KR101936471B1

KR101936471B1 - 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 kbc1109 및 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 식물 병해충 방제용 조성물

Info

Publication number: KR101936471B1
Application number: KR1020160141774A
Authority: KR
Inventors: 강재곤; 이영의; 강훈석; 박창석; 박정찬; 정윤우; 김정준
Original assignee: (주)한국바이오케미칼; 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2016-10-28
Filing date: 2016-10-28
Publication date: 2019-01-11
Also published as: KR20180046537A

Abstract

본 발명은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109(Bacillus amyloliquefaciens KBC1109) 균주 및 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 식물 병해충 방제용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로, 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 균주 및 이의 배양액이 콜레토트리쿰 아큐타툼(Colletotrichum acutatum)에 의해 유발되는 고추 탄저병, 푸사리움 옥시스퍼룸(Fusarium oxysporum)에 의해 유발되는 시들음병, 스클레로티움 롤프시아이(Sclerotium rolfsii)에 의해 유발되는 흰비단병, 라이족토니아 솔라니 AG-2-2(Rhizoctonia solani AG-2-2)에 의해 유발되는 잔디 병, 라이족토니아 세레알리스(Rhizoctonia cerealis)에 의해 유발되는 누른잎마름병을 포함하는 다양한 식물 병원균에 대해 우수한 항진균활성을 나타내며, 고추 흰비단병에 대한 방제효과 및 식물기생성선충에 대한 살선충 효과가 있으므로, 친환경적인 식물 병해충 방제용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 및 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 식물 병해충 방제용 조성물{Composition for controlling plant disease comprising Bacillus amloliquefaciens KBC1109 or its culture fluid as an ingredient}

본 발명은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109(Bacillus amyloliquefaciens KBC1109) 균주 및 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 식물 병해충 방제용 조성물에 관한 것이다.

환경 및 생태계 보전에 관한 국제적인 관심이 집중되면서 식물병해충의 방제를 위한 유기합성농약의 과다한 사용으로 토양오염, 환경 및 생태계의 파괴, 인축독성 등의 피해로 인한 문제점이 부각되고 있다. 특히 유기합성농약의 오남용으로 인한 농업생태계 오염에 대한 우려는 친환경 안전농산물에 대한 소비자의 관심이 증폭되고 있는 실정이다.

이에 유기합성농약으로 인한 부작용을 해결하기 위해 생태계에서 조절적 역할을 하는 미생물 및 이의 대사산물을 이용하여 식물 병원균과 길항작용을 하도록 하는 생물학적 방제법이 연구되고 있다. 이러한 천연식물보호제의 가장 큰 장점은 환경과 농업생태계에 미치는 영향을 최소화할 수 있으나, 천연식물보호제가 살아있는 생물체이기 때문에 상온에서의 보존기간이 짧은 문제점이 있다. 천연식물보호제로 산업화된 미생물은 바실러스 속에 속하는 것이 대부분으로 이는 열과 건조 등의 환경 스트레스에 견딜 수 있는 내생포자를 형성하기 때문이다. 특히 바실러스균은 자연계에 많이 분포하며 복합 기능을 가지는 펩타이드 성 물질을 생산하는데 이는 농작물의 생육과 관련이 있는 식물의 생육촉진과 식물 병원균에 대항할 수 있는 항생기작 및 식물체 방어기작을 부여할 뿐만 아니라 근권 내 미생물의 정착을 돕는 것으로 알려져 있다.

천연식물보호제는 1970년 초반에 본격적인 연구가 진행되어 왔다. 주로 정부 기관연구소, 대학, 기업체에서 수행되어 왔으며 가장 성공적인 천연식물보호제로는 아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter)를 이용하여 개발된 Galltro-A, Nogall/Diegall, Norbac84C 등의 제품이 등록되어 사용되고 있고, 2003년 미국 Agraquest사가 개발한 Serenade는 라이센스를 통하여 다국적농약기업인 BASF를 통하여 전세계 25개국에 판매중이다. 국내에서는 현재 약 30여 종의 천연식물보호제가 등록되어 사용되고 있다. 특히 살균제로는 약 17종이 알려져 있는데 이중 바실러스 속 계열이 13종에 이르고 있다.

이러한 식물병에 대한 생물학적 방제제로 많이 사용되고 있는 바실러스 속 균주는 인간에게 비병원성이고 내생포자를 가지고 있는 그람 양성 세균으로 배양이 용이한 특성을 가지고 있다. 뿐만 아니라 프로테아제(protease), 아밀라아제(amylase), 글루카나제(glucanase) 및 셀룰라아제(cellulase) 등의 각종 효소나 다양한 구조를 가진 항균활성물질 등을 생산하는 것으로 보고되어 있어, 산업적으로 중요한 세균으로 생물산업에서 숙주균으로 활발히 이용되고 있다.

한편, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)를 이용한 식물 병원균 방제용 조성물로서, 식물 병원균에 대해 항진균 활성을 보이는 미생물 방제제는 많이 공개되어 있지만, 다양한 식물병을 효과적으로 방제할 수 있는 미생물 방제제개발은 미흡한 실정이므로 새로운 생물학적 미생물 방제제의 개발이 요구되고 있다. 또한, 종래의 연구에서는 병원균에 대한 항균작용을 주로 하는 미생물을 생물학적 방제에 이용하여 왔으나, 항균활성을 나타내는 물질의 활성 농도가 낮아 생물학적 방제효과가 떨어지는 등의 문제점이 유발되고 있다.

따라서, 본 발명자들은 다양한 식물 병원균에 대한 우수한 항진균 활성을 가지는 균주 및 물질을 개발하기 위해 노력한 결과, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109(Bacillus amyloliquefaciens KBC1109) 균주 및 이의 배양산물이 콜레토트리쿰 아큐타툼(Colletotrichum acutatum)에 의해 유발되는 고추 탄저병, 푸사리움 옥시스퍼룸(Fusarium oxysporum)에 의해 유발되는 시들음병, 스클레로티움 롤프시아이(Sclerotium rolfsii)에 의해 유발되는 흰비단병, 라이족토니아 솔라니 AG-2-2(IV)[Rhizoctonia solani AG-2-2(IV)]에 의해 유발되는 잔디 병, 라이족토니아 세레알리스(Rhizoctonia cerealis)에 의해 유발되는 누른잎마름병을 포함하는 다양한 식물 병원균에 대해 우수한 항진균활성을 나타냄을 확인하고, 고추 흰비단병에 대한 방제효과 및 식물기생성 선충에 대한 살선충 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

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대한민국 공개특허 10-2006-0110644호 대한민국 등록특허 10-1485182호

본 발명의 목적은 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 (Bacillus amyloliquefaciens KBC1109) 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 식물 병해충 방제용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수탁번호 KCTC 13084BP로 기탁된 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 (Bacillus amyloliquefaciens KBC1109) 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 식물 병해충 방제용 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 스클레로티움 롤프시아이(Sclerotium rolfsii)에 의하여 유발되는 흰비단병 방제용 조성물을 제공한다.

본 발명은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 (Bacillus amyloliquefaciens KBC1109) 균주 및 이의 배양액이 콜레토트리쿰 아큐타툼(Collectotrichum acutatum)에 의해 유발되는 고추 탄저병, 푸사리움 옥시스퍼룸(Fusarium oxysporum)에 의해 유발되는 시들음병, 스클레로티움 롤프시아이(Sclerotium rolfsii)에 의해 유발되는 흰비단병, 라이족토니아 솔라니 AG-2-2(Rhizoctonia solani AG-2-2)에 의해 유발되는 잔디 병, 라이족토니아 세레알리스(Rhizoctonia cerealis)에 의해 유발되는 누른잎마름병을 포함하는 다양한 식물 병원균에 대해 우수한 항진균활성을 나타내며, 고추 흰비단병에 대한 방제효과 및 식물기생성 선충에 대한 살선충 효과가 있으므로, 친환경적인 식물 병해충 방제용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 (Bacillus amyloliquefaciens KBC1109) 균주 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 BCRC14193(Bacillus amyloliquefaciens BCRC14193) 균주의 16S rRNA 염기서열을 통한 계통도 분석을 나타낸 도이다.
도 2는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 균주의 최적 배양온도와 최적 배양 pH를 확인한 도이다:
A: 25℃, 30℃, 38℃에서 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 균주의 최적 배양온도를 확인한 도;
B: pH 4, 5, 7, 9 에서 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 균주의 최적 배양pH를 확인한 도.
도 3은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 균주의 식물병원균에 대한 항균활성을 확인한 도이다:
Co: 탄저병균(Colletorichum acutatum);
Fu: 시들음병균(Fusarium oxysporum);
Sc: 흰비단병균(Sclerotium rolfsii);
Rs: 라지패취병균(Rhizoctonia solani AG2-2);
Rc: 옐로우패취균(Rhizoctonia cerealis).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 수탁번호 KCTC 13084BP로 기탁된 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109(Bacillus amyloliquefaciens KBC1109) 균주를 제공한다.

상기 균주는 고추 탄저병, 시들음병, 흰비단병, 잔디 병, 누른잎마름병으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 식물병원균에 대해 항균활성을 가지는 것을 특징으로 하는 균주이다.

또한, 상기 균주는 살선충 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 균주이다.

본 발명의 구체적인 실시 예에서, 본 발명자들은 흰비단병을 유발하는 스클레로티움 롤프시아이(Sclerotium rolfsii)에 대하여 길항력이 높은 균주를 분리하여 동정한 후, 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 NCBI GenBank 유전자 데이터베이스와의 상동성 검색을 수행하여 계통학적 위치를 확인하였다. 선발된 균주의 분자계통학적 분석 결과 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 BCRC14193(Bacillus amyloliquefaciens BCRC14193) 균주와 100%의 rRNA 상동성을 나타내는 균주임을 확인하고, 상기 균주는 전형적인 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 모양인 포자를 형성하는 그람 양성 간균의 모습을 가지고 있음을 확인하였다(도 1 참조). 또한, 상기 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 속 균주를 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109로 명명하고, 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 기탁하였다(기탁번호 KCTC 13084BP).

또한, 본 발명자들은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109(Bacillus amyloliquefaciens KBC1109) 균주의 생리, 생화학적 특성을 확인하기 위하여, 탄소원 이용성, 카세인(casein), 젤라틴(gelatin), 녹말(starch), 지질(lipid) 및 셀룰로오스 분해 시험, 포도당 발효의 최종산물로서의 아세토인(아세틸메틸카비놀)을 검출하는 포게스-프로스카우어 시험(Voges proskauer test), 메틸레드시험, 인돌시험, 카탈라제(catalase)시험 및 옥시다아제(oxidase)시험을 수행한 결과, 상기 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 균주는 카탈라제반응, 옥시다아제반응, 인돌반응, 포게스-프로스카우어 시험, 녹말분해, 카세인분해, 젤라틴분해에 양성반응을 보이며, 당 이용성에서는 포도당(glucose), 말토오스(maltose), 젖당(lactose) 및 만니톨(mannitol)은 이용하나 셀룰로오스(cellulose)는 이용하지 않는 것을 확인하였다(표 1 참조).

또한, 본 발명자들은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 균주의 최적 배양온도, 배양시간, pH 및 영양원을 확인한 결과, 상기 균주의 최적 배양 온도는 30℃, 최적 배양 pH는 7, 최적 배양 시간은 72시간, 최적 배양 탄소원은 포도당(glucose), 최적 배양 질소원은 효모추출물(yeast extract)임을 확인하였다(도 2 및 표 2 참조).

또한, 본 발명자들은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 균주의 식물 병원균에 대한 생육저지 효과를 확인한 결과, 상기 균주는 콜레토트리쿰 아큐타툼(Colletotrichum acutatum), 푸사리움 옥시스퍼룸(Fusarium oxysporum), 스클레로티움 롤프시아이(Sclerotium rolfsii), 라이족토니아 솔라니 AG-2-2(Rhizoctonia solani AG-2-2), 라이족토니아 세레알리스(Rhizoctonia cerealis)에 대해 유의적인 항진균 효과를 나타내는 것을 확인하였고, 특히, 흰비단병을 유발하는 병원균인 스클레로티움 롤프시아이(Sclerotium rolfsii)에 대해서는 현저한 항진균 활성을 나타내는 것을 확인하였다(표 3 및 도 3 참조).

또한, 본 발명자들은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 균주의 스클레로티움 롤프시아이(Sclerotium rolfsii)에 의하여 유발되는 흰비단병에 의한 포장효과를 확인한 결과, 상기 균주는 고추 흰비단병에 대한 방제효과가 있음을 확인하였다(표 4 참조).

아울러, 본 발명자들은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 균주의 살선충 효과를 확인한 결과, 상기 균주의 밀도가 높아짐에 따라 살선충 활성을 나타냄을 확인하였다(표 5 참조).

따라서, 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 균주는 콜레토트리쿰 아큐타툼(Colletotrichum acutatum), 푸사리움 옥시스퍼룸(Fusarium oxysporum), 스클레로티움 롤프시아이(Sclerotium rolfsii), 라이족토니아 솔라니 AG-2-2(Rhizoctonia solani AG-2-2), 라이족토니아 세레알리스(Rhizoctonia cerealis)에 대해 유의적인 항균활성 효과를 나타내며, 특히 흰비단병을 유발하는 스클레로티움 롤프시아이(Sclerotium rolfsii)에 대해서는 현저한 항균활성 효과를 나타내며, 흰 비단병에 대한 포장효과를 가지며, 살선충 효과를 가지며 이는 친환경적인 식물 병해충 방제용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109(Bacillus amyloliquefaciens KBC1109) 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 고추 탄저병, 시들음병, 흰비단병, 잔디 병, 누른잎마름병으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 식물병원균에 대해 항균활성을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물이다.

상기 식물병은 고추 탄저병, 시들음병, 흰비단병, 잔디 병, 누른잎마름병으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 식물병인것을 특징으로 하는 조성물이다.

상기 조성물은 흰 비단병에 대한 포장효과를 가지며, 살선충 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 식물병해충 방제용 조성물이다.

본 발명의 식물병 방제용 조성물은 계면활성제 및 발효알콜이 추가로 포함될 수 있으며, 추가로 포함되는 계면활성제의 양은 전체 조성물 100 중량부를 기준으로 1 내지 10 중량부, 추가로 포함되는 발효알콜의 양은 전체 조성물 100 중량부를 기준으로 1 내지 20 중량부일 수 있다.

상기 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소비탄 라우릴, 소디움도데실 벤젠썰포네이트, 실리콘 폴리에테르 코폴리머 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 특별히 이에 한정되지 않는다. 상기 발효알콜은 통상적으로 사용되는 발효알콜을 의미하며, 바람직하게는 95% 주정일 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물에는 살균효과 강화나 살균범위 확대를 위하여, 살균효과가 알려진 공지의 식물추출물이 더 포함될 수 있다.

본 발명은 식물병 방제용 조성물을 식물 또는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제방법을 제공하며, 처리방법은 특별히 한정되지 않고, 예컨대 식물이나 토양에 첨가하는 물이나 비료에 첨가하는 방법 등을 들 수 있다.

상기 식물은 바람직하게는 원예식물일 수 있으며, 과채류, 엽채류, 근채류 등을 포함하며, 보다 구체적으로 상기 과채류는 가지, 고추, 딸기, 수박, 오이, 참외, 토마토, 피망, 호박 등을 포함하고, 엽채류는 배추, 부추, 상추, 쌈채소 등을 포함하며, 근채류는 무 등을 포함할 수 있다.

상기 식물병 방제용 조성물은 적절한 배율로 희석하여 사용할 수 있으며, 예컨대, 무게 기준으로 500배 이하 (예컨대, 10 내지 500배), 바람직하게는 300배 이하 (예컨대 10 내지 300배), 더욱 바람직하게는 200배 이하 (예컨대, 10 내지 200배) 의 희석배율로 희석하여 사용할 수 있다.

본 발명의 방제용 조성물의 희석에 사용되는 희석제는 특별한 제한이 없으며 관련 분야에서 통상적으로 사용되는 희석제를 사용할 수 있으며, 예컨대, 물을 사용할 수 있다.

본 발명의 방제방법은 식물 또는 토양에 처리하되, 식물병해충 방제용 조성물을 식물의 경엽 또는 토양에 3일 내지 5일 간격으로 하여 2 내지 3회 살포하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 식물병해충 방제용 조성물의 주성분은 식물 이차대사산물로 원칙적인 유기합성살균제의 살포가 불가한 친환경농업에 적합하며, 사람과 가축에 대한 유해성과 잔류독성이 없기 때문에 농산물의 안전성이 보장되므로 원예식물의 수확기 중에도 처리가 가능하다.

이들 조성물의 살포 시 식물에 안전하여 유기합성살균제를 대체할 수 있는 안전한 방제물질이다. 또한 화학농약과 혼용 처리하거나 처리 중간에 살포하여도 식물병 방제가 가능하므로 화학농약의 살포횟수 절감에도 크게 기여할 수 있다.

본 발명은 식물병해충 방제용 조성물을 포함하는 식물병해충 방제제(제품)를 제공한다. 상기 식물병해충 방제제는 농축물로서 제형화될 수 있으며, 최종 사용자가 적절한 희석배율로 희석시켜 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 방제제는 그 자체로 토양 또는 식물에 처리되고 식물 보호를 제공하는 유동 가능한 제형, 현탁액, 미세 현탁액, 에멀젼(예컨대, 서스포에멀젼, 마이크로에멀젼), 분말 (예컨대, 습윤 가능한 분말), 과립 농축물, 페이스트 등의 형태로 제형화될 수 있다.

또한, 본 발명의 식물병해충 방제제는 유효성분으로서 필요에 따라 살충제, 다른 살균제, 제초제, 식물생장조절제, 비료, 광물질 등의 기타 성분을 포함할 수 있다.

상기 식물병해충 방제제는 식물병해충 방제용 조성물을 유효성분 중량을 기준으로 0.1 내지 99 중량부 바람직하게는 10 내지 90 중량부, 더욱 바람직하게는 50 내지 90 중량부의 양으로 포함할 수 있고, 잔부로서 1종 이상의 계면활성제 및/또는 당해 분야에 공지된 임의의 기타 불활성 성분, 예를 들면, 보호 콜로이드, 접착제, 증점제, 틱소트로픽제, 침투제, 보존제, 안정화제, 소포제, 동결방지제, 금속이온봉쇄제, 염료, 안료, 착색제 및 중합체와 함께 담체를 추가로 포함할 수 있다.

상기 침투제로서는, 지방 알코올 알콕시레이트, 광유, 식물유, 광유 혹은 식물유의 에스테르 등을 들 수 있다.

상기 안정화제로서는, 에폭시화 동식물유, 비이온계 폴리옥시에틸렌형 계면활성제, 음이온계 폴리옥시에틸렌형 계면활성제, 다가 알코올 및 염기성 물질 등을 들 수 있다.

상기 소포제로서는, 상품명 Anti-mousse(BELCHIM CROP PROTECTION제) 등을 들 수 있다.

상기 동결 방지제로서는, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등을 들 수 있다.

상기 담체로서는, 고체 담체와 액체 담체로 나눌 수 있고, 고체 담체로서는, 전분, 설탕, 셀룰로오스분, 시클로 덱스트린, 활성탄, 대두분, 소맥분, 왕겨분, 목분(木粉), 어분(魚粉), 분유 등의 동식물성 분말; 탈크, 카올린, 벤토나이트, 유기 벤토나이트, 탄산칼슘, 황산칼슘, 중탄산나트륨, 제올라이트, 규조토, 화이트카본, 진흙, 알루미나, 실리카, 유황분말, 소석회 등의 광물성 분말 등을 들 수 있다. 또한, 액체 담체로서는, 물; 대두유, 면실유 등의 식물유; 소의 지방, 경유 등의 동물유; 에틸알코올, 에틸렌글리콜 등의 알코올류; 아세톤, 메틸에틸케톤, 메틸이소부틸케톤, 이소포론 등의 케톤류; 디옥산, 테트라히드로푸란 등의 에테르류; 케로신, 등유, 유동파라핀, 시클로헥산 등의 지방족 탄화수소류; 톨루엔, 크실렌, 트리메틸벤젠, 테트라메틸벤젠, 솔벤트 나프타 등의 방향족 탄화수소류; 클로로포름, 클로로벤젠 등의 할로겐화 탄화수소류; N,N-디메틸포름아미드 등의 산아미드류; 초산에틸에스테르, 지방산의 글리세린 등의 에스테르류; 아세트니트릴 등의 니트릴류; 디메틸술폭시드 등의 유황함유 화합물류, 혹은, N-메틸-2-피롤리돈 등을 들 수 있다.

본 발명에 의한 조성물은 통상적인 방법으로 식물 병해충 방제용으로 제형화할 수 있으며 건조분말 형태 또는 액상 형태로 제조할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 의한 조성물은 액상 생물 농약 형태로 제조될 수 있으며, 이에 증량제를 첨가하여 가루분말의 형태로 이용하거나 이를 제형화하여 과립화시킬 수도 있다. 그러나 그 제형에 특별히 한정되지는 않는다.

또한, 상기 조성물은 증량제를 추가적으로 포함할 수 있으며, 증량제는 미생물과 같은 유효성분 조성에서 적절한 비율로 함유될 수 있도록 전체 생물농약 조성물의 양을 조절하는 역할을 한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 증량제로는 소듐알기네이트, 젤라틴화 전분, 옥수수 전분, 대두박, 밀기울, 입상섬유질, 유안, 규조토, 제올라이트, 벤토나이트, 탈크, 카올린, 파이로필라이트, 화이트카본, 당류 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109(Bacillus amyloliquefaciens KBC1109) 균주 또는 이의 배양액을 토양, 식물 또는 식물의 종자에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제방법을 제공한다.

상기 식물병은 고추 탄저병, 시들음병, 흰비단병, 잔디 병, 누른잎마름병으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 식물병인것을 특징으로 하는 방법이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 ( Bacillus amyloliquefaciens KBC1109 ) 균주의 분리 및 동정

<1-1> 균주의 선별

경남 합천의 고추농가와 경북 칠곡의 참외 시설재배 포장에서 근권부위 토양을 채취하여 10g의 토양을 살균수 90㎖와 혼합 진탕한 후 1㎖를 채취하여 9㎖ 멸균수에 차례대로 희석한 후 스클레로티움 롤프시아이(Sclerotium rolfsii) 균사가 함유된 PDA배지에 100㎕씩 도말하여 28℃에서 3일간 배양하였다. 이후 생육중인 병원균 균사의 생육을 억제하는 콜로니 98개를 분리하고, 1차 분리된 균주를 스클레로티움 롤프시아이(Sclerotium rolfsii)에 대하여 28℃에서 3일간 대치배양을 실시하여 형성된 병원균의 균사생육 저지대를 조사하여 길항력이 높은 균주를 선별하였다.

<1-2> 균주의 동정

상기 <실시예 1>에서 분리한 균주의 동정을 위하여 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 수행하였다.

구체적으로, 프라이머[27F 프라이머: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(서열번호 1); 1492R 프라이머: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'(서열번호 2)]를 사용하여 16S rRNA 유전자부분을 중합효소연쇄반응(PCR)으로 증폭하였으며 증폭산물은 PCR Product Purification Kit(Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 정제된 산물을 DNA Sequencer 3730xl(Applied Biosystems)를 사용하여 염기서열을 분석하고, NCBI/Genebank와 Ribosomal Database Project Ⅱ(RDP Ⅱ)의 데이터베이스에서 상동성 검색을 수행하여 균주를 동정하였고, 16s rRNA 염기서열에 기초해 분자계통분류학적 분석을 하였다.

그 결과, 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109(Bacillus amyloliquefaciens KBC1109) 균주는 서열번호 3으로 기재되는 16S rRNA 염기서열을 가지며, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 BCRC14193(Bacillus amyloliquefaciens BCRC14193) 균주와 100%의 rRNA 상동성을 나타내는 균주임을 확인하였다(도 1). 또한, 상기 균주를 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109(Bacillus amyloliquefaciens KBC1109)로 명명하고 한국생명공학연구원 생명자원센터에 기탁번호 KCTC 13084BP로서 기탁하였다.

바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 ( Bacillus amyloliquefaciens KBC1109 ) 균주의 생리, 생화학적 특성 확인

상기 <실시예 1>에서 최종 선발한 세균의 생리·생화학적 특성을 Smibert와 Krieg (1994)이 기술한 방법으로 Bergey's Manual(Palleroni, 1989)에서 기술한 탄소원 이용성, 카세인(casein), 젤라틴(gelatin), 녹말(starch), 지질(lipid) 및 셀룰로오스 분해 시험, 포도당 발효의 최종산물로서의 아세토인(아세틸메틸카비놀)을 검출하는 포게스-프로스카우어 시험(Voges proskauer test), 메틸레드시험, 인돌시험, 카탈라제(catalase)시험 및 옥시다아제(oxidase)시험을 수행하여 확인하였다.

그 결과, 상기 <실시예 1>을 통해 최종선별된 길항균주는 포자를 형성하는 그람양성 간균임을 확인하였으며, 카탈라제반응, 옥시다아제반응, 인돌반응, 포게스-프로스카우어 시험, 녹말분해, 카세인분해, 젤라틴분해에 양성반응을 보임을 확인하였다. 또한 당 이용성에서는 포도당(glucose), 말토오스(maltose), 젖당(lactose) 및 만니톨(mannitol)은 이용하나 셀룰로오스(cellulose)는 이용하지 않는 것을 확인하였다(표 1).

바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 균주의 생리, 생화학적 검사 결과

시험 또는 특성	결과
Cell type	막대(Rod)
Endospore	원형(round)
Gram reaction	양성(Positive)
Oxidase reaction	+
Catalase reaction	+
Indole test	+
Methyl red test	-
Voges proskauer test	+
Hydrolysis of
Starch	+
Casein	+
Lipid (Tween 80)	-
Gelatin	+
Cellulose	-
Utilization of
Glucose	+
Citrate	+
Maltose	+
Lactose	+
Mannitol	+
Cellulose	-

바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 ( Bacillus amyloliquefaciens KBC1109 ) 균주의 최적배양 조건 확인

상기 <실시예 1>에서 분리 동정한 기탁번호 KCTC 13084BP로 기탁된 길항미생물인 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 균주의 최적배양 조건을 확인하기 위하여 하기와 같은 방법으로 배양온도, 배양시간, pH 및 영양원을 측정하였다.

<3-1> 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 ( Bacillus amyloliquefaciens KBC1109) 균주의 최적 배양온도와 배양시간 및 pH의 확인

최적 배양온도는 LB배지 (BD Co., Sparks, MD, USA)에서 25℃, 30℃, 38℃에서 180rpm, 48시간 동안 배양 후 UV/Visible spectrophotometer(Hanson Tech Co. Ltd., Seoul, Korea)를 이용하여 OD 550nm에서 값을 측정하였고, 최적 배양시간은 LB broth에서 30℃, 180rpm으로 96시간 배양하면서 24시간 간격으로 흡광도와 생균수(cfu/mL)를 측정하였다. 최적 pH는 pH 4, 5, 7, 9로 조절된 LB broth에서 30℃, 180rpm으로 48시간 동안 배양하면서 24시간 간격으로 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 균주는 배양온도 30℃에서 배양이 가장 우수하였으나 그 이상의 온도인 38℃에서는 흡광도가 급격이 떨어지는 것을 확인하였으며, pH 7에서 흡광도 1.59로 배양이 가장 잘 이루어졌으나 pH 5와 9에서도 1.4이상의 흡광도를 나타내어 최적 pH가 5~9로 그 범위가 넓음을 확인함으로써, 상기 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 균주의 최적 배양온도는 30℃이며, 최적 pH는 7임을 확인하였다(도 2)

<3-2> 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 ( Bacillus amyloliquefaciens KBC1109) 균주의 최적 배양 영양원의 확인

적정한 영양원을 선발하기 위해 최소배지(K₂HPO₄ 0.7%, KH₂PO₄ 0.2%, glucose 0.5%, (NH₄)₂SO₄ 0.1%, MgSO₄₂O 0.01%)에 탄소원 결정을 위해 포도당(glucose)을 제외하고 만니톨(mannitol), 말토오스(maltose), 설탕(sucrose), 옥수수전분, 깻묵(oil cake), 쌀겨(rice bran) 탄소원을 전체용액의 1% 농도로 첨가하여 30℃, 180rpm으로 72시간 동안 배양하면서 24시간 마다 단계희석도말법으로 생균수를 측정하였다. 질소원은 최소배지에 (NH₄)₂SO₄ 0.1% 대신 효모추출물(yeast extract), 육추출물(beef extract), 황산암모늄, 아미노산, 카세인(casein), 대두분말(soyflour), 대두(soybean) 질소원을 0.5%씩 첨가하여 탄소원 선발과 같은 방법으로 배양정도를 측정하였다.

그 결과, 적정한 탄소원 중 생육 초기 및 중기에는 옥수수 전분을 이용하였을 때 배양이 잘 되었으나 생육 최적배양시간인 72시간에는 포도당(glucose)을 이용했을 때 옥수수 전분을 이용한 경우보다 5배 이상 배양이 잘 되었으며, 질소원의 경우 생육 초기 및 중기에는 비슷한 배양 정도를 보였으나 생육 최적배양시간인 72시간에는 효모추출물(yeast extracts)을 이용했을 때 배양이 가장 잘 됨을 확인함으로써, 상기 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 균주의 최적 탄소원은 포도당(glucose), 질소원은 효모추출물(yeast extract)임을 확인하였다(표 2).

바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 균주의 최적 배양 탄소원과 질소원

영양원		세포 밀도 (×10⁷cfu/mL)
영양원		24h	48h	72h
탄소원	Rice bran	0.47	1.3	2.3
	Oil cake	0.43	1	1.5
	Corn starch	0.93	2.3	6.3
	Sucrose	0.4	0.4	0.87
	Maltose	0.47	1	3
	Mannitol	0.47	0.5	3.3
	Glucose	0.57	2.3	38.3
질소원	Soybean	0.33	0.33	0.4
	Soyflour	0.53	1.5	2.3
	Casein	0.4	1.5	3.3
	Amino acids	0.43	2.3	3
	Ammonium sulfate	0.3	1	2.3
	Beef extract	0.4	3.3	7
	Yeast extract	0.47	2.1	11.3

바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 ( Bacillus amyloliquefaciens KBC1109 ) 균주의 주요 병원균에 대한 생육저지 효과 확인

상기 <실시예 1>에서 분리 동정한 기탁번호 KCTC 13084BP로 기탁된 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 균주의 식물 병원균에 대한 생육저지 효과를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 살균한 감자 한천배지 위에 다양한 식물 병원균과 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109를 대치배양하였다. 이때, 식물 병원균은 감자 한천배지에서 계대 배양된 개체군을 직경 5 mm크기로 원형절편한 것을 사용하였고, LB 배지에서 28℃, 24시간 배양된 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109를 직경 5 mm의 페이퍼디스크에 20 ㎕ 분주하여 대치배양을 실시하였다. 그 후, 각종 병원균의 생육이 잘되는 온도인 28℃에서 10일간 배양하고, 저지대(Inhibition zone)의 직경을 측정하였다. 상기 식물 병원균으로는 콜레토트리쿰 아큐타툼(Colletotrichum acutatum; Co), 푸사리움 옥시스퍼룸(Fusarium oxysporum ; Fu), 스클레로티움 롤프시아이(Sclerotium rolfsii ; Sc), 라이족토니아 솔라니 AG-2-2(Rhizoctonia solani AG-2-2; Rs), 라이족토니아 세레알리스(Rhizoctonia cerealis ; Rc)의 5종을 사용하였다.

그 결과, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 균주는 상기 식물 병원균 모두에 대해 유의적인 항진균 효과를 나타내는 것을 확인하였고, 특히, 흰비단병을 유발하는 병원균인 스클레로티움 롤프시아이(Sclerotium rolfsii)에 대해서는 현저한 항진균 활성을 나타내는 것을 확인하였다(표 3 및 도 3).

바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 균주의 식물병원균에 대한 항균활성

균주명	저지대(Inhibition zone, mm)
B. amyloliquefaciens KBC1109	Co	Fu	Sc	Rs	Rc
B. amyloliquefaciens KBC1109	4.2	4	10	2.5	4.5

바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 ( Bacillus amyloliquefaciens KBC1109 ) 균주의 흰비단병에 의한 포장효과 확인

상기 <실시예 1>에서 분리 동정한 기탁번호 KCTC 13084BP로 기탁된 길항미생물인 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 균주의 스클레로티움 롤프시아이(Sclerotium rolfsii)에 의하여 유발되는 흰비단병에 의한 포장효과를 확인하기 위하여 하기와 같은 방법으로 실험을 수행하였다.

구체적으로, 비닐하우스에 고추모종을 정식하고 20일 후에 무처리구와 길항균 처리구로 나누고 처리구당 고추모 15주씩 나누어 시험을 진행하였다. 병원균 처리는 고추 흰비단병에서 분리한 병원균을 PDA 배지에서 배양하여 형성된 균핵을 고추 1주당 10개씩 고추모 주변에 접종하였고, 길항균 처리구와 병원균 처리구에는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 균주 배양액(5×10⁸ cfu/ml)을 500배 희석하여 10ℓ 관주처리하였다. 길항균은 10일 간격으로 3회 처리하고 30일간 재배하면서 고추 흰비단병 발병 정도를 조사하여 무처리에 대한 방제가를 계산하였으며 모든 시험은 3반복으로 시험하였다.

그 결과, 병원균처리구는 7일째부터 발병되기 시작하여 재배 24일째 고추 15주 모두 흰비단병이 발병되었으나 길항균 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 균주 배양액 처리구에서는 17일째부터 발병되기 시작하여 재배 30일째 고추 5주만 흰비단병이 발병되었으며, 병원균처리구 대비 방제가는 66.7%로 생물적 방제제로서는 비교적 높은 방제율을 보임을 확인함으로써, 상기 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 균주는 흰비단병에 의한 포장효과가 있음을 확인하였다(표 4).

바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 균주의 고추 흰비단병에 대한 방제효과

처리(Treatment)	흰비단병 발병률[Occurrence rate of diseased plant(%)]	병원균 처리구 대비 방제가 [Control value(%)]
B. amyloliquefaciens KBC1109	33.3±6.65	66.7
무처리(Untreated)	100±0	-

바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 ( Bacillus amyloliquefaciens KBC1109 ) 균주의 살선충 효과 확인

상기 <실시예 1>에서 분리 동정한 기탁번호 KCTC 13084BP로 기탁된 길항미생물인 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 균주의 살선충 효과를 확인하기 위하여 하기와 같은 방법으로 실험을 수행하였다.

구체적으로, 5ℓ 용량의 삼각플라스크에 3ℓ씩 배지를 조성하여 48시간 동안 30℃의 진탕배양기에서 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 균주를 배양하였고, 1.0×10¹⁰cfu/㎖의 농도로 맞추기 위하여 울트라 원심분리기를 이용하여 농축하였다. 실험에 사용할 선충은 토양으로부터 버만깔대기법을 이용하여 분리하였으며, 멸균된 직경 50㎜의 페트리디쉬에 50마리/㎖의 농도로 1㎖씩 처리하였다. 선충이 처리된 페트리디쉬에 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 균주의 배양액을 1.0×10⁵, 1.0×10⁶, 1.0×10⁷, 1.0×10⁸, 1.0×10⁹cfu/㎖의 농도가 되도록 처리하였고, 24시간 후 치사율을 조사하였다.

그 결과, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 균주의 밀도가 높아짐에 따라 살선충 활성을 나타냄을 확인하였다(표 5).

바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109 균주의 농도별 선충에 대한 살선충효과

시험농도 (cfu/㎖)	균주 처리전 평균 선충 밀도	평균 생충수	방제율(%)
1.0×10⁵	43	40	6.42
1.0×10⁶	41	38	6.73
1.0×10⁷	50	36	25.76
1.0×10⁸	44	28	45.45
1.0×10⁹	49	22	49.39
대조군(control)	50	46	-

한국생명공학연구원

KCTC13084BP

20160824

<110> KOREA BIO CHEMICAL.CO.,LTD Rural Development Administration <120> Composition for controlling plant disease comprising Bacillus amloliquefaciens KBC1109 or its culture fluid as an ingredient <130> 2016P-07-035 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27F primer <400> 1 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1492R primer <400> 2 ggttaccttg ttacgactt 19 <210> 3 <211> 1393 <212> DNA <213> Bacillus amyloliquefaciens <400> 3 gtcgagcgga cagatgggag cttgctccct gatgttagcg gcggacgggt gagtaacacg 60 tgggtaacct gcctgtaaga ctgggataac tccgggaaac cggggctaat accggatggt 120 tgtctgaacc gcatggttca gacataaaag gtggcttcgg ctaccactta cagatggacc 180 cgcggcgcat tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa ggcgacgatg cgtagccgac 240 ctgagagggt gatcggccac actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag 300 cagtagggaa tcttccgcaa tggacgaaag tctgacggag caacgccgcg tgagtgatga 360 aggttttcgg atcgtaaagc tctgttgtta gggaagaaca agtgccgttc aaatagggcg 420 gcaccttgac ggtacctaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa 480 tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa agggctcgca ggcggtttct 540 taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggt cattggaaac tggggaactt 600 gagtgcagaa gaggagagtg gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag 660 gaacaccagt ggcgaaggcg actctctggt ctgtaactga cgctgaggag cgaaagcgtg 720 gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt 780 tagggggttt ccgcccctta gtgctgcagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta 840 cggtcgcaag actgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt 900 ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatcctct gacaatccta 960 gagataggac gtccccttcg ggggcagagt gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg 1020 tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgatctt agttgccagc 1080 attcagttgg gcactctaag gtgactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg 1140 tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga cagaacaaag 1200 ggcagcgaaa ccgcgaggtt aagccaatcc cacaaatctg ttctcagttc ggatcgcagt 1260 ctgcaactcg actgcgtgaa gctggaatcg ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg 1320 aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca cgagagtttg taacacccga 1380 agtcggtgag gta 1393

Claims

수탁번호 KCTC 13084BP로 기탁된 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KBC1109(Bacillus amyloliquefaciens KBC1109) 균주.
제 1항에 있어서, 상기 균주는 고추 탄저병, 시들음병, 흰비단병, 잔디 병, 누른잎마름병으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 식물병원균에 대해 항균활성을 가지는 것을 특징으로 하는 균주.
삭제
제 1항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물로서,
상기 식물병은 고추 탄저병, 시들음병, 흰비단병, 잔디 병 및 누른잎마름병으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 식물병인 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제