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KR20140102759A - 변형된 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 및 핵산 조성물 - Google Patents

변형된 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 및 핵산 조성물 Download PDF

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KR20140102759A
KR20140102759A KR1020147019601A KR20147019601A KR20140102759A KR 20140102759 A KR20140102759 A KR 20140102759A KR 1020147019601 A KR1020147019601 A KR 1020147019601A KR 20147019601 A KR20147019601 A KR 20147019601A KR 20140102759 A KR20140102759 A KR 20140102759A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
optionally substituted
modified
lipid
nucleic acid
modified mrna
Prior art date
Application number
KR1020147019601A
Other languages
English (en)
Inventor
푸제롤레 안토닌 드
크리스티 엠. 우드
사이다 엠. 엘바셔
누바 비. 아페얀
페드로 발렌시아
제이슨 피. 슈럼
Original Assignee
모더나 세라퓨틱스, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=48610363&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20140102759(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from PCT/US2012/058519 external-priority patent/WO2013052523A1/en
Application filed by 모더나 세라퓨틱스, 인코포레이티드 filed Critical 모더나 세라퓨틱스, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명의 개시내용은, 특히, 단백질, 단백질 전구체, 또는 단백질 혹은 단백질 전구체의 부분 혹은 전체 처리된 형태를 암호화할 수 있는 변형된 핵산 분자를 제공한다. 제형 조성물은 변형된 핵산 분자 및 전달제를 더 포함할 수 있다. 본 발명은 세포의 기능 및/또는 활성을 조절할 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는데 이용가능한 핵산을 더 제공한다.

Description

변형된 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 및 핵산 조성물{MODIFIED NUCLEOSIDE, NUCLEOTIDE, AND NUCLEIC ACID COMPOSITIONS}
서열목록에 대한 참조
본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 출원되고 있다. M11PCTSQLST.txt라는 명칭의 서열 목록 파일은, 2012년 12월 14일에 작성되었고 그 크기는 25,579 바이트이다. 서열 목록의 전자 형식의 정보는 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 미국 특허 가출원 제61/576,705호(출원일: 2012년 12월 16일, 발명의 명칭: 변형된 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 및 핵산 조성물(Modified Nucleoside, Nucleotide, and Nucleic Acid Compositions)), 미국 특허 가출원 제61/618,957호(출원일: 2012년 4월 2일, 발명의 명칭: 변형된 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 및 핵산 조성물), 미국 특허 가출원 제61/648,244호(출원일: 2012년 5월 17일, 발명의 명칭: 변형된 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 및 핵산 조성물), 미국 특허 가출원 제61/681,712호(출원일: 2012년 8월 10일, 발명의 명칭: 변형된 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 핵산 조성물) 및 미국 특허 가출원 제61/696,381호(출원일: 2012년 9월 4일, 발명의 명칭: 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 및 핵산 조성물, 그리고 핵산 조성물), 미국 특허 가출원 제61/709,303호(출원일: 2012년 10월 3일, 발명의 명칭: 변형된 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 및 핵산 조성물), 미국 특허 가출원 제61/712,490호(출원일: 2012년 10월 11일, 발명의 명칭: 변형된 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 및 핵산 조성물) 및 국제 출원 제PCT/US2012/058519호(출원일: 2012년 10월 3일, 발명의 명칭: 변형된 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 및 핵산, 그리고 그의 용도(Modified Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids, And Uses Thereof))의 유익을 주장하며, 이들의 내용은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다.
일반적으로, 세포 내로 도입되는 외인성 비변형(unmodified) 핵산 분자, 특히 바이러스성 핵산은 사이토카인 및 인터페론(IFN) 생산 및 궁극적으로 세포 사멸을 초래하는 선천적 면역 반응을 유도한다. 선천적 면역 반응을 일으키는 대신에 핵산의 세포내 번역 및 암호화된 단백질의 생산을 초래하기 위하여, 핵산, 예컨대, 리보핵산(RNA)을 세포 내로 전달할 수 있도록 하는 생물학적 검정과, 치료, 진단, 시약에 관하여 관심이 많다. 따라서, 선천적 면역 반응을 일으키는 일 없이 표적화된 세포에 핵산의 생체내 전달을 효과적으로 용이하게 할 수 있는 전달제를 포함하는 제형 조성물을 개발할 필요가 있다.
본 발명의 개시내용은, 특히, 단백질, 단백질 전구체, 또는 단백질 혹은 단백질 전구체의 부분 혹은 완전 처리된 형태를 암호화할 수 있는 변형된 핵산 분자를 제공한다. 제형 조성물은 변형된 핵산 분자 및 전달제를 더 포함할 수 있다. 본 발명은 세포의 기능 및/또는 활성을 변형시킬 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는데 이용가능한 핵산을 더 제공한다.
일 양상에 있어서, 포유류의 세포 혹은 조직에서 관심 대상 폴리펩타이드를 생산하는 방법이 기재된다. 상기 방법은, 포유류의 세포 혹은 조직을, 관심 대상 폴리펩타이드를 암호화하는 변형된 mRNA를 포함하는 제형과 접촉시키는 단계를 포함한다. 제형은 나노입자, 폴리(락틱-코-글라이콜산)(PLGA) 미소구(micropshere), 리피도이드(lipidoid), 리포플렉스(lipoplex), 리포솜, 중합체, 탄수화물(단당을 포함함), 양이온성 지질, 피브린 겔, 피브린 하이드로겔, 피브린 글루(fibrin glue), 피브린 봉합제(fibrin sealant), 피브리노겐, 트롬빈, 신속 제거형 지질 나노입자(rapidly eliminated lipid nanoparticle: reLNP) 및 이들의 조합일 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 변형된 mRNA는 정제된 IVT 전사물을 포함할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 변형된 mRNA를 포함하는 제형은 적어도 1종의 지질을 포함할 수 있는 나노입자이다. 지질은 DLin-DMA, DLin-K-DMA, 98N12-5, C12-200, DLin-MC3-DMA, DLin-KC2-DMA, DODMA, PLGA, PEG, PEG-DMG 및 페길화 지질(PEGylated lipid)로부터 선택될 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 다른 양상에 있어서, 지질은 DLin-DMA, DLin-D-DMA, DLin-MC3-DMA, DLin-KC2-DMA 및 DODMA 등(이들로 제한되는 것은 아님)과 같은 양이온성 기질일 수 있다.
제형 내에서 지질 대 변형된 mRNA 비는 10:1 및 30:10일 수 있다. 나노입자 제형의 평균 크기는 60 내지 225㎚의 변형된 mRNA를 포함할 수 있다. 변형된 mRNA를 포함하는 나노입자 제형의 PDI는 0.03 내지 0.15이다. 지질의 제타 전위는 pH 7.4에서 -10 내지 +10일 수 있다.
변형된 mRNA의 제형은 융합생성 지질(fusogenic lipid), 콜레스테롤 및 PEG 지질을 포함할 수 있다. 제형은 몰비 50:10:38.5:1.5-3.0(양이온성 지질:융합생성 지질:콜레스테롤:PEG 지질)을 지닐 수 있다. PEG 지질은 PEG-c-DOMG, PEG-DMG로부터 선택될 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 융합생성 지질은 DSPC일 수 있다.
포유류의 세포 혹은 조직은 주사기 펌프(syringe pump), 내부 삼투압 펌프 및 외부 삼투압 펌프 등(이들로 제한되지 않음)과 같은 장치를 사용해서 접촉될 수 있다.
변형된 mRNA의 제형은 4 내지 20㎛ 크기일 수 있는 PLGA 미소구일 수 있다. 변형된 mRNA는 48시간 기간에 제형으로부터 50% 미만으로 방출될 수 있다. PLGA 미소구 제형은 혈청에서 안정적일 수 있다. 안정성은 90% 중 비제형화된 변형된 mRNA(unformulated modified mRNA)에 대해서 결정될 수 있다.
변형된 mRNA PLGA 미소구의 장입 중량 퍼센트(loading weight percent)는 적어도 0.05%, 적어도 0.1%, 적어도 0.2%, 적어도 0.3%, 적어도 0.4% 또는 적어도 0.5%일 수 있다. PLGA 미소구 내 변형된 mRNA의 봉입 효율(encapsulation efficiency)은 적어도 50%, 적어도 70%, 적어도 90% 또는 적어도 97%일 수 있다.
본 발명의 지질 나노입자는 피브린 봉합제 등(이것으로 제한되는 것은 아님)과 같은 봉합제로 제형화(formulated)될 수 있다.
포유류의 세포들 혹은 조직들은, 정맥내, 근육내, 유리체내, 척수강내, 종양내, 폐 및 피하 등(이들로 제한되는 것은 아님)과 같은 투여 경로에 의해 접촉될 수 있다. 포유류의 세포들 혹은 조직들은 분할 투약 스케줄을 이용해서 접촉될 수 있다. 포유류의 세포 혹은 조직은 주사에 의해 접촉될 수 있다. 주사는 진피내 공간, 표피, 피하 조직 및 근육으로 이루어진 군으로부터 선택된 조직에 대해서 행해질 수 있다. 관심 대상 폴리펩타이드는 접촉하는 개소로부터 전신에 영향을 미치는 개소에 상기 세포 혹은 조직에서 생산될 수 있다.
관심 대상 폴리펩타이드는 접촉 후 72시간까지 혈청 중에서 검출가능할 수 있다. 관심 대상 폴리펩타이드의 수준은 투약 전의 수준보다 높을 수 있다. 관심 대상 폴리펩타이드의 수준은 수컷 대상체의 혈청 내에서보다 암컷 대상체의 혈청 내에서 높을 수 있다.
변형된 mRNA의 제형은 하나보다 많은 변형된 mRNA를 포함할 수 있다. 제형은 2 혹은 3개의 변형된 mRNA를 지닐 수 있다.
변형된 mRNA를 포함하는 제형은 50:10:38.5:1.5(reLNP 지질:융합생성 지질:콜레스테롤:PEG 지질)의 몰비로 reLNP 지질, 융합생성 지질, 콜레스테롤 및 PEG 지질을 포함할 수 있는 신속 제거형 지질 나노입자(reLNP)를 포함할 수 있다. 융합생성 지질은 DSPC일 수 있고, PEG 지질은 PEG-c-DOMG일 수 있다. reLNP 지질은 내부 혹은 말단 에스터를 가진 DLin-DMA 또는 내부 혹은 말단 에스터를 가진 DLin-MC3-DMA일 수 있다. 총 지질 대 변형된 mRNA 중량비는 10:1 내지 30:1일 수 있다.
변형된 mRNA를 포함하는 제형은 피브린 봉합제를 포함할 수 있다.
변형된 mRNA를 포함하는 제형은 리피도이드를 포함할 수 있되, 이때 지질은 C12-200 및 98N12-5로 이루어진 군으로부터 선택된다.
변형된 mRNA를 포함하는 제형은 중합체를 포함할 수 있다. 중합체는 하이드로겔 또는 수술 봉합제의 층으로 피복되거나(coated), 덮이거나(covered), 둘러싸이거나(surrounded), 포위되거나(enclosed) 또는 해당 층을 포함할 수 있다. 중합체는 PLGA, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴록사머 및 겔사이트(GELSITE)®로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
관심 대상 폴리펩타이드는, 포유류의 세포 혹은 조직을, 완충액 관심 대상 폴리펩타이드를 암호화하는 변형된 mRNA를 포함하는 제형과 접촉시킴으로써 포유류의 세포 혹은 조직에서 생산될 수 있다. 완충액 제형은 식염수, 인산염 완충 식염수 및 락트산 링거(Ringer's lactate)로부터 선택될 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 완충액 제형은 1 내지 10mM의 칼슘 농도를 포함할 수 있다. 완충액 제형 내 변형된 mRNA는 정제된 IVT 전사물을 포함할 수 있다.
영장류에서의 약리학적 효과는 관심 대상 폴리펩타이드를 암호화하는 제형화된 변형된 mRNA를 포함하는 조성물과 영장류를 접촉시킴으로써 발생될 수 있다. 변형된 mRNA는 정제된 IVT 전사물을 포함할 수 있고/있거나, 나노입자, 폴리(락틱-코-글라이콜산)(PLGA) 미소구, 리피도이드, 리포플렉스, 리포솜, 중합체, 탄수화물(단당을 포함함), 양이온성 지질, 피브린 겔, 피브린 하이드로겔, 피브린 글루, 피브린 봉합제, 피브리노겐, 트롬빈, 신속 제거형 지질 나노입자(reLNP) 및 이들의 조합으로 제형화될 수 있다. 약리학적 효과는 상기 약리학적 효과를 발생하는 것으로 알려진 치료제 및/또는 조성물과 연관된 약리학적 효과보다 클 수 있다. 조성물은 제형화된 혹은 비제형화된(unformulated) 변형된 mRNA를 포함할 수 있다. 약리학적 효과는 질환, 장애, 병태 또는 감염의 치료적으로 유효한 성과를 낼 수 있다. 이러한 치료적으로 유효한 성과는 치료, 하나 이상의 증상의 개선, 진단, 예방 및 발병의 지연을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 약리학적 효과는, 세포수 변화, 혈청 화학의 변경, 효소 활성의 변경, 헤모글로빈의 증가 및 헤마토크릿(hematocrit)의 증가를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 개시내용은 변형된 핵산 분자 및 전달제를 포함하는 제형 조성물을 제공한다. 변형된 핵산 분자는, DNA, 상보적 DNA(cDNA), RNA, 메신저 RNA(mRNA), RNAi-유도제, RNAi 제제, siRNA, shRNA, miRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 촉매적 DNA, 삼중 나선 형성, 앱타머, 벡터 및 이들의 조합을 유도하는 RNA로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 변형된 핵산 분자가 mRNA이면, mRNA는 cDNA로부터 유도될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자는 적어도 하나의 변형과 번역가능한 영역을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자는 적어도 2개의 변형과 번역가능한 영역을 포함한다. 변형은 핵산 분자의 골격 및/또는 뉴클레오사이드 상에 위치될 수 있다. 변형은 뉴클레오사이드와 골격 결합 둘 모두 상에 위치될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 변형은 변형된 핵산 분자의 골격 결합 상에 위치될 수 있다. 골격 결합은 하나 이상의 산소 원자의 대체에 의해 변형될 수 있다. 골격 결합의 변형은 적어도 하나의 포스포다이에스터 결합을 포스포로티오에이트 결합으로 대체하는 것을 포함할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 변형은 변형된 핵산 분자의 뉴클레오사이드 상에 위치될 수 있다. 뉴클레오사이드 상의 변형은 상기 뉴클레오사이드의 당 위에 위치될 수 있다. 뉴클레오사이드의 변형은 뉴클레오사이드 상의 2'-위치에서 일어날 수 있다.
뉴클레오사이드 변형은 피리딘-4-온 리보뉴클레오사이드, 5-아자-유리딘, 2-티오-5-아자-유리딘, 2-티오유리딘, 4-티오-유사유리딘, 2-티오-유사유리딘, 5-하이드록시유리딘, 3-메틸유리딘, 5-카복시메틸-유리딘, 1-카복시메틸-유사유리딘, 5-프로피닐-유리딘, 1-프로피닐-유사유리딘, 5-타우리노메틸유리딘, 1-타우리노메틸-유사유리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-유리딘, 1-타우리노메틸-4-티오-유리딘, 5-메틸-유리딘, 1-메틸-유사유리딘, 4-티오-1-메틸-유사유리딘, 2-티오-1-메틸-유사유리딘, 1-메틸-1-데아자-유사유리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-유사유리딘, 다이하이드로유리딘, 다이하이드로유사유리딘, 2-티오-다이하이드로유리딘, 2-티오-다이하이드로유사유리딘, 2-메톡시유리딘, 2-메톡시-4-티오-유리딘, 4-메톡시-유사유리딘, 4-메톡시-2-티오-유사유리딘, 5-아자-시티딘, 유사아이소시티딘, 3-메틸-시티딘, N4-아세틸시티딘, 5-폼일시티딘, N4-메틸시티딘, 5-하이드록시메틸시티딘, 1-메틸-유사아이소시티딘, 피롤로-시티딘, 피롤로-유사아이소시티딘, 2-티오-시티딘, 2-티오-5-메틸-시티딘, 4-티오-유사아이소시티딘, 4-티오-1-메틸-유사아이소시티딘, 4-티오-1-메틸-1-데아자-유사아이소시티딘, 1-메틸-1-데아자-유사아이소시티딘, 제불라린(zebularine), 5-아자-제불라린, 5-메틸-제불라린, 5-아자-2-티오-제불라린, 2-티오-제불라린, 2-메톡시-시티딘, 2-메톡시-5-메틸-시티딘, 4-메톡시-유사아이소시티딘, 4-메톡시-1-메틸-유사아이소시티딘, 2-아미노퓨린, 2,6-다이아미노퓨린, 7-데아자-아데닌, 7-데아자-8-아자-아데닌, 7-데아자-2-아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2-아미노퓨린, 7-데아자-2,6-다이아미노퓨린 7-데아자-8-아자-2,6-다이아미노퓨린 1-메틸아데노신, N6-메틸아데노신, N6-아이소펜테닐아데노신, N6-(시스-하이드록시아이소펜테닐)아데노신, 2-메틸티오-N6-(시스-하이드록시아이소펜테닐) 아데노신, N6-글라이시닐카바모일아데노신, N6-트레오닐카바모일아데노신, 2-메틸티오-N6-트레오닐 카바모일아데노신, N6,N6-다이메틸아데노신, 7-메틸아데닌, 2-메틸티오-아데닌, 2-메톡시-아데닌, 이노신, 1-메틸-이노신, 위오신(wyosine), 위부토신(wybutosine) 7-데아자-구아노신, 7-데아자-8-아자-구아노신, 6-티오-구아노신, 6-티오-7-데아자-구아노신, 6-티오-7-데아자-8-아자-구아노신, 7-메틸-구아노신, 6-티오-7-메틸-구아노신, 7-메틸이노신, 6-메톡시-구아노신, 1-메틸구아노신, N2-메틸구아노신, N2,N2-다이메틸구아노신, 8-옥소-구아노신, 7-메틸-8-옥소-구아노신, 1-메틸-6-티오-구아노신, N2-메틸-6-티오-구아노신 및 N2,N2-다이메틸-6-티오-구아노신으로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 변형은 독립적으로 5-메틸사이토신, 유사유리딘 및 1-메틸유사유리딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에 있어서, 변형은 변형된 핵산 분자의 핵염기 상에 위치될 수 있다. 핵염기 상의 변형은 사이토신, 구아닌, 아데닌, 티민 및 유라실로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 핵염기 상의 변형은 데아자-아데노신 및 데아자-구아노신으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 링커는 상기 데아자-아데노신 아자 데아자-구아노신의 C-7 또는 C-8 위치에서 부착될 수 있다. 변형된 핵염기는 사이토신 및 유라실로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 링커는 N-3 또는 C-5 위치에서 변형된 핵염기에 부착될 수 있다. 핵염기에 부착된 링커는 다이에틸렌 글라이콜, 다이프로필렌 글라이콜, 트라이에틸렌 글라이콜, 트라이프로필렌 글라이콜, 테트라에틸렌 글라이콜, 테트라에틸렌 글라이콜, 2가 알킬, 알케닐, 알키닐 모이어티, 에스터, 아마이드 및 에터 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 핵산 분자의 2개의 변형은 변형된 핵산 분자의 뉴클레오사이드 상에 위치될 수 있다. 변형된 뉴클레오사이드는 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로부터 선택될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자의 2개의 변형은 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 상에 위치될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 개시내용은, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 9 및 서열번호 10 및 전달제 등(이들로 제한되지 않음)과 같은 핵산 분자를 포함하는 제형을 제공한다. 핵산 분자는 약 160개의 뉴클레오타이드 길이의 폴리A 테일(polyA tail)을 포함할 수 있다. 또한, 핵산 분자는 캡0(Cap0), 캡1(Cap1), ARCA, 이노신, N1-메틸-구아노신, 2'플루오로-구아노신, 7-데아자-구아노신, 8-옥소-구아노신, 2-아미노-구아노신, LNA-구아노신 및 2-아자이도-구아노신 등(이들로 제한되지 않음)과 같은 적어도 하나의 5'말단 캡을 포함할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 개시내용은 서열번호 6, 캡1인 5'말단 캡, 대략 160개 길이의 뉴클레오타이드의 폴리 A 테일의 핵산 및 전달제를 제공한다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 개시내용은 서열번호 7, 캡1인 5'말단 캡, 대략 160개 길이의 뉴클레오타이드의 폴리 A 테일의 핵산 및 전달제를 제공한다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 개시내용은 서열번호 9, 캡1인 5'말단 캡, 대략 160개 길이의 뉴클레오타이드의 폴리 A 테일의 핵산 및 전달제를 제공한다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 개시내용은 서열번호 10, 캡1인 5'말단 캡, 대략 160개 길이의 뉴클레오타이드의 폴리 A 테일의 핵산 및 전달제를 제공한다.
일 실시형태에 있어서, 전달제는 리피도이드, 리포솜, 지질 나노입자, 신속 제거형 지질 나노입자(reLNP), 중합체, 리포플렉스, 펩타이드, 단백질, 하이드로겔, 봉합제, 화학적 변형, 컨쥬게이션, 세포 및 인핸서로 이루어진 군으로부터 선택된 전달을 향상시키는 적어도 하나의 방법을 포함한다. 전달제로서 이용될 수 있는 리피도이드, 지질 나노입자 및 신속 제거형 지질 나노입자는 C12-200, MD1, 98N12-5, DLin-DMA, DLin-K-DMA, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA, PLGA, PEG, PEG-DMG, 페길화 지질 및 그의 유사체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 지질을 포함할 수 있다. 신속 제거형 지질 나노입자는 지질 사슬의 말단 단부에 에스터 결합을 지닐 수 있거나, 에스터 결합이 지질 사슬의 포화된 탄소의 우측 혹은 좌측에 위치된 내부 결합일 수 있다. 전달제로서 이용될 수 있는 신속 제거형 지질 나노입자는 DLin-MC3-DMA 및 DLin-DMA일 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
일 실시형태에 있어서, 지질 나노입자는 PEG와, 콜레스테롤, 양이온성 지질 및 융합생성 지질 등(이들로 제한되지 않음)과 같은 적어도 하나의 성분을 포함할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 지질 나노입자는 PEG, 콜레스테롤, 양이온성 지질 및 융합생성 지질 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 융합생성 지질은 다이스테로일포스파티딜 콜린(DSPC)이다. 다른 실시형태에 있어서, PEG 지질은 PEG-DMG이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 양이온성 지질은, DLin-DMA, DLin-MC3-DMA, C12-200, 98N12-5 및 DLin-KC2-DMA일 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
일 실시형태에 있어서, 지질 나노입자 조성물은 50 ㏖% 양이온성 지질, 10 ㏖% DSPC, 1.5 내지 3.0 ㏖% PEG 및 37 내지 38.5 ㏖% 콜레스테롤을 포함할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 변형된 핵산은 PLGA와 제형화되어 서방성 제형을 형성할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 변형된 핵산은 PLGA 및 다른 활성 및/또는 비활성 성분으로 제형화되어 서방성 제형을 형성할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자는, 서열번호 9 및 서열번호 10을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
일 실시형태에 있어서, 서방성 제형은 서방성 미소구를 포함할 수 있다. 서방성 미소구는 약 10 내지 약 50㎛ 직경일 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 서방성 미소구는 약 0.001 내지 약 1.0 중량 퍼센트의 적어도 하나의 변형된 핵산 분자를 함유할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 변형된 핵산은 3' 비번역 영역(untranslated region: UTR) 전에 적어도 하나의 정지 코돈을 포함할 수 있다. 정지 코돈은 TGA, TAA 및 TAG로부터 선택될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 변형된 핵산은 정지 코돈 TGA와 1개의 추가의 정지 코돈을 포함한다. 추가의 실시형태에 있어서 추가의 정지 코돈은 TAA일 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 변형된 핵산은 3개의 정지 코돈을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 개시내용은 관심 대상 폴리펩타이드를 암호화할 수 있는 변형된 핵산을 포함하는 제어된 방출 제형을 제공한다. 변형된 핵산은 전달제에 봉입되거나 실질적으로 봉입될 수 있다. 전달제는 중합체, 하이드로겔 및/또는 수술 봉합제의 층으로 피복되거나, 덮이거나, 둘러싸이거나, 포위되거나 또는 해당 층을 포함할 수 있다. 추가의 실시형태에 있어서, 제어된 방출 제형은 중합체, 하이드로겔 및/또는 수술 봉합제의 제2층을 포함할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 제어된 방출 제형의 전달제는 리피도이드, 리포솜, 지질 나노입자, 신속 제거형 지질 나노입자, 리포플렉스 및 자체-조립된 지질 나노입자를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
제어된 방출 제형에 이용될 수 있는 중합체는 PLGA, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴록사머 및 겔사이트(GELSITE)®를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 제어된 방출 제형에 이용될 수 있는 수술 봉합제는 피브리노겐 중합체, 티젤(TISSEELL)®, PEG-계 봉합제 및 코실(COSEAL)®을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
일 실시형태에 있어서, 제어된 방출 제형의 전달제는 지질 나노입자 또는 신속 제거형 지질 나노입자 전달제를 포함한다. 일 양상에 있어서, 지질 나노입자 또는 신속 제거형 지질 나노입자는 중합체, 하이드로겔 및/또는 수술 봉합제의 층으로 피복되거나, 실질적으로 피복되거나, 덮이거나, 실질적으로 덮이거나, 둘러싸이거나, 실질적으로 둘러싸이거나, 포위되거나, 실질적으로 포위되거나 또는 해당 층을 포함할 수 있다. 다른 양상에 있어서, 전달제는, PLGA의 층으로 피복되거나, 실질적으로 피복되거나, 덮이거나, 실질적으로 덮이거나, 둘러싸이거나, 실질적으로 둘러싸이거나, 포위되거나, 실질적으로 포위되거나 또는 해당 층을 포함할 수 있는 지질 나노입자일 수 있다.
본 발명의 앞서 말한 것 및 다른 목적들, 특징들, 및 이점들은 첨부한 도면들에 예시된 바와 같이 특정 실시형태의 이하의 설명으로부터 명백해질 것이며, 도면에서 동일한 참조 부호들은 다양한 도면들 전체에 걸쳐서 동일한 부분들을 지칭한다. 도면들은 반드시 일정한 척도는 아니며, 대신에 본 발명의 각종 실시형태의 원리들을 예시하는데 중점을 둔다.
도 1은 본 발명에 유용한 종래 기술에서의 지질 구조를 예시한다. 98N12-5(TETA5-LAP), DLin-DMA, DLin-K-DMA(2,2-다이리놀레일-4-다이메틸아미노메틸-[1,3]-다이옥솔란), DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA 및 C12-200에 대한 구조가 도시되어 있다.
도 2는 본 명세서에서 교시된 IVT 반응에 유용한 대표적인 플라스미드이다. 플라스미드는 본 발명자들에 의해 설계된 삽입물(Insert) 64818을 포함한다.
도 3은 PLGA 미소구 내에 봉입된 변형된 mRNA의 겔 프로파일이다.
핵산의 세포 내로의 전달은, 부정확한 발현 수준, 자손 및 이웃 세포로의 핵산의 유해한 이송 및 돌연변이를 일으킬 실질적인 위험을 초래할 수 있는 표적 세포 게놈 내로의 핵산의 통합을 포함하는 많은 바람직하지 않은 문제를 지닌다. 본 발명의 개시내용의 변형된 핵산 분자들은 이들이 도입되는 세포들의 집단의 선천적 면역 활성을 저감시킬 수 있어, 그 세포 집단에서의 단백질 생산의 효율을 증가시킨다. 또한, 본 발명의 개시내용의 핵산 및 단백질의 하나 이상의 추가의 유리한 활성 및/또는 특성은 본 명세서에 기재되어 있다.
부가적으로, 본 명세서에서는 질환, 장애 및/또는 병태를 지니거나 이를 지니는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법이 제공되되, 해당 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 본 명세서에 기재된 조성물을 질환, 장애 및/또는 병태를 치료하는데 충분한 양으로 투여하는 단계를 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 당업계의 통상의 기술을 가진 자들에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것들과 유사하거나 등가인 방법 및 물질(재료)들이 본 발명에서 특징으로 하는 방법의 실시 혹은 테스트에 이용될 수 있지만, 적절한 방법과 재료는 이하에 기술된다.
변형된 핵산 분자
본 발명의 개시내용은, 본 명세서에 기재된 바와 같은 1개 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함하는 mRNA 등과 같은 RNA를 비롯한 핵산("변형된 핵산 분자", "변형된 mRNA" 또는 "변형된 mRNA 분자"라 지칭됨)을 제공한다. 본 발명의 핵산 분자의 변형은, 변형된 mRNA가 도입되는 세포의 선천적 면역 반응의 실질적 도입의 상당한 감소 혹은 결여를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아닌 유용한 특성을 지닐 수 있다. 변형된 핵산 분자는 또한 비변형 핵산 분자에 비해서 저감된 면역원성을 지닐 뿐만 아니라 단백질 생산, 핵산의 세포내 보유 및 접촉된 세포의 생존능의 증대된 효율을 발휘할 수 있다.
번역가능한 영역 및 1개, 2개 혹은 2개 이상의 상이한 뉴클레오사이드 변형을 포함하는 변형된 핵산 분자가 제공된다. 본 발명의 개시내용에 이용하기 위한 예시적인 핵산은 리보핵산(RNA), 데옥시리보핵산(DNA), 트레오스 핵산(TNA), 글라이콜 핵산(GNA), 잠금 핵산(LNA) 또는 그의 혼성체를 포함한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자는 메신저 RNA(mRNA)를 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명의 개시내용의 변형된 핵산 분자는 변형된 mRNA가 도입되는 세포의 선천적 면역 반응을 실질적으로 유발시키기 않을 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자는, 변형된 핵산 분자가 도입되는 세포에서, 변형되지 않은 핵산에 비해서, 저감된 분해를 발휘할 수 있다.
"핵산"이라는 용어는 올리고뉴클레오타이드 사슬 내에 있거나 해당 사슬 내로 편입되는 임의의 화합물 및/또는 물질을 포함한다. 본 발명의 개시내용에 따라서 이용하기 위한 예시적인 핵산은, 메신저 RNA(mRNA), 그의 혼성체, RNAi-유도제, RNAi 제제, siRNA, shRNA, miRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 촉매적 DNA, 삼중 나선 형성, 앱타머, 벡터 등을 유도하는 RNA를 포함하는 DNA, cDNA, RNA의 하나 이상을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
소정의 실시형태에서는, 세포 내로 도입된 변형된 핵산 분자를 세포내 분해시키는 것이 바람직하다. 예를 들어, 단백질 생산의 정확한 타이밍이 요망된다면 변형된 핵산 분자를 분해시키는 것이 바람직할 것이다. 이와 같이 해서, 본 발명의 개시내용은, 세포 내에 유도된 방식으로 작용할 수 있는 분해 도메인을 포함하는 변형된 핵산 분자를 제공한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자는 (예컨대, 핵염기의 5' 위치에서의) 당, 핵염기 또는 포스페이트 골격 상에서 화학적 변형(예컨대, 포스페이트를 티오포스페이트 등의 다른 모이어티로 치환)될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 변형은 선천적 면역 반응에 기여할 수 있는 주된 그루브 결합 상대 상호작용(major groove binding partner interaction)의 파괴를 유발할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 제형 조성물은, 대상체에게 투여될 경우, 전달제의 편입 없이 변형된 핵산 분자의 투여에 대해서 변형된 핵산 분자의 생체이용률, 치료적 창(therapeutic window), 또는 분포 용적의 개선을 가져올 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 변형된 핵산 분자의 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는, 국제 특허 공개 제WO2012138530호(이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함됨)에 기재된 O-보호된 화합물을 이용해서 합성될 수 있다.
소정의 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자는 mRNA를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 변형된 mRNA(mmRNA)는 cDNA로부터 전달될 수 있다. 소정의 실시형태에 있어서, mmRNA는 적어도 2개의 뉴클레오사이드 변형을 포함할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 뉴클레오사이드 변형은 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로부터 선택될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 뉴클레오사이드 변형의 적어도 하나는 5-메틸사이토신 및/또는 유사유리딘이 아니다. 소정의 실시형태에 있어서 전달제는 mmRNA의 국재화(localized) 및 전신 전달을 허용하는 제형을 포함할 수 있다. 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA의 제형은, 리피도이드, 리포솜 및 지질 나노입자, 신속 제거형 지질 나노입자, 중합체, 리포플렉스, 펩타이드 및 단백질, 적어도 하나의 화학적 변형 및 컨쥬게이션, 인핸서, 및/또는 세포로부터 선택될 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 변형된 핵산 분자는 3'비번역 영역(UTR) 전에 적어도 2개의 정지 코돈을 포함할 수 있다. 정지 코돈은 TGA, TAA 및 TAG로부터 선택될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 핵산은 정지 코돈 TGA와 1개의 부가적인 정지 코돈을 포함한다. 추가의 실시형태에 있어서 추가의 정지 코돈은 TAA일 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자는 3개의 정지 코돈을 포함할 수 있다.
핵산의 기타 성분은 변형된 핵산 분자에 있어서 선택적이지만, 이들 성분은 몇몇 실시형태에서 유리할 수 있다.
비번역 영역(UTR)들
유전자의 비번역 영역(UTR)들은 번역되지 않고 전사된다. 5' UTR은 전사 개시 위치에서 개시되어, 개시 코돈으로 연장되지만 개시 코돈을 포함하지 않으며; 반면에, 3' UTR은 정지 코돈 바로 뒤에서 개시되어, 전사 종결 신호가 될 때까지 계속된다. 핵산 분자의 안정성 및 번역의 점에서 UTR들에 의한 조절 역할에 대한 신체 성장의 증거가 있다. UTR의 조절 특성은 분자의 안정성을 증대시키기 위하여 본 발명의 변형된 mRNA 분자 내로 편입될 수 있다. 이 특이적 특성들은 또한 이들이 바람직하지 않은 장기 부위로 잘못 지향되는 경우에 전사물의 제어된 하향-조절을 확보하도록 편입될 수 있다.
5' UTR 및 번역 개시
천연의 5' UTR들은 번역 개시 역할을 하는 특징을 보유한다. 이들은 리보솜이 많은 유전자의 번역을 개시하는 과정에서 내포될 통상적으로 알려진 코작(Kozak) 서열과 같은 시그너처를 수용한다. 코작 서열은 컨센서스(consensus) CCR(A/G)CCAUGG(서열번호 1)를 지니며, 여기서 R은 개시 코돈(AUG)의 상류에 있는 퓨린(아데닌 또는 구아닌) 3염기이며, 이것에 이어서 다른 'G'가 이어진다. 5' UTR은 또한 연장 인자 결합에 내포되는 2차적인 구조를 형성하는 것으로 알려져 있다.
특이적 표적 장기의 풍부하게 발현되는 유전자에서 전형적으로 발견되는 특징들을 공학적으로 조작함으로써, 작업자는 본 발명의 변형된 mRNA 분자의 안정성 및 단백질 생산을 증대시킬 수 있다. 예를 들어, 간-발현되는 mRNA, 예컨대, 알부민, 혈청 아밀로이드 A, 아포리포단백질 A/B/E, 트랜스페린, 알파 페토단백질, 에리트로포이에틴 또는 인자 VIII의 5' UTR의 도입은, 간 세포주 혹은 간에서의 변형된 핵산 분자, 예컨대, mmRNA의 발현을 증대시키는데 사용될 수 있었다. 마찬가지로, 그 조직 내에서 발현을 향상시키기 위하여 기타 조직-특이적 mRNA로부터의 5' UTR의 이용은, 근육(MyoD, 미오신, 미오글로빈, 미오게닌, 헤르쿨린(Herculin))에 대해서, 내피세포(Tie-1, CD36)에 대해서, 골수 세포(C/EBP, AML1, G-CSF, GM-CSF, CD11b, MSR, Fr-1, i-NOS)에 대해서, 백혈구(CD45, CD18)에 대해서, 지방조직(CD36, GLUT4, ACRP30, 아디포넥틴)에 대해서 그리고 폐 상피세포(SP-A/B/C/D)에 대해서 가능하다.
기타 비-UTR 서열이 본 발명의 변형된 핵산 분자 5'(또는 3' UTR) UTR들 내로 편입될 수 있다. 예를 들어, 인트론들 혹은 인트론 서열의 일부가 본 발명의 변형된 mRNA의 측면 영역들 내로 편입될 수 있다. 인트론 서열의 편입은 mRNA 수준뿐만 아니라 단백질 생산을 증가시킬 수 있다.
3' UTR 및 AU 풍부 요소들
3' UTR들은 이들 내에 매립된 아데노신 및 유리딘의 연신부를 지니는 것으로 알려져 있다. 이들 AU 풍부 시그너처는 특히 높은 속도의 턴오버(turnover)로 유전자에 특히 널리 퍼져 있다. 그들의 서열 특징 및 작용적 특성에 기초하여, AU 풍부 요소(ARE)들은 3가지 부류로 분리될 수 있으며(Chen et al, 1995): 부류 I ARE들은 U-풍부 영역들 내에 AUUUA 모티프의 수개의 분산된 복제물을 함유한다. C-Myc 및 MyoD는 부류 I ARE들을 함유한다. 부류 II ARE들은 2개 이상의 중첩하는 UUAUUUA(U/A)(U/A)(서열번호 2) 구합체(nonamer)를 소유한다. 이런 유형의 ARE들을 함유하는 분자는 GM-CSF와 TNF-a를 포함한다. 부류 III ARE들은 그다지 잘 정의되어 있지 않다. 이들 U 풍부 영역은 AUUUA 모티프를 함유하지 않는다. c-Jun 및 미오게닌은 이 부류의 2개의 잘 연구된 예이다. ARE들에 대한 대부분의 단백질 결합은 메신저를 불안정하게 하는 것으로 알려져 있는 반면, ELAV 계열의 구성원, 가장 현저하게는 HuR은, mRNA의 안정성을 증가시키는 것으로 문서화되어 있다. HuR은 이들 세 부류 모두의 ARE들에 결합한다. HuR 특이적 결합 부위를 핵산 분자의 3' UTR 내로 공학적으로 조작하는 것은 HuR 결합을 초래할 것이고, 이에 따라서 생체내 메신저의 안정화를 초래할 것이다.
3' UTR AU 풍부 요소(ARE)들의 도입, 제거 혹은 변형은 본 발명의 변형된 mRNA의 안정성을 조절하는데 이용될 수 있다. 특이적으로 변형된 mRNA를 공학적으로 조작할 경우, ARE의 1개 이상의 복제물이 도입되어 본 발명의 변형된 mRNA를 덜 안정적이 되게 함으로써, 번역을 축소시키고 얻어지는 단백질의 생산을 증가시킬 수 있다.
마찬가지로, ARE들은 동정되고 제거 혹은 돌연변이되어 세포내 안정성을 증가시키고, 이에 따라서 번역과 얻어지는 단백질의 생산을 증가시킬 수 있다. 형질주입(혹은 형질감염) 실험은, 본 발명의 변형된 mRNA를 이용해서, 관련된 세포주에서 행해질 수 있고, 단백질 생산은 형질주입 후 각종 시점에서 검정(assay)될 수 있다. 예를 들어, 세포는 상이한 ARE-공학적으로 조작된 분자로 형질주입되고 관련된 단백질에 대해서 ELISA 키트를 이용하고 형질 주입 후 6시간, 12시간, 24시간, 48시간 및 7일에 생산된 단백질을 검정될 수 있다.
마이크로RNA 결합 부위의 편입
마이크로RNA(또는 miRNA)는 핵산 분자의 3' UTR에 결합하고, 핵산 분자 안정성을 저감시키거나 번역을 저해함으로써 유전자 발현을 하향 조절하는 19 내지 25개의 뉴클레오타이드 장쇄 비암호화 RNA이다. 본 발명의 변형된 mRNA는 하나 이상의 마이크로RNA 표적 서열, 마이크로RNA 서열 또는 마이크로RNA 시드를 포함할 수 있다. 이러한 서열은 미국 특허 공개 제US2005/0261218호 및 미국 특허 공개 US2005/0059005호에서 교시된 것들 등과 같은 임의의 공지된 마이크로RNA에 대응할 수 있으며, 이들 문헌의 내용은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다.
마이크로RNA 서열은 "시드"(seed) 영역, 즉, 성숙 마이크로RNA의 위치 2-8의 영역 내 서열을 포함하되, 이 서열은 miRNA 표적 서열에 대한 완전한 왓슨-크릭 상보성(Watson-Crick complementarity)을 지닌다. 마이크로RNA 시드는 성숙 마이크로RNA의 위치 2-8 또는 2-7을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 마이크로RNA 시드는 7개의 뉴클레오타이드(예컨대, 성숙 마이크로RNA의 뉴클레오타이드 2-8)를 포함할 수 있으며, 여기서 대응하는 miRNA 표적 내 시드-상보적 부위의 양쪽에는 마이크로RNA 위치 1과는 반대쪽에 있는 아데닌(A)이 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 마이크로RNA 시드는 6개의 뉴클레오타이드(예컨대, 성숙 마이크로RNA의 뉴클레오타이드 2-7)를 포함할 수 있으며, 여기서 대응하는 miRNA 표적 내 시드-상보적 부위의 양쪽에는 마이크로RNA 위치 1과는 반대쪽에 아데닌(A)이 있다. 예를 들어, 문헌[Grimson A, Farh KK, Johnston WK, Garrett-Engele P, Lim LP, Bartel DP; Mol Cell. 2007 Jul 6;27(1):91-105]을 참조하면 되고; 이들의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. 마이크로RNA 시드의 염기들은 표적 서열과 완전한 상보성을 지닌다. 본 발명의 변형된 mRNA의 3'UTR 내로 마이크로RNA 표적 서열을 공학적으로 조작함으로써, 작업자는, 당해 마이크로RNA가 입수가능하다는 조건 하에, 분해 혹은 저감된 번역을 위하여 분자를 표적화할 수 있다. 이 과정은 핵산 분자 전달 시 표적 이탈 효과의 위험을 저감시킬 것이다. 마이크로RNA, 마이크로RNA 표적 영역, 그리고 그들의 발현 패턴 및 생물학적 역할의 확인은 보고되어 있다(Bonauer et al., Curr Drug Targets 2010 11:943-949; Anand and Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171-176; Contreras and Rao Leukemia 2012 26:404-413 (2011 Dec 20. doi: 10.1038/leu.2011.356); Bartel Cell 2009 136:215-233; Landgraf et al, Cell, 2007 129:1401-1414; 이들의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
예를 들어, 변형된 핵산 분자가 변형된 mRNA이고 간으로 전달되도록 의도되지 않았지만 거기에서 종결된다면, miR-122, 간에서 풍부한 마이크로RNA는, miR-122의 1개 혹은 다수의 표적 부위가 변형된 mRNA의 3' UTR 내로 공학적으로 조작된다면, 관심 대상 유전자의 발현을 저해할 수 있다. 상이한 마이크로RNA에 대해서 1개 혹은 다수의 결합 부위의 도입은 변형된 핵산 분자 및/또는 변형된 mRNA의 장기 지속성, 안정성 및 단백질 번역을 더욱 저감시키도록 공학적으로 조작될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "마이크로RNA 부위"란 용어는, 마이크로RNA 표적 부위 또는 마이크로RNA 인식 부위, 또는 마이크로RNA가 결합되거나 연결되는 임의의 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. "결합"은 전통적인 왓슨-크릭 혼성화 규칙을 따를 수 있거나 또는 마이크로RNA 부위에서 혹은 인접하여 표적 서열과 마이크로RNA의 안정적인 연결을 반영할 수 있는 것이 이해되어야 한다.
역으로, 본 발명의 변형된 mRNA의 목적을 위하여, 마이크로RNA 결합 부위들은, 특정 조직에서 단백질 발현을 증가시키기 위하여 천연적으로 유래하는 서열로부터 공학적으로 조작(즉, 해당 서열로부터 제거)될 수 있다. 예를 들어, miR-122 결합 부위는 간에서 단백질 발현을 향상시키기 위하여 제거될 수 있다. 다수의 조직에서의 발현의 조절은 1개 혹은 수개의 마이크로RNA 결합 부위의 도입 혹은 제거를 통해서 달성될 수 있다.
마이크로RNA가 mRNA를 조절함으로써, 단백질 발현을 조절하는 것으로 알려져 있는 조직의 예로는, 간(miR-122), 근육(miR-133, miR-206, miR-208), 내피세포(miR-17-92, miR-126), 골수 세포(miR-142-3p, miR-142-5p, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, miR-27), 지방조직(let-7, miR-30c), 심장(miR-1d, miR-149), 신장(miR-192, miR-194, miR-204) 및 폐 상피세포(let-7, miR-133, miR-126)를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 마이크로RNA는 또한 신생혈관생성(miR-132) 등과 같은 복합적인 생물학적 과정을 조절할 수 있다(Anand and Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171-176; 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 본 발명의 변형된 mRNA에 있어서, 이러한 과정에 내포된 마이크로RNA용의 결합 부위는, 생물학적으로 관련된 세포 유형에 혹은 관련된 생물학적 과정의 맥락에 변형된 mRNA 발현을 맞춤화시키기 위하여, 제거되거나 도입될 수 있다.
마지막으로, 상이한 세포 유형에서 마이크로RNA의 발현 패턴의 이해를 통해서, 변형된 mRNA는 특정 세포 유형에서 혹은 단지 특정 생물학적 조건 하에 더 표적화된 발현을 위하여 공학적으로 조작될 수 있다. 조직-특이적 마이크로RNA 결합 부위의 도입을 통해서, 변형된 mRNA는, 조직 내 단백질 발현을 위하여 혹은 생물학적 조건의 맥락에서 최적화되도록 설계될 수 있었다.
형질주입 실험은, 공학적으로 변형된 mRNA를 사용해서, 관련된 세포주에서 수행될 수 있고, 단백질 생산은 형질주입 후 각종 시점에서 검정될 수 있다. 예를 들어, 세포는 상이한 마이크로RNA 결합 부위-공학적 조작 변형된 mRNA로 형질주입되어, 관련된 단백질에 ELISA 키트를 이용해서, 형질주입 후 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간 및 7일에서 생산된 단백질을 검정할 수 있다. 생체내 실험은 또한 제형화된 변형된 mRNA의 조직-특이적 발현을 조사하기 위하여 마이크로RNA-결합 부위-공학적으로 조작된 분자를 이용해서 수행될 수 있다.
5' 캐핑
mRNA의 5' 캡 구조는 핵 유출에 관여하여 mRNA 안정성을 증가시키고, 성숙 환식 mRNA 종들을 형성하기 위하여 CBP의 폴리(A) 결합 단백질과의 결합을 통해서 세포 내 mRNA 안정성 및 번역 능력을 담당하는 mRNA 캡 결합 단백질(CBP)과 결합한다. 캡은 또한 mRNA 스플라이싱 동안 5' 근위 인트론의 제거를 보조할 수 있다.
내인성 mRNA 분자는 5'-말단 캐핑되어 mRNA 분자의 말단 구아노신 캡 잔기와 5'-말단 전사된 센스 뉴클레오타이드 사이에 5'-ppp-5'-트라이포스페이트 결합을 생성할 수 있다. 이 5'-구아닐레이트 캡은 이어서 N7-메틸-구아닐레이트 잔기를 생성하기 위하여 메틸화될 수 있다. mRNA의 5' 말단의 말단 및/또는 말단전(anteterminal) 전사된 뉴클레오타이드의 리보스 당은 선택적으로 또한 2'-O-메틸화되어 있을 수 있다. 구아닐레이트 캡 구조의 가수분해와 절단을 통한 5'-탈캐핑(decapping)은 분해를 위한 mRNA 분자 등과 같은 표적 핵산 분자일 수 있다.
본 발명의 변형된 mRNA로의 변형은, 비-가수분해성(non-hydrolyzable) 캡 구조를 생성하여 탈캐핑을 방지하고 따라서 mRNA 반감기를 증가시킬 수 있다. 캡 구조 가수분해는 5'-ppp-5' 포스포로다이에스터 결합의 절단을 필요로 하기 때문에, 변형된 뉴클레오타이드가 캐핑 반응 동안 이용될 수 있다. 예를 들어, 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)(매사추세츠주의 입시치시에 소재)로부터의 백시니아 캐핑 효소(Vaccinia Capping Enzyme)는 5'-ppp-5' 캡에서 포스포로티오에이트 결합을 생성하기 위하여 제조사의 지시사항에 따라서 α-티오-구아노신 뉴클레오타이드와 함께 이용될 수 있다. α-메틸-포스포네이트 및 셀레노-포스페이트 뉴클레오타이드 등과 같은 추가의 변형된 구아노신 뉴클레오타이드가 이용될 수 있다.
추가의 변형은, mRNA(위에서 언급된 바와 같음)의 5'-말단 및/또는 5'-말단전 뉴클레오타이드의 리보스 당의 해당 당 고리의 2'-하이드록실기 상의 2'-O-메틸화를 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 다수의 별개의 5'-캡 구조가 mRNA 분자 등과 같은 핵산 분자의 5'-캡을 생성하는데 이용될 수 있다.
본 명세서에서 합성 캡 유사체, 화학적 캡, 화학적 캡 유사체, 또는 구조적 혹은 기능적 캡 유사체라고도 지칭되는 캡 유사체는, 그들의 화학적 구조에 있어서 천연의(즉 내인성, 야생형 또는 생리학적) 5'-캡과는 상이한 반면 캡 기능을 유지된다. 캡 유사체는 핵산 분자에 화학적으로(즉 비-효소적으로) 또는 효소적으로 합성될 수 있고/있거나 연결될 수 있다.
예를 들어, 안티-리버스 캡 유사체(ARCA) 캡은 5'-5'-트라이포스페이트기에 의해 연결된 2개의 구아닌을 함유하되, 여기서 1개의 구아닌은 N7 메틸기뿐만 아니라 3'-O-메틸기를 함유한다(즉, N7,3'-O-다이메틸-구아노신-5'-트라이포스페이트-5'-구아노신(m7G-3'mppp-G; 이것은 3' O-Me-m7G(5')ppp(5')G와 등가적으로 설계될 수 있다). 다른 비변형 구아닌의 3'-O 원자는 캐핑된 핵산 분자(예컨대 mRNA 또는 mmRNA)의 5'-말단 뉴클레오타이드에 연결되게 된다. N7- 및 3'-O-메틸화 구아닌은 캐핑된 핵산 분자(예컨대 mRNA 또는 mmRNA)의 말단 모이어티를 제공한다.
다른 예시적인 캡은 mCAP이며, 이는 ARCA와 유사하지만 구아노신 상에 2'-O-메틸기를 지닌다(즉, N7,2'-O-다이메틸-구아노신-5'-트라이포스페이트-5'-구아노신, m7Gm-ppp-G).
캡 유사체는 시험관내 전사 반응에서 핵산 분자의 동시 캐핑을 허용하는 한편, 전사물의 20%까지는 캐핑되지 않은 채로 있을 수 있다. 이것은, 내인성, 세포 전사 기구에 의해 생산된 핵산의 내인성 5'-캡 구조로부터 캡 유사체의 구조적 차이뿐만 아니라, 저감된 번역 능력 및 저감된 세포 안정성을 유발할 수 있다.
본 발명의 변형된 mRNA는 또한, 더욱 진정한(authentic) 5'-캡 구조를 생성하기 위하여, 효소를 이용해서 전사 후 캐핑될 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "더욱 진정한"이란 어구는 구조적으로 혹은 기능적으로 내인성 혹은 야생형 특성을 근사하게 반영하거나 모방하는 특성을 지칭한다. 이것은, "더욱 진정한" 특성이 종래 기술의 합성 특성 혹은 유사체 등과 비교해서 내인성, 야생형, 천연의 혹은 생리학적 세포 기능 및/또는 구조를 더 양호하게 나타내거나, 또는 하나 이상의 관점에서 대응하는 내인성, 야생형, 천연의 또는 생리학적 특성을 능가한다는 것이다. 본 발명의 더욱 진정한 5'캡 구조의 비제한적인 예는, 특히, 당업계에 공지된 합성 5'캡 구조(또는 야생형, 천연의 혹은 생리학적 5'캡 구조)와 비교해서, 캡 결합 단백질의 증대된 결합, 증가된 반감기, 5' 엔도뉴클레아제에 대한 저감된 감수성 및/또는 저감된 5'탈캐핑을 지니는 것들이다. 예를 들어, 재조합 백시니아 바이러스 캐핑 효소 및 재조합 2'-O-메틸트랜스페라제 효소는, mRNA의 5'-말단 뉴클레오타이드와 구아닌 캡 뉴클레오타이드 간에 정준 뉴클레오타이드(canonical nucleotide) 5'-5'-트라이포스페이트 결합을 생성할 수 있되, 여기서, 캡 구아닌은 N7 메틸화를 함유하며, mRNA의 5'-말단 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸을 함유한다. 이러한 구조는 캡1 구조라 지칭된다. 이 캡은, 예컨대, 당업계에 공지된 기타 5'캡 유사체 구조와 비교해서, 보다 높은 번역-능력 및 세포 안정성 그리고 세포 염증전 사이토카인의 저감된 활성화를 초래한다. 캡 구조는, 7mG(5')ppp(5')N,pN2p(캡 0), 7mG(5')ppp(5')NlmpNp(캡 1) 및 7mG(5')-ppp(5')NlmpN2mp(캡 2)를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
변형된 mRNA는 전사 후 캐핑될 수 있기 때문에, 그리고 이 과정은 더욱 효과적이기 때문에, 변형된 mRNA의 거의 100%가 캐핑될 수 있다. 이것은 캡 유사체가 시험관내 전사 반응 과정에서 mRNA에 연결될 경우 ~80%인 것과는 대조적이다.
본 발명에 따르면, 5' 말단 캡은 내인성 캡 또는 캡 유사체를 포함할 수 있다. 본 발명에 따르면, 5' 말단 캡은 구아닌 유사체를 포함할 수 있다. 유용한 구아닌 유사체는, 이노신, N1-메틸-구아노신, 2'플루오로-구아노신, 7-데아자-구아노신, 8-옥소-구아노신, 2-아미노-구아노신, LNA-구아노신 및 2-아자이도-구아노신을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
바이러스 서열
보리 황화 위축 바이러스(BYDV-PAV)의 번역 인핸서 서열 등(이것으로 제한되지 않음)과 같은 추가의 바이러스 서열은, 공학적으로 조작되어 본 발명의 변형된 mRNA의 3' UTR에 삽입될 수 있고, mRNA 시험관내 및 생체내의 번역을 촉진시킬 수 있다. 형질주입 실험은 관련된 세포주에서 수행될 수 있고, 단백질 생산은 12시간, 24시간, 48시간, 72시간 및 7일 형질주입 후 ELISA에 의해 검정될 수 있다.
IRES 서열
또한, 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosome entry site: IRES)를 포함할 수 있는 변형된 mRNA가 제공된다. 우선 특성 피코르나 바이러스(Picorna virus) RNA를 특성으로 확인하고, IRES는 5' 캡 구조의 부재 시 단백질 합성을 개시함에 있어서 중요한 역할을 한다. IRES는 단독의 리보솜 결합 부위로서 작용할 수 있거나, mRNA의 다수의 리보솜 결합 부위 중 하나로서 역할할 수 있다. 1개보다 많은 작용성 리보솜 결합 부위를 포함하는 변형된 RNA는 리보솜에 의해 독립적으로 번역되는 수개의 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다("다수 시스트론성 핵산 분자"). 변형된 mRNA가 IRES와 함께 제공될 경우, 제2의 번역가능한 영역이 추가로 선택적으로 제공된다. 본 발명에 따라 이용될 수 있는 IRES 서열의 예로는, 제한 없이, 피코르나바이러스(예컨대 FMDV), 페스트 바이러스(CFFV), 폴리오 바이러스(PV), 뇌심근염바이러스(ECMV), 구제역 바이러스(FMDV), C형 간염 바이러스(HCV), 돼지 열병 바이러스(CSFV), 쥣과 백혈병 바이러스(MLV), 유인원 면역 결핍 바이러스(SIV) 또는 귀뚜라미 마비 바이러스(CrPV)로부터의 것들을 포함한다.
폴리-A 테일
RNA 처리 과정 동안, 아데닌 뉴클레오타이드의 장쇄(폴리-A 테일)가 안정성을 증가시키기 위하여 변형된 mRNA 분자 등과 같은 변형된 핵산 분자에 부가될 수 있다. 전사 직후, 전사물의 3' 말단은 3' 하이드록실을 유리시키기 위하여 절단될 수 있다. 이어서, 폴리-A 중합효소가 아데닌 뉴클레오타이드의 사슬을 RNA에 부가시킨다. 폴리아데닐화라 불리는 이 과정은, 예를 들어, 대략 100 내지 250개 길이의 잔기일 수 있는 폴리-A 테일을 부가시킨다.
독특한 폴리-A 테일 길이는 본 발명의 변형된 mRNA에 소정의 이점을 제공하는 것이 발견되었다.
일반적으로, 본 발명의 폴리-A 테일의 길이는 30개 이상의 뉴클레오타이드 길이이다. 다른 실시형태에 있어서, 폴리-A 테일은 35개 이상의 뉴클레오타이드(예컨대, 적어도 또는 약 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,100, 1,200, 1,300, 1,400, 1,500, 1,600, 1,700, 1,800, 1,900, 2,000, 2,500 및 3,000개 혹은 그 이상의 뉴클레오타이드) 길이이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 mRNA는 약 30 내지 약 3,000개(예컨대, 30 내지 50, 30 내지 100, 30 내지 250, 30 내지 500, 30 내지 750, 30 내지 1,000, 30 내지 1,500, 30 내지 2,000, 30 내지 2,500, 50 내지 100, 50 내지 250, 50 내지 500, 50 내지 750, 50 내지 1,000, 50 내지 1,500, 50 내지 2,000, 50 내지 2,500, 50 내지 3,000, 100 내지 500, 100 내지 750, 100 내지 1,000, 100 내지 1,500, 100 내지 2,000, 100 내지 2,500, 100 내지 3,000, 500 내지 750, 500 내지 1,000, 500 내지 1,500, 500 내지 2,000, 500 내지 2,500, 500 내지 3,000, 1,000 내지 1,500, 1,000 내지 2,000, 1,000 내지 2,500, 1,000 내지 3,000, 1,500 내지 2,000, 1,500 내지 2,500, 1,500 내지 3,000, 2,000 내지 3,000, 2,000 내지 2,500 및 2,500 내지 3,000개)의 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 폴리-A 테일은 전체적인 변형된 mRNA의 길이에 대해서 설계된다. 이 설계는 암호화 영역의 길이, 특정 특징 혹은 영역(측면 영역 등)에 기초할 수 있거나, 또는 변형된 mRNA로부터 발현되는 궁극적인 산물의 길이에 기초할 수 있다.
이 맥락에서 폴리-A 테일은 변형된 mRNA, 영역 혹은 그의 특징보다 길이가 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100% 길 수 있다. 폴리-A 테일은 또한 그것이 속하는 변형된 mRNA의 일부분으로서 설계될 수도 있다. 이 맥락에서, 폴리-A 테일은 분자의 전체 길이에서 폴리-A 테일을 감산한 것의 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 혹은 90% 이상일 수 있다. 또한, 폴리-A 결합 단백질에 대한 변형된 mRNA의 공학적으로 조작된 결합 부위 및 컨쥬게이션은 발현을 증대시킬 수 있다.
부가적으로, 다수의 개별의 변형된 mRNA는 폴리-A 테일의 3'-말단에서 변형된 뉴클레오타이드를 이용해서 3'-단부를 통해 PABP(폴리-A 결합단백질)에 함께 연결될 수 있다. 형질주입 실험은 관련된 세포주에서 수행될 수 있고, 단백질 생산은 12시간, 24시간, 48시간, 72시간 및 7일 형질주입 후 ELISA에 의해 검정될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 변형된 mRNA는 폴리A-G 4분체(Quartet)를 포함하도록 설계되어 있다. G-4분체는 DNA와 RNA 양쪽 모두에서 G-풍부 서열에 의해 형성될 수 있는 4개의 구아닌 뉴클레오타이드의 환식 수소 결합된 어레이이다. 이 실시형태에 있어서, G-4분체는 폴리-A 테일의 단부에 편입되어 있다. 얻어진 mmRNA 분자는 각종 시점에서 안정성, 단백질 생산 및 반감기를 포함하는 기타 파라미터에 대해서 검정된다. 폴리A-G 4분체는 120개 뉴클레오타이드 단독의 폴리-A 테일을 이용할 경우 보여지는 것의 적어도 75%에 상당하는 단백질 생산을 초래하는 것이 발견되었다.
변형
본 발명의 변형된 핵산 및 변형된 mRNA(mmRNA)는 1, 2 또는 그 이상의 상이한 변형을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 및 mmRNA는 1, 2 또는 그 이상의 상이한 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 변형을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 세포에 도입된 변형된 핵산 또는 mmRNA(예컨대, 1개 혹은 그 이상의 mmRNA 분자를 지님)는, 비변형 핵산 또는 mmRNA와 비교해서, 세포 내 저감된 분해를 보일 수 있다.
변형된 핵산 및 mmRNA는 당, 핵염기에 대한 임의의 유용한 변형(예컨대, 피리미딘 핵염기의 원자를 선택적으로 치환된 아미노, 선택적으로 치환된 티올, 선택적으로 치환된 알킬(예컨대, 메틸 또는 에틸) 또는 할로(예컨대, 클로로 또는 플루오로)로 대체 혹은 치환하는 등에 의한 핵염기의 1개 이상의 변형, 또는 뉴클레오사이드간 결합(예컨대, 포스포다이에스터 골격에 대한 1개 이상의 변형)을 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에 있어서, 변형은 당 및 뉴클레오사이드간 결합의 양쪽 모두에 존재한다(예컨대, 1개 혹은 변형, 예를 들어, 리보핵산(RNA), 데옥시리보핵산(DNA), 트레오스 핵산(TNA), 글라이콜 핵산(GNA), 펩타이드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA) 또는 그의 혼성체에 존재하는 것들). 추가의 변형이 본 명세서에 기재되어 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명의 변형된 핵산 및 mmRNA는 mRNA가 도입되는 세포의 선천적 면역 반응을 실질적으로 유도하지 않는다. 소정의 실시형태에 있어서, 세포 내로 도입되는 변형된 핵산 분자 혹은 변형된 핵산 분자를 세포내 분해시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 변형된 핵산 분자 또는 변형된 mRNA의 분해는, 단백질 생산의 정확한 타이밍이 요망된다면 선호될 수 있다. 이와 같이 해서, 몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명은, 세포 내에 유도된 방식으로 작용할 수 있는 분해 도메인을 포함하는 변형된 핵산 분자를 제공한다. 다른 양상에 있어서, 본 발명의 개시내용은, (예컨대, 변형된 뉴클레오타이드가 비변형 뉴클레오타이드에 비해서 주된 그루브 상호작용 상대(major groove interacting partner)에 대한 감소된 결합 친화도를 지닐 경우) 주된 그루브 상호작용, 예컨대, 결합 상대의 핵산과의 결합을 파괴할 수 있는 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산을 제공한다.
변형된 핵산 및 mmRNA는 선택적으로 기타 제제(예컨대, RNAi-유도제, RNAi 제제, siRNA, shRNA, miRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 촉매적 DNA, tRNA, 삼중 나선 형성, 앱타머, 벡터 등을 유도하는 RNA)를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 또는 mmRNA는 1개 이상의 메신저 RNA(mRNA) 및 1개 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드(예컨대, mmRNA 분자)를 포함할 수 있다. 이들 변형된 핵산 및 mmRNA의 상세는 다음과 같다.
변형된 핵산
본 발명의 변형된 핵산 또는 mmRNA는 관심 대상 폴리펩타이드를 암호화하는 결합된 뉴클레오사이드의 제1 영역, 제1 영역의 5'말단에 위치된 제1 측면 영역 및 제1 영역의 3'말단에 위치된 제2 측면 영역을 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 또는 mmRNA는 하기 화학식 (Ia) 또는 화학식 (Ia-1):
Figure pct00001
또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체를 지니는 n개의 연결된 뉴클레오사이드를 포함하되, 식 중,
U는 O, S, N(RU)nu 또는 C(RU)nu이고, 여기서 nu는 0 내지 2의 정수이며, 각각의 RU는, 독립적으로, H, 할로 또는 선택적으로 치환된 알킬이고;
Figure pct00002
은 단일 결합이거나 존재하지 않으며;
R1', R2', R1", R2", R1, R2, R3, R4 및 R5의 각각은, 만약 존재한다면, 독립적으로, H, 할로, 하이드록시, 티올, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 알케닐옥시, 선택적으로 치환된 알키닐옥시, 선택적으로 치환된 아미노알콕시, 선택적으로 치환된 알콕시알콕시, 선택적으로 치환된 하이드록시알콕시, 선택적으로 치환된 아미노, 아자이도, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 아미노알킬, 선택적으로 치환된 아미노알케닐, 선택적으로 치환된 아미노알키닐이거나, 또는 존재하지 않고; R3과 R1', R1", R2, R2" 또는 R5 중 하나 이상의 조합(예컨대, R1'와 R3의 조합, R1"와 R3의 조합, R2'와 R3의 조합, R2"와 R3의 조합 또는 R5와 R3의 조합)은 함께 결합되어 선택적으로 치환된 알킬렌 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬렌을 형성할 수 있으며 또한 이들이 부착되는 탄소들과 함께 결합되어 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴(예컨대, 이환식, 삼환식 또는 사환식의 헤테로사이클릴)을 제공할 수 있고; R5와 R1', R1", R2' 또는 R2" 중 하나 이상의 조합(예컨대, R1'와 R5, R1"과 R5의 조합, R2'와 R5의 조합 또는 R2"와 R5의 조합)은 함께 결합되어 선택적으로 치환된 알킬렌 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬렌을 형성할 수 있고 또한 이들이 부착되는 탄소들과 함께 결합되어 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴(예컨대, 이환식, 삼환식 또는 사환식의 헤테로사이클릴)을 제공할 수 있으며; R4와 R1', R1", R2', R2", R3 또는 R5 중 하나 이상의 조합은 함께 결합되어 선택적으로 치환된 알킬렌 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬렌을 형성할 수 있고 또한 이들이 부착되는 탄소들과 함께 결합되어 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴(예컨대, 이환식, 삼환식 또는 사환식의 헤테로사이클릴)을 제공할 수 있으며;
m' 및 m"의 각각은, 독립적으로, 0 내지 3(예컨대, 0 내지 2, 0 내지 1, 1 내지 3 또는 1 내지 2)의 정수이고;
Y1, Y2 및 Y3의 각각은, 독립적으로, O, S, Se, -NRN1-, 선택적으로 치환된 알킬렌, 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬렌이되, 여기서 RN1은 H, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 아릴이거나 또는 존재하지 않으며;
각각의 Y4는, 독립적으로, H, 하이드록시, 티올, 보라닐, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 알케닐옥시, 선택적으로 치환된 알키닐옥시, 선택적으로 치환된 시티오알콕시, 선택적으로 치환된 알콕시알콕시 또는 선택적으로 치환된 아미노이고;
각각의 Y5는, 독립적으로, O, S, Se, 선택적으로 치환된 알킬렌(예컨대, 메틸렌) 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬렌이며;
n은 1 내지 100,000의 정수이고;
B는 핵염기(예컨대, 퓨린, 피리미딘, 또는 그의 유도체)이되, 여기서 B와 R1'의 조합, B와 R2'의 조합, B와 R1"의 조합 또는 B와 R2"의 조합은, 이들이 부착되는 탄소들과 함께 결합되어, 선택적으로 이환식기(예컨대, 이환식 헤테로사이클릴)를 형성할 수 있거나, 또는 B, R1" 및 R3의 조합 또는 B, R2" 및 R3의 조합은 선택적으로 삼환식 혹은 사환식기(예컨대, 삼환식 혹은 사환식 헤테로사이클릴, 예컨대, 본 명세서에서의 화학식 (IIo) 내지 (IIp))를 형성할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 또는 mmRNA는 변형된 리보스를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 또는 mmRNA는 하기 화학식 (Ia-2) 내지 (Ia-5) 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체를 지니는 n개의 연결된 뉴클레오사이드를 포함한다.
Figure pct00003
몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 또는 mmRNA는 하기 화학식 (Ib) 또는 화학식 (Ib-1):
Figure pct00004
또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체를 지니는 n개의 연결된 뉴클레오사이드를 포함하되, 식 중,
U는 O, S, N(RU)nu 또는 C(RU)nu이고, 여기서 nu는 0 내지 2의 정수이며, 각각의 RU는, 독립적으로, H, 할로 또는 선택적으로 치환된 알킬이고;
Figure pct00005
은 단일 결합이거나 존재하지 않으며;
R1, R3', R3" 및 R4의 각각은, 독립적으로, H, 할로, 하이드록시, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 알케닐옥시, 선택적으로 치환된 알키닐옥시, 선택적으로 치환된 아미노알콕시, 선택적으로 치환된 알콕시알콕시, 선택적으로 치환된 하이드록시알콕시, 선택적으로 치환된 아미노, 아자이도, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 아미노알킬, 선택적으로 치환된 아미노알케닐, 선택적으로 치환된 아미노알키닐이거나 또는 존재하지 않으며; 여기서 R1과 R3'의 조합 또는 R1과 R3"의 조합은 함께 결합되어 선택적으로 치환된 알킬렌 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬렌을 형성(예컨대, 잠금 핵산을 생산)할 수 있고;
각각의 R5는, 독립적으로, H, 할로, 하이드록시, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 알케닐옥시, 선택적으로 치환된 알키닐옥시, 선택적으로 시치환된 아미노알콕시, 선택적으로 치환된 알콕시알콕이거나 또는 존재하지 않으며;
Y1, Y2 및 Y3의 각각은, 독립적으로, O, S, Se, -NRN1-, 선택적으로 치환된 알킬렌, 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬렌이되, 여기서 RN1은 H, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 아릴이거나 또는 존재하지 않고;
각각의 Y4는, 독립적으로, H, 하이드록시, 티올, 보라닐, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 알케닐옥시, 선택적으로 치환된 알키닐옥시, 선택적으로 치환된 알콕시알콕시 또는 선택적으로 치환된 아미노이며;
n은 1 내지 100,000의 정수이고;
B는 핵염기이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 또는 mmRNA는 하기 화학식 (Ic):
Figure pct00006
(Ic) 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체를 지니는 n개의 연결된 뉴클레오사이드를 포함하되, 식 중,
U는 O, S, N(RU)nu 또는 C(RU)nu이고, 여기서 nu는 0 내지 2의 정수이며, 각각의 RU는, 독립적으로, H, 할로 또는 선택적으로 치환된 알킬이고;
Figure pct00007
은 단일 결합이거나 존재하지 않으며;
B1, B2 및 B3의 각각은, 독립적으로, 핵염기(예컨대, 본 명세서에 기재된 바와 같은 퓨린, 피리미딘, 또는 그의 유도체), H, 할로, 하이드록시, 티올, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 알케닐옥시, 선택적으로 치환된 알키닐옥시, 선택적으로 치환된 아미노알콕시, 선택적으로 치환된 알콕시알콕시, 선택적으로 치환된 하이드록시알콕시, 선택적으로 치환된 아미노, 아자이도, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 아미노알킬, 선택적으로 치환된 아미노알케닐 또는 선택적으로 치환된 아미노알키닐이고, 여기서 B1, B2 및 B3 중 유일한 1개는 핵염기이며;
Rb1, Rb2, Rb3, R3 및 R5의 각각은, 독립적으로, H, 할로, 하이드록시, 티올, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 알케닐옥시, 선택적으로 치환된 알키닐옥시, 선택적으로 치환된 아미노알콕시, 선택적으로 치환된 알콕시알콕시, 선택적으로 치환된 하이드록시알콕시, 선택적으로 치환된 아미노, 아자이도, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 아미노알킬, 선택적으로 치환된 아미노알케닐 또는 선택적으로 치환된 아미노알키닐이고;
Y1, Y2 및 Y3의 각각은, 독립적으로, O, S, Se, -NRN1-, 선택적으로 치환된 알킬렌 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬렌이되, 여기서 RN1은 H, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐 또는 선택적으로 치환된 아릴이며;
각각의 Y4는, 독립적으로, H, 하이드록시, 티올, 보라닐, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 알케닐옥시, 선택적으로 치환된 알키닐옥시, 선택적으로 치환된 시티오알콕시, 선택적으로 치환된 알콕시알콕시 또는 선택적으로 치환된 아미노이고;
각각의 Y5는, 독립적으로, O, S, Se, 선택적으로 치환된 알킬렌(예컨대, 메틸렌) 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬렌이며;
n은 1 내지 100,000의 정수이고;
여기서 U를 포함하는 고리는 1개 이상의 이중 결합을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에 있어서, U를 포함하는 고리는 U-CB3Rb3사이 혹은 CB3Rb3-CB2Rb2 사이에 이중 결합을 지니지 않는다.
몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 또는 mmRNA는 하기 화학식 (Id):
Figure pct00008
(Id) 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체를 지니는 n개의 연결된 뉴클레오사이드를 포함하되, 식 중,
U는 O, S, N(RU)nu 또는 C(RU)nu이고, 여기서 nu는 0 내지 2의 정수이며, 각각의 RU는, 독립적으로, H, 할로 또는 선택적으로 치환된 알킬이고;
R3의 각각은, 독립적으로, H, 할로, 하이드록시, 티올, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 알케닐옥시, 선택적으로 치환된 알키닐옥시, 선택적으로 치환된 아미노알콕시, 선택적으로 치환된 알콕시알콕시, 선택적으로 치환된 하이드록시알콕시, 선택적으로 치환된 아미노, 아자이도, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 아미노알킬, 선택적으로 치환된 아미노알케닐 또는 선택적으로 치환된 아미노알키닐이며;
Y1, Y2 및 Y3의 각각은, 독립적으로, O, S, Se, -NRN1-, 선택적으로 치환된 알킬렌 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬렌이되, 여기서 RN1은 H, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐 또는 선택적으로 치환된 아릴이고;
각각의 Y4는, 독립적으로, H, 하이드록시, 티올, 보라닐, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 알케닐옥시, 선택적으로 치환된 알키닐옥시, 선택적으로 치환된 시티오알콕시, 선택적으로 치환된 알콕시알콕시 또는 선택적으로 치환된 아미노이며;
각각의 Y5는, 독립적으로, O, S, 선택적으로 치환된 알킬렌(예컨대, 메틸렌) 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬렌이고;
n은 1 내지 100,000의 정수이며;
B는 핵염기(예컨대, 퓨린, 피리미딘, 또는 그의 유도체)이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는 하기 화학식 (Ie):
Figure pct00009
(Ie) 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체를 지니는 n개의 연결된 뉴클레오사이드를 포함하되, 식 중,
U 및 U"의 각각은, 독립적으로, O, S, N(RU)nu 또는 C(RU)nu이고, 여기서 nu는 0 내지 2의 정수이며, 각각의 RU는, 독립적으로, H, 할로 또는 선택적으로 치환된 알킬이고;
각각의 R6는, 독립적으로, H, 할로, 하이드록시, 티올, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 알케닐옥시, 선택적으로 치환된 알키닐옥시, 선택적으로 치환된 아미노알콕시, 선택적으로 치환된 알콕시알콕시, 선택적으로 치환된 하이드록시알콕시, 선택적으로 치환된 아미노, 아자이도, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 아미노알킬, 선택적으로 치환된 아미노알케닐 또는 선택적으로 치환된 아미노알키닐이며;
각각의 Y5는, 독립적으로, O, S, 선택적으로 치환된 알킬렌(예컨대, 메틸렌 또는 에틸렌) 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬렌이고;
n은 1 내지 100,000의 정수이며;
B는 핵염기(예컨대, 퓨린, 피리미딘, 또는 그의 유도체)이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 또는 mmRNA는 화학식 (If) 또는 (If-1):
Figure pct00010
(If),
Figure pct00011
(If-1), 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체를 지니는 n개의 연결된 뉴클레오사이드를 포함하되, 식 중,
U 및 U"의 각각은, 독립적으로, O, S, N, N(RU)nu 또는 C(RU)nu이고, 여기서 nu는 0 내지 2의 정수이며, 각각의 RU는, 독립적으로, H, 할로 또는 선택적으로 치환된 알킬이고(예컨대, U'는 O이고 U"는 N임);
Figure pct00012
은 단일 결합이거나 존재하지 않으며;
R1', R2', R1", R2", R3 및 R4의 각각은, 독립적으로, H, 할로, 하이드록시, 티올, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 알케닐옥시, 선택적으로 치환된 알키닐옥시, 선택적으로 치환된 아미노알콕시, 선택적으로 치환된 알콕시알콕시, 선택적으로 치환된 하이드록시알콕시, 선택적으로 치환된 아미노, 아자이도, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 아미노알킬, 선택적으로 치환된 아미노알케닐, 선택적으로 치환된 아미노알키닐이거나, 또는 존재하지 않으며; 여기서 R1'와 R3의 조합, R1"과 R3의 조합, R2'와 R3의 조합 또는 R2"와 R3의 조합은 함께 결합되어 선택적으로 치환된 알킬렌 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬렌을 형성하며(예컨대, 잠금 핵산을 생산하며); m' 및 m"의 각각은, 독립적으로, 0 내지 3(예컨대, 0 내지 2, 0 내지 1, 1 내지 3 또는 1 내지 2)의 정수이고;
Y1, Y2 및 Y3의 각각은, 독립적으로, O, S, Se, -NRN1-, 선택적으로 치환된 알킬렌, 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬렌이되, 여기서 RN1은 H, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 아릴이거나 또는 존재하지 않으며;
각각의 Y4는, 독립적으로, H, 하이드록시, 티올, 보라닐, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 알케닐옥시, 선택적으로 치환된 알키닐옥시, 선택적으로 치환된 시티오알콕시, 선택적으로 치환된 알콕시알콕시 또는 선택적으로 치환된 아미노이고;
각각의 Y5는, 독립적으로, O, S, Se, 선택적으로 치환된 알킬렌(예컨대, 메틸렌) 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬렌이며;
n은 1 내지 100,000의 정수이고;
B는 핵염기(예컨대, 퓨린, 피리미딘, 또는 그의 유도체)이다.
변형된 핵산 또는 mmRNA(예컨대, (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) 및 (IXa)-(IXr))의 몇몇 실시형태에 있어서, U를 포함하는 고리는 1개 혹은 2개의 이중 결합을 지닌다.
변형된 핵산 또는 mmRNA(예컨대, 화학식 (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) 및 (IXa)-(IXr))의 몇몇 실시형태에 있어서, R1, R1' 및 R1"의 각각은, 만약 존재한다면, H이다. 추가의 실시형태에 있어서, R2, R2' 및 R2"의 각각은, 만약 존재한다면, 독립적으로, H, 할로(예컨대, 플루오로), 하이드록시, 선택적으로 치환된 알콕시(예컨대, 메톡시 또는 에톡시) 또는 선택적으로 치환된 알콕시알콕시이다. 특정 실시형태에 있어서, 알콕시시알콕시는 -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR'이고, 여기서 s1은 1 내지 10(예컨대, 1 내지 6 또는 1 내지 4)의 정수이며, s2 및 s3의 각각은, 독립적으로, 0 내지 10(예컨대, 0 내지 4, 0 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 6 또는 1 내지 10)의 정수이고, R'는 H 또는 C1-20 알킬)이다. 몇몇 실시형태에 있어서, s2는 0이고, s1은 1 또는 2이며, s3은 0 또는 1이고, R'는 C1-6 알킬이다.
변형된 핵산 또는 mmRNA(예컨대, 화학식 (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) 및 (IXa)-(IXr))의 몇몇 실시형태에 있어서, R2, R2' 및 R2"의 각각은, 만약 존재한다면, ?이다. 추가의 실시형태에 있어서, R1, R1' 및 R1"의 각각은, 만약 존재한다면, 독립적으로, H, 할로(예컨대, 플루오로), 하이드록시, 선택적으로 치환된 알콕시(예컨대, 메톡시 또는 에톡시) 또는 선택적으로 치환된 알콕시알콕시이다. 특정 실시형태에 있어서, 알콕시알콕시는 -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR'이고, 여기서 s1은 1 내지 10(예컨대, 1 내지 6 또는 1 내지 4)의 정수이며, s2 및 s3의 각각은, 독립적으로, 0 내지 10(예컨대, 0 내지 4, 0 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 6 또는 1 내지 10)의 정수이고, R'는 H 또는 C1-20알킬)이다. 몇몇 실시형태에 있어서, s2는 0이고, s1은 1 또는 2이며, s3은 0 또는 1이고, R'는 C1-6 알킬이다.
변형된 핵산 또는 mmRNA(예컨대, 화학식 (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) 및 (IXa)-(IXr))의 몇몇 실시형태에 있어서, R3, R4 및 R5의 각각은, 독립적으로, H, 할로(예컨대, 플루오로), 하이드록시, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알콕시(예컨대, 메톡시 또는 에톡시) 또는 선택적으로 치환된 알콕시알콕시이다. 특정 실시형태에 있어서, R3은 H이고, R4는 H이며, R5는 H이고, 또는 R3, R4 및 R5는 모두 H이다. 특정 실시형태에 있어서, R3은 C1-6 알킬이고, R4는 C1-6 알킬이며, R5는 C1-6 알킬이고, 또는 R3, R4 및 R5은 모두 C1-6 알킬이다. 특정 실시형태에 있어서, R3과 R4는 둘 모두 H이고, R5는 C1-6 알킬이다.
변형된 핵산 또는 mmRNA(예컨대, 화학식 (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) 및 (IXa)-(IXr))의 몇몇 실시형태에 있어서, R3과 R5가 함께 결합되어 선택적으로 치환된 알킬렌 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬렌을 형성하고, 또한, 이들이 부착되는 탄소들과 함께 결합되어, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴(예컨대, 이환식, 삼환식 또는 사환식 헤테로사이클릴, 예컨대, 트랜스-3,4'유사체)를 제공하며, 여기서 R3와 R5는 함께 결합되어 헤테로알킬렌(예컨대, -(CH2)b1O(CH2)b2O(CH2)b3-, 여기서 b1, b2 및 b3의 각각은, 독립적으로, 0 내지 3의 정수임)을 형성한다.
변형된 핵산 또는 mmRNA(예컨대, 화학식 (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) 및 (IXa)-(IXr))의 몇몇 실시형태에 있어서, R3과 R1', R1", R2', R2" 또는 R5 중 하나 이상은 함께 결합되어 선택적으로 치환된 알킬렌 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬렌을 형성하고 또한 이들이 부착되는 탄소들과 함께 결합되어 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴(예컨대, 이환식, 삼환식 또는 사환식 헤테로사이클릴)을 제공하며, R3과 R1', R1", R2', R2" 또는 R5 중 하나 이상은 함께 결합하여 헤테로알킬렌(예컨대, -(CH2)b1O(CH2)b2O(CH2)b3-, 여기서 b1, b2 및 b3의 각각은, 독립적으로, 0 내지 3의 정수임)을 형성한다.
변형된 핵산 또는 mmRNA(예컨대, 화학식 (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) 및 (IXa)-(IXr))의 몇몇 실시형태에 있어서, R5와 R1', R1", R2' 또는 R2" 중 하나 이상은 함께 결합하여 선택적으로 치환된 알킬렌 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬렌을 형성하고, 이들이 부착되는 탄소들과 함께 결합되어, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴(예컨대, 이환식, 삼환식 또는 사환식 헤테로사이클릴)을 제공하거나, R5 및 R1', R1", R2' 또는 R2" 중 하나 이상은 함께 결합하여 헤테로알킬렌(예컨대, -(CH2)b1O(CH2)b2O(CH2)b3-, 여기서 b1, b2 및 b3의 각각은, 독립적으로, 0 내지 3의 정수임)을 형성한다.
변형된 핵산 또는 mmRNA(예컨대, 화학식 (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) 및 (IXa)-(IXr))의 몇몇 실시형태에 있어서, 각각의 Y2는, 독립적으로, O, S 또는 -NRN1-이고, 여기서 RN1은 H, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐 또는 선택적으로 치환된 아릴이다. 특정 실시형태에 있어서, Y2는 NRN1-이되, 여기서 RN1은 H 또는 선택적으로 치환된 알킬(예컨대, C1-6 알킬, 예컨대, 메틸, 에틸, 아이소프로필 혹은 n-프로필)이다.
변형된 핵산 또는 mmRNA(예컨대, 화학식 (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) 및 (IXa)-(IXr))의 몇몇 실시형태에 있어서, 각각의 Y3는, 독립적으로, O 또는 S이다.
변형된 핵산 또는 mmRNA(예컨대, 화학식 (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) 및 (IXa)-(IXr))의 몇몇 실시형태에 있어서, R1은 H이고; 각각의 R2는, 독립적으로, H, 할로(예컨대, 플루오로), 하이드록시, 선택적으로 치환된 알콕시(예컨대, 메톡시 또는 에톡시) 또는 선택적으로 치환된 알콕시알콕시(예컨대, -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR', 여기서 s1은 1 내지 10(예컨대, 1 내지 6 또는 1 내지 4)의 정수이고, s2 및 s3의 각각은, 독립적으로, 0 내지 10(예컨대, 0 내지 4, 0 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 6 또는 1 내지 10)의 정수이며, R'는 H 또는 C1-20알킬이고, 예컨대, s2는 0이며, s1은 1 또는 2이고, s3은 0 또는 1이며, R'은 C1-6 알킬임)이고; 각각의 Y2는, 독립적으로, O 또는 -NRN1-이며, 여기서 RN1은 H, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐 또는 선택적으로 치환된 아릴(예컨대, RN1은 H 또는 선택적으로 치환된 알킬(예컨대, C1-6 알킬, 예컨대, 메틸, 에틸, 아이소프로필 또는 n-프로필임)임)이며; 각각의 Y3는, 독립적으로, O 또는 S(예컨대, S)이다. 추가의 실시형태에 있어서, R3은 H, 할로(예컨대, 플루오로), 하이드록시, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알콕시(예컨대, 메톡시 또는 에톡시) 또는 선택적으로 치환된 알콕시알콕시이다. 또 다른 추가의 실시형태에 있어서, 각각의 Y1은, 독립적으로, O 또는 -NRN1-이되, 여기서 RN1은 H, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐 또는 선택적으로 치환된 아릴(예컨대, RN1은 H 또는 선택적으로 치환된 알킬(예컨대, C1-6 알킬, 예컨대, 메틸, 에틸, 아이소프로필 또는 n-프로필)임)이고; 각각의 Y4는, 독립적으로, H, 하이드록시, 티올, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 시티오알콕시, 선택적으로 치환된 알콕시알콕시 또는 선택적으로 치환된 아미노이다.
변형된 핵산 또는 mmRNA(예컨대, 화학식 (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) 및 (IXa)-(IXr))의 몇몇 실시형태에 있어서, 각각의 R1은 독립적으로, H, 할로(예컨대, 플루오로), 하이드록시, 선택적으로 치환된 알콕시(예컨대, 메톡시 또는 에톡시) 또는 선택적으로 치환된 알콕시알콕시(예컨대, -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR', 여기서 s1은 1 내지 10(예컨대, 1 내지 6 또는 1 내지 4)의 정수이고, s2 및 s3의 각각은, 독립적으로, 0 내지 10(예컨대, 0 내지 4, 0 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 6 또는 1 내지 10)의 정수이고, R'는 H 또는 C1-20알킬이되, 예컨대, 여기서, s2는 0이고, s1은 1 또는 2이며, s3은 0 또는 1이고, R'는 C1-6 알킬임)이고; R2는 H이며; 각각의 Y2는, 독립적으로, O 또는 -NRN1-이되, 여기서 RN1은 H, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐 또는 선택적으로 치환된 아릴(예컨대, 여기서 RN1은 H 또는 선택적으로 치환된 알킬(예컨대, C1-6 알킬, 예컨대, 메틸, 또는 n-프로필)임)이고; 각각의 Y3은, 독립적으로, O 또는 S(예컨대, S)이다. 추가의 실시형태에 있어서, R3은 H, 할로(예컨대, 플루오로), 하이드록시, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알콕시(예컨대, 메톡시 또는 에톡시) 또는 선택적으로 치환된 알콕시알콕시이다. 또 다른 추가의 실시형태에 있어서,각각의 Y1은, 독립적으로, O 또는 -NRN1-이되, 여기서 RN1은 H, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐 또는 선택적으로 치환된 아릴(예컨대, RN1은 H 또는 선택적으로 치환된 알킬(예컨대, C1-6 알킬, 예컨대, 메틸, 에틸, 아이소프로필 또는 n-프로필)임)이고; 각각의 Y4는, 독립적으로, H, 하이드록시, 티올, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 시티오알콕시, 선택적으로 치환된 알콕시알콕시 또는 선택적으로 치환된 아미노이다.
변형된 핵산 또는 mmRNA(예컨대, (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) 및 (IXa)-(IXr))의 몇몇 실시형태에 있어서, U를 포함하는 고리는 β-D(예컨대, β-D-리보) 입체형태이다.
변형된 핵산 또는 mmRNA(예컨대, (Ia) 내지 (Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) 및 (IXa)-(IXr))의 몇몇 실시형태에 있어서, U를 포함하는 고리는 α-L(예컨대, α-L-리보) 입체형태이다.
변형된 핵산 또는 mmRNA(예컨대, 화학식 (Ia) 내지 (Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) 및 (IXa)-(IXr))의 몇몇 실시형태에 있어서, 1개 이상의 B는 유사유리딘(ψ) 또는 5-메틸-시티딘(m5C)이 아니다. 몇몇 실시형태에 있어서, B 핵염기의 약 10% 내지 약 100%는 ψ 또는 m5C가 아니다(예컨대, n개의 B의 10% 내지 20%, 10% 내지 35%, 10% 내지 50%, 10% 내지 60%, 10% 내지 75%, 10% 내지 90%, 10% 내지 95%, 10% 내지 98%, 10% 내지 99%, 20% 내지 35%, 20% 내지 50%, 20% 내지 60%, 20% 내지 75%, 20% 내지 90%, 20% 내지 95%, 20% 내지 98%, 20% 내지 99%, 20% 내지 100%, 50% 내지 60%, 50% 내지 75%, 50% 내지 90%, 50% 내지 95%, 50% 내지 98%, 50% 내지 99%, 50% 내지 100%, 75% 내지 90%, 75% 내지 95%, 75% 내지 98%, 75% 내지 99%, 및 75% 내지 100%는 ψ 또는 m5C가 아니다). 몇몇 실시형태에 있어서, B는 ψ 또는 m5C가 아니다.
변형된 핵산 또는 mmRNA(예컨대, 화학식 (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) 및 (IXa)-(IXr))의 몇몇 실시형태에 있어서, B가 사이토신, 구아닌, 유라실 및 아데닌으로부터 선택된 비변형 핵염기이면, Y1, Y2 또는 Y3 중 적어도 하나는 O가 아니다.
몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 또는 mmRNA는 변형된 리보스를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 또는 mmRNA는 하기 화학식 (IIa) 내지 (IIc):
Figure pct00013
(IIa),
Figure pct00014
(IIb), 또는
Figure pct00015
(IIc), 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체를 지니는 n개의 연결된 뉴클레오사이드를 포함한다. 특정 실시형태에 있어서, U는 O 또는 C(RU)nu이되, 여기서 nu는 0 내지 2의 정수이고, 각각의 RU는, 독립적으로, H, 할로 또는 선택적으로 치환된 알킬이다(예컨대, 예컨대, U는 -CH2- 또는 -CH-이다). 다른 실시형태에 있어서, R1, R2, R3, R4 및 R5의 각각은, 독립적으로, H, 할로, 하이드록시, 티올, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 알케닐옥시, 선택적으로 치환된 알키닐옥시, 선택적으로 치환된 아미노알콕시, 선택적으로 치환된 알콕시알콕시, 선택적으로 치환된 하이드록시알콕시, 선택적으로 치환된 아미노, 아자이도, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 아미노알킬, 선택적으로 치환된 아미노알케닐, 선택적으로 치환된 아미노알키닐이거나 또는 존재하지 않으며(예컨대, 각각의 R1 및 R2는, 독립적으로, H, 할로, 하이드록시, 선택적으로 치환된 알킬 또는 선택적으로 치환된 알콕시이고; 각각의 R3및 R4는, 독립적으로, H 또는 선택적으로 치환된 알킬이며; R5는 H 또는 하이드록시임),
Figure pct00016
는 단일 결합 또는 이중 결합이다.
특정 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 또는 mmRNA는 화학식 (IIb-1) 내지 (IIb-2):
Figure pct00017
(IIb-1) 또는
Figure pct00018
(IIb-2), 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체를 지니는 n개의 연결된 뉴클레오사이드를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, U는 O 또는 C(RU)nu이고, 여기서 nu는 0 내지 2의 정수이며, 각각의 RU는, 독립적으로, H, 할로 또는 선택적으로 치환된 알킬이다(예컨대, U는 -CH2- 또는 -CH-이다). 다른 실시형태에 있어서, R1 및 R2의 각각은, 독립적으로, H, 할로, 하이드록시, 티올, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 알케닐옥시, 선택적으로 치환된 알키닐옥시, 선택적으로 치환된 아미노알콕시, 선택적으로 치환된 알콕시알콕시, 선택적으로 치환된 하이드록시알콕시, 선택적으로 치환된 아미노, 아자이도, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 아미노알킬, 선택적으로 치환된 아미노알케닐, 선택적으로 치환된 아미노알키닐이거나 또는 존재하지 않는다(예컨대, 각각의 R1 및 R2는, 독립적으로, H, 할로, 하이드록시, 선택적으로 치환된 알킬 또는 선택적으로 치환된 알콕시, 예컨대, H, 할로, 하이드록시, 알킬 또는 알콕시이다). 특정 실시형태에 있어서, R2는 하이드록시 또는 선택적으로 치환된 알콕시(예컨대, 메톡시, 에톡시, 또는 본 명세서에 기재된 임의의 것)이다.
특정 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 또는 mmRNA는 하기 화학식 (IIc-1) 내지 (IIc-4):
Figure pct00019
(IIc-1),
Figure pct00020
(IIc-2),
Figure pct00021
(IIc-3) 또는
Figure pct00022
(IIc-4), 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체를 지니는 n개의 연결된 뉴클레오사이드를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, U는 O 또는 C(RU)nu이고, 여기서 nu는 0 내지 2의 정수이며, 각각의 RU는, 독립적으로, H, 할로 또는 선택적으로 치환된 알킬이다(예컨대, U는 -CH2- 또는 -CH-이다). 몇몇 실시형태에 있어서, R1, R2 및 R3의 각각은, 독립적으로, H, 할로, 하이드록시, 티올, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 알케닐옥시, 선택적으로 치환된 알키닐옥시, 선택적으로 치환된 아미노알콕시, 선택적으로 치환된 알콕시알콕시, 선택적으로 치환된 하이드록시알콕시, 선택적으로 치환된 아미노, 아자이도, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 아미노알킬, 선택적으로 치환된 아미노알케닐, 선택적으로 치환된 아미노알키닐이거나 또는 존재하지 않는다(예컨대, 각각의 R1 및 R2는, 독립적으로, H, 할로, 하이드록시, 선택적으로 치환된 알킬 또는 선택적으로 치환된 알콕시, 예컨대, H, 할로, 하이드록시, 알킬 또는 알콕시이고; 각각의 R3은, 독립적으로, H 또는 선택적으로 치환된 알킬이다)). 특정 실시형태에 있어서, R2는 하이드록시 또는 선택적으로 치환된 알콕시(예컨대, 메톡시, 에톡시, 또는 본 명세서에 기재된 임의의 것)이다. 특정 실시형태에 있어서, R1은 선택적으로 치환된 알킬이고, R2는 하이드록시이다. 다른 실시형태에 있어서, R1은 하이드록시이고, R2는 선택적으로 치환된 알킬이다. 추가의 실시형태에 있어서, R3은 선택적으로 치환된 알킬이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 또는 mmRNA는 비환식의 변형된 리보스를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 또는 mmRNA는 하기 (IId) 내지 (IIf):
Figure pct00023
(IId),
Figure pct00024
(IIe), 또는
Figure pct00025
(IIf), 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체를 포함하는 n개의 연결된 뉴클레오사이드를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 또는 mmRNA는 비환식의 변형된 헥시톨을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 또는 mmRNA는 하기 화학식 (IIg) 내지 (IIj):
Figure pct00026
(IIg),
Figure pct00027
(IIh),
Figure pct00028
(IIi), 또는
Figure pct00029
(IIj), 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체를 포함하는 n개의 연결된 뉴클레오사이드를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 또는 mmRNA는 수축된 혹은 확장된 리보스 고리를 지니는 당 모이어티를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 또는 mmRNA는 하기 화학식 (IIk) 내지 (IIm):
Figure pct00030
(IIk),
Figure pct00031
(IIl), 또는
Figure pct00032
(IIm), 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체를 포함하는 n개의 연결된 뉴클레오사이드를 포함하되, 식 중, R1', R1", R2' 및 R2"의 각각은, 독립적으로, H, 할로, 하이드록시, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 알케닐옥시, 선택적으로 치환된 알키닐옥시, 선택적으로 치환된 아미노알콕시, 선택적으로 치환된 알콕시알콕시이거나, 또는 존재하지 않으며; R2'와 R3의 조합 또는 R2"와 R3의 조합은 함께 연결되어 선택적으로 치환된 알킬렌 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬렌을 형성할 수 있다
몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 또는 mmRNA는 잠금 변형된 리보스를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 또는 mmRNA는 하기 화학식 (IIn):
Figure pct00033
(IIn), 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체를 포함하는 n개의 연결된 뉴클레오사이드를 포함하되, 식 중, R3'는 O, S 또는 -NRN1-이고, 여기서 RN1은 H, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐 또는 선택적으로 치환된 아릴이며, R3"는 선택적으로 치환된 알킬렌(예컨대, -CH2-, -CH2CH2- 또는 -CH2CH2CH2-) 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬렌(예컨대, -CH2NH-, -CH2CH2NH-, -CH2OCH2- 또는 -CH2CH2OCH2-)(예컨대, R3'는 O이고, R3"는 선택적으로 치환된 알킬렌(예컨대, -CH2-, -CH2CH2- 또는 -CH2CH2CH2-)임)이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 또는 mmRNA는 하기 화학식 (IIn-1)-(II-n2):
Figure pct00034
(IIn-1) 또는
Figure pct00035
(IIn-2), 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체를 포함하는 n개의 연결된 뉴클레오사이드를 포함하되, 식 중, R3는 O, S 또는 -NRN1-이고; 여기서, RN1은 H, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐 또는 선택적으로 치환된 아릴이고, R3"는 선택적으로 치환된 알킬렌(예컨대, -CH2-, -CH2CH2- 또는 -CH2CH2CH2-) 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬렌(예컨대, -CH2NH-, -CH2CH2NH-, -CH2OCH2- 또는 -CH2CH2OCH2-)(예컨대, R3는 O이고, R3"는 선택적으로 치환된 알킬렌(예컨대, -CH2-, -CH2CH2- 또는 -CH2CH2CH2-)임)이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 또는 mmRNA는 사환식의 헤테로사이클릴을 형성하는 잠금 변형된 리보스를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 또는 mmRNA는 하기 화학식 (IIo):
Figure pct00036
(IIo) 또는
Figure pct00037
(IIp), 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체를 지니는 n개의 연결된 뉴클레오사이드를 포함하되, 여기서, R12a, R12c, T1', T1", T2', T2", V1 및 V3은 본 명세서에 기재된 바와 같다.
변형된 핵산 또는 mmRNA에 대한 화학식들 중 어느 하나는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 핵염기(예컨대, 화학식 (b1)-(b43))를 포함할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명은 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 포함하는 변형된 핵산 또는 mmRNA(예컨대, mmRNA 분자)를 제조하는 방법을 제공하되, 여기서 변형된 핵산은 본 명세서에서 정의된 바와 같은 화학식 (Ia)를 지니는 n개의 뉴클레오사이드를 포함하며:
Figure pct00038
(Ia), 상기 방법은 본 명세서에서 정의된 바와 같은 화학식 (IIIa)의 화합물을:
Figure pct00039
(IIIa)
RNA 중합효소 및 cDNA 주형과 반응시키는 단계를 포함한다.
추가의 실시형태에 있어서, 본 발명은, 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 포함하는 변형된 핵산 또는 mmRNA(예컨대, mmRNA 분자)를 증폭시키는 단계를 제공하되, 해당 방법은 본 명세서에서 정의된 바와 같은 화학식 (IIIa)의 화합물을 프라이머, cDNA 주형 및 RNA 중합효소와 반응시키는 단계를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명은 적어도 하나의 뉴클레오타이드(예컨대, mmRNA 분자)를 포함하는 변형된 핵산 또는 mmRNA를 제조하는 방법을 제공하되, 여기서 변형된 핵산은 본 명세서에서 정의된 바와 같은 화학식 (Ia-1)을 지니는 n개의 뉴클레오사이드를 포함하며:
Figure pct00040
(Ia-1),
상기 방법은 본 명세서에서 정의된 바와 같은 화학식 (IIIa-1)의 화합물을:
Figure pct00041
(IIIa-1)
RNA 중합효소 및 cDNA 주형과 반응시키는 단계를 포함한다.
추가의 실시형태에 있어서, 본 발명은 적어도 하나의 뉴클레오타이드(예컨대, mmRNA 분자)를 포함하는 변형된 핵산 또는 mmRNA를 증폭시키는 방법을 제공하되, 해당 방법은 본 명세서에서 정의된 바와 같은 화학식 (IIIa-1)의 화합물을, 프라이머, cDNA 주형 및 RNA 중합효소와 반응시키는 단계를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명은 적어도 1개의 뉴클레오타이드(예컨대, mmRNA 분자)를 포함하는 변형된 mRNA를 제공하는 방법을 제공하되, 여기서 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 화학식 (Ia-2)를 지니는 n개의 뉴클레오사이드를 포함하며:
Figure pct00042
(Ia-2),
상기 방법은 본 명세서에서 정의된 바와 같은 화학식 (IIIa-2)의 화합물을:
Figure pct00043
(IIIa-2),
RNA 중합효소 및 cDNA 주형과 반응시키는 단계를 포함한다.
추가의 실시형태에 있어서, 본 발명은 적어도 하나의 뉴클레오타이드(예컨대, mmRNA 분자)를 포함하는 변형된 mRNA를 증폭시키는 단계를 포함하되, 상기 방법은,
본 명세서에서 정의된 바와 같은 화학식 (IIIa-2)의 화합물을 프라이머, cDNA 주형 및 RNA 중합효소와 반응시키는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 상기 반응은 1 내지 약 7,000회 반복될 수 있다. 본 명세서의 실시형태의 어느 것에 있어서도, B는 화학식 (b1) 내지 (b43)의 핵염기를 지닐 수 있다.
변형된 핵산 및 mmRNA는 본 명세서에 기재된 5' 및/또는 3' 측면 영역을 선택적으로 포함할 수 있다.
변형된 RNA(예컨대 mmRNA) 분자
본 발명은 또한 변형된 RNA(mmRNA) 분자의 빌딩 블록, 예컨대, 변형된 리보뉴클레오사이드, 변형된 리보뉴클레오타이드를 포함한다. 예를 들어, 이들 mmRNA는 본 발명의 변형된 핵산 또는 mmRNA를 제조하는데 유용할 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 빌딩 블록 분자는 하기 화학식 (IIIa) 또는 (IIIa-1):
Figure pct00044
(IIIa),
Figure pct00045
(IIIa-1) 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체를 지니되, 여기서, 치환기들은 본 명세서에 기재된 바와 같으며(예컨대, 화학식 (Ia) 및 (Ia-1)에 대해서), 이때 B가 사이토신, 구아닌, 유라실 및 아데닌으로부터 선택된 비변형 핵염기이면, Y1, Y2 또는 Y3 중 적어도 하나는 O가 아니다.
몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 또는 mmRNA 내로 편입될 수 있는 빌딩 블록 분자는, 하기 화학식 (IVa)-(IVb):
Figure pct00046
(IVa) 또는
Figure pct00047
(IVb), 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체를 지니되, 여기서 B는 본 명세서에 기재된 바와 같다(예컨대, (b1)-(b43) 중 어느 하나이다). 특정 실시형태에 있어서, 화학식 (IVa) 또는 (IVb)는 변형된 유라실(예컨대, 화학식 (b1)-(b9), (b21)-(b23) 및 (b28)-(b31) 중 어느 하나, 예들 들어, 화학식 (b1), (b8), (b28), (b29) 또는 (b30))과 조합된다. 특정 실시형태에 있어서, 화학식 (IVa) 또는 (IVb)는 변형된 사이토신(예컨대, 화학식 (b10)-(b14), (b24), (b25) 및 (b32)-(b36) 중 어느 하나, 예들 들어, 화학식 (b10) 또는 (b32))과 조합된다. 특정 실시형태에 있어서, 화학식 (IVa) 또는 (IVb)는 변형된 구아닌(예컨대, 화학식 (b15)-(b17) 및 (b37)-(b40) 중 어느 하나)과 조합된다. 특정 실시형태에 있어서, 화학식 (IVa) 또는 (IVb)는 변형된 아데닌(예컨대, 화학식 (b18)-(b20) 및 (b41)-(b43) 중 어느 하나)과 조합된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA 내로 편입될 수 있는 빌딩 블록 분자는, 하기 화학식 (IVc)-(IVk):
Figure pct00048
Figure pct00049
(IVl), 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체를 지니되, 여기서 B는 본 명세서에 기재된 바와 같다(예컨대, (b1)-(b43) 중 어느 하나이다). 특정 실시형태에 있어서, 화학식 (IVc)-(IVk) 중 하나는 변형된 유라실(예컨대, 화학식 (b1)-(b9), (b21)-(b23) 및 (b28)-(b31) 중 어느 하나, 예들 들어, 화학식 (b1), (b8), (b28), (b29) 또는 (b30))과 조합된다. 특정 실시형태에 있어서, 화학식 (IVc)-(IVk) 중 하나는 변형된 사이토신(예컨대, 화학식 (b10)-(b14), (b24), (b25) 및 (b32)-(b36) 중 어느 하나, 예들 들어, 화학식 (b10) 또는 (b32))과 조합된다. 특정 실시형태에 있어서, 화학식 (IVc)-(IVk) 중 하나는 변형된 구아닌(예컨대, 화학식 (b15)-(b17) 및 (b37)-(b40) 중 어느 하나)과 조합된다. 특정 실시형태에 있어서, 화학식 (IVc)-(IVk) 중 하나는 변형된 아데닌(예컨대, 화학식 (b18)-(b20) 및 (b41)-(b43) 중 어느 하나)과 조합된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 또는 mmRNA 내로 편입될 수 있는 빌딩 블록 분자는, 하기 화학식(Va) 또는 (Vb):
Figure pct00050
(Va) 또는
Figure pct00051
(Vb), 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체를 지니되, 여기서 B는 본 명세서에 기재된 바와 같다(예컨대, (b1)-(b43) 중 어느 하나이다).
다른 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA 내로 편입될 수 있는 빌딩 블록 분자는, 하기 화학식 (IXa)-(IXd):
Figure pct00052
또는
Figure pct00053
(IXd), 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체, 여기서 B는 본 명세서에 기재된 바와 같다(예컨대, (b1)-(b43) 중 어느 하나이다). 특정 실시형태에 있어서, 화학식 (IXa)-(IXd) 중 하나는 변형된 유라실(예컨대, 화학식 (b1)-(b9), (b21)-(b23) 및 (b28)-(b31) 중 어느 하나, 예들 들어, 화학식 (b1), (b8), (b28), (b29) 또는 (b30))과 조합된다. 특정 실시형태에 있어서, 화학식 (IXa)-(IXd) 중 하나는 변형된 사이토신(예컨대, 화학식 (b10)-(b14), (b24), (b25) 및 (b32)-(b36) 중 어느 하나, 예들 들어, 화학식 (b10) 또는 (b32))과 조합된다. 특정 실시형태에 있어서, 화학식 (IXa)-(IXd) 중 하나는 변형된 구아닌(예컨대, 화학식 (b15)-(b17) 및 (b37)-(b40))과 조합된다. 특정 실시형태에 있어서, 화학식 (IXa)-(IXd) 중 하나는 변형된 아데닌(예컨대, 화학식 (b18)-(b20) 및 (b41)-(b43) 중 어느 하나)과 조합된다.
다른 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA 내로 편입될 수 있는 빌딩 블록 분자는, 하기 화학식 (IXe)-(IXg):
Figure pct00054
(IXe),
Figure pct00055
(IXf) 또는
Figure pct00056
(IXg), 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체를 지니되, 여기서 B는 본 명세서에 기재된 바와 같다(예컨대, (b1)-(b43) 중 어느 하나이다). 특정 실시형태에 있어서, 화학식 (IXe)-(IXg) 중 하나는 변형된 유라실(예컨대, 화학식 (b1)-(b9), (b21)-(b23) 및 (b28)-(b31) 중 어느 하나, 예들 들어, 화학식 (b1), (b8), (b28), (b29) 또는 (b30))과 조합된다. 특정 실시형태에 있어서,화학식 (IXe)-(IXg) 중 하나는 변형된 사이토신(예컨대, 화학식 (b10)-(b14), (b24), (b25) 및 (b32)-(b36) 중 어느 하나, 예들 들어, 화학식 (b10) 또는 (b32))와 조합된다. 특정 실시형태에 있어서, 화학식 (IXe)-(IXg) 중 하나는 변형된 구아닌(예컨대, 화학식 (b15)-(b17) 및 (b37)-(b40) 중 어느 하나)과 조합된다. 특정 실시형태에 있어서, 화학식 (IXe)-(IXg) 중 하나는 변형된 아데닌(예컨대, 화학식 (b18)-(b20) 및 (b41)-(b43) 중 어느 하나)과 조합된다.
다른 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA 내로 편입될 수 있는 빌딩 블록 분자는, 하기 화학식 (IXh)-(IXk):
Figure pct00057
또는
Figure pct00058
(IXk), 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체를 지니되, 여기서 B는 본 명세서에 기재된 바와 같다(예컨대, (b1)-(b43) 중 어느 하나이다). 특정 실시형태에 있어서, 화학식 (IXh)-(IXk) 중 하나는 변형된 유라실(예컨대, 화학식 (b1)-(b9), (b21)-(b23) 및 (b28)-(b31) 중 어느 하나, 예들 들어, 화학식 (b1), (b8), (b28), (b29) 또는 (b30))과 조합된다. 특정 실시형태에 있어서, 화학식 (IXh)-(IXk) 중 하나는 변형된 사이토신(예컨대, 화학식 (b10)-(b14), (b24), (b25) 및 (b32)-(b36) 중 어느 하나, 예들 들어, 화학식 (b10) 또는 (b32))과 조합된다. 특정 실시형태에 있어서, 화학식 (IXh)-(IXk) 중 하나는 변형된 구아닌(예컨대, 화학식 (b15)-(b17) 및 (b37)-(b40))과 조합된다. 특정 실시형태에 있어서, 화학식 (IXh)-(IXk) 중 하나는 변형된 아데닌(예컨대, 화학식 (b18)-(b20) 및 (b41)-(b43) 중 어느 하나)과 조합된다.
다른 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA 내로 편입될 수 있는 빌딩 블록 분자는, 하기 화학식 (IXl)-(IXr):
Figure pct00059
또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체를 지니되, 여기서 각각의 r1 및 r2는, 독립적으로, 0 내지 5(예컨대, 0 내지 3, 1 내지 3 또는 1 내지 5)의 정수이고, B는 본 명세서에 기재된 바와 같다(예컨대, (b1)-(b43) 중 어느 하나이다). 특정 실시형태에 있어서, 화학식 (IXl)-(IXr) 중 하나는 변형된 유라실(예컨대, 화학식 (b1)-(b9), (b21)-(b23) 및 (b28)-(b31) 중 어느 하나, 예들 들어, 화학식 (b1), (b8), (b28), (b29) 또는 (b30))과 조합된다. 특정 실시형태에 있어서, 화학식 (IXl)-(IXr) 중 하나는 변형된 사이토신(예컨대, 화학식 (b10)-(b14), (b24), (b25) 및 (b32)-(b36) 중 어느 하나, 예들 들어, 화학식 (b10) 또는 (b32))과 조합된다. 특정 실시형태에 있어서, 화학식 (IXl)-(IXr) 중 하나는 변형된 구아닌(예컨대, 화학식 (b15)-(b17) 및 (b37)-(b40) 중 어느 하나)와 조합된다. 특정 실시형태에 있어서, 화학식 (IXl)-(IXr) 중 하나는 변형된 아데닌(예컨대, 화학식 (b18)-(b20) 및 (b41)-(b43) 중 어느 하나)과 조합된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA 내로 편입될 수 있는 빌딩 블록 분자는,
Figure pct00060
Figure pct00061
또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 여기서 각각의 r은, 독립적으로, 0 내지 5(예컨대, 0 내지 3, 1 내지 3 또는 1 내지 5)의 정수이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA 내로 편입될 수 있는 빌딩 블록 분자는,
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064
(BB-20), 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 여기서 각각의 r은, 독립적으로, 0 내지 5(예컨대, 0 내지 3, 1 내지 3 또는 1 내지 5)의 정수이며, s1은 본 명세서에 기재된 바와 같다.
몇몇 실시형태에 있어서, 핵산(예컨대, RNA, mRNA 또는 mmRNA) 내로 편입될 수 있는 빌딩 블록 분자는, 변형된 유리딘이다(예컨대,
Figure pct00065
Figure pct00066
Figure pct00067
Figure pct00068
Figure pct00069
Figure pct00070
Figure pct00071
Figure pct00072
Figure pct00073
Figure pct00074
Figure pct00075
Figure pct00076
Figure pct00077
Figure pct00078
Figure pct00079
Figure pct00080
(BB-125), 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체로 이루어진 군으로부터 선택되되, 여기서 Y1, Y3, Y4, Y6 및 r은 본 명세서에 기재된 바와 같다(예컨대, 각각의 r은, 독립적으로, 0 내지 5, 예컨대 0 내지 3, 1 내지 3 또는 1 내지 5이다)).
몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA에 편입될 수 있는 빌딩 블록 분자는 변형된 시티딘이다(예컨대,
Figure pct00081
Figure pct00082
Figure pct00083
Figure pct00084
Figure pct00085
Figure pct00086
(BB-159), 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체로 이루어진 군으로부터 선택되되, 여기서, Y1, Y3, Y4, Y6 및 r은 본 명세서에 기재된 바와 같다(예컨대, 각각의 r은, 독립적으로, 0 내지 5, 예컨대 0 내지 3, 1 내지 3 또는 1 내지 5이다)). 예를 들어, 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA 내로 편입될 수 있는 빌딩 블록 분자는,
Figure pct00087
(BB-160) 또는
Figure pct00088
(BB-161), 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체일 수 있되, 여기서 각각의 r은, 독립적으로, 0 내지 5(예컨대, 0 내지 3, 1 내지 3 또는 1 내지 5)의 정수이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA 내로 편입될 수 있는 빌딩 블록 분자는, 변형된 아데노신이다(예컨대,
Figure pct00089
Figure pct00090
Figure pct00091
Figure pct00092
Figure pct00093
및
Figure pct00094
(BB-200) 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체로 이루어진 군으로부터 선택되되, 여기서, 식 중, Y1, Y3, Y4, Y6 및 r은 본 명세서에 기재된 바와 같다(예컨대, 각각의 r은, 독립적으로, 0 내지 5, 예컨대 0 내지 3, 1 내지 3 또는 1 내지 5이다)).
몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA 내로 편입될 수 있는 빌딩 블록 분자는, 변형된 구아노신이다(예컨대,
Figure pct00095
Figure pct00096
Figure pct00097
Figure pct00098
Figure pct00099
Figure pct00100
(BB-237), 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체로 이루어진 군으로부터 선택되되, 여기서 Y1, Y3, Y4, Y6 및 r은 본 명세서에 기재된 바와 같다(예컨대, 각각의 r은, 독립적으로, 0 내지 5, 예컨대 0 내지 3, 1 내지 3 또는 1 내지 5이다)).
몇몇 실시형태에 있어서, 화학적 변형은 고리(예컨대, 피리미딘 뉴클레오사이드에 대해서, 예를 들어, 사이토신 혹은 유라실)의 C-5에서 C기의 N으로의 대체(예컨대, C-5에서 >CH 기의 >NRN1기로의 대체, 여기서 RN1은 H 또는 선택적으로 치환된 알킬임)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 변형된 핵산 또는 mmRNA 내로 편입될 수 있는 mmRNA 분자는,
Figure pct00101
그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체일 수 있으며, 여기서 각각의 r은, 독립적으로, 0 내지 5(예컨대, 0 내지 3, 1 내지 3 또는 1 내지 5)의 정수이다.
다른 실시형태에 있어서, 화학적 변형은 사이토신의 C-5에서의 수소의 할로(예컨대, Br, Cl, F 또는 I) 또는 선택적으로 치환된 알킬(예컨대, 메틸)로의 대체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 변형된 핵산 또는 mmRNA 내로 편입될 수 있는 mmRNA 분자는,
Figure pct00102
그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체일 수 있으며, 여기서 각각의 r은, 독립적으로, 0 내지 5(예컨대, 0 내지 3, 1 내지 3 또는 1 내지 5)의 정수이다.
또 다른 추가의 실시형태에 있어서, 화학적 변형은 C-4 위치에서의 NH2 및 C-5 위치에서의 탄소 원자에 의해 형성된 축합 고리를 포함할 수 있다. 예를 들어, 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA 내로 편입될 수 있는 빌딩 블록 분자는,
Figure pct00103
(BB-246), 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체일 수 있되, 여기서 각각의 r은, 독립적으로, 0 내지 5(예컨대, 0 내지 3, 1 내지 3 또는 1 내지 5)의 정수이다.
당에 대한 변형
변형된 핵산 또는 mmRNA(예컨대, 본 명세서에 기재된 바와 같은 RNA 또는 mRNA) 내로 편입될 수 있는 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드(예컨대, 빌딩 블록 분자)는, 리보핵산의 당에서 변형될 수 있다. 예를 들어, 2'하이드록실기(OH)는 다수의 상이한 치환기로 변형 혹은 대체될 수 있다. 2'-위치에서의 예시적인 치환기는, H, 할로, 선택적으로 치환된 C1-6알킬; 선택적으로 치환된 C1-6 알콕시; 선택적으로 치환된 C6-10 아릴옥시; 선택적으로 치환된 C3-8 사이클로알킬; 선택적으로 치환된 C3-8 사이클로알콕시; 선택적으로 치환된 C6-10 아릴옥시; 선택적으로 치환된 C6-10 아릴-C1-6 알콕시, 선택적으로 치환된 C1-12(헤테로사이클릴)옥시; 당(예컨대, 리보스, 펜토스, 또는 본 명세서에 기재된 임의의 것); 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), -O(CH2CH2O)nCH2CH2OR(여기서 R은 H 또는 선택적으로 치환된 알킬이고, n은 0 내지 20(예컨대, 0 내지 4, 0 내지 8, 0 내지 10, 0 내지 16, 1 내지 4, 1 내지 8, 1 내지 10, 1 내지 16, 1 내지 20, 2 내지 4, 2 내지 8, 2 내지 10, 2 내지 16, 2 내지 20, 4 내지 8, 4 내지 10, 4 내지 16 및 4 내지 20)의 정수임); 2'-하이드록실이 동일한 리보스 당의 4'-탄소에 C1-6알킬렌 또는 C1-6헤테로알킬렌 브리지에 의해 연결된 "잠금" 핵산(LNA)(여기서, 예시적인 브리지는 메틸렌, 프로필렌, 에터 또는 아미노 브리지를 포함함); 본 명세서에서 정의된 바와 같은 아미노알킬; 본 명세서에서 정의된 바와 같은 아미노알콕시; 본 명세서에 정의된 바와 같은 아미노; 및 본 명세서에서 정의된 바와 같은 아미노산을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
일반적으로, RNA는 산소를 가진 5-원 고리인 당 기 리보스를 포함한다. 예시적인, 비제한적인 변형된 뉴클레오타이드는 리보스 내 산소의 (예컨대, S, Se 또는 알킬렌, 예를 들어, 메틸렌 또는 에틸렌 등으로의) 대체; (예컨대, 리보스를 사이클로펜테닐 혹은 사이클로헥세닐로 대체하기 위하여) 이중 결합의 추가; (예컨대, 사이클로뷰탄 혹은 옥세탄의 4-원 고리를 형성하기 위하여) 리보스의 고리 축합); (예컨대, 추가의 탄소 또는 헤테로원자를 지니는 6- 또는 7-원 고리를 형성하기 위하여, 예를 들어, 안하이드로헥시톨, 알티톨, 만니톨, 사이클로헥사닐, 사이클로헥세닐 및 포스포라미데이트 골격을 또한 가지는 몰폴리노를 위하여) 리보스의 고리 확대; 다환식 형태(예컨대, 트라이사이클로; 및 "비잠금" 형태, 예를 들어, 글라이콜 핵산(GNA)(예컨대, R-GNA 혹은 S-GNA, 여기서 리보스는 포스포다이에스터 결합에 의해 결합된 글라이콜 단위에 의해 대체됨), 트레오스 핵산(TNA, 여기서 리보스는 α-L-트레오푸라노실-(3'→2')로 대체됨), 및 펩타이드 핵산(PNA, 여기서 2-아미노-에틸-글라이신 결합은 리보스 및 포스포다이에스터 골격과 대체됨)을 포함한다. 당 기는 또한 리보스 내 대응하는 탄소의 것과는 반대의 입체화학적 입체형태를 가지는 1개 이상의 탄소를 포함할 수 있다. 이와 같이 해서, 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는 당으로서 예컨대 아라비노스를 함유하는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
핵염기에 대한 변형
본 발명의 개시내용은 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드를 제공한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 "뉴클레오사이드"는 당 분자(예컨대, 펜토스 혹은 리보스) 또는 그의 유도체를 유기 염기(예컨대, 퓨린 또는 피리미딘) 또는 그의 유도체와 조합하여 함유하는 화합물로서 정의된다. 본 명세서에 기재된 바와 같은, "뉴클레오타이드"는 포스페이트기를 포함하는 뉴클레오사이드로서 정의된다. 변형된 뉴클레오타이드(예컨대, 변형된 mRNA)는, (예컨대, 1개 이상의 변형된 혹은 비-천연의 뉴클레오사이드를 화학적으로, 효소적으로 혹은 재조합적으로 포함시키기 위하여) 본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 유용한 방법에 의해 합성될 수 있다.
변형된 뉴클레오타이드 염기쌍은 표준 아데노신-티민, 아데노신-유라실, 또는 구아노신-사이토신 염기쌍뿐만 아니라, 비-표준 또는 변형된 염기를 포함하는 뉴클레오타이드 및/또는 변형된 뉴클레오타이드 간에 형성된 염기쌍도 망라하며, 여기서 수소 결합 공여체와 수소 결합 수용체의 배열은 비-표준 염기와 표준 염기 간 또는 상보적 비-표준 염기 구조 간의 수소 결합을 허용한다. 이러한 비-표준 염기쌍의 일례는 변형된 뉴클레오타이드 이노신과 아데닌, 사이토신 혹은 유라실 간의 염기쌍이다.
변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 변형된 핵염기를 포함할 수 있다. RNA에서 발견되는 핵염기의 예로는, 아데닌, 구아닌, 사이토신 및 유라실을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. DNA에서 발견되는 핵염기의 예로는, 아데닌, 구아닌, 사이토신 및 티민을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 이들 핵염기는 증대된 특성, 예컨대, 주된 그루브 결합 상대의 결합의 파괴를 통한 뉴클레아제에 대한 저항을 지니는 변형된 핵산 또는 mmRNA를 제공하도록 변형되거나 전체적으로 대체될 수 있다. 이하의 표 1은 각 정준 뉴클레오타이드의 화학적 국면들을 확인해준다. 원은 각 화학적 영역을 포함하는 원자를 확인해준다.
Figure pct00104
몇몇 실시형태에 있어서, B는 변형된 유라실이다. 예시적인 변형된 유라실은 하기 화학식 (b1)-(b5):
Figure pct00105
Figure pct00106
(b5) 지니는 것들, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체를 포함하되, 식 중,
Figure pct00107
는 단일 또는 이중 결합이고;
T1', T1", T2 및 T2"의 각각은, 독립적으로, H, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알콕시 또는 선택적으로 치환된 티오알콕시이거나, 또는 T1'와 T1"의 조합 또는 T2'와 T2"의 조합은 함께(예컨대, T2에서처럼) 결합되어 O(옥소), S(티오) 또는 Se(셀레노)를 형성하며;
V1 및 V2의 각각은, 독립적으로, O, S, N(RVb)nv 또는 C(RVb)nv이되, 여기서 nv는 0 내지 2의 정수이고, 각각의 RVb는, 독립적으로, H, 할로, 선택적으로 치환된 아미노산, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 할로알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 알케닐옥시, 선택적으로 치환된 알키닐옥시, 선택적으로 치환된 하이드록시알킬, 선택적으로 치환된 하이드록시알케닐, 선택적으로 치환된 하이드록시알키닐, 선택적으로 치환된 아미노알킬(예컨대, 본 명세서에 기재된 임의의 것, 예컨대, 트라이플루오로아세틸 등과 같은 N-보호기로 치환됨), 선택적으로 치환된 아미노알케닐, 선택적으로 치환된 아미노알키닐, 선택적으로 치환된 아실아미노알킬(예컨대, 본 명세서에 기재된 임의의 것, 예컨대, 트라이플루오로아세틸 등과 같은 N-보호기로 치환됨), 선택적으로 치환된 알콕시카보닐알킬, 선택적으로 치환된 알콕시카보닐알케닐, 선택적으로 치환된 알콕시카보닐알키닐 또는 선택적으로 치환된 알콕시카보닐알콕시(예컨대, 본 명세서에 기재된 임의의 치환기, 예컨대, 알킬에 대해서 (1) 내지 (21)로부터 선택된 것으로 선택적으로 치환됨)이며;
R10은 H, 할로, 선택적으로 치환된 아미노산, 하이드록시, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 아미노알킬, 선택적으로 치환된 하이드록시알킬, 선택적으로 치환된 하이드록시알케닐, 선택적으로 치환된 하이드록시알키닐, 선택적으로 치환된 아미노알케닐, 선택적으로 치환된 아미노알키닐, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 알콕시카보닐알킬, 선택적으로 치환된 알콕시카보닐알케닐, 선택적으로 치환된 알콕시카보닐알키닐, 선택적으로 치환된 알콕시카보닐알콕시, 선택적으로 치환된 카복시알콕시, 선택적으로 치환된 카복시알킬 또는 선택적으로 치환된 카바모일알킬이고;
R11은 H 또는 선택적으로 치환된 알킬이며;
R12a는 H, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 하이드록시알킬, 선택적으로 치환된 하이드록시알케닐, 선택적으로 치환된 하이드록시알키닐, 선택적으로 치환된 아미노알킬, 선택적으로 치환된 아미노알케닐 또는 선택적으로 치환된 아미노알키닐, 선택적으로 치환된 카복시알킬(예컨대, 하이드록시로 선택적으로 치환됨), 선택적으로 치환된 카복시알콕시, 선택적으로 치환된 카복시아미노알킬 또는 선택적으로 치환된 카바모일알킬이고;
R12c는 H, 할로, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 티오알콕시, 선택적으로 치환된 아미노, 선택적으로 치환된 하이드록시알킬, 선택적으로 치환된 하이드록시알케닐, 선택적으로 치환된 하이드록시알키닐, 선택적으로 치환된 아미노알킬, 선택적으로 치환된 아미노알케닐 또는 선택적으로 치환된 아미노알키닐이다.
다른 예시적인 변형된 유라실은 하기 화학식 (b6)-(b9):
Figure pct00108
그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체를 포함하되, 식 중,
Figure pct00109
는 단일 또는 이중 결합이고;
T1', T1", T2' 및 T2"의 각각은, 독립적으로, H, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알콕시 또는 선택적으로 치환된 티오알콕시이거나, 또는 T1'와 T1"의 조합은 (예컨대, T1에서처럼) 함께 결합되거나, 또는 T2'와 T2"의 조합은 (예컨대, T2에서처럼) 함께 결합되어 O(옥소), S(티오) 또는 Se(셀레노)를 형성하거나, 또는 각각의 T1 및 T2는, 독립적으로, O(옥소), S(티오) 또는 Se(셀레노)이며;
W1 및 W2의 각각은, 독립적으로, N(RWa)nw 또는 C(RWa)nw이되, 여기서 nw는 0 내지 2의 정수이고, 각각의 RWa는, 독립적으로, H, 선택적으로 치환된 알킬 또는 선택적으로 치환된 알콕시이며;
각각의 V3는, 독립적으로, O, S, N(RVa)nv 또는 C(RVa)nv이되, 여기서 nv는 0 내지 2의 정수이고, 각각의 RVa는, 독립적으로, H, 할로, 선택적으로 치환된 아미노산, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 하이드록시알킬, 선택적으로 치환된 하이드록시알케닐, 선택적으로 치환된 하이드록시알키닐, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴, 선택적으로 치환된 알크헤테로사이클릴, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 알케닐옥시 또는 선택적으로 치환된 알키닐옥시, 선택적으로 치환된 아미노알킬(예컨대, 본 명세서에 기재된 임의의 것, 예컨대, 트라이플루오로아세틸, 또는 설포알킬등과 같은 N-보호기로 치환됨), 선택적으로 치환된 아미노알케닐, 선택적으로 치환된 아미노알키닐, 선택적으로 치환된 아실아미노알킬(예컨대, 본 명세서에 기재된 임의의 것, 예컨대, 트라이플루오로아세틸 등과 같은 N-보호기로 치환됨), 선택적으로 치환된 알콕시카보닐알킬, 선택적으로 치환된 알콕시카보닐알케닐, 선택적으로 치환된 알콕시카보닐알키닐, 선택적으로 치환된 알콕시카보닐아실, 선택적으로 치환된 알콕시카보닐알콕시, 선택적으로 치환된 카복시알킬(예컨대, 하이드록시 및/또는 O-보호기로 선택적으로 치환됨), 선택적으로 치환된 카복시알콕시, 선택적으로 치환된 카복시아미노알킬 또는 선택적으로 치환된 카바모일알킬(예컨대, 본 명세서에 기재된 임의의 치환기, 예컨대, 알킬에 대해서 (1) 내지 (21)로부터 선택된 것으로 선택적으로 치환됨)이고, 여기서 RVa와 R12c는 이들이 부착되는 탄소 원자들과 함께 결합하여 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴(예컨대, 5- 또는 6-원 고리)을 형성할 수 있으며;
R12a는 H, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 하이드록시알킬, 선택적으로 치환된 하이드록시알케닐, 선택적으로 치환된 하이드록시알키닐, 선택적으로 치환된 아미노알킬, 선택적으로 치환된 아미노알케닐, 선택적으로 치환된 아미노알키닐, 선택적으로 치환된 카복시알킬(예컨대, 하이드록시로 선택적으로 치환됨 및/또는 O-보호기), 선택적으로 치환된 카복시알콕시, 선택적으로 치환된 카복시아미노알킬, 선택적으로 치환된 카바모일알킬이거나, 또는 존재하지 않으며;
R12b는 H, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 하이드록시알킬, 선택적으로 치환된 하이드록시알케닐, 선택적으로 치환된 하이드록시알키닐, 선택적으로 치환된 아미노알킬, 선택적으로 치환된 아미노알케닐, 선택적으로 치환된 아미노알키닐, 선택적으로 치환된 알크아릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴, 선택적으로 치환된 알크헤테로사이클릴, 선택적으로 치환된 아미노산, 선택적으로 치환된 알콕시카보닐아실, 선택적으로 치환된 알콕시카보닐알콕시, 선택적으로 치환된 알콕시카보닐알킬, 선택적으로 치환된 알콕시카보닐알케닐, 선택적으로 치환된 알콕시카보닐알키닐, 선택적으로 치환된 알콕시카보닐알콕시, 선택적으로 치환된 카복시알킬(예컨대, 하이드록시로 선택적으로 치환됨 및/또는 O-보호기), 선택적으로 치환된 카복시알콕시, 선택적으로 치환된 카복시아미노알킬 또는 선택적으로 치환된 카바모일알킬이고,
여기서, R12b와 T1'의 조합 또는 R12b와 R12c의 조합은 함께 결합되어 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴을 형성할 수 있으며;
R12c는 H, 할로, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 티오알콕시, 선택적으로 치환된 아미노, 선택적으로 치환된 아미노알킬, 선택적으로 치환된 아미노알케닐 또는 선택적으로 치환된 아미노알키닐이다.
추가의 예시적인 변형된 유라실은 하기 화학식 (b28)-(b31):
Figure pct00110
Figure pct00111
(b31)을 지니는 것들, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체를 포함하되, 식 중,
T1 및 T2의 각각은, 독립적으로, O(옥소), S(티오) 또는 Se(셀레노)이고;
각각의 RVb' 및 RVb"는, 독립적으로, H, 할로, 선택적으로 치환된 아미노산, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 할로알킬, 선택적으로 치환된 하이드록시알킬, 선택적으로 치환된 하이드록시알케닐, 선택적으로 치환된 하이드록시알키닐, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 알케닐옥시, 선택적으로 치환된 알키닐옥시, 선택적으로 치환된 아미노알킬(예컨대, 본 명세서에 기재된 임의의 것, 예컨대, 트라이플루오로아세틸, 또는 설포알킬등과 같은 N-보호기로 치환됨), 선택적으로 치환된 아미노알케닐, 선택적으로 치환된 아미노알키닐, 선택적으로 치환된 아실아미노알킬(예컨대, 본 명세서에 기재된 임의의 것, 예컨대, 트라이플루오로아세틸 등과 같은 N-보호기로 치환됨), 선택적으로 치환된 알콕시카보닐알킬, 선택적으로 치환된 알콕시카보닐알케닐, 선택적으로 치환된 알콕시카보닐알키닐, 선택적으로 치환된 알콕시카보닐아실, 선택적으로 치환된 알콕시카보닐알콕시, 선택적으로 치환된 카복시알킬(예컨대, 하이드록시 및/또는 O-보호기로 선택적으로 치환됨), 선택적으로 치환된 카복시알콕시, 선택적으로 치환된 카복시아미노알킬 또는 선택적으로 치환된 카바모일알킬(예컨대, 본 명세서에 기재된 임의의 치환기, 예컨대, 알킬에 대해서 (1) 내지 (21)로부터 선택된 것으로 선택적으로 치환됨)(예컨대, RVb'는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐 또는 선택적으로 치환된 아미노알킬, 예컨대, 본 명세서에 기재된 임의의 것, 예컨대, 트라이플루오로아세틸, 또는 설포알킬 등과 같은 N-보호기로 치환됨)이며;
R12a는 H, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 카복시아미노알킬, 선택적으로 치환된 아미노알킬(예컨대, 예컨대, N-보호기, 본 명세서에 기재된 임의의 것들, 예컨대, 트라이플루오로아세틸, 또는 설포알킬 등과 같은 N-보호기로 치환됨), 선택적으로 치환된 아미노알케닐 또는 선택적으로 치환된 아미노알키닐이고;
R12b는 H, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 하이드록시알킬, 선택적으로 치환된 하이드록시알케닐, 선택적으로 치환된 하이드록시알키닐, 선택적으로 치환된 아미노알킬, 선택적으로 치환된 아미노알케닐, 선택적으로 치환된 아미노알키닐(예컨대, 예컨대, 본 명세서에 기재된 임의의 것, 예컨대, 트라이플루오로아세틸, 또는 설포알킬 등과 같은 N-보호기로 치환됨),
선택적으로 치환된 알콕시카보닐아실, 선택적으로 치환된 알콕시카보닐알콕시, 선택적으로 치환된 알콕시카보닐알킬, 선택적으로 치환된 알콕시카보닐알케닐, 선택적으로 치환된 알콕시카보닐알키닐, 선택적으로 치환된 알콕시카보닐알콕시, 선택적으로 치환된 카복시알콕시, 선택적으로 치환된 카복시알킬 또는 선택적으로 치환된 카바모일알킬이다.
특정 실시형태에 있어서, T1은 O(옥소)이고, T2는 S(티오) 또는 Se(셀레노)이다. 다른 실시형태에 있어서, T1은 S(티오)이고, T2는 O(옥소) 또는 Se(셀레노)이다. 몇몇 실시형태에 있어서, RVb'는 H, 선택적으로 치환된 알킬 또는 선택적으로 치환된 알콕시이다.
다른 실시형태에 있어서, 각각의 R12a 및 R12b는, 독립적으로, H, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐 또는 선택적으로 치환된 하이드록시알킬이다. 특정 실시형태에 있어서, R12a는 H이다. 다른 실시형태에 있어서, R12a와 R12b의 둘 모두는 H이다.
몇몇 실시형태에 있어서, R12b의 각각의 RVb'는, 독립적으로, 선택적으로 치환된 아미노알킬(예컨대, 본 명세서에 기재된 임의의 것, 예컨대, 트라이플루오로아세틸, 또는 설포알킬등과 같은 N-보호기로 치환됨), 선택적으로 치환된 아미노알케닐, 선택적으로 치환된 아미노알키닐 또는 선택적으로 치환된 아실아미노알킬(예컨대, 본 명세서에 기재된 임의의 것, 예컨대, 트라이플루오로아세틸 등과 같은 N-보호기로 치환됨)이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 선택적으로 치환된 아미노알킬 중 아미노 및/또는 알킬은 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 설포알킬, 선택적으로 치환된 카복시(예컨대, O-보호기로 치환됨), 선택적으로 치환된 하이드록시(예컨대, O-보호기로 치환됨), 선택적으로 치환된 카복시알킬(예컨대, O-보호기로 치환됨), 선택적으로 치환된 알콕시카보닐알킬(예컨대, O-보호기로 치환됨) 또는 N-보호기 중 하나 이상으로 치환된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 선택적으로 치환된 아미노알킬은 선택적으로 치환된 설포알킬 또는 선택적으로 치환된 알케닐로 치환된다. 특정 실시형태에 있어서, R12a 및 RVb"는 둘 모두 H이다. 특정 실시형태에 있어서, T1은 O(옥소)이고, T2는 S(티오) 또는 Se(셀레노)이다.
몇몇 실시형태에 있어서, RVb'는 선택적으로 치환된 알콕시카보닐알킬 또는 선택적으로 치환된 카바모일알킬이다.
특정 실시형태에 있어서, R12a, R12b, R12c 또는 RVa에 대한 선택적 치환기는 폴리에틸렌 글라이콜기(예컨대, -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR', 여기서 s1은 1 내지 10(예컨대, 1 내지 6 또는 1 내지 4)의 정수이고, s2 및 s3의 각각은, 독립적으로, 0 내지 10(예컨대, 0 내지 4, 0 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 6 또는 1 내지 10)의 정수이고, R'는 H 또는 C1-20알킬임); 또는 아미노-폴리에틸렌 글라이콜기(예컨대, -NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1이며, 여기서 s1은 1 내지 10(예컨대, 1 내지 6 또는 1 내지 4)의 정수이고, s2 및 s3의 각각은, 독립적으로, 0 내지 10(예컨대, 0 내지 4, 0 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 6 또는 1 내지 10)의 정수이고, 각각의 RN1은, 독립적으로, 수소 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬임)이다.
몇몇 실시형태에 있어서, B는 변형된 사이토신이다. 예시적인 변형된 사이토신은 하기 화합물 (b10)-(b14):
Figure pct00112
Figure pct00113
(b14), 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체를 포함하되, 식 중
T3' 및 T3"의 각각은, 독립적으로, H, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알콕시 또는 선택적으로 치환된 티오알콕시이거나, 또는 T3' 및 T3"의 조합은 (예컨대, T3에서처럼) 함께 결합되어 O(옥소), S(티오) 또는 Se(셀레노)를 형성하고;
각각의 V4는, 독립적으로, O, S, N(RVc)nv 또는 C(RVc)nv이되, 여기서 nv는 0 내지 2의 정수이고, 각각의 RVc는, 독립적으로, H, 할로, 선택적으로 치환된 아미노산, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 알케닐옥시, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴, 선택적으로 치환된 알크헤테로사이클릴 또는 선택적으로 치환된 알키닐옥시(예컨대, 본 명세서에 기재된 임의의 치환기, 예컨대, 알킬에 대해서 (1) 내지 (21)로부터 선택된 것으로 선택적으로 치환됨)이며, 여기서 R13b와 RVc의 조합은 함께 결합되어 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴을 형성할 수 있고;
V5는, 독립적으로, N(RVd)nv 또는 C(RVd)nv이되, 여기서 nv는 0 내지 2의 정수이고, 각각의 RVd는, 독립적으로, H, 할로, 선택적으로 치환된 아미노산, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 알케닐옥시, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴, 선택적으로 치환된 알크헤테로사이클릴 또는 선택적으로 치환된 알키닐옥시(예컨대, 본 명세서에 기재된 임의의 치환기, 예컨대, 알킬에 대해서 (1) 내지 (21)로부터 선택된 것으로 선택적으로 치환됨)(예컨대, V5는 CH 또는 N임)이며;
R13a 및 R13b의 각각은, 독립적으로, H, 선택적으로 치환된 아실, 선택적으로 치환된 아실옥시알킬, 선택적으로 치환된 알킬 또는 선택적으로 치환된 알콕시이되, 여기서 R13b와 R14의 조합은 함께 결합되어 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴을 형성하며;
각각의 R14는, 독립적으로, H, 할로, 하이드록시, 티올, 선택적으로 치환된 아실, 선택적으로 치환된 아미노산, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 할로알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 하이드록시알킬(예컨대, O-보호기로 치환됨), 선택적으로 치환된 하이드록시알케닐, 선택적으로 치환된 하이드록시알키닐, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 알케닐옥시, 선택적으로 치환된 알키닐옥시, 선택적으로 치환된 아미노알콕시, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 아실옥시알킬, 선택적으로 치환된 아미노(예컨대, -NHR, 여기서 R은 H, 알킬, 아릴 또는 포스포릴임), 아자이도, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴, 선택적으로 치환된 알크헤테로사이클릴, 선택적으로 치환된 아미노알킬, 선택적으로 치환된 아미노알케닐 또는 선택적으로 치환된 아미노알킬이며;
R15 및 R16의 각각은, 독립적으로, H, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐 또는 선택적으로 치환된 알키닐이다.
추가의 예시적인 변형된 사이토신은 하기 화학식 (b32)-(b35):
Figure pct00114
를 지니는 것들, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체를 포함하되, 식 중,
T1 및 T3의 각각은, 독립적으로, O(옥소), S(티오) 또는 Se(셀레노)이고;
R13a 및 R13b의 각각은, 독립적으로, H, 선택적으로 치환된 아실, 선택적으로 치환된 아실옥시알킬, 선택적으로 치환된 알킬 또는 선택적으로 치환된 알콕시이되, 여기서 R13b와 R14의 조합은 함께 결합되어 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴을 형성하며;
각각의 R14는, 독립적으로, H, 할로, 하이드록시, 티올, 선택적으로 치환된 아실, 선택적으로 치환된 아미노산, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 할로알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 하이드록시알킬(예컨대, O-보호기로 치환됨), 선택적으로 치환된 하이드록시알케닐, 선택적으로 치환된 하이드록시알키닐, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 알케닐옥시, 선택적으로 치환된 알키닐옥시, 선택적으로 치환된 아미노알콕시, 선택적으로 치환된 알콕시알콕시, 선택적으로 치환된 아실옥시알킬, 선택적으로 치환된 아미노(예컨대, -NHR, 여기서 R은 H, 알킬, 아릴 또는 포스포릴임), 아자이도, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴, 선택적으로 치환된 알크헤테로사이클릴, 선택적으로 치환된 아미노알킬(예컨대, 하이드록시알킬, 알킬, 알케닐 또는 알키닐), 선택적으로 치환된 아미노알케닐 또는 선택적으로 치환된 아미노알키닐이고;
R15 및 R16의 각각은, 독립적으로, H, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐 또는 선택적으로 치환된 알키닐(예컨대, R15는 H이고, R16은 H 또는 선택적으로 치환된 알킬임)이다.
몇몇 실시형태에 있어서, R15는 H이고, R16은 H 또는 선택적으로 치환된 알킬이다. 특정 실시형태에 있어서, R14는 H, 아실 또는 하이드록시알킬이다. 몇몇 실시형태에 있어서, R14는 할로이다. 몇몇 실시형태에 있어서, R14 및 R15는 둘 모두 H이다. 몇몇 실시형태에 있어서, R15 및 R16은 둘 모두 H이다. 몇몇 실시형태에 있어서, R14 및 R15 및 R16의 각각은 H이다. 추가의 실시형태에 있어서, R13a 및 R13b의 각각은 독립적으로, H 또는 선택적으로 치환된 알킬이다.
변형된 사이토신의 추가의 비제한적인 예는 하기 화학식 (b36):
Figure pct00115
(b36)의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체를 포함하되, 식 중,
각각의 R13b는, 독립적으로, H, 선택적으로 치환된 아실, 선택적으로 치환된 아실옥시알킬, 선택적으로 치환된 알킬 또는 선택적으로 치환된 알콕시이고, 여기서 R13b와 R14b의 조합은 함께 결합되어 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴을 형성할 수 있으며;
각각의 R14a 및 R14b는, 독립적으로, H, 할로, 하이드록시, 티올, 선택적으로 치환된 아실, 선택적으로 치환된 아미노산, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 할로알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 하이드록시알킬(예컨대, O-보호기로 치환됨), 선택적으로 치환된 하이드록시알케닐, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 알케닐옥시, 선택적으로 치환된 알키닐옥시, 선택적으로 치환된 아미노알콕시, 선택적으로 치환된 알콕시알콕시, 선택적으로 치환된 아실옥시알킬, 선택적으로 치환된 아미노(예컨대, -NHR, 여기서 R은 H, 알킬, 아릴, 포스포릴, 선택적으로 치환된 아미노알킬 또는 선택적으로 치환된 카복시아미노알킬임), 아자이도, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴, 선택적으로 치환된 알크헤테로사이클릴, 선택적으로 치환된 아미노알킬, 선택적으로 치환된 아미노알케닐 또는 선택적으로 치환된 아미노알키닐이고;
R15의 각각은, 독립적으로, H, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐 또는 선택적으로 치환된 알키닐이다.
특정 실시형태에 있어서, R14b는 선택적으로 치환된 아미노산(예컨대, 선택적으로 치환된 라이신)이다. 몇몇 실시형태에 있어서, R14a는 H이다.
몇몇 실시형태에 있어서, B는 변형된 구아니딘이다. 예시적인 변형된 구아닌은 하기 화학식 (b15)-(b17):
Figure pct00116
의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체를 포함하되, 식 중,
T4', T4", T5', T5", T6' 및 T6"의 각각은, 독립적으로, H, 선택적으로 치환된 알킬 또는 선택적으로 치환된 알콕시이고, 여기서 T4'와 T4"의 조합(예컨대, T4에서처럼) 또는 T5'와 T5"의 조합(예컨대, T5에서처럼) 또는 T6'와 T6"의 조합은 (예컨대, T6에서처럼) 함께 결합되어 O(옥소), S(티오) 또는 Se(셀레노)를 형성하며;
V5 및 V6의 각각은, 독립적으로, O, S, N(RVd)nv 또는 C(RVd)nv이되, 여기서 nv는 0 내지 2의 정수이고, 각각의 RVd는, 독립적으로, H, 할로, 티올, 선택적으로 치환된 아미노산, 사이아노, 아미딘, 선택적으로 치환된 아미노알킬, 선택적으로 치환된 아미노알케닐, 선택적으로 치환된 아미노알키닐, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 알케닐옥시, 선택적으로 치환된 알키닐옥시(예컨대, 본 명세서에 기재된 임의의 치환기, 예컨대, 알킬에 대해서 (1) 내지 (21)로부터 선택된 것으로 선택적으로 치환됨), 선택적으로 치환된 티오알콕시 또는 선택적으로 치환된 아미노이며;
R17, R18, R19a, R19b, R21, R22, R23 및 R24의 각각은, 독립적으로, H, 할로, 티올, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 티오알콕시, 선택적으로 치환된 아미노 또는 선택적으로 치환된 아미노산이다.
예시적인 변형된 구아노신은 하기 화학식(b37)-(b40):
Figure pct00117
Figure pct00118
(b40)의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체를 포함하되, 식 중,
T4'의 각각은, 독립적으로, H, 선택적으로 치환된 알킬 또는 선택적으로 치환된 알콕시이고, 각각의 T4는, 독립적으로, O(옥소), S(티오) 또는 Se(셀레노)이며;
R18, R19a, R19b 및 R21의 각각은, 독립적으로, H, 할로, 티올, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 티오알콕시, 선택적으로 치환된 아미노 또는 선택적으로 치환된 아미노산이다.
몇몇 실시형태에 있어서, R18은 H 또는 선택적으로 치환된 알킬이다. 추가의 실시형태에 있어서, T4는 옥소이다 몇몇 실시형태에 있어서, R19a 및 R19b의 각각은, 독립적으로, H 또는 선택적으로 치환된 알킬이다.
몇몇 실시형태에 있어서, B는 변형된 아데닌이다. 예시적인 변형된 아데노신은 하기 화학식 (b18)-(b20):
Figure pct00119
의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체를 포함하되, 식 중,
각각의 V7는, 독립적으로, O, S, N(RVe)nv 또는 C(RVe)nv이고, 여기서 nv는 0 내지 2의 정수이며, 각각의 RVe는, 독립적으로, H, 할로, 선택적으로 치환된 아미노산, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 알케닐옥시 또는 선택적으로 치환된 알키닐옥시(예컨대, 본 명세서에 기재된 임의의 치환기, 예컨대, 알킬에 대해서 (1) 내지 (21)로부터 선택된 것으로 선택적으로 치환됨)이고;
각각의 R25는, 독립적으로, H, 할로, 티올, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 티오알콕시 또는 선택적으로 치환된 아미노이며;
R26a 및 R26b의 각각은, 독립적으로, H, 선택적으로 치환된 아실, 선택적으로 치환된 아미노산, 선택적으로 치환된 카바모일알킬, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 하이드록시알킬, 선택적으로 치환된 하이드록시알케닐, 선택적으로 치환된 하이드록시알키닐, 선택적으로 치환된 알콕시 또는 폴리에틸렌 글라이콜기(예컨대, -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR', 여기서 s1은 1 내지 10(예컨대, 1 내지 6 또는 1 내지 4)의 정수이고, s2 및 s3의 각각은, 독립적으로, 0 내지 10(예컨대, 0 내지 4, 0 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 6 또는 1 내지 10)의 정수이며, R'는 H 또는 C1-20알킬임); 또는 아미노-폴리에틸렌 글라이콜기(예컨대, -NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, 여기서 s1은 1 내지 10(예컨대, 1 내지 6 또는 1 내지 4)의 정수이고, s2 및 s3의 각각은, 독립적으로, 0 내지 10(예컨대, 0 내지 4, 0 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 6 또는 1 내지 10)의 정수이며, 각각의 RN1은, 독립적으로, 수소 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬임)이고;
각각의 R27은, 독립적으로, H, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 티오알콕시 또는 선택적으로 치환된 아미노이며;
각각의 R28은, 독립적으로, H, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐 또는 선택적으로 치환된 알키닐이고;
각각의 R29는, 독립적으로, H, 선택적으로 치환된 아실, 선택적으로 치환된 아미노산, 선택적으로 치환된 카바모일알킬, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 하이드록시알킬, 선택적으로 치환된 하이드록시알케닐, 선택적으로 치환된 알콕시 또는 선택적으로 치환된 아미노이다.
예시적인 변형된 아데닌은 하기 화학식 (b41)-(b43):
Figure pct00120
의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체를 포함하되, 식 중,
각각의 R25는, 독립적으로, H, 할로, 티올, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 티오알콕시 또는 선택적으로 치환된 아미노이며;
R26a 및 R26b의 각각은, 독립적으로, H, 선택적으로 치환된 아실, 선택적으로 치환된 아미노산, 선택적으로 치환된 카바모일알킬, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 하이드록시알킬, 선택적으로 치환된 하이드록시알케닐, 선택적으로 치환된 하이드록시알키닐, 선택적으로 치환된 알콕시 또는 폴리에틸렌 글라이콜기(예컨대, -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR', 여기서 s1은 1 내지 10(예컨대, 1 내지 6 또는 1 내지 4)의 정수이고, s2 및 s3의 각각은, 독립적으로, 0 내지 10(예컨대, 0 내지 4, 0 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 6 또는 1 내지 10)의 정수이며, R'는 H 또는 C1-20알킬임); 또는 아미노-폴리에틸렌 글라이콜기(예컨대, -NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, 여기서 s1은 1 내지 10(예컨대, 1 내지 6 또는 1 내지 4)의 정수이고, s2 및 s3의 각각은, 독립적으로, 0 내지 10(예컨대, 0 내지 4, 0 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 6 또는 1 내지 10)의 정수이며, 각각의 RN1은, 독립적으로, 수소 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬임)이며;
각각의 R27은, 독립적으로, H, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 티오알콕시 또는 선택적으로 치환된 아미노이다.
몇몇 실시형태에 있어서, R26a는 H이고, R26b는 선택적으로 치환된 알킬이다. 몇몇 실시형태에 있어서, R26a 및 R26b의 각각은, 독립적으로, 선택적으로 치환된 알킬이다. 특정 실시형태에 있어서, R27은 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알콕시 또는 선택적으로 치환된 티오알콕시이다. 다른 실시형태에 있어서, R25는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알콕시 또는 선택적으로 치환된 티오알콕시이다.
특정 실시형태에 있어서, R26a, R26b 또는 R29에 대한 선택적 치환기는 폴리에틸렌 글라이콜기(예컨대, -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR'이되, 여기서 s1은 1 내지 10(예컨대, 1 내지 6 또는 1 내지 4)의 정수이고, s2 및 s3의 각각은, 독립적으로, 0 내지 10(예컨대, 0 내지 4, 0 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 6 또는 1 내지 10)의 정수이며, R'는 H 또는 C1-20알킬임); 또는 아미노-폴리에틸렌 글라이콜기(예컨대, -NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, 이때 s1은 1 내지 10(예컨대, 1 내지 6 또는 1 내지 4)의 정수이고, s2 및 s3의 각각은, 독립적으로, 0 내지 10(예컨대, 0 내지 4, 0 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 6 또는 1 내지 10)의 정수이며, 각각의 RN1은, 독립적으로, 수소 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬임)이다.
몇몇 실시형태에 있어서, B는 하기 화학식 (b21):
Figure pct00121
(b21)을 지닐 수 있되, 식 중, X12는, 독립적으로, O, S, 선택적으로 치환된 알킬렌(예컨대, 메틸렌) 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬렌이고, xa는 0 내지 3의 정수이며, R12a 및 T2는 본 명세서에 기재된 바와 같다.
몇몇 실시형태에 있어서, B는 하기 화학식 (b22):
Figure pct00122
(b22)를 지닐 수 있되, 식 중, R10'는, 독립적으로, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴, 선택적으로 치환된 아미노알킬, 선택적으로 치환된 아미노알케닐, 선택적으로 치환된 아미노알키닐, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 알콕시카보닐알킬, 선택적으로 치환된 알콕시카보닐알케닐, 선택적으로 치환된 알콕시카보닐알키닐, 선택적으로 치환된 알콕시카보닐알콕시, 선택적으로 치환된 카복시알콕시, 선택적으로 치환된 카복시알킬 또는 선택적으로 치환된 카바모일알킬이고, R11, R12a, T1 및 T2는 본 명세서에 기재된 바와 같다.
몇몇 실시형태에 있어서, B는 하기 화학식 (b23):
Figure pct00123
(b23)을 지닐 수 있고, 식 중 R10은 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴(예컨대, 선택적으로 치환된 푸릴, 선택적으로 치환된 티에닐 또는 선택적으로 치환된 피롤릴), 선택적으로 치환된 아릴(예컨대, 선택적으로 치환된 페닐 또는 선택적으로 치환된 나프틸) 또는 본 명세서에 기재된 임의의 치환기(예컨대, R10에 대해서)이고; 이때 R11(예컨대, H 또는 본 명세서에 기재된 임의의 치환기), R12a(예컨대, H 또는 본 명세서에 기재된 임의의 치환기), T1(예컨대, 옥소 또는 본 명세서에 기재된 임의의 치환기) 및 T2(예컨대, 옥소 또는 본 명세서에 기재된 임의의 치환기)는 본 명세서에 기재된 바와 같다.
몇몇 실시형태에 있어서, B는 하기 화학식 (b24):
Figure pct00124
(b24)를 지닐 수 있되, 식 중, R14'는, 독립적으로, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴, 선택적으로 치환된 알크아릴, 선택적으로 치환된 알크헤테로사이클릴, 선택적으로 치환된 아미노알킬, 선택적으로 치환된 아미노알케닐, 선택적으로 치환된 아미노알키닐, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 알콕시카보닐알킬, 선택적으로 치환된 알콕시카보닐알케닐, 선택적으로 치환된 알콕시카보닐알키닐, 선택적으로 치환된 알콕시카보닐알콕시, 선택적으로 치환된 카복시알콕시, 선택적으로 치환된 카복시알킬 또는 선택적으로 치환된 카바모일알킬이고, R13a, R13b, R15 및 T3은 본 명세서에 기재된 바와 같다.
몇몇 실시형태에 있어서, B는 하기 화학식 (b25):
Figure pct00125
(b25)를 지닐 수 있되, 식 중, R14'는 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴(예컨대, 선택적으로 치환된 푸릴, 선택적으로 치환된 티에닐 또는 선택적으로 치환된 피롤릴), 선택적으로 치환된 아릴(예컨대, 선택적으로 치환된 페닐 또는 선택적으로 치환된 나프틸) 또는 본 명세서에 기재된 임의의 치환기(예컨대, R14 또는 R14'에 대해서)이고; R13a(예컨대, H 또는 본 명세서에 기재된 임의의 치환기), R13b(예컨대, H 또는 본 명세서에 기재된 임의의 치환기), R15(예컨대, H 또는 본 명세서에 기재된 임의의 치환기) 및 T3(예컨대, 옥소 또는 본 명세서에 기재된 임의의 치환기)은 본 명세서에 기재된 바와 같다.
몇몇 실시형태에 있어서, B는 사이토신, 구아닌, 아데닌 및 유라실로 이루어진 군으로부터 선택된 핵염기이다. 몇몇 실시형태에 있어서, B는,
Figure pct00126
일 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵염기는 변형된 유라실이다. 변형된 유라실을 지니는 예시적인 핵염기 및 뉴클레오사이드는 유사유리딘(ψ), 피리딘-4-온 리보뉴클레오사이드, 5-아자-유리딘, 6-아자-유리딘, 2-티오-5-아자-유리딘, 2-티오-유리딘(s2U), 4-티오-유리딘(s4U), 4-티오-유사유리딘, 2-티오-유사유리딘, 5-하이드록시-유리딘(ho5U), 5-아미노알릴-유리딘, 5-할로-유리딘(예컨대, 5-아이오도--유리딘 또는 5-브로모-유리딘), 3-메틸-유리딘(m3U), 5-메톡시-유리딘(mo5U), 유리딘 5-옥시아세트산(cmo5U), 유리딘 5-옥시아세트산 메틸 에스터 (mcmo5U), 5-카복시메틸-유리딘(cm5U), 1-카복시메틸-유사유리딘, 5-카복시하이드록시메틸-유리딘(chm5U), 5-카복시하이드록시메틸-유리딘 메틸 에스터 (mchm5U), 5-메톡시카보닐메틸-유리딘(mcm5U), 5-메톡시카보닐메틸-2-티오-유리딘(mcm5s2U), 5-아미노메틸-2-티오-유리딘(nm5s2U), 5-메틸아미노메틸-유리딘(mnm5U), 5-메틸아미노메틸-2-티오-유리딘(mnm5s2U), 5-메틸아미노메틸-2-셀레노-유리딘(mnm5se2U), 5-카바모일메틸-유리딘(ncm5U), 5-카복시메틸아미노메틸-유리딘(cmnm5U), 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오-유리딘(cmnm5s2U), 5-프로피닐-유리딘, 1-프로피닐-유사유리딘, 5-타우리노메틸-유리딘(τm5U), 1-타우리노메틸-유사유리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-유리딘(τm5s2U), 1-타우리노메틸-4-티오-유사유리딘, 5-메틸-유리딘(m5U, 즉, 핵염기 데옥시티민을 지님), 1-메틸-유사유리딘(m1ψ), 5-메틸-2-티오-유리딘(m5s2U), 1-메틸-4-티오-유사유리딘(m1s4ψ), 4-티오-1-메틸-유사유리딘, 3-메틸-유사유리딘(m3ψ), 2-티오-1-메틸-유사유리딘, 1-메틸-1-데아자-유사유리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-유사유리딘, 다이하이드로유리딘(D), 다이하이드로유사유리딘, 5,6-다이하이드로유리딘, 5-메틸-다이하이드로유리딘(m5D), 2-티오-다이하이드로유리딘, 2-티오-다이하이드로유사유리딘, 2-메톡시-유리딘, 2-메톡시-4-티오-유리딘, 4-메톡시-유사유리딘, 4-메톡시-2-티오-유사유리딘, N1-메틸-유사유리딘, 3-(3-아미노-3-카복시프로필)유리딘(acp3U), 1-메틸-3-(3-아미노-3-카복시프로필)유사유리딘(acp3ψ), 5-(아이소펜테닐아미노메틸)유리딘(inm5U), 5-(아이소펜테닐아미노메틸)-2-티오-유리딘(inm5s2U), α-티오-유리딘, 2'-O-메틸-유리딘(Um), 5,2'-O-다이메틸-유리딘(m5Um), 2'-O-메틸-유사유리딘(ψm), 2-티오-2'-O-메틸-유리딘(s2Um), 5-메톡시카보닐메틸-2'-O-메틸-유리딘(mcm5Um), 5-카바모일메틸-2'-O-메틸-유리딘(ncm5Um), 5-카복시메틸아미노메틸-2'-O-메틸-유리딘(cmnm5Um), 3,2'-O-다이메틸-유리딘(m3Um), 5-(아이소펜테닐아미노메틸)-2'-O-메틸-유리딘(inm5Um), 1-티오-유리딘, 데옥시티미딘, 2'-F-아라-유리딘, 2'-F-유리딘, 2'-OH-아라-유리딘, 5-(2-카보메톡시비닐)유리딘 및 5-[3-(1-E-프로페닐아미노)유리딘을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵염기는 변형된 사이토신이다. 변형된 사이토신을 지니는 예시적인 핵염기 및 뉴클레오사이드는 5-아자-시티딘, 6-아자-시티딘, 유사아이소시티딘, 3-메틸-시티딘(m3C), N4-아세틸-시티딘(ac4C), 5-폼일-시티딘(f5C), N4-메틸-시티딘(m4C), 5-메틸-시티딘(m5C), 5-할로-시티딘(예컨대, 5-아이오도-시티딘), 5-하이드록시메틸-시티딘(hm5C), 1-메틸-유사아이소시티딘, 피롤로-시티딘, 피롤로-유사아이소시티딘, 2-티오-시티딘(s2C), 2-티오-5-메틸-시티딘, 4-티오-유사아이소시티딘, 4-티오-1-메틸-유사아이소시티딘, 4-티오-1-메틸-1-데아자-유사아이소시티딘, 1-메틸-1-데아자-유사아이소시티딘, 제불라린, 5-아자-제불라린, 5-메틸-제불라린, 5-아자-2-티오-제불라린, 2-티오-제불라린, 2-메톡시-시티딘, 2-메톡시-5-메틸-시티딘, 4-메톡시-유사아이소시티딘, 4-메톡시-1-메틸-유사아이소시티딘, 라이시딘(k2C), α-티오-시티딘, 2'-O-메틸-시티딘(Cm), 5,2'-O-다이메틸-시티딘(m5Cm), N4-아세틸-2'-O-메틸-시티딘(ac4Cm), N4,2'-O-다이메틸-시티딘(m4Cm), 5-폼일-2'-O-메틸-시티딘(f5Cm), N4,N4,2'-O-트라이메틸-시티딘(m4 2Cm), 1-티오-시티딘, 2'-F-아라-시티딘, 2'-F-시티딘 및 2'-OH-아라-시티딘을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵염기는 변형된 아데닌이다. 변형된 아데닌을 지니는 예시적인 핵염기 및 뉴클레오사이드는 2-아미노-퓨린, 2, 6-다이아미노퓨린 2-아미노-6-할로-퓨린(예컨대, 2-아미노-6-클로로-퓨린), 6-할로-퓨린(예컨대, 6-클로로-퓨린), 2-아미노-6-메틸-퓨린, 8-아자이도-아데노신, 7-데아자-아데닌, 7-데아자-8-아자-아데닌, 7-데아자-2-아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2-아미노퓨린, 7-데아자-2,6-다이아미노퓨린 7-데아자-8-아자-2,6-다이아미노퓨린 1-메틸-아데노신(m1A), 2-메틸-아데닌(m2A), N6-메틸-아데노신(m6A), 2-메틸티오-N6-메틸-아데노신(ms2m6A), N6-아이소펜테닐-아데노신(i6A), 2-메틸티오-N6-아이소펜테닐-아데노신(ms2i6A), N6-(시스-하이드록시아이소펜테닐)아데노신(io6A), 2-메틸티오-N6-(시스-하이드록시아이소펜테닐)아데노신(ms2io6A), N6-글라이시닐카바모일-아데노신(g6A), N6-트레오닐카바모일-아데노신(t6A), N6-메틸-N6-트레오닐카바모일-아데노신(m6t6A), 2-메틸티오-N6-트레오닐카바모일-아데노신(ms2g6A), N6,N6-다이메틸-아데노신(m6 2A), N6-하이드록시노발릴카바모일-아데노신(hn6A), 2-메틸티오-N6-하이드록시노발릴카바모일-아데노신(ms2hn6A), N6-아세틸-아데노신(ac6A), 7-메틸-아데닌, 2-메틸티오-아데닌, 2-메톡시-아데닌, α-티오-아데노신, 2'-O-메틸-아데노신(Am), N6,2'-O-다이메틸-아데노신(m6Am), N6,N6,2'-O-트라이메틸-아데노신(m6 2Am), 1,2'-O-다이메틸-아데노신(m1Am), 2'-O-리보실아데노신(포스페이트)(Ar(p)), 2-아미노-N6-메틸-퓨린, 1-티오-아데노신, 8-아자이도-아데노신, 2'-F-아라-아데노신, 2'-F-아데노신, 2'-OH-아라-아데노신 및 N6-(19-아미노-펜타옥사노나데실)-아데노신을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵염기는 변형된 구아닌이다. 변형된 구아닌을 지니는 예시적인 핵염기 및 뉴클레오사이드는 이노신(I), 1-메틸-이노신(m1I), 위오신(imG), 메틸위오신(mimG), 4-데메틸-위오신(imG-14), 아이소위오신(imG2), 위부토신(yW), 퍼옥시위부토신(o2yW), 하이드록시위부토신(OHyW), 미변형(undermodified) 하이드록시위부토신(OHyW*), 7-데아자-구아노신, 큐오신(Q), 에폭시큐오신(oQ), 갈락토실-큐오신(galQ), 만노실-큐오신(manQ), 7-사이아노-7-데아자-구아노신(프레Q0), 7-아미노메틸-7-데아자-구아노신(프레Q1), 아케오신(G+), 7-데아자-8-아자-구아노신, 6-티오-구아노신, 6-티오-7-데아자-구아노신, 6-티오-7-데아자-8-아자-구아노신, 7-메틸-구아노신(m7G), 6-티오-7-메틸-구아노신, 7-메틸-이노신, 6-메톡시-구아노신, 1-메틸-구아노신(m1G), N2-메틸-구아노신(m2G), N2,N2-다이메틸-구아노신(m2 2G), N2,7-다이메틸-구아노신(m2,7G), N2,N2,7-다이메틸-구아노신(m2,2,7G), 8-옥소-구아노신, 7-메틸-8-옥소-구아노신, 1-메틸-6-티오-구아노신, N2-메틸-6-티오-구아노신, N2,N2-다이메틸-6-티오-구아노신, α-티오-구아노신, 2'-O-메틸-구아노신(Gm), N2-메틸-2'-O-메틸-구아노신(m2Gm), N2,N2-다이메틸-2'-O-메틸-구아노신(m2 2Gm), 1-메틸-2'-O-메틸-구아노신(m1Gm), N2,7-다이메틸-2'-O-메틸-구아노신(m2,7Gm), 2'-O-메틸-이노신(Im), 1,2'-O-다이메틸-이노신(m1Im), 2'-O-리보실구아노신(포스페이트)(Gr(p)), 1-티오-구아노신, O6-메틸-구아노신, 2'-F-아라-구아노신 및 2'-F-구아노신을 포함한다.
뉴클레오타이드의 핵염기는 퓨린, 피리미딘, 퓨린 또는 피리미딘 유사체로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 예를 들어, 핵염기는 각각 아데닌, 사이토신, 구아닌, 유라실 또는 하이포잔틴로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 핵염기는, 예를 들어, 피라졸로[3,4-d]피리미딘, 5-메틸사이토신(5-me-C), 5-하이드록시메틸 사이토신, 잔틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 기타 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 기타 알킬 유도체, 2-티오유라실, 2-티오티민 및 2-티오사이토신, 5-프로피닐 유라실 및 사이토신, 6-아조 유라실, 사이토신 및 티민, 5-유라실(유사유라실), 4-티오유라실, 8-할로(예컨대, 8-브로모), 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 기타 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로 특히 5-브로모, 5-트라이플루오로메틸 및 기타 5-치환된 유라실 및 사이토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 데아자구아닌, 7-데아자구아닌, 3-데아자구아닌, 데아자아데닌, 7-데아자아데닌, 3-데아자아데닌, 피라졸로[3,4-d]피리미딘, 이미다조[1,5-a]1,3,5 트라이아지논, 9-데아자퓨린, 이미다조[4,5-d]피라진, 티아졸로[4,5-d]피리미딘, 피라진-2-온, 1,2,4-트라이아진, 피리다진; 및 1,3,5 트라이아진을 비롯한, 염기의 천연 유래 및 합성 유도체를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드가 약칭 A, G, C, T 또는 U를 이용해서 묘사된 경우, 각 문자는 대표적인 염기 및/또는 그의 유도체를 지칭하며, 예컨대, A는 아데닌 또는 아데닌 유사체, 예컨대, 7-데아자 아데닌을 포함한다.
뉴클레오사이드간 결합에 대한 변환
변형된 핵산 또는 mmRNA 분자 내로 편입될 수 있는 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는, 뉴클레오사이드간 결합(예컨대, 포스페이트 골격) 상에서 변형될 수 있다. 골격의 포스페이트기는 산소 원자의 하나 이상을 상이한 치환기로 대체함으로써 변형될 수 있다. 또한, 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 비변형 포스페이트 모이어티를 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 포스페이트로의 대규모의 대체를 포함할 수 있다. 변형된 포스페이트기의 예로는, 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노포스페이트, 보라노포스페이트 에스터, 하이드로겐 포스포네이트, 포스포라미데이트, 포스포로다이아미데이트, 알킬 혹은 아릴 포스포네이트 및 포스포트라이에스터를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 포스포로다이티오에이트는 황에 의해 대체된 두 비결합 산소를 지닌다. 포스페이트 링커는 또한 질소(브리지된 포스포라미데이트), 황(브리지된 포스포로티오에이트) 및 탄소(브리지된 메틸렌-포스포네이트)에 의한 연결 산소의 대체에 의해 변형될 수 있다.
α-티오 치환된 포스페이트 모이어티는 비천연의 포스포로티오에이트 골격 결합을 통해 RNA 및 DNA 중합체에 안정성을 부여하도록 제공된다. 포스포로티오에이트 DNA 및 RNA는 세포 환경에서 증가된 뉴클레아제 내성과 후속하여 보다 긴 반감기를 지닌다. 포스포로티오에이트 연결된 변형된 핵산 또는 mmRNA 분자는 세포의 선천적 면역 분자의 보다 약한 결합/활성화를 통해 선천적 면역 반응을 또한 저감시킬 것으로 예상된다.
특정 실시형태에 있어서, 변형된 뉴클레오사이드로는 알파-티오-뉴클레오사이드(예컨대, 5'-O-(1-티오포스페이트)-아데노신, 5'-O-(1-티오포스페이트)-시티딘(α-티오-시티딘), 5'-O-(1-티오포스페이트)-구아노신, 5'-O-(1-티오포스페이트)-유리딘 또는 5'-O-(1-티오포스페이트)-유사유리딘)을 포함한다.
변형된 당, 핵염기 및 뉴클레오사이드간 결합의 조합
본 발명의 변형된 핵산 및 mmRNA는 당, 핵염기 및/또는 뉴클레오사이드간 결합에 대한 변형의 조합을 포함할 수 있다. 이들 조합은 본 명세서에 기재된 임의의 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 화학식 (Ia), (Ia-1)-(Ia-3), (Ib)-(If), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) 및 (IXa)-(IXr)에 있어서 본 명세서에 기재된 뉴클레오타이드의 어느 하나는 (예컨대, 화학식 (b1)-(b43) 또는 본 명세서에 기재된 임의의 기타의 것에 있어서) 본 명세서에 기재된 핵염기의 어느 것과도 조합될 수 있다.
변형된 핵산 및 mmRNA 분자의 합성
본 발명에 따라서 이용하기 위한 변형된 핵산 및 mmRNA 분자는 본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 유용한 수법에 따라서 제조될 수 있다. 본 명세서에 개시된 변형된 핵산 및 mmRNA 분자의 합성에 이용되는 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 이하의 일반적인 방법 및 절차를 이용해서 용이하게 입수가능한 출발 물질로부터 제조될 수 있다. 전형적인 혹은 바람직한 공정 조건(예컨대, 반응 온도, 횟수, 반응물의 몰비, 용매, 압력 등)이 제공될 경우, 당업자라면 추가의 공정 조건을 최적화하고 개발할 수 있을 것이다. 최적 반응 조건은 특정 반응물 또는 이용되는 용매에 때라 변할 수 있지만, 이러한 조건은 통상의 최적화 절차에 의해 당업자에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에 기재된 공정들은, 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법에 따라서 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 생성물 형성은, 핵자기 공명 분광법(예컨대, 1H 또는 13C) 적외선 분광법, 분광광도법(예컨대, UV-가시광) 혹은 질량 분광법 등과 같은 분광 수단에 의해, 또는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 혹은 박층 크로마토그래피 등과 같은 크로마토그래피에 의해 모니터링될 수 있다.
본 발명의 변형된 핵산 및 mmRNA 분자의 제조는 각종 화학적 기의 보호 및 탈보호를 수반할 수 있다. 적절한 보호기의 보호 및 탈보호 그리고 선택에 대한 필요성은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 보호기의 화학은, 예를 들어, 문헌[Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis, 2d. Ed., Wiley & Sons, 1991]에서 찾을 수 있으며, 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다.
본 명세서에 기재된 방법들의 반응은 유기 합성 분야의 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있는 적절한 용매 중에서 수행될 수 있다. 적절한 용매는, 반응이 수행되는 온도, 즉, 용매의 동결 온도에서부터 용매의 비등 온도까지에 이를 수 있는 온도에서 출발 물질(반응물), 중간생성물 또는 생성물과 실질적으로 비반응성일 수 있다. 주어진 반응은 하나의 용매 혹은 하나보다 많은 용매의 혼합물에서 수행될 수 있다. 특정 반응 단계에 따라서 특정 단계용의 적절한 용매가 선택될 수 있다.
변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드의 라세미 혼합물의 분리는 당업계에 공지된 수많은 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 그 예시적인 방법은 광학적으로 활성인 염-형성 유기산인 "카이럴 분리산"을 이용한 분별 재결정을 포함한다. 분별 재결정화법을 위한 적절한 분리 시약은, 예를 들어, 광학적으로 활성인 산, 예컨대, D 및 L 형태의 타르타르산, 다이아세틸타르타르산, 다이벤조일타르타르산, 만델산, 말산, 락트산 또는 각종 광학적으로 활성인 캄퍼설폰산이다. 라세미 혼합물의 분리는 또한 광학적으로 활성인 분리 시약(예컨대, 다이나이트로벤조일페닐글라이신)으로 채워진 칼럼 상에서의 용리에 의해 수행될 수 있다. 적절한 용리 용매 조성물은 당업자에 의해 결정될 수 있다.
변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드(예컨대, 빌딩 블록 분자)는 문헌[Ogata et al., J. Org. Chem. 74:2585-2588 (2009); Purmal et al., Nucl. Acids Res. 22(1): 72-78, (1994); Fukuhara et al., Biochemistry, 1(4): 563-568 (1962); 및 Xu et al., Tetrahedron, 48(9): 1729-1740 (1992)]에 기재된 합성 방법에 따라서 제조될 수 있으며, 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 포함된다.
본 발명의 변형된 핵산 및 mmRNA는 분자의 전체 길이를 따라 균일하게 변형될 필요는 없다. 예를 들어, 뉴클레오타이드의 하나 이상 혹은 모든 유형(예컨대, 퓨린 또는 피리미딘, 또는 A, G, U, C의 임의의 하나 이상 혹은 전부)은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 주어진 미리 결정된 서열 영역에서 균일하게 변형될 수 있거나 혹은 그렇치 않을 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 내(또는 그의 주어진 서열 영역 내)의 모든 뉴클레오타이드 X가 변형되되, 여기서 X는 뉴클레오타이드 A, G, U, C 중 어느 하나, 또는 A+G, A+U, A+C, G+U, G+C, U+C, A+G+U, A+G+C, G+U+C 또는 A+G+C의 조합의 어느 하나일 수 있다.
상이한 당 변형, 뉴클레오타이드 변형 및/또는 뉴클레오사이드간 결합(예컨대, 골격 구조)는 변형된 핵산 또는 mmRNA 내 각종 위치에 존재할 수 있다. 당업자라면, 뉴클레오타이드 유사체 또는 기타 변형(들)은 변형된 핵산 또는 mmRNA의 기능이 실질적으로 감소되지 않도록 변형된 핵산 또는 mmRNA의 임의의 위치(들)에 위치될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 변형은 또한 5' 또는 3'말단 변형일 수 있다. 변형된 핵산 또는 mmRNA는 약 1% 내지 약 100% 또는 임의의 중간 퍼센트(예컨대, 1% 내지 20%, 1% 내지 25%, 1% 내지 50%, 1% 내지 60%, 1% 내지 70%, 1% 내지 80%, 1% 내지 90%, 1% 내지 95%, 10% 내지 20%, 10% 내지 25%, 10% 내지 50%, 10% 내지 60%, 10% 내지 70%, 10% 내지 80%, 10% 내지 90%, 10% 내지 95%, 10% 내지 100%, 20% 내지 25%, 20% 내지 50%, 20% 내지 60%, 20% 내지 70%, 20% 내지 80%, 20% 내지 90%, 20% 내지 95%, 20% 내지 100%, 50% 내지 60%, 50% 내지 70%, 50% 내지 80%, 50% 내지 90%, 50% 내지 95%, 50% 내지 100%, 70% 내지 80%, 70% 내지 90%, 70% 내지 95%, 70% 내지 100%, 80% 내지 90%, 80% 내지 95%, 80% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100% 및 95% 내지 100%)의 변형된 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 또는 mmRNA는 변형된 피리미딘(예컨대, 변형된 유라실/유리딘 또는 변형된 사이토신/시티딘)을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 또는 mmRNA 분자 내 유라실 또는 유리딘은 약 1% 내지 약 100%의 변형된 유라실 또는 변형된 유리딘(예컨대, 1% 내지 20%, 1% 내지 25%, 1% 내지 50%, 1% 내지 60%, 1% 내지 70%, 1% 내지 80%, 1% 내지 90%, 1% 내지 95%, 10% 내지 20%, 10% 내지 25%, 10% 내지 50%, 10% 내지 60%, 10% 내지 70%, 10% 내지 80%, 10% 내지 90%, 10% 내지 95%, 10% 내지 100%, 20% 내지 25%, 20% 내지 50%, 20% 내지 60%, 20% 내지 70%, 20% 내지 80%, 20% 내지 90%, 20% 내지 95%, 20% 내지 100%, 50% 내지 60%, 50% 내지 70%, 50% 내지 80%, 50% 내지 90%, 50% 내지 95%, 50% 내지 100%, 70% 내지 80%, 70% 내지 90%, 70% 내지 95%, 70% 내지 100%, 80% 내지 90%, 80% 내지 95%, 80% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 및 95% 내지 100%의 변형된 유라실 또는 변형된 유리딘)으로 대체될 수 있다. 변형된 유라실 또는 유리딘은 단일의 독특한 구조를 지니는 화합물에 의해 또는 상이한 구조(예컨대, 본 명세서에 기재된 바와 같은 2, 3, 4 혹은 그 이상의 독특한 구조)를 지니는 복수의 화합물에 의해 대체될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 또는 mmRNA 분자 내 사이토신 또는 시티딘은 약 1% 내지 약 100%의 변형된 사이토신 또는 변형된 시티딘(예컨대, 1% 내지 20%, 1% 내지 25%, 1% 내지 50%, 1% 내지 60%, 1% 내지 70%, 1% 내지 80%, 1% 내지 90%, 1% 내지 95%, 10% 내지 20%, 10% 내지 25%, 10% 내지 50%, 10% 내지 60%, 10% 내지 70%, 10% 내지 80%, 10% 내지 90%, 10% 내지 95%, 10% 내지 100%, 20% 내지 25%, 20% 내지 50%, 20% 내지 60%, 20% 내지 70%, 20% 내지 80%, 20% 내지 90%, 20% 내지 95%, 20% 내지 100%, 50% 내지 60%, 50% 내지 70%, 50% 내지 80%, 50% 내지 90%, 50% 내지 95%, 50% 내지 100%, 70% 내지 80%, 70% 내지 90%, 70% 내지 95%, 70% 내지 100%, 80% 내지 90%, 80% 내지 95%, 80% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100% 및 95% 내지 100%의 변형된 사이토신 또는 변형된 시티딘)으로 대체될 수 있다. 변형된 사이토신 또는 시티딘은 단일의 독특한 구조를 지니는 화합물에 의해 또는 상이한 구조(예컨대, 본 명세서에 기재된 바와 같은 2, 3, 4 혹은 그 이상의 독특한 구조)를 지니는 복수의 화합물에 의해 대체될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 개시내용은 하기 화학식 (Ia-1):
Figure pct00127
(Ia-1)을 지니는 n개의 연결된 뉴클레오사이드를 포함하는 변형된 핵산 또는 mmRNA를 합성하는 방법을 제공하되, 해당 방법은 이하의 단계들을 포함한다:
a) 하기 화학식 (IV-1):
Figure pct00128
(IV-1)
의 뉴클레오타이드를, 하기 화학식 (V-1):
Figure pct00129
(V-1)
(식 중, Y9는 H, 하이드록시, 포스포릴, 피로포스페이트, 설페이트, 아미노, 티올, 선택적으로 치환된 아미노산 또는 펩타이드(예컨대, 2 내지 12개의 아미노산을 포함함)이고; 각각의 P1,P2 및 P3는, 독립적으로, 적절한 보호기이며;
Figure pct00130
는 고체 지지체를 나타냄)
의 포스포라미다이트 화합물과 반응시켜, 하기 화학식 (VI-1):
Figure pct00131
(VI-1)
의 변형된 핵산 또는 mmRNA를 제공하는 단계, 및
b) 화학식 (V)의 변형된 핵산 또는 mmRNA를 산화 혹은 황화시켜 하기 화학식 (VII-1):
Figure pct00132
(VII-1)
의 변형된 핵산 또는 mmRNA를 수득하는 단계, 및
c) 보호기들을 제거하여 화학식 (Ia)의 변형된 핵산 또는 mmRNA를 수득하는 단계.
몇몇 실시형태에 있어서, 단계 a) 및 b)는 1 내지 약 10,000회 반복된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 방법은 아데노신, 사이토신, 구아노신 및 유라실로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드(예컨대, 빌딩 블록 분자)를 더 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 핵염기는 피리미딘 또는 그의 유도체일 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 또는 mmRNA는 번역가능하다.
변형된 핵산 및 mmRNA의 기타 성분은 임의선택적이며, 몇몇 실시형태에 있어서 유익하다. 예를 들어, 5' 비번역 영역(UTR) 및/또는 3'UTR이 제공되되, 이들 중 한쪽 혹은 양쪽 모두는 하나 이상의 상이한 뉴클레오사이드 변형을 독립적으로 포함할 수 있다. 이러한 실시형태에 있어서, 뉴클레오사이드 변형은 또한 번역가능한 영역에 존재할 수 있다. 또한 코작 서열을 포함하는 변형된 핵산 및 mmRNA에 제공된다.
변형된 핵산 또는 mmRNA, 예컨대, RNA 혹은 mRNA 내로 편입되는 변형된 뉴클레오타이드의 예시적인 합성이 이하에 반응식 1 내지 반응식 11에서 제공된다. 반응식 1은, 변형된 뉴클레오사이드를 비롯하여, 뉴클레오사이드의 인산화에 대한 일반적인 방법을 제공한다.
반응식 1
Figure pct00133
각종 보호기는 반응을 제어하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 반응식 2는 2' 및 3' 하이드록실기보다 오히려, 당의 5' 위치에서 인산화를 촉진시키기 위하여 다수의 보호 및 탈보호 단계의 이용을 제공한다.
반응식 2
Figure pct00134
변형된 뉴클레오타이드는 임의의 유용한 방식으로 합성될 수 있다. 반응식 3, 4 및 7은 변형된 메톡시-퓨린 핵염기를 지니는 변형된 뉴클레오타이드를 합성하기 위한 예시적인 방법을 제공하고; 반응식 5 및 6은 각각 변형된 유사유리딘 또는 유사아이소시티딘을 지니는 변형된 뉴클레오타이드를 합성하는 예시적인 방법을 제공한다.
반응식 3
Figure pct00135
반응식 4
Figure pct00136
반응식 5
Figure pct00137
반응식 6
Figure pct00138
반응식 7
Figure pct00139
반응식 8 및 9는 변형된 뉴클레오타이드의 예시적인 합성을 제공한다. 반응식 10은 뉴클레오타이드를 생산하는 비제한적인 바이오촉매적 방법을 제공한다.
반응식 8
Figure pct00140
반응식 9
Figure pct00141
반응식 10
Figure pct00142
반응식 11은 변형된 유라실의 예시적인 합성을 제공하되, 여기서 N1 위치는, 다른 경우에 제공되는 바와 같이 R12b로 변형되고, 리보스의 5'-위치는 인산화된다. T1, T2, R12a, R12b 및 r은 본 명세서에서 제공되어 있다. 이 합성뿐만 아니라 그의 최적화된 버전은 기타 피리미딘 핵염기 및 메톡시-퓨린 핵염기(예컨대, 화학식 (b1)-(b43))를 변형시키고/시키거나 1개 이상의 포스페이트기를 (예컨대, 당의 5' 위치에) 설치하는데 이용될 수 있다. 이 알킬화 반응은 또한 본 명세서에 기재된 임의의 핵염기에서의 임의의 반응성 기(예컨대, 아미노기)(예컨대, 사이토신, 유라실, 아데닌 및 구아닌에 대해서 왓슨-크릭 염기-짝짓기 국면에서의 아미노기)에서 1개 이상의 선택적으로 치환된 알킬기를 포함시키는데도 이용될 수 있다.
반응식 11
Figure pct00143
mmRNA 내 뉴클레오타이드의 조합
변형된 뉴클레오타이드 및 변형된 뉴클레오타이드 조합의 추가의 예는 이하의 표 2에서 제공된다. 변형된 뉴클레오타이드의 이들 조합은 본 발명의 변형된 핵산 또는 mmRNA를 형성하는데 이용될 수 있다. 달리 언급되지 않는 한, 변형된 뉴클레오타이드는 본 발명의 변형된 핵산 또는 mmRNA의 천연의 뉴클레오타이드에 대해서 완전히 치환될 수 있다. 비제한적인 예로서, 천연의 뉴클레오타이드 유리딘은 본 명세서에 기재된 변형된 뉴클레오사이드로 치환될 수 있다. 다른 비제한적인 예에서, 천연의 뉴클레오타이드 유리딘이 본 명세서에 개시된 변형된 뉴클레오사이드의 적어도 하나로 부분적으로 (예컨대, 약 0.1%, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 혹은 99.9%) 치환될 수 있다.
Figure pct00144
Figure pct00145
변형된 뉴클레오타이드 조합의 추가의 예는 이하에서 표 3에 제공된다. 변형된 뉴클레오타이드의 이들 조합은 본 발명의 변형된 핵산 또는 mmRNA를 형성하는데 이용될 수 있다.
Figure pct00146
몇몇 실시형태에 있어서, 사이토신의 적어도 25%(예컨대, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 약 100%)가 화학식 (b10)-(b14)의 화합물로 대체된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 사이토신의 적어도 25%(예컨대, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 약 100%)가 화학식 (b1)-(b9)의 화합물로 대체된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 사이토신의 적어도 25%(예컨대, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 약 100%)가 화학식 (b10)-(b14)의 화합물로 대체되고, 유라실의 적어도 25%가 화학식 (b1)-(b9)의 화합물로 대체된다.
변형된 핵산 분자의 합성
본 발명의 개시내용에 따라 이용하기 위한 변형된 핵산 분자는 화학 합성 및 효소 합성 등과 같은 시험관내 전사 또는 보다 긴 전구체의 효소적 및 화학적 절단 등을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 임의의 적절한 수법에 따라 제조될 수 있다. RNA를 합성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예컨대, 문헌[Gait, M.J. (ed.) Oligonucleotide synthesis: a practical approach, Oxford [Oxfordshire], Washington, DC: IRL Press, 1984; and Herdewijn, P. (ed.) Oligonucleotide synthesis: methods and applications, Methods in Molecular Biology, v. 288 (Clifton, N.J.) Totowa, N.J.: Humana Press, 2005]을 참조하면 되고; 이들 문헌은 양쪽 모두 참조로 본 명세세서에 포함된다).
본 명세서에 개시된 변형된 핵산 분자는 이하의 일반적인 방법 및 절차를 이용해서 용이하게 입수가능한 출발 물질로부터 제조될 수 있다. 전형적인 혹은 바람직한 공정 조건(즉, 반응 온도, 횟수, 반응물의 몰비, 용매, 압력 등)이 제공될 경우, 달리 기술되지 않는 한 다른 공정 조건도 이용될 수 있다는 것이 이해된다. 최적 반응 조건은 특정 반응물 또는 이용되는 용매에 때라 변할 수 있지만, 이러한 조건은 통상의 최적화 절차에 의해 당업자에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에 기재된 공정들은, 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법에 따라서 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 생성물 형성은, 핵자기 공명 분광법(예컨대, 1H 또는 13C),적외선 분광법, 분광광도법(예컨대, UV-가시광), 질량 분광법 등과 같은 분광 수단에 의해, 또는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 혹은 박층 크로마토그래피 등과 같은 크로마토그래피에 의해 모니터링될 수 있다.
변형된 핵산 분자의 제조는 제조는 각종 화학적 기의 보호 및 탈보호를 수반할 수 있다. 적절한 보호기의 보호 및 탈보호 그리고 선택에 대한 필요성은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 보호기의 화학은, 예를 들어, 문헌[Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis, 2d. Ed., Wiley & Sons, 1991]에서 찾을 수 있으며, 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다.
본 명세서에 기재된 방법들의 반응은 유기 합성 분야의 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있는 적절한 용매 중에서 수행될 수 있다. 적절한 용매는, 반응이 수행되는 온도, 즉, 용매의 동결 온도에서부터 용매의 비등 온도까지에 이를 수 있는 온도에서 출발 물질(반응물), 중간생성물 또는 생성물 과 실질적으로 비반응성일 수 있다. 주어진 반응은 하나의 용매 혹은 하나보다 많은 용매의 혼합물에서 수행될 수 있다. 특정 반응 단계에 따라서 특정 단계용의 적절한 용매가 선택될 수 있다.
변형된 핵산 분자의 라세미 혼합물의 분리는 당업계에 공지된 수많은 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 그 예시적인 방법은 광학적으로 활성인 염-형성 유기산인 "카이럴 분리산"을 이용한 분별 재결정을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 분별 재결정화법을 위한 적절한 분리 시약은, 예를 들어, 광학적으로 활성인 산, 예컨대, D 및 L 형태의 타르타르산, 다이아세틸타르타르산, 다이벤조일타르타르산, 만델산, 말산, 락트산 또는 각종 광학적으로 활성인 캄퍼설폰산이다. 라세미 혼합물의 분리는 또한 광학적으로 활성인 분리 시약(예컨대, 다이나이트로벤조일페닐글라이신)으로 채워진 칼럼 상에서의 용리에 의해 수행될 수 있다. 적절한 용리 용매 조성물은 당업자에 의해 결정될 수 있다.
변형된 핵산 분자는 분자의 전체 길이를 따라 균일하게 변형될 필요는 없다. 상이한 핵산 변형 및/또는 골격 구조는 핵산 내 각종 위치에서 존재할 수 있다. 당업자라면, 뉴클레오타이드 유사체 또는 기타 변형(들)은 핵산의 기능이 실질적으로 감소되지 않도록 핵산의 임의의 위치(들)에 위치될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 변형은 또한 5' 또는 3'말단 변형일 수 있다. 핵산은 최소한 하나의 변형된 뉴클레오타이드와 최대 100% 변형된 뉴클레오타이드, 또는 임의의 중간 퍼센트, 예컨대, 적어도 5% 변형된 뉴클레오타이드, 적어도 10% 변형된 뉴클레오타이드, 적어도 25% 변형된 뉴클레오타이드, 적어도 50% 변형된 뉴클레오타이드, 적어도 80% 변형된 뉴클레오타이드 또는 적어도 90% 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 핵산은 유라실 또는 사이토신 등과 같은 변형된 피리미딘을 함유할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 핵산 중 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 100%의 유라실은 변형된 유라실로 대체될 수 있다. 변형된 유라실은 단일의 독특한 구조를 지니는 화합물에 의해 또는 상이한 구조(예컨대, 2, 3, 4 또는 그 이상의 독특한 구조)를 지니는 복수의 화합물에 의해 대체될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 핵산 내 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 100%의 사이토신은 변형된 사이토신으로 대체될 수 있다. 변형된 사이토신은 단일의 독특한 구조를 지니는 화합물에 의해 또는 상이한 구조(예컨대, 2, 3, 4 또는 그 이상의 독특한 구조)를 지니는 복수의 화합물에 의해 대체될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 개시내용의 변형된 mRNA, 여기서는, "mmRNA"의 최단 길이는 다이펩타이드를 암호화하는데 충분할 수 있는 mRNA 서열의 길이일 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, mRNA 서열의 길이는 트라이펩타이드를 암호화하는데 충분할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, mRNA 서열의 길이는 테트라펩타이드를 암호화하는데 충분할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, mRNA 서열의 길이는 펜타펩타이드를 암호화하는데 충분할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, mRNA 서열의 길이는 헥사펩타이드를 암호화하는데 충분할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, mRNA 서열의 길이는헵타펩타이드를 암호화하는데 충분할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, mRNA 서열의 길이는 옥타펩타이드를 암호화하는데 충분할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, mRNA 서열의 길이는 노나펩타이드를 암호화하는데 충분할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, mRNA 서열의 길이는 데카펩타이드를 암호화하는데 충분할 수 있다.
변형된 핵산 분자 서열이 암호화할 수 있는 다이펩타이드의 예로는, 카노신 및 안세린을 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
추가의 실시형태에 있어서, mRNA는 30개 길이의 뉴클레오타이드 길이보다 길 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, RNA 분자는 35개 이상의 길이의 뉴클레오타이드(예컨대, 적어도 또는 약 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,100, 1,200, 1,300, 1,400, 1,500, 1,600, 1,700, 1,800, 1,900, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000 및 5,000개 이상의 뉴클레오타이드)일 수 있다.
변형된 핵산 분자의 예시적인 특성
주된 그루브 상호작용 상대
변형된 핵산 분자, 예컨대, 본 명세서에 기재된 변형된 mRNA(mmRNA)는, 뉴클레오타이드 또는 핵산의 주된 그루브 면과의 상호작용, 예컨대 결합을 통해서 검출되고 RNA 리간드에 반응하는 인지 수용체와의 상호작용을 파괴할 수 있다. 이와 같이, 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 뉴클레오타이드 또는 변형된 핵산 분자를 포함하는 RNA 리간드는 주된 그루브 결합 상대와의 상호작용을 감소시키고, 따라서 선천적 면역 반응 또는 발현과 염증전 사이토카인의 분비 혹은 양쪽 모두를 감소시킨다.
예시적인 주된 그루브 상호작용, 예컨대 결합 상대로는, 이하의 뉴클레아제 및 헬리카제를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 멤브레인(즉, 막) 내에서, TLR(Toll-like Receptor) 3, 7 및 8은 단일- 및 이중-가닥 RNA에 반응할 수 있다. 세포질 내에서, DEX(D/H) 헬리카제 및 ATP효소(ATPase)의 서브패밀리 2 부류의 구성원은 항바이러스 반응을 개시시키는 센스 RNA일 수 있다. 이들 헬리카제는 RIG-I(retinoic acid-inducible gene I) 및 MDA5(melanoma differentiation-associated gene 5)를 포함한다. 기타 예로는 LGP2(laboratory of genetics and p)hysiology 2), HIN-200 도메인 함유 단백질 또는 헬리카제-도메인 함유 단백질을 포함한다.
변형된 핵산 분자를 이용한 선천성 세포 면역 반응 활성화의 방지 혹은 저감.
변형된 핵산 분자, 예컨대, 본 명세서에 기재된 mmRNA는 세포 내 선천적 면역 반응을 감소시킨다. "선천적 면역 반응"(innate immune response)이란 용어는, 일반적으로 바이러스 혹은 박테리아 기원의 단일 가닥 핵산을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 외인성 핵산에 대한 세포 반응을 포함하며, 이는 사이토카인 발현 및 방출, 특히 인터페론, 및 세포 사멸의 유도를 수반한다. 단백질 합성은 또한 선천성 세포 면역 반응 동안 저감될 수도 있다. 세포 내 선천적 면역 반응을 제거하는 것이 유리하지만, 본 발명의 개시내용은, 인터페론 신호 전달을 비롯한 면역 반응을 실질적으로 저감시키는 변형된 변형된 mRNA를, 이러한 반응을 전체적으로 제거하는 일 없이, 제공한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 면역 반응은 대응하는 비변형 핵산 분자에 의해 유도된 면역 반응에 비해서 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 99.9%, 또는 99.9% 이상만큼 저감될 수 있다. 이러한 저감은 톨-유사 수용체(예컨대, TLR7 및 TLR8) 등과 같은 인터페론-조절제의 발현 또는 유형 1 인터페론의 발현 혹은 활성 수준에 의해 측정될 수 있다. 선천적 면역 반응의 저감은 또한 세포 집단에 변형된 RNA의 1회 이상의 투여 후 감소된 세포 사멸에 의해 측정될 수 있고; 예컨대, 세포 사멸은 대응하는 비변형 핵산 분자에 의해 관찰된 세포 사멸 빈도보다 10%, 25%, 50%, 75%, 85%, 90%, 95% 혹은 95% 이상 낮다. 게다가, 세포 사멸은 변형된 핵산 분자와 접촉된 세포보다 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1%, 0.1%, 0.01% 낮게 또는 0.01% 미만으로 영향을 미칠 수 있다.
본 발명의 개시내용은, 예컨대, 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 표적 세포 집단 내로 변형된 핵산 분자의 반복된 도입(예컨대, 형질주입)을 제공한다. 세포 집단을 접촉시키는 단계는 1회 이상(예컨대, 2회, 3회, 4회, 5회 혹은 5회보다 많이) 반복될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 세포 집단을 변형된 핵산 분자와 접촉시키는 단계는 세포 집단에서 미리 결정된 효율의 단백질 번역이 달성되도록 충분한 횟수 반독될 수 있다. 핵산 변형에 의한 표적 세포 집단의 저감된 세포독성의 부여, 예컨대, 반복된 형질주입은 각종 세포 유형에서 달성가능하다.
본 명세서에 교시된 변형의 조합을 비롯하여, 본 발명의 변형된 핵산은 치료 양식으로 이들을 더욱 적절하게 만드는 우수한 특성을 지닐 수 있다.
당업계에서의 "전부 혹은 전무"(all or none)는 변형된 mRNA의 치료 효과와 연관된 생물학적 현상을 기술하는데 몹시 불충분한 것으로 결정된 바 있다. 본 발명자들은, 단백질 생산을 향상시키기 위하여, 작업자가 특정 변형된 mRNA의 효능 및 유해 프로파일을 결정하는 1종보다 많은 사이토키인 혹은 측정기준의 속성, 또는 변형, 변형 퍼센트 및 조사를 고려할 수 있다고 결정하였다.
본 발명의 일 양상에 있어서, 비변형된 것에 비해서 변형된 mRNA의 유효성을 결정하는 방법은, 발현이 본 발명의 외인성 핵산의 투여에 의해 촉발되는 1종 이상의 사이토카인의 측정 및 분석을 수반한다. 이들 값은 비변형 핵산의 투여와 비교되거나, 또는 사이토카인 반응, 폴리IC, R-848 또는 표준 당업계에 공지된 기타의 것들 등과 같은 표준 측정기준(standard metric)과 비교된다.
본 명세서에서 개발된 표준 측정기준의 일례는, 변형된 핵산의 투여 혹은 해당 핵산과의 접촉의 결과로서 세포, 조직 혹은 유기체에서 촉발되는 사이토카인의(또는 패널의) 1종 이상의 수준 혹은 양에 대한 세포, 조직 혹은 유기체에서 생산되는 암호화된 폴리펩타이드(단백질)의 수준 혹은 양의 비의 계측치이다. 이러한 비는 본 명세서에서는 단백질:사이토카인 비 또는 "PC" 비라 지칭한다. PC 비가 높을수록, 변형된 핵산(측정된 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)가 더 효과적으로 된다. 본 발명의 사이토카인에 의한 바람직한 PC 비는 1 이상, 10 이상, 100 이상, 1000 이상, 10,000 이상일 수 있다. 상이한 혹은 비변형 작제물의 변형된 핵산보다 높은 PC 비를 가진 변형된 핵산이 바람직하다.
PC 비는 폴리뉴클레오타이드에 존재하는 변형 퍼센트에 의해 더 정량화될 수 있다. 예를 들어, 100% 변형된 핵산에 대해 정규화된, 사이토카인(또는 유해)의 함수로서의 단백질 생산 또는 사이토카인 프로파일이 결정될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명은, 변형된 핵산(폴리뉴클레오타이드)의 PC 비와 비교함으로써 화학, 사이토카인 혹은 변형 퍼센트에 걸친, 임의의 특정 변형된 폴리뉴클레오타이드의 상대 효능을 결정하는 방법을 제공한다.
면역 반응의 활성화: 백신
본 발명의 일 실시형태에 있어서, mRNA 분자는 유기체 내 면역 반응을 유발하거나 불러일으키는데 이용될 수 있다. 전달될 mRNA 분자는 면역원성 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화할 수 있고 1개 이상의 이러한 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다.
부가적으로, 소정의 변형된 뉴클레오사이드, 또는 그의 조합은, 본 발명의 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA 내로 조입될 경우, 선천적 면역 반응을 활성화시킬 것이다. 이러한 활성화 분자는 폴리펩타이드 및/또는 기타 백신과 조합될 경우 애주번트로서 유용하다. 소정의 실시형태에 있어서, 활성화 분자는 백신으로서 유용한 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 번역가능한 영역을 포함하므로, 자체-애주번트로 되는 능력을 제공한다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA는 면역원을 암호화할 수 있다. 면역원을 암호화하는 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA의 전달은 면역 반응을 활성화시킬 수 있다. 비제한적인 예로서, 면역원을 암호화하는 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA는 다수의 선천성 반응 경로를 기동시키기 위하여 세포에 전달될 수 있다(국제 특허 공개 제 WO2012006377호, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 다른 비제한적인 예로서, 면역원을 암호화하는 본 발명의 변형된 핵산 분자 및 mmRNA는 가축에게 면역원성을 부여하도록 충분한 대량 용량으로 가축에게 전달될 수 있다(국제 특허 공개 제WO2012006372호 및 제WO2012006369호 참조; 이들의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
본 발명의 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는 백신용의 폴리펩타이드 서열을 암호화할 수 있고, 저해제를 더 포함할 수 있다. 저해제는 항원 제시를 손상시키고/시키거나 당업계에 공지된 각종 경로를 저해할 수 있다. 비제한적인 예로서, 본 발명의 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA는 항원 제시를 손상시킬 수 있는 저해제와 조합하여 백신을 위하여 이용될 수 있다(국제 특허 공개 제WO2012089225호 및 제WO2012089338호 참조, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA는 자가-복제 RNA일 수 있다. 자가-복제 RNA 분자는 RNA 전달의 효율 및 밀폐된 유전자 산물의 발현을 증대시킬 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는 본 명세서에 기재된 및/또는 당업계에 공지된 적어도 하나의 변형을 포함할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 자가-복제 RNA는 자가-복제 RNA가 감염성 바이러스 입자의 생산을 유도하지 않도록 설계될 수 있다. 비제한적인 예로서, 자가-복제 RNA는 미국 특허 공개 제US20110300205호 및 국제 특허 공개 제WO2011005799호에 개시된 방법에 의해 설계될 수 있으며, 이들의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 자가-복제 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는 면역 반응을 일으킬 수 있는 단백질을 암호화할 수 있다. 비제한적인 예로서, 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA는 적어도 하나의 항원을 암호화할 수 있는 자가-복제 mRNA일 수 있다(미국 특허 공개 제US20110300205호 및 국제 특허 공개 제WO2011005799호 참조, 이들의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 자가-복제 변형된 핵산 또는 mmRNA는 본 명세서에 기재되거나 당업계에 공지된 방법을 이용해서 제형화될 수 있다. 비제한적인 예로서, 자가-복제 RNA는 Geall 등(Nonviral delivery of self-amplifying RNA vaccines, PNAS 2012; PMID: 22908294; 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함됨)에 기재된 방법에 의해 전달을 위하여 제형화될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는 양친매성 및/또는 면역원성 양친매성 펩타이드를 암호화할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA의 제형은 양친매성 및/또는 면역원성 양친매성 펩타이드를 더 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 양친매성 및/또는 면역원성 양친매성 펩타이드를 포함하는 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는 미국 공개 제 US20110250237호 및 국제 특허 공개 제WO2010009277호 및 제WO2010009065호에 개시된 바와 같이 제형화될 수 있고, 이들의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 변형된 핵산 분자 및 mmRNA는 면역자극성일 수 있다. 비제한적인 예로서, 변형된 핵산 분자 및 mmRNA는 양성-센스 혹은 음성-센스 가닥 RNA 바이러스 게놈의 일부 혹은 전부를 암호화할 수 있다(국제 특허 공개 제WO2012092569호 및 미국 특허 공개 제US20120177701호 참조, 이들의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 다른 비제한적인 예에서, 본 발명의 면역자극성 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는 본 명세서에 기재된 바와 같은 및/또는 당업계에 공지된 투여용의 부형제와 함께 제형화될 수 있다(국제 특허 공개 제WO2012068295호 및 미국 특허 공개 제US20120213812호 참조, 이들의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
일 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 제형화된 백신의 반응은 치료 효과를 유도하기 위하여 각종 화합물의 첨가에 의해 증대될 수 있다. 비제한적인 예로서, 백신 제형은 MHC II 결합 펩타이드 또는 MHC II 결합 펩타이드와 유사한 서열을 지니는 펩타이드를 포함할 수 있다(국제 특허 공개 제WO2012027365호, 제WO2011031298호 및 미국 특허 공개 제US20120070493호, 제US20110110965호 참조, 이들의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 다른 예로서, 백신 제형은 대상체 내에서 니코틴 잔기에 항체 반응을 발생시킬 수 있는 변형된 니코틴 화합물을 포함할 수 있다(국제 특허 공개 제WO2012061717호 및 미국 특허 공개 제US20120114677호 참조, 이들의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
폴리펩타이드 변이체
변형된 핵산 분자는 기준 폴리펩타이드 서열에 대해서 소정의 동일성(identity)을 지니는 폴리펩타이드, 예컨대, 변이체 폴리펩타이드를 암호화한다. 당업계에서, "동일성"은 또한 2개 이상의 아미노산 잔기의 스트링들 간의 정합부의 개수에 의해 결정되는 바와 같은, 펩타이드들 간의 서열 관련성의 정도를 지칭한다. 당업계에서, "동일성"은 또한 2개 이상의 아미노산 잔기의 스트링들 간의 정합부의 개수에 의해 결정되는 바와 같은, 펩타이드들 간의 서열 관련성의 정도를 지칭한다. 동일성은 특정 수학적 모델 혹은 컴퓨터 프로그램(즉, "알고리즘")에 의해 다루어지는 갭 얼라인먼트(gap alignment)(만약 있다면)를 지니는 2개 이상의 서열 중 보다 작은 것 간의 동일한 정합부의 퍼센트를 측정한다. 이러한 방법은 문헌들[Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; 및 Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988)]에 기재된 것들을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니며, 이들 문헌은 모두 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 폴리펩타이드 변이체는 기준 폴리펩타이드와 동일 혹은 유사한 활성을 지닐 수 있다. 대안적으로, 변이체는 기준 폴리펩타이드에 관하여 변경된 (예컨대, 증가되거나 혹은 감소된) 활성을 지닐 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 개시내용의 특정 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 변이체는, 본 명세서에 기재되고 당업자에게 공지된 서열 얼라인먼트 프로그램 및 파라미터에 의해 결정되는 바와 같은, 특정 기준 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 서열 동일성에 대해서 적어도 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 지닐 것이다.
당업자가 인식하고 있는 바와 같이, 단백질 단편, 기능적 단백질 도메인 및 상동 단백질은 또한 본 발명의 개시내용의 범주 내인 것으로 간주된다. 예를 들어, 본 명세서에서는, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 100개 초과의 아미노산 길이를 지니는, 기준 단백질(기준 폴리펩타이드 서열보다 짧지만 동일한 적어도 하나의 아미노산 잔기인 폴리펩타이드 서열을 의미함)의 임의의 단백질 단편이 제공된다. 다른 예에서, 본 명세서에 기재된 서열들의 어느 하나와 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 또는 약 100% 동일한 약 20, 약 30, 약 40, 약 50 또는 약 100개의 아미노산의 연신부를 포함하는 임의의 단백질이 본 발명의 개시내용에 따라서 이용될 수 있다. 소정의 실시형태에 있어서, 본 발명의 개시내용에 따라서 이용될 단백질 서열은 본 명세서에서 제공되거나 인용되는 서열들 의 어느 하나로 표시된 바와 같은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 돌연변이를 포함한다.
폴리펩타이드-핵산 복합체
적절한 단백질 번역은 mRNA와 연관된 많은 폴리펩타이드와 핵산의 물리적 응집을 수반한다. 본 발명의 개시내용에 의하면, 1개 이상의 뉴클레오사이드 변형(예컨대, 적어도 2개의 상이한 뉴클레오사이드 변형)과 mRNA에 결합된 1개 이상의 폴리펩타이드를 함유하는, 단백질-핵산 복합체가 제공된다. 일반적으로, 단백질은 복합체가 도입되는 세포의 선천적 면역 반응을 방지하거나 저감시키는데 유효한 양으로 제공된다.
번역불가능한 변형된 핵산 분자
본 명세서에 기재된 바와 같이, 실질적으로 번역가능하지 않은 서열을 지니는 mRNA가 제공된다. 이러한 mRNA는 대상체에 투여될 경우 백식으로서 유효할 수 있다. 백신이 투여된 대상체는 포유류, 더 바람직하게는 인간 그리고 가장 바람직하게는 환자일 수 있는 것이 더 제공된다.
또 하나 이상의 비암호화 영역을 포함하는 변형된 핵산 분자가 제공된다. 이러한 변형된 핵산 분자는 리보솜 단백질 또는 운반 RNA(tRNA) 등과 같은 하나 이상의 번역적 기계 성분에 결합하여 이를 봉쇄할 수 있지만 일반적으로 번역되지 않으며, 따라서 세포 내 단백질 발현을 효과적으로 저감시킨다. 변형된 핵산 분자는 소인 RNA(small nucleolar RNA: sno-RNA), 마이크로 RNA(miRNA), 소간섭 RNA(siRNA) 또는 피위-상호작용 RNA(Piwi-interacting RNA: piRNA)를 함유할 수 있다.
약제학적 조성물
제형, 투여, 전달 및 용량
본 발명은 1종 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제와 조합하여 변형된 핵산 및 mmRNA 조성물 그리고 복합체를 제공한다. 약제학적 조성물은 1종 이상의 추가의 활성 물질, 예컨대, 치료적 및/또는 예방적 활성 물질을 선택적으로 포함할 수 있다. 제형 및/또는 약제학적 제제의 제조에 있어서의 일반적인 고려사항은, 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005](그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함됨)에서 찾을 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 조성물은 인간, 인간 환자 또는 대상체에게 투여된다. 본 발명의 개시내용의 목적을 위하여, "활성 성분"이라는 어구는, 일반적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 전달될 변형된 핵산 및 mmRNA를 지칭한다.
본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물의 설명은 원칙적으로 인간에게 투여하기에 적절한 약제학적 조성물에 관한 것이지만, 이러한 조성물은 임의의 다른 동물, 예컨대, 인간이 아닌 동물, 예컨대 비-인간 포유류에게 투여하기에 일반적으로 적절하다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 각종 동물에게 투여하기에 적절한 조성물을 부여하기 위하여 인간에게 투여하기에 적절한 약제학적 조성물의 변형은 잘 이해되며, 통상의 기술을 지닌 수의학 약리학자는 이러한 변형을, 만약 있다면, 단순한 통상의 실험으로 설계 및/또는 수행할 수 있다. 약제학적 조성물의 투여가 상정되는 대상체는, 인간 및/또는 기타 영장류; 소, 돼지, 말, 양, 고양이, 개, 마우스 및/또는 래트 등과 같은 상업적으로 관련된 포유류를 포함하는 포유류; 및/또는 가금류, 닭, 오리, 거위 및/또는 칠면조 등과 같은 상업적으로 관련 조류를 포함하는 조류를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에 기재된 약제학적 조성물의 제형은 공지되거나 그 후 약리학 분야에서 개발된 어떠한 방법에 의해서도 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 준비방법은, 부형제 및/또는 1종 이상의 기타 보조 성분과 활성 성분을 회합시키는 단계, 그리고, 이어서, 필요하다면 및/또는 요망된다면, 생성물을 목적으로 하는 단일- 혹은 다회-용량 단위로 분할, 정형화 및/또는 포장하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은, 벌크로, 단일의 단위 용량으로서, 및/또는 복수의 단일의 단위 용량으로 제조, 포장 및/또는 판매될 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "단위 용량"은 미리 결정된 양의 활성 성분을 포함하는 별개의 양의 약제학적 조성물이다. 활성 성분의 양은, 일반적으로, 대상체에게 투여될 활성 성분의 용량과 같고/같거나, 예를 들어, 이러한 용량의 1/2 혹은 1/3 등과 같은 이러한 용량의 편리한 분획이다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물 중의 활성 성분, 약제학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 임의의 추가 성분의 상대적인 양은, 동일성, 크기 및/또는 치료대상체의 상태에 따라서, 또한 조성물이 투여되는 경로에 따라서 다양할 것이다. 예로서, 조성물은, 0.1% 내지 100%, 예컨대, 5 내지 50%, 1-30%, 5-80%, 적어도 80%(w/w)의 활성 성분을 포함할 수 있다.
제형
본 발명의 변형된 핵산 및 mmRNA는, (1) 안정성을 증가; (2) 세포 형질주입을 증가; (3) (예컨대, 변형된 핵산 혹은 mmRNA의 데포 제형으로부터의) 서방출 혹은 지연된 방출을 허용; (4) 생물분류를 변경(예컨대, 특정 조직 혹은 세포 유형에 대해서 변형된 핵산 혹은 mmRNA를 표적화); (5) 생체내 암호화된 단백질의 번역을 증가; 및/또는 (6) 생체내 암호화된 단백질의 방출 프로파일을 변경하기 위하여, 1종 이상의 부형제를 이용해서 제형화될 수 있다. 임의의 그리고 모든 용매 등과 같은 전통적인 부형제에 부가해서, 본 발명의 분산 매체, 희석제, 혹은 기타 액체 비히클, 분산 혹은 현탁액 조제, 표면 활성제, 등장제, 증점 혹은 유화제, 방부제, 부형제는, 제한 없이, 리피도이드, 리포솜, 지질 나노입자, 중합체, 리포플렉스, 코어-쉘 나노입자(core-shell nanoparticle), 펩타이드, 단백질, (예컨대, 대상체 내로의 이식을 위하여) 변형된 핵산 혹은 mmRNA로 형질주입된 세포, 히알루로니다제, 나노입자 모방체 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 제형은, 1종 이상의 부형제를, 함께, 변형된 핵산 또는 mmRNA의 안정성을 증가, 변형된 핵산 또는 mmRNA에 의한 세포 형질주입을 증가, 변형된 핵산 또는 mmRNA 암호화된 단백질에 의한 발현을 증가 및/또는 변형된 핵산 또는 mmRNA 암호화된 단백질의 방출 프로파일을 변경시키는 양으로 각각 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 변형된 핵산 및 mmRNA는 자체-조립된 핵산 나노입자를 이용해서 제형화될 수 있다.
본 명세서에 기재된 약제학적 조성물의 제형은 공지되거나 그 후 약리학 분야에서 개발된 어떠한 방법에 의해서도 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 준비방법은 부형제 및/또는 1종 이상의 보조 성분과 활성 성분을 회합시키는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 벌크로, 단일의 단위 용량으로서, 및/또는 복수의 단일의 단위 용량으로 제조, 포장 및/또는 판매될 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "단위 용량"은 미리 결정된 양의 활성 성분을 포함하는 별개의 양의 약제학적 조성물이다. 활성 성분의 양은, 일반적으로, 대상체에게 투여될 활성 성분의 용량과 같고/같거나, 예를 들어, 이러한 용량의 1/2 혹은 1/3 등과 같은 이러한 용량의 편리한 분획이다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물 중의 활성 성분, 약제학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 임의의 추가 성분의 상대적인 양은, 동일성, 크기 및/또는 치료대상체의 상태에 따라서, 또한 조성물이 투여되는 경로에 따라서 다양할 것이다. 예를 들어, 조성물은 활성 성분을 0.1% 내지 99% (w/w) 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 변형된 mRNA 제형은 적어도 하나의 변형된 mRNA를 함유할 수 있다. 제형은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 변형된 mRNA를 함유할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 제형은 적어도 3개의 변형된 mRNA 암호화 단백질을 함유한다. 일 실시형태에 있어서, 제형은 적어도 5개의 변형된 mRNA 암호화 단백질을 함유한다.
약제학적 제형은, 부가적으로, 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 목적으로 하는 특정 투약 형태에 적합한, 임의의 모든 용매, 분산 매체, 희석제 또는 액체 비히클, 분산 혹은 현탁 조제, 표면 활성제, 등장제, 증점 혹은 유화제, 방부제 등을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아닌 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물을 조제하는 각종 부형제 및 해당 조성물을 제조하는 수법은 당업계에 공지되어 있다(문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006] 참조; 이들 문헌은 모두 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 종래의 부형제 매질의 이용은, 임의의 종래의 부형제 매질이 약제학적 조성물의 임의의 기타 성분(들)에 의해 유해한 방식으로 상호작용하거나 또는 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과는 내는 등과 같이, 물질 혹은 그의 유도체와 공존할 수 없는 경우를 제외하고, 본 발명의 개시내용의 범위 내인 것으로 간주될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 지질 나노입자의 입자 크기는 증가 및/또는 감소될 수 있다. 입사 크기의 변화는, 염증 등(이것으로 제한되는 것은 아님)과 같은 상대 생물학적 반응을 도울 수 있거나, 또는 포유류에 전달된 변형된 mRNA의 생물학적 효과를 증가시킬 수 있다.
약제학적 조성물의 제조에서 이용되는 약제학적으로 허용가능한 부형제는, 비활성 희석제, 표면 활성제 및/또는 유화제, 방부제, 완충제, 윤활제 및/또는 오일을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 이러한 부형제는 선택적으로 본 발명의 약제학적 제형에 포함될 수 있다.
리피도이드
리피도이드의 합성은 광범위하게 기술되어 있고, 이들 화합물을 함유하는 제형은 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA의 전달에 특히 적합하다(문헌[Mahon et al., Bioconjug Chem. 2010 21:1448-1454; Schroeder et al., J Intern Med. 2010 267:9-21; Akinc et al., Nat Biotechnol. 2008 26:561-569; Love et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 107:1864-1869; Siegwart et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 108:12996-3001] 참조; 이들 문헌은 모두 그들의 전문이 본 명세서에 포함된다).
이들 리피도이드는 설치류 및 비-인간 영장류에서 이중 가닥 소간섭 RNA 분자를 유효하게 전달하는데 이용된 한편(문헌[Akinc et al., Nat Biotechnol. 2008 26:561-569; Frank-Kamenetsky et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 105:11915-11920; Akinc et al., Mol Ther. 2009 17:872-879; Love et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 107:1864-1869; Leuschner et al., Nat Biotechnol. 2011 29:1005-1010] 참조; 이들 문헌은 모두 그들의 전문이 본 명세서에 포함됨), 본 발명의 개시내용은 그들의 제형, 그리고 단일 가닥의 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA를 전달함에 있어서의 용도를 기술한다. 복합체, 마이셀, 리포솜 혹은 입자는 이들 리피도이드를 함유하여 제조될 수 있고, 따라서, 국재화된 및/또는 전신 경로의 투여를 통한 리피도이드 제형의 주사 후, 암호화된 단백질의 생산에 의해 판단되는 바와 같이, 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA의 유효한 전달을 가져올 수 있다. 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA의 리피도이드 복합체는 정맥내, 근육내 또는 피하 경로를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 각종 수단에 의해 투여될 수 있다.
핵산의 생체내 전달은, 제형 조성물, 입자 페길화(PEGylation)의 속성, 장입 정도, 올리고뉴클레오타이드 대 지질비, 그리고 입자 크기 등(이것으로 제한되는 것은 아님)과 같은 생물물리학적 파라미터를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 많은 파라미터에 의해 영향받을 수 있다(Akinc et al., Mol Ther. 2009 17: 872-879] 참조; 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 일례로서, 폴리(에틸렌 글라이콜)(PEG) 지질의 앵커 사슬길이의 작은 변화는 생체내 효능에 상당한 효과를 초래할 수 있다. 펜타[3-(1-라우릴아미노프로피오닐)]-트라이에틸렌테트라민 하이드로클로라이드(TETA-5LAP; 98N12-5라고도 지칭됨, 문헌[Murugaiah et al., Analytical Biochemistry, 401:61 (2010)] 참조; 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함됨), C12-200(유도체 및 변이체를 포함함) 및 MD1을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 상이한 리피도이드를 지닌 제형은, 생체내 활성을 위하여 테스트될 수 있다.
본 명세서에서 "98N12-5"라고 지칭되는 리피도이드는 문헌[Akinc et al., Mol Ther. 2009 17:872-879]에 개시되어 있고, 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다(도 1 참조).
본 명세서에서 "C12-200"이라고 지칭되는 리피도이드는 문헌[Love et al., Proc Natl Acad Sci U S A.2010 107:1864-1869 및 Liu and Huang, Molecular Therapy. 2010 669-670(도 1 참조)]에 의해 개시되어 있으며, 이들 둘 모두 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. 리피도이드 제형은 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA에 부가해서 3 혹은 4 또는 그 이상의 성분을 포함하는 입자를 포함할 수 있다. 일례로서, 소정의 리피도이드를 지니는 제형은, 98N12-5를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니며, 42% 리피도이드, 48% 콜레스테롤 및 10% PEG (C14 알킬 사슬 길이)를 함유할 수 있다. 다른 예로서, 소정의 리피도이드를 지니는 제형은, C12-200을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니며, 50% 리피도이드, 10% 다이스테로일포스파티딜 콜린, 38.5% 콜레스테롤 및 1.5% PEG-DMG를 함유할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 전신 정맥내 투여용의 리피도이드로 제형화된 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는 간을 표적화할 수 있다. 예를 들어, 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA를 이용하고 또한 42% 98N12-5, 48% 콜레스테롤, 및 10% PEG-지질의 지질 몰농도 조성물을 포함하며, 약 7.5 대 1의 최종 중량비의 총 지질 대 변형된 핵산 혹은 mmRNA, 그리고 PEG 지질 상에 C14 알킬 사슬 길이를 지니고, 대체로 50 내지 60㎚의 평균 입자 크기를 지니는, 최종의 최적화된 정맥내 제형은, 간에 대해서 해당 제형의 분포가 90% 이상이 되도록 할 수 있다(문헌[Akinc et al., Mol Ther. 2009 17:872-879] 참조; 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 다른 예에서, C12-200(미국 가특허 출원 제61/175,770호 및 국제 특허 공개 제WO2010129709호 참조, 이들의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함됨) 리피도이드를 이용하는 정맥내 제형은 50/10/38.5/1.5 몰비의 C12-200/다이스테로일포스파티딜 콜린/콜레스테롤/PEG-DMG를 지니고, 또 7 대 1의 중량비의 총 지질 대 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA를 지닐 수 있으며, 80㎚의 평균 입자 크기는 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA를 간세포에 전달하는데 효과적일 수 있다(문헌[Love et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 107:1864-1869] 참조, 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 다른 실시형태에 있어서, MD1 리피도이드-함유 제형은 생체내에서 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA를 간세포에 효과적으로 전달하는데 이용될 수 있다. 근육내 혹은 피하 경로용의 최적화된 리피도이드 제형의 특징은 세포외 매트릭스를 통해서 혈류 내로 확산시키는 제형의 능력 및 표적 세포 유형에 상당히 좌우되어 변화될 수 있다. 150㎚ 미만의 입자 크기는 내피창(endothelial fenestrae)의 크기로 인해 간세포 전달에 효과적인 것으로 바람직할 수 있지만(문헌[Akinc et al., Mol Ther. 2009 17:872-879], 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함됨), 내피세포, 골수 세포 및 근육 세포를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 기타 세포 유형으로 제형을 전달하기 위하여 리피도이드-제형화된 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA를 사용하는 것은 마찬가지로 크기-제한될 수 없다. 골수 세포 및 내피 등과 같은 기타 비-간세포에 siRNA를 생체내에 전달하기 위하여 리피도이드 제형을 사용하는 것은 보고되어 있었다(문헌[Akinc et al., Nat Biotechnol. 2008 26:561-569; Leuschner et al., Nat Biotechnol. 2011 29:1005-1010; Cho et al. Adv. Funct. Mater. 2009 19:3112-3118; 8th International Judah Folkman Conference, Cambridge, MA October 8-9, 2010] 참조, 이들의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 단핵구, 리피도이드 제형 등과 같은, 골수 세포로의 효과적인 전달은 유사한 성분 몰비를 지닐 수 있다. 리피도이드와, 다이스테로일포스파티딜 콜린, 콜레스테롤 및 PEG-DMG를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아닌 기타 성분의 상이한 비는, 간세포, 골수 세포, 근육 세포 등을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아닌 상이한 세포 유형에 전달하기 위한 변형된 핵산 또는 mmRNA의 제형을 최적화하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 성분 몰비는 50% C12-200, 10% 다이스테로일포스파티딜 콜린, 38.5% 콜레스테롤 및 1.5% PEG-DMG를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다(문헌[Leuschner et al., Nat Biotechnol 2011 29:1005-1010] 참조; 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 피하 혹은 근육내 전달을 통한 핵산의 세포(지방 세포 및 근육 세포 등(이들로 제한되는 것은 아님))로의 국재화된 전달을 위해 리피도이드 제형을 이용하는 것은, 전신 전달을 위해 바람직한 제형 성분의 모두를 요구할 수는 없고, 따라서 단지 리피도이드와 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA만을 포함할 수 있다.
상이한 리피도이드들의 조합은, 리피도이드가 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA에 의한 세포 형질주입을 증가시키고/시키거나; 암호화된 단백질의 번역을 증가시킬 수 있으므로 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA 지향된 단백질 생산의 효능을 향상시키는데 이용될 수 있다(문헌[Whitehead et al., Mol. Ther. 2011, 19:1688-1694] 참조, 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
리포솜, 리포플렉스 및 지질 나노입자
본 발명의 변형된 핵산 분자 및 mmRNA는 하나 이상의 리포솜, 리포플렉스 또는 지질 나노입자를 이용해서 제형화될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA의 약제학적 조성물은 리포솜을 포함한다. 리포솜은 지질 이중층으로 주로 구성될 수 있고 영양분 및 약제학적 제형의 투여를 위한 전달 비히클로서 이용될 수 있는 인공적으로-제작된 소포이다. 리포솜은, 직경이 수백 나노미터일 수 있고 좁은 수성 구획에 의해 분리된 일련의 동심형상의 이중층을 함유할 수 있는 다중층 소포(multilamellar vesicle: MLV), 직경이 50㎚ 미만일 수 있는 소형 단세포 소포(small unicellular vesicle: SUV), 및 직경이 50 내지 500㎚일 수 있는 대형 단세포 소포(large unilamellar vesicle: LUV) 등(이들로 제한되지 않음)과 같이 상이한 크기일 수 있다. 리포솜 설계는 리포솜의 건강하지 못한 조직으로의 부착을 향상시키거나 또는 엔도시토시스(endocytosis) 등(이것으로 제한되는 것은 아님)과 같은 이벤트를 활성화시키기 위하여 옵소닌 또는 리간드를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 리포솜은 약제학적 제형의 전달을 개선시키기 위하여 낮은 혹은 높은 pH를 수용할 수 있다.
리포솜의 형성은, 포획된 약제학적 제형 및 리포솜 성분, 지질 소포가 확산되는 매질의 속성, 포획된 물질의 유효 농도 및 그의 전위 독성, 소포의 용도 및/또는 전달 동안 수반되는 임의의 부가적인 공정, 의도된 용도를 위한 소포의 최적화 크기, 다분산 및 저장수명, 그리고 안전하고 효과적인 리포솜 제품의 대규모 생산의 배취-대-배취 재현성(batch-to-batch reproducibility) 및 가능성 등(이들로 제한되지 않음)과 같은 물리화학적 특징에 좌우될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은, 제한 없이, 1,2-다이올레일옥시-N,N-다이메틸아미노프로판(DODMA) 리포솜, 마리나 바이오테크사(Marina Biotech)(워싱틴주의 보델시에 소재)로부터의 DiLa2 리포솜, 1,2-다이리놀레일옥시-3-다이메틸아미노프로판(DLin-DMA), 2,2-다이리놀레일-4-(2-다이메틸아미노에틸)-[1,3]-다이옥솔란(DLin-KC2-DMA) 및 MC3(US20100324120; 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함됨), 그리고 얀센 바이오테크사(Janssen Biotech, Inc.)(펜실베니아주의 호르섬시에 소재)로부터의 독실(DOXIL)® 등(이것으로 제한되지 않음) 과 같은 소분자 약물을 전달 수 있는 리포솜으로부터 형성된 것들과 같은 리포솜을 포함할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은, 제한 없이, 시험관내 및 생체내에서 올리고뉴클레오타이드 전달에 적절한 것으로 제시되고 앞서 기술된 안정화된 플라스미드-지질 입자(SPLP) 또는 안정화된 핵산 지질 입자(SNALP)의 합성으로부터 형성된 것들 등과 같은 리포솜을 포함할 수 있다(문헌[Wheeler et al. Gene Therapy. 1999 6:271-281; Zhang et al. Gene Therapy. 1999 6:1438-1447; Jeffs et al. Pharm Res. 2005 22:362-372; Morrissey et al., Nat Biotechnol. 2005 2:1002-1007; Zimmermann et al., Nature. 2006 441:111-114; Heyes et al. J Contr Rel. 2005 107:276-287; Semple et al. Nature Biotech. 2010 28:172-176; Judge et al. J Clin Invest. 2009 119:661-673; deFougerolles Hum Gene Ther. 2008 19:125-132] 참조; 이들 문헌은 모두 그들의 전문이 본 명세서에 포함된다). Wheeler 등에 의한 본래의 제조 방법은, Jeffs 등이 나중에 개선시킨 세제 투석법이었으며, 이는 자발적 소포 형성 방법이라고 지칭된다. 리포솜 제형은 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA에 부가해서 3 내지 4가지 지질 성분으로 구성된다. 일례로서, 리포솜은, Jeffs 등이 기재한, 55% 콜레스테롤, 20% 다이스테로일포스파티딜 콜린(DSPC), 10% PEG-S-DSG 및 15% 1,2-다이올레일옥시-N,N-다이메틸아미노프로판(DODMA)을 함유할 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 다른 예로서, 소정의 리포솜 제형은, Heyes 등이 기재한, 48% 콜레스테롤, 20% DSPC, 2% PEG-c-DMA 및 30% 양이온성 지질을 함유할 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니며, 여기서 양이온성 지질은 2,1-다이스테알록시-N,N-다이메틸아미노프로판(DSDMA), DODMA, DLin-DMA 또는 1,2-다이리놀레닐옥시-3-다이메틸아미노프로판(DLenDMA)일 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 약제학적 조성물은 적어도 하나의 면역원을 암호화할 수 있는 mmRNA를 전달하도록 형성될 수 있는 리포솜을 포함할 수 있다. mmRNA는 리포솜에 의해 봉입될 수 있고/있거나 수성 코어에 함유되고 나서 리포솜에 의해 봉입될 수도 있다(국제 특허 공개 제WO2012031046호, 제WO2012031043호, 제WO2012030901호 및 제WO2012006378호 참조; 이들의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 다른 실시형태에 있어서, 면역원을 암호화할 수 있는 mmRNA는 양이온성 수중유 에멀전으로 제형화될 수 있으며, 여기서 에멀전 입자는 해당 에멀전 입자에 분자를 고정시키는 mmRNA와 상호작용할 수 있는 양이온성 지질과 오일 코어를 포함한다(국제 특허 공개 제WO2012006380호 참조, 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 또 다른 실시형태에 있어서, 지질 제형은 적어도 양이온성 지질, 형질주입을 증대시킬 수 있는 지질 및 지질 모이어티에 연결된 친수성 헤드기를 함유하는 적어도 하나의 지질을 포함할 수 있다(국제 특허 공개 제WO2011076807호 및 미국 특허 공개 제20110200582호, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 다른 실시형태에 있어서, 면역원을 암호화하는 변형된 mRNA는 작용화된 지질 이중층 간에 가교결합을 가질 수 있는 지질 소포로 제형화될 수 있다(미국 특허 공개 제20120177724호 참조, 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
일 실시형태에 있어서, 변형된 mRNA는 작용화된 지질 이중층들 간에 가교결합을 지닐 수 있는 지질 소포 중에 제형화될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 변형된 mRNA는 지질-다가양이온 복합체로 제형화될 수 있다. 지질-다가양이온 복합체의 형성은 당업계에 공지되고/되었거나 미국 특허 공개 제20120178702호에 기재된 바와 같은 방법에 의해 달성될 수 있으며, 이 문헌의 내용은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. 비제한적인 예로서, 다가양이온은 국제 특허 공개 제WO2012013326호에 기재된 폴리라이신, 폴리오르니틴 및/또는 폴리아르기닌 및 양이온성 펩타이드 등(이들로 제한되는 것은 아님)과 같은 양이온성 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 포함할 수 있으며; 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. 다른 실시형태에 있어서, 변형된 mRNA는, 콜레스테롤 또는 다이올레일 포스파티딜에탄올아민(DOPE) 등(이들로 제한되지 않음)과 같은 중성 지질을 더 포함할 수 있는 지질-다가양이온 복합체로 제형화될 수 있다.
리포솜 제형은 양이온성 지질 성분의 선택, 양이온성 지질 포화도, 페길화(PEGylation)의 속성, 모든 성분의 비 및 생물물리학적 파라미터, 예컨대, 크기(이들로 제한되지 않음)에 의해 영향받을 수 있다. Semple 등(Semple et al. Nature Biotech. 2010 28:172-176; 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함됨)에 의한 일례에 있어서, 리포솜 제형은 57.1% 양이온성 지질, 7.1% 다이팔미토일포스파티딜콜린, 34.3% 콜레스테롤 및 1.4% PEG-c-DMA로 구성되어 있었다. 다른 예로서, 양이온성 지질의 조성을 변화시키는 것은, 각종 항원 제시 세포에 siRNA를 더욱 효율적으로 전달할 수 있었다(Basha et al. Mol Ther. 2011 19:2186-2200; 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
몇몇 실시형태에 있어서, 지질 나노입자(LNP) 제형 내 PEG의 비는 증가되거나 감소될 수 있고/있거나, PEG 지질의 탄소 사슬 길이는 LNP 제형의 약동학 및/또는 생물분류를 변경하기 위하여 C14에서 C18까지 변경될 수 있다. 비제한적인 예로서, LNP 제형은, 양이온성 지질, DSPC 및 콜레스테롤과 비교해서 1 내지 5%의 PEG-c-DOMG를 함유할 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, PEG-c-DOMG는, PEG- DSG (1,2-다이스테아로일-sn-글라이세롤, 메톡시폴리에틸렌 글라이콜) 또는 PEG-DPG(1,2-다이팔미토일-sn-글라이세롤, 메톡시폴리에틸렌 글라이콜) 등(이들로 제한되는 것은 아님)과 같은 PEG 지질과 대체될 수 있다. 양이온성 지질은, DLin-MC3-DMA, DLin-DMA, C12-200 및 DLin-KC2-DMA 등(이들로 제한되는 것은 아님)과 같은 당업계에 공지된 임의의 지질로부터 선택될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 양이온성 지질은 국제 특허 공개 제WO2012040184호, 제WO2011153120호, 제WO2011149733호, 제WO2011090965호, 제WO2011043913, WO2011022460호, 제WO2012061259호, 제WO2012054365호, 제WO2012044638호, 제WO2010080724호, 제WO201021865호 및 제WO2008103276호, 미국 특허 제7,893,302호, 제7,404,969호 및 제8,283,333호 및 미국 특허 공개 제US20100036115호 및 제US20120202871호에 기재된 양이온성 지질로부터 선택될 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니며; 이들의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. 다른 실시형태에 있어서, 양이온성 지질은, 국제 특허 공개 제WO2012040184호, 제WO2011153120호, 제WO2011149733호, 제WO2011090965호, 제WO2011043913호, 제WO2011022460호, 제WO2012061259호, 제WO2012054365호 및 제WO2012044638호에 기재된 화학식 A(이것으로 제한되지 않음)로부터 선택될 수 있으며, 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 양이온성 지질은, 국제 특허 공개 제 WO2008103276호의 화학식 CLI-CLXXIX, 미국 특허 제7,893,302호의 화학식 CLI-CLXXIX, 미국 특허 제7,404,969호의 화학식 CLI-CLXXXXII 및 미국 특허 공개 제US20100036115호의 화학식 I-VI으로부터 선택될 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니며; 이들의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. 비제한적인 예로서, 양이온성 지질은 (20Z,23Z)-N,N-다이메틸노나코사-20,23-다이엔-10-아민, (17Z,20Z)-N,N-다이메틸헥사코사-17,20-다이엔-9-아민, (1Z,19Z)-N5N-다이메틸펜타코사-16,19-다이엔-8-아민, (13Z,16Z)-N,N-다이메틸도코사-13,16-다이엔-5-아민, (12Z,15Z)-N,N-다이메틸헨아이코사-12,15-다이엔-4-아민, (14Z,17Z)-N,N-다이메틸트라이코사-14,17-다이엔-6-아민, (15Z,18Z)-N,N-다이메틸테트라코사-15,18-다이엔-7-아민, (18Z,21Z)-N,N-다이메틸헵타코사-18,21-다이엔-10-아민, (15Z,18X)-N,N-다이메틸테트라코사-15,18-다이엔-5-아민, (14Z,17Z)-N,N-다이메틸트라이코사-14,17-다이엔-4-아민, (19Z,22Z)-N,N-다이메틸옥타코사옥타코사-19,22-다이엔-9-아민, (18Z,21Z)-N,N-다이메틸헵타코사-18,21-다이엔-8-아민, (17Z,20Z)-N,N-다이메틸헥사코사-17,20-다이엔-7-아민, (16Z,19Z)-N,N-다이메틸펜타코사-16,19-다이엔-6-아민, (22Z,25Z)-N,N-다이메틸헨트라이아콘타-22,25-다이엔-10-아민, (21Z,24Z)-N,N-다이메틸트라이아콘타-21,24-다이엔-9-아민, (18Z)-N,N-다이메틸헵타코스-18-엔-10-아민, (17Z)-N,N-다이메틸헥사코스-17-엔-9-아민, (19Z,22Z)-N,N-다이메틸옥타코사-19,22-다이엔-7-아민, N,N-다이메틸헵타코산-10-아민, (20Z,23Z)-N-에틸-N-메틸노나코사-20,23-다이엔-10-아민, 1-[(11Z,14Z)-1-노닐아이코사-11,14-다이엔-1-일] 피롤리딘, (20Z)-N,N-다이메틸헵타코스-20-엔-10-아민, (15Z)-N,N-다이메틸 엡타코스-15-엔-l 0-아민, (14Z)-N,N-다이메틸노나코스-14-엔-10-아민, (17Z)-N,N-다이메틸노나코스-17-엔-10-아민, (24Z)-N,N-다이메틸트라이트라이아콘트-24-엔-l0-아민, (20Z)-N,N-다이메틸노나코스-20-엔-10-아민, (22Z)-N,N-다이메틸헨트라이아콘트-22-엔-l0-아민, (16Z)-N,N-다이메틸펜타코스-16-엔-8-아민, (12Z,15Z)-N,N-다이메틸-2-노닐헨아이코사-12,15-다이엔-1-아민, (13Z,16Z)-N,N-다이메틸-3-노닐도코사-13,16-다이엔-1-아민, N,N-다이메틸-1-[(1S,2R)-2-옥틸사이클로프로필]엡타데칸-8-아민, 1-[(1S,2R)-2-헥실사이클로프로필]-N,N-다이메틸노나데칸-10-아민, N,N-다이메틸-1-[(1S,2R)-2-옥틸사이클로프로필]노나데칸-10-아민, N,N-다이메틸-21-[(1S,2R)-2-옥틸사이클로프로필]헨아이코산-l0-아민, N,N-다이메틸-1-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-사이클로프로필]메틸}사이클로프로필]노나데칸-10-아민,N,N-다이메틸-1-[(1S,2R)-2-옥틸사이클로프로필]헥사데칸-8-아민, N,N-다이메틸-[(1R,2S)-2-운데실사이클로프로필]테트라데칸-5-아민, N,N-다이메틸-3-{7-[(1S,2R)-2-옥틸사이클로프로필]헵틸}도데칸-1-아민, 1-[(1R,2S)-2-헵틸사이클로프로필]-N,N-다이메틸옥타데칸-9-아민, 1-[(1S,2R)-2-데실사이클로프로필]-N,N-다이메틸펜타데칸-6-아민, N,N-다이메틸-1-[(lS,2R)-2-옥틸사이클로프로필]펜타데칸-8-아민, R-N,N-다이메틸-1-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일옥시]-3-(옥틸옥시)프로판-2-아민, S-N,N-다이메틸-1-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일옥시]-3-(옥틸옥시)프로판-2-아민, 1-{2-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일옥시]-1-[(옥틸옥시)메틸]에틸}피롤리딘, (2S)-N,N-다이메틸-1-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일옥시]-3-[(5Z)-옥트-5-엔-1-일옥시]프로판-2-아민, 1-{2-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일옥시]-1-[(옥틸옥시)메틸]에틸}아제티딘, (2S)-1-(헥실옥시)-N,N-다이메틸-3-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일옥시]프로판-2-아민, (2S)-1-(헵틸옥시)-N,N-다이메틸-3-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일옥시]프로판-2-아민, N,N-다이메틸-1-(노닐옥시)-3-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일옥시]프로판-2-아민, N,N-다이메틸-1-[(9Z)-옥타데크-9-엔-1-일옥시]-3-(옥틸옥시)프로판-2-아민; (2S)-N,N-다이메틸-1-[(6Z,9Z,12Z)-옥타데카-6,9,12-트라이엔-1-일옥시]-3-(옥틸옥시)프로판-2-아민, (2S)-1-[(11Z,14Z)-아이코사-11,14-다이엔-1-일옥시]-N,N-다이메틸-3-(펜틸옥시)프로판-2-아민, (2S)-1-(헥실옥시)-3-[(11Z,14Z)-아이코사-11,14-다이엔-1-일옥시]-N,N-다이메틸프로판-2-아민, 1-[(11Z,14Z)-아이코사-11,14-다이엔-1-일옥시]-N,N-다이메틸-3-(옥틸옥시)프로판-2-아민, 1-[(13Z,16Z)-도코사-l3,16-다이엔-l-일옥시]-N,N-다이메틸-3-(옥틸옥시)프로판-2-아민, (2S)-1-[(13Z,16Z)-도코사-13,16-다이엔-1-일옥시]-3-(헥실옥시)-N,N-다이메틸프로판-2-아민, (2S)-1-[(13Z)-도코스-13-엔-1-일옥시]-3-(헥실옥시)-N,N-다이메틸프로판-2-아민, 1-[(13Z)-도코스-13-엔-1-일옥시]-N,N-다이메틸-3-(옥틸옥시)프로판-2-아민, 1-[(9Z)-헥사데크-9-엔-1-일옥시]-N,N-다이메틸-3-(옥틸옥시)프로판-2-아민, (2R)-N,N-다이메틸-H(1-메토일옥틸메토일옥틸)옥시]-3-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일옥시]프로판-2-아민, (2R)-1-[(3,7-다이메틸옥틸)옥시]-N,N-다이메틸-3-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일옥시]프로판-2-아민, N,N-다이메틸-1-(옥틸옥시)-3-({8-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-펜틸사이클로프로필]메틸}사이클로프로필]옥틸}옥시)프로판-2-아민, N,N-다이메틸-1-{[8-(2-옥틸사이클로프로필)옥틸]옥시}-3-(옥틸옥시)프로판-2-아민 및 (11E,20Z,23Z)-N,N-다이메틸노나코사-11,20,2-트라이엔-10-아민 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 입체이성질체로부터 선택될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 양이온성 지질은, 당업계에 공지된 및/또는 국제 특허 공개 제제WO2012040184호, 제WO2011153120호, 제WO2011149733호, 제WO2011090965호, 제WO2011043913호, 제WO2011022460호, 제WO2012061259호, 제WO2012054365호, 제WO2012044638호, 제WO2010080724호 및 제WO201021865호에 기재된 바와 같은 방법에 의해 합성될 수 있으며; 이들의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다.
일 실시형태에 있어서, LNP 제형은 3% 지질 몰비로 PEG-c-DOMG를 함유할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, LNP 제형은 1.5% 지질 몰비로 PEG-c-DOMG를 함유할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, LNP 제형은 PEG-DMG 2000(1,2-다이미리스토일-sn-글라이세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글라이콜)-2000)을 함유할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, LNP 제형은 PEG-DMG 2000, 당업계에 공지된 양이온성 지질 및 적어도 하나의 기타 성분을 함유할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, LNP 제형은 PEG-DMG 2000, 당업계에 공지된 양이온성 지질, DSPC 및 콜레스테롤을 함유할 수 있다. 비제한적인 예로서, LNP 제형은 PEG-DMG 2000, DLin-DMA, DSPC 및 콜레스테롤을 함유할 수 있다. 다른 비제한적인 예로서, LNP 제형은 PEG-DMG 2000, DLin-DMA, DSPC 및 콜레스테롤을 2:40:10:48의 몰비로 함유할 수 있다(예컨대 문헌[Geall et al., Nonviral delivery of self-amplifying RNA vaccines, PNAS 2012; PMID: 22908294] 참조; 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
일 실시형태에 있어서, LNP 제형은 국제 특허 공개 제WO2011127255호 또는 제WO2008103276호에 기재된 방법에 의해 제형화될 수 있으며; 이들의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. 비제한적인 예로서, 본 명세서에 기재된 변형된 RNA는 제WO2011127255호 및/또는 제WO2008103276호에 기재된 바와 같은 LNP 제형에 봉입될 수 있으며; 이들의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. 비제한적인 예로서, 본 명세서에 기재된 변형된 RNA는 미국 특허 공개 제20120207845호에 기재된 바와 같은 비경구 경로에 의해 전달되는 나노입자로 제형화될 수 있으며, 상기 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다.
일 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 LNP 제형은 다가양이온성 조성물을 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 다가양이온성 조성물은 미국 특허 공개 제US20050222064호의 화학식 1 내지 60으로부터 선택될 수 있고; 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. 다른 실시형태에 있어서, 다가양이온성 조성물을 포함하는 LNP 제형은 생체내 및/또는 시험관내에서 본 명세서에 기재된 변형된 RNA의 전달을 위하여 이용될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 LNP 제형은 부가적으로 투과성 인핸서 분자를 포함할 수 있다. 비제한적인 투과성 인핸서 분자(permeability enhancer molecule)들은 미국 특허 공개 제US20050222064호에 기재되어 있으며; 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다.
일 실시형태에 있어서, 약제학적 조성물은, DiLa2 리포솜(마리나 바이오테크사, 워싱틴주의 보델시에 소재), 스마티클스(SMARTICLES)®(마리나 바이오테크사, 워싱틴주의 보델시에 소재), 중성 DOPC(1,2-다이올레오일-sn-글라이세로-3-포스포콜린)계 리포솜(예컨대, 난소 암에 대한 siRNA 전달(Landen et al. Cancer Biology & Therapy 2006 5(12)1708-1713); 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함됨) 및 히알루로난-피복된 리포솜(콰이어트 테라퓨틱스사(Quiet Therapeutics), 이스라엘에 소재) 등(이들로 제한되지 않음)과 같은 리포솜으로 제형화될 수 있다.
나노입자 제형은 탄수화물 담체 및 변형된 핵산 분자(예컨대, mmRNA)를 포함하는 탄수화물 나노입자일 수 있다. 비제한적인 예로서, 탄수화물 담체는 무수물-변형된 파이토글라이코겐 또는 글라이코겐형 재료, 포토글라이코겐 옥테닐 숙시네이트, 파이토글라이코겐 베타-덱스트린, 무수물-변형된 파이토글라이코겐 베타-덱스트린을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다(예컨대, 국제 특허 공개 제 WO2012109121호 참조; 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
지질 나노입자 제형은 양이온성 지질을 신속 제거형 지질 나노입자(reLNP)로서 알려진 생분해성 양이온성 지질과 대체함으로써 개선될 수 있다. DLinDMA, DLin-KC2-DMA 및 DLin-MC3-DMA 등(이들로 제한되지 않음)과 같은 이온화가능한 양이온성 지질은 시간 경과에 따라서 혈장 및 조직 내에 축적된 것으로 나타난 바, 독성의 잠재적인 공급원일 수 있다. 신속 제거형 지질의 신속 대사는 래트에서 1 ㎎/㎏ 용량 내지 10 ㎎/㎏ 용량의 크기 정도만큼 지질 나노입자의 내성 및 치료 지수를 향상시킬 수 있다. 효소적으로 분해된 에스터 결합의 내포는 양이온성 성분의 분해 및 대사 프로파일을 향상시킬 수 있는 한편, reLNP 제형의 활성을 유지시킬 수 있다. 에스터 결합은 지질 사슬 내에 내부적으로 위치될 수 있거나, 또는 지질 사슬의 말단 단부에서 말단에 위치될 수 있다. 내부 에스터 결합은 지질 사슬 내 임의의 탄소를 대체할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 내부 에스터 결합은 포화된 탄소의 어느 한쪽 상에 위치될 수 있다.
reLNP의 비제한적인 예로는,
Figure pct00147
를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 면역 반응은 나노종들, 중합체 및 면역원을 포함할 수 있는 지질 나노입자를 전달함으로써 유도될 수 있다(미국 특허 공개 제 20120189700호 및 국제 특허 공개 제 WO2012099805호; 이들의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 중합체는 나노종들을 봉입할 수 있거나, 또는 나노종들을 부분적으로 봉입할 수 있다. 면역원은 재조합 단백질인 본 명세서에 기재된 변형된 RNA일 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 지질 나노입자는 병원체에 대항하는 등(이로써 제한되지 않음)과 같은 백식에 이용하기 위하여 제형화될 수 있다.
지질 나노입자는 지질 나노입자가 점막 장벽을 침투할 수 있도록 입자의 표면 특성을 변경하도록 공학적으로 조작될 수 있다. 점액은, 경구(예컨대, 구강내(buccal) 및 식도막 그리고 편도 조직), 안과, 위장(예컨대, 위, 소장, 대장, 결장, 직장), 비강, 호흡기(예컨대, 비강, 인두, 기관 및 기관지막), 생식기(예컨대, 질, 자궁경부 및 요도막) 등(이들로 제한되는 것은 아님)과 같은 점막 조직 상에 위치된다. 보다 높은 약물 봉입 효율 및 약물의 광범위한 어레이의 지속적 전달을 제공하는 능력을 위해 선호되는 10 내지 200㎚의 나노입자는 너무 커서 신속하게 점막 장벽을 통해 확산되기 어려운 것으로 여겨졌다. 점액은 계속적으로 분비되고, 흐르고, 폐기 혹은 소화되고 재순환되므로, 포획된 입자의 대부분은 점막 조직으로부터 수 초 내 혹은 수 시간 내에 제거될 수 있다. 저분자량 폴리에틸렌 글라이콜(PEG)로 치밀하게 피복된 커다란 중합체 나노입자(직경 200㎚ 내지 500㎚)은 물 속에 확산되어 있는 다른 입자보다 단지 4 내지 6배 낮게 점액을 통해 확산되었다(Lai et al. PNAS 2007 104(5):1482-487; Lai et al. Adv Drug Deliv Rev. 2009 61(2):158-171; 이들의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 나노입자의 수송은, 광표백 후 형광 회복(fluorescence recovery after photobleaching: FRAP) 및 고해상도 다중 입자 트래킹(multiple particle tracking: MPT)을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 형광 현미경 수법 및/또는 침투율을 이용해서 결정될 수 있다. 비제한적인 예로서, 점막 장벽을 침투할 수 있는 조성물은 참조로 전문이 본 명세서에 포함되는 미국 특허 제8,241,670호에 기재된 바와 같이 만들어질 수 있다.
점액을 침투하도록 공학적으로 조작된 지질 나노입자는, 중합체성 재료(즉, 중합체성 코어) 및/또는 중합체-비타민 컨쥬게이트 및/또는 삼중-블록 공중합체를 포함할 수 있다. 중합체성 재료는 폴리아민, 폴리에터, 폴리아마이드, 폴리에스터, 폴리카바메이트, 폴리유레아, 폴리카보네이트, 폴리(스타이렌), 폴리이미드, 폴리설폰, 폴리우레탄, 폴리아세틸렌, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌이민, 폴리아이소사이아네이트, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴로나이트릴 및 폴리아릴레이트를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 중합체성 재료는 생분해성 및/또는 생체적합성일 수 있다. 중합체성 재료는 부가적으로 조사될 수 있다. 비제한적인 예로서, 중합체성 재료는 감마 조사될 수 있다(예컨대, 국제 특허 공보 제WO201282165호 참조, 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 구체적인 중합체의 비제한적인 예로는 폴리(카프로락톤)(PCL), 에틸렌 비닐 아세테이트 중합체(EVA), 폴리(락트산)(PLA), 폴리(L-락트산)(PLLA), 폴리(글라이콜산)(PGA), 폴리(락트산-코-글라이콜산)(PLGA), 폴리(L-락트산-코-글라이콜산)(PLLGA), 폴리(D,L-락타이드)(PDLA), 폴리(L-락타이드)(PLLA), 폴리(D,L-락타이드-코-카프로락톤), 폴리(D,L-락타이드-코-카프로락톤-코-글라이콜라이드), 폴리(D,L-락타이드-코-PEO-코-D,L-락타이드), 폴리(D,L-락타이드-코-PPO-코-D,L-락타이드), 폴리알킬 사이아노아크랄레이트, 폴리우레탄, 폴리-L-라이신(PLL), 하이드록시프로필 메타크릴레이트(HPMA), 폴리에틸렌글라이콜, 폴리-L-글루탐산, 폴리(하이드록시산), 폴리안하이드라이드, 폴리오쏘에스터, 폴리(에스터 아마이드), 폴리아마이드, 폴리(에스터 에터), 폴리카보네이트, 폴리알킬렌, 예컨대, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌, 폴리알킬렌 글라이콜, 예컨대, 폴리(에틸렌 글라이콜)(PEG), 폴리알킬렌 옥사이드(PEO), 폴리알킬렌 테레프탈레이트, 예컨대, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리비닐 에터, 폴리비닐 에스터, 예컨대, 폴리(비닐 아세테이트), 폴리비닐 할라이드, 예컨대, 폴리(염화비닐)(PVC), 폴리비닐피롤리돈, 폴리실록산, 폴리스타이렌(PS), 폴리우레탄,유도체화 셀룰로스, 예컨대, 알킬 셀룰로스, 하이드록시알킬 셀룰로스, 셀룰로스 에터, 셀룰로스 에스터, 나이트로 셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스, 아크릴산의 중합체, 예컨대, 폴리(메틸(메타)아크릴레이트)(PMMA), 폴리(에틸(메타)아크릴레이트), 폴리(뷰틸(메타)아크릴레이트), 폴리(아이소뷰틸(메타)아크릴레이트), 폴리(헥실(메타)아크릴레이트), 폴리(아이소데실(메타)아크릴레이트), 폴리(라우릴(메타)아크릴레이트), 폴리(페닐(메타)아크릴레이트), 폴리(메틸 아크릴레이트), 폴리(아이소프로필 아크릴레이트), 폴리(아이소뷰틸 아크릴레이트), 폴리(옥타데실 아크릴레이트) 및 공중합체 및 이들의 혼합물, 폴리다이옥산 및 그의 공중합체, 폴리하이드록시알카노에이트, 폴리프로필렌 퓨마레이트, 폴리옥시메틸렌, 폴록사머, 폴리(오쏘)에스터, 폴리(뷰티르산), 폴리(발레르산), 폴리(락타이드-코-카프로락톤), 및 트라이메틸렌 카보네이트, 폴리비닐피롤리돈을 포함한다. 지질 나노입자는, 블록 공중합체 및 (폴리(에틸렌 글라이콜))-(폴리(프로필렌 옥사이드))-(폴리(에틸렌 글라이콜)) 삼중블록 공중합체 등(이들로 제한되지 않음)과 같은 공중합체로 피복되거나 이와 회합될 수 있다(예컨대, 미국 특허 공개 제20120121718호 및 미국 특허 공개 제20100003337호 및 미국 특허 제8,263,665호 참조; 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 공중합체는 일반적으로 안전한 것으로 간주되는(generally regarded as safe: GRAS) 중합체일 수 있고, 지질 나노입자의 형성은 새로운 화학적 엔티티가 작성되지 않도록 하는 방식으로 행해질 수 있다. 예를 들어, 지질 나노입자는 여전히 인간 점액을 신속하게 침투할 수 있는 새로운 화학적 엔티티를 형성하는 일 없이 PLGA 나노입자를 피복하는 폴록사머를 포함할 수 있다(Yang et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2011 50:2597-2600] 참조; 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
중합체-비타민 컨쥬게이트의 비타민은 비타민 E일 수 있다. 컨쥬게이트의 비타민 부분은, 비타민 A, 비타민 E, 기타 비타민, 콜레스테롤, 소수성 모이어티, 또는 기타 계면활성제의 소수성 성분(예컨대, 스테롤 사슬, 지방산, 탄화수소 사슬 및 알킬렌 옥사이드 사슬) 등(이들로 제한되지 않음)과 같은 기타 적절한 성분으로 치환될 수 있다.
점액을 투과하도록 공학적으로 조작된 지질 나노입자는, mmRNA, 음이온성 단백질(예컨대, 소 혈청 알부민), 계면활성제(예컨대, 양이온성 계면활성제, 예를 들어, 다이메틸다이옥타데실-암모늄 브로마이드), 당 혹은 당 유도체(예컨대, 사이클로덱스트린), 핵산, 중합체(예컨대, 헤파린, 폴리에틸렌 글라이콜 및 폴록사머), 점액용해제(예컨대, N-아세틸시스테인, 머거워트(mugwort), 브로멜라인, 파파인, 클레로덴드럼, 아세틸시스테인, 브롬헥신, 카보시스테인, 에프라지논, 메스나, 암브록솔, 소브레롤, 도미오돌, 레토스테인, 스테프로닌, 티오프로닌, 겔솔린, 티모신 β4 도나제 알파, 넬테넥신, 에르도스테인) 및 rhDNA분해효소(rhDNase)를 포함하는 각종 DNA분해효소(DNase) 등(이들로 제한되지 않음)과 같은 표면 변경제를 포함할 수 있다. 표면 변경제는 입자의 표면에 매립되거나 얽어 넣거나 지질 나노입자의 표면 상에 (예컨대, 피복, 흡착, 공유 결합 혹은 기타 공정에 의해) 배치될 수 있다(예컨대, US 공개 제20100215580호 및 미국 특허 공개 제20080166414호 참조; 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
점액 침투용 지질 나노입자는 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 mmRNA를 포함할 수 있다. mmRNA는 지질 나노입자 내에 봉입될 수 있고/있거나 해당 입자의 표면 상에 배치될 수 있다. mmRNA는 지질 나노입자에 공유 결합될 수 있다. 점액 침투용 지질 나노입자의 제형은 복수개의 나노입자를 포함할 수 있다. 또한, 제형은 점액과 상호작용하여 둘러싸고 있는 점액의 구조 및/또는 점착 특성을 변경시켜서, 점막점착성을 감소시켜, 점액 침투용 지질 나노입자의 점막 조직으로의 전달을 증가시킬 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는, 예컨대, 제한 없이, 사일런스 테라퓨틱스사(Silence Therapeutics)(영국 런던에 소재)로부터의 아투플렉스(ATUPLEX)™ 시스템, DACC 시스템, DBTC 시스템 및 기타 siRNA-리포플렉스 기술, 스템젠트(STEMGENT)®(매사추세츠주의 케임브리지시에 소재)로부터의 스템펙트(STEMFECT)™ 및 폴리에틸렌이민(PEI) 또는 프로타민계 표적화된 및 비표적화된 핵산의 전달(Aleku et al. Cancer Res. 2008 68:9788-9798; Strumberg et al. Int J Clin Pharmacol Ther 2012 50:76-78; Santel et al., Gene Ther 2006 13:1222-1234; Santel et al., Gene Ther 2006 13:1360-1370; Gutbier et al., Pulm Pharmacol. Ther. 2010 23:334-344; Kaufmann et al. Microvasc Res 2010 80:286-293Weide et al. J Immunother. 2009 32:498-507; Weide et al. J Immunother. 2008 31:180-188; Pascolo Expert Opin. Biol. Ther. 4:1285-1294; Fotin-Mleczek et al., 2011 J. Immunother. 34:1-15; Song et al., Nature Biotechnol. 2005, 23:709-717; Peer et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2007 6;104:4095-4100; deFougerolles Hum Gene Ther. 2008 19:125-132; 이들 문헌은 모두 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함됨) 등과 같은 리포플렉스로서 제형화된다.
일 실시형태에 있어서, 이러한 제형들은 또한 이들이 간세포, 면역 세포, 종양 세포, 내피세포, 항원 제시 세포 및 백혈구를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌, 생체내 상이한 세포 유형으로 수동적으로 혹은 능동적으로 지향되도록 변경된 조성물이거나 작제될 수 있다(Akinc et al. Mol Ther. 2010 18:1357-1364; Song et al., Nat Biotechnol. 2005 23:709-717; Judge et al., J Clin Invest. 2009 119:661-673; Kaufmann et al., Microvasc Res 2010 80:286-293; Santel et al., Gene Ther 2006 13:1222-1234; Santel et al., Gene Ther 2006 13:1360-1370; Gutbier et al., Pulm Pharmacol. Ther. 2010 23:334-344; Basha et al., Mol. Ther. 2011 19:2186-2200; Fenske and Cullis, Expert Opin Drug Deliv. 2008 5:25-44; Peer et al., Science. 2008 319:627-630; Peer and Lieberman, Gene Ther. 2011 18:1127-1133; 이들 문헌은 모두 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 간 세포에 제형을 수동적 표적화하는 일례는 아포리질단백질 E에 결합되어 생체내에서 이들 제형의 간세포 내로의 흡수를 촉진시키는 것으로 제시된 DLin-DMA, DLin-KC2-DMA 및 DLin-MC3-DMA계 지질 나노입자 제형을 포함한다(Akinc et al. Mol Ther. 2010 18:1357-1364; 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 제형은 또한 폴레이트, 트랜스페린, N-아세틸갈락토사(GalNAc) 및 항체 표적화 접근법에 의해 예시되는(단, 이들로 제한되지 않음) 그들의 표면 상에 상이한 리간드의 발현을 통해서 선택적으로 표적화될 수 있다(Kolhatkar et al., Curr Drug Discov Technol. 2011 8:197-206; Musacchio and Torchilin, Front Biosci. 2011 16:1388-1412; Yu et al., Mol Membr Biol. 2010 27:286-298; Patil et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 2008 25:1-61; Benoit et al., Biomacromolecules. 2011 12:2708-2714; Zhao et al., Expert Opin Drug Deliv. 2008 5:309-319; Akinc et al., Mol Ther. 2010 18:1357-1364; Srinivasan et al., Methods Mol Biol. 2012 820:105-116; Ben-Arie et al., Methods Mol Biol. 2012 757:497-507; Peer 2010 J Control Release. 20:63-68; Peer et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 104:4095-4100; Kim et al., Methods Mol Biol. 2011 721:339-353; Subramanya et al., Mol Ther. 2010 18:2028-2037; Song et al., Nat Biotechnol. 2005 23:709-717; Peer et al., Science. 2008 319:627-630; Peer and Lieberman, Gene Ther. 2011 18:1127-1133; 이들 문헌은 모두 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
일 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는 고체 지질 나노입자로서 제형화된다. 고체 지질 나노입자(SLN)는 평균 직경이 10 내지 1000㎚인 구형일 수 있다. SLN은 친지성 분자를 가용화시킬 수 있고 계면활성제 및/또는 유화제로 안정화될 수 있는 고체 지질 코어를 지닌다. 추가의 실시형태에 있어서, 지질 나노입자는 저체-조립 지질-중합체 나노입자일 수 있다(문헌[Zhang et al., ACS Nano, 2008, 2 (8), pp 1696-1702] 참조; 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
리포솜, 리포플렉스, 또는 지질 나노입자는 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA에 의한 세포 형질주입을 증가; 및/또는 암호화된 단백질의 번역을 증가시킬 수 있으므로 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA의 단백질 생산을 지향하는 효능을 향상시키는데 이용될 수 있다. 이러한 하나의 예는 폴리플렉스 플라스미드 DNA의 유효한 전신 전달을 가능하게 하는 지질 봉입의 이용을 수반한다(Heyes et al., Mol Ther. 2007 15:713-720] 참조; 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 리포솜, 리포플렉스 또는 지질 나노입자는 또한 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA의 안정성을 증가시키는데 이용될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA는 제어된 방출 및/또는 표적화된 전달을 위하여 제형화될 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "제어된 방출"이란 치료적 성과를 얻기 위하여 특정 방출 패턴에 합치되는 약제학적 조성물 또는 화합물 방출 프로파일을 지칭한다. 일 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는 제어된 방출 및/또는 표적화된 전달을 위하여 본 명세서에 기재된 및/또는 당업계에 공지된 전달제 내로 봉입될 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "봉입하다"(encapsulate)란 용어는 둘러싸거나 에워싸거나 혹은 감싸는 것을 의미한다. 이것은 본 발명의 화합물의 제형에 관한 것이므로, 봉입은 실질적이거나, 완전하거나 혹은 부분적일 수 있다. "실질적으로 봉입된"이란 용어는 본 발명의 약제학적 조성물 또는 화합물의 적어도 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.9, 99.9% 이상 또는 99.999% 이상이 전달제 내에 에워싸이거나 둘러싸이거나 감싸질 수 있는 것을 의미한다. "부분적으로 봉입"이란 본 발명의 약제학적 조성물 또는 화합물의 10, 10, 20, 30, 40 50 미만 혹은 이하가 전달제 내에 에워싸이거나 둘러싸이거나 감싸질 수 있는 것을 의미한다. 유리하게는, 봉입은 형광 및/또는 전자 마이크로그래프를 이용해서 본 발명의 약제학적 조성물 혹은 화합물의 탈출 혹은 활성을 측정함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 적어도 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.9, 99.99 또는 99.99% 이상의 본 발명의 약제학적 조성물 또는 화합물이 전달제 내에 봉입된다.
일 실시형태에 있어서, 제어된 방출 제형은 삼중-블록 공중합체를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 비제한적인 예로서, 제형은 2가지 상이한 유형의 삼중-블록 공중합체를 포함할 수 있다(국제 특허 공개 제WO2012131104호 및 제WO2012131106호; 이들의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
다른 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는 지질 나노입자 혹은 신속 제거형 지질 나노입자 내에 봉입될 수 있고, 지질 나노입자 혹은 신속 제거형 지질 나노입자는 본 명세서에 기재된 및/또는 당업계에 공지된 중합체, 하이드로겔 및/또는 수술 봉합제에 봉입될 수 있다. 비제한적인 예로서, 중합체, 하이드로겔 또는 수술 봉합제는 PLGA, 에틸렌 비닐 아세테이트(EVAc), 폴록사머, 겔사이트(GELSITE)®(나노테라퓨틱스사(Nanotherapeutics, Inc.), 플로리다주의 알라추아시에 소재), 하일레넥스(HYLENEX)®(할로자임 테라퓨틱스사(Halozyme Therapeutics), 캘리포니아주의 샌디에고시에 소재), 수술 봉합제, 예컨대, 피브리노겐 중합체(에티콘사(Ethicon Inc), 조지아주의 코넬리아시에 소재), 티젤(TISSELL)®(백스터 인터내셔널사(Baxter International, Inc), 일리노이주의 데어필드시에 소재), PEG-계 봉합제 및 쾨실(COSEAL)®(백스터 인터내셔널사, 일리노이주의 데어필드시에 소재)일 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 지질 나노입자는 대상체에 주입될 경우 겔을 형성할 수 있는 당업계에 공지된 임의의 중합체 내로 봉입될 수 있다. 비제한적인 예로서, 지질 나노입자는 생분해성일 수 있는 중합체 매트릭스 내로 봉입될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 제어된 방출 및/또는 표적화된 전달을 위한 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA 제형은 또한 적어도 하나의 제어된 방출 피막을 포함할 수 있다. 제어된 방출 피막은, 오파드라이(OPADRY)®, 폴리비닐피롤리돈/비닐 아세테이트 공중합체, 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 유드라지트(EUDRAGIT) RL®, 유드라지트(EUDRAGIT) RS® 및 셀룰로스 유도체, 예컨대, 에틸셀룰로스 수성 분산액(아쿠아코트(AQUACOAT)® 및 수레리즈(SURELEASE)®)을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
일 실시형태에 있어서, 제어된 방출 및/또는 표적화된 전달 제형은 다가양이온성 곁사슬을 함유할 수 있는 적어도 하나의 분해성 폴리에스터를 포함할 수 있다. 분해성 폴리에스터는, 폴리(세린 에스터), 폴리(L-락타이드-코-L-라이신), 폴리(4-하이드록시-L-프롤린 에스터), 및 이들의 조합물을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 다른 실시형태에 있어서, 분해성 폴리에스터는 페길화(PEGylated) 중합체를 형성하는 PEG 컨쥬게이션을 포함할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA는 치료적 나노입자 내에 봉입될 수 있다. 치료적 나노입자는 이하의 문헌들 등(이들로 제한되지 않음)과 같은 본 명세서에 기재되고, 국제 특허 공개 제WO2010005740호, 제WO2010030763호, 제WO2010005721호, 제WO2010005723호, 제WO2012054923호, 미국 특허 공개 제US20110262491호, 제US20100104645호, 제US20100087337호, 제US20100068285호, 제US20110274759호, 제US20100068286호 및 제US20120288541호, 그리고 미국 특허 제8,206,747호, 제8,293,276호, 제8,318,208호 및 제8,318,211호(이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함됨) 등(이들로 제한되지 않음)과 같은 방업에 의해 제형화될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 치료적 중합체 나노입자는 전문이 참조로 본 명세서에 포함되는 미국 특허 공개 제US20120140790호에 기재된 방법에 의해 확인될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 치료적 나노입자는 서방성을 위하여 제형화될 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "서방성"이란 특정 시간 기간에 걸친 방출 속도에 정합하는 약제학적 조성물 또는 화합물을 지칭한다. 시간 기간은, 시간, 일, 주, 개월 및 년을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 비제한적인 예로서, 서방성 나노입자는, 본 발명의 변형된 핵산 분자 및 mmRNA 등(이들로 제한되지 않음)과 같은 치료적 제제 및 중합체를 포함할 수 있다(국제 특허 공개 제2010075072호 및 미국 특허 공개 제US20100216804호, 제US20110217377호 및 제US20120201859호 참조, 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
일 실시형태에 있어서, 치료적 나노입자는 특이적으로 표적화되도록 제형화될 수 있다. 비제한적인 예로서, 치료적 나노입자는 코르티코스테로이드를 포함할 수 있다(국제 특허 공개 제WO2011084518호 참조, 이 문헌의 내용은 찹조로 그의 전문이 본 명세서에 포함된다). 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 치료적 나노입자는 암 특이적이 되도록 제형화될 수 있다. 비제한적인 예로서, 치료적 나노입자는 국제 특허 공개 제WO2008121949호, 제WO2010005726호, 제WO2010005725호, 제WO2011084521호 및 미국 특허 공개 제US20100069426호, 제US20120004293호 및 제US20100104655호에 기재된 나노입자로 제형화될 수 있으며, 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 나노입자는 중합체성 매트릭스를 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 나노입자는, 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 폴리안하이드라이드, 폴리하이드록시산, 폴리프로필퓨마레이트, 폴리카프로락톤, 폴리아마이드, 폴리아세탈, 폴리에터, 폴리에스터, 폴리(오쏘에스터), 폴리사이아노아크릴레이트, 폴리비닐 알코올, 폴리우레탄, 폴리포스파젠, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리사이아노아크릴레이트, 폴리유레아, 폴리스타이렌, 폴리아민, 폴리라이신, 폴리(에틸렌 이민), 폴리(세린 에스터), 폴리(L-락타이드-코-L-라이신), 폴리(4-하이드록시-L-프롤린 에스터), 및 이들의 조합물 등(이들로 제한되지 않음)과 같은 2종 이상의 중합체를 포함할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 치료적 나노입자는 이중블록 공중합체를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 이중블록 공중합체는, 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 폴리안하이드라이드, 폴리하이드록시산, 폴리프로필푸마레이트, 폴리카프로락톤, 폴리아마이드, 폴리아세탈, 폴리에터, 폴리에스터, 폴리(오쏘에스터), 폴리사이아노아크릴레이트, 폴리비닐 알코올, 폴리우레탄, 폴리포스파젠, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리사이아노아크릴레이트, 폴리유레아, 폴리스타이렌, 폴리아민, 폴리라이신, 폴리(에틸렌 이민), 폴리(세린 에스터), 폴리(L-락타이드-코-L-라이신), 폴리(4-하이드록시-L-프롤린 에스터), 및 이들의 조합물로 제한되지 않는 중합체와 조합하여 PEG를 포함할 수 있다
비제한적인 예로서 치료적 나노입자는 PLGA-PEG 블록 공중합체를 포함한다(미국 특허 공개 제US20120004293호 및 미국 특허 제8,236,330호 참조, 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 다른 비제한적인 예에서, 치료적 나노입자는 PEG 및 PLA 또는 PEG 및 PLGA의 이중블록 공중합체를 포함하는 스텔스(stealth) 나노입자이다(미국 특허 제8,246,968호 참조, 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
일 실시형태에 있어서, 치료적 나노입자는 다중블록 공중합체를 포함할 수 있다(예컨대, 미국 특허 제8,263,665호 및 제8,287,910호 참조; 이들의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
일 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 블록 공중합체는 비-중합체성 마이셀 및 블록 공중합체를 포함하는 다가이온 복합체 중에 포함될 수 있다(예컨대, 미국 특허 공개 제20120076836호 참조; 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
일 실시형태에 있어서, 치료적 나노입자는 적어도 하나의 아크릴 중합체를 포함할 수 있다. 크릴 중합체는, 아크릴산, 메타크릴산, 아크릴산 및 메타크릴산 공중합체, 메틸 메타크릴레이트 공중합체, 에톡시에틸 메타크릴레이트, 사이아노에틸 메타크릴레이트, 아미노 알킬 메타크릴레이트 공중합체, 폴리(아크릴산), 폴리(메타크릴산), 폴리사이아노아크릴레이트 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
일 실시형태에 있어서, 치료적 나노입자는 본 명세서에 기재된 및/또는 당업계에 공지된 적어도 하나의 양이온성 중합체를 포함할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 치료적 나노입자는, 폴리라이신, 폴리에틸렌 이민, 폴리(아마이도아민) 덴드리머, 폴리(베타-아미노 에스터)(예컨대, 미국 특허 제8,287,849호 참조; 여기에서 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함됨) 및 이들의 조합 등(이들로 제한되는 것은 아님)과 같은 적어도 하나의 아민-함유 중합체를 포함할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 치료적 나노입자는 다가양이온성 곁사슬을 함유할 수 있는 적어도 1종의 분해성 폴리에스터를 포함할 수 있다. 분해성 폴리에스터는, 폴리(세린 에스터), 폴리(L-락타이드-코-L-라이신), 폴리(4-하이드록시-L-프롤린 에스터), 및 이들의 조합물을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 다른 실시형태에 있어서, 분해성 폴리에스터는 페길화(PEGylated) 중합체를 형성하는 PEG 컨쥬게이션을 포함할 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 치료적 나노입자는 적어도 하나의 표적화 리간드의 컨쥬게이션을 포함할 수 있다. 표적화 리간드는 단클론성 항체 등(이것으로 제한되는 것은 아님)과 같은 당업계에 공지된 임의의 리간드일 수 있다(Kirpotin et al, Cancer Res. 2006 66:6732-6740] 참조; 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
일 실시형태에 있어서, 치료적 나노입자는 표적 암에 이용될 수 있는 수성 용액으로 제형화될 수 있다(국제 특허 공개 제WO2011084513호 및 미국 특허 공개 제US20110294717호 참조, 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
일 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는, 합성 나노담체(synthetic nanocarrier)에 봉입되거나, 연결되거나 및/또는 이 나노담체에 연결된다. 합성 나노담체는, 국제 특허 공개 제WO2010005740호, 제WO2010030763호, 제WO201213501호, 제WO2012149252호, 제WO2012149255호, 제WO2012149259호, 제WO2012149265호, 제WO2012149268호, 제WO2012149282호, 제WO2012149301호, 제WO2012149393호, 제WO2012149405호, 제WO2012149411호 및 제WO2012149454호 및 미국 특허 공개 제US20110262491호, 제US20100104645호, 제US20100087337호 및 제US20120244222호에 기재된 것들을 포함하지만, 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. 합성 나노담체는 당업계에 공지된 및/또는 본 명세서에 기재된 방법을 이용해서 제형화될 수 있다. 비제한적인 예로서, 합성 나노담체는 국제 특허 공개 제WO2010005740호, 제WO2010030763호 및 제WO201213501호 그리고 미국 특허 공개 제US20110262491호, 제US20100104645호, 제US20100087337호 및 제US20120244222호에 기재된 것들을 포함하지만, 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. 다른 실시형태에 있어서, 합성 나노담체 제형은 국제 특허 공개 제WO2011072218호 및 미국 특허 제8,211,473호에 기재된 방법에 의해 동결건조될 수 있으며; 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다.
일 실시형태에 있어서, 합성 나노담체는 본 명세서에 기재된 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA를 방출하도록 반응성 기를 함유할 수 있다(국제 특허 공개 제WO20120952552호 및 미국 특허 공개 제US20120171229호 참조, 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
일 실시형태에 있어서, 합성 나노담체는 합성 나노담체의 전달로부터 면역 반응을 증대시키기 위하여 면역 촉진제를 함유할 수 있다. 비제한적인 예로서, 합성 나노담체는 면역 시스템의 Th1-기반 반응을 증대시킬 수 있는 Th1 면역촉진제를 포함할 수 있다(국제 특허 공개 제WO2010123569호 및 미국 특허 공개 제US20110223201호 참조, 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
일 실시형태에 있어서, 합성 나노담체는 표적화된 방출을 위하여 제형화될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 합성 나노담체는 특정 pH에서 및/또는 소망의 시간 간격 후 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA를 방출하도록 제형화된다. 비제한적인 예로서, 합성 나노입자는 24시간 후 및/또는 pH 4.5에서 변형된 mRNA 분자 및/또는 mmRNA를 방출하도록 제형화될 수 있다(국제 특허 공개 제WO2010138193호 및 제WO2010138194호, 그리고 미국 특허 공개 제US20110020388호 및 제US20110027217호 참조, 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
일 실시형태에 있어서, 합성 나노담체는 본 명세서에 기재된 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRN의 제어된 방출 및/또는 서방성을 위하여 제형화될 수 있다. 비제한적인 예로서, 서방성용의 합성 나노담체는, 당업계에 공지된, 본 명세서에 기재된 및/또는 국제 특허 공개 제WO2010138192호 및 미국 특허 공개 제20100303850호에 기재된 바와 같은 방법에 의해 제형화될 수 있으며, 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다.
일 실시형태에 있어서, 합성 나노담체는 백신으로서 사용하기 위하여 제형화될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 합성 나노담체는 적어도 하나의 항원을 암호화하는 적어도 하나의 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA를 봉입할 수 있다. 비제한적인 예로서, 합성 나노담체는 백신 투약 형태용의 부형제와 적어도 하나의 항원을 포함할 수 있다(국제 특허 공개 제WO2011150264호 및 미국 특허 공개 제US20110293723호 참조; 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 다른 비제한적인 예로서, 백신 투약 형태는 동일 혹은 상이한 항원 및 부형제를 지닌 적어도 2종의 합성 나노담체를 포함할 수 있다(국제 특허 공개 제WO2011150249호 및 미국 특허 공개 제US20110293701호 참조, 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 백신 투약 형태는 본 명세서에 기재된, 당업계에 공지된 및/또는 국제 특허 공개 제WO2011150258호 및 미국 특허 공개 제US20120027806호에 기재된 방법에 의해 선택될 수 있으며, 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
일 실시형태에 있어서, 합성 나노담체는 적어도 하나의 애주번트를 암호화하는 적어도 하나의 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA를 봉입할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 합성 나노담체는 적어도 하나의 항원을 암호화하는 적어도 하나의 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA를 봉입할 수 있다. 비제한적인 예로서, 애주번트를 포함하는 합성 나노담체는 국제 특허 공개 제WO2011150240호 및 미국 특허 공개 제US20110293700호에 기재된 방법에 의해 제형화될 수 있으며, 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다.
일 실시형태에 있어서, 합성 나노담체는 바이러스로부터 펩타이드, 단편 혹은 영역을 암호화하는 적어도 하나의 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA를 봉입할 수 있다. 비제한적인 예로서, 합성 나노담체는 국제 특허 공개 제WO2012024621호, 제WO201202629호, 제WO2012024632호 및 미국 특허 공개 제US20120064110호, 제US20120058153호 및 제US20120058154호에 기재된 나노담체를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니며, 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다.
일 실시형태에 있어서, 나노입자는 경구투여를 위하여 최적화될 수 있다. 나노입자는, 키토산 또는 그의 유도체 등(이들로 제한되는 것은 아님)과 같은 적어도 하나의 양이온성 바이오중합체를 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 나노입자는 미국 특허 공개 제20120282343호에 기재된 방법에 의해 제형화될 수 있으며; 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다.
중합체, 생분해성 나노입자 및 코어-쉘 나노입자
본 발명의 변형된 핵산 분자 및 mmRNA는 천연의 및/또는 합성 중합체를 이용해서 제형화될 수 있다. 전달에 이용될 수 있는 중합체의 비제한적인 예로는, 미러스(등록상표) 바이오사(MIRUS® Bio)(위스콘신주의 매디슨시에 소재) 및 로슈 매디슨사(Roche Madison)(위스콘신주의 매디슨시에 소재)로부터의 다이나믹 폴리컨쥬게이트(DYNAMIC POLYCONJUGATE)®(에로우헤드 리서치사(Arrowhead Research Corp.), 캘리포니아주의 패서디나시에 소재) 제형, 페이즈알엑스(PHASERX)™ 중합체 제형. 예컨대, 제한 없이, 스마트 폴리머 테크놀로지사(SMARTT POLYMER TECHNOLOGY)™(워싱턴주의 시애들시에 소재), DMRI/DOPE, 폴록사머, 비칼사(Vical)(캘리포니아주의 샌디에이고시에 소재))로부터의 박스펙틴(VAXFECTIN)® 애주번트, 키토산, 칼란도 파마슈티컬즈사(Calando Pharmaceuticals)(캘리포니아주의 패서디나시에 소재)로부터의 사이클로덱스트린, 덴드리머 및 폴리(락틱-코-글라이콜산)(PLGA) 중합체, 론델(RONDEL)™(RNAi/올리고뉴클레오타이드 나노입자 전달) 중합체(에로우헤드 리서치사, 캘리포니아주의 패서디나시에 소재) 및 pH 반응성 공-블록 중합체, 예컨대, 페이즈알엑스(PHASERX)™(워싱턴주의 시애들시에 소재)를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
키토산 제형의 비제한적인 예로는 양하전 키토산의 코어와 음하전 기판의 외부를 포함한다(미국 특허 공개 제20120258176호; 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 키토산으로는, N-트라이메틸 키토산, 모노-N-카복시메틸 키토산(MCC), N-팔미토일 키토산(NPCS), EDTA-키토산, 저분자량 키토산, 키토산 유도체, 또는 이들의 조합물을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명에 이용되는 중합체는 중합체의 표면에 박테리아 등(이것으로 제한되지 않음)과 같은 원치 않는 물질의 부착을 저감 및/또는 억제시키는 가공처리를 수행한다. 중합체는 공지되고/되거나 당업계에 기재되어 있고/있거나 전문이 참조로 본 명세서에 포함된 국제 특허 공개 제WO2012150467호에 기재되어 있을 수 있다.
PLGA 제형의 비제한적인 예로는, PLGA 주사가능한 데포(예컨대, 엘리가드(ELIGARD)®를 포함하지만 이로써 제한되지 않으며, 이것은 66% N-메틸-2-피롤리돈(NMP) 중에 PLGA를 용해시켜서 형성되고 나머지는 수성 용매와 류프롤라이드이다. 일단 주사되면, PLGA 및 류프롤라이드 펩타이드는 피하 공간 내로 석출된다).
이들 중합체 접근법의 다수는 올리고뉴클레오타이드를 생체내에서 세포 세포질 내로 전달함에 있어서의 효능이 입증되어 있다(문헌[deFougerolles Hum Gene Ther. 2008 19:125-132]에 보고됨; 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 핵산의 강한(robust) 생체내 전달을 얻는 2가지 접근법은, (이 경우에 소간섭 RNA(siRNA)를 이용함), 동적 폴리컨쥬게이트와 사이클로덱스트린계 나노입자이다. 이들 전달 접근법 중 첫번째는 동적 폴리컨쥬게이트를 이용하며, 마우스의 생체내에서 siRNA를 효과적으로 전달하고 간세포 내 내인성 표적 mRNA를 침묵시키는 것으로 나타났다(Rozema et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 104:12982-12887; 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 이 특수한 접근법은 은, 주된 특성이 PEG기(전하 은폐용)와 N-아세틸갈락토사민기(간세포 표적용) 둘 모두가 pH-민감성 결합을 통해서 연결되는 이황화 결합을 통해서 핵산, 이 경우에 siRNA가 공유 결합되는 멤브레인-활성 중합체를 포함하는 다성분 중합체 시스템이다(Rozema et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 104:12982-12887; 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 간세포에 결합되어 엔도솜에 진입 시, 중합체 복합체는 낮은-pH 환경에서 분해되어, 중합체가 그의 양 전하를 노출시켜서, 중합체로부터의 siRNA의 엔도좀 탈출 및 세포질 방출을 초래한다. 만노스기를 지니는 N-아세틸갈락토사민기의 대체를 통해서, 아시알로당단백질 수용체-발현 간세포로부터 굴혈관 내피(sinusoidal endothelium) 및 쿠퍼 세포로의 표적화를 변경시킬 수 있는 것이 제시되었다. 다른 중합체 접근법은 트랜스페린-표적화 사이클로덱스트린-함유 다가양이온 나노입자를 이용하는 것을 수반한다. 이들 나노입자는 트랜스페린 수용체-발현 유잉 육종 종양 세포(Hu-Lieskov et al., Cancer Res.2005 65: 8984-8982; 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함됨) 중에서 EWS-FLI1 유전자 산물의 표적화된 침묵을 입증하였으며, 이들 나노입자로 제형화된 siRNA는 비-인간 영장류에 잘 견디었다(Heidel et al., Proc Natl Acad Sci USA 2007 104:5715-21; 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 이들 전달 전략의 양쪽 모두는 표적화된 전달 및 엔도솜 탈출 기전의 양쪽 모두를 이용하는 합리적인 접근법을 내포한다.
중합체 제형은 (예컨대, 근육내 또는 피하 주사 후) 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA의 지속된 혹은 지연된 방출을 허용할 수 있다. 변형된 핵산 또는 mmRNA용의 변경된 방출 프로파일은, 예를 들어, 연장된 시간 기간에 걸쳐서 암호화된 단백질의 번역을 유발할 수 있다. 중합체 제형은 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA의 안정성을 증가시키는데 이용될 수 있다. 생분해성 중합체는, mmRNA 이외의 핵산을 분해로부터 보호하는데 이미 사용되었고, 생체내에서 페이로드(payload)의 서방성을 초래하는 것으로 제시되었다(Rozema et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 104:12982-12887; Sullivan et al., Expert Opin Drug Deliv. 2010 7:1433-1446; Convertine et al., Biomacromolecules. 2010 Oct 1; Chu et al., Acc Chem Res. 2012 Jan 13; Manganiello et al., Biomaterials. 2012 33:2301-2309; Benoit et al., Biomacromolecules. 2011 12:2708-2714; Singha et al., Nucleic Acid Ther. 2011 2:133-147; deFougerolles Hum Gene Ther. 2008 19:125-132; Schaffert and Wagner, Gene Ther. 2008 16:1131-1138; Chaturvedi et al., Expert Opin Drug Deliv. 2011 8:1455-1468; Davis, Mol Pharm. 2009 6:659-668; Davis, Nature 2010 464:1067-1070; 이들의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
일 실시형태에 있어서, 약제학적 조성물 서방성 제형일 수 있다. 추가의 실시형태에 있어서, 서방성 제형은 피하 전달용일 수 있다. 서방성 제형은, PLGA 미소구, 에틸렌 비닐 아세테이트(EVAc), 폴록사머, 겔사이트(GELSITE)®(나노테라퓨틱스사, 플로리다주의 알라추아시에 소재), 하일레넥스(HYLENEX)®(할로자임 테라퓨틱스사(Halozyme Therapeutics), 캘리포니아주의 샌디에고시에 소재), 수술 봉합제, 예컨대, 피브리노겐 중합체(에티콘사(Ethicon Inc), 지아주의 코넬리아시에 소재), 티젤(TISSELL)®(백스터 인터내셔널사, 일리노이주의 데어필드시에 소재), PEG-계 봉합제 및 코실(COSEAL)®(백스터 인터내셔널사, 일리노이주의 데어필드시에 소재)일 수 있다.
비제한적인 예로서, 변형된 mRNA는 조율가능한 방출 속도(예컨대, 일 및 주)를 지니는 PLGA 미소구를 제조하고 봉입 과정 동안 변형된 mRNA의 통합성(변형된 RNA)을 유지하면서 PLGA 미소구 내에 변형된 mRNA를 봉입함으로써 PLGA 미소구로 제형화될 수 있다. EVAc는 임상전 서방성 이식물 적용(예컨대, 연장된 방출 제품인 오쿠서트(Ocusert) 녹내장용의 필로카핀 안과용 삽입물 또는 프로게스타서트 서방성 프로게스테론 자궁내 장치; 경피 전달 시스템인 테스토덤(Testoderm), 두라게스틱(Duragesic) 및 셀레길린(Selegiline); 카테터)에서 광범위하게 이용되는 비생분해가능한, 생체적합성 중합체이다. 폴록사머 F-407 NF는 5℃ 미만의 온도에서 저점도를 지니는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌의 친수성, 비이온성 계면활성제 삼중블록 공중합체이고 15℃ 초과의 온도에서 저점도 고체 겔을 형성한다. PEG-계 수술 봉합제는 1분 내에 제조될 수 있고 3분 내에 봉합되며 30일 이내에 재흡수되는 전달 장치에서 혼합되는 2종의 합성 PEG 성분을 포함한다. 겔사이트(GELSITE)® 및 천연의 중합체는 투여 부위에서 동일 반응계 겔화(in-situ gelation)를 가능하게 한다. 이들은 안정화 효과를 제공하기 위하여 이온성 상호작용을 통해서 단백질 및 펩타이드 치료 후보와 상호작용하는 것으로 나타났다.
중합체 제형은 또한, 폴레이트, 트랜스페린 및 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)으로 예시되는 바와 같은(그러나 이들로 제한되지 않음) 상이한 리간드의 발현을 통해서 선택적으로 표적화될 수 있다(Benoit et al., Biomacromolecules. 2011 12:2708-2714; Rozema et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 104:12982-12887; Davis, Mol Pharm. 2009 6:659-668; Davis, Nature 2010 464:1067-1070; 이들의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
본 발명의 변형된 핵산 분자 및 mmRNA는 중합체 화합물과 함께 혹은 해당 중합체 화합물 내에 제형화될 수 있다. 중합체는, 폴리에텐, 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 폴리(1-라이신)(PLL), PLL에 그라프트화된 PEG, 양이온성 지질중합체, 생분해성 양이온성 지질중합체, 폴리에틸렌이민(PEI), 가교결합된 분지쇄의 폴리(알킬렌 이민), 폴리아민 유도체, 변형된 폴록사머, 생분해성 중합체, 탄성 생분해성 중합체, 생분해성 블록 공중합체, 생분해성 랜덤 공중합체, 생분해성 폴리에스터 공중합체, 생분해성 폴리에스터 블록 공중합체, 생분해성 폴리에스터 블록 랜덤 공중합체, 다중블록 공중합체, 선형 생분해성 공중합체, 폴리[α-(4-아미노뷰틸)-L-글라이콜산)(PAGA), 생분해성 가교결합된 양이온성 다중블록 공중합체, 폴리카보네이트, 폴리안하이드라이드, 폴리하이드록시산, 폴리프로필푸머레이트, 폴리카프롤락톤, 폴리아마이드, 폴리아세탈, 폴리에터, 폴리에스터, 폴리(오쏘에스터), 폴리사이아노아크릴레이트, 폴리비닐 알코올, 폴리우레탄, 폴리포스파젠, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리사이아노아크릴레이트, 폴리유레아, 폴리스타이렌, 폴리아민, 폴리라이신, 폴리(에틸렌 이민), 폴리(세린 에스터), 폴리(L-락타이드-코-L-라이신), 폴리(4-하이드록시-L-프롤린 에스터), 아크릴 중합체, 아민-함유 중합체, 덱스트란 중합체, 덱스트란 중합체 유도체 또는 이들의 조합 등(이들로 제한되지 않음)과 같은 적어도 하나의 중합체를 포함할 수 있다.
비제한적인 예로서, 본 발명의 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA는 미국 특허 제6,177,274호에 기재된 바와 같은 PLL로 그래프트된 PEG의 중합체 화합물과 함께 제형화될 수 있으며; 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. 제형은 변형된 핵산 분자 및 mmRNA의 시험관내 세포의 형질주입을 위하여 또는 생체내 전달을 위하여 이용될 수 있다. 다른 예에서, 변형된 핵산 분자 및 mmRNA는 양이온성 중합체를 지니는 용액 혹은 매질 중에, 건조 약제학적 조성물 중에 혹은 미국 특허 공개 제20090042829호 및 제20090042825호에 기재된 바와 같이 건조될 수 있는 용액 중에 현탁될 수 있으며; 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다.
다른 비제한적인 예로서, 본 발명의 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA는 PLGA-PEG 블록 공중합체(미국 특허 공개 제US20120004293호 및 미국 특허 제8,236,330호 참조, 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함됨) 또는 PLGA-PEG-PLGA 블록 공중합체(미국 특허 제6,004,573호 참조, 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함됨)와 함께 제형화될 수 있다. 비제한적인 예로서, 본 발명의 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA는 PEG와 PLA 또는 PEG와 PLGA의 이중블록 공중합체와 함께 제형화될 수 있다(전문이 참조로 본 명세서에 포함되는 미국 특허 제8,246,968호 참조).
폴리아민 유도체는 핵산 분자 및/또는 mmRNA를 전달하는데 또는 질환을 치료 및/또는 예방하는데 또는 이식가능한 혹은 주사가능한 장치 내에 포함시키는데 이용될 수 있다(미국 특허 공개 제20100260817호, 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 비제한적인 예로서, 약제학적 조성물은 변형된 핵산 분자 및 mmRNA와, 미국 특허 공개 제20100260817호에 기재된 폴리아민 유도체를 포함할 수 있다(이 문헌은 모두 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 비제한적인 예로서, 본 발명의 변형된 핵산 또는 mmRNA는, 탄수화물 다아자이드 단량체를, 올리고아민을 포함하는 다이알킨 단위와 배합함으로써 제조된 1,3- 이극성 부가 중합체를 포함하는 중합체 등(이것으로 제한되지 않음)과 같은 폴리아민 중합체를 이용해서 전달될 수 있다(미국 특허 제8,236,280호; 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
본 발명의 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA는 적어도 하나의 아크릴 중합체와 함께 제형화될 수 있다. 아크릴 중합체는, 아크릴산, 메타크릴산, 아크릴산 및 메타크릴산 공중합체, 메틸 메타크릴레이트 공중합체, 에톡시에틸 메타크릴레이트, 사이아노에틸 메타크릴레이트, 아미노 알킬 메타크릴레이트 공중합체, 폴리(아크릴산), 폴리(메타크릴산), 폴리사이아노아크릴레이트 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
일 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA는 국제 특허 공개 제WO2011115862호, 제WO2012082574호 및 제WO2012068187호 및 미국 특허 공개 제20120283427호에 기재된 적어도 하나의 중합체 및/또는 그의 유도체와 함께 제형화될 수 있으며, 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는, 전문이 참조로 본 명세서에 포함되는 제WO2011115862호에 기재된 바와 같은 화학식 Z의 중합체와 함께 제형화될 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는 국제 특허 공개 제WO2012082574호 또는 제WO2012068187호에 기재된 바와 같이 화학식 Z, Z' 또는 Z"의 중합체와 함께 제형화될 수 있으며, 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. 본 발명의 변형된 핵산 및/또는 변형된 mRNA로 제형화된 중합체는 국제 특허 공개 제WO2012082574호 또는 제WO2012068187호에 기재된 바와 같은 방법에 의해 합성될 수 있으며, 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA의 제형은, 폴리라이신, 폴리에틸렌 이민, 폴리(아마이도아민) 덴드리머 또는 이들의 조합 등(이들로 제한되지 않음)과 같은 적어도 1종의 아민-함유 중합체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA는 폴리(알킬렌 이민), 생분해성 양이온성 지질중합체, 생분해성 블록 공중합체, 생분해성 중합체 또는 생분해성 랜덤 공중합체, 생분해성 폴리에스터 블록 공중합체, 생분해성 폴리에스터 중합체, 생분해성 폴리에스터 랜덤 공중합체, 선형 생분해성 공중합체, PAGA, 생분해성 가교결합된 양이온성 다중블록 공중합체 또는 이들의 조합을 포함하는 약제학적 화합물로 제형화될 수 있다. 생분해성 양이온성 지질중합체는 당업계에 공지된 및/또는 미국 특허 제 6,696,038호, 미국 특허 공개 제20030073619호 및 제20040142474호에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. 폴리(알킬렌 이민)은 당업계에 공지된 및/또는 미국 특허 공개 제20100004315호에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. 생분해성 중합체, 생분해성 블록 공중합체, 생분해성 랜덤 공중합체, 생분해성 폴리에스터 블록 공중합체, 생분해성 폴리에스터 중합체, 또는 생분해성 폴리에스터 랜덤 공중합체는 당업계에 공지된 및/또는 미국 특허 제6,517,869호 및 제6,267,987호에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. 선형 생분해성 공중합체는 당업계에 공지된 및/또는 미국 특허 제6,652,886호에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. PAGA 중합체는 당업계에 공지된 및/또는 미국 특허 제6,217,912호에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. PAGA 중합체는, 폴리-L-라이신, 폴리아르긴, 폴리오르니틴, 히스톤, 아비딘, 프로타민, 폴리락타이드 및 폴리(락타이드-코-글라이콜라이드) 등(이들로 제한되지 않음)과 같은 중합체와 공중합체 혹은 블록 공중합체를 형성하도록 공중합될 수 있다. 생분해성 가교결합된 양이온성 다중블록 공중합체는 당업계에 공지된 및/또는 미국 특허 제8,057,821호 또는 미국 특허 공개 제2012009145호에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. 예를 들어, 다중블록 공중합체는 분지된 폴리에틸렌이민과 비교해서 독특한 패턴을 가지는 선형 폴리에틸렌이민(LPEI)을 이용해서 합성될 수 있다. 또한, 조성물 또는 약제학적 조성물은 당업계에 공지되거나, 본 명세서에 기재되거나 또는 미국 특허 공개 제20100004315호 또는 미국 특허 제6,267,987호 및 제6,217,912호에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 변형된 핵산 분자 및 mmRNA는 다가양이온성 곁사슬을 함유할 수 있는 적어도 하나의 분해성 폴리에스터와 함께 제형화될 수 있다. 분해성 폴리에스터는, 폴리(세린 에스터), 폴리(L-락타이드-코-L-라이신), 폴리(4-하이드록시-L-프롤린 에스터), 및 이들의 조합물을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 다른 실시형태에 있어서, 분해성 폴리에스터는 페길화(PEGylated) 중합체를 형성하기 위하여 PEG 컨쥬게이션을 포함할 수 있다.
본 발명의 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA는 적어도 하나의 가교가능한 폴리에스터로 제형화될 수 있다. 가교가능한 폴리에스터는 당업계에 공지되고 미국 특허 공개 제20120269761호에 기재된 것들을 포함하며, 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다.
일 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 중합체는 지질-종결 PEG에 컨쥬게이트될 수 있다. 비제한적인 예로서, PLGA는 지질-종결 PEG에 컨쥬게이트되어 PLGA-DSPE-PEG를 형성할 수 있다. 다른 비제한적인 예로서, 본 발명에서 사용하기 위한 PEG 컨쥬게이트는 국제 특허 공개 제WO2008103276호에 기재되어 있고, 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. 중합체는 전문이 참조로 본 명세서에 포함되는 미국 특허 제8,273,363호에 기재된 컨쥬게이트 등(이것으로 제한되지 않음)과 같은 리간드 컨쥬게이트를 이용해서 컨쥬게이트될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA는 다른 화합물에 컨쥬게이트될 수 있다. 컨쥬게이트의 비제한적인 예는 미국 특허 제7,964,578호 및 제7,833,992호에 기재되어 있고, 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 변형된 RNA는 미국 특허 제7,964,578호 및 제7,833,992호(이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함됨)에 기재된 바와 같은 식 1-122의 컨쥬게이트(와 컨쥬게이트될 수 있다. 본 명세서에 기재된 변형된 RNA는 금 등(이것으로 제한되지 않음)과 같은 금속과 컨쥬게이트될 수 있다(예컨대, 문헌[Giljohann et al. Journ. Amer. Chem. Soc. 2009 131(6):2072-2073] 참조; 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA는 금-나노입자에 컨쥬게이트 및/또는 봉입될 수 있다(국제 특허 공개 제WO201216269호 및 미국 특허 공개 제20120302940호; 이들의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
전문이 참조로 본 명세서에 포함된 미국 특허 공개 제20100004313호에 기재된 바와 같이, 유전자 전달 조성물은 뉴클레오타이드 서열과 폴록사머를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 변형된 핵산 및 mmRNA는 미국 특허 공개 제20100004313호에 기재된 폴록사머와 함께 유전자 전달 조성물에 이용될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 중합체 제형은, 양이온성 담체를 포함할 수 있는 중합체 제형을, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌 글라이콜기에 공유 결합될 수 있는 양이온성 지질중합체와 접촉시킴으로써 안정화될 수 있다. 중합체 제형은, 전문이 참조로 본 명세서에 포함되는 미국 특허 공개 제20090042829호에 기재된 방법을 이용해서 양이온성 지질중합체와 접촉될 수 있다. 양이온성 담체는, 폴리에틸렌이민, 폴리(트라이메틸렌이민), 폴리(테트라메틸렌이민), 폴리프로필렌이민, 아미노글라이코사이드-폴리아민, 다이데옥시-다이아미노-b-사이클로덱스트린, 스퍼민, 스퍼미딘(spermidine), 폴리(2-다이메틸아미노)에틸 메타크릴레이트, 폴리(라이신), 폴리(히스티딘), 폴리(아르기닌), 양이온화 젤라틴, 덴드리머, 키토산, 1,2-다이올레오일-3-트라이메틸암모늄-프로판(DOTAP), N-[1-(2,3-다이올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), 1-[2-(올레오일옥시)에틸]-2-올레일-3-(2-하이드록시에틸)이미다졸늄 클로라이드(DOTIM), 2,3-다이올레일옥시-N-[2(스퍼민카복사마이도)에틸]-N,N-다이메틸-1-프로판아미늄 트라이플루오로아세테이트(DOSPA), 3B-[N-(N',N'-다이메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤 하이드로클로라이드(DC-콜레스테롤 HCl) 다이헵타데실아마이도글라이실 스퍼미딘(DOGS), N,N-다이스테아릴-N,N-다이메틸암모늄 브로마이드(DDAB), N-(1,2-다이미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-다이메틸-N-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DMRIE), N,N-다이올레일-N,N-다이메틸암모늄 클로라이드 DODAC) 및 이들의 조합을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA는 1종 이상의 중합체의 폴리플렉스로 제형화될 수 있다(미국 특허 공개 제20120237565호 및 제20120270927호; 이들의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 일 실시형태에 있어서, 폴리플렉스는 2종 이상의 양이온성 중합체를 포함한다. 양이온성 중합체는 선형 폴리(에틸렌이민)(PEI) 등과 같은 PEI를 포함할 수 있다.
본 발명의 변형된 핵산 분자 및 mmRNA는 또한 중합체, 지질, 및/또는 인산칼슘 등(이들로 제한되지 않음)과 같은 기타 생분해성 제제의 조합을 이용해서 나노입자로서 제형화될 수 있다. 성분들은 코어-쉘, 혼성체 및/또는 층상 구조에 조합되어, 나노 입자의 미세 조절이 변형된 핵산 분자 및 mmRNA의 전달을 증대시킬 수 있다(Wang et al., Nat Mater. 2006 5:791-796; Fuller et al., Biomaterials. 2008 29:1526-1532; DeKoker et al., Adv Drug Deliv Rev. 2011 63:748-761; Endres et al., Biomaterials. 2011 32:7721-7731; Su et al., Mol Pharm. 2011 Jun 6;8(3):774-87; 이들의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 비제한적인 예로서, 나노입자는 친수성-소수성 중합체(예컨대, PEG-PLGA), 소수성 중합체(예컨대, PEG) 및/또는 친수성 중합체 등(이들로 제한되지 않음)과 같은 복수의 중합체를 포함할 수 있다(국제 특허 공개 제WO20120225129; 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
지질 및/또는 중합체와 조합하여 생분해성 인산칼슘 나노입자는 변형된 핵산 분자 및 mmRNA를 생체내 전달하는 것으로 제시되었다. 일 실시형태에 있어서, 아니스아마이드 등과 같은 표적하 리간드를 또 함유할 수 있는 지질 코팅된 인산칼슘 나노입자는, 본 발명의 변형된 핵산 분자 및 mmRNA를 전달하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 마우스 전이 폐 모델에서 siRNA를 효과적으로 전달하기 위하여, 지질 코팅된 인산칼슘 나노입자가 이용되었다(Li et al., J Contr Rel. 2010 142: 416-421; Li et al., J Contr Rel. 2012 158:108-114; Yang et al., Mol Ther. 2012 20:609-615; 이들은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 이 전달 시스템은, siRNA의 전달을 향상시키기 위하여, 표적화된 나노입자와 엔도솜 탈출을 증대시키는 성분인 인산칼슘을 조합한다.
일 실시형태에 있어서, PEG-다가 음이온 블록 공중합체를 지닌 인산칼슘은 변형된 핵산 분자 및 mmRNA를 전달하는데 이용될 수 있다(Kazikawa et al., J Contr Rel. 2004 97:345-356; Kazikawa et al., J Contr Rel. 2006 111:368-370; 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
일 실시형태에 있어서, PEG-전하-전환 중합체(PEG-charge-conversional polymer)(Pitella et al., Biomaterials. 2011 32:3106-3114)는 본 발명의 변형된 핵산 분자 및 mmRNA를 전단하는 나노입자를 전달하는데 이용될 수 있다. PEG-전하-전환 중합체는 산성 pH에서 다가양이온으로 절단됨으로써 EG-다가 음이온 블록 공중합체에 대해 개량되어서, 엔도솜 탈출을 증대시킬 수 있다.
코어-쉘 나노입자의 이용은 합성 양이온성 가교결합된 나노겔 코어 및 각종 쉘에 높은 처리량 접근법에 부가적으로 초점을 맞춘 것이다(Siegwart et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 108:12996-13001). 중합체성 나노입자의 복합화, 전달, 및 내부화는, 나노입자의 코어와 쉘 성분의 양쪽 모두에 있어서 화학적 조성을 변경함으로써 정밀하게 제어될 수 있다. 예를 들어, 코어-쉘 나노입자는 이들이 콜레스테롤을 나노입자에 공유결합적으로 부착시킨 후 마우스 간세포에 siRNA를 효과적으로 전달할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, PEG를 함유하는 외부의 중성 지질층과 중간의 PLGA층을 포함하는 중공의 지질 코어는 본 발명의 변형된 핵산 분자 및 mmRNA를 전달하는데 이용될 수 있다. 비제한적인 예로서, 루시페라제-발현 종양을 보유하는 마우스에서, 종래의 리포플렉스에 비해서 지질-중합체-지질 혼성체 나노입자가 루시페라제 발현을 상당히 억제하는 것으로 결정되었다(Shi et al, Angew Chem Int Ed. 2011 50:7027-7031; 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
일 실시형태에 있어서, 지질 나노입자는 본 명세서에 개시된 변형된 핵산 분자의 코어와, 중합체 쉘을 포함할 수 있다. 중합체 쉘은 본 명세서에 기재되고 당업계에 공지된 중합체의 어느 하나일 수 있다. 추가의 실시형태에 있어서, 중합체 쉘은 코어 내의 변형된 핵산을 보호하기 위하여 이용될 수 있다.
본 발명의 변형된 핵산 분자와 함께 이용하기 위한 코어-쉘 나노입자는 기술되어 있고, 전문이 참조로 본 명세서에 포함되는 미국 특허 제8,313,777호에 기재된 방법에 의해 형성될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 코어-쉘 나노입자는 본 명세서에 개시된 변형된 핵산 분자의 코어와, 중합체 쉘을 포함할 수 있다. 중합체 쉘은 본 명세서에 기재되고 당업계에 공지된 중합체의 어느 하나일 수 있다. 추가의 실시형태에 있어서, 중합체 쉘은 코어 내의 변형된 핵산 분자를 보호하기 위하여 이용될 수 있다.
펩타이드 및 단백질
본 발명의 변형된 핵산 분자 및 mmRNA는 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA에 의해 세포의 형질주입을 증가시키기 위하여 펩타이드 및/또는 단백질과 함께 제형화될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 세포 침투 펩타이드 및 단백질 그리고 세포내 전달을 암호화하는 펩타이드 등(이들로 제한되는 것은 아님)과 같은 펩타이드는 약제학적 제형을 전달하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 약제학적 제형과 함께 이용될 수 있는 세포 침투 펩타이드의 비제한적인 예는, 세포내 공간에의 전달을 용이하게 하는 다가양이온에 부착된 세포-침투 펩타이드 서열, 예컨대, HIV-유래 TAT 펩타이드, 페네트라틴, 트랜스포탄, 또는 hCT 유래 세포-침투 펩타이드를 포함한다(예컨대, 문헌[Caron et al., Mol. Ther. 3(3): 310-8 (2001); Langel, Cell-Penetrating Peptides: Processes and Applications (CRC Press, Boca Raton FL, 2002); El-Andaloussi et al., Curr. Pharm. Des. 11(28):3597-611 (2003); 및 Deshayes et al., Cell. Mol. Life Sci. 62(16):1839-49 (2005)] 참조, 이들 문헌은 모두 참조로 본 명세서에 포함된다). 조성물은 또한, 세포내 공간으로 조성물의 전달을 증대시키는, 세포 침투제, 예컨대, 리포솜을 포함하도록 제형화될 수 있다. 본 발명의 변형된 핵산 분자 및 mmRNA는, 세포내 전달을 가능하게 하기 위하여 에일레론 테라퓨틱스사(Aileron Therapeutics)(매사추세츠주의 케임브리지시에 소재) 및 퍼메온 바이오로직스사(Permeon Biologics)(매사추세츠주의 케임브리지시에 소재)로부터의 펩타이드 및/또는 단백질 등(이들로 제한되는 것은 아님)과 같은 펩타이드 및/또는 단백질에 복합체화될 수 있다(Cronican et al., ACS Chem. Biol. 2010 5: 747-752; McNaughton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2009 106: 6111-6116; Sawyer, Chem Biol Drug Des. 2009 73:3-6; Verdine and Hilinski, Methods Enzymol. 2012;503:3-33; 이들은 모두 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
일 실시형태에 있어서, 세포-침투 폴리펩타이드는 제1 도메인 및 제2 도메인을 포함할 수 있다. 제1 도메인은 수퍼차지된(supercharged) 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 제2 도메인은 단백질-결합 상대를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "단백질-결합 상대"는, 항체 및 그의 기능적 단편, 스캐폴드 단백질, 또는 펩타이드를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 세포-침투 폴리펩타이드는 단백질-결합 상대에 대한 세포내 결합 상대를 더 포함할 수 있다. 세포-침투 폴리펩타이드는 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA가 도입될 수 있는 세포로부터 분리될 수 있는 능력이 있을 수 있다.
펩타이드 또는 단백질을 포함하는 제형은, 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA에 의해 세포 형질주입을 증가시키고, (예컨대, 특정 조직 또는 세포 유형을 표적화함으로써) 변형된 핵산 분자의 생물분류를 변경하고, 및/또는 암호화된 단백질의 번역을 증가시키는데 이용될 수 있다(예컨대, 국제 특허 공개 제WO2012110636호 참조; 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
세포
본 발명의 변형된 핵산 분자 및 mmRNA는 세포 내로 생체외에서 형질주입될 수 있고, 이어서 대상체 내로 이식된다. 약제학적 조성물은, 변형된 RNA를 간 및 골수 세포로 전달하는 적혈구, 변형된 핵산 분자 및 mmRNA를 바이러스-유사 입자(VLP)로 전달하는 비로좀(virosome), 및 변형된 RNA를 전달하는, 맥스사이트(MAXCYTE)®(메릴랜드주의 게이더스버그시에 소재)로부터 그리고 에리테크(ERYTECH)®(프랑스의 리옹에 소재)로부터(단 이들로 제한되지 않음) 등과 같은 전기천공된 세포를 포함할 수 있다. mmRNA 이외의 페이로드를 전달하는 적혈구, 바이러스 입자 및 전기천공된 세포의 사용예가 문서화되어 있다(Godfrin et al., Expert Opin Biol Ther. 2012 12:127-133; Fang et al., Expert Opin Biol Ther. 2012 12:385-389; Hu et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 108:10980-10985; Lund et al., Pharm Res. 2010 27:400-420; Huckriede et al., J Liposome Res. 2007;17:39-47; Cusi, Hum Vaccin. 2006 2:1-7; de Jonge et al., Gene Ther. 2006 13:400-411; 이들은 모두 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 변형된 핵산 분자 및 mmRNA는 국제 특허 공개 제WO2011085231호 및 미국 특허 공개 제20110171248호에 기재된 방법에 의해 합성된 합성 VLP에서 전달될 수 있으며, 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 변형된 핵산 분자 및 mmRNA의 세포-기반 제형은, (예컨대, 세포 담체 내에) 세포 형질주입을 확실하게 하고/하거나, (예컨대, 세포 담체를 특정 조직 또는 세포 유형에 표적화함으로써) 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA의 생물분류를 변경하고/하거나, 암호화된 단백질의 번역을 증가시키는 데 이용될 수 있다.
세포 내로의 도입
바이러스 및 비바이러스 매개 기술을 포함하여, 세포 내로 핵산을 도입을 위하여 적절한 각종 방법이 당업계에 공지되어 있다. 전형적인 비-바이러스 매개 수법은, 전기천공, 인산칼슘 매개 전달, 뉴클레오펙션(nucleofection), 초음파천공법(sonoporation), 열 충격, 자기주입법(magnetofection), 리포솜 매개 전달, 마이크로주사, 미세투사물 매개 전달(나노입자), 양이온성 중합체 매개 전달(DEAE-덱스트란, 폴리에틸렌이민, 폴리에틸렌 글라이콜(PEG) 등) 또는 세포 융합을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
초음파천공법 또는 세포 초음파 수법은, 세포 혈장막의 투과성을 변형시키기 위하여 소리(예컨대, 초음파 주파수)의 이용이다. 초음파천공법은, 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 공개 제20100196983호 및 미국 특허 공개 제20100009424호에 있어서 박테리아에 관한 것과 같이 교시되어 있으며, 상기 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다.
전기천공 수법은 또한 당업계에 잘 알려져 있다. 일 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는 실시예 8에 기재된 바와 같이 전기천공에 의해 전달될 수 있다.
히알루로니다제
본 발명의 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA의 근육내 또는 피하 국재화된 주사는 히알루로난의 가수분해를 촉매하는 히알루로니다제를 포함할 수 있다. 간질세포 장벽(interstitial barrier)의 구성요소인 히알루로난의 가수분해를 촉매함으로써, 히알루로니다제는 히알루로난의 점도를 낮추며, 이에 따라서 조직 투과성을 증가시킨다(Frost, Expert Opin. Drug Deliv. (2007) 4: 427-440] 참조; 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 형질주입된 세포에 의해 생산된 암호화된 단백질의 그들의 분산 및 전신 분포를 빠르게 하는 것이 유용하다. 대안적으로, 히알루로니다제는 근육내 혹은 피하로 투여된 본 발명의 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA에 노출된 세포의 수를 증가시키는데 이용될 수 있다.
나노입자 모방체
본 발명의 변형된 핵산 분자 및 mmRNA는 나노입자 모방체 내에 봉입될 수 있고/있거나 해당 모방체에 흡수될 수 있다. 나노입자 모방체는, 병원체, 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충, 프리온 및 세포 등(이들로 제한되는 것은 아님)과 같은 전달 기능 유기체 또는 입자를 모방할 수 있다. 비제한적인 예로서, 본 발명의 변형된 mRNA는 바이러스의 전달 기능을 모방할 수 있는 비-비리온 입자 내에 봉입될 수 있다(전문이 참조로 본 명세서에 포함되는 국제 특허 공개 제WO2012006376호 참조).
나노튜브
본 발명의 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA는, 로제트 나노튜브, 링커와 함께 쌍염기를 지니는 로제트 나노튜브, 탄소 나노튜브 및/또는 단일벽 탄소 나노튜브 등(이들로 제한되는 것은 아님)과 같은 적어도 하나의 나노튜브에 부착되거나 다르게는 결합될 수 있다. 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는 입체, 이온, 공유결합 및/또는 기타 힘 등(이들로 제한되지 않음)과 같은 힘을 통해서 나노튜브에 결합될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 나노튜브는 세포 내로 방출 1개이상의 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA를 방출시킬 수 있다. 적어도 하나의 나노튜브의 크기 및/또는 표면 구조는, 체내에 나노튜브의 상호작용을 지배하고/하거나 본 명세서에 개시된 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA에 부착되거나 결합되도록 변경될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 빌딩 블록 및/또는 적어도 하나의 나노튜브의 빌딩 블록에 부착된 작용기는 나노튜브의 치수 및/또는 특성을 조절하기 위하여 변경될 수 있다. 비제한적인 예로서, 나노튜브의 길이는 나노튜브가 정상 혈관의 벽 내의 구멍을 통과하는 것을 방해하지만 종양 조직의 혈관 내 보다 큰 구멍을 충분히 통과하도록 훨씬 작게 변경될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 나노튜브는 또한 폴리에틸렌 글라이콜 등(이것으로 제한되지 않음)과 같은 중합체를 포함하는 전달 향상 화합물로 피복될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 나노튜브 및/또는 변형된 mRNA는 약제학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 전달 비히클과 혼합될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 변형된 mRNA는 적어도 하나의 로제트 나노튜브에 부착되고/되거나 다르게는 결합된다. 로제트 나노튜브는 당업계에 공지된 방법 및/또는 전문이 참조로 본 명세서에 포함되는 국제 특허 공개 제WO2012094304호에 기재된 방법에 의해 형성될 수 있다. 적어도 하나의 변형된 mRNA는 전문이 참조로 본 명세서에 포함되는 국제 특허 공개 제 WO2012094304호에 기재된 방법에 의해 적어도 하나의 로제트 나노튜브에 부착되고/되거나 다르게는 결합될 수 있으며, 여기서 로제트 나노튜브 혹은 로제트 나노튜브를 형성하는 모듈은 적어도 하나의 변형된 mRNA가 로제트 나노튜브에 부착되거나 다르게는 결합될 수 있게 하는 조건 하에서 적어도 하나의 변형된 mRNA와 수성 매질 중에서 혼합된다.
일 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는 적어도 하나의 탄소 나노튜브에 부착 및/또는 다르게는 결합될 수 있다. 비제한적인 예로서, 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는 연결제(linked agent)에 결합될 수 있고, 이 연결제는 탄소 나노튜브에 결합될 수 있다(예컨대, 미국 특허 제8,246,995호 참조; 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 탄소 나노튜브는 단일벽 나노튜브일 수 있다(예컨대, 미국 특허 제8,246,995호 참조; 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
컨쥬게이트
본 발명의 변형된 핵산 분자 및 mmRNA는, 담체 혹은 표적화기에 공유결합적으로 연결되거나 융합 단백질(예컨대, 표적화 기 및 치료적 단백질 또는 펩타이드를 보유함)을 함께 생산하는 2개의 암호화 영역을 포함하는 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA 등과 같은 컨쥬게이트를 포함한다.
본 발명의 컨쥬게이트는 천연 유래 물질, 예컨대, 단백질(예컨대, 인간 혈청 알부민(HSA), 저밀도 지질단백질(LDL), 고밀도 지질단백질(HDL) 또는 글로불린); 탄수화물(예컨대, 덱스트란, 풀루란, 키틴, 키토산, 이눌린, 사이클로덱스트린 또는 히알루론산); 또는 지질을 포함한다. 리간드는 또한 합성 중합체, 예컨대, 합성 폴리아미노산, 올리고뉴클레오타이드(예컨대 앱타머) 등과 같은 재조합 혹은 합성 분자일 수 있다. 폴리아미노산의 예로는 폴리라이신(PLL), 폴리 L-아스파르트산, 폴리 L-글루탐산, 스타이렌-말레산 무수물 공중합체, 폴리(L-락타이드-코-글라이콜라이드) 공중합체, 다이비닐 에터-말레산 무수물 공중합체, N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아마이드 공중합체(HMPA), 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리우레탄, 폴리(2-에틸아크릴산), N-아이소프로필아크릴아마이드 중합체 또는 폴리포스파진을 포함한다. 폴리아민의 예로는 폴리에틸렌이민, 폴리라이신(PLL), 스퍼민, 스퍼미딘, 폴리아민, 유사펩타이드-폴리아민, 펩티도미메틱 폴리아민, 덴드리머 폴리아민, 아르기닌, 아미딘, 프로타민, 양이온성 지질, 양이온성 포르피린, 폴리아민의 4급염, 또는 알파 헬리컬펩타이드를 포함한다.
특히 RNA에 대한 폴리뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는, 미국 특허 제4,828,979호; 제4,948,882호; 제5,218,105호; 제5,525,465호; 제5,541,313호; 제5,545,730호; 제5,552,538호; 제5,578,717호; 제5,580,731호; 제5,591,584호; 제5,109,124호; 제5,118,802호; 제5,138,045호; 제5,414,077호; 제5,486,603호; 제5,512,439호; 제5,578,718호; 제5,608,046호; 제4,587,044호; 제4,605,735호; 제4,667,025호; 제4,762,779호; 제4,789,737호; 제4,824,941호; 제4,835,263호; 제4,876,335호; 제4,904,582호; 제4,958,013호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,245,022호; 제5,254,469호; 제5,258,506호; 제5,262,536호; 제5,272,250호; 제5,292,873호; 제5,317,098호; 제5,371,241호; 제5,391,723호; 제5,416,203호; 제5,451,463호; 제5,510,475호; 제5,512,667호; 제5,514,785호; 제5,565,552호; 제5,567,810호; 제5,574,142호; 제5,585,481호; 제 5,587,371호; 제5,595,726호; 제5,597,696호; 제5,599,923호; 제5,599,928호 및 제5,688,941호; 제6,294,664호; 제6,320,017호; 제6,576,752; 6,783,931호; 제6,900,297호; 제7,037,646호를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니며; 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 컨쥬게이트는 본 발명의 변형된 핵산 분자 및 mmRNA용의 담체로서 기능할 수 있다. 컨쥬게이트는 폴리(에틸렌 글라이콜)에 그라프트될 수 있는 폴리아민, 폴리라이신, 폴리알킬렌이민 및 폴리에틸렌이민 등(이들로 제한되지 않음)과 같은 양이온성 중합체를 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 컨쥬게이트는, 전문이 참조로 본 명세서에 포함되는 미국 특허 제 6,586,524호에 기재된 중합체성 컨쥬게이트 및 중합체성 컨쥬게이트를 합성하는 방법과 유사할 수 있다.
컨쥬게이트는 또한 표적화 기, 예컨대, 세포 혹은 조직 표적화제, 예컨대, 렉틴, 당단백질, 지질 혹은 단백질, 예컨대, 항체, 신장 세포 등과 같은 특정 세포 유형에 결합하는 항체를 포함할 수 있다. 표적화 기는 티로트로핀, 멜라노트로핀, 렉틴, 당단백질, 계면활성제 단백질 A, 뮤신 탄수화물, 다가 락토스, 다가 갈락토스, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-글루코사민 다가 만노스, 다가 푸코스, 글라이코실화 폴리아미노산, 다가 갈락토스, 트랜스페린, 비스포스포네이트, 폴리글루타메이트, 폴리아스파테이트, 지질, 콜레스테롤, 스테로이드, 담즙산, 폴레이트, 비타민 B12, 바이오틴, RGD 펩타이드, RGD 펩타이드 모방체 또는 앱타머일 수 있다.
표적화 기는 단백질, 예컨대, 당단백질 혹은 펩타이드, 예컨대, 공동-리간드(co-ligand)에 대해서 특정 친화도를 지니는 분자, 또는 항체들, 예컨대, 암 세포, 내피세포 혹은 골 세포 등과 같은 특정 세포 유형에 결합되는 항체일 수 있다. 표적화 기는 또한 호르몬 및 호르몬 수용체를 포함할 수 있다. 이들은 또한 비-펩타이드 종, 예컨대, 지질, 렉틴, 탄수화물, 비타민, 보조인자, 다가 락토스, 다가 갈락토스, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-글루코사민 다가 만노스, 다가 푸코스 또는 앱타머를 포함할 수 있다. 리간드, 예를 들어, 지질다당류, 또는 p38 MAP 키나제의 활성제일 수 있다.
표적화 기는 특이적 수용체를 표적화할 수 있는 리간드이면 어느 것이라도 가능하다. 그 예로는, 제한 없이, 폴레이트, GalNAc, 갈락토스, 만노스, 만노스-6P, 아파타머, 인테그린 수용체 리간드, 케모카인 수용체 리간드, 트랜스페린, 바이오틴, 세로토닌 수용체 리간드, PSMA, 엔도텔린, GCPII, 소마스타틴, LDL 및 HDL 리간드를 포함한다. 특정 실시형태에 있어서, 표적화 기는 앱타머이다. 앱타머는 비변형되어 있을 수 있거나, 또는 변형 본 명세서에 개시된 변형의 임의의 조합을 지닐 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은, 잠금 핵산과 유사한 변형 등(이것으로 제한되는 것은 아님)과 같은 화학적 변형을 포함할 수 있다.
산타리스사(Santaris)로부터의 것들과 같은 잠금 핵산(LNA)의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 이하의 것들을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다: 미국 특허 제6,268,490호; 제6,670,461호; 제6,794,499호; 제6,998,484호; 제7,053,207호; 제7,084,125호; 및 제7,399,845호, 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다.
PNA 화합물의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는, 미국 특허 제5,539,082호; 제5,714,331호; 및 제5,719,262호를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니며, 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. PNA 화합물의 추가의 교시는, 예를 들어, 문헌[Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500]에서 찾을 수 있다.
본 발명에서 특징화된 몇몇 실시형태는, 포스포로티오에이트 골격을 지니는 변형된 핵산 또는 mmRNA 및 다른 변형된 골격, 특히 --CH2--NH--CH2--, --CH2--N(CH3)--O--CH2--[메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 골격으로서 공지됨], --CH2--O--N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2-- 및 --N(CH3)--CH2--CH2--여기서 천연의 포스포다이에스터 골격은 --O-P(O)2--O--CH2--로서 표시됨](상기 언급된 미국 특허 제5,489,677호에 기재됨), 및 상기 언급된 미국 특허 제 5,602,240호의 아마이드 골격을 지니는 올리고뉴클레오사이드를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에서의 폴리뉴클레오타이드 특성은 상기 언급된 미국 특허 제5,034,506호의 몰폴리노 골격 구조를 지닌다.
2' 위치에서의 변형은 또한 전달을 도울 수 있다. 바람직하게는, 2' 위치에서의 변형은 폴리펩타이드-암포화 서열 내에 위치되지 않고, 즉, 번역가능한 영역에 위치되지 않는다. 2' 위치에서의 변형은 5' UTR 또는 3' UTR 및/또는 테일링 영역에 위치될 수 있다. 2' 위치에서의 변형은 2' 위치에 이하의 것들 중 하나를 포함할 수 있다: H(즉, 2'-데옥시); F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬, 여기서, 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환된 혹은 비치환된 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐일 수 있다. 예시적인 적절한 변형은 O[(CH2)nO] mCH3, O(CH2).nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2) nCH3, O(CH2)nONH2 및 O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2를 포함하며, 여기서 n 및 m은 1 내지 약 10이다. 다른 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 또는 mmRNA는 2' 위치에 이하의 것들 중 하나를 포함한다: C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 알킬, 알크아릴, 아르알킬, O-알크아릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알크아릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단기, 리포터기, 인터칼레이터, 동학적 특성을 향상시키기 위한 기, 또는 약역학적 특성을 향상시키기 위한 기, 및 유사한 특성을 지니는 기타 치환기. 몇몇 실시형태에 있어서, 변형은 2'-메톡시에톡시(2'-O--CH2CH2OCH3, 또한 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로서 공지됨)(Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78: 486-504), 즉, 알콕시-알콕시기를 포함한다. 다른 예시적인 변형은, 2'-다이메틸아미노옥시에톡시, 즉, 본 명세서에서 이하의 실시예에 기재된 바와 같은, O(CH2)2ON(CH3)2기(2'-DMAOE로서도 알려짐), 및 2'-다이메틸아미노에톡시(또한 당업계에 2'-O-다이메틸아미노에톡시에틸 또는 2'-DMAEOE로서 공지됨), 즉, 본 명세서에서 이하의 실시예에 기재된 바와 같은, 2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2이다. 기타 변형은 2'-메톡시(2'-OCH3), 2'-아미노프로폭시(2'-OCH2CH2CH2NH2) 및 2'-플루오로(2'-F)를 포함한다. 유사한 변형은 또는 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오타이드의 당의 3' 위치 또는 2'-5' 연결된 dsRNA 및 5' 말단 뉴클레오타이드의 5' 위치에서 행해질 수도 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 또한 펜토푸라노실 당 대신에 사이클로뷰틸 모이어티 등과 같은 당 모방체를 지닐 수 있다. 이러한 변형된 당 구조의 제제를 교시하는 대표적인 미국 특허는, 미국 특허 제4,981,957호; 제5,118,800호; 제5,319,080호; 제5,359,044호; 제5,393,878호; 제5,446,137호; 제5,466,786호; 제5,514,785호; 제5,519,134호; 제5,567,811호; 제5,576,427호; 제5,591,722호; 제5,597,909호; 제5,610,300호; 제5,627,053호; 제5,639,873호; 제5,646,265호; 제5,658,873호; 제5,670,633호; 및 제5,700,920호를 포함하지만, 이들로 제한되는 것을 아니며, 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다.
또 다른 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는 세포-침투 폴리펩타이드에 공유결합적으로 컨쥬게이트된다. 세포-침투 펩타이드는 또한 신호 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 컨쥬게이트는 증가된 안정성; 증가된 세포 형질주입; 및/또는 변경된 생물분류(예컨대, 특정 조직 혹은 세포 유형에 표적화된)를 지니도록 설계될 수 있다.
자체-조립된 나노입자
핵산 자체-조립된 나노입자
자체-조립된 나노입자는, 핵산 가닥들이 용이하게 재프로그래밍가능하게 될 수 있으므로 잘 규정된 크기를 지닌다. 예를 들어, 암-표적화된 나노전달 담체에 대한 최적 입자 크기는, 20 내지 100㎚인 데, 그 이유는, 20㎚보다 큰 직경이 신장 클리어런스(renal clearance)를 피하고 증대된 투과율 유지 효과를 통해서 소정의 종양으로의 전달을 증대시키기 때문이다. 자체-조립된 핵산 나노입자를 이용해서, 증대된 전달을 위하여 암-표적화된 리간드의 정밀하게 제어된 공간적 배향 및 밀도를 지니는 크기와 형상의 단일의 균일한 집단. 비제한적인 예로서, 올리고뉴클레오타이드 나노입자는 짧은 DNA 단편 및 치료적 siRNA의 프로그래밍가능한 자체-조립체를 이용해서 제조되었다. 이들 나노입자는 제어가능한 입자 크기와 표적 리간드 개소 및 밀도와 분자적으로 동일하다. DNA 단편 및 siRNA는 표적화된 생체내 전달을 위한 DNA/siRNA 4면체 나노입자를 생성하는 1-단계 반응으로 자체-조립된다(Lee et al., Nature Nanotechnology 2012 7: 389-393; 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
일 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 변형된 핵산 분자 및 mmRNA는 자체-조립된 나노입자로서 제형화될 수 있다. 비제한적인 예로서, 핵산은 본 발명의 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA용의 전달 시스템에 이용될 수 있는 나노입자를 제조하는데 이용될 수 있다(예컨대, 국제 특허 공개 제WO2012125987호 참조; 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
일 실시형태에 있어서, 핵산자체-조립된 나노입자는 본 명세서에 개시된 변형된 변형된 핵산 분자 및 mmRNA의 코어와, 중합체 쉘을 포함할 수 있다. 중합체 쉘은 본 명세서에 기재되고 당업계에 공지된 중합체의 어느 하나일 수 있다. 추가의 실시형태에 있어서, 중합체 쉘은 코어 내의 변형된 핵산 분자 및 mmRNA를 보호하기 위하여 이용될 수 있다.
중합체계 자체 조립 나노입자
중합체는 나노입자로 자체-조립되는 시트를 형성하는데 이용될 수 있다. 이들 나노입자는 본 발명의 변형된 핵산 및 mmRNA를 전달하는데 이용될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 이들 자체-조립된 나노입자는, 마이크로스펀지로 자체-조립되기 전에 결정성의 "주름진" 시트로 형성되는 RNA 헤어핀의 긴 중합체로 형성된 마이크로스펀지일 수 있다. 이들 마이크로스펀지는 유효한 담체로서 기능할 수 있고 세포에 적재물(cargo)을 전달할 수 있는 마이크로입자와 같은 치밀하게 채워진 스펀지이다. 마이크로스펀지는 직경이 1㎛ 내지 300㎚일 수 있다. 마이크로스펀지는 당업계에 공지된 기타 제제와 복합화되어 보다 큰 마이크로스펀지를 형성할 수 있다. 비제한적인 예로서, 마이크로스펀지는 다가양이온 폴리에틸렌이민(PEI) 등과 같은 세포 흡수를 촉진시키는 외부층을 형성하는 제제와 복합화될 수 있다. 이복합체는 250-㎚의 직경 입자를 형성할 수 있고, 이것은 고온(150℃)에서 안정하게 유지될 수 있다(Grabow and Jaegar, Nature Materials 2012, 11: 269-269; 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 부가적으로 이들 마이크로스펀지는 리보뉴클레아제에 의한 분해로부터 놀라운 정도의 보호를 발휘할 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 마이크로스펀지 등(이것으로 제한되지 않음)과 같은 중합체계 자체-조립된 나노입자는 완전히 프로그래밍가능한 나노입자일 수 있다. 나노입자의 기하 형태 및 입체화학은, 변형된 핵산 분자 및 mmRNA 등(이들로 제한되지 않음)과 같은 적재물의 전달용의 최적의 나노입자를 작성하도록 정밀하게 제어될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 중합체계 나노입자는 본 명세서에 개시된 변형된 핵산 분자 및 mmRNA의 코어와, 중합체 쉘을 포함할 수 있다. 중합체 쉘은 본 명세서에 기재되고 당업계에 공지된 중합체의 어느 하나일 수 있다. 추가의 실시형태에 있어서, 중합체 쉘은 코어 내의 변형된 핵산 분자 및 mmRNA를 보호하기 위하여 이용될 수 있다.
무기 나노입자
본 발명의 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는 무기 나노입자로 제형화될 수 있다(미국 특허 제8,257,745호, 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 무기 나노입자는 팽윤 가능한 점토 물질을 포함할 수 있지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 비제한적인 예로서, 무기 나노입자는 단순한 실리케이트로 제조된 합성 스멕타이트 점토를 포함할 수 있다(예컨대, 미국 특허 제5,585,108호 및 제8,257,745호 참조, 이들의 각각은 모두 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
일 실시형태에 있어서, 지질 나노입자는 본 명세서에 개시된 변형된 핵산의 코어와, 중합체 쉘을 포함할 수 있다. 중합체 쉘은 본 명세서에 기재되고 당업계에 공지된 중합체의 어느 하나일 수 있다. 추가의 실시형태에 있어서, 중합체 쉘은 코어 내의 변형된 핵산을 보호하기 위하여 이용될 수 있다.
반도체 및 금속 나노입자
본 발명의 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는 반도체 혹은 금속 재료를 포함하는 수-분산성 나노입자로 제형화될 수 있거나(미국 특허 공개 제20120228565호; 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함됨), 또는 자기 나노입자로 형성될 수 있다(미국 특허 공개 제20120265001호 및 제20120283503호; 이들의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 수-분산성 나노입자는 소수성 나노입자 또는 친수성 나노입자일 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 반도체 및/또는 금속 나노입자는 본 명세서에 개시된 변형된 핵산의 코어와, 중합체 쉘을 포함할 수 있다. 중합체 쉘은 본 명세서에 기재되고 당업계에 공지된 중합체의 어느 하나일 수 있다. 추가의 실시형태에 있어서, 중합체 쉘은 코어 내의 변형된 핵산을 보호하기 위하여 이용될 수 있다.
겔 및 하이드로겔
일 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 변형된 mRNA는, 대상체에게 주입될 경우 겔을 형성할 수 있는 당업계에 공지된 임의의 하이드로겔 내로 봉입될 수 있다. 하이드로겔은, 친수성인 중합체 사슬의 망이며, 물이 분산매질인 콜로이드성 겔로서 때로 발견된다. 하이드로겔은 고도의 흡수제(이는 99% 이상의 물을 함유할 수 있음) 천연 또는 합성 중합체이다. 하이드로겔은 또한 그의 상당한 수분 함량으로 인해 천연 조직과 매우 유사한 유연도를 지닌다. 본 명세서에 기재된 하이드로겔은 생체적합성, 생분해성 및/또는 다공성인 지질 나노입자를 봉입하는데 이용될 수 있다.
비제한적인 예로서, 하이드로겔은 앱타머-작용화 하이드로겔일 수 있다. 앱타머-작용화 하이드로겔은 핵산 혼성화를 이용해서 하나 이상의 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA를 방출하도록 프로그래밍되어 있을 수 있다(Battig et al., J. Am. Chem. Society. 2012 134: 12410-12413] 참조; 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
다른 비제한적인 예로서, 하이드로겔은 역전된 오팔로서 정형화되어 있을 수 있다. 오팔 하이드로겔은 보다 높은 팽윤비를 나타내며, 팽윤 역학 또한 더 빠른 크기의 차수이다. 오팔 하이드로겔을 생성하는 방법 및 오팔 하이드로겔의 설명은 국제 특허 공개 제WO2012148684호에 기재되어 있으며, 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다.
또 다른 비제한적인 예에 있어서, 하이드로겔은 항균성 하이드로겔일 수 있다. 항균성 하이드로겔은 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 유기 재료, 예컨대, 약제학적 등급 및/또는 의료 등급의 은염 및 알로에베라겔 혹은 추출물(이들로 제한되지 않음)을 포함할 수 있다(국제 특허 공개 제WO2012151438, 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
일 실시형태에 있어서, 변형된 mRNA는 지질 나노입자 내에 봉입될 수 있고, 이어서 지질 나노입자가 하이드로겔 내로 봉입될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 변형된 mRNA는 당업계에 공지된 임의의 겔 내로 봉입될 수 있다. 비제한적인 예로서, 겔은 플루오로유라실 주사가능 겔 또는 당업계에 공지된 화학적 화합물 및/또는 약물을 함유하는 플루오로유라실 주사가능 겔일 수 있다. 다른 예로서, 변형된 mRNA는 에피네프린을 함유하는 플루오로유라실 겔 내에 봉입될 수 있다(예컨대, 문헌[Smith et al. Cancer Chemotherapty and Pharmacology, 1999 44(4): 267-274] 참조; 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
일 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA는 피브린 겔, 피브린 하이드로겔 또는 피브린 글루 내로 봉입될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA는 피브린 겔, 피브린 하이드로겔 또는 피브린 글루 내로 봉입되기 전에 지질 나노입자 혹은 신속 제거형 지질 나노입자로 제형화될 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA는 피브린 겔, 피브린 하이드로겔 또는 피브린 글루 내로 봉입되기 전에 리포플렉스로서 제형화될 수 있다. 피브린 겔, 하이드로겔 및 글루는 2가지 성분인, 피브리노겐 용액과 칼슘이 풍부한 트롬빈 용액을 포함한다(예컨대, 문헌[Spicer and Mikos, Journal of Controlled Release 2010. 148:49-55; Kidd et al. Journal of Controlled Release 2012. 157:80-85] 참조; 이들의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 피브린 겔, 하이드로겔 및/또는 글루의 성분들의 농도는, 피브린 겔, 하이드로겔 및/또는 글루의 방출 특징을 변화시키는 등(이로써 제한되는 것은 아님)과 같은 겔, 하이드로겔 및/또는 글루의 특징, 망 메쉬 크기 및/또는 분해 특징을 변화시키기 위하여 변경될 수 있다(예컨대, 문헌[Spicer and Mikos, Journal of Controlled Release 2010. 148:49-55; Kidd et al. Journal of Controlled Release 2012. 157:80-85; Catelas et al. Tissue Engineering 2008. 14:119-128] 참조; 이들의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 이 특징은 본 명세서에 개시된 변형된 mRNA를 전달하는데 이용될 경우 유리할 수 있다(예컨대, 문헌[Kidd et al. Journal of Controlled Release 2012. 157:80-85; Catelas et al. Tissue Engineering 2008. 14:119-128] 참조; 이들의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
양이온 및 음이온
본 명세서에 개시된 변형된 핵산 분자의 제형은 양이온 혹은 음이온을 포함할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 제형은, Zn2+, Ca2+, Cu2+, Mg+ 및 이들의 조합 등(이것으로 제한되지 않음)과 같은 금속 양이온을 포함한다. 비제한적인 예로서, 제형은 금속 양이온과 복합화된 변형된 mRNA 및 중합체를 포함할 수 있다(예컨대, 미국 특허 제6,265,389호 및 제6,555,525호 참조, 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
성형된 나노입자 및 마이크로입자
본 명세서에 개시된 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA는 나노입자 및/또는 마이크로입자로 제형화될 수 있다. 이들 나노입자 및/또는 마이크로입자는 임의의 크기 형상 및 화학으로 성형될 수 있다. 일례로서, 나노입자 및/또는 마이크로입자는, 리퀴다 테크놀로지즈(LIQUIDA TECHNOLOGIES)®(노스캐롤라이나주의 모리스빌시에 소재)에 의한 프린트(PRINT)® 기술을 이용해서 제조될 수 있다(예컨대, 국제 특허 공개 제WO2007024323호 참조; 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
일 실시형태에 있어서, 변형된 나노입자는 본 명세서에 개시된 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA의 코어와, 중합체 쉘을 포함할 수 있다. 중합체 쉘은 본 명세서에 기재되고 당업계에 공지된 중합체의 어느 하나일 수 있다. 추가의 실시형태에 있어서, 중합체 쉘은 코어 내의 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA를 보호하기 위하여 이용될 수 있다.
나노재킷 및 나노리포솜
본 명세서에 개시된 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA는 키스톤 나노(Keystone Nano)사(펜실베니아주의 스테이트 칼리지에 소재)에 의한 나노재킷 및 나노리포솜으로 제형화될 수 있다. 나노재킷은 칼슘, 포스페이트를 포함하는 체내에서 자연적으로 발견되는 화합물로 만들어지고, 또한 소량의 실리케이트를 포함할 수 있다. 나노재킷은 크기 5 내지 50㎚의 범위일 수 있고, 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA 등(이것으로 제한되지 않음)과 같은 친수성 및 소수성 화합물을 전달하는데 이용될 수 있다.
나노리포솜은, 체내에서 자연적으로 생기는 지질 등(이것으로 제한되지 않음)과 같은 지질로 만들어진다. 나노리포솜은, 60 내지 80㎚의 범위일 수 있고, 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA 등(이것으로 제한되지 않음)과 같은 친수성 및 소수성 화합물을 전달하는데 이용될 수 있다. 일 양상에 있어서, 본 명세서에 개시된 변형된 핵산은, 세라마이드 나노리포솜 등(이것으로 제한되지 않음)과 같은 나노리포솜으로 제형화된다.
부형제
약제학적 제형은, 원하는 특정 투약 형태에 적합한 바와 같은, 본 명세서에서 이용되는 바와 같은, 임의의 모든 용매, 분산 매체, 희석제, 혹은 기타 액체 비히클, 분산 혹은 현탁 조제, 표면 활성제, 등장제, 증점 혹은 유화제, 방부제, 고체 결착제, 윤활제 등을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아닌, 약제학적으로 허용가능한 부형제를 부가적으로 포함할 수 있다. 약제학적 조성물을 제형화하기 위한 각종 부형제 및 조성물을 제조하기 위한 수법은 당업계에 공지되어 있다(문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006] 참조; 이들 문헌은 모두 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 종래의 부형제 매질의 이용은, 임의의 종래의 부형제 매질이 약제학적 조성물의 임의의 기타 성분(들)에 의해 유해한 방식으로 상호작용하거나 또는 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과는 내는 등과 같이, 물질 혹은 그의 유도체와 공존할 수 없는 경우를 제외하고, 본 발명의 개시내용의 범위 내인 것으로 간주될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 부형제는 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 순수할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 부형제는 인간 및 수의과 용도용으로 이용하기 위하여 승인되어 있을 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 부형제는 미국 미국식품의약관리국에 의해 승인되어 있을 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 부형제는 약제학적 등급일 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 부형제는 미국 약전(USP), 유럽 약전(EP), 영국 약전 및/또는 국제 약전의 표준에 부응할 수 있다.
약제학적 조성물의 제조에서 이용되는 약제학적으로 허용가능한 부형제는, 비활성 희석제, 분산 및/또는 과립화제, 표면 활성제 및/또는 유화제, 붕해제, 결착제, 방부제, 완충제, 윤활제 및/또는 오일을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 이러한 부형제는 선택적으로 약제학적 제형에 포함될 수 있다. 조성물은 또한 코코아 버터 및 좌제 왁스, 착색제, 코팅제, 감미제, 풍미제 및/또는 방향제 등과 같은 부형제를 포함할 수 있다.
예시적인 희석제로는, 탄산칼슘, 탄산나트륨, 인산칼슘, 인산이칼슘, 황산칼슘, 칼슘 수소 포스페이트, 나트륨 포스페이트 락토스, 수크로스, 셀룰로스, 미세결정성 셀룰로스, 카올린, 만니톨, 솔비톨, 이노시톨, 염화나트륨, 건조 전분, 옥수수전분, 분말당, 등, 및/또는 이들의 조합물을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
예시적인 과립화 및/또는 분산제로는, 감자 전분, 옥수수 전분, 타피오카 전분, 나트륨 전분 글라이콜레이트, 점토, 알긴산, 구아 검, 시트러스 펄프, 한천, 벤토나이트, 셀룰로스 및 목재 제품, 천연의 스펀지, 양이온-교환 수지, 탄산칼슘, 실리케이트, 탄산나트륨, 가교결합된 폴리(비닐-피롤리돈)(크로스포비돈), 소듐 카복시메틸 전분(나트륨 전분 글라이콜레이트), 카복시메틸 셀룰로스, 가교결합된 소듐 카복시메틸 셀룰로스(크로스카멜로스), 메틸셀룰로스, 전호화 전분(전분 1500), 미세결정성 전분, 수 불용성 전분, 칼슘 카복시메틸 셀룰로스, 마그네슘 알루미늄 실리케이트(비검(VEEGUM)®), 라우릴황산나트륨, 4급 암모늄 화합물, 등 및/또는 이들의 조합물을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
예시적인 표면 활성제 및/또는 유화제로는, 천연의 유화제(예컨대 아카시아, 한천, 알긴산, 알긴산나트륨, 트래거캔트, 콘드룩스, 콜레스테롤, 잔탄, 펙틴, 젤라틴, 난황, 카제인, 양모지, 콜레스테롤, 왁스 및 레시틴), 콜로이드성 점토(예컨대 벤토나이트[알루미늄 실리케이트] 및 비검(VEEGUM)®[마그네슘 알루미늄 실리케이트]), 장쇄 아미노산 유도체, 고분자량 알코올(예컨대 스테아릴 알코올, 세틸 알코올, 세틸 알코올, 올레일 알코올, 트라이아세틴 모노스테아레이트, 에틸렌 글라이콜 다이스테아레이트, 글라이세릴 모노스테아레이트 및 프로필렌 글라이콜 모노스테아레이트, 폴리비닐 알코올), 카보머(예컨대 카복시 폴리메틸렌, 폴리아크릴산, 아크릴산 중합체, 및 카복시비닐 중합체), 카라기난, 셀룰로스 유도체(예컨대 카복시메틸셀룰로스 나트륨, 분체화 셀룰로스, 하이드록시메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스), 솔비탄 지방산 에스터(예컨대 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노라우레이트[트윈(TWEEN)®20], 폴리옥시에틸렌 솔비탄[트윈(TWEEN)®60], 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노올레에이트[트윈(TWEEN)®80], 솔비탄 모노팔미테이트[스판(SPAN)®40], 솔비탄 모노스테아레이트[스판(SPAN)®60], 솔비탄 트라이스테아레이트[스판(SPAN)®65], 글라이세릴 모노올레에이트, 솔비탄 모노올레에이트[스판(SPAN)®80]), 폴리옥시에틸렌 에스터(예컨대 폴리옥시에틸렌 모노스테아레이트[MYRJ®45], 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 폴리에톡실화 피마자유, 폴리옥시메틸렌 스테아레이트 및 솔루톨(SOLUTOL)®), 수크로스 지방산 에스터, 폴리에틸렌 글라이콜 지방산 에스터(예컨대 크레모포(CREMOPHOR)®), 폴리옥시에틸렌 에터(예컨대 폴리옥시에틸렌 라우릴 에터[BRIJ®30]), 폴리(비닐-피롤리돈), 다이에틸렌 글라이콜 모노라우레이트, 트라이에탄올아민 올레에이트, 올레산나트륨, 올레산칼륨, 올레산에틸, 올레산, 에틸 라우레이트, 라우릴황산나트륨, 플루로닉(PLUORINC)®F 68, 폴록사머(POLOXAMER)® 188, 세트리모늄 브로마이드, 염화세틸피리디늄, 염화벤잘코늄, 도큐세이트 나트륨, 등 및/또는 이들의 조합물을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
예시적인 결착제로는, 전분(예컨대 옥수수전분 및 전분 페이스트); 젤라틴; 당(예컨대 수크로스, 글루코스, 덱스트로스, 덱스트린, 당밀, 락토스, 락티톨, 만니톨); 천연 및 합성 검(예컨대 아카시아, 나트륨 알지네이트, 아이리쉬 모스(Irish moss)의 추출물, 판와 검(panwar gum), 가티 검, 이사폴 허스크(isapol husk)의 점액질, 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 미세결정성 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 폴리(비닐-피롤리돈), 마그네슘 알루미늄 실리케이트(비검(VEEGUM)®), 및 라치 아라보갈락탄(larch arabogalactan); 알지네이트; 폴리에틸렌 옥사이드; 폴리에틸렌 글라이콜; 무기 칼슘염; 규산; 폴리메타크릴레이트; 왁스; 물; 알코올 등; 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
예시적인 방부제로는, 항산화제, 킬레이트제, 항균성 방부제, 항진균성 방부제, 알코올 방부제, 산성 방부제, 및/또는 기타 방부제를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 예시적인 항산화제로는, 알파 토코페롤, 아스코르브산, 아코빌 팔미테이트, 뷰틸화 하이드록시아니솔, 뷰틸화 하이드록시톨루엔, 모노티오글라이세롤, 메타중아황산칼륨, 프로판산, 프로필 갈레이트, 아스코르브산나트륨, 중아황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 및/또는 아황산나트륨을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 예시적인 킬레이트제로는 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA), 시트르산 1수화물, 에데트산이나트륨, 에테트산이칼륨, 에데트산, 푸말산, 말산, 인산, 에데트산나트륨, 타르타르산 및/또는 에데트산삼나트륨을 포함한다. 예시적인 항균성 방부제로는, 염화벤잘코늄, 염화벤제토늄, 벤질 알코올, 브로노폴, 세트리마이드, 염화세틸피리디늄, 클로르헥시딘, 클로로뷰탄올, 클로로크레졸, 클로로자일레놀, 크레졸, 에틸 알코올, 글라이세린, 헥세티딘, 이미드유레아, 페놀, 페녹시에탄올, 페닐에틸 알코올, 질산페닐수은(phenylmercuric nitrate), 프로필렌 글라이콜 및/또는 티메로살을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 예시적인 항진균성 방부제로는, 뷰틸 파라벤, 메틸 파라벤, 에틸 파라벤, 프로필 파라벤, 벤조산, 하이드록시벤조산, 칼륨 벤조에이트, 칼륨 솔베이트, 벤조산나트륨, 프로피온산나트륨 및/또는 솔브산을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 예시적인 알코올 방부제로는, 에탄올, 폴리에틸렌 글라이콜, 페놀, 페놀 화합물, 비스페놀, 클로로뷰탄올, 하이드록시벤조에이트 및/또는 페닐에틸 알코올을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 예시적인 산성 방부제로는, 비타민 A, 비타민 C, 비타민 E, 베타-카로텐, 시트르산, 아세트산, 데하이드로아세트산, 아스코르브산, 솔브산 및/또는 피트산을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 기타 방부제로는, 토코페롤, 토코페롤 아세테이트, 데테록심 메실레이트, 세트리마이드, 뷰틸화 하이드록시아니솔(BHA), 뷰틸화 하이드록시톨루엔(BHT), 에틸렌다이아민, 라우릴황산나트륨(SLS), 라우릴 에터 황산나트륨(SLES), 중아황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산칼륨, 메타중아황산칼륨, 글라이던트 플러스(GLYDANT PLUS)®, 페노닙(PHENONIP)®, 메틸파라벤, 저몰(GERMALL)®115, 저마벤(GERMABEN)®II, 네올론(NEOLONE)™, 카톤(KATHON)™ 및/또는 유실(EUXYL)®을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
예시적인 완충제로는, 시트르산염 완충 용액, 아세트산염 완충 용액, 인산염 완충 용액, 암모늄 클로라이드, 탄산칼슘, 염화칼슘, 시트르산칼슘, 칼슘 글루바이오네이트, 칼슘 글루셉테이트, 칼슘 글루코네이트, d-글루콘산, 칼슘 글라이세로포스페이트, 락트산칼슘, 프로판산, 레불린산칼슘, 펜탄산, 제2인산칼슘, 인산, 제3인산칼슘, 칼슘 하이드록사이드 포스페이트, 아세트산 칼륨, 염화칼륨, 칼륨 글루코네이트, 칼륨 혼합물, 제2인산칼륨, 제1인산칼륨, 인산칼륨 혼합물, 아세트산나트륨, 중탄산나트륨, 염화나트륨, 시트르산나트륨, 락트산나트륨, 제2인산나트륨, 제1인산나트륨, 인산나트륨 혼합물, 트로메타민, 수산화마그네슘, 수산화알루미늄, 알긴산, 발열성 물질 무함유 물(pyrogen-free water), 등장성 식염수, 링거 용액, 에틸 알코올, 등, 및/또는 이들의 조합물을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
예시적인 윤활제로는, 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 스테아르산, 실리카, 탤크, 맥아, 글라이세릴 베헤네이트, 수소화 식물성 오일, 폴리에틸렌 글라이콜, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 류신, 라우릴황산마그네슘, 라우릴황산나트륨, 등, 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
예시적인 오일로는, 아몬드, 행인(apricot kernel), 아보카도, 바바쑤(babassu), 베르가못(bergamot), 블랙 커런트 종자(black current seed), 서양지치, 두송(cade), 카모밀레(camomile), 카놀라, 캐러웨이(caraway), 카르나우바(carnauba), 피마자, 신나몬, 코코아 버터, 코코넛, 대구 간, 커피, 옥수수, 목화씨, 에뮤(emu), 유칼립투스, 달맞이꽃, 어류, 아마씨, 게라니올(geraniol), 박, 포도씨, 개암(hazel nut), 히솝풀(hyssop), 이소프로필 미리스테이트, 호호바(jojoba), 쿠쿠이 너트(kukui nut), 라반딘(lavandin), 라벤더, 레몬, 릿세아 쿠베바(litsea cubeba), 마카데미아 견과(macademia nut), 아욱, 망고 종자, 메도우폼 종자(meadowfoam seed), 밍크, 육두구(nutmeg), 올리브, 오렌지, 오렌지 러피(orange roughy), 야자, 야자핵, 복숭아 핵, 땅콩, 양귀비 종자, 호박 종자, 평지씨, 쌀겨, 로즈마리, 잇꽃, 백단, 사스쿠아나(sasquana), 사보우리(savoury), 산자나무, 참깨, 시어 버터(shea butter), 실리콘, 대두, 해바라기꽃, 차 나무, 엉겅퀴, 동백, 베티베르풀(vetiver), 호두, 및 맥아 오일을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 예시적인 오일로는, 뷰틸 스테아레이트, 카프릴 트라이글라이세라이드, 카프르 트라이글라이세라이드, 사이클로메티콘, 다이에틸 세바케이트, 다이메티콘 360, 아이소프로필 미리스테이트, 미네랄 오일, 옥틸도데칸올, 올레일 알코올, 실리콘 오일, 및/또는 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
코코아 버터 및 좌제 왁스, 착색제, 코팅제, 감미, 향료 및/또는 방향제 등과 같은 부형제는 조제자의 판단에 따라서 조성물에 존재할 수 있다.
전달
본 발명의 개시내용은 약물 전달의 과학에서 진행 중인 것으로 고려되고 있는 임의의 적절한 경로에 의해 치료, 약제학, 진단 혹은 영상의 어느 것을 위하여 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA의 전달을 망라한다. 전달은 네이키드 혹은 제형화되어 있을 수 있다.
네이키드 전달(Naked Delivery)
본 발명의 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는 네이키드 세포로 전달될 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "네이키드"(naked)란 형질주입을 촉진시키는 제제가 없이 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA를 전달하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 세포에 전달되는 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는 변형을 포함하지 않을 수 있다. 네이키드 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는 당업계에 공지되고 본 명세서에 기재된 투여 경로를 이용해서 세포에 전달될 수 있다.
제형화된 전달(Formulated Delivery)
본 발명의 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는 본 명세서에 기재된 방법을 이용해서 제형화될 수 있다. 제형은 변형 및/또는 비변형되어 있을 수 있는 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA를 포함할 수 있다. 제형은, 세포 침투제, 약제학적으로 허용가능한 담체, 전달제, 생체침식성 또는 생체적합성 중합체, 용매, 및 지속-방출 전달 데포를 더 포함할 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 제형화된 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는 당업계에 공지되고 본 명세서에 기재된 투여 경로를 이용해서 세포에 전달될 수 있다.
조성물은 또한 조성물 등으로 피복되거나 함침된 직물 혹은 생분해성 재료 등과 같은 물질을 이용해서, 카테터를 통해서, 겔, 분말, 연고, 크림, 겔, 로션 및/또는 점적에 의해 직접 침지 혹은 입욕(bathing) 등을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 임의의 여러 방법으로 장기 혹은 조직에 직접 전달하기 위하여 제형화될 수 있다.
투여
본 발명의 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는 치료적으로 유효한 성과를 가져오는 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다. 이들은 경장(enteral), 위장, 경막외, 경구, 경피, 경막외(경막 주위), 뇌내(대뇌 내로), 심실내(뇌의 심실 내로), 에피큐테니우스(epicutaneous)(피부 상에 도포), 진피내(피부 자체 내로), 피하(피부 밑), 비강 투여(코를 통해서), 정맥내(정맥 내로), 동맥내(동맥 내로), 근육내(근육 내로), 심장내(심장 내로), 골질내 주입(골수 내로), 척수강내(척추관 내로), 복강내(복막내로 주입 또는 주사), 방광내 주입, 유리체내(눈을 통해서), 해면체내 주사(음경의 기부 내로), 질내 투여, 자궁내, 양수외 투여, 경피(전신 분포를 위하여 온전한 피부를 통한 확산), 경점막(점막을 통한 확산), 흡입(코로 흡입), 설하, 입술밑, 관장, 점안제(결막 상으로), 또는 귀약으로를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 특정 실시형태에 있어서, 조성물은 혈액 뇌 관문, 혈관 장벽 혹은 기타 상피 장벽을 가로지를 수 있도록 하는 방식으로 투여될 수 있다. 본 발명의 변형된 핵산 또는 mmRNA에 대한 비제한적인 투여 경로는 이하에 기술되어 있다.
비경구 및 주사 투여
비경구 투여용의 액체 투약 형태는 약제학적으로 허용가능한 에멀전, 마이크로에멀전, 용액, 현탁액, 시럽 및/또는 엘릭시르를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 활성 성분에 부가해서, 액체 투약 형태는, 예를 들어, 물 혹은 기타 용매, 가용화제 및 유화제, 예컨대, 에틸 알코올, 아이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글라이콜, 1,3-뷰틸렌 글라이콜, 다이메틸폼아마이드, 오일류(특히 면실유, 땅콩유, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유 및 참기름), 글라이세롤, 테트라하이드로푸르푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글라이콜 및 솔비탄의 지방산 에스터, 그리고 이들의 혼합물 등과 같은 당업계에서 통상적으로 이용되는 비활성 희석제를 포함할 수 있다. 비활성 희석제 이외에, 경구조성물은 습윤제, 유화 및 현탁제, 감미제, 풍미제 및/또는 방향제 등과 같은 애주번트를 포함할 수 있다. 비경구 투여를 위한 소정의 실시형태에 있어서, 조성물은 크레모포(CREMOPHOR)®, 알코올, 오일, 변성유, 글라이콜, 폴리솔베이트, 사이클로덱스트린, 중합체, 및/또는 이들의 조합물 등과 같은 가용화제와 혼합된다.
주사가능한 제제, 예를 들어, 멸균성의 주사가능한 수성 혹은 유성 현탁액은, 적절한 분산제, 습윤제 및/또는 현탁제를 이용해서 당업계에 따라서 조제될 수 있다. 멸균성의 주사가능한 제제는, 예를 들어, 1,3-뷰탄다이올의 용액으로서, 비독성의 비경구적으로 허용가능한 희석제 및/또는 용매 중 멸균성의 주사가능한 용액, 현탁액, 및/또는 에멀전일 수 있다. 이용될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매 중에는 물, 링거액, U.S.P. 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 멸균성의 고정 오일(fixed oil)은 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 사용된다. 이 목적을 위하여, 합성 모노- 또는 다이글라이세라이드를 포함하는 어떠한 배합물 고정된 오일도 사용될 수 있다. 올레산과 같은 지방산이 주사가능한 제제에 사용될 수 있다.
주사가능한 제형은, 예를 들어, 세균 보유 여과기를 통한 여과에 의해, 및/또는 사용 전에 멸균수 또는 다른 멸균 주사가능한 매질 속에 용해되거나 분산될 수 있는 멸균 고체 조성물의 형태로 멸균화제를 혼입시킴으로써 멸균될 수 있다.
활성 성분의 효과를 연장시키기 위하여, 종종 피하 혹은 근육내 주사로부터 활성 성분의 흡수를 늦추는 것이 바람직하다. 이것은 난수용성을 가진 결정성 혹은 비정질 물질의 액체 현탁액의 이용에 의해 달성될 수 있다. 이어서, 약물의 흡수율은, 최종적으로 결정 크기 및 결정성 형태에 의존할 수 있는, 그의 용해율에 의존한다. 대안적으로, 비경구적으로 투여되는 약물 형태의 지연된 흡수는 오일 비히클 중에 약물을 용해 혹은 현탁시킴으로써 달성된다. 주사가능한 데포 형태는 폴리락타이드-폴리글라이콜라이드 등과 같은 생분해성 중합체 중에 약물의 미세봉입 매트릭스를 형성함으로써 제조된다. 약물 대 중합체의 비 및 이용되는 특정 중합체의 속송에 따라서, 약물 방출의 비율이 제어될 수 있다. 기타 생분해성 중합체의 예로는 폴리(오쏘에스터) 및 폴리(안하이드라이드)를 포함한다. 데포 주사가능한 제형은 체 조직과 거부반응을 일으키지 않는 리포솜 혹은 마이크로에멀전 중에 약물을 포획함으로써 제조된다.
직장 및 질 투여
직장 혹은 질 투여용의 조성물은, 전형적으로, 조성물을, 고체 분위기 온도에서 고체이지만 체온에서 액체이므로 직장 혹은 질강에서 녹아서 활성 성분을 방출하는, 적절한 비제한적인 부형제, 예컨대, 코코아 버터, 폴리에틸렌 글라이콜 또는 좌제 왁스와 혼합함으로써 제조될 수 있는 좌제이다.
경구 투여
경구 투여용의 액체 투약 형태는 약제학적으로 허용가능한 에멀전, 마이크로에멀전, 용액, 현탁액, 시럽 및/또는 엘릭시르를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 활성 성분에 부가해서, 액체 투약 형태는, 예를 들어, 물 혹은 기타 용매, 가용화제 및 유화제, 예컨대, 에틸 알코올, 아이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글라이콜, 1,3-뷰틸렌 글라이콜, 다이메틸폼아마이드, 오일류(특히 면실유, 땅콩유, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유 및 참기름), 글라이세롤, 테트라하이드로푸르푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글라이콜 및 솔비탄의 지방산 에스터, 그리고 이들의 혼합물 등과 같은 당업계에서 통상적으로 이용되는 비활성 희석제를 포함할 수 있다. 비활성 희석제 이외에, 경구조성물은 습윤제, 유화 및 현탁제, 감미제, 풍미제 및/또는 방향제 등과 같은 애주번트를 포함할 수 있다. 비경구 투여를 위한 소정의 실시형태에 있어서, 조성물은 크레모포(CREMOPHOR)®, 알코올, 오일, 변성유, 글라이콜, 폴리솔베이트, 사이클로덱스트린, 중합체, 및/또는 이들의 조합물 등과 같은 가용화제와 혼합된다.
경구 투여용의 고체 투약 형태는 캡슐, 정제, 환제, 분말 및 과립을 포함한다. 이러한 고체 투약 형태에 있어서, 활성 성분은 적어도 하나의 비활성의, 약제학적으로 허용가능한 부형제, 예컨대, 시트르산나트륨 또는 인산이칼슘 및/또는 충전제 또는 증량제(예컨대 전분, 락토스, 수크로스, 글루코스, 만니톨 및 규산), 결착제(예컨대 카복시메틸셀룰로스, 알지네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 수크로스 및 아카시아), 보습제(예컨대 글라이세롤), 붕해제(예컨대 한천, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 소정의 실리케이트 및 탄산나트륨), 용액 지연제(예컨대 파라핀), 흡수 촉진제(예컨대 4급 암모늄 화합물), 습윤제(예컨대 세틸 알코올 및 글라이세롤 모노스테아레이트), 흡수제(예컨대 카올린 및 벤토나이트 점토), 및 윤활제(예컨대 탤크, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글라이콜, 라우릴황산나트륨), 및 이들의 혼합물과 혼합된다. 캡슐, 정제 및 환제의 경우에, 투약 형태는 완충제를 포함할 수 있다.
국소 또는 경피 투여
본 명세서에 기재된 바와 같은, 본 발명의 변형된 핵산 분자 및/또는 mmRNA를 함유하는 조성물은 국소적으로 투여하기 위하여 제형화될 수 있다. 피부는 용이하게 접근가능하므로 전달을 위한 이상적인 표적 부위일 수 있다. 유전자 발현은, 비특이적 독성을 잠재적으로 피하는 피부로 제한될 뿐만 아니라, 피부 내 특정 층 및 세포 유형으로 제한될 수도 있다.
전달된 조성물의 피부 발현의 부위는 핵산 전달 경로에 의존할 것이다. 3가지 경로, 즉, (i) 국소 적용(예컨대 국소/지역적 치료를 위하여); (ii) 진피내 주사(예컨대 국소/지역적 치료를 위하여); 및 (iii) 전신 전달(예컨대 진피 영역과 진피외 영역의 양쪽 모두에 영향을 미치는 피부 질환의 치료를 위하여)은, 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA를 피부에 전달하는 것으로 통상 여겨진다. 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는 당업계에 공지된 수개의 상이한 접근법에 의해 피부에 전달될 수 있다. 대부분의 국소 전달 접근법은, 비-양이온성 리포솜-DNA 복합체, 양이온성 리포솜-DNA 복합체, 입자-매개(유전자 총), 천자-매개 유전자 형질주입, 및 바이러스 전달 접근법의 국소 적용 등(이들로 제한되지 않음)과 같은 DNA의 전달을 위하여 작용하는 것으로 제시된 바 있다. 핵산의 전달 후, 유전자 산물은, 기저 각질세포, 피지선 세포, 진피 섬유아세포 및 피부 대식세포를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 다수의 많은 피부 세포 유형에서 검출된 바 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 방법을 편리하게 및/또는 효과적으로 수행하기 위한 각종 드레싱(예컨대, 상처 드레싱) 또는 붕대(예컨대, 접착 붕대)를 제공한다. 전형적으로 드레싱 혹은 붕대는 사용자에게 대상체(들)의 다중 치료를 수행하게 할 수 있도록 본 명세서에 기재된 충분한 양의 약제학적 조성물 및/또는 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA를 포함할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명은 1회보다 많은 주사에서 전달될 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA 조성물을 제공한다.
일 실시형태에 있어서, 국소 및/또는 경피 투여 전에, 조직, 예컨대, 피부의 적어도 하나의 영역은 투과성을 증가시킬 수 있는 장치 및/또는 용액에 적용될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 조직에는 피부의 투과성을 증가시키는 연마 장치(abrasion device)가 적용될 수 있다(미국 특허 공개 제20080275468호 참조, 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 다른 실시형태에 있어서, 조직에는 초음파 증강 장치가 적용될 수 있다. 초음파 증강 장치는 미국 특허 공개 제20040236268호 및 미국 특허 제6,491,657호 및 제6,234,990호에 기재된 장치를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니며; 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. 조직의 투과성을 증대시키는 방법은, 미국 특허 공개 제20040171980호 및 제20040236268호 및 미국 특허 제6,190,315호에 기재되어 있으며; 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다.
일 실시형태에 있어서, 장치는 본 명세서에 기재된 변형된 mRNA의 제형을 전달하기 전에 조직의 투과성을 증가시키는데 이용될 수 있다. 피부의 투과성은 당업계에 공지된 및/또는 전문이 참조로 본 명세서에 포함되는 미국 특허 제6,190,315호에 기재된 방법에 의해 측정될 수 있다. 비제한적인 예로서, 변형된 mRNA 제형은 전문이 참조로 본 명세서에 포함되는 미국 특허 제6,190,315호에 기재된 약물 전달 방법에 의해 전달될 수 있다.
다른 비제한적인 예에서, 조직은, 투과성을 증가시킬 수 있는 장치에 조직이 적용될 수 있기 전에, 동안 및/또는 후에 국소마취제의 공용혼합물(eutectic mixture of local anesthetics: EMLA) 크림으로 처리될 수 있다. Katz 등(Anesth Analg (2004); 98:371-76; 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함됨)은, 낮은 에너지와 조합하여 EMLA 크림을 이용하면, 낮은 에너지 초음파에 의한 사전치료 이래로 가능한 한 빨리 5분 후에 표면상 피부 무통각증의 시작이 보이는 것을 제시하였다.
일 실시형태에 있어서, 인핸서는, 투과성을 증가시키도록 조직이 처리되기 전, 동안 및/또는 후에 조직에 적용될 수 있다. 인핸서는 수송 인핸서, 물리적 인핸서 및 공동화 인핸서를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 인핸서의 비제한적인 예는 전문이 참조로 본 명세서에 포함되는 미국 특허 제6,190,315호에 기재되어 있다.
면역 반응을 유발하는 물질을 더 포함할 수 있는 장치가, 본 명세서에 기재된 변형된 mRNA의 제형을 전달하기 전에 조직의 투과성을 증가시키기 위하여 이용될 수 있다. 다른 비제한적인 예에서, 면역 반응을 유발하는 물질을 함유하는 제형이 미국 특허 공개 제20040171980호 및 제20040236268호에 기재된 방법에 의해 전달될 수 있으며; 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다.
조성물의 국소 및/또는 경피 투여용의 투약 형태는 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 분말, 용액, 스프레이, 흡입제 및/또는 패취를 포함할 수 있다. 일반적으로, 활성 성분은 약제학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 임의의 필요로 되는 방부제 및/또는 필요에 따라서 완충액과 멸균 조건 하에 혼합된다.
부가적으로, 본 발명은, 종종 화합물의 신체로의 제어진 전달을 제공하는 부가적인 이점을 지니는, 경피 패취의 사용을 상정한다. 이러한 투약 형태는, 예를 들어, 화합물을 적절한 매질 중에 용해 및/또는 분배시킴으로써 제조될 수 있다. 대안적으로 혹은 부가적으로, 속도는 속도 제어막을 제공함으로써 및/또는 화합물을 중합체 매트릭스 및/또는 겔 중에 분산시킴으로써 제어될 수 있다.
국소 투여에 적절한 제형은, 액체 및/또는 반액체 제제, 예컨대, 도찰제, 로션, 수중유 및/또는 유중수 에멀전, 예컨대, 크림, 연고 및/또는 페이스트, 및/또는 용액 및/또는 현탁액을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 국소-투여가능한 제형은, 예를 들어, 약 0.1% 내지 약 10% (w/w)의 활성 성분을 포함할 수 있지만, 활성 성분의 농도는 용매 중 활성 성분의 용해도 한계만큼 높을 수 있다. 국소 투여용의 제형은 본 명세서에 기재된 1종 이상의 추가 성분을 더 포함할 수 있다.
데포 투여
본 명세서에 기재된 바와 같이, 몇몇 실시형태에 있어서, 조성물은 연장된 방출을 위하여 데포로 제형화된다. 일반적으로, 특정 장기 또는 조직("표적 조직")은 투여를 위하여 표적화된다.
본 발명의 몇몇 양상에 있어서, 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는 표적 조직 내에 혹은 인접하여 공간적으로 유지된다. 조성물, 특히 해당 조성물의 핵산 성분(들)이 표적 조직 내에 실질적으로 유지되도록 하는 조건(이는 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.9, 99.99 또는 99.99% 이상의 조성물이 표적 조직 내에 유지되는 것을 의미함) 하에, 표적 조직(1개 이상의 표적 세포를 포함함)을 상기 조성물과 접촉시킴으로써, 포유류 대상체의 표적 조직에 조성물을 제공하는 방법이 제공된다. 유리하게는, 보유는 하나 이상의 표적 세포에 진입하는 조성물에 존재하는 핵산의 양을 측정함으로써 결정된다. 예를 들어, 대상체에 투여된 적어도 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.9, 99.99 또는 99.99% 이상의 핵산이 투여 후 소정 시간 기간에 세포내에 존재한다. 예를 들어, 포유류 대상체에 대한 근육내 주사는 리보핵산 및 형질주입 시약을 함유하는 수성 조성물을 이용해서 수행되며, 조성물의 보유는 근육 세포 내에 존재하는 리보핵산의 양을 측정함으로써 결정된다.
본 발명의 양상은, 조성물이 표적 세포 내에 실질적으로 유지되는 조건 하에 표적 조직(1개 이상의 표적 세포를 포함함)을 조성물과 접촉시킴으로써 포유류 대상체의 표적 조직에 조성물을 제공하는 방법에 관한 것이다. 조성물은, 관심 대상 폴리펩타이드가 적어도 하나의 표적 세포에서 생산되도록 유효량의 핵산 분자 또는 mmRNA를 함유한다. 조성물은 일반적으로 세포 침투제 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유하지만, "네이키드" 핵산(예컨대, 세포 침투제 혹은 기타 제제가 없는 핵산)도 상정된다.
몇몇 상황에서, 조직 내 세포에 의해 생산된 단백질의 양은 바람직하게는 증가된다. 바람직하게는, 단백질 생산의 이 증가는 표적 조직 내의 세포로 공간적으로 제한된다. 이와 같이 해서, 포유류 대상체의 조직 내에서 관심 대상 단백질의 생산을 증가시키는 방법이 제공된다. 단위량의 조성물이 미리 결정된 용적의 표적 조직 내에 포함된 실질적인 양의 세포에 관심 대상 폴리펩타이드를 생산하도록 결정된 것을 특징으로 하는 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA를 함유하는 조성물이 제공된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 조성물은 복수개의 상이한 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA를 포함하며, 여기서 1개 이상의 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA가 관심 대상 폴리펩타이드를 암호화한다. 선택적으로, 조성물은 또한 해당 조성물의 세포내 전달을 보조하도록 세포 침투제를 함유한다. (일반적으로, 미리 결정된 용적에 인접한 또는 표적 조직에 대해서 원위에 있는 조직 내에 관심 대상 폴리펩타이드의 충분한 생산을 유도하는 일 없이) 표적 조직의 미리 결정된 용적 내에 포함되는 세포의 실질적인 퍼센트로 관심 대상 폴리펩타이드를 생산하는데 요구되는 조성물의 용량의 결정이 행해진다. 이 결정에 이어서, 결정된 용량은 포유류 대상체의 조직 내로 직접 도입된다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명은 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA 조성물을 1회보다 많은 주사로 또는 분할 용량 주사로 전달하도록 제공된다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명은 소형의 1회용 약물 저장기(small disposable drug reservoir), 패취 펌프 또는 삼투압 펌프를 이용해서 표적 조직 부근에서 유지될 수 있다. 패취 펌프의 비제한적인 예로는 BD®(뉴저지주의 프랭클린 레이크스시에 소재), 인슐렛사(Insulet Corporation)(매사추세츠주의 베드포드시에 소재), 스테디메드 테라퓨틱스사(SteadyMed Therapeutics)(캘리포니아 샌프란시스코시에 소재), 메드트로닉사(Medtronic)(미네소타 미니애폴리스시에 소재)(예컨대, 미니메드(MiniMed)), 유니라이프사(UniLife)(펜실베니아 요크시에 소재), 발레리타스사(Valeritas)(뉴저지 브리지워터) 및 스프링리프 테라퓨틱스사(SpringLeaf Therapeutics)(매사추세츠 보스턴시에 소재)에서 제조된 및/또는 판매된 것들을 포함한다. 삼투압 펌프의 비제한적인 예는 듀렉트(DURECT)®(캘리포니아 쿠퍼티노)에 의해 제조된 것들(예컨대, 듀로스(DUROS)® 및 알제트(ALZET)®)을 포함한다.
폐 투여
약제학적 조성물은 구강을 통한 폐 투여에 적합한 제형으로 제조, 포장 및/또는 판매될 수 있다. 이러한 제형은 활성 성분을 포함하고 약 0.5㎚ 내지 약 7㎚ 또는 약 1㎚ 내지 약 6㎚ 범위의 직경을 지니는 건조 입자를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은, 적절하게는, 추진제의 스트림(stream)이 분말을 분산시키도록 유도될 수 있는 건조 분말 저장기를 포함하는 장치를 사용하고/하거나 밀봉된 용기 속에서 저-비등 추진제 속에 용해되고/되거나 현탁된 활성 성분을 포함하는 장치와 같은 자가 추진 용매/분말 분산 용기를 사용하는 투여용 무수 분말들의 형태로 존재한다. 이러한 분말은, 입자의 적어도 98 중량%가 0.5㎚ 이상의 직경을 갖고 입자의 적어도 95 개수%(% by number)가 7㎚ 미만의 직경을 갖는 입자를 포함한다. 대안적으로, 적어도 95중량%의 입자가, 직경이 1㎚ 이상이고 적어도 90 개수 %의 입자가, 직경이 6㎚ 미만이다. 건조 분말 조성물은 당과 같은 고체 미세 분말 희석제를 포함할 수 있으며 편리하게는 단위 용량 형태로 제공된다.
저 비등 추진제는 일반적으로, 대기압에서 비점이 65℉ 이하인 액체 추진제를 포함한다. 일반적으로 추진제는 조성물의 50% 내지 99.9%(w/w)를 구성할 수 있으며, 활성 성분은 조성물의 0.1% 내지 20%(w/w)를 구성할 수 있다. 추진제는 액체 비-이온성 및/또는 고체 음이온성 표면활성제 및/또는 고체 희석제(이는 활성 성분을 포함하는 입자들과 동일한 정도의 입자 크기를 가질 수 있음)와 같은 추가의 성분들을 더 포함할 수 있다.
비제한적인 예로서, 본 명세서에 기재된 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는 미국 특허 제8,257,685호에 기재된 방법에 의해 폐 전달용으로 조제될 수 있으며; 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다.
폐 전달을 위해 제형화된 약제학적 조성물은 액제 및/또는 현탁제의 액적(droplet)의 형태로 활성 성분을 제공할 수 있다. 이러한 제형은, 활성 성분을 포함하는, 선택적으로 멸균된 수성 및/또는 희석 알코올성 액제 및/또는 현탁제로서 제조, 포장 및/또는 판매될 수 있으며, 편리하게는 어떠한 분무 및/또는 미립자화 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 이러한 제형은 사카린 나트륨, 휘발성 오일, 완충제, 표면 활성제 및/또는 메틸하이드록시벤조에이트와 같은 방부제와 같은 풍미제를 포함하나, 이에 한정되지 않는 하나 이상의 추가의 성분을 더 포함할 수 있다. 이 투여 경로에 의해 제공되는 액적은 약 0.1㎚ 내지 약 200㎚ 범위의 평균 직경을 지닐 수 있다.
비강내, 코 및 구강내 투여
폐 전달용으로 유용한 본 명세서에 기재된 제형은 약제학적 조성물의 비강내 전달용으로 유용하다. 비강내 투여용으로 적합한 다른 제형은 활성 성분을 포함하고 평균 입자 크기가 약 0.2㎛ 내지 500㎛인 조악한 분말이다. 이러한 제형은, 코가 취하는 방식, 즉, 코에 근접하게 유지된 분말의 용기로부터 비강 통로를 통한 신속한 흡입에 의해 투여된다.
비강 투여용으로 적합한 제형은 예를 들어, 약 0.1%(w/w)로 적은 및 100%(w/w)로 많은 활성 성분을 포함할 수 있으며, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 추가의 성분을 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 구강내 투여에 적합한 제형으로 제조, 포장 및/또는 판매될 수 있다. 이러한 제형은, 예를 들어, 통상의 방법을 사용하여 제조된 정제 및/또는 로젠지(lozenge)의 형태일 수 있고, 예를 들어, 0.1% 내지 20%(w/w)의 활성 성분일 수 있으며, 잔량으로는 경구적으로 용해가능하고/하거나 분해가능한 조성물, 및 선택적으로 본 명세서에 기재된 하나 이상의 추가의 성분을 포함한다. 대안적으로, 구강내 투여용으로 적합한 제형은 활성 성분을 포함하는 산제 및/또는 에어로졸화되고/되거나 미립자화된 액제 및/또는 현탁제를 포함할 수 있다. 이러한 분말화되고/되거나, 에어로졸화되고/되거나 에어로졸화된 제형들은, 분산될 경우, 평균 입자 크기 및/또는 액적 크기가 약 0.1㎚ 내지 약 200㎚의 범위일 수 있고, 본 명세서에 기재된 어떠한 추가의 성분들 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
안과 투여
약제학적 조성물은 안과 투여용으로 적합한 제형으로 제조, 포장 및/또는 판매될 수 있다. 이러한 제형은, 예를 들어, 수성 또는 유성 액체 부형제 속의 활성 성분의 0.1/1.0%(w/w) 용액 및/또는 현탁액을 포함하는 점안제의 형태일 수 있다. 이러한 점적제는 완충제, 염 및/또는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 다른 임의의 추가의 성분을 더 포함할 수 있다. 유용한 다른 안과적으로 투여가능한 제형들은 미세결정성 형태 및/또는 리포솜 제제 중에 활성 성분을 포함하는 것들을 포함한다. 귀 점적제 및/또는 점안제는 본 발명의 범위 내인 것으로 상정된다. 다층 박막 장치는 눈 및/또는 주위 조직에 전달하기 위한 약제학적 조성물을 함유하도록 제조될 수 있다.
페이로드 투여: 검출가능한 제제 및 치료제
본 명세서에 기재된 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는 생물학적 표적으로의 물질("페이로드")의 전달, 예를 들어, 표적의 검출을 위한 검출가능한 물질의 전달, 또는 치료제의 전달이 바람직한 다수의 상이한 시나리오에서 사용될 수 있다. 검출 방법은, 시험관내 및 생체내 영상 방법들 둘 다의 영상, 예컨대, 면역조직화학, 생물방광 영상(BLI), 자기 공명 영상(MRI), 양전자 방사 단층촬영(PET), 전자 현미경, X-선 컴퓨터처리된 단층촬영(X-ray computed tomography), 라만 영상, 광간섭 단층촬영(optical coherence tomography), 흡수 영상, 열 영상, 형광 반사 영상, 형광 현미경, 형광성 분자 단층촬영 영상(fluorescence molecular tomographic imaging), 핵 자기 공명 영상, X-선 영상, 초음파 영상, 광음향 영상, 실험실 검정(lab assay), 또는 태그화(tagging)/염색/영상이 요구되는 어떠한 상황도 포함한다.
변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는 임의의 유용한 배향에서 링커와 페이로드 둘 다를 포함하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 두 단부를 갖는 링커는, 데아자-아데노신 아자 데아자-구아노신의 C-7 또는 C-8 위치에서 또는 사이토신 혹은 유라실의 N-3 또는 C-5 위치로 등과 같이 일 단부를 페이로드에 그리고 타단부를 핵염기에 부착시키는데 이용된다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 절단가능한 링커뿐만 아니라 하나보다 많은 페이로드(예컨대, 표지 및 전사 저해제)를 포함할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 변형된 뉴클레오타이드는 변형된 7-데아자-아데노신 트라이포스페이트이고, 여기서 절단가능한 링커의 일 단부는 7-데아자-아데닌의 C7 위치에 부착되고, 링커의 타단부는 저해제에(예컨대, 시티딘 상의 핵염기의 C5 위치에) 부착되며, 표지(예컨대, Cy5)는 링커의 중앙에 부착된다(예컨대, 참조로 본 명세서에 포함되는 미국 특허 제7,994,304호의 도 5와 제9 및 제10 칼럼에서의 A*pCp C5 Parg 캡리스(Capless)의 화합물 1 참조). 변형된 7-데아자-아데노신 트라이포스페이트를 암화화 영역에 혼입시킬 때, 얻어지는 폴리뉴클레오타이드는 저해제(예컨대, 중합효소 저해제) 및 표지에 부착된 절단가능한 링커를 지닌다. (예컨대, 절단가능한 이황화 모이어티를 가진 링커를 환원시키는 환원 조건을 이용해서) 링커의 절단 시, 표지 및 저해제는 방출된다. 추가의 링커 및 페이로드(예컨대, 치료제, 검출가능한 표지 및 세포 침투 페이로드)는 본 명세서에 기재되어 있다.
이하의 반응식 12는 예시적인 변형된 뉴클레오타이드를 도시하며, 여기서 핵염기인 아데닌은 7-데아자 아데닌의 C-7 탄소에 있는 링커에 부착된다. 또한, 반응식 12는 mRNA의 3' 말단 상에 혼입된 링커 및 페이로드, 예컨대, 검출가능한 제제를 지니는 변형된 뉴클레오타이드를 도시한다. 프로파길 에스터 상의 티올기의 1,2-부가 및 이황화 절단은 검출가능한 제제를 방출시킨다. 나머지 구조(예를 들어 반응식 12에서 pApC5Parg로서 도시됨)는 저해제이다. 변형된 뉴클레오타이드의 구조에 대한 근거는, 테더링된 저해제가 제2 염기를 혼입시키는 중합효소의 능력을 입체적으로 방해하는 것에 있다. 이와 같이 해서, 테더는 이 기능에 영향을 미치도록 충분히 길고, 저해제는 성장 중인 폴리뉴클레오타이드 가닥 내로 제2 및 그 후속부를 억제 혹은 저해하는 입체화학적 배향으로 있는 것이 중요하다.
반응식 12
Figure pct00148
Figure pct00149
예를 들어, 본 명세서에 기재된 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는 유도된 다능성 줄기 세포(iPS 세포)를 재프로그램하는데 사용될 수 있으며, 당해 줄기 세포는 집단 내에서 전체 세포와 비교하여 형질주입된 세포를 직접 추적할 수 있다. 다른 예에서, 링커를 통해 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA에 부착될 수 있고 형광 표지될 수 있는 약물을 사용하여 해당 약물을 생체내에서, 예컨대 세포내에서 추적할 수 있다. 다른 예는 세포 내로의 가역성 약물 전달에 있어서 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA의 사용을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에 기재된 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는, 페이로드, 예컨대, 검출가능한 제제 또는 치료제를 특정 세포기관으로 세포내 표적화하는데 사용될 수 있다. 예시적인 세포내 표적은 진전된 mRNA 프로세싱을 위한 핵 국제화, 또는 저해제를 포함하는 mRNA에 연결된 핵 국재화 서열(nuclear localization sequence: NLS)을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 명세서에 기재된 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는 치료제를 예컨대, 살아 있는 동물 내의 세포들 혹은 조직들로 전달하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 변형된 핵산 또는 mmRNA는 고도로 극성인 화학치료제를 전달하여 암 세포들을 사멸하는데 이용될 수 있다. 링커를 통해서 치료제에 부착된 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는 구성원 침투를 촉진시켜 치료제가 세포 내로 이동하여 세포내 표적에 도달하게 할 수 있다.
일례에서, 링커는 리보스 고리의 2'-위치에 및/또는 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA의 3' 및/또는 5' 위치에 부착된다(예컨대, 국제 특허 공개 제WO2012030683호 참조, 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 링커는 본 명세서에 개시된, 당업계에 공지된 및/또는 국제 특허 공개 제WO2012030683호(이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함됨)에 개시된 임의의 링커일 수 있다.
다른 예에서, 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는 링커를 통해 바이러스 억저해성 펩타이드(viral inhibitory peptide: VIP)를 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA에 부착시킬 수 있다. 절단가능한 링커는 VIP 및 염료를 세포 내로 방출할 수 있다. 다른 예에서, 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는 링커를 통해서 콜레라 독소, 디프테리아 독소 및 백일해 독소와 같은 일부 세균 독소의 작용을 담당하는 ADP-리보실레이트에 부착될 수 있다. 이들 독소 단백질은 인간 세포 속에서 표적 단백질을 변형시키는 ADP-리보실트랜스퍼라제이다. 예를 들어, 콜레라 독소는 G 단백질을 ADP-리보실화시켜 소장의 내층(lining)으로부터 거대한 유액 분비를 유발함으로써 인간 세포를 변형시켜서, 생명을 위협하는 설사를 일으킨다.
몇몇 실시형태에 있어서, 페이로드는 세포 독소, 방사성 이온, 화학치료제 혹은 기타 치료제 등과 같은 치료제일 수 있다. 세포 독소 또는 세포독성제는 세포에 유해할 수 있는 임의의 제제를 포함한다. 예들은 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블리스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 다이하이드록시안트라신다이온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프로놀롤, 푸로마이신, 마이탄시노이드, 예컨대, 마이탄시놀(전문이 참조로 본 명세서에 포함되는 미국특허 제5,208,020호 참조), 레이첼마이신(CC-1065, 미국 특허 제5,475,092호, 제5,585,499호 및 제5,846,545호 참조, 이들 문헌은 모두 참조로 본 명세서에 포함됨), 및 이들의 유사체 혹은 동족체를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 방사성 이온은 요오드(예컨대, 요오드 125 또는 요오드 131), 스트론튬 89, 인, 팔라듐, 세슘, 이리듐, 포스페이트, 코발트, 이트륨 90, 사마륨 153 및 프라세오듐을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 다른 치료제는 항대사제(예컨대, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 사이타라빈, 5-플루오로유라실 데카바진), 알킬화제(예컨대, 메클로르에타민, 티오에파 클로람부실(CC-1065), 멜팔란, 카무스틴(BSNU), 로무스틴(CCNU), 사이클로포스파마이드, 부설판, 다이브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C 및 시스-다이클로로다이아민 플라티늄(II)(DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린(예컨대, 다우노루비신(이전에는 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예컨대, 닥티노마이신(이전에는 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신(AMC)), 및 항-유사분열제(예컨대, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 탁솔 및 마이탄시노이드)를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
몇몇 실시형태에 있어서, 페이로드는, 각종 유기 소 분자, 무기 화합물, 나노입자, 효소 또는 효소 기질, 형광물질, 발광 물질(예컨대, 루미놀), 생물발광성 물질(예컨대, 루시페라제, 루시페린 및 에쿼린), 화학발광성 물질, 방사활성 물질(예컨대, 18F, 67Ga, 81mKr, 82Rb, 111In, 123I, 133Xe, 201Tl, 125I, 35S, 14C, 3H 또는 99mTc(예컨대, 과테크니튬산염(테크니튬산(VII), TcO4 -)으로서), 및 조영제(예컨대, 금(예컨대, 금 나노입자), 가돌리늄(예컨대, 킬레이트된 Gd), 철 산화물(예컨대, 초상자성 철 산화물(SPIO), 단결정성 철 산화물 나노입자(MION), 및 초소형 초상자성 철 산화물(USPIO)), 망간 킬레이트(예컨대, Mn-DPDP), 황산바륨, 요오드화 조영매질(아이오헥솔), 마이크로버블, 또는 퍼플루오로카본) 등과 같은 검출가능한 제제일 수 있다. 이러한 광학적으로-검출가능한 표지는, 예를 들어, 제한 없이, 4-아세트아마이도-4'-아이소티오사이아나토스틸벤-2,2'다이설폰산; 아크리딘 및 유도체(예컨대, 아크리딘 및 아크리딘 아이소티오사이아네이트); 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌알렌-1-설폰산(EDANS); 4-아미노-N-[3-비닐설포닐)페닐]나프탈렌알리미드-3,5 다이설포네이트; N-(4-아닐리노-1-나프틸)말레이미드; 안트라닐아마이드; BODIPY; 브릴리언트 옐로; 쿠마린 및 유도체(예컨대, 쿠마린, 7-아미노-4-메틸쿠마린(AMC, 쿠마린 120), 및 7-아미노-4-트라이플루오로메틸쿠마린(쿠마린 151)); 사이아닌 염료; 사이아노신; 4',6-다이아미니디노-2-페닐인돌(DAPI); 5'5"-다이브로모피로갈롤-설포나프탈렌알레인(브로모피로갈롤 레드); 7-다이에틸아미노-3-(4'-아이소티오사이아나토페닐)-4-메틸쿠마린; 다이에틸렌트라이아민 펜타아세테이트; 4,4'-다이아이소티오사이아나토다이하이드로-스틸벤-2,2'-다이설폰산; 4,4'-다이아이소티오사이아나토스틸벤-2,2'-다이설폰산; 5-[다이메틸아미노]-나프탈렌알렌-1-설포닐 클로라이드(DNS, 단실클로라이드); 4-다이메틸아미노페닐아조페닐-4'-아이소티오사이아네이트(DABITC); 에오신 및 유도체(예컨대, 에오신 및 에오신 아이소티오사이아네이트); 에리트로신 및 유도체(예컨대, 에리트로신 B 및 에리트로신 아이소티오사이아네이트); 에티듐; 플루오레세인 및 유도체(예컨대, 5-카복시플루오레세인(FAM), 5-(4,6-다이클로로트라이아진-2-일)아미노플루오레세인(DTAF), 2',7'-다이메톡시-4'5'-다이클로로-6-카복시플루오레세인,플루오레세인, 플루오레세인 아이소티오사이아네이트, X-로다민-5-(및-6)-아이소티오사이아네이트(QFITC 또는 XRITC) 및 플루오레사민); 2-[2-[3-[[1,3-다이하이드로-1,1-다이메틸-3-(3-설포프로필)-2H-벤즈[e]인돌-2-일리덴]에틸리덴]-2-[4-(에톡시카보닐)-1-피페라지닐]-1-사이클로펜텐-1-일]에테닐]-1,1-다이메틸-3-(3-설포프로필)-1H-벤즈[e]인돌륨 하이드록사이드, 내부염(inner salt), n,n-다이에틸에탄아민(1:1)을 지닌 화합물 (IR144); 5-클로로-2-[2-[3-[(5-클로로-3-에틸-2(3H)-벤조티아졸-일리덴)에틸리덴]-2-(다이페닐아미노)-1-사이클로펜텐-1-일]에테닐]-3-에틸 벤조티아졸륨 퍼클로레이트(IR140); 말라카이트 그린(Malachite Green) 아이소티오사이아네이트; 4-메틸움벨리페론 오쏘크레졸프탈레인; 나이트로티로신; 파라로사닐린; 페놀 레드; B-피코에리트린; o-프탈다이알데하이드; 피렌 및 유도체(예컨대, 피렌, 피렌 부티레이트, 석신이미딜 1-피렌); 뷰티레이트 콴텀 도트(butyrate quantum dot); 반응성 레드(Reactive Red) 4(치바크론(Cibacron)TM 브릴리언트 레드(Brilliant Red) 3B-A); 로다민 및 유도체(예컨대, 6-카복시-X-로다민(ROX), 6-카복시로다민(R6G), 리쓰아민 로다민 B 설포닐 클로라이드 로다민(Rhod), 로다민 B, 로다민 123, 로다민 X 아이소티오사이아네이트, 설포로다민 B, 설포로다민 101, 설포로다민 101의 설포닐 클로라이드 유도체(텍사스 레드(Texas Red)), N,N,N',N'테트라메틸-6-카복시로다민(TAMRA) 테트라메틸 로다민 및 테트라메틸 로다민 아이소티오사이아네이트 (TRITC)); 리보플라빈; 로솔산; 테르븀 킬레이트 유도체; 사이아닌-3(Cy3); 사이아닌-5(Cy5); 사이아닌-5.5(Cy5.5), 사이아닌-7(Cy7); IRD 700; IRD 800; 알렉사(Alexa) 647; 라 졸타 블루(La Jolta Blue);프탈로 사이아닌; 및 나프탈로 사이아닌을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 검출가능한 제제는 활성화 시 검출가능하게 되는 비-검출가능한 전구체(예컨대, 형광원 테트라진-형광단 구조물(예컨대, 테트라진-BODIPY FL, 테트라진-오레곤 그린(tetrazine-Oregon Green) 488, 또는 테트라진-BODIPY TMR-X) 또는 효소 활성화가능한 형광성 제제(예컨대, 프로센스(PROSENSE)®(비스엔메디칼(VisEn Medical)))일 수 있다. 효소 표지된 조성물이 사용될 수 있는 시험관내 검정은 효소 연결된 면역흡착 검정(ELISA), 면역침전 검정, 면역형광, 효소 면역검정(EIA), 방사면역검정(RIA) 및 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 포함할 수 있지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 병용
핵산 분자 또는 mmRNA는 1종 이상의 기타 치료제, 예방제, 진단제 혹은 조영제와 병용하여 이용될 수 있다. "과 병용하여"(또는 와 조합하여)란, 제제들이 동시에 투여되어야만 하고/하거나 함께 전달을 위하여 제형화되어야만 하는 것을 의미하도록 의도된 것은 아니고, 이들 전달 방법이 본 발명의 개시내용의 범위 내이면 된다. 조성물은 하나 이상의 기타 바람직한 치료적 혹은 의료적 절차와 동시에, 전에 혹은 후에 투여될 수 있다. 일반적으로, 각 제제는 그 제제에 대해서 결정된 용량에서 및/또는 시간 스케줄로 투여될 것이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 개시내용은, 생체 이용률을 향상시키고/시키거나, 대사를 저감 및/또는 변경시키고/시키거나, 분비를 저해하고/하거나, 체내 분포를 변경시킬 수 있는 제제와 병용하여 약제학적, 예방학적, 진단학적 혹은 조영 조성물을 망라한다. 비제한적인 예로서, 핵산 분자 또는 mmRNA는 과증식성 세포를 제어하거나 또는 암의 치료를 위한 약제학적 제제와 병용하여 이용될 수 있다. 전문이 참조로 본 명세서에 포함되는 미국 특허 제7,964,571호에서, 지질중합체와 함께 인터류킨-12를 암호화하는 DNA 플라스미드를 포함하는 약제학적 조성물을 이용하고 항암제 혹은 화학치료제 중 적어도 하나를 투여하는 고형의 원발성 혹은 전이된 종양의 치료를 위한 병용 요법이 기술되어 있다. 또한, 항증식성 분자를 암호화하는 본 발명의 핵산 분자 또는 mmRNA는, 적어도 하나의 화학치료제 혹은 항암제와 함께 투여될 수 있는, 지질중합체를 지닌 약제학적 조성물 내에 있을 수 있다(예컨대, 전문이 참조로 본 명세서에 포함되는 미국 특허 공개 제20110218231호 참조, 항증식성 분자를 암호화하는 DNA 플라스미드 및 지질중합체를 포함하는 약제학적 조성물을 청구함).
세포 침투성 페이로드
몇몇 실시형태에 있어서, 핵산, 예컨대, RNA 또는 mRNA 내에 혼입되는 변형된 뉴클레오타이드 및 변형된 핵산 분자는, 또한 조성물의 세포내 전달을 증대시키는 세포 침투성 모이어티일 수 있는 페이로드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 세포내 공간으로의 전달을 용이하게 하는 세포-침투 펩타이드 서열, 예컨대, HIV-유래 TAT 펩타이드, 페네트라틴, 트랜스포탄, 또는 hCT 유래 세포-침투 펩타이드를 포함할 수 있지만 이들로 제한되는 것은 아니다[예컨대, Caron et al., (2001) Mol Ther. 3(3):310-8; Langel, Cell-Penetrating Peptides: Processes and Applications (CRC Press, Boca Raton FL 2002); El-Andaloussi et al., (2005) Curr Pharm Des. 11(28):3597-611 및 Deshayes et al., (2005) Cell Mol Life Sci. 62(16):1839-49 참조; 이들 문헌은 모두 참조로 본 명세서에 포함된다]. 조성물은 또한 세포 침투제, 예컨대, 세포간 공간으로 조성물의 전달을 증대시키는 리포솜을 포함하도록 제형화될 수 있다.
생물학적 표적
핵산, 예컨대, RNA 또는 mRNA, 내로 혼입되는, 본 명세서에 기재된 변형된 뉴클레오타이드 및 변형된 핵산 분자는, 페이로드를 특이적인 리간드가 존재하거나 생성될 수 있는 어떠한 생물학적 표적으로도 전달하는데 이용될 수 있다. 리간드는 생물학적 표적에 공유결합적으로 또는 비-공유결합적으로 결합할 수 있다.
예시적인 생물학적 표적은 생물중합체, 예컨대, 항체, RNA 및 DNA와 같은 핵산, 단백질, 효소를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니며; 단백질의 예는 효소, 수용체 및 이온 채널(ion channel)을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 표적은 조직- 또는 세포-유형 특이적인 마커, 예컨대, 선택된 조직 또는 세포 유형에서 특이적으로 발현되는 단백질일 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 표적은 수용체, 예를 들면, 혈장막 수용체 및 핵 수용체를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니며; 보다 구체적인 예는 G-단백질-커플링된 수용체, 세포 공극 단백질, 트랜스포터 단백질(transporter protein), 표면-발현된 항체, HLA 단백질, MHC 단백질 및 성장 인자 수용체를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
투약
본 발명은 본 발명에 따라 변형된 mRNA 및 그의 암호화된 단백질 또는 복합체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 핵산, 단백질 또는 복합체, 또는 그의 약제학적, 영상, 진단적 혹은 예방적 조성물은, 질환, 장애 및/또는 병태(예컨대, 작업 기억 결함과 관련된 질환, 장애 및/또는 병태)를 예방, 치료, 진단 혹은 영상화하는데 유효환 임의의 양 및 임의의 투여 경로를 이용해서 대상체에게 투여될 수 있다. 요구되는 정확한 양은 대상체의 종류, 연령 및 일반적 상태, 질환의 중증도, 특정 조성물, 그의 투여 형태, 그의 활성 모드 등에 따라서 대상체마다 다를 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 전형적으로 투여의 용이함 및 용량의 균일성을 위하여 용량 단위 형태로 제형화된다. 그러나, 본 발명의 조성물의 총 1일 용량은 건전한 의학적 판단(sound medical judgment)의 범위 내에서 주치의에 의해 결정될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 어떠한 특정 환자에 대한 구체적인 치료학적으로 유효하거나, 예방학적으로 유효하거나, 또는 적절한 영상 용량 수준은 치료되는 질환 및 질환의 중증도; 사용된 구체적인 화합물의 활성; 사용된 구체적인 조성물; 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이; 투여 시간, 투여 경로 및 사용된 구체적인 화합물의 배출률; 치료 기간; 사용된 구체적인 화합물과 병용해서 또는 동시에 사용된 약물; 그리고 의학 분야에 잘 알려진 유사 인자들을 포함하는 각종 인자에 좌우될 것이다
소정의 실시형태에 있어서, 본 발명에 따른 조성물은, 목적으로 하는 치료학적, 진단학적, 예방학적 혹은 영상 효과를 얻기 위하여, 1일당 대상체의 체중의 약 0.0001 ㎎/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏, 약 0.001 ㎎/㎏ 내지 약 0.05 ㎎/㎏, 약 0.005 ㎎/㎏ 내지 약 0.05 ㎎/㎏, 약 0.001 ㎎/㎏ 내지 약 0.005 ㎎/㎏, 약 0.05 ㎎/㎏ 내지 약 0.5 ㎎/㎏, 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 약 50 ㎎/㎏, 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 약 40 ㎎/㎏, 약 0.5 ㎎/㎏ 내지 약 30 ㎎/㎏, 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏, 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏ 또는 약 1 ㎎/㎏ 내지 약 25 ㎎/㎏을 1일 1회 이상 전달하는데 충분한 용량 수준에서 투여될 수 있다. 바람직한 용량은 1일에 3회, 1일에 2회, 1일에 1회, 격일로, 매 3일마다, 매주, 매 2주마다, 매 3주마다 또는 매 4주마다 전달될 수 있다. 소정의 실시형태에 있어서, 바람직한 용량은 다수의 투여(예컨대, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 11회, 12회, 13회, 14회 이상의 투여)를 사용하여 전달될 수 있다.
본 발명에 따르면, 분할-용량 요법으로의 mmRNA의 투여가 포유류 대상체 내에 보다 높은 수준의 단백질을 생산하는 것을 발견하였다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "분할 용량"은 단일의 단위 용량 또는 총 1일 용량을 2회 이상의 용량, 예컨대, 단일 단위 용량의 2회 이상의 투여로의 분할이다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "단일의 단위 용량"은 1용량/1회/단일 경로/단일 접촉적, 즉, 단일 투여 이벤트로 투여되는 임의의 치료제의 용량이다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "총 1일 용량"은 24시간 주기로 부여되거나 처방된 양이다. 이것은 단일의 단위 용량으로서 투여될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 mmRNA는 분할 용량으로 대상체에게 투여된다. mmRNA는 완충액 단독으로 혹은 본 명세서에 기재된 제형으로 제형화될 수 있다.
투약 형태(Dosage Form)
본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은, 국소, 비강내, 기관내, 혹은 주사가능형(예컨대, 정맥내, 안구내, 유리체내, 근육내, 심장내, 복강내, 피하) 등과 같은 본 명세서에 기재된 투약 형태로 제형화될 수 있다.
액체 투약 형태
비경구 투여용의 액체 투약 형태는 약제학적으로 허용가능한 에멀전, 마이크로에멀전, 용액, 현탁액, 시럽 및/또는 엘릭시르를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 활성 성분에 부가해서, 액체 투약 형태는, 물 또는 기타 용매, 가용화제 및 유화제, 예컨대, 에틸 알코올, 아이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글라이콜, 1,3-뷰틸렌 글라이콜, 다이메틸폼아마이드, 오일류(특히 면실유, 땅콩유, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유 및 참기름), 글라이세롤, 테트라하이드로푸르푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글라이콜 및 솔비타의 지방산 에스터솔비탄, 및 이들의 혼합물을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 당업계에 통상적으로이용되는 비활성 희석제를 포함할 수 있다. 비경구 투여를 위한 소정의 실시형태에 있어서, 조성물은, 크레모포(CREMOPHOR)®, 알코올, 오일, 변형된 오일, 글라이콜, 폴리솔베이트, 사이클로덱스트린, 중합체, 및/또는 이들의 조합 등과 같은 가용화제와 혼합될 수 있다.
주사가능한
주사가능한 제제, 예를 들어, 멸균 주사가능한 수성 또는 유성 현탁액은 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있고, 적합한 분산제, 습윤제 및/또는 현탁제를 포함할 수 있다. 멸균 주사가능한 제제는, 비독성의 비경구적으로 허용가능한 희석제 및/또는 용매, 예를 들어, 1,3-뷰탄다이올 중 용액 중의 멸균 주사가능한 용액, 현탁액 및/또는 에멀전일 수 있다. 사용될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매 중에는, 물, 링거액, U.S.P. 및 등장성 염화나트륨 용액을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 멸균성의 고정 오일은 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 사용된다. 이 목적을 위하여, 합성 모노- 또는 다이글라이세라이드를 포함하는 어떠한 배합물 고정된 오일도 사용될 수 있다. 올레산과 같은 지방산이 주사가능한 제제에 사용될 수 있다.
주사가능한 제형은, 예를 들어, 세균 보유 여과기를 통한 여과에 의해, 및/또는 사용 전에 멸균수 또는 다른 멸균 주사가능한 매질 속에 용해되거나 분산될 수 있는 멸균 고체 조성물의 형태로 멸균화제를 혼입시킴으로써 멸균될 수 있다.
활성 성분의 효과를 연장시키기 위하여, 피하 또는 근육내 주사로부터 활성 성분의 흡수를 늦추는 것이 흔히 바람직하다. 이것은 난수용성을 가진 결정성 혹은 비정질 물질의 액체 현탁액의 이용에 의해 달성될 수 있다. 이후에, 변형된 mRNA의 흡수율은, 최종적으로 결정 크기 및 결정성 형태에 의존할 수 있는, 그의 용해율에 의존한다. 대안적으로, 비경구적으로 투여된 변형된 mRNA 형태의 지연된 흡수는 변형된 mRNA를 오일 비히클(oil vehicle) 속에 용해시키거나 현탁시킴으로써 달성될 수 있다. 주사가능한 데포 형태는 변형된 mRNA의 미세봉입 매트릭스(microencapsule matrix)들을 폴리락타이드-폴리글리콜라이드와 같은 생분해성 중합체 속에 형성시킴으로써 제조된다. 중합체에 대한 변형된 mRNA의 비 및 사용된 특정 중합체의 속성에 따라, 변형된 mRNA 방출의 비가 조절될 수 있다. 다른 생분해성 중합체의 예로는 폴리(오쏘에스터) 및 폴리(무수물)을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 데포 주사가능한 제형은 변형된 mRNA를 체조직과 혼화성인 리포솜 또는 마이크로에멀전 속에 포획(entrapping)시킴으로써 제조될 수 있다.
폐
폐 전달을 위해 유용한 본 명세서에 기재된 제형은 또한 약제학적 조성물의 비강내 전달에 이용될 수도 있다. 비강내 투여용으로 적합한 다른 제형은 활성 성분을 포함하고 평균 입자 크기가 약 0.2㎛ 내지 500㎛인 조악한 분말이다. 이러한 제형은, 코가 취하는 방식, 즉, 코에 근접하게 유지된 분말의 용기로부터 비강 통로를 통한 신속한 흡입에 의해 투여된다.
비강 투여용으로 적합한 제형은 예를 들어, 약 0.1%(w/w)로 적은 및 100%(w/w)로 많은 활성 성분을 포함할 수 있으며, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 추가의 성분을 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 구강내 투여에 적합한 제형으로 제조, 포장 및/또는 판매될 수 있다. 이러한 제형은, 예를 들어, 통상의 방법을 사용하여 제조된 정제 및/또는 로젠지의 형태일 수 있고, 예를 들어, 0.1% 내지 20%(w/w)의 활성 성분을 함유할 수 있으며, 이 경우 잔량으로는 경구적으로 용해가능하고/하거나 분해가능한 조성물, 및 선택적으로 본 명세서에 기재된 하나 이상의 추가의 성분을 포함한다. 대안적으로, 구강내 투여용으로 적합한 제형은 활성 성분을 포함하는 산제 및/또는 에어로졸화되고/되거나 미립자화된 액제 및/또는 현탁제를 포함할 수 있다. 이러한 분말화되고/되거나, 에어로졸화되고/되거나 에어로졸화된 제형들은, 분산될 경우, 평균 입자 크기 및/또는 액적 크기가 약 0.1㎚ 내지 약 200㎚의 범위일 수 있고, 본 명세서에 기재된 어떠한 추가의 성분들 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
제형 및/또는 약제학적 제제의 제조에 있어서 일반적인 고려사항은 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005(이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함됨)]에서 찾을 수 있다.
코팅 또는 쉘
정제, 당의정, 캡슐, 환제 및 과립의 고체 투약 형태는 장용 코팅 및 약제학적 제형 분야에 잘 공지된 다른 코팅과 같은 코팅 및 쉘들을 사용하여 제조할 수 있다. 이들은 불투명화제를 선택적으로 포함할 수 있으며, 이들이 활성성분(들)만을, 또는 우선적으로는, 장관의 특정 부분에서, 선택적으로 지연된 방식으로 방출하는 조성물일 수 있다. 사용될 수 있는 봉입 조성물(embedding composition)의 예는 중합체성 물질 및 왁스를 포함한다. 유사한 유형의 고체 조성물은 락토스 또는 유당뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 부형제를 사용하여 연질 및 경질-충전된 젤라틴 캡슐 속에 충전제들로서 사용될 수 있다.
약제학적 조성물의 특성
본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 이하의 특성들 중 하나 이상을 특징으로 할 수 있다:
생체이용률
변형된 핵산 분자 및 mmRNA는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 전달제와 함께 조성물로 제형화될 때, 본 명세서에 기재된 바와 같은 전달제가 결여된 조성물에 비해서, 생체이용률의 증가를 발휘할 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "생체이용률"이란 용어는, 포유류에게 투여된 주어진 양의 변형된 핵산 분자의 전신 이용가능성을 지칭한다. 생체이용률은 포유류에게 화합물의 투여 후 화합물의 변하지 않은 형태의 곡선하 면적(area under the curve: AUC) 또는 혈장 농도(Cmax)를 측정함으로써 평가될 수 있다. AUC는 세로축(Y-축)을 따른 화합물의 혈청 혹은 혈장 농도 대 가로축(X-축)을 따른 시간을 그린 곡선하 면적의 결정치이다. 일반적으로, 특정 화합물에 대한 AUC는 당업자에게 공지되고 또한 참조로 전문이 본 명세서에 포함되는 문헌[G. S. Banker, Modern Pharmaceutics, Drugs and the Pharmaceutical Sciences, v. 72, Marcel Dekker, New York, Inc., 1996]에 기재된 바와 같은 방법을 이용해서 계산될 수 있다.
Cmax값은 포유류에게 화합물의 투여 후 포유류의 혈청 혹은 혈장에서 달성되는 화합물의 최대 농도이다. 특정 화합물의 Cmax값은 당업자에게 공지된 방법을 이용해서 측정될 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "생체이용률을 증가시키는" 또는 "약동학을 향상시키는"이란 어구는, 포유류에서 AUC, Cmax 또는 Cmin에서 측정된, 제1의 변형된 핵산 분자의 전신 이용가능성이, 본 명세서에 기재된 바와 같은 전달제와 공동-투여된 경우, 이러한 공통-투여가 일어나지 않은 경우보다 큰 것을 의미한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자의 생체이용률은 적어도 약 2%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 약 100%만큼 증가할 수 있다.
치료적 창
변형된 핵산 분자 및 mmRNA는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 전달제와 함께 조성물로 제형화될 때, 본 명세서에 기재된 바와 같은 전달제를 결여하는 투여된 변형된 핵산 분자 조성물의 치료적 창에 비해서, 투여된 변형된 핵산 분자 조성물의 치료적 창의 증가를 발휘할 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "치료적 창"은 치료 효과를 유발하는 높은 확률을 가진 채 작용 부위에서 치료적으로 활성인 물질의 수준의 범위 또는 혈장 농도의 범위를 지칭한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자의 치료적 창은, 본 명세서에 기재된 바와 같은 전달제와 공동-투여될 경우, 적어도 약 2%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 약 100%만큼 증가할 수 있다.
용적 분포
변형된 핵산 분자는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 전달제와 함께 조성물로 제형화될 때, 예컨대, 본 명세서에 기재된 바와 같은 전달제를 결여하는 변형된 핵산 분자 조성물에 비해서 저감되거나 표적화된, 증가된 용적 분포(Vdist)를 발휘할 수 있다. 용적 분포 (Vdist)는 혈액 혹은 혈장 중 약물의 농도에 대한 신체 내 약물의 양에 관한 것이다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "용적 분포"란 용어는, 혈액 혹은 혈장 중에서와 같은 농도에서 체내 약물의 총량을 함유하도록 요구되는 유체 용적을 지칭하며; Vdist는 체내 약물의 양/혈액 혹은 혈장 내 약물의 농도와 동등하다. 예를 들어, 10㎎ 용량 및 10 ㎎/ℓ의 혈장 농도에 대해서, 용적 분포는 1 리터일 것이다. 용적 분포는 약물이 혈관 밖에 존재하는 정도를 지칭한다. 커다란 용적 분포는 혈장 단백질 결합과 비교해서 조직 성분에 결합되는 화학물의 경향을 반영한다. 임상 세팅에 있어서, Vdist는 정상 상태 농도를 달성하기 위한 장입 용량을 구하는데 이용될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자의 용적 분포는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 전달제와 공동-투여될 때, 적어도 약 2%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70% 감소할 수 있다.
생물학적 효과
일 실시형태에 있어서, 동물에게 전달된 변형된 mRNA의 생물학적 효과는 동물에서 단백질 발현을 분석함으로써 분류될 수 있다. 단백질 발현은 본 발명의 포유류 투여된 변형된 mRNA로부터 수집된 생물학적 샘플을 분석하는 것으로부터 결정될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 적어도 50 pg/㎖의 포유류에게 투여된 변형된 mRNA에 의해 암호화된 발현 단백질이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 포유류에게 전달된 변형된 mRNA에 의해 암호화된 단백질에 대한 50 내지 200 pg/㎖의 단백질 발현은 포유류에서 치료적 유효량의 단백질로서 보여질 수 있다.
질량 분광법에 의한 변형된 핵산의 검출
질량 분광법(MS)은 이온으로의 전환을 변경하기 위하여 분자에 대한 구조 및 분자량/농도 정보를 제공할 수 있는 분석 수법이다. 분자는 우선 이온화되어 양 혹은 음 전하를 획득하고, 이어서 이들은 그들의 질량/전하(m/z) 비에 따라서 검출기의 상이한 영역에 도달하도록 질량 분석기를 통해서 이행한다.
질량 분광법은 단편화된 샘플을 이온화하고 하전된 분자를 추가의 분석을 위하여 작성하기 위하여 이온 공급원을 포함하는 질량 분광기를 이용해서 수행된다. 예를 들어, 샘플의 이온화는, 전기분무 이온화(electrospray ionization: ESI), 대기압 화학 이온화(atmospheric pressure chemical ionization: APCI), 광이온화, 전자 이온화, 고속 원자 충격(fast atom bombardment: FAB)/액체 이차 이온화(액체 secondary ionization: LSIMS), 매트릭스보조 레이저 탈착/이온화(matirx assisted laser desorption/ionization: MALDI), 전계 전리, 전계 탈착, 열분무/플라즈마 분무 이온화 및 입자 빔 이온화에 의해 수행될 수 있다. 당업자라면 이온화 방법의 선택이 측정된 분석물, 샘플의 유형, 검출기의 유형, 양의 모드 대 음의 모드의 선택 등에 기초하여 결정될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
샘플이 이온화된 후에, 이에 따라서 양으로 하전되거나 음으로 하전된 이온을 분석하여 질량-대-전하비(즉, m/z)를 결정할 수 있다. 질량-대-전하비를 결정하기 위한 적절한 분석기로는 사중극 분석기, 이온 포획 분석기 및 비행시간 분석기를 포함한다. 이온은 수개의 검출 모드를 이용해서 검출될 수 있다. 예를 들어, 선택된 이온은 (즉 선택적 이온 모니터링 모드(SIM)를 이용해서) 검출될 수 있거나, 또는 대안적으로, 이온은 스캐닝 모드, 예컨대, 다중 반응 모니터링(MRM) 또는 선택된 반응 모니터링(SRM)을 이용해서 검출될 수 있다.
펩타이드 표준의 안정적인 동위원소 표지 희석액과 결합된 액체 크로마토그래피-다중 반응 모니터링(LC-MS/MRM)은 단백질 검증을 위하여 효과적인 모드인 것으로 밝혀졌다(예컨대, 문헌[Keshishian et al., Mol Cell Proteomics 2009 8: 2339-2349; Kuhn et al., Clin Chem 2009 55:1108-1117; Lopez et al., Clin Chem 2010 56:281-290]; 이들의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 바이오마커 개발 연구에서 빈번하게 이용되는 비표적화된 질량 분광법과 달리, 표적화된 MS 방법은 복합체 혼합물 중 수십 내지 수백개의 선택된 펩타이드에 대한 기구의 전체 분석적 용량에 초점을 맞추는 MS의 펩타이드 서열-기반 모드이다. 관심 대상 단백질로부터 유도된 이들 펩타이드에 대해서만 검출 및 단편화를 규제함으로써, 감도 및 재현성은 발견-모드(discovery-mode) MS 방법에 비해서 극적으로 향상된다. 단백질의 질량 분광법-기반 다중 반응 모니터링(MRM) 정량화의 이 방법은, 임상 샘플의 신속하고 표적화된 다중화 단백질 발현 프로파일링을 통해서 바이오마커의 발견과 정량화에 극적으로 영향을 미칠 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 적어도 하나의 변형된 mRNA에 의해 암호화된 적어도 하나의 단백질을 함유할 수 있는 생물학적 샘플은 MRM-MS의 방법에 의해 분석될 수 있다. 생물학적 샘플의 정량화는 동위원소 표지된 펩타이드 혹은 단백질(이것으로 제한되지 않음)을 내부 표준으로서 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 생물학적 샘플은, 일단 대상체로부터 획득되면, 효소 소화가 실시될 수 있게 된다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "소화하다"란 용어는, 보다 짧은 펩타이드로 파괴되는 것을 의미한다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "샘플을 처리하여 단백질을 소화시키는"이란 샘플 내 단백질을 파괴시키는 방식으로 샘플을 조작하는 것을 의미한다. 이들 효소는, 트립신, 엔도단백질분해효소 Glu-C 및 케모 트립신을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 적어도 하나의 변형된 mRNA에 의해 암호화된 적어도 하나의 단백질을 함유할 수 있는 생물학적 샘플은 효소를 이용해서 소화될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 변형된 mRNA에 의해 암호화된 단백질을 함유할 수 있는 생물학적 샘플은 전기분무 이온화)을 이용해서 단백질에 대해서 분석될 수 있다. 전기분무 이온화(ESI) 질량 분광법(ESIMS)은 질량 분광법에 의해 분석하기 전에 용액으로부터 기상으로의 이온의 전이를 돕기 위하여 전기적 에너지를 이용한다. 샘플은 당업계에 공지된 방법(예컨대, 문헌[Ho et al., Clin Biochem Rev. 2003 24(1):3-12; 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함됨)을 이용해서 분석될 수 있다. 용액 중에 함유된 이온종은 하전 액적의 미세 분무를 분산시키고, 용매를 증발시켜 하전된 액적으로부터 이온을 배출하여 고도로 하전된 액적의 미스트를 발생시킴으로써 기상으로 전이될 수 있다. 고도로 하전된 액적의 미스트는 사중극 질량 분석기 등(이것으로 제한되지 않음)과 같은 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3 혹은 적어도 4개의 질량 분석기를 이용해서 분석될 수 있다. 또한, 질량 분광법은 정제(purification) 단계를 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 제1 사중극자는 단일의 m/z 비를 선택하도록 설정될 수 있으므로 MS 분석 전에 복합화된 및 시간-소비적인 샘플 정제 절차를 제거할 수 있는 상이한 m/z 비를 지니는 기타 분자 이온을 여과 제거할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 변형된 mRNA에 의해 암호화된 단백질을 함유할 수 있는 생물학적 샘플은 탄뎀(tandem) ESIMS 시스템(예컨대, MS/MS)에서 단백질에 대해서 분석될 수 있다. 비제한적인 예로서, 액적은 생성물 스캔(또는 자손 스캔(daughter scan)), 전구체 스캔(부모 스캔(parent scan)), 중성 소실 혹은 다중 반응 모니터링을 이용해서 분석될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 변형된 mRNA에 의해 암호화된 단백질을 함유할 수 있는 생물학적 샘플은 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화(MALDI) 질량 분광법(MALDIMS)을 이용해서 분석될 수 있다. MALDI는 단백질 등과 같은 대분자와 소분자의 둘 모두의 비파괴 기화 및 이온화를 제공한다. MALDI 분석에서, 분석물은 우선 대과잉 몰량의 매트릭스 화합물과 공-결정화되며, 이것은 또한 자외 흡수성의 약한 유기산을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. MALDI에 이용되는 매트릭스의 비제한적인 예는 α-사이아노-4-하이드록시신남산, 3,5-다이메톡시-4-하이드록시신남산 및 2,5-다이하이드록시벤조산이다. 분석물-매트릭스 혼합물의 레이저 방사는 매트릭스 및 분석물의 기화를 유발할 수 있다. 레이저 유도 탈착은 온전한 분석물의 높은 이온 수율을 제공하며, 높은 정확도로 화합물의 측정을 가능하게 한다. 샘플은 당업계에 공지된 방법(예컨대, 문헌[Lewis, Wei and Siuzdak, Encyclopedia of Analytical Chemistry 2000:5880-5894]; 참조로 전문이 본 명세서에 포함됨)을 이용해서 분석될 수 있다. 비제한적인 예로서 MALDI 분석에 이용되는 질량 분석기는 선형 비행시간(time-of-flight: TOF), TOF 리플렉트론 또는 퓨리에 변환 질량 분석기를 포함할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 분석물-매트릭스 혼합물은 건조-액적 방법을 이용해서 형성될 수 있다. 생물학적 샘플은 매트릭스와 혼합되어 포화된 매트릭스 용액을 생성하며, 이때 매트릭스-대-샘플 비는 대략 5000:1이다. 포화된 매트릭스 용액의 분획(대략 0.5 내지 2.0㎕)은 이어서 건조되어 분석물-매트릭스 혼합물을 형성할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 분석물-매트릭스 혼합물은 박층 방법을 이용해서 형성될 수 있다. 매트릭스 균질화 막이 우선 현성되고, 이어서 샘플이 적용되어, 매트릭스에 의해 흡수되어 분석물-매트릭스 혼합물을 형성할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 분석물-매트릭스 혼합물은 후막 방법을 이용해서 형성될 수 있다. 매트릭스 균질화 막은 나이트로-셀룰로스 매트릭스 첨가제와 함께 형성된다. 일단 균일한 나이트로-셀룰로스 매트릭스 층이 얻어지면, 샘플이 적용되어 매트릭스 내로 흡수되어 분석물-매트릭스 혼합물을 형성한다.
일 실시형태에 있어서, 분석물-매트릭스 혼합물은 샌드위치 방법을 이용해서 형성될 수 있다. 매트릭스 결정의 박층은 박층 방법에서처럼 제조되고 나서 수성 트라이플루오로아세트산, 샘플 및 매트릭스를 첨가한다. 샘플은 이어서 매트릭스 내로 흡수되어 분석물-매트릭스 혼합물을 형성한다.
변형된 핵산 분자의 이용
치료제
본 명세서에 기재된 변형된 핵산 분자 및 변형된 핵산 분자로부터 번역된 단백질은 치료제로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 변형된 핵산 분자는 대상체에게 투여될 수 있으며, 여기서, 변형된 핵산 분자는 생체내에서 번역되어 대싱체 내에서 치료학적 펩타이드를 생산한다. 따라서, 인 및 다른 동물에서의 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하기 위한 조성물, 방법, 키트 및 시약이 본 명세서에서 제공된다. 본 발명의 개시내용의 활성 치료제는 변형된 핵산 분자, 변형된 핵산 분자 또는 변형된 핵산 분자로부터 번역된 폴리펩타이드를 함유하는 세포, 변형된 핵산 분자로부터 번역된 폴리펩타이드, 변형된 핵산 분자 또는 변형된 핵산 분자로부터 번역된 폴리펩타이드와 접촉된 세포를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
소정의 실시형태에 있어서, 항체-의존형 세포 독성을 유발하는 단백질과 함께 번역가능한 영역을 함유하는 1개 이상의 변형된 핵산 분자를 함유할 수 있는 병용 치료제가 제공된다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이 "번역가능한 영역"은 대상체의 면역을 촉진시킬 수 있는 단백질 혹은 단백질들을 암호화한다. 예를 들어, 본 명세서에서는 트라스투주맙 및 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF)를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 함유하는 치료제가 제공된다 특히, 이러한 병용 치료제는 트라스투주맙에 대해 유도된 내성을 발달시키는 Her2+ 유방암 환자에서 유용할 수 있다(예컨대, 문헌[Albrecht, Immunotherapy. 2(6):795-8 (2010)] 참조; 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
본 명세서에 기재된 변형된 핵산 분자를 이용하는 세포 집단 내 재조합 펩타이드의 번역을 유도하는 방법이 또한 제공된다. 이러한 번역은 생체내, 생체외, 배양물 속 또는 시험관내의 것일 수 있다. 세포 집단은 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형, 및 재조함 폴리펩타이드를 암호화하는 번역가능한 영역을 갖는 핵산을 함유하는 조성물의 유효량과 접촉될 수 있다. 집단은, 핵산이 세포 집단의 하나 이상의 세포 내로 국재화되고 재조합 폴리펩타이드가 핵산으로부터 세포 내로 번역되도록 하는 조건 하에서 접촉될 수 있다.
유효량의 조성물은 적어도 부분적으로, 표적 조직, 표적 세포 유형, 투여 수단, 핵산의 물리적 특성(예컨대, 변형된 뉴클레오사이드의 크기 및 정도), 그리고 다른 결정인자에 기초하여 제공될 수 있다. 일반적으로, 유효량의 조성물은 세포 내에서 효율적인 단백질 생산을 제공하며, 바람직하게는 대응하는 비변형 핵산을 함유하는 조성물보다 더 효율적이다. 증가된 효능은 증가된 세포 형질주입(즉, 핵산으로 형질주입된 세포의 퍼센트), 핵산으로부터의 증가된 단백질 번역, 감소된 핵산 분해(예컨대, 변형된 핵산 분자로부터 단백질 번역의 증가된 지속에 의해 입증됨), 또는 숙주 세포의 감소된 선천적 면역 반응에 의해 입증될 수 있다.
본 발명의 개시의 양상들은 이를 필요로 하는 포유류 대상체 내에서 재조합체 폴리펩타이드의 생체내 번역을 유도하는 방법들에 관한 것이다. 여기서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 및 폴리펩타이드를 암호화하는 번역가능한 영역을 갖는 핵산을 함유하는 유효량의 조성물은 본 명세서에 기재된 전달 방법을 사용하여 대상체에게 투여될 수 있다. 핵산은, 당해 핵산이 대상체의 세포 내로 국재화되고 재조합체 폴리펩타이드가 핵산으로부터 세포 내에서 번역될 수 있도록 하는 다른 조건 하에서 그리고 그러한 양으로 제공된다. 핵산이 국재화되는 세포, 또는 세포가 존재하는 조직은 핵산 투여의 1회 이상의 라운드로 표적화될 수 있다.
본 발명의 개시내용의 다른 양상은 포유류 대상체에게 변형된 핵산 분자를 함유하는 세포의 이식에 관한 것이다. 포유류 대상체에게 세포의 투여는, 당업자에게 공지되어 있으며, 국소 이식(예컨대, 국소 또는 피하 투여), 장기 전달 또는 전신 주사(예컨대, 정맥내 주사 또는 흡입), 그리고 약제학적으로 허용가능한 담체 중에 세포의 제형을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 변형된 핵산 분자를 함유하는 조성물은 근육내로, 경동맥으로, 복강내로, 정맥내로, 비강내로, 피하로, 내시경적으로, 경피로 또는 척수내로 투여하기 위해 제형화된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 조성물은 연장된 방출을 위해 제형화될 수 있다.
치료제가 투여될 수 있는 대상체는 질환, 장애, 또는 위험한 병태로 고생하거나 진행될 위험이 있다. 임상적 진단, 생물마커 수준, 전장유전체 연관 연구(genome-wide association studies: GWAS), 및 당업계에 공지된 다른 방법을 포함할 수 있는, 이들 염기에 대해 대상체를 확인하고, 진단하며, 분류하는 방법들이 제공된다.
소정의 실시형태에 있어서, 투여된 변형된 핵산 분자는, 재조합 폴리펩타이드가 번역될 수 있는 세포내에 실질적으로 존재하지 않을 수 있는 기능적 활성을 제공하는 하나 이상의 재조합 폴리펩타이드의 생산을 지시한다. 기능적 활성을 상실하는 것은 속성상 효소적, 구조적 또는 유전자 조절성일 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자의 투여는, 재조합 폴리펩타이드가 번역될 수 있는 세포내에 실질적으로 존재하지 않을 수 있는(부재할 수 있는) 폴리펩타이드(또는 다수의 폴리펩타이드)를 대체하는 하나 이상의 재조합체 폴리펩타이드의 생산을 지시한다. 이러한 부재는 암호화 유전자 또는 이의 조절 경로의 유전적 돌연변이에 기인할 수 있다. 재조합 폴리펩타이드는 세포 내에, 세포의 표면 상에 존재하거나, 또는 세포로부터 분비된 내인성 단백질의 활성을 길항작용시키기 위하여 기능한다. 통상, 내인성 단백질의 활성은, 내인성 단백질의 활성은, 예를 들어, 변경된 활성 또는 국재화를 초래하는 내인성 단백질의 돌연변이로 인하여, 대상체에게 유해할 수 있다. 부가적으로, 재조합 폴리펩타이드는 세포 내에, 세포의 표면 상에 존재하거나, 또는 세포로부터 분비된 생물학적 잔기의 활성을 직접 또는 간접적으로 길항작용시킨다. 길항작용된 생물학적 모이어티의 예로는 지질(예컨대, 콜레스테롤), 지질단백질 (예컨대, 저밀도 지질단백질), 핵산, 탄수화물 또는 소분자 독소를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에 기재된 재조합 단백질은 세포 내에, 잠재적으로는 핵과 같은 특수한 구획 속에 국재화시키기 위해 거나, 또는 세포로부터의 분비 또는 세포의 혈장막으로의 전좌를 위해 공학적으로 조작된다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명의 개시내용의 변형된 핵산 분자의 유용한 특성은 외인성 핵산에 대한 세포의 선천적 면역반응을 저감시키는 능력이다. 세포 또는 세포들의 집단에서 면역 반응의 적정, 저감 또는 제거를 수행하는 방법이 제공된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 세포는 번역가능한 영역 및 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형을 포함하는 제1 외인성 핵산의 제1 용량을 함유하는 제1 조성물과 접촉될 수 있으며, 제1 외인성 핵산에 대한 세포의 선천적 면역 반응의 수준이 결정될 수 있다. 후속적으로, 세포는 제2 용량의 제1 외인성 핵산을 포함하는 제2 조성물과 접촉되되, 제2 용량은 제1 용량과 비교하여 보다 적은 양의 제1 외인성 핵산을 함유한다. 대안적으로, 세포는 제2 외인성 핵산의 제1 용량과 접촉된다. 제2 외인성 핵산은, 제1 외인성 핵산과 동일하거나 상이할 수 있는 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드를 함유할 수 있거나, 또는 대안적으로, 제2 외인성 핵산은 변형된 뉴클레오사이드를 함유하지 않을 수 있다. 세포를 제1 조성물 및/또는 제2 조성물과 접촉시키는 단게는 1회 이상 반복될 수 있다. 부가적으로, 세포 내 단백질 생산(예컨대, 단백질 번역)의 효율은 선택적으로 결정될 수 있으며, 세포는, 표적 단백질 생산 효율이 달성될 때까지 반복적으로 제1 및/또는 제2 조성물로 재-형질주입될 수 있다.
질환 및 병태의 치료제
본 명세서에서는, 비정상적인 단백질 활성을 손실시키거나, 손실된 단백질 활성을 공급하거나 또는 비정상적인 단백질 활성을 극복하는 것을 특징으로 하는, 질환의 증상을 치료하거나 예방하는 방법이 제공된다. 바이러스 DNA 벡터와 비교해서, 변형된 mRNA의 도입 후 단백질 생산의 신속한 개시로 인하여, 본 발명의 개시내용의 화합물은 패혈증, 뇌졸중 및 심근경색과 같은 급성 질환을 치료하는 데 있어서 특히 유리하다. 게다가, 변형된 mRNA가 전사율을 변경시킬 수 있고 따라서 유전자 발현의 변화를 초래할 수 있으므로 본 발명의 개시내용의 변형된 mRNA를 이용하면 단백질의 정밀한 적정이 달성될 수 있다.
기능이상 또는 비정상적인 단백질 활성으로 특징화되는 질병들은 암 및 증식성 질환, 유전적 질환(예컨대, 낭성 섬유증), 자가면역질환, 당뇨병, 신경변성 질환, 심혈관 질환 및 대사 질환을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 개시내용은 본 명세서에서 제공된 핵산, 또는 변형된 핵산 분자를 함유하는 세포계 치료제를 도입시킴으로써 대상체 내에서 이러한 병태 또는 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 변형된 핵산 분자는 대상체의 세포 내에 존재하는 비정상적인 단백질을 길항작용시키거나 달리는 극복하는 단백질을 암호화한다. 기능장애 단백질의 구체적인 예로는, 낭성 섬유증을 유발하는, 낭성 섬유증 막관통 전도 조절인자(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator: CFTR) 단백질의 각각 기능이상 또는 비기능성 단백질 변이체를 생산하는, CFTR의 미스센스(missense) 돌연변이 변이체를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
다수의 질환은 단백질 활성을 손실(또는 적절한 단백질 기능이 일어나지 않도록 실질적으로 감소)하는 것을 특징으로 한다. 이러한 단백질은 존재하지 않을 수 있거나, 또는 이들은 본질적으로 비작용성일 수 있다.
따라서, 대상체의 세포와, 기능적 CFTR 폴리펩타이드를 암호화하는 번역가능한 영역을 갖는 변형된 핵산 분자를, CTFR 폴리펩타이드의 유효량이 세포 속에 존재하도록 하는 조건 하에 접촉시킴으로써 포유류 대상체 내에서 낭성 섬유증을 치료하는 방법이 제공된다. 바람직한 표적 세포는 상피 세포, 예를 들어, 폐이며, 투여 방법은 표적 조직, 즉, 폐 전달의 측면에서 결정되고, RNA 분자는 흡입에 의한 투여를 위해 제형화된다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 개시내용은 대상체의 세포 집단 내로 게놈 연구에 의해 최근에 특성규명된 단백질인, 소르틸린(Sortilin)을 암호화함으로써 대상체 내에서 과지질혈증을 완화시키는 변형된 mRNA 분자를 도입시킴으로써, 대상체에서 고지질혈증을 치료하는 방법을 제공한다. SORT1 유전자는 소르틸린이라고 불리는 트랜스-골지 네트워크(trans-Golgi network: TGN) 막관통 단백질을 암호화한다. 유전 연구는, 5명의 개체 중 한명이 이들을 낮은 수준의 저밀도 지단백질(LDL) 및 초-저밀도 지단백질(VLDL)을 갖도록 하는 SORT1 유전자의 1p13 유전자자리(locus) 내에서 단일의 뉴클레오타이드 다형성, rs12740374를 갖는 것을 밝혔다. 약 30%의 사람에서 존재하는, 마이너 대립형질(minor allele)의 각각의 복제물은 LDL 콜레스테롤을 8 ㎎/㎗까지 변경시키는 반면, 집단의 약 5%에 존재하는 마이너 대립형질의 2개의 복제물은 LDL 콜레스테롤을 16 ㎎/㎗로 저하시킨다. 마이너 대립형질의 담체는 또한 심근경색의 약 40% 감소된 위험을 갖는 것으로 밝혀졌다. 마우스에서 기능적 생체내 연구는, 마우스 간 조직 내에서 SORT1의 과발현이 유의하게 보다 낮은, 즉, 80%만큼 더 낮은 LDL-콜레스테롤 수준을 초래하였으며, 침묵(silencing) SORT1은 LDL 콜레스테롤을 대략 200% 증가시켰음을 기술한다(Musunuru K et al. From noncoding variant to phenotype via SORT1 at the 1p13 cholesterol locus. Nature 2010; 466: 714-721; 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
세포 핵산 전달 방법
본 발명의 개시내용의 방법은 세포 집단, 생체내, 생체외 또는 배양액내에서 세포 집단 내로 핵산 전달을 증대시킨다. 예를 들어, 다수의 숙주 세포(예컨대, 효모 및 포유류의 세포와 같은 진핵 세포)를 함유하는 세포 배양액을 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형, 및 선택적으로, 번역가능한 영역을 갖는 변형된 핵산을 함유하는 조성물과 접촉시킬 수 있다. 조성물은 또한 일반적으로 숙주 세포 내로 변형된 핵산 분자 흡수의 효율을 증가시킬 수 있는 형질주입 시약 또는 다른 화합물을 함유할 수 있다. 변형된 핵산 분자는 대응하는 비변형 핵산 분자에 비해서, 세포 집단 내에서 증대된 보유를 나타낼 수 있다. 변형된 핵산 분자의 보유는 비변형 핵산의 보유보다 더 클 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 이것은 비변형 핵산분자의 보유보다 적어도 약 50%, 75%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200% 또는 200% 이상이다. 이러한 보유 이점은 변형된 핵산 분자를 사용한 1 라운드의 형질주입에 의해 달성될 수 있거나, 또는 형질주입의 반복된 라운드들 후 얻어질 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자는 하나 이상의 추가의 핵산을 갖는 표적 세포 집단에 전달될 수 있다. 이러한 전달은 동시에 이루어질 수 있거나, 또는 변형된 핵산 분자는 하나 이상의 추가의 핵산의 전달 전에 전달된다. 추가의 하나 이상의 핵산은 변형된 핵산 분자 또는 비변형 핵산일 수 있다. 변형된 핵산 분자의 초기의 존재는 세포 집단의 선천적 면역 반응을 실질적으로 유도하지 않을 수 있으며, 게다가, 선천적 면역 반응은 비변형 핵산의 이후의 존재에 의해 활성화되지 않을 수 있다는 것이 이해된다. 이와 관련하여, 표적 세포 집단 내에 존재하는 것이 바람직한 단백질이 비변형 핵산 분자로부터 번역되는 경우, 증대된 핵산은 자체로 번역가능한 영역을 함유하지 않을 수 있다.
표적화 모이어티
몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자는 구체적인 조직 공간에 대해 세포를 표적화시키기 위해 또는 생체내 또는 시험관내에서 특정 모이어티와 상호작용하기 위해 기능할 수 있는, 세포의 표면 상에 단백질-결합 상대 또는 수용체를 발현하기 위해 제공된다. 적절한 단백질-결합 상대는, 항체 및 그의 기능적 단편, 스캐폴드 단백질, 또는 펩타이드를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 변형된 핵산 분자는 지질, 탄수화물 또는 다른 생물학적 모이어티의 합성 및 세포외 국재화를 지향하는데 이용될 수 있다.
영구적인 유전자 발현 침묵
포유류 대상체 내에서 유전자 발현을 후성적으로 침묵시키는 방법은, 번역가능한 영역이 서열-특이적인 히스톤 H3 메틸화를 지시하여 헤테로크로마틴 형성을 개시하고 유전자를 침묵시킬 목적으로 특정 유전자 주변에 유전자 전사를 감소시킬 수 있는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들을 암호화하는 핵산을 포함한다. 예를 들어, 야뉴스 키나제 2(Janus Kinase 2) 유전자 내 기능 획득(gain-of-function) 돌연변이는 골수증식 질환들의 계열에 원인이 있다.
세포 표면 상에의 리간드 혹은 수용체의 발현
본 명세서에 기재된 몇몇 양상 및 이들 양상의 실시형태에 있어서, 변형된 RNA는 세포(예컨대, 귀소 모이어티(homing moiety))의 표면 상에 리간드 혹은 리간드 수용체를 발현시키는데 이용될 수 있다. 세포 표면에 부착된 리간드 혹은 리간드 수용체 모이어티는 세포에 생체내에서 조직 혹은 제제와 목적으로 하는 생물학적 상호작용을 지니게 할 수 있다. 리간드는 항체, 항체 단편, 앱타머, 펩타이드, 비타민, 탄수화물, 단백질 혹은 폴리펩타이드, 수용체, 예컨대, 세포-표면 수용체, 부착 분자, 당단백질, 당 잔기, 치료제, 약물, 글라이코사미노글라이칸 또는 이들의 임의 조합물일 수 있다. 예를 들어, 리간드는 변형된 세포의 종양-특이적 국재화를 허용하도록 종양 세포와 우선적으로 상호작용할 수 있는 세포를 부여하는, 암-세포 특이적 항원을 인식하는 항체일 수 있다. 리간드는, 바람직한 리간드가 치료될 조직의 외부면 상에서 표적 분자와 상호작용할 수 있으므로, 치료될 조직에 축적하는 세포 조성물의 능력을 부여할 수 있다. 다른 조직에 대한 제한된 교차-반응성을 지니는 리간드가 일반적으로 바람직하다.
몇몇 경우에, 리간드는 세포가 조직에 표적화되거나 혹은 특정 리간드와 상호작용할 수 있는 귀소 모이어티로서 작용할 수 있다. 이러한 귀소 모이어티는, 제한 없이, Fv 단편, 단일 사슬 Fv(scFv) 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, 단일 도메인 항체, 카멜화 항체(camelized antibody) 및 항체 단편, 인간화 항체 및 항체 단편, 및 이들의 다가 변이체를 포함하는, 특정 결합쌍, 항체, 단클론성 항체 또는 그의 유도체 혹은 유사체; 단일 특이적 혹은 이중 특이적 항체, 예컨대, 이황화 안정화 Fv 단편, scFv 탄뎀((SCFV)2 단편), 전형적으로 공유결합적으로 연결되거나 다르게는 안정화된(즉, 류신 지퍼 혹은 헬릭스 안정화된) scFv 단편인, 다이아바티, 트라이바디 혹은 테트라바디를 포함하는 다가 결합 시약; 및 예를 들어, 앱타머, 수용체 및 융합 단백질을 포함하는 기타 귀소 모이어티를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
몇몇 실시형태에 있어서, 귀소 모이어티는 세포 표적화 특이성의 조율을 허용할 수 있는 표면-결합된 항체일 수 있다. 이것은 고도로 특이적인 항체가 목적으로 하는 표적화 부위를 위하여 관심 대상 에피토프에 대해서 발생될 수 있으므로 특별히 유용하다. 일 실시형태에 있어서, 다수의 항체가 세포의 표면 상에 발현되며, 각 항체는 목적으로 하는 표적에 대해서 상이한 특이성을 지닐 수 있다. 이러한 접근법은 귀소 상호작용의 결합활성 및 특이성을 증가시킬 수 있다.
당업자라면, 세포, 예를 들어, 에스트로겐 수용체 리간드, 예컨대, 타목시펜의 목적으로 하는 국재화 혹은 기능에 기초하여 임의의 귀소 모이어티를 선택할 수 있고, 세포 표면 상에 증가된 수의 에스트로겐 수용체를 갖는 에스트로겐-의존형 유방암 세포에 대해서 세포를 표적화할 수 있다. 리간드/수용체 상호작용의 다른 비제한적인 예는 CCRI(예컨대, 염증 관절조직 혹은 뇌의 류마니스 관절염, 및/또는 다발성 경화증의 치료를 위하여), CCR7, CCR8(예컨대, 림프절 조직에의 표적화), CCR6, CCR9, CCR10(예컨대, 창자 조직에 표적화하기 위하여), CCR4, CCR10(예컨대, 피부에 표적화하기 위하여), CXCR4(예컨대, 일반적으로 증대된 이행을 위하여), HCELL(예컨대, 염증 및 염증성 장애, 골수의 치료를 위하여), 알파4베타7(예컨대, 창자점막 표적화를 위하여), VLA-4/VCAM-1(예컨대, 내피에의 표적화)를 포함한다. 일반적으로, 표적화에 관여하는 임의의 수용체(예컨대, 암 전이)는 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 이용하기 위하여 이용될 수 있다.
세포 사멸의 매개체
일 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자 조성물은 사멸 수용체, 사멸 수용체 리간드 또는 이들의 조합의 발현을 증가시킴으로써 세포 (예컨대, 암 세포) 내에서 세포자멸사를 유도하는데 이용될 수 있다. 본 방법은 임의의 목적 세포에서 세포 사멸을 유발하는데 이용될 수 있으며, 또한 세포가 천연의 세포자멸 신호를 회피하는 암의 치료에서 특별한 유용성을 갖는다.
세포자멸사는, 종양 괴사 인자(TNF) 수용체/리간드 수퍼패밀리에 속하는, 수개의 "사멸 수용체"과 그들의 리간드 간의 다수의 상호작용으로 구성된 최종 효과기 기전에 대해 커버하는 다수의 독립적인 신호전달 경로에 의해 유도될 수 있다. 가장 특징적인 사멸 수용체는 CD95("Fas"), TNFRI(p55), 사멸 수용체 3(DR3 또는 Apo3/TRAMO), DR4 및 DR5(apo2-TRAIL-R2)이다. 세포자멸사의 최종 효과기 기전은 카스파제라고 지칭되는 일련의 단백질분해효소의 활성화일 수 있다. 이들 카스파제의 활성화는 일련의 필수적인 세포 단백질 및 세포 사멸의 절단을 초래한다. 예를 들어, Fas/FasL-매개 세포자멸사는, C-말단 사멸 도메인(DD)을 통해서 Fas 수용체의 삼합체화를 유도하고, 이어서 어댑터 단백질 FADD(Fas-associated protein with death domain) 및 카스파제-8을 보충하는 3개의 FasL 분자의 결합에 의해 유도된다. 이 삼분자 복합체 Fas/FAIDD/카스파제-8의 올리고머화는 활성 카스파제-8 내로 효소전구제 카스파제-8의 단백질가수분해적 절단을 초래하고, 이어서 단백질 가수분해를 통해서 카스파제-3을 비롯한 기타 하류의 카스파제를 활성화에 의해 세포자멸사 과정을 개시한다. 사멸 리간드는 일반적으로 삼합체 혹은 기타 고차 구조로 형성될 때 세포자멸성이다. 단량체로서, 이들은 사멸 수용체에 결합하기 위하여 삼합체와 경쟁함으로써 항세포자멸제로서 역할할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자 조성물은 사멸 수용체(예컨대, Fas, TRAIL, TRAMO, TNFR, TLR 등)을 암호화한다. 변형된 RNA의 형질주입에 의해 사멸 수용체를 발현시키는 세포는 그 수용체를 활성화시키는 리간드에 의해 유도된 사멸을 받기 쉽게 된다. 마찬가지로, 사멸 리간드를 예컨대, 그들의 표면 상에 발현시키는 세포는, 형질주입된 세포가 표적 세포와 접촉할 때 수용체에 의해 세포의 사멸을 유도할 것이다. 다른 실시형태에 있어서, 변형된 RNA 조성물은 사멸 수용체 리간드(예컨대, FasL, TNF 등)를 암호화한다. 다른 실시형태에 있어서, 변형된 RNA 조성물은 카스파제(예컨대, 카스파제 3, 카스파제 8, 카스파제 9 등)를 암호화한다. 암 세포가 종종 비증식 혹은 제어된 증식 형태로 적절하게 분화되는 데 실패할 경우, 다른 실시형태에 있어서는, 합성, 변형된 RNA 조성물은 사멸 수용체 및 그의 적절한 활성화 리간드의 둘 모두를 암호화한다. 다른 실시형태에 있어서, 합성, 변형된 RNA 조성물은, 암 세포, 예컨대, 암 줄기 세포에서 발현될 경우, 비병원체 혹은 비자체-재생 표현형으로 분화시키도록 세포를 유도(예컨대, 저감된 세포 성장 속도, 저감된 세포 분할 등)하거나, 또는 휴면 세포상(예컨대, G0 휴지상)으로 도입되도록 세포를 유도할 것이다.
당업자라면, 예컨대, 종양 세포로 적절하게 표적화되어 원치 않는 광범위한 세포 사멸을 방지하는 세포자멸사-유도 기술의 사용이 필요할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 이와 같이 해서, 작업자는 변형된 핵산 분자가 단지 암 세포에서만 발현되도록 암 항원을 인식하는 전달 기전(예컨대, 부착된 리간드 혹은 항체, 표적화된 리포솜 등)을 사용할 수 있다.
키트 및 장치
키트
본 발명은 본 발명의 방법을 편리하게 및/또는 효율적으로 수행하는 다양한 키트를 제공한다. 전형적으로 키트는 사용자가 대상체(들)의 다중 치료를 가능하게 하고/하거나 다수의 실험을 수행할 수 있게 하도록 충분한 양 및/또는 개수의 성분을 포함할 것이다.
일 양상에 있어서, 본 발명은, 번역가능한 영역을 포함하는 제1 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA를 포함하는, 단백질 생산용 키트를 제공한다. 키트는 포장 및 설명서 및/또는 제형 조성물을 형성하기 위한 전달제를 더 포함할 수 있다. 전달제는 식염수, 완충 용액, 리피도이드 또는 본 명세서에 개시된 임의의 전달제를 포함할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 완충 용액은 염화나트륨, 염화칼슘, 포스페이트 및/또는 EDTA를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 완충 용액은, 식염수, 2mM 칼슘을 지닌 식염수, 5% 수크로스, 2mM 칼슘을 지니는 5% 수크로스, 5% 만니톨, 2mM 칼슘을 지닌 5% 만니톨, 락트산 링거, 염화나트륨, 2mM 칼슘을 지닌 염화나트륨 및 만노스를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다(예컨대, 미국 특허 공개 제20120258046호 참조; 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다). 추가의 실시형태에 있어서, 완충 용액은 석출될 수 있거나 동결건조될 수 있다. 각 성분의 양은 일관성 있고 재현성 있는 보다 높은 농도의 식염수 혹은 간단한 완충액 제형을 가능하게 하도록 변경될 수 있다. 성분들은 또한 시간 기간에 걸쳐서 및/또는 다양한 조건 하에서 완충 용액 중 변형된 핵산 분자 및 mmRNA의 안정성을 증가시키기 위하여 변경될 수도 있다.
일 양상에 있어서, 본 발명은, 표적 세포 내로 도입된 경우 번역가능한 영역에 의해 암호화된 목적으로 하는 양의 단백질을 생산하는데 유효한 양으로 제공된, 번역가능한 영역을 포함하는 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA; 세포의 선천적 면역 반응을 실질적으로 저해하는데 유효한 양으로 제공된, 저해성 핵산을 포함하는 제2 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA; 그리고 포장 및 설명서를 포함하는, 단백질 생산용 키트를 제공한다.
일 양상에 있어서, 본 발명은, 핵산이 세포 뉴클레아제에 의한 저감된 분해를 발휘하는, 번역가능한 영역을 포함하는 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA, 그리고 포장 및 설명서를 포함하는, 단백질 생산용 키트를 제공한다.
일 양상에 있어서, 본 발명은, 핵산이 세포 뉴클레아제에 의한 저감된 분해를 발휘하는, 번역가능한 영역을 포함하는 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA, 및 제1 핵산의 번역가능한 영역의 번역을 위해 적절한 포유류의 세포를 포함하는, 단백질 생산용 키트를 제공한다.
장치
본 발명은 관심대상 폴리펩타이드를 암호화하는 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA를 편입시킬 수 있는 장치를 제공한다. 이들 장치는, 인간 환자 등과 같은, 이를 필요로 하는 대상체에게 즉시 전달되도록 이용가능한 제형으로 합성 핵산에 시약들을 적절한 제형으로 수용한다. 이러한 관심 대상 폴리펩타이드의 비제한적인 예는 상처 치유를 위한 성장 인자 및/또는 신생혈관생성 촉진제, 감염 제어를 용이하게 하기 위한 펩타이드 항생제, 및 새롭게 확인된 바이러스에 대해서 면역 반응을 신속하게 촉진시키는 항원을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 장치는, 생성된 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA의 합성 및/또는 분석을 위한 설명서를 얻기 위하여 무선 원격 접근 가능할 수 있거나, 자체 수용하고 있다. 장치는 적어도 하나의 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA 및 다수의 비제한적인 수의 상이한 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA의 모바일 합성을 가능하게 한다. 소정의 실시형태에 있어서, 장치는 하나 혹은 보다 적은 수의 개체에 의해 운반될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 장치는 벤치탑 혹은 데스크 상에 끼워맞춤되는 크기로 되어 있다. 다른 실시형태에 있어서, 장치는 슈트케이스, 백팩 혹은 유사한 크기의 물체 내에 끼워맞춤되는 크기로 되어 있다.
다른 실시형태에 있어서, 장치는 케어 혹은 핸드헬드 장치의 포인트일 수 있다. 추가의 실시형태에 있어서, 장치는 차량, 예컨대, 자동차, 트럭 혹은 앰뷸런스, 또는 탱크 혹은 개인용 운반체 등과 같은 군용 차량에 끼워맞춤되는 크기로 되어 있다. 관심 대상 폴리펩타이드를 암호화하는 변형된 mRNA를 발생시키는데 필요한 정보는 장치 내에 존재하는 컴퓨터 판독가능한 매체 내에 존재한다.
일 실시형태에 있어서, 장치는 변형된 핵산 또는 mmRNA의 형태로 투여된 단백질의 수준에 접근하는데 이용될 수 있다. 장치는 혈액, 소변 혹은 기타 체액 테스트를 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 장치는 핵산 및 폴리펩타이드 서열의 데이터베이스와의 통신(예컨대, 무선 통신)이 가능하다. 장치는 1개 이상의 샘플 용기의 삽입을 위한 적어도 하나의 샘플 블록을 포함한다. 이러한 샘플 용기는 주형 DNA, 뉴클레오타이드, 효소, 완충액 및 기타 시약 등과 같은 임의의 개수의 물질을 액체 혹은 기타 형태로 수용할 수 있다. 샘플 용기는 또한 샘플 블록과의 접촉에 의해 가열 및 냉각될 수 있다. 샘플 블록은 일반적으로 적어도 하나의 샘플 블록용의 1개 이상의 전자 제어 유닛을 지니는 장치 베이스와 통신한다. 샘플 블록은 바람직하게는 가열 모듈을 포함하며, 이러한 가열 분자는 샘플 용기 및 그의 내용물의 약 -20C 내지 약 +100C의 온도로의 가열 및/또는 냉각을 가능하게 한다. 장치 베이스는 배터리 혹은 외부 전원 등과 같은 전압 공급부와 통신한다. 장치는 또한 RNA 합성용의 물질을 보관하고 분배시키기 위한 수단을 포함한다.
선택적으로, 샘플 블록은 합성된 핵산을 분리하기 위한 모듈을 포함한다. 대안적으로, 장치는 샘플 블록에 작동가능하게 연결된 분리 모듈을 포함한다. 바람직하게는, 장치는 합성된 핵산의 분석을 위한 수단을 포함한다. 이러한 분석은 서열 동일성(예컨대, 혼성화에 의해 입증됨), 바람직하지 않은 서열의 부재, 합성 mRNA의 통합성의 측정(예컨대, 분광광도법과 조합된 미세유체 점도측정법에 의해), 및 변형된 RNA의 농도 및/또는 역가(예컨대 분광광도법에 의해)을 포함한다.
소정의 실시형태에 있어서, 장치는 대상체로부터 얻어진 생물학적 물질 내에 존재하는 병원체의 검출을 위한 수단, 예컨대, 미생물 동정용의 IBIS PLEX-ID 시스템(애보트사(Abbott), 일리노이주의 애보트 파크시에 소재)과 조합된다.
본 명세서에 기재된 진피내 약제학적 조성물을 전달함에 있어서 이용하기 위한 적절한 장치는 미국 특허 제4,886,499호; 제5,190,521호; 제5,328,483호; 제5,527,288호; 제4,270,537호; 제5,015,235호; 제5,141,496호; 및 제5,417,662호에 기재된 것들 등과 같은 짧은 니들(혹은 바늘) 장치를 포함하며; 이들의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. 피부내 조성물은 PCT 공개 제WO 99/34850호(그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함됨)에 기재된 것들 및 그들의 기능적 등가물 등과 같은 피부 내로 니들의 효과적인 침투 길이를 제한하는 장치에 의해 투여될 수 있다. 액체 조성물을 액체 제트 인젝터(jet injector) 및/또는 각질층을 뚫는 니들을 통해 피부에 전달하고 피부에 도달하는 제트를 생산하는 제트 주사 장치가 적합하다. 제트 주사 장치는, 예를 들어, 미국 특허 제5,480,381호; 제5,599,302호; 제5,334,144호; 제5,993,412호; 제5,649,912호; 제5,569,189호; 제5,704,911호; 제5,383,851호; 제5,893,397호; 제5,466,220호; 제5,339,163; 5,312,335호; 제5,503,627호; 제5,064,413호; 제5,520,639호; 제4,596,556호; 제4,790,824호; 제4,941,880호; 제4,940,460호; 및 PCT 공개 제WO 97/37705호 및 제WO 97/13537호에 기재되어 있으며; 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. 압축 가스를 사용하여 분말 형태의 백신을 피부(skin)의 외부 층을 통해 진피(dermis)로 가속화시키는 탄도 분말(Ballistic powder)/입자 전달 장치가 적합하다. 대안적으로 혹은 부가적으로, 통상의 주사기는 진피내 투여의 고전적인 망투 방법(mantoux method)에서 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 장치는 펌프일 수 있거나 또는 혈뇌장벽을 가로질러 본 발명의 화합물 혹은 조성물의 투여용의 카테터를 포함할 수 있다. 이러한 장치는 가압 올팩토리 전달 장치(pressurized olfactory delivery device), 이온영동 장치, 다층 미세유체 장치 등을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 이러한 장치는 휴대용 혹은 고정적일 수 있다. 이들은 신체에 이식가능하거나 외부에서 테더링될 수 있거나 혹은 이들의 조합일 수 있다.
투여용 장치는 본 명세서에서 교시된 단일, 다회- 혹은 분할-투약 요법에 따라서 본 발명의 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA를 전달하는데 이용될 수 있다. 이러한 장치는 이하에 기술되어 있다.
세포, 장기 및 조직에 다회-투여를 위하여 당업계에 공지된 방법 및 장치는 본 발명의 실시형태로서 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물과 함께 이용하기 위하여 상정된다. 이들은, 예를 들어, 다수 니들을 구비한 이들 방법 및 장치, 예를 들어 루멘 혹은 카테터를 이용하는 혼성 장치뿐만 아니라 열, 전류 혹은 방사선 구동 기구를 이용하는 장치를 포함한다.
본 발명에 따르면, 이들 다회-투여 장치는 본 명세서에서 상정된 단일, 다회- 혹은 분횔-용량을 잔달하는데 이용될 수 있다.
고체 조직에 치료제를 전달하기 위한 방법은 Bahrami 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 공개 제20110230839, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Bahrami에 따르면, 니들들의 어레이는 각 니들의 길이에 따라서 상기 고체 조직 내의 임의의 개소에서 실질적으로 동일한 양의 유체를 전달하는 장치 내에 편입되어 있다.
생물학적 조직을 가로질러 생물학적 물질을 전달하기 위한 장치는 Kodgule 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 공개 제20110172610호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Kodgule에 따르면, 종 이상의 금속으로 만들어지고 약 200 마이크론 내지 약 350 마이크론의 외경과 적어도 100 마이크론의 길이를 지니는 다수 중공 마이크로-니들은, 펩타이드, 단백질, 탄수화물, 핵산 분자, 지질 및 기타 약제학적 활성 성분 또는 이들의 조합물을 전달하는 장치 내에 편입되어 있다.
조직에 치료제를 전달하기 위한 전달 탐침은 Gunday 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 공개 제20110270184호 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Gunday에 따르면, 다수 니들은 이 니들들을 통해 캡슐로부터 제제를 강제로 보내기 위하여 활성화된 위치와 비활성화된 위치 간에 부착된 캡슐을 이동시키는 장치 내에 편입되어 있다.
다수-주사 의료 장치는 Assaf에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 공개 제20110218497호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Assaf에 따르면, 다수 니들은 각 주사 후 의학적 유체를 연속적으로 재충전하기 위한 수단 및 상기 니들들 중 하나 이상에 연결된 챔버를 구비한 장치 내에 편입되어 있다.
일 실시형태에 있어서, 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA는 피하로 혹은 근육내로 적어도 3개의 니들을 통하여 3개의 상이한, 선택적으로 인접한 부위에 동시에 또는 60분의 기간 내에 투여(예컨대, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 부위에 동시에 혹은 60분의 기간 내에 투여)된다. 분할 용량은 미국 특허 공개 제20110230839호 및 제20110218497호에 기재된 장치를 이용해서 인접한 조직에 동시에 투여될 수 있으며, 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다.
환자의 신체 내에 물질을 주입하기 위한 적어도 부분적으로 이식가능한 시스템, 특히 음경 발기 자극 시스템은 Forsell에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 공개 제20110196198호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Forsell에 따르면, 다수 니들은 환자의 좌측 및 우측 해면체에 인접한 하나 이상의 하우징을 따라 이식된 장치 내에 편입되어 있다. 저장기 및 펌프는 또한 니들을 통한 약물을 공급하기 위하여 이식된다.
치료적 유효량의 철의 경피 전달을 위한 방법은 Berenson에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 공개 제20100130910호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Berenson에 따르면, 다수 니들은 이온영동 패취 상의 이온성 철의 경피 전달을 증대시키기 위하여 각질층 내에 다수의 마이크로 채널을 형성하는데 이용될 수 있다.
생물학적 조직을 가로질러 생물학적 물질을 전달하기 위한 방법은 Kodgule 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 공개 제20110196308호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Kodgule에 따르면, 치료적 활성 성분을 함유하는 다수의 생분해성 마이크로니들은 단백질, 탄수화물, 핵산 분자, 지질 및 기타 약제학적 활성 성분 또는 이들의 조합물을 전달하는 장치 내로 편입되어 있다.
보툴리늄 독소 조성물을 포함하는 경피 패취는 Donovan에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 공개 제20080220020호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Donovan에 따르면, 다수 니들은, 혈관을 파열시키는 일 없이 피부의 각질층을 통해 투사되는 해당 니들들을 통해서 각질층 밑에 보튤리늄 독소를 전달하는 패취 내에 편입되어 있다.
대략 0.2 내지 15㎖의 액체 제형을 보유할 수 있는 소형의 1회용 약물 저장기 또는 패취 펌프는, 피부 상에 위치되어, 요구되는 작은 구멍(예컨대, 26 내지 34 게이지)을 이용해서 피하로 연속적으로 제형을 전달할 수 있다. 비제한적인 예로서, 패취펌프는 30 내지 34 게이지의 니들이 장입된 50㎜ x 76㎜ x 20㎜ 스프링(BD™ 마이크로인퓨즈(Microinfuse)사, 뉴저지주의 프랭클린 레이크스시에 소재), 인슐린 등과 같은 약물 전달에 이용되는 41㎜ x 62㎜ x 17㎜의 2㎖ 저장기(옴니포드(OMNIPOD)®, 인슐렛사, 매사추세츠주의 베드포드시에 소재) 또는 43 내지 60㎜ 직경, 10㎜ 두께, 0.5 내지 10㎖ 저장기(패취펌프(PATCHPUMP)®, 스테디메드 테라퓨틱스사(SteadyMed Therapeutics), 캘리포니아주의 샌프란시스코시에 소재)일 수 있다. 또한, 패취 펌프는 전지 기동될 수 있고/있거나 재충전가능할 수 있다.
저온 치료의 개소에 활성제를 투여하기 위한 저온탐침은 Toubia에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 공개 제20080140061호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Toubia에 따르면, 다수 니들은 챔버에 활성제를 수용하고 해당 활성제를 조직에 투여하는 탐침 내에 편입되어 있다.
염증을 치료 혹은 예방하거나 또는 건강한 관절을 촉진시키는 방법은 Stock에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 공개 제20090155186호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Stock에 따르면, 다수 니들은 신호 전달 조절자 화합물을 함유하는 조성물을 투여하는 장치에 편입되어 있다.
다수 부위 주사 시스템은 Kimmell 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 공개 제20100256594호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Kimmell에 따르면, 다수 니들은 해당 니들을 통해 각질층 내로 약물을 전달하는 장치 내에 편입되어 있다.
진피내 구획부에 인터페론을 전달하는 방법은 Dekker 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 공개 제20050181033호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Dekker에 따르면, 0 내지 1 mm의 노출 높이를 가진 출구를 구비한 다수 니들은 0.3㎜ 내지 2㎜의 깊이에서 물질을 전달함으로써 약동학 및 생체이용률을 향상시키는 장치 내에 편입되어 있다.
유전자, 효소 및 생물학적 제제를 조직 세포에 전달하는 방법은 Desai에 의해 기술되고, 예를 들어 미국 특허 공개 제20030073908호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Desai에 따르면, 다수 니들은 신체 내로 삽입되어 상기 니들을 통해 약물 유체를 전달하는 장친 내에 편입되어 있다.
섬유아세포를 이용한 심부정맥을 치료하는 방법은 Lee 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 공개 제20040005295호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Lee에 따르면, 다수 니들은 조직의 국소 영역 내로 섬유아세포 세포를 전달하는 장치 내에 편입되어 있다.
뇌종양을 치료하기 위하여 자기 제어식 펌프를 이용하는 방법은 Shachar에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 공개 제7,799,012호(방법) 및 제7,799,016호(장치)에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Shachar에 따르면, 다수 니들은 제어된 속도로 니들을 통해 약물을 밀어넣는 펌프 내에 편입되어 있었다.
포유류의 암컷 내의 방광의 기능 장애를 치료하는 방법은 Versi 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 제8,029,496호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Versi에 따르면, 마이크로-니들의 어레이는 장치 내로 편입되어 해당 니들을 통해서 치료제를 방광의 삼각부 내로 직접 전달한다.
마이크로-니들 경피 수송 장치는 Angel 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 공개 제7,364,568호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Angel에 따르면, 다수 니들은 상이한 방향으로부터 표면 상에 삽입된 니들들을 통해서 체표면내로 물질을 수송하는 장치 내에 편입되어 있다. 마이크로-니들 경피 수송 장치는 고체 마이크로-니들 시스템 혹은 중공의 마이크로-니들 시스템일 수 있다. 비제한적인 예로서, 고체 마이크로-니들 시스템은, 약물로 피복된 약 150 내지 700㎛ 크기이고 ㎠당 300 내지 1500개의 고체 마이크로-니들을 지니며, 0.5㎎ 용량까지 지닐 수 있다. 마이크로-니들은 각질층을 뚫고 단시간(예컨대, 20 초 내지 15분) 동안 피부에 잔류한다. 다른 예에서, 중공의 마이크로-니들 시스템은 대략 950㎛ 크기인 ㎠당 15 내지 20개의 마이크로니들을 이용해서 액체 제형을 전달하기 위하여 3㎖까지의 용량을 지닌다. 마이크로-니들은 피부를 뚫어 액체 제형이 장치로부터 피부 속으로 흐르게 한다. 중공의 마이크로-니들 시스템은 제형 용적 및 점도에 따라서 1 내지 30분 지속된다.
피하 주입용의 장치는 Dalton 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 공개 제7,150,726호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Dalton에 따르면, 다수 니들은 해당 니들을 통해서 피하 조직 내로 유체를 전달하는 장치 내에 편입되어 있다.
마이크로캐뉼러를 통한 백신 및 유전자 치료제의 진피내 전달하는 장치 및 방법은 Mikszta 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 제7,473,247호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Mitszta에 따르면, 적어도 하나의 중공의 마이크로-니들은 0.025㎜ 내지 2㎜의 깊이까지 대상체의 피부에 백신을 전달하는 장치 내로 편입되어 있다.
인슐린을 전달하기 위한 방법은 Pettis 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 공개 제7,722,595호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Pettis에 따르면, 2개의 니들은, 두 니들이 본질적으로 동시에 피부에 삽입되는 장치 내에 편입되어 있되, 이때 제1니들은 진피내 구획부 내로 인슐린을 전달하기 위하여 2.5㎜ 미만의 깊이에 있고, 제2니들은 피하 구획부 내로 인슐린을 전달하기 위하여 2.5㎜ 이상 내지 5.0㎜ 미만의 깊이에 있다.
흡인 하의 Cutaneous 주사 전달은 Kochamba 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 제6,896,666호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Kochamba에 따르면, 서로 상대적으로 인접한 다수 니들이 각질층 밑에 유체를 주입하는 장치 내에 편입되어 있다.
피부를 통해 물질을 전달하거나 빼내는 장치는 Down 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 제6,607,513호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Down에 따르면, 장치 내로 편입되는 다수 피부 침투 부재는 약 100 마이크론 내지 약 2000 마이크론의 길이를 지니고 약 30 내지 50 게이지이다.
피부에 물질을 전달하기 위한 장치는 Palmer 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 제6,537,242호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Palmer에 따르면, 마이크로-니들들의 어레이는, 연신 조립체를 이용해서 니들과 피부의 접촉을 향상시켜 물질의 더욱 균일한 전달을 제공하는 장치 내에 편입되어 있다.
국재화된 약물 전달용의 관류 장치는 Zamoyski에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 제6,468,247호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Zamoyski에 따르면, 다수의 피하 니들은 피하 주사기가 쑥 들어감에 따라서 피하주사기의 내용물을 조직 내로 주입하는 장치 내에 편입되어 있다.
마이크로-니들과 인간 피부 간의 상호작용을 향상시킴으로써 조직을 가로질러 약물 및 생물학적 분자의 증대된 수송을 위한 방법은 Prausnitz 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 제6,743,211호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Prausnitz에 따르면, 다수의 마이크로-니들은 마이크로-니들이 적용되는 더 강고하고 덜 변형가능한 표면을 제공할 수 있는 장치 내에 편입되어 있다.
의약 제제의 장기내 투여를 위한 장치는 Ting 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 제6,077,251호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Ting에 따르면, 증대된 투여를 위한 측면 개공들을 구비한 다수 니들은, 상기 니들을 확장 및 수축시킴으로써 니들 챔버가 저장기로부터 상기 니들 내로 약물 제제를 강제로 보내어 상기 약물 제제를 표적 장기 내로 주입하는 장치 내에 편입되어 있다.
다수 니들 홀더 및 피하 다수 채널 주입 포트는 Brown에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 공개 제4,695,273호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Brown에 따르면, 니들 홀더 상의 다수 니들은 주입구의 중격을 통해 삽입되어 상기 주입구 내의 격리된 챔버와 연통한다.
이중 피하 주사기는 Horn에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 제3,552,394호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Horn에 따르면, 장치 내에 편입된 2개의 니들은 68㎜ 미만으로 떨어져 있고 상이한 스타일과 길이로 되어 있으므로, 주사가 상이한 깊이로 행해질 수 있게 된다.
다수 니들 및 다수의 유체 구획부를 가진 주사기는 Hershberg에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 공개 제3,572,336호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Hershberg에 따르면, 다수 니들이 다수의 유체 구획부를 지니는 주사기 내에 편입되어 있어, 한번의 주사에 대해서 혼합될 수 없는 비상용성의 약물을 동시에 투여가능하다.
유체의 진피내 주사용의 수술 기구는 Eliscu 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 제2,588,623호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Eliscu에 따르면, 다수 니들이 보다 넓은 분포로 진피 내에 유체를 주사하는 기구 내에 편입되어 있다.
다수의 모유관에 물질의 동시 전달을 위한 장치는 Hung에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 유럽 특허 공개 제1818017호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Hung에 따르면, 다수의 루멘이 덕트 망의 오르피스를 통해 삽입되어 해당 덕트 망으로 유체를 전달하는 장치 내에 편입되어 있다.
심장 혹은 기타 장기의 조직에 약물의 도입을 위한 카테터는 Tkebuchava에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 제WO2006138109호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Tkebuchava에 따르면, 평탄한 궤적으로 장기 벽으로 유입되는 2개의 만곡된 니들이 편입되어 있다.
의약적 제제를 전달하는 장치는, Mckay 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 제WO2006118804호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Mckay에 따르면, 각 니들 상에 다수의 오리피스를 지니는 다수 니들이 조직, 예컨대 경추 디스크의 내부 디스크 공간에 지역적인 전달을 용이하게 하는 장치 내에 편입되어 있다.
포유류의 피부 내의 진피내 공간에 면역 조절 물질을 직접 전달하는 방법은 Pettis에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 제WO2004020014호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Pettis에 따르면, 다수 니들은 0.3㎜ 내지 2㎜ 깊이로 니들을 통해서 물질을 전달하는 장치 내에 편입되어 있다.
전신 흡수 및 향상된 약동학을 위하여 피부 내 적어도 2개의 구획부 내로의 물질의 투여를 위한 방법 및 장치는 Pettis 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 제WO2003094995호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Pettis에 따르면, 약 300㎛ 내지 약 5㎜ 길이를 지니는 다수의 니들이 진피 내 및 피하 조직 구획부에 동시에 전달하는 장치 내에 편입되어 있다.
니들 및 롤러를 구비한 약물 전달 장치는 Zimmerman 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 제 WO2012006259호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Zimmerman에 따르면, 롤러 내에 위치결정된 다수의 중공의 니들은 롤러가 회전함에 따라서 해당 니들들을 통해서 저장기 내의 내용물을 전달하는 장치 내에 편입되어 있다.
스텐트 등과 같은 약물 전달 장치는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 공개 제US20060020329호, 제US20040172127호 및 제US20100161032호에 교시되며, 이들의 내용은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. 본 명세서에 기재된 변형된 핵산 분자 및 mmRNA의 제형은 스텐트를 이용해서 전달될 수 있다. 부가적으로, 본 명세서에서 이용되는 스텐트는 동일 혹은 다양한 전달 속도에서 다수의 변형된 핵산 분자 및/또는 제형을 전달할 수 있다. 스텐트의 제조사의 비제한적인 예는 코디스(CORDIS)®(플로리다주의 마이애미시에 소재)(사이퍼(CYPHER)®), 보스톤 사이언티픽사(Boston Scientific Corporation)(매사추세츠주의 내틱시에 소재)(탁서스(TAXUS)®), 메드트로닉사(Medtronic)(미네소타주의 미니애폴리스시에 소재)(엔데버(ENDEAVOUR)®) 및 애보트사(Abbott)(일리노이주의 애포트 파크시에 소재)(시엔스 브이(XIENCE V)®)를 포함한다.
카테터 및/또는 루멘을 이용하는 방법 및 장치
카테터 및 루멘을 이용하는 방법 및 장치는 단일, 다회- 또는 분할 투약 스케줄로 본 발명의 mmRNA를 투여하는데 이용될 수 있다. 이러한 방법 및 장치는 이하에 설명되어 있다.
손상된 심장의 심근에의 골격 근아세포의 카테터-기반 전달은 Jacoby 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 공개 제20060263338호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Jacoby에 따르면, 다수 니들은 적어도 일부가 혈관 내로 삽입되어 세포 조성물을 니들을 통해서 대상체의 심장의 국재화된 영역으로 전달하는 장치 내에 편입되어 있다.
신경독소를 이용한 천식을 치료하는 장치는 Deem 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 공개 제20060225742호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Deem에 따르면, 다수 니들은 신경 독소를 니들을 통해서 기관 조직 내로 전달하는 장치 내에 편입되어 있다.
다성분 요법을 투여하는 방법은 Nayak에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 제7,699,803호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Nayak에 따르면, 다수의 주사 캐뉼러는 치료적 물질이 조직 내료 전달되는 깊이를 제어하기 위하여 깊이 슬롯이 포함될 수 있는 장치 내에 편입될 수 있다.
채널을 절제하고 조직의 소망의 영역 내로 적어도 하나의 치료제를 전달하는 수술 장치는 McIntyre 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 제8,012,096호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. McIntyre에 따르면, 다수 니들은 채널 둘레의 조직의 영역으로 치료제를 분배하고, 경심근 혈관 재생 수술에 특히 적합한 장치 내에 편입되어 있다.
포유류의 암컷의 방광의 기능 장애를 치료하는 방법이 Versi 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 제8,029,496호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Versi에 따르면, 마이크로-니들의 어레이는 장치 내로 편입되어 해당 니들을 통해서 치료제를 방광의 삼각부 내로 직접 전달한다.
가요성의 생물학적 장벽 내로 유체를 전달하기 위한 장치 및 방법이 Yeshurun 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 제7,998,119호(장치) 및 제8,007,466호(방법)에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Yeshurun에 따르면, 장치 상의 마이크로-니들이 가요성의 생물학적 장벽 내로 침투하여 뻗어, 유체가 이 중공의 마이크로니들의 구멍을 통해서 주입된다.
동체 내에 배치되어 심외막 표면을 지니는 심장의 조직의 영역 내로 물질을 심막외로 주입하는 방법은 Bonner 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 제7,628,780호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Bonner에 따르면, 장치는 니들을 조직 내로 구동하여 의약적 제제를 해당 니들을 통해서 조직 내로 주입하는 세장형 샤프트 및 원위 주사 헤드를 구비한다.
천자를 봉합하는 장치는 Nielsen 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 제7,972,358호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Nielsen에 따르면, 다수 니들은 천자 관 둘레의 조직 내로 폐쇄제(closure agent)를 전달하는 장치 내에 편입되어 있다.
근육생성 및 신생혈관생성을 위한 방법은 Chiu 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 제6,551,338호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Chiu에 따르면, 6 내지 20㎜의 천자 깊이를 제공하는데 유효한 길이 및 적어도 1.25㎜의 최대 직경을 지니는 5 내지 15개의 니들은 심근에 근접하여 삽입되어 외생적 혈관신생 혹은 근원성(myogenic) 인자를 상기 니들의 적어도 일부에 있는 도관을 통해서 상기 심근에 공급하는 장치 내에 편입되어 있다.
전립선 조직의 치료를 위한 방법은 Bolmsj 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 제6,524,270호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Bolmsj에 따르면, 요도를 통해 삽입되는 카테터를 포함하는 장치는 둘레의 전립선 조직 내로 연신가능한 적어도 하나의 중공의 선단을 구비한다. 지혈 및 진동 약물이 상기 선단부를 통해서 상기 전립선 조직으로 투여된다.
골내 부위에 유체를 주입하기 위한 방법은 Findlay 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 제6,761,726호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Findlay에 따르면, 다수 니들은 연질 재료층에 의해 덮인 경질 재료의 쉘을 침투가능하고 상기 경질 재료의 쉘 밑에 소정의 거리에서 유체를 전달하는 장치 내에 편입되어 있다.
혈관벽에 약물을 주사하기 위한 방법은 Vigil 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 제5,713,863호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Vigil에 따르면, 다수의 인젝터가 약물 유체를 다수-루멘 카테터를 통해 가요성 관 내로 도입하고 주입용의 상기 인젝터로부터 혈관 벽 내로 도입하는 장치 내의 가요성 관의 각각 상에 장착되어 있다.
신체 통로를 둘러싸고 있는 조직에 치료제 및/또는 진단제를 전달하기 위한 카테터는 Faxon 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 제5,464,395호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Faxon에 따르면, 적어도 하나의 니들 캐뉼러는 목적으로 하는 제제를 카테터의 외부로 돌출하는 니들을 통해 조직으로 전달하는 카테터 내에 편입되어 있다.
치료제를 전달하는 풍선 카테터는 Orr에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 제WO2010024871호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Orr에 따르면, 다수 니들은 치료제를 조직 내에 상이한 깊이로 전달하는 장치 내에 편입되어 있다. 다른 양상에 있어서, 약물-방출 풍선은 본 명세서에 기재된 제형을 전달하는데 이용될 수 있다. 물-방출 풍선은 스텐트내 재협착증, 구불구불한 혈관 내 치료용 병변, 분기 병변, 대퇴부/슬와 병변 및 무릎 병변 아래(이것으로 제한되지 않음) 등과 같은 표적 병변 적용에 이용될 수 있다.
루민(lumin)에 대해서 배치된 조직에 치료제(예컨대, 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA)를 전달하는 장치는 Perry 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 공개 제US20100125239호에 교시되며, 이들의 내용은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Perry에 따르면, 카테터는 당업계에 공지되고 Perry에 기재된 방법에 의해 치료제로 피복되어 있을 수 있는 풍선을 구비한다. 풍선이 팽창되면, 치료제는 둘레 조직과 접촉할 것이다. 장치는 조직에 치료제를 방출하기 위하여 풍선 상의 피막의 온도를 변화시키는 열 공급원을 부가적으로 구비할 수 있다.
전류를 이용하는 방법 및 장치
전류를 이용하는 방법 및 장치는 본 명세서에 교시된 단일, 다회- 혹은 분할 투약 요법에 따라서 본 발명의 mmRNA를 전달하는데 이용될 수 있다. 이러한 방법 및 장치는 이하에 설명되어 있다.
전기콜라겐 유도 치료 장치는 Marquez에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 공개 제20090137945호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Marquez에 따르면, 다수 니들은 반복해서 피부를 꿰뚫어 처음에 피부에 적용된 물질의 일부를 피부에서 끌어내는 장치 내에 편입되어 있다.
동전기적(electrokinetic) 시스템은 Etheredge 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 공개 제20070185432호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Etheredge에 따르면, 마이크로-니들은 전류에 의해 약물을 니들을 통해서 표적화된 치료 부위 내로 구동시키는 장치 내에 편입되어 있다.
이온영동 장치는 Matsumura 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 공개 제7,437,189호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Matsumura에 따르면, 다수 니들은 보다 고속으로 혹은 보다 높은 효율로 이온화가능한 약물을 전달할 수 있는 장치 내에 편입되어 있다.
무 바늘(혹은 니들-프리) 주사 및 전기천공에 의한 생물학적 활성제의 피부내 전달은 Hoffmann 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 제7,171,264, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Hoffmann에 따르면, 1개 이상의 니들-프리 주사기가 전기천공 장치 내에 편입되어, 니들-프리 주사와 전기천공의 조합은 피부, 근육 혹은 점막 내의 세포에 제제를 도입하기에 충분하다.
전기투과-매개 세포내 전달 방법은 Lundkvist 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 미국 특허 제6,625,486호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Lundkvist에 따르면, 1쌍의 니들 전극이 카테터 내에 편입되어 있다. 상기 카테터는 본체 루멘 내에 위치결정된 후에 상기 니들 전극을 확대시켜서 상기 루멘 둘레의 조직 내로 침투시킨다. 이어서 장치는 상기 니들 전극들 중 적어도 하나를 통해서 제제를 도입하고,상기 니들 전극의 쌍에 의해 전계를 인가하여 상기 제제를 세포막을 통해서 치료 부위의 세포 내로 통과시킬 수 있게 된다.
경피 면역화를 위한 전달 시스템은 Levin 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 제 WO2006003659호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Levin에 따르면, 다수의 전극이 해당 전극들 사이에 전기 에너지를 인가하여 피부 내 마이크로 채널을 발생시켜서 경피 전달을 용이하게 하는 장치 내에 편입되어 있다.
RF 에너지를 피부 내로 전달하기 위한 방법은 Schomacker 등에 의해 기술된 바 있고, 예를 들어 제WO2011163264호에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. Schomacker에 따르면, 다수 니들은 플레이트와 접촉하여 피부를 당기므로 니들이 플레이트 상의 구멍을 통해서 니들이 삽입되어 RF 에너지를 전달하는 장치 내에 편입되어 있다.
정의들
본 명세서에서의 다양한 위치에서, 본 발명의 개시내용의 화합물의 치환체가 그룹들 또는 범위들로 기재되어 있다. 본 발명의 개시내용은 이러한 그룹 및 범위의 구성원들의 각각의 및 모든 개별적 소조합을 포함하는 것으로 구체적으로 의도된다. 예를 들어, "C1-6 알킬"이란 용어는, 메틸, 에틸, C3 알킬, C4 알킬, C5 알킬 및C6 알킬을 개별적으로 개시하는 것으로 구체적으로 의도된다.
약: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "약"이란 용어는, 언급된 값의 +/- 10%를 의미한다.
병용하여 투여된: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "병용하여 투여된" 또는 "병용 투여"란 용어는, 2종 이상의 제제(예컨대, 항균성 폴리펩타이드(예컨대, 항-박테리아 폴리펩타이드), 예컨대, 본 명세서에 기재된 항균성 폴리펩타이드를 암호화하는 변형된 핵산 또는 mmRNA 및 항균제(예컨대, 본 명세서에 기재된 항균성 폴리펩타이드 또는 소분자 항균성 화합물))가 대상체에게 동시에 또는 환자에서 각각의 제제의 효과가 중첩될 수 있도록 하는 간격 내에서 투여됨을 의미한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 이들은 서로 약 60, 30, 15, 10, 5, 또는 1분 내에 투여된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 제제들의 투여는, 병용(예컨대, 상승작용) 효과가 달성되도록 함께 충분히 근접하게 간격을 둔다.
동물: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "동물"이란 용어는, 동물계의 어떠한 구성원을 지칭한다. 몇몇 실시형태에 있어서, "동물"이란 어느 단계의 발달에 있는 인간을 지칭한다. 몇몇 실시형태에 있어서, "동물"이란 어느 단계의 발달에 있는 비-인간 동물을 지칭한다. 소정의 실시형태에 있어서, 비-인간 동물은 포유류(예컨대, 설치류, 마우스, 래트, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 양, 소, 영장류 또는 돼지)이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 동물은 포유류, 조류, 파충류, 양서류, 어류 및 벌레를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 몇몇 실시형태에 있어서, 동물은 형질전환 동물, 일반적으로-공학적으로 조작된 동물 또는 클론이다.
관심 대상 항원 혹은 목적으로 하는 항원: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "관심 대상 항원" 또는 "목적으로 하는 항원"이란 용어는 본 명세서에 기재된 항체 및 단편, 돌연변이체, 변이체 및 그의 변형들에 의해 면역특이적으로 결합된 본 명세서에서 제공되는 단백질 및 기타 바이오분자를 포함한다. 관심 대상 항원의 예로는, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자, hGH, tPA, 사이토카인, 예컨대 인터류킨(IL), 예컨대, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, 인터페론(IFN) 알파, IFN 베타, IFN 감마, IFN 오메가 또는 IFN 타우, 종양 괴사 인자(TNF), 예컨대, TNF 알파 및 TNF 베타, TNF 감마, TRAIL; G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 및 VEGF를 이들로 제한되는 것은 아니다.
대략: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "대략" 또는 "약"이란 용어는, 관심 대상의 하나 이상의 값에 적용되는 바와 같이, 기술된 참조 값과 유사한 값을 말한다. 소정의 실시형태에 있어서, "대략" 또는 "약"이란 용어는 달리 기술되지 않거나 내용으로부터 다른 증거가 없는 한 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 미만에 속하는 값의 범위(이러한 수가 가능한 값의 100%를 초과할 수 있는 경우는 제외함)를 지칭한다.
와 연관된(associated with): 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "과 연관된", "컨쥬게이트된," "연결된," "부착된," 및 "테더링된"이란, 2개 이상의 모이어티와 관련하여 사용될 경우, 당해 모이어티들이 직접적으로 또는 연결제로서 제공되는 하나 이상의 추가의 모이어티를 통해 물리적으로 연합되거나 연결됨으로써, 당해 모이어티가 당해 구조가 사용되는 조건, 예컨대, 생리학적 조건 하에서 물리적으로 연합되어 잔존하도록 하기에 충분히 안정한 구조를 형성함을 의미한다. "연합"(association)은 직접적인 공유결합적 화학 결합을 통해 엄격하게 되어 있을 필요는 없다. 이온성 또는 수소 결합 또는 하이브리드화계 연결성이 충분히 안정적이어서 "연합된" 실체들이 생리학적으로 연합된 채로 있는 것이 또한 제안될 수 있다.
이작용성: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "이작용성"이란 용어는 적어도 2개의 기능을 유지할 수 있는 임의의 물질, 분자 혹은 모이어티를 지칭한다. 이 기능은 동일한 성과 혹은 상이한 성과를 발휘할 수 있다. 기능을 발생하는 구조는 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 이작용성 변형된 RNA는 세포독성 펩타이드을 암호화(제1기능)할 수 있는 반면 암호화 RNA를 포함하는 뉴클레오사이드는 그 자체 내에 혹은 그 자체로 세포독성이다(제2기능). 이 예에서, 이작용성 변형된 RNA의 암 세포로의 전달은 암을 개선하거나 치료하는 펩타이드 혹은 단백질 분자를 생산할 뿐만 아니라, 변형된 RNA의 번역 대신에, 분해를 일으켜야만 하는 세포로 뉴클레오사이드의 세포독성 페이로드를 전달한다.
생체적합성: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "생체적합성"이란 용어는, 손상, 독성 또는 면역 시스템에 의한 거부를 일으킬 위험이 거의 없는 살아있는 세포, 조직, 장기 혹은 시스템과 거부반응을 일으키지 않는 것을 의미한다.
생분해성: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "생분해성"이란 용어는 살아있는 것들의 작용에 의해 무해한 생성물들로 분해될 수 있음을 의미한다.
생물학적으로 활성인: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "생물학적으로 활성인"이라는 어구는 생물학적 시스템 및/또는 유기체 내에서 활성을 갖는 임의의 물질의 특징을 지칭한다. 예를 들어, 유기체에 투여되는 경우, 당해 유기체에서 생물학적 효과를 갖는 물질은 생물학적으로 활성인 것으로 고려된다. 특정 실시형태에 있어서, 본 발명의 변형된 핵산 또는 mmRNA는, 변형된 핵산 또는 mmRNA의 일부가 생물학적으로 활성이거나 생물학적으로 관련된 것으로 고려된 활성을 모사하는 경우에도, 생물학적으로 활성인 것으로 고려될 수 있다.
화학적 용어들: 이하는 "아실"로부터 "티올"까지의 다양한 화학적 용어의 정의를 제공한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "아실"이란 용어는, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 카보닐기를 통해서 모 분자기에 부착된 수소 또는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 알킬기(예컨대, 할로알킬기)를 나타내며, 폼일(즉, 카복시알데하이드기), 아세틸, 프로피오닐, 뷰타노일기 등으로 예시된다. 예시적인 비치환 아실기는 1 내지 7, 1 내지 11 또는 1 내지 21개의 탄소를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 알킬기는 본 명세서에 기재된 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 더 치환된다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "아실아미노"란 용어는, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 아미노기를 통해 모 분자기에 부착된 본 명세서에서 정의된 바와 같은 아실기(즉, N(RN1)-C(O)-R을 나타내되, 여기서 R은 H 또는 선택적으로 치환된 C1-6, C1-10 또는 C1-20 알킬기이고, RN1은 본 명세서에서 정의된 바와 같음)를 나타낸다. 예시적인 비치환된 아실아미노기로는 1 내지 41개의 탄소(예컨대, 1 내지 7, 1 내지 13, 1 내지 21, 2 내지 7, 2 내지 13, 2 내지 21 또는 2 내지 41개의 탄소)를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 알킬기는 본 명세서에 기재된 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 더 치환되고/되거나, 아미노기는 -NH2 또는 -NHRN1이며, 이때 RN1은, 독립적으로, OH, NO2, NH2, NRN2 2, SO2ORN2, SO2RN2, SORN2, 알킬 또는 아릴이고, 각각의 RN2는 H, 알킬 또는 아릴일 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "아실옥시"란 용어는, 산소 원자를 통해 모 분자에 부차된 본 명세서에서 정의된 바와 같은 아실기(즉, -O-C(O)-R, 여기서 R은 H 또는 선택적으로 치환된 C1-6, C1-10 또는 C1-20 알킬기임)를 나타낸다. 예시적인 비치환된 아실옥시기는 1 내지 21개의 탄소(예컨대, 1 내지 7 또는 1 내지 11개의 탄소)를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 알킬기는 본 명세서에 기재된 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 더 치환되고/되거나, 아미노기는 -NH2 또는 -NHRN1이며, 이때 RN1은, 독립적으로, OH, NO2, NH2, NRN2 2, SO2ORN2, SO2RN2, SORN2, 알킬 또는 아릴이고, 각각의 RN2는 H, 알킬 또는 아릴일 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "알크아릴"이란 용어는, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 알킬렌기를 통해서 모 분자기에 부착된 본 명세서에서 정의된 바와 같은 아릴기를 나타낸다. 예시적인 비치환된 알크아릴기는 7 내지 30개의 탄소(예컨대, 7 내지 16 또는 7 내지 20 탄소, 예를 들어, C1-6 알크-C6-10 아릴, C1-10 알크-C6-10 아릴 또는 C1-20 알크-C6-10 아릴)로 이루어진다. 몇몇 실시형태에 있어서, 알킬렌 및 아릴은 각각 각각의 기에 대해서 본 명세서에 기재된 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 더 치환될 수 있다. 접두사 "알크-"에 의해 선행되는 기타 기는 마찬가지 방식으로 정의되며, 여기서, "알크"는 달리 나타내지 않는 한, C1-6 알킬렌을 나타내며, 부착된 화학 구조식은 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"알크사이클로알킬"이란 용어는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 알킬렌기(예컨대, 1 내지 4, 1 내지 6, 1 내지 10 또는 1 내지 20개의 탄소의 알킬렌기)를 통해서 모 분자기에 부착된 본 명세서에서 정의된 바와 같은 사이클로알킬기를 나타낸다. 몇몇 실시형태에 있어서, 알킬렌 및 사이클로알킬은 각각 각각의 기에 대해서 본 명세서에 기재된 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 더 치환될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "알케닐"이란 용어는, 달리 특정되지 않는 한, 탄소 이중 결합을 포함하는 2 내지 20개의 탄소(예컨대, 2 내지 6 또는 2 내지 10개의 탄소)의 1개 이상의 탄소-1가의 직쇄 혹은 분지쇄기를 나타내며, 에테닐, 1-프로페닐, 2-프로페닐, 2-메틸-1-프로페닐, 1-뷰테닐, 2-뷰테닐 등에 의해 예시된다. 알케닐은 시스 이성질체와 트랜스 이성질체의 둘 다를 포함한다. 알케닐기는, 본 명세서에서 정의된 바와 같은, 아미노, 아릴, 사이클로알킬 또는 헤테로사이클릴(예컨대, 헤테로아릴), 또는 본 명세서에 기재된 예시적인 알킬 치환기들 중 어느 하나로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 선택적으로 치환될 수 있다.
"알케닐옥시"란 용어는, 달리 특정되지 않는 한, 화학식 -OR의 화학적 치환기를 나타내되, 여기서 R은 C2-20 알케닐기(예컨대, C2-6 또는 C2-10 알케닐)이다. 예시적인 알케닐옥시기는 에테닐옥시, 프로페닐옥시 등을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 알케닐기는 본 명세서에 기재된 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환(예컨대, 하이드록시기)로 더 치환될 수 있다.
"알크헤테로아릴"이란 용어는, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 알킬렌기를 통해서 모 분자기에 부착된 본 명세서에서 정의된 바와 같은 헤테로아릴기를 나타낸다. 예시적인 비치환된 알크헤테로아릴기는 2 내지 32 탄소(예컨대, 2 내지 22, 2 내지 18, 2 내지 17, 2 내지 16, 3 내지 15, 2 내지 14, 2 내지 13 또는 2 내지 12 탄소, 예를 들어, C1-6 알크-C1-12 헤테로아릴, C1-10 알크-C1-12 헤테로아릴 또는 C1-20 알크-C1-12 헤테로아릴)이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 알킬렌 및 헤테로아릴은 각각 각각 각각의 기에 대해서 본 명세서에 기재된 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 더 치환될 수 있다. 알크헤테로아릴기는 알크헤테로사이클릴기의 부분집합이다.
"알크헤테로사이클릴"이란 용어는, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 알킬렌기를 통해서 모 분자기에 부착된 본 명세서에서 정의된 바와 같은 헤테로사이클릴기를 나타낸다. 예시적인 비치환된 알크헤테로사이클릴기는 2 내지 32 탄소(예컨대, 2 내지 22, 2 내지 18, 2 내지 17, 2 내지 16, 3 내지 15, 2 내지 14, 2 내지 13 또는 2 내지 12 탄소, 예를 들어, C1-6 알크-C1-12 헤테로사이클릴, C1-10 알크-C1-12 헤테로사이클릴 또는 C1-20 알크-C1-12 헤테로사이클릴)이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 알킬렌 및 헤테로사이클릴은 각각 각각의 기에 대해서 본 명세서에 기재된 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 더 치환될 수 있다.
"알콕시"란 용어는, 달리 특정되지 않는 한, 식 -OR의 화학적 치환기를 나타내되, 여기서 R은 C1-20알킬기(예컨대, C1-6 또는 C1-10알킬)이다. 예시적인 알콕시기는 메톡시, 에톡시, 프로폭시(예컨대, n-프로폭시 및 아이소프로폭시), t-뷰톡시 등을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 알킬기는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기(예컨대, 하이드록시 또는 알콕시)로 더 치환될 수 있다.
"알콕시알콕시"란 용어는 알콕시기로 치환된 알콕시기를 나타낸다. 예시적인 비치환된 알콕시알콕시기는 2 내지 40개의 탄소(예컨대, 2 내지 12 또는 2 내지 20개의 탄소, 예를 들어, C1-6 알콕시-C1-6 알콕시, C1-10 알콕시-C1-10 알콕시 또는 C1-20 알콕시-C1-20 알콕시)를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 각각의 알콕시기는 본 명세서에 기재된 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 더 치환될 수 있다.
"알콕시알킬"이란 용어는 알콕시기로 치환된 알킬기를 나타낸다. 예시적인 비치환된 알콕시알킬기는 2 내지 40개의 탄소(예컨대, 2 내지 12 또는 2 내지 20개의 탄소, 예를 들어, C1-6 알콕시-C1-6 알킬, C1-10 알콕시-C1-10 알킬 또는 C1-20 알콕시-C1-20 알킬)를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 알킬 및 알콕시 각각은 각각의 기에 대해서 본 명세서에서 정의된 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 치환기로 더 치환될 수 있다.
"알콕시카보닐"이란 용어는, 카보닐 원자를 통해서 모 분자기에 부착된 본 명세서에서 정의된 바와 같은 알콕시(예컨대, -C(O)-OR, 여기서 R은 H 또는 선택적으로 치환된 C1-6, C1-10 또는 C1-20 알킬기임)를 나타낸다. 예시적인 비치환된 알콕시카보닐은 1 내지 21개의 탄소(예컨대, 1 내지 11 또는 1 내지 7 탄소)를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 알콕시기는 본 명세서에 기재된 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 더 치환된다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "알콕시카보닐알콕시"란 용어는, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 알콕시카보닐기로 치환된, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 알콕시기(예컨대, -O-알킬-C(O)-OR, 여기서 R은 선택적으로 치환된 C1-6, C1-10 또는 C1-20 알킬기임)를 나타낸다. 예시적인 비치환된 알콕시카보닐알콕시는 3 내지 41개의 탄소(예컨대, 3 내지 10, 3 내지 13, 3 내지 17, 3 내지 21 또는 3 내지 31개의 탄소, 예를 들어, C1-6 알콕시카보닐-C1-6 알콕시, C1-10 알콕시카보닐-C1-10 알콕시 또는 C1-20 알콕시카보닐-C1-20 알콕시)를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 각 알콕시기는 본 명세서에 기재된 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기(예컨대, 하이드록시기)로 추가로 독립적으로 치환된다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "알콕시카보닐알킬"이란 용어는, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 알콕시카보닐기로 치환된, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 알킬기(예컨대, -알킬-C(O)-OR, 여기서 R은 선택적으로 치환된 C1-20, C1-10 또는 C1-6 알킬기임)를 나타낸다. 예시적인 비치환된 알콕시카보닐알킬은 3 내지 41개의 탄소(예컨대, 3 내지 10, 3 내지 13, 3 내지 17, 3 내지 21 또는 3 내지 31개의 탄소, 예를 들어, C1-6 알콕시카보닐-C1-6 알킬, C1-10 알콕시카보닐-C1-10 알킬 또는 C1-20 알콕시카보닐-C1-20 알킬)를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 각 알킬 및 알콕시기는 본 명세서에 기재된 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기(예컨대, 하이드록시기)로 추가로 독립적으로 치환된다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "알킬"이란 용어는, 달리 특정되지 않는 한, 직쇄 및 분지쇄 포화기의 양쪽 모두인 1 내지 20(예컨대, 1 내지 10 또는 1 내지 6)개의 탄소를 내포한다. 알킬기는, 메틸, 에틸, n- 및 아이소-프로필, n-, sec-, 아이소- 및 tert-뷰틸, 네오펜틸 등으로 예시되며, (1) C1-6 알콕시; (2) C1-6 알킬설피닐; (3) 본 명세서에 정의된 바와 같은 아미노(예컨대, 비치환된 아미노(즉, -NH2) 또는 치환된아미노(즉, -N(RN1)2(여기서 RN1은 아미노에 대해 정의된 것과 같음)); (4) C6-10 아릴-C1-6 알콕시; (5) 아자이도; (6) 할로; (7) (C2-9 헤테로아실)옥시; (8) 하이드록시; (9) 나이트로; (10) 옥소(예컨대, 카복시알데하이드 또는 아실); (11) C1-7 스피로사이클릴; (12) 티오알콕시; (13) 티올; (14) -CO2RA'(여기서, RA'는 (a) C1-20 알킬(예컨대, C1-6 알킬), (b) C2-20 알케닐(예컨대, C2-6 알케닐), (c) C6-10 아릴, (d) 수소, (e) C1-6 알크-C6-10 아릴, (f) 아미노-C1-20 알킬, (g) -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR'의 폴리에틸렌 글라이콜(여기서 s1은 1 내지 10(예컨대, 1 내지 6 또는 1 내지 4)의 정수이고, s2 및 s3의 각각은, 독립적으로, 0 내지 10(예컨대, 0 내지 4, 0 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 6 또는 1 내지 10)의 정수이고, R'는 H 또는 C1-20 알킬, 및 (h) -NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1의 아미노-폴리에틸렌 글라이콜(여기서 s1은 1 내지 10(예컨대, 1 내지 6 또는 1 내지 4)의 정수이고, s2 및 s3의 각각은, 독립적으로, 0 내지 10(예컨대, 0 내지 4, 0 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 6 또는 1 내지 10)의 정수이며, 각각의 RN1은, 독립적으로, 수소 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬임)로 이루어진 군으로부터 선택됨); (15) -C(O)NRB'RC'(여기서 RB' 및 RC'의 각각은, 독립적으로, (a) 수소, (b) C1-6 알킬, (c) C6-10 아릴 및 (d) C1-6 알크-C6-10 아릴로 이루어진 군으로부터 선택됨); (16) -SO2RD'(여기서 RD'는 (a) C1-6 알킬, (b) C6-10 아릴, (c) C1-6 알크-C6-10 아릴 및 (d) 하이드록시로 이루어진 군으로부터 선택됨); (17) -SO2NRE'F'(여기서 RE' 및 RF'의 각각은, 독립적으로, (a) 수소, (b) C1-6 알킬, (c) C6-10 아릴 및 (d) C1-6 알크-C6-10 아릴로 이루어진 군으로부터 선택됨); (18) -C(O)RG'(여기서 RG'는 (a) C1-20 알킬(예컨대, C1-6 알킬), (b) C2-20 알케닐(예컨대, C2-6 알케닐), (c) C6-10 아릴, (d) 수소, (e) C1-6 알크-C6-10 아릴, (f) 아미노-C1-20 알킬, (g) -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR'의 폴리에틸렌 글라이콜(여기서 s1은 1 내지 10(예컨대, 1 내지 6 또는 1 내지 4)의 정수이고, s2 및 s3의 각각은, 독립적으로, 0 내지 10(예컨대, 0 내지 4, 0 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 6 또는 1 내지 10)의 정수이고, R'는 H 또는 C1-20 알킬임) 및 (h) -NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1의 아미노-폴리에틸렌 글라이콜(여기서 s1은 1 내지 10(예컨대, 1 내지 6 또는 1 내지 4)의 정수이고, s2 및 s3의 각각은, 독립적으로, 0 내지 10(예컨대, 0 내지 4, 0 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 6 또는 1 내지 10)의 정수이고, 각각의 RN1은, 독립적으로, 수소 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬임)로 이루어진 군으로부터 선택됨); (19) -NRH'C(O)RI'(여기서 RH'는 (a1) 수소 및 (b1) C1-6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, RI'는 (a2) C1-20 알킬(예컨대, C1-6 알킬), (b2) C2-20 알케닐(예컨대, C2-6 알케닐), (c2) C6-10 아릴, (d2) 수소, (e2) C1-6 알크-C6-10 아릴, (f2) 아미노-C1-20 알킬, (g2) -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR'의 폴리에틸렌 글라이콜(여기서 s1은 1 내지 10(예컨대, 1 내지 6 또는 1 내지 4)의 정수이고, s2 및 s3의 각각은, 독립적으로, 0 내지 10(예컨대, 0 내지 4, 0 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 6 또는 1 내지 10)의 정수이며, R'는 H 또는 C1-20 알킬임), 및 (h2) -NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1의 아미노-폴리에틸렌 글라이콜(여기서 s1은 1 내지 10(예컨대, 1 내지 6 또는 1 내지 4)의 정수이고, s2 및 s3의 각각은, 독립적으로, 0 내지 10(예컨대, 0 내지 4, 0 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 6 또는 1 내지 10)의 정수이며, 각각의 RN1은, 독립적으로, 수소 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬임)로 이루어진 군으로부터 선택됨); (20) -NRJ'C(O)ORK'(여기서 RJ'는 (a1) 수소 및 (b1) C1-6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, RK'는 (a2) C1-20 알킬(예컨대, C1-6 알킬), (b2) C2-20 알케닐(예컨대, C2-6 알케닐), (c2) C6-10 아릴, (d2) 수소, (e2) C1-6 알크-C6-10 아릴, (f2) 아미노-C1-20 알킬, (g2) -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR'의 폴리에틸렌 글라이콜(여기서 s1은 1 내지 10(예컨대, 1 내지 6 또는 1 내지 4)의 정수이고, s2 및 s3의 각각은, 독립적으로, 0 내지 10(예컨대, 0 내지 4, 0 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 6 또는 1 내지 10)의 정수이며, R'는 H 또는 C1-20 알킬임) 및 (h2) -NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1의 아미노-폴리에틸렌 글라이콜(여기서 s1은 1 내지 10(예컨대, 1 내지 6 또는 1 내지 4)의 정수이고, s2 및 s3의 각각은, 독립적으로, 0 내지 10(예컨대, 0 내지 4, 0 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 6 또는 1 내지 10)의 정수이며, 각각의 RN1은, 독립적으로, 수소 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬임)로 이루어진 군으로부터 선택됨); 및 (21) 아미딘으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3개의 치환기, 또는 2개 이상의 탄소의 알킬기의 경우에는, 4개의 치환기로 선택적으로 치환될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 이들 기의 각각은 본 명세서에 기재된 바와 같이 더 치환될 수 있다. 예를 들어, C1-알크아릴의 알킬렌기는 옥소기로 더 치환되어 각각의 아릴로일 치환기를 제공할 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "알킬렌" 및 접두사 "알크-"란 용어는, 직쇄 또는 분지쇄의 포화 탄화수소로부터 2개의 수소 원자의 제거에 의해 유도된 포화 2가 탄화수소기를 나타내며, 메틸렌, 에틸렌, 아이소프로필렌 등으로 예시된다. "Cx-y 알킬렌" 및 접두사 "Cx-y 알크-"란 용어는, x 및 y개의 탄소를 지니는 알킬렌기를 나타낸다. x에 대한 예시적인 값은 1, 2, 3, 4, 5 및 6이고, y에 대한 예시적인 값은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20(예컨대, C1-6, C1-10, C2-20, C2-6, C2-10 또는 C2-20 알킬렌)이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 알킬렌은 알킬기에 대해서 본 명세서에서 정의된 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 치환기로 더 치환될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "알킬설피닐"이란 용어는, -S(O)-기를 통해서 모 분자기에 부착된 알킬기를 나타낸다. 예시적인 비치환된 알킬설피닐기는 1 내지 6, 1 내지 10 또는 1 내지 20개의 탄소이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 알킬기는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 치환기로 더 치환될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "알킬설피닐알킬"이란 용어는, 알킬설피닐기로 치환된 본 명세서에서 정의된 바와 같은 알킬기를 나타낸다. 예시적인 비치환된 알킬설피닐알킬기는 2 내지 12, 2 내지 20 또는 2 내지 40개의 탄소이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 각 알킬기는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 치환기로 더 치환될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "알키닐"이란 용어는, 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 2 내지 20개의 탄소 원자(예컨대, 2 내지 4, 2 내지 6 또는 2 내지 10개의 탄소)를 지니는 1가의 직쇄 혹은 분지쇄기이며, 에티닐, 1-프로피닐 등으로 예시된다. 알키닐기는, 본 명세서에서 정의된 바와 같은, 아릴, 사이클로알킬 또는 헤테로사이클릴(예컨대, 헤테로아릴), 또는 본 명세서에 기재된 예시적인 알킬 치환기들 중 어느 하나로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 선택적으로 치환될 수 있다.
"알키닐옥시"란 용어는 식 -OR의 화학적 치환기를 나타내되, 여기서 R은 달리 특정되지 않는 한 C2-20 알키닐기(예컨대, C2-6 또는 C2-10 알키닐)이다. 예시적인 알키닐옥시기는 에티닐옥시, 프로피닐옥시 등을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 알키닐기는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기(예컨대, 하이드록시기)로 치환기로 더 치환될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "아미딘"이란 용어는, -C(=NH)NH2기를 나타낸다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "아미노"란 용어는, -N(RN1)2를 나타내되, 여기서 각각의 RN1은, 독립적으로, H, OH, NO2, N(RN2)2, SO2ORN2, SO2RN2, SORN2, N-보호기, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 아릴, 알크아릴, 사이클로알킬, 알크사이클로알킬, 카복시알킬, 설포알킬, 헤테로사이클릴(예컨대, 헤테로아릴) 또는 알크헤테로사이클릴(예컨대, 알크헤테로아릴)이고, 이때 이들 인용된 RN1기의 각각은, 각 기에 대해서 본 명세서에서 정의된 바와 같이 선택적으로 치환될 수 있거나; 또는 2개의 RN1이 조합되어 헤테로사이클릴 또는 N-보호기를 형성하며, 각각의 RN2는, 독립적으로, H, 알킬 또는 아릴이다. 본 발명의 아미노기는 치환된 아미노(즉, -NH2) 또는 치환된 아미노(즉, -N(RN1)2)일 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 아미노는 -NH2 또는 -NHRN1이되, 여기서 RN1은, 독립적으로, OH, NO2, NH2, NRN2 2, SO2ORN2, SO2RN2, SORN2, 알킬, 카복시알킬, 설포알킬 또는 아릴이고, 각각의 RN2는 H, C1-20 알킬(예컨대, C1-6 알킬) 또는 C6-10 아릴일 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 "아미노산"이란 용어는, 곁사슬, 아미노기 및 산 기를 지니는 분자(예컨대, -CO2H의 카복시기 또는 -SO3H의 설포기)를 지칭하되, 여기서 아미노산은 곁사슬, 아미노기 또는 산 기(예컨대, 곁사슬)에 의해 모 분자기에 부착된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 아미노산은 카보닐기에 의해 모 분자기에 부착되되, 여기서 곁사슬 혹은 아미노기는 카보닐기에 부착된다. 예시적인 곁사슬은 선택적으로 치환된 알킬, 아릴, 헤테로사이클릴, 알크아릴, 알크헤테로사이클릴, 아미노알킬, 카바모일알킬 및 카복시알킬을 포함한다. 예시적인 아미노산의 예로는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글라이신, 히스티딘, 하이드록시노르발린, 아이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 노르발린, 오르니틴, 페닐알라닌, 프롤린, 피롤라이신, 셀레노시스테인, 세린, 타우린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린을 포함한다. 아미노산기는 (1) C1-6 알콕시; (2) C1-6 알킬설피닐; (3) 본 명세서에 정의된 바와 같은 아미노(예컨대, 비치환된 아미노(즉, -NH2) 또는 치환된 아미노(즉, -N(RN1)2(여기서 RN1은 아미노에 대해서 정의된 바와 같음); (4) C6-10 아릴-C1-6 알콕시; (5) 아자이도; (6) 할로; (7) (C2-9 헤테로사이클릴)옥시; (8) 하이드록시; (9) 나이트로; (10) 옥소(예컨대, 카복시알데하이드 또는 아실); (11) C1-7 스피로사이클릴; (12) 티오알콕시; (13) 티올; (14) -CO2RA'(여기서 RA'는 (a) C1-20 알킬(예컨대, C1-6 알킬), (b) C2-20 알케닐(예컨대, C2-6 알케닐), (c) C6-10 아릴, (d) 수소, (e) C1-6 알크-C6-10 아릴, (f) 아미노-C1-20 알킬, (g) -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR'의 폴리에틸렌 글라이콜(여기서 s1은 1 내지 10(예컨대, 1 내지 6 또는 1 내지 4)의 정수이고, s2 및 s3의 각각은, 독립적으로, 0 내지 10(예컨대, 0 내지 4, 0 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 6 또는 1 내지 10)의 정수이고, R'는 H 또는 C1-20 알킬임), 및 (h) -NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1의 아미노-폴리에틸렌 글라이콜(여기서 s1은 1 내지 10(예컨대, 1 내지 6 또는 1 내지 4)의 정수이고, s2 및 s3의 각각은, 독립적으로, 0 내지 10(예컨대, 0 내지 4, 0 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 6 또는 1 내지 10)의 정수이며, 각각의 RN1은, 독립적으로, 수소 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬임)로 이루어진 군으로부터 선택됨); (15) -C(O)NRB'RC'(여기서 RB' 및 RC'의 각각은, 독립적으로, (a) 수소, (b) C1-6 알킬, (c) C6-10 아릴 및 (d) C1-6 알크-C6-10 아릴로 이루어진 군으로부터 선택됨); (16) -SO2RD'(여기서 RD'는 (a) C1-6 알킬, (b) C6-10 아릴, (c) C1-6 알크-C6-10 아릴 및 (d) 하이드록시로 이루어진 군으로부터 선택됨); (17) -SO2NRE'RF'(여기서 RE' 및 RF'의 각각은, 독립적으로, (a) 수소, (b) C1-6 알킬, (c) C6-10 아릴 및 (d) C1-6 알크-C6-10 아릴로 이루어진 군으로부터 선택됨); (18) -C(O)RG'(여기서 RG'는 (a) C1-20 알킬(예컨대, C1-6 알킬), (b) C2-20 알케닐(예컨대, C2-6 알케닐), (c) C6-10 아릴, (d) 수소, (e) C1-6 알크-C6-10 아릴, (f) 아미노-C1-20 알킬, (g) -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR'의 폴리에틸렌 글라이콜(여기서 s1은 1 내지 10(예컨대, 1 내지 6 또는 1 내지 4)의 정수이고, s2 및 s3의 각각은, 독립적으로, 0 내지 10(예컨대, 0 내지 4, 0 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 6 또는 1 내지 10)의 정수이며, R'는 H 또는 C1-20 알킬임), 및 (h) -NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1의 아미노-폴리에틸렌 글라이콜(여기서 s1은 1 내지 10(예컨대, 1 내지 6 또는 1 내지 4)의 정수이고, s2 및 s3의 각각은, 독립적으로, 0 내지 10(예컨대, 0 내지 4, 0 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 6 또는 1 내지 10)의 정수이며, 각각의 RN1은, 독립적으로, 수소 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬임)로 이루어진 군으로부터 선택됨); (19) -NRH'C(O)RI'(여기서 RH'는 (a1) 수소 및 (b1) C1-6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, RI'는 (a2) C1-20 알킬(예컨대, C1-6 알킬), (b2) C2-20 알케닐(예컨대, C2-6 알케닐), (c2) C6-10 아릴, (d2) 수소, (e2) C1-6 알크-C6-10 아릴, (f2) 아미노-C1-20 알킬, (g2) -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR'의 폴리에틸렌 글라이콜(여기서 s1은 1 내지 10(예컨대, 1 내지 6 또는 1 내지 4)의 정수이고, s2 및 s3의 각각은, 독립적으로, 0 내지 10(예컨대, 0 내지 4, 0 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 6 또는 1 내지 10)의 정수이며, R'는 H 또는 C1-20 알킬임) 및 (h2) -NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1의 아미노-폴리에틸렌 글라이콜(여기서 s1은 1 내지 10(예컨대, 1 내지 6 또는 1 내지 4)의 정수이고, s2 및 s3의 각각은, 독립적으로, 0 내지 10(예컨대, 0 내지 4, 0 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 6 또는 1 내지 10)의 정수이며, 각각의 RN1은, 독립적으로, 수소 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬임)로 이루어진 군으로부터 선택됨)로 이루어진 군으로부터 선택됨); (20) -NRJ'C(O)ORK'(여기서 RJ'는 (a1) 수소 및 (b1) C1-6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, RK'는 (a2) C1-20 알킬(예컨대, C1-6 알킬), (b2) C2-20 알케닐(예컨대, C2-6 알케닐), (c2) C6-10 아릴, (d2) 수소, (e2) C1-6 알크-C6-10 아릴, (f2) 아미노-C1-20 알킬, (g2) -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR'의 폴리에틸렌 글라이콜(여기서 s1은 1 내지 10(예컨대, 1 내지 6 또는 1 내지 4)의 정수이고, s2 및 s3의 각각은, 독립적으로, 0 내지 10(예컨대, 0 내지 4, 0 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 6 또는 1 내지 10)의 정수이며, R'는 H 또는 C1-20 알킬임), 및 (h2) -NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1의 아미노-폴리에틸렌 글라이콜(여기서 s1은 1 내지 10(예컨대, 1 내지 6 또는 1 내지 4)의 정수이고, s2 및 s3의 각각은, 독립적으로, 0 내지 10(예컨대, 0 내지 4, 0 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 6 또는 1 내지 10)의 정수이며, 각각의 RN1은, 독립적으로, 수소 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬임)로 이루어진 군으로부터 선택됨); 및 (21) 아미딘으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3개의 치환기, 또는 2개 이상의 탄소의 아미노산기의 경우에는 4개의 치환기로 선택적으로 치환될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 이들 기의 각각은 본 명세서에 기재된 바와 같이 더 치환될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "아미노알콕시"란 용어는, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 아미노기에 의해 치환된 본 명세서에서 정의된 바와 같은 알콕시기를 나타낸다. 알킬 및 아미노는 각각 각각의 기(예컨대, CO2RA', 여기서 RA'는 (a) C1-6 알킬, (b) C6-10 아릴, (c) 수소, 및 (d) C1-6 알크-C6-10 아릴, 예컨대, 카복시로 이루어진 군으로부터 선택됨)에 대해서 본 명세서에 정의된 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 더 치환될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "아미노알킬"이란 용어는, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 아미노기에 의해 치환된,본 명세서에서 정의된 바와 같은 알킬기를 나타낸다. 알킬 및 아미노는 각각 각각의 기(예컨대, CO2RA', 여기서 RA'는 (a) C1-6 알킬, (b) C6-10 아릴, (c) 수소, 및 (d) C1-6 알크-C6-10 아릴, 예컨대, 카복시로 이루어진 군으로부터 선택됨)에 대해서 본 명세서에 정의된 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 더 치환될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "아릴"이란 용어는,1 혹은 2개의 방향족 고리를 지니는 단환식-, 이환식 또는 다환식 탄소환 고리계를 나타내고, 페닐, 나프틸, 1,2-다이하이드로나프틸, 1,2,3,4-테트라하이드로나프틸, 안트라세닐, 페난트레닐, 플루오레닐, 인다닐 등으로 예시되며, (1) C1-7 아실(예컨대, 카복시알데하이드); (2) C1-20 알킬(예컨대, C1-6 알킬, C1-6 알콕시-C1-6 알킬, C1-6 알킬설피닐-C1-6 알킬, 아미노-C1-6 알킬, 아자이도-C1-6 알킬, (카복시알데하이드)-C1-6 알킬, 할로-C1-6 알킬(예컨대, 퍼플루오로알킬), 하이드록시-C1-6 알킬, 나이트로-C1-6 알킬 또는 C1-6 티오알콕시-C1-6 알킬); (3) C1-20 알콕시(예컨대, C1-6 알콕시, 예를 들어, 퍼플루오로알콕시); (4) C1-6 알킬설피닐; (5) C6-10 아릴; (6) 아미노; (7) C1-6 알크-C6-10 아릴; (8) 아자이도; (9) C3-8 사이클로알킬; (10) C1-6 알크-C3-8 사이클로알킬; (11) 할로; (12) C1-12 헤테로사이클릴(예컨대, C1-12 헤테로아릴); (13) (C1-12 헤테로사이클릴)옥시; (14) 하이드록시; (15) 나이트로; (16) C1-20 티오알콕시(예컨대, C1-6 티오알콕시); (17) -(CH2)qCO2RA'(여기서 q는 0 내지 4의 정수이고, RA'는 (a) C1-6 알킬, (b) C6-10 아릴, (c) 수소 및 (d) C1-6 알크-C6-10 아릴로 이루어진 군으로부터 선택됨); (18) -(CH2)qCONRB'RC'(여기서 q는 0 내지 4의 정수이고, RB' 및 RC'는 독립적으로 (a) 수소, (b) C1-6 알킬, (c) C6-10 아릴 및 (d) C1-6 알크-C6-10 아릴로 이루어진 군으로부터 선택됨); (19) -(CH2)qSO2RD'(여기서 q는 0 내지 4의 정수이고, RD'는 (a) 알킬, (b) C6-10 아릴 및 (c) 알크-C6-10 아릴로 이루어진 군으로부터 선택됨); (20) -(CH2)qSO2NRE'RF'(여기서 q는 0 내지 4의 정수이고, RE' 및 RF'의 각각은, 독립적으로, (a) 수소, (b) C1-6 알킬, (c) C6-10 아릴 및 (d) C1-6 알크-C6-10 아릴로 이루어진 군으로부터 선택됨); (21) 티올; (22) C6-10 아릴옥시; (23) C3-8 사이클로알콕시; (24) C6-10 아릴-C1-6 알콕시; (25) C1-6 알크-C1-12 헤테로사이클릴(예컨대, C1-6 알크-C1-12 헤테로아릴); (26) C2-20 알케닐; 및 (27) C2-20 알키닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1,2, 3, 4 또는 5개의 치환기로 선택적으로 치환될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 이들 기의 각각은 본 명세서에 기재된 바와 같이 더 치환될 수 있다. 예를 들어, C1-알크아릴 또는 C1-알크헤테로사이클릴의 알킬렌기는 옥소기로 더욱 치환되어 각각의 아릴로일 및 (헤테로사이클릴)오일 치환기를 제공할 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "아릴알콕시"란 용어는, 산소 원자를 통해서 모 분자기에 부착된 본 명세서에서 정의된 바와 같은 알크아릴기를 나타낸다. 예시적인 비치환된 알콕시알킬기는 7 내지 30개의 탄소(예컨대, 7 내지 16 또는 7 내지 20개의 탄소, 예를 들어, C6-10 아릴-C1-6 알콕시, C6-10 아릴-C1-10 알콕시 또는 C6-10 아릴-C1-20 알콕시)를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 아릴알콕시기는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 치환될 수 있다.
"아릴옥시"란 용어는, 달리 특정되지 않는 한, 화학식 -OR'의 화학적 치환기를 나타내되, 여기서 R'는 6 내지 18개의 탄소로 이루어진 아릴기이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 아릴기는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 치환될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "아릴로일"이란 용어는, 카보닐기를 통해서 모 분자기에 부착된 본 명세서에서 정의된 바와 같은 아릴기를 나타낸다. 예시적인 비치환 아릴로일기는 7 내지 11 탄소로 이루어진다. 몇몇 실시형태에 있어서, 아릴기는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 치환될 수 있다.
"아자이도"란 용어는, -N3기를 나타내며, 이는 또한 -N=N=N으로서 나타낼 수도 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "이환식"이란 용어는, 방향족 또는 비방향족일 수 있는, 2개의 고리를 갖는 구조를 지칭한다. 이환식 구조는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 스피로환식 기를 포함하되, 그 2개의 고리는 1개 이상의 브리지와 공유되며, 여기서 이러한 브리지는 2, 3 또는 그 이상의 원자를 포함하는 1개의 원자 혹은 사슬을 포함할 수 있다. 예시적인 이환식 기는 이환식 카보사이클릴기(여기서 제1 및 제2고리는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 카보사이클릴기임); 이환식 아릴기(여기서 제1 및 제2고리는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 아릴기임); 이환식 헤테로사이클릴기(여기서 제1고리는 복소환기이고, 제2고리는 카보사이클릴(예컨대, 아릴) 또는 헤테로사이클릴(예컨대, 헤테로아릴)기임); 및 이환식 헤테로아릴기(여기서 제1고리는 헤테로아릴기이고, 제2고리는 카보사이클릴(예컨대, 아릴) 또는 헤테로사이클릴(예컨대, 헤테로아릴)기임)를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 이환식기는 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 아릴기에 대해서 본 명세서에서 정의된 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 치환될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "탄소환식" 및 "카보사이클릴"이란 용어는, 선택적으로 치환된 C3-12 단환식, 이환식 또는 삼환식 구조를 지칭하며, 여기서 고리는 탄소 원자에 의해 형성된 방향족 혹은 비방향족일 수 있다. 탄소환 구조는 사이클로알킬, 사이클로알케닐 및 아릴기를 포함한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "카바모일"이란 용어는, -C(O)-N(RN1)2를 나타내며, 여기서 각각의 RN1의 의미는 본 명세서에서 제공되는 "아미노"의 정의에서 발견할 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "카바모일알킬"이란 용어는, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 카바모일기로 치환된 본 명세서에서 정의된 바와 같은 알킬기를 나타낸다. 알킬기는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 치환될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "카바밀"이란 용어는, 구조 -NRN1C(=O)OR또는 -OC(=O)N(RN1)2를 지니는 카바메이트기를 지칭하며, 여기서 각각의 RN1의 의미는 본 명세서에서 제공되는 "아미노"의 정의에서 발견할 수 있고, R은 본 명세서에서 정의된 바와 같은 알킬, 사이클로알킬, 알크사이클로알킬, 아릴, 알크아릴, 헤테로사이클릴(예컨대, 헤테로아릴) 또는 알크헤테로사이클릴(예컨대, 알크헤테로아릴)이다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "카보닐"이란 용어는 C(O)기를 나타내며, 이것은 또한 C=O로서 나타낼 수도 있다.
"카복시알데하이드"란 용어는, 구조 -CHO를 지닌 아실기를 나타낸다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "카복시"란 용어는 -CO2H를 나타낸다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "카복시알콕시"란 용어는, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 카복시기에 의해 치환된 본 명세서에서 정의된 바와 같은 알콕시기를 나타낸다. 알콕시기는 알킬기에 대해서 본 명세서에 기재된 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 치환기로 더 치환될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "카복시알킬"이란 용어는, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 카복시기에 의해 치환된 본 명세서에서 정의된 바와 같은 알킬기를 나타낸다. 알킬기는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 치환될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "사이아노"란 용어는 -CN기를 나타낸다.
"사이클로알콕시"란 용어는, 달리 특정되지 않는 한, 화학식 -OR의 화학적 치환기를 나타내되, 여기서 R은 본 명세서에서 정의된 바와 같은 C3-8 사이클로알킬기이다. 사이클로알킬기는 본 명세서에서 이용되는 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 더 치환될 수 있다. 예시적인 비치환 사이클로알콕시기는 3 내지 8개의 탄소이다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "사이클로알킬"이란 용어는, 달리 특정되지 않는 한, 3 내지 8개의 탄소의 1가 포화 혹은 불포화의 비방향족 환식 탄화수소기를 나타내며, 사이클로프로필, 사이클로뷰틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 바이사이클로[2.2.1.]헵틸 등으로 예시된다. 사이클로알킬기가 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 포함할 경우, 사이클로알킬기는 "사이클로알케닐"기로서 지칭될 수 있다. 예시적인 사이클로알케닐기는 사이클로펜테닐, 사이클로헥세닐 등을 포함한다. 본 발명의 사이클로알킬기는, (1) C1-7 아실(예컨대, 카복시알데하이드); (2) C1-20 알킬(예컨대, C1-6 알킬, C1-6 알콕시-C1-6 알킬, C1-6 알킬설피닐-C1-6 알킬, 아미노-C1-6 알킬, 아자이도-C1-6 알킬, (카복시알데하이드)-C1-6 알킬, 할로-C1-6 알킬(예컨대, 퍼플루오로알킬), 하이드록시-C1-6 알킬, 나이트로-C1-6 알킬 또는 C1-6 티오알콕시-C1-6 알킬); (3) C1-20 알콕시(예컨대, C1-6 알콕시, 예를 들어, 퍼플루오로알콕시); (4) C1-6 알킬설피닐; (5) C6-10 아릴; (6) 아미노; (7) C1-6 알크-C6-10 아릴; (8) 아자이도; (9) C3-8 사이클로알킬; (10) C1-6 알크-C3-8 사이클로알킬; (11) 할로; (12) C1-12 헤테로사이클릴(예컨대, C1-12 헤테로아릴); (13) (C1-12 헤테로사이클릴)옥시; (14) 하이드록시; (15) 나이트로; (16) C1-20 티오알콕시(예컨대, C1-6 티오알콕시); (17) -(CH2)qCO2RA'(여기서 q는 0 내지 4의 정수이고, RA'는 (a) C1-6 알킬, (b) C6-10 아릴, (c) 수소 및 (d) C1-6 알크-C6-10 아릴로 이루어진 군으로부터 선택됨); (18) -(CH2)qCONRB'RC'(여기서 q는 0 내지 4의 정수이고, RB' 및 RC'는 독립적으로 (a) 수소, (b) C1-6 알킬, (c) C6-10 아릴 및 (d) C1-6 알크-C6-10 아릴로 이루어진 군으로부터 선택됨); (19) -(CH2)qSO2RD'(여기서 q는 0 내지 4의 정수이고, RD'는 (a) 알킬, (b) C6-10 아릴 및 (c) 알크-C6-10 아릴로 이루어진 군으로부터 선택됨); (20) -(CH2)qSO2NRE'RF'(여기서 q는 0 내지 4의 정수이고, RE' 및 RF'의 각각은, 독립적으로, (a) 수소, (b) C1-6 알킬, (c) C6-10 아릴 및 (d) C1-6 알크-C6-10 아릴로 이루어진 군으로부터 선택됨); (21) 티올; (22) C6-10 아릴옥시; (23) C3-8 사이클로알콕시; (24) C6-10 아릴-C1-6 알콕시; (25) C1-6 알크-C1-12 헤테로사이클릴(예컨대, C1-6 알크-C1-12 헤테로아릴); (26) 옥소; (27) C2-20 알케닐; 및 (28) C2-20 알키닐로 이루어진 군으로부터 선택적으로 치환될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 이들 기의 각각은 본 명세서에 기재된 바와 같이 더 치환될 수 있다. 예를 들어, C1-알크아릴 또는 C1-알크헤테로사이클릴의 알킬렌기는 옥소기로 더욱 치환되어 각각의 아릴로일 및 (헤테로사이클릴)오일 치환기를 제공할 수 있다.
"부분입체이성질체"란 용어는, 서로 거울 상들이 아니고 서로 중첩되지 않는 입체이성질체를 의미한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 제제의 "유효량"이란 용어는, 유리하거나 바람직한 결과, 예를 들어, 임상 결과를 달성하기에 충분한 양이며, 이와 같이, "유효량"은, 이것이 적용되는 맥락에 의존한다. 예를 들어, 암을 치료하는 제제를 투여하는 맥락에서, 제제의 유효량은, 예를 들어, 제제의 투여없이 얻어지는 반응과 비교해서, 암의 본 명세서에서 정의된 바와 같은, 치료를 달성하기에 충분한 양이다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "거울상이성질체"란 용어는, 광학적 순도 또는 적어도 80%(즉, 적어도 90%의 하나의 거울상이성질체 및 거의 10%의 다른 거울상이성질체), 바람직하게는 적어도 90% 및 보다 바람직하게는 적어도 98%의 거울상이성질체성 과량(당해 분야에서 표준 방법에 의해 결정된 것)을 갖는, 본 발명의 화합물의 각각 개개의 광학적으로 활성인 형태를 의미한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "할로"란 용어는, 브롬, 염소, 요오드 또는 불소로부터 선택된 할로겐을 나타낸다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "할로알콕시"란 용어는, 할로겐기(즉, F, Cl, Br 또는 I)로 치환된 본 명세서에서 정의된 바와 같은 알콕시기를 나타낸다. 할로알콕시는 1개, 2개, 3개, 또는 탄소수가 2개 이상인 알킬 그룹들의 경우에, 4개의 할로겐으로 치환될 수 있다. 할로알콕시기는 퍼플루오로알콕시(예컨대, -OCF3), -OCHF2, -OCH2F, -OCCl3, -OCH2CH2Br, -OCH2CH(CH2CH2Br)CH3 및 -OCHICH3를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 할로알콕시기는 알킬기에 대해서 본 명세서에 기재된 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 치환기로 더 치환될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "할로알킬"이란 용어는, 할로겐기(즉, F, Cl, Br 또는 I)로 치환된, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 알킬기를 나타낸다. 할로알킬은 1개, 2개, 3개, 또는 탄소수가 2 이상인 알킬기의 경우에 4개의 할로겐으로 치환될 수 있다. 할로알킬기는 퍼플루오로알킬(예컨대, -CF3), -CHF2, -CH2F, -CCl3, -CH2CH2Br, -CH2CH(CH2CH2Br)CH3 및 -CHICH3를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 할로알킬기는 알킬기에 대해서 본 명세서에 기재된 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 치환기로 더 치환될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "헤테로알킬렌"이란 용어는, 구성 탄소 원자들 중 1개 혹은 2개가 각각 질소, 산소 또는 황으로 대체되어 있는, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 알킬렌기를 지칭한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 헤테로알킬렌기는 알킬렌기에 대해서 본 명세서에 기재된 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 치환기로 더 치환될 수 있다.
"헤테로아릴"이란 용어는, 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 방향족인, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 헤테로사이클릴의 부분집합을 나타내며: 즉, 이들은 단환식 혹은 다환식 고리계 내에 4n+2 파이 전자를 포함한다. 예시적인 비치환 헤테로아릴기는 1 내지 12(예컨대, 1 내지 11, 1 내지 10, 1 내지 9, 2 내지 12, 2 내지 11, 2 내지 10 또는 2 내지 9)개의 탄소로 이루어진다. 몇몇 실시형태에 있어서, 헤테로아릴은 헤테로사이클릴기에 대해서 정의된 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 치환될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "헤테로사이클릴"이란 용어는, 달리 특정되지 않는 한, 질소, 산소 및 황으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3 또는 4개의 헤테로원자를 함유하는 5-, 6- 또는 7-원 고리를 나타낸다. 5-원 고리는 2개의 이중 결합을 지니고, 6- 및 7-원 고리는 0 내지 3개의 이중 결합을 지닌다. 예시적인 비치환된 헤테로사이클릴기는 1 내지 12(예컨대, 1 내지 11, 1 내지 10, 1 내지 9, 2 내지 12, 2 내지 11, 2 내지 10 또는 2 내지 9)개의 탄소로 이루어진다. "헤테로사이클릴"이란 용어는, 또한 1개 이상의 탄소 및/또는 헤테로원자가 단환식 고리, 예컨대, 퀴누클리디닐기의 2개의 비인접 구성원과 브리지되는, 브리지된 다환식 구조를 지니는 헤테로사이클릭 화합물을 나타낸다. "헤테로사이클릴"이란 용어는, 이환식, 삼환식 및 사환식 기를 포함하되, 여기서 상기 헤테로사이클릭기의 어느 것이라도 1, 2 또는 3개의 탄소환식 고리, 예컨대, 아릴 고리, 사이클로헥산 고리, 사이클로헥산 고리, 사이클로펜탄 고리, 사이클로펜텐 고리 또는 다른 단환식 헤테로사이클릭 고리에 융합되며, 예컨대, 인돌릴, 퀴놀릴, 아이소퀴놀릴, 테트라하이드로퀴놀릴, 벤조푸릴, 벤조티에닐 등이다. 융합된 헤테로사이클릴의 예는 트로판 및 1,2,3,5,8,8a-헥사하이드로인돌리진을 포함한다. 헤테로사이클릭은 피롤릴, 피롤리닐, 피롤리디닐, 피라졸릴, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸릴, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피리딜, 피페리디닐, 호모피페리디닐, 피라지닐, 피페라지닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 옥사졸릴, 옥사졸리디닐, 아이소옥사졸릴, 아이소옥사졸리디닐, 몰폴리닐, 티오몰폴리닐, 티아졸릴, 티아졸리디닐, 아이소티아졸릴, 아이소티아졸리디닐, 인돌릴, 인다졸릴, 퀴놀릴, 아이소퀴놀릴, 퀴녹살리닐, 다이하이드로퀴녹살리닐, 퀴나졸리닐, 신놀리닐, 프탈라지닐, 벤즈이미다졸릴, 벤조티아졸릴, 벤즈옥사졸릴, 벤조티아다이아졸릴, 퓨릴, 티에닐, 티아졸리디닐, 아이소티아졸릴, 트라이아졸릴, 테트라졸릴, 옥사다이아졸릴(예컨대, 1,2,3-옥사디아졸릴), 퓨리닐, 티아다이아졸릴(예컨대, 1,2,3-티아디아졸릴), 테트라하이드로퓨라닐, 다이하이드로퓨라닐, 테트라하이드로티에닐, 다이하이드로티에닐, 다이하이드로인돌릴, 다이하이드로퀴놀릴, 테트라하이드로퀴놀릴, 테트라하이드로이소퀴놀릴, 다이하이드로아이소퀴놀릴, 피라닐, 다이하이드로피라닐, 다이티아졸릴, 벤조퓨라닐, 아이소벤조퓨라닐, 벤조티에닐 등, 예컨대, 그의 다이하이드로 및 테트라하이드로형태를 포함하되, 여기서 1개 이상의 이중 결합은 환원되어 수소로 대체되어 있다. 또 다른 예시적인 헤테로사이클릴은 2,3,4,5-테트라하이드로-2-옥소-옥사졸릴; 2,3-다이하이드로-2-옥소-1H-이미다졸릴; 2,3,4,5-테트라하이드로-5-옥소-1H-피라졸릴(예컨대, 2,3,4,5-테트라하이드로-2-페닐-5-옥소-1H-피라졸릴); 2,3,4,5-테트라하이드로-2,4-다이옥소-1H-이미다졸릴(예컨대, 2,3,4,5-테트라하이드로-2,4-다이옥소-5-메틸-5-페닐-1H-이미다졸릴); 2,3-다이하이드로-2-티옥소-1,3,4-옥사다이아졸릴(예컨대, 2,3-다이하이드로-2-티옥소-5-페닐-1,3,4-옥사다이아졸릴); 4,5-다이하이드로-5-옥소-1H-트라이아졸릴(예컨대, 4,5-다이하이드로-3-메틸-4-아미노 5-옥소-1H-트라이아졸릴); 1,2,3,4-테트라하이드로-2,4-다이옥소피리디닐(예컨대, 1,2,3,4-테트라하이드로-2,4-다이옥소-3,3-다이에틸피리디닐); 2,6-다이옥소-피페리디닐(예컨대, 2,6-다이옥소-3-에틸-3-페닐피페리디닐); 1,6-다이하이드로-6-옥소피리디미닐; 1,6-다이하이드로-4-옥소피리미디닐(예컨대, 2-(메틸티오)-1,6-다이하이드로-4-옥소-5-메틸피리미딘-1-일); 1,2,3,4-테트라하이드로-2,4-다이옥소피리미디닐(예컨대, 1,2,3,4-테트라하이드로-2,4-다이옥소-3-에틸피리미디닐); 1,6-다이하이드로-6-옥소-피리다지닐(예컨대, 1,6-다이하이드로-6-옥소-3-에틸피리다지닐); 1,6-다이하이드로-6-옥소-1,2,4-트라이아지닐(예컨대, 1,6-다이하이드로-5-아이소프로필-6-옥소-1,2,4-트라이아지닐); 2,3-다이하이드로-2-옥소-1H-인돌릴(예컨대, 3,3-다이메틸-2,3-다이하이드로-2-옥소-1H-인돌릴 및 2,3-다이하이드로-2-옥소-3,3'-스피로프로판-1H-인돌-1-일); 1,3-다이하이드로-1-옥소-2H-아이소-인돌릴; 1,3-다이하이드로-1,3-다이옥소-2H-아이소-인돌릴; 1H-벤조피라졸릴(예컨대, 1-(에톡시카보닐)-1H-벤조피라졸릴); 2,3-다이하이드로-2-옥소-1H-벤즈이미다졸릴(예컨대, 3-에틸-2,3-다이하이드로-2-옥소-1H-벤즈이미다졸릴); 2,3-다이하이드로-2-옥소-벤즈옥사졸릴(예컨대, 5-클로로-2,3-다이하이드로-2-옥소-벤즈옥사졸릴); 2,3-다이하이드로-2-옥소-벤즈옥사졸릴; 2-옥소-2H-벤조피라닐; 1,4-벤조다이옥사닐; 1,3-벤조다이옥사닐; 2,3-다이하이드로-3-옥소,4H-1,3-벤조티아지닐; 3,4-다이하이드로-4-옥소-3H-퀴나졸리닐(예컨대, 2-메틸-3,4-다이하이드로-4-옥소-3H-퀴나졸리닐); 1,2,3,4-테트라하이드로-2,4-다이옥소-3H-퀴나졸릴(예컨대, 1-에틸-1,2,3,4-테트라하이드로-2,4-다이옥소-3H-퀴나졸릴); 1,2,3,6-테트라하이드로-2,6-다이옥소-7H-퓨리닐(예컨대, 1,2,3,6-테트라하이드로-1,3-다이메틸-2,6-다이옥소-7H-퓨리닐); 1,2,3,6-테트라하이드로-2,6-다이옥소-1H-퓨리닐(예컨대, 1,2,3,6-테트라하이드로-3,7-다이메틸-2,6-다이옥소-1H-퓨리닐); 2-옥소벤즈[c,d]인돌릴; 1,1-다이옥소-2H-나프탈렌[1,8-c,d]아이소티아졸릴; 및 1,8-나프틸렌다이카복사미도를 포함한다. 추가의 헤테로사이클릭은 3,3a,4,5,6,6a-헥사하이드로-피롤로[3,4-b]피롤-(2H)-일, 및 2,5-다이아자바이사이클로[2.2.1]헵탄-2-일, 호모피페라지닐(또는 다이아제파닐), 테트라하이드로피라닐, 다이티아졸릴, 벤조퓨라닐, 벤조티에닐, 옥세파닐, 티에파닐, 아조카닐, 옥세카닐 및 티오카닐을 포함한다. 헤테로사이클릭 기는 또한 식
Figure pct00150
의 기들을 포함하되, 식 중,
E'는 -N- 및 -CH-로 이루어진 군으로부터 선택되고; F'는 -N=CH-, -NH-CH2-, -NH-C(O)-, -NH-, -CH=N-, -CH2-NH-, -C(O)-NH-, -CH=CH-, -CH2-, -CH2CH2-, -CH2O-, -OCH2-, -O-및 -S-로 이루어진 군으로부터 선택되며; G'는 -CH- 및 -N-으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 명세서에서 언급된 헤테로사이클릴기는, (1) C1-7 아실(예컨대, 카복시알데하이드); (2) C1-20 알킬(예컨대, C1-6 알킬, C1-6 알콕시-C1-6 알킬, C1-6 알킬설피닐-C1-6 알킬, 아미노-C1-6 알킬, 아자이도-C1-6 알킬, (카복시알데하이드)-C1-6 알킬, 할로-C1-6 알킬(예컨대, 퍼플루오로알킬), 하이드록시-C1-6 알킬, 나이트로-C1-6 알킬 또는 C1-6 티오알콕시-C1-6 알킬); (3) C1-20 알콕시(예컨대, C1-6 알콕시, 예를 들어, 퍼플루오로알콕시); (4) C1-6 알킬설피닐; (5) C6-10 아릴; (6) 아미노; (7) C1-6 알크-C6-10 아릴; (8) 아자이도; (9) C3-8 사이클로알킬; (10) C1-6 알크-C3-8 사이클로알킬; (11) 할로; (12) C1-12 헤테로사이클릴(예컨대, C2-12 헤테로아릴); (13) (C1-12 헤테로사이클릴)옥시; (14) 하이드록시; (15) 나이트로; (16) C1-20 티오알콕시(예컨대, C1-6 티오알콕시); (17) -(CH2)qCO2RA'(여기서 q는 0 내지 4의 정수이고, RA'는 (a) C1-6 알킬, (b) C6-10 아릴, (c) 수소 및 (d) C1-6 알크-C6-10 아릴로 이루어진 군으로부터 선택됨); (18) -(CH2)qCONRB'RC'(여기서 q는 0 내지 4의 정수이고, RB' 및 RC'는 독립적으로 (a) 수소, (b) C1-6 알킬, (c) C6-10 아릴 및 (d) C1-6 알크-C6-10 아릴로 이루어진 군으로부터 선택됨); (19) -(CH2)qSO2RD'(여기서 q는 0 내지 4의 정수이고, RD'는 (a) C1-6 알킬, (b) C6-10 아릴 및 (c) C1-6 알크-C6-10 아릴로 이루어진 군으로부터 선택됨); (20) -(CH2)qSO2NRE'RF'(여기서, q는 0 내지 4의 정수이고, RE' 및 RF'의 각각은, 독립적으로, (a) 수소, (b) C1-6 알킬, (c) C6-10 아릴, 및 (d) C1-6 알크-C6-10 아릴로 이루어진 군으로부터 선택됨); (21) 티올; (22) C6-10 아릴옥시; (23) C3-8 사이클로알콕시; (24) 아릴알콕시; (25) C1-6 알크-C1-12 헤테로사이클릴(예컨대, C1-6 알크-C1-12 헤테로아릴); (26) 옥소; (27) (C1-12 헤테로사이클릴)이미노; (28) C2-20 알케닐; 및 (29) C2-20 알키닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환기로 선택적으로 치환될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 이들 기의 각각은 본 명세서에 기재된 바와 같이 더 치환될 수 있다. 예를 들어, C1-알크아릴 또는 C1-알크헤테로사이클릴의 알킬렌기는 옥소기로 더욱 치환되어 각각의 아릴로일 및 (헤테로사이클릴)오일 치환기를 제공할 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "(헤테로사이클릴)이미노"란 용어는, 이미노기를 통해서 모 분자기에 부착된 본 명세서에서 정의된 바와 같은 헤테로사이클릴기를 나타낸다. 몇몇 실시형태에 있어서, 헤테로사이클릴기는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 치환될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "(헤테로사이클릴)옥시"란 용어는, 산소 원자를 통해서 모 분자기에 부착된 본 명세서에서 정의된 바와 같은 헤테로사이클릴기를 나타낸다. 몇몇 실시형태에 있어서, 헤테로사이클릴기는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 치환될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "(헤테로사이클릴)오일"이란 용어는, 카보닐기를 통해서 모 분자기에 부착된 본 명세서에서 정의된 바와 같은 헤테로사이클릴기를 나타낸다. 몇몇 실시형태에 있어서, 헤테로사이클릴기는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 치환될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "탄화수소"란 용어는, 오로지 탄소 원자와 수소 원자로 이루어진 기를 나타낸다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "하이드록시"란 용어는 -OH기를 나타낸다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "하이드록시알케닐"이란 용어는, 1개 이하의 하이드록시기가 알킬기의 단일의 탄소 원자에 부착될 수 있다는 조건 하에, 1 내지 3개의 하이드록시기로 치환된, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 알케닐기를 나타내며, 다이하이드록시프로페닐, 하이드록시아이소펜테닐 등으로 예시된다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "하이드록시알킬"이란 용어는, 1개 이하의 하이드록시기가 알킬기의 단일의 탄소 원자에 부착될 수 있는 조건 하에, 1 내지 3개의 하이드록시기로 치환된, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 알킬기를 나타내며, 하이드록시메틸, 다이하이드록시프로필 등으로 예시된다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "이성질체"란 용어는, 본 발명의 어느 화합물의 임의의 호변이성질체, 입체이성질체, 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체를 의미한다. 본 발명의 화합물은 하나 이상의 카이럴 중심 및/또는 이중 결합을 가질 수 있으므로, 이중-결합 이성질체(즉, 기하학적 E/Z 이성질체) 또는 부분입체이성질체(예를 들면, 거울상이성질체(즉, (+) 또는 (-)) 또는 시스/트랜스 이성질체)로서 존재할 수 있다. 본 발명에 따르면, 본 명세서에 나타낸 화학 구조, 및 따라서 본 발명의 화합물은 모든 상응하는 입체이성질체, 즉, 입체이성질체적으로 순수한 형태(예를 들어, 기하학적으로 순수한, 거울상이성질체적으로 순수한, 또는 부분입체이성질체적으로 순수한) 및 거울상이성질체성 및 입체이성질체성 혼합물, 예를 들어, 라세미체의 둘 다를 포함한다. 본 발명의 화합물의 거울상이성질체성 및 입체이성질체성 혼합물은 잘 알려진 방법, 예를 들어, 카이럴-상 가스 크로마토그래피, 카이럴-상 고 성능 액체 크로마토그래피, 카이럴 염 복합체로서의 화합물의 결정화 또는 카이럴성 용매 속의 화합물의 결정화에 의해 이들의 성분 거울상이성질체 또는 입체이성질체로 전형적으로 분해될 수 있다. 거울상이성질체 및 입체이성질체는 또한 입체이성질체적으로 또는 거울상이성질체적으로 순수한 중간체, 반응제 및 촉매로부터 잘 알려진 비대칭 합성 방법에 의해 얻어질 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "N-보호된 아미노"란 용어는, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 1개 혹은 2개의 N-보호기가 부착되어 있는, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 아미노기를 지칭한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "N-보호기"란 용어는, 합성 과정 동안 바람직하지 않은 반응에 대해 아미노기를 보호하도록 의도된 기들 나타낸다. 통상적으로 이용되는 N-보호기는, 참조로 본 명세서에 포함되는 문헌[Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis," 3rd Edition (John Wiley & Sons, New York, 1999)]에 개시되어 있다. N-보호기로는 아실, 아릴로일, 또는 카바모일기, 예컨대, 폼일, 아세틸, 프로피오닐, 피발로일, t-뷰틸아세틸, 2-클로로아세틸, 2-브로모아세틸, 트라이플루오로아세틸, 트라이클로로아세틸, 프탈릴, o-나이트로페녹시아세틸, α-클로로뷰티릴, 벤조일, 4-클로로벤조일, 4-브로모벤조일, 4-나이트로벤조일, 및 카이럴 보조제, 예컨대, 보호된 혹은 탈보호된 D, L 또는 D, L-아미노산, 예컨대, 알라닌, 류신, 페닐알라닌 등; 설포닐-함유 기, 예컨대, 벤젠설포닐, p-톨루엔설포닐 등; 카바메이트 형성기, 예컨대, 옥시카보닐, p-클로로벤질옥시카보닐, p-메톡시벤질옥시카보닐, p-나이트로벤질옥시카보닐, 2-나이트로벤질옥시카보닐, p-브로모벤질옥시카보닐, 3,4-다이메톡시벤질옥시카보닐, 3,5-다이메톡시벤질옥시카보닐, 2,4-다이메톡시벤질옥시카보닐, 4-메톡시벤질옥시카보닐, 2-나이트로-4,5-다이메톡시벤질옥시카보닐, 3,4,5-트라이메톡시벤질옥시카보닐, 1-(p-바이페닐릴)-1-메틸에톡시카보닐, α,α-다이메틸-3,5-다이메톡시벤질옥시카보닐, 벤즈하이드릴옥시 카보닐, t-뷰틸옥시카보닐, 다이아이소프로필메톡시카보닐, 아이소프로필옥시카보닐, 에톡시카보닐, 메톡시카보닐, 알릴옥시카보닐, 2,2,2-트라이클로로에톡시카보닐, 페녹시카보닐, 4-나이트로페녹시 카보닐, 플루오레닐-9-메톡시카보닐, 사이클로펜틸옥시카보닐, 아다만틸옥시카보닐, 사이클로헥실옥시카보닐, 페닐티오카보닐 등, 알크아릴기, 예컨대, 벤질, 트라이페닐메틸, 벤질옥시메틸 등 및 실릴기, 예컨대, 트라이메틸실릴 등을 포함한다. 바람직한 N-보호기는 폼일, 아세틸, 벤조일, 피발로일, t-뷰틸아세틸, 알라닐, 페닐설포닐, 벤질, t-뷰틸옥시카보닐(Boc) 및 벤질옥시카보닐(Cbz)이다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "나이트로"란 용어는 -NO2기를 나타낸다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "옥소"란 용어는 =O를 나타낸다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "퍼플루오로알킬"이란 용어는, 알킬기에 결합된 각 수소 라디칼이 플루오라이드 라디칼로 대체되어 있는, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 알킬기를 나타낸다. 퍼플루오로알킬기는 트라이플루오로메틸, 펜타플루오로에틸 등으로 예시된다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "퍼플루오로알콕시"란 용어는, 알콕시에 결합된 각 수소 라디칼이 플루오라이드 라디칼로 대체되어 있는, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 알콕시기를 나타낸다. 퍼플루오로알콕시기는 트라이플루오로메톡시, 펜타플루오로에톡시 등으로 예시된다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "스피로사이클릴"이란 용어는, 양 말단들이 모 기(parent group)의 동일한 탄소 원자에 결합되어 스피로환식기를 형성하는 C2-7 알킬렌 다이라디칼, 또한 양 말단들이 동일한 원자에 결합된 C1-6 헤테로알킬렌 다이라디칼을 나타낸다. 스피로환식 기를 형성하는 헤테로알킬렌 라디칼은 질소, 산소 및 황으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3 또는 4개의 헤테로원자를 함유할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 스피로환식 기는, 다이라디칼이 부착된 탄소 원자를 제외하고, 1 내지 7개의 탄소를 포함한다. 본 발명의 스피로환식 기는 사이클로알킬 및/또는 헤테로사이클릴기용의 선택적 치환기로서 제공된 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 선택적으로 치환될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "입체이성질체"란 용어는, 모든 가능한 상이한 이성질체 및 또한, 화합물이 소유할 수 있는 구조적 형태(예컨대, 본 명세서에 기재된 어떠한 화학식의 화합물), 특히 기본 분자 구조의 모든 가능한 입체화학적으로 및 구조적으로 이성질체인 형태, 모든 부분입체이성질체, 거울상이성질체 및/또는 형태이성질체(conformer)를 지칭한다. 본 발명의 일부 화합물은 상이한 호변이성질체 형태로 존재할 수 있으며, 이들 형태 모두는 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "설포알킬"이란 용어는, -SO3H의 설포기로 치환된, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 알킬기를 나타낸다. 몇몇 실시형태에 있어서, 알킬기는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 치환될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "설포닐"이란 용어는, -S(O)2-기를 나타낸다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "티오알크아릴"이란 용어는, 화학식 -SR의 화학적 치환기를 나타내되, 여기서 R은 알크아릴기이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 알크아릴기는 본 명세서에 기재된 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 치환기로 더 치환될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "티오알크헤테로사이클릴"이란 용어는, 식 -SR의 화학적 치환기를 나타내되, 여기서 R은 알크헤테로사이클릴기이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 알크헤테로사이클릴기는 본 명세서에 기재된 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 치환기로 더 치환될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "티오알콕시"란 용어는, 식 -SR의 화학적 치환기를 나타내되, 여기서 R은 본 명세서에서 정의된 바와 같은 알킬기이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 알킬기는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 치환될 수 있다.
"티올"이란 용어는 -SH기를 나타낸다.
화합물: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "화합물"이란 용어는, 표시된 구조의 모든 입체이성질체, 기하 이성질체, 호변이성질체 및 동위원소를 포함함을 의미한다.
본 명세서에 기재된 화합물은 비대칭(예컨대, 1개 이상의 입체중심을 지님)일 수 있다. 달리 나타내지 않는 한, 모든 입체이성질체, 예를 들어, 거울상이성질체 및 부분입체이성질체가 의도된다. 비대칭적으로 치환된 탄소 원자들을 함유하는 본 발명의 개시내용의 화합물은 광학적으로 활성이거나 라세미 형태로 단리될 수 있다. 광학적으로 활성인 출발 물질로부터 광학적으로 활성인 형태를 제조하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 라세미 혼합물의 분해 또는 입체선택적 합성에 의한다. 올레핀의 많은 기하학적 이성체, C=N 이중 결합 등이 또한 본 명세서에 기재된 화합물에 존재할 수 있으며, 모든 이러한 이성질체가 본 발명의 개시내용에서 상정된다. 본 발명의 개시내용의 화합물의 시스 및 트랜스 기하학적 이성질체가 기술되어 있으며 이성질체들의 혼합물로서 또는 분리된 이성질체 형태들로서 단리될 수 있다.
본 발명의 개시내용의 화합물은 호변이성질체 형태를 또한 포함한다. 호변이성질체 형태는 인접한 이중 결합과 단일 결합의 스와핑(swapping) 및 양성자의 동시 이주로부터 생성된다. 호변이성질체 형태는 동일한 실험식 및 총 전하를 갖는 이성질체성 양성자화 상태인 양성자성 호변이성질체를 포함한다. 양성자성 호변이성질체의 예는 케톤-에놀 쌍, 아미드-이미드산 쌍, 락탐-락팀 쌍, 아미드-이미드산 쌍, 에나민-이민 쌍, 및 고리 모양 형태를 포함하며, 여기서, 양성자는 복소환식 시스템의 2개 이상의 위치들, 예를 들어, 1H- 및 3H-이미다졸, 1H-, 2H- 및 4H-1,2,4-트리아졸, 1H- 및 2H- 이소인돌, 및 1H- 및 2H-피라졸을 점유할 수 있다. 호변이성질체 형태는 평형일 수 있거나 적절한 치환에 의해 1개 형태로 입체적으로 잠금된다.
본 발명의 개시내용의 화합물은 중간체 또는 최종 화합물 속에 존재하는 원자들의 동위원소들 모두를 또한 포함한다. "동위원소"는 동일한 원자수를 가지지만 핵내 중성자의 상이한 수로 초래되는 상이한 질량수를 갖는 원자를 지칭한다. 예를 들어, 수소의 동위원소들은 삼중수소 및 중수소를 포함한다.
본 발명의 개시내용의 화합물 및 염은 용매 또는 물 분자와 함께 제조되어 통상의 방법에 의해 용매화물 및 수화물을 형성할 수 있다.
보존된: 용어 "보존된"이란 용어는, 비교하는 2개 이상의 서열의 동일한 부위 내에서 변경되지 않는 것들인, 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 폴리펩타이드 서열의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기 각각을 지칭한다. 비교적 보존된 뉴클레오타이드 또는 아미노산은 서열 내 어디에서도 존재하는 뉴클레오타이드 또는 아미노산보다 더 관련된 서열들 중에서 보존된 것들이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 2개 이상의 서열은, 이들이 서로 100% 동일한 경우, "완전히 보존된" 으로 일컬어진다. 몇몇 실시형태에 있어서, 2개 이상의 서열은, 이들이 서로에 대해 적어도 70% 동일하거나, 적어도 80% 동일하거나, 적어도 90% 동일하거나, 또는 적어도 95% 동일한 경우, "고도로 보존된"으로 일컬어진다. 몇몇 실시형태에 있어서, 2개 이상의 서열은, 이들이 서로에 대해 약 70% 동일하거나, 약 80% 동일하거나, 약 90% 동일하거나, 약 95%, 약 98%, 또는 약 99% 동일한 경우, "고도로 보존된"으로 일컬어진다. 몇몇 실시형태에 있어서, 2개 이상의 서열은, 이들이 서로에 대해 적어도 30% 동일하거나, 적어도 40% 동일하거나, 적어도 50% 동일하거나, 적어도 60% 동일하거나, 적어도 70% 동일하거나, 적어도 80% 동일하거나, 적어도 90% 동일하거나, 또는 적어도 95% 동일한 경우, "보존된"으로 일컬어진다. 몇몇 실시형태에 있어서, 2개 이상의 서열은, 이들이 서로에 대해 약 30% 동일하거나, 약 40% 동일하거나, 약 50% 동일하거나, 약 60% 동일하거나, 약 70% 동일하거나, 약 80% 동일하거나, 약 90% 동일하거나, 약 95% 동일하거나, 약 98% 동일하거나, 또는 약 99% 동일한 경우, "보존된"으로 일컬어진다. 서열의 보존은 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 전체 길이에 적용될 수 있거나 또는 그의 일부, 영역 또는 특성에 적용될 수 있다.
제어된 방출: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "제어된 방출"이란 용어는 치료적 성과를 얻기 위한 특정 패턴의 방출에 합치되는 약제학적 조성물 혹은 화합물 방출 프로파일을 지칭한다.
환식(혹은 사이클릭) 또는 환화된: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "환식"이란 연속된 루프의 존재를 지칭한다. 환식 분자는 원형일 필요가 없고, 단지 결합하여 소단위들의 깨지지 않은 쇄를 형성하면 된다. 본 발명의 공학적으로 조작된 RNA 또는 mRNA와 같은 사이클릭 분자들은 단일 단위들 또는 다합체(multimer)일 수 있거나 복합체의 하나 이상의 성분 또는 보다 높은 차수의 구조를 포함한다.
세포정지성: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "세포정지성"이란 세포(예컨대, 포유류의 세포(예컨대, 인간 세포)), 세균, 바이러스, 진균, 원생동물, 기생충, 프리온(prion), 또는 이들의 조합의 성장, 분할 또는 증식을 저해하거나, 감소시키거나, 억제하는 것을 지칭한다.
세포독성: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "세포독성"이란, 세포(예컨대, 포유류의 세포(예컨대, 인간 세포)), 균, 바이러스, 진균, 원생동물, 기생충, 프리온 또는 이들의 조합의 사멸, 또는 손상, 독성 또는 치명적인 효과를 유발하는 것을 지칭한다.
전달: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "전달"이란, 화합물, 물질, 실체, 모이어티, 적재물 또는 페이로드를 전달하는 작용 또는 방식을 지칭한다.
전달제: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "전달제"란, 표적화된 세포로 변형된 핵산 또는 mmRNA의 생체내 전달을 적어도 부분적으로 촉진하는 임의의 물질을 지칭한다.
탈안정화된: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "탈안정화", "탈안정화하다" 또는 "탈안정화 영역"이란 용어는, 동일한 영역 또는 분자의 출발, 야생형 또는 천연 형태보다 덜 안정한 영역 또는 분자를 의미한다.
검출가능한 표지: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "검출가능한 표지"는 방사선촬영, 형광성, 화학발광성, 효소 활성, 흡광도 등을 포함하는 당해 분야에 공지된 방법들로 용이하게 검출되는 다른 실체와 함께 부착되거나, 혼입되거나 연합된 하나 이상의 마커, 신호 또는 모이어티를 지칭한다. 검출가능한 표지는 방사선동위원소, 형광단, 발색단, 효소, 염료, 금속 이온, 리간드, 예를 들어, 바이오틴, 아비딘, 스트렙타비딘 및 합텐, 양자점 등을 포함한다. 검출가능한 표지는 본 명세서에 개시된 펩타이드 또는 단백질 내의 임의의 위치에 위치될 수 있다. 이들은 아미노산, 펩타이드 또는 단백질내에 존재할 수 있거나, N- 또는 C- 말단에 위치될 수 있다.
소화하다: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "소화하다"란 용어는, 보다 작은 조각들 또는 성분들로 파괴되는 것을 의미한다. 폴리펩타이드 또는 단백질을 언급하는 경우, 소화는 펩타이드의 생산을 초래한다.
원위(distal): 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "원위"란 용어는, 관심 대상 지점 또는 영역으로부터 멀거나 중심으로부터 멀리 위치함을 의미한다.
용량 분할 인자(dose splitting factor: DSF)-비는 총 1일 용량 또는 단일의 단위 용량의 PUD로 나뉜 용량 분할 치료의 PUD이다. 이 값은 투약 요법군들의 비교로부터 유도된다.
봉입하다: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "봉입하다"란 용어는, 포위되거나, 둘러싸이거나 혹은 감싸는 것을 의미한다.
공학적으로 조작된: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 본 발명의 실시형태들은, 출발점, 야생형 또는 천연 분자로부터 변하는 구조이든지 또는 화학물질이든지 간에, 특징 또는 특성을 갖도록 설계되는 경우 "공학적으로 조작된"이다.
엑소좀: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "엑소좀"은 포유류의 세포들에 의해 분비된 소포이다.
발현: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 핵산 서열의 "발현"이란, 다음의 현상들 중의 하나 이상을 지칭한다: (1) DNA 서열로부터 RNA 주형의 생산(예컨대, 전사에 의한); (2) RNA 전사체의 프로세싱 (예컨대, 스플라이싱(splicing), 편집(editing), 5' 캡 형성 및/또는 3' 말단 프로세싱에 의한); (3) RNA의 폴리펩타이드 또는 단백질 내로의 번역; 및 (4) 폴리펩타이드 또는 단백질의 번역후 변형.
특성(feature): 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "특성"이란 특징, 특성(property) 또는 독특한 요소를 지칭한다.
제형: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "제형"은 적어도 변형된 핵산 또는 mmRNA 및 전달제를 포함한다.
단편: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "단편"이란 일부분을 지칭한다. 예를 들어, 단백질의 단편은 배양된 세포들로부터 단리된 전장 단백질을 소화시킴으로써 얻어진 폴리펩타이드들을 포함할 수 있다.
기능적: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "기능적" 생물학적 분자는 이것이 특징화된 특성 및/또는 활성을 나타내는 형태의 생물학적 분자이다.
상동성: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "상동성"이란 용어는, 중합체성 분자들, 예컨대, 핵산 분자들(예컨대, DNA 분자들 및/또는 RNA 분자들) 간의 및/또는 폴리펩타이드 분자들 간의 전체적인 관련성을 지칭한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체성 분자들은 그들의 서열이 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일하거나 유사하다면 서로 "상동성"인 것으로 고려된다. "상동성"이란 용어는, 필수적으로 적어도 2개의 서열(폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열) 간의 비교를 지칭한다. 발명에 따라서, 2개의 폴리뉴클레오타이드 서열은, 이들이 암호화하는 폴리펩타이드가 적어도 약 20개의 아미노산의 적어도 하나의 신장에 대해 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 심지어 99%인 경우 상동성인 것으로 고려된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 상동성 폴리뉴클레오타이드 서열은 적어도 4-5개의 고유하게 특정된 아미노산의 신장을 암호화하는 능력으로 특징규명된다. 길이가 60개 미만의 뉴클레오타이드인 폴리뉴클레오타이드 서열의 경우, 상동성은 적어도 4 내지 5개의 고유하게 특정된 아미노산의 신장을 암호화하는 능력에 의해 결정된다. 본 발명에 따라서, 2개의 단백질 서열은, 단백질이 적어도 약 20개의 아미노산의 적어도 하나의 신장에 대해 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 동일한 경우 상동성인 것으로 고려된다.
동일성: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "동일성"이란 용어는, 중합체 분자들 간, 예컨대, 올리고뉴클레오타이드 분자들(예컨대, DNA 분자들 및/또는 RNA 분자들) 간 및/또는 폴리펩타이드 분자들 간의 전체 관련성을 지칭한다. 2개의 폴리뉴클레오타이드 서열의 동일성 퍼센트의 계산은, 예를 들어, 최적의 비교 목적을 위해 2개 서열을 정렬함으로써 수행될 수 있다((예컨대, 갭(gap)들이 최적의 정렬을 위해 제1의 및 제2의 핵산 서열들 중 하나 또는 둘 다 내로 도입될 수 있고 동일하지 않은 서열들은 비교 목적을 위해 무시될 수 있다). 소정의 실시형태에 있어서, 비교 목적을 위해 정렬된 서열의 길이는 참조 서열의 길이의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%이다. 대응하는 뉴클레오타이드 위치에서의 뉴클레오타이드들이 이어서 비교된다. 제1의 서열내 위치가 제2의 서열내 대응하는 위치와 동일한 뉴클레오타이드에 의해 점유되는 경우, 분자는 그 위치에서 동일하다. 2개의 서열 사이의 동일성 퍼센트는 2개의 서열의 최적의 정렬을 위해 도입될 필요가 있는, 각각의 갭의 길이, 및 갭들의 수를 고려하여, 서열에 의해 공유된 동일한 위치의 개수의 함수이다. 서열들의 비교 및 2개의 서열 사이의 동일성 퍼센트의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이의 동일성 퍼센트는 문헌[Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; 및 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; 이들 문헌의 각각은 참조로 본 명세서에 포함됨)에 기재된 것들과 같은 방법을 이용해서 결정될 수 있다. 예를 들어, 2개의 뉴클레오타이드 서열 간의 동일성 퍼센트는, PAM120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 패널티 및 4의 갭 패널티를 사용하는 ALIGN 프로그램(버전 2.0) 내로 편입된, 메이어스(Meyers) 및 밀러(Miller)의 알고리즘(CABIOS, 1989, 4:11-17)을 사용하여 결정될 수 있다. 2개의 뉴클레오타이드 서열 간의 동일성 퍼센트는, 대안적으로, NWSgapdna.CMP 매트릭스를 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지 내의 GAP 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 서열들 간의 동일성 퍼센트를 결정하는데 통상적으로 이용되는 방법은 문헌[Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48:1073 (1988); 참조로 본 명세서에 포함됨]에 개시된 것들을 이들로 제한되는 것은 아니다. 동일성을 결정하기 위한 기술은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램으로 암호화되어 있다. 서열 간의 상동성을 결정하는 예시적인 컴퓨터 소프트웨어는 GCG 프로그램 패키지, Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1), 387 (1984)), BLASTP, BLASTN 및 FASTA Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215, 403 (1990))를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
유전자의 발현을 저해하다: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "유전자의 발현을 저해하다"란 어구는 유전자의 발현 생성물의 양의 저감을 일으키는 것을 의미한다. 발현 생성물은 유전자로부터 전사된 RNA(예컨대, mRNA) 또는 유전자로부터 전사된 mRNA로부터 번역된 폴리펩타이드일 수 있다. 전형적으로 mRNA 수준의 저감은 이로부터 번역된 폴리펩타이드 수준의 저감을 초래한다. 발현 수준은 mRNA 또는 단백질을 측정하기 위한 표준 기술을 사용하여 결정할 수 있다.
시험관내: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "시험관내"란 용어는, 유기체(예컨대, 동물, 식물 또는 미생물) 내가 아닌 인공 환경, 예컨대, 시험관 또는 반응 용기, 세포 배양액, 페트리 접시(petri dish) 등에서 발생하는 이벤트를 지칭한다.
생체내: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "생체내"란 용어는, 유기체(예컨대, 동물, 식물, 또는 미생물 또는 이의 세포 또는 조직) 내에서 발생하는 이벤트를 지칭한다.
단리된: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "단리된"이란 용어는, 이것이 관련되었던(천연이든 혹은 실험적 세팅이든지) 적어도 일부의 성분으로부터 분리된 물질 혹은 실체를 지칭한다. 단리된 물질들은 이들이 연관된 물질을 기준으로 다양한 수준의 순도를 지닐 수 있다. 단리된 물질 및/또는 실체는 이들이 초기에 관련된 다른 성분의 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 그 이상으로부터 분리될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 단리된 제제는 약 80% 이상, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%또는 약 99% 이상 순수하다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 물질은 실질적으로 다른 성분이 없다면 "순수하다". 실질적으로 단리된: "실질적으로 단리된"이란 화합물이 형성되었거나 검출된 환경으로부터 실질적으로 분리되는 것을 의미한다. 부분 분리는, 예를 들어, 본 발명의 개시내용의 화합물 속에 풍부한 조성물을 포함할 수 있다. 실질적인 분리는 본 발명의 개시내용의 화합물 또는 그의 염을 적어도 약 50 중량%, 적어도 약 60 중량%, 적어도 약 70 중량%, 적어도 약 80 중량%, 적어도 약 90 중량%, 적어도 약 95 중량%, 적어도 약 97 중량% 또는 적어도 약 99 중량% 함유하는 조성물을 포함할 수 있다. 화합물 및 그의 염을 단리시키는 방법은 당업계에서 통상적이다.
링커: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 링커란 원자들의 군, 예컨대, 10-1,000개의 원자를 지칭하며, 탄소, 아미노, 알킬아미노, 산소, 황, 설폭사이드, 설포닐, 카보닐 및 이민 등(이들로 제한되지 않음)과 같은 원자 혹은 기로 구성될 수 있다. 링커는 제1 단부에서 핵염기 혹은 당 모이어티 상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드에, 그리고 제2 단부에서 페이로드, 예컨대, 검출가능한 제제 혹은 치료제에 부착될 수 있다. 링커는 핵산 서열 내로의 혼입을 방해하지 않기에 충분한 길이일 수 있다. 링커는 본 명세서에 기재된 바와 같은 페이로드를 투여할 뿐만 아니라 mmRNA 다합체(예컨대, 2개 이상의 변형된 핵산 분자 또는 mmRNA 분자의 결합을 통해서) 또는 mmRNA 컨쥬게이트를 형성하는 등과 같은 임의의 유용한 목적을 위하여 이용될 수 있다. 링커 내에 혼입될 수 있는 화학적 기의 예는, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 각각 선택적으로 치환된, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아마이도, 아미노, 에터, 티오에터, 에스터, 알킬렌, 헤테로알킬렌, 아릴 또는 헤테로사이클릴을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 링커의 예는, 불포화 알칸, 폴리에틸렌 글라이콜(예컨대, 에틸렌 또는 프로필렌 글라이콜 단량체성 단위, 예컨대, 다이에틸렌 글라이콜, 다이프로필렌 글라이콜, 트라이에틸렌 글라이콜, 트라이프로필렌 글라이콜, 테트라에틸렌 글라이콜 또는 테트라에틸렌 글라이콜), 및 덱스트란 중합체 및 이들의 유도체를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 기타 예는, 환원제 혹은 열분해를 이용해 절단될 수 있는, 링커 내의 절단가능한 모이어티, 예를 들어, 이황화 결합(-S-S-) 또는 아조 결합(-N=N-)을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 선택적으로 절단가능한 결합의 비제한적인 예는, 예를 들어 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP) 또는 기타 환원제, 및/또는 열분해에 의해 절단될 수 있는 아마이도 결합뿐만 아니라, 예를 들어 산성 혹은 염기성 가수분해에 의해 절단될 수 있는 에스터 결합을 포함한다.
마이크로RNA(miRNA) 결합 부위: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 마이크로RNA(miRNA) 결합 부위는 miRNA의 적어도 "시드" 영역이 결합되는 핵산 전사물의뉴클레오타이드 위치 또는 영역을 나타낸다.
변형된: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "변형된"이란 본 발명의 분자의 변화된 상태 혹은 구조를 지칭한다. 분자 화학적으로, 구조적으로, 및 기능적으로를 포함하는 많은 방식들로 변형될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 mRNA 분자는 비-천연의 뉴클레오사이드 및/또는 뉴클레오타이드의 도입에 의해 변형된다.
점액: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "점액"이란 점성이고 점액 당단백질을 포함하는 천연의 물질을 지칭한다.
천연 유래: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "천연 유래"란 인공 보조제 없이 자연에 존재함을 의미한다.
비-인간 척추동물: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "비-인간 척추동물"은 야생 종 및 사육된 종을 포함하는, 호모사피엔스(Homo sapiens)를 제외한 모든 척추동물을 포함한다. 비-인간 척추동물의 예는 알파카(alpaca), 반텡(banteng), 비손(bison), 낙타, 고양이, 소, 사슴, 개, 당나귀, 가얄(gayal), 염소, 기니아 피그, 말, 라마(llama), 노새, 돼지, 토끼, 순록, 양, 물소(sheep water buffalo) 및 야크(yak)와 같은 포유류를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
오프-표적(off-target): 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "오프 표적"이란 임의의 하나 이상의 표적, 유전자 또는 세포 전사물 상에서 임의의 의도되지 않은 효과를 지칭한다
개방 판독 프레임: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "개방 판독 프레임" 또는 "ORF"란 주어진 판독 프레임 내에서 정지 코돈을 함유하지 않는 서열을 지칭한다.
작동가능하게 연결된: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "작동가능하게 연결된"이란 어구는 2개 이상의 분자, 작제물, 전사물, 실체, 모이어티 등 사이의 기능적 연결을 지칭한다.
파라토프(paratope): 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "파라토프"란 항체의 항원-결합 부위를 지칭한다.
환자: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "환자"란 치료를 추구할 수 있거나 치료가 요구되거나, 치료를 필요로 하거나, 치료를 받는 중이거나, 치료를 받을 예정인 대상체, 또는 특수한 질환 또는 병태에 대해 숙련된 전문가에 의한 관리 하에 있는 대상체를 지칭한다.
펩타이드: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "펩타이드"는 50개 이하의 아미노산 길이, 예컨대, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개의 아미노산의 길이이다.
약제학적으로 허용가능한: "약제학적으로 허용가능한"이란 어구는, 본 명세서에서, 이상적인 유익/유해비와 상응하는, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 문제점 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉해서 사용하기에 적합한, 건전한 의학적 판단의 영역 내에 있는 화합물, 물질, 조성물 및/또는 용량 형태를 지칭한다.
약제학적으로 허용가능한 부형제: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "약제학적으로 허용가능한 부형제"란 어구는, 본 명세서에 기재된 화합물 이외의 임의의 성분(예를 들어, 활성 화합물을 현탁시키거나 용해시킬 수 있는 비히클)을 지칭하며, 환자에서 실질적으로 무독성이고 비-염증성인 특성들을 갖는 것이다. 부형제는, 예를 들어: 점착방지제, 항산화제, 결착제, 코팅, 압착 보조제, 붕해제, 염료(착색제), 유연제, 유화제, 충전제(희석제), 필름 형성제 또는 코팅, 풍미제, 향수, 활주제(유동 증진제), 윤활제, 방부제, 인쇄 잉크, 흡수제, 현탁제, 분산제, 감미제 및 수화용 수(waters of hydration)를 포함할 수 있다. 예시적인 부형제는, 뷰틸화 하이드록시톨루엔(BHT), 탄산칼슘, 인산칼슘(이염기성), 칼슘 스테아레이트, 크로스카멜로스, 가교결합폴리비닐 피롤리돈, 시트르산, 크로스포비돈, 시스테인, 에틸셀룰로스, 젤라틴, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 락토스, 마그네슘 스테아레이트, 말티톨, 만니톨, 메티오닌, 메틸셀룰로스, 메틸 파라벤, 미세결정성 셀룰로스, 폴리에틸렌 글라이콜, 폴리비닐 피롤리돈, 포비돈, 전호화 전분, 프로필 파라벤, 레티닐 팔미테이트, 쉘락, 이산화규소, 소듐 카복시메틸 셀룰로스, 시트르산나트륨, 나트륨 전분 글라이콜레이트, 솔비톨, 전분(옥수수), 스테아르산, 수크로스, 탤크, 이산화티타늄, 비타민 A, 비타민 E, 비타민 C 및 자일리톨을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
약제학적으로 허용가능한 염: 본 발명의 개시내용은 또한 본 명세서에 기재된 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "약제학적으로 허용가능한 염"이란, 개시된 화합물의 유도체를 지칭하며, 여기서, 모 화합물(parent compound)은 존재하는 산 또는 염기 모이어티를 그의 염 형태로 전환시킴으로써(예컨대, 유리 염기기를 적절한 유기 산과 반응시킴으로써) 변형시킨다. 약제학적으로 허용가능한 염의 예는, 아민 등과 같은 염기성 잔기의 광산 또는 유기산 염; 카복실산과 같은 산성 잔기의 알칼리 또는 유기 염 등을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 대표적인 산 부가 염은 아세테이트, 아디페이트, 알지네이트, 아스코르베이트, 아스파테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 바이설페이트, 보레이트, 뷰티레이트, 캄포레이트, 캄퍼설포네이트, 시트레이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 다이글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵토네이트, 헥사노에이트, 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 하이드로아이오다이드, 2-하이드록시-에탄설포네이트, 락토바이오네이트, 락테이트,라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 나이트레이트, 올레에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 석시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 티오사이아네이트, 톨루엔설포네이트, 운데카노에이트, 발레레이트염 등을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등뿐만 아니라, 무독성 암모늄, 4급 암모늄, 및 예를 들어, 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 에틸아민 등을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 아민 양이온을 포함한다. 본 발명의 개시내용의 약제학적으로 허용가능한 염은 형성된 모 화합물, 예를 들어, 무독성 무기 또는 유기 산으로부터의 통상적인 무독성 염을 포함한다. 본 발명의 개시내용의 약제학적으로 허용가능한 염은 통상의 화학적 방법에 의해 염기성 또는 산성 모이어티를 함유하는 모 화합물로부터 합성될 수 있다. 일반적으로, 이러한 염은 이들 화합물의 유리 산 또는 염기 형태를 화학량론적 양의 적절한 염기 또는 산과 물 또는 유기 용매, 또는 2개의 혼합물 중에서 반응시킴으로써 제조될 수 있으며; 일반적으로 에터, 에틸 아세테이트, 에탄올, 아이소프로판올 또는 아세토나이트릴과 같은 비수성 매질이 바람직하다. 적절한 염의 리스트는 문헌들[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p. 1418, Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P.H. Stahl and C.G. Wermuth (eds.), Wiley-VCH, 2008, 및 Berge et al., Journal of Pharmaceutical Science, 66, 1-19 (1977)]에서 찾을 수 있으며, 이들 문헌의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다.
약제학적으로 허용가능한 용매화물: 본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "약제학적으로 허용가능한 용매화물"이란 용어는, 적절한 용매의 분자가 결정 격자에 혼입되어 있는 본 발명의 화합물을 의미한다. 적절한 용매는 투여된 용량에서 생리학적으로 허용된다. 예를 들어, 용매화물은 유기 용매, 물 또는 이들의 혼합물을 포함하는 용액으로부터의 결정화, 재결정화 혹은 석출에 의해 제조될 수 있다. 적절한 용매의 예는 에탄올, 물(예를 들어, 1-, 2- 및 3-수화물), N-메틸피롤리돈(NMP), 다이메틸 설폭사이드(DMSO), N,N'-다이메틸폼아마이드(DMF), N,N'-다이메틸아세트아마이드(DMAC), 1,3-다이메틸-2-이미다졸리디논(DMEU), 1,3-다이메틸-3,4,5,6-테트라하이드로-2-(1H)-피리미디논(DMPU), 아세토나이트릴(ACN), 프로필렌 글라이콜, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 2-피롤리돈, 벤질 벤조에이트 등이다. 물이 용매인 경우, 용매화물은 "수화물"로서 지칭된다.
약동학: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "약동학"이란 살아있는 유기체에 투여된 물질의 수명의 측정과 관련되므로, 분자 또는 화합물의 임의의 하나 이상의 특성을 지칭한다. 약동학은 흡수, 분포, 물질대사 및 분비의 정도 및 속도를 포함하는, 수개의 영역으로 나누어진다. 이것은 통상 ADME라 지칭되며, 여기서 (A) 흡수는 물질이 혈류로 도입되는 공정이며; (D) 분포는 신체의 유액 및 조직을 통한 물질의 분산 또는 보급이며; (M) 물질대사(또는 생물전환)는 모 화합물의 자손 대사산물로의 비가역적인 변환이고; (E) 배출(제거)은 신체로부터 물질의 제거를 지칭한다. 드문 경우에, 몇몇 약물은 신체 조직 내에 비가역적으로 축적된다.
약리학적 효과: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "약리학적 효과"는 유기체 혹은 시스템이 외인성 제제와 접촉하거나 이 외인성 제제에 노출된 후에 일어나는 유기체 혹은 시스템 내의 측정가능한 생물학적 현상이다. 약리학적 효과는 질환, 장애, 병태 혹은 감염의 치료, 하나 이상의 증상의 개선, 진단, 예방 및 발병의 지연 등과 같은 치료적으로 유효한 성과를 초래할 수 있다. 이러한 생물학적 현상의 측정은 다른 생물학적 현상에 대해서 정량적이거나 정성적이거나 상대적일 수 있다. 정성적 측정은 통계학적으로 유의할 수 있다. 정량적 측정은 정도 혹은 종류로 나타낼 수 있고, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 상이할 수 있다. 이들은 존재하거나 부재하거나 더 양호하거나 나쁘거나, 더 크거나 혹은 더 작게 관찰될 수 있다. 외인성 제제는, 약리학적 효과를 지칭할 경우, 유기체 혹은 시스템에 대한 전체적으로 혹은 부분적으로 이물질인 제제이다. 예를 들어, 야생형 바이오분자로의 변형은, 구조적이든 화학적이든 간에, 외인성 제제를 생산할 것이다. 마찬가지로, 유기체 혹은 시스템 내에서 천연적으로 발견되지 않는 화합물, 분자 혹은 물질 내로 혹은 이와 함께 야생형 분자의 혼입 혹은 배합은 또한 외인성 제제를 생산할 것이다. 본 발명의 변형된 mRNA는 외인성 제제를 포함한다. 약리학적 효과의 예는, 세포 수의 변경, 예컨대, 호중구, 망상적혈구, 과립구, 적혈구(erythrocyte)(적혈구(red blood cell)), 거핵구, 혈소판, 단핵구, 결합 조직 대식세포, 상피 랑게르한스 세포, 파골세포, 수지상 세포, 미세아교 세포, 호중구, 호산구, 호염기구, 비만세포, 헬퍼 T 세포, 억제인자 T 세포, 세포독성 T 세포, 천연의 킬러 T 세포, B 세포, 천연의 킬러 세포 또는 망상적혈구의 증가 혹은 감소를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 약리학적 효과는 또한 혈액 화학, pH, 헤모글로빈, 헤마토크릿의 변경, 간 효소 AST 및 ALT 등(이들로 제한되지 않음)과 같은 효소의 수준의 변화, 지질 프로파일, 전해질, 대사 마커, 호르몬 혹은 당업자에게 공지된 기타 마커 혹은 프로파일의 변화를 포함한다.
물리화학적: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "물리화학적"은 물리적 및/또는 화학적 특성과 관련됨을 의미한다.
예방하는: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "예방하는"이란 용어는, 감염, 질환, 장애 및/또는 병태의 발병을 부분적으로 또는 완전히 지연시키고/시키거나; 특수한 감염, 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상, 특징 또는 임상적 징후의 발병을 부분적으로 또는 완전히 지연시키고/시키거나; 특수한 감염, 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상, 특징 또는 징후의 발병을 부분적으로 또는 완전히 지연시키고/시키거나; 감염, 특수한 질환, 장애 및/또는 병태로부터의 진행을 부분적으로 또는 완전히 지연시키고/시키거나; 감염, 질환, 장애 및/또는 병태와 관련된 병리학의 발전 위험성을 감소시킴을 지칭한다.
전구약물: 본 발명의 개시내용은 또한 본 명세서에 기재된 화합물의 전구약물을 포함한다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "전구약물"이란 화학적 또는 물리적 변경 시 치료제로서 작용하기 위한 물질, 분자 또는 실체에 대해 예견된 형태의 임의의 물질, 분자 또는 실체를 지칭한다. 전구약물은 일부 방식으로 공유결합적으로 결합되거나 봉쇄될 수 있으며, 이는 포유류 대상체에게 투여되기 전, 투여 시 또는 투여 후에 활성 약물 모이어티로 방출되거나 전환된다. 전구약물은, 변형이 통상의 조작 또는 생체내에서 모 화합물에 대해서 절단되는 방식으로 화합물 속에 존재하는 작용기를 변형(즉, 수식)시킴으로써 제조될 수 있다. 전구약물은, 하이드록실, 아미노, 설프하이드릴, 또는 카복실기가 포유류 대상체에게 투여되는 경우, 하이드록실, 아미노, 설프하이드릴 또는 카복실기가 각각 없는 형태로 절단되는 임의의 기에 결합되는 화합물을 포함한다. 전구약물의 제조 및 용도는 문헌[T. Higuchi and V. Stella, "Pro-drugs as Novel Delivery Systems," Vol. 14 of the A.C.S. Symposium Series] 및 문헌[Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987]에서 논의되어 있으며, 이들 두 문헌은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다.
증식하다: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "증식하다"란 용어는, 성장하거나, 확장하거나 또는 증가하거나, 또는 신속하게 성장하도록, 확장하도록 또는 증가하도록 함을 의미한다. "증식성"은 증식하는 능력을 지니는 것을 의미한다. "항증식성"이란 증식 특성과 대향 혹은 반대인 특성을 지니는 것을 의미한다.
관심 대상 단백질: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "관심 대상 단백질" 또는 "목적으로 하는 단백질"이란 용어는, 본 명세서에서 제공된 것들 및 이들의 단편, 돌연변이체, 변이체 및 변형을 포함한다.
근위(proximal): 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "근위"란 용어는, 중심 또는 관심 대상 지점 또는 영역에 대해 가장 가까이 위치함을 의미한다.
유사유리딘: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 유사유리딘은 뉴클레오사이드 유리딘의 C-글라이코사이드의 이성질체를 지칭한다. "유사유리딘 유사체"는 유사유리딘의 임의의 변형, 변이체, 아이소형태 혹은 유도체이다. 예를 들어, 유사유리딘 유사체는, 1-카복시메틸-유사유리딘, 1-프로피닐-유사유리딘, 1-타우리노메틸-유사유리딘, 1-타우리노메틸-4-티오-유사유리딘, 1-메틸-유사유리딘(m1ψ), 1-메틸-4-티오-유사유리딘(m1s4ψ), 4-티오-1-메틸-유사유리딘, 3-메틸-유사유리딘(m3ψ), 2-티오-1-메틸-유사유리딘, 1-메틸-1-데아자-유사유리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-유사유리딘, 다이하이드로유사유리딘, 2-티오-다이하이드로유사유리딘, 2-메톡시유리딘, 2-메톡시-4-티오-유리딘, 4-메톡시-유사유리딘, 4-메톡시-2-티오-유사유리딘, N1-메틸-유사유리딘, 1-메틸-3-(3-아미노-3-카복시프로필)유사유리딘(acp3ψ) 및 2'-O-메틸-유사유리딘(ψm)을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
정제된: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "정제하다", "정제된", "정제"란, 원치 않는 성분, 물질 오염, 혼합물 또는 결함으로부터 실질적으로 순수하게 하거나 청소함을 의미한다.
샘플: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "샘플" 또는 "생물학적 샘플"이란 용어는, 그의 조직, 세포 또는 성분 부분(예컨대, 혈액, 점액, 림프액, 관절 낭액, 뇌 척수액, 타액, 양수, 양막제대혈, 뇨, 질액 및 정액을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 체액)의 부분집합을 지칭한다. 샘플은 또한 전체 유기체 또는 그의 조직, 세포 또는 성분 부분의 부분집합, 또는 예를 들어, 혈장, 혈청, 척수액, 림프액, 피부, 호흡기, 창자 및 비뇨생식기관의 외부 단면들을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아닌 그의 분획 또는 부위로부터 제작된 균질물, 용해물 또는 추출물, 눈물, 타액, 유액, 혈액 세포, 종양, 장기를 포함할 수 있다. 샘플은 또한 영양 브로쓰(nutrient broth) 또는 겔과 같은 배지를 지칭하며, 이는 단백질 또는 핵산 분자와 같은 세포 성분을 함유할 수 있다.
신호 서열: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "신호 서열"이란 어구는 수송 또는 국재화를 지시할 수 있는 서열을 지칭한다.
단일 단위 용량: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "단일 단위 용량"은 1회 용량/1회로/단일 경로/ 단일 접촉점, 즉, 단일 투여 이벤트로 투여된 임의의 치료제의 용량이다.
유사성: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "유사성"이란 용어는, 예컨대 폴리뉴클레오타이드 분자들(예컨대 DNA 분자들 및/또는 RNA 분자들) 사이 및/또는 폴리펩타이드 분자들 사이의 전체적인 관련성을 지칭한다. 서로에 대한 중합체 분자들의 유사성 퍼센트의 계산은, 유사성 퍼센트의 계산이 당해 분야에 이해되는 바와 같이 보존적 치환을 고려하는 것을 제외하고는, 동일성 퍼센트의 계산과 동일한 방식으로 수행될 수 있다.
분할 용량: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "분할 용량"은 단일 단위 용량 혹은 총 1일 용량을 2회 이상의 용량으로 분할한 것이다.
안정적인: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "안정적인"이란, 반응 혼합물로부터 유용한 정도의 순도로의 분리에 견디기에 충분히 강하고, 바람직하게는 유효한 치료제로 제형화될 수 있는 화합물을 지칭한다.
안정화된: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "안정화하다", "안정화된", "안정화된 영역"이란 용어는, 안정적으로 만들거나 안정적이 된 것을 의미한다.
대상체: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "대상체" 또는 "환자"란 용어는, 본 발명에 따른 조성물이, 예컨대, 실험적, 진단적, 예방적 및/또는 치료학적 목적을 위해 투여될 수 있는 임의의 유기체를 지칭한다. 전형적인 대상체는 동물(예컨대, 포유류, 예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 비-인간 영장류 및 인간) 및/또는 식물을 포함한다.
실질적으로: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "실질적으로"란 용어는, 관심 대상 특징 또는 특성의 전체 또는 전체에 근접한 한도 또는 정도를 나타내는 정성적인 상태를 지칭한다. 생물학적 분야에서 통상의 기술자는, 생물학적 및 화학적 현상이 설사 드믈게 완성으로 완료되고/되거나 진행되는 경우 또는 절대적인 결과를 달성하거나 피하는 것으로 이해할 것이다. 따라서, "실질적으로"란 용어는 많은 생물학적 및 화학적 현상에서 고유한 완성도의 잠재적인 결여를 포착하기 위해 사용된다.
실질적으로 동일한: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이 그리고 이것이 용량들 사이의 시간차에 관한 것이므로, 이 용어는 +/- 2%를 의미한다.
실질적으로 동시에: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이 그리고 이것이 다수의 용량에 관련되므로, 이 용어는 2초 이내를 의미한다.
로 고생하는: 질환, 장애 및/또는 병태"로 고생하는" 개체는 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상으로 진단되거나 나타낸다.
에 대해 민감한: 질환, 장애 및/또는 병태"에 대해 민감한" 개체는 질환, 장애 및/또는 병태를 지닌 것으로 진단되지 않고/않거나 이들의 증상들을 나타내지 않을 수 있지만, 질환 혹은 그의 증상을 발달시킬 성향을 갖고 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 질환, 장애 및/또는 병태(예를 들어, 암)에 대해 민감한 개체는 (1) 질환, 장애 및/또는 병태의 발달과 관련된 유전적 돌연변이; (2) 질환, 장애 및/또는 병태의 발달과 관련된 유전적 다형체; (3) 질환, 장애 및/또는 병태와 관련된 단백질 및/또는 핵산의 증가되고/되거나 감소된 발현 및/또는 활성; (4) 질환, 장애 및/또는 병태이 발달과 관련된 습관 및/또는 생활방식들; (5) 질환, 장애 및/또는 병태의 가족력; 및 (6) 질환, 장애 및/또는 병태의 발달과 관련된 미생물에 대한 노출 및/또는 감염 중 하나 이상을 특징으로 할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 질환, 장애 및/또는 병태에 대해 민감한 개체는 그 질환, 장애 및/또는 병태를 발병할 것이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 질환, 장애 및/또는 병태에 대해 민감한 개체는 그 질환, 장애 및/또는 병태를 발병하지 않을 것이다.
지속 방출: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "지속 방출"이란 용어는 특정 시간 주기에 걸쳐서 방출 속도에 합치하는 약제학적 조성물 또는 화합물 방출 프로파일을 지칭한다.
합성: "합성"이란 용어는, 사람의 손으로 생산되고/되거나, 제조되고/되거나, 제작됨을 의미한다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 또는 기타 분자의 합성은 화학적 혹은 효소적일 수 있다.
표적화된 세포: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "표적화된 세포"란 임의의 하나 이상의 관심 대상 세포를 지칭한다. 세포는 시험관내, 생체내, 동일 반응계내 또는 유기체의 조직 혹은 장기 내에서 발견될 수 있다. 유기체는, 동물, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간 및 가장 바람직하게는 환자일 수 있다.
치료제: "치료제"란 용어는, 대상체에게 투여되는 경우, 치료학적, 진단적, 및/또는 예방적 효과를 가지고/가지거나 바람직한 생물학적 및/또는 약리학적 효과를 유발하는 임의의 제제를 지칭한다.
치료적 유효량: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "치료적 유효량"이란 용어는, 감염, 질환, 장애 및/또는 병태로 고생하거나 이에 대해 민감한 대상체에게 투여 시 감염, 질환, 장애 및/또는 병태를 치료하고/하거나 이의 증상들을 개선시키고/시키거나, 진단하고/하거나, 예방하고/하거나 이의 발병을 지연시키기에 충분한 전달될 제제(예컨대, 핵산, 약물, 치료제, 진단제, 예방제 등)의 양을 의미한다.
치료적으로 유효한 성과: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "치료적으로 유효한 성과"란 용어는, 감염, 질환, 장애 및/또는 병태로 고생하거나 이에 대해 민감한 대상체 내에서, 감염, 질환, 장애 및/또는 병태를 치료하고/하거나 이의 증상들을 개선시키고/시키거나, 진단하고/하거나, 예방하고/하거나 이의 발병을 지연시키기에 충분한 성과를 의미한다.
총 1일 용량: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "총 1일 용량"은 24시간 내에 부여되거나 처방되는 양이다. 이것은 단일의 단위 용량으로서 투여될 수 있다.
전사 인자: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "전사 인자"란 용어는, 예를 들어, 전사의 활성화 또는 억제에 의해, DNA의 RNA로의 전사를 조절하는 DNA-결합 단백질을 지칭한다. 일부 전사 인자는 전사만을 조절하는 반면, 다른 것은 다른 단백질과 관련하여 작용한다. 일부 전사 인자는 소정 조건 하에서 전사를 활성화하고 억제하는 것 둘 다를 할 수 있다. 일반적으로, 전사 인자는 표적 유전자의 조절 영역 내에서 특이적인 컨센서스 서열(consensus sequence)과 고도로 유사한 특이적인 표적 서열 또는 서열들에 결합한다. 전사 인자는 표적 유전자만의 전사를 조절하거나 다른 분자와의 복합체로 조절할 수 있다.
치료하는: 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "치료하는"이란 용어는, 특수한 감염, 질병, 질환, 및/또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특징의 발병을 부분적으로 또는 완전히 완화시키고/시키거나, 개선시키고/시키거나, 향상시키고/시키거나, 경감시키고/시키거나, 지연시키고/시키거나, 이의 진행을 저해하고/하거나, 이의 중증도를 저감시키고/시키거나, 이의 발생을 저감시키는 것을 지칭한다. 예를 들어, 암을 "치료하는"은 종양의 생존, 성장 및/또는 확산을 저해하는 것을 지칭할 수 있다. 치료는 질병, 질환 및/또는 병태의 증상을 나타내지 않는 대상체에게, 및/또는 질병, 질환 및/또는 병태와 관련된 병리학으로 진행될 위험을 감소시킬 목적으로 질병, 질환 및/또는 병태의 조기 증상만을 나타내는 대상체에게 투여될 수 있다.
비변형(Unmodified): 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "비변형"이란 어떠한 방식으로도 변화되기 전의 어떠한 물질, 화합물 또는 분자를 지칭한다. 비변형은, 반드시 그런 것은 아니지만, 생물분자의 야생형 또는 천연형을 지칭한다. 분자는 일련의 변형을 겪을 수 있고, 이에 따라서 각각의 변형된 분자가 후속적인 변형에 대한 "비변형" 출발 분자로서 제공될 수 있다.
등가물 및 범위
당업자들은 통상적인 실험, 본 명세서에 기재된 본 발명에 따른 구체적인 실시형태들에 대한 많은 등가물을 사용하여 인식하거나, 추정할 수 있을 것이다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명으로 제한되는 것으로 의도된 것이 아니라, 오히려 첨부된 특허청구범위에 기술된 바와 같다.
특허청구범위에서, 단수 표현은, 반대로 나타내거나 달리 본문으로부터 명백하지 않는 한, 하나 이외의 하나 이상을 의미할 수 있다. 하나의 군의 하나 이상의 구성원들 사이에 "또는"을 포함하는 특허청구범위 또는 설명들은, 그 군 구성원들 중의 하나, 하나 이상, 또는 모두가, 달리 나타내지 않는 한 또는 내용으로부터 명백하지 않는 한, 제공된 생성물 또는 공정에 사용되거나, 달리는 이와 관련되는 경우 만족되는 것으로 고려된다. 본 발명은, 군의 정확히 하나의 구성원이 제공된 생성물 또는 공정에, 또는 달리는 이와 관련하여 존재하는 실시형태들을 포함한다. 본 발명은, 군 구성원들의 하나 이상, 또는 모두가 제공된 생성물 또는 공정에 존재하거나, 사용되거나, 또는 달리는 이와 관련되는 실시형태들을 포함한다.
또한, "포함하는"이란 용어는, 추가의 요소들 또는 단계들의 포괄을 개방하고 허용하는 것에 유의해야 한다.
범위가 부여되는 경우, 종점이 포함된다. 또한, 달리 나타내거나 달리는 당업자의 이해 및 정황으로부터 명백한 경우를 제외하고, 범위로 나타낸 값들은, 내용이 달리 명확하게 나타내지 않는 한, 본 발명의 상이한 실시형태에서 기술된 범위 내에서 어떠한 구체적인 값 또는 소범위 내지 그 범위의 하한치의 단위의 10분의 1까지 추정할 수 있다.
또한, 선행 기술에 속하는 본 발명의 어떠한 특정 실시형태도 특허청구범위의 어느 하나 이상으로부터 명확하게 배제될 수 있음이 이해되어야 한다. 이러한 실시형태는 당업자에게 공지된 것으로 간주되므로, 이들은, 배제가 본 명세서에 명확하게 기술되지 않은 경우에도, 배제될 수 있다. 본 발명의 조성물의 어느 특수한 실시형태(예컨대, 이에 의해 암호화된 어떠한 핵산 또는 단백질; 어떠한 생산 방법; 어떠한 사용 방법 등)은 어떠한 하나 이상의 특허청구범위로부터 어떠한 이유에서도, 선행 기술의 존재와의 관련 여부와 상관없이 배제될 수 있다.
모든 인용된 자료들, 예를 들면, 본원에 인용된 참조문헌, 공보, 데이터베이스, 데이터베이스 실체, 및 기술은, 심지어 인용에서 명확하게 기술되지 않는 경우에도, 참조로 본 출원에 포함된다. 인용된 자료와 본 출원의 기술들이 상충되는 경우에, 본 출원의 기술이 지배할 것이다.
부분 및 표 제목은 제한으로 의도되지 않는다.
실시예들
본 발명은 하기의 실시예들에서 추가로 기술되고, 이는, 특허청구범위에 기술된 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
실시예 1. 변형된 mRNA 생산
본 발명에 따른 변형된 mRNA(mmRNA)는 표준 실험실 방법 및 재료를 사용하여 제조될 수 있다. 관심 대상 유전자의 개방 판독 프레임(ORF)은 코작 번역 개시 신호를 포함할 수 있는 5' 비번역 영역(UTR) 및/또는 폴리-A 테일의 주형화된 부가용의 올리고(dT) 서열을 포함할 수 있는 알파-글로빈 3' UTR이 그의 각 측면에 있을 수 있다. 변형된 mRNA는 세포의 선천적 면역 반응을 저감시키기 위하여 변형될 수 있다. 세포 반응을 저감시키기 위한 변형은 유사유리딘(ψ) 및 5-메틸-시티딘(5meC 또는 m5C)을 포함할 수 있다(문헌[Kariko K et al. Immunity 23:165-75 (2005), Kariko K et al. Mol Ther 16:1833-40 (2008), Anderson BR et al. NAR (2010)] 참조; 이들의 각각은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).
ORF는 또한 다양한 상류(upstream) 또는 하류(downstream) 첨가물(예를 들면, β-글로빈, 태그 등(이들로 제한되지 않음))을 포함할 수 있으며, DNA2.0(캘리포니아주 멘로 파크시에 소재)과 같은, 그러나 이것으로 제한되지 않는 최적화 서비스로부터 주문될 수 있고, XbaI 인식을 가질 수 있는 다중 클로닝 부위를 함유할 수 있다. 플라스미드 DNA의 수령 시, 이는 재구성되어 화학적으로 컴피턴트(competent)한 대장균(E. coli) 내로 형질전환될 수 있다.
본 발명을 위하여, NEB DH5-알파 컴피턴트 대장균(E. coli)이 이용된다. 형질전환은 100ng의 플라스미드를 사용하는 NEB 지시사항에 따라서 수행된다. 프로토콜은 다음과 같다:
1. NEB 5-알파 컴피턴트 대장균(E. coli) 세포의 튜브를 얼음 위에서 10분 동안 해동시킨다.
2. 1 pg 내지 100ng의 플라스미드 DNA를 함유하는 1 내지 5㎕를 세포 혼합물에 첨가한다. 튜브를 4 내지 5회 주의해서 휘둘러서 세포와 DNA를 혼합한다. 와동(vortex)시키지 않는다.
3. 혼합물을 얼음 상에서 30분 동안 둔다. 혼합하지 않는다.
4. 42℃에서 정확히 30분 동안 열 쇼크(heat shock)시킨다. 혼합하지 않는다.
5. 얼음 상에 5분 동안 둔다. 혼합하지 않는다.
6. 실온의 950㎕의 SOC를 혼합물 내로 피펫팅한다.
7. 37℃에서 60분 동안 둔다. 격렬하게(250 rpm) 진탕시키거나 회전시킨다.
8. 선택 플레이트를 37℃로 가온시킨다.
9. 튜브를 휘두르고 뒤집어서 세포를 완전히 혼합한다.
50 내지 100㎕의 각각의 희석물을 선택 플레이트 상에 분사하고, 37℃에서 하룻밤 배양한다. 대안적으로, 30℃에서 24 내지 36시간 동안 또는 25℃에서 48시간 동안 배양한다.
이어서, 단일 콜로니를 사용하여 적절한 항생제를 사용하는 5㎖의 LB 성장 배지에 접종한 후 5시간 동안 성장(250 RPM, 37℃)하도록 한다. 이어서, 이것을 사용하여 200㎖의 배양 배지에 접종하고 동일한 조건 하에 하룻밤 성장시킨다.
플라스미드(850㎍까지)를 단리시키기 위하여, 제조사의 지시사항에 따라서 인비트로젠 퓨어링크(상표명) 하이퓨어 맥시프렙 키트(Invitrogen PURELINK™ HiPure Maxiprep Kit)(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)를 사용하여 맥시 프렙(maxi prep)을 수행한다.
시험관내 전사(IVT)를 위한 cDNA를 생성시키기 위해, 플라스미드(이의 예는 도 2에 도시됨)를 우선 XbaI와 같은 제한 효소를 사용하여 선형화시킨다. XbaI를 사용한 전형적인 제한 소화는 다음을 포함할 것이다: 플라스미드 1.0㎍; 10x 완충액 1.0㎕; XbaI 1.5㎕; dH20 10㎕까지; 37℃에서 1시간 동안 배양됨. 실험실 규모(< 5㎍)에서 수행할 경우, 반응물을 인비트로젠사의 퓨어링크(상표명) PCR 마이크로 키트(PURELINK™ PCR Micro Kit)(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 세정한다. 보다 큰 규모의 정제는 인비트로젠사의 표준 퓨어링크(상표명) PCR 키트(PURELINK™ PCR Kit)(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)와 같은 큰 부하 용량을 갖는 제품을 사용하여 수행하는 것이 필요할 수 있다. 세정 후, 선형화된 벡터를 나노드롭(NanoDrop)을 사용하여 정량화하고 분석하여 아가로스 겔 전기영동을 사용한 선형화를 확인한다.
변형된 mRNA를 제조하는 본 명세서에 기재된 방법은 긴 분자를 포함한 모든 크기의 분자를 생산하는데 이용될 수 있다. 기재된 방법을 이용해서 변형된 mRNA는 글로코시다제, 알파; 산(GAA)(3.2 kb), 낭성섬유증 막전위 전도도 조절자(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator: CFTR)(4.7 kb), 인자 VII(7.3 kb), 라이소좀 산 리파제(45.4kDa), 글루코세레브로시다제(59.7 kDa) 및 이두로네이트 2-설파타제(76 kDa)를 포함하는 상이한 크기의 분자에 대해서 수행되었다.
비제한적인 예로서, G-CSF는 관심 대상 폴리펩타이드를 대표할 수 있다. 실시예 1 내지 5에 개략적으로 요약된 단계들에 이용된 서열은 표 4에 표시되어 있다. 개시 코돈(ATG)은 표 4의 각 서열에서 밑줄그어져 있는 것임에 유의할 필요가 있다.
Figure pct00151
Figure pct00152
실시예 2: cDNA 생산용의 PCR
cDNA의 제조를 위한 PCR 절차는 카파 바이오시스템스사(Kapa Biosystems)(매사츄세츠주의 워번시에 소재)에 의한 2x 카파 하이파이(상표명) 핫스타트 레디믹스(2x KAPA HIFI™ HotStart ReadyMix)를 사용하여 수행한다. 이 시스템은 2x 카파 레디믹스(2x KAPA ReadyMix) 12.5㎕; 순방향 프라이머(10μM) 0.75㎕; 역방향 프라이머(10μM) 0.75㎕; 주형 cDNA 100ng; 및 25.0㎕로 희석된 dH2O를 포함한다. 반응 조건은 95℃에서 5분 동안, 그리고 98℃에서 20초 동안, 이어서 58℃에서 15초 동안, 이어서 72℃에서 45초, 이어서 72℃에서 5분 동안, 이어서 4℃에서 종결하는 25 사이클이다.
본 발명의 역방향 프라이머는 mRNA 내 폴리-A120을 위하여 폴리-T120을 혼입시킨다. 보다 길거나 보다 짧은 폴리(T) 트랙트(tract)를 갖는 다른 역방향 프라이머를 사용하여 mRNA 중 폴리(A) 테일의 길이를 조절할 수 있다.
반응물을 인비트로젠사의 퓨어링크(상표명) PCR 마이크로 키트(PURELINK™ PCR Micro Kit)(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 세정한다(5㎍까지). 보다 긴 반응은 용량이 보다 큰 생성물을 사용한 세정을 필요로 할 것이다. 세정 후에, cDNA를 나노드롭(NANODROP)™을 사용하여 정량화하고, 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하여 cDNA가 예측된 크기임을 확인한다. 이어서, cDNA를 서열 분석을 위해 제공한 후 시험관내 전사 반응을 진행시킨다.
실시예 3. 시험관내 전사
시험관내 전사 반응은 변형된 뉴클레오타이드 또는 변형된 RNA를 함유하는 mRNA를 생성한다. 도입 뉴클레오타이드 트라이포스페이트(NTP) 믹스는 천연의 및 비-천연의 NTP를 이용해서 사내에서 제조한다.
전형적인 시험관내 전사 반응은 이하를 포함한다:
1. 주형 cDNA 1.0㎍
2. 10x 전사 완충액(400mM 트리스-HCl pH 8.0, 190mM MgCl2, 50mM DTT, 10mM 스퍼미딘) 2.0㎕
3. 통상의 NTP들(각각 25mM) 7.2㎕
4. RNA분해효소(RNase) 저해제 20 U
5. T7 RNA 중합효소 3000 U
6. dH20 20.0㎕까지 및
7. 37℃에서 3시간 내지 5시간 배양.
조질의 IVT 혼합물은 다음날 세정을 위해 4℃에서 하룻밤 보존될 수 있다. 이어서, 1 U의 RNA분해효소-미함유 DNA분해효소를 사용해서 원래의 주형을 소화시킨다. 37℃에서 15분 배양 후, mRNA를 암비온사(Ambion)의 메가클리어(MEGACLEAR)™ 키트(텍사스주의 오스틴시에 소재)를 사용하여 제조사의 지사에 따라서 정제시킨다. 이 키트는 500㎍까지의 RNA를 정제할 수 있다. 세정 후, RNA를 나노드롭(NanoDrop)을 사용하여 정량화하고, 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하여 RNA가 적절한 크기임을, 그리고 RNA의 소화가 일어나지 않았음을 확인한다.
실시예 4. mRNA의 효소적 캐핑
mRNA의 캡핑은 다음과 같이 수행하며, 여기서, 혼합물은 다음을 포함한다: IVT RNA 60㎍ 내지 180㎍ 및 dH2O 72㎕까지. 이 혼합물을 65℃에서 5분 동안 배양하여 RNA를 변성시킨 후, 얼음 상으로 즉시 이동시킨다.
이어서, 프로토콜은, 10x 캐핑 완충액(0.5M 트리스-HCl(pH 8.0), 60mM KCl, 12.5mM MgCl2)(10.0㎕); 20mM GTP(5.0㎕); 20mM S-아데노실 메티오닌(2.5㎕); RNA분해효소 저해제(100 U); 2'-O-메틸트랜스페라제(400U); 백시니아 캡핑 효소(구아닐릴 트랜스퍼라제)(40 U); dH2O(28㎕)의 혼합; 및 60㎍ RNA에 대해서 37℃에서 30분 동안 또한 180㎍ RNA에 대해서 2시간까지의 배양을 포함한다.
이어서, mRNA를 암비온사(Ambion)의 메가클리어(MEGACLEAR)™ 키트(텍사스주의 오스틴시에 소재)를 사용하여 제조사의 지사에 따라서 정제시킨다. 세정 후, RNA를 나노드롭(NANODROP)™(써모피셔사(ThermoFisher), 매사츄세츠주의 왈탐시에 소재)을 사용하여 정제하고, 아가로스 겔 전기영동으로 분석하여 RNA가 적절한 크기임을, 그리고 RNA의 소화가 일어나지 않았음을 확인한다. 또한, RNA 산물은 역-전사-PCR을 가동시켜서 서열분석함으로써 서열분석용 cDNA를 생성할 수 있다.
실시예 5. 폴리A 테일링 반응
cDNA 중 폴리-T 없이, 폴리-A 테일링 반응은 최종 산물의 세정 전에 수행되어야 한다. 이것은 캡핑된 IVT RNA(100㎕); RNA분해효소 저해제(20 U); 10x 테일링 완충액(0.5M 트리스-HCl(pH 8.0), 2.5M NaCl, 100mM MgCl2)(12.0㎕); 20mM ATP(6.0㎕); 폴리-A 중합효소(20 U); dH2O 123.5㎕까지의 혼합 및 37℃에서 30분 동안의 배양에 의해 수행된다. 폴리-A 테일이 이미 전사물 내에 있다면, 테일링 반응은 생략하고 암비온사(Ambion)의 메가클리어(MEGACLEAR)™ 키트(텍사스주의 오스틴시에 소재)를 사용하여 직접 세정한다(500㎍까지). 폴리-A 중합효소는 바람직하게는 효모 내에서 발현된 재조합 효소이다.
본 명세서에서 수행되고 기재된 연구를 위하여, 폴리-A 테일은 IVT 주형에 암호화되어 길이가 160인 뉴클레오타이드를 포함한다. 그러나, 폴리A 테일링 반응의 진행성 또는 통합성은 항상 정확하게 160개의 뉴클레오타이드를 생성할 수는 없다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 대략 160개, 예컨대, 약 150 내지 165, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164 또는 165개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일이 본 발명의 범위 내이다.
실시예 6. 천연의 5' 캡 및 5' 캡 유사체
변형된 RNA의 5' 캡핑은, 이하의 화학적 RNA 캡 유사체를 사용하는 시험관내-전사 반응 동안 동시에 완료시켜 제조사의 프로토콜에 따라서 5'-구아노신 캡 구조를 생성시킬 수 있다: 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G[ARCA 캡];G(5')ppp(5')A; G(5')ppp(5')G; m7G(5')ppp(5')A; m7G(5')ppp(5')G(뉴 잉글랜드 바이오랩스사(New England BioLabs), 매사츄세츠주의 입스위치시에 소재). 변형된 RNA의 5' 캡핑은, 백시니아 바이러스 캡핑 효소를 이용해서 전사후에 완료시켜 "캡 0" 구조: m7G(5')ppp(5')G(뉴 잉글랜드 바이오랩스사, 매사츄세츠주의 입스위치시에 소재)를 생성시킬 수 있다. 캡 1 구조는 백시니아 바이러스 캡핑 효소 및 2'-O 메틸-트랜스퍼라제 둘 다를 사용하여 생성시켜, m7G(5')ppp(5')G-2'-O-메틸을 생성시킬 수 있다. 캡 2 구조는 캡 1 구조로부터 2'-O 메틸-트랜스페라제를 이용해서 5'-뒤에서 세번째(antepenultimate) 뉴클레오타이드의 2'-O-메틸화를 수행함으로써 생성될 수 있다. 캡 3 구조는 캡 2 구조로부터 2'-O 메틸-트랜스페라제를 이용해서 5'-뒤에서 네번째(preantepenultimate) 뉴클레오타이드의 2'-O-메틸화를 수행함으로써 생성될 수 있다. 효소는 바람직하게는 재조합체 공급원으로부터 유도된다.
포유류의 세포 내로 형질주입된 경우, 변형된 mRNA는 12 내지 18시간 또는 18시간 이상, 예컨대, 24, 36, 48, 60, 72 혹은 72시간 이상의 안정성을 갖는다.
실시예 7. 캐핑
A. 단백질 발현 검정
ARCA(3' O-Me-m7G(5')ppp(5')G) 캡 유사체 또는 캡1 구조를 포함하는 인간 G-CSF를 암호화하는 합성 mRNA(서열번호 5로 표시된 cDNA; 각 사이토신에서 5-메틸사이토신으로 완전 변형된 mRNA 서열 및 서열로 표시되지 않은 대략 160개 길이의 뉴클레오다이트의 폴리A 테일에 의한 서열번호 6으로 표시된 각 유리딘 부위에서의 유사유리딘 대체)는 동등한 농도에서 인간 원시 각질세포 내로 형질주입될 수 있다. 6, 12, 24 및 36시간 형질주입 후, 배양 배지 내로 분비된 G-CSF의 양은 ELISA에 의해 검정될 수 있다. 배지 내로 더 높은 수준의 G-CSF를 분비하는 합성 mRNA는 더 고도의 번역-컴피턴트 캡 구조를 갖는 합성 mRNA에 상응할 것이다.
B. 순도 분석 합성
ARCA 캡 유사체 또는 캡1 구조 조질 합성 산물을 포함하는 인간 G-CSF를 암호화하는 합성 mRNA(서열번호 5로 표시된 cDNA; 각 사이토신에서 5-메틸사이토신으로 완전 변형된 mRNA 서열 및 서열로 표시되지 않은 대략 160개 길이의 뉴클레오다이트의 폴리A 테일에 의한 서열번호 6으로 표시된 각 유리딘 부위에서의 유사유리딘 대체)는 변성 아가로스-요소 겔 전기영동 또는 HPLC 분석을 이용해서 순도에 대해서 비교될 수 있다. 전기영동에 의해 단일의 통합된 밴드를 지니는 합성 mRNA는 다중 밴드 또는 스트리킹 밴드(streaking band)를 지니는 합성 mRNA에 비해서 보다 고순도의 산물에 상당한다. 단일의 HPLC 피크를 지니는 합성 mRNA는 또한 보다 고순도의 산물에 대응할 것이다. 보다 고효율의 캐핑 반응은 더 순수한 mRNA 집단을 제공할 것이다.
C. 사이토카인 분석
ARCA 캡 유사체 또는 캡1 구조를 포함하는 인간 G-CSF를 암호화하는 합성 mRNA(서열번호 5로 표시된 cDNA; 각 사이토신에서 5-메틸사이토신으로 완전 변형된 mRNA 서열 및 서열로 표시되지 않은 대략 160개 길이의 뉴클레오다이트의 폴리A 테일에 의한 서열번호 6으로 표시된 각 유리딘 부위에서의 유사유리딘 대체)는 다수의 농도에서 인간 원시 각질세포 내로 형질주입될 수 있다. 형질주입 후 6, 12, 24 및 36시간째에, 배양 배지 내로 분비된 TNF-알파 및 IFN-베타 등과 같은 염증전 사이토카인의 양이 ELISA에 의해 검정될 수 있다. 배지 내로 보다 높은 수준의 염증전 사이토카인을 분비하는 합성 mRNA는 면역-활성화 캡 구조를 함유하는 합성 mRNA에 상당할 것이다.
D. 캐핑 반응 효율
ARCA 캡 유사체 또는 캡1 구조를 포함하는 인간 G-CSF를 암호화하는 합성 mRNA(서열번호 5로 표시된 cDNA; 각 사이토신에서 5-메틸사이토신으로 완전 변형된 mRNA 서열 및 서열로 표시되지 않은 대략 160개 길이의 뉴클레오다이트의 폴리A 테일에 의한 서열번호 6으로 표시된 각 유리딘 부위에서의 유사유리딘 대체)는 캐핑된 mRNA 뉴클레아제 처리 후에 LC-MS에 의해 캐핑 반응 효율에 대해서 분석될 수 있다. 캡핑된 mRNA의 뉴클레아제 처리는 유리 뉴클레오타이드와 LC-MS에 의해 검출가능한 캡핑된 5'-5-트라이포스페이트 캡 구조의 혼합물을 수득할 것이다. LC-MS 스펙트럼 상에서의 캡핑된 산물의 양은 반응으로부터의 총 mRNA의 퍼센트로서 표현될 수 있고, 캐핑 반응 효율에 상응할 것이다. 보다 높은 캐핑 반응 효율을 가진 캡 구조는 LC-MS에 의한 보다 높은 양의 캡핑된 산물을 지닐 것이다.
실시예 8. 변형된 RNA 또는 RT PCR 산물의 아가로스 겔 전기영동
개개의 변형된 RNA(20㎕ 용적 중 200 내지 400ng) 또는 역전사된 PCR 산물(200 내지 400ng)을 웰 내에 1.2% 아가로스 E-겔(인비트로젠사, 캘리포니아주의 칼스버드시에 소재) 상에 장입하고 제조사의 프로토콜에 따라서 12 내지 15분 동안 가동시킨다.
실시예 9. 리피도이드를 이용한 변형된 mRNA의 제형
변형된 mRNA(mmRNA)는 세포에 대한 첨가 전에 mmRNA를 리피도이드와 설정된 비로 혼합함으로써 시험관내 실험을 위하여 제형화한다. 생체내 제형은 신체 전체에 순환을 용이하게 하기 위하여 추가의 성분의 첨가를 필요로 할 수 있다. 생체내 작업을 위하여 적절한 입자를 형성하기 위한 이들 리피도이드의 능력을 테스트하기 위하여, siRNA-리피도이드 제형에 이용되는 표준 제형과정이 출발 점으로서 이용되었다. 초기 mmRNA-리피도이드 제형은 42% 리피도이드, 48% 콜레스테롤 및 10% PEG로 구성된 입자로 이루어질 수 있고, 이때 비의 추가의 최적화가 가능하다. 입자의 형성 후, mmRNA가 첨가되어 복합체와 일체화된다. 봉입 효율은 표준 염료 배제 분석을 이용해서 결정한다.
실시예 10 내지 14에 대한 재료 및 방법
A. 지질 합성
6가지 지질, DLin-DMA, DLin-K-DMA, DLin-KC2-DMA, 98N12-5, C12-200 및 DLin-MC3-DMA는, 변형된 RNA와 제형화하기 위하여 당업계에 개략적으로 알려진 방법에 의해 합성되었다. DLin-DMA 및 전구체는 문헌[Heyes et. al, J. Control Release, 2005, 107, 276-287]에 기재된 바와 같이 합성되었다. DLin-K-DMA 및 DLin-KC2-DMA 및 전구체는 문헌[Semple et. al, Nature Biotechnology, 2010, 28, 172-176]에 기재된 바와 같이 합성되었다. 98N12-5 및 전구체는 문헌[Akinc et. al, Nature Biotechnology, 2008, 26, 561-569]에 기재된 바와 같이 합성되었다.
C12-200 및 전구체는 문헌[Love et. al, PNAS, 2010, 107, 1864-1869]에 기재된 방법에 따라 합성되었다. 2-에폭시도데칸(5.10g, 27.7 m㏖, 8.2 eq)은 아민 200(0.723g, 3.36 m㏖, 1 eq) 및 교반봉을 수용하는 바이알에 첨가하였다. 이 바이알을 밀봉하고 80℃로 가온시켰다. 반응물을 80℃에서 4일 동안 교반하였다. 이어서, 이 혼합물을 순수한 다이클로로메탄(DCM)에서 DCM:MeOH 98:2까지의 구배를 이용하는 실리카겔 크로마토그래피에 의해 정제시켰다. 표적 화합물을 RP-HPLC에 의해 더욱 정제시켜 목적으로 하는 화합물을 얻었다.
DLin-MC3-DMA 및 전구체는 참조로 전문이 본 명세서에 포함되는 제WO 2010054401호에 기재된 절차에 따라서 합성되었다. DMF 10㎖ 중 다이리놀레일 메탄올(1.5g, 2.8 m㏖, 1 eq), N,N-다이메틸아미노뷰티르산(1.5g, 2.8 m㏖, 1eq), DIPEA(0.73㎖, 4.2 m㏖, 1.5 eq) 및 TBTU(1.35g, 4.2 m㏖, 1.5 eq)의 혼합물을 실온에서 10시간 동안 교반하였다. 이어서, 이 반응 혼합물을 에터 중에 희석시키고 물로 세척하였다. 유기 층은 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과 후 감압 하에 농축시켰다. 조질의 생성물은 DCM 내지 DCM:MeOH 98:2의 구배를 이용하는 실리카겔 크로마토그래피에 의해 정제시켰다. 이어서, 표적 화합물에 YMC - 팩 C4 칼럼을 이용해서 수행된 추가의 RP-HPLC 정제를 실시하여 표적 화합물을 얻었다.
B. 변형된 RNA 나노입자의 제형
합성된 지질, 1,2-다이스테아로일-3-포스파티딜콜린(DSPC)(아반티 폴라 리피즈사(Avanti Polar Lipids), 앨라배마주의 엘라베스터시에 소재), 콜레스테롤(시그마-알드리치사(Sigma-Aldrich), 독일 타우프커르첸에 소재) 및 α-[3'-(1,2-다이미리스토일-3-프로판옥시)-카복사마이드-프로필]-ω-메톡시-폴리옥시에틸렌(PEG-c-DOMG)(NOF, 벨기에의 부벨벤에 소재)의 용액은 50mM 에탄올의 농도로 제조하고 -20℃에서 저장(즉, 보관)하였다. 50:10:38.5:1.5(지질:DSPC:콜레스테롤:PEG-c-DOMG)의 몰비를 얻도록 지질을 배합하고, 25mM의 최종 지질 농도로 되도록 에탄올로 희석하였다. 수중 1 내지 2 ㎎/㎖의 농도의 변형된 mRNA의 용액을 pH 3에서 50mM 시트르산나트륨 완충액 중에 희석시켜 스톡 변형된 mRNA 용액을 형성하였다. 지질 및 변형된 mRNA의 제형은 합성된 지질 용액을 변형된 mRNA 용액과 총 지질 대 변형된 mRNA 중량비 10:1, 15:1, 20:1 및 30:1에서 배합함으로써 제조하였다. 지질 에탄올 용액을 수성 변형된 mRNA 용액에 신속하게 주입하여 33% 에탄올을 함유하는 현탁액을 얻었다. 용액을 수동으로(manually: MI) 혹은 주사기 펌프(SP)(하버드 펌프 33(Harvard Pump 33) 듀얼 시린지 펌프(Dual Syringe Pump) 하버드 어패러터스사(Harvard Apparatus), 매사추세츠주의 홀리스튼시에 소재)의 도움으로 주입하였다.
에탄올을 제거하고 완충액 교환을 달성하기 위하여, 제형은 10kD의 분획 분자량(molecular weight cutoff: MWCO)을 가진 슬라이더-A-라이저 카세트(Slide-A-Lyzer cassettes)(써모 피셔 사이언티픽사(Thermo Fisher Scientific Inc). 일리노이주의 록퍼드시에 소재)를 이용해서 1차 산물의 200배의 용적에서 인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.4에 대해서 2회 투석을 행하였다. 첫번째 투석은 실온에서 3시간 동안 수행하였고, 이어서 제형은 4℃에서 하룻밤 투석을 행하였다. 얻어진 나노입자 현탁액은 유리 바이알 내에서 0.2㎛ 멸균 필터(사스테드사(Sarstedt), 독일 뉨프레흐트에 소재)를 통해서 여과하고 크림프 클로저(crimp closure)로 밀봉하였다.
C. 제형의 특성규명
제타사이저 나노 ZS(Zetasizer Nano ZS)(몰번 인스트루먼츠사(Malvern Instruments Ltd), 영국 우스터셔 몰번에 소재)는 입자 크기를 결정함에 있어서는 1X PBS 및 제타 전위를 결정함에 있어서는 15mM PBS 중에서 변형된 mRNA 나노입자의 입자 크기, 다분산 지수(PDI) 및 제타 전위를 결정하는데 이용되었다.
자외-가시광 분광법은 변형된 mRNA 나노입자 제형의 농도를 결정하는데 이용되었다. 1X PBS 중에 희석된 제형 100㎕를 메탄올과 클로로폼의 4:1 (v/v) 혼합물 900㎕에 첨가하였다. 혼합 후, 용액의 흡광도 스펙트럼은 DU 800 분광광도계(벡크만 콜터(Beckman Coulter), 벡크만 콜터사(Beckman Coulter, Inc.), 캘리포니아주의 브레아시에 소재) 상에서 230㎚ 내지 330㎚에서 기록되었다. 나노입자 제형 중 변형된 RNA 농도는 제형에 이용된 변형된 RNA의 소광 계수 및, 260㎚ 파장에서의 흡광도와 330㎚ 파장에서의 기준선 값 간의 차에 의거해서 산출하였다.
QUANT-IT™ 리보그린(RIBOGREEN)® RNA 검정(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재한 인비트로젠사)은 나노입자에 의해 변형된 RNA의 봉입을 평가하는데 이용되었다. 샘플을 TE 완충액(10mM 트리스-HCl, 1mM EDTA, pH 7.5) 중 대략 5㎍/㎖의 농도로 희석시켰다. 희석된 샘플 50㎕를 폴리스타이렌 96 웰 플레이트로 옮기고 나서, TE 완충액 50㎕ 혹은 2% 트리톤(Triton) X-100 용액 50㎕를 첨가하였다. 플레이트를 37℃의 온도에서 15분 동안 배양하였다. 리보그린(RIBOGREEN)® 시약은 TE 완충액 중에 1:100으로 희석하고, 이 용액 100㎕를 각 웰에 첨가하였다. 형광 강도는 ~480㎚의 여기 파장 및 ~520㎚의 발광 파장에서 형광 플레이트 판독기(월락 빅터 1420 멀티라벨 카운터(Wallac Victor 1420 Multilablel Counter); 퍼킨 엘머사(Perkin Elmer), 매사추세츠주의 월섬시에 소재)를 이용해서 측정하였다. 시약 블랭크의 형광 값은 샘플의 각각의 형광 값으로부터 감산했으며, 프리 변형된 RNA의 퍼센트는 온전한 샘플(트리톤 X-100 첨가 없음)의 형광 강도를 파손된 샘플(트리톤 X-100의 첨가에 의해 초래됨)의 형광 강도로 나눔으로써 결정하였다.
D. 시험관내 배양
인간 배아 신장 상피(HEK293) 및 간세포 암종 상피(HepG2) 세포(LGC 스탠더즈 게엠베하(LGC standards GmbH), 독일 베젤에 소재)를 96-웰 플레이트(그라이너 바이오-온 게엠베하(Greiner Bio-one GmbH), 독일 프릭켄하우젠에 소재)에 파종하고, HEK293 세포용 플레이트를 콜라겐 유형 1로 사전 코팅하였다. HEK293을 세포 배양 배지 100㎕ 중에 웰당 30,000의 밀도로, 그리고 HepG2를 35,000 세포의 밀도로 파종하였다. HEK293 세포에 대해서는, 배양 배지가 2mM L-글루타민, 1mM 피루브산나트륨 및 1x 비필수 아미노산(바이오크롬 아게(Biochrom AG), 독일 베를린에 소재) 및 1.2 ㎎/㎖ 중탄산나트륨(시그마-알드리치사, 독일 뮌헨에 소재)을 첨가한 10% FCS, DMEM이었고, HepG2에 대해서는, 배양 배지가 2mM L-글루타민, 1mM 피루브산나트륨 및 1x 비필수 아미노산(바이오크롬 아게, 독일 베를린에 소재)을 첨가한 10% FCS, MEM(깁코 라이프 테크놀로지즈사(Gibco Life Technologies), 독일 다름슈타트에 소재)이었다. mCherry mRNA(서열번호 7로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡(5'cap), 캡 1(Cap 1))를 함유하는 제형은 세포 파종 후 직접 4중으로 첨가하고 배양하였다. 시험관내 전사(IVT)에서 이용된 T7 프로모터, 5'비번역 영역(UTR) 및 3' UTR을 지닌 mCherry cDNA는 서열번호 8로 부여된다. mCherry mRNA는 각 유리딘 부위에서의 각 사이토신 및 유사유리딘 대체에서 5meC로 변형되었다.
배양 배지 상청액을 96-웰 프로-바인드 U-바텀 플레이트(Pro-Bind U-bottom plate)(벡톤 딕킨슨 게엠베하(Beckton Dickinson GmbH), 독일 하이델베르크에 소재)로 옮김으로써 세포를 수확하였다. 세포를 ½ 용적 트립신/EDTA(바이오크롬 아게, 독일 베를린에 소재)로 트립신화하고, 각각의 상청액으로 풀링 후, 1 용적 PBS/2%FCS(둘 모두 바이오크롬 아게, 독일 베를린에 소재)/0.5% 폼알데하이드(머크사(Merk), 독일 다름슈타트에 소재)를 첨가하여 고정시켰다. 샘플은 이어서 LSRII 세포분석기(벡톤 딕킨슨 게엠베하, 독일 하이델베르크에 소재) 중 PE-텍사스 레드용의 610/20 필터 및 532㎚ 여기 레이저를 이용한 유세포 분석 측정을 실시하였다. 모든 이벤트의 평균 형광 강도(mean fluorescent intensity: MFI) 및 4개의 독립된 웰의 표준 편차는 분석된 샘플에 대해서 제시된다.
실시예 10. 나노입자 제형의 정제
HEK293 및 HepG2 중 DLin-KC2-DMA 및 98N12-5의 나노입자 제형은, 평균 형광 강도(MFI)가 지질 대 변형된 RNA 비 및/또는 정제(purification)에 의존했는지의 여부를 결정하기 위하여 테스트하였다. DLin-KC2-DMA의 3개의 제형 및 98N12-5의 2개의 제형은 표 5에 기재된 사양으로 주사기 펌프를 이용해서 제조하였다. 정제된 샘플은 세파덱스(SEPHADEX)™ G-25 DNA 그레이드(GE 헬스케어(GE Healthcare), 스웨덴에 소재)에 의해 정제시켰다. 정제(aP) 전후의 각 제형은 24 웰 플레이트에서 웰 당 250ng 변형된 RNA의 농도에서 테스트하였다. 각 제형 및 배경 샘플에 대해 유세포 분석기에 이해 분석한 경우 FL4 채널에 대한 마커에 대해서 양성인 세포의 퍼센트(%FL4-양성)와, 각 제형 및 배경 샘플에 대해서 FL4 채널에 대한 마커의 MFI는 표 6에 표시되어 있다. 정제된 제형은 정제 전에 테스트된 제형의 것보다 약간 높은 MFI를 가졌다.
Figure pct00153
Figure pct00154
실시예 11. 농도 반응 곡선
98N12-5(NPA-005) 및 DLin-KC2-DMA(NPA-003)의 나노입자 제형은 용량의 범위에 걸쳐서 FL4 또는 mCherry(서열번호 7로 표시된 mRNA; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨)의 MFI를 결정하기 위하여 다양한 농도에서 테스트하였다. 테스트된 제형은 표 7에 개략적으로 요약되어 있다. 98N12-5의 나노입자 제형의 최적 농도를 결정하기 위하여, 제형화된 변형된 RNA의 다양한 농도(웰당 100ng, 10ng, 1.0ng, 0.1ng 및 0.01ng)를 HEK293의 24-웰 플레이트에서 테스트하였으며, 각 용량의 FL4 MFI의 결과는 표 8에 표시되어 있다. 마찬가지로, DLin-KC2-DMA의 나노입자 제형의 최적 농도를 결정하기 위하여, 제형화된 변형된 RNA의 다양한 농도(웰당 250ng 100ng, 10ng, 1.0ng, 0.1ng 및 0.01ng)를 HEK293의 24-웰 플레이트에서 테스트하였으며, 각 용량의 FL4 MFI의 결과는 표 9에 표시되어 있다. DLin-KC2-DMA의 나노입자 제형도 또한 제형화된 변형된 RNA의 다양한 농도(웰당 250ng, 100ng 및 30ng)에서 HEK293의 24 웰 플레이트에서 테스트하였고, 각 용량의 FL4 MFI의 결과는 표 10에 표시되어 있다. 98N12-5에 대한 1ng/웰의 용량과 DLin-KC2-DMA에 대한 10ng/웰의 용량은 배경의 FL4 MFI와 유사한 것으로 판명되었다.
이 농도가 배경과 얼마나 근사한지를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 mCherry 발현의 검출을 위한 최적화된 필터 설정치를 가진 유세포 분석기를 이용하였고, 또한 배경 수준에 비해서 증가된 감도를 지니는 결과를 얻을 수 있었다. 25ng/웰, 0.25ng/웰, 0.025ng/웰 및 0.0025 ng/웰의 용량은, mCherry의 MFI를 구하기 위하여 98N12-5(NPA-005) 및 DLin-KC2-DMA(NPA-003)에 대해서 분석하였다. 표 11에 표시된 바와 같이, 0.025 ng/웰의 농도 및 그보다 작은 농도는 약 386.125인 mCherry의 배경 MFI 수준과 유사하다.
Figure pct00155
Figure pct00156
Figure pct00157
Figure pct00158
Figure pct00159
실시예 12. 수동 주사 및 주사기 펌프 제형
DLin-KC2-DMA 및 98N12-5의 두 제형은 수동 주사(MI) 및 주사기 펌프 주사(SP)에 의해 제조하고, 배경 샘플과 함께 분석하여, 상이한 제형의 mCherry(서열번호 7로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨)의 MFI를 비교하였다. 표 12는, 주사기 펌프 제형이 동일한 지질 및 지질/RNA 비의 수동 주사 제형과 비교해서 더 높은 MFI를 가진 것을 나타낸다.
Figure pct00160
실시예 13. LNP 제형
DLin-DMA, DLin-K-DMA, DLin-KC2-DMA, 98N12-5, C12-200 및 DLin-MC3-DMA의 제형은 HEK293의 플레이트에서 60 ng/웰 혹은 62.5 ng/웰의 농도로 그리고 HepG2 세포의 플레이트에서 62.5 ng/웰의 농도로 24시간 배양하여 각 제형에 대해서 Cherry(서열번호 7로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨)의 MFI를 구하였다. 테스트된 제형은 이하의 표 13에 개략적으로 요약되어 있다. 60 ng/웰에 대해서 표 14에, 그리고 62.5 ng/웰에 대해서 표 15, 표 16, 표 17 및 표 18에 표시된 바와 같이, NPA-003 및 NPA-018의 제형은 최고 mCherry MFI를 지니고, NPA-008, NPA-010 및 NPA-013의 제형은 배경 샘플 mCherry MFI값과 거의 유사하다.
Figure pct00161
Figure pct00162
Figure pct00163
Figure pct00164
Figure pct00165
Figure pct00166
실시예 14. 생체내 제형 연구
설치류(n=5)에 적어도 하나의 변형된 mRNA 및 지질을 함유하는 제형의 단일 용량을 정맥내로, 피하로 혹은 근육내로 투여한다. 설치류에게 투여되는 변형된 mRNA는 G-CSF(서열번호 6으로 표시된 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1), 에리트로포이에틴(EPO)(서열번호 9로 표시된 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1), 인자 IX(서열번호 10으로 표시된 mRNA; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1) 또는 mCherry(서열번호 7로 표시된 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1)로부터 선택된다. 시험관내 전사(IVT)에서 이용된 T7 프로모터, 5'비번역 영역(UTR) 및 3'UTR을 가진 에리트로포이에틴 cDNA는 서열번호 11 및 서열번호 12로 부여되어 있다.
각 제형은 또한 DLin-DMA, DLin-K-DMA, DLin-KC2-DMA, 98N12-5, C12-200, DLin-MC3-DMA, reLNP, 아투플렉스(ATUPLEX)®, DACC 및 DBTC 중 하나로부터 선택된 지질을 함유한다. 설치류에게 제형화된 변형된 mRNA 100㎍, 10㎍ 혹은 1㎍을 주사하고, 각 특정된 시간 간격에서 샘플을 수집한다.
인간 G-CSF 변형된 mRNA를 함유하는 제형이 투여된 설치류로부터의 혈청은 특정 G-CSF ELISA에 의해 측정하고, 인간 인자 IX 변형된 RNA가 투여된 마우스로부터의 혈청은 특정 인자 IX ELISA 또는 색소생산성 검정(chromogenic assay)에 의해 분석한다. mCherry 변형된 mRNA가 투여된 마우스들로부터의 간 및 비장은 면역조직화학(immunohistochemistry: IHC) 또는 형광-활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting: FACS)에 의해 분석한다. 대조군으로서, 하나의 군의 마우스들은 어떠한 제형도 주입하지 않고, 그들의 혈청 및 조직을 수집하여 ELISA, FACS 및/또는 IHC에 의해 분석한다.
A. 시간 과정
설치류에게는, 투여된 제형에 대한 단백질 발현의 시간 과정을 연구하기 위하여 적어도 하나의 변형된 mRNA를 함유하는 제형을 투여한다. 설치류는 단백질 발현 및 전혈구수를 결정하기 위하여 변형된 mRNA 제형의 투여 전 및 후에 특정 시간 간격에서 채혈한다. 조직 내 단백질 발현을 결정하기 위하여 변형된 mRNA 제형이 피하로 그리고 근육내로 투여된 설치류의 투여 부위로부터 샘플을 또한 수집한다.
B. 용량 반응
설치류에게 각 제형의 용량 반응을 결정하기 위하여 적어도 하나의 변형된 mRNA를 함유하는 제형을 투여한다. 설치류는 단백질 발현 및 전혈구수를 결정하기 위하여 변형된 mRNA 제형의 투여 전 및 후에 특정 시간 간격에서 채혈한다. 또한 내부 조직에 대한 변형된 mRNA 제형의 효과를 분석하기 위하여 설치류를 희생시킨다. 조직 내 단백질 발현을 결정하기 위하여 변형된 mRNA 제형이 피하로 그리고 근육내로 투여된 설치류의 투여 부위로부터 샘플을 또한 수집한다.
C. 독성
설치류에게 각 제형의 독성을 연구하기 위하여 적어도 하나의 변형된 mRNA를 함유하는 제형을 투여한다. 설치류는 단백질 발현 및 전혈구수를 결정하기 위하여 변형된 mRNA 제형의 투여 전 및 후에 특정 시간 간격에서 채혈한다. 또한 내부 조직에 대한 변형된 mRNA 제형의 효과를 분석하기 위하여 설치류를 희생시킨다. 조직 내 단백질 발현을 결정하기 위하여 변형된 mRNA 제형이 피하로 그리고 근육내로 투여된 설치류의 투여 부위로부터 샘플을 또한 수집한다.
실시예 15. PLGA 미소구 제형
PLGA 미소구의 제형에 이용된 파라미터의 최적화는 조율가능한 방출 속도 및 높은 봉입 효율을 허용할 수 있는 한편 미소구 내에 봉입된 변형된 RNA의 통합성을 유지시킨다. 입자 크기, 회수율 및 봉입 효율 등(이들로 제한되지 않음)과 같은 파라미터는 최적 제형을 얻기 위하여 최적화될 수 있다.
A. PLGA 미소구의 합성
폴리락틱글라이콜산(PLGA) 미소구는 당업계에 공지된 물/오일/물 이중 유화 방법을 이용해서 PLGA(락텔사(Lactel), Cat# B6010-2, 고유 점도 0.55-0.75, 50:50 LA:GA), 폴리비닐알코올(PVA)(시그마사, Cat#348406-25G, MW13-23k) 다이클로로메탄 및 물을 이용해서 합성하였다. 간단히, 물 (W1) 0.1㎖를 PLGA의 50 내지 200 ㎎/㎖ 범위의 농도에서 다이클로로메탄(DCM)(O1) 중에 용해된 PLGA 2 ㎖에 첨가하였다. W1/O1 에멀전을 속도 4(~15,000 rpm)에서 30초 동안 균질화시켰다(이카 울트라-튜락스 균질화기, T18). 이어서 W1/O1 에멀전을 0.3 내지 1% PVA(W2) 100 내지 200㎖에 첨가하고, 다양한 속도에서 1분 동안 균질화시켰다. 제형을 3시간 동안 교반하고 나서, 원심분리(20 내지 25분, 4,000 rpm, 4℃)에 의해 세척하였다. 상청액을 버리고 PLGA 펠릿을 물 5 내지 10㎖에 재현탁시키고, 이것을 2회 반복하였다. 각 제형에 대한 평균 입자 크기(20 내지 30개의 입자를 나타냄)를 세척 후 현미경에 의해 결정하였다. 표 19는, PLGA 농도의 증가가 보다 큰 크기의 미소구를 초래하는 것을 나타낸다. 200 ㎎/㎖의 PLGA 농도는 14.8㎛의 평균 입자 크기를 부여하였고, 100 ㎎/㎖는 8.7㎛, 50 ㎎/㎖의 PLGA는 4.0㎛의 평균 입자 크기를 부여하였다.
Figure pct00167
표 20은 5(~20,000 rpm)에서 속도 4(~15,000 rpm)로의 균질화 속도의 감소가 입자 크기 14.8㎛에서 29.7㎛로의 입자 크기의 증가를 초래한 것을 나타낸다.
Figure pct00168
표 21은 W2 용적의 증가(즉, 50:1에서 100:1로의 W2:O1의 비의 증가)가 평균 입자 크기를 다소 감소시킨 것을 나타낸다. 0.3에서 1 wt%로의 PVA 농도의 변경은 PLGA 미소구 크기에 대한 영향을 거의 지니지 않았다.
Figure pct00169
B. 변형된 mRNA의 봉입
변형된 G-CSF mRNA(서열번호 6; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨)를 2 ㎎/㎖(W3)의 농도로 물에 용해시켰다. PLGA 미소구 제형의 3개의 배취를 이하의 파라미터로 위에 기재된 바와 같이 제조하였다: 2 ㎎/㎖에서 0.1㎖의 W3, 200 ㎎/㎖에서 1.6㎖의 O1, 1%에서의 160㎖의 W2 그리고 제1 에멀전(W3/O1)에 대해서 4의 속도에서 균질화되고 제2 에멀전(W3/O1/W2)에 대해서 5의 속도로 균질화됨. 원심분리에 의한 세척 후, 제형을 액체 질소에서 동결시키고 나서 3일 동안 동결건조시켰다. 제형의 봉입 효율을 테스트하기 위하여, 동결건조된 재료를 DCM 중에서 6시간 동안 탈제형화시키고 나서 수중에서 하룻밤 추출하였다. 샘플 내 변형된 RNA 농도는 이어서 OD260에 의해 결정하였다. 봉입 효율은 변형된 RNA의 실제량을 취하여 변형된 RNA의 개시량으로 나눔으로써 산출하였다. 테스트된 3개의 배취에 있어서, 59.2, 49.8 및 61.3의 봉입 효율이 있었다.
C. PLGA 미소구 내에 봉입된 변형된 mRNA의 통합성
변형된 인자 IX mRNA(서열번호 10; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨)을 다양한 농도로 물(W4) 속에 용해시켜 제형 중 중량 퍼센트 장입량(㎎ 변형된 RNA/㎎ PLGA * 100)을 변화시키고 봉입 효율을 구하였다. 표 22의 파라미터를 이용해서 제1에멀전(W4/O1)에 대해서 4의 균질화 속도 및 제2에멀전(W4/O1/W2)에 대해서 5의 균질화 속도로 PLGA 미소구 제형의 4종의 상이한 배취를 제조하였다.
Figure pct00170
동결건조 후, PLGA 미소구를 변형된 RNA ~ 10㎍에 대응하도록 2㎖ 에펜도르프 튜브 중에서 칭량하였다. 동결건조는 PLGA 미소구의 전체적인 구조를 파괴시키지 않은 것으로 확인되었다. PLGA 미소구에 대한 중량 퍼센트 장입량(wt%)을 증가시키기 위하여, 증가량의 변형된 RNA를 샘플에 첨가하였다. PLGA 미소구를 각 튜브에 DCM 1.0㎖ 첨가하고 샘플을 6시간 동안 진탕함으로써 탈제형화시켰다. 변형된 RNA 추출을 위하여, 물 0.5㎖를 각 샘플에 첨가하고, 샘플을 하룻밤 진탕시키고 나서 샘플 중 변형된 RNA의 농도를 OD260에 의해 구하였다. 추출 공정의 회수를 결정하기 위하여, 비제형화된 인자 IX 변형된 RNA(서열번호 10; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨)(탈제형화 대조군)는 DCM 내로 스파이킹하고 탈제형 공정을 실시한다. 표 23은 샘플에 대한 장입 및 봉입 효율을 나타낸다. 모든 봉입 효율 샘플은 탈제형화 대조군에 대해서 정규화되었다.
Figure pct00171
D. PLGA 미소구 내에 봉입된 변형된 mRNA의 방출 연구
인자 IX 변형된 RNA(서열번호 10)로 제형화된 PLGA 미소구를 위에 기재된 바와 같이 탈제형화시키고, 추출된 변형된 RNA의 통합성을 자동화 전기영동(Bio-Rad Experion)에 의해 결정하였다. 추출된 변형된 mRNA는 봉입된 변형된 mRNA의 통합성을 테스트하기 위하여 비제형화된 변형된 mRNA 및 탈제형화 대조군과 비교하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, modRNA의 대부분은 배취 ID A, B, C 및 D에 대해서, 탈제형화된 대조군(탈제형화 대조군) 및 비제형화된 대조군 (비제형화 대조군)에 대해서 온전하였다.
E. PLGA 미소구 내에 봉입된 변형된 mRNA의 단백질 발현
인자 IX 변형된 RNA(서열번호 10; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨)로 제형화된 PLGA 미소구를 전술한 바와 같이 탈제형화시키고, 추출된 변형된 RNA의 단백질 발현은 시험관내 형질주입 검정에 의해 결정하였다. HEK293 세포에 세 벌로 RNAiMAX(인비트로젠)로 복합체화된 인자 IX 변형된 RNA 250ng을 형질주입시켰다.
인자 IX 변형된 RNA를 뉴클레아제-물함유 물로 25 ng/㎕의 농도로 희석시키고, RNAiMAX를 혈청-무함유 EMEM으로 13.3x 희석시켰다. 희석된 변형된 RNA 및 희석된 RNAiMAX의 동일한 용적을 함께 혼합하고, 실온에서 20 내지 30분 동안 정치시켰다. 이어서, 인자 IX 변형된 RNA 250ng을 함유하는 형질주입 믹스 20㎕를 30,000개의 세포를 함유하는 세포 현탁액 80㎕에 첨가하였다. 세포 배양 상청액을 수확하기 전에 세포를 이어서 가습 37℃/5% CO2 세포 배양 인큐베이터에서 16시간 동안 배양하였다. 세포 상청액 중 인자 IX 단백질 발현을 인자 IX에 특이적인 ELISA 키트(몰리큘러 이노베이션즈사(Molecular Innovations), Cat # HFIXKT-TOT)에 의해 분석하고, 단백질 발현은 표 24에 표시되어 있다. 테스트된 모든 PLGA 미소구 배취에 있어서, 인자 IX 변형된 RNA는 활성인 채로 있었고, PLGA 미소구 내 제형화 및 후속의 탈제형화 후에 인자 IX 단백질을 발현하였다.
Figure pct00172
F. PLGA 미소구 내에 봉입된 변형된 mRNA의 방출 연구
인자 IX 변형된 RNA(서열번호 10; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전히 변형됨)로 제형화된 PLGA 미소구를 물에 24 ㎎/㎖의 PLGA 미소구 농도로 재현탁시켰다. 재현탁액 후, PLGA 미소구 현탁액 150㎕를 에펜도르프 튜브에 분배하였다. 샘플은 이 연구 동안 37℃에서 배양 및 진탕시켰다. 세 벌의 샘플을 0.2, 1, 2, 8, 14 및 21일에 풀링하였다. PLGA 미소구로부터 방출된 변형된 RNA의 양을 구하기 위하여, 샘플을 원심분리하고, 상청액을 제거하여, 상청액 중의 변형된 RNA 농도는 OD 260에 의해 구하였다. 표 25에 표시된 방출 퍼센트는, 각 샘플 내 변형된 RNA의 총량에 의거해서 산출되었다. 31일 후에, 인자 IX 변형된 RNA의 96%가 PLGA 미소구 제형으로부터 방출되었다.
Figure pct00173
G. PLGA 미소구의 입자 크기 재현성
인자 IX 변형된 RNA(서열번호 10 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨) PLGA 미소구의 3개의 배취를 표 22에 표시된 배취 D에 대해서 기재된 동일한 조건을 이용해서 제조하였다(0.4㎖의 W4(4 ㎎/㎖), 2.0㎖의 O1(200 ㎎/㎖), 200㎖의 W2(1%), 그리고 W4/O1/W2 에멀전에 대해서 5의 속도로 균질화됨). PLGA 미소구 현탁액의 균질성을 향상시키기 위하여, 원심분리 전에 여과를 편입시켰다. 3시간 교반 후 원심분리 전에, 모든 제형화된 재료를 100㎛ 나일론 메쉬 스트레이너(시펴브랜드 셀 스트레이너(Fisherbrand Cell Strainer), Cat # 22-363-549)를 통과시켜 보다 큰 응집물을 제거하였다. 세척과 물을 이용한 재현탁 후, 100 내지 200㎕의 PLGA 미소구 샘플을 이용해서 레이저 회절에 의해 제형의 입자 크기를 측정하였다(몰번 마스터사이저(Malvern Mastersizer)2000). 샘플의 입자 크기는 표 26에 표시되어 있다.
Figure pct00174
여과를 이용한 3개의 PLGA 미소구 배취의 결과는 여과 없이 동일한 조건 하에서 만들어진 PLGA 미소구 배취와 비교되었다. 세척 전의 여과 단계의 내포는 평균 입자 크기를 저감시켰고, 3개의 PLGA 미소구 배취 간의 일정한 입자 크기 분포를 입증하였다.
H. 인자 IX PLGA 미소구의 혈청 안정성
인자 IX mRNA 완충액(TE) 혹은 90% 혈청(Se) 중 인자 IX mRNA(서열번호 10 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨) 또는 완충액, 90% 혈청 혹은 1% 혈청 중 PLGA 내 인자 IX mRNA를 완충액, 90% 혈청 또는 1% 혈청 중에서 총 용적 70㎕ 중 50 ng/㎕의 mRNA 농도로 인큐베이팅하였다. 샘플은 0, 30, 60 또는 120분에 제거하였다. RNA분해효소는 25㎕의 4x 단백질분해효소 K 완충액(0.4㎖의 1M 트리스-HCl pH 7.5, 0.1㎖의 0.5M EDTA, 0.12㎖의 5M NaCl 및 0.4㎖의 10% SDS) 및 8㎕의 단백질분해효소 K를 20 ㎎/㎖에서 첨가함으로써 55℃에서 20분 동안 단백질분해효소 K 소화에 의해 불활성화되었다. 인자 IX mRNA는, 바이오분석기로 분석되기 전에, 석출되거나(250㎕의 95% 에탄올을 1시간 동안 첨가하고, 13 k rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상청액을 제거하고, 200㎕의 70% 에탄올을 펠릿에 첨가하고, 13 k rpm에서 재차 5분 동안 원심분리하여 상청액을 제거하고 펠릿을 70㎕의 물에 재현탁시킴) 또는 PLGA 미소구로부터 추출되었다(13k rpm에서 5분 원심분리하여 상청액을 제거하고, 펠릿을 1㎖의 물로 세척하고, 13k rpm에서 5분 원심분리하여 상청액을 제거하고, 또한 펠릿에 280㎕의 다이클로로메탄을 첨가하고 15분 동안 진탕하고, 70㎕의 물을 첨가하고 나서 2시간 동안 진탕하여 수상을 제거함). PLGA 미소구는 2시간에 걸쳐서 90% 및 1% 혈청에서의 분해로부터 인자 IX 변형된 mRNA를 보호한다. 인자 IX 변형된 mRNA는 초기 시점에서 90% 혈청에서 완전히 분해된다.
실시예 16. 지질 나노입자 생체내 연구
G-CSF(시험관내 전사에서 이용되는 T7 프로모터, 5'비번역 영역(UTR) 및 3'UTR을 지닌 cDNA는 서열번호 5로 부여됨. 서열번호 6으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 변형됨) 및 인자 IX(시험관내 전사에서 이용되는 T7 프로모터, 5' UTR 및 3'UTR을 지니는 cDNA는 서열번호 13으로 부여됨. 서열번호 10으로 표시되는 mRNA; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨) 변형된 mRNA는 주사기 펌프 방법을 이용해서 지질 나노입자(LNP)로서 제형화하였다. LNP는 50:10:38.5:1.5(DLin-KC2-DMA: DSPC: 콜레스테롤: PEG-c-DOMG)의 최종 지질 몰비를 갖도록 총 지질 대 변형된 mRNA의 20:1 중량비로 제형화하였다. 표 27에 열거된 제형은, 입자 크기, 제타 전위 및 봉입에 의해 특성규명된다.
Figure pct00175
LNP 제형을 100, 10 또는 1㎍의 변형된 mRNA 용량에서 마우스(n=5)에게 정맥내로 투여하였다. 투약 후 8시간째에 마우스를 희생시켰다. G-CSF 또는 인자 IX 변형된 mRNA 제형이 투여된 마우스로부터 심장 천자에 의해 혈청을 수집하였다. 단백질 발현은 ELISA에 의해 결정하였다.
G-CSF 또는 인자 IX 용량군에서 유의한 체중 손실(<5%)은 없었다. G-CSF 또는 인자 IX 용량군에 대한 단백질 발현은 표준 곡선으로부터 ELISA에 의해 결정되었다. 혈청 샘플은, (G-CSF에 대해서 약 20-2500x, 인자 IX에 대해서 약 10-250x)로 희석시켜 샘플을 확보하였으며, 이것은 표준 곡선의 선형 범위 내였다. 표 28에 표시된 바와 같이, ELISA에 의해 구한 G-CSF 단백질 발현은, 1, 10 및 100㎍ 용량군에 대해서 각각, 대략 17, 1200 및 4700 ng/㎖였다. 표 29에 표시된 바와 같이, ELISA에 의해 구한 인자 IX 단백질 발현은, 1, 10 및 100㎍ 용량군에 대해서 각각, 대략 36, 380 및 3000 내지 11000 ng/㎖였다.
Figure pct00176
Figure pct00177
표 30에 표시된 바와 같이, 위에 기재된 LNP 제형은, 동일 용량의 변형된 mRNA에 대한 정맥내 (IV)-리포플렉스 제형의 투여 및 식염수 중 동일 용량의 변형된 mRNA의 근육내(IM) 또는 피하(SC) 투여에 비해서 단백질 생산을 약 10,000-100,000배 증가시켰다. 표 30에서 이용되는 바와 같이, 기호 "~"는 약을 의미한다.
Figure pct00178
실시예 17 내지 22에 대한 재료 및 방법
G-CSF(서열번호 6으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨) 및 EPO(서열번호 9로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨) 변형된 mRNA는 주사기 펌프 방법을 이용해서 지질 나노입자(LNP)로서 제형화하였다. LNP는 50:10:38.5:1.5(DLin-KC2-DMA: DSPC: 콜레스테롤: PEG-c-DOMG)의 최종 지질 몰비를 갖도록 총 지질 대 변형된 mRNA의 20:1 중량비로 제형화하였다. 표 31에 열거된 제형은 입자 크기, 제타 전위 및 봉입에 의해 특징규명된다.
Figure pct00179
실시예 17. 변형된 mRNA를 이용한 지질 나노입자 생체내 연구
표 31(상기 참조)에 기재된 LNP 제형은, 0.05 ㎎/㎏의 단일의 변형된 mRNA 용량에서 래트(n=5)에 정맥내로(IV), 근육내로(IM) 또는 피하로(SC) 투여하였다. 대조군의 래트(n=4)는 미처리하였다. 래트들은, ELISA를 이용하여 단백질 발현을 결정하기 위하여, 이들에게 G-CSF 혹은 EPO 변형된 mRNA 제형이 투여된 후에 2시간, 8시간, 24시간, 48시간 및 96시간째에 채혈하였다. EPO 변형된 mRNA가 정맥내로 투여된 래트들은 7일째에 또한 채혈하였다.
표 32에 표시된 바와 같이, 정맥내로 변형된 EPO mRNA가 투여된 래트들에서의 EPO 단백질 발현은 5일까지 검출가능하였다. 변형된 G-CSF mRNA가 정맥내로 투여된 래트들에서의 G-CSF는 7일까지 검출가능하였다. EPO 변형된 mRNA의 피하 및 근육내 투여는 적어도 24시간까지 검출가능하였고, G-CSF 변형된 mRNA는 적어도 8시간까지 검출가능하였다. 표 32에서, "OSC"는 표준 곡선 밖에 있는 값을 지칭하고, "NT"는 테스트되지 않은 것을 의미한다.
Figure pct00180
실시예 18. 시간 과정 생체내 연구
표 31(상기 참조)에 표시된 LNP 제형은, 0.5, 0.05 또는 0.005 ㎎/㎏의 단일의 변형된 mRNA 용량에서 마우스(n=5)에게 정맥내로(IV) 투여하였다. 마우스들은, ELISA를 이용하여 단백질 발현을 결정하기 위하여, 이들에게 G-CSF 혹은 EPO 변형된 mRNA 제형이 투여된 후에 8시간, 24시간, 72시간 및 6일에 채혈하였다.
표 33에 표시된 바와 같이, 변형된 mRNA가 정맥내로 투여된 마우스들에서의 EPO 및 G-CSF 단백질 발현은 0.005 ㎎/㎏ 및 0.05 ㎎/㎏의 변형된 mRNA로 투약된 마우스들에 대해서 72시간까지 검출가능하였고, EPO 변형된 mRNA가 투여된 마우스들에서 대해서는 6일까지 검출가능하였다. 표 33에서, ">"는 보다 큰을 의미하고, "ND"는 검출되지 않은 것을 의미한다.
Figure pct00181
실시예 19. 설치류에서의 LNP 제형 생체내 연구
A. 마우스에서의 LNP 제형
표 31(상기 참조)에 표시된 LNP 제형은, 단일의 변형된 mRNA 용량 0.05 ㎎/㎏ 또는 0.005 ㎎/㎏에서 마우스(n=4)에게 정맥내로(IV) 투여하였다. 또 미처리된 마우스(n=4)의 3개의 대조군이 있었다. 마우스들은, 단백질 발현을 결정하기 위하여, 이들에게 G-CSF 혹은 EPO 변형된 mRNA 제형이 투여된 후에 2시간, 8시간, 24시간, 48시간 및 72시간째에 채혈하였다. G-CSF 및 EPO의 단백질 발현은 ELISA를 이용해서 측정하였다.
표 34에 표시된 바와 같이, 마우스들에서의 EPO 및 G-CSF 단백질 발현은 0.005 ㎎/㎏ 변형된 RNA의 용량을 입수한 마우스들에 대해서는 적어도 48시간까지 검출가능하였고, 0.05 ㎎/㎏ 변형된 RNA의 용량을 입수한 마우스들에 대해서는 72시간까지 검출가능하였다. 표 34에서, "OSC"는 표준 곡선 밖에 있는 값을 지칭하고, "NT"는 테스트되지 않은 것을 의미한다.
Figure pct00182
B. 래트에서의 LNP 제형
표 31(상기 참조)에 표시된 바와 같은 LNP 제형을, 단일의 변형된 mRNA 용량 0.05 ㎎/㎏에서 래트(n=4)에게 정맥내로(IV) 투여한다. 미처리된 래트(n=4)의 대조군도 있다. 래트들은, 단백질 발현을 결정하기 위하여, 이들에게 G-CSF 혹은 EPO 변형된 mRNA 제형이 투여딘 후에 2시간, 8시간, 24시간, 48시간, 72시간, 7일 및 14일에 채혈한다. G-CSF 및 EPO의 단백질 발현은 ELISA를 이용해서 측정하였다.
실시예 20. LNP의 조기 시간 과정 연구
표 31(상기 참조)에 표시된 바와 같은 LNP 제형을, 포유류에게 0.5 ㎎/㎏, 0.05 ㎎/㎏ 또는 0.005 ㎎/㎏의 단일의 변형된 mRNA 용량으로 정맥내(IV), 근육내(IM) 또는 피하(SC)로 투여하였다. 대조준의 포유류는 처치하지 않았다. 포유류들은, ELISA를 이용한 단백질 발현을 결정하기 위하여, 이들에게 변형된 mRNA LNP 제형이 투여된 후에 5분, 10분, 20분, 30분, 45분, 1시간, 1.5시간 및/또는 2시간째에 채혈한다. 포유류들은 또한 과립구 수준 및 적혈구수 등과 같은 전혈구수를 구하기 위하여 채혈한다.
실시예 21. 비-인간 영장류 생체내 연구
표 31(위쪽)에 표시된 LNP 제형은, 비-인간 영장류(NHP)(게잡이 원숭이(cynomolgus monkey))(n=2)에게 필요 시 주사기/아보카트(abbocath) 혹은 버터플라이에 부착될 수 있는 피하 바늘을 이용해서 구강내 정맥내 주사(IV)로서 대략 30초에 걸쳐서 투여하였다. NHP에게는 0.5 ㎖/kg의 용량 용적으로 0.05㎎/㎏ EPO 또는 G-CSF 또는 0.005 ㎎/㎏ EPO의 단일의 변형된 mRNA IV 용량을 투여하였다. NHP는 변형된 mRNA LNP 제형으로 투약 5 내지 6일 전에 채혈하여, 혈청 내 단백질 발현 및 기준선 전혈구 검사를 행하였다. 변형된 mRNA 제형으로 투여 후, NHP는 8, 24, 48 및 72시간에 채혈하여 단백질 발현을 측정하였다. 투여 후 24 및 72시간째에, NHP의 전혈구 측정을 또 행하였다. G-CSF 및 EPO의 단백질 발현은 ELISA를 이용해서 결정하였다. NHP로부터의 소변을 전체 실험의 과정에 걸쳐서 수집하고 임상 안전성을 평가하기 위하여 분석하였다. ELISA를 이용한 단백질 발현을 결정하기 위하여 G-CSF 혹은 EPO 변형된 mRNA 제형을 투여한 후에 NHP로부터 샘플을 수집하였다. 비-인간 영장류의 임상 화학, 혈액학, 소변검사 및 사이토카인이 또한 분석되었다.
표 35에 표시된 바와 같이, 0.05 ㎎/㎏ 투여된 NHP에서의 EPO 단백질 발현은 72시간까지 검출가능하고, EPO 제형을 0.005 ㎎/㎏ 투약한 것은 48시간까지 검출가능하다. 표 35에서, "<"는 부여된 값 미만을 의미한다. G-CSF 단백질 발현은 변형된 mRNA 제형의 투여 후 24시간까지 보였다. 예비적으로, 변형된 mRNA 제형의 투여 후 NHP에서 보인 과립구 및 망상적혈구 수준의 증가가 있었다.
Figure pct00183
실시예 22. G-CSF 및 EPO에 대한 비-인간 영장류 생체내 연구
표 31(위쪽)에 표시된 LNP 제형은, 비-인간 영장류(NHP)(게잡이 원숭이(cynomolgus monkey))(n=2)에 정맥내 주사(IV)로서 투여하였다. NHP에는 0.5 ㎎/㎏, 0.05㎎/㎏ 또는 0.005 ㎎/㎏의 G-CSF 또는 EPO의 단일의 변형된 mRNA IV 용량을 0.5 ㎖/kg의 용량 용적으로 투여하였다. NHP는 혈청 내 단백질 발현 및 기준선 전혈구 검사를 측정하기 위하여 변형된 mRNA LNP 제형을 투약하기 전에 채혈하였다. G-CSF 변형된 mRNA 제형의 투여 후, NHP는 단백질 발현을 결정하기 위하여 8, 24, 48 및 72시간에 채혈하였다. EPO 변형된 mRNA 제형의 투여 후, NHP는 단백질 발현을 결정하기 위하여 8, 24, 48, 72시간 및 7일에 채혈하였다.
G-CSF 또는 EPO 변형된 mRNA 제형으로 투여된 후 NHP로부터 수집된 샘플은 단백질 발현을 결정하기 위하여 ELISA에 의해 분석되었다. 호중구 및 망상 적혈구 수는 또한 변형된 G-CSF 혹은 EPO 제형의 투여 후 24시간, 3일, 7일, 14일 및 18일에 프레-용량을 결정하였다.
표 36에 표시된 바와 같이, G-CSF 단백질 발현은 72시간을 넘어서 검출되지 않았다. 표 36에서, "<39"는 39 pg/㎖의 검출 하한치 미만의 값을 지칭한다.
Figure pct00184
표 37에 표시된 바와 같이, EPO 단백질 발현은 7일을 넘어서는 검출되지 않았다. 표 37에서, "<7.8"이란 7.8 pg/㎖의 검출 하한치 미만을 지칭한다.
Figure pct00185
표 38에 표시된 바와 같이, 프레-용량 수준에 대해서 모든 G-CSF 군에 있어서 호중구의 증가가 있었다.
Figure pct00186
표 39에 표시된 바와 같이, 투약 후 24시간의 망상적혈구 수준에 대해서 투약 후 3일 내지 14/18일의 모든 EPO 군에서 망상적혈구의 증가가 있었다.
Figure pct00187
표 40 내지 표 42에 표시된 바와 같이, EPO 변형된 RNA의 투여는 헤모글로빈(HGB), 헤마토크릿(HCT) 및 적혈구(RBC) 수를 포함하는 기타 적혈구 조혈성 파라미터에 대한 효과를 지녔다.
Figure pct00188
Figure pct00189
Figure pct00190
표 43 및 표 44에 표시된 바와 같이, 변형된 RNA의 투여는 알라닌 아미노기전이효소(ALT) 및 아스파테이트 아미노기전이효소(AST)를 포함하는 혈청 화학 파라미터에 대한 효과를 지녔다.
Figure pct00191
Figure pct00192
표 45에 표시된 바와 같이, 변형된 RNA의 투여는 변형된 mRNA의 투여 후 사이토카인, 인터페론-알파(IFN-알파)의 증가를 유발한다.
Figure pct00193
실시예 23. 비-인간 영장류에서의 근육내 및/또는 피하 투여의 연구
식염수 중 변형된 EPO mRNA(서열번호 9; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨) 또는 G-CSF mRNA(서열번호 6; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨)를 함유하는 제형을 비-인간 영장류(게잡이 원숭이)(NHP)에게 근육내(IM) 또는 피하(SC)에게 투여하였다. 0.05㎎/㎏ 또는 0.005 ㎎/㎏의 단일의 변형된 mRNA 용량은 0.5 ㎖/kg의 용량 용적으로 되었다. 비-인간 영장류는 투약 5 내지 6일 전에 채혈하여 혈청 단백질 농도 및 기준선 전혈구 검사를 행한다. 변형된 mRNA 제형으로 투여 후, NHP는 8시간, 24시간, 48시간, 72시간, 7일 및 14일에 채혈하여 단백질 발현을 측정한다. G-CSF 및 EPO의 단백질 발현은 ELISA를 이용해서 측정한다. 투여 후 24시간, 72시간, 7일 및 14일에 NHP의 전혈구 검사를 또 행한다. NHP로부터의 소변을 전체 실험의 과정에 걸쳐서 수집하고 임상 안전성을 평가하기 위하여 분석한다. 주사 부위 근처의 조직 또한 수집하여 단백질 발현을 결정하기 위하여 분석한다.
실시예 24. 변형된 mRNA 트래픽킹(trafficking)
변형된 mRNA의 국재화 및/또는 트래픽킹을 결정하기 위하여, 연구는 다음과 같이 수행될 수 있다.
siRNA 및 변형된 mRNA의 LNP 제형은 당업계에 공지된 및/또는 본 명세서에 기재된 방법에 따라서 제형화한다. LNP 제형은 G-CSF, EPO, 인자 VII, 및/또는 본 명세서에 기재된 임의의 단백질 등과 같은 단백질을 암호화할 수 있는 적어도 하나의 변형된 mRNA를 포함할 수 있다. 제형은 근육내 혹은 피하 주사를 이용해서 포유류의 근육 내로 국소 투여될 수 있다. 변형된 mRNA의 용량 및 LNP의 크기는 포유류의 신체 내의 트래픽킹에 대한 효과를 결정하기 위하여 및/또는 염증 등(이것으로 제한되지 않음)과 같은 생물학적 반응에 대한 효과를 평가하기 위하여 변할 수 있다. 포유류는 혈청에 존재하는 투여된 변형된 mRNA에 의해 암호화된 단백질의 발현을 결정하기 위하여 및/또는 포유류 내 전혈구수를 결정하기 위하여 상이한 시점에서 채혈될 수 있다.
예를 들어, 간에서 발현되고 혈청 내로 분비되는 인자 VII을 암호화하는 변형된 mRNA는 근육내로 및/또는 피하로 투여될 수 있다. 변형된 mRNA 투여와 동시에 혹은 투여 전에, siRNA가 내인성 인자 VII를 넉아웃시키기 위하여 투여된다. 변형된 mRNA의 근육내 및/또는 피하 주사 투여에 기인하는 인자 VII은 혈중에서 측정한다. 또한, 인자 VII의 수준은 주사 부위 근처의 조직에서 측정한다. 인자 VII이 혈중에 발현되면, 변형된 mRNA의 트래픽킹이 있다. 인자 VII이 혈중이 아니라 조직 내에 발현되면, 인자 VII의 국소 발현만이 있다.
실시예 25. 다중 변형된 mRNA의 제형
변형된 mRNA의 LNP 제형은 당업계에 공지된 및/또는 본 명세서에 기재된 방법에 따라서 제형화한다. LNP 제형은 G-CSF, EPO, 트롬보포이에틴 및/또는 본 명세서에 기재된 또는 당업계에 공지된 임의의 단백질 등과 같은 단백질을 암호화할 수 있는 적어도 하나의 변형된 mRNA를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 변형된 mRNA는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 변형된 mRNA 분자를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 변형된 mRNA를 함유하는 제형은 단일 혹은 다회 투약 요법으로 정맥내로, 근육내로 혹은 피하로 투여될 수 있다. 혈액 및/또는 혈청 등(이들로 제한되는 것은 아님)과 같은 생물학적 샘플은 적어도 하나의 변형된 mRNA 제형의 투여 전 및/또는 후에 상이한 시점에서 수집되고 분석될 수 있다. 상기 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 변형된 mRNA를 함유하는 제형이 포유류에게 투여된 후 50 내지 200 pg/㎖의 생물학적 샘플 내의 단백질의 발현은 생물학적으로 유효한 것으로 간주될 것이다.
실시예 26. 폴리에틸렌 글라이콜 비연구
A. 제형 그리고 PEG LNP의 특성규명
지질 나노입자(LNP)들은 주사기 펌프 방법을 이용해서 제형화되었다. LNP는 20:1 중량비의 총 지질 대 변형된 G-CSF mRNA(서열번호 6; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨)에서 제형화되었다. 제형의 몰비 범위는 표 46에 나타낸다.
Figure pct00194
두 유형의 PEG 지질, 1,2-다이미리스토일-sn-글라이세롤, 메톡시폴리에틸렌 글라이콜(PEG-DMG, NOF Cat # 선브라이트(SUNBRIGHT)® GM-020) 및 1,2-다이스테아로일-sn-글라이세롤, 메톡시폴리에틸렌 글라이콜(PEG-DSG, NOF Cat #선브라이트(SUNBRIGHT)® GS-020)은, 1.5 또는 3.0 ㏖%에서 테스트되었다. LNP의 형성 및 변형된 G-CSF mRNA의 봉입 후, LNP 제형은 입자 크기, 제타 전위 및 봉입 퍼센트로 특성규명되었고, 그 결과는 표 47에 표시되어 있다.
Figure pct00195
B. PEG LNP의 생체내 선별(Screening)
표 40에 기재된 PEG LNP의 제형은 0.5 ㎎/㎏의 용량에서 마우스(n=5)에게 정맥내로 투여하였다. 혈청은 제형의 투여 후 2시간, 8시간, 24시간, 48시간, 72시간 및 8일에 마우스들로부터 수집하였다. 혈청은 G-CSF의 단백질 발현을 결정하기 위하여 ELISA에 의해 분석되었고, 그 발현 수준은 표 48에 표시되어 있다. PEG-DMG을 이용한 LNP 제형은 PEG-DSA를 지닌 LNP 제형보다 실질적으로 더 높은 수준의 단백질 발현을 부여하였다.
Figure pct00196
실시예 27. 양이온성 지질 제형 연구
A. 제형 및 양이온성 지질 나노입자의 특성규명
지질 나노입자(LNP)들은 주사기 펌프 방법을 이용해서 제형화되었다. LNP들은 20:1 중량비의 총 지질 대 변형된 mRNA에서 제형화되었다. 양이온성 지질, DSPC, 콜레스테롤 및 PEG-c-DOMG의 최종 지질 몰비 범위는 표 49에 개략적으로 요약되어 있다.
Figure pct00197
에탄올 중 25mM 지질 용액과 pH 3에서의 50mM 시트레이트 중 변형된 RNA를 혼합하여 자발적 소포 형성을 행하였다. 소포는 에탄올을 제거하기 전에 안정화되었고, 투석에 의한 완충액 교환이 있었다. 이어서 LNP들은 입자 크기, 제타 전위 및 봉입 퍼센트로 특성규명되었다. 표 50은, EPO 변형된 mRNA(서열번호 9 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨) 또는 G-CSF 변형된 mRNA(서열번호 6; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨)를, DLin-MC3-DMA, DLin-DMA 또는 C12-200을 양이온성 지질로서 이용해서 봉입한 LNP들의 특성규명을 기재하고 있다.
Figure pct00198
B. 이온성 LNP 제형의 생체내 선별
표 42에 기재된 양이온성 지질 제형의 제형들을 0.5 ㎎/㎏의 용량에서 마우스(n=5)에게 정맥내로 투여하였다. 혈청을 제형의 투여 후 2시간, 24시간, 72시간 및/또는 7일에 마우스들로부터 수집하였다. 혈청은 EPO 또는 G-CSF의 단백질 발현을 결정하기 위하여 ELISA에 의해 분석되었고, 그 발현 수준은 표 51에 표시되어 있다.
Figure pct00199
양이온성 지질 C12-200(NPA-075-1 및 NPA-076-1)을 가진 LNP 제형을 투여한 마우스들에서 독성이 보였고, 이들은 열등한 모피, 움추러드는 거동 및 10% 이상의 중량 손실 등과 같은 증상을 보였기 때문에 24시간째에 희생시켰다. C12-200는 단기간에 걸쳐서 높은 발현 수준을 지닐 뿐만 아니라 더 독성인 것으로 예상되었다. 양이온성 지질 DLin-DMA(NPA-073-1 및 NPA-074-1)는 테스트된 3가지 양이온성 지질 중 가장 낮은 발현을 지녔다. DLin-MC3-DMA(NPA-071-1 및 NPA-072-1)는 3일까지 양호한 발현을 보였고, EPO 제형에 대해서 7일을 넘어서는 배경 샘플 이상이었다.
실시예 28. 단백질 발현의 선별 방법
A. 전기분무 이온화
대상체에게 투여된 변형된 RNA에 의해 암호화된 단백질들을 함유할 수 있는 생물학적 샘플을 제조하여 1, 2, 3 또는 4개의 질량 분석기를 사용하여 전기분무 이온화(ESI)용 제조업자 프로토콜에 따라서 분석한다. 또한, 생물학적 샘플은 탄뎀 ESI 질량 분광분석 시스템을 사용하여 분석할 수 있다.
단백질 단편, 또는 전체 단백질의 패턴을, 주어진 단백질에 대해 공지된 대조군과 비교하고, 동일성을 비교에 의해 결정한다.
B. 매트릭스-보조된 레이저 탈착/이온화
대상체에게 투여된 변형된 RNA에 의해 암호화된 단백질을 함유할 수 있는 생물학적 샘플을 제조하여 매트릭스-보조된 레이저 탈착/이온화(MALDI)를 위한 제조업자 프로토콜에 따라서 분석한다.
단백질 단편, 또는 전체 단백질의 패턴을, 주어진 단백질에 대해 공지된 대조군과 비교하고, 동일성을 비교에 의해 결정한다.
C. 액체 크로마토그래피-질량 분광법-질량 분광법
변형된 RNA에 의해 암호화된 단백질을 함유할 수 있는 생물학적 샘플을 트립신 효소로 처리하여 이들 내에 함유된 단백질을 소화시킬 수 있다. 얻어진 펩타이드는 액체 크로마토그래피-질량 분광분석-질량 분광분석법(LC/MS/MS)으로 분석한다. 펩타이드를 질량 분광분석계에서 단편화하여 컴퓨터 알고리즘을 통해 단백질 서열 데이터베이스에 매칭될 수 있는 진단 패턴을 수득한다. 1ng 이하의 출발 물질을 주어진 단백질에 대해 달성하기 위하여 소화된 샘플을 희석시킬 수 있다. 단순한 완충액 배경(예컨대, 물 또는 휘발성 염)을 함유하는 생물학적 샘플은 용액 내 소화를 지향하도록 보정가능하며; 보다 복잡한 배경(예컨대, 세제, 비-휘발성 염, 글라이세롤)은 샘플 분석을 촉진시키기 위한 추가의 세정을 필요로 한다.
단백질 단편, 또는 전체 단백질의 패턴을, 주어진 단백질에 대해 공지된 대조군과 비교하고, 동일성을 비교에 의해 결정한다.
실시예 29. LNP 생체내 연구
mCherry mRNA(서열번호 14; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨)는 주사기 펌프 방법을 이용해서 지질 나노입자(LNP)로서 제형화하였다. LNP는 최종 지질 몰비 50:10:38.5:1.5(DLin-KC2-DMA: DSPC: 콜레스테롤: PEG-c-DOMG)를 지니는 20:1 중량비의 총 지질 대 변형된 mRNA에서 제형화하였다. 표 52에 열거된 mCherry 제형은, 입자 크기, 제타 전위 및 봉입에 의해 특성규명되었다.
Figure pct00200
LNP 제형은 100㎍의 변형된 mRNA 용량에서 마우스 (n=5)에게 정맥내로 투여하였다. 투약 후 24시간째에 마우스를 희생시켰다. mCherry 변형된 mRNA가 투여된 마우스들로부터의 간 및 비장은 면역조직화학(IHC), 웨스턴 블롯 또는 형광-활성화 세포 분류(FACS)에 의해 분석되었다.
간의 조직학은 절편을 통해서 균일한 mCherry 발현을 보인 반면, 미처리 동물은 mCherry를 발현하지 않았다. 웨스턴 블롯이 또한 처리된 동물에서의 mCherry 발현을 확인하기 위하여 이용된 반면, mCherry는 미처리된 동물에서 검출되지 않았다. 튜블린이 대조군 마커로서 이용되었고, 처리된 마우스와 미처리 마우스 양쪽 모두에서 검출되었는 바, 이것은 간세포에서의 정상의 단백질 발현이 영향을 받지 않았다는 것을 나타낸다.
FACS 및 IHC는 또한 mCherry 및 미처리 마우스의 비장에 대해 수행되었다. 모든 백혈구 세포 집단은 FACS 분석에 의해 mCherry 발현에 대해 음성이었다. IHC에 의하면, mCherry 처리된 마우스와 미처리 마우스 간에 비장에서 관찰가능한 차이는 없었다.
실시예 30. 주사기 펌프 생체내 연구
mCherry 변형된 mRNA는 주사기 펌프 방법을 이용해서 지질 나노입자(LNP)로서 제형화된다. LNP는 20:1 중량비의 총 지질 대 변형된 mRNA에서 최종 지질 몰비 50:10:38.5:1.5(DLin-KC2-DMA: DSPC: 콜레스테롤: PEG-c-DOMG)로 제형화된다. mCherry 제형은 입자 크기, 제타 전위 및 봉입으로 특성규명된다.
LNP 제형은 10 또는 100㎍의 변형된 mRNA 용량에서 마우스(n=5)에게 정맥내로 투여한다. 마우스들은 투약 후 24시간에 희생시킨다. mCherry 변형된 mRNA가 투여된 마우스들로부터의 간 및 비장은 면역조직화학(IHC), 웨스턴 블롯 및/또는 형광-활성화 세포 분류(FACS)에 의해 분석된다.
실시예 31. 시험관내 및 생체내 발현
A. 리피도이드 제형을 이용한 인간 세포에서의 시험관내 발현
시험관내 형질주입을 위해 이용된 mmRNA 대 리피도이드의 비는 상이한 리피도이드:mmRNA 비에서 경험적으로 테스트된다. siRNA 및 리피도이드를 이용한 이전의 작업은 2.5:1, 5:1, 10:1 및 15:1 리피도이드:siRNA wt:wt 비를 이용하였다. siRNA에 비해서 더 긴 길이의 mmRNA를 부여하면, 보다 낮은 wt:wt 비의 리피도이드 대 mmRNA가 효과적일 수 있다. 부가적으로, 비교를 위하여 mmRNA는 또한 RNAIMAX™(인비트로젠사, 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재) 또는 TRANSIT-mRNA(Mirus Bio, 위스콘신주의 매디슨시에 소재) 양이온성 지질 전달 비히클을 이용해서 제형화하였다. 리피도이드-제형화된 루시페라제(서열번호 15로 표시되는 IVT cDNA 서열; 서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열, 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일, 5'캡, 캡 1, 각 유리딘 부위에서 유사유리딘 대체 및 각각의 사이토신에서 5-메틸사이토신으로 완전 변형됨), 녹색 형광 단백질(GFP)(IVT cDNA 야생형 서열은 서열번호 17로 표시되고; 서열번호 18로 표시되는 mRNA 서열, 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일, 5'캡, 캡 1), G-CSF(서열번호 6으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1), 및 EPO mRNA(서열번호 9로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1)의 목적으로 하는 단백질 산물을 발현시키는 능력은 루시페라제 발현에 대해서는 발광에 의해, GFP 발현에 대해서 유세포 분석에 의해, 그리고 G-CSF 및 에리트로포이에틴(EPO) 분비에 대해서는 ELISA에 의해 확인될 수 있다.
B. 정맥내 주사 후 생체내 발현
제형의 전신 정맥내 투여는, 98N12-5, C12-200 및 MD1을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아닌 각종 상이한 리피도이드를 이용해서 행해진다.
mmRNA를 함유하는 리피도이드 제형은 동물 내로 정맥내 주사한다. 변형된 mRNA(mmRNA)-암호화된 단백질의 발현은 동물로부터 수집된 간 및 비장 등(이들로 제한되지 않음)과 같은 기타 장치 샘플 및/또는 혈액에서 평가된다. 단일 용량 정맥내 연구를 수행하는 것은 또한 목적으로 하는 산물의 크기, 용량, 반응도 및 지속성의 평가를 허용할 것이다.
일 실시형태에 있어서, 98N12-5, C12-200, MD1 및 기타 리피도이드의 리피ㅤ도이드계 제형은, 루시페라제, 녹색 형광 단백질(GFP), mCherry 형광 단백질, 분비된 알칼리성 포스파타제(sAP), 인간 G-CSF, 인간 인자 IX 또는 인간 에리트로포이에틴(EPO) mmRNA를 동물에 전달하는데 이용된다. 앞서 기술된 바와 같이 지질로 mmRNA를 제형화한 후, 동물들을 식염수 제형, 또는 루시페라제, GFP, mCherry, sAP, 인간 G-CSF, 인간 인자 IX 및 인간 EPO로부터 선택된 상이한 mmRNA들 중 하나를 함유하는 리피도이드-제형을 입수하기 위한 군들로 나눈다. 동물에게 주사하기 전에, mmRNA-함유 리피도이드 제형은 PBS 중에 희석시킨다. 동물에게는 이어서 10 ㎎/㎏의 용량에서부터 1 ng/kg과 같이 낮은 용량까지의 범위(바람직한 범위는 10 ㎎/㎏ 내지 100 ng/kg임)의 제형화된 mmRNA의 단일 용량을 투여하며, 여기서 mmRNA의 용량은 0.2㎖의 최대 제형을 입수하는 20그램의 마우스 등과 같은 동물 체중에 의존한다(투약은 kg 체중 당 mmRNA의 수에 의거한다). mmRNA-리피도이드 제형의 투여 후, 혈청, 조직 및/또는 조직 용해물이 얻어지고, mmRNA-암호화 산물의 수준은 단일 및/또는 시간 간격의 범위에서 결정된다. 목적으로 하는 단백질 산물을 발현하는 리피도이드-제형화된 루시페라제, GFP, mCherry, sAP, G-CSF, 인자 IX 및 EPO mmRNA의 능력은 루시페라제의 발현에 대해서는 발광에 의해, GFP의 발현 및 mCherry 발현에 대해서는 유세포분석에 의해, sAP에 대해서는 효소 활성에 의해, 또는 G-CSF, 인자 IX 및/또는 EPO의 분비에 대해서는 ELISA에 의해 확인하였다.
다회-용량 용법에 대한 추가의 연구는 또한 mmRNA의 최대 발현을 결정하고, mmRNA-기동 발현의 포화도를 평가하기 위하여(서열과 병행해서 혹은 서열 내에서 대조군 및 활성 mmRNA 제형을 부여함으로써), 그리고 반복 약물 투여의 실현가능성을 결정하기 위하여(수주 혹은 수개월 개별적인 용량으로 mmRNA를 부여하고 면역원성 등과 같은 인자에 의해 영향받는지의 여부를 결정함으로써) 수행된다. G-CSF 및 EPO 등과 같은 단백질의 생리학적 기능의 평가는 또한 테스트된 동물로부터의 샘플을 분석하고 각각 과립구 및 적혈구수의 증가를 검출하는 것을 통해 결정된다. 동물에서 인자 IX 등과 같은 발현된 단백질 산물의 활성은 또한 인자 IX 효소활성의 분석(예컨대, 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간 검정) 및 응고 시간의 효과를 통해 평가될 수 있다.
C. 근육내 및/또는 피하 주사 후의 시험관내 발현
주사의 근육내 경로 혹은 피하 경로를 통해서, mRNA를 비롯한 올리고뉴클레오타이드를 전달하는 리피도이드 제형의 이용은 이전에 보고되지 않았으므로 평가될 필요가 있다. mmRNA의 근육내 및/또는 피하 주사는, mmRNA-함유 리피도이드 제형이 목적으로 하는 부분의 국제화된 발현과 전신 발현의 양쪽 모두를 생성할 수 있는지의 여부를 결정하기 위하여 평가된다.
루시페라제, 녹색 형광 단백질(GFP), mCherry 형광 단백질, 분비된 알칼리성 포스파타제(sAP), 인간 G-CSF, 인간 인자 IX 또는 인간 에리트로포이에틴(EPO) mmRNA로부터 선택된 98N12-5, C12-200 및 MD1 함유 mmRNA의 리피도이드 제형은 동물에 근육내로 및/또는 피하로 주사한다. mmRNA-암호화된 단백질의 발현은 근육 혹은 피하 조직 내로 그리고 혈액과 간 및 비장 등과 같은 기타 장기에 전신으로 이들 양쪽 모두에 대해 평가된다. 단일 용량 연구는 목적으로 하는 산물의 크기, 용량 반응도 및 지속성의 평가를 허용할 것이다.
동물은 식염수 제형 혹은 변형된 mRNA를 함유하는 제형을 입수하는 군들로 나뉜다. 주사 전에 mmRNA-함유 리피도이드 제형은 PBS 중에 희석시킨다. 동물에게는 50 ㎎/㎏에서부터 1 ng/kg과 같이 낮은 용량까지의 범위(바람직한 범위는 10 ㎎/㎏ 내지 100 ng/kg임)의 제형화된 mmRNA의 단일 근육내 용량을 투여한다. 마우스에 대해서 근육내 투여를 위한 최대 용량은, 마우스의 뒷다리 내로의 근육내 주사에 대해서 대략 1㎎ mmRNA이거나, 0.02ng mmRNA로 낮다. 피하 투여를 위하여, 동물들에게는 400 ㎎/㎏에서부터 1 ng/kg과 같이 낮은 용량까지의 범위(바람직한 범위는 80 ㎎/㎏ 내지 100 ng/kg임)의 제형화된 mmRNA의 단일 근육내 용량을 투여한다. 마우스에 대해서 피하 투여를 위한 최대 용량은, 대략 8㎎ mmRNA이거나, 0.02ng mmRNA로 낮다.
20그램 마우스에 대해서, 단일 근육내 주사의 용적은 최대 0.025㎖이고, 단일 피하 주사는 최대 0.2㎖이다. 투여된 mmRNA의 최적 용량은 동물의 체중으로부터 산출한다. mmRNA-리피도이드의 투여 후의 각종 시점에서, 혈청, 조직 및 조직 용해물이 얻어지고, mmRNA-암호화된 산물의 수준이 결정된다. 목적으로 하는 단백질 산물을 발현하는 리피도이드-제형화된 루시페라제, 녹색 형광 단백질(GFP), mCherry 형광 단백질, 분비된 알칼리성 포스파타제(sAP), 인간 G-CSF, 인간 인자 IX 또는 인간 에리트로포이에틴(EPO) mmRNA의 능력은, 루시페라제 발현에 대해서는 발광에 의해, GFP 및 mCherry 발현에 대해서는 유세포분석에 의해, sAP에 대해서는 효소 활성에 의해, 그리고 G-CSF, 인자 IX 및 에리트로포이에틴(EPO) 분비에 대해서는 ELISA에 의해 확인한다.
다회 용량 요법에 대한 추가의 연구는 또한 mmRNA를 이용한 최대 발현을 결정하고, mmRNA-기동 발현의 포화도를 평가하기 위하여(서열과 병행해서 혹은 서열 내에서 대조군 및 활성 mmRNA 제형을 부여함으로써), 그리고 반복 약물 투여의 실현가능성을 결정하기 위하여(수주 혹은 수개월 개별적인 용량으로 mmRNA를 부여하고 면역원성 등과 같은 인자에 의해 영향받는지의 여부를 결정함으로써) 수행된다. 하나의 시점에서의 다수의 피하 혹은 근육내 주사 부위를 이용한 연구는, 또한 mmRNA 약물 노출을 더 증가시키고 단백질 생산을 향상시키기 위하여 이용된다. GFP, mCherry, sAP, 인간 G-CSF, 인간 인자 IX, 및 인간 EPO 등과 같은 단백질의 생리학적 기능의 평가는, 테스트된 동물로부터 샘플을 분석하고 과립구 및/또는 적혈구수의 변화를 검출하는 것을 통해서 결정된다. 동물에서 인자 IX 등과 같은 발현된 단백질 산물의 활성은 또한 인자 IX 효소활성의 분석(예컨대, 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간 검정) 및 응고 시간의 효과를 통해 평가될 수 있다.
실시예 32: 리포플렉스를 이용한 생체내 전달
A. 인간 EPO 변형된 RNA 리포플렉스
100㎍의 변형된 인간 에리트로포이에틴(EPO) mRNA(서열번호 9로 표시된 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1)(EPO; 완전 변형된 5-메틸사이토신; N1-메틸유사유리딘)를 함유하는 제형은, 4마리의 C57/BL6 마우스에게 근육내로 50 내지 70㎕ 전달된 30 용적%의 RNAIMAX™(리포플렉스-h-Epo-46; 제2세대 혹은 Gen2)로 리포플렉스화시켰다. 다른 군은 30 용적%의 RNAiMAX™으로 리포플렉스화된 100㎍의 변형된 루시페라제 mRNA를 함유하는 대조군으로서 역할하는 리포플렉스화되고 변형된 루시페라제 mRNA(리포플렉스-luc)(서열번호 15로 표시되는 IVT cDNA 서열; 서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열, 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일, 5'캡, 캡 1, 각 유리딘 부위에서 유사유리딘 대체 및 각 사이토신에서 5-메틸사이토신으로 완전 변형됨)의 주사를 입수한 마우스 또는 65㎕의 용량 용적에서 음성 대조군으로서 제형 완충액의 주사를 받은 마우스로 구성하였다. 근육내 주사 후 13시간 째에, 혈청을 각 마우스로부터 수집하여 인간 EPO ELISA에 의한 마우스 혈청 내 인간 EPO 단백질의 양을 측정하고, 그 결과를 표 53에 표시하고 있다.
Figure pct00201
B. 인간 G-CSF 변형된 RNA 리포플렉스
변형된 인간 G-CSF mRNA(서열번호 6으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1)의 두 버전(5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형된 G-CSF(G-CSF) 또는 5-메틸사이토신 및 N1-메틸-유사유리딘으로 완전 변형된 C-CSF(G-CSF-N1)) 중 하나를 100㎍ 함유하는 제형을 RNAIMAX™의 30 용적%로 리포플렉스화시키고, 150㎕로 근육내로(I.M), 150㎕로 피하로(S.C) 그리고 225㎕로 정맥내로(I.V) C57/BL6 마우스들에게 전달하였다.
3개의 대조군에게는 100㎍의 변형된 루시페라제 mRNA(서열번호 15로 표시되는 IVT cDNA 서열; 서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열, 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일, 5'캡, 캡 1, 각 유리딘 부위에서 유사유리딘 대체 및 각각의 사이토신에서 5-메틸사이토신으로 완전 변형됨)를 근육내로(Luc-unsp I.M.) 또는 150㎍의 변형된 루시페라제 mRNA를 정맥내로(Luc-unsp I.V.) 또는 150㎕의 제형 완충액을 근육내로(완충액 I.M.) 투여하였다. 제형의 투여 후 6시간째에, 각 마우스로부터 혈청을 수집하여, 인간 G-CSF ELISA에 의해 마우스 혈청 속에서 인간 G-CSF 단백질의 양을 측정하고, 그 결과를 표 54에 나타낸다.
이들 결과는, 5-메틸사이토신/유사유리딘 및 5-메틸사이토신/N1-메틸유사유리딘 변형된 인간 G-CSF mRNA가 양쪽 모두 리포플렉스 제형으로 I.V. 혹은 I.M. 투여 경로로 전달될 경우 혈청 내에서 특이적 인간 G-CSF 단백질 발현을 초래할 수 있는 것을 입증한다.
Figure pct00202
C. 인간 G-CSF 변형된 RNA 리포플렉스 비교
5-메틸사이토신(5mc) 및 유사유리딘(ψ) 변형을 지닌 30 용적%의 RNAIMAX™으로 리포플렉스화된 변형된 인간 G-CSF mRNA(G-CSF-Gen1-리포플렉스), 식염수 중 5mc 및 ψ 변형을 지니는 변형된 인간 G-CSF mRNA(G-CSF-Gen1-식염수), 30 용적%의 RNAIMAX™으로 리포플렉스화된 ψ 변형 및 N1-5-메틸사이토신(N1-5mc)을 지니는 변형된 인간 G-CSF mRNA(G-CSF-Gen2-리포플렉스), 식염수 중 N1-5mc 및 ψ 변형을 지니는 변형된 인간 G-CSF mRNA(G-CSF-Gen2-식염수), 30 용적%의 RNAIMAX™으로 리포프렉스된 5mc 및 ψ 변형을 지니는 변형된 루시페라제 (Luc-리포플렉스) 또는 식염수 중 5mc 및 ψ 변형을 지니는 변형된 루시페라제 mRNA(Luc-식염수) 100㎍을 함유하는 제형을 근육내로(I.M.) 또는 피하로(S.C.) 전달하고, 각 투여 방법에 대한 대조군은, 80㎕ 용량의 제형 완충액(F.완충액)을 C57/BL6 마우스에게 부여하였다. 주사 후 13시간 째에, 주사 부위로부터 혈청 및 조직을 각각의 마우스로부터 수집하고, G-CSF ELISA에 의해 분석하여 인간 G-CSF 단백질 수준들을 비교하였다. 근육내 투여 및 피하 투여 결과로부터 마우스 혈청 중 인간 G-CSF 단백질의 결과를 표 55에 나타낸다.
이들 결과는, 5-메틸사이토신/유사유리딘 및 5-메틸사이토신/N1-메틸유사유리딘 변형된 인간 G-CSF mRNA가 식염수 제형이든 리포플렉스 제형이든지 간에 I.M. 또는 S.C. 투여 경로로 전달된 경우 혈청 중 특이적인 인간 G-CSF 단백질 발현을 초래할 수 있는 것을 입증한다. 표 55에 표시된 바와 같이, 5-메틸사이토신/N1-메틸유사유리딘 변형된 인간 G-CSF mRNA는 일반적으로 5-메틸사이토신/유사유리딘 변형된 인간 G-CSF mRNA에 비해서 증가된 인간 G-CSF 단백질 생산을 입증한다.
Figure pct00203
D. mCherry 변형된 RNA 리포플렉스 비교
근육내 및 피하 투여
30 용적%의 RNAIMAX™으로 리포플렉스화된 변형된 mCherry mRNA(서열번호 7로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1) 또는 식염수 중 변형된 mCherry mRNA 100㎍을 함유하는 제형을 마우스에게 근육내로 또는 피하로 전달한다. 제형 완충액을 또한 대조군의 마우스에게 근육내로 혹은 피하로 투여한다. 마우스의 주사 부위는 단백질을 생산하는 것을 담당하는 세포 유형(들)을 결정하기 위하여 절편화를 위하여 17시간 주사 후에 수집할 수 있다.
유리체내 투여
RNAIMAX™으로 리포플렉스화된 변형된 mCherry mRNA, 제형 완충액 중 변형된 mCherry mRNA, RNAMAX™으로 리포플렉스화된 변형된 루시페라제 mRNA, 제형 완충액 중 변형된 루시페라제 mRNA 10㎍을 함유하는 제형을 5㎕/눈의 용량 용적으로 래트 내 유리체내 주사(IVT)에 의해 투여할 수 있다. 제형 완충액은 또한 5㎕/눈의 용량 용적으로 래트의 대조군에 IVT에 의해 투여한다. 처리된 래트로부터의 눈은 주사 후 18시간 후에 수집하여, 절편화하고 용해시켜서, mmRNA가 눈에 생체내에 효과적으로 전달될 수 있어 단백질 생산을 초래하는지의 여부를 결정하고, 또한 생체내 단백질을 생산하는 것을 담당하는 세포 유형(들)을 결정한다
비강내 투여
30 용적%의 RNAIMAX™으로 리포플렉스화된 변형된 mCherry mRNA, 식염수 중 변형된 mCherry mRNA, 30 용적%의 RNAIMAX™으로 리포플렉스화된 변형된 루시페라제 mRNA 또는 식염수 중 변형된 루시페라제 mRNA 100㎍을 함유하는 제형을 비강내로 전달한다. 제형 완충액은 또한 대조군에 비강내로 투여한다. 폐는 절편화(mCherry mRNA를 입수한 것들에 대해서) 또는 균질화(루시페라제 mRNA를 입수한 것들에 대해서)를 위하여 적하 후 약 13시간째에 수집할 수 있다. 이들 샘플은, mmRNA가 폐에 생체내에 효과적으로 전달될 수 있어 단백질 생산을 초래하는지의 여부를 결정하고, 또한 생체내 단백질을 생산하는 것을 담당하는 세포 유형(들)을 결정하는데 이용될 수 있다.
실시예 33: 다양한 지질비를 이용한 생체내 전달
변형된 mRNA는 다양한 지질 비 및 얻어지는 단백질 발현을 평가하기 위하여 C57/BL6에 전달하였다. 100㎍ 변형된 인간 EPO mRNA(서열번호 9로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨)(10%, 30% 또는 50% RNAIMAX™으로 리포플렉스화됨), 10%, 30% 또는 50% RNAIMAX™으로 리포플렉스화된 100㎍ 변형된 루시페라제 mRNA(서열번호 15로 표시되는 IVT cDNA 서열; 서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열, 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일, 5'캡, 캡 1, 각 유리딘 부위에서 유사유리딘 대체 및 각각의 사이토신에서 5-메틸사이토신으로 완전 변형됨) 의 제형 또는 제형 완충액을 단일의 70㎕ 용량으로 마우스에게 근육내로 투여하였다. 혈청은 인간 EPO ELISA를 실시하여 각 마우스 내 인간 EPO 단백질 수준을 결정하기 위하여 주사 후 13시간째에 수집하였다. 표 56에 표시된 인간 EPO ELISA의 결과는, 근육 내에 발현된 변형된 인간 EPO는 상이한 퍼센트의 RNAIMAX™의 각각에 대해서 혈청 내로 분비되는 것을 나타낸다.
Figure pct00204
실시예 34: 포유류에서의 근육내 및 피하 생체내 전달
제형 완충액으로 제형화된 변형된 인간 EPO mRNA(서열번호 9로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨)는 인간 EPO 생산에 대한 용량 의존성을 평가하기 위하여 C57/BL6 마우스 혹은 스프라그-다우리 래트(Sprague-Dawley rat)에 전달하였다. 래트들에게는, 용량 차트표 57에 기재된 바와 같이, 50㎕의 변형된 인간 EPO mRNA(h-EPO), 변형된 루시페라제 mRNA(Luc)(서열번호 15로 표시되는 IVT cDNA 서열; 서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열, 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일, 5'캡, 캡 1, 각 유리딘 부위에서 유사유리딘 대체 및 각각의 사이토신에서 5-메틸사이토신으로 완전 변형) 또는 제형 완충액(F.완충액)을 근육내에 주사하였다.
마우스들에게는, 용량 차트표 58에 기재된 바와 같이, 50㎕의 변형된 인간 EPO mRNA(h-EPO), 변형된 루시페라제 mRNA(Luc) 또는 제형 완충액(F.완충액)을 근육내에 혹은 피하에 주사하였다. 주사 후 13시간째에, 혈액을 수집하고, 각 마우스 혹은 래트에 대해서 인간 EPO의 양을 구하기 위하여 혈청을 분석하였다. 래트 연구에 대한 평균 및 기하 평균(pg/㎖)이 표 57에 표시되어 있다.
Figure pct00205
Figure pct00206
실시예 35: 근육내 생체내 전달 후의 활성의 지속기간
제형 완충액으로 제형화된 변형된 인간 EPO mRNA(서열번호 9로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨)는 용량 반응의 지속기간을 결정하기 위하여 스프라그-다우리 래트에 전달하였다. 래트들에게는, 용량 차트표 59에 기재된 바와 같이, 50㎕의 변형된 인간 EPO mRNA(h-EPO), 변형된 루시페라제 mRNA(서열번호 15로 표시되는 IVT cDNA 서열; 서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열, 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일, 5'캡, 캡 1, 각 유리딘 부위에서 유사유리딘 대체 및 각 사이토신에서 5-메틸사이토신으로 완전 변형됨)(Luc) 또는 제형 완충액(F.완충액)을 근육내 주사하였다. 래트들은 근육내 주사 후 2, 6, 12, 24, 48 및 72시간에 채혈하여 주어진 시간에 인간 EPO의 농도를 구하였다. 이 연구에 대한 평균 및 기하 평균(pg/㎖)이 표 59에 표시되어 있다.
Figure pct00207
실시예 36: 투여 경로
연구는 상이한 투여 경로를 이용해서 분할 투약을 조사하기 위하여 수행되었다. 하나의 시점에서 피하 혹은 근육내 주사 부위를 이용하는 연구는 mmRNA 약물 노출을 증가시키고 단백질 생산을 향상시키기 위하여 설계되고 수행되었다. 발현된 단백질 산물의 검출에 부가해서, 단백질의 생리학적 기능의 평가는 또한 테스트된 동물로부터의 샘플의 분석을 통해서 결정되었다.
놀랍게도, mmRNA의 분할 투약은 단일의 단위 용량 혹은 다회-용량 반응식에 의해 생산된 것보다 큰 단백질 생산 및 표현형 반응을 일으키는 것이 결정되었다.
분할 용량 실험의 설계는 완충액 단독에 투여되거나 또는 30% 리포플렉스 (RNAIMAX™)로 제형화된 인간 에리트로포이에틴(EPO) mmRNA(서열번호 9로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1) 또는 루시페라제 mmRNA(서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1)를 이용하는 것을 수반하였다. 투약 비히클(제형 완충액)은 150mM NaCl, 2mM CaCl2, 2mM Na+-포스페이트(1.4mM 제1인산나트륨; 0.6mM 제2인산나트륨), 및 0.5mM EDTA, pH 6.5로 구성되었다. pH는 수산화나트륨을 이용해서 조절하고, 최종 용액은 필터 멸균시켰다. mRNA는 각 유리딘 부위에서 유사유리딘 대체 및 각 사이토신에서 5meC로 변형되었다.
군당 4마리의 마우스에게는 표 60에 개략적으로 표시된 용량 차트에 의해 근육내로(I.M.), 정맥내로(I.V.) 또는 피하로(S.C.) 투약되었다. 혈청은 모든 마우스로부터의 주사 후 13시간째에 수집하고, 조직은 근육내 및 피하 군으로부터의 주사 부위로부터 수집하였으며, 비장, 간 및 신장은 정맥내 군으로부터 수집하였다. 근육내 군 및 피하 군으로부터의 결과는 표 61에 표시되어 있다.
Figure pct00208
Figure pct00209
실시예 37. 신속 제거형 지질 나노입자 (reLNP) 연구
A. 변형된 RNA reLNP들의 제형
합성된 지질, 1,2-다이스테아로일-3-포스파티딜콜린(DSPC)(아반티 폴라 리피즈사, 앨라배마주의 엘라베스터시에 소재), 콜레스테롤(시그마-알드리치사, 독일 타우프커르첸에 소재) 및 α-[3'-(1,2-다이미리스토일-3-프로판옥시)-카복사마이드-프로필]-ω-메톡시-폴리옥시에틸렌(PEG-c-DOMG)(NOF, 벨기에의 부벨벤에 소재)의 용액을 제조하고 -20℃에서 저장한다. 합성된 지질은 내부 에스터를 지닌 DLin-DMA, 말단 에스터를 지닌 DLin-DMA, DLin-MC3-DMA-내부 에스터 및 말단 에스터를 지닌 DLin-MC3-DMA로부터 선택된다. reLNP를 배합하여 50:10:38.5:1.5의 몰비(reLNP: DSPC: 콜레스테롤: PEG-c-DOMG)를 수득한다. reLNP 및 변형된 mRNA의 제형은 지질 용액을 변형된 mRNA 용액과 총 지질 대 변형된 mRNA 중량비 10:1, 15:1, 20:1 및 30:1에서 배합함으로써 제조한다.
B. 제형의 특성규명
제타사이저 나노 ZS(Zetasizer Nano ZS)(몰번 인스트루먼츠사, 영국 우스터셔 몰번에 소재)는 입자 크기를 결정함에 있어서는 1X PBS 및 제타 전위를 결정함에 있어서는 15mM PBS 중에서 변형된 mRNA 나노입자의 입자 크기, 다분산 지수(PDI) 및 제타 전위를 결정하는데 이용된다.
자외-가시광 분광법은 변형된 mRNA 나노입자 제형의 농도를 결정하는데 이용되었다. 혼합 후, 용액의 흡광도 스펙트럼은 DU 800 분광광도계(벡크만 콜터(Beckman Coulter), 벡크만 콜터사, 캘리포니아주의 브레아시에 소재) 상에서 230㎚ 내지 330㎚에서 기록된다. 나노입자 제형 중 변형된 RNA 농도는 제형에 이용된 변형된 RNA의 소광 계수 및, 260㎚에서의 흡광도와 330m 파장에서의 기준선 값 간의 차에 의거해서 산출한다.
QUANT-IT™ 리보그린(RIBOGREEN)® RNA 검정(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재한 인비트로젠사)은 나노입자에 의해 변형된 RNA의 봉입을 평가하는데 이용된다. 샘플을 희석시키고, 폴리스타이렌 96 웰 플레이트로 옮기고 나서, TE 완충액 또는 2% 트리톤 X-100 용액을 첨가한다. 플레이트를 배양하고, 리보그린(RIBOGREEN)® 시약을 TE 완충액 중에 희석시키고 나서, 이 용액을 각 웰에 첨가한다. 형광 강도는 형광 판독기(월락 빅터 1420 멀티라벨 카운터(Wallac Victor 1420 Multilablel Counter); 퍼킨 엘머사, 매사추세츠주의 월섬시에 소재)를 이용해서 측정한다. 시약 블랭크의 형광값은 각 샘플의 각각으로부터 감산하고, 변형된 RNA의 유리 변형된 퍼센트는 온전한 샘플의 형광 강도를 파손된 샘플의 형광값으로 나눔으로써 결정된다.
C. 시험관내 배양
인간 배아 신장 상피(HEK293) 및 간세포 암종 상피(HepG2) 세포(LGC 스탠더즈 게엠베하(LGC standards GmbH), 독일 베젤에 소재)를 96-웰 플레이트(그라이너 바이오-온 게엠베하, 독일 프릭켄하우젠에 소재)에 파종하고, HEK293 세포용의 플레이트는 콜라겐 유형1로 미리 코팅한다. HEK293은 세포 배양 배지 100㎕ 중에 웰당 약 30,000의 밀도로, 그리고 HepG2는 약 35,000 세포의 밀도로 파종한다. mCherry mRNA(서열번호 7로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1)를 함유하는 제형은 세포의 파종 후에 직접 첨가하고 배양한다. 시험관내 전사(IVT)에서 이용된 T7 프로모터, 5'비번역 영역(UTR) 및 3' UTR을 지닌 mCherry cDNA는 서열번호 8로 부여된다.
배양 배지 상청액을 96-웰 프로-바인드 U-바텀 플레이트(Pro-Bind U-bottom plate)(벡톤 딕킨슨 게엠베하, 독일 하이델베르크에 소재)로 옮김으로써 세포를 수확하였다. 세포를 ½ 용적 트립신/EDTA(바이오크롬 아게, 독일 베를린에 소재)로 트립신화하고, 각각의 상청액으로 풀링 후, 1 용적 PBS/2%FCS(바이오크롬 아게, 독일 베를린에 소재)/0.5% 폼알데하이드(머크사, 독일 다름슈타트에 소재)를 첨가하여 고정시켰다. 샘플은 이어서 LSRII 세포분석기(벡톤 딕킨슨 게엠베하, 독일 하이델베르크에 소재) 중 PE-텍사스 레드용의 필터 및 여기 레이저를 이용한 유세포 분석 측정을 실시한다. 모든 이벤트의 평균 형광 강도(Mean Fluorescence Intensity: MFI) 및 4개의 독립된 웰의 표준 편차는 분석된 샘플에 대해서 제시된다.
D. 생체내 제형 연구
마우스들에게 변형된 mRNA 및 reLNP를 함유하는 제형의 단일 용량을 정맥내로 투여한다. 마우스들에게 투여되는 변형된 mRNA는 G-CSF(서열번호 6으로 표시된 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1), 인자 IX(서열번호 10으로 표시된 mRNA; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1) 또는 mCherry(서열번호 7로 표시된 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1)로부터 선택된다.
마우스들에게 100㎍, 10㎍ 또는 1㎍의 제형화된 변형된 mRNA를 주입하고 이들에게 제형이 투여된 후 8시간째에 희생시킨다. 인간 G-CSF 변형된 mRNA를 함유하는 제형이 투여된 마우스로부터의 혈청은 특정 G-CSF ELISA에 의해 측정하고, 인간 인자 IX 변형된 RNA가 투여된 마우스로부터의 혈청은 특정 인자 IX ELISA 또는 색소생산성 검정에 의해 분석한다. mCherry 변형된 mRNA가 투여된 마우스들로부터의 간 및 비장은 면역조직화학(immunohistochemistry: IHC) 또는 형광-활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting: FACS)에 의해 분석한다. 대조군으로서, 하나의 군의 마우스들은 어떠한 제형도 주입하지 않고, 그들의 혈청 및 조직을 수집하여 ELISA, FACS 및/또는 IHC에 의해 분석한다.
실시예 38. VEGF-A의 시험관내 형질주입
인간 혈관 내피 성장 인자-아이소폼 A(VEGF-A) 변형된 mRNA(서열번호 19로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1)는 24 다중-웰 플레이트 내 인간 각질세포 세포 중의 역 형질주입을 통해서 형질주입시켰다. 시험관내 전사(IVT)에서 이용된 T7 프로모터, 5'비번역 영역(UTR) 및 3'UTR을 가진 VEGF-A cDNA는 서열번호 20으로 부여되어 있다. 인간 각질세포 세포들은, 이들이 50 내지 70%의 컨플루언스에 도달할 때까지 인비트로젠사(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)로부터의 서플리멘트 S7(Supplement S7)을 구비한 에피라이프(EPILIFE)® 배지에서 성장시켰다. 세포에는 인비트로젠사(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)로부터 RNAIMAX™으로 복합체화된 변형된 mRNA(mmRNA) 암호화 VEGF-A 0, 46.875, 93.75, 187.5, 375, 750 및 1500ng을 형질주입시켰다. RNA:RNAIMAX™ 복합체는 실온에서 10분 동안 5X 용적측정 희석으로 서플리멘트-무함유 에피라이프(EPILIFE)® 배지에서 RNA를 우선 배양함으로써 형성하였다. 두번째 바이알에서, RNAIMAX™ 시약을 10분 동안 10X 용적측정 희석으로 서플리멘트-무함유 에피라이프(EPILIFE)® 배지에서 배양하였다. RNA 바이알은 이어서 RNAIMAX™ 바이알과 혼합하고, 20 내지 30분 동안 실온에서 배양하고 나서 적가 방식으로 세포에 첨가한다.
인간 각질세포 세포로 형질주입된 완전히 최적화된 mmRNA 암호화 VEGF-A(서열번호 19로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1)는, 천연의 뉴클레오사이드 트라이포스페이트(NTP), 각 유리딘 부위에서의 유사유리딘 및 각 사이토신 부위에서의 5-메틸사이토신(유사-U/5mC), 및 각 유리딘 부위에서의 N1-메틸-유사유리딘 및 각 사이토신 부위에서의 5-메틸사이토신(N1-메틸-유사-U/5mC) 등과 같은 번역 동안의 변형을 포함하였다. 세포에는 mmRNA 암호화 VEGF-A를 형질주입시키고, 배양 배지 내 분비된 VEGF-A 농도(ρg/㎖)는 제조사의 권고 지시사항에 따라서 인비트로젠사(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)로부터의 ELISA 키트를 이용해서 농도의 각각에 대해서 형질주입 후 6, 12, 24 및 48시간에 측정하였다. 표 62에 표시된 이들 데이터는, 변형된 mmRNA 암호화 VEGF-A가 인간 각질세포 세포에서 번역될 수 있고 VEGF-A가 세포로부터 수송되어 세포외 환경으로 방출되는 것을 나타낸다.
Figure pct00210
실시예 39. 인자 IX의 생체내 연구
제형 완충액 내에 제형화된 인간 인자 IX mmRNA(Gen1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨)를 근육내 주사를 통해서 마우스에게 전달하였다. 결과는 인자 IX 단백질이 투여 후 13시간에 측정된 바와 같이 혈청 내에서 상승한 것을 입증한다.
이 연구에서, 마우스(인자 IX에 대해서 N=5, 루시페라제 또는 완충액 대조군에 대해서 N=3)에게는 50㎕의 인자 IX mmRNA(서열번호 10으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1), 루시페라제(서열번호 15로 표시된 IVT용의 cDNA 서열; 서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열, 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일, 5'캡, 캡 1, 각 유리딘 부위에서 유사유리딘 대체 및 각각의 사이토신에서 5-메틸사이토신으로 완전 변형됨) 또는 제형 완충액(F.완충액)을 2x 100 ㎍/마우스로 근육내로 주사하였다. 마우스는 혈청 내 인간 폴리펩타이드의 농도(pg/㎖)를 구하기 위하여 근육내 주사 후 13시간에 채혈하였다. 결과는, 인자 IX mmRNA의 투여가 루시페라제 또는 완충액 대조군 투여에 대해서 100 pg/㎖ 미만의 인자 IX에 비해서 13시간에 1600 pg/㎖의 수준에서 일어난 것을 나타내었다.
실시예 40. 다수-부위 투여: 근육내 및 피하
Gen1 또는 Gen2(5-메틸사이토신(5mc) 및 유사유리딘(ψ) 변형, G-CSF-Gen1; 또는 N1-5-메틸사이토신(N1-5mc) 및 ψ 변형, G-CSF-Gen2)로서 변형되고 또한 제형 완충액으로 제형화된 인간 G-CSF 변형된 mRNA(서열번호 6으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1)는 근육내(IM) 혹은 피하(SC) 주사를 통해서 마우스에게 전달하였다. 3일 동안 매일(24시간 간격) 4가지 용량 또는 2x 50㎍(2개 부위)의 주사를 수행하였다. 4번째 용량은 혈액 수집 및 CBC 분석 전 6시간에 투여하였다. 대조군은 루시페라제(서열번호 15로 표시되는 IVT용 cDNA 서열; 서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열, 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일, 5'캡, 캡 1, 각 유리딘 부위에서 유사유리딘 대체 및 각 사이토신에서 5-메틸사이토신으로 완전 변형됨) 또는 제형 완충액(F.완충액)을 포함하였다. 마우스는, 호중구 계수에 대한 mRNA-암호화된 인간 G-CSF의 효과를 결정하기 위하여 첫번째 mRNA 주사 후 72시간(마지막 mRNA 용량 후 6시간)째에 채혈하였다. 투약 요법은 얻어지는 호중구 계수(천개/㎕)로서 표 63에 표시되어 있다. 표 63에서, 별표(*)는 p<0.05에서 통계학적 유의성을 나타낸다.
근육내 투여에 대해서, 데이터는 Gen1 G-CSF mRNA에 대해서 3일째에 대조군보다 호중구 계수의 4개 증가 및 Gen2 G-CSF mmRNA에 대해서 2배 증가를 나타낸다. 피하 투여에 대해서, 데이터는 Gen2 G-CSF mRNA에 대해서 3일째에 대조군보다 호중구 계수의 2배 증가를 나타낸다.
이들 데이터는, 5-메틸시티딘/유사유리딘 및 5-메틸시티딘/N1-메틸유사유리딘-변형된 mRNA가 양쪽 모두 혈액 호중구 계수의 특이적 증가에 의해 입증되는 바와 같이 생물학적으로 활성일 수 있는 것을 증명한다.
Figure pct00211
실시예 41. 정맥내 투여
5-메틸사이토신(5mc) 및 유사유리딘(ψ) 변형으로 변형(Gen1)되거나; 또는 변형이 없이 10% 리포플렉스(RNAiMax)로 제형화된 인간 G-CSF 변형된 mRNA(서열번호 6으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1)를 마우스에게 0, 2 및 4일에 정맥내 (IV) 주사를 통해서 50㎍ RNA의 용량으로 그리고 100㎕의 용적으로 전달하였다. 호중구는 1, 5 및 8일째에 측정하였다. 대조군은 비-특이적 포유류의 RNA 또는 제형 완충액 단독(F.완충액)을 포함하였다. 마우스들은 호중구 계수를 증가시키기 위하여 mRNA-암호화된 인간 G-CSF의 효과를 결정하기 위하여 1, 5 및 8일째에 채혈하였다. 투약 요법은 표 64에 표시되어 있고, 얻어지는 호중구 계수(천개/㎕; K/㎕)도 표시되어 있다.
정맥내 투여를 위하여, 데이터는, 비변형 G-CSF mRNA 혹은 비-특이적 대조군이 아니라 G-CSF 변형된 mRNA로 5일에 대조군 이상의 호중구 계수의 4 내지 5배 증가를 보였다. 혈구수는 최종 주사 후 4일에 기준선으로 되돌아왔다. 백혈구 집단에서의 다른 변화는 관찰되지 않았다.
표 64에서, 별표(*)는 완충액과 비교해서 p<0.001에서 통계학적 유의성을 나타낸다.
이들 데이터는, 리포플렉스-제형화된 5-메틸시티딘/유사유리딘-변형된 mRNA가 혈액 호중구 계수혈액 호중구 계수의 특이적 증가에 의해 입증되는 바와 같이 I.V. 투여 경로를 통해서 전달될 경우, 생물학적으로 활성일 수 있는 것을 증명한다. 다른 세포 하위집단은 유의하게 변경되지 않았다. 유사하게 투여된 비변형 G-CSF mRNA는 호중구 계수에 대한 약리학적 효과를 보이지 않았다.
Figure pct00212
실시예 42. 식염수 제형: 근육내 투여
A. 단백질 발현
인간 G-CSF 변형된 mRNA(서열번호 6으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1) 및 인간 EPO mmRNA(서열번호 9로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1); G-CSF 변형된 mRNA(5-메틸사이토신(5mc) 및 유사유리딘(ψ)으로 변형됨) 및 EPO 변형된 mRNA(N1-5-메틸사이토신(N1-5mc) 및 ψ 변형으로 변형됨 )는, 제형 완충액(150mM 염화나트륨, 2mM 염화칼슘, 2mM 포스페이트, 0.5mM EDTA, pH 6.5에서)으로 제형화되고, 100㎍의 용량으로 근육내(IM) 주사를 통하여 마우스에게 전달되었다.
대조군은 루시페라제(서열번호 15로 표시되는 IVT용의 cDNA; 서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열, 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일, 5'캡, 캡 1, 각 유리딘 부위에서 유사유리딘 대체 및 각 사이토신에서 5-메틸사이토신으로 완전 변형) 또는 제형 완충액(F.완충액)을 포함하였다. 마우스는, 혈청 내 인간 폴리펩타이드의 농도(pg/㎖)를 결정하기 위하여 주사 후 13시간째에 채혈하였다(G-CSF 군은 마우스 혈청 내 인간 G-CSF를 측정하였고, EPO 군은 마우스 혈청 내 인간 EPO를 측정하였다). 결과는 표 65에 나타낸다.
Figure pct00213
B. 용량 반응
인간 EPO 변형된 mRNA(서열번호 9로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨)는 제형 완충액으로 제형화되고 근육내(IM) 주사를 통해서 마우스에게 전달되었다.
대조군은 루시페라제(서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열, 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일, 5'캡, 캡 1, 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨) 또는 제형 완충액(F.완충액)을 포함하였다. 마우스는 혈청 중 인간 폴리펩타이드의 농도(pg/㎖)를 결정하기 위하여 주사 후 13시간에 채혈하였다. 용량 및 발현은 표 66에 표시되어 있다.
Figure pct00214
실시예 43. 다회-용량/다회-투여
하나의 시점에서의 다수의 근육내 주사 부위를 이용하는 연구가 설계되어 수행되었다.
단일의 다회-용량 실험의 설계는 제형 완충액 중에 투여되는 인간 에리트로포이에틴(EPO) mmRNA(서열번호 9로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1) 또는 G-CSF(서열번호 6으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1)를 이용하는 것을 수반한다. 투약 비히클(F. 완충액)은 대조군으로서 이용하였다. EPO 및 G-CSF mmRNA는 각 유리딘 부위에서의 유사유리딘 대체 및 각 사이토신에서 5-메틸사이토신으로 변형되었다.
동물(n=5)인 스프라그-다우리 래트에는 100㎍의 단일의 단위 용량에 대해서 IM (근육내)로 주사(한쪽 넓적다리로 전달)하였다. 다회-용량을 위하여, 100㎍의 6 용량(양쪽 넓적다리로 전달됨)을 EPO 및 G-CSF mmRNA 양쪽에 대해서 이용하였다. 대조 용량은 단일 용량에서 완충액의 이용을 수반한다. 인간 EPO 혈액 수준은 주사 후 13시간째에 평가하였다.
인간 EPO 단백질은 I.M 후 13시간째에 래트 혈청에서 측정하였다. 5군의 래트가 처리되고 평가되었다. 결과는 표 67에 나타낸다.
Figure pct00215
실시예 44. 신호 서열 교환 연구
인간 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)를 암호화하는 mmRNA의 수개의 변이체(서열번호 6으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1)는 변형된 뉴클레오타이드 유사유리딘 및 5-메틸사이토신(유사-U/5mC)을 이용해서 합성하였다. 이들 변이체는 야생형 N 말단 분비 신호 펩타이드 서열(MAGPATQSPMKLMALQLLLWHSALWTVQEA; 서열번호 21)을 암호화하지만, 분비 신호 펩타이드 서열 또는 다른 mRNA로부터 취한 분비 신호 펩타이드 서열은 암호화하지 않는 G-CSF 작제물을 포함하였다. 이들은 야생형 GCSF 신호 펩타이드 서열이 인간 α-1-안티트립신(AAT)(MMPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLA; 서열번호 22), 인간 인자 IX(FIX)(MQRVNMIMAESPSLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKR; 서열번호 23), 인간 프로락틴(Prolac)(MKGSLLLLLVSNLLLCQSVAP; 서열번호 24) 또는 인간 알부민(Alb)(MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR; 서열번호 25)의 신호 펩타이드 서열로 대체된 서열을 포함하였다.
각 G-CSF 변이체를 암호화하는 변형된 mRNA 250ng을 1㎕의 리포펙타민(Lipofectamine) 2000(라이프 테크놀로지즈사)을 이용해서 24 웰 플레이트 내에서 HEK293A(표 중 293A), 마우스 근아세포(표 중 MM)(C2C12, CRL-1772, ATCC) 및 래트 근아세포(표 중 RM)(L6 라인, CRL-1458, ATCC) 세포주에 형질주입시켰으며, 각 웰은 300,000개의 세포를 포함한다. 상청액을 24시간 후에 수확하고, 분비된 G-CSF 단백질은 인간 G-CSF ELISA 키트(라이프 테크놀로지즈사)를 이용해서 ELISA에 의해 분석하였다. 표 68에 표시된 데이터는, 알부민 신호 펩타이드를 암호호하는 G-CSF mmRNA로 형질주입된 세포가 그의 야생형 상대보다 적어도 12배 많은 G-CSF 단백질을 분비하는 것을 나타낸다.
Figure pct00216
실시예 45. 사이토카인 연구: PBMC
PBMC 단리 및 배양: 두 공여자로부터의 인간 혈액 50㎖는 나트륨 헤파린 튜브 속의 리서치 블러드 컴포턴츠(Research Blood Components)(로트 KP30928 및 KP30931)로부터 입수하였다. 각각의 공여자에 대해, 혈액을 혼주시키고 DPBS(SAFC Bioscience 59331C, 로트 071M8408)를 사용하여 70㎖로 희석시키고 2개의 50㎖ 원뿔형 튜브에 균일하게 나누었다. 10㎖의 피콜 파크(Ficoll Paque)(GE 헬스케어사 17-5442-03, 로트 10074400)를 혈액층 아래에 균일하게 분배하였다. 튜브를 2000rpm에서 30분 동안 낮은 가속 및 브레이킹(braking)으로 원심분리하였다. 튜브를 제거하고 버피 코트(buffy coat) PBMC 층을 신선한 50㎖ 원뿔형 튜브로 옮기고, DPBS로 세척하였다. 튜브를 1450rpm에서 10분 동안 원심분리하였다.
상청액을 흡인하고 PBMC 펠렛을 재현탁시키고 50㎖의 DPBS 속에서 세척하였다. 튜브들을 1250rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 이 세척 단계를 반복하여, PBMC 펠렛을 19㎖의 옵티멤 I(Optimem I)(Gibco 11058, 로트 1072088)에 재현탁하여 계수하였다. 세포 현탁액을 3.0 x 10^6 세포/㎖의 생 세포의 농도로 조절하였다.
이어서, 이들 세포를 공여자당 5개의 96 웰 조직 배양물로 처리된 둥근 바닥 플레이트(Costar 3799) 상에 웰당 50㎕로 평판배양하였다. 30분 내에, 형질주입 혼합물을 각각의 웰에 웰당 50㎕의 용적으로 첨가하였다. 형질주입 후 4시간째에, 배지에 10㎕의 소 태아 혈청(Gibco 10082, 로트 1012368)을 보충하였다
형질주입 제제: 인간 G-CSF를 암호화하는 mmRNA(서열번호 6으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1)((1) 천연의 NTP, (2) 5-메틸 시티딘 및 유사유리딘에 의한 100% 치환 또는 (3) 5-메틸 시티딘 및 N1-메틸 유사유리딘에 의한 100% 치환을 포함함; 루시페라제를 암호화하는 mmRNA(서열번호 15로 표시되는 IVT cDNA 서열; 서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열, 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일, 5'캡, 캡 1, 각 유리딘 부위에서 유사유리딘 대체 및 각 사이토신에서 5-메틸사이토신으로 완전 변형됨)((1) 천연의 NTP 또는 (2) 5-메틸 시티딘 및 유사유리딘에 의한 100% 치환을 함유) 및 TLR 작용제 R848(인비트로젠 tlrl-r848)을 최종 용적 2500㎕의 Optimem I 중에38.4 ng/㎕로 희석시켰다.
별도로, 432㎕의 리포펙타민 2000(인비트로젠 11668-027, 로트 1070962)을 13.1㎖ 옵티멤 I(Optimem I)로 희석시켰다. 96 웰 플레이트에, 135㎕의 각 mmRNA, 양성 대조군(R-848) 또는 음성 대조군(옵티멤 I(Optimem I))의 9분획을 135㎕의 희석된 리포펙타민 2000에 첨가하였다. 형질주입될 물질을 포함하는 플레이트를 20분 동안 배양시켰다. 이어서, 형질주입 혼합물을 웰당 50㎕에서 인간 PBMC 플레이트로 옮겼다. 플레이트를 이어서 37 C에서 배양시켰다. 2, 4, 8, 20 및 44시간에, 각 플레이트를 인큐베이터로부터 제거하고, 상청액을 동결시켰다.
마지막 플레이트를 제거한 후, 상청액은 인간 G-CSF ELISA 키트(인비트로젠사 KHC2032) 및 인간 IFN-알파 ELISA 키트(써모 사이언티픽사 41105-2)를 이용해서 검정하였다. 각 조건은 두 벌로 수행하였다.
결과: 암호화된 단백질을 생산하는 비변형 및 변형된 mRNA(mmRNA)의 능력은, 인터페론-알파 생산에 의해 측정된 바와 같은 선천적 면역 인지를 촉발시키는 mRNA의 능력과 같이, 시간 경과에 따라서 평가하였다(G-CSF 생산). 시험관내 PBMC 배양물의 사용은 올리고뉴클레오타이드의 면역 촉진 전위를 측정하기 위한 허용된 방식이다(Robbins et al., 올리고뉴클레오타이드 2009 19:89-102).
결과는 4 파라미터 로지스틱 곡선 적합화를 이용해서 각 ELISA 플레이트의 표준 곡선에 대해서 내삽시켰다. 표 69 및 표 70에는, 특정 ELISA에 의해 측정된 바와 같은 시간 경과에 따른 G-CSF 및 IFN-알파 생산의 평균 2개의 개별의 PBMC 공여자가 표시되어 있다.
G-CSF ELISA에 있어서, 리포펙타민 2000 미처리 조건으로부터의 배경 신호는 각 시점에서 감산하였다. 데이터는, 인간 말추 혈액 단핵에 의한 인간 G-CSF 단백질의 특이적 생산이 천연의 NTP, 5-메틸 시티딘 및 유사유리딘에 의한 100% 치환 또는 5-메틸 시티딘 및 N1-메틸 유사유리딘에 의한 100% 치환을 함유하는 G-CSF mRNA에서 나타난 것을 입증하였다. G-CSF의 생산은, 비변형 mRNA에 비해서 변형된 mRNA의 사용을 통해서 유의하게 증가되었으며, 5-메틸 시티딘 및 N1-메틸 유사유리딘 함유 G-CSF mmRNA는 최고 수준의 G-CSF 생산을 보였다. 선천적 면역 인지에 관하여, 비변형 mRNA는 상당한 IFN-알파 생산을 초래한 반면, 변형된 mRNA는 인터페론-알파 생산을 크게 방지하였다. 5-메틸 시티딘 및 N1-메틸유사유리딘으로 완전 변형된 G-CSF mRNA는 사이토카인을 유의하게 증가시키지 않은 반면, 5-메틸 시티딘 및 유사유리딘으로 완전 변형된 G-CSF mRNA는IFN-알파, TNF-알파 및 IP10을 유도하였다. 많은 다른 사이토카인은 어떠한 변형에 의해서도 영향받지 않았다.
Figure pct00217
Figure pct00218
실시예 46. 변형된 mRNA의 화학적 변형 범위
화학적 변형 5-메틸사이토신 및 유사유리딘 등(이것으로 제한되지 않음)과 같은 변형된 뉴클레오타이드는, 선천적 면역 반응을 저하시키고 포유류의 세포 내 RNA의 발현을 증가시키는 것으로 판명되었다. 경이롭게도, 이전에 알려져 있지 않지만, 화학적 변형에 의해 나타나는 효과는 화학적 변형의 양이 100% 미만인 경우 적정될 수 있다. 이전에, 완전 변형은 화학적 변형의 유리한 효과를 유발하기에 충분하고 필수적이었으며, mRNA의 100% 미만 변형은 거의 효과를 지니지 않은 것으로 여겨졌었다. 그러나, 이제 화학적 변형의 유익은 완전한 변형 미만을 이용해서 유도될 수 있고, 그 효과는 표적, 농도 및 변형 의존적인 것으로 나타났다.
A. PBMC에 형질주입된 변형된 RNA
5-메틸사이토신(5mC) 및 유사유리딘(유사U)으로 변형된 G-CSF mRN 또는 비변형 G-CSF mRNA 960ng을 3명의 정상 혈액 공여자(D1, D2, D3)로부터의 말초 혈액 단핵구(PBMC)에 0.8㎕의 리포펙타민 2000과 함께 형질주입시켰다. G-CSF mRNA(서열번호 6; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1) 는 5mC 및유사U로 완전히 변형시키거나(100% 변형), 5mC 및 유사U로 변형시키지 않거나(0% 변형), 또는 mRNA가 50% 변형, 25% 변형, 10% 변형, 5% 변형, 1% 변형 혹은 0.1% 변형을 포함하도록 5mC 및 유사U로 부분적으로 변형시켰다. 루시페라제(서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 완전 변형된 5meC 및 유사U)의 대조군 샘플은 또한 G-CSF 발현에 대해서 분석되었다. 리포펙타민2000, LPS, R-848, 루시페라제(서열번호 16으로 표시된 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드 폴리A 테일; 5'캡, 캡1; 완전 변형된 5mC 및 유사) 및 P(I)P(C)의 TNF-알파 및 IFN-알파 대조군 샘플에 대해서 또한 분석되었다. 상청액을 수거하고, 단백질 발현을 결정하기 위하여 형질주입 후 22시간째에 ELISA에 의해 실행시켰다. G-CSF의 발현은 표 71에 표시되어 있고, IFN-알파 및 TNF-알파의 발현은 표 72에 표시되어 있다. IFN-알파 및 TNF-알파의 발현은 G-CSF mRNA의 형질주입으로부터의 부차적인 효과일 수 있다. 표들은, G-CSF, IFN-알파 및 TNF-알파의 화학적 변형의 양이 mRNA가 완전 변형되지 않았을 때 적정가능하고 적정가능한 경항은 각 표적에 대해서 동일하지 않은 것을 나타낸다.
Figure pct00219
Figure pct00220
B. HEK293에 형질주입된 변형된 RNA
인간 배아 신장 상피(HEK293) 세포를 세포 배양 배지 100㎕ 내 웰당 30,000 세포의 밀도로 96-웰 플레이트 상에 파종하였다. RNAiMAX™(인비트로젠사, 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)로 제형화된 변형된 G-CSF mRNA(서열번호 6; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1) 250ng을 웰에 첨가하였다. G-CSF를 5mC 및 유사U로 완전히 변형시키거나(100% 변형), 5mC 및 유사U로 변형시키기 않거나(0% 변형) 또는 mRNA가 75% 변형, 50% 변형 또는 25% 변형을 포함하도록 5mC 및 유사U로 부분적으로 변형시켰다. 대조군 샘플(AK 5/2, mCherry(서열번호 7; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 완전 변형된 5mC 및 유사U) 및 미처리됨)이 또한 분석되었다. 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형된 G-CSF mRNA의 반감기는 대략 8-10시간이다. 상청액은 16시간 후에 수확하고, 분비된 G-CSF 단백질을 ELISA에 의해 분석하였다. 표 73은 mRNA가 완전히 변형되지 않은 경우 G-CSF의 화학적 변형의 양이 적정가능한 것을 나타낸다.
Figure pct00221
실시예 47: 변형된 mRNA(mmRNA)의 생체내 전달
변형된 RNA는 루시페라제를 이용하는 변형된 RNA의 바이오-분포를 평가하기 위하여 근육내로, 피하로 혹은 정맥내로 C57/BL6 마우스에게 전달하였다. 150mM 염화나트륨, 2mM 염화칼슘, 2mM Na+-인산염(1.4mM의 제1인산나트륨 및 0.6mM의 제2인산나트륨을 함유함) 및 0.5mM 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA)을 함유하는 모든 전달 방법에서 이용되는 제형 완충액은, 여과 및 합성 전에 최종 pH 6.5에 도달하도록 수산화나트륨을 이용해서 조절된다. 1X 농도는 전달 완충액으로서 이용되었다. 마우스에게 전달되는 리포플렉스화된 용액을 작성하기 위하여, 하나의 바이알에서 50㎍의 RNA를 전달 완충액 중에서 실온에서 10분 동안 평형화시키고, 제2바이알에서, 10㎕ RNAiMAX™을 전달 완충액 중에서 실온에서 10분 동안 평형화시켰다. 평형 후, 바이알들을 배합하여, 전달 완충액을 첨가해서 최종 용적 100㎕에 도달하도록 하였으며, 이것은 실온에서 20분 동안 배양하였다. 각 마우스에게 150 ㎎/㎏으로 루시페린을 복강내 주사(IP)에 의해 투여하고, 15 내지 30분인 루시페린 노출 곡선의 고조기 동안 영상화하였다 루시페린을 작성하기 위하여, 1g의 D-루시페린 칼륨 혹은 나트륨염을 Mg2+ 또는 Ca2+를 함유하지 않는 증류된 인산염 완충 용액(DPBS) 66.6㎖에 용해시켜, 15 ㎎/㎖ 용액을 제조하였다. 이 용액을 서서히 혼합하고 0.2㎛ 주사기 필터를 통과시킨 후, 질소로 퍼지시키고 나서, 분획하여 -80℃에서 동결시키는 한편 가능한 한 많이 광으로부터 보호시켰다. 이 용액을, 루시페린이 용해되지 않았다면, 수욕을 이용해서 해동시키고, 서서히 혼합하여, 투약 당일에 얼음에 유지시켰다.
전신 영상은 투약 후 2, 8 및 24시간째에 각 마우스로부터 촬영하였다. 조직 영상 및 혈청은 투약 후 24시간째에 각 마우스로부터 수집하였다. 정맥내로 용량 투여된 마우스들은 영상화된 그들의 간, 비장, 신장, 폐, 심장, 신장주변 지방조직 및 흉선을 지녔다. 근육내로 혹은 피하로 투여된 마우스들은 주사 부위에서 그들의 간, 비장, 신장, 폐, 신장주변 지방조직 및 근육을 지녔다. 전신 영상으로부터, 생물발광은 각 투여 경로 및 투약 요법에 대해서 초당 광자로 측정되었다.
A. 근육내 투여
마우스에게는 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형된 변형된 루시페라제 mRNA(네이키드-Luc), 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형된 리포플렉스화된 변형된 루시페라제 mRNA(리포플렉스-luc)(서열번호 15로 표시되는 IVT cDNA 서열; 서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열, 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일, 5'캡, 캡 1, 각 유리딘 부위에서 유사유리딘 대체 및 각각의 사이토신에서 5-메틸사이토신으로 완전 변형됨), 리포플렉스화된 변형된 과립구 집락-자극 인자(G-CSF) mRNA(서열번호 6으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨)(리포플렉스-사이토카인) 또는 형성 완충액을 우측 뒷다리에서 각 제형에 대해서 주사 용적 50㎕에서 변형된 RNA 50㎍ 의 단일 용량 및 좌측 뒷다리에서 주사 용적 50㎕에서 변형된 RNA 5㎍의 단일 용량으로 근육내로(I.M.) 투여하였다. 투약 후 2, 8 및 24시간째의 각 군에 대한 루시페라제 발현 신호에 대한 생물발광 평균은 표 74에 표시되어 있다. 생물발광은, 리포플렉스를 함유하는 변형된 RNA 제형 5㎍ 및 리포플렉스를 함유하하지 않는 변형된 RNA 제형 50㎍의 주사 부위에서 양성 신호를 나타내었다.
Figure pct00222
B. 피하 투여
마우스들에게는 변형된 루시페라제 mRNA(네이키드-Luc), 리포플렉스화된 변형된 루시페라제 mRNA(리포플렉스-luc), 리포플렉스화된 변형된 G-CSF mRNA(리포플렉스-G-CSF) 또는 형성 완충액을 각 제형에 대해서 100㎕의 주사 용적으로 50㎍의 변형된 mRNA의 단일 용량으로 피하로(S.C.) 투여하였다. 투약 후 2, 8 및 24시간째의 각 군에 대한 루시페라제 발현 신호에 대한 생물발광 평균은 표 75에 표시되어 있다. 생물발광은, 리포플렉스를 함유하거나 함유하지 않는 변형된 RNA 제형 50㎍의 주사 부위에서 양성 신호를 나타내었다.
Figure pct00223
C. 정맥내 투여
마우스들에게는 변형된 루시페라제 mRNA(네이키드-Luc), 리포플렉스화된 변형된 루시페라제 mRNA(리포플렉스-luc), 리포플렉스화된 변형된 G-CSF mRNA(리포플렉스-G-CSF) 또는 형성 완충액을 각 제형에 대해서 100㎕의 주사 용적으로 50㎍의 변형된 mRNA의 단일 용량으로 정맥내로(I.V.) 투여하였다. 투약 후 2시간째의 각 군으로부터의 비장에서의 루시페라제 발현 신호에 대한 생물발광 평균은 표 76에 표시되어 있다. 생물발광은, 리포플렉스를 함유하는 변형된 RNA 제형 50㎍의 비장에서 양성 신호를 나타내었다.
실시예 48. 분할 용량 연구
하나의 시점에서 피하 혹은 근육내 주사 부위를 이용하는 연구는 mmRNA 약물 노출을 증가시키고 단백질 생산을 향상시키기 위하여 설계되고 수행되었다. 발현된 단백질 산물의 검출에 부가해서, 단백질의 생리학적 기능의 평가는 또한 테스트된 동물로부터의 샘플의 분석을 통해서 결정되었다.
놀랍게도, mmRNA의 분할 투약은 단일의 단위 용량 혹은 다회-용량 반응식에 의해 생산된 것보다 큰 단백질 생산 및 표현형 반응을 일으키는 것이 결정되었다.
단일의 단위 용량, 다회-용량 및 분할 용량 실험의 설계는 완충액 단독으로 투여되는 인간 에리트로포이에틴(EPO) 변형된 mRNA(서열번호 9로 표시된 mRNA; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1)를 이용하는 것을 수반하였다. 투약 비히클(F. 완충액)은 150mM NaCl, 2mM CaCl2, 2mM Na+-포스페이트(1.4mM 제1인산나트륨; 0.6mM 제2인산나트륨) 및 0.5mM EDTA, pH 6.5로 구성되었다. pH는 수산화나트륨을 이용해서 조절하고, 최종 용액은 필터 멸균시켰다. mRNA는 각 유리딘 부위에서 유사유리딘 대체 및 각 사이토신에서 5meC으로 변형되었다.
동물(n=5)에게는 100㎍의 단일의 단위 용량에 대해서 IM(근육내로) 주사하였다. 다회-용량을 위하여, 100㎍의 3 용량과 100㎍의 6 용량의 2개의 스케줄이 이용되었다. 분할 용량 방식을 위하여, 16.5㎍ mmRNA 6용량과 33.3㎍의 3 용량의 2개의 스케쥴이 이용되었다. 대조군 투약은 단지 6 용량에서 완충액을 사용하는 것을 포함하였다. 대조군 mmRNA는 100㎍에서 6회 투약된 루시페라제 mmRNA(서열번호 15 로 표시되는IVT cDNA; 서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 각 유리딘 부위에서 각각의 사이토신 및 유사 유리딘 대체에서의 완전 변형된 5meC)를 사용하는 것을 포함하였다. 혈액 및 근육 조직은 주사 후 13시간째에 평가되었다.
인간 EPO 단백질은 완충액 중 EPO mmRNA의 단일, 다회- 혹은 분할 용량의 I.M. 후 13시간째에 마우스 혈청 중에서 측정하였다. 7군의 마우스들(군당 n=5 마우스)이 처치되고 평가되었다. 결과는 표 77에 나타낸다.
Figure pct00225
분할 인자는 단일 용량의 산물/단위 약물(PUD)로 나눈 산물/단위 약물로서 규정된다. 예를 들어 처리군 2에 대해서 값 .28 혹은 산물(EPO)/단위 약물(mmRNA)은 0.14의 단일 용량 산물/단위 약물로 나뉜다. 결과는 2이다. 마찬가지로, 처리군 4에 대해서, 값 1.1 또는 산물(EPO)/단위 약물(mmRNA)은 0.14의 단일 용량 산물/단위 약물로 나뉜다. 결과는 7.9이다. 따라서, 용량 분할 인자(DSF)는 분할 용량 요법의 효능의 지시자로서 이용될 수 있다. 총 1일 용량의 임의의 단일 투여를 위하여, DSF는 1과 동일해야 한다. 따라서, 분할 용량 요법에서 이 값보다 큰 임의의 DSF는 증가된 효능의 표시이다.
용량 반응 경향, 주사 부위의 영향 및 주사 타이밍의 영향을 결정하기 위하여, 연구가 수행된다. 이들 연구에 있어서, 1㎍, 5㎍, 10㎍, 25㎍, 50㎍, 및 이들 사이의 값의 다양한 용량이 용량 반응 성과를 결정하기 위하여 이용된다. 100㎍ 총 용량을 위한 분할 용량은 선택된 총 용량의 투여와 동일한 3 혹은 6 용량의 1.6㎍, 4.2㎍, 8.3㎍, 16.6㎍ 또는 값 및 총 용량을 포함한다.
주사 부위는 주사를 위하여 적절한 면적을 제공하는 사지 혹은 임의의 신체 표면으로부터 선택된다. 이것은 또한 피부(피부내), 표피(상피), 피하 조직(SC) 또는 근육(IM)을 표적화하는 주사 깊이의 선택을 포함할 수 있다. 주사 각도는, 피부의 표면의 평면으로부터의 10 내지 15도 각도, 피하 주사를 위하여 피부의 표면의 평면으로부터 20 내지 45도 사이의 각도, 및 실질적으로 근육 내로 주사하기 위한 60 내지 90도 사이가 되도록 피부내 부위를 표적화하는 주사로 표적화된 전달 부위에 기초하여 다양할 것이다.
실시예 49. 엑소좀에서의 정량화
본 발명의 mmRNA의 양 및 국재화는 단리된 엑소좀의 양(초기, 시간 경과 또는 잔류 기준)을 측정함으로써 결정될 수 있다. 이 연구에서, mmRNA는 전형적으로 내인성 mRNA와는 서열이 독특하고 코돈-최적화되어 있으므로, mmRNA의 수준은 기빙스(Gibbings)의 방법(제PCT/IB2009/005878호, 이 문헌의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함됨)을 이용해서 천연 혹은 야생형 mRNA의 내인성 수준과 비교해서 정량화된다.
이들 연구에서, 이 방법은 바람직하게는 본 발명의 mmRNA로 미리 처치된 환자의 체액으로부터 엑소좀 혹은 소포를 우선 단리시키고 나서, 상기 엑소좀에서의 변경된 mmRNA 수준을, mRNA 마이크로어레이, qRT-PCR 또는 적절한 항체 혹은 면역조직화학 방법에 의해 포함하는 당업계의 RNA를 측정하기 위한 기타 수단 중 하나에 의해 측정함으로써 수행된다.
실시예 50. 변형된 mRNA 형질주입
A. 역방향 형질주입
24-웰 콜라겐-피복된조직 배양판에서 수행되는 실험을 위하여, 각질세포를 1 x 105의 세포 밀도로 파종한다. 96-웰 콜라겐-피복된조직 배양판에서 수행되는 실험을 위하여, 각질세포를 0.5 x 105의 세포 밀도로 파종한다. 형질주입될 각 변형된 mRNA(mmRNA)을 위하여: RNAIMAX™을 기술된 바와 같이 제조하고, 세포가 조직 배양판에 부착되기 전에 소정 시간 기간, 예컨대, 6시간 내에 다중- 플레이트 내의 세포와 혼합한다.
B. 순방향 형질주입
24-웰 콜라겐-피복된조직 배양판에서, 각질세포를 0.7 x 105의 세포 밀로로 파종한다. 96-웰 콜라겐-피복된조직 배양판에서 수행되는 실험을 위하여, 각질세포를 0.3 x 105의 세포 밀도로 파종한다. 각질세포를 24시간에 걸쳐서 70% 미만의 컨플루언시로 성장시킨다. 형질주입될 각 변형된 mRNA(mmRNA)를 위하여, 변형된 mRNA: RNAIMAX™을 기재된 바와 같이 제조하고 조직 배양판에의 세포 파종 및 부착 후 24시간에 걸쳐서 다중-웰 플레이트 내의 세포 상에 형질주입시킨다.
C. 변형된 mRNA 번역 선별: G-CSF ELISA
각질세포는 70% 미만의 컨플루언스에서 인비트로젠사(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)로부터의 서플리멘트 S7을 구비한 에피라이프(EPILIFE) 배지에서 성장시킨다. 1세트의 각질세포에 인비트로젠사로부터의 RNAIMAX™으로 복합체화된 화학적으로 변형된 mRNA(mmRNA) 300ng을 역방향 형질주입시켰다. 다른 세트의 각질세포를 인비트로젠사로부터의 RNAIMAX™과 복합체화된 변형된 mRNA 300ng으로 순방향 형질주입시킨다. 변형된 mRNA: RNAIMAX™ 복합체는 우선 5X 용적의 희석액 중 서플리멘트-무함유 에피라이프(EPILIFE)® 배지에서 RNA를 실온에서 10분 동안 배앙함으로써 형성된다.
제2바이알에서, RNAIMAX™ 시약은 10X 용적의 희석액 중 서플리멘트-무함유 에피라이프(EPILIFE)® 배지에서 RNA를 실온에서 10분 동안 배앙하였다. RNA 바이알은 이어서 RNAIMAX™ 바이알과 혼합하고, 20 내지 30분 동안 실온에서 배양하고 나서 적가 방식으로 세포에 첨가한다. 배양 배지 중의 분비된 인간 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF) 농도는 세 벌의 화학적으로 변형된 mRNA의 각각에 대해서 형질주입 후 18시간째에 측정한다.
형질주입된 인간 각질세포로부터의 인간 G-CSF의 분비는 제조사의 권고된 지시사항에 따라서 R&D 시스템(미네소타주의 미니애폴리스시에 소재) 또는 인비트로젠사로부터의 ELISA 키트를 이용해서 정량화한다.
D. 변형된 mRNA 용량 및 지속기간: G-CSF ELISA
각질세포는 70% 미만의 컨플루언스에서 인비트로젠사로부터의 서플리멘트 S7을 구비한 에피라이프(EPILIFE)® 배지에서 성장시켰다. 각질세포에 인비트로젠사(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)로부터의 RNAIMAX™으로 복합체화된 변형된 mRNA 0ng, 46.875ng, 93.75ng, 187.5ng, 375ng, 750ng 또는 1500ng을 형질주입시켰다. 변형된 mRNA:RNAIMAX™ 복합체는 기재된 바와 같이 형성한다. 배양 배지 내 분비된 인간 G-CSF 농도는 각 변형된 mRNA의 각 농도에 대해서 세 벌로 형질주입 후 0, 6, 12, 24 및 48시간에 측정한다. 형질주입된 인간각질세포로부터의 인간 G-CSF의 분비는 제조사의 권고 지시사항에 따라서 R&D 시스템 또는 인비트로젠사로부터의 ELISA 키트를 이용해서 정량화한다.
실시예 51. ELISA 검정을 이용한 변형된 mRNA에 대한 세포의 선천적 면역 반응의 검출
시험관내-형질주입된 인간 각질세포 세포로부터 분비된 인간 종양 괴사 인자-α(TNF-α), 인간 인터페론-β(IFN-β) 및 인간 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF)에 대한 효소-연결된 면역흡착 검정(ELISA)을 세포의 선천성 면역 반응의 검정을 위하여 테스트한다. 각질세포는 70% 미만의 컨플루언스에서 인비트로젠사(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)로부터의 하이드로코르티손의 부재에서 인간 각질세포 성장 서플리멘트를 구비한 에피라이프(EPILIFE)® 배지에서 성장시킨다. 분비된 TNF-α 각질세포에 세 벌로 인비트로젠사로부터의 RNAIMAX™으로 복합체화된 화학적으로 변형된 mRNA(mmRNA) 0ng, 93.75ng, l 87.5ng, 375ng, 750ng, 1500ng 또는 3000ng을 형질주입시켰다. 배양 배지 내 분비된 TNF-α는 인비트로젠사로부터의 ELISA 키트를 이용해서 제조사의 프로토콜에 따라서 화학적으로 변형된 mRNA의 각각에 대해서 형질주입 후 24시간째에 측정한다.
동일 배양 배지 내의 분비된 IFN-β는 인비트로젠사로부터의 ELISA 키트를 이용해서 제조사의 프로토콜에 따라서 화학적으로 변형된 mRNA의 각각에 대해서 형질주입 후 24시간째에 측정한다. 동일 배양 배지 내의 분비된 인간 G-CSF 농도는 화학적으로 변형된 mRNA의 각각에 대해서 형질주입 후 24시간째에 측정한다. 인간 각질세포로부터의 인간 G-CSF의 분비는 제조사의 권고된 지시사항에 따라서 R&D 시스템(미네소타주의 미니애폴리스시에 소재) 또는 인비트로젠사로부터의 ELISA 키트를 이용해서 정량화한다. 이들 데이터는, 변형된 mRNA(mmRNA)가 예시적인 유형 1 사이토카인 TNF-α 및 IFN-β를 측정함으로써 천연 및 기타 화학적으로 변형된 폴리뉴클레오타이드 또는 기준 화합물과 비교해서 저감된 세포 선천성 면역 반응을 유발할 수 있는 것을 나타낸다.
실시예 52. 인간 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF) 변형된 mRNA-유도 세포 증식 검정
인간 각질세포는 24-웰 콜라겐-코팅된 트랜스웰(TRANSWELL)®(코닝사(Coming), 매사추세츠주의 로웰시에 소재) 공-배양 조직 배양판에서 70% 미만의 컨플루언스에서 인비트로젠사로부터의 서플리멘트 S7을 구비한 에피라이프(EPILIFE)® 배지에서 성장시켰다. 각질세포에 세 벌로 기재된 바와 같이 인비트로젠사로부터의 RNAIMAX로 복합체화된 화학적으로 변형된 mRNA(mmRNA) 750ng을 형질주입시켰다. 변형된 mRNA:RNAIMAX 복합체는 기재된 바와 같이 형성된다. 각질세포 배지는 형질주입 후 6 내지 8시간에 교환된다. 42-시간 형질주입 후, 0.4㎛-기공의 반-침투가능한 폴리에스터 막을 구비한 24-웰 트랜스웰(TRANSWELL)® 플레티트 삽입물을 인간 GCSF 변형된 mRNA-형질주입된 각질세포 수용 배양판에 배치한다.
인간 골수아세포 세포인, 카즈미Kasumi)-1 세포 또는 KG-1(0.2 x 105세포)를 상기 삽입물 웰에 파종하고, 96-웰 플레이트 내 100 내지 120㎕ 용적에서 사이퀀트 다이렉트 셀 증식 아세이(CyQuant Direct Cell Proliferation Assay)(인비트로젠사, 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)를 이용해서 공동 배양 개시 후 42시간째에 세포 증식을 정량화한다. 변형된 mRNA-암호화 인간 G-CSF-유도 골수아세포의 세포 증식은 형질주입하지 않은 각질세포/골수아세포 공동-배양 대조 웰에 대해서 정규화된 세포 증식 퍼센트로서 표현된다. 각질세포 및 골수아세포 삽입물 공동 배양 웰 양쪽 모두에서의 분비된 인간 G-CSF 농도는 두 벌로 각 변형된 mRNA에 대해서 공동 배양 개시 후 42시간째에 측정한다. 인간 G-CSF의 분비는 제조사의 권고 지시사항에 따라서 인비트로젠사의 ELISA 키트를 이용해서 정량화한다.
인간 각질세포 공급물 세포 및 형질주입되지 않은 인간 골수아세포 내 형질주입된 인간 G-CSF 변형된 mRNA는 RT-PCR에 의해 검출된다. 샘플 세포로부터의 총 RNA는 제조사의 지시사항에 따라서 RNEASY® 키트(퀴아겐사, 캘리포니아주의 발렌시아시에 소재)를 이용해서 추출하고 용해시킨다. 추출된 총 RNA는 프로스크립트(PROTOSCRIPT)® M-MuLV Taq RT-PCR 키트(뉴 잉글랜드 바이오랩스사(New England BioLabs), 매사추세츠주의 입시치시에 소재)를 이용해서 변형된 mRNA-G-CSF의 특정 증폭에 대해서 RT-PCR을 실시한다. RT-PCR 산물은 1.2% 아가로스 겔 전기영동에 의해 가시화한다.
실시예 53. 완충액 제형 연구
완충 용액 중 G-CSF 변형된 mRNA(서열번호 6; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; N1-유사유리딘 및 5-메틸사이토신으로 완전 변형됨) 또는 인자 IX 변형된 mRNA(서열번호 10; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; N1-유사유리딘 및 5-메틸사이토신으로 완전 변형됨)를, 표 78에 기재된 바와 같이 래트 당 200㎍의 변형된 mRNA 용량에서 주사 부피 50㎕(n=5)로 래트들에게 근육내에 투여한다. 변형된 mRNA는 1-2일 동안 수중에서 동결건조시킨다. 이어서, 6 ㎎/㎖의 표적 농도로 이하에 열거된 완충액 중에 재구성시킨다. 농도는 OD 260에 의해 구한다. 샘플은 투약 전에 적절한 완충액 중에 4 ㎎/㎖로 희석시킨다.
변형된 mRNA를 석출시키기 위하여, 3M 아세트산나트륨, pH 5.5 및 순수 에탄올을 각각 변형된 mRNA의 총 용적의 4배 및 총 용적의 1/10배로 첨가한다. 재료는 -80C에서 최소 1시간 동안 배치한다. 이어서 재료를 4000 rpm, 4C에서 30분 동안 원심분리한다. 상청액을 제거하고, 펠릿을 원심분리하고 75% 에탄올로 3회 세척한다. 마지막으로, 펠릿을 완충액으로 표적 농도 6 ㎎/㎖로 재구성한다. 농도는 OD 260에 의해 구한다. 샘플은 투약 전에 적절한 완충액 중에 4 ㎎/㎖로 희석시킨다. 모든 샘플은 이하에 표시하지 않는 한 동결건조에 의해 제조한다.
Figure pct00226
혈청 샘플은 각종 시간 간격에서 래트로부터 수집하고, G-CSF 또는 인자 IX ELISA를 이용해서 G-CSF 또는 인자 IX 단백질 발현에 대해 분석한다.
실시예 54. 다회-용량 연구
스프라그-다우리 래트(n=8; 4마리의 암컷, 4마리의 수컷)에 28일에 걸쳐서 8회(주 2회) 정맥내 주사한다. 래트들에는 지질 나노입자에 제형화된 루시페라제 변형된 mRNA의 인간 G-CSF 변형된 mRNA 0.5 ㎎/㎏, 0.05 ㎎/㎏, 0.005 ㎎/㎏ 또는 0.0005 ㎎/㎏, 식염수 중 인간 G-CSF 변형된 mRNA 0.5 ㎎/㎏, 인간 G-CSF 단백질 뉴포겐(Neupogen) 또는 지질 나노입자에 제형화된 비-번역가능한 인간 G-CSF 변형된 mRNA 0.2 ㎎/㎏을 주사한다. 혈청은 G-CSF 단백질 발현(그 주의 제1용량 후 8, 24 및 72시간), 전혈구수 및 백혈구수(그 주의 제1용량 후 24 및 72시간) 및 임상 화학(그 주의 제1용량 후 24 및 72시간)을 평가하기 위하여 미리 결정된 시간 간격 동안 수집한다. 래트는, 혈구수, 백혈구수, 임상 화학, 단백질 발현을 결정하고 또한 조직병리학 및 부검에 의한 주된 장기에 대한 효과를 평가하기 위하여, 최종 투약 후 4일인 29일째에 희생시킨다. 또한, 항체 검정은 29일째에 래트에 대해 수행한다.
실시예 55. 루시페라제 LNP 생체내 연구
루시페라제 변형된 mRNA(서열번호 16; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일, 5'캡, Cap1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨)는 주사기 펌프법을 이용해서 지질 나노입자(LNP)로서 제형화되었다. LNP는 50:10:38.5:1.5(DLin-KC2-DMA: DSPC: 콜레스테롤: PEG-DMG)의 지질 몰비를 지니는 20:1 중량비의 총 지질 대 변형된 mRNA로 제형화되었다. 표 79에 표시된 바와 같이, 루시페라제 LNP 제형은 입자 크기, 제타 전위 및 봉입에 의해 특성규명되었다.
Figure pct00227
표 80에 대략적으로 표시된 바와 같이, 루시페라제 LNP 제형은 Balb-C 마우스(n=3)에게 근육내, 정맥내 및 피하로 투여하고, PBS 중에 제형된 루시페라제 변형된 RNA는 마우스에게 정맥내로 투여하였다.
Figure pct00228
루시페라제 LNP 제형을 정맥내 및 근육내에 투여한 마우스는 2, 8, 24, 48, 120 및 192시간에 촬영하고, 그리고 루시페라제 LNP 제형을 피하 투여한 마우스는 2, 8, 24, 48 및 120시간에 촬영하여 표 81에 표시된 바와 같이 루시페라제 발현을 측정하였다. 표 81에서, "NT"는 테스트되지 않은 것을 의미한다. 영상화 20분 전에, 마우스에게 D-루시페린 용액을 150 ㎎/㎏으로 복강내로 주사하였다. 이 동물은 이어서 마취시키고, IVIS 루미나 II 이미징 시스템(IVIS Lumina II imaging system)(퍼킨 엘머사)으로 영상을 획득하였다. 생물발광은 전체 마우스의 총 플럭스(광자/초)로서 측정되었다.
Figure pct00229
LNP 제형이 정맥내로 투여된 1마리의 마우스는 간 및 비장에서의 루시페라제 발현을 결정하기 위하여 8시간째에 희생시켰다. 또한, LNP 제형이 근육내로 투여된 1마리의 마우스는 주사 부위 주위 그리고 간 및 비장 내에서의 루시페라제 발현을 결정하기 위하여 8시간째에 희생시켰다. 표 82에 표시된 바와 같이, 발현은 정맥내 및 근육내 투여 후의 간과 비장, 그리고 근육내 주사 부위의 근육 내 모두에서 보였다.
Figure pct00230
실시예 56. 시험관내 PBMC 연구: 변형 퍼센트
5-메틸사이토신(5mC) 및 슈도우리딘(유사U)으로 변형된 G-CSF mRNA 또는 비변형 G-CSF mRNA 480ng을, 3명의 정상 혈액 공여자(D1, D2 및 D3)로부터의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 내에 0.4㎕의 리포펙타민 2000과 함께 형질주입시켰다. G-CSF mRNA(서열번호 6; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1)를 5mC 및 유사U로 변형시키거나(100% 변형), 5mC 및 유사U로 변형시키지 않거나(0% 변형) 또는 mRNA가 75% 변형, 50% 변형 또는 25% 변형을 함유하도록 5mC 및 유사U로 부분 변형시켰다. 루시퍼라제(서열 번호 16으로 표시된 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리 A 테일; 5'캡, 캡 1; 완전히 변형된 5meC 및 유사U)의 대조 샘플은 또한 G-CSF 발현에 대해 분석하였다. 리포펙타민2000, LPS, R-848, 루시페라제(서열번호 16으로 표시된 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드 폴리A 테일; 5'캡, 캡1; 완전 변형된 5mC 및 유사) 및 P(I)P(C)의 TNF-알파 및 IFN-알파 대조군 샘플에 대해서 또한 분석되었다. 상청액을 수거하고, 단백질 발현을 결정하기 위하여 형질주입 후 22시간째에 ELISA에 의해 실행시켰다. G-CSF의 발현은 표 83에 표시되어 있고, IFN-알파 및 TNF-알파의 발현은 표 84에 표시되어 있다. IFN-알파 및 TNF-알파의 발현은 G-CSF mRNA의 형질주입으로부터의 부차적인 효과일 수 있다. 표 83 및 표 84는, G-CSF, 인터페론 알파(IFN-알파) 및 종양 괴사 인자-알파(TNF-알파)의 화학적 변형의 양이, mRNA가 완전히 변형되지 않은 경우 적정될 수 있으며, 적정가능한 경향은 각각의 표적에 대해 동일하지 않음을 나타낸다.
위에서 나타낸 바와 같이, 시험관내 검정 시스템에서처럼 PBMC를 사용하여, 번역(이 경우 G-CSF 단백질 생산)과 사이토카인 생산(이 경우 IFN-알파 단백질 생산으로 예시) 사이에 상관관계를 확립하는 것이 가능하다. 보다 우수한 단백질 생산은 선천적 면역 활성화 경로의 보다 낮은 유도와 상관되며, 화학물질의 변형 퍼센트는 당해 비를 기준으로 유리하게 판단할 수 있다(표 85). 표 83 및 표 84로부터 계산되고, 표 85에 표시된 바와 같이, 5-메틸사이티딘 및 슈도우리딘에 의한 완전한 변형은 어떠한 변형(천연의 G-CSF mRNA)도 없는 것보다 훨씬 더 양호한 비의 단백질/사이토카인 생산을 나타낸다(IFN-알파의 경우 100배 및 TNF-알파의 경우 27배). 부분적인 변형은 점증적으로 적은 변형이 낮은 단백질/사이토카인 비를 생성하는 선형 관계를 나타낸다.
Figure pct00231
Figure pct00232
Figure pct00233
실시예 57. PBMC에 형질주입된 변형된 RNA
5-메틸사이토신(5mC) 및 유사유리딘(유사U)으로 변형된 G-CSF mRN 또는 비변형 G-CSF mRNA 500ng을 3명의 정상 혈액 공여자(D1, D2 및 D3)로부터의 말초 혈액 단핵구(PBMC)에 0.4㎕의 리포펙타민 2000과 함께 형질주입시켰다. G-CSF mRNA(서열번호 6; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1)는 5mC 및 유사U로 완전히 변형시키거나(100% 변형), 5mC 및 유사U로 변형시키지 않거나(0% 변형), 또는 mRNA가 50% 변형, 25% 변형, 10% 변형, 5% 변형, 1% 변형 혹은 0.1% 변형을 포함하도록 5mC 및 유사U로 부분적으로 변형시켰다. mCherry(서열번호 7로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5meC 및 유사유리딘으로 완전 변형됨) 및 5-메틸사이토신 및 유사유리딘로 완전 변형된 G-CSF의 대조군 샘플(대조군 G-CSF)은 또한 G-CSF 발현에 대해서 분석하였다. 리포펙타민2000, LPS, R-848, 루시페라제(서열번호 16으로 표시된 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드 폴리A 테일; 5'캡, 캡1; 완전 변형된 5mC 및 유사) 및 P(I)P(C)의 종양 괴사 인자-알파(TNF-알파) 및 인터페론-알파(IFN-알파) 대조군 샘플에 대해서 또한 분석하였다. 상청액을 형질주입 후 6시간 및 18시간째에 수확하고, 단백질 발현을 구하기 위하여 ELISA에 의해 실행하였다. 공여자 1에 대한 G-CSF, IFN-알파, 및 TNF-알파의 발현은 표 86에 표시되어 있고, 공여자 2는 표 87에 표시되어 있으며, 공여자 3은 표 88에 표시되어 있다.
5-메틸시티딘 및 유사유리딘에 의한 완전 100% 변형은 대부분의 단백질 번역(G-CSF)에서 일어났고, 최저량의 사이토카인이 세 인간 PBMC 공여자 모두에 걸쳐서 생산되었다. 변형의 감소하는 양은 보다 많은 사이토카인 생산(IFN-알파 및 TNF-알파)을 초래하므로, 사이토카인들을 감소시키고 단백질 번역을 개선시키기 위한 완전한 변형의 중요성을 추가로 강조한다(본 명세서에서 G-CSF 생산으로 입증됨).
Figure pct00234
Figure pct00235
Figure pct00236
실시예 58. BJ 섬유아세포에서의 선천적 면역 반응 연구
A. 단일 형질주입
인간 원시 포피 섬유아세포(BJ 섬유아세포)는 ATCC(American Type Culture Collection)(카탈로그 번호 CRL-2522)로부터 입수하여, 5% CO2 하에 37℃에서 10% 소 태아 혈청이 보충된 이글의 최소필수배지(ATCC, 카탈로그 번호 30-2003)에서 성장시켰다. BJ 섬유아세포를 0.5㎖의 배양 배지 내 웰당 300,000개 세포의 밀도로 24-웰 플레이트 상에 파종하였다. 5-메틸사이토신 및 유사유리딘(Gen1)으로 완전 변형된 또는 5-메틸사이토신으로 완전 변형되고 그리고 캡0, 캡1 또는 어떠한 캡도 지니지 않은 N1-메틸유사유리딘(Gen2)으로 완전 변형된 변형된 G-CSF mRNA(서열번호 6으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 140개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1) 250ng은 제조사의 프로토콜에 따라서 리포펙타민 2000(인비트로젠사, 카탈로그 번호 11668-019)으로 형질주입하였다. 대조군 샘플인 폴리 I:C(PIC), 리포펙타민 2000(Lipo), 천연의 루시페라제 mRNA(서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1) 및 천연의 G-CSF mRNA도 형질주입시켰다. 세포를 18시간 후에 수확하고, 총 RNA를 단리시키고, DNASE®를 제조사의 프로토콜에 따라서 RNeasy 마이크로 키트(카탈로그 번호 74004)를 이용해서 처리하였다. 100ng의 총 RNA를 고 용량(capacity) cDNA 역전사 키트(제품 번호4368814)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 cDNA 합성에 사용하였다 이어서, cDNA를 선천적 면역 반응 유전자의 발현에 대해 바이오라드(Biorad) CFX 384 장치 속에서 SybrGreen을 사용하는 정량적 실시간 PCR 의해 제조사의 프로토콜에 따라 분석하였다. 표 89는 하우스-키핑 유전자(house-keeping gene) HPRT(하이포잔틴 포스포리보실트랜스페라제)에 대해 상대적인 선천적 면역 반응 전사물의 발현 수준을 보이며, HPRT에 대해 배-유도(fold-induction)로서 나타낸다. 표에서, 표준 측정기준의 패널은 다음을 포함한다: RIG-I는 레티노산 유도성 유전자 1이고, IL6은 인터루킨-6이며, OAS-1은 올리도아데닐레이트 신타제 1이고, IFNb는 인터페론-베타이며, AIM2는 흑색종-2에 존재하지 않으며, IFIT-1은 테트라트리코펩타이드 반복체 1을 지닌 인터페론-유도된 단백질이고, PKR은 단백질 키나제 R이며, TNFα는 종양 괴사 인자 알파이고, IFNα는 인터페론 알파이다.
Figure pct00237
B. 반복 형질주입
인간 원시 포피 섬유아세포(BJ 섬유아세포)는 ATCC(American Type Culture Collection)(카탈로그 번호 CRL-2522)로부터 입수하여, 5% CO2 하에 37℃에서 10% 소 태아 혈청이 보충된 이글의 최소필수배지(ATCC, 카탈로그 번호 30-2003)에서 성장시켰다. BJ 섬유아세포를 0.5㎖의 배양 배지 내 웰당 300,000개의 세포의 밀도로 24-웰 플레이트 상에 파종하였다. 5-메틸사이토신 및 유사유리딘(Gen1)으로 완전 변형되거나, 또는 5-메틸사이토신 및 N1-메틸유사유리딘(Gen2)으로 완전 변형된 변형된 G-CSF mRNA(서열번호 6으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 140개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1) 250ng을 제조사의 프로토콜에 따라서 5일 동안 매일 형질주입시켰다. 리포펙타민 2000(L2000) 및 mCherry mRNA(서열번호 7로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸시티딘 및 유사유리딘으로 완전 변형됨)의 대조군 샘플들은 또한 5일 동안 매일 형질주입되었다. 결과는 표 90에 나타낸다.
비변형 mRNA는 1일 후에 인터페론-베타(IFN-베타) 및 인터류킨-6(IL-6) 중에서 사이토카인 반응을 보였다. 적어도 유사유리딘으로 변형된 mRN는 2 내지 3일 후에 사이토카인 반응을 보인 반면, 5-메틸사이토신 및 N1-메틸유사유리딘으로 변형된 mRNA는 3 내지 5일 후에 저감된 반응을 보였다.
Figure pct00238
실시예 59. 선천적 면역 반응 연구의 생체내 검출
암컷 BALB/C 마우스(n=5)에게, 표 91에 기재된 바와 같은, 캡1의 5'캡을 지니는 G-CSF mRNA(GCSF mRNA unmod)(서열번호 6으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일), 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형된 G-CSF mRNA(GCSF mRNA 5mc/pU), 5'캡을 지니는 G-CSF mRNA(GCSF mRNA 5mc/N1pU) 또는 5'캡을 지니지 않는(GCSF mRNA 5mc/N1 pU 캡 없음) 5-메틸사이토신 및 N1-메틸유사유리딘으로 완전 변형된 G-CSF mRNA 또는 R848 혹은 5% 수크로스의 대조군을 근육내로 주사하였다. 투약 후 8시간째에 혈액을 수집하고, ELISA를 사용하여 G-CSF 및 인터페론-알파(IFN-알파)의 단백질 수준을 ELISA에 의해 구하여 표 81에 나타낸다.
표 91에 표시된 바와 같이, 비변형, 5mc/pU 및 5mc/N1pU 변형된 G-CSF mRNA는 마우스 혈청 중에 인간 G-CSF 발현을 일으켰다. 캡핑되지 않은 5mC/N1pU 변형된 G-CSF mRNA는 혈청 중에 인간 G-CSF 발현을 보이지 않았으며, 이는 단백질 번역을 위한 5' 캡 구조를 갖는 것의 중요성을 강조한다.
예측된 바와 같이, 인간 G-CSF 단백질은 R848, 5% 수크로스 단독 및 미처리군에서 발현되지 않았다. 중요하게도, 유의적인 차이가 혈청 중 마우스 IFN-알파에 의해 측정된 바와 같은 사이토카인 생산에서 관찰되었다. 예측된 바와 같이, 비변형 G-CSF mRNA는 생체내에서 풍부한 (양성 대조군인 R848보다 큰) 사이토카인 반응을 입증하였다. 5mc/pU 변형된 G-CSF mRNA는 사이토카인 반응 생체내에서 낮지만 검출가능한 사이토카인 반응을 보인 반면, 5mc/N1pU 변형된 mRNA는 혈청 중 검출가능한 IFN-알파는 보이지 않았다(비히클 혹은 미처리 동물과 동일함).
또, 5mc/N1pU 변형된 mRNA의 반응은 이것이 캡핑되어 있는지의 여부와 상관 없이 동일하였다. 이들 생체내 결과는 1) 비변형 mRNA가 풍부한 선천적 면역 반응을 일으키고, 2) 이는 5mc/pU의 변형의 100% 혼입을 통해 저감되지만, 소멸되지는 않고, 그리고 3) 5mc/N1pU 변형의 혼입이 검출가능한 사이토카인 반응을 일으키지 않는다는 결론을 보강한다.
마지막으로, 이들 주사가 5% 수크로스(이는 자체로서는 효과가 없음) 속에 있다면, 이들 결과는 이들 변형의 면역자극 효능을 정확하게 반영하여야 한다.
이 데이터로부터 N1pU 변형된 분자사 보다 많은 단백질을 생산하지만 동시에 IFN-알파 발현에 있어서 효과는 거의 없거나 전혀 없음이 명백하다. 캡핑이 이러한 화학적 변형을 위한 단백질 생산에 요구됨은 또한 명백하다. 비변형 mRNA(PC=9)에 대한 PC 비에 비해서 748의 단백질:사이토카인의 비는, 이 화학적 변형이 IFN-알파와 관련된 효과 또는 생물학적 영향과 관련된 바와 같이 훨씬 우수함을 의미한다.
Figure pct00239
실시예 60: 변형된 RNA의 생체내 전달
변형된 mRNA의 단백질 생산은 변형된 G-CSF mRNA 혹은 변형된 인자 IX mRNA를 암컷 스프라그 다울리 래트(n=6)로 전달함으로써 평가하였다. 래트들은 5% 수크로스 중에 동결건조된 형태로부터 재구성된 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형된 G-CSF mRNA(서열번호 6으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1)(G-CSF Gen1), 5-메틸사이토신 및 N1-메틸유사유리딘으로 완전 변형된 G-CSF mRNA(G-CSF Gen2) 또는 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형된 인자 IX mRNA(서열번호 10으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1)(인자 IX Gen1) 100㎕ 중 400㎍으로 주사하였다. 혈액을 주사 후 8시간에 수집하고, 혈청 내 G-CSF 단백질 수준을 ELISA에 의해 측정하였다. 표 92는 8시간 후 혈청 중 G-CSF 단백질 수준을 표시하고 있다.
이들 결과는, G-CSF Gen 1 및 G-CSF Gen 2 변형된 mRNA가 단일 근육내 주사 후 래트에서 인간 G-CSF 단백질을 생산할 수 있고, 또한 인간 G-CSF 단백질 생산이 Gen 1 화학에 비해서 Gen 2 화학을 이용한 경우 개선된 것을 입증한다.
Figure pct00240
실시예 61. 변형된 RNA의 안정성
변형된 RNA의 통합성을 유지하기 위한 저장 조건의 보다 나은 이해를 얻기 위하여 안정성 실험을 수행하였다. 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형된 비변형 G-CSF mRNA(서열번호 6으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1), G-CSF mRNA(서열번호 6으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1) 및 5-메틸사이토신으로 완전 변형되고 및 RNAIMAX™의 0.75용적%로 유사유리딘 리포플렉스화된 G-CSF mRNA는 50℃, 40℃, 37℃, 25℃, 4℃ 또는 -20℃에서 저장하였다. mRNA를 0시간, 2시간, 6시간, 24시간, 48시간, 5일 및 14일 동안 저장한 후, mRNA를 겔 바이오-라드(Bio-Rad) 엑스페리온(EXPERION)™ 시스템을 이용해서 전기영동에 의해 분석하였다. 변형된, 변형되지 않은(비변형) 및 리포플렉스화된 G-CSF mRNA는 또한 겔 전기영동에 의해 분석하기 전에 RNASTABLE® (바이오매트리카사(Biomatrica, Inc.), 캘리포니아주의 샌디에이고시에 소재) 속에 40℃에서, 또는 물 속에 -80℃ 또는 40℃에서 35일 동안 저장하였다.
안정화제가 없는 모든 mRNA 샘플은 4℃ 또는 -20℃에서 저장 2주 후에 안정적이었다. 리포플렉스를 지니거나 지니지 않는 변형된 G-CSF mRNA는 25℃(5일 대 48시간까지 안정), 37℃(24시간 대 6시간까지 안정) 및 50℃(6시간 대 2시간까지 안정)에서 저장 시 비변형 G-CSF보다 더 안정적이었다. 비변형 G-CSF mRNA, 리포플렉스를 지니거나 지니지 않는 변형된 G-CSF mRNA는 12회의 동결/해동 사이클을 견디었다.
40℃에서 안정화제 속에 저장된 mRNA 샘플은 35일 후 -80℃에서 물 속에 저장된 mRNA 샘플과 유사한 안정성을 나타내었지만, 40℃에서 물 속에 저장된 mRNA는 18일 후 상당한 분해를 보였다.
4℃, 25℃ 및 37℃에서 저장된 mRNA 샘플은 1x TE 완충액 혹은 제형 완충액(150mM 염화나트륨, 2mM 염화칼슘, 2mM 포스페이트, 0.5mMmMTA, pH 6.5) 속에 저장되었다. 4℃에서 저장된 mRNA는 TE 및 제형 완충액의 양쪽 모두에서 적어도 60일까지 안정적이었다. 25℃에서 제형 완충액 중 mRNA는 14일까지 안정적이었고, TE 완충액은 적어도 6일 동안 안정적이었다. 37℃에서 제형 완충액 중 mRNA의 저장은, 단지 4일만 안정적이던 TE 완충액에 비해서 6일까지 안정적이었다.
실시예 62. 제형화된 mRNA에 대한 화학적 변형의 효과
5-메틸사이토신 및 2'플루오로유리딘으로 완전 변형된 루시페라제 mRNA(서열번호 16; 서열로 표시되지 않은 대략 140개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1)는 식염수 또는 DLin-MC3-DMA로 제형화되고, 0.5 ㎎/㎏, 0.05 ㎎/㎏, 0.005 ㎎/㎏ 및/또는 0.0005 ㎎/㎏의 용량으로 설치류에게 정맥내, 근육내 혹은 피하에 투여된다. 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형된 루시페라제 mRNA(서열번호 16; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1)는 DLin-MC3-DMA로 제형화하고, 0.5 ㎎/㎏, 0.05 ㎎/㎏, 0.005 ㎎/㎏ 및/또는 0.0005 ㎎/㎏의 용량으로 설치류에게 근육내 혹은 피하에 투여한다. DLin-MC3-DMA 제형은 평균 크기 및 제타 전위를 결정하기 위하여 투여 전에 분석된다. 설치류는 투약 후 2시간, 8시간, 24시간, 72시간, 96시간, 144시간 및 168시간에 영상화하고, 생물발광은 각 투여 경로 및 제형에 대해서 초당 광자로 측정한다.
실시예 63. PLGA 제형화된 mRNA의 발현
A. 루시페라제 PLGA 미소구의 합성 및 특성규명
5-메틸사이토신 및 N1-메틸 유사유리딘으로 완전 변형되거나, 2-티오유리딘으로 대체된 25%의 유리딘과 5-메틸사이토신으로 대체된 25%의 사이토신으로 변형되거나, N1-메틸 유사유리딘으로 완전 변형되거나, 유사유리딘으로 완전 변형된 루시페라제 mRNA(서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 140개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1)는 1x TE 완충액 중에 재구성하고 나서 PLGA 미소구로 제형화하였다. PLGA 미소구는 당업계에 공지된 물/오일/물 이중 유화 방법을 이용해서 PLGA-에스터 캡(락텔사, Cat# B6010-2, 고유 점도 0.55-0.75, 50:50 LA:GA), 폴리비닐알코올(PVA)(시그마사, Cat#348406-25G, MW13-23k) 다이클로로메탄 및 물을 이용해서 합성하였다. 간단히, 4 ㎎/㎖(W1)에서 TE 완충액 중 mRNA 0.4㎖를 200 ㎎/㎖의 PLGA의 농도에서 다이클로로메탄(DCM)(O1) 중에 용해된 PLGA 2㎖에 첨가하였다. W1/O1 에멀전을 속도 5(~19,000 rpm)에서 30초 동안 균질화시켰다(이카 울트라-튜락스 균질화기, T18). 이어서, 250㎖의 1% PVA(W2)에 W1/O1 에멀전을 첨가하고, 속도 5(~19,000 rpm)에서 1분 동안 균질화시켰다. 제형은 3시간 동안 교반하고 나서, 100㎛ 나일론 메쉬 스트레이너(Fisherbrand Cell Strainer, Cat # 22-363-549)를 통과시켜 보다 큰 응집물을 제거하고, 마지막으로 원심분리(10분, 9,250 rpm, 4℃)에 의해 세척하였다. 상청액을 버리고 PLGA 펠릿을 물 5 내지 10㎖에 재현탁시키고, 이것을 2회 반복하였다. 세척과 물을 이용한 재현탁 후, 100 내지 200㎕의 PLGA 미소구 샘플을 이용해서 레이저 회절에 의해 제형의 입자 크기를 측정하였다(몰번 마스터사이저(Malvern Mastersizer)2000). 세척된 제형을 액체 질소 중에서 동결시키고 나서, 2 내지 3일 동안 동결건조시켰다.
동결건조 후, ~10㎎의 PLGA MS를 2㎖ 에펜도르프 튜브 중에서 칭량하고, DCM 1㎖를 첨가하고 샘플을 2 내지 6시간 동안 진탕시킴으로써 탈제형화시켰다. 물 0.5㎖를 첨가하고 샘플을 하룻밤 진탕함으로써 탈제형화된 PLGA 미소구로부터 mRNA를 추출하였다. TE 완충액 중 비제형화된 루시페라제 mRNA(비제형화된 대조군)를 DCM 중에 스파이킹하고, 형질주입 검정에서 대조군으로서 이용되도록 탈제형 과정(탈제형화 대조군)을 수행하였다. 봉입 효율, 중량 퍼센트 장입 및 입자 크기는 표 93에 표시되어 있다. 봉입 효율은 PLGA 미소구의 탈제형화로부터의 mRNA의 ㎎을 제형에 첨가된 초기량의 mRNA로 나눔으로써 산출하였다. 제형 중 장입 중량 퍼센트는 PLGA 미소구의 탈제형화로부터의 mRNA의 ㎎을 제형에 첨가된 초기량의 PLGA로 나눔으로써 산출하였다.
Figure pct00241
B. PLGA 미소구 내에 봉입된 변형된 mRNA의 단백질 발현
형질주입 전날, 20,000 HeLa 세포(ATCC 번호 CCL-2; 버지니아주의 머내서스시에 소재)를 트립신-EDTA 용액(라이프 테크놀로지즈사, 뉴욕주의 그랜드 아일랜드시에 소재)에 의한 처리에 의해 수확하고, 96-웰 세포 배양판(코닝사, 버지니아주의 머내서스시에 소재) 내 웰당 총 용적 100㎕의 EMEM 배지(10%FCS 및 1x 글루타맥스로 보충됨)에 파종하였다. 세포는 37℃에서 5% CO2 분위기 중에서 하룻밤 성장시켰다. 그 다음날, 83ng의 탈제형화된 루시페라제 mRNA PLGA 미소구 샘플, 탈제형화된 루시페라제 mRNA 대조군(탈제형화 대조군) 또는 비제형화된 루시페라제 mRNA 대조군(비제형화 대조군)을 최종 용적 10㎕의 OPTI-MEM(라이프 테크놀로지즈사, 뉴욕주의 그랜드 아일랜드시에 소재) 중에 희석시켰다. 리포펙타민 2000(라이프 테크놀로지즈사, 뉴욕주의 그랜드 아일랜드시에 소재)을 형질주입 시약으로서 이용해서, 0.2㎕를 최종 용적 10㎕의 OPTI-MEM로 희석하였다. 실온에서 배양 5분 후, 두 용액을 배합하고, 실온에서 추가로 15분 배양하였다. 이어서, 배합된 용액 20㎕를, HeLa 세포를 함유하는 세포 배양 배지 100㎕에 첨가하였다. 플레이트를 이어서 앞에서 기재된 바와 같이 배양하였다.
18 내지 22시간 배양 후, 루시페라제를 발현하는 세포를 제조사의 지시사항에 따라서 100㎕ 패시브 라이시스 완충액(Passive Lysis Buffer)(프로메가사(Promega), 위스콘신주의 매디슨시에 소재)에 용해시켰다. 용해물의 분액들을 불투명한 폴리스타이렌 96-웰 플레이트(코닝사, 버지니아주의 머내서스시에 소재)로 옮기고, 100㎕ 완전 루시페라제 검정 용액(프로메가사, 위스콘신주의 매디슨시에 소재)과 배합하였다. 시약 없는 플레이트의 배경 신호는 웰 당 약 200 상대 광 단위었다. 플레이트 판독기는 바이오테크 시너지 H1(BioTek Synergy H1)(바이오테크사(BioTek), 버몬트주의 위누스키에 소재)이었다.
세포를 수확하였으며, 각 샘플에 대해서 생물발광(상대 광 단위, RLU)은 표 94에 표시되어 있다. 이들 샘플의 형질주입은, 루시페라제 mRNA의 다양한 화학이 PLGA 미소구 제형 후 루시페라제 단백질을 여전히 발현할 수 있는 것으로 확인되었다.
Figure pct00242
실시예 64. 인자 IX의 시험관내 연구
A. 혈청-무함유 배지
인간 인자 IX mRNA(서열번호 10으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨)를 혈청-무함유 배지에 형질주입시켰다. 세포 배양 상청액을 수집하고, 펩타이드의 2-차원 HPLC 분리를 실시하기 전에 트립신 소화시켰다. 매트릭스-보조된 레이저 탈착/이온화를 이용해서 펩타이드를 검출하였다. 8가지 펩타이드가 검출되었고, 검출된 펩타이드 중 7가지는 인자 IX에 고유한 것이다. 이들 결과는, 혈청-무함유 배지에 형질주입된 mRNA가 전장 인자 IX 단백질을 발현할 수 있는 것을 나타낸다.
B. 인간 배아 신장(HEK) 293A 세포
250ng의 코돈 최적화 인간 인자 IX mRNA(서열번호 10으로 표시되는 mRNA 서열; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1)를 10% FBS의 존재 하에 DMEM 중 리포펙타민 2000을 이용해서 HEK 293A 세포(150, 000 세포/웰)에 형질주입하였다. 형질주입 복합체는 형질주입 후 3시간째에 제거하였다. 세포는 형질주입 후 3, 6, 9, 12, 24, 48 및 72시간째에 수확하였다. 총 RNA를 단리시키고, cDNA 합성에 이용하였다. cDNA에 대해서 코돈 최적화된 인자 IX 특이적 프라이머 세트를 이용해서 정량적 실시간 PCR에 의해 분석을 실시하였다. 인간 하이포잔틴 포스포리보실트랜스퍼라제 1(HPRT) 수준은 정규화하기 위하여 이용하였다. 데이터는, mRNA 수준을 3시간 시점에서 100%로서 고려해서, 검출가능한 mRNA의 퍼센트로서 플롯한다. 인간 배아 신장 293(HEK293) 세포 내에서 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형된 인자 IX 변형된 mRNA의 반감기는 약 8-10시간이다.
실시예 65. 식염수 제형: 피하 투여
인간 G-CSF 변형된 mRNA(서열번호 6으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨) 및 인간 EPO 변형된 mRNA(서열번호 9로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨)는 식염수 중에 제형화하고, 근육내(IM) 주사를 통해서 100㎍의 옹량으로 마우스에게 전달하였다.
대조군은 루시페라제(서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨)) 또는 제형 완충액(F.완충액)을 포함하였다. 마우스는 혈청 중 인간 폴리펩타이드의 농도(pg/㎖)를 결정하기 위하여 주사 후 13시간에 채혈하였다(G-CSF 군은 마우스 혈청 내 인간 G-CSF를 측정하고, EPO기는 마우스 혈청 내 인간 EPO를 측정하였다). 결과는 표 95에 나타낸다.
mRNA는 제형의 부재 하에 혈청 내에서 신속하게 분해되며, 이것은 mRNA를 제형화함으로써 시스템 내에서 보다 길게 지속하도록 mRNA를 전달하는 최상의 방법을 시사한다. 표 95에 표시된 바와 같이, mRNA는 완충액 제형만을 이용해서 피하에 전달될 수 있다.
Figure pct00243
실시예 66. 제형의 나노입자의 안정성
20:1의 지질:mRNA 비에서 DLin-KC2-DMA의 제형, Teta-5-Lap, DLin-DMA, DLin-K-DMA, C12-200, DLin-MC3-DMA는 입자 크기, 다분산 지수 및 실온에서의 안정성에 대한 봉입 효율에 대해서 평가하였다. 대부분의 나노입자는 표 96 및 표 97에 표시된 바와 같이 적어도 1개월 동안 실온에서 안정적이다.
Figure pct00244
Figure pct00245
실시예 67. 유리체내 전달
식염수로 제형화된 mCherry 변형된 mRNA(서열번호 7로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨) 및 루시페라제 변형된 mRNA(서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨)는 표 98에 기재된 바와 같이 유리체내에 전달하였다. 샘플은 유리체 내에만 단지 전달된 대조군과 비교하였다.
Figure pct00246
제형은 1일째에 각 동물의 좌측 혹은 우측 눈에 투여할 것인 한편, 동물은 마취된다. 투여 전날에 겐타마이신 안과 연고 혹은 용액을 양 눈에 2회 적용하였다. 겐타마이신 안과 연고 혹은 용액은 또한 주사 직후 혹은 주사 당일에 적용하였다. 투약 전에, 산동제 점적(1% 트로픽아마이드 및/또는 2.5% 페닐에프린)을 각 눈에 적용한다.
투약 후 18시간에, mCherry 및 전달 완충액의 용량을 입수한 눈들을 적출하고, 각 눈은 하룻밤 조직 고정화 동안 실온에서 10㎖의 4% 파라폼알데하이드를 함유하는 튜브속에 개별적으로 놓았다. 다음 날, 눈들을 30% 수크로스 10㎖를 함유하는 튜브로 개별적으로 옮기고, 이들 눈이 처리되어 절편화될 때까지 21℃에서 저장하였다. 상이한 절편으로부터 제작한 슬라이드는 F-현미경 하에서 평가하였다. mCherry 변형된 mRNA를 투여한 눈에서 제작한 슬라이드에서 양성 발현이 보였고, 대조군은 아무런 발현도 보이지 않았다.
실시예 68. 생체내 사이토카인 발현 연구
마우스들에게는 5'캡, 캡 1(비변형)로 비변형, 5-메틸사이토신 및 유사유리딘 및 5'캡, 캡 1(Gen1)로 완전 변형되거나 또는 5-메틸사이토신 및 N1-메틸유사유리딘 및 5'캡, 캡 1(Gen2 캡) 또는 무 캡(no cap)(Gen2 언캡핑됨)으로 완전 변형된 G-CSF 변형된 mRNA(서열번호 6으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일) 200㎍을 근육내 주사하였다. R-848, 5% 수크로스 및 미처리된 마우스들의 대조군이 또한 분석되었다. 8시간 후, 혈청을 마우스들로부터 수집하고, 인터페론-알파 (IFN-알파) 발현에 대해서 분석하였다. 결과는 표 99에 나타낸다.
Figure pct00247
실시예 69. VEGF 변형된 mRNA의 시험관내 발현
HEK293 세포에는, 표 100에 표시된 농도에서 인비트로젠(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)로부터의 리포펙타민2000과 복합체화된 변형된 mRNA(mmRNA)VEGF-A(서열번호 19로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨)를 형질주입시켰다. 단백질 발현은 ELISA에 의해 검출되었고, 단백질(pg/㎖)은 표 100에 표시되어 있다.
Figure pct00248
실시예 70. GFP의 HeLa 세포의 시험관내 선별
형질주입 전날, 20,000 HeLa 세포(ATCC 번호 CCL-2; 버지니아주의 머내서스시에 소재)를 트립신-EDTA 용액(라이프 테크놀로지즈사, 뉴욕주의 그랜드 아일랜드시에 소재)에 의한 처리에 의해 수확하고, 96-웰 세포 배양판(코닝사, 버지니아주의 머내서스시에 소재) 내 웰당 총 용적 100㎕의 EMEM 배지(10%FCS 및 1x 글루타맥스로 보충됨)에 파종하였다. 세포는 37℃에서 5% CO2 분위기 중에서 하룻밤 성장시켰다. 그 다음날, 표 101에 기재된 화학적 변형을 가진 녹색 형광 단백질(GFP) 변형된 RNA(서열번호 18로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1) 37.5ng 혹은 75ng을, 최종 용적 10㎕의 OPTI-MEM(라이프 테크놀로지즈사, 뉴욕주의 그랜드 아일랜드시에 소재) 중에 희석시켰다. 리포펙타민 2000(라이프 테크놀로지즈사, 뉴욕주의 그랜드 아일랜드시에 소재)을 형질주입 시약으로서 사용하고, 0.2㎕를 총 용적 10㎕의 OPTI-MEM 중에 희석시켰다. 실온에서 5분의 배양 후, 두 용액을 배합하여 실온에서 추가로 15분 배양하였다. 이어서, 20㎕의 배합 용액을 HeLa 세포를 함유하는 세포 배양 배지 100㎕에 첨가하고 실온에서 배양하였다.
18 내지 22시간 배양 후, 루시페라제를 발현하는 세포를 제조사의 지시사항에 따라서 100㎕의 패시브 라이시스 완충액(프로메가사, 위스콘신주의 매디슨시에 소재)에 용해시켰다. 용해물의 분액들을 불투명한 폴리스타이렌 96-웰 플레이트(코닝사, 버지니아주의 머내서스시에 소재)로 옮기고, 완전 루시페라제 검정 용액(프로메가사, 위스콘신주의 매디슨시에 소재) 100㎕와 배합하였다. 중앙 형광 강도(median fluorescence intensity: MFI)는 각 화학에 대해서 결정되었고, 표 101에 표시되어 있다.
이들 결과는, N1-메틸유사유리딘 및 5-메틸사이토신으로 완전 변형된 GFP가 다른 화학과 비교해서 HeLa 세포 중 더 많은 단백질을 생산하는 것을 입증한다. 부가적으로 세포에 투여된 더 높은 용량의 GFP는 가장 높은 MFI값을 생성하였다.
Figure pct00249
실시예 71. 독성 연구
A. 연구 설계
스프라그-다우리 래트(n=8, 4 수컷, 4 암컷)에는 표 102에서의 용량 차트에 요약된 바와 같이 변형된 루시페라제 mRNA(서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨)를 주사에 의해 투여하였다. 대조군에는 제형 완충액(F.완충액)을 투여하였다. 7일 후 래트를 희생시켰다.
Figure pct00250
B. 체중 증가 및 식품 소비
래트들은 mRNA의 투여 및 투여 7일 전에 체중을 쟀다. 표 103은 평균 체중 증가 및 성별로 테스트된 군 당의 체중 증가 퍼센트를 나타낸다. 모든 동물은 계속해서 체중이 증가하였고 정상적으로 거동하였다. 분석된 각 군은 연구 과정에 걸쳐서 동일량의 음식을 소비하였다.
Figure pct00251
C. 전해질
7일 후 래트를 희생시키고, 전해질을 구하기 위하여 샘플을 취하였다. 각 군에서 칼슘, 중탄산염, 칼륨, 인, 염화물 및 나트륨 수준을 분석하였다. 결과는 표 104에 나타낸다. 7일 후 래트에서 보이던 전해질의 변화는 없었다.
Figure pct00252
D. 혈액학
7일 후 래트를 희생시키고, 혈액학 수준을 구하기 위하여 샘플을 취하였다. 적혈구(RBC), 헤마토크릿(HGT), 평균 적혈구 용적(MCV), 헤모글로빈(HGB), 평균 적혈구 헤모글로빈(MCH) 및 평균 적혈구 헤모글로빈 농도(MCHC)를 각 군에 대해서 구하였다. 결과는 표 105에 나타낸다. 투여 후 7일에 혈구수 혹은 혈액 응고 인자에 변화는 없었다.
Figure pct00253
E. 백혈구
7일 후, 래트들을 희생시키고, 백혈구수를 구하기 위하여 샘플을 취하였다. 호중구(단편화된 호중구 퍼센트), 단핵구, 호염기구, 림프구, 호산구 및 백혈구(WBC)를 각 군에 대해서 구하였다. 결과는 표 106에 나타낸다. 표 106에서, "NT"는 테스트되지 않은 것을 의미한다. 투여 후 7일에, 백혈구 증가가 없었는 바, 이것은 염증이 없는 것을 시사한다.
Figure pct00254
F. 혈청 화학
7일 후, 래트들을 희생시키고, 혈청 화학을 구하기 위하여 샘플을 취하였다. 알칼리성 포스파타제(ALP), 아스파테이트 아미노기전이효소(AST), 알라닌 아미노기전이효소(ALT) 및 크레아틴 포스포키나제(CPK)를 각 군에 대해서 구하였다. 결과는 표 107에 나타낸다.
Figure pct00255
G. 간 단백질
7일 후 래트를 희생시키고, 간 단백질 수준을 구하기 위하여 샘플을 취하였다. 각 군에 대해서 알부민, 글로불린 및 총 단백질의 수준을 구하였다. 결과는 표 108에 나타낸다. 변형된 mRNA의 투여 후 7일째에 간 효소 또는 간 단백질 생산에서 보이던 변화는 없었다.
Figure pct00256
H. 결론
변형된 mRNA의 투여 후 7일째에 래트의 분석으로부터, 고용량의 mRNA의 투여는 부작용을 유발하지 않는다. 유효 용량보다 30배만큼 높은 용량은 이 분석으로부터 안전한 것으로 보인다. 조직병리학은 주사 부위에서 단지 최소의 염증을 보였고, 주사 부위는 주사와 일치하는 변화만을 보였으며 용량 관련 쟁점을 암시하는 것은 아무것도 없었다. 부가적으로 근육 손상이 있었던 것을 시사하는 근육 효소의 변화는 없었다.
실시예 72. 변형된 RNA에 대한 저장 조건
A. 유기물
유기 환경에 견디는 mRNA의 능력을 평가하기 위하여, 루시페라제 mRNA(서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨)는 에탄올, 메탄올 혹은 다이클로로메탄의 용액 중에서 1 ㎎/㎖의 농도에서 실온에서 저장하였다. 샘플을 1시간, 6시간 및 1일에 수집하였다. 샘플을 200 ng/㎕까지 물로 희석시키고, 유기 용매를 증발시키기 위하여 흄 후드에서 실온에서 하룻밤 배양하였다. 대조군 샘플은 물(물 대조군, 유기물) 속에서 mRNA와 병행해서 완성되었다. mRNA는 바이오분석기 상에 샘플을 가동시킴으로써 3개의 용액의 각각에서 1일 동안 실온에서 안정적이었다.
B. 수성 용매
루시페라제 mRNA(서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 유사유리딘 및 5-메틸사이토신으로 완전 변형됨)를 3개의 상이한 완충액 및 물에 첨가하고 mRNA 안정성에 대한 수성 용매의 효과를 평가하였다. mRNA는 시트르산염 완충액(pH3, 100mM 시트르산), 인산염 완충 식염수(PBS) 완충액(pH 7.4, 6.7mM 포스페이트 및 154mM 염화나트륨), TE 완충액(pH 8, 10mM 트리스-염산 및 1mM 에틸렌다이아민테트라아세트산) 또는 물(pH 5.5, 주사용수(WFI))에 1 ㎎/㎖에서 첨가하였다. 샘플을 1시간, 6시간 및 1일째에 수집하고, 물로 200 ng/㎕의 농도로 희석시켰다. 대조군 샘플은 물(물 대조군, 수성) 속에서 mRNA와 병행해서 완성되었다. PBS 완충액, TE 완충액 및 물 속에서 mRNA의 배양은 1일 후 mRNA 통합성에 영향을 미치지 않았다. 시트레이트 중에서 배양된 샘플은 바이오분석기에 의해 검출가능하지 않았다.
시트르산염 완충액을 평가하기 위한 추가의 연구에, 10mM 시트르산염 및 1㎎/㎖의 루시페라제 mRNA(서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 유사유리딘 및 5-메틸사이토신으로 완전 변형됨)를 지니는 각각 pH 2, 3 및 4의 시트르산염 완충액을 평가하였다. pH 2에서, 석출이 육안으로 검출되었고, mRNA는 pH 4 이하에서 바이오분석기에 의해 검출되지 않았다. 인산염 완충액과 비교된 경우, mRNA는 낮은 pH를 지니는 샘플에서 검출되지 않았으며, 석출은 pH 2를 지니는 인산염 완충액 샘플에서 볼 수 있었다.
C. pH
mRNA의 안정성에 대한 pH의 효과를 연구하기 위하여, 루시페라제 mRNA(서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 유사유리딘 및 5-메틸사이토신으로 완전 변형됨)를 pH 5.8, 6.5 또는 7.2를 지니는 수성 완충액 중에서 실온에서 보존하였다. 이 pH 샘플에 mRNA를 첨가한 후 1시간, 1일 및 1주째에 샘플을 수집하였다. 수집 후, 샘플을 1 ㎎/㎖ 농도에서 배양하고 나서, 바이오분석기에 의한 특성 규명 및 동결 전에 물로 200 ng/㎕로 희석시켰다. 평가된 5.8 내지 7.2의 pH 범위에서 실온에서 1주 저장 후 mRNA는 안정적이었다.
D. 동결/해동 및 동결건조
mRNA 안정성에 대한 동결/해동 사이클의 효과를 평가하기 위하여, 제형 완충액 중 루시페라제 mRNA(서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨)에 다수의 동결/해동 사이클을 적용하였다. mRNA는 적어도 18 사이클에 대해서 안정적인 것으로 판명되었다.
또한, 루시페라제 mRNA(mRNA 서열번호 16; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨)에 대해서는 mRNA의 안정성을 테스트하기 위하여 3라운드의 동결 건조를 실시하였다. mRNA를 물에 첨가하고, 샘플을 3라운드의 동결건조의 각각 후에 수집하였다. 건조된 mRNA를 1 ㎎/㎖의 농도에 도달하도록 물로 희석시켰다. 샘플을 200 ng/㎕에서 바이오분석기 특성규명이 될 때까지 동결 상태로 저장하였다. 대조군 샘플은 mRNA 및 물 제형과 병행해서 완성되었고 동일한 동결 및 해당 사이클을 수행하였다. mRNA는 200 ng/㎕에서 바이오분석기 특성규명에 의해 분석된 경우 3 사이클의 동결건조 후에 안정적인 것으로 판명되었다.
E. 원심분리
mRNA 통합성에 대한 원심분리의 효과를 평가하기 위하여, 1 ㎎/㎖에서 물 중 루시페라제 mRNA(서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨)를 4℃에서 10분 동안 10k RPM(13.3k xg)의 10 사이클에 노출시켰다. mRNA 및 물 샘플을 원심분리 동안 대조군으로서 4℃에서 저장하였다. 10 사이클의 원심분리 후, mRNA는 200 ng/㎕에서 바이오분석기 특성규명에 의해 분석된 경우 안정적인 것으로 판명되었다.
F. 저장 후의 시험관내 형질주입
형질주입 전날, 20,000 HeLa 세포(ATCC 번호 CCL-2; 버지니아주의 머내서스시에 소재)를 트립신-EDTA 용액(라이프 테크놀로지즈사, 뉴욕주의 그랜드 아일랜드시에 소재)에 의한 처리에 의해 수확하고, 96-웰 세포 배양판(코닝사, 버지니아주의 머내서스시에 소재) 내 웰당 총 용적 100㎕의 EMEM 배지(10%FCS 및 1x 글루타맥스로 보충됨)에 파종하였다. 세포는 37℃에서 5% CO2 분위기 중에서 하룻밤 성장시켰다. 그 다음날, 동결건조되고, 원심분리되고, 유기 및 수성 용매 샘플의 제형으로부터의 250ng의 루시페라제 mRNA는 최종 용적 10㎕의 OPTI-MEM(라이프 테크놀로지즈사, 뉴욕주의 그랜드 아일랜드시에 소재) 중에 희석시켰다. 리포펙타민 2000(라이프 테크놀로지즈사, 뉴욕주의 그랜드 아일랜드시에 소재)을 형질주입 시약으로서 이용해서, 0.2㎕를 최종 용적 10㎕의 OPTI-MEM로 희석하였다. 실온에서 배양 5분 후, 두 용액을 배합하고, 실온에서 추가로 15분 배양하였다. 이어서, 배합된 용액 20㎕를, HeLa 세포를 함유하는 세포 배양 배지 100㎕에 첨가하였다. 플레이트를 이어서 앞에서 기재된 바와 같이 배양하였다.
18 내지 22시간 배양 후, 루시페라제를 발현하는 세포를 제조사의 지시사항에 따라서 100㎕의 패시브 라이시스 완충액(프로메가사, 위스콘신주의 매디슨시에 소재)에 용해시켰다. 용해물의 분액들을 불투명한 폴리스타이렌 96-웰 플레이트(코닝사, 버지니아주의 머내서스시에 소재)로 옮기고, 100㎕ 완전 루시페라제 검정 용액(프로메가사, 위스콘신주의 매디슨시에 소재)과 배합하였다. 시약 없는 플레이트의 배경 신호는 웰 당 약 200 상대 광 단위었다. 플레이트 판독기는 바이오테크 시너지 H1(BioTek Synergy H1)(바이오테크사, 버몬트주의 위누스키시에 소재)이었다.
모의 형질주입의 대조군(형질주입 시약 단독), 수중 루시페라제 mRNA 대조군 및 미처리된 것들도 평가하였다. 세포를 수확하고, 각 신호에 대한 생물발광 평균(상대 광 단위, RLU)은 표 109에 표시되어 있다. 이들 샘플의 형질주입은, 동결건조, 원심분리, 유기 용매 및 시트르산염 완충액 이외의 수성 용매가 루시페라제 mRNA의 활성에 영향을 주지 않은 것으로 확인되었다. 시트르산염 완충액은 형질주입 후에 저감된 활성을 보였다.
Figure pct00257
실시예 73. 균질화
상이한 루시페라제 mRNA 용액(표 110에 기재됨, 여기서 "X"는 그 성분을 함유하는 용액을 지칭함)(서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨)은 상이한 용액의 수율 퍼센트, 바이오분석기에 의한 mRNA의 통합성, 및 시험관내 형질주입에 의한 mRNA의 단백질 발현을 테스트하기 위하여 평가하였다. mRNA 용액은 표 110에 표시된 바와 같이 4 ㎎/㎖에서의 1x TE 완충액, 물 속에서 제조하고, 다이클로로메탄(DCM) 혹은 200 ㎎/㎖의 폴리(락틱-코-글라이콜산)(PLGA)(락텔사, Cat# B6010-2, 고유 점도 0.55-0.75, 50:50 LA:GA)을 함유하는 DCM에 첨가하여 최종 mRNA 농도 0.8 ㎎/㎖를 얻었다. 균질화를 요하는 용액은 속도 5(대략 19,000 rpm)에서 30초 동안 균질화시켰다(이카 울트라-튜락스 균질화기, T18). 물, 다이클로로메탄 및 폴리(락틱-코-글라이콜산)(PLGA) 중 mRNA 샘플은 회수불가능하였다(NR). NR 샘플을 제외하고 모든 샘플은, 바이오분석기(Bio-rad Experion)에 의해 결정된 바와 같이 mRNA의 통합성을 유지하였다.
형질주입 전날, 20,000 HeLa 세포(ATCC 번호 CCL-2; 버지니아주의 머내서스시에 소재)를 트립신-EDTA 용액(라이프 테크놀로지즈사, 뉴욕주의 그랜드 아일랜드시에 소재)에 의한 처리에 의해 수확하고, 96-웰 세포 배양판(코닝사, 버지니아주의 머내서스시에 소재) 내 웰당 총 용적 100㎕의 EMEM 배지(10%FCS 및 1x 글루타맥스로 보충됨)에 파종하였다. 세포는 37℃에서 5% CO2 분위기 중에서 하룻밤 성장시켰다. 그 다음날, 회수가능한 샘플 로부터의 루시페라제 mRNA 250ng을 최종 용적 10㎕의 OPTI-MEM(라이프 테크놀로지즈사, 뉴욕주의 그랜드 아일랜드시에 소재) 중에 희석시켰다. 리포펙타민 2000(라이프 테크놀로지즈사, 뉴욕주의 그랜드 아일랜드시에 소재)을 형질주입 시약으로서 이용해서, 0.2㎕를 최종 용적 10㎕의 OPTI-MEM로 희석하였다. 실온에서 5분의 배양 후, 두 용액을 배합하여 실온에서 추가로 15분 배양하였다. 이어서, 배합된 용액 20㎕를, HeLa 세포를 함유하는 세포 배양 배지 100㎕에 첨가하였다. 플레이트를 이어서 앞에서 기재된 바와 같이 배양하였다. 대조군 루시페라제 mRNA(식염수 중에 제형화된 루시페라제 mRNA)(대조군)과 미처리 세포(미처리)도 평가하였다. 세포를 수확하고, 각 신호에 대한 생물발광 평균(광자/초)(생물발광(p/s))은 또한 표 110에 표시되어 있다. 회수가능한 샘플은 모두 분석 시 루시페라제 mRNA의 활성을 나타내었다.
18 내지 22시간 배양 후, 루시페라제를 발현하는 세포를 제조사의 지시사항에 따라서 100㎕의 패시브 라이시스 완충액(프로메가사, 위스콘신주의 매디슨시에 소재)에 용해시켰다. 용해물의 분액들을 불투명한 폴리스타이렌 96-웰 플레이트(코닝사, 버지니아주의 머내서스시에 소재)로 옮기고, 100㎕ 완전 루시페라제 검정 용액(프로메가사, 위스콘신주의 매디슨시에 소재)과 배합하였다. 시약 없는 플레이트의 배경 신호는 웰 당 약 200 상대 광 단위었다. 플레이트 판독기는 바이오테크 시너지 H1(BioTek Synergy H1)(바이오테크사, 버몬트주의 위누스키시에 소재)이었다.
세포를 수확하고, 각 신호에 대한 생물발광 평균(상대 광 단위, RLU)(생물발광(RLU))은 또한 표 110에 표시되어 있다. 회수가능한 샘플은 모두 분석 시 루시페라제 mRNA의 활성을 나타내었다.
Figure pct00258
실시예 74. TE 완충액 및 물 평가
루시페라제 mRNA(서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨)를 표 111에 개략적으로 표시된 바와 같이 물 또는 TE 완충액 중에 재구성하고, 이어서 PLGA 미소구로 제형화하였다. PLGA 미소구는 당업계에 공지된 물/오일/물 이중 유화 방법을 이용해서 PLGA(락텔사, Cat# B6010-2, 고유 점도 0.55-0.75, 50:50 LA:GA), 폴리비닐알코올(PVA)(시그마사, Cat# 348406-25G, MW 13-23k) 다이클로로메탄 및 물을 이용해서 합성하였다. 간단히, 2 내지 6 ㎎/㎖(W1)의 농도에서 물 또는 TE 완충액 중 mRNA 0.2 내지 0.6㎖를 100 ㎎/㎖ 농도의 PLGA에서 다이클로로메탄(DCM)(O1) 중에 용해된 PLGA 2㎖에 첨가하였다. W1/O1 에멀전을 속도 5(~19,000 rpm)에서 30초 동안 균질화시켰다(이카 울트라-튜락스 균질화기, T18). 이어서, 250㎖의 1% PVA(W2)에 W1/O1 에멀전을 첨가하고, 속도 5(~19,000 rpm)에서 1분 동안 균질화시켰다. 제형은 3시간 동안 교반하고 나서, 100㎛ 나일론 메쉬 스트레이너(Fisherbrand Cell Strainer, Cat # 22-363-549)를 통과시켜 보다 큰 응집물을 제거하고, 마지막으로 원심분리(10분, 9,250 rpm, 4℃)에 의해 세척하였다. 상청액을 버리고 PLGA 펠릿을 물 5 내지 10㎖에 재현탁시키고, 이것을 2회 반복하였다. 세척된 제형을 액체 질소 중에서 동결시키고 나서, 2 내지 3일 동안 동결건조시켰다. 동결건조 후, ~10㎎의 PLGA MS를 2㎖ 에펜도르프 튜브 중에서 칭량하고, DCM 1㎖를 첨가하고 샘플을 2 내지 6시간 동안 진탕시킴으로써 탈제형화시켰다. 물 0.5㎖를 첨가하고 이 샘플을 하룻밤 진탕함으로써 탈제형화된 PLGA 미소구로부터 mRNA를 추출하였다. 물 또는 TE 완충액 중 비제형화된 루시페라제 mRNA(탈제형화 대조군)를 DCM 중에 스파이킹하고, 형질주입 검정에서 대조군으로서 이용되도록 탈제형 과정을 수행하였다.
형질주입 전날, 20,000 HeLa 세포(ATCC 번호 CCL-2; 버지니아주의 머내서스시에 소재)를 트립신-EDTA 용액(라이프 테크놀로지즈사, 뉴욕주의 그랜드 아일랜드시에 소재)에 의한 처리에 의해 수확하고, 96-웰 세포 배양판(코닝사, 버지니아주의 머내서스시에 소재) 내 웰당 총 용적 100㎕의 EMEM 배지(10%FCS 및 1x 글루타맥스로 보충됨)에 파종하였다. 세포는 37℃에서 5% CO2 분위기 중에서 하룻밤 성장시켰다. 그 다음날, 탈제형화된 루시페라제 mRNA 샘플 100ng을 최종 용적 10㎕의 OPTI-MEM(라이프 테크놀로지즈사, 뉴욕주의 그랜드 아일랜드시에 소재) 중에 희석시켰다. 리포펙타민 2000(라이프 테크놀로지즈사, 뉴욕주의 그랜드 아일랜드시에 소재)을 형질주입 시약으로서 이용해서, 0.2㎕를 최종 용적 10㎕의 OPTI-MEM로 희석하였다. 실온에서 5분의 배양 후, 두 용액을 배합하여 실온에서 추가로 15분 배양하였다. 이어서, 배합된 용액 20㎕를, HeLa 세포를 함유하는 세포 배양 배지 100㎕에 첨가하였다. 플레이트를 이어서 앞에서 기재된 바와 같이 배양하였다.
18 내지 22시간 배양 후, 루시페라제를 발현하는 세포를 제조사의 지시사항에 따라서 100㎕의 패시브 라이시스 완충액(프로메가사, 위스콘신주의 매디슨시에 소재)에 용해시켰다. 용해물의 분액들을 불투명한 폴리스타이렌 96-웰 플레이트(코닝사, 버지니아주의 머내서스시에 소재)로 옮기고, 100㎕ 완전 루시페라제 검정 용액(프로메가사, 위스콘신주의 매디슨시에 소재)과 배합하였다. 시약 없는 플레이트의 배경 신호는 웰 당 약 200 상대 광 단위었다. 플레이트 판독기는 바이오테크 시너지 H1(BioTek Synergy H1)(바이오테크사, 버몬트주의 위누스키시에 소재)이었다. 각 제형으로부터 루시페라제 mRNA의 활성을 결정하기 위하여, 각 제형의 상대 광 단위(RLU)는 적절한 mRNA 탈제형화 대조군(mRNA 물 혹은 TE 완충액 중 mRNA)의 RLU로 나누었다. 표 111은 루시페라제 mRNA의 활성을 표시한다. PLGA 미소구 제형(제형) 내 루시페라제 mRNA의 활성은 TE 완충액 대 물 속에 제형화함으로써 실질적으로 향상되었다.
Figure pct00259
실시예 75. mRNA 상의 화학적 변형
형질주입 전날에, 20,000 HeLa 세포(ATCC 번호 CCL-2; 버지니아주의 머내서스시에 소재)를 트립신-EDTA 용액(라이프 테크놀로지즈사, 뉴욕주의 그랜드 아일랜드시에 소재)에 의한 처리에 의해 수확하고, 96-웰 세포 배양판(코닝사, 버지니아주의 머내서스시에 소재) 내 웰 당 총 용적 100㎕의 EMEM 배지(10%FCS 및 1x 글루타맥스로 보충됨)를 파종하였다. 세포는 37℃에서 5% CO2 분위기 중에서 하룻밤 성장시켰다. 그 다음날, 표 112에 기재된 화학적 변형에 의한 83ng의 루시페라제 변형된 RNA(서열번호 16으로 표시된 mRNA; 서열로 표시되지 않은 대략 140개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1)를 총 용적 10㎕의 OPTI-MEM(라이프 테크놀로지즈사, 뉴욕주의 그랜드 아일랜드시에 소재) 중에 희석시켰다. 리포펙타민 2000(라이프 테크놀로지즈사, 뉴욕주의 그랜드 아일랜드시에 소재)을 형질주입 시약으로서 사용하고, 0.2㎕를 총 용적 10㎕의 OPTI-MEM 중에 희석시켰다. 실온에서 5분의 배양 후, 두 용액을 배합하여 실온에서 추가로 15분 배양하였다. 이어서, 20㎕의 배합 용액을 HeLa 세포를 함유하는 세포 배양 배지 100㎕에 첨가하고 실온에서 배양하였다.
18 내지 22시간 배양 후, 루시페라제를 발현하는 세포를 제조사의 지시사항에 따라서 100㎕의 패시브 라이시스 완충액(프로메가사, 위스콘신주의 매디슨시에 소재)에 용해시켰다. 용해물의 분액들을 불투명한 폴리스타이렌 96-웰 플레이트(코닝사, 버지니아주의 머내서스시에 소재)로 옮기고, 100㎕ 완전 루시페라제 검정 용액(프로메가사, 위스콘신주의 매디슨시에 소재)과 배합하였다. 용해물 용적은 웰당 2 미오(mio) 이하의 상대 광 단위(RLU)가 샘플을 생산하는 가장 강한 신호에 대해서 검출될 때까지 조정되거나 희석되었으며, 테스트된 각 화학에 대한 RLU는 표 112에 표시되어 있다. 플레이트 판독기는 바이오테크 시너지 H1(BioTek Synergy H1)(바이오테크사, 버몬트주의 위누스키시에 소재)이었다. 시약 없는 배경 신호는 웰 당 약 200 상대 광 단위였다.
Figure pct00260
실시예 76. 변형된 mRNA의 근육내 및 피하 투여
PBS(pH 7.4) 중에 제형화된, 5-메틸사이토신 및 유사유리딘(5mC/pU)으로 완전 변형되거나, 5-메틸사이토신 및 N1-메틸유사유리딘(5mC/N1mpU)으로 완전 변형되거나, 유사유리딘(pU)으로 완전 변형되거나, N1-메틸유사유리딘(N1mpU)으로 완전 변형되거나 또는 25%의 사이토신이 5-메틸사이토신으로 대체되고 유리딘의 25%가 2-티오유리딘(5mC/s2U)로 대체된 것으로 변형된 루시페라제 변형된 mRNA(서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 140개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1)를 Balb-C 마우스에 2.5 ㎎/㎏의 용량으로 근육내 혹은 피하에 투여하였다. 마우스를, 근육내 전달을 위하여 2시간, 8시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 120시간 및 144시간째에 영상화하고, 피하 전달을 위하여 2시간, 8시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간 및 120시간째에 영상화하였다. 영상화 20분 전에, 마우스에게 D-루시페린 용액을 150 ㎎/㎏으로 복강내로 주사하였다. 이 동물은 이어서 마취시키고, IVIS 루미나 II 이미징 시스템(IVIS Lumina II imaging system)(퍼킨 엘머사)으로 영상을 획득하였다. 생물발광은 전체 마우스의 총 플럭스(광자/초)로서 측정되었다. 근육내 투여에 대한 평균 총 플럭스(광자/초)는 표 113에 표시되어 있고, 피하 투여에 대한 평균 총 플럭스(광자/초)는 표 114에 표시되어 있다. 배경 신호는 3.79E+05 (p/s)였다. 근육내 투여에 대한 피크 발현은 모든 화학에 대해서 24시간 내지 48시간 사이에서 보였고, 발현은 144시간에 여전히 검출되었다. 피하 전달을 위하여, 피크 발현은 2 내지 8시간에 보였고, 발현은 72시간에 검출되었다.
Figure pct00261
Figure pct00262
실시예 77. 삼투압 펌프 연구
이식 전에, 삼투압 펌프(ALZET® 삼투압 펌프 2001D, 듀렉트사, 캘리포니아주의 쿠퍼티노시에 소재)에 0.2㎖의 1X PBS(pH 7.4)(PBS 장입 펌프) 또는 1x PBS(pH 7.4) 중 1 ㎎/㎖에서 0.2㎖의 루시페라제 변형된 mRNA(서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 140개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 N1-메틸유사유리딘으로 완전 변형됨)(루시페라제 장입 펌프)를 장입하고, 37℃에서 1x PBS(pH 7.4) 중에서 하룻밤 배양하였다.
Balb-C 마우스(n=3)에게 PBS 장입 펌프 또는 루시페라제 장입 펌프를 피하 이식하고, 2시간, 8시간 및 24시간째에 영상화한다. 대조군으로서, PBS 장입 펌프를 피하 이식하고, 마우스에게 1x PBS 중 루시페라제 변형된 mRNA(PBS 장입 펌프; SC 루시페라제)를 피하 주사하거나, 또는 삼투압 펌프를 이식하지 않고 마우스에게 1x PBS 중 루시페라제 변형된 mRNA(SC 루시페라제)를 피하 주사하였다. 이 루시페라제 제형은 표 115에 요약되어 있다
Figure pct00263
실시예 78. 외부 삼투압 펌프 연구
외부 삼투압 펌프(ALZET® 삼투압 펌프 2001D, 듀렉트사, 캘리포니아주의 쿠퍼티노시에 소재)에 0.2㎖의 1X PBS(pH 7.4)(PBS 장입 펌프) 또는 1x PBS(pH 7.4) 중 1 ㎎/㎖에서 0.2㎖의 루시페라제 변형된 mRNA(서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 140개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 N1-메틸유사유리딘으로 완전 변형됨)(루시페라제 장입 펌프)를 장입하고, 37℃에서 1x PBS(pH 7.4) 중에서 하룻밤 배양한다.
외부 PBS 장입 펌프 또는 루시페라제 장입 펌프에 연결된 카테터를 이용해서, Balb-C 마우스(n=3)에게 제형을 투여한다. 마우스들은 2시간, 8시간 및 24시간에 영상화한다. 대조군으로서, 외부 PBS 장입 펌프를 이용하고, 마우스들에게 1x PBS 중 루시페라제 변형된 mRNA(PBS 장입 펌프; SC 루시페라제)를 피하 주입하거나, 또는 외부 펌프를 사용하지 않고, 마우스들에게 1x PBS 중 루시페라제 변형된 mRNA(SC 루시페라제)를 피하 주사하였다. 영상화 20분 전에, 마우스에게 D-루시페린 용액을 150 ㎎/㎏으로 복강내로 주사한다. 이 동물은 이어서 마취시키고, IVIS 루미나 II 이미징 시스템(IVIS Lumina II imaging system)(퍼킨 엘머사)으로 영상을 획득한다. 생물발광은 전체 마우스의 총 플럭스(광자/초)로서 측정한다. 루시페라제 제형은 표 116에 요약되어 있고, 평균 총 플럭스(광자/초).
Figure pct00264
실시예 79. 피브린 봉합제 연구
티젤(Tisseel)(박스터 헬스캐어사(Baxter Healthcare Corp.), 일리노이주의 데어필드시에 소재) 등과 같은 피브린 봉합제는, 이중-배럴형 주사기 내에 피브리노겐과 트롬빈으로 구성되어 있다. 혼합 시, 피브리노겐은 피브린으로 전환되어 약 10 내지 30초에 피브린 응괴를 형성한다. 이 응괴는 신체의 천연의 응고 기전을 모방할 수 있다. 부가적으로, 피브린 하이드로겔은 서방성 전달에 잠재적으로 이용될 수 있는 3차원 구조이다. 현재, 피브린 봉합제는 봉합사, 결찰사(ligature) 및 소작기(cautery) 등과 같은 통상의 수술기법을 대체하는 지혈 및 봉합에 있어서 적용을 위하여 승인되어 있다.
트롬빈 및 피브리노겐 성분은 이중 배럴형 주사기 속으로 개별적으로 장입되었다. Balb-C 마우스(n=3)에게는 50㎕의 피브리노겐, 50㎕의 트롬빈을 피하 주사하고, 이들에게는 또한 변형된 루시페라제 mRNA(서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 140개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 N1-메틸유사유리딘으로 완전 변형됨)(티젤(Tisseel)+루시페라제), 50㎕의 피브리노겐 및 50㎕ 트롬빈(티젤(Tisseel)) 또는 변형된 루시페라제 mRNA(루시페라제)를 동일 부위에 주사하였다. 피브리노겐 및 트롬빈의 주사는 이중-배럴형 주사기를 이용해서 동시에 행하였다. 루시페라제의 피하 주사는 피브리노겐/트롬빈 주사 후 15분에 행하여 피브린 하이드로겔이 중합(티젤(Tisseel) + 루시페라제군)되도록 하였다. 미처리된 마우스의 대조군도 평가하였다. 마우스들은 5시간 및 24시간째에 영상화하였다. 영상화 20분 전에, 마우스에게 D-루시페린 용액을 150 ㎎/㎏으로 복강내로 주사하였다. 이 동물은 이어서 마취시키고, IVIS 루미나 II 이미징 시스템(IVIS Lumina II imaging system)(퍼킨 엘머사)으로 영상을 획득하였다. 생물발광은 전체 마우스의 총 플럭스(광자/초)로서 측정되었다. 루시페라제 제형은 표 117에 요약되어 있고, 평균 총 플럭스(광자/초)는 표 118에 표시되어 있다. 피브린 봉합제는 영상화를 간섭하지 않는 것으로 판명되었고, 루시페라제와 티젤의 주사는 루시페라제의 발현을 보였다.
Figure pct00265
Figure pct00266
실시예 80. 피브린 함유 mRNA 봉합제 연구
A. 변형된 mRNA 및 염화칼슘
재구성 전에, 5-메틸사이토신 및 N1-메틸유사유리딘으로 완전 변형되거나 또는 N1-메틸유사유리딘으로 완전 변형된 루시페라제 mRNA(서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 140개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1)는 염화칼슘에 첨가하였다. 이어서, 염화칼슘을 이용해서 트롬빈을 재구성한다. 피브리노겐은 제조사의 지시사항에 따라서 섬유소용해 저해제 용액과 함께 재구성한다. 재구성된 트롬빈 함유 변형된 mRNA 및 피브리노겐을 함유하는 재구성된 트롬빈은 이중 배럴형 주사기 속에 장입한다. 마우스들에게는 50㎕의 트롬빈 및 50㎕의 피브리노겐 함유 변형된 mRNA를 피하에 주사하거나, 또는 이들에게는 등가 용량의 변형된 루시페라제 mRNA를 함유하는 50㎕의 PBS를 주입하였다. 미처리 마우스들의 대조군도 평가한다. 마우스들은 평균 총 플럭스(광자/초)를 구하기 위하여 미리 결정된 간격에서 영상화한다.
B. 지질 나노입자 제형화된 변형된 mRNA 및 염화칼슘
재구성 전에, 5-메틸사이토신 및 N1-메틸유사유리딘으로 완전 변형되거나 또는 N1-메틸유사유리딘으로 완전 변형된 루시페라제 mRNA(서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 140개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1)는 지질 나노입자로 제형화하고 염화칼슘에 첨가한다. 이어서, 염화칼슘을 이용해서 트롬빈을 재구성한다. 피브리노겐은 제조사의 지시사항에 따라서 섬유소용해 저해제 용액과 함께 재구성한다. 재구성된 트롬빈 함유 변형된 mRNA 및 피브리노겐을 함유하는 재구성된 트롬빈은 이중 배럴형 주사기 속에 장입한다. 마우스들에게는 50㎕의 트롬빈 및 50㎕의 피브리노겐 함유 변형된 mRNA를 피하에 주사하거나, 또는 이들에게는 등가 용량의 변형된 루시페라제 mRNA를 함유하는 50㎕의 PBS를 주입하였다. 미처리 마우스들의 대조군도 평가한다. 마우스들은 평균 총 플럭스(광자/초)를 구하기 위하여 미리 결정된 간격에서 영상화한다.
C. 변형된 mRNA 및 피브리노겐
재구성 전에, 5-메틸사이토신 및 N1-메틸유사유리딘으로 완전 변형되거나 또는 N1-메틸유사유리딘으로 완전 변형된 루시페라제 mRNA(서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 140개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1)는 섬유소용해 저해제 용액에 첨가한다. 이어서 섬유소용해 저해제 용액은 피브리노겐을 재구성하는데 이용된다. 트롬빈은 염화칼슘 용액 제조사의 지시사항에 따라서 염화칼슘 용액과 함께 구성한다. 변형된 mRNA 및 트롬빈을 함유하는 재구성된 피브리노겐을 이중 통형 주사기에 장입한다. 마우스들에게는 50㎕의 트롬빈 및 50㎕의 피브리노겐 함유 변형된 mRNA를 피하에 주사하거나, 또는 이들에게는 등가 용량의 변형된 루시페라제 mRNA를 함유하는 50㎕의 PBS를 주입하였다. 미처리 마우스들의 대조군도 평가한다. 마우스들은 평균 총 플럭스(광자/초)를 구하기 위하여 미리 결정된 간격에서 영상화한다.
D. 지질 나노입자 제형화된 변형된 mRNA 및 피브리노겐
재구성 전에, 5-메틸사이토신 및 N1-메틸유사유리딘으로 완전 변형되거나 또는 N1-메틸유사유리딘으로 완전 변형된 루시페라제 mRNA(서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 140개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1)는 지질 나노입자로 재구성되고 나서, 섬유소용해 저해제 용액에 첨가된다. 이어서 섬유소용해 저해제 용액은 피브리노겐을 재구성하는데 이용된다. 트롬빈은 염화칼슘 용액 제조사의 지시사항에 따라서 염화칼슘 용액과 함께 구성한다. 변형된 mRNA 및 트롬빈을 함유하는 재구성된 피브리노겐을 이중 통형 주사기에 장입한다. 마우스들에게는, 50㎕의 트롬빈 및 50㎕의 피브리노겐 함유 변형된 mRNA를 피하에 주사하거나, 또는 이들에게는 등가 용량의 변형된 루시페라제 mRNA를 함유하는 50㎕의 PBS를 주입하였다. 미처리 마우스들의 대조군도 평가한다. 마우스들은 평균 총 플럭스(광자/초)를 구하기 위하여 미리 결정된 간격에서 영상화한다.
E. 변형된 mRNA 및 트롬빈
재구성 전에, 5-메틸사이토신 및 N1-메틸유사유리딘으로 완전 변형되거나 또는 N1-메틸유사유리딘으로 완전 변형된 루시페라제 mRNA(서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 140개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1)는 제조사의 지시사항에 따라서 염화칼슘으로 재구성된 후 재구성된 트롬빈에 첨가된다. 이어서 섬유소용해 저해제 용액을 이용해서 제조사의 지시사항에 따라서 피브리노겐을 재구성한다. 재구성된 피브리노겐 및 트롬빈 함유 변형된 mRNA는 이중 배럴형 주사기 속에 장입한다. 마우스들에게 50㎕의 트롬빈 함유 변형된 mRNA 및 50㎕의 피브리노겐을 피하 주사하거나, 이들에게 등가 용량의 변형된 루시페라제 mRNA를 함유하는 50㎕의 PBS를 주사하였다. 미처리 마우스들의 대조군도 평가한다. 마우스들은 평균 총 플럭스(광자/초)를 구하기 위하여 미리 결정된 간격에서 영상화한다.
F. 지질 나노입자 제형화된 변형된 mRNA 및 트롬빈
재구성 전에, 5-메틸사이토신 및 N1-메틸유사유리딘으로 완전 변형되거나 또는 N1-메틸유사유리딘으로 완전 변형된 루시페라제 mRNA(서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 140개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1)는 지질 나노입자로 제형화되고 나서, 제조사의 지시사항에 따라서 염화칼슘으로 재구성된 후에 재구성된 트롬빈에 첨가한다. 이어서 섬유소용해 저해제 용액을 이용해서 제조사의 지시사항에 따라서 피브리노겐을 재구성한다. 재구성된 피브리노겐 및 트롬빈 함유 변형된 mRNA는 이중 배럴형 주사기 속에 장입한다. 마우스들에게 50㎕의 트롬빈 함유 변형된 mRNA 및 50㎕의 피브리노겐을 피하 주사하거나, 이들에게 등가 용량의 변형된 루시페라제 mRNA를 함유하는 50㎕의 PBS를 주사하였다. 미처리 마우스들의 대조군도 평가한다. 마우스들은 평균 총 플럭스(광자/초)를 구하기 위하여 미리 결정된 간격에서 영상화한다.
실시예 81. 5-M메틸사이토신 및 N1-메틸유사유리딘 변형된 mRNA의 양이온성 지질 제형
5-메틸사이토신 및 N1-메틸유사유리딘으로 완전 변형된 루시페라제 mRNA(서열번호 16; 서열로 표시되지 않은 대략 140 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1)는 표 119에 기재된 양이온성 지질로 제형화되었다. 제형은 0.05 ㎎/㎏의 용량으로 Balb-C 마우스에게 정맥내로(I.V.), 근육내로(I.M.) 또는 피하로(S.C.) 투여하였다.
Figure pct00267
영상화 20분 전에, 마우스에게 D-루시페린 용액을 150 ㎎/㎏으로 복강내로 주사하였다. 이 동물은 이어서 마취시키고, IVIS 루미나 II 이미징 시스템(IVIS Lumina II imaging system)(퍼킨 엘머사)으로 영상을 획득하였다. 생물발광은 전체 마우스의 총 플럭스(광자/초)로서 측정되었다. 마우스는 투약 후 2시간, 8시간 및 24시간에 촬영하여, 평균 총 플럭스(광자/초)를 각 투여 경로 및 양이온성 지질 제형에 대해서 측정하였다. 배경 플럭스는 약 4.17E+05 p/s였다. 영상화의 결과는 표 120에 표시되어 있다. 표 120에서, "NT"는 테스트되지 않은 것을 의미한다.
Figure pct00268
실시예 82. 지질 나노입자 정맥내 연구
루시페라제 mRNA(서열번호 16; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨)는, 표 121에 기재된 바와 같은 50% DLin-MC3-DMA 또는 DLin-KC2-DMA, 38.5% 콜레스테롤, 10% DSPC 및 1.5% PEG를 함유하는 지질 나노입자로 제형화하였다. 제형은 0.5 ㎎/㎏, 0.05 ㎎/㎏, 0.005 ㎎/㎏ 또는 0.0005 ㎎/㎏의 용량으로 Balb-C 마우스에게 정맥내(I.V.)로 투여하였다. 영상화 20분 전에, 마우스에게 D-루시페린 용액을 150 ㎎/㎏에서 복강내 주사하였다. 동물들을 이어서 마취시키고, IVIS 루미나 II 이미징 시스템(퍼킨 엘머사)을 이용해서 영상을 획득하였다. 생물발광은 전체 마우스의 총 플럭스(광자/초)로서 측정되었다.
Figure pct00269
DLin-KC2-DMA에 대해서, 마우스는 투약 후 2시간, 8시간, 24시간, 72시간, 96시간 및 168시간에 촬영하여, 평균 총 플럭스(광자/초)를 각 투여 경로 및 양이온성 지질 제형에 대해서 측정하였다. 배경 플럭스는 약 3.66E+05 p/s였다. 영상화의 결과는 표 122에 표시되어 있다. 장기는 8시간째에 영상화하고, 평균 총 플럭스(광자/초)는 간, 비장, 폐 및 신장에 대해서 측정하였다. 각 장기에 대한 대조군도 분석하였다. 결과는 표 123에 나타낸다. 모든 용량 수준에 대한 피크 신호는 투여 후 8시간에 있었다. 또한, 각종 장기(간, 비장, 폐 및 신장)에 대한 분포는 LNP 용량을 증가 혹은 감소시킴으로써 제어될 수 있다.
Figure pct00270
Figure pct00271
DLin-MC3-DMA에 대해서, 마우스는 투약 후 2시간, 8시간, 24시간, 48시간, 72시간 및 144시간에 촬영하여, 평균 총 플럭스(광자/초)를 각 투여 경로 및 양이온성 지질 제형에 대해서 측정하였다. 배경 플럭스는 약 4.51E+05 p/s였다. 영상화의 결과는 표 124에 표시되어 있다. 장기는 8시간째에 영상화하고, 평균 총 플럭스(광자/초)는 간, 비장, 폐 및 신장에 대해서 측정하였다. 각 장기에 대한 대조군도 분석하였다. 결과는 표 125에 나타낸다. 모든 용량 수준에 대한 피크 신호는 투여 후 8시간에 있었다. 또한, 각종 장기(간, 비장, 폐 및 신장)에 대한 분포는 LNP 용량을 증가 혹은 감소시킴으로써 제어될 수 있다.
Figure pct00272
Figure pct00273
실시예 83. 지질 나노입자 피하 연구
루시페라제 mRNA(서열번호 16; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨)는, 표 126에 기재된 바와 같은 50% DLin-KC2-DMA, 385% 콜레스테롤, 10% DSPC 및 1.5% PEG를 함유하는 지질 나노입자로 제형화되었다. 제형은 0.5 ㎎/㎏, 0.05 ㎎/㎏ 또는 0.005 ㎎/㎏의 용량으로 Balb-C 마우스에게 피하로(S.C.) 투여하였다.
Figure pct00274
영상화 20분 전에, 마우스에게 D-루시페린 용액을 150 ㎎/㎏으로 복강내로 주사하였다. 이 동물은 이어서 마취시키고, IVIS 루미나 II 이미징 시스템(IVIS Lumina II imaging system)(퍼킨 엘머사)으로 영상을 획득하였다. 생물발광은 전체 마우스의 총 플럭스(광자/초)로서 측정되었다. 마우스는 투약 후 2시간, 8시간, 24시간, 48시간, 72시간 및 144시간에 촬영하여 평균 총 플럭스(광자/초)를 각 투여 경로 및 양이온성 지질 제형에 대해서 측정하였다. 검출 하한치는 약 3E+05 p/s였다. 영상화의 결과는 표 127에 표시되어 있다. 장기는 8시간째에 영상화하고, 평균 총 플럭스(광자/초)는 간, 비장, 폐 및 신장에 대해서 측정하였다. 각 장기에 대한 대조군도 분석하였다. 결과는 표 128에 나타낸다. 모든 용량 수준에 대한 피크 신호는 투여 후 8시간에 있었다. 또한, 각종 장기(간, 비장, 폐 및 신장)에 대한 분포는 LNP 용량을 증가 혹은 감소시킴으로써 제어될 수 있다. 고 용량에서, LNP 제형은, 높은 수준의 루시페라제 발현이 간, 비장, 폐 및 신장에서 검출됨에 따라서, 피하 주사 부위 밖으로 이동한다.
Figure pct00275
Figure pct00276
실시예 84. 양이온성 지질 나노입자 피하 연구
루시페라제 mRNA(서열번호 16; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨)는 50% DLin-MC3-DMA, 38.5% 콜레스테롤, 10% DSPC 및 1.5% PEG를 함유하는 지질 나노입자로 제형화한다. 제형은 0.5 ㎎/㎏, 0.05 ㎎/㎏ 또는 0.005 ㎎/㎏의 용량으로 Balb-C 마우스에게 피하(S.C.)로 투여한다.
마우스는 투약 후 2시간, 8시간, 24시간, 48시간, 72시간 및 144시간에 촬영하여, 평균 총 플럭스(광자/초)를 각 투여 경로 및 양이온성 지질 제형에 대해서 측정하였다. 장기들은 8시간째에 영상화되고, 평균 총 플럭스(광자/초)는 간, 비장, 폐 및 신장에 대해서 측정된다. 각 장기에 대한 대조군이 또한 분석된다.
실시예 85. 리포플렉스 연구
리포플렉스화된 루시페라제 mRNA(서열번호 16; 서열로 표시되지 않은 대략 140개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1)는 5-메틸사이토신 및 유사유리딘(5mC/pU)으로 완전 변형되거나, 5-메틸사이토신 및 N1-메틸유사유리딘(5mC/N1mpU)으로 대체된 채로 변형되거나, 또는 사이토신의 25%가 5-메틸사이토신으로 대체되고 유리딘의 25%가 2-티오유리딘(5mC/s2U)으로 대체된 상태로 변형되었다. 제형은 0.10 ㎎/㎏의 용량으로 Balb-C 마우스에게 정맥내로(I.V.), 근육내로(I.M.) 또는 피하로(S.C.) 투여하였다.
영상화 20분 전에, 마우스에게 D-루시페린 용액을 150 ㎎/㎏으로 복강내로 주사하였다. 이 동물은 이어서 마취시키고, IVIS 루미나 II 이미징 시스템(IVIS Lumina II imaging system)(퍼킨 엘머사)으로 영상을 획득하였다. 생물발광은 전체 마우스의 총 플럭스(광자/초)로서 측정되었다. 마우스들은 투약 후 8시간, 24시간 및 48시간째에 영상화되었고, 평균 총 플럭스(광자/초)는 각 투여 경로 및 화학적 변형에 대해서 측정되었다. 배경 신호는 약 3.91E+05 p/s였다. 영상의 결과는 표 129에 표시되어 있다. 장기들은 6시간째에 영상화되었고, 평균 총 플럭스(광자/초)는 간, 비장, 폐 및 신장에 대해서 측정되었다. 각 장기에 대한 대조군도 분석하였다. 결과는 표 130에 나타낸다.
Figure pct00277
Figure pct00278
실시예 86. 변형된 mRNA의 양이온성 지질 제형
사이토신의 25%가 5-메틸사이토신으로 대체되고 유리딘의 25%가 2-티오유리딘(5mC/s2U)으로 대체된 상태로 변형된 루시페라제 mRNA(서열번호 16; 서열로 표시되지 않은 대략 140개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1)는 표 131에 기재된 바와 같이 양이온성 지질로 제형화되었다. 제형은 0.05 ㎎/㎏의 용량으로 Balb-C 마우스에게 정맥내로(I.V.), 근육내로(I.M.) 또는 피하로(S.C.) 투여하였다.
Figure pct00279
영상화 20분 전에, 마우스에게 D-루시페린 용액을 150 ㎎/㎏으로 복강내로 주사하였다. 이 동물은 이어서 마취시키고, IVIS 루미나 II 이미징 시스템(IVIS Lumina II imaging system)(퍼킨 엘머사)으로 영상을 획득하였다. 생물발광은 전체 마우스의 총 플럭스(광자/초)로서 측정되었다. 마우스는 투약 후 2시간, 8시간 및 24시간에 촬영하여, 평균 총 플럭스(광자/초)를 각 투여 경로 및 양이온성 지질 제형에 대해서 측정하였다. 배경 플럭스는 약 3.31E+05 p/s였다. 영상화의 결과는 표 132에 표시되어 있다. 표 132에서, "NT"는 테스트되지 않은 것을 의미한다. 미처리된 마우스들은 2시간에 3.14E+05, 8시간에 3.33E+05 그리고 24시간에 3.46E+05의 평균 플럭스를 보였다. 피크 발현은 8시간째에 테트스된 3가지 경로 모두에 대해서 보였다. DLin-KC2-DMA는 DLin-MC3-DMA보다 양호한 발현을 지니고, DODMA는 평가된 모든 경로에 대해서 발현을 보였다.
Figure pct00280
실시예 87. 5-메틸사이토신 및 N1-메틸유사유리딘 변형된 mRNA의 제형
5-메틸사이토신 및 N1-메틸유사유리딘으로 변형된 루시페라제 mRNA(서열번호 16; 서열로 표시되지 않은 대략 140개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1)는 PBS(pH 7.4)로 제형화되었다. 제형은 2.5 ㎎/㎏의 용량으로 Balb-C 마우스에게 근육내(I.M.) 또는 피하(S.C.)로 투여하였다.
영상화 20분 전에, 마우스에게 D-루시페린 용액을 150 ㎎/㎏으로 복강내로 주사하였다. 이 동물은 이어서 마취시키고, IVIS 루미나 II 이미징 시스템(IVIS Lumina II imaging system)(퍼킨 엘머사)으로 영상을 획득하였다. 생물발광은 전체 마우스의 총 플럭스(광자/초)로서 측정되었다. 마우스는 투약 후 5분, 30분, 60분 및 120분에 촬영하여 평균 총 플럭스(광자/초)를 각 투여 경로 및 양이온성 지질 제형에 대해서 측정하였다. 배경 플럭스는 약 3.78E+05 p/s였다. 영상화의 결과는 표 133에 표시되어 있다. 루시페라제의 발현은 두 전달 경로에서 30분에 이미 보였다. 피하 투여로부터의 피크 발현은 30 내지 60분에 보인다. 근육내 발현은 120분째에 여전히 증가하고 있었다.
Figure pct00281
실시예 88. 화학적으로 변형된 mRNA의 근육내 및 피하 투여
PBS(pH 7.4) 중에 제형화된, N4-아세틸시티딘으로 완전 변형되거나 5-메톡시유리딘으로 완전 변형되거나, N4-아세틸시티딘 및 N1-메틸유사유리딘으로 완전 변형되거나 또는 5-메틸사이토신 및 5-메톡시유리딘으로 완전 변형된 루시페라제 변형된 mRNA(서열번호 16으로 표시되는 mRNA 서열; 서열로 표시되지 않은 대략 140개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1)를 Balb-C 마우스에게 2.5 ㎎/㎏의 용량으로 근육내에 혹은 피하에 투여하였다. 영상화 20분 전에, 마우스에게 D-루시페린 용액을 150 ㎎/㎏으로 복강내로 주사하였다. 이 동물은 이어서 마취시키고, IVIS 루미나 II 이미징 시스템(IVIS Lumina II imaging system)(퍼킨 엘머사)으로 영상을 획득하였다. 생물발광은 전체 마우스의 총 플럭스(광자/초)로서 측정되었다. 마우스들은 2시간, 8시간 및 24시간째에 영상화하였다. 근육내 투여에 대한 평균 총 플럭스(광자/초)는 표 134에 표시되어 있고, 피하 투여에 대한 평균 총 플럭스(광자/초)는 표 135에 표시되어 있다. 배경 신호는 3.84E+05(p/s)였다. 근육내 투여에 대한 피크 발현은 모든 화학에 대해서 24시간 내지 48시간 사이에 보였고, 발현은 여전히 120시간에 검출되었다. 피하 전달을 위하여, 피크 발현은 2 내지 8시간에 보였고, 발현은 72시간에 검출되었다.
Figure pct00282
Figure pct00283
실시예 89. 생체내 연구
적어도 하나의 화학적 변형을 함유하는 루시페라제 변형된 mRNA는 주사기 펌프 방법을 이용해서 지질 나노입자(LNP)로서 제형화하고, 입자 크기, 제타 전위 및 봉입에 의해 특성규명된다.
표 136에 개략적으로 나타낸 바와 같이, 루시페라제 LNP 제형은 Balb-C 마우스에게 근육내(I.V.), 정맥내(I.V.) 또는 피하(S.C.)로 투여한다. 대조군으로서, PBS로 제형화된 루시페라제 변형된 RNA는 마우스에게 정맥내로 투여한다.
Figure pct00284
마우스는 생물발광(전체 마우스의 총 플럭스(광자/초)로서 측정됨)을 결정하기 위하여 2, 8, 24, 48, 120 및 192시간에 영상화한다. 8시간 또는 192시간에, 간, 비장, 신장 및 피하 및 근육내 투여용의 주사 부위는 생물발광을 결정하기 위하여 영상화한다.
실시예 90. 화학적으로 변형된 mRNA의 양이오성 지질 제형 연구
5-메틸사이토신 및 유사유리딘(5mC/pU), 유사유리딘(pU) 또는 N1-메틸유사유리딘(N1mpU)으로 변형된 루시페라제 mRNA(서열번호 16; 서열로 표시되지 않은 대략 140개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1)는 표 137에 기재된 바와 같이 양이온성 지질로 제형화되었다. 제형은 0.05 ㎎/㎏의 용량으로 Balb-C 마우스에게 정맥내로(I.V.), 근육내로(I.M.) 또는 피하로(S.C.) 투여하였다.
Figure pct00285
영상화 20분 전에, 마우스에게 D-루시페린 용액을 150 ㎎/㎏으로 복강내로 주사하였다. 이 동물은 이어서 마취시키고, IVIS 루미나 II 이미징 시스템(IVIS Lumina II imaging system)(퍼킨 엘머사)으로 영상을 획득하였다. 생물발광은 전체 마우스의 총 플럭스(광자/초)로서 측정되었다. 마우스는 투약 후 2시간, 8시간 및 24시간에 촬영하여, 평균 총 플럭스(광자/초)를 각 투여 경로 및 양이온성 지질 제형에 대해서 측정하였다. 배경 플럭스는 약 4.11E+05 p/s였다. 영상화의 결과는 표 138에 표시되어 있다. 피크 발현은 8시간째에 테트스된 3가지 경로 모두에 대해서 보였다.
Figure pct00286
실시예 91. 화학적 변형된 mRNA의 연구
N4-아세틸시티딘(N4-아세틸)으로 완전 변형되거나, 5-메톡시유리딘(5meth)으로 완전 변형되거나, N4-아세틸시티딘 및 N1-메틸유사유리딘(N4-아세틸/N1mpU)으로 완전 변형되거나 5-메틸사이토신 및 5-메톡시유리딘(5mC/5-meth)으로 완전 변형된 루시페라제 mRNA(서열번호 16; 서열로 표시되지 않은 대략 140개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1)는 표 139에 기재된 바와 같이 DLin-MC3-DMA로 제형화되었다. 이 제형은 0.05 ㎎/㎏의 용량으로 Balb-C 마우스에게 정맥내로(I.V.), 근육내로(I.M.) 또는 피하로(S.C.) 투여하였다.
Figure pct00287
영상화 20분 전에, 마우스에게 D-루시페린 용액을 150 ㎎/㎏으로 복강내로 주사하였다. 이 동물은 이어서 마취시키고, IVIS 루미나 II 이미징 시스템(IVIS Lumina II imaging system)(퍼킨 엘머사)으로 영상을 획득하였다. 생물발광은 전체 마우스의 총 플럭스(광자/초)로서 측정되었다. 마우스는 투약 후 2시간, 6시간 및 24시간에 촬영하여 평균 총 플럭스(광자/초)를 각 투여 경로 및 양이온성 지질 제형에 대해서 측정하였다. 배경 플럭스는 약 2.70E+05 p/s였다. 영상화의 결과는 표 140에 표시되어 있다.
Figure pct00288
실시예 92. PLGA 미소구
A. PLGA 미소구의 합성
폴리락틱글라이콜산(PLGA) 미소구는 당업계에 공지된 물/오일/물 이중 유화 방법을 이용해서 PLGA-에스터 캡(락텔사, Cat# B6010-2, 고유 점도 0.55-0.75, 50:50 LA:GA) 또는 PLGA-산 캡(락텔사, Cat#B6013-2, 고유 점도 0.55-0.75, 50:50 LA:GA), 폴리비닐알코올(PVA)(시그마사, Cat# 348406-25G, MW13-23k) 다이클로로메탄 및 물을 이용해서 합성하였다. 간단히, 4 ㎎/㎖에서 물(W1) 중 mRNA 0.4㎖를 PLGA의 50 내지 200 ㎎/㎖ 범위의 농도에서 다이클로로메탄(DCM)(O1) 중에 용해된 PLGA 2㎖에 첨가하였다. W1/O1 에멀전을 속도 4(~15,000 rpm)에서 30초 동안 균질화시켰다(이카 울트라-튜락스 균질화기, T18). 이어서 W1/O1 에멀전을 1% PVA(W2) 250㎖에 첨가하고, 속도 5(~19,000 rpm)에서 1분 동안 균질화시켰다. 제형은 3시간 동안 교반하고 나서, 100㎛ 나일론 메쉬 스트레이너(Fisherbrand Cell Strainer, Cat # 22-363-549)를 통과시켜 보다 큰 응집물을 제거하고, 마지막으로 원심분리(10분, 9,250 rpm, 4℃)에 의해 세척하였다. 상청액을 버리고 PLGA 펠릿을 물 5 내지 10㎖에 재현탁시키고, 이것을 2회 반복하였다. 세척된 제형을 액체 질소 중에서 동결시키고 나서, 2 내지 3일 동안 동결건조시켰다.
B. 균질화 속도 또는 PLGA 농도의 감소
PLGA 루시페라제 미소구(서열번호 16으로 표시된 루시페라제 mRNA; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨)는 에스터-캡핑된 PLGA로 위에서 기재된 조건을 이용해서 제조하였다. 세척과 물을 이용한 재현탁 후, 100 내지 200㎕의 PLGA 미소구 샘플을 이용해서 레이저 회절에 의해 제형의 입자 크기를 측정하였다(몰번 마스터사이저(Malvern Mastersizer)2000). PLGA 농도 200 ㎎/㎖를 지닌 제2 에멀전에 제1 에멀전의 첨가 동안 균질화 속도를 감소시킴으로써 제조한 미소구의 입자 크기는 표 141에 표시되어 있고, 다이클로로메탄(DCM) 중 PLGA 농도를 감소시킴으로써 제조한 미소구는 제2 에멀전에의 제1 에멀전의 첨가 동안 5의 균질화 속도로 해서 표 142에 표시되어 있다.
Figure pct00289
Figure pct00290
산 혹은 에스터 캡핑된, 고유 점도 0.55 내지 0.75를 지니는 PLGA를 이용해서 표 143에 표시된 미소구를 제조하였다. 미소구의 입자 크기 및 방출 동역학이 또한 결정되었고, 표 143에 표시되어 있다.
Figure pct00291
C. PLGA 미소구 내에 봉입된 변형된 mRNA의 방출 연구
루시페라제 변형된 RNA(서열번호 16; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨)로 제형화된 PLGA 미소구를 탈제형화시키고, 추출된 변형된 RNA의 통합성을 자동화 전기영동(Bio-Rad Experion)에 의해 결정하였다. 동결건조 후, ~10㎎의 PLGA MS를 2㎖ 에펜도르프 튜브 중에서 칭량하고, DCM 1㎖를 첨가하고 샘플을 2 내지 6시간 동안 진탕시킴으로써 탈제형화시켰다. 물 0.5㎖를 첨가하고 이 샘플을 하룻밤 진탕함으로써 탈제형화된 PLGA 미소구로부터 mRNA를 추출하였다. 수중 비제형화된 루시페라제 mRNA(탈제형화 대조군)는 DCM 내에 스파이킹하고, 대조군으로서 이용될 탈제형화 공정으로 보냈다. 추출된 변형된 mRNA는 봉입된 변형된 mRNA의 통합성을 테스트하기 위하여 비제형화된 변형된 mRNA 및 탈제형화 대조군과 비교하였다. 대부분의 변형된 RNA는, 탈제형화된 대조군(탈제형화 대조군) 및 비제형화된 대조군(비제형화 대조군)에 비해서, 배취 ID A, B, C, D, E에 대해서 온전하였다.
D. PLGA 미소구 내에 봉입된 변형된 mRNA의 방출 연구
루시페라제 변형된 RNA(서열번호 16; 서열로 표시되지 않은 대략 160개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 유사유리딘으로 완전 변형됨)로 제형화된 PLGA 미소구를 두벌 혹은 세벌로 PLGA 미소구 농도 80 ㎎/㎖로 TE 완충액에 재현탁시켰다. 재현탁 후, 샘플은 연구 과정 동안 37℃에서 배양 및 진탕시켰다. 각 시점(0.04, 0.25, 1.2, 4 및 7일)에 대해서, 튜브를 원심분리하여, 상청액을 제거하고, 펠릿을 새로운 TE 완충액 0.25㎖에 재현탁시켰다. PLGA 미소구로부터 방출된 변형된 RNA의 양을 결정하기 위하여, 상청액 중 변형된 RNA 농도는 OD 260에 의해 결정하였다. 표 144에 표시된 방출 퍼센트는, 각 샘플 내 변형된 RNA의 총량에 의거해서 산출되었다. mRNA 제형의 방출 속도는 입자 크기, PLGA 농도, 그리고 산 대 에스터-말단 캡을 변경해서 맞춤화시킬 수 있다.
Figure pct00292
E. 루시페라제 PLGA 미소구 생체내 연구
5-메틸사이토신 및 N1-메틸유사유리딘으로 완전 변형되거나 또는 N1-메틸유사유리딘으로 완전 변형된 루시페라제 mRNA(서열번호 16, 서열로 표시되지 않은 대략 140개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡1)를 함유하는 PLGA 미소구는 표 145에 기재된 바와 같이 제형화하고, 마우들에게 피하 주사한다. 영상화 20분 전에, 마우스들에게 D-루시페린 용액을 150 ㎎/㎏으로 복강내에 주사한다. 이어서 동물들을 마취시키고, VIS 루미나 II 이미징 시스템(퍼킨 엘머사)으로 영상을 얻었다. 생물발광은 전체 마우스의 총 플럭스(광자/초)로서 측정되었다.
Figure pct00293
실시예 93. 완충액 제형
변형된 mRNA는 수계 완충액으로 제형화될 수 있다. 생물학적 시스템과 유사한 완충액은 전통적으로 등장성이다. 이러한 완충액 및 완충 용액은 이하의 지침에 따라서 제조될 수 있다. 성분예는 표 146에 부여되어 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 칼슘 이온이 제형용의 완충 용액에 첨가될 수 있다.
Figure pct00294
실시예 94. 복수의 변형된 mRNA를 함유하는 지질 나노입자
EPO mRNA(서열번호 9; 서열로 표시되지 않은 대략 140개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 N1-메틸유사유리딘으로 완전 변형됨), G-CSF mRNA(서열번호 6; 서열로 표시되지 않은 대략 140개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 N1-메틸유사유리딘으로 완전 변형됨) 및 인자 IX mRNA(서열번호 10; 서열로 표시되지 않은 대략 140개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 N1-메틸유사유리딘으로 완전 변형됨)는, 표 147에 기재된 바와 같이 DLin-MC3-DMA로 제형화된다. 제형은 0.05 ㎎/㎏의 용량으로 Balb-C 마우스에게 정맥내로(I.V.), 근육내로(I.M.) 또는 피하로(S.C.) 투여한다. 단지 하나의 mRNA만을 함유하는 대조군 LNP 제형에게도 동등 용량으로 투여한다.
Figure pct00295
혈청은 제형의 투여 후 8시간, 24시간, 72시간 및/또는 7일에 마우스로부터 수집한다. 혈청은 EPO, G-CSF 및 인자 IX의 단백질 발현을 결정하기 위하여 ELISA에 의해 분석된다.
실시예 95. 5-메틸사이토신 및 N1-메틸유사유리딘 변형된 mRNA의 양이온성 지질 제형 연구
EPO mRNA(서열번호 9; 서열로 표시되지 않은 대략 140개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 N1-메틸유사유리딘으로 완전 변형됨) 또는 G-CSF mRNA(서열번호 6; 서열로 표시되지 않은 대략 140개의 뉴클레오타이드의 폴리A 테일; 5'캡, 캡 1; 5-메틸사이토신 및 N1-메틸유사유리딘으로 완전 변형됨)는 표 148에 기재된 바와 같이 DLin-MC3-DMA 및 DLin-KC2-DMA로 제형화된다. 제형은 0.05 ㎎/㎏의 용량으로 Balb-C 마우스에게 정맥내로(I.V.), 근육내로(I.M.) 또는 피하로(S.C.) 투여하였다.
Figure pct00296
혈청은 제형의 투여 후 8시간, 24시간, 72시간 및/또는 7일에 마우스로부터 수집한다. 혈청은 EPO 및 G-CSF의 단백질 발현을 결정하기 위하여 ELISA에 의해 분석된다.
실시예 96. 유사유리딘 및 N1-메틸 유사유리딘의 지향된 SAR
피리미딘 뉴클레오사이드 유사유리딘에 대한 최근의 집중에 의해, 일련의 구조-활성 연구는 유사유리딘 또는 N1-메틸-유사유리딘에 대한 mRNA 함유 변형을 연구하도록 설계되었다.
연구는, 변형이 N1 위치, C6 위치, 2-위치, 4-위치에 그리고 포스페이트 골격 상에서 이루어진 때에, 사슬 길이의 효과, 친유성 증가, 고리 구조의 존재 및 소수성 혹은 친수성 상호작용의 변경을 탐구하도록 설계되었다. 안정성 또한 조사되었다.
이 목적을 위하여, 알킬화, 사이클로알킬화, 알킬-사이클로알킬화, 아릴화, 알킬-아릴화, 아미노기를 지닌 알킬화 모이어티, 카복실산기를 지닌 알킬화 모이어티 및 아미노산 하전된 모이어티를 함유하는 알킬화 모이어티와 연루된 변형이 조사되었다. 알킬화 정도는 일반적으로 C1-C6이다. 화학 변형의 예들은 표 149 및 표 150에 열거된 것들을 포함한다.
Figure pct00297
Figure pct00298
Figure pct00299
Figure pct00300
실시예 97. 천연 및 비-천연 유래 뉴클레오사이드의 혼입
관심 대상 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA 내로 천연형 및 비천연형 뉴클레오사이드를 혼입시킨다. 이들의 예는 표 151 및 표 152에 부여되어 있다. 소정의 상업적으로 입수가능한 뉴클레오사이드 트라이포스페이트(NTP)는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에서 조사된다. 이들의 선택은 표 152에 부여되어 있다. 얻어진 mRNA는 이어서 단백질을 생산하고/하거나, 사이토카인을 유도하고/하거나, 치료적 성과를 내는 그들의 능력에 대해서 조사된다.
Figure pct00301
Figure pct00302
실시예 98. 핵염기 및 탄수화물(당)로의 변형의 혼입
관심 대상 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA 내로 천연형 및 비천연형 뉴클레오사이드를 혼입시킨다. 핵염기와 탄수화물(당) 둘 모두에 대한 변형을 가진 NTP 및 상업적으로 입수가능한 뉴클레오사이드에 대해서, mRNA 내로의 혼입되어 단백질을 생산하고/하거나, 사이토카인을 유도하고/하거나, 치료적 성과를 내는 그들의 능력에 대해서 조사한다. 이들의 예는 표 153 및 표 154에 부여되어 있다.
Figure pct00303
Figure pct00304
표에서, "UTP"는 유리딘 트라이포스페이트를 지칭하고, "GTP"는 구아노신 트라이포스페이트를 지칭하며, "ATP"는 아데노신 트라이포스페이트를 지칭하고, "CTP"는 사이토신 트라이포스페이트를 지칭하며, "TP"는 트라이포스페이트를 지칭하고, "Bz"는 벤질을 지칭한다.
이용되고 있는 단어들은 제한보다는 설명을 위한 단어들이며, 본 발명의 범위와 정신으로부터 벗어나는 일 없이 첨부된 특허청구범위의 조항 내에서 그의 보다 넓은 양상으로 변화가 행해질 수 있다는 것이 이해될 것이다.
본 발명은 수개의 기술된 실시형태에 관하여 일부 길이로 그리고 일부 상세하게 기술되어 있지만, 임의의 이러한 상세 혹은 실시형태 또는 임의의 특수한 실시형태로 제한되도록 의도된 것이 아니라, 종래 기술에 비추어 첨부된 특허청구범위의 가능한 최광의의 해석을 제공하고 따라서 본 발명의 의도된 범위를 효과적으로 망라하도록 이러한 청구범위를 참조하여 해석되어야 한다.
본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 공보 및 기타 참조문헌은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. 상충될 경우, 정의를 비롯하여 본 명세서가 지배할 것이다. 또한, 부문의 제목, 재료, 방법 및 실시예들은 단지 예시적일 뿐 제한되도록 의도된 것은 아니다.
SEQUENCE LISTING <110> MODERNA THERAPEUTICS, INC. <120> MODIFIED NUCLEOSIDE, NUCLEOTIDE, AND NUCLEIC ACID COMPOSITIONS <130> WO2013/090648 <150> US 61/576,705 <151> 2011-12-16 <150> US 61/618,957 <151> 2012-04-02 <150> US 61/648,244 <151> 2012-05-17 <150> US 61/681,712 <151> 2012-08-10 <150> US 61/696,381 <151> 2012-09-04 <150> US 61/709,303 <151> 2012-10-03 <150> PCT/US2012/058519 <151> 2012-10-03 <150> US 61/712,490 <151> 2012-10-11 <160> 25 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 10 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> modified_base <222> (4)...(4) <223> n= A or G <400> 1 ccrnccaugg 10 <210> 2 <211> 9 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> modified_base <222> (8)...(8) <223> n= U or A <220> <221> modified_base <222> (9)...(9) <223> n = U or A <400> 2 uuauuuann 9 <210> 3 <211> 615 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atggctggac ctgccaccca gagccccatg aagctgatgg ccctgcagct gctgctgtgg 60 cacagtgcac tctggacagt gcaggaagcc acccccctgg gccctgccag ctccctgccc 120 cagagcttcc tgctcaagtg 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uugucugcgg 1200 uccaccaaau ucacaaucua caacaauaug uucugugcgg gauuccauga aggugggaga 1260 gauagcugcc agggagacuc aggggguccc cacgugacgg aagucgaggg gacgucauuu 1320 cugacgggaa uuaucucaug gggagaggaa ugugcgauga aggggaaaua uggcaucuac 1380 acuaaagugu cacgguaugu caauuggauc aaggaaaaga cgaaacucac gugaucagcc 1440 agcgcugccu ucugcggggc uugccuucug gccaugcccu ucuucucucc cuugcaccug 1500 uaccucuugg ucuuugaaua aagccugagu aggaag 1536 <210> 11 <211> 767 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 taatacgact cactataggg aaataagaga gaaaagaaga gtaagaagaa atataagagc 60 caccatggga gtgcacgagt gtcccgcgtg gttgtggttg ctgctgtcgc tcttgagcct 120 cccactggga ctgcctgtgc tgggggcacc acccagattg atctgcgact cacgggtact 180 tgagaggtac cttcttgaag ccaaagaagc cgaaaacatc acaaccggat gcgccgagca 240 ctgctccctc aatgagaaca ttactgtacc ggatacaaag gtcaatttct atgcatggaa 300 gagaatggaa gtaggacagc aggccgtcga agtgtggcag gggctcgcgc ttttgtcgga 360 ggcggtgttg cggggtcagg ccctcctcgt caactcatca cagccgtggg agcccctcca 420 acttcatgtc gataaagcgg tgtcggggct 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cuacaaugag cgggaacucu ugaauagcau gggaaucucc cagccgacgg 420 ucguguuugu cuccaaaaag gggcugcaga aaauccucaa cgugcagaag aagcucccca 480 uuauucaaaa gaucaucauu auggauagca agacagauua ccaaggguuc cagucgaugu 540 auaccuuugu gacaucgcau uugccgccag gguuuaacga guaugacuuc guccccgagu 600 cauuugacag agauaaaacc aucgcgcuga uuaugaauuc cucggguagc accgguuugc 660 caaagggggu ggcguugccc caccgcacug cuugugugcg guucucgcac gcuagggauc 720 cuaucuuugg uaaucagauc auucccgaca cagcaauccu guccguggua ccuuuucauc 780 acgguuuugg cauguucacg acucucggcu auuugauuug cgguuucagg gucguacuua 840 uguaucgguu cgaggaagaa cuguuuuuga gauccuugca agauuacaag auccagucgg 900 cccuccuugu gccaacgcuu uucucauucu uugcgaaauc gacacuuauu gauaaguaug 960 accuuuccaa ucugcaugag auugccucag ggggagcgcc gcuuagcaag gaagucgggg 1020 aggcaguggc caagcgcuuc caccuucccg gaauucggca gggauacggg cucacggaga 1080 caacauccgc gauccuuauc acgcccgagg gugacgauaa gccgggagcc gucggaaaag 1140 ugguccccuu cuuugaagcc aaggucguag accucgacac gggaaaaacc cucggaguga 1200 accagagggg cgagcucugc 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gacacaaguu uucgguaucc ggagaaggag agggugacgc cacauacgga aagcuuacac 180 ucaaauucau cuguacgacg gggaaacugc ccguacccug gccuacgcuc guaaccacgc 240 ugacuuaugg agugcagugc uuuagcagau accccgacca uaugaagcag cacgacuucu 300 ucaagucggc gaugcccgag ggguacgugc aagagaggac cauuuucuuc aaagacgaug 360 gcaauuacaa aacacgcgca gaagucaagu uugagggcga uacucugguc aaucggaucg 420 aauugaaggg aaucgauuuc aaagaagaug gaaacauccu uggccauaag cucgaguaca 480 acuauaacuc gcauaauguc uauaucaugg cugacaagca gaaaaacggu aucaaaguca 540 acuuuaagau ccgacacaau auugaggacg guucggugca gcuugcggac cacuaucaac 600 agaauacgcc gauuggggau gguccggucc uuuugccgga uaaccauuau cucucaaccc 660 agucagcccu gagcaaagau ccaaacgaga agagggacca cauggucuug cucgaauucg 720 ugacagcggc agggaucacu cugggaaugg acgaguugua caagugauaa gcugccuucu 780 gcggggcuug ccuucuggcc augcccuucu ucucucccuu gcaccuguac cucuuggucu 840 uugaauaaag ccugaguagg aag 863 <210> 19 <211> 716 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 19 gggaaauaag agagaaaaga agaguaagaa gaaauauaag agccaccaug aacuuucucu 60 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Ile Leu Leu Leu Ala Gly Leu 1 5 10 15 Cys Cys Leu Val Pro Val Ser Leu Ala 20 25 <210> 23 <211> 46 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Ser Leu Ile Thr 1 5 10 15 Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu 20 25 30 Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro Lys Arg 35 40 45 <210> 24 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Met Lys Gly Ser Leu Leu Leu Leu Leu Val Ser Asn Leu Leu Leu Cys 1 5 10 15 Gln Ser Val Ala Pro 20 <210> 25 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg 20

Claims (63)

  1. 포유류의 세포 혹은 조직에서 관심 대상 폴리펩타이드를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은, 상기 포유류의 세포 혹은 조직을, 상기 관심 대상 폴리펩타이드를 암호화하는 변형된 mRNA(modified mRNA)를 포함하는 제형과 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 제형은 나노입자, 폴리(락틱-코-글라이콜산)(PLGA) 미소구(micropshere), 리피도이드, 리포플렉스, 리포솜, 중합체, 탄수화물(단당을 포함함), 양이온성 지질, 피브린 겔, 피브린 하이드로겔, 피브린 글루, 피브린 봉합제, 피브리노겐, 트롬빈, 신속 제거형 지질 나노입자(rapidly eliminated lipid nanoparticle: reLNP) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 변형된 mRNA는 정제된 IVT 전사물을 포함하는 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 변형된 mRNA를 포함하는 제형은 나노입자를 포함하고, 상기 나노입자는 적어도 1종의 지질을 포함하는 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 지질은 DLin-DMA, DLin-K-DMA, 98N12-5, C12-200, DLin-MC3-DMA, DLin-KC2-DMA, DODMA, PLGA, PEG, PEG-DMG 및 페길화 지질로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 지질은 양이온성 지질인 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 양이온성 지질은 DLin-DMA, DLin-K-DMA, DLin-MC3-DMA, DLin-KC2-DMA 및 DODMA로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  7. 제3항에 있어서, 상기 지질 대 변형된 mRNA 중량비는 10:1 내지 30:1인 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 변형된 mRNA를 포함하는 상기 나노입자 제형의 평균 크기는 60 내지 225㎚인 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 변형된 mRNA를 포함하는 상기 나노입자 제형의 PDI는 0.03 내지 0.15인 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  10. 제3항에 있어서, 상기 지질의 제타 전위는 pH 7.4에서 -10 내지 +10인 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 변형된 mRNA를 포함하는 상기 나노입자 제형은 융합생성 지질(fusogenic lipid), 콜레스테롤 및 PEG 지질을 더 포함하는 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 변형된 mRNA를 포함하는 상기 나노입자 제형은 50:10:38.5:1.5-3.0(양이온성 지질:융합생성 지질:콜레스테롤:PEG 지질)의 몰비를 지니는 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 PEG 지질은 PEG-c-DOMG 및 PEG-DMG로부터 선택되고, 상기 융합생성 지질은 DSPC인 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  14. 제1항에 있어서, 접촉은 주사기 펌프(syringe pump), 내부 삼투압 펌프 및 외부 삼투압 펌프로 이루어진 군으로부터 선택된 장치의 사용을 통하는 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 변형된 mRNA를 포함하는 제형은 폴리(락틱-코-글라이콜산)(PLGA) 미소구인 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 변형된 mRNA를 포함하는 PLGA 미소구 제형의 미소구는 4 내지 20㎛ 크기인 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 변형된 mRNA를 포함하는 PLGA 미소구 제형은 48시간의 기간에 상기 변형된 mRNA의 50% 미만을 방출하는 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  18. 제15항에 있어서, 상기 변형된 mRNA를 포함하는 PLGA 미소구 제형은 혈청 중에서 안정적인 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  19. 제18항에 있어서, 안정성은 90% 혈청 중 비제형화된 변형된 mRNA에 대해서 결정되는 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  20. 제15항에 있어서, 장입 중량 퍼센트(loading weight percent)는 적어도 0.05%, 적어도 0.1%, 적어도 0.2%, 적어도 0.3% 또는 적어도 0.4%인 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  21. 제15항에 있어서, 상기 PLGA 미소구 내 상기 변형된 mRNA의 봉입 효율은 적어도 50%인 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  22. 제15항에 있어서, 상기 PLGA 미소구 내 상기 변형된 mRNA의 봉입 효율은 적어도 70%인 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  23. 제15항에 있어서, 상기 PLGA 미소구 내 상기 변형된 mRNA의 봉입 효율은 적어도 90%인 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  24. 제15항에 있어서, 상기 PLGA 미소구 내 상기 변형된 mRNA의 봉입 효율은 적어도 97%인 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  25. 제11항에 있어서, 상기 포유류의 세포들 혹은 조직들을 접촉시키는 단계는 정맥내, 근육내, 유리체내, 척수강내, 종양내, 폐 및 피하로 이루어진 군으로부터 선택된 투여 경로를 통해서 일어나는 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 관심 대상 폴리펩타이드는 접촉 전의 수준보다 높은 수준에서 접촉 후 72시간까지 상기 혈청 중에서 검출가능한 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 관심 대상 폴리펩타이드는 수컷 대상체의 혈청 내에서보다 높은 수준에서 암컷 대상체의 혈청 내에서 검출가능한 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  28. 제1항에 있어서, 상기 제형은 제2의 변형된 mRNA를 더 포함하는 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 제형은 제3의 변형된 mRNA를 더 포함하는 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  30. 제1항에 있어서, 상기 변형된 mRNA를 포함하는 제형은 신속 제거형 지질 나노입자를 포함하는 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 신속 제거형 지질 나노입자는 50:10:38.5:1.5(reLNP 지질:융합생성 지질:콜레스테롤:PEG 지질)의 몰비로 reLNP 지질, 융합생성 지질, 콜레스테롤 및 PEG 지질을 포함하는 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 융합생성 지질은 DSPC이고, 상기 PEG 지질은 PEG-c-DOMG인 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  33. 제31항에 있어서, 상기 reLNP 지질은 내부 에스터를 가진 DLin-DMA, 말단 에스터를 가진 DLin-DMA, 내부 에스터를 가진 DLin-MC3-DMA 및 말단 에스터를 가진 DLin-MC3-DMA로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  34. 제30항에 있어서, 총 지질 대 변형된 mRNA 중량비가 10:1 내지 30:1인 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  35. 제1항에 있어서, 접촉은 분할 투약 스케줄을 이용한 주사를 통해 일어나는 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 주사는 진피내 공간, 표피, 피하 조직 및 근육으로 이루어진 군으로부터 선택된 조직에 대해서 행하는 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  37. 제1항에 있어서, 상기 변형된 mRNA를 포함하는 제형은 피브린 봉합제를 포함하는 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  38. 제1항에 있어서, 상기 변형된 mRNA를 포함하는 제형은 리피도이드(lipidoid)를 포함하고, 상기 지질은 C12-200 및 98N12-5로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  39. 제1항에 있어서, 상기 변형된 mRNA를 포함하는 제형은 중합체이고, 상기 중합체는 하이드로겔 또는 수술 봉합제의 층으로 피복되거나(coated), 덮이거나(covered), 둘러싸이거나(surrounded), 포위되거나(enclosed) 또는 해당 층을 포함하는 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 중합체는 PLGA, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴록사머 및 겔사이트(GELSITE)®로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  41. 제40항에 있어서, 중합체, 하이드로겔 또는 수술 봉합제의 부가적인 층을 더 포함하는 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  42. 제2항에 있어서, 상기 변형된 mRNA는 캡0(Cap0), 캡1(Cap1), ARCA, 이노신, N1-메틸-구아노신, 2'플루오로-구아노신, 7-데아자-구아노신, 8-옥소-구아노신, 2-아미노-구아노신, LNA-구아노신 및 2-아자이도-구아노신으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 5' 말단 캡을 포함하는 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 5'말단 캡은 캡1(Cap1)인 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 변형된 mRNA는 적어도 2개의 변형을 포함하는 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 적어도 2개의 변형은 독립적으로 5-메틸시티딘, 유사유리딘 및 1-메틸-유사유리딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  46. 포유류의 세포 혹은 조직 내에서 관심 대상 폴리펩타이드를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은, 상기 포유류의 세포 혹은 조직을, 상기 관심 대상 폴리펩타이드를 암호화하는 변형된 mRNA를 포함하는 완충액 제형과 접촉시키는 단계를 포함하는, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 완충액 제형은 식염수, 인산염 완충 식염수 및 락트산 링거(Ringers lactate)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  48. 제46항에 있어서, 상기 완충액 제형은 1 내지 10mM의 칼슘 농도를 포함하는 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  49. 제46항에 있어서, 상기 변형된 mRNA는 정제된 IVT 전사물을 포함하는 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  50. 제46항에 있어서, 상기 포유류의 세포 혹은 조직을 접촉시키는 단계는 정맥내, 근육내, 유리체내, 척수강내, 종양내, 폐 및 피하로 이루어진 군으로부터 선택된 투여 경로를 통해서 일어나는 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  51. 제25항 또는 제50항에 있어서, 상기 관심 대상 폴리펩타이드는 접촉하는 개소로부터 전신에 영향을 미치는 개소에 상기 세포 혹은 조직에서 생산되는 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 투여 경로는 근육내 또는 피하를 통하는 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  53. 제3항에 있어서, 상기 지질 나노입자 제형은 봉합제로 더욱 제형화된 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 봉합제는 피브린 봉합제인 것인, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  55. 영장류에서 약리학적 효과를 발생시키는 방법으로서, 상기 영장류를, 관심 대상 폴리펩타이드를 암호화하는 제형화된 변형된 mRNA를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 영장류에서 약리학적 효과를 발생시키는 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 변형된 mRNA는 정제된 IVT 전사물을 포함하는 것인, 영장류에서 약리학적 효과를 발생시키는 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 제형은 나노입자, 폴리(락틱-코-글라이콜산)(PLGA) 미소구, 리피도이드, 리포플렉스, 리포솜, 중합체, 탄수화물(단당을 포함함), 양이온성 지질, 피브린 겔, 피브린 하이드로겔, 피브린 글루, 피브린 봉합제, 피브리노겐, 트롬빈, 신속 제거형 지질 나노입자(reLNP) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 영장류에서 약리학적 효과를 발생시키는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 약리학적 효과는 상기 약리학적 효과를 발생하는 것으로 알려진 치료제와 연관된 약리학적 효과보다 큰 것인, 영장류에서 약리학적 효과를 발생시키는 방법.
  59. 제57항에 있어서, 상기 약리학적 효과는 상기 관심 대상 폴리펩타이드를 암호화하는 비제형화된 변형된 mRNA를 포함하는 조성물에 의해 발생된 약리학적 효과보다 큰 것인, 영장류에서 약리학적 효과를 발생시키는 방법.
  60. 제57항에 있어서, 상기 약리학적 효과는 상기 관심 대상 폴리펩타이드를 암호화하는 비제형화된 변형된 mRNA를 포함하는 조성물에 의해 발생된 약리학적 효과보다 큰 것인 방법.
  61. 제57항에 있어서, 상기 약리학적 효과는 질환, 장애, 병태 또는 감염의 치료적으로 유효한 성과를 내는 것인, 영장류에서 약리학적 효과를 발생시키는 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 약리학적 효과는 세포수 변화, 혈청 화학의 변경, 효소 활성의 변경, 헤모글로빈의 증가 및 헤마토크릿(hematocrit)의 증가로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 영장류에서 약리학적 효과를 발생시키는 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 치료적으로 유효한 성과는 치료, 하나 이상의 증상의 개선, 진단, 예방 및 발병의 지연으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 영장류에서 약리학적 효과를 발생시키는 방법.
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