 카르보네이트, 지방산 에스테르, 및 감마-부티로락톤; 지방산; 포스포네이트; 아민; 아미드, 예를 들어 N-메틸피롤리돈, 지방산 디메틸아미드; 및 그의 혼합물이다.

적합한 고체 담체 또는 충전제는 광물 토류, 예를 들어 실리케이트, 실리카 겔, 탈크, 고령토, 석회암, 석회, 백악, 점토, 돌로마이트, 규조토, 벤토나이트, 칼슘 술페이트, 마그네슘 술페이트, 마그네슘 옥시드; 다당류, 예를 들어 셀룰로스, 전분; 비료, 예를 들어 암모늄 술페이트, 암모늄 포스페이트, 암모늄 니트레이트, 우레아; 식물성 기원의 제품, 예를 들어 피트, 곡물 가루, 나무 껍질 가루, 목재 가루, 견과 껍질 가루, 및 그의 혼합물이다.

적합한 계면활성제는 표면 활성 화합물, 예컨대 음이온성, 비이온성, 양이온성 및 양쪽성 계면활성제, 블록 중합체, 고분자전해질, 및 그의 혼합물이다. 이러한 계면활성제는 유화제, 분산제, 가용화제, 습윤제, 침투 증진제, 보호성 콜로이드, 또는 아주반트로서 사용될 수 있다. 계면활성제의 예는 문헌 [McCutcheon's, Vol.1: Emulsifiers & Detergents, McCutcheon's Directories, Glen Rock, USA, 2008 (International Ed. or North American Ed.)]에 열거되어 있다.

적합한 음이온성 계면활성제는 알칼리, 알칼리 토류 또는 술포네이트, 술페이트, 포스페이트, 카르복실레이트의 암모늄 염, 및 그의 혼합물을 포함한다. 술포네이트의 예는 알킬아릴술포네이트, 디페닐술포네이트, 알파-올레핀 술포네이트, 리그닌 술포네이트, 지방산 및 오일의 술포네이트, 에톡실화 알킬페놀의 술포네이트, 알콕실화 아릴페놀의 술포네이트, 축합 나프탈렌의 술포네이트, 도데실- 및 트리데실벤젠의 술포네이트, 나프탈렌 및 알킬나프탈렌의 술포네이트, 술포숙시네이트 또는 술포숙시나메이트이다. 술페이트의 예는 지방산 및 오일, 에톡실화 알킬페놀, 알콜, 에톡실화 알콜, 또는 지방산 에스테르의 술페이트이다. 포스페이트의 예는 포스페이트 에스테르이다. 카르복실레이트의 예는 알킬 카르복실레이트, 및 카르복실화 알콜 또는 알킬페놀 에톡실레이트이다.

적합한 비이온성 계면활성제는 알콕실레이트, N-치환된 지방산 아미드, 아민 옥시드, 에스테르, 당-기반 계면활성제, 중합체성 계면활성제, 및 그의 혼합물을 포함한다. 알콕실레이트의 예는 화합물, 예컨대 알콜, 알킬페놀, 아민, 아미드, 아릴페놀, 1 내지 50 당량으로 알콕실화된 지방산 또는 지방산 에스테르이다. 예를 들어, 에틸렌 옥시드 및/또는 프로필렌 옥시드, 바람직하게는 에틸렌 옥시드가 알콕실화에 이용될 수 있다. N-치환된 지방산 아미드의 예는 지방산 글루카미드 또는 지방산 알칸올아미드이다. 에스테르의 예는 지방산 에스테르, 글리세롤 에스테르 또는 모노글리세리드이다. 당-기반 계면활성제의 예는 소르비탄, 에톡실화 소르비탄, 수크로스 및 글루코스 에스테르 또는 알킬폴리글루코시드이다. 중합체성 계면활성제의 예는 비닐피롤리돈, 비닐알콜 또는 비닐아세테이트의 단독- 또는 공중합체이다.

상기 적어도 1종의 비이온성 계면활성제는 바람직하게는 적어도 1종의 폴리알킬렌옥시드 PAO이다. 폴리알킬렌옥시드 PAO는 말단 위치에서 폴리에틸렌 옥시드 (PEO)의 블록을 포함하는 반면에, 폴리프로필렌 옥시드 (PPO), 폴리부틸렌 옥시드 (PBO) 및 폴리-THF (pTHF)와 같은 에틸렌 옥시드와 상이한 폴리알킬렌 옥시드의 블록은 중심 위치에서 포함된다. 바람직한 폴리알킬렌옥시드 PAO는 구조 PEO-PPO-PEO, PPO-PEO-PPO, PEO-PBO-PEO 또는 PEO-pTHF-PEO를 갖는다. 적합한 폴리알킬렌옥시드 PAO는 일반적으로 1.1 내지 100 알킬렌옥시드 단위, 바람직하게는 5 내지 50 단위의 수 평균을 포함한다.

적합한 양이온성 계면활성제는 4차 계면활성제, 예를 들어 1 또는 2개의 소수성 기를 갖는 4차 암모늄 화합물, 또는 장-쇄 1차 아민의 염을 포함한다. 적합한 양쪽성 계면활성제는 알킬베타인 및 이미다졸린이다. 적합한 블록 중합체는 폴리에틸렌 옥시드 및 폴리프로필렌 옥시드의 블록을 포함하는 A-B 또는 A-B-A 유형, 또는 알칸올, 폴리에틸렌 옥시드 및 폴리프로필렌 옥시드를 포함하는 A-B-C 유형의 블록 중합체이다. 적합한 고분자전해질은 폴리산 또는 폴리염기이다. 폴리산의 예는 폴리아크릴산의 알칼리 염 또는 폴리산 빗형 중합체이다. 폴리염기의 예는 폴리비닐아민 또는 폴리에틸렌아민이다.

적합한 아주반트는 무시할 만한 살충 활성을 갖거나 또는 심지어 살충 활성 그 자체가 없고, 포자의 생물학적 성능을 개선시키는 화합물이며, 화합물은 표적 상에 세포를 발아함으로써 그에 부착되거나 또는 생산된다. 예는 계면활성제, 미네랄 또는 식물성 오일, 및 다른 보조제이다. 추가 예는 문헌 [Knowles, Adjuvants and additives, Agrow Reports DS256, T&F Informa UK, 2006, chapter 5]에 의해 열거되어 있다.

본 발명에 따른 조성물은 바람직하게는 0.01 내지 2 wt%의 유기 또는 무기 증점제를 포함한다. 적합한 증점제는 다당류 (예를 들어 크산탄 검, 카르복시메틸셀룰로스), 무기 점토 (유기 변형되거나 또는 변형되지 않음), 폴리카르복실레이트, 및 실리케이트를 포함한다.

적합한 증점제는 다당류 (예를 들어 크산탄 검, 카르복시메틸셀룰로스), 무기 점토 (유기 변형되거나 또는 변형되지 않음), 폴리카르복실레이트, 및 실리케이트이다. 본 발명의 조성물 중 바람직한 증점제는 크산탄 검이다. 바람직하게는 크산탄 검은 제제에 기반하여, 0.01 내지 0.4 wt%, 바람직하게는 0.05 내지 0.15 wt%의 양으로 본 발명에 따른 조성물에 포함된다.

본 발명에 따른 조성물은 바람직하게는 증점제로서 마그네슘 알루미늄 실리케이트 (예를 들어 몬모릴로나이트 및/또는 사포나이트), 벤토나이트, 아타펄자이트 또는 실리카를 포함한다. 마그네슘 알루미늄 실리케이트 (예를 들어 몬모릴로나이트 및 사포나이트), 벤토나이트, 아타펄자이트 또는 실리카의 함량은 바람직하게는 총 조성물의 0.1 내지 2 wt%, 바람직하게는 0.5 내지 1.5 wt%이다.

적합한 소포제는 실리콘, 장쇄 알콜, 및 지방산의 염이다. 바람직하게는 본 발명에 따른 조성물은 0.01 내지 1.0 wt%의 소포제, 예를 들어 실리콘 소포제를 함유한다.

적합한 착색제 (예를 들어 적색, 청색, 또는 녹색)는 낮은 수용해도의 안료 및 수용성 염료이다. 예는 무기 착색제 (예를 들어 산화철, 산화티탄, 철 헥사시아노페레이트) 및 유기 착색제 (예를 들어 알리자린-, 아조- 및 프탈로시아닌 착색제)이다.

적합한 살박테리아제는 브로노폴 및 이소티아졸리논 유도체, 예컨대 알킬이소-티아졸리논 및 벤즈이소티아졸리논이다. 적합한 동결 방지제는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 우레아 및 글리세린이다. 적합한 소포제는 실리콘, 장쇄 알콜, 및 지방산의 염이다. 적합한 착색제 (예를 들어 적색, 청색, 또는 녹색)는 낮은 수용해도의 안료 및 수용성 염료이다. 예는 무기 착색제 (예를 들어 산화철, 산화티탄, 철 헥사시아노페레이트) 및 유기 착색제 (예를 들어 알리자린-, 아조- 및 프탈로시아닌 착색제)이다. 적합한 점착제 또는 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐아세테이트, 폴리비닐 알콜, 폴리아크릴레이트, 생물학적 또는 합성 왁스, 및 셀룰로스 에테르이다.

적합한 피브릴, 마이크로피브릴 및 나노피브릴 보조제 및 농업 조성물로의 이들의 혼입은 예를 들어 WO2019035881에 기재되어 있다.

바람직하게는 조성물은 식물 해충 방제 조성물이고/거나 식물병원성 진균 또는 박테리아성 질환을 예방하거나, 제한하거나 또는 감소시키고/거나 식물의 건강을 개선시키거나 또는 촉진하고/거나 이러한 식물, 그의 부분 또는 번식 물질 또는 식물이 성장할 기재에 적용될 때 식물의 수확율을 증가시키거나 또는 촉진한다. 본원에 기재된 바와 같이, 포자가 후속 발효에서의 짧은 유도기 기간 및 대수성장기 성장의 늦은 종료를 갖는 조성물에 혼입될 수 있다는 것이 본 발명의 포자 조성물의 이점이다. 포자는 따라서 식물, 식물 부분 또는 식물 성장 기재, 예를 들어 토양 상에 펼친 후 신속히 발아할 수 있으며, 이로써 이들의 식물에 유익한 특성, 예를 들어 병원성 미생물의 감소를 발휘하거나 또는 영양이 식물 또는 식물 부분에게 이용가능하게 만든다. 특히 본 발명의 조성물은, 예를 들어, 신속히 성장하는 식물 뿌리로의 유익한 박테리아 및 다른 농업 페이로드의 유의하게 개선된 운반 및 분산을 촉진하는 데 사용될 수 있다.

조성물은 바람직하게는 총 조성물의 ml당 적어도 10^4 콜로니 형성 단위 (cfu), 보다 바람직하게는 10^4-10^17 cfu/ml, 보다 바람직하게는 10^7-10^13 cfu/ml의 농도의 적어도 상기 포자를 포함한다. 필요로 하는 재배지 또는 환자 또는 동물에의 적용 후 보다 현저하거나 또는 빠른 효과를 발휘하기 위해, 본 발명의 조성물이 적어도 10^6 cfu/ml의 포자, 보다 바람직하게는 10^7 내지 10^17 cfu/ml, 보다 바람직하게는 10^8 내지 10^15 cfu/ml을 포함하는 것이 특히 바람직하다.

더욱이 높은 포자 농도는 생명공학 배양 공정에서, 특히 마스터 또는 제조용 "세포" 은행을 유지하는 데 유리하다. 순수한 생존가능한 세포 대신에 포자를 함유하거나 또는 이로 이루어진 제조용 세포 은행의 사용은 종자의 저장 안정성을 유의하게 증가시키는 것으로 공지되어 있고 따라서 발효 공정의 재현성을 개선시킨다. 이러한 세포 은행에서 저장된 미생물 물질이 발아 및 생장 활성의 유의한 손실 없이, 1년 초과, 바람직하게는 1-5년의 연장된 기간 동안 여전히 생존가능한 것이 필수적이다. 본원에 기재된 바와 같이 일반 저장 조건 하에 장기간 저장에 적합한 이러한 조성물을 제공하는 것이 본 발명의 특정 이점이다. 본 발명의 조성물이 심지어 이러한 긴 저장 후에도 발아 빈도 및 속도에서의 유의한 감소를 당하지 않는다는 것이 추가 이점이다. 이는 보다 높은 분획의 후기 형성된 포자를 포함하는 조성물과 비교하여 본 발명의 포자에서의 낮은 함량의 디피콜린산의 관점에서 특히 놀라웠다.

본 발명에 따른 바람직한 마스터 또는 제조용 세포 은행 샘플은 따라서 본 발명에 따른 조성물이며, 여기서 조성물은 동결보호에 충분한 양으로, 동결보호제, 바람직하게는 글리세롤을 포함한다. 동결보호는 -180℃뿐만 아니라 -80℃, -20℃ 최대 0℃의 보다 높은 저장 온도에서의 저장이 권고된다. 또한, 예를 들어 적어도 부분적으로 포자형성 미생물 배양물의 동결 건조로부터 수득된, 건조된 포자가 제조용 세포 은행으로서 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 또한 동결보호제, 예를 들어 글리세롤의 첨가를 필요로 하지 않으면서, 0℃ 미만, 특히 -180℃ 내지 -20℃의 온도에서 양호한 저장 안정성을 유리하게 나타낸다. 그러나, 본 조성물 중 포자가 이미 이들의 비교적 낮은 디피콜린산 함량에도 불구하고 놀랍게도 강한 저장 안정성을 나타내기 때문에, 예를 들어 문헌 [F. S. (1995) Freeze-Drying and Cryopreservation of Bacteria. In: Day J.G., Pennington M.W. (eds) Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols. Methods in Molecular Biology™, vol 38. Humana Press, Totowa, NJ. https://doi.org/10.1385/0-89603-296-5:21]에 기재된 바와 같은 표준 세포 은행 샘플 조성물과 비교하여 동결보호제의 양이 감소될 수 있다는 것이 본 발명의 이점이다.

본 발명의 조성물은 바람직하게는 첨가된 디피콜린산을, 바람직하게는 4x10^-6 내지 4x10^-5 μmol/포자, 보다 바람직하게는 5x10^-6 내지 2x10^-5 μmol/포자, 보다 바람직하게는 7x10^-6 내지 1x10^-5 μmol/포자의 최종 함량으로 포함한다. 상기 언급된 농도를 달성하기 위한 디피콜린산의 첨가는 추가로 특히 조성물이 낮은 물 함량을 가질 때, 예를 들어 조성물이 분말 또는 과립 형태일 때, 또는 조성물이 상승된 온도, 예를 들어 4-45℃에서의 저장을 위해 의도될 때, 포자의 안정성, 즉 발아 빈도 및 속도를 개선시킨다.

상기 기재된 바와 같은 조성물은 생존가능한 및/또는 비-생존가능한 세포를 포함할 수 있다. 바람직하게는 포자의 적어도 분획은 이들의 표면 상에 페이로드 도메인을 포함하는 단백질을 포함하며, 상기 단백질은 또한 상기 포자의 표면으로의 페이로드 도메인의 전달을 위한 표적화 도메인을 포함한다. 바람직한 단백질, 포자 및 이들의 생산 방법의 예는 WO2020232316 및 WO2019099635에 기재되어 있다.

본 발명의 조성물은 그 자체로 제품으로서 용이하게 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명의 조성물은 또한 키트의 일부일 수 있다. 이는 본 발명의 조성물이 잠재적으로 해로운 추가 키트 구성 요소로부터 별개로 유지될 수 있도록, 해로운 화학물질 또는 처리와 함께 또는 적시에 근접하여 적용이 목적하는 상황에 특히 유용하다.

특히, 본 발명의 조성물은 바람직하게는 광물 표면의 처리를 위한 및/또는 시멘트의 제조를 위한 페인트, 코트 또는 함침 조성물로서 사용되거나 또는 그에 혼입된다. 상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 조성물에 포함된 클로스트리디아 포자는 심지어 장기간 후에도 발아하고 대사 석회화 공정을 제공하여 크랙의 치유를 개선시킬 수 있다.

더욱이 본 발명은 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 식품 또는 사료 제품을 제공한다. 바람직하게는 프로바이오틱 또는 프리바이오틱 식품 또는 사료 제품. 상기 기재된 바와 같은 호기성 및 혐기성 미생물의 다양한 내생포자는 가치있는 프로바이오틱 작용제이고; 이들은 또한 프리바이오틱 물질을 함유할 수 있다. 따라서, 본 발명은 유리하게, 계획가능한 방식으로, 이들 포자 군집에 의해 부여된 이익을 달성하기 위해 초기 대 후기 포자 군집의 목적하는 비율로 프로- 및/또는 프리바이오틱 식품 및 사료 조성물을 제공한다. 이러한 조성물에서 포자는 프로바이오틱 또는 프리바이오틱 종으로부터 선택될 것이다. 이러한 종은, 적합한 양으로 투여될 때, 숙주에 건강 이익을 부여한다. 바람직한 종은 바실루스 아밀로리퀘파시엔스, 바실루스 아퀴마리스, 바실루스 아리아브하타이, 바실루스 세레우스, 바실루스 클라우시이, 바실루스 코아굴란스, 바실루스 플렉수스, 바실루스 푸시포르미스(bacillus fusiformis), 바실루스 인디쿠스, 바실루스 리케니포르미스, 바실루스 메가테리움, 바실루스 폴리페르멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus), 바실루스 푸밀루스, 바실루스 서브틸리스, 바실루스 투린기엔시스, 바실루스 비레티, 클로스트리디움 부티리쿰, 클로스트리디움 셀룰로시(Clostridium cellulosi), 클로스트리디움 렙툼, 클로스트리디움 스포로스파에로이데스(Clostridium sporosphaeroides), 파에칼리박테리움 프라우스니트치이(Faecalibacterium prausnitzii) 파에니바실루스 에히멘시스, 파에니바실루스 엘기이, 파에니바실루스 파불리 및 파에니바실루스 폴리믹사이다.

본 발명은 더욱이 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능하거나 또는 수득된 조성물로 코팅되거나 또는 주입된 식물 배양 기재를 포함하는, 식물 보호 제품을 제공한다. 이러한 제품은 본 발명에 따른 조성물에 의해 부여된 이점을 실현한다. 특히, 이러한 제품은 생물살충 포자 및 포자에 부착된 화합물을 제공할 수 있고, 바람직하게는 상기 포자는 본원에 기재된 바와 같이 빠르고 신뢰성이 높게 발아한다. 따라서, 본 발명에 따른 식물 배양 기재는 특히 상기 포자로부터의 식물 건강에 유익한 미생물의 발아 및 생장을 용이하게 한다. 바람직하게는 식물 보호 제품은 비처리된 식물 배양 기재와 비교하여 1종 이상의 식물 건강 지표를 개선시키고/거나 상기 발아된 미생물로 인해 병원체 압력을 감소시킨다.

본 조성물의 유익한 효과는 바람직하게는 하기 식물 건강 지표 중 1종 이상에서 관측된다: 이른 및 보다 우수한 발아, 과실-보유 식물의 수를 손상시키지 않으면서 보다 적은 종자 필요, 보다 이른 또는 보다 지속적인 출아, 개선된 뿌리 형성, 증가된 뿌리 밀도, 증가된 뿌리 길이, 개선된 뿌리 크기 유지, 개선된 뿌리 유효성, 바람직하게는 질소 및/또는 인의 개선된 영양 흡수, 증가된 순 성장, 증진된 식물 활력, 증가된 입목, 식물 높이에서의 증가, 보다 큰 잎몸, 보다 적은 죽은 근생엽, 분얼 증가, 보다 강한 분얼지, 보다 생산적인 분얼지, 스트레스 (예를 들어 가뭄, 열, 염, UV, 물, 추위에 대한)에 대한 증가된 내성, 비료, 살충제 및/또는 물에 대한 감소된 필요, 감소된 에틸렌 생산 및/또는 감소된 에틸렌 수용, 증가된 광합성 활성, 보다 녹색의 잎 색상, 개선된 안료 함량, 보다 이른 개화, 보다 이른 곡물 성숙, 증가된 작물 수확율, 과실 또는 종자에서의 증가된 단백질 함량, 과실 또는 종자에서의 증가된 오일 함량 및 과실 또는 종자에서의 증가된 전분 함량. 본 발명의 바람직한 조성물의 생물살충 액틴의 관점에서, 가장 바람직하게는 조성물은 포자가 파에니바실루스 속의 것, 더욱 더 바람직하게는 파에니바실루스 폴리믹사, 파에니바실루스 폴리믹사 폴리믹사, 파에니바실루스 폴리믹사 플란타룸 및/또는 파에니바실루스 테르라에의 포자를 포함하거나 또는 이루어지고, 본 발명의 이러한 조성물은 식물, 식물 부분 또는 식물 성장 기재의 화학적 살충제 처리에 대한 필요를 감소시킬 수 있다. 본 발명의 농업 조성물은 따라서 화학적 살충제에 대한 노출에 대한 필요를 감소시키는 것을 도움으로써 식물 제품의 안전성을 유리하게 개선시킨다.

본 발명은 또한 식물, 식물 부분 또는 식물 번식 물질을 제공하며, 여기서 물질은, 그의 표면 상에 또는 그에 주입된, 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능하거나 또는 수득된 조성물을 포함한다. 종자 주입 방법은, 예를 들어, WO2020214843에 기재되어 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 조성물 중 포자는 특히 신뢰성이 높고 빠른 발아 속도를 갖는다. 따라서, 포자는 종자, 뿌리, 잎 및 줄기를 포함하는 식물 물질의 신속한 콜로니생성을 지원하며, 이로써 포자 및/또는 발아된 미생물에 의해 부여된 유익한 효과를 발휘함으로써 식물 건강 지표 중 1종 이상을 촉진한다.

더욱이, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 식물, 식물 부분 또는 식물 번식 물질 또는 식물 배양 기재를 포함하는, 농장, 바람직하게는 재배지 또는 온실 베드를 제공한다. 상기 기재된 바와 같이 본 발명의 조성물의 포자 및/또는 상응하는 발아된 미생물이 생물살충 효과를 발휘하는 것이 본 발명의 이점이다. 따라서, 본 발명의 조성물 또는 제품으로 처리된 농장은 바람직하게는 조성물의 포자로부터의 미생물의 증가된 및/또는 가속화된 생장으로 인해, 농장으로부터의 식물병원성 진균 또는 박테리아 물질의 방출을 유리하게 예방하거나, 지연시키거나, 제한하거나 또는 감소시킨다. 식물 배양 영역, 예를 들어 식물, 식물 물질 및/또는 그의 토양 상의 본 발명의 조성물 또는 제품의 적용은 영역 상 해충을 감소시키는 것을 돕는다. 해충이 바람직하게는 비처리된 영역 상에서만큼 빠르게 영역 상에서 증식하지 않기 때문에, 보다 적은 해충이 상기 영역으로부터 탈출하여 이웃 영역을 감염시킬 것이다. 따라서, 본 발명의 제품 또는 조성물의 적용은 부위 상의 살충제 처리의 수를 유리하게 감소시킬 뿐만 아니라 인접 영역에 이러한 절약을 제공할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 세정 또는 화장 제품을 제공한다. 상기 기재된 바와 같이, 포자는 세정 제품의, 예를 들어 피부 세정 제품, 헤어 세정 제품, 세탁 제품, 식기세척 제품, 파이프 디그리서, 알레르겐 제거 제품, 보다 바람직하게는 화장품 파운데이션, 립스틱, 세안제, 박피 크림, 블러셔, 아이라이너, 아이 섀도, 로션, 크림, 샴푸, 치약, 치아 겔, 구강 린스, 치실, 테이프 또는 이쑤시개의 특성을 유리하게 개선시킬 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 이러한 제품에서 초기 대 후기 포자 군집의 비율을 한정하는 것, 예컨대 목적하는 정도의 빠른 포자 작용 및 후기 발아 포자의 보다 긴 지속 효과를 달성하는 것이 유리하다. 바람직하게는 세정 제품은 세제 및 세정 성능에 효과적이거나 또는 세제의 물리적 특징을 유지하는 데 효과적인 양으로 존재하는 계면활성제, 빌더, 및 굴수성 물질로부터 선택된 적어도 1종의 구성 요소를 포함한다. 이러한 구성 요소의 예는 예를 들어 문헌 ["complete Technology Book on Detergents with Formulations (Detergent Cake, Dishwashing Detergents, Liquid & Paste Detergents, Enzyme Detergents, Cleaning Powder & Spray Dried Washing Powder)", Engineers India Research Institute (EIRI), 6th edition (2015)], 또는 문헌 ["Detergent Formulations Encyclopedia", Solverchem Publications]에 기재되어 있다.

상응하게 본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 원핵 미생물의 포자를 포함하는 조성물을 생산하는 방법을 제공한다:

1) 포자형성에 도움이 되는 배지에서 미생물을 발효시키는 단계,

2) 포자를 정제하여 조성물을 수득하는 단계.

상기 기재된 바와 같이, 방법은 본 발명의 조성물을 생산하는 빠르고 신뢰성이 높은 방식을 제공한다. 본 발명의 방법이 해당 미생물에 대해 이미 확립된 표준 산업적인 장비 및 발효 루틴을 사용하여 수행될 수 있거나 또는 관련된 산업적으로 관련이 있는 균주로부터 적응될 수 있다는 것이 특정 이점이다.

또한 수거로 불리는, 정제는 배치 액체 상 발효의 마지막 단계이다. 정제의 목표는 일반적으로 본 발명의 조성물에서의 저장 동안 내생포자를 탈안정화시킬 발효 배지 구성 요소를 제거하거나 또는 감소시키는 것이다. 바람직한 정제 단계는 본원에 기재되고; 바람직하게는 정제는 포자의 농축을 포함하고 바람직하게는 건조, 동결건조, 균질화, 추출, 접선 유동 여과, 심층 여과, 원심분리 또는 침강분리 단계를 포함한다. 생성된 농축된 포자 제제, 바람직하게는 생존가능한 세포가 고갈된 제제, 더욱 더 바람직하게는 세포-무함유 제제는 이어서 건조되고/거나 본원에 기재된 바와 같은 추가 구성 요소로 제제화될 수 있다.

바람직하게는 정제는 발효 단계 1)에서 수득가능한 최대 생존가능한 포자 농도의 85%에 도달할 때 가장 늦게 수행되고, 보다 바람직하게는 정제는 1-75% 범위의 농도에 도달할 때, 보다 바람직하게는 10-75% 범위의 농도에 도달할 때, 보다 바람직하게는 20-70% 범위의 농도에 도달할 때, 보다 바람직하게는 30-68% 범위의 농도에 도달할 때 수행된다. 이를 위해, 제1 검량 발효는 선택된 배지에서 및 선택된 발효 조건 하에 수행된다. 검량 발효는 바이오매스에서의 추가 증가가 대수성장기 후 관측되지 않을 때까지, 바람직하게는 바이오매스가 6시간당 1% 미만만큼 증가할 때까지 수행된다. 도 1에 따른 발효에서, 48시간에서 결정된 포자 농도는 따라서 최대 포자 농도로서 취급된다. 표시된 수준의 성숙에서 포자를 수거함으로써, 높은 지분의 초기 포자 군집의 포자를 포함하는 본 발명의 조성물은 수득될 수 있다. 따라서, 정제는 바람직하게는 상기 정제된 포자가 콜로니 형성에 적합한 배지 상에 플레이팅될 때 콜로니를 형성하며, 여기서 플레이팅 후 호기성 배양의 경우 72시간 및 혐기성 배양의 경우 96시간 내에 형성된 모든 이러한 콜로니 중 적어도 40%, 보다 바람직하게는 40-90%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 50-90%, 보다 바람직하게는 적어도 60%, 보다 바람직하게는 60-90%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 70-90%가 48시간 내에 형성되도록, 및/또는 상기 정제된 포자 중 적어도 40%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 55%, 보다 바람직하게는 적어도 60%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%가 제1 포자 형성기 동안 수거된 발효로부터 수득가능하거나 또는 수득되도록 수행된다.

액체 상 발효로부터의 정제에 적합한 시간을 결정하는 또 다른 바람직한 방법은 포자당 디피콜린산의 평균 함량이 발효 단계 1)에서 최대 포자 농도에 도달할 때 생산된 포자의 디피콜린산의 평균 함량의 최대 80%일 때 (또한 본원에서 편평기로 불림), 보다 바람직하게는 디피콜린산의 평균 함량이 20-80% 범위, 더욱 더 바람직하게는 22-70% 범위, 더욱 더 바람직하게는 30-65% 범위일 때이다. 실시예에 기재된 바와 같이, 검량 발효가 먼저 수행되고 포자의 디피콜린산 함량 및 생존가능한 포자 농도 둘 다가 측정된다. 이어서, 생존가능한 포자당 디피콜린산의 농도가 계산된다. 예를 들어 도 9에 제시된 바와 같이, 포자당 디피콜린산의 비율은 변동이 없게 되고; 비율이 더 이상 증가하지 않거나 또는 적어도 6시간당 3% 초과만큼 더 이상 증가하지 않을 때, 비율은 100%에 도달된 것으로 설정되고 디피콜린산의 농도는 최대인 것으로 설정된다. 모든 추가 백분율은 이어서 이들 값에 대해 계산될 수 있다. 상기 표시된 바와 같이, 표시된 디피콜린산 함량에서 포자를 수거함으로써, 높은 지분의 초기 포자 군집의 포자를 포함하는 본 발명의 조성물이 수득될 수 있다.

실시예 섹션 다음에 기재된 바와 같이, 본 발명은 더욱이 높은 분획의 후기 포자 군집을 포함하는 조성물을 생산하는 방법을 제공하고, 또한 그의 용도 및 이점을 제공한다.

바람직하게는 조성물의 디피콜린산 함량은, 예를 들어 외부 생산된 디피콜린산의 첨가에 의해 정제 후 추가로 증가된다. 포자에의 디피콜린산의 첨가가 추가로 포자 저장 안정성을 개선시킬 수 있다는 것이 문헌 [Daniel et al., J. Mol. Biol. 1993, 468-483]에 의해 기재되었다.

상기 표시된 바와 같이, 정제 단계 2)는 바람직하게는 이와 같이 조성물에서의 포자 발아의 억제 또는 감소를 초래한다. 이는 저장 안정성의 유리한 추가 개선 및 -20℃ 내지 45℃의 저장 온도에서의 본 발명의 조성물 중 포자의 생존율을 야기한다. 따라서, 정제 단계는 바람직하게는 포자의 건조, 동결건조, 균질화, 추출, 여과, 원심분리, 침강분리, 또는 농축 단계를 포함하고/거나, 조성물의 물 함량을 건조 조성물의 경우 조성물의 대략 1-8% (w/w), 바람직하게는 3-5 중량%, 및 액체 또는 페이스트 조성물의 경우 조성물의 10-98중량%으로 조정하는 단계를 포함하고/거나, 조성물의 가용성 탄소 공급원 함량을 포자 수거 시 그의 함량과 비교하여 조성물의 최대 50 중량%, 보다 바람직하게는 조성물의 5-30중량%로 조정하는 단계를 포함한다. 하류 프로세싱의 이러한 방법은 일반적으로 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 이들은 표준 산업 장비를 사용하고 관련 기술분야에 공지된 최소 개조 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 따라서 본 발명의 조성물이 낮은 비용으로 용이하게 생산될 수 있다는 것이 본 발명의 특정 이점이다.

더욱이 방법은 바람직하게는 또한 바람직하게는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 해충 방제제의 첨가를 포함한다:

i) 살진균, 살박테리아, 살바이러스 및/또는 식물 방어 활성화제 활성을 갖는 1종 이상의 미생물 살충제,

ii) 살진균, 살박테리아, 살바이러스 및/또는 식물 방어 활성화제 활성을 갖는 1종 이상의 생화학적 살충제,

iii) 살곤충, 살진드기, 살연체동물 및/또는 살선충 활성을 갖는 1종 이상의 미생물 살충제,

iv) 살곤충, 살진드기, 살연체동물, 페로몬 및/또는 살선충 활성을 갖는 1종 이상의 생화학적 살충제,

v) 호흡 억제제, 스테롤 생합성 억제제, 핵산 합성 억제제, 세포 분열 및 세포골격 형성 또는 기능의 억제제, 아미노산 및 단백질 합성의 억제제, 신호 전달 억제제, 지질 및 막 합성 억제제, 다중 부위 작용을 갖는 억제제, 세포벽 합성 억제제, 식물 방어 유도제 및 미지의 작용 방식을 갖는 살진균제로부터 선택된 1종 이상의 살진균제.

이러한 추가적인 살충제 및 처리 작용제의 이점은 상기 기재되었다.

또한 방법이 적어도 1종의 푸사리시딘, 바람직하게는 적어도 2종 이상의 푸사리시딘, 파에니세린 또는 파에니프록실린, 보다 바람직하게는 3 내지 40종의 푸사리시딘, 보다 바람직하게는 조성물의 총 푸사리시딘의 적어도 50 mol%를 구성하는 2-10종의 푸사리시딘, 보다 바람직하게는 조성물의 총 푸사리시딘의 적어도 60 mol%를 구성하는 2-10종의 푸사리시딘, 보다 바람직하게는 조성물의 총 푸사리시딘의 적어도 70 mol%를 구성하는 2-10종의 푸사리시딘, 보다 바람직하게는 조성물의 총 푸사리시딘의 적어도 80 mol%를 구성하는 2-10종의 푸사리시딘의 첨가를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 각각의 경우에 1종 이상의 푸사리시딘이 푸사리시딘 A, B 또는 D 중 임의의 것을 포함하는 것이 특히 바람직하다. 바람직하게는 방법은, 적어도 1종의 푸사리시딘 첨가에 더하여 또는 그 대신에, 첨가된 수르팩틴 및/또는 이투린을 포함하고/거나 안정화제 (바람직하게는: 글리세롤), 증량제, 용매, 계면활성제, 자발성 촉진제, 고체 담체, 액체 담체, 유화제, 분산제, 필름 형성제, 결빙 보호제, 증점제, 식물 성장 조절제, 무기 포스페이트, 비료, 아주반트, 지방산 및 피브릴, 마이크로피브릴 또는 나노피브릴 구조화제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 보조제의 첨가를 추가로 포함한다. 다시, 상응하게 수득가능한 이점이 상기 기재되었다.

본 발명은 또한 적합한 발효 배지를 포함하는 발효조에 본 발명의 조성물 또는 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능하거나 또는 수득된 조성물을 접종하는 단계를 포함하는 발효 방법을 제공한다. 상기 기재된 바와 같이, 본 발명에 따른 조성물 중 포자가, 심지어 저장 후에도, 빠른 발아 거동을 나타내는 것이 특정 이점이다. 따라서, 본 발명의 조성물은 유리하게 신속히 사용가능한 마스터 또는 제조용 세포 은행의 제조에 적합하다.

상응하게 본 발명은 적합한 발효 배지에 본 발명의 조성물 또는 임의의 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능하거나 또는 수득된 조성물을 접종하는 단계, 및 접종된 배지를 발효시키는 단계를 포함하는, 포자-형성 원핵 미생물의 발효에서, 유도기의 기간 및/또는 대수성장기의 종료에 도달할 때까지의 시간을 제어하는 방법을 제공하며, 여기서 유도기의 보다 짧은 기간 및/또는 대수성장기의 보다 빠른 종료를 위해 보다 높은 백분율의 제1 포자 형성기에 수거된 포자를 갖는 조성물이 사용되고, 유도기의 보다 긴 기간 또는 대수성장기의 보다 늦은 종료를 위해 보다 높은 백분율의 제2 포자 형성기에 수거된 포자를 갖는 조성물이 사용된다. 따라서, 배치 발효를 수행할 때 통상의 기술자가 목적하는 함량의 신속히 발아 포자를 제공하는 시간에 상기 발효 반응으로부터 포자를 정제하는 것이 편리하다. 특히 본 발명은 산업적인 배치 발효의 수거 시간의 계획 및 조정을 개선시킨다. 발효 배치의 완료 시간으로서 본 발명의 조성물의 함량에 따라 신뢰성이 높게 예측될 수 있다. 따라서, 미리정의된 발효 단계에 도달하는 시간은 접종에 적절한 본 발명의 조성물을 선택함으로써 조정될 수 있다. 본원에 기재되고 바람직한 바와 같이, 높은 함량의 제1 포자 형성기의 포자는 발효 단계 1)에서 수득가능한 최대 포자 농도의 85%에 도달할 때, 보다 바람직하게는 1-75% 범위의 농도에 도달할 때, 보다 바람직하게는 10-75% 범위의 농도에 도달할 때, 보다 바람직하게는 20-70% 범위의 농도에 도달할 때, 보다 바람직하게는 30-68% 범위의 농도에 도달할 때 가장 늦게 수득가능하고; 대안적으로, 높은 함량의 제1 포자 형성기의 포자는 포자당 디피콜린산의 평균 함량이 발효 단계 1)에서 최대 포자 농도에 도달할 때 생산된 포자의 디피콜린산의 평균 함량의 최대 80%일 때, 보다 바람직하게는 디피콜린산의 평균 함량이 20-80% 범위, 더욱 더 바람직하게는 22-70% 범위, 더욱 더 바람직하게는 30-65% 범위일 때 수득가능하다.

바람직하게는 포자-형성 원핵 미생물의 발효에서, 유도기의 기간 및/또는 대수성장기의 종료에 도달할 때까지의 시간을 제어하는 방법은 (1) 표적 성장 신호를 수득하는 단계 및 (2) 유도기의 보다 짧은 기간 및/또는 대수성장기의 보다 빠른 종료를 위해 보다 높은 백분율의 제1 포자 형성기에 수거된 포자를 갖는 조성물이 사용되고, 유도기의 보다 긴 기간 또는 대수성장기의 보다 늦은 종료를 위해 보다 높은 백분율의 제2 포자 형성기에 수거된 포자를 갖는 조성물이 사용되도록 접종하는 조성물의 함량을 조정하는 단계를 포함하는, 컴퓨터 실행된 방법이다. 특히, 발효 반응기는 바람직하게는 본 발명의 조성물을 포함하는 접종 샘플 저장, 즉 제조용 세포 은행 샘플의 수집에 연결된다. 각각의 조성물에 대해 초기 포자 군집의 함량은 본원에 기재된 바와 같이, 바람직하게는 샘플을 플레이팅하고 호기성 배양의 경우 72시간 및 혐기성 배양의 경우 96시간 중 48시간의 제1 관측 기간 내에 형성된 콜로니의 백분율을 기록하거나, 또는 또한 바람직하게는 포자가 조성물을 위해 정제된 시간에서 발효 단계를 기록함으로써 기록되고, 예를 들어 포자의 백분율은 제1 포자 형성기 동안 수거된 발효, 포자당 디피콜린산의 평균 함량 또는 이러한 발효에서 성취할 수 있는 최대 포자 농도의 백분율로부터 수득된다. 접종 샘플 저장은 상기 컴퓨터-실행된 방법을 수행하기 위해 장착된 컴퓨터를 포함한다. 목적하는 유도기 기간 또는 대수성장기의 종료를 나타내는 타이밍 신호를 받으면, 컴퓨터는 어떤 제조용 세포 은행 샘플이 타이밍 신호에 가장 잘 맞는 지를 결정한다. 바람직하게는, 컴퓨터는 사용자가 타이밍 신호 및 가능한 정확한 타이밍 신호를 재고할 수 있도록 예상되는 유도기의 기간을 나타내는 또는 대수성장기의 종료까지의 타이밍 예측을 방출한다. 최종적인 타이밍 신호가 컴퓨터에 의해 수용되고 적절한 제조용 세포 은행 샘플이 선택될 때, 컴퓨터는 (1) 발효조 접종을 위한 사용자에 의한 제조용 세포 은행 샘플 수집으로부터의 샘플의 회수를 허용하기 위한 선택된 샘플의 식별자를 방출하고/거나, (2) 제조용 세포 은행 샘플 수집으로부터 선택된 샘플의 회수를 자동적으로 수행하고 회수된 샘플을 발효조 접종을 위한 사용자에게 넘겨주거나, 또는 (3) 발효조에의 제조용 세포 은행 샘플 수집으로부터의 선택된 샘플의 투여를 자동적으로 수행하거나, 또는 (4) 각각 초기 포자 군집 풍부화된 및 후기 포자 군집 풍부화된 스톡으로부터 추출함으로써 초기 및 후기 포자 군집의 비율을 조정함으로써 새로운 제조용 세포 은행 샘플을 자동적으로 혼합한다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법에서 제1 포자 형성기 동안 수거된 포자를 제공하는 단계를 포함하는, 포자-형성 원핵 미생물의 포자 발아 및/또는 영양 성장을 촉진하는 방법을 제공하며, 여기서 바람직하게는 무기 포스페이트가 포자와 함께 또는 순차적으로 제공된다. 무기 포스페이트는 바람직하게는 인산, 폴리인산, 아인산 및/또는 H2PO4^(-), H2PO3^(-), HPO4^(2-) 또는 PO4^(3-)의 염으로부터 선택된다. 바람직하게는 무기 포스페이트는 모노암모늄 포스페이트, 디암모늄 포스페이트, 모노포타슘 포스페이트, 디포타슘 포스페이트, 암모늄 폴리포스페이트, 칼슘 포스페이트, 일염기성 칼슘 포스페이트, 이염기성 칼슘 포스페이트, 마그네슘 포스페이트, 아연 포스페이트, 망가니즈 포스페이트, 철 포스페이트, 포타슘 포스파이트, 구리 포스페이트, NPK 비료, 인광석 및 이들의 조합으로부터 이루어진 군으로부터 선택된다. 예를 들어 WO2018140542에 기재된 바와 같이, 식물 부분, 종자 또는 식물을 위한 성장 기재 - 바람직하게는 토양 - 상의 0.2 내지 2.7 mg/ml의 무기 포스페이트, 바람직하게는 칼슘 포스페이트의 적용은 바실루스 또는 파에니바실루스 균주의 포자 발아 및/또는 영양 성장을 촉진한다.

더욱이, 본 발명은

a) 발효에 접종하기 위한, 또는

b) 해충 방제를 위한 및/또는 식물병원성 진균 또는 박테리아성 질환의 강도를 예방하거나, 지연시키거나, 제한하거나 또는 감소시키기 위한 및/또는 식물의 건강을 개선시키기 위한 및/또는 식물의 수확율을 증가시키기 위한 및/또는 식물 배양 영역으로부터의 식물병원성 진균 또는 박테리아 물질의 방출을 예방하거나, 지연시키거나, 제한하거나 또는 감소시키기 위한

본 발명의 또는 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능하거나 또는 수득된 조성물의 용도를 제공한다.

상기 기재된 바와 같이, 이러한 용도는 본 발명의 조성물 또는 생산 방법에 의해 부여된 이점을 실현한다. 특히, 식물병원성 진균 또는 박테리아 감염의 강도를 예방하거나, 지연시키거나, 제한하거나 또는 감소시킴으로써, 식물 건강은 개선되며 이는, 결과적으로, 하기 1종 이상의 유리한 효과를 야기할 수 있다: 이른 및 보다 우수한 발아, 보다 이른 또는 보다 지속적인 출아, 증가된 작물 수확율, 증가된 단백질 함량, 증가된 오일 함량, 증가된 전분 함량, 보다 발생된 뿌리 시스템, 개선된 뿌리 성장, 개선된 뿌리 크기 유지, 개선된 뿌리 유효성, 스트레스 (예를 들어, 가뭄, 열, 염, UV, 물, 추위에 대한)에 대한 증가된 내성, 감소된 에틸렌 생산 및/또는 감소된 에틸렌 수용, 분얼 증가, 식물 높이에서의 증가, 보다 큰 잎몸, 보다 적은 죽은 근생엽, 보다 강한 분얼지, 보다 녹색의 잎 색상, 안료 함량, 증가된 광합성 활성, 비료, 살충제 및/또는 물에 대한 감소된 필요, 보다 적은 종자 필요, 보다 생산적인 분얼지, 보다 이른 개화, 이른 곡물 성숙, 보다 적은 식물 도복 (쓰러짐), 증가된 순 성장, 증진된 식물 활력 및 증가된 입목.

또한 바람직하게는 식재 전 또는 후에, 출아 전 또는 후에, 또는 바람직하게는 미립자, 분말, 현탁액 또는 용액으로서, 해충, 식물, 그의 부분 또는 번식 물질 또는 식물이 성장할 기재를 유효량의 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능하거나 또는 수득된 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 해충 손상으로부터의 보호를 필요로 하는 식물 또는 그의 부분을 보호하는 방법이 본 발명에 따라 제공된다. 바람직하게는 조성물은 헥타르당, 약 1x10^10 내지 약 1x10^12 콜로니 형성 단위 (cfu)의 포자, 바람직하게는 바실루스 또는 파에니바실루스 포자 및 가장 바람직하게는 파에니바실루스 포자, 또는 헥타르당 약 0.5 kg 내지 약 5 kg 조성물 고체로 적용된다.

더욱이 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능하거나 또는 수득된 조성물을 식물, 식물 부분, 종자 또는 기재에 적용하는 단계를 포함하는, 단백질 페이로드를 식물, 식물 부분, 종자 또는 성장 기재에 전달하는 방법이 본 발명에 의해 제공되며, 여기서 포자는 페이로드 도메인 및 상기 포자의 표면으로의 페이로드 도메인의 전달을 위한 표적화 도메인을 포함하는 단백질을 발현하는 미생물의 것이다. 상기 기재된 바와 같이, 표적 도메인 전달에 적합한 단백질 및 파에니바실루스 균주의 유전자 조작 방법은 예를 들어 WO2020232316 및 WO2019099635에 기재되어 있다.

본 발명은 특히 본원에 기재된 바와 같은 용도 또는 방법을 제공하며, 여기서

i) 진균 질환은 흰녹가루병, 노균병, 흰가루병, 뿌리혹병, 스클레로티니아 썩음병, 푸사리움 시들음병 및 썩음병, 보트리티스 썩음병, 탄저병, 리족토니아 썩음병, 잘록병, 당근 무름병, 덩이줄기병, 녹병, 검은 뿌리 썩음병, 갈색윤반병, 아파노미세스 뿌리 썩음병, 아스코치타 지제부 썩음병, 구미 줄기 마름병, 알테르나리아 잎반점병, 흑반병, 둥근무늬병, 마름역병, 점무늬병, 잎 마름병, 세프토리아 반점병, 잎 마름병, 또는 이들의 조합으로부터 선택되고/거나,

ii) 진균 질환은 하기 분류학적 계급으로부터 선택된 미생물에 의해 초래되거나 또는 악화된다:

- 소르다리오미세테스 강, 보다 바람직하게는 히포크레알레스 목의 것, 보다 바람직하게는 넥트리아세아에 과의 것, 보다 바람직하게는 푸사리움 속의 것;

- 소르다리오미세테스 강, 보다 바람직하게는 글로메렐랄레스 목의 것, 보다 바람직하게는 글로메렐라세아에 과의 것, 보다 바람직하게는 콜레토트리쿰 속의 것;

- 레오티노미세테스 강, 보다 바람직하게는 헬로티알레스 목의 것, 보다 바람직하게는 스클레로티니아세아에 과의 것, 보다 바람직하게는 보트리티스 속의 것;

- 도티데오미세테스 강, 보다 바람직하게는 플레오스포랄레스 목의 것, 보다 바람직하게는 플레오스포라세아에 과의 것, 보다 바람직하게는 알테르나리아 속의 것;

- 도티데오미세테스 강, 보다 바람직하게는 플레오스포랄레스 목의 것, 보다 바람직하게는 파에오스파에리아세아에 과의 것, 보다 바람직하게는 파에오스파에리아 속의 것;

- 도티데오미세테스 강, 보다 바람직하게는 보트리오스파에리알레스 목의 것, 보다 바람직하게는 보트리오스파에리아세아에 과의 것, 보다 바람직하게는 마크로포미나 속의 것;

- 도티데오미세테스 강, 보다 바람직하게는 카프노디알레스 목의 것, 보다 바람직하게는 미코스파에렐라세아에 과의 것, 보다 바람직하게는 지모세프토리아 속의 것;

- 아그라리코미세테스 강, 보다 바람직하게는 칸타렐랄레스 목의 것, 보다 바람직하게는 세라토바시디아세아에 과의 것, 보다 바람직하게는 리족토니아 또는 타나테포루스 속의 것;

- 푹시니오미세테스 강, 보다 바람직하게는 푹시니알레스 목의 것, 보다 바람직하게는 푹시니아세아에 과의 것, 보다 바람직하게는 우로미세스 또는 푹시니아 속의 것;

- 우스틸라기노미세테스 강, 보다 바람직하게는 우스틸라기날레스 목의 것, 보다 바람직하게는 우스틸라기나세아에 과의 것, 보다 바람직하게는 우스틸라고 속의 것;

- 오오미코타 강, 보다 바람직하게는 피티알레스 목의 것, 보다 바람직하게는 피티아세아에 과의 것, 보다 바람직하게는 피티움 속의 것;

- 오오미코타 강, 보다 바람직하게는 페로노스포랄레스 목의 것, 보다 바람직하게는 페로노스포라세아에 과의 것, 보다 바람직하게는 피토프토라, 플라스모파라 또는 슈도페로노스포라 속의 것.

이러한 진균 해충은 광범위한 작물 손상 및/또는 수확율 감소에 대한 원인이 된다. 본 발명의 조성물이 상기 열거된 바와 같은 식물병원성 진균에 의한 감염의 강도를 예방하거나, 지연시키거나, 제한하거나 또는 감소시키기 위해 적합하고 조정되는 것이 특히 유리하다. 이러한 용도 또는 방법에서, 포자는 바람직하게는 파에니바실루스 속, 보다 바람직하게는 파에니바실루스 코레엔시스, 파에니바실루스 리조스파에라에, 파에니바실루스 폴리믹사, 파에니바실루스 아밀로리티쿠스, 파에니바실루스 테르라에, 파에니바실루스 폴리믹사 폴리믹사, 파에니바실루스 폴리믹사 플란타룸, 파에니바실루스 신규 종 에피피티쿠스, 파에니바실루스 테르라에, 파에니바실루스 마세란스, 파에니바실루스 알베이, 보다 바람직하게는 파에니바실루스 폴리믹사, 파에니바실루스 폴리믹사 폴리믹사, 파에니바실루스 폴리믹사 플란타룸, 파에니바실루스 신규 종 에피피티쿠스, 파에니바실루스 테르라에, 파에니바실루스 마세란스, 파에니바실루스 알베이, 더욱 더 바람직한 파에니바실루스 폴리믹사, 파에니바실루스 폴리믹사 폴리믹사, 파에니바실루스 폴리믹사 플란타룸 및 파에니바실루스 테르라에 및 가장 바람직하게는 파에니바실루스 폴리믹사 또는 파에니바실루스 테르라에의 포자이다.

상기 고지된 바와 같이 본 발명은, 또 다른 측면에서, 또한:

1) 바이오매스가 세포의 1%/4시간 미만만큼 증가할 때까지 포자형성에 도움이 되는 액체 배지에서 미생물을 발효시키는 단계, 2) 발효 배지에 영양을 타서 배지에서 포자의 발아를 초래하는 단계, 및

3) 배지로부터 후기 포자를 정제하는 단계

를 포함하는, 원핵 미생물의 포자를 포함하는 조성물을 생산하는 방법을 제공하며,

여기서 정제는

a) 10%만큼, 보다 바람직하게는 20%만큼, 보다 바람직하게는 30%만큼, 보다 바람직하게는 40%만큼 배지에서의 포자 농도의 감소 후, 및/또는

b) 2%만큼, 보다 바람직하게는 5%만큼, 보다 바람직하게는 10%만큼 배지에서의 세포 수의 증가 후

수행되고,

여기서 정제는 형성 공정에서, 바람직하게는 UV 처리에 의해 및/또는, 보다 바람직하게는, 열 처리에 의해, 생존가능한 세포 및/또는 포자를 불활성화시키는 단계를 포함한다.

상기 기재된 바와 같은 완전 포자형성 액체 상 발효는 초기 포자 군집 및 후기 포자 군집 둘 다를 함유할 것이다. 후기 군집 포자를 선택적으로 풍부화시키는 것은 초기 및 후기 포자가 표현형으로 거의 구별할 수 없기 때문에, 분리 방법에 의해 실현가능하지 않다. 그러나, 신속히 발아하는 초기 포자 군집의 경향으로 인해, 이러한 초기 포자는 발아가 유발되고 다수의 후기 포자가 발아되기 전에 불활성화될 수 있다. 따라서, 본 발명은 후기 군집 포자가 풍부화된 포자 조성물을 제공하는 신뢰성이 높고, 빠르고 복잡하지 않은 방법을 제공한다. 포자가 매우 지속적이고 장기간 동안 느리나 꾸준히 포자형성할 수 있다는 것이 이러한 조성물의 이점이다. 농업, 세정 또는 프로바이오틱 제품에서, 이러한 조성물은 따라서 심지어 이러한 조성물의 이러한 포자가 발아하고 생존가능한 세포가 결국 손실된 후에도 초기 포자 조성물에 의해 수득가능한 효과를 연장하는 데 유리하다. 더욱이, 초기 포자 군집의 포자가 고갈되고 후기 포자가 풍부화된 이러한 조성물은 의도적으로, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 발효조 접종을 위해 초기 포자 군집이 풍부화된 조성물과 혼합되는 것이 유리하다.

바람직하게는 본 발명의 조성물은 2종의 종의 포자를 포함하며, 여기서 1종의 종의 포자는 초기 발아 포자가 풍부화되고 다른 종의 포자는 후기 발아 포자가 풍부화된다. 보다 상세하게, 본 발명은 적어도 2종의 원핵 미생물의 정제된 포자를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서

i) 제1 종에 대해

a) 상기 포자는 콜로니 형성에 적합한 배지 상에 플레이팅될 때 콜로니를 형성하고, 여기서 플레이팅 후 호기성 배양의 경우 72시간 및 혐기성 배양의 경우 96시간 내에 형성된 모든 이러한 콜로니 중 적어도 40%, 보다 바람직하게는 40-90%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 50-90%, 보다 바람직하게는 적어도 60%, 보다 바람직하게는 60-90%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 70-90%는 48시간 내에 형성되고/거나,

b) 포자 중 적어도 40%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 55%, 보다 바람직하게는 적어도 60%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%는 제1 포자 형성기 동안 수거된 발효로부터 수득가능하거나 또는 수득되고/거나

c) 포자당 디피콜린산의 평균 함량은 편평기까지 적합한 배지에서 발효된 포자의 디피콜린산의 평균 함량의 최대 80%, 보다 바람직하게는 20-80%, 더욱 더 바람직하게는 22-70%, 더욱 더 바람직하게는 30-65%이고,

ii) 제2 종에 대해

a) 상기 포자는 콜로니 형성에 적합한 배지 상에 플레이팅될 때 콜로니를 형성하고, 여기서 플레이팅 후 호기성 배양의 경우 72시간 및 혐기성 배양의 경우 96시간 내에 형성된 모든 이러한 콜로니 중 적어도 30%, 보다 바람직하게는 40-90%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 50-90%, 보다 바람직하게는 적어도 60%, 보다 바람직하게는 60-90%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 70-90%는 48시간 후 형성되고/거나,

b) 포자 중 적어도 40%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 55%, 보다 바람직하게는 적어도 60%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%는 제2 포자 형성기 동안 수거된 발효로부터 수득가능하거나 또는 수득되고/거나

c) 포자당 디피콜린산의 평균 함량은 편평기까지 적합한 배지에서 발효된 포자의 디피콜린산의 평균 함량의 적어도 70%, 보다 바람직하게는 80-100%, 더욱 더 바람직하게는 85-100%, 더욱 더 바람직하게는 90-100%이다.

이러한 조성물은 유익하게, 조성물의 사용 동안, 예를 들어 식물, 식물 부분 또는 식물 성장 기재에의 조성물의 적용 후, 제1 종의 포자가 발아하고 빠르게 성장하게 하는 것을 허용하는 반면에, 제2 종은 보다 늦게 및 보다 긴 기간 동안 발아하며, 이로써 보다 긴 기간 동안 일관되게 상응하는 유익한 효과를 제공한다.

본 발명은 이하 추가로 하기 비-제한적인 예로서 예시된다.

실시예

실시예 1: 12L 규모 발효에서의 파에니바실루스 균주 32의 포자 형성

발효 과정 동안 파에니바실루스 및 바실루스 균주의 포자 형성을 모니터링하기 위해, 12L 규모 발효를 수행하였다. 이로부터, 예로서, 파에니바실루스 균주 균주 32를 사용하는 이러한 발효에서의 포자의 수 / ml은 도 1에 도시된다.

균주 균주 32는 야생형 단리물 피.폴리믹사 LU17007의 폴리믹신 무함유 돌연변이체이고 무작위 돌연변이유발 접근법으로부터 유래한다. 균주는 배양 동안 포자 형성을 입증하기 위해 예시적으로 선택되었으나, 포자 형성에서의 비동시성이 또한 야생형 균주 피.폴리믹사 LU17007 및 그의 추가 돌연변이체 후계자, 예컨대 LU54 및 LU52, 공중 파에니바실루스 균주, 예컨대 피. 폴리믹사 DM365 또는 피. 테르라에 DSM15891, 뿐만 아니라 생물방제 균주 바실루스 벨렌지엔시스(Bacillus velenziensis) MBI600 (데이터는 제시되지 않음)에서 입증되었다.

파에니바실루스 균주 32에서의 포자 형성의 시기를 분석하기 위한 발효 조건.

사전배양 조건

PX-125의 조성은 표 1에 열거된다. 원액의 구성 요소를 증류수 중에 용해시키고 121 ℃, 1 bar 과압에서 60분 동안 멸균 여과하거나 또는 오토클레이빙하였다. 멸균 용액을 실온에서 또는 4 ℃에서 저장하였다. 소포제를 오토클레이빙 공정을 시작하기 직전에 주요 용액에 첨가하였다. 원액을 혼합한 후, 배지의 pH를 25 % (w/w) 암모니아 용액 또는 40 % (w/w) 인산으로 6.5로 설정하였다.

표 1 원액의 저장 (실온 (RT) 또는 4 ℃) 및 멸균 방법 (멸균-여과된 / 오토클레이빙된, s/a)에 대한 사양을 갖는 복합 배지 PX-125의 조성.

사전배양 배양을 통기성이 있는 실리콘 플러그로 밀봉된 110 ml의 배양 배지 PX-125를 함유하는 배플을 갖는 1L 진탕 플라스크에서 수행하였다. 배지에 파에니바실루스 균주 32의 동결 배양 바이알을 사용하여 0.6% (v/v)로 접종하였다. 배양을 33℃, 150 rpm 및 25 mm 진탕 주파수에서 24시간 동안 수행하였다.

주요 배양 조건

사전배양 진탕 플라스크를 풀링하고 12l PX-141 배지 (2% 접종 v/v)를 함유하는 21l 생물반응기로 이동시켰다. 주요 배양 배지 PX-141의 배합표는 표 2에 열거된다.

주요 배양 배지: PX-141

표 2 원액의 저장 (실온 (RT) 또는 4 ℃) 및 멸균 방법 (멸균-여과된 / 오토클레이빙된, s / a)에 대한 사양을 갖는 복합 배지 PX-141의 조성.

발효를 33℃에서 72시간 동안 수행하였다. pH를 6.5로 설정하고 암모늄 히드록시드 또는 인산으로 조정하였다. 용해된 산소를 교반기 속도 (500-1200 rpm) 및 에어레이션 (5-30 L/분)을 조절함으로써 > 20%로 설정하였다. 발효 배양 샘플을 6시간마다 채취하고 4℃에서 저장하였다.

포자의 정량화

발효 샘플에서의 포자 계수를 제조업체의 매뉴얼에 따라 C-Chip 일회용 계수판 (노이바우어 / 나노엔텍(NanoEnTek))을 사용하는 위상차 현미경에 의해 평가하였다. 정확한 계수를 위해, 발효 샘플을 멸균된 0.9% NaCl 용액을 사용하여 연속 희석하였다. 연속 희석액의 생성 및 포자 역가의 계수를 각각의 샘플링 지점에 대해 삼중으로 수행하였다.

발효의 시간 구간당 포자의 알짜 생산은 도 2에 제시된다.

실시예 2: 발효 동안 상이한 시점에서 형성된 포자의 생장 시기

생장 특성을 관측하기 위한 정제된 포자 용액의 생성

발효 과정 동안 상이한 시점에서 형성된 포자의 발아 시기를 조사하기 위해, 정제된 포자 용액을 생성하고 하기 절차에 따라 동일한 포자 계수 / ml로 조정하였다.

처음에, 영양 세포를 60℃에서 60분 동안 실시예 1의 상기 언급된 발효의 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66 및 72시간 배양 시간에 수거된 2 ml 배양 브로스 샘플의 열 처리에 의해 사멸시켰다.

후속적으로, 포자를 4℃에서 3,000 g으로의 원심분리에 의해 세척하고 5 ml 멸균된 ddH₂O로 재현탁시켰다. 세척 사이클을 적어도 5회 동안 수행하여 세포 잔해 및 배지 잔류물을 제거하였다. 그 후에, 포자를 5 ml 멸균된 ddH₂0 중에 재현탁시키고 밤새 4℃에서 저장하였다. 세척 사이클을 다음 날 다시 적어도 5회 동안 수행하였다. 정제된 포자 스톡을 1 ml 멸균된 ddH₂0 중에 재현탁시키고 4℃에서 저장하였다. 포자 순도를 현미경 사진 섹션당 ≥200개의 세포 (포자)를 계수하면서 ≥99% 포자를 밝혀내는 위상차 현미경에 의해 평가하였다.

정제된 포자 농도를 이어서 이전에 실시예 1에 기재된 바와 같이 C-Chip 계수에 의해 결정하였고, dH20로 동일한 포자의 수 / 샘플로 조정하였다.

정제된 포자 샘플의 생장 시기를 바이오렉터(BioLector) (m2p-랩) 배양 장치를 사용하는 마이크로타이터 플레이트 배양 (48-라운드 웰-MTP, MTP-R48-BOH, m2p-랩)에서의 바이오매스의 증가를 모니터링함으로써 평가하였다.

이를 위해, 상기 언급된 절차에서 생성된 10E+6개의 정제된 포자를 48-라운드 웰-플레이트 (MTP-R48-BOH, m2p-랩)의 1.2 ml의 PX-131 배지로 접종하였다.

마이크로타이터 플레이트 배양에 사용된 PX-131의 배지 배합표는 표 3에 제시된다.

표 3 원액의 저장 (실온 (RT) 또는 4 ℃) 및 멸균 방법 (멸균-여과된 / 오토클레이빙된, s / a)에 대한 사양을 갖는 복합 배지 PX-131의 조성.

증발을 감소시키기 위해, 플레이트를 증발 감소 층 (m2p-랩)을 갖는 기체-투과성 밀봉 포일로 밀봉하였다.

48-웰 플레이트에서의 배양을 900 rpm, 2.5mm 진탕 직경, 33℃ 및 85% 습도에서 적어도 72시간 동안 수행하였다. 바이오매스 (A.U.)를 620 nm의 파장을 갖는 산란 광을 통해 15분마다 측정하였다.

실시예 1의 발효 과정 동안 상이한 시점 후 수거된 포자 샘플 (각각 10E+6개의 포자)의 MTP 규모 배양에서의 바이오매스 형성은 도 3에 도시된다. 포자 생장의 시기는 ≥1 A.U.의 바이오매스에 도달함으로써 정의되었고 도 4에 제시된다.

실시예 3: "초기" 및 "후기" 포자 샘플의 푸사리시딘 생산

푸사리시딘의 생산을 48시간 배양 후 실시예 2의 발효 샘플에서 평가하였다. 이를 위해, 50 μl의 배양 브로스를 추출을 위해 950 μl 아세토니트릴-물 (1:1) 혼합물과 함께 혼합하였다. 샘플을 30분 동안 20℃에서 초음파 수조에서 처리하였다. 샘플을 이어서 5분 동안 14000 rpm에서 원심분리하였고 상청액을 측정을 위해 HPLC 바이알로 여과하였다. 푸사리시딘 농도를 표 5, 5 및 표 6에 열거된 바와 같이 HPLC-UV-VIS에 의해 결정하였다:

표 4 형광 현미경 여과 설정

표 5 배양 브로스 샘플에서의 푸사리시딘 A, B 및 C의 정량화를 위한 HPLC 설정

표 6 배양 브로스 샘플에서의 푸사리시딘 A, B 및 C의 HPLC 기반 정량화를 위한 용매 구배

실시예 2의 배양에서의 푸사리시딘 A, B 및 D의 생산은 도 5에 제시된다.

실시예 4: 상이한 시점의 파일럿 규모 발효에서의 초기 및 후기 포자의 비율

상이한 시점으로부터 포자를 수집하기 위한 발효 조건

사전배양 조건

파에니바실루스 균주 32를 위한 사전배양 진탕 플라스크를 실시예 1에 기재된 바와 같이 PX-125 배지를 사용하여 취급하였다. 오직 말토스 수준만이 30g/L로 감소되었다. 21.5시간 배양 시간 후, 진탕 플라스크 사전배양을 표 7에 열거된 12l PX-172 배지로 채워진 21l 생물반응기의 접종 (1.5% v/v)에 사용하였다.

표 7 PX-172 주요 배양 배지의 배지 배합표

발효를 실시예 1에 기재된 바와 같이 33℃에서 18시간 동안 수행하였고 이어서 180l 다시 PX-172 배지를 함유하는 300L 주요 배양 발효조에 이동시켰다. 주요 발효를 33℃에서 72시간 동안 수행하였다. pH를 6.5로 설정하고 암모늄 히드록시드 또는 인산으로 조정하였다. 용해된 산소를 교반기 속도 (300 - 600 rpm) 및 에어레이션 (2.5 - 12 m³/h)을 조절함으로써 > 20%로 설정하였다. 발효 배양 샘플을 6시간마다 채취하고 4℃에서 저장하였다.

발효의 상이한 시점에 파에니바실루스 폴리믹사 균주 32의 빠른 및 느린 발아 포자의 비율을 확인하기 위해, 배양 브로스 샘플을 36시간 및 56시간 배양 시간 후 상기-언급된 발효로부터 채취하였다.

이를 위해, 100μl의 배양 브로스를 900μl의 멸균 0.9% NaCl .9% NaCl + 0.1 g/L Tween 80 용액으로 희석하였다. 2ml 튜브를 사용하여, 혼합물을 동일한 희석액을 사용하는 10단계로 최대 10E-9의 최종 희석액 수준으로 추가로 희석하였다.

이어서, 각각의 배양 희석 단계를 써모사이클러에서 60℃에서 30분 동안 가열하여 영양 세포를 사멸시켰다. 100μl의 각각의 어프로치를 ISP2 아가 플레이트 상에 플레이팅하고 후속적으로 72시간 동안 33℃에서 배양하였다. ISP2 아가의 배합표는 표 8에 제시된다.

표 8 ISP2 아가 배지의 조성. 모든 구성 요소를 함께 혼합하고, 오토클레이빙하고 실온에서 저장하였다.

아가 플레이트 상 콜로니 형성 단위 (CFU)를 계수에 의해 배양의 48시간 및 72시간 후 결정하였다. 두 평가 시점 후 발견된 CFU의 비율은 도 6에 제시된다.

실시예 5: 발효 샘플에서의 파에니바실루스의 초기 및 후기 포자의 디피콜린산 (DPA) 수준

포자로부터의 DPA 추출을 하기 절차에 따라 수행하였다:

1. 포자 펠릿 생성: 10ml의 발효 브로스를 18,000 g에서 10분 동안 원심분리한다

2. 조심히 상청액을 폐기한다

3. 10ml 멸균 dH20를 첨가하고 진탕하고 피펫을 통해 전도시킴으로써 펠릿을 용해시켜 포자 펠릿을 세척한다

4. 세척된 포자 용액을 18,000 g에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 폐기한다

5. 세척 단계 3-4를 반복한다

6. 펠릿을 5ml dH20 중에 재현탁시키고 진탕하고 피펫을 통해 전도시킴으로써 펠릿을 용해시킨다

7. 전체 어프로치를 압력-저항 30ml 유리 주사-관으로 이동시키고 부틸 고무 스톱으로 밀봉한다. 알루미늄 크림프로 밀봉한다

8. 샘플을 121℃에서 60분 동안 오토클레이빙한다

9. 식힌 후, 유리 관을 개방하고 2ml을 2ml 마이크로 원심분리 튜브로 이동시킨다. 원심분리를 18,000 g에서 10분 동안 수행한다

10. 상청액을 HPLC 분석 바이알로 이동시키고 여과한다

DPA 수준을 표 9 및 표 10에 열거된 파라미터에 따라 HPLC UV-VIS에 의해 정량화하였다.

표 9 배양 브로스 샘플에서의 DPA 정량화를 위한 HPLC 설정

표 10 배양 브로스 샘플에서의 DPA의 HPLC 기반 정량화를 위한 용매 구배

검량 곡선을 0.1, 0.5 및 1mM 99% 디피콜린산을 사용하여 설정하였다. 디피콜린산은 5.7분 유지 시간에 검출되었다.

이 방법을 사용하여, 총 DPA 수준 / ml 발효 브로스를 배양의 과정 동안 채취된 실시예 3에서 수행된 발효의 배양 브로스 샘플에서 분석하였다. 동시에, 생존가능한 포자 역가를 실시예 4에 기재된 바와 같이 희석 및 플레이트 계수에 의해 평가하였다. 결과는 도 7에 제시된다.

이에 기반하여, 단일 포자당 DPA의 비율을 공식

을 사용함으로써 계산하였고 상이한 시점에 대해 생성된 비율은 도 8에 제시된다.

실시예 9: 클로스트리디아로부터의 포자의 비동시성 생장

바실루스 및 파에니바실루스와 다른 포자 형성 박테리아의 포자 생장의 시기를 평가하기 위해, 클로스트리디움 속으로부터의 2종의 균주, 즉 씨. 테타노모르품 DSM528 및 씨. 티로부티리쿰 DSM1460을 추가 특징규명을 위해 예시적으로 선택하였다. 두 균주를 5일 동안 RCM 아가 상에 28℃에서 혐기성 조건 하에 배양하였다. RCM 아가의 배합표는 표 11에 제시된다. 이후, 5개의 개별 콜로니를 고르고 6ml의 TSB 브로스를 함유하는 액체 배양 바이알에 이동시켰다. TSB 브로스 배지의 배합표는 표 12에 제시된다. 모든 단계를 생물학적 삼중으로 혐기성 클러브 박스를 사용하여 혐기성 조건 하에 수행하였다. 씨. 테타노모르품 DSM528 및 씨. 티로부티리쿰 DSM1460의 액체 배양물을 7일 동안 28℃ 웰에서 포자형성까지 배양하였다. 포자 생장의 시기를 분석하기 위해, 1ml의 각각의 액체 배양물을 60℃에서 30분 동안 가열하여 남아 있는 영양 세포를 사멸시켰다. 이어서, 100μl의 각각의 어프로치를 TSB 아가 상에 플레이팅하였다 (표 12). 아가 배양물을 96시간 동안 28℃에서 혐기성 조건 하에 성장시켰다. 콜로니 형성 단위 (CFU)를 48시간 및 96시간 배양 후 계수하였다. 96시간으로부터의 총 CFU 계수와 관련하여 48시간 및 96시간 배양 시간 후 발견된 CFU의 비율이 도 9에 제시된다.

표 11 클로스트리디아의 성장을 위한 RCM 아가의 조성, pH: 6.8±0.2

표 12 클로스트리디아의 성장을 위한 TSB 브로스 및 아가의 조성, pH: 7.3±0.2

Claims (23)

1. 원핵 미생물의 정제된 포자를 포함하는 포자 조성물로서, 여기서
   a) 상기 포자는 콜로니 형성에 적합한 배지 상에 플레이팅될 때 콜로니를 형성하고, 여기서 플레이팅 후 호기성 배양의 경우 72시간 및 혐기성 배양의 경우 96시간 내에 형성된 모든 이러한 콜로니 중 적어도 40%, 보다 바람직하게는 40-90%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 50-90%, 보다 바람직하게는 적어도 60%, 보다 바람직하게는 60-90%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 70-90%는 48시간 내에 형성되고/거나,
   b) 포자 중 적어도 40%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 55%, 보다 바람직하게는 적어도 60%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%는 제1 포자 형성기 동안 수거된 발효로부터 수득가능하거나 또는 수득되고/거나,
   c) 포자당 디피콜린산의 평균 함량은 편평기까지 적합한 배지에서 발효된 포자의 디피콜린산의 평균 함량의 최대 80%, 보다 바람직하게는 20-80%, 더욱 더 바람직하게는 22-70%, 더욱 더 바람직하게는 30-65%인 조성물.
2. 제1항에 있어서, 미생물이 피르미쿠테스 문, 바실루스, 클로스트리디아 또는 네가티비쿠테스 강,
   보다 바람직하게는 바실랄레스, 클로스트리디알레스, 써모아나에로박테랄레스, 써모세디미니박테랄레스 또는 셀레노모나달레스 목,
   보다 바람직하게는 바실라세아에, 파에니바실라세아에, 파스토리아세아에, 클로스트리디아세아에, 펩토코카세아에, 헬리오박테리아세아에, 신트로포모나다세아에, 써모아나에로박테라세아에, 테피다나에로박테라세아에 또는 스포로무사세아에 과,
   보다 바람직하게는 알칼리바실루스, 바실루스, 게오바실루스, 할로바실루스, 리시니바실루스, 피스키바실루스, 테리바실루스, 브레비바실루스, 파에니바실루스, 써모바실루스, 파스토리아, 클로스트리디움, 데술포토마쿨룸, 헬리오박테리움, 펠로스포라, 펠로토마쿨룸, 칼다나에로박터, 무렐라, 써모아나에로박터, 테피다나에로박터, 프로피오니스포라 또는 스포로무사 속,
   보다 바람직하게는 바실루스, 파에니바실루스 또는 클로스트리디움 속
   의 분류학적 계급으로부터 선택된 것인 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   a) 최대 4:1, 보다 바람직하게는 3:1 내지 0.2:1의 비율로 생존가능한 세포 및 포자를 포함하고/거나,
   b) 상기 포자에 더하여, 바람직하게는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 해충 방제제를 포함하고/거나:
   i) 살진균, 살박테리아, 살바이러스 및/또는 식물 방어 활성화제 활성을 갖는 1종 이상의 미생물 살충제,
   ii) 살진균, 살박테리아, 살바이러스 및/또는 식물 방어 활성화제 활성을 갖는 1종 이상의 생화학적 살충제,
   iii) 살곤충, 살진드기, 살연체동물 및/또는 살선충 활성을 갖는 1종 이상의 미생물 살충제,
   iv) 살곤충, 살진드기, 살연체동물, 페로몬 및/또는 살선충 활성을 갖는 1종 이상의 생화학적 살충제,
   v) 호흡 억제제, 스테롤 생합성 억제제, 핵산 합성 억제제, 세포 분열 및 세포골격 형성 또는 기능의 억제제, 아미노산 및 단백질 합성의 억제제, 신호 전달 억제제, 지질 및 막 합성 억제제, 다중 부위 작용을 갖는 억제제, 세포벽 합성 억제제, 식물 방어 유도제 및 미지의 작용 방식을 갖는 살진균제로부터 선택된 1종 이상의 살진균제,
   c) 1종 이상의 푸사리시딘이 푸사리시딘 A, B 또는 D 중 임의의 것을 포함하는, 적어도 1종의 푸사리시딘, 파에니세린 또는 파에니프로릭신, 바람직하게는 적어도 2종 이상의 푸사리시딘, 파에니세린 또는 파에니프록실린, 보다 바람직하게는 3 내지 80종의 푸사리시딘, 및/또는 수르팩틴 및/또는 이투린을 포함하고/거나,
   d) 안정화제 (바람직하게는: 글리세롤), 증량제, 용매, 계면활성제, 자발성 촉진제, 고체 담체, 액체 담체, 유화제, 분산제, 필름 형성제, 결빙 보호제, 증점제, 식물 성장 조절제, 무기 포스페이트, 비료, 아주반트, 포자 발아촉진제, 지방산 및 피브릴, 마이크로피브릴 또는 나노피브릴 구조화제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 보조제를 포함하는 것인 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 해충 방제 조성물이고/거나 식물병원성 진균 또는 박테리아성 질환을 예방하거나, 제한하거나 또는 감소시키고/거나 식물의 건강을 개선시키거나 또는 촉진하고/거나 이러한 식물, 그의 부분 또는 번식 물질 또는 식물이 성장할 기재에 적용될 때 식물의 수확율을 증가시키거나 또는 촉진하는 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 10^4 cfu/ml의 상기 포자, 보다 바람직하게는 10^4-10^17 cfu/ml, 보다 바람직하게는 10^7-10^15 cfu/ml을 포함하는 조성물.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 포자의 적어도 분획이 이들의 표면 상에 페이로드 도메인을 포함하는 단백질을 포함하며, 상기 단백질은 또한 상기 포자의 표면으로의 페이로드 도메인의 전달을 위한 표적화 도메인을 포함하는 것인 조성물.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 또는 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능하거나 또는 수득된 조성물로 코팅되거나 또는 주입된 식물 배양 기재를 포함하는, 식물 보호 제품.
8. 식물, 식물 부분 또는 식물 번식 물질로서, 여기서 물질은, 그의 표면 상에 또는 그에 주입된, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 또는 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능하거나 또는 수득된 조성물을 포함하는 것인 식물, 식물 부분 또는 식물 번식 물질.
9. 제8항에 따른 식물, 식물 부분 또는 식물 번식 물질 또는 제7항에 따른 식물 배양 기재를 포함하는, 농장, 바람직하게는 재배지 또는 온실 베드.
10. 바람직하게는 세제 및 세정 성능에 효과적이거나 또는 세제의 물리적 특징을 유지하는 데 효과적인 양으로 존재하는 계면활성제, 빌더, 및 굴수성 물질로부터 선택된 적어도 1종의 구성 요소를 포함하는, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 또는 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능하거나 또는 수득된 조성물을 포함하는 세정 제품으로서, 바람직하게는 피부 세정 제품, 헤어 세정 제품, 세탁 제품, 식기세척 제품, 파이프 디그리서 또는 알레르겐 제거 제품으로 이루어진 군으로부터 선택된 세정 제품.
11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 또는 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능하거나 또는 수득된 조성물을 포함하는 식품, 사료 또는 화장 제품, 바람직하게는 프로바이오틱 또는 프리바이오틱 식품, 프로바이오틱 또는 프리바이오틱 사료 또는 프로바이오틱 또는 프리바이오틱 화장 제품.
12. 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 건축 제품, 바람직하게는 광물 표면의 처리를 위한 페인트, 코트 또는 함침 조성물, 시멘트 제제, 콘크리트 또는 응결 콘크리트의 제조를 위한 첨가제.
13. 1) 포자형성에 도움이 되는 배지에서 미생물을 발효시키는 단계,
    2) 포자를 정제하여 조성물을 수득하는 단계
    를 포함하는, 원핵 미생물의 포자를 포함하는 조성물을 생산하는 방법으로서,
    여기서
    a) 정제는 발효 단계 1)에서 수득가능한 최대 포자 농도의 85%에 도달할 때 가장 늦게 수행되고, 보다 바람직하게는 정제는 상기 최대에 비해 1-75% 범위의 농도에 도달할 때, 보다 바람직하게는 상기 최대에 비해 10-75% 범위의 농도에 도달할 때, 보다 바람직하게는 상기 최대에 비해 20-70% 범위의 농도에 도달할 때, 보다 바람직하게는 상기 최대에 비해 30-68% 범위의 농도에 도달할 때 수행되고/거나,
    b) 정제는 상기 정제된 포자가 콜로니 형성에 적합한 배지 상에 플레이팅될 때 콜로니를 형성하도록 수행되고, 여기서 플레이팅 후 호기성 배양의 경우 72시간 및 혐기성 배양의 경우 96시간 내에 형성된 모든 이러한 콜로니 중 적어도 40%, 보다 바람직하게는 40-90%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 50-90%, 보다 바람직하게는 적어도 60%, 보다 바람직하게는 60-90%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 70-90%는 48시간 내에 형성되고/거나,
    c) 정제는 상기 정제된 포자 중 적어도 40%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 55%, 보다 바람직하게는 적어도 60%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%가 제1 포자 형성기 동안 수거된 발효로부터 수득가능하거나 또는 수득되도록 수행되고/거나
    d) 정제는 포자당 디피콜린산의 평균 함량이 발효 단계 1)에서 최대 포자 농도에 도달할 때 생산된 포자의 디피콜린산의 평균 함량의 최대 80%일 때, 보다 바람직하게는 디피콜린산의 평균 함량이 20-80% 범위, 더욱 더 바람직하게는 22-70% 범위, 더욱 더 바람직하게는 30-65% 범위일 때 수행되는 것인 방법.
14. 제13항에 따라, 미생물이
    피르미쿠테스 문, 바실루스, 클로스트리디아 또는 네가티비쿠테스 강,
    보다 바람직하게는 바실랄레스, 클로스트리디알레스, 써모아나에로박테랄레스, 써모세디미니박테랄레스 또는 셀레노모나달레스 목,
    보다 바람직하게는 바실라세아에, 파에니바실라세아에, 파스토리아세아에, 클로스트리디아세아에, 펩토코카세아에, 헬리오박테리아세아에, 신트로포모나다세아에, 써모아나에로박테라세아에, 테피다나에로박테라세아에 또는 스포로무사세아에 과,
    보다 바람직하게는 알칼리바실루스, 바실루스, 게오바실루스, 할로바실루스, 리시니바실루스, 피스키바실루스, 테리바실루스, 브레비바실루스, 파에니바실루스, 써모바실루스, 파스토리아, 클로스트리디움, 데술포토마쿨룸, 헬리오박테리움, 펠로스포라, 펠로토마쿨룸, 칼다나에로박터, 무렐라, 써모아나에로박터, 테피다나에로박터, 프로피오니스포라 또는 스포로무사 속,
    보다 바람직하게는 바실루스, 파에니바실루스 또는 클로스트리디움 속
    의 분류학적 계급으로부터 선택된 것인 방법.
15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    a) 정제 단계 2)가
    - 포자의 건조, 동결건조, 균질화, 추출, 여과, 원심분리, 침강분리, 또는 농축 단계를 포함하고/거나,
    - 조성물의 물 함량을
    a) 건조, 분말 또는 과립 조성물의 경우: 조성물의 1-10중량%, 바람직하게는 조성물의 2-8중량%로,
    b) 액체 또는 페이스트 조성물의 경우 조성물의 10-98중량%, 조성물의 최대 97 중량%, 보다 바람직하게는 조성물의 80-95중량%로
    조정하는 단계를 포함하고/거나,
    - 조성물의 탄소 공급원 함량을 포자 수거 시 그의 함량과 비교하여 조성물의 최대 50 중량%, 보다 바람직하게는 조성물의 5-30중량%로 조정하는 단계를 포함하고/거나
    - 조성물에서의 포자 발아의 억제 또는 감소를 초래하고/거나,
    b) 방법이 바람직하게는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 해충 방제제의 첨가를 추가로 포함하고/거나:
    i) 살진균, 살박테리아, 살바이러스 및/또는 식물 방어 활성화제 활성을 갖는 1종 이상의 미생물 살충제,
    ii) 살진균, 살박테리아, 살바이러스 및/또는 식물 방어 활성화제 활성을 갖는 1종 이상의 생화학적 살충제,
    iii) 살곤충, 살진드기, 살연체동물 및/또는 살선충 활성을 갖는 1종 이상의 미생물 살충제,
    iv) 살곤충, 살진드기, 살연체동물, 페로몬 및/또는 살선충 활성을 갖는 1종 이상의 생화학적 살충제,
    v) 호흡 억제제, 스테롤 생합성 억제제, 핵산 합성 억제제, 세포 분열 및 세포골격 형성 또는 기능의 억제제, 아미노산 및 단백질 합성의 억제제, 신호 전달 억제제, 지질 및 막 합성 억제제, 다중 부위 작용을 갖는 억제제, 세포벽 합성 억제제, 식물 방어 유도제 및 미지의 작용 방식을 갖는 살진균제로부터 선택된 1종 이상의 살진균제,
    c) 방법이 1종 이상의 푸사리시딘이 푸사리시딘 A, B 또는 D 중 임의의 것을 포함하는, 적어도 1종의 푸사리시딘, 파에니세린 또는 파에니프로릭신, 바람직하게는 적어도 2종 이상의 푸사리시딘, 파에니세린 또는 파에니프록실린, 보다 바람직하게는 3 내지 80종의 푸사리시딘, 및/또는, 수르팩틴 및/또는 이투린의 첨가를 추가로 포함하고/거나,
    d) 방법이 안정화제 (바람직하게는: 글리세롤), 증량제, 용매, 계면활성제, 자발성 촉진제, 고체 담체, 액체 담체, 유화제, 분산제, 필름 형성제, 결빙 보호제, 증점제, 식물 성장 조절제, 무기 포스페이트, 비료, 아주반트, 포자 발아촉진제, 지방산 및 피브릴, 마이크로피브릴 또는 나노피브릴 구조화제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 보조제의 첨가를 추가로 포함하는 방법.
16. 적합한 발효 배지를 포함하는 발효조에 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 또는 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능하거나 또는 수득된 조성물을 접종하는 단계를 포함하는 발효 방법.
17. 적합한 발효 배지에 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 또는 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능하거나 또는 수득된 조성물을 접종하는 단계 및 접종된 배지를 발효시키는 단계를 포함하는, 포자-형성 원핵 미생물의 발효에서, 유도기의 기간 및/또는 대수성장기의 종료에 도달할 때까지의 시간을 제어하는 방법으로서, 여기서 유도기의 보다 짧은 기간 및/또는 대수성장기의 보다 빠른 종료를 위해 보다 높은 백분율의 제1 포자 형성기에 수거된 포자를 갖는 조성물이 사용되고, 유도기의 보다 긴 기간 또는 대수성장기의 보다 늦은 종료를 위해 보다 높은 백분율의 제2 포자 형성기에 수거된 포자를 갖는 조성물이 사용되는 것인 방법.
18. 하기 단계를 포함하는, 발효를 위한 접종물 샘플을 제공하는 컴퓨터-실행된 방법:
    i) 유도기의 표적 기간 및/또는 대수성장기의 종료를 수득하는 단계,
    ii) 제1 포자 형성기 및/또는 제2 포자 형성기 동안 수거된 포자의 요구되는 백분율을 계산하는 단계, 및
    iii) 단계 2에서의 계산에 기반하여 하기 중 1개 이상으로부터 선택된 반응을 수행하는 단계:
    (1) 계산된 비율에 가장 잘 맞는 제조용 세포 은행 샘플 수집의 접종물 샘플의 식별자의 방출,
    (2) 계산된 비율에 가장 잘 맞는 제조용 세포 은행 샘플 수집의 접종물 샘플의 회수,
    (3) 발효조에의 계산된 비율에 가장 잘 맞는 제조용 세포 은행 샘플 수집의 접종물 샘플의 투여, 또는
    (4) 각각 초기 포자 군집 풍부화된 및 후기 포자 군집 풍부화된 스톡으로부터 추출함으로써 초기 및 후기 포자 군집의 비율을 조정함으로써 새로운 제조용 세포 은행 샘플을 혼합하는 것, 임의로 상기 혼합물을 발효조에 투여하는 것.
19. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 방법에서 제1 포자 형성기 동안 수거된 포자를 제공하는 단계를 포함하는, 포자-형성 원핵 미생물의 포자 발아 및/또는 영양 성장을 촉진하는 방법으로서, 여기서 바람직하게는 무기 포스페이트가 포자와 함께 또는 순차적으로 제공되는 것인 방법.
20. a) 발효에 접종하기 위한, 또는
    b) 해충 방제를 위한 및/또는 식물병원성 진균 또는 박테리아성 질환의 강도를 예방하거나, 지연시키거나, 제한하거나 또는 감소시키기 위한 및/또는 식물의 건강을 개선시키기 위한 및/또는 식물의 수확율을 증가시키기 위한 및/또는 식물 배양 영역으로부터의 식물병원성 진균 또는 박테리아 물질의 방출을 예방하거나, 지연시키거나, 제한하거나 또는 감소시키기 위한, 또는
    c) 식물 보호 제품의 제조를 위한, 또는
    d) 프로바이오틱 식품, 사료 또는 화장품 제제의 제조를 위한, 또는
    e) 세정 제품의 제조를 위한, 바람직하게는 세정 제품의 항박테리아 또는 항진균 효과를 부여하거나, 증가시키거나 또는 연장하기 위한,
    e) 콘크리트의 제조를 위한
    제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 또는 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능하거나 또는 수득된 조성물의 용도.
21. 바람직하게는 식재 전 또는 후에, 출아 전 또는 후에, 또는 바람직하게는 미립자, 분말, 현탁액 또는 용액으로서, 해충, 식물, 그의 부분 또는 번식 물질 또는 식물이 성장할 기재를 유효량의 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 또는 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능하거나 또는 수득된 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 해충 손상으로부터의 보호를 필요로 하는 식물 또는 그의 부분을 보호하는 방법.
22. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 또는 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능하거나 또는 수득된 조성물을 식물, 식물 부분, 종자 또는 기재에 적용하는 단계를 포함하는, 단백질 페이로드를 식물, 식물 부분, 종자 또는 성장 기재에 전달하는 방법으로서, 여기서 포자는 페이로드 도메인 및 상기 포자의 표면으로의 페이로드 도메인의 전달을 위한 표적화 도메인을 포함하는 단백질을 발현하는 미생물의 것인 방법.
23. 제20항 또는 제21항에 있어서,
    i) 진균 질환이 흰녹가루병, 노균병, 흰가루병, 뿌리혹병, 스클레로티니아 썩음병, 푸사리움 시들음병 및 썩음병, 보트리티스 썩음병, 탄저병, 리족토니아 썩음병, 잘록병, 당근 무름병, 덩이줄기병, 녹병, 검은 뿌리 썩음병, 갈색윤반병, 아파노미세스 뿌리 썩음병, 아스코치타 지제부 썩음병, 구미 줄기 마름병, 알테르나리아 잎반점병, 흑반병, 둥근무늬병, 마름역병, 점무늬병, 잎 마름병, 세프토리아 반점병, 잎 마름병, 또는 이들의 조합으로부터 선택되고/거나,
    ii) 진균 질환이 하기 분류학적 계급으로부터 선택된 미생물에 의해 초래되거나 또는 악화되는 것인 용도 또는 방법:
    - 소르다리오미세테스 강, 보다 바람직하게는 히포크레알레스 목의 것, 보다 바람직하게는 넥트리아세아에 과의 것, 보다 바람직하게는 푸사리움 속의 것;
    - 소르다리오미세테스 강, 보다 바람직하게는 글로메렐랄레스 목의 것, 보다 바람직하게는 글로메렐라세아에 과의 것, 보다 바람직하게는 콜레토트리쿰 속의 것;
    - 레오티노미세테스 강, 보다 바람직하게는 헬로티알레스 목의 것, 보다 바람직하게는 스클레로티니아세아에 과의 것, 보다 바람직하게는 보트리티스 속의 것;
    - 도티데오미세테스 강, 보다 바람직하게는 플레오스포랄레스 목의 것, 보다 바람직하게는 플레오스포라세아에 과의 것, 보다 바람직하게는 알테르나리아 속의 것;
    - 도티데오미세테스 강, 보다 바람직하게는 플레오스포랄레스 목의 것, 보다 바람직하게는 파에오스파에리아세아에 과의 것, 보다 바람직하게는 파에오스파에리아 속의 것;
    - 도티데오미세테스 강, 보다 바람직하게는 보트리오스파에리알레스 목의 것, 보다 바람직하게는 보트리오스파에리아세아에 과의 것, 보다 바람직하게는 마크로포미나 속의 것;
    - 도티데오미세테스 강, 보다 바람직하게는 카프노디알레스 목의 것, 보다 바람직하게는 미코스파에렐라세아에 과의 것, 보다 바람직하게는 지모세프토리아 속의 것;
    - 아그라리코미세테스 강, 보다 바람직하게는 칸타렐랄레스 목의 것, 보다 바람직하게는 세라토바시디아세아에 과의 것, 보다 바람직하게는 리족토니아 또는 타나테포루스 속의 것;
    - 푹시니오미세테스 강, 보다 바람직하게는 푹시니알레스 목의 것, 보다 바람직하게는 푹시니아세아에 과의 것, 보다 바람직하게는 우로미세스 또는 푹시니아 속의 것;
    - 우스틸라기노미세테스 강, 보다 바람직하게는 우스틸라기날레스 목의 것, 보다 바람직하게는 우스틸라기나세아에 과의 것, 보다 바람직하게는 우스틸라고 속의 것;
    - 오오미코타 강, 보다 바람직하게는 피티알레스 목의 것, 보다 바람직하게는 피티아세아에 과의 것, 보다 바람직하게는 피티움 속의 것;
    - 오오미코타 강, 보다 바람직하게는 페로노스포랄레스 목의 것, 보다 바람직하게는 페로노스포라세아에 과의 것, 보다 바람직하게는 피토프토라, 플라스모파라 또는 슈도페로노스포라 속의 것.

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