KR20120106729A - 과수포 발생 시겔라 균주 - Google Patents

Abstract

과수포 발생 시겔라 균주는 Tol-Pal 시스템의 한 가지 이상의 성분이 붕괴됨에 의해 일어난다. 이 균주로부터의 수포는 백신 접종을 위한 유용한 면역원이다. 이들 수포에서 발견되는 개개 단백질도 또한 면역원으로서 사용될 수 있다.

Description

과수포 발생 시겔라 균주{HYPERBLEBBING SHIGELLA STRAINS}

본 발명은 시겔라(Shigella) 균주에 대한 면역화의 분야이다.

시겔라는 그람-음성이고 운동 능력이 없고 통성 혐기성 간균으로, 혈청형에 따라 네 그룹으로 나눌 수 있다.: 에스.디센테리에(S.dysenteriae), 에스.플렉스네리(S.flexneri), 에스.보이디이(S.boydii) 및 에스.소네이(S.sonnei). 이것들은 시겔라증 (세균성 이질)을 유발한다.

임상적 시겔라증의 특징은 고열, 메스꺼움, 탈수증, 거식증, 고름 및 혈액이 섞인 설사와 잔변감을 동반하는 급성 직장결장염이다. 시겔라균이 야기한 이질은 풍토적이고 개발도상국에서 수 백 만의 병 사례를 유발한다. 예를 들어, 시겔라 설사는 연간 1억 6500만 건으로 계산되고, 그 중 99%가 개발도상국에서 발생하고, 69%가 5살 이하의 어린이에서 발생한다. 시겔라증으로 인한 사망률과 치사율은 개발도상국 어린이들에서 특히 높다.

시겔라 백신에 현존하는 접근법은 참고문헌 1에서 검토되었고 구강 면역화를 위한 살아있는 약독화된 균주, 주사용의 접합된 O 당류, 비강 내 사용을 위한 프로테오좀(시겔라 LPS가 부착된 뇌척수막염균의 외막 소낭), 비강 내 사용을 위한 인바플렉스(IpaB, IpaC와 LPS를 포함하는 시겔라균의 아세포성 추출물) 및 해독된 LPS를 가지고 있는 msbB^{- ve} 변이종으로부터 제조된 핵단백질-리보솜 복합체에 기초하였다. 이들 백신의 일부는 현장 시험에서 효험이 있었지만, 다수의 시겔라 혈청형에 대해 예방하는 것은 없었다.

본 발명의 목적은 시겔라 백신, 특히 다수의 혈청형에 대해 예방할 수 있는 백신을 제조하는데 유용한 더욱 개선된 구성요소를 제공하기 위한 것이다.

시겔라는 세포 외피의 팽압 때문에 성장하는 동안 자연스럽게 외막 수포들을 방출한다. 참고문헌 2에 개시된 것과 같이, 수포들의 방출은 박테리아의 외피 구조에 대단히 의존적이다. 본 발명자들은 외피 구조를 교란하기 위해 Tol-Pal 시스템을 붕괴한 시겔라 돌연변이 균주를 사용하였다. 정상적인 성장의 동안에 이들 돌연변이 균주는 많은 양의 수포를 배지로 방출하는데 이 것은 면역원성 외막 단백질이 풍부하고, 따라서 이들 수포는 면역원으로서 사용될 수 있다.

그래서 본 발명은 4 가지 이하의 TolA, TolB, TolQ, TolR과 Pal 단백질을 발현하는 시겔라 박테리아를 제공한다. 이로 인해 자연적인 5 개의 단백질의 Tol-Pal 시스템으로부터 적어도 한 가지의 단백질은 부족하게 되어, 배지에서 자라는 동안 5 개의 Tol-Pal 단백질을 모두 발현하는 같은 박테리아보다 더 많은 양의 외막 수포를 방출하는 세균을 가져온다.

본 발명은 TolR 단백질을 발현하지 않는 시겔라 박테리아를 또한 제공한다. 본 발명은Δ tolR Δ galU 균주와 같은 시겔라의 Δ tolR 균주를 또한 제공한다.

본 발명은 TolA, TolB, TolQ 및 Pal 단백질을 발현하는 시겔라 박테리아를 또한 제공하는데 TolA, TolQ, TolR 및/또는 Pal 단백질들은 박테리아의 내막 또는 외막에 위치하고, 한 가지 이상의 아미노산 서열 돌연변이들을 포함하여, 상기 돌연변이가 없는 같은 박테리아와 비교했을 때, 배양 배지에서 성장할 때 더 많은 양의 외막 수포를 방출하게 된다.

본 발명은 또한 Tol-Pal 시스템의 한 가지 이상의 요소가 변형을 가지므로 배지에서 자라는 동안 변형을 결핍한 박테리아보다 더 많은 양의 외막 기포를 배지로 방출하고, (i) 음성 시겔라 리포다당류 및/또는 (ii) 시겔라 장독소를 발현하지 않는 시겔라 박테리아를 제공한다.

본 발명은 배지에서 성장될 때 변형이 박테리아로 하여금 원래의 박테리아보다 배지로 더 많은 양의 외막 수포를 방출하도록 하며, 변형은 한 가지 이상의 tolA, tolB, tolQ, tolR 및/또는 pal 유전자를 돌연변이 시키는 것을 포함하는, 박테리아의 Tol-Pal 시스템의 한 가지 이상의 구성 요소를 암호화하는 유전자를 변형시키는 단계를 포함하는 과수포발생 시겔라 박테리아의 제조 방법을 또한 제공한다. 돌연변이 단계는 유전자를 삭제할 수도 있다. 본 방법은 또한 박테리아의 리포다당류나 장독소의 합성에 필요한 단백질을 암호화하는 유전자의 변형을 수반할 수도 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 박테리아로부터 분리되거나 얻을 수 있는 수포를 제공한다. 이 수포들은 시겔라 백신의 구성 요소로서 유용하다.

본 발명은 또한 박테리아에 의해 배지로 수포가 방출을 허용하는 조건에서 성장시킨 본 발명의 박테리아를 포함하는 배지로부터 수포를 분리하는 단계를 포함하는 시겔라 수포의 제조 방법을 제공한다. 이 방법에 의해 제조된 수포는 시겔라 백신의 성분으로서 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 박테리아에 의해 배지로 수포의 방출을 허용하는 조건에서 성장시킨 본 발명의 박테리아를 포함하는 배지를 제공한다. 수포는 이 배지로부터 정제될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 박테리아 배양 동안에 배지로 방출된 수포를 포함하는 조성물을 제공한다. 이 조성물은 어떤 살아있는 및/또는 전체 박테리아를 포함하지 않는다. 이 조성물 및/또는 그것의 성분은 시겔라 백신 제조에 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 박테리아를 성장시킨 배지를 0.22 μm의 필터를 통해 여과 후 얻을 수 있는 여액에 존재하는 수포를 포함하는 조성물을 제공한다. 이 조성물 및/또는 그것의 성분은 시겔라 백신 제조에 사용될 수 있다.

본 발명은 한 가지 이상 (즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 또는 60)의 (a) SEQ ID NOs: 8 내지 67로부터 선택된 아미노산 서열로 구성되는 단백질; (b) SEQ ID NOs: 8 내지 67 중 하나와 적어도 j% 동일한 아미노산 서열로 구성된 단백질, 이때 j는 50 이상 (e.g. 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99)이고 및/또는 SEQ ID NOs: 8 내지 67 중 어느 하나의 적어도 n 개의 연속적인 아미노산의 단편을 포함하는 단백질, 이때 n은 7 이상 (예를 들어, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 또는 그 이상)인 이들 단백질을 포함하는 시겔라 수포를 제공한다. 바람직한 단편들은 SEQ ID NOs: 8 내지 67 중에서 한 가지로부터 얻은 에피토프를 포함한다. 다른 바람직한 단편들은 C-말단으로부터 한 가지 이상의 아미노산 (예를 들어, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 그 이상) 및/또는 SEQ ID NO의 N-말단으로부터 한 가지 이상의 아미노산 (예를 들어, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 그 이상)을 결핍하는 한편:, SEQ ID NO의 적어도 하나의 에피토프는 유지한다. 다른 단편들은, 예를 들어 신호 펩티드를 결핍하는 등 한 가지 이상의 단백질 도메인을 생략한다.

60 개의 단백질이 본 발명의 수포 내에 존재하고 수포에 대해 제조된 혈청과 면역 반응성인 것으로 확인되었다. 따라서 각각의 단백질은 정제된 형태로 수포에서 분리되어 면역원성 성분으로서 사용될 수 있다. 그러므로 본 발명은 또한 (a) SEQ ID NOs: 8 내지 67 중 한 가지 이상 (예를 들어, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 또는 60); (b) SEQ ID NOs: 8 내지 67 중 하나와 적어도 j% 동일성을 갖는, 이때 j는 50 이상 (예를 들어, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99)인 아미노산 서열 및/또는 SEQ ID NOs: 8 내지 67 중 어느 하나의 적어도 n 개의 연속적인 아미노산의 단편을 포함하는, 이때 n은 7 이상 (예를 들어, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 또는 그 이상)인 아미노산 서열을 포함하는 수포 단백질을 포함하는 수포 없는 면역원성 조성물을 제공한다. 바람직한 단편들은 SEQ ID NOs: 8 내지 67 중에서 한 가지로부터 얻은 에피토프를 포함하고, 더 바람직한 단편들은 면역원성 단편이다. 다른 바람직한 단편들은 C-말단으로부터 한 가지 이상의 아미노산 (예를 들어, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 그 이상) 및/또는 SEQ ID NO의 N-말단으로부터 한 가지 이상의 아미노산 (예를 들어, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 그 이상)을 결핍하는 한편:, SEQ ID NO의 적어도 하나의 에피토프는 유지한다. 다른 단편들은, 예를 들어 트랜스막 펩티드를 결핍하는 등 한 가지 이상의 단백질 도메인을 생략한다.

본 발명은 한 가지 이상 (즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101 , 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128 또는 129)의: (a) SEQ ID NOs: 8 내지 136으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성되는 단백질; (b) SEQ ID NOs: 8 내지 136 중 어느 하나와 적어도 j% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질,이때 j는 50 이상 (예를 들어, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99) 및/또는 SEQ ID NOs: 8 내지 136 중 어느 하나의 적어도 n 개의 연속적인 아미노산의 단편을 포함하는, 이때 n은 7 이상 (예를 들어, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 또는 그 이상)인 아미노산 서열을 포함하는 시겔라 수포를 제공한다. 바람직한 단편들은 SEQ ID NOs: 8 내지 136 중에서 한 가지로부터 얻은 에피토프를 포함한다. 다른 바람직한 단편들은 C-말단 방향으로부터 한 가지 이상의 아미노산 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 그 이상) 및/또는 SEQ ID NO의 N-말단 방향으로부터 하나 이상의 아미노산 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 그 이상)을 결핍하는 한편:, SEQ ID NO의 적어도 하나의 에피토프 유지한다. 다른 단편들은, 예를 들어 신호 펩티드를 결합하는 등 한 가지 이상의 단백질 도메인을 생략한다.

129 개의 단백질이 본 발명의 수포 내에 존재하고 수포에 대해 제조된 혈청과 면역 반응성인 것으로 확인되었다. 따라서 각각의 단백질은 정제된 형태로 수포에서 분리되어 면역원성 성분으로서 사용될 수 있다. 그러므로 본 발명은 또한 (a) SEQ ID NOs: 8 내지 67 중 한 가지 이상 (예를 들어, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1 10, 11 1 , 112, 1 13, 114, 1 15, 1 16, 1 17, 118, 1 19, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128 또는 129); (b) SEQ ID NOs: 8 내지 136 중 하나와 적어도 j% 동일성을 갖는, 이때 j는 50 이상 (예를 들어, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99)인 아미노산 서열 및/또는 SEQ ID NOs: 8 내지 136 중 어느 하나의 적어도 n 개의 연속적인 아미노산의 단편을 포함하는, 이때 n은 7 이상 (예를 들어, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 또는 그 이상)인 아미노산 서열을 포함하는 수포 단백질을 포함하는 수포 없는 면역원성 조성물을 제공한다. 바람직한 단편들은 SEQ ID NOs: 8 내지 136 중에서 한 가지로부터 얻은 에피토프를 포함하고, 더 바람직한 단편들은 면역원성 단편이다. 다른 바람직한 단편들은 C-말단으로부터 한 가지 이상의 아미노산 (예를 들어, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 그 이상) 및/또는 SEQ ID NO의 N-말단으로부터 한 가지 이상의 아미노산 (예를 들어, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 그 이상)을 결핍하는 한편:, SEQ ID NO의 적어도 하나의 에피토프는 유지한다. 다른 조각들은, 예를 들어 트랜스막 펩티드, 신호 펩티드를 결핍하는 등 한 가지 이상의 단백질 도메인을 생략한다.

SEQ ID NO: 8에서 136번 중에서 에스.플렉스네리와 관련된 바람직한 서브세트는 아래 표 1에 "Subset1"에 열거된 SEQ ID NO: 8 내지 136 중에서 "Subset 1"에 열거된 SEQ ID NO들이고, 에스.소네이와 관련된 바람직한 서브세트는 아래 표 1에 "Subset 2"에 열거된 SEQ ID NO들이다.

Tol - Pal 시스템

많은 그람-음성 박테리아와 같이, 시겔라는 자연적으로 TolA, TolB, TolQ, TolR 및 Pal 단백질로 이루어진 Tol-Pal 시스템을 가지고 있다. 본 발명에 따르면, 자연적인 Tol-Pal 시스템은 붕괴되어, 이로써 박테리아 복제 동안에 많은 양의 외막 수포를 배지로 방출하게 된다. 여러 가지 붕괴가 행해질 수 있다.

어떤 구체예에는, 다섯 가지의 Tol-Pol 단백질 중 적어도 한 가지는 단백질을 암호화하는 유전자의 삭제 또는 불활성화에 의해 제거된다. 따라서 박테리아는 TolA, TolB, TolQ, TolR 및 Pal 단백질 중에서 0, 1, 2, 3 또는 4개가 발현될 수도 있다. 다섯 가지 단백질 중에 하나만 제거해도 충분할 수 있는데, 그 경우 박테리아는 이 단백질 중 네 가지 밖에 발현할 수 없다. 바람직하게는 TolR 단백질은 원료 균주의 tolR 유전자의 불활성화에 의해 제거된다. 따라서 박테리아는 tolA ⁺, tolB ⁺, tolQ ⁺, TolR ^-, Pal ⁺ 일 것이다.

어떤 구체예에는, 박테리아는 모두 다섯 가지 Tol-Pal 단배질을 발현하지만, 과수포발생을 유발하기 위해 적어도 한 가지는 돌연변이가 되었다. 예를 들어, TolA, TolQ, TolR 및/또는 Pal 단백질은 단백질이 자신의 막 위치를 유지하지만 Tol-Pal 시스템의 다른 요소들과의 상호작용이 방해받도록 돌연변이 될 수도 있다. 이와 같이 박테리아는 TolA, TolQ 및 TolR을 트랜스막 단백질로서 내막에 유지하고 Pal 단백질은 주변 세포질에 면하는 지방 단백질로서 외막에 유지하지만 TolA, TolQ, TolR 또는 Pal 단백질 중 적어도 한 가지는 돌연변이가 되어 있다.

TolA, TolB, TolQ, TolR 및 Pal 단백질의 야생형 시겔라의 아미노산 서열의 예는 SEQ ID NOs: 1 내지 5로 서열 목록에 나와있다.

시겔라 박테리아

본 발명에서는 혈청형으로 나눈 그룹 에스.디센테리에 , 에스 . 플렉스네리 , 에 스. 보이디이 및 에스 . 소네이 중 어떤 것도 사용될 수 있다.

붕괴된 Tol-Pal 시스템을 가지므로, 박테리아로 하여금 박테리아 복제 과정 중에 배지로 많은 양의 외막 수포를 방출하도록 하는 것에 더하여, 본 발명의 시겔라는 유리하게도 야생형에 비해 한 가지 이상의 변화를 포함할 수 있다. 이 변화는 구체적으로 인간 백신에 좋지않거나 유독한 박테리아로부터의 성분들을 제거하기 위해 사용될 수 있다.

예를 들어, 박테리아는 고유한 시겔라 리포다당류 (LPS)를 발현하지 않을 수도 있고,그렇게 함으로써 내독소 활성을 감소시키게 된다. 다양한 변형이 고유한 LPS의 합성을 방지하기 위해 행해질 수 있고, 이 변형이 고유한 지질 A 구조, 올리고당류 핵 (oligosaccharide core), 또는 외부의 O 항원을 붕괴할 수 있다. 예를 들어, 참고문헌 3에서는 rfe 및 galU 유전자의 불활성화로 인한 LPS 돌연변이를 보고하고, 참고문헌 4에서는 yihE, galE, galK, galM 및 galT 유전자의 불활성화로 인해 생긴 LPS 돌연변이를 보고하였다. 비슷하게, 참고문헌 5에서는 rfc, rfaL, 또는 galU의 돌연변이로 인해 결함이 있는 LPS가 보고되었다. 참고문헌 6에서는 지질 A의 아세틸화를 감소시키는 msbB1 및 msbB2의 불활성화에 의한 LPS 돌연변이가 보고되었다. 여기서 보여진 것 처럼, 감소된 지질 A 아세틸화에 따른 또 다른 LPS 돌연변이는 htrB의 불활성화에 의해 일어날 수 있다 [참고문헌 7, 8].

LPS에 O 항원이 없으면, 그것 때문에 혈청형-특이적 반응을 피하게 된다. 에스.소네이에서 병독성 플라스미드가 제거되면 O 항원은 없어진다 (아래 참조). galU 유전자는 우리딘 디포스포글루코스 (UDP-glucose) 피로포스포릴라제를 암호화하고 그것의 불활성화는 O 항원이 부착되지 않은 LPS를 합성하는 결과를 낳게 된다. galU의 불활성화는 우리딘 디포스포글루코스 피로포스포릴라제 활성 없이 시겔라를 제공하는데 유용하다. rfbF 및/또는 rfbG 유전자의 불활성화는 람노실 전이효소 활성 없이 시겔라를 제공하기 위해 사용될 수 있다. rfc의 불활성화는 O 항원 중합효소 활성 없이 시겔라를 제공하기도 한다. rfbF, rfbG와 rfc 세 가지 모두의 불활성화는 유용한 균주를 제공할 수 있다.

LPS에 헥사-아실화 지질 A가 없으면 바람직하다. 병독성 플라스미드 (아래 참조)의 상실은 자동적으로 msbB2 유전자의 상실로 이어지고 염색체 msbB1 유전자가 불활성화 될 수 있고, 이로써 LPS에서 미리스토일 전이 효소 활성을 제거하고 LPS에 펜타-아실화 지질 A를 제공한다. HtrB 라우로일 전이 효소의 불활성화는 주로 테트라-아실화 지질 A를 시겔라에 제공할 수 있다. 바람직한 균주는 펜타- 또는 테트라-아실화 LPS를 갖는다.

바람직한 균주는 galU와 msbB1 둘 다에 대해 불활성화되고 또한 병독성 플라스미드를 결핍하며, 이로써 LPS가 펜타-아실화되고 부착된 O 항원을 결핍한 균주를 제공한다.

어떤 유용한 균주는 부착된 O 항원을 포함하는 펜타- 또는 테트라-아실화 LPS를 갖는다. 더 일반적으로, 그럼에도 불구하고, 바람직한 균주는 부착된 O 항원이 부족한 펜타- 또는 테트라-아실화 LPS를 갖는다. TolR, rfbG 및 htrB가 넉아웃된 (그리고, 선택적으로, rfbF 및/또는 rfc 불활성화) 에스.플렉스네리 균주는 유용하다. 유용한 에스.소네이 균주는 tolR 돌연변이를 가지며 병독성 플라스미드를 결핍한다.

박테리아는 장독소를 발현하지 않을 수도 있다. 예를 들어, 에스.플렉스네리 균주 (특히 2a 균주)는 시겔라 엔테로톡신 1 (ShET-1)의 모든 소단위를 발현하지 않을 수도 있다. 예를 들어 set1A 및/또는 set1B 유전자가 불활성화될 수도 있다. 에스.디센테리에 균주는 Shiga 독소의 소단위 모두를 발현하지 않을 수도 있다. 예를 들어 stxA 및/또는 stxB 유전자 중 한 가지 또는 둘 다 불활성화될 수 있다. 시겔라, 특히 에스.소네이 또는 에스.플렉스네리는 엔테로톡신 2 (ShET-2)를 발현하지 않을 수도 있다. 예를 들어 ospD3 유전자는 불활성화되거나 병독성 플라스미드가 없을 수도 있다. 바람직한 균주는 ShET-1, ShET-2 및 Shiga 독소 중 아무것도 암호화하지 않는다.

본 발명의 시겔라 박테리아는 참고문헌 9 내지 11에서 볼 수 있는 종래의 돌연변이 유발 기술을 사용하여 야생형 또는 다른 시작 균주로부터 편리하게 제조될 수 있다. 람다 레드 재조합 시스템 (lambda red recombination system)은 시겔라에 특히 유용하다. 예를 들어 프로모터의 삭제 또는 돌연변이에 의해서, 시작 코돈의 삭제 또는 돌연변이에 의해서, 덜 성숙한 종결 코돈의 도입에 의해서, 완전한 암호 영역의 삭제에 의해서, 넉아웃에 의해서 등등 다양한 방법으로 유전자를 불활성화시킬 수 있다. 동질유전자형의 넉아웃 돌연변이가 바람직하다. 결과적인 시겔라 박테리아에는, 원하는 유전자를 암호화할 mRNA가 없고 및/또는 그것의 번역이 억제되어 있다 (예를 들어, 야생형 수준 1% 미만으로).

본 발명의 시겔라 박테리아는 예를 들어, 불활성화된 유전자 대신에 항생제 저항성 마커 같은 마커 유전자를 함유할 수도 있다. 이것은 상동 재조합 방법을 이용해서 이룰 수 있다. 그럼에도 불구하고, 바람직하게는, 마킹되지 않은 삭제 (즉, 마커 유전자의 도입 없이 삭제)가 사용된다.

병독성 시겔라 균주는 병독성 성질을 유발하는 220 kb의 플라스미드를 지닌다. 이 "병독성 플라스미드"는 타겟 상피 세포의 부착소, 침입 플라스미드 항원, virF, virG 등을 포함하는 시겔라 병독성의 몇 가지 양태에 대한 유전자를 암호화하는 것으로 나타났다. 본 발명의 시겔라는 병독성 플라스미드를 지닐 수도 있지만, 바람직하게는, 시겔라는 병독성 플라스미드를 지니지 않는다. 플라스미드가 없으면 상업적으로 배양하는 동안 균주는 안정화할 수 있고, 병독성 요소들을 제거함으로써 균주를 약독화하고, 리포다당류 (에스.소네이에서 O 항원에 대한 생합성 유전자는 플라스미드 위에 있다)를 붕괴하고, ShET-2 엔테로톡신 (ospD3 또는 플라스미드에 있는 sen 유전자에 의해 암호화됨)의 존재를 피하고, 지질 A가 아실화되게 하는 msbB 유전자의 두 번째 복사품인 msbB2의 존재를 피하게 할 수 있다.

본 발명의 시겔라는 한 가지 이상의 이종 단백질을, 예를 들어, 시겔라에서 자연적으로 발견되지 않는 단백질을 발현할 수도 있다. 만약 이종 단백질이 외막 단백질이면, 그때 균주로부터의 수포는 면역계에서 비-시겔라 항원을 제공하기 위한 전달 시스템으로서 사용될 수 있다.

시겔라균을 성장시키기 위한 배양 조건은 참고문헌 12 내지 14에서 볼 수 있듯이, 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 그것들은 유기 질소원 (아미노산 혼합물, 예를 들어 Ala, Arg, Asn, Asp를 함유함; 카사미노산이 사용될 수도 있다), 탄소원으로서 글리세롤 등을 사용하여 성장시킬 수 있다. 배지에 L-아스파르트 산이 포함되면 특히 유용하고 질소 및 탄소원으로 기능을 할 수 있다.

유리하게는, 본 발명의 시겔라는 철-제한 조건에서 배양될 수 있는데, 이것은 시겔라 균주 중에서 면역성이고 잘 보전된 철-조절된 단백질을 상향 조절하는 것으로 나타났기 때문이다. 예를 들어, 박테리아는 데스페랄 또는 2,2'-디피리딜 또는 8-히드록시퀴놀린과 같은 화합물의 존재 하에 성장시킬 수 있다. 이런 조건에서 박테리아는 FepA 외막 수용체, 콜리신 1 수용체 (CirA) 및/또는 철 성분이 있는 담철세포 (ferric siderophore) 수용체 (FhuA)와 같은 단백질의 발현이 증가시킬 수 있을 것이다.

수포와 과수포발생

본 발명에서 시겔라 박테리아는, 그것들의 대응하는 야생형 균주에 비해, 과수포발생한다. 즉, 그들은 야생형 균주보다 더 많은 양의 수포를 배지로 방출한다. 이 수포는 시겔라 백신의 성분으로서 유용하다.

수포는 전형적으로 전자현미경으로 관찰했을 때, 35-120 nm의 직경, 예를 들어 50 nm 직경을 갖는다.

수포는 박테리아가 자라는 동안 자발적으로 방출되고 배지로부터 정제될 수 있다. 정제는 이상적으로는, 예를 들어 수포는 통과할 수 있고 본래의 박테리아는 통과할 수 없는 0.22 μm 필터와 같은 필터를 사용하는 크기에 기초한 여과에 의해서, 또는 저속 원심분리를 이용하여 현탁액에 수포들을 남기면서 세포는 펠릿으로 함으로써 살아있는 및/또는 본래의 시겔라 박테리아로부터 수포를 분리하는 것을 포함한다.

이와 같이 배지와 달리 본 발명의 수포-함유 조성은 일반적으로 살아있든 죽어 있든 온전한 박테리아는 실질적으로 없게 된다. 수포의 크기는 그것들이, 예를 들어 필터 멸균에 전형적으로 사용되는 바와 같이, 여과에 의해 온전한 박테리아로부터 쉽게 분리될 수 있다는 것을 의미한다. 수포는 표준 0.22 μm 필터를 통과하지만 다른 물질에 의해 쉽게 막힐 수 있어서, 0.22 μm 필터를 사용하기 전에 연속적으로 구멍의 크기를 줄여가며 필터 멸균의 순차적인 단계를 수행하는 것이 유용할 수 있다. 예를 들어, 진행할 필터의 예들은 구멍의 크기가 0.8 μm, 0.45 μm 등인 것들이 좋다.

연속적으로 방출된 수포를 배지로부터 분리하는 것은 외막에 소낭을 형성하는 외막의 고의적 붕괴를 수반하는 방법 (예를 들면, 세제 처리 또는 초음파 분해에 의함)보다 더 편리하다. 게다가, 그것들은 내막과 세포질 오염이 실질적으로 없다.

본 발명의 수포는 지질과 단백질을 함유한다. 수포의 단백질 내용물을 분석하였고 그것들은 표 1에 열거된 단백질을 함유하며 아래에서 논의되었다.

시겔라 외막 단백질

표 1에는 본 발명의 시겔라 수포에서 검출된 129 가지의 단백질에 대한 GenBank 이름과 GI 번호를 열거한다. 이 127 단백질은 수포로부터 분리되어 정제된 형태로 면역원성 성분으로서 사용될 것이다. 129 가지의 바람직한 서브세트는 "Subset 3" 목록에 처음 60 개이다.

폴리펩티드는 다양한 방법으로 준비될 수 있는데, 예를 들어 화학적 합성에 의한 방법 (적어도 부분적으로), 프로테아제를 사용하여 더 긴 폴리펩티드를 분해하는 방법, mRNA의 번역에 의한 방법, 세포 배양으로부터 정제하는 방법 (예를 들어, 재조합 발현이나 시겔라 배양으로부터) 등이 있다. E.coli 숙주에서 이종 발현은 바람직한 발현 경로이다.

본 발명의 폴리펩티드는 고체 지지체에 부착되거나 고정화될 것이다. 본 발명의 폴리펩티드는 검출 가능한 표지, 예를 들어 방사성 표지, 형광 물질 표지 또는 비오틴 표지 등으로 구성되어 있다. 이것은 면역학적 검정 (immunoassay) 기술에 있어서 특히 유용하다.

폴리펩티드는 다양한 형태를 가질 수 있다 (예를 들어, 본래 형태, 결합, 글리코실화, 비-글리코실화, 지질화, 이황화 결합 등). 폴리펩티드는 바람직하게 시겔라 폴리펩티드이다.

폴리펩티드는 바람직하게 실질적으로 정제되거나 실질적으로 독립된 형태 (즉, 시겔라 또는 숙주세포 폴리펩티가 없는 형태)로 제조된다. 일반적으로, 폴리펩티드는 비자연적으로 발생한 환경에서 제공된다. 즉, 자연스럽게 발생한 환경으로부터 분리되었다. 어떤 구체예에는, 대상 폴리펩티드는 대조군과 비교해서 폴리펩티드가 풍부한 조성에 존재한다. 보통 말하는, 정제된 폴리펩티드가 제공되는데, 정제되었다는 것은 다른 발현된 폴리펩티드가 실질적으로 없는 조성에 폴리펩티드가 존재한다는 것을 의미하고, 실질적으로 없다는 것은 다른 발현된 폴리펩티드로 구성된 조성이 50% 미만, 보통은 30% 미만, 더 대게 더 보통은 10% 미만인 것을 의미한다.

"폴리펩티드"라는 용어는 어떤 길이의 아미노산 폴리머를 나타낸다. 폴리머는 선형이거나 분지형일 수도 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수도 있고, 비-아미노산이 끼어들 수도 있다. 그 용어는 또한 자연적으로 또는 간섭에 의해 변형; 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 표지 성분과 결합 등의 어떤 다른 조작 또는 변형된 아미노산 폴리머를 포함한다. 또한 정의에 포함된 것으로, 예를 들면, 한 가지 이상의 아미노산 유사체 (예를 들어, 비자연적 아미노산 등을 포함하는) 뿐만 아니라 당업계에 알려진 다른 변형체를 함유하는 폴리펩티드이다. 폴리펩티드는 단일 사슬 또는 결합된 사슬로 나타날 수 있다.

약학적 조성물

본 발명은 (a) 본 발명의 수포 및 (b) 약학적으로 허용되는 담체 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 수포와 약학적으로 허용되는 담체를 혼합하는 단계를 포함한, 그러한 조성물의 제조방법도 제공한다.

본 발명은 또한 (a) 상기 수포 없는 면역원성 조성물 및 (b) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

면역원성 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수도 있는데, 조성물을 받는 환자에게 해로운 항체의 생산을 스스로 유발하지 않고 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 어떤 물질이라도 될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올 같은 액체를 포함할 수 있다. 습윤제 또는 에멀젼 같은 보조 물질, pH 완충 물질 등등 또한 그런 비히클에 존재할 수 있다. 적합한 담체에 대한 철저한 논의는 참고문헌 15를 창조할 수 있다.

시겔라 감염은 신체의 다양한 부위에 영향을 줄 수 있어서 본 발명의 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 조성물들은 주사가 가능한 형태, 액체 용액 또는 현탁액으로 제조될 수 있다. 주사하기 전, 액체 비히클, 용액 또는 현탁액에 존재하기 적합한 고체형태 또한 제조될 수 있다. 조성물은 예를 들어, 연고, 크림 또는 분말 등 국부 투여용으로 제조될 수도 있다. 조성물은 타블렛 또는 캡슐, 또는 시럽 (선택적으로 맛이 남) 등 경구 투여를 위해 제조될 수도 있다. 조성물은 흡입기로서 입자가 작은 분말 또는 스프레이를 이용하여 등 폐 투여를 위해 제조될 수도 있다. 조성물는 좌약 또는 질좌약으로서 제조될 수도 있다. 조성물은 액적으로서, 등 코, 귀 또는 눈 투여를 위해 제조될 수도 있다.

조성물은 바람직하게는 멸균된다. 바람직하게는 피로겐이 없다. 바람직하게는, 예를 들어 pH 6 내지 pH 8 사이, 일반적으로 약 pH 7로 완충된다. 본 발명의 조성물은 사람에 대하여 등장성일 수도 있다.

면역원성 조성물은 면역학적으로 유효한 양의 면역원뿐만 아니라 필요하다면, 다른 특정의 성분을 포함한다. '면역학적으로 유효한 양'이란, 일회투여량 또는 계속 투여의 일부에서 개인에게 그 양의 투여는 치료 또는 예방에 효과적이다 라는 것을 의미한다. 이 양은 처치 받는 개인의 건강 및 육체 상태, 나이, 처치 받는 개인의 분류학적 그룹 (예를 들어, 비인간 영장류, 영장류, 등), 항체를 합성하기 위한 개인 면역계의 수용력, 원하는 보호의 정도, 백신의 형태, 의료 상황에서 처치하는 의사의 평가 및 다른 관련된 요인에 의존하여 달라진다. 그 양은 일상적인 평가를 통해 결정될 수 있는 비교적으로 넓은 범위로 나열될 것으로 예상된다.

베지클 백신 (예를 들어, 뇌척수막염균에 대한)에 대한 이전의 연구는 수포 투여에 대한 제약학적, 약량학적 및 제제화에 대한 가이드를 제공하고 있다. 본 발명의 조성에서 수포의 농도는 일반적으로 10 내지 500 μg/ml, 바람직하게 25 내지 200 μg/ml 및 더 바람직하게 약 50 μg/ml 또는 100 μg/ml일 것이다 (수포 내 발현된 모든 단백질에 관하여). 0.5 ml의 투여량은 주사에 일반적이다.

본 조성물은 다른 면역조절 시약과 함께 투여될 수도 있다.

본 발명의 조성물에 사용될 수도 있는 보조제 (특히 수포 없는 조성물에서)는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다:

A. 무기물을 함유한 조성물

본 발명에서 면역 보조제(adjuvant)로서 사용에 적합한 무기물을 함유한 조성물은 알루미늄염 및 칼슘염 같은 무기염을 포함한다. 본 발명은 히드록시드 (예를 들어, 옥시히드록시드), 인산염 (예를 들어, 히드록시인산염, 오르토인산염), 황산염 등(예를 들어, 참고문헌 19의 8 & 9장 참조)의 무기염, 또는 다른 무기 화합물의 혼합물을 포함하고, 이때 무기화합물은 어떤 적합한 형태 (예를 들어, 젤, 결정형, 무정형 등)를 갖고 바람직하게는 흡착성이다. 무기물을 함유한 조성물은 또한 금속염의 입자로 조제될 수도 있다.

"알루미늄 히드록시드"로 알려진 면역 보조제는 일반적으로 알루미늄 옥시히드록시드 염인데, 대게는 적어도 부분적으로 결정이다. 알루미늄 옥시히드록시드는, 화학식 AlO(OH)로 나타낼 수 있는데, 적외선 (IR) 분광법에 의해, 특히 1070 cm^-1에서의 흡착밴드와 3090-3100 cm^-1에서의 strong shoulder의 존재에 의해, 알루미늄 히드록시드 Al(OH)₃ 같은 다른 알루미늄 화합물과 구별될 수 있다 (참고문헌 19의 9장). 알루미늄 히드록시드 보조제의 결정도의 정도는 반높이에서 회절띠의 넓이 (WHH)에 의해 반영되는데, 결정이 덜된 입자는 더 작은 결정의 크기 때문에 선의 넓어짐이 더 크다. WHH의 증가에 따라 표면은 증가하고, 및 높은 WHH 값을 갖는 보조제는 더 큰 항원 흡착 능력을 갖는 것으로 보여져 왔다. 섬유 모양 (예를 들어, 투과 전자 현미경 사진을 보면)은 알루미늄 히드록시드 보조제에서 일반적이다. 알루미늄 히드록시드 보조제의 pI는 일반적으로 약 11인데 즉, 보조제 자체는 생리학적 pH에서 스스로 양성 표면 전하를 갖는다. pH 7.4에서 Al⁺⁺⁺ mg 당 1.8-2.6 mg 단백질의 흡착 수용력이 알루미늄 히드록시드 보조제에 대해 보고되어 왔다.

"알루미늄 인산염"으로 알려진 면역 보조제는 일반적으로 알루미늄 수산화인산염이고, 종종 소량의 황산염 (예를 들어, 알루미늄 수산화인산염 황산염) 또한 함유한다. 침전에 의해 얻을 수도 있고, 및 침전 중 반응 조건과 농도는 염 내 히드록실기를 인산염으로 치환하는 정도에 영향을 준다. 수산화인산염은 일반적으로 PO₄/Al의 분자비가 0.3 내지 1.2이다. 수산화인산염은 히드록실기의 존재에 의해 엄밀한 AlPO₄와 구별될 수 있다. 예를 들어, 3164 cm^-1에서 IR 스펙트럼 띠(예를 들어, 200 ℃에서)는 구조상 히드록실기의 존재를 가리킨다 (참고문헌 19의 9장).

알루미늄 인산염 보조제의 PO₄/Al^{3 +} 몰비는 일반적으로 0.3 내지 1.2, 바람직하게 0.8 내지 1.2, 더 바람직하게 0.95 ± 0.1일 것이다. 알루미늄 인산염은 일반적으로 특히 수산화인산염일 때, 무정형이다. 일반적인 보조제는 PO₄/Al 몰비가 0.84 내지 0.92, 0.6 mg Al^{3 +}/ml를 포함하는 무정형 알루미늄 수산화인산염이다. 알루미늄 인산염은 일반적으로 입자화될 것이다 (예를 들어, 투과성 전자 현미경 사진에서 보여질 때 플레이트 유사 모양). 미립자들의 일반적 직경은 어느 항원 흡착 후에 0.5-20 μm (예를 들어, 약 5-10 μm) 범위에 있다. pH 7.4에서 Al⁺⁺⁺ mg 당 0.7-1.5 mg 단백질의 흡착 수용량이 알루미늄 인산염 보조제에 대해 보고되어 왔다.

알루미늄 인산염의 영전하점 (PZC)은 히드록실기를 인산염으로 치환한 정도와 반비례 관계가 있고, 이 치환 정도는 침전에 의해 염을 제조하는데 사용한 반응 조건과 반응물의 농도에 따라 다양해질 수 있다. PZC는 또한 용액 내 자유 인산 이온의 농도 변화 (더 많은 인산염 = 더 산성의 PZC) 또는 히스티딘 완충액 같은 완충액 첨가 (PZC를 더 염기성으로 만들어줌)에 의해 달라졌다. 본 발명에 따라 사용된 알루미늄 인산염은 일반적으로 4.0 내지 7.0, 바람직하게 5.0 내지 6.5, 예를 들면 약 5.7의 PZC를 가질 것이다.

본 발명의 조성물을 제조하는데 사용된 알루미늄 염 현탁액은 완충액 (예를 들어, 인산염 또는 히스티딘 또는 트리스 완충액)을 함유하지만, 이것은 항상 필요한 것은 아니다. 현탁액은 바람직하게 멸균되고 및 피로겐이 없다. 현탁액은 예를 들어, 1.0 내지 20 mM, 바람직하게 5 내지 15 mM 및 더 바람직하게 약 10 mM의 농도로 존재하는 자유 수성의 인산 이온을 포함할 수도 있다. 현탁액은 염화나트륨 또한 포함할 수도 있다.

하나의 구체예에서, 면역 보조제 성분은 알루미늄 히드록시드 및 알루미늄 인산염 둘 다의 혼합물을 포함한다. 이 경우 히드록시드보다 알루미늄 인산염이 더 많이 있을 수도 있다., 예를 들면, 적어도 2 : 1의 질량비, 예를 들어 ≥5 : 1 , ≥6 : 1, ≥7 : 1, ≥8 : 1, ≥9 : 1 등이다.

환자에 투여하기 위한 조성물에 A⁺⁺⁺의 농도는 바람직하게 10 mg/ml 미만, 예를 들어 ≤5 mg/ml, ≤4 mg/ml, ≤3 mg/ml, ≤2 mg/ml, ≤1 mg/ml 등이다. 바람직한 범위는 0.3 내지 1 mg/ml이다. 최대 복용량은 0.85 mg/일회 복용량 미만이 바람직하다.

B. 오일 에멀젼

본 발명에서 면역 보조제로서 사용에 적합한 오일 에멀젼의 조성물은 MF59 [참고문헌 19의 10장; 참고문헌 16] (5% 스쿠알렌, 0.5% Tween 80, 그리고 0.5% Span 85, 미세유동화기를 이용하여 미크론 미만의 입자로 조제) 같은 스쿠알렌-물 에멀젼을 포함한다. 완전프로인트보조제 (CFA) 및 불완전프로인트보조제 (IFFA) 또한 사용될 수 있다.

다양한 적합한 수중유 에멀젼이 알려져 있고, 그것들은 일반적으로 생분해 가능하고 (대사 가능하고) 생체에 적합한 적어도 한 가지의 오일과 적어도 한 가지의 계면활성제를 포함한다. 에멀젼 안에 작은 오일 방울은 일반적으로 직경 5 μm 미만이고, 유리하게도 에멀젼은 안정한 에멀젼을 제공하기 위해 미세유동화기로 얻어진 작은 크기, 즉, 서브-미크론의 직경을 갖는 오일 방울을 포함한다. 220 nm 미만 크기의 방울이 더 바람직한데 필터 멸균될 것이기 때문이다.

본 발명은 동물 (예, 물고기) 또는 야채 원료로부터의 오일들이 사용될 수 있다. 야채 오일의 원료는 견과류, 씨앗 및 곡물을 포함한다. 땅콩 오일, 콩 오일, 코코넛 오일 및 올리브 오일을 가장 흔히 이용하는데, 견과류 오일의 예가 된다. 호호바 (jojoba) 오일, 예를 들어 호호바 콩에서 얻어진 것도 사용될 수 있다. 씨앗 오일은 홍화씨 오일, 목화씨 오일, 해바라기씨 오일, 참깨씨 오일 등을 포함한다. 곡류에서, 옥수수 오일을 가장 손쉽게 이용하지만, 밀, 귀리, 호밀, 쌀, 테프, 라이밀 등의 다른 곡류의 오일 또한 사용될 수 있다. 글리세롤과 1,2-프로판디올의 6-10 탄소 지방산 에스테르는, 씨앗 오일에서 자연적으로 발생하지 않지만, 견과류 및 씨앗 오일 유래의 적절한 물질의 가수분해, 분리 및 에스테르화에 의해 제조될 수도 있다. 포유동물 젖의 지방과 오일이 대사되어, 본 발명에 사용될 수도 있다. 동물 원료로부터 순수한 오일을 얻기 위해 필요한 분리, 정제, 비누화 및 다른 수단은 당업계에 잘 알려져 있다. 대부분 물고기는 손쉽게 회수될 수도 있는 대사가능한 오일을 함유한다. 예를 들어, 대구 간 오일, 상어 간 오일 및 경랍 (spermaceti)같은 고래 오일은 여기에 사용될 수도 있는 여러 가지 물고기 오일의 예가 된다. 다수의 분지형 오일은 5-탄소 이소프렌 단위로 생화학적으로 합성되고 일반적으로 테르페노이드이라고 부른다. 상어 간 오일은 스쿠알렌, 2,6,10,15,19,23-헥사메틸-2,6,10,14,18,22-테트라코사헥사엔이라고 알려진 분지형의, 불포화 테르페노이드를 함유한다. 다른 바람직한 오일은 토코페롤이다 (하기 참조). 스쿠알렌을 포함하는 수중유 에멀젼이 특히 바람직하다. 오일의 혼합물도 사용될 수 있다.

계면활성제는 그들의 'HLB' (친수/친유 밸란스)에 의해 분류될 수 있다. 본 발명에서 바람직한 계면활성제는 적어도 10, 바람직하게 적어도 15 및 더 바람직하게 적어도 16의 HLB를 갖는다. 본 발명은 다음을 포함하는 계면활성제와 함께 사용될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다: 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제 (일반적으로 Tweens라고 불림), 특히 폴리소르베이트 20과 폴리소르베이트 80; DOWFAX^TM이라는 상표로 시판되는, 선형의 EO/PO 블록 코폴리머 같은, 에틸렌 옥시드 (EO), 프로필렌 옥시드 (PO) 및/또는 부틸렌 옥시드 (BO)의 코폴리머; 특히 옥톡시놀-9 (triton X-100, 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올)와 함께, 반복되는 에톡시기 (옥시-1,2-에탄디일)의 수가 다양할 수 있는 옥톡시놀; (옥틸페녹시)폴리에톡시에탄올 (IGEPAL CA-630/NP-40); 포스파티딜콜린 같은 인지질 (레시틴); 트리에틸렌글리콜 모노라우릴 에테르 (Brij 30) 같은, 라우릴, 세틸, 스테아릴 및 올레일 알콜 유래의 폴리옥시에틸렌 지방 에테르 (Brij 계면활성제); 소르비탄 트리올리에이트 (Span 85) 및 소르비탄 모노라우레이트 같은 소르비탄 에스테르 (일반적으로 SPANs라고 알려짐). 에멀젼에 포함되는 바람직한 계면활성제는 Tween 80 (플리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트), Span 85 (소르비탄 트리올리에이트), 레시틴 및 triton X-100이다. 위에서 언급하였듯이, Tween 80 같은 세제는 아래 예에서 보여지듯, 온도 안정성에 기여할 수도 있다.

계면활성제의 혼합물이 사용될 수 있는데, 예를 들면 Tween 80/Span 85 혼합물이다. 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트 (Tween 80) 같은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 및 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올 (triton X-100) 같은 옥톡시놀의 조합 또한 적합하다. 또 다른 유용한 조합은 laureth 9 에 더하여 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 및/또는 옥톡시놀을 포함한다.

계면활성제의 바람직한 양은 (중량 %): 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 (Tween 80) 0.01 내지 1%, 특히 약 0.1%; 옥틸- 또는 노닐페톡시 폴리옥시에탄올 (triton X-100 또는 triton 계열의 다른 세제) 0.001 내지 0.1%, 특히 0.005 내지 0.02%; 폴리옥시에틸렌 에테르 (laureth 9) 0.1 내지 20%, 바람직하게 0.1 내지 10%, 및 특히 0.1 내지 1% 또는 약 0.5%이다

본 발명에 유용한 특정 수중유 에멀젼 보조제는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다:

● 스쿠알렌, tween 80 및 Span 85의 서브 미크론 에멀젼. 에멀젼의 조성은 부피 기준으로 약 5% 스쿠알렌, 약 0.5% 폴리소르베이트 80과 약 0.5% Span 85로 구성. 중량기준에서, 4.3% 스쿠알렌, 0.5% 폴리소르베이트 80 및 0.48% Span 85의 비율이다. 이 보조제는 'MF59'로 알려져있고 [참고문헌 16-18], 참고문헌 19의 10장과 참고문헌 20의 12장에 더 자세히 설명되어 있다. MF59 에멀젼은 유리하게 시트레이트 이온을 포함하는데, 예를 들어,10 mM 시트르산나트륨 완충액을 포함한다.

● 스쿠알렌, α-토코페롤 및 폴리소르베이트 80으로 이루어진 에멀젼. 이 에멀젼은 2-10% 스쿠알렌, 2-10% 토코페롤 및 0.3-3% Tween 80으로 구성되어 있고, 스쿠알렌과 토코페롤의 중량비는 바람직하게는 1 미만 (예를 들어, 0.90)이 좋은데 더 안정된 에멀젼을 제공하기 때문이다. 스쿠알렌과 Tween 80은 부피비가 약 5 : 2 또는 중량비가 약 11 : 5이다. 이런 에멀젼은 PBS에 Tween 80을 녹여 2% 용액을 만든 다음, 이 용액 90 ml과 (5 g DL-α-토코페롤과 5 ml 스쿠알렌) 의 혼합물을 혼합한 후, 그 혼합물을 마이크로유동화한다. 얻어진 에멀젼은 서브 미크론의 오일 방울을 가지는데, 평균 지름이 100에서 250 nm이고, 바람직하게는 약 180 nm 정도를 가진다.

● 스쿠알렌, 토코페롤 및 triton 세제 (예를 들어, triton X-100)의 에멀젼. 이 에멀젼은 3d-MPL 또한 포함한다 (하기 참조). 이 에멀젼은 인산완충액을 함유할 수 있다.

● 폴리소르베이트 (예를 들어, 폴리소르베이트 80), triton 세제 (예를 들어, triton X-100) 및 토코페롤 (예를 들어, α-토코페롤 숙시네이트)을 포함하는 에멀젼. 에멀젼은 약 75 : 11 : 10 (750 μg/ml 폴리소르베이트 80, 110 μg/ml triton X-100 및 100 μg/ml α-토코페롤 숙신산)의 질량비의 세 가지 성분을 포함할 수도 있고, 이 농도는 항원으로부터 성분들의 기여를 포함해야 한다. 에멀젼은 스쿠알렌도 포함할 수도 있다. 에멀젼은 3d-MPL을 포함할 수도 있다 (하기 참조). 수성상은 인산염 완충액을 함유할 수도 있다.

● 스쿠알렌, 폴리소르베이트 80 및 폴록사머 401 ("Pluronic^TM L121")의 에멀젼. 에멀젼은 pH 7.4의 인산염 완충 식염수로 조제될 수 있다. 이 에멀젼은 무라밀 디펩티드에 대한 유용한 전달 비히클이고, "SAF-1" 보조제 [참고문헌 21] (0.05-1% Thr-MDP, 5% 스쿠알렌, 2.5% Pluronic L121 및 0.2% 폴리소르베이트 80)에서 트레오닐-MDP와 함께 사용된다. 또한 "AF" 보조제 (참고문헌 22)에서 (5% 스쿠알렌, 1.25% Pluronic L121 및 0.2% 폴리소르베이트 80) Thr-MDP 없이 사용될 수도 있다. 미세유동화가 바람직하다.

● 스쿠알렌, 수성 용매, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 친수성 비이온성 계면활성제 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 (12) 세토스테아릴 에테르) 및 소수성 비이온성 계면활성제 (예를 들어, 소르비탄 모노올레이트 또는 'Span 80' 같은 소르비탄 에스테르 또는 만니드 에스테르)를 포함하는 에멀젼. 에멀젼은 바람직하게 열 가역성 및/또는 크기가 200 nm 미만인 오일 방울을 적어도 90% 부피를 가진다 [참고문헌 23]. 에멀젼은 또한 한 가지 이상의: 알디톨; 동결보호제 (예를 들어, 도데실말토시드 및/또는 수크로즈 같은 당); 및/또는 알킬폴리글리코시드를 포함할 것이다. 이러한 에멀젼은 동결건조될 수 있다.

● 0.5-50%의 오일, 0.1-10%의 인지질 및 0.05-5%의 비이온성 계면활성제를 포함하는 에멀젼. 참고문헌 24에서 설명된 바와 같이, 바람직한 인지질 성분은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 포스파티드산, 네핑고미엘린 및 카디올리핀이다. 서브 미크론의 방울 크기가 유리하다.

● 대사되지 않는 오일 (경 미네랄 오일) 및 적어도 한 가지 이상의 계면활성제 (레시틴, Tween 80 또는 Span 80)로 이루어진 서브 미크론 수중유 에멀젼. QuilA 사포닌, 콜레스테롤, 사포닌-친유성기 컨쥬게이트 (참고문헌 25에서 설명된 바와 같이, 글루쿠로닉산의 카복실기를 통해 데스아실사포닌에 알리파틱 아민 첨가에 의해 생성된 GPI-0100), 디메티이디옥타데실암모늄 브로마이드 및/또는 N,N-디옥타데실-N,N,-비스 (2-히드록시에틸) 프로판디아민 같은 첨가제를 포함할 수도 있다.

● 미네랄 오일, 비이온성 친유성 에톡실화 지방 알콜 및 비이온성 친수성 계면활성제 (예를 들어, 에톡실화 지방 알콜 및/또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 코폴리머) 를 포함하는 에멀젼 [참고문헌 26].

● 미네랄 오일, 비이온성 친수성 에톡실화 지방 알콜 및 비이온성 친유성 계면활성제 (예를 들어 에톡실화 지방 알콜 및/또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 코폴리머) 를 포함하는 에멀젼 [참고문헌 26].

● 사포닌 (예를 들어, QuilA 또는 QS21) 및 스테롤 (예를 들어, 콜레스테롤)이 나선형 미셀로 결합되어 있는 에멀젼이다 [참고문헌 27].

조성물 내의 항원 및 면역 보조제는 일반적으로 환자에게 전달하는 시점에 혼합될 것이다. 에멀젼은 제조 시 또는 전달 시점에 즉시 항원과 섞일 수도 있다. 따라서 보조제와 항원은 포장된 백신 또는 유통된 백신에서 별개로 보관되어, 사용 시점에 최종 제제가 되도록 준비한다. 항원은 백신이 최종적으로 두 액체의 혼합에 의해 제조되도록 일반적으로 수성 형태일 것이다. 섞기 위한 두 액체의 부피비는 다양하지만 (5 : 1 내지 1 : 5) 일반적으로 약 1 : 1이다.

C. 사포닌 제제 [참고문헌 19의 22장]

본 발명에서 사포닌 제제는 면역 보조제로서 사용될 수도 있다. 사포닌은 스테롤 글리코시드 및 트리테르페노이드 글리코시드의 불균일 혼합물이고, 식물 종의 넓은 범위의 나무 껍질, 잎, 줄기, 뿌리 및 꽃에서 발견된다. Quillaia saponaria Molina 나무 껍질로부터의 사포닌은 보조제로서 널리 연구되고 있다. 사포닌은 또한 상업적으로 Smilax ornata (사르사프릴라), Gypsophilla paniculata (brides veil) 및 Saponaria officianalis (석회패랭이꽃)로부터 얻어질 수 있다. 사포닌 보조제 제제는 QS21 같은 정제된 제제뿐만 아니라 ISCOMs 같은 지질 제제도 포함한다. QS21은 Stimulon^TM으로서 판매된다.

사포닌 조성물은 HPLC 및 RP-HPLC를 이용하여 정제되어 왔다. 이 기술을 이용하여 정제된 특정 분획이 확인되었는데, QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B 및 QH-C를 포함한다. 바람직하게, 그 사포닌은 QS21이다. QS21을 생산하는 방법은 참고문헌 28에 개시되어 있다. 사포닌 제제는 또한 콜레스테롤 같은 스테롤을 포함할 수도 있다 [참고문헌 29].

사포닌 및 콜레스테롤의 조합은 면역 자극 복합체 (ISCOMs; 참고문헌 19의 23장 참조; 또한 참고문헌 30 & 31)라고 불리는 독특한 미립자를 형성하기 위해 사용될 수 있다. ISCOMs는 일반적으로 포스파티딜에탄올아민 또는 포스파티딜콜린 같은 인지질 또한 포함한다. 사포닌으로 알려진 어떤 것도 ISCOMs에 사용될 수 있다. 바람직하게, ISCOM은 QuilA, QHA & QHC 중 한 가지 이상을 포함한다. 선택적으로, ISCOMS는 추가적인 세제가 전혀 없을 수도 있다 [참고문헌 32].

면역 보조제에 기초한 사포닌 개발의 검토는 참고문헌 33 &34에서 발견될 수 있다.

D. 박테리아 또는 미생물의 파생물

본 발명에서 사용에 적합한 면역 보조제는 장내세균 리포다당류 (LPS)의 비독성 파생물, 지질 A 파생물, 면역자극 올리고뉴클레오티드 및 ADP-리보실화 독소 같은 박테리아 또는 세균의 파생물 및 그것의 해독된 파생물을 포함한다.

LPS의 비독성 파생물은 모노포스포릴 지질 A (MPL) 및 3-O-디아실화 MPL (3dMPL)을 포함한다. 3dMPL은 3 데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A와 4, 5 또는 6 아실화 사슬과의 혼합물이다. 3 데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A의 바람직한 "작은 미립자" 형태는 참고문헌 35에 개시되어 있다. 이러한 3dMPL의 "작은 미립자"는 작아서 충분히 0.22 μm 막을 통해 필터멸균된다 [참고문헌 35]. 또 다른 비독성 LPS 파생물은 아미노알킬 글루코사미니드 인산염 파생물, 예를 들어 RC-529 같은 모노포스포릴 지질 A 유사체를 포함한다 [참고문헌 36, 37]

지질 A 파생물은 OM-174 같은 Escherichia coli로부터의 지질 A의 파생물을 포함한다. OM-174는 참고문헌 38 & 39에 예를 들어 설명되어 있다.

본 발명에서 면역 보조제로서 사용에 적합한 면역자극 올리고뉴클레오티드는 CpG motif (인산 결합에 의해 구아노신에 메틸화되지 않은 시토신이 결합된 디뉴클레오티드 서열)를 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 팔린드로믹 또는 poly(dG) 서열을 함유하는 이중 나선 RNAs 및 올리고뉴클레오티드 또한 면역자극성이 관찰되었다.

CpG's는 포스포로티오에이트 변형체 같은 뉴클레오티드 변형체/유사체를 포함할 수 있고 이중 나선 또는 단일 나선일 수 있다. 참고문헌 40, 41 및 42는 가능한 유사체 치환, 예를 들어, 구아노신을 2'-디옥시-7-디아자구아노신으로 대체한 것을 개시한다. CpG 올리고뉴클레오티드의 보조제 효과는 참고문헌 43-48에서 더 논의된다.

CpG 서열은 motif GTCGTT 또는 TTCGTT 같은 TLR9와 관련될 수도 있다 [참고문헌 49]. CpG 서열은 CpG-A ODN 같이 Thl 면역반응을 유발하는데 특이적일 수도 있고 또는 CpG-B ODN 같이 B 세포 반응을 유발하는데 특이적일 수도 있다. CpG-A 및 CpG-B ODN은 참고문헌 50-52에서 논의된다. 바람직하게, CpG는 CpG-A ODN이다.

바람직하게, CpG 올리고뉴클레오티드의 5' 말단은 수용체 인식이 가능하도록 설계된다. 선택적으로, 두 가지 CpG 올리고뉴클레오티드 서열은 "immunomer"를 형성하기 위해 그들의 3' 말단에 부착될 수도 있다. 예를 들면, 참고문헌 53-55참조.

면역자극 올리고뉴클레오티드에 기초한 특히 유용한 면역 보조제는 IC-31^TM이라고 알려져 있다 [참고문헌 56-58]. 따라서 본 발명에 사용된 보조제는 (i) 적어도 하나의 (그리고 바람직하게 여러 가지) CpI motifs (즉, 디뉴클레오티드를 형성하기 위해 이노신에 결합한 시토신)를 포함하는 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 15-40 뉴클레오티드) 및 (ii) 적어도 하나의 (그리고 바람직하게 여러 개) Lys-Arg-Lys 트리펩티드 서열(들)을 포함하는 올리고펩티드 (예를 들어, 5에서 20 사이의 아미노산) 같은 폴리양이온성 (polycationic) 폴리머의 혼합물을 포함할 수도 있다. 올리고뉴클레오티드는 26-mer 서열 5'-(IC)₁₃-3' (SEQ ID NO : 7)을 포함하는 디옥시뉴클레오티드일 수도있다. 폴리양이온성 중합체는 11-mer 아미노산 서열 KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO: 6)을 포함하는 펩티드일 수도 있다. SEQ ID NOs : 6 및 7의 이 조합은 IC-31^TM 보조제를 제공한다.

본 발명에서 박테리아 ADP-리보실화 독소 및 그것의 해독된 파생물은 면역 보조제로서 사용될 수도 있다. 바람직하게, 단백질은 E.coli (E.coli 열 불안정 장독소 "LT"), 콜레라 ("CT") 또는 백일해 ("PT")로부터 파생된다. 해독된 ADP-리보실화 독소의 사용과 관련하여 점막의 보조제는 참고문헌 59에 개시되어 있고, 장외 보조제는 참고문헌 60에서 설명된다. 독소와 변성독소는 바람직하게 A 및 B 서브유닛 둘 다 포함하는 홀로톡신의 형태이다. 바람직하게, A 서브유닛은 해독 기능의 돌연변이를 함유하고; 바람직하게 B 서브유닛은 돌연변이 되지 않는다. 바람직하게, 보조제는 LT-K63, LT-R72 및 LT-G192 같은 해독된 LT 돌연변이이다. ADP-리보실화 독소 및 그것의 해독된 파생물, 특히 LT-K63 및 LT-R72의 보조제로서 사용은 참고문헌 61-68에서 발견될 수 있다. 유용한 CT 돌연변이는 또한 CT-E29H이다 [참고문헌 69]. 아미노산 치환에 관한 참조번호는 바람직하게, ADP-리보실화 독소의 A 및B 서브유닛의 정렬에 기초하고, 이는 참고문헌 70에 개시되어 있다.

E. 인간 면역조절인자

본 발명에서 면역 보조제로서 사용에 적합한 인간 면역조절인자는 인터류킨들 (예를 들어, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [참고문헌 71] 등), 인터페론들 (예를 들어, 인터페론-γ), 대식세포 콜로니 자극 인자 및 종양 괴사 인자 같은 사이토카인들을 포함한다. 바람직한 면역조절인자는 IL-12이다.

F. 생접착제 및 점막접착제

본 발명에서 생접착제 (bioadhesives) 및 점막접착제는 또한 보조제로서 사용될 수도 있다. 적합한 생접착제는 에스테르화된 히알루론산 미크로스피어를 포함하고 [참고문헌 73] 또는 폴리(아크릴산), 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리사카라이드 및 카복시메틸셀룰로즈의 가교결합 파생물 같은 점막접착제를 포함한다. 본 발명에서 키토산 및 그것의 파생물은 보조제로서 사용될 수도 있다 [참고문헌 74].

G. 미립자

본 발명에서 미립자 또한 면역 보조제로서 사용될 수도 있다. 미립자 (즉, 직경 ~100 nm 내지 ~150 μm, 더 바람직하게 직경 ~200 nm 내지 30 μm 및 가장 바람직하게 직경 ~500 nm 내지 10 μm인 미립자)는 생분해성 및 비독성 (예를 들어, 폴리(α-히드록시산), 폴리히드록시낙산, 폴리오르토에스테르, 폴리무수물, 폴리카프로락톤 등)인 물질로부터, 폴리(락티드-코-글리콜리드)와 함께 형성된 미립자가 바람직하고, 선택적으로 음성 전하를 띈 표면을 갖기 위해 (예를 들어, SDS로 처리) 또는 양성 전하를 띈 표면을 갖기 위해 (예를 들어, CTAB 같은 양이온 세제로 처리) 처리된다.

H. 리포솜 (참고문헌 19의 13 &14장)

면역 보조제로서 사용에 적합한 리포솜 제제의 예는 참고문헌 75-77에 설명되어 있다.

I. 이미다조퀴놀론 화합물

본 발명에서 면역 보조제로서 사용에 적합한 이미다조퀴놀론 화합물의 예는 이미콰모드 및 그것의 상동체 (예를 들어, "레시퀴모드 3M")를 포함하고, 참고문헌 78 및 79에 더 설명되어 있다.

본 발명은 또한 상기 확인된 한 가지 이상의 보조제 양태의 조합을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명에서 다음의 보조제 조성이 사용될 수도 있다: (1) 사포닌과 수중유 에멀젼 [80]; (2) 사포닌 (예를 들어, QS21) + 비독성 LPS 파생물 (예를 들어, 3dMPL) [81]; (3)사포닌 (예를 들어, QS21) + 비독성 LPS 파생물 (예를 들어, 3dMPL) + 콜레스테롤; (4) 사포닌 (예를 들어, QS2) + 3dMPL + IL-12 (임의적으로, + 스테롤) [82]; (5) 3dMPL과 예를 들어, QS21 및/또는 수중유 에멀젼의 조합 [83]; (6) 10% 스쿠알렌, 0.4% Tween 80^TM, 5% 플루로닉-차단 폴리머 L121 및 thr-MDP를 포함하는 SAF로서, 서브 미크론의 에멀젼으로 미세유동화 또는 더 큰 미립자 크기의 에멀젼을 발생하기 위해 섞는다. (7) 2% 스쿠알렌, 0.2% Tween 80, 및 모노포스포릴지질 A (MPL), 트리할로스 디미콜레이트 (TDM) 및 세포벽 골격 (CWS)으로 구성된 군으로부터 선택된 한 가지 이상의 박테리아 세포벽 성분을 함유한 Ribi^TM 보조제 시스템 (RAS), (Ribi Innunochem), 바람직하게 MPL + CWS (디톡스^TM); 및 (8) 한 가지 이상의 무기염 (예를 들어, 알루미늄염) + LPS의 비독성 파생물 (예를 들어, 3dMPL)

면역자극제로서 작용하는 다른 물질은 참고문헌 19의 7장에 개시되어 있다.

알루미늄 히드록시드 보조제는 유용하고, 항원들은 일반적으로 이 염에 흡착된다. 서브 미크론의 오일 방울과 함께, 스쿠알렌을 포함하는 수중유 에멀젼 또한 바람직한데, 특히 나이 많은 사람들에게 바람직하다. 유용한 보조제 조합은 CpG & 알루미늄염, 또는 레시퀴모드 & 알루미늄염 같은, Th1 및 Th2 보조제의 조합을 포함한다. 알루미늄염 및 3dMPL의 조합도 또한 사용될 수도 있다.

면역화

상기 설명된 것과 같이 면역원성 조성물을 제공함에 더하여, 본 발명은 포유류에서 항체 반응을 증가시키기 위한 방법 또한 제공하는데, 포유류에 본 발명의 면역원성 조성물 투여를 포함한다. 항체 반응은 바람직하게 보호성 항체 반응이다. 본 발명은 또한 이러한 방법에 사용하기 위해 본 발명의 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 시겔라 감염 및/또는 병에 대해 (예를 들어, 시겔라병, Reiter 증후군 및/또는 용혈성 요독 증후군에 대해) 포유류를 보호하는 방법을 제공하는데, 포유류에 본 발명의 면역원성 조성물 투여를 포함한다.

본 발명은 약제로서 (예를 들어, 면역원성 조성물 또는 백신으로서) 사용하기 위해 본 발명의 조성물을 제공한다. 그것은 또한 포유류의 시겔라 감염을 예방하기 위해 (예를 들어, 시겔라병, Reiter 신드롬 및/또는 용혈성 요독 증후군을 예방하기 위해) 약제 제조에 본 발명의 소낭의 사용을 제공한다. 그것은 또한 포유류의 시겔라 감염을 예방하기 위해, 예를 들면, 시겔라병을 예방하기 위해 수포 없는 약제를 제조하는데 (상기 정의된 것과 같이)수포 단백질의 사용을 제공한다.

포유류는 바람직하게 사람이다. 사람은 성인 또는 바람직하게 아이일 수도 있다. 백신이 예방용일 경우, 사람은 바람직하게 아이이고 (예를 들어, 걸음마 아기 또는 젖먹이), 백신이 치료용일 경우, 사람은 바람직하게 성인이다. 아이 대상의 백신은, 예를 들어, 안전성, 일회복용량, 면역원성 등을 평가하기 위해 어른에게 투여될 수도 있다.

사용과 방법은 특히 시겔라병, Reiter 신드롬 및/또는 용혈성 요독 증후군을 포함한 병을 예방/치료하는데 유용하지만, 그것에만 제한된 것은 아니다.

치료 효능은 본 발명의 조성물 투여 후 시겔라 감염을 관찰함에 의해 검사될 수 있다. 예방용 처치의 효능은 조성물 투여 후 수포 또는 다른 항원에서 면역원성 단백질에 대한 면역 반응을 관찰함에 의해 검사될 수 있다. 본 발명의 조성물의 면역원성은 시험 대상 (예를 들어, 12-16 개월 아이들)에 투여한 후, 그때 표준 혈청 파라미터를 결정함으로써 확인될 수 있다. 이 면역 반응은 일반적으로 조성물 투여 약 4 주 후 결정되고, 조성물 투여 전 결정된 값과 비교될 것이다. 조성물이 일회 투여량 이상이 투여되면, 하나 이상의 투여 후 측정이 행해질 수 있다.

본 발명의 조성물은 일반적으로 환자에게 직접 투여될 것이다. 직접 전달은 비경구 (예를 들어, 피하, 복강 내부, 정맥 내부, 근육 내부 또는 조직의 사이 공간에) 주사, 또는 직장, 구강, 질, 국부, 피부를 통해, 또는 비강내, 안구, 귀, 폐 또는 다른 점막 투여에 의해 달성될 수 있다. 넓적다리 또는 상완의 근육 내부 투여가 바람직하다. 주사는 바늘을 통해서 (예를 들어, 피하주사기) 될 수도 있지만, 바늘 없는 주사가 대신 사용될 수도 있다. 일반적인 근육 내 투여량은 약 0.5 ml이다.

본 발명은 전신 및/또는 점막의 면역력을 유도하기 위해 사용될 수도 있다.

일회투여량 처치는 한 번 투여 또는 다수 투여일 수 있다. 다수 투여는 1차 면역 발생 및/또는 면역 발생 촉진에서 사용될 수도 있다. 1차 투여에 이어 촉진 투여가 있을 수도 있다. 1차 투여 사이 (예를 들어, 4-16주 사이) 및 1차와 촉진 사이의 적합한 간격이 통상적으로 결정될 수 있다.

일반

용어 "포함하는"은 "구성하는" 뿐만 아니라 "포함하는"을 포함하며, 예를 들어, X를 포함하는 조성물은 오로지 X만으로 구성될 수도 있고, 추가적인 어떤 것, 예를 들어, X + Y를 포함할 수도 있다.

숫자 x와 관련된 용어 "약"은 임의적이고, 예를 들어, x ± 10%를 의미한다이다.

단어 "실질적으로"는 "완전히"를 제외하지 않으며, 예를 들어 Y가 "실질적으로 없는"조성물은 Y가 완전히 없을 수도 있다. 필요하다면, 단어 "실질적으로"는 본 발명의 정의로부터 제외될 수 있다.

두 가지의 아미노산 서열 사이의 백분율 서열 동일성에 관한 참고문헌은 정렬했을 때, 아미노산의 백분율은 두 서열을 비교했을 때와 같다는 것을 의미한다. 이 정렬 및 백분율 상동성 또는 서열 동일성은 당업계에 알려진 소프트웨어 프로그램을 사용하여 결정될 수 있는데, 예를 들어, 참고문헌 84의 7.7.18 부분에 설명되어 있다. 바람직한 정렬은 틈이 열리는 패널티가 12이고 틈 확장 패널티가 2, BLOSUM 매트릭스가 62인 affine 틈 검색을 이용한 Smith-Waterman 상동성 검색 알고리듬에 의해 결정된다. Smith-Waterman 상동성 검색 알고리듬은 잘 알려져있고, 참고문헌 85에 개시되어 있다.

"GI" 넘버링은 상기 사용되었다. GI 번호, 또는 "GenInfo Identifier"는, 서열이 데이터베이스에 추가되었을 때 NCBI에 의해 진행된 각 서열 기록에 연속적으로 맡겨진 숫자 시리즈이다. GI 번호는 서열 기록의 수납번호와 유사성을 낳지 않는다. 서열이 업데이트 될 때 (예를 들면, 정정 또는 더 많은 주석 또는 정보를 추가하기 위해) 그때 새로운 GI 번호를 받게 된다. 따라서 주어진 GI 번호에 관계된 서열은 절대 변하지 않는다.

본 발명이 "에피토프"와 관련된 경우, 이 에피토프는 B-세포 및/또는 T-세포의 에피토프일 것이다. 이러한 에피토프는 경험적으로 (예를 들어, PEPSCAN을 사용하거나 [86, 87] 또는 유사한 방법을 이용하여) 확인될 수 있고, 또는 예측될 수 있다 (예를 들어, Jameson- Wolf antigenic index [88], matrix-based approaches [89], MAPITOPE [90], TEPITOPE [91,92], neural networks [93], OptiMer & EpiMer [94, 95], ADEPT [96], Tsites [97], hydrophilicity [98], antigenic index [99] 또는 참고문헌 100-101 등에 개시된 방법을 사용하여). 에피토프는 항체의 일부로서, 항체 또는 T-세포 수용기의 항원 결합부위에 의해 인식되어 결합하고, "항원 결정기"로서 인용될 수도 있다.

도 1은 배지로부터 정제된 본 발명의 수포의 전자 현미경 사진을 나타낸다.
도 2는 에스.소네이 ΔtolRΔgalU로부터의 수포의 2D SDS-PAGE를 나타낸다.
도 3은 다양한 표시된 균주에서 항-코어 항체로 염색된 수포의 LPS를 나타낸다.
도 4는 면역된 생쥐로부터의 혈청을 이용하여 수포의 2D-분리된 단백질의 면역블롯을 나타낸다.
도 5는 다른 환경에서 자란 박테리아의 SDS-PAGE를 보여준다.
도 6은 수포의 흡착된 단백질을 나타낸다. 왼쪽부터 오른쪽 레인으로: 1) 단백질 분자 무게 마커, 2) Ss OMB 10 μg, 3) Ss OMB 2 μg, 4) 1 달 동안 명반에 흡착된 Ss OMB 10 μg.
도 7은 표시된 종에 대한 FACS 결과를 나타낸다.

에스 . 소네이 돌연변이의 준비

야생형 에스.소네이 53G의 tolR 유전자는 λ Red 시스템 [11, 102]을 이용하여 결실되었다. λ Red 플라스미드로 형질전환된 컴피턴트 세포가 준비되고, 그때 상동재조합에 의해 tolR 유전자를 항생제 저항 유전자로 바꾸기 위해 설계된 선형 단편으로 형질전환된다. 단편과 염색체를 통합한 클론은 행생제 저항성에 의해 선별되고 tolR 유전자의 결실는 PCR 또는 다른 기술에 의해 확인된다. 온도에 민감한 λ Red 플라스미드는 그때 37°C에서 새 클론이 자람에 의해 제거될 수 있다.

이 Δ tolR 돌연변이에서 TolR 발현 결핍이 확인되었고, 원래의 야생형 분리균주에 비해, 자라는 동안 배지로 더 많은 수포 방출이 확인되었다.

galU 유전자 또한 유사한 방법으로 결실되었는데, Δ galU 단일 돌연변이 및 Δt o lRΔ galU 이중 돌연변이를 제공하기 위해서이다. 돌연변이에 의해 방출되는 수포는 O 항원 결핍인 불완전한 LPS를 얻기 위해 확인되었다.

변형된 LPS의 Δ tolR Δ msbB 이중 돌연변이 균주는 같은 방법으로 제조된다.

병독성의 플라스미드는 또한 Δ tolR 및 Δ tolR Δ msbB 균주로부터 제거되었다.

에스 . 플렉스네리 돌연변이의 준비

에스.플렉스네리의 tolR 유전자는 상기 에스.소네이를 설명했듯이 λ Red 시스템을 이용하여 결실되었다. 에스.플렉스네리의 O 항원 생합성은 완전한 rfbG 유전자 및 rfbF와 rfc의 일부를 포함하고, 모든 세 유전자를 활성화하는, 염색체 단편의 결실에 의해 폐지되었다. 결실는 λ Red 시스템을 이용하여 일어났고 ,Δ rfbG처럼 줄어들었다.

Δ tolR Δ rfbG 이중 돌연변이는 같은 방법으로 일어났다.

변형된 LPS를 함유하는 Δ tolR Δ htrB 이중 돌연변이는 같은 방법으로 일어났다.

병독성 플라스미드 또한 이 균주들로부터 제거되었다.

수포의 정제

이중 돌연변이 Δ tolR Δ galU 균주의 발효가 다음 조건에서 실행되었다: pH 7.1 , 37°C, 교반 조절 및 최대 급기 설정에 의해 30% 포화도를 유지하는 용존산소량. pH는 4 M 암모늄 히드록시드를 첨가함에 의해 조절되었다. 거품은 실행하는 동안 10% PPG를 첨가함에 의해 조절되었다. 배지는 다음 성분들로 구성되었다.: KH₂PO₄ 5 g/l, K₂HP0₄ 20 g/l 및 이스트 추출물 30 g/l. 가압 멸균법에 의해 배지가 멸균된 후, 글리세롤 15 g/l 및 MgSO₄ 2 mM이 접종 전에 첨가되었다. 배양 접종물은 발효기 부피의 5%였다. 발효 과정은 대략 13시간이 걸렸고 세포 농도는 600 nm에서 흡광도로 측정되었다.

에스.소네이 Δ tolR Δ msbB 이중 돌연변이 균주의 발효 과정은 다음 정의된 배지로 수행되었다: 글리세롤 30 g/l, KH₂P0₄ 13.3 g/l, (NH₄)₂HP0₄ 4 g/l, MgS0₄-7H₂0 (1M) 2ml, 시트르산 1.7 g/l, CoCl₂-6H₂0 2.5 mg/l, MnCl₂-4H₂0 15 mg 1, CuCl₂-2H₂0 1.5 mg/l, H₃B0₃ 3 mg/1, Na₂Mo0₄-2H₂0 2.5 mg/l, Zn(CH₃COO)₂-2H₂0 13 mg/l 페릭 시트레이트 2μΜ, 티아민 50 mg/l, 니코틴산 10 mg/l, L-acid aspartic 2.5g/l.

발효 배지에 생성된 소낭은 두 가지 연속적인 TFF (tangential flow filtration) 단계를 이용하여 정제된다: 0.22 μm에서 미세 여과 및 그때 0.1 μm에서 두 번째 미세 여과. 첫 번째 여과 단계 중 소낭은 구멍 크기가 0.22 μm인 카세트를 통과하여 TFF에 의해 생물군에서 분리되었다. 생물군은 처음 농도가 4 배였고, PBS에서 5 번의 정용 여과 단계 후, 소낭은 여액에 수거되었다. 두 번째 여과 단계에서, 0.22 μm TFF로부터 여액은 0.1 μm 제한 카세트를 통해 더 미세 여과되었는데, 수용성 단백질로부터 소낭을 정제하기 위해서이다. 소낭은 여과 카세트를 통과할 수 없다. 5 번의 정용 여과 과정 후, 소낭을 포함한 투석물이 수거된다.

최종 정제된 생산물은 TEM으로 관찰되었다 (도 1). 수포는 직경 약 50 nm의 동일한 크기를 갖는다.

에스.플렉스네리 돌연변이로부터 수포는 에스.소네이 Δ tolR Δ galU에 사용된 것처럼 이스트 추출 배지에 다양한 균주를 키운 후 같은 방법으로 정제하였다.

수포의 성질

단백질체학 접근은 수포가 본질적으로 순수한 외막이라고 확인하였다. 외막의 분열에서 파생된 평범한 외막 소낭 (OMV)과 다르게, 수포는 친유성의 단백질을 보존하고 본질적으로 세포질 및 내막 성분들에서 자유롭다.

에스.소네이 및 에스. 플렉스네리 균주로부터의 수포는 세제에 의해 변성되었고, 단백질은 LC-MS/MS 접근으로 확인되었다. 그 대신, 수포는 SDS page 또는 2D gel 전기영동으로 분리되었다 (도 2). 눈에 보이는 밴드 및 스팟은 gel로부터 잘라졌고 단백질 질량 지문을 통해 확인하였다. 다른 단백질의 상대적 양은 SDS-PAGE의 밴드 또는 2D gel의 스팟의 농도계 분석으로 연구되었다.

도 3은 Δ galU 돌연변이 균주에서 야생형 시겔라 및 E.coli와 비교하여 LPS 이동성의 변화 (모든 균주는Δ tolR 배경에 있다)를 보여준다.

표면 소화에 기초한 두 번째 단백질체학적 접근은 막단백질의 노출된 부분을 특징짓는데 사용되었다. 한 세트의 단백질은 수포에 면역된 생쥐로부터의 혈청에 반응하는 것이 확인되었고 이들 중 많은 수는 균주의 대형 패널에 보존되고 있는 것이 발견되었다. 대부분의 완전한 외막 단백질의 구조에 대해 알려진 것이 거의 없다. 수포의 서폼 (surfome)은 프로테아제 처리 및 방출된 펩티드의 LC-MS/MS를 통한 회복 및 확인이 조사되었다. 수포가 모든 살아있는 박테리아 세포의 표면을 대표하는 것처럼, 이 지도는 에스.소네이 표면에 노출된 단백질을 대표한다고 해야할 것이다.

이것들과 다른 접근법에 의해 표 1에 나열된 129 가지의 단백질이 수포에서 보여진다.

수포 면역원성

Δ tolR Δ galU 균주로부터의 수포에 면역된 생쥐는 도 4에 나타난 바와 같이, 수포의 2D gel에 반응하는 혈청을 생산한다. 따라서 수포는 면역원성이다.

생쥐에게 보조제 (알루미늄 히드록시드 또는 프로인트의 완전보조제)와 함께 또는 없이 2 μg 또는 10 μg의 에스.소네이 Δ tolR Δ galU 수포를 (전체 단백질로 측정) 주었다. 면역성 연구로부터 얻어진 혈청에서 IgG 생산의 분석을 위해 종래의 ELISA 방법을 수행하였다. 모든 그룹의 생쥐로부터의 혈청은 수포 특이적 IgG의 높은 수준의 생산량을 나타내었다. 수포가 단독 사용되거나 또는 보조제와 조합으로 사용되었을 때, IgG 생산에 큰 차이는 발견되지 않았다. 2 μg의 낮은 투여량으로 면역된 집단은 10 μg으로 면역된 집단과 같은 수준의 수포 특이적 IgG를 보였고, 낮은 투여량의 백신이 성취할 수도 있다, 즉, 달러당 많은 투여량이 성취가능할 수 있다는 것을 보여준다. 에스.소네이 뿐만 아니라 에스.플렉스네리 균주의 수포도 비슷하게 면역원성이다.

수포에 대해 높아진 혈청은 에스.소네이 G53, 에스.플렉스네리 2a 2457T 또는 에스.플렉스네리 5 M90T의 표본은 표지된 이차 항체를 이용하여 염색되었고, 동세포분석법으로 분석되었다. 도 7에 보이는 것처럼, 에스.소네이 및 에스.플렉스네리 균주는 혈청에 교차반응했다.

그러므로 수포 접근은 효과적이고 값싼 백신을 생산하기 위한 강력한 가능성을 갖고 광역 백신을 향해 다른 시겔라 균주로 확장될 수 있다.

수포 흡수

수포는 흡착하기 위해 알루미늄 히드록시드 (2 mg/ml)와 결합하였다. 흡착된 물질을 4°C에서 하루, 일주일 또는 한 달간 저장하였다. 수포는 한 시간 후 모두 흡착되었고 한 달 후조차 탈착의 흔적은 없었다 (도 6).

철-제한 성장

도 5는 다양한 조건에서 배양된 시겔라에 의해 발현되는 단백질을 보여준다. 4번 레인에서 박테리아는 200 μM FeSO₄의 존재에서 자란 반면, 5번 레인에 배양균은 200 μM 디피리딜을 가졌다. 삽화는 철-제한 조건에서 세 가지 단백질은 상향조절된다는 것을 보여준다. 이 세 가지 단백질은 FepA 외막 수용체 (GI 74311118), 콜리신 I 수용체 (GI 74312677) 및 추정으로 철의 담철세포 수용체 (GI 74313972)로 확인되었다. 이 단백질들은 시겔라 균주 및 장내세균 중 잘 보존되었고, 잠재적으로 높은 면역원성이다. 따라서 철-제한 조건에서 시겔라의 성장은, 보통 성장 조건과 비교해서, 이 세 가지 단백질이 풍부한 수포의 방출을 유도할 수 있다.

본 발명은 단지 예시적인 방법에 의해 기재되었으며, 본 발명의 범위 및 사상 이내에서 변형이 될 수 있다.

[표 1]

SEQ ID NOs: 70, 71, 73, 74, 76, 111, 112, 114-129 및 131-135는 에스.소네이 Δ tolR 수포로부터 확인되었다. SEQ ID NOs: 8-15 및 17-58은 에스.소네이 Δt o lRΔ galU 수포로부터 확인되었다. SEQ ID NOs: 68, 69, 72, 75, 77-82, 84-93, 95, 96, 98-106, 108-10, 113, 130 및 136 은 에스.플렉스네리 Δ tolR Δ rfbG 수포로부터 확인되었다. SEQ ID NOs: 60-67은 에스.소네이의 표면 소화로부터 확인되었다.

서브세트 1: SEQ ID NOs: 68, 69, 72, 75, 77-110, 113, 130 및 136.

서브세트 2: SEQ ID NOs: 8-15, 17-58, 60-67, 70, 71, 73, 74, 76, 111, 112, 114-129 및 131-135.

서브세트 3: SEQ ID NOs: 1-60

NB: SEQ ID NO: 18은 SEQ ID NO: 5와 같다; SEQ ID NO: 33은 SEQ ID NO: 2와 같다; SEQ ID NOs: 9 및 16은 관계 있다 (~97% 동일성); SEQ ID NOs: 23 및 59는 관계 있다 (~98% 동일성).

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Claims (23)

1. TolA, TolB, TolQ, TolR 및 Pal 단백질 중 4 가지 이하를 발현하는 시겔라 박테리아.
2. 제 1항에 있어서, 단백질 중 4 가지를 발현하지만, TolR은 발현하지 않는 것을 특징으로 하는 아닌 박테리아.
3. TolR 단백질을 발현하지 않는 시겔라 박테리아.
4. 시겔라의 Δ tolR 균주인 박테리아.
5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 천연 시겔라 리포다당류를 발현하지 않는 것을 특징으로 하는 박테리아.
6. 제 5항에 있어서, 천연 시겔라 O항원을 발현하지 않는 것을 특징으로 하는 박테리아.
7. 제 4항에 있어서, 상기 균주는 Δ tolR Δ galU 균주인 것을 특징으로 하는 박테리아.
8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, stxA 및/또는 stxB 유전자가 불활성화된 것을 특징으로 하는 박테리아.
9. TolA, TolB, TolQ, TolR 및 Pal 단백질을 발현하는 시겔라 박테리아에 있어서, 상기 TolA, TolQ, TolR 및/또는 Pal 단백질은, (a) 박테리아의 내막 또는 외막에 위치하고, (b) 하나 이상의 아미노산 서열 돌연변이를 포함함으로써, 상기 돌연변이가 없는 동일한 박테리아와 비교하여, 배양 배지에서 배양할 때 더 많은 양의 외막 수포를 방출하는 것을 특징으로 하는 시겔라 박테리아.
10. Tol-Pal 시스템의 하나 이상의 요소에 변형을 가짐으로써, 배지에서 배양하는 동안 상기 변형이 결핍된 동일한 박테리아보다 많은 양의 외막 수포를 배지에 방출하고, (i) 천연 시겔라 리포다당류 및/또는 (ii) 시겔라 장내 독소를 발현하지 않는 시겔라 박테리아.
11. 박테리아에 의해 수포의 배지로의 방출이 허락되는 조건 하에서 배양한 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 박테리아를 포함하는 배양 배지로부터 수포를 분리하는 단계를 포함하는 시겔라 수포를 제조하는 방법.
12. 제 11항에 있어서, 상기 박테리아는 철-제한 조건 하에서 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 시작 박테리아의 Tol-Pal 시스템의 하나 이상의 요소를 암호화하는 유전자를 변형시켜서, 상기 변형이 박테리아가 배양 배지에서 배양될 때 시작 박테리아보다 많은 양의 외막 수포를 배지에 방출하도록 하는 단계를 포함하고, 상기 변형은 시작 박테리아의 tolA, tolB, tolQ, tolR 및/또는 Pal 유전자 중 하나 이상의 돌연변이를 수반하는 과수포발생 시겔라 박테리아를 제조하는 방법.
14. 제 1항 내지 10항 중 어느 한 항에 따른 박테리아로부터 또는, 제 13항에 따른 방법에 의하거나 제 11항 또는 12항의 방법에 의해 얻을 수 있는 박테리아로부터 분리 또는 얻을 수 있는 수포.
15. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따르는, 또는 제 13항에 따른 방법에 의에 얻을 수 있는 박테리아의 배양 동안에 배양 배지로 방출되는 수포를 포함하는 조성물.
16. 제 15항에 있어서, 여하의 살아있는 및/또는 온전한 박테리아를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
17. 제 1항 내지 10항 중 어느 한 항에 따르는, 또는 제 13항에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 박테리아가 배양되었던 배양 배지의 0.22 μm 필터를 통한 여과 후 얻을 수 있는 여액에 수포가 존재하는 수포를 포함하는 조성물.
18. 박테리아에 의한 수포의 배지로의 방출을 허용하는 조건에서 배양된 제 1항 내지 제 10항에 따르는, 또는 제13항에 따르는 방법에 의해 얻을 수 있는 박테리아를 포함하는 배양 배지.
19. 기능성 HtrB 효소를 발현하지 않는 시겔라 균주.
20. 제 19항에 있어서, HtrB 넉아웃인 것을 특징으로 하는 시겔라 균주.
21. 다음의 하나 이상을 포함하는 시겔라 수포:
    (a) SEQ ID NOs: 8 내지 67로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;
    (b) SEQ ID NOs: 8 내지 67 중 하나와 적어도 85%의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는, 및/또는 SEQ ID NOs: 8 내지 67 중 어느 하나의 적어도 7개의 연속적인 아미노산의 단편을 포함하는 단백질(여기서, 상기 단편은 에피토프를 포함한다).
22. (a) SEQ ID NOs: 8 내지 136의 아미노산 서열;
    (b) SEQ ID NOs: 8 내지 136 중 하나와 적어도 85%의 동일성을 가지고, 및/또는 SEQ ID NOs: 8 내지 136 중 어느 하나의 적어도 7 개의 연속적인 아미노산의 단편을 포함하고, SEQ ID NOs: 8 내지 136 중 하나로부터의 에피토프를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는,
    단백질을 포함하는 수포가 없는 면역원성 조성물.
23. 철-가용성이 제한된 시겔라를 배양하는 방법.

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