EA023031B1 - Антиген-связывающая конструкция и ее применение - Google Patents
Антиген-связывающая конструкция и ее применение Download PDFInfo
- Publication number
- EA023031B1 EA023031B1 EA201000704A EA201000704A EA023031B1 EA 023031 B1 EA023031 B1 EA 023031B1 EA 201000704 A EA201000704 A EA 201000704A EA 201000704 A EA201000704 A EA 201000704A EA 023031 B1 EA023031 B1 EA 023031B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- binding
- antigen
- chain
- antibody
- domain
- Prior art date
Links
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 1133
- 238000009739 binding Methods 0.000 title claims abstract description 1124
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 468
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 468
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 468
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 157
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 55
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 55
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 10
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 10
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 34
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 28
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 claims description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 12
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 12
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 claims description 10
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 claims description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 7
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 claims description 6
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 4
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 claims description 3
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 claims description 2
- 229940100602 interleukin-5 Drugs 0.000 claims description 2
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 159
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 139
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 139
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 101
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 99
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 93
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 86
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 78
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 74
- 229950011485 pascolizumab Drugs 0.000 description 70
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 69
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 65
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 64
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 64
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 55
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 53
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 51
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 50
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 49
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 49
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 48
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 45
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 44
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 41
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 41
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 40
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 36
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 35
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 35
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 33
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 32
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 32
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 31
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 31
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 30
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 29
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 29
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 28
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 27
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 27
- 102000025171 antigen binding proteins Human genes 0.000 description 26
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 25
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 25
- 230000006870 function Effects 0.000 description 25
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 25
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 22
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 21
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 20
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 20
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 20
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 20
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 20
- 229940082789 erbitux Drugs 0.000 description 19
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 19
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- 230000004044 response Effects 0.000 description 19
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 18
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 17
- 102000002111 Neuropilin Human genes 0.000 description 16
- 108050009450 Neuropilin Proteins 0.000 description 16
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 15
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 15
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 15
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 15
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 14
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 13
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 13
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 13
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 12
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 12
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 12
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 11
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 11
- 238000013461 design Methods 0.000 description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 11
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 10
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 10
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 10
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 10
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 9
- -1 for example Proteins 0.000 description 9
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 9
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 9
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 8
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 8
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 8
- RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N benzene-1,2-diamine;hydron;dichloride Chemical compound Cl.Cl.NC1=CC=CC=C1N RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 8
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 8
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 8
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 8
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 7
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 7
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 7
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 7
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 7
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 7
- 102000011721 Matrix Metalloproteinase 12 Human genes 0.000 description 6
- 108010076501 Matrix Metalloproteinase 12 Proteins 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 6
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 6
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 6
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 6
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 6
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 6
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 6
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 description 5
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 5
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 5
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 5
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 5
- JRMUNVKIHCOMHV-UHFFFAOYSA-M tetrabutylammonium bromide Chemical compound [Br-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC JRMUNVKIHCOMHV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 102000009091 Amyloidogenic Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010048112 Amyloidogenic Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102100029470 Apolipoprotein E Human genes 0.000 description 4
- 101710095339 Apolipoprotein E Proteins 0.000 description 4
- 102100036849 C-C motif chemokine 24 Human genes 0.000 description 4
- 101100227826 Caenorhabditis elegans mks-5 gene Proteins 0.000 description 4
- 108010083647 Chemokine CCL24 Proteins 0.000 description 4
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 4
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 4
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 4
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 4
- 101000599458 Homo sapiens Protein phosphatase inhibitor 2 family member C Proteins 0.000 description 4
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 4
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 4
- 102000046229 human PPP1R2C Human genes 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 239000000893 inhibin Substances 0.000 description 4
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 229960005108 mepolizumab Drugs 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 101150053844 APP1 gene Proteins 0.000 description 3
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 3
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 3
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 3
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 description 3
- 102100023688 Eotaxin Human genes 0.000 description 3
- 101710139422 Eotaxin Proteins 0.000 description 3
- 102000004864 Fibroblast growth factor 10 Human genes 0.000 description 3
- 108090001047 Fibroblast growth factor 10 Proteins 0.000 description 3
- 102100035233 Furin Human genes 0.000 description 3
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 3
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 3
- 101100189105 Homo sapiens PABPC4 gene Proteins 0.000 description 3
- 101000713575 Homo sapiens Tubulin beta-3 chain Proteins 0.000 description 3
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 3
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 3
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 3
- 101000574441 Mus musculus Alkaline phosphatase, germ cell type Proteins 0.000 description 3
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 3
- 101150006989 NDEL1 gene Proteins 0.000 description 3
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 3
- 102100023312 Nuclear distribution protein nudE-like 1 Human genes 0.000 description 3
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 102100039424 Polyadenylate-binding protein 4 Human genes 0.000 description 3
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 206010039085 Rhinitis allergic Diseases 0.000 description 3
- 102220469221 S-adenosyl-L-methionine-dependent tRNA 4-demethylwyosine synthase TYW1B_E18A_mutation Human genes 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 3
- 102100039037 Vascular endothelial growth factor A Human genes 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 201000010105 allergic rhinitis Diseases 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 210000000991 chicken egg Anatomy 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 102000046142 human TUBB3 Human genes 0.000 description 3
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 3
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 3
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 3
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 3
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 3
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 3
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- ARLKVQYMFRECLV-JSGCOSHPSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-(1h-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanamide Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(N)=O)=CNC2=C1 ARLKVQYMFRECLV-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 2
- UXKQLDYBPWULKJ-BPUTZDHNSA-N (3s)-4-amino-3-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-(1h-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(N)=O)=CNC2=C1 UXKQLDYBPWULKJ-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZSLUVFAKFWKJRC-IGMARMGPSA-N 232Th Chemical compound [232Th] ZSLUVFAKFWKJRC-IGMARMGPSA-N 0.000 description 2
- VNEOHNUYPRAJMX-UHFFFAOYSA-N 3-[[2-[[2-amino-3-(1h-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-[[1-(butoxycarbonylamino)-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(N)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC(O)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(=O)OCCCC)CC1=CC=CC=C1 VNEOHNUYPRAJMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100038776 ADP-ribosylation factor-related protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 description 2
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 101000716807 Arabidopsis thaliana Protein SCO1 homolog 1, mitochondrial Proteins 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- 102100023702 C-C motif chemokine 13 Human genes 0.000 description 2
- 101710112613 C-C motif chemokine 13 Proteins 0.000 description 2
- 102100021935 C-C motif chemokine 26 Human genes 0.000 description 2
- 102100032366 C-C motif chemokine 7 Human genes 0.000 description 2
- 101710155834 C-C motif chemokine 7 Proteins 0.000 description 2
- 102100034871 C-C motif chemokine 8 Human genes 0.000 description 2
- 101710155833 C-C motif chemokine 8 Proteins 0.000 description 2
- 102100036153 C-X-C motif chemokine 6 Human genes 0.000 description 2
- 102100032528 C-type lectin domain family 11 member A Human genes 0.000 description 2
- 101710167766 C-type lectin domain family 11 member A Proteins 0.000 description 2
- 108091005932 CCKBR Proteins 0.000 description 2
- 102100031168 CCN family member 2 Human genes 0.000 description 2
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 2
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 2
- 241000282421 Canidae Species 0.000 description 2
- 102100028892 Cardiotrophin-1 Human genes 0.000 description 2
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 2
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 108010083698 Chemokine CCL26 Proteins 0.000 description 2
- 108010014423 Chemokine CXCL6 Proteins 0.000 description 2
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 2
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 2
- 102400000884 Cholecystokinin-5 Human genes 0.000 description 2
- 101800001545 Cholecystokinin-5 Proteins 0.000 description 2
- 102400000887 Cholecystokinin-7 Human genes 0.000 description 2
- 101800001542 Cholecystokinin-7 Proteins 0.000 description 2
- 102400000888 Cholecystokinin-8 Human genes 0.000 description 2
- 101800005151 Cholecystokinin-8 Proteins 0.000 description 2
- 108090000227 Chymases Proteins 0.000 description 2
- 102000003858 Chymases Human genes 0.000 description 2
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 2
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010039419 Connective Tissue Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 2
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 2
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 2
- 102400000686 Endothelin-1 Human genes 0.000 description 2
- 101800004490 Endothelin-1 Proteins 0.000 description 2
- 108010055325 EphB3 Receptor Proteins 0.000 description 2
- 102100031982 Ephrin type-B receptor 3 Human genes 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 101000809413 Homo sapiens ADP-ribosylation factor-related protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000606465 Homo sapiens Inactive tyrosine-protein kinase 7 Proteins 0.000 description 2
- 101001076292 Homo sapiens Insulin-like growth factor II Proteins 0.000 description 2
- 101001131829 Homo sapiens P protein Proteins 0.000 description 2
- 101001076715 Homo sapiens RNA-binding protein 39 Proteins 0.000 description 2
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 2
- 102100039813 Inactive tyrosine-protein kinase 7 Human genes 0.000 description 2
- 101000668058 Infectious salmon anemia virus (isolate Atlantic salmon/Norway/810/9/99) RNA-directed RNA polymerase catalytic subunit Proteins 0.000 description 2
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 102100025947 Insulin-like growth factor II Human genes 0.000 description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 208000003456 Juvenile Arthritis Diseases 0.000 description 2
- 206010059176 Juvenile idiopathic arthritis Diseases 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 102000016267 Leptin Human genes 0.000 description 2
- 108010092277 Leptin Proteins 0.000 description 2
- 102000019298 Lipocalin Human genes 0.000 description 2
- 108050006654 Lipocalin Proteins 0.000 description 2
- 102100035304 Lymphotactin Human genes 0.000 description 2
- 102000009571 Macrophage Inflammatory Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010009474 Macrophage Inflammatory Proteins Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 2
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 2
- 101000686985 Mouse mammary tumor virus (strain C3H) Protein PR73 Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 101100185026 Mus musculus Msln gene Proteins 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 102000004230 Neurotrophin 3 Human genes 0.000 description 2
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 description 2
- 108010015406 Neurturin Proteins 0.000 description 2
- 102100021584 Neurturin Human genes 0.000 description 2
- 102000004140 Oncostatin M Human genes 0.000 description 2
- 108090000630 Oncostatin M Proteins 0.000 description 2
- 102000004264 Osteopontin Human genes 0.000 description 2
- 108010081689 Osteopontin Proteins 0.000 description 2
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 2
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 102000004211 Platelet factor 4 Human genes 0.000 description 2
- 108090000778 Platelet factor 4 Proteins 0.000 description 2
- 206010065159 Polychondritis Diseases 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 101710135630 Protein phosphatase inhibitor 2 family member C Proteins 0.000 description 2
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 2
- 102100023361 SAP domain-containing ribonucleoprotein Human genes 0.000 description 2
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000021386 Sjogren Syndrome Diseases 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 101150006914 TRP1 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 229910052776 Thorium Inorganic materials 0.000 description 2
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 2
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 2
- LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N Trp-P-1 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C(C)=C(N)N=C2C LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060005989 Tryptase Proteins 0.000 description 2
- 102000001400 Tryptase Human genes 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010046851 Uveitis Diseases 0.000 description 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 229960002964 adalimumab Drugs 0.000 description 2
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 2
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 2
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 2
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 2
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 2
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 2
- 239000005667 attractant Substances 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000004109 brown FK Substances 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 238000002045 capillary electrochromatography Methods 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 108010041776 cardiotrophin 1 Proteins 0.000 description 2
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 208000015636 celiac disease-epilepsy-cerebral calcification syndrome Diseases 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000031902 chemoattractant activity Effects 0.000 description 2
- 208000019069 chronic childhood arthritis Diseases 0.000 description 2
- 108010030175 colony inhibiting factor Proteins 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 2
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 2
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 2
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 102000047119 human OCA2 Human genes 0.000 description 2
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 229940068935 insulin-like growth factor 2 Drugs 0.000 description 2
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 2
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 2
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 201000002215 juvenile rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N leptin Chemical compound O=C([C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CCSC)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N 0.000 description 2
- 229940039781 leptin Drugs 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 108010019677 lymphotactin Proteins 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 101150088250 matK gene Proteins 0.000 description 2
- AEUKDPKXTPNBNY-XEYRWQBLSA-N mcp 2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 AEUKDPKXTPNBNY-XEYRWQBLSA-N 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000009149 molecular binding Effects 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- 229940032018 neurotrophin 3 Drugs 0.000 description 2
- 230000003448 neutrophilic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000001525 receptor binding assay Methods 0.000 description 2
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 2
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- PUZPDOWCWNUUKD-UHFFFAOYSA-M sodium fluoride Chemical compound [F-].[Na+] PUZPDOWCWNUUKD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000001957 sucroglyceride Substances 0.000 description 2
- 231100000617 superantigen Toxicity 0.000 description 2
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 206010043778 thyroiditis Diseases 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 2
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N (4S)-4-[[(4R,7S,10S,16S,19S,25S,28S,31R)-31-[[(2S)-2-[[(1R,6R,9S,12S,18S,21S,24S,27S,30S,33S,36S,39S,42R,47R,53S,56S,59S,62S,65S,68S,71S,76S,79S,85S)-47-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-18-(4-aminobutyl)-27,68-bis(3-amino-3-oxopropyl)-36,71,76-tribenzyl-39-(3-carbamimidamidopropyl)-24-(2-carboxyethyl)-21,56-bis(carboxymethyl)-65,85-bis[(1R)-1-hydroxyethyl]-59-(hydroxymethyl)-62,79-bis(1H-imidazol-4-ylmethyl)-9-methyl-33-(2-methylpropyl)-8,11,17,20,23,26,29,32,35,38,41,48,54,57,60,63,66,69,72,74,77,80,83,86-tetracosaoxo-30-propan-2-yl-3,4,44,45-tetrathia-7,10,16,19,22,25,28,31,34,37,40,49,55,58,61,64,67,70,73,75,78,81,84,87-tetracosazatetracyclo[40.31.14.012,16.049,53]heptaoctacontane-6-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-7-(3-carbamimidamidopropyl)-25-(hydroxymethyl)-19-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-28-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15,18,21,24,27,30-nonaoxo-16-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14,17,20,23,26,29-nonazacyclodotriacontane-4-carbonyl]amino]-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-3-carboxy-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(1S)-1-carboxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H]3NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H]4CCCN4C(=O)[C@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc3ccccc3)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N3CCC[C@H]3C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](Cc2ccccc2)NC(=O)[C@H](Cc2c[nH]cn2)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc2c[nH]cn2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc2ccc(O)cc2)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N 0.000 description 1
- NTASFODDPBHBAM-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxyethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CC([NH3+])O NTASFODDPBHBAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GGZZISOUXJHYOY-UHFFFAOYSA-N 8-amino-4-hydroxynaphthalene-2-sulfonic acid Chemical compound C1=C(S(O)(=O)=O)C=C2C(N)=CC=CC2=C1O GGZZISOUXJHYOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 1
- 235000005749 Anthriscus sylvestris Nutrition 0.000 description 1
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 101100327159 Arabidopsis thaliana CCB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100438795 Arabidopsis thaliana CCMB gene Proteins 0.000 description 1
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 241000963790 Beilschmiedia tawa Species 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100025634 Caspase recruitment domain-containing protein 16 Human genes 0.000 description 1
- 102100031437 Cell cycle checkpoint protein RAD1 Human genes 0.000 description 1
- 108010078239 Chemokine CX3CL1 Proteins 0.000 description 1
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 101100462378 Danio rerio otpb gene Proteins 0.000 description 1
- 201000003066 Diffuse Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- 101100016026 Drosophila melanogaster GstE14 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100036908 Equilibrative nucleoside transporter 4 Human genes 0.000 description 1
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000003971 Fibroblast Growth Factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100023593 Fibroblast growth factor receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710182386 Fibroblast growth factor receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100023600 Fibroblast growth factor receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100027842 Fibroblast growth factor receptor 3 Human genes 0.000 description 1
- 101710182396 Fibroblast growth factor receptor 3 Proteins 0.000 description 1
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 1
- 102000013818 Fractalkine Human genes 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010018691 Granuloma Diseases 0.000 description 1
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039121 Histone-lysine N-methyltransferase MECOM Human genes 0.000 description 1
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 1
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 101001130384 Homo sapiens Cell cycle checkpoint protein RAD1 Proteins 0.000 description 1
- 101001033280 Homo sapiens Cytokine receptor common subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 101000827688 Homo sapiens Fibroblast growth factor receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001033728 Homo sapiens Histone-lysine N-methyltransferase MECOM Proteins 0.000 description 1
- 101000581326 Homo sapiens Mediator of DNA damage checkpoint protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000589482 Homo sapiens Nuclear cap-binding protein subunit 2 Proteins 0.000 description 1
- 101100085225 Homo sapiens PTPRN gene Proteins 0.000 description 1
- 101100094863 Homo sapiens SLC29A4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001440206 Homodes Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 101150084658 INA gene Proteins 0.000 description 1
- 201000009794 Idiopathic Pulmonary Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 108010042653 IgA receptor Proteins 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000019223 Interleukin-1 receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050006617 Interleukin-1 receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100039897 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 125000003798 L-tyrosyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C1=C([H])C([H])=C(O[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000282838 Lama Species 0.000 description 1
- 241000282852 Lama guanicoe Species 0.000 description 1
- 208000004554 Leishmaniasis Diseases 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 239000005574 MCPA Substances 0.000 description 1
- 241000948268 Meda Species 0.000 description 1
- 102100027643 Mediator of DNA damage checkpoint protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YNPVMLGQOLHBEQ-UHFFFAOYSA-N NOBO Chemical compound NOBO YNPVMLGQOLHBEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 102100032342 Nuclear cap-binding protein subunit 2 Human genes 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108010088535 Pep-1 peptide Proteins 0.000 description 1
- 241001442654 Percnon planissimum Species 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 102100034014 Prolyl 3-hydroxylase 3 Human genes 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 101710188313 Protein U Proteins 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102100034091 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase-like N Human genes 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 102400000827 Saposin-D Human genes 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000006045 Spondylarthropathies Diseases 0.000 description 1
- 201000002661 Spondylitis Diseases 0.000 description 1
- 201000009594 Systemic Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- 206010042953 Systemic sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 102400001320 Transforming growth factor alpha Human genes 0.000 description 1
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- WHKUVVPPKQRRBV-UHFFFAOYSA-N Trasan Chemical compound CC1=CC(Cl)=CC=C1OCC(O)=O WHKUVVPPKQRRBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010054094 Tumour necrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 101150060585 USP20 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241001416177 Vicugna pacos Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000001745 anti-biotin effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 239000012482 calibration solution Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 230000010405 clearance mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- 235000014510 cooky Nutrition 0.000 description 1
- HKRZVBZNEKKEAS-UHFFFAOYSA-L copper;2,4,5-trichlorophenolate;3,4,5-trichlorophenolate Chemical compound [Cu+2].[O-]C1=CC(Cl)=C(Cl)C(Cl)=C1.[O-]C1=CC(Cl)=C(Cl)C=C1Cl HKRZVBZNEKKEAS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000033581 fucosylation Effects 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 1
- 239000010440 gypsum Substances 0.000 description 1
- 229910052602 gypsum Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 102000055647 human CSF2RB Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 208000036971 interstitial lung disease 2 Diseases 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000002356 laser light scattering Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003519 mature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 1
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 1
- 230000027405 negative regulation of phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 230000024717 negative regulation of secretion Effects 0.000 description 1
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 1
- 230000037434 nonsense mutation Effects 0.000 description 1
- GTUJJVSZIHQLHA-XPWFQUROSA-N pApA Chemical compound C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@@H]([C@@H]1O)O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@H]1OP(O)(=O)OC[C@H]([C@@H](O)[C@H]1O)O[C@H]1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 GTUJJVSZIHQLHA-XPWFQUROSA-N 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229960003330 pentetic acid Drugs 0.000 description 1
- 108700010839 phage proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000003566 phosphorylation assay Methods 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000022983 regulation of cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 1
- 102220082846 rs373113507 Human genes 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 201000004409 schistosomiasis Diseases 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011775 sodium fluoride Substances 0.000 description 1
- 235000013024 sodium fluoride Nutrition 0.000 description 1
- POECFFCNUXZPJT-UHFFFAOYSA-M sodium;carbonic acid;hydrogen carbonate Chemical compound [Na+].OC(O)=O.OC([O-])=O POECFFCNUXZPJT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- IHIXIJGXTJIKRB-UHFFFAOYSA-N trisodium vanadate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-][V]([O-])([O-])=O IHIXIJGXTJIKRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/244—Interleukins [IL]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/244—Interleukins [IL]
- C07K16/247—IL-4
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
- C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2318/00—Antibody mimetics or scaffolds
- C07K2318/20—Antigen-binding scaffold molecules wherein the scaffold is not an immunoglobulin variable region or antibody mimetics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к антиген-связывающей конструкции, способной связывать более чем один антиген, один из которых представляет собой интерлейкин-13 (IL-13), представляющей собой полноразмерную молекулу антитела, связанную с двумя отдельными вариабельными доменами иммуноглобулина, где указанная антиген-связывающая конструкция имеет 4 антиген-связывающих сайта, два из которых имеют происхождение из спаренных доменов VH/VL молекулы антитела и два из которых имеют происхождение из указанных отдельных вариабельных доменов иммуноглобулина, присоединенных к молекуле антитела, к полинуклеотиду, кодирующему указанную конструкцию, и содержащей его рекомбинантной клетке-хозяину, а также к способу получения такой конструкции и ее применению для лечения воспалительных заболеваний.
Description
Антитела представляют собой гетеромультимерные гликопротеины, содержащие по меньшей мере две тяжелые и две легкие цепи. За исключением 1дМ, интактные антитела обычно представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины массой приблизительно 150 кДа, состоящие из двух идентичных легких цепей (Ь-цепей) и двух идентичных тяжелых цепей (Н-цепей). Обычно каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, в то время как число дисульфидных связей между тяжелыми цепями различных изотипов иммуноглобулинов варьирует. Каждая тяжелая и легкая цепь также имеет дисульфидные связи внутри цепи. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (УН), за которым следуют несколько константных областей. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен (УЬ) и константную область на ее другом конце; константная область легкой цепи расположена на одном уровне с первой константной областью тяжелой цепи, и вариабельный домен легкой цепи расположен на одном уровне с вариабельным доменом тяжелой цепи. Легкие цепи антител от большинства видов позвоночных могут быть отнесены к одному из двух типов, называемых каппа и лямбда, на основании аминокислотной последовательности константной области. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области их тяжелых цепей человеческие антитела могут быть отнесены к пяти различным классам, 1дА, 1§ϋ, 1дЕ, 1дО и 1дМ. 1дО и 1дА могут быть дополнительно подразделены на подклассы, 1дО1, 1дО2, 1дО3 и 1дО4; и 1дА1 и 1дА2. Видовые варианты существуют у мышей и крыс, имеющих, по меньшей мере, 1дО2а, 1дО2Ь. Вариабельный домен антитела придает антителу специфичность связывания посредством определенных областей, демонстрирующих исключительную вариабельность, называемых областями, определяющими комплементарность (СОК). Более консервативные части вариабельной области называют каркасными областями (РК). Каждый вариабельный домен интактных тяжелых и легких цепей содержит четыре РК, соединенные тремя СОК. В каждой цепи РК-области удерживают СОК вместе в непосредственной близости, и эти СОК вместе с СОК другой цепи вовлечены в образование антиген-связывающего сайта антител. Константные области не являются непосредственно вовлеченными в связывание антигена антителом, но демонстрируют различные эффекторные функции, такие как участие в антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (АЭСС), фагоцитозе посредством связывания РсУ-рецептора, периоде полувыведения/скорости клиренса через неонатальный Рс-рецептор (РсКп) и комплемент-зависимой цитотоксичности посредством Ск] компонента системы комплемента.
Характер структуры антитела 1дО таков, что в нем присутствуют два антиген-связывающих сайта, специфичных в отношении одного и то же эпитопа. Таким образом, они являются моноспецифичными.
Биспецифичное антитело представляет собой антитело, имеющее специфичности связывания в отношении по меньшей мере двух различных эпитопов. Способы получения таких антител известны в данной области техники. Традиционно, рекомбинантное получение биспецифичных антител основано на коэкспрессии двух пар Н-цепь-Ь-цепь иммуноглобулина, где две Н-цепи имеют различные специфичности связывания, см. Мйк!еш е! а1, ЫаЮге 305537-539 (1983), \УО 93/08829 и Тгаипескег е! а1. ЕМВО, 10, 1991, 3655-3659. Ввиду случайного распределения Н- и Ь-цепей возможно получение смеси десяти различных структур антител, из которых только одна имеет желаемую специфичность связывания. Альтернативный подход включает слияние вариабельных доменов с желаемыми специфичностями связывания с константной областью тяжелой цепи, содержащей по меньшей мере часть шарнирной области, областями СН2 и СН3. Предпочтительно по меньшей мере в одном из компонентов, подвергаемых слиянию, присутствует область СН1, содержащая сайт, необходимый для связывания легкой цепи. ДНК, кодирующую эти компоненты, подвергаемые слиянию, и, если желательно, Ь-цепь, вводят в раздельные векторы экспрессии и затем котрансфицируют ими подходящий организм-хозяин. Тем не менее, возможно введение кодирующих последовательностей для двух или всех трех цепей в один вектор экспрессии. В одном способе, биспецифичное антитело состоит из Н-цепи с первой специфичностью связывания на одном плече и парой Н-цепь-Ь-цепь, обеспечивающей вторую специфичность связывания, на другом плече, см. \УО 94/04690. Также см. ЗитекЬ е! а1. Мебюбк ίη Еп/уто1оду 121, 210, 1986. Другие подходы включают молекулы антител, содержащие однодоменные сайты связывания, изложенные в \УО 2007/095338.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к антиген-связывающей конструкции, способной связывать более чем один антиген, один из которых представляет собой интерлейкин-13 (1Ь-13), представляющей собой полноразмерную молекулу антитела, связанную с двумя отдельными вариабельными доменами иммуноглобулина, где указанная антиген-связывающая конструкция имеет 4 антиген-связывающих сайта, два из которых имеют происхождение из спаренных доменов УН/УЬ молекулы антитела, и два из которых имеют происхождение из указанных отдельных вариабельных доменов иммуноглобулина, присоединенных к молекуле антитела.
Предпочтительной является антиген-связывающая конструкция по изобретению, где отдельный вариабельный домен иммуноглобулина представляет собой отдельный вариабельный домен иммуноглобулина человека.
Также предпочтительной является антиген-связывающая конструкция по изобретению, где отдель- 1 023031 ный вариабельный домен иммуноглобулина представляет собой отдельный вариабельный домен иммуноглобулина представителя семейства Верблюдовых.
Также предпочтительной является антиген-связывающая конструкция по изобретению, где отдельный вариабельный домен иммуноглобулина представляет собой отдельный вариабельный домен иммуноглобулина акулы (ЫЛКУ).
Еще более предпочтительной является антиген-связывающая конструкция по изобретению, как она определена выше, способная связывать интерлейкин-4 (1Б-4).
Еще более предпочтительной является антиген-связывающая конструкция по изобретению, как она определена выше, способная связывать интерлейкин-5 (1Б-5).
Наиболее предпочтительной является антиген-связывающая конструкция по изобретению, как она определена выше, где молекула антитела относится к изотипу иммуноглобулинов С (1дС).
Предпочтительный аспект изобретения составляет антиген-связывающая конструкция, как она определена выше, где по меньшей мере один из отдельных вариабельных доменов иммуноглобулина непосредственно присоединен к молекуле антитела линкером, содержащим 1-50 аминокислот.
Более предпочтительной является такая антиген-связывающая конструкция по изобретению, где линкер имеет аминокислотную последовательность, выбранную из 8ЕЦ ГО N0: 6-11 или «С8», либо является любой их комбинацией.
Также более предпочтительной является антиген-связывающая конструкция по изобретению, где линкер содержит последовательность 8ЕЦ ГО N0:7.
Еще один предпочтительный аспект изобретения составляет антиген-связывающая конструкция, как она определена выше, в которой отдельный вариабельный домен иммуноглобулина присоединен к молекуле антитела на С-конце тяжелой цепи.
Более предпочтительной является антиген-связывающая конструкция, представляющая собой антитело против 1Б-13 с присоединенным к С-концу или Ν-концу тяжелой цепи либо к С-концу или Ν-концу легкой цепи отдельным вариабельным доменом иммуноглобулина против 1Б-4.
Наиболее предпочтительной является антиген-связывающая конструкция, в которой последовательность легкой цепи антитела представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 13.
Также более предпочтительной является антиген-связывающая конструкция, представляющая собой антитело против 1Б-5 с присоединенным отдельным вариабельным доменом иммуноглобулина против 1Б-13.
Еще более предпочтительной является антиген-связывающая конструкция, представляющая собой антитело против 1Б-5 с присоединенным к С-концу или Ν-концу тяжелой цепи либо к С-концу или Νконцу легкой цепи отдельным вариабельным доменом иммуноглобулина против 1Б-13.
Наиболее предпочтительной является антиген-связывающая конструкция, в которой тяжелая цепь антитела содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности 8ЕЦ ГО N0:65, и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности 8ЕЦ ГО N0:66, и особенно антигенсвязывающая конструкция, в которой последовательность легкой цепи по меньшей мере на 90% идентична последовательности 8ЕЦ ГО N0:72, которая включает 8ЕЦ ГО N0:66.
Еще один предпочтительный аспект изобретения составляет антиген-связывающая конструкция, представляющая собой антитело против 1Б-4 с присоединенным к С-концу или Оконцу тяжелой цепи либо к С-концу или Оконцу легкой цепи отдельным вариабельным доменом иммуноглобулина против 1Б-13.
Также предпочтительный аспект изобретения составляет антиген-связывающая конструкция по изобретению, в которой тяжелая цепь антитела представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 12, последовательность линкера представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 7 и отдельный вариабельный домен иммуноглобулина имеет последовательность 8ЕЦ ГО N0: 3.
Еще один предпочтительный аспект изобретения составляет антиген-связывающая конструкция по изобретению, способная связывать 1Б-13 и 1Б-4, в которой последовательность тяжелой цепи антитела по меньшей мере на 90% идентична последовательности 8ЕЦ ГО N0: 26, и последовательность легкой цепи по меньшей мере на 90% идентична последовательности 8ЕЦ ГО N0: 13.
Согласно настоящему изобретению предложен также полинуклеотид, кодирующий легкую цепь антитела антиген-связывающей конструкции, как она определена выше, и полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь антитела антиген-связывающей конструкции, как она определена выше.
Изобретение также относится к рекомбинантной трансформированной или трансфицированной клетке-хозяину, содержащей по меньшей мере один полинуклеотид, как он определен выше.
Соглано изобретению предложен способ получения антиген-связывающей конструкции, как она определена выше, включающий стадию культивирования клетки-хозяина, как она определена выше, и выделения антиген-связывающей конструкции.
Также изоретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антиген-связывающую конструкцию, как она определена выше, и фармацевтически приемлемый носитель.
Согласно изобретению также предложено применение антиген-связывающей конструкции, как она
- 2 023031 определена выше, в изготовлении лекарственного средства для лечения воспалительных заболеваний.
Изобретение также относится к способу лечения пациента, страдающего от воспалительного заболевания, такого как астма, ревматоидный артрит или остеоартрит, включающий введение терапевтического количества антиген-связывающей конструкции по настоящему изобретению.
Согласно изобретению также предложено применение антиген-связывающей конструкции, как она определена выше, для лечения воспалительных заболеваний, таких как астма, ревматоидный артрит или остеоартрит.
Определения
При использовании здесь термин белковый каркас включает, без ограничения, каркас на основе иммуноглобулина (1д), например иммуноглобулина С (1дС), который может представлять собой четырехцепочечное или двуцепочечное антитело, или который может содержать только Ре-область антитела, или который может содержать одну или более чем одну константную область антитела, которая может иметь происхождение из человека или примата, или которая может представлять собой искусственную химерную конструкцию константных областей человека и примата. Такие белковые каркасы могут содержать антиген-связывающие сайты в дополнение к одной или более чем одной константной области, например, где белковый каркас содержит полный 1дС. Будет возможным связывание таких белковых каркасов с другими белковыми доменами, например, белковыми доменами, имеющими антигенсвязывающие сайты, например, эпитоп-связывающими доменами или доменами §сРу.
Домен представляет собой прошедшую фолдинг белковую структуру, имеющую третичную структуру независимо от остальной части белка. В большинстве случаев, домены обеспечивают дискретные функциональные свойства белков, и во многих случаях могут быть добавлены, удалены или перемещены на другие белки без потери функции оставшейся части белка и/или домена. Отдельный вариабельный домен антитела представляет собой прошедший фолдинг полипептидный домен, содержащий последовательности, характерные для вариабельных доменов антител. Таким образом, он включает полные вариабельные домены антител и модифицированные вариабельные домены, например, в которых одна или более петли были заменены последовательностями, не характерными для вариабельных доменов антител, или вариабельные домены, которые были процессированы или содержат Ν- или С-концевые расширения, а также прошедшие фолдинг фрагменты вариабельных доменов, сохраняющие по меньшей мере связывающую активность и специфичность связывания полноразмерного домена.
Фраза отдельный вариабельный домен иммуноглобулина относится к вариабельному домену антитела (νΗ, νΗΗ, ^), специфично связывающему антиген или эпитоп независимо от другой вариабельной области (ν-области) или домена. Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина может быть представлен в формате (например, гомо- или гетеромультимера) с другими отличающимися вариабельными областями или вариабельными доменами, где другие области или домены не являются необходимыми для связывания антигена отдельным вариабельным доменом иммуноглобулина (то есть, где отдельный вариабельный домен иммуноглобулина связывает антиген независимо от дополнительных вариабельных доменов). Однодоменное антитело или бАЬ в качестве используемого здесь термина является тем же, что и отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, способный связывать антиген. Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина представляет собой человеческий вариабельный домен антитела, но также включает отдельные вариабельные домены антител от других видов, такие как бАЬ грызунов (например, как раскрыто в \УО 00/29004), акулы-няньки и νΗΗ бАЬ представителей семейства Верблюдовых. νΗΗ представителей семейства Верблюдовых являются полипептидами отдельных вариабельных доменов иммуноглобулинов, имеющими происхождение из видов, включающих верблюда, ламу, альпаку, одногорбого верблюда и гуанако, которые продуцируют антитела из тяжелых цепей, естественным образом лишенные легких цепей. Такие домены νΗΗ могут быть гуманизированы по стандартным методикам, доступным в данной области техники, и такие домены все еще рассматривают как однодоменные антитела по изобретению. При использовании здесь νΗ включает домены νΗΗ представителей семейства Верблюдовых. ΝΑΚν представляют собой другой тип отдельных вариабельных доменов иммуноглобулинов, обнаруженных у хрящевых рыб, включая акулу-няньку. Эти домены также известны как вариабельная область нового рецептора антигенов (Νονοί АпБдсп КесерЮг уапаЫс тедюп, обычно сокращаемая как ν(ΝΑΚ) или ΝΑΚν). Более подробно см. Μοί. 1ттипо1. 44, 656-665 (2006) и И8 20050043519А.
Термин эпитоп-связывающий домен относится к домену, специфично связывающему антиген или эпитоп независимо от другой ν-области или домена, он может представлять собой однодоменное антитело (б АЬ), например, отдельный вариабельный домен иммуноглобулина человека, представителя семейства Верблюдовых или акулы.
При использовании здесь термины спаренный домен νΗ, спаренный домен АЪ и спаренные домены νΗ/νΡ относятся к вариабельным доменам антител, специфично связывающим антиген только в паре с их вариабельным доменом-партнером. В любой паре всегда присутствует один νΗ и один νΚ и термин спаренный домен νΗ относится к νΗ-партнеру, термин спаренный домен УЪ относится к УЪ-партнеру, и термин спаренные домены νΗ/νΡ относится к двум доменам вместе.
В одном воплощении изобретения антиген-связывающий сайт связывает антиген с Кб по меньшей
- 3 023031 мере 1 мМ, например Κά 10 нМ, 1 нМ, 500 пМ, 200 пМ, 100 пМ, для каждого антигена, как измерено посредством Ыасоге™, как например способ Ыасоге™, как описано в способе 4 или 5.
При использовании здесь термин антиген-связывающий сайт относится к сайту на конструкции, способному специфично связывать антиген, он может представлять собой отдельный домен, например, эпитоп-связывающий домен, или он может представлять собой спаренные домены УНА/Ь, которые можно обнаружить в стандартном антителе. В некоторых аспектах изобретения антиген-связывающие сайты могут быть обеспечены одноцепочечными доменами Ρν (БсРу).
Термины тАЬ/бАЬ и бАЬ/тАЬ использованы здесь для обозначения антиген-связывающих конструкций по настоящему изобретению. Два термина могут быть использованы взаимозаменяемо, и подразумевают, что при использовании здесь они имеют одинаковое значение.
Термин константный домен тяжелой цепи 1 использован здесь для обозначения домена СН1 тяжелой цепи иммуноглобулина.
Термин константный домен легкой цепи использован здесь для обозначения константного домена легкой цепи иммуноглобулина.
Подробное описание изобретения
Некоторые примеры антиген-связывающих конструкций по изобретению изложены на фиг. 1.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению также называют тАЬбАЬ.
В одном воплощении белковый каркас антиген-связывающей конструкции по настоящему изобретению представляет собой 1§, например, 1§О или 1§А. 1§О может включать все домены антитела (то есть, СН1, СН2, СН3, УН, УЬ). Антиген-связывающая конструкция по настоящему изобретению может содержать 1дО, выбранный из 1дО1, 1дО2, 1дО3, 1дО4 или 1дО4РЕ.
В одном воплощении настоящего изобретения эпитоп-связывающий домен представляет собой бАЬ.
Следует понимать, что любая из антиген-связывающих конструкций, описанных здесь, будет способна нейтрализовать один более чем один антиген.
Термин нейтрализует и его грамматические вариации при использовании в настоящем описании в отношении антиген-связывающих конструкций по изобретению обозначают, что биологическая активность мишени снижена, полностью или частично, в присутствии антиген-связывающих конструкций по настоящему изобретению по сравнению с активностью мишени в отсутствие таких антигенсвязывающих конструкций. Нейтрализация может быть обусловлена, без ограничения, одним или более из следующего: блокады связывания лиганда, предотвращения активации рецептора лигандом, понижающей регуляции рецептора или воздействия на эффекторную функцию.
Степени нейтрализации могут быть измерены несколькими способами, например, применением любого из анализов, как изложено в примерах и способах ниже, например, в анализе, при котором измеряют ингибирование связывания лиганда с рецептором, который может быть проведен, например, как описано в любом из способов 12, 19 или 21 или примере 32. Нейтрализацию сосудистого эндотелиального фактора роста (УЕОР), интерлейкина-4 (1Ь-4), 1Ь-13 или фактора роста гепатоцитов (НОР) в этих анализах измеряли оценкой сниженного связывания между лигандом и его рецептором в присутствии нейтрализующей антиген-связывающей конструкции.
Степени нейтрализации могут также быть измерены, например, в анализе ТР1, который может быть проведен, например, как описано в способе 8, 9, 10, 20 или 21. Нейтрализацию 1Ь-13, 1Ь-4 или обоих этих цитокинов в этом анализе измеряют оценкой ингибирования пролиферации клеток ТР1 в присутствии нейтрализующей антиген-связывающей конструкции.
Альтернативно, нейтрализация может быть измерена в анализе фосфорилирования рецептора эпидермального фактора роста (ЕОРК), который может быть проведен, например, как описано в способе 13. Нейтрализацию ЕОРК в этом анализе измеряют оценкой ингибирования фосфорилирования тирозинкиназы рецептора в присутствии нейтрализующей антиген-связывающей конструкции. Или нейтрализация может быть измерена в анализе секреции 1Ь-8 клетками МКС-5, который может быть проведен, например, как описано в способе 14 или 15. Нейтрализацию фактора некроза опухоли-а (ТИРа) или рецептора интерлейкина-1 1 типа (1Ь-1К1) в этом анализе измеряют оценкой ингибирования секреции 1Ь-8 в присутствии нейтрализующей антиген-связывающей конструкции.
В данной области техники известны другие способы оценки нейтрализации, например оценкой сниженного связывания между лигандом и его рецептором в присутствии нейтрализующей антигенсвязывающей конструкции, и они включают, например, анализы В1асоге™.
В альтернативном аспекте настоящего изобретения предложены антиген-связывающие конструкции, имеющие по меньшей мере по существу эквивалентную нейтрализующую активность по сравнению с антителами, примеры которых приведены здесь, например, антиген-связывающие конструкции, сохраняющие нейтрализующую активность 586Н-ТУААР8-210 или РаксоН-048-474, или РаксоН-474, РаксоН474 с удаленным ОБ, Ра8соЬ-О48-474 или Ра8соНЬ-О48-474, в анализе пролиферации клеток ТР1 или анализе ингибирования сигналинга р8ТАТ6, как изложено в примерах 4 и 20, соответственно, или, например, антиген-связывающие конструкции, сохраняющие нейтрализующую активность ВРС1603,
- 4 023031
ВРС1604, ВРС1605, ВРС1606 в анализе связывания УЕСРР или ингибирования фосфорилирования рецепторов инсулиноподобного фактора роста-1 (ΙΟΡ-1Κ), как изложено в примерах 14.6 и 14.7.
Антиген-связывающие конструкции по изобретению представляют собой антиген-связывающие конструкции, имеющие специфичность в отношении 1Ь-13, например, содержащие эпитоп-связывающий домен, способный связывать 1Ь-13, или содержащие спаренный домен УНА/Ь, связывающий 1Ь-13. Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать 1Ь-13. Антигенсвязывающая конструкция может включать бАЬ, способное связывать 1Ь-13.
В одном воплощении антиген-связывающая конструкция по настоящему изобретению имеет специфичность в отношении более чем одного антигена, например, где она способна связывать два или более чем два антигена, выбранные из 1Ь-13, 1Ь-5 и 1Ь-4, например, где она способна связывать 1Ь-13 и 1Ь4, или где она способна связывать 1Ь-13 и 1Ь-5, или где она способна связывать 1Ь-5 и 1Ь-4.
В одном воплощении антиген-связывающая конструкция по настоящему изобретению имеет специфичность в отношении более чем одного антигена, например, где она способна связывать два или более чем два антигена, выбранные из 1Ь-13, 1Ь-5 и 1Ь-4, например, где она способна связывать 1Ь-13 и 1Ь-4 одновременно, или где она способна связывать 1Ь-13 и 1Ь-5 одновременно, или где она способна связывать 1Ь-5 и 1Ь-4 одновременно.
Следует понимать, что любая из антиген-связывающих конструкций, описанных здесь, может быть способна связывать два или более чем два антигена одновременно, например, как определено стехиометрическим анализом с применением подходящего анализа, такого как описанный в разделе примеры, способе 7.
Примеры антиген-связывающих конструкций по изобретению включают антитела к ГО-13, имеющие эпитоп-связывающий домен со специфичностью в отношении 1Ь-4, например бАЬ против 1Ь-4, присоединенный к С-концу или Ν-концу тяжелой цепи или С-концу или Ν-концу легкой цепи, например, тАЬбАЬ, имеющее последовательность тяжелой цепи, изложенную в δΕΟ ГО N0: 16-39, δΕΟ ГО N0: 4143, δΕΟ ГО N0: 87-90, δΕΟ ΙΌ N0: 151, δΕΟ ΙΌ N0: 152 или δΕΟ ΙΌ N0: 155. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ГО-13 с эпитоп-связывающим доменом к ГО-4, присоединенным к Уконцу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ГО-13 с эпитоп-связывающим доменом к ГО-4, присоединенным к N концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ГО-13 с эпитоп-связывающим доменом к ГО-4, присоединенным к С-концу тяжелой цепи. Антигенсвязывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ГО-13 с эпитопсвязывающим доменом к ГО-4, присоединенным к С-концу легкой цепи. Такие антиген-связывающие конструкции могут также иметь один или более чем один другой эпитоп-связывающий домен с такой же или другой специфичностью в отношении антигена, присоединенный к С-концу и/или Уконцу тяжелой цепи и/или С-концу и/или Уконцу легкой цепи.
Примеры таких антиген-связывающих конструкций включают антитела к ГО-4, имеющие эпитопсвязывающий домен со специфичностью в отношении ГО-13, например, бАЬ против ГО-13, присоединенный к С-концу или Уконцу тяжелой цепи или С-концу или Уконцу легкой цепи, например, тАЬбАЬ, имеющее последовательность тяжелой цепи, изложенную в δΕΟ ΙΌ N0: 48-53, δΕΟ ΙΌ N0: 91, δΕΟ ΙΌ N0: 92, δΕΟ ΙΌ N0: 149, δΕΟ ΙΌ N0: 150 или δΕΟ ΙΌ N0: 157-160, и/или последовательность легкой цепи, изложенную в δΕΟ ΙΌ N0: 54-59.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ГО-4 с эпитоп-связывающим доменом к ΙΠ-13, присоединенным к Уконцу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ГО-4 с эпитоп-связывающим доменом к ΙΠ-13, присоединенным к Уконцу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ГО-4 с эпитоп-связывающим доменом к ΙΠ-13, присоединенным к Сконцу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ГО-4 с эпитоп-связывающим доменом к ΙΠ-13, присоединенным к С-концу легкой цепи. Такие антиген-связывающие конструкции могут также иметь один или более чем один другой эпитопсвязывающий домен с такой же или другой специфичностью в отношении антигена, присоединенный к С-концу и/или Уконцу тяжелой цепи и/или С-концу и/или Уконцу легкой цепи.
Примеры таких антиген-связывающих конструкций по изобретению включают антитела к ΙΠ-13, имеющие эпитоп-связывающий домен со специфичностью в отношении ГО-5, например, бАЬ против ГО5, присоединенный к С-концу или Уконцу тяжелой цепи или С-концу или Уконцу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ΙΠ-13 с эпитопсвязывающим доменом к ГО-5, присоединенным к Уконцу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ΙΠ-13 с эпитоп-связывающим доменом к ГО-5, присоединенным к Уконцу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ΙΠ-13 с эпитоп-связывающим доменом к ГО-5, присоединенным к С-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ГО13 с эпитоп-связывающим доменом к ГО-5, присоединенным к С-концу легкой цепи. Такие антигенсвязывающие конструкции могут также иметь один или более чем один другой эпитоп-связывающий
- 5 023031 домен с такой же или другой специфичностью в отношении антигена, присоединенный к С-концу и/или Ν-концу тяжелой цепи и/или С-концу и/или Ν-концу легкой цепи.
Примеры таких антиген-связывающих конструкций включают антитела к 1Ь-5, имеющие эпитопсвязывающий домен со специфичностью в отношении ГО-13, например, бАЬ против ГО-13, присоединенный к С-концу или Ν-концу тяжелой цепи или С-концу или Ν-концу легкой цепи, например тАЬбАЬ. имеющее последовательность легкой цепи 8ЕО ГО N0: 72.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ГО-5 с эпитоп-связывающим доменом к ГО-13, присоединенным к Ν-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ГО-5 с эпитоп-связывающим доменом к ГО-13, присоединенным к Ν-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ГО-5 с эпитоп-связывающим доменом к ГО-13, присоединенным к Сконцу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ГО-5 с эпитоп-связывающим доменом к ГО-13, присоединенным к С-концу легкой цепи. Такие антиген-связывающие конструкции могут также иметь один или более чем один другой эпитопсвязывающий домен с такой же или другой специфичностью в отношении антигена, присоединенный к С-концу и/или Ν-концу тяжелой цепи и/или С-концу и/или Ν-концу легкой цепи.
Примеры таких антиген-связывающих конструкций по изобретению включают антитела к ГО-4, имеющие эпитоп-связывающий домен со специфичностью в отношении ГО-5, например бАЬ против ГО-5, присоединенный к С-концу или Ν-концу тяжелой цепи или С-концу или Ν-концу легкой цепи. Антигенсвязывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ГО-4 с эпитопсвязывающим доменом к ГО-5, присоединенным к Ν-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ГО-4 с эпитоп-связывающим доменом к ГО-5, присоединенным к Ν-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ГО-4 с эпитоп-связывающим доменом к ГО-5, присоединенным к С-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ГО-4 с эпитоп-связывающим доменом к ГО-5, присоединенным к С-концу легкой цепи. Такие антигенсвязывающие конструкции могут также иметь один или более чем один другой эпитоп-связывающий домен с такой же или другой специфичностью в отношении антигена, присоединенный к С-концу и/или Ν-концу тяжелой цепи и/или С-концу и/или Ν-концу легкой цепи.
Примеры таких антиген-связывающих конструкций включают антитела к ГО-5, имеющие эпитопсвязывающий домен со специфичностью в отношении ГО-4, например, бАЬ против ГО-4, присоединенный к С-концу или Ν-концу тяжелой цепи или С-концу или Ν-концу легкой цепи, например, тАЬбАЬ, имеющее последовательность легкой цепи 8Е0 ГО Ν0: 71.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ГО-5 с эпитоп-связывающим доменом к ГО-4, присоединенным к Ν-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ГО-5 с эпитоп-связывающим доменом к ГО-4, присоединенным к Ν-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ГО-5 с эпитоп-связывающим доменом к ГО-4, присоединенным к С-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ГО5 с эпитоп-связывающим доменом к ГО-4, присоединенным к С-концу легкой цепи. Такие антигенсвязывающие конструкции могут также иметь один или более чем один другой эпитоп-связывающий домен с такой же или другой специфичностью в отношении антигена, присоединенный к С-концу и/или Ν-концу тяжелой цепи и/или С-концу и/или Ν-концу легкой цепи.
Согласно изобретению также предложена триспецифичная связывающая конструкция, способная связывать ГО-4, ГО-13 и ГО-5.
Примеры таких антиген-связывающих конструкций включают антитела к ГО-5, имеющие эпитопсвязывающий домен со специфичностью в отношении ГО-4, например, бАЬ против ГО-4, присоединенный к С-концу или Ν-концу тяжелой цепи или С-концу или Ν-концу легкой цепи, и эпитоп-связывающий домен со специфичностью в отношении ГО-13, например, бАЬ против ГО-13, присоединенный к С-концу или Ν-концу тяжелой цепи или С-концу или Ν-концу легкой цепи.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ГО-5 с эпитоп-связывающим доменом к ГО-4, присоединенным к Ν-концу тяжелой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к ГО-13, присоединенным к Ν-концу легкой цепи.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ГО-5 с эпитоп-связывающим доменом к ГО-4, присоединенным к Ν-концу тяжелой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к ГО-13, присоединенным к С-концу легкой цепи.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ГО-5 с эпитоп-связывающим доменом к ГО-4, присоединенным к Ν-концу тяжелой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к ГО-13, присоединенным к С-концу тяжелой цепи.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ГО-5 с эпитоп-связывающим доменом к ГО-4, присоединенным к Ν-концу легкой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к ГО-13, присоединенным к С-концу легкой цепи.
- 6 023031
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к 1Ь-5 с эпитоп-связывающим доменом к 1Ь-4, присоединенным к Ν-концу легкой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к 1Ь-13, присоединенным к С-концу тяжелой цепи.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к 1Ь-5 с эпитоп-связывающим доменом к 1Ь-4, присоединенным к Ν-концу легкой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к 1Ь-13, присоединенным к Ν-концу тяжелой цепи.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к 1Ь-5 с эпитоп-связывающим доменом к 1Ь-4, присоединенным к С-концу тяжелой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к 1Ь-13, присоединенным к С-концу легкой цепи.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к 1Ь-5 с эпитоп-связывающим доменом к 1Ь-4, присоединенным к С-концу тяжелой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к 1Ь-13, присоединенным к Ν-концу легкой цепи.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к 1Ь-5 с эпитоп-связывающим доменом к 1Ь-4, присоединенным к С-концу тяжелой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к 1Ь-13, присоединенным к Ν-концу тяжелой цепи.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к 1Ь-5 с эпитоп-связывающим доменом к 1Ь-4, присоединенным к С-концу легкой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к 1Ь-13, присоединенным к С-концу тяжелой цепи.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к 1Ь-5 с эпитоп-связывающим доменом к 1Ь-4, присоединенным к С-концу легкой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к 1Ь-13, присоединенным к Ν-концу тяжелой цепи.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к 1Ь-5 с эпитоп-связывающим доменом к 1Ь-4, присоединенным к С-концу легкой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к 1Ь-13, присоединенным к Ν-концу легкой цепи.
Такие антиген-связывающие конструкции могут также иметь один или более чем один другой эпитоп-связывающий домен с такой же или другой специфичностью в отношении антигена, присоединенный к С-концу и/или Ν-концу тяжелой цепи и/или С-концу и/или Ν-концу легкой цепи.
Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции, имеющие специфичность в отношении 1Ь-18, например, содержащие эпитоп-связывающий домен, способный связывать 1Ь-18, или содержащие спаренный домен УНА/Ь, связывающий 1Ь-18.
Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать 1Ь-18. Антиген-связывающая конструкция может включать бАЬ, способное связывать 1Ь-18.
Согласно изобретению также предложена триспецифичная связывающая конструкция, способная связывать 1Ь-4, 1Ь-13 и 1Ь-18.
Примеры таких антиген-связывающих конструкций включают антитела к 1Ь-18, имеющие эпитопсвязывающий домен со специфичностью в отношении 1Ь-4, например бАЬ против 1Ь-4, присоединенный к С-концу или Ν-концу тяжелой цепи или С-концу или Ν-концу легкой цепи, и эпитоп-связывающий домен со специфичностью в отношении 1Ь-13, например, бАЬ против 1Ь-13, присоединенный к С-концу или Ν-концу тяжелой цепи или С-концу или Ν-концу легкой цепи.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ГЛ-18 с эпитоп-связывающим доменом к 1Ь-4, присоединенным к Ν-концу тяжелой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к 1Ь-13, присоединенным к Ν-концу легкой цепи.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ГЬ-18 с эпитоп-связывающим доменом к 1Ь-4, присоединенным к Ν-концу тяжелой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к 1Ь-13, присоединенным к С-концу легкой цепи.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ГЬ-18 с эпитоп-связывающим доменом к 1Ь-4, присоединенным к Ν-концу тяжелой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к 1Ь-13, присоединенным к С-концу тяжелой цепи.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ГЬ-18 с эпитоп-связывающим доменом к 1Ь-4, присоединенным к Ν-концу легкой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к 1Ь-13, присоединенным к С-концу легкой цепи.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ГЬ-18 с эпитоп-связывающим доменом к 1Ь-4, присоединенным к Ν-концу легкой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к 1Ь-13, присоединенным к С-концу тяжелой цепи.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ГЬ-18 с эпитоп-связывающим доменом к 1Ь-4, присоединенным к Ν-концу легкой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к 1Ь-13, присоединенным к Ν-концу тяжелой цепи.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ГЬ-18 с эпитоп-связывающим доменом к 1Ь-4, присоединенным к С-концу тяжелой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к 1Ь-13, присоединенным к С-концу легкой цепи.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ГЬ-18 с эпитоп-связывающим доменом к ГЬ-4, присоединенным к С-концу тяжелой цепи, и эпитоп-связывающим
- 7 023031 доменом к 1Б-13, присоединенным к Ν-концу легкой цепи.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к !Б-18 с эпитоп-связывающим доменом к 1Ь-4, присоединенным к С-концу тяжелой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к 1Б-13, присоединенным к Ν-концу тяжелой цепи.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к 1Б-18 с эпитоп-связывающим доменом к 1Б-4, присоединенным к С-концу легкой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к 1Б-13, присоединенным к С-концу тяжелой цепи.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к 1Б-18 с эпитоп-связывающим доменом к 1Б-4, присоединенным к С-концу легкой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к 1Б-13, присоединенным к Ν-концу тяжелой цепи.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к 1Б-18 с эпитоп-связывающим доменом к 1Б-4, присоединенным к С-концу легкой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к 1Б-13, присоединенным к Ν-концу легкой цепи.
Такие антиген-связывающие конструкции могут также иметь один или более чем один другой эпитоп-связывающий домен с такой же или другой специфичностью в отношении антигена, присоединенный к С-концу и/или Ν-концу тяжелой цепи и/или С-концу и/или Ν-концу легкой цепи.
Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции, имеющие специфичность в отношении ΤΝΡα, например, содержащие эпитоп-связывающий домен, способный связывать ΤΝΡα, или содержащие спаренный домен УНА/Ь, связывающий ΤΝΡα.
Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать ΤΝΡα. Антиген-связывающая конструкция может включать 6АЬ. способное связывать ΤΝΡα.
В одном воплощении антиген-связывающая конструкция по настоящему изобретению имеет специфичность в отношении более чем одного антигена, например, где она способна связывать два или более чем два антигена, выбранные из ΤΝΡα, ΕΟΡΚ и УЕСЕ, например, где она способна связывать ΤΝΡα и БОЕК, или где она способна связывать ΤΝΡα и УΕСЕ, или где она способна связывать ΕΟΡΚ и УΕСЕ. Примеры таких антиген-связывающих конструкций включают антитела к ΤΝΡα, имеющие эпитопсвязывающий домен со специфичностью в отношении ΕΟΡΚ, например, 6АЬ против ΕΟΡΚ, присоединенный к С-концу или Ν-концу тяжелой цепи или С-концу или Ν-концу легкой цепи, например, тАЬбАЬ, имеющее последовательность тяжелой цепи 5>ЕО ГО ΝΟ: 74, и/или последовательность легкой цепи 5ΕΟ ГО ΝΟ: 79.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ΤΝΡα с эпитоп-связывающим доменом к ΕΟΡΚ, присоединенным к Ν-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ΤΝΡα с эпитоп-связывающим доменом к ΕΟΡΚ, присоединенным к Ν-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ΤΝΡα с эпитоп-связывающим доменом к ΕΟΡΚ, присоединенным к С-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ΤΝΡα с эпитоп-связывающим доменом к ΕΟΡΚ, присоединенным к С-концу легкой цепи. Такие антиген-связывающие конструкции могут также иметь один или более чем один другой эпитопсвязывающий домен с такой же или другой специфичностью в отношении антигена, присоединенный к С-концу и/или Ν-концу тяжелой цепи и/или С-концу и/или Ν-концу легкой цепи.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ΕΟΡΚ с эпитоп-связывающим доменом к ΤΝΡα, присоединенным к Ν-концу тяжелой цепи. Антигенсвязывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ΕΟΡΚ с эпитопсвязывающим доменом к ΤΝΡα, присоединенным к Ν-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ΕΟΡΚ с эпитоп-связывающим доменом к ΤΝΡα, присоединенным к С-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ΕΟΡΚ с эпитоп-связывающим доменом к ΤΝΡα, присоединенным к С-концу легкой цепи. Такие антиген-связывающие конструкции могут также иметь один или более чем один другой эпитоп-связывающий домен с такой же или другой специфичностью в отношении антигена, присоединенный к С-концу и/или Ν-концу тяжелой цепи и/или С-концу и/или Ν-концу легкой цепи.
Примеры таких антиген-связывающих конструкций включают антитела к ΤΝΡα, имеющие эпитопсвязывающий домен со специфичностью в отношении νΕΟΡ, например, 6АЬ против νΕΟΡ, присоединенный к С-концу или Ν-концу тяжелой цепи или С-концу или Ν-концу легкой цепи, например, тАЬбАЬ, имеющее последовательность тяжелой цепи 5ΕΟ ГО ΝΟ: 75, 78 или 185.
Антиген-связывающая конструкция по настоящему изобретению может иметь специфичность в отношении более чем одного антигена, например, где она способна связывать ΤΝΡα, и один или оба антигена, выбранные из 1Б-4 и 1Б-13, например, где она способна связывать ΤΝΡα и 1Б-4, или где она способна связывать ΤΝΡα и 1Б-13, или где она способна связывать ΤΝΡα и 1Б-13 и 1Б-4. Примеры таких антиген-связывающих конструкций включают антитела к 1Б-13, имеющие эпитоп-связывающий домен со специфичностью в отношении ΤΝΡα, например, аднектин против ΤΝΡα, присоединенный к С-концу или Ν-концу тяжелой цепи или С-концу или Ν-концу легкой цепи, например, тАЬбАЬ, имеющее последова- 8 023031 тельность тяжелой цепи, изложенную в δΞΟ ΙΌ N0: 134 или 135. Другие примеры таких антигенсвязывающих конструкций включают антитела к 1Ь-4, имеющие эпитоп-связывающий домен со специфичностью в отношении ΤΝΡα, например, аднектин против ΤΝΡα, присоединенный к С-концу или Νконцу тяжелой цепи или С-концу или Ν-концу легкой цепи, например, шЛЬйЛЬ, имеющее последовательность тяжелой цепи, изложенную в δΕΟ ΙΌ N0: 146 или 147.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ΤΝΡα с эпитоп-связывающим доменом к УЕОР, присоединенным к Ν-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ΤΝΡα с эпитоп-связывающим доменом к УЕОР, присоединенным к Ν-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ΤΝΡα с эпитоп-связывающим доменом к УЕОР, присоединенным к С-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ΤΝΡα с эпитоп-связывающим доменом к УЕОР, присоединенным к С-концу легкой цепи. Такие антиген-связывающие конструкции могут также иметь один или более чем один другой эпитопсвязывающий домен с такой же или другой специфичностью в отношении антигена, присоединенный к С-концу и/или Ν-концу тяжелой цепи и/или С-концу и/или Ν-концу легкой цепи.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к УЕОР с эпитоп-связывающим доменом к Τ№α, присоединенным к Ν-концу тяжелой цепи. Антигенсвязывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к УЕОР с эпитопсвязывающим доменом к Τ№α, присоединенным к Ν-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к УЕОР с эпитоп-связывающим доменом к Τ№α, присоединенным к С-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к УЕОР с эпитоп-связывающим доменом к Τ№α, присоединенным к С-концу легкой цепи. Такие антиген-связывающие конструкции могут также иметь один или более чем один другой эпитоп-связывающий домен с такой же или другой специфичностью в отношении антигена, присоединенный к С-концу и/или Ν-концу тяжелой цепи и/или С-концу и/или Ν-концу легкой цепи.
Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции, имеющие специфичность в отношении СЭ-20, например, содержащие эпитоп-связывающий домен, способный связывать СЭ-20, или содержащие спаренный домен УН/УЪ, связывающий СЭ-20.
Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать СЭ-20, например, она может включать антитело, имеющее последовательности тяжелой и легкой цепи δΞΟ ΙΌ Ν0: 120 и 117. Антиген-связывающая конструкция может включать бЛЬ, способное связывать СЭ-20. Примеры тЛЬбЛЬ со специфичностью в отношении СЭ-20 представляют собой тЛЬбЛЬ, имеющие последовательность тяжелой цепи, изложенную в δΞΟ ΙΌ Ν0: 116, 118, или тЛЬбЛЬ, имеющие последовательность легкой цепи, изложенную в δΞΟ ΙΌ Ν0: 119 или 121. Такие антиген-связывающие конструкции могут также иметь один или более чем один другой эпитоп-связывающий домен с такой же или другой специфичностью в отношении антигена, присоединенный к С-концу и/или Ν-концу тяжелой цепи и/или С-концу и/или Ν-концу легкой цепи.
Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции, имеющие специфичность в отношении ΙΕ-1Κ1, например, содержащие эпитоп-связывающий домен, способный связывать ΙΕ-1Κ1, или содержащие спаренный домен УНА/Ь, связывающий ΙΕ-1Κ1.
Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать ΙΕ-1Κ1. Антиген-связывающая конструкция может включать ЙАЬ, способное связывать ΙΕ-1Κ1.
В одном воплощении антиген-связывающая конструкция по настоящему изобретению имеет специфичность в отношении более чем одного антигена, например, где она способна связывать ΙΕ-1 К1 и второй антиген, например, где она способна связывать ΙΕ-1 К1 и УЕОР. Примеры таких антигенсвязывающих конструкций включают антитела к ΙΕ-1Κ1, имеющие эпитоп-связывающий домен со специфичностью в отношении УЕОР, например, ЙАЬ против УЕОР, присоединенный к С-концу или Νконцу тяжелой цепи или С-концу или Ν-концу легкой цепи, например, тЛЬбЛЬ, имеющее последовательность легкой цепи, изложенную в δΞΟ ΙΌ Ν0: 77.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ΙΕ-1Κ1 с эпитоп-связывающим доменом к УЕОР, присоединенным к Ν-концу тяжелой цепи. Антигенсвязывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ΙΕ-1Κ1 с эпитопсвязывающим доменом к УЕОР, присоединенным к Ν-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ΙΕ-1Κ1 с эпитоп-связывающим доменом к УЕОР, присоединенным к С-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к ΙΕ-1Κ1 с эпитоп-связывающим доменом к УЕОР, присоединенным к С-концу легкой цепи. Такие антиген-связывающие конструкции могут также иметь один или более чем один другой эпитоп-связывающий домен с такой же или другой специфичностью в отношении антигена, присоединенный к С-концу и/или Ν-концу тяжелой цепи и/или С-концу и/или Ν-концу легкой цепи.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к УЕОР с эпитоп-связывающим доменом к ΙΕ-1Κ1, присоединенным к Ν-концу тяжелой цепи. Антиген- 9 023031 связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к УЕОР с эпитопсвязывающим доменом к 1Ь-1К1, присоединенным к Ν-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к УЕОР с эпитоп-связывающим доменом к 1Ь-1 К1, присоединенным к С-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к УЕОР с эпитоп-связывающим доменом к 1Ь-1К1, присоединенным к Сконцу легкой цепи. Такие антиген-связывающие конструкции могут также иметь один или более чем один другой эпитоп-связывающий домен с такой же или другой специфичностью в отношении антигена, присоединенный к С-концу и/или Ν-концу тяжелой цепи и/или С-концу и/или Ν-концу легкой цепи.
Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции, имеющие специфичность в отношении ЕОРК, например, содержащие эпитоп-связывающий домен, способный связывать ЕОРК, или содержащие спаренный домен УН/УЪ, связывающий ЕОРК.
Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать ЕОРК. Антиген-связывающая конструкция может включать бАЬ, способное связывать ЕОРК. Некоторые примеры такой антиген-связывающей конструкции будут способны связывать эпитоп на ЕОРК, содержащий 8ЕЦ ГО N0: 103, например, антиген-связывающая конструкция, содержащая одну или более чем одну СОК, изложенную в 8ЕЦ ГО N0: 97 - 8ЕЦ ГО N0: 102 и 8ЕЦ ГО N0: 104-8ЕЦ ГО N0: 107.
В одном воплощении антиген-связывающая конструкция по настоящему изобретению имеет специфичность в отношении более чем одного антигена, например, где она способна связывать два или более антигена, выбранные из ЕОРК, 1ОР-1К, рецептора УЕОР 2 типа (УЕОРК2) и УЕОР, например, где она способна связывать ЕОРК и 1ОР-1К, или где она способна связывать ЕОРК и УЕОР, или где она способна связывать УЕОР и 1ОР-1К, или где она способна связывать ЕОРК и УЕОРК2, или где она способна связывать 1ОР-К1 и УЕОРК2, или где она способна связывать УЕОР и УЕОРК2, или где она способна связывать ЕОРК, 1ОР-1К и УЕОРК2, или где она способна связывать УЕОР, 1ОР-1К и УЕОРК2, или где она способна связывать ЕОРК, УЕОР, и УЕОРК2, или где она способна связывать ЕОРК, УЕОР и 1ОР1К. Примеры таких антиген-связывающих конструкций включают антитела к ЕОРК, имеющие эпитопсвязывающий домен со специфичностью в отношении УЕОРК2, например, аднектин против УЕОРК2, присоединенный к С-концу или Оконцу тяжелой цепи или С-концу или Оконцу легкой цепи, например, тАЬбАЬ, имеющее последовательность тяжелой цепи, изложенную в 8ЕЦ ГО N0: 136, 140 или 144, и/или последовательность легкой цепи, изложенную в 8ЕЦ ГО N0: 138, 142 или 145.
Примеры таких антиген-связывающих конструкций включают антитела к ЕОРК, имеющие эпитопсвязывающий домен со специфичностью в отношении УЕОР, например, бАЬ против УЕОР, присоединенный к С-концу или Оконцу тяжелой цепи или С-концу или Оконцу легкой цепи, например, тАЬбАЬ, имеющее последовательность тяжелой цепи, изложенную в 8ЕЦ ГО N0: 165, 174, 176, 178, 184 или 186, и/или последовательность легкой цепи, изложенную в 8ЕЦ ГО N0: 188 или 190.
Примеры таких антиген-связывающих конструкций включают антитела к УЕОР, имеющие эпитопсвязывающий домен со специфичностью в отношении ЕОРК, например, бАЬ против ЕОРК, присоединенный к С-концу или Оконцу тяжелой цепи или С-концу или Оконцу легкой цепи, например, тАЬбАЬ, имеющее последовательность тяжелой цепи, изложенную в 8ЕЦ ГО N0: 180. Такие тАЬбАЬ могут также содержать последовательность легкой цепи, изложенную в 8ЕЦ ГО N0: 182.
Примеры таких антиген-связывающих конструкций включают антитела к 1ОР-1К, имеющие эпитоп-связывающий домен со специфичностью в отношении УЕОР, например, липокалин против УЕОР, присоединенный к С-концу или Оконцу тяжелой цепи или С-концу или Оконцу легкой цепи, например, тАЬбАЬ, имеющее последовательность тяжелой цепи, изложенную в 8ЕЦ ГО N0: 123 или 125. Такие тАЬбАЬ могут также содержать последовательность легкой цепи, изложенную в 8ЕЦ ГО N0: 113.
Примеры таких антиген-связывающих конструкций включают антитела к 1ОР-1 К, имеющие эпитоп-связывающий домен со специфичностью в отношении УЕОРК2, например, аднектин против УЕОРК2, присоединенный к С-концу или Оконцу тяжелой цепи или С-концу или Оконцу легкой цепи, например, тАЬбАЬ, имеющее последовательность тяжелой цепи, изложенную в 8ЕЦ ГО N0: 124 или 133. Такие тАЬбАЬ могут также содержать последовательность легкой цепи, изложенную в 8ЕЦ ГО N0: 113.
Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции, имеющие специфичность в отношении ГО-23, например, содержащие эпитоп-связывающий домен, способный связывать ГО-23, или содержащие спаренный домен УН/УЪ, связывающий ГО-23.
Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать ГО-23. Антиген-связывающая конструкция может включать бАЬ, способное связывать ГО-23.
В одном воплощении антиген-связывающая конструкция по настоящему изобретению имеет специфичность в отношении более чем одного антигена, например, где она способна связывать два или более чем два антигена, выбранные из цитокинов ТН17-типа, например, ГО-17, ГО-22 или ГО-21, например, где она способна связывать ГО-23 и ГО-17, или где она способна связывать ГО-23 и ГО-21, или где она способна связывать ГО-23 и ГО-22. Примеры таких антиген-связывающих конструкций включают антитела к ГО-23, имеющие эпитоп-связывающий домен со специфичностью в отношении ГО-17, например, бАЬ против ГО-17, присоединенный к С-концу или Оконцу тяжелой цепи или С-концу или Оконцу легкой
- 10 023031 цепи.
Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции, имеющие специфичность в отношении а-рецептора тромбоцитарного фактора роста (ΡΌΟΡΚη), например, содержащие эпитоп-связывающий домен, способный связывать РЭСРКа. или содержащие спаренный домен УН/УЪ. связывающий РЭСРКа. Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать РЭСРКа. Антиген-связывающая конструкция может включать ЙЛЬ. способное связывать РЭСРКа.
Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции, имеющие специфичность в отношении рецептора фактора роста фибробластов 1 типа (РСРК1), например, содержащие эпитоп-связывающий домен. способный связывать РСРК1. или содержащие спаренный домен УНА/Ь. связывающий РСРК1. Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать РСРК1. Антиген-связывающая конструкция может включать ЙАЬ. способное связывать РСРК1.
Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции, имеющие специфичность в отношении рецептора фактора роста фибробластов 3 типа (РСРКЗ), например, содержащие эпитоп-связывающий домен. способный связывать РСРКЗ. или содержащие спаренный домен УНА/Ь. связывающий РСРКЗ. Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать РСРКЗ. Антиген-связывающая конструкция может включать ЙАЬ. способное связывать РСРКЗ.
Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции, имеющие специфичность в отношении УЕСРК2, например, содержащие эпитоп-связывающий домен. способный связывать УЕСРК2. или содержащие спаренный домен УН/УЪ. связывающий УЕСРК2.
Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать УЕСРК2. Антиген-связывающая конструкция может включать ЙАЬ. способное связывать УЕСРК2.
Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции, имеющие специфичность в отношении рецетора УЕСР 3 типа (УЕСРКЗ), например, содержащие эпитопсвязывающий домен. способный связывать УЕСРКЗ. или содержащие спаренный домен УН/УЪ. связывающий УЕСРКЗ.
Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать УЕСРКЗ. Антиген-связывающая конструкция может включать ЙАЬ. способное связывать УЕСРКЗ.
Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции, имеющие специфичность в отношении УЕ-кадгерина. например, содержащие эпитоп-связывающий домен. способный связывать УЕ-кадгерин. или содержащие спаренный домен УН/УЪ. связывающий УЕкадгерин.
Антиген-связывающая конструкция может включать антитело. способное связывать УЕ-кадгерин. Антиген-связывающая конструкция может включать ЙАЬ. способное связывать УЕ-кадгерин.
Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции. имеющие специфичность в отношении нейропилина. например. содержащие эпитоп-связывающий домен. способный связывать нейропилин. или содержащие спаренный домен УН/УЪ. связывающий нейропилин.
Антиген-связывающая конструкция может включать антитело. способное связывать нейропилин. Антиген-связывающая конструкция может включать ЙАЬ. способное связывать нейропилин.
Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции. имеющие специфичность в отношении Р11-З. например, содержащие эпитоп-связывающий домен. способный связывать Р11-З. или содержащие спаренный домен УН/УЪ. связывающий Р11-З.
Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать Р11-З. Антигенсвязывающая конструкция может включать ЙАЬ. способное связывать Р11-З.
Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции. имеющие специфичность в отношении гоп. например, содержащие эпитоп-связывающий домен. способный связывать гоп, или содержащие спаренные домены УН/УЪ. связывающие гоп.
Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать гоп. Антигенсвязывающая конструкция может включать ЙАЬ. способное связывать гоп.
Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции. имеющие специфичность в отношении Тгр-1. например, содержащие эпитоп-связывающий домен. способный связывать Тгр-1. или содержащие спаренный домен УН/УЪ. связывающий Тгр-1.
Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать Тгр-1. Антиген-связывающая конструкция может включать ЙАЬ. способное связывать Тгр-1.
В одном воплощении антиген-связывающая конструкция по настоящему изобретению имеет специфичность в отношении более чем одного антигена. например. где она способна связывать два или более чем два антигена. вовлеченные в рак. например. где она способна связывать два или более чем два антигена. выбранные из РЭСРРа. РСРК1. РСРКЗ. УЕСРК2. УЕСРКЗ. 1СР1К. ЕСРК и УЕСР. УЕкадгерина, нейропилина. Р11-З. гоп, Тгр-1. СЭ-20. например, где она способна связывать РЭСРВа и
- 11 023031
ЕСЕК1, или где она способна связывать РЭСЕКа и УЕСЕ, или где она способна связывать РЭСЕРа и ЕСЕК3, или где она способна связывать РЭСРРа и УЕСЕР2, или где она способна связывать РЭСЕРа и УЕСЕР3. или где она способна связывать РЭСЕРа и 1СЕ1К, или где она способна связывать РЭСЕРа и ЕСЕК, или где она способна связывать РЭСЕРа и УЕСР, или где она способна связывать РЭСЕРа и УЕкадгерин, или где она способна связывать РЭСЕРа и нейропилин, или где она способна связывать РЭСЕРа и ΡΙΐ-3, или где она способна связывать РЭСЕРа и гап, или где она способна связывать РЭСЕРа и Тгр1, или где она способна связывать РЭСЕРа и СП-20, или где она способна связывать ЕСЕК1 и ЕСЕК3, или где она способна связывать ЕСЕК1 и УЕСЕК2, или где она способна связывать ЕСЕК1 и УЕСК3, или где она способна связывать ЕСЕК1 и 1СЕ1К, или где она способна связывать ЕСЕК1 и ЕСЕК, или где она способна связывать ЕСЕК1 и УЕСЕ, или где она способна связывать ЕСЕК1 и УЕ-кадгерин, или где она способна связывать ЕСЕК1 и нейропилин, или где она способна связывать ЕСЕК1 и Е11-3, или где она способна связывать ЕСЕК1 и гоп, или где она способна связывать ЕСЕК1 и Тгр-1, или где она способна связывать ЕСЕК1 и СП-20, или где она способна связывать ЕСЕК3 и УЕСЕК2, или где она способна связывать ЕСЕК3 и УЕСЕК3, или где она способна связывать ЕСЕК3 и 1СЕ1К, или где она способна связывать ЕСЕК3 и ЕСЕК, или где она способна связывать ЕСЕК3 и УЕСЕ, или где она способна связывать ЕСЕК3 и УЕ-кадгерин, или где она способна связывать ЕСЕК3 и нейропилин, или где она способна связывать ЕСЕК3 и ΡΙΐ-3, или где она способна связывать ЕСЕК3 и гоп, или где она способна связывать ЕСЕК3 и Тгр-1, или где она способна связывать ЕСЕК3 и СП-20, или где она способна связывать УЕСЕК2 и УЕСЕК3, или где она способна связывать УЕСЕК2 и 1СЕ1К, или где она способна связывать УЕСЕК2 и ЕСЕК, или где она способна связывать УЕСЕК2 и УЕСЕ, или где она способна связывать УЕСЕК2 и УЕ-кадгерин, или где она способна связывать УЕСЕК2 и нейропилин, или где она способна связывать УЕСЕК2 и Е11-3, или где она способна связывать УЕСЕК2 и гоп, или где она способна связывать УЕСЕК2 и Тгр-1, или где она способна связывать УЕСЕК2 и СП-20, или где она способна связывать УЕСЕК3 и 1СЕ-1 К, или где она способна связывать УЕСЕК3 и ЕСЕК, или где она способна связывать УЕСЕК3 и УЕСЕ, или где она способна связывать УЕСЕК3 и УЕ-кадгерин, или где она способна связывать УЕСЕК3 и нейропилин, или где она способна связывать УЕСЕК3 и Е11-3, или где она способна связывать УЕСЕК3 и Тгр-1, или где она способна связывать УЕСЕК3 и СП-20, или где она способна связывать 1СЕ1К и ЕСЕК, или где она способна связывать 1СЕ1К и УЕСЕ, или где она способна связывать 1СЕ1К и УЕ-кадгерин, или где она способна связывать 1СЕ1К и нейропилин, или где она способна связывать 1СЕ1К и Е11-3, или где она способна связывать 1СЕ1К и гоп, или где она способна связывать 1СЕ1К и Тгр-1, или где она способна связывать 1СЕ1К и СП-20, или где она способна связывать ЕСЕК и УЕСЕ, или где она способна связывать ЕСЕК и УЕ-кадгерин, или где она способна связывать ЕСЕК и нейропилин, или где она способна связывать ЕСЕК и Е11-3, или где она способна связывать ЕСЕК и гоп, или где она способна связывать ЕСЕК и Тгр-1, или где она способна связывать ЕСЕК и СЭ20, или где она способна связывать УЕСЕ и УЕ-кадгерин, или где она способна связывать УЕСЕ и нейропилин, или где она способна связывать УЕСЕ и Е11-3, или где она способна связывать УЕСЕ и гоп, или где она способна связывать УЕСЕ и Тгр-1, или где она способна связывать УЕСЕ и СП-20, или где она способна связывать УЕ-кадгерин и нейропилин, или где она способна связывать УЕ-кадгерин и Е11-3, или где она способна связывать УЕ-кадгерин и гоп, или где она способна связывать УЕ-кадгерин и Тгр-1, или где она способна связывать УЕ-кадгерин и СП-20, или где она способна связывать нейропилин и Е11-3, или где она способна связывать нейропилин и гоп, или где она способна связывать нейропилин и Тгр-1, или где она способна связывать нейропилин и СП-20, или где она способна связывать Е11-3 и гоп, или где она способна связывать Е11-3 и Тгр-1, или где она способна связывать Е11-3 и СП-20, или где она способна связывать гап и Тгр-1, или где она способна связывать гоп и СП-20, и или где она способна связывать Тгр-1 и СП-20.
Такие антиген-связывающие конструкции могут также иметь один или более чем один другой эпитоп-связывающий домен с такой же или другой специфичностью в отношении антигена, присоединенный к С-концу и/или Оконцу тяжелой цепи и/или С-концу и/или Оконцу легкой цепи.
Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции, имеющие специфичность в отношении бета-амилоида, например, содержащие эпитоп-связывающий домен, способный связывать бета-амилоид, или содержащие спаренный домен УНА/Ь, связывающий бетаамилоид.
Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать бета-амилоид. Антиген-связывающая конструкция может включать бАЬ, способное связывать бета-амилоид.
Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции, имеющие специфичность в отношении СП-3, например, содержащие эпитоп-связывающий домен, способный связывать СП-3, или содержащие спаренный домен УН/УЬ, связывающий СП-3.
Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать СП-3. Антигенсвязывающая конструкция может включать бАЬ, способное связывать СЛ-3.
Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции, имеющие специфичность в отношении дрШЬ/Па, например, содержащие эпитоп-связывающий домен,
- 12 023031 способный связывать дрШЪ/Па, или содержащие спаренный домен УН/УЪ, связывающий дрШЪ/Па.
Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать дрШЪ/Па. Антиген-связывающая конструкция может включать ЙАЪ, способное связывать дрШЪ/Па.
Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции, имеющие специфичность в отношении трансформирующего фактора роста-бета (ТСР-бета), например, содержащие эпитоп-связывающий домен, способный связывать ТСР-бета, или содержащие спаренный домен УН/УЪ, связывающий ТСР-бета.
Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать ТСР-бета. Антиген-связывающая конструкция может включать ЙАЬ. способное связывать ТСР-бета.
В одном воплощении настоящего изобретения предложена антиген-связывающая конструкция по изобретению, описанная здесь и содержащая такую константную область, что антитело имеет сниженную функцию АЭСС и/или активации комплемента, или эффекторную функцию. В одном таком воплощении константная область тяжелой цепи может включать естественную неполноценную константную область изотипа 1дС2 или 1дС4 или мутированную константную область 1дС1. Примеры подходящих модификаций описаны в ЕР 0307434. Один пример включает замены аланиновых остатков в положениях 235 и 237 (нумерация ЕЙ).
В одном воплощении антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению будут сохранять Рс-функцию, например, будут способны к АЭСС-активности и/или СЭС-активности. Такие антиген-связывающие конструкции могут содержать эпитоп-связывающий домен, расположенный на легкой цепи, например на С-конце легкой цепи.
Согласно изобретению также раскрыт способ сохранения функции АЭСС и СЭС антигенсвязывающих конструкций расположением эпитоп-связывающего домена на легкой цепи антитела, в частности, расположением эпитоп-связывающего домена на С-конце легкой цепи. Такая функция АЭСС и СЭС может быть измерена любым подходящим анализом, например, анализом АЭСС, изложенным в примере 15.3, и анализом СЭС, изложенным в примере 15.4.
Согласно изобретению также раскрыт способ снижения функции СЭС антиген-связывающих конструкций расположением эпитоп-связывающего домена на тяжелой цепи антитела, в частности, расположением эпитоп-связывающего домена на С-конце тяжелой цепи. Такая функция СЭС может быть измерена любым подходящим анализом, например, анализом СЭС, изложенным в примере 15.4.
В другом воплощении антиген-связывающая конструкция по настоящему изобретению способна связывать два или более чем два антигена, выбранные из УЕСР, 1СР-1К и ЕСРК, например, она способна связывать ЕСРК и УЕСР, или ЕСРК и 1СР-1К, или 1СР-1К и УЕСР, или, например, она способна связывать ТИР и 1Ь1-К. В воплощениях изобретения, включающих связывающий сайт для 1СР-1К, связывающий сайт для 1СР-1К антиген-связывающей конструкции по изобретению может содержать спаренный домен УН/УЬ в белковом каркасе, причем спаренный домен УН/УЪ может содержать одну или более чем одну из СЭК, выбранных из СЭК, изложенных в 8ЕЦ ГО N0: 80, 8ЕЦ ГО N0: 81, 8ЕЦ ГО N0: 82, 8ЕЦ ГО N0: 83, 8ЕЦ ГО N0: 84, 8ЕЦ ГО N0: 85 и 8ЕЦ ГО N0: 86, например, он может содержать по меньшей мере третью область тяжелой цепи, определяющую комплементарность (СЭКН3), как изложено в 8ЕЦ ГО N0: 80, например, он может содержать все СЭК, изложенные в 8ЕЦ ГО N0: 80, 8ЕЦ ГО N0: 81, 8ЕЦ ГО N0: 82, 8ЕЦ ГО N0: 83, 8ЕЦ ГО N0: 85 и 8ЕЦ ГО N0: 86.
В воплощениях изобретения, включающих связывающий сайт для ЕСРК, антиген-связывающая конструкция по настоящему изобретению может связывать эпитоп, включающий остатки 273-501 зрелой или нормальной последовательности ЕСРК или последовательности ЕСРК дикого типа, например, она может связывать эпитоп, включающий остатки 287-302 зрелого или нормального ЕСРК или ЕСРК дикого типа (8ЕЦ ГО N0: 103).
В одном воплощении связывающий сайт для ЕСРК антиген-связывающей конструкции по изобретению может содержать спаренный домен УН/УЪ в белковом каркасе, причем спаренный домен УН/УЪ может содержать одну или более чем одну из СЭК, выбранных из СЭК, изложенных в 8ЕЦ ГО N0: 104, 8ЕЦ ГО N0: 105, 8ЕЦ ГО N0: 106, 8ЕЦ ГО N0: 100, 8ЕЦ ГО N0: 101 и 8ЕЦ ГО N0: 102, например, он может содержать СЭКН3, как изложено в 8ЕЦ ГО N0: 106, или он может содержать все шесть СЭК, изложенные в 8ЕЦ ГО N0: 104, 8ЕЦ ГО N0: 105, 8ЕЦ ГО N0: 106, 8ЕЦ ГО N0: 100, 8ЕЦ ГО N0: 101 и 8ЕЦ ГО N0: 102. Такой спаренный домен УН/УЪ может дополнительно содержать дополнительные остатки, в частности, в СЭР тяжелой цепи, и в одном воплощении СЭКН1 может содержать 8ЕЦ ГО N0: 104 и еще до пяти дополнительных остатков, например, один или более чем один из пяти дополнительных остатков, изложенных в 8ЕЦ ГО N0: 97, СЭКН2 может содержать 8ЕЦ ГО N0: 105 и еще до двух дополнительных остатков, например, один или оба из двух дополнительных остатков, изложенных в 8ЕЦ ГО N0: 98 и 8ЕЦ ГО N0: 107, и СЭКН3 может содержать 8ЕЦ ГО N0: 106 и еще до двух дополнительных остатков, например, один или оба из двух дополнительных остатков, изложенных в 8ЕЦ ГО N0: 99. В одном таком воплощении спаренный домен УН/УЪ содержит одну или более чем одну СЭК, изложенную в 8ЕЦ ГО N0: 97, 8ЕЦ ГО N0: 98, 8ЕЦ ГО N0: 99, 8ЕЦ ГО N0: 100, 8ЕЦ ГО N0: 101 и 8ЕЦ ГО N0: 102, например, он может содержать по меньшей мере СЭКН3, как изложено в 8ЕЦ ГО N0: 99, например, он может содержать все шесть СЭК, изложенные в 8ЕЦ ГО N0: 97, 8ЕЦ ГО N0: 98, 8ЕЦ ГО N0: 99, 8ЕЦ ГО
- 13 023031
N0: 100, δΕΟ ΙΌ N0: 101 и δΕΟ ΙΌ N0: 102 (более подробно о подходящих антителах см. АО 02/092771 и АО 2005/081854).
Антиген-связывающие конструкции по изобретению содержат эпитоп-связывающий домен, представляющий собой однодоменное антитело (бЛЬ), например, эпитоп-связывающий домен может представлять собой человеческий νΗ или человеческий УЪ, или νΗΗ представителя семейства Верблюдовых или бАЬ акулы (ΝΑΚν).
Белковые каркасы по настоящему изобретению могут быть связаны с эпитоп-связывающими доменами с применением линкеров. Примеры подходящих линкеров включают аминокислотные последовательности, которые могут иметь длину от 1 аминокислоты до 150 аминокислот, или от 1 до 140 аминокислот, например, от 1 до 130 аминокислот, или от 1 до 120 аминокислот, или от 1 до 80 аминокислот, или от 1 до 50 аминокислот, или от 1 до 20 аминокислот, или от 1 до 10 аминокислот, или от 5 до 18 аминокислот. Такие последовательности могут иметь свою собственную третичную структуру, например, линкер по настоящему изобретению может содержать отдельный вариабельный домен. В одном воплощении размер линкера эквивалентен отдельному вариабельному домену. Подходящие линкеры могут иметь размер 1-20 ангстрем (0,1-2 нм), например, менее 15 ангстрем (1,5 нм) или менее 10 ангстрем (1 нм), или менее 5 ангстрем (0,5 нм).
В одном воплощении настоящего изобретения по меньшей мере один из эпитоп-связывающих доменов непосредственно присоединен к каркасу 1дС линкером, содержащим от 1 до 50 аминокислот, например, от 1 до 20 аминокислот, например, от 1 до 10 аминокислот. Такие линкеры могут быть выбраны из любого, изложенного в δΕΟ ΙΌ Ν0: 6-11, δΤΟ' (серин, треонин, глицин), 'ΌδΊΌ или Κδ, например, линкер может представлять собой ΤνΑΑΡδ, или линкер может представлять собой ССССδ. Линкеры, используемые в антиген-связывающих конструкциях по настоящему изобретению, могут содержать, сами по себе или в дополнение к другим линкерам, одну или более чем одну группу остатков Сδ, например, ’ΌδΤνΑΑΡδ или ΤVΑΑΡδСδ, или СδΤVΑΑΡδСδ. В другом воплощении между эпитоп-связывающим доменом, например, бАЬ, и каркасом 1д нет линкера. В другом воплощении эпитопсвязывающий домен, например, бАЬ, связан с каркасом 1д линкером ΤνΑΑΡδ. В другом воплощении эпитоп-связывающий домен, например, άΑΕ. связан с каркасом 1д линкером ΤVΑΑΡδСδ. В другом воплощении эпитоп-связывающий домен, например, άΑΕ, связан с каркасом 1д линкером ’Όδ.
В одном воплощении антиген-связывающая конструкция по настоящему изобретению содержит по меньшей мере один эпитоп-связывающий домен, способный связывать человеческий сывороточный альбумин.
В одном воплощении антиген-связывающая конструкция способна связывать 3 или 4 антигена, например, она способна связывать 3 или 4 антигена одновременно.
Согласно изобретению также предложены антиген-связывающие конструкции для применения в медицине, например, для применения в изготовлении лекарственного средства для лечения рака или воспалительных заболеваний, таких как астма, ревматоидный артрит или остеоартрит.
Согласно изобретению также предложен способ лечения пациента, страдающего от рака или воспалительных заболеваний, таких как астма, ревматоидный артрит или остеоартрит, включающий введение терапевтического количества антиген-связывающей конструкции по изобретению.
Антиген-связывающие конструкции по изобретению могут быть использованы для лечения рака или воспалительных заболеваний, таких как астма, ревматоидный артрит или остеоартрит.
Антиген-связывающие конструкции по изобретению могут иметь некоторую эффекторную функцию. Например, если белковый каркас содержит Рс-область, имеющую происхождение из антитела с эффекторной функцией, например, если белковый каркас содержит СН2 и СН3 из 1дС1. Уровни эффекторной функции могут быть изменены в соответствии с известными методиками, например, мутациями в домене СН2, например, где домен СН2 1дС1 имеет одну или более чем одну мутацию в положениях, выбранных из выбранных из 239 и 332, и 330, например, мутации выбраны из δ239Ό и Ι332Ε, и Α330Ε, таким образом, что антитело имеет усиленную эффекторную функцию, и/или, например, изменением профиля гликозилирования антиген-связывающей конструкции по изобретению, таким образом, что фукозилирование Рс-области снижено.
Белковые каркасы, используемые в настоящем изобретении включают полные каркасы моноклональных антител, содержащие все домены антитела, или белковые каркасы по настоящему изобретению могут содержать структуру необычного антитела, такого как моновалентное антитело. Такие моновалентные антитела могут содержать спаренные тяжелые и легкие цепи, где шарнирная область тяжелой цепи модифицирована таким образом, что тяжелые цепи не образуют гомодимеров, как например моновалентное антитело, описанное в АО 2007059782. Другие моновалентные антитела могут содержать спаренную тяжелую и легкую цепь, образующую димеры со второй тяжелой цепью без функциональной вариабельной области и области СН1, где первая и вторая тяжелые цепи модифицированы таким образом, что они скорее будут образовывать гетеродимеры, а не гомодимеры, что приводит к образованию моновалентного антитела с двумя тяжелыми цепями и одной легкой цепью, как например моновалентное антитело, описанное в АО 2006015371. Такие моновалентные антитела могут обеспечить белковый каркас по настоящему изобретению, к которому могут быть присоединены эпитоп-связывающие домены,
- 14 023031 например, такие как антиген-связывающие конструкции, описанные в примере 32.
Эпитоп-связывающие домены, используемые в настоящем изобретении, представляют собой домены, специфично связывающие антиген или эпитоп, независимо от другой У-области или домена, он может представлять собой однодоменное антитело.
Эпитоп-связывающие домены могут быть связаны с белковым каркасом в одном или более чем одном положении. Эти положения включают С-конец и Ν-конец белкового каркаса, например, С-конец тяжелой цепи и/или С-конец лекой цепи 1§О, или, например, Ν-конец тяжелой цепи и/или Ν-конец легкой цепи1§О.
В одном воплощении первый эпитоп-связывающий домен связан с белковым каркасом, а второй эпитоп-связывающий домен связан с первым эпитоп-связывающим доменом, например, там, где белковый каркас представляет собой каркас 1дО, первый эпитоп-связывающий домен может быть связан с Сконцом тяжелой цепи каркаса 1дО, и этот эпитоп-связывающий домен может быть связан своим Сконцом со вторым эпитоп-связывающим доменом, или, например, первый эпитоп-связывающий домен может быть связан с С-концом легкой цепи каркаса 1дО, и этот первый эпитоп-связывающий домен может также быть связан своим С-концом со вторым эпитоп-связывающим доменом, или, например, первый эпитоп-связывающий домен может быть связан с Ν-концом легкой цепи каркаса 1дО, и этот первый эпитоп-связывающий домен может также быть связан своим Ν-концом со вторым эпитоп-связывающим доменом, или, например, первый эпитоп-связывающий домен может быть связан с Ν-концом тяжелой цепи каркаса 1дО, и этот первый эпитоп-связывающий домен может также быть связан своим Ν-концом со вторым эпитоп-связывающим доменом. Примеры таких антиген-связывающих конструкций описаны в примере 31.
Если эпитоп-связывающий домен представляет собой однодоменное антитело, некоторые однодоменные антитела могут быть подходящими для определенных положений в пределах каркаса.
Однодоменные антитела, используемые в настоящем изобретении, могут быть связаны с Сконцевой областью тяжелой цепи и/или легкой цепи обычных 1§О. В дополнение, некоторые бАЬ могут быть связаны с С-концевыми областями как тяжелой цепи, так и легкой цепи обычных антител.
В конструкциях, где Ν-конец бАЬ слит с константным доменом антитела (либо СН3, либо СЬ), пептидный линкер может способствовать связыванию бАЬ с антигеном. Действительно, Ν-концевая область бАЬ расположена близко к областям, определяющим комплементарность (СИК), вовлеченным в антигенсвязывающую активность. Таким образом, короткий пептидный линкер действует как спейсер между эпитоп-связывающим доменом и константным доменом белкового каркаса, что может облегчить достижение антигена СИК бАЬ, которые, следовательно, могут связывать с высокой аффинностью.
Окружение, в котором бАЬ связаны с 1дО, будут варьировать в зависимости от того, с какой цепью антитела они слиты.
При слиянии с С-концевой областью легкой цепи антитела каркаса 1дО ожидают, что каждое бАЬ будет расположено вблизи шарнирной области антитела и Рс-части. Вероятно, такие бАЬ будут расположены на большом расстоянии друг от друга. В обычных антителах угол между РаЬ-фрагментами и угол между каждым РаЬ-фрагментом и Рс-областью может существенно варьировать. Вероятно, в тАЬбАЬ угол между РаЬ-фрагментами не будет сильно отличаться, поскольку можно наблюдать определенные угловые ограничения для угла между каждым РаЬ-фрагментом и Рс-частью.
При слиянии с С-концевой областью тяжелой цепи антитела каркаса 1дО ожидают, что каждое бАЬ будет расположено вблизи доменов СН3 Рс-части. Полагают, что это не будет оказывать влияния на связывающие свойства Рс в отношении Рс-рецепторов (например, РсуК1, II, III и РсКп), поскольку эти рецепторы взаимодействуют с доменами Сн2 (для класса рецепторов РсуЫ, II и III) или с шарнирной областью между доменами Сн2 и СН3 (например, рецептор РсКп). Другое свойство таких антигенсвязывающих конструкций состоит в том, что, как полагают, бАЬ будут расположены пространственно близко друг к другу и при условии, что гибкость обеспечена предоставлением подходящих линкеров, эти бАЬ могут даже образовывать гомодимерные разновидности, воспроизводя, таким образом, четвертичную структуру застежки-молнии Рс-части, что может повышать стабильность конструкции.
Такие структурные соображения могут способствовать выбору наиболее подходящего положения для присоединения эпитоп-связывающего домена, например, бАЬ, к белковому каркасу, например антителу.
Размер антигена, его локализация (в крови или на клеточной поверхности), его четвертичная структура (мономерная или мультимерная) могут варьировать. Обычные антитела естественным образом устроены для функционирования в качестве адаптерных конструкций ввиду наличия шарнирной области, где ориентация двух антиген-связывающих сайтов на конце РаЬ-фрагментов может варьировать в широких пределах, и, таким образом, возможна ее адаптация к молекулярным свойствам антигена и его окружения. Наоборот, бАЬ, связанные с антителом или другим белковым каркасом, например, с белковым каркасом, содержащим антитело без шарнирной области, могут иметь меньшую структурную гибкость, либо непосредственно, либо косвенно.
Также полезно понимание состояния в растворе и характера связывания бАЬ. Накоплены доказательства того, что в растворе ίη νίίΐΌ бАЬ могут преимущественно существовать в мономерных, гомоди- 15 023031 мерных или мультимерных формах (Кекег е! а1. (1999) ί Мо1 Βίο1 290 Р685-698; Е\уег1 е! а1 (2003) ί Мо1 Βίο1 325, р531-553, .ккрегк е! а1 (2004) I Мо1 Βίο1. 337 р893-903; .ккрегк е! а1 (2004) Ыа! Вю!есЬпо1 22 р1161-1165; МагИп е! а1. (1997) Рто!еш Епд. 10 р607-614; Зери1уаба е! а1 (2003) I Мо1 Вю1. 333 р355-365). Это в известной степени напоминает мультимеризационные события, наблюдаемые ш утуо с доменами 1дО, как например белки Бенс-Джонса (представляющие собой димеры легких цепей иммуноглобулинов (Ерр е! а1. (1975) ВюсНетМгу 14 р4943-4952; Ниап е! а1. (1994) ВюсНетМгу 33 р14848-14857; Ниапд е! а1. (1997) Мо1 1ттипо1 34 р1291-1301)) и амилоидные волокна (1ате8 е! а1. (2007) I Мо1 Вю1. 367:603-8).
Например, может быть желательным присоединение однодоменных антител, имеющих тенденцию к димеризации в растворе, к С-концевой области Рс-части вместо С-концевой области легкой цепи, поскольку присоединение к С-концевой области Рс сделает возможной димеризацию этих бАЬ в контексте антиген-связывающей конструкции по изобретению.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению могут содержать антигенсвязывающие сайты, специфичные в отношении одного антигена, или могут иметь антиген-связывающие сайты, специфичные в отношении двух или более чем двух антигенов, или в отношении двух или более чем двух эпитопов на одном антигене, или могут присутствовать антиген-связывающие сайты, специфичные в отношении разных эпитопов на одном и том же антигене или на разных антигенах.
Каждый антиген-связывающий сайт может иметь специфичность связывания в отношении антигена, такого как белки человека или животных, включая цитокины, рецепторы цитокинов, рецепторы факторов роста, ферменты (например, протеазы), кофакторы ферментов, ДНК-связывающие белки, липиды и углеводы. Подходящие мишени, включая цитокины, факторы роста, рецепторы цитокинов, рецепторы факторов роста и другие белки, включают, без ограничения: аполипопротеин Е (АроЕ), аполипопротеин ЗАА (Аро-ЗАА), нейротрофический фактор головного мозга (ВЭЫР), кардиотрофин-1, раковоэмбриональный антиген (СЕА), СЭ40. лиганд СЭ40. СЭ56. СЭ38. СЭ138. эпидермальный фактор роста (ЕОР), рецептор ЕОР, ЕЫА-78. эотаксин, эотаксин-2, Ехобик-2. ЕроК, РАРа, кислый фактор роста фибробластов (РОР), основной РОР, фактор роста фибробластов-10, лиганд РЬТ3, фракталкин (СХЗС), глиальный нейротрофический фактор (ОЭЫР), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (О-С8Р), гранулоцитарно-моноцитарный колониестимулирующий фактор (ОМ-С8Р), СЕ-131. человеческий сывороточный альбумин, инсулин, интерферон-γ (ГЕЫ-γ), инсулиноподобный фактор роста-1 (1ОР-1), инсулиноподобный фактор роста-2 (1ОР-11), интерлейкин-1а (1Ь-1а), 1Ь-1В, 1Ь-2, 1Ь-3, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6, 1Ь-7, 1Ь-8 (72 аминокислоты (а/к)), 1Ь-8 (77 а/к), 1Ь-9, 1Ь-10, 1Ь-11, 1Ь-12, 1Ь-13, 1Ь-15, 1Ь-16, 1Ь-17, 1Ь-18 (1РЫ^индуцирующий фактор (1О1Р)), ингибин α, ингибин β, 1Р-10, фактор роста кератиноцитов-2 (КОР-2), КОР, лептин, лейкемический ингибиторный фактор (ЫЕ), лимфотактин, мюллерову ингибирующую субстанцию, фактор, ингибирующий колонии моноцитов, моноцитарный аттрактантный белок, моноцитарный колониестимулирующий фактор (М-С8Р), с-Гтк. у-ГткМЭС (67 а/к), МЭС (69 а/к), моноцитарный хемотаксический белок-1 (МСР-1) (моноцитарный хемотаксический и активирующий фактор (МСАР)), МСР-2, МСР-3, МСР-4, МЭС (67 а/к), МЭС (69 а/к), М1О, макрофагальный воспалительный белок-1а (М1Р-1а), М1Р-1в, М1Р-3а, М1Р-3в, М1Р-4, фактор, ингибирующий миелоидных предшественников, 1 типа (МР1Р-1), нейтрофил-активирующий белок-2 (ЫАР-2), неуртурин, фактор роста нервов, фактор роста нервов-β (β-ЫОР), нейротрофин-3 (ЫТ-3), ΝΤ-4, онкостатин М, тромбоцитарный фактор роста АА (РПОР-АА), РЭОР-АВ, РЭОР-ВВ, тромбоцитарный фактор-4 (РР-4), КАЫТЕ8, фактор стромальных клеток-1а (δΌΡ1α), δΌΡ1β, фактор стволовых клеток (8СР), фактор роста стволовых клеток (8СОР), фактор стволовых клеток (8СР), тимус-ассоциированные регуляторные хемокины (ТАКС), трансформирующий фактор роста-а (ТОР-α), ТОР-β, ТОР-в2, ТОР-33, фактор некроза опухоли (ТЫР), ТЫЕ-а. ТЫЕ-β. рецептор ТЫР I типа, рецептор ТЫР II типа, ТЫ1Ь-1, ТРО, сосудистый эндотелиальный фактор роста (УЕОР), УЕОР А, УЕОР В, УеОр С, УЕОР Ό, рецептор УЕОР 1 типа, рецептор УЕОР 2 типа, рецептор УЕОР 3 типа, гранулоцитарный хемотаксический белок-2 (ОСР-2), ОКО/МО8А, ОКО-3, ОКО-Υ, НСС1, 1-309, рецептор человеческого эпидермального фактора роста-1 (НЕК 1), НЕК 2, НЕК 3 и НЕК 4, сывороточный альбумин, фактор фон Виллебранда (у^Р), амилоидные белки (например, альфаамилоид), матриксную металлопротеиназу-12 (ММР12), фосфолипид-зависимую киназу-1 (РЭК1), 1дЕ, и другие мишени, раскрытые здесь. Следует понимать, что этот список никоим образом не является исчерпывающим.
В некоторых воплощениях устойчивый к протеазам пептид или полипептид связывает мишень в легочной ткани, такую как мишень, выбранная из группы, состоящей из рецептора ТЫР 1 типа (ТЫРК1), 1Ь-1, рецептора 1Ь-1 (1Ь-1К), 1Ь-4, 1Ь-4К, 1Ь-5, 1Ь-6, 1Ь-6К, 1Ь-8, 1Ь-8К, 1Ь-9, 1Ь-9К, 1Ь-10, 1Ь-12 1Ь-12К, 1Ь-13, 1Ь-13Ка1, 1Ь-13Ка2, 1Ь-15, 1Ь-15К, 1Ь-16, 1Ь-17К, 1Ь-17, 1Ь-18, 1Ь-18К, 1Ь-23 Ш-23К, 1Ь-25, СЭ2. СЭ4. СЭ11а, СЭ23, СЭ25, СЭ27, СЭ28. СЭ30, СЭ40. лиганда СЭ40 (СЭ40Е). СЭ56, СЭ138, АЬК5, ЕОРК, РсЕК1, ТОРЬ, ССЬ2, ССЬ18, СЕА, СК8, фактора роста соединительной ткани (СТОР), СХСЬ12 (8ΌΡ-1), химазы, РОР, фурина, эндотелина-1, эотаксинов (например, эотаксина, эотаксина-2, эотаксина3), ОМ-С8Р, молекулы межклеточной адгезии 1 типа (1САМ-1), 1СО8, 1дЕ, 1РЫа, 1-309, интегринов, Ьселектина, М1Р, М1Р4, МЭС. МСР-1, ММР, нейтрофильной эластазы, остеопонтина, ОХ-40, РАКС, РЭ-1. КАЫТЕ8, 8СР, 8ΌΡ-1, 81д1ес 8, ТАКС, ТОРЬ, тромбина, ТЫ, ТЫР, ТКАЫСЕ, триптазы, УЕОР, аль- 16 023031 фа4бета1 (УЪА-4), сосудистой молекулы адгезии (УСАМ), α4β7, ССК2, ССК3, ССК4, ССК5, ССК7, ССК8, альфаубетаб, альфаубета8, сМЕТ, СЭ8, у\УЕ. амилоидных белков (например, альфа-амилоида), ММР12, ΡΌΚ1 и 1дЕ.
В частности, антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению могут быть полезны в лечении заболеваний, ассоциированных с 10-13, 1Ь-5 и 1Ь-4, например, атопического дерматита, аллегрического ринита, болезни Крона, хронической обструктивной болезни легких (СОРЭ), фибротических заболеваний или расстройств, таких как идиопатический легочный фиброз, прогрессирующий системный склероз, фиброз печени, гранулемы печени, шистосомоз, лейшманиоз, заболевания регуляции клеточного цикла, такие как болезнь Ходжкина, В-клеточный хронический лимфоидный лейкоз, например, конструкции могут быть полезны в лечении астмы.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению могут быть полезны в лечении заболеваний, ассоциированных с факторами роста, такими как ЮР-1К, УЕСР и ЕСРК, например, рака или ревматоидного артрита, примерами типов злокачественных новообразований, при которых могут быть применимы такие терапии, являются рак молочной железы, рак предстательной железы, рак легкого и миелома.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению могут быть полезны в лечении заболеваний, ассоциированных с ΤΝΕ, например, артрита, например, ревматоидного артрита или остеоартрита.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению могут быть полезны в лечении заболеваний, ассоциированных с 1Ь-1К, например, артрита, например, ревматоидного артрита или остеоартрита.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению могут быть полезны в лечении заболеваний, ассоциированных с СЭ-20, например, аутоиммунных заболеваний, таких как псориаз, воспалительное заболевание кишечника, неспецифический язвенный колит, болезнь Крона, ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит, системная красная волчанка, нейродегенеративных заболеваний, например рассеянного склероза, связанных с нейтрофилами заболеваний, например, СОРЭ, васкулита Вегенера, муковисцидоза, синдрома Шегрена, хронического отторжения трансплантата, диабета 1 типа, болезни трансплантат против хозяина, астмы, аллергических заболеваний, атопического дерматита, экзематозного дерматита, аллергического ринита, других аутоиммунных заболеваний, включая тиреоидит, спондилоартропатию, анкилозирующий спондилит, увеит, полихондрит или склеродермию, или злокачественных новообразований, например, В-клеточных лимфом, или зрелых В-клеточных опухолей, таких как хронический лимфолейкоз (СЬЬ) или лимфома из малых лимфоцитов (БЬЬ).
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению могут быть полезны в лечении заболеваний, ассоциированных с 1Ь-17 и 1Ь-23, например, псориаза, воспалительного заболевания кишечника, неспецифического язвенного колита, болезни Крона, ревматоидного артрита, ювенильного ревматоидного артрита, системной красной волчанки, нейродегенеративных заболеваний, например, рассеянного склероза, связанных с нейтрофилами заболеваний, например, СОРЭ, васкулита Вегенера, муковисцидоза, синдрома Шегрена, хронического отторжения трансплантата, диабета 1 типа, болезни «трансплантат против хозяина», астмы, аллергических заболеваний, атопического дерматита, экзематозного дерматита, аллергического ринита, других аутоиммунных заболеваний, включая тиреоидит, спондилоартропатию, анкилозирующий спондилит, увеит, полихондрит или склеродермию.
Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению могут быть получены трансфекцией клетки-хозяина вектором экспрессии, содержащим кодирующую последовательность антигенсвязывающей конструкции по изобретению. Вектор экспрессии или рекомбинантную плазмиду получают функциональным объединением этих кодирующих последовательностей антиген-связывающей конструкции с обычными регуляторными контрольными последовательностями, способными контролировать репликацию и экспрессию в клетке-хозяине и/или секрецию из клетки-хозяина. Регуляторные последовательности включают промоторные последовательности, например, промотор цитомегаловируса (СМУ), и сигнальные последовательности, которые могут иметь происхождение из других известных антител. Сходным образом, второй вектор экспрессии может получен при наличии последовательности ДНК, кодирующей комплементарную тяжелую или легкую цепь антиген-связывающей конструкции. В определенных воплощениях этот второй вектор экспрессии идентичен первому, за исключением случаев, когда затронуты кодирующие последовательности и селектируемые маркеры, обеспечивая, по возможности, функциональную экспрессию каждой полипептидной цепи. Альтернативно, кодирующие последовательности тяжелой и легкой цепи антиген-связывающей конструкции могут быть расположены на одном векторе, например, в двух экспрессионных кассетах в одном и том же векторе.
Осуществляют котрансфекцию выбранной клетки-хозяина как первым, так и вторым вектором с применением обычных методик (или просто трансфицируют ее одним вектором) с получением трансфицированной клетки-хозяина по изобретению, содержащей рекомбинантные и/или синтетические тяжелые и легкие цепи. Трансфицированную клетку затем культивируют с применением обычных методик с получением конструированной антиген-связывающей конструкции по изобретению. Проводят скрининг антиген-связывающей конструкции, включающей объединение рекомбинантных тяжелой цепи и/или
- 17 023031 легкой цепи, из культуры подходящим анализом, таким как твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ8А) или радиоиммунный анализ (ΚΙΆ). Сходные обычные методики могут быть применены для конструирования других антиген-связывающих конструкций.
Подходящие векторы для стадий клонирования и субклонирования, используемые в способах и конструировании композиций по данному изобретению, могут быть выбраны специалистом в данной области техники. Например, может быть использована обычная серия клонирующих векторов рИС. Один вектор, риС19, имеется в продаже от таких поставщиков, как Атеткйат (ВискшдйаткЫте, ИШей Κίη§бот) или Рйагтааа (Ирр8а1а, 8\\ебеп).
В дополнение, для клонирования может быть использован любой вектор, способный к быстрой репликации, имеющий множество сайтов клонирования и селектиуремых генов (например, устойчивости к антибиотикам) и простой в обращении. Таким образом, выбор клонирующего вектора не является ограничивающим фактором в данном изобретении.
Векторы экспрессии также могут отличаться генами, подходящими для усиления экспрессии гетерологичных последовательностей ДНК, например, гена дигидрофолатредуктазы млекопитающих (ΌΗΡΚ). Другие предпочтительные векторные последовательности включают сигнальную последовательность поли-А, такую как сигнальная последовательность бычьего гормона роста (ВОН) и промоторная последовательность бетаглобина (Ье!ад1орго). Векторы экспрессии, применимые здесь, могут быть синтезированы методиками, хорошо известными специалистам в данной области техники.
Компоненты таких векторов, например, репликоны, селектируемые гены, энхансеры, промоторы, сигнальные последовательности и тому подобное, могут быть получены из коммерческих или природных источников или синтезитрованы известными способами для применения в управлении экспрессией и/или секрецией продукта рекомбинантной ДНК в выбранном хозяине. С этой целью могут также быть выбраны другие подходящие векторы экспрессии, многие типы которых известны в данной области техники для экспрессии у млекопитающих, бактерий, насекомых, дрожжей и грибов.
Настоящее изобретение также включает клеточную линию, трансфицированную рекомбинантной плазмидой, содержащей кодирующие последовательности антиген-связывающих конструкций по настоящему изобретению. Клекти-хозяева, применимые для клонирования и других манипуляций с этими клонирующими векторами, также общеприняты. Тем не менее, клетки различных штаммов Е. сой могут быть использованы для репликации клонирующих векторов и других стадий при конструировании антиген-связывающих конструкций по данному изобретению.
Подходящие клетки-хозяева или клеточные линии для экспрессии антиген-связывающих конструкций по изобретению включают клетки млекопитающих, такие как N80, 8р2/0, СНО (например, ΌΟ44), СО8, НЕК, клетку-фибробласт (например, 3Т3) и клетки миеломы, например, она может быть экспрессирована в клетке СНО или клетке миеломы. Могут быть использованы человеческие клетки, делая, таким образом, возможным модификацию молекулы с человеческими паттернами гликозилирования. Альтернативно, могут быть использованы другие эукариотические клеточные линии. Селекция подходящих клеток-хозяев млекопитающих и способы трансформации, культивирования, амплификации, скрининга и получения и очистки продукта хорошо известны в данной области техники (см., например, 8атЬгоок е! а1., приведенную выше).
Бактериальные клетки могут оказаться полезными в качестве клеток-хозяев, подходящих для экспрессии рекомбинантных РаЬ-фрагментов или других воплощений настоящего изобретения (см., например, Р1иск1йип, А., 1ттипо1. Кеу., 130:151-188 (1992)). Тем не менее, ввиду склонности белков, экспрессированных в бактериальных клетках, к существованию в состоянии, не прошедшем фолдинг или прошедшем неправильный фолдинг, или в негликозилированной форме будет необходим скрининг любого рекомбинантного РаЬ-фрагмента, полученного в бактериальной клетке, на предмет сохранения способности связывать антиген. Если молекула, экспрессированная бактериальной клеткой, была образована в форме, прошедшей правильный фолдинг, такая бактериальная клетка будет желательным хозяином, или в альтернативных воплощениях может быть осуществлена экспрессия молекулы в бактериальном хозяине и затем проведен ее повторный фолдинг. Например, различные штаммы Е. сой, используемые для экспрессии, хорошо известны в качестве клеток-хозяев в области биотехнологии. Различные штаммы В. киЬДйк, 81тер1отусе8, другие бациллы и тому подобное могут также быть использованы в данном способе.
Там, где желательно, штаммы дрожжевых клеток, известные специалистам в данной области техники, также доступны в качестве клеток-хозяев, а также клетки насекомых, например, Эгохорййа и ЬсрИорЮге. и вирусные системы экспрессии. См., например, МШег е! а1., Оепейс Епдшеетшд, 8:277-298, Р1епит Рте88 (1986) и приведенные там ссылки.
Все общие способы, которыми могут быть конструированы векторы, способы трансфекции, необходимые для получения клеток-хозяев по изобретению, и способы культивирования, необходимые для получения антиген-связывающей конструкции по изобретению из такой клетки-хозяина, могут представлять собой обычные методики. Обычно способ культивирования по настоящему изобретению представляет собой способ культивирования, свободный от сыворотки, обычно культивирование клеток в суспензии, свободной от сыворотки. Аналогично, после получения антиген-связывающих конструкций по изо- 18 023031 бретению они могут быть очищены от содержимого клеточной культуры в соответствии со стандартными способами данной области техники, включая преципитацию с сульфатом аммония, колонки для аффинной хроматографии, хроматографию на колонках, гель-электрофорез и тому подобное. Такие методики входят в объем знаний специалиста в данной области техники и не ограничивают данное изобретение. Например, получение измененных антител описано в \У0 99/58679 и \У0 96/16990.
В еще одном способе экспрессии антиген-связывающих конструкций может быть применена экспрессия в трансгенном животном, такая как описана в патенте США № 4873316. Он относится к системе экспрессии с использованием промотора казеина животного, который делает возможным, при трансгенном введении млекопитающему, образование желаемого рекомбинантного белка в молоке самки.
В другом аспекте изобретения предложен способ получения антитела по изобретению, включающий стадию культивирования клетки-хозяина, трансформированной или трансфицированной вектором, кодирующим легкую и/или тяжелую цепь антитела по изобретению, и выделение полученного таким образом антитела.
Согласно настоящему изобретению предложен способ получения антиген-связывающей конструкции по настоящему изобретению, включающий стадии:
а) предоставления первого вектора, кодирующего тяжелую цепь антиген-связывающей конструкции;
б) предоставления второго вектора, кодирующего легкую цепь антиген-связывающей конструкции;
в) трансформации клетки-хозяина млекопитающего (например, СНО) указанными первым и вторым векторами;
г) культивирования клетки-хозяина по стадии (в) в условиях, приводящих к секреции антигенсвязывающей конструкции из указанной клетки-хозяина в указанную культуральную среду;
д) выделения секретированной антиген-связывающей конструкции по стадии (г).
После ее экспрессии желаемым способом антиген связывающую конструкцию исследуют на предмет активности ίη νίίτο с применением подходящего анализа. В настоящее время для качественной и количественной оценки связывания антиген-связывающей конструкции с ее мишенью используют обычные форматы ЕШЗА-анализа. В дополнение, другие анализы ίη νίίτο могут также быть использованы для верификации эффективности нейтрализации перед последующими клиническими исследованиями у людей, проводимыми для оценки персистенции антиген-связывающей конструкции в организме, кроме обычных механизмов клиренса.
Доза и продолжительность лечения связаны с относительной продолжительностью персистенции молекул по настоящему изобретению в кровообращении у человека, и они могут быть скорректированы специалистом в данной области техники в зависимости от состояния, подлежащего лечению, и общего состояния здоровья пациента. Предполагают, что для достижения максимальной терапевтической эффективности может быть необходимым повторное введение (например, один раз в неделю или один раз в две недели) в течение продолжительного периода времени (например, от четырех до шести месяцев).
Способ введения терапевтического агента по изобретению может представлять собой любой подходящий способ введения, обеспечивающий доставку агента хозяину. Антиген-связывающие конструкции и фармацевтические композиции по изобретению особенно полезны для парентерального введения, то есть подкожно (п/к), интратратекально, внутрибрюшинно, внутримышечно (в/м), внутривенно (в/в) или интраназально.
Терапевтические агенты по изобретению могут быть изготовлены как фармацевтические композиции, содержащие эффективное количество антиген-связывающей конструкции по изобретению в качестве активного ингредиента в фарамацевтически приемлемом носителе. В профилактическом агенте по изобретению предпочтительна водная суспензия или раствор, содержащий антиген-связывающую конструкцию, предпочтительно, забуференный при физиологическом рН, в форме, готовой для инъекции. Композиции для парентерального введения будут обычно содержать раствор антиген-связывающей конструкции по изобретению или их смесь, растворенную в фармацевтически приемлемом носителе, предпочтительно, водном носителе. Может быть использовано множество водных носителей, например, 0,9% физиологический раствор, 0,3% глицин и тому подобное. Эти растворы могут быть изготовлены стерильными и в целом свободными от твердых частиц. Эти растворы могут быть стерилизованы обычными хорошо известными методиками стерилизации (например, фильтрацией). Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, как необходимо для приближения к физиологическим условиям, как например, коррекция рН и буферные агенты, и тому подобное. Концентрация антиген-связывающей конструкции по изобретению в такой фармацевтической композиции может варьировать в широких пределах, то есть от менее чем приблизительно 0,5%, обычно от 1% или от по меньшей мере 1 до 15 или 20 мас.%, и будет выбрана в первую очередь на основании объемов жидкостей, вязкостей и тому подобного в соответствии с конкретным выбранным способом введения.
Таким образом, фармацевтическая композиция по изобретению для внутримышечных инъекций может быть изготовлена так, чтобы содержать 1 мл стерильной забуференной воды и от приблизительно 1 нг до приблизительно 100 мг, например, от приблизительно 50 нг до приблизительно 30 мг, или более предпочтительно от приблизительно 5 до приблизительно 25 мг антиген-связывающей конструкции по
- 19 023031 изобретению. Сходным образом, фармацевтическая композиция по изобретению для внутривенных инфузий может быть изготовлена так, чтобы содержать приблизительно 250 мл стерильного раствора Рингера и от приблизительно 1 до приблизительно 30 и предпочтительно от 5 до приблизительно 25 мг антиген-связывающей конструкции по изобретению на мл раствора Рингера. Существующие способы изготовления композиций для парентерального введения хорошо известны или будут очевидны специалистам в данной области техники, и описаны более подробно, например, в Кетшдфп'к РЬагтасеибса1 δαепсе, 151Н еб., Маск РиЬЬкЫпд Сотрапу, ΕαΠοη, Реппкуката. Для изготовления композиций антигенсвязывающих конструкций по изобретению для внутривенного введения см. Ьактаг и апб Рагктк Ό ΤΙι; Погти1айоп оП ВюрЬагтасеиОса1 ргобиск, РЬагта. δс^.ΤесЬ.ΐοбау, раде 129-137, νοί. 3 (3гб Аргб 2000), ^апд, V 1пк1аЬббу, к1аЬШкабоп апб £огти1абоп оП Ьсцнб рго1ет рЬагтасеибса1к, 1п1. 1. РЬагт 185 (1999) 129-188, §1аЫ1Ьу оП Рго1еш РЬагтасеиОса1к Рай А апб В еб АЬет Τ.Ι, Маптпд М.С., Ν;\υ Уогк, ΝΥ: Р1епит Ргекк (1992), Акегк.М.к Εxс^р^еηΐ-^^ид ЬИегасОопк т Рагеп1ега1 Еο^ти1аΐ^οηк, БРЬагт δα 91 (2002) 2283-2300, 1татига, К е1 а1. ΕΠαΙκ оП 1урек оП кидаг оп к1аЫП/аЬоп оП Рго1ет ш 1Ье бпеб к1а1е, 1 РЬагт δα 92 (2003) 266-274, 1/и1ки, Ккорта, δ. Εxс^р^еηΐ сгук1аЬпЪу апб Ьк рго1ет-к1гис1иге-к1аЫП/тд еПсс1 бигшд Пгее/е-бгутд, 1 РЬагт. РЬагтасо1, 54 (2002) 1033-1039, 1оЬпкоп, К, МаппЪо1-кисгоке т1х1игекуегкаЫе Погти1абопк Пог рго1ет корЬШ/аОоп, 1. РЬагт. δοί, 91 (2002) 914-922, На Ε \Уапд V, \Уапд Υ). Регох1бе Погтабоп ш ро1укогЬа1е 80 апб рго1ет к1аЫН1у, 1. РЬагт δά, 91, 2252-2264,(2002), содержание которых полностью включено сюда посредством ссылки, и на которые особым образом сделана ссылка для читателя.
Предпочтительно, чтобы терапевтический агент по изобретению в фармацевтическом препарате был представлен в стандартных лекарственных формах. Подходящая терапевтически эффективная доза будет легко определена специалистами в данной области техники. Подходящие дозы могут быть вычислены для пациентов в соответствии с их массой тела, например, подходящие дозы могут составлять от 0,01 до 20 мг/кг, например от 0,1 до 20 мг/кг, например 1 до 20 мг/кг, например от 10 до 20 мг/кг, или например от 1 до 15 мг/кг, например от 10 до 15 мг/кг. Для эффективного лечения состояний, используемого в настоящем изобретении у человека, подходящие дозы могут составлять от 0,01 до 1000 мг, например от 0,1 до 1000 мг, например от 0,1 до 500 мг, например 500 мг, например от 0,1 до 100 мг, или от 0,1 до 80 мг, или от 0,1 до 60 мг, или от 0,1 до 40 мг, или, например от 1 до 100 мг, или от 1 до 50 мг антиген-связывающей конструкции по данному изобретению, которые могут быть введены парентерально, например, подкожно, внутривенно или внутримышечно. Такую дозу можно, при необходимости, повторять через подходящие промежутки времени по соответствующему выбору врача.
Антиген-связывающие конструкции, описанные здесь, могут быть лиофилизированы для хранения и восстановлены в подходящем носителе перед применением. Была продемонстрирована эффективность данной методики с обычными иммуноглобулинами, и могут быть применены известные в данной области техники методики лиофилизации и восстановления.
В данной области техники известны несколько способов, которые могут быть применены для поиска эпитоп-связывающих доменов для использования в настоящем изобретении.
Термин библиотека относится к смеси гетерогенных полипептидов или нуклеиновых кислот. Библиотека состоит из членов, каждый из которых имеет одну полипептидную последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты. В этой степени библиотека является синонимом репертуара. Различия последовательностей между членами библиотеки обеспечивают разнообразие, присутствующее в библиотеке. Библиотека может иметь форму простой смеси полипептидов или нуклеиновых кислот или может быть представлена в форме организмов или клеток, например, бактерий, вирусов, животных или растительных клеток и тому подобного, трансформированных библиотекой нуклеиновых кислот. В одном воплощении каждый отдельный организм или клетка содержит только один или ограниченное число членов библиотеки. Предпочтительно, нуклеиновые кислоты включены в векторы экспрессии, чтобы сделать возможной экспрессию полипептидов, кодируемых нуклеиновыми кислотами. Таким образом, в одном аспекте библиотека может иметь форму популяции организмов-хозяев, каждый из которых содержит одну или более чем одну копию вектора экспрессии, содержащего один член библиотеки в форме нуклеиновой кислоты, которая может быть экспрессирована с образованием соответствующего ей полипептидного члена. Таким образом, популяция организмов-хозяев может кодировать широкий репертуар различных полипептидов.
Универсальная каркасная область представляет собой последовательность отдельной каркасной области антитела, соответствующую областям антитела, имеющим консервативную последовательность, как определено КаЬа1 ('Бециепсек оП Рго1етк оП 1ттипо1одюа1 1п1егек1, υδ ОераПтеШ оП НеаЬЬ апб Нитап δεΜαε^ или соответствующую репертуару человеческих иммуноглобулинов зародышевого типа или структуре, как определено СЬобна апб Ьекк, (1987) 1. Мо1. Вю1. 196:910-917. Каркасная область может быть одна, или возможно наличие набора таких каркасных областей, что, как было обнаружено, делает возможным получение практически любой специфичности связывания посредством изменения только гипервариабельных областей.
В одном воплощении выравнивания аминокислотных и нуклеотидных последовательностей осуществляют и гомологию, сходство или идентичность, как определено здесь, определяют с применением
- 20 023031 алгоритма ΒΕΑδΤ 2 δοςυοηοοδ, с использованием параметров по умолчанию (ΤαΙιίδονα Τ. А. с1 а1., ΡΕΜδ МюгоЬю1 Ьей, 174:187-188 (1999).
Каждый эпитоп-связывающий домен и антиген-связывающий сайт может иметь специфичность связывания в отношении лиганда общего типа или любого желаемого лиганда-мишени, такого как белки человека или животных, включая цитокины, рецепторы цитокинов, рецепторы факторов роста, ферменты (например, протеазы), кофакторы ферментов, ДНК-связывающие белки, липиды и углеводы. Подходящие мишени, включая цитокины, факторы роста, рецепторы цитокинов, рецепторы факторов роста и другие белки, включают, без ограничения: аполипопротеин Е (АроЕ), аполипопротеин δΑΑ (Аро^АА), нейротрофический фактор головного мозга (ΒΌΝΡ), кардиотрофин-1, раковоэмбриональный антиген (СЕА), СЭ40, лиганд СЭ40, СЭ56, СЭ38, СЭ138, эпидермальный фактор роста (ЕОР), рецептор ЕОР, ΕNΑ-78, эотаксин, эотаксин-2, Ехойи8-2, ЕроК, ΡΑΡα, кислый фактор роста фибробластов (РОР), основной РОР, фактор роста фибробластов-10, лиганд ΡΕΤ3, фракталкин (СХ3С), глиальный нейротрофический фактор (ОЭОТ1), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (О-СδΡ), гранулоцитарномоноцитарный колониестимулирующий фактор (ОМ-СδΡ), ОР-В1, человеческий сывороточный альбумин, инсулин, интерферон-γ (ΙΡΝ-γ), инсулиноподобный фактор роста-1 (ЮР-Ι), инсулиноподобный фактор роста-2 (ЮР-ΙΙ), интерлейкин-Ю (ΙΕ-1α), ΙΕ-1 β, Ю-2, Ю-3, Ю-4, Ю-5, Ю-6, Ю-7, Ю-8 (72 аминокислоты (а/к)), Ю-8 (77 а/к), Ю-9, Ю-10, Ю-11, Ю-12, Ю-13, Ю-15, Ю-16, Ю-17, Ш-18 (ΙΡΝ-γ-индуцирующий фактор (ЮГР)), ингибин α, ингибин 6, ΙΡ-10, фактор роста кератиноцитов-2 (КОР-2), КОР, лептин, лейкемический ингибиторный фактор (ЫР), лимфотактин, мюллерову ингибирующую субстанцию, фактор, ингибирующий колонии моноцитов, моноцитарный аттрактантный белок, моноцитарный колониестимулирующий фактор (М-СδΡ), с-Гиъ, у-ГпъМЭС’ (67 а/к), МЭС (69 а/к), моноцитарный хемотаксический белок-1 (МСР-1) (моноцитарный хемотаксический и активирующий фактор (МСАР)), МСР-2, МСР-3, МСР-4, МЭС (67 а/к), МЭС (69 а/к), МЮ, макрофагальный воспалительный белок-Ю (ΜΙΡ-1α), ΜΙΡ-1β, ΜΙΡ-3α, МЮ-3в, МЮ-4, фактор, ингибирующий миелоидных предшественников, 1 типа (МРЮЛ), нейтрофил-активирующий белок-2 (NΑΡ-2), неуртурин, фактор роста нервов, фактор роста нервов-β (βNОΡ), нейротрофин-3 (ΝΤ-3), ΝΤ-4, онкостатин М, тромбоцитарный фактор роста АА (ТВСР-АА), Ρ^ОΡ-ΑΒ, Ρ^ОΡ-ΒΒ, тромбоцитарный фактор-4 ^Р-Т), КΑNΤΕδ, фактор стромальных клеток-Ю (δΌΡ1α), δΌΡ1β, фактор стволовых клеток ^СР), фактор роста стволовых клеток ^СОР), фактор стволовых клеток ^СР), тимус-ассоциированные регуляторные хемокины (ΤΑКС), трансформирующий фактор роста-α (ТСР-α), ТСР-β, ТСР^, ΤОΡ-β3, фактор некроза опухоли (ΤΝΡ), ΤΝΡ-α, ΤΝΡ-β, рецептор ΤΝΡ Ι типа, рецептор ΤΝΡ ΙΙ типа, ΤΝΙΕ-1, ТРО, сосудистый эндотелиальный фактор роста (УЕОР), УЕОР А, УеОр В, УЕОР С, УЕОР Ό, рецептор УЕОР 1 типа, рецептор УЕОР 2 типа, рецептор УЕОР 3 типа, гранулоцитарный хемотаксический белок-2 (ОСΡ-2), ОКΟ/ΜОδΑ, ОК0-В, ОК0-У, НСС1, 1-309, рецептор человеческого эпидермального фактора роста-1 (НЕК 1), НЕК 2, НЕК 3 и НЕК 4, сывороточный альбумин, фактор фон Виллебранда (ννΡ), амилоидные белки (например, альфа-амилоид), матриксную металлопротеиназу-12 (ММР12), фосфолипид-зависимую киназу-1 (ΡΌΚ1), Ι§Ε, и другие мишени, раскрытые здесь. Следует понимать, что этот список никоим образом не является исчерпывающим.
В некоторых воплощениях связывание представляет собой связывание мишени в легочной ткани, такой как мишень, выбранная из группы, состоящей из рецептора ΤΝΡ 1 типа (ШРК!), ΙΕ-1, рецептора ΙΕ-1 (Ю-1К), ГО-4, ГО-4К, ГО-5, ГО-6, ГО-6К, ГО-8, ГО-8К, ГО-9, ГО-9К, ГО-10, ГО-12 ГО-12К, ГО-13, ГО-13Ка1, ГО-П^, Ш-15, ГО-15К, ГО-16, ГО-17К, ГО-17, ГО-18, ГО-18К, ГО-23 ГО-23К, ГО-25, СЭ2, СЭ4, СЭ11а, СЭ23, СЭ25, СЭ27, СЭ28, СЭ30, СЭ40, лиганда СЭ40 (СЭ40Ь), СЭ56, СЭ138, АЬК5, ЕОРК, РсЕК1, ΤОΡЬ, ССЬ2, ССЬ18, СЕА, СК8, фактора роста соединительной ткани (СТСР), СХСЬ12 (δΌΡ-1), химазы, РОР, фурина, эндотелина-1, эотаксинов (например, эотаксина, эотаксина-2, эотаксина-3), ОΜ-СδΡ, молекулы межклеточной адгезии 1 типа (ЮАМ-1), ΚΌδ, Ι§Ε, ΙΡΝα, Ι-309, интегринов, Ь-селектина, МГО, МГО4, МЭС, МСР-1, ММР, нейтрофильной эластазы, остеопонтина, ОХ-40, ΡЛКС, ΡΌ-1, КΑNΤΕδ, δСΡ, δΌΡ-1, δί§^ 8, ΤΑКС, ΤОΡЬ, тромбина, Τίιη-1, ΤΝΡ, ΤКΑNСΕ, триптазы, УЕОР, альфа4бета1 (УЪА-4), сосудистой молекулы адгезии (УСАМ), α4β7, ССК2, ССК3, ССК4, ССК5, ССК7, ССК8, альфаνбета6, альфаνбета8, сМЕГО СЭ8, ν\νΡ, амилоидных белков (например, альфа-амилоида), ММР12, ΡΌΚ1 и Ι§Ε.
При использовании дисплейной системы (например, дисплейной системы, в которой связаны кодирующая функция нуклеиновой кислоты и функциональные свойства пептида или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой) в способах, описанных здесь, например, в селекции ЙАЬ или другого эпитоп-связывающего домена, часто может быть полезно амплифицировать или увеличивать число копий нуклеиновых кислот, кодирующих селетируемые пептиды или полипептиды. Это обеспечивает эффективный способ получения достаточных количеств нуклеиновых кислот и/или пептидов или полипептидов для дополнительных раундов селекции с применением способов, описанных здесь, или других подходящих способов или для получения дополнительных репертуаров (например, репертуаров созревания аффинности). Таким образом, в некоторых воплощениях способы селекции эпитоп-связывающих доменов включают применение дисплейной системы (например, в которой связаны кодирующая функция нуклеиновой кислоты и функциональные свойства пептида или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, такой как фаговый дисплей) и дополнительно включают амплификацию или увеличение числа
- 21 023031 копий нуклеиновой кислоты, кодирующей селетируемый пептид или полипептид. Нуклеиновые кислоты можно амплифицировать с применением любых подходящих способов, таких как фаговая амплификация, клеточный рост или полимеразная цепная реакция.
В одном примере в способах использована дисплейная система, в которой связаны кодирующая функция нуклеиновой кислоты и физические, химические и/или функциональные свойства полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой. Такая дисплейная система может включать множество реплицируемых генетических компонентов, таких как бактериофаги или клетки (бактерии). Дисплейная система может включать библиотеку, такую как бактериофаговая дисплейная библиотека. Примером дисплейной системы является бактериофаговый дисплей.
Были описаны несколько подходящих бактериофаговых дисплейных систем (например, моновалентные дисплейные системы и мультивалентные дисплейные системы). (См., например, СпййЬз е! а1., патент США № 6555313 В1 (включенный сюда посредством ссылки); 1оЬи8ои е! а1., патент США № 5733743 (включенный сюда посредством ссылки); МсСайейу е! а1, патент США № 5969108 (включенный сюда посредством ссылки); МиШдап-КеЬое, патент США № 5702892 (включенный сюда посредством ссылки); ХУиНег. С. е! а1.,Аппи. Кеу. Iттиηо1. 72:433-455 (1994); δοит^11^οп. Р. е! а1, Арр1. ВюсЬет. Βίο!есЬпо1. 47(2-3): 175-189 (1994); СахЮдпоЬ. Ь. е! а1., СотЬ. СЬет. ШдЬ ТЬгоидЬри! Зсгееп, 4(2):121-133 (2001).) Пептиды или полипептиды, представленные в бактериофаговой дисплейной системе, могут быть представлены на любом подходящем бактериофаге, таком как, например, нитчатый фаг (например, £б, М13, Р1), литический фаг (например, Т4, Т7, лямбда) или РНК-фаг (например, Μδ2).
В большинстве случаев получают или предоставляют библиотеку фагов, на которой представлен репертуар пептидов или фаговых полипептидов в виде слитых белков с подходящим белком оболочки фага (например, белком ρΙΙΙ £б). В слитом белке пептиды или полипептиды могут быть представлены на верхушке белка оболочки фага или, если желательно, во внутреннем положении. Например, представленный пептид или полипептид может присутствовать в положении, расположенном ближе к Уконцу по отношению к домену 1 ρΙΙΙ. (Домен 1 ρΙΙΙ также называют N1.) Представленный полипептид может быть непосредственно слит с ρΙΙΙ (например, ^концом домена 1 ρΙΙΙ) или слит с ρΙΙΙ с использованием линкера. Если желательно, слитый белок может также включать метку (например, тус-эпитоп, Ηίδ-метку). Библиотеки, содержащие репертуар пептидов или полипептидов, представленных в виде слитых белков с белком оболочки фага, могут быть получены любыми подходящими способами, как например введением библиотеки фаговых векторов или фагмидных векторов, кодирующих представленные пептиды или полипептиды, в подходящие бактерии-хозяева и культивированием полученных бактерий с получением фагов (например, с использованием подходящего хелперного фага или комплементарной плазмиды, если желательно). Библиотека фагов может быть выделена из культуры с применением любого подходящего способа, такого как преципитация и центрифугирование.
Дисплейная система может включать репертуар полипептидов, включающий любую желаемую степень разнообразия. Например, репертуар может включать пептиды или полипептиды, имеющие аминокислотные последовательности, соответствующие встречающимся в природе полипептидам, экспрессируемым организмом, группой организмов (например, репертуар последовательностей УНН бАЬ, выделенных от представителя семейства Верблюдовых), желаемым типом тканей или желаемым типом клеток, или может включать пептиды или полипептиды, имеющие случайные или рандомизированные аминокислотные последовательности. Если желательно, пептиды могут иметь общую сердцевину или каркас. Например, все полипептиды в таком репертуаре или библиотеке могут содержать определенные области случайной или рандомизированной аминокислотной последовательности и области общей аминокислотной последовательности. В определенных воплощениях все или по существу все полипептиды в репертуаре представляют собой полипептиды желаемого типа, такого как желаемый фермент (например, полимераза) или желаемый антиген-связывающий фрагмент антитела (например, человеческий УН или человеческий Уь). В некоторых воплощениях полипептидная дисплейная система включает репертуар полипептидов, где каждый полипептид содержит вариабельный домен антитела. Например, каждый полипептид в репертуаре может содержать УН, Уъ или РУ (например, одноцепочечный Ру).
Разнообразие аминокислотной последовательности может быть введено в любую желаемую область пептида или полипептида, или каркаса, с применением любого желаемого способа. Например, разнообразие аминокислотной последовательности может быть введено в целевую область, такую как область, определяющая комплементарность, вариабельного домена антитела или гидрофобный домен, получением библиотеки нуклеиновых кислот, кодирующих диверсифицированные полипептиды, с применением любых подходящих способов мутагенеза (например, ПЦР со сниженной точностью (1оте йбе1Ьу РСК), олигонуклеотид-опосредованного или сайт-направленного мутагенеза, диверсификации с применением NNК-кодонов) или любого другого подходящего способа. Если желательно, область полипептида, подлежащая диверсификации, может быть рандомизирована. Размер полипептидов, составляющих репертуар, в значительной степени является предметом свободного выбора, и в одинаковом размере полипептидов нет необходимости. Полипептиды в репертуаре могут иметь по меньшей мере третичную структуру (образовывать по меньшей мере один домен).
- 22 023031
Селекция/выделение/получение
Эпитоп-связывающий домен или популяция доменов может быть селектированы, выделены и/или получены из репертуара или библиотеки (например, в дисплейной системе) с применением любого подходящего способа. Например, домен селектируют или выделяют на основании селектируемого свойства (например, физического свойства, химического свойства, функционального свойства). Подходящие селектируемые функциональные свойства включают биологические активности пептидов или полипептидов репертуара, например, связывание лиганда общего типа (например, суперантигена), связывание лиганда-мишени (например, антигена, эпитопа, субстрата), связывание с антителом (например, через эпитоп, экспрессированный на пептиде или полипептиде) и каталитическую активность. (См., например, ТотПпюп е! а1., УО 99/20749; УО 01/57065; УО 99/58655).
В некоторых воплощениях устойчивый к протеазам пептид или полипептид селектируют и/или выделяют из библиотеки или репертуара пептидов или полипептидов, в котором по существу все домены имеют общее селектируемое свойство. Например, домен может быть селектирован из библиотеки или репертуара, в котором по существу все домены связывают общий лиганд общего типа, связывают общий лиганд-мишень, связывают общее антитело (или их связывает общее антитело) или обладают общей каталитической активностью. Этот тип селекции особенно применим для получения репертуара доменов, основанных на исходном пептиде или полипептиде, имеющем желаемую биологическую активность, например, при проведении созревания аффинности отдельного вариабельного домена иммуноглобулина. Селекция на основании связывания общего лиганда общего типа может привести к образованию совокупности или множества доменов, включающего все или по существу все домены, которые являлись компонентами исходной библиотеки или репертуара. Например, домены, связывающие лиганд-мишень или лиганд общего типа, такой как белок А, белок Ь или антитело, могут быть селектированы, выделены и/или получены паннингом или с использованием подходящей аффинной матрицы. Паннинг может быть осуществлен добавлением раствора лиганда (например, лиганда общего типа, лиганда-мишени) в подходящий сосуд (например, пробирку, чашку Петри) и обеспечением возможности осаждения лиганда на стенки сосуда или их покрытия лигандом. Избыток лиганда можно отмыть и в сосуд можно добавить домены, и сосуд можно содержать в условиях, подходящих для связывания пептидов или полипептидов и иммобилизованного лиганда. Несвязанные домены можно отмыть, а связанные домены могут быть выделены с применением любого подходящего способа, такого как, например, соскабливание или снижение рН.
Подходящие аффинные матрицы для лигандов в большинстве случаев включают твердую подложку или гранулу (например, агарозу), к которой ковалентно или нековалентно присоединен лиганд. Аффинную матрицу можно комбинировать с пептидами или полипептидами (например, репертуаром, инкубированным с протеазой) с применением серийного способа, способа с применением колонок или любого другого подходящего способа в условиях, подходящих для связывания доменов с лигандом на матрице. Домены, не связанные с аффинной матрицей, можно отмыть, а связанные домены можно элюировать и выделить с применением любого подходящего способа, такого как элюирование буфером с меньшим рН, мягким денатурирующим агентом (например, мочевиной) или пептидом или доменом, конкурирующим за связывание лиганда. В одном примере биотинилированный лиганд-мишень комбинируют с репертуаром в условиях, подходящих для связывания доменов репертуара с лигандом-мишенью. Связанные домены выделяют с применением иммобилизованного авидина или стрептавидина (например, на грануле).
В некоторых воплощениях лиганд общего типа представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Антитела или антиген-связывающие фрагменты, связывающие структурные элементы пептидов или полипептидов, по существу консервативные в пептидах или полипептидах библиотеки или репертуара, особенно применимы в качестве лигандов общего типа. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, подходящие для применения в качестве лигандов для выделения, селекции и/или получения устойчивых к протеазам пептидов или полипептидов, могут быть моноклональными или поликлональными и могут быть получены с применением любого подходящего способа.
Библиотеки/репертуары
Библиотеки, кодирующие и/или включающие устойчивые к протеазам эпитоп-связывающие домены, могут быть образованы или получены с применением любого подходящего способа. Библиотека может быть разработана, чтобы кодировать домены, основанные на интересующем домене или каркасе (например, домене, селектированном из библиотеки), или может быть селектирована из другой библиотеки с применением способов, описанных здесь. Например, библиотека, обогащенная доменами, может быть получена с применением подходящей полипептидной дисплейной системы.
Библиотеки, кодирующие репертуар желаемого типа доменов, могут быть легко получены с применением любого подходящего способа. Например, может быть получена последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая желаемый тип полипептида (например, вариабельный домен иммуноглобулина), и может быть получена совокупность нуклеиновых кислот, каждая из которых содержит одну или более чем одну мутацию, например, амплификацией нуклеиновой кислоты с применением системы полимеразной цепной реакции (ПЦР) пониженной точности, химическим мутагенезом (Иеп§ е! а1., 1. ΒίοΙ. СЬет.,
- 23 023031
269:9533 (1994)) или с использованием бактериальных мутаторных штаммов (Ьоте с! а1., 1. ΜοΙ.ΒΐοΙ., 260:359 (1996)).
В других воплощениях диверсификация может быть направлена на определенные области нуклеиновой кислоты. Способы мутации выбранных положений также хорошо известны в данной области техники и включают, например, применение некомплементарных олигонуклеотидов или вырожденных олигонуклеотидов, с или без применения ПЦР. Например, библиотеки синтетических антител были получены направлением мутаций в антиген-связывающие петли. Случайные или полуслучайные области антител Н3 и Ь3 были присоединены к сегментам генов вариабельных областей (У-генов) иммуноглобулинов зародышевого типа с образованием больших библиотек с немутированными каркасными областями (НоодспЬоот аиб ХУиНсг (1992) хирга; Νίχχίιη с! а1. (1994) хирга; СпГГпНх с! а1. (1994) хирга; ЭсКпиГ с! а1. (1995) хирга). Такая диверсификация была расширена для включения некоторых или всех других антиген-связывающих петель (Сгатсп с! а1. (1996) №1игс Мсб., 2:100; КтссЬтаии с! а1. (1995) Вю/ТссЬпо1оду, 13:475; МогрБохух, \УО 97/08320, хирга). В других воплощениях диверсификация может быть направлена на определенные области нуклеиновой кислоты посредством, например, двухстадийной ПЦР-стратегии с использованием продукта первой ПЦР в качестве мегапраймера (тсда-рптсг). (См., например, Ьапб!, О. с! а1, Ссис 96:125-128 (1990).) Направленная диверсификация может также быть осуществлена, например, посредством ПЦР с перекрывающейся элонгацией (8ОЕ РСК). (См., например, НоПоп, К.М. с! а1., Ссис 77:61-68 (1989).)
Разнообразие последовательностей в выбранных положениях может быть достигнуто изменением кодирующей последовательности, задающей последовательность полипептида, таким образом, что в данное положение могут быть введены несколько возможных аминокислот (например, все 20 или их подгруппа). По номенклатуре Международного союза теоретической и прикладной химии (1п!сгпабопа1 Итои оГ Ригс апб АррПсб СБст1х!гу (ШРАС)) наиболее универсальным кодоном является ΝΝΚ, кодирующий все аминокислоты, а также стоп-кодон ТАС. Кодон ΝΝΚ может быть использован для введения необходимого разнообразия. Также применимы другие кодоны, позволяющие добиться таких же результатов, включая кодон ΝΝΝ, приводящий к образованию дополнительных стоп-кодонов ТСА и ТАА. Такой целевой способ позволяет обследовать все пространство последовательности в целевой области.
Некоторые библиотеки включают домены, являющиеся членами суперсемейства иммуноглобулинов (например, антитела и их части). Например, библиотеки могут включать домены, имеющие известную конформацию главной цепи (См., например, ТотПпхоп с! а1., \УО 99/20749.) Библиотеки могут быть получены в подходящей плазмиде или векторе. При использовании здесь вектор относится к дискретному элементу, используемому для введения в клетки гетерологичной ДНК для ее экспрессии и/или репликации. Можно использовать любой подходящий вектор, включая плазмиды (например, бактериальные плазмиды), вирусные или бактериофаговые векторы, искусственные хромосомы и эписомные векторы. Такие векторы можно использовать для простого клонирования и мутагенеза, или вектор экспрессии можно использовать для управления экспрессией библиотеки. Векторы и плазмиды обычно содержат один или более чем один сайт клонирования (например, полилинкер), репликатор и по меньшей мере один селектируемый маркерный ген. Векторы экспрессии могут дополнительно содержать элементы управления транскрипцией и трансляцией полипептида, такие как энхансерный элемент, промотор, сигнал терминации транскрипции, сигнальные последовательности и тому подобное. Зги элементы могут быть расположены таким образом, что они функционально связаны с клонируемой вставкой, кодирующей полипептид, таким образом, что экспрессия и образование полипептида происходит при содержании такого вектора экспрессии в условиях, подходящих для экспрессии (например, в подходящей клеткехозяине).
Клонирующие векторы и векторы экспрессии в большинстве случаев содержат последовательности нуклеиновых кислот, которые делают возможной репликацию вектора в одной или более чем одной выбранной клетке-хозяине. Обычно в клонирующих векторах эта последовательность представляет собой последовательность, которая делает возможной независимую от хромосомной ДНК хозяина репликацию вектора, и включает репликаторы или автономно реплицируемые последовательности. Такие последовательности хорошо известны для множества бактерий, дрожжей и вирусов. Репликатор плазмиды рВК322 является подходящим для большинства грамотрицательных бактерий, 2 мкм плазмидный репликатор является подходящим для дрожжей, и репликаторы различных вирусов (например, вируса обезьян 40 (8У40), аденовируса) являются подходящими для клонирующих векторов в клетках млекопитающих. В большинстве случаев репликатор не является необходимым для векторов экспрессии млекопитающих, если их не используют в клетках млекопитающих, способных реплицировать большие количества ДНК, таких как клетки СО 8.
Клонирующие векторы или векторы экспрессии могут содержать селектируемый ген, также называемый селектируемым маркером. Такие маркерные гены кодируют белок, необходимый для выживания или роста трансформированных клеток-хозяев, выращиваемых на селективной культуральной среде. Клетки-хозяева, не трансформированные вектором, содержащим селектируемый ген, следовательно, не будут выживать на культуральной среде. Типичные селектируемые гены кодируют белки, придающие устойчивость к антибиотикам и другим токсинам, например, ампициллину, неомицину, метотрексату
- 24 023031 или тетрациклину, возмещающие ауксотрофные недостаточности или обеспечивающие жизненно необходимые питательные вещества, не доступные в питательных средах.
Подходящие векторы экспрессии могут содержать несколько компонентов, например, репликатор, селектируемый маркерный ген, один или более чем один элемент контроля экспрессии, такой как элемент контроля транскрипции (например, промотор, энхансер, терминатор), и/или один или более чем один трансляционный сигнал, сигнальную последовательность или лидерную последовательность, и тому подобное. Элементы контроля экспрессии и сигнальная или лидерная последовательность, если они присутствуют, могут быть предоставлены вектором или другим источником. Например, для управления экспрессией могут быть использованы последовательности контроля транскрипции и/или трансляции клонированной нуклеиновой кислоты, кодирующей цепь антитела.
Для экспрессии в желаемой клетке-хозяине может быть предоставлен промотор. Промоторы могут быть конститутивными или индуцибельными. Например, промотор может быть функционально связан с нуклеиновой кислотой, кодирующей антитело, цепь антитела или его часть, таким образом, что он управляет транскрипцией нуклеиновой кислоты. Доступны множество подходящих промоторов для прокариотических (например, промоторные системы |3-лактамазы и лактозы, промоторная система щелочной фосфатазы, триптофановая (1гр) промоторная система, промоторы 1ас, 1ас, Т3, Т7 для Е. сой) и эукариотических (например, ранний или поздний промотор вируса обезьян 40, промотор длинных терминальных повторов вируса саркомы Рауса, цитомегаловирусный промотор, поздний аденовирусный промотор, промотор ЕО-1а) хозяев.
В дополнение, векторы экспрессии обычно содержат селектируемый маркер для селекции клетокхозяев, несущих вектор, и, в случае реплицируемого вектора экспрессии, репликатор. Гены, кодирующие продукты, придающие устойчивость к антибиотикам или лекарственным средствам, являются распространенными селектируемыми маркерами и могут быть использованы в прокариотических (например, ген β-лактамазы (устойчивость к ампициллину), ген Те! устойчивости к тетрациклину) и эукариотических клетках (например, гены устойчивости к неомицину (О418 или генетицину), др! (микофеноловой кислоте), ампициллину или гигромицину). Маркерные гены дигидрофолатредуктазы делают возможной селекцию с использованием метотрексата у множества хозяев. Гены, кодирующие генный продукт ауксотрофных маркеров хозяина (например, ЬЕи2, ИКА3, Н183) часто используют в качестве селектируемых маркеров у дрожжей. Также предполагают применение вирусных (например, бакуловирусных) или фаговых векторов, и векторов, способных к интеграции в геном клетки-хозяина, таких как ретровирусные векторы.
Подходящие векторы экспрессии для экспрессии в прокариотических клетках (например, бактериальных клетках, таких как Е. сой) или клетках млекопитающих включают, например, вектор рЕТ (например, рЕТ-12а, рЕТ-36, рЕТ-37, рЕТ-39, рЕТ-40, Шуадеп и другие), фаговый вектор (например, рСАЭТАВ 5 Е, Рйагтаиа), рК1Т2Т (вектор, слитый с белком А (Рго1е1п А Гикюп уес(ог), Рйагтааа), рСЭМ8, рСБВД1.1/атр, рс^NА3.1, рКс/К8У, рЕР-1 Дпуйгодеп, Саг1кЬаб, СА), рСМУ-8СК1РТ, рРВ, р8О5, рХТ1 (81га1адепе, Ьа Ло11а, СА), рСЭЕР3 (Оо1бтап, Ь.А., е! а1, ВюГесйпищек, 27:1013-1015 (1996)), р8У8Р0КТ (О1ЬсоВКЬ, КоскуШе, ΜΌ), рЕР-Вок (М|/икй1та, 8., е! а1, №с1ек Лабк Кек., 78:5322 (1990)) и тому подобное. Доступны векторы экспрессии, подходящие для применения в различных хозяевах для экспрессии, таких как прокариотические клетки (Е. сой), клетки насекомых (клетки 8сйтебег 82 Эгокорййа, 8Г9), клетки дрожжей (Р. теШапойса, Р. ракЮпк, 8. сегеуыае) и клетки млекопитающих (например, клетки С08).
Некоторые примеры векторов представляют собой векторы экспрессии, делающие возможной экспрессию нуклеотидной последовательности, соответствующей члену библиотеки полипептидов. Таким образом, селекция лигандами общего типа и/или лигандами-мишенями может быть проведена раздельным размножением и экспрессией отдельного клона, экспрессирующего член библиотеки полипептидов. Как описано выше, заслуживающей особого внимания дисплейной системой для селекции является бактериофаговый дисплей. Таким образом, можно использовать фаговые или фагмидные векторы, например, векторы могут представлять собой фагмидные векторы, имеющие репликатор Е. сой (для двуцепочечной репликации) и также фаговый репликатор (для образования одноцепочечной ДНК). Манипуляция такими векторами и их экспрессия хорошо известны в данной области техники (НоодепЬоот апб \УШ1ег (1992) кирга; №кыт е! а1. (1994) кирга). Кратко, вектор может содержать ген β-лактамазы для придания фагмиде селективности и промотор 1ас ближе к 5'-концу от экспрессионной кассеты, которая может содержать подходящую лидерную последовательность, множественный сайт клонирования, одну или более чем одну пептидную метку, один или более чем один стоп-кодон ТАО и фаговый белок рШ. Таким образом, с использованием различных супрессорных и несупрессорных штаммов Е. сой и с добавлением глюкозы, изопропилтио-в-Э-галактозида (1РТО) или хелперного фага, такого как УС8 М13, вектор способен проходить репликацию, как плазмида, без экспрессии, вырабатывать большие количества члена библиотеки полипептидов самого по себе или образуемых фагов, некоторые из которых содержат на своей поверхности по меньшей мере одну копию слитого белка полипептид-р111.
Вариабельные домены антител могут содержать сайт связывания лиганда-мишени и/или сайт свя- 25 023031 зывания лиганда общего типа. В определенных воплощениях сайт связывания лиганда общего типа представляет собой сайт связывания суперантигена, такого как белок А. белок Ь или белок С. Вариабельные домены могут быть основаны на любом желаемом вариабельном домене. например. человеческом УН (например. УН1а. УН1Ь. УН2. УНЗ. УН4. УН5. Ун6), человеческом УХ (например. УХ1. УХ11, УХ111. УХ1У. УХУ. УХУ1 ИЛИ Ук1) или человеческом Ук (например. Ук2. УКЗ. УК4. УК5. Ук6, УК7. УК8. УК9 или Ук10).
Еще одна категория методик включает селекцию репертуаров в искусственных компартментах. что делает возможной связь гена с его генным продуктом. Например, селекционная система. в которой нуклеиновые кислоты. кодирующие желаемые генные продукты. могут быть селектированы в микрокапсулах. сформированных эмульсиями типа вода в масле. описана в \УО 99/02671, \УО 00/40712 и Та\\'Пк & СпГГлкк (1998) №Лиге Вю1ескпо1 16(7). 652-6. Генетические элементы. кодирующие генный продукт. имеющий желаемую активность. компартментализуют в микрокапсулах и затем транскрибируют и/или транслируют для образования их соответствующих генных продуктов (РНК или белка) в микрокапсулах. Затем сортируют генетические элементы. вырабатывающие генный продукт. имеющий желаемую активность. В таком способе селектируют интересующие генные продукты выявлением желаемой активности множеством способов.
Описание эпитоп-связывающих доменов
Связывание домена с его специфичным антигеном или эпитопом можно исследовать способами. которые будут знакомы специалистам в данной области техники и включают ЕЬРЗА. В одном примере связывание исследуют с применением моноклонального фагового ЕЬТЗА.
Фаговый ЕЬТЗА может быть проведен в соответствии с любым подходящим способом. типичный протокол изложен ниже.
Популяции фага. полученные на каждом раунде селекции. могут быть подвергнуты скринингу на предмет связывания с выбранным антигеном или эпитопом посредством ЕЬТЗА для идентификации поликлональных фаговых антител. Фаг из отдельных инфицированных бактериальных колоний из этих популяций может затем быть подвергнут скринингу посредством ЕЬТЗА для идентификации моноклональных фаговых антител. Также желательно провести скрининг растворимых фрагментов антител на связывание с антигеном или эпитопом. и это также может быть проведено посредством ЕЬТЗА с использованием реагентов. например. против С- или Ν-концевой метки (см.. например. \УиИег е! а1. (1994) Апп. Кеу. 1ттипо1оду 12. 4ЗЗ-55 и ссылки. приведенные там).
Разнообразие селектируемых фаговых моноклональных антител может также быть оценено гельэлектрофорезом продуктов ПЦР (Маткк е! а1. 1991. кирта; Νίκκίιη е! а1. 1994 кирта). зондированием (ТотИпкоп е! а1.. (1992) I. Мо1. Вю1. 227. 776) или секвенированием векторной ДНК.
Д. Структура ЙАЬ
В случае. если ЙАЬ выбраны из репертуаров У-генов. селектируемых. например. с применением технологии фагового дисплея. как описано здесь. эти вариабельные домены содержат универсальную каркасную область. таким образом. что они могут быть распознаны определенным лигандом общего типа. как определено здесь. Применение универсальных каркасных областей. лигандов общего типа и тому подобного описано в \УО 99/20749.
Там где используют репертуары У-генов. разнообразие полипептидной последовательности может быть локализовано в структурных петлях вариабельных доменов. Полипептидные последовательности каждого домена могут быть изменены перетасовкой ДНК или мутацией с целью усиления взаимодействия каждого вариабельного домена с его комплементарной парой. ДНК-перетасовки известны в данной области техники и о них сообщают. например. 5>1еттег. 1994. №Лиге З70: З89-З91 и патент США № 629705З, оба из которых включены сюда посредством ссылки. Другие способы мутагенеза хорошо известны специалистам в данной области техники.
Е. Каркасы для использования в конструировании ЙАЬ
1. Выбор конформации главной цепи
Все члены суперсемейства иммуноглобулинов имеют сходную конформацию их полипептидной цепи. Например. несмотря на то. что антитела сильно отличаются в отношении их первичной последовательности. сравнением последовательностей и кристаллографических структур было выявлено. что. вопреки ожиданиям. пять из шести антиген-связывающих петель антител (Н1. Н2. Ь1. Ь2. ЬЗ) принимают ограниченное число конформации главной цепи или канонических структур (СНоЙиа и Ьекк (1987) ί. Мо1. Вю1. 196: 901; СкоШа е! а1. (1989) №Лиге. З42: 877). Анализ длин петель и ключевых остатков сделал. таким образом. возможным предсказание конформации главной цепи Н1. Н2. Ь1. Ь2 и ЬЗ. обнаруженных в большинстве человеческих антител (СкоШа е! а1. (1992) ί. Мо1. Вю1. 227: 799; ТотИпкоп е! а1. (1995) ЕМВО I.. 14: 4628; ХУПНатк е! а1. (1996) I. Мо1. Вю1. 264: 220). Несмотря на то. что область НЗ намного более разнообразна в отношении последовательности. длины и структуры (ввиду использования Ό-сегментов). она также образует ограниченное число конформаций главной цепи для коротких длин петель. которые зависят от длины и присутствия определенных остатков или типов остатка в ключевых положениях в петле и каркасной области антитела (Матйп е! а1. (1996) ί. Мо1. Вю1. 26З: 800; δ1ιίπ·ιί е! а1.
- 26 023031 (1996) ΡΕΒδ Ьсйсгк, 399: 1).
άΑЬ преимущественно образованы из библиотек доменов, таких как библиотеки доменов νΗ и/или библиотеки доменов Уь. В одном аспекте разработаны библиотеки доменов, в которых длины определенных петель и ключевые остатки были выбраны для обеспечения известной конформаций главной цепи их членов. Преимущественно, они представляют собой реально существующие конформаций молекул суперсемейства иммуноглобулинов, обнаруженные в природе, для сведения к минимуму шансов, что они нефункциональны, как обсуждено выше. Сегменты ν-генов зародышевого типа служат в качестве одной подходящей основной каркасной области для конструирования библиотек антител или Т-клеточных рецепторов; также применимы другие последовательности. Изменения могут происходить с низкой частотой таким образом, что малое число функциональных членов может обладать измененной конформацией главной цепи, что не влияет на ее функцию.
Теорию канонических структур также применяют для оценки числа различных конформаций главной цепи, кодируемых лигандами, для предсказания конформаций главной цепи на основании последовательностей лигандов, и для выбора остатков для внесения разнообразия, которые не влияют на каноническую структуру. Известно, что в человеческом домене νκ петля Ь1 может принимать одну из четырех канонических структур, петля Ь2 имеет одну каноническую структуру, и что 90% человеческих доменов νκ принимают одну из четырех или пяти канонических структур для петли Ь3 (ЛотИпкоп с! а1. (1995) кирга); таким образом, в домене νκ самом по себе различные канонические структуры могут сочетаться с образованием ряда различных конформаций главной цепи. При условии, что домен νλ кодирует отличный ряд канонических структур для петель Ь1, Ь2 и Ь3, и что домены νκ и νλ могут образовывать пару с любым доменом νΗ, который может кодировать несколько канонических структур для петель Н1 и Н2, число комбинаций канонических структур, наблюдаемых для этих пяти петель, очень велико. Это предполагает, что формирование разнообразия в конформации главной цепи может быть необходимым для получения широкого диапазона специфичностей связывания. Тем не менее, конструированием библиотеки антител, основанной на одной известной конформации главной цепи, было обнаружено, вопреки ожиданиям, что разнообразие в конформации главной цепи не является необходимым для формирования достаточного разнообразия для нацеливания на практически все антигены. Даже более удивительно, нет необходимости, чтобы одна конформация главной цепи представляла собой консенсусную структуру, одна встречающаяся в природе конформация может быть использована в качестве основы для всей библиотеки. Таким образом, в одном определенном аспекте, άΑЬ обладают одной известной конформацией главной цепи.
Одна выбранная конформация главной цепи может быть общей для молекул суперсемейства иммуноглобулинов обсуждаемого типа. Конформация является общей, если согласно наблюдениям значительное число встречающихся в природе молекул принимают ее. Соответственно, в одном аспекте изобретения, по отдельности принимают во внимание распространенность в природе различных конформаций главной цепи для каждой связывающей петли домена иммуноглобулина и затем выбирают встречающийся в природе вариабельный домен, обладающий желаемой комбинацией конформаций главной цепи для различных петель. Если таковые недоступны, может быть выбран ближайший эквивалент. Желаемую комбинацию конформаций главной цепи для различных петель можно получить выбором сегментов генов зародышевого типа, кодирующих желаемые конформации главной цепи. В одном примере выбранные сегменты генов зародышевого типа часто экспрессированы в природе, и, в частности, из всех естественных сегментов генов зародышевого типа они могут быть экспрессированы чаще всего.
При разработке библиотек встречаемость различных конформаций главной цепи для каждой из шести антиген-связывающих петель может быть рассмотрена отдельно. Для Н1, Н2, Ь1, Ь2 и Ь3 выбирают заданную конформацию, которую принимают от 20% до 100% антиген-связывающих петель встречающихся в природе молекул. Типично, наблюдаемая распространённость составляет более 35% (то есть, от 35 до 100%) и, в идеальном случае, более 50% или даже более 65%. Поскольку подавляющее большинство петель НЗ не имеет канонических структур, предпочтительно выбрать конформацию главной цепи, являющуюся общей для тех петель, в которых представлены канонические структуры. Для каждой из петель, следовательно, выбирают конформацию, наиболее часто наблюдаемую в природном репертуаре. В человеческих антителах наиболее распространенные канонические структуры (Οδ) для каждой петли представляют собой следующие: Н1 - ί',’δ 1 (79% экспрессируемого репертуара), Н2 - ί',’δ 3 (46%), Ь1 - ί',’δ 2 νκ (39%), Ь2 - Οδ 1 (100%), Ь3 - Οδ 1 νκ (36%) (при вычислениях предполагали соотношение к:Л 70:30, Ηοοά с! а1. (1967) Со1б δρππμ ВагЬог δутр. ОнаШ. Βίο1., 48: 133). Для петель Н3, имеющих канонические структуры, длина СЭВ3 (1<аЬа1 с! а1. (1991) δ^μιαι^κ о£ ргоЮтк о£ 1ттипо1одюа1 1п1сгск1, Министерство здравоохранения и социальных услуг США (υ.δ. Осрайтсп! о£ ИсаЦН апб Интам δ^ί^κ)) в семь остатков с ионной связью от остатка 94 к остатку 101, по-видимому, является наиболее распространенной. В библиотеке данных ΕΜΒΕ имеются последовательности по меньшей мере 16 человеческих антител с длиной Н3 и ключевыми остатками, необходимыми для образования этой конформации, и по меньшей мере две кристаллографические структуры в белковой базе данных, которые могут быть использованы в качестве основы для моделирования антител (2сдг и 1 !с!). Наиболее часто экспрессируе- 27 023031 мые сегменты генов зародышевого типа, кодирующие эту комбинацию канонических структур, представляют собой сегмент УН 3-23 (ИР-47), сегмент 1Н Ш4Ь, сегмент Ук 02/012 (ИРК9) и ίΚ сегмент ίΚ1. Сегменты УН ИР45 и ИР38 также являются подходящими. Эти сегменты, следовательно, могут быть использованы в комбинации в качестве основы для конструирования библиотеки с желаемой одной конформацией главной цепи.
Альтернативно, вместо выбора одной конформации главной цепи на основании распространенности в природе различных конформации главной цепи отдельно для каждой из связывающих петель, распространенность в природе комбинаций конформации главной цепи используют в качестве основания для выбора одной конформации главной цепи. В случае антител, например, может быть определена распространенность в природе комбинаций канонических структур для любых двух, трех, четырех, пяти или для всех шести антиген-связывающих петель. В данном случае, выбранная конформация может быть общей у встречающихся в природе антител, и, возможно, в природном репертуаре ее наблюдают чаще всего. Таким образом, в человеческих антителах, например, когда рассматривают естественные комбинации пяти антиген-связывающих петель, Н1, Н2, Ь1, Ь2 и Ь3, определяют наиболее распространенную комбинацию канонических структур и затем комбинируют ее с наиболее распространенной конформацией для петли Н3 как основание для выбора одной конформации главной цепи.
Внесение разнообразия в каноническую последовательность
После выбора нескольких известных конформации главной цепи или одной известной конформации главной цепи, можно конструировать бАЬ изменением связывающего сайта молекулы с целью создания репертуара со структурным и/или функциональным разнообразием. Это означает, что варианты создают таким образом, что они обладают достаточным разнообразием в их структуре и/или в их функции таким образом, что они способны обеспечить ряд активностей.
Желаемое разнообразие обычно создают изменением выбранной молекулы в одном или более чем одном положении. Положения, подлежащие изменению, могут быть выбраны случайно, или они могут быть селектированы. Изменение может в таком случае быть достигнуто либо рандомизацией, когда резидентную аминокислоту заменяют любой аминокислотой или ее аналогом, природным или синтетическим, с образованием очень большого числа вариантов, либо заменой резидентной аминокислоты одной или более сем одной аминокислотой из определенной подгруппы аминокислот с образованием более ограниченного числа вариантов.
Было сообщено о различных способах внесения такого разнообразия. Для введения случайных мутаций в гены, кодирующие молекулу, могут быть применены ПЦР пониженной точности (На\\ктк е! а1. (1992) I. Мо1. Вю1., 226: 889), химический мутагенез (Иепд е! а1. (1994) I. Вю1. СЬет., 269: 9533) или бактериальные мутаторные штаммы (Боте е! а1. (1996) ί. Мо1. Вю1., 260: 359). Способы мутирования выбранных положений также хорошо известны в данной области техники и включают использование некомплементарных олигонуклеотидов или вырожденных олигонуклеотидов, с или без применения ПЦР. Например, несколько библиотек синтетических антител были созданы нацеливанием мутаций на антиген-связывающие петли. Область Н3 человеческого РаЬ, связывающего столбнячный анатоксин, была рандомизирована для создания ряда новых специфичностей связывания (ВагЬак е! а1. (1992) Ргос. Ν;·ιΐ1. Асаб. 8с1. И8А, 89: 4457). Рандомизированные или полурандомизированные области Н3 и Ь3 были присоединены к сегментам У-генов зародышевого типа для создания обширных библиотек с немутированными каркасными областями (НоодепЬоот & ХУиНег (1992) ί. Мо1. Вю1., 227: 381; ВагЬак е! а1. (1992) Ргос. ЦаИ. Асаб. 8сг И8А, 89: 4457; Мккпп е! а1. (1994) ЕМВО I., 13: 692; ОйГГЬЬк е! а1. (1994) ЕМВО I., 13: 3245; Ие КгшГ е! а1. (1995) I. Мо1. Вю1, 248: 97). Такая внесение разнообразия было расширено для включения некоторых или всех других антиген-связывающих петель (Статей е! а1. (1996) №Лиге Меб., 2: 100; ЫесЬтапп е! а1. (1995) Вю/ТесЬпо1оду, 13: 475; МогрЬокук, \УО97/08320. кирга).
Поскольку рандомизация петель имеет потенциал для создания приближенно более чем 1015 структур только для Н3 и похожего большого числа вариантов для других пяти петель, создание библиотеки, отражающей все возможные комбинации, неосуществимо с применением современной технологии трансформации или даже с применением систем, свободных от клеток. Например, в одной из наиболее обширных библиотек, конструированных на настоящий момент, были созданы 6 х 1010 различных антител, что представляет собой лишь часть возможного разнообразия для библиотеки такого плана (ОпГГЬЬк е! а1. (1994) кирга).
В одном воплощении, разнообразие вносят только в те остатки, которые непосредственно вовлечены в создание или модификацию желаемой функции молекулы. Для многих молекул функцией будет связывание мишени и, следовательно, разнообразие следует концентрировать в сайте связывания мишени, избегая в то же время изменения остатков, имеющих решающее значение для общей упаковки молекулы или для поддержания выбранной конформации главной цепи.
В одном аспекте используют библиотеки бАЬ, в которых изменяют только те остатки, которые расположены в антиген-связывающем сайте. Эти остатки чрезвычайно разнообразны в репертуаре человеческих антител, и известно, что они образуют контакты в комплексах антитело/антиген высокого разрешения. Например, в Ь2 известно, что положения 50 и 53 различаются во встречающихся в природе антите- 28 023031 лах, и, согласно наблюдениям, они образуют контакт с антигеном. В отличие от этого, обычным способом было бы внесение разнообразия во все остатки в соответствующей области, определяющей комплементарность (СИК1), как определено КаЬа1 е! а1. (1991, кирга), некоторые семь остатков по сравнению с двумя, в которые вносят разнообразие, в библиотеке для использования по изобретению. Это отражает значимое улучшение в отношении функционального разнообразия, необходимого для создания ряда специфичностей связывания антигена.
В природе разнообразие антител является результатом двух процессов: соматической рекомбинации сегментов генов V, Ό и 1 зародышевого типа с образованием интактного первичного репертуара (так называемые гаметное разнообразие и множественность 1-сегментов) и соматической сверхмутации полученных перестроенных ν-генов. Анализом последовательностей человеческих антител было показано, что разнообразие в первичном репертуаре сфокусировано в центре антиген-связывающего сайта, в то время как соматическая сверхмутация распространяет разнообразие на области на периферии антигенсвязывающего сайта, высококонсервативной в первичном репертуаре (см. ТотИпкоп е! а1. (1996) 1. Мо1. Βίο1., 256: 813). Эта комплементарность, возможно, эволюционировала как эффективная стратегия поиска пространства последовательностей, и, хотя, вероятно, она присуща только антителам, она может легко быть применена к другим полипептидным репертуарам. Изменяемые остатки представляют собой подгруппу остатков, формирующих сайт связывания для мишени. В различные (включая перекрывающиеся) подгруппы остатков в области связывания мишени разнообразие вносят на различных стадиях в течение селекции, если желательно.
В случае репертуара антител создают начальный интактный репертуар, где в некоторые, но не во все остатки в антиген-связывающем сайте внесено разнообразие. При использовании здесь в данном контексте термин интактный или модельный относится к молекулам антител, не имеющим предопределенной мишени. Эти молекулы имеют сходство с молекулами, кодируемыми генами иммуноглобулинов индивида, не прошедшего иммунную диверсификацию, как в случае с плодами и новорожденными индивидами, иммунная система которых еще не была подвержена воздействию широкого спектра антигенных стимулов. Этот репертуар затем подвергают селекции против ряда антигенов или эпитопов. Если необходимо, дополнительное разнообразие может затем быть внесено вне области, в которую внесено разнообразие в начальном репертуаре. Этот зрелый репертуар может быть подвергнут селекции на предмет модифицированной функции, специфичности или аффинности.
Следует понимать, что последовательности, описанные здесь, включают последовательности, являющиеся, по существу, идентичными, например последовательности, являющиеся по меньшей мере на 90% идентичными, например являющиеся по меньшей мере на 91 или по меньшей мере на 92, или по меньшей мере на 93, или по меньшей мере на 94, или по меньшей мере на 95, или по меньшей мере на 96, или по меньшей мере на 97, или по меньшей мере на 98, или по меньшей мере на 99% идентичными последовательностям, описанным здесь.
Для нуклеиновых кислот, термин по существу идентичные обозначает, что две нуклеиновые кислоты или их указанные последовательности, при их оптимальном выравнивании и сравнении, идентичны, с соответствующими нуклеотидными вставками или делециями, в по меньшей мере приблизительно 80% нуклеотидов, обычно по меньшей мере приблизительно от 90 до 95% и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно от 98 до 99,5% нуклеотидов. Альтернативно, идентичность, по существу, присутствует при гибридизации сегментов, в селективных условиях гибридизации, с комплементом цепи.
Для нуклеотидных и аминокислотных последовательностей термин идентичный указывает на степень идентичности между двумя последовательностями нуклеиновой кислоты или аминокислотными последовательностями при их оптимальном выравнивании и сравнении с соответствующими вставками или делециями. Альтернативно, существенная идентичность присутствует при гибридизации сегментов ДНК, в селективных условиях гибридизации, с комплементом цепи.
Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией числа идентичных положений в обеих последовательностях (то есть % идентичности = число идентичных положений/общее число положений х 100), при учете числа разрывов и длины каждого разрыва, который необходимо ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями может быть осуществлено с применением математического алгоритма, как описано в неограничивающих примерах ниже.
Процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями может быть определен с применением программы ОАР в пакете программного обеспечения ОСО с использованием матрицы ЖУ8дарбпа.СМР и значения разрыва 40, 50, 60, 70 или 80, и значения длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Процент идентичности между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями может также быть определен с применением алгоритма Е. Меуетк и МШет (Сотри! . Арр1 . Вюкст, 4:11-17 (1988)), включенного в программу ΑΣΣΟΝ (версия 2.0), с использованием таблицы масс остатков РАМ 120, штрафа за длину пропуска в последовательности 12 и штрафа за пропуск в последовательности 4. В дополнение, процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями может быть определен с применением алгоритма №еб1етап и ХУшъсй (Σ. Мо1. Βίο1.48:444-453 (1970)), включенного
- 29 023031 в программу ОАР в пакете программного обеспечения ОСО с использованием либо матрицы В1оззиш б2, либо матрицы РАМ250, и значения разрыва 1б, 14, 12, 10, 8, б или 4, и значения длины 1, 2, 3, 4, 5 или б.
В качестве примера полинуклеотидная последовательность по настоящему изобретению может быть идентичной эталонной последовательности 8Н(Э ГО N0: 122, то есть, быть идентичной на 100%, или она может включать до определенного целого числа нуклеотидных изменений по сравнению с эталонной последовательностью. Такие изменения выбраны из группы, состоящей из по меньшей мере одной нуклеотидной делеции, замены, включая транзицию и трансверсию, или вставки, и где указанные изменения могут присутствовать в 5'- или З'-концевых положениях эталонной нуклеотидной последовательности или где-либо в другом месте между этими концевыми положениями, распределенные либо по отдельности среди нуклеотидов эталонной последовательности, либо в одной или более чем одной непрерывной группе в пределах эталонной последовательности. Число нуклеотидных изменений определяют умножением общего числа нуклеотидов в 8ЕР ГО N0: 122 на числовой процент соответствующего процента идентичности (разделенный на 100) и вычитанием полученного числа из указанного общего числа нуклеотидов в 8ЕР ГО N0: 122, или
где пп представляет собой число нуклеотидных изменений, хп представляет собой общее число нуклеотидов в 8ЕР ГО N0: 122, а у представляет собой 0,50 для 50%, 0,б0 для б0%, 0,70 для 70%, 0,80 для 80%, 0,85 для 85%, 0,90 для 90%, 0,95 для 95%, 0,97 для 97% или 1,00 для 100%, и где любое нецелое произведение хп и у округляют в сторону уменьшения до ближайшего целого числа перед его вычитанием из хп. Изменения полинуклеотидной последовательности 8Н(Э ГО N0: 122 могут приводить к появлению нонсенс-мутаций, миссенс-мутаций или мутаций со сдвигом рамки считывания в этой кодирующей последовательности и посредством этого изменять полипептид, кодируемый полинуклеотидом, после таких изменений.
Сходным образом, в другом примере полипептидная последовательность по настоящему изобретению может быть идентичной эталонной последовательности, кодируемой 8ЕР ГО N0: 2б, то есть, быть идентичной на 100%, или она может включать до определенного целого числа аминокислотных изменений по сравнению с эталонной последовательностью, таким образом, что % идентичности составляет менее 100%. Такие изменения выбраны из группы, состоящей по меньшей мере из одной аминокислотной делеции, замены, включая консервативную и неконсервативную замену, или вставки, и где указанные изменения могут присутствовать в N или С-концевых положениях эталонной полипептидной последовательности или где-либо в другом месте между этими концевыми положениями, распределенные либо по отдельности среди аминокислот эталонной последовательности, либо в одной или более чем одной непрерывной группе в пределах эталонной последовательности. Число аминокислотных изменений для данного % идентичности определяют умножением общего числа аминокислот в полипептидной последовательности, кодируемой 8Н(Э ГО N0: 2б, на числовой процент соответствующего процента идентичности (разделенный на 100) и затем вычитанием полученного числа из указанного общего числа аминокислот в полипептидной последовательности, кодируемой 8ЕР ГО N0: 2б, или
где па представляет собой число аминокислотных изменений, ха представляет собой общее число аминокислот в полипептидной последовательности, кодируемой 8ЕР ГО N0: 2б, у представляет собой, например, 0,70 для 70%, 0,80 для 80%, 0,85 для 85% и так далее, и где любое нецелое произведение ха и у округляют в сторону уменьшения до ближайшего целого числа перед его вычитанием из ха.
Примеры
Следующие способы использовали в примерах, описанных здесь.
Способ 1. Связывание с экспрессированным в Е. сой рекомбинантным человеческим ГО-13 согласно ЕЫ8А
Молекулы шАЬбАЬ оценивали на предмет связывания с рекомбинантным экспрессированным в Е. сой человеческим ГО-13 в ЕЫ8А прямого связывания. Кратко, 5 мкг/мл рекомбинантного экспрессированного в Е. сой человеческого 10-13 (полученного и очищенного в О8К) наносили на 9б-луночный планшет для ЕЫ8А. Лунки блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре, затем проводили раститровку конструкций шАЬбАЬ по планшету (обычно от приблизительно 100 нМ с 3-кратными разведениями до приблизительно 0,01 нМ). Связывание выявляли с использованием подходящего разведения антитела против человеческой легкой цепи каппа, конъюгированного с пероксидазой (номер по каталогу А71б4, 81дша-А1бг1сй), или подходящего разведения антитела для выявления против человеческого 1дО, специфичного в отношении γ-цепи, конъюгированного с пероксидазой (номер по каталогу Аб029, 81дшаАШпсй).
Способ 2. Связывание с экспрессированным в Е. сой рекомбинантным человеческим ГО-4 согласно ЕЫ8А
Конструкции шАЬбАЬ оценивали на предмет связывания с рекомбинантным экспрессированным в Е. сой человеческим ГО-4 в ЕЫ8А прямого связывания. Кратко, 5 мкг/мл рекомбинантного экспрессированного в Е. сой человеческого ГО-4 (полученного и очищенного в О8К) наносили на 9б-луночный
- 30 023031 планшет для ЕЫ8А. Лунки блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре, затем проводили раститровку конструкций тАЬбАЬ по планшету (обычно от приблизительно 100 нМ с 3-кратными разведениями до приблизительно 0,01 нМ). Связывание выявляли с использованием подходящего разведения козьего антитела против человеческой легкой цепи каппа, конъюгированного с пероксидазой (номер по каталогу А7164, 81дта-А1йпсй), или подходящего разведения антитела для выявления против человеческого 1дО, специфичного в отношении γ-цепи, конъюгированного с пероксидазой (номер по каталогу А6029, 81дта-А1бпсй).
Способ 3. Связывание с экспрессированным в Е. сой рекомбинантным человеческим 10-18 согласно ЕЫ8А
Конструкции тАЬбАЬ оценивали на предмет связывания с рекомбинантным экспрессированным в Е. сой человеческим 10-18 в ЕЫ8А прямого связывания. Кратко, 5 мкг/мл рекомбинантного экспрессированного в Е. сой человеческого 10-18 (полученного и очищенного в О8К) наносили на 96-луночный планшет для ЕЫ8А. Лунки блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре, затем проводили раститровку конструкций тАЬбАЬ по планшету (обычно от приблизительно 100 нМ с 3-хкратными разведениями до приблизительно 0,01 нМ). Связывание выявляли с использованием разведения 1 к 2000 антитела против человеческой легкой цепи каппа, конъюгированного с пероксидазой (номер по каталогу А7164, 81дта-А1йпсй) или с использованием разведения 1 к 2000 антитела для выявления против человеческого 1дО, специфичного в отношении γ-цепи, конъюгированного с пероксидазой (номер по каталогу А6029, 81дта-А1йпсй).
Способ 4. Оценка аффиности связывания В1асоге™ для связывания экспрессированного в Е. сой рекомбинантного человеческого 10-13
Аффинность связывания конструкций тАЬбАЬ для рекомбинантного экспрессированного в Е. сой человеческого 10-13 оценивали анализом В1асоге™. Анализы проводили с использованием захвата белком А или антителом против человеческого 1дО. Кратко, белок А или антитело против человеческого 1дО сочетали с чипом СМ5 сочетанием первичных аминов в соответствии с рекомендациями изготовителя. Конструкции тАЬбАЬ затем иммобилизовали на этой поверхности и человеческий 10-13 (изготовленный и очищенный в О8К) пропускали над чипом в определенных концентрациях. Поверхность восстанавливали до поверхности с белком А с использованием слабокислых условий элюирования (как например 100 мМ фосфорная кислота), это не оказывало существенного влияния на способность иммобилизовать антитело для последующего связывания 10-13. Поверхность с антителом против человеческого 1дО восстанавливали либо с использованием условий, сходных с условиями для поверхности с белком А, либо с использованием 3 М МдС12. Анализ проводили на аппарате В1асоте™ 3000 и/или Т100, данные анализировали с использованием программного обеспечения аппарата для оценки и приспосабливали к модели связывания 1:1. Эксперименты В1асоте™ проводили при 25 или 37°С.
Способ 5. Оценка аффиности связывания В1асоте™ для связывания экспрессированного в Е. сой рекомбинантного человеческого 1Ь-4
Аффинность связывания конструкций тАЬбАЬ для рекомбинантного экспрессированного в Е. сой человеческого 1Ь-4 оценивали анализом В1асоте™. Анализы проводили с использованием захвата белком А или антителом против человеческого 1дО. Кратко, белок А или антитело против человеческого 1дО сочетали с чипом СМ5 сочетанием первичных аминов в соответствии с рекомендациями изготовителя. Конструкции тАЬбАЬ затем иммобилизовали на этой поверхности и человеческий 1Ь-4 (изготовленный и очищенный в О8К) пропускали над чипом в определенных концентрациях. Поверхность восстанавливали до поверхности с белком А с использованием слабокислых условий элюирования (как например 100 мМ фосфорная кислота), это не оказывало существенного влияния на способность иммобилизовать антитело для последующего связывания 1Ь-4. Поверхность с антителом против человеческого 1дО восстанавливали либо с использованием условий, сходных с условиями для поверхности с белком А, либо с использованием 3 М МдС12. Анализ проводили на аппарате В1асоте™ 3000 и/или Т100, и/или А100, данные анализировали с использованием программного обеспечения аппарата для оценки и приспосабливали к модели связывания 1:1. Эксперименты В1асоте™ проводили при 25 или 37°С.
Способ 6. Оценка аффиности связывания В1асоте™ для связывания экспрессированного в Е. сой рекомбинантного человеческого 10-18
Аффинность связывания конструкций тАЬбАЬ для рекомбинантного экспрессированного в Е. сой человеческого 10-18 оценивали анализом В1асоте™. Анализы проводили с использованием захвата белком А или антителом против человеческого 1дО. Кратко, белок А или антитело против человеческого 1дО сочетали с чипом СМ5 сочетанием первичных аминов в соответствии с рекомендациями изготовителя. Конструкции тАЬбАЬ затем иммобилизовали на этой поверхности и человеческий 10-18 (изготовленный и очищенный в О8К) пропускали над чипом в определенных концентрациях. Поверхность восстанавливали до поверхности с белком А с использованием слабокислых условий элюирования (как например 100 мМ фосфорная кислота), это не оказывало существенного влияния на способность иммобилизовать антитело для последующего связывания 10-18. Поверхность с антителом против человеческого 1дО восстанавливали либо с использованием условий, сходных с условиями для поверхности с белком А, либо с
- 31 023031 использованием 3 М МдС12. Анализ проводили на аппарате В1асоге™ 3000 и/или Т100, и/или А100, данные анализировали с использованием программного обеспечения аппарата для оценки и приспосабливали к модели связывания 1:1. Эксперименты В1асоге™ проводили при 25°С.
Способ 7. Стехиометрическая оценка биспецифичных антител тЛЬбЛЬ или триспецифично го антитела к ГЙ-13, 1Й-4 или ГЙ-18 (с применением В1асоге™)
Антитело против человеческого ГдО иммобилизовали на биосенсорном чипе СМ5 сочетанием первичных аминов. Конструкции тЛЬбЛЬ захватывали на этой поверхности, после чего над чипом пропускали одну концентрацию цитокина ГЙ-13, ГЙ-4 или ГЙ-18, этой концентрации было достаточно для насыщения связывающей поверхности, и наблюдаемый сигнал связывания достигал полного К-тах. Стехиометрии затем вычисляли с использованием данной формулы:
Шоюй = Ктах * М\у (молекулярная масса) (лиганд)/М^ (аналит) * К (лиганд, иммобилизованный или захваченный).
Там, где стехиометрии вычисляли для более чем одного аналита одновременно, различные цитокины пропускали над чипом последовательно с насыщающей концентрацией цитокина и стехиометрии вычисляли, как описано выше. Анализ проводили на В1асоте 3000 при 25°С с использованием буфера для анализа ΗΒδ-ΕΡ.
Способ 8. Нейтрализация экспрессированного в Е. сой рекомбинантного человеческого ГЙ-13 в биологическом анализе пролиферации клеток ТР-1
Клетки ТР-1 пролиферируют в ответ на несколько различных цитокинов, включая человеческий ГЕ13. Таким образом, пролиферативный ответ этих клеток на ГЕ-13 может быть использован для измерения биологической активности ГЕ-13, и впоследствии был разработан анализ для определения нейтрализующей активности конструкций тЛЬбЛЬ в отношении ГЕ-13 (ингибирования биологической активности ГЕ13 конструкциями тЛЬбЛЬ).
Анализ проводили в стерильных 96-луночных планшетах для тканевых культур в стерильных условиях и все исследуемые лунки анализировали трижды. Приблизительно 14 нг/мл рекомбинантного экспремированного в Е. сой человеческого ГЕ-13 предварительно инкубировали с различными разведениями конструкций тЛЬбЛЬ (обычно от 200 нМ, раститрованными с 3-кратными разведениями до 0,02 нМ) в общем объеме 50 мкл в течение 1 чпри 37°С. Эти образцы затем добавляли к 50 мкл клеток ТР-1 (в концентрации 2 х 105 клеток на мл) в стерильном 96-луночном планшете для тканевых культур. Таким образом, конечный анализируемый объем 100 мкл содержал различные разведения конструкций тЛЬбЛЬ (в конечной концентрации 100 нМ, раститрованные с 3-хкратными разведениями до 0,01 нМ), рекомбинантный экспрессированный в Е. сой человеческий ГЙ-13 (в конечной концентрации 7 нг/мл) и клетки ТР-1 (в конечной концентрации 1 х 105 клеток на мл). Планшет для анализа инкубировали при 37°С в течение приблизительно 3 суток в СО2 инкубаторе с увлажнением. Значение пролиферации клеток затем определяли с использованием 'СеИТПге 96® Ыоп-Кабюасйуе Се11 РтойГегаГюп Аккау' от Рготеда (номер по каталогу 04100), как описано в инструкциях изготовителя. Оптическую плотность образцов в 96луночном планшете считывали в спектрофотометре для прочтения планшетов при 570 нм.
Способность конструкций тАЬбАЬ нейтрализовать биологическую активность рекомбинантного экспрессированного в Е. сой человеческого ГЙ-13 выражали как концентрацию конструкции тАЬйАЬ. необходимую для нейтрализации биологической активности определенного количества человеческого ГЙ-13 (7 нг/мл) на 50% (= средняя нейтрализующая доза (ΝΏ50)). Чем меньше необходимая концентрация конструкции тАЬбАЬ, тем выше нейтрализующая способность. Данные по ΝΏ50, представленные здесь, были вычислены либо вручную, либо с применением пакета программного обеспечения КоЬокаде, входящего в Мютокой Ехсе1.
Способ 9. Нейтрализация экспрессированного в Е. сой рекомбинантного человеческого ГЙ-4 в биологическом анализе пролиферации клеток ТР-1
Клетки ТР-1 пролиферируют в ответ на несколько различных цитокинов, включая человеческий Гй4. Таким образом, пролиферативный ответ этих клеток на ГЙ-4 может быть использован для измерения биологической активности ГЙ-4, и впоследствии был разработан анализ для определения нейтрализующей активности конструкций тАЬбАЬ в отношении ГЙ-4 (ингибирования биологической активности ГЙ-4 конструкциями тАЬбАЬ).
Анализ проводили в стерильных 96-луночных планшетах для тканевых культур в стерильных условиях и все исследуемые лунки анализировали трижды. Приблизительно 2,2 нг/мл рекомбинантного экспрессированного в Е. сой человеческого ГЙ-4 предварительно инкубировали с различными разведениями конструкций тАЬбАЬ (обычно от 200 нМ, раститрованными с 3-кратными разведениями до 0,02 нМ) в общем объеме 50 мкл в течение 1 ч при 37°С. Эти образцы затем добавляли к 50 мкл клеток ТР-1 (в концентрации 2 х 105 клеток на мл) в стерильном 96-луночном планшете для тканевых культур. Таким образом, конечный анализируемый объем 100 мкл содержал различные разведения конструкций тАЬбАЬ (в конечной концентрации 100 нМ, раститрованные с 3-кратными разведениями до 0,01 нМ), рекомбинантный экспрессированный в Е. сой человеческий ГЙ-4 (в конечной концентрации 1,1 нг/мл) и клетки ТР-1 (в конечной концентрации 1 х 105 клеток на мл). Планшет для анализа инкубировали при 37°С в течение
- 32 023031 приблизительно 3 суток в СО2 инкубаторе с увлажнением. Значение пролиферации клеток затем определяли с использованием 'СейТйге 96® Шп-Кабюасйуе Се11 РгойГегайоп Аккау' от Рготеда (номер по каталогу С4100), как описано в инструкциях изготовителя. Оптическую плотность образцов в 96-луночнорм планшете считывали в спектрофотометре для прочтения планшетов при 570 нм.
Способность конструкций тАЬбАЬ нейтрализовать биологическую активность рекомбинантного экспрессированного в Е. сой человеческого 1Ь-4 выражали как концентрацию конструкции тАЬбАЬ, необходимую для нейтрализации биологической активности определенного количества человеческого 1Ь-4 (1,1 нг/мл) на 50% (=ХО50). Чем меньше необходимая концентрация конструкции тАЬбАЬ, тем выше нейтрализующая способность. Данные по N0^,, представленные здесь, были вычислены либо вручную, либо с применением пакета программного обеспечения КоЬокаде, входящего в Мтсгокой Ехсе1.
Способ 10. Двойная нейтрализация экспрессированного в Е. соП рекомбинантного человеческого 1Ь-13 и экспрессированного в Е. сой рекомбинантного человеческого 1Ь-4 в биологическом анализе пролиферации клеток ТЕ-1
Клетки ТЕ-1 пролиферируют в ответ на несколько различных цитокинов, включая человеческий ГО13 и человеческий ГО-4. Таким образом, пролиферативный ответ этих клеток на ГО-13 и ГО-4может быть использован для измерения биологической активности ГО-13 и ГО-4 одновременно, и впоследствии был разработан анализ для определения двойной нейтрализующей активности конструкций тАЬбАЬ в отношении ГО-13 и ГО-4 (двойного ингибирования биологической активности ГО-4 конструкциями тАЬбАЬ).
Анализ проводили в стерильных 96-луночных планшетах для тканевых культур в стерильных условиях и все исследуемые лунки анализировали трижды. Приблизительно 14 нг/мл рекомбинантного экспремированного в Е. сой человеческого ГО-13 приблизительно 2,2 нг/мл рекомбинантного экспрессированного в Е. сой человеческого ГО-4 предварительно инкубировали с различными разведениями конструкций тАЬбАЬ (обычно от 200 нМ, раститрованными с 3-кратными разведениями до 0,02 нМ) в общем объеме 50 мкл в течение 1 ч при 37°С. Эти образцы затем добавляли к 50 мкл клеток ТЕ-1 (в концентрации 2 х 105 клеток на мл) в стерильном 96-луночном планшете для тканевых культур. Таким образом, конечный анализируемый объем 100 мкл содержал различные разведения конструкций тАЬбАЬ (в конечной концентрации 100 нМ, раститрованные с 3-кратными разведениями до 0,01 нМ), рекомбинантный экспрессированный в Е. сой человеческий ГО-13 (в конечной концентрации 7 нг/мл), рекомбинантный экспрессированный в Е. сой человеческий ГО-4 (в конечной концентрации 1,1 нг/мл) и клетки ТЕ-1 (в конечной концентрации 1 х 105 клеток на мл). Планшет для анализа инкубировали при 37°С в течение приблизительно 3 суток в СО2 инкубаторе с увлажнением. Значение пролиферации клеток затем определяли с использованием 'СейТйге 96® Шп-Кабюасйуе Се11 РгойГегайоп Аккау' от Рготеда (номер по каталогу С4100), как описано в инструкциях изготовителя. Оптическую плотность образцов в 96-луночнорм планшете считывали в спектрофотометре для прочтения планшетов при 570 нм.
Способ 11. Оценка аффиности связывания Ыасоге™ для связывания экспрессированного в клетках 8Г21 рекомбинантного человеческого ГО-5
Аффинность связывания молекул тАЬбАЬ для рекомбинантного экспрессированного в клетках 8Г21 человеческого ГО-5 оценивали анализом Ыасоге™. Анализы проводили с использованием захвата белком А или антителом против человеческого 1дС. Кратко, белок А или антитело против человеческого 1дС сочетали с чипом СМ5 сочетанием первичных аминов в соответствии с рекомендациями изготовителя. Молекулы тАЬбАЬ затем иммобилизовали на этой поверхности и человеческий ГО-5 (изготовленный и очищенный в С8К) пропускали над чипом в определенных концентрациях.
Поверхность восстанавливали до поверхности с белком А с использованием слабокислых условий элюирования (как например 100 мМ фосфорная кислота), это не оказывало существенного влияния на способность иммобилизовать антитело для последующего связывания ГО-5. Поверхность с антителом против человеческого 1дС восстанавливали либо с использованием условий, сходных с условиями для поверхности с белком А, либо с использованием 3 М МдС12. Анализ проводили на аппаратах Ыасоге™ 3000, Т100 и А100, данные анализировали с использованием программного обеспечения аппаратов для оценки и приспосабливали к модели связывания 1:1. Эксперимент Ыасоге™ проводили при 25°С.
Способ 12. Анализ связывания рецепторов УЕСЕ
В данном анализе измеряют связывание УЕОЕ165 с УЕСЕ К2 (рецептором УЕСЕ) и способность исследуемых молекул блокировать это взаимодействие. На планшеты для ЕЬ18А в течение ночи наносили рецептор УЕСЕ (К&Э 8ук1етк, номер по каталогу: 357-10-050) (конечная концентрация 0,5 мкг/мл в 0,2 М карбонате-бикарбонате натрия, рН9,4), отмывали и блокировали 2% В8А в РВ8. УЕСЕ (К&Э 8ук1етк, номер по каталогу 293-УЕ-050) и исследуемые молекулы (разведенные в 0,1% В8А в 0,05% Т\\ееп 20™РВ8) предварительно инкубировали в течение одного часа перед добавлением в планшет (конечная концентрация УЕСЕ 3 нг/мл). Связывание УЕСЕ с рецептором УЕСЕ выявляли с использованием биотинилированного антитела против УЕСЕ (конечная концентрация 0,5 мкг/мл) (К&Э 8ук1етк, номер по каталогу: ВАЕ293) и конъюгнированного с пероксидазой вторичного антитела против биотина (разведение 1:5000) (81га1есй номер по каталогу: 200-032-096) и визуализировали по оптической плотности при 450 нм (0Ό450) с использованием колориметрического субстрата (пероксидазного субстрата 8иге В1ие ТМВ,
- 33 023031
КРЬ) после остановки реакции равным объемом 1 М НС1.
Способ 13. Анализ киназы ЕСРК
Активация ЕСРК, экспрессированного на поверхности клеток А431, при его взаимодействии с ЕСР приводит к фосфорилированию тирозинкиназы рецептора. Снижение фосфорилирования тирозинкиназы ЕСРК измеряли для определения активности исследуемых молекул. Клеткам А431 позволяли адгезировать на 96-луночные планшеты для тканевых культур в течение ночи, затем добавляли исследуемую молекулу и оставляли на 1 ч и затем инкубировали в течение 10 мин с ЕСР (в концентрации 300 нг/мл) (К&Э §у51етк, номер по каталогу 236-ЕС). Клетки лизировали и лизированный препарат переносили в планшеты для ЕЫ§А, покрытые антителом против ЕСРК (в концентрации 1 мкг/мл) (К&Э §ук1етк, номер по каталогу АР231). Происходил захват как фосфорилированного, так и нефосфорилированного ЕСРК, присутствовавшего в лизированном клеточном растворе. После отмывки несвязанных веществ фосфорилированный ЕСРК специфично выявляли с использованием конъюгированного с пероксидазой хрена (НКР) антитела против фосфотирозина (разведение 1:2000) (Ирк1а1е В|о1есНпо1оду, номер по каталогу 16-105). Связывание визуализировали с использованием колориметрического субстрата.
Способ 14. Анализ МКС-5/ТМР
Способность исследуемых молекул предотвращать связывание человеческого ТМР-а с человеческим Т№К1 и нейтрализовать секрецию 1Ь-8 определяли с использованием клеток-фибробластов легких человека МКС-5. Серию разведений исследуемых образцов инкубировали с ТМР-а (500 пг/мл) (Рерго1есй) в течение 1 ч. Эти образцы затем разводили в соотношении 1 к 2 суспензией клеток МКС-5 (Американская коллекция типовых культур (АТСС), номер по каталогу ССЬ-171) (5 χ 103 клеток на лунку). После инкубации в течение ночи образцы разводили в соотношении 1 к 10 и высвобождение 1Ь-8 определяли с использованием клеточной системы выявления 1Ь-8 АВ1 8200 (РМАТ), где концентрацию 1Ь-8 определяли с использованием полистироловых гранул, покрытых антителом против 1Ь-8 (К&Э кук1етк, номер по каталогу 208-1Ь), биотинилированного антитела против 1Ь-8 (К&Э ку51етк, номер по каталогу ВАР208) и стрептавидина А1ехаДиог 647 (Мо1еси1аг РгоЪек, номер по каталогу §32357). Считываемым показанием в данном анализе было испускание флуоресценции при 647 нм, и неизвестные концентрации 1Ь-8 интерполировали с использованием калибровочной кривой для 1Ь-8, включенной в анализ.
Способ 15. Анализ МКС-5/1Ь-1
Способность исследуемых молекул предотвращать связывание человеческого 1Ь-1а с человеческим 1Ь1-К и нейтрализовать секрецию 1Ь-8 определяли с использованием клеток-фибробластов легких человека МКС-5. Клетки МКС-5 (АТСС, номер по каталогу ССЬ-171) трипсинизировали, затем инкубировали с исследуемыми образцами в течение одного часа в виде суспензии. Затем добавляли 1Ь-1а (конечная концентрация 200 пг/мл) (К&Э §ук1етк, номер по каталогу 200-ЬА). После инкубации в течение ночи высвобождение 1Ь-8 определяли с использованием набора для количественного ЕЫ§А на 1Ь-8 (К&Э §ук1етк) с покрытыми антителом против 1Ь-8 планшетами для ЕЫ§А, биотинилированного антитела против 1Ь-8 и стрептавидина-НКР. Считываемым показанием в данном анализе была колориметрическая оптическая плотность при 450 нм, и неизвестные концентрации 1Ь-8 интерполируют с использованием калибровочной кривой для 1Ь-8, включенной в анализ.
Способ 16. Нейтрализующая активность экспрессированного в Е. сой рекомбинантного человеческого 1Ь-13 или 1Ь-4 в биологическом анализе фосфо-§ТАТ6 цельной крови
Клетки цельной крови можно стимулировать ех νί\Ό рекомбинантным экспрессированным в Е. сой человеческим 1Ь-4 (тй1Ь-14) или 1Й-13 (гЫЬ-13) для экспрессии сроссро-§ТАТ6 (р§ТАТ6). Этот анализ был разработан для количественной оценки р§ТАТ6 и последующего определения нейтрализующей активности (ингибирования биологической активности 1Ь-4 или 1Й-13 конструкциями тАЪйАЪ).
Анализ проводили в стерильных 96-луночных планшетах для тканевых культур в стерильных условиях и все исследуемые лунки анализировали трижды. 12 нг/мл гЫЬ-13 или тй1Ь-4 готовили в свободной от сыворотки культуральной среде и 31,2 мкл добавляли в лунки 96-луночного планшета. Строили кривую разведения конструкций тАЪйАЪ или контрольного изотипа из 9 точек с шестикратной конечной анализируемой концентрацией и 31,2 мкл каждого разведения добавляли в лунки, содержащие либо гй1Ь4, либо тЫЬ-13. Во все лунки добавляли 125 мкл гепаринизированной человеческой цельной крови и перемешивали на шейкере в течение 30 с. Конечный анализируемый объем содержал различные разведения конструкций тАЪйАЪ вместе с тЫЬ-13 или тЫЬ-4 в конечной концентрации 2 нг/мл. Планшет для анализа инкубировали при 37°С, 5%СО2 в течение 60 мин.
Лунки затем лизировали добавлением 62,5 мкл 4х лизирующего буфера. Лизирующий буфер содержал конечные концентрации для анализа, составлявшие 50 мМ гидроксиметиламинометанагидрохлорида (Трис-НС1), 300 мМ хлорида натрия, 1% №40, 0,5% дезоксихолата натрия, 50 мМ фторида натрия, 1 мМ ортованадата натрия, 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЕЭТА) и смесь ингибиторов протеаз. Планшеты помещали на лед на 30 минут, затем замораживали при -80°С до анализа на р§ТАТ6.
Измерение р§ТАТ6 в образцах цельной крови проводили с применением электрохемилюминес- 34 023031 центного иммуноанализа (Ме8о^са1е-Э18соуегу, ΜδΌ). Кратко, покрытые авидином 96-луночные планшеты ΜδΌ блокировали с использованием 150 мкл 5% блокирующего раствора ΜδΌ А на лунку в течение 1 ч при комнатной температуре на шейкере при 750 оборотах в минуту (об/мин). Планшет отмывали три раза 3 раза с использованием 150 мкл отмывочного Трис-буфера ΜδΌ на лунку. Добавляли 25 мкл иммобилизующего антитела (биотинилированного мышиного моноклонального антитела против человеческого δТАТ6) на лунку и планшет инкубировали в течение ночи при 4°С. Иммобилизующее антитело предварительно разводили до 4 мкг/мл в буфере для анализа, состоящего из 50 мМ Трис, 150 мМ хлорида натрия, 0,2% бычьего сывороточного альбумина (ΒδА), 0,5% Т\\ееп 20, 1 мМ ΕΌΤΛ. Планшет отмывали 3 раза отмывочным Трис-буфером ΜδΌ, затем блокировали с использованием 150 мкл 5% блокирующего раствора ΜδΌ А на лунку в течение 1 ч при комнатной температуре на шейкере. Планшеты отмывали 3 раза, как указано выше, затем добавляли 25 мкл лизата цельной крови или калибровочного раствора ρδΤАΤ6 на лунку. Планшеты инкубировали в течение 3 ч при комнатной температуре на шейкере. Планшеты отмывали 3 раза, затем добавляли 25 мкл кроличьего антитела против человеческого ρδΤАΤ6 (разведенного 1 к 800 в буфере для анализа) и затем инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После еще одной отмывки добавляли 25 мкл козьего антитела против кроличьего ЦС ΜδΌ ТАС в разведении 1 к 500 на лунку и затем инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре на шейкере. Планшеты отмывали еще раз перед добавлением 150 мкл 2х ΜδΌ буфера Т для считывания. Планшеты считывали немедленно на устройстве для визуализации ΜδΌ δΕί'.'Τ0Κ.
Способность конструкций тАЬбАЬ нейтрализовать биологическую активность тЫЬ-13 или тЫЬ-4 выражали как концентрацию конструкции тАЬбАЬ, необходимую для нейтрализации 2 нг/мл человеческого ГО-4 или человеческого ГО-13 на 50% (средняя ингибирующая концентрация (Ю50)). Чем меньше необходимая концентрация конструкции тАЬбАЬ, тем выше нейтрализующая способность.
Способ 17. Связывание с экспрессированным в Е. соН рекомбинантным ГО-13 яванского макака согласно Ε^IδΛ
Молекулы тАЬбАЬ оценивали на предмет связывания с рекомбинантным экспрессированным в Е. соИ ГО-13 яванского макака в Ε^IδΛ прямого связывания. Кратко, 5 мкг/мл рекомбинантного экспрессированного в Е. соН ГО-13 яванского макака (полученного и очищенного в СδК) наносили на 96-луночный планшет для Ε^IδΛ. Лунки блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре, затем проводили раститровку конструкций тАЬбАЬ по планшету (обычно от приблизительно 100 нМ с 3-кратными разведениями до приблизительно 0,01 нМ). Связывание выявляли с использованием подходящего разведения антитела против человеческой легкой цепи каппа, конъюгированного с пероксидазой (номер по каталогу А7164, δ^дта-А1б^^сЬ), или подходящего разведения антитела для выявления против человеческого ЦС. специфичного в отношении γ-цепи, конъюгированного с пероксидазой (номер по каталогу А6029, δ^дтаА1бпсЬ).
Способ 18. Не применяли.
Способ 19. Ингибирование связывания человеческого ГО-4 с альфа-рецептором человеческого ГО-4 (ГО-4Ка) согласно Ε^IδΛ
Если не указано иное, все реагенты разводили до необходимой концентрации в блокирующем растворе (4% бычий сывороточный альбумин в забуференном Трис физиологическом растворе и 0,05% Т\уееп20) непосредственно перед применением. На планшет для Ε^IδΛ в течение ночи при 4°С наносили химерную конструкцию рекомбинантного человеческого ГО-4Ка-Рс в концентрации 5 мкг/мл (К&И δу8!етз, номер по каталогу 604-4К) в забуференном фосфатом физиологическом растворе. Все последующие стадии проводили при комнатной температуре. Планшет блокировали в течение 2 ч в блокирующем растворе перед добавлением 50 мкл различных концентраций тАЬбАЬ (или тАЬ или бАЬ положительного контроля), которые предварительно смешивали с 0,02 мкг/мл рекомбинантного человеческого ГО-4 (полученного в СδК). Планшеты инкубировали в течение 1 ч перед 4-кратной отмывкой отмывочным буфером (забуференным Трис физиологическим раствором и 0,05% Т\уееп20). В каждую лунку добавляли 50 мкл раствора биотинилированного антитела против человеческого ГО-4 (К&И δу8!ет8, номер по каталогу ВАР 204) в концентрации 0,5 мкг/мл и инкубировали в течение 1 ч. Планшет отмывали 4 раза в буфере для отмывки перед добавлением ΕχΙππ^πι (δί^ιη;·!, номер по каталогу Е2886) в разведении 1/2000 в объеме 50 мкл на лунку. Через 1 ч планшет отмывали 4 раза и колориметрический сигнал детектировали инкубацией с пероксидазным субстратом 0РИ (от δ^дта), реакцию останавливали раствором для остановки реакции (3 Μ серной кислотой (Н^04)) и данные по оптической плотности получали считыванием на спектрофотометре для прочтения планшетов при 490 нм. Среднюю оптическую плотность и стандартную ошибку наносили на график в С^аρЬРаб Рйзт и значения Ю50 вычисляли с применением СатЬпбде δοй ВюАззау.
Способ 20. Нейтрализация экспрессированного в Ε. сой рекомбинантного ГО-13 яванского макака в биологическом анализе пролиферации клеток ТР-1
Клетки ТР-1 пролиферируют в ответ на несколько различных цитокинов, включая ГО-13 яванского макака. Таким образом, пролиферативный ответ этих клеток на ГО-13 может быть использован для измерения биологической активности ΙΠ-13, и впоследствии был разработан анализ для определения нейтра- 35 023031 лизующей активности конструкций тАЬбАЬ в отношении 1Л-13 (ингибирования биологической активности 1Л-13 конструкциями тАЬбАЬ).
Анализ проводили в стерильных 96-луночных планшетах для тканевых культур в стерильных условиях и все исследуемые лунки анализировали трижды. Приблизительно 14 нг/мл рекомбинантного экспремированного в Е. сой 1Л-13 яванского макака предварительно инкубировали с различными разведениями конструкций тАЬбАЬ (обычно от 1000 или 200 нМ, раститрованными с 3-кратными разведениями до 1 или 0,02 нМ) в общем объеме 50 мкл в течение 1 ч при 37°С. Эти образцы затем добавляли к 50 мкл клеток ТР-1 (в концентрации 2 х 105 клеток на мл) в стерильном 96-луночном планшете для тканевых культур. Таким образом, конечный анализируемый объем 100 мкл содержал различные разведения конструкций тАЬбАЬ (в конечной концентрации 500 нМ или 100 нМ, раститрованные с 3-кратными разведениями до 0,5 нМ или 0,01 нМ), рекомбинантный экспрессированный в Е. сой 1Л-13 яванского макака (в конечной концентрации 7 нг/мл) и клетки ТР-1 (в конечной концентрации 1 х 105 клеток на мл). Планшет для анализа инкубировали при 37°С в течение приблизительно 3 суток в СО2 инкубаторе с увлажнением. Значение пролиферации клеток затем определяли с использованием ’СсПТБгс 96® Nοη-Каб^οасί^νс Сс11 РгойГсгайоп Аххау' от Рготсда (номер по каталогу С4100), как описано в инструкциях изготовителя. Оптическую плотность образцов в 96-луночнорм планшете считывали в спектрофотометре для прочтения планшетов при 570 нм.
Способность конструкций тАЬбАЬ нейтрализовать биологическую активность рекомбинантного экспрессированного в Б. соН 1Л-13 яванского макака выражали как концентрацию конструкции тАЬбАЬ, необходимую для нейтрализации биологической активности определенного количества 1Л-13 яванского макака (7 нг/мл) на 50% (= ΝΏ50). Чем меньше необходимая концентрация конструкции тАЬбАЬ, тем выше нейтрализующая способность. Данные по ΝΏ50, представленные здесь, были вычислены либо вручную, либо с применением пакета программного обеспечения КоЬохадс, входящего в МюгохоГ! Ехсс1.
Способ 21. Нейтрализация экспрессированного в Е. сой рекомбинантного 1Ь-4 яванского макака в биологическом анализе пролиферации клеток ТР-1
Клетки ТР-1 пролиферируют в ответ на несколько различных цитокинов, включая 1Ь-4 яванского макака. Таким образом, пролиферативный ответ этих клеток на 1Ь-4 может быть использован для измерения биологической активности 1Ь-4, и впоследствии был разработан анализ для определения нейтрализующей активности конструкций тАЬбАЬ в отношении 1Ь-4 (ингибирования биологической активности 1Ь-4 конструкциями тАЬбАЬ).
Анализ проводили в стерильных 96-луночных планшетах для тканевых культур в стерильных условиях и все исследуемые лунки анализировали трижды. Приблизительно 2,2 нг/мл рекомбинантного экспрессированного в Е. сой ГЬ-4 яванского макака предварительно инкубировали с различными разведениями конструкций тАЬбАЬ (обычно от 200 нМ, раститрованными с 3-хкратными разведениями до 0,02 нМ) в общем объеме 50 мкл в течение 1 ч при 37°С. Эти образцы затем добавляли к 50 мкл клеток ТР-1 (в концентрации 2 х 105 клеток на мл) в стерильном 96-луночном планшете для тканевых культур. Таким образом, конечный анализируемый объем 100 мкл содержал различные разведения конструкций тАЬбАЬ (в конечной концентрации 100 нМ, раститрованные с 3-кратными разведениями до 0,01 нМ), рекомбинантный экспрессированный в Е. сой 1Ь-4 яванского макака (в конечной концентрации 1,1 нг/мл) и клетки ТР-1 (в конечной концентрации 1 х 105 клеток на мл). Планшет для анализа инкубировали при 37°С в течение приблизительно 3 суток в СО2 инкубаторе с увлажнением. Значение пролиферации клеток затем определяли с использованием 'Сс11Тйгс 96® Nοη-Каб^οас!^νс Сс11 РгойГсгайоп Аххау' от Рготсда (номер по каталогу С4100), как описано в инструкциях изготовителя. Оптическую плотность образцов в 96луночнорм планшете считывали в спектрофотометре для прочтения планшетов при 570 нм.
Способность конструкций тАЬбАЬ нейтрализовать биологическую активность рекомбинантного экспрессированного в Е. сой 1Ь-4 яванского макака выражали как концентрацию конструкции тАЬбАЬ, необходимую для нейтрализации биологической активности определенного количества 1Ь-4 яванского макака (1,1 нг/мл) на 50% (= ΝΏ50). Чем меньше необходимая концентрация конструкции тАЬбАЬ, тем выше нейтрализующая способность. Данные по ΝΏ50, представленные здесь, были вычислены либо вручную, либо с применением пакета программного обеспечения КоЬохадс, входящего в МюгохоГ! Ехсс1.
Способ 22. Ингибирование связывания человеческого 1Л-13 с альфа-2-рецептором человеческого ГЬ-13 (1Ь-13Ка2) согласно ЕЬ18А
Если не указано иное, все реагенты разводили до необходимой концентрации в блокирующем растворе (1% бычий сывороточный альбумин в забуференном Трис физиологическом растворе и 0,05% Т\уссп20) непосредственно перед применением. На планшет для ЕЬ18А в течение ночи при 4°С наносили химерную конструкцию рекомбинантного человеческого 1Ь-13Ка2/Рс, экспрессированную в клетках 8Г21 (Κ&Ό 8ух!стх, номер по каталогу 614-1К), в концентрации 5 мкг/мл в растворе буфера для сорбции (0,05 М бикарбонат, рН 9,6, 81дта С-3041). Планшет блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре в блокирующем растворе (1% В8А в забуференном Трис физиологическим растворе с Т\уссп20 (ТВ8Т)) перед добавлением различных концентраций тАЬбАЬ (или тАЬ или бАЬ положительного контроля), которые предварительно инкубировали с 30 нг/мл рекомбинантного человеческого ГЛ-13 (полученного в
- 36 023031
О8К) в течение 30 мин при 37°С. Планшеты инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре перед 3-кратной отмывкой отмывочным буфером (забуференным Трис физиологическим раствором и 0,05% Т\уееп20). В каждую лунку добавляли 50 мкл раствора биотинилированного антитела против человеческого 1Ь-13 (Р&Э 8ук!етк, номер по каталогу ВАР 213) в концентрации 0,5 мкг/мл и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшет отмывали три раза в буфере для отмывки перед добавлением подходящего разведения Ехйауабш (81дта, номер по каталогу Е2886). Через один час планшет отмывали и колориметрический сигнал детектировали инкубацией с пероксидазным субстратом 0РЭ (от 81дта), реакцию останавливали раствором для остановки реакции (3 М кислотой) и данные по оптической плотности получали считыванием на спектрофотометре для прочтения планшетов при 490 нм. Среднюю оптическую плотность и стандартную ошибку фиксировали в листе Ехсе1 и значения 1С50 вычисляли с применением программного обеспечения КоЬокаде от Мюгокой Ехсе1.
Способ 23. Оценка аффиности связывания В1асоге™ для связывания экспрессированного в Е. сой рекомбинантного 1Ь-13 яванского макака
Аффинность связывания молекул тАЬбАЬ (или тАЬ) для рекомбинантного экспрессированного в Е. сой 1Й-13 яванского макака оценивали анализом В1асоге™. Анализы проводили с использованием захвата белком А или антителом против человеческого 1дО. Кратко, белок А или антитело против человеческого 1дО сочетали с чипом СМ5 сочетанием первичных аминов в соответствии с рекомендациями изготовителя. Молекулы тАЬбАЬ (или тАЬ) затем иммобилизовали на этой поверхности и 1Й-13 яванского макака (изготовленный и очищенный в О8К) пропускали над чипом в определенных концентрациях. Поверхность восстанавливали до поверхности с белком А с использованием слабокислых условий элюирования, это не оказывало существенного влияния на способность иммобилизовать антитело для последующего связывания 1Й-13. Анализ проводили на аппарате В1асоге™ 3000 и/или Т100, данные анализировали с использованием программного обеспечения аппаратов для оценки и приспосабливали к модели связывания 1:1. Эксперименты В1асоге™ проводили при 25 или 37°С.
Способ 24. Оценка аффиности связывания В1асоге™ для связывания экспрессированного в Е. сой рекомбинантного 1Ь-4 яванского макака
Аффинность связывания молекул тАЬбАЬ (или тАЬ) для рекомбинантного экспрессированного в Е. сой 1Ь-4 яванского макака оценивали анализом В1асоге™. Анализы проводили с использованием захвата белком А или антителом против человеческого 1дО. Кратко, белок А или антитело против человеческого 1дО сочетали с чипом СМ5 сочетанием первичных аминов в соответствии с рекомендациями изготовителя. Молекулы тАЬбАЬ (или тАЬ) затем иммобилизовали на этой поверхности и 1Ь-4 яванского макака (изготовленный и очищенный в О8К) пропускали над чипом в определенных концентрациях. Поверхность восстанавливали до поверхности с белком А с использованием слабокислых условий элюирования (как например 100 мМ фосфорная кислота), это не оказывало существенного влияния на способность иммобилизовать антитело для последующего связывания 1Ь-4. Поверхность с антителом против человеческого 1дО восстанавливали либо с использованием условий, сходных с условиями для поверхности с белком А, либо с использованием 3 М МдС12. Анализ проводили на аппарате В1асоге™ 3000 и/или Т100 и/или А100, данные анализировали с использованием программного обеспечения аппаратов для оценки и приспосабливали к модели связывания 1:1. Эксперименты В1асоге™ проводили при 25 или 37°С.
Способ 25. Клеточный анализ нейтрализации 1Й-13
Активность тАЬбАЬ, имеющих специфичность в отношении 1Ь-13, анализировали в клеточном анализе 1Й-13 с использованием конструированной репортерной клеточной линии НЕК В1ие-8ТАТ6. К активации транскрипционного фактора 8ТАТ6 приводят, в первую очередь, два цитокина с перекрывающимися биологическими функциями, 1Ь-4 и 1Ь-13, связывающие рецепторный комплекс, состоящий из 1Ь-4Ральфа и 1Ь-13Ральфа1. При связывании лиганда рецепторный комплекс активирует рецепторассоциированные киназы йпшк (1АК1 и Тук2), приводя к рекрутингу 8ТАТ6 и его фосфорилированию. Активированный 8ТАТ6 образует гомодимер, перемещающийся в ядро, стимулируя транскрипцию генов под контролем восприимчивого промотора. Линия НЕК В1ие-8ТАТ6 конструирована для экспрессии секретируемой эмбриональной щелочной фосфатазы (8ЕАР) под контролем такого промотора.
Клетки высевали на 96-луночные планшеты и инкубировали в течение 20-24 ч с предуравновешенным человеческим 1Й-13 и исследуемыми молекулами. После такого периода инкубации с использованием системы Циапй-Ыие (1пу1уодеп) измеряли количество 8ЕАР, продуцируемой клетками в результате стимуляции 1Й-13.
Пример 1.
1. Получение тАЬбАЬ против двух мишеней тАЬбАЬ против двух мишеней, изложенные в табл. 1-4, конструировали следующим образом. Экспрессионные конструкции получали переносом последовательности, кодирующей однодоменное антитело на последовательность, кодирующую тяжелую цепь или легкую цепь (или и ту, и другую) моноклонального антитела, таким образом, что при экспрессии бАЬ присоединено С-концу тяжелой или легкой цепи. Для некоторых конструкций использовали линкерные последовательности для соединения одно- 37 023031 доменного антитела с тяжелой цепью СН3 или легкой цепью Ск. В других конструкциях однодоменное антитело присоединено непосредственно к тяжелой или легкой цепи без линкерной последовательности. Общее схематическое представление этих конструкций тΑЬάΑЬ показано на фиг. 8 (тяжелая цепь тΑЬ изображена серым; легкая цепь тΑЬ изображена белым; άΑЬ изображено черным).
Пример тΑЬάΑЬ 1 типа, как изложено на фиг. 8, может представлять собой ΡаδсοΗ-С4δ-474. Пример тΑЬάΑЬ 2 типа, как изложено на фиг. 8, может представлять собой Ρаδсο^-С4δ-474. Пример тΑЬάΑЬ 3 типа, как изложено на фиг. 8, может представлять собой ΡаδсοΗ^-С4δ-474. тΑЬάΑЬ 1 и 2 представляют собой тетравалентные конструкции, тΑЬάΑЬ 3 типа представляет собой гексавалентную конструкцию.
Схематическое представление, на котором изображена конструкция тяжелой цепи тΑЬάΑЬ (верхняя иллюстрация) или легкой цепи тΑЬάΑЬ (нижняя иллюстрация), показано ниже. Если не указано иное, для конструирования тΑЬάΑЬ, описанных в табл. 1-4, использовали эти сайты рестрикции.
ΗίηΰΙΙΙ 5ре1 ВатН1 ЕсоК1
линкер
ΗίηύΙΙΙ Βδΐννΐ ВатН1 ЕсоК1
| ск | 0АЬ |
ί линкер
Следует отметить, что для тяжелой цепи термин Ун представляет собой последовательность вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела; СН1, СН2 и СН3 представляют собой последовательности константной области тяжелой цепи человеческого 1дС1; линкер представляет собой последовательность определенной используемой линкерной области; άΑ^' представляет собой последовательность однодоменного антитела. Для легкой цепи термин УЕ представляет собой последовательность вариабельной области легкой цепи моноклонального антитела; Ск представляет собой последовательность человеческой константной области легкой цепи; линкер представляет собой последовательность определенной используемой линкерной области; άΑό представляет собой последовательность однодоменного антитела.
Некоторые экспрессионные ДНК-конструкции получали бс поуо синтезом олигонуклеотидов. В то же время другие экспрессионные ДНК-конструкции имели происхождение из существующих конструкций (которые получали, как описано выше) рестрикционным клонированием или сайт-направленным мутагенезом.
Эти конструкции (тяжелые или легкие цепи тΑЬάΑЬ) клонировали в векторы экспрессии млекопитающих (серии векторов К1п, Κΐά или рТТ) с применением стандартных молекулярно-биологических методик. В конструировании этих конструкций использовали аминокислотную сигнальную последовательность млекопитающих (как показано в δΕ^ ΙΌ NО: 64).
Для экспрессии тΑЬάΑЬ, где άΑЬ соединено с С-концевой областью тяжелой цепи моноклонального антитела, подходящий вектор экспрессии тяжелой цепи тΑЬάΑЬ сочетали с подходящим вектором экспрессии легкой цепи для данного моноклонального антитела. Для экспрессии тΑЬάΑЬ, где άΑЬ соединено с С-концевой областью легкой цепи моноклонального антитела, подходящий вектор экспрессии легкой цепи тΑЬάΑЬ сочетали с подходящим вектором экспрессии тяжелой цепи для данного моноклонального антитела.
Для экспрессии тΑЬάΑЬ, где άΑЬ соединено с С-концевой областью тяжелой цепи моноклонального антитела, и где άΑЬ соединено с С-концевой областью легкой цепи моноклонального антитела, подходящий вектор экспрессии тяжелой цепи тΑЬάΑЬ сочетали с подходящим вектором экспрессии легкой цепи тΑЬάΑЬ.
1.1. Используемая номенклатура и аббревиатуры
Моноклональное антитело (тΑЬ).
Моноклональные антитела (тΑЬ).
Однодоменное антитело (άΑ^.
Однодоменные антитела (άΑ^.
Тяжелая цепь (Н-цепь).
Легкая цепь (Ь-цепь).
Вариабельная область тяжелой цепи (Ун).
Вариабельная область легкой цепи (Уь).
Первая константная область тяжелой цепи человеческого 1дС1 (СН1).
Вторая константная область тяжелой цепи человеческого 1дС1 (СН2).
Третья константная область тяжелой цепи человеческого 1дС1 (СН3).
- 38 023031
Константная область человеческой легкой цепи каппа (Ск).
1.2. тАЬ против 1Ь-13-бАЬ против 1Ь-4
Биспецифичные тАЬ против 1Ь-13-бАЬ против 1Ь-4 конструировали, как описано выше. Для соединения однодоменных антител против 1Ь-4 с моноклональным антителом использовали несколько различных линкеров. Некоторые конструкции не имели линкера.
Следует отметить, что для клонирования линкеров и бАЬ либо в СН3 тяжелой цепи тАЬ, либо в С к легкой цепи тАЬ, использовали сайт клонирования ВатН1 (кодирующий аминокислотные остатки О и δ). Таким образом, в дополнение к данной линкерной последовательности, между линкерной последовательностью и однодоменным антителом присутствуют дополнительные аминокислотные остатки О и δ, как для экспрессионных конструкций тяжелой цепи, так и для экспрессионных конструкций легкой цепи, или между СН3 и линкерной последовательностью в некоторых, но не всех экспрессионных конструкциях тяжелой цепи. Тем не менее, при расположении линкера Ο4δ между тАЬ и бАЬ в формате тАЬбАЬ сайт клонирования ВатН1 уже присутствовал (ввиду аминокислотных остатков О и δ, входящих в последовательность линкера Ο4δ), и, таким образом, в конструкциях с использованием этого линкера между СН3 или Ск и однодоменным антителом не было дополнительных аминокислотных остатков О и δ. Без использования линкерной последовательности между тАЬ и бАЬ в формате тАЬбАЬ сайт клонирования ВатН1 (и, следовательно, аминокислотные остатки О и δ) все еще присутствовали СН3 или Ск и однодоменным антителом. Все подробности об аминокислотных последовательностях тяжелых и легких цепей тАЬбАЬ изложены в табл. 1.
В некоторых из следующих примеров в качестве контрольного антитела использовали тАЬ против 1Ь-4. Контрольное тАЬ против 1Ь-4, используемое в этих примерах, либо будет представлять собой антитело, имеющее последовательность тяжелой цепи δΕ^ ΙΌ ΝΟ: 14 и последовательность легкой цепи δΕ^ ΙΌ ΝΟ: 15, либо будет представлять собой антитело, имеющее последовательность тяжелой цепи δΕ^ ΙΌ ΝΟ: 166 и последовательность легкой цепи δΕ^ ΙΌ ΝΟ: 15. Оба эти тАЬ против 1Ь-4 имеют одинаковые СОК, и ожидают, что они обладают одинаковым связыванием, поэтому в следующих примерах оба эти антитела называют пасколизумабом или тАЬ против 1Ь-4.
В некоторых из следующих примеров в качестве контрольного антитела использовали тАЬ против 1Ь-5. Контрольное тАЬ против 1Ь-5, используемое в этих примерах, будет представлять собой либо антитело, имеющее последовательность тяжелой цепи δΕ^ ΙΌ ΝΟ: 65 и последовательность легкой цепи δΕ^ ΙΌ ΝΟ: 66, либо антитело, имеющее последовательность тяжелой цепи δΕ^ ΙΌ ΝΟ: 191 и последовательность легкой цепи δΕ^ ΙΌ ΝΟ: 66. Оба эти антитела против ΙΕ-5 имеют одинаковые СОК, и ожидают, что они обладают одинаковым связыванием, поэтому в следующих примерах оба эти антитела называют меполизумабом или тАЬ против ΙΕ-5.
тАЬбАЬ, изложенные в табл. 1, транзиторно экспрессировали в супернатантах клеток СНОК1. После количественной оценки на предмет тАЬбАЬ анализировали активность этих супернатантов, содержащих тАЬбАЬ, в Ε^IδА связывания ΙΕ-13 и ΙΕ-4.
Таблица 1
| Название | Описание | Идентификатор последовательности (ЗЕО ГО N0.) |
| 586Н-25 | Н-цепь = тяжелая цепь тАЬ против человеческого 11_-13-С5-с1АЬ ООМ9-155- 25 ί-цепь = легкая цепь тАЬ против человеческого 11_-13 | 16 (= Н-цепь) 13 (= ί-цепь) |
| 586Н-С45- | Н-цепь = тяжелая цепь тАЬ против | 20 (= Н-цепь) |
| 25 | человеческого Ιί-13-линкер О43-с1АЬ ϋΟΜ9-155-25 ί-цепь = легкая цепь тАЬ против человеческого Ιί-13 | 13 (= ί-цепь) |
| 586Н- | Н-цепь = тяжелая цепь тАЬ против | 24 (= Н-цепь) |
- 39 023031
ТХ/ААРЗ25 человеческого 11_-13-линкер ТХ/ААР8СЗ-ЬАЬ ϋΟΜ9-155-25 1_-цепь = легкая цепь тАЬ против человеческого 11_-13 (= !_-цепь)
586НАЗТКС-25
Н-цепь = тяжелая цепь тАЬ против человеческого 11_-13-05-линкер
АЗТКСРТ-СЗ-ЬАЬ ϋΟΜ9-155-25 1_-цепь = легкая цепь тАЬ против человеческого 11_-13 (= 13 (=
Н-цепь) ί-цепь)
586НЕРКЗС-25
Н-цепь = тяжелая цепь тАЬ против человеческого 11_-13-03-линкер
ЕРКЗСОКТНТСРРСР-ОЗ-ЬАЬ ϋΟΜ9155-25
1_-цепь = легкая цепь тАЬ против человеческого 11_-13 (= 13 (=
Н-цепь)
1_-цепь)
586НΕίΰίΕ-25
Н-цепь = тяжелая цепь тАЬ против человеческого 11_-13-линкер
Е1_С11_ЕЕЗСАЕАСЮСЕ1.ОС-е5-с1АЬ ϋΟΜ9-155-25 ί-цепь = легкая цепь тАЬ против человеческого 11_-13 (= 13 (=
Н-цепь) : !_-цепь)
586Н-147
Н-цепь = тяжелая цепь тАЬ против человеческого 11_-13-О5-с1АЬ ООМ9-155147
1_-цепь = легкая цепь тАЬ против человеческого 11_-13 (= 13 (=
Н-цепь) ί-цепь)
586Н-С43147
Н-цепь = тяжелая цепь тАЬ против человеческого 11_-13-линкер О43-с!АЬ ООМ9-155-147
1_-цепь = легкая цепь тАЬ против человеческого Н_-13 (= 13 (=
Н-цепь)
1_-цепь)
586НТХ/ААРЗН-цепь = тяжелая цепь тАЬ против человеческого Ιί-13-линкер ТХ/ААР525 (= 13 ( Н-цепь) ί-цепь)
- 40 023031
147
С8-с!АЬ ΟΟΜ9-155-147
Ь-цепь = легкая цепь тАЬ против человеческого 11_-13
586НА5ТКС147
Н-цепь = тяжелая цепь тАЬ против человеческого 11_-13-С5-линкер
АЗТКСРТ-СЗ-ЬАЬ ООМ9-155-147 Ь-цепь = легкая цепь тАЬ против человеческого 1Ь-13 (= 13 (=
Н-цепь)
Ь-цепь)
586НЕРК5С147
Н-цепь = тяжелая цепь тАЬ против человеческого 1Ь-13-СЗ-линкер
ЕРКЗСОКТНТСРРСР-ОЗ-ЬАЬ ϋΟΜ9155-147
Ь-цепь = легкая цепь тАЬ против человеческого 1Ь-13 (= 13 (=
Н-цепь)
Ь-цепь)
586НЕЬОЬЕ147
Н-цепь = тяжелая цепь тАЬ против человеческого 1Ь-13-СЗ-линкер
ЕЬОЬЕЕЗСАЕАООСЕЬОО-СЗ-с1АЬ ООМ9-155-147
Ь-цепь = легкая цепь тАЬ против человеческого 1Ь-13 (= 13 (=
Н-цепь)
Ь-цепь)
586Н-154
Н-цепь = тяжелая цепь тАЬ против человеческого 1Ь-13-СЗ-с1АЬ ООМ9-155154
Ь-цепь = легкая цепь тАЬ против человеческого 1Ь-13 (= 13 (=
Н-цепь)
Ь-цепь)
586Н-С43154
Н-цепь = тяжелая цепь тАЬ против человеческого 1Ь-13-линкер С43-0АЬ ООМ9-155-154
Ь-цепь = легкая цепь тАЬ против человеческого 1Ь-13 (= 13 (=
Н-цепь)
Ь-цепь)
586НТЛ/ААРЗ154
Н-цепь = тяжелая цепь тАЬ против человеческого 1Ь-13-линкер Т\/ААРЗСЗ-ЬАЬ ООМ9-155-154 (= 13(=
Н-цепь)
Ь-цепь)
- 41 023031
| ί-цепь = легкая цепь тАЬ против человеческого 11_-13 | ||
| 586Н- | Н-цепь = тяжелая цепь глАЬ против | 30 (= Н-цепь) |
| АЗТКС- | человеческого 11_-13-С8-линкер | 13 (= ί-цепь) |
| 154 | АЗТКОРТ-ОЗ-с1АЬ ООМ9-155-154 1_-цепь = легкая цепь тАЬ против человеческого 11_-13 | |
| 586Н- | Н-цепь = тяжелая цепь тАЬ против | 34 (= Н-цепь) |
| ЕРК8С- | человеческого 11_-13-С8-линкер | 13 (= !_-цепь) |
| 154 | ЕРК8С0КТНТСРРСР-С8-с!АЬ ϋΟΜ9- 155-154 1_-цепь = легкая цепь тАЬ против человеческого 11_-13 | |
| 586Н- | Н-цепь = тяжелая цепь тАЬ против | 38 (= Н-цепь) |
| ΕΙ_ΩΙ_Ε- | человеческого И-13-СЗ-линкер | 13 (= ί-цепь) |
| 154 | Е1_С)1_ЕЕЗСАЕАСЮеЕ1_ОС-еЗ-с1АЬ ООМ9-155-154 1_-цепь = легкая цепь тАЬ против человеческого 11_-13 | |
| 586Η-210 | Н-цепь = тяжелая цепь тАЬ против | 19 (= Н-цепь) |
| человеческого И-13-С8-с1АЬ ООМ9-112- 210 1_-цепь = легкая цепь тАЬ против человеческого 11_-13 | 13 (= 1_-цепь) | |
| 586Н-С43- | Н-цепь = тяжелая цепь тАЬ против | 23 (= Н-цепь) |
| 210 | человеческого 11.-13-линкер С43-с1АЬ ЭОМ9-112-210 1_-цепь = легкая цепь тАЬ против человеческого 11.-13 | 13 (= 1_-цепь) |
| 586Η- | Н-цепь = тяжелая цепь тАЬ против | 27 (= Н-цепь) |
| ТЛ/ААРЗ- | человеческого 11_-13-линкер Т\/ААРЗ- | 13 (= !_-цепь) |
| 210 | СЗ-с1АЬ ООМ9-112-210 ί-цепь = легкая цепь тАЬ против |
- 42 023031
| человеческого П_-13 | ||
| 586Н- А8ТКО- 210 | Н-цепь = тяжелая цепь тАЬ против человеческого Ιί-13-05-линкер А5ТКОРТ-С5-с1АЬ ООМ9-112-210 1_-цепь = легкая цепь тАЬ против человеческого Ιί-13 | 31 (= Н-цепь) 13 (= 1_-цепь) |
| 586Н- ЕРК5С- 210 | Н-цепь = тяжелая цепь тАЬ против человеческого Ιί-13-СЗ-линкер ЕРКЗСОКТНТСРРСР-ОЗ-ЬАЬ ϋΟΜ9- 112-210 1_-цепь = легкая цепь тАЬ против человеческого Ιί-13 | 35 (= Н-цепь) 13 (= (.-цепь) |
| 586Н- ΕίΟίΕ- 210 | Н-цепь = тяжелая цепь тАЬ против человеческого Ιί-13-СЗ-линкер Е1_С11_ЕЕЗСАЕАаОСЕ1_ОС-ОЗ-с1АЬ ООМ9-112-210 ί-цепь = легкая цепь тАЬ против человеческого 11_-13 | 39 (= Н-цепь) 13 (= ί-цепь) |
| 586Н | Н-цепь = тяжелая цепь тАЬ против человеческого Ιί-13-05- 1_-цепь = легкая цепь тАЬ против человеческого Ιί-13 | 40 (= Н-цепь) 13 (= ί-цепь) |
| 586Н- АЗТКО | Н-цепь = тяжелая цепь тАЬ против человеческого Ιί-13-05-линкер А5ТКОРТ-С5- 1_-цепь = легкая цепь тАЬ против человеческого 11.-13 | 41 (= Н-цепь) 13 (= ί-цепь) |
| 586Н- ЕРК8С- 210 | Н-цепь = тяжелая цепь тАЬ против человеческого Ιί-13-03-линкер ЕРК5СОКТНТСРРСР-О5- 1_-цепь = легкая цепь тАЬ против человеческого 11_-13 | 42 (= Н-цепь) 13 (= ί-цепь) |
| 586Н- | Н-цепь = тяжелая цепь тАЬ против | 43 (= Н-цепь) |
| ΕίΩίΕ | человеческого Iί-13-03-линкер Е1_О1_ЕЕ5САЕАСЮСЕ1_ОС-С5- ί-цепь = легкая цепь тАЬ против человеческого 11_-13 | 13 (= ί-цепь) |
тАЬйАЬ. изложенные в табл. 2. экспрессировали в супернатантах клеток СНОК1 и/или СНОЕ1а. очищали и анализировали в нескольких анализах на активность 1Ь-1З и 1Ь-4.
- 4З 023031
Таблица 2
| Название | Описание | Идентификатор последовательности (5ЕО ГО N0:) |
| 586Н- | Н-цепь = тяжелая цепь тАЬ | 24 (= Н-цепь) |
| ΤνΑΑΡδ-25 | против человеческого И-13- линкер Т\/ААРЗ-СЗ-с1АЬ ϋΟΜ9- 155-25 1_-цепь = легкая цепь тАЬ против человеческого Н_-13 | 13 (= 1_-цепь) |
| 586Н- | Н-цепь = тяжелая цепь тАЬ | 26 (= Н-цепь) |
| ТХ/ААРЗ- | против человеческого 11_-13- | 13 (= 1_-цепь) |
| 154 | линкер Т\/ААРЗ-СЗ-с1АЬ ϋΟΜ9- 155-154 1_-цепь = легкая цепь тАЬ против человеческого 11_-13 | |
| 586Н- | Н-цепь = тяжелая цепь тАЬ | 27 (= Н-цепь) |
| ΤΧΖΑΑΡδ- | против человеческого И-13- | 13 (= !_-цепь) |
| 210 | линкер Т\/ААРЗ-ОЗ-с1АЬ ϋΟΜ9- 112-210 Ь-цепь = легкая цепь тАЬ против человеческого И-13 |
1.3. тАЬ против 1Ь-4-дАЬ против 1Б-13
Биспецифичные тАЬ против 1Ь-4-дАЬ против 1Б-13 конструировали, как описано выше. Для соединения однодоменных антител против 1Б-13 с моноклональным антителом использовали несколько различных линкеров. Некоторые конструкции не имели линкера.
Следует отметить, что для клонирования линкеров и с!АЬ либо в СН3 тяжелой цепи тАЬ, либо в Ск легкой цепи тАЬ, использовали сайт клонирования ВатН1 (кодирующий аминокислотные остатки О и 8). Таким образом, в дополнение к данной линкерной последовательности, между линкерной последовательностью и однодоменным антителом присутствуют дополнительные аминокислотные остатки О и 8, как для экспрессионных конструкций тяжелой цепи, так и для экспрессионных конструкций легкой цепи, или между СН3 и линкерной последовательностью в некоторых, но не всех экспрессионных конструкциях тяжелой цепи. Тем не менее, при расположении линкера О48 между тАЬ и с!АЬ в формате тАМАЬ сайт клонирования ВатН1 уже присутствовал (ввиду аминокислотных остатков О и 8, входящих в последовательность линкера О48), и, таким образом, в конструкциях с использованием этого линкера между СН3 или Ск и однодоменным антителом не было дополнительных аминокислотных остатков О и 8. Без использования линкерной последовательности между тАЬ и с!АЬ в формате тАМАЬ сайт клонирования ВатН1 (и, следовательно, аминокислотные остатки О и 8) все еще присутствовали СН3 или Ск и однодоменным антителом. Все подробности об аминокислотных последовательностях тяжелых и легких цепей тАЬЬАЬ изложены в табл. 3.
тАЬдАЬ, изложенные в табл. 3, транзиторно экспрессировали в супернатантах клеток СНОК1. После количественной оценки на предмет тАЬЬАЬ анализировали активность этих супернатантов, содержащих тАЬдАЬ, в ЕЫ8А связывания 1Б-13 и 1Б-4.
Таблица 3
| Название | Описание | Идентификатор последовательности (5ЕО Ю ΝΟ:) |
| РазсоН- 474 | Н-цепь = тяжелая цепь пасколизумаба-С8-с!АЬ ϋΟΜΙΟ-53- 474 | 48 (= Н-цепь) 15 (= Ь-цепь) |
- 44 023031 ί-цепь = легкая цепь пасколизумаба
РазсоНС43-474
Н-цепь = тяжелая цепь пасколизумаба-линкер С45-6А6 ΩΟΜ10-53-474 ί-цепь = легкая цепь пасколизумаба (= Н-цепь) 15 (= ί-цепь)
РазсоНТЛ/ААР8474
Н-цепь = тяжелая цепь пасколизумаба-линкер Т\/ААР5-С5с!АЬ ϋΟΜ10-53-474 ί-цепь = легкая цепь пасколизумаба (= Н-цепь) 15 (= ί-цепь)
РазсоНАЗТКС-474
Н-цепь = тяжелая цепь пасколизумаба-СЗ-линкер АЗТКСРТС5-с1АЬ ΩΟΜ10-53-474 ί-цепь = легкая цепь пасколизумаба (= Н-цепь) 15 (= ί-цепь)
РазсоНЕРКЗС-474 цепь
РазсоНΕίΟίΕ-474
Ρ85θθί-474
РазсоЬС43-474
РазсоЮ
Τλ/ΑΑΡδН-цепь = тяжелая пасколизумаба-СЗ-линкер ЕРКЗСОКТНТСРРСР-СЗ-бАЬ ΩΟΜ10-53-474 ί-цепь = легкая цепь пасколизумаба
Н-цепь = тяжелая пасколизумаба-СЗ-линкер ΕίΟίΕΕδΟΑΕΑΩΟΟΕίΟΟ-Οδ-άΑΡ ΩΟΜ10-53-474 ί-цепь = легкая цепь пасколизумаба тяжелая цепь цепь (= Н-цепь) 15 (= ί-цепь) (= Н-цепь) 15 (= ί-цепь)
Н-цепь = пасколизумаба ί-цепь = легкая цепь пасколизумабаСЗ-бАЬ ΩΟΜ10-53-474
Н-цепь = пасколизумаба ί-цепь = легкая цепь пасколизумабалинкер С43-с!АЬ ΩΟΜ10-53-474
Н-цепь = пасколизумаба тяжелая цепь тяжелая цепь (= Н-цепь) 54 (= ί-цепь) (= Н-цепь) 55 (= ί-цепь) (= Н-цепь) 56 (= ί-цепь)
- 45 023031
| 474 | ί-цепь = легкая цепь пасколизумаба- линкер ТУААРЗ-65-с1АЬ ϋΟΜΙΟ-53- 474 | |
| Ра5со1_- | Н-цепь = тяжелая цепь | 14 (= Н-цепь) |
| А5ТК6-474 | пасколизумаба ί-цепь = легкая цепь пасколизумаба- линкер АЗТК6РТ-68-с1АЬ ϋΟΜ 10-53474 | 57 (= ί-цепь) |
| РазсоЬ- | Н-цепь = тяжелая цепь | 14 (= Н-цепь) |
| ЕРК5С-474 | пасколизумаба ί-цепь = легкая цепь пасколизумаба- линкер ЕРКЗСОКТНТСРРСР-еЗ-бАЬ ϋΟΜ10-53-474 | 58 (= ί-цепь) |
| РазсоЬ | Н-цепь = тяжелая цепь | 14 (= Н-цепь) |
| ΕίΟίΕ-474 | пасколизумаба ί-цепь = легкая цепь пасколизумаба- линкер Εί0ίΕΕ50ΑΕΑ006Είϋ6- 63-с1АЬ ϋΟΜ10-53-474 | 59 (= ί-цепь) |
тАЬбАЬ, изложенные в табл. 4, экспрессировали в одних или более из клеток СНОК1, СНОЕ1а и НЕК293-6Е.
Таблица 4
| Название | Описание | Идентификатор последовательности (ЗЕО ГО ΝΟ;) | |
| РазсоН- | Н-цепь = тяжелая | цепь | 49 (= Н-цепь) |
| 645-474 | пасколизумаба-линкер 645-с1АЬ | 15 (= ί-цепь) | |
| ϋΟΜ 10-53-474 ί-цепь = легкая пасколизумаба | цепь | ||
| РазсоН-474 | Н-цепь = тяжелая | цепь | 48 (= Н-цепь) |
| пасколизумаба -63-с!АЬ | ЭОМЮ- | 15 (= ί-цепь) | |
| 53-474 | |||
| ί-цепь = легкая | цепь | ||
| пасколизумаба | |||
| РазсоП | Н-цепь = тяжелая | цепь | 14 (= Н-цепь) |
| 643-474 | пасколизумаба ί-цепь = легкая | цепь | 55 (= ί-цепь) |
| пасколизумаба-линкер 645-бАЬ | |||
| ϋΟΜ 10-53-474 | |||
| РазсоНЬ | Н-цепь = тяжелая | цепь | 49 (= Н-цепь) |
| 643-474 | пасколизумаба-линкер 645-бАЬ | 55 (= ί-цепь) | |
| ϋΟΜ10-53-474 | |||
| ί-цепь = легкая | цепь | ||
| пасколизумаба-линкер 645-бАЬ | |||
| ϋΟΜ 10-53-474 |
1.4. Идентификационные номера последовательностей для моноклональных антител, однодоменных антител и линкеров
Идентификационные номера последовательностей для моноклональных антител (тАЬ), однодоменных антител (бАЬ) и линкеров, используемых для получения тАЬбАЬ, показаны ниже в табл. 5.
- 46 023031
Таблица 5
| Название | Специфичность | Идентификационный номер последовательности |
| Моноклональное антитело против человеческого Н_-13 (также известное как 586) | Человеческий 11_-13 | 12 (Н-цепь) 13 (1_-цепь) |
| Моноклональное антитело против человеческого ΙΙ_-4 (также известное как пасколизумаб) | Человеческий И-4 | 14 (Н-цепь) 15 (1_-цепь) |
| Однодоменное антитело ϋΟΜ10-53-474 | Человеческий 11_-13 | 5 |
| Моноклональное антитело против человеческого Н_-13 (также известное как 656) | Человеческий ΙΙ--13 | 161(Н-цепь) 156 (1-цепь) |
| Однодоменное антитело ϋΟΜ9-112-210 | Человеческий П_-4 | 4 |
| Однодоменное антитело ϋΟΜ10-53-616 | Человеческий 11_-13 | 148 |
| Однодоменное антитело ООМ9-155-25 | Человеческий ΙΙ.-4 | 1 |
| Однодоменное антитело ООМ9-155-147 | Человеческий П_-4 | 2 |
| Однодоменное антитело ООМ9-155-154 | Человеческий П_-4 | 3 |
| Последовательность линкера А5ТКСР5 | Имеет происхождение из Н-цепи человеческого 1дО1 (УН-СН1) | 9 |
| Последовательность линкера АЗТКСРТ | Имеет происхождение из Н-цепи человеческого 1дС1 (УН-СН1), где последний аминокислотный остаток нативной последовательности (3) был заменен на Т | 8 |
| Последовательность линкера ЕРК5С0КТНТСРРСР | Имеет происхождение из Н-цепи человеческого 1дС1 (СН1-СН2) | 10 |
| Последовательность линкера Т\/ААРЗ | Имеет происхождение из человеческой 1_-цепи каппа (\/1_-Ск) | 7 |
| Последовательность линкера ЕЮ1_ЕЕ5САЕАСЮСЕ1_ОС | Имеет происхождение из цепи СНЗ человеческого 1д61 | 11 |
| Последовательность линкера СССС5 | Последовательность опубликованного линкера | 6 |
- 47 023031
Зрелая аминокислотная последовательность человеческого 1Ь-13 (без сигнальной последовательности) приведена в 8ЕЦ ГО N0: 63.
Зрелая аминокислотная последовательность человеческого 1Ь-4 (без сигнальной последовательности) приведена в 8ЕЦ ГО N0: 62.
1.5. Экспрессия и очистка тАЬбАЬ
Экспрессионными конструкциями тАЬбАЬ, описанными в примере 1, трансфицировали одни или более из клеток СНОК1, клеток СНОЕ1а и клеток НЕК293-6Е, экспрессировали эти конструкции в небольшом (приблизительно 3 мл), среднем (приблизительно от 50 до 100 мл) или укрупненном (приблизительно 1 л) масштабе и затем некоторые из конструкций очищали с использованием колонок с иммобилизованным белком А и количественно оценивали считыванием оптической плотности при 280 нм.
1.6. Гель-хроматографические анализы очищенных тАЬбАЬ
Некоторые тАЬбАЬ анализировали гель-хроматографией (8ЕС) и электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (8Э8-РАСЕ). Репрезентативные данные для некоторых из этих молекул (РаксоН-С48-474, РаксоЬ-С48-474, РаксоН-474 и РаксоНЬ-С48-474) показаны на фиг. 9, 10, 11 и 12 соответственно. Репрезентативные данные, демонстрирующие 8ЕС- и 808-РАСЕ-анализ этих молекул с удаленным мотивом С8 показаны на фиг. 90-98.
В некоторых случаях 8ЕС применяли для дополнительной очистки этих молекул для удаления агрегатов.
Пример 2. Связывание тАЬбАЬ с человеческим ГО-13 и человеческим ГО-4 согласно ЕЫ8А
2.1. Связывание тАЬ против ГО-13-бАЬ против ГО-4 с ГО-13 и ГО-4
Супернатанты с тАЬбАЬ исследовали на предмет связывания с человеческим ГО-13 в ЕЫ8А прямого связывания (как описано в способе 1). Эти данные показаны на фиг. 13.
На фиг. 13 показано, что все эти тАЬ против ГО-13-бАЬ против ГО-4 связывали ГО-13. Связывающая активность этих тАЬбАЬ была также приблизительно эквивалентна (в пределах 2-3 раз) очищенному тАЬ против человеческого ГО-13 самому по себе, которое было включено в этот анализ в качестве положительного контроля связывания ГО-13 и для непосредственного сравнения с тАЬбАЬ. Очищенное тАЬ против человеческого ГО-4 (пасколизумаб) было включено в качестве отрицательного контроля связывания ГО-13.
Эти молекулы также исследовали на предмет связывания с человеческим ГО-4 в ЕЫ8А прямого связывания (как описано в способе 2). Эти данные показаны на фиг. 14.
На фиг. 14 показано, что все эти тАЬ против ГО-13-бАЬ против ГО-4 связывали ГО-4, но в связывании ГО-4 наблюдали некоторую вариабельность. Связывания ГО-4 не наблюдали, если в конструкции тАЬбАЬ присутствовало бАЬ против ГО-4. Очищенное тАЬ против человеческого ГО-13 было также включено в качестве отрицательного контроля связывания с ГО-4. Следует отметить, что бАЬ против ГО-4 сами по себе не были исследованы в данном анализе ввиду невозможности выявления бАЬ вторичным антителом для выявления; вместо этого, очищенное тАЬ против человеческого ГО-4 (пасколизумаб) использовали в качестве положительного контроля для демонстрации связывания ГО-4 в этом анализе.
Очищенные образцы тАЬбАЬ также исследовали на предмет связывания с человеческим ГО-13 в ЕЫ8А прямого связывания (как описано в способе 1). Эти данные показаны на фиг. 15.
Эти очищенные тАЬ против ГО-13-бАЬ против ГО-4 связывали ГО-13. Связывающая активность этих тАЬбАЬ в отношении ГО-13 была эквивалентна связывающей активности очищенного тАЬ против человеческого ГО-13 самого по себе. тАЬ того же изотипа (со специфичностью в отношении постороннего антигена) было также включено в качестве отрицательного контроля связывания ГО-13 в этом анализе.
Эти очищенные тАЬбАЬ также исследовали на предмет связывания с человеческим ГО-4 в ЕЫ8А прямого связывания (как описано в способе 2). Эти данные показаны на фиг. 16.
Все эти тАЬ против ГО-13-бАЬ против ГО-4 связывали ГО-4. Следует отметить, что бАЬ против ГО-4 сами по себе не были исследовалы в данном анализе ввиду невозможности выявления бАЬ вторичным антителом для выявления; вместо этого, очищенное тАЬ против человеческого ГО-4 (пасколизумаб) использовали в качестве положительного контроля для демонстрации связывания ГО-4 в этом анализе. тАЬ того же изотипа (со специфичностью в отношении постороннего антигена) было также включено в качестве отрицательного контроля связывания ГО-4 в этом анализе.
2.2. Связывание тАЬ против ГО-4-бАЬ против ГО-13 с ГО-13 и ГО-4
Супернатанты с тАЬбАЬ исследовали на предмет связывания с человеческим ГО-4 в ЕЫ8А прямого связывания (как описано в способе 2). Эти данные показаны на фиг. 17 (некоторые образцы были приготовлены и исследованы дважды и это снабжено примечаниями образец 1 и образец 2).
На фиг. 17 показано, что все эти тАЬбАЬ связывали ГО-4. В данный анализ было включено очищенное тАЬ против человеческого ГО-4 само по себе (пасколизумаб), однако для него не было получено кривой связывания из-за ошибки при разведении данного тАЬ для использования в анализе (пасколизумаб был успешно использован во всех других последующих ЕЫ8А связывания ГО-4). Очищенное тАЬ против человеческого ГО-13 было включено в качестве отрицательного контроля связывания ГО-4.
Те же супернатанты тАЬбАЬ также исследовали на предмет связывания с человеческим ГО-13 в ЕЫ8А прямого связывания (как описано в способе 1). Эти данные показаны на фиг. 18 (некоторые об- 48 023031 разцы были приготовлены и исследованы дважды и это снабжено примечаниями образец 1 и образец 2).
На фиг. 18 показано, что все эти тΑЬ против ΙΕ-4-άΑό против Ш-13 связывали Ш-13. В данный анализ было включено очищенное тΑЬ против человеческого Ш-13 само по себе, однако для него не было получено кривой связывания из-за ошибки при разведении данного тΑЬ для использования в анализе (очищенное тΑЬ против человеческого Ш-13 было успешно использовано во всех последующих ΕίΙδΑ связывания Ш-13). Очищенное тΑЬ против 1Ь-4 (пасколизумаб) было включено в качестве отрицательного контроля связывания Ш-13. Следует отметить, что άΑЬ против Ш-13 само по себе (ЭОМ1053-474) не было исследовано в данном анализе ввиду невозможности выявления этого άΑЬ вторичным идентифицирующим антителом.
Очищенные тΑЬ против ΙΕ-4-άΑό против Ш-13 Ρа5СοΗ-С4δ-474, РаксоН-474, Ρ;·ΐ5^Ε^4δ-474 и Ρ;-^οΗΕ^4δ-474 также исследовали на предмет связывания с человеческим 1Ь-4 в Εί-ΙδΑ прямого связывания (как описано в способе 2). Эти данные показаны на фиг. 19.
Эти очищенные тΑЬ против Ш-4-άΑό против Ш-13 связывали 1Ь-4. Связывающая активность этих тΑЬάΑЬ была приблизительно эквивалентна (в пределах 2 раз) очищенному тΑЬ против Ш-4 самому по себе (пасколизумабу). тΑЬ того же изотипа (со специфичностью в отношении постороннего антигена) было также включено в качестве отрицательного контроля связывания с Ш-4 в этом анализе.
Те же очищенные тΑЬ против ΙΡ-4-άΑό против ΙΕ-13 Ρа5СοΗ-С4δ-474, РаксоН-474, Ρ;·^οΕ^4δ-474 и Ρ;·^οΗΕ^4δ-474 также исследовали на предмет связывания с человеческим Ш-13 в Εί-ΙδΑ прямого связывания (как описано в способе 1). Эти данные показаны на фиг. 20А.
Эти очищенные тΑЬ против Ш-4-άΑό против Ш-13 связывали Ш-13. тΑЬ того же изотипа (со специфичностью в отношении постороннего антигена) было также включено в качестве отрицательного контроля связывания Ш-13 в этом анализе. Следует отметить, что άΑЬ против Ш-13 само по себе (ЭОМ10-53-474) не было исследовано в данном анализе ввиду невозможности выявления άΑЬ вторичным антителом для выявления; вместо этого, тΑЬ против человеческого Ш-13 использовали в качестве положительного контроля для демонстрации связывания ΙΕ-13 в этом анализе.
Очищенные РаксоН-474, Ρа5СοΗ-ΤVΑΑΡδ-474, Ρа5СοΗ-ΑδΤКС-474 и Ра5соН-ВЬрЬВ-474 также исследовали на предмет связывания с ΙΕ-13 яванского макака в Εί-ΙδΑ прямого связывания, как описано в способе 17. (В данный анализ были также включены РаксоН-474 с удаленным Сδ и Ρа5СοΗ-ΤVΑΑΡδ-474 с удаленным Сδ, конструирование этих молекул описано в примере 18). График, на котором показаны репрезентативные данные, показан на фиг. 20Б.
Все очищенные РаксоН-474, Ρа5СοΗ-ΤVΑΑΡδ-474, Ρа5СοΗ-ΑδΤКС-474 и Ρа5СοΗ-В^^^В-474 связывали ΙΕ-13 яванского макака. Очищенное тΑЬ против человеческого Ш-4 само по себе (пасколизумаб) было включено в данный анализ в качестве отрицательного контроля связывания с ΙΕ-13. Очищенное тΑЬ против человеческого ΙΕ-13 было включено в качестве положительного контроля связывания ΙΕ-13 яванского макака. Следует отметить, что άΑЬ против ΙΕ-13 само по себе (ЭОМ10-53-474) не было исследовано в данном анализе ввиду невозможности выявления άΑЬ вторичным антителом для выявления; вместо этого, тΑЬ против человеческого ΙΕ-13 использовали в качестве положительного контроля для демонстрации связывания ΙΕ-13 в этом анализе.
Пример 3. Связывание тΑЬάΑЬ с человеческим ΙΕ-13 и человеческим Ш-4 согласно поверхностному плазмонному резонансу (ВШсогс™)
3.1. Связывание тΑЬ против ΙΕ-13-άΑό против Ш-4 с ΙΕ-13 и Ш-4 согласно ВШсогс™ тΑЬάΑЬ (в супернатантах клеток СНО, приготовленных, как описано в разделе 1.5) исследовали на предмет связывания с человеческим ΙΕ-13 с применением ВШсогс™ при 25°С (как описано в способе 4). Для данного набора данных оценивали кривые при двух концентрациях ΙΕ-13 (100 и 1 нМ) и для каждой конструкции тΑЬάΑЬ достигали уровней связывания в относительных единицах ответа от 1000 до 1300 (приближенно). Ввиду ограниченного числа использованных концентраций ΙΕ-13 полученные данные больше подходят для ранжирования конструкций, чем для точных кинетических измерений. Эти данные показаны в табл. 6.
- 49 023031
| Антитело | Таблица 6 | Аффинность связывания (Ко (нМ)) |
| 586Н-25 | 0,39 | |
| 586Н-С48-25 | 0,41 | |
| 586Η-ΤνΑΑΡδ-25 | 0,5 | |
| 586Н-АЗТКС-25 | 0,54 | |
| 586Н-ЕРК5С-25 | 0,55 | |
| 586Н-Е1_01_Е-25 | 0,42 | |
| 586Н-147 | 0,46 | |
| 586Н-645-147 | 0,45 | |
| 586Η-ΊΛ/ΑΑΡ3-147 | 0,56 | |
| 586Н-А8ТКС-147 | 0,44 | |
| 586Н-ЕРКЗС-147 | 0,46 | |
| 586Н-Е1_01-Е-147 | 0,51 | |
| 586Н-154 | 0,46 | |
| 586Η-Θ43-154 | 0,37 | |
| 586Н-Т\/ААР8-154 | 0,56 | |
| 586Н-АЗТКС-154 | 0,44 | |
| 586Н-ЕРК8С-154 | 0,42 | |
| 586Н-ЕЮ1-Е-154 | 0,44 | |
| 586Н-210 | 0,44 | |
| 586Н-С43-210 | 0,42 | |
| 586Н-Т\/ААР8-210 | 0,4 | |
| 586Н-АЗТКС-2Ю | 0,4 | |
| 586Н-ЕРКЗС-210 | 0,43 | |
| 586Н-ЕЮ1.Е-210 | 0,43 | |
| 586Н | 0,44 | |
| 586Н-А8ТКС | 0,32 | |
| 586Η-ΕΙ_0Ι_Ε | 0,47 | |
| 586Н-ЕРКЗС | 0,45 | |
| тАЬ против человеческого 11_-13 (очищенное) | 0,38 | |
| Пасколизумаб (очищенный) | нет связывания |
Все эти тАЬ против ΙΌ-13-бАЬ против 1Ь-4 связывали ΙΌ-13 со сходными аффинностями связывания, которые были приблизительно эквивалентны аффинности связывания очищенного тАЬ против человеческого ΙΌ-13 самого по себе. Эти данные предполагали, что присоединение линкеров и/или бАЬ против 1Ь-4 к тяжелой цепи тАЬ против ΙΌ-13 не влияло на аффинность связывания тАЬ-компонента этих конструкций тАЬбАЬ для ΙΌ-13.
Эти таЬбаЬ также исследовали на предмет связывания с человеческим ίί-4 с применением Ыасоге™ при 25°с (как описано в способе 5). Эти данные показаны в табл. 7. Для данного набора данных оценивали кривые при четырех концентрациях 1Ь-4 (512, 128 32 и 8 нМ), и приблизительные уровни связывания в относительных единицах ответа для каждого исследованного тАЬбАЬ указаны в таблице. Следует отметить, что бАЬ против 1Ь-4 сами по себе не были исследованы в данном анализе, поскольку бАЬ не могут быть иммобилизованы на чипе СМ5, покрытом белком А или антителом против человеческого 1дО; вместо этого, тАЬ против человеческого 1Ь-4 (пасколизумаб) использовали в качестве положительного контроля для демонстрации связывания 1Ь-4 в этом анализе.
- 50 023031
Таблица 7
| Антитело | Уровень связывания | Скорость ассоциации (ка, Мс'1) | Скорость диссоциации (ка, с4) | Аффинность связывания (Κϋ (нМ)) |
| 586Н-25 | 864 | 6,13е3 | 4,11е-4 | 67 |
| 586Н-С45-25 | 1818 | 6,ЗеЗ | 9,54е-4 | 151 |
| 586Н-Т\/ААРЗ-25 | 673 | 1,27е5 | 1,2е-4 | 0,95 |
| 586Н-АЗТКО-25 | 809 | 5,4е5 | 1,20е-3 | 21,8 |
| 586Н-ЕРКЗС-25 | 748 | 4,79е4 | 1,42е-3 | 29,6 |
| 586Н-Е1_О1_Е-25 | 603 | 1,26е6 | 1,63е-6 | 0,001* |
| 586Н-147 | 1095 | 3,42е3 | 1,18е-3 | 344,8 |
| 586Н-О43-147 | 1200 | 4,21еЗ | 4,57е-4 | 108,5 |
| 586Η-ΊΛ/ΑΑΡ8- 147 | 433 | 6,62е4 | 6,69е-7 | 0,011** |
| 586Н-А5ТКС-147 | 1248 | 3,67е4 | 6,9е-4 | 18,8 |
| 586Н-ЕРК5С-147 | 878 | 2,54е4 | 6,71 е-4 | 26,4 |
| 586Н-Е1_СН_Е-147 | 676 | 7,01е5 | 1,52е-5 | 0,027* |
| 586Н-154 | 436 | 6,1еЗ | 1,74е-3 | 285 |
| 586Н-С43-154 | 1437 | 5,00еЗ | 6,85е-4 | 137,8 |
| 586Η-ΊΛ/ΑΑΡ3- 154 | 1530 | 6,44е4 | 1,15е-7 | 0,002** |
| 586Н-АЗТКО-154 | 1373 | 3,26е4 | 2,84е-4 | 8,7 |
| 586Н-ЕРКЗС-154 | 794 | 3,03е4 | 5,7е-4 | 18,8 |
| 586Н-Е1_01_Е-154 | 795 | 1,25е6 | 3,57е-6 | 0,003* |
| 586Н-210 | 1520 | не определена | не определена | |
| 586Н-С45-210 | 1448 | не определена | не определена | |
| 586Н-В/ААРЗ- 210 | 1693 | не определена | не определена | |
| 586Н-А5ТКО-2Ю | 1768 | не определена | не определена | |
| 586Н-ЕРКЗС-210 | 1729 | не определена | не определена | |
| 586Η-ΕίΩίΕ-210 | 1350 | не определена | не определена | |
| 586Н | 1500 | нет связывания | нет связывания | |
| 586Н-А5ТКС | 1615 | нет связывания | нет связывания | |
| 586Η-ΕΙ_ΟΙ_Ε | 343 | нет связывания | нет связывания | |
| 586Н-ЕРКЗС | 1416 | нет связывания | нет связывания | |
| Пасколизумаб (очищенный) | 1092 | 2,04е6 | 1,23е-4 | 0,060 |
В отношении некоторых из наборов данных, приведенных выше, были получены предупреждения. Для некоторых наборов данных было получено неудовлетворительное соответствие кривым (*), таким образом, фактические значения аффинности связывания, определенные для этих данных, следует рассматривать с осторожностью. Для некоторых кривых наблюдали положительную диссоциацию (**), таким образом, фактические значения аффинности связывания, определенные для этих данных, следует рассматривать с осторожностью. В дополнение, с применением ШАсоге141 было невозможно определить
- 51 023031 скорости ассоциации и диссоциации для всех конструкций тАЬбАЬ, включающих бАЬ ООМ9-112-210, ввиду исключительно прочного связывания этих тАЬбАЬ с 1Ь-4 (то есть, В1Асоге™ был недостаточно чувствителен). Определению кинетики связывания этих тАЬбАЬ в отношении II ,-4 также препятствовали наблюдаемые положительные эффекты диссоциации. Эти данные показаны на фиг. 21.
Сходные данные были получены в дополнительном эксперименте. Эти данные показаны на фиг. 22.
Эти 2 независимых набора данных указывали на то, что все тАЬ против 1Ь-13-бАЬ против 1Ь-4 связывали II ,-4. но аффинности связывания варьировали в зависимости от линкера, используемого для соединения бАЬ против П.-4 и тяжелой цепи тАЬ против 1Ь-13. В данном эксперименте было обнаружено, что присутствие линкера повышало аффинность связывания компонента бАЬ против II .-4 в отношении 1Ь-4 (при расположении на тяжелой цепи) в формате тАЬбАЬ. Например, молекулы, имеющие линкеры ТУААРЗ или Е^^^ЕЕЗСАЕА^^СЕ^^С, по-видимому, являются более активными связывающими агентами. Отсутствие связывания с 1Ь-4 наблюдали при отсутствии бАЬ против II .-4 в конструкции тАЬбАЬ. Было невозможно определить аффинность связывания тАЬбАЬ 586-линкер-210 в отношении П.-4. ввиду того факта, что компонент ООМ9-112-210 этих пзАЫ.АЬ обладает очень прочным связыванием и поэтому скорость диссоциации была слишком мала для определения с применением В1Асоге™.
Очищенные тАЬ против 1Ь-13-бАЬ против П.-4 также исследовали на предмет связывания с человеческим 1Ь-13 и человеческим 1Ь-4 с применением В1Асоге™ при 25°С (как описано в способах 4 и 5). Эти данные показаны в табл. 8.
Таблица 8
| Конструкция | Аффинность связывания (Κϋ (нМ)) | |
| Человеческий 1Ь-13 | Человеческий 11_-4 | |
| 586Н-ТУААРЗ-25 | 0,38 | 1,1 |
| 586Н-ТУААРЗ-154 | 0,41 | 0,49 |
| 586Н-ТУААРЗ-210 | 0,38 | Очень прочное связывание (невозможно определить Ко ввиду положительных эффектов диссоциации и уровня чувствительности методики В1Асоге™) |
| тАЬ против человеческого 11_-13 (очищенное) | 0,43 | |
| Пасколизумаб (очищенный) | 0,03 |
Все 586Н-ТУААРЗ-25, 586Н-ТУААРЗ-154 и 586Н-ТУААРЗ-210 связывали 1Ь-13 со сходными аффинностями связывания, и это было приблизительно эквивалентно аффинности связывания очищенного тАЬ против человеческого 1Ь-13 самого по себе. Все 586Н-ТУААРЗ-25, 586Н-ТУААРЗ-154 и 586НТУААРЗ-210 связывали 1Ь-4. Было невозможно определить аффинность связывания 586-ТУААРЗ-210 в отношении П.-4. ввиду того факта, что компонент ООМ9-112-210 этого шАЬ6АЬ обладал очень прочным связыванием, и поэтому скорость диссоциации была слишком мала для определения с применением В1Асоге™. Следует отметить, что бАЬ против П.-4 сами по себе (ООМ9-155-25, ООМ9-155-154 и ООМ9112-210) не были исследованы в данном формате анализа, поскольку бАЬ не могут быть иммобилизованы на чипе СМ5, покрытом белком А или антителом против человеческого 1дО; вместо этого, тАЬ против человеческого II .-4 (пасколизумаб) использовали в качестве положительного контроля для демонстрации связывания П.-4 в этом анализе. 3.2. Связывание тАЬ против 1Ь-4-бАЬ против П.-13 с П.-4 и 1Ь-13 согласно В1Асоге™.
тАЬбАЬ (в супернатантах клеток СНО, приготовленных. как описано в разделе 1.5) исследовали на предмет связывания с человеческим 1Ь-4 с применением В1Асоге™ при 25°С (как описано в способе 5). Эти данные показаны в табл. 9 (некоторые образцы были приготовлены и исследованы дважды, это было снабжено примечаниями образец 1 и образец 2). Для данного набора данных оценивали кривые при четырех концентрациях 1Ь-4 (100 нМ, 10 нМ, 1 нМ и 0,1 нМ), и приблизительные уровни связывания в относительных единицах ответа для каждого исследованного тАЬбАЬ указаны в таблице. тАЬ того же изотипа (со специфичностью в отношении постороннего антигена) также было включено в качестве отрицательного контроля связывания с 1Ь-4 в данном анализе.
- 52 023031
Таблица 9
| Антитело | Уровень связывания | Скорость ассоциации (ка, Мс'1) | Скорость диссоциации (кс1, с'1) | Аффинность связывания (Κϋ (нМ)) |
| Эксперимент 1 | ||||
| РазсоН-СДЗ- 474 | «500 | 5,1е6 | 8,6е-5 | 0,02 |
| РазсоН- ΊΛ/ΑΑΡ3-474 | «500 | 5,5е6 | 9,7е-5 | 0,02 |
| РазсоН-474 | «500 | 4,8е6 | 9,4е-5 | 0,02 |
| РазсоН- АЗТКО-474 | «500 | 5, Зеб | 8,6е-5 | 0,02 |
| РазсоН-ЕЮЬЕ- 474 | «500 | 5,1е6 | 1,1е-4 | 0,02 |
| РазсоН- ЕРКЗС-474 | «500 | 4,9е6 | 9,8е-5 | 0,02 |
| Пасколизумаб (очищенный) Эксперимент 2 | «700 | 5, Зеб | 1,6е-4 | 0,03 |
| Ра5со1_-С43- 474 (образец 1) | 1871 | 2,14е6 | 1,35е^4 | 0,063 |
| Ра5со1_-С48- 474 (образец 2) | 1921 | 2,1 Зеб | 1,11е-4 | 0,052 |
| РазсоЬ- ΤνΑΑΡδ-474 (образец 1) | 2796 | 2,48е6 | 2,12е-4 | 0,085 |
| Разсо1_- ΤνΑΑΡδ-474 (образец 2) | 3250 | 3,04е6 | 2,79е-4 | 0,092 |
| Разсо1_-474 (образец 1) | 3254 | 2,8е6 | 1,84е-4 | 0,065 |
| Ра5со1_-474 (образец 2) | 2756 | 2,53е6 | 1,22е-4 | 0,048 |
| РазсоЬ-АЗТКС- 474 (образец 1) | 3037 | 2,95е6 | 1,21е-4 | 0,041 |
| РавсоЬ-АЗТКб- 474 (образец 2) | 3784 | 2,54е6 | 1,52е-4 | 0,060 |
| РазсоЬ-ЕРКЗС- 474 (образец 1) | 3238 | 1,86е6 | 2,58е-4 | 0,139 |
| РазсоЬ-ЕРКЗС- 474 (образец 2) | 3276 | 2,51е6 | 3,18е-4 | 0,127 |
| Пасколизумаб (очищенный) | 1152 | 2,04е6 | 1,23е-4 | 0,060 |
| тАЬ отрицательного контроля | 2976 | нет связывания | нет связывания |
Все исследованные тАЬ против 1Ь-4-бАЬ против 1Ь-13 связывали 1Ь-4 со сходными аффинностями связывания, и это было приблизительно эквивалентно аффинности связывания тАЬ против человеческого ГЬ-4 самого по себе (пасколизумаба). РахсоЬ-ЕРК8С-474 связывала 1Ь-4 приблизительно в 2 раза менее активно, чем пасколизумаб. Эти данные предполагали, что добавление линкеров и бАЬ против 1Ь-13
- 53 023031 либо к тяжелой цепи, либо к легкой цепи пасколизумаба не оказывало очевидного влияния на аффинность связывания 1Ь-4 тАЬ-компонентом конструкции тАЬйАЬ.
Эти тАЬйАЬ также исследовали на предмет связывания с человеческим 1Ь-13 с применением В1Асоге™ при 25°С (как описано в способе 4). Эти данные показаны в табл. 10 (некоторые образцы были приготовлены и исследованы дважды, это было снабжено примечаниями образец 1 и образец 2). Для данного набора данных оценивали кривые при четырех концентрациях 1Ь-13 (128, 32, 8 и 2 нМ), и приблизительные уровни связывания в относительных единицах ответа для каждого исследованного тАЬЙАЬ указаны в таблице.
Таблица 10
| Антитело | Уровень | Скорость | Скорость | Аффинность |
| связывания | ассоциации | диссоциации | связывания | |
| (ка, Мс'1) | (кб, с'1) | (Κϋ (нМ)) |
Эксперимент 1
| РазсоН-474 | «500 | 3,6е5 | 3,1 е-4 | 0,84 |
| РазсоН-043-474 | «500 | 3,9е5 | 2,6е-4 | 0,67 |
| РазсоН-ТЛ/ААРЗ- 474 | «500 | 4,5е5 | 4,2е-4 | 0,94 |
| РазсоН-АЗТКС- 474 | «500 | 3,1 е5 | 4,6е-4 | 1,5 |
| РазсоН-ΕίΟίΕ- 474 | «500 | 3,4е5 | 6,2е-4 | 1,8 |
| РазсоН-ЕРКЗС- 474 | «500 | 3,5е5 | 4,0е-4 | 1,1 |
| тАЬ против человеческого Ιί- 13 (очищенное) | «650 | 8,6е5 | 4,9е-4 | 0,57 |
Эксперимент 2
| РазсоЬ-474 (образец 1) | 3254 | 2,86е5 | 3,82е-4 | 1,34 |
| РазсоЬ-474 (образец 2) | 2756 | 3,12е5 | 3,86е-4 | 1,24 |
| РазсоЬ-С43-474 (образец 1) | 1871 | 5,63е5 | 4,25е-4 | 0,756 |
| РазсоЬ-С43-474 (образец 2) | 1921 | 5,59е5 | 3,47е-4 | 0,621 |
| РазсоЬ-ТХ/ААРЗ- 474 (образец 1) | 2796 | 7,42е5 | 2,58е-4 | 0,348 |
| РазсоЬ-ТХ/ААРЗ- 474 (образец 2) | 3250 | 6,22е5 | 1,71 е-4 | 0,275 |
| РазсоЬ-АЗТКб- 474 (образец 1) | 3037 | 5,26е5 | 2,38е-4 | 0,451 |
| РазсоЬ-АЗТКО- 474 (образец 2) | 3784 | 5,38е5 | 3,20е-4 | 0,595 |
| РазсоЬ-ЕРКЗС- 474 (образец 1) | 3238 | 4,17е5 | 3,34е-4 | 0,801 |
| РазсоЬ-ЕРКЗС- 474 (образец 2) | 3276 | 3,51 е5 | 2,86е-4 | 0,815 |
| тАЬ против человеческого Ιί- 13 (очищенное) | 1373 | 9,12е4 | 6,11 е-4 | 0,67 |
| Пасколизумаб (очищенный) | 1152 | нет связывания | нет связывания | |
| тАЬ отрицательного контроля | 2976 | нет связывания | нет связывания |
- 54 023031
Данные по аффинности связывания конструкций, исследованных в эксперименте 2, также показаны на фиг. 23.
Все гпАЬ против ΣΕ-4-бАЬ против ΣΕ-13 связывали ΣΕ-13. По-видимому, в большинстве случаев присутствие линкера не повышало аффинности связывания компонента бАЬ против ΣΕ-13 в отношении П.-13 при расположении на тяжелой цепи тАЬ против ΣΕ-4. Тем не менее, по-видимому, присутствие линкера повышало аффинность связывания компонента бАЬ против ΣΕ-13 в отношении ΣΕ-13 при расположении на легкой цепи тАЬ против ΣΕ-4. По-видимому, Раδсо^-ТУЛАР8-474 обладала наибольшей аффинностью связывания в отношении ΣΕ-13 в данном эксперименте.
Следует отметить, что бАЬ против ΣΕ-13 само по себе (БОМ10-53-474) не было исследовано в данном анализе, поскольку бАЬ не может быть иммобилизовано на чипе СМ5, покрытом белком А или антителом против человеческого Σ§Ο; вместо этого, очищенное тАЬ против человеческого П.-13 использовали в качестве положительного контроля для демонстрации связывания ΣΕ-13 в этом анализе. тАЬ того же изотипа (со специфичностью в отношении постороннего антигена) также было включено в качестве отрицательного контроля связывания с ΣΕ-13 в данном анализе.
Очищенные тАЬ против ΣΕ-4-бАЬ против ΣΕ-13 также исследовали на предмет связывания с человеческим ΣΕ-4 и человеческим ΣΕ-13 с применением В^соке™ при 25°С (как описано в способах 4 и 5). Эти данные показаны в табл. 11.
Таблица 11
| Конструкция | Аффинность связывания (Κϋ (нМ)) | |
| Человеческий И_-4 | Человеческий Ιί-13 | |
| Ра5СоН-С43-474 | 0,036 | 0,58 |
| РазсоН-474 | 0,037 | 0,71 |
| Ра5Со1_-С)43-474 | 0,028 | 1,2 |
| РазсоН1_-О43Щ74 | 0,035 | 0,87 |
| тАЬ против человеческого И-13 (очищенное) | 0,41 | |
| Пасколизумаб (очищенный) | 0,037 |
В этом эксперименте все РаксоН-О48-474, РаксоН-474, Раксо1_-О48-474 и Ра§соНЬ-О48-474 связывали ΣΕ-4 со сходными аффинностями связывания, и это было приблизительно эквивалентно аффинности связывания тАЬ против человеческого П.-4 самого по себе (пасколизумаба). Все они также связывали Ш-13. Следует отметить, что бАЬ против Ш-13 само по себе (БОМ10-53-474) не было исследовано в данном анализе, поскольку бАЬ не может быть иммобилизовано на чипе СМ5, покрытом белком А или антителом против человеческого Σ§Ο; вместо этого, тАЬ против человеческого Ш-13 использовали в качестве положительного контроля для демонстрации связывания Ш-13 в этом анализе.
3.3. Стехиометрия связывания Ш-13 и Ш-4 с тАЬ против ΣΕ-4-бАЬ против Ш-13 с применением В^соге™
Очищенные тАЬ против ΣΕ-4-бАЬ против Ш-13 оценивали на предмет стехиометрии связывания для Ш-13 и ΣΕ-4 с применением В^соке™ (как описано в способе 7). Эти данные показаны в табл. 12.
Т аблица 12
| Конструкция | Стехиометрия | |
| Человеческий 11_-4 | Человеческий ΙΙ--13 | |
| Разсо 1.-643-474 | 1,8 | 1,8 |
| РазсоН-043-474 | 1,8 | 1,9 |
| Разсо-474 | 1,8 | 1,9 |
| Ра5СоН1_-643-474 | 1,7 | 3,5 |
| тАЬ против человеческого 11_-13 (очищенное) | 1,8 | |
| Пасколизумаб (очищенный) | 1,8 |
РаксоН-О48-474, РаксоН-474 и Ра§соЬ-О48-474 могли связывать приблизительно две молекулы ΣΕ13 и две молекулы ΣΕ-4. Ра§соНЬ-О48-474 могла связывать приблизительно две молекулы ΣΕ-4 и приблизительно четыре молекулы Ш-13. Эти данные указывали, что исследованные конструкции могли быть полностью связаны с ожидаемым числом молекул Ш-13 или ΣΕ-4.
- 55 023031
Пример 4. Нейтрализующая активность тАЬбАЬ в биологических анализах ГО-13 и ГО-4
4.1. тАЬ против ГО-13-бАЬ против ГО-4
Очищенные тАЬ против ГО-13-бАЬ против ГО-4 исследовали на предмет нейтрализации человеческого ГО-13 в биологическом анализе с клетками ТР-1 (как описано в способе 8). Эти данные показаны на фиг. 24.
Очищенные тАЬ против ГО-13-бАЬ против ГО-4 586Η-ΤУАΛРδ-25, 586Н-ΤУАΛРδ-154 и 586НΤУАΛРδ-210 полностью нейтрализовали биологическую активность ГО-13 в биологическом анализе с клетками ТР-1. Нейтрализующие активности этих тАЬбАЬ отличались от очищенного тАЬ против человеческого ГО-13 самого по себе не более чем в 2 раза. Очищенное тАЬ против человеческого ГО-4 (пасколизумаб) и очищенные бАЬ против ГО-4 (Ό0Μ9-155-25, Ό0Μ9-155-154 или Ό0Μ9-112-210) были включены в качестве отрицательных контролей нейтрализации ГО-13 в данном анализе.
Очищенные тАЬ против ГО-13-бАЬ против ГО-4 586Η-ΤУАΛРδ-25, 586НΤУΛАРδ-154 и 586Η-ΤУΛАРδ-210 также исследовали на предмет нейтрализации человеческого ГО4 в биологическом анализе с клетками ТР-1 (как описано в способе 9). Эти данные показаны на фиг. 25.
586Η-ΤУАΛРδ-210 полностью нейтрализовала биологическую активность ГО-4 в данном биологическом анализе с клетками ТР-1. Нейтрализующая активность этого тАЬбАЬ отличалась от очищенного бАЬ против человеческого ГО-4 самого по себе (Ό0Μ9-112-210) не более чем в 2 раза. 586Η-ΤУАΛРδ-25 и 586Η-ΤУАΛРδ-154 не нейтрализовали биологическую активность ГО-4, и это отличалось от очищенных бАЬ против человеческого ГО-4 самих по себе (Ό0Μ9-155-25 и Ό0Μ9-155-154). Как продемонстрировано Высоте™, очищенные 586Н-ΤУАΛРδ-25 и 586Η-ΤУАΛРδ-154 имели аффинности связывания 1,1 нМ и 0,49 нМ (соответственно) в отношении ГО-4. ГО-4 связывает рецептор ГО-4 очень прочно (в публикациях в литературе сообщают об аффинностях связывания приблизительно 50 пМ), и, таким образом, наблюдение того, что ни 586Н-ΤУАΛРδ-25, ни 586Η-ΤУАΛРδ-154 не могла эффективно нейтрализовать биологическую активность ГО-4 в биологическом анализе с клетками ТР-1, может быть результатом относительно низкой аффинности этих тАЬбАЬ в отношении ГО-4 по сравнению с активностью ГО-4 в отношении рецептора ГО-4.
Очищенное глАЬ против человеческого ГО-4 (пасколизумаб) было включено в качестве положительного контроля нейтрализации ГО-4 в данном биологическом анализе. Очищенное тАЬ против человеческого ГО-13 было включено в качестве отрицательного контроля нейтрализации ГО-4 в данном биологическом анализе.
4.2 тАЬ против ГО-4-бАЬ против ΙΠ-13
Очищенные тАЬ против ГО-4-бАЬ против ΙΠ-13 РаδсοΗ-С4δ-474, РазсоН-474, Ра8СοΗ^-С4δ-474 и Ра8СοΗ^-С4δ-474 исследовали на предмет нейтрализации человеческого ГО-4 в биологическом анализе с клетками ТР-1 (как описано в способе 9). Эти данные показаны на фиг. 26.
Очищенные тАЬ против ГО-4-бАЬ против ΙΠ-13 Ра8СοΗ-С4δ-474, РазсоН-474, Ра8СΟ^-С4δ-474 и Ра8СοΗ^-С4δ-474 полностью нейтрализовали биологическую активность ГО-4 в биологическом анализе с клетками ТР-1. Нейтрализующие активности этих тАЬбАЬ были приблизительно эквивалентны нейтрализующей активности очищенного тАЬ против человеческого ГО-4 самого по себе (пасколизумаба). Очищенное тАЬ против человеческого ΙΠ-13, очищенное бАЬ Ό0Μ 10-53-474 и бАЬ со специфичностью в отношении постороннего антигена (бАЬ отрицательного контроля), также были включены в качестве отрицательных контролей нейтрализации ГО-4 в данном биологическом анализе.
Очищенные тАЬ против ГО-4-бАЬ против ΙΠ-13 Ра8СοΗ-С4δ-474, РазсоН-474, Ра8СΟ^-С4δ-474 и Ра8СοΗ^-С4δ-474 исследовали на предмет нейтрализации человеческого ГО-13 в биологическом анализе с клетками ТР-1 (как описано в способе 8). Эти данные показаны на фиг. 27.
Очищенные тАЬ против ГО-4-бАЬ против ΙΠ-13 Ра8СοΗ-С4δ-474, РазсоН-474, Ра8СΟ^-С4δ-474 и Ра8СοΗ^-С4δ-474 полностью нейтрализовали биологическую активность ГО-13 в биологическом анализе с клетками ТР-1. Нейтрализующие активности этих тАЬбАЬ отличались от бАЬ против ГО-13 самого по себе (Ό0Μ10-53-474) не более чем в 3 раза. Очищенное тАЬ против человеческого ΙΠ-13 было также включено в качестве положительного контроля нейтрализации ГО-13 в данном биологическом анализе. бАЬ со специфичностью в отношении постороннего антигена (бАЬ отрицательного контроля) и очищенное тАЬ против человеческого ГО-4 само по себе (пасколизумаб) были также включены в качестве отрицательных контролей нейтрализации ГО-4 в данном биологическом анализе.
Очищенные тАЬ против ГО-4-бАЬ против ΙΠ-13 Ра8СοΗ-С4δ-474, РазсоН-474, Ра8СΟ^-С4δ-474 и Ра8СοΗ^-С4δ-474 также исследовали на предмет одновременной нейтрализации человеческого ГО-4 и человеческого ГО-13 в биологическом анализе двойной нейтрализации с клетками ТР-1 (как описано в способе 10). Эти данные показаны на фиг. 28.
Очищенные тАЬ против ГО-4-бАЬ против ΙΠ-13 Ра8СοΗ-С4δ-474, РазсоН-474, Ра8СΟ^-С4δ-474 и Ра8СοΗ^-С4δ-474 полностью нейтрализовали биологическую активность как ГО-4, так и ГО-13 в биологическом анализе двойной нейтрализации с клетками ТР-1. Нейтрализующие активности этих тАЬбАЬ были приблизительно эквивалентны нейтрализующей активности комбинации очищенного тАЬ против человеческого ГО-4 (пасколизумаба) и очищенного бАЬ против ΙΠ-13 (Ό0Μ10-53-474). Очищенное тАЬ против человеческого ГО-13 само по себе, очищенное тАЬ против человеческого ГО-4 само по себе (пас- 56 023031 колизумаб) и ЙАЪ против человеческого Ш-13 (Э0М10-53-474) само по себе (которые были включены в качестве отрицательных контролен) не обеспечивали полной нейтрализации биологической активности как 1Ь-4, так и ГС-13 в этом биологическом анализе двойной нейтрализации 1Ь-4 и 1Ь-13.
Пример 5. ЗЕС-МАГГЗ-анализ ЙАЪ
Антиген-специфичные ЙАЪ описывали в отношении их состояния в растворе посредством ЗЕСМАТЬБ (гель-хроматографиии с рассеиванием лазерного излучения с кратными углами), и результаты показаны в табл. 13: ЙАЪ Э0М10-53-474 существует в растворе в форме мономера, в то время как все ЙАЪ Э0М9 (О0М9-112-210, О0М9-155-25, О0М9-155-147 и О0М9-155-154) способны образовывать стабильные димеры (и, в некоторых случаях, тетрамеры).
5.1. Приготовление белков
Проводили очистку и диализ образцов в подходящем буфере, например, РВЗ. После диализа образцы фильтровали и определяли концентрацию (0,43 мг/мл Э0М-155-25, 1,35 мг/мл Э0М9-155-147 и 1,4 мг/мл Э0М9-155-159). Концентрацию Э0М10-53-474 и Э0М9-112-210 корректировали до 1 мл/мл.
Бычий сывороточный альбумин (ВЗА) приобретали от Зщта и использовали без очистки.
5.2. Гель-хроматография и настройка детектора
Систему ЗЫтаЙги ГС-20АЭ Рготтепсе НРГС с автоматическим пробоотборником (8ΙΓ-20Ά) и детектором ЗРЭ-20А Рготтепсе ИУ/У1к соединяли с Шуа11 М1ш Вамп Тгеок (МАГГЗ, детектор рассеивания лазерного излучения с кратными углами) и детектором Шуа11 0рй1аЪ гЕХ ЭК1 (дифференциальный коэффициент преломления). Детекторы соединяли в следующем порядке: ГЗ-ИУ-КГ Как детектором К1, так и детектором ГЗ работали при длине волны 488 нм. Использовали колонку ТЗК2000 (корпорация Токой) (колонка для НРГС на основе диоксида кремния) с подвижной фазой, представляющей собой 50 мМ фосфатный буфер (без соли) или 1х РВЗ, оба при рН7,4. Используемая скорость потока составляет 0,5 или 1 мл/мин, время опыта корректировали для отражения различных скоростей потока (45 или 23 мин) и ожидали, что оно не будет оказывать значительного эффекта на разделение молекул. Белки готовили в буфере в концентрации 1 мг/мл, и вносимый объем составлял 100 мкл.
5.3. Калибровка детектора
Детектор рассеяния излучения калибровали толуолом в соответствии с инструкциями изготовителя.
5.4. Калибровка детектора с использованием ВЗА
Выход детектора ИУ и выход детектора К1 соединяли с детектором рассеяния излучения таким образом, что сигналы от всех трех детекторов могли быть получены одновременно с использованием программного обеспечения Шуа11 АЗТКА. Несколько введений ВЗА в подвижной фазе РВЗ (1 мл/минуту) пропускают через колонку Токой ТЗК2000, получая сигналы ИУ, ЬЗ и К1 с использованием программного обеспечения Шуа11. Записи затем анализируют с использованием программного обеспечения АЗТКА и сигналы нормализуют, выравнивают и корректируют для размывания зоны, следуя инструкциям изготовителя. Калибровочные константы затем усредняют и вносят в матрицу, используемую для дальнейшего анализа образцов.
5.5. Вычисления абсолютной молярной массы
100 мкл каждого образца вносят в подходящую предварительно уравновешенную колонку. После ЗЕС-колонки образец проходит через 3 оп-йпе детектора, ИУ, МАГЬЗ (рассеивание лазерного излучения с кратными углами) и ΏΕΙ (дифференциальный коэффициент преломления), позволяя определить абсолютную молярную массу. В колонке происходит приблизительно 10-кратное разведение и концентрация, при которой определяли состояние в растворе, была подходящей.
Основой вычислений в АЗТКА, а также методики построения 71тт, часто реализуемой в режиме пакетной обработки образцов, является уравнение /пит [I. Сйет. Рйук. 16, 1093-1099 (1948)]
Κη/Κ*6= ΜΡ(Θ) - 2А2сМ2Р2(0) (уравнение 1) где с представляет собой массовую концентрацию молекул растворенного вещества в растворителе (г/мл);
М представляет собой средневзвешенную молярную массу (г/моль);
А2 представляет собой второй вириальный коэффициент (моль*мл/г2);
. ЛГ ~ Яо (ιΙη/ιΙί'Γ Г4 Ν,\1 _ „ _ „ представляет собой оптическую постоянную, где п0 представляет собой коэффициент преломления растворителя при длине волны падающего излучения (в вакууме), Ι0 представляет собой длину волны падающего излучения (в вакууме), выраженную в нанометрах, представляет собой число Авогадро, равное 6,022 χ 1023 моль-1, и Йп/Йс представляет собой дифференциальный инкремент коэффициента преломления раствора растворенного вещества в растворителе по отношению к изменению концентрации растворенного вещества, выраженный в мл/г (этот множитель необходимо измерять независимо с использованием детектора ЙК1);
Р(ц) представляет собой теоретически получаемый форм-фактор, приблизительно равный 1-2ц2(г2)/31+, где т=(4п/Г)кт(0/2), и <г2> представляет собой средний квадрат радиуса.
- 57 023031
Р(ц) является функцией ζ-среднего размера, формы и структуры молекул;
Кч представляет собой избыточный коэффициент Релея (КауЫдй) (см -1).
Это уравнение подразумевает вертикально поляризованный падающий свет и верно до порядка с2.
Для проведения вычислений способом приведения 71тт. что является приведением к Кч/К*с относительно 5ш2(ц/2). необходимо преобразовать реципрокное уравнение 1 первого порядка к с;
Для проведения вычислений способом приведения 71тт. что является приведением к Кч/К*с относительно 5ш2(ц/2). необходимо преобразовать реципрокное уравнение 1 первого порядка к с
К*с/Кч=(1/МР(0))+2А2г (уравнение 2)
Подходящие результаты в данном случае представляют собой
М=ГК*с/Кв-2Л2г}·' (уравнение 3) и
(1^)=3 т<Д2М/16π2 (уравнение 4) где то^ЕК^/К^/фш^/г)]^ (уравнение 5)
Вычисления проводят автоматически программным обеспечением А5ТКА. получая молярную массу. определенную для каждого образца. в виде графика [инструкция АЭга|.
Молярную массу. полученную из графика для каждого из пиков. наблюдаемых на хроматограмме. сравнивали с ожидаемой молекулярной массой одной единицы белка. Это обеспечивало основание для выводов о состоянии белка в растворе. Репрезентативные данные показаны в табл. 1З.
Таблица 1З. Итоговая сводка
| бАЬ | ЗЕС-ΜΑίίδ | Молекулярная масса (М\Л/) | Колонка и подвижная фаза |
| ϋΟΜ 10-53-474 | мономер | 14 кДа | ТЗК2000, РВ8, рН7,4, 0,5 мл/мин |
| ϋΟΜ9-112-210 | димер | 30 «Да | Т5К2000, РВЗ, рН7,4, 0,5 мл/мин |
| ϋΟΜ9-155-25 | димер | 28 кДа | ТЗК2000, 50 мМ фосфатный буфер, рН7,4, 1 мл/мин |
| ϋΟΜ9-155-147 | равновесие димер-тетрамер | 26-51 кДа | ТЗК2000, 50 мМ фосфатный буфер, рН7,4, 1 мл/мин |
| ΟΟΜ9-155-159 | димер | 28 кДа | ТЗК2000, 50 мМ фосфатный буфер, рН7,4, 1 мл/мин |
ϋΟΜ10-53-474
Один пик со средней молярной массой. определенной как = 14 кДа. что указывает на мономерное состояние в растворе. показан на фиг. 29.
ϋΟΜ9-112-210
Один пик с молярной массой. определенной как ЗО кДа. что указывает на димерное состояние в растворе. показан на фиг. ЗО.
БОМ9-155-25
Подходящий симметричный пик. но расположенный на границе буфера. Для определения молярной массы использовали среднюю часть пика (см. изображение ниже со всеми тремя сигналами в наложении). Молярная масса составляет 28 кДа. что отражает димерное ЙАЬ. показанное на фиг. З1. Все три сигнала в наложении (фиг. З2).
БОМ9-155-147
У основного пика определена молярная масса 26 кДа в правой части пика. резко возрастающая в левой части пика до 5З кДа. Пик наиболее вероятно отражает димер и меньшую фракцию тетрамера в
- 58 023031 динамическом равновесии. Значительно меньший пик элюирования при 7,б мин отражает тетрамерный белок с молярной массой 51 кДа (фиг. 33).
БОМ9-155-159
В анализе белку соответствует один симметричный пик со средней молярной массой, определенной как = 28 кДа, что указывает на димерное состояние в растворе (фиг. 34).
Контроль определения М\У посредством 8ЕС-МАЬЬ8: Б8А
Каждый анализ В8А для каждого из изложенных выше экспериментов приводил к ожидаемой МШ, например, 2 пика с молярной массой б7 и 145 кДа (мономер и димер) (фиг. 35).
Пример б. Получение триспецифичных тАЬдАЬ
Триспецифичные тЛЬ-0АЬ конструировали либо получением последовательностей УН и УЬ ПЦРсборкой (аззетЫу РСК), которые затем клонировали в существующие векторы экспрессии тАЬдАЬ, либо субклонированием существующих областей УН и УЬ из веторов экспрессии тАЬ в существующие векторы экспрессии тАЬдАЬ, таким образом, что при экспрессии триспецифичное тАЬдАЬ имеет 0АЬ, присоединенные к С-концам как легких, так и тяжелых цепей.
Для соединения однодоменного антитела с тяжелой цепью СН3 или легкой цепью Ск использовали линкерную последовательность. Схематическое представление триспецифичной молекулы тАЬдАЬ показано на фиг. 3б (тяжелая цепь тАЬ изображена серым; легкая цепь тАЬ изображена белым; 0АЬ изображено черным).
Схематическое представление, на котором изображена конструкция тяжелой цепи триспецифичного тАЬдАЬ (верхняя иллюстрация) и легкой цепи триспецифичного тАЬдАЬ (нижняя иллюстрация), показано ниже.
Для тяжелой цепи термин УН представляет собой последовательность вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела; СН1, СН2 и СН3 представляют собой последовательности константной области тяжелой цепи человеческого 1дО1; линкер представляет собой последовательность определенной используемой линкерной области; 0АЬ представляет собой последовательность однодоменного антитела. Для легкой цепи Уц представляет собой последовательность вариабельной области легкой цепи моноклонального антитела; Ск представляет собой последовательность человеческой константной области легкой цепи; линкер представляет собой последовательность определенной используемой линкерной области; 0АЬ представляет собой последовательность однодоменного антитела.
При получении этих конструкций использовали аминокислотную сигнальную последовательность млекопитающих (как показано в 8Е0 ГО N0: б4).
б.1. Триспецифичное тАЬ против ГО-18-0АЬ против ГО-4-0АЬ против ГО-13
Триспецифичное тАЬ против ГО-18-0АЬ против ГО-4-0АЬ против ГО-13 (также известную как ГО18тАЬ-210-474) конструировали переносом последовательности, кодирующей однодоменное антитело против человеческого ГО-4 (Ώ0Μ9-112-210), на последовательность, кодирующую тяжелую цепь, и последовательности, кодирующей однодоменное антитело против человеческого ГО-13 (Ώ0Μ10-53-474), на последовательность, кодирующую легкую цепь гуманизированного моноклонального антитела против человеческого ГО-18. Линкер О48 использовали для соединения однодоменного антитела против ГО-4 с тяжелой цепью моноклонального антитела. Линкер О48 также использовали для соединения однодоменного антитела против ГО-13 с легкой цепью моноклонального антитела.
I^18тΛЬ-210-474 транзиторно экспрессировали в супернатантах клеток СНОК1 и после количественного определения I^18тЛЬ-210-474 в клеточном супернатанте анализировали его в нескольких анализах связывания ГО-18, ГО-4 и ГО-13.
- 59 023031
Название
Описание
Идентификационный номер последовательности (ЗЕО Ю N0:)
11_18тАЬ210-474
Н-цепь = тяжелая цепь тАЬ против человеческого И-18-линкер 043-ЬАЬ (= Н-цепь) (= !_-цепь)
ООМ9-112-210
1_-цепь = легкая цепь тАЬ против человеческого 11_-18-линкер С43-с!АЬ ϋΟΜ 10-53-474
6.2. Триспецифичное тАЬ против ГЬ-5-бАЬ против ГЬ-4-бАЬ против ГЬ-13
Триспецифичное тАЬ против ГО-5-бАЬ против ГО-4-бАЬ против ГЬ-13 (также известное как Меро210-474) конструировали переносом последовательности, кодирующей однодоменное антитело ЭОМ9112-210 (5Е9 Ώ NО: 4) против человеческого ГЬ-4, на последовательность, кодирующую тяжелую цепь гуманизированного моноклонального антитела против человеческого ГЬ-5 (δΕ^ ГО NО: 65), и переносом последовательности, кодирующей однодоменное антитело ЭОМ10-53-474 (δΕ^ ГО NО: 5) против человеческого ГЬ-13, на последовательность, кодирующую легкую цепь гуманизированного моноклонального антитела против человеческого ГО-5 (δΕ9 ГО NО: 66). Линкер Ο4δ использовали для соединения однодоменного антитела против ГО-4 с тяжелой цепью моноклонального антитела. Линкер Ο4δ также использовали для соединения однодоменного антитела против ГЬ-13 с легкой цепью моноклонального антитела.
Это тАЬйАЬ транзиторно экспрессировали в супернатантах клеток СНОК1 и НЕК293-6Е и после количественной оценки клеточного супернатанта анализировали его в нескольких анализах связывания ГЬ-4, ГО-5 и ГЬ-13._
| Название | Описание | Идентификационный номер последовательности (ЗЕО Ю ΝΟ:) |
| Меро-210- | Н-цепь = тяжелая цепь тАЬ | 71 (= Н-цепь) |
| 474 | против человеческого 1Ь-5- линкер 043-ОАЬ ϋΟΜ9-112-210 Ь-цепь = легкая цепь тАЬ против человеческого И-5- линкер 043-бАЬ ϋΟΜ10-53-474 | 72 (= Ь-цепь) |
6.3. Последовательности моноклональных антител, однодоменных антител и линкеров Последовательности моноклональных антител, однодоменных антител и линкеров, использованных для получения триспецифичных тАЬйАЬ (или использованных в качестве контрольных реагентов в соответствующих примерах), показаны ниже в табл. 14.
Таблица 14
| Название | Специфичность | Идентификационный номер последовательности |
| Однодоменное антитело ϋΟΜ9-112-210 | Человеческий Н_-4 | 4 |
| Однодоменное антитело ϋΟΜ10-53-474 | Человеческий 11_-13 | 5 |
| Последовательность линкера ССССЗ | 6 | |
| Пасколизумаб | Человеческий И-4 | 14 (= Н-цепь) |
- 60 023031
| (моноклональное антитело против человеческого 11_-4) | 15 (= ί-цепь) | |
| Меполизумаб (моноклональное антитело против человеческого Н_-5) | Человеческий Ιί-5 | 65 (= Н-цепь) 66 (= ί-цепь) |
| Моноклональное антитело против человеческого Ιί-13 (гуманизированное) | Человеческий Ιί-13 | 12 (= Н-цепь) 13 (= ί-цепь) |
| Моноклональное антитело против человеческого Ιί-18 (гуманизированное) | Человеческий Н_-18 | 67 (= Н-цепь) 68 (= ί-цепь) |
Зрелая аминокислотная последовательность человеческого 1Ь-4 (без сигнальной последовательности) приведена в 8НС) ГО N0: 62.
Зрелая аминокислотная последовательность человеческого ГО-13 (без сигнальной последовательности) приведена в 8НС) ГО N0: 63.
6.4 Экспрессия и очистка триспецифичных шАЬбАЬ
Последовательности ДНК, кодирующие триспецифичные молекулы шАЬбАЬ, клонировали в векторы экспрессии млекопитающих (К1п, Κΐά или рТТ) с применением стандартных молекулярнобиологических методик. Экспрессионными конструкциями триспецифичных шАЬбАЬ транзиторно трансфицировали клетки СНОК1 и/или клетки НЕК293-6Е и экспрессировали эти конструкции в небольшом масштабе (от 3 до 150 мл). Способы экспрессии, используемые для получения триспецифичных шАЬбАЬ, были такими же, как обычно используемые для экспрессии моноклональных антител.
Некоторые из конструкций очищали с использованием колонок с иммобилизованным белком А и количественно оценивали считыванием оптической плотности при 280 нм.
Пример 7. Связывание триспецифичных шАЬбАЬ с человеческим ГО-4, человеческим ГО-13 и человеческим ГО-18 согласно ЕЫ8А
7.1. Связывание ГО-18тАЬ-210-474 с ГО-4, ГО-13 и ГО-18 согласно ЕЫ8А
Триспецифичное тАЬбАЬ ГО18тАЬ-210-474 (супернатанты), полученное, как описано в примере 6 (8Е^ ГО N0: 69 и 70), исследовали на предмет связывания с человеческим ГО-18, человеческим ГО-13 и человеческим ГО-4 в ЕЫ8А прямого связывания (как описано в способах 1, 2 и 3), и эти данные показаны на фиг. 37, 38 и 39 соответственно (ГО18шАЬ-210-474 получали и исследовали несколько раз, и в графических материалах это снабжено примечаниями образец 1, образец 2, образец 3 и так далее).
На этих графических материалах показано, что ГО18тАЬ-210-474 связывало ГО-4, ГО-13 и ГО-18 согласно ЕЫ8А. Очищенное тАЬ против человеческого ГО-18 было включено в ЕЫ8А связывания ГО-18 в качестве положительного контроля связывания ГО-18. бАЬ против ГО-4 (Ό0Μ9-112-210) не было исследовано в ЕЫ8А связывания ГО-4, поскольку это бАЬ не может быть выявлено вторичным антителом для выявления; вместо этого очищенное шАЬ против человеческого ГО-4 (пасколизумаб) было использовано в качестве положительного контроля для демонстрации связывания ГО-4 в этом ЕЫ8А. бАЬ против ГО-13 (Ό0Μ 10-53-474) не было исследовано в ЕЫ8А связывания ГО-13, поскольку это бАЬ не может быть выявлено вторичным антителом для выявления; вместо этого, очищенное шАЬ против человеческого ГО-13 было включено в качестве положительного контроля для демонстрации связывания ГО-13 в этом ЕЫ8А. Как показано в графических материалах, в каждый ЕЫ8А связывания были включены шАЬ отрицательного контроля к постороннему антигену.
В каждом ЕЫ8А кривая связывания для образца 5 ГО18шАЬ-210-474 отличается от кривых связывания для других образцов ГО18шАЬ-210-474. Причина этого неизвестна, однако это может быть обусловлено проблемой количественного определения в ЕЫ8А с количественным определением человеческого 1дО для данного конкретного образца 5 ГО18шАЬ-210-474.
7.2. Связывание Меро-210-474 с ГО-4 и ГО-13 согласно ЕЫ8А
Триспецифичные шАЬбАЬ Меро-210-474 (супернатант), полученные, как описано в разделе 1 (идентификаторы последовательностей 71 и 72), исследовали на предмет связывания с человеческим ГО13 и человеческим ГО-4 в ЕЫ8А прямого связывания (как описано в способах 1 и 2, соответственно), и эти данные показаны на фиг. 40 и 41 соответственно (Меро-210-474 получали и исследовали четыре раза, и это снабжено примечаниями образец 1, образец 2, образец 3 и образец 4).
На этих графических материалах показано, что Меро-210-474 связывало ГО-4 и ГО-13 согласно ЕЫ- 61 023031 δΑ. с!АЬ против Ш-4 (И0М9-112-210) не было исследовано в ЕЬША связывания Ш-4, поскольку это с!АЬ не может быть выявлено вторичным антителом для выявления; вместо этого, очищенное тАЬ против человеческого Ш-4 (пасколизумаб) было включено в качестве положительного контроля для демонстрации связывания Ш-4 в этом ЕЬША. с!АЬ против Ш-13 (И0М 10-53-474) не было исследовано в ЕЬША связывания Ш-13, поскольку это с!АЬ не может быть выявлено вторичным антителом для выявления; вместо этого, очищенное тАЬ против человеческого Ш-13 было включено в качестве положительного контроля для демонстрации связывания Ш-13 в этом ЕЬША. Как показано на фиг. 40 и 41, в каждый ЕЬША связывания были включены тАЬ отрицательного контроля к постороннему антигену.
Образец 1 и образец 2 Меро-210-474 были получены в одном эксперименте транзиторной трансфекции, а образец 3 и образец 4 Меро-210-474 были получены в другом отдельном эксперименте транзиторной трансфекции. Все четыре образца связывали Ш-13 и Ш-4 в ЕЬША связывания Ш-13 и Ш-4. Тем не менее, причина отличия профилей связывания образцов 1 и 2 с одной стороны и образцов 3 и 4 с другой стороны неизвестна, однако она может отражать отличие в качестве тАЬбАЬ (в супернатанте), полученных в каждом эксперименте трансфекции.
Пример 8. Связывание триспецифичных тАЬбАЬ с человеческим Ш-4, человеческим Ш-5, человеческим Ш-13 и человеческим Ш-18 согласно поверхностному плазмонному резонансу (В^со^™)
8.1. Связывание Ш-18тАЬ-210-474 с Ш-4, Ш-13 и Ш-18 согласно В^^оге™
Триспецифичное тАЬбАЬ Ш18тАЬ-210-474 (супернатанты), полученное, как описано в примере 6.1 (δΕ^ ΙΌ Ν0: 69 и 70), исследовали на предмет связывания с человеческим Ш-4, человеческим Ш-13 и человеческим Ш-18 с применением ВМ.соге™ при 25°С (как описано в способах 4, 5 и 6 соответственно). Уровни связывания были в пределах приблизительно от 400 до 850 единиц ответа. Исследовали три концентрации каждого аналита (256, 32 и 4 нМ). Полученные данные показаны в табл. 15 (образцы получали и исследовали трижды, это было снабжено примечаниями образец 1, образец 2 и образец 3).
Таблица 15
| Конструкция | Скорость ассоциации (ка) | Скорость диссоциации (кс!) | Аффинность связывания (ΚΏ (нМ)) |
Связывание с ΙΙ--18
| 11_18т АЬ-210-474 (образец 1) | 2,1е6 | 2,Зе-5 | 0,011 |
| 11_18тАЬ-210-474 (образец 2) | 2,1е6 | 2,8е-5 | 0,014 |
| 11_18тАЬ-210-474 (образец 3) | 2,1 еб | 2,9е-5 | 0,014 |
| тАЬ против человеческого И-18 (очищенное) | 1,9е6 | 6,8е-5 | 0,035 |
Связывание с И_-13
| 11.18т АЬ-210-474 (образец 1) | 5,8е5 | 5,7 е-4 | 0,99 |
| 11_18тАЬ-210-474 (образец 2) | 6,2е5 | 6,1 е-4 | 0,99 |
| 11_18т АЬ-210-474 (образец 3) | 7,4е5 | 7,4е-4 | 1,0 |
| тАЬ против человеческого Ιί-13 (очищенное) | 1,2е6 | 5,0е-4 | 0,41 |
Связывание с Ιί-4
| 11_18тАЬ-210-474 (образец 1) | очень прочное связывание * | ||
| И18т АЬ-210-474 | - | - | очень прочное |
| (образец 2) | связывание * | ||
| 11_18тАЬ-210-474 (образец 3) | очень прочное связывание * | ||
| Пасколизумаб (очищенный) | 4,6е6 | 1,7е-4 | 0,037 |
*невозможно определить ΚΌ ввиду положительных эффектов диссоциации и уровня чувствительности методики В^сого™
- 62 023031
Триспецифичное тАЬбАЬ связывало 1Ь-4, ГО-13 и ГО-18 с применением В1Асоге™. Аффинность связывания тАЬбАЬ для 1Ι.-18 была приблизительно эквивалентна аффинности связывания очищенного тАЬ против человеческого ГО-18 самого по себе, которое было включено в данный анализ в качестве положительного контроля связывания ГО-18 и для непосредственного сравнения аффинности связывания тАЬбАЬ. Определение абсолютной аффинности связывания тАЬбАЬ для 1Ι.-4 было невозможным ввиду того факта, что компонент Ό0Μ9-112-210 этого триспецифичного тАЬбАЬ очень прочно связывал 1Ь-4, и поэтому скорость диссоциации была слишком мала для определения с применением В1Асоге™. бАЬ против 1Ь-4 само по себе (Ό0Μ9-112-210) не было исследовано в данном анализе, поскольку это бАЬ не может быть иммобилизовано на чипе СМ5, покрытом белком А или антителом против человеческого 1дС; вместо этого, тАЬ против человеческого 1Е-4 (пасколизумаб) было включено в качестве положительного контроля для демонстрации связывания 1Ь-4 в этом анализе. бАЬ против ГО-13 само по себе (Ό0Μ10-53-474) не было исследовано в данном анализе, поскольку это бАЬ не может быть иммобилизовано на чипе СМ5, покрытом белком А или антителом против человеческого 1дС; вместо этого тАЬ против человеческого ГО-13 было включено в качестве положительного контроля для демонстрации связывания ГО-13 в этом анализе.
8.2. Связывание Меро-210-474 с 1Ь-4, 1Ь-5 и ГО-13 согласно В1Асоге™
Триспецифичное тАЬбАЬ Меро-210-474 (супернатанты), полученное, как описано в примере 6.2 (8Е^ ГО N0: 71 и 72), исследовали на предмет связывания с человеческим 1Е-4, человеческим 1Е-5 и человеческим ГО-13 с применением В1Асоге™ при 25°С (как описано в способах 5, 11 и 4, соответственно). Уровни связывания были в пределах приблизительно от 550 до 900 единиц ответа. Для связывания ГО-4 и ГО-13 исследовали пять концентраций каждого аналита (256, 64, 16, 4 и 1 нМ). Для связывания ГО-5 исследовали четыре концентрации каждого аналита (64, 16, 4 и 1 нМ). Полученные данные показаны в табл. 16.
Таблица 16
| Конструкция | Скорость ассоциации (ка) | Скорость диссоциации (кф | Аффинность связывания (Κϋ (нМ)) |
| Связывание с ΙΙ--5 | |||
| Меро-210-474 | 3,34е5 | 1,50е-4 | 0,45 |
| Меполизумаб (очищенный) | 3,78е4 | 1,30е-4 | 0,34 |
| Связывание с 11_-13 | |||
| Меро-210-474 | 6,38е5 | 1,03е-3 | 1,62 |
| тАЬ против человеческого 11_-13 (очищенное) | 1,51е6 | 5,68е-4 | 0,38 |
| Связывание с ΙΙ--4 | |||
| Меро-210-474 | очень прочное связывание (невозможно определить Κϋ ввиду положительных эффектов диссоциации и уровня чувствительности методики В1Асоге™) | ||
| Пасколизумаб (очищенный) | 6,26е6 | 1,43е-4 | 0,02 |
Меро-210-474 связывало ΙΙ_-4, ΙΙ_-5 и 11.-13 с применением В1Асоге™
Аффинность связывания Меро-210-474 для ГО-5 была приблизительно эквивалентна аффинности связывания очищенного тАЬ против человеческого ГО-5 (меполизумаба) самого по себе, которое было включено в данный анализ в качестве положительного контроля связывания ГО-5 и для непосредственного сравнения аффинности связывания Меро-210-474. Определение абсолютной аффинности связывания Меро-210-474 для ГО-4 было невозможным ввиду того факта, что компонент Ό0Μ9-112-210 этого триспецифичного АЬбАЬ очень прочно связывал ГО-4, и поэтому скорость диссоциации была слишком мала для определения с применением В1Асоге™. бАЬ против ГО-4 само по себе (Ό0Μ9-112-210) не было исследовано в данном анализе, поскольку это бАЬ не может быть иммобилизовано на чипе СМ5, покрытом белком А или антителом против человеческого 1дС; вместо этого, тАЬ против человеческого ГО-4 (пасколизумаб) было включено в качестве положительного контроля для демонстрации связывания ГО-4 в этом анализе. бАЬ против ГО-13 само по себе (Ό0Μ10-53-474) не было исследовано в данном анализе, поскольку это бАЬ не может быть иммобилизовано на чипе СМ5, покрытом белком А или антителом
- 63 023031 против человеческого ^С; вместо этого, тΑЬ против человеческого К-13 было включено в качестве положительного контроля для демонстрации связывания К-13 в этом анализе.
Пример 9. Стехиометрия
9.1. Стехиометрия связывания К-4, ΙΚ-13 и ΙΚ-18 с I^-18тΑЬ-210-474 с применением ΒΙΑυοίΌ™1 I^18тΑЬ-210-474 (в супернатантах клеток СНО, приготовленных как описано в разделе 1) (δΕΡ ΙΌ NО: 69 и 70) оценивали на предмет стехиометрии связывания для К-4, К-13 и К-18 с применением ВКсогс™1 (как описано в способе 7). Эти данные показаны в табл. 17 (Κ-тах представляет собой ответ при насыщенном связывании и необходим для вычисления стехиометрии согласно формуле, приведенной в способе 7). Концентрация каждого из цитокинов составляла 500 нМ. Место введения относится к порядку, в котором добавляли каждый из цитокинов.
Таблица 17
| Цитокин | Место введения | К-тах | Стехиометрия |
| 11_-4 | 1-е | 59 | 0,9 |
| 11_-4 | 2-е | 56 | 0,9 |
| 11_-4 | 3-е | 51 | 0,8 |
| ΙΙ.-13 | 1-е | 74 | 1,6 |
| И-13 | 2-е | 77 | 1,7 |
| 11_-13 | 3-е | 80 | 1,8 |
| 11_-18 | 1-е | 112 | 1,8 |
| 11_-18 | 2-е | 113 | 1,8 |
| 11_-18 | 3-е | 110 | 1,7 |
Стехиометрические данные показали, что I^18тΑЬ-210-474 связывало приблизительно две молекулы ΙΚ-18, две молекулы ΙΚ-13 и только одну молекулу К-4. Известно, что бΑЬ против К-4 само по себе (БОМ9-112-210) существует в растворенном состоянии в форме димера и способно связывать только одну молекулу К-4. Таким образом, связывание I^18тΑЬ-210-474 лишь одной молекулы К-4 не является неожиданным. Эти данные указывали на то, что исследуемые молекулы могут быть полностью связаны с ожидаемым числом молекул ΙΚ-18, ΙΚ-13 и К-4. Стехиометрические данные также указывали на то, что, по-видимому, прядок связывания цитокинов не зависит от порядка добавления цитокинов.
Пример 10.
10.1. Получение тΑЬбΑЬ против двух мишеней против ΤΝΡ/против ВСΡΚ
Это тΑЬбΑЬ против двух мишеней конструировали слиянием бΑЬ с С-концом тяжелой цепи тΑЬ. Экспрессионные кассеты тяжелой и легкой цепи тΑЬ против ΤΝΡ были конструированы ранее. Сайты рестрикции, использованные для клонирования, показаны ниже (фиг. 42).
Для введения сайтов рестрикции для вставки бΑЬ в тяжелую цепь использовали сайт-направленный мутагенез с созданием сайтов клонирования δа11 и НтбШ с использованием вектора экспрессии тяжелой цепи тΑЬ в качестве матрицы. ДНК, кодирующую бΑЬ против ВСΡΚ (БОМ16-39-542) затем амплифицировали с применением ПЦР (с использованием праймеров, кодирующих концы δа11 и НтбШ) и вводили в модифицированную 3'-кодирующую область, приводя к образованию линкера 'ЪТС (серин, треонин, глицин) между тΑЬ и άΑΟ.
Были выбраны клоны с верифицированной последовательностью (δΕΡ ΙΌ NО: 170 и 169 для легкой и тяжелой цепей соответственно) и получение в укрупненном масштабе было осуществлено с применением набора Р1адсп Мсда Ргср κΐΐ в соответствии с протоколами изготовителя. тΑЬбΑЬ экспрессировали в клетках млекопитающих НЕК293-6Е с применением методик транзиторной трансфекции котрансфекцией легких и тяжелых цепей (δΕΡ ΙΌ NО: 73 и 74).
10.2. Очистка и δВС-анализ тΑЬбΑЬ против двух мишеней против ΤΝΡ/против ВСΡΚ тΑЬбΑЬ против ΤΝΡ/против ВСΡΚ очищали из осветленного экспрессионного супернатанта с применением аффинной хроматографии с белком А согласно установленным протоколам. Концентрации очищенных образцов определяли спектрофотометрией на основании измерений оптической плотности при 280 нм. δ^δ-ΡΑСВ-анализ (фиг. 43) очищенного образца демонстрирует невосстановленный образец « 170 кДа, в то время как восстановленный образец показывает две полосы « 25 и « 60 кДа, что соответствует легкой цепи и слитой с бΑЬ тяжелой цепи соответственно.
Для гель-хроматографического анализа (δВС-анализа) тΑЬбΑЬ против ΤΝΡ/против ВСΡΚ вносили в предварительно уравновешенную колонку διιρ0'ίΚχ-200 10/30 ΗΚ (подсоединенную к системе жидкостной хроматографии быстрого разрешения (РРЬС) Α1<Ρι Рхргскк) для использования с ΡΒδ при 0,5 мл/мин. δВС-профиль демонстрирует одну разновидность в виде симметричного пика (фиг. 44).
10.3. Аффинности связывания тΑЬбΑЬ против двух мишеней против ΤΝΡ/против ВСΡΚ
Аффинности связывания для ВСΡΚ и ΤΝΡ определяли, как описано в способах 13 и 14 соответственно. Полученные в анализе данные анализировали с применением Сгар№аб Ρΐ'ίκιη. Значения активно- 64 023031 сти определяли с использованием сигмовидной кривой доза-ответ и данные корректировали с использованием наиболее подходящей модели. Было вычислено, что активность данного тАЬдАЬ против ЕОРК (фиг. 45) составляла 39,1 нМ, в то время как для контроля, тАЬ против ЕОРК, было получено значение ЕС50 3,4 нМ. В биологическом анализе против ТУ (фиг. 4б) активность тАЬдАЬ составляла 3 пМ (0,0028 нМ), в то время как для контрольного тАЬ против Т№ была получена ЕС50 104 пМ. В заключение, данные анализа показывают, что конструкция по примеру 10, тАЬдАЬ против двух мишеней против Т№Упротив ЕОРК, активна против обоих антигенов.
10.4. Фармакокинетика (РК) тАЬдАЬ против двух мишеней против Т№Упротив ЕОРК у крыс
Эту молекулу исследовали на предмет ее фармакокинетических свойств у крыс т У1уо. тАЬдАЬ против Т№Упротив ЕОРК вводили внутривенно (в/в) трем крысам и образцы сыворотки получали в течение периода продолжительностью 7 суток (1б8 ч). Концентрацию лекарственного средства, сохранявшуюся в различных временных точках после введения, оценивали посредством ЕЫ8А как против Т№\ так и против ЕОРК. Результаты показаны на фиг. 125.
РК-параметры подтвердили, что данная молекула имела длительный период полувыведения, в том же диапазоне, что наблюдали ранее для немодифицированного адалимумаба (125 ч). Другие подробности показаны в табл. 17.1.
Таблица 17.1
| Анализируемый антиген | Период полувыведения (ч) | Максимальная концентрация (Стах) (мкг/мл) | Площадь под кривой (АиС) (0- ϊηί) (ч*мкг/мл) | Клиренс (мл/ч/кг) | Экстраполированный % лис |
| ΤΝΡ | 157,2 | 149,8 | 10301,3 | 0,5 | 40,6 |
| ЕСРК | 140,8 | 123,6 | 7986,7 | 0,7 | 35 |
Пример 11.
11.1. Получение тАЬдАЬ против двух мишеней против Т№Упротив УЕОР тАЬдАЬ против Т№Упротив УЕОР получали с применением способа, сходного с описанным в примере 10. Для конструирования экспрессионной кассеты тяжелой цепи в качестве начальной точки была взята векторная ДНК, кодирующая тяжелую цепь, по примеру 10. дАЬ против ЕОРК дАЬ вырезали с использованием рестриктаз 8а11 и НтЛП. Ό0Μ 15-2б-593, дАЬ против УЕОР амплифицировали с применением ПЦР (с использованием праймеров, кодирующих концы 8а11 и НтдШ) и лигировали в каркас вектора, из которого ранее было вырезано дАЬ против ЕОРК с применением тех же сайтов рестрикции, приводя к образованию линкера 8ТО (серин, треонин, глицин) между тАЬ и дАЬ.
Были выбраны клоны с верифицированной последовательностью (8ЕР ГО N0: 1б9 и 1б8 для легкой и тяжелой цепей соответственно) и было осуществлено получение препаратов ДНК в укрупненном масштабе, и тАЬдАЬ против Т№Упротив УЕОР экспрессировали в клетках млекопитающих НЕК293-бЕ с применением методик транзиторной трансфекции ко-трансфекцией легких и тяжелых цепей (8ЕР ГО N0: 73 и 75).
11.2. Очистка и 8ЕС-анализ тАЬдАЬ против двух мишеней против Т№Упротив УЕОР тАЬдАЬ против Т№Упротив УЕОР (обозначенное ΌΜ84000) очищали из осветленного экспрессионного супернатанта с применением аффинной хроматографии с белком А согласно установленным протоколам. Концентрации очищенных образцов определяли спектрофотометрией на основании измерений оптической плотности при 280 нм. 8Э8-РАОЕ-анализ (фиг. 47) очищенного образца демонстрирует невосстановленный образец « 170 кДа, в то время как восстановленный образец показывает две полосы « 25 и « б0 кДа, что соответствует легкой цепи и слитой с дАЬ тяжелой цепи соответственно.
Для гель-хроматографического анализа (8ЕС-анализа) тАЬдАЬ против Т№Упротив ЕОРК вносили в предварительно уравновешенную колонку 8ирегдех-200 10/30 НК (подсоединенную к системе РРЕС АЙа ЕхргеББ) для использования с РВ8 при 0,5 мл/мин. 8ЕС-профиль демонстрирует одну разновидность в виде симметричного пика (фиг. 48).
11.3. Аффинности связывания тАЬдАЬ против двух мишеней против Т№Упротив УЕОР
Аффинности связывания для УЕОР и Т№ определяли, как описано в способах 12 и 14 соответственно. Полученные в анализе данные анализировали с применением ОгарЬРад Рп§т. Значения активности определяли с использованием сигмовидной кривой доза-ответ и данные корректировали с использованием наиболее подходящей модели. Было вычислено, что активность данного тАЬдАЬ против УЕОР (фиг. 49) составляла 57 пМ, в то время как для контроля, тАЬ против УЕОР, было получено значение ЕС50 35б пМ. В биологическом анализе против Т№ (фиг. 50) активность тАЬдАЬ составляла 10 пМ, в то время как для контрольного тАЬ против Т№ была получена ЕС50 22 пМ. В заключение, данные анализа показывают, что молекула по примеру 11, тАЬдАЬ против двух мишеней против Т№Упротив УЕОР, активна против обоих антигенов.
11.4. Фармакокинетика (РК) тАЬдАЬ против двух мишеней против Т№Упротив УЕОР у крыс
Эту молекулу исследовали на предмет ее фармакокинетических свойств у крыс т У1уо. тАЬдАЬ
- б5 023031 против ТЫР/против УЕОР вводили в/в трем крысам и образцы сыворотки получали в течение периода продолжительностью 10 суток (240 ч). Концентрацию лекарственного средства, сохранявшуюся в различных временных точках после введения, оценивали посредством ЕЫ8А как против ТЫР, так и против УЕОР. Результаты показаны на фиг. 126.
РК-параметры подтвердили, что данная молекула имела фармакокинетические свойства т у1уо, сопоставимые с фармакокинетическими свойствами немодифицированного адалимумаба. Более короткий наблюдаемый !ι/2β для УЕОР-компонента не рассматривают как значимый, и он может являться артефактом анализа. Другие подробности показаны в табл. 17.2.
Таблица 17.2
| Антиген | Период полувыведения (ч) | Стах (мкг/мл) | А11С (0-ϊηί) (ч*мкг/мл) | Клиренс (мл/ч/кг) | Экстраполированный % лис |
| ΤΝΡ | 180,1 | 89,9 | 7286,3 | 0,7 | 35,8 |
| УЕОР | 94,2 | 102,8 | 4747,1 | 1,1 | 14,3 |
11.5. Получение альтернативного тАЬс!АЬ против ΤΝΡ/против УЕСР
Альтернативное тАЬбАЬ против ТЫР/против УЕОР конструировали способом, сходным с описанным выше в примере 11.1, с использованием того же тАЬ против ТЫР, соединенного с бАЬ против УЕОР на С-конце тяжелой цепи с использованием линкера 8ТО. Использованное в данном случае бАЬ против УЕОР представляло собой ИОМ15-10-11. Эту молекулу экспрессировали в клетках млекопитающих НЕК293-6Е с применением методик транзиторной трансфекции ко-трансфекцией легких и тяжелых цепей (8Е^ ГО ЫО: 73 и 185). Эту молекулу экспрессировали с получением тАЬбАЬ с уровнями экспрессии, сходными с описанными в примере 11.2, тем не менее, при исследовании на предмет активности в том же анализе УЕОР, как описано в примере 11.3, было обнаружено, что она имела невыявляемые уровни ингибирования связывания УЕОР с рецептором УЕОР в данном анализе.
Пример 12 .
12.1. Получение бАЬ-расширенного 1дО против двух мишеней против УЕОР/против ГО-1К1
Две молекулы бАЬ-расширенных 1дО против двух мишеней конструировали с применением стандартных молекулярно-биологических методик, следуя способу вставки областей, кодирующих модельные У-домены, между бАЬ и константными областями обеих цепей.
Для легкой цепи бАЬ против ГО-1К1 ИОМ4-130-54 ранее клонировали в экспрессионную кассету с сайтами 8а11 и ВчШ1 (фиг. 51) с образованием бАЬ-Ск-цепи. Для получения легкой цепи бАЬрасширенного 1дО модельную УК-область амплифицировали с применением ПЦР с использованием праймеров, кодирующих ВмШ1 на обоих концах. Плазмиду, содержащую экспрессионную кассету бАЬСк, расщепляли с использованием ВчШ1. Расщепленный с использованием ВчШ1 модельный домен УК лигировали в эту плазмиду с образованием легкой цепи бАЬ-расширенного 1дО с линкером «ТУААР8» между двумя вариабельными доменами.
Идентичному способу следовали для получения тяжелой цепи бАЬ-расширенного 1дО, где амплифицированный посредством ПЦР модельный домен УН с ЫНе1-концами лигировали в расщепленную ЫНе1 тяжелую цепь бАЬ между бАЬ ИОМ15-26 и СН1 (фиг. 51) с линкером А8ТКОР8 между двумя вариабельными доменами.
Она обозначена ИМ82090 и имеет последовательность, изложенную в 8НС) ГО ЫО: 163 (последовательность ДНК 8НС) ГО ЫО: 162). Ее соединяли с легкой цепью, изложенной в 8НС) ГО ЫО: 77 (последовательность ДНК 8НС) ГО ЫО: 171).
Вторую тяжелую цепь конструировали таким же способом, но с использованием бАЬ 1Х)М 15-26593. Она была обозначена ИМ82091 и имеет последовательность, изложенную в 8НС) ГО ЫО: 76 (последовательность ДНК 8НС) ГО ЫО: 172). Ее соединяли с легкой цепью, изложенной в 8НС) ГО ЫО: 77 (последовательность ДНК 8НС) ГО ЫО: 171).
Были выбраны клоны с верифицированной последовательностью, и получение препаратов ДНК в укрупненном масштабе было осуществлено с применением наборов ^^адеη Мах1 или Меда Ргер КЕ в соответствии с протоколами изготовителя. Полученные конструкции экспрессировали в клетках млекопитающих с применением методик транзиторной трансфекции ко-трансфекцией легких и тяжелых цепей.
12.2. Очистка и 8ЕС-анализ тАЬбАЬ против двух мишеней против УЕОР/против ГО1-К1
Обе молекулы бАЬ-расширенных 1дО против ГО-1К1/против УЕОР очищали из осветленного экспрессионного супернатанта с применением аффинной хроматографии с белком А согласно установленным протоколам. Концентрации очищенных образцов определяли спектрофотометрией на основании измерений оптической плотности при 280 нм. 8В8-РАОЕ-анализ ИМ82090 показан на фиг. 52, и ИМ82091 показан на фиг. 53. Оба очищенных образца показывают невосстановленные образцы 190 кДа, в то время как восстановленные образцы показывают две полосы 35 и 60 кДа, что соответствует бАЬрасширенной легкой цепи и тяжелым цепям соответственно.
Для гель-хроматографического анализа (8ЕС-анализа) бАЬ-расширенный 1дО против УЕОР/против ГО-1К1 вносили в предварительно уравновешенную колонку 8ирегбех-200 10/30 НК (подсоединенную к системе РРЕС Ак!а Ехргезз) для использования с РВ8 при 0,5 мл/мин. 8ЕС-профили ИМ82090 (фиг. 54) и
- 66 023031 □М32091 (фиг. 55) оба демонстрируют одну разновидность в виде симметричного пика.
12.3. Аффинности связывания тАЬйАЬ против двух мишеней против νΕΟΡ/против ΡΠ1-Κ1
Аффинности связывания для νΕΟΡ и 1Ы-К1 определяли, как описано в способах 12 и 15 соответственно. Полученные в анализе данные анализировали с применением ОгарЬРаб Рп§т. Значения активности определяли с использованием сигмовидной кривой доза-ответ и данные корректировали с использованием наиболее подходящей модели. Было вычислено, что активность БМ32090 против νΕΟΡ (фиг. 57) составляла 158,4 пМ, в то время как для контроля, тАЬ против νΕΟΡ, было получено значение ЕС50 689,2 пМ. Было вычислено, что активность БМ32091 против νΕΟΡ (фиг. 56) составляла 55 пМ, в то время как для контроля, тАЬ против νΕΟΡ, было получено значение ЕС50 766 пМ.
В биологическом анализе против 1Б-1К1 (фиг. 58) активность БМ32090 составляла 32 пМ, в то время как для контрольного тАЬ против 1Б-1К1 была получена ЕС50 25 пМ. Активность БМ32091 (фиг. 59) составляла 17,47 пМ, в то время как для контрольного тАЬ против 1Б-1К1 была получена ЕС50 35,02 пМ.
В заключение, данные анализа показывают, что пример 12, йАЬ-расширенный Ι§Ο против 1Ь1К1/против νΕΟΡ, активен против обоих антигенов.
12.4. Фармакокинетика (РК) тАЬйАЬ против двух мишеней против νΕΟΡ/против 1Б-1К1 у крыс
Эту молекулу исследовали на предмет ее фармакокинетических свойств у крыс ΐη νί\Ό. ЙАЬрасширенный Ι§Ο против 1Ь-1К1/против νΕΟΡ вводили в/в трем крысам и образцы сыворотки получали в течение периода продолжительностью 7 суток (168 ч). Концентрацию лекарственного средства, сохранявшуюся в различных временных точках после введения, оценивали посредством Ε^IδΑ как против 1Ь1Κ1, так и против νΕΟΡ. Результаты показаны на Фиг. 127.
РК-параметры показаны в табл. 17.3.
Таблица 17.3
| Молекула | Анализируемый антиген | Период полувыведения | Стах | лис (0- ϊηί) | Клиренс | Экстраполированный % Аис |
| (ч) | (мкг/мл) | (ч*м кг/мл) | (мл/ч/кг) | |||
| ЦМ32090 | ΤΝΡ | 72,1 | 100,4 | 4811,6 | 1.1 | 19 |
| ОМ32091 | И-1К1 | 86,3 | 87,7 | 3467,4 | 1.6 | 23,7 |
Пример 13.
13.1. Получение тАЬйАЬ против трех мишеней против ΤΝΡ/против νΕΟΡ/против ΕΟΡΚ тАЬйАЬ против трех мишеней конструировали с применением стандартных молекулярнобиологических методик и следуя способу вставки областей, кодирующих ν-домен тАЬ между ЙАЬ и константными областями обеих цепей.
Для легкой цепи ЙАЬ против ΕΟΡΚ Б0М16-39-542 ранее клонировали в экспрессионную кассету с сайтами 8а11 и Βδΐ^Ι (фиг. 15) с образованием йАЬ-Ск-цепи. Для получения легкой цепи тАЬйАЬ область νΡ тАЬ амплифицировали с применением ПЦР с праймерами, кодирующими Βδΐ^Ι на обоих концах. Плазмиду, содержащую экспрессионную кассету ЙАЬ-Ск, расщепляли с использованием Βδΐ^Ι. Расщепленный с использованием Βδΐ^Ι домен νΡ тАЬ лигировали в эту плазмиду с образованием легкой цепи тАЬйАЬ, что приводило к образованию линкера ^ААР8 между двумя вариабельными доменами.
Идентичному способу следовали для получения тяжелой цепи тАЬйАЬ, где амплифицированную посредством ПЦР область νΗ тАЬ с №е1-концами лигировали в расщепленный Νίκΐ вектор тяжелой цепи бАЬ между ЙАЬ (Б0М15-26) и СН1 (фиг. 60), приводя к образованию линкера 'Ά3ΤΚΟΡ3 между двумя вариабельными доменами.
Были выбраны клоны с верифицированной последовательностью (аминокислотные δΕΟ ΙΌ Ν0: 78 и 79 для тяжелой и легкой цепей соответственно) и получение препаратов ДНК в укрупненном масштабе было осуществлено с применением наборов Р1а§еп Меда Ргер Κΐί в соответствии с протоколами изготовителя. тАЬйАЬ экспрессировали в клетках млекопитающих с применением методик транзиторной трансфекции ко-трансфекцией легких и тяжелых цепей.
13.2. Очистка тАЬйАЬ против трех мишеней против ΤΝΡ/против νΕΟΡ/против ΕΟΡΚ тАЬйАЬ против ΤΝΡ/против νΕΟΡ/против ΕΟΡΚ очищали из осветленного экспрессионного супернатанта с применением аффинной хроматографии с белком А согласно установленным протоколам. Концентрации очищенных образцов определяли спектрофотометрией на основании измерений оптической плотности при 280 нм. 3^3-РΑΟΕ-анализ (фиг. 61) очищенного образца показывает невосстановленный образец 190 кДа, в то время как восстановленный образец показывает две полосы 35 и 60 кДа, что соответствует йАЬ-расширенной легкой цепи и тяжелым цепям соответственно.
13.3. Аффинности связывания тАЬйАЬ против трех мишеней против ΤΝΡ/против νΕΟΡ/против ΕΟΡΚ
Аффинности связывания для νΕΟΡ, ΕΟΡΚ и ΤΝΡ определяли, как описано в способах 12, 13 и 14, соответственно. Полученные в анализе данные анализировали с применением СтгарИРас! Рикш. Значения активности определяли с использованием сигмовидной кривой доза-ответ и данные корректировали с
- 67 023031 использованием наиболее подходящей модели. Было вычислено, что активность данного тАЬбАЬ против УΕСР (фиг. 62) составляла 1,885 мМ, в то время как для контроля, тАЬ против УΕСР, было получено значение ЕС50 0,145 нМ.
В биологическом анализе против ΤNР (фиг. 63) активность составляла 87 пМ, в то время как для контрольного тАЬ против Т№ была получена ЕС50 104 пМ. В анализе против ΕΟΗΚ (фиг. 64) тАЬбАЬ против трех мишеней обеспечивало примерно 20% ингибирование в концентрации примерно 300 нМ. В то время как для связывания УΕСР и ΤNР были вычислены значения ЕС50, для связывания ΕСРК не было получено полной кривой для вычисления значения ЕС50.
Пример 14. тАЬбАЬ против IСР-1К/УΕСР
14.1. Конструирование тАЬбАЬ против IСР-1К/УΕСР
Последовательности генов вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи против ЮР-1К изначально синтезировали бе поуо посредством ПЦР с перекрывающимися олигонуклеотидами. Проводили слияние этих областей с человеческим 1цС1 или константными областями каппа в векторе экспрессии млекопитающих с применением стандартных молекулярно-биологических методик. Последовательность гена для однодоменного антитела против УΕСР конструировали сходным образом посредством ПЦР с использованием перекрывающихся олигонуклеотидов и проводили ее слияние с 3'концом генов либо тяжелой, либо легкой цепи компонентов против ЮР-1К, описанных выше. Слитая конструкция содержала либо линкер из двух аминокислот ^δ), либо линкер из 8 аминокислот (ΤУАΛРδСδ) между компонентами антитела и однодоменного антитела. Тяжелые и легкие цепи антитела также конструировали без однодоменного антитела и линкерных последовательностей. Клоны с верифицированной последовательностью были выбраны для получения ДНК в укрупненном масштабе с использованием набора Рпс1оГгее СРауеп Μаx^ρ^еρ, следуя протоколам изготовителя.
В последовательностях δΡ() ΙΌ N0: 108, 109, 111 и 112 положение линкерной последовательности между антителом и однодоменным антителом подчеркнуто. Альтернативные варианты могут быть конструированы либо полным удалением линкера, либо использованием других линкеров. Примеры других подходящих линкеров приведены в δΕΟ ΙΌ N0: 6 и 8-11. В табл. 18 представлен перечень конструированных и экспрессированных антител.
Таблица 18. Конструированные и исследованные антитела
| Идентификатор | Альтернативные названия | Антитело | Однодоменное антитело | Линкер | ЗЕО Ю ΝΟ: тяжелой цепи | ЗЕО Ю ΝΟ: легкой цепи | Место слияния |
| ВРС1603 | 81Н П/ААР5С5 593, ОМ34019 | Антитело против 1СР- 1К НОЮ | ϋοιτιΐ5- 26-593 против νΕΟΡ | ТУААРЗСЗ | 108 | 113 | С-конец тяжелой цепи |
| ВРС1604 | 381Η СЗ 593, ϋΜ34020 | Антитело против 1СР- 1Р НОЮ | ϋοιτιΐδ- 26-593 против \/ЕСР | СЗ | 109 | 113 | С-конец тяжелой цепи |
| ВРС1605 | 38Л. ТУААР5СЗ 593, ОМ54021 | Антитело против 1СР- 1К НОЮ | Оот15- 26-593 против νΕΟΡ | ТУААРЗСЗ | 110 | 111 | С-конец легкой цепи |
| ВРС1606 | 3811.(38 593, ОМ34022 | Антитело против 1СР- 1Р НОЮ | ϋοιτιΐδ- 26-593 против УЕСР | СЗ | 110 | 112 | С-конец легкой цепи |
Пример 14.2. Экспрессия, очистка и δΕС-профиль тАЬбАЬ IСР-1К/УΕСР
Комбинации векторов тяжелой и легкой цепи экспрессировали транзиторными трансфекциями ΗΕК293-6Е. Кратко, 50 мл клеток НЕК293-6Е в концентрации 1,5 х 106 клеток/мл трансфицировали 25 мкг плазмиды тяжелой цепи и 25 мкг плазмиды легкой цепи, предварительно инкубированными с реагентом 293Гесйп (ПтЦоуеп # 51-0031). Клетки помещали в инкубатор с перемешиванием при 37°С, 5% СО2 и относительной влажности 95%. Через 24 ч добавляли триптоновую питательную среду и клетки выращивали еще в течение 72 ч. Супернатант собирали центрифугированием с последующей фильтрацией с использованием 0,22 мкм фильтра. Экспрессированный белок очищали с использованием сефарозной колонки с белком А и проводили диализ в РΒδ. Очищенный белок анализировали гельхроматографией (δΕС), и она показана на фиг. 65.
Антитело против ЮР-1К (Н0Ь0) использовали в качестве антитела сравнения в следующих анализах. Данная молекула имеет последовательность тяжелой цепи, изложенную в δΕΟ ΙΌ N0: 110, и последовательность легкой цепи, изложенную в δΕΟ ΙΌ N0: 113.
Другое тАЬбАЬ со специфичностью в отношении постороннего антигена использовали в качестве антитела сравнения в следующих анализах. Данная молекула имеет последовательность тяжелой цепи,
- 68 023031 изложенную в 8ЕО ГО NО: 87, и последовательность легкой цепи, изложенную в 8Е0 ГО NО: 13, и его обозначают ВРС1601.
Пример 14.3. ЕЫ8А связывания ЮР-1К
ЕЫ8А связывания проводили для исследования связывания очищенных тАЪбАЪ против ЮР1К/УЕОР с ЮР-1К. Кратко, планшеты для ЕЫ8А покрывали антителом против полигистидина (АЬСат АВ9108) в концентрации 1 мкг/мл и блокировали блокирующим раствором (4% В8А в забуференном Трис-физиологическом растворе), и вносили рекомбинантный человеческий ЮР-1К с гистидиновой меткой (Κ&Ό 8ук!етк 305-ОК) в концентрации 400 нг/мл в РВ8. Планшет инкубировали 1 ч при комнатной температуре перед отмывкой в ТВ8 + 0,05% Тгееп 20 (ТВ8Т). Добавляли различные концентрации очищенных тЛЪбАЪ, а также моноклональное антитело против ЮР-1К (Н0Ь0) и постороннее тЛЪбАЪ (ВРС1601), разведенные в блокирующем растворе. Планшет инкубировали 1 ч при комнатной температуре перед отмывкой в ТВ8Т. Связывание выявляли добавлением меченного пероксидазой антитела против человеческой легкой цепи каппа (81дша А7164) в разведении 1/1000 в блокирующем растворе. Планшет инкубировали 1 час при комнатной температуре перед отмывкой в ТВ8Т. Планшет проявляли добавлением ОРЭ-субстрата (81дша Р9187) и окраску останавливали добавлением ЗМ Н28О4. Оптическую плотность измеряли при 490 нм спектрофотометром для прочтения планшетов и среднюю оптическую плотность наносили на диаграмму.
Результаты ЕЫ8А связывания представлены на фиг. 66 и подтверждают, что все исследованные варианты тАЪбАЪ против ЮР1К-УЕОР (ВРС1603-1606) показывают связывание с ЮР-1К на уровнях, сопоставимых с антителом против ЮР-1К ОБО. Значения ЕС50 вычисляли с использованием программного обеспечения СатЬйбдекой Вюаккау, и они представляют собой следующее: НОБО (0,1797 мкг/мл), ВРС1603 (0,1602 мкг/мл), ВРС1604 (0,1160 мкг/мл), ВРС1605 (0,1975 мкг/мл), ВРС1606 (0,1403 мкг/мл). Для постороннего контрольного биспецифичного антитела ВРС1601 было показано отсутствие выявляемого связывания с ЮР-1 К.
Пример 14.4. ЕЫ8А связывания УЕОР
ЕЫ8А связывания проводили для исследования связывания очищенных биспецифичных антител против ЮР-1К/УЕОР с УЕОР. Планшеты для ЕЫ8А покрывали рекомбинантным человеческим УЕОР (О8К) в концентрации 400 нг/мл в РВ8 и затем блокировали в блокирующем растворе (4% В8А в ТВ8). Добавляли различные концентрации очищенных тАЬбАЬ, разведенных в блокирующем растворе, и тАЬбАЬ ВРС1601 использовали в качестве отрицательного контроля. Планшет инкубировали 1 ч при комнатной температуре перед отмывкой в ТВ8Т. Связывание выявляли добавлением меченного пероксидазой антитела против человеческой легкой цепи каппа (81дша А7164) в разведении 1/1000 в блокирующем растворе. Планшет инкубировали 40 мин при комнатной температуре перед отмывкой в ТВ8Т. Планшет проявляли добавлением ОРЭ-субстрата (81дша Р9187) и окраску останавливали добавлением 3М Н28О4. Оптическую плотность измеряли при 490 нм спектрофотометром для прочтения планшетов и среднюю оптическую плотность наносили на диаграмму.
Результаты ЕЫ8А связывания представлены на фиг. 67 и подтверждают, что все четыре тЛЪбАЪ против ЮР1К-УЕОР (ВРС1603-1606) способны связывать иммобилизованный УЕОР. Вероятная меньшая связывающая активность ВРС1605 и ВРС1606 может быть связана с взаимодействием однодоменного антитела (расположенного на С-конце легкой цепи) и антитела для выявления. Значения ЕС50 вычисляли с использованием программного обеспечения СатЬйбдекой Вюаккау, и они представляют собой следующее: ВРС1603 (0,044 мкг/мл), ВРС1604 (0,059 мкг/мл), ВРС1605 (0,571 мкг/мл). Вычислить точное значение ЕС50 для ВРС1606 не представлялось возможным ввиду низких значений ответа. Для антитела против ЮР-1К Н0Б0 и постороннего контрольного тЛЪбАЪ ВРС1601 было показано отсутствие выявляемого связывания с УЕОР.
Пример 14.5. Кинетика связывания с УЕОР
Моноклональное мышиное антитело против человеческого ^О (В1асоге ВК-1008-39) иммобилизовали на биосенсорном чипе СМ5 сочетанием первичных аминов. Конструкции антител иммобилизовали с использованием этой поверхности. После иммобилизации УЕОР пропускали над поверхностью, которую затем восстанавливали с использованием 3М М§С12. Использованные для определения кинетики концентрации УЕОР составляли 256, 64, 16, 4, 1 и 0,25 нМ, с пропусканием только буфера над поверхностью с иммобилизованными конструкциями для двойного контроля. Эксперименты проводили на аппарате В1асоге Т100 с использованием 1х буфера НВ8-ЕР (ВК-1006-69) при 25°С. Данные приспосабливали к модели связывания 1:1, входящую в программное обеспечение аппарата для анализа. Данные, показанные в табл. 19, получены в двух независимых экспериментах.
- 69 023031
Таблица 19. Кинетика связывания с человеческим УЕОР
| Эксперимент 1 | Эксперимент 2 | |||||
| Конструкция | ка | кб | Κϋ (нМ) | ка | кб | Κϋ (нМ) |
| ВРС1603 | 2.398Е+6 | 2.762Е-4 | 0,115 | 1.334Е+6 | 3.497Е-4 | 0,262 |
| ВРС1604 | 9,933Е+5 | 3.092Е-4 | 0,311 | 5.806Е+5 | 3.266Е-4 | 0,563 |
| ВРС1605 | 1.599Е+6 | 2,161 Е-4 | 0,135 | 1.089Е+6 | 2.727Е-4 | 0,251 |
| ВРС1606 | 4.343Е+5 | 1.573Е-4 | 0,362 | 2,717Е+5 | 1.607Е-4 | 0,591 |
Пример 14.6. Ингибирование связывания УЕОР с рецептором
Активность тАЬбАЬ измеряли с применением анализа связывания рецептора УЕОР, как описано в способе 12. 1С50, полученные в данном анализе для ингибирования связывания УЕОР с УЕОРК2, представляют собой следующие:
ВРС1603 (0,037 нМ),
ВРС1604 (0,100 нМ),
ВРС1605 (0,167 нМ),
ВРС1606 (0,431 нМ).
Эти результаты подтверждают, что все четыре антиген-связывающие конструкции ингибируют связывание лиганда с рецептором.
Пример 14.7. Ингибирование фосфорилирования рецептора 1ОР-1К
Клетки 3Т3/^I8N с4 высевали с плотностью 10 000 клеток на лунку в 96-луночные планшеты и инкубировали в течение ночи в полной ИМЕМ (модификация ИМЕМ-Нерек +10% фетальной телячьей сыворотки (РС8)). В лунки добавляли очищенные тАЬбАЬ и инкубировали 1 ч. гЫОР-1 добавляли в обработанные лунки, достигая конечной концентрации 50 нг/мл и инкубировали еще 30 минут для стимуляции фосфорилирования рецепторов.
Среду аспирировали и затем клетки лизировали добавлением лизирующего буфера К1РА (150 мМ №С1, 50 мМ Трис-НС1, 6 мМ дезоксихолата №, 1% Т\уееп 20) со смесью ингибиторов протеаз (Косйе 11 697 498 001). Планшет замораживали на ночь. После оттаивания лизат из каждой лунки переносили в 96луночный планшет для ЕЫ8А, предварительно покрытый иммобилизующим антителом 2В9 против 1ОР1К (О8К) в концентрации 2 мкг/мл и блокировали 4% В8А/ТВ8. Планшет отмывали ТВ8Т (ТВ8 + 0,1%Т^ееп 20) и в каждую лунку добавляли меченное европием антитело против фосфотирозина (РегкшЕ1тег 1)1 АПЛ Еи-№ РТ66) в разведении 1/2500 в 4% В8А/ТВ8. После 1 ч инкубации планшет отмывали и добавляли раствор Ι)ΙΑΙ;ΙΛ Епйапсетеп! (РегктЕ1тег 1244-105). После 10 мин инкубации уровень фосфорилирования рецепторов определяли с использованием спектрофотометра для прочтения планшетов, настроенного для измерения флуоресценции европия во временном разрешении (ТКР).
Результаты эксперимента представлены на фиг. 68 и 69. Результаты подтверждают, что тАЬбАЬ ВРС1603-1606 могут ингибировать опосредованное 1ОР-1 фосфорилирование рецепторов на уровнях, сопоставимых с моноклональным антителом против 1ОР-1К Н0Ь0. Для постороннего антитела (меченного как 1дО1, 81§та 15154) было показано отсутствие активности в данном анализе.
Пример 15. Антиген-связывающий белок против СБ20/1Т-13
Пример 15.1.Молекулярная биология
Векторы экспрессии млекопитающих, кодирующие последовательности тяжелой цепи и легкой цепи тАЬ против СБ20, изложенные в 8ЕО ГО N0: 117 и 120, изначально конструировали бе поуо с применением способа, основанного на ПЦР, и стандартных молекулярно-биологических методик. Тяжелые и легкие цепи биспецифичного тАЬ против СБ20-бАЬ против ГО-13 конструировали клонированием последовательностей, кодирующих вариабельные области тяжелой и легкой цепи тАЬ против С1)20 в векторы экспрессии млекопитающих, содержащие константные области человеческого антитела, слитые с однодоменным антителом против человеческого ГО-13 (Б0М10-53-474).
Экспрессионными конструкциями тАЬбАЬ трансфицировали клетки СНОЕ1а. Собирали супернатант и затем антитело очищали с использованием иммобилизованного белка А и количественно определяли считыванием оптической плотности при 280 нм. Конструированные и исследованные тАЬбАЬ (и контрольное тАЬ против СБ20) перечислены в табл. 20.
- 70 023031
Таблица 20
| Идентификатор | Альтернативные названия | Мишень антитела | Однодоменное антитело | Линкер | ЗЕО Ю ΝΟ: тяжелой цепи | ЗЕО 10 ΝΟ: легкой цепи | Место слияния |
| ВРС1401 | КИихапН- ТУААРЗСЗ- ООМ474 | СО20 | ϋΟΜ10-53-474 | ТУААРЗСЗ | 116 | 117 | С-конец тяжелой цепи |
| ВРС1402 | РКихапН-СЗ- ООМ474 | СО20 | ϋΟΜ10-53-474 | СЗ | 118 | 117 | С-конец тяжелой цепи |
| ВРС1403 | РИихапФ- ТУААРЗСЗ- ООМ474 | СО20 | ϋΟΜ10-53-474 | ТУААРЗеЗ | 120 | 119 | С-конец легкой цепи |
| ВРС1404 | РИихапФ-СЗЗ- ООМ474 | СО20 | ϋΟΜ10-53-474 | СЗ | 120 | 121 | С-конец легкой цепи |
| тАЬ против СО20 | Ритуксан (гйихап) | СЦ20 | 120 | 117 |
Пример 15.2. Кинетика связывания с человеческим ГЬ-13
Аффинность ввязывания конструкций тАЬбАЬ для человеческого ГЬ-13 оценивали анализом ВГАсоге™. Анализы проводили с использованием иммобилизованного антитела против человеческого ГдО. Кратко, антитело против человеческого ГдО (В1асоге ВК-1008-39) иммобилизовали на чипе СМ5 сочетанием первичных аминов. Затем на этой поверхности иммобилизовали конструкции тАЬбАЬ и человеческий ГЬ-13 (полученный и очищенный в ΟδΚ) пропускали над чипом в определенных концентрациях. Поверхность восстанавливали до поверхности с белком А с использованием 3 М МдС12. Эта обработка не оказывала существенного влияния на способность иммобилизовать антитело для последующего связывания ГЬ-13. Эксперименты проводили при 25°С с использованием буфера ΗΒδ-ΕΡ на аппарате В1асоге™ Т100. Данные анализировали с использованием программного обеспечения аппарата для оценки и приспосабливали к модели связывания 1:1. Результаты анализа представлены в табл. 48, подтверждая что кинетика связывания ГЬ-13 сопоставима для всех конструкций тАМАЬ.
Т аблица 48. Данные, полученные поверхностным плазмонным резонансом (ВГАсоге™)
Связывание тАЬ-бАЬ с СО20 оценивали проточной цитометрией с использованием СО20положительной клеточной линии (Шет133). Для всех тАЬ-бАЬ (ВРС1401-ВРС1404) и контрольного антитела против СО20 было продемонстрировано дозозависимое увеличение средней интенсивности флуоресценции (МРГ) (данные не показаны).
Пример 15.3. Анализ АОСС с биспецифичным антителом против СО20/ГЬ-13
Анализ АОСС был основан на опубликованном способе Воуб е! а1. (1995) I. Гтт. Ме!Ь. 184:29-38. Кратко, клетки Кац (мишени) метили европием следующим образом. Клетки собирали, считали и готовили в конечной концентрации 1 х 107 в 15 мл пробирке с однократной отмывкой буфером Нерек (50 мМ ΗΕΡΕδ, 83 мМ №С1, 5 мМ КС1, 2 мМ МдС12 х Н2О, рН 7,4). Клетки осаждали и в каждую пробирку добавляли 1 мл ледяного буфера для мечения европием (буфер ΗΕΡΕδ плюс 600 мкМ ΕυΟ3, 3 мМ диэтилентриаминпентауксусной кислоты (ОТРА) и 25 мг/мл сульфата декстрана). Клеточную суспензию энергично взбалтывали в начале мечения и затем каждые 10 мин в течение 30 мин инкубации на льду. Добавляли 10 мл ледяного восстанавливающего буфера (буфера Нерек, содержащего 294 мг/л СаС12 х 2Н2О, 1,8 г/л Ό-глюкозы, рН 7,4) и клетки инкубировали на льду в течение еще 10 мин. Клетки затем центрифугировали, отбрасывая супернатант, и отмывали дважды восстанавливающим буфером и затем один раз полной средой. Меченные клетки затем считали и ресуспендировали в свободной от сыворотке среде в концентрации 2 х 105 клеток/мл и хранили на льду.
Человеческие очищенные мононуклеарные клетки крови (РВМС или эффекторные клетки) получали следующим образом. 150 мл цельной крови центрифугировали при 2000 об/мин в течение 10 мин для удаления сыворотки. Клетки затем разводили ΡΒδ до объема в два раза превышавшего исходный (Гпу11годеп/О1Ьсо, #14190). Пробирки Ассикрт с градиентом плотности ^1§та, #А2055-10ΕА) готовили до- 71 023031 бавлением 15 мл 1утрйоргер (Ах1к кЫе1Й, #N¥01114547) и центрифугировали в течение 1 мин при 1500 об/мин. В пробирки с градиентом плотности добавляли 25 мл кровяной суспензии и центрифугировали в течение 20 мин при 2500 об/мин с отключенным тормозом центрифуги. Верхние 10 мл супернатанта сливали. Остаток (включая лейкоцитарный слой) помещали в чистую пробирку, сверху добавляли РВЗ и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин. Супернатант сливали, клеточные осадки объединяли, отмывали один раз в среде КРМ1, повторно центрифугировали и считали. Эффекторные клетки готовили в концентрации 5 χ 106/мл в свободной от сыворотки среде КРМ1.
Планшеты для анализа готовили с использованием 96-луночных планшетов с закругленным дном (Ципс 96 тах1когЪ р1а1е, #735-0199) следующим образом. Готовили разведения антител в свободной от сыворотки среде КРМ1 в начальной концентрации приблизительно 12 мкг/мл с одиннадцатью дальнейшими 3-кратными разведениями. С использованием показанной ниже планировки планшета образец антитела объемом 50 мкл добавляли в соответствующие лунки (только горизонтальные ряды Б-Ж) с 6 повторами на разведение. Во все лунки в рядах А и 3 добавляли 50 мкл среды КРМ1. Во все лунки в планшетах с отметкой среда добавляли 50 мкл среды КРМ1. Во все лунки в планшетах с отметкой +1Ш3 добавляли 50 мкл рекомбинантного человеческого 1Ь-13, разведенного в среде КРМ1 до 4 мкг/мл (конечная концентрация 1 мкг/мл, собственный материал С§К). Все планшеты инкубировали при 4°С в течение минимум 30 мин. Во все планшеты добавляли 50 мкл меченных европием клеток-мишеней. Во все лунки в ряду 3 во всех планшетах добавляли 20 мкл 10х Тп1оп. Планшеты инкубировали при 4°С в течение по меньшей мере 30 мин. 50 мкл среды КРМ1 добавляли во все лунки в вертикальных рядах, отмеченных только мишени. 50 мкл РВМС добавляли во все лунки в вертикальных рядах с отметкой эффектор:мишени в соотношении эффектор: мишень 25:1. Планшеты центрифугировали при 1500 об/мин в течение 3 мин и инкубировали при 37°С в течение 3-4 ч. 200 мкл раствора для усиления (АУаПас/Регкт Е1тег, номер по каталогу 1244-105) добавляли в каждую лунку 96-луночных иммуносорбентных планшетов Жипс для ЕЫ8А (каждому планшету для анализа соответствует один планшет для ЕИГЗА). 20 мкл супернатанта переносили из планшета для анализа в планшет для ЕИГЗА. Планшеты для ЕИГЗА инкубировали при комнатной температуре на шейкере для планшетов в течение минимум 30 минут или хранили в течение ночи при 4°С. Высвобождение европия измеряли флуориметрией с временной задержкой (спектрофотометр для прочтения планшетов \Уа11ас У1с1ог). Спонтанный лизис = значение высвобождения европия из клеток и среды самой по себе. Максимальный лизис = неспецифический лизис клетокмишеней добавлением Тп1оп-Х100 (неионного детергента).
Эффектор:мишени Мишени Эффектор:мишени Мишени
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| А | Спонтанное высвобождение | Спонтанное высвобождение | ||||||||||
| Б | 3 мкг/мл | 0,003 мкг/мл | ||||||||||
| В | 1 мкг/мл | 0,001 мкг/мл | ||||||||||
| Г | 0,3 мкг/мл | 0,0003 мкг/мл | ||||||||||
| д | 0,1 мкг/мл | 0,0001 мкг/мл | ||||||||||
| Е | 0,03 мкг/мл | 0,00003 мкг/мл | ||||||||||
| Ж | 0,01 мкг/мл | 0,00001 мкг/мл | ||||||||||
| 3 | Максимальное высвобождение | Максимальное высвобождение |
Анализ АЭСС проводили два раза независимо с использованием РМВС от двух разных доноров. Результаты одного репрезентативного анализа представлены на фиг. 70 и 71. В дополнение, независимо был проведен сходный анализ АЭСС с использованием меньшего диапазона доз с использованием РМВС от разных доноров. Результаты этого анализа представлены на фиг. 72 и 73.
Пример 15.4. Анализ СЭС с биспецифичным антителом против СО20/1Е-13
Клетки УУЕШ (мишени) метили европием следующим образом. Кратко, клетки собирали, считали и готовили в конечной концентрации 1 χ 107 в 15 мл пробирке с однократной отмывкой буфером Нерек (50 мМ НЕРЕЗ, 83 мМ №С1, 5 мМ КС1, 2 мМ М§С12-Н20, рН 7,4). Клетки осаждали и в каждую пробирку добавляли 1 мл ледяного буфера для мечения европием (буфер НЕРЕЗ плюс 600 мкМ ЕиС13, 3 мМ ЭТРА и 25 мг/мл сульфата декстрана). Клеточную суспензию энергично взбалтывали в начале мечения и затем каждые 10 минут в течение 30 минут инкубации на льду. Добавляли 10 мл ледяного восстанавливающего буфера (буфера Нерек, содержащего 294 мг/л СаС12-2Н20, 1,8 г/л Ό-глюкозы, рН 7,4) и клетки инкубировали на льду в течение еще 10 минут. Клетки затем центрифугировали, отбрасывая супернатант, и отмывали дважды восстанавливающим буфером и затем один раз полной средой. Меченные клетки затем считали и ресуспендировали в свободной от сыворотке среде в концентрации 2 χ 105 клеток/мл и хранили на льду.
- 72 023031
Сыворотку отбирали центрифугированием из цельной крови, полученной от собственных доноров. Половину образца инактивировали тепловой обработкой при 56°С в течение 30 мин. Образцы антител разводили в свободной от сыворотки среде КРМ1, начиная с 12 мкг/мл с еще пятью 3-кратным разведениями. Образец антител объемом 50 мкл добавляли в подходящие лунки только в горизонтальных рядах Б-Ж (согласно приведенной ниже планировке планшета). 50 мкл среды КРМ1 добавляли в лунки 1-6 вертикальных рядов. Там, где указано, 50 мкл рекомбинантного человеческого 1Э-13 (в концентрации 4 мкг/мл в среде КРМ1) добавляли во все лунки 7-12 вертикальных рядов. Планшеты инкубировали при 4°С в течение минимум 30 мин. Во все планшеты добавляли 50 мкл меченных европием клеток-мишеней и планшеты инкубировали при 4°С в течение минимум 30 мин. В подходящие лунки добавляли 50 мкл сыворотки (активной или термоинактивированной) (см. приведенную ниже планировку планшета). Планшеты инкубировали в инкубаторе при 37°С в течение 2-3 ч, после чего планшеты центрифугировали при 1500 об/мин в течение 3 мин. 200 мкл раствора для усиления (^аНас/Рсгкхп Ρ1ιικί', номер по каталогу 1244-105) добавляли в каждую лунку 96-луночных иммуносорбентных планшетов \ипс для ЕЫ8А (каждому планшету для анализа соответствует один планшет для ЕЫ8А). 20 мкл супернатанта переносили из планшета для анализа в планшет для ЕЫ8А. Планшеты для ЕЫ8А инкубировали при комнатной температуре на шейкере для планшетов в течение минимум 30 мин или хранили в течение ночи при 4°С. Высвобождение европия измеряли флуориметрией с временной задержкой (спектрофотометр для прочтения планшетов УУ'аМас У1с!ог). Спонтанный лизис = значение высвобождения европия из клеток и среды самой по себе. Максимальный лизис = неспецифический лизис клеток мишеней добавлением Тп!оп-Х100 (неионного детергента).
СРЕДА ΙΙ.-13
Активный комплемент Температурная Активный комплемент Температурная обработка обработка
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| А | Спонтанное высвобождение | |||||||||||
| Б | 3 мкг/мл | |||||||||||
| В | 1 мкг/мл | |||||||||||
| Г | 0,3 мкг/мл | |||||||||||
| Д | 0,1 мкг/мл | |||||||||||
| Е | 0,03 мкг/мл | |||||||||||
| Ж | 0,01 мкг/мл | |||||||||||
| 3 | Максимальное высвобождение |
Анализ СЭС проводили три раза независимо с использованием сыворотки от трех разных доноров. Результаты одного репрезентативного анализа представлены на фиг. 74 и 75 и демонстрируют, что СЭСактивность образцов антител сопоставима в отсутствие 1Э-13. При избытке ΙΠ-13 СЭС-активность образцов антител ВРС1401 и ВРС1402 (однодоменного антитела, слитого с тяжелой цепью) снижена, в то время как на СЭС-активность ВРС1403 и ВРС1404 (однодоменного антитела, слитого с легкой цепью) присутствие 1Э-13 почти не влияет.
Пример 16.
16.1. Разработка и конструирование антиген-связывающих белков, содержащих эпитопсвязывающие домены, состоящие из альтернативных каркасов
Пять альтернативных каркасов, перечисленные ниже, комбинировали с моноклональными антителами для обеспечения биспецифичных молекул тАЬ-альтернативный каркас:
липокалин слезы (ТЭРС) против УЕСР; аффитело (АРР1) против НЕК2;
ЭАКРш (1)КР\) против НЕК2;
NАКУ против лизоцима белка куриного яйца;
УНН представителей семейства Верблюдовых против РНКазы А.
Белковые последовательности ТЭРС (дополнительную информацию см. в и8 2007/0224633), АРР1 (дополнительную информацию см. в \\'О 2005003156 А1), 1ЖР\ (дополнительную информацию см. в /аНпс!, С. с! а1. (2007), I. Мо1. Вю1., 369, 1015-1028) и NАКУ (дополнительную информацию см. в ϋ8 20050043519 А) подвергали обратной трансляции с образованием ДНК и оптимизации кодонов. Для облегчения клонирования в каждый из этих четырех альтернативных каркасов был включен сайт ВатНГ на Ν-конце и сайт ЕсоКГ на С-конце.
Фрагменты ДНК, кодирующие конечные последовательности ДНК четырех альтернативных каркасов, конструировали бс поуо с применением способа, основанного на ПЦР, и перекрывающихся олигонуклеотидов. ПЦР-продукты ТЭРС, АРР1 и 1ЖР\ клонировали в векторы экспрессии млекопитающих,
- 73 023031 содержащие тяжелую цепь НОЬО, антитела против 11СР-1К. Полученные последовательности ДНК кодируют альтернативные каркасы, слитые с С-концом тяжелой цепи посредством линкера ТУААР8С8 или линкера 08. ПЦР-продукт NАКУ клонировали в векторы экспрессии млекопитающих, содержащие ДНК. кодирующую тяжелую цепь пасколизумаба (антитела против ΙΕ-4). Полученная последовательность ДНК кодирует NАКУ, слитый с С-концом тяжелой цепи посредством линкера С8.
Для облегчения клонирования последовательность ДНК УНН представителей семейства Верблюдовых против РНКазы А модифицировали посредством ПЦР. чтобы она включала сайт ВатН1 на 5'конце и сайт ЕсоК1 на З'-конце. ПЦР-продукт клонировали в векторы экспрессии млекопитающих, содержащие тяжелую цепь пасколизумаба, антитела против 1Ь-4. Полученная последовательность ДНК кодирует УНН представителей семейства Верблюдовых. слитый с С-концом тяжелой цепи посредством линкера С8.
Конструированные антиген-связывающие белки изложены ниже в табл. 21.
Таблица 21
| Идентификатор антитела | Описание | 5Е0 аминок послед | Ю N0: ислотной овательности |
| ВРС1803 | тяжелая цепь против ЮР-1Р-С5- | 123 | |
| Т1_РС | |||
| легкая цепь против ЮР-1 Р | 113 | ||
| ВРС1804 | тяжелая цепь против ЮР-1Р- | 125 | |
| Т7ААР505-Т1_РС | |||
| легкая цепь против ЮР-1Р | 113 | ||
| ВРС1805 | тяжелая цепь против ЮР-1Р-С8-АРР1 | 126 | |
| легкая цепь против ЮР-1 Р | 113 | ||
| ВРС1806 | тяжелая цепь против ЮР-1Р- | 127 | |
| ΤΛ/ΑΑΡδΟδ-ΑΡΡΙ | |||
| легкая цепь против ЮР-1 Р | 113 | ||
| ВРС1807 | тяжелая цепь против ЮР-1 Р-Οδ- | 128 | |
| ϋΡΡΝ | |||
| легкая цепь против ЮР-1 Р | 113 | ||
| ВРС1808 | тяжелая цепь против ЮР-1Р- ΤνΑΑΡδΟδ-ϋΡΡΝ | 129 | |
| легкая цепь против ЮР-1 Р | 113 | ||
| ВРС1809 | тяжелая цепь против Ιί-4-Οδ-νΗΗ представителей семейства Верблюдовых против РНКазы А | 130 | |
| легкая цепь против ΙΕ4 | 15 | ||
| ВРС1816 | тяжелая цепь против ИЧ-Οδ-ΝΑΡν | 131 | |
| легкая цепь против И-4 | 15 |
Плазмидами экспрессии. кодирующими тяжелые и легкие цепи антиген-связывающих белков. изложенных в табл. 21. транзиторно трансфицировали клетки НЕК 29З-6Е с использованием 29ЗГес1т (1пуйгодеп. 12З47О19). В тот же день или на следующий день в каждую из клеточных культур добавляли триптоновую питательную среду и надосадочный материал собирали через приблизительно 2-6 суток после начала трансфекции. Антиген-связывающий белок очищали от супернатанта с использованием колонки с белком А перед исследованием в анализах связывания.
16.2. ЕЕ18А связывания гк1СР-1К
96-луночные планшеты с интенсивным связыванием покрывали 1 мкг/мл антитела против гистидиновой метки (АЬеат, аЬ91О8) в РВ8 и хранили в течение ночи при 4°С. Планшеты отмывали дважды забуференным Трис физиологическим раствором с 0,05% Т\\ееп-20. В каждую лунку добавляли 2ОО мкл блокирующего раствора (5% В8А в буфере Г)РВ8) и планшеты инкубировали по меньшей мере 1 ч при комнатной температуре. Затем проводили еще одну стадию отмывки. В каждую лунку добавляли О.4 мкг/мл гк1СР-1К (К&Г) 8уз1ет8) в объеме 50 мкл на лунку. Планшеты инкубировали в течение часа при комнатной температуре и затем отмывали. Проводили последовательное разведение очищенных антигенсвязывающих белков/антител по планшетам в блокирующем растворе. Через 1 ч инкубации планшеты отмывали. Козье противочеловеческое антитело, специфичное в отношении легкой цепи каппа, конъю- 74 023031 гированное с пероксидазой, разводили в блокирующем растворе до 1 мкг/мл и 50 мкл добавляли в каждую лунку. Планшеты инкубировали в течение одного часа. После еще одной стадии отмывки в каждую лунку добавляли 50 мкл раствора субстрата Ο6Ω (дигидрохлорида о-фенилендиамина) δ^дтаΡаκΐ и через 15 мин реакцию останавливали добавлением 25 мкл 3 М серной кислоты. Оптическую плотность считывали при 490 нм с использованием УегкаМах ΤιιικιΝ; Мюгор1а1е Кеабег (Мо1еси1аг Эе\асек) с применением протокола основной конечной точки.
На фиг. 76, 78 и 80 показаны результаты ΕΟδΆ, и они подтверждают, что антиген-связывающие белки ВРС1803-ВРС1808 связывают рекомбинантный человеческий IΟЕ-1Κ. Для моноклинального антитела Н0Ь0 против IΟЕ-1Κ также было показано связывание с рекомбинантным человеческим IΟЕ-1Κ, в то время как для антитела отрицательного контроля ^1дта Ι5154) было показано отсутствие связывания с ЮТ-ТК
16.3. Ε^IδΆ связывания УΕΟЕ
96-луночные планшеты с интенсивным связыванием покрывали 0,4 мкг/мл ЬУΕΟЕ165 (К&Э δуκΐетκ) и инкубировали при +4°С в течение ночи. Планшеты дважды отмывали забуференным Трис физиологическим раствором с 0,05% Τ\υ;;ιί-20. В каждую лунку добавляли 200 мкл блокирующего раствора (5% ВδΆ в буфере ΩΓΕδ) и планшеты инкубировали по меньшей мере 1 ч при комнатной температуре. Затем проводили еще одну стадию отмывки. Проводили последовательное разведение очищенных антиген-связывающих белков/антител по планшетам в блокирующем растворе. Через 1 ч инкубации планшеты отмывали. Козье противочеловеческое антитело, специфичное в отношении легкой цепи каппа, конъюгированное с пероксидазой, разводили в блокирующем растворе до 1 мкг/мл и 50 мкл добавляли в каждую лунку. Планшеты инкубировали в течение одного часа. После еще одной стадии отмывки в каждую лунку добавляли 50 мкл раствора субстрата Ο6Ω (дигидрохлорида о-фенилендиамина) δ^дтаΡаκΐ и через 15 мин реакцию останавливали добавлением 25 мкл 3 М серной кислоты. Оптическую плотность считывали при 490 нм с использованием УегкаМах ΤιιικιΝ; Мюгор1а1е Кеабег (Мо1еси1аг Эе\асек) с применением протокола основной конечной точки.
На фиг. 77 показаны результаты Ε^IδΆ связывания УΕΟЕ, и они подтверждают, что биспецифичные антитела ВРС1803 и ВРС1804 связывают человеческий УΕΟЕ. Биспецифичное антитело против УΕΟЕ (ВРС1603) было использовано в качестве положительного контроля в данном анализе, и для него было показано связывание с УΕΟЕ. Наоборот, для моноклонального антитела Н0Ь0 против IΟЕ-1Κ было показано отсутствие связывания с человеческим УΕΟЕ.
16.4. Ε^IδΆ связывания ЖК2
96-луночные планшеты с интенсивным связыванием покрывали 1 мкг/мл НΕΚ2 (К&Э δуκΐетκ) и инкубировали при +4°С в течение ночи. Планшеты отмывали дважды забуференным Трис физиологическим раствором с 0,05% Τ\υ;;ιί-20. В каждую лунку добавляли 200 мкл блокирующего раствора (5% ВδΆ в буфере ΩΓΕδ) и планшеты инкубировали по меньшей мере 1 ч при комнатной температуре. Затем проводили еще одну стадию отмывки. Проводили последовательное разведение очищенных антигенсвязывающих белков/антител по планшетам в блокирующем растворе. Через 1 ч инкубации планшеты отмывали. Козье противочеловеческое антитело, специфичное в отношении легкой цепи каппа, конъюгированное с пероксидазой, разводили в блокирующем растворе до 1 мкг/мл и 50 мкл добавляли в каждую лунку.
Планшеты инкубировали в течение одного часа. После еще одной стадии отмывки в каждую лунку добавляли 50 мкл раствора субстрата Ο6Ω (дигидрохлорида о-фенилендиамина) δ^дтаΡаκΐ и через 15 мин реакцию останавливали добавлением 25 мкл 3 М серной кислоты. Оптическую плотность считывали при 490 нм с использованием УегкаМах ΤιιικιΝ; Мюгор1а1е Кеабег (Мо1еси1аг Эе\асек) с применением протокола основной конечной точки.
На фиг. 79 и 81 показаны результаты Ε^IδΆ связывания ΜΕΕΣ, и они подтверждают, что антигенсвязывающие белки ВРС1805, ВРС1806, ВРС1807 и ВРС1808 связывают рекомбинантный человеческий ΜΕΕ2. Герцептин был использован в качестве положительного контроля в данном анализе, и для него было показано связывание с НΕΚ2. Наоборот, для моноклонального антитела Н0Ь0 против IΟЕ-1Κ было показано отсутствие связывания с человеческим НΕΚ2.
16.5: Ε^IδΆ связывания Ш-4
96-луночные планшеты с интенсивным связыванием покрывали 5 мкг/мл человеческого ГБ-4 в РВδ и хранили в течение ночи при 4°С. Планшеты отмывали дважды забуференным Трис физиологическим раствором с 0,05% 1кееп-20. В каждую лунку добавляли 200 мкл блокирующего раствора (5% ВδΆ в буфере ΩΓΕδ) и планшеты инкубировали по меньшей мере 1 ч при комнатной температуре. Затем проводили еще одну стадию отмывки. Проводили последовательное разведение очищенных антигенсвязывающих белков/антител по планшетам в блокирующем растворе. Через 1 ч инкубации планшеты отмывали. Козье противочеловеческое антитело, специфичное в отношении легкой цепи каппа, конъюгированное с пероксидазой ^дта, А7164), разводили в блокирующем растворе до 1 мкг/мл и 50 мкл добавляли в каждую лунку. Планшеты инкубировали в течение одного часа. После еще одной стадии отмывки в каждую лунку добавляли 50 мкл раствора субстрата Ο6Ω (дигидрохлорида офенилендиамина) δ^дтаЕаκΐ и через 15 мин реакцию останавливали добавлением 25 мкл 3 М серной ки- 75 023031 слоты. Оптическую плотность считывали при 490 нм с использованием УеткаМах ТипаЬ1е Мютор1а1е Кеабег (Мо1еси1аг ЭеуюеЦ с применением протокола основной конечной точки.
На фиг. 82 показаны результаты ЕЫ8А, и они подтверждают, что антиген-связывающий белок ВРС1809 связывает человеческий 1Ь-4 на уровнях, сопоставимых с моноклоналыным антителом против 1Ь-4, пасколизумабом. Для антитела отрицательного контроля (8фта 15154) было показано отсутствие связывания с 1Ь-4.
На фиг. 84 показаны результаты ЕЫ8А, и они подтверждают, что антиген-связывающий белок ВРС1816 связывает человеческий 1Ь-4 на уровнях, сопоставимых с моноклональным антителом против 1Ь-4, пасколизумабом. Для антитела отрицательного контроля (8фта 15154) было показано отсутствие связывания с 1Ь-4.
16.6: ЕЫ8А связывания РНКазы А мкл 1 мкг/мл РНКазы А (ф1адеп, 19101), разведенной в РВ8, добавляли в каждую лунку 96луночного планшета С.051аг. Планшет инкубировали 2 ч при комнатной температуре, затем отмывали РВ8Т перед добавлением в каждую лунку 200 мкл блокирующего раствора 4% В8А/РВ8. Планшет инкубировали в течение часа и отмывали перед добавлением образцов. Очищенные антитела и антигенсвязывающий белок ВРС1809 в концентрации 2 мкг/мл добавляли в лунки 1 вертикального ряда, затем проводили серийные разведения по планшету в блокирующем растворе в соотношении 1 к 2. Планшет инкубировали в течение часа, затем отмывали. Добавляли 50 мкл на лунку козьего противочеловеческого антитела, специфичного в отношении легкой цепи каппа, конъюгированного с пероксидазой (81дта, А7164), в разведении 1 к 1000. Планшет инкубировали в течение часа, затем отмывали. В каждую лунку добавляли 50 мкл 0РЭ и реакцию останавливали 3 М серной кислотой через 15-30 мин. Оптическую плотность считывали при 490 нм с использованием УеткаМах ТипаЬ1е Мютор1а1е Кеабег (Мо1еси1аг ЭеуюеЦ с применением протокола основной конечной точки.
На фиг. 83 показаны результаты ЕЫ8А связывания РНКазы А, и они подтверждают, что очищенное биспецифичное антитело из человеческого моноклонального антитела и УНН представителей семейства Верблюдовых, ВРС1809, демонстрирует связывание с РНКазой А. Наоборот, для моноклонального антитела против 1Ь-4, пасколизумаба, и антитела отрицательного контроля (8фта 15154) было показано отсутствие связывания РНКазы А.
16.7. ЕЫ8А связывания лизоцима куриного яйца (НЕЬ)
96-луночный планшет с интенсивным связыванием покрывали 5 мкг/мл НЕЬ (лизоцим куриного яйца, 8фта Ь6876) в РВ8 и хранили в течение ночи при 4°С. Планшет отмывали дважды забуференным Трис физиологическим раствором с 0,05% Тгееп-20. В каждую лунку добавляли 200 мкл блокирующего раствора (5% В8А в буфере ЭРВ8) и планшет инкубировали по меньшей мере 1 ч при комнатной температуре. Затем проводили еще одну стадию отмывки. Проводили последовательное разведение очищенных антител по планшету в блокирующем растворе. Через 1 ч инкубации планшет отмывали. Козье противочеловеческое антитело, специфичное в отношении легкой цепи каппа, конъюгированное с пероксидазой (81дта, А7164), разводили в блокирующем растворе до 1 мкг/мл и 50 мкл добавляли в каждую лунку. Планшет инкубировали в течение одного часа. После еще одной стадии отмывки в каждую лунку добавляли 50 мкл раствора субстрата 0РЭ (дигидрохлорида о-фенилендиамина) 81дтаРа81 и через 15 минут реакцию останавливали добавлением 25 мкл 3 М серной кислоты. Оптическую плотность считывали при 490 нм с использованием УеткаМах ТипаЬ1е Мютор1а1е Кеабег (Мо1еси1аг Эеу1се5) с применением протокола основной конечной точки.
На фиг. 85 показаны результаты ЕЫ8А связывания НЕЬ, и они подтверждают, что очищенное биспецифичное антитело из человеческого моноклонального антитела и NΆΚV, ВРС1816, связывает НЕЬ. Наоборот, для моноклонального антитела против 1Ь-4, пасколизумаба, было показано отсутствие связывания с НЕЬ.
Пример 17.
17.1. Разработка и конструирование антиген-связывающих белков, содержащих эпитопсвязывающие домены, состоящие из аднектина
Аднектин СТ01 специфичен в отношении УЕОРК2 (дополнительную информацию см. в \У0 2005/056764). Белковую последовательность аднектина СТ01 подвергали обратной трансляции с образованием ДНК и оптимизации кодонов. Для облегчения клонирования были включены сайт ВатН1 на N конце и сайт ЕсоК1 на С-конце.
Фрагменты ДНК, кодирующие конечные последовательности ДНК СТ01, конструировали бе поуо с применением способа, основанного на ПЦР, и перекрывающихся олигонуклеотидов. ПЦР-продукт клонировали в векторы экспрессии млекопитающих, содержащие тяжелую цепь Н0Ь0 (антитела против ЫОР-1К), что делало возможным слияние аднектина с С-концом тяжелой цепи посредством либо линкера О8, либо линкера ТУААР8О8. Белковые последовательности тяжелой и легкой цепей биспецифичного антитела против 1СР-1К/УЕСРК2 приведены в 8ЕЦ ГО N0: 124, 113 и 133.
Белковую последовательность другого аднектина, кодирующую аднектин против ТЮТ-а (дополнительную информацию см. в И8 20080139791), подвергали обратной трансляции с образованием ДНК, оптимизации кодонов и модифицировали ее для включения терминальных сайтов ВатН1 и ЕсоК1 перед
- 76 023031 конструированием с применением способа ПЦР перекрывающихся олигонуклеотидов, описанного ранее. ПЦР-продукт клонировали в векторы экспрессии млекопитающих, содержащие ДНК, кодирующую тяжелую цепь пасколизумаба (антитела против ГО-4), что делало возможным слияние ДНК, кодирующей аднектин против ТЖ'-а, с С-концом тяжелой цепи посредством либо линкера 08, либо линкера ТУААР8О8. Белковые последовательности тяжелой и легкой цепей биспецифичного антитела против 1Ь4Τ\Ι;-α приведены в 8Ер 1Ό N0: 146, 147 и 15.
Также были разработаны антиген-связывающие белки с использованием аднектина, специфичного в отношении ТУ-о., слитого на С-конце с тяжелой цепью моноклонального антитела против ГО-13. Типичные белковые последовательности приведены в 8Ер 1Ό N0: 134, 13 и 135. В дополнение, были разработаны биспецифичные молекулы, основанные на слиянии СТ01 либо с С-концом, либо с ^концом тяжелой или легкой цепи антител против ЕСЕК эрбитукса (ЕгЬйих) и 1МС-11Е8. Типичные разработанные белковые последовательности приведены в 8Ер 1Ό N0: 136-145.
Несколько из этих типичных последовательностей были конструированы. Были конструированы последовательности ДНК, кодирующие 8Ер 1Ό N0: 136 (СТ01, слитый с С-концом тяжелой цепи эрбитукса), 8Ер 1Ό N0: 144 (СТ01 слитый с ^концом тяжелой цепи эрбитукса) и 8Ер 1Ό N0: 138 (СТ01, слитый с С-концом легкой цепи эрбитукса). Все эти последовательности были конструированы с применением способов, основанных на ПЦР, и клонированы в векторы экспрессии млекопитающих. В табл. 22 ниже представлено краткое описание разработанных и/или конструированных антиген-связывающих белков.
Таблица 22
| Идентификатор | Описание | δΕΟ | Ю N0: |
| антитела | аминокислотной последовательности | ||
| ВРС1801 (конструированное) | тяжелая цепь против Ι0Ρ-1Ρ-0δ- аднектин СТ01 | 124 | |
| легкая цепь против ЮР-1 К | 113 | ||
| ВРС1802 (конструированное) | тяжелая цепь против ЮР-1Р- ΤνΑΑΡδΟδ-аднектин СТ01 | 133 | |
| легкая цепь против ЮР-1 Р | 113 | ||
| ВРС1810 (разработанное) | тяжелая цепь против И-13-Οδ- аднектин против ΤΝΡα | 134 | |
| легкая цепь против 11_-13 | 13 | ||
| ВРС1811 (разработанное) | тяжелая цепь против 11_-13- ΤνΑΑΡδΟδ-аднектин против ΤΝΡα | 135 | |
| легкая цепь против И-13 | 13 | ||
| ВРС1812 (конструированное) | тяжелая цепь эрбитукса-Ρδ- аднектин СТ01 | 136 | |
| легкая цепь эрбитукса | 137 | ||
| ВРС1813 (конструированное) | легкая цепь эрбитукса -Ρδ- аднектин СТ01 | 138 | |
| тяжелая цепь эрбитукса | 139 | ||
| ВРС1814 (разработанное) | тяжелая цепь 11 Ρδ-Οδ-аднектин СТ01 | 140 | |
| легкая цепь 11Р8 | 141 | ||
| ВРС1815 (разработанное) | легкая цепь 11 Ρδ-Οδ-аднектин СТ01 | 142 | |
| тяжелая цепь 11Р8 | 143 | ||
| ВРС1818 (конструированное) | Οδ-аднектин ΟΤΟΙ-ΟδΤΟ- тяжелая цепь эрбитукса | 144 | |
| легкая цепь эрбитукса | 137 |
- 77 023031
ВРС1819 (разработанное)
ВРС1823 (конструированное)
ВРС1822 (конструированное)
| аднектин СТ01-ЗТС- легкая цепь эрбитукса | 145 |
| тяжелая цепь эрбитукса | 139 |
| тяжелая цепь против И-4-СЗ- аднектин против ΤΝΡα | 146 |
| легкая цепь против Н_-4 | 15 |
| тяжелая цепь против ΙΙ.-4- ТУААРЗСЗ-аднектин против ΤΝΡα | 147 |
| легкая цепь против И-4 | 15 |
Плазмидами экспрессии, кодирующими тяжелые и легкие цепи ВРС1801, ВРС1802, ВРС1822, ВРС1823, ВРС1812, ВРС1813 и ВРС1818, транзиторно трансфицировали клетки НЕК 293-6Е с использованием 293Гесйп (Iην^ΐ^о§еη, 12347019). В тот же день или на следующий день в клеточную культуру добавляли триптоновую питательную среду и надосадочный материал собирали через приблизительно 2-6 суток после начала трансфекции. В некоторых случаях надосадочный материал использовали в качестве исследуемого препарата в анализах связывания. В других случаях антиген-связывающий белок очищали с использованием колонки с белком А перед исследованием в анализах связывания.
17.2. ЕЫ8А связывания гЬ1ОР-1К
96-луночные планшеты с интенсивным связыванием покрывали 1 мкг/мл антитела против гистидиновой метки (АЬеат, аЬ9108) в РВ8 и хранили в течение ночи при 4°С. Планшеты отмывали дважды забуференным Трис физиологическим раствором с 0,05% Т\уееп-20. В каждую лунку добавляли 200 мкл блокирующего раствора (5% В8А в буфере БРВ8) и планшеты инкубировали по меньшей мере 1 ч при комнатной температуре. Затем проводили еще одну стадию отмывки. В каждую лунку добавляли 0,4 мкг/мл гЫОР-1 К (К&Б кук!етк) в объеме 50 мкл на лунку. Планшеты инкубировали в течение часа при комнатной температуре и затем отмывали. Проводили последовательное разведение очищенных антигенсвязывающих белков/антител по планшетам в блокирующем растворе. Через 1 ч инкубации планшеты отмывали. Козье противочеловеческое антитело, специфичное в отношении легкой цепи каппа, конъюгированное с пероксидазой, разводили в блокирующем растворе до 1 мкг/мл и 50 мкл добавляли в каждую лунку. Планшеты инкубировали в течение одного часа. После еще одной стадии отмывки в каждую лунку добавляли 50 мкл раствора субстрата ОР12 (дигидрохлорида о-фенилендиамина) 8щтаРак1 и через 15 мин реакцию останавливали добавлением 25 мкл 3 М серной кислоты. Оптическую плотность считывали при 490 нм с использованием УегкаМах ТипаЬ1е М1сгор1а1е Кеабег (Мо1еси1аг ^еν^сек) с применением протокола основной конечной точки.
На фиг. 86 показаны результаты ЕЫ8А связывания ЮР-1К, и они подтверждают, что очищенные биспецифичные антитела из человеческого моноклонального антитела и аднектина (ВРС1801 и ВРС1802) связывают рекомбинантный человеческий ЮР-1К на уровнях, сопоставимых с моноклональным антителом Н0Ь0 против ЮР-1К. Для антитела отрицательного контроля (8щта ^154) было показано отсутствие связывания с ЮР-1К.
17.3: ЕЫ8А связывания УЕОРК2
96-луночные планшеты с интенсивным связыванием покрывали 0,4 мкг/мл УЕОРК2 (К&Б 8ук1етк) и инкубировали при +4°С в течение ночи. Планшеты отмывали дважды забуференным Трис физиологическим раствором с 0,05% Т\уееп-20. В каждую лунку добавляли 200 мкл блокирующего раствора (5% В8А в буфере БРВ8) и планшеты инкубировали по меньшей мере 1 ч при комнатной температуре. Затем проводили еще одну стадию отмывки. Проводили последовательное разведение супернатантов или очищенных антител по планшетам в блокирующем растворе. Через 1 ч инкубации планшеты отмывали. Козье противочеловеческое антитело, специфичное в отношении легкой цепи каппа, конъюгированное с пероксидазой, разводили в блокирующем растворе до 1 мкг/мл и 50 мкл добавляли в каждую лунку. Планшеты инкубировали в течение одного часа. После еще одной стадии отмывки в каждую лунку добавляли 50 мкл раствора субстрата ОР12 (дигидрохлорида о-фенилендиамина) 81§таРак1 и через 15 мин реакцию останавливали добавлением 25 мкл 3 М серной кислоты. Оптическую плотность считывали при 490 нм с использованием УегкаМах ТипаЬ1е М1сгор1а1е Кеабег (Мо1еси1аг ^еν^сек) с применением протокола основной конечной точки.
На фиг. 87 показаны результаты ЕЫ8А связывания УЕОРК2, и они подтверждают, что очищенные биспецифичные антитела из человеческого моноклонального антитела и аднектина (ВРС1801 и ВРС1802) связывают рекомбинантный человеческий УЕОРК2. Наоборот, для моноклонального антитела Н0Ь0 против ЮР-1К было показано отсутствие связывания с человеческим УЕОРК2.
На фиг. 172 показаны результаты ЕЫ8А связывания УЕОРК2, и они подтверждают, что антигенсвязывающие белки ВРС1818 и ВРС1813 связывают рекомбинантный человеческий УЕОРК2. Наоборот, для эрбитукса было показано отсутствие связывания человеческого УЕОРК2. Для антиген-связывающих
- 78 023031 белков ВРС1813 и ВРС1818 содержание антитела в супернатанте не было определено количественно, поэтому данные, приведенные на фиг. 172, представлены как коэффициент разведения неразбавленного надосадочного материала. Для эрбитукса в анализе использовали очищенное вещество в начальной концентрации 2 мкг/мл, что соответствует коэффициенту разведения 1 на фиг. 172.
На фиг. 175 показаны результаты Εί-ΙδΑ связывания УВСΡΚ2, и они подтверждают, что антигенсвязывающий белок ВРС1812 связывает рекомбинантный человеческий \ΈΗΡΚ2. Наоборот, для эрбитукса и антитела отрицательного контроля δίβίικ-ι ^С 15154 было показано отсутствие связывания человеческого \ΈΗΡΚ2. Для антиген-связывающего белка ВРС1812 содержание антитела в супернатанте не было определено количественно, поэтому данные, приведенные на фиг. 175, представлены как коэффициент разведения неразбавленного надосадочного материала. Для эрбитукса и δίβίικι ^С 15154 в анализе использовали очищенное вещество в начальной концентрации 2 мкг/мл, что соответствует коэффициенту разведения 1 на фиг. 175.
17.4. Εί-ΙδΑ связывания Ш-4
96-луночные планшеты с интенсивным связыванием покрывали 5 мкг/мл человеческого Ш-4 в ΡΒδ и хранили в течение ночи при 4°С. Планшеты отмывали дважды забуференным Трис физиологическим раствором с 0,05% Τ\\υα·ι-20. В каждую лунку добавляли 200 мкл блокирующего раствора (5% ΒδΑ в буфере ΌΡΒδ) и планшеты инкубировали по меньшей мере 1 ч при комнатной температуре. Затем проводили еще одну стадию отмывки.
Проводили последовательное разведение супернатанта или очищенных антител/антигенсвязывающих белков по планшетам в блокирующем растворе. Через 1 ч инкубации планшеты отмывали. Козье противочеловеческое антитело, специфичное в отношении легкой цепи каппа, конъюгированное с пероксидазой ^1дта, Α7164), разводили в блокирующем растворе до 1 мкг/мл и 50 мкл добавляли в каждую лунку. Планшеты инкубировали в течение одного часа. После еще одной стадии отмывки в каждую лунку добавляли 50 мкл раствора субстрата ОΡ^ (дигидрохлорида о-фенилендиамина) δ^дтаΡа5! и через 15 минут реакцию останавливали добавлением 25 мкл 3 М серной кислоты. Оптическую плотность считывали при 490 нм с использованием УсгкаМах ΤиηаЬ1с Мюгор1а!с Ксабсг (Мо1сси1аг Эсуюск) с применением протокола основной конечной точки.
На фиг. 88 показаны результаты Εί-ΙδΑ связывания Ш-4, и они подтверждают, что биспецифичные антитела из человеческого моноклонального антитела и аднектина (ВРС1823 и ВРС1822) связывают рекомбинантный человеческий Ш-4. Для положительного контрольного моноклонального антитела против Ш-4, пасколизумаба, было показано связывание с Ш-4 и для антитела отрицательного контроля (δίβίικι Ι5154) было показано отсутствие связывания с Ш-4.
Трансфекцию НЕК для данного эксперимента повторяли для получения надосадочного материала с большей концентрацией антител. На фиг. 886 показано связывание этого супернатанта с более высокой концентрацией биспецифичного антитела из человеческого моноклонального антитела и аднектина (ВРС1823) с человеческим Ш-4, как определено посредством Εί-ΙδΑ.
Для антиген-связывающих белков ВРС1823 и ВРС1822 содержание антитела в супернатанте не было определено количественно, поэтому данные, приведенные на фиг. 88 и 886, представлены как коэффициент разведения неразбавленного надосадочного материала. Для пасколизумаба и антитела отрицательного контроля (δίβίικι Ι5154) в анализе использовали очищенное вещество в начальной концентрации 1 мкг/мл, что соответствует коэффициенту разведения 1 на фиг. 88 и 88Б.
17.5. Εί-ΙδΑ связывания ΤΝΡ-α
96-луночный планшет с интенсивным связыванием покрывали 5 мкг/мл рекомбинантного человеческого ΤΝΡ-а (КпО δу5!ст5 210-ΤΑ-050/ίΤ) в ΡΒδ и хранили в течение ночи при 4°С. Планшет отмывали дважды забуференным Трис физиологическим раствором с 0,05% Τ\\υα'ΐ-20. В каждую лунку добавляли 200 мкл блокирующего раствора (5% ΒδΑ в буфере ΌΡΒδ) и планшет инкубировали по меньшей мере 1 час при комнатной температуре. Затем проводили еще одну стадию отмывки. Проводили последовательное разведение супернатанта или очищенных антител по планшету в блокирующем растворе. Через 1 час инкубации планшет отмывали. Козье противочеловеческое антитело, специфичное в отношении легкой цепи каппа, конъюгированное с пероксидазой ^1дта, Α7164), разводили в блокирующем растворе до 1 мкг/мл и 50 мкл добавляли в каждую лунку. Планшет инкубировали в течение одного часа. После еще одной стадии отмывки в каждую лунку добавляли 50 мкл раствора субстрата ОΡ^ (дигидрохлорида о-фенилендиамина) δίβ^^-ΐδΐ и через 15 минут реакцию останавливали добавлением 25 мкл 3 М серной кислоты. Оптическую плотность считывали при 490 нм с использованием УсгкаМах ΤиηаЬ1с Мюгор1а!с Ксабсг (Мо1сси1аг Эсуюск) с применением протокола основной конечной точки.
На фиг. 89 показаны результаты Εί-ΙδΑ связывания ΤΝΡα, и они подтверждают, что биспецифичные антитела из человеческого моноклонального антитела и аднектина (ВРС1823 и ВРС1822) связывают рекомбинантный человеческий ΤΝΡ-α. Наоборот, для моноклонального антитела против Ш-4, пасколизумаба, было показано отсутствие связывания с рекомбинантным человеческим ΤΝΡ-α.
Трансфекцию НЕК для данного эксперимента повторяли для получения надосадочного материала с большей концентрацией антител. На фиг. 89Б показано связывание этого супернатанта с более высокой
- 79 023031 концентрацией биспецифичного антитела из человеческого моноклонального антитела и аднектина (ВРС1823) с рекомбинантным человеческим ТЫР-а, как определено посредством ЕЫ8А. Для контрольного 1дО было показано отсутствие связывания с рекомбинантным человеческим ТЫР-а.
Для антиген-связывающих белков ВРС1823 и ВРС1822 содержание антитела в супернатанте не было определено количественно, поэтому данные, приведенные на Фиг. 89 и 896, представлены как коэффициент разведения неразбавленного надосадочного материала. Для пасколизумаба в анализе использовали очищенное вещество в начальной концентрации 1 мкг/мл, что соответствует коэффициенту разведения 1 на фиг. 89 и 89Б.
17.6. ЕЫ8А связывания ЕОРК
96-луночный планшет с интенсивным связыванием покрывали 0,67 мкг/мл рекомбинантного белка человеческого ЕОРК в РВ8 и хранили в течение ночи при 4°С. Планшет отмывали дважды забуференным Трис физиологическим раствором с 0,05% Т\уееп-20. В каждую лунку добавляли 200 мкл блокирующего раствора (5% В8А в буфере БРВ8) и планшет инкубировали по меньшей мере 1 ч при комнатной температуре. Затем проводили еще одну стадию отмывки. Проводили последовательное разведение антиген-связывающих белков/антител по планшету в блокирующем растворе. Через 1 ч инкубации планшет отмывали. Козье противочеловеческое антитело, специфичное в отношении легкой цепи каппа, конъюгированное с пероксидазой (81дта, А7164), разводили в блокирующем растворе до 1 мкг/мл и 50 мкл добавляли в каждую лунку. Планшет инкубировали в течение одного часа. После еще одной стадии отмывки в каждую лунку добавляли 50 мкл раствора субстрата ОРБ (дигидрохлорида офенилендиамина) 81дтаРа5! и через 25 мин реакцию останавливали добавлением 25 мкл 3 М серной кислоты. Оптическую плотность считывали при 490 нм с использованием УегзаМах ТипаЬ1е М1сгор1а!е Кеабег (Мо1еси1аг Беухсез) с применением протокола основной конечной точки.
На фиг. 171 показаны результаты ЕЫ8А связывания ЕОРК, и они подтверждают, что биспецифичные антитела ВРС1818 и ВРС1813 связывают рекомбинантный человеческий ЕОРК. Для антитела положительного контроля, эрбитукса, также было показано связывание с рекомбинантным человеческим ЕОРК. Наоборот, для 81дта 1дО 15154 было показано отсутствие связывания с рекомбинантным человеческим ЕОРК. Для биспецифичных антител ВРС1813 и ВРС1818 содержание антитела в супернатанте не было определено количественно, поэтому данные, приведенные на фиг. 171, представлены как коэффициент разведения неразбавленного надосадочного материала. Для эрбитукса и антитела отрицательного контроля (81дта 15154) в анализе использовали очищенное вещество в начальной концентрации 2 мкг/мл и 1 мкг/мл соответственно, что соответствует коэффициенту разведения 1 на фиг. 171.
На фиг. 176 показаны результаты ЕЫ8А связывания ЕОРК, и они подтверждают, что биспецифичное антитело ВРС1812 связывает рекомбинантный человеческий ЕОРК. Для антитела положительного контроля, эрбитукса, также было показано связывание с рекомбинантным человеческим ЕОРК. Наоборот, для 81дта 1дО 15154 было показано отсутствие связывания с рекомбинантным человеческим ЕОРК. Для биспецифичных антител ВРС1812 содержание антитела в супернатанте не было определено количественно, поэтому данные, приведенные на фиг. 176, представлены как коэффициент разведения неразбавленного надосадочного материала. Для эрбитукса и антитела отрицательного контроля (81дта 15154) в анализе использовали очищенное вещество в начальной концентрации 2 и 1 мкг/мл соответственно, что соответствует коэффициенту разведения 1 на фиг. 176.
Пример 18. Данные о связывающей активности тАЬбАЬ против ΙΕ-13/ΙΕ-4 с удаленными аминокислотными остатками О и 8
18.1. Конструирование тАЬбАЬ
Конструировали тАЬбАЬ с удаленными аминокислотными остатками О и 8 (рядом с линкерной последовательностью). Плазмиды экспрессии конструировали с применением стандартных молекулярнобиологических методик. Эти тАЬбАЬ описаны в табл. 23. Их клонировали, затем экспрессировали в одном или более из клеток НЕК293-6Е, клеток СНОК1 или клеток СНОЕ1а, проводили их очистку (как описано в примерах 1, 1.3 и 1.5 соответственно) и анализировали в нескольких анализах активности 1Ь13 и ΙΕ-4.
Таблица 23
| Название | Описание | Идентификационный номер последовательности (ЗЕО ГО ΝΟ:) |
| РазсоН-474 с | Н-цепь = тяжелая цепь | 91 (= Н-цепь) |
| удаленным СЗ | пасколизумаба-бАЬ ϋΟΜ10-53-474 | 15 (= Ь-цепь) |
- 80 023031
| !_-цепь = легкая цепь пасколизумаба | ||
| РазсоН- | Н-цепь = тяжелая цепь | 92 (= Н-цепь) |
| ТУААРЗ- 474 с удаленным СЗ | пасколизумаба-ТУААРЗ-бАЬ ϋΟΜ10-53-474 1_-цепь = легкая цепь пасколизумаба | 15 (= 1_-цепь) |
| РазсоН-С5- | Н-цепь = тяжелая цепь | 96 (= Н-цепь) |
| А8ТКСРТ-474 с удаленным вторым СЗ | пасколизумаба-С5- АЗТКСРТ-бАЬ ϋΟΜ 10-53-474 Ь-цепь = легкая цепь пасколизумаба | 15 (= (.-цепь) |
| 586Н-210 с | Н-цепь = тяжелая цепь тАЬ против | 87 (= Н-цепь) |
| удаленным СЗ | человеческого Ιί-13-бАЬ ООМ9-112- 210 1_-цепь = легкая цепь тАЬ против человеческого П_-13 | 13 (= 1_-цепь) |
| 586Н-ТУААРЗ- | Н-цепь = тяжелая цепь тАЬ против | 88 (= Н-цепь) |
| 210 с удаленным СЗ | человеческого 11_-13- Т\/ААРЗ-бАЬ ϋΟΜ9-112-210 1_-цепь = легкая цепь тАЬ против человеческого П_-13 | 13 (= !_-цепь) |
18.2. Экспрессия и очистка
Проводили очистку и анализ этих тАЬбАЬ посредством 8ЕС и 8В8-РАОЕ. Были получены несколько очищенных препаратов, и данные 8ЕС и 8В8-РАОЕ, показанные на фиг. 90-98, типичны для этих препаратов.
18.3. Связывание с человеческим ГО-4 в ЕЫ8А прямого связывания
Очищенные РазсоН-474 с удаленным О8 и РазсоН-ТУААР8-474 с удаленным О8 исследовали на предмет связывания с человеческим ГО-4 в ЕЫ8А прямого связывания, как описано в способе 2 (РазсоН474, ΡаδсоН-ΤУАЛΡ8-474, РазсоН-А8ТКО-474 и ΡаδсоН-Е^^^Е-474 также исследовали на предмет связывания в этом анализе). Для этих молекул было проведено несколько ЕЫ8А-анализов, данные, показанные на фиг. 99, типичны для этих анализов.
Как РазсоН-474 с удаленным О8, так и РазсоН-ТУААР8-474 с удаленным О8 связывали человеческий ГО-4. Очищенное шАЬ против человеческого ГО-4 само по себе (пасколизумаб) было включено в данный анализ в качестве положительного контроля связывания с ГО-4. Очищенное шАЬ против человеческого ГО-13 было включено в качестве отрицательного контроля связывания с ГО-4. Связывающая активность РазсоН-474 с удаленным О8 и РазсоН-ТУААР8-474 с удаленным О8 была сходна с очищенным тАЬ против ГО-4 самим по себе (пасколизумабом), РазсоН-474, ΡаδсоН-ΤУАЛΡ8-474, РазсоН-А8ТКО474 и ΡаδсоН-Е^^^Е-474.
18.4. Связывание с человеческим ГО-13 в ЕЫ8А прямого связывания
Очищенные РазсоН-474 с удаленным О8 и РазсоН-ТУААР8-474 с удаленным О8 также исследовали на предмет связывания с человеческим ГО-13 в ЕЫ8А прямого связывания, как описано в способе 1 (РазсоН-б1б и Ра8соН-ТУААР8-б1б также исследовали на предмет связывания в этом анализе, получение этих молекул описано в Примере 19). Для этих молекул было проведено несколько ЕЫ8А-анализов, данные, показанные на Фиг. 100, типичны для всех анализов.
Все РазсоН-474 с удаленным О8, РазсоН-ТУААР8-474 с удаленным О8, РазсоН-б1б и РазсоНТУААР8-б1б связывали человеческий ГО-13. Очищенное тАЬ против человеческого ГО-4 само по себе (пасколизумаб) было включено в данный анализ в качестве отрицательного контроля связывания с ГО-13. Очищенное шАЬ против человеческого ГО-13 было включено в качестве положительного контроля связывания с ГО-13. Следует отметить, что бАЬ против ГО-13 само по себе (Ό0Μ10-53-474) не исследовали в данном анализе ввиду невозможности выявления бАЬ вторичным антителом для выявления; вместо этого, очищенное тАЬ против человеческого ГО-13 использовали в качестве положительного контроля для демонстрации связывания ГО-13 в этом анализе.
18.5. Связывание с ГО-13 яванского макака в ЕЫ8А прямого связывания
Очищенные тАЬбАЬ РазсоН-474 с удаленным О8, ΡаδсоН-ΤУАЛΡ8-474 с удаленным О8, РазсоНб1б и ΡаδсоН-ΤУАЛΡ8-б1б также исследовали на предмет связывания с ГО-13 яванского макака в ЕЫ8А прямого связывания (как описано в способе 17). Для этих молекул было проведено несколько ЕЫ8Аанализов, данные, показанные на фиг. 101, типичны для всех анализов.
Все РазсоН-474 с удаленным О8, РазсоН-ТУААР8-474 с удаленным О8, РазсоН-б1б и РазсоНТУААР8-б1б связывали ГО-13 яванского макака. Очищенное тАЬ против человеческого ГО-4 само по
- 81 023031 себе (пасколизумаб) было включено в данный анализ в качестве отрицательного контроля связывания с Ιί-13. Очищенное тАЬ против человеческого Ιί-13 было включено в качестве положительного контроля связывания с Ιί-13 яванского макака. Следует отметить, что ЙАЬ против Ιί-13 сами по себе (Э0М10-53474 и Э0М10-53-616) не исследовали в данном анализе ввиду невозможности выявления ЙАЬ вторичным антителом для выявления; вместо этого, очищенное тАЬ против человеческого Ιί-13 использовали в качестве положительного контроля для демонстрации связывания Ιί-13 в этом анализе.
18.6. Β^асο^е-анализ связывания с человеческим Ιί-4 и человеческим Ιί-13
Очищенные тАЬйАЬ исследовали на предмет связывания с человеческим Ιί-4 и человеческим Ю 13 с использованием ΒIΑсο^е™ Τ100 при 25°С (как описано в способах 4 и 5). Эти данные показаны в табл. 24.
В эксперименте 1 для тАЬйАЬ достигали уровня связывания приблизительно 600 относительных единиц ответа и оценивали кривые при шести концентрациях Ιί-13 и Ιί-4 (256 нМ, 64 нМ, 16 нМ, 4 нМ, 1 нМ и 0,25 нМ). Для тАЬ в эксперименте 1 оценивали кривую только при одной концентрации Ιί-13 (256 нМ) и П,4 (256 нМ).
В эксперименте 2 для тАЬЙАЬ достигали уровня связывания приблизительно 400 относительных единиц ответа и оценивали кривые при шести концентрациях Ιί-4 (64, 16, 4, 1, 0,25 и 0,0625 нМ) и шести концентрациях Ιί-13 (256, 64, 16, 4, 1 и 0,25 нМ). Для тАЬ против Ιί-13 в эксперименте 2 оценивали кривую только при одной концентрации Ιί-13 (256 нМ), а для пасколизумаба оценивали кривые при пяти концентрациях Ιί-4 (64, 16, 4, 1 и 0,25 нМ).
В эксперименте 3 для тАЬЙАЬ достигали уровня связывания приблизительно 700 относительных единиц ответа и оценивали кривые при шести концентрациях Ιί-4 (256, 64, 16, 4, 1 и 0,25 нМ) и кривые при шести концентрациях Ιί-13 (256, 64, 16, 4, 1 и 0,25 нМ).
Таблица24
| Молекула (очищенное вещество) | Аффинность связывания, Κϋ (нМ) | |||||
| Человеческий И-4 | Человеческий Ιί-13 | |||||
| Эксперимент 1 | Эксперимент 2 | Эксперимент 3 | Эксперимент 1 | Эксперимент 2 | Эксперимент 3 | |
| РазсоН-474 с удаленным <38 | не исследовали | 0,005 | не исследовали | 0,3307 | 0,351 | не исследовали |
| РазсоН- ΤνΑΑΡδ-474 с удаленным <38 | не исследовали | 0,011 | не исследовали | 0,2677 | 0,305 | не исследовали |
| 586Н-210 с удаленным <33 | не исследовали | не исследовали | очень прочное связывание * | не исследовали | не исследовали | 0,438 |
| 586Η-ΤνΑΑΡδ- 210 с удаленным <38 | не исследовали | не исследовали | очень прочное связывание * | не исследовали | не исследовали | 0,501 |
| тАЬ против человеческого Ιί-13 | отсутствие связывания | отсутствие связывания | отсутствие связывания | 0,2799 | 0,31 | 0,547 |
| Пасколизумаб | 0,0137 | 0,011 | 0,013 | отсутствие связывания | отсутствие связывания | отсутствие связывания |
В экспериментах 1 и 2 как РаксоН-474 с удаленным Ο8, так и РаδсοΗ-ΤVΑΑР8-474 с удаленным Ο8 связывали Ιί-4 со сходными аффинностями связывания, и это было приблизительно эквивалентно аффинности связывания тАЬ против человеческого Ю4 самого по себе (пасколизумаба). РаксоН-474 с удаленным Ο8 и РаδсοΗ-ΤVΑΑР8-474 с удаленным Ο8 также связывали Ιί-13 со сходными аффинностями связывания. Следует отметить, что ЙАЬ против Ιί-13 само по себе (Э0М10-53-474) не было исследовано в данном анализе, поскольку ЙАЬ не может быть иммобилизовано на чипе СМ5, покрытом белком А или антителом против человеческого Ι§Ο; вместо этого, тАЬ против человеческого Ιί-13 использовали в качестве положительного контроля для демонстрации связывания Ιί-13 в этом анализе.
В эксперименте 3 как 586Н-210 с удаленным Ο8, так и 586Η-ΤVΑΑР8-210 с удаленным Ο8 связывали Ιί-13 со сходными аффинностями связывания, и это было приблизительно эквивалентно аффинности связывания тАЬ против человеческого Ιί-13. 586Н-210 с удаленным Ο8 и 586Η-ΤVΑΑР8-210 с удаленным Ο8 также связывали Ιί-4 очень прочно, однако определить аффинность связывания данным способом было невозможно ввиду положительных эффектов диссоциации и уровня чувствительности методики ΒIΑсο^е™ (*). Следует отметить, что ЙАЬ против Ю4 само по себе (Э0М9-112-210) не было иссле- 82 023031 довано в данном анализе, поскольку бАЬ не может быть иммобилизовано на чипе СМ5, покрытом белком А или антителом против человеческого 1дО; вместо этого, тАЬ против человеческого !Б-4 (пасколизумаб) использовали в качестве положительного контроля для демонстрации связывания II ,-4 в этом анализе.
18.7. В1асоге-анализ связывания с ГО-4 яванского макака и ГО-13 яванского макака
Очищенные тАЬбАЬ исследовали на предмет связывания с ГО-4 яванского макака и ГО-13 яванского макака с использованием В1Асоге™ Т100 при 25°С (как описано в способах 24 и 23). Эти данные показаны в табл. 25. Для тАЬбАЬ достигали уровня связывания приблизительно 600 относительных единиц ответа и оценивали кривые при шести концентрациях 1ГО-13 (256, 64, 16, 4, 1 и 0,25 нМ) и кривые при пяти концентрациях ГО-4 (64, 16, 4, 1 и 0,25 нМ).
Таблица 25
А8ТКО-474 связывали ГО-4 яванского макака со сходными аффинностями связывания. Все РаксоН-474 с удаленным О8, РаксоН-ТУААР8-474 с удаленным О8, РаксоН-А8ТКОРТ-474 с удаленным вторым О8, РаксоН-474, РаксоН-ТУААР8-474 и РаксоН-А8ТКО-474 также связывали 1ГО-13 со сходными аффинностями связывания.
Очищенные тАЬбАЬ также исследовали на предмет связывания с ГО-4 яванского макака и П.-13 яванского макака с использованием В1Асоге™ Т100 при 25°С (как описано в способах 24 и 23). Эти данные показаны в табл. 26. Для тАЬбАЬ достигали уровня связывания приблизительно 600 относительных единиц ответа и оценивали кривые при шести концентрациях ГО-13 и шести концентрациях ГО-4 (256, 64 16, 4, 1 и 0,25 нМ).
Таблица 26
| Молекула | Аффинность связывания, КЬ | |||||
| (очищенное | 1Б-13 яванского макака | ΙΙ-4 яванского макака | ||||
| вещество) | Скорость ассоциации (ка, Мс'1) | Скорость диссоциации (кб, с’1) | КЭ (нМ) | Скорость ассоциации (ка, Мс1) | Скорость диссоциации (кб, с1) | Κϋ (пМ) |
| 586Н-Т\/ААР5- 210 с удаленным СЗ | 4.92Е+5 | 2.86Е-5 | 58 | очень прочное связывание * | очень прочное связывание * | очень прочное связывание * |
| 586Н-210 с удаленным СЗ | 5.07Е+5 | 2.24Е-5 | 44 | очень прочное связывание * | очень прочное связывание * | очень прочное связывание * |
| тАЬ против 11_- 13 | 4.74Е+5 | 1.05Е-4 | 222 | отсутствие связывания | отсутствие связывания | отсутствие связывания |
| Пасколизумаб | отсутствие связывания | отсутствие связывания | отсутствие связывания | 2.34Е+6 | 1.08Е-4 | 46 |
Как 586Н-210 О8 с удаленным О8, так и 586Н-ТУААР8-210 с удаленным О8 связывали 1ГО-13 со
- 83 023031 сходными аффинностями связывания; эти тАЪЙАЪ, по видимому, связывали Ι1.-13 активнее тАЪ против человеческого Ш-13, тем не менее, в случае тАЪ была завершена кривая только при одной концентрации, что само по себе менее точно, чем оценка полного ряда концентраций. 586Н-210 08 с удаленным 08 и 586Н-ТУААР8-210 с удаленным С8 также связывали Ш-4 очень прочно, однако, определить аффинность связывания данным способом было невозможно ввиду положительных эффектов диссоциации и уровня чувствительности методики ВГАсоге™ (*). Следует отметить, что ЙАЪ против Ш-4 само по себе (О0М9-112-210) не было исследовано в данном анализе, поскольку ЙАЪ не может быть иммобилизовано на чипе СМ5, покрытом белком А или антителом против человеческого 1дС; вместо этого тАЪ против человеческого Ш-4 (пасколизумаб) использовали в качестве положительного контроля для демонстрации связывания Ш-4 в этом анализе.
18.8. В1асоте-анализ эффекта связывания Ш-4 с тАЪЙАЪ на кинетику последующего связывания Ш13 и наоборот; и эффекта связывания Ш-13 с тАЪЙАЪ на кинетику последующего связывания Ш-4 и наоборот
В1Асоге™-анализы связывания Ш-13 и Ш-4 также применяли для оценки эффекта связывания Ш-4 с РаксоН-474 с удаленным С8 на кинетику последующего связывания Ш-13 и наоборот; и эффекта связывания Ш-13 с 586Н-ТУААР8-210 на кинетику последующего связывания Ш-4 и наоборот. Анализы проводили на аппарате ВГАсоге™ Т100 при 25°С, с применением иммобилизации тАЪЙАЪ (или тАЪ положительного контроля) антителом против человеческого 1дС. Кратко, антитело против человеческого 1дС иммобилизовали на чипе СМ5 сочетанием первичных аминов в соответствии с рекомендациями изготовителя. Конструкции тАЪЙАЪ (или тАЪ положительного контроля) затем иммобилизовали на этой поверхности (при приблизительно 250-750 единицах ответа (Ки)) и первый аналит (либо человеческий Ш13, либо человеческий Ш-4) пропускали над чипом в концентрации 256 нМ в течение 4 мин. Затем над чипом пропускали второй аналит (человеческий Ш-4 или человеческий Ш-13 соответственно) в концентрациях 256, 64, 16, 4, 1 и 0,25 нМ и для двойного контроля над поверхностью с антителом для иммобилизации или тАЪЙАЪ пропускали инъекцию буфера. Данные анализировали (приспосабливали к модели связывания 1:1) с использованием программного обеспечения аппарата для оценки. Поверхность затем восстанавливали с использованием хлорида магния. Данные, полученные в этих экспериментах, показаны в табл. 27 и 28.
Таблица 27
| Молекула | Кинетика связывания 1ЫЗ | |||||
| с человеческим И-4, связанным с молекулой | без человеческого 11_-4, связанного с молекулой | |||||
| Скорость ассоциации (ка, Мс'1) | Скорость диссоциации (кс!, с'1) | Κϋ (пМ) | Скорость ассоциации (ка, Мс'1) | Скорость диссоциации (кс1, с'1) | КЭ (пМ) | |
| РабсоН-474 с удаленным (33 | 5.66Е+5 | 2,31Е-4 | 407,7 | 6.09Е+5 | 2.59Е-4 | 425,2 |
| 586Η-ΤνΑΑΡ3- 210 | 9.68Е+5 | 3.15Е-4 | 325,2 | 9.09Е+5 | 3.47Е-4 | 381,3 |
| тАЬ против II.- 13 | не исследовали | 1.01Е+6 | 3.68Е-4 | 366,1 |
Аффинность связывания РаксоН-474 с удаленным С8 для человеческого Ш-13 была сходной, независимо от связывания с данной молекулой Ш-4. В дополнение аффинность связывания 586Н-ТУААР8210 для человеческого Ш-13 была сходной, независимо от связывания с данной молекулой Ш-4, а также была сходна с аффинностью связывания тАЪ против Ш-13 для человеческого Ш-13.
Скорости диссоциации (кЙ) для связывания Ш-4, полученные для РаксоН-474 с удаленным С8 и 586Н-ТУААР8-210, очень низки и выходят за пределы чувствительности ВГАсоге™ Т100, поэтому их нельзя использовать для точного определения аффинности связывания (данные не показаны). Тем не менее, данные указывают на то, что все исследованные конструкции очень прочно связывают человеческий Ш-4. Таким образом, аффинность связывания РаксоН-474 с удаленным С8 для человеческого Ш-4 была очень высока, независимо от связывания с данной молекулой 1С-13. В дополнение, аффинность связывания 586Н-ТУААР8-210 для человеческого Ш-4 была очень высока, независимо от связывания сданной молекулой 1С-13.
18.9. Активность тАЪЙАЪ тАЪЙАЪ исследовали на предмет ингибирования связывания человеческого Ш-4 с человеческим Ш4Ка посредством ЕЫ8А, как описано в способе 19. Все молекулы, показанные в Таблице 28, исследовали в одном эксперименте, тем не менее, данные наносили на два графика для разграничения между построенными кривыми (586Н-ТУААР8-210 анализировали дважды, это отмечено как образец 1 и образец 2 в табл. 25). Эти данные показаны на фиг. 102 и 103.
- 84 023031
РахсоН-474 с удаленным С8 ингибировал связывание человеческого ГЬ-4 с человеческим 1Ь-4Ка аналогично пасколизумабу. Все 586Н-210 с удаленным С8, 586Н-ТУААР8-210 с удаленным С8, 586НТУААР8-210, 586Н-210, 586Н-С48-210 и 586Н-А8ТКС-210 ингибировали связывание человеческого 1Ь4 с человеческим 1Ь-4Ка аналогично ЭОМ9-112-210. Пасколизумаб и ЭОМ9-112-210 использовали в качестве положительных контролен ингибирования связывания ГЬ-4 с 1Ь-4Ка. ЭОМ10-53-474 и тАЬ того же изотипа (со специфичностью в отношении постороннего антигена) были включены качестве отрицательных контролей ингибирования связывания ГЬ-4 с 1Ь-4Ка.
Эти данные также использовали для определения значений 1С50 для каждой молекулы. Значение 1С50 представляет собой концентрацию тАЬбАЬ или тАЬ, или бАЬ, способную ингибировать связывание человеческого ГЬ-4 с человеческим ГЬ-4Ка на 50%. Значения 1С50 показаны в табл. 28.
Таблица 28
| Молекула | 1С50 (нМ) |
| РазсоН-474 с удаленным С5 | 5,14 |
| Пасколизумаб | 3,45 |
| ЭОМ9-112-210 | 36,77 |
| 586Н-210 | 26,79 |
| 586Н-210 с удаленным СЗ | 36,18 |
| 586Η-Τ\ΖΑΑΡδ-210 (образец 1) | 23,77 |
| 586Η-ΤνΑΑΡδ-210 (образец 2) | 21,03 |
| 586Η-Τ\/ΆΑΡδ-210 с удаленным СЗ | 19,21 |
| 586Н-АЗТКС-210 | 27,32 |
| 586Н-С43-210 | 29,85 |
| ϋΟΜ10-53-474 | отсутствие ингибирования в исследованном диапазоне концентраций |
| тАЬ отрицательного контроля | отсутствие ингибирования в исследованном диапазоне концентраций |
Эти данные подтверждают, что РахсоН-474 с удаленным С8 действует аналогично пасколизумабу, и что все члены семейства тАЬбАЬ 586Н-210 действуют аналогично бАЬ ЭОМ9-112-210.
18.10. Нейтрализация человеческого ГЬ-13 и ГЬ-13 яванского макака тАЬбАЬ в биологических анализах с клетками ТР-1
Несколько очищенных тАЬбАЬ исследовали на предмет нейтрализации человеческого 1Ь-13 и 1Ь13 яванского макака в биологических анализах с клетками ТР-1 (как описано в способе 8 и способе 20 соответственно). В этих анализах каждую молекулу исследовали от одного до девяти раз, не все графики показаны, но на фиг. 104 и 105 представлены типичные графики, на которых показаны данные по нейтрализации человеческого 1Ь-13 и 1Ь-13 яванского макака соответственно. ЭОМ10-53-474 было включено в качестве положительного контроля нейтрализации человеческого 1Ь-13 или 1Ь-13 яванского макака в биологических анализах. бАЬ со специфичностью в отношении постороннего антигена (бАЬ отрицательного контроля) было также включено в качестве отрицательного контроля нейтрализации человеческого 1Ь-13 или 1Ь-13 яванского макака в этих биологических анализах.
РахсоН-474 с удаленным С8, РахсоН-ТУААР8-474 с удаленным С8 и РахсоН-А8ТКС-474 с удаленным вторым С8, а также РахсоН-616, РахсоН-ТУААР8-616 и ЭОМ10-53-616 (они описаны в примере 19) полностью нейтрализовали биологическую активность как человеческого 1Ь-13, так и 1Ь-13 яванского макака в биологических анализах с клетками ТР-1.
18.11. Нейтрализация тАЬбАЬ человеческого 1Ь-4 и 1Ь-4 яванского макака в биологических анализах с клетками ТР-1
Несколько очищенных тАЬбАЬ исследовали на предмет нейтрализации человеческого 1Ь-4 и 1Ь-4 яванского макака в биологических анализах с клетками ТР-1 (как описано в способе 9 и способе 21 соответственно). В этих анализах каждую молекулу исследовали дважды, не все графики показаны, но на фиг. 106 и 107 представлены типичные графики (из набора данных), на которых показаны данные по нейтрализации человеческого 1Ь-4 и 1Ь-4 яванского макака, соответственно. тАЬ против 1Ь-13 было включено в качестве отрицательного контроля, а пасколизумаб был включен в качестве положительного контроля нейтрализации человеческого 1Ь-4 или 1Ь-4 яванского макака в этих биологических анализах. В дополнение, РахсоН-474, РахсоН-ТУААР8-474, РахсоН-А8ТКС-474 и РахсоН-С48-474 также исследовали на предмет нейтрализации человеческого 1Ь-4 и 1Ь-4 яванского макака в этих биологических анализах.
РахсоН-474 с удаленным С8 и РахсоН-ТУААР8-474 с удаленным С8 полностью нейтрализовали биологическую активность как человеческого ГЬ-4, так и ГЬ-4 яванского макака в биологических анали- 85 023031 зах с клетками ТР-1. В дополнение, Ра§соН-474, РаδсοΗ-ΤУААРδ-474, РаδсοΗ-АδΤКС-474 и РаδсοΗС4δ-474 также полностью нейтрализовали биологическую активность человеческого ΙΌ-4 в биологическом анализе с клетками ТР-1.
Значения \'[У0 были получены на основании данных, полученных в нескольких различных экспериментах. Значение N^5ο представляет собой концентрацию тАЬбАЬ или тАЬ, или бАЬ, способную нейтрализовать биологическую активность ΙΌ-13 или ΙΌ-4 на 50%. Среднее значение N050, стандартное отклонение (δΌ) и число экспериментов (п) показаны в табл. 29.
Таблица 29
| Молекула | Среднее значение Ш50 и стандартное отклонение (нМ) | |||||||
| Человеческий И-13 | И-13 яванского макака | Человеческий1Ь- 4 | И-4 яванского макака | |||||
| среднее (30) | η | среднее (3ϋ) | η | среднее (3ϋ) | η | среднее (5ϋ) | η | |
| РазсоН-474 с удаленным 68 | 2,269 (0,763) | 9 | 39,834 (14,675) | 8 | 2,855 (1,464) | 2 | 1,89 (0,325) | 2 |
| РазсоН-Т7ААРЗ-474 с удаленным 68 | 2,114 (0,766) | 9 | 47,882 (13,181) | 9 | 3,015(2,015) | 2 | 1,36(0,41) | 2 |
| РазсоН-68- АЗТК6РТ-474 с удаленным вторым 68 | 1,37 | 1 | 21,49 | 1 | не исследовали | не исследовали | ||
| ϋΟΜ10-53-474 | 1,035 (0,741) | 4 | 10,495 (6,958) | 4 | отсутствие нейтрализации | отсутствие нейтрализации | ||
| ЙАЬ отрицательного контроля | отсутствие нейтрализации | отсутствие нейтрализации | не исследовали | не исследовали | ||||
| Пасколизумаб | отсутствие нейтрализации | отсутствие нейтрализации | 1,36 (0,198) | 2 | 2,615(2,242) | 2 |
Все РаδсοΗ-474 с удаленным Сδ, РаδсοΗ-ΤУААРδ-474 с удаленным Сδ и РаδсοΗ-АδΤКСРΤ-474 с удаленным вторым Сδ полностью нейтрализовали биологическую активность человеческого Ι1.-13 и ΙΡ13 яванского макака в биологических анализах с клетками ТР-1. В дополнение, нейтрализующие активности (значения N0^) РаδсοΗ-474 с удаленным Сδ, РаδсοΗ-ΤУААРδ-474 с удаленным Сδ и РаδсοΗАδΤКСРΤ-474 с удаленным вторым Сδ для человеческого ΙΌ-13 были сходны и были в пределах значения ^50 очищенного бАЬ против ΙΌ-13 самого по себе (ΌΘΜ10-53-474).
Как РаδсοΗ-474 с удаленным Сδ, так и РаδсοΗ-ΤУААРδ-474 с удаленным Сδ полностью нейтрализовали биологическую активность человеческого ΙΌ-4 и ΙΌ-4 яванского макака в биологических анализах с клетками ТР-1. В дополнение, нейтрализующие активности (значения \Т)50) РаδсοΗ-474 с удаленным Сδ и РаδсοΗ-ΤУААРδ-474 с удаленным Сδ для человеческого ΙΌ-13 и ΙΌ-13 яванского макака были сходны и были в пределах значения \'[У0 пасколизумаба.
18.12. Способность тАЬбАЬ ингибировать связывание человеческого ΙΌ-13 с человеческим ΙΌ13Ка2
Молекулы, перечисленные в табл. 30, исследовали на предмет ингибирования связывания человеческого ΙΌ-13 с человеческим !Ь-13Ка2 посредством Ε^IδА, как описано в способе 22. Все молекулы исследовали в одном эксперименте. Данные показаны на фиг. 108.
Все исследованные тАЬбАЬ ингибировали связывание человеческого ΙΌ-13 с человеческим ΙΡ13Ка2. Уровень ингибирования был сходным с уровнем ингибирования ^ΘΜ10-53-474, Ό0Μ10-53-616 и тАЬ против Ι1.-13. Пасколизумаб и бАЬ отрицательного контроля (со специфичностью в отношении постороннего антигена) были включены качестве отрицательных контролей ингибирования связывания ΙΌ13 с Ш-13Ка2.
Эти данные также использовали для определения значений !С50 для каждой молекулы. Значение !С50 представляет собой концентрацию тАЬбАЬ или тАЬ, или бАЬ, способную ингибировать связывание человеческого ΙΌ-13 с человеческим !Ь-13Ка2 на 50%. Значения !С50 показаны в табл. 30.
- 86 023031
Таблица 30
Эти данные подтверждают, что ΡаδсοН-474 с удаленным θδ, ΡаδсοН-ΤVΑΑΡδ-474 с удаленным θδ, Ραδ^^616 и ΡаδсοН-ΤVΑΑΡδ-616 действуют аналогично 00М10-53-474, Б0М10-53-616 и тАЬ против Ш-13.
Пример 19. тАЬбАЬ. содержащие бАЬ против Ш-13 Б0М10-53-616
19.1. Конструирование тАЬбАЬ, содержащих бАЬ против Ш-13 Б0М10-53-616
Два тАЬ против Ш-4-бАЬ против !С-13, как изложено в табл.31, клонировали из существующих векторов сайт-направленным мутагенезом, как описано в примере 1.
Таблица 31
| Название | Описание | Идентификационные номер последовательности (5ЕО Ю ΝΟ:) |
| РЭ5СОН-616 | Н-цепь = тяжелая цепь пасколизумаба- бАЬ ϋΟΜ 10-53-616 ί-цепь = легкая цепь пасколизумаба | 149 (= Н-цепь) 15 (= ί-цепь) |
| РазсоН- Τ\/ΑΑΡδ-616 | Н-цепь = тяжелая цепь пасколизумаба- ΤνΑΑΡδ-όΑό ϋΟΜ 10-53-616 ί-цепь = легкая цепь пасколизумаба | 150 (= Н-цепь) 15 (= ί-цепь) |
19.2. Экспрессия и очистка тАЬбАЬ. содержащих бАЬ против Ш-13 Б0М10-53-616
Эти тАЬбАЬ экспрессировали в клетках НЕК293-6Е и клетках СНОЕ1а, как описано в примере 1.3.
Проводили очистку и анализ тАЬбАЬ посредством δΕС и δ^δ-ΡΑΘΕ. Были получены несколько очищенных препаратов тАЬбАЬ Ραδ^№616 и ΡаδсοН-ΤVΑΑΡδ-616, данные δΕС и δ^δ-ΡΑΘΕ, показанные на фиг. 109 ^ЕС-профиль ΡаδсοН-616), 110 ^ЕС-профиль ΡаδсοН-ΤVΑΑΡδ_616), 111 (δ^δ-ΡΑΘΕ Ραδ^^616) и 112 (δ^δ-ΡΑΘΕ ΡаδсοН-ΤVΑΑΡδ-616), типичны для этих препаратов.
19.3. Связывание тАЬбАЬ с человеческим Ι^-13 в ЕЫ8А прямого связывания
Очищенные тАЬбАЬ Ραδ^№616 и ΡаδсοН-ΤVΑΑΡδ-616 исследовали на предмет связывания с человеческим БС-13 в ЕЫ8А прямого связывания (как описано в способе 1). Эти данные показаны на фиг. 113.
Как очищенное ΡаδсοН-616, так и очищенное ΡаδсοН-ΤVΑΑΡδ-616 связывали человеческий Ш-13. Очищенное тАЬ против человеческого Ш-4 само по себе (пасколизумаб) было включено в данный анализ в качестве отрицательного контроля связывания с Ι^-13. Очищенное тАЬ против человеческого Ш13 было включено в качестве положительного контроля связывания с Ш-13. Следует отметить, что бАЬ против Ι^-13 само по себе (Б0М10-53-616) не исследовали в данном анализе ввиду невозможности выявления бАЬ вторичным антителом для выявления; вместо этого, очищенное тАЬ против человеческого БС-13 использовали в качестве положительного контроля для демонстрации связывания Ι^-13 в этом анализе.
19.4. В1асоге-анализ связывания с человеческим Ш-4 и человеческим Ш-13
Очищенные тАЬбАЬ исследовали на предмет связывания с человеческим Ш-4 и человеческим Ш-13 с использованием ВШсот™ Τ100 при 25°С (как описано в способах 4 и 5). Эти данные показаны в табл. 32.
- 87 023031
В эксперименте 1 для тАЬйАЬ достигали уровня связывания приблизительно 6ОО относительных единиц ответа и оценивали кривые при шести концентрациях 1Ь-1З и 1Ь-4 (256, 64, 16, 4, 1 и 0,25 нМ). Для тАЬ в эксперименте 1 оценивали кривую только при одной концентрации 1Ь-1З (256 нМ) и 1Ь-4 (256 нМ).
В эксперименте 2 для тАЬйАЬ достигали уровня связывания приблизительно 4ОО относительных единиц ответа и оценивали кривые при шести концентрациях 1Ь-4 (64, 16, 4, 1, 0,25 и 0,0625 нМ) и при шести концентрациях 1Ь-1З (256, 64, 16, 4, 1 и 0,25 нМ). Для тАЬ против 1Ь-1З в эксперименте 2 оценивали кривую только при одной концентрации 1Ь-1З (256 нМ), а для пасколизумаба оценивали кривые при пяти концентрациях 1Ь-4 (64, 16, 4, 1 и 0,25 нМ).
Таблица З2
| Молекула (очищенное вещество) | Аффинность связывания, Κϋ (нМ) | |||
| Человеческий ΙΙ.-4 | Человеческий Ιί-13 | |||
| Эксперимент 1 | Эксперимент 2 | Эксперимент 1 | Эксперимент 2 | |
| РазсоН-616 | 0,00172 | очень прочное связывание | 0,1137 | 0,15 |
| РазсоН- ΤνΑΑΡδ-616 | 0,003 | 0,005 | 0,0497 | 0,056 |
| тАЬ против человеческого Ιί-13 | отсутствие связывания | отсутствие связывания | 0,2799 | 0,31 |
| Пасколизумаб | 0,0137 | 0,011 | отсутствие связывания | отсутствие связывания |
Как РаксоН-616, так и Ра§соН-ТУААР8-616 связывали 1Ь-4 со сходными аффинностями связывания, и это было сходно с аффинностью связывания тАЬ против человеческого 1Ь-4 самого по себе (пасколизумаба). Как РаксоН-616, так и Ра§соН-ТУААР8-616 связывали 1Ь-1З. Следует отметить, что ЙАЬ против 1Ь-1З само по себе (ЭОМ1О-5З-616) не было исследовано в данном анализе, поскольку ЙАЬ не может быть иммобилизовано на чипе СМ5, покрытом белком А или антителом против человеческого 1дС; вместо этого, тАЬ против человеческого 1Ь-1З использовали в качестве положительного контроля для демонстрации связывания 1Ь-1З в этом анализе.
19.5. В1асоге-анализ связывания с 1Ь-1З яванского макака
Очищенные тАЬйАЬ также исследовали на предмет связывания с 1Ь-1З яванского макака с использованием В1Асоге™ Т1ОО при 25°С (как описано в способе ЗО). Эти данные показаны в табл. ЗЗ. Для тАЬйАЬ достигали уровня связывания приблизительно 4ОО относительных единиц ответа и оценивали кривые при шести концентрациях 1Ь-1З (256, 64, 16, 4, 1 и 0,25 нМ). Для тАЬ против 1Ь-1З была кривая только при одной концентрации 1Ь-1З (256 нМ).
Таблица ЗЗ
Молекула (очищенное вещество)
РазсоН-616
РазсоН-ТУААРЗ-
5.498Е+5 отсутствие связывания
6,549Е-5 отсутствие связывания
0,119 отсутствие связывания
616 тАЬ против Ιί-13 Пасколизумаб
Как РаксоН-616, так и Ра§соН-ТУААР8-616 связывали 1Ь-1З яванского макака со сходными аффинностями связывания. Следует отметить, что йАЬ против 1Ь-1З само по себе (ЭОМ1О-5З-616) не было исследовано в данном анализе, поскольку йАЬ не может быть иммобилизовано на чипе СМ5, покрытом белком А или антителом против человеческого 1дС; вместо этого, тАЬ против человеческого 1Ь-1З использовали в качестве положительного контроля для демонстрации связывания 1Ь-1З в этом анализе.
- 88 023031
19.6. Нейтрализация человеческого ГЬ-13 и ГЬ-13 яванского макака тАМАЬ в биологических анализах с клетками ТР-1
Очищенные тАЬбАЬ исследовали на предмет нейтрализации человеческого ГЬ-13 и ГЬ-13 яванского макака в биологических анализах с клетками ТР-1 (как описано в способе 8 и способе 20, соответственно). В каждом анализе эти молекулы исследовали 3 раза и на фиг. 114 представлен типичный график, на котором показаны данные по нейтрализации для человеческого ГЬ-13. На фиг. 114а представлен типичный график, на котором показаны данные по нейтрализации для ГЬ-13 яванского макака. БОМ10-53-616 было включено в качестве положительного контроля нейтрализации ГЬ-13 в этом биологическом анализе. бАЬ со специфичностью в отношении постороннего антигена (бАЬ отрицательного контроля) было также включено в качестве отрицательного контроля нейтрализации ГЬ-13 в этом биологическом анализе.
Среднее значение ΝΌ50, стандартное отклонение и (δΌ) и число экспериментов (п) показаны в табл. 34.
Таблица 34
| Молекула | Среднее значение Νϋ5ο и стандартное отклонение (нМ) | |||
| Человеческий 11_-13 | 11_-13 яванского макака | |||
| среднее (5ϋ) | η | среднее (8ϋ) | η | |
| РазсоН-616 | 0,7956 (0,129) | 3 | 9,23(1,422) | 3 |
| РазсоН-Т\/ААР5-616 | 0,722 (0,245) | 3 | 14,477 (2,847) | 3 |
| ϋΟΜΙΟ-53-616 | 0,416(0,144) | 3 | 4,81 (3,266) | 3 |
| бАЬ отрицательного | отсутствие | отсутствие | ||
| контроля | нейтрализации | нейтрализации |
Как РаксоН-616, так и ΡаксοΗ-ТVААΡδ-616, а также в дополнение, тАЬбАЬ ΡаксοΗ-ТVААΡδ-474 с удаленным Οδ и РаксоН-474 с удаленным Οδ, полностью нейтрализовали биологическую активность человеческого ГЬ-13 и ГЬ-13 яванского макака в биологических анализах с клетками ТР-1. В дополнение, нейтрализующие активности (значения ΝΌ50) РаксоН-616 и ΡаксοΗ-ТVААΡδ-616 для человеческого ГЬ13 были сходны и отличались от значения ΝΌ50 очищенного бАЬ против ГЬ-13 самого по себе (БОМ1053-474) не более чем в 2 раза.
РаксоН-616 и ΡаксοΗ-ТVААΡδ-616 также исследовали на предмет ингибирования связывания человеческого ГЬ-13 с человеческим ГЬ-13Ка2 посредством Ε^ГδА, как описано в способе 22. Эти данные представлены в примере 18.12.
Пример 20. Способность тАЬбАЬ нейтрализовать человеческий ГЬ-13 или ГЬ-4 в биологическом анализе фосфо^ТАТ6 цельной крови человека
Исследование способности тАЬбАЬ нейтрализовать человеческий ГЬ-13 или ГЬ-4 в биологическом анализе фосфо^ТАТ6 цельной крови человека проводили, как описано в способе 16. Определяли нейтрализующие способности 2 конструкций тАЬбАЬ (очищенного тАЬ против ГЬ-13-ТАЬ против ГЬ-4, 586Η-ТVААΡδ-210 и очищенного тАЬ против ГЬ-4-ТАЬ против ГЬ-13, РаксоН-474 с удаленным Οδ) в отношении ГЬ-4 или ГЬ-13 (то есть ингибирование биологической активности ГЬ-4 или ГЬ-13). Очищенное тАЬ против человеческого ГЬ-4 (пасколизумаб) и очищенное бАЬ против ГЬ-4 (БОМ9-112-210) были включены в качестве положительных контролей нейтрализации гЬ1Ь-4 в этом анализе. Очищенное тАЬ против человеческого ГЬ-13 и очищенное бАЬ против ГЬ-13 (БОМ10-53-474) были включены в качестве положительных контролей нейтрализации гЫЬ-13. тАЬ того же изотипа, смешанное с бАЬ (оба из которых специфичны в отношении посторонних антигенов), были включены в качестве отрицательного контроля нейтрализации гЬ1Ь-4 или гЫЬ-13. Каждую молекулу исследовали по меньшей мере дважды с использованием крови от разных доноров. На фиг. 115-124 представлены графики, на которых показаны репрезентативные данные.
Очищенные тАЬбАЬ полностью нейтрализовали биологическую активность гЫЬ-13 и гЬ1Ь-4.
Как описано в способе 16, способность исследуемых молекул нейтрализовать биологическую активность гЫЬ-13 или гЬ1Ь-4 выражали как концентрацию молекул (например, тАЬбАЬ), необходимую для нейтрализации 2 нг/мл человеческого ГЬ-4 или человеческого ГЬ-13 на 50% (ГС50). Эти данные представлены в табл. 35. Представлена совокупная средняя ГС50 от всех доноров для каждой молекулы, а также стандартное отклонение.
- 89 023031
Таблица 35
| Молекула | Мишень при анализе | Средняя ΙΟδο (стандартное отклонение) нМ | Число доноров |
| 586-Т\/ААРЗ-210 | Ιί-4 | 1,23 (0,6) | 3 |
| Ιί-13 | 2,68 (1,2) | 3 | |
| РазсоН-474 с | Ιί-4 | 7,95 (7,8) | 3 |
| удаленным С5 | Ιί-13 | 2,78 (0,7) | 3 |
| тАЬ против 11_-13 | Ιί-13 | 1,47 (0,4) | 3 |
| Пасколизумаб | Ιί-4 | 2,44(1,2) | 3 |
| ϋΟΜ10-53-474 | Ιί-13 | 6,83 (2,2) | 2 |
| ϋΟΜ9-112-210 | Ιί-4 | 3,51 (0,8) | 2 |
| тАЬ отрицательного | - | Показано отсутствие | 4 |
| контроля | связывания | ||
| ЬАЬ отрицательного | - | Показано отсутствие | 4 |
| контроля | связывания |
Сравнение значений Ιί.\ο показало, что 586-ΤУΆΆРδ-210 ингибировало индуцированный ГЬ-13 и ΙΕ-4 рδΤΆΤ-6 аналогично тАЬ против ΙΕ-13 и ^ΟМ9-112-210 (в анализах цельной крови с Ш-13 и ΙΕ-4, соответственно). Сравнение данных по ГС50 также показало, что РаксоН-474 с удаленным Οδ ингибировало индуцированный Ш-13 и ΙΕ-4 рδΤΆΤ-6 аналогично ^ΟМ10-53-474 и пасколизумабу (в анализах цельной крови с Ш-13 и ΙΕ-4, соответственно). Для контрольного тАЬ было показано отсутствие ингибирования вплоть до максимальной исследованной концентрации 661 нМ у всех доноров, и для контрольного бАЬ было показано отсутствие нейтрализации вплоть до максимальной исследованной концентрации 2291 нМ у всех доноров.
Пример 21. Исследования фармакокинетики (РК) тАЬбАЬ против двух мишеней против ΙΕ4/против Ш-13 у крыс
РаκсοН-Ο4δ-474, Раκсο^-Ο4δ-474, 586Н-ΤУΆΆРδ-210 и 586Н-ΤУΆΆРδ-154 оценивали в исследованиях РК у крыс (как изложено в табл. 35.1). Кратко, самцам крыс δр^а§ие-^аν1еу (массой приблизительно от 200 до 220 г) однократно внутривенно (в/в) вводили тАЬбАЬ на уровне запланированной дозы 2 мг/кг. В назначенные временные точки (от 0 часов до 312 ч) производили забор образцов крови объемом 100 мкл и обрабатывали их с получением плазмы. Образцы плазмы крыс оценивали на присутствие исследуемой молекулы в анализе выявления человеческого ^О и/или анализе связывания лиганда Ш-13, и/или анализе связывания лиганда ΙΕ-4. В дополнение также оценивали РК-профиль пасколизумаба в плазме (у крыс): в этом случае образцы плазмы крыс оценивали на присутствие пасколизумаба в анализе выявления человеческого ^О и анализе связывания лиганда ΙΕ-4.
В первом исследовании пасколизумаб вводили 4 крысам. Во втором исследовании было четыре группы введения (2 мг/кг РаκсοН-Ο4δ-474, 2 мг/кг Раκсο^-Ο4δ-474, 2 мг/кг 586Н-ΤУΆΆРδ-210 и 2 мг/кг 586Н-ΤУΆΆРδ-154), по 4 крысы в каждой группе.
РК-параметры (показанные в табл. 35.1) получали на основании данных профиля концентрация в плазме-время (не показаны). Следует отметить, что в этих анализах некоторые образцы плазмы анализировали более одного раза, и РК-параметры, показанные в табл. 35.1, получали на основании только одного из этих наборов данных. Также следует отметить, что РК-параметры не были нормализованы для отдельных доз, вводимых животным, вместо этого предполагали номинальные дозы 2 мг/кг. Следует отметить, что при анализе РК ^О для РаκсοН-Ο4δ-474 возникли некоторые технические трудности, поэтому концентрации могут быть завышены. В дополнение, анализ профилей концентрация ^О в плазме-время в некоторых случаях проводили дважды (примечания анализ 1 и анализ 2 в табл. 35.1). Анализ данных профиля концентрация в плазме-время, полученных в РК-анализах связывания лигандов Ш-13 и ΙΕ-4, проводили только в анализе 2. Данные профиля концентрация в плазме-время, полученные в анализах связывания лигандов Ш-13 и ΙΕ-4 для Раκсο^-Ο4δ-474 и 586Н-ΤУΆΆРδ-154, не были использованы для получения РК-параметров для этих молекул.
- 90 023031
Таблица 35.1
| Молекула | Исследование | Анализ | Т1/2 (ч) | Стах (нг/мл) | лис (последняя) (нг*ч/мл) | Аис (экстраполированная) (%) | Клиренс (мл/ч/кг) | Среднее время удержания ® |
| РазсоН- | 1дО | 1 | 129 | 60950 | 3430345 | 18,7 | 0,49 | 83 |
| 045-474 | И-4 | 2 | 117 | 21975 | 1231243 | 17,2 | 1,42 | 83 |
| И_-13 | 2 | 87 | 22050 | 1328651 | 13,2 | 1,36 | 85 | |
| 586Н- | |дс | 1 | 134 | 42400 | 1932615 | 21,9 | 0,81 | 88 |
| ТА/ААРЗ- | |до | 2 | 92 | 42400 | 2215579 | 16,1 | 0,76 | 82 |
| 210 | |[_-4 | 2 | 60 | 41350 | 1674740 | 20,9 | 1,08 | 77 |
| И-13 | 2 | 101 | 31125 | 1515155 | 16,0 | 1,13 | 83 | |
| Пасколи- | |дс | 1 | 188 | 45150 | 3528174 | 31,9 | 0,39 | 110 |
| зумаб | |до | 2 | 193 | 45150 | 3496503 | 34,9 | 0,38 | 109 |
| И-4 | 2 | 136 | 42825 | 2590114 | 30,6 | 0,54 | 110 | |
| Разсо!.- 045-474 | |до | 1 | 69 | 42550 | 2539978 | 6,8 | 0,75 | 87 |
| 586Н- 1Л/ААР5- 154 | |до | 1 | 166 | 43900 | 3315164 | 41,7 | 0,36 | 93 |
Данные профиля концентрация в плазме-время, полученные в анализах
16-13 и 1Ь-4 для РазсоН-С48-474, (и полученные в результате РК-параметры) имели тенденцию быть сопоставимыми; аналогичную тенденцию наблюдали для данных профиля концентрация в плазмевремя, полученных в РК-анализах 1Б-13, 1Ь-4 и 1дС для 586Н-ТУААР8-210 (и полученных в результате РК-параметров). Это позволяет предположить, что эти тАЬбАЬ остаются интактными в плазме крыс на всем протяжении исследования. РК-параметры, полученные для 586Н-ТУААР8-154, по-видимому, были ближе к РК-параметрам, полученным для пасколизумаба, чем любые другие тАЬбАЬ.
Пример 22. Исследования РК у яванских макаков
Проводили исследования РК у яванских макаков. Животным проводили однократное внутривенное введение на уровне запланированной дозы 1 мг/кг. В назначенные временные точки производили забор образцов крови объемом 500 мкл и обрабатывали их с получением плазмы. Образцы плазмы яванских макаков затем оценивали на присутствие исследуемой молекулы в анализе связывания лиганда Ш-13, анализе связывания лиганда 1Ь-4 и анализе мостикового конъюгирования 1Б-13/1Б-4.
Предварительные данные этих исследований с тАЬбАЬ РазсоН-474 с удаленным С8 и 586НТУААР8-210 соответствуют данным о РК у крыс, показанным выше, и указывали на более быстрый, чем у тАЬ, но менее быстрый, чем у бАЬ, клиренс этих молекул из большого круга кровообращения.
Пример 23.
23.1. Получение тАЬбАЬ против двух мишеней против ЕСЕК/против УЕСЕ
Это тАЬбАЬ против двух мишеней конструировали слиянием бАЬ с С-концом тяжелой цепи тАЬ. Экспрессионные кассеты тяжелой и легкой цепи тАЬ против ЕСЕК были конструированы ранее. Сайты рестрикции, использованные для клонирования, представляли собой те же, что изложены в примере 10 (8а11 и НтбШ).
ДНК, кодирующую бАЬ против УЕСЕ (Ώ0Μ15-26-593) затем амплифицировали посредством ПЦР (с использованием праймеров, кодирующих концы 8а11 и НтбШ) и вводили в модифицированную 3'кодирующую область, что приводило к образованию линкера 8ТС (серин, треонин, глицин) между тАЬ и бАЬ.
Были выбраны клоны с верифицированной последовательностью (8Е0 ГО N0: 164 и 243 для легкой и тяжелой цепей соответственно), и получение препаратов ДНК в укрупненном масштабе было осуществлено с применением набора (Эшдеп Меда Ргер Κίί в соответствии с протоколами изготовителя.
1пАЬбАЬ экспрессировали в клетках млекопитающих НЕК293-6Е с применением методик транзиторной трансфекции ко-трансфекцией легких и тяжелых цепей (8Е0 ГО N0: 165 и 137).
23.2. Очистка и 8 ЕС-анализ тАЬбАЬ против двух мишеней против ЕСЕК/против УЕСЕ
Это тАЬбАЬ против двух мишеней очищали из осветленного экспрессионного супернатанта с применением аффинной хроматографии с белком А согласно установленным протоколам. Концентрации очищенных образцов определяли спектрофотометрией на основании измерений оптической плотности при 280 нм. 8О8-РАСЕ-анализ (фиг. 128) очищенного образца (обозначенного 0М84010) демонстрирует невосстановленный образец примерно 170 кДа, в то время как восстановленный образец показывает две полосы примерно 25 и примерно 60 кДа, что соответствует легкой цепи и слитой с бАЬ тяжелой цепи соответственно.
Для гель-хроматографического анализа (8ЕС-анализа) тАЬбАЬ против ЕСЕК/против УЕСЕ вносили в предварительно уравновешенную колонку 8-200 10/300 С1, (подсоединенную к системе НРБС) для использования с РВ8 при 1 мл/мин. 8ЕС-профиль демонстрирует одну разновидность в виде симметричного пика (фиг. 129). 23.3. Активность тАЬбАЬ против двух мишеней против ЕСЕК/против УЕСЕ
Способность молекулы нейтрализовать УЕСЕ и ЕСЕК определяли, как описано в способах 12 и 13
- 91 023031 соответственно. Полученные в анализе данные анализировали с применением ОгарйРаб Рпзт. Значения активности определяли с использованием сигмовидной кривой доза-ответ и данные корректировали с использованием наиболее подходящей модели. Было вычислено, что активность данного тАЬбАЬ (обозначенного ЭМ84010) против ЕОРК (фиг. 130) составляла 4,784 нМ, в то время как для контроля, тАЬ против ЕОРК, было получено значение ЕС50 4,214 нМ. В анализе связывания рецептора УЕОР (фиг. 131) ЕС50 тАЬбАЬ (обозначенного ЭМ84010) составляла 58 пМ (0,058 нМ), в то время как для контрольного тАЬ против УЕОР была получена ЕС50 214,1 пМ (0,2141 нМ). В заключение, данные анализа показывают, что конструкция по примеру 23, тАЬбАЬ против двух мишеней против ЕОРК/против УЕОР, активна против обоих антигенов.
23.4. РК тАЬбАЬ против двух мишеней против ЕОРК/против УЕОР
Определяли фармакокинетический профиль тАЬбАЬ против двух мишеней против ЕОРК/против УЕОР (обозначенного ЭМ84010) после введения яванским макакам. Соединение вводили в дозе 5 мг/кг в/в и уровни лекарственного средства в сыворотке в нескольких временных точках после введения определяли по связыванию как с ЕОРК, так и с УЕОР, в отдельных ЕЫ8А-аналзах. На фиг. 132 показаны результаты данного анализа, где данные сравнивали со накопленными данными, полученными для тАЬ цетуксимаба (против ЕОРК) и бевацизумаба (против УЕОР). Дополнительные подробности показаны в табл. 36.
Таблица 36
| Антиген | Период полувыведения | Стах | АИС (0- ϊηί) | Клиренс | Экстраполированный % А11С | |
| (ч) | (мкг/мл) | (ч*м кг/мл) | (мл/ч/кг) | |||
| Цетуксимаб | ЕСРР | 43,6 | 151,4 | 5684,3 | 0,9 | 18,4 |
| Бевацизумаб | УЕСР | 238,7 | 167,4 | 24201,9 | 0,2 | 13,4 |
| ЦМ54010 | ЕСРИ | 7,5 | 89,7 | 623,2 | 8,1 | 5,2 |
| ЭМ54010 | УЕСР | 6,7 | 125,5 | 733,8 | 7 | 7,2 |
23.5. Получение альтернативного тАЬбАЬ против ΕΘΡΡ /против УЕСР
Альтернативное тАЬбАЬ против ЕОРК/против УЕОР конструировали способом, сходным с описанным выше в примере 11.1, с использованием того же тАЬ против ЕОРК, соединенного с бАЬ против УЕОР на С-конце тяжелой цепи с использованием линкера 8ТО. Использованное в данном случае бАЬ против УЕОР представляло собой ЭОМ15-10-11. Эту молекулу экспрессировали в клетках млекопитающих НЕК293-6Е с применением методик транзиторной трансфекции ко-трансфекцией легких и тяжелых цепей (8Е9 ГО ЫО: 165 и 186), однако были получены значительно сниженные уровни экспрессии по сравнению с экспрессией молекулы, описанной в примере 23.2. При исследовании на предмет активности в том же анализе УЕОР, как описано в примере 23.3, было обнаружено, что она имела невыявляемые уровни ингибирования связывания УЕОР с рецептором УЕОР в данном анализе.
Пример 24 24.1. Получение тАЬбАЬ против двух мишеней против ЕОРК/против УЕОР без линкера
Получали производное тАЬбАЬ, описанного выше в примере 23, где был удален линкер 8ТО между бАЬ и доменом СН3 тАЬ. Для удаления остатков, кодирующих линкер 8ТО, из плазмиды, кодирующей тяжелую цепь, использовали сайт-направленный мутагенез (8ЭМ). Были выбраны клоны с верифицированной последовательностью легкой и тяжелой цепей (8Е9 ГО ЫО: 243 и 8НС) ГО ЫО: 174), соответственно, и получение препаратов ДНК в укрупненном масштабе было осуществлено с применением набора 91адеп Меда Ргер Кй в соответствии с протоколами изготовителя. тАЬбАЬ экспрессировали в клетках млекопитающих НЕК293-6Е с применением методик транзиторной трансфекции котрансфекцией легких и тяжелых цепей (8Е^ ГО ЫО: 175 и 137).
24.2. Очистка и 8ЕС-анализ тАЬбАЬ против двух мишеней против ЕОРК/против УЕОР без линкера тАЬбАЬ против двух мишеней очищали из осветленного экспрессионного супернатанта с применением аффинной хроматографии с белком А согласно установленным протоколам. Концентрации очищенных образцов определяли спектрофотометрией на основании измерений оптической плотности при 280 нм. 8^8-РΛОЕ-анализ (фиг. 133) очищенного образца (обозначенного ЭМ84011) демонстрирует невосстановленный образец примерно 170 кДа, в то время как восстановленный образец показывает две полосы примерно 25 и примерно 60 кДа, что соответствует легкой цепи и слитой с бАЬ тяжелой цепи соответственно.
Для гель-хроматографического анализа (8ЕС-анализа) тАЬбАЬ против ЕОРК/против УЕОР вносили в предварительно уравновешенную колонку 8-200 10/300 ОЬ (подсоединенную к системе НРЬС) для использования с РВ8 при 1 мл/мин. 8ЕС-профиль демонстрирует одну разновидность в виде симметричного пика (фиг. 134).
24.3. Активность тАЬбАЬ против двух мишеней против ЕОРК/против УЕОР без линкера
Способность молекулы нейтрализовать УЕОР и ЕОРК определяли, как описано в способах 12 и 13, соответственно. Полученные в анализе данные анализировали с применением ОгарйРаб Рпзт. Значения активности определяли с использованием сигмовидной кривой доза-ответ и данные корректировали с использованием наиболее подходящей модели. Было вычислено, что активность данного тАЬбАЬ (обозначенного ЭМ84011) против ЕОРК (фиг. 135) составляла 3,529 нМ, в то время как для контроля, тАЬ
- 92 023031 против ЕОРК, было получено значение ЕС50 3,647 нМ. В анализе связывания рецептора УЕСР (фиг. 136) ЕС50 тАЬбАЬ (обозначенного ОМ84011) составляла 342,9 пМ (0,3429 нМ), в то время как для контрольного тАЬ против УЕСР была получена ЕС50 214,1 пМ (0,2141 нМ). В заключение, данные анализа показывают, что конструкция по примеру 24, тАЬбАЬ против двух мишеней против ЕСРК/против УЕСР без линкера, активна против обоих антигенов.
Пример 25.
25.1. Получение тАЬбАЬ против двух мишеней против ЕСРК/против УЕСР с удлиненными линкерами
Получали производные тАЬбАЬ, описанного выше в примере 23, где линкер между бАЬ и доменом СН3 тАЬ был удлинен введением одного или более чем одного повтора гибкого мотива СССС8 в плазмиду, кодирующую тяжелую цепь.
Первая молекула с тяжелой цепью, как изложено в 8ЕЦ ГО N0: 175, имеет один повтор этого мотива, поэтому она имеет линкер 8ТССССС8.
Вторая молекула с тяжелой цепью, как изложено в 8ЕЦ ГО N0: 177, имеет два повтора этого мотива, поэтому она имеет линкер 8ТССССС8СССС8.
Обе эти молекулы независимо соединяли с такой же легкой цепью, как использованная в примере 23 (8ЕО ГО N0: 243).
Были выбраны клоны с верифицированной последовательностью легкой и тяжелой цепей, и получение препаратов ДНК в укрупненном масштабе было осуществлено с применением набора ф1адеп Меда Ргер КП в соответствии с протоколами изготовителя. тАЬбАЬ экспрессировали в клетках млекопитающих НЕК293-6Е с применением методик транзиторной трансфекции ко-трансфекцией легких и тяжелых цепей (8Еф ГО N0: 176 и 137, что обозначено ОМ84023; и 8ЕЦ ГО N0: 178 и 137, что обозначено ОМ84024).
25.2. Очистка и 8ЕС-анализ тАЬбАЬ против двух мишеней против ЕСРК/против УЕСР с удлиненными линкерами тАЬбАЬ против двух мишеней очищали из осветленного экспрессионного супернатанта с применением аффинной хроматографии с белком А согласно установленным протоколам. Концентрации очищенных образцов определяли спектрофотометрией на основании измерений оптической плотности при 280 нм. 8Н8-РАСЕ-анализ очищенных образцов ЭМ84023 и ЭМ84024 (фиг. 137) демонстрирует невосстановленные образцы примерно 170 кДа, в то время как восстановленные образцы показывают две полосы примерно 25 и примерно 60 кДа, что соответствует легкой цепи и слитой с бАЬ тяжелой цепи, соответственно.
Для гель-хроматографического анализа (8ЕС-анализа) тАЬбАЬ против ЕСРК/против УЕСР вносили в предварительно уравновешенную колонку 8-200 10/300 СЬ (подсоединенную к системе НРЬС) для использования с РВ8 при 1 мл/мин. 8ЕС-профиль как ОМ84023 (фиг. 138), так и ОМ84024 (фиг. 139) демонстрирует одну разновидность в виде слегка асимметричного пика. 25.3. Активность тАЬбАЬ против двух мишеней против ЕСРК/против УЕСР с удлиненным линкером
Способность молекулы нейтрализовать УЕСР и ЕСРК определяли, как описано в способах 12 и 13 соответственно. Полученные в анализе данные анализировали с применением СгарйРаб Ргын Значения активности определяли с использованием сигмовидной кривой доза-ответ и данные корректировали с использованием наиболее подходящей модели. Было вычислено, что активность тАЬбАЬ ЭМ84023 против ЕСРК (фиг. 140) составляла 7,066 нМ, а активность тАЬбАЬ ОМ84024 против ЕСРК (фиг. 140) составляла 6,420 нМ в то время как для контроля, тАЬ против ЕСРК, было получено значение ЕС50 7,291 нМ. В анализе связывания рецептора УЕСР (фиг. 141) ЕС50 тАЬбАЬ ЭМ84023 составляла 91,79 пМ (0,091 нМ), а ЕС50 тАЬбАЬ ОМ84023 составляла 90 пМ (0,0906 нМ), в то время как для контрольного тАЬ против УЕСР была получена ЕС50 463,2 пМ (0,4632 нМ). В заключение, данные анализа показывают, что конструкции по примеру 25, тАЬбАЬ против двух мишеней против ЕСРК/против УЕСР с удлиненными линкерами, активны против обоих антигенов.
Пример 26.
26.1. Получение тАЬбАЬ против двух мишеней против УЕСР/против ЕСРК
Это тАЬбАЬ против двух мишеней конструировали слиянием бАЬ с С-концом тяжелой цепи тАЬ. Экспрессионные кассеты тяжелой и легкой цепи тАЬ против УЕСР были конструированы ранее. Сайты рестрикции, использованные для клонирования, представляли собой те же, что изложены в примере 10 (8а11 и НшбШ).
ДНК, кодирующую бАЬ против ЕСРК (Н0М16-39-542) затем амплифицировали посредством ПЦР (с использованием праймеров, кодирующих концы 8аЛ и НшбШ) и вводили в модифицированную 3'кодирующую область, приводя к образованию линкера 8ТС (серин, треонин, глицин) между тАЬ и бАЬ.
Были выбраны клоны с верифицированной последовательностью (8Еф ГО N0: 179 и 181 для легкой и тяжелой цепей, соответственно), и получение препаратов ДНК в укрупненном масштабе было осуществлено с применением набора ф1адеп Меда Ргер КП в соответствии с протоколами изготовителя. тАЬбАЬ экспрессировали в клетках млекопитающих НЕК293-6Е с применением методик транзиторной
- 93 023031 трансфекции ко-трансфекцией легких и тяжелых цепей (8ЕЦ ГО N0: 180 и 182).
26.2. Очистка и 8ЕС-анализ тАЬбАЬ против двух мишеней против ЕОРК/против УЕОР
Эти тАЬбАЬ против двух мишеней очищали из осветленного экспрессионного супернатанта с применением аффинной хроматографии с белком А согласно установленным протоколам. Концентрации очищенных образцов определяли спектрофотометрией на основании измерений оптической плотности при 280 нм. 8О8-РАОЕ-анализ очищенного образца (обозначенного ЭМ84009 (фиг. 142) демонстрирует невосстановленные образцы примерно 170 кДа, в то время как восстановленные образцы показывают две полосы примерно 25 и примерно 60 кДа, что соответствует легкой цепи и слитой с бАЬ тяжелой цепи соответственно.
Для гель-хроматографического анализа (8ЕС-анализа) тАЬбАЬ против ЕОРК/против УЕОР вносили в предварительно уравновешенную колонку 8-200 10/300 ОЬ (подсоединенную к системе НРЬС) для использования с РВ8 при 1 мл/мин. 8ЕС-профиль данной молекулы (фиг. 143) демонстрирует одну разновидность в виде симметричного пика.
26.3. Активность тАЬбАЬ против двух мишеней против УЕОР/против ЕОРК
Способность молекулы нейтрализовать УЕОР и ЕОРК определяли, как описано в способах 12 и 13, соответственно. Полученные в анализе данные анализировали с применением ОгарйРаб Рпкт. Значения активности определяли с использованием сигмовидной кривой доза-ответ и данные корректировали с использованием наиболее подходящей модели. Было вычислено, что активность тАЬбАЬ ЭМ84009 против ЕОРК (фиг. 144) составляла 132,4 нМ, в то время как для контроля, тАЬ против ЕОРК, было получено значение ЕС50 6,585 нМ. В анализе связывания рецептора УЕОР (фиг. 145) ЕС50 тАЬбАЬ составляла 539,7 пМ (0,5397 нМ), в то время как для контрольного тАЬ против УЕОР была получена ЕС50 380,5 пМ (0,3805 нМ). В заключение, данные анализа показывают, что конструкция по примеру 26, тАЬбАЬ против двух мишеней против УЕОР/против ЕОРК, активна против обоих антигенов.
Пример 27.
27.1. Получение тАЬбАЬ против двух мишеней против ЕОРК/против ГО-13
Это тАЬбАЬ против двух мишеней конструировали слиянием бАЬ с С-концом тяжелой цепи тАЬ. Экспрессионные кассеты тяжелой и легкой цепи тАЬ против ЕОРК были конструированы ранее. Сайты рестрикции, использованные для клонирования, представляли собой те же, что изложены в примере 10 (8а11 и НшбШ).
ДНК, кодирующую бАЬ против ГО-13 (Э0М10-53-474) затем амплифицировали посредством ПЦР (с использованием праймеров, кодирующих концы 8а11 и НшбШ) и вводили в модифицированную 3'кодирующую область, приводя к образованию линкера 8ТО (серин, треонин, глицин) между тАЬ и бАЬ.
Были выбраны клоны с верифицированной последовательностью (8ЕЦ ГО N0: 243 и 183 для легкой и тяжелой цепей соответственно) и получение препаратов ДНК в укрупненном масштабе было осуществлено с применением набора Ц1адеп Меда Ргер Кй в соответствии с протоколами изготовителя. тАЬбАЬ экспрессировали в клетках млекопитающих НЕК293-6Е с применением методик транзиторной трансфекции ко-трансфекцией легких и тяжелых цепей (8ЕЦ ГО N0: 137 и 184).
27.2. Очистка и 8 ЕС-анализ тАЬбАЬ против двух мишеней против ЕОРК/против ГО-13
Эти тАЬбАЬ против двух мишеней очищали из осветленного экспрессионного супернатанта с применением аффинной хроматографии с белком А согласно установленным протоколам. Концентрации очищенных образцов определяли спектрофотометрией на основании измерений оптической плотности при 280 нм. 8О8-РАОЕ-анализ очищенного образца (обозначенного ЭМ84029) (фиг. 146) демонстрирует невосстановленный образец примерно 170 кДа, в то время как восстановленный образец показывает две полосы примерно 25 и примерно 60 кДа, что соответствует легкой цепи и слитой с бАЬ тяжелой цепи соответственно.
Для гель-хроматографического анализа (8ЕС-анализа) тАЬбАЬ против ЕОРК/против ГО-13 вносили в предварительно уравновешенную колонку 8-200 10/300 ОЬ (подсоединенную к системе НРЬС) для использования с РВ8 при 0,5 мл/мин. 8ЕС-профиль данной молекулы (фиг. 147) демонстрирует одну разновидность в виде симметричного пика.
27.3. Активность тАЬбАЬ против двух мишеней против ЕОРК/против ГО-13
Способность молекулы нейтрализовать ЕОРК и ГО-13 определяли, как описано в способах 12 и 25, соответственно. Полученные в анализе данные анализировали с применением ОгарйРаб Рпкт. Значения активности определяли с использованием сигмовидной кривой доза-ответ и данные корректировали с использованием наиболее подходящей модели. Было вычислено, что активность данного тАЬбАЬ ЭМ84029 против ЕОРК (фиг. 148) составляла 9,033 нМ, в то время как для контроля, тАЬ против ЕОРК, было получено значение ЕС50 8,874 нМ. В клеточном анализе нейтрализации ГО-13 (фиг. 149) ЕС50 тАЬбАЬ составляла 1,654 нМ, в то время как для контрольного тАЬ против ГО-13 была получена ЕС50 0,996 нМ. В заключение, данные анализа показывают, что конструкция по примеру 27, тАЬбАЬ против двух мишеней против ЕОРК/против ГО-13, активна против обоих антигенов.
- 94 023031
Пример 28 28.1. Получение тАЬбАЬ против двух мишеней против ЕОРК/против УЕОР, где бАЬ расположено на легкой цепи тАЬбАЬ против двух мишеней против ЕОРК/против УЕОР конструировали слиянием бАЬ с Сконцом легкой цепи тАЬ. Экспрессионные кассеты тяжелой и легкой цепи тАЬ против ЕОРК были конструированы ранее.
Для введения сайтов рестрикции для вставки бАЬ в легкую цепь использовали сайт-направленный мутагенез с образованием сайтов клонирования ВатШ и НшбШ с использованием вектора экспрессии легкой цепи тАЬ в качестве матрицы. ДНК, кодирующую бАЬ против УЕОР (ЭОМ15-26-593) затем амплифицировали посредством ПЦР (с использованием праймеров, кодирующих концы ВатШ и НшбШ) и вводили в модифицированную 3'-кодирующую область, приводя к образованию либо линкера О8ТО, либо линкера О8ТVАЛР8 между тАЬ и бАЬ.
Первая молекула с легкой цепью, как изложено в 8Е0 ГО NО: 187, имеет линкер О8ТО.
Вторая молекула с легкой цепью, как изложено в 8Е0 ГО NО: 189 имеет линкер О8ТVАЛР8.
Обе эти молекулы независимо соединяли с тяжелой цепью 8Е0 ГО NО: 245.
Были выбраны клоны с верифицированной последовательностью, и получение препаратов ДНК в укрупненном масштабе было осуществлено с применением набора О1адеп Меда Ргер Κι! в соответствии с протоколами изготовителя. тЛЬбАЬ экспрессировали в клетках млекопитающих НЕК293-6Е с применением методик транзиторной трансфекции ко-трансфекцией легких и тяжелых цепей (8Е0 ГО NО: 188 и 139, что обозначено ОМ84013; и 8Е0 ГО NО: 190 и 139, что обозначено ОМ84027).
28.2. Очистка и 8ЕС-анализ тАЬбАЬ против двух мишеней против ЕОРК/против УЕОР, где бАЬ расположено на легкой цепи
Эти тАЬбАЬ против двух мишеней очищали из осветленного экспрессионного супернатанта с применением аффинной хроматографии с белком А согласно установленным протоколам. Концентрации очищенных образцов определяли спектрофотометрией на основании измерений оптической плотности при 280 нм. 8О8-РАОЕ-анализ очищенных образцов ОМ84013 и ОМ84027 (фиг. 150) демонстрирует невосстановленные образцы примерно 170 кДа, в то время как восстановленные образцы показывают две полосы примерно 38 и примерно 50 кДа, что соответствует слитой с бАЬ легкой цепи и тяжелой цепи соответственно.
Для гель-хроматографического анализа (8ЕС-анализа) тАЬбАЬ против ЕОРК/против УЕОР вносили в предварительно уравновешенную колонку 8-200 10/300 ОЬ (подсоединенную к системе НРЬС) для использования с РВ8 при 1 мл/мин. 8ЕС-профили как ОМ84013 (фиг. 151), так и ОМ84027 (фиг. 152) демонстрируют одну разновидность в виде симметричного пика.
28.3. Активность тЛЬбАЬ против двух мишеней против ЕОРК/против УЕОР, где бАЬ расположено на легкой цепи
Способность молекулы нейтрализовать УЕОР и ЕОРК определяли, как описано в способах 12 и 13, соответственно. Полученные в анализе данные анализировали с применением ОгарЬРаб Рпкт. Значения активности определяли с использованием сигмовидной кривой доза-ответ и данные корректировали с использованием наиболее подходящей модели. Было вычислено, что активность тАЬбАЬ ОМ84013 против ЕОРК (фиг. 153) составляла 7,384 нМ, а активность тЛЬбАЬ ЭМ84027 составляла 7,554 нМ, в то время как для контроля, тАЬ против ЕОРК, было получено значение ЕС50 7,093 нМ. В анализе связывания рецептора УЕОР (фиг. 154) ЕС50 тЛЬбАЬ ОМ84013 составляла 1,179 нМ, а ЕС50 тЛЬбАЬ ОМ84027 составляла 0,1731 нМ, в то время как для контрольного тАЬ против УЕОР была получена ЕС50 0,130 нМ. В заключение, данные анализа показывают, что конструкция по примеру 28, тАЬбАЬ против двух мишеней против ЕОРК/против УЕОР, где бАЬ расположено на легкой цепи, активна против обоих антигенов.
Пример 29. В1асоге-анализ тЛЬбАЬ против двух мишеней против ЕОРК/против УЕОР и против ТОТ/против УЕОР
Проводили В^соге-анализ тЛЬбАЬ, описанных в примере 11 (тЛЬбАЬ против ТНР/против УЕОР) и примерах 23, 24, 25 и 28 (тЛЬбАЬ против ЕОРК/против УЕОР) для определения кинетических констант ассоциации и диссоциации для связывания их соответствующих антигенов. Анализ проводили на приборе В^соге™ 3000. Температура прибора была установлена на 25°С. В качестве буфера для экспериментов использовали буфер НВ8-ЕР. Экспериментальные данные получали при максимально возможной скорости прибора. Одну проточную ячейку на чипе СМ5 для исследований покрывали белком А с использованием стандартной химии сочетания аминов согласно инструкциям изготовителя, а вторые проточные ячейки обрабатывали таким же образом, но вместо белка А использовали буфер для создания контрольной поверхности. Проточную ячейку, покрытую белком А затем использовали для иммобилизации тЛЬбАЬ. Антиген вносили в виде серии 2-ратных разведений, как описано в табл. 37. Несколько разведений исследовали дважды. Введения только буфера вместо лиганда использовали для вычитания фона. Образцы затем вводили в случайном порядке с использованием Кшейск νί/агб, входящего в программное обеспечение прибора. В конце каждого цикла поверхность восстанавливали введением 10 мМ глицина, рН 1,5. Как обработку данных, так и коррекцию кинетики проводили с использованием программного обеспечения В беуа1иаЬоп коП\\аге 4.1. Данные, где показаны средние величины двух резуль- 95 023031 татов (из одного и того же эксперимента), показаны в табл. 37. Несколько значений, показанные для ^Μδ4010, отражают два независимых эксперимента. Значение 787 нМ, вероятно, завышает аффинность ввиду анализируемых концентраций лиганда.
Таблица 37
Пример 30. Триспецифичные антитела, содержащие однодоменные антитела, слитые с каркасом биспецифичного антитела
30.1. Конструирование
Гены, кодирующие вариабельные домены тяжелой и легкой цепи молекулы биспецифичного антитела со специфичностью в отношении антигенов К-18 и ГС-12 (дополнительную информацию см. в АО 2007/024715) конструировали бс поуо с присоединением подходящих сайтов рестрикции и сигнальной последовательности. С применением стандартных молекулярно-биологических методик вариабельные домены тяжелой цепи клонировали в вектор экспрессии, содержащий константную область тяжелой цепи 1дС1, слитую с однодоменным антителом против К-4 БОМ9-112-210 (δΕΡ ΙΌ NО: 4) через линкер ΤνΑΑΡδ на С-конце константной области. Вариабельный домен легкой цепи сходным образом клонировали в вектор экспрессии, содержащий последовательность константной области Ск. Конструированные и экспрессированные антитела перечислены в табл. 38.
Таблица 38
| Идентификатор антитела | Описание | 5Εϋ ГО ΝΟ: аминокислотной последовательности |
| ВРС1616 | 1С12/18 ΟνϋΗ Τλ/ΑΑΡδ-тяжелая цепь 210 | 193 |
| И-12/18 ϋλ/ϋ легкая цепь каппа | 194 |
30.2. Экспрессия и очистка
Кратко, 25 мл клеток НЕК293 в концентрации 1,5 х 106 клеток на мл ко-трансфицировали плазмидами экспрессии тяжелой и легкой цепи, предварительно инкубированными с реагентом 2931сс!т (Ιιινί!годсп # 51-0031). Клетки помещали в инкубатор с перемешиванием при 37°С, 5% СО2 и относительной влажности 95%. Через 24 ч добавляли триптоновую питательную среду и клетки выращивали еще в течение 48 ч. Супернатант собирали центрифугированием и уровни СО оценивали количественно посредством ΕΡΙδΑ. Полученное тΑЬάΑЬ было обозначено ВРС1616 (δΕΡ ΙΌ NО: 193 и 194).
30.3. ΕΡΙδΑ связывания ΕΌ-12
Супернатант трансфицированных клеток оценивали на предмет связывания рекомбинантного человеческого ЕС-12. Кратко, планшеты для ΕΕΙδΑ покрывали антителом против человеческого ΕΌ-12 (Κ&Ό δуδ!стδ ΑΡ219ΝΑ) в концентрации 2 мкг/мл и блокировали блокирующим раствором (4% ΒδΑ в забуференном Трис физиологическом растворе). В планшеты потом вносили 25 нг/мл рекомбинантного человеческого К-12 ^срю^сЬ #200-12) в блокирующем растворе. Планшет инкубировали 1 ч при комнатной температуре перед отмывкой в ΤΒδ + 0,05% 'Суссп 20 (ΤΒδΤ). Добавляли различные разведения клеточного супернатанта, а также посторонних контрольных антител (пасколизумаба и контрольного человече- 96 023031 ского ΙβΟ (Η1βΟ) того же изотипа), разведенных в блокирующем растворе. Планшет инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре перед отмывкой в ΤΒ8Τ. Связывание выявляли добавлением меченного пероксидазой антитела против человеческой легкой цепи каппа (81дта А7164) в разведении 1/1000 в блокирующем растворе. Планшет инкубировали 1 ч при комнатной температуре перед отмывкой в ΤΒ8Τ. Планшет проявляли добавлением субстрата 0РЭ (81дта Р9187) и окрашивание останавливали добавлением 3М Н2804. Оптическую плотность измеряли при 490 нм спектрофотометром для прочтения планшетов и среднюю оптическую плотность наносили на диаграмму.
Результаты представлены на фиг. 155, и они показывают, что ВРС1616 связывает рекомбинантный человеческий ГО-12, в то время как для двух контрольных антител показано отсутствие связывания.
30.4. Ε^I8Α связывания ГЪ-18
Супернатанты трансфицированных клеток оценивали на предмет связывания рекомбинантного человеческого ГО-18. Кратко, планшеты для Ε^I8Α покрывали человеческим ГО-18 (полученным в Ο8Κ) в концентрации 1 мкг/мл и блокировали блокирующим раствором (4% Β8Α в забуференном Трис физиологическом растворе). Добавляли различные разведения клеточного супернатанта, а также посторонних антител (пасколизумаба и контрольного человеческого Ι§Ο того же изотипа), разведенных в блокирующем растворе. Планшет инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре перед отмывкой в ΤΒ8 + 0,05% ГОуееп 20 (ΤΒ8Τ). Связывание выявляли добавлением меченного пероксидазой антитела против человеческой легкой цепи каппа (81дта А7164) в разведении 1/1000 в блокирующем растворе. Планшет инкубировали 1 ч при комнатной температуре перед отмывкой в ΤΒ8Τ. Планшет проявляли добавлением субстрата 0РЭ (81дта Р9187) и окрашивание останавливали добавлением 3 М Н2804. Оптическую плотность измеряли при 490 нм спектрофотометром для прочтения планшетов и среднюю оптическую плотность наносили на диаграмму. Результаты представлены на фиг. 156, и они показывают, что ВРС1616 связывает рекомбинантный человеческий ГО-18, в то время как для двух контрольных антител показано отсутствие связывания.
30.5. Ε^I8Α связывания ГО-4
Супернатанты трансфицированных клеток оценивали на предмет связывания рекомбинантного человеческого ГО-4. Кратко, планшеты для Ε^I8Α покрывали человеческим ГО-4 (полученным в Ο8Κ) в концентрации 1 мкг/мл и блокировали блокирующим раствором (4% Β8Α в забуференном Трис физиологическом растворе). Добавляли различные разведения клеточного супернатанта, а также моноклонального антитела против ГО-4 (пасколизумаба) и постороннего антитела (контрольного Ε^Ο того же изотипа), разведенных в блокирующем растворе. Планшет инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре перед отмывкой в ΤΒ8 + 0,05% ГОуееп 20 (ΤΒ8Τ). Связывание выявляли добавлением меченного пероксидазой антитела против человеческой легкой цепи каппа (81дта А7164) в разведении 1/1000 в блокирующем растворе. Планшет инкубировали 1 час при комнатной температуре перед отмывкой в ΤΒ8Τ. Планшет проявляли добавлением субстрата 0РЭ (81дта Р9187) и окрашивание останавливали добавлением 3 М Н2804. Оптическую плотность измеряли при 490 нм спектрофотометром для прочтения планшетов и среднюю оптическую плотность наносили на диаграмму.
Результаты представлены на фиг. 157, и они показывают, что ВРС1616 и пасколизумаб связывают рекомбинантный человеческий ГО-4, в то время как для контрольного антитела показано отсутствие связывания.
Пример 31. Триспецифичные тАЬЙАЬ, содержащие два однодоменных антитела, линейно слитых с С-концом моноклонального антитела
31.1. Конструирование
Конструировали три триспецифичных антитела (шАЬйАЬ-йАЬ), где два однодоменных антитела линейно слиты с С-концом тяжелой цепи моноклонального антитела.
Кратко, сайт рестрикции ΒдШ на Ν-конце и сайт ресктрикции ΒашΗI на С-конце вводили посредством ПЦР для фланкирования последовательностей ДНК, кодирующих однодоменные антитела Э0М 1053-474 (8ΕΟ ΙΌ Ν0: 5), П0М9-155-154 (8ΕΕ) ГО Ν0: 3) и П0М9-112-210 (8ΕΕ) ГО Ν0: 4).
Фрагмент ДНК, кодирующий однодоменное антитело 00М10-53-474, затем клонировали в сайт ΒашΗI вектора экспрессии млекопитающих, кодирующего тяжелую цепь моноклонального антитела против ГО-5, слитую с однодоменным антителом против ГО-4 О0М9-112-10 210 (8ΕΟ ГО Ν0: 71). Фрагменты ДНК, кодирующие однодоменные антитела Э0М9-155-154 и 00М9-112-210, независимо клонировали в сайт ΒашΗI вектора экспрессии млекопитающих, кодирующего тяжелую цепь моноклонального антитела против ί'.Ό20, слитую с однодоменным антителом против ЕЬ-13 О0М10-53-474 (8ΕΟ ГО Ν0: 116). Полученные векторы экспрессии кодируют тяжелую цепь с двумя однодоменными антителами, слитыми с С-концом. Белковые последовательности тяжелых цепей приведены в 8ΕΟ ГО Ν0: 195, 196 и 197, как изложено в табл. 39.
Конструированные тАЬЙАЬ изложены в табл. 39.
- 97 023031
| Таблица 39 | ||
| Идентификатор антитела | Описание | 3Εϋ Ю ΝΟ: аминокислотной последовательности |
| ВРС1008 | тяжелая цепь против И-5-С45- с1АЬ474-ТУААР5СЗ-с1АЬ210 | 195 |
| легкая цепь против Ш-5 | 66 | |
| ВРС1009 | тяжелая цепь против Οϋ-20- В/ААР8ОЗ-с1АЫ 54-ΤνΑΑΡ3Ο3- 0АР474 | 196 |
| легкая цепь против Θϋ-20 | 117 | |
| ВРС1О1О | тяжелая цепь против Οϋ-20- ΤνΑΑΡ3Ο5-όΑΡ210-ТУААРЗОЗ- ЙАЬ474 | 197 |
| легкая цепь против 0ϋ-20 | 117 |
31.2. Экспрессия и очистка
Плазмидами экспрессии, кодирующими тяжелые и легкие цепи ВРС1008, ВРС1009 и ВРС1010, котрансфицировали клетки НЕК 2936Е с использованием 293£есйп (Гпуйгодеп, 12347019). На следующий день в клеточную культуру добавляли триптоновую питательную среду и надосадочный материал собирали через приблизительно 2-6 суток после начала трансфекции. Антитела очищали с использованием колонки с белком А перед исследованием в анализах связывания.
31.3: ЕП8А связывания Ш-4
96-луночные планшеты с интенсивным связыванием покрывали 5 мкг/мл человеческого Ш-4 (С8К) в сорбционном буфере (0,05 бикарбонат, рН 9,6, 8щта С-3041 ) и хранили в течение ночи при 4°С. Планшеты отмывали дважды забуференным Трис физиологическим раствором с 0,05% Тмееп-20 (ТВ8Т). В каждую лунку добавляли 100 мкл блокирующего раствора (1% В8А в буфере ТВ8Т) и планшеты инкубировали по меньшей мере один час при комнатной температуре. Проводили последовательное разведение очищенных антител по планшетам в блокирующем растворе. Через один час инкубации планшеты отмывали три раза. Козье противочеловеческое антитело, специфичное в отношении легкой цепи каппа, конъюгированное с пероксидазой (8щта, А7164), разводили в блокирующем растворе в соотношении 1 к 2000 и 50 мкл добавляли в каждую лунку. Планшеты инкубировали в течение одного часа. Планшеты отмывали три раза, затем в каждую лунку добавляли раствор субстрата 0РГ) (дигидрохлорида офенилендиамина) ЗщтаРак! и через 5 мин реакцию останавливали добавлением 25 мкл 3 М серной кислоты. Оптическую плотность считывали при 490 нм с использованием УегкаМах ТипаЪ1е М1сгор1а1е КеаЙег (Мо1еси1аг Эеуюек) с применением протокола основной конечной точки.
Результаты ЕЫ8А показаны на фиг. 158, и они подтверждают, что антитела ВРС1008, 1009 и ВРС1010 связывают рекомбинантный человеческий Ш-4. Для положительного контроля, пасколизумаба, также было показано связывание с рекомбинантным Ш-4, в то время как для отрицательного контроля, тАЪ против 1Ш-13 и меполизумаба, было показано отсутствие связывания с Ш-4. Антитела ВРС1009 и ВРС1010 также исследовали в отдельном эксперименте, в котором были получены результат, сходный с показанными на фиг. 158.
31.4: ЕЫ8А связывания Ш-5
96-луночные планшеты с интенсивным связыванием покрывали 5,9 мкг/мл человеческого Ш-5 (С8К) в сорбционном буфере (0,05 бикарбонат, рН 9,6) и хранили в течение ночи при 4°С. Планшеты отмывали дважды забуференным Трис физиологическим раствором с 0,05% Тмееп-20 (ТВ8Т). В каждую лунку добавляли 100 мкл блокирующего раствора (1% В8А в буфере ТВ8Т) и планшеты инкубировали по меньшей мере один час при комнатной температуре. Проводили последовательное разведение очищенных антител по планшетам в блокирующем растворе. Через один час инкубации планшеты отмывали три раза. Козье противочеловеческое антитело, специфичное в отношении легкой цепи каппа, конъюгированное с пероксидазой (8щта, А7164), разводили в блокирующем растворе в соотношении 1 к 2000 и 50 мкл добавляли в каждую лунку. Планшеты инкубировали в течение одного часа. Их отмывали три раза, затем в каждую лунку добавляли раствор субстрата 0РГ) (дигидрохлорида о-фенилендиамина) 8ΐβтаРак1 и через 5 мин реакцию останавливали добавлением 25 мкл 3 М серной кислоты. Оптическую плотность считывали при 490 нм с использованием УегкаМах ТипаЪ1е М1сгор1а1е КеаЙег (Мо1еси1аг Эеу1сек) с применением протокола основной конечной точки.
На фиг. 159 показаны результаты ЕЫ8А, подтверждающие, что антитела ВРС1008 связывают рекомбинантный человеческий Ш-5, в то время как для ВРС1009 и ВРС1010 было показано отсутствие связывания с Ш-5. Для положительного контроля, меполизумаба, также было показано связывание с реком- 98 023031 бинантным ГЬ-5, в то время как для отрицательного контроля, тАЬ против ГЬ-13 и пасколизумаба, было показано отсутствие связывания с ГЬ-5.
ЕЫ8А связывания 1Ь-13
96-луночные планшеты с интенсивным связыванием покрывали 5 мкг/мл человеческого ГЬ-13 (ΟδΚ) в сорбционном буфере (0,05 бикарбонат, рН 9,6, δ^дта С-3041 ) и хранили в течение ночи при 4°С. Планшеты отмывали дважды забуференным Трис физиологическим раствором с 0,05% Т\\;ееп-20 (ТΒδТ). В каждую лунку добавляли 100 мкл блокирующего раствора (1% ΒδА в буфере ТΒδТ) и планшеты инкубировали по меньшей мере один час при комнатной температуре. Проводили последовательное разведение очищенных антител по планшетам в блокирующем растворе. Через один час инкубации планшеты отмывали три раза. Козье противочеловеческое антитело, специфичное в отношении легкой цепи каппа, конъюгированное с пероксидазой ^1дта, А7164), разводили в блокирующем растворе в соотношении 1 к 2000 и 50 мкл добавляли в каждую лунку. Планшеты инкубировали в течение одного часа. Их отмывали три раза, затем в каждую лунку добавляли раствор субстрата ОРЬ (дигидрохлорида офенилендиамина) δ^дтаРак! и через 5 мин реакцию останавливали добавлением 25 мкл 3 М серной кислоты. Оптическую плотность считывали при 490 нм с использованием УегкаМах ТипаЬ1е М1сгор1а!е Кеабег (Мо1еси1аг ОеуЬек) с применением протокола основной конечной точки.
Результаты Ε^ГδА показаны на фиг. 160, и они подтверждают, что антитела ВРС1008, 1009 и ВРС1010 связывают рекомбинантный человеческий ГЬ-13. Для положительного контроля, тАЬ против ГЬ-13, также было показано связывание с рекомбинантным ГЬ-13, в то время как для отрицательного контроля, пасколизумаба и меполизумаба, было показано отсутствие связывания с ГЬ-13. Антитела ВРС1009 и ВРС1010 также исследовали в отдельном эксперименте, в котором были получены результат, сходный с показанными на фиг. 160.
Пример 32. тАЬбАЬ с однодоменными антителами, слитыми с моновалентным каркасом
32.1. Конструирование тАЬбАЬ
Биспецифичные антитела, содержащие слитую конструкцию моновалентного антитела (более подробно см. УО 2006015371 и УО 2007059782) и однодоменного антитела ЬОМ15-26-293 конструировали следующим образом. Последовательности ДНК, кодирующие тяжелую цепь КпоЬ-ш!о-Ьо1е против с-Ме! (δΕρ ГЬ NО: 202 и 203), конструировали с применением способа, основанного на ПЦР, с последующим сайт-направленным мутагенезом. Последовательность ДНК, кодирующую тяжелую цепь унитела (ишЬобу) против с-Ме! (δΕρ ГЬ NО: 204), конструировали с применением способа, основанного на ПЦР, с последующим удалением шарнирной области способом, основанным на ПЦР. В дополнение, для слитых конструкций в С-конец экспрессионной кассеты тяжелой цепи были включены сайты рестрикции ВатНГ и ΕсοКГ для облегчения последующего клонирования последовательности ДНК однодоменного антитела против VΕΟР-А (ЬОМ15-26-593) (кодирующей аминокислоты 455-570 δΕρ ГЬ NО: 75) в виде ВатНГΕсοКГ-фрагмента из существующего вектора. Полученные векторы экспрессии кодируют однодоменное антитело против VΕΟР-А, слитое с С-концом тяжелой цепи через линкер Οδ (δΕρ ГЬ NО: 198, 199 и 201). Последовательность ДНК, кодирующую легкую цепь против с-Ме! (δΕρ ГЬ NО: 200) конструировали способом, основанным на ПЦР.
Конструирование ВРС1604 описано в примере 14. В табл. 40 ниже представлено описание тАЬбАЬ с моновалентным каркасом и полученных и экспрессированных антител.
| Таблица 40 | |||
| Идентификатор | Описание | 8Εϋ | Ю ΝΟ: |
| антитела | аминокислотной | ||
| последовательности | |||
| ВРС1017 | тяжелая цепь против СМЕТ 5ϋ5ν2 | 198 | |
| (Но1е)-С8-с1АЬ593 тяжелая цепь против сМЕТ 5ϋ5ν2 (кпоЬ)-С8-с1АЬ593 | 199 | ||
| легкая цепь против СМЕТ 5ϋ5ν2 | 200 | ||
| ВРС1018 | тяжелая цепь против СМЕТ 5ϋ5ν2 | 201 | |
| 1дС4 (υΝΙΒΟΟΥ)-Ο8-όΑό593 легкая цепь против сМЕТ 5ϋ5ν2 | 200 | ||
| ВРС1019 | тяжелая цепь против сМЕТ 5ϋ5ν2 (Ио1е) | 202 | |
| тяжелая цепь против СМЕТ 5ϋ5ν2 | 203 | ||
| (кпоЬ) легкая цепь против сМЕТ 5ϋ5ν2 | 200 | ||
| ВРС1020 | тяжелая цепь против сМЕТ 5ϋ5ν2 1дО4 (ΙΙΝΙΒΟϋΥ) | 204 | |
| легкая цепь против сМЕТ 5ϋ5ν2 | 200 |
- 99 023031
32.2. Экспрессия и очистка
Плазмидами экспрессии, кодирующими тяжелую цепь ВРС1О17. ВРС1О18. ВРС1О19 и ВРС1О2О. котрансфицировали клетки НЕК 29З6Е с использованием 29ЗГесйп (1пуйго§еп, 12З47О19). На следующий день в клеточную культуру добавляли триптоновую питательную среду и надосадочный материал собирали через приблизительно 2-6 суток после начала трансфекции. Антитела очищали с использованием колонки с белком А перед исследованием в анализах связывания.
32.3. ЕЬ18 А связывания рецептора фактора роста гепатоцитов (НСР)
96-луночные планшеты с интенсивным связыванием покрывали 5 мкг/мл химерной конструкции рекомбинантного человеческого рецептора фактора роста гепатоцитов (НСР-К) (с-МЕТ) и Рс-области (К&1) зуз!ет. номер по каталогу З58-МТ/СР) в сорбционном буфере (0,05 бикарбонат, рН 9.6. 81§та СЗО41) и хранили в течение ночи при 4°С. Планшеты отмывали дважды забуференным Трис физиологическим раствором с О.О5% Т\ееп-2О (ТВ8Т). В каждую лунку добавляли 1ОО мкл блокирующего раствора (1% В8А в буфере ТВ8Т) и планшеты инкубировали по меньшей мере ЗО мин при комнатной температуре. Планшеты отмывали три раза. Затем проводили последовательное разведение очищенных антител по планшетам в блокирующем растворе. Через один час инкубации при комнатной температуре планшеты отмывали три раза. Козье противочеловеческое антитело, специфичное в отношении легкой цепи каппа. конъюгированное с пероксидазой (81§та. А7164), разводили в блокирующем растворе в соотношении 1 к 2ООО и добавляли в каждую лунку. Планшеты инкубировали в течение одного часа. Их отмывали три раза. затем в каждую лунку добавляли раствор субстрата ОР1) (дигидрохлорида о-фенилендиамина) 8ΐβтаРаз! и через 5 мин реакцию останавливали добавлением 25 мкл З М серной кислоты. Оптическую плотность считывали при 49О нм с использованием УегзаМах ТипаЬ1е М1сгор1а1е Кеайег (Мо1еси1аг Пеуюез) с применением протокола основной конечной точки.
Результаты ЕЕ18А показаны на фиг. 161, и они подтверждают, что тАЬйАЬ ВРС1О17 и ВРС1О18 связывают рекомбинантный человеческий с-МЕТ с активностью. сопоставимой с антителами ВРС1О19 и ВРС1О2О. Для отрицательного контроля, пасколизумаба и ВРС16О4 (тАЬйАЬ против 1СР-1КА/ЕСР) было показано отсутствие связывания с с-МЕТ.
32.4. ЕЕ18А связывания УЕСР
96-луночные планшеты с интенсивным связыванием покрывали О.4 мкг/мл человеческого УЕСР165 (С8К) и инкубировали при 4°С в течение ночи. Планшеты отмывали дважды забуференным Трис физиологическим раствором с О.О5% Т\\ееп-2О (ТВ8Т). В каждую лунку добавляли 1ОО мкл блокирующего раствора (4% В8А в буфере ТВ8Т) и планшеты инкубировали по меньшей мере один час при комнатной температуре. Затем проводили еще одну стадию отмывки. Проводили последовательное разведение очищенных антител по планшетам в блокирующем растворе. Через один час инкубации при комнатной температуре планшеты отмывали. Козье противочеловеческое антитело. специфичное в отношении легкой цепи каппа. конъюгированное с пероксидазой. разводили в блокирующем растворе в соотношении 1 к 2ООО и добавляли в каждую лунку. Планшеты инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре. После еще одной стадии отмывки в каждую лунку добавляли раствор субстрата ОРП (дигидрохлорида о-фенилендиамина) 81§таРаз1 и через 5 мин реакцию останавливали добавлением 25 мкл З М серной кислоты. Оптическую плотность считывали при 49О нм с использованием УегзаМах ТипаЬ1е М1сгор1а1е Кеайег (Мо1еси1аг Пеуюез) с применением протокола основной конечной точки.
На фиг. 162 показаны результаты ЕЕ18А. подтверждающие, что тАЬйАЬ ВРС1О17 и ВРС1О18 связывают рекомбинантный человеческий УЕСР. Для положительного контроля, ВРС1604, также было показано связывание с рекомбинантным человеческим УЕСР. в то время как для пасколизумаба. ВРС1О19 и ВРС1О2О было показано отсутствие связывания с УЕСР.
Пример ЗЗ. тАЬйАЬ. содержащие йАЬ против ΙΕ-ЕЗ ПОМ1О-5З-546 и ПОМ1О-5З-567
ЗЗ.1. Конструирование, экспрессия и очистка тАЬ против ΙΕ-4-йАЬ против 1Е-1З. показанные в табл. 41. клонировали и транзиторно экспрессировали в клетках НЕК29З6Е. и проводили их очистку (как описано в примерах 1. 1.З и 1.5. соответственно).
Таблица 41
| Название | Описание | Идентификационный номер последовательности (ЗЕО Ю N0:) |
| РазсоН- ΤνΑΑΡδ-546 | Н-цепь = тяжелая цепь пасколизумаба-В/ААР δ-бАЬ ООМЮ- 53-546 ί-цепь = легкая цепь пасколизумаба | 157 (= Н-цепь) 15 (= ί-цепь) |
| РазсоН- ΤνΑΑΡδ-567 | Н-цепь = тяжелая цепь пасколизумаба-ТУААР δ-бАЬ ϋΟΜ10- 53-567 ί-цепь = легкая цепь пасколизумаба | 159 (= Н-цепь) 15 (= ί-цепь) |
- 1ОО 023031
Очищенные шАйбАй РаδсοΗ-ΤУΛАРδ-546 и РаδсοΗ-ΤУΛΛРδ-567 анализировали гельхроматографией (δΕ^ и электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (δϋδРΛСΕ) в восстанавливающих условиях. Данные δΕС и δ^δ-РΛСΕ показаны на фиг. 163, 164, 165 и 166.
33.2. В1асоге-анализ связывания с ΙΌ-13 и ΙΌ-4
Очищенные РаδсοΗ-ΤУΛАРδ-546 и РаδсοΗ-ΤУΛΛРδ-567 исследовали на предмет связывания с человеческим РЙ-13 и человеческим ΙΌ-4 с использованием В^соге™ Т100 при 25°С (как описано в способах 4 и 5). Эти данные показаны в табл. 42.
Таблица 42
ет отметить, что для РаδсοΗ-ΤУΛΛРδ-567 аффинность выходила за пределы чувствительности прибора) и со сходной аффинностью связывания по сравнению с шАй против человеческого ΙΉ-4 самим по себе (пасколизумабом). Как РаδсοΗ-ΤУΛΛРδ-546, так и РаδсοΗ-ΤУΛΛРδ-567 связывали ΙΌ-13. Следует отметить, что бАй против РЙ-13 сами по себе (Ώ0Μ10-53-546 и Ώ0Μ10-53-567) не были исследованы в данном анализе, поскольку бАЬ не может быть иммобилизовано на чипе СМ5, покрытом белком А или антителом против человеческого ^С; вместо этого, шАй против человеческого ΙΌ-13 использовали в качестве положительного контроля для демонстрации связывания РЙ-13 в этом анализе.
Эти шАйбАй также исследовали на предмет связывания с РЙ-13 яванского макака с использованием В^соге™ Т100 при 25°С (как описано в способе 23). Эти данные показаны в табл. 43. Для шАйбАй достигали уровня связывания приблизительно 500 и 750 относительных единиц ответа, для обоих шАйбАй и шАй против ΙΌ-13 оценивали кривые при шести концентрациях ΙΌ-13 (256, 64, 16, 4, 1 и 0,25 нМ).
Таблица 43
Как РаδсοΗ-ΤУΛАРδ-546, так и РаδсοΗ-ΤУΛΛРδ-567 связывали РЙ-13 яванского макака со сходными аффинностями связывания. Следует отметить, что бАй против ΙΌ-13 сами по себе (Ώ0Μ10-53-546 и Ώ0Μ10-53-567) не были исследованы в данном анализе, поскольку бАй не может быть иммобилизовано на чипе СМ5, покрытом белком А или антителом против человеческого Ι§^; вместо этого шАй против человеческого ΙΌ-13 использовали в качестве положительного контроля для демонстрации связывания РЙ-13 в этом анализе.
33.3. Нейтрализация человеческого РЙ-13 и РЙ-13 яванского макака в биологических анализах с клетками ТР-1
Очищенные РаδсοΗ-ΤУΛАРδ-546 и РаδсοΗ-ΤУΛАРδ-567 исследовали на предмет нейтрализации человеческого РЙ-13 и РЙ-13 яванского макака в биологических анализах с клетками ТР-1 (как описано в способе 8 и способе 20 соответственно). На фиг. 167 и 168 представлены данные по нейтрализации человеческого РЙ-13 и РЙ-13 яванского макака (в биологических анализах с клетками ТР-1) соответственно. Ώ0Μ10-53-616 было включено в качестве положительного контроля нейтрализации ΙΌ-13 в этих биологических анализах. бАй со специфичностью в отношении постороннего антигена (бАй отрицательного контроля) было также включено в качестве отрицательного контроля нейтрализации РЙ-13. В дополнение, в этих анализах также исследовали РаδсοΗ-616 и РаδсοΗ-ΤУΛАРδ-616.
- 101 023031
Как ΡаδсοН-ΤУΑΑΡδ-546, так и ΡаδсοН-ΤУΑΑΡδ-567 полностью нейтрализовали биологическую активность человеческого Ш-13 и Ш-13 яванского макака в биологических анализах с клетками ΤΡ-1.
На основании набора данных вычисляли значения ΝΌ50. Значение ΝΌ50 представляет собой концентрацию тАЬбАЬ или тАЬ, или бАЬ, способную нейтрализовать биологическую активность Ш-13 на 50%. Среднее значение ΝΌ50, стандартное отклонение (δΌ) и число экспериментов (п) показаны в табл. 44.
Таблица 44
| Молекула | Среднее значение Νϋ5ο и стандартное отклонение (нМ) | |||
| Человеческий Н_-13 | И-13 яванского макака | |||
| среднее (5ϋ) | η | среднее (δϋ) | η | |
| РазсоН-ТУААР5-546 | 1,522 | 1 | 33,88 | 1 |
| РазсоН-ТУААР5-567 | 2,06 | 1 | 38,25 | 1 |
| ϋΟΜ10-53-616 | 0,536 | 1 | 3,57 | 1 |
| с1АЬ отрицательного | отсутствие нейтрализации | отсутствие нейтрализации | ||
| контроля |
Пример 34. тАЬбАЬ с константными областями тяжелой цепи 1цО2, 1дО4 и Ιμ('.ι4ΡΕ
34.1. Конструирование тАЬбАЬ
Константные области тяжелой цепи генов изотипов человеческих антител 1дО2, 1дО4 и варианта 1дО4 (1дО4ΡΕ) амплифицировали из существующих конструкций посредством ПЦР и клонировали с применением стандартных молекулярно-биологических методик в вектор экспрессии, кодирующий тяжелую цепь ΡаδсοН-Оδ-474 (δΕρ ΙΌ Ν0: 48). Разработанные и исследованные тАЬбАЬ-антитела перечислены в табл. 45.
Таблица 45
| Идентификатор антитела | Описание | 3ΕΌ Ю ΝΟ: аминокислотной последовательности |
| ВРС1617 | РазсоН 1дО2-О5-474 | 207 |
| Разсо каппа | 15 | |
| ВРС1618 | РазсоН 1дС4-О8-474 | 208 |
| Разсо каппа | 15 | |
| ВРС1619 | РазсоН 1дС4РЕ-СЗ-474 | 209 |
| Разсо каппа | 15 |
34.2. Экспрессия тАЬбАЬ, изложенные в табл. 45, экспрессировали вместе с ΡаδсοН-Оδ-474 (δΕρ ΙΌ Ν0: 48 и 15), обозначенным ВРС1000. Кратко, 750 мкл клеток НЕК293 в концентрации 1,5 х 106 клеток на мл котрансфицировали плазмидами экспрессии тяжелой и легкой цепи, предварительно инкубированными с реагентом 293Гесбп ЦпиДодеп # 51-0031). Клетки помещали в инкубатор с перемешиванием при 37°С, 5% СО2 и относительной влажности 95%. Через 1 ч добавляли триптоновую питательную среду и клетки выращивали еще в течение 72 ч. Супернатант собирали центрифугированием.
34.3. ЕЬ^А связывания Ш-4
Супернатанты, содержащие эти тАЬбАЬ, оценивали на предмет связывания рекомбинантного человеческого Ш-4. Кратко, планшеты для ЕЬ^А покрывали человеческим Ш-4 (полученным в ОδΚ) в концентрации 1 мкг/мл и блокировали блокирующим раствором (4% ΒδΑ в забуференном Трис физиологическом растворе). Добавляли различные разведения клеточного супернатанта, моноклонального антитела против Ш-4 (пасколизумаба) и антитела со специфичностью в отношении постороннего антигена (586 против ΙΌ-13). Все образцы разводили в блокирующем растворе. Планшет инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре перед отмывкой в ΤΒδ + 0,05% 'Гхуееп 20 (ΤΒδΤ). Связывание выявляли добавлением меченного пероксидазой антитела против человеческой легкой цепи каппа (Б1§та А7164) в разведении 1/1000 в блокирующем растворе. Планшет инкубировали 1 ч при комнатной температуре перед отмывкой в ^δΈ Планшет проявляли добавлением субстрата 0ΡΌ (Б1§та Ρ9187) и окрашивание останавливали добавлением 3 М Н2δ04. Оптическую плотность измеряли при 490 нм спектрофотометром для прочтения планшетов и среднюю оптическую плотность наносили на диаграмму.
Результаты, представленные на фиг. 169, показывают, что все тАЬбАЬ, содержащие альтернативные изотипы, связывают человеческий Ш-4. Для тАЬбАЬ ВРС1000, ВРС1617, ВРС1618 и ВРС1619 содержание антитела в супернатанте не было определено количественно, поэтому данные, приведенные на фиг. 169, представлены как коэффициент разведения неразбавленного надосадочного материала. Для
- 102 023031 контрольных антител против ГО-4 и ГО-13 в анализе использовали очищенное вещество в начальной концентрации 1 мкг/мл и 1 мкг/мл, соответственно (что соответствует коэффициенту разведения 1 на фиг. 1б9).
34.4. ЕП8А связывания ГО-13
Супернатанты, содержащие эти шАЬбАЬ, оценивали на предмет связывания рекомбинантного человеческого ГО-13. Кратко, планшеты для ЕЫ8А покрывали человеческим ГО-13 (полученным в О8К) в концентрации 5 мкг/мл и блокировали блокирующим раствором (4% В8А в забуференном Трис физиологическом растворе). Добавляли различные разведения клеточного супернатанта, моноклонального антитела против ГО-13 (58б) и антитела со специфичностью в отношении постороннего антигена (пасколизумаба против ГО-4). Все образцы разводили в блокирующем растворе. Планшет инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре перед отмывкой в ТВ8 + 0,05% Т\\ееп 20 (ТВ8Т). Связывание выявляли добавлением меченного пероксидазой антитела против человеческой легкой цепи каппа (8щта А71б4) в разведении 1/1000 в блокирующем растворе. Планшет инкубировали 1 час при комнатной температуре перед отмывкой в ТВ8Т. Планшет проявляли добавлением субстрата 0Р1) (8щта Р9187) и окрашивание останавливали добавлением 3 М Н2804. Оптическую плотность измеряли при 490 нм спектрофотометром для прочтения планшетов и среднюю оптическую плотность наносили на диаграмму.
Результаты, представленные фиг. 170, показывают, что все биспецифичные антитела, содержащие альтернативные изотипы, связывают человеческий ГО-13. Для биспецифичных антител ВРС1000, ВРС1б17, ВРС1б18 и ВРС1б19 содержание антитела в супернатанте не было определено количественно, поэтому данные, приведенные на фиг. 170, представлены как коэффициент разведения неразбавленного надосадочного материала. Для контрольных антител против ГО-4 и ГО-13 в анализе использовали очищенное вещество в начальной концентрации 1 мкг/мл и 1 мкг/мл, соответственно (что соответствует коэффициенту разведения 1 на фиг. 170).
Пример 35. Альтернативные шАЬбАЬ против ГО-13/ГО-4
35.1. Конструирование шАЬбАЬ против ГО-13/ГО-4 с последовательностями альтернативной вариабельной области
С применением стандартных молекулярно-биологических методик последовательности ДНК, кодирующие альтернативную вариабельную область тяжелой цепи тАЬ против ГО-13, обозначенные С1 и Ώ1, переносили из существующих конструкций в вектор экспрессии, содержащий ДНК, кодирующую константную область человеческого 1дО1 (Ы§О1), слитую с однодоменным антителом против ГО-4 (Э0М9-112-210) через линкер ТУААР8О8 на С-конце константной области. Проводили сборку последовательностей ДНК, кодирующих альтернативную вариабельную область легкой цепи шАЬ против ГО-13, обозначенных МО и N0, бе поуо и клонировали их в векторы экспрессии, содержащие человеческую константную область Ск. Эти альтернативные вариабельные области тяжелой и легкой цепи антитела содержат те же СЭК-области, что и антитело против ГО-13, описанное в 8Ер ГО N0: 12 и 13, но с альтернативной гуманизированной каркасной областью вариабельной области.
35.2. Конструирование шАЬбАЬ с использованием вариабельных областей тАЬ б5б против ГО-13
С применением стандартных молекулярно-биологических методик последовательность ДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи гуманизированного тАЬ б5б против ГО-13, переносили из существующей конструкции и клонировали в вектор экспрессии, содержащий ДНК, кодирующую константную область Ы§О1, слитую с однодоменным антителом против ГО-4 (Э0М9-112-210) через линкер ТУААР8О8 на С-конце константной области. Последовательность ДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи, переносили из существующей конструкции и клонировали в вектор экспрессии, содержащий человеческую константную область Ск.
35.3. Экспрессия шАЬбАЬ
Кратко, 25 мл клеток НЕК293 в концентрации 1,5 х 10б клеток на мл ко-трансфицировали плазмидами экспрессии тяжелой и легкой цепи, предварительно инкубированными с реагентом 293Гес1т (1пу1Цоцеп # 51-0031). Клетки помещали в инкубатор с перемешиванием при 37°С, 5% СО2 и относительной влажности 95%. Через 24 ч добавляли триптоновую питательную среду и клетки выращивали еще в течение 72 ч. Супернатант собирали центрифугированием и уровни 1дО оценивали количественно посредством ЕЫ8А. Конструированные и экспрессированные антитела перечислены в табл. 4б.
Таблица 4б
| Идентификатор | Описание | 5Εϋ ГО ΝΟ; |
| антитела/название | аминокислотной последовательности | |
| ВРС1607 | Н-цепь = С1-ТЛ/ААРЗОЗ-2Ю | 151 |
| Ь-цепь = МО каппа | 154 | |
| ВРС1608 | Н-цепь = С1-В/ААРЗСЗ-210 | 151 |
| 1_-цепь = N0 каппа | 153 | |
| ВРС1609 | Н-цепь = С1-ТУААР5О5-2Ю | 151 |
- 103 023031
ВРС1610
ВРС1611
ВРС1612
ВРС1613
1-цепь = 586 каппа (легкая цепь тАЬ против человеческого И-13)
Н-цепь = Э1-ТУААР5е5-210 1_-цепь = МО каппа Н-цепь = Э1-Т\/ААРЗСЗ-210 1_-цепь = N0 каппа Н-цепь = ϋ1-ΤνΑΑΡ 563-210 Ь-цепь = 586 каппа (легкая цепь тАЬ против человеческого И-13)
Н-цепь = 586Н-ТУААР5-210 (тяжелая цепь тАЬ против человеческого 11_-13-Т\/ААРЗ-с1АЬ
152
Ϊ54
Ϊ52
Ϊ53
Ϊ52
ЬТ
35.4. Связывание тАЬбАЬ с ГЬ-13
Связывающую активность тАЬбАЬ в отношении ГЬ-13 оценивали посредством ЕЬГ8А. Кратко, 96луночный планшет для ЕЬГ8А покрывали 5 мкг/мл рекомбинантного экспрессированного в Е. сой человеческого ГЬ-13 (полученного и очищенного в С8К). Лунки блокировали в течение 2 ч при комнатной температуре, затем проводили раститровку конструкций тАЬбАЬ по планшету. Связывание выявляли с использованием разведения антитела против человеческой легкой цепи каппа, конъюгированного с пероксидазой, в соотношении 1 к 1000 (номер по каталогу А7164, 81дта-А1бпсй).
На фиг. 177 показано, что все исследованные молекулы были способны связывать человеческий ГЬ13. Несмотря на то, что для ВРС1615 было показано связывание в данном ЕЬГ8А, точное количественное определение концентрации этой молекулы было невозможным, поэтому данные ЕЬГ8А по связыванию ГЬ-13 для этой молекулы не нанесены на диаграмму на фиг. 177. Высокая аффинность связывания ВРС1615 с ГЬ-13 была также продемонстрирована в независимом В1асогс-аналнзе (табл. 47).
35.5. Связывание тАЬ против ГЬ-13-бАЬ против ГЬ-4 с ГЬ-13 согласно ВГАсогс™
Клеточные супернатанты трансфицированных клеток НЕК также исследовали на предмет связывания рекомбинантного экспрессированного в Е. сой человеческого ГЬ-13 с применением ВГАсогс™ при 25°с (как описано в способе 4). ВРС1601 исследовали в виде очищенного белка. аффинности связывания, представленные в табл. 47, подтверждают, что все антитела демонстрируют высокую аффинность связывания с человеческим ГЬ-13.
- 104 023031
Таблица 47
| ка | кб | Κϋ (нМ) | |
| С1-Т\/ААР563-210 и МО каппа ВРС1607 | 5,15Е+5 | 8,89Е-4 | 1,73 |
| 01-ΤνΑΑΡ3Θ3-210 и N0 каппа ВРС1608 | 4.90Е+5 | 8.83Е-4 | 1,80 |
| С1-ТУААР563-210 и 586 каппа ВРС1609 | 7,55Е+5 | 7,61 Е-4 | 1,01 |
| 01-ТУААР565-210 и МО каппа ВРС1610 | 3,31 Е+5 | 4,66Е-4 | 1,41 |
| 01-ΤνΑΑΡ505-210 и N0 каппа ВРС1611 | 2,59Е+5 | 3,31 Е-4 | 1,28 |
| 01-ТУААР365-210 и 586 каппа ВРС1612 | 4.85Е+5 | 2.74Е-4 | 0,565 |
| 586Н ТУААР5-210 и МО каппа ВРС1613 | 5,54Е+5 | 4.45Е-4 | 0,804 |
| 586Н ТУААРЗ-210 и N0 каппа ВРС1614 | 5,49Е+5 | 4.42Е-4 | 0,805 |
| 656Н ТУААРЗ-210 и 656 каппа ВРС1615 | 4,89Е+6 | 4.17Е-4 | 0,085 |
| 586Н-ТУААРЗ-210 без 63 ВРС1602 | 8,21 Е+5 | 4,62Е-4 | 0,562 |
| 586Н-без линкера-210 без 63 ВРС1601 очищенное | 8.93Е+5 | 3,93Е-4 | 0,440 |
Пример 36. Получение тΑЪбΑЪ со специфичностью в отношении человеческого К-5 и человеческого К-13
36.1. Конструирование и экспрессия тΑЪбΑЪ
Молекулу тΑЪбΑЪ, имеющую тяжелую цепь, изложенную в δΕΟ ΙΌ NО: 65, и легкую цепь, изложенную в δΕΟ ΙΌ NО: 72, экспрессировали в клетках НЕК2936Е. Она была обозначена МсроИгитаЪЬΘ4δ-474 или ВРС1021.
36.2. Связывание тΑЪ против I^-5-бΑЪ против К-13 с К-5 и ТС-13
Это тΑЪбΑЪ (в супернатантах клеток) исследовали на предмет связывания с человеческим К-13 в ΕΕΙδΑ прямого связывания (как описано в способе 1). Эти данные показаны на фиг. 173. Образец трансфицировали и исследовали дважды и это было снабжено примечаниями образец А и образец Б.
Это тΑЪбΑЪ связывало К-13. Очищенное тΑЪ против человеческого К-13 само по себе было включено в этот анализ в качестве положительного контроля связывания К-13. Очищенное тΑЪ против человеческого К-4 (пасколизумаб) и тΑЪ против человеческого К-5 (меполизумаб) были включены в качестве отрицательных контролей связывания К-13.
Это тΑЪбΑЪ также исследовали на предмет связывания с человеческим К-5 в ΕΕΙδΑ прямого связывания (как описано в примере 31.4). Эти данные показаны на фиг. 174.
Μсрο1^ζитаЪ^-Θ4δ-474 связывало К-5. Очищенное тΑЪ против человеческого К-4 (пасколизумаб) и очищенное тΑЪ против человеческого К-13 были включены в качестве отрицательных контролей связывания с К-5.
Очищенное тΑЪ против человеческого К-5 (меполизумаб) использовали в качестве положительного контроля для демонстрации связывания К-5 в этом анализе.
- 105 023031
Последовательности
Таблица 49
| Описание белка или полинуклеотида | Последовательность ДНК (ЗЕО ГО ΝΟ:) | Белковая последовательность (ЗЕО ГО N0:) |
| ООМ9-155-25 | - | 1 |
| ООМ9-155-147 | 60 | 2 |
| ООМ9-155-154 | 61 | 3 |
| ϋΟΜ9-112-210 | - | 4 |
| ϋΟΜ10-53-474 | - | 5 |
| Линкер 043 | - | 6 |
| Линкер | - | 7 |
| Линкер | - | 8 |
| Линкер | - | 9 |
| Линкер | - | 10 |
| Линкер | - | 11 |
| Тяжелая цепь тАЬ против человеческого И-13 и последовательность альтернативного полинуклеотида | 205 206 | 12 |
| Легкая цепь тАЬ против человеческого И-13 | 210 | 13 |
| Тяжелая цепь пасколизумаба | 211 | 14 |
| Легкая цепь пасколизумаба | 212 | 15 |
| Тяжелая цепь меполизумаба | 213 | 65 |
| Легкая цепь меполизумаба | 214 | 66 |
| Тяжелая цепь тАЬ против человеческого 11_-18 | 67 | |
| Легкая цепь тАЬ против человеческого 11_-18 | 68 |
- 106 023031
Тяжелая цепь 586Н-25 Тяжелая цепь 586Н-147 Тяжелая цепь 586Н-154 Тяжелая цепь 586Н-210 Тяжелая цепь 586Н-С43-25 Тяжелая цепь 586Н-643-147 Тяжелая цепь 586Н-648-154 Тяжелая цепь 586Н-645-210 Тяжелая цепь 586Н-Т\/ААРЗ-25 Тяжелая цепь 586Н-Т\/ААРЗ-147 Тяжелая цепь 586Н-Т\/ААРЗ-154 Тяжелая цепь 586Н-Т\/ААР5-210 Тяжелая цепь 586Н-АЗТК6-25 Тяжелая цепь 586Н-А5ТК6-147 Тяжелая цепь 586Н-А5ТК6-154 Тяжелая цепь 586Н-АЗТК6-210 Тяжелая цепь 586Н-ЕРКЗС-25 Тяжелая цепь 586Н-ЕРК5С-147 Тяжелая цепь 586Н-ЕРКЗС-154 Тяжелая цепь 586Н-ЕРК5С-210 Тяжелая цепь 586Н-ЕЮ1-Е-25 Тяжелая цепь 586Н-Е1_О1_Е-147 Тяжелая цепь 586Η-ΕΙ.ΟΙ.Ε-154 Тяжелая цепь 586Н-Е1_01_Е-210 Тяжелая цепь 586Н-65 Тяжелая цепь 586Н-АЗТК6 Тяжелая цепь 586Н-ЕРКЗС Тяжелая цепь 586Η-ΕΙ_ΟΙ_Ε Легкая цепь 586Ι--643-25 Легкая цепь 5861-643-147 Легкая цепь 5861_-645-154 Легкая цепь 5861_-645-210
122
Тб7
192
ТУ
ТУ
УТ зТ
4Ϊ
ТУ
- 107 023031
| Тяжелая цепь РазсоН-474 | 215 | 48 |
| Тяжелая цепь РазсоН-С45-474 | - | 49 |
| Тяжелая цепь РазсоН-ТУААРЗ- 474 | 216 | 50 |
| Тяжелая цепь РазсоН-АЗТКС-474 | - | 51 |
| Тяжелая цепь РазсоН-ЕРКЗС-474 | - | 52 |
| Тяжелая цепь РазсоН-ЕЬОЬЕ-474 | - | 53 |
| Легкая цепь РазсоН-474 | 217 | 54 |
| Легкая цепь РазсоН-С43-474 | - | 55 |
| Легкая цепь РазсоН-ТУААРЗ-474 | 218 | 56 |
| Легкая цепь РазсоН-АЗТКС-474 | - | 57 |
| Легкая цепь РазсоН-ЕРКЗС-474 | - | 58 |
| Легкая цепь РазсоН-ЕЬОЬЕ-474 | - | 59 |
| Интерлейкин-4 | - | 62 |
| Интерлейкин-13 | - | 63 |
| Сигнальная последовательность млекопитающих | 64 | |
| ΟϋΡ3 УН, связывающего 1СР-1Р | - | 80 |
| ΟϋΡ2 УН, связывающего 1СР-1Р | - | 81 |
| СОР1 УН, связывающего 1ОР-1Р | - | 82 |
| СОР1 УЬ, связывающего ΙΟΡ-1Ρ | - | 83 |
| ΘϋΡ2 альтернативного УЬ, связывающего 1СР-1Р | 84 | |
| СОНЗУЬ, связывающего 1СР-1Р | - | 85 |
| СОР2 УЬ, связывающего 1СР-1Р | - | 86 |
| Тяжелая цепь тАЬ против 1Ь-18- С43-ООМ9-112-210 | 69 | |
| Легкая цепь тАЬ против 1Ь-18- Ο45-ϋΟΜ10-53-474 | 70 | |
| Тяжелая цепь тАЬ против 1Ь-5- С43-ООМ9-112-210 | 219 | 71 |
| Легкая цепь тАЬ против !Ь-5-С43- | 220 | 72 |
- 108 023031
| ϋΟΜ1 0-53-474 | ||
| Легкая цепь тАЬ против ΤΝΡ | 169 | 73 |
| Тяжелая цепь тАЬ против ΤΝΡ- ϋΟΜ16-39-542 | 170 | 74 |
| Тяжелая цепь тАЬ против ΤΝΡΟΟΜΙ 5-26-593 | 168 | 75 |
| Тяжелая цепь ϋΟΜ15-26-593- УНсЮММУ | 172 | 76 |
| Легкая цепь ООМ4-130-54- УкбиММУ | 171 | 77 |
| Тяжелая цепь ϋΟΜ15-26-т АЬ против ΤΝΡ | 78 | |
| Легкая цепь ООМ16-39-542-т АЬ против ΤΝΡ | 79 | |
| Тяжелая цепь 586Н-210 (с удаленным СЗ) | 221 | 87 |
| Тяжелая цепь 586Н-Т\/ААРЗ-210 (с удаленным СЗ) | 222 | 88 |
| Тяжелая цепь 586Р1-АЗТКСРТ-210 (с обоими удаленными СЗ) | 89 | |
| Тяжелая цепь 586Н-АЗТКСРЗ-210 (с обоими удаленными СЗ, линкер АЗТКСРЗ) | 90 | |
| Тяжелая цепь Ра5соН-474 (с удаленным СЗ) | 223 | 91 |
| Тяжелая цепь РазсоН-ТХ/ААРЗ- 474 (с удаленным СЗ) | 224 | 92 |
| Тяжелая цепь РазсоН-АЗТКСРТ- 474 (с обоими удаленными СЗ) | 93 | |
| Тяжелая цепь РазсоР1-А5ТКСРЗ- 474 (с обоими удаленными СЗ, линкер АЗТКСРЗ) | 94 | |
| Тяжелая цепь РазсоН-АЗТКСРЗ- | - | 95 |
- 109 023031
- 110 023031
| Легкая цепь антитела против ΙΟΡ- 1Р | 231 | 113 |
| Вариабельный домен тяжелой цепи антитела 2В9 | 114 | |
| Вариабельный домен легкой цепи антитела 2В9 | 115 | |
| Тяжелая цепь тАЬ против 0ϋ-20 с линкером ΤνΑΑΡδΟδ и однодоменным антителом ϋΟΜ10- 53-474, слитым на С-конце | 116 | |
| Легкая цепь тАЬ против СО-20 | - | 117 |
| Тяжелая цепь тАЬ против Όϋ-20 с линкером Οδ и однодоменным антителом ϋΟΜ10-53-474, слитым на С-конце | 118 | |
| Легкая цепь тАЬ против СО-20 с линкером ΤΛ/ΑΑΡδΟδ и однодоменным антителом ϋΟΜ10- 53-474, слитым на С-конце | 119 | |
| Тяжелая цепь тАЬ против СО-20 | - | 120 |
| Легкая цепь тАЬ против СО-20 с линкером СЗ и однодоменным антителом ϋΟΜ10-53-474, слитым на С-конце | 121 | |
| Тяжелая цепь против ΙΘΡ-1Ρ-63- Т1_РС | 232 | 123 |
| Тяжелая цепь против 1ОР-1Р-СЗ- аднектин СТ01 | 233 | 124 |
| Тяжелая цепь против 1СР-1Р- ТЛ/ААРЗСЗ-Т1_РС | 234 | 125 |
| Тяжелая цепь против 1ОР-1Р-СЗ- ΑΡΡΙ | 235 | 126 |
| Тяжелая цепь против 1СР-1Р- | 236 | 127 |
- 111 023031
| ТУААР363-АРР1 | ||
| Тяжелая цепь против ЮР-1Р-СЗ- ϋΡΡΝ | 237 | 128 |
| Тяжелая цепь против 1СР-1Р- Τ\/ΑΑΡ3Ο3-ΟΡΡΝ | 238 | 129 |
| Тяжелая цепь против 11_-4-СЗ-\/НН представителей семейства Верблюдовых против РНКазы А | 239 | 130 |
| Тяжелая цепь против И.-4-СЗ- ΝΑΡν | 240 | 131 |
| Тяжелая цепь против ЮР-1 Р- Т\/ААРЗСЗ-аднектин СТ01 | 241 | 133 |
| Тяжелая цепь против ΙΙ.-13-68- аднектин против ΤΝΡα | 134 | |
| Тяжелая цепь против 11_-13- Т\/ААРЗСЗ-аднектин против ΤΝΡα | 135 | |
| Тяжелая цепь эрбитукса-РЗ- аднектин СТ01 | 242 | 136 |
| Легкая цепь тАЬ против ЕСРР (Р312) | 243 | 137 |
| Легкая цепь эрбитукса-РЗ- аднектин СТ01 | 244 | 138 |
| Тяжелая цепь тАЬ против ЕСРР | 245 | 139 |
| Тяжелая цепь 11 Р8-СЗ-аднектин СТ01 | 140 | |
| Легкая цепь 11Р8 | - | 141 |
| Легкая цепь 11Р8-СЗ-аднектин СТ01 | 142 | |
| Тяжелая цепь 11Р8 | - | 143 |
| Аднектин СТ01-СЗТС-тяжелая цепь эрбитукса | 246 | 144 |
| Аднектин СТ01-ЗТС-легкая цепь эрбитукса | 247 | 145 |
- 112 023031
| Тяжелая цепь против 11_-4-С8- аднектин против ΤΝΡα | 270 | 146 |
| Тяжелая цепь против 11_-4- Т\/ААР8С5-аднектин против ΤΝΡα | 132 | 147 |
| ϋΟΜ10-53-616 | - | 148 |
| Тяжелая цепь РазсоН-616 | 248 | 149 |
| Тяжелая цепь РазсоН-ТХ/ААРЗ- 616 | 249 | 150 |
| Тяжелая цепь С1-Т\/ААРЗС8-210 | - | 151 |
| Тяжелая цепь 01-Т\/ААР8СЗ-210 | - | 152 |
| Легкая цепь N0 | - | 153 |
| Легкая цепь МО | - | 154 |
| Тяжелая цепь 656Н-Т\/ААРЗ-210 | 250 | 155 |
| Легкая цепь 656 | 251 | 156 |
| Тяжелая цепь РазсоР1-Т\/ААР8- 546 | 252 | 157 |
| Тяжелая цепь РазсоР1-546 | 253 | 158 |
| Тяжелая цепь РазсоР1-Т\/ААРЗ- 567 | 254 | 159 |
| Тяжелая цепь РазсоН-567 | 255 | 160 |
| Тяжелая цепь 656 | 256 | 161 |
| Тяжелая цепь ООМ15-26- νΗόΙΙΜΜΥ | 162 | 163 |
| Цетуксимаб-тяжелая цепь ϋΟΜ15- 26-593 | 164 | 165 |
| Альтернативная тяжелая цепь пасколизумаба | 166 | |
| Цетуксимаб-тяжелая цепь ϋΟΜ15- 26-593 без линкера | 173 | 174 |
| Цетуксимаб-тяжелая цепь ϋΟΜ15- 26-593 линкер 8ТССССС8 | 175 | 176 |
| Цетуксимаб-тяжелая цепь ООМ15- | 177 | 178 |
- 113 023031
Фиг.
Фиг.
Фиг.
Краткое описание графических материалов
-7: Примеры антиген-связывающих конструкций.
8: Схематическое представление конструкций тАЬбАЬ.
9: δΕί'- и δΏδ^^Ε^^^ РаκсοН-Ο4δ-474.
- 114 023031
Фиг. 10: δΕΟ’- и δ^δ-РАСВ-анализ Раδсο^-С4δ-474.
Фиг. 11: δΕί'.’- и δ^δ-РАСВ-анализ РазсоН-474.
Фиг. 12: δΕΟ’- и δϋδ-РАСВ-анализ Ра5СοΗ^-С4δ-474.
Фиг. 13: Связывание супернатантов, содержащих тАЬбАЬ, с человеческим ГО-13 в В^IδА прямого связывания.
Фиг. 14: Связывание супернатантов, содержащих тАЬбАЬ, с человеческим ГО-4 в В^IδА прямого связывания.
Фиг. 15: Связывание очищенных тАЬбАЬ с человеческим ГО-13 в В^IδА прямого связывания.
Фиг. 16: Связывание очищенных тАЬбАЬ с человеческим ГО-4 в В^IδА прямого связывания.
Фиг. 17: Связывание супернатантов, содержащих тАЬбАЬ, с человеческим ГО-4 в В^IδА прямого связывания.
Фиг. 18: Связывание супернатантов, содержащих тАЬбАЬ, с человеческим ГО-13 в В^IδА прямого связывания.
Фиг. 19: Связывание очищенных тАЬбАЬ с человеческим ГО-4 в В^IδА прямого связывания.
Фиг. 20А: Связывание очищенных тАЬбАЬ с человеческим ГО-13 в В^IδА прямого связывания.
Фиг. 20Б: Связывание очищенных тАЬбАЬ с ГО-13 яванского макака в В^IδА прямого связывания.
Фиг. 21: Кинетика связывания тАЬбАЬ для ГО-4 с применением Высоте™.
Фиг. 22: Кинетика связывания тАЬбАЬ для ГО-4 с применением Высоте™.
Фиг. 23: Кинетика связывания тАЬбАЬ для ГЪ-13 с применением Высоте™.
Фиг. 24: Способность очищенных тАЬ против ГО-13-бАЬ против ГО-4 нейтрализовать человеческий ГО-13 в биологическом анализе с клетками ТР-1.
Фиг. 25: Способность очищенных тАЬ против ГО-13-бАЬ против ГО-4 нейтрализовать человеческий ГО-4 в биологическом анализе с клетками ТР-1.
Фиг. 26: Способность очищенных тАЬ против ГО-4-бАЬ против ГЪ-13 Ра8СοΗ-С4δ-474, РазсоН-474, Ра8СΟ^-С4δ-474 и Ра8СοΗ^-С4δ-474 нейтрализовать человеческий ГО-4 в биологическом анализе с клетками ТР-1.
Фиг. 27: Способность очищенных тАЬ против ГО-4-бАЬ против ГЪ-13 Ра8СοΗ-С4δ-474, РазсоН-474, Ра8СΟ^-С4δ-474 и Ра8СοΗ^-С4δ-474 нейтрализовать человеческий РЪ-13 в биологическом анализе с клетками ТР-1.
Фиг. 28: Способность очищенных тАЬ против ГО-4-бАЬ против ГЪ-13 Ра8СοΗ-С4δ-474, РазсоН-474, Ра8СΟ^-С4δ-474 и Ра8СοΗ^-С4δ-474 одновременно нейтрализовать человеческий ГО-4 и человеческий ГО13 в биологическом анализе двойной нейтрализации с клетками ТР-1.
Фиг. 29: δВС-ΜΛ^^δ Ό0Μ 10-53-474.
Фиг. 30: δВС-ΜΛ^^δ Ό0Μ9-112-210.
Фиг. 31: δВС-ΜΛ^^δ Ό0Μ9-155-25.
Фиг. 32: δВС-ΜΛ^^δ Ό0Μ9-155-25, наложение всех трех сигналов.
Фиг. 33: δВС-ΜΛ^^δ Ό0Μ9-155-147.
Фиг. 34: δВС-ΜΛ^^δ Ό0Μ9-155-159.
Фиг. 35: Контроль определения Μν посредством δВС-ΜΛ^^δ: ΒδА.
Фиг. 36: Схематическое представление молекулы триспецифичного тАЬбАЬ.
Фиг. 37: Связывание триспецифичного тАЬбАЬ ГО18тАЬ-210-474 (супернатанты) с человеческим ГО-18 в В^IδА прямого связывания.
Фиг. 38: Связывание триспецифичного тАЬбАЬ ГО18тАЬ-210-474 (супернатанты) с человеческим ГО-13 в В^IδА прямого связывания.
Фиг. 39: Связывание триспецифичного тАЬбАЬ ГО18тАЬ-210-474 (супернатанты) с человеческим ГО-4 в В^IδА прямого связывания.
Фиг. 40: Связывание триспецифичного тАЬбАЬ Меро-210-474 (супернатант) с человеческим ГЪ-13 в В^IδА прямого связывания.
Фиг. 41: Связывание триспецифичного тАЬбАЬ Меро-210-474 (супернатант) с человеческим ГО-4 в В^IδА прямого связывания.
Фиг. 42: Клонирование тАЬбАЬ против ТОТУпротив ВСРК.
Фиг. 43. δ^δ-РАСВ-анализ тАЬбАЬ против ТОТУпротив ВСРК.
Фиг. 44. δВС-профиль тАЬбАЬ против ТОТУпротив ВСРК (пример 10).
Фиг. 45: Активность примера 10 против ВСРК.
Фиг. 46. Активность примера 10 против ТОТ1.
Фиг. 47. δ^δ-РАСВ-анализ тАЬбАЬ против ТОТУпротив УБСР (пример 11).
Фиг. 48. δВС-профиль тАЬбАЬ против ТОТУпротив УБСР (пример 11).
Фиг. 49. Активность примера 11 против УБСР.
Фиг. 50. Активность примера 11 против ТОТ1.
Фиг. 51. Клонирование бАЬ-расширенного-1дС против УВСР/против ГО-1К1 (пример 12).
Фиг. 52. δ^δ-РАСВ-анализ бАЬ-расширенного-1дС А против ТОТУпротив УЬСР (пример 12).
- 115 023031
Фиг. 53: δ^δ-РАΟΕ-анализ бАЬ-расширенного-1дО В против ΤΝΡ/против УΕΟΡ (пример 12).
Фиг. 54. δΕС-профиль бАЬ-расширенного-1дО А против ΤΝΡ/против УΕΟΡ (пример 12).
Фиг. 55: δΕС-профиль бАЬ-расширенного-1дО В против ΤΝΡ/против УΕΟΡ (пример 12).
Фиг. 56. Активность примера 12 против УΕΟΡ (^Мδ2091).
Фиг. 57. Активность примера 12 против УΕΟΡ (^Мδ2090).
Фиг. 58. Активность примера 12 против ГО1-К1 (^Мδ2090).
Фиг. 59: Активность примера 12 против ГО1-К1 (^Мδ2091).
Фиг. 60: Клонирование тАЬбАЬ против ΤΝΡ/против УΕΟΡ/против ΕΟΡΚ (пример 13).
Фиг. 61. δ^δ-РАΟΕ-анализ тАЬбАЬ против ΤΝΡ/против УΕΟΡ/против ΕΟΡΚ (пример 13).
Фиг. 62: Активность примера 13 против УΕΟΡ.
Фиг. 63: Активность примера 13 против ΤΝΡ.
Фиг. 64: Активность примера 13 против ΕΟΡΚ.
Фиг. 65: δΕС-анализ очищенных биспецифичных антител ВРС1603 (А), ВРС1604 (Б), ВРС1605 (В),
ВРС1606 (Г).
Фиг. 66. Связывание биспецифичных антител с иммобилизованным ЮР-1К.
Фиг. 67. Связывание биспецифичных антител с иммобилизованным УРОР.
Фиг. 68. Ингибирование опосредованного лигандом фосфорилирования рецепторов различными биспецифичными антителами.
Фиг. 69: Ингибирование опосредованного лигандом фосфорилирования рецепторов различными биспецифичными антителами.
Фиг. 70: Анализ АЭСС с биспецифичным антителом против СО20/ГО-13.
Фиг. 71: Анализ АЭСС с биспецифичным антителом против СО20/ГО-13.
Фиг. 72: Анализ АЭСС с биспецифичным антителом против СО20/ГО-13 с использованием меньшего диапазона доз.
Фиг. 73: Анализ АЭСС с биспецифичным антителом против СО20/ГО-13 с использованием меньшего диапазона доз.
Фиг. 74: Анализ СЭС с биспецифичным антителом против СО20/ГО-13.
Фиг. 75: Анализ СЭС с биспецифичным антителом против СО20/ГО-13.
Фиг. 76: Связывание ВРС1803 и ВРС1804 в Ε^IδА с рекомбинантным человеческим ЮР-1К.
Фиг. 77: Связывание ВРС1803 и ВРС1804 в Ε^IδА связывания рекомбинантного УΕΟΡ.
Фиг. 78: Связывание ВРС1805 и ВРС1806 в Ε^IδА с рекомбинантным человеческим ЮР-1 К.
Фиг. 79: Связывание ВРС1805 и ВРС1806 в Ε^IδА с рекомбинантным человеческим ЖК2.
Фиг. 80: Связывание ВРС1807 и ВРС1808 в Ε^IδА с рекомбинантным человеческим ЮР-1К.
Фиг. 81: Связывание ВРС1807 и ВРС1808 в Ε^IδА с рекомбинантным человеческим ЖК2.
Фиг. 82 Связывание ВРС1809 в Ε^IδА с рекомбинантным человеческим ГО-4.
Фиг. 83: Связывание ВРС1809 в Ε^IδА с РНКазой А.
Фиг. 84: Связывание ВРС1816 в Ε^IδА с рекомбинантным человеческим ГО-4.
Фиг. 85: Связывание ВРС1816 в Ε^IδА с ЖР
Фиг. 86: Связывание ВРС1801 и ВРС1802 в Ε^IδА с рекомбинантным человеческим ЮР-1 К.
Фиг. 87: Связывание ВРС1801 и ВРС1802 в Ε^IδА с рекомбинантным человеческим УРОРК2.
Фиг. 88: Связывание ВРС1823 и ВРС1822 в Ε^IδА с рекомбинантным человеческим ГО-4.
Фиг. 88Б: Связывание ВРС1823 (супернатант с большей концентрацией) в Ε^IδА с рекомбинантным человеческим ГО-4.
Фиг. 89: Связывание ВРС1823 и ВРС1822 в Ε^IδА с рекомбинантным человеческим ΤΝΡ-α.
Фиг. 89Б: Связывание ВРС1823 (супернатант с большей концентрацией) в Ε^IδА с рекомбинантным человеческим ΤΝΡ-α.
Фиг. 90: δΕС-профиль РаксоН-474 с удаленным Οδ.
Фиг. 91: δΕС-профиль РаκсοН-ΤУАΆρδ-474 с удаленным Οδ.
Фиг. 92: δΕС-профиль РаκсοН-Οδ-АδΤΚΟРΤ-474 с удаленным вторым Οδ.
Фиг. 93: δΕС-профиль 586Н-210 с удаленным Οδ.
Фиг. 94: δΕС-профиль 586Н-ΤУАΆРδ-210 с удаленным Οδ.
Фиг. 95: δ^δ-РАΟΕ РаксоН-474 с удаленным Οδ (линия В) и РаκсοН-ΤУАΆРδ-474 с удаленным Οδ (линия А).
Фиг. 96: δ^δ-РАΟΕ РаκсοН-Οδ-АδΤΚΟРΤ-474 с удаленным вторым Οδ [А = невосстанавливающие условия, В = восстанавливающие условия].
Фиг. 97: δ^δ-РАΟΕ 586Н-210 с удаленным Οδ (линия А)
Фиг. 98: δ^δ-РАΟΕ 586Н-ΤУАΆРδ-210 с удаленным Οδ (линия А).
Фиг. 99: Связывание очищенного РаксоН-474 с удаленным Οδ и РаκсοН-ΤУАΆРδ-474 с удаленным
Οδ в Ε^IδА с человеческим ГО-4.
Фиг. 100: Связывание очищенного РаксоН-474 с удаленным Οδ и РаκсοН-ΤУААРδ-474 с удаленным Οδ в Ε^IδА с человеческим РБ-13.
- 116 023031
Фиг. 101: Связывание РаксоН-474 с удаленным О8, РаксоН-ТУААР8-474 с удаленным О8, РаксоН616 и РаксоН-ТУААР8-616 в ЕЫ8А с 1Ь-13 яванского макака.
Фиг. 102: Ингибирование связывания человеческого 1Ь-4 с человеческим 1Ь-4Ка тАЬбАЬ согласно
ЕЫ8А.
Фиг. 103: Ингибирование связывания человеческого 1Ь-4 с человеческим 1Ь-4Ка тАЬбАЬ согласно
ЕЫ8А.
Фиг. 104: Нейтрализация человеческого 1Ь-13 тАЬбАЬ в биологических анализах с клетками ТР-1. Фиг. 105: Нейтрализация ГО-13 яванского макака тАЬбАЬ в биологических анализах с клетками ТР-1. Фиг. 106: Нейтрализация человеческого ГО-4 тАЬбАЬ в биологических анализах с клетками ТР-1.
Фиг. 107: Нейтрализация ГО-4 яванского макака тАЬбАЬ в биологических анализах с клетками ТР-1. Фиг. 108: Способность тАЬбАЬ ингибировать связывание человеческого ГО-13 с человеческим ГО13Ка2.
Фиг. 109: 8ЕС-профиль РаксоН-616.
Фиг. 110: 8ЕС-профиль РаксоН-ТУААР8-616.
Фиг. 111.808-РАСЕ РаксоН-616 [Е1 = невосстанавливающие условия, Е2 = восстанавливающие условия] .
Фиг. 112: 8О8-РАОЕ РаксоН-ТУААР8-616 [А = невосстанавливающие условия, В = восстанавливающие условия].
Фиг. 113: Связывание очищенных РаксоН-616 и РаксоН-ТУААР8-616 в ЕЫ8А с человеческим ГО13.
Фиг. 114: Нейтрализация человеческого ГО-13 тАЬбАЬ в биологических анализах с клетками ТР-1. Фиг. 114а: Нейтрализация ГО-13 яванского макака тАЬбАЬ в биологических анализах с клетками
ТР-1.
Фиг. 115: Ингибирование активности ГО-4 РаксоН-474 с удаленным О8.
Фиг. 116: Ингибирование активности ГО-13 РаксоН-474 с удаленным О8.
Фиг. 117: Ингибирование активности ГО-4 586-ТУААР8-210.
Фиг. 118: Ингибирование активности ГО-13 586-ТУААР8-210.
Фиг. 119: Ингибирование активности ГО-4 пасколизумабом.
Фиг. 120: Ингибирование активности ГО-4 00М9-112-210.
Фиг. 121: Ингибирование активности ГО-13 тАЬ против ГО-13.
Фиг. 122: Ингибирование активности ГО-13 О0М 10-53-474.
Фиг. 123: Активность контрольных тАЬ и бАЬ в анализе цельной крови с Фиг. 124: Активность контрольных тАЬ и бАЬ в анализе цельной крови с ГО-13.
Фиг. 125: Концентрация лекарственного средства, сохранявшаяся в различные временные точки после введения, как оценено посредством ЕЫ8А против ТОТ1 и ЕОРК.
Фиг. 126: Концентрация лекарственного средства, сохранявшаяся в различные временные точки после введения, как оценено посредством ЕЫ8А против ТОТ1 и УЕОР.
Фиг. 127: Концентрация лекарственного средства, сохранявшаяся в различные временные точки после введения, как оценено посредством ЕЬ18А против ГО-1К1 и УЕОР.
Фиг. 128: 8О8-РАОЕ очищенного 0М84010.
Фиг. 129: 8ЕС-профиль очищенного 0М84010.
Фиг. 130: Активность 0М84010 против ЕОРК.
Фиг. 131: Анализ связывания рецепторов против УЕОР.
Фиг. 132: Фармакокинетический профиль тАЬбАЬ против двух мишеней против ЕОРК/против
УЕОР.
Фиг. 133: 8О8-РАОЕ-анализ очищенного ОМ84011.
Фиг. 134: 8ЕС-профиль очищенного ОМ84011.
Фиг. 135: Активность ОМ84011 против ЕОРК.
Фиг. 136: ОМ84011 в анализе связывания рецепторов против УЕОР.
Фиг. 137: 8О8-РАОЕ-анализ очищенных образцов ОМ84023 и ОМ84024.
Фиг. 138: 8ЕС-профиль ОМ84023
Фиг. 139: 8ЕС-профиль ОМ84024
Фиг. 140: Активность ОМ84023 против ЕОРК.
Фиг. 141: ОМ84023 и ОМ84024 в анализе связывания рецепторов против УЕОР.
Фиг. 142: 8О8-РАОЕ-анализ очищенного 0М84009.
Фиг. 143: 8ЕС-профиль 0М84009.
Фиг. 144: Активность тАЬбАЬ 0М84009 против ЕОРК.
Фиг. 145: 0М84009 в анализе связывания рецепторов против УЕОР.
Фиг. 146: 8О8-РАОЕ-анализ очищенного ОМ84029.
Фиг. 147: 8ЕС-профиль ОМ84029.
Фиг. 148: Активность тАЬбАЬ ОМ84029 против ЕОРК.
Фиг. 149: ОМ84029 в клеточном анализе нейтрализации ГО-13.
- 117 023031
Фиг. 150: 808-РАСЕ-анализ очищенных образцов ЭМ84013 и ЭМ84027.
Фиг. 151: 8ЕС-профиль ОМ84013.
Фиг. 152: 8ЕС-профиль ОМ84027.
Фиг. 153: Активность тАЬбАЬ ЭМ84013 против ЕСРК.
Фиг. 154: ОМ84013 в анализе связывания рецепторов против УЕСР.
Фиг. 155: Связывание ВРС1616 в ЕЬГ8А с рекомбинантным человеческим ГЬ-12.
Фиг. 156: Связывание ВРС1616 в ЕЬГ8А с рекомбинантным человеческим ГЬ-18.
Фиг. 157: Связывание ВРС1616 в ЕЬГ8А с рекомбинантным человеческим ГЬ-4.
Фиг. 158: Связывание ВРС1008, 1009 и ВРС1010 в ЕЬГ8А с рекомбинантным человеческим ГЬ-4.
Фиг. 159: Связывание ВРС1008 в ЕЬГ8А с рекомбинантным человеческим ГЬ-5.
Фиг. 160: Связывание ВРС1008, 1009 и ВРС1010 в ЕЬГ8А с рекомбинантным человеческим ГЬ-13.
Фиг. 161: Связывание ВРС1017 и ВРС1018 в ЕЬГ8А с рекомбинантным человеческим с-МЕТ.
Фиг. 162: Связывание ВРС1017 и ВРС1018 в ЕЬГ8А с рекомбинантным человеческим УЕСР.
Фиг. 163: 8ЕС-профиль РахсоН-ТУААР8-546.
Фиг. 164: 8ЕС-профиль РахсоН-ТУААР8-567.
Фиг. 165: 8Э8-РАСЕ РахсоН-ТУААР8-546 [А = невосстанавливающие условия, В = восстанавливающие условия]
Фиг. 166: 8Э8-РАСЕ РахсоН-ТУААР8-567 [А = невосстанавливающие условия, В = восстанавливающие условия]
Фиг. 167: Данные по нейтрализации человеческого ГЬ-13 в биологическом анализе с клетками ТР-1.
Фиг. 168: Данные по нейтрализации ГЬ-13 яванского макака в биологическом анализе с клетками ТР-1.
Фиг. 169: Связывание тАЬбАЬ, содержащих альтернативные изотипы, в ЕЬГ8А с человеческим ГЬ-4.
Фиг. 170: Связывание тАЬбАЬ, содержащих альтернативные изотипы, в ЕЬГ8А с человеческим ГЬ-13.
Фиг. 171: Связывание ВРС1818 и ВРС1813 в ЕЬГ8А с рекомбинантным человеческим ЕСРК.
Фиг. 172: Связывание ВРС1818 и ВРС1813 в ЕЬГ8А с рекомбинантным человеческим УЕСРК2.
Фиг. 173: Связывание тАЬ против ГЬ-5-бАЬ против ГЬ-13 в ЕЬГ8А с ГЬ-13.
Фиг. 174: Связывание тАЬ против ГЬ-5-бАЬ против ГЬ-13 в ЕЬГ8А с ГЬ-5.
Фиг. 175: Связывание ВРС1812 в ЕЬГ8А с рекомбинантным человеческим УЕСРК2.
Фиг. 176: Связывание ВРС1812 в ЕЬГ8А с рекомбинантным человеческим ЕСРК.
Фиг. 177: Связывание тАЬбАЬ в ЕЬГ8А с человеческим ГЬ-13.
Claims (28)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Антиген-связывающая конструкция, способная связывать более чем один антиген, один из которых представляет собой интерлейкин-13 (ГЬ-13), представляющая собой полноразмерную молекулу антитела, связанную с двумя отдельными вариабельными доменами иммуноглобулина, где указанная антиген-связывающая конструкция имеет 4 антиген-связывающих сайта, два из которых имеют происхождение из спаренных доменов УН/УЬ молекулы антитела и два из которых имеют происхождение из указанных отдельных вариабельных доменов иммуноглобулина, присоединенных к молекуле антитела.
- 2. Антиген-связывающая конструкция по п.1, где отдельный вариабельный домен иммуноглобулина представляет собой отдельный вариабельный домен иммуноглобулина человека.
- 3. Антиген-связывающая конструкция по п.1, где отдельный вариабельный домен иммуноглобулина представляет собой отдельный вариабельный домен иммуноглобулина представителя семейства верблюдовых.
- 4. Антиген-связывающая конструкция по п.1, где отдельный вариабельный домен иммуноглобулина представляет собой отдельный вариабельный домен иммуноглобулина акулы ЩАКУ).
- 5. Антиген-связывающая конструкция по любому из пп.1-4, способная связывать интерлейкин-4 (ГЬ-4).
- 6. Антиген-связывающая конструкция по любому из пп.1-5, способная связывать интерлейкин-5 (ГЬ-5).
- 7. Антиген-связывающая конструкция по любому из пп.1-6, где молекула антитела относится к изотипу иммуноглобулинов С (ГдС).
- 8. Антиген-связывающая конструкция по любому из пп.1-7, где по меньшей мере один из отдельных вариабельных доменов иммуноглобулина непосредственно присоединен к молекуле антитела линкером, содержащим 1-50 аминокислот.
- 9. Антиген-связывающая конструкция по п.8, где линкер имеет аминокислотную последовательность, выбранную из 8ЕЦ ГО NО: 6-11 или С8 либо является любой их комбинацией.
- 10. Антиген-связывающая конструкция по п.8, где линкер содержит последовательность 8ЕЦ ГО ΝΌ: 7.
- 11. Антиген-связывающая конструкция по любому из пп.1-10, в которой отдельный вариабельный домен иммуноглобулина присоединен к молекуле антитела на С-конце тяжелой цепи.
- 12. Антиген-связывающая конструкция по любому из пп.1-11, представляющая собой антитело- 118 023031 против 1Ь-13 с присоединенным к С-концу или \-концу тяжелой цепи либо к С-концу или \-концу легкой цепи отдельным вариабельным доменом иммуноглобулина против 16-4.
- 13. Антиген-связывающая конструкция по п.12, в которой последовательность легкой цепи антитела представляет собой 8ЕС) ГО N0: 13.
- 14. Антиген-связывающая конструкция по любому из пп.1-11, представляющая собой антитело против ГО-5 с присоединенным отдельным вариабельным доменом иммуноглобулина против 16-13.
- 15. Антиген-связывающая конструкция по п.14, представляющая собой антитело против ГО-5 с присоединенным к С-концу или \-концу тяжелой цепи либо к С-концу или \-концу легкой цепи отдельным вариабельным доменом иммуноглобулина против 16-13.
- 16. Антиген-связывающая конструкция по п.14, в которой тяжелая цепь антитела содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности 86С) 10 N0: 65, и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности 8ЕС) 10 N0: 66.
- 17. Антиген-связывающая конструкция по п.16, в которой последовательность легкой цепи по меньшей мере на 90% идентична последовательности 8ЕР ГО N0: 72, которая включает 8ЕС) ГО N0: 66.
- 18. Антиген-связывающая конструкция по любому из пп.1-11, представляющая собой антитело против ГО-4 с присоединенным к С-концу или \-концу тяжелой цепи либо к С-концу или \-концу легкой цепи отдельным вариабельным доменом иммуноглобулина против 16-13.
- 19. Антиген-связывающая конструкция по п.12, в которой тяжелая цепь антитела представляет собой 8ЕР ГО N0: 12, последовательность линкера представляет собой 8ЕС) ГО N0: 7 и отдельный вариабельный домен иммуноглобулина имеет последовательность 8ЕС) 10 N0: 3.
- 20. Антиген-связывающая конструкция по п.1, способная связывать ГО-13 и ГО-4, в которой последовательность тяжелой цепи антитела по меньшей мере на 90% идентична последовательности 8ЕС) 10 N0: 26 и последовательность легкой цепи по меньшей мере на 90% идентична последовательности 8ЕС) ГО N0: 13.
- 21. Полинуклеотид, кодирующий легкую цепь антитела антиген-связывающей конструкции по любому из пп.1-20.
- 22. Полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь антитела антиген-связывающей конструкции по любому из пп.1-20.
- 23. Рекомбинантная трансформированная или трансфицированная клетка-хозяин, содержащая по меньшей мере один полинуклеотид по любому из пп.21, 22.
- 24. Способ получения антиген-связывающей конструкции по любому из пп.1-20, включающий стадии культивирования клетки-хозяина по п.23 и выделения антиген-связывающей конструкции.
- 25. Фармацевтическая композиция, содержащая антиген-связывающую конструкцию по любому из пп.1-20 и фармацевтически приемлемый носитель.
- 26. Применение антиген-связывающей конструкции по любому из пп.1-20 в изготовлении лекарственного средства для лечения воспалительных заболеваний.
- 27. Способ лечения пациента, страдающего от воспалительного заболевания, такого как астма, ревматоидный артрит или остеоартрит, включающий введение терапевтического количества антигенсвязывающей конструкции по любому из пп. 1-20.
- 28. Применение антиген-связывающей конструкции по любому из пп.1-20 для лечения воспалительных заболеваний, таких как астма, ревматоидный артрит или остеоартрит.
Ключ &4Ϊ. бАЬ бАЬ (ΙΟν-домены тАЬ VI. или νΗ бАЬ Модельный VI ^СН1 & Модельный \/Н Фиг. 1
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US99144907P | 2007-11-30 | 2007-11-30 | |
| US2785808P | 2008-02-12 | 2008-02-12 | |
| US4657208P | 2008-04-21 | 2008-04-21 | |
| US8119108P | 2008-07-16 | 2008-07-16 | |
| US8443108P | 2008-07-29 | 2008-07-29 | |
| PCT/EP2008/066438 WO2009068649A2 (en) | 2007-11-30 | 2008-11-28 | Antigen-binding constructs |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201000704A1 EA201000704A1 (ru) | 2010-12-30 |
| EA023031B1 true EA023031B1 (ru) | 2016-04-29 |
Family
ID=40491579
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201000704A EA023031B1 (ru) | 2007-11-30 | 2008-11-28 | Антиген-связывающая конструкция и ее применение |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US20110008345A1 (ru) |
| EP (3) | EP2641919A3 (ru) |
| JP (1) | JP5791898B2 (ru) |
| KR (1) | KR101710472B1 (ru) |
| CN (2) | CN101932608A (ru) |
| AR (1) | AR069495A1 (ru) |
| AU (2) | AU2008328726B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI0819693A2 (ru) |
| CA (1) | CA2706419A1 (ru) |
| CL (1) | CL2008003561A1 (ru) |
| CO (1) | CO6280497A2 (ru) |
| DE (1) | DE112008003232T5 (ru) |
| EA (1) | EA023031B1 (ru) |
| ES (1) | ES2614284T3 (ru) |
| GB (1) | GB2468232B (ru) |
| IL (1) | IL205906A (ru) |
| MA (1) | MA31940B1 (ru) |
| MX (1) | MX2010005927A (ru) |
| PE (1) | PE20091234A1 (ru) |
| TW (1) | TW200944231A (ru) |
| UY (1) | UY31504A1 (ru) |
| WO (1) | WO2009068649A2 (ru) |
| ZA (1) | ZA201003850B (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2756623C2 (ru) * | 2017-02-17 | 2021-10-04 | Кафа Терапьютикс Лимитед | Антитело к il-13ra2 и его применение |
Families Citing this family (221)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7981414B2 (en) * | 2005-12-20 | 2011-07-19 | Cephalon Australia Pty Ltd | Anti-inflammatory dAb |
| EP1987064A4 (en) | 2006-02-01 | 2010-04-07 | Arana Therapeutics Ltd | DOMAIN ANTIBODY CONSTRUCT |
| US10118970B2 (en) | 2006-08-30 | 2018-11-06 | Genentech, Inc. | Multispecific antibodies |
| ES2667729T3 (es) | 2007-09-26 | 2018-05-14 | Ucb Biopharma Sprl | Fusiones de anticuerpos con doble especificidad |
| JP5791898B2 (ja) * | 2007-11-30 | 2015-10-07 | グラクソ グループ リミテッドＧｌａｘｏ Ｇｒｏｕｐ Ｌｉｍｉｔｅｄ | 抗原結合性構築物 |
| US8574577B2 (en) | 2008-01-03 | 2013-11-05 | The Scripps Research Institute | VEGF antibodies comprising modular recognition domains |
| EP2237797A4 (en) | 2008-01-03 | 2012-11-07 | Scripps Research Inst | ANTIBODY TARGETING BY MODULAR DETECTION DOMAIN |
| US8557242B2 (en) | 2008-01-03 | 2013-10-15 | The Scripps Research Institute | ERBB2 antibodies comprising modular recognition domains |
| US8557243B2 (en) | 2008-01-03 | 2013-10-15 | The Scripps Research Institute | EFGR antibodies comprising modular recognition domains |
| US8454960B2 (en) | 2008-01-03 | 2013-06-04 | The Scripps Research Institute | Multispecific antibody targeting and multivalency through modular recognition domains |
| MX353984B (es) * | 2008-09-03 | 2017-11-27 | Genentech Inc Star | Anticuerpos multi-especificos. |
| PL2334705T3 (pl) | 2008-09-26 | 2017-06-30 | Ucb Biopharma Sprl | Produkty biologiczne |
| US8268314B2 (en) | 2008-10-08 | 2012-09-18 | Hoffmann-La Roche Inc. | Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies |
| US20110236380A1 (en) * | 2008-11-26 | 2011-09-29 | De Wildt Rudolf M T | Ligands that bind il-13 |
| GB0904214D0 (en) | 2009-03-11 | 2009-04-22 | Ucb Pharma Sa | Biological products |
| CN102458471A (zh) * | 2009-05-28 | 2012-05-16 | 葛兰素集团有限公司 | 用于治疗或预防眼病的TNFα拮抗剂和VEGF拮抗剂的组合 |
| CA2763446A1 (en) * | 2009-05-28 | 2010-12-02 | Victoria Ballard | Stem cell targeting |
| CA2763491A1 (en) * | 2009-05-28 | 2010-12-02 | Paul Andrew Hamblin | Antigen-binding proteins |
| US8680245B2 (en) | 2009-05-28 | 2014-03-25 | Glaxo Group Limited | IL-13 binding protein |
| US20120064064A1 (en) * | 2009-05-28 | 2012-03-15 | Thil Dinuk Batuwangala | Antigen-binding proteins |
| EP2481754B1 (en) * | 2009-09-22 | 2014-06-18 | Shanghai Yijie Biotechnology Co., Ltd | Specific binding proteins and uses thereof |
| EP2308897A1 (en) * | 2009-10-09 | 2011-04-13 | Pierre Fabre Medicament | Chimeric antibodies specific for CD151 and use thereof in the treatment of cancer |
| EP2493506B1 (en) | 2009-10-30 | 2019-04-10 | Janssen Biotech, Inc. | Il-17a antagonists |
| TW201120210A (en) * | 2009-11-05 | 2011-06-16 | Hoffmann La Roche | Glycosylated repeat-motif-molecule conjugates |
| WO2011057347A1 (en) | 2009-11-12 | 2011-05-19 | Tgr Biosciences Pty Ltd | Analyte detection |
| EP2534175A2 (en) * | 2010-02-09 | 2012-12-19 | Glaxo Group Limited | Treatment of a metabolic disorder |
| BR112012019881A2 (pt) | 2010-02-18 | 2017-06-27 | Bristol Myers Squibb Co | proteínas de domínio estrutural baseadas na fibronectina que ligam-se à il-23 |
| AR080794A1 (es) * | 2010-03-26 | 2012-05-09 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos bivalentes biespecificos anti- vegf/ anti-ang-2 |
| JP2013528362A (ja) | 2010-04-21 | 2013-07-11 | グラクソ グループ リミテッド | 結合ドメイン |
| HUE060541T2 (hu) * | 2010-05-14 | 2023-03-28 | Univ Leland Stanford Junior | Humanizált és kiméra monoklonális CD47 elleni ellenanyagok |
| BR112012029280A2 (pt) | 2010-05-20 | 2016-11-29 | Glaxo Group Ltd | variante de domínio variável único de imunoglobulina antialbumina sérica, imunoglobulina anti-sa, ligando multiespecífico, proteína de fusão, composição, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira isolada, e, uso de uma variante, ligando multiespecífico ou proteína de fusão |
| TWI488966B (zh) * | 2010-07-09 | 2015-06-21 | 優普生物科技股份有限公司 | Ｄｎａ疫苗 |
| US20120100166A1 (en) | 2010-07-15 | 2012-04-26 | Zyngenia, Inc. | Ang-2 Binding Complexes and Uses Thereof |
| EP2600901B1 (en) | 2010-08-06 | 2019-03-27 | ModernaTX, Inc. | A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof |
| JP2013538566A (ja) | 2010-08-13 | 2013-10-17 | グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッド | 改良された抗血清アルブミン結合変異体 |
| AU2011290797A1 (en) | 2010-08-20 | 2013-04-11 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Improved anti-serum albumin binding variants |
| BR112013007862A2 (pt) | 2010-10-01 | 2019-09-24 | Moderna Therapeutics Inc | ácidos nucleicos manipulados e métodos de uso dos mesmos. |
| AU2011325833C1 (en) | 2010-11-05 | 2017-07-13 | Zymeworks Bc Inc. | Stable heterodimeric antibody design with mutations in the Fc domain |
| SG190362A1 (en) | 2010-11-24 | 2013-06-28 | Glaxo Group Ltd | Multispecific antigen binding proteins targeting hgf |
| SG10201912646UA (en) | 2010-12-06 | 2020-02-27 | Seattle Genetics Inc | Humanized antibodies to liv-1 and use of same to treat cancer |
| WO2012088290A2 (en) * | 2010-12-22 | 2012-06-28 | Abbott Laboratories | Tri-variable domain binding proteins and uses thereof |
| WO2012088006A1 (en) * | 2010-12-22 | 2012-06-28 | Bristol-Myers Squibb Company | Fibronectin based scaffold domain proteins that bind il-23 |
| DK2668210T3 (da) | 2011-01-26 | 2020-08-24 | Celldex Therapeutics Inc | Anti-kit antistoffer og anvendelser deraf |
| EP2670778A1 (en) | 2011-02-02 | 2013-12-11 | Glaxo Group Limited | Novel antigen binding proteins |
| CN102251013A (zh) * | 2011-02-22 | 2011-11-23 | 北京市肿瘤防治研究所 | 一个识别肿瘤起始细胞的抗体和抗原及其应用 |
| TWI719112B (zh) | 2011-03-16 | 2021-02-21 | 賽諾菲公司 | 雙重ｖ區類抗體蛋白質之用途 |
| US8710200B2 (en) | 2011-03-31 | 2014-04-29 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids encoding a modified erythropoietin and their expression |
| JP2014516924A (ja) * | 2011-04-07 | 2014-07-17 | グラクソスミスクライン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー | 粘度が低減された処方物 |
| CN106432506A (zh) | 2011-05-24 | 2017-02-22 | 泽恩格尼亚股份有限公司 | 多价和单价多特异性复合物及其用途 |
| KR20140030250A (ko) * | 2011-06-16 | 2014-03-11 | 노파르티스 아게 | 치료제로서 사용하기 위한 가용성 단백질 |
| WO2012178137A1 (en) * | 2011-06-24 | 2012-12-27 | Gillies Stephen D | Light chain immunoglobulin fusion proteins and methods of use thereof |
| EP2546268A1 (en) * | 2011-07-13 | 2013-01-16 | F-Star Biotechnologische Forschungs - und Entwicklungsges. M.B.H. | Internalising immunoglobulin |
| GB201112429D0 (en) * | 2011-07-19 | 2011-08-31 | Glaxo Group Ltd | Antigen-binding proteins with increased FcRn binding |
| WO2013014208A2 (en) * | 2011-07-27 | 2013-01-31 | Glaxo Group Limited | Antigen binding constructs |
| TW201321405A (zh) | 2011-08-17 | 2013-06-01 | Glaxo Group Ltd | 經修飾之蛋白質及肽 |
| US9464124B2 (en) | 2011-09-12 | 2016-10-11 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
| KR102014061B1 (ko) | 2011-10-03 | 2019-08-28 | 모더나 세라퓨틱스, 인코포레이티드 | 변형된 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 및 핵산, 및 이들의 용도 |
| RS62689B1 (sr) | 2011-11-04 | 2021-12-31 | Zymeworks Inc | Dizajn stabilnog heterodimernog antitela sa mutacijama u fc domenu |
| RS63244B1 (sr) | 2011-12-16 | 2022-06-30 | Modernatx Inc | Kompozicije modifikovane mrna |
| EA034778B1 (ru) | 2012-02-06 | 2020-03-19 | Инхибркс, Инк. | Антитела к cd47 и способы их применения |
| GB2502127A (en) * | 2012-05-17 | 2013-11-20 | Kymab Ltd | Multivalent antibodies and in vivo methods for their production |
| US9283287B2 (en) | 2012-04-02 | 2016-03-15 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins |
| US9254311B2 (en) | 2012-04-02 | 2016-02-09 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of proteins |
| US9192651B2 (en) | 2012-04-02 | 2015-11-24 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of secreted proteins |
| US9572897B2 (en) | 2012-04-02 | 2017-02-21 | Modernatx, Inc. | Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins |
| US20130280282A1 (en) * | 2012-04-24 | 2013-10-24 | Daiichi Sankyo Co., Ltd. | Dr5 ligand drug conjugates |
| RU2713121C2 (ru) | 2012-04-27 | 2020-02-03 | Сайтомкс Терапьютикс, Инк. | Активируемые антитела, которые связываются с рецептором эпидермального фактора роста, и способы их применения |
| CN102676569A (zh) * | 2012-05-08 | 2012-09-19 | 百泰生物药业有限公司 | 一种新型噬菌粒展示载体pCANTAB5M |
| EP2847230B1 (en) * | 2012-05-10 | 2020-08-12 | Zymeworks Inc. | Heteromultimer constructs of immunoglobulin heavy chains with mutations in the fc domain |
| US9499634B2 (en) | 2012-06-25 | 2016-11-22 | Zymeworks Inc. | Process and methods for efficient manufacturing of highly pure asymmetric antibodies in mammalian cells |
| EP2867360B1 (en) * | 2012-06-28 | 2019-05-08 | Molecular Partners AG | Designed ankyrin repeat proteins binding to platelet-derived growth factor |
| SI3495387T1 (sl) | 2012-07-13 | 2021-12-31 | Roche Glycart Ag | Bispecifična protitelesa proti VEGF/proti ANG-2 in njihova uporaba pri zdravljenju bolezni očesnih žil |
| NZ630363A (en) | 2012-07-25 | 2018-09-28 | Celldex Therapeutics Inc | Anti-kit antibodies and uses thereof |
| WO2014029752A1 (en) | 2012-08-22 | 2014-02-27 | Glaxo Group Limited | Anti lrp6 antibodies |
| CA2886422C (en) | 2012-10-03 | 2022-12-13 | Jason Baardsnes | Methods of quantitating heavy and light chain polypeptide pairs |
| US9597380B2 (en) | 2012-11-26 | 2017-03-21 | Modernatx, Inc. | Terminally modified RNA |
| US9914785B2 (en) | 2012-11-28 | 2018-03-13 | Zymeworks Inc. | Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof |
| CN105026430A (zh) | 2012-11-28 | 2015-11-04 | 酵活有限公司 | 工程化免疫球蛋白重链-轻链对及其用途 |
| WO2014111550A1 (en) | 2013-01-17 | 2014-07-24 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Modified anti-serum albumin binding proteins |
| JP2016504918A (ja) | 2013-01-31 | 2016-02-18 | グラクソ グループ リミテッドＧｌａｘｏ Ｇｒｏｕｐ Ｌｉｍｉｔｅｄ | タンパク質を製造する方法 |
| AU2013377886B2 (en) * | 2013-02-06 | 2018-11-29 | Inhibrx Biosciences, Inc. | Non-platelet depleting and non-red blood cell depleting CD47 antibodies and methods of use thereof |
| CA2896370A1 (en) * | 2013-02-26 | 2014-09-04 | Roche Glycart Ag | Bispecific t cell activating antigen binding molecules |
| CN105451767B (zh) | 2013-03-15 | 2019-10-18 | 泽恩格尼亚股份有限公司 | 多价和单价多特异性复合物及其用途 |
| US8980864B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-03-17 | Moderna Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of altering cholesterol levels |
| KR101671955B1 (ko) | 2013-05-22 | 2016-11-07 | 메타볼랩(주) | 항 ＴＮＦ-α/ＣＸＣＬ10 이중 타겟 항체 및 그의 용도 |
| KR102236367B1 (ko) | 2013-07-26 | 2021-04-05 | 삼성전자주식회사 | DARPin을 포함하는 이중 특이 키메라 단백질 |
| CN104341504B (zh) * | 2013-08-06 | 2017-10-24 | 百奥泰生物科技(广州)有限公司 | 双特异性抗体 |
| EP3052106A4 (en) | 2013-09-30 | 2017-07-19 | ModernaTX, Inc. | Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides |
| CA2926218A1 (en) | 2013-10-03 | 2015-04-09 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor |
| WO2015066279A2 (en) | 2013-10-30 | 2015-05-07 | Cytomx Therapeutics, Inc. | Activatable antibodies that bind epidermal growth factor receptor and methods of use thereof |
| MX2016006301A (es) | 2013-11-13 | 2016-12-16 | Zymeworks Inc | Construcciones de unión a antígeno monovalente que se dirigen a egfr y/o her2, y sus usos. |
| KR102357906B1 (ko) | 2013-11-27 | 2022-02-03 | 자임워크스 인코포레이티드 | Her2를 표적화하는 이중특이성 항원-결합 작제물 |
| US9737623B2 (en) | 2013-12-11 | 2017-08-22 | Cytomx Therapeutics, Inc. | Antibodies that bind activatable antibodies and methods of use thereof |
| CN106459981A (zh) * | 2013-12-23 | 2017-02-22 | 酵活有限公司 | 包含c端轻链多肽延伸的抗体和缀合物及其使用方法 |
| TW201609805A (zh) | 2013-12-23 | 2016-03-16 | 美國禮來大藥廠 | 結合ｅｇｆｒ及ｍｅｔ之多功能抗體 |
| CA2936611A1 (en) * | 2014-01-13 | 2015-07-16 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Multi-specific polypeptide useful for localized tumor immunomodulation |
| JOP20200094A1 (ar) | 2014-01-24 | 2017-06-16 | Dana Farber Cancer Inst Inc | جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها |
| JOP20200096A1 (ar) | 2014-01-31 | 2017-06-16 | Children’S Medical Center Corp | جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها |
| WO2015138920A1 (en) | 2014-03-14 | 2015-09-17 | Novartis Ag | Antibody molecules to lag-3 and uses thereof |
| WO2015142675A2 (en) | 2014-03-15 | 2015-09-24 | Novartis Ag | Treatment of cancer using chimeric antigen receptor |
| WO2015181805A1 (en) | 2014-05-28 | 2015-12-03 | Zymeworks Inc. | Modified antigen binding polypeptide constructs and uses thereof |
| US9884921B2 (en) | 2014-07-01 | 2018-02-06 | Pfizer Inc. | Bispecific heterodimeric diabodies and uses thereof |
| KR102272213B1 (ko) * | 2014-07-08 | 2021-07-01 | 삼성전자주식회사 | 표적화 부위, 절단 부위, 및 세포막 투과 부위를 포함하는 융합 단백질 및 그의 용도 |
| JP2017528433A (ja) | 2014-07-21 | 2017-09-28 | ノバルティス アーゲー | 低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤とＣＡＲの組み合わせ |
| KR102612313B1 (ko) | 2014-07-21 | 2023-12-12 | 노파르티스 아게 | 인간화 항-bcma 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료 |
| US11542488B2 (en) | 2014-07-21 | 2023-01-03 | Novartis Ag | Sortase synthesized chimeric antigen receptors |
| EP3722316A1 (en) | 2014-07-21 | 2020-10-14 | Novartis AG | Treatment of cancer using a cd33 chimeric antigen receptor |
| US20170209492A1 (en) | 2014-07-31 | 2017-07-27 | Novartis Ag | Subset-optimized chimeric antigen receptor-containing t-cells |
| AU2015301460B2 (en) | 2014-08-14 | 2021-04-08 | Novartis Ag | Treatment of cancer using GFR alpha-4 chimeric antigen receptor |
| JP7084138B2 (ja) | 2014-08-19 | 2022-06-14 | ノバルティス アーゲー | 癌処置に使用するための抗ｃｄ１２３キメラ抗原受容体（ｃａｒ） |
| PL3194443T3 (pl) | 2014-09-17 | 2022-01-31 | Novartis Ag | Nakierowywanie komórek cytotoksycznych za pośrednictwem receptorów chimerycznych do immunoterapii adoptywnej |
| GB201416832D0 (en) | 2014-09-24 | 2014-11-05 | Glaxosmithkline Plc | Methods of treatment |
| RU2609627C2 (ru) * | 2014-09-26 | 2017-02-02 | Закрытое Акционерное Общество "Биокад" | Высокоаффинные и агрегационно стабильные антитела на основе вариабельных доменов vl и производного vhh |
| CR20170143A (es) | 2014-10-14 | 2017-06-19 | Dana Farber Cancer Inst Inc | Moléculas de anticuerpo que se unen a pd-l1 y usos de las mismas |
| WO2016090034A2 (en) | 2014-12-03 | 2016-06-09 | Novartis Ag | Methods for b cell preconditioning in car therapy |
| WO2016135041A1 (en) * | 2015-02-26 | 2016-09-01 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Fusion proteins and antibodies comprising thereof for promoting apoptosis |
| JP6961490B2 (ja) | 2015-04-08 | 2021-11-05 | ノバルティス アーゲー | Ｃｄ２０療法、ｃｄ２２療法、およびｃｄ１９キメラ抗原受容体（ｃａｒ）発現細胞との併用療法 |
| US12128069B2 (en) | 2015-04-23 | 2024-10-29 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker |
| EP3292148B1 (en) | 2015-05-04 | 2024-01-24 | Pieris Pharmaceuticals GmbH | Anti-cancer fusion polypeptide |
| SG10201913807QA (en) * | 2015-07-23 | 2020-03-30 | Inhibrx Inc | Multivalent and multispecific gitr-binding fusion proteins |
| ES2878188T3 (es) | 2015-07-29 | 2021-11-18 | Novartis Ag | Terapias de combinación que comprenden moléculas de anticuerpos contra LAG-3 |
| US20180207273A1 (en) | 2015-07-29 | 2018-07-26 | Novartis Ag | Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3 |
| US20180222982A1 (en) | 2015-07-29 | 2018-08-09 | Novartis Ag | Combination therapies comprising antibody molecules to pd-1 |
| EP4056590A1 (en) | 2015-08-24 | 2022-09-14 | GlaxoSmithKline Intellectual Property (No.2) Limited | Biopharmaceutical compositions |
| ES2878008T3 (es) * | 2015-09-17 | 2021-11-18 | Scripps Research Inst | Inmunoconjugados de dominio variable dual y usos de los mismos |
| US20180275121A1 (en) * | 2015-10-02 | 2018-09-27 | Tgr Biosciences Pty Ltd. | Analyte Detection with Multiple Substrates |
| JP6932693B2 (ja) | 2015-10-08 | 2021-09-08 | ザイムワークス，インコーポレイテッド | カッパ及びラムダ軽鎖を含む抗原結合ポリペプチド構築物及びその使用 |
| AU2016369623A1 (en) | 2015-12-17 | 2018-06-28 | Novartis Ag | Combination of c-Met inhibitor with antibody molecule to PD-1 and uses thereof |
| BR112018012138A2 (pt) | 2015-12-17 | 2018-12-04 | Novartis Ag | moléculas de anticorpo para pd-1 e usos das mesmas |
| WO2017125897A1 (en) | 2016-01-21 | 2017-07-27 | Novartis Ag | Multispecific molecules targeting cll-1 |
| WO2017143406A1 (en) * | 2016-02-26 | 2017-08-31 | Imunexus Pty Ltd | Multi-specific molecules |
| JP2019513347A (ja) | 2016-03-04 | 2019-05-30 | ノバルティス アーゲー | 複数のキメラ抗原受容体（ｃａｒ）分子を発現する細胞およびその使用 |
| MA45324A (fr) | 2016-03-15 | 2019-01-23 | Seattle Genetics Inc | Polythérapie utilisant un adc-liv1 et un agent chimiothérapeutique |
| EP3432924A1 (en) | 2016-03-23 | 2019-01-30 | Novartis AG | Cell secreted minibodies and uses thereof |
| SG11201809041TA (en) | 2016-04-15 | 2018-11-29 | Novartis Ag | Compositions and methods for selective protein expression |
| CN114617962A (zh) | 2016-04-27 | 2022-06-14 | 艾伯维公司 | 使用抗-il-13抗体治疗il-13活性在其中有害的疾病的方法 |
| US20210177896A1 (en) | 2016-06-02 | 2021-06-17 | Novartis Ag | Therapeutic regimens for chimeric antigen receptor (car)- expressing cells |
| CN106084067A (zh) * | 2016-06-15 | 2016-11-09 | 无锡市人民医院 | 具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白及其制备方法 |
| JP7219376B2 (ja) | 2016-07-15 | 2023-02-08 | ノバルティス アーゲー | キメラ抗原受容体をキナーゼ阻害薬と併用して使用したサイトカイン放出症候群の治療及び予防 |
| WO2018014260A1 (en) * | 2016-07-20 | 2018-01-25 | Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. | Multispecific antigen binding proteins and methods of use thereof |
| IL264486B1 (en) | 2016-07-28 | 2024-12-01 | Novartis Ag | Combination therapies of chimeric antigen receptors and PD-1 inhibitors |
| CN110267677A (zh) | 2016-08-01 | 2019-09-20 | 诺华股份有限公司 | 使用与原m2巨噬细胞分子抑制剂组合的嵌合抗原受体治疗癌症 |
| EP3523331A1 (en) | 2016-10-07 | 2019-08-14 | Novartis AG | Chimeric antigen receptors for the treatment of cancer |
| WO2018068201A1 (en) | 2016-10-11 | 2018-04-19 | Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. | Single-domain antibodies and variants thereof against ctla-4 |
| UY37463A (es) * | 2016-11-02 | 2018-05-31 | Glaxosmithkline Ip No 2 Ltd | Proteínas de unión |
| US11535662B2 (en) | 2017-01-26 | 2022-12-27 | Novartis Ag | CD28 compositions and methods for chimeric antigen receptor therapy |
| WO2018160731A1 (en) | 2017-02-28 | 2018-09-07 | Novartis Ag | Shp inhibitor compositions and uses for chimeric antigen receptor therapy |
| CA3058477A1 (en) | 2017-04-11 | 2018-10-18 | Inhibrx, Inc. | Multispecific polypeptide constructs having constrained cd3 binding and methods of using the same |
| US20200055948A1 (en) | 2017-04-28 | 2020-02-20 | Novartis Ag | Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor |
| EP3615068A1 (en) | 2017-04-28 | 2020-03-04 | Novartis AG | Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor |
| KR20240042244A (ko) | 2017-05-19 | 2024-04-01 | 신닥스 파마슈티컬스, 인크. | 조합 요법 |
| BR112019025736A2 (pt) | 2017-06-06 | 2020-06-30 | Glaxosmithkline Llc | uso de um anticorpo e composições para tratar uma doença e para diminuir uma contagem absoluta de eosinófilo no sangue |
| EP3638215A4 (en) | 2017-06-15 | 2021-03-24 | Modernatx, Inc. | RNA FORMULATIONS |
| MX2019015885A (es) | 2017-06-22 | 2020-09-10 | Novartis Ag | Moleculas de anticuerpo que se unen a cd73 y usos de las mismas. |
| AU2018292618A1 (en) | 2017-06-27 | 2019-12-19 | Novartis Ag | Dosage regimens for anti-TIM-3 antibodies and uses thereof |
| CA3069438A1 (en) | 2017-07-11 | 2019-01-17 | Compass Therapeutics Llc | Agonist antibodies that bind human cd137 and uses thereof |
| GB201711208D0 (en) | 2017-07-12 | 2017-08-23 | Iontas Ltd | Ion channel inhibitors |
| WO2019018730A1 (en) | 2017-07-20 | 2019-01-24 | Novartis Ag | DOSAGE REGIMES FOR ANTI-LAG3 ANTIBODIES AND USES THEREOF |
| US11053309B2 (en) | 2017-08-04 | 2021-07-06 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating active eosinophilic esophagitis |
| WO2019046809A1 (en) | 2017-08-31 | 2019-03-07 | Modernatx, Inc. | METHODS OF MANUFACTURING LIPID NANOPARTICLES |
| WO2019062831A1 (zh) | 2017-09-29 | 2019-04-04 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | Il-5抗体、其抗原结合片段及医药用途 |
| WO2019089753A2 (en) | 2017-10-31 | 2019-05-09 | Compass Therapeutics Llc | Cd137 antibodies and pd-1 antagonists and uses thereof |
| US20210179709A1 (en) | 2017-10-31 | 2021-06-17 | Novartis Ag | Anti-car compositions and methods |
| AU2018368731A1 (en) | 2017-11-16 | 2020-05-14 | Novartis Ag | Combination therapies |
| US11851497B2 (en) | 2017-11-20 | 2023-12-26 | Compass Therapeutics Llc | CD137 antibodies and tumor antigen-targeting antibodies and uses thereof |
| CN111699198B (zh) | 2017-12-28 | 2023-09-05 | 南京传奇生物科技有限公司 | 针对tigit的单域抗体和其变体 |
| US20200369770A1 (en) * | 2018-01-08 | 2020-11-26 | Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. | Multispecific antigen binding proteins and methods of use thereof |
| US11713353B2 (en) | 2018-01-15 | 2023-08-01 | Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. | Single-domain antibodies and variants thereof against PD-1 |
| US20210038659A1 (en) | 2018-01-31 | 2021-02-11 | Novartis Ag | Combination therapy using a chimeric antigen receptor |
| EP3765517A1 (en) | 2018-03-14 | 2021-01-20 | Elstar Therapeutics, Inc. | Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof |
| US20210147547A1 (en) | 2018-04-13 | 2021-05-20 | Novartis Ag | Dosage Regimens For Anti-Pd-L1 Antibodies And Uses Thereof |
| US20210047405A1 (en) | 2018-04-27 | 2021-02-18 | Novartis Ag | Car t cell therapies with enhanced efficacy |
| TW202003580A (zh) | 2018-05-21 | 2020-01-16 | 美商坎伯斯治療有限責任公司 | 用於增強nk細胞對標靶細胞之殺死之組合物及方法 |
| WO2019226658A1 (en) | 2018-05-21 | 2019-11-28 | Compass Therapeutics Llc | Multispecific antigen-binding compositions and methods of use |
| EP3801769A1 (en) | 2018-05-25 | 2021-04-14 | Novartis AG | Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies |
| US12168691B2 (en) | 2018-05-31 | 2024-12-17 | Board Of Regents, The University Of Texas System | VHS format bi-specific antibodies specific for HER2 and VEGF and use thereof |
| WO2019232244A2 (en) | 2018-05-31 | 2019-12-05 | Novartis Ag | Antibody molecules to cd73 and uses thereof |
| SG11202011830SA (en) | 2018-06-13 | 2020-12-30 | Novartis Ag | Bcma chimeric antigen receptors and uses thereof |
| MA52969A (fr) | 2018-06-19 | 2021-04-28 | Atarga Llc | Molécules d'anticorps se liant au composant du complément 5 et leurs utilisations |
| AR116109A1 (es) | 2018-07-10 | 2021-03-31 | Novartis Ag | Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos |
| WO2020021465A1 (en) | 2018-07-25 | 2020-01-30 | Advanced Accelerator Applications (Italy) S.R.L. | Method of treatment of neuroendocrine tumors |
| GB2576914A (en) * | 2018-09-06 | 2020-03-11 | Kymab Ltd | Antigen-binding molecules comprising unpaired variable domains produced in mammals |
| CA3113651A1 (en) | 2018-09-20 | 2020-03-26 | Modernatx, Inc. | Preparation of lipid nanoparticles and methods of administration thereof |
| BR112021008795A2 (pt) | 2018-11-13 | 2021-08-31 | Compass Therapeutics Llc | Construtos de ligação multiespecíficos contra moléculas de ponto de verificação e seus usos |
| KR20210106483A (ko) | 2018-12-20 | 2021-08-30 | 노파르티스 아게 | Mdm2 억제제를 위한 확장된 저용량 요법 |
| JP2022514315A (ja) | 2018-12-20 | 2022-02-10 | ノバルティス アーゲー | ３－（１－オキソイソインドリン－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオン誘導体を含む投与計画及び薬剤組み合わせ |
| EP3917564A4 (en) * | 2019-02-01 | 2022-12-21 | NovaRock Biotherapeutics, Ltd. | ANTI-CLAUDINE 18 ANTIBODIES AND THEIR METHODS OF USE |
| AU2020222346B2 (en) | 2019-02-15 | 2021-12-09 | Novartis Ag | Substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof |
| US10871640B2 (en) | 2019-02-15 | 2020-12-22 | Perkinelmer Cellular Technologies Germany Gmbh | Methods and systems for automated imaging of three-dimensional objects |
| WO2020165833A1 (en) | 2019-02-15 | 2020-08-20 | Novartis Ag | 3-(1-oxo-5-(piperidin-4-yl)isoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof |
| US20220088075A1 (en) | 2019-02-22 | 2022-03-24 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Combination therapies of egfrviii chimeric antigen receptors and pd-1 inhibitors |
| CA3129963A1 (en) | 2019-03-06 | 2020-09-10 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Il-4/il-13 pathway inhibitors for enhanced efficacy in treating cancer |
| JP2022526738A (ja) | 2019-03-21 | 2022-05-26 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | アレルギーを治療するためのｉｌ－４／ｉｌ－１３経路阻害剤と形質細胞除去の組み合わせ |
| TW202102261A (zh) | 2019-03-29 | 2021-01-16 | 美商艾特加有限責任公司 | Fgf23之抗體分子及其用途 |
| KR20220052898A (ko) * | 2019-06-06 | 2022-04-28 | 재눅스 테라퓨틱스 인크. | 종양 활성화 t 세포 인게이저와 관련된 조성물 및 방법 |
| WO2021079188A1 (en) | 2019-10-21 | 2021-04-29 | Novartis Ag | Combination therapies with venetoclax and tim-3 inhibitors |
| CN114786680A (zh) | 2019-10-21 | 2022-07-22 | 诺华股份有限公司 | Tim-3抑制剂及其用途 |
| BR112022010206A2 (pt) | 2019-11-26 | 2022-11-29 | Novartis Ag | Receptores de antígeno quiméricos e usos dos mesmos |
| KR20220116257A (ko) | 2019-12-20 | 2022-08-22 | 노파르티스 아게 | 골수섬유증 및 골수이형성 증후군을 치료하기 위한, 데시타빈 또는 항 pd-1 항체 스파르탈리주맙을 포함하거나 또는 포함하지 않는, 항 tim-3 항체 mbg453 및 항 tgf-베타 항체 nis793의 조합물 |
| EP4090762A1 (en) | 2020-01-17 | 2022-11-23 | Becton, Dickinson and Company | Methods and compositions for single cell secretomics |
| CN114980902A (zh) | 2020-01-17 | 2022-08-30 | 诺华股份有限公司 | 用于治疗骨髓增生异常综合征或慢性粒单核细胞白血病的包含tim-3抑制剂和低甲基化药物的组合 |
| BR112022016633A2 (pt) | 2020-02-27 | 2022-12-13 | Novartis Ag | Métodos para produzir células que expressam receptor de antígeno quimérico |
| EP4168007A1 (en) | 2020-06-23 | 2023-04-26 | Novartis AG | Dosing regimen comprising 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives |
| WO2022002006A1 (zh) * | 2020-06-30 | 2022-01-06 | 和铂医药(上海)有限责任公司 | Fab-HCAb结构的结合蛋白 |
| UY39324A (es) | 2020-07-16 | 2022-02-25 | Novartis Ag | Anticuerpos anti-betacelulina, sus fragmentos, moléculas de unión multiespecíficas, casetes de expresión, composiciones y métodos de tratamiento. |
| WO2022026592A2 (en) | 2020-07-28 | 2022-02-03 | Celltas Bio, Inc. | Antibody molecules to coronavirus and uses thereof |
| WO2022029573A1 (en) | 2020-08-03 | 2022-02-10 | Novartis Ag | Heteroaryl substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof |
| EP4204020A1 (en) | 2020-08-31 | 2023-07-05 | Advanced Accelerator Applications International S.A. | Method of treating psma-expressing cancers |
| WO2022043557A1 (en) | 2020-08-31 | 2022-03-03 | Advanced Accelerator Applications International Sa | Method of treating psma-expressing cancers |
| WO2022097065A2 (en) | 2020-11-06 | 2022-05-12 | Novartis Ag | ANTIBODY Fc VARIANTS |
| AU2021378316A1 (en) | 2020-11-13 | 2023-06-01 | Novartis Ag | Combination therapies with chimeric antigen receptor (car)-expressing cells |
| WO2022162569A1 (en) | 2021-01-29 | 2022-08-04 | Novartis Ag | Dosage regimes for anti-cd73 and anti-entpd2 antibodies and uses thereof |
| TW202304979A (zh) | 2021-04-07 | 2023-02-01 | 瑞士商諾華公司 | 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途 |
| AR125874A1 (es) | 2021-05-18 | 2023-08-23 | Novartis Ag | Terapias de combinación |
| EP4405396A2 (en) | 2021-09-20 | 2024-07-31 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer |
| WO2023092004A1 (en) | 2021-11-17 | 2023-05-25 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the treatment of tau-related disorders |
| CA3241374A1 (en) | 2021-12-30 | 2023-07-06 | Gregory GEBA | Methods for attenuating atopic march by administering an il-4/il-13 antagonist |
| CN118647633A (zh) | 2022-02-07 | 2024-09-13 | 威斯特拉公司 | 抗独特型抗体分子及其用途 |
| WO2023220695A2 (en) | 2022-05-13 | 2023-11-16 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer |
| TW202435912A (zh) | 2022-08-03 | 2024-09-16 | 美商航海家醫療公司 | 用於穿過血腦屏障之組合物及方法 |
| WO2024168061A2 (en) | 2023-02-07 | 2024-08-15 | Ayan Therapeutics Inc. | Antibody molecules binding to sars-cov-2 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6492123B1 (en) * | 1992-12-04 | 2002-12-10 | Medical Research Council | Multivalent and multispecific binding proteins and their use |
| WO2007066106A1 (en) * | 2005-12-06 | 2007-06-14 | Domantis Limited | Ligands that have binding specificity for egfr and/or vegf and methods of use therefor |
| EP2050764A1 (en) * | 2007-10-15 | 2009-04-22 | sanofi-aventis | Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof |
Family Cites Families (49)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3883899T3 (de) | 1987-03-18 | 1999-04-22 | Sb2, Inc., Danville, Calif. | Geänderte antikörper. |
| US4873316A (en) | 1987-06-23 | 1989-10-10 | Biogen, Inc. | Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals |
| GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
| WO1993008829A1 (en) | 1991-11-04 | 1993-05-13 | The Regents Of The University Of California | Compositions that mediate killing of hiv-infected cells |
| WO1993011236A1 (en) | 1991-12-02 | 1993-06-10 | Medical Research Council | Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage |
| US5733743A (en) | 1992-03-24 | 1998-03-31 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
| DE69308573T2 (de) | 1992-08-17 | 1997-08-07 | Genentech Inc | Bispezifische immunoadhesine |
| GB9221657D0 (en) * | 1992-10-15 | 1992-11-25 | Scotgen Ltd | Recombinant bispecific antibodies |
| US5605793A (en) | 1994-02-17 | 1997-02-25 | Affymax Technologies N.V. | Methods for in vitro recombination |
| GB9424449D0 (en) | 1994-12-02 | 1995-01-18 | Wellcome Found | Antibodies |
| US5702892A (en) | 1995-05-09 | 1997-12-30 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Phage-display of immunoglobulin heavy chain libraries |
| DK0859841T3 (da) | 1995-08-18 | 2002-09-09 | Morphosys Ag | Protein/(poly)peptidbiblioteker |
| CA2295324C (en) | 1997-07-07 | 2012-12-18 | Andrew Griffiths | In vitro sorting method |
| DE19742706B4 (de) | 1997-09-26 | 2013-07-25 | Pieris Proteolab Ag | Lipocalinmuteine |
| GB9722131D0 (en) | 1997-10-20 | 1997-12-17 | Medical Res Council | Method |
| GB9809839D0 (en) | 1998-05-09 | 1998-07-08 | Glaxo Group Ltd | Antibody |
| DE69937735T2 (de) | 1998-05-13 | 2008-11-27 | Domantis Ltd., Brentford | Phagen-display-selektionssystem für korrekt gefaltete proteine |
| IL127127A0 (en) | 1998-11-18 | 1999-09-22 | Peptor Ltd | Small functional units of antibody heavy chain variable regions |
| US7115396B2 (en) | 1998-12-10 | 2006-10-03 | Compound Therapeutics, Inc. | Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins |
| US6818418B1 (en) | 1998-12-10 | 2004-11-16 | Compound Therapeutics, Inc. | Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins |
| GB9900298D0 (en) | 1999-01-07 | 1999-02-24 | Medical Res Council | Optical sorting method |
| JP2003523742A (ja) | 2000-02-03 | 2003-08-12 | ドマンティス リミテッド | コンビナトリアルタンパク質ドメイン |
| US6846486B1 (en) * | 2000-02-24 | 2005-01-25 | Advanced Biotherapy Concepts, Inc. | Method of treating allergy by administering an anti-histamine antibody |
| AU2001247616B2 (en) * | 2000-04-11 | 2007-06-14 | Genentech, Inc. | Multivalent antibodies and uses therefor |
| US7417130B2 (en) | 2000-09-08 | 2008-08-26 | University Of Zurich | Collection of repeat proteins comprising repeat modules |
| WO2002092771A2 (en) | 2001-05-11 | 2002-11-21 | Ludwig Institute For Cancer Research | Specific binding proteins and uses thereof |
| ATE459651T1 (de) | 2001-08-10 | 2010-03-15 | Univ Aberdeen | Antigenbindende domäne aus fisch |
| US20050142539A1 (en) * | 2002-01-14 | 2005-06-30 | William Herman | Targeted ligands |
| US7317091B2 (en) * | 2002-03-01 | 2008-01-08 | Xencor, Inc. | Optimized Fc variants |
| WO2005003156A1 (en) | 2003-07-04 | 2005-01-13 | Affibody Ab | Polypeptides having binding affinity for her2 |
| WO2005019255A1 (en) | 2003-08-25 | 2005-03-03 | Pieris Proteolab Ag | Muteins of tear lipocalin |
| JP5006651B2 (ja) * | 2003-12-05 | 2012-08-22 | ブリストル−マイヤーズ スクウィブ カンパニー | ２型血管内皮増殖因子受容体の阻害剤 |
| US7767792B2 (en) | 2004-02-20 | 2010-08-03 | Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. | Antibodies to EGF receptor epitope peptides |
| AR049390A1 (es) * | 2004-06-09 | 2006-07-26 | Wyeth Corp | Anticuerpos contra la interleuquina-13 humana y usos de los mismos |
| PT1773885E (pt) | 2004-08-05 | 2010-07-21 | Genentech Inc | Antagonistas anti-cmet humanizados |
| US7563612B2 (en) * | 2004-09-27 | 2009-07-21 | Cornell Research Foundation, Inc. | Recombinant bifunctional protein of human lutropin receptor and human chorionic gonadotropin B-subunit and uses thereof |
| CA2618482C (en) | 2005-08-19 | 2014-10-07 | Abbott Laboratories | Dual variable domain immunoglobin and uses thereof |
| US7612181B2 (en) * | 2005-08-19 | 2009-11-03 | Abbott Laboratories | Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof |
| JP2009516513A (ja) * | 2005-11-21 | 2009-04-23 | ラボラトワール セローノ ソシエテ アノニム | ハイブリッド抗原結合分子の組成物及び製造方法並びにその使用 |
| WO2007059782A1 (en) | 2005-11-28 | 2007-05-31 | Genmab A/S | Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof |
| EP1973978B1 (en) * | 2006-01-18 | 2009-10-14 | Basf Se | Multipurpose additive for low voc solvent based coatings |
| US20100047171A1 (en) * | 2006-01-24 | 2010-02-25 | Roland Beckmann | Fusion Proteins That Contain Natural Junctions |
| CN101432015A (zh) | 2006-02-15 | 2009-05-13 | 英克隆系统公司 | 功能性抗体 |
| WO2007104529A2 (en) * | 2006-03-13 | 2007-09-20 | Ablynx N.V. | Amino acid sequences directed against il-6 and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with il-6-mediated signalling |
| EP1958957A1 (en) | 2007-02-16 | 2008-08-20 | NascaCell Technologies AG | Polypeptide comprising a knottin protein moiety |
| JP5398703B2 (ja) * | 2007-05-14 | 2014-01-29 | バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド | 一本鎖ＦＣ（ＳｃＦｃ）領域、それを含む結合ポリペプチド、およびそれに関連する方法 |
| JP5791898B2 (ja) * | 2007-11-30 | 2015-10-07 | グラクソ グループ リミテッドＧｌａｘｏ Ｇｒｏｕｐ Ｌｉｍｉｔｅｄ | 抗原結合性構築物 |
| MX2010008874A (es) * | 2008-02-14 | 2010-09-22 | Bristol Myers Squibb Co | Terapeuticos dirigidos a base de proteinas manipuladas que se unen al receptor de factor de crecimiento epidermico. |
| CN102711828B (zh) * | 2009-10-20 | 2015-06-17 | Abbvie公司 | 使用蛋白a亲和色谱法分离和纯化抗-il-13抗体 |
-
2008
- 2008-11-28 JP JP2010535396A patent/JP5791898B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2008-11-28 ES ES08854122.2T patent/ES2614284T3/es active Active
- 2008-11-28 EP EP13154223.5A patent/EP2641919A3/en not_active Withdrawn
- 2008-11-28 EA EA201000704A patent/EA023031B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2008-11-28 MX MX2010005927A patent/MX2010005927A/es active IP Right Grant
- 2008-11-28 CL CL2008003561A patent/CL2008003561A1/es unknown
- 2008-11-28 EP EP08854122.2A patent/EP2222709B1/en active Active
- 2008-11-28 AR ARP080105206A patent/AR069495A1/es not_active Application Discontinuation
- 2008-11-28 US US12/744,799 patent/US20110008345A1/en not_active Abandoned
- 2008-11-28 AU AU2008328726A patent/AU2008328726B2/en not_active Ceased
- 2008-11-28 CN CN2008801263100A patent/CN101932608A/zh active Pending
- 2008-11-28 US US12/324,905 patent/US20090148905A1/en not_active Abandoned
- 2008-11-28 PE PE2008001998A patent/PE20091234A1/es not_active Application Discontinuation
- 2008-11-28 BR BRPI0819693-1A patent/BRPI0819693A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2008-11-28 GB GB1008468.9A patent/GB2468232B/en not_active Expired - Fee Related
- 2008-11-28 EP EP13154451.2A patent/EP2615115A3/en not_active Withdrawn
- 2008-11-28 CN CN201410818231.3A patent/CN104650235A/zh active Pending
- 2008-11-28 WO PCT/EP2008/066438 patent/WO2009068649A2/en active Application Filing
- 2008-11-28 KR KR1020107014403A patent/KR101710472B1/ko active IP Right Grant
- 2008-11-28 TW TW097146549A patent/TW200944231A/zh unknown
- 2008-11-28 CA CA2706419A patent/CA2706419A1/en not_active Abandoned
- 2008-11-28 UY UY31504A patent/UY31504A1/es unknown
- 2008-11-28 DE DE112008003232T patent/DE112008003232T5/de not_active Withdrawn
-
2010
- 2010-05-23 IL IL205906A patent/IL205906A/en not_active IP Right Cessation
- 2010-05-28 CO CO10064737A patent/CO6280497A2/es not_active Application Discontinuation
- 2010-05-28 ZA ZA2010/03850A patent/ZA201003850B/en unknown
- 2010-06-25 MA MA32954A patent/MA31940B1/fr unknown
-
2014
- 2014-09-11 AU AU2014224077A patent/AU2014224077A1/en not_active Abandoned
-
2015
- 2015-06-15 US US14/739,099 patent/US20160207993A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6492123B1 (en) * | 1992-12-04 | 2002-12-10 | Medical Research Council | Multivalent and multispecific binding proteins and their use |
| WO2007066106A1 (en) * | 2005-12-06 | 2007-06-14 | Domantis Limited | Ligands that have binding specificity for egfr and/or vegf and methods of use therefor |
| EP2050764A1 (en) * | 2007-10-15 | 2009-04-22 | sanofi-aventis | Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| SCALLON BERNARD ET AL.: "Addition of an extra immunoglobulin domain to two anti-rodent TNF monoclonal antibodies substantially increased their potency", MOLECULAR IMMUNOLOGY, PERGAMON, GB, vol. 41, no. 1, 1 May 2004 (2004-05-01), pages 73-80, XP002424159, ISSN: 0161-5890, fig. 2 * |
| SHEN JUQUN ET AL.: "Single variable domain antibody as a versatile building block for the construction of IgG-I ike bispecific antibodies", JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS B.V. AMSTERDAM, NL, vol. 318, no. 1-2, 1 January 2007 (2007-01-01), pages 65-74, XP002500843, ISSN: 0022-1759 [retrieved on 2006-10-26], paragraphs [03.1]-[03.5]; fig. Ia * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2756623C2 (ru) * | 2017-02-17 | 2021-10-04 | Кафа Терапьютикс Лимитед | Антитело к il-13ra2 и его применение |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA023031B1 (ru) | Антиген-связывающая конструкция и ее применение | |
| Cuende et al. | Monoclonal antibodies against GARP/TGF-β1 complexes inhibit the immunosuppressive activity of human regulatory T cells in vivo | |
| Khoshnoodi et al. | Nephrin promotes cell-cell adhesion through homophilic interactions | |
| JP2023071948A (ja) | ヒトプログラム死リガンド１（ｐｄ－ｌ１）に結合する抗体 | |
| US7968681B2 (en) | c-MET kinase binding proteins | |
| CN107074951B (zh) | 拮抗性抗-ox40l抗体及其使用方法 | |
| TW201837056A (zh) | Ｂ７－ｈ３抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途 | |
| AU2016322934A1 (en) | Compositions and methods for treating cancer via antagonism of the CD155/TIGIT pathway and TGF-beta | |
| TWI779253B (zh) | 抗IL-23p19抗體及其用途 | |
| WO2019084067A1 (en) | ANTI-CD117 ANTIBODIES AND METHODS OF USE | |
| US20170218046A1 (en) | Methods and compositions for modulating the activity of the interleukin-35 receptor complex | |
| JP2021119785A (ja) | 抗ｃｄ９５ｌ抗体 | |
| Ipsen | Fresh from the biologic pipeline—2009 | |
| US20130115217A1 (en) | Antibodies against hmgb1 and fragments thereof | |
| Liu et al. | A broad blockade of signaling from the IL-20 family of cytokines potently attenuates collagen-induced arthritis | |
| US20230203157A1 (en) | Bispecific molecules for selectively modulating t cells | |
| Schardt et al. | Discovery and characterization of high-affinity, potent SARS-CoV-2 neutralizing antibodies via single B cell screening | |
| JP2021530511A (ja) | 抗ｐｄ−１抗体、投薬量、およびその使用 | |
| JP7525123B2 (ja) | Ｄｎａポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する抗体 | |
| JP2016540506A (ja) | 新規ｂ細胞サイトカインの同定 | |
| Wang et al. | In vitro affinity maturation of antibody against membrane-bound GPCR molecules | |
| CN113912728A (zh) | 降低抗人白介素-33单克隆抗体生产中宿主细胞蛋白含量的亲和纯化方法 | |
| Zhang et al. | Neutrophil lactoferrin release induced by IgA immune complexes differed from that induced by cross-linking of Fc α receptors (Fc α R) with a monoclonal antibody, MIP8a | |
| JP5106111B2 (ja) | Ｔ細胞接着分子およびそれに対する抗体 | |
| Suzuki et al. | Reduction of caveolin-1 expression in tumorigenic human cell hybrids |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): RU |