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KR20160037130A - 신규한 항체 접합체 및 이의 용도 - Google Patents

신규한 항체 접합체 및 이의 용도 Download PDF

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Publication number
KR20160037130A
KR20160037130A KR1020157026213A KR20157026213A KR20160037130A KR 20160037130 A KR20160037130 A KR 20160037130A KR 1020157026213 A KR1020157026213 A KR 1020157026213A KR 20157026213 A KR20157026213 A KR 20157026213A KR 20160037130 A KR20160037130 A KR 20160037130A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
antibody
dll3
conjugate
variable region
Prior art date
Application number
KR1020157026213A
Other languages
English (en)
Inventor
마이클 토르고브
필립 윌슨 하워드
Original Assignee
스템센트알엑스 인코포레이티드
스피로즌 살
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 스템센트알엑스 인코포레이티드, 스피로즌 살 filed Critical 스템센트알엑스 인코포레이티드
Publication of KR20160037130A publication Critical patent/KR20160037130A/ko

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Abstract

본원에는 신규한 항체 약물 접합체(ADC), 및 증식성 장애를 치료하기 위한 이러한 ADC의 사용 방법이 제공된다.

Description

신규한 항체 접합체 및 이의 용도{NOVEL ANTIBODY CONJUGATES AND USES THEREOF}
상호 참조 출원
본 출원은, 전문이 본원에 참조로 인용된 2013년 2월 22일에 출원된 미국 가특허 출원 제61/768368호의 우선권을 주장한다.
서열목록
본 출원은, 전자출원시스템-웹(EFS-Web)을 통해 ASCII 포맷으로 제출되었던 서열목록을 함유하고 있으며 그 전문이 본원에 참조로 인용되어 있다. 상기 ASCII 사본은, 2014년 2월 15일에 생성된 것으로, S69697_1110WO_ST25.txt라고 명명되며, 582KB(596,345바이트)의 크기이다.
본 발명의 분야
본 출원은, 일반적으로 피롤로벤조디아제핀(PBD)에 접합된 항-DLL3 항체 또는 이의 면역반응성 단편을 포함하는 신규 화합물, 및 암 및 이의 임의의 재발 또는 전이의 치료 또는 예방을 위한 이의 용도에 관한 것이다.
줄기 세포 및 전구 세포의 분화 및 증식은, 기관형성 동안의 조직 성장, 세포 수복 및 세포 교체를 지지하기 위해 협력해서 작용하는 정상적으로 계속 진행하는 과정이다. 시스템은, 단지 적합한 신호가 유기체의 필요에 따라 발생된다는 것을 보장하기 위해 엄밀하게 조절된다. 세포 증식 및 분화는, 보통 손상되었거나 죽어가는 세포의 교체에 혹은 성장에 필요할 때에만 일어난다. 그러나, 이러한 과정의 파괴는, 각종의 신호전달 화학물질의 과소 또는 과다, 변경된 미소환경의 존재, 유전적 돌연변이 또는 이들의 조합을 포함하는 다수의 인자에 의해 유발될 수 있다. 정상 세포의 증식 및/또는 분화의 파괴는, 암과 같은 증식성 질환을 포함하는 각종 장애를 초래할 수 있다.
암의 종래 치료법으로는 화학치료요법, 방사선치료요법 및 면역치료요법이 포함된다. 흔히, 이러한 치료법은 비효과적이고, 외과적 절제는 실행가능한 임상 대안을 제공할 수 없다. 치료의 현재 표준에서 제한은 환자가 첫 번째 라인 치료를 받고 이후 재발한 경우에 특히 명백하다. 상기한 경우에서, 종종 공격적이고 불치의 난치성 종양이 자주 발생한다. 많은 고형 종양의 전체적인 생존율은 적어도 부분적으로 재발, 종양 재발 및 전이를 방지하기 위한 기존의 치료요법의 실패에 기인하여 다년간 크게 변화되지 않았다. 현재 이용가능한 치료의 치료학적 제약은 효과적으로 신생물성 세포를 표적화하고 그들을 처리할 수 있는 부수적인 피해와 함께 제거하는 새로운 제제를 개발할 필요성을 강조하고 있다.
이러한 제제 및 관련 치료법의 개발을 위한 하나의 유망한 영역은 항체를 사용하는 표적화 치료요법을 포함한다. 이와 관련하여, 항체 치료요법은 암, 면역학적 및 혈관형성 장애 환자의 표적화 치료를 위해 확립되었다(참조: Carter, P. (2006) Nature Reviews Immunology 6:343-357). 보다 구체적으로, 세포 독성 또는 세포증식 억제제의 국소 전달을 위한 성분 및 약물 페이로드(payload) 성분을 표적화하는 세포 결합제를 포함하는 항체 약물 접합체(즉, ADC 또는 면역접합체)의 사용은 종양 세포내에 약물의 세포내 축적을 촉진시키는 것으로 나타났다. 이러한 국소화는 종양 내에 비교적 고농도의 약물을 제공하는 반면, 동일한 종양 농도를 달성하기 위한 비접합된(즉, 비표적화된) 약물의 전신 투여는 정상 세포에 허용할 수 없는 수준의 독성을 일으킬 수 있다(참조: Xie et al (2006) Expert. Opin. Biol. Ther. 6(3):281-291; Kovtun et al (2006) Cancer Res. 66(6):3214-3121; Law et al (2006) Cancer Res. 66(4):2328-2337; Wu et al (2005) Nature Biotech. 23(9):1137-1145; Lambert J. (2005) Current Opin. in Pharmacol. 5:543-549; Hamann P. (2005) Expert Opin. Ther. Patents 15(9):1087-1103; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Trail et al (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614).
임상적 관점으로부터, 이러한 항체 약물 접합체는 그것에 의해 독성의 상응하는 감소와 함께 향상된 효능을 제공할 수 있다. ADC를 설계하고 정제하기 위한 노력은 모노클로날 항체(mAb)의 선택도 뿐만 아니라 약물의 작용 메카니즘, 접합 기술 및 링커, 약물/항체 비(부하) 및 약물 방출 특성에 초점을 맞추고 있다(참조: Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; Dornan et al (2009) Blood 114(13):2721-2729; US 7521541; US 7723485; WO2009/052249; McDonagh (2006) Protein Eng. Design & Sel. 19(7): 299-307; Doronina et al (2006) Bioconj. Chem. 17:114-124; Erickson et al (2006) Cancer Res. 66(8):1-8; Sanderson et al (2005) Clin. Cancer Res. 11:843-852; Jeffrey et al (2005) J. Med. Chem. 48:1344-1358; Hamblett et al (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070). 항체 선택도 및 종양 국소화와 관련하여, 공지된 종양 마커의 수는 낮은 발현, 내재성의 결여, 박리 등을 포함하는 다양한 이유로 비효과적인 ADC 표적인 것으로 입증되었다. 적합한 ADC 약물 성분의 선택은 또한 과거에 문제가 되는 것으로 입증되었다. 다양한 제제가 튜불린 결합, DNA 결합, 프로테아솜 및/또는 토포아이소머라제 억제를 포함하는 메카니즘에 의해 세포독성 및 세포증식 억제 효과를 부여하는 약물 잔기를 포함하는 ADC에 사용하기 위해 제안되었다. 일부 성공에도 불구하고, 특정 세포독성 약물은 거대한 항체 또는 단백질 수용체 리간드에 접합될 때 비활성 또는 저활성으로 되는 경향이 있다. 따라서, ADC 성분으로서 적합한 표적화 또는 세포 결합제 및 유효한 약물 페이로드의 선택은 목적하는 임상 프로파일을 나타내는 화합물을 제공하는데 중요하다.
잠재적인 ADC 페이로드로서 유망한 것으로 나타나 있는 한 가지 부류의 화합물은 피롤로벤조디아제핀(PBD)이다. 이와 관련하여, PBD는 바람직한 서열 PuGPu를 포함하는 DNA의 특이적 서열을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다. 제1 PBD 항종양 항생물질 안트라마이신이 1965년에 발견되었다(참조: Leimgruber, et al., J. Am. Chem. Soc., 87, 5793-5795 (1965); Leimgruber, et al., J. Am. Chem. Soc., 87, 5791-5793 (1965)). 그때부터, 천연 발생 PBD의 수가 보고되었고, 10개 이상의 합성 경로가 다양한 유사체에 대해 개발되었다(참조: Thurston, et al., Chem. Rev. 1994, 433-465 (1994); Antonow, D. and Thurston, D.E., Chem. Rev. 2011 111 (4), 2815-2864). 패밀리 구성원은 아베이마이신(참조: Hochlowski, et al., J. Antibiotics, 40, 145-148 (1987)), 치카마이신(참조: Konishi, et al., J. Antibiotics, 37, 200-206 (1984)), DC-81(참조: Japanese Patent 58-180 487; Thurston, et al., Chem. Brit., 26, 767-772 (1990); Bose, et al., Tetrahedron, 48, 751-758 (1992)), 마제트라마이신(참조: Kuminoto, et al., J. Antibiotics, 33, 665-667 (1980)), 네오트라마이신 A 및 B(참조: Takeuchi, et al., J. Antibiotics, 29, 93-96 (1976)), 포로트라마이신(참조: Tsunakawa, et al., J. Antibiotics, 41, 1366-1373 (1988)), 프로트라카르신(참조: Shimizu, et al, J. Antibiotics, 29, 2492-2503 (1982); Langley and Thurston, J. Org. Chem., 52, 91-97 (1987)), 시바노미신(DC-102)(참조: Hara, et al., J. Antibiotics, 41, 702-704 (1988); Itoh, et al., J. Antibiotics, 41, 1281-1284 (1988)), 시비로마이신(참조: Leber, et al., J. Am. Chem. Soc., 110, 2992-2993 (1988)) 및 토마마이신(참조: Arima, et al., J. Antibiotics, 25, 437-444 (1972))을 포함한다.
PBD는 일반적 구조이다:
Figure pct00001
이들은 이들의 방향족 A 환 및 피롤로 C 환 둘 다에서, 치환체의 수, 형태 및 위치, 및 C 환의 포화도가 상이하다. B-환에서 DNA의 알킬화를 담당하는 친전자성 중심인 N10-C11 위치에 이민(N=C), 카비놀아민(NH-CH(OH)) 또는 카비놀아민 메틸 에테르(NH-CH(OMe))가 존재한다. 공지된 천연 생성물 모두는 C 환으로부터 A 환을 향해 볼 때 그들에게 오른쪽 트위스트를 제공하는 키랄 C11a 위치에 (S)-배열을 갖는다. 이는 그들에게 B-형태 DNA의 최소 그루브를 갖는 이소헬리시티(isohelicity)를 위한 적합한 3차원 형상을 제공하여 결합 부위에서 꼭 맞는 적합도를 유도한다(참조: Kohn, In Antibiotics III. Springer-Verlag, New York, pp. 3-11 (1975); Hurley and Needham-VanDevanter, Acc. Chem. Res., 19, 230-237 (1986)). 최소 그루브에서 부가물을 형성하는 능력은 그들이 DNA 처리를 방해하고, 따라서 항종양제로서 이들의 사용을 가능하게 한다.
특히 유리한 피롤로벤조디아제핀 화합물은 문헌(참조: Gregson et al. (Chem. Commun . 1999, 797-798))에 의해 화합물 1로서, 문헌(참조: Gregson et al. (J. Med. Chem. 2001, 44, 1161-1174))에 의해 화합물 4a로서 기재된다. SG2000으로서 또한 공지된 이 화합물은 이하 제시된다:
Figure pct00002
.
WO 제2007/085930호는 항체와 같은 세포 결합제에 연결하기 위한 링커 그룹을 갖는 이량체 PBD 화합물의 제조방법을 기재한다. 링커는 이량체의 단량체 PBD 단위를 연결하는 브릿지에 존재한다.
WO 제2011/130598호는 항체와 같은 세포 결합제에 연결하기 위한 링커 그룹을 갖는 이량체 PBD 화합물을 기재한다. 이러한 화합물 중의 링커는 이용 가능한 N10 위치 중의 하나에 부착되고, 바람직하게는 링커 그룹 상의 효소의 작용에 의해 절단된다.
다양한 PBD ADC는 특정 증식성 장애의 치료를 위한 가능성을 보여준 반면, 당해 기술 분야에서 임상적으로 효과적인 표적화 화합물 및 증식성 장애를 치료하기 위한 이러한 화합물의 사용 방법에 대한 필요성이 잔류한다.
본 발명의 요약
이러한 목적 및 다른 목적은 넓은 의미로, DDL3 관련 장애(예: 증식성 장애 또는 종양성 장애)의 치료에 사용될 수 있는 선택된 PBD를 포함하는 특정 항체 약물 접합체를 포함하는 제조방법, 화합물, 조성물 및 물품에 관한 본 발명에 의해 제공된다. 그 목적을 위해, 본 발명은 종양 세포 및/또는 암 줄기 세포를 효과적으로 표적화하고 광범위한 종류의 증식성 장애 및 이의 임의의 확장, 반복, 재발 또는 전이로 고통 받는 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있는 선택된 PBD에 접합된 델타-유사 리간드 3(Delta-like ligand 3)(또는 DLL3) 항체를 제공한다. 광범위한 국면에서, 본 발명은 실질적으로 바로 아래 ADC 1-5에 나타낸 DLL3 면역접합체를 제공하기 위해 선택된 피롤로벤조디아제핀에 접합된 델타-유사 리간드 3(DDL3) 항체에 관한 것이다. 따라서, 하나의 국면에서, 본 발명은
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 접합체로서, Ab가 항-DLL3 항체 또는 이의 면역반응성 단편을 포함하는, 접합체에 관한 것이다. 접합체 각각에서 링커 약물 잔기에의 접합은 바람직하게는 항-DLL3 항체 상의 유리 티올을 통해서이다.
다른 국면에서, 본 발명은 ADC 1을 포함하는 조성물, ADC 2를 포함하는 조성물, ADC 3을 포함하는 조성물, ADC 4를 포함하는 조성물 또는 ADC 5를 포함하는 조성물을 포함한다.
나타낸 바와 같이, 이러한 접합체는 증식성 장애 또는 이의 재발 또는 진행을 치료, 관리, 개선 또는 예방하기 위해 사용할 수 있다. 본 발명의 선택된 양태는 바람직하게는 종양 개시 세포의 빈도의 감소를 포함하는 악성 종양의 면역치료요법 치료를 위한 이러한 DLL3 접합체의 용도를 제공한다. 개시된 ADC는 단독으로 또는 화학치료요법제 또는 면역치료요법제(예: 치료용 항체) 또는 생물학적 반응 개질제와 같은 다양한 종류의 항암 화합물과 조합하여 사용할 수 있다. 다른 선택된 양태에서, 둘 이상의 개별적인 DLL3 항체 약물 접합체는 개선된 항종양 효과를 제공하기 위해 조합하여 사용될 수 있다.
첨부된 실시예에 나타낸 또 다른 국면에서, 본 발명은
Figure pct00006
,
Figure pct00007
,
Figure pct00008
,
Figure pct00009
및
Figure pct00010
로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화합물을 항-DLL3 항체 또는 이의 면역반응성 단편으로 접합시킴을 포함하는, ADC 1-5의 제조방법을 제공한다. 따라서, 본 출원의 목적을 위해, DL은 "약물-링커"의 약어로서 사용되고, 상기 나타낸 바와 같이 약물 링커 1-5(즉, DL1, DL2, DL3, DL4 및 DL5)를 포함한다.
말단 말레이미도 잔기(DL1 - DL3 및 DL5) 또는 요오도아세트아미드 잔기(DL4)가 첨부된 링커는 당해 기술 분야 인식 기술을 사용하여 선택된 DLL3 항체 상의 유리 설프하이드릴(들)에 접합시킬 수 있다는 것이 이해된다. 이하 보다 상세히 논의되는 것 이외에, DL 1-5의 각 화합물에 대한 합성 경로는 첨부된 실시예 1에 제공되는 반면, ADC 1-5를 제공하기 위해 이러한 화합물을 접합시키는 구체적인 방법은 실시예 7에 나타낸다.
본 출원의 목적을 위해, 용어 "조절인자" 및 "항체"는 문맥에 의해 다르게 지시되지 않는 한 상호교환적으로 사용될 수 있다는 것이 이해된다는 것을 주의한다. 유사하게, 용어 "항-DLL3 접합체" 및 "DLL3 접합체" 또는 간단히 "접합체"는 모두 항-DLL3 항체를 포함하는 ADC 1-5로서 나타낸 화합물을 의미하고, 문맥에 의해 다르게 지시되지 않는 한 상호교환적으로 사용될 수 있다.
어떠한 경우에도, 이들 및 다른 목적은, 넓은 의미에서, DLL3 관련 장애(증식성 장애 또는 종양성 장애)의 치료에 사용될 수 있는 상술한 DLL3 접합체 및 관련 방법, 조성물 및 제조 물품에 관한 것인 본 발명에 의해 제공된다. 이를 위해, 본 발명은 종양 세포 및/또는 암 줄기 세포를 효과적으로 표적화하고, 다양한 종류의 악성 종양으로 고생하고 있는 환자를 치료하기 위해 사용할 수 있는 신규한 델타-유사 리간드 3(또는 DLL3) 항체 접합체를 제공한다. 본원에서 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 적어도 두 개의 천연 발생 DLL3 이소형 또는 변이체가 존재하고, 개시된 조절제는 하나의 이소형 또는 다른 것과 또는 둘 다를 선택적으로 포함하거나 이와 연관시킬 수 있다. 또한, 특정 양태에서, 개시된 DLL3 조절인자는 추가로 하나 이상의 DLL 패밀리 구성원(예: DLL1 또는 DLL4)과 반응시킬 수 있거나, 다른 양태에서, 하나 이상의 DLL3 이소형과 배타적으로 연관시키거나 반응시키기 위해 생성되고 선택될 수 있다.
개시된 항체 약물 접합체가 DLL3 결정인자 (또는 이의 단편)를 인식하고, 경쟁하고, 괴로워하고, 길항시키고, 상호작용하고, 결합하거나 연관시키고, 하나 이상의 생리학적 경로 상의 DLL3 단백질의 영향을 조절하고, 조정하고, 바꾸고, 조절하고, 변경시키거나 변형시키고/시키거나 DLL3 관련 세포를 억제하거나 제거하는 임의의 조절인자, 항체 또는 이의 면역반응성 단편을 포함할 수 있다는 것이 추가로 이해될 것이다. 따라서, 넓은 의미에서, 본 발명은 일반적으로 DLL3 접합체 및 이의 용도에 관한 것이다. 또한, 이하 광범위하게 논의되는 바와 같이, 이러한 항체 약물 접합체는 암을 포함하는 증식성 장애의 예방, 진단 또는 치료용으로 유용한 약제학적 조성물을 제공하기 위해 사용될 수 있다.
ADC 1-5와 관련하여, 적합한 항체는, 예를 들면, 폴리클로날 및 모노클로날 항체, 키메라, CDR 절편이식된, 인간화 및 인간 항체 및 면역반응성 단편 및/또는 상기 각각의 변이체를 포함하는 다수의 형태 중의 임의의 하나를 취할 수 있다는 것이 이해된다. 바람직한 양태는 인간화되거나 완전 인간 작제물과 같은 비교적 비-면역원성인 항체를 포함한다. 물론, 본 개시를 고려하여, 당업자는 DLL3 항체 조절인자의 중쇄 및 경쇄 가변 영역과 관련되는 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 용이하게 동정할 수 있고, 과도한 실험 없이 키메라, 인간화 또는 CDR 절편이식된 항체를 조작하거나 제조할 수 있다. 따라서, 특정의 바람직한 양태에서, 개시된 ADC의 DLL3 항체 성분은 도 3a 및 3b에 정의된 바와 같고 본원에 나타낸 예시적인 연속 경쇄(도 3a) 또는 중쇄(도 3b) 뮤린 가변 영역(서열번호 21-387, 홀수)으로부터 유도된 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 도입한 항체를 포함한다. 예시적인 인간화(CDR 절편이식) 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열은 서열번호 389-407을 포함하는 도 3에 또한 나타낸다. 바람직한 양태에서, 도 3a 및 3b에 나타낸 CDR을 포함하는 항체는 모노클로날 항체를 포함하고, 훨씬 더 바람직한 양태에서, 키메라, CDR 절편이식된 또는 인간화된 항체를 포함한다. 도 3a 및 3b에 나타낸 아미노산 서열 각각을 암호화하는 예시적인 핵산 서열은 여기에 서열목록으로 첨부한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 본원에 기재된 예시적 항체의 아미노산 서열에 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 항체는 본 발명의 항-DLL3 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다.
보다 특히, 선택된 양태에서, 임의의 ADC 1-5에 포함된 항체는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 갖는 항체 또는 이의 면역반응성 단편을 포함할 수 있고, 여기서 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 21, 서열번호 25, 서열번호 29, 서열번호 33, 서열번호 37, 서열번호 41, 서열번호 45, 서열번호 49, 서열번호 53, 서열번호 57, 서열번호 61, 서열번호 65, 서열번호 69, 서열번호 73, 서열번호 77, 서열번호 81, 서열번호 85, 서열번호 89, 서열번호 93, 서열번호 97, 서열번호 101, 서열번호 105, 서열번호 109, 서열번호 113 , 서열번호 117, 서열번호 121, 서열번호 125, 서열번호 129, 서열번호 133, 서열번호 137, 서열번호 141, 서열번호 145, 서열번호 149, 서열번호 153, 서열번호 157, 서열번호 161, 서열번호 165, 서열번호 169, 서열번호 173, 서열번호 177, 서열번호 181, 서열번호 185, 서열번호 189, 서열번호 193, 서열번호 197, 서열번호 201, 서열번호 205, 서열번호 209, 서열번호 213, 서열번호 217, 서열번호 221, 서열번호 225, 서열번호 229, 서열번호 233, 서열번호 237, 서열번호 241, 서열번호 245, 서열번호 249, 서열번호 253, 서열번호 257, 서열번호 261, 서열번호 265, 서열번호 269, 서열번호 273, 서열번호 277, 서열번호 281, 서열번호 285, 서열번호 289, 서열번호 293, 서열번호 297, 서열번호 301, 서열번호 305, 서열번호 309, 서열번호 313, 서열번호 317, 서열번호 321, 서열번호 325, 서열번호 329, 서열번호 333, 서열번호 337, 서열번호 341, 서열번호 345, 서열번호 349, 서열번호 353, 서열번호 357, 서열번호 361, 서열번호 365, 서열번호 369, 서열번호 373, 서열번호 377, 서열번호 381 및 서열번호 385로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열에 적어도 60% 상동성인 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 23, 서열번호 27, 서열번호 31, 서열번호 35, 서열번호 39, 서열번호 43, 서열번호 47, 서열번호 51, 서열번호 55, 서열번호 59, 서열번호 63, 서열번호 67, 서열번호 71, 서열번호 75, 서열번호 79, 서열번호 83, 서열번호 87, 서열번호 91, 서열번호 95, 서열번호 99, 서열번호 103, 서열번호 107, 서열번호 111, 서열번호 115, 서열번호 119, 서열번호 123, 서열번호 127, 서열번호 131, 서열번호 135, 서열번호 139 서열번호 143, 서열번호 147, 서열번호 151, 서열번호 155, 서열번호 159, 서열번호 163, 서열번호 167, 서열번호 171, 서열번호 175, 서열번호 179, 서열번호 183, 서열번호 187, 서열번호 191, 서열번호 195, 서열번호 199, 서열번호 203, 서열번호 207, 서열번호 211, 서열번호 215, 서열번호 219, 서열번호 223, 서열번호 227, 서열번호 231, 서열번호 235, 서열번호 239, 서열번호 243, 서열번호 247, 서열번호 251, 서열번호 255, 서열번호 259, 서열번호 263, 서열번호 267, 서열번호 271, 서열번호 275, 서열번호 279, 서열번호 283, 서열번호 287, 서열번호 291, 서열번호 295, 서열번호 299, 서열번호 303, 서열번호 307 서열번호 311, 서열번호 315, 서열번호 319, 서열번호 323, 서열번호 327, 서열번호 331, 서열번호 335, 서열번호 339, 서열번호 343, 서열번호 347, 서열번호 351, 서열번호 355, 서열번호 359, 서열번호 363, 서열번호 367, 서열번호 371, 서열번호 375, 서열번호 379, 서열번호 383 및 서열번호 387로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산에 적어도 60% 상동성인 아미노산 서열을 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 선택된 조절인자는 상기한 뮤린 서열에 65, 70, 75 또는 80% 상동성인 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 양태에서, 조절인자는 개시된 뮤린 서열에 85, 90 또는 심지어 95% 상동성인 중쇄 및 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 이와 관련하여, 뮤린 공급원 항체로부터 유도된 인간화된 항체는 전형적으로 공급원 항체와 관련하여 바람직하게는 약 70% 내지 약 85% 상동성인 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는다는 것이 이해된다. 비교로써, 인간화된 항체는 전형적으로 수용체 인간 항체와 바람직하게는 약 80% 내지 약 95% 상동성인 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는다.
다른 바람직한 양태에서, 선택된 항체는 상기한 경쇄 및 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 중의 어느 하나로부터 수득된 하나 이상의 CDR을 포함한다. 따라서, 본 발명의 선택된 양태는 서열번호 21 내지 387, 홀수 중의 어느 하나로부터의 하나 이상의 CDR을 포함하는 DLL3 조절인자를 포함한다. 바람직하게는, 항체는 도 3a에 나타낸 단일 경쇄 가변 영역 아미노산 서열로부터 수득된 3개의 경쇄 CDR 및 도 3b에 나타낸 단일 중쇄 가변 영역 아미노산으로부터 수득된 3개의 중쇄 CDR을 포함한다. 예를 들면, 예시적 항체는 도 3a에 나타낸 단일 경쇄 가변 영역 아미노산 서열로부터 수득된 3개의 경쇄 CDDR 및 도 3b에 나타낸 단일 중쇄 가변 영역 아미노산으로부터 수득된 3개의 중쇄 CDR을 포함할 수 있고, 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 동일한 클론으로부터이다. 기타 양태에서, 본 발명의 접합체는 상기한 조절인자 중의 어느 하나와 결합에 대해 경쟁하는 임의의 항체 또는 이의 면역반응성 단편을 포함한다.
따라서, 본 발명의 또 다른 국면은 SC16.3, SC16.4, SC16.5, SC16.7, SC16.8, SC16.10, SC16.11, SC16.13, SC16.15, SC16.18, SC16.19, SC16.20, SC16.21, SC16.22, SC16.23, SC16.25, SC16.26, SC16.29, SC16.30, SC16.31, SC16.34, SC16.35, SC16.36, SC16.38, SC16.41, SC16.42, SC16.45, SC16.47, SC16.49, SC16.50, SC16.52, SC16.55, SC16.56, SC16.57, SC16.58, SC16.61, SC16.62, SC16.63, SC16.65, SC16.67, SC16.68, SC16.72, SC16.73, SC16.78, SC16.79, SC16.80, SC16.81, SC16.84, SC16.88, SC16.101, SC16.103, SC16.104, SC16.105, SC16.106, SC16.107, SC16.108, SC16.109, SC16.110, SC16.111, SC16.113, SC16.114, SC16.115, SC16.116, SC16.117, SC16.118, SC16.120, SC16.121, SC16.122, SC16.123, SC16.124, SC16.125, SC16.126, SC16.129, SC16.130, SC16.131, SC16.132, SC16.133, SC16.134, SC16.135, SC16.136, SC16.137, SC16.138, SC16.139, SC16.140, SC16.141, SC16.142, SC16.143, SC16.144, SC16.147, SC16.148, SC16.149 및 SC16.150으로부터 수득되거나 유도된 ADC 도입 항체; 또는 임의의 상기 동정된 항체, 또는 이의 키메라 또는 인간화 변형체를 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명의 ADC는 임의의 상기 조절인자로부터 하나 이상의 CDR, 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 CDR을 갖는 DLL3 항체를 포함한다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 접합체를 포함하고, 여기서 항-DLL3 항체 또는 이의 면역반응성 단편은 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 21, 서열번호 25, 서열번호 29, 서열번호 33, 서열번호 37, 서열번호 41, 서열번호 45, 서열번호 49, 서열번호 53, 서열번호 57, 서열번호 61, 서열번호 65, 서열번호 69, 서열번호 73, 서열번호 77, 서열번호 81, 서열번호 85, 서열번호 89, 서열번호 93, 서열번호 97, 서열번호 101, 서열번호 105, 서열번호 109, 서열번호 113 , 서열번호 117, 서열번호 121, 서열번호 125, 서열번호 129, 서열번호 133, 서열번호 137, 서열번호 141, 서열번호 145, 서열번호 149, 서열번호 153, 서열번호 157, 서열번호 161, 서열번호 165, 서열번호 169, 서열번호 173, 서열번호 177, 서열번호 181, 서열번호 185, 서열번호 189, 서열번호 193, 서열번호 197, 서열번호 201, 서열번호 205, 서열번호 209, 서열번호 213, 서열번호 217, 서열번호 221, 서열번호 225, 서열번호 229, 서열번호 233, 서열번호 237, 서열번호 241, 서열번호 245, 서열번호 249, 서열번호 253, 서열번호 257, 서열번호 261, 서열번호 265, 서열번호 269, 서열번호 273, 서열번호 277, 서열번호 281, 서열번호 285, 서열번호 289, 서열번호 293, 서열번호 297, 서열번호 301, 서열번호 305, 서열번호 309, 서열번호 313, 서열번호 317, 서열번호 321, 서열번호 325, 서열번호 329, 서열번호 333, 서열번호 337, 서열번호 341, 서열번호 345, 서열번호 349, 서열번호 353, 서열번호 357, 서열번호 361, 서열번호 365, 서열번호 369, 서열번호 373, 서열번호 377, 서열번호 381 및 서열번호 385로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열로부터 유도된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 23, 서열번호 27, 서열번호 31, 서열번호 35, 서열번호 39, 서열번호 43, 서열번호 47, 서열번호 51, 서열번호 55, 서열번호 59, 서열번호 63, 서열번호 67, 서열번호 71, 서열번호 75, 서열번호 79, 서열번호 83, 서열번호 87, 서열번호 91, 서열번호 95, 서열번호 99, 서열번호 103, 서열번호 107, 서열번호 111, 서열번호 115, 서열번호 119, 서열번호 123, 서열번호 127, 서열번호 131, 서열번호 135, 서열번호 139 서열번호 143, 서열번호 147, 서열번호 151, 서열번호 155, 서열번호 159, 서열번호 163, 서열번호 167, 서열번호 171, 서열번호 175, 서열번호 179, 서열번호 183, 서열번호 187, 서열번호 191, 서열번호 195, 서열번호 199, 서열번호 203, 서열번호 207, 서열번호 211, 서열번호 215, 서열번호 219, 서열번호 223, 서열번호 227, 서열번호 231, 서열번호 235, 서열번호 239, 서열번호 243, 서열번호 247, 서열번호 251, 서열번호 255, 서열번호 259, 서열번호 263, 서열번호 267, 서열번호 271, 서열번호 275, 서열번호 279, 서열번호 283, 서열번호 287, 서열번호 291, 서열번호 295, 서열번호 299, 서열번호 303, 서열번호 307 서열번호 311, 서열번호 315, 서열번호 319, 서열번호 323, 서열번호 327, 서열번호 331, 서열번호 335, 서열번호 339, 서열번호 343, 서열번호 347, 서열번호 351, 서열번호 355, 서열번호 359, 서열번호 363, 서열번호 367, 서열번호 371, 서열번호 375, 서열번호 379, 서열번호 383 및 서열번호 387로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열로부터 유도된 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들면, 이러한 항체는 도 3a 및 3b에서 동정된 동일한 클론의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
다른 적합한 양태에서, 본 발명의 항체 약물 접합체는 CDR 절편이식 또는 인간화 DLL3 항체 hSC16.13, hSC16.15, hSC16.25, hSC16.34 및 hSC16.56 중의 하나를 포함한다.
다른 양태는 항체를 포함하는 ADC에 관한 것이고, 상기 항체는
서열번호 408을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열번호 409를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2 및 서열번호 410을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 항체 경쇄; 및
서열번호 411을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열번호 412를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2 및 서열번호 413을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 항체 중쇄를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 항체를 포함하는 ADC에 관한 것이고, 상기 항체는
서열번호 414를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열번호 415를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2 및 서열번호 416을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 항체 경쇄; 및
서열번호 417을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열번호 418을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2 및 서열번호 419를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 항체 중쇄를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 항체를 포함하는 ADC에 관한 것이고, 상기 항체는
서열번호 420을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열번호 421을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2 및 서열번호 422를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 항체 경쇄; 및
서열번호 423을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열번호 424를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2 및 서열번호 425를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 항체 중쇄를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 항체를 포함하는 ADC에 관한 것이고, 상기 항체는
서열번호 426을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열번호 427을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2 및 서열번호 428을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 항체 경쇄; 및
서열번호 429를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열번호 430을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2 및 서열번호 431을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 항체 중쇄를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 항체를 포함하는 ADC에 관한 것이고, 상기 항체는
서열번호 432를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열번호 433을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2 및 서열번호 434를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 항체 경쇄; 및
서열번호 435를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열번호 436을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2 및 서열번호 437을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 항체 중쇄를 포함한다.
특정의 바람직한 양태에서, 상기한 항체 각각은 인간화된 항체를 포함한다. 또한, 본원에 기재된 바와 같이, 이러한 예시적인 인간화 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 첨부된 서열목록에 나타낸다.
또한, 본 발명의 하나의 국면은 DLL3 폴리펩티드와 암 줄기 세포의 치료학적 연관성을 포함할 수 있다. 따라서, 특정의 다른 양태에서, 본 발명은 대상체에게 투여시 종양 개시 세포의 빈도를 감소시키는 ADC 1-5의 DLL3 접합체를 포함한다. 바람직하게는, 빈도의 감소는 시험관내 또는 생체내 제한 희석 분석을 사용하여 측정한다. 특히 바람직한 양태에서, 이러한 분석은 면역약화 마우스에 살아있는 인간 종양 세포의 이식을 포함하는 생체내 제한 희석 분석을 사용하여 수행할 수 있다. 또는, 제한 희석 분석은 시험관내 콜로니 지지 조건으로 살아있는 인간 종양 세포의 제한 희석 퇴적을 포함하는 시험관내 제한 희석 분석을 사용하여 수행할 수 있다. 어느 경우에도, 빈도의 감소의 분석, 계산 또는 정량화는 바람직하게는 정확한 계산을 제공하기 위해 뿌아송(Poisson) 분포 통계학의 사용을 포함한다. 이러한 정량화 방법이 바람직하지만, 다른 덜 노동 집약적인 방법론, 예를 들면, 유동 세포분석법 또는 면역조직화학도 또한 목적하는 값들을 제공하는 데 사용될 수 있으며, 따라서, 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 명백히 생각될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 이러한 경우에, 빈도 감소는 종양 개시 세포에 대하여 풍부한 것으로 알려진 종양 세포 표면 마커의 유동 세포 분석이나 면역조직화학적 검출을 이용하여 측정될 수 있다.
이와 관련하여, 본 발명은 DLL3 면역원이 종양 형성을 포함하는 각종 증식성 장애의 원인론에 연루되어 있는 종양 영속화 세포(즉, 암 줄기 세포)에 치료상 연관되어 있다는 발견에, 적어도 부분적으로 기초한 것임을 이해할 것이다. 더욱 구체적으로, 본 출원은 개시된 DLL3 접합체의 투여가 종양 개시 세포에 의한 종양발생 신호전달을 매개하거나, 감소시키거나, 고갈시키거나, 억제하거나 또는 제거할 수 있다(즉, 종양 개시 세포의 빈도를 감소시킬 수 있다)는 것을 개시한다. 이 감소된 신호전달은, 종양 개시 세포의 고갈, 중화, 감소, 제거, 재프로그래밍 또는 침묵에 의한 것이든 또는 종양 세포 형태(예: 분화 유도, 틈새 파괴)를 변형시킨 것이든 간에, 또한 종양형성, 종양 유지, 확장 및/또는 전이 및 재발을 억제함으로써 DLL3 관련 장애의 더욱 효과적인 치료를 가능하게 한다.
상기한 암 줄기 세포와의 연관성 이외에도, DLL3 이소형은 신경내분비 특성 또는 표현형 결정인자를 포함하거나 나타내는 종양의 성장, 재발 또는 전이 가능성과 관련될 수 있다는 증거가 있다. 본 발명의 목적을 위해, 이러한 종양은 신경내분비 종양 및 의사(pseudo) 신경내분비 종양을 포함할 것이다. 본원에 기재된 새로운 DLL3 접합체를 사용하여 상기 종양형성 세포의 증식에의 개입은 하나 이상의 메커니즘 (예를 들면, 종양 개시 세포 감소 및 종양발생 경로 신호전달의 파괴)에 의해 장애를 개선시키거나 치료하여 부가적이거나 상승적인 효과를 제공할 수 있다. 또 다른 바람직한 양태는 첨부된 항암제를 전달하기 위한 세포 표면 DLL3 단백질의 세포 내재화를 이용할 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명은 (각종 종양형성을 포함하는) DLL3 관련 장애를 치료하기 위해 임의의 특정 작용 메커니즘에 의해 한정되는 것은 아니고 오히려 개시된 조절인자의 광범위한 사용을 포함한다는 것을 이해할 것이다.
또 다른 바람직한 양태에서, 조절인자는 DLL3의 특정 에피토프, 부분, 모티프 또는 도메인에 연관되거나 결합할 것이다. 이하 다소 상세하게 논의되는 바와 같이, DLL3 이소형은 둘 다 적어도 N-말단 도메인, DSL(델타(Delta)/세레이트(Serrate)/lag-2) 도메인 및 여섯 개의 EGF-유사 도메인(즉, EGF1 - EGF6)을 포함하는 동일한 세포외 영역을 도입하고 있다(도 2 참조). 따라서, 특정 양태에서 조절인자는 DLL3의 N-말단 도메인 (즉, 성숙 단백질 중의 아미노산 27-175)과 결합하거나 연관될 것이고, 다른 선택된 양태에서 조절인자는 DSL 도메인 (즉, DLL3의 아미노산 176-215) 또는 그 안의 에피토프와 연관될 것이다. 본 발명의 다른 국면은 DLL3의 특별한 EGF-유사 도메인에 소재한 특정 에피토프에 연관되거나 결합하는 항체를 포함한다. 이와 관련하여, 특별한 조절인자는 EGF1 (아미노산 216-249), EGF2 (아미노산 274-310), EGF3 (아미노산 312-351), EGF4 (아미노산 353-389), EGF5 (아미노산들 391-427) 또는 EGF6 (아미노산 429-465)에 소재한 에피토프에 연관되거나 결합할 수 있다. 물론, 상기한 도메인 각각은 하나 이상의 에피토프 및/또는 하나 이상의 빈(bin)을 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 특히 바람직한 양태에서, 본 발명은 DSL 도메인 또는 그 안의 에피토프와 결합하거나, 반응하거나 연관되는 항체를 포함할 것이다. 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 특정한 EGF-유사 도메인 또는 그 안의 에피토프와 결합하거나, 반응하거나 연관되는 항체를 포함할 것이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 조절인자는 N-말단 도메인 또는 그 안의 에피토프와 결합하거나, 반응하거나 연관될 것이다.
조절인자 또는 항체 "빈(bin)"과 관련하여, DLL3 항원이 그 단백질 상에 또는 단백질에 따라 소재한 특정 빈을 정의하는 당해 분야 인지 기술을 사용하는 경쟁 항체 결합을 통해 분석되거나 맵핑될 수 있음을 이해할 것이다. 본원에 더욱 상세하게 논의되며 이하 실시예에 제시되지만, 두 개의 항체(그 중 하나는 "기준 항체(reference antibody)", "빈 겨냥 항체(bin delineating antibody)" 또는 "겨냥 항체(delineating antibody)"라 지칭될 수 있음)는 표적 항원에 결합하기 위해 서로 경쟁한다면 그것들은 동일한 빈에 속하는 것으로 간주될 수 있다. 그러한 경우에, 두 항체가 항원에의 결합으로부터 입체적으로 또는 정전기적으로 억제되거나 배제되도록 대상체 항체 에피토프는 동일하거나 실질적으로 동일하거나 (그들이 몇 개 아미노산에 의해 구별되는 선형적인 의미 또는 형태적으로) 충분히 밀접할 수 있다. 상기 정의된 빈은 일반적으로 특정의 DLL3 도메인과 연관될 수 있지만 (예를 들면, 기준 항체는 특정 도메인에 함유되어 있는 에피토프와 결합할 것이다), 그 상관관계가 항상 정확한 것은 아니다 (예를 들면, 하나의 도메인에 하나 이상의 빈이 존재할 수 있거나 빈이 형태적으로 정의되어 하나 이상의 도메인을 포함할 수 있다). 당업자는 DLL3 도메인과 경험적으로 결정된 빈 사이의 관계를 용이하게 결정할 수가 있음을 이해할 것이다.
본 발명과 관련하여, 당해 분야 인지 기술을 사용하는 경쟁 결합 분석(예를 들면, ELISA, 표면 플라스몬 공명 또는 바이오-층 간섭분석법)으로 적어도 아홉 개의 별개의 빈을 정의하였고, 이들 각각은 다수의 항체 조절인자를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 본 발명 개시의 목적을 위하여, 아홉 개의 빈은 빈 A부터 빈 I로 명명되었다. 따라서, 선택된 양태에서, 본 발명은 빈 A, 빈 B, 빈 C, 빈 D, 빈 E, 빈 F, 빈 G, 빈 H 및 빈 I으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 빈에 존재하는 ADC 1-5의 항체 약물 접합체를 포함할 것이다.
다른 양태에서, 본 발명의 접합체는 SC16.3, SC16.4, SC16.5, SC16.7, SC16.8, SC16.10, SC16.11, SC16.13, SC16.15, SC16.18, SC16.19, SC16.20, SC16.21, SC16.22, SC16.23, SC16.25, SC16.26, SC16.29, SC16.30, SC16.31, SC16.34, SC16.35, SC16.36, SC16.38, SC16.41, SC16.42, SC16.45, SC16.47, SC16.49, SC16.50, SC16.52, SC16.55, SC16.56, SC16.57, SC16.58, SC16.61, SC16.62, SC16.63, SC16.65, SC16.67, SC16.68, SC16.72, SC16.73, SC16.78, SC16.79, SC16.80, SC16.81, SC16.84, SC16.88, SC16.101, SC16.103, SC16.104, SC16.105, SC16.106, SC16.107, SC16.108, SC16.109, SC16.110, SC16.111, SC16.113, SC16.114, SC16.115, SC16.116, SC16.117, SC16.118, SC16.120, SC16.121, SC16.122, SC16.123, SC16.124, SC16.125, SC16.126, SC16.129, SC16.130, SC16.131, SC16.132, SC16.133, SC16.134, SC16.135, SC16.136, SC16.137, SC16.138, SC16.139, SC16.140, SC16.141, SC16.142, SC16.143, SC16.144, SC16.147, SC16.148, SC16.149 및 SC16.150으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기준 항체로 정의된 빈에 존재하는 항체를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 빈 A로부터의 항체, 빈 B로부터의 항체, 빈 C로부터의 항체, 빈 D로부터의 항체, 빈 E로부터의 항체, 빈 F로부터의 항체, 빈 G로부터의 항체, 빈 H로부터의 항체 또는 빈 I로부터의 항체를 포함할 것이다. 또 다른 바람직한 양태는 기준 항체 조절인자 및 기준 항체와 경쟁하는 임의의 항체를 포함할 것이다.
개시된 조절인자의 맥락에서 사용될 때의 용어 "경쟁하다(compete)" 또는 "경쟁하는 항체(competing antibody)"는 기준 항체 또는 면역학적으로 기능하는 단편이 공통 항원에 대한 시험 항체의 특이적 결합을 (예를 들면, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 초과로) 실질적으로 방지하거나 억제하는 검정에 의해 측정된 항체들 간의 결합 경쟁을 의미한다. 그러한 경쟁을 측정하는 적합한 방법은, 예를 들면, 바이오-층 간섭분석법, 표면 플라스몬 공명, 유동 세포분석법, 경쟁 ELISA 등과 같은 당해 기술 분야 공지된 기술을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 DLL3 접합체를 사용하는 키트 또는 장치 및 연관된 방법, 및 암과 같은 DLL3 연관 장애의 치료에 유용한, 본원에 개시된 바와 같은 DLL3 접합체의 약제학적 조성물을 제공한다. 이를 위해, 본 발명은 바람직하게는 ADC 1-5의 항체 약물 접합체를 함유하는 용기 및 DLL3 연관 장애 또는 이의 진행 또는 재발을 치료하고, 개선시키거나 방지하기 위해 접합체를 사용하기 위한 설명 자료를 포함하는, DLL3 연관 장애 치료용으로 유용한 제품을 제공한다.
상기는 요약이며, 따라서, 부득이, 상세의 단순화, 일반화, 그리고 생략을 함유한다; 따라서, 당업자는 요약이 설명적인 것일 뿐이며 어떤 식으로도 한정적인 것을 의미하는 것이 아님을 이해할 것이다. 본원에 기재된 방법, 조성물 및/또는 장치 및/또는 다른 주제의 다른 국면, 특징 및 이점은 본원에 나타낸 교시에서 명백해질 것이다. 요약은 상세한 설명에서 이하 추가로 기재된 단순화한 형태로 개념의 선택을 소개하기 위해 제공된다. 이러한 요약은 특허청구되는 주제의 핵심 특징 또는 본질적 특징을 확인하는 것을 의도하지도 않고, 특허청구되는 주제의 범위를 결정하는 데 도움되는 자료로 사용되는 것을 의도하는 것도 아니다.
도 1은 DLL3 단백질의 두 개의 이소형의 서열 정렬(서열번호 1 및 2)을 제공한다.
도 2는 다양한 도메인의 위치를 예시하는 DLL3 단백질의 세포외 영역의 개략도를 제공한다.
도 3a 및 3b는 본원의 실시예에 기재된 바와 같이 단리되고, 클로닝되고 조작된 개시된 항체 약물 접합체에 적합한 다수의 뮤린 및 인간화 예시적 DLL3 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 연속 아미노산 서열(서열번호 21-407, 홀수)을 표 형태로 제공한다.
도 4는 본원 실시예에 기재된 바와 같이 단리되고, 클로닝되고 조작된 예시적인 DLL3 조절인자의 도메인 수준 맵핑 분석 결과를 개략적인 형태로 묘사한다.
도 5는 표 형태로 제시된 예시적인 DLL3 조절자의 생화학적 및 면역학적 특성을 기재한다.
도 6은 본 개시에 따라 생성된 예시적인 항체 약물 접합체의 목록을 제공한다.
I. 서론
본 발명은 여러 가지 다른 형태로 구현될 수 있지만, 본 발명의 원리를 예시하는 특정의 예시적 양태가 본원에 개시된다. 본 발명은 예시된 특정 양태에 한정되는 것이 아니라는 것이 강조되어야 한다. 게다가, 본원에 사용된 임의의 항목 제목은 단지 구성상의 목적만을 위한 것이며 기재된 주제를 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 최종적으로, 본 발명 개시의 목적을 위해, 모든 동정 서열 수탁 번호(sequence Accession number)는 달리 언급되지 않는 한 NCBI Reference Sequence (RefSeq) 데이터베이스 및/또는 NCBI GenBank® 기록 서열 데이터베이스에서 찾아 볼 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, DLL3 표현형 결정인자가, 신경내분비 특징을 나타내는 종양형성을 포함하는 각종 증식성 장애와 임상적으로 연관되어 있으며, DLL3 단백질 및 이의 변이체 또는 이소형이 관련 질환의 치료에 이용될 수 있는 유용한 종양 마커를 제공한다는 것이 밝혀졌다. 이와 관련하여, 본 발명은 항-DLL3 항체 표적화 제제 및 PBD 페이로드를 포함하는 상기 ADC 1-5로서 나타낸 다수의 항체 약물 접합체를 제공한다. 이하 보다 상세히 논의되고 첨부된 실시예에 나타낸 바와 같이, 개시된 DLL3 ADC는 종양형성성 세포를 제거하는데 특히 효과적이고, 따라서 특정의 증식성 장애 또는 이의 진행 또는 재발의 치료 및 예방에 유용하다.
게다가, 본 출원에서 나타낸 바와 같이, 세포 표면 DLL3 단백질과 같은 DLL3 마커 또는 결정인자가 암 줄기 세포들 (종양 영속화 세포로 공지되기도 함)에 치료상 연관이 있으며 암 줄기 세포를 제거하거나 침묵시키는 데 효과적으로 이용될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 암 줄기 세포를 본원에 개시된 접합 DLL3 조절인자의 사용을 통해 선택적으로 감소시키거나 제거하는 능력은 그러한 세포가 일반적으로 많은 종래의 치료에 내성이 있는 것으로 공지되어 있다는 점에서 놀라운 것이었다. 즉, 전통적인, 뿐만 아니라 더욱 최근의 표적화 치료 방법의 효과는 이들 다양한 치료 방법에도 불구하고 종양 성장을 영속화할 수 있는 저항성 암 줄기 세포의 존재 및/또는 출현으로 종종 제한된다. 더욱이, 암 줄기 세포와 연관된 결정인자는 낮거나 일관성이 없는 발현, 종양형성 세포와의 연관 상태 유지불능 또는 세포 표면에 존재 불능 때문에 치료 표적을 종종 불량하게 만든다. 종래 기술의 교시와 뚜렷하게 대조적으로, 본 개시된 항체 약물 접합체 및 방법은 이런 고유한 저항성을 효과적으로 극복한 것이며 상기 암 줄기 세포의 분화를 특이적으로 제거하거나, 고갈시키거나, 침묵시키거나 촉진시킴으로써 암 줄기 세포의 근원적인 종양 성장을 유지하거나 재유도할 수 있는 능력을 무효화한다. 게다가, DLL3 단백질의 발현은 주로 골지(Golgi)와 같은 세포내 위치와 연관되어 왔으므로, 이러한 표현형 결정인자는 본원에 교시된 것과 같은 특이적 ADC의 치료 표적으로 성공적으로 이용할 수가 있을지는 불확실하였다.
따라서, 본원에 개시된 것들과 같은 DLL3 접합체가 선택된 증식성(예를 들면, 신생물성) 장애 또는 이의 진행 또는 재발의 치료 및/또는 예방에 유리하게 사용될 수 있다는 것은 특히 주목할만하다. 본 발명의 바람직한 양태가, 특히 특별한 도메인, 영역 또는 에피토프의 측면에서 또는 신경내분비 특징과 개시된 항체 약물 접합체와의 상호작용을 포함하는 암 줄기 세포 또는 종양의 맥락에서, 이하 광범하게 논의될 것이지만, 당업자는 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 양태에 의하여 한정되지 않는다는 것을 이해할 것이다. 오히려, 본 발명과 첨부된 특허청구범위의 가장 광범위한 양태는 폭넓고도 분명하게 개시된 DLL3 접합체 및, 임의의 특별한 작용 메커니즘이나 특이적으로 표적화된 종양, 세포상 또는 분자 성분과 관계없이, 종양 또는 세포 증식성 장애를 포함하는, 다양한 DLL3 연관되거나 매개된 장애의 치료 및/또는 예방에서의 이의 용도에 관한 것이다.
이를 위해, 그리고 본 출원에서 증명된 바와 같이, 개시된 DLL3 접합체가 증식성 또는 종양형성 세포를 표적화하여 제거하거나 달리 무능력하게 만들고, DLL3 연관 장애(예를 들면, 종양형성)를 치료하는 데 효과적으로 사용될 수 있음이 예기치 않게 밝혀졌다. 본원에 사용된 바와 같은 "DLL3 연관 장애(DLL3 associated disorder)"는 질환 또는 장애의 경과 또는 원인 연구 동안에 DLL3 유전자 성분 또는 발현("DLL3 결정인자")의 표현형 이상으로 표시되고, 진단되고, 검출되거나 동정되는 (증식성 장애를 포함하는) 임의의 장애 또는 질환을 의미하는 것으로 간주될 것이다. 이와 관련하여, DLL3 표현형 이상 또는 결정인자는, 예를 들면, DLL3 단백질 발현의 상승 또는 저하 수준, 특정의 정의할 수 있는 세포 집단 상에서의 비정상적인 DLL3 단백질 발현 또는 세포 생명주기의 부적합한 상 또는 단계에서의 비정상적인 DLL3 단백질 발현을 포함할 수 있다. 물론, DLL3의 유전자형 결정인자(예를 들면, mRNA 전사 수준)의 유사한 발현 패턴도 또한 DLL3 장애를 분류하고, 검출시키거나 치료하는데 사용될 수 있다고 이해될 것이다.
개시된 접합체와 관련하여, 본 발명은 PBD 잔기 중의 하나 상의 위치에 결합된 링커를 갖고 링커를 통해 DLL3 항체 조절인자에 접합된 PBD 이량체를 제공한다. 이러한 조심스럽게 조작된 배열을 통해 접합체는 바람직하게는 링커의 임의 부분을 유지하지 않는 활성 PBD 화합물의 방출을 가능하게 한다. 즉, PBD 페이로드의 반응성에 악영향을 미칠 수 있는 스터브 또는 링커 잔기가 존재하지 않는다. 따라서, 개시된 DLL3 접합체는 링커의 절단시에 다음 이량체 PBD 화합물을 방출시킨다.
ADC 1의 접합체는 화합물 PBD 1을 방출시킨다:
Figure pct00011
ADC 2의 접합체는 화합물 PBD 2를 방출시킨다:
Figure pct00012
ADC 3의 접합체는 화합물 PBD 3을 방출시킨다:
Figure pct00013
ADC 4의 접합체는 화합물 PBD 4를 방출시킨다:
Figure pct00014
ADC 5의 접합체는 화합물 PBD 5를 방출시킨다:
Figure pct00015
따라서, PBD 1, PBD 2, PBD 3, PBD 4 또는 PBD 5의 독성 화합물의 전달은 결합 그룹 상, 특히 도입된 발린-알라닌 디펩티드 잔기 상의 카텝신과 같은 효소의 작용을 통해 ADC 1-5에 의해 목적하는 활성화 부위(즉, 종양형성성 세포 내)에서 달성된다. 이하 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 개시된 PBD 세포독소의 국소 전달은 치료 화학치료요법의 비표적화 표준과 연관된 것보다 실질적으로 낮은 독성으로 여러 형태의 종양형성 세포의 효과적인 제거를 제공할 수 있다.
이와 관련하여, 본 발명의 한 국면은 DLL3 접합체를 투여하는 단계를 포함하는, PBD 1, PBD 2, PBD 3, PBD 4 및 PBD 5로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화합물의 전달을 포함한다.
II. DLL3 생리학
시. 엘레간스(C. elegans) 및 드로소필라(Drosophila)에서 처음 동정되어 이후 무척추동물에서부터 척추동물에 이르기까지 진화상 보존되어 있는 것으로 밝혀진 노치 신호전달 경로는 정상 배아 발달, 성인 조직 항상성, 및 줄기 세포 유지를 포함하는 일련의 기본적인 생물학적 과정에 참여하고 있다(참조: D'Souza et al., 2010; Liu et al., 2010). 노치 신호전달은 특수화(specification), 패턴화 및 형태형성 동안 다양한 세포 종류에 중요하다. 종종, 이것은 측면 억제의 메커니즘을 통해 일어나는데, 여기서 노치 리간드(들)를 발현하는 세포는 디폴트 세포 운명(default cell fate)을 취하지만, 노치 신호전달의 자극을 통해 인접한 세포에서는 이 운명을 억압한다(참조: Sternberg, 1988, Cabrera 1990). 노치 신호전달에 의해 매개되는 이러한 이원 세포 운명 선택은 발달 신경계(참조: de la Pompa et al., 1997), 조혈 및 면역계(참조: Bigas and Espinosoa, 2012; Hoyne et al, 2011; Nagase et al., 2011), 소화관(참조: Fre et al., 2005; Fre et al., 2009), 내분비 췌장(참조: Apelqvist et al., 1999; Jensen et al., 2000), 뇌하수체(참조: Raetzman et al., 2004), 및 확산성 신경내분비계(참조: Ito et al., 2000; Schonhoff et al, 2004)를 포함하는 다수의 조직에서 역할을 하는 것이 밝혀졌다. 이러한 이원 스위치를 구현하기 위한 일반적인 메커니즘은 노치가 역할을 하는 발달계의 폭넓은 범위에도 불구하고 보존되는 것으로 나타난다; 예를 들면, 디폴트 세포 운명 선택이 염기성 나선-루프-나선(basic helix-loop-helix, bHLH) 단백질로서 공지된 전사 조절인자에 의해 결정되는 세포에서, 노치 신호전달은 노치 반응성 유전자 부류의 활성화를 유도하는데, 이는 또한 bHLH 단백질의 활성을 억압한다(참조: Ball, 2004). 이러한 이원 결정은 노치 신호전달이 증식을 초래하거나 억제하고, 자기-재생을 일으키거나 억제하도록 하는 발달 및 신호전달 신호의 보다 광범위한 문맥에서 일어난다.
드로소필라에서, 노치 신호전달은 하나의 노치 수용체 유전자와, 세레이트 및 델타로 공지된 두 개의 리간드 유전자에 의해 주로 매개된다(참조: Wharton et al, 1985; Rebay et al., 1991). 인간에서, 네 개의 공지된 노치 수용체와 다섯 개의 DSL(델타-세레이트 LAG2) 리간드- 재기드1(Jagged1) 및 재기드 2(Jagged 2)로 공지된, 세레이트의 두 개의 상동체, 및 델타-유사 리간드 또는 DLL1, DLL3 및 DLL4라 지칭되는, 델타의 세 개의 상동체가 존재한다. 일반적으로, 신호-수용 세포의 표면 상에 있는 노치 수용체는 대립하는 신호-전송 세포의 표면 상에서 발현되는 리간드와의 상호작용(트랜스-상호작용이라고 지칭되는)에 의해 활성화된다. 이들 트랜스-상호작용은 노치 수용체의 프로테아제 매개 절단의 서열을 유도한다. 그 결과로서, 노치 수용체 세포내 도메인은 막에서 핵으로 자유롭게 이동하고, 여기서 전사 인자의 CSL 패밀리(인간에서 RBPJ)와 파트너가 되어 그들을 전사 억압인자로부터 노치 반응성 유전자의 활성인자로 전환시킨다.
인간 노치 리간드 중에서, DLL3은 트랜스-상호작용을 통하여 노치 수용체를 활성화할 능력이 없는 것으로 보인다는 점에서 다르다(참조: Ladi et al., 2005). 노치 리간드는 또한 노치 수용체와 (같은 세포 상의) 시스형으로 상호작용하여 노치 신호의 억제로 유도할 수 있으나, 시스-억제의 정확한 메커니즘은 여전히 불분명하며 리간드에 따라 달라질 수 있다(예를 들면, Klein et al., 1997; Ladi et al., 2005; Glittenberg et al., 2006 참조). 억제의 두 가지 가설 방식은 트랜스-상호작용을 방해함으로써, 또는 내형질 세망 또는 골지에서 수용체의 처리를 교란시킴으로써 또는 수용체의 체류를 물리적으로 야기함으로써 세포 표면 상의 노치 수용체의 양을 감소시킴으로써 세포 표면에서 노치 신호전달을 조절하는 단계를 포함한다(참조: Sakamoto et al., 2002; Dunwoodie, 2009). 그러나, 이웃하는 세포 상의 노치 수용체 및 리간드의 발현의 확률론적인 차이는 전사 및 비-전사 과정 둘 다를 통해 증폭될 수 있으며, 시스- 및 트랜스-상호작용의 미묘한 균형은 이웃하는 조직에서 발산 세포 운명의 노치 매개 윤곽의 미세한 조율을 유도할 수 있다(참조: Sprinzak et al., 2010).
(델타-유사 3 또는 SCDO1로도 공지되어 있는) DLL3은 노치 DSL 리간드의 델타-유사 패밀리의 구성원이다. 대표적인 DLL3 단백질 오솔로그(ortholog)는 인간(수탁 번호 NP_058637 및 NP_982353), 침팬지(수탁 번호 XP_003316395), 마우스(수탁 번호 NP_031892), 및 래트(수탁 번호 NP_446118)를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 인간에서, DLL3 유전자는 염색체 19q13 상에 위치한 9.5 kBp에 걸쳐 있는 8개의 엑손으로 이루어져 있다. 최종 엑손 내의 선택적 스플라이싱은 두 개의 처리 전사물, 2389 염기 중의 하나(수탁 번호 NM_016941) 및 2052 염기 중의 하나(수탁 번호 NM_203486)를 생성시킨다. 전자의 전사물은 618개 아미노산 단백질(수탁 번호 NP_058637; 도 1, 서열번호 1)을 암호화하는 반면, 후자는 587개 아미노산 단백질(수탁 번호 NP_982353; 도 1, 서열번호 2)을 암호화한다. DLL3의 이들 두 가지 단백질 이소형은 그들의 세포외 도메인과 그들의 막관통 도메인을 가로질러 전체적으로 100% 동일성을 공유하며, 더 긴 이소형이 단백질의 카복시 말단에 32개 추가 잔기를 함유하는 확장된 세포질 꼬리를 함유한다는 점에서만 상이하다(도 1). 이소형의 생물학적 관련성은 불확실하나, 두 이소형은 종양 세포에서 검출될 수 있다.
일반적으로, DSL 리간드는 일련의 구조적 도메인으로 구성되어 있다: 독특한 N-말단 도메인, 이어서 보존성 DSL 도메인, 다수의 직렬 상피 성장 인자(EGF)-유사 반복체, 막관통 도메인, 및 독특한 E3 유비퀴틴 리가아제에 의한 유비퀴틴화의 잠재적 부위인 복수의 라이신 잔기를 함유하는 것을 제외한 리간드들 상호간에 고도로 보존되어 있지 않은 세포질 도메인. DSL 도메인은 노치 수용체와의 상호작용에 필요하나 충분한 것은 아닌 축퇴성 EGF-도메인이다(참조: Shimizu et al., 1999). 게다가, 대부분 DSL 리간드의 처음 두 개의 EGF-유사 반복체는 노치 신호전달을 활성화할 때 DSL 도메인과 협동적으로 상호작용하는 DOS 도메인으로 공지된 더 작은 단백질 서열 모티프를 함유한다.
도 2는 여섯 개의 EGF-유사 도메인, 단일 DSL 도메인 및 N-말단 도메인의 일반적인 병치 상태를 예시하는 DLL3 단백질의 세포외 영역의 개략도를 제공한다. 일반적으로, EGF 도메인은 hDLL3(서열번호 1 및 2)의 거의 아미노산 잔기 216 내지 249(도메인 1), 274 내지 310(도메인 2), 312 내지 351(도메인 3), 353 내지 389(도메인 4), 391 내지 427(도메인 5) 및 429 내지 465(도메인 6)에서 발생하는 것으로 인지되고, DSL 도메인은 거의 아미노산 잔기 176 내지 215에서, N-말단 도메인은 거의 아미노산 잔기 27 내지 175에서 발생하는 것으로 인지된다. 본원에서 더욱 상세히 논의되고 아래 실시예에 나타낸 바와 같이, EGF-유사 도메인, DSL 도메인 및 N-말단 도메인 각각은 상이한 아미노산 서열로 정의되는 DLL3 단백질의 부분을 포함한다. 본 발명 개시의 목적을 위하여, 각각의 EGF-유사 도메인은 EGF1 내지 EGF6으로 지칭될 수 있고, EGF1이 단백질의 N-말단 부분에 가장 근접되어 있음을 주목한다. 단백질의 구조적 조성과 관련하여, 본 발명의 한 가지 중요한 국면은 개시된 DLL3 조절인자가 선택된 도메인, 모티프 또는 에피토프와 반응할 수 있도록 생성되거나, 제조되거나, 조작되거나 선택될 수 있다는 것이다. 특정의 경우에, 이러한 부위 특이적 조절인자는 그들의 주요한 작용 방식에 따라 향상된 반응성 및/또는 효능을 제공할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "성숙 단백질(mature protein)" 또는 "성숙 폴리펩티드(mature polypeptide)"는 포유동물 세포에서의 발현에 의해 생성된 단백질 형태(들)를 의미한다는 것을 주목한다. 거친 소포체를 가로지르는 성장하는 단백질 쇄의 유출이 일단 개시되면, 포유동물 세포에 의해 분비된 단백질은 완전한 폴리펩티드로부터 절단되어 단백질의 "성숙" 형태를 생성하는 신호 펩티드(SP) 서열을 갖는다고 일반적으로 가정된다. DLL3의 두 이소형에서 성숙 단백질은 세포 표면 발현 이전에 잘라질 수 있는 26개 아미노산의 신호 펩티드를 포함한다. 따라서, 성숙 단백질에서 N-말단 도메인은 단백질의 27번 위치에서부터 DSL 도메인의 시작까지 확장될 것이다. 물론, 단백질이 이런 방식으로 처리되지 않는다면 N-말단 도메인은 서열번호 1 및 2의 1번 위치까지 확장시키기 위해 유지될 것이다.
다양한 델타-유사 리간드 중에서, DLL3이 패밀리 중 다른 것들로부터 가장 벗어나 있는데, 이는 축퇴성 DSL 도메인을 포함하고, DOS 모티프가 없으며, 리신 잔기가 결여된 세포내 도메인을 함유하고 있기 때문이다. 축퇴성 DSL과 DOS 모티프의 결여는 DLL3이 (세포 간의) 트랜스형으로 노치 신호전달을 일으킬 수 없음과 일치하는데, 이는 DLL3이, DLL1 또는 DLL4와 달리, 노치 신호전달의 억제인자로서만 작용한다는 것을 시사한다(참조: Ladi et al., 2005). 연구는 DLL3이 주로 시스-골지에 상주할 수 있음을 나타내었고(참조: Geffers et al., 2007), 이는 노치 수용체를 세포내에 유지하거나, 또는 노치 수용체의 처리를 방해하여 세포 표면으로의 유출을 막고 대신 이를 리소솜으로 재표적화한다는 가정된 능력과 일치할 수 있다(참조: Chapman et al., 2011). 그러나, 일부 DLL3 단백질은, 단백질이 모델 시스템에서 인공적으로 과발현되면, 세포 표면에 나타날 수 있지만(참조: Ladi et al., 2005), 이것이 정상적인 생물학적 상황에서의 경우인지 아니면 DLL3 mRNA 전사물이 상승되는 종양에서의 경우인지는 분명하지 않다; 다소 놀랍게도, 본원에 개시된 종양 종류에서 검출된 단백질 수준은 유의한 DLL3 단백질이 각종 종양의 세포 표면으로 탈출하고 있음을 나타낸다.
또한, 상기 논의된 바와 같이 노치 신호전달은 신경내분비 세포와 신경내분비 특징을 나타내는 종양을 발생 및 유지시키는데 역할을 한다. 이와 관련하여, 노치 신호전달은 정상 내분비 기관 및 확산성 신경내분비계 중의 광범위한 범위의 세포 운명 결정에 관여한다. 예를 들면, 췌장에서, 노치 신호전달은 bHLH 전사 인자 NGN3에 의해 매개되는 디폴트 내분비 표현형의 발생을 억제하기 위해 요구된다(참조: Habener et al, 2005). 내분비 세포 운명들의 유사한 노치 매개 억제는 장(腸)내분비 세포(참조: Schonhoff et al., 2004), 갑상선 여포 세포(참조: Cook et al., 2010)에서 일어나고, 뇌하수체(참조: Dutta et al., 2011)에서 신경내분비 세포 종류의 상대 비율을 지정할 때 일어나며, 신경내분비 또는 비-신경내분비 표현형을 채택하기 위한 폐 내부의 세포의 결정에 관여한다(참조: Chen et al., 1997; Ito et al., 2000; Sriuranpong et al., 2002). 따라서, 많은 조직에서, 노치 신호전달의 억제는 신경내분비 표현형에 결합된다는 것이 분명하다.
발달 신호전달 경로의 부적절한 재활성화 또는 정상 신호전달 경로의 조절이상은 종양에서 흔히 관찰되며, 노치 신호전달의 경우에는, 다수의 종양 종류와 연관되어 왔다(참조: Koch and Radtke, 2010; Harris et al., 2012). 노치 경로는 림프종, 직장결장, 췌장, 및 몇몇 종류의 비-소세포 폐암의 종양유전자로서 연구되어 왔다(참조: Zarenczan and Chen, 2010 및 그 안의 참고문헌들). 대조적으로, 노치는 신경내분비 특징을 갖는 종양에서 종양 억제인자로서 작용한다고 보고되어 있다(참조: 상기 Zarenczan and Chen, 2010). 신경내분비 특징을 갖는 종양은 가끔 광범위한 범위의 원발성 부위에서 발생하고, 그들의 철저한 분류는 문제로 남아 있지만(참조: Yao et al., 2008; Klimstra et al., 2010; Kloppel, 2011), 그들은 네 개의 주요한 종류로 분류될 수 있다: 저등급 양성 유암종, 악성 거동을 갖는 저등급 고분화 신경내분비 종양, 혼합된 신경내분비 및 상피 특징을 갖는 종양, 및 고등급 저분화 신경내분비 암종. 이러한 분류 중에서, 소세포 폐암(SCLC) 및 비-소세포 폐암(NSCLC)의 부분집합을 포함하는 저분화 신경내분비 암종은 음울한 예후를 갖는 암 종류이다. SCLC는 기원이 기관지이며 부분적으로 폐 신경내분비 세포로부터 발생한다고 가정되어 왔다(참조: Galluzzo and Bocchetta, 2011). 신경내분비 표현형을 포함하는 이들 종양 각각의 기원의 구체적인 세포 공급원이 무엇이든 간에, 노치 경로 유전자 자체에서의 직접적인 병변에 의한, 또는 노치 신호전달을 억제하는 다른 유전자의 활성화에 의한 노치 신호전달의 억제가 이러한 종양의 내분비 표현형의 획득을 유도할 수 있다는 것이 예상될 수 있다. 확장하여, 노치 경로의 교란을 유도하는 유전자는 신경내분비 표현형을 갖는 종양 치료를 위한, 특히 현재 임상 결과가 좋지 않은 징후를 위한 치료 표적을 제공할 수 있다.
ASCL1은 DLL3을 통해 노치 신호전달 경로와 상호작용하는 것으로 보이는 그런 유전자 중 하나이다. 많은 신경내분비 종양은 저분화(즉, 부분적으로 완전한) 내분비 표현; 예를 들면, 각종 내분비 단백질 및 폴리펩티드(예를 들면, 크로모그라닌 A, CHGA; 칼시토닌, CALCA; 프로피오멜라노코린, POMC; 소마토스타틴, SST), 분비성 소포와 연관된 단백질(예를 들면, 시냅토피신, SYP), 및 생리활성 아민의 합성의 원인이 되는 생화학적 경로에 관여하는 유전자(예를 들면, 도파 데카복실라제, DDC)의 뚜렷한 상승 또는 발현을 나타낸다는 것이 명백하다. 아마도 놀랍지는 않지만, 이들 종양은 신경 및 신경내분비 표현형을 유도하는 유전자 캐스케이드를 조직하는 데 역할을 하는 것으로 공지된 전사 인자인 ASCL1(또한, 마우스에서 mASH1, 또는 인간에서 hASH1로서 공지됨)을 종종 과발현시킨다. 상기 캐스케이드의 특정 분자의 상세한 내용은 여전히 불명확하지만, 특정 세포 종류의 경우, 특히 갑상선 여포 세포(참조: Kameda et al., 2007), 부신 수질의 크로마핀 세포(참조: Huber et al., 2002) 및 폐의 확산성 신경내분비계에서 발견된 세포(참조: Chen et al., 1997; Ito et al., 2000; Sriuranpong et al., 2002)의 경우, ASCL1은 세포 운명 선택이 ASCL1-매개 및 노치-매개 유전자 발현 캐스케이드의 균형에 의해 매개되는 미세하게 조율되는 발달 조절 루프의 일부이다는 것이 점점 분명하다. 예를 들면, ASCL1은 정상 마우스 폐 신경내분비 세포에서 발현되는 것으로 밝혀졌지만, 노치 신호전달 효과기 HES1은, 폐의 비-신경내분비 세포에서 발현되었다(참조: Ito et al., 2000). 이들 두 캐스케이드가 잠재적으로 교차-조절과의 미묘한 균형에 있다는 것이 점점 이해되고 있다. 노치 효과기 HES1은 ASCL1 발현을 하향조절하는 것으로 나타났다(참조: Chen et al., 1997; Sriuranpong et al., 2002). 이러한 결과는 노치 신호전달이 신경내분비 분화를 억제할 수 있다는 것을 명백하게 입증한다. 그러나, DLL3 프로모터에 대한 ASCL1 결합이 DLL3 발현을 활성화시킨다는 증명(참조: Henke et al., 2009)과 DLL3이 노치 신호전달을 약화시킨다는 관찰(참조: Ladi et al., 2005)은 신경내분비 및 비-신경내분비 표현형 간의 세포 운명 선택을 위한 유전자 회로를 폐쇄시킨다.
노치 신호전달은 발산 분화 경로(예를 들면, 상기한 바와 같은 "측면 억제")를 갖는 뚜렷하게 경계를 접하고 있는 조직 도메인이 허용하는 이웃하는 세포들 간의 미묘한 차이를 증폭시키기 위해 진화한 것으로 나타나는 점을 고려하면, 이들 데이터는 종합해 볼 때 미세하게 조율되는 발달 조절 루프가 재활성화되고 신경내분비 표현형을 갖는 암에서 조절이상으로 되었다는 것을 시사한다. DLL3이 세포의 내부 막 구획 내부에 이의 정상 체류 및 내부의 노치와 이의 가상 상호작용을 제공하는 항체 치료제를 개발하기 위한 적합한 세포 표면 표적을 제공할 것임(참조: Geffers et al., 2007)이 명백하지 않지만, 신경내분비 종양에서 생성되는 DLL3 발현의 상승이 신경내분비 표현형을 갖는 종양(예를 들면, NET 및 pNET)을 위한 독특한 치료 표적을 제공할 수 있다는 것은 가능하다. 실험실 시스템에서 단백질의 광대한 과발현은 세포 내의 과발현된 단백질의 비정상적 위치(mislocalization)를 야기할 수 있다는 것이 일반적으로 관찰된다. 따라서, 종양에서 DLL3의 과발현은 단백질의 일부 세포 표면 발현을 유도할 수 있고, 그 때문에 본 발명의 개시된 ADC를 위한 표적을 제공할 수 있다는 것은 합리적인 가설이나, 실험적 입증 없이는 명백하지 않다.
III. 암 줄기 세포
상기 언급한 바와 같이, 놀랍게도 비정상적인 DLL3 발현(유전자형 및/또는 표현형)은 다양한 종양형성 세포 아집단과 연관된다는 것이 밝혀졌다. 이 점에서, 본 발명은 그런 세포(예: 암 줄기 세포)를 표적화함으로써, 종양 장애의 치료, 관리 또는 예방을 용이하게 하기에 특히 유용할 수 있는 DLL3 항체 약물 접합체를 제공한다. 따라서, 바람직한 양태에서 개시된 DLL3 ADC는 본 발명의 교시에 따라 종양 개시 세포 빈도를 감소시킴으로써 증식성 장애의 치료 또는 관리를 용이하게 하는 데에 유리하게 사용될 수 있다.
본 출원의 목적을 위하여, 용어 "종양 개시 세포(tumor initiating cell)"(TIC)는 "종양 영속화 세포(tumor perpetuating cell)"(TPC; 즉, 암 줄기 세포 또는 CSC)와 매우 증식성 "종양 전구 세포(tumor progenitor cell)"(TProg라 지칭됨)들 둘 다를 포함하고, 이는 함께 일반적으로 벌크 종양 또는 덩어리의 독특한 아집단(즉, 0.1-40%)을 포함한다. 본 발명 개시의 목적을 위하여, 용어 "종양 영속화 세포"와 "암 줄기 세포" 또는 "신생물성 줄기 세포(neoplastic stem cell)"는 등가이며, 본원에서 상호교환적으로 사용할 수 있다. TPC는 TPC가 종양 내부에 존재하는 종양 세포의 조성을 완전히 재현할 수 있고, 적은 수의 단리된 세포의 연속 이식(마우스를 통한 두 개 이상의 통로)에 의해 증명되는 바와 같이 무제한의 자기-재생 능력을 가질 수 있는 반면, TProg는 무제한의 자기-재생 능력을 나타내지 않는다는 점에서 TProg와 다르다.
당업자는 적합한 세포 표면 마커를 사용하는 형광-활성화 세포 분류(FACS)가, 적어도 부분적으로 단일 세포와 세포의 덩어리(즉, 더블릿 등)를 구별할 수 있는 능력 때문에 고도의 농축된 암 줄기 세포 아집단(예를 들면, > 99.5% 순도)을 분리하기 위한 신뢰할 수 있는 방법이다는 것을 이해할 것이다. 이러한 기술을 사용하면 적은 세포 수의 매우 정제된 TProg 세포가 면역약화 마우스로 이식될 때 그들은 1차 이식에서 종양 성장을 촉진시킬 수 있음을 나타냈다. 그러나, 정제된 TPC 아집단과 달리, TProg 생성된 종양은 표현형 세포 이질성에서 모체 종양을 완전히 반영하지 못하고, 후속 이식에서 연속 종양형성을 재개하기에는 명백히 비효과적이다. 대조적으로, 암 줄기 세포 아집단은 모체 종양의 세포상 이질성을 완전히 재구성하며, 연속적으로 단리되고 이식될 때 종양을 효과적으로 개시할 수 있다. 따라서, 당업자는 TPC와 TProg 사이의 결정적인 차이는, 비록 둘 다가 1차 이식에서 종양을 생성시킬 수 있지만, 적은 세포로 연속 이식시 이질성 종양 성장을 영속적으로 촉진시키는 TPC의 독특한 능력임을 인식할 것이다. TPC를 특성확인하기 위한 다른 일반적인 접근법은 세포 표면 마커의 형태학 및 시험, 전사 프로파일, 및 약물 반응을 포함하지만, 마커 발현은 배양 조건에 따라 그리고 시험관내 세포주 통로에 따라 변할 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적을 위하여 종양 영속화 세포는, 정상 조직에서 세포상 계층 구조를 지지하는 정상 줄기 세포와 마찬가지로, 바람직하게는 다계통 분화능을 유지하면서도 무한히 자기-재생하는 이들의 능력으로 정의된다. 종양 영속화 세포는 따라서 종양형성 자손(즉, 종양 개시 세포: TPC 및 TProg)과 비-종양형성(NTG) 자손 둘 다를 생성할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이 "비-종양형성 세포(non-tumorigenic cell)"(NTG)는 종양 개시 세포로부터 발생하나, 자체는 자기-재생하거나 종양을 포함하는 종양 세포의 이질 계통을 생성하는 능력을 갖지 않는 종양 세포를 의미한다. 실험적으로, NTG 세포는 과량의 세포 수로 이식하였을 때조차도, 마우스에서 재현가능하게 종양을 형성할 수 없다.
나타낸 바와 같이, TProg는 마우스에서 종양을 생성시키는 이들의 한정된 능력 때문에 종양 개시 세포(또는 TIC)로 분류되기도 한다. TProg는 TPC의 자손이며 전형적으로 유한한 수의 비-자기-재생 세포 분열을 할 수 있다. 게다가, TProg 세포는 추가로 초기 종양 전구 세포(ETP)와 후기 종양 전구 세포(LTP)로 나누어질 수 있는데, 이들 각각은 표현형 (예를 들면, 세포 표면 마커들)과 종양 세포 구조를 재현하는 상이한 능력으로 구별될 수 있다. 그러한 기술적 차이에도 불구하고, ETP와 LTP 둘 다는 그들이 적은 세포 개수로 이식되었을 때 종양을 연속적으로 재구성할 능력이 일반적으로 떨어지며 전형적으로는 모체 종양의 이질성을 반영하지 못하는 점에서 TPC와 기능적으로 다르다. 상기의 차이점에도 불구하고, 각종 TProg 집단은, 드물게, 정상적으로 줄기 세포에 속하는 자기-재생 능력을 획득하여 그들 자신이 TPC (또는 CSC)가 될 수 있다는 것도 또한 나타냈다. 아무튼 종양-개시 세포의 종류 둘 다는 단일 환자의 전형적인 종양 덩어리에 나타날 가능성이 있고, 본원에 개시된 조절인자를 이용하는 치료 대상체이다. 즉, 개시된 조성물은 종양에 나타난 특별한 양태나 혼합물에 관계없이 상기 DLL3 양성 종양 개시 세포의 빈도를 감소시키거나 화학감도를 변화시키는 데 일반적으로 효과적이다.
본 발명의 맥락에서, TPC는 종양의 대부분을 포함하는 TProg (ETP와 LTP 둘 다), NTG 세포 및 종양-침윤성 비-TPC 유래 세포(예: 섬유아세포/스트로마, 내피 & 조혈 세포)보다 더욱 종양유발적이고, 비교적 더 침묵적이며 종종 더욱 화학치료요법 저항적이다. 종래의 치료요법 및 섭생이, 대부분, 종양의 크기를 축소시킬 뿐만 아니라 빠르게 증식하는 세포를 공격하도록 설계되었음을 고려하면, TPC는 더 빠르게 증식하는 TProg 및 다른 벌크 종양 세포 집단보다 종래 치료요법 및 섭생에 더욱 저항적일 가능성이 있다. 더욱이, TPC는 자신들을 종래 치료요법에 비교적 화학치료요법 저항적이도록 만들어 주는 다른 특성, 예를 들면, 다중-약제 내성 수송체의 발현 증가, 강화된 DNA 회복 메커니즘 및 항-아폽토시스 단백질을 종종 발현시킨다. 각각이 TPC의 약물 내성에 기여하는 이러한 성질은 진행된 단계 종양을 갖는 대부분 환자에게 장기에 걸친 혜택을 보장하는 표준 종양학 치료 섭생의 실패의 중요한 이유이기도 하다; 즉, 계속되는 종양 성장과 재발을 촉진하는 세포들(즉, TPC 또는 CSC)을 적절히 표적화하고 근절하지 못하는 중요한 이유다.
많은 종래 기술의 치료와 달리, 본 발명의 새로운 항체 약물 접합체는 ADC의 대상체에게 투여시 바람직하게는 종양 개시 세포의 빈도를 감소시킨다. 상기 언급한 바와 같이, 종양 개시 세포 빈도의 감소는 a) 종양 개시 세포의 제거, 고갈, 감작, 침묵화 또는 억제; b) 종양 개시 세포의 성장, 확장 또는 재발을 조절함; c) 종양 개시 세포의 개시, 전파, 유지, 또는 증식을 차단함; 또는 d) 다르게는 종양 형성성 세포의 생존, 재생 및/또는 전이를 방해한 결과로서 일어날 수 있다. 일부 양태에서, 종양 개시 세포의 빈도의 감소는 하나 이상의 생리학적 경로에서의 변화의 결과로 일어난다. 경로상의 변화는, 종양 개시 세포의 축소 또는 제거에 의한 것이거나 또는 종양 환경 또는 다른 세포에 영향을 미칠 수 있는 그들의 잠재력(예를 들면, 분화의 유도, 틈새 파괴)을 변형시키거나 또는 다르게는 그들의 능력을 간섭함에 의한 것이든 간에, 차례로 종양형성, 종양 유지 및/또는 전이 및 재발을 억제함으로써 DLL3 연관 장애의 보다 효과적인 치료를 가능하게 한다.
종양 개시 세포의 그러한 빈도 감소를 평가하는 데 사용될 수 있는 당해 기술 분야 인지 방법 중에는 시험관내 또는 생체내 제한 희석 분석이 있는데, 이는 바람직하게는 뿌아송 분포 통계학을 사용하거나 또는 생체내에서든 아니든 종양을 생성시키는 능력과 같은 소정의 명확한 이벤트의 빈도를 평가하는 계산을 수반한다. 그러한 제한 희석 분석은 종양 개시 세포 빈도 감소를 계산하는 바람직한 방법을 포함하지만 다른, 덜 힘든 방법도, 비록 약간 덜 정확하지만, 목적하는 값을 효과적으로 측정하는 데 사용될 수 있으며 본원의 교시에 완전히 적합한 것이다. 따라서, 당압자에 의해 이해되는 바와 같이, 익히 공지된 유동 세포분석 또는 면역조직화학적 수단을 통해 빈도 값의 감소를 측정하는 것도 또한 가능하다. 앞에 언급한 방법 모두에 대하여는, 예를 들면, 문헌(참조: Dylla et al. 2008, PMID: 18560594 & Hoey et al. 2009, PMID: 19664991)을 참조하고; 그 각각은 그 전문이, 특히 개시된 방법들에 대해 참조로 본원에 인용된다.
제한 희석 분석과 관련하여, 종양 개시 세포 빈도의 시험관내 계산은 분획화된 또는 분획화되지 않은 인간 종양 세포(예를 들면, 각각 치료된 및 미치료된 종양으로부터)를 콜로니 형성을 촉진하는 시험관내 성장 조건에 부착시킴으로써 달성될 수 있다. 이러한 방식으로, 콜로니 형성 세포는 콜로니의 단순 계수 및 특성확인에 의해, 또는, 예를 들면, 인간 종양 세포를 연속 희석물로 플레이트에 부착시키고, 도포 후 적어도 10일 동안 콜로니 형성에 대해 각각의 웰을 양성 또는 음성으로 득점화하는 단계로 이루어진 분석으로 계산할 수 있을 것이다. 종양 개시 세포 빈도를 측정하는 이들의 능력면에서 일반적으로 보다 정확한 생체내 제한 희석 실험 또는 분석은 미치료된 대조군 또는 치료된 집단으로부터 인간 종양 세포의, 예를 들면, 연속 희석물로 면역약화 마우스에의 이식 및 후속적으로 이식 후 적어도 60일의 종양 형성에 대해 각각의 마우스를 양성 또는 음성으로서 득점화하는 단계를 포함한다. 시험관내 또는 생체내 제한 희석 분석에 의한 세포 빈도 값의 도출은 바람직하게는 뿌아송 분포 통계학을 양성 및 음성 이벤트의 공지된 빈도에 적용하고, 그것에 의해 양성 이벤트의 정의를 충족시키는 이벤트, 이 경우에는, 각각 콜로니 또는 종양 형성에 대한 빈도를 제공함으로써 수행된다.
종양 개시 세포 빈도를 계산하는 데에 사용될 수 있는 본 발명에 적합한 다른 방법에 대하여, 가장 일반적인 것은 정량화할 수 있는 유동 세포분석 기술 및 면역조직화학적 염색 절차를 포함한다. 비록 바로 위에 기술된 제한 희석 분석 기술만큼 정확하지 않다 하더라도, 이들 절차는 훨씬 덜 노동 집약적이며 비교적 짧은 기간에 합리적인 값을 제공한다. 따라서, 당업자는 종양 개시 세포에 대하여 풍부한 것으로 공지된 당해 분야-인지된 세포 표면 단백질(예를 들면, 그 전문이 본원에 인용되어 있는 PCT 출원 제2012/031280호에 제시된 바와 같은 잠재적으로 적합한 마커)을 결합시켜 각종 샘플로부터 TIC 수준을 측정하는 하나 이상의 항체 또는 시약을 사용하는 유동 세포분석 세포 표면 마커 프로파일 측정을 이용할 수 있음을 이해할 것이다. 또 다른 적합한 방법에서 당업자는 상기 세포를 구별해 주는 것으로 생각되는 세포 표면 단백질을 결합할 수 있는 하나 이상의 항체 또는 시약을 사용하는 면역조직화학에 의해서 동일반응계(즉, 조직 단편에서) TIC 빈도를 계산할 수 있을 것이다.
다수의 마커 (또는 그들의 부재)는 암 줄기 세포의 다양한 집단과 연관되어 있으며 종양 세포 아집단을 단리시키거나 특성확인하는데 사용되어 왔음을 인식할 것이다. 이 점에서, 예시적인 암 줄기 세포 마커는 OCT4, 나노그(Nanog), STAT3, EPCAM, CD24, CD34, NB84, TrkA, GD2, CD133, CD20, CD56, CD29, B7H3, CD46, 트랜스페린 수용체, JAM3, 카복시펩티다제 M, ADAM9, 옹코스타틴(oncostatin) M, Lgr5, Lgr6, CD324, CD325, 네스틴(nestin), Sox1, Bmi-1, eed, easyh1, easyh2, mf2, yy1, smarcA3, smarckA5, smarcD3, smarcE1, mllt3, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, WNT2, WNT2B, WNT3, WNT5A, WNT10B, WNT16, AXIN1, BCL9, MYC, (TCF4) SLC7A8, IL1RAP, TEM8, TMPRSS4, MUC16, GPRC5B, SLC6A14, SLC4A11, PPAP2C, CAV1, CAV2, PTPN3, EPHA1, EPHA2, SLC1A1, CX3CL1, ADORA2A, MPZL1, FLJ10052, C4.4A, EDG3, RARRES1, TMEPAI, PTS, CEACAM6, NID2, STEAP, ABCA3, CRIM1, IL1R1, OPN3, DAF, MUC1, MCP, CPD, NMA, ADAM9, GJA1, SLC19A2, ABCA1, PCDH7, ADCY9, SLC39A1, NPC1, ENPP1, N33, GPNMB, LY6E, CELSR1, LRP3, C20orf52, TMEPAI, FLVCR, PCDHA10, GPR54, TGFBR3, SEMA4B, PCDHB2, ABCG2, CD166, AFP, BMP-4, β-카테닌, CD2, CD3, CD9, CD14, CD31, CD38, CD44, CD45, CD74, CD90, CXCR4, 데코린(decorin), EGFR, CD105, CD64, CD16, CD16a, CD16b, GLI1, GLI2, CD49b, 및 CD49f를 포함한다. 예를 들면, 그 각각이 참조로 본원에 포함된 문헌(참조: Schulenburg et al., 2010, PMID: 20185329, U.S.P.N. 7,632,678 및 U.S.P.Ns. 2007/0292414, 2008/0175870, 2010/0275280, 2010/0162416 및 2011/0020221)을 참조한다. 상기 마커 각각이 본 발명의 이중특이적 또는 다중특이적 항체의 맥락에서 이차 표적 항원으로 사용될 수도 있다는 것이 추가로 이해될 것이다.
유사하게, 특정의 종양 종류의 암 줄기 세포와 연관된 세포 표면 표현형의 비제한적인 예에는 당해 기술 분야에 공지되어 있는 다른 암 줄기 세포 표면 표현형 뿐만 아니라 CD44hiCD24low, ALDH+, CD133+, CD123+, CD34+CD38-, CD44+CD24-, CD46hiCD324+CD66c-, CD133+CD34+CD10-CD19-, CD138-CD34-CD19+, CD133+RC2+, CD44+α2 β1 hiCD133+, CD44+CD24+ESA+, CD271+, ABCB5+가 포함된다. 예를 들면, 각각 전문이 본원에 참조로 인용된 문헌(참조: Schulenburg et al., 2010, 상기, Visvader et al., 2008, PMID: 18784658 및 U.S.P.N. 2008/0138313)을 참조한다. 당업자는 바로 위에 예시된 것들과 같은 마커 표현형을 표준 유동 세포 분석 및 세포 분류 기술과 함께 사용하여 추가의 분석을 위한 TIC 및/또는 TPC 세포 또는 세포 집단을 특성확인하거나, 단리시키거나, 정제하거나 또는 농축시킬 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명에 관련하여 흥미로운 것으로 CD46, CD324 및, 임의로, CD66c는, 분석되는 종양 시험편이 1차 환자 종양 시험편인지 또는 환자-유래의 비-전통적인 이종이식편(NTX) 종양인지와 관계없이, 많은 인간 직장결장("CR"), 유방("BR"), 비-소세포 폐(NSCLC), 소세포 폐(SCLC), 췌장("PA"), 흑색종("Mel"), 난소("OV"), 및 두경부암("HN") 종양 세포의 표면 상에서 고도로 또는 이질적으로 발현되고 있다.
당해 기술 분야에 공지된 상기 언급한 방법 및 선택된 마커 중의 어느 것을 사용하면 본원의 교시에 따라 (세포독성제에 접합된 것들을 포함하는) 개시된 DLL3 조절인자에 의해서 제공되는 TIC (또는 그 속의 TPC)의 빈도 감소를 정량화하는 것이 가능하다. 일부 경우에, 본 발명의 화합물은 (제거, 분화의 유도, 틈새 파괴, 침묵화 등을 포함하는 상기 언급한 다양한 메커니즘에 의해) TIC 또는 TPC의 빈도를 10%, 15%, 20%, 25%, 30% 또는 심지어 35%까지도 감소시킬 수 있다. 다른 양태에서, TIC 또는 TPC의 빈도 감소는 40%, 45%, 50%, 55%, 60% 또는 65% 정도일 수 있다. 특정의 양태에서, 개시된 화합물은 TIC 또는 TPC의 빈도를 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 심지어 95%까지도 감소시킬 수 있다. 물론, TIC 또는 TPC의 빈도의 임의의 감소는 아마 종양의 종양형성, 지속, 재발 및 공격성의 상응하는 감소를 유도한다는 것이 이해될 것이다.
IV. 세포 결합제
1. 항체 구조
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 특히 바람직한 양태는 우선적으로 DLL3 단백질의 이소형의 1개 이상의 도메인 및, 임의로, 다른 DLL 패밀리 구성원과 연관되는 항체 또는 이의 면역반응성 단편의 형태로 세포 결합제와의 개시된 DLL3 접합체를 포함한다. 이와 관련하여, 허용된 명명법 및 넘버링 시스템을 포함하여 항체 및 이의 변이체 및 유도체는, 예를 들면, 문헌(참조: Abbas et al. (2010), Cellular and Molecular Immunology (6th Ed.), W.B. Saunders Company; 또는 Murphey et al. (2011), Janeway's Immunobiology (8th Ed.), Garland Science)에 광범위하게 기재된다.
"항체" 또는 "온전한 항체"는 전형적으로 공유 디설파이드 결합 및 비공유 상호작용에 의해 함께 유지된 두 개의 중(H) 및 두 개의 경(L) 폴리펩티드 쇄를 포함하는 Y-형 사량체 단백질을 의미한다. 인간 경쇄는 가변 도메인(VL) 및 불변 도메인(CL)을 포함하고, 여기서 불변 도메인은 아미노산 서열 및 유전자 좌에 기초하에 카파 또는 람다로서 용이하게 분류될 수 있다. 각각의 중쇄는 하나의 가변 도메인(VH) 및 하나의 불변 영역을 포함하고, 이는 IgG, IgA 및 IgD의 경우에, CH1, CH2 및 CH3이라 지칭되는 3개의 도메인을 포함한다(IgM 및 IgE는 제4의 도메인, CH4를 갖는다). IgG, IgA 및 IgD 부류에서, CH1 및 CH2 도메인은 (일반적으로 IgG 중 약 10 내지 약 60개의 아미노산의) 가변 길이의 프롤린 및 시스테인 풍부 절편인 유연한 힌지 영역에 의해 분리된다. 경쇄 및 중쇄 둘 다에서 가변 도메인은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 불변 도메인에 결합되고, 중쇄는 또한 약 10개의 추가 아미노산의 "D" 영역을 갖는다. 각 부류의 항체는 추가로 쇄간 및 대응 시스테인 잔기에 의해 형성된 쇄간 디설파이드 결합을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 광범위하게 해석될 수 있고, 폴리클로날 항체, 다중클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 및 영장류화 항체, CDR 절편이식된 항체, 인간 항체, 재조합 생성된 항체, 세포내 항체(intrabody), 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 1가 항체, 다가 항체, 항-유전자형 항체, 뮤테인 및 이의 변이체를 포함하는 합성 합체, 면역 특이적 항체 단편, 예를 들면, Fd, Fab, F(ab')2, F(ab') 단편, 단일-쇄 단편(예: ScFv 및 ScFvFc); 및 Fc 융합 및 다른 변형을 포함하는 이의 유도체, 및 DLL3 결정인자와 우선적인 연관 또는 결합을 나타내는 한 임의의 다른 면역반응성 분자를 포함한다. 또한, 문맥상의 제약에 의해 다른 방법으로 지시되지 않는 한, 상기 용어는 추가로 모든 부류의 항체(즉, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM) 및 모든 아이소타입(즉, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)을 포함한다. 상이한 부류의 항체에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 전형적으로 각각 상응하는 소문자 그리스 문자 α, δ, ε, γ 및 μ로 나타낸다. 임의의 척추동물 종으로부터의 항체의 경쇄는 이들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 카파(κ) 및 람다(λ)로 칭명되는 두 개의 명확하게 구별된 형태 중의 하나로 할당될 수 있다.
선택된 양태에서 그리고 첨부된 실시예에 나타낸 바와 같이, CL 도메인은 카파 CL 도메인을 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 공급원 항체는 람다 CL 도메인을 포함할 수 있다. 모든 인간 IgG CL 도메인의 서열이 충분히 공지되어 있기 때문에, 숙련가는 본 개시에 따라서 람다 및 카파 서열 둘 다를 용이하게 분석할 수 있고, 적합한 항체 작제물을 제공하기 위해 이들을 사용할 수 있다. 유사하게, 설명 및 증명의 목적을 위해, 하기 논의 및 첨부된 실시예는 주로 IgG1 (뮤린 또는 인간) 형태 항체를 특징으로 한다. 경쇄 불변 영역의 경우와 같이, 상이한 아이소타입(IgM, IgD, IgE, IgA) 및 아부류(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2)로부터의 중쇄 불변 도메인은 익히 공지되어 특성확인되어 있다. 따라서, 숙련가는 본 발명의 항체 약물 접합체를 제공하기 위해 본원에 교시된 바와 같이 개시된 PBD와 함께 각각 임의의 아이소타입 또는 아부류 및 접합체를 포함하는 항-DLL3 항체를 용이하게 이용할 수 있다.
항체의 가변 도메인은 하나의 항체로부터 또 다른 것으로 아미노산 조성의 상당한 변동을 나타내고, 항원 인식 및 결합에 주로 관여하고 있다. 각각의 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 온전한 IgG 항체가 두 개의 결합 부위를 갖도록(즉, 이는 2가이다) 항체 결합 부위를 형성한다. VH 및 VL 도메인은 프레임워크 영역(FR)으로서 공지된 4개의 더 적은 가변 영역에 의해 프레임화되고 분리되는 초가변 영역이라 지칭되는 극도의 가변성을 갖는 3개 영역, 또는 보다 일반적으로 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. VH 및 VL 영역 사이의 비공유 연관은 항체의 두 개의 항원 결합 부위 중의 하나를 함유하는 Fv 단편("단편 변수"의 경우)을 형성한다. 유전자 조작으로 수득될 수 있는 ScFv 단편(단일 쇄 단편 변수의 경우)은 단일 폴리펩티드 쇄 중에서 펩티드 링커에 의해 분리된 항체의 VH 및 VL 영역을 연관시킨다.
본원에 사용된 바와 같이, 각 도메인, 프레임워크 영역 및 CDR에의 아미노산의 할당은 다르게 언급되지 않는 한 문헌(참조: Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th　Ed.), US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242; Chothia et al., 1987, PMID: 3681981; Chothia et al., 1989, PMID: 2687698; MacCallum et al.,1996, PMID: 8876650; 또는 Dubel, Ed. (2007) Handbook of Therapeutic Antibodies, 3rd Ed.,　Wily-VCH Verlag GmbH and Co.)에 의해 제공된 넘버링 방식 중의 하나에 따를 수 있다. Abysis 웹사이트 데이터베이스(하기)로부터 수득된 카바트(Kabat), 초티아(Chothia) 및 맥칼룸(MacCallum)에 의해 정의된 CDR을 포함하는 아미노산 잔기는 이하 기재되어 있다.
Figure pct00016
항체 서열 중의 가변 영역 및 CDR은 당해 기술 분야에서 개발되고 있는 일반적인 규칙에 따라서 또는 공지된 가변 영역의 데이터베이스에 대해 서열을 정렬시킴으로써 동정될 수 있다. 이러한 영역을 동정하는 방법은 문헌(참조: Kontermann and Dubel, eds., Antibody Engineering, Springer, New York, NY, 2001 and Dinarello et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons Inc., Hoboken, NJ, 2000)에 기재되어 있다. 항체 서열의 예시적 데이터베이스는 문헌(참조: Retter et al., Nucl. Acids Res., 33 (Database issue): D671-D674 (2005)에 기재된 바와 같이, www.bioinf.org.uk/abs의 "Abysis" 웹사이트(영국 런던의 런던 대학의 학과 생화학 & 분자생물학부의 에이.씨. 마틴(A.C. Martin)에 의해 유지됨) 및 www.vbase2.org의 VBASE2 웹사이트에 기재되어 있고 이를 통해 평가될 수 있다. 바람직하게는, 서열은 카바트, IMGT 및 단백질 데이터 은행(PDB)으로부터의서열 데이터를 PDB로부터의 구조 데이터와 통합하는 Abysis 데이터베이스를 사용하여 분석한다. 문헌(참조: See Dr. Andrew C. R. Martin's book chapter　Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In:　Antibody Engineering Lab Manual 　(Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg, ISBN-13: 978-3540413547, 또한 웹사이트 bioinforg.uk/abs 상에서 이용가능함)을 참조한다. Abysis 데이터베이스 웹사이트는 추가로 본원의 교시에 따라 사용될 수 있는 CDR을 동정하기 위해 개발되고 있는 일반적 규칙을 포함한다. 다르게 지시되지 않는 한, 본원에 기재된 모든 CDR은 카바트에 따라 Abysis 데이터베이스에 따라 도출된다.
본 발명에서 논의된 중쇄 불변 영역 아미노산 위치를 위해, 넘버링은 전하는 바에 따르면 서열화된 제1 인간 IgG1인 골수종 단백질 Eu의 아미노산 서열을 기재하는 문헌(참조: Edelman et al., 1969, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 63(1): 78-85)에 최초로 기재된 Eu 지수에 따른다. 에델만(Edelman)의 Eu 지수는 또한 문헌(참조: Kabat et al., 1991 (상기))에 기재되어 있다. 따라서, 중쇄의 관점에서 용어 "카바트에 기재되어 있는 바와 같은 EU 지수" 또는 "카바트의 EU 지수"는 문헌(참조: Kabat et al., 1991 (상기))에 기재되어 있는 바와 같이, 에델만 등의 인간 IgG1 Eu 항체에 기초하는 잔기 넘버링 시스템을 의미한다. 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 위해 사용된 넘버링 시스템은 유사하게 문헌(참조: Kabat et al., 1991)에 기재되어 있다. 본 발명에 적합한 예시적인 카파 CL 및 IgG1 중쇄 불변 영역 아미노산 서열은 첨부된 서열목록에 서열번호 5 및 6으로서 기재된다. 숙련가들은, 개시된 불변 영역 서열이 본 발명의 DLL3 접합체에 도입될 수 있는 전장 항체를 제공하기 위해 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 개시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역과 결합될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 항체 또는 면역글로불린은 임의의 DLL3 결정인자를 특이적으로 인식하거나 이와 연관되는 임의의 항체를 포함하거나, 또는 이로부터 유도될 수 있다. 본원에 사용된 "결정인자" 또는 "표적"은 특별한 세포, 세포 집단 또는 조직에서 또는 조직 상에서 동정가능하게 연관되거나, 또는 구체적으로 발견되는 임의의 검출가능한 특성, 성질, 마커 또는 인자를 의미한다. 결정인자 또는 표적은 특성상 형태학적, 기능적 또는 생화학적일 수 있고, 바람직하게는 표현형이다. 특정의 바람직한 양태에서, 결정인자는 특이적 세포 형태 또는 특정 조건하의 세포(예: 세포 주기 또는 특정 틈새 중의 세포의 특정 시점 동안)에 의해 차별적으로 발현된(과잉발현되거나 과소 발현된) 단백질이다. 본 발명의 목적을 위해, 결정인자는 바람직하게는 비정상 암 세포 상에서 차별적으로 발현되고, DLL3 단백질 또는 임의의 이의 스플라이스 변이체, 이소형 또는 패밀리 구성원 또는 이의 특정 도메인, 영역 또는 에피토프를 포함할 수 있다. "항원", "면역원성 결정인자", "항원 결정인자" 또는 "면역원"은 면역적격 동물에게 도입될 때 면역 반응을 자극할 수 있고 동물의 면역 반응으로부터 생성된 항체에 의해 인식되는 임의의 단백질(DLL3 포함) 또는 이의 임의의 단편, 영역, 도메인 또는 에피토프를 의미한다. 본원에서 고려된 결정인자의 존재 또는 부재를 사용하여 세포, 세포 아집단 또는 조직(예: 종양, 종양형성성 세포 또는 CSC)을 동정할 수 있다.
실시예에서 이하 기재된 바와 같이, 본 발명의 선택된 양태는 "공급원" 항체로 간주될 수 있는 DLL3에 면역특이적으로 결합하는 뮤린 항체를 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명에 의해 고려되는 항체는 공급원 항체의 불변 영역 또는 에피토프 결합 아미노산 서열의 임의의 변형을 통해 이러한 "공급원" 항체로부터 유도될 수 있다. 하나의 양태에서, 항체는, 공급원 항체 중의 선택된 아미노산이 결실, 돌연변이, 치환, 통합 또는 조합을 통해 변경되는 경우, 공급원 항체로부터 "유도된다". 또 다른 양태에서, "유도된" 항체는 공급원 항체의 단편(예: 하나 이상의 CDR 또는 전체 가변 영역)이 수용체 항체 서열과 조합되거나 이에 도입되어 유도체 항체(예: 키메라, CDR 절편이식된 또는 인간화된 항체)를 제공하는 것이다. 이러한 "유도된"(예: 인간화 또는 CDR-절편이식된) 항체는, 예를 들면, 결정인자에 대한 친화성을 향상시키고, 세포 배양물 중의 생산성 및 수율을 향상시키고, 생체내 면역원성을 감소시키고, 독성을 감소시키고, 활성 잔기의 접합을 촉진시키거나 다중특이적 항체를 생성하는 것과 같은 다양한 이유로 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 생성할 수 있다. 이러한 항체는 또한 화학적 수단 또는 변역후 변형에 의해 성숙 분자의 변형(예: 글리코실화 패턴 또는 페길화)을 통해 공급원 항체로부터 유도될 수 있다.
본 발명의 맥락에서 도 3a 또는 도 3b에 제시된 뮤린 가변 영역 아미노산 서열로부터 유도된 임의의 개시된 경쇄 및 중쇄 CDR이 본 발명의 교시에 따라 수용체 항체와 조합하거나 재배열하여 최적화된 항-인간 DLL3(예: 인간화 또는 키메라 항-hDLL3) 항체를 제공할 수 있음을 이해할 것이다. 즉, 도 3a에 제시된 연속 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 또는 도 3b에 제시된 연속 중쇄 가변 영역 아미노산 서열(함께 서열번호 21 내지 387, 홀수)로부터 유래되거나 수득된 하나 이상의 CDR은 DLL3 조절인자, 특히 바람직한 양태에서는, 하나 이상의 DLL3 이소형과 면역특이적으로 연관되는 CDR 절편이식된 또는 인간화된 항체에 도입될 수 있다. 이러한 인간화 조절인자의 유도된 경쇄 및 중쇄 가변 영역 아미노산 서열의 예는 또한 도 3a 및 3b에 제시되어 있다(서열번호 389-407, 홀수).
도 3a 및 도 3b에서, 주석이 달린 CDR은 독점 Abysis 데이터베이스를 사용하여 카바트에 따라 정의된다. 그러나, 본원에서 논의된 바와 같이, 당업자는 도 3a 또는 도 3b에 제시된 각각의 중쇄 및 경쇄 서열에 대해 카바트 등, 초티아 등 또는 맥칼룸 등에 의해 정의된 CDR을 쉽게 정의하고, 동정하고, 도출하고/하거나 계산할 수 있을 것이다. 따라서, 상기 모든 명명법에 의해 정의된 CDR을 포함하는 대상체 CDR 및 항체 각각은 명백히 본 발명의 범위 내에 포함된다. 보다 광범위하게, 용어 "가변 영역 CDR 아미노산 잔기" 또는 더 간단하게 "CDR"은 상기 제시된 바와 같은 임의의 서열 또는 구조 기반 방법을 사용하여 동정되는 CDR 내의 아미노산을 포함한다. 이러한 맥락 내에서, 도 3a 및 3b 중의 예시적 인간화된 항체를 위한 카바트 CDR은 첨부된 서열목록에 서열번호 408 내지 437로서 제공된다.
다른 양태에서, 적합한 DLL3 항체는 본원에 기재된 예시적 항체(인간화 및 뮤린 둘 다)의 아미노산 서열에 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 항체는 본 발명의 항-DLL3 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다.
예를 들면, 적합한 DLL3 항체는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 갖는 항체 또는 이의 면역반응성 단편을 포함할 수 있고, 여기서 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 21, 서열번호 25, 서열번호 29, 서열번호 33, 서열번호 37, 서열번호 41, 서열번호 45, 서열번호 49, 서열번호 53, 서열번호 57, 서열번호 61, 서열번호 65, 서열번호 69, 서열번호 73, 서열번호 77, 서열번호 81, 서열번호 85, 서열번호 89, 서열번호 93, 서열번호 97, 서열번호 101, 서열번호 105, 서열번호 109, 서열번호 113 , 서열번호 117, 서열번호 121, 서열번호 125, 서열번호 129, 서열번호 133, 서열번호 137, 서열번호 141, 서열번호 145, 서열번호 149, 서열번호 153, 서열번호 157, 서열번호 161, 서열번호 165, 서열번호 169, 서열번호 173, 서열번호 177, 서열번호 181, 서열번호 185, 서열번호 189, 서열번호 193, 서열번호 197, 서열번호 201, 서열번호 205, 서열번호 209, 서열번호 213, 서열번호 217, 서열번호 221, 서열번호 225, 서열번호 229, 서열번호 233, 서열번호 237, 서열번호 241, 서열번호 245, 서열번호 249, 서열번호 253, 서열번호 257, 서열번호 261, 서열번호 265, 서열번호 269, 서열번호 273, 서열번호 277, 서열번호 281, 서열번호 285, 서열번호 289, 서열번호 293, 서열번호 297, 서열번호 301, 서열번호 305, 서열번호 309, 서열번호 313, 서열번호 317, 서열번호 321, 서열번호 325, 서열번호 329, 서열번호 333, 서열번호 337, 서열번호 341, 서열번호 345, 서열번호 349, 서열번호 353, 서열번호 357, 서열번호 361, 서열번호 365, 서열번호 369, 서열번호 373, 서열번호 377, 서열번호 381 및 서열번호 385로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열에 적어도 60% 상동성인 아미노산 서열을 포함하고, 상기한 중쇄 가변 영역은 서열번호 23, 서열번호 27, 서열번호 31, 서열번호 35, 서열번호 39, 서열번호 43, 서열번호 47, 서열번호 51, 서열번호 55, 서열번호 59, 서열번호 63, 서열번호 67, 서열번호 71, 서열번호 75, 서열번호 79, 서열번호 83, 서열번호 87, 서열번호 91, 서열번호 95, 서열번호 99, 서열번호 103, 서열번호 107, 서열번호 111, 서열번호 115, 서열번호 119, 서열번호 123, 서열번호 127, 서열번호 131, 서열번호 135, 서열번호 139 서열번호 143, 서열번호 147, 서열번호 151, 서열번호 155, 서열번호 159, 서열번호 163, 서열번호 167, 서열번호 171, 서열번호 175, 서열번호 179, 서열번호 183, 서열번호 187, 서열번호 191, 서열번호 195, 서열번호 199, 서열번호 203, 서열번호 207, 서열번호 211, 서열번호 215, 서열번호 219, 서열번호 223, 서열번호 227, 서열번호 231, 서열번호 235, 서열번호 239, 서열번호 243, 서열번호 247, 서열번호 251, 서열번호 255, 서열번호 259, 서열번호 263, 서열번호 267, 서열번호 271, 서열번호 275, 서열번호 279, 서열번호 283, 서열번호 287, 서열번호 291, 서열번호 295, 서열번호 299, 서열번호 303, 서열번호 307 서열번호 311, 서열번호 315, 서열번호 319, 서열번호 323, 서열번호 327, 서열번호 331, 서열번호 335, 서열번호 339, 서열번호 343, 서열번호 347, 서열번호 351, 서열번호 355, 서열번호 359, 서열번호 363, 서열번호 367, 서열번호 371, 서열번호 375, 서열번호 379, 서열번호 383 및 서열번호 387로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열에 적어도 60% 상동성인 아미노산 서열을 포함한다.
다른 양태에서, VH 　및/또는 VL 　아미노산 서열은 상기 제시된 서열에 대해 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 상동성일 수 있다. 상기 제시된 서열의 VH 　및 VL 　영역에 대해 높은(즉, 80% 이상) 상동성을 갖는 VH　및 VL　영역을 갖는 항체는 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 수득되거나 유도될 수 있다. 예를 들면, 이하 표 4에 나타낸 바와 같이, 뮤린 공급원 항체로부터 실시예 4에 제시된 바와 같이 유도된 인간화된 항체는 공급원 항체의 것들에 거의 75% 내지 85% 상동성인 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이 두 아미노산 서열 사이의 % 상동성은 두 서열 사이의 % 동일성과 등가이다. 두 서열 사이의 % 동일성은 두 서열의 최적의 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려하여 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수(즉 % 상동성= 동일한 위치의 수/총 위치의 수 x 100)이다. 서열의 비교 및 두 서열 사이의 % 동일성의 측정은 이하 비한정적인 실시예에 기재된 바와 같이 수학적 알고리즘을 사용하여 달성할 수 있다.
두 아미노산 서열 사이의 % 동일성은 PAM120 중량 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용하여 ALIGN 프로그램(버젼 2.0)으로 도입된 이. 마이어스(E. Meyers) 및 더블유. 밀러(W. Miller)의 알고리즘(참조: Comput. Appl. Biosci.,4:11-17 (1988))을 사용하여 측정할 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열 사이의 % 동일성은 블로썸(Blossum) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 갭 중량 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4 및 길이 중량 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 사용하여 GCG 소프트웨어 패키지 중의 GAP 프로그램(www.gcg.com에서 이용가능함)에 도입된 니들맨(Needleman) 및 운슈(Wunsch)(참조: J. Mol. Biol.　48:444-453 (1970))를 사용하여 측정할 수 있다.
추가로 또는 대안적으로, 본 발명의 단백질 서열은, 예를 들면, 관련 서열을 동정하기 위해 공적 데이터베이스에 대해 검색을 실행하기 위한 "쿠에리 서열(query sequence)"로서 추가로 사용될 수 있다. 이러한 검색은 문헌(참조: Altschul, et al. (1990)　J. Mol. Biol.　215:403-10)의 XBLAST 프로그램(버젼 2.0)을 사용하여 수행할 수 있다. BLAST 단백질 검색은 본 발명의 항체 분자에 상동성인 아미노산 서열을 수득하기 위해 XBLAST 프로그램, 스코어= 50, 워드 길이= 3을 사용하여 수행할 수 있다. 비교 목적으로 갭화 정렬을 수득하기 위해, 갭화 BLAST를 문헌(참조: Altschul et al., (1997)　Nucleic Acids Res.　25(17):3389-3402)에 기재된 바와 같이 이용할 수 있다. BLAST 및 갭화 BLAST 프로그램을 이용할 경우, 각각의 프로그램(예: XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다.
2. 항체 생성
a. 폴리클로날 항체
래빗, 마우스, 래트 등을 포함하는 각종 숙주 동물에서의 폴리클로날 항체의 생성은 당해 기술 분야에 익히 공지되어 있다. 일부 양태에서, 폴리클로날 항-DLL3 항체 함유 혈청은 동물을 출혈시키거나 희생시킴으로써 수득된다. 혈청은 동물로부터 얻어진 형태로 연구 목적으로 사용될 수 있으며 또는, 다른 선택으로는, 항-DLL3 항체를 부분적으로 또는 완전히 정제하여 면역글로불린 분획 또는 상동성 항체 제제를 제공할 수 있다.
간단히 말해 선택된 동물을, 예를 들면, 선택된 이소형, 도메인 및/또는 펩티드를 포함할 수 있는 DLL3 면역원(예: 가용성 DLL3 또는 sDLL3), 또는 DLL3 또는 이의 면역반응성 단편을 발현하는 살아 있는 세포 또는 세포 제제로 면역시킨다. 접종된 종에 따라, 면역 반응을 증가시키는 데 사용될 수 있는 당해 기술 분야에 공지된 보조제는 프로인트(Freund's) 보조제(완전 및 불완전), 미네랄 겔, 예를 들면, 수산화알루미늄, 표면 활성 물질, 예를 들면, 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다가음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림핏 헤모시아닌, 디니트로페놀, 및 잠재적으로 유용한 인간 보조제, 예를 들면, BCG(칼메뜨-게랭 세균(bacille Calmette-Guerin)) 또는 코리네박테리움 파르붐(corynebacterium parvum)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 보조제는 항원을 국소 저장장소(local deposit)에 격리함으로써 항원이 빨리 분산되는 것을 보호할 수 있으며, 또는 그들은 숙주를 자극하여 면역 시스템의 마크로파지 및 다른 성분에 대해 화학주성인 인자를 분비하는 물질을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 면역화 스케쥴은 소정의 기간에 걸쳐 확산하는 선택된 면역원을 두 번 이상 투여함을 포함할 것이다.
도 1에 나타낸 DLL3 단백질의 아미노산 서열을 분석하여 항체를 생성시키기 위한 DLL3 단백질의 특정 영역을 선택할 수 있다. 예를 들면, DLL3 아미노산 서열의 소수성 및 친수성 분석은 DLL3 구조 속의 친수성 영역을 동정하는 데에 사용된다. 다른 영역 및 도메인 뿐만 아니라, 면역원성 구조를 나타내는 DLL3 단백질의 영역은 당해 기술 분야에 공지된 각종의 다른 방법, 예를 들면, 쵸우-파스만(Chou-Fasman), 가니어-롭슨(Garnier-Robson), 카이트-둘리틀(Kyte-Doolittle), 아이젠버그(Eisenberg), 카플러스-슐츠(Karplus-Schultz) 또는 제임슨-울프(Jameson-Wolf) 분석을 사용하여 쉽게 동정될 수 있다. 평균 유연성 프로파일은 문헌(참조: Bhaskaran R., Ponnuswamy P. K., 1988, Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255)의 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 베타-회전(Beta-turn) 프로파일은 문헌(참조: Deleage, G., Roux B., 1987, Protein Engineering 1:289-294)의 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 따라서, 이러한 프로그램 또는 방법 중의 어느 것에 의해 동정되는 각각의 DLL3 영역, 도메인 또는 모티프는 본 발명의 범위 내에 있으며, 목적하는 성질을 포함하는 조절인자를 생기게 하는 면역원을 제공하기 위하여 단리되거나 조작될 수 있다. DLL3 항체의 생성을 위한 바람직한 방법은 본원에 제공된 실시예에 의해 추가로 예시된다. 면역원으로 사용하기 위한 단백질 또는 폴리펩티드의 제조방법은 당해 기술 분야에 익히 공지되어 있다. BSA, KLH 또는 다른 담체 단백질과 같은 담체와 단백질의 면역원성 접합체의 제조방법도 또한 당해 기술 분야에 익히 공지되어 있다. 어떠한 상황에서는, 예를 들면, 카보디이미드 시약을 사용하는 직접 접합이 사용되고; 다른 경우에서는 결합 시약이 효과적이다. DLL3 면역원의 투여는 당해 기술 분야에서 이해되는 바와 같이, 흔히 적당한 기간의 주사 및 적당한 보조제의 사용으로 실시된다. 면역화 스케쥴 동안, 항체의 역가는 아래의 실시예에서 기재된 바와 같이 취하여 항체 형성의 타당성을 측정할 수 있다.
b. 모노클로날 항체
또한, 본 발명은 모노클로날 항체의 사용을 고려한다. 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이, 용어 "모노클로날 항체" (또는 mAb)는 실질적으로 상동성인 항체의 집단으로부터 얻어진 항체를 의미하고, 즉, 집단을 포함하는 개개의 항체는 미량으로 존재할 수 있는, 가능한 돌연변이(예: 천연 발생 돌연변이)를 제외하고는 동일하다. 특정 양태에서, 그러한 모노클로날 항체는 항원과 결합하거나 연관되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하고, 여기서 항원-결합 폴리펩티드 서열은 다수의 폴리펩티드 서열로부터 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열을 선택하는 단계를 포함하는 과정에 의해 수득된다.
더욱 일반적으로, 그리고 본원의 실시예에 기재된 바와 같이, 모노클로날 항체는 하이브리도마 기술, 재조합 기술, 파지 디스플레이 기술, 유전자이식 동물(예: XenoMouse®) 또는 이들의 일부 조합을 포함하는 당해 기술 분야에 공지된 다양한 종류의 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 모노클로날 항체는 각각 참조로 그 전체가 본원에 인용된 문헌(참조: An, Zhigiang (ed.) Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, John Wiley and Sons, 1st ed. 2009; Shire et. al. (eds.) Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing, Springer Science + Business Media LLC, 1st ed. 2010; Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988; Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981))에서 더욱 상세하게 기재되어 있는 것과 같은 하이브리도마 및 당해 기술 분야-인식된 생화학적 및 유전공학적 기술을 사용하여 생성할 수 있다. 선택된 결합 서열을 추가로 변경시켜, 예를 들면, 표적에 대한 친화성을 향상시키고, 표적 결합 서열을 인간화하고, 세포 배양물에서 이의 생성을 향상시키고, 생체 내에서 이의 면역원성을 감소시키고, 다중특이적 항체를 생성할 수 있으며 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체도 또한 본 발명의 항체임을 이해해야 한다.
c. 키메라 및 인간화된 항체
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 적어도 두 개의 상이한 종 또는 부류의 항체로부터의 공유결합된 단백질 절편으로부터 유도된 키메라 항체를 포함할 수 있다. 용어 "키메라(chimeric)" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고, 그 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 뿐만 아니라 이러한 항체의 단편의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 작제물에 관한 것이다(참조: U.S. P.N. 4,816,567; Morrison et al., 1984, PMID:6436822).
하나의 양태에서, 키메라 항체는 뮤린 VH 및 VL 아미노산 서열과 인간 공급원으로부터 유래된 불변 영역, 예를 들면, 이하 기재되는 바와 같은 인간화된 항체를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 항체는 "CDR-절편이식(CDR-grafted)"될 수 이고, 여기서 항체는 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 하나 이상의 CDR을 포함하고, 항체 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이다. 인간에서의 사용을 위해, 선택된 설치류 CDR, 예를 들면, 마우스 CDR은 인간 항체 속으로 절편이식되어 인간 항체의 하나 이상의 천연 발생 CDR을 치환할 수 있다. 이러한 작제물은 일반적으로 충분한 강도의 항체 기능, 예를 들면, 보체 의존성 세포독성(CDC) 및 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)을 제공하고 동시에 대상체에서 항체에 대한 바람직스럽지 않은 면역 반응을 감소시키는 이점을 갖는다.
CDR-절편이식된 항체와 유사한 것이 "인간화" 항체이다. 본원에 사용된 바와 같이, 비-인간(예: 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 하나 이상의 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 하나의 양태에서, 인간화된 항체는 수용자의 하나 이상의 CDR로부터의 잔기가 마우스, 래트, 래빗, 또는 비인간 영장류와 같은 비-인간 종(공여체 항체)의 하나 이상의 CDR로부터의 잔기로 치환된 인간 면역글로불린(수용자 또는 수용체 항체)이다. 특정의 바람직한 양태에서, 인간 면역글로불린의 가변 도메인에 있는 하나 이상의 FR 중의 잔기는 공여체 항체의 상응하는 비-인간 잔기로 치환되어 절편이식된 CDR(들)의 적합한 삼차원 배열상태를 유지하게 도와주고 그 결과 친화성을 개선시킨다. 이는 "역 돌연변이(back mutation)"의 도입으로서 지칭될 수 있다. 더욱이, 인간화된 항체는, 예를 들면, 항체 성능을 추가로 개량시키기 위해, 수용체 항체에서 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다.
다양한 공급원은, 인간 서열을 인간화된 항체에 사용하는가를 결정하기 위해 사용할 수 있다. 이러한 공급원은, 예를 들면, 인간 면역글로불린 가변 영역 서열의 포괄적인 디렉토리(편집: Tomlinson, I. A. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK)를 제공하는 문헌(참조: Tomlinson, I. A. et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798; Cook, G. P. et al. (1995) Immunol. Today 16: 237-242; Chothia, D. et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:799-817; 및 Tomlinson et al. (1995) EMBO J 14:4628-4638; the V-BASE directory (VBASE2 Retter et al., Nucleic Acid Res. 33; 671-674, 2005))에 개시된 인간 생식계열 서열; 또는, 예를 들면, U.S.P.N. 6,300,064에 기재된 컨센서스 인간 FR을 포함한다.
CDR 절편이식된 및 인간화된 항체는, 예를 들면, U.S.P.N. 6,180,370 및 5,693,762에 기재된다. 추가의 상세함은, 예를 들면, 문헌(참조: Jones et al., 1986, PMID: 3713831); 및 U.S.P.Ns. 6,982,321 및 7,087,409)을 참조한다.
또 다른 방법은, 예를 들면, U.S.P.N. 2005/0008625에 기재되어 있는 "인간공학(humaneering)"이라 지칭된다. 또 하나의 양태에서, 비인간 항체는 인간 T-세포 에피토프의 특이적 결실 또는 WO 98/52976 및 WO 00/34317에 개시된 방법에 의한 "탈면역화(deimmunization)"에 의해 변형시킬 수 있다.
선택된 양태에서 상기 논의된 바와 같이, 인간화 또는 CDR 절편이식된 항체 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 아미노산 잔기의 적어도 60%, 65%, 70%, 75% 또는 80%는 수용자 인간 서열의 잔기에 상응한다. 다른 양태에서, 인간화된 항체 가변 영역 잔기의 적어도 83%, 85%, 87% 또는 90%는 수용자 인간 서열의 잔기에 상응한다. 추가의 바람직한 양태에서, 인간화된 항체 가변 영역 각각의 95% 초과는 수용자 인간 서열의 잔기에 상응한다.
인간 수용체 가변 영역에 대한 인간화된 항체 가변 영역의 서열 동일성 또는 상동성은 이전에 논의된 바와 같이 측정될 수 있고, 그렇게 측정했을 때, 바람직하게는 적어도 60% 또는 65% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 서열 동일성, 더욱 더 바람직하게는 적어도 93%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 공유할 것이다. 바람직하게는, 동일하지 않는 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성(예: 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄(R 그룹)를 갖는 또 하나의 아미노산 잔기로 치환된 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 특성을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 둘 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 상이한 경우에, % 서열 동일성 또는 유사성의 정도는 치환의 보존적 성질을 보정하기 위해 상향 조정될 수 있다.
d. 인간 항체
또 다른 양태에서, 항체는 완전 인간 항체를 포함할 수 있다. 용어 "인간 항체"는 인간에 의해 생성되고/되거나 인간 항체를 제조하기 위한 임의의 기술을 사용하여 제조된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 항체를 의미한다.
인간 항체는 당해 기술 분야에 공지된 각종 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 한 가지 기술은 (바람직하게는 인간) 항체의 라이브러리가 파지 상에서 합성되고, 그 라이브러리는 관심의 항원 또는 이의 항체-결합 부분으로 스크린되고, 그 항원을 결합하는 파지가 분리되는 파지 디스플레이이고, 그것으로부터 면역반응성 단편을 얻을 수 있다. 상기 라이브러리를 제조하고 스크리닝하는 방법은 당해 기술 분야에 익히 공지되어 있고, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하기 위한 키트는 시판되고 있다(예를 들면, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, 카탈로그 번호 27-9400-01; 및 Stratagene SurfZAPTM 파지 디스플레이 키트, 카탈로그 번호 240612). 항체 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하는 데에 사용될 수 있는 다른 방법 및 시약도 또한 존재한다(참조: 예를 들면, U.S.P.N. 5,223,409; PCT 공보 번호 WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; 및 Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982 (1991)).
하나의 양태에서, 재조합 인간 항체는 상기한 바와 같이 제조된 재조합 조합 항체 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 하나의 양태에서, 라이브러리는 B-세포로부터 단리된 mRNA로부터 제조된 인간 VL 및 VH cDNA를 사용하여 생성된 scFv 파지 디스플레이 라이브러리이다.
실험된 일 없는 라이브러리(천연 또는 합성)에 의해서 제조된 항체는 중간 정도의 친화성(Ka 약 106 내지 107 M-1)일 수 있지만, 친화성 성숙은 또한 당해 기술 분야에 기재된 바와 같이 구성하여 2차 라이브러리로부터 재선택함으로써 또한 시험관내에서 모방할 수 있다. 예를 들면, 돌연변이는 오류가 발생하기 쉬운(error-prone) 폴리머라제(문헌(참조: Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989))에 보고됨)를 사용하여 시험관 내에서 무작위로 도입될 수 있다. 추가로, 친화성 성숙은 하나 이상의 CDR을 무작위로 돌연변이시킴으로써, 예를 들면, 선택된 개개의 Fv 클론에서, 관심의 CDR에 걸치는 무작위 서열을 갖는 프라이머를 갖는 PCR을 사용하고 더 높은 친화성 클론을 스크리닝하여 수행될 수 있다. WO 9607754는 면역글로불린 경쇄의 CDR에서 돌연변이생성을 유도하여 경쇄 유전자의 라이브러리를 생성하는 방법을 기재한다. 또 다른 효과적인 접근법은 파지 디스플레이에 의해 선택된 VH 또는 VL 도메인을 면역되지 않은 공여체로부터 수득된 천연 발생 V 도메인 변이체의 레포토리와 재조합하고, 문헌(참조: Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992))에 기재된 몇 차례의 쇄 개편(chain reshuffling)으로 높은 친화성을 스크리닝하는 것이다. 이 기술은 약 10-9 M 이하의 해리 상수 KD(koff/kon)를 갖는 항체 및 항체 단편의 생성을 가능하게 한다.
다른 양태에서, 자신들의 표면에 결합 쌍을 발현하는 진핵 세포(예: 효모)를 포함하는 라이브러리를 사용하는 유사한 절차를 사용할 수 있다. 예를 들면, U.S.P.N. 7,700,302 및 U.S.S.N. 12/404,059를 참조한다. 하나의 양태에서, 인간 항체는 파지 라이브러리로부터 선택되는데, 그 파지 라이브러리는 인간 항체를 발현시킨다(참조: Vaughan et al. Nature Biotechnology 14:309-314 (1996): Sheets et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6157-6162 (1998)). 다른 양태에서, 인간 결합 쌍은 효모와 같은 진핵 세포 중에서 생성된 조합 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 예를 들면, U.S.P.N. 7,700,302를 참조한다. 이러한 기술은 유리하게는 많은 수의 후보 조절인자의 스크리닝을 가능하게 하고, (예를 들면, 친화성 성숙 또는 재조합체 셔플링에 의한) 후보 서열의 비교적 쉬운 조작을 제공한다.
인간 항체는 또한 인간 면역글로불린 유전자좌를 내인성 면역글로불린 유전자는 부분적으로 또는 완전히 불활성화되고, 인간 면역글로불린 유전자가 도입된 유전자도입 동물, 예를 들면, 마우스에 도입함으로써 제조될 수 있다. 도전 중에, 인간 항체 생산이 관찰되는데, 이것은 유전자 재배열, 어셈블리 및 항체 레퍼토리 를 포함하는 모든 국면에서 인간에서 보여지는 것과 아주 유사하다. 이러한 접근법은, 예를 들면, 문헌(참조: U.S.P.Ns. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, 및 XenoMouse® 기술에 대한 U.S.P.Ns. 6,075,181 및 6,150,584; Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995))에 기재되어 있다. 또는, 표적 항원에 대한 항체를 생성하는 인간 B 림프구의 불멸화를 통해 인간 항체를 제조할 수 있다(이러한 B 림프구는 종양성 장애를 앓고 있는 개체로부터 회수될 수 있거나 시험관내에서 면역화할 수 있다). 예를 들면, 문헌(참조: Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol, 147 (l):86-95 (1991); 및 U.S.P.N. 5,750,373)을 참조한다.
3. 항체의 재조합 생산
항체 및 이의 단편은 항체 생산 세포 및 재조합 기술로부터 수득된 유전 물질을 사용하여 생성시키거나 변형시킬 수 있다(참조: 예를 들면, Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology vol. 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA; Sambrook and Russell (Eds.) (2000) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Ed.), NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al. (2002) Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (supplemented through 2006); 및 U.S.P.N. 7,709,611).
보다 특히, 본 발명의 또 하나의 국면은 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 핵산은 전체 세포에, 세포 용해물에 또는 부분 정제되거나 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 다른 세포상 성분 또는 다른 오염물, 예를 들면, 다른 세포상 핵삭 또는 단백질로부터 알칼리성/SDS 처리, CsCl 밴딩, 칼럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당해 기술 분야에 익히 공지된 다른 것들을 포함하는 표준 기술에 의해 정제제되는 경우 "단리된" 또는 "실질적으로 순수하게 된다". 본 발명의 핵산은, 예를 들면, DNA 또는 RNA일 수 있고, 인트론 서열을 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있다. 보다 일반적으로, 용어 "핵산"은, 본원에 사용된 바와 같이, 단일-가닥이든 또는 이중-가닥이든, 게놈 DNA, cDNA, RNA 및 이의 인공 변이체(예: 펩티드 핵산)을 포함한다. 바람직한 양태에서, 핵산은 cDNA 분자이다.
본 발명의 핵산은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 수득할 수 있다. 하이브리도마(예: 이하 추가로 기재되는 바와 같이 인간 면역글루불린 유전자를 수반하는 유전자도입 마우스로부터 제조된 하이브리도마)에 의해 발현된 항체의 경우, 하이브리도마에 의해 제조된 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 cDNA는 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술에 의해 수득할 수 있다. (예를 들면, 파지 디스플레이 기술을 사용하여) 면역글로불린 유전자 라이브러리로부터 수득된 항체의 경우, 항체를 암호화하는 핵산은 라이브러리로부터 회수될 수 있다.
VH 및 VL 절편을 암호화하는 DNA 단편이 수득되면, 이러한 DNA 단편은, 예를 들면, 가변 영역 유전자를 전장 항체 쇄 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 전환시키기 위해 표준 재조합 DNA 기술로 추가로 조작할 수 있다. 이러한 조작에서, VL- 또는 VH-암호화 DNA 단편은 또 다른 단백질을 암호화하는 또 다른 DNA 단편, 예를 들면, 항체 불변 영역 또는 유연한 링커에 작동가능하게 연결된다. 이러한 맥락에서 사용된 용어 "작동가능하게 연결된"은, 두 개의 DNA 단편이 두 DNA 단편에 의해 암호화된 아미노산 서열이 인-프레임 상태로 잔류하도록 결합됨을 의미하고자 한다.
VH 영역을 암호화하는 단리된 DNA는 VH-암호화 DNA를 중쇄 불변 영역(CH1, CH2 및 CH3)을 암호화하는 또 다른 DNA 분자에 작동적으로 연결함으로써 전장 중쇄 유전자로 전환시킬 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당해 기술 분야에 공지되어 있고(참조: 예를 들면, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), 이러한 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있지만, 가장 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 불변 영역이다. 이하 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 본원의 교시에 적합한 예시적인 IgG1 불변 영역은 첨부된 서열목록에서 서열번호 6으로 기재된다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우, VH-암호화 DNA는 단지 중쇄 CH1 불변 영역을 암호화하는 또 다른 DNA 분자에 작동적으로 연결할 수 있다.
VL 영역을 암호화하는 단리된 DNA는 VL-암호화 DNA를 경쇄 불변 영역 CL을 암호화하는 또 다른 DNA 분자에 작동적으로 연결함으로써 전장 경쇄 (뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 전환시킬 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당해 기술 분야에 공지되어 있고(참조: 예를 들면, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), 이러한 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있지만, 가장 바람직하게는 카파 불변 영역이다. 이와 관련하여, 예시적인 적합한 카파 경쇄 불변 영역은 첨부된 서열목록에서 서열번호 5로서 기재된다.
본 발명은 또한 상기한 핵산을 포함하는 벡터를 제공하고, 이는 프로모터(참조: 예를 들면, WO 86/05807; WO 89/01036; 및 U.S.P.N. 5,122,464); 및 진핵생물 분비 경로의 다른 전사 조절 및 처리 억제 요소에 작동가능하게 연결시킬 수 있다. 본 발명은 또한 이러한 벡터 및 숙주 발현 시스템을 보유하는 숙주 세포를 제공한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "숙주-발현 시스템"은 핵산 또는 본 발명의 폴리펩티드 및 항체를 생성시키기 위해 조작될 수 있는 임의의 종류의 세포상 시스템을 포함한다. 이러한 숙주-발현 시스템은 박테리오파지 DNA 또는 플라스미드 DNA로 형질전환시키거나 형질감염시킨 미생물(예를 들면, 이. 콜라이(E. coli) 또는 비. 서브틸리스(B. subtilis), 재조합 효모 발현 벡터로 형질감염시킨 효모(예: 사카로마이세스(Saccharomyces)); 또는 포유동물 세포 또는 바이러스의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 작제물을 보유하는 포유동물 세포(예: COS, CHO-S, HEK-293T, 3T3 세포)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 숙주 세포는 두 개의 발현 벡터, 예를 들면, 중쇄 유래 폴리펩티드를 암호화하는 제1 벡터 및 경쇄 유래 폴리펩티드를 암호화하는 제2 벡터로 공형질감염시킬 수 있다.
포유동물을 형질전환시키는 방법은 당해 기술 분야에 익히 공지되어 있다. 예를 들면, U.S.P.N.s. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 및 4,959,455를 참조한다. 숙주 세포는 또한 조작되어 다양한 특성을 갖는 항원 결합 분자(예를 들면, 변형된 글리코형 또는 GnTIII 활성을 갖는 단백질)의 생산을 가능하게 한다.
재조합 단백질의 장기간 고수율 생산을 위해, 안정한 발현이 바람직하다. 따라서, 선택된 항체를 안정하게 발현시키는 세포주는 표준의 기술 분야에 인지된 기술을 사용하여 조작되고 본 발명의 일부를 형성할 수 있다. 바이러스 복제 기원을 함유하는 발현 벡터를 사용하기 보다는, 숙주 세포는 적합한 발현 조절 요소(예: 프로모터 또는 인핸서 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택가능한 마커에 의해 조절된 DNA로 형질변형시킬 수 있다. 특정 조건 하에 발현을 향상시키기 위한 효율적인 접근법을 제공하는 글루타민 합성효소 유전자 발현 시스템(GS 시스템)을 포함하는, 당해 기술 분야에 익히 공지된 임의의 선택 시스템이 사용될 수 있다. FS 시스템은 전체적으로 또는 부분적으로 EP 0 216 846, EP 0 256 055, EP 0 323 997 및 EP 0 338 841 및 U.S.P.N.s 5,591,639 및 5,879,936와 관련하여 논의된다. 안정한 세포주의 개발을 위한 또 다른 바람직한 발현 시스템은 FreedomTM CHO-S Kit(Life Technologies)이다.
본 발명의 항체가 재조합 발현 또는 개시된 기술 중의 임의의 다른 것에 의해 생성되면, 이는 당해 기술 분야에 공지된 방법에 의해 정제되거나 단리될 수 있고, 이는 동정되고, 이의 자연 환경으로부터 분리되고/되거나 회수되고, 항체의 진단 또는 치료 사용을 방해하는 오염물로부터 분리된다는 것을 의미한다. 단리된 항체는 재조합 세포 내에서 항체를 동일반응계로 포함한다.
이러한 단리된 제제는 다앵한 기술 분야에서 인지된 기술, 예를 들면, 이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피, 투석, 정용여과(diafiltration), 및 친화성 크로마토그래피, 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제시킬 수 있다.
4. 생산 후 선택
어떻게 수득되었는지와 상관없이, 항체 생산 세포(예: 하이브리도마, 효모 콜로니 등)는 선택되고, 클로닝되고, 예를 들면, 강건한 성자, 높은 항체 생산 및 바람직한 항체 특성, 예를 들면, 관심의 항원에 대한 높은 친화성을 포함하는 바람직한 특성을 위해 스크리닝할 수 있다. 하이브리도마는 세포 배양물 중에서는 시험관내로 또는 동계 면역약화 동물에서는 생체내로 확대될 수 있다. 하이브리도마의 선택, 클로닝 및 확대하는 방법은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 목적하는 항체가 동정되면, 관련 유전 물질은 통상적인 기술 분야에서 인지된 분자 생물학 및 생화학적 기술을 사용하여 단리시키고, 조작하고 발현시킬 수 있다.
실험된 일 없는 라이브러리(천연 또는 합성)에 의해서 생산된 항체는 중간 정도의 친화성(Ka 약 106 내지 107 M-1)일 수 있다. 친화성을 향상시키기 위해, 친화성 성숙은 항체 라이브러리를 작제하고(예를 들면, 오류가 발생하기 쉬운 폴리머라제를 사용하여 시험관내로 무작위 돌연변이를 도입하여), 그러한 2차 라이브러리로부터의 항원에 대해 높은 친화성을 갖는 항체를 재선택함으로써(예를 들면, 파지 또는 효모 디스플레이를 사용하여) 시험관내에서 모방할 수 있다. WO 9607754는 경쇄 유전자의 라이브러리를 생성하기 위해 면역글로불린 경쇄의 CDR에서 돌연변이를 유도하는 방법을 기재한다.
인간 조합 항체 또는 scFv 단편의 라이브러리가 파지 또는 효모 상에서 합성되고, 그 라이브러리가 관심의 항원 또는 이의 항체 결합 부분으로 스크리닝되고, 항원을 결합하는 파지 또는 효모가 단리되는 파지 또는 효모 디스플레이를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 다양한 기술이 항체를 선택하기 위해 사용될 수 있고, 이로부터 항체 또는 면역반응성 단편을 수득할 수 있다(참조: Vaughan et al., 1996, PMID: 9630891; Sheets et al., 1998, PMID: 9600934; Boder et al., 1997, PMID: 9181578; Pepper et al., 2008, PMID: 18336206). 파지 또는 효모 디스플레이 라이브러리를 생성하기 위한 키트는 시판되고 있다. 항체 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하는데 사용될 수 있는 다른 방법 및 시약도 또한 존재한다(참조: U.S.P.N. 5,223,409; WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; 및 Barbas et al., 1991, PMID: 1896445). 이러한 기술은 유리하게는 다수의 후보 항체의 스크리닝을 가능하게 하고, 비교적 용이한 서열 조작(예: 재조합 셔플링에 의해)을 제공한다.
5. 항체 단편 및 유도체
a. 단편
어떤 형태의 조절인자(예를 들면, 키메라성, 인간화 등)가 본 발명을 실시하기 위해 선택되는지와 무관하게, 본원의 교시에 따라, 이들의 면역반응 단편이 사용될 수 있음을 이해할 것이다. "항체 단편"은 온전한 항체의 적어도 일부를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 항체분자의 "단편"은 항체의 항원-결합 단편을 포함하고, 용어 "항원-결합 단편"은 선택된 항원 또는 이의 면역원성 결정인자와 면역특이적으로 결합 또는 반응하거나, 단편들이 특이적 항원결합을 위해 유도된 온전한 항체와 경쟁하는 면역글로불린 또는 항체의 폴리펩티드 단편을 의미한다.
단편의 예로는 VL, VH, scFv, F(ab')2 단편, Fab 단편, Fd 단편, Fv 단편, 단일 도메인 항체 단편들, 디아바디(diabody), 선형화된 항체, 단일-쇄 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함된다. 게다가, 활성 단편은 항원/기질 또는 수용체와 상호작용하고, (다소 낮은 효력을 갖고 있음에도 불구하고) 온전한 항체의 방법과 유사한 방법으로 그들을 변형시키는 능력을 유지하는 항체의 일부를 포함한다.
다른 양태에서, 항체 단편은 Fc 영역을 포함하고, FcRn 결합, 항체 반감기 조절, ADCC 기능 및 보완 결합과 같은, 온전한 항체내에 존재할 때 Fc 영역과 정상적으로 연관되는 생물학적 기능 중 적어도 하나를 보유하는 단편이다. 하나의 양태에서, 항체 단편은 온전한 항체와 실질적으로 유사한 생체내 반감기를 갖는 1가 항체이다. 예를 들면, 이러한 항체 단편은 그 단편에 생체내 안정성을 부여할 수 있는 Fc 서열에 연결된 항원 결합 암을 포함할 수 있다.
당업자들에게 충분히 인식되어 있는 바와 같이, 단편은 온전한 또는 완전한 항체 또는 항체 쇄의 화학적 또는 효소적 처리(예를 들면, 파파인 또는 펩신)를 통해, 또는 재조합 수단에 의해 수득할 수 있다. 항체 단편에 대한 보다 상세한 설명을 위해, 예를 들면, 문헌(참조: Fundamental Immunology, W. E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1999))을 참조한다.
b. 다가 항체
하나의 양태에서, 본 발명의 조절인자는 1가 또는 다가(예를 들면, 2가, 3가 등)일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "원자가"는 항체와 연관되는 잠재적인 표적 결합 부위의 수를 의미한다. 각 표적 결합 부위는 1개의 표적 분자 또는 표적 분자 상의 특정 위치 또는 유전자좌에 특이적으로 결합한다. 항체가 1가인 경우, 분자의 각 결합 부위는 단일 항원 위치 또는 에피토프에 특이적으로 결합할 것이다. 항체가 1개 이상의 표적 결합 부위(다가)를 포함하는 경우, 각 표적 결합 부위는 동일하거나 상이한 분자에 특이적으로 결합할 수 있다(예를 들면, 상이한 리간드 또는 상이한 항원, 또는 동일한 항원 상의 상이한 에피토프 또는 위치에 결합할 수 있다). 예를 들면, U.S.P.N. 2009/0130105를 참조한다. 각각의 경우에, 결합 부위 중 적어도 하나는 DLL3 이소형과 연관된 에피토프, 모티프 또는 도메인을 포함할 것이다.
하나의 양태에서, 조절인자는 문헌(참조: Millstein et al., 1983, Nature, 305:537-539)에 기재된 바와 같이, 2개의 쇄가 다른 특이성을 갖는 이중특이적 항체이다. 다른 양태는 삼중특이적 항체와 같은 추가의 특이성을 갖는 항체를 포함한다. 다른 보다 정교한 적합한 다중특이적 작제물 및 이의 제조방법은 문헌(참조: U.S.P.N. 2009/0155255, 뿐만 아니라 WO 94/04690; Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology, 121:210; 및 WO96/27011)에 기재되어 있다.
상기 언급되어 있는 바와 같이, 다가 항체는 목적하는 표적 분자의 상이한 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있거나, 이질성 폴리펩티드 또는 고체 지지체 물질과 같은 이질성 에피토프 뿐만 아니라 표적 분자 모두에 면역특이적으로 결합할 수 있다. 항-DLL3 항체의 바람직한 양태는 오직 2개의 항원(즉, 이중특이적 항체)과 결합하는 반면, 삼중특이적 항체와 같은 추가의 특이성을 갖는 항체도 또한 본 발명에 포함된다. 이중특이적 항체는 또한, 가교-결합된 또는 "헤테로접합체" 항체를 포함한다. 예를 들면, 헤테로접합체 중의 항체 중 하나는 아비딘에 결합될 수 있으며, 나머지 하나는 비오틴에 결합될 수 있다. 이러한 항체는, 예를 들면, 원치 않는 세포에 면역계 세포를 표적화하기 위해(U.S.P.N. 4,676,980), HIV 감염을 치료하기 위해(WO 91/00360, WO 92/200373 및 EP 03089) 제안되어 왔다. 헤테로접합체 항체는 임의의 편리한 가교-결합 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 적당한 가교-결합제는 당해 기술 분야에 익히 공지되어 있고, 다수의 가교=결합 기술과 함께 U.S.P.N. 4,676,980에 개시되어 있다.
또 다른 양태에서, 목적하는 결합 특이성(항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인은 당업자에게 충분히 공지된 방법을 사용하여, 힌지, CH2 및/또는 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과 같은 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다.
c. Fc 영역 변형
상기 기재된 개시된 항체의 가변 또는 결합 영역에 대한 다양한 변형, 치환, 부가 또는 결실 이외에, 당업자는 본 발명의 선택된 양태가 불변 영역(즉, Fc 영역)의 치환 또는 변형도 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 더욱 특히, 본 발명의 DLL3 조절인자가 특히 1개 이상의 아미노산 잔기 치환, 돌연변이 및/또는 변형을 함유할 수 있으며, 이들은 변경된 약동학, 증가된 혈청 반감기, 증가된 결합 친화성, 감소된 면역원성, 증가된 생산성, Fc 수용체(FcR)에 대한 변경된 Fc 리간드 결합, 개선된 또는 감소된 "ADCC"(항체-의존성 세포 매개 세포독성) 또는 "CDC"(보체-의존성 세포독성) 활성, 변경된 글리코실화 및/또는 디설파이드 결합 및 변형된 결합 특이성을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 바람직한 특성을 갖는 화합물을 유도한다. 이와 관련하여, 이러한 Fc 변이체는 개시된 조절인자의 효과적인 항-종양성 특성을 개선시키기 위해 유리하게 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
이 때문에, 본 발명의 특정 양태는 Fc 영역의 치환 또는 변형, 예를 들면, 1개 이상의 아미노산 잔기의 부가, 개선된 또는 바람직한 Fc 효과기 기능을 갖는 화합물을 생성하기 위한 치환, 돌연변이 및/또는 변형을 포함할 수 있다. 예를 들면, Fc 도메인과 Fc 수용체(예: FcγRI, FcγRIIA 및 B, FcγRIII 및 FcRn) 사이의 상호작용에 관여하는 아미노산 잔기의 변화는 증가된 세포독성 및/또는 증가된 혈청 반감기와 같은 변경된 약동학을 유도할 수 있다(참조: 예를 들면, Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); and de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995), 이들 각각은 본원에 참조로 인용된다).
선택된 양태에서, 증가된 생체내 반감기를 갖는 항체는 Fc 도메인과 FcRn 수용체 사이의 상호작용에 관여하는 것으로 동정된 아미노산 잔기를 변형(예를 들면, 치환, 결실, 또는 부가)시킴으로써 생성될 수 있다(참조: 예를 들면, 국제공보 WO 97/34631; WO 04/029207; U.S.P.N. 6,737,056 및 U.S.P.N. 2003/0190311). 이러한 양태와 관련하여, Fc 변이체는 포유동물, 바람직하게 인간에서 5일 초과, 10일 초과, 15일 초과, 바람직하게 20일 초과, 25일 초과, 30일 초과, 35일 초과, 40일 초과, 45일 초과, 2개월 초과, 3개월 초과, 4개월 초과 또는 5개월 초과의 반감기를 제공할 수 있다. 증가된 반감기는 높은 혈청 역가를 유도하고, 이는 따라서 항체의 투여 빈도를 감소시키고/시키거나 투여되는 항체의 농도를 감소시킨다. 생체내 인간 FcRn에 대한 결합 및 인간 FcRN 고친화성 결합 폴리펩티드의 혈청 반감기는 예를 들면, 유전자도입 마우스 또는 인간 FcRn을 발현하는 형질감염된 인간 세포주, 또는 변이체 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드가 투여되는 영장류에서 검정될 수 있다. WO 2000/42072에는 FcRn에 대한 결합을 개선시키거나 감소시킨 항체 변이체가 기재되어 있다. 예를 들면, 문헌(참조: Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001))을 참조한다.
다른 양태에서, Fc 변경은 ADCC 또는 CDC 활성을 개선시키거나 감소시킬 수 있다. 당해 기술 분야에 공지되어 있는 바와 같이, CDC는 보체의 존재하에 표적 세포의 용해를 의미하고, ADCC는 특정 세포독성 세포(예: 자연 사멸 세포, 호중구 및 마크로파지) 상에 존재하는 FcR 위에 결합된 분비된 Ig는 이러한 세포독성 효과기 세포가 항원-포함 표적 세포에 특이적으로 결합할 수 있게 하고, 후속적으로 세포독소를 갖는 표적 세포를 사멸시킬 수 있는 세포독성의 형태를 의미한다. 본 발명의 맥락에서, 항체 변이체는 "변경된" FcR 결합 친화성이 제공되고, 이는 천연 서열 FcR을 포함하는 항체 또는 모체 또는 비변형 항체와 비교하여, 개선되거나 감소된 결합을 가진다. 감소된 결합을 나타내는 상기 변이체는 당해 기술 분야에 잘 알려진 기술에 의해 측정되는 바와 같이, 천연 서열과 비교하여, FcR에 대하여 약한 또는 거의 인지할 수 없는 결합, 예를 들면, 0-20% 결합을 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 변이체는 천연 면역글로불린 Fc 도메인과 비교하여, 개선된 결합을 나타낼 것이다. 이러한 종류의 Fc 변이체는 개시된 항체의 효과적인 항-종양성 특성을 개선시키기 위해 유리하게 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 또 다른 양태에서, 상기 변경은 결합 친화성을 증가시키고, 면역원성을 감소시키며, 생산성을 증가시키고, 글리코실화 및/또는 디설파이드 결합(예를 들면, 접합 부위)을 변경하고, 결합 특이성을 변형시키고, 식균 작용을 증가시키고/증가시키거나; 세포 표면 수용체(예: B 세포 수용체; BCR)를 하향 조절한다.
d. 변경된 글리코실화
또 다른 양태는 1개 이상의 조작된 글리코형, 즉 단백질에 공유결합된 변경된 탄수화물 조성물 또는 변경된 글리코실화 패턴을 포함하는 DLL3 조절인자를 포함한다. 예를 들면, 문헌(참조: Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740)을 참고한다. 조작된 글리코형은 효과기 기능을 개선시키거나 감소시키고, 표적에 대한 조절인자의 친화성을 증가시키거나 조절인자의 생성을 촉진시키는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 여러 목적에 유용할 수 있다. 감소된 효과기 기능을 목적으로 하는 특정 양태에서, 분자는 비글리코실화 형태를 발현하도록 조작될 수 있다. 1개 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위를 제거하여, 그 부위에서의 글리코실화를 제거할 수 있는 치환은 익히 공지되어 있다(참조: 예를 들면, U.S.P.N. 5,714,350 및 6,350,861). 역으로, 개선된 효과기 기능 또는 개선된 결합은 1개 이상의 추가의 글리코실화 부위에서 조작함으로써 Fc 함유 분자에 부여될 수 있다.
다른 양태는 감소된 양의 푸코실 잔기를 갖는 하이포푸코실화(hypofucosylated) 항체 또는 증가된 2등분 GlcNAc 구조를 갖는 항체와 같은 변경된 글리코실화 조성을 갖는 Fc 변이체를 포함한다. 상기 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증되었다. 조작된 글리코형은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들면 조작된 또는 변이체 발현 균주를 사용함으로써, 1개 이상의 효소(예: N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III(GnTI11))와 함께 동시-발현시킴으로써, 여러 유기체의 Fc 영역 또는 여러 유기체로부터의 세포주를 포함하는 분자를 발현시킴으로써, 또는 Fc 영역을 포함하는 분자가 발현된 후, 탄수화물(들)을 변형시킴으로써 생성될 수 있다(참조: 예를 들면, WO 2012/117002).
e. 추가 처리
조절인자는, 예를 들면, 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단 그룹에 의한 유도체화, 단백질분해 절단, 항체 분자 또는 다른 세포상 리간드에 대한 결합 등에 의해 제조 중에 또는 제조 후에 별도로 변형시킬 수 있다. 임의의 수많은 화학적 변형은 시아노겐 브로마이드, 트립신, 키모트립신, 파파인, V8 프로테아제, NaBH4에 의한 특정의 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 산화, 환원, 튜니카마이신의 존재하의 대사 합성을 포함하지만 이에 제한되지 않는 공지된 기술에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 포함되는 다양한 번역후 변형은, 예를 들면, N-연결된 또는 O-연결된 탄수화물 쇄, N-말단 또는 C-말단 단부의 처리, 아미노산 골격에 화학적 잔기의 부착, N-연결된 또는 O-연결된 탄수화물 쇄들의 화학적 변형, 및, 원핵 숙주 세포 발현의 결과로서 N-말단 메티오닌 잔기의 부가 및 결실을 포함한다. 게다가, 조절인자는 조절인자의 검출 및 단리를 가능하게 하기 위해, 효소, 형광, 방사성동위원소 또는 친화성 표지와 같은 검출가능한 표지에 의해 변형시킬 수도 있다.
6. 항체 특성
수득된 방법이 무엇이든, 또는 조절인자가 상기 형태 중 어떤 형태를 취했는지와 무관하게, 개시된 조절인자의 다양한 양태는 특정의 특성을 나타낼 수 있다. 선택된 양태에서, 항체-생성 세포(예: 하이브리도마 또는 효모 콜로니)는 강력한 성장, 높은 조절인자 생산성 및 하기 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 바람직한 조절인자 특성을 포함하는 바람직한 특성을 위해, 선택되고, 클로닝되고 추가로 스크리닝될 수 있다. 다른 경우에, 조절인자의 특성은 동물의 접종을 위한 표적 항원의 면역반응성 단편 또는 특정 항원(예: 특이적 DLL3 이소형)을 선택함으로써 부여되거나 영향을 받을 수 있다. 또 다른 양태에서, 선택된 조절인자는 친화성 또는 약동학과 같은 면역화학적 특성을 향상시키거나 개량하기 위해 상기한 바와 같이 조작할 수 있다.
a. 중화 항체
특정 양태에서, 접합체는 "중화" 항체 또는 이의 유도체 또는 단편을 포함할 것이다. 즉, 본 발명은 특정 도메인, 모티프 또는 에피토프를 결합하고, DLL3의 생물학적 활성을 차단하고, 감소시키거나 억제할 수 있는 항체 분자를 포함할 수 있다. 보다 일반적으로, 용어 "중화 항체"는 표적 분자 또는 리간드에 결합하거나 이와 상호작용하고, 수용체 또는 기질과 같은 결합 파트너에 표적 분자의 결합 또는 연관을 방해함으로써, 다르게는 분자들의 상호작용으로부터 생성되는 생물학적 반응을 차단하는 항체를 의미한다.
당해 기술 분야에 공지된 경쟁적 결합 검정은 항체 또는 면역학적으로 기능성 단편 또는 이의 유도체의 결합 및 특이성을 평가하기 위해 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명과 관련하여, 항체 또는 단편은 노치 수용체 활성에 의해 또는 시험관내 경쟁적 결합 검정으로 측정되는 바와 같이, 과량의 항체가 DLL3에 결합된 결합 파트너의 양을 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 그 이상까지 감소시킬 때, 결합 파트너 또는 기질에 대한 DLL3의 결합을 억제하거나 감소시키기 위해 유지시킬 것이다. DLL3에 대한 항체의 경우, 중화 항체 또는 길항제는 바람직하게는 노치 수용체 활성을 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 그 이상까지 변경시킬 것이다. 이 변형된 활성은 당해 기술 분야에서 인지된 기술을 사용하여 직접 측정될 수 있거나, 변경된 활성이 하류(예: 종양형성, 세포생존 또는 노치 반응성 유전자의 활성화 또는 억제)를 갖는다는 영향에 의해 측정할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 바람직하게는, DLL3 활성을 중화시키는 항체의 능력은 노치 수용체에 대한 DLL3 결합을 억제함으로써, 또는 노치 신호전달의 DLL3 매개 억제를 경감시키는 능력을 평가함으로써 평가된다.
b. 내재화 항체
발현된 DLL3 단백질의 실질적인 부분은 종양형성성 세포 표면과 연관된 채로 유지되고, 이에 의해 개시된 조절인자의 국소화 및 내재화를 가능하게 한다는 증거가 있다. 바람직한 양태에서, 이러한 조절인자는 내재화시 세포를 사멸시키는 세포독성 잔기와 같은 항암제와 연관되거나 이에 접합될 수 있다. 특히 바람직한 양태에서, 조절인자는 내재화 항체 약물 접합체를 포함할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이 "내재화하는" 조절인자는 연관된 항원 또는 수용체에 결합시 세포에 의해 (임의의 페이로드와 함께) 흡수되는 것이다. 이해되고 있는 바와 같이, 내재화 조절인자는 바람직한 양태에서, 항체 접합체 뿐만 아니라 항체 단편 및 이의 유도체를 포함하는 항체를 포함한다. 내재화는 시험관내 또는 생체내에서 일어날 수 있다. 치료적 용도를 위해, 내재화는 바람직하게는 이를 필요로 하는 대상체의 생체내에서 일어날 것이다. 내재화된 항체 분자의 수는 항원-발현 세포, 특히 항원-발현 암 줄기 세포를 사멸시키기에 충분하거나 적당할 수 있다. 일부 경우에, 항체 또는 항체 접합체의 효능에 따라, 단일 항체 분자의 세포로의 흡수는 항체가 결합하는 표적 세포를 사멸시키기 위해 충분하다. 예를 들면, 특정의 독소는 매우 강력해서, 항체에 접합된 독소 몇 분자의 내재화가 종양 세포를 사멸시키기에 충분하다. 포유동물 세포에 결합시 항체가 내재화하는지의 여부는 하기 실시예에 기재된 것들을 포함하는 다양한 당해 기술 분야에 인지된 검정에 의해 측정될 수 있다. 항체가 세포로 내재화하는지의 여부를 검출하는 방법은 또한 전문이 본원에 참조로 인용된 U.S.P.N. 7,619,068에 기재되어 있다.
c. 고갈성 항체
다른 양태에서, 항체는 고갈성 항체 또는 이의 유도체 또는 단편을 포함할 것이다. 용어 "고갈성" 항체는 바람직하게는 세포 표면 상에서 또는 부근에서 항원과 결합하거나 연관되고, (예를 들면, CDC, ADCC 또는 세포독성제의 도입에 의한) 세포의 사망 또는 제거를 유도, 촉진 또는 유발하는 항체를 의미한다. 일부 양태에서, 선택된 고갈성 항체는 세포독성제에 연관되거나 접합될 것이다.
바람직하게는, 고갈성 항체는 정의된 세포 집단 내의 DLL3 종양형성성 세포의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 99%를 제거, 무력화, 제거 또는 사멸시킬 수 있을 것이다. 일부 양태에서, 세포 집단은 증대된, 단편화된, 정제된 또는 단리된 종양 영속화 세포를 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 세포 집단은 종양 영속화 세포를 포함하는 이질성 종양 추출물 또는 전체 종양 샘플을 포함할 수 있다. 당업자는 하기 실시예(예: 실시예 8 내지 10)에 기재된 표준 생화학적 기술이 본원 교시에 따라 종양 형성성 세포 또는 종양 영속화 세포의 고갈을 모니터링하고 정량화하는데 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
d. 비닝 (binning) 및 에피토프 맵핑
개시된 항-DLL3 항체 조절인자가 선택된 표적 또는 이의 단편에 의해 제공된 별도의 에피토프 또는 면역원성 결정인자와 연관되거나 이에 결합할 것임이 추가로 이해될 것이다. 특정 양태에서, 에피토프 또는 면역원성 결정인자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 그룹 또는 설포닐 그룹과 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹화를 포함하고, 특정 양태에서, 특이적인 3차원 구조적 특성 및/또는 특정 전하 특성을 가질 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합하거나, 그렇지 않으면 분자와 상호작용할 수 있는 임의의 단백질 결정인자를 포함한다. 특정 양태에서, 항체는 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물에서 이의 표적 항원을 우선적으로 인지할 때, 항원과 특이적으로 결합(또는 면역특이적으로 결합 또는 반응)하는 것이라고 한다. 바람직한 양태에서, 항체는 평형 해리 상수(KD)가 10-6M 이하 또는 10-7M 이하일 때, 보다 바람직하게는 평형 해리 상수가 10-8M 이하, 보다 더 바람직하게는 평형 해리 상수가 10-9M 이하일 때 항원에 특이적으로 결합한다고 한다.
보다 직접적으로, 용어 "에피토프"는 이의 일반적인 생화학적 의미로 사용되고, 특정 항체 조절인자에 의해 인지되고, 특이적으로 결합될 수 있는 표적 항원의 일부를 의미한다. 항원이 DLL3과 같은 폴리펩티드일 경우, 에피토프는 인접한 아미노산 및 단백질의 삼차 폴딩(folding)에 의해 병치된 비인접한 아미노산 둘 다로부터 일반적으로 형성될 수 있다("입체구조적 에피토프"). 상기 입체구조적 에피토프에서, 상호작용의 지점은 서로 선형으로 분리된 단백질 상에서 아미노산 잔기를 교차하여 일어난다. 인접한 아미노산으로부터 형성된 에피토프(때로 "선형" 또는 "연속성" 에피토프로서 지칭됨)는 전형적으로 단백질 변성시에 보유되는 반면, 삼차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 단백질 변성시에 손실된다. 아무튼, 항체 에피토프는 전형적으로 독특한 공간적 입체구조 내에 적어도 3개, 보다 일반적으로 적어도 5개 또는 8개 내지 10개의 아미노산을 포함한다.
이와 관련하여, 특정 양태에서 에피토프는 DLL3 단백질의 1개 이상의 영역, 도메인 또는 모티프(예: 이소형 1의 아미노산 1-618)와 연관되거나 이에 존재할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 본원에서 보다 상세히 논의된 바와 같이, DLL3 단백질의 세포외 영역은 6개의 EGF-유사 도메인 및 DSL 도메인을 포함하는 일련의 일반적으로 인지된 도메인을 포함한다. 본 개시의 목적을 위해, 용어 "도메인"은 일반적으로 허용된 의미에 따라서 사용될 것이며, 독특한 2차 구조 함량을 나타내는 단백질 내의 식별가능하거나 정의가능한 보존된 구조적 실체를 의미하기 위해 유지될 것이다. 많은 경우에, 일반적인 기능을 갖는 상동성 도메인은 일반적으로 서열 유사성을 나타내며, 다수의 이종 단백질에서 발견될 것이다(예를 들면, EGF-유사 도메인은 보고에 따르면 적어도 471개의 상이한 단백질에서 발견된다). 유사하게, 당해 분야에 인지된 용어 "모티프"는 이의 일반적인 의미에 따라 사용될 것이며, 전형적으로 10 내지 20개의 인접한 아미노산 잔기인 단백질의 짧은 보존 영역을 의미할 것이다. 전체적으로 논의된 바와 같이, 선택된 양태는 DLL3의 특정 영역, 도메인 또는 모티프내의 에피토프와 연관되거나 이에 결합하는 조절인자를 포함한다.
아무튼, 항원 상의 목적하는 에피토프가 결정되면, 본 발명에서 기재된 기술을 사용하여 에피토프를 포함하는 펩티드로 면역화함으로써, 그 에피토프에 대한 항체를 생성시킬 수 있다. 또는, 발견 과정 중에, 항체의 생성 및 특성확인은 특정 도메인 또는 모티프 내에 위치된 바람직한 에피토프에 대한 정보를 설명할 수 있다. 이 정보로부터, 동일한 에피토프에 결합하기 위한 항체를 경쟁적으로 스크리닝할 수 있다. 이를 달성하기 위한 접근법은 서로 경쟁적으로 결합하는 항체, 즉 항원에 결합하기 위해 경쟁하는 항체를 발견하기 위한 경쟁 연구를 수행하는 것이다. 교차-경쟁에 근거한 항체의 비닝을 위한 고처리량 방법은 WO 03/48731에 기재되어 있다. 효모 상의 항원 단편 발현 또는 조절인자 경쟁을 포함하는 에피토프 맵핑 또는 비닝 또는 도메인 수준의 다른 방법은 하기 실시예에 기재되어 있다.
본원에 사용된 용어 "비닝"은 그들의 항원 결합 특성 및 경쟁에 기초하여 항체를 그룹화 또는 분류하기 위해 사용되는 방법을 의미한다. 이 기술은 본 발명의 조절인자를 정의하고 분류하기 위해 유용한 반면, 빈은 에피토프와 항상 직접 상관되지는 않고, 에피토프 결합의 상기 초기 결정은 본원에 기재된 다른 기술 분야-인지된 방법론에 의해 추가로 개선되고 확인될 수 있다. 그러나, 하기 실시예에서 논의되고 나타낸 바와 같이, 각각의 빈에 대한 항체 조절인자의 경험적 할당은 개시된 조절인자의 치료적 잠재력의 지표일 수 있는 정보를 제공한다.
보다 구체적으로, 당해 기술 분야에 공지되고, 본원의 실시예에 개시된 방법을 사용하여, 선택된 기준 항체 (또는 이의 단편)가 동일한 에피토프에 결합하는지 또는 2차 시험 항체와 결합하기 위해 교차 경쟁하는지의 여부를 측정할 수 있다. 하나의 양태에서, 기준 항체 조절인자는 포화 조건 하에 DLL3 항원과 연관되고, DLL3에 결합하는 2차 또는 시험 항체 조절인자의 능력은 표준 면역화학적 기술을 사용하여 측정된다. 시험 항체가 기준 항-DLL3 항체와 동시에 DLL3에 실질적으로 결합할 수 있다면, 2차 또는 시험 항체는 1차 또는 기준 항체와 다른 에피토프에 결합한다. 그러나, 시험 항체가 동시에 DLL3과 실질적으로 결합할 수 없다면, 시험 항체는 동일한 에피토프, 오버랩핑 에피토프, 또는 1차 항체에 의해 결합된 에피토프에 (적어도 입체적으로) 근접한 에피토프에 결합한다. 즉, 시험 항체는 항원 결합을 위해 경쟁하고, 기준 항체로서 동일한 빈에 존재한다.
용어 "경쟁하다" 또는 "경쟁 항체"는 개시된 조절인자의 맥락으로 사용될 때, 시험하의 시험 항체 또는 면역학적 기능성 단편이 일반적인 항원에 대한 기준 항체의 특이적 결합을 방해하거나 억제하는 검정에 의해 측정된, 항체 사이의 경쟁을 의미한다. 전형적으로, 이러한 검정은 비표지된 시험 면역글로불린 및 표지된 기준 면역글로불린 중 하나를 함유하는 고체 표면 또는 세포에 결합된 정제 항원(예: DLL3 또는 도메인 또는 이의 단편)의 사용을 포함한다. 경쟁적 억제는 시험 면역글로불린의 존재하에서 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정함으로써 측정된다. 일반적으로, 시험 면역글로불린은 과량으로 존재하고/하거나 첫번째로 결합된다. 경쟁 분석법(경쟁 항체들)에 의해 동정된 항체는 발생할 입체 장해를 위해 기준 항체에 의해 결합된 에피토프에 충분히 근접한 인접 에피토프에 결합하는 기준 항체 및 항체로서 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다. 경쟁적 결합을 측정하기 위한 방법에 관련된 추가의 상세한 설명은 본원 실시예에 제공된다. 일반적으로, 경쟁 항체가 과량으로 존재할 때, 이는 일반 항원에 대한 기준 항체의 특이적 결합을 적어도 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 75%까지 억제할 것이다. 일부 경우에, 결합은 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 97% 또는 그 이상까지 억제된다.
역으로, 기준 항체가 결합될 때, 이는 바람직하게는 이후에 첨가된 시험 항체(즉, DLL3 조절인자)의 결합을 적어도 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 75%까지 억제할 것이다. 일부 경우에, 시험 항체의 결합은 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 97% 또는 그 이상까지 억제된다.
본 발명과 관련하여, 그리고 하기 실시예에 개시된 바와 같이, DLL3의 세포외 도메인이 본원에서 "빈 A" 내지 "빈 I"로 지칭되는 경쟁적 결합에 의해 적어도 9개의 빈을 정의한다는 것이 (표면 플라스몬 공명 또는 바이오-층 간섭법을 통해) 측정되었다. 조절인자 비닝 기술에 의해 제공된 해상도를 고려해 볼 때, 이러한 9개의 빈은 DLL3 단백질의 세포외 영역내에 존재하는 대다수의 빈을 포함한다고 간주된다.
이와 관련하여, 그리고 당해 기술 분야에 공지되고 하기 실시예에서 상세화된 바와 같이, 목적하는 비닝 또는 경쟁적 결합 데이터는 고체상 직접적 또는 간접적 방사면역검정법(RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소 면역검정법(EIA 또는 ELISA), 샌드위치 경쟁 검정법, Biacore™ 2000 시스템(즉, 표면 플라스몬 공명-GE Healthcare), ForteBio® 분석기(즉, 바이오-층 간섭법-ForteBio, Inc.) 또는 유동 세포분석 방법론을 사용하여 수득할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "표면 플라스몬 공명"은 바이오센서 매트릭스내 단백질 농도 변화를 검출함으로써, 실시간 특이적 상호작용의 분석을 가능하게 하는 광학 현상을 의미한다. 용어 "바이오-층 간섭법"은 바이오센서 팁 상의 고정 단백질 층 및 내부 참조층의 두 층들로부터 반사된 백색 광의 간섭 패턴을 분석하는 광학적 분석 기술을 의미한다. 바이오센서 팁에 결합된 분자 수의 임의의 변화는 실시간 측정될 수 있는 간섭 패턴의 이동을 야기한다. 특히 바람직한 양태에서, 분석(표면 플라스몬 공명, 바이오-층 간섭법 또는 유동 세포 분석법)은 하기 실시예에서 입증된 바와 같이 Biacore 또는 ForteBio 장비 또는 유동 세포 분석기(예: FACSAria II)를 사용하여 수행된다.
개시된 DLL3 항체 조절인자가 연관되거나 결합하는 에피토프를 추가로 특성확인하기 위해, 도메인-수준 에피토프 맵핑은 문헌(참조: 본원에 참조로 인용된 Cochran et al., (J Immunol Methods. 287 (1-2):147-158 (2004)))에 의해 기재된 프로토콜의 변형을 사용하여 수행되었다. 간단히 말하면, 특정 아미노산 서열을 포함하는 DLL3의 각각의 도메인은 효모 표면 상에서 발현되었으며, 각각의 DLL3 항체에 의한 결합은 유동 세포분석법을 통해 측정되었다. 결과는 하기 실시예 6에 논의되어 있고, 도 4에 제시된다.
다른 적합한 에피토프 맵핑 기술은 알라닌 스캐닝 돌연변이, 펩티드 블롯(참조: Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63)(전문이 본원에 참조로 인용됨), 또는 펩티드 절단 분석을 포함한다. 또한, 에피토프 적출, 에피토프 추출 및 항원의 화학적 변형과 같은 방법이 사용될 수 있다(참조: Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496)(전문이 구체적으로 본원에 참조로 인용됨). 다른 양태에서, 항원구조-기반 항체 프로파일링(ASAP)으로서 공지되기도 한 변형-보조 프로파일링(MAP)은, 화학적으로 또는 효소적으로 변형된 항원 표면에 대한 각 항체의 결합 프로필의 유사성에 따라 동일한 항원에 대한 대다수의 모노클로날 항체(mAb)를 분류하는 방법을 제공한다(U.S.P.N. 2004/0101920, 전문이 구체적으로 본원에 참조로 인용됨). 각 카테고리는 다른 카테고리에 의해 나타낸 에피토프와 뚜렷하게 상이하거나, 또는 부분적으로 오버랩핑된 독특한 에피토프를 반영할 수 있다. 이 기술은 유전적으로 동일한 항체를 신속하게 여과시켜, 특성확인이 유전적으로 구별되는 항체 상에서 집중될 수 있도록 한다. MAP가 본 발명의 hDLL3 항체 조절인자를 다른 에피토프를 결합하는 항체의 그룹으로 분류하는데 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
고정된 항원의 구조를 변경시키기 위해 유용한 제제는 단백질분해 효소(예: 트립신, 엔도프로테이나제 Glu-C, 엔도프로테이나제 Asp-N, 키모트립신 등)와 같은 효소를 포함한다. 고정된 항원의 구조를 변경시키기 위해 유용한 제제는 또한 화학적 제제, 예를 들면, 석신이미딜 에스테르 및 이들의 유도체, 1급 아민-함유 화합물, 하이드라진 및 카보하이드라진, 유리 아미노산 등일 수 있다.
항원 단백질은 바이오센서 칩 표면 또는 폴리스티렌 비드 상에서 고정될 수 있다. 후자는, 예를 들면, 멀티플렉스 LUMINEX™ 검출 검정(Luminex Corp.)과 같은 검정으로 처리될 수 있다. 100개 이하의 다른 종류의 비드에 의해 멀티플렉스 분석을 취급하는 LUMINEX의 용량 때문에, LUMINEX는 다양하게 변형된 거의 무제한의 항원 표면을 제공하여, 바이오센서 검정 동안 항체 에피토프 프로파일링에서 개선된 해상도를 유도한다.
e. 결합 친화성
에피토프 특이성 이외에, 개시된 항체는, 예를 들면, 결합 친화성과 같은 물리적 특성을 사용하여 특성확인할 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명은 1개 이상의 DLL3 이소형, 또는 팬(pan)-항체의 경우, DLL 패밀리의 1개 이상의 구성원에 대해 높은 결합 친화성을 갖는 항체의 사용을 추가로 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, IgG 항체에 대한 용어 "높은 친화성"은 표적 항원에 대해 10-8M 이하, 보다 바람직하게는 10-9M 이하, 더욱 더 바람직하게는 10-10M 이하의 KD를 갖는 항체를 의미한다. 그러나, "높은 친화성" 결합은 다른 항체 아이소타입에 대해 변할 수 있다. 예를 들면, IgM 아이소타입에 대한 "높은 친화성" 결합은 10-7M 이하, 더욱 바람직하게는 10-8M 이하, 더욱 더 바람직하게는 10-9M 이하의 KD를 갖는 항체를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "KD"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 의미하고자 의도된다. 본 발명의 항체는 해리 상수 KD(koff/kon)가 10-7M 이하일 때 이의 표적 항원에 면역특이적으로 결합한다고 한다. 항체는 KD가 5x10-9M 이하일 때 항원에 높은 친화성으로, 그리고 KD가 5x10-10M 이하일 때는 더 높은 친화성으로 특이적으로 결합한다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체는 10-9M 이하의 KD 및 약 1x10-4/sec의 오프-속도(off-rate)를 갖는다. 본 발명의 하나의 양태에서, 오프-속도는 1x10-5/sec 미만이다. 본 발명의 다른 양태에서, 항체는 약 10-7M 내지 10-10M의 KD를 갖는 DLL3에 결합할 것이고, 또 다른 양태에서, 이는 2x10-10M 이하의 KD로 결합할 것이다. 본 발명의 또 다른 선택된 양태는 10-2M 미만, 5x10-2M 미만, 10-3M 미만, 5x10-3M 미만, 10-4M 미만, 5x10-4M 미만, 10-5M 미만, 5x10-5M 미만, 10-6M 미만, 5x10-6M 미만, 10-7M 미만, 5x10-7M 미만, 10-8M 미만, 5x10-8M 미만, 10-9M 미만, 5x10-9M 미만, 10-10M 미만, 5x10-10M 미만, 10-11M 미만, 5x10-11M 미만, 10-12M 미만, 5x10-12M 미만, 10-13M 미만, 5x10-13M 미만, 10-14M 미만, 5x10-14M 미만, 10-15M 미만 또는 5x10-15M 미만의 해리 상수 또는 KD(koff/kon)를 갖는 항체를 포함한다.
특정 양태에서, DLL3에 면역특이적으로 결합하는 본 발명의 항체는 적어도 105M-ls-l, 적어도 2x105M- ls-l, 적어도 5x105M- ls-l, 적어도 106M- ls-l, 적어도 5x106M- ls-l, 적어도 107M- ls-l, 적어도 5x107M-ls-l 또는 적어도 108M- ls- l 의 결합 속도 상수 또는 k on (또는 k a ) 속도 (DLL3 (Ab) + 항원 (Ag)k on←Ab-Ag)를 갖는다.
또 다른 양태에서, DLL3에 면역특이적으로 결합하는 본 발명의 항체는 10- ls-l 미만, 5x10- ls-l 미만, 10-2s-l 미만, 5x10-2s-l 미만, 10-3s-l 미만, 5x10-3s-l 미만, 10-4s-l 미만, 5x10-4s-l 미만, 10-5s-l 미만, 5x10-5s-l 미만, 10-6s-l 미만, 5x10-6s-l 미만, 10-7s-l 미만, 5x10-7s-l 미만, 10-8s-l 미만, 5x10-8s-l 미만, 10-9s-l 미만, 5x10-9s-l 미만 또는 10-10s-l 미만의 해리 속도 상수 또는 k off (또는 k d ) 속도 (DLL3 (Ab) + 항원 (Ag)k off←Ab-Ag)를 갖는다.
본 발명의 다른 선택된 양태에서, 항-DLL3 항체는 적어도 102M-1, 적어도 5x102M-1, 적어도 103M-1, 적어도 5x103M-1, 적어도 104M-1, 적어도 5x104M-1, 적어도 105M-1, 적어도 5x105M-1, 적어도 106M-1, 적어도 5x106M-1, 적어도 107M-1, 적어도 5x107M-1, 적어도 108M-1, 적어도 5x108M-1, 적어도 109M-1, 적어도 5x109M-1, 적어도 1010M-1, 적어도 5x1010M-1, 적어도 1011M-1, 적어도 5x1011M-1, 적어도 1012M-1, 적어도 5x1012M-1, 적어도 1013M-1, 적어도 5x1013M-1, 적어도 1014M-1, 적어도 5x1014M-1, 적어도 1015M-1 또는 적어도 5x1015M-1의 친화성 상수 또는 Ka(kon/koff)를 가질 것이다.
상기한 조절인자 특성 이외에, 본 발명의 항체는, 예를 들면, 열 안정성(즉, 융점; Tm) 및 등전점을 포함하는 추가의 물리적 특성들을 사용하여 추가로 특성확인할 수 있다(참조: 예를 들면, Bjellqvist et al., 1993, Electrophoresis 14:1023; Vermeer et al., 2000, Biophys. J. 78:394-404; Vermeer et al., 2000, Biophys. J. 79: 2150-2154, 이들 각각은 본원에 참조로 인용된다).
V. 항체 약물 접합체 및 약물-링커 잔기
본 발명의 DLL3 접합체는 링커 잔기를 통해 PBD 약물 페이로드에 공유결합된DLL3 세포 결합제를 포함한다. 본원에 논의된 바와 같이, 본 발명의 DLL3 접합체는 표적 위치(예: 종양형성성 세포)에서 PBD 1, PBD 2, PBD 3, PBD 4 또는 PBD 5 중의 어느 하나를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 이는 결합된 약물 페이로드를, 약물 페이로드를 방출하고 활성화시키기 전에 비교적 비반응성의 무독성 상태로, 표적 부위로 지시하는 개시된 ADC에 의해 유리하게 달성된다. 이러한 독성 페이로드의 표적화된 방출은 주로 ADC가 종양형성성 세포에 도달할 때까지 절단되어 세포독성 이량체 PBD를 방출시키지 않도록 제조된 약물-링커 화합물 DL 1-5에 도입된 링커를 통해 달성된다. 이는 유리하게는 비표적화 세포 및 조직의 노출은 최소화하면서 종양 부위에 비교적 높은 수준의 활성 PBD 약물을 제공한다.
1. 링커 화합물
보다 구체적으로, 개시된 ADC에 도입된 링커는 바람직하게 세포외적으로 안정하고, ADC 분자들의 응집을 억제하고, 수성 매질 및 단량체 상태에서 ADC가 자유롭게 가용성이도록 유지해준다. 세포로의 수송 또는 전달 전에, 항체-약물 접합체(ADC)는 바람직하게는 안정하며, 온전하게 잔류하고, 즉 항체가 약물 물질에 결합된 상태로 존재한다. 링커는 표적 세포 외부에서 안정하지만, 그들은 세포내에서 일부 유효 비율로 절단되도록 설계된다. 따라서, 효과적인 링커는 (i) 항체의 특이적 결합 특성을 유지하고; (ii) 접합체 또는 약물 잔기의 세포내 전달을 가능하게 하고; (iii) 접합체가 그의 표적 부위로 전달 또는 수송될 때까지 안정하고 온전하게 잔류하며, 즉 절단되지 않고; (iv) PBD 약물 잔기의 세포독성, 세포-사멸 효과 또는 세포 증식 억제 효과를 유지할 것이다. ADC의 안정성은 질량분석법, HPLC 및 분리/분석 기술 LC/MS와 같은 표준 분석 기술에 의해 측정될 수 있다. 항체 및 약물 잔기의 공유결합은 2개의 반응성 작용성 그룹을 갖는, 즉 반응성 면에서 2가를 갖는 링커를 필요로 한다. 펩티드, 핵산, 약물, 독소, 항체, 합텐 및 리포터 그룹과 같은 2개 이상의 작용성 또는 생물학적 활성 잔기를 결합시키는데 유용한 2가 링커 시약이 공지되어 있고, 방법은 그들의 생성되는 접합체를 기재하고 있다(참조: Hermanson, G.T. (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: New York, p 234-242).
이를 위해, 본 발명의 DLL3 ADC는 세포내 환경(예: 리소좀 또는 엔도솜 또는 포낭내)에 존재하는 절단제에 의해 절단가능한 링커를 포함한다. ADC 1-5의 경우에, 링커는 리소좀 또는 엔도솜 프로테아제를 포함하나, 이에 한정되지 않는 세포내 펩티다제 또는 프로테아제 효소에 의해 절단되는 펩티딜 링커를 포함한다. 특정 양태에서, 펩티딜 링커는 바람직하게는 적어도 2개의 아미노산 길이 또는 다른 양태에서, 적어도 3개의 아미노산 길이이다. 절단제는 카텝신 B 및 D 및 플라스민을 포함할 수 있으며, 이들 각각은 디펩티드 약물 유도체를 가수분해시켜 표적 세포 내부로 활성 약물을 방출시키는 것으로 공지되어 있다. 개시된 약물-링커 잔기 DL1-DL5에서, 세포내 프로테아제에 의해 절단가능한 펩티딜 링커는 발린-알라닌 디펩티드 잔기이다. 치료제의 세포내 단백질분해 방출을 사용하는 하나의 이점은, 당해 제제가 접합될 때 전형적으로 약화되고, 접합체의 혈청 안정성이 전형적으로 높다는 점이다.
효소 절단가능한 디펩티드 단위 이외에, ADC 1-5 (또는 DLD1-DL5) 각각에서 발견된 개시된 링커는 스페이서 단위, 약물-링커를 세포 결합제에 연결하는 결합 잔기, 및 적어도 DL4 및 DL5의 경우에, 링커의 절단시 PBD 약물의 깨끗한 절단을 제공하는 자기 희생 잔기(self-immolative moiety)를 포함한다. 자기 희생 잔기와 관련하여, DL4 및 DL5는 모두 동일 잔기를 도입한다. 이를 위해, 자기 희생 링커와 디펩티드는 함께 이하 예시되는 그룹 -NH-Val-Ala-CO-NH-PABC-를 형성한다:
Figure pct00017
상기 식에서, 별표는 선택된 PBD 세포독성 잔기에 대한 결합점을 나타내고, 파선은 항체에 접합될 수 있는 링커(예: 스페이서-항체 결합 절편)의 나머지 부분에 대한 결합점을 나타낸다. 디펩티드의 효소 절단시, 자기 희생 링커는 원격 부위가 활성화될 때 보호된 화합물(즉, 독성 PBD 이량체)의 깨끗한 방출을 이하 제시된 라인에 따라서 진행하도록 한다:
Figure pct00018
상기 식에서, L*는 지금 절단된 펩티딜 단위를 포함하는 링커의 나머지 부분의 활성화 형태이다. PBD 4 및 PBD 5의 깨끗한 방출은 그들이 목적한 독성 활성을 유지시킬 것임을 보장한다.
이하 보다 상세히 논의되고 실시예 7에 개시된 바와 같이, 본 발명의 약물 링커는 반응성 티올 친핵체에 결합될 것이다. 항체는 DTT(디티올트레이톨)과 같은 환원제로 처리함으로써 링커 시약과의 접합에 반응성이도록 할 수 있다. 따라서, 각각의 시스테인 브릿지는 이론적으로 두 개의 반응성 티올 친핵체를 형성할 것이다. U.S.P.N. 7,521,541은 반응성 시스테인 아미노산을 도입시켜 항체를 조작함을 교시한다.
DL 1, DL 2, DL 3 및 DL 5에서, 세포 결합제와 약물-링커 잔기 사이의 연결은 세포 결합제의 티올 잔기와 링커 상에 존재하는 말단 말레이미드 그룹을 통해서이다. 이러한 양태에서, 세포 결합제와 약물-링커 사이의 연결은 다음과 같다:
Figure pct00019
상기 식에서, 별표는 약물-링커의 나머지 부분에 대한 결합점을 나타내고, 파선은 세포 결합제의 나머지 부분에 대한 결합점을 나타낸다. 이 양태에서, S 원자는 전형적으로 DLL3 항체로부터 유도된다.
DL4와 관련하여, 결합 잔기는 활성화 티올과 반응하여 목적하는 ADC 4를 제공할 수 있는 말단 요오도아세트아미드를 포함한다. 이하 실시예 7에 개시되어 있는 바와 같이, DL4의 바람직한 접합 절차는 다른 양태에서 발견된 말레이미드 결합 그룹의 바람직한 접합 절차와 약간 상이하다. 아무튼, 당업자는 개시된 약물-링커 화합물 각각을 본 개시의 관점에서 적합한 DLL3 조절인자와 용이하게 접합시킬 수 있다.
2. PBD 화합물
상기 논의되고 이하 실시예에 제시된 바와 같이, 개시된 PBD(바로 아래 도시됨) 각각은 본 발명의 ADC에 도입되는 잠재적인 후보이도록 하는 세포독성 특성을 나타낸다. DL 1-5 각각의 성분으로서 PBD 1-5 각각의 합성은 이하 실시예 1에 보다 상세히 제시된다. 본 개시의 관점에서, 본 발명의 ADC의 페이로드를 포함하는 독성 화합물은 용이하게 생성되어 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 링커의 절단시 ADC 1-5로부터 방출된 PBD 화합물은 바로 아래에 개시되어 있다:
Figure pct00020
종양 부위(들)에 이러한 화합물의 전달 및 방출은 본 개시에 따라서 증식성 장애를 치료하거나 관리하는데 임상적으로 효과적인 것으로 입증할 수 있다. 화합물과 관련하여, 개시된 PBD 각각은 각 C-환에 2개의 sp2 중심을 갖고, 이는 DNA의 최소 그루브에서 각 C-환에 단지 하나의 sp2 중심을 갖는 화합물보다 강한 결합 (및 따라서 더 큰 독성)을 가능하게 할 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 DLL3 ADC에 사용될 때, 개시된 PBD는 증식성 장애의 치료용으로 특히 효과적임을 입증할 수 있다.
3. 약물-링커 잔기
본원의 교시에 따라서, 개시된 PBD를 상기 개시된 바와 같은 링커와 결합하여 바로 아래 개시되어 있는 약물-링커 화합물 DL1-DL5를 제공할 것이다. 개시된 약물-링커 각각의 합성에 대한 상세한 프로토콜은 이하 실시예 1에 개시된다.
Figure pct00021
,
Figure pct00022
,
Figure pct00023
,
Figure pct00024
및
Figure pct00025
약물-링커 DL 1-5와 관련하여, DL 1, DL 2, DL 3 및 DL 5 각각은 화합물을 선택된 DLL3 항체와 접합시키는데 사용될 수 있는 말단 말레이미드 그룹을 포함한다는 것이 이해될 것이다. 역으로, DL 4는 PBD 페이로드를 표적화 항체에 접합시키는데 사용되는 말단 요오도아세트아미드 그룹을 포함한다. 특정 조건 하에, 요오도아세트아미드 잔기의 사용이 특정의 바람직하지 않은 부반응을 피하고, 강화된 ADC 안정성을 제공한다고 할 수 있다. 또한, DL 4 및 DL 5는 B 환 상의 N10 위치를 통해 DLL3 조절인자에 결합되는 PBD를 포함하는 반면, DL1, DL2 및 DL3은 C 환 상의 C2 위치를 통해 선택된 항체에 결합된다. N10 위치를 통해 결합하는 화합물과 관련하여, 링커가 페이로드의 깨끗한 분리를 보장하기 위해 PABC 자기 희생 잔기를 포함한다는 것이 추가로 주시될 것이다. 본 교시의 관점에서, 당업자는 DL (및 연관된 ADC)이 선택된 증식성 장애의 치료용으로 효과적인 것으로 입증될 것임을 용이하게 결정할 수 있다.
4. 화합물 특성
바로 아래 개시되어 있는 다음 양태 및 변형은 개시된 ADC, 약물 링커 및/또는 PBD에 적용가능하고, 명백하게 본 발명의 범위 내인 것으로 고려된다.
a. 용매화물
약물 링커, ADC 또는 PBD의 상응하는 용매화물을 제조하고, 정제하고/하거나 취급하는 것이 편리하거나 바람직할 수 있다. 용어 "용매화물"은 용질(예: 활성 화합물, 활성 화합물의 염)과 용매의 복합체를 의미하기 위해 통상적인 의미로 본원에 사용된다. 용매가 물이면, 용매화물은 수화물, 예를 들면, 일수화물, 이수화물, 삼수화물 등으로서 편리하게 지칭될 수 있다.
본 발명은, 용매가 PBD 잔기의 이민 결합을 교차하여 첨가되는 화합물을 포함하고, 이는 이하 예시되며, 여기서 용매는 물 또는 알콜(RAOH, 여기서 RA는 C1 -4 알킬이다)이다:
Figure pct00026
이러한 형태는 (상기 R10에 관한 단락에서 기재된 바와 같이) PBD의 카비놀아민 및 카비놀아민 에테르로 칭명될 수 있다. 이러한 평형의 균형은 잔기 그 자체의 성질 뿐만 아니라 화합물이 발견되는 조건에 의존한다.
b. 이성체
본 발명의 특정 화합물은 시스- 및 트랜스-형태; E- 및 Z-형태; c-, t- 및 r- 형태; 엔도- 및 엑소-형태; R-, S- 및 메소-형태; D- 및 L-형태; d- 및 l-형태; (+) 및 (-) 형태; 케토-, 에놀- 및 에놀레이트-형태; syn- 및 안티-형태; 향사상(synclinal)- 및 배시(anticlinal)-형태; α- 및 β-형태; 축방향 및 적도 형태; 보트-, 체어-, 트위스트-, 인벨로프- 및 하프체어-형태; 및 이의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 하나 이상의 기하, 광학, 에난티오머, 디아스테레오머, 에피머, 아트로프, 입체이성체, 토오토머, 형태 또는 아노머 형태로 존재할 수 있고, 이후 총제적으로 "이성체" (또는 "이성체 형태")로서 지칭된다.
용어 "키랄"은 거울상 파트너의 비포개짐성(non-superimposability) 특성을 갖는 분자를 의미하고, 용어 "어키랄"은 이들의 거울상 파트너에 포개질 수 있는 분자를 의미한다.
용어 "입체이성체"는 동일한 화학적 구성을 갖지만, 공간에서 원자 또는 그룹의 배열이 상이한 화합물을 의미한다.
"디아스테레오머"는 둘 이상의 키랄성 중심을 갖는 입체이성체를 의미하고, 이의 분자는 서로 거울상이 아니다. 디아스테레오머는 상이한 물리적 특성, 예를 들면, 융점, 비점, 분광 특성 및 반응성을 갖는다. 디아스테레오머의 혼합물은 전기영동 및 크로마토그래피와 같은 고해상도 분석 절차하에 분리시킬 수 있다.
"에난티오머"는 서로 비포개짐성 거울 상인 화합물의 두 입체이성체이다.
본원에 사용된 입체화학적 정의 및 규칙은 일반적으로 문헌(참조: S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; and Eliel, E. and Wilen, S., "Stereochemistry of Organic Compounds", John Wiley & Sons, Inc., New York, 1994)을 따른다. 본 발명의 화합물은 비대칭성 또는 키랄 중심을 함유할 수 있고, 따라서 상이한 입체이성체 형태로 존재한다. 디아스테레오머, 에난티오머 및 아트로프이성체 뿐만 아니라 이의 혼합물, 예를 들면, 라세미체 혼합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 본 발명의 화합물의 모든 입체이성체 형태는 본 발명의 일부를 형성하고자 한다. 많은 유기 화합물은 광학적으로 활성 형태로 존재한다. 즉, 이들은 평면-편광면을 회전하는 능력을 갖는다. 광학 활성 화합물을 기술하는데 있어서, 접두사 D 및 L, 또는 R 및 S는 이의 키랄 중심(들) 주위의 분자의 절대 배열을 나타내기 위해 사용된다. 접두사 d 및 l 또는 (+) 및 (-)는 화합물에 의한 평면-편광의 회전 신호를 지정하기 위해 사용되고, (-) 또는 l은 화합물이 좌선성임을 의미한다. (+) 또는 d로 시작하는 화합물은 우선성이다. 소정의 화학 구조에 대해, 이러한 입체이성체는, 그들이 서로 거울상이라는 점 이외에는 동일하다. 특정의 입체이성체는 또한 에난티오머로서 지칭될 수도 있고, 이러한 이성체의 혼합물은 흔히 에난티오머성 혼합물로서 칭명된다. 에난티오머의 50:50 혼합물은 라세미 혼합물 또는 라세미체로서 지칭되고, 이는 화학 반응 또는 과정에서 입체선택 또는 입체특이성이 존재하지 않는 경우 발생할 수 있다. 용어 "라세미 혼합물" 및 "라세미체"는 광학 활성 없는 두 에난티오머 종의 등몰량 혼합물을 의미한다.
본원에 사용된, 구체적으로 용어 "이성체"로부터 배제된 토오토머 형태에 관해 이하 논의된 경우를 제외하고, 구조 (또는 구조) 이성체(즉, 단지 공간에서의 원자의 위치에 의해서보다 원자 사이의 결합이 상이한 이성체)가 존재함을 주의한다. 예를 들면, 메톡시 그룹, -OCH3에 대한 참조는 이의 구조 이성체, 하이드록시메틸 그룹, -CH2OH에 대한 참조로서 해석되지 않는다. 유사하게, 오르토-클로로페닐에 대한 참조는 이의 구조 이성체, 메타-클로로페닐에 대한 참조로서 해석되지 않는다. 그러나, 구조물 부류에 대한 참조는 그 부류에 속하는 구조적 이성체 형태를 포함할 것이다(예: C1-7 알킬은 n-프로필 및 이소-프로필을 포함하고, 부틸은 n-, 이소-, 2급- 및 3급-부틸을 포함하고; 메톡시페닐은 오르토-, 메타- 및 파라-메톡시페닐을 포함한다).
상기 제외는, 예를 들면, 다음 토오토머 쌍에서와 같이, 토오토머 형태, 예를 들면, 케토-, 에놀- 및 에놀레이트-형태에 관련되지 않는다: 케토/에놀(이하 예시됨), 이민/엔아민, 아미드/이미노 알콜, 아미딘/아미딘, 니트로소/옥심, 티오케톤/에네티올, N-니트로소/하이드록시아조 및 니트로/아시-니트로.
Figure pct00027
용어 "토오토머" 또는 "토오토머성 형태"는 저에너지 장벽을 통해 상호전환가능한 상이한 에너지의 구조 이성체를 의미한다. 예를 들면, (또한 양성자성 토오토머로서 공지된) 양성자 토오토머는 케토-에놀 및 이민-엔아민 이성체화와 같은 양성자의 이동을 통한 상호전환을 포함한다. 원자가 토오토머는 일부 결합 전자의 재구성에 의한 상호전환을 포함한다.
용어 "이성체"에 하나 이상의 동위원소 치환을 갖는 화합물이 구체적으로 포함된다는 것을 주의한다. 예를 들면, H는 1H, 2H (D) 및 3H (T)를 포함하는 임의의 동위원소 형태로 존재할 수 있고; C는 12C, 13C 및 14C를 포함하는 임의의 동위원소 형태로 존재할 수 있고; O는 16O 및 18O를 포함하는 임의의 동위원소 형태로 존재할 수 있고; 등을 들 수 있다.
본 발명의 화합물에 도입될 수 있는 동위원소의 예는, 제한되지 않지만, 2H (중수소, D), 3H (삼중수소), 11C, 13C, 14C, 15N, 18F, 31P, 32P, 35S, 36Cl, 및 125I와 같은 수소, 탄소, 질소, 산소, 인, 불소, 염소의 동위원소를 포함한다. 본 발명의 다양한 동위원소 표지된 화합물은, 예를 들면, 3H, 13C 및 14C와 같은 방사활성 동위원소가 도입된 것들이다. 이러한 동위원소 표지된 화합물은 대사 연구, 반응 동역학 연구, 약물 또는 기질 조직 분포 검정을 포함하는 양전자 방출 단층 촬영(PET) 또는 단일 광자 방출 전산화 단층 촬영(SPECT)과 같은 검출 또는 영상화 기술, 또는 환자의 방사성 치료에 유용할 수 있다. 본 발명의 중수소 표지되거나 치환된 치료 화합물은 분포, 대사 및 배설(ADME)과 관련하여 향상된 DMPK(약물 대사 및 약동학) 특성을 가질 수 있다. 중수소와 같은 무거운 동위원소로의 치환은 보다 큰 대사 안정성으로부터 생성되는 특정의 치료상 이점, 예를 들면, 생체내 반감기 연장 또는 필요 용량 감소를 제공할 수 있다. 18F 표지된 화합물은 PET 또는 SPECT 연구에 유용할 수 있다. 본 발명의 동위원소 표지된 화합물 및 이의 프로드럭은 일반적으로 비-동위원소 표지된 시약을 용이하게 입수가능한 동위원소 표지된 시약으로 치환함으로써 반응식 또는 실시예에 개시된 절차 및 이하 기재된 제조방법을 수행함으로써 제조될 수 있다. 추가로, 보다 무거운 동위원소, 특히 중수소(즉, 2H 또는 D)로의 치환은 보다 큰 대사 안정성으로부터 생성되는 특정의 치료상 이점, 에를 들면, 생체내 반감기의 연장 또는 필요 용량의 감소 또는 치료 지수의 개선을 제공할 수 있다. 이러한 맥락에서 중수소는 치환체로서 간주되는 것으로 이해된다. 이러한 보다 무거운 동위원소, 구체적으로 중수소의 농도는 동위원소 농축 계수로 정의될 수 있다. 본 발명의 화합물에서, 특정 동위원소로서 구체적으로 지정되지 않은 임의의 원자는 그 원자의 임의의 안정한 동위원소를 나타내는 것을 의미한다.
다르게 구체화되지 않는 한, 특정 화합물에 대한 참조는 (전체적으로 또는 부분적으로) 라세미체 및 이의 다른 혼합물을 포함하는 모든 상기 이성체 형태를 포함한다. 이러한 이성체 형태의 제조방법(예: 비대칭 합성) 및 분리 방법(예: 분별 결정화 및 크로마토그래피 수단)은 당해 기술 분야에 공지되어 있거나 본원에 교시된 방법 또는 공지된 방법을 공지된 방식으로 적용함으로써 용이하게 수득된다.
5. 접합체 및 약물 부하
상기 논의된 바와 같이, 다음 항체 약물 접합체가 본 발명에 의해 제공된다:
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
본 발명의 조절인자 및 약물-링커가 본원의 교시에 따라서 생성되고/되거나 제조되고 선택되면, 그들은 개시된 ADC를 제공하기 위해 결합시키거나 접합시킬 수 있다. 본원에 사용된 용어 "접합체" 또는 "조절인자 접합체" 또는 "항체 접합체" 또는 "DLL3 접합체" 또는 "ADC"는 상호교환적으로 사용되고, 임의의 ADC 1, ADC 2, ADC 3, ADC 4 또는 ADC 5를 의미하기 위해 보유된다. 당해 분야에서 인지된 기술을 목적하는 ADC를 제공하기 위해 선택된 항체와 약물-링커를 접합시키는데 사용할 수 있다. 바람직한 접합 방법은 이하 실시예 7에 기재되어 있다. 또한, 당해 기술 분야에 공지된 접합 조건을 변경하거나 특정의 항체 작제물을 선택함으로써, 약물 대 항체의 다양한 화학량론적 몰 비를 나타내는 ADC가 생성될 수 있고, 명백히 본 발명의 범위 내이다.
보다 일반적으로, 당업자는 상이한 반응의 수가 개시된 약물-링커의 DLL3 결합제에의 부착 또는 연관을 위해 이용가능하다는 것을 이해할 것이다. 예로써, 항체 상의 친핵성 그룹은 측쇄 티올 그룹, 예를 들면, 시스테인을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 티올 그룹은 친핵성이고, 공유결합을 형성하기 위해 본 발명의 것들과 같은 링커 잔기 상에서 친전자성 그룹과 반응할 수 있다. 본 발명의 바람직한 항체는 환원성 쇄간 디설파이드, 즉, 이러한 친핵성 그룹을 제공하는 시스테인 브릿지를 가질 것이다. 따라서, 특정 양태에서, 조절인자 시스테인의 유리 설프하이드릴 그룹 및 개시된 약물-링커의 말단 말레이미도 또는 요오도아세트아미드 그룹의 반응은 목적하는 접합을 제공할 것이다. 이러한 경우에, 항체는 환원제, 예를 들면, 디티올트레이톨(DTT) 또는 (트리스 (2-카복시에틸)포스핀(TCEP)을 사용하는 처리로 링커 시약과의 접합에 대해 반응성이도록 할 수 있다. 따라서, 각각의 시스테인 디설파이드 브릿지는 이론적으로 두 개의 반응성 티올 친핵체를 형성할 것이다. 다른 양태에서, 추가의 친핵성 그룹은 2-이미노티올란(트라우트 시약(Traut's reagent)), SATA, SATP 또는 SAT(PEG)4를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 시약과 리신의 반응을 통해 항체에 도입되어 아민을 티올로 전환시킬 수 있다. 이러한 시약이 바람직하지만, 개시된 약물-링커와 DLL3 조절인자의 접합은 항체 또는 세포 결합제의 친핵성 그룹과 약물-링커 시약의 공유 결합을 제공하는, 당업자에게 공지된 다양한 반응, 조건 및 시약을 사용하여 수행될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 나타낸 바와 같이, 특히 바람직한 방법은 이하 실시예 7에 보다 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 ADC 및 ADC 조성물은 적어도 부분적으로 접합을 수행하기 위해 사용된 방법에 따라 다양한 화학량론적 몰 비로 약물 및 항체 잔기를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 화학량론적 몰 비는 "약물 대 항체 비", "DAR" 또는 "약물 부하" 측면에서 정의된다. 또 다른 방법으로, 약물 부하 또는 DAR은 세포 결합제, 예를 들면, 조성물 중 항체당 PBD 약물의 가중 평균 수이다. 본 발명의 PBD 화합물이 IgG1 중의 천연 발생 시스테인에 접합되는 경우, 약물 부하는 세포 결합제당 1 내지 8개의 약물 범위일 수 있고, 즉 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 약물 잔기가 각각의 세포 결합제에 공유결합된다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물의 DAR은 약 2, 4 또는 6일 것이고, 특히 바람직한 양태에서, DAR은 약 2를 포함할 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명의 접합체 조성물은 1 내지 8(IgG1의 경우에)의 PBD 화합물 범위와 접합된 세포 결합제, 예를 들면, 항체를 포함한다. 이와 같이, 개시된 항체 약물 접합체 조성물은 성분 항체의 대부분이 하나 이상의 PBD 약물 잔기에 공유결합되고 약물 잔기가 다양한 아미노산 잔기에서 항체에 부착될 수 있는 항체 약물 접합체 화합물의 혼합물을 포함한다. 즉, 본 발명의 접합후 ADC 조성물은 다양한 농도에서 DLL3 접합체와 상이한 약물 부하(예: 1 내지 8개의 약물/TgG1 항체)의 혼합물을 포함할 것이다. 선택적 접합 조건 및 정제 방법을 사용하여 접합체 조성물을 그들이 대부분 비교적 낮은 수준의 다른 ADC 종(예: 1, 4, 6 등의 약물 부하로)과 함께 단일의 우세한 목적하는 ADC 종(예: 약물 부하 2로)을 함유하는 지점으로 구동시킬 수 있다. DAR 값은 전체로서(즉, 모든 ADC 종을 함께 취한다) 조성물을 위한 약물 부하의 가중 평균을 나타낸다. 사용된 정량화 방법론에서 고유의 불확실성 및 상업적 세팅에서 비우세한 ADC 종을 완전히 제거하는데 있어서의 곤란함에 기인하여, 허용되는 DAR 값 또는 사양은 흔히 범위 또는 분포(즉, DAR 2 +/- 0.5)로서 제시된다. 바람직하게는, 범위(즉, 1.5 내지 2.5) 내의 측정된 DAR을 포함하는 조성물은 약제학적 세팅에 사용될 것이다.
따라서, 특정의 바람직한 양태에서 본 발명은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 각각 +/- 0.4의 DAR를 갖는 조성물을 포함할 것이다.　 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 2, 4, 6 또는 8 +/- 0.4의 DAR를 포함할 것이다. 최종적으로, 선택된 바람직한 양태에서, 본 발명은 2 +/- 0.4의 DAR을 포함할 것이다. 범위 또는 편차는 특정의 바람직한 양태에서 0.4 미만일 수 있다고 이해될 것이다. 따라서, 다른 양태에서, 조성물은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 각각 +/- 0.3의 DAR, 2, 4, 6 또는 8 +/- 0.3의 DAR 또는 더욱 더 바람직하게는 2 +/- 0.3의 DAR을 포함할 것이다. 다른 양태에서, IgG1 접합체 조성물은 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 각각 +/- 0.4의 DAR 및 비교적 낮은 수준(즉, 30% 미만)의 비우세한 ADC 종을 포함하는 조성물을 포함할 것이다. 다른 바람직한 양태에서, ADC 조성물은 비교적 낮은 수준(30% 미만)의 비우세한 ADC 종과 함께 2, 4, 6 또는 8 각각 +/- 0.4의 DAR을 포함할 것이다. 특히 바람직한 양태에서, ADC 조성물은 비교적 낮은 수준(30% 미만)의 비우세한 ADC 종과 함께 2 +/- 0.4의 DAR을 포함한다.
접합 반응으로부터의 ADC의 제조에서 항체당 약물의 분포는 통상적인 방법, 예를 들면, UV, 역상 HPLC, HIC, 질량 분석법, ELISA 검정 및 전기영동에 의해 특성확인할 수 있다. 항체당 약물 관점에서 ADC의 정량적 분포도 또한 측정될 수 있다. ELISA에 의해, ADC의 특정 제제에서 항체당 약물의 평균 값이 측정될 수 있다(참조: Hamblett et al (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070; Sanderson et al (2005) Clin. Cancer Res. 11:843-852). 그러나, 항체 값당 약물의 분포는 ELISA의 항체-항원 결합 및 검출 제한에 의해 인식되지 않는다. 또한, 항체-약물 접합체의 검출을 위한 ELISA 검정은 약물이 항체, 예를 들면, 중쇄 또는 경쇄 단편, 또는 특정 아미노산 잔기에 부착되는 경우에 측정하지 않는다. 일부 경우에, DAR이 다른 약물 부하와 함께 ADC로부터의 특정의 충분히 정의된 값을 포함하는 균질한 ADC의 분리, 정제 및 특성확인은 역상 HPLC 또는 전기영동과 같은 수단으로 달성할 수 있다. 이러한 기술은 또한 다른 종류의 접합체에 적용가능하다.
항체의 하나 이상의 친핵성 또는 친전자성 그룹이 약물-링커 중간체 또는 약물 잔기 시약이 따르는 링커 시약과 반응하면, 수득되는 생성물은 항체에 부착된 약물 잔기의 분포, 예를 들면, 1, 2, 3 등을 갖는 ADC 화합물의 혼합물이다. 중합체 역상(PLRP) 및 소수성 상호작용(HIC)과 같은 액체 크로마토그래피 방법은 약물 부하 값으로 혼합물 중의 화합물을 분리할 수 있다. 단일 약물 부하 값을 갖는 ADC의 제제를 단리시킬 수 있지만, 이러한 단일 부하 값 ADC는 약물 잔기가 링커를 통해 항체 상의 상이한 부위에 부착될 수 있기 때문에 여전히 불균질한 혼합물을 포함할 수 있다.
일부 항체-약물 접합체를 위해, 약물 부하 수는 항체 상의 부착 부위의 수로 제한될 수 있다. 예를 들면, 항체는 단지 하나 또는 다수의 시스테인 티올 그룹을 가질 수 있거나, 통해서 링커가 부착될 수 있는 단지 하나 또는 다수의 충분히 반응성 티올 그룹을 가질 수 있다. 예를 들면, 5 초과의 높은 약물 부하는 응집, 불용성, 독성, 또는 특정 항체-약물 접합체의 세포상 침투성의 상실을 일으킬 수 있다.
전형적으로, 약물 잔기의 이론적인 최대치보다 적게 접합 반응 동안 항체에 접합된다. 항체는, 예를 들면, 약물-링커 중간체 또는 링커 시약과 반응하지 않는 다수의 리신 잔기를 함유할 수 있다. 단지 가장 반응성 리신 그룹을 아민 반응성 링커 시약과 반응시킬 수 있다. 또한, 단지 가장 반응성 시스테인 티올 그룹을 티올 반응성 링커 시약과 반응시킬 수 있다. 일반적으로, 항체는 약물 잔기에 결합할 수 있는 유리 및 반응성 시스테인 티올 그룹을, 있다 하더라도, 다수 함유하지 않는다. 화합물의 항체 중의 대부분의 시스테인 티올 잔기는 디설파이드 브릿지로서 존재하고, 부분적 또는 전체적 환원 조건 하에 디티올트레이톨(DTT) 또는 TCEP와 같은 환원제로 환원되어야 한다. ADC의 부하(약물/항체 비)는 (i) 항체에 대한 약물-링커 중간체 또는 링커 시약의 몰 과량을 한정하고, (ii) 접합 반응 시간 또는 온도를 한정하고, (iii) 부분적 또는 시스테인 티올 변형을 위한 환원 조건을 한정함을 포함하는 다수의 상이한 방식으로 조절할 수 있다.
반응성 티올 그룹을 하나, 둘, 셋, 넷, 또는 그 이상의 시스테인 잔기를 조작함으로써(예를 들면, 하나 이상의 비천연 시스테인 아미노산 잔기를 포함하는 돌연변이 항체를 제조함으로써) 항체 (또는 이의 단편)에 도입할 수 있음이 추가로 이해될 것이다. 즉, 시스테인 아미노산 잔기는 항체 중의 반응성 부위에서 조작될 수 있고, 이는 쇄간 또는 분자간 디설파이드 결합을 형성하지 않는다(참조: Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; Dornan et al (2009) Blood 114(13):2721-2729; US 7521541; US 7723485; WO2009/052249). 조작된 시스테인 티올은 시스테인 조작된 항체 및 PBD 약물 잔기를 갖는 ADC를 형성하기 위해 말레이미드 또는 알파-요오도 아미드와 같은 티올 반응성 친전자성 그룹을 갖는 본 발명의 링커 시약 또는 약물-링커 시약과 반응시킬 수 있다. 따라서, 약물 잔기의 위치를 설계하고, 조절되고 공지될 수 있다. 약물 부하는, 조작된 시스테인 티올 그룹이 전형적으로 티올 반응성 링커 시약 또는 약물-링커 시약과 고수율로 반응하기 때문에, 조절될 수 있다. 중쇄 또는 경쇄 상의 단일 부위에서 치환에 의해 시스테인 아미노산을 도입하기 위한 IgG 항체의 조작은 대칭적 항체 상에 두 개의 새로운 시스테인을 제공한다. 거의 2의 약물 부하가 접합 생성물 ADC의 거의 균일성으로 달성할 수 있다.
VI. 약제학적 제제 및 치료학적 용도
1. 제형 및 투여 경로
선택된 접합체의 형태, 의도된 전달 방식, 치료되거나 모니터링되는 질환 및 다수의 기타 변수에 따라, 본 발명의 조성물은 기술 분야에서 인정된 기술을 사용하여 목적하는 대로 제형화될 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 치료학적 조성물은 순수하게 또는 최소의 추가 성분과 함께 투여할 수 있는 한편, 기타 조성물은 당해 기술 분야에서 익히 공지된 부형제 및 보조제를 포함하는 적합한 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하도록 임의로 제형화될 수 있다[예를 들면, 다음 문헌 참조: Gennaro, Remington : The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons: Drugfacts Plus, 20th ed. (2003); Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th ed., Lippencott Williams and Wilkins (2004); Kibbe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd ed., Pharmaceutical Press (2000)]. 비히클, 어주번트 및 희석제를 포함하는, 다양한 약제학적으로 허용되는 담체는, 다수의 상업적 공급원으로부터 즉시 입수 가능하다. 더욱이, pH 조절 및 완충제, 긴장성 조절제, 안정화제, 습윤제 등의, 약제학적으로 허용되는 각종 보조 물질이 또한 입수 가능하다. 특정한 비제한적인 예시적 담체는 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 배합물을 포함한다.
보다 특히, 일부 양태에서, 본 발명의 치료학적 조성물은 순수하게 또는 최소의 추가 성분과 함게 투여될 수 있다는 것이 인정될 것이다. 반대로, 본 발명의 DLL3 ADC는 당해 기술분야에 익히 공지되고 접합체의 투여를 용이하게 하는 상대적으로 불활성인 물질이거나 활성 화합물을 활성 부위로의 전달에 대하여 약제학적으로 최적화된 제제로 가공하는 것을 돕는 부형제 및 보조제를 포함하는 적합한 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하도록 임의로 제형화될 수 있다. 예를 들면, 부형제는 형태 또는 조도를 제공하거나 희석제로서 작용하여 ADC의 약동학 또는 안정성을 개선시킬 수 있다. 적합한 부형제 또는 첨가제는, 이들로 제한되지는 않지만, 안정화제, 습윤제 및 유화제, 삼투도를 변화시키기 위한 염, 캡슐화제, 완충제 및 피부 투과 강화제를 포함한다. 특정 바람직한 양태에서, 약제학적 조성물은 동결 건조된 형태로 제공되어 투여 전 예를 들면, 완충 염수에서 재구성될 수 있다. 이러한 재구성된 조성물은 바람직하게는 정맥내 투여된다.
개시된 전신 투여용 ADC는 장용, 비경구 또는 국소 투여를 위하여 제형화될 수 있다. 사실상, 모든 세 가지 유형의 제형이 동시에 사용되어 활성 성분의 전신 투여를 달성할 수 있다. 비경구 및 비경구가 아닌 약물 전달용 제형 뿐만 아니라 부형제는 문헌[참조: Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)]에 기술되어 있다. 비경구 투여용 적합한 제형은 수용성 형태, 예를 들면, 수용성 염의 활성 화합물의 수용액을 포함한다. 또한, 유성 주사 현탁액제에 적합한 활성 화합물의 현탁액제가 투여될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 지방유, 예를 들면, 헥실 치환된 폴리(락티드), 참기름 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들면, 에틸 올레에이트 또는 트리글리세라이드를 포함한다. 수성 주사 현탁액제는 현탁액제의 점도를 상승시키는 물질을 함유할 수 있고, 예를 들면, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 및/또는 덱스트란을 포함한다. 임의로, 현탁액제는 또한 안정화제를 함유할 수도 있다. 리포솜이 또한 세포로의 전달을 위한 제제를 캡슐화시키는 데 사용될 수도 있다.
장용 투여에 적합한 제형은 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐, 환제, 피복정을 포함한 정제, 엘릭서, 현탁액제, 시럽 또는 흡입제 및 이들의 조절 방출 형태를 포함한다.
경구 투여(예를 들면, 주사에 의한)에 적합한 제형은 활성 성분이 (예를 들면, 리포솜 또는 기타 마이크로미립자에) 용해되거나 현탁되거나 달리 제공되어 있는, 수성 또는 비-수성, 등장성, 무발열원, 멸균 액체(예: 용액제, 현탁액제)를 포함한다. 이러한 액체는 기타 약제학적으로 허용되는 성분, 예를 들면, 산화 방지제, 완충제, 보존제, 안정화제, 세균발육 저지제(bacteriostat), 현탁액제, 증점제, 및 제형을 의도된 수용자의 혈액(또는 기타 관련 체액)과 등장성으로 만드는 용질을 추가로 함유할 수 있다. 부형제의 예는, 예를 들면, 물, 알코올, 폴리올, 글리세롤, 식물유 등을 포함한다. 이러한 제형에 사용하기 위한 적합한 등장성 담체의 예는 염화나트륨 주사액, 링거액 또는 락테이트화 링거 주사를 포함한다.
비경구 투여(예를 들면, 정맥내 주사)용 상용성 제형은 약 10㎍/㎖ 내지 약 100㎎/㎖의 ADC 농도를 포함할 것이다. 특정한 선택 양태에서, ADC 농도는 20㎍/㎖, 40㎍/㎖, 60㎍/㎖, 80㎍/㎖, 100㎍/㎖, 200㎍/㎖, 300,㎍/㎖, 400㎍/㎖, 500㎍/㎖, 600㎍/㎖, 700㎍/㎖, 800㎍/㎖, 900㎍/㎖ 또는 1㎎/㎖를 포함할 것이다. 기타 바람직한 양태에서, ADC 농도는 2㎎/㎖, 3㎎/㎖, 4㎎/㎖, 5㎎/㎖, 6㎎/㎖, 8㎎/㎖, 10㎎/㎖, 12㎎/㎖, 14㎎/㎖, 16㎎/㎖, 18㎎/㎖, 20㎎/㎖, 25㎎/㎖, 30㎎/㎖, 35㎎/㎖, 40㎎/㎖, 45㎎/㎖, 50㎎/㎖, 60㎎/㎖, 70㎎/㎖, 80㎎/㎖, 90㎎/㎖ 또는 100㎎/㎖를 포함할 것이다.
일반적으로, DLL3 ADC를 포함하는 본 발명의 화합물 및 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게, 이들로 제한되지는 않지만, 경구, 정맥내, 동맥내, 피하, 비경구, 비내, 근육내, 두개내, 심장내, 심실내, 기관내, 구강, 직장내, 복강내, 피내, 국소, 경피 및 경막내를 포함하는 다양한 경로에 의하여, 또는 그렇지 않으면 이식 또는 흡입에 의하여, 생체내 투여될 수 있다. 대상 조성물은 이들로 제한되지는 않지만, 정제, 캡슐제, 산제, 입제, 연고, 용액제, 좌제, 관장제, 주사액, 흡입제 및 에어로졸을 포함하는, 고형, 반고형, 액상 또는 기체상 형태로 제제로 제형화될 수 있다. 적합한 제형 및 투여 경로는 의도된 적용 및 치료학적 용량 용법에 따라 선택될 수 있다. 특히 바람직한 양태에서, 본 발명의 화합물은 정맥내 전달된다.
2. 용량
유사하게, 특정 용량 용법, 즉 용량, 시기 및 반복은 특정 개인 및 그 개인의 병력뿐만 아니라, 약동학과 같은 경험적 고려 사항(예: 반감기, 제거율 등)에 좌우된다. 투여 빈도수는 치료 과정에 걸쳐 결정되고 조절될 수 있으며, 증식 또는 종양 형성 세포의 수를 감소시키거나, 이러한 신생 세포의 감소를 유지하거나, 신생 세포의 증식을 감소시키거나, 전이의 전개를 지연시키는 데 기반을 둔다. 기타 양태에서, 투여되는 용량은 잠재적 부작용 및/또는 독성을 관리하도록 조절하거나 감쇠시킬 수 있다. 대안적으로, 대상 치료학적 조성물의 연속 서방성 제형이 적합할 수 있다.
접합체 화합물의 적합한 용량 및 접합체 화합물을 포함하는 조성물이 환자마다 다양할 수 있음이 당업자에 의하여 인정된다. 최적 용량을 결정하는 데에는 일반적으로 어떠한 위험 또는 유해한 부작용에 대해서도 치료학적 이익 수준을 균형을 유지하는 것이 수반된다. 선택된 용량 수준은 이들로 제한되는 것은 아니지만, 특정 화합물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 화합물의 배설 속도, 치료 기간, 병용되는 기타 약제, 화합물 및/또는 물질, 상태의 중증도, 및 환자의 종, 성별, 연령, 체중, 상태, 일반적 건강 및 이전 병력을 포함하는 다양한 인자에 좌우된다. 화합물의 양 및 투여 경로는 궁극적으로 의사, 수의사 또는 임상의의 재량에 따르지만, 일반적으로 용량은 실질적으로 해롭거나 유해한 부작용을 유발하지 않고 목적하는 효과를 달성하는 작용의 부위에서 국소적 농도를 달성하도록 선택된다.
일반적으로, 본 발명의 ADC는 다양한 범위로 투여될 수 있다. 이는 용량당 약 5㎍/kg 체중 내지 약 100㎎/kg 체중; 용량당 약 50㎍/kg 체중 내지 약 5㎎/kg 체중; 용량당 약 100㎍/kg 내지 약 10㎎/kg을 포함한다. 기타 범위는 용량당 약 100㎍/kg 체중 내지 약 20㎎/kg 체중 및 용량당 약 0.5㎎/kg 체중 내지 약 20㎎/kg 체중을 포함한다. 특정 양태에서, 용량은 약 100㎍/kg 체중 이상, 약 250㎍/kg 체중 이상, 약 750㎍/kg 체중 이상, 약 3㎎/kg 체중 이상, 약 5㎎/kg 체중 이상, 약 10㎎/kg 체중 이상이다.
선택된 양태에서, ADC는 용량당 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100㎍/kg 체중으로 투여될 수 있다(바람직하게는 정맥내). 기타 양태는 용량당 약 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 또는 2000㎍/kg 체중으로의 ADC의 투여를 포함한다. 기타 바람직한 양태에서, 개시된 접합체는 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.58, 9 또는 10㎎/kg으로 투여된다. 기타 양태에서, 접합체는 용량당 12, 14, 16, 18 또는 20㎎/kg으로 투여될 수 있다. 기타 양태에서, 접합체는 용량당 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90 또는 100㎎/kg으로 투여될 수 있다. 본원에서의 교시로, 당업자는 임상전 동물 연구, 임상적 관찰 및 표준 의학 및 생화학 기술 및 측정을 기준으로 하여 다양한 ADC에 대한 적합한 용량을 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 특히 바람직한 양태에서, 이러한 DLL3 접합체 용량은 일정 기간에 걸쳐 정맥내 투여된다. 더욱이, 이러한 용량은 정의된 처리 기간에 걸쳐 다수회 투여될 수 있다.
기타 용량 용법은 U.S.P.N. 제7,744,877호에 개시된 바와 같은 체표면적(BSA) 산출에 대하여 예상될 수 있다. 익히 공지된 바와 같이, BSA는 환자의 신장 및 체중을 사용하여 산출되고 대상체의 신체의 표면적에 의하여 나타내어지는 대상체의 크기의 척도를 제공한다. 특정 양태에서, 접합체는 1 내지 800㎎/㎡의 용량, 50 내지 500㎎/㎡의 용량 및 100㎎/㎡, 150㎎/㎡, 200㎎/㎡, 250㎎/㎡, 300㎎/㎡, 350㎎/㎡, 400㎎/㎡ 또는 450㎎/㎡의 용량으로 투여될 수 있다. 기술 인식 및 경험적 기술이 적합한 용량을 결정하는 데 사용될 수 있음이 또한 인정된다.
아무튼, DLL3 ADC는 바람직하게는 이를 필요로 하는 대상체에게 필요한 만큼 투여된다. 투여 빈도수의 결정은 치료되는 상태, 치료되는 대상체의 연령, 치료되는 상태의 중증도, 치료되는 대상체의 일반 건강 상태 등의 고려 사항을 기반으로 하여, 담당의와 같은 당업자에 의하여 이루어질 수 있다. 일반적으로, DLL3 접합체의 유효 용량은 대상체에게 1회 이상 투여된다. 보다 특히, ADC의 유효 용량은 대상체에게 1개월에 1회, 1개월에 1회 초과 또는 1개월에 1회 미만으로 투여된다. 특정 양태에서, DLL3 ADC의 유효 용량은 1개월 이상, 6개월 이상, 1년 이상, 2년 이상의 기간 또는 수 년의 기간 동안을 포함하여, 다수회 투여될 수 있다. 기타 양태에서, 개시된 조절제의 투여 사이에 수 일(2, 3, 4, 5, 6 또는 7일), 수 주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주) 또는 수 개월(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개월) 또는 1년 또는 수년까지도 경과할 수 있다.
특정한 바람직한 양태에서, 접합된 조절제를 수반하는 치료의 과정은 수 주 또는 수 개월의 기간에 걸쳐 선택된 약제 제품의 다중 용량을 포함한다. 보다 특히, 본 발명의 접합된 조절제는 매일, 2일마다, 4일마다, 매주, 10일마다, 2주마다, 3주마다, 매월, 6주마다, 2개월마다, 10주마다 또는 3개월마다 1회 투여될 수 있다. 이와 관련하여, 환자 반응 및 임상 실시를 기반으로 하여 용량이 변경되거나 간격이 조정될 수 있음이 인정된다.
용량 및 용량 용법은 또한 1회 이상 투여받은 개인에 있어서 개시된 치료학적 조성물에 대하여 경험적으로 결정될 수도 있다. 예를 들면, 개인은 본원에 기재된 바와 같이 생성된 치료학적 조성물의 증가하는 양을 투여받을 수 있다. 선택된 양태에서, 용량은 경험적으로 결정되거나 관찰된 부작용 또는 독성을 각각 기준으로 하여 점진적으로 증가되거나 감소되거나 감쇠될 수 있다. 선택된 조성물의 효능을 검정하기 위하여, 특정한 질환, 장애 또는 상태의 마커가 위에서 기재된 바와 같이 후속될 수 있다. 암에 대하여, 이들은 촉진 또는 육안 관찰을 통한 종양 크기의 직접적인 측정, x-선 또는 기타 이미징 기술에 의한 종양 크기의 간접적인 측정; 직접 종양 생검 및 종양 샘플의 현미경 검사에 의하여 검정된 바와 같은 개선; 본원에 기재된 방법에 따라 확인된 간접적 종양 마커(예: 전립선 암에 대한 PSA) 또는 종양형성 항원의 측정, 통증 또는 마비의 감소; 개선된 화술, 시력, 호흡 또는 종양과 관련된 기타 장애; 식욕 증가; 또는 허용된 시험 또는 생존율 연장에 의하여 측정되는 바와 같은 삶의 질 증가를 포함한다. 용량이 개인, 신생물 상태의 유형, 신생물 상태의 단계, 신생물 상태가 개인의 다른 위치로 전이되기 시작했는지의 여부, 및 사용되는 과거 및 동시 치료에 따라 변화한다는 것은 당업자에게 명백하다.
3. 병용 요법
본 발명에 따라 병용 요법이 원치않는 신생 세포 증식을 감소 또는 억제하거나, 암 발생을 감소시키거나, 암의 재발을 감소 또는 예방하거나, 암의 확산 또는 전이를 감소 또는 예방하는 데 특히 유용할 수 있다. 이러한 경우, 본 발명의 ADC는 종양 질량을 유지하거나 지속시키는 CSC를 제거함으로써 감작제 또는 화학 감작제로서 기능하고, 이로써 관련 용적 축소 또는 항암 제제의 현재 표준을 보다 효과적으로 사용하도록 할 수 있다. 즉, 개시된 ADC는, 특정 양태에서, 또 다른 투여된 치료제의 작용 방식을 증강시키는 강화된 효과(예를 들면, 자연 상태에서 추가적 또는 상승적)를 제공한다. 본 발명의 맥락에서 "병용 요법"은 광범위하게 해석되어야 하고, 단지 DLL3 ADC와, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 세포독성제, 세포증식 억제제, 항혈관형성제, 용적 축소제, 화학 요법제, 방사선 요법(radiotherapy) 및 방사선 치료제, 표적 항암제(모노클론 항체 및 소분자 신약 포함), BRM, 치료 항체, 암 백신, 시토카인, 호르몬 요법, 방사선 요법(radiation therapy) 및 항전이제 및 면역 치료제(특이적 및 비특이적 접근을 둘 다 포함)를 포함하는 하나 이상의 항암제의 투여를 언급한다.
각각의 치료(예: ADC 및 항암제)가 개별적으로 수행될 때 관찰되는 효과의 병용된 결과가 부가적일 필요는 없다. 적어도 부가적 효과가 일반적으로 바람직하지만, 단일 요법들 중 하나보다 우위인 어떠한 증가된 항종양 효과가 유리하다. 추가로, 본 발명은 상승 효과를 나타내는 병용 치료를 필요로 하지 않는다. 그러나, 당업자는 바람직한 양태를 포함하는 특정 선택 병용으로 상승 작용이 관찰될 수 있음을 인정한다.
병용 요법을 실시시, DLL3 접합체 및 항암제는 대상체에 단일 조성물로, 또는 동일하거나 상이한 투여 경로를 사용한 2개 이상의 개별 조성물로서, 동시에 투여될 수 있다. 대안적으로, ADC는 예를 들면, 수 분 내지 수 주 범위의 간격으로, 항암제 치료를 선행하거나 후속할 수 있다. 각각의 전달 사이의 기간은 항암제 및 접합체가 종양에 대한 병용 효과를 발휘할 수 있도록 하는 것이다. 하나 이상의 양태에서, 항암제와 ADC는 둘 다 각각 약 5분 내지 약 2주 내에 투여된다. 기타 양태에서, DLL3 ADC와 항암제의 투여 사이에 수 일(2, 3, 4, 5, 6 또는 7일), 수 주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주) 또는 수 개월(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개월)이 경과할 수 있다.
병용 요법은 1회, 2회 또는 적어도 상태가 치료되거나 완화되거나 치유될 때까지의 기간 동안 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 병용 요법은 다수 회, 예를 들면, 일일 3회 내지 6개월마다 1회 투여된다. 투여는 일일 3회, 일일 2회, 일일 1회, 2일마다 1회, 3일마다 1회, 매주 1회, 2주마다 1회, 매달 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회, 6개월마다 1회 등의 스케쥴로 수행될 수 있거나, 미니펌프를 통하여 여속적으로 투여될 수 있다. 병용 요법은 이전에 주목된 바와 같이, 어떠한 경로를 통해서라도 투여될 수 있다. 병용 요법은 종양 위치로부터 떨어진 위치에서 투여될 수 있다.
한 양태에서, ADC는 이를 필요로 하는 대상체에게 짧은 치료 사이클 동안 하나 이상의 항암제와 병용하여 투여된다. 본 발명은 또한 불연속적 투여 또는 몇 개의 부분 투여로 분할된 일일 용량을 또한 고려한다. 접합체와 항암제는 격일 또는 격주로 상호 교환적으로 투여될 수 있거나; 연속적 항체 치료가 제공된 다음, 항암제 요법의 1회 이상의 치료가 후속될 수 있다. 아무튼, 당업자가 이해하는 바와 같이, 화학 치료제 및 개시된 접합체의 적합한 용량은 일반적으로 임상 요법에 이미 사용된 용량 정도이며, 여기서 화학 치료제는 단독으로 또는 기타 화학 치료제와 병용하여 투여된다.
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명의 DLL3 접합체는 질환의 초기 발생 이후 종양 재발 기회를 감소시키거나 제거하는 유지관리 요법에 사용될 수 있다. 바람직하게는 장애는 치료되고, 초기 종양 질량은 제거되거나 감소되거나 개선되어 환자가 무증상이거나 차도를 보이도록 한다. 이 때 대상체는 표준 진단 절차를 사용하여 질환의 징후가 거의 또는 전혀 없더라도 개시된 DLL3 접합체의 약제학적 유효량을 2회 이상 투여받을 수 있다. 일부 양태에서, ADC는 매주, 2주마다, 매달, 6주마다, 2개월마다, 3개월마다, 6개월마다 또는 매년 등의 기간에 걸쳐 정기적인 스케쥴에서 투여된다. 본원에서의 교시가 제공되어, 당업자는 유리한 용량 및 용량 용법을 쉽게 결정하여 질환 재발 잠재성을 감소시킬 수 있을 것이다. 더욱이, 이러한 치료는 환자 반응 및 임상 및 진단 파라미터에 따라 수 주, 수 개월, 수 년 또는 무기한까지의 기간 동안 지속될 수 있을 것이다.
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명의 ADC는 예방적으로 또는 보조 요법으로서 사용되어 용적 축소 시술 이후의 종양 전이 가능성을 방지하거나 감소시킬 수 있다. 당해 명세서에 사용된 바와 같이, "용적 축소 시술"는 광범위하게 정의되고, 종양 또는 종양 증식을 제거하거나 감소시키거나 치료하거나 경감시키는 어떠한 시술, 기술 또는 방법이라도 의미한다. 예시적인 용적 축소 시술는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 수술, 방사선 치료(즉, 빔 방사), 화학 요법, 면역 요법 또는 절제를 포함한다. 당해 명세서를 고려하여 당업자에 의하여 쉽게 결정되는 적합한 시기에 개시된 ADC는 임상적, 진단적 또는 테라그노시스(theragnosis)의 절차에 의하여 제안되는 바와 같이 투여되어 종양 전이를 감소시킬 수 있다. 접합체는 표준 기술을 사용하여 측정되는 약제학적으로 효과적인 용량으로 1회 이상 투여될 수 있다. 바람직하게는 용량 용법은 이를 변경시키는 적합한 진단 또는 모니터링 기술을 동반할 것이다.
본 발명의 기타 양태는 개시된 DLL3 접합체를 무증상이지만 증식 장애를 발달시킬 위험이 있는 대상체에게 투여함을 포함한다. 즉, 본 발명의 접합체는 검사되고 시험되어 하나 이상의 주목된 위험 인자(예: 게놈 표지, 가족 병력, 생체내 또는 시험관내 시험 결과 등)를 갖지만 신생물을 발달시키지 않은 환자에게 진정으로 예방적인 의미로 사용되고 제공될 수 있다. 이러한 경우, 당업자는 경험적인 관찰 또는 허용된 임상적 실시를 통하여 유효한 용량 용법을 결정할 수 있을 것이다.
4. 항암제
본원 전체에서 논의된 바와 같이, 본 발명의 DLL3 접합체는 항암제와 병용하여 사용될 수 있다. 용어 "항암제" 또는 "항증식제"는 암 등의 세포 증식 장애를 치료하는 데 사용될 수 있고, 이들로 제한되지는 않지만, 세포 독성제, 세포 증식제, 항혈관신생제, 용적 축소제, 화학 치료제, 방사선 요법 및 방사선 치료제, 표적 항암제, BRM, 치료 항체, 암 백신, 시토카인, 호르몬 요법, 방사선 치료 및 항전이제 및 면역 치료제를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "세포독성제"는 세포에 독성이고, 세포의 기능을 감소시키거나 억제하고/하거나 세포의 파괴를 유발하는 물질을 의미한다. 특정 양태에서, 당해 물질은 살아있는 유기체로부터 유도된 자연 발생 분자이다. 세포독성제의 예는, 이들로 제한되지는 않지만, 박테리아(예: 디프테리아 독소, 수도모나스(Pseudomonas) 내독소 및 외독소, 스타필로코칼 엔테로독신(Staphylococcal enterotoxin) A), 진균류(예: α-사르신, 레스트릭토신), 식물류(예: 아브린, 리신, 모덱신, 비스쿠민, 포크위드 항바이러스성 단백질, 사포린, 겔로닌, 모모리딘, 트리코산틴, 보리 독소, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨락카 메리카나(Phytolacca mericana) 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(Momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사포나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 미테겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 네오마이신 및 트리코테센) 또는 동물류(예: 세포독성 RNase, 예를 들면, 세포외 췌장 RNase; DNase I(이들의 단편 및/또는 변종을 포함))를 포함한다.
본 발명에 대하여, "화학 치료제"는 암 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 비특이적으로 감소시키거나 억제하는 화학적 화합물(예: 세포독성제 또는 세포증식 억제제)을 포함한다. 이러한 화학 제제는 종종 세포 성장 또는 분열에 필요한 세포내 공정을 향한 것이고, 따라서, 일반적으로 신속하게 성장하고 분열하는 암성 세포에 대하여 특히 효과적이다. 예를 들면, 빈크리스틴은 미세관을 해중합시켜, 세포가 유사분열에 들어가는 것을 억제한다. 일반적으로, 화학 치료제는 암성 세포 또는 암성이 되거나 종양발생 후대(예: TIC)를 발생시킬 가능성이 있는 세포를 억제하도록 설계된 어떠한 화학 제제라도 포함할 수 있다. 이러한 제제는 예를 들면, CHOP 또는 FOLFIRI 등의 용량 용법에서 병용하여, 종종 투여될 수 있고, 종종 가장 효과적이다.
본 발명의 DLL3 ADC와 병용하여 사용될 수 있는 항암제의 예는, 이들로 제한되지는 않지만, 알킬화제, 알킬 설포네이트, 아지리딘, 에틸렌이민 및 메틸아멜아민, 아세토게닌, 캄프토테신, 브리오스타틴, 칼리스타틴, CC-1065, 크립토파이신, 돌라스타틴, 두오카마이신, 엘류테로빈, 판크라티스타틴, 사코딕틴, 스폰기스타틴, 질소 머스터드, 항생제, 엔다이인 항생제, 다이네미신, 비스포스포네이트, 에스퍼라미신, 크로모단백질 엔다이인 항생제 발색단, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, ADRIAMYCIN® 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, ?라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사 물질, 에를로티니브, 베무라페니브, 크리조티니브, 소라페니브, 이브루티니브, 엔잘루타마이드, 엽산 유사체, 푸린 유사체, 안드로겐, 항부신, 엽산 보충제, 예를 들면, 프롤린산, 아세글라톤, 알도포스파미드 글리코사이드, 아미노레불린산, 에닐우라실, 암사크린, 베스트라부실, 비스안트렌, 에다트락세이트, 데포파민, 데메콜신, 디아지쿠온, 엘포르니틴, 엘립티늄 아세테이트, 에포틸론, 에토글루시드, 질산갈륨, 하이드록시우레아, 레티난, 로니다이닌, 마이탄시노이드, 미토구아존, 미톡산트론, 모피단몰, 니트라에린, 펜토스타틴, 페나메트, 피라루비신, 로속산트론, 포도필린산, 2-에틸하이드라지드, 프로카바진, PSK® 다당류 착체(JHS Natural Products, Eugene, OR), 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(특히 T-2 독소, 베르라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드; 클로란부실; GEMZAR® 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토푸린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 빈블라스틴; 백금; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; NAVELBINE® 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸(Camptosar, CPT-11), 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸로르니틴; 레티노이드; 카페시타빈; 콤브레타스타틴; 류코보린; 옥살리플라틴; 세포 중식을 감소시키는 PKC-α, Raf, H-RAS, EGFR 및 VEGF-A의 억제제, 및 이들 중의 어느 하나의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 또한, 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항호르몬제, 예를 들면, 항에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제, 부신에서의 에스트로겐 생성을 조절하는, 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 및 항안드로겐; 뿐만 아니라 트록사시타빈(1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 예를 들면, VEGF 발현 억제제 및 HER2 발현 억제제; 백신, PROLEUKIN® RIL-2; LURTOTECAN® 토포이소머라제 1 억제제; ABARELIX® rmRH; 비노렐빈 및 에스페라미신, 및 이들 중 어느 하나의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체가 당해 정의에 포함된다.
특히 바람직한 항암제는 상업적으로 또는 임상적으로 입수 가능한 화합물, 예를 들면, 에를로티닙(TARCEVA®, Genentech/OSI Pharm.), 도세탁셀(TAXOTERE®, Sanofi-Aventis), 5-FU(플루오로우라실, 5-플루오로우라실, CAS No. 51-21-8), 겜시타빈(GEMZAR®, Lilly), PD-0325901(CAS No. 391210-10-9, Pfizer), 시스플라틴(시스-디아민, 디클로로백금(II), CAS No. 15663-27-1), 카보플라틴(CAS No. 41575-94-4), 파클리탁셀(TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), 트라스투주맙(HERCEPTIN®, Genentech), 테모졸로미드(4-메틸-5-옥소-2,3,4,6,8-펜타자바이사이클로[4.3.0]노나-2,7,9-트리엔-9-카복스아미드, CAS No. 85622-93-1, TEMODAR®, TEMODAL®, Schering Plough), 타목시펜((Z)-2-[4-(1,2-디페닐부트-1-에닐)페녹시]-N,N-디메틸에탄아민, NOLVADEX®, ISTUBAL®, VALODEX®), 및 독소루비신(ADRIAMYCIN®)을 포함한다. 추가의 상업적으로 또는 임상적으로 입수 가능한 항암제는 옥살리플라틴(ELOXATIN®, Sanofi), 보르테조밉(VELCADE®, Millennium Pharm.), 수텐트(SUNITINIB®, SU11248, Pfizer), 레트로졸(FEMARA®, Novartis), 이마티닙 메실레이트(GLEEVEC®, Novartis), XL-518(Mek 억제제, Exelixis, WO 제2007/044515호), ARRY-886(Mek 억제제, AZD6244, Array BioPharma, Astra Zeneca), SF-1126(PI3K 억제제, Semafore Pharmaceuticals), BEZ-235(PI3K 억제제, Novartis), XL-147(PI3K 억제제, Exelixis), PTK787/ZK 222584(Novartis), 풀베스트란트(FASLODEX®, AstraZeneca), 류코보린(폴린산), 라파마이신(시롤리무스, RAPAMUNE®, Wyeth), 라파티닙(TYKERB®, GSK572016, Glaxo Smith Kline), 로나파닙(SARASAR™, SCH 66336, Schering Plough), 소라페닙(NEXAVAR®, BAY43-9006, Bayer Labs), 게피티닙(IRESSA®, AstraZeneca), 이리노테칸(CAMPTOSAR®, CPT-11, Pfizer), 티피파닙(ZARNESTRA™, Johnson & Johnson), ABRAXANE™(무크레모퍼), 파클리탁셀의 알부민 가공된 나노입자 제형(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Il), 반데타닙(rINN, ZD6474, ZACTIMA®, AstraZeneca), 클로람부실, AG1478, AG1571(SU 5271; Sugen), 템시롤리무스(TORISEL®, Wyeth), 파조파닙(GlaxoSmithKline), 칸포스파미드(TELCYTA®, Telik), 티오테파 및 사이클로스포스파미드(CYTOXAN®, NEOSAR®); 비노렐빈(NAVELBINE®); 카페시타빈(XELODA®, Roche), 타목시펜(NOLVADEX®; 타목시펜 시트레이트를 포함), FARESTON®(토레미핀 시트레이트), MEGASE®(메게스트롤 아세테이트), AROMASIN®(엑세메스탄; Pfizer), 포르메스탄, 파드로졸, RIVISOR®(보로졸), FEMARA®(레트로졸; Novartis), 및 ARIMIDEX®(아나스트로졸; AstraZeneca)를 포함한다.
기타 양태에서, 본 발명의 DLL3 접합체는 현재 임상 시험에서 다수의 항체(또는 면역치료제) 중의 어느 하나와 병용 사용될 수 있거나 상업적으로 입수 가능하다. 이를 위하여, 개시된 DLL3 접합체는 아바고보맙, 아데카투무맙, 아푸투주맙, 알렘투주맙, 알투모맙, 아마툭시맙, 아나투모맙, 아르시투모맙, 바비툭시맙, 벡투모맙, 베박시주맙, 비바투주맙, 블리나투모맙, 브렌툭시맙, 칸투주맙, 카투막소맙, 세툭시맙, 시타투주맙, 식수투무맙, 클리바투주맙, 코나투무맙, 다라투무맙, 드로지투맙, 둘리고투맙, 두시기투맙, 데투모맙, 다세투주맙, 달로투주맙, 에크로멕시맙, 엘로투주맙, 엔시툭시맙, 에르투막소맙, 에타라시주맙, 팔레투주맙, 피클라투주맙, 피기투무맙, 플란보투맙, 푸툭시맙, 가니투맙, 겜투주맙, 기렌툭시맙, 글렘바투무맙, 이블투모맙, 이고보맙, 임가투주맙, 인다툭시맙, 이노투주맙, 인테투무맙, 이필리무맙, 이라투무맙, 라베투주맙, 렉사투무맙, 린투주맙, 로르보투주맙, 루카투무맙, 마파투무맙, 마투주맙, 밀라투주맙, 민레투모맙, 미투모맙, 목세투모맙, 나르나투맙, 나프투모맙, 네시투무맙, 니모투주맙, 노페투모맙, 오카라투주맙, 오파투무맙, 올라라투맙, 오나르투주맙, 오파르투주맙, 오레고보맙, 파니투무맙, 파르사투주맙, 파트리투맙, 펨투모맙, 페르투주맙, 핀투모맙, 프리투무맙, 라코투모맙, 라무시루맙, 라드레투맙, 릴로투무맙, 리툭시맙, 로바투무맙, 사투모맙, 시브로투주맙, 실툭시맙, 심투주맙, 솔리토맙, 타카투주맙, 타플리투모맙, 테나투모맙, 테프로투무맙, 티가투주맙, 토시투모맙, 트라스투주맙, 투코투주맙, 우블리툭시맙, 벨투주맙, 보르세투주맙, 보투무맙, 잘루투무맙, CC49, 3F8 및 이들의 병용물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항체와 병용 사용될 수 있다.
기타 더욱 특히 바람직한 양태는 이들로 제한되지는 않지만, 리툭시맙, 트라스투주맙, 겜투주맙 오조감신, 알렘투주맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 토시투모맙, 베바시주맙, 세툭시맙, 파니투무맙, 라무시루맙, 오파투무맙, 이필리무맙 및 브렌툭시맙 베도틴을 포함하는, 암 치료에 대하여 시험중이거나 승인된 항체의 사용을 포함한다. 당업자는 본원에서의 교시와 양립되는 추가의 항암제를 쉽게 확인할 수 있다.
5. 방사선 요법
본 발명은 또한 DLL3 접합체와 방사선 요법(즉, 감마-조사, X-선, UV-조사, 마이크로파, 전자 방출 등의 종양 세포내 국소적으로 DNA 손상을 유도하기 위한 어떠한 메카니즘)의 병용을 제공한다. 방사성 동위원소의 종양 세포로의 유도된 전달을 사용하는 병용 요법이 또한 고려되고, 개시된 접합체는 표적화 항암제 또는 기타 표적화 수단과 관련되어 사용될 수 있다. 통상적으로, 방사선 요법은 약 1 내지 2주의 기간에 걸쳐 펄스로 실시된다. 방사선 요법은 두부암 및 경부암을 앓는 대상체에게 약 6 내지 7주 동안 실시될 수 있다. 임의로, 방사선 요법은 단일 용량으로서 또는 다수의, 순차 용량으로서 실시될 수 있다.
VII. 징후
본 발명의 ADC는 어떠한 DLL3 관련 장애의 발생 또는 재발을 치료하거나 에방하거나 관리하거나 억제하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 단독으로 투여되든 또는 항암제 또는 방사선 요법과 병용하여 투여되든, 본 발명의 ADC는 양성 또는 악성 종양(예: 부신, 간, 신장, 방광, 유방, 위, 난소, 결장, 전립선, 췌장, 폐, 갑상선, 간, 자궁 경부, 자궁 내막, 식도 및 자궁 암종; 육종; 교아세포종; 및 각종 두경부 종양); 백혈병 및 림프 악성 종양; 신경, 신경교, 성상 세포, 시상 하부 및 기타 선, 대식세포, 상피, 간질 및 포배강 장애 등의 기타 장애; 및 염증, 혈관발생, 면역 장애 및 병원체로 인한 장애를 포함할 수 있는 환자 또는 대상체의 신생물 상태를 일반적으로 치료하는 데 특히 유용하다. 특히, 치료용 주요 표적은 고형 종양을 포함하는 신생물 상태이지만, 혈액암은 본 발명의 영역 내에 있다.
상태를 치료하는 맥락에서 본원에서 사용된 용어 "치료"는 일반적으로 사람이든 동물(예: 수의학적 적용)이든 이들의 치료 및 요법에 관하며, 여기서 일부 목적하는 치료 효과, 예를 들면, 상태의 진행 억제가 달성되고, 진행률 감소, 진행률 중단, 상태 회복, 상태 개선 및 상태 치유를 포함한다. 예방책으로서의 치료(즉, 예방, 방지)도 포함된다.
본원에서 사용된 용어 "치료학적 유효량"은 활성 화합물 또는 활성 화합물을 포함하는 물질, 조성물 또는 용량의 양에 관하며, 이는 목적하는 치료 계획에 따라 투여시, 합당한 이익/위험 비에 상응하여, 일부 목적하는 치료 효과를 생성하기에 유효하다.
유사하게, 본원에서 사용된, 용어 "예방적 유효량"은 활성 화합물, 또는 활성 화합물을 포함하는 물질, 조성물 또는 용량의 양에 관하며, 이는 목적하는 치료 계획에 따라 투여시, 합당한 이익/위험 비에 상응하여, 일부 목적하는 예방 효과를 생성하기에 유효하다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따라 치료를 받는 신생물 상태는 이들로 제한되지는 않지만, 부신 종양, AIDS 관련 암, 포상 연부 육종, 성상 세포 종양, 방광암(편평 상피 세포암과 이행 세포암), 골암(법랑종, 동맥류성 골 낭종, 골 연골종, 골육종), 뇌 및 척수암, 전이성 뇌종양, 유방암, 경동맥체 종양, 자궁 경부암, 연골육종, 척삭종, 난염성 신장 세포 암종, 투명 세포 암종, 결장암, 대장암, 피부 양성 섬유 조직구종, 결합 조직 형성 소원형 세포 종양, 뇌실막종, 유잉(Ewing) 종양, 골외성 점액양 연골육종, 골성 불완전 섬유 생성증, 골, 담낭 및 담관암의 섬유 이형성증, 임신성 융모성 질환, 생식 세포 종양, 두부 및 경부암, 췌장 세포 종양, 카포시 육종, 신장암(신아세포종, 유두상 신세포암), 백혈병, 지방종/양성 지방종성 종양, 지방 육종/악성 지방종성 종양, 간암(간 모세포종, 간세포 암종), 림프종, 폐암(소세포 암종, 선암종, 편평 세포 암종, 대세포 암종 등), 수모세포종, 흑색종, 수막종, 다발성 내분비 신생물, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 신경 모세포종, 신경내분비 종양, 난소암, 췌장암, 유두 갑상선 암종, 부갑상선 종양, 소아암, 말초 신경 시스 종양, 크롬친화세포종, 뇌하수체 종양, 전립선암, 후방 포도막 흑색종, 희귀 혈액 장애, 신장 전이성 암, 횡문근 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연조직 육종, 편평 세포암, 위암, 활막 육종, 고환암, 흉선 암종, 흉선종, 갑상선 전이성 암, 자궁암(자궁 경부의 암종, 자궁 내막 암종 및 자궁 근종)을 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다.
특정한 바람직한 양태에서, 증식 장애는 이들로 제한되지는 않지만, 부신, 간, 신장, 방광, 유방, 위, 난소, 자궁 경부, 자궁, 식도, 대장, 전립선, 췌장, 폐(소세포 및 비소세포 둘 다), 갑상선, 암종, 육종, 교아세포종 및 각종 두경부 종양을 포함하는 고형 종양을 포함한다. 기타 바람직한 양태에서, 아래 실시예에 나타낸 바와 같이, 개시된 ADC는 소세포 폐암(SCLC) 및 비소세포 폐암(NSCLC)(예: 편평 세포 비소세포 폐암 또는 편평 세포 소세포 페암) 치료에 특히 효과적이다. 한 양태에서, 폐암은 백금계 제제(예: 카보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 토포테칸) 및/또는 탁산(예: 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀 또는 카바지탁셀)에 불응성이거나 재발되거나 저항성이다.
특히 바람직한 양태에서, 개시된 ADC는 소세포 페암을 치료하는 데 사용될 수 있다. 이러한 양태에 관하여, 접합된 조절제를 제한기 질환을 나타내는 환자에게 투여할 수 있다. 기타 양태에서, 개시된 ADC는 확장기 질환을 나타내는 환자에게 투여한다. 기타 바람직한 양태에서, 개시된 ADC는 불응성 환자(즉, 초기 치료의 과정 동안 또는 그 직후 재발하는 환자) 또는 재발 소세포암 환자에게 투여한다. 기타 양태는 개시된 ADC를 민감성 환자(즉, 재발이 주 치료 후 2-3개월 이상인 환자)에게 투여함을 포함한다. 각각의 경우, 상용성 ADC가 선택된 용량 용법 및 임상 진단에 따라 기타 항암제와 함께 사용될 수 있다는 것이 인정된다.
위에서 논의된 바와 같이, 개시된 ADC는 신경내분비 종양을 포함한 표현형 또는 신경내분비 특징을 갖는 종양을 예방, 치료 또는 진단하는 데 추가로 사용될 수 있다. 분산된 내분비계로부터 발생한 진정한 또는 표준(canonical) 신경내분비 종양(NET)은 상대적으로 희귀하며, 발병률이 100,000명당 2-5건이지만 매우 공격적이다. 신경내분비 종양은 신장, 비뇨생식관(방광, 전립선, 난소, 자궁 경부 및 자궁 내막), 위장관(대장, 위), 갑상선(갑상선 수질암) 및 폐(소세포 폐 암종 및 대세포 신경내분비 암종)에서 발생한다. 이들 종양은 카르시노이드 증후군으로 공지된 쇠약화 증상을 유발할 수 있는 세로토닌 및/또는 크로모그라닌 A를 포함한 몇 가지 호르몬을 분비할 수 있다. 이러한 종양들은 뉴런 특이적 에놀라제(NSE, 감마 에놀라제로도 공지됨, 유전자 기호 = ENO2), CD56(또는 NCAM1), 크로모그라닌 A(CHGA) 및 시납토피신(SYP) 등의 양성 면역조직화학적 마커, 또는 ASCL1 등의 상승된 발현을 나타내는 것으로 공지된 유전자에 의하여 나타날 수 있다. 불행하게도, 기존의 화학요법은 NET를 치료하는 데 특히 효과적이지 않았고, 간 전이가 흔한 결과이다.
개시된 ADC는 신경내분비 종양을 치료하는 데 유리하게 사용될 수 있지만, 이는 또한 유전자형으로 또는 표현형으로 표준 신경내분비 종양의 일반 특징을 모방사거나 이와 유사하거나 이를 나타내는 가성 신경내분비 종양(pNET)을 치료하거나 예방하거나 진단하는 데 사용될 수도 있다. 가성 신경내분비 종양 또는 신경내분비 특징을 갖는 종양은 확산 신경내분비계의 세포 또는 신경내분비 분화 캐스케이드가 종양발생 과정 동안 비정상적으로 재활성화되는 세포로부터 발생하는 종양이다. 이러한 pNET는 생물학적 활성 아민, 신경전달물질 및 펩티드 호르몬의 부분집합을 생성하는 능력을 포함한, 기존에 정의된 신경내분비 종양과 특정 표현형 또는 생화학적 특징을 공통으로 공유한다. 조직학적으로, 이러한 종양(NET 및 pNET)은 블랜드 세포병리학의 최소 세포질 및 원형 내지 타원형의 점상 핵을 갖는 밀집되게 연결된 소세포를 종종 나타내는 공통의 외형을 공유한다. 본 발명에 대하여, 신경내분비 및 가성 신경내분비 종양을 정의하는 데 사용될 수 있는 일반적으로 발현되는 조직학적 마커 또는 유전자 마커는, 이들로 제한되지는 않지만, 크로모그라닌 A, CD56, 시납토피신, PGP9.5, ASCL1 및 신경 특이적 에놀라제(NSE)를 포함한다.
따라서, 본 발명의 ADC는 가성 신경내분비 종양 및 표준 신경내분비 종양을 둘 다 치료하는 데 유리하게 사용될 수 있다. 이와 관련하여, ADC는 신장, 비뇨생식관(방광, 전립선, 난소, 자궁, 자궁 내막과), 위장관(대장, 위), 갑상선(갑상선 수질 암) 및 폐(소세포 폐암종 및 대세포 신경내분비 암종)에서 발생하는 신경내분비 종양(NET 및 pNET 둘 다)을 치료하는 데 사용될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 ADC는 NSE, CD56, 시냅토파이신, 크로모그라닌 A, ASCL1 및 PGP9.5(UCHL1)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현하는 종양을 치료하는 데 사용될 수 있다. 즉, 본 발명은 NSE+ 또는 CD56+ 또는 PGP9.5+ 또는 ASCL1+ 또는 SYP+ 또는 CHGA+ 또는 이들의 일부 조합인 종양을 앓고 있는 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다.
혈액암에 대하여, 본 발명의 화합물 및 방법이 저등급/NHL 난포 세포 림프종(FCC), 맨틀 세포 림프종(MCL), 확산 대세포 림프종(DLCL), 소 림프구(SL) NHL, 중간 등급/난포 NHL, 중간 등급 확산 NHL, 고등급 면역아세포 NHL, 고 등급 림프모구 NHL, 고 등급 소 비절개 세포 NHL, 벌키 질환 NHL, 발덴스트롬(Waldenstrom) 마크로글로불린혈증, 림포플라스마사이토이드 림프종(LPL), 맨틀 세포 림프종(MCL), 난포성 림프종(FL), 확산 대세포 림프종(DLCL), 버킷(Burkitt) 림프종(BL), AIDS 관련 림프종, 단구 B 세포 림프종, 혈관면역모세포성 림프선종, 소 림프구, 난포성, 확산 대세포, 확산 소 절개 세포, 대세포 면역아세포 림프아세포종, 소, 비절개, 버킷 및 비-버킷, 난포성, 주로 대세포; 난포성, 주로 소 절개 세포; 및 난포성, 혼합 소 절개 세포와 대세포 림프종을 포함하는, 다양한 B-세포 림프종을 치료하는 데 특히 효과적일 수 있다는 것이 추가로 인정된다. 문헌[Gaidono et al., "Lymphomas", IN CANCER: PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY, Vol. 2: 2131-2145 (DeVita et al., eds., 5.sup.th ed. 1997)]을 참고한다. 이들 림프종이 분류 체계의 변화로 인해 종종 상이한 병명을 갖고, 상이한 병명하에 분류된 림프종을 앓는 환자 또한 본 발명의 병용 치료 계획으로 혜택을 얻음은 당업자에게 명백해야 한다.
본 발명은 또한 양성 또는 전암성 종양이 있는 것으로 나타난 대상체의 방지 또는 예방적 치료를 제공한다. DLL3 관련 장애 이외에, 어떠한 특정 유형의 종양 또는 증식 장애라도 본 발명을 사용한 치료로부터 배제되어야 한다고 고려되어서는 않된다. 그러나, 종양 세포의 유형은 제2 치료제, 특히 화학 치료제 및 표적 항암제와 병용한 본 발명의 용도와 관련될 수 있다.
바람직하게는, 치료되는 "대상체" 또는 "환자"는 사람이지만, 본원에서 사용된 바와 같이, 상기 용어는 모든 포유동물을 포함한 어떠한 종이라도 포함하는 것으로 유지된다. 따라서, 대상체/환자는 동물, 포유동물, 태반 포유동물, 유대류(예: 캥거루, 웜뱃), 단공류(예: 오리 주둥이의 오리너구리), 설치류(예: 기니피그, 햄스터, 래트, 마우스), 뮤린(예: 마우스), 토끼목(예: 래빗), 조류(예: 새), 개과(예: 개), 고양이과(예: 고양이), 말속(예: 말), 멧돼지속(예: 돼지), 양속(예: 양), 소과(예: 소), 영장류, 진원류(예: 원숭이 또는 유인원), 원숭이(예: 마모셋, 비비), 유인원(예: 고릴라, 침팬지, 오랑우탄, 긴팔 원숭이), 또는 사람일 수 있다.
VIII. 제조품
DLL3 ADC의 하나 이상의 용량을 포함하는, 하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩 및 키트가 또한 제공된다. 특정 양태에서, 단위 용량이 하나 이상의 첨가제의 존재 또는 부재하에, 예를 들면, 항-DLL3 접합체를 포함하는 소정량의 조성물을 함유하는 단위 용량이 제공된다. 기타 양태에 대하여, 이러한 단위 용량은 주사용 1회용 예비충전 주사기에 공급된다. 기타 양태에서, 단위 용량에 함유된 조성물은 염수, 수크로스 등; 완충제, 예를 들면, 인산염 등을 포함하고/하거나; 안정하고 유효한 pH 범위 내에서 제형화될 수 있다. 대안적으로, 특정 양태에서, 접합체 조성물은 적합한 액체, 예를 들면, 멸균수 또는 염수 용액의 첨가시 재구성될 수 있는 동결건조 분말로서 제공될 수 있다. 특정 바람직한 양태에서, 조성물은 이들로 제한되지는 않지만, 수크로스 및 아르기닌을 포함하는, 단백질 응집체를 억제하는 하나 이상의 물질을 포함한다. 용기 위 또는 용기와 결합된 어떠한 라벨이라도 봉입 접합체 조성물이 선택된 신생물 질환 상태를 치료하는 데 사용됨을 나타낸다.
본 발명은 또한 DLL3 접합체와, 임의로, 하나 이상의 항암제의 단일 용량 또는 다중 용량 투여 단위를 생성하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 용기 및 용기 위 또는 용기와 결합된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들면, 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱 등의 다양한 물질로부터 형성될 수 있고, 접합체 또는 비접합체 형태로 개시된 약제학적 유효량의 DLL3 접합체를 함유할 수 있다. 기타 바람직한 양태에서, 용기(들)는 멸균 접근 포트(예를 들면, 용기는 피하 주사 바늘에 의하여 천공 가능한 마개를 갖는 정맥내 용액제 백 또는 바이알일 수 있다)를 포함한다. 이러한 키트는 일반적으로 적합한 용기에 DLL3 접합체와, 임의로, 동일하거나 상이한 용기내 하나 이상의 항암제의 약제학적으로 허용되는 제형을 함유한다. 키트는 또한 진단 또는 병용 요법을 위하여, 기타 약제학적으로 허용되는 제형을 함유할 수도 있다. 예를 들면, 본 발명의 DLL3 접합체 이외에, 이러한 키트는 화학치료 또는 방사선 치료 약제 등의 항암제; 항신생혈관제; 항전이제; 표적 항암제; 세포 독성제; 및/또는 기타 항암제의 범위중 어느 하나 이상을 함유할 수 있다.
보다 구체적으로, 키트는 DLL3 ADC를 추가의 성분의 존재 또는 부재하에 함유하는 단일 용기를 가질 수 있거나, 각각의 목적하는 제제에 대한 별개의 용기를 가질 수 있다. 병용 요법이 접합체에 대하여 제공되는 경우, 단일 용액은 몰 당량 조합으로, 또는 한 성분과 과량의 다른 성분으로 예비 혼합될 수 있다. 대안적으로, 키트의 DLL3 접합체 및 어떠한 임의의 항암제라도 환자에게 투여하기 전에 별개의 용기 내에 개별적으로 유지될 수 있다. 키트는 또한 약제학적으로 허용되는 멸균 완충제 또는 기타 희석제, 예를 들면, 주사용 정균수(BWFI), 인산염 완충 염수(PBS), 링거액 및 덱스트로스 용액을 함유하기 위한 제2/제3 용기 수단을 포함한다.
키트 성분이 하나 이상의 액상 용액에 제공되는 경우, 액상 용액은 바람직하게는 수용액이며, 멸균 수성 또는 염수 용액이 특히 바람직하다. 그러나, 키트의 성분은 건조 분말(들)로서 제공될 수 있다. 시약 또는 성분이 건조 분말로서 제공되는 경우, 분말은 적합한 용매의 첨가로 재구성될 수 있다. 용매는 또한 또 다른 용기에 제공될 수도 있다는 것이 계획된다.
위에 간략하게 나타낸 바와 같이, 키트는 또한 항체 접합체 및 어떠한 임의 성분이라도 동물 또는 환자에게 투여하는 수단, 예를 들면, 하나 이상의 바늘, I.V. 백 또는 주사기, 또는 점안기, 피펫, 또는 이로부터 제형이 동물로 주사되거나 도입되거나, 신체의 감염 부위에 적용될 수 있는, 기타 이러한 유사 기구를 함유할 수 있다. 본 발명의 키트는 또한 통상적으로는 상업적 판매를 위한 밀폐 구금내 바이알 또는 이러한 유사, 및 기타의 성분을 함유하기 위한 수단, 예를 들면, 내부로 목적하는 바이알 및 기타 기구가 위치하여 보유되는 사출 또는 취입 성형된 플라스틱 용기를 포함한다. 어떠한 라벨 또는 패키지 삽입물이라도 DLL3 접합체 조성물이 암, 예를 들면, 소세포 폐암을 치료하는 데 사용된다는 것을 나타낸다.
기타 바람직한 양태에서, 본 발명의 접합체는 증식 장애의 예방 또는 치료에 유용한 진단 또는 치료 장치와 함께 사용되거나 이를 포함할 수 있다. 예를 들면, 바람직한 양태에서, 본 발명의 화합물 및 조성물은 증식 장애의 병인 또는 징후에 수반되는 세포 또는 마커를 검출하거나 모니터링하거나 정량하거나 프로파일링하는 데 사용될 수 있는 특정 진단 장치 또는 기기와 결합될 수 있다. 선택된 양태에 대하여, 마커 화합물은 NSE, CD56, 시납토파이신, 크로모그라닌 A 및 PGP9.5를 포함할 수 있다.
특히 바람직한 양태에서, 장치는 생체내 또는 시험관내에서 순환 종양 세포를 검출, 모니터링 및/또는 정량하는 데 사용될 수 있다(예를 들면, 본원에서 참조로 인용되는 WO 제2012/0128801호 참조). 기타 바람직한 양태에서, 위에서 논의된 바와 같이, 순환 종양 세포는 암 줄기 세포를 포함할 수 있다.
IX. 염기 서열 요약
다수의 핵산 및 아미노산 서열을 포함한 염기 서열이 본원에 첨부된다. 다음 표 2는 포함된 서열의 요약을 제공한다.
Figure pct00031
X. 기타
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학적 기술적 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는다. 추가로, 문맥상 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고, 복수 용어는 단수를 포함한다. 보다 구체적으로, 본 명세서 및 첨부된 청구항에 사용된 바와 같이, 단수 형태 하나("a," "an") 및 상기("the")는 문맥에서 달리 지시되지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "단백질" 언급은 복수의 단백질을 포함하고; "세포" 언급은 세포 등의 혼합물을 포함한다. 또한, 명세서 및 첨부된 청구항에 제공된 범위는 종점 및 종점들 사이의 모든 점을 포함한다. 그러므로, 2.0 내지 3.0은 2.0, 3.0 및 2.0과 3.0 사이의 모든 점을 포함한다.
일반적으로, 본원에서 사용된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 하이브리드화와 관련하여 사용된 명명법 및 이들의 교시는 당해 기술분야에서 일반적으로 사용된다. 본 발명의 방법 및 기술은 달리 지시되지 않는 한, 일반적으로 당해 기술분야에 익히 공지되고 본 명세서 전체에서 인용되고 논의된 다양한 일반적인 그리고 보다 특정한 참조 문헌에 기재된 바와 같은 종래의 방법에 따라 수행된다. 예를 들면, 문헌[참조: Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 6th ed., W.B. Saunders Company (2010); Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); and Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003)]을 참조한다. 효소 반응 및 정제 기술은 당해 기술분야에서 일반적으로 달성되거나 본원에 기재된 바와 같이, 제조자의 명세서에 따라 수행된다. 본원에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학 및 의학 및 약화학과 관련하여 사용된 명명법 및 이들의 실험 절차 및 교시는 당해 기술분야에 익히 공지되어 있거나 일반적으로 사용되는 것이다. 더욱이, 본원에 사용된 어떠한 절의 제목이라도 단지 구성을 목적으로 한 것이고, 기재된 주제를 제한하는 것으로 이해되지 않아야 한다.
본원에 사용된 특정 약어는 다음과 같다:
Ac 아세틸
Acm 아세트아미도메틸
Alloc 알릴옥시카보닐
Boc 디-3급-부틸 디카보네이트
t-Bu 3급-부틸
Bzl 벤질(여기서, Bzl-OMe는 메톡시벤질이고, Bzl-Me는 메틸벤젠이다)
Cbz 또는 Z 벤질옥시-카보닐(여기서, Z-Cl 및 Z-Br은 각각 클로로- 및 브로모벤질옥시카보닐이다)
DMF N,N-디메틸포름아미드
Dnp 디니트로페닐
DTT 디티로트레이톨
Fmoc 9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐
imp N-10 이민 보호 그룹: 3-(2-메톡시에톡시)프로파노에이트-Val-Ala-PAB MC-OSu 말레이미도카프로일-O-N-석신이미드
Moc 메톡시카보닐
MP 말레이미도프로판아미드
Mtr 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠설포닐
PAB 파라-아미노벤질옥시카보닐
PEG 에틸렌옥시
PNZ p-니트로벤질 카바메이트
Psec 2-(페닐설포닐)에톡시카보닐
TBDMS 3급-부틸디메틸실릴
TBDPS 3급-부틸디페닐실릴
Teoc 2-(트리메틸실릴)에톡시카보닐
Tos 토실
Troc 2,2,2-트리클로르에톡시카보닐 클로라이드
Trt 트리틸
Xan 크산틸
실시예
이렇게 일반적으로 위에서 기재된, 본 발명은 다음 실시예를 참조로 하여 보다 용이하게 이해되며, 실시예는 예시로서 제공되고 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 실시예는 아래 실험들이 전부이거나 수행된 유일한 실험들임을 나타내려는 것이 아니다. 달리 지시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨이고, 압력은 대기압 또는 거의 대기압이다.
실시예 1
PBD 약물-링커 화합물의 제조
PBD 약물-링커 화합물 DL1 - DL5는 다음과 같이 합성되었다:
A. 일반 실험 방법
ADP 220 편광계(Bellingham Stanley Ltd.)에서 광학 회전을 측정하였고, 농도(c)는 g/100㎖로 제공된다. 융점은 디지털 융점 기구(Electrothermal)를 사용하여 측정하였다. IR 스펙트럼들을 퍼킨-엘머(Perkin-Elmer) 스펙트럼 1000 FT IR 스펙트로미터에서 기록하였다. 1H 및 13C NMR 스펙트럼들은 각각 400 및 100MHz에서 브루커 어드밴스(Bruker Avance) 분광계를 사용하여 300K에서 획득되었다. 화학 이동은 TMS(δ = 0.0ppm)에 대하여 보고되어 있고, 신호는 s(단일항), d(이중항), t(삼중항), dt(이중 삼중항) dd(이중항의 이중항), ddd(이중항의 이중 이중항) 또는 m(다중항)으로서 표시하고, 커플링 상수는 헤르츠(Hz)로 제시된다. 질량 분광학(MS) 데이터는 워터스(Waters) 2695 HPLC와 워터스 2996 PDA에 연결된 워터스 마이크로매스 ZQ 기기를 사용하여 회수하였다. 사용된 워터스 마이크로매스 ZQ 파라미터는: 모세관(kV), 3.38; 콘(V), 35; 추출기(V), 3.0; 공급 온도(℃), 100; 탈용매화 온도(℃), 200; 콘 유랑(L/h), 50; 탈용매화 유량(L/h), 250. 고해상도 질량 분광법(HRMS) 데이터를 샘플을 기기로 도입하는 금속 피복된 보로실리케이트 유리 팁을 사용하여 양성 W-모드에서 워터스 마이크로매스 QTOF 글로벌에 기록하였다. 박층 크로마토그래피(TLC)를 실리카 겔 알루미늄 플레이트(Merck 60, F254)에서 수행하고, 섬광 크로마토그래피는 실리카 겔을 이용하였다(Merck 60, 230-400 메쉬 ASTM). HOBt(NovaBiochem) 및 고체 지지 시약(Argonaut)을 제외하고는 모든 기타 화학 물질 및 용매는 시그마-알드리치로부터 구입하였고, 추가의 정제 없이 공급한 그대로 사용되었다. 무수 용매는 적합한 건조제의 존재하에 건조 질소 대기하에 증류시켜 제조하였고, 4Å 분자 체 또는 나트륨 와이어에서 저장하였다. 석유 에테르는 40-60℃에서 비등하는 분획을 말한다.
발생시 개시된 화합물은 2개의 약간 상이한 절차를 사용하여 LC/MS를 수행하였다. 디폴트 절차는 달리 지시되지 않는 한 사용된 기재된 제1 방법이었다.
방법 1(디폴트 방법, 달리 언급되지 않는 한 사용됨) - 물(A)(포름산 0.1%) 및 아세토니트릴(B)(포름산 0.1%)의 이동상을 사용하여 HPLC(Waters Alliance 2695)를 실시하였다. 구배: 초기 조성 5% B를 10분에 걸쳐 유지한 다음, 5% B로부터 95% B로 3분에 걸쳐 증가시켰다. 조성을 95% B에서 0.1분 동안 유지시킨 다음, 0.03분만에 5% B로 회귀하고, 여기서 0.87분 동안 유지하였다. 전체 구배 실시 시간은 5분이다.
방법 2 - 물(A)(포름산 0.1%) 및 아세토니트릴(B)(포름산 0.1%)의 이동상을 사용하여 HPLC(Waters Alliance 2695)를 실시하였다. 구배: 초기 조성 5% B를 10분에 걸쳐 유지한 다음, 5% B로부터 95% B로 2.5분에 걸쳐 증가시켰다. 조성을 95% B에서 0.5분 동안 유지시킨 다음, 0.1분만에 5% B로 회귀하고, 여기서 0.9분 동안 유지하였다. 전체 구배 실시 시간은 5분이다.
두 방법 모두에 대하여 유량은 3.0㎖/min였고, 400㎕는 질량 분광계로 통과하는 0 불용 체적 티 피스(zero dead volume tee piece)를 통하여 분할되었다. 파장 검출 범위: 220 내지 400nm. 기능 유형: 다이오드 어레이(535 스캔). 컬럼: Phenomenex Onyx Monolithic C18 50×4.60 mm.
역상 섬광 정제 상태는 다음과 같았다: 물(A) 및 아세토니트릴(B)(포름산 0.1%)의 이동상을 사용하여 섬광 정제 시스템(Varian 971-Fp)을 실시하였다. 구배: 초기 조성 5% B를 20 C.V(컬럼 용적)에 걸쳐 유지한 다음, 5% B로부터 70% B로 60 C.V. 내에 증가시켰다. 조성을 95% B에서 15 C.V. 동안 유지시킨 다음, 5 C.V.만에 5% B로 회귀시키고, 5% B에서 10 C.V. 동안 유지하였다. 전체 구배 실시 시간은 120 C.V.이다. 유량 6.0㎖/min. 파장 검출 범위: 254nm. 컬럼: Agilent AX1372-1 SF10-5.5gC8.
분취용 HPLC를 다음과 같이 수행하였다: 역상 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC)를 다음 치수를 갖는 페노메넥스 제미니(Phenomenex Gemini) NX 5μ C-18 컬럼에서 수행하였다: 분석에 대하여 150×4.6mm, 제조 작업에 대하여 150×21.20mm. 모든 UPLC 실험은 구배 상태로 수행하였다. 사용된 용출제는 용매 A(H2O와 0.1% 포름산) 및 용매 B(CH3CN와 0.1% 포름산)였다. 사용된 유량은 분석에 대하여 1.0㎖/min, 분취용 HPLC에 대하여 20.0㎖/min이었다. 검출은 254 및 280nm에서 수행하였다.
B. 약물-링커 DL1의 합성(경로 1)
Figure pct00032
(a) 1',3'-비스[2-메톡시-4-(메톡시카보닐)페녹시]프로판 (3)
디이소프로필 아조디카복실레이트(71.3㎖, 73.2g, 362mmol)를 무수 THF(800㎖) 중의 메틸 바닐레이트(2)(60.0g, 329mmol)와 Ph3P(129.4g, 494mmol)의 오버헤드 교반 용액에 질소 대기하에 0-5℃(얼음/아세톤)에서 60분에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 0-5℃에서 추가로 1시간 동안 교반한 후, THF(12㎖) 중의 1,3-프로판디올(11.4㎖, 12.0g, 158mmol)의 용액을 20분 동안 적가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온시키고, 5일 동안 교반하였다. 수득한 백색 침전물(3)을 진공 여과로 회수하고, THF로 세척하고, 진공 데시케이터에서 일정 중량까지 건조시켰다. 수율 = 54.7g (1,3-프로판디올을 기준으로 84%). LC/MS(3.20 min (ES+) m/z (상대 강도) 427 ([M + Na]+, 10))에 의한 만족스러운 순도;
Figure pct00033
(b) 1',3'-비스[2-메톡시-4-(메톡시카보닐)-5-니트로페녹시]프로판 (4)
고체 Cu(NO3)2.3H2O(81.5g, 337.5mmol)를 0-5℃(얼음/아세톤)에서 아세트산 무수물(650㎖) 중의 비스-에스테르(3)(54.7g, 135mmol)의 오버헤드 교반 슬러리에 서서히 가하였다. 반응 혼합물을 0-5℃에서 1시간 동안 교반한 다음, 실온으로 가온시켰다. 혼합물의 증점 및 NO2의 발생에 의하여 달성된, 온화한 발열(약 40-50℃)이 이 단계에서 관찰되었다. 추가의 아세트산 무수물(300㎖)을 가하고, 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 얼음(약 1.5ℓ)으로 붓고, 교반하고, 실온으로 회귀시켰다. 수득한 황색 침전물을 진공 여과로 회수하고, 데시케이터에서 건조시켜 목적하는 비스-니트로 화합물(4)을 황색 고체로서 수득하였다. 수율 = 66.7g(100%). LC/MS(3.25 min (ES+) m/z (상대 강도) 517 ([M + Na]+, 40))에 의한 만족스러운 순도;
Figure pct00034
(c) 1',3'-비스(4-카복시-2-메톡시-5-니트로페녹시) 프로판 (5)
THF(700㎖) 중의 메틸 에스테르(4)(66.7g, 135mmol)의 슬러리를 1N NaOH(700㎖)로 처리하고, 반응 혼합물을 실온에서 격렬하게 교반하였다. 4일간의 교반 후, 슬러리는 어두운 색의 용액이 되었고, 이를 감압하에 회전 증발시켜 THF를 제거하였다. 수득한 수성 잔사를 농축 HCl로 pH 1로 산성화시켰고, 무색 침전물(5)을 회수하고, 진공 오븐(50℃)에서 완전히 건조시켰다. 수율 = 54.5g (87%). LC/MS(2.65 min (ES+) m/z (상대 강도) 489 ([M + Na]+, 30))에 의한 만족스러운 순도;
Figure pct00035
(d) 1,1'-[[(프로판-1,3- 디일 ) 디옥시 ] 비스 [(5- 메톡시 -2-니트로-1,4- 페닐렌 )카보닐]]비스[(2S,4R)-메틸-4-하이드록시피롤리딘-2-카복실레이트] (6)
옥살릴 클로라이드(24.5㎖, 35.6g, 281mmol)를 무수 DCM(600㎖) 중의 니트로벤조산(5)(43g, 92.3mmol)과 DMF(6㎖)의 교반 현탁액에 가하였다. 초기 비등(effervescence) 이후 반응 현탁액은 용액이 되었고, 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물의 샘플을 MeOH로 처리하여 산 클로라이드로의 전환을 확인하고, 수득한 비스-메틸 에스테르를 LC/MS에 의하여 관찰하였다. 감압하에 증발시켜 용매 대부분을 제거하고; 수득한 농축 용액을 최소량의 무수 DCM에 재용해시키고, 디에틸 에테르와 분쇄하였다. 수득한 황색 침전물을 여과시켜 회수하고, 냉 디에틸 에테르로 세척하고, 40℃의 진공 오븐에서 1시간 동안 건조시켰다. 고체 산 클로라이드를 -40℃(드라이 아이스/CH3CN)에서 25분에 걸쳐 DCM(400㎖) 중의 (2S,4R)-메틸-4-하이드록시피롤리딘-2-카복실레이트 하이드로클로라이드(38.1g, 210mmol)와 TEA(64.5㎖, g, 463mmol)의 교반 현탁액에 조금씩 가하였다. 즉시, 반응을 LC/MS(2.47 min (ES+) m/z (상대 강도) 721 ([M + H]+, 100))에 의하여 판단하여 완료하였다. 혼합물을 DCM(200㎖)으로 희석하고, 1N HCl(300㎖), 포화 NaHCO3(300㎖), 염수(400㎖)로 세척하고, 건조시키고(MgSO4), 여과하고, 진공하에 용매를 증발시켜 순수한 생성물(6)을 오렌지색 고체(66.7g, 100%)로서 수득하였다. [α]22 D = -46.1°(c = 0.47, CHCl3);
Figure pct00036
(e) 1,1'-[[(프로판-1,3-디일)디옥시]비스(11aS,2R)-2-(하이드록시)-7-메톡시-1,2,3,10,11,11a-헥사하이드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]-벤조디아제핀-5,11-디온] (7)
방법 A: MeOH(2.8ℓ) 중의 니트로-에스테르(6)(44g, 61.1mmol)의 용액을 5ℓ 3구 환저 플라스크 중의 새로이 구입한 라니(Raney)® 니켈(H2O 중의 약 50% 슬러리 약 50g)과 범핑 방지 과립(anti-bumping granule)에 가하였다. 혼합물을 환류 가열한 다음, MeOH(200㎖) 중의 하이드라진 수화물(21.6㎖, 22.2g, 693mmol)의 용액으로 적가 처리하고 이 시점에서 격렬한 비등이 관찰되었다. 첨가가 완료되면(약 45분), 비등이 중단되고 반응 혼합물의 초기 황색이 방출될 때까지 추가의 라니® 니켈을 조심스럽게 가하였다. 혼합물을 추가로 5분 동안 환류 가열하고 이 시점에서 반응은 TLC(90:10 v/v CHCl3/MeOH) 및 LC/MS(2.12 min (ES+) m/z (상대 강도) 597 ([M + H]+, 100))에 의하여 완료된 것으로 간주되었다. 반응 혼합물을 진공 흡인으로 셀라이트를 함유하는 소결 깔때기를 통하여 즉시 뜨거운 상태로 여과하였다. 여액을 진공하에 증발시켜 용적 감소시켰고 이 시점에서 무색 침전물이 형성되어 이를 여과시켜 회수하고 진공 데시케이터에서 건조시켜 (7)(31g, 85%)을 제공하였다. [α]27 D = +404°(c = 0.10, DMF);
Figure pct00037
방법 B: DMF(40㎖) 중의 10% Pd/C(7.5g, 10% w/w)의 현탁액을 DMF(360㎖) 중의 니트로-에스테르(6)(75g, 104mmol)의 용액에 가하였다. 현탁액을 파르(Parr) 수소화 기구에서 8시간에 걸쳐 수소화시켰다. 수소 흡수를 중단시킨 후, 반응 진행을 LC/MS에 의하여 모니터링하였다. 고체 Pd/C를 여과시켜 제거하고, 여액을 40℃에서 진공하에(10mbar 미만) 회전 증발시켜 농축시켜 미량의 DMF와 잔여 목탄을 함유하는 어두운 오일을 수득하였다. 잔사를 수욕(회전 증발기 욕) 상에서 40℃에서 EtOH(500㎖)에 침지시키고(digesting), 수득한 현탁액을 셀라이트를 통하여 여과하고, 에탄올(500㎖)로 세척하여 투명한 여액을 수득하였다. 하이드라진 수화물(10㎖, 321mmol)을 용액에 가하고, 반응 혼합물을 환류 가열하였다. 20분 후, 백색 침전물의 형성이 관찰되었고, 환류를 추가로 30분 동안 지속하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 침전물을 여과시켜 회수하고, 디에틸 에테르(침전물의 2:1 용적)로 세척하고, 진공 데시케이터에서 건조시켜 (7)(50g, 81%)을 제공하였다. 방법 B에 대한 분석 데이터: 방법 A에 대하여 수득한 것과 동일함(광 회전, 1H NMR, LC/MS 및 TLC).
(f) 1,1'-[[(프로판-1,3-디일)디옥시]비스(11aS,2R)-2-(3급-부틸디메틸실릴옥시)-7-메톡시-1,2,3,10,11,11a-헥사하이드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]-벤조디아제핀-5,11-디온] (8)
TBSCl(27.6g, 182.9mmol) 및 이미다졸(29.9g, 438.8mmol)을 0℃에서(얼음/아세톤) 무수 DMF(400㎖) 중의 테트라락탐(7)(21.8g, 36.6mmol)의 혼탁 용액에 가하였다. 혼합물을 질소 대기하에 3시간 동안 교반한 후, LC/MS(3.90 min (ES+) m/z (상대 강도) 825 ([M + H]+, 100))에 의하여 판단하여 반응이 완료되었다고 간주된다. 반응 혼합물을 얼음(약 1.75ℓ)으로 붓고, 교반하면서 실온으로 가온시켰다. 수득한 백색 침전물을 진공 여과에 의하여 회수하고, H2O 및 디에틸 에테르로 세척하고, 진공 데시케이터에서 건조시켜 순수한 (8)(30.1g, 99%)을 제공하였다. [α]23 D = +234°(c = 0.41, CHCl3);
Figure pct00038
(g) 1,1'-[[(프로판-1,3-디일)디옥시]비스(11aS,2R)-2-(3급-부틸디메틸실릴옥시)-7-메톡시-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-1,2,3,10,11,11a-헥사하이드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]-벤조디아제핀-5,11-디온] (9)
n-BuLi(헥산 중의 1.6M 용액 68.3㎖, 109mmol)을 질소 대기하에 -30℃에서(드라이 아이스/에틸렌 글리콜) 무수 THF(600㎖) 중의 테트라락탐(8)(30.08g, 36.4mmol)에 적가하였다. 반응 혼합물을 이 온도에서 1시간 동안 교반하고(이제 붉으스름한 오렌지색) 이 시점에서 무수 THF(120㎖) 중의 SEMCl(19.3㎖, 18.2g, 109mmol)의 용액을 적가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 서서히 가온시키고, 질소 대기하에 16시간 동안 교반하였다. 반응은 TLC(EtOAc) 및 LC/MS(4.77 min (ES+) m/z (상대 강도) 1085 ([M + H]+, 100))에 의하여 판단하여 완료된 것으로 간주되었다. 진공하에 증발시켜 THF를 제거하고, 수득한 잔사를 EtOAc(750㎖)에 용해시키고, H2O(250㎖), 염수(250㎖)로 세척하고, 건조시키고(MgSO4) , 여과하고, 진공하에 증발시켜 조 N10-SEM 보호 테트라락탐(9)을 오일(maxm 39.5g, 100%)로서 제공하였다. 생성물을 정제하지 않고 다음 단계로 진행시킨다. [α]23 D = +163°(c = 0.41, CHCl3);
Figure pct00039
(h) 1,1'-[[(프로판-1,3-디일)디옥시]비스(11aS,2R)-2-하이드록시-7-메톡시-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-1,2,3,10,11,11a-헥사하이드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]-벤조디아제핀-5,11-디온] (10)
TBAF(THF 중의 1.0M 용액 150㎖, 150mmol)를 실온에서 THF(800㎖) 중의 조 비스-실릴 에테르(9)[84.0g (maxm 56.8g), 52.4mmol]의 교반 용액에 가하였다. 1시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 TLC(95:5 v/v CHCl3/MeOH)에 의하여 분석하여 반응 완료를 밝혀내었다. THF를 실온에서 감압하에 증발시켜 제거하고, 수득한 잔사를 EtOAc(500㎖)에 용해시키고, NH4Cl(300㎖)로 세척하였다. 합한 유기층을 염수(60㎖)로 세척하고, 건조시키고(MgSO4), 여과하고, 감압하에 증발시켜 조 생성물을 제공하였다. 섬광 크로마토그래피(구배 용출: 100% CHCl3 내지 96:4 v/v CHCl3/MeOH)로 정제하여 순수한 테트라락탐(10)을 백색 발포체(36.0g, 79%)로서 수득하였다. LC/MS 3.33 min (ES+) m/z (상대 강도) 879 ([M + Na]+, 100), 857 ([M + H]+, 40); [α]23 D = +202° (c = 0.34, CHCl3);
Figure pct00040
(i) 1,1'-[[(프로판-1,3-디일)디옥시]비스(11aS)-7-메톡시-2-옥소-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-1,2,3,10,11,11a-헥사하이드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]-벤조디아제핀-5,11-디온] (11)
디올(10)(25.6g, 30mmol, 1당량), NaOAc(6.9g, 84mmol, 2.8당량) 및 TEMPO(188㎎, 1.2mmol, 0.04당량)를 Ar하에 DCM(326㎖)에 용해시켰다. 이를 -8℃(내부 온도)로 냉각시키고, TCCA(9.7g, 42mmol, 1.4당량)를 15분에 걸쳐 조금씩 가하였다. 30분 후 TLC(EtOAc) 및 LC/MS[3.60 min. (ES+) m/z (상대 강도) 854.21 ([M + H]+, 40), (ES-) m/z (상대 강도) 887.07 ([M - H + Cl]-, 10)]는 반응이 완료됨을 나타내었다. 냉 DCM(200㎖)을 가하고, 혼합물을 셀라이트 패드를 통하여 여과한 후, 포화 탄산수소나트륨/티오황산나트륨의 용액(1:1 v/v; 200㎖×2)으로 세척하였다. 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 용매를 진공하에 제거하여 황색/오렌지색 스폰지(25.4g, 99%)를 수득하였다. LC/MS [3.60 min. (ES+) m/z (상대 강도) 854.21 ([M + H]+, 40); [α]20 D = +291° (c = 0.26, CHCl3);
Figure pct00041
(j) 1,1'-[[(프로판-1,3-디일)디옥시]비스(11aS)-7-메톡시-2-[[(트리플루오로메틸)설포닐]옥시]-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-1,10,11,11a-테트라하이드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]-벤조디아제핀-5,11-디온] (12)
무수 2,6-루티딘(5.15㎖, 4.74g, 44.2mmol)을 질소 대기하에 -45℃에서(드라이 아이스/아세토니트릴), 무수 DCM(180㎖) 중의 비스-케톤(11)(6.08g, 7.1mmol)의 격렬하게 교반된 용액에 일부분 주입하였다. 새로이 개방된 앰플로부터 취한, 무수 트리플산 무수물(7.2㎖, 12.08g, 42.8mmol)을 신속하게 적가하여 주입하는 한편, 온도를 -40℃ 이하로 유지시켰다. 반응 혼합물을 -45℃에서 1시간 동안 교반하고, 이 시점에서 TLC(50/50 v/v n-헥산/EtOAc)는 출발 물질의 완전한 소모를 밝혀내었다. 냉 반응 혼합물을 DCM(200㎖)로 즉시 희석히키고, 격렬하게 진탕시키면서, 물(1×100㎖), 5% 시트르산 용액(1×200㎖), 포화 NaHCO3(200㎖), 염수(100㎖)로 세척하고, 건조시켰다(MgSO4). 감압하에 용매를 여과 및 증발시켜 조 생성물을 수득하고 이를 섬광 크로마토그래피(구배 용출: 90:10 v/v n-헥산/EtOAc 내지 70:30 v/v n-헥산/EtOAc)에 의하여 정제하여 비스-에놀 트리플레이트(12)를 황색 발포체(5.5g, 70%)로서 수득하였다. LC/MS 4.32 min (ES+) m/z (상대 강도) 1139 ([M + Na]+, 20); [α]24 D = +271° (c = 0.18, CHCl3);
Figure pct00042
Figure pct00043
(a) (S)-8-(3-(((S)-2-(4-아미노페닐)-7-메톡시-5,11-디옥소-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-5,11-디옥소-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-2-일 트리플루오로메탄설포네이트 (13)
Pd(PPh3)4(116.9㎎, 0.101mmol)를 비스-에놀 트리플레이트(12)(5.65g, 5.06mmol), 4-아미노페닐보론산 피나콜 에스테르(1g, 4.56mmol), Na2CO3(2.46g, 23.2mmol), MeOH(37㎖), 톨루엔(74㎖) 및 물(37㎖)의 교반 혼합물에 가하였다. 반응 혼합물을 질소 대기하에 30℃에서 24시간 동안 교반하고, 그 후 모든 보론산 에스테르가 소모되었다. 이어서, 반응 혼합물을 건조 상태로 증발시킨 후, 잔사를 EtOAc(150㎖)에 흡수시키고, H2O(2×100㎖), 염수(150㎖)로 세척하고, 건조시키고(MgSO4), 여과하고, 감압하에 증발시켜 조 생성물을 제공하였다. 섬광 크로마토그래피(구배 용출: 80:20 v/v 헥산/EtOAc 내지 60:40 v/v 헥산/EtOAc)에 의하여 정제하여 생성물(13)을 노르스름한 발포체(2.4g, 45%)로서 수득하였다. LC/MS 4.02 min (ES+) m/z (상대 강도) 1060.21 ([M + H]+, 100);
Figure pct00044
(b) (S)-2-(4-아미노페닐)-8-(3-(((S)-2-사이클로프로필-7-메톡시-5,11-디옥소-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온 (14)
트리페닐아르신(0.24g, 0.8mmol), 산화은(I)(1.02g, 4.4mmol), 사이클로프로필보론산(0.47g, 5.5mmol) 및 출발 물질(13)(1.15g, 1.1mmol)을 아르곤 대기하에 디옥산(30㎖)에 용해하였다. 인산칼륨 삼염기성(2.8g, 13.2mmol)을 막자 및 유발로 분쇄하고, 신속하게 반응 혼합물에 가하였다. 반응 혼합물을 배출하고, 아르곤으로 3회 플러슁하고, 71℃로 가열하였다. 팔라듐(II) 비스(벤조니트릴 클로라이드)(84㎎, 0.22mmol)를 가하고, 반응 용기를 비우고, 아르곤으로 3회 플러슁하였다. 10분 후, 작은 샘플을 TLC(80:20 v/v 에틸 아세테이트/헥산) 및 LC/MS에 의한 분석을 위하여 취하였다. 30분 후, 반응은 완료되었고(LC/MS 분석은 출발 물질의 완전한 소모를 나타내었음), 반응물은 에틸 아세테이트(400㎖)로 세척된 필터 패드 및 셀라이트를 통하여 여과하였다. 여액을 물(2×200㎖) 및 염수(2×200㎖)로 세척하였다. 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 진공하에 용매를 제거하였다. 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(30:70 v/v 헥산/ 에틸 아세테이트)로 정제하여 생성물(14)을 오렌지색/황색 고체(0.66g, 63%)로서 수득하였다. 방법 1, LC/MS (3.85 min (ES+) m/z (상대 강도) 952.17 ([M + H]+, 100).
Figure pct00045
(c) (S)-2-(4-아미노페닐)-8-(3-(((S)-2-사이클로프로필-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-5(11aH)-온 (15)
SEM 디락탐(14)(0.66g, 0.69mmol)을 THF(23㎖)에 용해시키고, 아르곤 대기하에 -78℃로 냉각시켰다. 수퍼-하이드라이드(Super-Hydride)® 용액(1.7㎖, THF 중의 1M)을 5분에 걸쳐 적가하는 한편, 온도를 모니터링하였다. 20분 후, 소량의 샘플을 취하고, LC/MS 분석을 위하여 물로 세척하였다. 물(50㎖)을 가하고, 냉 욕을 제거하였다. 유기층을 추출하고, 염수(60㎖)로 세척하였다. 합한 수성 층을 CH2Cl2/MeOH(90/10 v/v)(2×50㎖)로 세척하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 진공하에 용매를 제거하였다. 조 생성물을 MeOH(48㎖), CH2Cl2(18㎖) 및 물(6㎖)에 용해하고, 충분한 실리카 겔을 가하여 두꺼운 현탁액을 수득하였다. 5일 동안 교반한 후, 현탁액을 소결 깔때기를 통하여 여과하고, 생성물이 용출되지 않을 때까지 CH2Cl2/MeOH(9:1)(약 200㎖)로 세척하였다. 유기층을 염수(2×70㎖)로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 진공하에 용매를 제거하였다. 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(100% CHCl3 내지 96/4 v/v CHCl3/MeOH)로 정제하여 생성물(15)을 황색 고체(302㎎, 66%)로서 수득하였다. 방법 1, LC/MS (2.42 min (ES+) m/z (상대 강도) 660.74 ([M + H]+, 30).
Figure pct00046
(d) 알릴 ((2S)-1-(((2S)-1-((4-(8-(3-((2-사이클로프로필-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카바메이트 (16)
아르곤으로 충전된 탈기 환저 플라스크에 HO-Ala-Val-alloc(149.6㎎, 0.549mmol) 및 EEDQ(135.8㎎, 0.549mmol)를 무수 CH2Cl2/MeOH(5㎖)의 9:1 혼합물에 용해시켰다. 플라스크를 알루미늄 박으로 감싸고, 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 출발 물질(15)(302㎎, 0.457mmol)을 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 추가로 40시간 동안 교반한 후, 휘발물을 감압하에 회전 증발에 의하여 제거하였다(반응 이후 LC/MS, RT 출발 물질 2.32 min, (ES+ 660.29 ([M+H]+,100)). 조 생성물을 실리카 겔 크로마토그래피컬럼(100% CHCl3 내지 90/10 v/v CHCl3/MeOH)에 의하여 직접 정제하여 순수한 생성물(16)을 42% 수율(174㎎)로 수득하였다. 방법 2 LC/MS (2.70 min (ES+) m/z (상대 강도) 914.73 ([M+H]+, 60), 660.43 (60), 184.31 (100)).
(e) (2S)-2-아미노-N-((2S)-1-((4-(8-(3-((2-사이클로프로필-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)-3-메틸부탄아미드 (17)
출발 물질(16)(170㎎, 0.185mmol)을 아르곤으로 충전된 환저 플라스크내 무수 CH2Cl2(5㎖)에 용해시킨 후, 피롤리딘(41㎕, 0.21mmol)을 가하였다. 플라스크를 아르곤으로 3회 퍼징/재충전시킨 후, Pd(PPh3)4(14㎎, 0.084mmol)를 가하고, 플러슁 공정을 반복하였다. 1시간 후, 출발 물질의 완전한 소모가 관찰되고(반응 이후 LC/MS), Et2O(50㎖)를 반응 혼합물에 가하여 이를 모든 생성물이 용액에서 빠져나올때가지 교반하였다. 고체를 소결 깔때기를 통하여 여과하고, Et2O(2×25㎖)로 2회 세척하였다. 회수 플라스크를 대체시키고, 분리된 고체를 CHCl3(100㎖ 또는 모든 생성물이 소결 깔때기를 통과할 때까지)에 용해시켰다. 이어서, 휘발물을 감압하에 회전 증발에 의하여 제거하여 조 생성물(17)(168㎎)을 수득하고 이를 다음 단계에 직접 사용하였다. LC/MS 방법 2 (2.70 min (ES+) m/z (상대 강도) 830.27 ([M+H]+, 50), 660.13 (80), 171.15 (100)).
(f) N-((R)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-사이클로프로필-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-1-(3-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)프로판아미도)-3,6,9,12,15,18,21,24-옥타옥사헵타코산-27-아미드( 18 또는 DL1)
출발 물질(17)(154㎎, 0.185mmol) 및 EDCI.HCl(110㎎, 0.185mmol)을 아르곤으로 퍼징되고 충전된 환저 플라스크내 무수 CH2Cl2(5㎖)에 가용화시켰다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 후, PEG8-말레이미드(35.6㎎, 0.185mmol)를 가하고, 반응 혼합물을 추가로 16시간 동안(또는 반응이 LC/MS에 의하여 모니터링하여, 완료될 때까지) 교반하였다. 반응 용액을 CH2Cl2(50㎖)로 희석하고, 유기물을 H2O(50㎖) 및 염수(50㎖)로 세척한 후, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 회전 증발에 의하여 용매를 제거하여 조 생성물을 수득하였다. 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(100% CHCl3 내지 85/15 v/v CHCl3/MeOH)상 정제로 목적하는 생성물(135mg)을 수득하였지만, 미량의 잔여 미반응 PEG8-말레이미드가 관찰되었다(LC/MS에 의하여, 2.21 min, 방법 2). 자동화 역상 실리카 겔 크로마토그래피(H2O/CH3CN)(상태에 대한 일반 정보 참조)로 불순물을 성공적으로 제거하여 순수한 최종 생성물(18, 110mg으로부터 출발하여 순수한 생성물 37mg, 33%)을 수득하였다. 전체 수율 = 17%. 방법 2 LC/MS (2.58 min (ES+) m/z (상대 강도) 1404.03 ([M+H]+, 20), 702.63 (100)).
Figure pct00047
C. 약물-링커 DL1의 합성(경로 2)
Figure pct00048
(a) (R)-2-((R)-2-((((9H- 플루오렌 -9-일) 메톡시 ) 카보닐 )아미노)-3- 메틸부탄아미도 ) 프로판산( 20b )
HO-Ala-Val-H(20a)(350㎎, 1.86mmol) 및 Na2CO3(493㎎, 4.65mmol)을 증류 H2O(15㎖)에 용해시키고, 혼합물을 0℃로 냉각시킨 후, 디옥산(15㎖)을 가하였다(아미노산 염의 부분 침전이 발생하였다). 디옥산(15㎖) 중의 Fmoc-Cl(504㎎, 1.95mmol)의 용액을 10분에 거쳐 격렬하게 교반하면서 적가하였다. 수득한 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반한 후, 빙욕을 제거하고, 16시간 동안 교반을 지속하였다. 용매를 감압하에 회전 증발시켜 제거하고, 잔사를 물(150㎖)에 용해시켰다. pH를 1N HCl로 9 내지 12로 조절하고, 수성 층을 후속적으로 EtOAc(3×100㎖)로 추출하였다. 합한 유기물을 염수(100㎖)로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 회전 증발에 의하여 휘발물을 제거하여, 순수한 HO-Ala-Val-Fmoc(20b)(746㎎, 97% 수율)를 수득하였다. LC/MS 2.85 min (ES+) m/z (상대 강도) 410.60;
Figure pct00049
(b) (9H- 플루오렌 -9-일) 메틸 ((S)-3-메틸-1-옥소-1-(((S)-1-옥소-1-((4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)페닐)아미노)프로판-2-일)아미노)부탄-2-일)카바메이트( 20 )
4-아미노페닐보론산 피나콜 에스테르(146.9㎎, 0.67mmol)를 아르곤으로 플러슁된 플라스크 내에서 실온에서 30분 동안 미리 교반한 무수 DCM(8㎖) 중의 HO-Ala-Val-Fmoc(20b)(330mg, 0.8mmol), DCC(166㎎, 0.8mmol) 및 DMAP(5㎎, cat.)의 용액에 가하였다. 반응 혼합물을 이어서 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 이후 LCMS 및 TLC가 후속되었다. 반응 혼합물을 CH2Cl2로 희석하고, 유기물을 H2O 및 염수로 세척한 후, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 회전 증발에 의하여 용매를 제거하였다. 조 생성물을 실리카 겔 크로마토그래피 컬럼(헥산/EtOAc, 6:4)에 건조 가중시키고, 순수한 생성물(20)을 백색 고체로서 99% 수율로 분리하였다(360㎎).
(c) 8-(3-((2-(4-((S)-2-((S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)페닐)-7-메톡시-5,11-디옥소-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-5,11-디옥소-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-5,{0,11,11a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-2-일 트리플루오로메탄설포네이트 ( 21 )
비스-트리플레이트(12)(2.03g, 1.81mmol), 보론산 피나콜 에스테르(1g, 1.63mmol) 및 Na2CO3(881㎎, 8.31mmol)을 톨루엔/MeOH/H2O의 혼합물, 2:1:1(40㎖)에 용해시켰다. 반응 플라스크를 퍼징시키고, 아르곤으로 3회 충전시킨 후, 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0)(41㎎, 0.035mmol)을 가하고, 반응 혼합물을 30℃로 밤새 가열하였다. 용매를 감압하에 제거하고, 잔사를 H2O(100㎖)에 흡수시키고, EtOAc(3×100㎖)로 추출하였다. 합한 유기물을 염수(100㎖)로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 휘발물을 감압하에 회전 증발로 제거하였다. 조 생성물을 실리카 겔 크로마토그래피컬럼(헥산/EtOAc, 8:2 내지 25:75)으로 정제하여 순수한 (21)을 33% 수율로 수득하였다(885㎎). LC/MS 3.85 min (ES+) m/z (상대 강도) 1452.90;
Figure pct00050
(d) (9H-플루오렌-9-일)메틸((2S)-1-(((2S)-1-((4-(8-(3-((2-사이클로프로필-7-메톡시-5,11-디옥소-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-5,11-디옥소-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카바메이트( 22 )
트리페닐아르신(42㎎, 0.137mmol)을 아르곤 대기하에, 무수 디옥산(10㎖) 중의 PBD-트리플레이트(21)(250㎎, 0.172mmol), 사이클로프로필보론산(73.9㎎, 0.86mmol), 산화은(159㎎, 0.688mmol) 및 인산칼륨 삼염기성(438㎎, 2.06mmol)의 혼합물에 가하였다. 반응물을 아르곤으로 3회 플러슁하고, 비스(벤조니트릴)팔라듐(II) 클로라이드(13.2㎎, 0.034mmol)를 가하였다. 반응을 아르곤으로 3회 더 플러슁한 후, 75℃로 가온시키고, 10분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통하여 여과하고, 이는 후속적으로 에틸 아세테이트로 세정하였다. 용매를 감압하에 회전 증발로 제거하였다. 수득한 잔사를 섬광 크로마토그래피(실리카 겔; 1% 메탄올/클로로포름)로 처리하였다. 순수한 분획을 회수하고, 합하고, 과량의 용출제를 감압하에 회전 증발로 제거하여 목적하는 생성물(22)(132㎎, 수율 50%)을 수득하였다. LC/MS 3.83 min (ES+) m/z (상대 강도) 1345.91;
Figure pct00051
(e) (9H-플루오렌-9-일)메틸((2S)-1-(((2S)-1-((4-(8-(3-((2-사이클로프로필-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카바메이트( 23 )
수퍼-하이드라이드®(0.5㎖, THF 중의 1M)의 용액을 아르곤 대기하에 -78℃에서 THF(10㎖) 중의 SEM 디락탐(22)(265㎎ g, 0.19mmol)의 용액에 적가하였다. 적가는 5분에 걸쳐 완료하여 반응 혼합물의 내부 온도를 일정하기 유지하였다. 20분 후, 분취액을 LC/MS 분석을 위하여 물로 켄칭하고, 이는 반응이 완료됨을 나타내었다. 물(20㎖)을 반응 혼합물에 가하고, 빙욕을 제거하였다. 유기층을 EtOAc(3×30㎖)로 추출하고, 합한 유기물을 염수(50㎖)로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 회전 증발에 의하여 용매를 제거하였다. 조 생성물을 MeOH(12㎖), CH2Cl2(6㎖), 물(2㎖) 및 충분한 실리카 겔에 용해시켜 두꺼운 교반 현탁액을 형성하였다. 5일 후, 현탁액을 소결 깔때기를 통하여 여과하고, 생성물의 용출이 완료될 때까지 CH2Cl2/MeOH(9:1)(200㎖)로 세척하였다. 유기층을 염수(2×70㎖)로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고. 감압하에 회전 증발에 의하여 용매를 제거하였다. 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(100% CHCl3 내지 96% CHCl3/ 4% MeOH)로 정제하여 생성물(23)을 황색 고체(162㎎, 78%)로서 수득하였다. LC/MS 3.02 min (ES+) m/z (상대 강도) 1052.37.
(f) (2S)-2-아미노-N-((2S)-1-((4-(8-(3-((2-사이클로프로필-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)-3-메틸부탄아미드( 17 )
과량의 피페리딘(0.2㎖, 2mmol)을 DMF(1㎖) 중의 SEM-디락탐(23)(76㎎, 0.073mmol)의 용액에 가하였다. 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반하고, 이 시점에서 반응은 완료되었다(LC/MS로 모니터링하여). 반응 혼합물을 CH2Cl2(75㎖)로 희석하고, 유기 상을 피페리딘이 완전히 제거될 때까지 H2O(3×75㎖)로 세척하였다. 유기 상을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 회전 증발에 의하여 과량의 용매를 제거하여 생성물(17)을 수득하고, 이는 다음 단계에 그대로 사용되었다. LC/MS 2.32 min (ES+) m/z (상대 강도) 830.00.
(g) N-((2S)-1-(((2S)-1-((4-(8-(3-((2-사이클로프로필-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-1-(3-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)프로판아미도)-3,6,9,12,15,18,21,24-옥타옥사헵타코산-27-아미드(18 또는 DL 1)
EDCI 하이드로클로라이드(14㎎, 0.0732mmol)를 아르곤 대기하에 무수 CH2Cl2(5㎖) 중의 말레이미드-PEG8-산(43.4㎎, 0.0732mmol)의 현탁액에 가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 후, PBD(17)(60.7㎎, 0.0732mmol)을 가하였다. 반응이 완료될 때까지 교반을 유지하였다(통상적으로 5시간). 반응물을 CH2Cl2로 희석하고, 유기 상을 H2O 및 염수로 세척한 후, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 회전 증발에 의하여 과량의 용매를 제거하였다. 생성물을 조심스러운 실리카 겔 크로마토그래피(100% CHCl3로 출발하여 9:1 CHCl3/MeOH까지의 느린 용출)로 정제한 후, 역상 크로마토그래피로 미반응 말레이미드-PEG8-산을 제거하였다. 생성물(18)(DL1)은 17.6%(21.8㎎)로 분리되었다. LC/MS 2.57 min (ES+) m/z (상대 강도) 1405.30;
Figure pct00052
D. 약물-링커 DL2의 합성(경로 1)
Figure pct00053
(a) (S)-7-메톡시-8-(3-(((S)-7-메톡시-2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)-5,11-디옥소-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-5,11-디옥소-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-2-일 트리플루오로메탄설포네이트( 24 )
Pd(PPh3)4(20.6㎎, 0.018mmol)를 비스-에놀 트리플레이트(12)(500㎎, 0.44mmol), N-메틸 피페라진 보론산 에스테르(100㎎, 0.4mmol), Na2CO3(218㎎, 2.05mmol), MeOH(2.5㎖), 톨루엔(5㎖) 및 물(2.5㎖)의 교반 혼합물에 가하였다. 반응 혼합물을 질소 대기하에 30℃에서 24시간 동안 교반한 후, 모든 보론산 에스테르가 소모되었다. 이어서, 반응 혼합물을 건조 상태로 증발시킨 후, 잔사를 EtOAc(100㎖)에 흡수시키고, H2O(2×50㎖), 염수(50㎖)로 세척하고, 건조시키고(MgSO4), 여과하고, 감압하에 증발시켜 조 생성물을 제공하였다. 섬광 크로마토그래피(구배 용출: 80:20 v/v 헥산/EtOAc 내지 60:40 v/v 헥산/EtOAc)로 정제하여 생성물(24)을 누르스름한 발포체(122.6㎎, 25%)로서 수득하였다.
LC/MS 3.15 min (ES+) m/z (상대 강도) 1144 ([M + H]+, 20%).
(b) (9H- 플루오렌 -9-일) 메틸 ((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-7-메톡시-8-(3-(((S)-7-메톡시-2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)-5,11-디옥소-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-5,11-디옥소-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카바메이트( 25 )
PBD-트리플레이트(24)(359㎎, 0.314mmol), 보론산 피나콜 에스테르(20)(250㎎, 0.408mmol) 및 트리에틸아민(0.35㎖, 2.51mmol)을 톨루엔/MeOH/H2O, 2:1:1(3㎖)의 혼합물에 용해시켰다. 마이크로파 용기를 퍼징시키고, 아르곤으로 3회 충전시킨 후, 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0)(21.7㎎, 0.018mmol)을 가하고, 반응 혼합물을 80℃에서 10분 동안 마이크로파에 위치시켰다. 후속적으로, CH2Cl2(100㎖)를 가하고, 유기물을 물(2×50㎖) 및 염수(50㎖)로 세척한 후, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 휘발물을 감압하에 회전 증발로 제거하였다. 조 생성물을 실리카 겔 크로마토그래피컬럼(CHCl3/MeOH, 100% 내지 9:1)으로 정제하여 순수한 (25)(200㎎, 수율 43%)를 수득하였다. LC/MS 3.27 min (ES+) m/z (상대 강도) 1478 ([M + H]+, 100%).
(c) (9H- 플루오렌 -9-일) 메틸 ((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-7-메톡시-8-(3-(((S)-7-메톡시-2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카바메이트( 26 )
수퍼-하이드라이드®의 용액(0.34㎖, THF 중의 1M)을 아르곤 대기하에 -78℃에서 THF(5㎖) 중의 SEM-디락탐(25)(200㎎, 0.135mmol)의 용액에 적가하였다. 적가는 5분에 걸쳐 완료하여 반응 혼합물의 내부 온도를 인정하게 유지하였다. 20분 후, 분취액을 LC/MS 분석을 위하여 물로 켄칭시키고, 이는 반응이 완료되는 것을 밝혀내었다. 물(20㎖)을 반응 혼합물에 가하고, 냉욕을 제거하였다. 유기층을 EtOAc(3×30㎖)로 추출하고, 합한 유기물을 염수(50㎖)로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 회전 증발에 의하여 용매를 제거하였다. 조 생성물을 MeOH(6㎖), CH2Cl2(3㎖), 물(1㎖) 및 충분한 실리카 겔에 용해시켜 두꺼운 교반 현탁액을 형성하였다. 5일 후, 현탁액을 소결 깔때기를 통하여 여과하고, 생성물의 용출이 완료될 때까지 CH2Cl2/MeOH(9:1)(100㎖)로 세척하였다. 유기층을 염수(2×50㎖)로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 회전 증발에 의하여 용매를 제거하였다. 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(100% CHCl3 내지 96% CHCl3/ 4% MeOH)로 정제하여 생성물(26)을 황색 고체(100㎎, 63%)로서 수득하였다. LC/MS 2.67 min (ES+) m/z (상대 강도) 1186 ([M + H]+, 5%).
(d) (S)-2-아미노-N-((S)-1-((4-((R)-7-메톡시-8-(3-(((R)-7-메톡시-2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)-3-메틸부탄아미드( 27 )
과량의 피페리딘(0.1㎖, 1mmol)을 DMF(0.9㎖) 중의 PBD(26)(36.4㎎, 0.03mmol)의 용액에 가하였다. 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반하고, 이 때 반응이 완료되었다(LC/MS로 모니터링됨). 반응 혼합물을 CH2Cl2(50㎖)로 희석하고, 완전히 피페리딘이 제거될 때까지 유기 상을 H2O(3×50㎖)로 세척하였다. 유기 상을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 회전 증발에 의하여 과량의 용매를 제거하여 조 생성물(27)을 수득하고, 이를 다음 단계에서 그대로 사용하였다. LC/MS 2.20 min (ES+) m/z (상대 강도) 964 ([M + H]+, 5%).
(e) 6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)-N-((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-7-메톡시-8-(3-(((S)-7-메톡시-2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)헥산아미드( 28 또는 DL 2 )
EDCI 하이드로클로라이드(4.7㎎, 0.03mmol)를 아르곤 대기하에 무수 CH2Cl2(3㎖) 중의 6-말레이미도헥산산(6.5㎎, 0.03mmol)의 현탁액에 가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 후, PBD(27)(34㎎, 조 생성물)를 가하였다. 반응이 완료될 때까지(6시간) 교반을 유지하였다. 반응물을 CH2Cl2로 희석하고, 유기 상을 H2O 및 염수로 세척한 후, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 회전 증발에 의하여 과량의 용매를 제거하였다. 생성물을 조심스러운 실리카 겔 크로마토그래피(100% CHCl3으로 출발하여 9:1 CHCl3/MeOH까지의 느린 용출) 이후 역상 크로마토그래피로 정제하여 미반응 말레이미드-PEG8-산을 제거하였다. 생성물(28)을 2단계에 걸쳐 41%로 분리하였다(14.6㎎). LC/MS 2.40 min (ES+) m/z (상대 강도) 1157 ([M + H]+, 5%)
E. 약물-링커 DL2의 합성(경로 2)
Figure pct00054
PBD-트리플레이트(21)(469㎎, 0.323mmol), 보론산 피나콜 에스테르(146.5㎎, 0.484mmol) 및 Na2CO3(157㎎, 1.48mmol)을 톨루엔/MeOH/H2O, 2:1:1의 혼합물(10㎖)에 용해시켰다. 반응 플라스크를 아르곤으로 3회 퍼징시킨 후, 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0)(7.41㎎, 0.0064mmol)을 가하고, 반응 혼합물을 30℃로 밤새 가열하였다. 용매를 감압하에 제거하고, 잔사를 H2O(50㎖)에 흡수시키고, EtOAc(3×50㎖)로 추출하였다. 합한 유기물을 염수(100㎖)로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 휘발물을 감압하에 회전 증발로 제거하였다. 조 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(CHCl3 100% 내지 CHCl3/MeOH 95%:5%)로 정제하여 순수한 (25)를 수율 33%로 수득하였다(885㎎). LC/MS 3.27 min (ES+) m/z (상대 강도) 1478 ([M + H]+, 100%).
F. 약물-링커 DL3의 합성(경로 1)
Figure pct00055
(a) (S)-2-(4-아미노페닐)-8-(3-(((S)-2-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-7-메톡시-5,11-디옥소-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온( 29 )
3,4-(메틸렌디옥시)페닐 보론산(356㎎, 2.1mmol, 1.3당량), TEA (1.8㎖, 12.9mmol, 8당량) 및 트리플레이트/아닐린(13)(1.75g, 1.7mmol, 1당량)을 Ar 대기하에 에탄올(7㎖), 톨루엔(13㎖) 및 물(2㎖)의 혼합물에 용해시켰다. 반응 혼합물을 배출하고, Ar로 3회 플러슁한 후, 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) (114㎎, 0.1mmol, 0.06당량)을 가하였다. 플라스크는 다시 비우고, Ar로 3회 플러슁하고, 80℃에서 8분 동안 마이크로파에서 가열하고 30초의 예비 교반 시간을 갖는다. TLC에 의한 분석(80:20 v/v 에틸 아세테이트/헥산)은 출발 물질의 완전한 소모를 나타내었다. 반응 혼합물을 디클로로메탄(50㎖)으로 희석하고, 물(50㎖)로 세척하였다. 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 용매를 진공하에 제거하였다. 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(60:40 내지 20:80 v/v 헥산/ 에틸 아세테이트)에 의한 정제로 생성물(29)을 황색 고체(1.21g, 71%)로서 수득하였다. LC/MS (3.92 min (ES+) m/z (상대 강도) 1032.44 ([M + H]+, 100).
(b) (S)-2-(4-아미노페닐)-8-(3-(((S)-2-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5(11aH)-온( 30 )
SEM 디락탐(29)(0.25g, 0.24mmol, 1당량)을 THF(8㎖)에 용해시키고, Ar 대기하에 78℃로 냉각시켰다. 수퍼-하이드라이드®(0.6㎖, THF 중의 1M, 2.5당량)를 5분에 걸쳐 적가하는 한편, 온도를 모니터링하였다. 20분 후, 소량의 샘플을 취하고, LCMS 분석에 대하여 후처리하였다. 물(50㎖)을 가하고, 냉 욕을 제거하고, 용액을 에틸 아세테이트(50㎖)로 세척하였다. 유기층을 추출하고, 염수(60㎖)로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 용매를 진공하에 제거하였다. 조 생성물을 EtOH(15㎖), CH2Cl2(7.5㎖) 및 물(2.5㎖)에 용해시키고, 두꺼운 현탁액이 될 때까지 충분한 실리카 겔을 가하였다. 5일 동안 교반한 후, 이를 소결 깔때기를 통하여 여과하고, 생성물이 용출되지 않을 때까지 CH2Cl2/MeOH(9:1)(100㎖)로 세척하였다. 유기층을 염수(2×50㎖)로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 용매를 진공하에 제거하였다. 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(CHCl3과 1 내지 4% MeOH 구배)에 의한 정제로 생성물(30)을 황색 고체(94㎎, 53%)로서 수득하였다. LC/MS (2.53 min (ES+) m/z (상대 강도) 739.64 ([M ]+, 70).
(c) 알릴 ((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카바메이트( 31 )
Ar 대기하에, 알라닌-발린-알릴옥시카보닐(180㎎, 0.66mmol, 1.2당량)을 무수 CH2Cl2(21㎖)와 메탄올(1㎖) 중의 EEDQ(163㎎, 0.66mmol, 1.2당량)와 1시간 동안 교반하였다. PBD(30)(407㎎, 0.55mmol, 1당량)을 무수 CH2Cl2(21㎖)와 메탄올(1㎖)에 용해시키고, 반응에 가하였다. 5일 동안 실온에서 교반 후 LC/MS는 대부분의 생성물 형성을 나타내었다. 용매를 진공하에 제거한 후, 컬럼 크로마토그래피(CH2Cl2와 1 내지 6% MeOH 구배)로 정제하여 생성물(31)을 황색 고체(184㎎, 34%)로서 수득하였다. LC/MS (2.95 min (ES+) m/z (상대 강도) 994.95 ([M + H]+, 60).
(d) (S)-2-아미노-N-((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)-3-메틸부탄아미드( 32 )
이민(31)(100㎎, 0.1mmol, 1당량)을 Ar 대기하에 무수 DCM(10㎖)에 용해시켰다(메탄올 1방울로 용해를 도움). 피롤리딘(30㎕, 0.15mmol, 1.5당량)을 적가한 후, 플라스크를 비우고, Ar로 3회 플러슁하였다. Pd(PPh3)4(7㎎, 6μmol, 0.06당량)를 가하고, 플라스크를 비우고, Ar로 3회 플러슁하였다. 1시간 후 LC/MS 분석은 생성물 형성 및 출발 물질의 완전한 손실을 나타내었다. Et2O(60㎖)를 반응 혼합물에 가하고, 모든 생성물이 용액에서 빠져나올 때까지 교반하였다. 침전물을 소결 깔때기를 통하여 여과하고, Et2O(2×20㎖)로 2회 세척하였다. 회수 플라스크를 대체시키고, 분리된 고체를 CHCl3(100㎖)로의 소결을 통하여 용해하고 세척하였다. 용매를 진공하에 제거하여 조 생성물(32)을 황색 고체로서 수득하고 이를 그 다음 단계에서 직접 사용하였다. LC/MS (1.14 min (ES+) m/z (상대 강도) 910.40 ([M + H]+, 67).
(e) N-((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-1-(3-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)프로판아미도)-3,6,9,12,15,18,21,24-옥타옥사헵타코산-27-아미드( 33 또는 DL 3 )
이민(32)(92㎎, 0.1mmol, 1.1당량)을 무수 MeOH 한 방울로 CHCl3(6㎖)에 용해시켜 용해를 도왔다. 말레이미드-PEG8-산(53㎎, 0.09mmol, 1당량) 이후 EEDQ(33㎎, 0.14mmol, 1.5당량)를 가하였다. LC/MS 분석이 대부분의 생성물 형성을 나타낼 때까지 이를 Ar하에 실온에서 4일 동안 격렬하게 교반하였다. 용매를 진공하에 제거하고, 조 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(CHCl3과 1 내지 10% MeOH 구배)로 부분적으로 정제하여 (33)(81mg)을 수득하였다. 물질을 분취용 HPLC로 추가로 정제하여 (33)을 황색 고체(26.3㎎, 18%)로서 수득하였다. 신속한 포름산 실시: LC/MS (1.39 min (ES+) m/z (상대 강도) 1485.00 ([M + H]+, 64).
G. 약물-링커 DL3의 합성(경로 2)
Figure pct00056
(a) 9H- 플루오렌 -9-일) 메틸 ((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-7-메톡시-5,11-디옥소-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-5,11-디옥소-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카바메이트( 34 )
트리플레이트(21)(0.5g, 0.35mmol, 1당량), 3,4-(메틸렌디옥시)페닐 보론산(75㎎, 0.45mmol, 1.3당량) 및 Na2CO3(0.17g, 1.6mmol, 4.5당량)을 Ar 대기하에 톨루엔(11㎖), EtOH (5.5㎖) 및 물(5.5㎖)에 용해시켰다. 플라스크를 비우고, Ar로 3회 플러슁하였다. Pd(PPh3)4(24㎎, 0.02mmol, 0.06당량)를 가하고, 플라스크를 다시 비우고, Ar로 3회 플러슁하였다. 이를 30℃로 가열하고, 밤새 교반하였다. LC/MS에 의한 분석은 출발 물질의 완전한 손실을 나타내었다. 용매를 진공하에 제거하고, 잔사를 물(60㎖)에 용해시킨 후, 에틸 아세테이트(60㎖×3)로 세척하였다. 합한 유기층을 염수(50㎖)로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 용매를 진공하에 제거하였다. 컬럼 크로마토그래피(50:50 내지 25:75 v/v 헥산/ 에틸 아세테이트)로 정제하여 생성물(34)을 황색 고체(310㎎, 64%)로서 수득하였다. LC/MS (1.44 min (ES-) m/z (상대 강도) 1423.35 ([M - H]-, 79).
(b) (9H- 플루오렌 -9-일) 메틸 ((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카바메이트( 35 )
SEM 디락탐(34)(0.31g, 0.22mmol, 1당량)을 THF(10㎖)에 용해시키고, Ar 대기하에 78℃로 냉각시켰다. 수퍼-하이드라이드®(0.5㎖, THF 중의 1M, 2.5당량)를 5분에 걸쳐 적가하는 한편, 온도를 모니터링하였다. 30분 후, 소량의 샘플을 취하고, LC/MS 분석을 위하여 후처리하였다. 물(50㎖)을 가하고, 냉 욕을 제거하고, 용액을 에틸 아세테이트(50㎖)로 세척하였다. 유기층을 추출하고, 염수(60㎖)로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 용매를 진공하에 제거하였다. 조 생성물을 EtOH(13.2㎖), CH2Cl2(6.6㎖) 및 물(2.2㎖)에 용해하고, 두꺼운 현탁액이 될 때까지 충분한 실리카 겔을 가하였다. 5일 동안 교반한 후, 이를 소결 깔때기를 통하여 여과하고, 생성물이 용출되지 않을 때까지 CH2Cl2/MeOH(9:1)(100㎖)로 세척하였다. 유기층을 염수(2×50㎖)로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 용매를 진공하에 제거하였다. 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(CHCl3과 1 내지 4% MeOH 구배)로 정제하여 순수한 생성물(35)을 황색 고체(185㎎, 75%)로서 수득하였다. LC/MS (1.70 min (ES+) m/z (상대 강도) 1132.85 ([M + H]+, 60).
(c) (S)-2-아미노-N-((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)-3-메틸부탄아미드( 32 )
이민(35)(82㎎, 0.07mmol, 1당량)을 DMF(1㎖)에 용해시킨 후, 피페리딘(0.2㎖, 2mmol, 과량)을 서서히 가하였다. 이 용액을 LC/MS 분석이 출발 물질의 완전한 소모를 나타낼 때까지 실온에서 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 CH2Cl2(50㎖)로 희석하고, 물(50㎖×4)로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 진공하에 용매를 제거하였다. 생성물(33)을 추가로 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다. LC/MS (1.15 min (ES+) m/z (상대 강도) 910.60 ([M + H]+, 58).
H. 약물-링커 DL5의 합성
(i) (S)-(2-아미노-5- 메톡시 -4-(( 트리이소프로필실릴 ) 옥시 ) 페닐 )(2-(((3급-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)-4-메틸-2,3-디하이드로-1H-피롤-1-일)메탄온( 49 )
Figure pct00057
(a) 5-메톡시-2-니트로-4-((트리이소프로필실릴)옥시)벤즈알데히드( 42 )
순수 트리이소프로필실릴클로라이드(56.4㎖, 262mmol)를 이미다졸(48.7g, 715.23mmol)과 4-하이드록시-5-메톡시-2-니트로벤즈알데히드(41)(47g, 238mmol)의 혼합물(함께 분쇄됨)에 가하였다. 혼합물을 페놀과 이미다졸이 용융되어 용액이 될 때까지 가열하였다(100℃). 반응 혼합물을 15분 동안 교반한 다음, 냉각시키고, 이 때 고체는 플라스크의 기저에 형성된 것으로 관찰되었다(이미다졸 클로라이드). 반응 혼합물을 5% EtOAc/헥산으로 희석하고, 실리카 겔로 직접 가중시키고, 패드를 5% EtOAc/헥산에 이어서 10% EtOAc/헥산으로 용출시켰다(낮은 과량으로 인하여, 매우 소량의 미반응 TIPSCI가 생성물에서 발견되었다). 목적하는 생성물을 헥산 중의 5% 에틸 아세테이트로 용출시켰다. 과량의 용출제를 감압하에 회전 증발로 제거한 후, 고 진공하에 건조시켜 결정성 광 민감성 고체(74.4g, 88%)를 수득하였다. LC/MS(4.22 min (ES+) m/z (상대 강도) 353.88 ([M + H]+, 100))에 의한 만족스러운 순도;
Figure pct00058
(b) 5-메톡시-2-니트로-4-((트리이소프로필실릴)옥시)벤조산( 43 )
물(800㎖) 중의 아염소산나트륨(47.3g, 523mmol, 80% 기술 등급)과 나트륨 디하이드로겐포스페이트 일염기성(35.2g, 293mmol)(NaH2PO4)의 용액을 실온에서 테트라하이드로푸란(500㎖) 중의 화합물(2)(74g, 209mmol)의 용액에 가하였다. 과산화수소(60% w/w, 140㎖, 2.93 mol)를 격렬하게 교반된 이염기성 혼합물에 즉시 가하였다. 반응 혼합물은 기체(산소)를 발생시켰고, 출발 물질이 용해되었고, 반응 혼합물의 온도를 45℃로 상승시켰다. 30분 후, LC/MS는 반응이 완료되었음을 밝혔다. 반응 혼합물을 빙 욕에서 냉각시켰고, 염산(1M)을 가하여 pH를 3으로 저하시켰다(이 단계는 반응 종료시 pH가 이미 산성이므로, 다수의 예에서 불필요한 것으로 밝혀졌으며; 추출 전 pH를 체크하시오). 이어서, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(1ℓ)로 추출하고, 유기 상을 염수(2×100㎖)로 세척하고, 황산마그네슘으로 건조시켰다. 유기 상을 여과하고, 감압하에 회전 증발에 의하여 과량의 용매를 제거하여 생성물(43)을 정량적인 수율로 황색 고체로서 수득하였다. LC/MS (3.93 min (ES-) m/z (상대 강도) 367.74 ([M - H]-, 100));
Figure pct00059
(c) ((2S,4R)-2-(((3급- 부틸디메틸실릴 ) 옥시 ) 메틸 )-4- 하이드록시피롤리딘 -1-일)(5-메톡시-2-니트로-4-((트리이소프로필실릴)옥시)페닐)메탄온( 45 )
DCC(29.2g, 141mmol, 1.2당량)를 0℃에서 디클로로메탄(200㎖) 중의 산(3)(43.5g, 117.8mmol, 1당량)과 하이드록시벤조트리아졸 수화물(19.8g, 129.6mmol, 1.1당량)의 용액에 가하였다. 냉 욕을 제거하고, 반응을 실온에서 30분 동안 진행하였으며, 이 때 디클로로메탄(100㎖) 중의 (2S,4R)-2-t-부틸디메틸실릴옥시메틸-4-하이드록시피롤리딘(44)(30g, 129.6mmol, 1.1당량)과 트리에틸아민(24.66㎖, 176mmol, 1.5당량)의 용액을 아르곤하에 -10℃에서 신속하게 가하였다(대규모로, 첨가 시간은 반응 혼합물을 더 냉각시킴으로써 단축할 수 있을 것이다). 반응 혼합물을 실온에서 40분 내지 1시간 동안 교반하고, LC/MS 및 TLC(EtOAc)에 의하여 모니터링하였다. 고체를 셀라이트로 여과하여 제거하고, 유기 상을 pH가 4 또는 5로 측정될 때까지 냉 수성 0.1M HCl로 세척하였다. 그 다음, 유기 상을 물에 이어서 포화 수성 중탄산나트륨 및 염수로 세척하였다. 유기 상을 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 회전 증발에 의하여 과량의 용매를 제거하였다. 잔사를 컬럼 섬광 크로마토그래피(실리카 겔; 구배 40/60 에틸 아세테이트/헥산 내지 80/20 에틸 아세테이트/ 헥산)로 처리하였다. 감압하에 회전 증발로 과량의 용매를 제거하여 순수한 생성물(45)을 수득하였다(순수한 생성물 66% 45.5g 및 약간 불순한 생성물 17g, 총 90%). LC/MS 4.43 min (ES+) m/z (상대 강도) 582.92 ([M + H]+, 100);
Figure pct00060
(d) (S)-5-(((3급- 부틸디메틸실릴 ) 옥시 ) 메틸 )-1-(5- 메톡시 -2-니트로-4-(( 트리이소프로필실릴 )옥시)벤조일)피롤리딘-3-온( 46 )
TCCA(8.82g, 40mmol, 0.7당량)를 0℃에서 무수 디클로로메탄(250㎖) 중의 (45)(31.7g, 54mmol, 1당량)와 TEMPO(0.85g, 5.4mmol, 0.1당량)의 교반 용액에 가하였다. 반응 혼합물을 20분 동안 격렬하게 교반하고, 이 때 TLC(50/50 에틸 아세테이트/헥산)는 출발 물질의 완전한 소모를 밝혀내었다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통하여 여과하고, 여액을 수성 포화 중탄산나트륨(100㎖), 티오황산나트륨(300㎖중 9g), 염수(100㎖)로 세척하고, 황산마그네슘으로 건조하였다. 감압하에 회전 증발시켜 생성물(46)을 정량적인 수율로 수득하였다. LC/MS 4.52 min (ES+) m/z (상대 강도) 581.08 ([M + H]+, 100);
Figure pct00061
(e) (S)-5-(((3급- 부틸디메틸실릴 ) 옥시 ) 메틸 )-1-(5- 메톡시 -2-니트로-4-(( 트리이소프로필실릴 )옥시)벤조일)-4,5-디하이드로-1H-피롤-3-일 트리플루오로메탄설포네이트 ( 47 )
트리플산 무수물(27.7㎖, 46.4g, 165mmol, 3당량)을 -50℃(아세톤/드라이 아이스 욕)에서 2,6-루티딘(25.6㎖, 23.5g, 220mmol, 4당량, 체로 건조됨)의 존재하에 무수 디클로로메탄(900㎖) 중의 케톤(46)의 격렬하게 교반된 현탁액에 주입하였다(조절 온도). 반응 혼합물을 1.5시간 동안 교반하고, 이 때 소규모 후처리(물/디클로로메탄) 이후, LC/MS로 반응이 완료됨이 밝혀졌다. 물을 여전히 차가운 반응 혼합물에 가하고, 유기층을 분리하고, 포화 중탄산나트륨, 염수 및 황산마그네슘으로 세척하였다. 유기 상을 여과하고, 과량의 용매를 감압하에 회전 증발로 제거하였다. 잔사를 컬럼 섬광 크로마토그래피(실리카 겔; 10/90 v/v 에틸 아세테이트/헥산)로 처리하고, 과량의 용출제를 제거하여 생성물(47)(37.6g, 96%)을 수득하였다. LC/MS, 방법 2, 4.32 min (ES+) m/z (상대 강도) 712.89 ([M + H]+, 100);
Figure pct00062
(f) (S)-(2-(((3급- 부틸디메틸실릴 ) 옥시 ) 메틸 )-4- 메틸 -2,3- 디하이드로 -1H-피롤-1-일)(5-메톡시-2-니트로-4-((트리이소프로필실릴)옥시)페닐)메탄온( 48 )
트리페닐아르신(1.71g, 5.60mmol, 0.4당량)을 아르곤 대기하에 무수 디옥산(80㎖) 중의 트리플레이트(47)(10.00g, 14mmol, 1당량), 메틸보론산(2.94g, 49.1mmol, 3.5당량), 산화은(13g, 56mmol, 4당량) 및 인산칼륨 삼염기성(17.8g, 84mmol, 6당량)의 혼합물에 가하였다. 반응을 아르곤으로 3회 플러슁하고, 비스(벤조니트릴)팔라듐(II) 클로라이드(540㎎, 1.40mmol, 0.1당량)를 가하였다. 반응을 아르곤으로 3회 더 플러슁한 후, 110℃로 즉시 가온시켰다(건조 합성 가열 블록은 플라스크에 가하기 전에 미리 110℃로 가온시켰다). 10분 후, 반응물을 실온으로 냉각시키고, 패드 셀라이트를 통하여 여과하였다. 용매를 감압하에 회전 증발로 제거하였다. 수득한 잔사를 컬럼 섬광 크로마토그래피(실리카 겔; 10% 에틸 아세테이트/헥산)로 처리하였다. 순수한 분획을 회수하고, 합하고, 과량의 용출제를 감압하에 회전 증발로 제거하여, 생성물(48)(4.5g, 55%)을 수득하였다. LC/MS, 4.27 min (ES+) m/z (상대 강도) 579.18 ([M + H]+, 100);
Figure pct00063
(g) (S)-(2-아미노-5- 메톡시 -4-(( 트리이소프로필실릴 ) 옥시 ) 페닐 )(2-(((3급-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)-4-메틸-2,3-디하이드로-1H-피롤-1-일)메탄온( 49 )
아연 분말(28g, 430mmol, 37당량)을 약 15℃에서 에탄올 v/v(70㎖) 중의 5% 포름산 중의 화합물(48)(6.7g, 11.58mmol)의 용액에 가하였다. 발생된 발열을 빙 욕을 사용하여 조절하여 반응 혼합물을 온도를 30℃ 미만으로 유지하였다. 30분 후, 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통하여 여과하였다. 여액을 에틸 아세테이트로 희석하고, 유기 상을 물, 포화 수성 중탄산나트륨 및 염수로 세척하였다. 유기 상을 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 회전 증발에 의하여 과량의 용매를 제거하였다. 수득한 잔사를 섬광 크로마토그래피(실리카 겔; 헥산 중의 10% 에틸 아세테이트)로 처리하였다. 순수한 분획을 회수하고, 합하고, 과량의 용매를 감압하에 회전 증발에 의하여 제거하여 생성물(49)(5.1g, 80%)을 수득하였다. LC/MS, 4.23 min (ES+) m/z (상대 강도) 550.21 ([M + H]+, 100);
Figure pct00064
(ii) (11S,11 aS )-알릴 11-((3급-부틸디메틸실릴)옥시)-8-((5-요오도펜틸)옥시)-7-메톡시-2-메틸-5-옥소-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카복실레이트
Figure pct00065
(a) (S)-알릴 (2-(2-(((3급- 부틸디메틸실릴 ) 옥시 ) 메틸 )-4- 메틸 -2,3- 디하이드로 -1H-피롤-1-카보닐)-4-메톡시-5-((트리이소프로필실릴)옥시)페닐)카바메이트( 50 )
알릴 클로로포르메이트(0.30㎖, 3.00mmol, 1.1당량)를 -78℃에서(아세톤/드라이 아이스 욕) 무수 디클로로메탄(20㎖) 중의 무수 피리딘(0.48㎖, 6.00mmol, 2.2당량)의 존재하에 아민(49)(1.5g, 2.73mmol)의 용액에 가하였다. 30분 후, 욕을 제거하고, 반응 혼합물을 실온으로 가온시켰다. 반응 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고, 포화 수성 황산구리를 가하였다. 그 다음, 유기층을 이어서 포화 수성 중탄산나트륨 및 염수로 세척하였다. 유기 상을 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 회전 증발에 의하여 과량의 용매를 제거하여 생성물(50)을 수득하고 이를 다음 단계에 직접 사용하였다. LC/MS, 4.45 min (ES+) m/z (상대 강도) 632.91 ([M + H]+, 100)
(b) (S)-알릴 (2-(2-( 하이드록시메틸 )-4- 메틸 -2,3- 디하이드로 -1H-피롤-1- 카보닐 )-4-메톡시-5-((트리이소프로필실릴)옥시)페닐)카바메이트( 51 )
조 생성물(50)을 아세트산/메탄올/테트라하이드로푸란/물(28:4:4:8㎖)의 7:1:1:2 혼합물에 용해시키고, 실온에서 교반하였다. 3시간 후, 출발 물질의 완전한 소멸이 LC/MS에 의하여 관찰되었다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 이어서 물(2×500㎖), 포화 수성 중탄산나트륨(200㎖) 및 염수로 세척하였다. 유기 상을 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고, 과량의 에틸 아세테이트를 감압하에 회전 증발에 의하여 제거하였다. 수득한 잔사를 섬광 크로마토그래피(실리카 겔, 헥산 중의 25% 에틸 아세테이트)로 처리하였다. 순수한 분획을 회수하고, 합하고, 과량의 용출제를 감압하에 회전 증발에 의하여 제거하여 목적하는 생성물(51)(1g, 71%)을 수득하였다. LC/MS, 3.70 min (ES+) m/z (상대 강도) 519.13 ([M + H]+, 95);
Figure pct00066
(c) (11S,11 aS )-알릴 11-하이드록시-7-메톡시-2-메틸-5-옥소-8-((트리이소프로필실릴)옥시)-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카복실레이트( 52 )
디메틸 설폭사이드(0.35㎖, 4.83mmol, 2.5당량)를 아르곤 대기하에 -78℃에서(드라이 아이스 /아세톤 욕) 무수 디클로로메탄(10㎖) 중의 옥살릴 클로라이드(0.2㎖, 2.32mmol, 1.2당량) 용액에 적가하였다. 10분 후, 무수 디클로로메탄(8㎖) 중의 (51)(1g, 1.93mmol)의 용액을 여전히 -78℃의 온도에서 서서히 적가하였다. 15분 후, 트리에틸아민(1.35㎖, 4Å 분자 체에서 건조됨, 9.65mmol, 5당량)을 적가하고, 드라이 아이스/아세톤 욕을 제거하였다. 반응 혼합물을 실온이 되도록 하고, 냉 염산(0.1M), 포화 수성 중탄산나트륨 및 염수로 추출하였다. 유기 상을 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고, 과량의 디클로로메탄을 감압하에 회전 증발에 의하여 제거하여 생성물(52)(658㎎, 66%)를 수득하였다. LC/MS, 3.52 min (ES+) m/z (상대 강도) 517.14 ([M + H]+, 100);
Figure pct00067
(d) (11S,11 aS )-알릴 11-((3급-부틸디메틸실릴)옥시)-7-메톡시-2-메틸-5-옥소-8-((트리이소프로필실릴)옥시)-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카복실레이트( 53 )
3급-부틸디메틸실릴트리플레이트(0.70㎖, 3.00mmol, 3당량)를 아르곤하에 0℃에서 무수 디클로로메탄(40㎖) 중의 화합물(52)(520㎎, 1.00mmol)과 2,6-루티딘(0.46㎖, 4.00mmol, 4당량)의 용액에 가하였다. 10분 후, 냉 욕을 제거하고, 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물, 포화 수성 중탄산나트륨 및 염수로 추출하였다. 유기 상을 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고, 과량을 감압하에 회전 증발에 의하여 제거하였다. 수득한 잔사를 섬광 크로마토그래피(실리카 겔; 구배, 헥산 중의 10% 에틸 아세테이트 내지 헥산 중의 20% 에틸 아세테이트)로 처리하였다. 순수한 분획을 회수하고, 합하고, 과량의 용출제를 감압하에 회전 증발에 의하여 제거하여 생성물(53)(540㎎, 85%)을 수득하였다. LC/MS, 4.42 min (ES+) m/z (상대 강도) 653.14 ([M + Na]+, 100);
Figure pct00068
(e) (11S,11 aS )-알릴 11-((3급-부틸디메틸실릴)옥시)-8-하이드록시-7-메톡시-2-메틸-5-옥소-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카복실레이트(54)
아세트산리튬(87㎎, 0.85mmol)을 습윤 디메틸포름아미드(6㎖, 50:1 DMF/물) 중의 화합물(53)(540㎎, 0.85mmol)의 용액에 가하였다. 4시간 후, 반응을 완료하고, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(25㎖)로 희석하고, 수성 시트르산 용액(pH 약 3), 물 및 염수로 세척하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고, 과량의 에틸 아세테이트를 감압하에 회전 증발에 의하여 제거하였다. 수득한 잔사를 섬광 크로마토그래피(실리카 겔; 구배, 헥산 중의 25% 내지 75% 에틸 아세테이트)로 처리하였다. 순수한 분획을 회수하고, 합하고, 과량의 용출제를 감압하에 회전 증발에 의하여 제거하여 생성물(54)(400mg, 정량적)을 수득하였다. LC/MS, (3.33 min (ES+) m/z (상대 강도) 475.26 ([M+H]+, 100).
(f) (11S,11 aS )-알릴 11-((3급-부틸디메틸실릴)옥시)-8-((5-요오도펜틸)옥시)-7-메톡시-2-메틸-5-옥소-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카복실레이트( 55 )
디요오도펜탄(0.63㎖, 4.21mmol, 5당량) 및 탄산칼륨(116㎎, 0.84mmol, 1당량)을 아세톤(4㎖, 분자 체로 건조됨) 중의 페놀(54)(400㎎, 0.84mmol) 용액에 가하였다. 그 다음, 반응 혼합물을 60℃로 가온시키고, 6시간 동안 교반하였다. 아세톤을 감압하에 회전 증발에 의하여 제거하였다. 수득한 잔사를 섬광 크로마토그래피(실리카 겔; 50/50, v/v, 헥산/에틸 아세테이트)로 처리하였다. 순수한 분획을 회수하고, 합하고, 과량을 용출제를 제거하여 (55)를 수율 90%로 제공하였다. LC/MS, 3.90 min (ES+) m/z (상대 강도) 670.91 ([M]+, 100).
Figure pct00069
(iii) (11S,11 aS )-4-(2-(1-((1-( 알릴옥시 )-4- 메틸 -1,2- 디옥소펜탄 -3-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)하이드라지닐)벤질 11-((3급-부틸디메틸실릴)옥시)-8-하이드록시-7-메톡시-2-메틸-5-옥소-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카복실레이트( 70 )
Figure pct00070
(a) 알릴 3-(2-(2-(4-((((2-((S)-2-(((3급-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)-4-메틸-2,3-디하이드로-1H-피롤-1-카보닐)-4-메톡시-5-((트리이소프로필실릴)옥시)페닐)카바모일)옥시)메틸)페닐)하이드라지닐)프로판아미도)-4-메틸-2-옥소펜타노에이트( 56 )
트리에틸아민(2.23㎖, 18.04mmol, 2.2당량)을 5℃(빙욕)에서 무수 테트라하이드로푸란(40㎖) 중의 아민(49)(4g, 8.20mmol)과 트리포스겐(778㎎, 2.95mmol, 0.36당량)의 교반 용액에 가하였다. 이소시아네이트 반응의 진행을 반응 혼합물로부터 분취액을 주기적으로 제거하고, 메탄올을 켄칭하고, LC/MS 분석을 수행함으로써 모니터링하였다. 일단 이소시아네이트 형성이 완료되면, 무수 테트라하이드로푸란(40㎖) 중의 alloc-Val-Ala-PABOH(4.12g, 12.30mmol, 1.5당량)와 트리에틸아민(1.52㎖, 12.30mmol, 1.5당량)의 용액을 새로이 제조된 이소시아네이트에 주입함으로써 신속하게 가하였다. 반응 혼합물을 40℃에서 교반하였다. 과량의 용매를 감압하에 회전 증발에 의하여 제거하였다. 수득한 잔사를 섬광 크로마토그래피(실리카 겔; 구배, 디클로로메탄 중의 1% 메탄올 내지 5% 메탄올)로 처리하였다(EtOAc 및 헥산을 사용한 대안적 크로마토그래피 조건 또한 성공적이었다). 순수한 분획을 회수하고, 합하고, 과량의 용출제를 감압하에 회전 증발에 의하여 제거하여 생성물(56)(3.9g, 50%)을 수득하였다. LC/MS, 4.23 min (ES+) m/z (상대 강도) 952.36 ([M + H]+, 100);
Figure pct00071
(b) 알릴 3-(2-(2-(4-((((2-((S)-2-(하이드록시메틸)-4-메틸-2,3-디하이드로-1H-피롤-1-카보닐)-4-메톡시-5-((트리이소프로필실릴)옥시)페닐)카바모일)옥시)메틸)페닐) 하이드라지닐)프로판아미도)-4-메틸-2-옥소펜타노에이트( 57 )
TBS 에테르(56)(1.32g, 1.38mmol)를 아세트산/메탄올/테트라하이드로푸란/물(14:2:2:4㎖)의 7:1:1:2 혼합물에 용해시키고, 실온에서 교반하였다. 3시간 후, 출발 물질이 더 이상 LC/MS에 의하여 관찰되지 않았다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(25㎖)로 희석하고, 물, 포화 수성 중탄산나트륨 및 염수로 순차적으로 세척하였다. 유기 상을 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고, 과량의 에틸 아세테이트를 감압하에 회전 증발에 의하여 제거하였다. 수득한 잔사를 섬광 크로마토그래피(디클로로메탄 중의 실리카 겔, 2% 메탄올)로 처리하였다. 순수한 분획을 회수하고, 합하고, 과량의 용출제를 감압하에 회전 증발에 의하여 제거하여 목적하는 생성물(57)(920㎎, 80%)을 수득하였다. LC/MS, 3.60 min (ES+) m/z (상대 강도) 838.18 ([M+H]+, 100).
Figure pct00072
(c) (11S,11 aS )-4-(2-(1-((1-( 알릴옥시 )-4- 메틸 -1,2- 디옥소펜탄 -3-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)하이드라지닐)벤질 11-하이드록시-7-메톡시-2-메틸-5-옥소-8-((트리이소프로필실릴)옥시)-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카복실레이트( 58 )
디메틸 설폭사이드(0.2㎖, 2.75mmol, 2.5당량)를 아르곤 대기하에 -78℃(드라이 아이스 /아세톤)에서 무수 디클로로메탄(7㎖) 중의 옥살릴 클로라이드(0.11㎖, 1.32mmol, 1.2당량) 용액에 적가하였다. 10분 후, 무수 디클로로메탄(5㎖) 중의 (57)(920㎎, 1.10mmol) 용액을 온도를 여전히 -78℃로 하여 서서히 가하였다. 15분 후, 트리에틸아민(0.77㎖, 4Å 분자 체로 건조됨, 5.50mmol, 5당량)을 적가하고, 드라이 아이스/아세톤 욕을 제거하였다. 반응 혼합물을 실온이 되도록 하고, 냉 염산(0.1M), 포화 수성 중탄산나트륨 및 염수로 추출하였다. 유기 상을 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고, 과량의 디클로로메탄을 감압하에 회전 증발에 의하여 제거하였다. 수득한 잔사를 컬럼 섬광 크로마토그래피(실리카 겔; 구배 디클로로메탄 중의 2% 메탄올 내지 5% 메탄올)로 처리하였다. 순수한 분획을 회수하고, 합하고, 과량의 용출제를 감압하에 회전 증발에 의하여 제거하여 생성물(58)(550㎎, 60%)을 수득하였다. LC/MS, 3.43 min (ES+) m/z (상대 강도) 836.01 ([M]+, 100).
Figure pct00073
(d) (11S,11 aS )-4-(2-(1-((1-( 알릴옥시 )-4- 메틸 -1,2- 디옥소펜탄 -3-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)하이드라지닐)벤질 11-((3급-부틸디메틸실릴)옥시)-7-메톡시-2-메틸-5-옥소-8-((트리이소프로필실릴)옥시)-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카복실레이트( 59 )
3급-부틸디메틸실릴트리플레이트(0.38㎖, 1.62mmol, 3당량)를 아르곤하에 0℃에서 무수 디클로로메탄(5㎖) 중의 화합물(58)(450㎎, 0.54mmol)과 2,6-루티딘(0.25㎖, 2.16mmol, 4당량)의 용액에 가하였다. 10분 후, 냉 욕을 제거하고, 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물, 포화 수성 중탄산나트륨 및 염수로 추출하였다. 유기 상을 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고, 과량의 용매를 감압하에 회전 증발에 의하여 제거하였다. 수득한 잔사를 컬럼 섬광 크로마토그래피(실리카 겔; 50/50 v/v 헥산/에틸 아세테이트)로 처리하였다. 순수한 분획을 회수하고, 합하고, 과량의 용출제를 감압하에 회전 증발에 의하여 제거하여 생성물(59)(334㎎, 65%)을 수득하였다. LC/MS, 4.18 min (ES+) m/z (상대 강도) 950.50 ([M]+, 100).
Figure pct00074
(e) (11S,11 aS )-4-(2-(1-((1-( 알릴옥시 )-4- 메틸 -1,2- 디옥소펜탄 -3-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)하이드라지닐)벤질 11-((3급-부틸디메틸실릴)옥시)-8-하이드록시-7-메톡시-2-메틸-5-옥소-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카복실레이트(60)
아세트산리튬(50㎎, 0.49mmol)을 습윤 디메틸포름아미드(4㎖, 50:1 DMF/물) 중의 화합물(59)(470㎎, 0.49mmol)의 용액에 가하였다. 4시간 후, 반응은 완료되었고, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 시트르산(pH 약 3), 물 및 염수로 세척하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고, 과량의 에틸 아세테이트를 감압하에 회전 증발에 의하여 제거하였다. 수득한 잔사를 컬럼 섬광 크로마토그래피(실리카 겔; 구배, 50/50 내지 25/75 v/v 헥산/에틸 아세테이트)로 처리하였다. 순수한 분획을 회수하고, 합하고, 과량의 용출제를 감압하에 회전 증발에 의하여 제거하여 생성물(60)(400㎎, 정량적)을 수득하였다. LC/MS, 3.32 min (ES+) m/z (상대 강도) 794.18 ([M+H]+, 100).
Figure pct00075
(iv) (11S,11aS)-4-((2S,5S)-37-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)-5-이소프로필-2-메틸-4,7,35-트리옥소-10,13,16,19,22,25,28,31-옥타옥사-3,6,34-트리아자헵타트리아콘탄아미도)벤질 11-하이드록시-7-메톡시-8-((5-(((S)-7-메톡시-2-메틸-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일)옥시)펜틸)옥시)-2-메틸-5-옥소-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카복실레이트( 64 )
Figure pct00076
(a) (11S)-알릴 8-((5-(((11S)-10-(((4-(2-(1-((1-(알릴옥시)-4-메틸-1,2-디옥소펜탄-3-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)하이드라지닐)벤질)옥시)카보닐)-11-((3급-부틸디메틸실릴)옥시)-7-메톡시-2-메틸-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일)옥시)펜틸)옥시)-11-((3급-부틸디메틸실릴)옥시)-7-메톡시-2-메틸-5-옥소-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카복실레이트( 61 )
탄산칼륨(70㎎, 0.504mmol, 1당량)을 무수 아세톤(25㎖) 중의 (55)(370㎎, 0.552mmol, 1.2당량)와 페놀(60)(400㎎, 0.504mmol)의 용액에 가하였다. 반응을 70℃에서 8시간 동안 교반하였다. LC/MS는 모든 출발 물질이 소모되지 않음을 나타내어, 반응을 실온에서 밤새 교반하고, 다음날 추가로 2시간 동안 교반하였다. 아세톤을 감압하에 회전 증발에 의하여 제거하였다. 수득한 잔사를 섬광 크로마토그래피(실리카 겔; 헥산 중의 80% 에틸 아세테이트 내지 100% 에틸 아세테이트)로 처리하였다. 순수한 분획을 회수하고, 합하고, 과량의 용출제를 감압하에 회전 증발에 의하여 제거하여 생성물(61)(385㎎, 57%)을 수득하였다. LC/MS, 4.07 min (ES+) m/z (상대 강도) 1336.55 ([M+H]+, 50).
(b) (11S)-알릴 8-((5-(((11S)-10-(((4-(2-(1-((1-(알릴옥시)-4-메틸-1,2-디옥소펜탄-3-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)하이드라지닐)벤질)옥시)카보닐)-11-하이드록시-7-메톡시-2-메틸-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일)옥시)펜틸)옥시)-11-하이드록시-7-메톡시-2-메틸-5-옥소-11,11a-디하이드歇-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카복실레이트( 62 )
테트라-n-부틸암모늄 플루오라이드(1M, 0.34㎖, 0.34mmol, 2당량)를 무수 테트라하이드로푸란(3㎖) 중의 (61)(230㎎, 0.172mmol)의 용액에 가하였다. 출발 물질이 10분 후에 완전히 소모되었다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(30㎖)로 희석하고, 물 및 염수로 순차적으로 세척하였다. 유기 상을 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고, 과량의 에틸 아세테이트를 감압하에 회전 증발에 의하여 제거하였다. 수득한 잔사(62)를 다음 반응에 대한 조 혼합물로서 사용하였다. LC/MS, 2.87 min (ES+) m/z (상대 강도) 1108.11 ([M+H]+, 100).
(c) (11S)-4-(2-(1-((1-아미노-3- 메틸 -1- 옥소부탄 -2-일)아미노)-1- 옥소프로판 -2-일)하이드라지닐)벤질 11-하이드록시-7-메톡시-8-((5-((7-메톡시-2-메틸-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일)옥시)펜틸)옥시)-2-메틸-5-옥소-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카복실레이트(63)
테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0)(12㎎, 0.01mmol, 0.06당량)을 무수 디클로로메탄(10㎖) 중의 조 화합물(62)(0.172mmol)과 피롤리딘(36㎕, 0.43mmol, 2.5당량)의 용액에 가하였다. 반응 혼합물을 20분 동안 교반하고, 디클로로메탄으로 희석하고, 포화 수성 염화나트륨 및 염수로 순차적으로 세척하였다. 유기 상을 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고, 과량의 디클로로메탄을 감압하에 회전 증발에 의하여 제거하였다. 수득한 잔사(63)를 다음 반응에 대한 조 혼합물로서 사용하였다. LC/MS, 2.38 min (ES+) m/z (상대 강도) 922.16 ([M+H]+, 40).
(d) (11S,11aS)-4-((2S,5S)-37-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)-5-이소프로필-2-메틸-4,7,35-트리옥소-10,13,16,19,22,25,28,31-옥타옥사-3,6,34-트리아자헵타트리아콘탄아미도)벤질 11-하이드록시-7-메톡시-8-((5-(((S)-7-메톡시-2-메틸-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일)옥시)펜틸)옥시)-2-메틸-5-옥소-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카복실레이트( 64 또는 DL5 )
1-에틸-3-(3'-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDCI, 33㎎, 0.172mmol)를 무수 디클로로메탄(10㎖) 중의 조 화합물(63)(0.172mmol)과 Mal-(PEG)8-산(100㎎, 0.172mmol)의 용액에 가하였다. 반응물을 2시간 동안 교반하고, 출발 물질의 존재가 LC/MS에 의하여 더이상 관찰되지 않았다. 반응물을 디클로로메탄으로 희석하고, 물 및 염수로 순차적으로 세척하였다. 유기 상을 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고, 과량의 디클로로메탄을 감압하에 회전 증발에 의하여 제거하였다. 수득한 잔사를 섬광 크로마토그래피 (실리카 겔; 100% 클로로포름 내지 클로로포름 중의 10% 메탄올)로 처리하였다. 순수한 분획을 합하고, 과량의 용출제를 감압하에 회전 증발에 의하여 제거하여 (64) 또는 (DL5)(60㎎, 3단계에 걸쳐 25%)를 수득하였다.
I. 약물-링커 DL4의 합성(경로 1)
Figure pct00077
화합물(65)은 WO 제2011/130598호의 화합물(79)이다.
(11S)-4-(1- 요오도 -20-이소프로필-23- 메틸 -2,18,21- 트리옥소 -6,9,12,15- 테트라옥사 -3,19,22-트리아자테트라코산아미도)벤질 11-하이드록시-7-메톡시-8-(3-((7-메톡시-5-옥소-2-((E)-프로프-1-엔-1-일)-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-5-옥소-2-((E)-프로프-1-엔-1-일)-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카복실레이트( 66 또는 DL4 )
N,N'-디이소프로필카보디이미드(DIC, 4.71㎕, 0.0304mmol)를 무수 디클로로메탄(0.8㎖) 중의 아민(65)(0.0276mmol)과 요오도-(PEG)4-산(13.1㎎, 0.0304mmol)의 용액에 가하였다. 반응을 3시간 동안 교반하고, 출발 물질의 존재는 더이상 LC/MS에 의하여 관찰되지 않았다. 반응 혼합물을 박층 크로마토그래피(TLC) 플레이트로 직접 가중시키고, 제조-TLC(클로로포름 중의 10% 메탄올)로 정제하였다. 순수한 밴드를 TLC 플레이트에서 긁어내어, 클로로포름 중의 10% 메탄올에 흡수시키고, 여과하고, 과량의 용출제를 감압하에 회전 증발에 의하여 제거하여 (66)(D)(20.9㎎, 56%)을 수득하였다. LC/MS, 방법 2, 3.08 min (ES+) m/z (상대 강도) 1361.16 ([M+H]+, 100).
J. 약물-링커 DL4의 합성(경로 2)
다음 방법을 이 실시예 J에 사용하였다.
전기분무 이온화로, 아길런트(Agilent) 6110 사중극 MS를 갖는 아길런트 1200 시리즈 LC/MS를 사용하여 LCMS 데이터를 수득하였다. 이동상 A - 수중 0.1% 아세트산. 이동상 B - 아세토니트릴 중의 0.1%. 1.00㎖/min의 유량. 5% B로부터 3분에 걸쳐 95% B까지 상승, 95% B에서 1분 동안 유지, 그 다음 5% B에서 6초에 걸쳐 되돌림. 전체 실시 시간은 5분이다. 컬럼: Phenomenex Gemini-NX 3㎛ C18, 30×2.00mm. 254nm에서의 UV 검출에 기반한 크로마토그램. 질량 스펙트럼들은 양성 모드의 MS를 사용하여 달성하였다. 양성자 NMR 화학 이동 값은 브루커 AV400을 사용하여 400MHz에서 델타 규모로 측정하였다. 다음 약어가 사용되었다: s, 단일항; d, 이중항; t, 삼중항; q, 사중항; m, 다중항; br, 광역. 커플링 상수는 Hz로 보고되어 있다. 달리 언급되지 않는 경우, 컬럼 크로마토그래피(섬광 절차에 의한)는 머크 키젤겔(Merck Kieselgel) 실리카(Art. 9385)에서 수행하였다. 질량 분광(MS) 데이터를 워터스 2795 HPLC 분리 모듈에 결합된 워터스 마이크로매스 LCT 기기를 사용하여 회수하였다. 박층 크로마토그래피(TLC)는 실리카 겔 알루미늄 플레이트(Merck 60, F254)에서 수행하였다. 모든 기타 화학 물질 및 용매는 시그마-알드리치 또는 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)으로부터 구입하였고, 추가로 정제하지 않고 공급된 상태로 사용하였다.
광학 회전은 ADP 220 편광계(Bellingham Stanley Ltd.)에서 측정하였고, 농도(c)는 g/100㎖로 제공된다. 융점은 디지털 융점 기구(Electrothermal)를 사용하여 측정하였다. IR 스펙트럼들은 퍼킨-엘머 스펙트럼 1000 FT IR 분광계에서 기록되었다. 1H 및 13C NMR 스펙트럼들은 각각 400MHz 및 100MHz에서, 브루커 어드밴스 NMR 분광계를 사용하여 300K에서 수득하였다. 화학 이동은 TMS(□ = 0.0ppm)에 대하여 보고되고, 신호는 s(단일항), d(이중항), t(삼중항), dt(이중 삼중항), dd(이주항의 이중항), ddd(이중항의 이중 이중항) 또는 m(다중항)으로서 지정되고, 커플링 상수는 헤르츠(Hz)로 제공된다. 질량 분광(MS) 데이터는 워터스 2996 PDA를 갖는 워터스 2695 HPLC에 결합된 워터스 마이크로매스 ZQ 기기를 사용하여 회수하였다. 사용된 워터스 마이크로매스 ZQ 파라미터는 다음과 같았다: 모세관(kV), 3.38; 콘(V), 35; 추출기(V), 3.0; 공급 온도(℃), 100; 탈용매화 온도(℃), 200; 콘 유량(L/h), 50; 탈용매화 유량(L/h), 250. 고해상도 질량 분광(HRMS) 데이터는 샘플을 기기로 도입하는 금속 피복된 보로실리케이트 유리 팁을 사용하여 워터스 마이크로매스 QTOF 글로벌에 양성 W-모드에서 기록되었다. 박층 크로마토그래피(TLC)는 실리카 겔 알루미늄 플레이트(Merck 60, F254)에서 수행하고, 섬광 크로마토그래피는 실리카 겔(Merck 60, 230-400 mesh ASTM)을 이용하였다. HOBt(NovaBiochem) 및 고체 지지 시약(Argonaut)을 제외하고는, 모든 기타 화학 물질 및 용매는 시그마-알드리치로부터 구입하고, 추가로 정제하지 않고 공급된 그대로 사용하였다. 무수 용매를 적합한 건조제의 존재하에 무수 질소 대기하에 증류에 의하여 제조하고, 4Å 분자 체 또는 나트륨 와이어 위에 저장하였다. 석유 에테르는 40-60℃에서 비등하는 분획을 말한다.
일반 LC/MS 조건: HPLC(Waters Alliance 2695)를 물(A)(포름산 0.1%) 및 아세토니트릴(B)(포름산 0.1%)의 이동 상을 사용하여 실시하였다. 구배: 10분에 걸쳐 초기 조성 5% B, 그 다음 3분 내로 95% B로. 조성은 95% B에서 0.5분 동안 유지한 다음, 0.3분만에 5% B로 회귀하였다. 총 구배 실시 시간은 5분이다. 유량 3.0㎖/min, 400㎕는 질량 분광계로 통과하는 0 불용 체적 티 피스를 통하여 분할하였다. 파장 검출 범위: 220 내지 400nm. 기능 유형: 다이오드 어레이(535 스캔). 컬럼: Phenomenex® Onyx Monolithic C18 50×4.60mm
초기에 다음 중간체를 제조하였다.
Figure pct00078
(a-i) (S)-2-(알릴옥시카보닐아미노)-3-메틸부탄산( I2 )
알릴 클로로포르메이트(36.2㎖, 340.59mmol, 1.2당량)를 물(650㎖)과 THF(650㎖) 중의 L-발린(I1)(33.25g, 283.82mmol, 1.0당량)과 탄산칼륨(59.27g, 425.74mmol, 1.5당량)의 교반 용액에 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반한 다음, 용매를 감압하에 농축하고, 잔여 용액을 디에틸 에테르(3×100㎖)로 추출하였다. 수성 부분을 농축 HCl로 pH 2로 산성화시키고, DCM(3×100㎖)으로 추출하였다. 합한 유기물은 염수로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하여 생성물을 무색 오일(57.1g, 수율 100%로 추정)로서 수득하였다. LC/MS (1.966 min (ES+)), m/z: 202.1 [M+H]+.
Figure pct00079
(a-ii) (S)-2,5- 디옥소피롤리딘 -1-일 2-( 알릴옥시카보닐아미노 )-3-메틸부타노에이트( I3 )
무수 THF(800㎖) 중의 보호 산(I2)(60.6g, 301.16mmol, 1.0당량)과 N-하이드록시석신이미드(34.66g, 301.16mmol, 1.0당량)의 교반 용액에 디사이클로헥실카보디이미드(62.14g, 301.16mmol, 1당량)를 가하였다. 반응을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 그 다음, 반응 혼합물을 여과하고, 고체를 THF로 세척하고, 합한 여액을 감압하에 농축하였다 잔사를 DCM에 재용해시키고, 0℃에서 30분 동안 방치하였다. 현탁액을 여과하고, 냉 DCM으로 세척하였다. 감압하에 여액을 농축하여 생성물을 점성 무수 오일(84.7g, 수율 100%로 추정)로서 수득하였으며, 이는 추가로 정제하지 않고 다음 단계에서 사용되었다. LC/MS (2.194 min (ES+)), m/z: 321.0 [M+Na]+.
Figure pct00080
(a-iii) (S)-2-((S)-2-( 알릴옥시카보닐아미노 )-3- 메틸부탄아미도 )프로판산( I4 )
THF(50㎖) 중의 석신이미드 에스테르(I3)(12.99g, 43.55mmol, 1.0당량)의 용액을 THF(100㎖)와 H2O (100㎖) 중의 L-알라닌(4.07g, 45.73mmol, 1.05당량)과 NaHCO3(4.02g, 47.90mmol, 1.1당량)의 용액에 가하였다. 혼합물을 실온에서 72시간 동안 저장하고, 이 때 THF를 감압하에 제거하였다. pH를 시트르산으로 3-4로 조절하여 백색 검을 침전시켰다. 에틸 아세테이트(6×150㎖)로 추출한 후, 합한 유기물을 H2O(200㎖)로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축시켰다. 디에틸 에테르와 분쇄시켜 생성물을 백색 분말로서 수득하고 이를 여과에 의하여 회수하고 디에틸 에테르로 세척하였다(5.78g, 49%).
LC/MS (1.925 min (ES+)), m/z: 273.1 [M+H]+.
Figure pct00081
(a-iv) 알릴 (S)-1-((S)-1-(4-( 하이드록시메틸 ) 페닐아미노 )-1- 옥소프로판 -2-일아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일카바메이트( I5 )
EEDQ(5.51g, 22.29mmol, 1.05당량)를 무수 THF(100㎖) 중의 p-아미노벤질 알콜(2.74g, 22.29mmol, 1.05당량)과 산(I4)(5.78g, 21.23mmol, 1당량)의 용액에 가하고, 실온에서 72시간 동안 교반하였다. 그 다음, 반응 혼합물을 감압하에 농축하고, 수득한 갈색 고체를 디에틸 에테르와 분쇄시키고, 여과하고 과량의 디에틸 에테르로 후속적으로 세척하여 생성물을 회백색 고체(7.1g, 88%)로서 수득하였다. LC/MS (1.980 min (ES+)), m/z: 378.0 [M+H]+.
Figure pct00082
Figure pct00083
1-요오도-2-옥소-6,9,12,15-테트라옥사-3-아자옥타데칸-18-산( I7 )
무수 DCM(1㎖) 중의 요오도아세트산 무수물(0.250g, 0.706mmol, 1.1당량)의 용액을 DCM(1㎖) 중의 아미노-PEG(4)-산(I6)(0.170g, 0.642mmol, 1.0당량)에 가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 암실에서 교반하였다. 반응 혼합물을 0.1M HCl, 물로 세척하였고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축시켰다. 잔사를 섬광 크로마토그래피(실리카 겔, 클로로포름 중의 3% MeOH 및 0.1% 포름산 내지 클로로포름 중의 10% MeOH 및 0.1% 포름산)로 정제하여 생성물을 오렌지색 오일(0.118g, 42%)로서 수득하였다. LC/MS (1.623 min (ES+)), m/z: 433..98 [M+H]+.
Figure pct00084
(ii) (11S,11 aS )-알릴 11-(3급-부틸디메틸실릴옥시)-8-(3-요오도프로폭시)-7-메톡시-5-옥소-2-((E)-프로프-1-에닐)-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카복실레이트( 74 )
Figure pct00085
(a) (S)-5-((3급- 부틸디메틸실릴옥시 ) 메틸 )-1-(5- 메톡시 -2-니트로-4-( 트리이소프로필실릴옥시 )벤조일)-4,5-디하이드로-1H-피롤-3-일 트리플루오로메탄설포네이트 ( 47 )
트리플산 무수물(28.4g, 100.0mmol, 3.0당량)을 -50℃에서 2,6-루티딘(14.4g, 130.0mmol, 4.0당량)을 함유하는 DCM(550㎖) 중의 케톤(46)(19.5g, 30.0mmol, 1.0당량)의 격렬하게 교반된 용액에 25분에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 1.5시간 동안 교반하고, 이 때 LC/MS는 완전한 반응을 나타내었다. 유기 상을 물(100㎖), 포화 중탄산나트륨(150㎖), 염수(50㎖)로 연속적으로 세척하고, 유기 상을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔사를 섬광 크로마토그래피(실리카 겔, 90/10 v/v n-헥산/EtOAc)로 정제하여 생성물을 담황색 오일(19.5g, 82%)로서 수득하였다. LC/MS (4.391 min (ES+)), m/z: 713.25 [M+H]+.
Figure pct00086
(b) (S,E)-(2-((3급-부틸디메틸실릴옥시)메틸)-4-(프로프-1-에닐)-2,3-디하이드로-1H-피롤-1-일)(5-메톡시-2-니트로-4-(트리이소프로필실릴옥시)페닐)메탄온( 67 )
테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0)(0.41g, 0.35mmol, 0.03당량)을 질소 대기하에 무수 디옥산(60㎖) 중의 트리플레이트(47)(8.4g, 11.8mmol, 1.0당량), E-1-프로펜-1-일보론산(1.42g, 16.5mmol, 1.4당량) 및 인산칼륨(5.0g, 23.6mmol, 2.0당량)의 혼합물에 가하였다. 혼합물을 25℃에서 120분 동안 교반하고 이때 LC/MS는 완전한 반응을 나타내었다. 에틸 아세테이트(120㎖) 및 물(120㎖)을 가하고, 유기 상을 제거하고, 염수(20㎖)로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔사를 섬광 크로마토그래피(실리카 겔, 95/5 v/v n-헥산/EtOAc 내지 90/10 v/v n-헥산/EtOAc)로 정제하여 생성물을 황색 발포체(4.96g, 70%)로서 수득하였다. LC/MS (4.477 min (ES+)), m/z: 605.0 [M+H]+.
Figure pct00087
(c) (S,E)-(2-아미노-5-메톡시-4-(트리이소프로필실릴옥시)페닐)(2-((3급-부틸디메틸실릴옥시)메틸)-4-(프로프-1-에닐)-2,3-디하이드로-1H-피롤-1-일)메탄온( 68 )
아연 분진(22.0g, 0.33 mol, 37당량)을 빙 욕을 사용하여, 5% v/v 포름산/에탄올(55㎖) 중의 프로페닐 중간체(67)(5.5g, 9.1mmol, 1.0당량)의 용액에 20분에 걸쳐 조금씩 가하여 온도를 25-30℃로 유지하였다. 30분 후, 반응 혼합물을 셀라이트®의 짧은 상을 통하여 여과하였다. 셀라이트®를 에틸 아세테이트(65㎖)로 세척하고, 합한 유기물을 물(35㎖), 포화 중탄산나트륨(35㎖) 및 염수(10㎖)로 연속적으로 세척하였다. 유기 상을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔사를 섬광 크로마토그래피(실리카 겔, 90/10 v/v n-헥산/EtOAc)로 정제하여 생성물을 담황색 오일(3.6g, 69.0%)로서 수득하였다. LC/MS (4.439 min (ES+)), m/z: 575.2 [M+H]+.
Figure pct00088
(d) (S,E)-알릴 2-(2-((3급-부틸디메틸실릴옥시)메틸)-4-(프로프-1-에닐)-2,3-디하이드로-1H-피롤-1-카보닐)-4-메톡시-5-(트리이소프로필실릴옥시)페닐카바메이트( 69 )
알릴 클로로포르메이트(0.83g, 6.88mmol, 1.1당량)를 -78℃에서 무수 피리딘(1.09g, 13.77mmol, 2.2당량)을 함유하는 무수 DCM(80㎖) 중의 아민(68)(3.6g, 6.26mmol, 1.0당량)의 용액에 가하였다. 드라이 아이스를 제거하고, 반응 혼합물을 실온으로 가온시켰다. 추가로 15분 동안 교반한 후, LC/MS는 완전한 반응을 나타내었다. 유기 상을 0.01N HCl(50㎖), 포화 중탄산나트륨(50㎖), 염수(10㎖)로 연속적으로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축시켜 담황색 오일을 남기고, 이를 추가로 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다(4.12g, 수율 100%로 추정). LC/MS (4.862 min (ES+)), m/z: 659.2 [M+H]+.
(e)(S,E)-알릴 2-(2-( 하이드록시메틸 )-4-( 프로프 -1- 에닐 )-2,3- 디하이드로 -1H-피롤-1-카보닐)-4-메톡시-5-(트리이소프로필실릴옥시)페닐카바메이트( 70 )
조 중간체(69)(수율 100%로 추정, 4.12g, 6.25mmol, 1.0당량)를 아세트산 (70㎖), 메탄올(10㎖), THF(10㎖) 및 물(20㎖)의 혼합물에 용해하고, 실온에서 교반하였다. 6시간 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(500㎖)로 희석하고, 물(2×500㎖), 포화 중탄산나트륨 (300㎖) 및 염수(50㎖)로 연속적으로 세척하였다. 유기 상을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔사를 섬광 크로마토그래피(실리카 겔, 1/99 v/v 메탄올/DCM 내지 5/95 v/v 메탄올/DCM)로 정제하여 생성물을 황색 오일로서 수득하고, 추가의 미반응 출발 물질 1g을 회수하였다. 이러한 물질을 위와 동일한 반응 조건으로 처리하며, 다만 16시간 동안 교반하였다. 후처리 및 정제 후, 추가의 생성물을 분리하였다(2.7g, 79%, 2단계) LC/MS (3.742 min (ES+)), m/z: 545.2 [M+H]+.
Figure pct00089
(f) (11S,11 aS )-알릴 11-하이드록시-7-메톡시-5-옥소-2-((E)-프로프-1-에닐)-8-(트리이소프로필실릴옥시)-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카복실레이트( 71 )
무수 디메틸 설폭사이드(1.16g, 14.87mmol, 3.0당량)를 질소 대기하에 -78℃에서 DCM(25㎖) 중의 옥살릴 클로라이드(0.94g, 7.43mmol, 1.5당량)의 용액에 적가하였다. 온도를 -78℃에서 유지하고, 10분 후, DCM(20㎖) 중의 1차 알콜(70)(2.7g, 4.96mmol, 1.0당량)의 용액을 적가하였다. 추가로 15분 후, 무수 트리에틸아민(2.5g, 24.78mmol, 5.0당량)을 가하고, 반응 혼합물을 실온으로 가온시켰다. 반응 혼합물을 냉 0.1N HCl(50㎖), 포화 탄산수소나트륨(50㎖) 및 염수(10㎖)로 연속적으로 세척하고, 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하여 생성물을 황색 오일로서 수득하고, 이는 추가로 정제하지 않고 다음 단계에서 사용되었다(2.68g, 수율 100%로 추정됨). LC/MS (3.548 min (ES+)), m/z: 543.2 [M+H]+.
(g) (11S,11 aS )-알릴 11-(3급-부틸디메틸실릴옥시)-7-메톡시-5-옥소-2-((E)-프로프-1-에닐)-8-(트리이소프로필실릴옥시)-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카복실레이트( 72 )
3급-부틸디메틸실릴트리플루오로메탄 설포네이트(3.93g, 14.87mmol, 3.0당량)를 0℃에서 무수 DCM(40㎖) 중의 카비놀아민(71)(수율 100%로 추정됨, 2.68g, 4.96mmol, 1.0당량)과 2,6-루티딘(2.12g, 19.83mmol, 4.0당량)의 용액에 가하였다. 10분 후, 반응 혼합물을 실온으로 가온시키고, 추가로 60분 동안 교반하였다. 유기 상을 물(10㎖), 포화 중탄산나트륨(10㎖) 및 염수(5㎖)로 연속적으로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔사를 섬광 크로마토그래피(실리카 겔, 클로로포름 내지 2/98 v/v 메탄올/클로로포름)에 의하여 정제하여 생성물을 황색 오일(2.0g, 63%, 2단계)로서 수득하였다. LC/MS (4.748 min (ES+)), m/z: 657.2 [M+H]+.
Figure pct00090
(h) (11S,11 aS )-알릴 11-(3급-부틸디메틸실릴옥시)-8-하이드록시-7-메톡시-5-옥소-2-((E)-프로프-1-에닐)-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카복실레이트( 73 )
아세트산리튬 이수화물(0.31g, 3.04mmol, 1.0당량)을 25℃에서 습윤 DMF(20㎖) 중의 디아제핀(72)(2.0g, 3.04mmol, 1.0당량)의 용액에 가하고, 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(200㎖)로 희석하고, 0.1M 시트르산(50㎖, pH 3), 물(50㎖) 및 염수(10㎖)로 연속적으로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축시켰다. 잔사를 섬광 크로마토그래피(실리카 겔, 50/50 v/v n-헥산/EtOAc 내지 25/75 v/v n-헥산/EtOAc)로 정제하여 생성물을 담황색 고체(0.68g, 45%)로서 수득하였다. LC/MS (3.352 min (ES+)), m/z: 501.1 [M+H]+.
Figure pct00091
(i) (11S,11 aS )-알릴 11-(3급-부틸디메틸실릴옥시)-8-(3-요오도프로폭시)-7-메톡시-5-옥소-2-((E)-프로프-1-에닐)-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카복실레이트( 74 )
디요오도프로판(0.295g, 1.00mmol, 5.0당량) 및 탄산칼륨(0.028g, 0.20mmol, 1.0당량)을 무수 아세톤(5㎖) 중의 페놀(33)(0.100g, 0.020mmol, 1.0당량)의 용액에 가하였다. 반응 혼합물을 60℃에서 6시간 동안 가열하고, 이 때 LC/MS는 완전한 반응을 나타내었다. 반응 혼합물을 감압하에 건조 상태로 농축하고, 잔사를 섬광 크로마토그래피(실리카 겔, 75/25 v/v n-헥산/EtOAc 내지 50/50 v/v n-헥산/EtOAc)로 정제하여 생성물을 무색 오일(0.074g, 56%)로서 수득하였다. LC/MS (3.853 min (ES+)), m/z: 669.0 [M+H]+.
Figure pct00092
(iii) (11S,11 aS )-4-((S)-2-((S)-2-( 알릴옥시카보닐아미노 )-3- 메틸부탄아미도 )프로판아미도)벤질 11-(3급-부틸디메틸실릴옥시)-8-하이드록시-7-메톡시-5-옥소-2-((E)-프로프-1-에닐)-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카복실레이트( 79 )
Figure pct00093
(a) 알릴 ((S)-1-(((S)-1-((4-((((2-((S)-2-(((3급-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)-4-((E)-프로프-1-엔-1-일)-2,3-디하이드로-1H-피롤-1-카보닐)-4-메톡시-5-((트리이소프로필실릴)옥시)페닐)카바모일)옥시)메틸)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카바메이트( 75 )
트리에틸아민(0.256㎖, 1.84mmol, 2.2당량)을 5℃(빙욕)에서 무수 THF(15㎖) 중의 아민(68)(0.480g, 0.835mmol, 1.0당량)과 트리포스겐(0.089g, 0.301mmol, 0.36당량)의 교반 용액에 가하였다. 이소시아네이트 반응의 진행을 반응 혼합물로부터 분취액을 주기적으로 제거하고, 메탄올로 켄칭시키고, LCMS 분석을 수행함으로써 모니터링하였다. 일단 이소시아네이트 반응이 완료되면, 무수 THF(10㎖) 중의 Alloc-Val-Ala-PABOH(I5)(0.473g, 1.25mmol, 1.5당량)과 트리에틸아민(0.174㎖, 1.25mmol, 1.5당량)의 용액을 새로이 제조된 이소시아네이트에 신속하게 주입하였다. 반응을 40℃에서 4시간 동안 교반한 후, 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 감압하에 농축시키고, 섬광 크로마토그래피(실리카 겔, 20/80 v/v n-헥산/EtOAc 내지 50/50 v/v n-헥산/EtOAc, 그 다음 1/99 v/v DCM/MeOH 내지 5/95 v/v DCM/MeOH)로 정제하여 생성물을 황색 고체(0.579g, 71%)로서 수득하였다. LC/MS (4.468 min (ES+)), m/z: 978.55 [M+H]+.
Figure pct00094
(b) 알릴 ((S)-1-(((S)-1-((4-((((2-((S)-2-(하이드록시메틸)-4-((E)-프로프-1-엔-1-일)-2,3-디하이드로-1H-피롤-1-카보닐)-4-메톡시-5-((트리이소프로필실릴)옥시)페닐)카바모일)옥시)메틸)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카바메이트( 76 )
실릴 에테르(75)(1.49g, 1.52mmol, 1.0당량)를 아세트산/ 메탄올/ 테트라하이드로푸란/ 물의 7:1:1:2 혼합물(14:2:2:4㎖)에 용해시키고, 실온에서 교반하였다. 2시간 후, 반응을 EtOAc(100㎖)로 희석하고, 물, 수성 중탄산나트륨, 그 다음 염수로 순차적으로 세척하였다. 그 다음, 유기 상을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축시켰다. 잔사를 섬광 크로마토그래피(실리카 겔, 100/0 그 다음 99/1 내지 92/8 v/v DCM/ MeOH)로 정제하여 생성물을 오렌지색 고체(1.2g, 92%)로서 수득하였다. LC/MS (3.649 min (ES+)), m/z: 865.44 [M+H]+.
Figure pct00095
(c) (11S,11 aS )-4-((S)-2-((S)-2-( 알릴옥시카보닐아미노 )-3- 메틸부탄아미도 )프로판아미도)벤질 11-하이드록시-7-메톡시-5-옥소-2-((E)-프로프-1-에닐)-8-(트리이소프로필실릴옥시)-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카복실레이트( 77 )
무수 디메틸 설폭사이드(0.180g, 2.3mmol, 3.0당량)를 질소 대기하에 -78℃에서 DCM(10㎖) 중의 옥살릴 클로라이드(0.147g, 1.1mmol, 1.5당량)의 용액에 적가하였다. 온도를 -78℃에서 유지시키고, 20분 후, DCM(10㎖) 중의 1차 알콜(76)(0.666g, 0.77mmol, 1.0당량)의 용액을 적가하였다. 추가로 15분 후, 무수 트리에틸아민(0.390g, 3.85mmol, 5.0당량) 을 가하고, 반응 혼합물을 실온으로 가온시켰다. 반응 혼합물을 냉 0.1N HCl (10㎖), 포화 탄산수소나트륨(10㎖) 및 염수(5㎖)로 연속적으로 세척하였다. 그 다음 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 그 다음, 잔사를 섬광 크로마토그래피(실리카 겔, 50/50 v/v n-헥산/EtOAc 내지 25/75 v/v n-헥산/EtOAc)로 정제하여 생성물을 백색 고체(0.356g, 54%)로서 수득하였다. LC/MS (3.487 min (ES+)), m/z: 862.2 [M+H]+.
Figure pct00096
(d) (11S,11 aS )-4-((S)-2-((S)-2-( 알릴옥시카보닐아미노 )-3- 메틸부탄아미도 )프로판아미도)벤질 11-(3급-부틸디메틸실릴옥시)-7-메톡시-5-옥소-2-((E)-프로프-1-에닐)-8-(트리이소프로필실릴옥시)-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카복실레이트( 78 )
3급-부틸디메틸실릴트리플루오로메탄 설포네이트(0.46g, 1.74mmol, 3.0당량)를 질소 대기하에 0℃에서 무수 DCM(10㎖) 중의 2차 알콜(77)(0.5g, 0.58mmol, 1.0당량)과 2,6-루티딘(0.25g, 2.32mmol, 4.0당량)의 용액에 가하였다. 10분 후, 반응 혼합물을 실온으로 가온시키고, 추가로 120분 동안 교반하였다. 그 다음, 유기 상을 물(10㎖), 포화 중탄산나트륨(10㎖) 및 염수(5㎖)로 연속적으로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔사를 섬광 크로마토그래피(실리카 겔, 50/50 v/v n-헥산/EtOAc)로 정제하여 생성물을 백색 고체(0.320g, 57%)로서 수득하였다. LC/MS (4.415 min (ES+)), m/z: 976.52 [M+H]+.
Figure pct00097
(e) (11S,11 aS )-4-((S)-2-((S)-2-( 알릴옥시카보닐아미노 )-3- 메틸부탄아미도 )프로판아미도)벤질 11-(3급-부틸디메틸실릴옥시)-8-하이드록시-7-메톡시-5-옥소-2-((E)-프로프-1-에닐)-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카복실레이트( 79 )
아세트산리튬 이수화물(0.010g, 0.10mmol, 1.0당량)을 25℃에서 3시간 동안 습윤 DMF(2㎖) 중의 실릴 에테르(78)(0.100g, 0.10mmol, 1.0당량)의 용액에 가하였다. 반응 혼합물을 그 다음 에틸 아세테이트(20㎖)로 희석하고, 0.1M 시트르산 (20㎖, pH 3), 물(20㎖) 및 염수(5㎖)로 연속적으로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축시켰다. 잔사를 섬광 크로마토그래피(실리카 겔, 5/95 v/v 메탄올/DCM)로 정제하여 생성물을 담황색 오일(0.070g, 83%)로서 수득하였다. LC/MS (3.362 min (ES+)), m/z: 820.2 [M+H]+.
Figure pct00098
(iv) (11S,11 aS )-4-((20S,23S)-1- 요오도 -20-이소프로필-23- 메틸 -2,18,21- 트리옥소 -6,9,12,15-테트라옥사-3,19,22-트리아자테트라코산아미도)벤질 11-하이드록시-7-메톡시-8-(3-((S)-7-메톡시-5-옥소-2-((E)-프로프-1-에닐)-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일옥시)프로폭시)-5-옥소-2-((E)-프로프-1-에닐)-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카복실레이트( 66 또는 DL4 )
Figure pct00099
(a) (11S,11 aS )-알릴 8-(3-((11S,11aS)-10-((4-((R)-2-((R)-2-(알릴옥시카보닐아미노)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)벤질옥시)카보닐)-11-(3급-부틸디메틸실릴옥시)-7-메톡시-5-옥소-2-((E)-프로프-1-에닐)-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일옥시)프로폭시)-11-(3급-부틸디메틸실릴옥시)-7-메톡시-5-옥소-2-((E)-프로프-1-에닐)-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카복실레이트( 80 )
탄산칼륨(0.030g, 0.21mmol, 1.0당량)을 아세톤(10㎖) 중의 페놀(79)(0.175g, 0.21mmol, 1.0당량)과 요오도 링커(74)(0.214g, 0.32mmol, 1.5당량)의 용액에 가하였다. 반응 혼합물을 75℃에서 밀봉 플라스크 내에서 17시간 동안 질소 대기하에 가열하였다. 반응 혼합물을 감압하에 건조 상태로 농축하고, 섬광 크로마토그래피(실리카 겔, 2/98 v/v 메탄올/DCM 내지 5/95 v/v 메탄올/DCM)로 정제하여 생성물을 담황색 고체(0.100g, 35%)로서 수득하였다. LC/MS (4.293 min (ES+)), m/z: 1359.13 [M]+.
(b) (11S,11 aS )-알릴 8-(3-((11S,11aS)-10-((4-((R)-2-((R)-2-(알릴옥시카보닐아미노)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)벤질옥시)카보닐)-11-하이드록시-7-메톡시-5-옥소-2-((E)-프로프-1-에닐)-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일옥시)프로폭시)-11-하이드록시-7-메톡시-5-옥소-2-((E)-프로프-1-에닐)-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카복실레이트( 81 )
테트라-n-부틸암모늄 플루오라이드(1M, 0.22㎖, 0.22mmol, 2.0당량)를 무수 THF(2㎖) 중의 실릴 에테르(80)(0.150g, 0.11mmol, 1.0당량)의 용액에 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반하고, 그 후 LC/MS는 완전한 반응을 나타내었다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(10㎖)로 희석하고, 물(5㎖) 및 염수(5㎖)로 순차적으로 세척하였다. 유기 상을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축시켜 황색 고체를 남겼다. 섬광 크로마토그래피(실리카 겔, 6/94 v/v 메탄올/DCM 내지 10/90 v/v 메탄올/DCM)로 정제하여 생성물을 담황색 고체(0.090g, 73%)로서 수득하였다. LC/MS (2.947 min (ES+)), m/z: 1154.0 [M+Na]+.
Figure pct00100
(c) (11S,11 aS )-4-((R)-2-((R)-2-아미노-3- 메틸부탄아미도 ) 프로판아미도 )벤질 11-하이드록시-7-메톡시-8-(3-((S)-7-메톡시-5-옥소-2-((E)-프로프-1-에닐)-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일옥시)프로폭시)-5-옥소-2-((E)-프로프-1-에닐)-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카복실레이트( 65 )
테트라키스(트리페닐포스펜)팔라듐(0)(0.005g, 0.005mmol, 0.06당량)을 무수 DCM(5㎖) 중의 비스-카비놀아민(81)(0.090g, 0.08mmol, 1.0당량)과 피롤리딘(16㎕, 0.20mmol, 2.5당량)의 용액에 가하였다. 20분 후, 반응 혼합물을 DCM(10㎖)으로 희석하고, 포화 염화암모늄(5㎖) 및 염수(5㎖)로 순차적으로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 용매를 감압하에 제거하여 조 생성물을 담황색 고체로서 남기고 이를 추가로 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다(0.075g, 수율 100%로 추정됨). LC/MS (2.060 min (ES+)), m/z: 947.2 [M+H]+.
(d) (11S,11 aS )-4-((20S,23S)-1- 요오도 -20-이소프로필-23- 메틸 -2,18,21- 트리옥소 -6,9,12,15-테트라옥사-3,19,22-트리아자테트라코산아미도)벤질 11-하이드록시-7-메톡시-8-(3-((S)-7-메톡시-5-옥소-2-((E)-프로프-1-에닐)-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일옥시)프로폭시)-5-옥소-2-((E)-프로프-1-에닐)-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카복실레이트( 66 또는 DL4 )
EDCI(0.015g, 0.08mmol, 1.0당량)를 무수 디클로로메탄(5㎖) 중의 아민(65)(수율 100%로 추정됨, 0.075g, 0.08mmol, 1.0당량)과 요오도아세트아미드-PEG4-산(I7)(0.034g, 0.08mmol, 1.0당량)의 용액에 가하고, 반응물을 암실에서 교반하였다. 50분 후, 추가량의 요오도아세트아미드-PEG4-산(I7)(0.007g, 0.016mmol, 0.2당량)을 추가량의 EDCI(0.003g, 0.016mmol, 0.2당량)와 함께 가하였다. 총 2.5시간 후, 반응 혼합물을 디클로로메탄(15㎖)으로 희석하고, 물(10㎖) 및 염수(10㎖)로 순차적으로 세척하였다. 유기 상을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 수득한 잔사를 섬광 크로마토그래피(실리카 겔, 클로로포름 100% 내지 90:10 v/v 클로로포름:메탄올)로 정제하였다. 순수한 분획들을 합하여 생성물(0.0254g, 23%, 2단계)을 수득하였다. 조 분획들을 회수하고, 분취용 TLC(실리카 겔, 90:10 v/v 클로로포름:메탄올)로 정제하여 생성물의 제2 배치(0.0036g, 3%, 2단계)를 수득하였다. LC/MS (2.689 min (ES+)), m/z: 681.0 1/2[M+2H]+.
당해 실시예 1에서 합성된 화합물은 본원에 개시된 항-DLL3 항체와 접합되어 개시된 ADC 1 - 5를 제공함이 인정된다.
실시예 2
항- DLL3 항체의 생성
항-DLL3 뮤린 항체는 다음과 같이 생산했다. 1차 면역화 캠페인에서, 3마리의 마우스(하기 균주 각각으로부터의 하나: Balb/c, CD-1, FVB)를 동일한 용적의 TiterMax® 또는 알룸 보조제로 유화시킨 인간 DLL3-fc 단백질(hDLL3-Fc)로 접종시켰다. hDLL3-Fc 융합 작제물은 아디포겐 인터내셔날(Adipogen International) (Catalog No. AG-40A-0113)로부터 구입했다. 초기 면역화는 TiterMax에서 마우스당 10㎍ hDLL3-Fc의 에멀젼으로 수행했다. 이어서, 마우스를 알룸 보조제에서 마우스당 5㎍ hDLL3-Fc로 격주로 부스팅시켰다. 융합 전의 최종 주사는 PBS에서 마우스당 5㎍ hDLL3-Fc로 수행했다.
2차 면역화 캠페인에서, 6마리 마우스(하기 균주로부터의 2개 각각: Balb/c, CD-1, FVB)를, 동일한 용적의 TiterMax® 또는 알룸 보조제로 유화시킨 인간 DLL3-His 단백질(hDLL3-His)로 접종시켰다. 재조합 hDLL3-His 단백질은, hDLL3-His를 과발현하도록 조작된 CHO-S 세포의 상청액으로부터 정제했다. 초기 면역화는 TiterMax에서 마우스당 10㎍ hDLL3-His의 에멀젼으로 수행했다. 이어서, 마우스를 알룸 보조제에서 마우스당 5㎍ hDLL3-His로 격주로 부스팅시켰다. 최종 주사는 hDLL3을 과발현하도록 조작된 2×105 HEK-293T 세포로 수행했다.
고체상 ELISA 검정을 사용하여 인간 DLL3에 특이적인 마우스 IgG 항체에 대한 마우스 혈청을 스크리닝했다. 배경을 초과하는 양성 신호는, DLL3에 특이적인 항체를 나타낸다. 요약하면, 96웰 플레이트(VWR International, Cat. #610744)를 ELISA 코팅 완충액 중에서 밤새 0.5㎍/ml의 재조합 DLL3-His로 코팅시켰다. 0.02%(v/v) 트윈 20을 함유하는 PBS로 세척한 후, 웰을 실온(RT)에서 1시간 동안 PBS 중의 3%(w/v) BSA, 200μL/웰로 차단시켰다. 마우스 혈청을 적정(1:100, 1:200, 1:400 및 1:800)하고, 50μL/웰로 DLL3 코팅된 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 항온배양했다. 플레이트를 세척한 다음, 실온에서 1시간 동안 PBS 중의 3% BSA-PBS 또는 2% FCS에서 1:10,000으로 희석시킨 50μL/웰 HRP-표지된 염소 항-마우스 IgG와 함께 항온배양했다. 다시, 플레이트를 세척하고, 40μL/웰의 TMB 기질 용액(Thermo Scientific 34028)을 실온에서 15분 동안 첨가했다. 현상한 후, 동일한 용적의 2N H2SO4를 첨가하여 기질 발달을 중지시키고, 플레이트를 OD 450에서 분광광도계로 분석했다.
혈청-양성 면역화 마우스를 희생시키고, 배수 림프절(오금, 사타구니 및 내측 장골)을 해부하고, 항체 생산 세포의 공급원으로 사용했다. B 세포(hDLL3-Fc 면역화된 마우스로부터 대략 229×106 세포, 및 hDLL3-His 면역화된 마우스로부터 510×106 세포)의 세포 현탁액은, 모델 BTX 하이브리뮨 시스템(BTX Hybrimmune System)(BTX Harvard Apparatus)를 사용하여 전기 세포 융합에 의해 1:1의 비율로 비-분비성 P3x63Ag8.653 골수종 세포와 융합시켰다. 세포를 아자세린, 15% 태아 클론 I 혈청, 10% BM 콘디메드(Condimed)(Roche Applied Sciences), 1mM 비필수 아미노산, 1mM HEPES, 100IU 페니실린-스트렙토마이신 및 50μM 2-머캅토에탄올이 보충된 DMEM 배지로 이루어진 하이브리도마 선택 배지에 재현탁시키고, 플라스크당 100mL 선택 배지에서 4개의 T225 플라스크에서 배양했다. 플라스크는, 5% CO2 및 95% 공기를 함유하는 습윤 37℃ 항온배양기에 6 내지 7일 동안 넣어 두었다.
융합 후 6일 또는 7일째에, 하이브리도마 라이브러리 세포를 플라스크로부터 수집하고, hDLL3-His 면역화 캠페인을 위해 64 팔콘 96-웰 플레이트 및 48 96-웰 플레이트 내로 200μL의 보충된 하이브리도마 선택 배지(상기한 바와 같음)에서 웰당 1개 세포로 플레이팅시켰다(FACSAria I 세포 분류기 사용). 라이브러리의 나머지를 액체 질소에 보관했다.
하이브리도마를 10일 동안 배양하고, 상청액은, 하기와 같이 수행된 유동 세포 분석법을 사용하여 hDLL3에 특이적인 항체에 대해 스크리닝했다. 인간 DLL3, 마우스 DLL3(염료로 사전-염색) 또는 시노몰구스 DLL3(Dylight800으로 사전 염색)을 과발현하도록 조작된 웰당 1×105개의 HEK-293T 세포를 25μL 하이브리도마 상청액과 함께 30분 동안 항온배양했다. 세포를 PBS/2% FCS로 세척하고, 이어서, PBS/2%FCS에서 1:300으로 2차 희석시킨 특이적 Fc 단편인, 샘플당 25μL의 DyeLight 649 표지된 염소-항-마우스 IgG와 함께 항온배양했다. 15분 항온배양 후, 세포를 PBS/2% FCS로 2회 세척하고, DAPI와 함께 PBS/2% FCS에서 재현탁시키고, 아이소타입 대조군 항체로 염색한 세포의 형광을 초과하는 형광에 대해 유동 세포 분석법에 의해 분석했다. 잔류하는 미사용 하이브리도마 라이브러리 세포는 장래 라이브러리 시험 및 스크리닝을 위해 액체 질소에서 동결시켰다.
hDLL3-His 면역화 캠페인은 대략 50 뮤린 항-hDLL3 항체를 수득했고, hDLL3-Fc 면역화 캠페인은 대략 90 뮤린 항-hDLL3 항체를 수득했다.
실시예 3
항- DLL3 항체의 서열분석
상기에 기초하여, 고정된 인간 DLL3 또는 h293-hDLL3 세포에 대해 명백하게 높은 친화성으로 결합하는 다수의 예시적 별개 모노클로날 항체를 서열분석 및 추가 분석을 위해 선택했다. 도 3a 및 3b에서 표 형식으로 제시한 바와 같이, 실시예 2에서 생성된 선택된 모노클로날 항체로부터의 경쇄 가변 영역(도 3a) 및 중쇄 가변 영역(도 3b)의 서열 분석은, 다수가 신규한 상보성 결정 영역을 가졌고 종종 신규한 VDJ 배열을 나타냈음을 확인했다. 도 3a 및 도 3b에 제시된 상보성 결정 영역 및 프레임워크 영역은, 분석 데이터베이스의 등록상표 버젼을 사용하여 카바트 등(Kabat et al., supra)에 따라 정의된다.
목적하는 항체를 발현하는 초기 선택된 하이브리도마 세포는, 항체를 암호화하는 RNA를 제조하기 위해 트리졸(Trizol®) 시약(Trizol® Plus RNA 정제 시스템, Lif Technologies)에서 용해시켰다. 104 내지 105 세포를 1mL 트리졸에 재현탁시키고, 200μL 클로로포름의 첨가 후에 격렬하게 진탕시켰다. 이어서, 샘플을 10분 동안 4℃에서 원심분리하고, 수성 상을 새로운 미량원심 튜브로 옮기고, 동일 용적의 70% 에탄올을 첨가했다. 샘플을 RNeasy Mini 스핀 컬럼 상에 부하하고, 2mL 수집 튜브에 넣고, 제조업자의 지침에 따라 처리했다. 전체 RNA는, 100μL RNase-비함유 물을 사용하여 스핀 컬럼 막으로 직접 용출에 의해 추출했다. RNA 제제의 품질은, 사용할 때까지 -80℃에서 보관하기 전에 1% 아가로스 겔에서 3μL를 분획화함으로써 측정했다.
각각의 하이브리도마의 Ig 중쇄의 가변 영역은, 모든 마우스 Ig 아이소타입에 특이적인 3' 마우스 Cγ 프라이머와 조합하여 완전 마우스 VH 레퍼토리를 표적화하도록 설계된 32 마우스 특이적 리더 서열 프라이머를 포함하는 5' 프라이머 혼합물을 사용하여 증폭시켰다. 유사하게는, Vκ 마우스 부류 각각을 증폭시키도록 설계된 32개 5' Vκ 리더 서열을 함유하는 프라이머 혼합물은, 카파 경쇄를 증폭시키고 서열분석하기 위해 마우스 카파 불변 영역에 특이적인 단일 역 프라이머와 조합하여 사용했다. 람다 경쇄를 함유하는 항체의 경우, 증폭은, 마우스 람다 불변 영역에 특이적인 하나의 역 프라이머와 조합하여 3개의 5' VL 리더 서열을 사용하여 수행했다. VH 및 VL 전사물은, 다음과 같이 퀴아겐 원 스텝(Qiagen One Step) RT-PCR 키트를 사용하여 100ng 전체 RNA로부터 증폭시켰다. 8개 RT-PCR 반응물 전체를 각각의 하이브리도마에 대해 실행하고, Vκ 경쇄에 대해 4개를 실행하고, Vγ 중쇄에 대해 4개를 실행했다. PCR 반응 혼합물은 3μL의 RNA, 0.5μL의 100μM 중쇄 또는 카파 경쇄 프라이머(Ingegrated Data Technologies에 의해 커스텀(custom) 합성됨), 5μL의 5× RT-PCR 완충액, 1μL dNTP, 역 전사효소 및 DNA 폴리머라제를 함유하는 1μL의 효소 혼합물, 및 0.4㎕의 리보뉴클레아제 억제제 RNasin(1단위)을 포함했다. 열 순환기 프로그램은 50℃에서 30분 동안 RT 단계, 95℃에서 15분 동안, 이어서, 30사이클(30초 동안 95℃, 30초 동안 48℃, 1분 동안 72℃)이었다. 이어서, 72℃에서 10분 동안 최종 항온배양을 수행했다.
추출된 PCR 생성물은, 가변 영역의 증폭에 대해 상기 기술된 바와 동일한 특이적 가변 영역 프라이머를 사용하여 서열분석했다. 직접적 DNA 서열분석을 위한 PCR 생성물을 제조하기 위해, 이들은 제조업자의 프로토콜에 따라 QIAquickTM PCR 정제 키트(Qiagen)를 사용하여 정제했다. DNA는 50μL의 멸균수를 사용하여 스핀 컬럼으로부터 용출시키고, 이어서, 양쪽 가닥으로부터 직접 서열분석했다. 뉴클레오티드 서열은 최고 서열 상동성을 갖는 생식계 V, D 및 J 유전자 구성원을 동정하기 위해 IMGT 서열 분석 도구를 사용하여 분석했다(http://www.imgt.org/IMGTmedical/sequence analysis.html). 유도된 서열은 등록상표의 항체 서열 데이터베이스를 사용하여 마우스 생식계 데이터베이스에 대한 VH 및 VL 유전자의 정렬에 의해 Ig V- 및 J-영역의 공지된 생식계 DNA 서열과 비교했다.
보다 구체적으로, 도 3a는, 항-DLL3 항체로부터 다수의 신규 뮤린 경쇄 가변 영역 및 대표적 뮤린 경쇄로부터 유도된 예시적 인간화된 경쇄 가변 영역의 연속한 아미노산 서열을 나타낸다. 유사하게, 도 3b는, 동일한 항-DLL3 항체로부터 다수의 신규한 뮤린 중쇄 가변 영역, 및 인간화된 경쇄를 제공하는 동일한 뮤린 항체로부터 유도된 예시적 인간화된 중쇄 가변 영역의 연속한 아미노산 서열을 나타낸다. 뮤린 경쇄 및 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 서열번호 21 내지 387(홀수)에 제공되어 있고, 인간화된 경쇄 및 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 서열번호 389 내지 407(홀수)에 제공되어 있다.
따라서, 도 3a 및 3b와 함께 다수의 조작가능한 뮤린 항-DLL3 항체(SC16.3, SC16.4, SC16.5, SC16.7, SC16.8, SC16.10, SC16.11, SC16.13, SC16.15, SC16.18, SC16.19, SC16.20, SC16.21, SC16.22, SC16.23, SC16.25, SC16.26, SC16.29, SC16.30, SC16.31, SC16.34, SC16.35, SC16.36, SC16.38, SC16.41, SC16.42, SC16.45, SC16.47, SC16.49, SC16.50, SC16.52, SC16.55, SC16.56, SC16.57, SC16.58, SC16.61, SC16.62, SC16.63, SC16.65, SC16.67, SC16.68, SC16.72, SC16.73, SC16.78, SC16.79, SC16.80, SC16.81, SC16.84, SC16.88, SC16.101, SC16.103, SC16.104, SC16.105, SC16.106, SC16.107, SC16.108, SC16.109, SC16.110, SC16.111, SC16.113, SC16.114, SC16.115, SC16.116, SC16.117, SC16.118, SC16.120, SC16.121, SC16.122, SC16.123, SC16.124, SC16.125, SC16.126, SC16.129, SC16.130, SC16.131, SC16.132, SC16.133, SC16.134, SC16.135, SC16.136, SC16.137, SC16.138, SC16.139, SC16.140, SC16.141, SC16.142, SC16.143, SC16.144, SC16.147, SC16.148, SC16.149 및 SC16.150으로 명명됨) 및 예시적 인간화된 항체(hSC16.13, hSC16.15, hSC16.25, hSC16.34 및 hSC16.56로 명명됨)의 주석 부여 서열을 제공한다. 이들 동일한 명칭은 대상체 항체를 생성하는 클론을 지칭할 수 있고, 임의의 특정 명칭의 사용은 주변 개시의 문맥에서 해석되어야만 하는 것에 유의해야 한다.
본원의 목적을 위한 각각의 특정 항체의 서열번호는 순차 홀수이다. 따라서, mAb SC16.3은 각각 경쇄 및 중쇄 가변 영역에 대해 아미노산 서열번호 21 및 23을 포함한다. 이와 관련하여, SC16.4는 서열번호 25 및 27을 포함하고, SC16.5는 서열번호 29 및 31을 포함한다. 각 항체 아미노산 서열에 대한 상응하는 핵산 서열은, 첨부된 서열목록에 포함되어 있고, 상응하는 아미노산 서열번호의 직전의 서열번호를 갖는다. 따라서, 예를 들면, SC16.3 항체의 VL 및 VH의 서열번호는 각각 21 및 23이고, SC16.3 항체의 VL 및 VH의 핵산 서열의 서열번호는 각각 서열번호 20 및 22이다.
보고된 서열과 관련하여, 서열분석 이상에 기인하여, 특정 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열은 공정 동안 조기 절단되어 있음에 유의해야 한다. 이는, 보고된 프레임워크 4개 서열에서 하나 이상의 아미노산의 결함을 초래했다. 이러한 경우에, 상호교환적 아미노산(다른 클론으로부터 상응하는 서열의 검토에 의해 결정됨)은, 대상체 가변 영역 서열을 필수적으로 완료하기 위해 공급되었다. 예를 들면, 잔기 "IK"는, 완전 프레임워크 4를 갖는 작동가능한 경쇄 가변 영역을 제공하기 위해 도 3a의 SC16.22 경쇄 서열(서열번호 73)의 말단에 부가되었다. 부가된 아미노산을 암호화하는 염기는, 유사하게는 일관성을 확보하기 위해 상응하는 핵산 서열(서열번호 72)에 부가되었다. 도 3a 및 3b에서 이러한 각각의 경우에, 부가된 아미노산은 용이하게 식별할 수 있도록 밑줄 및 볼드체로 되어 있다(첨부된 서열목록에서는 그렇지 않음).
실시예 4
키메라 및 인간화된 항- DLL3 항체의 생성
상기에서 언급한 바와 같이, 실시예 2로부터의 특정 뮤린 항체(SC16.13, SC16.15, SC16.25, SC16.34 및 SC16.56)는, 뮤린 가변 영역을 갖는 인간 불변 영역을 포함하는 키메라 항체, 및 인간 수용체 항체 내로 절편이식된 뮤린 CDR을 포함하는 인간화된 항체를 유도하기 위해 사용되었다. 바람직한 양태에서, 이들 유도된 항체(키메라 또는 인간화된)는 개시된 DLL3 접합체에 도입될 수 있다.
보다 구체적으로, 키메라 항-DLL3 항체는, 다음과 같이 당해 기술분야에서 인식된 기술을 사용하여 생성했다. 전체 RNA를 하이브리도마로부터 추출하고, 실시예 3에 제시된 바와 같이 증폭시켰다. 뮤린 항체의 VH 및 VL의 V, D 및 J 유전자 절편에 관한 데이터는, 유도된 핵산 서열로부터 수득했다. 항체의 VH 및 VL 쇄의 리더 서열에 특이적인 프라이머 세트는 하기 제한 부위를 사용하여 설계했다: VH 단편의 경우 AgeI 및 XhoI, 및 VL 단편의 경우 XmaI 및 DraIII. PCR 생성물은 퀴아퀵(Qiaquick) PCR 정제 키트(Qiagen)로 정제하였고, 이어서, VH 단편의 경우에 제한 효소 AgeI 및 XhoI 및 VL 단편의 경우에 XmaI 및 DraIII으로 분해시켰다. VH 및 VL 분해된 PCR 생성물을 정제하고, 인간 IgG1(서열번호 6) 중쇄 불변 영역 발현 벡터 또는 카파 CL(서열번호 5) 인간 경쇄 불변 영역 발현 벡터에 각각 연결시켰다.
연결 반응은 200U T4-DNA 리가제(New England Biolabs)로 전체 용적 10㎕, 7.5㎕의 분해 및 정제된 유전자-특이적 PCR 생성물 및 25ng 선형화된 벡터 DNA에서 다음과 같이 수행했다. 경쟁인자 이.콜라이 DH10B 세균(Life Technologies)은 3μL 연결 생성물을 사용하여 42℃에서 열 충격에 의해 형질전환시키고, 100㎍/mL의 농도로 암피실린 플레이트에 플레이팅시켰다. 증폭된 연결 생성물의 정제 및 분해 후, VH 단편을 pEE6.4HuIgG1 발현 벡터(Lonza)의 AgeI-XhoI 제한 부위에 클로닝하고, VL 단편을 pEE12.4Hu-카파 발현 벡터(Lonza)의 XmaI-DraIII 제한 부위에 클로닝했다.
키메라 항체는 pEE6.4HuIgG1 및 pEE12.4Hu-카파 발현 벡터를 사용한 HEK-293T 세포의 동시-형질감염에 의해 발현시켰다. 형질감염 전, HEK-293T 세포는 10% 열 불활성화된 FCS, 100㎍/mL 스트렙토마이신 및 100U/mL 페니실린 G가 보충된 둘베코 변형된 이글 배지(DMEM)에서 표준 조건 하에 150mm 플레이트에서 배양했다. 일시적 형질감염을 위해, 세포를 80% 컨플루언시(confluency)로 성장시켰다. 12.5㎍의 각 pEE6.4HuIgG1 및 pEE12.4Hu-카파 벡터 DNA를 1.5mL Opti-MEM에서 50㎕ HEK-293T 형질감염 시약에 첨가했다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 항온배양하고, 플레이팅했다. 상청액은 형질감염 후 3 내지 6일째에 수거했다. 재조합 키메라 항체를 함유하는 배양 상청액은 10분 동안 800×g에서 원심분리하여 세포 파편으로부터 제거하고, 4℃에서 보관했다. 재조합 키메라 항체를 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제했다.
또한, 동일한 뮤린 항-DLL3 항체(예: SC16.13, SC16.15, SC16.25, SC16.34 및 SC16.56)를 사용하여 CDR-절편이식된 또는 인간화된 항체를 유도했다. 이와 관련하여, 뮤린 항체는, 등록상표의 컴퓨터-지원 CDR-절편이식 방법(Abysis Database, UCL Business) 및 표준 분자 조작 기술을 사용하여 다음과 같이 인간화시켰다. 가변 영역의 인간 프레임워크 영역은, 인간 생식계 항체 서열의 프레임워크 서열 및 CDR 정규 구조와 관련 마우스 항체의 프레임워크 서열 및 CDR 사이의 최고 상동성에 기반하여 설계했다. 분석 목적을 위해, 각각의 CDR 도메인에 대한 아미노산의 할당은 카바트 등의 넘버링에 따라 수행했다. 일단 가변 영역이 선택되면, 이들은 합성 유전자 절편(Ingegrated DNA Technologies)으로부터 생성되었다. 인간화된 항체를 클로닝하고, 키메라 항체에 대해 상기 기재된 분자 방법을 사용하여 발현시켰다.
선택된 인간 수용체 가변 영역을 위한 유전자 조성은, 각각의 인간화된 항체에 대한 바로 아래의 표 3에 제시되어 있다. 표 3에 도시된 서열은, 대상체 클론에 대해 도 3a 및 3b에 제시된 주석부여 중쇄 및 경쇄 서열에 상응한다. 보다 구체적으로, 하기 표 3의 엔트리는 서열번호 389 및 391(hSC16.13), 서열번호 393 및 395(hSC16.15), 서열번호 397 및 399(hSC16.25), 서열번호 401 및 403(hSC16.34) 및 서열번호 405 및 407(hSC16.56)에 제시된 연속한 가변 영역 서열에 상응한다. 유전자 조성 이외에, 표 3은, 이들 선택된 양태에서, 선택된 항체의 바람직한 결합 특성을 유지하기 위해 프레임워크 변화 또는 역 돌연변이가 필요하지 않음을 나타낸다. 물론, 다른 CDR 절편이식된 작제물에서, 이러한 프레임워크 변화 또는 역 돌연변이는 바람직할 수 있고 이와 같이 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 명백하게 간주되는 것이 이해될 것이다.
Figure pct00101
어떠한 잔기도 프레임워크 영역에서 변경되지 않았지만, 하나의 인간화된 클론(hSC16.13)에서 돌연변이는 안정성 문제를 해소하기 위해 중쇄 CDR2에 도입되었다. 변형된 CDR을 갖는 항체의 결합 친화성은, 이것이 상응하는 키메라 또는 뮤린 항체의 어느 하나와 동등하다는 것을 확인하기 위해 검사했다.
CDR 절편이식에 의해 모든 선택된 항체의 인간화 후, 수득되는 경쇄 및 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은, 뮤린 공여체 및 인간 수용체 경쇄 및 중쇄 가변 영역과 관련하여 상동성을 측정하기 위해 분석했다. 바로 아래의 표 4에 제시되는 결과는, 인간화된 작제물이 뮤린 공여체 서열보다 인간 수용체 서열과 관련하여 보다 높은 상동성을 일정하게 나타냈음을 보여준다. 보다 구체적으로, 뮤린 중쇄 및 경쇄 가변 영역은, 인간화된 항체 및 공여체 하이브리도마 단백질 서열의 상동성(74% 내지 83%)과 비교하여 인간 생식계 유전자의 가장 가까운 정합과 유사한 전체 백분율 상동성(85 내지 93%)을 나타낸다.
Figure pct00102
시험시 및 하기 보다 상세히 논의될 것인 바와 같이, 각각의 유도된 인간화된 작제물은, 뮤린 모 항체에 의해 제시된 것에 거의 필적하는 바람직한 결합 특성을 나타냈다.
실시예 5
항- DLL3 항체의 특성
각종 방법을 사용하여, 상기 제시된 바와 같이 생성된 선택된 DLL3 항체 조절인자의 결합 및 면역화학 특성을 분석했다. 구체적으로, 항체 조절인자의 수는, 유동 세포 분석법을 포함하는 당해 기술분야에 인지된 방법에 의해 인간, 시노몰구스, 래트 및 마우스 항원 인식(세포 및 DLL3 단백질 작제물 사용)과 관련하여 친화성, 동태, 비닝, 결합 위치 및 교차 반응성에 대해 특성확인했다. 선택된 조절인자의 친화성 및 속도 상수 kon 및 koff는, 제조업자의 지시에 따라 각각 포르테바이오 레드(ForteBio RED)(ForteBio, Inc.) 상에서의 바이오-층 간섭 분석, 또는 바이아코어(Biacore) 2000을 사용한 표면 플라스몬 공명을 사용하여 측정했다.
특성확인 결과는 표 5에 표 형태로 제시되어 있고, 여기서, 선택된 조절인자는 일반적으로 나노몰 범위에서 비교적 높은 친화성을 나타냈고, 다수의 경우에 교차-반응성이었음을 볼 수 있다. 도 5는 추가로 바로 아래의 실시예 6에 보다 상세하게 기재된 효모 매개된 항원 단편 발현을 사용하여 측정된 바와 같이 대상체 항체에 의해 결합된 DLL3 도메인 뿐만 아니라 경험적으로 측정된 항체 빈을 수록한다.
항체 비닝과 관련하여, 제조업자의 지시에 따라 포르테바이오 레드를 사용하여, 동일하거나 상이한 빈에 결합된 경쟁 항체를 동정했다. 요약하면, 참조 항체(Ab1)는 항-마우스 포획 칩 상에 포획되었고, 이어서, 고농도의 비-결합 항체는 칩을 차단하기 위해 사용되었으며, 기저선이 수집되었다. 이어서, 단량체성 재조합 인간 DLL3-플래그(Adipogen International)는 특이적 항체(Ab1)에 의해 포획되었고, 선단부는, 대조군으로서 동일한 항체(Ab1)를 갖는 웰 내로 또는 상이한 시험 항체(Ab2)를 갖는 웰 내로 침지되었다. 추가의 결합이 신규한 항체에 의해 관찰되는 경우, Ab1 및 Ab2는 상이한 빈에 존재하는 것으로 결정되었다. 결합 수준을 대조군 Ab1과 비교하여 측정된 바와 같이 추가의 결합이 발생하지 않으면, Ab2는 동일한 빈에 존재하는 것으로 결정되었다. 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 이 프로세스는 96-웰 플레이트에서 유일한 빈을 나타내는 항체의 안정한 열을 사용하여 특유한 항체의 거대 라이브러리를 스크리닝하기 위해 확장할 수 있다. 본 발명의 경우에, 이러한 비닝 프로세스는, DLL3 단백질 상에 적어도 9개의 상이한 빈(도 5에서 빈 A 내지 I로 지정됨)에 결합된 스크리닝된 항체를 나타냈다. DLL 항원의 외관상 크기(ECD는 대략 56kD이다) 및 사용된 비닝 방법의 분해능에 기초하여, 9개의 동정된 빈은, DLL3 세포외 항원 상에 존재하는 대부분의 빈을 나타낸다고 생각된다.
상기 제시된 예시적 조절인자를 평가하는 것에 추가하여, 유동 세포 분석법을 수행하여, 선택된 SC16 항체 조절인자가 인간 DLL3과 면역특이적으로 연관될 수 있다는 것을 확인하고, 동일한 항체가 시노몰구스, 래트 및/또는 뮤린 DLL3과 교차-반응하는지의 여부를 결정할 수 있다. 보다 구체적으로, 예시적 뮤린 항체는, 뮤린, 래트, 시노몰구스 또는 인간 DLL3을 과발현하는 FACSCanto II 및 293 세포를 사용하여 유동 세포 분석법에 의해 분석했다. 몇몇 경우에, 예시적 뮤린 조절인자는, 문헌[참조: Cochran et al., J Immunol Methods. 287 (1-2):147-158 (2004)]에 기재된 방법을 사용하여 시노몰구스 DLL3을 표시하는 FACSCanto II 및 효모 세포를 사용하여 유동 세포 분석법에 의해 분석했다.
유동 세포 분석법에 기반하여, 모든 선택된 항체 조절인자는 293 세포 상에서 과발현된 인간 DLL3에 결합하는 것으로 밝혀졌고(데이터는 도시하지 않음), 다수의 시험된 항체는 시노몰구스 및/또는 뮤린 DLL3과 교차-반응하는 것으로 밝혀졌다(마우스와 반응하는 모든 항체는 또한 래트와 반응했다). 이와 관련하여 및 도 5에 수록된 바와 같이, 인간 DLL3과 면역특이적으로 반응하는 13개 조절인자 중의 8개는 또한 뮤린(또는 래트) DLL3과 반응하는 것으로 밝혀졌다. 구체적으로, mAb SC16.4, SC16.8, SC16.15, SC16.34, SC16.39, SC16.46, SC16.51 및 SC16.56은 다소간에 뮤린 DLL3과 교차-반응하는 것으로 밝혀졌지만, mAb SC16.7, SC16.10, SC16.13, SC16.25 및 SC16.65는 뮤린 DLL3과 적절하게 연관되지 않았다. 이러한 결과는, 뮤린 DLL3이 인간 DLL3의 아이소타입 2와 대략 83% 상동성이라는 것을 고려하면 예상외는 아니다. 이러한 교차-반응성은, 약물 발견 및 개발에서 동물 모델의 사용을 통해 본 발명의 문맥에서 유리하게 이용될 수 있는 것으로 이해된다.
상기 언급한 검정 이외에, 실시예 4로부터 인간화된 작제물 hSC16.13, hSC16.15, hSC16.25, hSC16.34 및 hSC16.56은, CDR 절편이식 프로세스가 이들의 결합 특성을 눈에 띠게 변화시켰는지를 측정하기 위해 분석했다. 이와 관련하여, 인간화된 작제물(절편이식된 CDR)은, 인간화된 작제물에 사용된 것과 실질적으로 등가인 뮤린 모(또는 공여체) 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 및 인간 불변 영역을 포함하는 "종래"의 키메라 항체와 비교했다. 이들 작제물에 있어서, 바이아코어(Biacore) 2000(GE Healthcare)을 사용하여 표면 플라스몬 공명(SPR)을 수행하여 인간화 프로세스에 의해 발생한 속도 상수의 임의의 미묘한 변화를 식별했다.
일련의 25 및 12.5nM 농도의 인간 DLL3 항원에 기반하고 1:1 랑뮈르 결합 모델을 사용하여, 인간 DLL3 항원에 대한 SC16.15 항체 결합의 KD는 0.2nM인 것으로 평가되었다. 이어서, 유사한 실험은, 이들이 치료학적 친화성 값(데이터는 도시하지 않음)을 보유하는지를 입증하기 위해 다른 인간화된 작제물 및 키메라 작제물로 실행하였다. 이러한 결과는 인간화 프로세스가 조절인자의 친화성에 현저하게 영향을 미치지 않았음을 입증하고, 이들이 개시된 DLL3 ADC에서 사용하기 위한 실행가능한 후보임을 나타냈다.
실시예 6
항- DLL3 항체의 도메인 및 에피토프 맵핑
개시된 DLL3 항체 약물 접합체가 연관되고 결합하는 에피토프를 특성확인하고 배치하기 위해, 도메인-수준 에피토프 맵핑은, 문헌[참조: Cochran et al., 2004 (supra)]에 기재된 프로토콜의 변형을 사용하여 다수의 예시적 항체에 대해 수행되었다. 요약하면, 특이적 아미노산 서열을 포함하는 DLL3의 개개 도메인을 효모의 표면 상에서 발현시키고, 선택된 DLL3 항체에 의한 결합을 유동 세포 분석법에 의해 측정했다.
보다 구체적으로, 효모 디스플레이 플라스미드 작제물은 하기 작제물의 발현을 위해 생성했다: DLL3 세포외 도메인(아미노산 27 내지 466); DLL3의 EGF-유사 도메인 1 내지 6(아미노산 220 내지 466)과 융합된 DLL1의 N-말단 영역 및 DSL 도메인(아미노산 22 내지 225)로 이루어진 DLL1-DLL3 키메라; DLL1의 EGF-유사 도메인 1 내지 8(아미노산 222 내지 518)과 융합된 DLL3의 N-말단 영역 및 DSL 도메인(아미노산 27 내지 214)로 이루어진 DLL3-DLL1 키메라; EGF-유사 도메인 #1(아미노산 215 내지 249); EGF-유사 도메인 #2(아미노산 274 내지 310); EGF-유사 도메인 #1 및 #2(아미노산 215 내지 310); EGF-유사 도메인 #3(아미노산 312 내지 351); EGF-유사 도메인 #4(아미노산 353 내지 389); EGF-유사 도메인 #5(아미노산 391 내지 427); 및 EGF-유사 도메인 #6(아미노산 429 내지 465). (도메인 정보에 대해서는 일반적으로 본원에서 참조로서 도입되는 UniProtKB/Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9NYJ7 참조. 아미노산 넘버링은, 서열번호 1에 제시된 바와 같은 리더 서열을 갖는 미처리된 DLL3 단백질을 참조함에 의한 것임에 유의해야 한다.). 전체로서 N-말단 영역 또는 EGF 도메인의 분석을 위해, 패밀리 구성원 DLL1을 갖는 키메라(DLL1-DLL3 및 DLL3-DLL1)는 단백질 폴딩의 잠재적 문제를 최소화하기 위해 단편과 반대로 사용된다. 도메인-맵핑 항체는 DLL1과 교차 반응하지 않는 것으로 밝혀졌고, 이는 이들 작제물에 대한 임의의 결합이 작제물의 DLL3 부분과의 연관을 통해 발생하고 있음을 나타낸다. 이들 플라스미드를 효모로 형질전환시키고, 이어서, 문헌[참조: Cochran et al.]에 기재된 바와 같이 성장시키고 유도했다.
특정 작제물에 대한 결합을 시험하기 위해, 목적하는 작제물을 발현하는 200,000 유도된 효모 세포를 PBS + 1mg/mL BSA(PBSA)에서 2회 세척하고, 0.1㎍/mL의 비오티닐화된 항-HA 클론 3F10(Roche Diagnostics) 및 50nM 정제된 항체 또는 7일동안 배양한 하이브리도마로부터의 미정제 상청액의 1:2 희석물과 함께 50㎕의 PBSA에서 항온배양했다. 세포는 빙상에서 90분 동안 항온배양한 다음, PBSA에서 2회 세척했다. 이어서, 세포는 적절한 2차 항체와 함께 50㎕ PBSA에서 항온배양했다: 뮤린 항체의 경우, Alexa 488 접합된 스트렙트아비딘 및 Alexa 647 접합된 염소 항 마우스(둘 다 Life Technologies)를 각각 1㎍/mL로 첨가하고, 인간화된 또는 키메라 항체의 경우, Alexa 647 접합된 스트렙트아비딘(Life Technologies) 및 R-피코에리트린 접합된 염소 항-인간(Jackson Immunoresearch)를 각각 1㎍/mL로 첨가했다. 빙상에서 20분 항온배양한 후, 세포를 PBSA로 2회 세척하고, FACS Canto II 상에서 분석했다. DLL3-DLL1 키메라에 결합된 항체는, N-말단 영역 + DSL에 결합하는 것으로 지정했다. 특정 EGF-유사 도메인 상에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합된 항체는 이의 각각의 도메인에 결합하는 것으로 지정했다.
에피토프를 입체배좌(예: 불연속) 또는 선형으로 분류하기 위해, DLL3 세포외 도메인을 표시하는 효모를 30분 동안 80℃에서 열 처리한 다음, 빙냉 PBSA에서 2회 세척했다. 이어서, 변성된 항원(변성된 효모)을 표시하는 효모는, 상기 기재된 바와 같이 동일한 염색 프로토콜 및 유동 세포 분석법으로 처리했다. 변성된 효모 및 천연 효모 둘 다에 결합된 항체는, 선형 에피토프에 결합하는 것으로 분류하고, 천연 효모에 결합하지만 변성된 효모에 결합하지 않는 항체는, 입체배좌상 특이적인 것으로 분류했다.
시험된 항체의 도메인-수준 에피토프 맵핑 데이터의 모식 개략도는 도 4에 제시되어 있고, 선형 에피토프에 결합하는 항체는 밑줄그어져 있고, 변성된 경우, 상응하는 빈은 괄호 안에 기재했다. 도 4의 검토는 조절인자의 대부분이 DLL3의 N-말단/DSL 영역에서 발견된 에피토프에 또는 제2 EGF-유사 도메인에 맵핑하는 경향이 있음을 나타낸다. 이전에 시사한 바와 같이, 도 5는, 표 형태로 다수의 선택된 조절인자에 대해 빈 측정 및 도메인 맵핑에 관한 유사한 데이터를 나타낸다.
미세 에피토프 맵핑은, 2개 방법 중 하나를 사용하여 선택된 항체에 대해 추가로 수행되었다. 첫번째 방법은, 제조업자의 지시에 따라 사용된 Ph.D.-12 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리 키트(New England Biolabs E8110S)를 사용했다. 요약하면, 에피토프 맵핑을 위한 항체는 Nunc MaxiSorp 튜브(Nunc) 상에 3mL 0.1M 중탄산나트륨 용액(pH 8)에서 50㎍/mL로 밤새 코팅했다. 튜브를 중탄산염 용액 중의 3% BSA 용액으로 차단시켰다. 이어서, PBS + 0.1% 트윈-20 중의 1011 투입 파지를 결합하게 한 다음, 비-결합 파지를 세척제거하기 위해 0.1% 트윈-20으로 10회 연속 세척한다. 잔류하는 파지를 온화하게 진탕시키면서 실온에서 10분 동안 1mL 0.2M 글리신으로 용출시킨 다음, 150㎕ 1M 트리스-HCl(pH 9)로 중화시켰다. 용출된 파지를 증폭시키고, 세척 단계 동안 0.5% 트윈-20을 사용하여 1011 투입 파지로 다시 패닝(panned)하여 선택 스트리전시(stringency)를 증가시켰다. 제2 라운드로부터 용출된 파지의 24개 플라크로부터의 DNA는, Qiaprep M13 스핀 키트(Qiagen)을 사용하여 단리하고, 서열분석했다. 클로날 파지의 결합은 ELISA 검정을 사용하여 확인하고, 여기서, 맵핑된 항체 또는 대조군 항체는 ELISA 플레이트 상에 코팅하고, 차단하며, 각각의 파지 클론에 노출시켰다. 파지 결합은 서양고추냉이 퍼옥시다제 접합된 항-M13 항체(GE Healthcar) 및 1-단계 Turbo TMB ELISA 용액(Pierce)을 사용하여 검출했다. 특이적으로 결합하는 파지로부터의 파지 펩티드 서열은, 결합 에피토프를 결정하기 위해 항원 ECD 펩티드 서열에 대한 벡터(Vector) NTI(Life Technologies)를 사용하여 정렬시켰다.
대안으로, 효모 디스플레이 방법[참조: Chao et al., Nat Protoc. 1(2): 755-768, 2007]을 사용하여 선택 항체를 에피토프 맵핑했다. 요약하면, DLL3 ECD 돌연변이체의 라이브러리는 클론당 하나의 아미노산 돌연변이의 표적 돌연변이유발을 위해 뉴클레오티드 유사체 8-옥소-2'-데옥시구아노신-5'-트리포스페이트 및 2'-데옥시-p-뉴클레오시드-5' 트리포스페이트(둘 다 TriLink Bio)를 사용하여 에러 유발 PCR로 생성했다. 이들을 효모 디스플레이 포맷으로 형질전환시켰다. 도메인-수준 맵핑에 대해 상기한 기술을 사용하여, 라이브러리는 HA, 및 50nM에서의 항체 결합를 위해 염색했다. FACS Aria(BD)를 사용하여, 야생형 DLL3 ECD와 비교하여 결합 상실을 나타낸 클론을 분류했다. 이들 클론을 재-성장시키고, 표적 항체에 대한 결합 상실을 위해 다른 라운드의 FACS 분류를 행하였다. 지모프렙(Zymoprep) 효모 플라스미드 미니프렙(Miniprep) 키트(Zymo Research)를 사용하여, 개개 ECD 클론을 단리하고, 서열분석했다. 필요한 경우, 돌연변이는 Quikchange 부위 지시된 돌연변이유발 키트(Agilent)를 사용하여 단일-돌연변이체 ECD 클론으로서 재-포맷시켰다.
이어서, 개개 ECD 클론을 스크리닝하여, 결합 상실이 에피토프에서의 돌연변이 또는 미스폴딩을 야기한 돌연변이에 기인한 것인지를 측정했다. 시스테인, 프롤린 및 정지 코돈을 수반한 돌연변이는 미스폴딩 돌연변이의 높은 가능성에 기인하여 자동적으로 폐기시켰다. 이어서, 잔류하는 ECD 클론은 비-경쟁, 입체배좌상 특이적 항체에 대한 결합에 대해 스크리닝했다. 비-경쟁, 입체배좌상 특이적 항체에 대한 결합을 상실한 ECD 클론은, 미스폴딩 돌연변이를 함유하는 것으로 결론지었고, 반면, 야생형 DLL3 ECD에 대해 동등한 결합을 보유한 ECD 클론은 적절하게 폴딩되는 것으로 결론지었다. 후자 그룹에서 ECD 클론의 돌연변이는 에피토프 내에 존재하는 것으로 결론지었다. 결과는 바로 아래의 표 5에 수록되어 있다.
Figure pct00103
보다 구체적으로, 항체 결합에 관여하는 아미노산 잔기를 포함하는 이들의 유도된 에피토프와 함께 선택된 항체의 요약은 표 5에 수록되어 있다. 이와 관련하여, 항체 SC16.34 및 SC16.56은, 도 4에 제시된 비닝 정보 및 도메인 맵핑 결과와 일치하는 통상의 아미노산 잔기와 명백하게 상호작용한다. 또한, SC16.23은 개별 연속 에피토프와 상호작용하는 것으로 밝혀졌고, SC16.34 또는 SC16.56과 빈하지 않는 것으로 밝혀졌다.
실시예 7
DLL3 항체 약물 접합체의 제조
본 발명의 다양성을 추가로 입증하기 위해, 실질적으로 ADC 1-5에 제시된 바와 같은 항-DLL3 항체 약물 접합체는 DL1-DL5의 화합물을 본원에 개시된 것들과 같은 DLL3 항체에 접합시킴으로써 제조한다. 이와 관련하여, DL4에 대해 선택된 링커 때문에, 2개의 약간 상이한 접합 공정을 사용하여 개시된 접합체를 제공했음을 이해할 것이다. 보다 구체적으로, ADC 1-3 및 5는 바람직하게는 하기 제1 접합 공정을 사용하여 제조하고, ADC 4는 바람직하게는 하기 제2 공정을 사용하여 제조한다.
(a) 말레이미도 접합
보다 구체적으로, 개시된 항체에 공유 부착된 DL1-DL3 및 DL5에 제시된 링커 및 피롤로벤조디아제핀(PBD) 이량체를 포함하는 DLL3 항체 약물 접합체를 제조한다[참조: 일반적으로 미국 특허 제2011/0256157호 및 제2012/0078028호 및 미국 특허 제6,214,345호, 각각은 이의 전문이 본원에서 참조로서 도입된다].
DL1-DL3 및 DL5의 약물-링커 조합물을 합성하고, 실질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 당해 기술분야에 인식된 기술을 사용하여 정제한다. 제조 후, 말단 말레이미도 잔기를 포함하는 약물-링커 단위를 선택된 DLL3 항체 상의 유리 설프하이드릴에 접합시킨다. 이와 관련하여, DLL3 접합체는, 선택된 DLL3 항체를 트리스(2-카복시에틸)-포스핀(TCEP)로 부분 환원시킨 다음, 환원된 Cys 잔기를 말레이미도-링커 페이로드와 반응시켜 제조한다.
보다 구체적으로, 선택된 DLL3 항체 조절인자는 200mM 트리스(pH 7.5) 및 32mM EDTA 완충액에서 90분 동안 20℃에서 mAb mol당 1.3mol 트리스(2-카복시에틸)-포스핀(TCEP)으로 환원시킨다. 반응물을 15℃로 냉각시키고, DMA에 용해시킨 링커 페이로드를 3.2mol/mol mAb의 비율로 첨가한 다음, 6%(v/v)의 최종 농도로 추가량의 DMA를 첨가한다. 반응을 30분 동안 진행시켰다. 미반응 약물-링커는 등몰 과량의 N-아세틸 시스테인의 첨가에 의해 포획한다. 이어서, 실질적으로 ADC 1-3 및 5에 제시된 바와 같은 접합체는, 응집된 고분자량 항체, 조용매 및 소분자를 제거하기 위해 AKTA 익스플로러 FPLC 시스템(G.E. Healthcare)을 사용하여 이온 교환 컬럼에 의해 정제한다. 이어서, 용출된 접합체는, 제형화 완충액 내로 접선 유동 여과(TFF), 이어서, 농도 조정 및 세정제의 첨가에 의해 완충액-교환한다. 최종 접합체는 단백질 농도(UV를 측정함으로써), 응집(SEC), 역상(RP) HPLC에 의한 약물 대 항체 비율(DAR), 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) HPLC에 의한 미접합된 항체의 존재, RP HPLC에 의한 비-단백질성 물질, 및 DLL3 발현 세포주를 사용한 시험관내 세포독성에 대해 분석한다.
(b) 요오도아세트아미드 접합
ADC 4는 실질적으로 다음과 같이 제조한다. DL4를 합성하고, 실시예 1에 제시된 바와 같이 제공한다. 제조 후, 말단 요오도아세트아미드 잔기를 포함하는 사이토톡신-링커 단위를 선택된 DLL3 항체 상의 유리 설프하이드릴과 접합시킨다. 이와 관련하여, DLL3 접합체는, 선택된 DLL3 항체를 트리스(2-카복시에틸)-포스핀(TCEP)으로 부분 환원시킨 다음, 환원된 Cys 잔기를 요오도아세트아미드-링커 페이로드와 반응시켜 제조한다.
보다 구체적으로, 선택된 DLL3 항체 조절인자는 PBS(pH 7.2) 및 5mM EDTA 완충액 중에서 90분 동안 20℃에서 mAb mol당 1.8mol TCEP로 환원시킨다. 이어서, 환원된 항체 용액은 100mM 붕산나트륨으로 pH 8.5로 조정하고, DMSO 중의 링커 페이로드를 적어도 5mol/mAb mol의 비율로 첨가한 다음, 추가량의 DMSO를 첨가하여 6%(v/v)의 최종 농도로 되게 한다. 이어서, 반응을 20℃에서 밤새 진행시킨다. 이어서, 접합체는 투석여과 완충액 내로 접선 유동 여과(TFF), 이어서, 농도 조정 및 세정제의 첨가에 의해 완충액-교환한다. 이어서, 최종 접합체는, 단백질 농도(UV를 측정함으로써), 응집(SEC), 역상(RP) HPLC에 의한 약물 대 항체 비율(DAR), 및 DLL3 발현 세포주를 사용한 시험관내 세포독성에 대해 분석한다.
상술한 절차 또는 당해 기술분야에 공지된 실질적으로 유사한 방법을 사용하여, 다양한 DLL3 항체 조절인자 및 DL 잔기의 조합물을 포함하는 다수의 접합체를 생성하고, 본원에 기재된 바와 같이 특성확인한다. 이와 관련하여, 도 6은 특이적 항체(예: SC16.3)를 선택된 약물-링커(예: DL1)와 접합시켜 상응하는 ADC(즉, SC16.3-DL1 또는 SC16.3-ADC1)를 제공함으로써 본원 개시에 따라 생성할 수 있다. 당업자는, 인간화된(예: hSC16.34-DL4)로서 동정된 것들을 제외한, 도 6의 예시적 작제물에서 각각의 항체 명칭이 임의의 유형의 항체(동정된 뮤린 클론의 키메라, 인간화된, 인간, IgG1, IgG3 등의 버젼) 또는 이의 면역반응성 단편을 나타낼 수 있음을 이해할 것이다. 더욱이, 예시적 ADC 1, ADC 2, ADC 3 및 ADC 5 화합물은 실시예 7(a)에 제시된 프로토콜을 사용하여 접합되고, 예시적 ADC 4 화합물은 실시예 7(b)에 제시된 프로토콜을 사용하여 접합되는 것을 이해할 것이다. 선택된 양상에서 본 발명은 도 6에 제시된 접합체를 포함하는 것을 이해할 것이다.
실시예 8
DLL3 항체 약물 접합체를 사용한 종양 세포 사멸의 시험관내 검정
본 발명의 DLL3 ADC가, 살아있는 세포에 대한 세포독성제의 전달을 매개할 수 있는 것을 입증하기 위해, 상기 실시예에 따라 제조된 선택된 DLL3 접합체를 사용하여 시험관내 세포 사멸 검정을 수행한다.
몇몇 PBD 페이로드(즉, PBD 1-PBD 5) 중 하나를 갖는 DLL3-표적화된 ADC는 시험관 내에서 평가하고, 이는 나노몰 친화성으로, 인간 DLL3을 과발현하도록 조작된 인간 293 세포 상의 DLL3에 특이적으로 결합하지만, 미반응(naive) 모 293 세포 상에서 DLL3에 특이적으로 결합하지 않는다. 시험관내에서 선택된 ADC 1-5의 세포독성 가능성을 탐구하기 위해, 인간 DLL3을 과발현하는 293 세포를 사멸시키는 이들의 능력을 평가한다. 구체적으로, DLL3을 발현하도록 조작된 모 293T 세포 또는 293T 세포는 제조업자의 지시에 따라 세포 역가 글로(Cell Titer Glo®)(Promega)를 사용한 세포 생존력을 평가하기 전에 48 내지 72시간 동안 선택된 ADC 1-5의 희석물과 함께 배양한다. 0.1 내지 100pM의 IC50으로 DLL3을 과발현하는 293 세포를 사멸시키지만 천연 모 293 세포를 사멸시키는 능력이 없거나 거의 없는 것을 입증하는 ADC는 전임상 후보물질로서 선택된다.
293 세포독성 검정에 기초하여, 접합체는 종양 세포를 사용한 추가 실험을 위해 선택한다. 초기에, 2,500 세포/웰의 인간 KDY66, 즉, 내인성 DLL3을 발현하는 신장 NET NTX는 단일 세포 현탁액에 해리시키고, 당해 기술분야에 공지된 바와 같이 성장 인자 보충된 혈청 비함유 배지에서 BD 프리마리아TM 플레이트(BD Biosciences) 상에 플레이팅한다. 24시간 후, 다양한 농도(0.1 내지 100pM)의 정제된 DLL3 항체 접합체, 예를 들면, SC16.26-DL1, SC16.81-DL2, SC16.118-DL4 및 SC16.67-DL5를, 적절한 대조군(예: 비-결합 IgG1-DL 접합체)과 함께, 배양물에 첨가한다. 7일의 기간 후, 플레이트는 세포 생존능에 대한 DLL3 항체 접합체의 영향을 측정하기 위해 검사한다. 종양 세포를 내재화하고 사멸시키는 항체 약물 접합체의 능력은, 제조업자의 지시에 따라 세포 역가 글로(Cell Titer Glo®)를 사용하여 생존 세포 수를 계수함으로써 측정한다. 아이소타입 항체 접합체 대조군에 노출된 세포를 함유하는 배양물을 사용한 원료 발광 계수는 100% 참조 값으로 설정하고, 모든 기타 계수는 이에 따라 계산한다. 일부 또는 모든 DLL3 접합체는 0.1pM 내지 100pM의 IC50에서 KDY66 종양 세포를 사멸시키고, 아이소타입 접합체 대조군은 극히 높은 IC50 값을 나타내는 것으로 예상된다.
활성 DLL3 항체 접합체는, 활성에 대한 EC50 값을 측정하기 위해 희석 검정으로 시험한다. 바로 위에 기재된 동일한 검정을 사용하여, 선택된 항체 접합체 및 적절한 접합체 대조군을 플레이팅된 난소 종양 세포(예: OV26, 난소 NET NTX 종양)와 함께 배양한다. 모든 접합체 중의 일부는 피코몰 또는 피코몰 이하 범위의 측정된 EC50 값으로 난소 종양 세포의 효율적 사멸을 나타내는 것으로 예상된다. 역으로, 대조군 ADC는 비교적 높은 EC 값을 나타내고, 이는 이들이 효율적으로 내재화되지 않고 접합체 약물이 불활성 상태로 잔류하는 것을 나타낸다.
개시된 발명의 범용성을 추가로 입증하기 위해, 거대 세포 신경내분비 폐 암종(LU37)으로부터 유도되는 종양 세포를 본원의 교시에 따라 선택된 접합체(예: SC16.26-DL1, SC16.81-DL2 및 SC16.67-DL5)에 노출시킨다. 보다 구체적으로, 웰당 2,500 LU37 NTX 세포는 접합된 DLL3 항체 및 접합된 아이소타입 대조군의 첨가 1일 전에 성장 인자 보충된 혈청 비함유 배지에서 플레이팅한다(BD PrimariaTM 플레이트). 플레이팅된 세포는 7일 동안 다양한 농도의 DLL3 접합체 및 대조군 접합체에 노출시킨다. 노출 후, 세포 생존력은, 상기 기재된 세포 역가 글로(Cell Titer Glo®)를 사용하여 생존 세포 수를 계수함으로써 측정한다. DLL3 접합체는 임상적으로 관련 농도에서 종양을 효과적으로 제거할 것으로 예상된다. 예를 들면, DLL3 접합체는 약 100pM 미만의 농도에서 시험관 내에서 LU37 세포의 50%를 사멸시키는 능력을 보유할 것으로 예상되는 반면, 아이소타입 대조군 접합체는 종양 세포의 50%를 사멸시키기 위해 > 1nM의 농도를 필요로 한다.
이러한 결과는, 개시된 접합체가 다양한 신생물성 장애의 치료에 유용하다는 것을 나타낸다.
실시예 9
DLL3 항체 약물 접합체를 사용한 종양 성장 억제의 생체내 검정
상술한 시험관내 결과에 비추어, 생체내에서 인간 종양을 발현하는 DLL3의 성장을 축소하고 억제하는 개시된 DLL3 ADC의 능력을 평가하기 위해 실험을 수행한다. 보다 구체적으로, 뮤린 및 인간화된 조절인자를 포함하는 선택된 DLL3 접합체를 시험하여, 면역결핍 마우스에서 인간 NTX 종양 성장을 억제하는 이들의 능력을 입증한다.
실험을 준비하기 위해, 환자-유도된 NTX 종양(LU37, LU73 및 OV26)은, 당해 기술분야에서 인식된 기술을 사용하여 암컷 NOD/SCDI 수용체 마우스의 옆구리에 피하 성장시킨다. 종양 용적 및 마우스 중량은 1주 2회 모니터링한다. 종양 용적이 150 내지 250mm3에 도달하면, 마우스는 처리 그룹으로 랜덤으로 할당하고, 다양한 용량의 DLL3 접합체, 예를 들면, SC16.21-DL2, SC16.144-DL4, hSC16.34-DL5, hSC16.56-DL1 또는 동일한 DL을 포함하는 아이소타입 대조군(각각 실질적으로 상기 실시예 7에 기재된 바와 같이 생성됨)으로 복강내 주사에 의한 주사를 제공했다. 마우스는 7일에 걸쳐 균일한 간격으로 0.1 내지 1mg/kg으로 ADC의 3개 동일 주사를 제공한다. 처리 후, 종양 용적 및 마우스 중량은 종양이 800mm3을 초과하거나 마우스가 병들 때까지 모니터링한다.
다소간 선택된 DLL3 접합체는 종양 용적을 감소시키거나 종양 성장을 억제시키는 능력을 나타낼 것으로 예상된다. 몇몇 예에서, 종양 성장 억제는 지속, 예를 들면, 3개의 상이한 종양 세포주 각각과 관련하여 30일, 40일, 50일, 60일 또는 그 이상까지 지속한다. 연장된 기간 동안 생체내에서 종양 성장을 지연 또는 억제하는, 인간화된 접합체를 포함하는 다수의 접합된 조절인자의 능력은 증식성 장애의 치료를 위한 치료제로서 개시된 DLL3 접합체의 용도를 추가로 검증할 것이다.
실시예 10
DLL3 항체 약물 접합체를 사용한 암 줄기 세포 빈도의 감소 검정
상기 실시예에 제시된 바와 같이, 개시된 DLL3 접합체는, 종양 성장을 억제하는데 효과적인 것으로 예상된다. 더욱이, 상기 논의된 바와 같이, DLL3 발현은, 약물 내성이고 종양 전이 및 전이에 연료를 공급하는 것으로 일반적으로 공지되어 있는 암 줄기 세포와 연관되어 있다. 따라서, DLL3-ADC를 사용한 치료가 NTX 균주의 재발 가능성을 감소시키는 것을 입증하기 위해, 생체내 제한 희석 검정(LDA)을 수행하여, DLL3 접합체, 예를 들면, hSC16.13-DL2 또는 hSC16.34-DL5에 의한 치료 후에 소세포 폐암 종양에서 암 줄기 세포의 빈도를 측정한다.
환자-유도된 소세포 폐암 이종이식편 종양(LU95) 및 유두상 신장 세포 암종(KDY66)으로부터 환자-유도된 이종이식편을 면역결핍 숙주 마우스에서 피하 성장시킨다. 종양 용적이 평균 150mm3 내지 250mm3인 경우, 마우스를 7마리 마우스의 2개 그룹으로 랜덤으로 분리한다. 복강내 주사를 통해, 마우스는 음성 대조군으로 인간 IgG1-DL2 또는 인간 IgG1-DL5(1mg/kg; 각각 n=7마리 마우스) 또는 DLL3 접합체, 예를 들면, hSC16.13-DL2 또는 hSC16.34-DL5(1mg/kg; 각각 n=7마리 마우스)를 사용하여 0일, 4일 및 7일에 주사한다. 8일에, 각 그룹으로부터 2마리 대표적 마우스(총 4마리)를 안락사시키고, 이들의 종양을 수거하고 단일-세포 현탁액에 분산시킨다. 아이소타입 대조군 접합체로 처리한 종양은 나머지 5마리 마우스에서 계속 성장하는 반면, DLL3 접합체로 처리한 종양의 용적은 나머지 5마리 마우스에서 0 또는 거의 0까지 감소할 것으로 예상된다.
표준 유동 세포측정 기술 및 표지된 항-DLL3 항체를 사용하여, 각각의 4개 처리 그룹으로부터 수거된 종양은 양성 DLL3 발현을 확인하기 위해 평가한다. 이어서, 각각의 개개 처리 그룹으로부터 종양 세포를 풀링하고, 살아있는 인간 세포는 제조업자의 지시 및 당해 기술분야에 인식된 기술에 따라 FACSAria III(Becton Dickinson)을 사용하여 FACS에 의해 단리한다. 요약하면, 세포를 FITC 접합된 항-뮤린 H2Kd 및 항-뮤린 CD45 항체(둘 다 BioLegend, Inc.)로 표지한 다음, 1㎍/ml DAPI에 재현탁시킨다. 이어서, 수득된 현탁액을 표준 조건 하에 DAPI-, mH2Kd- 및 mCD45-로 분류하여 인간 세포는 수집하고 뮤린 세포는 폐기한다.
이어서, 수용자 5마리 마우스의 코호트는 DLL3 접합체로 처리한 종양으로부터 2000, 500, 120 또는 30개의 분류된 살아있는 인간 세포를 이식한다. 비교를 위해, 각각의 아이소타입 접합체 대조군으로 처리한 종양으로부터 1000, 250, 60 또는 15개의 분류된 살아있는 인간 세포를 이식한다. 수용자 마우스 중의 종양은 매주 측정하고, 개개 마우스는 종양이 1500mm3에 도달하기 전에 안락사시킨다. 종양 성장의 개시 후, 연구는, 임의의 추가의 마우스에서 나타나는 새로운 종양 없이 연속하는 4주 후에 종료한다. 이때, 수용자 마우스는 종양 성장에 대해 양성 또는 음성으로 채점하고, 양성 성장은 100mm3를 초과하는 용적을 갖는다. DLL3 접합체로 처리된 LU95 또는 KDY66 세포의 수용자는 DL2 아이소타입 대조군으로 처리된 LU95 또는 KDY66 세포의 수용자와 비교하여 보다 적은 종양을 생성할 것으로 예상된다.
독성 분포 통계학(L-Calc 소프트웨어, Stemcell Technologies)을 사용하여, 이식후 18주에서 종양을 갖거나 갖지 않는 수용자의 주사된 세포 용량을 사용하여 각각의 집단에서 종양-개시 세포의 빈도를 계산한다. LU95 또는 KDY66 샘플에서 10,000개의 살아있는 인간 세포당 TIC의 수는, DLL3 접합체로 처리한 동물에서 현저히 감소, 예를 들면, 적어도 약 10배 감소, 또는 20배 감소 또는 50배 감소 또는 100배 감소할 것으로 예상된다. 암 줄기 세포 빈도에서의 실질적 감소는, 본 발명의 조절인자가 확장, 재발, 전이 또는 재성장 가능성 종양에 의해 암 줄기 세포 집단을 현저히 및 특이적으로 감소시킬 수 있음을 시사할 것이다.
본원에 인용된 모든 특허, 특허출원 및 공보들, 및 전자적으로 사용가능한 자료(예를 들면, GenBank 및 RefSeq에서 뉴클레오티드 서열 제출 및 예를 들면, GenBank 및 RefSeq의 첨부된 암호화 영역들로부터의 SwissProt, PIR, PRF, PBD 및 번역들에서 아미노산 서열 제출을 포함함)는 본원에 참조로 포함된다. 본 발명의 상기 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 및 실시예들은 단지 이해를 돕기 위해 제공될 뿐이다. 이로부터 불필요한 한정은 없는 것으로 이해된다. 본 발명은 개시되고 설명된 정확한 상세에 제한되지 않고, 당업자에게 명백한 변형은 청구범위에 의해 한정된 본 발명 내에 포함될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> STEMCENTRX, INC. SPIROGEN SARL <120> NOVEL ANTIBODY CONJUGATES AND USES THEREOF <130> S69697 1110WO / sc1602.pct <150> US 61/768,368 <151> 2013-02-22 <160> 437 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 618 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Val Ser Pro Arg Met Ser Gly Leu Leu Ser Gln Thr Val Ile Leu 1 5 10 15 Ala Leu Ile Phe Leu Pro Gln Thr Arg Pro Ala Gly Val Phe Glu Leu 20 25 30 Gln Ile His Ser Phe Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly Ala Pro Arg Ser 35 40 45 Pro Cys Ser Ala Arg Leu Pro Cys Arg Leu Phe Phe Arg Val Cys Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Leu Ser Glu Glu Ala Ala Glu Ser Pro Cys Ala Leu Gly 65 70 75 80 Ala Ala Leu Ser Ala Arg Gly Pro Val Tyr Thr Glu Gln Pro Gly Ala 85 90 95 Pro Ala Pro Asp Leu Pro Leu Pro Asp Gly Leu Leu Gln Val Pro Phe 100 105 110 Arg Asp Ala Trp Pro Gly Thr Phe Ser Phe Ile Ile Glu Thr Trp Arg 115 120 125 Glu Glu Leu Gly Asp Gln Ile Gly Gly Pro Ala Trp Ser Leu Leu Ala 130 135 140 Arg Val Ala Gly Arg Arg Arg Leu Ala Ala Gly Gly Pro Trp Ala Arg 145 150 155 160 Asp Ile Gln Arg Ala Gly Ala Trp 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Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 325 <210> 7 <211> 0 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 000 <210> 8 <211> 0 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 000 <210> 9 <211> 0 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 000 <210> 10 <211> 0 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 000 <210> 11 <211> 0 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 000 <210> 12 <211> 0 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 000 <210> 13 <211> 0 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 000 <210> 14 <211> 0 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 000 <210> 15 <211> 0 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 000 <210> 16 <211> 0 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 000 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Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 gct gaa gat gct gcc act tat tac tgc cac cag tat cat cgt tcc cca 288 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 ttc acg ttc ggc gcg ggg aca aag ttg aaa ata aga 324 Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Lys Ile Arg 100 105 <210> 21 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 21 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Phe Phe Thr Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Lys Ile Arg 100 105 <210> 22 <211> 369 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(369) <223> SC16.3 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(369) <400> 22 cag gtt act ctg aaa gag tct ggc cct ggg ata ttg cag ccc tcc cag 48 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 acc ctc agt ctg act tgt tct ttc tct ggg ttt tca ctg agc act tct 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 ggt atg ggt gta ggc tgg att cgt cag cca tca ggg aag ggt ctg gag 144 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 tgg ctg gca cac att tgg tgg gat gat gtc aag cgc tat aac cca gcc 192 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys Arg Tyr Asn Pro Ala 50 55 60 ctg aag agc cga cta act atc tcc aag gat acc tcc agc agc cag gta 240 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Ser Gln Val 65 70 75 80 ttc ctc aag atc gcc agt gtg gac act gca gat act gcc aca tac tac 288 Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 tgt gct cga ata gct gac tat ggc gga gat tac tat gct atg gac tac 336 Cys Ala Arg Ile Ala Asp Tyr Gly Gly Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 100 105 110 tgg ggt caa gga acc tca gtc acc gtc tcc tca 369 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 23 <211> 123 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys Arg Tyr Asn Pro Ala 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Ser Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ile Ala Asp Tyr Gly Gly Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 24 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(321) <223> SC16.4 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 24 gat atc cag atg aca cag act aca tct tcc ctg tct gcc tct ctg gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc atc agt tgc agg gca agt cag gac att agc aat tat 96 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 tta aac tgg tat cag cag aaa cca gat gga act gtt aaa ctc ctg atc 144 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tac tac aca tca aga tta cac tca ggc gtc cca tca agg ttc agt ggc 192 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt ggg tct gga aca gat tat tct ctc acc att agc aac ctg gag cta 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Leu 65 70 75 80 gaa gat att gcc act tac ttt tgc caa cag ggt gat atg ctt ccg tgg 288 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asp Met Leu Pro Trp 85 90 95 acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa 321 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 25 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 25 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Leu 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asp Met Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 26 <211> 351 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(351) <223> SC16.4 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(351) <400> 26 cag atc cag ttg gtg cag tct gga cct gag ctg aag aag cct gga gag 48 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 aca gtc aag atc tcc tgc aag gct tct ggt tat acc ttc aca gac tat 96 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 tca atg cac tgg gtg aag cag gct cca gga aag ggt tta aag tgg atg 144 Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 ggc tgg ata aac act gag act ggt gag cca gga tat gca gat gac ttc 192 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Gly Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 aag gga cgg ttt gcc ttc tct ttg gaa acc tct gcc agc act gcc tat 240 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ttg cag atc aac aac ctc aaa aat gag gac acg gct aca tat ttc tgt 288 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 gct cgg tac gac ggg tat gct atg gac tat tgg ggt caa gga acc tca 336 Ala Arg Tyr Asp Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 gtc acc gtc tcc tca 351 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 27 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 27 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Gly Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Asp Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 28 <211> 318 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(318) <223> SC16.5 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(318) <400> 28 caa att gtt ctc acc cag tct cca gca atc atg tct gca tct cca ggg 48 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 gag aag gtc acc atg acc tgc agt gcc agc tca agt gta agt tac atg 96 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 cac tgg tac cag cag aag tca ggc acc tcc ccc aaa aga tgg att tat 144 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 gac aca tcc aaa ctg gct tct gga gtc cct gct cgc ttc agt ggc agt 192 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 ggg tct ggg acc tct tac tct ctc aca atc agc agc atg gag gct gaa 240 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 gat gct gcc act tat tac tgc cag cag tgg act aga aac ccg ctc acg 288 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Arg Asn Pro Leu Thr 85 90 95 ttc ggg gct gga acc aag ctg gag ctg aaa 318 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 29 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 29 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Arg Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 30 <211> 372 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(372) <223> SC16.5 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(372) <400> 30 cag gtt act ctg aaa gag tct ggc cct ggg ata ttg cag ccc tcc cag 48 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 acc ctc agt ctg act tgt tct ttc tct ggg ttt tca ctg agc act tct 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 ggt atg ggt gta ggc tgg att cgt cag cct tca gga gag ggt cta gag 144 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Glu Gly Leu Glu 35 40 45 tgg ctg gca gac att tgg tgg gat gac aat aag tac tat aac cca tcc 192 Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 ctg aag agc cgg ctc aca atc tcc aag gat acc tcc agc aac cag gta 240 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gln Val 65 70 75 80 ttc ctc aag atc acc agt gtg gac act gca gat act gcc act tac tac 288 Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 tgt gct cga aga gtt aac tat gtt tac gac ccg tac tat gct atg gac 336 Cys Ala Arg Arg Val Asn Tyr Val Tyr Asp Pro Tyr Tyr Ala Met Asp 100 105 110 tac tgg ggt caa gga acc tca gtc acc gtc tcc tca 372 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 31 <211> 124 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 31 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Glu Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Val Asn Tyr Val Tyr Asp Pro Tyr Tyr Ala Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 32 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(336) <223> SC16.7 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <400> 32 aac att atg atg aca cag tcg cca tca tct ctg gct gtg tct gca gga 48 Asn Ile Met Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 gaa aag gtc act atg agc tgt aag tcc agt caa agt gtt tta tac agt 96 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 tca aat cag aag aac tac ttg gcc tgg tac caa cag aaa cca ggg cag 144 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 tct cct aaa ctg ctg atc tac tgg gca tcc act agg gaa tct ggt gtc 192 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 cct gat cgc ttc aca ggc agt gga tct ggg aca gat ttt act ctt acc 240 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 atc agc act gta caa gtt gaa gac ctg gca gtt tat tac tgt cat caa 288 Ile Ser Thr Val Gln Val Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln 85 90 95 tac ctc tcc tcg tgg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa 336 Tyr Leu Ser Ser Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 33 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 33 Asn Ile Met Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Thr Val Gln Val Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln 85 90 95 Tyr Leu Ser Ser Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 34 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(357) <223> SC16.7 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(357) <400> 34 gag gtc cag ctg caa cag tct gga cct gag ctg gtg aag cct ggg gct 48 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag att tcc tgc aag gct tct ggt tac tca ttc act ggc tat 96 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 aaa atg cac tgg gtg aag caa agc cat gta aag agc ctt gag tgg att 144 Lys Met His Trp Val Lys Gln Ser His Val Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga cgt att aat cct tac aat ggt gct act agc tac aac cag aat ttc 192 Gly Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 aag gac aag gcc acc ttg act gta gat aag tcc tcc agc aca gcc tac 240 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gac ctc cac agc ctg aca tct gag gac tct gca gtc tat ttc tgt 288 Met Asp Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 gca aga ggg gac tat agg tac gac tgg ttt gct tac tgg ggc caa ggg 336 Ala Arg Gly Asp Tyr Arg Tyr Asp Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 act ctg gtc act gtc tct gca 357 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 35 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 35 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Lys Met His Trp Val Lys Gln Ser His Val Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Asp Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asp Tyr Arg Tyr Asp Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 36 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(321) <223> SC16.8 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 36 gaa atc cag atg acc cag tct cca tcc tct atg tct gca tct ctg gga 48 Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gac aga ata acc atc act tgc cag gca act caa gac att gtt aag aat 96 Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Gln Ala Thr Gln Asp Ile Val Lys Asn 20 25 30 tta aac tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa ccc cct tca ttc ctg atc 144 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Ser Phe Leu Ile 35 40 45 tat tat gca att gaa ctg gca gaa ggg gtc cca tca agg ttc agt ggc 192 Tyr Tyr Ala Ile Glu Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt ggg tct ggg tca gac tat tct ctg aca atc agc aac ctg gag tct 240 Ser Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Ser 65 70 75 80 gaa gat ttt gca gac tat tac tgt cta cag ttt tat gag ttt ccg ttc 288 Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Phe Tyr Glu Phe Pro Phe 85 90 95 acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg aaa 321 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 37 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 37 Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Gln Ala Thr Gln Asp Ile Val Lys Asn 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Ser Phe Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ile Glu Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Phe Tyr Glu Phe Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 38 <211> 363 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(363) <223> SC16.8 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 38 cag gcc cag ctg cag cag tct gga gct gag ctg gta agg cct ggg act 48 Gln Ala Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15 tca gtg aag gtg tcc tgc aag gct tct gga tac gcc ttc act aat tac 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 ttg ata gag tgg gta aag cag agg cct gga cag ggc ctt gag tgg att 144 Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gtg att aat cct gga act ggt ggt act aac tac aat gag aac ttc 192 Gly Val Ile Asn Pro Gly Thr Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 aag ggc aag gca act ctg act gca gac aaa tcc tcc agt act gcc tac 240 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg cag ctc agc agc ctg aca tct gat gac tct gcg gtc tat ttc tgt 288 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 gca aga tcc ccc tat gat tac cac gag ggt gct atg gac tac tgg ggt 336 Ala Arg Ser Pro Tyr Asp Tyr His Glu Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 caa gga acc tca gtc acc gtc tcc tca 363 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 39 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 39 Gln Ala Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Gly Thr Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Pro Tyr Asp Tyr His Glu Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 40 <211> 324 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(324) <223> SC16.10 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 40 caa att gtt ctc acc cag tct cca gca atc atg tct gca tct cta ggg 48 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gaa cgg gtc acc atg acc tgc act gcc agc tca agt gta agt tcc agt 96 Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 tac ttg cac tgg tac cag cag aag cca gga tca tcc ccc aaa ctc tgg 144 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 att tat agc act tcc aac ctg gct tct gga gtc cca act cgc ttc agt 192 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser 50 55 60 ggc agt ggg tct ggg acc tct tac tct ctc aca atc agc agc atg gag 240 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 gct gaa gat gct gcc act tat tac tgc cac cag tat cat cgt tcc cca 288 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 ttc acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gaa ata aaa 324 Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 41 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 41 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 42 <211> 360 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(360) <223> SC16.10 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <400> 42 cag gtt act ctg aaa gag tct ggc cct ggg ata ttg cag tcc tcc cag 48 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Ser Ser Gln 1 5 10 15 acc ctc agt ctg act tgt tct ttc tct ggg ttt tca ctg agc act tct 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 ggt atg ggt gta ggc tgg att cgt cag cca tca ggg aag ggt ctg gag 144 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 tgg ctg gca cac att tgg tgg gat gat gtc aag cgc tat aac cca gtc 192 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys Arg Tyr Asn Pro Val 50 55 60 ctg aag agc cga ctg act atc tcc aag gat acc tcc agc agc cag gta 240 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Ser Gln Val 65 70 75 80 ttc ctc aag atc gcc agt gtg gac act gca gat act gcc aca tac tat 288 Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 tgt gct cga tta gtt gat gat ctg tac tac ttt gac tac tgg ggc caa 336 Cys Ala Arg Leu Val Asp Asp Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 ggc acc act ctc aca gtc tcc tca 360 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 43 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 43 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Ser Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys Arg Tyr Asn Pro Val 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Ser Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Leu Val Asp Asp Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 44 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(336) <223> SC16.11 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <400> 44 gat gtt gag atg acc cag act cca ctc act ttg tcg gtt acc att gga 48 Asp Val Glu Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 caa cca gcc tcc atc tct tgc aag tca agt cag agc ctc tca gac agt 96 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Ser Asp Ser 20 25 30 gat gga aag aca tat ttg aat tgg atg ttt cag agg cca ggc cgg tct 144 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Met Phe Gln Arg Pro Gly Arg Ser 35 40 45 cca aag cgc cta atc tat ctg gtg tct aaa ctg gac tct gga gtc cct 192 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 gac agg ttc act ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca ctg aaa atc 240 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 agc aga gtg gag gct gag gat ttg gga gtt tac tat tgc tgg caa ggt 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 aaa cat ttt ccg tgg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa 336 Lys His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 45 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 45 Asp Val Glu Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Ser Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Met Phe Gln Arg Pro Gly Arg Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Lys His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 46 <211> 351 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(351) <223> SC16.11 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(351) <400> 46 cag atc cag ttg gtg cag tct gga cct gag ctg aag aag cct gga gag 48 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 aca gtc aag atc tcc tgc aag gct tct ggt tat acc ttc aca gac tat 96 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 tca atg cac tgg gtg aag cag gct cca gga aag ggt tta aag tgg atg 144 Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 ggc tgg ata aac act gag act gtt gag cca aca tat gca gat gac ttc 192 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Val Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 atg gga cgg ttt gcc ttc tct ttg gaa acc tct gcc agc act gcc ttt 240 Met Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 ttg cag atc aac aac ctc gaa aat gag gac acg gct aca tat ttc tgt 288 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Glu Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 gct aga ttt ggt tcc tat gct atg gac tac tgg ggt caa gga acc tca 336 Ala Arg Phe Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 gtc acc gtc tcc tca 351 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 47 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 47 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Val Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Met Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Glu Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 48 <211> 318 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(318) <223> SC16.13 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(318) <400> 48 caa att gtt ctc acc cag tct cca gca ctc gtg tct gca tct cca ggg 48 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Val Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 gag aag gtc acc atg acc tgc agt gcc agc tca agt gta agt tac atg 96 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 tac tgg tac cag cag aaa cca aga tcc tcc ccc aaa ccc tgg att tat 144 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 ctc aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cct gct cgc ttc agt ggc agt 192 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 ggg tct ggg acc tct tac tct ctc aca atc agc agc atg gag gct gaa 240 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 gat gct gcc act tat tac tgc cag cag tgg cgt agt aac cca ttc acg 288 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gaa ata aaa 318 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 49 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 49 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Val Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 50 <211> 372 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(372) <223> SC16.13 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(372) <400> 50 cag gtt act ctg aaa gag tct ggc cct ggg ata ttg cag ccc tcc cag 48 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 acc ctc agt ctg act tgt tct ttc tct ggg ttt tca ctg agc act tct 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 ggt atg ggt gta ggc tgg att cgg cag cca tca ggg aag ggt ctg gag 144 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 tgg ctg gca cac att tgg tgg gat gat gtc aag cgc tat aac cca gcc 192 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys Arg Tyr Asn Pro Ala 50 55 60 ctg aag agc cga ctg act atc tcc aag gat acc tcc agc agc cag gta 240 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Ser Gln Val 65 70 75 80 ttc ctc aag atc gcc agt gtg gac act gca gat act gcc aca tac tac 288 Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 tgt gct cgc ata gtt tcc ttt gat aac gac gtt gtc tct gct atg gac 336 Cys Ala Arg Ile Val Ser Phe Asp Asn Asp Val Val Ser Ala Met Asp 100 105 110 tac tgg ggt caa gga acc tca gtc acc gtc tcc tcn 372 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Xaa 115 120 <210> 51 <211> 124 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (124)..(124) <223> The 'Xaa' at location 124 stands for Ser. <400> 51 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys Arg Tyr Asn Pro Ala 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Ser Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ile Val Ser Phe Asp Asn Asp Val Val Ser Ala Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Xaa 115 120 <210> 52 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(321) <223> SC16.15 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 52 gac atc cag atg act cag tct cca gcc tcc ctg gct gca tct gtg gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gaa act gtc gcc atc aca tgt cga gca agt gag aac att tac tac aat 96 Glu Thr Val Ala Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Tyr Asn 20 25 30 tta gca tgg tat cag cag aaa caa ggg aaa tct cct cag ctc ctg atc 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 tat act gca aac agt ttg gaa gat ggt gtc cca tcg agg ttc agt ggc 192 Tyr Thr Ala Asn Ser Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca cag tat tct ttg aag atc aac agc atg cag cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Met Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat tcc gca act tat ttc tgt aaa cag gct tat gac gtt cct ccg 288 Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Phe Cys Lys Gln Ala Tyr Asp Val Pro Pro 85 90 95 acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa 321 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 53 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 53 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Ala Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Tyr Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Thr Ala Asn Ser Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Met Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Phe Cys Lys Gln Ala Tyr Asp Val Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 54 <211> 351 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(351) <223> SC16.15 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(351) <400> 54 cag gtc cag ctt cag cag tct ggg gct gaa ctg gca aaa cct ggg gcc 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag atg tcc tgt aag gct tct ggc tac acc ttt act cgc tac 96 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 tgg ata cac tgg ata aaa cag agg cct gga cag ggt ctg gaa tgg att 144 Trp Ile His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga tac att aat cct aca act gtt tat act gag ttc aat cag aac ttc 192 Gly Tyr Ile Asn Pro Thr Thr Val Tyr Thr Glu Phe Asn Gln Asn Phe 50 55 60 aag gac aag gcc act ttg act gca gac aaa tcc tcc acc aca gcc tcc 240 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Ser 65 70 75 80 atg caa ctg agc agc ctg aca tct gag gac tct gca gtc tat tac tgt 288 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga ggc ggt agt aac ttc ttt gac tac tgg ggc caa ggc acc act 336 Ala Arg Gly Gly Ser Asn Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 ctc aca gtc tcc tca 351 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 55 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 55 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Trp Ile His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Thr Thr Val Tyr Thr Glu Phe Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Ser 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Ser Asn Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 56 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(321) <223> SC16.18 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 56 gat atc cag atg aca cag act aca tcc tcc ctg tct gcc tct ttg gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc atc agt tgc agg gca agt cag aat att atc aat tat 96 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Ile Asn Tyr 20 25 30 tta aac tgg tat cag cag aag cca gat gga act gtt aaa ctc ctg atc 144 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tac tac aca tca aga tta cac tca gga gtc cca tca agg ttc agt ggc 192 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt ggg tct ggg aca gat tat tct ctc acc atc agc aac ctg gaa cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 gaa gat att gcc act tac tat tgt caa cag tat agt gag cgt ccg tac 288 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Glu Arg Pro Tyr 85 90 95 acg ttc ggg ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa 321 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 57 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 57 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Ile Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Glu Arg Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 58 <211> 351 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(351) <223> SC16.18 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(351) <400> 58 gaa gtg aag ctg gag gag tca gga gga ggc ttg gta caa cct gga gaa 48 Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 tcc atg aaa ctc tct tgt gct gct tct gga ttc act ttt agt gat gcc 96 Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30 tgg atg gac tgg gtc cgc cag tct cca gag aag gga ctt gag tgg gtt 144 Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gct gaa att aga aac aaa gct aat aat cat gca aca tat tat gct gag 192 Ala Glu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60 tct gtg aaa ggg aaa ttc acc atc tca aga gat gat tcc aaa agt aga 240 Ser Val Lys Gly Lys Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Arg 65 70 75 80 gtg tac ctg caa atg aac aac tta aga gct gca gac act ggc att tat 288 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Ala Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 tac tgt acg gcc tat agt aac ttt gct tac tgg ggc caa ggg act ctg 336 Tyr Cys Thr Ala Tyr Ser Asn Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 gtc act gtc tct aca 351 Val Thr Val Ser Thr 115 <210> 59 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 59 Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30 Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Lys Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Arg 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Ala Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Ala Tyr Ser Asn Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Thr 115 <210> 60 <211> 318 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(318) <223> SC16.19 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(318) <400> 60 gac atc cag atg aca cag tct cca tcc tca ctg tct gca tct ctg gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 ggc aaa gtc acc ttc act tgc aag gca agc caa gac att cac aag tat 96 Gly Lys Val Thr Phe Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile His Lys Tyr 20 25 30 gta gct tgg tac caa cac aag cct gga aaa ggt cct agg ctg ctc ata 144 Val Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 cat tac aca tct aca tta cag cca ggc atc tca tca agg ttc agt gga 192 His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Ser Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt ggg tct ggg aga gat tat tcc ttc agc atc agc aac ctg gag cct 240 Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 gaa gat att gca act tat tat tgt cta cag tat aat aat ctg tac acg 288 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asn Asn Leu Tyr Thr 85 90 95 ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa 318 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 61 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 61 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gly Lys Val Thr Phe Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile His Lys Tyr 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Ser Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asn Asn Leu Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 62 <211> 354 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(354) <223> SC16.19 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(354) <400> 62 gag gtt cag ctg cag cag tct ggg gct gag ctt gtg agg cca ggg gcc 48 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtc aag ttg tcc tgc aca gct tct ggc ttc aac att aaa gac agc 96 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser 20 25 30 ctt ttg cac tgg gtg aag cag agg cct gaa aag ggc ctg gag tgg att 144 Leu Leu His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 ggg tgg att gat cct gag gat ggt gaa act aaa tat gcc ccg aac ttc 192 Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Lys Tyr Ala Pro Asn Phe 50 55 60 cag gac aag gcc act ata act aca gac tca tcc tcc aac aca gcc tac 240 Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Thr Asp Ser Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ctg caa ctc atc agc ctg aca tct gtt gac act gcc atc tat tac tgt 288 Leu Gln Leu Ile Ser Leu Thr Ser Val Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcc tat ggt aac tac gtg cgg cac ttt gac tac tgg ggc caa ggc acc 336 Ala Tyr Gly Asn Tyr Val Arg His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 act ctc aca gtc tcc tca 354 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 63 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 63 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser 20 25 30 Leu Leu His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Lys Tyr Ala Pro Asn Phe 50 55 60 Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Thr Asp Ser Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ile Ser Leu Thr Ser Val Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Tyr Gly Asn Tyr Val Arg His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 64 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(321) <223> SC16.20 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 64 gaa atc cag atg acc cag tct cca tcc tct atg tct gca tct ctg gga 48 Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gac aga ata acc atc act tgc cag gca act caa gac att gtt aag aat 96 Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Gln Ala Thr Gln Asp Ile Val Lys Asn 20 25 30 tta aac tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa ccc cct tca ttc ctg atc 144 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Ser Phe Leu Ile 35 40 45 tat tat gca act gaa ctg gca gaa ggg gtc cca tca agg ttc agt ggc 192 Tyr Tyr Ala Thr Glu Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt ggg tct ggg tca gac tat tct ctg aca atc agg aac ctg gag tct 240 Ser Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Arg Asn Leu Glu Ser 65 70 75 80 gaa gac ttt gca gac cat tac tgt cta cag ttt tat gag ttt ccg ttc 288 Glu Asp Phe Ala Asp His Tyr Cys Leu Gln Phe Tyr Glu Phe Pro Phe 85 90 95 acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg aaa 321 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 65 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 65 Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Gln Ala Thr Gln Asp Ile Val Lys Asn 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Ser Phe Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Thr Glu Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Arg Asn Leu Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Asp His Tyr Cys Leu Gln Phe Tyr Glu Phe Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 66 <211> 363 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(363) <223> SC16.20 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 66 cag gtc cag ttg cag cag tct gga act gag ctg gta agg cct ggg act 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15 tca gtg agg gtg tcc tgc aag gct tct gga tac gcc ttc ggt aat cac 96 Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Gly Asn His 20 25 30 ttg att gag tgg gtg aag cag agg cct gga cag ggc ctt gag tgg att 144 Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gtg att aat cct gga act ggt ggt act cac tac aat gag aag ttc 192 Gly Val Ile Asn Pro Gly Thr Gly Gly Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 aag gac aag gca aga ctg acc gca gac aaa tcc tcc aac act gcc tac 240 Lys Asp Lys Ala Arg Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg cac ctc aac agc ctg aca tct gat gac tct gcg gtc tat ttc tgt 288 Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 gca aga tcc ccc tat gat tac cac gag ggt gct atg gac tac tgg ggt 336 Ala Arg Ser Pro Tyr Asp Tyr His Glu Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 caa gga acc tca gtc acc gtc tcc tca 363 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 67 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 67 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Gly Asn His 20 25 30 Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Gly Thr Gly Gly Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Arg Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Pro Tyr Asp Tyr His Glu Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 68 <211> 339 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(339) <223> SC16.21 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(339) <400> 68 gac att gtg atg aca cag tct cca tcc tcc ctg gct atg tca gta gga 48 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly 1 5 10 15 cag aag gtc act atg agc tgc aag tcc agt cag agc ctt tta aat agt 96 Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 agc aat caa aag aat tat ttg gcc tgg tat cag cag gaa cca gga cag 144 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Glu Pro Gly Gln 35 40 45 tct cct aaa ctt ctg gta tcc ttt gca tcc act agg gaa tct ggg gtc 192 Ser Pro Lys Leu Leu Val Ser Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 cct gat cgc ttc aca ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctt acc 240 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 atc agc ggt gtg cag gct gaa gac ctg gca gtt tat tac tgt cag caa 288 Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 cat tat agc att ccg ctc acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg 336 His Tyr Ser Ile Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 aaa 339 Lys <210> 69 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 69 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly 1 5 10 15 Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Glu Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Val Ser Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 His Tyr Ser Ile Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys <210> 70 <211> 372 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(372) <223> SC16.21 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(372) <400> 70 cag gtt cag cta caa cag tct gga cct gag ctg gtg aag cct ggg gcc 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag att tcc tgc aag gct tct ggc tat gca ttc agt agc tcc 96 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Ser 20 25 30 tgg atg aac tgg gtg aag cag agg cct gga aag ggt ctt gag tgg att 144 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga cgg att tat cct gga gat gga gat act aac tac aat ggg aag ttc 192 Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 aag ggc aag gcc aca ctg act gca gac aaa tcc tcc agc aca gcc tac 240 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg caa ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gcg gtc tac ttc tgt 288 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 gca atg ggt att tat aac tac gat ggt agc cgt tac tat tct atg gac 336 Ala Met Gly Ile Tyr Asn Tyr Asp Gly Ser Arg Tyr Tyr Ser Met Asp 100 105 110 tac tgg ggt caa gga acc tca gtc acc gtc tcc tca 372 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 71 <211> 124 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 71 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Met Gly Ile Tyr Asn Tyr Asp Gly Ser Arg Tyr Tyr Ser Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 72 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(321) <223> SC16.22 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 72 gat atc cag atg aca cag act aca tcc tcc ctg tct gcc tct ctg gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc atc agt tgc agg gca agt cag gac att aag aat tat 96 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Lys Asn Tyr 20 25 30 tta aac tgg tat cag cag aaa cca gat gga act gtt aaa ccc ctg atc 144 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Pro Leu Ile 35 40 45 tac tac aca tca aga gta cac tca gga gtc cca tca agg ttc agt ggc 192 Tyr Tyr Thr Ser Arg Val His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt ggg tct gga aca gat tat tct ctc acc att agc aac ctg gag caa 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 gaa gat att gcc act tac ttt tgc cag cag ggt tat acg ctt cca ttc 288 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Phe 85 90 95 acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gaa ath aar 321 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 73 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 73 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Lys Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Pro Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Val His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 74 <211> 360 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(360) <223> SC16.22 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <400> 74 cag gtc cag ctg cag cag cct ggg gct gaa ctg gtg aag cct ggg gct 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag ctg tcc tgt aag gct tct gga tac acc ttc act acc tac 96 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 tgg atg cac tgg gtg aag cag agg cct gga caa ggc ctt gag tgg atc 144 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gag att gat cct tct gat agt tat act tac tac aat caa aag ttc 192 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aag ggc aag gcc aca ttg act gta gac aaa tcc tcc agc aca gcc tac 240 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg caa ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gcg gtc tat tat tgt 288 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga ggg gac tat ggt aac ccc tat gct atg gac tac tgg ggt caa 336 Ala Arg Gly Asp Tyr Gly Asn Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 gga tcc tca gtc acc gtc tcc tca 360 Gly Ser Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 75 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 75 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asp Tyr Gly Asn Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Ser Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 76 <211> 324 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(324) <223> SC16.23 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 76 caa att gtt ctc acc cag tct cca gca atc atg tct gca tct cct ggg 48 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 gag aag gtc acc ttg acc tgc agt gcc agc tca agt gta agt tcc agg 96 Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Arg 20 25 30 tac ttg tac tgg tac cag cag aag cca gga tcc tcc ccc aaa ctc tgg 144 Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 att tat agc aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cct gct cgc ttc agt 192 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 ggc agt ggg tct ggg acc tct tac tct ctc ata atc agc agc atg gag 240 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Ile Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 gct gaa gat gct gcc tct tat ttc tgc cat cag tgg agt aat tac cca 288 Ala Glu Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Asn Tyr Pro 85 90 95 ctc acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg aaa 324 Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 77 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 77 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Arg 20 25 30 Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Ile Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Asn Tyr Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 78 <211> 372 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(372) <223> SC16.23 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(372) <400> 78 cag gtt act ctg aaa gag tct ggc cct ggg ata ttg cag ccc tcc cag 48 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 acc ctc agt ctg act tgt tct ttc tct ggg ttt tca ctg agc act tct 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 aat acg ggc ata ggc tgg att cgt cag cct tca ggg acg ggt ctg gag 144 Asn Thr Gly Ile Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Thr Gly Leu Glu 35 40 45 tgg ctg gca cac att tgg tgg aat gat gat aag tac tat aat cca tcc 192 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asn Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 ctg aag agc cgg ctc aca atc tcc aag gaa acc tcc aac aac cag gta 240 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Glu Thr Ser Asn Asn Gln Val 65 70 75 80 ttc ctc aag atc acc aat gtg gac act gca gat act gcc tca tac ttc 288 Phe Leu Lys Ile Thr Asn Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Ser Tyr Phe 85 90 95 tgt gtt caa atc ggg cgc gac tac agt aac tac gcc tgg tat ttc gat 336 Cys Val Gln Ile Gly Arg Asp Tyr Ser Asn Tyr Ala Trp Tyr Phe Asp 100 105 110 gtc tgg ggc gca ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 372 Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 79 <211> 124 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 79 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Asn Thr Gly Ile Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Thr Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asn Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Glu Thr Ser Asn Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Thr Asn Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Ser Tyr Phe 85 90 95 Cys Val Gln Ile Gly Arg Asp Tyr Ser Asn Tyr Ala Trp Tyr Phe Asp 100 105 110 Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 80 <211> 318 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(318) <223> SC16.25 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(318) <400> 80 caa att gtt ctc acc cag tct cca gca atc atg tct gca tct cca ggg 48 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 gag aag gtc acc atg acc tgc agt gcc agc tca agt gta agt tac atg 96 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 cac tgg tac cag cag aag tca ggc acc tcc ccc aaa aga tgg att tat 144 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 gac tca tcc aaa ctg gct tct gga gtc cct gct cgc ttc agt ggc agt 192 Asp Ser Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 ggg tct ggg acc tct tac tct ctc aca atc agc agc atg gag gct gaa 240 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 gat gct gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt agt aac ccg ctc acg 288 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg aaa 318 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 81 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 81 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Ser Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 82 <211> 372 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(372) <223> SC16.25 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(372) <400> 82 cag gtt act ctg aaa gag tct ggc cct ggg ata ttg cag ccc tcc cag 48 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 acc ctc agt ctg act tgt tct ttc tct ggg ttt tca ctg agc act tct 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 ggt atg ggt gta ggc tgg att cgt cag cct tca gga gag ggt cta gag 144 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Glu Gly Leu Glu 35 40 45 tgg ctg aca gac att tgg tgg gat gac aat aag tac tat aac cca tcc 192 Trp Leu Thr Asp Ile Trp Trp Asp Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 ctg aag agc cgg ctc aca atc tcc aag gat acc tcc agc aac cag gta 240 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gln Val 65 70 75 80 ttc ctc aat atc acc agt gtg gac act gca gat act gcc act tac tac 288 Phe Leu Asn Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 tgt gct cga aga gtt aac tat tat tac gac ccg tac tat gct atg gac 336 Cys Ala Arg Arg Val Asn Tyr Tyr Tyr Asp Pro Tyr Tyr Ala Met Asp 100 105 110 tac tgg ggt caa gga acc tca gtc acc gtc tcc tca 372 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 83 <211> 124 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 83 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Glu Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Thr Asp Ile Trp Trp Asp Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Asn Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Val Asn Tyr Tyr Tyr Asp Pro Tyr Tyr Ala Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 84 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(336) <223> SC16.26 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <400> 84 gat gtt gag atg acc cag act cca ctc act ttg tcg gtt acc att gga 48 Asp Val Glu Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 caa cca gcc tcc atc tct tgc aag tca agt cag agc ctc tca gac agt 96 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Ser Asp Ser 20 25 30 gat gga aag aca tat ttg aat tgg atg ttt cag agg cca ggc cgg tct 144 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Met Phe Gln Arg Pro Gly Arg Ser 35 40 45 cca aag cgc cta atc tat ctg gtg tct aaa ctg gac tct gga gtc cct 192 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 gac agg ttc act ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca ctg aaa atc 240 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 agc aga gtg gag gct gag gat ttg gga gtt tac tat tgc tgg caa ggt 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 aaa cat ttt ccg tgg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa 336 Lys His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 85 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 85 Asp Val Glu Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Ser Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Met Phe Gln Arg Pro Gly Arg Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Lys His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 86 <211> 351 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(351) <223> SC16.26 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(351) <400> 86 cag atc cag ttg gtg cag tct gga cct gag ctg aag aag cct gga gag 48 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 aca gtc aag atc tcc tgc aag gct tct ggt tat tcc ttc aca gac tat 96 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 tca atg cac tgg gtg aag cag gct cca gga aag ggt tta aag tgg atg 144 Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 ggc tgg ata aac act gag act gtt gag cca aca tat gca gat gac ttc 192 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Val Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 atg gga cgg ttt gcc ttc tct ttg gaa acc tct gcc agc act gcc ttt 240 Met Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 ttg cag atc aac aac ctc gaa aat gag gac acg gct aca tat ttc tgt 288 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Glu Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 gct aga ttt ggt tcc tat gct atg gac tac tgg ggt caa gga acc tca 336 Ala Arg Phe Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 gtn acv gtn tcn tcn 351 Val Xaa Val Xaa Xaa 115 <210> 87 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (114)..(114) <223> The 'Xaa' at location 114 stands for Thr. <220> <221> misc_feature <222> (116)..(116) <223> The 'Xaa' at location 116 stands for Ser. <220> <221> misc_feature <222> (117)..(117) <223> The 'Xaa' at location 117 stands for Ser. <400> 87 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Val Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Met Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Glu Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Xaa Val Xaa Xaa 115 <210> 88 <211> 318 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(318) <223> SC16.29 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(318) <400> 88 caa att gtt ctc acc cag tct cca gca atc atg tct gca tct cca ggg 48 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 gag aag gtc acc ata acc tgc agt gcc agc tca agt gta agt tac atg 96 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 cac tgg ttc cag cag aag cca ggc act tct ccc aaa ctc tgg att tat 144 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45 acc aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cct gct cgc ttc agt ggc agt 192 Thr Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 gga tct ggg acc tct tac tct ctc aca gtc agc cga atg gag gct gaa 240 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Val Ser Arg Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 gat gct gcc act tat tac tgc cag caa agg agt ctt tat ccg tac acg 288 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Leu Tyr Pro Tyr Thr 85 90 95 ttc gga ggg ggg acc aag gtg gaa ata aaa 318 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 89 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 89 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45 Thr Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Val Ser Arg Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Leu Tyr Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 90 <211> 363 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(363) <223> SC16.29 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 90 cag gtt cag cta cag cag tct gga gct gag ctg gcg agg ccc ggg gct 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag ctg tcc tgc aag gct tca ggc tac acc ttc act gac cag 96 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Gln 20 25 30 tat ata aac tgg gtg aag cag agg act gga cag ggc ctt gag tgg att 144 Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gag att tat ccc gga agg ggt aat act tac tac aat gag aag ttc 192 Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 aag ggc aag gcc aca ctg act gca gac aaa tcc tcc agc aca gcc tac 240 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg caa ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gca gtc tat ttc tgt 288 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 gca aga gag gat ggt ggt tac gac gat gcc tgg ttt gct tac tgg ggc 336 Ala Arg Glu Asp Gly Gly Tyr Asp Asp Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 caa ggg act ctg gtc act gtc tct gca 363 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 91 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 91 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Gln 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Asp Gly Gly Tyr Asp Asp Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 92 <211> 324 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(324) <223> SC16.30 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 92 caa att gtt ctg acc cag tct cca aca atc atg tct gca tct cta ggg 48 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gaa cgg gtc acc atg acc tgc act gcc agc tca agt gta act tcc agt 96 Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Thr Ser Ser 20 25 30 tac ttg cac tgg tac cag cag aag cca gga tcc tcc ccc aaa ctc tgg 144 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 att tat agc aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cca gct cgc ttc agt 192 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 ggc agt ggg tct ggg acc tct tac tct ctc aca atc agc agc atg gag 240 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 gct gaa gat gct gcc act tat tac tgc cac cag ttt cat cgt tcc cca 288 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Phe His Arg Ser Pro 85 90 95 ttc acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gaa ata aaa 324 Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 93 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 93 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Thr Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Phe His Arg Ser Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 94 <211> 360 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(360) <223> SC16.30 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <400> 94 cag gtt act ctg aaa gag tct ggc cct ggg ata ttg cag ccc tcc cag 48 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 acc ctc agt ctg act tgt tct ttc tct ggg ttt tca ctg agc act tct 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 ggt atg ggt gta ggc tgg att cgt cag cca tca ggg aag ggt ctg gag 144 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 tgg ctg gca cac att tgg tgg gat gat gtc aag cgc tat aaa cca gcc 192 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys Arg Tyr Lys Pro Ala 50 55 60 ctg aag agc cga ctg act gtc tcc aag gat acc tcc agc aac cag gtt 240 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Val Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gln Val 65 70 75 80 ttc ctc aag atc gcc act gtg gac gct gca gat act ggc aca tac tac 288 Phe Leu Lys Ile Ala Thr Val Asp Ala Ala Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr 85 90 95 tgt gct cga atc gtt gat ggt cac ccc ccg ttt gct tac tgg ggc caa 336 Cys Ala Arg Ile Val Asp Gly His Pro Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 ggg act ctg gtc act gtc tct gca 360 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 95 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 95 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys Arg Tyr Lys Pro Ala 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Val Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Ala Thr Val Asp Ala Ala Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ile Val Asp Gly His Pro Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 96 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(336) <223> SC16.30 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <400> 96 gac att gtg ctg acc cag tct cca ctc tct ctg cct gtc aat att gga 48 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Asn Ile Gly 1 5 10 15 gat caa gcc tct atc tct tgc aag tct act aag agt ctt ctg aat agt 96 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Thr Lys Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 gat gga ttc act tat ttg gac tgg tat ttg cag agg cca ggc cag tct 144 Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 cca caa ttc cta ata tat ttg gtt tct aat cga ttt tct gga gtt cca 192 Pro Gln Phe Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 gac agg ttc agt ggc agt ggg tca gga aca gat ttc aca ctc aag atc 240 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 agc aga gtg gag gct gag gat ttg gga gta tat tat tgc ttc cag agt 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser 85 90 95 aac tat ctt ccg ctc acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg aga 336 Asn Tyr Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg 100 105 110 <210> 97 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 97 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Asn Ile Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Thr Lys Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Phe Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser 85 90 95 Asn Tyr Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg 100 105 110 <210> 98 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(357) <223> SC16.31 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(357) <400> 98 gag gtc caa ctg cag cag tct gga cct gag ctg gtg aag cct ggg gct 48 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag ata tcc tgc aag gct tct ggt tac tca ttc agt cgt ttc 96 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Arg Phe 20 25 30 tat atg cac tgg gtg aag caa agt cct gaa aat agt ctt gag tgg att 144 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Glu Asn Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gag att aat cct agc act ggg ggt aca agc tac aac cag aag ttc 192 Gly Glu Ile Asn Pro Ser Thr Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aag ggc aag gcc aca tta act gta gat aaa tcc tcc agc aca gcc tac 240 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg cag ctc aag agc ctg aca tct gaa gag tct gca gtc tat tac tgt 288 Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Glu Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 act agg ggt tac ggg agc aac tgg tac ttc gat gtc tgg ggc gca ggg 336 Thr Arg Gly Tyr Gly Ser Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly 100 105 110 acc acg gtc acc gtc tcc aca 357 Thr Thr Val Thr Val Ser Thr 115 <210> 99 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 99 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Arg Phe 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Glu Asn Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Ser Thr Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Glu Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Tyr Gly Ser Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Thr 115 <210> 100 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(321) <223> SC16.34 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 100 agt att gtg atg acc cag act ccc aaa ttc ctg ctt gta tca gca gga 48 Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 gac agg gtt acc ata acc tgc aag gcc agt cag agt gtg agt aat gat 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 gta gct tgg tac caa cag aag cca ggg cag tct cct aaa ctg ctg ata 144 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tac tat gca tcc aat cgc tac agt gga gtc cct gat cgc ttc act ggc 192 Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 agt gga tat ggg acg gat ttc act ttc acc atc agc act gtg cag gct 240 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala 65 70 75 80 gaa gac ctg gca gtt tat ttc tgt cag cag gat tat agc tct ccg tgg 288 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Trp 85 90 95 acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa 321 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 101 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 101 Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 102 <211> 354 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(354) <223> SC16.34 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(354) <400> 102 cag atc cag ttg gtg cag tct gga cct gag ctg aag agg cct gga gag 48 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Arg Pro Gly Glu 1 5 10 15 aca gtc aag atc tcc tgc aag gct tct gga tat acc ttc aca aac tat 96 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 gga atg aac tgg gtg aag cag gct cca gga aag ggt tta aag tgg atg 144 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 ggc tgg ata aac acg tac act gga gac cca aca tat gct gat gac ttc 192 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Asp Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 aag gga cgg ttt gcc ttc tct ttg gaa acc tct gcc agc act gcc tat 240 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ttg cag atc aac aac ctc aaa aat gag gac acg gct aca tat ttc tgt 288 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 gca aga att ggc ggt aat agt ccc tct gat tac tgg ggc caa ggc acc 336 Ala Arg Ile Gly Gly Asn Ser Pro Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 tct ctc aca gtc tcc tca 354 Ser Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 103 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 103 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Arg Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Asp Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Gly Gly Asn Ser Pro Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 104 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(321) <223> SC16.35 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 104 gat atc cag atg aca cag act aca tcc tcc ctg tct gcc tct ctg gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc atc agt tgc agg gca agt cag gac att agc aat tat 96 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 tta aac tgg tat cag cag aaa cca gat gga act gtt aaa ctc ctg atc 144 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tac tac aca tca aga tta cac tca gga gtc cca tca agg ttc agt ggc 192 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt ggg tct gga aca gat tat tct ctc acc att agc aac ctg gag caa 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 gaa gat att gcc act tac ttt tgc caa cag ggt aat acg ctt ccg tac 288 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa 321 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 105 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 105 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 106 <211> 360 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(360) <223> SC16.35 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <400> 106 gat gtg cag ctt cag gag tcg gga cct ggc ctg gtg aaa cct tct cag 48 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 tct ctg tcc ctc acc tgc act gtc act ggc tac tca atc acc agt gat 96 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 tat gcc tgg aac tgg atc cgg cag ttt cca gga aac aaa ctg gag tgg 144 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 atg ggc tac ata agc tac agt ggt agc act agc tac aac cca tct ctc 192 Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 aaa agt cga atc tct atc act cga gac aca tcc aag aac cag ttc ttc 240 Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 ctg cag ttg aat tct gtg act act gag gac aca gcc aca tat tac tgt 288 Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga ttt tac tac ggt agt agc tat gct atg gac tac tgg ggt caa 336 Ala Arg Phe Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 gga acc tca gtc acc gtc tcc tca 360 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 107 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 107 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 108 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(321) <223> SC16.36 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 108 gaa aca act gtg acc cag tct cca gca tcc ctg tcc gtg act aca gga 48 Glu Thr Thr Val Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 gaa aaa gtc act atc aga tgc ata acc acc cct gat att gat gat gat 96 Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Ile Thr Thr Pro Asp Ile Asp Asp Asp 20 25 30 atg aac tgg tac cag cag aag cca ggg gaa cct cct aac ctc ctt att 144 Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro Asn Leu Leu Ile 35 40 45 tca gaa ggc aat agt ctt cgt cct gga gtc cca tcc cga ttc tcc agc 192 Ser Glu Gly Asn Ser Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser 50 55 60 agt ggc tat ggc aca aat ttt gtt ttt aca att gaa aac acg ctc tca 240 Ser Gly Tyr Gly Thr Asn Phe Val Phe Thr Ile Glu Asn Thr Leu Ser 65 70 75 80 gaa gat gtt gca gat tac tac tgt ttg caa agt gat aac atg cca ttc 288 Glu Asp Val Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Asn Met Pro Phe 85 90 95 acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gaa ata aar 321 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 109 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 109 Glu Thr Thr Val Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Ile Thr Thr Pro Asp Ile Asp Asp Asp 20 25 30 Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro Asn Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Glu Gly Asn Ser Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asn Phe Val Phe Thr Ile Glu Asn Thr Leu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Asn Met Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 110 <211> 354 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(354) <223> SC16.35 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(354) <400> 110 cag gtc cag ctg cag cag tct ggg gct gaa ctg gca aaa cct ggg gcc 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct ggc tac acc ttt act acc tac 96 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 tgg atg cac tgg gta aaa cag agg cct gga cag ggt ctg gaa tgg att 144 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga tac att aat cct agc agt ggt tat act gag tac aat cag aag ttc 192 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aag gac aag gcc aca ttg act gca gac aaa tcc tcc agc aca gcc tac 240 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg caa cta agc agc ctg aca tct gag gac tct tca gtc tat tac tgt 288 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ser Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga aag ggt agt aac agg ggg ttt gct tac tgg ggc caa ggg act 336 Ala Arg Lys Gly Ser Asn Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 ctg gtc act gtc tct tcn 354 Leu Val Thr Val Ser Xaa 115 <210> 111 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (118)..(118) <223> The 'Xaa' at location 118 stands for Ser. <400> 111 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ser Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Lys Gly Ser Asn Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Xaa 115 <210> 112 <211> 312 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(312) <223> SC16.38 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(312) <400> 112 caa att gtt ctc acc cag tct cca gca atc atg tct gca tct cca ggg 48 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 gag aag gtc acc atg acc tgc agt gcc agc tca agt ata aat tac atg 96 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Asn Tyr Met 20 25 30 cac tgg tac cag cag aag cca ggc acc tcc ccc aaa aga tgg att tat 144 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 gac aca tcc aaa ctg gct tct gga gtc cct gct cgc ttc agt ggc agt 192 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 ggg tct ggg acc tct tat tct ctc aca atc agc agc atg gag gct gaa 240 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 gat gct gcc act tat tac tgc cat cag cgg agt acg tgg acg ttc ggt 288 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Thr Trp Thr Phe Gly 85 90 95 gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa 312 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 <210> 113 <211> 104 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 113 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Asn Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Thr Trp Thr Phe Gly 85 90 95 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 <210> 114 <211> 348 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(348) <223> SC16.38 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(348) <400> 114 gag gtt cag ctg cag cag tct ggg gca gag ctt gtg aag cca ggg gcc 48 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtc aag ttg tcc tgc aca gtt tct ggc ttc aac att aaa gac acc 96 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 tat ata cac tgg gtg aag cag agg cct gaa cag ggc ctg gag tgg att 144 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga agg att gat cct gcg aat ggt aat act aaa tat gac ccg aag ttc 192 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 cag ggc aag gcc act ata aca gca gac aca tcc tcc aac aca gcc tac 240 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ctg cag ctc agc agc ctg aca tct gag gac act gcc gtc tat tac tgt 288 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gct aga ccg acg ggg tac ttt gaa tac tgg ggc caa ggc acc act ctc 336 Ala Arg Pro Thr Gly Tyr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 100 105 110 aca gtc tcc tca 348 Thr Val Ser Ser 115 <210> 115 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 115 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Thr Gly Tyr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 116 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(321) <223> SC16.41 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 116 gat atc cag atg aca cag act aca tcc tcc ctg tct gcc tct ttg gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc atc agt tgc agg gca agt cag gat gtt atc aat tat 96 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ile Asn Tyr 20 25 30 tta aac tgg tat cag cag aaa cca gat gga act gtt aaa ctc ctg atc 144 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tac tac aca tca agg tta cac tca gga gtc cca tca agg ttc agt ggc 192 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt ggg tct agg aca gat tat tct ctc acc atc agc aac ctg gaa cct 240 Ser Gly Ser Arg Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 gaa gat att gcc act tac tat tgt cag cag tat agt gag cgt ccg tac 288 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Glu Arg Pro Tyr 85 90 95 acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa 321 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 117 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 117 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ile Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Arg Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Glu Arg Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 118 <211> 351 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(351) <223> SC16.41 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(351) <400> 118 gaa gtg aag ctt gag gag tct gga gga ggc ttg gtg caa ttt gga gga 48 Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Phe Gly Gly 1 5 10 15 tcc atg aaa ctc tct tgt gct gct tct gga ttc act ttt agt gat gcc 96 Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30 tgg atg gac tgg gtc cgc cag tct cca gag aag ggg ctt gag tgg gtt 144 Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gct gaa att aga aac aaa gct aat aat cat gca aca tat tat cct gag 192 Ala Glu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Pro Glu 50 55 60 tct gtg aaa ggg agg ttc acc atc tca aga gat gat tcc aaa agt aga 240 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Arg 65 70 75 80 gtg tac ctg caa atg aac aac tta aga gct gaa gac act ggc att tat 288 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 tac tgt acg ggt tac tcc tcg ttt gct tac tgg ggc caa ggg act ctg 336 Tyr Cys Thr Gly Tyr Ser Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 gtc act gtc tct gca 351 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 119 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 119 Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Phe Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30 Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Pro Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Arg 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Gly Tyr Ser Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 120 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(336) <223> SC16.42 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <400> 120 gat gtt ttg atg aca cag tct cca ctc tcc ctg tct gtc agt ctt gga 48 Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 gat caa gcc tcc atc tct tgt aga tct agt cag aac att gta cac agt 96 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser 20 25 30 gat aga tac acc tat tta gaa tgg tac ctg cag aaa cca ggc cag tcg 144 Asp Arg Tyr Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 cca aaa ctc ctg ata tat ggg gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca 192 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca ctc aag atc 240 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 agc aga gtg gag gct gag gat atg gga gtt tat tac tgc ttt caa ggt 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Met Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 aca cat gtt ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa 336 Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 121 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 121 Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser 20 25 30 Asp Arg Tyr Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Met Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 122 <211> 354 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(354) <223> SC16.42 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(354) <400> 122 cag atc cag ttg gtg cag tct gga cct gaa ctg aag aag cct gga gag 48 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 aca gtc aag atc tcc tgc aag gct tct ggg tat acc ttc aca act gct 96 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Ala 20 25 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Lys Met Pro Gly Lys Gly Phe Lys Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr His Ser Gly Glu Pro Lys Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Thr Phe Phe Cys 85 90 95 Ala Pro Leu Trp Ser Asp Ser Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 124 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(321) <223> SC16.45 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 124 gaa atc cag atg acc cag tct cca tcc tct atg tct gca tct ctg gga 48 Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gac aga ata acc atc act tgc cag gca act caa gac att gtt aag aat 96 Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Gln Ala Thr Gln Asp Ile Val Lys Asn 20 25 30 tta aac tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa ccc cct tca ttc ctg atc 144 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Ser Phe Leu Ile 35 40 45 tat tat gca act gaa ctg gca gaa ggg gtc cca gca agg ttc agt ggc 192 Tyr Tyr Ala Thr Glu Leu Ala Glu Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt ggg tct ggg tca gac tat tct ctg aca atc agc aac ctg gag tct 240 Ser Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Ser 65 70 75 80 gaa gat ttt gca gac tat cac tgt cta cag ttt tat gag ttt ccg ttc 288 Glu Asp Phe Ala Asp Tyr His Cys Leu Gln Phe Tyr Glu Phe Pro Phe 85 90 95 acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg aaa 321 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 125 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 125 Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Gln Ala Thr Gln Asp Ile Val Lys Asn 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Ser Phe Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Thr Glu Leu Ala Glu Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Asp Tyr His Cys Leu Gln Phe Tyr Glu Phe Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 126 <211> 363 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(363) <223> SC16.45 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 126 cag gtc cag ctg cag cag tct gga gct gac ctg gta agg cct ggg act 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Asp Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15 tca gtg aag gtg tcc tgc aag gct tct gga tac tcc ttc act aat tac 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 ctg ata gag tgg gta aag cag agg cca gga cag ggc ctt gag tgg att 144 Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gtg att aat cct gga agt ggt gga act cac tac aat gag aaa ttc 192 Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 aag gac aag gca gtt ctg act gca gac aaa tcc tcc act act gcc cac 240 Lys Asp Lys Ala Val Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala His 65 70 75 80 atg cag ctc agc agc ctg aca tct gat gac tct gcg gtc tat ttc tgt 288 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 gca aga tcc ccc tat gat tat aac gat ggt gct atg gac tac tgg ggt 336 Ala Arg Ser Pro Tyr Asp Tyr Asn Asp Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 caa gga acc tca gtc acc gtc tct tca 363 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 127 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 127 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Asp Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Val Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala His 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Pro Tyr Asp Tyr Asn Asp Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 128 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(336) <223> SC16.47 VL <220> <221> 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Glu Leu Arg 100 105 110 <210> 129 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 129 Asp Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Asn Ile Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Thr Lys Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Phe Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser 85 90 95 Asn Tyr Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg 100 105 110 <210> 130 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(357) <223> SC16.47 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(357) <400> 130 gag gtc caa ctg cag cag tct gga cct gag ctg gtg aag cct ggg gct 48 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag ata tcc tgc aag gct tct ggt tac tca ttc agt cgt ttc 96 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Arg Phe 20 25 30 tat atg cac tgg gtg aag caa agt cct gaa aat agt ctt gag tgg att 144 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Glu Asn Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gag att aat cct agc act ggg ggt aca agc tac aac cag aag ttc 192 Gly Glu Ile Asn Pro Ser Thr Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aag ggc aag gcc aca tta act gta gat aaa tcc tcc agc aca gcc tac 240 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg cag ctc aag agc ctg aca tct gaa gag tct gca gtc tat tac tgt 288 Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Glu Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 act agg ggt tac ggg agc aac tgt tac ttc gat gtc tgg ggc gca ggg 336 Thr Arg Gly Tyr Gly Ser Asn Cys Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly 100 105 110 acc acg gtc acc gtc tcc aca 357 Thr Thr Val Thr Val Ser Thr 115 <210> 131 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 131 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Arg Phe 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Glu Asn Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Ser Thr Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Glu Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Tyr Gly Ser Asn Cys Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Thr 115 <210> 132 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(321) <223> SC16.49 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 132 gac atc aag atg acc cag tct cca tct tcc atg tat gca tct cta gga 48 Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gag aga gtc act atc act tgc aag gcg agt cag gac att aat agt tat 96 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr 20 25 30 tta agc tgg ttc cag cag aaa cca ggg aaa tct cct aag acc ctg atc 144 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 tat cga gca aac aga ttg gta gat ggg gtc cca tca agg ttc agt ggc 192 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg caa gat tat tct ctc acc atc acc agc ctg gag tat 240 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Ser Leu Glu Tyr 65 70 75 80 gaa gat atg gga att tat tat tgt cta cag tat gat gaa ttt ccg ctc 288 Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu 85 90 95 acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg aaa 321 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 133 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 133 Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Ser Leu Glu Tyr 65 70 75 80 Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 134 <211> 351 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(351) <223> SC16.49 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(351) <400> 134 cag gtt caa ctg cag cag tct gga cct gag ctg gtg aag cct ggg act 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15 tta gtg aag ata tcc tgc aag gct tct ggt tac acc ttc aca agc tac 96 Leu Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 gat ata aac tgg gtg aag cag agg cct gga cag gga ctt gaa tgg att 144 Asp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga tgg att tat cct gga gat ggt aat act aag tac agt gag aaa ttc 192 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 aag ggc aag gcc aca ctg act gca gac aaa tcc tcc agc aca gcc tac 240 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg cag ctc acc agc ctg act tct gag aac tct gca gtc tat ttc tgt 288 Met Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asn Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 gca aga gac tat gat tac cct ttt gct tac tgg ggc caa ggg act ctg 336 Ala Arg Asp Tyr Asp Tyr Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 gtc act gtc tct gca 351 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 135 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 135 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15 Leu Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asn Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Tyr Asp Tyr Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 136 <211> 318 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(318) <223> SC16.50 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(318) <400> 136 gat atc cag atg aca cag act aca tcc tcc ctg tct gcc tct ctg gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc atc agt tgc agg gca agt cag gac att agc aat tat 96 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 tta aac tgg tat cag cag aaa cca gat gga act gtt aaa ctc ctg atc 144 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tac tac aca tca aga tta cac tca gga gtc cca tca agg ttc agt ggc 192 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt ggg tct ggt aca gat tat tct ctc acc att agc aac ctg gag caa 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 gaa gat att gcc act tac ttt tgc caa cag ggt aat acg ctt cgg acg 288 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Arg Thr 85 90 95 ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa 318 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 137 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 137 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Arg Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 138 <211> 363 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(363) <223> SC16.50 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 138 gaa gtg cag ctg gtg gag tgt ggg gga tgc tta gtg aag cct gga ggg 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Cys Gly Gly Cys Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 tac ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc act ttc agt agc tat 96 Tyr Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 gcc atg tct tgg gtt cgc cag tct cca gag aag agg ctg gag tgg gtc 144 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 gca gaa atc agt att ggt ggt agc tac acc tac tat cca gac act gtg 192 Ala Glu Ile Ser Ile Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 acg ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat gcc aag aac acc ctg tac 240 Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg gaa atg agc agt ctg agg tct gag gac acg gcc atg tat tac tgt 288 Leu Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca agg gag ggc tat gat tac gac gtg aga gct atg gac tac tgg ggt 336 Ala Arg Glu Gly Tyr Asp Tyr Asp Val Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 caa gga acc tca gtc acc gtc tcc tca 363 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 139 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 139 Glu Val Gln Leu Val Glu Cys Gly Gly Cys Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Tyr Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Ser Ile Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Tyr Asp Tyr Asp Val Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 140 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(321) <223> SC16.52 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 140 gac atc cag atg att cag tct cca tcg tcc atg ttt gcc tct ctg gga 48 Asp Ile Gln Met Ile Gln Ser Pro Ser Ser Met Phe Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gac aga gtc agt ctc tct tgt cgg gct agt cag ggc att aga ggg act 96 Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Gly Thr 20 25 30 tta gac tgg tat caa cag aaa cca aat gga act att aaa ctc ctg atc 144 Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asn Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tac tcc aca tcc aat tta aat tct ggt gtc cca tca agg ttc agt ggc 192 Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Asn Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt ggg tct ggg tca gat tat tct ctc acc atc agc agc cta gag tct 240 Ser Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser 65 70 75 80 gaa gat ttt gca gac tat tac tgt cta cag cgt aat gcg tat cct ctc 288 Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Arg Asn Ala Tyr Pro Leu 85 90 95 acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg aaa 321 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 141 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 141 Asp Ile Gln Met Ile Gln Ser Pro Ser Ser Met Phe Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Gly Thr 20 25 30 Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asn Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Asn Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Arg Asn Ala Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 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tct cca tct tcc atg tat gca tct cta gga 48 Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gag aga gtc act atc act tgc aag gcg agt cag gac att aat agc tat 96 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr 20 25 30 tta aac tgg ttc cag cag aaa cca ggg aaa tct cct aag acc ctg atc 144 Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 tat cgt gca aac aga ttg gta gat ggg gtc cca tca agg ttc agt ggc 192 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg caa gat tat tct ctc acc atc agc agc ctg gag tat 240 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr 65 70 75 80 gaa gat atg gga att tat tat tgt cta cag tat gat gag ttt ccg tac 288 Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr 85 90 95 acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa 321 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 145 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 145 Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr 65 70 75 80 Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 146 <211> 351 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(351) <223> SC16.55 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(351) <400> 146 gag gtg cag ctt gtt gag tct ggt gga gga ttg gtg cag cct aaa ggg 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly 1 5 10 15 tca ttg aaa ctc tca tgt gca gtc tct gca ttc acc ttc act acc tac 96 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Ala Phe Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 gcc atg aac tgg gtc cgc cag gct cca gga aag ggt ttg gag tgg gtt 144 Ala Met Asn Trp Val 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Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Ile Glu Asp Thr Ala Met Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Phe Tyr Tyr Asp Tyr Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 148 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(321) <223> SC16.56 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 148 agt att gtg atg acc cag act ccc aaa ttc ctg ctt gta tca gca gga 48 Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 gac agg gtt acc ata acc tgc aag gcc agt cag agt gtg agt aat gat 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 gta gta tgg tac caa cag aag cca ggg cag tct cct aaa ctg ctg ata 144 Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tac tat gca tcc aat cgc tac act gga gtc cct gat cgc ttc gct ggc 192 Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ala Gly 50 55 60 agt gga tat ggg acg gat ttc tct ttc acc atc agc act gtg cag gct 240 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Ser Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala 65 70 75 80 gaa gac ctg gca gtt tat ttc tgt cag cag gat tat acc tct ccg tgg 288 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Thr Ser Pro Trp 85 90 95 acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aga 321 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg 100 105 <210> 149 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 149 Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ala Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Ser Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Thr Ser Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg 100 105 <210> 150 <211> 354 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(354) <223> SC16.56 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(354) <400> 150 cag atc cag ttg gtg cag tct gga cct gaa ctg aag aag cct gga gag 48 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 aca gtc aag atc tcc tgc aag gct tct ggg tat acc ttc aca aac tat 96 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 gga atg aac tgg gtg aag cag gct cca gga aag ggt tta aag tgg atg 144 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 gcc tgg ata aac acc tac act gga gag cca aca tat gct gat gac ttc 192 Ala Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 aag gga cgg ttt gcc ttc tct ttg gaa acc tct gcc agc act gcc tct 240 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Ser 65 70 75 80 ttg cag atc atc aac ctc aaa aat gag gac acg gct aca tat ttc tgt 288 Leu Gln Ile Ile Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 gca agg atc ggc gat agt agt ccc tct gac tac tgg ggg cag ggc acc 336 Ala Arg Ile Gly Asp Ser Ser Pro Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 act ctc aca gtc tcc tca 354 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 151 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 151 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Ala Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Ser 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ile Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Gly Asp Ser Ser Pro Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 152 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(321) <223> SC16.57 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 152 gac att gtg atg acc cag tct cac aaa ttc atg tcc ata tca gta gga 48 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Ile 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Ser Gln Asp Val Ser Ile Phe 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Gly Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Lys Ile Arg 100 105 <210> 154 <211> 354 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(354) <223> SC16.57 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(354) <400> 154 gaa gtg aaa ctg gtg gag tct ggg gga gac tta gtg aag cct gga ggg 48 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc cta aaa ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc gct ttc agt agt tat 96 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 gac atg tct tgg gtt cgc cag act ccg gag aag aga ctg gag tgg gtc 144 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 gca acc att agc agt ggt ggt agt tac acc tat tat cca gac agt gtg 192 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat gtc agg gac acc ctg tac 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Arg Asp Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg agc agt ttg agg tct gag gac acg gcc ttg tat tac tgt 288 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga cag gca att ggg acg tac ttt gac tac tgg ggc caa ggc acc 336 Ala Arg Gln Ala Ile Gly Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 act ctc aca gtc tcc tca 354 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 155 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 155 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Arg Asp Thr Leu Tyr 65 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Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt ggg act tat tac tgt caa cat cat tat gat tct ccg ctc 288 Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asp Ser Pro Leu 85 90 95 acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg aga 321 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg 100 105 <210> 157 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 157 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ser Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asp Ser Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg 100 105 <210> 158 <211> 360 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(360) <223> SC16.58 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <400> 158 gat gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc tta gtg cag cct gga ggg 48 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc cgg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc act ttc agt agc ttt 96 Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 gga atg cac tgg gtt cgt cag gct cca gag aag ggg ctg gag tgg gtc 144 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gca tac att agt agt ggc agt agt aac atc tac tat gca gac aca gtg 192 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val 50 55 60 aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat ccc aag aac acc ctg ttc 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 ctg caa atg acc agt cta agg tct gag gac acg gcc atg tat tac tgt 288 Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga ggc tac tat ggt aac tac gat gct atg gac tac tgg ggt caa 336 Ala Arg Gly Tyr Tyr Gly Asn Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 gga acc tca gtc acc gtc tcc tca 360 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 159 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 159 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Tyr Gly Asn Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 160 <211> 339 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(339) <223> SC16.61 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(339) <400> 160 gat att gtg atg aca cag tct aca tcc tcc ctg gct atg tca gta gga 48 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Thr Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly 1 5 10 15 cag aag gtc act atg agc tgc aag tcc agt cag agc ctt tta aat agt 96 Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 agc aat caa aag aat tat ttg gcc tgg tac cag cag gaa cca gga cag 144 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Glu Pro Gly Gln 35 40 45 tct cct aaa ctt ctg gta tcc ttt gca tcc act agg gaa tct ggg gtc 192 Ser Pro Lys Leu Leu Val Ser Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 cct gat cgc ttc aca ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctt acc 240 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 atc agc ggt gtg cag gct gaa gac ctg gca gtt tat tac tgt cag caa 288 Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 cat tat agc att ccg ctc acg ttc ggt gct gga acc aag ctg gag ctg 336 His Tyr Ser Ile Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 aaa 339 Lys <210> 161 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 161 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Thr Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly 1 5 10 15 Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Glu Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Val Ser Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 His Tyr Ser Ile Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys <210> 162 <211> 360 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(360) <223> SC16.61 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <400> 162 gag gtc ctg ctc caa cgg tct gga cct gac ctg gtg aag cct ggg gct 48 Glu Val Leu Leu Gln Arg Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg acg ata ccc tgc aag gct tct gga tac aca ttc act gac tac 96 Ser Val Thr Ile Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 aac atg gac tgg gtg aag cag agc cat gga aag agc ctt gag tgg att 144 Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga aat att aat act tac aat ggt ggt act atc tac aac cag aag ttc 192 Gly Asn Ile Asn Thr Tyr Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aag ggc aag gcc aca ttg act gta gac aag ccc tcc agc aca gcc tac 240 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Pro Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ctc cgc agc ctg aca tct gag gac act gca gtc tat tac tgt 288 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga cgt cta cgg tat ggg gga cac tac ttt gac tac tgg ggc caa 336 Ala Arg Arg Leu Arg Tyr Gly Gly His Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 ggc acc gct ctc aca gtc tcc tca 360 Gly Thr Ala Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 163 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 163 Glu Val Leu Leu Gln Arg Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Thr Ile Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Asn Thr Tyr Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Pro Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Leu Arg Tyr Gly Gly His Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ala Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 164 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(321) <223> SC16.62 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 164 gac atc aag atg acc cag tct cca tct tcc atg tat gca tct cta gga 48 Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gag aga gtc act atc act tgc aag gcg agt cag gac att aat agc ttt 96 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Phe 20 25 30 tta agc tgg ttc cag cgg aaa cca ggg aaa tct ccg aag acc ctg atc 144 Leu Ser Trp Phe Gln Arg Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 tat cgt gca aac aga tta gta gat gga gtc cca tca agg ttc act ggc 192 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly 50 55 60 agt gga tct ggg caa gaa ttt tct ctc acc atc agc agc ctg gag tat 240 Ser Gly Ser Gly Gln Glu Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr 65 70 75 80 gaa gat ttg gga att tat tat tgt ctt cag tat gat gag ttt ccg tac 288 Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr 85 90 95 acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa 321 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 165 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 165 Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Phe 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Arg Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Gln Glu Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr 65 70 75 80 Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 166 <211> 351 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(351) <223> SC16.62 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(351) <400> 166 gaa gtg atg ctg gta gag tct ggg gga gac tta gtg aag cct gga ggg 48 Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc act ttc agt agc tat 96 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 gcc atg tct tgg gtt cgc cag act ccg gag aag agg ctg gag tgg gtc 144 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 gca tac att agc ggt ggt ggt gat cac atc tat tat cca gac agt gtg 192 Ala Tyr Ile Ser Gly Gly Gly Asp His Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 agg ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat gcc aag gac acc ctg tac 240 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg agc agt ctg agg tct gag gac acg gcc ttg tat gac tgt 288 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Asp Cys 85 90 95 gca aga gtg aga gac tgg tac ttc gat gtc tgg ggc gca ggg acc acg 336 Ala Arg Val Arg Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr 100 105 110 gtc acc gtc tcc tca 351 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 167 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 167 Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Gly Gly Gly Asp His Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Asp Cys 85 90 95 Ala Arg Val Arg Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 168 <211> 318 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(318) <223> SC16.63 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(318) <400> 168 caa att gtt ctc acc cag tct cca gca atc atg tct gca tct cca ggg 48 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 gag aag gtc acc atg acc tgc agt gcc agc tca agt gtc agt tac atg 96 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 tac tgg tac cag cag aag tca ggc acc tcc ccc aaa aga tgg att tat 144 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 gac aca tcc aaa ctg gct tct gga gtc cct gct cgc ttc agt ggc agt 192 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 ggg tct ggg acc tct tac tct ctc aca atc agc agc atg gag gct gaa 240 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 gat gct gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt agt aac ccg tac acg 288 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Tyr Thr 85 90 95 ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aar 318 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 169 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 169 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp 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Ser Gly Thr Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 aag ggc aag gcc acc ttc act gca gat aca tcc tcc aac aca gcc tac 240 Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg cat ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gcc gtc tat tac tgt 288 Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga ggg act aac tct ctc tgg ggc caa ggg act ctg gtc act gtc 336 Ala Arg Gly Thr Asn Ser Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 tct gca 342 Ser Ala <210> 171 <211> 114 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 171 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Leu Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Thr Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Asn Ser Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ala <210> 172 <211> 318 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(318) <223> SC16.65 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(318) <400> 172 caa att gtt ctc acc cag tct cca gca ctc atg tct gca tct cca ggg 48 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 gag aag gtc acc atg acc tgc agt gtc acc tca agt gta agt tac atg 96 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Val Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 tac tgg tac cag cag aag cct aga tcc tcc ccc aaa ccc tgg att tat 144 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 ctc aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cct gct cgc ttc agt ggc agt 192 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 ggg tct ggg acc tct tac tct ctc aca atc agc agc gtg gag gct gaa 240 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 gat gct gcc act tat tac tgc cag cag tgg agg aat aac cca 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Ser Gln 1 5 10 15 acc ctc agt ctg act tgt tct ttc tct ggg ttt tca ctg agc act tct 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 ggt atg ggt gta ggc tgg att cgt cag cca tca ggg aag ggt ctg gag 144 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 tgg ctg gca ctc att tgg tgg gat gat gtc aag cgc tat aat cca gcc 192 Trp Leu Ala Leu Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys Arg Tyr Asn Pro Ala 50 55 60 ctg aag agt cga ctg act atc tcc aag gat gcc tcc agc agc cag gtc 240 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Ala Ser Ser Ser Gln Val 65 70 75 80 ttc ctc aag atc gcc agt gtg gac act gca gat act gcc aca tac tac 288 Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 tgt gct cga ata gct tcc tat gat tac gac gta gtc tat gct atg gac 336 Cys Ala Arg Ile Ala Ser Tyr Asp Tyr Asp Val Val Tyr Ala Met Asp 100 105 110 tac tgg ggt caa gga acc tca gtc agc gtc tcc tca 372 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Ser Val Ser Ser 115 120 <210> 175 <211> 124 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 175 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Leu Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys Arg Tyr Asn Pro Ala 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Ala Ser Ser Ser Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ile Ala Ser Tyr Asp Tyr Asp Val Val Tyr Ala Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Ser Val Ser Ser 115 120 <210> 176 <211> 327 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(327) <223> SC16.67 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(327) <400> 176 cag gct gtt gtg act cag gaa tct gca ctc acc aca tca cct ggt gaa 48 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 aca gtc aca ctc act tgt cgc tca agt act ggg gct gtt aca act agt 96 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 aac tat gcc aac tgg atc caa gaa aaa cca gat cat tta ttc act ggt 144 Asn Tyr Ala Asn Trp Ile Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly 35 40 45 cta ata ggt ggt acc aac aac cga gct cca ggt gtt cct gcc aga ttc 192 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe 50 55 60 tca ggc tcc ctg att gga gac aag gct gcc ctc acc atc aca ggg gca 240 Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 cag act gag gat gag gca ata tat ttc tgt ggt cta tgg tac agc aac 288 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Gly Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 cat ttg gtg ttc ggt gga gga acc aaa ctg act gtc cta 327 His Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 177 <211> 109 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 177 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Ile Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Gly Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 His Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 178 <211> 351 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(351) <223> SC16.67 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(351) <400> 178 gag gtg cag ctt gtt gag act ggt gga gga ttg gtg cag cct aaa ggg 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly 1 5 10 15 tca ttg aaa ctc tca tgt gca gtc tct gca ttc acc ttc act acc tac 96 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Ala Phe Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 gcc atg aac tgg gtc cgc cag gct cca gga aag ggt ttg gag tgg gtt 144 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gct cgc ata aga aat aaa agt aat aat tat gca aca tat tat gcc gat 192 Ala Arg Ile Arg Asn Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 tca gtg aaa gac agg ttc acc atc tcc aga gat gat tca caa agc atg 240 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met 65 70 75 80 ctc tat ctg caa atg aac aac ttg aaa att gag gac aca gcc atg tat 288 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Ile Glu Asp Thr Ala Met Tyr 85 90 95 tac tgt gtg ttc tac tat gat tac gtc tac tgg ggc caa ggg act ctg 336 Tyr Cys Val Phe Tyr Tyr Asp Tyr Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 gtc act gtc tct gca 351 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 179 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 179 Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Ala Phe Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Asn Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Ile Glu Asp Thr Ala Met Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Phe Tyr Tyr Asp Tyr Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 180 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(321) <223> SC16.68 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 180 gaa aca act gtg acc cag tct cca gca ttc ctg tcc gtg gct aca gga 48 Glu Thr Thr Val Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Ala Thr Gly 1 5 10 15 gaa aaa gtc act atc aga tgc ata acc agc act gat att gat gat gat 96 Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp 20 25 30 atg aac tgg tac cag cag aag cca ggg gaa cct cct aat gtc ctt att 144 Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro Asn Val Leu Ile 35 40 45 tca gaa ggc aat act ctt cgt cct gga gtc cca tcc cga ttc tcc agc 192 Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser 50 55 60 agt ggc tat ggc aca gat ttt gtt ttt aca att gaa aac acg ctc tca 240 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr Ile Glu Asn Thr Leu Ser 65 70 75 80 gaa gat gtt gca gat tac tac tgt ttg caa agt gat aac atg cct ctc 288 Glu Asp Val Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Asn Met Pro Leu 85 90 95 acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg aaa 321 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 181 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 181 Glu Thr Thr Val Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Ala Thr Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp 20 25 30 Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro Asn Val Leu Ile 35 40 45 Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr Ile Glu Asn Thr Leu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Asn Met Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 182 <211> 363 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(363) <223> SC16.68 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 182 cag gtg caa ctg cag cag cct ggg gct gag ctg gtg aag cct ggg gcc 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val 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musculus <400> 183 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Phe Pro Gly Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Gly Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Gly Tyr Gly Ser Gly Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 184 <211> 318 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(318) <223> SC16.72 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(318) <400> 184 gaa aat gta ctc acc cag tct cca gca atc atg tct gca tct cta ggg 48 Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gag aag gtc acc atg agc tgc agg gcc agc tca agt gta aat tac atg 96 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met 20 25 30 tcc tgg tac cag cag aag tca gat gcc tcc ccc aaa cta tgg att tat 144 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asp Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45 tac aca tcc aac ctg gct cct gga gtc cca gct cgc ttc agt ggc agt 192 Tyr Thr Ser Asn Leu Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 ggg tct ggg aac tct tat tct ctc aca atc agc agc atg gag ggt gaa 240 Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Gly Glu 65 70 75 80 gat gct gcc act tat tac tgc cag cag ttt act agt tcc ccg tac acg 288 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Thr Ser Ser Pro Tyr Thr 85 90 95 ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa 318 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 185 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 185 Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asp Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45 Tyr Thr Ser Asn Leu Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Gly Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Thr Ser Ser Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 186 <211> 351 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(351) <223> SC16.72 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(351) <400> 186 gag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gag ctg gta aag cct ggg gct 48 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct gga tac aca ttc act agc tat 96 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 gtt atg cac tgg gtg aag cag aag cct ggg cag ggc ctt gag tgg att 144 Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga tat att aat cct tac aat gat ggt act aag tac aat gag aag ttc 192 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 aaa ggc aag gcc aca ctg act tca gac aaa tcc tcc agc aca gcc tac 240 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ctc agc agc ctg acc tct gag gac tct gcg gtc tat tac tgt 288 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga ttg agg tcg agg gct atg gac tac tgg ggt caa gga acc tca 336 Ala Arg Leu Arg Ser Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 gtc acc gtc tcc tca 351 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 187 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 187 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Arg Ser Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr 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ggc tac aca ttc agt agc tac 96 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 tgg ata gag tgg tta agg cag agg cct gga cat ggc ctt gag tgg att 144 Trp Ile Glu Trp Leu Arg Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gag att tta cct gga agt gat aat agt aat tat aat gag aag ttc 192 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asp Asn Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 aag ggc aag gcc aca ttc act gca gat aca tcc tcc aac aca gcc tac 240 Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg caa ctc agc agc ctg aca tct gag gaa tct gcc gtc tat tac tgt 288 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Glu Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 aca agg gga tta cga cga gac ggc tca tat tac tat gtt atg gaa cat 336 Thr Arg Gly Leu Arg Arg Asp Gly Ser Tyr Tyr Tyr Val Met Glu His 100 105 110 tgg ggt caa gga acc tca gtc acc gtc tcc tca 369 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 191 <211> 123 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 191 Gln Val Gln Leu Gln Gln 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cag aag cca ggg aga tct cct aag acc ctg atc 144 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 tat cgt gca aac aga ttg gta gat ggg gtc cca tca agg ttc agt ggc 192 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg caa gat tat tct ctc acc atc agc agc ctg gac tat 240 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Asp Tyr 65 70 75 80 gaa gat atg gga att tat tat tgt cta cag tat gat gaa ttt cca ttc 288 Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Phe 85 90 95 acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gar ath aar 321 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 193 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 193 Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Asp Tyr 65 70 75 80 Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 194 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(357) <223> SC16.78 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(357) <400> 194 gaa gtg aag ctg gtg gag tct ggg gga ggc tta gtg aag cct gga ggg 48 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc act ttc ggt cgc tat 96 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Arg Tyr 20 25 30 gtc atg tct tgg gtt cgc cag act cca gaa aag aaa ctg gag tgg gtc 144 Val Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Lys Leu Glu Trp Val 35 40 45 gca tcc att act agt ggt ggt act acc tac tat cca gac agt gtg aag 192 Ala Ser Ile Thr Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 ggc cga ttc acc atc tcc aga gat aat gcc agg aac atc ctg tac cta 240 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu 65 70 75 80 caa atg agc agt ctg agg tct gag gac acg gcc atg tat tac tgt gca 288 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 aga gtc tac tat cat tac gac gac atc ttt gct tac tgg ggc caa ggg 336 Arg Val Tyr Tyr His Tyr Asp Asp Ile Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 act ctg gtc act gtc tct gca 357 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 195 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 195 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Arg Tyr 20 25 30 Val Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Lys Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Thr Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Val Tyr Tyr His Tyr Asp Asp Ile Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val 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cct aag ctc ctt att 144 Met Ile Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tca gaa ggc aat act ctt cgt cct gga gtc cca tcc cga ttc tcc agc 192 Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser 50 55 60 agt ggc tat ggt aca gat ttt gtt ttt aca att gaa aac atg ctc tca 240 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr Ile Glu Asn Met Leu Ser 65 70 75 80 gaa gat gtt gcc gat tac tac tgt ttg aaa agg gat gac ttg cct tac 288 Glu Asp Val Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Lys Arg Asp Asp Leu Pro Tyr 85 90 95 acg ttc ggc ggg ggg aca cag gtg gaa att aaa 321 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Gln Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 201 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 201 Glu Thr Thr Val Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Met Ala Ile Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp 20 25 30 Met Ile Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr Ile Glu Asn Met Leu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Lys Arg Asp Asp Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Gln Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 202 <211> 351 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(351) <223> SC16.80 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(351) <400> 202 gag gtc cag ctg caa cag tct gga cct gag ctg gtg aag cct gga ggt 48 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 tca aag aag ata tcc tgc aag gct tct ggt tac tca ttc act ggc tac 96 Ser Lys Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 agt atg aac tgg gtg aag cag agc cat gga aag aac ctt gag tgg att 144 Ser Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga ctt att aat cct tac agt ggt ggt act atc tac aac cag aaa ttc 192 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Ser Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aag ggc aag gcc aca tta act gta gac aag tca tcc agc aca gcc tac 240 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ctc ctc agt ctg aca tct gag gac tct gca gtc tat tac tgt 288 Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga agg agt gat tac ccg tta gtt tac tgg ggc caa ggg act ctg 336 Ala Arg Arg Ser Asp Tyr Pro Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 gtc act gtc tct gca 351 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 203 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 203 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Lys Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Ser Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Ser Asp Tyr Pro Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 204 <211> 324 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(324) <223> SC16.81 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 204 caa att gtt ctc acc cag tct cca gca atc atg tct gca tct cta ggg 48 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gaa cgg gtc acc ctg acc tgc act gcc agc tca agt gta agt tcc agt 96 Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 tac ttg cac tgg tac cag cag aag cca gga tcc tcc ccc aaa ctc tgg 144 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 att tat agc aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cca act cgc ttc agt 192 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser 50 55 60 ggc agt ggg tct ggg acc tct tac tct ctc aga atc agc agc atg gag 240 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Arg Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 gct gaa gat gct gcc act tat tac tgc cac cag tat aat cgt tcc ccg 288 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Asn Arg Ser Pro 85 90 95 ctc acg ttc ggt gct ggg acc aag 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Ser Leu Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Gln Gly Asn Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 208 <211> 318 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(318) <223> SC16.84 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(318) <400> 208 gac atc cag atg aca cag tct cca tcc tca ctg tct gca tct ctg gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 ggc aaa gtc acc atc act tgc aag gca agc caa gac att aag aag tat 96 Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Lys Tyr 20 25 30 ata gct tgg tac caa cac aag cct gga aaa ggt cct agg cta ctc ata 144 Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 cat tac aca tct aca tta gag cca ggc atc cca tca agg ttc agt gga 192 His Tyr Thr Ser Thr Leu Glu Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt ggg tct ggg aga gat tat tcc ttc agc atc agc aac ctg gag cct 240 Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 gaa gat att gca act tat tat tgt cta caa tat gat att ctg tgg acg 288 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ile Leu Trp Thr 85 90 95 ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa 318 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 209 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 209 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Lys Tyr 20 25 30 Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 His Tyr Thr Ser Thr Leu Glu Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ile Leu 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(1)..(324) <223> SC16.88 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 212 gaa aat gtg ctc acc cag tct cca gca ata atg gct gcc tct ctg ggg 48 Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ala Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 cag aag gtc acc atg acc tgc agt gcc agc tca agt gta agt tcc agt 96 Gln Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 tac ttg cac tgg tac cag cag aag tca ggc gct tcc ccc aaa ccc ttg 144 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Pro Leu 35 40 45 att cat agg aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cca gct cgc ttc agt 192 Ile His Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 ggc agt ggg tct ggg acc tct tac tct ctc aca atc agc agc gtg gag 240 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu 65 70 75 80 gct gaa gat gat gca act tat tac tgc cgg cag tgg agt ggt tac ccg 288 Ala Glu Asp Asp Ala Thr Tyr Tyr Cys Arg Gln Trp Ser Gly Tyr Pro 85 90 95 tgg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa 324 Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 213 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 213 Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ala Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Pro Leu 35 40 45 Ile His Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Asp Ala Thr Tyr Tyr Cys Arg Gln Trp Ser Gly Tyr Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 214 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(357) <223> SC16.88 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(357) <400> 214 cag gtt cag ctg cag cag tct ggg gct gag ctg gca aga cct ggg gct 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag ttg tcc tgc aag gct tct ggc tac acc tgt act agc tac 96 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Cys Thr Ser Tyr 20 25 30 tgg atg cag tgg gta aaa cag agg cct gga cag ggt ctg gaa tgg att 144 Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 ggg gct att tat cct gga gat ggt gat act agg tac act cag aag ttc 192 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe 50 55 60 aag ggc aag gcc aca ttg act gca gat aaa tcc tcc agc aca gcc tac 240 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg caa ctc agc agc ttg gca tct gag gac tct gcg gtc tat tac tgt 288 Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca agg ggg agg cgg acg gag gcc tgg ttt gct tac tgg ggc caa ggg 336 Ala Arg Gly Arg Arg Thr Glu Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 act ctg gtc act gtc tct gca 357 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 215 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 215 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Cys Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Arg Arg Thr Glu Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 216 <211> 324 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(324) <223> SC16.101 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 216 caa att gtt ctc acc cag tct cca gca atc atg tct gca tct cta ggg 48 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gaa cgg gtc acc atg acc tgc act gcc agc tca agt gta agt tcc agt 96 Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 tac ttg cac tgg tac cag cag aag cca gga tcc tcc ccc aaa ctc tgg 144 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 att tat agc aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cca gct cgc ttc agt 192 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 ggc agt gag tct ggg acc tct tac tct ctc aca atc agc aac atg gag 240 Gly Ser Glu Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Met Glu 65 70 75 80 gct gag gat gct gcc act tat tac tgc cac cag tat cat cgt tcc cca 288 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 ttc acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gaa ata aaa 324 Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 217 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 217 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Glu Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Met Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 218 <211> 360 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(360) <223> SC16.101 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <400> 218 cag gtt act ctg aaa gag tct ggc cct ggg ata ttg cag ccc tcc cag 48 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 acc ctc agt ctg act tgt tct ttc tct gga ttt tca ctg agc act tct 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 ggt atg ggc gta ggc tgg att cgt cag cca tca ggg aag ggt ctg gag 144 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 tgg ctg gca cac att tgg tgg gat gat gtc aag cgc tat aac cca gcc 192 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys Arg Tyr Asn Pro Ala 50 55 60 ctt aag agc cga ctg act atc tcc aag gat gcc tcc agc agc cag gta 240 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Ala Ser Ser Ser Gln Val 65 70 75 80 ttc ctc aag atc gcc agt gtg gac act gca gaa act gcc aca tac tac 288 Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Glu Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 tgt gcc cac atc ctc gac cgg gct tac tac ttt gac tac tgg ggc caa 336 Cys Ala His Ile Leu Asp Arg Ala Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 ggc acc act ctc aca gtc acc tca 360 Gly Thr Thr Leu Thr Val Thr Ser 115 120 <210> 219 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 219 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys Arg Tyr Asn Pro Ala 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Ala Ser Ser Ser Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Glu Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala His Ile Leu Asp Arg Ala Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Leu Thr Val Thr Ser 115 120 <210> 220 <211> 333 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(333) <223> SC16.103 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(333) <400> 220 gac att gtg ctg aca cag tct cct gct tcc tta gct gta tct ctg ggg 48 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 cag agg gcc acc atc tca tgc agg gcc agc aaa agt gtc agt aca tct 96 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 ggc tat agt tat atg cac tgg tac caa cag aaa cca gga cag cca ccc 144 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 aaa ctc ctc atc tat ctt gca tcc aac cta gaa tct ggg gtc cct gcc 192 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc acc ctc aac atc cat 240 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 cct gtg gag gag gag gat gct gca acc tat tac tgt cag cac agt agg 288 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 gag ctt cct ctc acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg aaa 333 Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 221 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 221 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 222 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(357) <223> SC16.103 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(357) <400> 222 caa gtt act cta aaa gag tct ggc cct ggg ata ttg aag ccc tca cag 48 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 acc ctc agt ctg act tgt tct ttc tct ggg ttt tca ctg agc act tct 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 ggt atg ggt ata ggc tgg att cgt cag cct tca ggg aag ggt ctg gag 144 Gly Met Gly Ile Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 tgg ctg gca cac att tgg tgg gat gat gat aag tac tat aac cca tcc 192 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 ctg aag agc cag ctc aca atc tcc aag gat tcc tcc aga aac cag gtt 240 Leu Lys Ser Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Arg Asn Gln Val 65 70 75 80 ttc ctc aag atc acc agt gtg gac act gca gat act gcc act tac tac 288 Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 tgt gct cga aga ggg act gcg tac tac ttt gac tac tgg ggc caa ggc 336 Cys Ala Arg Arg Gly Thr Ala Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 acc act ctc aca gtc tcc tca 357 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 223 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 223 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Ile Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Arg Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Gly Thr Ala Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 224 <211> 318 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(318) <223> SC16.104 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(318) <400> 224 caa att gtt ctc tcc cag tct cca gca atc ctg tct gca tct cca ggg 48 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 gag aag gtc aca atg act tgc agg gcc agt tca agt gta agt tac att 96 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 cac tgg tac cgg cag aag cca gga tcc tcc ccc aaa ccc tgg att tat 144 His Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 gcc aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cct gct cgc ttc agt ggc agt 192 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 ggg tct ggg acc tct tac tct ctc aca atc agc aga gtg gag gct gaa 240 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 gat gct gcc act tat tac tgc cag cag tgg agc agt aat cca ccc acg 288 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg aaa 318 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 225 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 225 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 His Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 226 <211> 345 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(345) <223> SC16.104 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(345) <400> 226 cag gtg cag ctg aag gag tca gga cct gac ctt gtg cag ccc tca cag 48 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 acc ctg tct ctc acc tgc act gtc tct ggg ttc tca tta acc ttc tat 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Phe Tyr 20 25 30 ggt gtt cac tgg gtt cgc cag cct cca gga aag gga ctg gag tgg gtg 144 Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gga aca atg ggc tgg gat gac aaa aaa tat tat aat tca gct cta aaa 192 Gly Thr Met Gly Trp Asp Asp Lys Lys Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 tct cga ctg agc atc agc agg gat acc tcc aag aac cag gtt ttc tta 240 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 aaa ctg agc agt ctg caa act gaa gac aca gcc atg tac tac tgt act 288 Lys Leu Ser Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95 aga ggt ggg acg ggg ttt gac tac tgg ggc caa ggc acc act ctc aca 336 Arg Gly Gly Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr 100 105 110 gtc tcc tca 345 Val Ser Ser 115 <210> 227 <211> 115 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 227 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Phe Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Thr Met Gly Trp Asp Asp Lys Lys Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95 Arg Gly Gly Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 228 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(321) <223> SC16.105 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 228 gac att gtg atg acc cag tcg cac aaa ttc atg tcc aca tca gta gga 48 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 gac agg gtc agc atc acc tgc aag gcc agt cag gat gtg ggt act gct 96 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala 20 25 30 gta gcc tgg tat caa cag aaa cca ggg caa tct cct aaa cta ctg att 144 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tac tgg gca tcc atc cgg cac act gga gtc cct gat cgc ttc aca ggc 192 Tyr Trp Ala Ser Ile Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc att agc aat gtg cag tct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 gaa gac ttg gca gat tat ttc tgt cag caa tat agc agc tat ccg ctc 288 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg aaa 321 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 229 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 229 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Ile Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 230 <211> 363 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(363) <223> SC16.105 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 230 cag gtc caa ctg cag cag cct ggg gct gag ctt gtg aag cct ggg gct 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag ctg tcc tgc aag gct tct ggc tac acc ttc acc agc tac 96 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 tgg atg cac tgg gtg aag cag agg cct gga caa ggc ctt gag tgg att 144 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gtg att aat cct agc aac ggt cgt act aac tac aat gag aag ttc 192 Gly Val Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 aag agc aag gcc aca ctg act gta gac aaa tcc tcc agc aca gcc tac 240 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg caa ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gcg gtc tat tac tgt 288 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga aga agg gaa ctg gga acc ctc tat gct atg gac tac tgg ggt 336 Ala Arg Arg Arg Glu Leu Gly Thr Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 caa gga acc tca gtc acc gtc tcc tca 363 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 231 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 231 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 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Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg caa gat tat tct ctc acc atc agc agc ctg gag tat 240 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr 65 70 75 80 gaa gat atg gga att tat tat tgt cta cag tat gat gag ttt cca ttc 288 Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Phe 85 90 95 acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gaa ata aaa 321 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 233 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 233 Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr 65 70 75 80 Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 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95 aga ggt gtt tat gct atg gac tac tgg ggt caa gga acc tca gtc acc 336 Arg Gly Val Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr 100 105 110 gtc tcc tca 345 Val Ser Ser 115 <210> 235 <211> 115 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 235 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Phe Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 20 25 30 Glu Ile Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Ile 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Leu Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Arg Gly Val Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 236 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(321) <223> SC16.107 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 236 gac att gtg atg acc cag tct cac aaa ttc atg tcc aca tca gta gga 48 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 gac agg gtc agc atc acc tgc aag gcc agt cag gat gtg aat act gct 96 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 gta ggc tgg tat caa cag aaa cca gga caa tct cct aaa cta ctg att 144 Val Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tac tcg gca tcc tac cgg tac act gga gtc cct gat cgc ttc act ggc 192 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 agt gga tct ggg acg gat ttc act ttc acc atc agc agt gtg cag gct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 gaa gac ctg gca gtt tat tac tgt cag caa cat tat agt agt ccg tac 288 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Ser Pro Tyr 85 90 95 acg ttc gga ggg ggg acc aag gtg gaa ata aaa 321 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 237 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 237 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 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gga tat att aat cct tac aat gat ggt act aaa tac aat gag aag ttc 192 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 aaa ggc aag gcc aca ctg act tca gac aaa tcc tcc acc aca gcc tac 240 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gcg ctc agc agc ctg acc tct gag gac tct gcg gtc tat tac tgt 288 Met Ala Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca gta gcc tac tat agt aac tgg ggg ttt gct tac tgg ggc caa ggg 336 Ala Val Ala Tyr Tyr Ser Asn Trp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 act ctg gtc act gtc tct gca 357 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 239 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 239 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Ala Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Val Ala Tyr Tyr Ser Asn Trp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 240 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(321) <223> SC16.108 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 240 gac atc cag atg act cag tct cca gcc tcc cta tct gca tct gtg gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gaa act gtc acc atc aca tgt cga gca agt gag aat att tac agt tat 96 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 tta gca tgg tat cag cag aaa cag gga aaa tct cct cag ctc ctg gtc 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 tat aat gca aaa acc tta gca gaa ggt gtg cca tca agg ttc agt ggc 192 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt aga tca ggc tca cag ttt tct ctg aag atc aac agc ctg cag cct 240 Ser Arg Ser Gly Ser Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt ggg agt tat tac tgt caa cat cat tat ggt act ccg tac 288 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Tyr 85 90 95 acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa 321 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 241 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 241 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Ser Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 242 <211> 360 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(360) <223> 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Glu Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 ggc acc act ctc aca gtc tcc tca 360 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 243 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 243 Gln Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Tyr Trp Met Gln 20 25 30 Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile 35 40 45 Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe Lys Gly Lys 50 55 60 Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu 65 70 75 80 Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser 85 90 95 Pro Ala Tyr Tyr Arg Tyr Gly Glu Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 244 <211> 318 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(318) <223> SC16.109 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(318) <400> 244 caa att gtt ctc acc cag tct cca gca atc atg tct gca tct cca ggg 48 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile 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Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Phe Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Glu Trp Ser Gly Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Asp Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 246 <211> 354 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(354) <223> SC16.109 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(354) <400> 246 cag atc cag ttg gtg cag tct gga cct gag ctg aag aag cct gga gag 48 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 aca gtc aag atc tcc tgc aag gct tct ggg tat acc ttc aca aac tat 96 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 gga atg aac tgg gtg aag cag gct cca gga aag ggt tta aag tgg atg 144 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 ggc tgg ata aac acc tac act gga gag cca gca tat gct gat gac ttc 192 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Ala Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 aag gga cgg ttt gcc ttc tct ttg gaa acc tct gcc agc gct gcc tat 240 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Ala Ala Tyr 65 70 75 80 ttg cag atc aac aac ctc aaa aat gag gac acg gct act ttt ttc tgt 288 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Phe Phe Cys 85 90 95 gca aat atg agg ccc acg agg ggg ttt gct tac tgg ggg caa ggg act 336 Ala Asn Met Arg Pro Thr Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 ctg ggc act gtc tct gca 354 Leu Gly Thr Val Ser Ala 115 <210> 247 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 247 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Ala Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Ala Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Phe Phe Cys 85 90 95 Ala Asn Met Arg Pro Thr Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Gly Thr Val Ser Ala 115 <210> 248 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(321) <223> SC16.110 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 248 aat att gtg atg acc cag act ccc aaa ttc ctg ctt gta tca gca gga 48 Asn Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 gac agg gtt acc ata acc tgc aag gcc agt cag agt gtg agt aat gat 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 gta gct tgg tac caa cag aag cca ggg cag tct cct aaa ctg ctg ata 144 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tac tat gca tcc aat cgc tac act gga gtc cct gat cgc ttc act ggc 192 Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 agt gga tat ggg acg gat ttc act ttc acc atc agc act gtg cag gct 240 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala 65 70 75 80 gaa gac ctg gca gtt tat ttc tgt cag cag gat tat agc tct cct ccg 288 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Pro 85 90 95 acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa 321 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 249 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 249 Asn Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 250 <211> 354 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(354) <223> SC16.110 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(354) <400> 250 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tac tac agt 96 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Tyr Ser 20 25 30 tta gca tgg tat cag cag aag caa ggg aaa tct cct cag ctc ctg atc 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 tat aat gca aac agc ttg gaa gat ggt gtc cca tcg agg ttc agt ggc 192 Tyr Asn Ala Asn Ser Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca cag tat tct atg aag atc aac agc atg cag cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Met Lys Ile Asn Ser Met Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat acc gca act tat ttc tgt aag cag act tat gac gtt ccg ctc 288 Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Lys Gln Thr Tyr Asp Val Pro Leu 85 90 95 acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg aaa 321 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 253 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 253 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Tyr Ser 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Asn Ser Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Met Lys Ile Asn Ser Met Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Lys Gln Thr Tyr Asp Val Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 254 <211> 351 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(351) <223> SC16.111 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(351) <400> 254 gag gtt cag ctg cag cag tct gga cct gag ctg gag aag cct ggc gct 48 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag ata tcc tgc aag gct tct ggt tac tca ttc act ggc tac 96 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 aac atg aac tgg gtg aag cag agc aat gga aag agc ctt gag tgg att 144 Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Asn Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga aat att gat cct tat tat ggt ggt tct agc tac aaa cag aag ttc 192 Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Tyr Lys Gln Lys Phe 50 55 60 gag ggc aag gcc aca ttg act gta gac aaa tcc tcc agc aca gcc tac 240 Glu Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg cag ctc aag agc ctg aca tct gag gac tct gca gtc tat tac tgt 288 Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga ggt ggt agt aac ttc ttt gac tac tgg ggc caa ggc acc act 336 Ala Arg Gly Gly Ser Asn Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 ctc aca gtc tcc tca 351 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 255 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 255 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Asn Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Tyr Lys Gln Lys Phe 50 55 60 Glu Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Ser Asn Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 256 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(336) <223> SC16.113 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <400> 256 gat gtt gtg atg acc cag act cca ctc act ttg tcg gtt acc att gga 48 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 caa cca gcc tcc atc tct tgc aag tca agt cag agc ctc tta gat agt 96 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 gat gga acg aca tat ttg aat tgg ttg tta cag agg cca ggc cag tct 144 Asp Gly Thr Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 cca aag cgc cta atc tat ctg gtg tct aaa ctg gac tct gga gtc cct 192 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 gac agg ttc act ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca ctg aaa atc 240 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 agc aga gtg gag gct gag gat ttg gga gtt tat tat tgc tgg caa ggt 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 aca cat ttt ccg ctc acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg aaa 336 Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 257 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 257 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Thr Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 258 <211> 351 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(351) <223> SC16.113 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(351) <400> 258 gac gtg aag ctg gtg gag tct ggg gga ggc tta gtg aag cct gga ggg 48 Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc act ttc agt agc tat 96 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 acc atg tct tgg gtt cgc cag act ccg gag aag agg ctg gag tgg gtc 144 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 gca acc att agt agt ggt ggt agt tac ccc tac tat cca gac agt gtg 192 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Pro Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat gcc aag aac acc ctg tac 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg agc agt ctg aag tct gag gac aca gcc atg tat tac tgt 288 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 aca aga gat gtc tat gat ggt tac tcc tac tgg ggc caa ggc acc act 336 Thr Arg Asp Val Tyr Asp Gly Tyr Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 ctc aca gtc tcc tca 351 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 259 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 259 Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Pro Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Asp Val Tyr Asp Gly Tyr Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 260 <211> 318 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(318) <223> SC16.114 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(318) <400> 260 caa att gtt ctc tcc cag tct cca gca atc ctg tct gca tct cca ggg 48 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 gag aag gtc aca atg act tgc agg gcc agc tca agt gta agt tac atg 96 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 cac tgg tac cag cag aag cca gga tcc tcc ccc aaa ccc tgg att tat 144 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 gcc aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cct gct cgc ttc agt ggc agt 192 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 ggg tct ggg acc tct tac tct ctc aca atc agc aga gtg gag gct gaa 240 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 gat gct gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt agt aac cca tac acg 288 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Tyr Thr 85 90 95 ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa 318 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 261 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 261 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 262 <211> 369 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(369) <223> SC16.114 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(369) <400> 262 gag gtt cag ctg cag cag tct ggg gca gaa ctt gtg aag cca ggg gcc 48 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtc aaa ttg tcc tgc aca gct tct ggc ttc aac att aaa gac acc 96 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 tat ata cac tgg gtg aaa cag agg cct gaa cag ggc ctg gag tgg att 144 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga agg att gat cct gcg aat ggt aat act aaa tat gac ccg aag ttc 192 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 cag ggc aag gcc act ata aca cca gac aca tcc tcc aac aca gcc tac 240 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Pro Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ctg cag ctc agc agc ctg aca tct gag gac act gcc gtc tat tac tgt 288 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gct aga agc tgg cga aac tac ggt agt agt ttc tgg tac ttc gat gtc 336 Ala Arg Ser Trp Arg Asn Tyr Gly Ser Ser Phe Trp Tyr Phe Asp Val 100 105 110 tgg ggc gca ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 369 Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 263 <211> 123 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 263 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Pro Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Trp Arg Asn Tyr Gly Ser Ser Phe Trp Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 264 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(336) <223> SC16.115 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <400> 264 gat gtt gtg atg acc cag act cca ctc act ttg tcg gtt acc att gga 48 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 caa cca gcc tcc atc tct tgc aag tca agt cag agc ctc tta gat agt 96 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 gat gga acg aca tat ttg aat tgg ttg tta cag agg cca ggc cag tct 144 Asp Gly Thr Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 cca aag cgc cta atc tat ctg gtg tct aaa ctg gac tct gga gtc cct 192 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 gac agg ttc act ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca ctg aaa atc 240 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 agc aga gtg gag gct gag gat ttg gga gtt tat tat tgc tgg caa ggt 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 aca cat ttt ccg ctc acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg aaa 336 Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 265 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 265 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Thr Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 266 <211> 351 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(351) <223> SC16.115 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(351) <400> 266 gac gtg aag ctg gtg gag tct ggg gga ggc tta gtg aag cct gga ggg 48 Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc act ttc agt agc tat 96 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 acc atg tct tgg gtt cgc cag act ccg gag aag agg ctg gag tgg gtc 144 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 gca acc att agt agt ggt ggt agt tac ccc tac tat cca gac agt gtg 192 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Pro Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat gcc aag aac acc ctg tac 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg agc agt ctg aag tct gag gac aca gcc atg tat tac tgt 288 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 aca aga gat gtc tat gat ggt tac tcc tac tgg ggc caa ggc acc act 336 Thr Arg Asp Val Tyr Asp Gly Tyr Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 ctc aca gtc tcc tca 351 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 267 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 267 Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Pro Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Asp Val Tyr Asp Gly Tyr Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 268 <211> 333 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(333) <223> SC16.116 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(333) <400> 268 gac att gtg atg aca cag tct cca tcc tcc ctg act gtg aca gca gga 48 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 gag aag gtc act atg agc tgc acg tcc agt cag agt ctg tta acc agt 96 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Thr Ser Ser Gln Ser Leu Leu Thr Ser 20 25 30 gga aat caa aag aac tac ttg acc tgg tac cag cag aaa cca ggg cag 144 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 cct cct aaa ctg ttg atc tac tgg gca tcc act agg gaa tct ggg gtc 192 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 cct gat cgc ttc aca ggc agt gga tct gga aca gat ttc act ctc acc 240 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 atc agc agt ttg cag gct gaa gac ctg gca gtt tat tac tgt cag aat 288 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 gat tat agt ctc acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg aaa 333 Asp Tyr Ser Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 269 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 269 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Thr Ser Ser Gln Ser Leu Leu Thr Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Ser Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 270 <211> 354 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(354) <223> SC16.116 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(354) <400> 270 cag gtg cag ctg aag cag tca gga cct ggc cga gtg cag ccc tca cag 48 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Arg Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 agc ctg tcc atc acc tgc aca gtc tct ggt ttt tca tta act agc aat 96 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Asn 20 25 30 ggt gta cac tgg gtt cgc cag tct cca gga aag ggt ctg gag tgg ctg 144 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 gga gtg cta tgg agt ggt gga agc aca gac tat aat gca gct ttc ata 192 Gly Val Leu Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile 50 55 60 tcc aga ctg agc atc agc aag gac aat tac aag agc caa gtt ttc ttt 240 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Tyr Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 aaa atg aac agt ctg caa gct aat gac aca gcc ata tat tac tgt gcc 288 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 aga aat aat aat agg tac gga gct atg gac tac tgg ggt caa gga acc 336 Arg Asn Asn Asn Arg Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 tca gtc acc gtc tcc tca 354 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 271 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 271 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Arg Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Asn 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Leu Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Tyr Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asn Asn Asn Arg Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 272 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(321) <223> SC16.117 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 272 gac atc cag atg aac cag tct cca tcc agt ctg tct gca tcc ctt gga 48 Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gac aca att acc atc act tgc cat gtc agt cag aac att aat gtt tgg 96 Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Val Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp 20 25 30 tta agc tgg tac cag cag aaa cca gga aat att cct aaa cta ttg atc 144 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 caa aag gct tcc aac ttg cac aca ggc gtc ccc tca agg ttt agt ggc 192 Gln Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct gga aca ggt ttc aca tta acc atc agc agc ctg cag cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gac att gcc act tac tac tgt caa cag ggt caa agt tat cca ttc 288 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Phe 85 90 95 acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gaa ata aaa 321 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 273 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 273 Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Val Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Gln Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 274 <211> 351 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(351) <223> SC16.117 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(351) <400> 274 cag gtg cag ctg aag gag tca gga cct ggc ctg gtg gcg ccc tca cag 48 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 agc ctg tcc atc act tgc act gtc tct ggg ttt tca tta acc aac tat 96 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 ggt gta cac tgg gtt cgc cag cct cca gga aag ggt ctg gag tgg ctg 144 Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 gga gta ata tgg gct ggt gga atc aca aat tat aat tcg gct ctc atg 192 Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 tcc aga ctg agc atc agc gaa gac aac tcc aag agc caa gtt ttc tta 240 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Glu Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 aaa atg aac agt ctg caa act gat gac aca gcc atg tac tac tgt gcc 288 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 aga aat tta ggt ccc tat gct atg gac tac tgg ggt caa gga acc tca 336 Arg Asn Leu Gly Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 gtc acc gtc tcc tca 351 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 275 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 275 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Glu Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asn Leu Gly Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 276 <211> 333 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(333) <223> SC16.118 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(333) <400> 276 gac att gtg ctg acc caa tct cca gct tct ttg gct gtg tct cta ggg 48 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 cag agg gcc acc atc tcc tgc aag gcc agc caa agt gtt gat tat gat 96 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 ggt gat agt tat ttg acc tgg tac caa cag aaa cca gga cag cca ccc 144 Gly Asp Ser Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 aaa ctc ctc atc tat gct gca tcc aat cta gaa tct ggg atc cca gcc 192 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 agg ttt agt ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc acc ctc aac atc cat 240 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 cct gtg gag gag gag gac gct gca acc tat tac tgt cag caa agt aat 288 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 gag gat ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa 333 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 277 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 277 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 278 <211> 351 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(351) <223> SC16.118 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(351) <400> 278 gag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gac ctg gtg aag cct ggg gct 48 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag ata tcc tgc aag gct tct ggt tac tca ttc act ggc tac 96 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 tac atg cac tgg gtg aag cag agc cat gga aag agc ctt gag tgg att 144 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga cgt gtt aat cct aac aat ggt ggt act agc tac aac cag aag ttc 192 Gly Arg Val Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aag ggc aag gcc ata tta act gca gac aag tca tcc agc aca gcc tac 240 Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ctc cgc agc ctg aca tct gag gac tct gcg gtc tat tac tgt 288 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga ggg agt tat gat tac gcc gag ggc tgg ggc caa ggg act ctg 336 Ala Arg Gly Ser Tyr Asp Tyr Ala Glu Gly Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 gtc act gtc tct gca 351 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 279 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 279 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Val Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Tyr Asp Tyr Ala Glu Gly Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 280 <211> 339 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(339) <223> SC16.120 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(339) <400> 280 gac att gtg atg tca cag tct cca tcc tcc cta gct gtg tca gtt gga 48 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 gag aag gtt act atg agc tgc aag tcc agt cag agc ctt tta tat agt 96 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 agc act caa aag aac tac ttg gcc tgg tac cag cag aaa cca ggg cag 144 Ser Thr Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 tct cct aaa ctg ctg att tac tgg gca tcc act agg gaa tct ggg gtc 192 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 cct gat cgc ttc aca ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc 240 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 atc agc agt gtg aag gct gaa gac ctg gca gtt tat tac tgt cag caa 288 Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 tat tat agc tat ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata 336 Tyr Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 aaa 339 Lys <210> 281 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 281 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Thr Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 282 <211> 351 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(351) <223> SC16.120 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(351) <400> 282 gag atc cag ctg cag cag tct gga cct gag ctg gtg aag cct ggg gct 48 Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag gta tcc tgc aag gct tct ggt tat gca ttc act agc tac 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 aac atg tac tgg gtg atg cag agc cat gga aag agc ctt gag tgg att 144 Asn Met Tyr Trp Val Met Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga tat gtt gat cct tac aat ggt ggt act agc tac aac cag aag ttc 192 Gly Tyr Val Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aag ggc aag gcc aca ttg act gtt gac aag tcc tcc agc aca gcc tac 240 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg cat ctc aac agc ctg aca tct gag gac tct gca gtc tat tac tgt 288 Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga gaa aac tat agg tac ttt gac tac tgg ggc caa ggc acc act 336 Ala Arg Glu Asn Tyr Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 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agt tac atg 96 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 cac tgg ttc cag cag aag cca ggc act tct ccc aaa ctc tgg att tat 144 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45 agc aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cct gct cgc ttc agt ggc agt 192 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 gga tct ggg acc tct tac tct ctc aca atc agc cga atg gag gct gaa 240 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 gat gct gcc act tat tac tgc cag caa agg agt agt tac cca ccc acg 288 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Pro Thr 85 90 95 ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aar 318 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 285 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 285 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys 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Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 gaa gac ttg gca gag ttt ttc tgt cag caa tat aac agc tat cct ctg 288 Glu Asp Leu Ala Glu Phe Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa 321 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 289 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 289 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Glu Phe Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 290 <211> 354 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(354) <223> SC16.122 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(354) <400> 290 gaa gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc tta gtg aag cct gga ggg 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc act ttc agt gac tat 96 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 tac atg ttt tgg gtt cgc cag act ccg gaa aag agg ctg gag tgg gtc 144 Tyr Met Phe Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 gca acc att agt gat ggt ggt agt tac acc tac ttt cca gac agt gtg 192 Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Phe Pro Asp Ser Val 50 55 60 aag ggg cga ttc acc atc tcc aga gac aat gcc cag aac aac ctg tac 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Gln Asn Asn Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg agc agt ctg aag tct gag gac aca gcc atg tat tac tgt 288 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga gcc ggg acc ctc tat gct atg gac tac tgg ggt caa gga acc 336 Ala Arg Ala Gly Thr Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 tca gtc acc gtc tcc tca 354 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 291 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 291 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Phe Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Phe Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Gln Asn Asn Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Gly Thr Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 292 <211> 324 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(324) <223> SC16.123 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 292 caa att gtt ctc acc cag tct cca gca atc atg tct gca tct cta ggg 48 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gaa cgg gtc acc atg acc tgc act gcc agc tca agt gta agt tcc agt 96 Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 tac ttg cac tgg tac cag cag aag cca gga tcc tcc ccc aaa ctc tgg 144 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 att tat agc aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cca gct cgc ttc agt 192 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 ggc agt ggg tct ggg acc tct tac tct ctc aca atc agc agc atg gag 240 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 act gaa gat gct gcc act tat tac tgc cac cag tat cat cgt tcc ccc 288 Thr Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 ttc acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gaa ata aaa 324 Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 293 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 293 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 Thr Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 294 <211> 366 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(366) <223> SC16.123 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(366) <400> 294 cag gtt gct ctg aaa gag tct ggc cct ggg ata ttg cag ccc tcc cag 48 Gln Val Ala Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 acc ctc agt ctg act tgt tct ttc tct ggg ttt tca ctg agc act tct 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 ggt atg ggt gta ggc tgg att cgt cag cca tca ggg aag ggt ctg gag 144 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 tgg ctg gca cac att tgg tgg gat gat gtc aag cgc tat aac cca gcc 192 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys Arg Tyr Asn Pro Ala 50 55 60 ctg aag agc cga ctg act atc tcc aag gat acc tcc agc agc cag gta 240 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Ser Gln Val 65 70 75 80 ttc ctc aag atc gcc agt gtg gac act gca gat act gcc aca tac tac 288 Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 tgt gct cga atg gag gac tac ggt agt agc tcc tac ttt gac ttc tgg 336 Cys Ala Arg Met Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Ser Tyr Phe Asp Phe Trp 100 105 110 ggc cac ggc acc act ctc aca gtc tcc tca 366 Gly His Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 295 <211> 122 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 295 Gln Val Ala Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys Arg Tyr Asn Pro Ala 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Ser Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Met Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Ser Tyr Phe Asp Phe Trp 100 105 110 Gly His Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 296 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(321) <223> SC16.124 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 296 gac att cag atg acc cag tct cct gcc tcc cag tct gca tct ctg gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gaa agt gtc acc atc aca tgc ctg gca agt cag acc att ggt aca tgg 96 Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp 20 25 30 tta gca tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa tct cct cag ctc ctg att 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 tct gct gca acc agc ttg gca gat ggg gtc cca tca agg ttc agt ggt 192 Ser Ala Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggc aca aaa ttt tct ttc aag atc agc agc cta cag gct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 gaa gat ttt gta agt tat tac tgt caa caa ctt tac agt act ccg tgg 288 Glu Asp Phe Val Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Tyr Ser Thr Pro Trp 85 90 95 acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa 321 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 297 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 297 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Ala Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Phe Val Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Tyr Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 298 <211> 369 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(369) <223> SC16.124 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(369) <400> 298 gag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gag ctg gta aag cct ggg gct 48 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct gga tac aca ttc act agc tat 96 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 gtt atg cac tgg gtg aag cag aag cct ggg cag ggc ctt gag tgg att 144 Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga tat att aat cct tac aat gat ggt act aag tac aat gag aag ttc 192 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 aaa ggc aag gcc aca ctg act tca gac aaa tcc tcc agc aca gcc tac 240 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ctc agc agc ctg acc tct gag gac tct gcg gtc tat tac tgt 288 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga ggg gct ctc tac tat ggt aac tac ctc ggg tac ttc gat gtc 336 Ala Arg Gly Ala Leu Tyr Tyr Gly Asn Tyr Leu Gly Tyr Phe Asp Val 100 105 110 tgg ggc gca ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 369 Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 299 <211> 123 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 299 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Leu Tyr Tyr Gly Asn Tyr Leu Gly Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 300 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(321) <223> SC16.125 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 300 gac atc cag atg aac cag tct cca tcc agt ctg tct gca tcc ctt gga 48 Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gac aca att acc atc act tgc cat gcc agt cag aac att aat gtt tgg 96 Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp 20 25 30 tta agc tgg tac cag cag aaa cca gga aat att cct aaa cta ttg atc 144 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat aag gct tcc atc tta cac aca ggc gtc cca tca agg ttt agt ggc 192 Tyr Lys Ala Ser Ile Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct gga aca ggt ttc aca tta acc atc agc agc ctg cag cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gac att gcc act tac tcc tgt caa cag ggt caa agt tat ccg tac 288 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Ser Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Tyr 85 90 95 acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa 321 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 301 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 301 Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Ile Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Ser Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 302 <211> 354 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(354) <223> SC16.125 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(354) <400> 302 gat gtg cag ctt cag gag tca gga cct gac ctg gtg aaa cct tct cag 48 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 tca ctt tca ctc acc tgc act gtc act ggc tac tcc atc acc agt ggt 96 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 tat agc tgg cac tgg atc cgg cag ttt cca gga aac aaa ctg gaa tgg 144 Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 atg ggc tac ata cac tac agt ggt agc act aac tac aac cca tct ctc 192 Met Gly Tyr Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 aaa agt cga atc tct atc act cga gac aca tcc aag aac cag ttc ttc 240 Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 ctg cag ttc aaa tct gtg act act gaa gac tca gcc aca tat tac tgt 288 Leu Gln Phe Lys Ser Val Thr Thr Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcc cta gag ggg aat tac gac ggg ttt gct tac tgg ggc caa ggg act 336 Ala Leu Glu Gly Asn Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 ctg gtc act gtc tct tcn 354 Leu Val Thr Val Ser Xaa 115 <210> 303 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (118)..(118) <223> The 'Xaa' at location 118 stands for Ser. <400> 303 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Gln Phe Lys Ser Val Thr Thr Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Leu Glu Gly Asn Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Xaa 115 <210> 304 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(321) <223> SC16.126 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 304 gac atc cag atg aac cag tct cca tcc agt ctg tct gca tcc ctt gga 48 Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gac aca att acc atc act tgc cat gcc agt cag aac ata aat gtt tgg 96 Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp 20 25 30 tta agc tgg tac cag cag aaa cca gga aat att cct aaa cta ttg atc 144 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat aag gct tcc aac ttg cac aca ggc gtc cca tca agg ttt agt ggc 192 Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct gga aca ggt ttc aca tta acc atc agc agc ctg cag cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gac att gcc act tac tac tgt caa cag ggt caa agt tat cca ttc 288 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Phe 85 90 95 acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gaa ata aaa 321 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 305 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 305 Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 306 <211> 348 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(348) <223> SC16.126 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(348) <400> 306 cag gtg cag atg aag gag tca gga cct ggc ctg gtg gcg ccc tca cag 48 Gln Val Gln Met Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 agc ctg tcc atc act tgc act gtc tct ggg tct tca tta acc aac tat 96 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Ser Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 ggt gta cac tgg gtt cgc cag cct cca gga aag ggt cta gag tgg ctg 144 Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 gga gta ata tgg gct ggt gga agc aca aat tat aat tcg gct ctc atg 192 Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 tcc aga ctg agt atc agc aaa gac aac tcc aag agc caa gtt ttc tta 240 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 aaa atg aac agt ctg caa act gat gac aca gcc atg tac tac tgt gcc 288 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 aga gac tgg gag ggc tgg ttt gct tac tgg ggc caa ggg act ctg gtc 336 Arg Asp Trp Glu Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 act gtc tct gca 348 Thr Val Ser Ala 115 <210> 307 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 307 Gln Val Gln Met Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Ser Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Trp Glu Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ala 115 <210> 308 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(321) <223> SC16.129 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 308 gac att cag atg acc cag tct cct gcc tcc cag tct gca tct ctg gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gaa agt gtc acc atc aca tgc ctg gca agt cag acc att ggt aca tgg 96 Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp 20 25 30 tta gca tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa tct cct cag ctc ctg att 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 tat gct gca acc agc ttg gca gat ggg gtc cca tca agg ttc agt ggt 192 Tyr Ala Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggc aca aaa ttt tct ttc aag atc agc agc cta cag gct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 gaa gat ttt gta agt tat tac tgt caa caa ctt tac agt act ccg tac 288 Glu Asp Phe Val Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Tyr Ser Thr Pro Tyr 85 90 95 acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa 321 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 309 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 309 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Phe Val Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Tyr Ser Thr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 310 <211> 348 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(348) <223> SC16.129 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(348) <400> 310 cag gtg cag cta aag gag tca gga cct ggc ctg gtg gcg ccc tca cag 48 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 agc ctg tcc atc aca tgc act gtc tca ggg ttc tca tta acc gac tat 96 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr 20 25 30 ggt gta agc tgg att cgc cag cct cca gga aag ggt ctg gag tgg ctg 144 Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 gga gta ata tgg ggt ggt gga agc aca tac tat aat tca gct ctc aaa 192 Gly Val Ile Trp Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 tcc aga ctg agc atc agc aag gac aac tcc aag agc caa gtt ttc tta 240 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 gaa ctg aac agt ctg caa act gat gac aca gcc att tac tac tgt gcc 288 Glu Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 aaa cat tat ggt cac tac gct gct tac tgg ggc caa ggg act ctg gtc 336 Lys His Tyr Gly His Tyr Ala Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 act gtc tct gca 348 Thr Val Ser Ala 115 <210> 311 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 311 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr 20 25 30 Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Glu Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala 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tat tat tac tgt caa cat ttt tgg act act ccg tgg 288 Glu Asp Phe Gly Tyr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Thr Thr Pro Trp 85 90 95 aca ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa 321 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 313 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 313 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Ser Ile His Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Tyr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Thr Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 314 <211> 360 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(360) <223> SC16.130 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <400> 314 gag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gag ctg gta aag cct ggg gct 48 Glu 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aag gct tct ggt tac tca ttc act ggc tac 96 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 tac atg cac tgg gtg aag cag agc cat gga aag agg ctt gag tgg att 144 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga cgt gtt aat cct aac aat ggt ggt act aac tac aac cag aaa ttc 192 Gly Arg Val Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aag ggc aag gcc ata tta act gta gac aag tca tcc agc aca gcc tac 240 Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ctc cgc agc ctg aca tct gag gac tct gcg gtc tat tac tgt 288 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga ggg agt tat gat aac gcc gag ggc tgg ggc caa ggg act ctg 336 Ala Arg Gly Ser Tyr Asp Asn Ala Glu Gly Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 gtc act gtc tct gca 351 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 331 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 331 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 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Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 tat cgt gca aac aga ttg gta gat ggg gtc cca tca agg ttc agt ggc 192 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg caa gat tat tct ctc acc atc agc agc ctg gag tat 240 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr 65 70 75 80 gaa gat atg gga att tat tat tgt cta cag tat gat gag ttt cca ttc 288 Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Phe 85 90 95 acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gaa ata aaa 321 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 333 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 333 Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Arg Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr 65 70 75 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agc agc ctg aca tct gct gac tct gcg gtc tat ttc tgt 288 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Ala Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 gca aga tcg gac tat gat tac gcc ttc tat gct atg gac tac tgg ggt 336 Ala Arg Ser Asp Tyr Asp Tyr Ala Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 caa gga acc tca gtc acc gtc tcc tca 363 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 335 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 335 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Ser Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ala Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Ala Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Asp Tyr Asp Tyr Ala Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 336 <211> 321 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acc aag ctg gaa atc aaa 321 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 337 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 337 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro His Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 338 <211> 366 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(366) <223> SC16.136 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(366) <400> 338 gag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gag ctg gta aag cct ggg gct 48 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct gga tac aca ttc act agc tat 96 Ser Val 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atg agc agt ctg aag tct gag gac aca gcc atg tat tac tgt 288 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga cga aga gcc gat gct atg gac tac tgg ggt caa gga acc tca 336 Ala Arg Arg Arg Ala Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 gtc acc gtc tcc tca 351 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 343 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 343 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Arg Ala Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 344 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature 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192 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 agt gga tct ggg acg gat ttc act ttc acc atc agc agt gtg cag gct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 gaa gac ctg gca gtt tat tac tgt cag caa cat tat agt agt ccg tac 288 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Ser Pro Tyr 85 90 95 acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa att aaa 321 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 349 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 349 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Ser Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 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Tyr Cys 85 90 95 gca gta gcc tac tat agt aac tgg ggg ttt gct tac tgg ggc caa ggg 336 Ala Val Ala Tyr Tyr Ser Asn Trp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 act ctg gtc act gtc tct gca 357 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 351 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 351 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Ala Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Val Ala Tyr Tyr Ser Asn Trp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 352 <211> 333 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(333) <223> SC16.140 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(333) <400> 352 gac att gtg ctg aca cag tct ctt gct tcc tta gct gta tct ctg ggg 48 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Leu Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 cag agg gcc acc atc tca tgc agg gcc agc aaa agt gtc agt aca tct 96 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 ggc tat agt tat atg cac tgg tac caa cag aaa cca gga cag cca ccc 144 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 aaa ctc ctc att tat ctt gca tcc aac cta gaa tct ggg gtc cct gcc 192 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc acc ctc aac atc cat 240 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 cct gtg gaa gac gaa gat gct gca acc tat tac tgt cag cac agt agg 288 Pro Val Glu Asp Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 gag ctt ccg ttc acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aag 333 Glu Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 353 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 353 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Leu Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Asp Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Glu Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 354 <211> 348 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(348) <223> SC16.140 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(348) <400> 354 cag gtc caa ctg cag cag tct ggg cct gag ctg gtg agg cct ggg gct 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tca ggc tat acc ttc acc agc tac 96 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 tgg atg cac tgg gtg aaa cag agg cct gga caa ggc ctt gag tgg att 144 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 ggc atg att gat cct tcc aat agt gaa act agg tta aat cag aag ttc 192 Gly Met Ile Asp Pro Ser Asn Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aag gac aag gcc aca ttg aat gta gac aaa tcc tcc aac aca gcc tac 240 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Asn Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg cag ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gca gtc tat tac tgt 288 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca gta atg gac tac tac ttt gac tac tgg ggc caa ggc acc act ctc 336 Ala Val Met Asp Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 100 105 110 aca gtc tcc tca 348 Thr Val Ser Ser 115 <210> 355 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 355 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile Asp Pro Ser Asn Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Asn Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Val Met Asp Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 356 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(321) <223> SC16.141 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 356 gac atc aag atg acc cag tct cca tct tcc atg tat gca tct cta gga 48 Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gag aga gtc act atc act tgc aag gcg agt cag gac att aat agc tat 96 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr 20 25 30 tta agc tgg ttc cag cag aaa cca ggg aaa tct cct aag acc ctg atc 144 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 tat cgt gca aac aga ttg gta gat ggg gtc cca tca agg ttc agt ggc 192 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg caa gat tat tct ctc acc atc agc agc ctg gag tat 240 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr 65 70 75 80 gaa gat atg gga att tat tat tgt cta cag tat gat gag ttt cca ttc 288 Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Phe 85 90 95 acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gaa ata aaa 321 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 357 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 357 Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr 65 70 75 80 Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 358 <211> 345 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(345) <223> SC16.141 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(345) <400> 358 cag gtg caa ctg aag cag tca gga cct ggc ctg gtg gcg ccc tca cag 48 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 agc ctg ttc atc aca tgc acc gtc tca ggg ttc tca tta acc agc tat 96 Ser Leu Phe Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 20 25 30 gaa ata aac tgg gtt cgc cag cct cca gga aag ggt ctg gag tgg ctg 144 Glu Ile Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 gga gtg ata tgg act ggt gga agc aca aat tat aat tca gct ctc ata 192 Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Ile 50 55 60 tcc aga ctg agc atc agc aaa gac aac tcc aag agc cta gtt ttc tta 240 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Leu Val Phe Leu 65 70 75 80 aaa atg aac agt ctg caa act gat gac aca gcc ata tat tac tgt gta 288 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 aga ggt gtt tat gct atg gac tac tgg ggt caa gga acc tca gtc acc 336 Arg Gly Val Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr 100 105 110 gtc tcc tca 345 Val Ser Ser 115 <210> 359 <211> 115 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 359 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Phe Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 20 25 30 Glu Ile Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Ile 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Leu Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Arg Gly Val Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 360 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(321) <223> SC16.142 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 360 gac atc aag atg acc cag tct cca tct tcc atg tat gca tct cta gga 48 Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gag aga gtc act atc act tgc aag gcg agt cag gac att aat aat tat 96 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 tta agc tgg ttc cag cag aaa cca ggg aaa tct cct aag acc ctg atc 144 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 tat cgt gca aac aga ttg gta gat ggg gtc cca tca agg ttc agt ggc 192 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg caa gat tat tct ctc acc atc agc agc ctg gag tat 240 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr 65 70 75 80 gaa gat atg gga att tat tat tgt cta cag tat gat gag ttt ccg tac 288 Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr 85 90 95 acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa 321 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 361 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 361 Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr 65 70 75 80 Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 362 <211> 345 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(345) <223> SC16.142 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(345) <400> 362 gag gtc cag ctt cag cag tca gga cct gag ctg gtg aaa cct ggg gcc 48 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag ata tcc tgc aag gct tct gga tac aca ttc act gac tac 96 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 aac atg cac tgg gtg aag cag agc cat gga aag agc ctt gag tgg att 144 Asn Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga ttc ttt tat cct tac aac ggt aat act gtc tac agc cag aag ttc 192 Gly Phe Phe Tyr Pro Tyr Asn Gly Asn Thr Val Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 aag agc aag gcc aca ttg act gta gac aat tcc tcc agc aca gcc tac 240 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ctc cgc agc ctg aca tct gag gac tct gca gtc tat tac tgt 288 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga ctt aac tgg gag ggc tac tgg ggc caa ggc acc acc ctc acv 336 Ala Arg Leu Asn Trp Glu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Xaa 100 105 110 gtn tcn tcn 345 Val Xaa Xaa 115 <210> 363 <211> 115 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (112)..(112) <223> The 'Xaa' at location 112 stands for Thr. <220> <221> misc_feature <222> (114)..(114) <223> The 'Xaa' at location 114 stands for Ser. <220> <221> misc_feature <222> (115)..(115) <223> The 'Xaa' at location 115 stands for Ser. <400> 363 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Phe Phe Tyr Pro Tyr Asn Gly Asn Thr Val Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Asn Trp Glu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Xaa 100 105 110 Val Xaa Xaa 115 <210> 364 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(336) <223> SC16.143 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <400> 364 gat gtt ttg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga 48 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag agc att gta cat agt 96 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 aat gga aac acc tat tta gaa tgg tac ctg cag aaa cca ggc cag tct 144 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca 192 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca ctc aag atc 240 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat tac tgc ttt caa ggt 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 tca cat gtt ccg ctc acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg aaa 336 Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 365 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 365 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 366 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(357) <223> SC16.143 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(357) <400> 366 cag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gag ctg gtg aag cct ggg gct 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg agg ata tcc tgc aag gct tct ggc tac acc ttc aca agc tac 96 Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 tat ata cac tgg gtg aag cag agg cct gga cag gga ctt gag tgg att 144 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga tgg att tat cct gga aat ggt aat act aag tac aat gag aag ttc 192 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 aag ggc aag gcc aca ctg act gca gac aaa tcc tcc agc aca gcc tac 240 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg cag atc agc agc ctg acc tct gag gac tct gcg gtc tat ttc tgt 288 Met Gln Ile Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 gca aga gag aga tgg tta cta cta tgg ttt gct tac tgg ggc caa ggg 336 Ala Arg Glu Arg Trp Leu Leu Leu Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 act ctg gtc act gtc tct gca 357 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 367 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 367 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Ile Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Trp Leu Leu Leu Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 368 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(321) <223> SC16.144 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 368 agt att gtg atg acc cag act ccc aaa ttc ctg ctt gta tca gca gga 48 Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 gac agg gtt acc ata acc tgc aag gcc agt cag agt gtg agt aat gat 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 gta ggt tgg tac caa cag aag cca ggg cag tct cct aaa ctg ctg ata 144 Val Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tac tat gca tcc aat cgc tac aat gga gtc cct gat cgc ttc act ggc 192 Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Asn Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 agt gga tat ggg acg gat ttc act ttc acc atc agc act gtg cag gct 240 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala 65 70 75 80 gaa gac ctg gca gtt tat ttc tgt cag cag gat tat agc tct ccg tgg 288 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Trp 85 90 95 acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa 321 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 369 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 369 Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Asn Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 370 <211> 354 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(354) <223> SC16.144 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(354) <400> 370 cag atc cag ttg gtg cag tct gga cct gag ctg aag aag cct gga gag 48 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 aca gtc aag atc tcc tgc aag gct tct ggg tat acc ttc aca aac tat 96 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 gga atg aac tgg gtg aag cag gct cca gga aag ggt tta aag tgg gtg 144 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Val 35 40 45 ggc tgg ata aac acc tac act gga gag cca aca tat gct gat gac ttc 192 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 aag gga cgg ttt gcc ttc tct ttg gaa acc tct gcc agc act gcc tat 240 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ttg cag atc gac aac ctc aaa aat gag gac acg gct aca tat ttc tgt 288 Leu Gln Ile Asp Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 gca aga gtg ggg gat tac gtc ggc ttt gac tac tgg ggc caa ggc acc 336 Ala Arg Val Gly Asp Tyr Val Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 act ctc aca gtc tcc tca 354 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 371 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 371 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser 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Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tac tac aca tca aga tta cac tca gga gtc cca tca agg ttc agt ggc 192 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt ggg tct gga aca gat tat tct ctc acc att agc atc ctg gaa caa 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ile Leu Glu Gln 65 70 75 80 gaa gat att gcc act tac ttt tgc caa cag ggt gat acg ctt ccg tgg 288 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asp Thr Leu Pro Trp 85 90 95 acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa 321 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 373 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 373 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Ala Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ile Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr 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gac acg act aca tat ttc tgt 288 Leu Gln Ile Asn Asp Leu Lys Asn Glu Asp Thr Thr Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 ggt att tac gac ggg tat gct atg gac tac tgg ggt caa gga acc tca 336 Gly Ile Tyr Asp Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 gtc acc gtc tcc tca 351 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 375 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 375 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Thr Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Leu His Trp Val Lys Gln Ala Leu Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Ala Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asp Leu Lys Asn Glu Asp Thr Thr Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Gly Ile Tyr Asp Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 376 <211> 318 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(318) <223> 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cag gct cca gga aag ggt tta aag tgg atg 144 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 ggc tgg ata aac acc tac act gga gag cca aca tat gct gat gac ttc 192 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 aag gga cgg ttt gcc ttc tct ttg gaa acc tct gcc agg att gtc tat 240 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Arg Ile Val Tyr 65 70 75 80 ttg cag atc aac aac ctc aaa aat gag gac acg gct aca tat ttc tgt 288 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 gca aaa tat gag gcc cac gag ggg ttt gtt tat tgg ggc caa ggg act 336 Ala Lys Tyr Glu Ala His Glu Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 ctg gtc act gtc tct gca 354 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 379 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 379 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 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aga gac tgg gag ggc tgg ttt gct tac tgg ggc caa ggg act ctg gtc 336 Arg Asp Trp Glu Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 act gtc tct gca 348 Thr Val Ser Ala 115 <210> 383 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 383 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Phe 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Ile Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Trp Glu Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ala 115 <210> 384 <211> 339 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(339) <223> SC16.150 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(339) <400> 384 gac att gtg atg tca cag tct cca tcc tcc cta act gtg tca gtt gga 48 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ctt gag tgg att 144 Asn Met Tyr Trp Val Ser Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga tat att gat cct tac aat ggt ggc act agc tac aac cag aag ttc 192 Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 agg ggc aag gcc aca ttg act gtt gac aag tcc tca agc aca gcc tac 240 Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg cat ctc aac agc ctg aca tct gag gac tcg gca gtc tat tat tgt 288 Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga gag aac tat agg tac ttt gac ttc tgg ggc caa ggc acc act 336 Ala Arg Glu Asn Tyr Arg Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 ctc aca gtc tcc tca 351 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 387 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 387 Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met Tyr Trp Val Ser Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr 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192 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cct gaa 240 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 gat ttt gca act tac tac tgt caa cag tgg cgt agt aac cca ttc acg 288 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 ttc ggc cag ggg aca aag ttg gaa ata aaa 318 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 389 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 389 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 390 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(372) <223> HSC16.13 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(372) <400> 390 cag atc acc ttg aag gag tct ggt cct acg ctg gtg aaa ccc aca cag 48 Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 acc ctc acg ctg acc tgc acc ttc tct ggg ttc tca ctc agc act agt 96 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 gga atg ggt gtg ggc tgg atc cgt cag ccc cca gga aag gcc ctg gag 144 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 tgg ctt gca cac att tgg tgg gat gat gtt aag cgc tac agc cca tct 192 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys Arg Tyr Ser Pro Ser 50 55 60 ctg aag agc agg ctc acc atc acc aag gac acc tcc aaa aac cag gtg 240 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 gtc ctt aca atg acc aac atg gac cct gtg gac aca gcc aca tat tac 288 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 tgt gca cgc ata gtt tcc ttt gat aac gac gtt gtc tct gct atg gac 336 Cys Ala Arg Ile Val Ser Phe Asp Asn Asp Val Val Ser Ala Met Asp 100 105 110 tac tgg ggt caa gga acc cta gtc acc gtc tcc tcc 372 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 391 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 391 Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys Arg Tyr Ser Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ile Val Ser Phe Asp Asn Asp Val Val Ser Ala Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 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Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Lys Gln Ala Tyr Asp Val Pro Pro 85 90 95 acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa 321 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 393 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 393 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Tyr Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Thr Ala Asn Ser Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Lys Gln Ala Tyr Asp Val Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 394 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(351) <223> HSC16.15 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(351) <400> 394 cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg gcc 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag gtt tcc tgc aag gca tct gga tac acc ttc acc agg tac 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 tgg ata cac tgg ata cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg 144 Trp Ile His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 gga tac atc aac cct aca act gtt tat act gag ttc aat cag aac ttc 192 Gly Tyr Ile Asn Pro Thr Thr Val Tyr Thr Glu Phe Asn Gln Asn Phe 50 55 60 aag gac aga gtc acc atg acc agg gac acg tcc acg agc aca gtc tac 240 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg tat tac tgt 288 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aga ggc ggt agt aac ttc ttt gac tac tgg ggc caa ggc acc act 336 Ala Arg Gly Gly Ser Asn Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 gtc aca gtc tcc tca 351 Val Thr Val Ser Ser 115 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acc tgc agt gcc agt agc agt gtg agc tac atg 96 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 cac tgg tac cag cag aaa cca gat cag tct cca aag ctc ctc atc aag 144 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Lys 35 40 45 gat agt tcc aaa ctc gcc tca ggg gtc ccc tcg agg ttc agt ggc agt 192 Asp Ser Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 gga tct ggg aca gat ttc acc ctc acc atc aat agc ctg gaa gct gaa 240 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80 gat gct gca acg tat tac tgt cag cag tgg agt agt aac ccg ctc acg 288 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 ttc ggt cag ggg acc aag ctg gag atc aaa 318 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 397 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 397 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser 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Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 407 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Gly Asp Ser Ser Pro Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 408 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSC16.13 CDRL1 <400> 408 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr 1 5 10 <210> 409 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSC16.13 CDRL2 <400> 409 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 410 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSC16.13 CDRL3 <400> 410 Gln Gln Trp Arg Ser Asn Pro Phe Thr 1 5 <210> 411 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSC16.15 CDRL1 <400> 411 Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Tyr Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 412 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSC16.15 CDRL2 <400> 412 Thr Ala Asn Ser Leu Glu Asp 1 5 <210> 413 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSC16.15 CDRL3 <400> 413 Lys Gln Ala Tyr Asp Val Pro Pro Thr 1 5 <210> 414 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSC16.25 CDRL1 <400> 414 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His 1 5 10 <210> 415 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSC16.25 CDRL2 <400> 415 Asp Ser Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 416 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSC16.25 CDRL3 <400> 416 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 1 5 <210> 417 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSC16.34 CDRL1 <400> 417 Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala 1 5 10 <210> 418 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSC16.34 CDRL2 <400> 418 Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Ser 1 5 <210> 419 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSC16.34 CDRL3 <400> 419 Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 420 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSC16.56 CDRL1 <400> 420 Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Val 1 5 10 <210> 421 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSC16.56 CDRL2 <400> 421 Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 1 5 <210> 422 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSC16.56 CDRL3 <400> 422 Gln Gln Asp Tyr Thr Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 423 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSC16.13 CDRH1 <400> 423 Thr Ser Gly Met Gly Val Gly 1 5 <210> 424 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSC16.13 CDRH2 <400> 424 His Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys Arg Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 425 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSC16.13 CDRH3 <400> 425 Ile Val Ser Phe Asp Asn Asp Val Val Ser Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 426 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSC16.15 CDRH1 <400> 426 Arg Tyr Trp Ile His 1 5 <210> 427 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSC16.15 CDRH2 <400> 427 Tyr Ile Asn Pro Thr Thr Val Tyr Thr Glu Phe Asn Gln Asn Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 428 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSC16.15 CDRH3 <400> 428 Gly Gly Ser Asn Phe Phe Asp Tyr 1 5 <210> 429 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSC16.25 CDRH1 <400> 429 Thr Ser Gly Met Gly Val Gly 1 5 <210> 430 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSC16.25 CDRH2 <400> 430 Asp Ile Trp Trp Asp Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 431 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSC16.25 CDRH3 <400> 431 Arg Val Asn Tyr Tyr Tyr Asp Pro Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 432 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSC16.34 CDRH1 <400> 432 Asn Tyr Gly Met Asn 1 5 <210> 433 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSC16.34 CDRH2 <400> 433 Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Asp Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 434 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSC16.34 CDRH3 <400> 434 Ile Gly Gly Asn Ser Pro Ser Asp Tyr 1 5 <210> 435 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSC16.56 CDRH1 <400> 435 Asn Tyr Gly Met Asn 1 5 <210> 436 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSC16.56 CDRH2 <400> 436 Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 437 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSC16.56 CDRH3 <400> 437 Ile Gly Asp Ser Ser Pro Ser Asp Tyr 1 5

Claims (57)

  1. 하기 화학식의 ADC1, ADC2, ADC3, ADC4 및 ADC5로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 접합체.
    Figure pct00104
    ,
    Figure pct00105
    ,
    Figure pct00106
    ,
    Figure pct00107

    및
    Figure pct00108

    상기 화학식에서, Ab는 항-DLL3 항체 또는 이의 면역반응성 단편을 포함한다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항-DLL3 항체가 모노클로날 항체를 포함하는, 접합체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가, 키메라 항체, 인간화된 항체 및 인간 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 접합체.
  4. 제2항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 고갈성 항체를 포함하는, 접합체.
  5. 제2항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 내재화 항체를 포함하는, 접합체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-DLL3 항체 또는 이의 면역반응성 단편이, 3개의 상보성 결정 영역을 갖는 경쇄 가변 영역 및 3개의 상보성 결정 영역을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서, 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역은 도 3a에 제시되어 있고, 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역은 도 3b에 제시되어 있는, 접합체.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-DLL3 항체 또는 이의 면역반응성 단편이 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서, 상기 경쇄 가변 영역은, 서열번호 21, 서열번호 25, 서열번호 29, 서열번호 33, 서열번호 37, 서열번호 41, 서열번호 45, 서열번호 49, 서열번호 53, 서열번호 57, 서열번호 61, 서열번호 65, 서열번호 69, 서열번호 73, 서열번호 77, 서열번호 81, 서열번호 85, 서열번호 89, 서열번호 93, 서열번호 97, 서열번호 101, 서열번호 105, 서열번호 109, 서열번호 113 , 서열번호 117, 서열번호 121, 서열번호 125, 서열번호 129, 서열번호 133, 서열번호 137, 서열번호 141, 서열번호 145, 서열번호 149, 서열번호 153, 서열번호 157, 서열번호 161, 서열번호 165, 서열번호 169, 서열번호 173, 서열번호 177, 서열번호 181, 서열번호 185, 서열번호 189, 서열번호 193, 서열번호 197, 서열번호 201, 서열번호 205, 서열번호 209, 서열번호 213, 서열번호 217, 서열번호 221, 서열번호 225, 서열번호 229, 서열번호 233, 서열번호 237, 서열번호 241, 서열번호 245, 서열번호 249, 서열번호 253, 서열번호 257, 서열번호 261, 서열번호 265, 서열번호 269, 서열번호 273, 서열번호 277, 서열번호 281, 서열번호 285, 서열번호 289, 서열번호 293, 서열번호 297, 서열번호 301, 서열번호 305, 서열번호 309, 서열번호 313, 서열번호 317, 서열번호 321, 서열번호 325, 서열번호 329, 서열번호 333, 서열번호 337, 서열번호 341, 서열번호 345, 서열번호 349, 서열번호 353, 서열번호 357, 서열번호 361, 서열번호 365, 서열번호 369, 서열번호 373, 서열번호 377, 서열번호 381 및 서열번호 385로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 60% 이상 상동성인 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은, 서열번호 23, 서열번호 27, 서열번호 31, 서열번호 35, 서열번호 39, 서열번호 43, 서열번호 47, 서열번호 51, 서열번호 55, 서열번호 59, 서열번호 63, 서열번호 67, 서열번호 71, 서열번호 75, 서열번호 79, 서열번호 83, 서열번호 87, 서열번호 91, 서열번호 95, 서열번호 99, 서열번호 103, 서열번호 107, 서열번호 111, 서열번호 115, 서열번호 119, 서열번호 123, 서열번호 127, 서열번호 131, 서열번호 135, 서열번호 139 서열번호 143, 서열번호 147, 서열번호 151, 서열번호 155, 서열번호 159, 서열번호 163, 서열번호 167, 서열번호 171, 서열번호 175, 서열번호 179, 서열번호 183, 서열번호 187, 서열번호 191, 서열번호 195, 서열번호 199, 서열번호 203, 서열번호 207, 서열번호 211, 서열번호 215, 서열번호 219, 서열번호 223, 서열번호 227, 서열번호 231, 서열번호 235, 서열번호 239, 서열번호 243, 서열번호 247, 서열번호 251, 서열번호 255, 서열번호 259, 서열번호 263, 서열번호 267, 서열번호 271, 서열번호 275, 서열번호 279, 서열번호 283, 서열번호 287, 서열번호 291, 서열번호 295, 서열번호 299, 서열번호 303, 서열번호 307 서열번호 311, 서열번호 315, 서열번호 319, 서열번호 323, 서열번호 327, 서열번호 331, 서열번호 335, 서열번호 339, 서열번호 343, 서열번호 347, 서열번호 351, 서열번호 355, 서열번호 359, 서열번호 363, 서열번호 367, 서열번호 371, 서열번호 375, 서열번호 379, 서열번호 383 및 서열번호 387로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 60% 이상 상동성인 아미노산 서열을 포함하는, 접합체.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-DLL3 항체가, SC16.3, SC16.4, SC16.5, SC16.7, SC16.8, SC16.10, SC16.11, SC16.13, SC16.15, SC16.18, SC16.19, SC16.20, SC16.21, SC16.22, SC16.23, SC16.25, SC16.26, SC16.29, SC16.30, SC16.31, SC16.34, SC16.35, SC16.36, SC16.38, SC16.41, SC16.42, SC16.45, SC16.47, SC16.49, SC16.50, SC16.52, SC16.55, SC16.56, SC16.57, SC16.58, SC16.61, SC16.62, SC16.63, SC16.65, SC16.67, SC16.68, SC16.72, SC16.73, SC16.78, SC16.79, SC16.80, SC16.81, SC16.84, SC16.88, SC16.101, SC16.103, SC16.104, SC16.105, SC16.106, SC16.107, SC16.108, SC16.109, SC16.110, SC16.111, SC16.113, SC16.114, SC16.115, SC16.116, SC16.117, SC16.118, SC16.120, SC16.121, SC16.122, SC16.123, SC16.124, SC16.125, SC16.126, SC16.129, SC16.130, SC16.131, SC16.132, SC16.133, SC16.134, SC16.135, SC16.136, SC16.137, SC16.138, SC16.139, SC16.140, SC16.141, SC16.142, SC16.143, SC16.144, SC16.147, SC16.148, SC16.149 및 SC16.150으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항체로부터 유도되는, 접합체.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-DLL3 항체 또는 이의 면역반응성 단편이 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서, 상기 경쇄 가변 영역은, 서열번호 21, 서열번호 25, 서열번호 29, 서열번호 33, 서열번호 37, 서열번호 41, 서열번호 45, 서열번호 49, 서열번호 53, 서열번호 57, 서열번호 61, 서열번호 65, 서열번호 69, 서열번호 73, 서열번호 77, 서열번호 81, 서열번호 85, 서열번호 89, 서열번호 93, 서열번호 97, 서열번호 101, 서열번호 105, 서열번호 109, 서열번호 113 , 서열번호 117, 서열번호 121, 서열번호 125, 서열번호 129, 서열번호 133, 서열번호 137, 서열번호 141, 서열번호 145, 서열번호 149, 서열번호 153, 서열번호 157, 서열번호 161, 서열번호 165, 서열번호 169, 서열번호 173, 서열번호 177, 서열번호 181, 서열번호 185, 서열번호 189, 서열번호 193, 서열번호 197, 서열번호 201, 서열번호 205, 서열번호 209, 서열번호 213, 서열번호 217, 서열번호 221, 서열번호 225, 서열번호 229, 서열번호 233, 서열번호 237, 서열번호 241, 서열번호 245, 서열번호 249, 서열번호 253, 서열번호 257, 서열번호 261, 서열번호 265, 서열번호 269, 서열번호 273, 서열번호 277, 서열번호 281, 서열번호 285, 서열번호 289, 서열번호 293, 서열번호 297, 서열번호 301, 서열번호 305, 서열번호 309, 서열번호 313, 서열번호 317, 서열번호 321, 서열번호 325, 서열번호 329, 서열번호 333, 서열번호 337, 서열번호 341, 서열번호 345, 서열번호 349, 서열번호 353, 서열번호 357, 서열번호 361, 서열번호 365, 서열번호 369, 서열번호 373, 서열번호 377, 서열번호 381 및 서열번호 385로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열로부터 유도되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은, 서열번호 23, 서열번호 27, 서열번호 31, 서열번호 35, 서열번호 39, 서열번호 43, 서열번호 47, 서열번호 51, 서열번호 55, 서열번호 59, 서열번호 63, 서열번호 67, 서열번호 71, 서열번호 75, 서열번호 79, 서열번호 83, 서열번호 87, 서열번호 91, 서열번호 95, 서열번호 99, 서열번호 103, 서열번호 107, 서열번호 111, 서열번호 115, 서열번호 119, 서열번호 123, 서열번호 127, 서열번호 131, 서열번호 135, 서열번호 139 서열번호 143, 서열번호 147, 서열번호 151, 서열번호 155, 서열번호 159, 서열번호 163, 서열번호 167, 서열번호 171, 서열번호 175, 서열번호 179, 서열번호 183, 서열번호 187, 서열번호 191, 서열번호 195, 서열번호 199, 서열번호 203, 서열번호 207, 서열번호 211, 서열번호 215, 서열번호 219, 서열번호 223, 서열번호 227, 서열번호 231, 서열번호 235, 서열번호 239, 서열번호 243, 서열번호 247, 서열번호 251, 서열번호 255, 서열번호 259, 서열번호 263, 서열번호 267, 서열번호 271, 서열번호 275, 서열번호 279, 서열번호 283, 서열번호 287, 서열번호 291, 서열번호 295, 서열번호 299, 서열번호 303, 서열번호 307, 서열번호 311, 서열번호 315, 서열번호 319, 서열번호 323, 서열번호 327, 서열번호 331, 서열번호 335, 서열번호 339, 서열번호 343, 서열번호 347, 서열번호 351, 서열번호 355, 서열번호 359, 서열번호 363, 서열번호 367, 서열번호 371, 서열번호 375, 서열번호 379, 서열번호 383 및 서열번호 387로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열로부터 유도되는 아미노산 서열을 포함하는, 접합체.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-DLL3 항체 또는 이의 면역반응성 단편이, DLL3 단백질과 결합하기 위해 SC16.3, SC16.4, SC16.5, SC16.7, SC16.8, SC16.10, SC16.11, SC16.13, SC16.15, SC16.18, SC16.19, SC16.20, SC16.21, SC16.22, SC16.23, SC16.25, SC16.26, SC16.29, SC16.30, SC16.31, SC16.34, SC16.35, SC16.36, SC16.38, SC16.41, SC16.42, SC16.45, SC16.47, SC16.49, SC16.50, SC16.52, SC16.55, SC16.56, SC16.57, SC16.58, SC16.61, SC16.62, SC16.63, SC16.65, SC16.67, SC16.68, SC16.72, SC16.73, SC16.78, SC16.79, SC16.80, SC16.81, SC16.84, SC16.88, SC16.101, SC16.103, SC16.104, SC16.105, SC16.106, SC16.107, SC16.108, SC16.109, SC16.110, SC16.111, SC16.113, SC16.114, SC16.115, SC16.116, SC16.117, SC16.118, SC16.120, SC16.121, SC16.122, SC16.123, SC16.124, SC16.125, SC16.126, SC16.129, SC16.130, SC16.131, SC16.132, SC16.133, SC16.134, SC16.135, SC16.136, SC16.137, SC16.138, SC16.139, SC16.140, SC16.141, SC16.142, SC16.143, SC16.144, SC16.147, SC16.148, SC16.149 및 SC16.150으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 참조 항체와 경쟁하고, 상기 DLL3 단백질에 대한 상기 DLL3 항체 또는 이의 면역반응성 단편의 결합이 참조 항체에 의해 30% 이상 억제되는, 접합체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-DLL3 항체가, 빈(bin) A, 빈 B, 빈 C, 빈 D, 빈 E, 빈 F, 빈 G, 빈 H 및 빈 I로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 빈에 존재하는, 접합체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-DLL3 항체가, DLL3 단백질 N-말단 도메인과 연관된 에피토프에 결합하는, 접합체.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-DLL3 항체가, DLL3 단백질 DSL 도메인과 연관된 에피토프에 결합하는, 접합체.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-DLL3 항체가, DLL3 단백질 EGF1 도메인과 연관된 에피토프에 결합하는, 접합체.
  15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-DLL3 항체가, DLL3 단백질 EGF2 도메인과 연관된 에피토프에 결합하는, 접합체.
  16. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-DLL3 항체가, DLL3 단백질 EGF3 도메인과 연관된 에피토프에 결합하는, 접합체.
  17. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-DLL3 항체가, DLL3 단백질 EGF4 도메인과 연관된 에피토프에 결합하는, 접합체.
  18. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-DLL3 항체가, DLL3 단백질 EGF5 도메인과 연관된 에피토프에 결합하는, 접합체.
  19. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-DLL3 항체가 서열번호 21 내지 387(홀수) 중 어느 하나의 CDR을 포함하는, 접합체.
  20. 제19항에 있어서, 상기 항-DLL3 항체가 서열번호 21 내지 387(홀수) 중 어느 하나의 복수의 CDR을 포함하는, 접합체.
  21. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-DLL3 항체가, DLL3 단백질의 아미노산 Q93, P94, G95, A96 및 P97(서열번호 3)을 포함하는 에피토프에 결합하는, 접합체.
  22. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-DLL3 항체가, DLL3 단백질의 Q93, P94, G95, A96 및 P97(서열번호 3)을 포함하는 에피토프에 결합하는 항체와 경쟁하는, 접합체.
  23. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-DLL3 항체가, DLL3 단백질의 아미노산 G203, R205 및 P206(서열번호 4)을 포함하는 에피토프에 결합하는, 접합체.
  24. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-DLL3 항체가, DLL3 단백질의 아미노산 G203, R205 및 P206(서열번호 4)을 포함하는 에피토프에 결합하는 항체와 경쟁하는, 접합체.
  25. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-DLL3 항체가, hSC16.13, hSC16.15, hSC16.25, hSC16.34 및 hSC16.56로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항체를 포함하는, 접합체.
  26. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-DLL3 항체가 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서, 상기 경쇄 가변 영역은, 서열번호 389, 서열번호 393, 서열번호 397, 서열번호 401 및 서열번호 405에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은, 서열번호 391, 서열번호 395, 서열번호 399, 서열번호 403 및 서열번호 407에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 접합체.
  27. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-DLL3 항체가, SC16.3, SC16.4, SC16.5, SC16.7, SC16.8, SC16.10, SC16.11, SC16.13, SC16.15, SC16.18, SC16.19, SC16.20, SC16.21, SC16.22, SC16.23, SC16.25, SC16.26, SC16.29, SC16.30, SC16.31, SC16.34, SC16.35, SC16.36, SC16.38, SC16.41, SC16.42, SC16.45, SC16.47, SC16.49, SC16.50, SC16.52, SC16.55, SC16.56, SC16.57, SC16.58, SC16.61, SC16.62, SC16.63, SC16.65, SC16.67, SC16.68, SC16.72, SC16.73, SC16.78, SC16.79, SC16.80, SC16.81, SC16.84, SC16.88, SC16.101, SC16.103, SC16.104, SC16.105, SC16.106, SC16.107, SC16.108, SC16.109, SC16.110, SC16.111, SC16.113, SC16.114, SC16.115, SC16.116, SC16.117, SC16.118, SC16.120, SC16.121, SC16.122, SC16.123, SC16.124, SC16.125, SC16.126, SC16.129, SC16.130, SC16.131, SC16.132, SC16.133, SC16.134, SC16.135, SC16.136, SC16.137, SC16.138, SC16.139, SC16.140, SC16.141, SC16.142, SC16.143, SC16.144, SC16.147, SC16.148, SC16.149 및 SC16.150으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 참조 항체에 의해 정의된 빈(bin)에 존재하는, 접합체.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합체가 ADC 1을 포함하는, 접합체.
  29. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합체가 ADC 2를 포함하는, 접합체.
  30. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합체가 ADC 3을 포함하는, 접합체.
  31. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합체가 ADC 4를 포함하는, 접합체.
  32. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합체가 ADC 5를 포함하는, 접합체.
  33. 도 6에 제시된 바와 같은 접합체.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 접합체를 포함하는 약제학적 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 약물 대 항체 비(DAR)가 2 +/- 0.4, 4 +/- 0.4, 6 +/- 0.4, 또는 8 +/- 0.4인, 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 상기 DAR이 2 +/- 0.4인, 조성물.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, DLL3 연관 장애를 치료하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 DLL3 연관 장애가 증식성 장애를 포함하는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 증식성 장애가 신생물성(neoplastic) 장애를 포함하는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 신생물성 장애가, 신경 내분비 특징을 나타내는 종양을 포함하는, 방법.
  41. 제39항에 있어서, 상기 신생물성 장애가, 부신암, 방광암, 자궁경부암, 자궁내막암, 신장암, 간암, 소세포 폐암, 대세포 폐암, 난소암, 결장직장암, 췌장암, 전립선암 및 유방암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 장애를 포함하는, 방법.
  42. 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 항암제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  43. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 필요로 하는 대상체에서 종양 개시 세포의 빈도를 감소시키는 방법으로서, 상기 조성물을 필요로 하는 대상체에게 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 빈도의 감소가, 종양 개시 세포를 농후화하는 것으로 공지된 종양 세포 표면 마커의 유동 세포 분석법 또는 종양 개시 세포를 농후화하는 것으로 공지된 종양 세포 표면 마커의 면역조직화학적 검출을 사용하여 측정되는, 방법.
  45. 제43항에 있어서, 상기 빈도의 감소가, 시험관내 또는 생체내 제한 희석 분석을 사용하여 측정되는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 빈도의 감소가, 면역약화된(immunocompromised) 마우스 내로의 살아있는 인간 종양 세포의 이식을 포함하는 생체내 제한 희석 분석을 사용하여 측정되는, 방법.
  47. 제45항에 있어서, 상기 빈도의 감소가, 시험관내 콜로니 지지 조건 내로의 살아있는 인간 종양 세포의 제한 희석 퇴적을 포함하는 시험관내 제한 희석 분석을 사용하여 측정되는, 방법.
  48. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 필요로 하는 대상체에게 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 항암제를 사용한 치료를 위해 대상체에서 종양을 감작화하는 방법.
  49. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 전이를 억제 또는 예방하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 대상체가 접합체의 투여 전 또는 투여 후의 감량(debulking) 처치를 제공받는, 방법.
  51. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에 대해 유지 치료요법을 수행하는 방법.
  52. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항의 조성물을 증식성 장애를 앓고 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 증식성 장애를 앓고 있는 대상체에서 종양 개시 세포를 고갈시키는 방법.
  53. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료 방법.
  54. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 소세포 폐암을 앓고 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 소세포 폐암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법.
  55. 제43항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 항암제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  56. 제43항 내지 제55항 중 어느 한 항의 방법에 사용하기 위한 의약의 제조에 있어서 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물의 용도.
  57. 항-DLL3 항체 또는 이의 면역반응성 단편을 하기 화학식의 DL1, DL2, DL3, DL4 및 DL5로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화합물과 접합시키는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 접합체의 제조 방법.
    Figure pct00109
    ,
    Figure pct00110
    ,
    Figure pct00111
    ,
    Figure pct00112
    및
    Figure pct00113
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