KR20220035239A - 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 목적은, 세포 또는 조직의 동결 조작과 융해 조작의 작업성이 우수한 동결 보존용 지그를 제공하는 것이다. 본 발명은, 스트립 형상의 선단부를 가지는 본체 부재, 및, 상기 본체 부재의 선단부를 피포(被包)하는 캡 부재를 적어도 가지는 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그로서, 상기 선단부는 보존액 흡수체를 가지는 재치부(載置部)를 적어도 가지고, 상기 선단부의 단축 방향의 길이가 상기 캡 부재의 내경의 70% 이상이고, 상기 캡 부재의 내강의 장축 방향의 길이가 상기 선단부의 장축 방향의 길이의 200% 이하인 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그이다.
Description
본 발명은, 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그에 관한 것이다.
세포 또는 조직의 우수한 보존 기술은, 다양한 산업 분야에서 요구되고 있다. 예를 들면, 소의 배(胚)이식 기술에 있어서는, 배를 동결 보존하고, 수배우(受胚牛)의 발정 주기에 맞추어 배를 융해하여, 이식하는 것이 행해지고 있다. 또, 사람의 불임 치료에 있어서는, 모체로부터 난자 또는 난소를 채취 후, 이식에 적합한 타이밍에 맞추기 위해서 동결 보존해 두고, 이식 시에 융해하여 이용하는 것이 이루어지고 있다.
일반적으로, 생체 내로부터 채취된 세포 또는 조직은, 비록 배양액 중이어도, 차츰 활성이 없어지거나, 형질의 변화가 생기거나 하는 점에서, 생체 외에서의 세포 또는 조직의 장기간의 배양은 바람직하지 않다. 그 때문에, 생체 활성을 유지한 상태에서 장기간 보존하기 위한 기술이 중요하다. 우수한 보존 기술에 의해, 채취된 세포 또는 조직을 보다 정확하게 분석하는 것이 가능해진다. 또 우수한 보존 기술에 의해, 보다 높은 생체 활성을 유지한 채로 세포 또는 조직을 이식에 이용하는 것이 가능해져, 이식 후의 생착률이 향상되는 것이 기대된다. 또한, 생체 외에서 배양한 배양 피부, 생체 외에서 구축한 이른바 세포 시트와 같은 이식을 위한 인공 조직을, 순차적으로 생산하여 보존해 두고, 필요한 때에 사용하는 것도 가능해져, 의료면뿐만 아니라, 산업면에 있어서도 큰 메리트를 기대할 수 있다.
세포 또는 조직의 동결 보존 방법으로서, 예를 들면 완만 동결법이 알려져 있다. 이 방법에서는, 우선, 예를 들면 인산 완충 생리 식염수 등의 생리적 용액에 내동제를 함유시킴으로써 얻어진 보존액에, 세포 또는 조직을 침지한다. 당해 내동제로서는, 글리세롤, 에틸렌글리콜, 디메틸술폭시드 등의 화합물이 이용된다. 당해 보존액에, 세포 또는 조직을 침지 후, 비교적 느린 냉각 속도(예를 들면 0.3~0.5℃/분의 속도)로, -30~-35℃까지 냉각함으로써, 세포 내외 또는 조직 내외의 용액이 충분히 냉각되고, 점성이 높아진다. 이러한 상태에서, 당해 보존액 중의 세포 또는 조직을 추가로 액체 질소의 온도(-196℃)까지 냉각하면, 세포 내 또는 조직 내와 그 외 주위의 미소 용액이 모두 비결정인 채 고화되는 현상인 유리화가 일어난다. 유리화에 의해, 세포 내외 또는 조직 내외가 고화되면, 실질적으로 분자의 움직임이 없어지므로, 유리화된 세포 또는 조직을 액체 질소 중에 보존함으로써, 반영구적으로 보존할 수 있는 것으로 생각할 수 있다.
또, 세포 또는 조직의 동결 보존 방법으로서, 유리화 동결법도 알려져 있다. 유리화 동결법이란, 내동제를 다량으로 포함하는 보존액의 응고점 강하에 의해, 영하여도 빙정이 발생하기 어려워지는 원리를 이용한 것이다. 이 보존액을 급속히 액체 질소 중에서 냉각시키면, 빙정을 발생시키지 않은 채 고화시킬 수 있다. 이와 같이 고화하는 것을 유리화 동결이라고 한다. 또, 내동제를 다량으로 포함하는 보존액은, 유리화액이라 호칭된다.
상술한 완만 동결법에서는, 비교적 느린 냉각 속도로 냉각할 필요가 있기 때문에, 동결 보존을 위한 조작에 시간을 필요로 한다. 또, 냉각 속도를 제어하기 위한 장치 또는 지그를 필요로 하는 문제가 있다. 또한, 상기 완만 동결법에서는, 세포 외 또는 조직 외의 보존액 중에 빙정이 형성되므로, 세포 또는 조직이 당해 빙정에 의해 물리적으로 손해를 받을 우려가 있다. 이에 대해, 상기한 유리화 동결법에서는, 조작의 시간이 단시간이고, 특별한 장치 또는 지그를 필요로 하지 않는다. 또한, 유리화 동결법은, 빙정을 발생시키지 않음으로써 높은 생존율이 얻어진다.
유리화 동결법을 이용한 세포 또는 조직의 동결 보존 방법에 대해서는, 다양한 방법으로, 다양한 종류의 세포 또는 조직을 이용한 예가 나타내어져 있다. 예를 들면, 특허문헌 1에서는, 동물 또는 사람의 생식 세포 또는 체세포에 대한 유리화 동결법의 적용이, 동결 보존 및 융해 후의 생존율의 점에서, 매우 유용하다는 것이 나타내어져 있다.
유리화 동결법은, 주로 사람의 생식 세포를 이용하여 발전해 온 기술인데, 최근에는, iPS 세포나 ES 세포에 대한 응용도 널리 검토되고 있다. 또, 비특허문헌 1에서는, 초파리의 배의 보존에 유리화 동결법이 유효했던 것이 나타내어져 있다. 또한, 특허문헌 2에서는, 식물 배양 세포나 조직의 보존에 있어서, 유리화 동결법이 유효하다는 것이 나타내어져 있다. 이와 같이, 유리화 동결법은 넓고 다양한 종의 세포 및 조직의 보존에 유용하다는 것이 알려져 있다.
적절한 유리화 동결을 이루기 위해서, 동결 속도는 빠르면 빠를수록 바람직한 것이 알려져 있다. 또한, 동결 보존 후의 융해 공정 시에 있어서도, 세포 또는 조직 중으로의 재빙정 형성을 억제하는 관점에서, 융해 속도는 빠르면 빠를수록 바람직한 것이 알려져 있다.
적절한 유리화 동결을 이루기 위한 중요한 인자인 동결 속도와 융해 속도 중, 특히 중요한 것은, 융해 속도로 되어 있다. 예를 들면, 비특허문헌 2에 기재되는 바와 같이, 신속하게 동결된 세포여도, 융해 속도가 느린 경우에는 생존율이 낮아지는 것이 알려져 있다. 또 특허문헌 3에는, 동결한 샘플을 급속 융해법에 의해 융해함으로써, 융해 후의 사람 iPS 세포 유래 신경 줄기 세포/선구 세포의 생존율이 향상하는 것이 기재되어 있다.
일반적으로, 유리화 동결법에 관련된 동결 보존용 지그 및 동결 보존 방법으로서는, 특허문헌 4에 있어서, 포유동물배 또는 난자를 동결 스트로, 동결 바이알 또는 동결 튜브 등의 동결 보존용 용기의 내면에, 이들 배 또는 난자를 포피하기에 충분한 최소량의 유리화액으로 부착하고, 이 용기를 액체 질소에 접촉시켜 급속히 냉각하는 방법이 제안되고 있다. 당해 동결 보존 방법 후에 행해지는 융해 방법은, 상기의 방법으로 보존한 동결 보존용 용기를 액체 질소로부터 꺼내, 용기의 일단부를 개구하고, 이 용기 내에 33~39℃의 희석액을 주입하고, 동결한 배 또는 난자를 융해 희석하는 것이다. 이 동결 보존용 지그 및 동결 보존 방법에 의하면, 포유동물배 또는 난자를 바이러스나 세균에 감염시킬 우려가 없고 높은 생존율로 보존 및 융해 희석할 수 있다고 되어 있다. 그러나, 동결 스트로, 동결 바이알 또는 동결 튜브 등의 동결 보존용 용기의 내면에, 배 또는 난자를 부착하는 동결 공정의 난이도가 높아, 확실하게 배 또는 난자를 동결 보존용 용기에 재치된 것을 확인하는 것이 어려웠다. 또, 융해 공정에 있어서도, 희석액을 이용하여 융해하는데, 배 또는 난자를 재치한 장소를 시인하면서 융해하는 것이 어렵고, 확실하게 배 또는 난자를 회수하는 것이 어려웠다. 또, 동결 공정에 있어서 스트로 실러가 필요하고, 융해 공정에 있어서도 스트로 커터가 필요하는 등, 특별한 기구가 필요하여, 번잡한 프로세스가 되고 있었다.
특허문헌 5에서는, 열전도성 부재를 가진 세포 유지 부재와 통형상 수납 부재를 가진 세포 동결 보존용구가 기재되어 있으며, 특허문헌 4의 과제가 어느 정도 해결되고 있다. 특허문헌 5에 기재되어 있는 동결 보존용구의 사용 방법으로서, 현미경하에 있어서, 난자를 세포 유지 부재에 부착시키고, 세포 유지 부재를 통형상 수납 부재에 수납한 후에, 액체 질소에 침지하여 유리화 동결한다. 그 후에, 통형상 수납 부재의 개구부에 덮개 부재를 장착하고, 액체 질소 탱크 내에서 보관하는 방법이 기재되어 있다.
보다 프로세스가 적은 유리화 동결법에 관련된 동결 보존용 지그 및 동결 융해 방법으로서, 특허문헌 6, 특허문헌 7에 기재되는 바와 같은, 사람의 불임 치료 분야에서 사용되고 있는 이른바 Cryotop(등록상표)법이라는 방법이 개시되어 있다. 당해 방법의 동결 조작 시에는, 난자 부착 유지용 스트립으로서 스트립 형상의 가요성 또한 무색 투명한 필름을 구비한 난자 동결 보존용구를 사용하여, 현미경 관찰하에서 당해 필름 상에 극소량의 보존액과 함께 난자 또는 배를 재치하고, 난자가 부착된 필름을 액체 질소에 침지하여, 동결한다. 한편, 융해 조작 시에는, 난자 부착 유지용 스트립을 보온된 융해액에 침지하고, 융해액 중에서 필름 상에 재치된 난자 또는 배를 회수한다. 이 방법에서는 작업자의 조작에 의해, 난자나 배는 소량의 보존액과 함께 필름 상에 재치되고, 이러한 수법은 조작의 난도가 높다는 문제가 있지만, 높은 생존율로 난자 또는 배를 동결할 수 있는 것이 알려져 있다.
특허문헌 8~10에서는, 세포 또는 조직을, 내동제를 다량으로 포함하는 보존액과 함께 보존액 제거재 상에 재치하고, 세포 또는 조직 주위에 부착한 여분의 보존액을 제거하여, 우수한 생존율로 동결 보존하는 방법이 제안되고 있다. 특허문헌 8에서는, 특정 헤이즈값을 가지는 보존액 흡수체가 기재되고, 또한 특허문헌 9, 특허문헌 10에는, 보존액 흡수체로서 다공질 소결 형성체나 특정 굴절률을 가지는 소재로 형성된 다공질 구조체를 가지는 유리화 동결 보존용 지그가 기재되어 있다.
특허문헌 11에는, 스트립 형상의 광투과성을 가진 베이스부를 가지고, 또한 당해 베이스부 상의 일부에 흡수부(보존액 흡수체)에 둘러싸인 결손부가 형성됨으로써, 과잉인 보존액의 제거 조작이 불필요한 생체 세포 동결 보존용구의 예가 기재되어 있다. 또, 특허문헌 11에는 상기한 결손부에, 난자를 소량의 유리화액과 함께 재치하고, 난자 부착 유지용 스트립을 포함하는 동결 보존용 지그 전체를 통형상의 수납 용기에 수납한 후에, 액체 질소에 침지하고, 유리화 동결하는 동결 보존 방법이 기재되어 있다.
Steponkus et al., Nature 345:170-172(1990)
Hiroshi SOUZU 저 「생세포의 동결에 의한 장해와 보호의 기구」 화학과 생물 제18권(1980) 2호 P. 78~87 일본 농예화학회 발행
특허문헌 5에서는, 열전도성 부재를 가진 세포 유지 부재와 통형상 수납 부재를 가진 세포 동결 보존용구가 제안되고 있는데, 동결 공정 시에, 통형상 수납 부재에 덮개 부재를 장착하는 등의 공정이 있어, 번잡했다. 또, 융해 공정 시에는, 통형상 수납 부재에 수납된 세포 유지 부재를 꺼내기 위해서, 덮개 부재를 떼어내는 조작 이외에도, 꺼내기 위한 기구가 필요해지는 등 하여, 번잡했다.
특허문헌 6, 특허문헌 7에서는, 난자 또는 배를 재치하는 필름의 폭을 제한함으로써, 적은 양의 보존액과 함께 난자 또는 배를 동결 보존하고, 우수한 생존율을 얻는 동결 보존용 지그가 제안되고 있고, 보다 프로세스가 적은 유리화 동결법이 제안되고 있다. 그러나, 이들 방법은, 몇 가지의 문제를 가지고 있었다. 우선, 동결 조작 시에 있어서는, 폭이 제한된 필름 상에, 난자 또는 배를 보존액과 함께 적하하여, 동결하고, 그 후, 통형상 수납 부재에 수납하는데, 폭이 제한된 필름의 선단을 통형상 수납 부재에 수납할 때, 고화된 유리화액 및 난자 또는 배가, 통형상 수납 부재의 단면에 접촉하여, 실수로 탈락할 우려가 있었다. 또, 난자 또는 배를 융해·회수하는 융해 조작 시에, 필름 상에 기포가 부착하여, 현미경 관찰하에 있어서 재치된 배 또는 난자와 기포의 구별이 되기 어렵다는 문제가 있었다. 또, 융해 조작 시에, 필름 상에 부착한 기포가 난자 또는 배에 부착하여, 이들의 시인이 저해되는 것 이외에, 기포의 부력에 의해 난자 또는 배가 갑자기 현미경 시야로부터 벗어나버려, 놓친다는 문제가 있어, 배 또는 난자의 회수 작업을 저해한다는 문제도 있었다.
특허문헌 8~10에서는, 난자 또는 배의 주위에 부착한 여분의 보존액을 제거하는 흡수 성능을 구비한 동결 보존용 지그에 의해, 우수한 생존율로 이들 생식 세포를 동결 보존시키는 방법이 제안되고 있다. 그러나, 특허문헌 6, 특허문헌 7과 마찬가지로, 융해 조작 시에 있어서 생기는 기포의 영향에 관해서는 해결되지 않은 그대로였다.
특허문헌 11에서는, 난자를 재치한 본체부를, 통형상 수납 용기에 수납하는 동결 보존용 지그가 기재되어 있는데, 특허문헌 5와 마찬가지로, 융해 공정 시에, 절단 기구나 꺼냄 기구가 필요한 것 등에 의해, 수납된 동결 보존용 지그를 꺼내는 조작이 번잡해지고, 결과적으로, 융해 공정이 번잡했다. 또, 특허문헌 6, 특허문헌 7에서의 과제와 마찬가지로, 난자 또는 배를 보존액과 함께 재치 후에, 통형상 부재에 수납할 때의, 탈락의 우려에 대해서는 여전히 개선되지 않은 그대로였다.
본 발명은, 세포 또는 조직의 동결 보존 작업을 용이하고 또한 확실하게 행하는 것이 가능한, 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그를 제공하는 것을 주된 과제로 한다. 보다 구체적으로는, 동결 공정 시에, 적은 양의 보존액과 함께 난자 또는 배를 동결 보존하는 것이 가능하면서, 재치부를 통형상 부재에 수납할 때에 세포 또는 조직의 탈락의 우려가 없는, 우수한 삽입 작업성을 가지고, 또한, 융해 공정 시에는, 번잡한 조작을 필요로 하지 않고, 단시간에 융해 공정을 행하는 것, 및 기포의 부착을 억제함으로써, 융해액 중에서 우수한 시인성으로 세포 또는 조직을 회수 가능한, 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그를 제공하는 것이다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토한 결과, 이하의 구성을 가지는 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그(이하, 「본 발명의 동결 보존용 지그」라고도 한다)에 의해, 상기 과제를 해결할 수 있음을 찾아냈다.
본 발명은, 스트립 형상의 선단부를 가지는 본체 부재, 및, 상기 본체 부재의 선단부를 피포(被包)하는 캡 부재를 적어도 가지는 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그로서, 상기 선단부는 보존액 흡수체를 가지는 재치부를 적어도 가지고, 상기 선단부의 단축 방향의 길이가 상기 캡 부재의 내경의 70% 이상이고, 상기 캡 부재의 내강의 장축 방향의 길이가 상기 선단부의 장축 방향의 길이의 200% 이하인 것을 특징으로 하는 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그이다.
본 발명에 의하면, 동결 공정 시에, 적은 양의 보존액과 함께 난자 또는 배를 동결 보존하는 것이 가능하면서, 재치부를 캡 부재에 수납할 때에 배 또는 난자의 탈락의 우려가 없는, 우수한 삽입 작업성을 가지고, 또한, 융해 공정 시에는, 번잡한 조작을 필요로 하지 않고, 단시간에 융해 공정을 행하는 것, 및 융해액 중에서 우수한 시인성으로 세포 또는 조직을 회수 가능한 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그를 제공할 수 있다.
도 1은, 본 발명의 동결 보존용 지그의 본체 부재의 일례를 나타내는 상면 개략도이다.
도 2는, 본 발명의 동결 보존용 지그의 본체 부재의 일례를 나타내는 측면 개략도이다.
도 3은, 본 발명의 동결 보존용 지그의 캡 부재의 일례를 나타내는 측면 단면도이다.
도 4는, 본 발명의 동결 보존용 지그의 캡 부재의 일례를 개구부 측에서 본 측면도이다.
도 5는, 본체 부재와 캡 부재를 끼워맞춤·고정한 상태의 일례를 나타내는 개략도이다.
도 6은, 본 발명의 동결 보존용 지그에 세포와 보존액을 재치한 상태를 나타내는 측면 개략도이다.
도 7은, 본 발명의 동결 보존용 지그에 세포와 보존액을 재치한 후에, 캡 부재를 끼워맞춤·고정한 상태를 나타내는 측면 개략도이다.
도 8은, 본 발명의 동결 보존용 지그를 이용한 동결 융해 방법에서 이용하는 고정구의 일례를 나타내는 단면 개략도이다.
도 9는, 융해 공정의 개시 전에, 캡 부재에 의해 밀폐된 세포 또는 조직이 냉각 용매의 액면보다 하방에 위치하고, 또한 캡 부재의 접합부가 냉각 용매의 액면보다 상방에 위치하는 상태를 나타내는 개략도이다.
도 10은, 본체 부재와 캡 부재를 분리하고, 재치부를 융해액에 침지한 상태를 나타내는 개략도이다.
도 2는, 본 발명의 동결 보존용 지그의 본체 부재의 일례를 나타내는 측면 개략도이다.
도 3은, 본 발명의 동결 보존용 지그의 캡 부재의 일례를 나타내는 측면 단면도이다.
도 4는, 본 발명의 동결 보존용 지그의 캡 부재의 일례를 개구부 측에서 본 측면도이다.
도 5는, 본체 부재와 캡 부재를 끼워맞춤·고정한 상태의 일례를 나타내는 개략도이다.
도 6은, 본 발명의 동결 보존용 지그에 세포와 보존액을 재치한 상태를 나타내는 측면 개략도이다.
도 7은, 본 발명의 동결 보존용 지그에 세포와 보존액을 재치한 후에, 캡 부재를 끼워맞춤·고정한 상태를 나타내는 측면 개략도이다.
도 8은, 본 발명의 동결 보존용 지그를 이용한 동결 융해 방법에서 이용하는 고정구의 일례를 나타내는 단면 개략도이다.
도 9는, 융해 공정의 개시 전에, 캡 부재에 의해 밀폐된 세포 또는 조직이 냉각 용매의 액면보다 하방에 위치하고, 또한 캡 부재의 접합부가 냉각 용매의 액면보다 상방에 위치하는 상태를 나타내는 개략도이다.
도 10은, 본체 부재와 캡 부재를 분리하고, 재치부를 융해액에 침지한 상태를 나타내는 개략도이다.
본 발명의 동결 보존용 지그는, 세포 또는 조직을 이른바 유리화 동결 보존법에 있어서 동결 보존할 때에, 적합하게 이용되는 것이다. 본 발명에 있어서, 세포란, 단일한 세포뿐만 아니라, 복수의 세포로 이루어지는 생물의 세포 집단을 포함하는 것이다. 복수의 세포로 이루어지는 세포 집단이란 단일한 종류의 세포로 구성되는 세포 집단이어도 되고, 복수의 종류의 세포로 구성되는 세포 집단이어도 된다. 또, 조직이란, 단일한 종류의 세포로 구성되는 조직이어도 되고, 복수 종류의 세포로 구성되는 조직이어도 되고, 세포 이외에 세포 외 매트릭스와 같은 비세포성의 물질을 포함하는 것이어도 된다. 본 발명의 동결 보존용 지그는, 난자 또는 배의 동결 보존에 있어서, 특히 적합하게 이용할 수 있다.
본 발명의 동결 보존용 지그는, 세포 또는 조직을 재치 후에, 극저온의 냉각 용매를 이용하여 동결시키는 동결 공정과, 동결된 상태를 유지하는 보냉 공정, 및 세포 또는 조직을 융해액 중에서 융해·해동하고, 이것을 회수하는 융해 공정의 일련의 작업에서 이용된다.
본 발명의 동결 보존용 지그는, 세포 또는 조직의 보존용구, 세포 또는 조직의 동결 보존 기구, 세포 또는 조직의 보존용 기구 등으로 바꾸어 말할 수 있다.
이하에 본 발명의 동결 보존용 지그에 대하여 상세하게 설명한다.
본 발명의 동결 보존용 지그는, 스트립 형상의 선단부를 가지는 본체 부재, 및, 당해 본체 부재의 선단부를 피포 가능한 캡 부재를 가진다. 본체 부재는 봉형상이며, 한쪽 단부에 선단부를 가진다.
본 발명의 동결 보존용 지그의 본체 부재가 가지는 선단부는 스트립 형상이다. 당해 스트립 형상의 선단부는, 선단부의 장변 방향이 본체 부재의 길이 방향에 평행이 되도록 형성되어 있다. 스트립 형상이면 재치부를 캡 부재에 의해 피포·보호하는 것이 용이하다.
본 발명의 동결 보존용 지그의 캡 부재는, 재치부를 피포 보호 가능한 내강을 가진다. 또한, 캡 부재는, 개구된 한쪽 끝과 폐색된 한쪽 끝을 가지고, 대략 사각기둥 형상인 것이 바람직하다. 캡 부재의 내강은, 대략 원통 형상인 것이 바람직하다.
본 발명의 동결 보존용 지그의 캡 부재는, 본체 부재에 대해 착탈 가능한 것이 바람직하다. 착탈 가능이란, 특별한 기구를 필요로 하지 않고, 캡 부재를 본체 부재에 대해 용이하게 끼워맞춤·고정할 수 있고, 캡 부재를 본체 부재로부터 용이하게 떼어낼 수 있는 것을 의미한다. 착탈 가능을 가능하게 하기 위해서, 본체 부재는 선단부 측에 끼워맞춤 구조부를 가지는 것이 바람직하고, 본체 부재는 당해 끼워맞춤 구조부로서, 테이퍼 구조 또는 나사골 구조를 가지는 것이 바람직하다. 신속 또한 용이하게 착탈할 수 있는 관점에서, 당해 끼워맞춤 구조부는 테이퍼 구조를 가지는 것이 보다 바람직하다. 본체 부재의 끼워맞춤 구조부가, 나사골 구조를 가지는 경우에는, 캡 부재도 나사골 구조를 가지는 것이 바람직하다. 또, 본체 부재의 끼워맞춤 구조부가 테이퍼 구조를 가지는 경우에는, 보다 확실하게 끼워맞춤·고정하는 관점에서, 캡 부재도 테이퍼 구조를 가지는 것이 가능하다.
본 발명의 동결 보존용 지그의 캡 부재는, 예를 들면, 각종 수지, 금속 등의 액체 질소 등의 냉각 용매에 내성이 있는 소재를 이용하여 형성할 수 있다. 캡 부재는 1종류의 소재로 이루어지는 것이어도 되고, 2종류 이상의 소재로 이루어지는 것이어도 된다. 그 중에서도 수지는 사출 성형 등의 프로세스에 의해, 테이퍼 구조나 나사골 구조를 용이하게 형성할 수 있기 때문에, 바람직하다. 수지의 구체예로서는, 폴리에틸렌테레프탈레이트나 폴리에틸렌나프탈레이트 등의 폴리에스테르 수지, 아크릴 수지, 에폭시 수지, 실리콘 수지, 폴리카보네이트 수지, 디아세테이트 수지, 트리아세테이트 수지, 폴리아크릴레이트 수지, 폴리염화비닐 수지, 폴리술폰 수지, 폴리에테르술폰 수지, 폴리이미드 수지, 폴리아미드 수지, 폴리올레핀 수지, 환상 폴리올레핀 수지 등으로 이루어지는 수지를 들 수 있다. 또, 캡 부재의 전 광선 투과율이 80% 이상이면, 캡 부재를 끼워맞춤 후에, 캡 내부의 재치부의 모습을 용이하게 확인할 수 있기 때문에 바람직하다.
본 발명의 동결 보존용 지그가 가지는 캡 부재는, 융해 공정의 개시 전에 이용하는 고정구에 고정하기 위한 고정 부위를 가지는 것이 바람직하다. 캡 부재가 가지는 고정 부위는, 고정구의 형상에 맞추어, 오목부나 볼록부 등의 임의의 요철 형상으로 할 수 있다.
본 발명의 동결 보존용 지그의 본체 부재가 가지는 선단부는 보존액 흡수체를 가지는 재치부를 적어도 가진다. 재치부가 보존액 흡수체를 가지면, 당해 보존액 흡수체에 의해, 세포 또는 조직 주위에 존재하는 여분의 보존액을 효과적으로 제거할 수 있기 때문에, 세포 또는 조직을 재치하여 동결할 때의 조작성이 향상한다. 보존액 흡수체로서는, 예를 들면 철망, 종이 등이나 합성 수지로 이루어지는 필름상물로 관통 구멍을 가진 것이 예시된다. 그 외의 보존액 흡수체로서, 굴절률이 1.45 이하인 소재를 이용하여 형성된 다공질 구조체가 예시된다. 당해 다공질 구조체에 의해, 세포 또는 조직 주위에 존재하는 보존액을 제거할 수 있다. 또, 당해 다공질 구조체에 의해, 투과형의 광학 현미경 관찰하에 있어서, 세포 또는 조직을 재치하고 동결하는 조작 및 동결 후에 융해하는 조작을, 양호한 시인성으로 용이 또한 확실하게 행할 수 있다.
본 발명의 동결 보존용 지그는 재치부에 보존액 흡수체를 가짐으로써, 재치부에 재치한 보존액의 형상을 편평하게 할 수 있다. 또, 세포 또는 조직을 재치 후에, 극저온의 냉각 용매로 동결·고화시킬 때에는, 세포 또는 조직 주위의 보존액은, 보존액 흡수체 내에 흡수된 부분과 연속하고 있어, 결과적으로, 극저온의 냉각 용매에 의한 동결·고체화 후에, 세포 또는 조직이 재치부로부터 탈락하는 일 없이, 세포 또는 조직과 그 주위의 보존액을 재치부 상에 확실하게 유지하는 것이 가능하다.
상기한 다공질 구조체의 소재의 굴절률은, 예를 들면, 압베 굴절계(Na 광원, 파장: 589nm)를 이용하여 JIS K 0062:1992, JIS K 7142:2014에 준거하여 측정할 수 있다. 다공질 구조체를 형성하는 굴절률이 1.45 이하인 소재로서는, 폴리테트라플루오로에틸렌 수지, 폴리비닐리덴디플루오라이드 수지, 폴리클로로트리플루오로에틸렌 수지 등의 불소 수지나 실리콘 수지와 같은 플라스틱 수지 재료, 이산화규소와 같은 금속 산화물 재료, 불화나트륨, 불화마그네슘, 불화칼슘과 같은 무기 재료를 들 수 있다.
다공질 구조체에 의한 보존액 흡수체의 세공 직경은 5.5μm 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 1.0μm 이하, 더욱 바람직하게는 0.75μm 이하이다. 이에 의해 광학 현미경 관찰하에 있어서의 세포 또는 조직의 시인성을 높일 수 있다. 보존액 흡수체의 두께는, 10~500μm인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 25~150μm이다. 또한, 보존액 흡수체의 세공 직경은, 플라스틱 수지 재료의 다공질 구조체의 경우에는, 버블 포인트 시험에 의해 측정되는 가장 큰 세공의 직경이다. 또 금속 산화물 재료 혹은 무기 재료의 다공질 구조체의 경우에는, 당해 다공질 구조체의 표면 및 단면의 화상 관찰로부터 측정한 평균 세공 직경이다.
보존액 흡수체의 공극률은 30% 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 70% 이상이다. 공극률이란, 이하의 식으로 정의된다. 여기서 공극 용량 V는 수은 포로시미터(측정기 명칭 Autopore II 9220, 제조자 micromeritics instrument corporation)를 이용하여 측정·처리된, 보존액 흡수체에 있어서의 세공 반경 3nm에서 400nm까지의 누적 세공 용적(ml/g)에, 보존액 흡수체의 건조 고형분량(g/평방미터)을 곱함으로써, 단위면적(평방미터)당 수치로서 구할 수 있다. 또 보존액 흡수체의 두께 T는 보존액 흡수체의 단면을 전자현미경으로 촬영하여 측정함으로써 얻을 수 있다.
P=(V/T)×100(%)
P: 공극률(%)
V: 공극 용량(ml/m2)
T: 두께(μm)
본 발명의 동결 보존용 지그의 본체 부재의 선단부는, 보존액 흡수체를 가지는 재치부 이외에 지지체를 가질 수 있다. 지지체로서는, 예를 들면, 각종 수지 필름, 금속판, 유리판, 고무판 등을 들 수 있고, 1종류의 소재만으로 이루어지는 것이어도 되고, 2종류 이상의 소재로 이루어지는 것이어도 된다. 그 중에서도 수지 필름은, 취급의 관점에서 적합하게 이용된다. 수지 필름의 구체예로서는, 폴리에틸렌테레프탈레이트나 폴리에틸렌나프탈레이트 등의 폴리에스테르 수지, 아크릴 수지, 에폭시 수지, 실리콘 수지, 폴리카보네이트 수지, 디아세테이트 수지, 트리아세테이트 수지, 폴리아크릴레이트 수지, 폴리염화비닐 수지, 폴리술폰 수지, 폴리에테르술폰 수지, 폴리이미드 수지, 폴리아미드 수지, 폴리올레핀 수지, 환상 폴리올레핀 수지 등으로 이루어지는 수지 필름을 들 수 있다.
본 발명의 동결 보존용 지그의 본체 부재의 선단부가 지지체를 가지는 경우에, 열전도성이 우수하고, 급속한 동결을 가능하게 한다는 관점에서, 지지체로서 금속판도 적합하게 이용할 수 있다. 금속판의 구체예로서는, 구리, 구리 합금, 알루미늄, 알루미늄 합금, 금, 금 합금, 은, 은 합금, 철, 스테인리스 등을 들 수 있다.
상기한 각종 수지 필름, 금속판, 유리판, 고무판 등의 두께는 10μm~10mm인 것이 바람직하다. 또 목적에 따라, 각종 수지 필름, 금속판, 유리판, 고무판 등의 표면을, 예를 들면 코로나 방전 처리와 같은 전기적인 방법이나, 혹은 화학적인 방법에 의해 친수화할 수도 있고, 또한 조면화하는 것도 가능하다.
본 발명의 동결 보존용 지그의 본체 부재가 가지는 선단부는 스트립 형상이며, 시트 형상의 스트립의 면내에 있어서, 스트립의 장변 방향을 장축 방향으로 했을 때에, 그와 직교하는 단축 방향의 길이(스트립의 폭, 즉 스트립의 단변)는, 캡 부재의 내경의 70% 이상이다. 캡 부재의 내경이란, 캡 부재를 개구부 측에서 보았을 때의, 내강의 최대경을 말하는 것이다. 선단부의 단축 방향의 길이가, 상기의 범위이면, 세포 또는 조직이 보존액과 함께 재치된 재치부를 캡 부재에 삽입하여 수납할 때에, 캡 부재의 개구부 측의 단부에, 보존액 및 세포 또는 조직이 닿아 탈락할 우려가 없어, 캡 부재로 피포할 수 있다. 선단부의 단축 방향의 길이가 70% 미만인 경우에는, 상기의 수납 작업 시에, 선단부가 휘는 등 했을 경우에, 캡 부재의 개구부 측의 단부에, 보존액 및 세포 또는 조직이 닿아 탈락하는 일이 있다. 또한, 스트립 형상의 선단부의 단축 방향의 길이가 캡 부재의 내경의 70% 이상, 95% 이하이면, 삽입할 때의 작업성이 양호하여, 바람직하다. 또, 스트립 형상의 선단부는, 장축 방향으로 연장되는 시트의 단변(장변)이 평행(스트립의 폭이 일정)인 것이 바람직하지만, 스트립의 중심선이 장축 방향으로 직선형으로 연장되어 있다면 평행이 아니어도 상관없다. 그 경우는, 스트립의 최대 폭을 선단부의 단축 방향의 길이로 한다. 또, 선단부의 단축 방향의 길이는, 캡 부재의 내강의 최소경보다 작은 것이 바람직하다.
본 발명의 동결 보존용 지그의 캡 부재의 내강의 장축 방향의 길이는, 본체 부재가 가지는 선단부의 장축 방향의 길이의 200% 이하이다. 캡 부재의 내강의 장축 방향의 길이란, 캡 부재의 내강의 공간이 연장되는 방향에 있어서, 캡 부재의 개구된 한쪽 끝으로부터 폐색된 한쪽 끝까지의 내강의 공간의 길이를 말하는 것이다. 캡 부재의 내강의 장축 방향의 길이가 상기의 범위이면, 동결 조작 시에, 세포 또는 조직을 재치 후, 선단부가 가지는 재치부를 피포하기 위한 캡 부재를 삽입하고, 장착하는 작업을 적합한 작업성으로 행할 수 있다. 또, 융해 공정 시에, 선단부를 가지는 본체 부재와 캡 부재를 신속히 분리하는 것이 가능하다. 캡 부재의 내강의 장축 방향의 길이가, 본체 부재가 가지는 장축 방향의 길이의 200%를 초과하는 경우로서, 예를 들면 특허문헌 11에 기재·도시되는, 테이퍼 구조 등의 끼워맞춤 구조부를 파지부에 가까운 측에 형성한 것 같은 동결 보존용 지그가 알려져 있는데, 이러한 형태이면, 융해 공정 시에, 캡 부재와 본체 부재를 신속히 분리하는 것이 어렵다. 또, 선단부를 캡 부재에 의해 피포·보호하는 관점에서, 본 발명의 동결 보존용 지그의 캡 부재의 내강의 장축 방향의 길이는, 본체 부재가 가지는 선단부의 장축 방향의 길이의 105% 이상인 것이 바람직하다.
본 발명의 동결 보존용 지그의 본체 부재가 가지는 스트립 형상의 선단부는, 단축 방향의 길이가 캡 부재의 내경의 70% 이상이고, 또한, 당해 캡 부재의 내강의 장축 방향의 길이는, 본체 부재가 가지는 당해 선단부의 장축 방향의 길이의 200% 이하인 점에서, 동결 조작 시에, 재치부를 가지는 스트립 형상의 선단부를 캡 부재로 피포하고, 끼워맞춤·고정한 후에, 냉각 용매에 침지하여 냉각·동결할 때에, 캡 부재의 내강 중에 재치된 세포 또는 조직을 신속히 냉각할 수 있다. 예를 들면, 특허문헌 6에 기재·도시되는 종래 알려져 있는 동결 보존용 지그에서는, 재치부를 포함하는 선단부에 대해, 캡 부재의 내강이 크고, 신속한 냉각이 이루어지지 않는 일이 있어, 바람직하지 않다.
본 발명의 동결 보존용 지그의 본체 부재는 작업성의 관점에서 파지부를 가지는 것이 바람직하고, 그 경우, 파지부는, 파지의 용이함이나, 조작성의 향상을 목적으로 하여, 각기둥 형상인 것이 바람직하다. 당해 파지부는, 액체 질소 등의 냉각 용매에 내성이 있는 소재에 의해 형성된 부재인 것이 바람직하다. 이러한 소재로서는, 예를 들면 알루미늄, 철, 구리, 스테인리스 등의 각종 금속, ABS 수지, 아크릴 수지, 폴리프로필렌 수지, 폴리에틸렌 수지, 불소 수지나 각종 엔지니어링 플라스틱, 또한 유리 등을 적합하게 이용할 수 있다.
본 발명의 동결 보존용 지그의 본체 부재가 파지부를 가지는 경우, 재치부의 표리의 식별을 용이하게 할 목적으로, 파지부의 표면 또는 이면은, 마킹부를 가질 수 있다. 또, 동일한 목적으로, 예를 들면, 파지부의 표면의 일부에는, 특징적인 구조(예를 들면 오목부 또는 볼록부)를 형성할 수도 있다.
이상, 본 발명의 동결 보존용 지그에 대하여 설명했다. 다음에, 본 발명의 동결 보존용 지그를 이용한 동결 융해 방법의 일례에 대하여 설명한다.
본 발명의 동결 보존용 지그를 이용한 동결 융해 방법은, 동결 공정, 보냉 공정, 융해 공정을 행한다. 동결 공정에서는, 제1로, 동결 보존용 지그가 가지는 재치부에 세포 또는 조직을 보존액과 함께 재치한다. 이러한 작업은 투과형의 현미경 관찰하(이하, 단순히 현미경 관찰하라고도 기재)에 있어서 행하는 것이 바람직하다. 이때, 동결 보존용 지그가 가지는 재치부는 보존액 흡수체를 가지는 점에서, 여분의 보존액을 효과적으로 제거할 수 있기 때문에, 높은 조작성이 얻어지는 것에 추가하여, 세포 또는 조직 주위에 존재하는 보존액을 보다 적은 것으로 할 수 있기 때문에, 높은 동결 속도와 융해 속도를 얻는 것이 용이하다.
그 다음에, 제2로, 본체 부재의 재치부를 포함하는 선단부를 캡 부재에 삽입하고, 캡 부재를 끼워맞춤·고정한다. 캡 부재에 선단부를 삽입하는 조작은, 현미경 관찰하에서 행해도 된다. 이때, 본 발명의 동결 보존용 지그는, 선단부의 단축 방향의 길이가 캡 부재의 내경의 70% 이상인 것에 추가하여, 재치부 상에 재치된 보존액의 액적은, 보존액 흡수체의 작용에 의해 재치부 상에서 편평한 형상이 되는 점에서, 캡 부재의 단부에 보존액 및 세포 또는 조직이 닿아, 탈락할 우려가 없고, 재치부를 포함하는 선단부를 캡 부재로 피포할 수 있다. 선단부는, 캡 부재에 삽입 후, 캡 부재로 완전히 피포하고, 캡 부재를 본체 부재의 끼워맞춤 구조부에 끼워맞춤·고정함으로써 완전히 밀폐할 수 있다.
그 다음에, 제3으로, 본체 부재에 끼워맞춤, 고정한 캡 부재를 액체 질소 등의 냉각 용매에 침지하고, 재치부 상에 재치한 세포 또는 조직을 냉각·동결한다. 이때, 캡 부재에 의해 피포되고, 완전히 밀폐된 재치부 및 재치부 상의 세포 또는 조직은 냉각 용매와 접촉하지 않고 냉각된다. 본 발명의 동결 보존용 지그의 본체 부재가 가지는 스트립 형상의 선단부는, 단축 방향의 길이가 캡 부재의 내경의 70% 이상이고, 또한, 당해 캡 부재의 내강의 장축 방향의 길이는, 본체 부재가 가지는 당해 선단부의 장축 방향의 길이의 200% 이하인 점에서, 선단부를 캡 부재에 삽입하고, 캡 부재를 끼워맞춤 구조부에 끼워맞춤·고정하는 조작을 적합한 작업성으로 행할 수 있고, 캡 부재의 내강 중에 위치하는 재치부 상에 재치된 세포 또는 조직을 신속히 냉각할 수 있다.
세포 또는 조직을 보존액과 함께 재치부에 재치하고 나서, 밀폐하는 조작을 거치고, 캡 부재로 밀폐된 본체 부재를 냉각 용매에 침지할 때까지의 시간은, 1분 이내인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 30초 이내이다. 상기 동결 공정의 소요 시간이 1분을 초과하는 경우에는, 세포 또는 조직이 내동제를 포함하는 보존액의 영향을 강하게 받는 일이 있어, 생존성의 관점에서 바람직하지 않다. 본 발명의 동결 보존용 지그의 캡 부재의 내강의 장축 방향의 길이는, 본체 부재가 가지는 선단부의 장축 방향의 길이의 200% 이하인 점에서, 상기의 제한 시간 이내의 작업에 있어서도 높은 작업성이 얻어진다.
그 다음에, 냉각된 세포 또는 조직은, 그 유리화 동결 상태를 유지한 채, 냉각 용매 등에 의해 극저온이 유지된 저온 보관 용기 중에서 보냉된다. 이러한 공정은 이른바 보냉 공정이다.
융해 공정에 앞서, 본 발명의 동결 보존용 지그의 캡 부재가 고정 부위를 가지는 경우에는, 캡 부재가 바람직하게 가지는 고정 부위를 이용하고, 캡 부재의 고정 기능을 가진 고정구를 이용하여 동결 보존용 지그를 유지할 수 있다. 캡 부재의 고정 부위를 이용하여 고정구에 본 발명의 동결 보존용 지그를 고정시키고 고정구와 함께 냉각 용매에 침지하면, 캡 부재에 의해 밀폐된 세포 또는 조직을, 냉각 용매의 액면보다 하방에 위치시키고, 또한 동결 보존용 지그의 캡 부재의 접합부가 냉각 용매의 액면보다 상방에 위치하는 상태에서 일단 유지하는 것이 용이하여, 바람직하다.
상기한 고정구는, 바람직하게는 동결 보존용 지그의 캡 부재가 삽입·고정되는 슬릿부를 가진다. 또, 슬릿부는, 상기한 캡 부재가 가지는 고정 부위를 고정하기 위한 슬릿 고정부를 가지는 것이 바람직하다. 상기 고정구가 가지는 슬릿부는 1개소이어도 되고, 복수개소여도 된다.
본 발명에 있어서 고정구는, 상술한 캡 부재와 마찬가지로, 액체 질소 등의 냉각 용매에 내성이 있는 소재에 의해 형성되는 것이 바람직하다. 이러한 소재로서는, 예를 들면 알루미늄, 철, 구리, 스테인리스 등의 각종 금속, ABS 수지, 아크릴 수지, 폴리프로필렌 수지, 폴리에틸렌 수지, 불소 수지나 각종 엔지니어링 플라스틱, 또한 유리 등을 적합하게 이용할 수 있다. 자중이 크고, 동결 보존용 지그를 양호하게 고정할 수 있는 관점에서, 금속제의 고정구가 바람직하다.
본 발명의 동결 보존용 지그의 재치부는, 융해 공정의 개시 전에 있어서는, 캡 부재에 의해 밀폐되어 있고, 재치부에 재치된 세포 또는 조직의 위치는 냉각 용매 중에 있는데, 본체 부재와 캡 부재의 접합부가 냉각 용매 중에 들어가지 않는 상태에서 일단 유지하고, 그 다음에, 본체 부재와 캡 부재의 끼워맞춤·고정을 느슨하게 하고, 그 후 캡 부재와 본체 부재를 분리하는 것이 바람직하다. 이러한 분리 후, 재치부를 융해액에 침지하는 융해 공정을 행하는 것이 바람직하다. 융해 공정 전의 이들 조작에 의해, 본체 부재가 가지는 재치부는 액체 질소 등의 냉각 용매에 접촉하는 일 없이, 융해액 중에 신속히 침지할 수 있다.
융해 공정에 있어서, 본체 부재와 캡 부재의 끼워맞춤·고정을 느슨하게 하고 나서, 재치부를 융해액에 침지할 때까지의 시간은 5분 이내인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 1분 이내이다. 끼워맞춤·고정을 느슨하게 하고, 밀폐 상태가 개방된 상태가 긴 경우, 질소나 산소 등의 기체가, 캡 내에 들어가고, 그 다음에 냉각되어, 액화되는 경우가 있다. 액화된 기체가 재치부에 부착되어, 융해 공정 시에 융해액 중에 반입되면, 융해액의 온도를 낮출 우려가 있어, 바람직하지 않다.
본 발명의 동결 보존용 지그는, 캡 부재의 내강의 장축 방향의 길이가, 본체 부재가 가지는 선단부의 장축 방향의 길이의 200% 이하인 점에서, 상기 융해 공정에 있어서의, 캡 부재와 본체 부재를 분리하는 작업성이 양호하다. 특히, 유리화 동결법으로 구해지는 신속한 융해 속도를 달성하는 것이 용이하고, 재치부 상의 세포 또는 조직을 극저온 상태로부터, 바람직하게는 1초 미만으로 융해액 중으로 옮길 수 있다. 보다 바람직하게는 0.75초 이내이다.
본 발명의 동결 보존용 지그는, 상기와 같은 동결 융해 방법으로 적합하게 사용할 수 있다. 상기와 같은 동결 공정 및 융해 공정을 행하면, 재치부 상의 세포 또는 조직을 융해액 중에 침지하고, 재치부 상으로부터 회수할 때에, 재치부 상으로의 기포의 부착이 억제되고, 융해 공정 시에 우수한 회수 작업성을 나타내는 점에서 바람직하다.
이상, 본 발명의 동결 보존용 지그를 이용한 동결 융해 방법에 대하여 설명했다. 다음에, 본 발명의 동결 보존용 지그나 그것을 이용한 동결 융해 방법 중에서 바람직하게 이용하는 고정구에 대하여, 도면을 따라 더욱 상세하게 설명한다.
도 1은, 본 발명의 동결 보존용 지그의 본체 부재의 일례를 나타내는 상면 개략도이다. 도 1에 나타내는 본체 부재(2)는 파지부(8)와 끼워맞춤 구조부(10)와 선단부(4)를 가진다. 선단부(4)는 재치부(5)와 지지체(6), 및 선단 마킹부(7)를 구비하며, 끼워맞춤 구조부(10)에 부설되어 있다. 파지부(8)는, 세포 또는 조직을 재치하는 측을 식별하기 위한 파지부 마킹부(9)를 가진다. 선단부(4)의 선단, 즉 선단 마킹부(7)는 대략 반원 형상이며, 캡 부재로의 삽입 시의 작업성을 높일 수 있다. 또, 끼워맞춤 구조부(10)는 캡 부재를 본체 부재(2)에 고정하기 위한 부위이다. 도 1에 있어서, 끼워맞춤 구조부(10)는, 파지부(8)로부터 선단부(4)를 향해 가늘어지는 원뿔대형의 테이퍼 구조를 가지고 있다.
도 2는, 본 발명의 동결 보존용 지그의 본체 부재의 일례를 나타내는 측면 개략도이다. 도 2에 나타내는 본체 부재(2)가 가지는 파지부(8)는 그 일부에 오목부를 형성함으로써, 조작자가 본체 부재(2)를 파지했을 때에, 선단부(4)의 표리의 식별, 즉 세포 또는 조직을 재치하는 재치부(5) 측의 식별을 용이하게 하고 있다. 마찬가지로 선단부(4)의 표리를 식별할 목적으로, 파지부 마킹부(9)를 구비하고 있다. 본체 부재(2)의 선단부(4)는 지지체(6) 상에 보존액 흡수체로 이루어지는 재치부(5)와 선단 마킹부(7)를 가진다. 지지체(6) 상으로 재치부(5)의 설치는, 재치부(5)의 단변 두 변을 접착층을 개재하여 접착하는 등 하여 행할 수 있다(도 2에는 접착층은 나타내지 않는다).
도 3은, 본 발명의 동결 보존용 지그의 캡 부재의 일례를 나타내는 측면 단면도이다. 도 3에 나타내는 도면은, 본체 부재(2)의 선단부(4)를 피포하는 캡 부재(3)의 내강(11)의 구조를 도시한 것이다. 캡 부재(3)는 그 일단만이 개구한 구조이며, 개구부(23)의 근방에는, 본체 부재(2)의 끼워맞춤 구조부(10)와 끼워맞추기 위한 테이퍼 구조가 형성되어 있다. 또, 캡 부재(3)는, 융해 공정의 개시 전에, 캡 부재(3)를 고정구에 고정하기 위한 고정 부위(12)를 가진다. 고정 부위(12)는, 후술하는 고정구(16)의 형상에 맞춘 요철 형상을 가진다.
도 4는, 본 발명의 동결 보존용 지그의 캡 부재의 일례를 개구부 측에서 본 측면도이다. 도 4에 나타내는 캡 부재(3)는, 사각기둥 형상의 외면 형상을 가지고, 원통 형상의 내강(11)을 가지는 형상이다.
도 5는, 본체 부재(2)와 캡 부재(3)를 끼워맞춤·고정한 상태의 일례를 나타내는 개략도이다. 또한, 이하의 도면도 포함해, 캡 부재(3)에 피포되어 있는 끼워맞춤 구조부(10) 및 선단부(4)의 모습을 알 수 있도록, 캡 부재(3)는 내부 구조(단면 구조)를 도시하고 있다. 도 5에 나타내는 동결 보존용 지그(1)는, 본체 부재(2)가 가지는 끼워맞춤 구조부(10)에 의해, 캡 부재(3)가 본체 부재(2)에 완전히 끼워맞춤·고정되고, 선단부(4)는, 캡 부재(3)에 의해, 피포·밀폐되어, 외부 환경으로부터 완전히 보호되고 있다. 캡 부재에 이용하는 소재의 광투과성이 충분하지 않은 경우에는 선단부(4)의 표리의 식별이 곤란하기 때문에, 파지부 마킹부(9)를 형성하는 것이 바람직하다.
도 6은, 동결 보존용 지그에 세포와 보존액을 재치한 상태를 나타내는 개략도이다. 본 발명의 동결 보존용 지그(1)를 이용한 동결 융해 방법에 있어서, 조작자는, 본체 부재(2)의 선단부(4)에 부설된 재치부(5) 상에, 세포(14)와 보존액(15)을 적하 부착하고, 세포(14)를 재치부(5) 상에 재치한다. 적하 부착된 보존액(15)의 액적은, 보존액 흡수체로 이루어지는 재치부(5)에 의해, 여분의 보존액이 자동적으로 제거됨과 더불어, 재치부(5) 상에서 편평한 형상이 된다.
도 7은, 본 발명의 동결 보존용 지그에 세포와 보존액을 재치한 후에, 캡 부재를 끼워맞춤·고정한 상태를 나타내는 개략도이다. 본체 부재(2)의 재치부(5) 상에 보존액(15)과 함께, 세포(14)를 적하 부착하고, 재치한 후에, 캡 부재(3)를 본체 부재(2)에 끼워맞춤·고정한다. 이에 의해, 재치부(5) 상에 재치된 세포(14)는, 캡 부재(3)에 의해 완전히 피포·밀폐되어, 외부 환경으로부터 완전히 보호되고 있다. 캡 부재(3)와 본체 부재(2)의 경계선이 접합부(13)이다.
도 8은, 본 발명의 동결 보존용 지그를 이용한 동결 융해 방법에서 이용하는 고정구의 일례를 나타내는 측면 단면 개략도이다. 도 8에 있어서, 고정구(16)는, 캡 부재(3)가 삽입되는 슬릿부(17)를 가지고, 슬릿부(17)는 캡 부재(3)의 고정 부위(12)를 고정하기 위한, 슬릿 고정부(18)를 가진다.
도 9는, 융해 공정의 개시 전에, 캡 부재에 의해 밀폐된 세포 또는 조직이 냉각 용매의 액면보다 하방에 위치하고, 또한 캡 부재의 접합부가 냉각 용매의 액면보다 상방에 위치하는 상태를 나타내는 개략도이다. 도 9에 있어서, 동결 보존용 지그(1)가 가지는 캡 부재(3)의 고정 부위(12)는, 고정구(16)의 슬릿부(17)의 일부에 형성된 슬릿 고정부(18)에 삽입됨으로써, 유지·고정된다. 이때, 캡 부재(3)와 본체 부재(2)의 접합부(13)는, 동결 용기(19)에 충전된 냉각 용매(20)의 액면(21)보다 상부에 위치하고 있다. 그 때문에, 동결 보존용 지그(1)의 본체 부재(2)와 캡 부재(3)의 끼워맞춤·고정을 느슨하게 하여, 끼워맞춤을 해제한 경우에도, 주위의 냉각 용매가 직접적으로 캡 부재(3)의 내부에 침입하는 일은 없다. 즉, 냉각 용매는, 선단부(4)에는 접촉하지 않고, 세포(14) 및 보존액(15)에도 접촉하지 않지만, 세포 또는 조직의 냉각 상태는 유지되고 있어, 세포(14)는 충분히 냉각된다. 이와 같이 함으로써, 그 후의 융해 공정에 있어서, 세포 또는 조직을 극저온 상태로부터 융해액 중으로 옮기고, 신속히 융해할 수 있다. 즉, 융해 속도를 저하시키는 일 없이 세포 또는 조직을 신속히 융해할 수 있다.
도 10은, 본체 부재와 캡 부재를 분리하고, 재치부를 융해액에 침지한 상태를 나타내는 개략도이다. 도 10에 있어서, 캡 부재(3)가 고정구(16)에 고정됨으로써, 본체 부재(2)를 빼내는 조작만으로, 선단부(4)와 선단부(4)에 부설된 재치부(5)를 가지는 본체 부재(2)는 캡 부재(3)로부터 신속히 분리된다. 분리 후, 재치부(5)를 융해액(22)에 침지하고, 융해액(22) 중에서 세포(14)를 융해·회수한다.
본 발명의 동결 보존용 지그를 이용한 동결 융해 방법을 이용하여 세포 또는 조직을 동결 보존·융해하는 경우, 보존액은, 난자, 배 등의 세포의 동결을 위해서 통상 사용되는 것을 사용할 수 있고, 예를 들면, 상술한 인산 완충 생리 식염수 등의 생리적 용액에 각종 내동제(글리세롤, 에틸렌글리콜, DMSO(디메틸술폭시드) 등)를 함유하는 보존액이나, 각종 내동제를 다량으로(적어도 보존액의 전체 질량에 대해 10질량% 이상, 보다 바람직하게는 20질량% 이상) 함유하는 보존액을 사용할 수 있다. 융해액에 대해서도, 난자, 배 등의 세포의 융해를 위해서 통상 사용되는 것을 사용할 수 있고, 예를 들면, 상술한 인산 완충 생리 식염수 등의 생리적 용액에, 침투압 조정을 위해서 1M의 수크로오스를 함유하는 융해액을 사용할 수 있다.
본 발명의 동결 보존용 지그를 이용한 동결 융해 방법을 이용할 수 있는 세포로서, 예를 들면, 포유류(예를 들면, 인간(사람), 소, 돼지, 말, 토끼, 래트, 마우스 등)의 난자, 배, 정자 등의 생식 세포; 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포), 배성 줄기 세포(ES 세포) 등의 다능성 줄기 세포를 들 수 있다. 또, 초대 배양 세포, 계대 배양 세포, 및 세포주 세포 등의 배양 세포를 들 수 있다. 또, 세포는, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 섬유아 세포, 췌장암·간암 세포 등의 암 유래 세포, 상피 세포, 혈관 내피 세포, 임파관 내피 세포, 신경 세포, 연골 세포, 조직 줄기 세포, 및 면역 세포 등의 접착성 세포를 들 수 있다. 또한, 동결 보존·융해할 수 있는 조직으로서, 동종 또는 이종의 세포로 이루어지는 조직, 예를 들면, 난소, 피부, 각막 상피, 치근막, 심근 등의 조직을 들 수 있다. 본 발명은, 특히 시트 형상 구조를 가지는 조직(예를 들면, 세포 시트, 피부 조직 등)의 동결 보존에 적합하다. 본 발명의 동결 보존용 지그는, 직접 생체로부터 채취한 조직뿐만 아니라, 예를 들면, 생체 외에서 배양하여 증식시킨 배양 피부, 생체 외에서 구축한 이른바 세포 시트, 일본국 특허공개 2012-205516호 공보에서 제안되어 있는 삼차원 구조를 가지는 조직 모델과 같은 인공 조직의 동결 보존에 대해서도, 적합하게 이용할 수 있다. 본 발명의 동결 보존용 지그는, 상기와 같은 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그로서 적합하게 이용된다.
실시예
이하에 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세하게 나타내고, 본 발명을 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
(실시예 1)
도 1 및 도 3에 나타내는 형태로, 실시예 1의 동결 보존용 지그를 제작했다. 폴리에틸렌테레프탈레이트 수지 필름(전 광선 투과율 89%, 헤이즈값 2.3%)을 지지체로 하고, 보존액 흡수체로서, ADVANTEC TOYO KAISHA, LTD. 제조의 폴리테트라플루오로에틸렌 다공체(세공 직경 0.2μm, 공극률 71%, 두께 35μm)를, Henkel Japan Ltd. 제조의 핫멜트 우레탄 수지 Purmelt(등록상표) QR 170-7141P를 접착층으로 하고, 단축 측의 양끝 두 변만을 당해 지지체 상에 부착하고 고정하여, 재치부를 가지는 선단부를 제작했다. 또, 본체 부재의 파지부 및 끼워맞춤 구조부와, 캡 부재를, ABS 수지를 이용하여 제작했다. 선단부와 파지부 및 끼워맞춤 구조부를 접합하여, 실시예 1의 동결 보존용 지그를 제작했다. 실시예 1의 동결 보존용 지그의 본체 부재가 가지는 선단부의 단축 방향의 길이는 1.75mm이며, 장축 방향의 길이는 20mm이다. 또, 실시예 1의 동결 보존용 지그의 캡 부재의 내경은 2.1mm이며, 내강의 장축 방향의 길이는 35mm이다.
(실시예 2)
본체 부재가 가지는 선단부의 단축 방향의 길이를, 1.75mm 대신에 1.5mm로 한 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 하여, 실시예 2의 동결 보존용 지그를 제작했다.
(실시예 3)
캡 부재의 내강의 장축 방향의 길이를, 35mm 대신에 40mm로 한 것 이외에는, 실시예 2와 동일하게 하여, 실시예 3의 동결 보존용 지그를 제작했다.
(비교예 1)
보존액 흡수체를 설치하지 않고, 지지체를 그대로 재치부로 한 것 이외에는, 실시예 2와 동일하게 하여, 비교예 1의 동결 보존용 지그를 제작했다.
(비교예 2)
본체 부재가 가지는 선단부의 단축 방향의 길이를, 1.75mm 대신에 0.7mm로 한 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 하여, 비교예 2의 동결 보존용 지그를 제작했다.
(비교예 3)
캡 부재의 내강의 장축 방향의 길이가 80mm가 되는 캡 부재를 제작했다. 또, 동결 보존용 지그의 본체 부재의 길이 및, 캡 부재를 본체 부재에 끼워맞춤·고정했을 때의 전체 길이는 실시예 1의 동결 보존용 지그와 같아지는 형상으로, 끼워맞춤 구조부의 형상을 파지부 측으로 확장한 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 하여, 비교예 3의 동결 보존용 지그를 제작했다.
＜동결 공정 시의 캡 부재의 삽입 작업성의 평가＞
실시예 1~3 및 비교예 1~3의 동결 보존용 지그의 재치부 상에, 유리 비즈(직경 100μm)를 유사 세포로 하고, 보존액 0.1μL와 함께, 투과형 현미경하에서 적하 부착시켰다. 또한, 보존액은, Sigma-Aldrich Co. LLC 제조 Medium199 배지에, 15용적% DMSO, 15용적% 에틸렌글리콜, 17질량% 수크로오스가 포함되는 조성의 것을 이용했다. 그 다음에, 투과형 현미경하에서, 재치부를 포함하는 선단부를 캡 부재에 삽입했다. 그 때에, 캡 부재의 개구부 측의 단면에 재치부 상에 재치된 보존액이 접촉해버리는지 여부의 평가를 5회 행하고, 「동결 공정 시의 캡 부재의 삽입 작업성의 평가」로서 이하의 기준으로 평가했다. 이들의 결과를 표 1에 나타낸다.
○: 5회의 평가 중에서, 보존액이 캡 부재의 개구부 측의 단면에 접촉해버리는 경우가 한번도 없었다.
×: 5회의 평가 중에서, 보존액이 캡 부재의 개구부 측의 단면에 접촉해버리는 경우가 1회 이상 있었다.
＜융해 공정 시의 융해액 침지에 있어서의 작업성의 평가＞
상기와 동일한 순서에 의해, 실시예 1~3 및 비교예 1~3의 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그의 재치부 상에 유사 세포를 보존액과 함께 재치부에 적하 부착하고, 본체 부재에 캡 부재를 완전히 끼워맞춤·고정한 후에, 액체 질소에 침지하여 동결했다. 보냉 공정 후에, 융해 공정에 앞서, 도 8에 나타내는 형태의 고정구에, 도 9에 나타내는 형태로 본체 부재를 고정했다. 그 후, 유사 세포가 액체 질소의 액면보다 아래에 있는 상태를 유지하고, 또한, 액체 질소에 닿지 않도록 하면서, 캡 부재의 끼워맞춤·고정을 약간 느슨하게 했다. 그 다음에, 도 10에 나타내는 형태와 같이, 캡 부재를 고정구에 고정한 채, 본체 부재를 빼냄으로써, 캡 부재와 분리하고, 본체 부재의 선단부를 융해액 중에 침지시키고, 이때의 소요 시간을 계측하여, 「융해 공정 시의 융해액 침지에 있어서의 작업성의 평가」로서 이하의 기준으로 평가했다. 또한, 융해액은, 상기 Medium199 배지에 34질량% 수크로오스가 포함되는 조성의 것을 이용했다. 이들의 결과를 표 1에 나타낸다.
◎: 조작에 걸리는 시간이 0.75초 이내였다.
○: 조작에 걸리는 시간이 0.75초 초과 1초 이내였다.
×: 조작에 1초를 초과하는 시간을 필요로 했다.
＜융해 공정 시의 회수 작업에 있어서의 작업성의 평가＞
상기의 「융해 공정 시의 융해액 침지에 있어서의 작업성의 평가」와 동일한 방법에 의해, 실시예 1~3 및 비교예 1~3의 동결 보존용 지그의 재치부를 가지는 선단부를 융해액 중에 침지시켰다. 그 후, 현미경하에서, 융해액 중의 재치부 및 재치부 상의 유사 세포의 모습을 관찰했다. 그 때의 융해액 중에서 관찰되는 재치부 상의 기포의 부착의 유무를 확인했는데, 실시예 1~3 및 비교예 1~3의 모든 동결 보존용 지그에 있어서, 재치부 상으로의 기포의 부착은 보이지 않고, 융해 공정 시의 회수 작업에 있어서, 높은 작업성을 가지는 것이 나타내어졌다.
상기의 결과로부터, 본 발명의 동결 융해용 지그는, 동결 공정과 융해 공정 양쪽 모두가 우수한 작업성을 가짐을 알 수 있다. 또, 세포 또는 조직의 융해를 매우 단시간에 행하는 것이 가능하며, 높은 생존율이 얻어지는 것이 기대된다.
(산업상의 이용 가능성)
본 발명은, 소 등의 가축이나 동물의 배이식이나 인공 수정, 사람으로의 인공 수정 등 이외에, iPS 세포, ES 세포, 일반적으로 이용되고 있는 배양 세포, 배 또는 난자를 포함하는 생체로부터 채취한 검사용 또는 이식용의 세포 또는 조직, 생체 외에서 배양한 세포 또는 조직 등의 동결 보존 및 그 융해에 이용할 수 있다.
1: 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그
2: 본체 부재 3: 캡 부재
4: 선단부 5: 재치부
6: 지지체 7: 선단 마킹부
8: 파지부 9: 파지부 마킹부
10: 끼워맞춤 구조부 11: 캡 부재의 내강
12: 고정 부위 13: 접합부
14: 세포 15: 보존액
16: 고정구 17: 슬릿부
18: 슬릿 고정부 19: 동결 용기
20: 냉각 용매 21: 액면
22: 융해액 23: 개구부
2: 본체 부재 3: 캡 부재
4: 선단부 5: 재치부
6: 지지체 7: 선단 마킹부
8: 파지부 9: 파지부 마킹부
10: 끼워맞춤 구조부 11: 캡 부재의 내강
12: 고정 부위 13: 접합부
14: 세포 15: 보존액
16: 고정구 17: 슬릿부
18: 슬릿 고정부 19: 동결 용기
20: 냉각 용매 21: 액면
22: 융해액 23: 개구부
Claims (1)
- 스트립 형상의 선단부를 가지는 본체 부재, 및, 상기 본체 부재의 선단부를 피포(被包)하는 캡 부재를 적어도 가지는 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그로서,
상기 선단부는 보존액 흡수체를 가지는 재치부(載置部)를 적어도 가지고, 상기 선단부의 단축 방향의 길이가 상기 캡 부재의 내경의 70% 이상이고, 상기 캡 부재의 내강의 장축 방향의 길이가 상기 선단부의 장축 방향의 길이의 200% 이하인 것을 특징으로 하는 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그.
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