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KR20200086312A - 생체분자의 컨쥬게이트 및 이의 용도 - Google Patents

생체분자의 컨쥬게이트 및 이의 용도 Download PDF

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KR20200086312A
KR20200086312A KR1020207016078A KR20207016078A KR20200086312A KR 20200086312 A KR20200086312 A KR 20200086312A KR 1020207016078 A KR1020207016078 A KR 1020207016078A KR 20207016078 A KR20207016078 A KR 20207016078A KR 20200086312 A KR20200086312 A KR 20200086312A
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KR
South Korea
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antibody
ser
val
thr
leu
Prior art date
Application number
KR1020207016078A
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English (en)
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유안 리우
하이양 왕
렌케 리
루이 장
쳉 리우
Original Assignee
야페이 상하이 바이오로그 메디신 사이언스 앤드 테크놀로지 컴퍼니 리미티드
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Filing date
Publication date
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Abstract

생체분자의 컨쥬게이트 및 이의 용도가 개시된다. 제공된 생체분자의 컨쥬게이트는 생체분자 및 생체분자에 공유적으로 연결된 기능성 모이어티를 함유한다. 기능성 모이어티는 생체분자가 이의 리간드 또는 수용체에 결합하는 것을 방지하는 기, 단백질분해 효소에 의해 활성화될 수 있거나 질병의 미세환경에서 산성에 의해 활성화될 수 있는 절단 가능한 링커 아암, 절단 가능한 링커 아암이 절단된 후에 자동으로 쉐딩될 링커 아암, 및 리간드 또는 수용체에 대한 생체분자의 결합 능력을 유지시키거나 촉진시키는 기를 함유한다. 생체분자의 컨쥬게이트는 생체분자의 면역원성을 효과적으로 감소시키고, 이의 반감기를 증가시키고, 개체의 면역 장벽을 돌파하고, 병리학적 미세환경에 도달할 수 있으며, 병리학적 미세환경에서 활성화되고 방출되고, 종양에서 T 세포 등의 증식 또는 사멸 효과를 선택적으로 촉진시켜, 자가면역 질병의 염증성 미세환경에서 표적외 종양 독성을 예방하고, 낮은 자가면역 및 높은 효능을 달성할 수 있다.

Description

생체분자의 컨쥬게이트 및 이의 용도
본 발명은 생체분자의 컨쥬게이트 및 이의 용도에 관한 것이다.
고유 시스틴에 연결시킴에 의한 항체로의 제제의 컨쥬게이션은 항체의 사용을 더욱 발전시키기 위해 사용되어 왔다. 독소 및 약물과 같은 분자가 항체에 컨쥬게이션되어 항체-약물 컨쥬게이트(ADC)를 생성하였다. 프로바디(probody)를 생성시키기 위한 항체로의 절단, 마스킹 펩티드 서열의 융합이 종양에서 국소 활성화를 위해 사용되어 왔다. 그러나, 펩티드는 항체의 말단에 제한되고, 활성화 서열은 낮은 활성화 속도 및 마스킹 펩티드로부터의 높은 면역원성을 갖는 펩티드로 제한된다.
현재 상업적인 거대분자 약물의 일반적인 부작용은 면역독성이다. 면역독성은 면역억제, 면역원성의 생성, 과민증, 자기반응 및 불리한 면역 자극을 포함한다. 이들 부작용은 주로 외인성 거대분자에 의해 야기된다. 신체로의 진입 후, 이종성 거대분자는 이의 면역원성으로 인해 환자에서 면역 반응을 유발할 것이다. 정상 조직에서, 면역이 또한 자극될 것이고, 항체 또는 사이토카인과 같은 거대분자 약물이 항원 또는 수용체에 결합한 후 자가면역 반응이 발생될 것이다. 현재로서는, 이는 환자에게 매우 위험하다. 예를 들어, 현재 PD-1 항체, 키트루다(Keytruda) 및 옵디보(Opdivo)로 비소세포폐암을 치료하는 동안 심각한 폐렴이 발생할 수 있으며, 이는 심지어 환자의 사망으로 이어질 수 있다. CTLA4 항체(예르보이(yervoy)), 41BB, IL-2, IL-10 등의 임상적 사용에서도 유사한 효과가 보고되었다. 비소세포폐암에 대한 옵디보 및 예르보이의 병용 요법에서, 55%의 환자는 고 등급3-4 AE를 나타내었고, 36%의 환자는 약물 독성으로 인해 약물 치료를 중단해야 했다. 따라서, 혈액 및 정상 조직에서의 약물 활성을 차단함으로써 전체 독성 및 면역독성을 감소시키고, 병리학적 미세환경에서 활성 약물을 향상시키고, DMPK 및 혈청에서의 반감기를 조정하고, 항체의 Fab의 면역원성을 감소시키고, 활성 생체분자의 결합 친화성을 조정하고, 효능을 향상시키기 위해 새로운 기능을 갖는 생체분자의 지능적 컨쥬게이트가 상기 분야에서 필요하다.
본 발명의 개시는 하기 구조를 갖는 생체분자의 컨쥬게이트를 제공한다:
R1-R2-R3-R4-S-cys-R5
상기 식에서,
R5는 돌연변이에 의해 도입된 하나 이상의 시스테인 잔기를 갖는 생체분자를 나타내고;
cys는 R5에 함유된 시스테인 잔기(들)를 나타내고;
S는 시스테인 잔기(들)의 황 원자(들)를 나타내고;
R1은 R5가 이의 항원, 리간드 또는 수용체에 결합하는 것을 방지하는 기이고;
R2는 부재하거나, R2는 하나 이상의 단백질분해 효소에 의해 활성화될 수 있는 절단 가능한 링커 아암 또는 병리학적 미세환경에서 산성에 의해 활성화될 수 있는 화학 결합이고;
R3는 부재하거나, R3는 R2가 절단된 후 자동으로 쉐딩(shedding)될 수 있는 링커 아암 또는 병리학적 미세환경에서 산성에 의해 활성화될 수 있는 화학 결합이고; 단, R2가 부재하는 경우, R3는 병리학적 미세환경에서 산성에 의해 활성화될 수 있는 화학 결합이고;
R4는 R5에 함유된 시스테인 잔기(들)의 황 원자(들)를 통해 R5에 공유적으로 연결된 기이며, 이는 모이어티 R1-R2-R3가 절단된 후 R5의 항원, 리간드 또는 수용체에 대한 결합 능력을 회복시키거나, 유지시키거나, 촉진시킨다.
상기 식에서, R1-R2가 단백질분해 효소에 의해 또는 병리학적 미세환경에서 산 조건하에서 R3-R4-S-cys-R5로부터 절단되는 경우, R3-R4-S-cys-R5는 방출된다. 그리고, R5의 항원, 리간드 및 수용체에 대한 R4-S-cys-R5의 결합 능력은 R3가 자동으로 쉐딩되고, R4-S-cys-R5가 방출된 후에 회복되거나, 유지되거나, 개선될 것이다.
본 발명의 개시의 하나 이상의 구현예에서, 생체분자의 컨쥬게이트의 R1, R2, R3, R4 및 R5는 본 발명의 개시의 다른 부분에서와 같이 기재되어 있다.
본 발명의 개시는 또한 하기 구조를 갖는 화합물을 제공한다:
R4-S-cys-R5
상기 식에서,
R4는 R4-a-R4-b-R4-c-로 표현되고, 여기서 R4는 R4-a-R4-b-R4-c-로 표현되며, 여기서 R4-a는 하기로 구성된 군으로부터 선택되고;
Figure pct00001
상기 식에서, Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 H 및 C1-6 알킬 또는 C1-6 알콕실로 구성된 군으로부터 선택되고;
R4-b는 하기로 구성된 군으로부터 선택되고;
Figure pct00002
상기 식에서, 화학식 R4-b1에서, Rc는 부재하거나, C1-12 알킬, C1-12알콕시-C1-12알킬, C1-12알킬-C3-8사이클로알킬, (C1-4알킬-O)p-C1-12알킬, C1-12알킬카르보닐아미노-(C1-4알킬-O)p-C1-12알킬, 페닐-C1-12알킬, C3-8사이클로알킬, C1-12알킬-C3-8사이클로알킬-C1-12알킬 및 C1-12알킬-페닐-C1-12알킬로 구성된 군으로부터 선택되고; 화학식 R4-b2에서, Rc는 아미노기의 N 원자에서 치환된 Ra-1 및 Ra-2를 갖는 C1-12알킬아미노이고, 화학식 4-b3에서, Rc는 알킬의 말단의 마지막 C 원자가 Ra-1, Ra-2 및 R2-3에 의해 치환된 C1-12알킬이고, 여기서 Ra-1, Ra-2 및 Ra-3는 각각 독립적으로 C1-12알킬, C1-12알킬-OH 및 C1-12알킬-NR"R"'로 구성된 군으로부터 선택되고, 여기서 R" 및 R"'는 각각 독립적으로 H 및 C1-12알킬로 구성된 군으로부터 선택되고; 여기서, 화학식 R4-b2 및 R4-b3에서, R4-b는 Ra-1, Ra-2 및 Ra-3 중 적어도 하나를 통해 R4-c에 연결되고;
R4-c는 하기로 구성된 군으로부터 선택되고;
Figure pct00003
상기 식에서, Rx는 H, 할로 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 선택되고; p는 1 내지 10의 범위 내의 정수, 예를 들어, 1 내지 5의 범위 내의 정수이고; q는 1 내지 4의 범위 내의 정수, 예를 들어, 1 내지 2의 범위 내의 정수이고; 단, R4-a가 화학식 R4-a2, R4-a3 및 R4-a4로 구성된 군으로부터 선택되는 경우 R4-c는 부재하고;
여기서, R3는 R4의 R4-c를 통해 R4에 연결되고, R4-a의 각각의 화학식에 제시된 물결선은 R4-a가 R4-b에 연결되는 위치를 나타낸다.
R1-R2-R3-R4로 표현되는 화합물이 또한 제공되며, 여기서 R1, R2, R3 및 R4는 본 발명의 개시의 임의의 구현예에서와 같이 정의된다.
본 발명의 개시는 항-종양 약물의 제조에서의 본원에 기재된 바와 같은 생체분자 또는 R4-S-cys-R5 화합물의 컨쥬게이트의 용도를 제공한다.
본 발명의 개시는 본원에 기재된 바와 같은 생체분자의 컨쥬게이트를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 개시는 치료적 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 생체분자 또는 R4-S-cys-R5 화합물의 컨쥬게이트를 종양을 치료하거나 예방할 필요가 있는 대상체에 제공하는 것을 포함하는, 종양을 치료하거나 예방하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 개시는 또한 화합물 S1-S64 및 본 발명의 개시의 다른 부분에 기재된 화합물을 포함하는 화합물, 및 본원에 기재된 바와 같은 돌연변이를 함유하는 항체 및 사이토카인을 제공한다.
도 1: 항체의 경쇄의 아미노산 서열의 정렬.
도 2: 항-PD1 항체의 경쇄에서 점 돌연변이에 대한 Co-IP 스크리닝.
도 3: 항체의 구조.
도 4: 가변 영역의 루프 4의 서열은 보존적이다.
도 5: 2개의 항체의 가변 영역은 동일한 점라인의 항체의 가변 영역 프레임워크로부터 유래될 수 있다.
도 6: 여러 항체의 중쇄의 아미노산 서열의 정렬.
도 7: 여러 항체의 경쇄의 아미노산 서열의 정렬.
도 8: PD1 Ab-C28의 컨쥬게이션.
도 9: 활성화 전 및 후의 PD1에 대한 PD1 Ab-C28 컨쥬게이트의 결합.
도 10: 활성화 가능 및 결합 아암을 함유하고, 병리학적 미세환경에서 활성화되는 생체분자의 컨쥬게이트의 개략도.
도 11: IFN-감마의 분비.
도 12: 생존 곡선.
도 13: 사망 곡선.
도 14: T 세포의 증식.
도 15: 항-PD1 항체의 컨쥬게이트는 MC38 결장암으로 고통받는 마우스에서 종양의 성장을 억제한다.
도 16: IL2-C41 돌연변이체의 컨쥬게이션.
도 17: 활성화 전 및 후의 IL2 수용체 알파에 대한 IL2-C41 컨쥬게이트의 결합.
도 18: T 세포의 증식에 대한 IL2 돌연변이체 컨쥬게이션(IL2-Thr41Cys, 즉, IL2-C41)의 효과.
도 19: CD4/CD8 증식에 대한 IL2 컨쥬게이트의 효과.
도 20: IL2의 컨쥬게이트는 B16F10 종양의 성장을 억제한다.
도 21: 항-PD-1 항체와 조합된 IL2의 컨쥬게이트는 MC38 종양의 성장을 억제한다.
도 22: 시험관 내 효소 절단 후 돌연변이체 IL2, IL2 TMEAkine 및 회복 활성 IL2의 SDS-PAGE 결과.
도 23: 시험관 내 효소 절단 전 및 후의 IL2Rα 또는 Rβ에 대한 IL2 TMEAkine의 결합 활성을 나타내는 ELISA 결과.
도 24: 웨스턴 블롯에 의해 검출된 IL2-T41C-S47의 양 및 상응하는 결과.
도 25: IL2 TMEAkine이 IL2와 비교하는 경우 혈장에서 긴 반감기 및 높은 노출을 갖는 것을 나타내는 생체 내 약동학 연구.
도 26: IL2 TMEAkine이 야생형 IL12보다 폐에 대한 덜한 독성을 유도하는 것을 나타내는 폐(습윤 중량) 및 헤마톡실린 및 에오신으로 염색된 섹션의 측정.
도 27: IL2-T41C/S87C-S47 및 IL2-R38D/E61R/S87C-S47이 폐에 거의 독성을 유도하지 않음을 나타내는 폐 측정.
도 28: 처리 후의 종양 부피.
도 29: 항-종양 효과의 높은 효능과 일치하는 종양에서의 활성 IL2의 높은 노출, 및 폐 부종의 낮은 독성과 일치하는 폐 및 심장에서의 활성 IL2의 낮은 노출.
도 30: 5개 모두의 위치가 높은 효율로 S13 링커와 컨쥬게이션된 것을 나타내는 환원된 SDS-PAGE 젤 결과.
도 31: 8개의 선택된 항체 서열.
도 32: 상이한 R4 기를 항체의 선택된 돌연변이체 부위에 부위 특이적으로 컨쥬게이션시킴으로써, R4 기는 스크리닝을 위해 선택적으로 변화될 수 있었다.
도 33: 상이한 부위로의 컨쥬게이션은 상이한 정도의 결합 활성 회복을 나타낸다.
도 34: 인간 CTLA-4 단백질에 대한 유의한 감소된 결합 활성을 갖는 TMEAbodies는 또한 수용체 차단 활성의 극적인 감소를 나타낸다.
도 35: CTLA-4에 대한 감소된 결합 활성을 갖는 TMEAbody는 T 세포 활성화의 기능적 효능의 손상을 나타내고, 프로테아제 매개 활성화는 TMEAbody의 활성을 회복시킬 수 있다.
도 36: 이필리무맙 TMEAbodies는 WT 이필리무맙과 유사한 효능으로 종양에서 Treg 집단을 유의하게 하향 조절한다.
도 37: TMEAbody는 37℃에서 96시간 후 유의한 분해 없이 마우스 혈청에서 높은 안정성을 나타낸다.
도 38: CTLA-4 TMEAbodies는 WT-이필리무맙 및 CTLA-4 프로바디와 비교하여 S47 작용기와의 컨쥬게이션에 의해 증가된 반감기 및 노출을 나타낸다.
도 39: 이필리무맙 TMEAbodies는 WT 이필리무맙과 동등한 효능으로 종양 크기를 제어하는 반면, 대조군 인간 IgG는 어떠한 효능을 나타내는 데 실패하였다.
도 40: TMEAbody는 WT 이필리무맙과 동등하거나 이보다 낮은 항체 역가로 동물에서 매우 낮은 면역 반응을 유발한다.
도 41: 병용 요법 컨쥬게이트에서 항-CTLA4 TMEAbody의 컨쥬게이트에 의한 면역계의 보호는 일차 항체와 비교하여 자가면역을 감소시킬 수 있었다.
도 42: Niv-se001은 WT 니볼루맙의 432%인 40kD 컨쥬게이션된 TMEAbody의 R4-7 컨쥬게이션 또는 프로테아제 절단 후에 증가된 활성을 나타낸다.
도 43: R4-7과의 컨쥬게이션 후, 또는 40kD 작용기와 컨쥬게이션된 Niv-se005의 프로테아제 절단 후, Niv-se005의 결합 활성은 WT 니볼루맙(WT의 125%)과 동등한 수준으로 회복된다.
도 44: 펨브롤리주맙 및 니볼루맙 TMEAbodies는 WT 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙 항체와 동등한 효능으로 종양 크기를 제어하는 반면, 대조군 인간 IgG는 어떠한 효능을 나타내는 데 실패하였다.
도 45: 병용 요법에서의 항-CTLA4 또는 항-PD1 TMEAbody는 일차 항체와 비교하여 자가면역을 감소시킬 수 있었다.
도 46: 처리 후의 종양 부피.
본 발명의 개시의 범위 내에서, 상기 언급된 각각의 기술적 특징 및 실시예에서와 같은 하기에서 언급되는 각각의 기술적 특징은 서로 조합되어 바람직한 기술적 해법을 구성할 수 있음이 이해되어야 한다. 또한, 본 발명의 개시는 설명된 특정 구현예로 제한되지 않으며 이는 물론 다양할 수 있다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는 것이 또한 이해되어야 한다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 또한 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있으나, 바람직한 방법 및 재료가 이제 기재된다. 본원에 언급된 모든 간행물은 간행물이 인용한 방법 및/또는 물질을 개시하고 기재하기 위해 참조로서 본원에 포함된다.
본원 및 첨부된 청구항에서 사용되는 바와 같은 단수 형태는 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함하는 것이 인지되어야 한다. 따라서, 예를 들어, "항체"에 대한 언급은 복수의 항체를 포함하고, "항체"에 대한 언급은 당업자에게 공지된 하나 이상의 항체 및 이의 등가물에 대한 언급을 포함하고, 기타 등등이다. 청구항은 임의의 선택적인 요소를 배제하도록 작성될 수 있음이 추가로 주목된다. 이와 같이, 이러한 진술은 청구항 요소의 언급, 또는 "부정적인" 한계의 사용과 관련하여 "단독으로", "단독" 등과 같은 배타적 용어의 사용을 위한 선행 기초로서 제공되도록 의도된다.
본 발명의 개시의 목적 중 하나는 종양 미세환경 또는 염증 환경에서와 같은 병리학적 미세환경에서만 활성화되는 변형된 생체분자를 제공하여 병리학적 미세환경에서 리간드에 대한 동일하거나 심지어 개선된 결합 능력을 갖는 생체분자(R5)를 방출시킴으로써 생체분자의 표적화 및 효능을 개선시키고, 약물 내성을 극복하고, 독성을 감소시키는 것이다.
본 발명의 개시에서, 변형된 생체분자는 생체분자 및 생체분자에 공유적으로 연결된 기능성 모이어티를 포함하는 컨쥬게이트이다. 본 발명의 개시에서 사용하기에 적합한 생체분자는 다양한 기능성 단백질을 포함하나 이에 제한되지는 않는 생물학적 기능 또는 관심 활성을 갖는 생체분자일 수 있다. 생물학적 기능 또는 관심 활성은 효소학 및 면역학의 기능 또는 활성을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 본 발명의 개시에 사용하기에 적합한 생체분자는 항체 또는 이의 기능성 단편, 효소, 융합 단백질(예를 들어, 단백질-항체 융합체), 항체 약물 컨쥬게이트, 사이토카인, 및 임의의 다른 유전학적으로 조작된 생물학적 분자를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 이량체, 다합체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체) 및 항체 단편을 구체적으로 포함한다(Miller et al (2003) Jour. of Immunology 170:4854-4861). 본문 및 도면에서, 항체는 "Ab"로 약칭된다.
기본 항체 구조 단위는 2개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 사슬로 구성된 사량체를 포함하는 것으로 공지되어 있으며, 각각의 쌍은 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄를 갖는다. 각각의 사슬의 N 말단 부분은 주로 항원 인지를 담당하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각각의 사슬의 C 말단 부분은 주로 효과기 기능을 담당하는 불변 영역을 정의한다. 중쇄의 가변 영역(VH) 및 경쇄의 가변 영역(VL)은 각각 HCDR1, HCDR2, HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3를 포함하여 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 함유한다. 이들 6개의 CDR은 항체의 항원 결합 부위를 형성한다. 가변 영역의 나머지 아미노산은 비교적 보존적이며, 프레임워크 영역(FR)으로 언급된다. VH 및 VL은 각각 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 언급되는 4개의 프레임워크 영역을 각각 함유한다.
항체는 뮤린, 인간, 인간화, 키메라 항체일 수 있거나, 다른 종으로부터 유래될 수 있다. 본원에 개시된 면역글로불린은 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD 및 IgA), 부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스의 면역글로불린 분자일 수 있다. 면역글로불린은 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 그러나, 일 양태에서, 면역글로불린은 인간, 뮤린 또는 토끼 기원이다.
항체 단편은 전장 항체의 일부, 일반적으로 이의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 바람직하게는, 항체의 단편은 기능성 단편, 즉, 온전한 항체의 항원 결합 능력을 유지하는 것이다. 항체 단편 또는 기능성 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디(diabodies); 선형 항체; 및 단일 사슬 항체 분자(scFv) 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 융합 단백질은 항체의 항원 결합 도메인 및 선택적으로 사이토카인을 함유할 수 있다. 융합 단백질에 함유된 항체의 항원 결합 도메인은 HER2, CD19, EGFR, CD22, CD3, TROP2, 당단백질 NMB, 구아닐릴 사이클라제 C, CEA, CD79b, PSMA, ENPP3, 메소텔린(Mesothelin), CD138, NaPi2b, CD56, CD74, FOLR1, DLL3, CEACAM5, CD142, SLAMF7, CD25, SLTRK6, CD37, CD70, AGS-22, C4.4A, FGFR2, Ly6E, MUC16, BCMA, pCadherin, 에프린-A(Ephrin-A), LAMP1, MUC1, CD19, PDL1, HER2, NY-ESO-1, BCMA, WT1, MUC1, CD20, CD23, ROR1, CD123, CD33, CD44v6, CD174, CD30, CD133, cMet, EGFR, FAP, EphA2, GD2, GPC3, IL-13Ra2, LewisY, 메소텔린, SS1, CEA, CD171, EGFR, EGFRvIII, VEGFR2, NY-ESO-1, MUC-1 및 MAGE-A3로 구성된 군으로부터 선택되는 항원에 대한 항원 결합 도메인일 수 있거나, 본원에 기재된 바와 같은 임의의 항체의 항원 결합 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 HER2, CD19, EGFR, CD22, CD3, TROP2, 당단백질 NMB, 구아닐릴 사이클라제 C, CEA, CD79b, PSMA, ENPP3, 메소텔린, CD138, NaPi2b, CD56, CD74, FOLR1, DLL3, CEACAM5, CD142, SLAMF7, CD25, SLTRK6, CD37, CD70, AGS-22, C4.4A, FGFR2, Ly6E, MUC16, BCMA, pCadherin, 에프린-A, LAMP1, MUC1, CD19, PDL1, HER2, NY-ESO-1, BCMA, WT1, MUC1, CD20, CD23, ROR1, CD123, CD33, CD44v6, CD174, CD30, CD133, cMet, EGFR, FAP, EphA2, GD2, GPC3, IL-13Ra2, LewisY, 메소텔린, SS1, CEA, CD171, EGFR, EGFRvIII, VEGFR2, NY-ESO-1, MUC-1 및 MAGE-A3로 구성된 군으로부터 선택되는 항원에 대한 항원 결합 도메인을 함유하거나, 본원에 기재된 바와 같은 임의의 항체의 항원 결합 도메인을 함유하는 이중특이적 항체이다. 바람직하게는, 이중특이적 항체는 동일하거나 상이한 항체로부터의 2개의 scFv를 함유하는 단일 사슬 이중특이적 항체이다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 항체-사이토카인 융합 단백질이며, 이는 항체 또는 이의 기능성 단편 및 IL-2, IL-7, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15, IL-21, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, G-CSF, GM-CSF, TNF-α, TRAP 및 TRAIL로 구성된 군으로부터 선택되는 사이토카인을 함유한다. 상기 융합 단백질의 예는 항-PD-l 항체 또는 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 도메인과 IL2의 융합 단백질이다.
본원에서 사용되는 항체는 당 분야에 공지된 임의의 항체 및 이의 기능성 단편일 수 있다. 예를 들어, 본원에서 사용되는 항체는 항-Her2 항체, 항-EGFR 항체, 항-VEGFR 항체, 항-CD20 항체, 항-CD33 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-TNFα 항체, 항-CD28 항체, 항-4-1BB 항체, 항-OX40 항체, 항-GITR 항체, 항-CD27 항체, 항-CD40 항체, 또는 항-ICOS 항체, 항-CD25 항체, 항-CD30 항체, 항-CD3 항체, 항-CD22 항체, 항-CCR4 항체, 항-CD38 항체, 항-CD52 항체, 항-보체 C5 항체, RSV의 항-F 단백질, 항-GD2 항체, 항-GITR 항체, 항-당단백질 수용체 lib/Illa 항체, 항-ICOS 항체, 항-IL2R 항체, 항-LAG3 항체, 항-인테그린α4 항체, 항-lgE 항체, 항-PDGFRa 항체, 항-RANKL 항체, 항-SLAMF7 항체, 항-LTIGIT 항체, 항-TIM-3 항체, 항-VEGFR2 항체, 항-VISTA 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 항체 또는 이의 기능성 단편일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본원에서 사용되는 항체는 우토밀루맙(Utomilumab), 우렐루맙(Urelumab), ADG106, Poteligeo™(모가물리주맙(Mogamulizumab)), Poteligeo™(모가물리주맙), Bexxar™(토시투모맙(tositumomab)), Zevalin™(이브리투모맙 티욱세탄(ibritumomab tiuxetan)), Rituxan™(리툭시맙(rituximab)), Arzerra™(오파투무맙(Ofatumumab)), Gazyva™(오비누투주맙(Obinutuzumab)), Besponsa™(이노투주맙 오조가미신(Inotuzumab ozogamicin)), Zenapax™(다클리주맙(daclizumab)), 바르릴루맙(Varlilumab), 테랄리주맙(Theralizumab), Adcetris™(브렌툭시맙 베도틴(Brentuximab vedotin)), Myelotarg™(젬투주맙(gemtuzumab)), Darzalex™(다라투무맙(Daratumumab)), CDX-1140, SEA-CD40, RO7009789, JNJ-64457107, APX-005M, Chi Lob 7/4, Campath™(알렘투주맙(alemtuzumab)), Raptiva™(에팔리주맙(efalizumab)), Soliris™(에쿨리주맙(eculizumab)), Yervoy™(이필리무맙(ipilimumab)), 트레멜리무맙(tremelimumab), Erbitux™(세툭시맙(cetuximab)), Vectibix™(파니투무맙(panitumumab)), Portrazza™(네시투무맙(Necitumumab)), TheraCIM™(니모투주맙(Nimotuzumab)), Synagis™(팔리비주맙(palivizumab)), Unituxin™(디누툭시맙(Dinutuximab)), TRX-518, MK-4166, MK-1248, GWN-323, INCAGN0186, BMS-986156, AMG-228, ReoPro™(아비식시맙(abiciximab)), Herceptin™(트라스투주맙(trastuzumab)), Perjeta™(페르투주맙(Pertuzumab)), Kadcyla™(아도-트라스투주맙 엠탄신(Ado-trastuzumab emtansine)), GSK-3359609, JTX-2011, Simulect™(바실릭시맙(basiliximab)), Tysabri™(나탈리주맙(natalizumab)), BMS-986016, REGN3767, LAG525, Xolair™(오말리주맙(omalizumab)), 타볼리맙(Tavolimab), PF-04518600, BMS-986178, MOXR-0916, GSK-3174998, INCAGN01949, IBI-101, Keytruda™(펨브롤리주맙(Pembrolizumab)), Opdivo™(니볼루맙(Nivolumab)), Lartruvo™(올라라투맙(Olaratumab)), Tencentriq™(아테졸리주맙(Atezolizumab)), BMS-936559, Bavencio™(아벨루맙(Avelumab)), Imfinzi™(두랄루맙(Duralumab)), Prolia™(데노수맙(Denosumab)), Empliciti™(엘로투주맙(Elotuzumab)), MTIG7192A, TSR-022, MBG-453, Remicade™(인플릭시맙(infliximab)), Humira™(아달리무맙(adalimumab)), Avastin™(베바시주맙(bevacizumab)), Lucentis™(라니비주맙(ranibizumab)), Cyramza™(라무시루맙(Ramucirumab)) 및 JNJ-61610588로 구성된 군으로부터 선택되는 항체 또는 이의 기능성 단편일 수 있다.
본 발명의 개시에서, 사이토카인은 당 분야에서 일반적으로 사용되는 의미 및 구조를 가질 수 있다. 이는 일반적으로 단핵구, 대식세포, T 세포, B 세포, NK 세포 등과 같은 면역세포 또는 내피 세포, 표피 세포, 섬유모세포 등과 같은 비면역 세포를 자극함으로써 합성되고 분비되는 넓은 생물학적 활성을 갖는 일종의 작은 단백질을 나타낸다. 사이토카인은 상응하는 수용체에 대한 결합을 통해 세포 성장, 분화 및 효과, 및 면역 반응을 조절할 수 있다. 적합한 사이토카인은 인터루킨, 인터페론, 종양 괴사 인자 상과, 콜로니 자극 인자, 화학주성 인자 및 성장 인자 등을 포함한다.
예시적 사이토카인은 IL-2, IL-7, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15, IL-21, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, G-CSF, GM-CSF, TNF-α, TRAP 및 TRAIL을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 개시에서, 생체분자의 아미노산 서열의 적합한 위치(들)에서 하나 이상(예를 들어, 5개 이하 또는 3개 이하)의 아미노산은 시스테인으로 돌연변이되고, 생체분자는 시스테인의 티올기를 통해 본 발명의 개시의 기능성 모이어티(R1-R2-R3-R4)에 공유적으로 연결된다. 예를 들어, 흥미로운 생체분자에서 흥미로운 1개 또는 2개의 아미노산은 기능성 모이어티로의 컨쥬게이션을 위해 시스테인으로 돌연변이된다. 항체의 경우, 돌연변이 위치는 가변 영역의 상보성 결정 영역 또는 비-상보성 결정 영역에 존재할 수 있다. 바람직하게는, 돌연변이는 치환에 의한 돌연변이이다. 더욱 바람직하게는, 돌연변이는 항체의 경쇄의 가변 영역에서 발생한다. 일반적으로, 돌연변이체가 제조될 수 있고, 이후, 상응하는 항원에 대한 이의 결합 활성이 시험된다. 돌연변이체가 야생형 항체와 비교하여 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 결합 활성을 보유하는 경우, 돌연변이 위치에서의 아미노산 잔기는 시스테인으로 돌연변이되어 기능성 모이어티에 공유적으로 연결될 수 있는 것으로 생각된다. 대안적으로, 특정 구현예에서, 돌연변이체를 R4에 연결하여 생성된 컨쥬게이트가 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 결합 활성을 보유하는 경우, 돌연변이 위치에서의 아미노산 잔기는 시스테인으로 돌연변이되어 기능성 모이어티에 공유적으로 연결될 수 있는 것으로 생각된다.
일반적으로, 항체의 경쇄의 가변 영역의 CDR에서 G, A, S, T, L, I, F, E, K, D 및 Y 등 중 하나 이상, 더욱 바람직하게는 G, A, S, T, L, I, K 및 Y 중 하나 이상, 더욱 바람직하게는 G, A, T, L 및 S 중 하나 이상은 시스테인으로 돌연변이될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체의 중쇄의 가변 영역의 CDR에서 G, A, S, T, L, I, F, E, K, D 및 Y 등 중 하나 이상, 더욱 바람직하게는 G, A, S, T, L, I, K 및 Y 중 하나 이상, 더욱 바람직하게는 G, A, T, L, Y 및 S 중 하나 이상은 시스테인으로 돌연변이될 수 있다. 항체의 경쇄의 비-CDR에서 돌연변이가 발생하는 경우, 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역의 비-CDR에서 G, A, S, T, L, I, F, E, K, D 및 Y 등 중 하나 이상, 바람직하게는 G, A, S, T, K, I, Y 및 L, 더욱 바람직하게는 G, A, T ,Y 및 S 중 하나 이상은 시스테인으로 돌연변이될 수 있다. 일부 구현예에서, 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역의 비-상보성 결정 영역(예를 들어, FR1, FR2 또는 FR3 내)에서 S, T, L, I, F, E, K, D, N, Q, R 및 Y 잔기 등 중 하나 이상은 시스테인으로 돌연변이될 수 있다. 일부 구현예에서, 치환 돌연변이는 VH의 비-상보성 결정 영역(FR1, FR2 또는 FR3)에서 Gln3, Ser7, Ser26, Glu46, Thr68 및 Asp72, 및 VL의 비-상보성 결정 영역(FR1, FR2 또는 FR3)에서 Thr5, Tyr49, Arg61, Ser63, Ser65, Ser67, Thr72, Thr74, Ser76 및 Asp82의 보존 부위 중 하나 이상에 도입될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 개시의 일부 구현예에서, 항-PD-1 항체(예를 들어, 펨브롤리주맙)의 중쇄에서의 돌연변이 위치는 Ser7, Gly8, Gly15, Ala16, Ser17, Ala24, Ser25, Gly26, Tyr27, Thr28, Thr30, Asn31, Tyr32, Tyr33, Tyr35, Ala40, Gly42, Gly44, Leu45, Gly49, Gly50, Ile51, Asn52, Ser54, Asn55, Gly56, Gly57, Thr58, Asn59, Lys63, Lys65, Thr69, Leu70, Thr71, Thr72, Asp73, Ser74, Ser75, Thr76, Thr77, Thr78, Ala79, Leu83, Ser85, Leu86, Thr91, Ala92, Arg99, Asp100, Tyr101, Arg102, Asp104, Gly106, Gly111, Gly113, Thr114, 115Thr, 117Thr, Ser119, Ser120, Ala121, Ser122, Thr123, Lys124, Gly125 및 Ser127로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고; 경쇄에서의 돌연변이 위치는 Ile2, Thr5, Ser7, Ala9, Thr10, Leu11, Ser12, Leu13, Ser14, Gly16, Ala19, Thr20, Ala25, Ser26, Lys27, Gly28, Ser30, Thr31, Ser32, Gly33, Tyr34, Ser35, Tyr36, Leu37, Gly45, Ala47, Leu50, Leu51, Ile52, Tyr53, Leu54, Ala55, Ser56, Tyr57, Leu58, Ser60, Gly61, Ala64, Ser67, Gly68, Ser69, Gly70, Ser71, Gly72, Thr73, Ala76, Thr78, Ser80, Ser81, Ser95, Arg96, Asp97, Leu98, Leu100, Thr101, Phe102, Gly104, Ile110, Lys111 및 K130으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
대안적으로, 항-PD-1 항체(예를 들어, 니볼루맙)의 중쇄에서의 돌연변이 위치는 Gln3, Ser7, Gly8, Gly9, Gly10, Gly15, Ser17, Lys23, Ala24, Ser25, Gly26, Ile27, Asn31, Thr28, Ser30, Ser32, Gly33, Ala40, Gly42, Gly44, Leu45, Ala49, Ile51, Tyr53, Asp54, Gly55, Ser56, Lys57, Tyr59, Tyr60, Ala61, Asp62, Ser63, Lys65, Gly66, Thr69, Ile70, Ser71, Arg72, Asp73, Asn74, Ser75, Lys76, Asn77, Thr78, Leu79, Leu81, Ser85, Leu86, Ala88, Thr91, Ala92, Thr98, Asn99, Asp100, Asp101, Tyr102, Gly104, Gly106, Thr107, Leu108, Thr110, Ser112, Ser113, Ala114, Ser115, Thr116, Lys117, Gly118 및 Ser120으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고; 경쇄에서의 돌연변이 위치는 Ile2, Leu4, Thr5, Ser7, Ala9, Thr10, Leu11, Ser12, Leu13, Ser14, Gly16, Ala19, Thr20, Leu21, Ala25, Ser26, Ser28, Ser30, Ser31, Tyr32, Leu33, Ala34, Tyr36, Gly41, Ala43, Leu46, Leu47, Ile48, Tyr49, Asp50, Ala51, Ser52, Asn53, Arg54, Ala55, Thr56, Gly57, Ile58, Ala60, Arg61, Ser63, Gly64, Ser65, Gly66, Ser67, Gly68, Thr69, Thr72, Leu73, Thr74, Ile75, Ser76, Ser77, Leu78, Ala84, Ser91, Ser92, Asn93, Arg96, Thr97, Phe98, Gly99, Gly101, Thr102, Ile106, Lys107, Thr109, Ala111, Ala112, Ser114, Ile117 및 Ser121로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
항-CTLA-4 항체의 중쇄에서의 돌연변이 위치는 Ser7, Gly8, Gly9, Gly10, Gly15, Ser17, Leu18, Leu20, Ala24, Ser25, Gly26, Phe27, Thr28, Phe29, Ser30, Ser31, Tyr32, Thr33, Ala40, Gly42, Lys43, Gly44, Leu45, Glu46, Thr49, Phe50, Ile51, Ser52, Tyr53, Asp54, Gly55, Lys58, Tyr59, Tyr60, Ala61, Asp62, Ser63, Lys65, Gly66, Thr69, Ile70, Ser71, Ser75, Lys76, Thr78, Leu79, Leu81, Ser85, Leu86, Ala88, Gly89, Asp90, Thr91, Ala92, Tyr94, Tyr95, Ala97, Phe98, Thr99, Gly100, Leu102, Gly103, Asp106, Tyr107, Gly109, Gly111, Thr112, Leu113, Thr115, Ser117, Ser118, Ala119, Ser120, Thr121 및 Lys122로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고; 경쇄에서의 돌연변이 위치는 Ile2, Leu4, Thr5, Ser7, Gly9, Thr10, Leu11, Ser12, Leu13, Ser14, Gly16, Ala19, Thr20, Leu21, Ala25, Ser26, Ser28, Gly30, Ser31, Ser32, Tyr33, Leu34, Ala35, Tyr37, Lys40, Gly42, Ala44, Leu47, Leu48, Ile49, Tyr50, Gly51, Ala52, Phe53, Ser54, Ala56, Thr57, Gly58, Ile59, Ser64, Gly65, Ser66, Gly67, Ser68, Gly69, Thr70, Asp71, Thr73, Leu74, Thr75, Ile76, Ser77, Leu79, Ala85, Tyr92, Gly93, Ser94, Ser95, Thr98, Phe99, Gly100, Gly102, Thr103, Lys104, Ile107, Lys108, Thr110, Ala112, Ala113, Ser115, Ser128, Gly129 및 Thr130으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
항-CTLA-4 항체 이필리무맙의 중쇄에서의 돌연변이 위치는 Gln3, Arg19, Leu20, Ser25, Gly26, Phe27, Thr28, Phe29, Ser30, Ser31, Tyr32, Thr33, Met34, His35, Gly44, Phe50, Ile51, Ser52, Tyr53, Asp54, Gly55, Asn56, Asn57, Lys58, Tyr59, Tyr60, Thr69, Ser71, Arg72, Asp73, Asn74, Ser75, Lys76, Asn77, Thr99, Gly100, Trp101, Leu102, Gly103 및 Pro104로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고; 경쇄에서의 돌연변이 위치는 Gln6, Arg24, Ala25, Ser26, Gln27, Ser28, Val29, Gly30, Ser31, Ser32, Tyr33, Ile49, Tyr50, Gly51, Ala52, Phe53, Ser54, Arg55, Ala56, Phe53, Ser54, Arg55, Ala56, Thr57, Gly58, Ile59, Pro60, Asp61, Arg62, Ser68, Gly69, Thr70, Gln90, Gln91, Tyr92, Gly93, Ser94, Ser95, Pro96 및 Trp97로 구성된 군으로부터 선택된다.
항-TNFα 항체의 중쇄에서의 돌연변이 위치는 Ser7, Gly8, Gly9, Gly10, Leu11, Gly15, Ser17, Leu18, Leu20, Ala24, Ser25, Gly26, Thr28, Asp30, Asp31, Tyr32, Ala33, Ala40, Gly42, Gly44, Leu45, Ser49, Ala50, Ile51, Thr52, Asn54, Ser55, Gly56, Ile58, Asp59, Tyr60, Ala61, Asp62, Ser63, Glu65, Gly66, Phe68, Thr69, Ile70, Ser71, Asp73, Asn74, Ala75, Lys76, Ser78, Leu79, Tyr80, Leu81, Ser85, Leu86, Ala88, Thr91, Ala92, Lys98, Ser100, Tyr101, Leu102, Ser103, Thr104, Ala105, Ser106, Ser107, Leu108, Asp109, Tyr110, Gly112, Gly114, Thr115, Leu116, thr118, Ser120, Ser121, Ala122, Ser123 및 Thr124로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고; 경쇄에서의 돌연변이 위치는 Asp1, Thr5, Ser7, Ser9, Ser10, Leu11, Ser12, Ala13, Ser14, Gly16, Thr20, Ile21, Ala25, Ser26, Gln27, Gly28, Ile29, Arg30, Asn31, Tyr32, Leu33, Ala34, Tyr36, Lys39, Gly41, Lys42, Ala43, Leu48, Leu47, Ile48, Tyr49, Ala50, Ala51, Ser52, Thr53, Leu54, Gln55, Ser56, Gly57, Ser60, Ser63, Gly64, Ser65, Gly66, Ser67, Gly68, Thr69, Asp70, Thr72, Leu73, Thr74, Ile75, Ser76, Ser77, Leu78, Ala84, Thr85, Tyr91, Asn92, Arg93, Ala94, Tyr96, Thr97, Phe98, Gly99, Gly101, Thr102, Ile106, Lys107, Thr109 및 Ala111로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
항-CD28 항체의 중쇄에서의 돌연변이 위치는 Ser7, Gly8, Gly15, Ala16, Ser17, Ser21, Ala24, Ser25, Gly26, Tyr27, Thr28, Thr30, Ser31, Tyr32, Ala40, Gly42, Gly44, Gly49, Tyr52, Gly54, Thr58, Ala68, Thr69, Thr71, Thr74, Ser75, Ser77, Thr78, Ala79, Ser84, Leu86, Ser88, Thr91, Ala92, Thr97, Ser99, Tyr101, Gly102, Leu103, Gly113, Thr114, Thr115, Thr117, Ser119, Ser120, Ala121, Ser122 및 Thr123으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고; 경쇄에서의 돌연변이 위치는 Thr5, Ser7, Ser9, Ser10, Ser11, Ser12, Ala13, Ser14, Gly16, Thr20, Thr22, Ala25, Ser26, Ser27, Ile29, Tyr30, Ala43, Leu46, Leu47, Tyr49, Lys50, Ala51, Ser52, Leu54, Thr56, Gly57, Ser60, Ser63, Gly64, Ser65, Gly66, Ser67, Gly68, Thr69, Asp70, Thr72, Thr74, Ser76, Ser77, Ala84, Thr85, Gly91, Thr93, Tyr94, Tyr96, Thr97, Phe98, Gly99, Gly100, Gly101, Thr102, Thr109 및 Ala111로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
항-4-1BB 항체의 중쇄에서의 돌연변이 위치는 Thr31, Tyr32, Ser35, Lys50, Tyr52, Asp55, Ser56, Tyr57, Thr58, Asn59, Tyr60, Ser61, Gln65, Gly66, Gly99, Tyr100, Gly101, Asp104 및 Tyr105로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고; 경쇄에서의 돌연변이 위치는 Ser23, Gly24, Asp25, Asn26, Gly28, Asp29, Gln30, Tyr31, Gln49, Asp50, Lys51, Asn52, Arg53, Ser55, Gly56, Thr89, Tyr90, Thr91, Gly92, Gly94 및 Ser95로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
항-Her2 항체(예를 들어, 트라스투주맙의 중쇄에서의 돌연변이 위치는 Arg19, Lys30, Asp31, Tyr33, Arg50, Tyr62, Asn55, Tyr57, Arg59, Tyr60, Asp62, Lys65, Asp102 및 Tyr105로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고; 경쇄에서의 돌연변이 위치는 Asp1, Gln3, Gln27, Asp28, Asn30, Tyr49, Tyr55, Arg66, Asp70 및 Tyr92로 구성된 군으로부터 선택된다.
항-PD-L1 항체(예를 들어, 아테졸리주맙)의 중쇄에서의 돌연변이 위치는 Gln3, Asp31, Tyr54, Tyr59, Tyr60, Asp62, Lys65, Asp73, Lys76, Asn77 및 Arg99로 구성된 군으로부터 선택되고; 경쇄에서의 돌연변이 위치는 Arg24, Gln27, Asp28, Tyr49, Tyr55, Asp70, Gln89, Gln90, Tyr91 및 Tyr93으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 바람직한 구현예에서, 다양한 항체의 돌연변이 위치는 바람직하게는 돌연변이 후 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 결합 활성을 보유하거나, R4로의 컨쥬게이션 후 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상의 결합 활성을 보유하는 표 5 내지 19에 나열된 위치로부터 선택된다. 이들 돌연변이 위치는 CDR 및 비-CDR에서의 위치를 포함한다. 예를 들어, 항-PD-1 항체 1의 경쇄의 바람직한 돌연변이 위치는 Ala25, Ser26, Gly28, Ser30, Thr31, Ser32, Gly33, Ser35, Tyr36, Leu37, Leu54, Ala55, Ser56, Tyr57, Ser60, Gly61, Ser95, Thr101 및 Gly104를 포함할 수 있고; 더욱 바람직하게는, 돌연변이 위치는 Ser26, Gly28, Ser30, Ser32, Gly33, Ser35, Ala55, Ser56, Ser60, Gly61 및 Ser95를 포함한다. 항-PD-1 항체 2의 경쇄의 바람직한 돌연변이 위치는 Ala25, Ser26, Ser28, Ser30, Ser31, Ala34, Ala51, Ser52, Ser54, Ala55, Thr56, Gly57, Ile58, Ala60, Ser91, Ser92, Thr97 및 Gly99를 포함할 수 있고; 더욱 바람직하게는, 돌연변이 위치는 Ser26, Ser28, Ser30, Ser31, Ala34, Ser52, Ser54, Thr56, Gly57, Ser91, Ser92, Thr97 및 Gly99를 포함한다. 항-CTLA-4 항체의 경쇄의 바람직한 돌연변이 위치는 Ala25, Ser26, Ser28, Gly30, Ser31, Ser32, Leu34, Ala35, Gly51, Ala52, Ser54, Ala56, Thr57, Gly58, Gly93, Ser94, Ser95, Thr98 및 Gly100을 포함할 수 있고; 더욱 바람직하게는, 돌연변이 위치는 Ala25, Ser26, Ser28, Gly30, Ser31, Ser32, Gly51, Ser54, Thr57, Gly58, Gly93, Ser94, Ser95 및 Gly100을 포함한다. 항-CD28 항체의 경쇄의 바람직한 돌연변이 위치는 Ser26, Ile29, Tyr30, Lys50, Ala51, Ser52, Gly91, Thr93, Tyr94, Tyr96, Thr97 및 Gly99를 포함할 수 있고; 더욱 바람직하게는, 돌연변이 위치는 Tyr30, Ala51, Tyr96, Thr97 및 Gly99를 포함한다. 항-TNFα 항체의 경쇄의 바람직한 돌연변이 위치는 Ala25, Ser26, Gly28, Ile29, Tyr32, Leu33, Ala34, Ala50, Ala51, Ser52, Thr53, Leu54, Ser56, Gly57, Tyr91, Ala94 및 Thr97을 포함할 수 있고; 더욱 바람직하게는, 돌연변이 위치는 Ser26, Gly28, Ala51, Ser56, Gly57, Tyr91 및 Ala94를 포함한다.
항-PD-1 항체 1의 중쇄의 바람직한 돌연변이 위치는 Thr30, Tyr32, Tyr35, Gly50, Ile51, Ser54, Gly56, Gly57, Thr58, Lys63, Tyr101 및 Gly106을 포함할 수 있고; 더욱 바람직하게는, 돌연변이 위치는 Thr30, Gly50, Ser54, Gly56, Gly57, Thr58, Lys63 및 Gly106을 포함한다. 항-PD-1 항체 2의 중쇄의 바람직한 돌연변이 위치는 Ser30, Ser32, Gly33, Ile51, Tyr53, Asp54, Gly55, Ser56, Lys57, Ala61, Ser63, Lys65, Gly66, Asp101, Gly104, Gly106, Thr107 및 Leu108을 포함할 수 있고; 더욱 바람직하게는, 돌연변이 위치는 Ser30, Ser32, Gly33, Tyr53, Gly55, Ser56, Ser63, Lys65, Gly66, Gly104, Gly106 및 Thr107을 포함한다. 항-CTLA-4 항체의 중쇄의 바람직한 돌연변이 위치는 Ser30, Ser31, Tyr32, Thr33, Ile51, Asp54, Gly55, Lys58, Tyr59, Tyr60, Ala61, Asp62, Ser63, Lys65, Gly66, Gly100, Leu102, Gly103, Asp106 및 Tyr107을 포함할 수 있고; 더욱 바람직하게는, 돌연변이 위치는 Ser30, Ser31, Thr33, Gly55, Tyr60, Ala61, Ser63, Lys65, Gly66, Gly100 및 Gly103을 포함한다. 항-CD28 항체의 중쇄의 바람직한 돌연변이 위치는 Ser25, Gly26, Tyr27, Thr28, Thr30, Ser31, Tyr32, Tyr33, Tyr52, Gly54, Thr58, Ser99, Tyr101, Gly102 및 Leu103을 포함할 수 있고; 더욱 바람직하게는, 돌연변이 위치는 Gly26, Tyr27, Thr28, Thr30, Ser31, Tyr52, Gly54 및 Leu103을 포함한다. 항-TNFα 항체의 중쇄의 바람직한 돌연변이 위치는 Tyr32, Ala33, Ile51, Thr52, Ser55, Gly56, Ile58, Tyr60, Ala61, Ser63, Gly66, Ser100, Tyr101, Leu102, Ser103, Thr104, Ala105, Ser106, Ser107, Leu108 및 Tyr110을 포함할 수 있고; 더욱 바람직하게는, 돌연변이 위치는 Ala33, Ile51, Ala61, Ser63, Gly66, Ser100, Thr104 및 Ser106을 포함한다.
유사하게, 비-CDR, 즉, 경쇄의 가변 영역의 프레임워크 영역에서 돌연변이가 발생하는 경우, 다양한 항체의 돌연변이 위치는 바람직하게는 돌연변이 후 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상의 결합 활성을 보유하는 표 7 및 8에 나열된 것으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 항-PD-1 항체 1의 경쇄의 경우, 프레임워크 영역에서 바람직한 돌연변이 위치는 Thr5, Ser7, Ala9, Thr10, Leu11, Ser12, Leu13, Ser14, Gly16, Ala19, Thr20, Gly45, Ala47, Leu50, Leu51, Ile52, Ala64, Ser67, Gly68, Ser69, Gly70, Ser71, Gly72, Thr73, Ala76, Thr78, Ser80, Ser81, Ile110 및 Lys111을 포함하고; 더욱 바람직하게는, 돌연변이 위치는 Thr5, Ser7, Ala9, Leu11, Leu13, Ser14, Ala47, Leu50, Ala64, Gly68, Ser69, Ser71, Gly72, Thr73, Ser80 및 Ile110을 포함한다. 본원에 개시된 바와 같은 항-PD-1 항체 2의 중쇄의 경우, 프레임워크 영역의 바람직한 돌연변이 위치는 Ser7, Gly8, Gly9, Gly10, Gly15, Ser17, Ala24, Ser25, Gly26, Thr28, Ser30, Ala40, Gly42, Gly44, Thr68, Ser71, Ser75, Thr78, Thr85, Ala88, Thr91, Ala92, Thr98, Thr110, Ser112, Ser113, Ala114, Ser115, Thr116, Lys117, Gly118 및 Ser120을 포함하고; 더욱 바람직하게는, 돌연변이 위치는 Ser7, Gly8, Gly9, Ala24, Ser25, Gly26, Gly44, Thr68, Ser75, Thr78, Thr85, Thr110, Ser112, Ser113, Ser115, Thr116, Lys117, Gly118 및 Ser120을 포함한다.
사이토카인과 같은 다른 기능성 단백질과 관련하여, 이의 돌연변이체가 야생형 단백질의 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 결합 활성(예를 들어, 이의 고유 리간드에 대한 결합 능력)을 보유하는 경우, 상기 위치의 아미노산 잔기가 시스테인으로 돌연변이되어 기능성 모이어티에 연결될 수 있는 것으로 생각된다. 예를 들어, IL2의 돌연변이 위치는 알파 수용체를 차단하기 위해 Lys32, Lys35, Thr37, Met39, Thr41, Lys43, Lys48, Lys49, Lys64, Leu72, Ala73, Ser75, Lys76, Leu94, Thr101, Thr102, Tyr107, Ala108, Thr111 및 Ala112로 구성된 군으로부터 선택될 수 있거나; 베타 수용체를 차단하기 위해 Leu12, His16, Leu19, Met23, Gly27, Ser75, Arg81, Leu85, Ser87, Leu94, Gly98, Ser99, Thr101 및 Thr133으로 구성된 군으로부터 선택되거나; 감마 수용체를 차단하기 위해 Leu36, Ala50, Thr51, Thr123, Ser126, Ser127 및 Ser130으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, IL2의 돌연변이 위치는 IL2의 알파 수용체를 차단하기 위해 Lys32, Lys35, Thr37, Thr41, Lys43, Lys48, Lys49, Ala50, Leu72, Ala73, Ser75, Lys76, Leu94, Thr101, Thr102, Ala108, Thr111 및 Ala112로 구성된 군으로부터 선택될 수 있거나; IL2의 베타 수용체를 차단하기 위해 Leu19, Gly27, Ser75, Leu80, Ser87, Leu94, Gly98, Ser99, Thr101 및 Thr133으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있거나; IL2의 감마 수용체를 차단하기 위해 Leu36, Ala50, Thr51, Thr123, Ser126, Ser127 및 Ser130으로 구성된 군으로부터 선택된다.
IL2, IL10 및 IL15와 같은 사이토카인의 Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Lys, Tyr, Phe, Asp, Glu 및 Ile 중 하나 이상은 시스테인으로 돌연변이될 수 있다. 바람직하게는, 사이토카인의 아미노산 서열에서 Thr, Leu, Ala, Gly 및 Ser 중 임의의 것이 시스테인으로 돌연변이된다.
일부 구현예에서, 인간 IL10에서의 돌연변이 위치는 Thr6, Ser8, Ser11, Thr13, Gly17, Arg24, Ser31, Arg32, Lys34, Thr35, Lys40, Leu46, Lys49, Ser51, Lys57, Gly58, Ser66, Tyr72, Lys88, His90, Ser93, Lys99, Thr100, Arg104, Lys117, Ser118, Lys119, Lys125, Lys130, Lys134, Gly135, Tyr137, Tyr149, Thr155, Lys157 및 Arg159로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 개시의 융합 단백질의 경우, 하나 이상의 시스테인이 융합 단백질의 임의의 단백질에 도입될 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체의 경우, 돌연변이(들)는 scFv 중 어느 하나 또는 둘 모두의 CDR 또는 비-CDR, 또는 항원 결합 도메인 중 어느 하나 또는 둘 모두에 도입될 수 있다. 항체 및 사이토카인의 융합 단백질의 경우, 항체 및 사이토카인 중 어느 하나 또는 둘 모두는 돌연변이(들)를 함유할 수 있다.
예시된 서열은 SEQ ID NO:13-83을 지칭할 수 있다.
생체분자의 돌연변이, 형질감염, 발현 및 정제는 당 분야에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 위치를 갖는 생체분자의 핵산은 직접 합성될 수 있고, 이후 효소 소화에 의해 획득된 상이한 단편의 핵산 분자가 발현 벡터로 라이게이션될 수 있고, 발현 벡터는 박테리아 또는 진핵생물 숙주 세포로 형질전환된다. 시스테인 돌연변이를 함유하는 생체분자는 숙주 세포에서의 재조합을 통해 획득될 수 있다.
본 발명의 개시에서 사용하기에 적합한 박테리아 또는 진핵생물 숙주 세포는 박테리아, 효모 및 포유동물 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 숙주 세포일 수 있다. 유용한 진핵생물 숙주 세포는 CHO 세포, HEK293T 세포, 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 포함한다.
본 발명의 개시에서 사용하기에 적합한 발현 벡터는 배큘로바이러스, 원숭이 바이러스(SV40), 레트로바이러스 또는 백시니아 기반 바이러스 벡터를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 당 분야에 공지된 바이러스 기반 발현 벡터일 수 있다. 적합한 조절 요소 및 선택 마커를 함유하는 발현 벡터가 사용되어 돌연변이체를 안정적으로 발현하는 포유동물 세포주를 제조할 수 있다. 예를 들어, GS 진핵생물 발현 시스템(Lonza), DHFR 진핵생물 발현 시스템(Invitrogen) 및 피키아 파스토리스 발현 시스템(Invitrogen)이 발현 및 제조에 사용될 수 있다.
본 발명의 개시의 생체분자는 당 분야에 공지된 분리 방법에 의해 정제될 수 있다. 이들 방법은 DEAE 이온 교환, 젤 여과 및 하이드록시아파타이트 크로마토그래피를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 단백질 G 컬럼은 세포 배양물의 상층액 또는 세포질의 추출물에서 생체분자를 분리하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 생체분자는 생체분자가 친화성 매트릭스에 포획될 수 있게 하는 아미노산 서열을 함유하도록 이들을 "조작 변형"하는 데 적용될 수 있다. 예를 들어, 태그는 폴리펩티드의 정제를 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 태그는 c-myc, 헤마고늄(hemagonium), 폴리-His(예를 들어, 6His) 또는 Flag™(Kodak)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 종류의 태그는 카르복실 말단 또는 아미노 말단을 포함하여 폴리펩티드 내의 임의의 위치에 삽입될 수 있다. 본 발명의 개시의 생체분자는 또한 면역친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
본 발명의 개시에 사용하기에 적합한 기능성 모이어티는 화학식 R1-R2-R3-R4로 표현될 수 있다. 기능성 모이어티에서, R1, R2, R3 및 R4는 아미드, 에스테르, 카르바메이트, 우레아 또는 하이드라존 결합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 임의의 적합한 연결 방식을 통해 함께 연결된다. 본 발명의 개시에서, 아미드 결합은 "-CO-NH-"로 표현될 수 있고, 에스테르 결합은 "-C(O)-O-"로 표현될 수 있고, 카르바메이트 결합은 "-NH-C(O)-O-"로 표현될 수 있고, 우레아 결합은 "-NH-CO-NH-"로 표현될 수 있고, 하이드라존 결합은 "-CH=N-NH-"로 표현될 수 있다.
R1은 생체분자 R5에 대한 보호기이다. 이는 생체분자가 다른 분자에 의해 방해되는 것을 방지하기 위해 이를 이의 리간드 또는 수용체에 결합하는 것을 방지할 수 있는 임의의 기, 예를 들어, 종양 또는 염증 미세환경과 같은 병리학적 미세환경에 도달하기 전에 이를 이의 리간드 또는 수용체에 결합하는 것을 방지하는 임의의 기로부터 선택될 수 있다. 적합한 R1은 폴리에틸렌 글리콜-C1-5 알킬카르보닐, 나프틸카르보닐, 퀴놀릴카르보닐, 플루오레닐카르보닐, 아다만틸카르보닐,
Figure pct00004
로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며,
상기 식에서, 각각의 R은 독립적으로 C1-4알킬이고; 각각의 n은 독립적으로 1 내지 30000의 범위 내의 정수, 예를 들어, 1 내지 15000, 1 내지 5000, 1 내지 2000, 1 내지 300, 1 내지 150, 1 내지 50, 1 내지 20 또는 3 내지 12의 범위 내의 정수이고; 폴리에틸린 글리콜 또는 pegm은 44 내지 132000의 범위, 예를 들어, 1000 내지 50000 또는 10000 내지 30000의 범위 내의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 나타내고; m은 폴리에틸렌 글리콜의 분자량을 나타내고; 물결선은 R1이 R2에 연결되는 위치를 나타낸다.
일부 구현예에서, R1은 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:
Figure pct00005
Figure pct00006
.
일반적으로, 돌연변이 위치가 생체분자의 기능성 도메인, 예를 들어, 항체의 CDR에 존재하는 경우, R1의 분자량에 대한 특정 제한은 없고, R1은 비교적 낮은 분자량을 가질 수 있다. 돌연변이 위치가 생체분자의 기능성 도메인 외부, 예를 들어, 항체의 비-CDR에 존재하는 경우, R1은 바람직하게는 생체분자의 컨쥬게이트의 분자량이 5000 이상, 바람직하게는 8000 이상, 더욱 바람직하게는 10000 이상이 되도록 하기 위해 R1-R2-R3-R4의 분자량이 200 초과, 바람직하게는 500 초과, 더욱 바람직하게는 1000 초과가 되도록 선택됨으로써 생체분자가 병리학적 미세환경에 도달하기 전에 이의 리간드 또는 수용체와 결합하는 것을 더 잘 방지한다.
본 발명의 개시에서, R2는 절단 가능한 링커 아암이다. 이는 단백질분해 효소, 프로테아제 또는 펩티다제에 의해 활성화될 수 있는 펩티드 또는 병리학적 미세환경에서 산성에 의해 활성화될 수 있는 화학 결합일 수 있다. 본 발명의 개시에서, 단백질분해 효소, 프로테아제 또는 펩티다제는 병리학적 미세환경에 존재하는 다양한 단백질분해 효소, 프로테아제 또는 펩티다제일 수 있다. 예를 들어, 프로테아제는 시스테인 프로테아제, 아스파테이트 프로테아제, 글루탐산 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 젤라티나제, 메탈로프로테이나제, 또는 아스파라긴 펩티드 리아제일 수 있다. 일부 구현예에서, R2는 레구마인(Legumain), 카텝신 B(Cathepsin B), 카텝신 C, 카텝신 D, 카텝신 E, 카텝신 K, 카텝신 L, 칼리크레인(kallikrein), hKl, hKlO, hK15, 플라스민, 콜라게나제, 타입 IV 콜라게나제, 아스트로멜리신(astromelysin), 인자 Xa, 키모트립신-유사 프로테아제, 트립신-유사 프로테아제, 엘라스타제-유사 프로테아제, 섭틸리신(subtilisin)-유사 프로테아제, 악티니다인(actinidain), 브로멜라인(bromelain), 칼파인(calpain), 카스파제(caspase), 카스파제-3, Mirl-CP, 파파인(papain), HIV-1 프로테아제, HSV 프로테아제, CMV 프로테아제, 키모슴(chymosm), 펩슴(pepsm), 마트립타제(matriptase), 레구마인, 플라스멥슴(plasmepsm), 네펜테신(nepenthesin), 메탈로엑소펩티다제(metalloexopeptidase), 메탈로엔도펩티다제(metalloendopeptidase), 매트릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloprotease; MMP), MMPl, MMP2, MMP3, MMP8, MMP9, MMPlO, MMP11, MMP12, MMP13, MMP14, ADAMlO, ADAM12, 우로키나제 플라스미노겐 활성제(uPA), 넨테로키나제(nenterokinase), 전립선 특이적 항원(PSA, hK3), 인터루킨-113 전환 효소, 트롬빈, FAP (FAP-a), 메프린(meprin), 그랜자임(granzyme), 디펩티딜 펩티다제 및 디펩티딜 펩티다제 IV(DPPIV/CD26) 중 적어도 하나에 의해 절단될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 개시는 구체적으로 레구마인에 관한 것으로, 이는 주로 종양 미세환경에서 종양 세포에 의해 발현되고 분비된다. 종양 관련 대식세포(M2 타입)는 또한 레구마인의 발현에 의해 단핵구 및 염증성 대식세포(M1 타입)와 상이하다. 본 발명의 개시에서, 펩티드는 단백질분해 효소의 기질이다. 이는 단백질분해 효소에 의해 인지되고 절단될 수 있다.
본 발명의 개시의 R2는 -R2a-, -R2b-, -R2a-N-, -R2a-D-, -R2a-AAN-, -R2a-AAD- 또는 -R2a-R2b-로 표현될 수 있으며; 여기서 R2a는 하나 이상의 단백질분해 효소에 의해 아미드 결합에서 절단될 수 있는 펩티드이고; R2b는 R3와 함께 카르바메이트를 형성하는 측쇄에 질소를 갖는 일종의 펩티드이고, 카르바메이트는 하나 이상의 단백질분해 효소에 의해 절단될 수 있고; A는 알라닌이고; N은 R3와 함께 카르바메이트를 형성하는 측쇄에 질소를 갖는 아스파라긴이고, 카르바메이트는 레구마인에 의해 절단될 수 있고; D는 R3와 함께 카르바메이트를 형성하는 측쇄에 질소를 갖는 아스파르트산이고, 카르바메이트는 그랜자임 B에 의해 절단될 수 있다. R2a 및 R2b는 아미드 결합을 형성함으로써 연결될 수 있다. 레구마인 후, 그랜자임 B는 R2와 R3 사이의 결합(예를 들어, 카르바메이트)을 절단하고, R3는 신속하게 자가방출을 겪을 수 있다. 이후, R4 모이어티가 유지될 수 있다. 다른 효소는 R2의 아미드 결합을 절단할 수 있으며, 이는 링커에 일부 아미노산 잔기가 남아 있도록 할 수 있고, 이에 따라 R3의 자가방출이 발생하지 않을 것이다. 상기 R2의 예는 LTPRLGPAAN(SEQ ID NO:84), GPAAN(SEQ ID NO:85) 및 LSGRSDN(SEQ ID NO:86)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 단백질분해 효소에 의해 활성화될 수 있는 적합한 펩티드는 트리펩티드일 수 있다. 당 분야에 공지된 병리학적 미세환경에서 단백질분해 효소에 의해 인지되고 절단(활성화)될 수 있는 임의의 기질 펩티드가 본원에 개시된 바와 같이 R2로 사용될 수 있다. 상기 펩티드는 WO 2016/026458호에 개시된 구조를 가질 수 있으며, 이의 전체내용은 참조로서 본 발명의 개시에 포함된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시에서 사용하기에 적합한 트리펩티드 구조에서, R1에 연결된 아미노산 잔기는 Ala, Thr, Val 및 Ile로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 중간 아미노산 잔기는 Ala, Thr, Val 및 Asn으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, R3에 연결된 아미노산 잔기는 Asn 및 Asp로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일반적으로, R2는 아미드, 에스테르, 카르바메이트, 우레아 또는 하이드라존 결합의 연결 방식으로 이의 아미노산 잔기의 아미노기를 통해 R1에 연결되고, 아미드, 에스테르, 카르바메이트, 우레아 또는 하이드라존 결합의 연결 방식으로 이의 아미노산 잔기의 카르복실기를 통해 R3에 연결된다. 본 발명의 개시의 일부 바람직한 구현예에서, 트리펩티드는 Ala-Ala-Asn 및 Ala-Ala-Asp로 구성된 군으로부터 선택된다. Ala-Ala-Asn은 레구마인에 의해 인지되고 절단될 수 있고, Ala-Ala-Asp는 그랜자임에 의해 인지되고 절단될 수 있다.
일부 구현예에서, R2는 병리학적 미세환경에서 산성에 의해 활성화될 수 있는 화학 결합일 수 있다. 상기 결합은 아미드 결합, 에스테르 결합, 카르바메이트 결합, 우레아 결합 또는 하이드라존 결합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. R2가 화학 결합인 경우, 본원에 개시된 바와 같은 기능성 모이어티는 화학식 R1-R2-R3-R4로 표현될 수 있으며, 여기서 R1은 병리학적 미세환경에서 산성에 의해 활성화될 수 있는 화학 결합에 의해 R3에 연결된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, R1-R2-R3-R4의 구조는 하기와 같이 표현될 수 있다:
Figure pct00007
상기 식에서, X 및 Y는 각각 독립적으로 NR' 또는 O이고, Z는 H 또는 C1-10알킬, 바람직하게는 C1-4알킬이고, R'은 H 또는 C1-4알킬이고; R3는 아미드, 에스테르, 카르바메이트, 우레아 또는 하이드라존 결합의 연결 방식으로 X 및 Y를 통해 각각 R1 및 R4에 연결된다.
일부 구현예에서, R1-R2-R3-R4의 구조는 하기와 같이 표현될 수 있다:
Figure pct00008
.
본 발명의 개시에서, R3는 R4-S-cys-R5를 방출하기 위해 R2의 절단 후 자동으로 쉐딩될 수 있는 자동으로 절단 가능한 링커 아암일 수 있다. 예를 들어, 상기 링커는 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다:
Figure pct00009
상기 식에서, X 및 Y는 각각 독립적으로 NR' 또는 O이고, Z는 H 또는 C1-10알킬, 바람직하게는 C1-4알킬이고; R은 C1-4알킬이고; R'은 H 또는 C1-4알킬이고; 여기서, R4는 아미드 결합, 에스테르 결합, 카르바메이트 결합, 우레아 결합 및 하이드라존 결합과 같은 결합의 방식으로 상기 화학식에서 Y 또는 N을 통해 R3에 연결된다. 일부 구현예에서, R3는 -NH-페닐-CH2O-, -NH-페닐-CH=N-, -NH-페닐-C(CH3)=N-, -O-페닐-CH=N- 및 -O-페닐-C(CH3)=N-로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, R3는 병리학적 미세환경에서 산성에 의해 활성화될 수 있는 화학 결합이다. 화학 결합은 아미드 결합, 에스테르 결합, 카르바메이트 결합, 우레아 결합 및 하이드라존 결합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
R3가 산성에 의해 활성화될 수 있는 화학 결합인 경우, R2는 부재할 수 있어, R1-R3-R4-S-cys-R5는 단지 산성에 의해 활성화될 수 있다. 다른 한편으로, R2가 부재하는 경우, R3는 산성에 의해 활성화될 수 있는 화학 결합이어야 한다.
일부 구현예에서, R3는 하기 구조 중 임의의 구조로 표현된다:
Figure pct00010
.
상기 화학식 R3-1 내지 R3-12에서, R2 또는 R2가 부재하는 경우 R1은 아미드 결합, 에스테르 결합, 카르바메이트 결합, 우레아 결합 및 하이드라존 결합을 형성하는 한 화학식의 어느 한 말단에 연결될 수 있다.
본 발명의 개시에서, R4는 R2 및 R3의 절단 후 생체분자의 이의 항원, 리간드 또는 수용체에 대한 결합 능력을 회복시키거나, 유지시키거나, 감소시키거나, 촉진할 수 있는 결합 기이다. 일부 구현예에서, 결과로서 발생된 R4-s-Cys-R5는 R2 및 R3의 절단 후 항원, 리간드 또는 수용체에 대해 고유 R5의 60% 초과의 친화성을 나타낸다.
적합한 R4는 -R4-a-R4-b-R4-c-로 표현될 수 있으며, 여기서 R4-a는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다;
Figure pct00011
상기 식에서, Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 H 및 C1-6 알킬 또는 C1-6 알콕실로 구성된 군으로부터 선택되고;
R4-b는 하기로 구성된 군으로부터 선택되고;
Figure pct00012
상기 식에서, 화학식 R4-b1에서, Rc는 부재하거나, C1-12 알킬, C1-12알콕시-C1-12알킬, C1-12알킬-C3-8사이클로알킬, (C1-4알킬-O)p-C1-12알킬, C1-12알킬카르보닐아미노-(C1-4알킬-O)p-C1-12알킬, 페닐-C1-12알킬, C3-8사이클로알킬, C1-12알킬-C3-8사이클로알킬-C1-12알킬 및 C1-12알킬-페닐-C1-12알킬로 구성된 군으로부터 선택되고; 화학식 R4-b2에서, Rc는 아미노기의 N 원자에서 치환된 Ra-1 및 Ra-2를 갖는 C1-12알킬아미노이고, 화학식 4-b3에서, Rc는 알킬의 말단의 마지막 C 원자가 Ra-1, Ra-2 및 R2-3에 의해 치환된 C1-12알킬이고, 여기서 Ra-1, Ra-2 및 Ra-3는 각각 독립적으로 C1-12알킬, C1-12알킬-OH 및 C1-12알킬-NR"R"'로 구성된 군으로부터 선택되고, 여기서 R" 및 R"'는 각각 독립적으로 H 및 C1-12알킬로 구성된 군으로부터 선택되고; 여기서, 화학식 R4-b2 및 R4-b3에서, R4-b는 Ra-1, Ra-2 및 Ra-3 중 적어도 하나를 통해 R4-c에 연결되고;
R4-c는 하기로 구성된 군으로부터 선택되고;
Figure pct00013
상기 식에서, Rx는 H, 할로 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 선택되고; p는 1 내지 10의 범위 내의 정수, 예를 들어, 1 내지 5의 범위 내의 정수이고; q는 1 내지 4의 범위 내의 정수, 예를 들어, 1 내지 2의 범위 내의 정수이고; 단, R4-a가 화학식 R4-a2, R4-a3 및 R4-a4로 구성된 군으로부터 선택되는 경우 R4-c는 부재하고;
여기서, R3는 R4의 R4-c를 통해 R4에 연결되고, R4-a의 각각의 화학식에 제시된 물결선은 R4-a가 R4-b에 연결되는 위치를 나타낸다. 바람직하게는, 화학식 R4c-III, Rc4-IV, R4c-VI 및 R4c-VII에서, R3는 이들 기의 탄소 원자에 연결된다.
일반적으로, R4는 말레이미드(R4-a1), 아세틸렌(R4-a2), 비닐(R4-a3), 일치환된 부텐이산(R4-a4), 또는 이치환된 말레이미드(R4-a4)를 통해 R5의 시스테인의 S 원자에 연결된다.
일부 구현예에서, R4는 하기로 구성된 군으로부터 선택되고;
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
상기 식에서, 물결선은 R4가 R3에 연결되는 위치를 나타낸다.
일부 구현예에서, R4는 하기로 표현된다:
Figure pct00018
상기 식에서,
Ra는 C1-12 알킬, C1-12 알콕시, C1-12알킬카르보닐, 1개 또는 2개의 할로겐으로 선택적으로 치환되는 페녹시 또는 페닐 아미노, C1-12알킬아미노, C1-12알콕시-C1-12알킬아미노, C1-12알킬카르보닐옥시, C1-12알킬-C3-8사이클로알킬카르보닐옥시, (C1-4알킬-O)p-C1-12알킬카르보닐옥시, C1-12알킬카르보닐아미노-(C1-4알킬-O)p-C1-12알킬카르보닐옥시, C1-12알킬카르보닐아미노 및 페닐-C1-12알킬카르보닐아미노로 구성된 군으로부터 선택되고;
p는 1 내지 10의 범위 내의 정수, 예를 들어, 1 내지 5의 범위 내의 정수이고;
여기서, R3는 R4의 Ra를 통해 R4에 연결되고, R4의 말레이미드기를 통해 R5의 시스테인의 티올기에 연결된다.
본 발명의 개시의 컨쥬게이트에서, R4는 R5에 함유된 시스테인의 S를 통해 R5에 공유적으로 연결된다. R1-R2는 단백질분해 효소에 의해 또는 병리학적 미세환경의 산성 조건하에서 R3-R4-S-cys-R5로부터 절단되고, R3-R4-S-cys-R5는 방출된다. 이후, R3는 자동으로 쉐딩되고, R4-S-cys-R5가 방출된다. R4-S-cys-R5는 리간드 또는 수용체에 대한 R5의 결합 능력을 회복시키거나 촉진시킬 수 있다.
본 발명의 개시에서, 표시된 화학식 각각에서 사용되는 물결선(들)은 물결선(들)을 함유하는 기의 다른 기에 대한 연결 위치를 나타내고, 항체의 아미노산 잔기에 대해 언급된 아미노산의 모든 위치 번호는 케이뱃(Kabat) 넘버링에 기초한 것이 이해되어야 한다.
상기 기재된 바와 같이 R5는 시스테인으로 돌연변이된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는 생체분자를 나타낸다. 실제로, R5는 도입된 시스테인의 티올기의 수소 원자가 없는 생체분자의 모이어티이다. 티올기의 수소 원자의 부재는 R5가 본 발명의 개시의 R4에 연결되는 기로 간주되는 것을 가능하게 한다.
본 발명의 개시의 컨쥬게이트는 DTT, TCEP 또는 다른 환원제에 의해 돌연변이체 생체분자를 환원시키고; Cu2SO4, 데하이드로아스코르브산 또는 다른 산화제에 의해 산화시킨 후; 액체상 또는 고체상 조건에서 산화된 생체분자(R5)를 R1-R2-R3-R4에 컨쥬게이션시키는 것을 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 최종 생성물은 액체상으로 수집될 수 있다.
따라서, 컨쥬게이트에 더하여, 본 발명의 개시는 또한 기능성 모이어티, 즉, R1-R2-R3-R4; R2-R3-R4; R3-R4-S-cys-R5; R4-S-cys-R5; 및 돌연변이된 생체분자를 포함하며; 여기서, R1, R2, R3, R3, R5 및 이들의 연결 방식 및 돌연변이된 생체분자는 본 발명의 개시의 임의의 부분 또는 임의의 구현예에서와 같이 정의된다. 일부 구현예에서, 기능성 모이어티는 S1-S64로 제시된다. 본 발명의 개시에서, -S-cys-는 R4가 R5에서의 돌연변이에 의해 도입된 시스테인의 티올기를 통해 R5에 공유적으로 연결되는 것을 나타낸다. R3-R4-S-cys-R5는 단백질분해 효소에 의해 및 병리학적 미세환경의 산성 조건하에서 R1-R2의 절단에 의해 생성된 컨쥬게이트이다. 일반적으로, R2로부터의 R3의 분리 후, R2에 이전에 연결된 R3의 기는 하이드록실(-OH) 또는 아미노기(-NH2)를 형성한다. R4-S-cys-R5는 R3의 자동 쉐딩 후에 형성된 컨쥬게이트이다. 일반적으로, R3의 자동 쉐딩 후, R3에 이전에 연결된 R4의 기는 하이드록실(-OH) 또는 아미노기(-NH2)를 형성한다.
본원에 기재된 바와 같은 컨쥬게이트, 기능성 모이어티, R2-R3-R4, R3-R4-S-cys-R5 및 R4-S-cys-R5는 당 분야에 공지된 방법에 의해 합성될 수 있다. 예를 들어, 이들은 본 출원의 실시예 1에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 개시는 또한 본원에 기재된 바와 같은 컨쥬게이트를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다. 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 담체는 임의의 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제일 수 있으며, 이는 투여 형태 및 투여 방식에 따라 가변적일 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 일반적으로 안전하고 비독성이며, 충전제, 희석제, 응고제, 접착제, 윤활제, 활택제, 안정화제, 착색제, 습윤제 및 붕해제 등을 포함하는 약학 산업에서 약학적 조성물을 제형화하는 데 사용되는 임의의 공지된 물질을 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체는 당, 예를 들어, 락토스 또는 수크로스, 만니톨 또는 소르비톨; 셀룰로스 제형 및/또는 칼슘 포스페이트, 예를 들어, 트리칼슘 포스페이트 또는 칼슘 하이드로겐 포스페이트; 전분, 예를 들어, 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트래거캔쓰, 메틸 셀룰로스, 하이드록실프로필메틸 셀룰로스, 소듐 카르복실 메틸 셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈; 실리카, 탤크, 스테아르산 또는 이의 염, 예를 들어, 마그네슘 스테아레이트 또는 칼슘 스테아레이트; 및/또는 폴리에틸렌 글리콜 등을 포함한다. 약학적으로 허용되는 담체를 선택하는 경우, 주요 고려사항은 약학적 조성물의 투여 방식이다. 이는 당 분야에 널리 공지되어 있다.
약학적 조성물은 치료적으로 또는 예방적으로 유효한 양으로 컨쥬게이트를 포함할 수 있다. "유효량"은 성분의 양이 원하는 반응을 발생시키기에 충분한 것을 나타낸다. 구체적인 유효량은 치료되는 특정 질병, 환자의 신체 상태, 예를 들어, 체중, 연령 및 성별, 치료 기간, 공동 투여되는 요법(존재시) 및 사용되는 특정 제형과 같은 다양한 요인에 좌우될 것이다. 일반적으로, 본원에 기재된 바와 같은 "유효량"은 생체분자의 통상적인 양이다. 그러나, 일부 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물에 함유된 컨쥬게이트의 치료적 또는 예방적 유효량은 생체분자의 통상적인 양보다 적을 수 있으나, 더 나은 치료 또는 예방 효과를 발생시킬 수 있는데, 이는 상기 생체분자가 병리학적 미세환경에 도달하기 전에 이의 리간드 또는 수용체에 대한 결합으로부터 보호기에 의해 보호되기 때문이다.
본 발명의 개시의 약학적 조성물은 정제, 캡슐, 주사제 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 적합한 투여 형태로 제형화될 수 있으며, 이는 예상 목적을 달성하기 위해 임의의 적합한 경로를 통해 투여될 수 있다. 예를 들어, 이는 비경구, 피하, 정맥내, 근내, 복막내, 경피, 경구, 척수내, 두개내, 비내 또는 외부 투여될 수 있다. 약물의 용량은 환자의 연령, 건강 상태 및 체중, 병행 수행되는 치료, 및 치료 빈도 등에 좌우될 수 있다. 본 발명의 개시의 약학적 조성물은 이를 필요로 하는 임의의 대상체, 예를 들어, 포유동물, 특히 인간에게 투여될 수 있다.
종양 환자에서, 종양 항원을 보유하는 종양 세포 또는 항원 제시 세포(APC)는 T 세포에 대한 결합을 통해 숙주에 의한 종양의 면역학적 사멸을 부분적으로 또는 완전히 억제한다. 그러나, 본 발명의 개시의 컨쥬게이트는 병리학적 미세환경에서 단백질분해 효소, 특히 레구마인 또는 그랜자임에 의해 또는 산성 조건하에서 활성화되고 방출된다. 예를 들어, 생체분자가 IL2, 항-CD28 항체 또는 항-PD-1 항체 등인 본 발명의 개시의 컨쥬게이트는 T 세포의 증식을 선택적으로 자극할 수 있거나, 항-종양 사이토카인을 분비하는 이의 기능을 향상시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 개시의 컨쥬게이트는 개체의 면역 장벽을 효과적으로 돌파하고, 병리학적 미세환경에 도달한 후, 병리학적 미세환경에서 활성화되고 방출될 수 있다. 결과적으로, 이는 종양 또는 염증성 미세환경에서 T 세포 등의 증식 또는 사멸 효과를 선택적으로 촉진하여 낮은 자가면역 및 높은 효능을 실현할 수 있다.
따라서, 본 발명의 개시에 개시된 컨쥬게이트, R4-S-cys-R5 또는 돌연변이된 생체분자 각각은 종양 또는 염증을 치료하는 데 사용될 수 있거나, 종양 또는 염증을 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한 활성 성분으로 사용될 수 있다. 본원에 기재된 종양 또는 염증은 방광, 뇌, 유방, 자궁경부, 결장-직장, 식도, 신장, 간, 폐, 비인두, 췌장, 전립선, 피부, 위, 자궁, 난소, 고환 및 혈액 등의 암을 포함하나 이에 제한되지는 않는 본원에 기재된 바와 같은 생체분자에 의해 치료되는 것으로 공지된 임의의 종양 또는 염증일 수 있다. 구체적으로, 암은 방광암, 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, 식도암, 신장암, 간암, 폐암, 비인두암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 위암, 자궁암, 난소암, 고환암 및 혈액암을 포함한다.
치료적 또는 예방적 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 컨쥬게이트 또는 이의 약학적 조성물을 종양 또는 염증을 치료하거나 예방할 필요가 있는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 종양 또는 염증을 치료하거나 예방하기 위한 방법이 추가로 포함된다. 상기 방법은 임의의 공지된 방사선요법 또는 면역요법과 조합하여 이용될 수 있다.
본 발명의 개시에서 사용되는 용어 "포함하는(comprising)" 및 "포함하는(including)" 또는 유사한 표현이 또한 "~로 구성된" 등을 의미하는 것이 이해되어야 한다. 모든 중량 백분율 또는 부피 백분율의 합은 100%와 동일해야 한다. 달리 명시되지 않는 한, 실시예에서 사용된 다양한 시약 및 제품은 상업적 제품이다. 달리 명시되지 않는 한, 실시예에서 언급된 방법은 통상적인 기술에 따라 구현되었다. 하기 실시예는 본 발명의 개시의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
서열 정보는 하기 요약되어 있다:
Figure pct00019
Figure pct00020
실시예 1: 활성화 가능 및 결합 아암의 화학 구조의 합성
R2가 Ala-Ala-Asn의 아미노산 서열을 갖고, R3가 PABC (R3-5)인 경우, 합성 반응식은 하기 제시된다:
Figure pct00021
R1 및 R4가 상이한 치환기인 경우, 표 1에 제시된 하기 화합물이 획득되었다.
표 1
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
S15에 의해 예시된 바와 같이, 구체적 합성 과정은 하기 제시되었다:
Figure pct00025
1) Fmoc-Asn(Trt)-OH(20 g, 0.03 mol), 2-(7-아자벤조트리아졸)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오포스페이트(HATU)(15 g, 0.04 mol) 및 DMF(200mL)를 3-목 플라스크에 첨가하고, 30분 동안 교반하였다. p-아미노벤질 알콜(4.1 g, 0.03 mol) 및 N,N-디이소프로필 에틸아민(8.7 g, 0.06 mol)을 각각 0℃에서 첨가한 후, 3시간 동안 실온에서 교반하였다. 대부분의 DMF를 회전 증발에 의해 제거하였다. 잔여물을 아세트산 아세테이트(200mL)에 용해시키고, 포화 암모니아 클로라이드 용액 및 포화 소듐 클로라이드 용액으로 세척한 후, 무수 소듐 설페이트 상에서 건조시킨 후, 여과시켰다. 용매를 증발에 의해 제거하였다. 미정제 생성물을 두들겨서 백색 고체 Fmoc-Asn(Trt)-PABC(21.3g; 수율: 90%)를 획득하였다.
2) Fmoc-Asn(Trt)-PABC(16.0g, 22mmol)를 N,N-디메틸 포름아미드(80mL)에 용해시켰다. 피페리딘(30mL)을 첨가한 후, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 용매를 감압하에서 증발에 의해 제거하였다. 잔여물을 진공 오븐에서 고진공하에서 건조시켜 소량의 피페리딘을 제거하여 9.8g의 담황색 고체 NH2-Asn(Trt)-PABC를 생성시켰으며, 이는 정제 없이 다음 단계에서 사용할 수 있었다.
3) Alloc-Ala-Ala-OH(5.0g, 20.4mmol), 벤조트리아졸-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오포스페이트(HBTU)(11.6g, 30.6mmol) 및 DMF(50mL)를 3-목 플라스크에 첨가하고, 얼음 배쓰에서 30분 동안 교반하였다. NH2-Asn(Trt)-PABC(9.8g, 20.4mmol) 및 N,N-디이소프로필 에틸아민(7.89 g, 61.2 mmol)을 각각 0℃에서 첨가한 후, 밤새 실온에서 교반하였다. 용매를 감압하에서 증발에 의해 제거하였다. 잔여물을 아세트산 아세테이트(200mL)에 용해시키고, 포화 암모니아 클로라이드 용액 및 포화 소듐 클로라이드 용액으로 세척한 후, 무수 소듐 설페이트 상에서 건조시킨 후, 여과시켰다. 용매를 증발에 의해 제거하였다. 생성된 미정제 생성물을 재결정화에 적용시켜 백색 고체 Alloc-AAN(Trt)-PABC(13.0g; 수율: 90%)를 획득하였다.
4) Alloc-AAN(Trt)-PABC(10.0 g, 14.2 mmol)를 디클로로메탄(100 mL)에 용해시켰다. 트리플루오로아세트산(20 mL)을 첨가한 후, 4시간 동안 실온에서 교반하였다. 물 및 분획으로 세척한 후, 유기상을 무수 소듐 설페이트 상에서 건조시켰다. 용매를 감압하에서 증발에 의해 제거하고, 잔여 트리플루오로아세트산을 고진공하에서 증발에 의해 제거하였다. 미정제 생성물을 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 Alloc-AAN-PABC(5.9g; 수율: 89%)를 획득하였다.
5) 디클로로메탄(10 mL)에 용해된 Alloc-AAN-PABC(467 mg, 1.01 mmol)를 3-목 플라스크에 첨가하였다. 디클로로메탄 중 4-니트로페닐 클로로포르메이트(406 mg, 2.02 mmol) 및 디클로로메탄 중 피리딘(160 mg, 2.03 mmol)을 각각 질소 가스 보호하에서 얼음 배쓰 내의 플라스크에 적하한 후, 밤새 실온에서 교반하였다. 1-(6-아미노헥실)-1H-피롤로-2,5-디온(235mg, 1.2mmol)을 상기 용액에 배치(batch)로 첨가하고, 4시간 동안 실온에서 반응시켰다. 반응 용액을 회전 증발로 건조시켰다. 생성된 미정제 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 백색 고체 S15-1(540mg; 수율: 80%)을 획득하였다.
6) DMF(10ml), S15-1(208mg, 0.31mmol), 아세트산(274mg, 4.65mmol), 트리페닐포스핀 팔라듐(72mg, 0.062mmol) 및 트리부틸틴 하이드라이드(1.17g, 4.03mmol)를 1-목 플라스크에 연속적으로 첨가하였다. 플라스크 내의 공기를 질소 가스로 교체한 후, 혼합물을 S15-1이 완전히 반응할 때까지 실온에서 교반하였다. 반응이 완료된 후, DMF를 감압하에서 증발에 의해 제거하였다. 미정제 생성물을 분리시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, S15-2(백색 고체, 116mg, 수율: 62%)를 획득하였다.
7) S15-R1(940mg, 0.18 mmol), 벤조트리아졸-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오포스페이트(HBTU)(95mg, 0.25mmol) 및 DMF(10mL)를 3-목 플라스크에 첨가한 후, 30분 동안 얼음 배쓰에서 교반하였다. 이후, 화합물 S15-2(110mg, 0.18 mmol) 및 N,N-디이소프로필 에틸아민(70mg, 0.54mmol)을 각각 0℃에서 첨가한 후, 밤새 실온에서 교반하였다. 용매를 감압하에서 증발에 의해 제거하였다. 미정제 생성물을 분리시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 화합물 S15인 백색 고체(418mg; 수율: 40%)를 획득하였다.
R2가 Ala-Ala-Asp의 아미노산 서열을 갖고, R3가 PABC인 경우, 합성 반응식은 하기 제시된다:
Figure pct00026
R1 및 R4가 상이한 치환기인 경우, 표 2의 하기 화합물이 획득되었다.
표 2
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
S16에 의해 예시된 바와 같이, 구체적 합성 과정은 하기 제시되었다:
Figure pct00030
1) Fmoc-Asp(Alloc)-OH(13.2 g, 0.03 mol), 2-(7-아자벤조트리아졸)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오포스페이트(HATU)(15 g, 0.04 mol) 및 DMF(200mL)를 3-목 플라스크에 첨가하고, 30분 동안 교반하였다. p-아미노벤질 알콜(4.1 g, 0.03 mol) 및 N,N-디이소프로필 에틸아민(8.7 g, 0.06 mol)을 각각 0℃에서 첨가한 후, 3시간 동안 실온에서 교반하였다. DMF를 회전 증발에 의해 제거하였다. 잔여물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 백색 고체 Fmoc-Asp(Alloc)-PABC(14.7g; 수율: 89%)를 획득하였다.
2) Fmoc-Asp(Alloc)-PABC(14.0 g, 25mmol)를 N,N-디메틸 포름아미드(80mL)에 용해시켰다. 피페리딘(30mL)을 첨가한 후, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 용매를 감압하에서 증발에 의해 제거하였다. 잔여물을 진공 오븐에서 고진공하에서 건조시켜 8.0g의 담황색 고체 NH2-Asp(Alloc)-PABC를 생성시켰고, 이는 정제 없이 다음 단계에서 사용할 수 있었다.
3) Fmoc-Ala-Ala-OH(7.8 g, 20.4 mmol), 벤조트리아졸-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오포스페이트(HBTU)(11.6g, 30.6mmol) 및 DMF(50mL)를 3-목 플라스크에 첨가하고, 얼음 배쓰에서 30분 동안 교반하였다. NH2-Asp(Alloc)-PABC(6.6g, 20.4mmol) 및 N,N-디이소프로필 에틸아민(7.89 g, 61.2 mmol)을 각각 0℃에서 첨가한 후, 밤새 실온에서 교반하였다. 용매를 감압하에서 증발에 의해 제거하였다. 잔여물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 백색 고체 Fmoc-AAD(Alloc)-PABC(12.6g; 수율: 90%)를 획득하였다.
4) Fmoc-AAD(Alloc)-PABC(12 g, 17.5mmol)를 디클로로메탄(80 mL)에 용해시켰다. 피페리딘(30mL)을 첨가한 후, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 용매를 감압하에서 증발에 의해 제거하였다. 잔여물을 진공 오븐에서 고진공하에서 건조시켜 7.0 g의 담황색 고체를 획득하였고, 이를 다음 단계에서 직접 사용하였다.
5) 중간체 S16-R1(522mg, 0.1mmol), 2-(7-아자벤조트리아졸)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오포스페이트(46mg, 0.12mmol) 및 DMF(20mL)를 3-목 플라스크에 첨가하고, 30분 동안 교반하였다. NH2-AAD(Alloc)-PABC(46mg, 0.1mmol) 및 N,N-디이소프로필 에틸아민(38.7mg, 0.3mmol)을 각각 0℃에서 첨가한 후, 3시간 동안 실온에서 교반하였다. DMF를 회전 증발에 의해 제거하였다. 잔여물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 S16-1(백색 고체, 251mg, 수율: 45%)을 획득하였다.
6) 디클로로메탄(10mL)에 용해된 S16-1(240mg, 0.046 mmol)을 3-목 플라스크에 첨가하였다. 디클로로메탄 중 4-니트로페닐 클로로포르메이트(18 mg, 0.093 mmol) 및 디클로로메탄 중 피리딘(7.3 mg, 0.093 mmol)을 각각 질소 가스 보호하에서 얼음 배쓰 내의 플라스크에 적하한 후, 밤새 실온에서 교반하였다. R4-7(11mg,0.055mmol)을 상기 용액에 첨가하고, 4시간 동안 실온에서 반응시켰다. 반응 용액을 회전 증발로 건조시켰다. 생성된 미정제 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 백색 고체 S16-2(96mg; 수율: 38%)을 획득하였다.
7) DMF(10ml), 화합물 S16-2(96mg, 0.016mmol), 아세트산(127mg, 2.15mmol), 트리페닐포스핀 팔라듐(33mg, 0.029mmol) 및 트리부틸틴 하이드라이드(0.54g, 1.86mmol)를 1-목 플라스크에 연속적으로 첨가하였다. 플라스크 내의 공기를 질소 가스로 교체한 후, 혼합물을 S16-2가 완전히 반응할 때까지 실온에서 교반하였다. 반응이 완료된 후, DMF를 감압하에서 증발에 의해 제거하였다. 미정제 생성물을 분리시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 화합물 S16인 백색 고체(54 mg; 수율: 62%)를 획득하였다.
산성 활성화 가능한 기가 함유된 경우, 합성 반응식은 하기와 같이 제시되었다:
Figure pct00031
S20에 의해 예시된 바와 같이, 구체적 합성 과정은 하기 제시되었다:
Figure pct00032
1) R1-10(3.1 g, 0.01 mol), 2-(7-아자벤조트리아졸)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오포스페이트(HATU)(4.56 g, 0.012 mol) 및 DMF(20mL)를 3-목 플라스크에 첨가하고, 30분 동안 교반하였다. S20-1(1.35g, 0.01 mol) 및 N,N-디이소프로필 에틸아민(3.87 g, 0.03 mol)을 각각 0℃에서 첨가한 후, 3시간 동안 실온에서 교반하였다. DMF를 회전 증발에 의해 제거하였다. 잔여물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 담황색 유성 물질 S20-2(2.5g; 수율: 59%)를 획득하였다.
2) S20-2(98mg, 0.23mmol) 및 R4-18(42mg, 0.23mmol)을 칭량하고, 50ml 1-목 플라스크에 연속적으로 첨가하였다. 디클로로메탄(5mL)을 첨가하여 S20-2 및 R4-18을 용해시킨 후, 4A 분자체(81 mg)를 첨가하였다. 플라스크 내의 공기를 질소 가스로 교체한 후, 혼합물을 밤새 실온에서 반응시켰다. 반응 용액을 회전 증발로 건조시켰다. 미정제 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 S20인 백색 고체(81 mg; 수율: 60%)를 획득하였다.
R1, R3 및 R4가 상이한 치환기인 경우, 표 3의 하기 화합물을 획득하였다.
표 3
Figure pct00033
Figure pct00034
화합물 S1-64를 질량 스펙트럼(MS)에 의해 확인하였고, 이의 분자량은 표 4에 제시되었으며, 이는 이들의 구조에 기초하여 계산된 분자량과 일치하였다.
표 4
Figure pct00035
Figure pct00036
실시예 2: 항체의 가변 영역의 CDR에서의 돌연변이 후의 결합 활성에 대한 분석 및 R4에 대한 스크리닝
항-PD-1 항체 1의 아미노산 서열은 WO200815712A1호에 개시되어 있으며, 이의 DNA 서열은 숙주에서의 발현에 최적화되었고, 합성되었다(GENEWIZ, Inc., Suzhou, China). 항-PD-1 항체 2의 아미노산 서열은 WO2006121168A2호에 개시되어 있으며, 이의 DNA 서열은 숙주에서의 발현에 최적화되었고, 합성되었다(GENEWIZ, Inc., Suzhou, China). 항-CTLA-4 항체의 아미노산 서열은 US20150283234호에 개시되어 있으며, 이의 DNA 서열은 최적화되었고, 합성되었다(GENEWIZ, Inc., Suzhou, China). 항-TNFα 항체의 아미노산 서열은 US009534046호에 개시되어 있으며, 이의 DNA 서열은 숙주에서의 발현에 최적화되었고, 합성되었다(GENEWIZ, Inc., Suzhou, China). 항-CD28 항체의 아미노산 서열은 US007939638호에 개시되어 있으며, 이의 DNA 서열은 숙주에서의 발현에 최적화되었고, 합성되었다(GENEWIZ, Inc., Suzhou, China). 합성된 DNA를 절단하고, 변형된 pTT5 벡터(Biovector)에 라이게이션시켜, pTT5-항-PD-1-1, pTT5-항-PD-1-2, pTT5-항-CTLA-4, pTT5-항-TNFα 및 pTT5-항-CD28을 생성시켰다. 주형으로서 pTT5-항-PD-1-1, pTT5-항-CTLA-4, pTT5-항-TNFα 및 pTT5-항-CD28을 이용하고, 돌연변이 위치의 코돈을 시스테인의 코돈으로 대체하도록 프라이머를 설계하고, PCR을 수행하고, 돌연변이된 단편을 절단하고 변형된 pTT5 벡터 내로 작제함으로써 시스테인 돌연변이를 도입시켰다.
발현 숙주는 HEK293T 세포(Life Technologies)였다. 형질감염 전에, HEK293T 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 10% FBS(Gibico)를 함유하는 완전 배지에서 배양하였다. 형질감염 하루 전, 세포를 15 cm 배양 접시에 적절한 밀도로 접종하고, 배양 배지를 낮은 IgG(Gibico)를 갖는 FBS로 변경하였다. 형질감염 6시간 후 또는 2일째에, 배양 배지를 Freestyle293(Gibico)으로 변경하였다.
형질감염 당일에, 세포가 특정 컨플루언스(confluence)에 도달한 경우, 리포펙타민 2000(Life Technologies) 및 PEI(sigma)를 사용하여 표적 단백질을 발현하는 플라스미드를 293T 세포에 공동 형질감염시켰다. 항체 발현 플라스미드는 항체의 중쇄 및 경쇄를 포함하였다. 형질감염 4 및 6일 후에 배양 상층액을 각각 회수하였다. 단백질 또는 항체의 발현 및 활성을 검출하였고, 단백질 또는 항체를 정제하였다.
항체(Ab)의 중쇄 및 경쇄 내의 가변 영역의 과가변 영역은 항체의 항원(Ag) 결합 부위를 구성한다. 항원 결합 부위는 항원 에피토프의 구조에 상보적이므로, 과가변 영역은 또한 항체의 상보성 결정 영역(CDR)로 언급된다. 항-PD-1 항체 1, 항-PD-1 항체 2 및 CTAL4 항체의 경쇄에서 가변 영역의 서열을 정렬하였고, 이들의 CDR은 도 1에 제시되었다.
본 발명의 개시에서, 초기 항체와 비교하여 점 돌연변이를 갖는 각각의 돌연변이체의 활성을 ELISA에 의해 검출하였다. 구체적으로, 96-웰 플레이트를 항체의 항원으로 밤새 코팅한 후, 37℃에서 2시간 동안 1% BSA 차단제(ThermoFisher)로 차단하고, PBST로 3회 세척하였다. 상응하는 항체 또는 상응하는 돌연변이체를 첨가하고, 1시간 동안 37℃에서 결합시킨 후, PBST로 3회 세척하였다. HRP 효소-컨쥬게이션된 항-인간 IgG를 첨가하고, 1시간 동안 37℃에서 결합시킨 후, PBST로 3회 세척하였다. 450nm에서 흡광도를 검출하기 위해 TMB 기질(Solarbio., Inc.)을 사용하였다. 돌연변이체의 결합 강도에 대한 효과를 OD돌연변이 후/OD야생형에 의해 계산하였다.
표 5 및 6에 제시된 바와 같이 상이한 위치에서 돌연변이를 갖는 3개의 항체의 돌연변이체의 결합 활성을 상기 방법에 따라 시험하였다. 표 5 및 6에서, A는 90-110%의 결합 활성을 나타내고, B는 70-90%의 결합 활성을 나타내고, 기호 ↓는 70% 미만의 결합 활성을 나타낸다.
표 5: 결합 활성에 대한 항체의 경쇄 내의 가변 영역의 CDR에서의 돌연변이 위치의 효과
Figure pct00037
Figure pct00038
표 6: 결합 활성에 대한 항체의 중쇄 내의 가변 영역의 CDR에서의 돌연변이 위치의 효과
Figure pct00039
결과는 상이한 항체의 가변 영역에서 G, S 및 T의 일부를 C로 돌연변이시키는 것이 야생형 항체와 비교하여 결합 활성에 대한 영향이 적은 것을 나타내었고, 이는 원래의 결합 활성의 90% 이상이었다. A, I 및 T의 일부를 C로 돌연변이시키는 것은 야생형 항체의 결합 활성의 70-90%인 결합 활성을 발생시켰다.
항-PD1 항체 1의 경쇄 상의 점 돌연변이에 대한 Co-IP 스크리닝으로부터 획득된 결과는 도 2에 제시되며, 여기서 패널 a는 WB에 의해 검출된 발현에 대한 야생형 항체의 돌연변이의 효과를 제시하고, 패널 b는 WB에 의해 검출된 PD1에 대한 돌연변이된 항체의 결합을 제시한다.
R4로의 결합 후 CDR에 돌연변이를 갖는 항체의 돌연변이체의 결합 활성에 대한 분석
표 7-16에 제시된 바와 같이, 경쇄 또는 중쇄의 CDR에서 돌연변이를 갖는 항체를 컨쥬게이션을 위한 소분자의 라이브러리에서 R4에 컨쥬게이션시키고, 이들의 결합 활성을 야생형 항체와 비교(항체에 대한 컨쥬게이트의 결합 활성 / 야생형 항체의 결합 활성 * 100%)하여 분자간 힘을 제공하고 결합 활성을 향상시키는 컨쥬게이션 방식을 획득하였다.
표 7: R4-1 또는 R4-5에 대한 컨쥬게이션 후 경쇄의 CDR에서 돌연변이를 갖는 항-PD-1 항체 1의 돌연변이체의 결합 효과
Figure pct00040
표 8: R4에 대한 컨쥬게이션 후 중쇄의 CDR에서 돌연변이를 갖는 항-PD-1 항체 1의 돌연변이체의 결합 효과
Figure pct00041
표 7 및 8에 따르면, 항-PD-1 항체 1의 CDR에서 A, G, S, Y, T 또는 K를 C로 돌연변이시키고, R4에 결합한 후, 돌연변이체는 80% 초과의 결합 효율을 유지할 수 있었다.
표 9: R4-1 또는 R4-5에 대한 컨쥬게이션 후 경쇄의 CDR에서 돌연변이를 갖는 항-PD-1 항체 2의 돌연변이체의 결합 효과
Figure pct00042
표 10: R4에 대한 컨쥬게이션 후 중쇄의 CDR에서 돌연변이를 갖는 항-PD-1 항체 2의 돌연변이체의 결합 효과
Figure pct00043
표 9 및 10에 따르면, 항-PD-1 항체 2의 CDR에서 G, S, A, Y, K, L 또는 T를 C로 돌연변이시키고, R4에 결합한 후, 돌연변이체는 80% 초과의 결합 효율을 유지할 수 있었다.
표 11: R4-1에 대한 컨쥬게이션 후 경쇄의 CDR에서 돌연변이를 갖는 항-CTLA-4 항체의 돌연변이체의 결합 효과
Figure pct00044
표 12: R4에 대한 컨쥬게이션 후 중쇄의 CDR에서 돌연변이를 갖는 항-CTLA-4 항체의 돌연변이체의 결합 효과
Figure pct00045
표 11 및 12에 따르면, 항-CTLA-4 항체의 CDR에서 A, G, S, L, T, K, Y 또는 D를 C로 돌연변이시키고, R4에 결합한 후, 돌연변이체는 80% 초과의 결합 효율을 유지할 수 있었다.
표 13: R4에 대한 컨쥬게이션 후 경쇄의 CDR에서 돌연변이를 갖는 항-CD28 항체의 돌연변이체의 결합 효과
Figure pct00046
표 14: R4에 대한 컨쥬게이션 후 중쇄의 CDR에서 돌연변이를 갖는 항-CD28 항체의 돌연변이체의 결합 효과
Figure pct00047
표 13 및 14에 따르면, 항-CD28 항체의 CDR에서 G, S, A, I, L, K, Y 또는 T의 돌연변이 위치를 R4에 결합시킴으로써, 돌연변이체는 80% 초과의 결합 효율을 유지할 수 있었다.
표 15: R4에 대한 컨쥬게이션 후 경쇄의 CDR에서 돌연변이를 갖는 항-TNFα 항체의 돌연변이체의 결합 효과
Figure pct00048
표 16: R4에 대한 컨쥬게이션 후 중쇄의 CDR에서 돌연변이를 갖는 항-TNFα 항체의 돌연변이체의 결합 효과
Figure pct00049
표 13 및 14에 따르면, 항-TNFα 항체의 CDR에서 A, G, S, L, I, Y 또는 T를 C로 돌연변이시키고, R4에 결합한 후, 돌연변이체는 80% 초과의 결합 효율을 유지할 수 있었다.
실시예 3: 가변 영역의 비-CDR 내의 높은 상동성의 서열에서 돌연변이를 갖는 돌연변이체의 결합 활성에 대한 분석 및 R1에 대한 스크리닝
항체는 2개의 동일한 경쇄(LC) 및 2개의 동일한 중쇄(HC)를 포함하는 4개의 펩티드 사슬로 구성된다. 사슬은 디설파이드 결합(들) 및 비-공유 결합에 의해 단량체를 형성한다. 2개의 유형의 경쇄, 즉, κ 및 λ, 및 5개의 유형의 중쇄, 즉 μ, δ, γ, ε 및 α가 있다. 항체는 전체적으로 불변 영역 및 가변 영역으로 나뉜다. 가변 영역은 Y형 구조물의 2개의 아암의 말단에 위치한다. 인간화 또는 인간 항체는 특정한 일반성을 가지며, 즉, 이들은 모두 Y형 구조물의 2개의 아암의 말단에 중쇄 또는 경쇄에 4개의 루프를 함유한다(도 3). 3개의 루프는 매우 가변적이고, 항원에 대한 결합을 직접 예상한다. 이들 루프의 영역은 CDR로 언급되며, 여기서 CDR1, CDR2 및 CDR3가 이들 3개의 루프에 각각 존재한다. 항체가 4차원 공간으로부터 항원에 결합하는 동일한 측면에 또 다른 루프가 또한 존재한다. 일부 루프는 보존적인 구조를 가질뿐만 아니라 보존적인 서열도 갖는다.
8개의 상업적 항체(도 4의 첫 번째 항체에서 마지막 항체로 각각 제시된 테센트릭(Tecentriq)(아테졸리주맙), 예르보이(Yervoy)(이필리무맙), 휴미라(Humira)(아달리무맙), 키트루다(Keytruda)(펨브롤리주맙), 옵디보(Opdivo)(니볼루맙), 에르비툭스(Erbitux)(세툭시맙), 리툭산(Rituxan)(리툭시맙) 및 퍼제타(Perjeta)(퍼투주맙))로부터의 경쇄를 정렬하였고, 결과는 도 4에 제시되었다. 각각의 경쇄의 가변 영역에서 네 번째 루프(GSGSGST)는 보존적이었다.
항-PD-1 항체의 경쇄의 CDR의 동일 측면에서 4개의 루프가 있었고, 여기서 3개의 루프는 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 CDR이었다. 나머지 루프는 FDA에 의해 승인된 많은 약물과 비교하여 보존적인 구조 및 서열을 가졌다. 이러한 루프의 서열은 위치 64-72에 위치한 RFSGSGSGT였다(도 4). 항-PD-1 항체 1의 루프 4에서 아미노산 잔기 각각을 Cys로 돌연변이시키고, S9 또는 S13에 컨쥬게이션시켰다. PD-1에 대한 돌연변이체의 결합 활성에 대한 상이한 길이의 R1-R4에 대한 컨쥬게이션의 효과를 ELISA에 의해 검출하였다. 결과는 표 17에 제시되었다. 컨쥬게이션 아암의 입체 구조 또는 길이를 변화시킴으로써 돌연변이체의 활성의 70% 이상이 억제될 수 있는 것이 발견될 수 있었다.
표 17: 경쇄의 가변 영역의 루프 4에서 돌연변이를 갖는 항-PD-1 항체 1의 컨쥬게이트의 결합 활성
Figure pct00050
생체 내에서 면역글로불린 상과의 유전자의 재조합에 의해 항체를 생성시켰다. 상이한 항원에 대한 항체의 일부 프레임워크 영역은 동일한 점라인 항체의 유전자 또는 아미노산 서열로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, Her2 항체인 허셉틴(트라스투주맙)의 중쇄는 3개의 CDR에서 항-PD-1 항체인 테센트릭(아테졸리주맙)의 것과 상이하다. 이들은 동일한 점라인 항체로부터 유래된 동일한 비-CDR 프레임워크 서열을 갖는다(도 5). 허셉틴 및 테세트릭의 중쇄와 유사하게, PD-1 항체인 옵디보(니볼루맙) 및 키트루다(펨브롤리주맙)의 경쇄는 가변 영역의 3개의 CDR에서 상이하다. 이들의 비-CDR 프레임워크 영역은 동일한 점라인 항체로부터 유래된다(도 5).
많은 항체에서 유사한 상황이 발견되었다. FDA에 의해 승인된 재성형 항체(CDR-이식 항체로도 언급됨)에 의해 예시된 바와 같이, 항원에 대한 특이성을 유지시키고 이종성을 감소시키기 위해, 뮤린 유래 항체로부터의 CDR을 인간 유래 항체로부터의 CDR에 의해 직접 대체하였다. 인간화 기술 및 유전 공학 기술이 성숙함에 따라, 이후에 개발된 인간화 항체는 주로 인간화 항체 또는 인간 항체였다. 그러나, 그럼에도 불구하고, 많은 상업적 항체의 중쇄는 여전히 매우 높은 유사성을 나타낸다. 예를 들어, 도 6은 85% 이상인 7개의 상업적 항체(도 6에서 첫 번째에서 마지막 항체까지 제시된 아바스틴(베바시주맙), 허셉틴(트라스투주맙), 테센트릭(아테졸리주맙), 휴미라(아달리무맙), 예르보이(이필리무맙), 옵디보(니볼루맙) 및 퍼제타(퍼투주맙))의 중쇄의 유사성에 대한 비교 결과를 제시한다. 이들은 주로 CDR에서 서로 상이하고, 가변 영역에서 이들의 프레임워크 영역은 유사한 서열을 갖는다. 더욱이, 테센트릭(아테졸리주맙) 및 허셉틴(트라스투주맙)의 프레임워크 구조는 동일하다(도 5). 면역 체크포인트 항체인 옵디보, 키트루다 및 예르보이(도 7에 각각 제시된 첫 번째에서 마지막 항체)의 경쇄 가변 영역을 비교한 후, 이들의 상동성은 92%인 것으로 밝혀질 수 있었다. 주요 차이는 CDR에 있으며, 이들의 프레임워크 영역의 서열은 서로 가깝다(도 7).
보존적 프레임워크 영역을 갖는 항체의 경우, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역의 프레임워크 영역(비-CDR)에 돌연변이를 갖는 이의 돌연변이체 및 이의 컨쥬게이트의 활성을 시험하였다. 표 18 및 19에 제시된 아미노산 위치 각각을 시스테인으로 돌연변이시키고, 생성된 돌연변이체 각각을 S9 또는 S13에 컨쥬게이션시켰다. PD-1에 대한 결합 활성에 대해 상이한 길이를 갖는 R1-R4 측쇄에 대한 컨쥬게이션의 효과를 ELISA에 의해 시험하였다. 결과는 표 18 및 19에 제시되었다. 도 8은 S13에 대한 PD1 Ab-C28(PD1-Ab-Gly28Cys)의 컨쥬게이션을 제시하고, 도 9는 S13에 대한 컨쥬게이션 전 및 후의 PD1에 대한 항-PD1-Ab-C28의 결합을 제시한다.
표 18: 경쇄 가변 영역의 프레임워크 영역에서 돌연변이를 갖는 항-PD-1 항체 1의 돌연변이체 및 이의 컨쥬게이트의 결합 활성
Figure pct00051
표 19: 중쇄 가변 영역의 프레임워크 영역에서 돌연변이를 갖는 항-PD-1 항체 2의 돌연변이체 및 이의 컨쥬게이트의 결합 활성
Figure pct00052
항체 가변 영역의 비-CDR 영역에서 돌연변이를 갖는 돌연변이체의 결합 활성에 대한 분석은 돌연변이가 비-CDR에 도입되는 경우 및 돌연변이체가 작은 컨쥬게이션 분자 S9에 컨쥬게이션된 경우에 결합 활성에 대한 유의한 효과가 없음을 나타내었다. 그러나, 돌연변이체가 S13에 컨쥬게이션된 경우, 결합 활성이 감소되었다. 이들은 비-CDR의 아미노산 잔기가 시스테인으로 돌연변이될 수 있고, 이후 돌연변이체는 돌연변이체의 결합 활성을 차단하기 위해 큰 분자량을 갖거나 특정 작용기를 보유하는 R1-R2-R3-R4에 컨쥬게이션될 수 있음을 나타낸다. 이 방법으로, 돌연변이체의 활성이 억제될 수 있었다.
경쇄에 2개 이상의 돌연변이를 갖는 항-PD1 항체를 제조하고, S13에 컨쥬게이션시켰다. 돌연변이 부위를 하나의 돌연변이를 갖고 PD1 항원에 대한 95% 이상의 결합 활성을 갖는 상기 언급된 항-PD1 항체의 돌연변이 부위로부터 선택하였다. 활성화 후 상기 컨쥬게이트의 활성을 확인하였고, 결과는 표 20에 제시되었다.
표 20: 활성화 전 및 후의 PD1에 대한 2개 이상의 돌연변이를 갖는 항-PD1 항체 1의 컨쥬게이트의 결합 활성
Figure pct00053
상기 결과는 2개 이상의 돌연변이를 갖는 항-PD1 항체의 컨쥬게이트가 활성화 후 PD1에 대한 95% 이상의 결합 활성을 보유할 수 있음을 입증한다.
실시예 4: 생체분자 R5에 대한 스크리닝, R1, R2-R3-R4으로의 컨쥬게이션, 및 컨쥬게이션 후의 활성화
병리학적 미세환경에서 단백질분해 효소에 의한 활성화 동안, 활성화된 링커 아암이 생체분자에 결합하는 부위 및 이의 입체 형태는 활성화 효율에 상이한 영향을 미친다. 입체 장애 및 구조-활성 관계는 활성화에 의한 절단 효과를 결정한다. 병리학적 환경에서 효소 또는 산에 의한 활성화에 대한 병리학적 환경에서의 실시예 3의 컨쥬게이트의 생체분자 입체형태의 효과를 조사하기 위해, 하기 시험관 내 활성화 조사를 수행하였다.
활성화 시험에서, 활성화를 위한 10 마이크로그램의 단백질분해 효소를 37℃에서 1시간 동안 반응을 위해 1mg/ml Peg1000-R2-R3-R4-S-Cys-R5 컨쥬게이트에 첨가하였다. 활성화 후에 생성된 작은 화합물 Peg1000의 농도를 HPLC로 검출하였고, 대조군에 비한 활성화 또는 절단 효율(%)을 계산하였다. 각각의 컨쥬게이트의 절단 효율은 하기 표 21에 제시된다.
표 21
Figure pct00054
표 22 및 23에 제시된 바와 같이, 자동 쉐딩된 아암 R3는 작은 분자량 및 선형 구조로 인해 레구마인의 활성화에 실질적으로 영향을 미치지 않았으며, R3-2는 가장 낮은 효과를 발생시켰다.
표 22: 항-PD-1 항체 1
Figure pct00055
표 23: 항-CTLA-4 항체
Figure pct00056
표 22 및 23에서, 생체분자와의 컨쥬게이션이 없는 분자에 의해 발생된 활성화 효율을 양성 대조군으로 사용한 반면, 헤테로사이클릭 화합물 파클리탁셀의 위치 2에서 하이드록실에 대한 컨쥬게이션을 갖는 분자에 의해 발생된 활성화 효율을 음성 대조군으로 사용하였다. R4의 길이 및 측쇄 기는 항체의 가변 영역 또는 비-가변 영역에서 돌연변이 부위에 컨쥬게이션되는 경우 전체 컨쥬게이트의 절단 효율에 영향을 미쳤다. R4의 더 긴 사슬 구조는 향상된 절단 효율을 발생시켰다. 검출된 바와 같이, Ala-Ala-Asn 또는 Ala-Ala-Asp로의 컨쥬게이션 및 이후 항체에 대한 결합 후, 본 발명의 개시의 R4-1 내지 R4-25는 모두 돌연변이체가 활성화 효율의 60% 초과, 및 산-민감성 활성화에서 활성화 효율의 90% 초과를 보유하도록 하였다.
R1 선택의 효과 및 결합 능력의 회복에 대한 시험
PBS(pH 7.2)를 사용하여 리간드 분자 PD1, TNFα, CTLA-4, CD28을 각각 1 ug/ml로 희석시켰다. 이후, 희석된 용액 각각을 밤새 96-웰 플레이트(Nunc)에 고정시키기 위해 사용하였다. 1X 차단 BSA(Thermo Fisher)를 사용하여 플레이트를 2시간 동안 차단하였다. 항-PD-1 항체, 항-TNFα 항체, 항-CTLA-4 항체 및 항-CD28 항체의 상응하는 컨쥬게이트를 각각 동일한 농도로 첨가하고, 1시간 동안 37℃에서 결합시켰다. 플레이트를 PBST로 3회 세척하였다. 이차 항체로서 사용된 HRP 효소 컨쥬게이션된 인간 항체를 1시간 동안 37℃에서 반응시킨 후, PBST로 3회 세척하였다. HRP 효소에 의해 인지된 TMB 기질(Solarbio., Inc.)을 어두운 곳에서 15분 동안 37℃에서 반응에 사용하였다. 정지 용액의 1/2 부피를 반응을 정지시키는 데 사용하였다. 흡광도 강도(OD450)를 판독하였다. 활성화 전 및 후에 컨쥬게이트의 결합 효율과 야생형 항체의 결합 효율 사이의 백분율 비에 의해 상대 결합 효율을 계산하였다. 결과는 표 24-26에 제시되었다.
표 24: R1으로의 컨쥬게이션 후 및 컨쥬게이션 아암의 활성화 후 항-PD-1 항체의 결합 활성의 변화
Figure pct00057
결과는 R1으로의 컨쥬게이션이 항-PD-1 항체의 활성을 억제하지만, 항체의 활성화에 영향을 미치지 않음을 나타낸다. 활성화 전 R1 없는 컨쥬게이트의 이의 항원에 대한 결합 효율은 항원에 대한 야생형 항체의 것의 67.4%였다. 그러나, 활성화 후, 컨쥬게이트의 결합 효율은 야생형 항체의 것의 143%로 개선되었다. 동일한 R2-R3-R4 및 돌연변이된 항체에 R1을 결합시킨 후, 이는 생성된 컨쥬게이트가 이의 항원에 결합하는 것을 방지하였다. 그리고, R1의 분자량이 증가함에 따라 결합의 방지가 증가하였다. S17은 컨쥬게이트가 이의 항원에 결합하는 것을 완전히 방지할 수 있었다. 그러나, 레구마인에 의한 절단 후 결합 활성은 회복되었다.
표 25: R1으로의 컨쥬게이션 후 및 컨쥬게이션 아암의 활성화 후 항-TNFα 항체의 결합 활성의 변화
Figure pct00058
결과는 R1으로의 컨쥬게이션이 항-TNFα 항체의 활성을 억제하지만, 항체의 활성화에 영향을 미치지 않음을 나타낸다. 활성화 전 R1 없는 컨쥬게이트의 이의 항원에 대한 결합 효율은 항원에 대한 야생형 항체의 것의 57.9%였다. 그러나, 활성화 후, 컨쥬게이트의 결합 효율은 야생형 항체의 것의 125.6%였다. 동일한 R2-R3-R4 및 돌연변이된 항체에 R1을 결합시킨 후, 이는 생성된 컨쥬게이트가 이의 항원에 결합하는 것을 방지하였다. 그리고, R1의 분자량이 증가함에 따라 결합의 방지가 증가하였다. S18은 컨쥬게이트가 이의 항원에 결합하는 것을 완전히 방지할 수 있었다. 그러나, 레구마인에 의한 절단 후 결합 활성은 회복되었다.
표 26: 컨쥬게이트에 컨쥬게이션 후 및 컨쥬게이션 아암의 활성화 후 항-CTLA-4 항체 및 항-CD28 항체의 결합 활성의 변화
Figure pct00059
결과는 R1에 대한 컨쥬게이션이 항-CD28 항체 및 항-CTLA-4 항체의 활성을 억제하지만, 항체의 활성화에는 영향을 미치지 않음을 제시한다.
실시예 4로부터, 회복 후 컨쥬게이트의 활성화 효율 및 항원에 대한 이의 결합 능력은 항체에서의 돌연변이 위치에 의해 어느 정도 영향을 받은 것이 발견될 수 있었다. 그러나, R4의 사용으로 효소 절단에 의한 예상 활성화 효율이 생성될 수 있었다. 생체분자와 이의 리간드 사이의 결합에 관해서는, 활성화에 의한 절단 후 생성된 R4의 노출된 기는 항체 돌연변이체의 결합 능력을 조절할 수 있었다. 상이한 노출된 기는 상이한 돌연변이 위치에 상이한 영향을 미쳤다. R1 및 D4에 대해 스크리닝함으로써, R1의 장애 기능이 항원에 대한 컨쥬게이트의 결합 능력의 완전한 상실을 초래함이 발견될 수 있었다. 그러나, 효소에 의한 표적 절단 후 결합 능력은 회복되거나 심지어 향상되었다. 상기 컨쥬게이트-유형 항체는 표적 효소가 병리학적 미세환경에서 고도로 발현되거나 분비되어 항체 또는 단백질을 방출하는 영역에서만 활성화된다. 따라서, 상기 미세환경 활성화 항체는 도 10에 제시된 바와 같은 새로운 표적 활성화 항체이다.
실시예 5: 면역 지수에 대한 항체의 촉진 또는 억제.
1. T 세포가 IFN-γ를 분비하는 것을 촉진한 항-PD-1 항체
인간 전체 혈액(Shang Ruijin Hospital)을 희석시키고, PBS와 동일한 양으로 균일하게 혼합하였다. 희석된 용액을 원심분리 튜브의 벽을 따라 림프구 분리 용액을 함유하는 다른 원심분리 튜브로 천천히 옮겨서 희석된 용액이 림프구 분리 용액 상에 분리된 층을 형성하도록 하였다. 계면을 명확하게 유지시켰다. 튜브를 20분 동안 2000rpm에서 원심분리하였다. 원심분리 후, 원심분리 튜브를 꺼냈다. 튜브 내의 용액을 층화시켰다. 단핵 세포층을 50 ml 원심분리 튜브로 추출하였다. 5배 부피의 PBS를 첨가하고, 균일하게 혼합하고, 혼합물을 10분 동안 2000 rpm에서 원심분리하였다. 상층액을 폐기하고, 침전물을 PBS로 재현탁시켰다. 이후, 생성된 혼합물을 10분 동안 1500rpm에서 원심분리시키고, 생성된 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 5% 열 활성화 인간 혈청을 함유하는 RPMI1640 완전 배지로 재현탁시켰다. 인간 PBMC를 96-웰 플레이트에 웰 당 1~2Х105 세포의 농도로 접종하였다. 세포를 3일 동안 0.1 ug/ml SEB로 자극하였다. 비-접착성 세포(주로 단핵 세포)를 수집하고, 새로운 96-웰 플레이트에 균일하게 접종하였다. 상이한 농도의 돌연변이가 없는 항-PD-1 항체 또는 PD-1-Ab-Cys28-S-S13 컨쥬게이트를 첨가하고, 4일 동안 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 상층액을 수집하고, 세포독성 인자 IFN-γ의 농도를 ELISA 키트에 의해 검출하였다. 결과는 활성화된 항-PD-1 항체가 도 11에 제시된 바와 같이 분비 IFN-γ의 근접하거나 심지어 유의하게 개선된 활성을 나타냄을 제시하였다.
결과는 시험관 내에서 항-PD-1 항체 컨쥬게이트의 활성화 후, T 세포에 대한 항-PD-1 항체의 자극이 회복될 수 있을뿐만 아니라 절단 후 생성된 나머지 기가 항체에 대한 하나 또는 여러 개의 새로운 작용기를 도입할 수 있음을 나타낸다. 결과로서, 활성화 후, PD-1-Ab-Cys28-S-S13은 상기 활성화 T 세포의 활성을 향상시켰다. 상기 종류의 컨쥬게이션 유형 항체는 단지 병리학적 미세환경에서 표적 효소를 고도로 발현하거나 분비하는 영역에서 활성화되어 항체를 방출한다. 따라서, 상기 미세환경-활성화 항체는 새로운 표적-활성화 항체이다.
2. 신체의 자가면역을 감소시키는 항-PD-1 항체 및 항-CD28 항체의 컨쥬게이트
당 분야에 널리 공지된 바와 같이, 항-PD-1 항체는 종양을 치료하기에 효과적인 약물이지만, 현재의 임상 연구에서 항-PD-1 항체는 2개의 주요 문제를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 문제 중 하나는 환자가 항체의 투여 후 고열 및 거짓 진행의 부작용을 나타내지만, 메커니즘이 공지되어 있지 않다는 점이다. 본 발명자는 항체가 컨쥬게이트에 의해 억제되거나 차단되고, 병에 걸리지 않은 환경에서 활성 약물의 노출 시간 또는 용량을 감소시키기 위해 종양의 국소 환경에 도달한 후에 방출되는 경우 이들 부작용이 개선될 수 있다고 추정한다. 이러한 이유로, 타입 I 당뇨병(NOD)로 고통받는 마우스로 실험을 수행하였다. 이러한 종류의 마우스의 당뇨병은 자가면역 질환이며, 여기서 자가 활성화된 T 림프구 세포는 췌장 섬 β 세포를 파괴하여 인슐린의 불충분한 분비를 발생시킨다. 먼저, 0일에서 10주령의 암컷 NOD(Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.)에 대조군 IgG, 저용량(1mpk), 중간 용량(5 mpk) 또는 고용량(15 mpk)의 항체 또는 항체의 컨쥬게이트를 각각 주사하였다. 소변에서의 글루코스 및 2개의 혈당 수준을 포함하는 당뇨병의 지표를 소변 글루코스의 새로운 지표가 관찰되지 않을때까지 12일 동안 매일 관찰하였다.
PD-1-Ab-Cys28-S-S13 컨쥬게이트에 의한 자가면역으로부터의 보호는 도 12에 제시되었고, CD28-Ab-Cys-S-S13 컨쥬게이트에 의한 자가면역으로부터의 보호는 도 13에 제시되었다.
결과는 항-PD-1 항체의 컨쥬게이트에 의한 면역계의 보호가 항-PD-1 항체와 비교하여 약 15배만큼 증가하였고, 항-CD28 항체의 컨쥬게이트에 의한 면역계의 보호가 항-CD28 항체와 비교하여 약 10배만큼 증가한 것을 나타내었다. 따라서, 연결 모이어티가 단백질 또는 항체의 활성을 방해하거나 감소시키는 데 사용된 경우, 정상 조직에서 관련 리간드에 대한 컨쥬게이션된 단백질 또는 항체의 결합이 감소된 것이 관찰될 수 있는데, 이는 병에 걸린 미세환경 외부의 생리학적 환경 및 하이드롤라제로 인해 항-PD-1 항체 및 항-CD28 항체를 활성화시키는 것이 어렵기 때문이다. 결과로서, 컨쥬게이트는 일차 항체와 비교하여 자가면역을 감소시킬 수 있었다.
3. CD4 또는 CD8 세포를 특이적으로 활성화시키는 항-CD28 항체의 컨쥬게이트.
CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포를 키트의 명세서에 제공된 특정 단계에 따라 CD8 또는 CD4 자기 비드(Dynabeads)를 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터 분리시키고, CFSE 명세서에 따라 계수하고 염색하였다. 세포를 웰 당 1~2Х105 세포의 농도로 96-웰 플레이트에 접종하였다. 적절한 양의 대조군 항-CD3/항-CD28 항체, 0.3ug/ml의 항-CD28 항체 또는 항-CD28 항체의 컨쥬게이트를 각각 첨가하였다.
결과는 도 14에 제시되었다. 결과에 따르면, 본래의 항-CD28 항체와 비교하여, 중쇄 컨쥬게이트 CD28-Ab-Gly44Cys(CD28-Ab-Cys44-S-S13)는 CD4 T 세포를 선택적으로 활성화시킬 수 있었고, 경쇄 컨쥬게이트 CD28-Ab-Ser52Cys(CD28-Ab-Cys52-S-S13)는 CD8 T 세포를 선택적으로 활성화시킬 수 있었다. 결과는 연결 모이어티가 단백질 또는 항체의 활성을 방해하거나 감소시키는 데 사용된 경우, 정상 조직에서 관련 항원에 대한 연결 모이어티에 컨쥬게이션된 항체의 결합이 항체 또는 단백질이 표적 조직에 도달하기 전에 감소된 것을 나타내는데, 이는 하이드롤라제가 병에 걸린 미세환경 외부에서 낮은 수준으로 발현되고, 하이드롤라제가 항체 또는 단백질에 컨쥬게이션된 연결 모이어티를 활성화시키는 것이 매우 어렵기 때문이다. 연결 모이어티에 컨쥬게이션된 항체가 염증성 미세환경과 같은 병에 걸린 미세환경에 도달하는 경우, 컨쥬게이션된 연결 모이어티는 Treg의 표면에서 발현된 레구마인에 의해 활성화되어, Treg의 증식을 자극하고 염증 반응을 억제한다. 종양 영역에서, 컨쥬게이션된 연결 모이어티는 CD8 세포의 표면에서 발현된 Granzym-B에 의해 활성화되어, CD8 세포의 증식을 자극하고, 종양의 진행을 억제한다. 설계된 컨쥬게이트는 미세환경에서 하이드롤라제에 의해 조절되며, 컨쥬게이션된 연결 모이어티가 가수분해된 후에만 항체의 활성이 방출된다. 결과로서, 연결 모이어티에 컨쥬게이션된 항체는 미세환경에서 크게 농축될 수 있었다. 결국, 전체 효과, 즉, 감소된 부작용 및 개선된 효능이 달성될 수 있었다.
실시예 6: MC38 종양을 치료할 수 있는 미세환경에서 활성화된 항-PD-1 항체
MC38 세포를 마우스 당 2Х106 세포의 농도로 인간 PD-1 융합 단백질로 형질전환된 트랜스제닉 C57BL/6 마우스(Shanghai Research Center for Model Organisms)에 피하 접종하였다. 1주일 후, MC38 종양이 이식된 마우스를 무작위로 4개의 그룹으로 나누었다. 2주 동안 1주일에 2회로, 그룹 1에 10mg/kg 항-PD-1 항체 키트루다를 주사하였고, 그룹 2에 2mg/kg 항-PD-1 항체 키트루다를 주사하였고, 그룹 3에 1mg/kg PD-1-Ab-G28C-S13 컨쥬게이트를 주사하였고, 그룹 4에 용매 대조군을 주사하였다. 마우스의 종양을 매주 3회 기록하였다. 결과는 도 15에 제시되었다.
인간 PD-1 융합 단백질로 형질전환된 마우스는 트랜스제닉 마우스이다. 이의 내인성 PDCD1 유전자는 인간 PDCD1으로 대체되어, 인간 PDCD1 단백질을 발현한다. 상기 마우스는 인간 항-PD-1 항체에 반응하고, 다운스트림 면역을 자극할 수 있다. 결과는 10mg/kg 항-PD-1 항체가 MC38 종양의 성장을 효과적으로 억제할 수 있었고, 1마리의 마우스가 치료되고, 5마리의 마우스가 80% 이상의 유의한 억제 효과를 갖는 것을 제시한다. 1mg/kg PD-1-Ab-G47C-S13 컨쥬게이트는 10mg/kg 항-PD-1 항체 키트루다보다 나은 억제 효과를 발생시켰다. 결과는 실시예 5에서 입증된 바와 같이 항-PD1 항체의 컨쥬게이트가 종양 미세환경에서 효과기 T 세포의 활성 및 항체의 농축을 향상시킬 수 있었음을 입증한다. 따라서, 컨쥬게이트는 본래의 항체보다 개선된 효능을 나타낸다.
실시예 7a: 미세환경에서 활성화된 IL2 단백질
IL2의 아미노산 서열은 고유 인간 IL2 단백질이다. 이의 DNA 서열을 숙주에서의 발현에 최적화시키고, 합성하였다(GENEWIZ, Inc., Suzhou, China). 합성된 DNA를 절단하고, 변형된 pTT5 벡터(Biovector)에 라이게이션하여 pTT5-IL2를 생성시켰다. 주형으로서 pTT5-IL2를 이용하고, 돌연변이 위치의 코돈을 시스테인의 코돈으로 대체하도록 프라이머를 설계하고, PCR을 수행하고, 돌연변이된 단편을 절단하고, 변형된 pTT5 벡터로 작제함으로써 돌연변이된 벡터를 작제하였다. IL2 유전자의 합성, 돌연변이 및 형질감염을 실시예 2에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 리간드 IL2Ra 또는 IL2Rb에 대한 이의 결합 활성을 돌연변이 위치에 따라 IP 및 ELISA에 의해 분석하였다.
미세환경에서 거대분자의 활성화가 항체로 제한되지 않고, 다양한 단백질에 적용 가능한지 확인하기 위해, 사이토카인 IL2를 본원의 예로서 사용하였다. 이의 돌연변이 위치, 활성, 링커 아암, 및 활성화 후의 활성 및 기능을 스크리닝하였다. 결과는 하기 표 27-29에 제시된다.
표 27: 돌연변이된 IL2의 활성 및 링커 아암에 대한 스크리닝
Figure pct00060
돌연변이체가 고유의 IL2와 비교하여 이의 상응하는 수용체에 대한 결합 활성의 80% 이상을 유지하는 경우, 링커 아암의 길이를 조절함으로써 이의 결합 수용체의 활성이 억제되거나 방해될 수 있는 것이 결과로부터 발견될 수 있었다. 예를 들어, Lys32, Thr41, Ala73 또는 Leu19를 Cys로 돌연변이시킨 후, 생성된 돌연변이체 각각을 S3로 컨쥬게이션시키는 것은 이들의 상응하는 수용체에 대한 결합 활성의 60%를 억제할 수 있는 반면; Lys35, Lys43, Leu72, Lys76, Leu94, Thr101, Thr102, Ala108, Thr111, Ala112, Gly98, Ser99, Thr133 등을 Cys로 돌연변이시킨 후, 생성된 돌연변이체 각각을 S13으로 컨쥬게이션시키는 것은 이들의 상응하는 수용체에 대한 결합 활성의 60% 이상을 억제할 수 있다.
표 28: 컨쥬게이션된 IL2의 절단 효율
Figure pct00061
결과는 레구마인에 의한 활성화가 자동 쉐딩 아암 R3의 작은 분자 선형 구조로 인해 영향을 받지 않는 것을 나타낸다.
표 29: IL2의 R1으로의 컨쥬게이션 후 및 연결 아암의 활성화 후 수용체에 대한 결합 효율의 변화
Figure pct00062
따라서, 활성화 후 컨쥬게이트의 활성화 효율 및 수용체에 대한 이의 결합 능력은 단백질에서의 돌연변이 위치에 의해 어느 정도 영향을 받은 것이 관찰될 수 있다. 그러나, R4의 사용으로 표적 효소 절단에 의한 활성화 효율이 생성될 수 있었다. 생체분자와 이의 리간드 사이의 결합에 관해서는, 활성화에 의한 절단 후 생성된 R4의 노출된 기는 돌연변이된 항체의 결합 능력을 조절할 수 있었다. 상이한 노출된 기는 상이한 돌연변이 위치에 상이한 영향을 미쳤다. R1 및 D4에 대해 스크리닝함으로써, R1의 장애 기능이 항원에 대한 컨쥬게이트의 결합 능력의 완전한 상실을 초래함이 발견될 수 있었다. 그러나, 표적 효소에 의한 절단 후 결합 능력은 회복되거나 심지어 향상되었다. 상기 컨쥬게이션 유형 단백질은 단지 병리학적 미세환경에서 표적 효소를 고도로 발현하거나 분비하는 영역에서 이들의 활성을 활성화시키거나 방출시킨다. 따라서, 상기 단백질은 새로운 표적-활성화 단백질이다.
2개 이상의 돌연변이를 갖는 IL2 돌연변이체를 제조하고, S13에 컨쥬게이션시켰다. 돌연변이 부위를 하나의 돌연변이를 갖고 수용체에 대한 95% 이상의 결합 활성을 갖는 상기 언급된 IL-2 돌연변이체의 돌연변이 부위로부터 선택하였다. 활성화 후 상기 컨쥬게이트의 활성을 확인하였고, 결과는 표 30에 제시되었다.
표 30: 활성화 전 및 후의 수용체에 대한 2개 이상의 돌연변이를 갖는 IL2 돌연변이체의 컨쥬게이트의 결합 활성
Figure pct00063
상기 결과는 2개 이상의 돌연변이를 갖는 IL2 돌연변이체의 컨쥬게이트가 활성화 후 상응하는 수용체에 대한 95% 이상의 결합 활성을 보유할 수 있음을 입증한다.
CD4 또는 CD8 세포를 특이적으로 활성화시키는 IL2 단백질의 컨쥬게이트
CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포를 키트의 명세서에 제공된 특정 단계에 따라 CD8 또는 CD4 자기 비드(Dynabeads)를 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터 분리시키고, CFSE 명세서에 따라 계수하고 염색하였다. 세포를 웰 당 1~2Х105 세포의 농도로 96-웰 플레이트에 접종하였다. 적절한 양의 대조군 항-CD3 항체, 0.05ug/ml의 IL2 단백질 또는 S16에 컨쥬게이션된 컨쥬게이트 IL2-T41C-S16을 각각 첨가하였다. 도 16은 S16에 대한 IL2-T41C(IL2-Thr41Cys)의 컨쥬게이션을 제시한다. 도 17은 컨쥬게이션 전 및 후의 IL2 수용체 알파에 대한 결합을 제시한다. 도 18은 활성화 전 및 후의 T 세포의 증식에 대한 IL2-C41-S16 컨쥬게이션의 효과를 제시한다.
고유 IL2는 CD8 및 CD4에 대해 유사한 자극을 나타내었다. 그러나, 미세환경에서 활성화된 기능성 모이어티에 대한 컨쥬게이션 후, IL2-Thr37Cys 및 IL2-Thr41Cys는 CD8 T 세포의 증식을 특이적으로 활성화시키고 CD4 세포의 증식을 감소시킬 수 있었다. CD8 세포와 CD4 세포 사이의 세포 수의 비는 원래 1:1에서 410:1 및 157:1로 각각 증가하였다. IL2-Leu19Cys 및 IL2-Ser87Cys는 CD4 T 세포의 증식을 특이적으로 활성화시킬 수 있었으며, CD4/CD8의 세포 비는 각각 435:1 및 126:1로 증가되었다. 결과는 도 19에 제시된다. 결과는 IL2를 기능성 모이어티에 컨쥬게이션시켜 각각의 수용체에 대한 이의 결합 활성을 조절하고, 특정 미세환경에서 활성화되도록 함으로써 CD8 또는 CD4가 선택적으로 활성화될 수 있음을 입증한다.
흑색종 B16F10 및 결장암 MC38의 성장을 효과적으로 억제하는 IL2 단백질의 컨쥬게이트.
마우스 당 0.5Х106 B16F10 세포를 C57BL/6 마우스에 피하 접종하였다. 1주 후, 종양 부피가 100mm3에 도달한 경우, 흑색종이 이식된 마우스를 그룹 당 6마리의 마우스로 4개의 그룹으로 무작위로 나누었다. 그룹 1에 매주 2.5mg/kg의 IL2-T37C-S14 단백질 컨쥬게이트를 주사하였다. 그룹 2에 매주 0.5mg/kg의 IL2-Thr37Cys 단백질 컨쥬게이트를 주사하였다. 그룹 3에 1주일에 2회 3mg/kg의 알데스류킨(대조군)을 주사하였다. 그룹 4에 1주일에 2회 용매(대조군)를 주사하였다. 모든 그룹은 3주 동안 지속적으로 투여되었다. 마우스 종양을 1주일에 2회 측정하고, 마우스를 1주일에 2회 칭량하였다.
MC38 세포를 마우스 당 0.5Х106 세포의 농도로 인간 PD-1 융합 단백질로 형질전환된 트랜스제닉 C57BL/6 마우스에 피하 접종시켰다. 1주일 후, MC38 종양이 이식된 마우스를 무작위로 4개의 그룹으로 나누었다. 그룹 1에 2mg/kg의 IL2-T37C-S14 단백질 컨쥬게이트를 주사하였다. 그룹 2에 1주일에 2회 0.5mg/kg의 IL2-Thr37Cys 컨쥬게이트 및 시간 당 100 μg의 항-PD-1 항체를 주사하였다. 그룹 3에 1주일에 2회 3mg/kg의 알데스류킨(대조군)을 주사하였다. 그룹 4에 1주일에 2회 용매(대조군)를 주사하였다. 모든 그룹은 3주 동안 지속적으로 투여되었다. 마우스 종양을 1주일에 2회 측정하고, 마우스를 1주일에 2회 칭량하였다.
결과는 도 20 및 21에 제시되며, 이는 IL2-Thr37Cys 컨쥬게이트가 감소된 사용 용량으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 기존 IL2 생성물인 알데스류킨과 비교하여 B16F10 종양의 치료 효과를 유의하게 향상시키는 것을 입증한다. 그리고, 항-PD-1 항체와의 조합 치료 그룹에서, MC38 마우스가 치료되었다.
상기 결과로부터, 단백질 또는 항체의 활성을 방해하거나 감소시키기 위해 기능성 모이어티를 사용하는 경우, 정상 조직에서 수용체 또는 리간드에 대한 단백질의 결합은 표적 조직에 도달하기 전에 감소될 수 있는 것이 발견될 수 있는데, 이는 병에 걸린 미세환경 외부의 생리학적 환경 및 하이드롤라제에 의해 단백질에 컨쥬게이션된 기능성 모이어티를 활성화시키는 것이 매우 어렵기 때문이다. 그러나, 병에 걸린 미세환경에서, IL2-Thr37Cys 및 IL2-Thr41Cys 등은 병에 걸린 미세환경에서의 하이드롤라제에 의해 영향을 받았고, Granzym-B를 고도로 발현하는 CD8 세포의 표면에서 활성화되어 CD8 세포의 표면 상의 수용체에 결합하고 CD8 세포를 활성화시켰다. 결과로서, 기능성 모이어티와 컨쥬게이션된 단백질은 면역 독성을 감소시키면서 표적화된 효능을 향상시킬 수 있었다.
동일한 이유로, IL2-Leu19Cys 및 IL2-Ser87Cys는 레구마인을 고도로 발현하는 Treg 세포의 표면에서 활성화되었고, 이는 활성화된 IL2가 Treg 세포의 표면 상의 수용체에 결합하여 Treg 세포의 증식을 활성화시키는 것을 가능하게 하였다.
실시예 7b: 종양 미세환경 활성화된 IL2 사이토카인(IL2 TMEAkine)
1. 돌연변이체 IL2 사이토카인의 발현 및 정제
변형된 pTT5 벡터(Biovector)에 라이게이션된 돌연변이체 IL2 DNA 서열을 293T 세포에서의 발현에 대해 최적화하고, 합성하였다(GENEWIZ Inc., Suzhou, China). 돌연변이체 IL2 DNA의 형질감염을 수행하였다. 4-7일 동안 인큐베이션 후, 돌연변이체 IL2를 함유하는 상층액을 수집하였다.
진핵생물 발현에서, 돌연변이체 IL2 유전자를 함유하는 발현 벡터 pPICZα A를 최적화하고 제조하였다(GENEWIZ Inc., Suzhou, China). 야생형 IL2의 아미노산 서열은 하기 기재되고 제시된다:
APASSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT (SEQ ID NO:11).
발현 벡터 pPICZα A를 플라스미드 정제를 위해 E. 콜리(DH5α)에서 형질전환시켰다. 이후, pPICZα A를 전기천공에 의해 GS115로 형질전환시켰다. 형질전환된 콜로니를 100, 300, 500, 1000, 1500, 2000 ug/mL ZeocinTM 함유 YPD 플레이트에서의 성장 후 성장하는 콜로니를 획득하여 선택하였다. 형질전환체를 최종적으로 선택한 후, 재조합 GS115 균주를 배플드 플라스크(baffled flask)에서 강한 진탕과 함께 30℃에서 BMGY 배지에서 2-6의 OD600으로 성장시켰다. 이후, 세포를 원심분리에 의해 펠렛화시키고, 1의 OD600으로 BMMY에 현탁시키고, 여기에 0.5% 메탄올을 매일 첨가하여 이종성 단백질 발현을 유도하였다. 4일 유도 후, 분비된 돌연변이체 IL2 단백질을 함유하는 상층액을 원심분리에 의해 수집하였다. 상층액 중의 전체 단백질을 10-kDa 분자 질량 컷오프 막을 사용한 초여과에 의해 농축시켰다. 농축된 단백질을 24시간 초과 동안 완충액 A(50 mM HAc/NaAc, pH4.5)로 투석한 후, 완충액 A로 평형화된 양이온-교환 컬럼에 로딩하였다. 돌연변이체 IL2를 NaCl의 구배 농도로 컬럼으로부터 용리시키고, 용리액을 수집하고 농축시켰다. 응축된 샘플을 용리 완충액으로서 20 mM Tris-HCl, 20 mM NaCl, pH7.4를 사용하여 Sephacryl S-100 HR 젤 여과 컬럼 상에서 추가로 정제하였다.
원핵생물 발현에서, 돌연변이체 IL2 유전자를 함유하는 발현 벡터 pET22b (+)를 최적화하고 제조하였다(GENEWIZ Inc., Suzhou, China). 야생형 IL2의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:12에 기재되었다. 양성 클론을 선택하고, E. 콜리 세포(BL21DE3)에서 형질전환시켰다. 이소프로필 티오갈락토시드(IPTG)를 사용한 표적 단백질의 유도를 위한 표준 절차를 후속시켰다. 유도된 E. 콜리 세포를 원심분리하고, 세포 펠렛을 5 mM EDTA 및 1 mM PMSF를 함유하는 100 mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0)에 재현탁시켰다. 세포를 초음파처리에 의해 용해시키고, 원심분리하여 IL2 단백질 봉입체(IB)를 분리시켰다. 이후, IB 펠렛을 5 mM EDTA 및 2% 데옥시콜레이트를 함유하는 100 mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0), 및 증류수로 각각 세척하였다. IB를 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드(GuHCl) 용액(0.1 M Tris 완충액, pH 8.0에서 제조됨)에 용해시키고, 가벼운 볼텍싱과 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이션시킨 후, 원심분리하였다. 상층액을 재폴딩 완충액(10:1의 비의 10 mM 환원 및 1 mM 산화 글루타티온을 함유하는 0.1 M Tris 완충액, pH 8.0)으로 희석시켜, 0.1 mg/mL 및 2 M의 단백질 농축물 및 GuHCl을 각각 획득하였다. 이후, 용액을 IL2의 느린 재폴딩을 위해 실온에서 16시간 동안 유지시켰다. 불용성 단백질을 원심분리로 제거하였다. 상층액을 농축시키고, 2 M GuHCl을 함유하는 0.1 M Tris 완충액으로 평형화된 젤 여과 컬럼 Sephacryl S-100 HR에 로딩하였다.
형질전환체에 의해 생성된 야생형 IL2 아미노산 서열은 하기 제시된다:
PTSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT (SEQ ID NO: 12).
2. 돌연변이 후 돌연변이체의 IL2Rα 또는 IL2Rβ에 대한 이의 결합 활성의 스크리닝
다양한 IL2 돌연변이체를 293T 세포에 의해 발현시키고, 배지에 분비시켰다. IL2 돌연변이체를 함유하는 상층액을 섹션 1에 기재된 바와 같이 원심분리를 통해 획득하였다. 이후, 1 ug His-태깅된 IL2Rα 또는 IL2Rβ를 상기 언급된 1 mL 상층액에 첨가하고, 가벼운 진탕과 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 50 uL 사전 세척된 Ni-NTA 수지를 상층액 및 IL2Rα 또는 IL2Rβ의 혼합 용액으로 옮기고, 가벼운 진탕과 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 혼합물을 원심분리에 적용하고, 상층액을 폐기하였다. 생성된 펠렛을 25 mM 이미다졸을 함유하는 500 uL PBS로 3회 세척하였다. IL2 돌연변이체 및 IL2Rα/Rβ의 양을 IL2 항체 및 항 His-tag 모노클로날 항체를 사용한 웨스턴 블로팅에 의해 가시화시켰다.
3. 돌연변이체 IL2에 대한 S47 컨쥬게이션
돌연변이체 IL2 단백질을 섹션 1에 상기 기재된 바와 같이 생성시키고 정제하였다. 정제된 돌연변이체 IL2를 5 mM EDTA를 함유하는 50 mM 포스페이트 완충액(pH 7.4) 중 0.3 mg/mL의 농도로 배양하였다. TCEP 용액을 100:1의 몰비로 돌연변이체 IL2에 첨가하고, 생성된 혼합물을 가벼운 진탕과 함께 4℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 혼합물을 4℃에서 2시간 동안 150mM NaCl을 함유하는 50 mM 포스페이트 완충액(pH 7.4)으로 투석하였다. 이후, S47을 20:1의 몰비로 혼합물에 즉시 첨가하고, 생성된 혼합물을 가벼운 진탕과 함께 25℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 반응을 중지시키고, 잔여 S47을 제거하였다. 효소 절단 전에, IL2-S47의 컨쥬게이트(IL2 TMEAkine, 종양 미세환경 활성화 IL2 사이토카인)에 사용되는 완충액을 투석을 통해 효소에 사용되는 완충액으로 변경하였다. 이후, 효소를 IL2 TMEAkine 용액에 첨가하고, 혼합물을 16시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 도 22는 시험관 내에서의 효소 절단 후 돌연변이체 IL2, IL2 TMEAkine 및 회복 활성 IL2에 대한 콜로이드성 청색 염색을 갖는 SDS-PAGE 결과를 제시한다.
4. IL2Rα 또는 IL2Rβ에 대한 결합을 차단하고, 시험관 내 효소 절단 후 결합 활성을 회복시키는 IL2 TMEAkine 스크리닝
1 ug IL2Rα-Fc/IL2Rβ-Fc 용액을 함유하는 60 ul PBS 완충액을 웰에 분배하였다. 밀봉 테이프를 플레이트의 상부에 적용한 후, 플레이트를 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 테이프를 제거하여 각각의 웰을 흡인하였다. PBST로 3회 세척 후, 2% BSA를 함유하는 200 ul의 PBS 완충액을 각각의 웰에 분배하여 플레이트를 차단한 후, 플레이트를 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 3회 세척하고, 60 ul의 연속 희석 샘플을 적절한 웰에 첨가하였다. 플레이트를 1.5시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. PBST로 3회 세척 후, 60 ul의 1 ug/mL IL2 비오티닐화 항체 용액을 각각의 웰에 분배하고, 생성된 혼합물을 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 3회 세척한 후, 60 ul의 스트렙타비딘 용액을 각각의 용액에 분배하였다. 이후, 플레이트를 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 3회 세척 후, 100 ul의 HRP 기질 용액을 각각의 웰에 분배하고, 플레이트를 15분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 색 발달 후, 50 ul의 정지 용액을 각각의 웰에 분배하고, 각각의 웰의 흡광도를 450 nm의 파장에서 즉시 측정하였다. ELISA 결과는 도 23에 제시되었고, 이는 시험관 내 효소 절단 전 및 후의 IL2Rα 또는 Rβ에 대한 IL2 TMEAkine의 결합 활성을 나타낸다. 야생형 IL2의 IL2Rα 및 IL2Rβ에 대한 결합 활성과 비교하여, IL2 TMEAkine은 훨씬 낮은 결합 친화성으로 IL2Rα에 결합하지만, 거의 동일한 결합 친화성으로 IL2Rβ에 결합한다. 효소에 의한 활성화 후, IL2Rα에 대한 IL2 TMEAkine의 결합 친화성은 IL2Rα에 대한 야생형 IL2의 결합 친화성과 동일하다.
5. 다양한 IL2 돌연변이 부위의 요약
IL2 수용체는 세포 표면상에서 회합되어 다음의 이종체를 형성할 수 있다: IL2에 대한 중간-친화성 수용체:IL2Rβγ(Kd=1 nM) 및 IL2에 대한 낮은-친화성 수용체:IL2Rα(Kd=10 nM). 낮은-친화성 결합(Kd= 10nM)이므로, 결합 친화성을 회복하기 위해 R4 기에 연결하기 위한 위치를 스크리닝하는 것이 항체의 CDR 영역보다 용이하다. 본 발명자는 R4-S-IL2와 IL2Rα 사이의 결합 친화성을 증가시키고 싶어하지 않았으므로, 본 발명자는 고유 결합 친화성을 회복할 수 있는 특별한 R4를 갖는 컨쥬게이션된 IL2를 선택하였다. 일부 경우에, 결합 친화성을 향상시킬 수 있는 일부 R4 기가 있지만, 본 발명자는 이들을 약물 후보로서 선택하지 않았다. 본 발명자는 본 발명의 CMC 개발에서 대규모 합성을 위해 R-1, R4-7, R4-5, R4-8 및 R4-12를 선호한다. S47은 레구마인에 의해 절단된다. 절단 후, 이의 R4-7 화학기는 유지된다. 약물 후보를 선택하기 위해, 본 발명자는 또한 IL2Rα 및 IL2Rβ에 결합하는 도메인에서 IL2의 모든 아미노산과의 스크리닝 발현 및 S47 컨쥬게이션 반응을 수행하였다. 본 발명자는 가능한 약물 후보를 획득하였고, 결과는 하기 표 31-33에 제시된다.
표 31: 돌연변이된 IL2의 활성 및 링커 아암에 대한 스크리닝
Figure pct00064
Figure pct00065
표 32: 활성화 전 및 후의 수용체에 대한 2개 이상의 돌연변이 부위를 갖는 IL2 돌연변이체의 컨쥬게이트의 결합 활성
Figure pct00066
결과는 2개 이상의 돌연변이 부위를 갖는 IL2 돌연변이체의 컨쥬게이트가 활성화 후 상응하는 수용체에 대한 95% 이상의 결합 활성을 보유할 수 있음을 입증한다.
스크리닝 발현, 결합 활성, 컨쥬게이션, 절단, 회복 및 기능적 검정 후, 본 발명자는 표 33에 제시된 바와 같이 Rα를 갖는 결합 도메인 상에 하나 이상의 안정적 돌연변이 및 Rβ를 갖는 결합 도메인 상에 하나의 컨쥬게이션을 갖는 약물 후보를 획득하였다. 특히, Rα를 갖는 결합 도메인 상의 안정적 돌연변이는 Arg38 및 Glu61었고, 여기서 Arg38은 Asp로 돌연변이되고, Glu61은 Arg로 돌연변이되어, IL2 및 IL2Rα의 결합 활성에 영향을 미쳤다. 따라서, 이들 컨쥬게이션은 종양 미세환경에서 절단 후 Rα를 갖는 결합 도메인 상의 안정적인 돌연변이체를 방출한다.
표 33: 활성화 전 및 후의 수용체에 대한 하나 이상의 안정적 돌연변이 및 하나의 컨쥬게이션을 갖는 후보의 결합 활성
Figure pct00067
표 34: 활성화 전 및 후의 수용체에 대한 2개의 안정적 돌연변이체 및 하나의 컨쥬게이션을 갖는 후보의 결합 활성
Figure pct00068
결과는 R4 라이브러리 스크리닝 및 돌연변이의 컨쥬게이션으로, Rα에 대한 결합의 200배 감소 및 Rβ에 대한 결합의 1.35배 증가를 갖는 새로운 화학적으로 변형된 IL2를 획득한 것을 입증한다.
6. 인간 혈청에서의 안정성
IL2-T41C-S47 용액 및 인간 혈청을 1:19(v/v)의 비율로 혼합하고, 혼합물을 각각 0시간, 8시간, 24시간 및 48시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 이후, IL2-T41C-S47의 양을 웨스턴 블롯에 의해 검출하였고, 상응하는 결과는 도 24에 제시되었다. IL2-T41C-S47은 48시간 후에 인간 혈청에서 안정적이었고, 이는 IL2-T41C-S47이 시험관 내 인간 혈청에서 IL2보다 훨씬 더 안정적일 수 있음을 나타낸다. IL2 돌연변이체의 다른 컨쥬게이트의 인간 혈청에서의 안정성이 표 35에 제시되었다.
표 35: 인간 혈청에서의 IL2 돌연변이체의 다른 컨쥬게이트의 안정성
Figure pct00069
7. 마우스에서의 약동학
마우스에 샘플링 시간 당 n=3 마우스로 IL2-T41C-S47(0.8mg/kg)의 단일 정맥내 주사를 투여하였다. 대략 200 uL 혈액을 K2EDTA 코팅된 튜브에 수집하였다. 혈장을 원심분리 후 분리시키고, 분석때까지 -80℃에서 동결시켰다. 이후, IL2-T41C-S47 농도를 정량화된 ELISA를 이용하여 측정하였다. 결과는 도 25에 제시되었다. 생체 내 약동학 연구는 IL2 TMEAkine이 IL2와 비교하는 경우 혈장에서 긴 반감기 및 높은 노출을 갖는 것을 나타낸다.
8. 독성
C57BL/6 마우스에 5일 동안 PBS 또는 25 ug IL2의 매일 i.p. 주사 또는 5회 용량에 대해 5일마다 등몰 IL2-T41C-S47의 i.p. 주사를 각각 투여하였다. 마우스를 희생시키고, 폐를 10% 포르말린 용액에 고정시키고, 파라핀 포매된 섹션을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 결과는 도 26에 제시되었다. 폐(습윤 중량)의 측정 및 헤마톡실린 및 에오신으로 염색된 섹션은 IL2 TMEAkine이 야생형 IL12보다 폐에 대한 덜한 독성을 유도하는 것을 나타낸다.
C57BL/6 마우스에 5회 용량에 대해 5일마다 PBS, 25 ug IL2-T41C/S87C-S47 및 등몰 IL2-R38D/E61R/S87C-S47의 i.p. 주사를 각각 투여하였다. 마우스를 희생시켰다. 폐의 습윤 중량을 측정하고, 폐를 10% 포르말린 용액에 고정시키고, 파라핀 포매된 섹션을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 결과는 도 27에 제시되었다. 폐의 측정은 IL2-T41C/S87C-S47 및 IL2-R38D/E61R/S87C-S47이 폐에 거의 독성을 유도하지 않음을 나타낸다.
9. BALB/C 마우스 모델에서 CT26 종양 모델에서 IL2-T41C-S47 및 항-PD-1 항체와 조합된 IL2-T41C-S47의 효능에 대한 연구
시험 목적: CT26 종양 모델의 치료를 위해 BALB/C 마우스에서 IL2-T41C-S47 및 항-PD-1 항체와 조합된 IL2-T41C-S47의 항-종양 효능 조사.
시험 약물: 시험시 PBS에 의해 상응하는 농도로 희석된 IL2-T41C-S47, 항-PD-1 항체 및 IL2 주사.
방법 및 결과:
1. 동물: 5주령의 BALB/C 마우스, 모두 암컷.
2. 종양 모델의 생성
1) CT26 세포를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)로부터 구입하였고, ATCC에 의해 제공된 명세서에 따라 확인하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 10% 소 태아 혈청을 함유하는 RPMI 1640 배양 용액에서 배양하였다. 세포를 3일마다 계대하고, 9회 계대 내의 세포를 사용하였다.
2) 종양 모델의 생성. CT26 세포를 BALB/C 마우스의 등에 피하 주사하였다. 종양이 약 100-200mm3으로 성장한 후에 마우스를 무작위로 그룹화시키고, 약물 치료를 시작하였다. 마우스를 31일째에 마취 후에 희생시켰다.
3) 치료 과정
각각의 그룹에 6마리의 동물을 가진 5개의 그룹이 있었다. 0, 5 및 11일에 처리된 대조군 그룹 및 3개의 단일 제제 그룹(2, 4, 7, 9, 13 및 15일에 항-PD-1 항체, 또는 0, 5, 11일에 IL2, 또는 0, 5 및 11일에 IL2-T41C-S47에 의해 처리됨), 및 항-PD-1 항체 처리(2, 4, 7, 9, 13 및 15일에 제공됨) 전에 IL2-T41C-S47(0, 5 및 11일에 제공됨) 처리가 개시된 하나의 조합 면역요법 그룹이 포함되었다.
4) 그룹화 및 시험 결과가 표 36에 제시된다.
표 36: BALB/C 마우스 모델에서 CT26 종양 모델에서 IL2-T41C-S47 및 항-PD-1 항체와 조합된 IL2-T41C-S47의 효과
Figure pct00070
종양 부피를 1주일에 2-3회 모니터링하였고, 도 28에 제시되었다.
5) 결과 및 논의. 표 36에 제시된 바와 같이, BALB/C 마우스의 CT26 종양에 대한 회귀는 항-PD-1 항체와 조합된 IL2-T41C-S47의 주사 후에 크게 개선되었으며, 이는 항-PD-1 항체와 조합된 IL2-T41C-S47이 CT26 종양 모델에 대해 우수한 항-종양 효능을 나타내는 것을 나타낸다.
10. 종양, 폐 및 심장에서의 IL2-T41C-S47로부터 활성 IL2의 생체분포
BALB/C 마우스를 CT26 세포로 우측 옆구리에 피하 이식하였다. 이식 7일 후, 종양이 200 mm3로 측정된 경우, 동물에 IL2-T41C-S47(2 mg/kg Х 1)을 투여하였다. 24시간, 48시간, 96시간 및 192시간 후, 종양, 폐 및 심장을 수거하고(관찰 시간 당 n=2), 프로테아제 억제제 및 0.25% 아세트산을 함유하는 얼음 저온 PBS에서 균질화시키고, 원심분리하여 상층액을 획득하였다. IL2-T41C-S47 수준을 정량하기 위해, PEG 항체를 포획 항체로 사용하고, IL2 비오티닐화된 항체를 검출 항체로 사용한 ELISA를 수행하였다. IL2-T41C-S47 및 활성 IL2 수준을 정량하기 위해, IL 모노클로날 항체를 포획 항체로 사용하고, IL2 비오티닐화된 항체를 검출 항체로 사용한 ELISA를 수행하였다. 결과는 도 29에 제시되었고, 이는 항-종양 효과의 높은 효능과 일치하는 종양에서의 활성 IL2의 높은 노출, 및 폐 부종의 낮은 독성과 일치하는 폐 및 심장에서의 활성 IL2의 낮은 노출을 나타낸다.
실시예 8: 높은 활성화 효율을 획득하기 위한 화학 변형 링커의 섹션
R2-R3은 고유 펩티드 서열 링커와 비교하여 높은 활성화 효율을 나타내는 화학 변형 링커이다. R1이 5 kDa PEG이고, R4가 R4-2 및 대조군 링커(표에 제시된 C1-C4)인 상이한 R2-R3 링커의 활성화를 활성화 검정에서 평가하였다. R1-R2-R3-R4 컨쥬게이트를 용해시키고, 0.1 mM/ml의 최종 농도로 10회 희석시켰다. 37℃에서, 시험 화합물을 100 μg의 산성화 인간 유방암(MDA-MB435) 종양 조직 균질액(pH6.0)에 1 mg/ml의 농도로 첨가하였다. 종양 조직 균질액의 효소는 R1을 방출할 수 있었다. 방출된 R1을 HPLC로 검출하여 링커의 활성화 효율을 비교하였다. 결과는 표 37-39에 제시되었다.
표 37: 상이한 링커의 활성화 효율(%)
Figure pct00071
표 38: 상이한 링커의 활성화 효율(%)
Figure pct00072
표 39: 상이한 링커의 활성화 효율(%)
Figure pct00073
MDA-MB435 종양 조직은 레구마인, Grazym B 및 MMP2 또는 다른 프로테아제의 높은 활성을 나타낸다. 검정에서, AAN-R3-5, AAN-R3-6, AAD-R3-5, AAD-R3-6, AAD-3-7 및 AAD-R3-8은 비교적 높은 활성화 효율(>80%)을 갖는 것으로 증명되었다. R2가 부재하는 경우, R3-5는 pH6.0에서 안정적이고, R3-2, R3-4 및 R3-6은 비교적 높은 활성화 효율(>60%)을 갖는 산성(pH6.0) 활성화 링커이다.
실시예 9: 상이한 종양 미세환경에서 표적화된 활성화를 위한 상이한 활성화 가능한 링커의 활성화 효율
6개의 R1-R2-R3-R4 컨쥬게이트가 상이한 인간 종양 조직에서 검출되었으며, 여기서 R1은 5kDa PEG였고, R4는 R4-2였다. R1-R2-R3-R4 컨쥬게이트를 각각 용해시키고, 0.1 mM/ml의 농도로 10회 희석시켰다. 37℃에서, 시험 화합물을 100 μg의 상이한 산성화된 인간 종양 조직 균질액(pH6.0)에 1 mg/ml의 농도로 첨가하였다. 종양 조직 균질액의 효소는 R1을 방출할 수 있었다. 방출된 R1을 HPLC로 검출하여 링커의 활성화 효율을 비교하였다. 결과는 표 40에 나타내었다.
표 40: 상이한 종양 조직으로부터의 균질액에서 R3-3, R3-5, R3-6, AAN-R3-5, AAN-R3-6 및 AAD-R3-5의 활성화 효율(%)
Figure pct00074
실시예 10: 종양 조직 프로테아제에 의해 활성화되는 경우 상이한 생체분자에 대한 입체 장애를 나타내지 않는 화학 변형 링커
R4-1은 예시된 R4 기에서 가장 짧은 화학기이다. 상이한 생체분자를 R1-R2-R3-R4에 컨쥬게이션시켰으며, 여기서 R1은 5kDa PEG였고, R2-R3는 하기 표에 제시되었고, R4는 R4-1이었다. 컨쥬게이트를 용해시키고, 0.1 mM/ml의 농도로 10회 희석시켰다. 37℃에서, 컨쥬게이트를 100 μg의 상이한 산성화된 인간 종양 조직 균질액(pH6.0)에 1mg/ml의 농도로 첨가하거나, 레구마인 용액(0.1 ug/ml) 또는 그랜자임 B 용액(0.1 ug/ml)에 각각 첨가하였다. 종양 조직 균질액의 효소는 R1을 방출할 수 있었다. 방출된 R1을 HPLC로 검출하여 링커의 활성화 효율을 비교하였다. 결과는 표 41에 제시되었다.
표 41: 상이한 항체의 링커의 활성화 효율(%)
Figure pct00075
결과는 R2의 절단 부위가 생체분자(R5)와 거리가 멀다는 것을 입증한다. 가장 짧은 R4-1의 경우에도, R2의 절단은 생체분자에 의해 영향을 받지 않으며, 활성화 효율에 영향을 미치지 않는다.
실시예 11: 인간 혈청에서 화학 변형 링커의 안정성
화학 변형 링커 R2-R3의 안정성을 인간 혈청에서 시험하였다. R1이 5kDa PEG(PEG500)이고, R2-R3가 하기 표에 제시되고, R4가 R4-1인 R1-R2-R3-R4 컨쥬게이트를 제조하였다. 컨쥬게이트를 용해시키고, 0.1 mM/ml의 농도로 10회 희석시켰다. 컨쥬게이트를 각각 48시간 동안 37℃에서 1 mg/ml의 농도로 100 μg 인간 혈청에 첨가하였다. 온전한 컨쥬게이트는 ELISA 검정에 의해 검출될 수 있다. 남아 있는 컨쥬게이트의 농도를 비교함으로써, 안정성이 계산될 수 있었다. 결과는 표 42 및 43에 제시되었다.
표 42: 상이한 링커의 안정성(대조군의 %)
Figure pct00076
표 43: 상이한 링커의 안정성(대조군의 %)
Figure pct00077
실시예 12: 증가된 항체/S13 링커로 증가된 컨쥬게이션 효율
소규모 컨쥬게이션을 위해, 상이한 변이체에 대한 5~10 mg IgG를 반복된 원심분리에 의해 2 mM EDTA를 함유하는 50 mM Tris-HCl, pH7.5로 초여과 튜브(Merck Millipore)를 이용하여 완충액 교환하였다. 이후, 4~16시간 동안 실온에서 1:20~1:200 몰비로 DTT에 의해 항체를 약간 환원시켰다. 이후, 환원된 항체를 50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH7.5로 투석하고, 실온에서 1~3시간 동안 1:50~1:200 몰비의 Cu2SO4 또는 데하이드로아스코르브산(DHAA, Sigma)으로 재산화시켰다. 이후, 유리 설프하이드릴을 갖는 재산화된 항체를 4시간 동안 실온에서 1:10, 1:20, 1:50 또는 1:100의 비로 S13 화학 링커에 의해 컨쥬게이션시켰다. 컨쥬게이션 효율은 환원된 SDS-PAGE에 의해 제시되었다. 표 44에 제시된 바와 같이, 상이한 컨쥬게이션 효율이 획득되었다.
표 44: 증가된 항체(이필리무맙, SEQ ID NO:13)/S13 링커 비율로 증가된 컨쥬게이션 효율
Figure pct00078
CTLA4-항체의 상이한 위치에서 Cys 돌연변이를 갖는 CTLA4-항체(이필리무맙, SEQ ID NO:14): S13 링커 = 1:100 조건의 컨쥬게이션 반응에서, 돌연변이체 부위가 표 45에 제시되었다. CTLA4-항체:S13= 1:100 조건에서, 도 30의 환원된 SDS-PAGE 젤에서 제시된 바와 같이 5개 모두의 위치가 높은 효율로 S13 링커와 컨쥬게이션된다.
표 45: 1:100 분자 비 컨쥬게이션에 대한 상이한 돌연변이 부위
Figure pct00079
실시예 13: 인간 CTLA-항체의 가변 영역의 프레임워크(비-CDR)의 컨쥬게이션 효율 및 친화성 변화
본 발명자는 CTLA-4 항체의 프레임워크 영역(FR)에서 모든 비-시스테인 아미노산을 시스테인으로 돌연변이시켜 실험을 위한 시스틴 돌연변이체를 제조하였다. 일부 돌연변이 부위는 거의 100% 컨쥬게이션 효율을 나타내었다. 상이한 돌연변이체에 대한 컨쥬게이션 효율은 CTLA4-항체:S13= 1:100 조건에서 높았으며, 이는 표 46 및 47에 요약되었다. 일부 돌연변이는 매우 낮은 컨쥬게이션을 나타내며, 이는 Cys가 항체 내부에 묻힐 수 있음을 나타낸다.
표 46: 이필리무맙 경쇄 프레임워크 영역에 대한 컨쥬게이션 효율
Figure pct00080
Figure pct00081
Figure pct00082
표 47: 이필리무맙 중쇄 프레임워크 영역에 대한 컨쥬게이션 효율
Figure pct00083
Figure pct00084
Figure pct00085
S13의 높은 컨쥬게이션 효율(>80%)을 갖는 돌연변이체 부위를 R4-7과 컨쥬게이션시키고, EC50 비(WT 항체의 EC50: 돌연변이체 항체-R4-7의 EC50*100%)에 따라 ELISA 기반 검정에서 상대 결합 활성에 대해 시험하였다. 구체적으로, 96-웰 ELISA 플레이트(NUNC)를 밤새 1 ug/ml His-CTLA-4 단백질(Sino Biological)로 코팅한 후, 37℃에서 2시간 동안 1% BSA 차단제(ThermoFisher)로 차단하고, PBST로 3회 세척하였다. 상응하는 항체 또는 R4-7 컨쥬게이션을 갖는 상응하는 돌연변이체를 첨가하고, 1시간 동안 37℃에서 결합시킨 후, PBST로 3회 세척하였다. HRP 효소-컨쥬게이션된 항-인간 IgG를 첨가하고, 1시간 동안 37℃에서 결합시킨 후, PBST로 3회 세척하였다. 450nm에서 흡광도를 검출하기 위해 TMB 기질(Solarbio., Inc.)을 사용하였다. GraphPad 소프트웨어로 데이터 분석을 수행하고, 각각의 항체 또는 컨쥬게이트에 대한 EC50을 계산하였다.
FR 영역 내의 R4-7-s-cys-CTLA-4 및 CTLA-4의 WT 항체의 결합 친화성을 비교한 후, 본 발명자는 표 48 및 표 49에 제시된 바와 같이 대부분의 위치가 결합 친화성을 유지시키는 우수한 효과를 달성한 반면(그룹 A, WT 항체와 비교하여 >60%), 일부 위치가 낮은 결합 친화성(그룹 B, WT 항체와 비교하여 <60%)을 나타낸 것을 발견하였다.
표 48: R4-7과의 컨쥬게이션 후 경쇄 프레임워크 돌연변이체의 결합 활성
Figure pct00086
Figure pct00087
표 49: R4-7과의 컨쥬게이션 후 중쇄 프레임워크 돌연변이체의 결합 활성
Figure pct00088
Figure pct00089
결합 활성이 60% 미만인 이들 부위(상기 표에서 클래스 B)의 경우, 본 발명자는 이들을 상이한 화학 링커에 컨쥬게이션시켜 결합 활성을 구제하였다. 표 50에 제시된 바와 같이, 이들 중 일부의 경우, 결합 활성은 R4의 특정 화학적 변형으로 회복될 수 있다. 이들 결과는 이들 부위의 측쇄가 항체/항원 상호작용에 기여할 수 있고, 특정 화학 링커가 경쇄 구조를 모방할 수 있고, 고유 WT 아미노산과 같은 항원에 대한 분자 상호작용을 제공할 수 있음을 나타낸다.
표 50: R4-7과 컨쥬게이션되는 경우 낮은 활성을 갖는 부위의 활성을 회복시키기 위한 R4 스크리닝
Figure pct00090
S13(5kD 작용기) 또는 S47(40kD 작용기) 화학 링커와 컨쥬게이션되는 경우 선택된 부위의 차단 효과
본 발명자는 종양 미세환경 활성화 항체(TMEAbody) 스크리닝을 위한 후보 부위로서의 R4-7 또는 다른 R4 링커와의 컨쥬게이션 후 활성이 회복될 수 있는 상기 부위를 선택하였는데, 이는 프로테아제 절단 후, 컨쥬게이션된 항체가 항체 돌연변이체-s-R4 형태와 동일한 구조로 유지될 것이기 때문이다. S13(5kD 작용기)과 컨쥬게이션된 후의 차단 효과를 먼저 실시예 1과 같은 ELISA 검정으로 평가하였다. 표 51에 제시된 바와 같이, S13 링커와의 컨쥬게이션 후, 이들 중 일부는 항원 단백질에 대한 결합 활성의 유의한 차단 효과를 나타내었다. 본 발명자는 또한 표 51에 제시된 바와 같이 클래스 A로서 30% 미만의 활성을 갖는 이들 부위 및 클래스 B로서 다른 부위를 분류하였다.
표 51: S13(5kD) 링커와 컨쥬게이션된 경우 선택된 부위의 차단 효율
Figure pct00091
Figure pct00092
Figure pct00093
본 발명자는 고 분자량 작용기로 차단 효율이 개선될 수 있는지 추가로 조사하였다. S47(40kD 작용기를 가짐) 및 S64(80kD 작용기를 가짐)를 컨쥬게이션에 사용하였고, 차단 효율을 결합 ELISA 검정에서 상기 방법으로 측정하였다. 결과는 표 52에 요약되었고, 이는 증가된 분자량이 결합 활성의 차단 효율을 유의하게 개선시킬 수 있음을 나타내었다. 모든 부위는 S64(80kD) 작용기와 컨쥬게이션되는 경우 30% 미만의 활성을 나타내었다.
표 52: S13(5kD), S37(20kD), S47(40kD) 또는 S64(80kD) 링커와 컨쥬게이션되는 경우 선택된 부위의 차단 효율
Figure pct00094
Figure pct00095
Figure pct00096
인간 CTLA-4 항체 및 PD-1 항체의 가변 영역의 프레임워크(비-CDR)에서의 R4 라이브러리에 의한 R4 변형 항체의 결합 친화성 개선
프레임워크(비-CDR) 영역은 보존적 서열이며, CDR 영역을 연결하여 상이한 항체를 형성시키는 데 사용되었다. 표 51 및 표 52에 제시된 바와 같이, 일부 아미노산의 측쇄가 변하는 경우, 결합이 감소되며(클래스 B), 이는 아미노산의 측쇄가 CDR과의 항원 결합을 돕는 상호작용 또는 공간을 제공할 수 있음을 나타낸다. 일반적으로, 프레임워크와 항원 사이의 상호작용은 CDR 영역과 항원 사이의 상호작용보다 약하다. PD-1 항체(니볼루맙)의 선택된 돌연변이체 위치에 대한 상이한 R4의 컨쥬게이션에 의해, 본 발명자는 야생형 항체와 비교하여 더 높은 친화성을 획득하거나 화학 변형 항체의 친화성을 유지할 기회가 있다.
표 53: PD-1 항체(니볼루맙)에 대한 보존적 FR 부위(WT 항체의 %)에서 돌연변이 생체분자 라이브러리와 컨쥬게이션된 R4의 결합 활성
Figure pct00097
결과는 상이한 항체의 FR 영역에서 보존적 부위에 상이한 R4를 컨쥬게이션시키는 것이 결합 활성을 조정할 수 있음을 나타내었다. 대표적 Gly41에서, R4-1과의 컨쥬게이션에 의해 62.6% 결합 친화성을 회복할 기회를 또한 갖는다. VH의 보존적 Gln3, Ser7, Ser26, Glu46, Thr68, Asp72, 및 프레임워크의 Thr5, Tyr49, Arg61, Ser63, Ser65, Ser67, Thr72, Thr74, Ser76, Asp82에서, 더 높은 친화성 결합 컨쥬게이션이 스크리닝될 수 있다. 프레임워크 서열(FR1, FR2 및 FR3)은 모든 종류의 인간 항체에서 보존적이므로, FR 영역에서 이들 보존적 부위에 상이한 R4를 컨쥬게이션시킴으로서, 임의의 항체는 결합 친화성을 유지하거나 증가시킬 기회를 갖는다.
인간 점라인 항체의 가변 영역의 프레임워크(비-CDR)에서 높은 상동성 서열에서 돌연변이체의 결합 활성에 대한 분석
인간 항체는 2개의 동일한 경쇄(LC) 및 2개의 동일한 중쇄(HC)를 포함하는 4개의 펩티드 사슬로 구성된다. 사슬은 디설파이드 결합(들) 및 비-공유 결합에 의해 단량체를 형성한다. 2개의 유형의 경쇄, κ 및 λ, 및 5개의 유형의 중쇄, 즉 μ, δ, γ, ε 및 α가 있다. 항체는 전체적으로 불변 영역 및 가변 영역으로 나뉜다. 가변 영역은 Y형 구조물의 2개의 아암의 말단에 위치한다. 인간화 또는 인간 항체는 특정한 일반성을 가지며, 즉, 이들은 모두 Y형 구조물의 2개의 아암의 말단에 중쇄 또는 경쇄에 4개의 루프를 함유한다. 3개의 루프는 매우 가변적이고, 항원에 대한 결합을 직접 예상한다. 이들 루프의 영역은 CDR로 언급되며, 여기서 CDR1, CDR2 및 CDR3은 이들 3개의 루프에 각각 존재한다.
생체 내에서 면역글로불린 상과의 유전자의 재조합에 의해 항체를 생성시켰다. 상이한 항원에 대한 항체의 일부 프레임워크 영역은 동일한 점라인 항체의 유전자 또는 아미노산 서열로부터 유래될 수 있다. CDR 사이에는 모든 종류의 인간 항체에서 보존적인 프레임워크 서열(FR1, FR2 및 FR3)이 존재한다. 가변 영역에 대한 모든 종류의 인간 항체는 선도 서열의 경우 시작 코돈으로부터 가변 영역 유전자 엑손 전의 마지막 뉴클레오티드까지, VH, VK 및 VL의 경우 V 유전자 엑손의 시작(FR1의 잔기 1)으로부터 헵타머 재조합 신호 서열 전의 마지막 뉴클레오티드/아미노산까지 전체적으로 제시된다. 8개의 선택된 항체 서열이 도 31에 제시된다.
본 발명자는 FR 영역 및 WT 항체의 다른 부위와의 결합 친화성을 비교하기 위해 발현을 위해 동일한 보존된 위치에 해당하는 항체의 중쇄 및 경쇄 DNA 서열을 돌연변이시켰다. 5개의 항체 서열에서, R4-7와 컨쥬게이션시키기 위해 VH에서 Gln3, Ser7, Ser26, Glu46, Thr68 및 Asp72, 및 VL에서 Thr5, Tyr49, Arg61, Ser63, Ser65, Ser67, Thr72, Thr74, Ser76 및 Asp82(아미노산의 위치는 케이뱃 넘버링에 따라 넘버링됨)의 보존적 부위를 선택하였다.
표 54: 보존적 FR 부위에서 돌연변이 생체분자 라이브러리와 컨쥬게이션된 R4-7의 결합 활성(WT 항체의 %)
Figure pct00098
결과는 상이한 항체의 FR 영역에서 R4-6을 VH의 Gln3, Ser7, Ser26, Glu46, Thr68 또는 Asp72 및 VL의 Thr5, Tyr49, Arg61, Ser63, Ser65, Ser67, Thr72, Thr74, Ser76 또는 Asp82의 보존적 부위에 컨쥬게이션시키는 것은 야생형 항체 또는 다른 위치와 비교하여 결합 활성을 유지시킬 수 있음을 나타내었고, 이는 본래의 결합 활성의 60% 이상이었다. 대표적 음성 대조군 Gly41에서, 모든 항체에서 결합 친화성을 상실하였다(WT 항체의 <60%).
실시예 14
CTLA-4는 종양 미세환경에서 T 세포 표면에 존재한다. 본 발명자는 결합 친화성을 유지시키거나 증가시키기 위해 상이한 R4 기에 의해 스크리닝하기 위해 항체의 CDR 영역의 모든 아미노산을 돌연변이시켰다. 일부 경우에, 결합 친화성을 향상시킬 수 있는 일부 R4 기가 있지만, 본 발명자는 이들을 본 발명의 개발에서 약물 후보로서 선택하지 않았다. 본 발명자는 본 발명의 약물 개발에서 대규모 합성 및 안정성을 위해 R-1, R4-7, R4-5, R4-8 및 R4-12를 선호한다. R4와 컨쥬게이션된 CTLA-4 항체는 R4 라이브러리 스크리닝의 화학적 변형 성숙에 의해 일부 위치에서 60% 초과로 결합을 회복시킬 수 있다.
표 55: 상이한 R4 분자에 대한 컨쥬게이션 후 CDR 영역에서 돌연변이를 갖는 항-CTLA-4 항체의 돌연변이체의 결합 효과
Figure pct00099
Figure pct00100
Figure pct00101
결과에 따르면, 항-CTLA-4 항체의 CDR에서 G,A, S, L, T, I, F, E, K,D, N, Q, R 또는 Y를 C로 돌연변이시키고, 상이한 R4에 결합시킨 후, 돌연변이체는 60% 초과의 결합 효율을 유지할 수 있었다.
일부 경우에, 결합 친화성을 향상시킬 수 있는 일부 R4 기가 존재한다. 본 발명자는 본 발명의 약물 개발에서 약물 후보로서 R4-s-R5의 60~100% 사이의 결합 친화성을 선택하였다. 본 발명자는 본 발명의 약물 개발에서 대규모 합성 및 안정성을 위해 R-1, R4-7, R4-5, R4-8 및 R4-12를 선호한다. S47은 레구마인에 의해 절단되며, 절단 후 R4-7 화학기는 유지된다. CDR의 아미노산에 S47을 컨쥬게이션시킨 후, 이들 모든 컨쥬게이트는 감소된 친화성(WT CTLA-4보다 30% 미만의 활성)으로 CTLA-4 결합을 차단할 수 있다. 따라서, CDR 영역 또는 돌연변이체에서의 위치는 종양 미세환경 활성화 항체의 주요 약물 후보가 될 수 있다.
표 56: S47(40kD) 링커와 컨쥬게이션된 CDR 영역의 차단 효율
Figure pct00102
Figure pct00103
결과에 따르면, 항-CTLA-4 항체의 CDR의 고유 아미노산을 시스틴으로 돌연변이시키고, 상이한 R4(R4 라이브러리 스크리닝)에 화학적으로 컨쥬게이션시킨 후, 돌연변이체는 60% 초과의 결합 효율을 유지할 수 있었다. CDR의 아미노산과의 S47 컨쥬게이션 반응 후, 이들 모든 위치는 감소된 친화성(WT CTLA-4와 비교하여 30% 미만)으로 CTLA-4 결합을 차단할 수 있다. 따라서, 모든 S47 컨쥬게이트는 종양 미세환경 활성화 항체에 대한 일차 약물 후보가 될 수 있다.
항체의 친화성을 개선시키기 위해, CDR 루프 상의 아미노산을 친화성 성숙 동안 돌연변이시켰다. 실제로, 항체 친화성의 최적화는 또한 적합한 R4로의 컨쥬게이션(본원에서 항체의 화학적 성숙으로 언급됨)에 의해 달성될 수 있다. 도 32에 제시된 바와 같이, 상이한 R4 기를 항체의 선택된 돌연변이체 부위에 부위 특이적으로 컨쥬게이션시킴으로써, 본 발명자는 스크리닝을 위해 R4 기를 선택적으로 변경할 수 있다. (1) 고유 아미노산은 리간드와 H-결합 또는 전하 상호작용을 갖지 않는다. 화학적 성숙은 새로운 상호작용을 유도할 수 있다. (2) 고유 아미노산은 거리에 대해 리간드와 약한 H-결합 또는 전하 상호작용을 갖는다. 화학적 성숙은 거리를 조정(R4-b에 의함)하여 최상의 거리를 스크리닝할 수 있다. (3) 고유 아미노산은 약한 H-결합 또는 전하 상호작용을 갖는다. 화학적 성숙은 상호작용 기를 변화시켜 최상의 R4-c 기를 스크리닝할 수 있다. (4) 화학적 성숙은 또한 NH2 + 또는 O-를 증가시킴으로써 전하를 증가시킬 수 있다. 결과로서, 새로운 친화성 성숙의 일종으로 H-결합의 상호작용 또는 전하 상호작용을 증가시킬 가능성이 있다.
본 발명자는 동일한 CTLA-4 항체에서 1개 또는 2개의 돌연변이를 갖는 3개의 돌연변이체에 R4를 컨쥬게이션시킴으로써 항체의 화학적 성숙을 수행하였다. 결과는 표 57에 제시되었다.
표 57: 3개의 돌연변이체에 대한 R4 컨쥬게이션의 결합 활성
Figure pct00104
항체 친화성의 최적화는 또한 적합한 R4 기에 컨쥬게이션시킴으로써 항체의 CDR 루프에서 화학적 성숙에 의해 달성될 수 있다.
실시예 15
작제된 CTLA-4 TMEAbodies의 결합 ELISA 특성규명
약물 개발에서, 본 발명자는 최상의 차단 효율을 갖는 부위를 수집하고, 추가 개발을 위해 활성을 회복시켰다. S47과의 컨쥬게이션 후, 인간 항체는 종양 미세환경 활성화 항체가 되며, TMEAbody로 명명된다.
종양 미세환경에서 인간 CTLA-4 단백질에 대한 결합에서 TMEAbodies의 회복 능력을 평가하기 위해, 컨쥬게이션된 TMEAbodies를 레구마인에 의해 시험관 내에서 절단하고, 절단된 생성물을 인간 CTLA-4에 대한 회복된 결합 활성을 평가하기 위해 사용하였다. 인간 CTLA-4에 대한 작제된 TMEAbodies의 결합 특성을 특성규명하기 위해, 0.5 μg/ml CTLA-4 Fc 융합 단백질(R&D systems)을 밤새 4℃에서 인큐베이션하여 Maxisorp ELISA 플레이트(Nunc)에 코팅하였다. 이후, 플레이트를 PBST로 3회 세척하고, 2시간 동안 실온에서 2% BSA로 차단하였다. PBST로 3회 세척 후, 플레이트를 1시간 동안 실온에서 일련의 농도의 컨쥬게이션된 TMEAbodies, 컨쥬게이션 전의 TMEAbodies(시스테인 돌연변이체 형태) 및 대조군 야생형 (WT) 이필리무맙 항체와 함께 인큐베이션하였다. 이후, 플레이트를 PBST로 3회 세척하고, 1시간 동안 실온에서 1:5000 희석으로 HRP(Sigma)와 컨쥬게이션된 염소 항-인간 IgG Fab 단편에 의해 인큐베이션하였다. PBST로 3회 세척한 후, 플레이트를 테트라메틸벤지딘(TMB, Solarbio) 및 ELISA 정지 완충액(Solarbio)으로 발달시켰다. 이후, 450 nm에서의 흡광도를 ELISA 플레이트 판독기(Biotek)로 측정하였다. 이후, 데이터를 GraphPad Prism 5 소프트웨어로 분석하였다.
표 58에 제시된 바와 같이, 상이한 돌연변이체 부위에 대한 화학 링커의 컨쥬게이션은 상이한 정도의 차단 효율을 발생시킬 수 있다. 차단 효율은 결합 곡선의 EC50 값의 배수 변화에 의해 계산될 수 있다. 10배 초과의 차단 효율을 갖고 회복된(WT의 2배 미만의 EC50 값) 컨쥬게이션된 TMEAbodies를 추가 개발을 위한 우수한 후보로 간주하였다.
표 58: 차단 효율 및 프로테아제 절단 후 회복된 활성에 의해 선택된 이필리무맙 TMEAbody 후보
Figure pct00105
상기 기재된 바와 동일한 ELISA 방법을 수행하였다. 도 33에 제시된 바와 같이, 상이한 부위로의 컨쥬게이션은 상이한 정도의 결합 활성 회복을 나타내었다. 일부 돌연변이체 부위는 소화 후 WT 이필리무맙과 동등한 결합 활성(2 미만의 EC50 변화 배수, 또는 달리 말하면 WT의 50% 초과의 활성)을 나타내었다.
이필리무맙의 감소된 수용체 차단 활성을 발생시킨 TMEAbodies의 항원 결합의 차단
이후, CTLA-4 단백질에 대한 TMEAbodies의 감소된 결합이 또한 B7-1 CTLA-4 상호작용에 대한 이필리무맙의 차단 효능을 감소시키는 것을 입증하기 위해 수용체 차단 활성(RBA) 검정을 이용하였다. 0.5 μg/ml 인간 CTLA-4 Fc 융합 단백질(R&D systems)을 Maxisorp ELISA 플레이트(Nunc)에 흡수시킨 후, 플레이트를 2% BSA로 차단하였다. 상이한 농도의 TMEAbodies 또는 WT 이필리무맙을 갖는 0.02μg/ml 비오티닐화 인간 B7-1 또는 B7-2 단백질을 플레이트와 완전히 인큐베이션한 후, 스트렙타비딘-HRP(ThermoFisher Scientific) 인큐베이션 후 표준 ELISA의 절차와 같은 TMB 반응으로 수용체 차단 활성을 측정하였다.
도 34에 제시된 바와 같이, 인간 CTLA-4 단백질에 대한 유의한 감소된 결합 활성을 갖는 TMEAbodies는 또한 수용체 차단 활성의 극적인 감소를 나타내었다. IC50의 배수 변화는 수용체 차단 활성의 감소를 평가하기 위한 정량적 파라미터로 사용될 수 있었다.
RBA 검정에 대한 다른 후보의 데이터는 표 59에 요약되었다.
표 59: 이필리무맙 TMEAbody 후보의 RBA 검정 데이터 요약
Figure pct00106
SEB 유도 T 세포 활성화 검정에서 감소된 기능적 효능을 발생시킨 TMEAbodies의 항원 결합의 차단
다음으로, TMEAbodies에서 관찰된 감소된 항원 결합 활성 및 수용체 차단 활성이 이필리무맙의 기능적 효능의 감소에 기여할 수 있는지 평가하기 위해, 스태필로코커스 장독소(SEB) 유도 T 세포 활성화 검정을 수행하였다. SEB는 T 림프구를 강하게 활성화시키고 사이토카인 분비를 유도할 수 있는 초항원이다. 건강한 공여자로부터의 전체 PBMC 세포(Allcells)를 10% FBS(GIBCO), 100ng/ml SEB(Toxin Technology) 및 상이한 농도의 TMEAbodies, WT 이필리무맙 또는 동형 대조군 인간 IgG를 각각 갖는 1640 배지(GIBCO)에서 웰 당 1E5 세포로 배양하였다. 활성화 96시간 후, 상층액을 원심분리에 의해 수집하고, IL2 방출을 ELISA 방법(R&D systems)을 이용한 IL2 검출 키트에 의해 측정하였다.
도 35에 제시된 바와 같이, CTLA-4에 대한 감소된 결합 활성을 갖는 TMEAbody는 T 세포 활성화의 기능적 효능의 손상을 나타내었고, 프로테아제 매개 활성화는 TMEAbody의 활성을 회복시킬 수 있다.
이러한 검정을 또한 단일 농도(10 ug/ml)에서 다른 TMEAbody에 대해 수행하였고, 차단 효율이 계산되었다((WT-TMEAbody)/(WT-hIgG)*100%). 결과는 표 60에 제시되었다.
표 60: TMEAbody 차단 효율 SEB 유도 T 세포 활성화
Figure pct00107
종양에서 Treg을 조절하나 말초에서는 그렇지 않은 이필리무맙 TMEAbodies
TMEAbodies가 종양 미세환경에서 특이적으로 활성화되나, 말초 림프 기관에서는 그렇지 않은 것을 확인하기 위해 메커니즘 연구를 수행하였다. 이필리무맙 요법에 대해 제안된 메커니즘 중 하나는 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 효과를 통해 Treg 세포의 집단을 하향조절하여 종양에 대한 면역 반응을 활성화시킬 수 있다는 것이다. Treg 집단은 각각 CD4, CD25 및 Foxp3 마커와 함께 흐름세포측정법으로 분석하였다. 도 36에 제시된 바와 같이, 이필리무맙 TMEAbodies는 WT 이필리무맙과 유사한 효능으로 종양에서 Treg 집단을 유의하게 하향 조절하였다. 그럼에도 불구하고, 비장 또는 말초 혈액에서, 이필리무맙 TMEAbodies는 Treg 집단의 매우 약한 조절을 나타내거나 조절을 나타내지 않았다. 이들 결과는 이필리무맙 TMEAbodies가 종양 미세환경에서 특이적 활성을 나타내지만, 말초 림프 기관 또는 혈액에서는 그렇지 않음을 입증하였다.
인간 혈장에서 안정적인 TMEAbody
혈청에서 TMEAbody의 안정성을 평가하기 위해, 1ug CTLA-4 TEMAbody(S13의 컨쥬게이션을 갖는 Ipi053)를 20 ul 마우스 혈청에 넣고, 각각 2시간, 4시간, 24시간, 48시간 및 96시간 동안 37℃에서 유지시켰다. 이후, 항-인간 Fab HRP 항체(Sigma)로 웨스턴 블롯을 위해 샘플을 제조하였다. 젤 강도를 ImageJ 소프트웨어로 분석하였고, 상대 강도를 GraphPad로 분석하였다. 하기 도 37에 제시된 바와 같이, TMEAbody는 37℃에서 96시간 후 유의한 분해 없이 마우스 혈청에서 높은 안정성을 나타내었다.
WT-이필리무맙 및 CTLA-4 프로바디와 비교하여 S47 작용기와의 컨쥬게이션에 의해 증가된 반감기 및 노출을 나타낸 CTLA-4 TMEAbodies
TMEAbody의 약동학 특성을 조절하는 데 화학적 컨쥬게이션의 잠재적 효과를 평가하기 위해, 단일 IV 용량의 1mg/kg WT 이필리무맙 또는 이필리무맙TMEAbody를 Balb/c 마우스에 주사하였다. 0.5시간, 2시간, 4시간, 8시간, 1일, 2일, 5일, 10일, 15일, 20일 후, 혈장을 전체 항체의 ELISA 시험 및 활성 항체 농도 결정을 위해 수집하였다. 전체 항체 농도 결정을 위해, 항-인간 Fc 항체(Invitrogen)를 ELISA 플레이트(NUNC)에 코팅하고, 주입된 항체를 항-인간 Fab HRP 이차 항체(Invitrogen)에 의해 검출하였다. 활성 항체 농도 결정을 위해, 인간 CTLA-4 단백질(Sino Biological)을 ELISA 플레이트에 코팅하였다. 이후, 활성 항체는 항-인간 Fc HRP 이차 항체(Invitrogen)에 의해 검출되었다. WT 이필리무맙 또는 이필리무맙 TEMAbody의 연속 희석에 의해 표준 곡선을 그리고, 표준 결합 곡선을 4-파라미터 적합을 통해 확립하였다. 전체 항체 또는 활성 항체의 농도를 Y 값을 표준 곡선에 보간하여 계산하였다. 도 38(a)에 제시된 바와 같이, TMEAbody의 반감기는 WT 이필리무맙 항체 또는 이필리무맙 프로바디와 비교하여 40kd 작용기와의 컨쥬게이션 후 증가되었다(마스킹 펩티드로서 MY11 및 절단 모이어티로서 2011을 갖는 WO 2018/085555 A1호). 또한, CTLA-4TMEAbody는 도 38(b)에 제시된 바와 같이 시간이 지남에 따라 이필리무맙 프로바디보다 혈장에서 덜한 활성화를 나타내었다.
마우스 종양 모델에서의 TMEAbodies의 생체 내 특성규명
동물 모델에서 종양을 치료하는 데 TMEAbodies의 생체 내 효능을 추가로 특성규명하기 위해, 이필리무맙 TMEAbodies뿐만 아니라 WT 이필리무맙 및 대조군 인간 IgG를 인간 CTLA-4 넉-인 C57BL/6 마우스에서 MC38 결장 선암종 종양 모델에 투여하였다. 인간 CTLA-4 넉-인 C57BL/6 마우스에 2E6 MC38 세포를 좌측 하복부 사분면으로 피하 주사하였다. 종양 성장 7일 후, 동물을 유사한 평균 종양 부피를 갖도록 그룹화하였다. 동물에 지정된 단일 용량의 대조군 인간 IgG, WT 이필리무맙 또는 등몰 TMEAbodies(항체의 농도, n=6)를 각각 투여하고, 종양 부피를 각각의 동물에 대해 모니터링하였다. 도 39에 제시된 바와 같이, 이필리무맙 TMEAbodies는 WT 이필리무맙과 동등한 효능으로 종양 크기를 제어하는 반면, 대조군 인간 IgG는 어떠한 효능을 나타내는 데 실패하였다. 종양 부피 억제율은 표 61에 요약되었다. 이러한 결과는 이필리무맙 TMEAbodies가 종양 미세환경에서 활성화될 수 있고, 항-종양 면역 반응을 고무시킬 수 있음을 암시하였다.
표 61: 투여 17일 후의 종양 성장 억제율
Figure pct00108
표 61에 제시된 바와 같이, S47-Ipi053 및 S47-Ipi066에 의한 종양 성장에 대한 억제 및 치료율은 동일한 몰 농도를 사용하는 WT(Ipi)에 의해 치료되는 그룹과 비교하여 크게 개선되었다.
동물에서 낮은 면역원성을 나타낸 CTLA-4 TMEAbodies
TMEAbody의 면역원성을 평가하기 위해, 3개 그룹의 Balb/c 마우스(각각 n=5)를 완전 프로인트 애쥬번트(CFA)와 함께 50 μg 이필리무맙 TMEAbody, WT 이필리무맙 또는 이필리무맙 프로바디(마스킹 펩티드로서 MY11 및 절단 모이어티로서 2011을 이용한 WO 2018/085555 A1호)로 면역화시켰다. 일차 면역화 14일 후, 불완전 프로인트 애쥬번트(IFA)와 함께 25 μg 이필리무맙 TMEAbody, WT 이필리무맙 또는 이필리무맙 프로바디로 동물을 부스팅하였다. 부스팅 7일 후에 혈청을 획득하고, 각각 이필리무맙 TMEAbody, WT 이필리무맙 또는 이필리무맙 프로바디에 대한 항체 역가에 대해 시험하였다. 혈청 희석 완충액에 1% 인간 혈청을 사용하여 인간 IgG의 불변 영역에 대한 임의의 항체를 차단하였다. 도 40에 제시된 바와 같이, TMEAbody는 WT 이필리무맙과 동등하거나 이보다 낮은 항체 역가로 동물에서 매우 낮은 면역 반응을 유발하였다. 그럼에도 불구하고, 이필리무맙 프로바디는 경쇄의 N 말단에 포함된 외래 서열로 인한 것일 수 있는 면역원성의 급격한 증가를 유발하였다.
생체 내에서 낮은 독성을 나타낸 CTLA-4 TMEAbodies
항-PD-1 및 항-CTLA-4 항체의 조합이 흑색종을 치료하는데 효과적(ORR)이나, 조합이 55% TRAE 등급 3-4를 나타내고, 30%의 환자가 요법을 중단해야 하는 것이 현재 임상 연구에서 밝혀진 것이 당 분야에 널리 공지되어 있다. 본 발명자는 항체가 컨쥬게이트에 의해 억제되거나 차단되고, 병에 걸리지 않은 환경에서 활성 약물의 노출 시간 또는 용량을 감소시키기 위해 종양의 국소 환경에 도달한 후에 방출되는 경우 이들 TRAE가 개선될 수 있다고 추정한다. 이러한 이유로, 타입 I 당뇨병(NOD)로 고통받는 마우스로 실험을 수행하였다. 이러한 종류의 마우스의 당뇨병은 자가면역 질환이며, 여기서 자가 활성화된 T 림프구 세포는 췌장 섬 β 세포를 파괴하여 인슐린의 불충분한 분비를 발생시킨다. 먼저, 10주령의 암컷 NOD(Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.)에 0일에 대조군 IgG, 높은(15 mpk) 용량의 항-PD-1 및 항-CTLA-4 항체 또는 15 mpk 용량의 항-PD-1 및 항-CTLA-4 TMEAbody(S47-Ipi053)를 각각 주사하였다. 소변에서의 글루코스 및 2개의 혈당 수준을 포함하는 당뇨병의 지표를 소변 글루코스의 새로운 지표가 관찰되지 않을때까지 12일 동안 매일 관찰하였다.
컨쥬게이트에 의한 자가면역으로부터의 보호가 도 41에 제시되었다. 결과는 병용 요법 컨쥬게이트에서 항-CTLA4 TMEAbody의 컨쥬게이트에 의한 면역계의 보호가 일차 항체와 비교하여 자가면역을 감소시킬 수 있음을 나타내었다.
실시예 16: PD-1 TMEAbody(펨브롤리주맙)의 생성 및 특성규명
상기 이필리무맙 TMEAbody 스크리닝의 예에 제시된 바와 같이, 항-PD-1 항체(펨브롤리주맙)의 다수의 부위를 부위 특이적 컨쥬게이션을 위해 시스테인으로 돌연변이시켰다. 항-PD-1 항체(펨브롤리주맙)의 중쇄에서의 돌연변이 위치는 Ser7, Gly8, Gly15, Ala16, Ser17, Ala24, Ser25, Gly26, Tyr27, Thr28, Thr30, Asn31, Tyr32, Tyr33, Tyr35, Ala40, Gly42, Gly44, Leu45, Gly49, Gly50, Ile51, Asn52, Ser54, Asn55, Gly56, Gly57, Thr58, Asn59, Lys63, Lys65, Thr69, Leu70, Thr71, Thr72, Asp73, Ser74, Ser75, Thr76, Thr77, Thr78, Ala79, Leu83, Ser85, Leu86, Thr91, Ala92, Arg99, Asp100, Tyr101, Arg102, Asp104, Gly106, Gly111, Gly113, Thr114, 115Thr, 117Thr, Ser119, Ser120, Ala121, Ser122, Thr123, Lys124, Gly125 및 Ser127로 구성된 군으로부터 선택되고(케이벳 또는 다른 항체 넘버링 시스템을 이용하지 않고 N 말단으로부터 C 말단으로 순차적으로 넘버링됨); 경쇄에서의 돌연변이 위치는 Ile2, Thr5, Ser7, Ala9, Thr10, Leu11, Ser12, Leu13, Ser14, Gly16, Ala19, Thr20, Ala25, Ser26, Lys27, Gly28, Ser30, Thr31, Ser32, Gly33, Tyr34, Ser35, Tyr36, Leu37, Gly45, Ala47, Leu50, Leu51, Ile52, Tyr53, Leu54, Ala55, Ser56, Tyr57, Leu58, Ser60, Gly61, Ala64, Ser67, Gly68, Ser69, Gly70, Ser71, Gly72, Thr73, Ala76, Thr78, Ser80, Ser81, Ser95, Arg96, Asp97, Leu98, Leu100, Thr101, Phe102, Gly104, Ile110, Lys111 및 K130으로 구성된 군으로부터 선택된다. 인간 Fc 태깅된 PD-1 단백질(Sino Biological)을 이용한 ELISA 특성규명을 수행하여 우수한 차단 효율 및 회복 효율을 갖는 후보 부위를 확인하였다. 5배 초과(달리 말하면, 20% 미만의 활성)의 차단 효율 및 효소 소화 후 회복된 활성(2배 미만의 EC50 변화, 또는 달리 말하면, 50% 초과의 활성)을 갖는 부위를 표 62에 제시된 바와 같이 추가 개발을 위해 선택하였다.
표 62: 차단 및 회복 효율에 기초하여 선택된 항-PD-1 TMEAbody(펨브롤리주맙) 후보
Figure pct00109
실시예 17: 항-PD-1 TMEAbody(펨브롤리주맙)의 기능적 특성규명
인간 PBMC(Allcells)를 96-웰 플레이트에 웰 당 1Х105 세포의 농도로 접종하였다. 세포를 3일 동안 0.1 ug/ml SEB로 자극하였다. 상이한 농도의 WT 항-PD-1 항체, TMEAbody 또는 활성화된 TMEAbody를 첨가하고, 4일 동안 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 상층액을 수집하고, 세포독성 인자 IFN-γ의 농도를 ELISA 키트(R&D)에 의해 검출하였다. 기능적 차단 효율 및 회복율이 표 63에 요약되었다.
표 63: 항-PD-1 TMEAbody(펨브롤리주맙) 후보의 기능적 특성규명
Figure pct00110
실시예 18: PD-1 TMEAbody(니볼루맙)의 생성 및 특성규명
상기 이필리무맙 및 펨브롤리주맙 TMEAbody 스크리닝의 예에 제시된 바와 같이, 항-PD-1 항체(니볼루맙)의 다수의 부위를 부위 특이적 컨쥬게이션을 위해 시스테인으로 돌연변이시켰다. 항-PD-1 항체(니볼루맙)의 중쇄에서의 돌연변이 위치는 Gln3, Ser7, Gly8, Gly9, Gly10, Gly15, Ser17, Lys23, Ala24, Ser25, Gly26, Ile27, Asn31, Thr28, Ser30, Ser32, Gly33, Ala40, Gly42, Gly44, Leu45, Ala49, Ile51, Tyr53, Asp54, Gly55, Ser56, Lys57, Tyr59, Tyr60, Ala61, Asp62, Ser63, Lys65, Gly66, Thr69, Ile70, Ser71, Arg72, Asp73, Asn74, Ser75, Lys76, Asn77, Thr78, Leu79, Leu81, Ser85, Leu86, Ala88, Thr91, Ala92, Thr98, Asn99, Asp100, Asp101, Tyr102, Gly104, Gly106, Thr107, Leu108, Thr110, Ser112, Ser113, Ala114, Ser115, Thr116, Lys117, Gly118 및 Ser120으로 구성된 군으로부터 선택되고; 경쇄에서의 돌연변이 위치는 Ile2, Leu4, Thr5, Ser7, Ala9, Thr10, Leu11, Ser12, Leu13, Ser14, Gly16, Ala19, Thr20, Leu21, Ala25, Ser26, Ser28, Ser30, Ser31, Tyr32, Leu33, Ala34, Tyr36, Gly41, Ala43, Leu46, Leu47, Ile48, Tyr49, Asp50, Ala51, Ser52, Asn53, Arg54, Ala55, Thr56, Gly57, Ile58, Ala60, Arg61, Ser63, Gly64, Ser65, Gly66, Ser67, Gly68, Thr69, Thr72, Leu73, Thr74, Ile75, Ser76, Ser77, Leu78, Ala84, Ser91, Ser92, Asn93, Arg96, Thr97, Phe98, Gly99, Gly101, Thr102, Ile106, Lys107, Thr109, Ala111, Ala112, Ser114, Ile117 및 Ser121로 구성된 군으로부터 선택된다. 5배 초과의 차단 효율 및 효소 소화 후 회복된 활성(2배 미만의 EC50 변화)을 갖는 부위를 표 64에 제시된 바와 같이 추가 개발을 위해 선택하였다.
표 64: 차단 및 회복 효율에 기초하여 선택된 항-PD-1 TMEAbody(니볼루맙) 후보
Figure pct00111
도 42에 제시된 바와 같이, Niv-se001은 WT 니볼루맙의 432%인 40kD 컨쥬게이션된 TMEAbody의 R4-7 컨쥬게이션 또는 프로테아제 절단 후에 증가된 활성을 나타내었다. 이는 고유 리신 잔기보다 결합 활성이 증가된 경우 R4-7로 인한 것일 수 있다.
Niv-se005는 Try49가 시스테인으로 돌연변이된 경우에 결합 활성을 상실한 것을 나타내었다. 그러나, R4-7과의 컨쥬게이션 후, 또는 40kD 작용기와 컨쥬게이션된 Niv-se005의 프로테아제 절단 후, 결합 활성은 도 43에 제시된 바와 같이 WT 니볼루맙과 동등한 수준(WT의 125%)으로 회복된다.
실시예 19: 항-PD-1 TMEAbody(니볼루맙)의 기능적 특성규명
인간 PBMC(Allcells)를 96-웰 플레이트에 웰 당 1Х105 세포의 농도로 접종하였다. 세포를 3일 동안 0.1 ug/ml SEB로 자극하였다. 상이한 농도의 WT 항-PD-1 항체(니볼루맙), TMEAbody(니볼루맙) 또는 활성화된 TMEAbody(니볼루맙)를 첨가하고, 4일 동안 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 상층액을 수집하고, 세포독성 인자 IFN-γ의 농도를 ELISA 키트(R&D)에 의해 검출하였다. 기능적 차단 효율 및 회복율이 표 65에 요약되었다.
표 65: 항-PD-1 TMEAbody(니볼루맙) 후보의 기능적 특성규명
Figure pct00112
실시예 20: 마우스 종양 치료에서 항-PD-1 TMEAbody(펨브롤리주맙 및 니볼루맙)의 생체 내 특성규명
동물 모델에서 종양 치료에서 항-PD-1 TMEAbodies의 생체 내 효율을 추가로 특성규명하기 위해, 항-PD-1 TMEAbodies(펨브롤리주맙에 기초한 Pem-se010 TMEAbody 및 니볼루맙에 기초한 Niv-se007 TMEAbody)뿐만 아니라 WT PD-1 항체(펨브롤리주맙 및 니볼루맙) 및 대조군 인간 IgG를 인간 PD-1 넉-인 C57BL/6 마우스에서 MC38 결장 선암종 종양 모델로 투여하였다. 인간 PD-1 넉-인 C57BL/6 마우스에 2E6 MC38 세포를 좌측 하복부 사분면으로 피하 주사하였다. 종양 성장 7일 후, 동물을 유사한 평균 종양 부피를 갖도록 그룹화하였다. 동물에게 10mg/kg 단일 용량의 PD-1 TMEAbodies(PEG 링커가 없는 항체의 농도), WT PD-1 항체 또는 대조군 인간 IgG를 투여하고, 종양 부피를 각각의 동물에 대해 모니터링하였다.
도 44에 제시된 바와 같이, 펨브롤리주맙 및 니볼루맙 TMEAbodies는 WT 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙 항체와 동등한 효능으로 종양 크기를 제어하는 반면, 대조군 인간 IgG는 어떠한 효능을 나타내는 데 실패하였다. 흥미롭게도, Niv-se001 TMEAbody는 종양 치료에서 WT 니볼루맙보다 개선된 효능을 나타냈으며, 이는 프로테아제 절단 후의 이의 향상된 결합 활성으로 인한 것일 수 있다. 결과는 이들 항-PD-1 TMEAbodies가 종양 미세환경에서 활성화될 수 있고, 항-종양 면역 반응을 고무시킬 수 있음을 암시하였다.
실시예 21: 마우스 종양 모델에서의 효능 연구를 위한 마우스 항-PD-1 항체(J43v2)의 생성
햄스터 항-마우스 PD-1 항체 서열은 US 20170044259A1호에 개시되었다. 이러한 항체의 이러한 중쇄는 마우스에서 면역원성을 감소시키기 위해 마우스 IgG2a으로 재포맷화되었다. 상기 스크리닝 방법으로서, 다수의 부위가 높은 차단 효율을 갖는 TMEAbody의 스크리닝을 위해 설계되었다. 최종적으로, LC 상의 Ser95를 이의 높은 효율의 차단(마우스 PD-1 단백질을 사용한 ELISA 검정에서 35배)으로 인해 TMEAbody 생성을 위해 선택하였다. SN38 마우스 종양 모델을 10mg/kg 단일 용량의 WT J43v2 항체 또는 J43v2 TMEAbody(각각의 그룹에 대해 n=8)로 수행하였다. 투여 17일 후에, J43v2 TMEAbody는 WT J43v2 항체(83%)와 동등한 억제 효능으로 75% 종양 억제를 나타내었다. 이러한 결과는 PD-1 항체가 활성화되고, 생체 내에서 이의 항-종양 활성을 나타낼 수 있는 것을 나타내었다.
실시예 22: 마우스 종양 모델에서의 효능 연구를 위한 항-마우스 CTLA-4 항체(9D9)의 생성
추가 기능 및 독성 연구를 위해 마우스 CTLA-4 대용 TMEAbody를 생성시키기 위해, 본 발명자는 항-마우스 CTLA-4 항체 및 이의 돌연변이체 변이체를 생성하고 정제하였다(9D9 클론, mIgG2b 동형, WO 2007/123737 A2호에 제시된 서열). 상기 스크리닝 방법으로서, 다수의 부위가 높은 차단 효율을 갖는 TMEAbody의 스크리닝을 위해 설계되었다. 최종적으로, LC 상의 Tyr54를 이의 높은 효율의 차단(마우스 CTLA-4 단백질을 사용한 ELISA 검정에서 26배)으로 인해 TMEAbody 생성을 위해 선택하였다. CT26 마우스 종양 모델을 10mg/kg 단일 용량의 WT 9D9 항체 또는 9D9 TMEAbody(각각의 그룹에 대해 n=8)로 수행하였다. 투여 17일 후, 9D9 TMEAbody는 WT 9D9 항체(74%)와 동등한 억제 효능으로 69% 종양 억제를 나타내었다. 이러한 결과는 9D9 TMEAbody가 활성화되고, 생체 내에서 이의 항-종양 활성을 나타낼 수 있는 것을 나타내었다.
실시예 23: WT 항체보다 감소된 독성을 나타낸 마우스 PD-1 및 CTLA-4 TMEAbody
항-PD-1 및 항-CTLA-4 항체의 조합이 흑색종을 치료하는데 효과적(ORR)이나, 조합이 55% TRAE 등급 3-4를 나타내고, 30%의 환자가 요법을 중단해야 하는 것이 현재 임상 연구에서 밝혀진 것이 당 분야에 널리 공지되어 있다. 본 발명자는 항체가 컨쥬게이트에 의해 억제되거나 차단되고, 병에 걸리지 않은 환경에서 활성 약물의 노출 시간 또는 용량을 감소시키기 위해 종양의 국소 환경에 도달한 후에 방출되는 경우 이들 TRAE가 개선될 수 있다고 추정한다. 이러한 이유로, 타입 I 당뇨병(NOD)로 고통받는 마우스로 실험을 수행하였다. 이러한 종류의 마우스의 당뇨병은 자가면역 질환이며, 여기서 자가 활성화된 T 림프구 세포는 췌장 섬 β 세포를 파괴하여 인슐린의 불충분한 분비를 발생시킨다. 먼저, 10주령의 암컷 NOD(Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.)에 대조군 IgG, 높은(15 mpk) 용량의 항-마우스 PD-1(J43v2) 및 항-마우스 CTLA-4 항체(9D9)를 주사하거나, 이들 2개의 항체 중 하나 또는 둘 모두를 0일에서 이의 TMEAbody 형태로 대체하였다. 소변에서의 글루코스 및 2개의 혈당 수준을 포함하는 당뇨병의 지표를 소변 글루코스의 새로운 지표가 관찰되지 않을때까지 12일 동안 매일 관찰하였다.
컨쥬게이트에 의한 자가면역으로부터의 보호가 도 45에 제시되었다. 결과는 병용 요법에서의 항-CTLA4 또는 항-PD1 TMEAbody가 일차 항체와 비교하여 자가면역을 감소시킬 수 있는 것을 나타내었다. 또한, 이들 2개의 TMEAbodies의 조합은 대조군과 동등한 수준으로 매우 낮은 독성을 발생시켰다.
실시예 24: 항-PD-1 TMEAbody(특허 WO 2017/124050 Al호)의 생성 및 특성규명
상기 방법으로서, 항-PD-1 항체 서열을 특허 WO 2017/124050 Al호로부터 다운로드하고, 우수한 차단 효율을 갖는 TMEAbody를 확인하기 위해 부위 스크리닝을 수행하였다. 항-PD-1 항체의 중쇄에서의 돌연변이 위치는 Ser28, Ser31, tyr33, Asn36, Gly50, Tyr51, Ser53, Tyr54, Asp55, Ser57, Lys58, Asn59, Tyr60, Asn61, Lys65, Asn66, Thr69, Thr74, Gly100, Asp105, Tyr106으로 구성된 군으로부터 선택되고; 경쇄에서의 돌연변이 위치는 Lys24, Gln27, Ser28, Asp31, Asp32, Asn33, Asn34, Gln35, Lys36, Asn37, Tyr38, Ser58, Arg60, Glu61, Ser62, Gly63, Gly70, Ser73, Thr75, Gln95, Gln96, Tyr98, Thr100, Tyr102로 구성된 군으로부터 선택된다. 결합 ELISA를 Fc 태깅된 인간 PD-1 단백질(Sino Biological)로 수행하였고, 우수한 차단 효율(5배 초과의 EC50 변화) 및 회복(2배 미만의 EC50 변화)을 갖는 선택된 부위가 표 66에 요약되었다.
표 66: 차단 및 회복 효율을 기초로 하여 선택된 항-PD-1 TMEAbody(WO 2017/124050 A1호) 후보
Figure pct00113
실시예 25: 항-4-1BB TMEAbody의 생성 및 특성규명
4-1BB 항체 서열을 US 2018/0194851 A1호(클론 MOR 7480.1)로부터 다운로드하였다. 항-4-1BB 항체의 중쇄에서의 돌연변이 위치는 Thr31, Tyr32, Ser35, Lys50, Tyr52, Asp55, Ser56, Tyr57, Thr58, Asn59, Tyr60, Ser61, Gln65, Gly66, Gly99, Tyr100, Gly101, Asp104, Tyr105로 구성된 군으로부터 선택되고; 경쇄에서의 돌연변이 위치는 Ser23, Gly24, Asp25, Asn26, Gly28, Asp29, Gln30, Tyr31, Gln49, Asp50, Lys51, Asn52, Arg53, Ser55, Gly56, Thr89, Tyr90, Thr91, Gly92, Gly94, Ser95로 구성된 군으로부터 선택된다. 인간 4-1BB 단백질을 ELISA 특성규명에 사용하여 프로테아제 소화 후 우수한 차단 효율(5배 초과의 EC50 변화)뿐만 아니라 우수한 회복(2배 미만의 EC50 변화)을 갖는 돌연변이체 부위를 확인하였다. 선택된 부위는 표 67 및 68에 요약되었다.
표 67: 차단 및 회복 효율을 기초로 하여 선택된 항-4-1BB TMEAbody 후보
Figure pct00114
표 68: 차단 및 회복 효율을 기초로 하여 선택된 항-4-1BB TMEAbody 후보
Figure pct00115
실시예 26: 항-Her2 TMEAbody(트라스투주맙)의 생성 및 특성규명
트라스투주맙의 중쇄 및 경쇄 서열을 Drug Bank(https://www.drugbank.ca/drugs/DB00072)에서 다운로드하였고, 부위 스크리닝을 우수한 차단 효율을 갖는 항-Her2 TMEAbody를 확인하기 위해 수행하였다. 항-Her2 항체(트라스투주맙)의 중쇄에서의 돌연변이 위치는 Arg19, Lys30, Asp31, Tyr33, Arg50, Tyr62, Asn55, Tyr57, Arg59, Tyr60, Asp62, Lys65, Asp102, Tyr105로 구성된 군으로부터 선택되고; 경쇄에서의 돌연변이 위치는 Asp1, Gln3, Gln27, Asp28, Asn30, Tyr49, Tyr55, Arg66, Asp70, Tyr92로 구성된 군으로부터 선택된다. His 태깅된 Her2 단백질(Sino Biological)을 ELISA에 사용하였다. 우수한 차단 효율 및 우수한 회복을 갖는 선택된 부위가 표 69에 요약되었다.
표 69: 차단 및 회복 효율을 기초로 하여 선택된 항-Her2 TMEAbody 후보
Figure pct00116
실시예 27: 항-TNFa TMEAbody(아달리무맙)의 생성 및 특성규명
아달리무맙의 중쇄 및 경쇄 서열을 Drug Bank(https://www.drugbank.ca/drugs/DB00051)에서 다운로드하였고, 부위 스크리닝을 우수한 차단 효율을 갖는 항-TNFa TMEAbody를 확인하기 위해 수행하였다. 항-TNFα 항체의 중쇄에서의 돌연변이 위치는 Ser7, Gly8, Gly9, Gly10, Leu11, Gly15, Ser17, Leu18, Leu20, Ala24, Ser25, Gly26, Thr28, Asp30, Asp31, Tyr32, Ala33, Ala40, Gly42, Gly44, Leu45, Ser49, Ala50, Ile51, Thr52, Asn54, Ser55, Gly56, Ile58, Asp59, Tyr60, Ala61, Asp62, Ser63, Glu65, Gly66, Phe68, Thr69, Ile70, Ser71, Asp73, Asn74, Ala75, Lys76, Ser78, Leu79, Tyr80, Leu81, Ser85, Leu86, Ala88, Thr91, Ala92, Lys98, Ser100, Tyr101, Leu102, Ser103, Thr104, Ala105, Ser106, Ser107, Leu108, Asp109, Tyr110, Gly112, Gly114, Thr115, Leu116, thr118, Ser120, Ser121, Ala122, Ser123 및 Thr124로 구성된 군으로부터 선택되고; 경쇄에서의 돌연변이 위치는 Asp1, Thr5, Ser7, Ser9, Ser10, Leu11, Ser12, Ala13, Ser14, Gly16, Thr20, Ile21, Ala25, Ser26, Gln27, Gly28, Ile29, Arg30, Asn31, Tyr32, Leu33, Ala34, Tyr36, Lys39, Gly41, Lys42, Ala43, Leu48, Leu47, Ile48, Tyr49, Ala50, Ala51, Ser52, Thr53, Leu54, Gln55, Ser56, Gly57, Ser60, Ser63, Gly64, Ser65, Gly66, Ser67, Gly68, Thr69, Asp70, Thr72, Leu73, Thr74, Ile75, Ser76, Ser77, Leu78, Ala84, Thr85, Tyr91, Asn92, Arg93, Ala94, Tyr96, Thr97, Phe98, Gly99, Gly101, Thr102, Ile106, Lys107, Thr109 및 Ala111로 구성된 군으로부터 선택된다. TNFa 단백질(Sino Biological)을 ELISA 특성규명을 위해 사용하였고, 우수한 차단 효율(5배 초과의 EC50 변화) 및 우수한 회복(2배 미만의 EC50 변화)을 갖는 선택된 부위가 표 70에 요약되었다.
표 70: 차단 및 회복 효율을 기초로 하여 선택된 항-TNFa TMEAbody 후보
Figure pct00117
실시예 28: 항-PD-L1 TMEAbody(아테졸리주맙)의 생성 및 특성규명
항-PD-L1 항체(아테졸리주맙)의 중쇄 및 경쇄 서열을 Drug Bank(https://www.drugbank.ca/drugs/DB11595)로부터 다운로드하였고, 부위 스크리닝을 우수한 차단 효율을 갖는 항-TNFa TMEAbody를 확인하기 위해 수행하였다. 항-PD-L1 항체(아테졸리주맙)의 중쇄에서의 돌연변이 위치는 Gln3, Asp31, Tyr54, Tyr59, Tyr60, Asp62, Lys65, Asp73, Lys76, Asn77, Arg99로 구성된 군으로부터 선택되고; 경쇄에서의 돌연변이 위치는 Arg24, Gln27, Asp28, Tyr49, Tyr55, Asp70, Gln89, Gln90, Tyr91, Tyr93으로 구성된 군으로부터 선택된다. Fc 태깅된 인간 PD-L1 단백질(Sino Biological)을 ELISA 특성규명을 위해 사용하였고, 우수한 차단 효율(5배 초과의 EC50 변화) 및 우수한 회복(2배 미만의 EC50 변화)을 갖는 선택된 부위가 표 71에 요약되었다.
표 71: 차단 및 회복 효율을 기초로 하여 선택된 항-PD-L1 TMEAbody 후보
Figure pct00118
실시예 29: 항-CD28 TMEAbody의 생성 및 특성규명
항-인간 CD28 항체 중쇄 및 경쇄 서열을 특허 US008709414B2호로부터 다운로드하였고, 부위 스크리닝을 우수한 차단 효율을 갖는 항-CD28 TMEAbody를 확인하기 위해 수행하였다. 항-CD28 항체의 중쇄에서의 돌연변이 위치는 Ser7, Gly8, Gly15, Ala16, Ser17, Ser21, Ala24, Ser25, Gly26, Tyr27, Thr28, Thr30, Ser31, Tyr32, Ala40, Gly42, Gly44, Gly49, Tyr52, Gly54, Thr58, Ala68, Thr69, Thr71, Thr74, Ser75, Ser77, Thr78, Ala79, Ser84, Leu86, Ser88, Thr91, Ala92, Thr97, Ser99, Tyr101, Gly102, Leu103, Gly113, Thr114, Thr115, Thr117, Ser119, Ser120, Ala121, Ser122 및 Thr123으로 구성된 군으로부터 선택되고; 경쇄에서의 돌연변이 위치는 Thr5, Ser7, Ser9, Ser10, Ser11, Ser12, Ala13, Ser14, Gly16, Thr20, Thr22, Ala25, Ser26, Ser27, Ile29, Tyr30, Ala43, Leu46, Leu47, Tyr49, Lys50, Ala51, Ser52, Leu54, Thr56, Gly57, Ser60, Ser63, Gly64, Ser65, Gly66, Ser67, Gly68, Thr69, Asp70, Thr72, Thr74, Ser76, Ser77, Ala84, Thr85, Gly91, Thr93, Tyr94, Tyr96, Thr97, Phe98, Gly99, Gly100, Gly101, Thr102, Thr109 및 Ala111로 구성된 군으로부터 선택된다. Fc 태깅된 인간 CD28 단백질(Sino Biological)을 ELISA 특성규명을 위해 사용하였고, 우수한 차단 효율(5배 초과의 EC50 변화) 및 우수한 회복(2배 미만의 EC50 변화)을 갖는 선택된 부위가 표 72에 요약되었다.
표 72: 차단 및 회복 효율을 기초로 하여 선택된 항-CD28 TMEAbody 후보
Figure pct00119
실시예 30: 종양 미세환경 활성화 IL-10 사이토카인(IL-10 TMEAkine)
1. 돌연변이체 IL-10 사이토카인의 발현 및 정제
변형된 pTT5 벡터(Biovector)에 라이게이션된 돌연변이체 IL-10 DNA 서열을 293T 세포에서의 발현에 대해 최적화하고, 합성하였다(GENEWIZ Inc., Suzhou, China). 돌연변이체 IL-10 DNA의 형질감염을 수행하였고, 4-7일 동안 인큐베이션 후, 돌연변이체 IL-10을 함유하는 상층액을 수집하였다.
피키아 파스토리스(Pichia Pastoris) 발현에서, 돌연변이체 IL-10 유전자를 함유하는 발현 벡터 pPICZαA를 최적화하고 제조하였다(GENEWIZ Inc., Suzhou, China). 돌연변이체 IL-10의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.1에 기재되었다. 발현 벡터 pPICZα A를 플라스미드 정제를 위해 E. 콜리(DH5α)에서 형질전환시켰다. 이후, pPICZα A를 전기천공에 의해 GS115로 형질전환시켰다. 형질전환된 콜로니를 100, 300, 500, 1000, 1500, 2000 ug/mL Zeocin™ 함유 YPD 플레이트에서의 성장 후 성장하는 콜로니를 획득하여 선택하였다. 형질전환체를 최종적으로 선택한 후, 재조합 GS115 균주를 배플드 플라스크(baffled flask)에서 강한 진탕과 함께 30℃에서 BMGY 배지에서 2-6의 OD600으로 성장시켰다. 이후, 세포를 원심분리에 의해 펠렛화시키고, 1의 OD600으로 BMMY에 현탁시키고, 여기에 0.5% 메탄올을 매일 첨가하여 이종성 단백질 발현을 유도하였다. 4일 유도 후, 분비된 돌연변이체 IL-10 단백질을 함유하는 상층액을 원심분리에 의해 수집하였다. 상층액 중의 전체 단백질을 10-kDa 분자 질량 컷오프 막을 사용한 초여과에 의해 농축시켰다. 농축된 단백질을 24시간 초과 동안 완충액 A(20 mMBIS-TRIS, 0.065M NaCl, pH 6.5)로 투석한 후, 완충액 A로 평형화된 양이온-교환 컬럼에 로딩하였다. 돌연변이체 IL-10을 0.065-0.4M 범위의 NaCl의 구배 농도를 갖는 컬럼으로부터 용리시키고, 용리액을 수집하고, 농축시켰다. 응축된 샘플을 용리 완충액으로서 10 mMTris-HCl, pH7.4를 사용하여 Sephacryl S-100 HRgel 여과 컬럼에서 추가로 정제하였다.
2. 돌연변이체 IL-10에 S48을 컨쥬게이션시키고, 이를 IL-10 TMEAkine(종양 미세환경 활성화 IL-1- 사이토카인)의 명칭으로 불렀다.
돌연변이체 IL-10 단백질을 상기 기재된 바와 같이 생성하고 정제하였다. 정제된 돌연변이체 IL-10을 2mM EDTA를 함유하는 20 mMTris 완충액(pH 7.4)에서 0.5 mg/mL의 농도로 수행하였다. TCEP 용액을 돌연변이체 IL-10에 100:1의 비율로 첨가하고, 가벼운 진탕과 함께 4℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 돌연변이체 IL-10 용액을 4℃에서 4시간 동안 150 mM NaCl을 함유하는 20 mM Tris 완충액(pH 7.4)으로 투석 하였다. 이후, S48을 돌연변이체 IL-10 용액에 20:1의 비율로 즉시 첨가하고, 가벼운 진탕과 함께 25℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 잔여 S48의 제거로 반응을 종결시켰다. 효소 절단 전, 투석을 통해 IL-10TMEAkine 완충액을 효소 완충액으로 변경하였다. 활성화를 위해, 효소를 IL-10TMEAkine 용액에 첨가하고, 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다.
3. IL-10R1 또는 R2에 대한 결합을 차단하고, 시험관 내에서 효소 절단 후에 결합 활성을 회복시키는 IL-10TMEAkine 스크리닝
1 ug IL-10R1-Fc/ IL-10R2-Fc/His 용액을 함유하는 60 ul PBS 완충액을 웰에 분배하였다. 플레이트의 상부에 밀봉 테이프를 적용하고, 4℃에서 밤새 플레이트를 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 테이프를 제거하고, 각각의 웰을 흡인하였다. PBST로 3회 세척 후, 2% BSA를 함유하는 200 ul의 PBS 완충액을 각각의 웰에 분배하여 플레이트를 차단하고, 실온에서 2시간 동안 플레이트를 인큐베이션하였다. 플레이트를 3회 세척하고, 60 ul의 연속 희석된 샘플을 적절한 웰에 첨가하였다. 실온에서 1.5시간 동안 플레이트를 인큐베이션하였다. PBST로 3회 세척 후, 60 ul의 2 ug/mL IL-10 비오티닐화 항체 용액을 각각의 웰에 분배하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 3회 세척하고, 60 ul의 스트렙타비딘 용액을 각각의 웰에 분배하였다. 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 3회 세척 후, 100 ul의 HRP 기질 용액을 각각의 웰에 분배하고, 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 색 발달 후, 50 ul의 정지 용액을 각각의 웰에 분배하고, 450 nm의 파장에서 각각의 웰의 흡광도를 즉시 측정하였다.
4. 다양한 IL-10 돌연변이 부위의 요약
세포 표면 상의 IL-10 수용체는 2개의 상이한 형태를 갖는다: IL-10에 대한 고-친화성 수용체: IL-10R1(Kd= 50-200 pM) 및 IL10에 대한 저-친화성 수용체: IL-10R2. R4와 컨쥬게이션된 IL-10은 R4 라이브러리 스크리닝의 화학적 변형 성숙에 의해 일부 위치에서 80% 초과로 결합을 회복시킬 수 있다. 약물 후보를 선택하기 위해, 본 발명자는 또한 결합 IL-10R1 및 IL-10R2의 도메인에서 IL-10의 모든 아미노산과의 스크리닝 발현 및 S48 컨쥬게이션 반응을 수행하였다. 본 발명자는 가능한 약물 후보를 획득하였고, 결과는 하기 표 73에 제시된다.
표 73: 돌연변이된 IL-10의 활성 및 링커 아암에 대한 스크리닝
Figure pct00120
Figure pct00121
Figure pct00122
Figure pct00123
5. BALB/C 마우스 모델에서 4T1 종양 모델에 대한 IL10-K34C-S48의 효능에 대한 연구.
시험 목적: 4T1 종양 모델의 치료를 위한 BALB/C 마우스에서 IL10-K34C-S48의 항-종양 효능을 조사하기 위함. 시험 약물: 시험시 생리학적 PBS에 의해 상응하는 농도로 희석된 IL10-K34C-S48 및 IL-10 주사.
방법 및 결과:
1. 동물: 5주령의 BALB/C 마우스, 모두 암컷.
2. 종양 모델의 생성
1) 4T1 세포를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)로부터 구입하였고, ATCC에 의해 제공된 명세서에 따라 확인하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 10% 소 태아 혈청을 함유하는 RPMI 1640 배양 용액에서 배양하였다. 세포를 3일마다 계대하고, 13회 계대 내의 세포를 사용하였다.
2) 종양 모델의 생성. 4T1 세포를 BALB/C 마우스의 등에 피하 주사하였다. 종양이 약 100mm3으로 성장한 후에 마우스를 무작위로 그룹화시키고, 약물 치료를 시작하였다. 마우스를 28일째에 마취 후에 희생시켰다.
3) 치료 과정. 각각의 그룹에 6마리의 동물을 가진 3개의 그룹이 있었다. 매일 처리된 대조군 그룹, 및 2개의 단일 제제 그룹(매일 처리된 1 mg/kg IL-10 또는 매일 IL-10-K34C-S48(1 mg/kg IL-10 등가 용량))이 포함되었다.
4) 그룹화 및 시험 결과가 표 74에 제시된다.
5) 결과 및 논의. 표 74에 제시된 바와 같이, IL-10과 비교하여, BALB/C 마우스의 4T1 종양에 대한 완전한 회귀는 IL10-K34C-S48의 주사 후에 크게 개선되었으며, 이는 IL10-K34C-S48이 4T1 종양 모델에서 우수한 항-종양 효능을 나타내는 것을 나타낸다.
표 74: BALB/C 마우스 모델에서 4T1 종양 모델에 대한 IL10-K34C-S48의 효과
Figure pct00124
종양 부피를 1주일에 2-3회 모니터링하였고, 도 46에 제시된다.
실시예 31: 상이한 조직에서 표적화된 활성화에 대한 상이한 R2의 활성화 효율.
R1이 S13이고, R3가 R3-5이고, R4가 R4-7이고, R2가 표 75에 제시된 기 각각인 컨쥬게이트의 절단 효과를 상이한 조직에서 평가하였다. 컨쥬게이트를 각각 용해시키고, 0.1 mM/ml의 농도로 10회 희석시켰다. 37℃에서, 컨쥬게이트를 각각 100 μg의 상이한 산성화된 인간 종양 조직 균질액(pH6.0)에 0.2 mg/ml의 농도로 첨가하였다. 종양 조직 균질액의 효소는 R1을 방출할 수 있었다. 방출된 R1을 HPLC로 검출하여 링커의 활성화 효율을 비교하였다. 결과는 표 75에 제시되었다.
표 75: 상이한 종양 조직으로부터의 균질액에서의 상이한 R2 펩티드의 활성화 비율(%)
Figure pct00125
결과에 따르면, 다수의 효소에 의해 활성화되는 확장된 R2는 AAN보다 높은 활성화를 나타낸다. 그러나, 다수의 효소에 의한 활성화는 심장 및 폐 조직에서 제시된 바와 같이 안전성 문제를 일으킬 수 있다.
실시예 32: 항-VEGF TMEAbody(베바시주맙)의 생성 및 특성규명
베바시주맙의 중쇄 및 경쇄 서열을 Drug Bank(https://www.drugbank.ca/drugs/DB00112)로부터 다운로드하였고, 부위 스크리닝을 우수한 차단 효율을 갖는 항-VEGF TMEAbody를 확인하기 위해 수행하였다. 항-VEGF 항체(베바시주맙)의 중쇄에서의 돌연변이 위치는 Tyr32, Asn35, Tyr54, Tyr60, Lys65, Arg66, Tyr102, Tyr103 및 Tyr109로 구성된 군으로부터 선택되었고; 경쇄에서의 돌연변이 위치는 Ser24, Ser26, Asp28, Tyr32, Tyr49, Thr51, Tyr91, Ser92 및 Thr93으로 구성된 군으로부터 선택되었다. His 태깅된 VEGF 단백질을 ELISA에 사용하였다. 우수한 차단 효율 및 우수한 회복을 갖는 선택된 부위가 표 76에 요약되었다.
표 76: 차단 및 회복 효율을 기초로 하여 선택된 항-VEGF TMEAbody 후보
Figure pct00126
실시예 33: 항-CD20 TMEAbody(리툭시맙)의 생성 및 특성규명
베바시주맙의 중쇄 및 경쇄 서열을 Drug Bank(https://www.drugbank.ca/drugs/DB00073)로부터 다운로드하였고, 부위 스크리닝을 우수한 차단 효율을 갖는 항-CD20 TMEAbody를 확인하기 위해 수행하였다. 항-CD20 항체(리툭시맙)의 중쇄에서의 돌연변이 위치는 Tyr32, Asn33, Tyr52, Asn55, Lys63, Lys65, Tyr101, Tyr102 및 Tyr107로 구성된 군으로부터 선택되었고; 경쇄에서의 돌연변이 위치는 Ser26, Ser28, Tyr31, Tyr48, Thr50, Asn52, Thr91 및 Thr96으로 구성된 군으로부터 선택되었다. His 태깅된 CD20 단백질을 ELISA에 사용하였다. 우수한 차단 효율 및 우수한 회복을 갖는 선택된 부위가 표 77에 요약되었다.
표 77: 차단 및 회복 효율을 기초로 하여 선택된 항-VEGF TMEAbody 후보
Figure pct00127
실시예 34: 약물 후보에 대한 상이한 R4 및 R5의 차단 및 절단 스크리닝.
지정된 컨쥬게이션에서의 컨쥬게이트의 차단 및 절단 효과를 평가하였다. 컨쥬게이트를 각각 용해시키고, 0.1 mM/ml의 농도로 10회 희석시켰다. 37℃에서, 컨쥬게이트를 각각 100 μg MDA-MB231 인간 종양 조직 균질액(pH7)에 8시간 동안 1 mg/ml의 농도로 첨가하였다. 컨쥬게이션되고 방출된 생체분자를 ELISA에 의해 결합을 검출하여 링커의 활성화 효율을 비교하였다. 결과는 표 78에 제시되었다.
표 78: 상이한 생체분자에 대한 S48의 차단 및 절단 효과
Figure pct00128
표 79에 지정된 컨쥬게이션에서 컨쥬게이트의 차단 및 절단 효과를 평가하였다. 컨쥬게이트를 각각 용해시키고, 0.1 mM/ml의 농도로 10회 희석시켰다. 37℃에서, 컨쥬게이트를 각각 MMP2(pH6)에 16시간 동안 1 mg/ml의 농도로 첨가하였다. 컨쥬게이션되고 방출된 생체분자를 ELISA에 의해 결합을 검출하여 링커의 활성화 효율을 비교하였다. 결과는 표 79에 제시되었다.
표 79: 상이한 생체분자에 대한 S65의 컨쥬게이션의 차단 및 절단 효과
Figure pct00129
지정된 컨쥬게이션에서의 컨쥬게이트의 차단 및 절단 효과를 평가하였다. 컨쥬게이트를 각각 용해시키고, 0.1 mM/ml의 농도로 10회 희석시켰다. 37℃에서, 컨쥬게이트를 각각 100 μg MDA-MB231 산성화된 인간 종양 조직 균질액(pH6.5)에 첨가하였다. 컨쥬게이션되고 방출된 생체분자를 ELISA에 의해 결합을 검출하여 링커의 활성화 효율을 비교하였다. 결과는 표 80에 제시되었다.
표 80: 상이한 생체분자에 대한 S27의 컨쥬게이션의 차단 및 절단 효과
Figure pct00130
결과에 따르면, 이들 약물 후보는 지정된 활성화 조건에서 차단 효과 및 활성화 효과를 나타내었다.
실시예 35: CT26 종양 면역 모델에서 마우스 CTLA-4 항체와 컨쥬게이션된 지정된 S27, S39, S40, S47, S48 및 S65의 효능에 대한 연구
시험 목적: 면역 치료를 위해 마우스 CTLA-4 항체와 컨쥬게이션된 S27, S39, S40, S47, S48, S65의 항-종양 효능 조사.
시험 약물: 마우스 CTLA-4 항체(9D9)와 컨쥬게이션된 S27, S39, S40, S47, S48, S65, 모두 20 mg/kg(CTLA-4 항체의 등몰)으로 사용됨.
종양 모델의 생성:
1) CT26 종양 세포는 ATCC에서 사용되었다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 10% 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM 배양 용액에서 배양하였다. 세포를 3일마다 계대하고, 15회 계대 내의 세포를 사용하였다.
2) 종양 면역화. 방사선조사에 의해 사멸된 5Х105 CT26 암세포(ATCC로부터 구입)를 마우스에 복막내 주사하였다. 마우스에 2주에 1회로 3회 주사하였다. 면역화 후, 마우스에 종양 세포를 주사하고, 약물을 4주 동안 매주 투여하였다.
3) 종양의 생성. 32일에, 106개의 살아 있는 폐 종양 세포를 종양에 의해 면역화된 C57 마우스의 등에 피하 주사하였다. 종양이 0.3-0.4cm로 성장한 경우 치료를 개시하였다.
4) 종양 CD8+ T 세포에 대한 분석. 종양 조직을 균질화시키고, 종양의 개별 세포를 여과시키고, 분리시키고, 완충액으로 2회 세척한 후, 주위 온도에서 1시간 동안 백혈구 공통 항원 CD45-PE 및 CD8-FITC 마킹된 항체와 함께 배양하였다. 세포를 1% 소 태아 혈청을 함유하는 포스페이트 완충액으로 2회 세척한 후, 흐름세포측정법에 의해 백혈구 공통 항원(CD45) 양성 세포에서 T 림프구 항원(CD8) 양성 세포의 비율을 분석하였다. 비율의 증가는 증가된 T 림프구 세포를 나타내며, 이에 따라 종양에 대한 동물 면역이 개선되었다.
5) 그룹화 및 시험 결과가 표 81에 제시된다.
표 81: 마우스 CTLA-4 항체와 컨쥬게이션된 S27, S39, S40, S47, S48 및 S65 및 대조군의 종양 억제 및 면역 활성화에 대한 효과
Figure pct00131
6) 결과 및 논의. 마우스 CTLA-4 항체와 컨쥬게이션된 S27, S39, S40, S47, S48 및 S65의 처리 효과는 대조군 그룹 및 WT CTLA-4 항체 처리 그룹과 비교하여 크게 개선되었다. WT CTLA-4 항체 처리에서 1마리의 사망을 유발시키는 WT CTLA-4 항체는 고 용량 처리에서의 독성에 의해 야기될 수 있다. 마우스 CTLA-4 항체와 컨쥬게이션된 S27, S39, S40, S47, S48 및 S65의 처리 효과는 종양 조직에서 우수한 효과를 나타내고, CD8/CD45 T 세포 비율을 촉진시킨다.
실시예 36: RA 마우스 모델에서 S27, S47, S48 또는 S65와 컨쥬게이션된 아달리무맙(SEQ ID NO:29)의 효능에 대한 연구
hTNFα 유전자의 것을 대체하는 인간 β-글로빈의 아데닐중합체형성 부위 및 3' 비번역 영역(UTR)을 갖는 0.77 kb 단편에 융합된, 전체 코딩 영역 및 hTNFα 유전자의 프로모터를 갖는 2.8 kb 단편을 함유한 인간 TNF/β-글로빈(TNFglobin) 재조합 유전자 작제물을 사용하여 TgTC 마우스를 생성시켰다. 이후, 단편을 FVB/J 근친교계 수정란의 핵에 미세주입하였다. 최종적으로, 주입된 수정란을 8주령 암컷 거짓-임신 ICR 마우스의 난관에 이식하였다. 트랜스제닉 시조(founder) 개체를 FVB/J 근친교계와 역교배시킴으로써 트랜스제닉 계통을 확립하였다. 트랜스제닉 동물에 대해 스크리닝하기 위한 PCR에 의한 유전형분석뿐만 아니라 일상적인 테일 유전형분석(tail genotyping)을 수행하였다. 트랜스제닉 특이적 PCR 프라이머는 하기와 같았다:
5'-GAACTCCCTCGATGTTAACCA-3' (정방향 프라이머, SEQ ID NO:87); 및
5'-TTCAATCCCCAAATCCTAGCC-3' (역방향 프라이머, SEQ ID NO:88).
PCR 반응을 다음과 같이 수행하였다: 4분 동안 94℃; 30초 동안 95℃, 40초 동안 57℃ 및 40초 동안 72℃에서 35주기; 10분 동안 72℃.
염수에 용해된 상이한 항-hTNFα 항체(아달리무맙 2 mg/kg) 및 컨쥬게이션된 항체(2mg/kg 등몰의 아달리무맙)를 3주에서 10주까지 매주 TgTC 마우스에 복막내 투여(2mg/kg)하였고, 염수 처리된 TgTC 마우스를 대조군으로 제공하였다. 임상 평가인 매주의 체중 및 4개 모두의 사지에서의 관절염 스코어를 이유 후에 기록하였다. 각각의 발(발가락, 발목뼈 및 발목)에 대한 관절염의 임상적 중증도를 0 내지 3의 범위의 스코어를 부여함으로써 정량화하였다: 0, 정상; 1, 약간의 발적 및/또는 종창; 2, 현저한 부종성 종창; 3, 관절 변형 및 경축. 마우스 당 관절염 스코어는 4개의 사지의 평균이었다. 그룹화 및 시험 결과가 표 82에 제시된다.
표 82: 아달리무맙 항체와 컨쥬게이션된 S27, S47, S48 및 S65에 의한 관절염의 억제에 대한 효과
Figure pct00132
결과는 S27, S47, S48 및 S65와 컨쥬게이션된 아달리무맙이 관절염 스코어를 크게 감소시킨 것을 나타내었다.
실시예 37: 항-Her2/항-CD3 이중특이적 TMEAbody의 생성 및 특성규명
트라스투주맙의 중쇄 및 경쇄 서열을 Drug Bank(https://www.drugbank.ca/drugs/DB00072)에서 다운로드하였고, 부위 스크리닝을 우수한 차단 효율을 갖는 항-Her2의 scFv 형태를 확인하기 위해 수행하였다. 경쇄에서의 돌연변이 위치는 Asp1, Gln3, Gln27, Asp28, Asn30, Tyr49, Tyr55, Arg66, Asp70 및 Tyr92로 구성된 군으로부터 선택된다. 경쇄에서의 돌연변이 위치는 Arg19, Lys30, Asp31, Tyr33, Arg50, Tyr62, Asn55, Tyr57, Arg59, Tyr60, Asp62, Lys65, Asp102 및 Tyr105로 구성된 군으로부터 선택된다. 상기 선택된 돌연변이체의 scFv 형태를 C 말단 6His 태그를 사용하여 HEK293에서 발현시키고, Ni-NTA 컬럼으로 정제하고, 상응하는 화학 링커와 컨쥬게이션시켰다. 결합 ELISA를 항원으로서 His-태깅된 인간 Her2 단백질 및 이차 항체로서 항-인간 카파 사슬로 수행하였다. 차단 효율은 표 84에 요약되었다.
표 83: 차단 및 회복 효율을 기초로 하여 선택된 항-Her2 후보의 scFv 형태
Figure pct00133
본 발명자는 C 말단 6His 태그를 함유하는 항-인간 CD3 scFv에 선택된 시스테인 돌연변이(경쇄에서 Tyr49)를 갖는 항-Her2 scFv를 융합시켜 종양 및 T 세포를 표적화하는 이중특이적 항체를 형성시켰다. 이들 Her2/CD3 이중특이적 항체를 HEK293 세포에서 생성시키고, Ni-NTA 컬럼으로 정제하였다. 돌연변이체를 갖는 이들 Her2/CD3 이중특이적 항체를 S47과 추가로 컨쥬게이션시켰고, 인간 Her2 단백질에 대한 38배 감소된 결합 활성이 획득되었다. 레구마인을 이용한 절단 후, 둘 모두의 결합 활성이 회복되었다.
표 84에 제시된 바와 같이, S27, S47 또는 S48을 항-CD3 또는 이의 scFv를 갖는 융합 단백질 항-Her2 scFV에 컨쥬게이션시킴으로써 Her2/CD3 TMEAbody의 단일 사슬을 생성시켰다.
표 84: 차단 및 회복 효율을 기초로 하여 선택된 항-Her2 후보의 scFv 형태
Figure pct00134
본 발명자는 PD-1 항체 또는 PD-L1 항체를 돌연변이체 IL-2(IL2-S87C)에 융합시켜 표적화 종양 관련 항원 PD-L1/IL-2 TMEAkines 또는 PD-1/IL-2 TMEAkines을 형성시켰다.
IL2-T41C 돌연변이체를 갖는 이들 TMEAkines을 S47과 추가로 컨쥬게이션시켰다. 인간 IL-2Rβ에 대한 135배 초과의 감소된 결합 활성이 획득되었다. 레구마인에 의한 절단 후, IL-2Rβ에 대한 둘 모두의 결합 활성이 회복되었다. 돌연변이체 IL-2(결합 IL-2Rα S87C에서의 돌연변이체)를 갖는 융합된 PD-L1 또는 PD-1 항체를 S47과 추가로 컨쥬게이션시켜 표 85에 제시된 바와 같이 레구마인 활성화 융합체 TMEAkine을 획득하였다.
표 85: 차단 및 회복 효율에 기초한 융합 단백질 후보
Figure pct00135
인간 PBMC-전달 마우스 모델에서의 독성의 생체 내 특성규명
시험 목적: 정맥 주사를 통한 융합체 TMEAbody의 급성 독성 조사.
동물: 첫번째 등급의 SCID 마우스, 19-21 g 체중 및 모두 암컷인 마우스.
방법 및 결과: SCID 마우스를 체중에 따라 각각의 그룹에 10마리의 마우스로 21개의 그룹으로 무작위로 나누었다. 표 86에 제시된 바와 같이, 마우스에 30mg/kg의 용량(등몰의 항체)으로 단지 1회로 D1, D7 및 D14에 정맥내 주사하였다. 대조군 시험을 30mg/kg 인간 IgG를 주사하여 수행하였다. 동물을 매일 털세움, 모발 헝클어짐 및 윤기부족, 기면, 웅크림 및 과민한 반응 및 체중의 거동의 존재 또는 부재에 대해 연속 21일 동안 관찰하고, 사망을 표 86에 제시된 바와 같이 기록하였다.
표 86: 상이한 융합체 TMEAbody 주사를 투여받은 시험 마우스의 사망률의 비교
Figure pct00136
결과 및 논의: 그룹 2, 3, 10 및 14의 30 mg/kg을 투여받은 마우스에서 털세움, 모발 헝클어짐 및 윤기부족, 기면, 웅크림 및 과민한 반응 및 사망이 관찰되지 않았다. 표 86에 제시된 바와 같이, 융합 단백질의 MTD는 독성 및 사망을 관찰할 수 있는 30 mg/kg 미만이다.
인간 PBMC-전달 마우스 모델에서의 독성의 생체 내 특성규명
시험 목적: 정맥 주사를 통한 융합체 TMEAbody의 급성 독성 조사.
동물: 첫번째 등급의 SCID 마우스, 19-21 g 체중 및 모두 암컷인 마우스.
방법 및 결과: SCID 마우스를 체중에 따라 각각의 그룹에 5마리의 마우스로 21개의 그룹으로 무작위로 나누었다. 표 88에 제시된 바와 같이, 마우스에 30mg/kg(등몰의 항체)의 용량으로 D1, D7 및 D14에 융합 단백질 및 S47과의 융합 단백질 컨쥬게이션을 단지 1회 정맥내 주사하였다. 대조군 시험을 30 mg/kg 염수를 주사하여 수행하였다. 동물을 매일 털세움, 모발 헝클어짐 및 윤기부족, 기면, 웅크림 및 과민한 반응 및 체중의 거동의 존재 또는 부재에 대해 연속 21일 동안 관찰하고, 사망을 표 87에 제시된 바와 같이 기록하였다.
표 87: 상이한 융합체 TMEAkine 주사를 투여받은 시험 마우스의 사망률의 비교
Figure pct00137
결과 및 논의: 융합체 TMEAkine의 모든 그룹의 30 mg/kg을 투여받은 마우스에서 털세움, 모발 헝클어짐 및 윤기부족, 기면, 웅크림 및 과민한 반응 및 사망이 관찰되지 않았다. 그러나, S47과의 융합 후 독성이 감소되었다.
마우스 종양 모델에서의 CD3-Her2 TMEAbody의 단일 사슬의 생체 내 특성규명
동물 모델에서 종양을 치료하는 데 있어서 CD3-Her2 TMEAbody의 단일 사슬의 생체 내 효능을 추가로 특성규명하기 위해, CD3-Her2 TMEAbody의 단일 사슬뿐만 아니라 단일 사슬 CD3-Her2 항체를 종양 이종이식편에 투여하였다. 종양 이종이식을 개시하기 위해, 3 Х 106 KPL-4 세포를 암컷 중증 복합 면역결핍(SCID) 베이지 마우스의 우측 전종단 샅굴 유방 지방체(penultimate inguinal mammary fat pad)에 정위형(orthotopical)으로 이식하였다. 종양은 치료 개시 전에 이식 후 성장시켰다(KPL4의 경우 20일). KPL-4 종양(100 mm3)을 갖는 마우스를 연구 기간 동안 지정된 약물(5주 동안 매주 10 mg/kg)로 처리하였다. 종양 부피 및 체중을 매주 2회 측정하였다. 종양 부피 억제율은 표 88에 요약되었다. 결과는 CD3-Her2 TMEAbody의 단일 사슬이 종양 미세환경에서 활성화될 수 있고, CD3-Her2 항체의 단일 사슬의 효능을 향상시킬 수 있음을 암시하였다.
표 88: 투여 20일 후의 종양 성장 억제율
Figure pct00138
표 88에 제시된 바와 같이, Her2/CD3 TMEAbody에 의한 종양 성장에 대한 억제 및 치료율은 동일한 몰 농도를 이용하여 Her2/CD3 scFv 또는 Her2/CD3 항체에 의해 치료되는 그룹과 비교하여 크게 개선되었다. PD-L1/IL-2 TMEAkine 또는 항체에 의한 종양 성장에 대한 억제 및 치료율은 효능을 나타내고, 마우스를 치료한다. 그러나, PD-L1/IL-2 융합 항체 그룹에서, 독성이 일부 마우스 사망을 유발하였다.
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25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 72 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <230> VL of anti Her2 antibody with mutation <400> 72 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Cys Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 73 <211> 590 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <230> Fusion protein of scFvs of anti-Her2 antibody with anti-CD3 antibody <400> 73 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 115 120 125 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 130 135 140 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 145 150 155 160 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 180 185 190 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 195 200 205 Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 225 230 235 240 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 245 250 255 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 260 265 270 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 275 280 285 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 290 295 300 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 305 310 315 320 Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 325 330 335 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp 340 345 350 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe 355 360 365 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 370 375 380 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 385 390 395 400 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 405 410 415 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 420 425 430 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 435 440 445 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr 450 455 460 Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met 465 470 475 480 Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met 485 490 495 Leu Cys Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His 500 505 510 Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn 515 520 525 Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser 530 535 540 Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe 545 550 555 560 Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn 565 570 575 Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 580 585 590 <210> 74 <211> 595 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <230> Fusion protein of scFvs of anti-Her2 antibody with anti-CD3 antibody <400> 74 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly 435 440 445 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro 450 455 460 Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu 465 470 475 480 Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro 485 490 495 Lys Leu Thr Arg Met Leu Cys Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala 500 505 510 Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu 515 520 525 Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro 530 535 540 Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly 545 550 555 560 Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile 565 570 575 Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile Ser 580 585 590 Thr Leu Thr 595 <210> 75 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <230> anti CD3 antibody <400> 75 Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser 130 135 140 Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys 145 150 155 160 Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser 165 170 175 Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser 180 185 190 Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser 195 200 205 Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 210 215 220 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 225 230 235 240 Glu Leu Lys <210> 76 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <230> VH of Cetuximab <400> 76 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 77 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <230> VL of Cetuximab <400> 77 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 78 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <230> VH of Ramucirumab <400> 78 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Thr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 79 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <230> VL of Ramucirumab <400> 79 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Ile Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Asn Trp 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Asp Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ala Lys Ala Phe Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 80 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <230> VH of anti Her2 antibody <400> 80 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 81 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <230> VL of Her2 antibody <400> 81 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 82 <211> 496 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <230> Fusion protein of scFvs of anti-Her2 antibody with anti-CD3 antibody, with mutation <400> 82 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 130 135 140 Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr 165 170 175 Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile 180 185 190 Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 195 200 205 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp 210 215 220 Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala 245 250 255 Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser 260 265 270 Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro 275 280 285 Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr 290 295 300 Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp 305 310 315 320 Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu 325 330 335 Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys 340 345 350 Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu 355 360 365 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp 370 375 380 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 385 390 395 400 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 405 410 415 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Cys 420 425 430 Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser 435 440 445 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 450 455 460 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 465 470 475 480 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys His His His His His His 485 490 495 <210> 83 <211> 496 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <230> Fusion protein of scFvs of anti-Her2 antibody with anti-CD3 antibody, with mutation <400> 83 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Cys Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 130 135 140 Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr 165 170 175 Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile 180 185 190 Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 195 200 205 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp 210 215 220 Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala 245 250 255 Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser 260 265 270 Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro 275 280 285 Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr 290 295 300 Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp 305 310 315 320 Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu 325 330 335 Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys 340 345 350 Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu 355 360 365 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp 370 375 380 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 385 390 395 400 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 405 410 415 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Cys 420 425 430 Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser 435 440 445 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 450 455 460 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 465 470 475 480 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys His His His His His His 485 490 495 <210> 84 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <230> sequence of R2 <400> 84 Leu Thr Pro Arg Leu Gly Pro Ala Ala Asn 1 5 10 <210> 85 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <230> sequence of R2 <400> 85 Gly Pro Ala Ala Asn 1 5 <210> 86 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <230> sequence of R2 <400> 86 Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn 1 5 <210> 87 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <230> forward primer <400> 87 gaactccctc gatgttaacc a 21 <210> 88 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <230> reverse primer <400> 88 ttcaatcccc aaatcctagc c 21

Claims (39)

  1. 하기 구조를 갖는 생체분자의 컨쥬게이트로서;
    R1-R2-R3-R4-S-cys-R5
    상기 식에서,
    R5가 돌연변이에 의해 도입된 하나 이상의 시스테인 잔기를 갖는 생체분자를 나타내고;
    cys가 R5에 함유된 시스테인 잔기(들)를 나타내고;
    S가 시스테인 잔기(들)의 황 원자(들)를 나타내고;
    R1이 R5가 이의 항원, 리간드 또는 수용체에 결합하는 것을 방지하는 기이고;
    R2가 부재하거나, R2가 하나 이상의 단백질분해 효소에 의해 활성화될 수 있는 절단 가능한 링커 아암 또는 병리학적 미세환경에서 산성에 의해 활성화될 수 있는 화학 결합이고;
    R3가 부재하거나, R3가 R2가 절단된 후 자동으로 쉐딩(shedding)될 수 있는 링커 아암 또는 병리학적 미세환경에서 산성에 의해 활성화될 수 있는 화학 결합이고; 단, R2가 부재하는 경우, R3가 병리학적 미세환경에서 산성에 의해 활성화될 수 있는 화학 결합이고;
    R4가 R5에 함유된 시스테인 잔기(들)의 황 원자(들)를 통해 R5에 공유적으로 연결된 기이고, 이는 모이어티 R1-R2-R3가 절단된 후 R5의 항원, 리간드 또는 수용체에 대한 결합 능력을 회복시키거나, 유지시키거나, 촉진시키는,
    생체분자의 컨쥬게이트.
  2. 제1항에 있어서, R1이 폴리에틸렌 글리콜-C1-5 알킬카르보닐,
    Figure pct00139
    로 구성된 군으로부터 선택되고,
    상기 식에서, 각각의 R이 독립적으로 C1-4 알킬이고; 각각의 n이 독립적으로 1 내지 30000, 예를 들어, 1-150, 1-50, 1-20 또는 3-12의 범위 내의 정수이고; 폴리에틸렌 글리콜 또는 pegm이 44 내지 132000의 범위 내의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜, 예를 들어, 1000 내지 50000 또는 10000 내지 30000의 범위 내의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜이고; m이 폴리에틸렌 글리콜의 분자량을 나타내고; 물결선이 R2에 연결되는 R1의 위치를 나타내는, 생체분자의 컨쥬게이트.
  3. 제1항에 있어서, R1이 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 생체분자의 컨쥬게이트:
    Figure pct00140

    Figure pct00141

    Figure pct00142
    .
  4. 제5항에 있어서, R2가 하나 또는 다수의 다중 단백질분해 효소, 프로테아제 또는 펩티다제에 의해 활성화되거나 절단될 수 있는 펩티다제이고, 여기서 프로테아제가 시스테인 프로테아제, 아스파라긴 프로테아제, 아스파테이트 프로테아제, 글루탐산 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 젤라티나제, 메탈로프로테이나제 또는 아스파라긴 펩티드 리아제로 구성된 군으로부터 선택되고;
    바람직하게는, R2가 레구마인(Legumain), 그랜자임(granzyme), 카텝신 B(Cathepsin B), 카텝신 C, 카텝신 D, 카텝신 E, 카텝신 K, 카텝신 L, 칼리크레인(kallikrein), hKl, hKlO, hK15, 플라스민, 콜라게나제, 타입 IV 콜라게나제, 아스트로멜리신(astromelysin), 인자 Xa, 키모트립신-유사 프로테아제, 트립신-유사 프로테아제, 엘라스타제-유사 프로테아제, 섭틸리신(subtilisin)-유사 프로테아제, 악티니다인(actinidain), 브로멜라인(bromelain), 칼파인(calpain), 카스파제(caspase), 카스파제-3, Mirl-CP, 파파인(papain), HIV-1 프로테아제, HSV 프로테아제, CMV 프로테아제, 키모슴(chymosm), 펩슴(pepsm), 마트립타제(matriptase), 플라스멥슴(plasmepsm), 네펜테신(nepenthesin), 메탈로엑소펩티다제(metalloexopeptidase), 메탈로엔도펩티다제(metalloendopeptidase), 매트릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloprotease; MMP), MMPl, MMP2, MMP3, MMP8, MMP9, MMPlO, MMP11, MMP12, MMP13, MMP14, ADAMlO, ADAM12, 우로키나제 플라스미노겐 활성제(uPA), 넨테로키나제(nenterokinase), 전립선 특이적 항원(PSA, hK3), 인터루킨-113 전환 효소, 트롬빈, FAP (FAP-a), 메프린(meprin), 디펩티딜 펩티다제 및 디펩티딜 펩티다제 IV(DPPIV/CD26)로 구성된 군으로부터 선택되는 효소 중 적어도 하나에 의해 절단될 수 있는 펩티드인, 생체분자의 컨쥬게이트.
  5. 제1항에 있어서, R2가 -R2a-, -R2b-, -R2a-N-, -R2a-D-, -R2a-AAN-, -R2a-AAD- 또는 -R2a-R2b-로 표현되는 펩티드이고; 여기서, R2a가 하나 이상의 단백질분해 효소에 의해 아미드 결합에서 절단될 수 있는 펩티드이고; R2b가 R3와 함께 카르바메이트를 형성하는 측쇄에 질소를 갖는 펩티드이고, 여기서 카르바메이트가 하나 이상의 단백질분해 효소에 의해 절단될 수 있고; A가 알라닌이고; N이 R3와 함께 카르바메이트를 형성하는 측쇄에 질소를 갖는 아스파라긴이고, 여기서 카르바메이트가 레구마인에 의해 절단될 수 있고; D가 R3와 함께 카르바메이트를 형성하는 측쇄에 질소를 갖는 아스파르트산이고, 카르바메이트가 그랜자임 B에 의해 절단될 수 있고;
    바람직하게는, R2가 트리펩티드이고, 여기서 R1에 연결된 트리펩티드의 첫 번째 아미노산 잔기가 Ala, Thr, Val 및 Ile로 구성된 군으로부터 선태되고, 중간의 두 번째 아미노산 잔기가 Ala, Thr, Val 및 Asn으로 구성된 군으로부터 선택되고, R3에 연결된 세 번째 아미노산 잔기가 Asn 및 Asp로 구성된 군으로부터 선택되고; 여기서 R2가 아미드, 에스테르, 카르바메이트, 우레아 또는 하이드라존 결합의 연결 방식으로 첫 번째 아미노산 잔기의 아미노기를 통해 R1에 연결되고, 아미드, 에스테르, 카르바메이트, 우레아 또는 하이드라존 결합의 연결 방식으로 세 번째 아미노산 잔기의 카르복실기를 통해 R3에 연결되고; 바람직하게는, 트리펩티드가 Ala-Ala-Asn 및 Ala-Ala-Asp로 구성된 군으로부터 선택되는, 생체분자의 컨쥬게이트.
  6. 제1항에 있어서, R2가 병리학적 미세환경의 산성 조건에서 절단 가능한 결합이고, 아미드, 에스테르, 카르바메이트, 우레아 및 하이드라존 결합으로 구성된 군으로부터 선택되고;
    바람직하게는, R1-R2-R3-R4의 구조가 하기로 표현되고;
    Figure pct00143

    상기 식에서, X 및 Y가 각각 독립적으로 NR' 또는 O이고, Z가 H 또는 C1-10알킬이고, R'이 H 또는 C1-4알킬이고; R3가 아미드, 에스테르, 카르바메이트, 우레아 또는 하이드라존 결합의 연결 방식으로 X 및 Y를 통해 각각 R1 및 R4에 연결되는, 생체분자의 컨쥬게이트.
  7. 제1항에 있어서, R2가 병리학적 미세환경의 산성 조건에서 절단 가능한 결합이고, 아미드, 에스테르, 카르바메이트, 우레아 및 하이드라존 결합으로 구성된 군으로부터 선택되고, R1-R2-R3-R4의 구조가 하기로 표현되는, 생체분자의 컨쥬게이트:
    Figure pct00144
    .
  8. 제1항에 있어서, R3가 하기로 구성된 군으로부터 선택되고;
    Figure pct00145

    상기 식에서, X 및 Y가 각각 독립적으로 NR' 또는 O이고, Z가 H 또는 C1-10 알킬이고, R이 C1-4 알킬이고, R'이 H 또는 C1-4알킬이고; 여기서, R4가 아미드, 에스테르, 카르바메이트, 우레아 또는 하이드라존 결합의 연결 방식으로 상기 화학식에서 Y 또는 N을 통해 R3에 연결되는, 생체분자의 컨쥬게이트.
  9. 제8항에 있어서, R3가 -NH-페닐-CH2O-, -NH-페닐-CH=N-, -NH-페닐-C(CH3)=N-, -O-페닐-CH=N- 및 -O-페닐-C(CH3)=N-으로 구성된 군으로부터 선택되는 생체분자의 컨쥬게이트.
  10. 제1항에 있어서, R3가 아미드, 에스테르, 카르바메이트, 우레아 및 하이드라존 결합으로 구성된 군으로부터 선택되는 생체분자의 컨쥬게이트.
  11. 제1항에 있어서, R3가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 생체분자의 컨쥬게이트:
    Figure pct00146
    .
  12. 제1항에 있어서, R4가 -R4-a-R4-b-R4-c-로 표현되고, 여기서 R4-a가 하기로 구성된 군으로부터 선택되고;
    Figure pct00147

    상기 식에서, Ra 및 Rb가 각각 독립적으로 H 및 C1-6 알킬 또는 C1-6 알콕실로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R4-b가 하기로 구성된 군으로부터 선택되고;
    Figure pct00148

    상기 식에서, 화학식 R4-b1에서, Rc가 부재하거나, C1-12 알킬, C1-12알콕시-C1-12알킬, C1-12알킬-C3-8사이클로알킬, (C1-4알킬-O)p-C1-12알킬, C1-12알킬카르보닐아미노-(C1-4알킬-O)p-C1-12알킬, 페닐-C1-12알킬, C3-8사이클로알킬, C1-12알킬-C3-8사이클로알킬-C1-12알킬 및 C1-12알킬-페닐-C1-12알킬로 구성된 군으로부터 선택되고; 화학식 R4-b2에서, Rc가 아미노기의 N 원자에서 치환된 Ra-1 및 Ra-2를 갖는 C1-12알킬아미노이고, 화학식 4-b3에서, Rc가 알킬의 말단의 마지막 C 원자가 Ra-1, Ra-2 및 R2-3에 의해 치환된 C1-12알킬이고, 여기서 Ra-1, Ra-2 및 Ra-3가 각각 독립적으로 C1-12알킬, C1-12알킬-OH 및 C1-12알킬-NR"R"'로 구성된 군으로부터 선택되고, 여기서 R" 및 R"'이 각각 독립적으로 H 및 C1-12알킬로 구성된 군으로부터 선택되고; 여기서, 화학식 R4-b2 및 R4-b3에서, R4-b가 Ra-1, Ra-2 및 Ra-3 중 적어도 하나를 통해 R4-c에 연결되고;
    R4-c가 하기로 구성된 군으로부터 선택되고;
    Figure pct00149

    상기 식에서, Rx가 H, 할로 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 선택되고; p가 1 내지 10의 범위 내의 정수, 예를 들어, 1 내지 5의 범위 내의 정수이고; q가 1 내지 4의 범위 내의 정수, 예를 들어, 1 내지 2의 범위 내의 정수이고; 단, R4-a가 화학식 R4-a2, R4-a3 및 R4-a4로 구성된 군으로부터 선택되는 경우 R4-c가 부재하고;
    여기서, R3가 R4의 R4-c를 통해 R4에 연결되고, R4-a의 각각의 화학식에 제시된 물결선이 R4-a가 R4-b에 연결되는 위치를 나타내는, 생체분자의 컨쥬게이트.
  13. 제1항에 있어서, R4가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 생체분자의 컨쥬게이트:
    Figure pct00150

    Figure pct00151

    Figure pct00152
    .
  14. 제1항에 있어서, R5가 아미노산 중 하나 이상이 시스테인으로 돌연변이된 단백질이고, R5가 시스테인의 티올기를 통해 R4에 연결되고;
    바람직하게는, R5가 아미노산 중 하나 이상이 시스테인으로 돌연변이된 항체인, 생체분자의 컨쥬게이트.
  15. 제1항에 있어서, R5가 항체이고, 항체 분자의 가변 영역의 비-상보성 결정 영역에서의 돌연변이이고; 바람직하게는, 생체분자의 컨쥬게이트가 궁극적으로 컨쥬게이션을 통해 200 초과의 증가하는 분자량을 획득하는, 생체분자의 컨쥬게이트.
  16. 제14항에 있어서, R5가 단백질 서열에서 아미노산 중 하나 이상이 시스테인으로 돌연변이된 사이토카인을 나타내는 생체분자의 컨쥬게이트.
  17. 제14항에 있어서, R5가 항체 분자의 가변 영역의 상보성 결정 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 항체를 나타내고, 바람직하게는, R5가 상보성 결정 영역에서 G, A, S, T, L, I, F, E, K, D 및 Y로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기 중 하나 이상이 시스테인으로 돌연변이된 항체를 나타내는, 생체분자의 컨쥬게이트.
  18. 제14항에 있어서, R5가 항체의 가변 영역의 비-상보성 결정 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 항체를 나타내고, 바람직하게는, R5가 비-상보성 결정 영역에서 G, A, S, T, L, I, F, E, K, D 및 Y로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기 중 하나 이상이 시스테인으로 돌연변이된 항체를 나타내는, 생체분자의 컨쥬게이트.
  19. 제16항에 있어서, 생체분자가 G, A, S, T, L, I, F, E, K, D 및 Y로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기 중 하나 이상이 시스테인으로 돌연변이된 사이토카인인, 생체분자의 컨쥬게이트.
  20. 제14항에 있어서, R5가 항체의 가변 영역의 비-상보성 결정 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 갖고, 바람직하게는 VH의 비-상보성 결정 영역에서 Gln3, Ser7, Ser26, Glu46, Thr68, Asp72 및 VL의 비-상보성 결정 영역에서 Thr5, Tyr49, Arg61, Ser63, Ser65, Ser67, Thr72, Thr74, Ser76, Asp82 중 하나 이상이 시스테인으로 돌연변이된 항체를 나타내는, 생체분자의 컨쥬게이트.
  21. 제14항에 있어서, 돌연변이 전에,
    R5가 IL-2, IL-7, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15, IL-21, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, G-CSF, GM-CSF, TNF-α, TRAP 및 TRAIL로 구성된 군으로부터 선택되는 생체분자에 해당하거나;
    R5가 항-Her2 항체, 항-EGFR 항체, 항-VEGFR 항체, 항-CD20 항체, 항-CD33 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-TNFα 항체, 항-CD28 항체, 항-4-1BB 항체, 항-OX40 항체, 항-GITR 항체, 항-CD27 항체, 항-CD40 항체, 또는 항-ICOS 항체, 항-CD25 항체, 항-CD30 항체, 항-CD3 항체, 항-CD22 항체, 항-CCR4 항체, 항-CD38 항체, 항-CD52 항체, 항-보체 C5 항체, RSV의 항-F 단백질, 항-GD2 항체, 항-GITR 항체, 항-당단백질 수용체 lib/Illa 항체, 항-ICOS 항체, 항-IL2R 항체, 항-LAG3 항체, 항-인테그린α4 항체, 항-lgE 항체, 항-PDGFRa 항체, 항-RANKL 항체, 항-SLAMF7 항체, 항-LTIGIT 항체, 항-TIM-3 항체, 항-VEGFR2 항체, 항-VISTA 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 항체 또는 이의 기능성 단편에 해당하거나;
    R5가 우토밀루맙(Utomilumab), 우렐루맙(Urelumab), ADG106, Poteligeo™(모가물리주맙(Mogamulizumab)), Poteligeo™(모가물리주맙), Bexxar™(토시투모맙(tositumomab)), Zevalin™(이브리투모맙 티욱세탄(ibritumomab tiuxetan)), Rituxan™(리툭시맙(rituximab)), Arzerra™(오파투무맙(Ofatumumab)), Gazyva™(오비누투주맙(Obinutuzumab)), Besponsa™(이노투주맙 오조가미신(Inotuzumab ozogamicin)), Zenapax™(다클리주맙(daclizumab)), 바르릴루맙(Varlilumab), 테랄리주맙(Theralizumab), Adcetris™(브렌툭시맙 베도틴(Brentuximab vedotin)), Myelotarg™(젬투주맙(gemtuzumab)), Darzalex™(다라투무맙(Daratumumab)), CDX-1140, SEA-CD40, RO7009789, JNJ-64457107, APX-005M, Chi Lob 7/4, Campath™(알렘투주맙(alemtuzumab)), Raptiva™(에팔리주맙(efalizumab)), Soliris™(에쿨리주맙(eculizumab)), Yervoy™(이필리무맙(ipilimumab)), 트레멜리무맙(tremelimumab), Erbitux™(세툭시맙(cetuximab)), Vectibix™(파니투무맙(panitumumab)), Portrazza™(네시투무맙(Necitumumab)), TheraCIM™(니모투주맙(Nimotuzumab)), Synagis™(팔리비주맙(palivizumab)), Unituxin™(디누툭시맙(Dinutuximab)), TRX-518, MK-4166, MK-1248, GWN-323, INCAGN0186, BMS-986156, AMG-228, ReoPro™(아비식시맙(abiciximab)), Herceptin™(트라스투주맙(trastuzumab)), Perjeta™(페르투주맙(Pertuzumab)), Kadcyla™(아도-트라스투주맙 엠탄신(Ado-trastuzumab emtansine)), GSK-3359609, JTX-2011, Simulect™(바실릭시맙(basiliximab)), Tysabri™(나탈리주맙(natalizumab)), BMS-986016, REGN3767, LAG525, Xolair™(오말리주맙(omalizumab)), 타볼리맙(Tavolimab), PF-04518600, BMS-986178, MOXR-0916, GSK-3174998, INCAGN01949, IBI-101, Keytruda™(펨브롤리주맙(Pembrolizumab)), Opdivo™(니볼루맙(Nivolumab)), Lartruvo™(올라라투맙(Olaratumab)), Tencentriq™(아테졸리주맙(Atezolizumab)), BMS-936559, Bavencio™(아벨루맙(Avelumab)), Imfinzi™(두랄루맙(Duralumab)), Prolia™(데노수맙(Denosumab)), Empliciti™(엘로투주맙(Elotuzumab)), MTIG7192A, TSR-022, MBG-453, Remicade™(인플릭시맙(infliximab)), Humira™(아달리무맙(adalimumab)), Avastin™(베바시주맙(bevacizumab)), Lucentis™(라니비주맙(ranibizumab)), Cyramza™(라무시루맙(Ramucirumab)) 및 JNJ-61610588로 구성된 군으로부터 선택되는 항체 또는 이의 기능성 단편에 해당하는, 생체분자의 컨쥬게이트.
  22. 제21항에 있어서,
    IL2에서의 돌연변이 위치가 Lys32, Lys35, Thr37, Met39, Thr41, Lys43, Tyr45, Lys48, Lys49, Lys64, Leu72, Ala73, Ser75, Lys76, Leu94, Thr101, Thr102, Tyr107, Ala108, Thr111, Ala112, Leu12, His16, Leu19, Met23, Gly27, Ser75, Arg81, Leu85, Ser87 및 Asn88로 구성된 군으로부터 선택되거나;
    IL10에서의 돌연변이 위치가 Thr6, Ser8, Ser11. Thr13, Gly17, Arg24, Ser31, Arg32, Lys34, Thr35, Lys40, Leu46, Lys49, Ser51, Lys57, Gly58, Ser66, Tyr72, Lys88, His90, Ser93, Lys99, Thr100, Arg104, Lys117, Ser118, Lys119, Lys125, Lys130, Lys134, Gly135, Tyr137, Tyr149, Thr155, Lys157 및 Arg159로 구성된 군으로부터 선택되거나;
    항-PD-1 항체 펨브롤리주맙의 중쇄에서의 돌연변이 위치가 Ser7, Gly8, Gly15, Ala16, Ser17, Ala24, Ser25, Gly26, Tyr27, Thr28, Thr30, Asn31, Tyr32, Tyr33, Tyr35, Ala40, Gly42, Gly44, Leu45, Gly49, Gly50, Ile51, Asn52, Ser54, Asn55, Gly56, Gly57, Thr58, Asn59, Lys63, Lys65, Thr69, Leu70, Thr71, Thr72, Asp73, Ser74, Ser75, Thr76, Thr77, Thr78, Ala79, Leu83, Ser85, Leu86, Thr91, Ala92, Arg99, Asp100, Tyr101, Arg102, Asp104, Gly106, Gly111, Gly113, Thr114, 115Thr, 117Thr, Ser119, Ser120, Ala121, Ser122, Thr123, Lys124, Gly125 및 Ser127로 구성된 군으로부터 선택되고; 경쇄에서의 돌연변이 위치가 Ile2, Thr5, Ser7, Ala9, Thr10, Leu11, Ser12, Leu13, Ser14, Gly16, Ala19, Thr20, Ala25, Ser26, Lys27, Gly28, Ser30, Thr31, Ser32, Gly33, Tyr34, Ser35, Tyr36, Leu37, Gly45, Ala47, Leu50, Leu51, Ile52, Tyr53, Leu54, Ala55, Ser56, Tyr57, Leu58, Ser60, Gly61, Ala64, Ser67, Gly68, Ser69, Gly70, Ser71, Gly72, Thr73, Ala76, Thr78, Ser80, Ser81, Ser95, Arg96, Asp97, Leu98, Leu100, Thr101, Phe102, Gly104, Ile110, Lys111 및 K130으로 구성된 군으로부터 선택되거나;
    항-PD-1 항체 니볼루맙의 중쇄에서의 돌연변이 위치가 Gln3, Ser7, Gly8, Gly9, Gly10, Gly15, Ser17, Lys23, Ala24, Ser25, Gly26, Ile27, Asn31, Thr28, Ser30, Ser32, Gly33, Ala40, Gly42, Gly44, Leu45, Ala49, Ile51, Tyr53, Asp54, Gly55, Ser56, Lys57, Tyr59, Tyr60, Ala61, Asp62, Ser63, Lys65, Gly66, Thr69, Ile70, Ser71, Arg72, Asp73, Asn74, Ser75, Lys76, Asn77, Thr78, Leu79, Leu81, Ser85, Leu86, Ala88, Thr91, Ala92, Thr98, Asn99, Asp100, Asp101, Tyr102, Gly104, Gly106, Thr107, Leu108, Thr110, Ser112, Ser113, Ala114, Ser115, Thr116, Lys117, Gly118 및 Ser120으로 구성된 군으로부터 선택되고; 경쇄에서의 돌연변이 위치가 Ile2, Leu4, Thr5, Ser7, Ala9, Thr10, Leu11, Ser12, Leu13, Ser14, Gly16, Ala19, Thr20, Leu21, Ala25, Ser26, Ser28, Ser30, Ser31, Tyr32, Leu33, Ala34, Tyr36, Gly41, Ala43, Leu46, Leu47, Ile48, Tyr49, Asp50, Ala51, Ser52, Asn53, Arg54, Ala55, Thr56, Gly57, Ile58, Ala60, Arg61, Ser63, Gly64, Ser65, Gly66, Ser67, Gly68, Thr69, Thr72, Leu73, Thr74, Ile75, Ser76, Ser77, Leu78, Ala84, Ser91, Ser92, Asn93, Arg96, Thr97, Phe98, Gly99, Gly101, Thr102, Ile106, Lys107, Thr109, Ala111, Ala112, Ser114, Ile117 및 Ser121로 구성된 군으로부터 선택되거나;
    항-CTLA-4 항체 이필리무맙의 중쇄에서의 돌연변이 위치가 Gln3, Arg19, Leu20, Ser25, Gly26, Phe27, Thr28, Phe29, Ser30, Ser31, Tyr32, Thr33, Met34, His35, Gly44, Phe50, Ile51, Ser52, Tyr53, Asp54, Gly55, Asn56, Asn57, Lys58, Tyr59, Tyr60, Thr69, Ser71, Arg72, Asp73, Asn74, Ser75, Lys76, Asn77, Thr99, Gly100, Trp101, Leu102, Gly103 및 Pro104로 구성된 군으로부터 선택되고; 경쇄에서의 돌연변이 위치가 Gln6, Arg24, Ala25, Ser26, Gln27, Ser28, Val29, Gly30, Ser31, Ser32, Tyr33, Ile49, Tyr50, Gly51, Ala52, Phe53, Ser54, Arg55, Ala56, Phe53, Ser54, Arg55, Ala56, Thr57, Gly58, Ile59, Pro60, Asp61, Arg62, Ser68, Gly69, Thr70, Gln90, Gln91, Tyr92, Gly93, Ser94, Ser95, Pro96 및 Trp97로 구성된 군으로부터 선택되거나;
    항-TNFα 항체의 중쇄에서의 돌연변이 위치가 Ser7, Gly8, Gly9, Gly10, Leu11, Gly15, Ser17, Leu18, Leu20, Ala24, Ser25, Gly26, Thr28, Asp30, Asp31, Tyr32, Ala33, Ala40, Gly42, Gly44, Leu45, Ser49, Ala50, Ile51, Thr52, Asn54, Ser55, Gly56, Ile58, Asp59, Tyr60, Ala61, Asp62, Ser63, Glu65, Gly66, Phe68, Thr69, Ile70, Ser71, Asp73, Asn74, Ala75, Lys76, Ser78, Leu79, Tyr80, Leu81, Ser85, Leu86, Ala88, Thr91, Ala92, Lys98, Ser100, Tyr101, Leu102, Ser103, Thr104, Ala105, Ser106, Ser107, Leu108, Asp109, Tyr110, Gly112, Gly114, Thr115, Leu116, thr118, Ser120, Ser121, Ala122, Ser123 및 Thr124로 구성된 군으로부터 선택되고; 경쇄에서의 돌연변이 위치가 Asp1, Thr5, Ser7, Ser9, Ser10, Leu11, Ser12, Ala13, Ser14, Gly16, Thr20, Ile21, Ala25, Ser26, Gln27, Gly28, Ile29, Arg30, Asn31, Tyr32, Leu33, Ala34, Tyr36, Lys39, Gly41, Lys42, Ala43, Leu48, Leu47, Ile48, Tyr49, Ala50, Ala51, Ser52, Thr53, Leu54, Gln55, Ser56, Gly57, Ser60, Ser63, Gly64, Ser65, Gly66, Ser67, Gly68, Thr69, Asp70, Thr72, Leu73, Thr74, Ile75, Ser76, Ser77, Leu78, Ala84, Thr85, Tyr91, Asn92, Arg93, Ala94, Tyr96, Thr97, Phe98, Gly99, Gly101, Thr102, Ile106, Lys107, Thr109 및 Ala111로 구성된 군으로부터 선택되거나;
    항-CD28 항체의 중쇄에서의 돌연변이 위치가 Ser7, Gly8, Gly15, Ala16, Ser17, Ser21, Ala24, Ser25, Gly26, Tyr27, Thr28, Thr30, Ser31, Tyr32, Ala40, Gly42, Gly44, Gly49, Tyr52, Gly54, Thr58, Ala68, Thr69, Thr71, Thr74, Ser75, Ser77, Thr78, Ala79, Ser84, Leu86, Ser88, Thr91, Ala92, Thr97, Ser99, Tyr101, Gly102, Leu103, Gly113, Thr114, Thr115, Thr117, Ser119, Ser120, Ala121, Ser122 및 Thr123으로 구성된 군으로부터 선택되고; 경쇄에서의 돌연변이 위치가 Thr5, Ser7, Ser9, Ser10, Ser11, Ser12, Ala13, Ser14, Gly16, Thr20, Thr22, Ala25, Ser26, Ser27, Ile29, Tyr30, Ala43, Leu46, Leu47, Tyr49, Lys50, Ala51, Ser52, Leu54, Thr56, Gly57, Ser60, Ser63, Gly64, Ser65, Gly66, Ser67, Gly68, Thr69, Asp70, Thr72, Thr74, Ser76, Ser77, Ala84, Thr85, Gly91, Thr93, Tyr94, Tyr96, Thr97, Phe98, Gly99, Gly100, Gly101, Thr102, Thr109 및 Ala111로 구성된 군으로부터 선택되거나;
    항-4-1BB 항체의 중쇄에서의 돌연변이 위치가 Thr31, Tyr32, Ser35, Lys50, Tyr52, Asp55, Ser56, Tyr57, Thr58, Asn59, Tyr60, Ser61, Gln65, Gly66, Gly99, Tyr100, Gly101, Asp104 및 Tyr105로 구성된 군으로부터 선택되고; 경쇄에서의 돌연변이 위치가 Ser23, Gly24, Asp25, Asn26, Gly28, Asp29, Gln30, Tyr31, Gln49, Asp50, Lys51, Asn52, Arg53, Ser55, Gly56, Thr89, Tyr90, Thr91, Gly92, Gly94 및 Ser95로 구성된 군으로부터 선택되거나;
    항-Her2 항체의 중쇄에서의 돌연변이 위치가 Arg19, Lys30, Asp31, Tyr33, Arg50, Tyr62, Asn55, Tyr57, Arg59, Tyr60, Asp62, Lys65, Asp102 및 Tyr105로 구성된 군으로부터 선택되고; 경쇄에서의 돌연변이 위치가 Asp1, Gln3, Gln27, Asp28, Asn30, Tyr49, Tyr55, Arg66, Asp70 및 Tyr92로 구성된 군으로부터 선택되거나;
    항-PD-L1 항체 아테졸리주맙의 중쇄에서의 돌연변이 위치가 Gln3, Asp31, Tyr54, Tyr59, Tyr60, Asp62, Lys65, Asp73, Lys76, Asn77 및 Arg99로 구성된 군으로부터 선택되고; 경쇄에서의 돌연변이 위치가 Arg24, Gln27, Asp28, Tyr49, Tyr55, Asp70, Gln89, Gln90, Tyr91 및 Tyr93으로 구성된 군으로부터 선택되는,
    생체분자의 컨쥬게이트.
  23. 제1항에 있어서, R5가 시스테인으로 돌연변이된 하나 이상의 아미노산 잔기를 함유하는 융합 단백질이고;
    바람직하게는, 융합 단백질이 항체의 항원 결합 도메인 및 선택적으로 사이토카인을 함유하고; 바람직하게는 융합 단백질이 HER2, CD19, EGFR, CD22, CD3, TROP2, 당단백질 NMB, 구아닐릴 사이클라제 C, CEA, CD79b, PSMA, ENPP3, 메소텔린, CD138, NaPi2b, CD56, CD74, FOLR1, DLL3, CEACAM5, CD142, SLAMF7, CD25, SLTRK6, CD37, CD70, AGS-22, C4.4A, FGFR2, Ly6E, MUC16, BCMA, pCadherin, 에프린-A, LAMP1, MUC1, CD19, PDL1, HER2, NY-ESO-1, BCMA, WT1, MUC1, CD20, CD23, ROR1, CD123, CD33, CD44v6, CD174, CD30, CD133, cMet, EGFR, FAP, EphA2, GD2, GPC3, IL-13Ra2, LewisY, 메소텔린, SS1, CEA, CD171, EGFR, EGFRvIII, VEGFR2, NY-ESO-1, MUC-1 및 MAGE-A3로 구성된 군으로부터 선택되는 항원에 대한 항원 결합 도메인을 함유하는 이중특이적 항체이고; 바람직하게는, 이중특이적 항체가 단일 사슬 이중특이적 항체이고;
    바람직하게는, 융합 단백질이 항체의 항원 결합 도메인 및 IL-2, IL-7, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15, IL-21, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, G-CSF, GM-CSF, TNF-α, TRAP 및 TRAIL로 구성된 군으로부터 선택되는 사이토카인을 함유하고; 바람직하게는, 융합 단백질이 항-PD-l 항체 및 IL2의 융합 단백질인, 생체분자의 컨쥬게이트.
  24. 제1항에 있어서, R1-R2-R3-R4가 하기 구조 중 임의의 구조로 표현되고;
    Figure pct00153
    ,
    상기 식에서, R1이 제2항 또는 제3항에서 정의된 바와 같은, 생체분자의 컨쥬게이트.
  25. 제1항에 있어서, R1-R2-R3-R4가 하기 구조 중 임의의 구조로 표현되고;
    Figure pct00154

    Figure pct00155

    상기 식에서, pegm이 44 내지 132000의 범위 내의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜, 예를 들어, 1000 내지 50000 또는 10000 내지 30000의 범위 내의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜이고, m이 폴리에틸렌 글리콜의 분자량을 나타내고; n이 1 내지 30000의 범위 내의 정수, 예를 들어, 1-3000, 1-500, 1-300, 1-20 또는 5-12의 범위 내의 정수이고;
    Z가 카르보닐 치환기를 함유하는 나프틸, 퀴놀릴, 플루오레닐 또는 아다만틸이고, Z가 이의 카르보닐기를 통해 아미노에 연결되고; 바람직하게는, Z가
    Figure pct00156
    로 구성된 군으로부터 선택되는, 생체분자의 컨쥬게이트.
  26. 제1항에 있어서, 생체분자의 컨쥬게이트에서, R1-R2-R3-R4가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 생체분자의 컨쥬게이트:
    Figure pct00157

    Figure pct00158

    Figure pct00159

    Figure pct00160

    Figure pct00161

    Figure pct00162

    Figure pct00163

    Figure pct00164
    .
  27. 하기 구조를 갖는 컨쥬게이트로서;
    R4-S-cys-R5
    상기 식에서,
    R4가 -R4-a-R4-b-R4-c로 표현되고, 여기서 R4-a가 하기로 구성된 군으로부터 선택되고;
    Figure pct00165

    상기 식에서, Ra 및 Rb가 각각 독립적으로 H 및 C1-6 알킬 또는 C1-6 알콕실로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R4-b가 하기로 구성된 군으로부터 선택되고;
    Figure pct00166

    상기 식에서, 화학식 R4-b1에서, Rc가 부재하거나, C1-12 알킬, C1-12알콕시-C1-12알킬, C1-12알킬-C3-8사이클로알킬, (C1-4알킬-O)p-C1-12알킬, C1-12알킬카르보닐아미노-(C1-4알킬-O)p-C1-12알킬, 페닐-C1-12알킬, C3-8사이클로알킬, C1-12알킬-C3-8사이클로알킬-C1-12알킬 및 C1-12알킬-페닐-C1-12알킬로 구성된 군으로부터 선택되고; 화학식 R4-b2에서, Rc가 아미노기의 N 원자에서 치환된 Ra-1 및 Ra-2를 갖는 C1-12알킬아미노이고, 화학식 4-b3에서, Rc가 알킬의 말단의 마지막 C 원자가 Ra-1, Ra-2 및 R2-3에 의해 치환된 C1-12알킬이고, 여기서 Ra-1, Ra-2 및 Ra-3가 각각 독립적으로 C1-12알킬, C1-12알킬-OH 및 C1-12알킬-NR"R"'로 구성된 군으로부터 선택되고, 여기서 R" 및 R"'이 각각 독립적으로 H 및 C1-12알킬로 구성된 군으로부터 선택되고; 여기서, 화학식 R4-b2 및 R4-b3에서, R4-b가 Ra-1, Ra-2 및 Ra-3 중 적어도 하나를 통해 R4-c에 연결되고;
    R4-c가 하기로 구성된 군으로부터 선택되고;
    Figure pct00167

    상기 식에서, Rx가 H, 할로 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 선택되고; p가 1 내지 10의 범위 내의 정수, 예를 들어, 1 내지 5의 범위 내의 정수이고; q가 1 내지 4의 범위 내의 정수, 예를 들어, 1 내지 2의 범위 내의 정수이고; 단, R4-a가 화학식 R4-a2, R4-a3 및 R4-a4로 구성된 군으로부터 선택되는 경우 R4-c가 부재하고;
    여기서, R4-a의 각각의 화학식에 제시된 물결선이 R4-a가 R4-b에 연결되는 위치를 나타내고, R4-c의 각각의 화학식에 제시된 물결선이 R4-c가 R4-b에 연결되는 위치를 나타내는, 컨쥬게이트.
  28. 제27항에 있어서, R4가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물:
    Figure pct00168

    Figure pct00169

    Figure pct00170
    .
  29. 치료적 유효량의 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 생체분자의 컨쥬게이트 또는 제27항 또는 제28항의 화합물을 종양 또는 자가면역 질병을 치료할 필요가 있는 대상체에 제공하는 것을 포함하는, 종양 또는 자가면역 질병을 치료하기 위한 방법.
  30. 제29항에 있어서, 종양이 방광, 뇌, 유방, 자궁경부, 결장-직장, 식도, 신장, 간, 폐, 비인두, 췌장, 전립선, 피부, 위, 자궁, 난소, 고환 또는 혈액의 암인 방법.
  31. R1-R2-R3-R4로 표현되는 화합물로서, 여기서 R1이 H이거나 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 정의되고; R2가 제1항 및 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 정의되고; R3가 제1항 및 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 정의되고; R4가 제1항 및 제12항 또는 제13항 중 어느 한 항에 정의된, 화합물.
  32. 제31항에 있어서, 화합물이 하기로 표현되고;
    Figure pct00171

    상기 식에서, X 및 Y가 각각 독립적으로 NR' 또는 O이고, Z가 H 또는 C1-10알킬이고, R'이 H 또는 C1-4알킬이고; 아미드, 에스테르, 카르바메이트, 우레아 또는 하이드라존 결합의 연결 방식으로 각각 R1이 X에 결합되고, R4가 Y 또는 N에 연결되는, 화합물.
  33. 제31항에 있어서, 화합물이 하기로 표현되는, 화합물:
    Figure pct00172
    .
  34. 제31항에 있어서, 화합물이 하기로 표현되고;
    Figure pct00173

    상기 식에서, X 및 Y가 각각 독립적으로 NR' 또는 O이고, Z가 H 또는 C1-10알킬이고, R'이 H 또는 C1-4알킬이고; 아미드, 에스테르, 카르바메이트, 우레아 또는 하이드라존 결합의 연결 방식으로 각각 R2가 X에 결합되고, R4가 Y 또는 N에 연결되는, 화합물.
  35. 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물로서;
    Figure pct00174

    상기 식에서,
    R1이 H이거나, 제2항 또는 제3항에 정의된 바와 같고;
    R4가 제12항 또는 제13항에 정의된 바와 같은,
    화합물.
  36. 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물:
    Figure pct00175

    Figure pct00176

    Figure pct00177

    Figure pct00178

    Figure pct00179

    Figure pct00180

    Figure pct00181

    Figure pct00182

    Figure pct00183
    .
  37. 상보성 결정 영역에서 G, A, S, T, L, I, F, E, K, D 및 Y로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기 중 하나 이상 및/또는 비-상보성 결정 영역에서 G, A, S, T, L, I, F, E, K, D 및 Y로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기 중 하나 이상이 시스테인으로 돌연변이된 항체 또는 이의 기능성 단편으로서,
    바람직하게는, 항체가 항-Her2 항체, 항-EGFR 항체, 항-VEGFR 항체, 항-CD20 항체, 항-CD33 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-TNFα 항체, 항-CD28 항체, 항-4-1BB 항체, 항-OX40 항체, 항-GITR 항체, 항-CD27 항체, 항-CD40 항체, 또는 항-ICOS 항체, 항-CD25 항체, 항-CD30 항체, 항-CD3 항체, 항-CD22 항체, 항-CCR4 항체, 항-CD38 항체, 항-CD52 항체, 항-보체 C5 항체, RSV의 항-F 단백질, 항-GD2 항체, 항-GITR 항체, 항-당단백질 수용체 lib/Illa 항체, 항-ICOS 항체, 항-IL2R 항체, 항-LAG3 항체, 항-인테그린α4 항체, 항-lgE 항체, 항-PDGFRa 항체, 항-RANKL 항체, 항-SLAMF7 항체, 항-LTIGIT 항체, 항-TIM-3 항체, 항-VEGFR2 항체, 항-VISTA 항체로 구성된 군으로부터 선택되거나;
    더욱 바람직하게는, 항체가 우토밀루맙, 우렐루맙, ADG106, Poteligeo™(모가물리주맙), Poteligeo™(모가물리주맙), Bexxar™(토시투모맙), Zevalin™(이브리투모맙 티욱세탄), Rituxan™(리툭시맙), Arzerra™(오파투무맙), Gazyva™(오비누투주맙), Besponsa™(이노투주맙 오조가미신), Zenapax™(다클리주맙), 바르릴루맙, 테랄리주맙, Adcetris™(브렌툭시맙 베도틴), Myelotarg™(젬투주맙), Darzalex™(다라투무맙), CDX-1140, SEA-CD40, RO7009789, JNJ-64457107, APX-005M, Chi Lob 7/4, Campath™(알렘투주맙), Raptiva™(에팔리주맙), Soliris™(에쿨리주맙), Yervoy™(이필리무맙), 트레멜리무맙, Erbitux™(세툭시맙), Vectibix™(파니투무맙), Portrazza™(네시투무맙), TheraCIM™(니모투주맙), Synagis™(팔리비주맙), Unituxin™(디누툭시맙), TRX-518, MK-4166, MK-1248, GWN-323, INCAGN0186, BMS-986156, AMG-228, ReoPro™(아비식시맙), Herceptin™(트라스투주맙), Perjeta™(페르투주맙), Kadcyla™(아도-트라스투주맙 엠탄신), GSK-3359609, JTX-2011, Simulect™(바실릭시맙), Tysabri™(나탈리주맙), BMS-986016, REGN3767, LAG525, Xolair™(오말리주맙), 타볼리맙, PF-04518600, BMS-986178, MOXR-0916, GSK-3174998, INCAGN01949, IBI-101, Keytruda™(펨브롤리주맙), Opdivo™(니볼루맙), Lartruvo™(올라라투맙), Tencentriq™(아테졸리주맙), BMS-936559, Bavencio™(아벨루맙), Imfinzi™(두랄루맙), Prolia™(데노수맙), Empliciti™(엘로투주맙), MTIG7192A, TSR-022, MBG-453, Remicade™(인플릭시맙), Humira™(아달리무맙), Avastin™(베바시주맙), Lucentis™(라니비주맙), Cyramza™(라무시루맙) 및 JNJ-61610588로 구성된 군으로부터 선택되고;
    더욱 바람직하게는, 항체 또는 이의 기능성 단편이 제22항에 정의된 바와 같은 돌연변이 중 하나 이상을 함유하는,
    항체 또는 이의 기능성 단편.
  38. G, A, S, T, L, I, F, E, K, D 및 Y로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기가 시스테인으로 돌연변이된 사이토카인으로서,
    바람직하게는, 사이토카인이 IL-2, IL-7, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15, IL-21, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, G-CSF, GM-CSF, TNF-α, TRAP 및 TRAIL로 구성된 군으로부터 선택되고;
    더욱 바람직하게는, 사이토카인이 제22항에 정의된 바와 같은 돌연변이 중 하나 이상을 함유하는, 사이토카인.
  39. 하기 구조 중 임의의 구조로 표현되는 생체분자의 컨쥬게이트로서;
    Figure pct00184

    Figure pct00185

    Figure pct00186

    Figure pct00187

    상기 식에서, 사이토카인 및 항체가 제15항 내지 제23항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같고, 바람직하게는, 항체 및 사이토카인이 SEQ ID NO:1-83 중 임의의 것으로 구성된 군으로부터 선택되는, 생체분자의 컨쥬게이트.
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