DE69231123T2

DE69231123T2 - Konjugaten von Zell-bindender Mittel und Derivaten von CC-1065

Info

Publication number: DE69231123T2
Application number: DE69231123T
Authority: DE
Inventors: Walter A Blattler; Ravi V J Chari; Viktor S Goldmakher
Original assignee: Immunogen Inc
Current assignee: Immunogen Inc
Priority date: 1992-03-25
Filing date: 1992-08-20
Publication date: 2001-02-15
Anticipated expiration: 2012-08-21
Also published as: JP3700091B2; DE69231123D1; CA2076465C; US5475092A; ES2149768T3; EP0563475A1; EP0563475B1; DK0563475T3; HK1014674A1; US5846545A; US5585499A; JPH0656697A; CA2076465A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft neue cytotoxische Mittel und ihre therapeutische Verwendung. Die Erfindung betrifft insbesondere neue cytotoxische Mittel, die Analoge von CC-1065 und Derivate von CC-1065 umfassen, und die therapeutische Verwendung derselben. Diese neuen cytotoxischen Mittel haben als Resultat eines Zuführens der Analogen und Derivate zu einer spezifischen Zellpopulation in gezielter Art und Weise durch chemisches Verbinden der Analogen und Derivate mit einem Zell-Binde-Mittel eine therapeutische Verwendung.

Hintergrund der Erfindung

In den letzten Jahren ist eine Vielzahl von Berichten über das in Angriff genommene spezifische Zielen mit monoklonalen Antikörper-Arzneimittel-Konjugaten auf Tumorzellen erschienen {(Sela et al., in Immunoconjugates, S. 189-216 (C. Vogel, Ausgabe 1987); Ghose et al., in Targeted Drugs, S. 1-22 (E. Goldberg, Ausgabe 1983); Diener et al., in Antibody Mediated Delivery Systems, S. 1-23 (J. Rodwell, Ausgabe 1988); Pietersz et al., in Antibody Mediated Delivery Systems, S. 25-53 (J. Rodwell, Ausgabe 1988); Bumol et al., in Antibody Mediated Delivery Systems, S. 55-79 (J. Rodwell, Ausgabe 1988)}. Cytotoxische Arzneimittel wie z. B. Methotrexat, Daunorubicin, Doxorubicin, Vincristin, Vinblastin, Melphalan, Mitomycin C, Chlorambucil und Maytansinoide wurden mit einer Vielzahl von murinen monoklonalen Antikörpern konjugiert. In einigen Fällen wurden die Arzneimittelmoleküle durch ein intermediäres Trägermolekül wie z. B. Serumalbumin an die Antikörper-Moleküle gebunden {Garnett et al., 46 Cancer Res. 2407-2412 (1986); Ohkawa et al., 23 Cancer Immunol. Immunother. 81-86 (1986); Endo et al., 47 Cancer Res. 1076-1080 (1980)}, Dextran {Hurwitz et al., 2 Appl. Biochem. 25-35 (1980); Manabi et al., 34 Biochem. Pharmacol. 289-291 (1985); Dillman et al., 46 Cancer Res. 4886-4891 (1986); Shoval et al., 85 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 8276-8280 (1988}, oder Polyglutaminsäure {Tsukada et al., 73 J. Natl. Canc. Inst. 721-729 (1984); Kato et al., 27 J. Med. Chem. 1602-1607 (1984); Tsukada et al., 52 Br. J. Cancer 111-116 16 (1985)}.
Eine ganze Reihe von Linker-Techniken wurde zur Herstellung solcher Immunokonjugate verwendet, und es wurden sowohl abspaltbare wie auch nichtabspaltbare Linker untersucht. In den meisten Fällen konnte das gesamte cytotoxische Potential der Arzneimittel allerdings nur beobachtet werden, wenn die Arzneimittelmoleküle an der Zielstelle in unmodifizierter Form aus den Konjugaten freigesetzt werden konnten.
Einer der abspaltbaren Linker, der zur Herstellung von Antikörper-Arzneimittel- Konjugaten verwendet wurde, ist ein auf cys-Aconitsäure basierender säurelabiler Linker, der die saure Umgebung verschiedener Intrazellularräume ausnutzt, z. B. die Endosome, die während einer Rezeptor-vermittelten Endocytose auftreten, und die Lysosome. Shen und Ryser führten dieses Verfahren zur Herstellung von Konjugaten aus Daunorubicin mit makromolekularen Trägern ein {1102 Biochem. Biophys. Res. Commun. 1048-1054 (1981)}. Yang und Reisfeld verwendeten dieselbe Technik, um Daunorubicin mit einem Anti-Melanom-Antikörper zu verknüpfen {80 J. Natl. Canc. Inst. 1154-1159 (1988)}. Auch Dillman et al. verwendeten in ähnlicher Weise einen säurelabilen Linker, um Konjugate von Daunorubicin mit einem Anti-T-Zellen-Antikörper herzustellen {48 Cancer Res. 6097- 6102 (1988)}.
Eine alternative Methode, erläutert von Trouet et al., beinhaltete ein Binden von Daunorubicin an einen Antikörper über einen Peptid-Spacerarm {79 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 626-629 (1982)}. Dies wurde unter der Premisse durchgeführt, daß aus einem solchen Konjugat durch die Wirkung von lysosomalen Peptidasen freies Arzneimittel freigesetzt werden könnte.
In vitro-Cytotoxizitäts-Tests haben allerdings gezeigt, daß Antikörper-Arzneimittel- Konjugate selten dasselbe cytotoxische Potential erreichen wie die freien nicht-konjugierten Arzneimittel. Dies legt nahe, daß der Mechanismus, durch den Arzneimittel-Moleküle von den Antikörpern freigesetzt werden, sehr ineffizient sind. Auf dem Gebiet der Immunotoxine wurden Konjugate, die über Disulfid-Brücken zwischen monoklonalen Antikörpern und katalytisch aktiven Protein-Toxinen gebildet werden, als stärker cytotoxisch als Konjugate, die andere Linker enthalten, dargestellt. Siehe Lambert et al., 260 J. Biol. Chem. 12035-12041 (1985); Lambert et al., in Immunotoxins 175-209 (A. Frankel, Ausgabe 1988); Ghetie et al., 48 Cancer Res. 2610-2617 (1988). Dies wurde der hohen intrazellulären Konzentration an Glutathion zugeschrieben, das zu der effizienten Spaltung der Disulfid-Bindung zwischen einem Antikörper-Molekül und einem Toxin beiträgt. Dennoch gibt es nur wenige beschriebene Beispiele für die Verwendung von Disulfid-Brücken zur Herstellung von Konjugaten zwischen Arzneimitteln und Makromolekülen. Shen et al. beschreibt die Umwandlung von Methotrexat in ein Mercaptoethylamid-Derivat mit anschließender Konjugation mit Poly-D-lysin über eine Disulfid-Bindung (260 J. Biol. Chem. 10905-10908 (1985)). Ein neuerer Bericht beschrieb die Herstellung eines Konjugats des Trisulfid enthaltenden toxischen Arzneimittels Calicheamycin mit einem Antikörper {Menendez et al., Fourth International Conference on Monoclonal Antibody Immunoconjugates for Cancer, San Diego, Abstract 81 (1989)}.
Ein Grund für das Fehlen von Disulfid-gebundenen Antikörper-Arzneimittel- Konjugaten ist der, daß keine cytotoxischen Arzneimittel verfügbar sind, die eine ein Schwefelatom enthaltende Gruppierung besitzen, welches in einfacher Weise verwendet werden kann, um das Arzneimittel über eine Disulfid-Brücke an einen Antikörper zu binden. Außerdem ist eine chemische Modifizierung bestehender Arzneimittel ohne Verringerung ihre cytotoxischen Potentials schwierig.
Ein weiterer Hauptnachteil bei existierenden Antikörper-Arzneimittel-Konjugaten ist ihre Unfähigkeit, aufgrund der begrenzten Anzahl von Zielantigenen und der relativ moderaten Cytotoxizität von cancerostatischen Arzneimitteln wie Methotrexat, Daunorubicin und Vincristin eine ausreichende Arzneimittelkonzentration an der Zielstelle zu liefern. Um eine bedeutende Cytotoxizität zu erzielen, wird die Bindung einer großen Anzahl von Arzneimittelmolekülen entweder direkt oder durch ein polymeres Trägermolekül an den Antikörper notwendig. Allerdings zeigen solche stark modifizierten Antikörper oft eine verschlechterte Bindung an das Ziel-Antigen und eine rasche in vivo- Beseitigung aus dem Blutstrom.
CC-1065 ist ein wirksames Antitumor-Antibiotikum, das aus Kulturen von Streptomyces zelensis isoliert wird und das sich in vitro als außergewöhnlich cytotoxisch gezeigt hat.
Die Struktur von CC-1065 (Verbindung 1, Fig. 1A) wurde durch Röntgenstrahl- Kristallographie bestimmt (Martin, D.G. et al., 33 J. Antibiotics 902-903 (1980), und Chidester, C.G., et al., 103 J. Am. Chem. Soc. 7629-7635 (1981)). Das CC-1065-Molekül besteht aus drei substituierten Pyrrolindol-Gruppen, die durch Amid-Bindungen verbunden sind. Die "A" Untereinheit hat einen Cyclopropyl-Ring, der die einzigen asymmetrischen Kohlenstoffe im Molekül enthält. Obgleich die relative Konfiguration dieser Kohlenstoffe nur aus Röntgenstrahldaten verfügbar ist, wurde die absolute Konfiguration durch Verwendung von DNA als chirales Reagens als 3bR, 4aS abgeleitet {Hurley, L.H. et al., 226 Science 843-844 (1984)}. Die "B"- und "C"-Untereinheiten sind identische Pyrrolindol- Gruppierungen.
Die cytotoxische Wirksamkeit von CC-1065 wurde mit der Alkylierungs-Aktivität und der DNA-Bindungs- oder DNA-Einschluß-Aktivität von CC-1065 in Wechselbeziehung gebracht. Die zwei Aktivitäten liegen in zwei getrennten Teilen des Moleküls. Die Alkylierungs-Aktivität ist in der CPI-Einheit A (Cyclopropapyrrolindol- Einheit) und die DNA-Bindung in den zwei Untereinheiten B und C enthalten (siehe Fig. 1 A).
CC-1065 ist 100- bis 1000-mal cytotoxischer als herkömmliche chemotherapeutische Mittel gegen Krebs wie z. B. Methotrexat, Daunorubicin und Vincristin {B.K. Bhuyan et al., 42 Cancer Res. 3532-3537 (1982)}. Allerdings verursacht eine Verabreichung von CC-1065 an Mäuse eine verzögerte Hepatotoxizität, die 50 Tage nach einer einzelnen i.v.-Dosis von 12,5 ug/kg zum Tode führt {V.L. Reynolds et al., XXXIX J. Antibiotics 319-334 (1986)}. Die Synthese einiger neuer Analoge von CC-1065 (Fig. 1B und 1C), die die hohe in vitro-Cytotoxizität des Eltern-Arzneimittels beibehalten, ohne daß eine verzögerte Lethalität bei Mäusen verursacht wurde, wurde kürzlich beschrieben {M.A. Warpehoski et al., 31 J. Med. Chem. 590-603 (1988)}. Wie CC-1065 sind diese Analoge Alkylierungsmittel, die sich in kovalenter Weise an DNA binden, was den Zelltod verursacht. Diese Verbindungen inhibieren das Wachstum von murinen L1210- Leukämie-Zellen in vitro mit IC&sub5;&sub0;-Werten im Bereich von 1 · 10&supmin;¹&sup0; bis 1 · 10&supmin;¹¹ M. Einige dieser Verbindungen zeigen eine in vivo-Wirksamkeit gegen P388-Leukämie bei Mäusen. Das wirksamste Analogon U-73975 (Fig. 1 C) zeigt eine 170%ige Verlängerung der Lebensspanne gegenüber unbehandelten Kontrollen bei der optimalen Dosis von 0,05 mg/kg, die am Tag 1, 5 und 9 i.p. verabreicht wurde. Allerdings überlebte bei dieser Dosis nur eine von 6 behandelten Mäusen über 30 Tage. Wegen ihrer hohen Toxizität bei Konzentrationen, die für therapeutische Wirkungen notwendig sind, haben diese Arzneimittel einen sehr geringen therapeutischen Wert.
Boger et al., J. Org. Chem. 55, S. 5823-5832 (1990) beschreibt cytotoxische Materialien der Strukturformel:
und
Boger et al., Biorg. Med. Chem. Lett. I, S. 115-120 (1991) beschreibt cytotoxische Materialien der Strukturformel:
und
WO91/5324 (UpJohn) beschreibt Versuche, Strukturanaloge von CPI-Fragmenten von CC-1065 an Antikörper zu binden. Die Bindung ist im allgemeinen entweder nicht fähig in vivo gespalten zu werden, oder sie ist so labil, daß sie sich vor einer Bindung spaltet. Es wird eine geringe Zahl von Arzneimittelmolekülen an jeden Antikörper gebunden.
Dementsprechend besteht eine Notwendigkeit, die therapeutische Wirksamkeit von CC-1065 und seinen Analogen so zu verbessern, daß die Verbindungen ihre cytotoxische Aktivität beibehalten, aber eine verringerte systemische Toxizität haben.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von Analogen und Derivaten von CC-1065, die fähig sind, kovalent an ein Zell-Binde-Mittel gebunden zu werden. Die Zell-Binde-Mittel-Konjugate gestatten eine gezielte Zuführung der Analogen und Derivate, ohne daß in ihre cytotoxische Aktivität eingegriffen wird; dadurch wird die Toxizität für Nicht-Ziel-Zellen verringert und damit die systemische Toxizität gesenkt.
Diese und weitere Aufgaben der Erfindung wurden gelöst, indem ein cytotoxisches Mittel bereitgestellt wird, umfassend ein Zell-Binde-Mittel verbunden mit einem oder mehreren Analogen und Derivaten von CC-1065, wobei vor dem Binden der Analogen und Derivate an das Zell-Binde-Mittel diese Analogen und Derivate ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus einer A-Untereinheit der Formeln (A-1) oder (A-2), kovalent verbunden mit einer B-Untereinheit oder B-C-Untereinheit der Formeln (F-1), (F-2), (F-3), (F-4), (F-5), (F-6), (F-7), (F-8), (F-9) oder (F-10) über eine Amid-Bindung zwischen der sekundären Amino-Gruppe der Pyrrol-Gruppierung der A-Untereinheit und der C-2- Carboxyl-Gruppe der B- oder BC-Untereinheit,
wobei die Formeln A-1 und A-2 wie folgt sind:
und wobei die Formeln (F-1) bis (F-10) wie folgt sind:
worin in einer gegebenen Formel einer von entweder R und R' oder R&sub4; für eine Gruppierung steht, die die Bindung des Analogen oder Derivats von CC-1065 an ein Zell- Binde-Mittel ermöglicht; falls R oder R' für Gruppierungen stehen, die die Bindung ermöglichen, dann stehen R&sub1; bis R&sub6;, die identisch oder unterschiedlich sein können, für Wasserstoff, lineares C&sub1;-C&sub3;-Alkyl, Methoxy, Hydroxyl, primäres Amin, sekundäres Amin, tertiäres Amin oder Amido; und falls R&sub4; für eine Gruppierung steht, die die Bindung ermöglicht, stehen R, R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub5; und R&sub6;, die identisch oder unterschiedlich sein können, für Wasserstoff, lineares C&sub1;-C&sub3;-Alkyl, Methoxy, Hydroxyl, primäres Amin, sekundäres Amin, tertiäres Amin oder Amido, und steht R' für NH&sub2;, Alkyl, O-Alkyl, primäres Amin, sekundäres Amin, tertiäres Amin oder Amido.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein therapeutisches Mittel zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen bereit, umfassend:
(a) eine cytotoxische Menge eines oder mehrerer der oben beschriebenen cytotoxischen Mittel, und
(b) ein(en) pharmazeutisch annehmbare(n/s) Träger, Verdünnungsmittel oder Vehikel.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen, welches kein Verfahren für die Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Operation oder Therapie und diagnostische Methoden, ausgeführt am menschlichen oder tierischen Körper, ist, umfassend das Inkontaktbringen einer Zellpopulation oder eines Gewebes, bei denen der Verdacht besteht, daß sie Zellen dieser ausgewählten Zellpopulation enthalten, mit einer cytotoxischen Menge eines oder mehrerer der oben beschriebenen cytotoxischen Mittel.
Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Analogen oder eines Derivats von CC-1065, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer A-Untereinheit der Formeln (A-1) oder (A-2), kovalent verbunden mit einer B- Untereinheit oder einer B-C-Untereinheit der Formeln (F-1), (F-2), (F-3), (F-4), (F-5), (F-6), (F-7), (F-8), (F-9) oder (F-10) über eine Amid-Bindung zwischen der sekundären Amino-Gruppe der Pyrrol-Gruppierung der A-Untereinheit und der C-2-Carboxyl-Gruppe der B-Untereinheit,
wobei die Formeln A-1 und A-2 wie folgt sind:
und wobei die Formeln (F-1) bis (F-10) wie folgt sind:
worin in einer gegebenen Formel einer von entweder R und R' oder R&sub4; für eine Gruppierung steht, die die Bindung des Analogen oder Derivats von CC-1065 an ein Zell- Binde-Mittel ermöglicht; falls R oder R' für Gruppierungen stehen, die die Bindung ermöglichen, dann stehen R&sub1; bis R&sub6;, die identisch oder unterschiedlich sein können, für Wasserstoff, lineares C&sub1;-C&sub3;-Alkyl, Methoxy, Hydroxyl, primäres Amin, sekundäres Amin, tertiäres Amin oder Amido; und falls R&sub4; für eine Gruppierung steht, die die Bindung ermöglicht, stehen R, R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub5; und R&sub6;, die identisch oder unterschiedlich sein können, für Wasserstoff, lineares C&sub1;-C&sub3;-Alkyl, Methoxy, Hydroxyl, primäres Amin, sekundäres Amin, tertiäres Amin oder Amido, und R' steht für NH&sub2;, Alkyl, O-Alkyl, primäres Amin, sekundäres Amin, tertiäres Amin oder Amido.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1A zeigt die Struktur von CC-1065 und seinen Untereinheiten A, B und C.
Fig. 1 B und Fig. I C zeigen die Strukturen von zwei bekannten Analogen von CC-1065.
Fig. 2 ist ein Syntheseschema zur Herstellung des Monoindolyl-CC-1065- Analogen 7 und wird als Referenzbeispiel angegeben.
Die Fig. 3A und 3B sind Synthese-Schemata zur Herstellung von Indolyl- und Benzofuranyl-Derivaten. Fig. 3C ist ein Syntheseschema für das CC-1065-Analoge 18, das als Referenzbeispiel angegeben wird.
Fig. 4 ist ein Syntheseschema zur Herstellung des Bisindolyl-CC-1065-Analogen 22, das als Referenzbeispiel angegeben wird.
Die Fig. 5A und 5B sind Diagramme von Verfahren zur Herstellung der Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung. Fig. 5A ist ein Diagramm eines Verfahrens, das ein Thiolenthaltendes CC-1065-Analoges verwendet, und Fig. 5B ist ein Diagramm eines Verfahrens, das ein aktiviertes Disulfid enthaltendes CC-1065-Analoges verwendet. Referenzbeispiele sind angegeben.
Fig. 6 ist ein Diagramm, das die in vitro-Cytotoxizität und -spezifität von Derivat- Arzneimittel 7-Konjugat für SW2- und Namalwa-Zellen zeigt. Die Abszisse stellt die Konjugat-Konzentration dar und die Ordinate stellt die überlebende Zellfraktion dar. Die ausgefüllten Kreise stellen Daten für die Antigen-positiven SW2-Zellen dar, und die offenen Kreise stellen Daten für die Antigen-negativen Namalwa-Zellen dar. Diese Daten sind als Referenzbeispiel angegeben, um das Verhalten gegen Antigen-positive und Antigen-negative Zellen zu zeigen.
Fig. 7 ist ein Diagramm, das die in vitro-Cytotoxizität und -spezifität des Derivat- Arzneimittel 7-Konjugats für die Antigen-positiven A-375- und die Antigen-negativen SCaßER-Zellen zeigt. Die Abszisse gibt die Konjugat-Konzentration an und die Ordinate gibt die überlebende Zellfraktion an. Die ausgefüllten Kreise stellen die Daten für die A-375-Zellen dar, und die offenen Kreise stellen die Daten für die SCaBER-Zellen dar. Die Daten sind als Referenzbeispiel angegeben, um das Verhalten gegen Antigen-positive und Antigen-negative Zellen zu zeigen.
Fig. 8 ist ein Diagramm, das die in vitro-Cytotoxizität und -Spezifität des CC-1065-Analoges 18-Konjugats für SW2- und Namalwa-Zellen zeigt. Die Abszisse stellt die Konjugat-Konzentration dar und die Ordinate stellt die überlebende Zellfraktion dar. Die ausgefüllten Kreise geben Daten für die Antigen-positiven SW2-Zellen an und die offenen Kreise stellen Daten für die Antigen-negativen Namalwa-Zellen dar. Die Daten sind als Referenzbeispiel angegeben, um das Verhalten gegen Antigen-positive und Antigen-negative Zellen zu demonstrieren.
Fig. 9 ist ein Diagramm, das die in vitro-Cytotoxizität und -Spezifität des CC- -1065-Analoges 22-Konjugats für SW2- und Namalwa-Zellen zeigt. Die Abszisse stellt die Konzentration des Konjugats oder des freien CC-1065-Analogen 22 dar und die Ordinate stellt die überlebende Zellfraktion dar. Die Kreise stellen Daten für das Konjugat für die Antigen-positiven SW2-Zellen dar, die Dreiecke stellen Daten für das freie CC-1065- Analoge 22 dar, die Quadrate stellen Daten für das Konjugat in Gegenwart von freiem Antikörper dar und die Rauten stellen Daten für das Konjugat für die Antigen-negativen Namalva-Zellen dar. Die Daten sind als Referenzbeispiel angegeben, um die Antigen- Spezifität zu demonstrieren.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben festgestellt, daß die therapeutische Wirksamkeit von CC-1065 und Analogen desselben verbessert werden kann, indem die in vivo-Verteilung durch gezielte Zuführung des Arzneimittels zu der Tumorstelle verändert wird, was zu einer geringeren Toxizität für Nicht-Ziel-Gewebe und damit zu einer geringeren systemischen Toxizität führt. Um dieses Ziel zu erreichen, synthetisierten die Erfinder Analoge der cytotoxischen Arzneimittel 2 und 3 (Fig. 1B und 1C), die einen eine Thiol- oder Disulfid-Gruppe enthaltenden Substituenten an der C-4- oder C-5-Position der terminalen Indolyl- oder Benzofuranyl-Gruppierung des Arzneimittels enthalten. Diese Verbindungen behalten nicht nur die hohe Cytotoxizität des Eltern-Arzneimittels bei, sondern können auch über Disulfid-Bindungen mit Zell-Binde-Mitteln verbunden werden. Die Erfinder haben vorher gezeigt, daß die Bindung von hoch-cytotoxischen Arzneimitteln an Antikörper unter Verwendung einer spaltbaren Bindung, z. B. einer Disulfid-Bindung, die Freisetzung von vollständig aktivem Arzneimittel im Inneren der Zelle gewährleistet; solche Konjugate sind in einer Antigen-spezifischen Weise cytotoxisch {R.V.J. Chari et al., 52 Cancer Res. 127-131 (1992); U.S.-Patent Nr. 5 416 064 und 5 208 020}. In der vorliegenden Anmeldung beschreiben die Erfinder die Synthese von neuen Arzneimittel- Analogen, Verfahren zu ihrer Konjugation an molekulare Antikörper und die in vitro- Cytotoxizität und -Spezifität dieser Konjugate. Die Erfindung erlaubt den Analogen und Derivaten von CC-1065, ihr Potential zu entfalten, etwas, was ihre ungerichteten cytotoxischen Effekte vorher unmöglich gemacht hatten. Somit stellt die Erfindung nützliche Mittel für die Eliminierung von erkrankten oder abnormen Zellen bereit, die abgetötet oder lysiert werden sollen, z. B. Tumorzellen, Virus infizierte Zellen, von Mikroorganismen infizierte Zellen, mit Parasiten infizierte Zellen, autoimmune Zellen (Zellen, die Autoantikörper produzieren), aktivierte Zellen (solche, die bei der Transplantatabstoßung oder Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung involviert sind) oder jeder andere Typ erkrankter oder abnormaler Zellen, während sie ein Minimum an Nebenwirkungen aufweisen.
Somit lehrt die Erfindung die Synthese von Analogen und Derivaten von CC-1065, die chemisch mit einem Zell-Binde-Mittel verbunden sein können und die die hohe Cytotoxizität der Elternverbindung CC-1065 beibehalten haben. Außerdem sind diese Verbindungen, wenn sie mit einem Zell-Binde-Mittel verbunden sind, nur für Zellen, an das sich das Zell-Binde-Mittel bindet, hoch toxisch und für nicht-spezifische Zellen weniger toxisch. Hohe Cytotoxizität ist so definiert, daß der IC&sub5;&sub0;-Wert etwa 10&supmin;&sup9; M oder weniger ist, wenn in vitro mit SW2-Zellen bei einer Expositionszeit von 24 h für das Arzneimittel gemessen wird. Die Elternverbindung zeigt unter diesen Bedingungen einen IC&sub5;&sub0;-Wert von 2 · 10&supmin;¹&sup0; M.

CYTOTOXISCHES MITTEL

Das cytotoxische Mittel gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt ein oder mehrere Analoge oder Derivate von CC-1065, verbunden mit einem Zell-Binde-Mittel.
Erfindungsgemäß müssen die Analogen und Derivate von CC-1065 eine A- Untereinheit, eine CBI-Einheit (Cyclopropylbenzindol-Einheit) in der geschlossenen Cyclopropyl-Form oder der offenen Chlormethyl-Form enthalten. Die B- und C-Untereinheiten von CC-1065 sind sehr ähnlich und sind 2-Carboxy-indol-Derivate. Die Analogen von CC-1065 benötigen zur Aktivität mindestens eine derartige 2-Carboxy-indol-Untereinheit oder eine 2-Carboxy-benzofuran-Untereinheit, obgleich zwei Untereinheiten (d. h. B und C) das Analoge wirksamer machen. Wie es aus dem natürlichen CC-1065 und den veröffentlichten Analogen {z. B. Warpehoski et al., 31 J. Med. Chem. 590-603 (1988)} offensichtlich ist, können die B- und C-Untereinheiten auch verschiedene Substituenten an verschiedenen Positionen an den Indol- oder Benzofuran-Ringen tragen.
Um die CC-1065-Derivate mit einem Zell-Binde-Mittel zu verbinden, muß das CC-1065-Derivat zuerst derivatisiert werden, um eine Gruppierung zu enthalten, die es erlaubt, daß die Derivate über eine Disulfid-Bindung, eine säurelabile Gruppe, eine photolabile Gruppe, eine Peptidase-labile Gruppe oder eine Esterase-labile Gruppe an ein Zell-Binde-Mittel gebunden wird. Die Analogen werden so hergestellt, daß sie bereits eine Gruppierung enthalten, die notwendig ist, um das Analoge über eine Disulfid-Bindung, eine säurelabile Gruppe, eine photolabile Gruppe, eine Peptidase-labile Gruppe oder eine Esterase-labile Gruppe mit einem Zell-Binde-Mittel zu verbinden.
Analoge oder Derivate von CC-1065 können erfindungsgemäß insbesondere jede der folgenden A-Untereinheiten der Formeln (A-1) {CBI (Cyclopropyl-Form)} und (A-2) {CBI (Chlormethyl-Form)}, die über eine Amid-Bindung von der sekundären Amino- Gruppe der Pyrrol-Gruppierung der A-Untereinheit kovalent mit der C-2-Carboxy-Gruppe der folgenden B-Untereinheit oder kovalent mit den B- und C-Untereinheiten der Formel (F-1) bis (F-10) verbunden ist. A-Untereinheiten
und B und kovalent gebundene B- und C-Untereinheiten
worin in einer gegebenen Formel einer von entweder R und R' oder R&sub4; für eine Gruppierung steht, die die Bindung des Analogen oder Derivats von CC-1065 an ein Zell- Binde-Mittel ermöglicht; falls R oder R' für Gruppierungen stehen, die die Bindung ermöglichen, dann stehen R&sub1; bis R&sub6;, die identisch oder unterschiedlich sein können, für Wasserstoff, lineares C&sub1;-C&sub3;-Alkyl, Methoxy, Hydroxyl, primäres Amin, sekundäres Amin, tertiäres Amin oder Amido; und falls R&sub4; für eine Gruppierung steht, die die Bindung ermöglicht, stehen R, R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R5 und R&sub6;, die identisch oder unterschiedlich sein können, für Wasserstoff, lineares C&sub1;-C&sub3;-Alkyl, Methoxy, Hydroxyl, primäres Amin, sekundäres Amin, tertiäres Amin oder Amido, und R' steht für NH&sub2;, Alkyl, O-Alkyl, primäres Amin, sekundäres Amin, tertiäres Amin oder Amido.
Beispiele für primäre Amine umfassen Methylamin, Ethylamin und Isopropylamin.
Beispiele für sekundäre Amine umfassen Dimethylamin, Diethylamin und Ethylpropylamin.
Beispiele für tertiäre Amine umfassen Trimethylamin, Triethylamin und Ethylisopropylmethylamin.
Beispiele für Amido-Gruppen umfassen N-Methylacetamido, N-Methylpropionamido, N-Acetamido und N-Propionamido.
Beispiele für Alkyl, das durch R' dargestellt wird, umfassen, wenn R' keine bindende Gruppe ist, lineares oder verzweigtes C&sub1;-C&sub5;-Alkyl.
Beispiele für O-Alkyl, das durch R' dargestellt wird, umfassen, wenn R' keine bindende Gruppe ist, Verbindungen, worin die Alkyl-Gruppierung ein lineares oder verzweigtes C&sub1;-C&sub5;-Alkyl ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind R&sub1; bis R&sub6; alle Wasserstoff und stellen R und R' Gruppierungen dar, die die Bindung des Derivats von CC-1065 oder des Derivats des Analogen von CC-1065 über eine Disulfid-Bindung an ein Zell-Binde-Mittel ermöglichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform steht R oder R&sub4; für NHCO(CH&sub2;)lSZ&sub0;, NHCOC&sub6;H&sub4;(CH&sub2;)lSZ&sub0; oder O(CH&sub2;)lSZ&sub0; und steht R' für (CH&sub2;)lSZ&sub0;, NH(CH&sub2;)lSZ&sub0; oder O(CH&sub2;)lSZ&sub0;, worin Z&sub0; H oder SR&sub7; bedeutet, worin Rγ Methyl, lineares Alkyl, verzweigtes Alkyl, cyclisches Alkyl, einfaches oder substituiertes Aryl oder eine heterocyclische Gruppe bedeutet, und C eine ganze Zahl von 1 bis 10 bedeutet.
Beispiele für lineares Alkyl, das durch R&sub7; dargestellt wird, umfassen Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl und Hexyl.
Beispiele für verzweigtes Alkyl, das durch R&sub7; dargestellt wird, umfassen Isopropyl, Isobutyl, sek-Butyl, tert-Butyl, Isopentyl und 1-Ethylpropyl.
Beispiele für cyclisches Alkyl, das durch R&sub7; dargestellt wird, umfassen Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl und Cyclohexyl.
Beispiele für einfaches Aryl, das durch R&sub7; dargestellt wird, umfassen Phenyl und Naphthyl.
Beispiele für substituierte Aryle, die durch R&sub7; dargestellt werden, umfassen Aryle wie Phenyl oder Naphthyl, die mit Alkyl-Gruppen, Halogenen wie z. B. Cl, Br, F, Nitro- Gruppen, Amino-Gruppen, Sulfonsäure-Gruppen, Carbonsäure-Gruppen, Hydroxy- Gruppen und Alkoxy-Gruppen substituiert sind.
Hetrocyclische Gruppen, die durch R&sub7; dargestellt werden, sind Verbindungen, bei denen die Heteroatome aus O, N und S ausgewählt sind; Beispiele dafür umfassen Furyl, Pyrrolyl, Pyridyl und Thiophen.
Erfindungsgemäße Analoge und Derivate von CC-1065 können hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die Proliferation verschiedener unerwünschter Zellinien in vitro zu supprimieren, beurteilt werden. Z. B. können Zellinien wie die humane Epidermoid-Karzinom-Linie KB, die humane Brusttumor-Linie SKBR3 und die Burkitts Lymphom-Linie Namalwa in einfacher Weise für die Beurteilung der Cytotoxizität dieser Verbindungen verwendet werden. Zu beurteilende Zellen können für 24 h den Verbindungen ausgesetzt werden und die überlebenden Zellfraktionen nach bekannten Verfahren in direkten Tests gemessen werden. Aus den Resultaten dieser Tests können die IC&sub5;&sub0;-Werte dann errechnet werden.
Als Referenzbeispiele wurde die in vitro-Cytotoxizität für humane Krebszellinien für das Monoindol-CC-1065-Analoge 6, die Indolyl-benzofuranyl-CPI-Verbindung 18 und das Bisindolyl-CPI-Derivat 22 bestimmt. So hatte die Monoindolyl-Verbindung 6 für die verschiedenen untersuchten Zellinien (SW2, Namalwa und A-375) einen IC&sub5;&sub0;-Wert von 2,0 bis 7,0 · 10&supmin;¹&sup0; M. Das CPI-Derivat 18 war gegenüber der humanen kleinen Lungenkrebszellinie SW2 und der humanen Burkitts Lymphom-Zellinie Namalwa mit IC&sub5;&sub0;-Werten von 5 · 10&supmin;¹² M bzw. 1 · 10&supmin;¹¹ M nach einem 24-stündigen Ausgesetztsein gegenüber dem Arzneimittel in hohem Maße cytotoxisch. Das Bisindolyl-CPI-Derivat 22 war für SW2-Zellen mit einem IC&sub5;&sub0;-Wert von 4 · 10&supmin;¹¹ M ebenfalls sehr cytotoxisch.
Die oben beschriebenen Analogen und Derivate von CC-1065 können nach bekannten Verfahren, welche eine Isolierung aus natürlichen Quellen und anschließende Modifizierung, synthetische Herstellung oder eine Kombination aus beiden umfassen können, hergestellt werden.
Repreäsentative Synthese-Referenzbeispiele werden im folgenden beschrieben.

SYNTHESE-REFERENZBEISPIEL 1

Die Synthese des Monoindolyl-CC-1065-Analogen 7, das einen Thiol-Substituenten an der Seitenkette am C-5 der Indol-Gruppierung der B-Untereinheit enthält, ist in Schema 1 (Fig. 2) dargestellt. Phenyldithiopropionsäure 4 wurde mit Isobutylchlorformiat in Gegenwart von Triethylamin behandelt, wobei das gemischte Anhydrid erhalten wurde; danach folgte die Reaktion mit 5-Aminoindol-2-carbonsäure unter Erhalt des Amids 5. Eine Verknüpfung von 5 mit CPI wurde in Gegenwart von Ethyl-diaminopropyl-carbodiimid (EDC), wie vorher bei {M.A. Warpehoski et al., 31 J. Med. Chem., 590-603 (1988)) beschrieben, durchgeführt, wobei das eine Phenyldithio-Gruppe enthaltende CPI-Derivat 6 erhalten wurde. Die Reduktion von 6 zu dem Thiol-enthaltenden Derivat 7 lief glatt in Gegenwart von 1,1 Äquivalenten Dithiothreit bei 4ºC ab. Die Reaktion wurde nach 1 h als vollständig angesehen und das Produkt wurde durch HPLC unter Verwendung einer Umkehrphasen-C-18-Säule gereinigt.

SYNTHESE-REFERENZBEISPIEL 2

Die Syntheseschritte zur Herstellung des Indolyl-benzofuranyl-CPI-Derivats 18, das eine aktivierte Disulfid-Gruppe enthält, sind in den Schemen 2 und 3 (Fig. 3A, 3B und 3C) dargestellt. tert-Butyl-5-aminoindol-2-carboxylat 10 wurde aus Ethyl-5-nitroindol-2- carboxylat 8 (Schema 2a; Fig. 3a) hergestellt. 5-(2'-Pyridyldithiomethyl)benzofuran-2- carbonsäure 15 wurde aus 5-Methylbenzofuran-2-carbonsäure 11 hergestellt (Schema 2b; Fig. 3B). Carbonsäure 11 wurde in ihren tert-Butylester umgewandelt und dann an der benzylischen Position mit N-Bromsuccinimid (NBS) bromiert, wobei die Monobrommethyl-Verbindung 12 erhalten wurde. Ersetzen von Bromid mit Thioacetat, gefolgt von einer Reduktion mit Natriumborhydrid und Reaktion des freien Thiols mit 2-Pyridyldisulfid ergab Ester 14. Eine Hydrolyse des tert-Butylesters mit Trifluoressigsäure ging bei 0ºC unter Erhalt von 15 glatt vonstatten. Ein Verbinden von 15 mit tert-Butyl-5- aminoindol-2-carboxylat 10 wurde mit Dicyclohexylcarbodümid/4-N,N- Dimethylaminopyridin (DCCJDMAP) oder Carbonyldiimidazol unter Erhalt der Indolylbenzofuranyl-Verbindung 16 durchgeführt. Hydrolyse des tert-Butylesters unter Erhalt der Carbonsäure 17, anschließende Verknüpfung mit CPI in Gegenwart von EDC lieferte das Arzneimittel 18 (Schema 2c; Fig. 3C).

SYNTHESE-REFERENZBEISPIEL 3

Das Thiol-enthaltende Bisindolyl-CPI-Derivat 22 wurde durch die Schritte, die im Schema 3 dargestellt sind (Fig. 4), synthetisiert. Phenyldithiopropionsäure 4 wurde mit Isobutylchlorformiat aktiviert und dann mit tert-Butyl-5-aminoindol-2-carboxylat 10 umgesetzt, wobei der Ester 19 erhalten wurde. Hydrolyse des tert-Butylesters mit Trifluoressigsäure, gefolgt von einer Verknüpfung mit einem weiteren Molekül 10 in Gegenwart von DCC lieferte den Bisindolylester 20. Erneute Hydrolyse des Esters 20, gefolgt von einer Verknüpfung mit CPI ergab das Arzneimittel 21. Eine Abspaltung der Phenyldithio- Schutzgruppe mit Dithiothreit bei 0ºC unter Bedingungen, die mit denen identisch sind, die früher für die Reduktion der Disulfid-Gruppe in der Monoindolyl-CPI-Verbindung 6 angewendet wurden, lieferte das Thiol-enthaltende Arzneimittel 22.

BINDE-GRUPPEN (BZW. BINDENDE GRUPPEN)

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Derivate von CC-1065 oder der Analogen von CC-1065 können auch andere Bindegruppen als die, die oben in den Synthesebeispielen beschrieben wurden, verwendet werden.
Geeignete Bindegruppen sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und umfassen Disulfid-Gruppen, Thioether-Gruppen, säurelabile Gruppen, photolabile Gruppen, Peptidase-labile Gruppen und Esterase-labile Gruppen. Bevorzugt sind Disulfid-Gruppen.
Erfindungsgemäß ist die Bindegruppe Teil einer chemischen Gruppierung, die durch herkömmliche Verfahren, wie sie oben beschrieben wurden, mit CC-1065 oder dem CC-1065-Analogen kovalent verbunden ist. Die chemische Gruppierung kann über eine Alkyl-Gruppe, Amino-Gruppe, eine Amid-Bindung oder eine Ether-Bindung an der C-4 oder C-5-Position der terminalen Indol- oder Benzofuran-Gruppierung kovalent an das CC-1065 oder das CC-1065-Analoge gebunden sein. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die chemische Gruppierung über eine Methylen (CH&sub2;)-Gruppe oder eine Amid-Gruppe (NHCOCH&sub2;CH&sub2;) in der C-5-Position der terminalen Indol- oder Benzofuran-Gruppierung an das CC-1065 oder das CC-1065-Analoge gebunden sein.

HERSTELLUNG VON ZELL-BINDE-MITTELN

Die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen als therapeutische Mittel hängt von der sorgfältigen Auswahl eines geeigneten Zell-Binde-Mittels ab. Zell-Binde- Mittel können jeder beliebigen, derzeit bekannten Art oder bekannt werdenden Art sein und umfassen Peptide und Nicht-Peptide. Im allgemeinen können diese Antikörper (speziell monoklonale Antikörper), Lymphokine, Hormone, Wachstumsfaktoren, Nährstoff- Transportmoleküle (wie z. B. Transferin) oder jedes beliebige andere Zell-Binde-Molekül oder jede beliebige Zell-Binde-Substanz sein.
Spezifischere Beispiele für Zell-Binde-Mittel, die verwendet werden können, umfassen:
- monoklonale Antikörper;
- Einzelketten-Antikörper;
- Fragmente von Antikörpern, z. B. Fab, Fab', F(ab')&sub2; und Fv {Parham, 131 J. Immunol. 2895-2902 (1983); Spring et al., 113 J. Immunol. 470-478 (1974); Nisonoff et al., 89 Arch. Biochem. Biophys. 230-244 (1960)};
- Interferone (z. B. α, δ, γ);
- Lymphokine, z. B. IL-2, IL-3, IL-4, IL-6;
- Hormone, z. B. Insulin, TRH (Thyrotropin-freisetzende Hormone), MSH (Melanocyt-stimulierendes Hormon), Steroid-Hormone, wie Androgene und Estrogene;
- Wachstumsfaktoren und Kolonie-stimulierende Faktoren wie z. B. EGF, TGF-α, G-CSF, M-CSF und GM-CSF {Burgess, 5 Immunology Today 155-158 (1984)}; und
- Transferrin {O'Keefe et al., 260 J. Biol. Chem. 932-937 (1985)}.
Monoklonale Antikörper-Techniken ermöglichen die Produktion extrem spezifischer Zell-Binde-Mittel in Form von spezifischen monoklonalen Antikörpern. Auf dem Fachgebiet besonders gut bekannt sind Techniken zur Bildung monoklonaler Antikörper, die dadurch produziert werden, daß Mäuse, Ratten, Hamster oder ein beliebiges anderes Säugetier mit dem interessierenden Antigen, z. B. die intakte Zielzelle, Antigene, die aus der Zielzelle isoliert wurden, das ganze Virus, das verdünnte ganze Virus und virale Proteine wie z. B. virale Hüllen-Proteine, immunisiert werden.
Die Auswahl des geeigneten Zell-Binde-Mittels ist von Bedeutung und hängt von der besonderen Zellpopulation ab, auf die abgezielt wird; im allgemeinen aber sind monoklonale Antikörper bevorzugt, wenn ein geeigneter verfügbar ist.
Der monoklonale Antikörper JS ist z. B. ein muriner IgG2a-Antikörper, der sich spezifisch an das gemeine akute Lymphoblastenleukämie-Antigen (CALLA) bindet {Ritz et al., 283 Nature 583-585 (1980)); es kann eingesetzt werden, wenn die Zielzellen CALLA exprimieren, z. B. bei der Krankheit akute Lymphoblastenleukämie. Entsprechend ist der monoklonale Antikörper Anti-B4 ein murines IgGI, das sich an das CD19-Antigen auf B- Zellen bindet {Nadler et al., 131 J. Immunol. 244-250 (1983)}; es kann eingesetzt werden, wenn die Zielzellen B-Zellen oder erkrankte Zellen, die dieses Antigen exprimieren, z. B. beim Nicht-Hodgkinsen Lymphon oder bei chronischer Lymphoblastenleukämie, sind.
Außerdem kann GM-CSF, das sich an myeloide Zellen bindet, als Zell-Binde-Mittel für erkrankte Zellen bei akuter myeloischer Leukämie eingesetzt werden. IL-2, das sich an aktivierte T-Zellen bindet, kann zur Prävention einer Transplantatabstoßung, zur Therapie und Prävention einer Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung und zur Behandlung akuter T-Zellenleukämie eingesetzt werden. MSH, das sich an Melanocyten bindet, kann zur Melanombehandlung eingesetzt werden.
Brustkrebs und Hodenkrebs können erfolgreich gezielt mit Östrogen (oder Östrogen-Analogen) oder Androgen (oder Androgen-Analogen) als Zell-Binde-Mittel behandelt werden.

HERSTELLUNG VON CYTOTOXISCHEN MITTELN (KONJUGATEN)

Konjugate der Analogen und Derivate von CC-1065 gemäß der Erfindung mit einem Zell-Binde-Mittel können unter Anwendung jeder beliebigen derzeit bekannten Techniken gebildet werden. Ein Indolyl-, Benzofuranyl-, Bisindolyl-, Bisbenzofuranyl-, Indolyl-benzofuranyl- oder Benzofuranyl-indolyl-Derivat, verknüpft mit CBI, kann so hergestellt werden, daß es eine freie Amino-Gruppe enthält (z. B. ausgehend von Verbindung 10) und dann mit einem Antikörper oder einem anderen Zell-Binde-Mittel über einen säurelabilen Linker oder einen photolabilen Linker verbunden werden. Die cytotoxischen Verbindungen können mit einem Peptid kondensiert werden und anschließend mit einem Zell-Binde-Mittel verbunden werden, wodurch ein Peptidaselabiler Linker produziert wird. Cytotoxische Verbindungen können so hergestellt werden, daß sie eine primäre Hydroxyl-Gruppe enthalten (z. B. ausgehend von Verbindung 12), die dann succinyliert und mit einem Zell-Binde-Mittel verbunden werden kann, wodurch ein Konjugat produziert wird, welches durch intrazelluläre Esterasen unter Freisetzung des freien Arzneimittels gespalten werden kann. Am günstigsten werden die cytotoxischen Verbindungen so behandelt, daß sie eine freie oder geschützte Thiol-Gruppe bilden; dann wird (werden) eines oder viele Disulfid- oder Thiol-enthaltende Derivate über eine Disulfid-Bindung oder Disulfid-Bindungen kovalent mit dem Zell-Binde-Mittel verbunden.
Typische Konjugate der Erfindung sind Konjugate aus Analogen oder Derivaten von CC-1065 und Antikörpern, Antikörper-Fragmenten, epidermalem Wachstumsfaktor (EGF), Melanocyten-stimulierenden Hormon (MSH), die Schilddrüse stimulierenden Hormon (TSH), Östrogen, Östrogen-Analogen, Androgen und Androgen-Analogen.
Im folgenden werden typische Beispiele für die Herstellung verschiedener Konjugate von CC-1065-Analogen und -Derivaten und Zell-Binde-Mitteln beschrieben.

REFERENZBEISPIEL FÜR DISULFID-LINKER

Antikörper N901, der sich an das CD-56-Antigen, das an der Oberfläche von kleinzelligen Lungenkrebszellen exprimiert wird {J.D. Griffin, T. Hercend, R. Beveridge & S.F. Schlossman, J. Immunol., 130:2947 (1983)}, bindet, wurde zur Herstellung von Konjugaten verwendet. Der Antikörper wurde mit N-Succinimidyl-3-pyridyldithioproponat modifiziert, wie es vorher beschrieben wurde {J. Carlsson, H. Drevin & R. Axen, Biochem., J., 173: 723 (1978)}, um durchschnittlich vier Pyridyldithio-Gruppen pro Antikörper-Molekül einzuführen. Der modifizierte Antikörper wurde mit dem Thiolenthaltenden CC-1065-Analogen 7 unter Herstellung eines durch Disulfid-gebundenen Konjugat umgesetzt. Die Zahl der gebundenen Arzneimittelmoleküle war in inniger Übereinstimmung mit der Anzahl der Pyridyldithio-Gruppen, die in das Antikörper- Molekül eingeführt worden waren. Das Bisindolyl-CPI-Arzneimittel 20 wurde in gleicher Weise an Antikörper konjugiert (siehe Verfahren A, Fig. 5A).
Um Konjugate des aktiviertes Disulfid-enthaltenden Indolyl-benzofuranyl-CPI- Derivats 18 (Fig. 3C) herzustellen, wurde der Antikörper mit 2-Iminothiolan, wie vorher beschrieben, {J.M. Lambert et al., J. Biol. Chem., 260; 12035 (1985)} modifiziert, um so durchschnittlich 4 bis 6 Sulfhydryl-Gruppen pro Antikörper-Molekül einzuführen. Die Reaktion mit dem Arzneimittel 18 führte zur Herstellung von Konjugaten, die durchschnittlich 3 bis 4 Arzneimittelmoleküle pro Antikörper-Molekül enthalten (siehe Verfahren B, Fig. 5B).

REFERENZBEISPIEL FÜR SÄURELABILE LINKER

CPI oder CBI kann mit einem Indolyl-, Benzofuranyl-, Bisindolyl-, Bisbenzofuranyl- oder Indolyl-benzofuranyl- oder Benzofuranyl-indolyl-Derivat, das einen eine geschützte Amino-Gruppe enthaltenden Substituenten am C-4 oder C-5 der terminalen Indolyl- oder Benzofuranyl-Gruppierung trägt, verknüpft werden. Die Schutzgruppe kann eine tert-Butyloxycarbonyl- oder eine Biphenylpropyloxycarbonyl-Funktionalität sein, die unter milden Bedingungen unter Bildung des freien Amins abgespalten werden kann. Dieses eine Amino-Gruppe enthaltende CC-1065-Analoge oder -Derivat kann über einen säurelabilen Linker wie vorher beschrieben an Antikörper und andere Zell-Binde-Mittel gebunden werden. {W.A. Blattler et al., Biochemistry 24, 1517-1524 (1985); U.S. Patent- Nrn. 4 542 225, 4 569 789, 4 618 492, 4 764 368.}
In gleicher Weise kann CPI mit einem Indolyl-, Benzofuranyl-, Bisindolyl-, Bisbenzofuranyl-, Indolyl-benzofuranyl- oder Benzofuranyl-indolyl-Derivat, das einen eine geschützte Hydrazid-Gruppe enthaltenden Substituenten am C-4 oder C-5 der terminalen Indolyl- oder Benzofuranyl-Gruppierung trägt, verknüpft werden. Wieder kann die Schutzgruppe eine tert-Butyloxycarbonyl- oder Biphenylpropyloxycarbonyl-Funktionalität sein, die unter milden sauren Bedingungen unter Bildung des freien Hydrazids abgespalten werden kann. Dieses eine Hydrazid-Gruppe enthaltende CC-1065-Analoge oder -Derivat kann über einen säurelabilen Hydrazon-Linker {Beispiele für Hydrazon-Linker siehe B.C. Laguzza et al., J. Med. Chem., 32, 548-555 (1989); R.S. Greenfield et al., Cancer Res., 50, 6600-6607 (1990)} an den Kohlehydrat-Teil von Antikörpern und anderen Zell-Binde- Mitteln gebunden werden.

PHOTOLABILE LINKER

Die eine Amino-Gruppe enthaltenden CC-1065-Analoge oder-Derivate, die oben beschrieben wurden, können über einen photolabilen Linker, wie er bereits beschrieben wurde, an Antikörper und andere Zell-Binde-Mittel gebunden werden {P. Senter et al., Photochemistry and Photobiology, 42, 231-237 (1985); US-Patent Nr. 4 625 014}.

PEPTIDASE-LABILE LINKER

Die eine Amino-Gruppe enthaltenden CC-1065-Analogen oder -Derivate, die oben beschrieben sind, können auch über Peptid-Spacer mit Zell-Binde-Mitteln verbunden werden. Es wurde früher gezeigt, daß kurze Peptid-Spacer zwischen Arzneimitteln und makromolekularen Protein-Trägern im Serum stabil sind, aber durch intrazelluläre Peptidasen leicht gespalten werden {A. Trouet et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 79, 626-629 (1982)}. Die eine Amino-Gruppe enthaltenden CC-1065-Analoge oder -Derivate können mit Peptiden wie z. B. Ala-Leu, Leu-Ala-Leu und Ala-Leu-Ala-Leu unter Verwendung von Kondensationsmitteln wie z. B. 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-HC 1 (EDC- HC1) kondensiert werden, wobei ein Peptid-Derivat erhalten wird, das an Zell-Binde-Mittel gebunden werden kann.

REFERENZBEISPIEL FÜR ESTERASE-LABILE LINKER

CPI kann mit einem Indolyl-, Benzofuranyl-, Bisindolyl-, Bisbenzofuranyl-, oder Indolyl-benzofuranyl-Derivat, das einen eine Hydroxyalkyl-Gruppe enthaltenden Substituenten am C-4 oder am C-5 der terminalen Indolyl- oder Benzofuranyl-Gruppierung trägt, verknüpft werden. Dieses CC-1065-Analoge oder -Derivat kann mit Bernsteinsäureanhydrid succinyliert werden und dann an ein Zell-Binde-Mittel gebunden werden, wobei eine Konjugat hergestellt wird, das durch intrazellulare Esterasen unter Freisetzung von freiem Arzneimittel gespalten werden kann. {Für Beispiele siehe E. Aboud-Pirak et al., Biochem. Pharmacol., 38, 641-648 (1989)}.
Die Konjugate, die nach den obigen Verfahren hergestellt werden, können durch Standard-Säulenchromatographie oder durch HPLC gereinigt werden.
Vorteilhafte Konjugate zwischen monoklonalen Antikörpern oder Zell-Binde- Mitteln und Analogen oder Derivaten von CC-1065 sind solche, die über eine Disulfid- Bindung verbunden sind, wie sie oben diskutiert wurde, und die fähig sind, CC-1065 oder Analoge davon bereitzustellen. Solche Zell-Binde-Konjugate werden nach bekannten Verfahren hergestellt, beispielsweise durch Modifizieren von monoklonalen Antikörpern mit Succinimidyl-pyridyl-dithiopropionat (SPDP) {Carlsson et al., 173 Biochem. J. 723- 737 (1978)}. Die resultierende Thiopyridyl-Gruppe wird dann durch Behandlung mit Thiolenthaltendem CC-1065 oder Analogen davon ersetzt, wodurch Disulfid-gebundene Konjugate hergestellt werden. Im Fall der Aryldithio-CC-1065-Analogen oder -Derivate erfolgt alternativ die Bildung des Zell-Binde-Konjugats durch direktes Ersetzen des Arylthiols der CC-1065-Derivate durch Sulfhydiyl-Gruppen, die vorher in Antikörper- Moleküle eingeführt worden waren. Konjugate, die 1 bis 10 CC-1065-Arzneimittel über eine Disulfid-Brücke gebunden enthalten, werden nach jedem Verfahren in einfacher Weise hergestellt.
Genauer ausgedrückt, eine Lösung des mit Dithiopyridyl modifizierten Antikörpers wird in einer Konzentration von 1 mg/ml in 0,1 M Kaliumphosphat-Puffer mit einem pH von 7,0, der 1 mmol EDTA enthält, mit dem Thiol-enthaltenden CC-1056 oder Analogen desselben (1,25 Moläquivalent/Dithiopyridyl-Gruppe) behandelt. Die Freisetzung von Thiopyridin aus dem modifizierten Antikörper wird spektralphotometrisch bei 343 nm überwacht und ist in etwa 30 min vollständig. Das Antikörper-CC-1065-Konjugat wird durch Gel-Filtration durch eine Sephadex G-25-Säule gereinigt und von nicht-umgesetztem Arzneimittel und anderem Material mit niedrigem Molekulargewicht befreit. Die Anzahl an CC-1056-Molekülen oder CC-1056-Analogen-Molekülen, die pro Antikörper-Molekül gebunden sind, kann dadurch bestimmt werden, daß das Verhältnis der Extinktion bei 252 nm und 280 nm gemessen wird. Nach diesem Verfahren können durchschnittlich 1 bis 10 CC-1065 Moleküle oder Analoge davon/Antikörper-Molekül über Disulfid-Bindungen gebunden sein.
Konjugate zwischen Antikörpern und Analogen oder Derivaten von CC-1065 mit nicht-spaltbaren Bindungen können ebenfalls hergestellt werden. Der Antikörper kann mit vernetzenden Reagenzien wie z. B. Succinimidyl-4-(N-maleinimidomethyl)cyclohexan-1 carboxylat (SMCC), Sulfo-SMCC, m-Maleinimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS), Sulf-MBS oder Succinimidyl-jodoacetat, wie in der Literatur beschrieben, zur Einführung von 1 bis 10 reaktiven Gruppen modifiziert werden. Siehe Yoshitake et al., 101 Eur. J. Biochem. 395-399 (1979); Hashida et al., J. Applied Biochem. 56-63 (1984); und Liu et al., 18 Biochem. 690-697 (1979). Der modifizierte Antikörper wird dann mit dem Thiol-enthaltenden Analogen oder Derivat von CC-1065 unter Herstellung eines Konjugats umgesetzt. Das Konjugat kann durch Gel-Filtration durch eine Sephadex G-25-Säule gereinigt werden.
Die modifizierten Antikörper werden mit dem Thiol-enthaltenden CC-1065 (1,25 Moläquivalent/Maleinimido-Gruppe) behandelt. Die Gemische werden für etwa 1 h bei etwa 4ºC inkubiert. Die Konjugate zwischen Antikörpern und Analogen oder Derivaten von CC-1065 werden mittels Gel-Filtration durch eine Sphadex G-25-Säule gereinigt. Typischerweise sind durchschnittlich 1 bis 10 CC-1065-Moleküle oder Analoge/Antikörper gebunden.
Ein bevorzugtes Verfahren besteht darin, Antikörper mit Succinimidyl-4-(N- maleinimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxylat (SMCC) zur Einführung von Maleinimido- Gruppen zu modifizieren, worauf sich eine Reaktion des modifizierten Antikörpers mit den Thiol enthaltenden Analogen oder -Derivaten von CC-1065 unter Erhalt eines Thioethergebundenen Konjugats anschließt. Wieder werden Konjugate mit 1 bis 10 Arzneimittel- Molekülen pro Antikörper-Molekül erhalten.

IN VITRO-CYTOTOXIZITÄT VON KONJUGATEN ZWISCHEN ZELL-BINDEMITTELN UND ANALOGEN ODER DERIVATEN VON CC-1065

Die Cytotoxizität der Analogen und Derivate von CC-1065 und ihre Konjugate mit Zell-Binde-Mitteln für nicht-gebundene Zellinien wie z. B. Namalwa und SW2 kann durch Rück-Extrapolation der Zellprolieferationskurven, wie dies bei Goldmacher et al., 135 J. Immunol. 3648-3651 (1985) beschrieben ist, gemessen werden. Die Cytotoxizität dieser Verbindungen für gebundenen Zellinien wie z. B. A-365 und SCaBER kann durch Klonierungsversuche, wie sie bei Goldmacher et al., 102 J. Call Biol. 1312-1319 (1986) beschrieben sind, bestimmt werden.

THERAPEUTISCHES MITTEL UND VERFAHREN ZUM ABTÖTEN AUSGEWÄHLTER ZELLPOPULATIONEN

Die vorliegende Erfindung stellt auch ein therapeutisches Mittel zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen bereit, umfassend:
(a) eine cytotoxische Menge eines oder mehrerer der oben beschriebenen Analogen oder Derivate von CC-1065, verbunden mit einem Zell-Binde-Mittel, und
(b) ein(en) pharmazeutisch annehmbare(n/s) Träger, Verdünnungsmittel oder Vehikel.
Ebenso stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen bereit, welches kein Verfahren für die Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers oder Operation oder Therapie und diagnistische Methoden ist, ausgeführt am menschlichen oder tierischen Körper, umfassend das Inkontaktbringen einer Zellpopulation oder eines Gewebes, bei denen der Verdacht besteht, daß die Zellen diese ausgewählte Zellpopulation enthalten, mit einer cytotoxischen Menge eines cytotoxischen Mittels, das eines oder mehrere der oben beschriebenen Analogen oder Derivate von CC-1065, verbunden mit einem Zell-Binde-Mittel, umfaßt.
Das cytotoxische Mittel wird wie oben beschrieben hergestellt.
Geeignete pharmazeutisch annehmbare Träger, Verdünnungsmittel und Vehikel sind bekannt und können durch den Fachmann auf diesem Gebiet so festgelegt werden, wie es die klinische Situation erfordert.
Beispiele für geeignete Träger, Verdünnungsmittel und/oder Vehikel umfassen: (1) Dulbecco's Phosphat-gepufferte Salzlösung, pH etwa 7,8, die etwa 1 mg/ml bis 25 mg/ml humanes Serumalbumin enthält, (2) 0,9%ige Kochsalzlösung (0,9% G/V NaCl) und (3) 5%ige (G/V) Dextrose.
Das Verfahren zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen kann in vitro, in vivo oder ex vivo durchgeführt werden.
Beispiele für in vitro-Verwendungen umfassen Behandlungen von Zellkulturen, um alle Zellen abzutöten außer gewünschte Varianten, die das Ziel-Antigen nicht exprimieren; oder um Varianten abzutöten, die unerwünschtes Antigen exprimieren.
Die Bedingungen für eine nicht-klinische in vitro-Verwendung werden in einfacher Weise durch den Fachmann festgelegt.
Beispiele für ex vivo-Verwendungen umfassen Behandlungen von autologem Knochenmark vor seiner Transplantation in den gleichen Patienten, um erkrankte oder bösartige Zellen abzutöten: Behandlungen von Knochenmark vor der Transplantation, um kompetente T-Zellen abzutöten und einer Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung (GVHD) vorzubeugen.
Bei einer klinischen ex vivo-Verwendung zur Entfernung von Tumorzellen oder lymphoiden Zellen aus Knochenmark vor einer autologen Transplantation in der Krebsbehandlung oder in der Behandlung einer Autoimmunerkrankung oder zur Entfernung von T-Zellen und anderen lymphoiden Zellen aus allogenem Knochenmark oder -gewebe vor einer Transplantation, um GVHD zu verhindern, kann eine Behandlung wie folgt durchgeführt werden. Knochenmark wird aus einem Patienten oder einem anderen Individuum entnommen und dann in einem Medium, das Serum enthält, dem das cytotoxische Mittel der Erfindung zugesetzt ist, wobei die Konzentrationen von etwa 10 umol bis 1 pM reichen, enthält, für etwa 30 min bis etwa 48 h bei etwa 37ºC inkubiert. Die genauen Bedingungen von Konzentration und Inkubationszeit (= Dosis) werden in einfacher Weise von dem Fachmann festgelegt. Nach der Inkubation werden die Knochenmarkszellen mit Medium, das Serum enthält, gewaschen und durch i.v.-Infusion nach bekannten Verfahren zurück zum Patienten geführt. Wenn der Patient eine andere Behandlung wie z. B. eine ablative Chemotherapie oder eine Gesamtkörperbestrahlung zwischen der Zeit der Entnahme des Knochenmarks und der Reinfusion der behandelten Zellen erhält, werden die behandelten Markzellen unter Verwendung von medizinischem Standardgerät in flüssigem Stickstoff gefroren gelagert.
Für eine klinische in vivo-Verwendung wird das cytotoxische Mittel der Erfindung als Lösungen, die bezüglich Sterilität und bezüglich ihrer Endotoxin-Level untersucht sind, oder als lyophilisierter Feststoff, der in sterilem Wasser zur Injektion wieder aufgelöst werden kann, zugeführt. Beispiele geeigneter Protokolle einer Konjugatverabreichung sind wie folgt. Konjugate werden täglich 5 Tage lang entweder als i.v.-Bolus täglich 5 Tage lang oder als kontinuierliche Infusion über 5 Tage verabreicht. Bolus-Dosen werden in 50 bis 100 ml normaler Salzlösung, der humanes Serumalbumin (z. B. 0,5 bis 1 ml einer konzentrierten Lösung humanen Serumalbumins, 100 mg/ml) zugesetzt worden war, verabreicht. Kontinuierliche Infusionen werden in 250 bis 500 ml normaler Salzlösung, der z. B. 2,5 bis 5 ml der obigen konzentrierten Lösung von humanem Serumalbumins zugesetzt wurden, über einen Zeitraum von 24 h verabreicht. Die Dosierungen werden 10 ug bis 100 mg/kg Körpergewicht und Tag sein; bei i.v.-Verabreichung liegt die Dosis im Bereich von 1 ng bis 10 mg/kg und Tag. Ein bis vier Wochen nach der Behandlung kann der Patient eine zweite Behandlungskur erhalten. Spezifische klinische Protokolle hinsichtlich des Verabreichungswegs, der Vehikel, Verdünnungsmittel, Dosierungen, Zeiten, usw. können von dem Fachmann bestimmt werden, so wie es die klinische Situation erfordert.
Beispiele für medizinische Krankheitsbilder, die nach den in vivo- oder ex vivo- Verfahren zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen behandelt werden können, umfassen Malignität jeden Typs, einschließlich z. B. Lungen-, Brust-, Darm-, Prostata-, Nieren-, Pankreas-, Eierstock-Krebs und Krebs lymphatischer Organe; Melanome; Autoimmunerkrankungen wie z. B. systemischer Lupus, rheumatoide Arthritis und multiple Sklerose; Transplantatabstoßungen wie z. B. Nierentransplantat-Abstoßung, Lebertransplantat-Abstoßung, Lungentransplantat-Abstoßung, Herztransplantat-Abstoßung und Knochenmarkstransplantat-Abstoßung; Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung; virale Infektionen wie z. B. CMV-Infektion, HIV-Infektion, AIDS, usw.; bakterielle Infektion; und Parasiten-Infektionen, z. B. Giardiasis, Amoebiasis, Schistosomiasis und andere, wie sie vom Fachmann auf diesem Gebiet bestimmt werden.

BEISPIELE

Die Erfindung wird nun anhand nicht-beschränkender Beispiele erläutert. Wenn nichts anderes angegeben ist, sind alle Prozente, Verhältnisse, Teile, usw. auf das Gewicht bezogen.

MATERIALIEN UND VERFAHREN

Schmelzpunkte wurden unter Verwendung eines elektrothermischen Geräts gemessen und sind nicht korrigiert. NMR-Spektren wurden entweder mit einem Hitachi 1100-Gerät mit kontinuierlicher Welle (60 MHz) oder einem Bruker AM300 (300 MHz)- Spektrometer aufgezeichnet. Chemische Verschiebungen werden in ppm, bezogen auf TMS als inneren Standard, angegeben. Ultraviolett-Spektren wurden mit einem Hitachi U1200- Spektralphotometer aufgezeichnet. HPLC wurde unter Verwendung eines Rainin-HFLC- Systems, das mit einem Gilson-Detektor für variable Wellenlänge ausgestattet war, und einer Waters Radialpak-Umkehrphasen-C-18-Säule durchgeführt. Dünnschichtchromatographie wurde an Analtech GF-Silicagel-Platten zur Dünnschichtchromatographie durchgeführt. Silicagel zur Flash-Säulenchromatographie war von Baker. Tetrahydrofuran wurde durch Destillation über Lithiumaluminiumhydrid getrocknet. Dimethylacetamid und Dimethylformamid wurden durch Destillation über Calciumhydrid bei reduziertem Druck getrocknet. Alle anderen verwendeten Lösungsmittel hatten Analysenqualität oder HPLC- Qualität.
Humane kleine Zellen der Lungenkrebs-Zellinie 5W2 wurden vom Dana-Faber Cancer Institute erhalten. Humane Krebszellinien Namalwa (ATCC#CRL 1432), A-375 (ATCC#CRL 1619 und SCaßER (ATCC HTB 3) wurden von der American Type Culture Collection (ATCC), Bethesda, MD erhalten.

REFERENZBEISPIEL I

SYNTHESE DES MONOINDOLYL-CC-1065-ANALOGEN 7

Das Monoindolyl-CC-1065-Analoge 7 wurde nach dem Schema 1, das in Fig. 2 dargestellt ist, synthetisiert.

3-(Phenyldithio)propionsäure (4)

Diphenyldisulfid (9,33 g, 42,6 mmol) wurde in THF (40 ml) gelöst und anschließend mit einer Lösung vnn 3-Mercaptopropionäure (1,51 g. 14,2 mmol) in Methanol (40 ml) und 10 M NaOH (1,4 ml) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Stickstoffatmosphäre bei Raumtemperatur 3 h gerührt. Dann wurden die Lösungsmittel unter reduziertem Druck verdampft, der weiße Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst und durch Flash-Chromatographie an Silicagel gereinigt. Das Produkt wurde mit Ethylacetat : Hexan, die 5% Essigsäure enthielten, eluiert, wobei 4 als weißer Feststoff (1,82 g, 60%) erhalten wurde; Fp. 58-59ºC.
NMR (CDCl&sub3;)δ: 2,5-3,0 (m, 4H), 7,1 - 7,6 (m, 5H) und 10,8 (s, 1H).

5-[(3-Phenyldithio)propionylamino]-indol-2-carbonsäure (5)

Eine Lösung von 4 (535 mg, 2,50 mmol) in trockenem THF (10 ml) wurde in Argonatmosphäre auf -23ºC abgekühlt. Triethylamin (253 mg, 2,50 mmol) und Isobutylchlorformiat (340 mg, 2,50 mmol) wurde zugesetzt, dann wurde das Reaktionsgemisch bei dieser Temperatur 30 min gerührt. Eine Lösung von 5-Aminoindol-2- carbonsäure {M.A. Warpehoski et al., 31, J. Med. Chem., 590-603 (1988) und S.M. Parmerter et al., 80, J. Med. Chem. Soc., 4621 (1958)f (545 mg, 3,1 mmol) in trockenem DMF (2 ml) wurde zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde sich auf Raumtemperatur erwärmen gelassen; dann wurde für weitere 45 min gerührt. Der Niederschlag wurde durch Filtration entfernt und das Filtrat wurde unter reduziertem Druck eingedampft, wobei ein brauner Rückstand erhalten wurde. Säulenchromatographie an Silicagel unter Eluieren mit Ethylacetat : Hexan, die 5% Essigsäure enthielten, lieferte Verbindung 4 als gelbbraun gefärbtes Produkt (185 mg, 20%).
NMR (DMSO-d&sub6;)δ: 2,27 (t, 2H, J = 7 Hz), 3,06 (t, 2H, J = 7 Hz), 7,00 (s, 1 H), 7,1 - 7,7 (m, 8H), 7,98 (s, 1H), 9,92 (s, 1H), 11,62 (s, 1H).

Monoindolyl-CC-1065-Analoges 6

CPI wurde an Carbonsäure 5 gebunden und das Produkt wurde gereinigt, wie es bereits früher beschrieben wurde {M.A. Warpehoski et al., 31, J. Med. Chem., 590-603 (1988)}.
NMR (Aceton d&sub6;)δ: 2,42 (s, 3H), 2,83 (t, 2H, J = 7 Hz), 3,1 S (t, 2H, J = 7Hz), 3,50 - 3,65 (m, 1 H), 3,85-4,20 (m, 2H), 4,50 - 4,35 (m, 2H), 7,00-8,95 (m, 11 H), 8,16 (s, 1 H), 9,17 (s, 1 H), 9,93 (s, 1 H), 10,75 (s, 1 H).

Monoindolyl-CC-1065-Analoges 7

Eine Probe von Disulfid 6 (1,4 umol) wurde in Acetonitril (0,26 ml) gelöst und unter Argonatmosphäre auf 4ºC gekühlt. Eine Lösung von Dithiothreit (1,5 umol) in 0,1 M Kaliumphosphat-Puffer pH 7,5 (0,06 ml) wurde zugesetzt und das Fortschreiten der Reaktion (die in 1 h vollständig war) wurde durch HPLC überwacht, wobei eine Waters- Radialpak-Umkehrphasen-C-18-Säule verwendet wurde und mit einem Gradienten von Acetonitril : Wasser (50% CH&sub3;CN 0-8 min. 50-100% CH&sub3;CN 8-12 min. Durchflußgeschwindigkeit = 1,5 ml/min) eluiert wurde. Das Ausgangsmaterial 6 hatte eine Retentionszeit von 12,3 min. während das Produkt 7 bei 5,7 min eluiert wurde. Der Thiol- Gehalt von 7 wurde unter Verwendung des kolorimetrischen Ellmans-Assays bestimmt und entsprach exakt der Konzentration des Arzneimittels, wie sie spektralphotometrisch bestimmt worden war.

REFERENZBEISPIEL II

SYNTHESE DES INDOLYL-BENZOFURANYL-CC-1065-ANALOGEN 18

Das Indolyl-benzofuranyl-CC-1065-Analoge 18 wurde nach den Schemata 2a, 2b und 2c, die in den Fig. 3A, 3B und 3C dargestellt sind, synthetisiert.

t-Butyl-5-nitroindol-2-carboxylat (9)

Zu einer gerührten Lösung von Ethyl-5-nitroindol-2-carboxylat (8) (4,3 g, 19,5 mmol) in 100 ml THF-Methanol (1 : 1, V/V) wurde bei Raumtemperatur unter Argon eine Lösung von NaOH (12 g, 300 mmol) in 300 ml Wasser gegeben. Die resultierende tiefrotbraune Lösung wurde 3 h gerührt, dann durch Ansäuern auf pH 1 mit verdünnter HCl abgeschreckt. Ausgefälltes Produkt wurde durch Vakuumfiltration gesammelt und das verbleibende gelöste Produkt wurde mit THF : Ethylacetat (1 : 1 V/V) extrahiert. Der Niederschlag wurde in THF gelöst und diese Lösung wurde mit den organischen Schichten aus den Extraktionen vereinigt. Trocknen über Magnesiumsulfat und Verdampfen des Lösungsmittels lieferte 5-Nitroindol-2-carbonsäure (3,6 g, 90% Ausbeute) als leichtbraunen Feststoff:
NMR (Aceton d&sub6;):δ 7,0-9,0 (m, 4H), δ 9,5 (s, 1H), δ 12,5 (s, 1H).
Zu einer gerührten Lösung von 5-Nitroindol-2-carbonsäure (3,1 g, 15 mmol) in 150 ml THF wurde unter Argon Oxalylchlorid (4,8 g, 37,6 mmol) gefolgt von 0,1 ml DMF gegeben, was eine starke Gasentwicklung verursachte. Nach 40 min wurde das Reaktionsgemisch zur Trockene eingedampft. Der resultierende Feststoff wurde wieder 100 ml THF gelöst und auf -23ºC abgekühlt und unter Argon gerührt. Danach wurde über einen Zeitraum von 30 min eine Lösung von Kalium-t-Butoxid (1,0 M in THF, 45 ml, 45 mmol) zugesetzt und es wurde für weitere 20 min gerührt. Die Reaktion wurde mit 5 Volumina Wasser beendet, mit verdünnter HCl neutralisiert und mit Ethylacetat extrahiert. Die organischen Extrakte wurden mit gesättigtem wäßrigem Natriumbicarbonat gewaschen, dann über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und konzentriert, wobei 6 (3,24 g, 83% Ausbeute) als brauner Feststoff erhalten wurde:
NMR (Aceton-d&sub6;):δ 1,6 (s, 9H), δ 7,4-8,9 (m, 5H).

t-Butyl-5-aminoindol-2-carboxylat (10)

Ein Kolben wurde mit 9 (3,5 g, 13,3 mmol) und 100 ml trockenem THF beschickt und mit Argon gespült. Zu dieser Lösung wurde dann Palladium-Hydrierungskatalysator (10% auf Kohle, 0,6 g) gegeben und 2,5 Tage lang wurde Wasserstoff in das Reaktionsgemisch blubbern gelassen. Der Katalysator wurde durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel wurde verdampft, wobei 10 (2,8 g, 91% Ausbeute) als brauner Feststoff erhalten wurde:
NMR (Aceton-d&sub6;): δ 1,6 (s, 9H), δ 6,6-7,6 (m, 4H).
Anmerkung: Dieses Produkt ist instabil, kann aber in einer inerten Atmosphäre bei - 20ºC im Dunklen gelagert werden.

t-Butyl-5-(brommethyl)benzofuran-2-carboxylat (13)

5-Methylbenzofuran-2-carbonsäure (11) wurde zunächst wie folgt in ihren t-Butylester übergeführt. Zu einer gerührten Lösung von 11 (20 g, 114 mmol) in 250 ml trockenem THF wurden unter Argon Oxalylchlorid (45 g, 356 mmol) und 0,25 ml DMF gegeben, was eine starke Gasentwicklung verursachte. Nach 40 min wurde die Lösung zur Trockene eingedampft. Der feste Rückstand wurde in 250 ml trockenem THF wieder aufgelöst und auf -23ºC gekühlt, wobei unter Argon gerührt wurde. Danach wurde eine Lösung von Kalium-t-butoxid (1,0 M in THF, 280 ml, 280 mmol) tropfenweise über einen Zeitraum von 1 h zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde in 600 ml Wasser gegossen, dann mit Ethylacetat extrahiert. Die organischen Extrakte wurden mit gesättigter wäßriger Natriumbicarbonat-Lösung und Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter Erhalt des Esters (24,4 g, 93% Ausbeute) als gelbe Flüssigkeit eingeengt, welche beim Abkühlen auf -20ºC fest wurde:
NMR (CDCl&sub3;): δ 1,6 (s, 9H), δ 2,4 (s, 3H), δ 7,1 - 7,6 (m, 4H).
Zu einer gerührten Lösung dieses Esters (10 g, 43,1 mmol) in 100 ml destilliertem Tetrachlorkohlenstoff wurden N-Bromsuccinimid (9,2 g, 51,7 mmol) und Benzoylperoxid (0,2 g, 0,81 mmol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei Rückfluß erhitzt. Das Fortschreiten der Reaktion wurde durch NMR überwacht (Methyl: δ 2,4; Brommethyl: δ 4,6; Dibrommethyl: δ 6,8), da es wichtig ist, die Reaktion zu stoppen, bevor eine deutliche Bildung der dibromierten Verbindung erfolgt ist. Ausgefallenes Succinimid wurde aus der Lösung abfiltriert; das Filtrat wurde der Reihe nach mit Wasser, gesättigter wäßriger Natriumbicarbonat-Lösung und wieder mit Wasser gewaschen. Die Tetrakohlenstoff- Lösung wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt, wobei 12 (12,9 g, 96% Ausbeute) als gelblich weißer Feststoff erhalten wurde:
NMR (CDCl&sub3;): δ 1,6 (s, 9H), δ 4,6 (s, 2H), δ 7,3 - 7,9 (m, 4H).

t-Butyl-5-(8-acetylthiomethyl)benzofuran-2-carboxylat (13)

Zu einer gerührten Lösung von 12 (10 g, 30,6 mmol) in 100 ml trockenem Aceton wurde unter Argon bei Raumtemperatur Kaliumthioacetat (6,11 g, 53,5 mmol) zugesetzt. Nach 3,5 h wurde das Reaktionsgemisch mit 400 ml gesättigter wäßriger Natriumbicarbonat-Lösung behandelt und mit Chloroform extrahiert. Die Chloroform-Schicht wurde mit Bicarbonat-Lösung und Wasser gewaschen, dann über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und konzentriert, wobei ein dickes schwarzes Öl erhalten wurde. Das Rohprodukt wurde durch Chromatographie an einer Silicagelsäule gereinigt, mit Ethylacetat : Hexan (10 : 90) eluiert, wobei 13 (5,2 g, 55% Ausbeute) als blaßgelber Feststoff erhalten wurde:
NMR (Aceton-d&sub6;): δ 1,6 (s, 9H), δ 2,3 (s, 3H), δ 4,2 (s, 2H), δ 7,2 - 7,7 (m, 4H).

t-Butyl-5-(2-pyridyldithiomethyl)benzofuran-2-carboxylat (14')

Eine Lösung von 13 (1,0 g, 3,3 mmol) in 50 ml absolutem Ethanol wurde unter Argon bei Raumtemperatur gerührt und mit einer Lösung von Natriumborhydrid (2,5 g, 65 mmol) in 75 ml Ethanol behandelt. Als eine TLC (Dünnschichtchromatographie)- Analyse (Silicagel, Chloroform : Hexane 60 : 40) des Reaktionsgemisches keinen restlichen Ausgangsester (etwa 2 h) zeigte, wurde das Reaktionsgemisch auf 0ºC abgekühlt und mit 30 ml Wasser behandelt. Der pH der Lösung wurde durch Zusatz von Eisessig auf 4 gesenkt. Dann wurde die Lösung durch Zusatz von 3 M NaOH-Lösung auf pH 5 gebracht. Es wurde eine Lösung von 2-Pyridyldisulfid (2,87 g, 13 mmol) in 10 ml absolutem Ethanol zugesetzt und das Reaktionsgemisch 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde durch Zusatz von gesättigter wäßriger Bicarbonat-Lösung abgeschreckt, dann wurde das Gemisch mit Chloroform extrahiert. Die Chloroform-Schicht wurde mit Natriumbicarbonat-Lösung und Wasser gewaschen, danach über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. Das Rohprodukt wurde dann durch Chromatographie an einer Silicagel-Säule gereinigt und mit Ethylacetat : Hexan (20 : 80) gereinigt. Das Rohprodukt 14 wurde als weißer Feststoff isoliert:
NMR (CDCl&sub3;): δ 1,6 (s, 9H), δ 4,1 (s, 2H), δ 6,8-7,6 (m, 7H), δ 8,3 - 8,5 (m, 1H).

5-(2-Pyridyldithiomethyl)benzofuran-2-carbonsäure (15')

Zu 15 ml Trifluoressigsäure von 0ºC, die unter Argon gerührt wurde, wurde der Ester 14 (2,2 g, 5,9 mmol) zugesetzt. Nach 1,5 h wurde die Trifluoressigsäure aus dem Reaktionsgemisch abgezogen, wobei 15 (1,8 g, 97% Ausbeute) als weißer Feststoff erhalten wurde:
NMR (DMSO-d&sub6;): δ 4,3 (s, 2H), δ 7,0 - 7,8 (m, 7H), δ 8,3 - 8,5 (m, 1H).

t-Butyl-5-{[5-(2-pyridyldithiomethyl)benzofuran-2-ylcarbonyl]amino}indol-2- carboxylat (16)

Eine gerührte Lösung von 15 (247 mg, 0,78 mmol) in 30 ml trockenem THF wurde bei Raumtemperatur unter Argon der Reihe nach mit Lösungen von Dicyclohexylcarbodümid (177 mg, 0,86 mmol) in S ml Methylenchlorid, 4-(Dimethylamino)-pyridin (29 mg, 0,23 mmol) in 2 ml Methylenchlorid und 10 (200 mg, 0,86 mmol) in 5 ml Methylenchlorid behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht gerührt. Dicyclohexyharnstoff wurde aus dem Reaktionsgemisch abfiltriert und das Filtrat wurde mit Wasser, kalter 0,1 M HCl, gesättigter wäßriger Natriumbicarbonat-Lösung und wieder mit Wasser gewaschen. Die organische Lösung wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und konzentriert, wobei ein dunkles Öl erhalten wurde. Das Rohprodukt wurde außerdem durch Chromatographie an einer Silicagel-Säule und Eluieren mit Ethylacetat : Hexan gereinigt, wobei 16 als schmutzigweißer Farbstoff erhalten wurde:
NMR (Aceton-d&sub6;): δ 1,6 (s, 9H), δ 4,3 (s, 2H), δ 7,0-8,6 (m, 12H).

5-{[5-2-Pyridyldithiomethylbenzofuran-2-yl-carbonyl]amino}indol-2-carbonsäure

Zu 4 ml Trifluoressigsäure, die auf 0ºC gekühlt war und unter Argon gerührt wurde, wurde 16 (120 mg, 0,23 mmol) gegeben. Nach 2 h wurde Trifluoressigsäure unter reduziertem Druck entfernt, wobei 17 als schmutzigweißer Farbstoff erhalten wurde: NMR (Aceton-d&sub6;): δ 4,3 (2, 2H), δ 7,3-8,7 (m, 12H).

Indolyl-benzofuranyl-CC-1065-Analoges 18

CPI wurde mit 17 in Gegenwart von EDC wie es vorher beschrieben wurde, verbunden, wobei 18 erhalten wurde. Die Analyse von 18 an einer Waters-Umkehrphasen- C-18-HPLC-Säule unter Verwendung von Gemischen aus Acetonitril und Wasser als Elutionsmittel (Programm: 0-4 min 60% CH&sub3;CN; 4-5 min 0-100% CH&sub3;CN; 5-15 min 100% CH&sub3;CN; Durchflußgeschwindigkeit 1,5 ml/min) lieferte einen einzelnen Peak, der bei 8,2 min eluiert wurde.

REFERENZBEISPIEL III

SYNTHESE DES BISINDOLYL-CC-1065-ANALOGEN 22

Das Bisindolyl-CC-1065-Analoge 22 wurde nach dem Schema 3, das in Fig. 4 dargestellt ist, synthetisiert.

t-Butyl-(3'-phenyldithiopropionyl)-5-aminoindol-2-carboxylat (19)

Zu einer gerührten Lösung von 3-Phenyldithiopropionsäure (4) (1,40 g, 6,54 mmol) in wasserfreiem THF (15 ml) bei -23ºC wurde Isobutylchlorformiat (0,93 ml, 7,19 mmol) und unmittelbar danach Triethylamin (1,01 ml, 7,19 mmol) gegeben. Nach 15-minütigem Rühren bei -23ºC wurde eine Lösung von t-Butyl-5-aminoindol-2-carboxylat (10) (1,52 g, 6,54 mmol) und Triethylamin (0,92 ml, 6,54 mmol) in wasserfreiem THF (15 ml) langsam über einen Zeitraum von 5 min zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 30 min bei -23ºC gerührt, auf Umgebungstemperatur gebracht und für weitere 30 min gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Zusatz von 50 ml 0,5 M HCl angesäuert und mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde mit Wasser, gesättigtem NaHCO&sub3; und dann wieder mit Wasser gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;) und konzentriert. Der Rückstand wurde an Silicagel chromatographiert, wobei mit einem Gradienten von Ethylacetat in Hexanen eluiert wurde. Das Produkt 19 wurde als schmutzigweißer Feststoff erhalten (1,43 g, 51% Ausbeute).
NMR (Aceton-d&sub6;): δ 1,6 (s, 9H), δ 2,9-3, 3 (m, 4H), δ 7,0-8,1 (m, 9H), δ 9,15 (s, 1H).

t-Butyl-5-[(3'-phenyldithiopropionyl)indol-2-yl-carbonylamino]indol-2-carboxylat

Der Ester 19 (1,4 g, 3,3 mmol) wurde bei 0ºC in einer Argonatmosphäre mit Trifluoressigsäure (14 ml) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde bei dieser Temperatur 1 h lang gerührt. Danach wurde die Lösung unter reduziertem Druck zur Trockene eingeengt und die resultierende Carbonsäure wurde ohne weitere Reinigung im nächsten Schritt eingesetzt.
Die oben erhaltene Carbonsäure (250 mg, 0,64 mmol) wurde in wasserfreiem DMF (1 ml) gelöst, unter Argonatmosphäre gerührt und mit Lösungen von Aminester 10 (149 mg, 0,64 mmol) in DMF (0,5 ml) und EDC (124 mg, 0,64 mmol) in DMF (0,5 ml) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 48 h lang gerührt. Es wurde kalte 0,5 M HCl 4 (25 ml) zugesetzt und das Gemisch wurde mit 1 : 1 (V/V) THF: Ethylacetat (4 · 50 ml) extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden der Reihe nach mit H&sub2;O (4 · 100 ml), gesättigter NaHCO&sub3;-Lösung (2 · 100 ml) und wieder mit H&sub2;O (2 · 100 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet (MgSO&sub4;), filtriert und die Lösungsmittel wurden bei reduziertem Druck zur Trockene abgedampft. Der Rückstand wurde an einer Silicagel-Säule chromatographiert, wobei mit Aceton : Toluol (30 : 70 V/V) eluiert wurde und das Rohprodukt 20 (200 mg, 52% Ausbeute) erhalten wurde.
NMR (DMSO-d&sub6;): 8,12 - 7,10 (m, 13H), 3,3 - 2,77 (m, 4H), 1,58 (s, 9H).

UMWANDLUNG VON 20 IN DAS BISINDOLYL-CC-1065-ANALOGE 21

Der Ester 20 wurde mit Trifluoressigsäure bei 0ºC, wie es oben für die Hydrolyse des Esters 19 beschrieben wurde, zu der Carbonsäure hydrolysiert. Die erhaltene Carbonsäure wurde mit EDC, wie es vorher beschrieben wurde, {M.A. Warpehoski et al., 31, J. Med. Chem., 590-603 (1988)}, an CPI gebunden, wodurch das Bisindolyl-CC-1065- Analoge 21 erhalten wurde. Die Analyse von 21 durch HPLC an einer Waters- Umkehrphasen-C-18-Säule unter Verwendung von Gemischen aus Acetonitril und Wasser als Elutionsmittel (Programm: 60 bis 100% CH&sub3;CN in 10 min. 100% CH&sub3;CN für 5 min. Durchflußgeschwindigkeit 2,5 ml/min) ergab einen einzelnen Peak für 21 mit einer Retentionszeit von 10,1 min.

REDUKTION VON 21 ZU DEM THIOL-ENTHALTENDEN CC-1065- ANALOGEN 22

Eine Lösung des Bisindolyl-CC-1065-Analogen 21 (0,04 umol) in Acetonitril: THF (0,08 ml) (1 : 1, V/V) wurde mit einer Lösung von Dithiothreit (0,06 umol) in 0,1 M Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,5 (0,014 ml), der 3 mM EDTA enthielt, behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde für 4 H bei 4ºC unter Argonatmosphäre gehalten. In dieser Zeit wurde eine zusätzliche Portion Dithiothreit (0,18 umol) zugesetzt. Nach 30 min wurde das Reaktionsgemisch durch HPLC gereinigt (Bedingungen wie sie oben zur Reinigung von 21 beschrieben wurden). Ein neuer Peak mit einer Retentionszeit von 8,0 min wurde als Thiolenthaltendes CC-1065-Analoges 22 identifiziert. Dieser Peak hatte ein charakteristisches Absorptionsspektrum und reagierte unter Verwendung des Ellmans Assay auf Thiol positiv {G.L. Ellman, 82, Arch. Biochem. Biophys., 70 (1959)}.

REFERENZBEISPIEL IV

KONJUGATION VON ARZNEIMITTELN MIT ANTIKÖRPERN

Die Konjugation von Arzneimitteln mit Antikörpern wurde wie folgt durchgeführt:
Verfahren A: Arzneimittel enthält eine Thiol-Gruppe: Der Antikörper wurde mit SPDP [N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat] zur Einführung von Dithiopyridyl- Gruppen modifiziert. Die Reaktion des Thiol-enthaltenden Arzneimittels mit dem modifizierten Antikörper produzierte Disulfid-gebundene Konjugate. (Siehe Fig. 5A).
Verfahren B: Das Arzneimittel enthält eine aktivierte Disulfid-Gruppe: Der Antikörper wurde mit 2-Iminothiolan zur Einführung von Thiol-Gruppen modifiziert. Die Reaktion des modifizierten Antikörpers mit dem Arzneimittel produzierte Disulfidgebundene Konjugate. (Siehe Fig. 5B).
Verfahren A: Antikörper N901 wurde mit SPDP wie es vorher beschrieben wurde {J. Carlsson et al., 173 Biochem. J, 723 (1978)} zur Einführung von durchschnittlich 4 bis 6 Dithiopyridyl-Gruppen pro Molekül Antikörper modifiziert. Eine Lösung des Antikörpers mit einer Konzentration von 4 mg/ml in 0,1 M Kaliumphosphat, pH 7,0, das 2 mmol EDTA enthielt, wurde mit einem 10-fachen molaren Überschuß von SPDP in Ethanol behandelt, dann wurde das Gemisch 30 min bei 30ºC inkubiert. Der modifizierte Antikörper wurde mittels Gel-Filtration durch eine Sephadex G-25-Säule gereinigt und danach mit einem 10- fach molaren Überschuß des Thiol-enthaltenden Arzneimittels in Dimethylacetamid (DMA), so daß die finale DMA-Konzentration < 10% war, inkubiert. Das Konjugationsgemisch wurde unter Argonatmosphäre im Dunkeln bei 20ºC 3 h lang inkubiert und dann gereinigt, indem es durch eine Sephadex G-25-Gel-Filtrationssäule geführt wurde, um nicht-konjugiertes Arzneimittel und anderes Material mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen. Durch dieses Verfahren wurden Konjugate erhalten, die durchschnittlich 4 Moleküle Arzneimittel pro Antikörper-Molekül enthalten.
Verfahren B: Antikörper N901 wurde unter Verwendung von 2-Iminothiolan (2-IT) zur Einführung von durchschnittlichen 4 bis 6 Thiol-Gruppen pro Antikörper Molekül, wie es vorher beschrieben wurde {J.M. Lambert et al., 260 J. Biol. Chem., 12035 (1985)} modifiziert. Eine Lösung des Antikörpers mit einer Konzentration von 4 mg/ml in 0,1 M Triethanolamin-Puffer, pH 8,0, der 2 mmol EDTA enthielt, wurde mit einer Lösung von 2- Iminothiolan (Endkonzentration = 1,5 mM) behandelt und 90 min lang bei 4ºC in einer Argonatmosphäre inkubiert. Der modifizierte Antikörper wurde durch Gel-Filtration durch eine Sephadex G-25-Säule gereinigt. Der Thiol-Einbau wurde unter Anwendung des Ellmans-Tests {82, Arch. Biochem. Biophys., 70 (1959)} bestimmt. Zu dem modifizierten Antikörper wurde eine Lösung von 16 in DMA derart, daß ein 10-fach molarer Überschuß von 16 verwendet wurde und die Endkonzentration von DMA < 10% war, gegeben. Das Konjugationsgemisch, das trüb wurde, wurde unter Argonatmosphäre im Dunkeln bei 20ºC 3 h lang inkubiert. Die Lösung wurde durch Zentrifugation geklärt und dann zur Entfernung von nicht-umgesetzten Arzneimittel auf eine Sephadex G-25-Gel-Filtrationssäule aufgebracht. Das resultierende Konjugat enthielt im Durchschnitt 3 bis 5 Moleküle Arzneimittel pro Antikörper-Molekül.

REFERENZBEISPIEL V

IN VITRO-CYTOTOXIZITÄT UND -SPEZIFITÄT DER ANTIKÖRPER-SS- ARZNEIMITTEL-KONJUGATE

IN VITRO-CYTOTOXIZITÄT VON N901-SS-ARZNEIMITTEL 7

Die in vitro-Cytotoxizität eines Disulfid-gebundenen Konjugats des Monoindolyl- CPI-Derivats 7 mit dem Antikörper N901, das durchschnittlich 3,3 Arzneimittel-Moleküle pro Antikörper-Molekül enthielt, wurde an Antigen-positiven SW2-Zellen und Antigennegativen Namalwa-Zellen gemessen. Zellen wurden dem Konjugat 24 h lang bei 37ºC ausgesetzt, dann wurden die überlebenden Zellfraktionen unter Verwendung eines Wachstums-Rückextrapolations-Tests bestimmt {V.S. Goldmacher et al., 135, J. Immunol., 3648-3651 (1985)).
Die Resultate sind in Fig. 6 dargestellt. In Fig. 6 stellt die Abszisse die Arzneimittelkonzentration dar und stellt die Ordinate die Fraktion überlebender Zellen dar. Ausgefüllte Kreise stehen für SW2-Zellen und offene Kreise stehen für Namalwa-Zellen.
Die Resultate zeigen, daß dieses Konjugat gegenüber den Antigen-positiven SW2- Zellen mit einem IC&sub5;&sub0;-Wert von 1,4 · 10&supmin;¹¹ M äußerst cytotoxisch ist. Im Gegensatz dazu ist dieses Konjugat für die Antigen-negativen Namalwa-Zellen selbst bei 1 · 10&supmin;&sup9; M nicht toxisch, was die Spezifität des cytotoxischen Effektes zeigt. Der Zusatz eines 1000-fachen Überschuß an nicht-konjugiertem Antikörper hebt die Cytotoxizität für SW2-Zellen auf, was weiter die Antigen-Spezifität des cytotoxischen Effektes beweist.
Die in vitro-Cytotoxizität des oben beschriebenen Disulfid-gebundenen Konjugats wurde auch an Antigen-positiven A-375-Zellen und Antigen-negativen ScABER-Zellen gemessen. Die Zellen wurden dem Konjugat 24 h bei 37ºC ausgesetzt, dann wurden die überlebenden Zellfraktionen unter Verwendung eines klonogenen Assays bestimmt {C.F. Scott et al., 25, Cancer Immunol Immunother., 31-40 (1987)).
Die Resultate sind in Fig. 7 dargestellt. In Figur gibt die Abszisse die Arzneimittelkonzentration an und gibt die Ordinate die Fraktion an überlebenden Zellen an. Ausgefüllte Kreise stehen für A-375-Zellen und offene Kreise stehen für SCaBER-Zellen.
Die Resultate zeigen, daß dieses Konjugat gegenüber der Melanom-Zellinie A-375 etwas weniger cytotoxisch war (IC&sub5;&sub0; = 2 · 10&supmin;¹&sup0; M, Fig. 7). Die verringerte Cytotoxizität stimmt mit der Tatsache überein, daß diese Zellinie viel weniger Antigene für N901 exprimiert. Hier ist das Konjugat gegenüber der Antigen-negativen humanen Blasenkrebs- Zellinie SCaBER nicht toxisch (überlebende Fraktion = 100% bei 1 · 10&supmin;&sup9; M).

IN VITRO-CYTOTOXIZITÄT VON N901-SS-ARZNEIMITTEL 18

Die in vitro-Cytotoxizität eines Disulfid-gebundenen Konjugats des Indolylbenzofuran-CC-1065-Analogen 18 mit Antikörper N901, das durchschnittlich nur zwei Arzneimittelmoleküle pro Antikörpermolekül enthält, wurde an Antigen-positiven SW2- Zellen und Antigen-negativen Namalwa-Zellen gemessen. Die Zellen wurden dem Konjugat 24 h lang bei 37ºC ausgesetzt, dann wurden die überlebenden Zellfraktionen unter Verwendung eines Wachstums-Rückextrapolations-Assays bestimmt {V.S. Goldmacher et al., 135, J. Immunol., 3648-3651, (1985)}.
Die Resultate sind in Fig. 8 dargestellt. In Fig. 8 stellt die Abszisse die Arzneimittelkonzentration dar und stellt die Ordinate die Fraktion der überlebenden Zellen dar. Ausgefüllte Kreise stehen für SW2-Zellen und offene Kreise stehen für Namalwa- Zellen.
Die Resultate zeigen, daß dieses Konjugat für die Antigen-positiven SW2-Zellen mit einem IC&sub5;&sub0;-Wert von 1 · 10&supmin;¹&sup0; M hoch cytotoxisch ist (99,9% Zellen wurden bei 1 · 10&supmin;&sup9; M abgetötet), während es für die Antigen-negativen Namalwa-Zellen selbst bei einer 100-mal höheren Konzentration (bei 1 · 10&supmin;&sup8; M), was die höchste getestete Konzentration ist, nicht toxisch ist, 100% der Zellen überlebten.

IN VITRO-CYTOTOXIZITÄT VON N901-SS-ARZNEIMITTEL 22

Die in vitro-Cytotoxizität eines Disulfid-gebundenen Konjugats des Indolylbenzofuran-CC-1065-Analogen 22 mit Antikörper N901, das durchschnittlich nur 4 Arzneimittelmoleküle pro Antikörpermolekül enthält, wurde an Antigen-psotiven SW2- Zellen und Antigen-negativen Namatwa-Zellen gemessen. Die Zellen wurden dem Konjugat 24 h lang bei 37ºC ausgesetzt, und die überlebenden Zellfraktionen wurden unter Verwendung eines Wachstums-Rückextrapolations-Tests bestimmt {V.S. Goldmacher et al., 135, J. Immunol., 3648-3651, (1985)}.
Die Resultate sind in Fig. 9 dargestellt. In Fig. 9 stellt die Abszisse Konjugat- oder Arzneimittelkonzentration dar und stellt die Ordinate die Fraktion der überlebenden Zellen dar. Die Kreise stellen Daten für das Konjugat für die Antigen-positiven SW2-Zellen dar, die Dreiecke stellen Daten für das freie CC-1065-Analoge 22 dar, die Quadrate stellen Daten für das Konjugat in Gegenwart von freiem Antikörper dar und die Rauten stellen Daten für das Konjugat für die Antigen-negativen Namalwa-Zellen dar.
Die Resultate zeigen, daß dieses Konjugat für die Antigen-positiven SW2-Zellen mit einem IC&sub5;&sub0;-Wert von 1,9 · 10&supmin;¹¹ M in hohem Maße cytotoxisch ist (99,9% der Zellen wurden bei 2 · 10&supmin;&sup9; M abgetötet), während es für Antigen-negative Namalwa-Zellen selbst bei einer 100-mal höheren Konzentration (bei 10 · 10&supmin;&sup9; M) viel weniger toxisch ist.
Obgleich die Erfindung anhand spezifischer Ausführungsformen detailliert beschrieben wurde, ist es dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt, daß verschiedene Änderungen und Modifizierungen daran durchgeführt werden können, ohne den Geist und Schutz der Erfindung zu verlassen.
Die folgenden nummerierten Absätze zeigen Besonderheiten einiger Ausführungsformen der Erfindung auf.
1. Cytotoxisches Mittel, umfassend ein Zell-Binde-Mittel verbunden mit einem oder mehreren Analogen oder Derivaten von CC-1065,
wobei vor dem Binden dieser Derivate diese Derivate ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus einer A-Untereinheit der Formeln (A-1) oder (A-2), kovalent verbunden mit einer B-Untereinheit oder einer B-C-Untereinheit der Formeln (F-1), (F-2), (F-3), (F-4), (F-5), (F-6), (F-7), (F-8), (F-9) oder (F-10) über eine eine Amid-Bindung zwischen der sekundären Amino-Gruppe der Pyrrol-Gruppierung der A-Untereinheit und der C-2-Carboxyl-Gruppe der B-Untereinheit,
wobei die Formeln A-1 und A-2 wie folgt sind:
und wobei die Formeln (F-1) bis (F-10) wie folgt sind:
worin in einer gegebenen Formel einer von entweder R und R' oder R&sub4; für eine Gruppierung steht, die die Bindung des Analogen oder Derivats von CC-1065 an ein Zell- Binde-Mittel ermöglicht, falls R oder R' für Gruppierungen stehen, die die Bindung ermöglichen, dann stehen R&sub1; bis R&sub6;, die identisch oder unterschiedlich sein können, für Wasserstoff, lineare C&sub1;-C&sub3;-Alkyl, Methoxy, Hydroxyl, primäres Amin, sekundäres Amin, tertiäres Amin oder Amido; und falls R&sub4; für eine Gruppierung steht, die Bindung ermöglicht, stehen R, R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub5; und R&sub6;, die identisch oder unterschiedlich sein können, für Wasserstoff, lineares C&sub1;-C&sub3;-Alkyl, Methoxy, Hydroxyl, primäres Amin, sekundäres Amin, tertiäres Amin oder Amido, und steht R' für NH&sub2;, Alkyl, O-Alkyl, primäres Amin, sekundäres Amin, tertiäres Amin oder Amido.
2. Das cytotoxische Mittel nach Absatz 1, wobei R und R' Gruppierungen darstellen, die die Bindung ermöglichen, und R&sub1; bis R&sub6; Wasserstoff bedeuten.
3. Das cytotoxische Mittel nach Absatz 1 oder 2, wobei R und R' Gruppierungen bedeuten, die eine Bindung des Analogen oder Derivats von CC-1065 an das Zell-Binde-Mittel über eine Disulfid-Bindung ermöglichen.
4. Das cytotoxische Mittel nach Absatz 1 oder 2, wobei R für NHCO(CH&sub2;)lSZ&sub0;, NHCOC&sub6;H&sub4;(CH&sub2;)lSZ&sub0; oder O(CH&sub2;)lSZ&sub0; steht, und R' für (CH&sub2;)lSZ&sub0;, NH(CH&sub2;)lSZ&sub0; oder O(CH&sub2;)lSZ&sub0; steht, worin
Z&sub0; für H oder SR&sub7; steht, worin R&sub7; für Methyl, lineares Alkyl, verzweigtes Alkyl, cyclisches Alkyl, einfaches oder substituiertes Aryl oder eine heterocyclische Gruppe steht; und
l eine ganze Zahl von 1 bis 10 bedeutet.
5. Das cytotoxische Mittel nach Absatz 4, wobei Z&sub0; für Wasserstoff steht und P für 2 steht.
6. Das cytotoxische Mittel nach Absatz 4, wobei Z&sub0; für SRγ steht, R&sub7; eine heterocyclische Gruppe bedeutet und Q für 1 steht.
7. Das cytotoxische Mittel nach Absatz 6, wobei R&sub7; für eine 2-substituierte Pyridin-Gruppe steht.
8. Das cytotoxische Mittel nach Absatz 1 oder 2, wobei R und R' für Gruppierungen stehen, die eine Bindung des Analogen oder Derivats von CC-1065 an ein Zell-Binde-Mittel über eine säurelabile Gruppe, eine photolabile Gruppe, eine Peptidaselabile Gruppe oder eine Esterase-labile Gruppe ermöglichen.
9. Das cytotoxische Mittel nach Absatz 1 oder 2, wobei das Zellbindemittel ein Peptid oder ein Nicht-Peptid ist.
10. Das cytotoxische Mittel nach Absatz 1 oder 2, wobei das Zell-Binde-Mittel ein polyklonaler oder monoklonaler Antikörper ist.
11. Das cytotoxische Mittel nach Absatz 10, wobei das Zell-Binde-Mittel ein monoklonaler Antikörper ist.
12. Das cytotoxische Mittel nach Absatz 10, wobei das Zell-Binde-Mittel mindestens eine Bindestelle des Antikörpers umfaßt.
13. Das cytotoxische Mittel nach Absatz 11, wobei das Zell-Binde-Mittel mindestens eine Bindestelle des Antikörpers umfaßt.
14. Das cytotoxische Mittel nach Absatz 1 oder 2, wobei das Zell-Binde-Mittel eine Hormon ist.
15. Das cytotoxische Mittel nach Absatz 14, wobei das Hormon Melanocytenstimulierendes Hormon (MSG) oder ein Analoges davon ist.
16. Das cytotoxische Mittel nach Absatz 14, wobei das Hormon Schilddrüsestimulierendes Hormon (TSH) oder ein Analoges davon ist.
17. Das cytotoxische Mittel nach Absatz 1 oder 2, wobei das Zell-Binde-Mittel ein Wachstumsfaktor ist.
18. Das cytotoxische Mittel nach Absatz 17, wobei der Wachstumsfaktor epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) ist.
19. Das cytotoxische Mittel nach Absatz 17, wobei der Wachstumsfaktor transformierender Wachstumsfaktor alpha (TGF-α) ist.
20. Ein therapeutisches Mittel zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen, umfassend:
(a) eine cytotoxische Menge eines oder mehrerer der cytotoxischen Mittel von Absatz 1, und
(b) ein(en) pharmazeutisch annehmbare(n/s) Träger, Verdünnungsmittel oder Vehikel.
21. Das therapeutische Mittel zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen nach Absatz 20, wobei R und R' für Gruppierungen stehen, die eine Bindung ermöglichen, und R&sub1; bis R&sub6; für Wasserstoff stehen.
22. Das therapeutische Mittel zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen nach Absatz 20 oder 21, wobei R und R' für Gruppierungen stehen, die eine Bindung des Analogen oder Derivats von CC-1065 an ein Zell-Binde-Mittel über eine Disulfid-Bindung ermöglichen.
23. Das therapeutische Mittel zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen nach Absatz 23 oder 24, wobei R für NHCO(CH&sub2;)lSZ&sub0;, NHCOC&sub6;H&sub4;(CH&sub2;)lSZ&sub0; oder O(CH&sub2;)lSZ&sub0; steht, und R' für (CH&sub2;)lSZO, NH(CH&sub2;)lSZ&sub0; oder O(CH&sub2;)lSZ&sub0; steht, worin Z&sub0;H oder SR&sub7; bedeutet, worin R&sub7; für Methyl, lineares Alkyl, verzweigtes Alkyl, cyclisches Alkyl, einfaches oder substituiertes Aryl oder eine heterocyclische Gruppe steht; und
l eine ganze Zahl von 1 bis 10 bedeutet.
24. Das therapeutische Mittel zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen nach Absatz 23, wobei Z&sub0; Wasserstoff bedeutet und l 2 bedeutet.
25. Das therapeutische Mittel zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen nach Absatz 23, wobei Z&sub0; SR&sub7; bedeutet, R&sub7; eine heterocyclische Gruppe bedeutet und l 1 bedeutet.
26. Das therapeutische Mittel zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen nach Absatz 23, wobei Z&sub0; SR&sub7; bedeutet, worin R&sub7; eine 2-substituierte Pyridin-Gruppe bedeutet.
27. Das therapeutische Mittel zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen nach Absatz 20 oder 21, wobei R und R' für Gruppierungen stehen, die die Bindung der Analogen oder Derivate von CC-1065 an Zell-Binde-Mittel über eine säurelabile Gruppe, eine photolabile Gruppe, eine Peptidase-labile Gruppe oder eine Esterase-labile Gruppe ermöglichen.
28. Das therapeutische Mittel zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen nach Absatz 20 oder 21, wobei das Zell-Binde-Mittel ein Peptid oder ein Nicht-Peptid ist.
29. Das therapeutische Mittel zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen nach Absatz 20 oder 21, wobei das Zell-Binde-Mittel eine polyklonaler oder monoklonaler Antikörper ist.
30. Das therapeutische Mittel zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen nach Absatz 29, wobei das Zell-Binde-Mittel ein monoklonaler Antikörper ist.
31. Das therapeutische Mittel zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen nach Absatz 29, wobei das Zell-Binde-Mittel mindestens eine Bindestelle des Antikörpers umfaßt.
32. Das therapeutische Mittel zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen nach Absatz 30, wobei das Zell-Binde-Mittel mindestens eine Bindestelle des Antikörpers umfaßt.
33. Das therapeutische Mittel zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen nach Absatz 20 oder 21, wobei das Zell-Binde-Mittel ein Hormon ist.
34. Das therapeutische Mittel zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen nach Absatz 33, wobei das Hormon ein Melanocyten-stimulierendes Hormon (MSH) oder ein Analoges davon ist.
35. Das therapeutische Mittel zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen nach Absatz 33, wobei das Hormon Schilddrüse-stimulierendes Hormon (TSH) oder ein Analoges davon ist.
36. Das therapeutische Mittel zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen nach Absatz 20 oder 21, wobei das Zell-Binde-Mittel ein Wachstumsfaktor ist.
37. Das therapeutische Mittel zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen nach Absatz 36, wobei der Wachstumsfaktor epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) ist.
38. Das therapeutische Mittel zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen nach Absatz 36, wobei der Wachstumsfaktor transformierender Wachstumsfaktor alpha (TFG-α) ist.
39. Verfahren zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen, welches kein Verfahren für die Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Operation oder Therapie und diagnostische Methoden ist, ausgeführt am menschlichen oder tierischen Körper, umfassend das Inkontaktbringen einer Zellpopulation oder eines Gewebes, bei denen der Verdacht besteht, daß sie Zellen dieser ausgewählten Zellpopulation enthalten, mit einer cytotoxischen Menge des cytotoxischen Mittels nach Absatz 1.
40. Verfahren zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen nach Absatz 39, wobei R und R' für Gruppierungen stehen, die die Bindung ermöglichen, und R&sub1; bis R&sub6; für Wasserstoff stehen.
41. Das Verfahren zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen nach Absatz 39 oder 40, wobei R und R&sub1; für Gruppierungen stehen, die eine Bindung des Analogen oder Derivats von CC-1065 an ein Zell-Binde-Mittel über eine Disulfid-Bindung ermöglichen.
42. Das Verfahren zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen nach Absatz 39 oder 40, wobei R für NHCO(CH&sub2;)lSZ&sub0;, NHCOC&sub6;H&sub4;(CH&sub2;)lSZ&sub0; oder O(CH&sub2;)lSZ&sub0; steht, und R' für (CH&sub2;)lSZO, NH(CH&sub2;)lSZ&sub0; oder O(CH&sub2;)lSZ&sub0; steht, worin Z&sub0; für H oder SR&sub7; steht, worin R&sub7; für Methyl, lineares Alkyl, verzweigtes Alkyl, cyclisches Alkyl, einfaches oder substituiertes Aryl oder eine heterocyclische Gruppe steht; und
l für eine ganze Zahl von 1 bis 10 steht.
43. Das Verfahren zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen nach Absatz 42, wobei Z&sub0; für Wasserstoff steht und t für 2 steht.
44. Das Verfahren zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen nach Absatz 42, wobei Z&sub0; für SRγ steht, R&sub7; für eine heterocyclische Gruppe steht und l für 1 steht.
45. Das Verfahren zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen nach Absatz 44, wobei R&sub7; für eine 2-substituierte Pyridin-Gruppe steht.
46.
47. Das Verfahren zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen nach Absatz 39 oder 40, wobei R und R' für Gruppierungen stehen, die die Bindung der Analogen oder Derivate von CC-1065 an das Zell-Binde-Mittel über eine säurelabile Gruppe, eine photolabile Gruppe, eine Peptidase-labile Gruppe oder eine Esterase-labile Gruppe ermöglichen.
48. Das Verfahren zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen nach Absatz 39 oder 40, wobei das Zell-Binde-Mittel ein Peptid oder ein Nicht-Peptid ist.
49. Das Verfahren zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen nach Absatz 39 oder 40, wobei das Zell-Binde-Mittel eine polyklonaler oder monoklonaler Antikörper ist.
50. Das Verfahren zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen nach Absatz 49, wobei das Zell-Binde-Mittel ein monoklonaler Antikörper ist.
51. Das Verfahren zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen nach Absatz 49, wobei das Zell-Binde-Mittel mindestens eine Bindestelle des Antikörpers umfaßt.
52. Das Verfahren zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen nach Absatz 50, wobei das Zell-Binde-Mittel mindestens eine Bindestelle des Antikörpers umfaßt.
53. Das Verfahren zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen nach Absatz 39 oder 40, wobei das Zell-Binde-Mittel ein Hormon ist.
54. Das Verfahren zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen nach Absatz 53, wobei das Hormon Melanocyten-stimulierendes Hormon (MSH) oder ein Analoges davon ist.
55. Das Verfahren zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen nach Absatz 49, wobei das Hormon Schilddrüse-stimulierendes Hormon (TSH) oder ein Analoges davon ist.
56. Das Verfahren zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen nach Absatz 39 oder 40, wobei das Zell-Binde-Mittel ein Wachstumsfaktor ist.
57. Das Verfahren zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen nach Absatz 56, wobei der Wachstumsfaktor epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) ist.
58. Das Verfahren zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen nach Absatz 56, wobei der Wachstumsfaktor transformierender Wachstumsfaktor alpha (TFG-α) ist.
59. Ein Analoges oder Derivat von CC-1065, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer A-Untereinheit der Formeln (A-1) oder (A-2), kovalent verbunden mit einer B-Untereinheit oder einer B-C-Untereinheit der Formeln (F-1), (F-2), (F-3), (F-4), (F-5), (F-6), (F-7), (F-8), (F-9) oder (F-10) über eine Amid-Bindung zwischen der sekundären Amino-Gruppe der Pyrrol-Gruppierung der A-Untereinheit und der C-2- Carboxyl-Gruppe der B-Untereinheit,
wobei die Formeln A-1 und A-2 wie folgt sind:
und wobei die Formeln (F-1) bis (F-10) wie folgt sind:
worin in einer gegebenen Formel einer von entweder R und R' oder R&sub4; für eine Gruppierung steht, die die Bindung des Analogen oder des Derivats von CC-1065 an ein Zell-Binde-Mittel ermöglicht; falls R oder R' für Gruppierungen stehen, die die Bindung ermöglichen, dann stehen R&sub1; bis R&sub6;, die identisch oder unterschiedlich sein können, für Wasserstoff, lineares C&sub1;-C&sub3;-Alkyl, Methoxy, Hydroxyl, primäres Amin, sekundäres Amin, tertiäres Amin oder Amido; und falls R&sub4; für eine Gruppierung steht, die Bindung ermöglicht, stehen R, R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub5; und R&sub6;, die identisch oder unterschiedlich sein können, für Wasserstoff, lineares C&sub1;-C&sub3;-Alkyl, Methoxy, Hydroxyl, primäres Amin, sekundäres Amin, tertiäres Amin oder Amido, und R' steht für NH&sub2;, Alkyl, O-Alkyl, primäres Amin, sekundäres Amin, tertiäres Amin oder Amido.
60. Das Derivat nach Absatz 59, wobei R und R' für Gruppierungen stehen, die die Bindung ermöglichen, und R&sub1; bis R&sub6; für Wasserstoff stehen.
61. Das Derivat nach Absatz 59 oder 60, wobei R und R' für Gruppierungen stehen, die die Bindung des Analogen oder Derivats von CC-1065 an ein Zell-Binde-Mittel über eine Disulfid-Bindung ermöglichen.
62. Das Derivat nach Absatz 59 oder 60, wobei R für NHCO(CH&sub2;)lSZ&sub0;, NHCOC&sub6;H&sub4;(CH&sub2;)lSZ&sub0; oder O(CH&sub2;)lSZ&sub0; steht, und R' für (CH&sub2;)lSZO, NH(CH&sub2;)lSZ&sub0; oder O(CH&sub2;)lSZ&sub0; steht, worin
Z&sub0; für H oder SR&sub7; steht, worin R&sub7; Methyl, lineares Alkyl, verzweigtes Alkyl, cyclisches Alkyl, einfaches oder substituiertes Aryl oder eine heterocyclische Gruppe bedeutet; und
l für eine ganze Zahl von 1 bis 10 steht.
63. Das Derivat nach Absatz 62, wobei Z&sub0; für Wasserstoff steht und l für 2 steht.
64. Das Derivat nach Absatz 62, wobei Z&sub0; für SR&sub7; steht, R&sub7; für eine heterocyclische Gruppe steht und l für 1 steht.
65. Das Derivat nach Absatz 64, wobei R&sub7; für eine 2-substituierte Pyridin- Gruppe steht.
66. Das Derivat nach Absatz 59 oder 60, wobei R und R' für Gruppierungen stehen, die die Bindung des Analogen oder Derivats von CC-1065 an ein Zell-Binde-Mittel über eine säurelabile Gruppe, eine photolabile Gruppe, eine Peptidase-labile Gruppe oder eine Esterase-labile Gruppe ermöglichen.

Claims

1. Cytotoxisches Mittel, umfassend ein Zell-Binde-Mittel verbunden mit einem oder mehreren Analogen oder Derivaten von CC-1065,

wobei vor dem Binden dieser Derivate an dieses Zell-Binde-Mittel diese Derivate ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus einer A-Untereinheit der Formeln (A-1) oder (A-2), covalent verbunden mit einer B-Untereinheit oder einer B-C-Untereinheit der Formeln (F-1), (F-2), (F-3), (F-4), (F-5), (F-6), (F-7), (F-8), (F-9) oder (F-10) über eine Amidbindung zwischen der sekundären Aminogruppe der Pyrrolgruppierung der A-Untereinheit und der C-2-Carboxylgruppe der B-Untereinheit,

wobei die Formeln A-1 und A-2 wie folgt sind:

und

wobei die Formeln (F-1) bis (F-10) wie folgt sind:

worin in einer gegebenen Formel einer von entweder R und R' oder R&sub4; für eine Gruppierung steht, die die Bindung des Analogs oder Derivats von CC-1065 an ein Zell-Binde-Mittel ermöglicht; falls R oder R' für Gruppierungen stehen, die die Bindung ermöglichen, dann stehen R&sub1; bis R&sub6;, die identisch oder unterschiedlich sein können, für Wasserstoff, lineares C&sub1;-C&sub3;-Alkyl, Methoxy, Hydroxyl, primäres Amin, sekundäres Amin, tertiäres Amin oder Amido; und falls R&sub4; für eine Gruppierung steht, die die Bindung ermöglicht, stehen R, R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub5; und R&sub6;, die identisch oder unterschiedlich sein können, für Wasserstoff, lineares C&sub1;-C&sub3;-Alkyl, Methoxy, Hydroxyl, primäres Amin, sekundäres Amin, tertiäres Amin oder Amido, und R' steht für NH&sub2;, primäres Amino, sekundäres Amino, Alkyl oder O-Alkyl.

2. Therapeutisches Mittel zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen, umfassend:

(a) eine cytotoxische Menge eines oder mehrerer der cytotoxischen Mittel nach Anspruch 1, und

(b) ein(en) pharmazeutisch annehmbare(n/s) Träger, Verdünnungsmittel oder Vehikel.

3. Verfahren zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen, welches nicht ein Verfahren für die Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Operation oder Therapie und diagnostische Methoden ist, ausgeführt am menschlichen oder tierischen Körper, umfassend das Inkontaktbringen einer Zellpopulation oder eines Gewebes, bei denen der Verdacht besteht, daß sie Zellen dieser ausgewählten Zellpopulation enthalten, mit einer cytotoxischen Menge des cytotoxischen Mittels nach Anspruch 1.

4. Analoges oder Derivat von CC-1065, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer A-Untereinheit der Formeln (A-1) oder (A-2), covalent verbunden mit einer B-Untereinheit oder einer B-C-Untereinheit der Formeln (F-1), (F-2), (F-3), (F-4), (F-5), (F-6), (F-7), (F-8), (F-9) oder (F-10) über eine Amidbindung zwischen der sekundären Aminogruppe der Pyrrolgruppierung der A-Untereinheit und der C-2-Carboxylgruppe der B-Untereinheit,

wobei die Formeln A-1 und A-2 wie folgt sind:

und

wobei die Formeln (F-1) bis (F-10) wie folgt sind:

worin in einer gegebenen Formel einer von entweder R und R' oder R&sub4; für eine Gruppierung steht, die die Bindung des Analogs oder Derivats von CC-1065 an ein Zell-Binde-Mittel ermöglicht; falls R oder R' für Gruppierungen stehen, die die Bindung ermöglichen, dann stehen R&sub1; bis R&sub6;, die identisch oder unterschiedlich sein können, für Wasserstoff, lineares C&sub1;-C&sub3;-Alkyl, Methoxy, Hydroxyl, primäres Amin, sekundäres Amin, tertiäres Amin oder Amido; und falls R&sub4; für eine Gruppierung steht, die die Bindung ermöglicht, stehen R, R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub5; und 1%, die identisch oder unterschiedlich sein können, für Wasserstoff, lineares C&sub1;-C&sub3;-Alkyl, Methoxy, Hydroxyl, primäres Amin, sekundäres Amin, tertiäres Amin oder Amido, und R' steht für NH&sub2;, Alkyl, O-Alkyl, primäres Amin, sekundäres Amin, tertiäres Amin oder Amido.

5. Cytotoxisches Mittel nach Anspruch 1 zur Verwendung als Medikament.

6. Verwendung eines Mittels nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Tumoren.

7. Erfindung nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 5 oder 6, wobei das Zell-Binde-Mittel ein Hormon ist wie MSH oder TSH oder Analoge davon oder ein Wachstumsfaktor wie EGF oder TGF-α.

8. Erfindung nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 5 oder 6, wobei das Zell-Binde-Mittel ein monoclonaler Antikörper oder ein polyclonaler Antikörper ist.