KR101143060B1 - 미세유체화된 수중유 유화액 및 백신 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항원의 면역원성을 개선시키기 위한 백신 보조약으로서 유용한 마이크로미터 미만의 수중유 유화액에 관한 것이다. 본 발명은 또한 내재적으로 또는 외부적으로 이런 유화액과 조합된 항원을 함유하는 백신 조성물을 제공한다. 유화액과 백신을 제조하는 방법 또한 본 발명에 의해 제공된다.

Description

미세유체화된 수중유 유화액 및 백신 조성물{MICROFLUIDIZED OIL-IN-WATER EMULSIONS AND VACCINE COMPOSITIONS}

본 발명은 백신, 특히, 가축의 면역 반응을 개선시키기 위한 보조약(adjuvant) 제제에 관한 것이다. 특히 본 발명은 항원의 면역원성을 개선시키기 위한 백신 보조약으로서의 마이크론 미만의 크기의 수중유 유화액의 사용에 관한 것이다. 마이크론 미만 크기의 수중유 유화액 제제, 이런 유화액에 혼입된 항원을 함유하는 백신 조성물, 및 유화액과 백신을 제조하는 방법이 본 발명에 의해 제공된다. 본 발명은 또한 백신에 사용하기에 적합한 사포닌 글리코사이드 및 스테롤에 의해 형성되는 복합체를 함유하는 조성물을 제공한다.

박테리아, 바이러스, 기생충 및 마이코플라즈마 감염은 소, 돼지 및 애완 동물과 같은 가축에 널러 퍼져있다. 이런 감염원으로 인한 질병은 종종 항생제 치료에 저항하여, 효과적인 치료 수단이 없을 수 있다. 결과적으로, 가축의 감염성 질병을 구제하기 위해 백신적 접근법이 점점 더 많이 사용되고 있다. 전체 감염성 병원균이, 화학적 불활성화나 적절한 유전자 조작 후에, 백신 제제에 사용하기에 적합하게 제조될 수 있다. 다르게는, 백신 제제에서 사용하기 위해 병원균의 단백질 서브유닛을 재조합 발현 시스템에서 발현시켜 정제할 수 있다.

보조약은 일반적으로 항원에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 증가시키는 임의의 물질을 의미한다. 전형적인 백신은 죽은 병원성 미생물의 조질 제제로 구성되어 있고, 병원성 미생물의 배양물과 관련된 불순물이 면역 반응을 개선시키기 위한 보조약으로서 작용할 수 있다. 그러나, 병원성 미생물 또는 정제된 단백질 서브유닛의 균질 제제가 백신 접종용 항원으로서 사용되는 경우, 이런 항원에 의해 유발된 면역성이 열악하고, 따라서, 보조약으로서 일부 외래 물질을 첨가해야만 한다. 또한, 합성 및 서브유닛 백신은 제조비가 비싸다. 따라서, 보조약의 도움을 받아, 면역 반응을 자극하는데 더 작은 투여량의 항원이 요구되어, 백신 제조 비를 절감할 수 있다.

보조약은 다수의 서로 다른 방식으로 작용하여 면역 반응을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 많은 보조약은 면역 반응과 관련된 사이토카인 네트워크를 변형시킨다. 이들 면역조절성 보조약은 이들이 항원과 함께하지 않을 때조차 이들의 효과를 발휘할 수 있다. 일반적으로, 면역조절성 보조약은 일부 사이토카인을 전반적으로 상승-조절시키고, 동시에 다른 것들을 하향-조절하여 세포 Th1 및/또는 체액 Th2 반응을 이끌어낸다.

일부 보조약은 항원의 형태 일체형을 유지시켜 항원이 적절한 면역 작동체 세포에 효과적으로 제시될 수 있게 한다. 보조약 제제에 의해 항원의 형태가 유지 된 결과, 백신은 면역 자극 복합체(ISCOM)에서 볼 수 있는 것과 같이 증가된 저장성을 가질 것이다. 오젤(Ozel M.) 등의 문헌[Quarternary Structure of the Immunestimmulating Complex(Iscom), J. of Ultrastruc. and Molec. Struc. Res. 102, 240-248 (1989)]을 참조할 수 있다.

일부 보조약은 주사 부위에서 저장소로서 항원을 보유하는 능력을 갖고 있다. 이 저장 효과의 결과로 항원은 간 청정에 의해 신속하게 손실되지 않는다. 알루미늄 염 및 유중수 유화액은 더 짧은 기간동안 이 저장 효과를 통해 작용한다. 예를 들면, 유중수 유화액인 프롱드 완전 보조약(FCA)을 이용함으로써 장기간 저장소를 수득할 수 있다. FCA는 전형적으로 생물학적 분해가 항원-제시 세포에 의한 항원 제거를 허용할 때까지 주사 부위에 남아 있는다.

이들의 물리적 성질에 근거하여, 보조약은 입자성 보조약과 비-입자성 보조약이라는 2개의 매우 넓은 카테고리로 분류될 수 있다. 입자성 보조약은 마이크로입자로서 존재한다. 면역원은 마이크로입자에 혼입되거나 이와 결합할 수 있다. 알루미늄 염, 유중수 유화액, 수중유 유화액, 면역 자극 복합체, 리포좀 및 나노- 및 마이크로입자가 입자성 보조약의 예이다. 비-입자성 보조약은 일반적으로 면역조절자이고, 이들은 일반적으로 입자성 보조약과 함께 사용된다. 뮤라밀 다이펩타이드(마이코박테리아에서 추출된 펩티도글리칸의 보조약-활성 성분), 비-이온성 블록 공중합체, 사포닌(퀼라자 사포나리아(Quillaja saponaria) 나무의 껍질에서 추출된 트라이터페노이드의 복합 혼합물), 리피드 A(2개의 포스페이트 기와 일반적으로 길이가 C12 내지 C16인 5 또는 6개의 지방산 쇄를 갖는 글루코사민의 다이사카 라이드), 사이토카인, 탄수화물 중합체, 유도된 폴리사카라이드 및 박테리아 독소, 예를 들면 콜레라 독소 및 이. 콜라이(E.Coli) 불안정 독소(LT)가 비-입자성 보조약의 예이다.

가장 잘 알려진 보조약의 일부는 보조약 제제에 저장 효과를 부여할 수 있는 입자성 물질과 비-입자성 면역조절자의 조합이다. 예를 들면 FAC는 오일 유화액의 단기간 저장 효과와 함께 마이코박테리움 튜베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)의 면역조절 성질 성분을 조합한다.

오일 유화액은 장기간용 백신 보조약으로 사용되어 왔다. 르 모이그닉(Le Moignic)과 피오니(Piony)는 1916년에 광유중의 죽은 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)의 현탁액이 면역 반응을 증가시킴을 발견하였다. 이어서, 1925년에 라몬(Ramon)은 디프테리아 독소에 대한 항독소 반응을 증대시키는 물질중 하나로 전분 오일을 개시하였다. 그러나, 오일 유화액은 프롱드가 현재 프롱드의 완전 보조약(FCA)으로 알려진 그의 보조약 제제를 들고 나왔을 때인 1937년까지는 대중화되지 않았다. FCA는 죽은 마이코박테리아와 아라셀(Arlacel) A와 혼합된 광유(파라핀 오일)로 구성된 유중수 유화액이다. 아라셀 A는 주로 만나이드 모노올리에이트이고, 유화제로서 사용된다. FCA가 항체 반응을 유도하는데 뛰어나긴 하지만, 이는 심한 통증, 종기 형성, 발열 및 육아종 염증을 야기한다. 이런 바람직하지 못한 부작용을 피하기 위해, 불완전 프롱드 보조약(IFA)이 개발되었다. IFA는 마이크로박테리아 성분이 없는 점을 제외하고는 조성이 FCA와 유사하다. IFA는 주사 부위에서 저장 제제를 통해 작용하고 항체-생성 세포를 활성화시키면서 항원을 서서히 분비시킨다.

FCA를 개선시키고자 하는 다른 접근법은 광유를 생물학적 상용성 오일로 대체하면 주사 부위에서 FCA와 연관된 반응이 없어지는 것을 도울 수 있다는 견해에 근거하였다. 또한 유화액은 주사 부위에서 장기간 지속되는 저장소를 생성하는 유중수가 아니라 수중유이어야 하는 것으로 생각되었다. 힐만(Hilleman) 등은 86% 호마유, 유화제로서 10% 아라셀 A 및 안정화제로서 4% 알루미늄 모노스테아레이트로 구성된 오일-계 보조약인 "보조약(Adjuvant) 65"를 개시하였다. 힐만(Hilleman) 등의 문헌[1966, Prog. Med. Virol. 8: 131-182]; 힐만 및 비알레(Beale)의 문헌[1983, in New Approaches to Vaccine Development (Eds. Bell, R. and Torrigiani, G. ), Schwabe, Basel]을 참조할 수 있다. 인간에서, 보조약 65는 안전하고 효능이 있지만, IFA에 비해 더 적은 보조약성을 나타내었다. 그럼에도 불구하고, 보조약 65의 경우 일부 로트의 백신을 맞은 사람들의 경우에 반응원성(reactogenicity)이 나타나고, 아라셀 A 대신 정제되거나 합성된 유화제를 사용할 경우 보조약성이 감소되어서 이의 사용이 중단되었다. 미국 특허 제5,718,904호 및 제5,690,942호는 수중유 유화액중의 광유가 안전성 프로파일을 개선시키기 위한 목적으로 물질대사될 수 있는 오일로 대체될 수 있음을 개시하고 있다.

보조약성과 안전성 이외에도, 유화액의 물리적 외형 또한 중요한 상업적 고려점이다. 물리적 외형은 유화액의 안정성에 의존한다. 크림을 형성하거나, 침강되고 응집되는 것은 유화액이 불안정하다는 지표이다. 크림을 형성하는 것은 유화 액의 유상과 수상이 서로 다른 비중을 갖고 있을 때 발생한다. 크림형성은 또한 유화액의 초기 소적 크기가 크고, 유화액 소적이 임의의 브라운 운동을 하지 않을 때 일어난다. 소적 크기가 큰 경우, 계면이 파괴되고 소적이 응집하여 큰 입자를 형성하는 경향이 있다. 유화액의 안정성은 사용되는 유화제의 특성 및 양, 유화액중의 소적의 크기 및 유상과 수상 사이의 밀도의 차이와 같은 다수의 인자에 의해 결정된다.

유화제는 계면 유리 에너지를 감소시키고, 소적 응집에 대한 물리적 또는 정전기 차단벽을 형성시킴으로써 분산된 소적의 안정화를 촉진시킨다. 이온성 세제뿐 아니라 비이온성 세제를 유화제로 사용하여 왔다. 비이온성 유화제는 계면을 향하고, 비교적 체적이 큰 구조를 생성하고, 이로 인해 분산된 소적의 입체 회피가 야기된다. 음이온성 또는 양이온성 유화제가 짝이온을 잡아당김으로써 전기적 이중 벽의 형성을 유도하고; 이중 층 반발력으로 인해, 소적들이 접근할 때 서로 밀어내게 된다.

유화제를 이용하는 것에 추가하여, 유화액의 안정성은 또한 기계적 수단에 의해 유화액의 소적 크기를 감소시킴으로써 수득될 수 있다. 전형적인 프로펠러 믹서, 터빈 로터, 콜로이드 밀, 균질화기 및 소니케이터를 이용하여 유화액을 제조하여왔다. 미세유체화는 유화액중의 소적의 크기의 균질성을 증가시키는 다른 방법이다. 미세유체화는 마이크론 미만의 범위인 일정한 입자 크기를 갖는 물리적으로 안정된 훌륭한 유화액을 만들 수 있다. 유화액의 안정성을 증가시키는 것 이외에도, 미세유체화 공정은 최종 생성물의 멸균성을 보증하는 바람직한 방법인 말단 여과를 가능하게 한다. 더욱이, 마이크론미만의 오일 입자는 주사 부위를 통과하여 임파선으로 들어간 후, 배액 체인의 림프절, 혈액 및 비장으로 갈 수 있다. 이는 국소 염증과 유의한 주사 부위 반응을 일으킬 수 있는 오일 저장소가 주사 부위에서 확립되는 경향을 감소시킨다.

미세유체화기는 이제 상업적으로 이용가능하다. 2개의 유체화된 스트림이 상호작용 챔버 내에서 높은 속도로 상호작용하는 동안 미세유체화기에서 유화액이 형성된다. 미세유체화기는 공기 또는 질소 구동되고, 20,000psi의 과다한 내부 압력에서 작동될 수 있다. 미국 특허 제4,908,154호는 임의의 유화제가 본질적으로 없는 유화액을 수득하기 위한 미세유체화기의 사용에 대해 개시하고 있다.

다수의 마이크론 미만 크기의 수중유 보조약 제제가 문헌에 개시되어 있다. 미국 특허 제5,376,369호는 신택스 보조약 제제(SAF; Syntax Adjuvant Formulation)로 공지된 마이크론 미만 크기의 수중유 유화액 보조약 제제를 개시하고 있다. SAF는 오일 성분으로 스쿠알렌 또는 스쿠알란, 유화액 형성 양의 플루로닉 L121(폴리옥시-프로필렌-폴리옥시에틸렌) 블록 중합체 및 면역강화 양의 뮤라밀다이펩타이드를 함유한다. 스쿠알렌은 많은 조직, 특히 상어와 다른 어류의 간에서 발견되는 콜레스테롤의 선형 탄화수소 전구체이다. 스쿠알란은 스쿠알렌의 수소화에 의헤 제조되고, 완전히 포화되어 있다. 스쿠알렌과 스쿠알란 둘모두 물질대사될 수 있고, 우수한 독성학 연구 기록을 갖고 있다. 스쿠알렌과 스쿠알란 유화액은 인간의 암 백신에서 사용되어 왔고, 부작용이 별로 없고, 바람직한 효능을 가졌다. 예를 들면, 앨리슨(Anthony C. Allison)의 문헌[1999, Squalene and Squalane emulsions as adjuvants, Methods 19:87-93]을 참고할 수 있다.

미국 특허 제6,299,884호 및 국제 특허 공보 제WO90/14837호는 폴리옥시-프로필렌-폴리옥시에틸렌 블록 공중합체가 마이크론 미만 크기의 수중유 유화액의 형성에 필수적이 아님을 개시하고 있다. 더욱이, 이들 문헌은, 비-독성, 대사가능한 오일의 사용을 개시하고 있고, 그들의 유화액 제제에서 광유와 독성 석유 증류 오일의 이용을 명확하게 배제하고 있다.

미국 특허 제5,961,970호는 백신 보조약으로서 사용되는 또다른 마이크론 미만 크기의 수중유 유화액에 대해 개시하고 있다. 이 특허에 개시된 유화액에서, 소수성 성분은 중쇄 트라이글리세라이드 오일, 식물성 오일 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된다. 이 유화액에 포함되는 계면활성제는 천연 생물학적 상용성 계면활성제, 예를 들면 인지질(예를 들면 레시틴) 또는 약학적으로 허용가능한 비-천연 계면활성제, 예를 들면 트윈(TWEEN)-80일 수 있다. 이 특허는 또한, 유화액이 독립적이고 외부에서 형성된 후에 유화액과 항원이 혼합되는 것과는 달리, 유화액이 형성되는 시점에서 항원이 유화액으로 혼입됨을 개시하고 있다.

미국 특허 제5,084,269호는 광유와 조합된 레시틴을 함유하는 보조약 제제가 숙주 동물 내부에서 자극을 감소시키면서 동시에 증가된 전신 면역성을 유도함을 개시한다. 미국 특허 제5,084,269호에서 생성된 보조약 제제는 상표명 암피겐(등록상표, Amphigen)으로 가축용 백신에서 상업적으로 사용되고 있다. 암피겐(등록상표) 제제는 미셀(micelle), 즉 레시틴으로 둘러싸인 오일 소적로 구성되어 있다. 이들 미셀은 종래의 오일계 보조약보다 더 많은 전체 세포 항원이 부착될 수 있게 한다. 더욱이, 전형적으로 10 내지 20%의 오일을 함유하는 보조약을 함유하는 다른 백신 제제와 비교할 때, 암피겐(등록상표)계 백신 제제는 2.5 내지 5%의 낮은 오일 함량의 광유를 함유한다. 이 낮은 오일 함량은 이들 보조약계 백신 제제가 주사 부위에서 피부를 덜 자극하여, 결과적으로 부종이 더 적게 생기고, 도살시 다듬어 낼 부위가 더 적어지게 한다. 또한 오일 소적을 둘러싼 레시틴 코팅이 주사 부위 반응을 추가로 감소시켜, 백신이 안전하고도 효과적이게 한다.

암피겐(등록상표) 제제는 다수의 가축용 백신에서 보조약으로 사용되고, 재구성시 뿐만 아니라, 단기 및 장기 저장 기간동안 백신 제품의 물리적 외형을 유지킬 필요가 있다. 또한, 동결건조된 항원은 주사 직전에 미리 만들어진 보조약 제제와 혼합된다. 이 관행은 수중유 유화액 내에 항원이 균일하게 분포되는 것을 항상 보증하지는 않아서, 유화액의 외형이 바람직하지 않을 수 있다. 더욱이, 정치시, 균질화된 유화액이 상 분리를 나타낼 수 있다. 따라서, 장기간 보관시에 상 분리를 나타내지 않는 안정한 보조약 제제에 대한 필요성이 존재한다. 상분리를 방지하는 한 가지 방법은 소적 크기를 감소시키고, 유화액의 입자 균일성을 증가시키는 것이다. 대사가능한 오일계 유화액 제제의 미세유체화 공정이 기록되어 있지만, 암피겐(등록상표) 제제와 같은 수중유 유화액의 미세유체화는 아직까지 수행되지 않았다.

본 발명은 항원의 면역원성을 개선시키기 위한 백신 보조약으로서의 마이크론 미만의 크기의 수중유 유화액의 사용에 관한 것이다. 마이크론 미만 크기의 수중유 유화액 제제, 이런 유화액에 혼입된 항원을 함유하는 백신 조성물, 및 유화액과 백신을 제조하는 방법이 본 발명에 의해 제공된다. 본 발명은 또한 백신에 사용하기에 적합한 사포닌 글리코사이드 및 스테롤에 의해 형성되는 복합체를 함유하는 조성물을 제공한다.

본 발명에서는, 미세유체화를 이용하여 레시틴이 둘러싼 광유 소적의 크기를 마이크론 미만의 크기로 감소시킨다. 예상치 못하게도, 본 발명자들은 레시틴과 오일의 혼합물을 포함하는 수중유 유화액으로 보조약된 백신 제제를 미세유체화시키면 제제의 물리적 외형이 개선될 뿐 아니라, 제제의 면역 효과가 개선됨을 발견하였다. 미세유체화된 제제는 또한 개선된 안전성 프로파일을 특징으로 한다.

발명의 요약

본 발명자들은 비-대사가능한 오일계 수중유 유화액의 보조약 활성과 안전성 프로파일이 미세유체화를 통해 개선될 수 있음을 예상치 못하게 발견하였다. 미세유체화된 유화액에 혼입된 항원은, 항원이 미세유체화 이전에 유화액으로 내재적으로 혼입된 경우에 조차 안정하다.

따라서, 한 양태에서, 본 발명은 백신 보조약으로서 유용한 마이크론 미만 크기의 수중유 유화액 제제를 제공한다. 본 발명의 마이크론 미만 크기의 수중유 유화액은 비-대사가능한 오일, 하나 이상의 계면활성제 및 수성 성분으로 구성되고, 여기서 오일은 마이크론 미만의 범위의 평균 오일 소적 크기로 수성 성분에 분산되어 있다. 바람직한 비-대사가능한 오일은 경질 광유이다. 바람직한 계면활성제는 레시틴, 트윈-80 및 스판(Span; 등록상표)-80을 포함한다.

본 발명에 의해 제공되는 바람직한 수중유 유화액은 암피겐(등록상표) 제제로 구성된다.

본 발명의 수중유 유화액은 방부제, 등장화제, 생물학적 접착 분자 및 면역자극 분자를 포함하는 적절하고 바람직한 추가성분을 포함할 수 있다. 바람직한 면역자극 분자는 예를 들면 퀼(Quil) A, 콜레스테롤, GPI-0100, 다이메틸다이옥타데실암모늄 브로마이드(DDA)를 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 마이크론 미만 크기의 수중유 유화액을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 오일, 하나이상의 계면활성제, 수성 성분 및 유화액에서 사용하기에 적절한 임의의 다른 성분을 포함하는 다양한 유화액 성분을 함께 혼합한다. 혼합물을 1차 유화 가공하여 수중유 유화액을 형성한 후, 이를 미세유체화기에 통과시켜 소적의 직경이 1마이크론 미만, 바람직하게는 평균 소적 크기가 0.5마이크론 미만인 수중유 유화액을 수득한다.

또다른 양태에서, 본 발명은 상기 개시된 마이크론 미만 크기의 수중유 유화액 및 항원을 함유하는 백신 조성물을 제공한다. 항원은 외부적으로 또는 내재적으로, 바람직하게는 내재적으로 유화액에 혼입된다.

본 발명의 백신 조성물에 포함될 수 있는 항원은 박테리아, 진균 또는 바이 러스 항원, 또는 이의 조합일 수 있다. 항원은 불활성화된 전체 또는 부분적 세포 또는 바이러스 제제의 형태이거나, 또는 종래의 단백질 정제, 유전자 조작 기법 또는 화학적 합성에 의해 수득된 항원 분자의 형태를 취할 수 있다.

추가의 양태에서, 본 발명은 항원 또는 마이크론 미만 크기의 수중유 유화액과 조합된 항원을 함유하는 백신 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 백신 조성물의 제조에서, 항원은 내재적으로(예를 들면 미세유체화 전) 또는 외부적으로(예를 들면 미세유체화 후) 수중유 유화액의 성분과 조합될 수 있다. 바람직하게는, 항원은 내재적으로 수중유 유화액의 성분과 조합된다.

또다른 양태에서, 본 발명은 마이크로캡슐화된 항원 및 상기 개시된 바와 같은 마이크론 미만 크기의 수중유 유화액을 함유하고, 여기서, 마이크로캡슐화된 항원이 유화액과 외부적으로 조합되는 백신 조성물을 제공한다.

또한 놀랍게도, 사포닌과 스테롤이, 용액에서 조합되는 경우, 서로 결합하여 나선 미셀 형태의 복합체를 형성하는 것으로 발견되었다. 본 발명에 따르면, 이들 나선 미셀 복합체는 면역자극 활성을 갖고, 특히 백신 조성물에서 보조약으로서 유용하다.

따라서, 본 발명은 사포닌과 스테롤을 함유하는 백신 조성물을 제공하고, 여기서, 사포닌과 스테롤은 나선 미셀 형태의 복합체를 형성한다. 본 발명은 또한 사포닌, 스테롤 및 항원을 함유하는 조성물을 제공하고, 여기서, 사포닌과 스테롤은 나선 미셀 형태의 복합체를 형성하고, 항원은 나선 미셀과 혼합되지만 이 내부로 혼입되지는 않는다.

발명의 상세한 설명

본 발명자들은 레시틴 및 광유의 혼합물로 구성된 수중유 유화액으로 보조약된 백신 제제를 미세유체화하면 놀랍게도 백신 제제의 물리적 외형이 개선될 뿐 아니라, 백신 제제의 면역 효과가 개선됨을 발견하였다. 미세유체화된 백신 제제는 또한 개선된 안전성 프로파일을 특징으로 한다.

이들 발견에 근거하여, 본 발명에서는 백신 조성물중의 보조약으로서 유용한 마이크론 미만 크기의 수중유 유화액을 제공한다. 미세유체화기를 이용하여 이들 마이크론 미만 크기의 수중유 유화액을 제조하는 방법 또한 제공된다. 또한, 본 발명은 항원이 마이크론 미만 크기의 수중유 유화액과 조합되어 있는 마이크론미만 크기의 백신 조성물을 제공한다. 이런 백신 조성물을 제조하는 방법 또한 제공된다. 본 발명은 또한 마이크론 미만 크기의 수중유 유화액과 조합된 마이크로캡슐화된 항원을 함유하는 백신 조성물 및 이런 백신을 제조하는 방법을 제공한다.

제한하는 것이 아니라, 명확하게 하기 위한 본 발명의 상세한 설명은 본 발명의 일부 특징, 양태 또는 용도를 개시하거나 설명하는 하기 절로 나누어진다.

마이크론 미만 크기의 수중유 유화액

한 양태에서, 본 발명은 백신 보조약으로서 유용한 마이크론 미만 크기의 수중유 유화액 제제를 제공한다. 본 발명의 마이크론 미만 크기의 수중유 유화액은 백신 조성물중의 항원의 면역원성을 개선시키고, 동물에 투여하기 안전하고, 저장동안 안정하다.

본 발명의 마이크론 미만 크기의 수중유 유화액은 비-대사가능한 오일, 하나 이상의 계면활성제 및 수성 성분으로 구성되고, 여기서, 오일은 마이크론 미만의 범위의 평균 오일 소적 크기로 수성 성분중에 분산되어 있다.

용어 "마이크론 미만 크기"는 소적이 1㎛(마이크론) 미만의 크기이고, 오일 소적 크기의 평균이 1㎛ 미만임을 의미한다. 바람직하게는, 유화액의 평균 소적 크기는 0.8㎛미만이고, 보다 바람직하게는 0.5㎛ 미만이고, 보다 더 바람직하게는 0.4㎛ 미만이거나, 약 0.1 내지 0.3㎛이다.

"평균 소적 크기"는 입자 크기의 체적 분포 이내의 체적 평균 직경(VMD) 입자 크기로서 정의된다. VMD는 각각의 입자 직경과 그 크기의 모든 입자의 체적을 곱하고 합함으로써 계산된다. 그런 다음, 이를 모든 입자의 총 체적으로 나눈다.

본원에서 사용되는 용어 "비-대사가능한 오일"은 유화액이 투여되는 동물 대상의 몸에서 대사될 수 없는 오일을 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "동물" 및 "동물 대상"은 예를 들면 소, 양 및 돼지를 포함하는 사람이 아닌 모든 동물을 의미한다.

본 발명의 유화액에 사용하기 적합한 비-대사가능한 오일은 알칸, 알켄, 알킨 및 이의 상응하는 산 및 알콜, 이의 에터 및 에스터, 및 이의 혼합물을 포함한다. 바람직하게는 오일의 개별적인 화합물은 경질 탄화수소 화합물, 예를 들면 6 내지 30개의 탄소 원자를 갖는 성분이다. 오일은 합성 제조되거나 석유 제품으로부터 정제될 수 있다. 본 발명의 유화액에 사용하기에 바람직한 비-대사가능한 오일은 예를 들면, 광유, 파라핀 유 및 사이클로파라핀을 포함한다.

용어 "광유"는 증류 기법에 의해 석유로부터 수득된 액체 탄화수소의 혼합물 을 의미한다. 이 용어는 "액화된 파라핀", "액체 바셀린" 및 "백색 광유"와 동의어이다. 이 용어는 또한 "경질 광유", 즉, 석유의 증류에 의해 유사하게 수득되지만 백색 광유보다 약간 더 낮은 비중을 갖는 오일을 포함하고자 한다. 예를 들면 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pa. : Mack Publishing Company, 1990, pages 788 및 1323)]을 참고할 수 있다. 광유는 다양한 공급원, 예를 들면 펜실바니아주 필립스버그 소재의 티. 제이. 베이커(J. T. Baker), 오하이오주 클리블랜드 소재의 유에스비 코포레이션(USB Corporation)으로부터 수득될 수 있다. 바람직한 광유는 드라케올(DRAKEOL, 등록상표)로 시판되는 경질 광유이다.

전형적으로, 본 발명의 마이크론 미만 크기의 유화액의 오일 성분은 1 내지 50체적%, 바람직하게는 10 내지 45체적%, 보다 바람직하게는 20 내지 40체적%의 양으로 존재한다.

본 발명의 수중유 유화액은 전형적으로 하나 이상의 계면활성제를 포함한다. 계면활성제와 유화제는 본원에서 서로 교환되어 사용되고, 이들은 오일 소적의 표면을 안정화시키고, 오일 소적을 바람직한 크기로 유지시키는 약물이다.

본 발명의 유화액에 사용하기에 적합한 계면활성제는 천연 생물학적 상용성 계면활성제 및 비-천연 합성 계면활성제를 포함한다. 생물학적 상용성 계면활성제는 인지질 화합물 또는 인지질의 혼합물을 포함한다. 바람직한 인지질은 포스파티딜콜린(레시틴), 예를 들면 콩 또는 계란 레시틴이다. 레시틴은, 조질 식물성 오일을 물 세척하고 분리시키고 생성된 수화된 검을 건조시킴으로써, 포스파타이드와 트라이글리세라이드의 혼합물로부터 수득된다. 정제된 생성물은 아세톤 세척에 의해 트라이글리세라이드와 식물성 오일을 제거한 후 남아있는 아세톤 불용성 인지질과 당지질을 위해 혼합물을 분획화함으로써 수득된다. 다르게는, 레시틴은 다양한 상업적인 공급원으로부터 수득될 수 있다. 다른 적합한 인지질은 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜세린, 포스파티드산, 카디오리핀 및 포스파티딜에탄올아민을 포함한다. 인지질은 천연 공급원으로부터 단리되거나 통상적으로 합성될 수 있다.

본 발명의 마이크론 미만 크기의 유화액에서 사용하기에 적합한 비-천연, 합성 계면활성제는 소르비탄-계 비-이온성 계면활성제, 예를 들면 지방 산-치환된 소르비탄 계면활성제(등록 상표 스판 또는 아라셀), 폴리에톡실화된 소르비톨의 지방 산 에스터(등록 상표 트윈), 피마자유와 같은 공급원에서 나온 지방산의 폴리에틸렌 글리콜 에스터(에뮬포(Emulfor); 폴리에톡실화된 지방산(예를 들면 상표명 시뮬솔(SIMULSOL M-53)로 시판되는 스테아르산), 폴리에톡실화된 아이소옥틸페놀/포름알데하이드 중합체(TYLOXAPOL), 폴리옥시에틸렌 지방 알콜 에터(BRIJ, 등록상표), 폴리옥시에틸렌 노닐페닐 에터(등록상표, 트리톤(TRITON) N), 폴리옥시에틸렌 아이소옥틸페닐 에터(트리톤 X)를 포함한다. 바람직한 합성 계면활성제는 상표명 스판 및 트윈으로 시판되는 계면활성제이다.

본 발명의 수중유 유화액에 사용하기에 바람직한 계면활성제는 레시틴, 트윈-80 및 스판-80을 포함한다.

일반적으로, 계면활성제, 또는 둘 이상의 계면활성제가 사용되는 경우, 계면 활성제의 조합은 0.01 내지 10체적%, 바람직하게는 0.1 내지 6.0체적%, 보다 바람직하게는 0.2 내지 5.0체적%의 양으로 유화액에 존재한다.

수성 성분은 유화액의 연속 상을 구성하고, 물, 완충된 염수 또는 임의의 다른 적합한 수용액일 수 있다.

본 발명의 수중유 유화액은 방부제, 등장화제, 생물학적 접착 분자 및 면역자극 분자를 포함하는 적절하고 바람직한 추가 성분을 포함할 수 있다.

생물학적 접착 분자는 점액 면역성을 부여하는 대상 점액 표면 상이나 이를 통한 항원의 배달 및 부착을 개선시킬 수 있다. 적합한 생물학적 접착 분자의 예는 산성 비-천연 발생 중합체, 예를 들면 폴리아크릴산 및 폴리메타크릴산(예를 들면 카보폴(CARBOPOL, 등록상표), 카보머(CARBOMER)); 산성 합성 개질된 천연 중합체, 예를 들면 카복시메틸셀룰로즈; 중성 합성 개질된 천연 중합체, 예를 들면 (하이드록시프로필) 메틸셀룰로즈; 염기성 아민-함유 중합체, 예를 들면 키토산; 천연 공급원으로부터 수득될 수 있는 산성 중합체, 예를 들면 알긴산, 히알루론산, 펙틴, 트라가칸트 검 및 카라야 검; 및 중성 비-천연 중합체, 예를 들면 폴리비닐알콜; 또는 이의 조합을 포함한다.

본원에서 사용되는 문구 "면역자극 분자"는 백신 조성물에서 항원 성분에 의해 유도되는 보호성 면역 반응을 개선시키는 분자를 의미한다. 적합한 면역자극 물질은 박테리아 세포 벽 성분, 예를 들면 N-아세틸 뮤라밀-L-알라닐-D-아이소글루타민의 유도체, 예를 들면 뮤라부타이드, 트레오닐-MDP 및 뮤라밀 트라이펩타이드; 사포닌 글리코사이드 및 이의 유도체, 예를 들면 퀼 A, QS 21 및 GPI-0100; 콜레스 테롤; 및 4차 암모늄 화합물, 예를 들면 다이메틸다이옥타데실암모늄 브로마이드(DDA) 및 N,N-다이옥타데실-N,N-비스(2-하이드록시에틸)프로판다이아민("아브리딘")을 포함한다.

사포닌은 광범위한 식물 종에서 2차 대사물질로서 생산되는 글리코사이드 화합물이다. 사포닌의 화학적 구조는 일부 강력하고 효율적인 면역학적 활성을 포함하는, 광범위한 약학적 및 생물학적 활성을 부여한다.

구조적으로, 사포닌은 하나 이상의 당 쇄에 결합된 임의의 아글리콘(aglycone)으로 구성된다. 사포닌은 이의 아글리콘 조성에 따라 다음과 같이 분류될 수 있다: 트라이터펜 글리코사이드, 스테로이드 글리코사이드 및 스테로이드 알칼로이드 글리코사이드.

사포닌은 퀼라자 사포나리아의 껍질로부터 단리될 수 있다. 사포닌은 오래동안 면역자극제로서 알려져 왔다. 달스가드(Dalsgaard, K.)의 문헌["Evaluation of its adjuvant activity with a special reference to the application in the vaccination of cattle against foot-and-mouth disease", Acta. Vet. Scand. 69: 1-40 1978]을 참고할 수 있다. 사포닌을 함유하는 식물의 조질 추출물은 구제역 백신의 활성을 개선시켰다. 그러나, 조질 추출물은 백신에서 사용할 경우 부작용과 관련되어 있었다. 이후에, 달스가드는 투석, 이온 교환 및 겔 투과 크로마토그래피에 의해 사포닌으로부터 보조약 활성 성분을 부분적으로 정제하였다. 달스가드 등의 문헌["Saponin adjuvants III. Isolation of a substance from Quillaja saponaria Morina with adjuvant activity in foot-and-mouth disease vaccines", Arch. Gesamte. Virusforsch. 44: 243-254 1974]을 참고할 수 있다. 이런 방식으로 정제된 보조약 활성 성분은 "퀼 A"로 알려졌다. 중량 기준으로 퀼 A는 조질 사포닌과 비교하였을 때 증가된 효능을 나타내었고, 감소된 국소 반응을 보였다. 퀼 A는 가축용 백신에서 광범위하게 사용되고 있다.

고압 크로마토그래피(HPLC)로 퀼 A를 추가 분석한 결과 이들이 밀접하게 연관된 사포닌의 이종 혼합물임이 밝혀졌고, 감소되거나 최소의 독성을 갖는 강력한 보조약였던 QS21이 발견되었다. 켄실(Kensil C. R.) 등의 문헌["Separation and characterization of saponins with adjuvant activity from Quillaja saponaria Molina cortex, " J. Immunol. 146: 431-437,1991]을 참조할 수 있다. 대부분의 다른 면역자극제와는 달리, QS21은 수용성이고, 유화액 유형 제제와 함께 또는 이들 없이 백신에서 사용될 수 있다. QS21은 마우스에서 Th1 유형 반응을 이끌어내어 IgG2a 및 IgG2b 항체의 생산을 자극하고, 서브유니트 항원에 반응하여 항원-특이적 CD8+ CTL(MHC 클래스 I)을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 인간에서의 임상 연구는 허용가능한 독성학 프로파일을 갖는 이의 보조약성을 입증하였다. 켄실 등의 문헌["Structural and imunological charaterization of the vaccine adjuvant QS-21. In Vaccine Design: the subunit and Adjvuant Approach, " Eds. Powell, M. F. and Newman, M. J. Plenum Publishing Corporation, New York. 1995, pp. 525-541]을 참고할 수 있다.

미국 특허 제6,080,725호는 사포닌-친유체 컨쥬게이트(conjugate)를 제조하고 이용하는 방법을 개시하고 있다. 이 사포닌-친유체 컨쥬게이트에서, 친유체 잔 기, 예를 들면 지질, 지방산, 폴리에틸렌 글리콜 또는 터핀은 트라이터핀 사포닌의 3-O-글루쿠론산 상에 존재하는 카복시 기에 의해 비-아실화되거나 탈아실화된 트라이터핀 사포닌에 공유결합되어 있다. 친유성 잔기의 사포닌, 예를 들면 퀼라자 데스아실사포닌, 루시오사이드 P 또는 깁소필라(Gypsophila), 사포나리아(saponaria) 및 아칸토필륨(Acanthophyllum)에서 나온 사포닌의 3-O-글루쿠론산으로의 결합은 체액 및 세포 매개되는 면역성에 대한 이들의 보조약 효과를 개선시킨다.

또한, 친유성 잔기를 비- 또는 데스아실사포닌의 3-O-글루쿠론산 잔기에 결합시키면 원래의 사포닌에 비해 더 쉽게 정제되고, 독성이 더 적고, 화학적으로 더 안정하고, 등가나 더 좋은 보조약 성질을 갖는 사포닌 유사체가 생성된다.

GPI-0100은 미국 특허 제6,080,725호에 개시된 사포닌-친유체 콘쥬게이트이다. GPI-0100은 글루쿠론산의 카복실 기를 통해 지방족 아민을 데스아실사포닌에 첨가함으로써 생성된다.

4차 암모늄 화합물 - 아민, 4차 암모늄 화합물, 구아니딘, 벤즈아미딘 및 티오우로늄을 포함하는 다수의 지방족 질소 염기가 면역학적 보조약으로서 사용되기 위해 제한되어 왔다. 구체적인 이런 화합물은 다이메틸다이옥타데실암모늄 브로마이드(DDA) 및 N,N-다이옥타데실-N,N-비스(2-하이드록시에틸)프로판다이아민("아브리딘")을 포함한다.

미국 특허 제5,951,988호는 오일 성분과 함께 DDA와 같은 4차 암모늄 염을 함유하는 보조약 제제를 개시한다. 이 제제는 면역 반응을 개선시키기 위해, 백신 조성물중의 공지된 면역학적 물질, 예를 들면 바이러스 또는 박테리아 항원과 관련 하여 유용하다. 조성물은 또한 비특이적 면역자극 제제로서 혼입된 항원 없이 유용하다.

미국 특허 제4,310,550호는 백신 보조약으로서 지방 또는 지질 유화액으로 배합된 N,N-고급 알킬-N,N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판다이아민 및 N,N-고급 알킬-자일렌다이아민의 용도를 개시하고 있다. 보조약 제제의 비경구 투여를 통한 인간 또는 동물에서 항원의 면역학적 반응을 유도 또는 개선시키는 방법이 미국 특허 제4,310,550호에 개시되어 있다.

바람직한 양태에서, 본 발명은 백신 보조약으로서 유용한 마이크론 미만 크기의 수중유 유화액을 제공하고, 이는 암피겐(등록상표) 제제로 구성되어 있으며 1㎛ 미만의 크기의 소적과 약 0.25㎛의 평균 소적 크기를 갖는다.

본원에서 사용되는 용어 "암피겐(등록상표) 제제"는 드라케올(상표명) 레시틴 오일 용액(네브라스카주 링콘 소재의 하이드로닉스(Hydronics))를 트윈 80과 스판 80의 존재 하에 염수와 혼합함으로써 형성된 용액을 의미한다. 전형적인 암피겐(등록상표) 제제는 40%(v/v)의 경질 광유, 약 25% w/v의 레시틴, 약 0.18%(v/v)의 트윈 80 및 약 0.08%(v/v)의 스판 80을 함유한다.

마이크론 미만 크기의 수중유 유화액의 제조 방법

다른 양태에서, 본 발명은 상기 개시된 마이크론 미만 크기의 수중유 유화액의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 오일, 하나 이상의 계면활성제, 수성 성분 및 유화액중에서 사용하기에 적절한 임의의 다른 성분을 포함하는 유화액의 다양한 성분을 함께 조합하고 혼합한다.

형성된 혼합물을 전형적으로 하나 이상의 균질화기 또는 유화기를 통과시켜 유화 가공하여 균일한 외형 및 약 0.5㎛의 평균 소적 크기를 갖는 수중유 유화액을 형성한다. 이 목적으로 임의의 상업적으로 이용가능한 균질화기 또는 유화기, 예를 들면 로스(Ross) 유화기(뉴욕주 하우포즈), 가울린(Gaulin) 균질화기(매사추세츠주 에버레트)를 이용할 수 있다.

그런 다음, 이렇게 형성된 유화액을 미세유체화시켜 소적 크기가 마이크론 미만 범위가 되게 한다. 상업적인 미세유체화기, 예를 들면 매사추세츠주 뉴톤 소재의 마이크로플루이딕스(Microfluidics)의 모델 번호 11OY; 가울린 모델 30CD(매사추세츠주 에버레트 소재의 가울린 인코포레이티드(Gaulin Inc.)); 및 라니 미니랩(Rainnie Minilab) 유형 8.30H(위스콘신주 허드슨 소재의 미로 아토마이저 푸드 앤드 데어리 인코포레이티드(Miro Atomizer Food and Dairy Inc.)를 이용함으로써 미세유체화를 달성할 수 있다. 이들 미세유체화기는 2개의 유체 스트림이 상호작용 챔버에서 높은 속도에서 상호작용하여 마이크론 미만 크기의 소적을 갖는 유화액을 형성하도록, 유체를 고압 하에서 작은 구멍을 통과시킴으로써 작동된다.

소적 크기는 시판되는 크기 분석 장치를 이용하여 당 분야에 공지된 다양한 방법, 예를 들면 레이저 회절에 의해 측정될 수 있다. 크기는 사용되는 계면활성제의 유형, 계면활성제 대 오일의 비율, 작동 압력, 온도 등에 따라 다양할 수 있다. 당 분야의 숙련자는 이들 변수를 바람직하게 조합하여 과도한 실험없이도 원하는 소적 크기를 갖는 유화액을 수득할 수 있다. 본 발명의 유화액의 소적은 직 경이 1㎛ 미만이고, 바람직하게는 소적의 평균 크기가 0.8㎛ 미만이고, 보다 바람직하게는 소적의 평균 크기가 0.5㎛ 미만이고, 보다 더 바람직하게는 소적의 평균 크기가 0.3㎛ 미만이다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 드라케올 레시틴 오일 용액(이는 네브라스카주 링콘 소재의 하이드로닉스에서 시판하며, 경질 광유중에 25% 레시틴을 함유한다)은 계면활성제인 트윈 80 및 스판 80뿐만 아니라 염수와 함께 조합되고 혼합되어 "암피겐(등록상표) 용액" 또는 "암피겐(등록상표) 제제"를 형성한다. 그런 다음, 암피겐(등록상표) 용액을 로스(등록상표)(뉴욕주 11788 하우포즈) 유화기를 이용하여 약 3400rpm에서 유화시켜 수중유 유화액을 형성한다. 그런 다음, 유화액을 약 4500±500psi에서 작동되는 미세유체화기에 1회 통과시킨다. 미세유체화된 수중유 유화액은 1㎛ 미만의 소적 크기를 갖고, 약 0.25㎛의 평균 소적 크기를 갖는다.

마이크론 미만 크기의 수중유 유화액에 혼입된 항원을 함유하는 백신 조성물

다른 양태에서, 본 발명은 상기 개시된 바와 같은 마이크론 미만 크기의 수중유 유화액 및 항원을 함유하는 백신 조성물을 제공한다. 이들 백신 조성물은 개선된 면역원성 효과 및 개선된 물리적 외형(예를 들면 장기간 저장한 후에도 상 분리가 관찰되지 않는다)을 가짐을 특징으로 한다. 또한 본 발명의 백신 조성물은 동물에게 투여하기에 안전하다.

본 발명에 따르면, 항원은 외부적으로, 또는 바람직하게는 내재적으로 유화액과 조합될 수 있다. 용어 "내재적으로"는 항원이 미세유체화 단계 이전에 유화 액 성분과 조합되는 공정을 의미한다. 용어 "외부적으로"는 유화액이 미세유체화된 후에 항원이 유화액에 첨가되는 공정을 의미한다. 외부적으로 첨가된 항원은 유리 항원이거나, 하기에 추가로 개시된 바와 같이 마이크로입자에 캡슐화될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "항원"은 동물에서 면역원성이고, 백신 조성물에 포함되어 백신 조성물이 투여된 동물에서 보호성 면역 반응을 이끌어내는 임의의 물질, 화합물 또는 조성물을 의미한다.

항원과 연관되어 사용되는 용어 "면역원성"은 항원이 동물에서 항원에 대한 면역 반응을 야기할 수 있는 능력을 의미한다. 면역 반응은 주로 세포독성 T-세포를 통해 매개되는 세포 면역 반응이거나, 주로 헬퍼 T-세포에 의해 매개되어 항체를 생산하는 B-세포를 활성화시키는 체액성 면역 반응일 수 있다.

"보호적 면역 반응"이란 항원이나 항원을 함유하는 병원균에 의해 야기되는 질환 또는 질병이 발생하는 것을 방지하거나 명확하게 감소시키거나, 이들의 심각성을 제거하거나 명확하게 감소시키거나, 진행 속도를 명확하게 늦추는, 동물에서 발생하는 항체 또는 세포 매개된 면역 반응중 하나 또는 이들 둘 모두에 의한 임의의 면역 반응으로서 정의된다.

본 발명의 백신 조성물에 포함될 수 있는 항원은 불활성화된 전체 또는 부분적 세포 제제의 형태이거나, 또는 종래의 단백질 정제, 유전자 조작 기법 또는 화학적 합성에 의해 수득된 항원 분자의 형태인 마이코플라스마 하이오뉴모니아에(Mycoplasma hyopneumoniae), 하에모필루스 솜누스(Haemophilus somnus), 하에모 필루스 파라수이스(Haemophilus parasuis), 보르데텔라 브론티셉티카(Bordetella bronchiseptica), 악티노바실러스 플뢰로뉴모니아에(Actinobacillus pleuropneumonie), 파스퇴렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 만하이미아 헤몰리티카(Manheimia hemolytica), 마이코플라즈마 보비스(Mycoplasma bovis), 마이코플라즈마 갈라나시에움(Mycoplasma galanacieum), 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 마이코박테리움 파라튜베르쿨로시스(Mycobacterium paratuberculosis), 클로스트리디알 종(Clostridial spp.), 스트렙토코커스 우베리스(Streptococcus uberis), 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis), 스태필로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus), 에리시펠로트릭스 루소파티아에(Erysipelothrix rhusopathiae), 캄필로박터 종(Campylobacter spp.), 푸소박테리움 네크로포룸(Fusobacterium necrophorum), 에스케리치아 콜리(Escherichia coli), 살모넬라 엔테리카 세로바스(Salmonella enterica serovars), 렙토스피라 종(Leptospira spp.); 병원성 진균, 예를 들면 캔디다(Candida); 원생동물, 예를 들면 크립토스포리듐 파르븀(Cryptosporidium parvum), 네오스포라 카니움(Neospora canium), 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii), 에이메리아 종(Eimeria spp.); 기생충, 예를 들면 오스터타기아(Ostertagia), 쿠페리아(Cooperia), 하에몬쿠스(Haemonchus), 파시올라(Fasciola)로부터 제조된 항원을 포함한다. 추가의 항원은 불활성화된 전체 또는 부분적 바이러스 제제의 형태이거나, 또는 종래의 단백질 정제, 유전자 조작 기법 또는 화학적 합성에 의해 수득된 항원 분자의 형태인 소의 허피스 바이러스-1,3,6, 소의 바이러스성 설사 바이러 스(BVDV) 제1형 및 제2형, 소의 파라인플루엔자 바이러스, 소의 호흡기 신시티알(syncytial) 바이러스, 소의 백혈병 바이러스, 우역 바이러스, 구제역 바이러스, 광견병, 돼지의 열병 바이러스, 아프리카 돼지 열병 바이러스, 돼지 파르보바이러스, PRRS 바이러스, 돼지의 시르코바이러스, 인플루엔자 바이러스, 돼지의 소포성 질병 바이러스, 테첸(Techen) 열병 바이러스, 위광견병 바이러스를 포함한다.

항원의 양은 수중유 유화액과 조합된 항원이 동물에게서 보호적인 면역 반응을 유도하는데 효과적인 양이어야 한다.

효과적인 항원의 정확한 양은 항원의 성질, 활성 및 순도에 따라 결정되고, 당 분야의 숙련된 자에 의해 결정될 수 있다.

백신 조성물에 존재하는 수중유 유화액의 양은 백신 조성물중의 항원의 면역원성을 강화시키기에 충분해야 한다. 바람직하고 적절한 경우, 추가량의 계면활성제 또는 추가의 계면활성제가 수중유 유화액에 의해 제공되는 계면활성제에 추가하여 백신 조성물에 첨가될 수 있다. 일반적으로, 오일 성분은 1.0 내지 20체적%의 양으로, 바람직하게는 1.0 내지 10체적%의 양으로, 보다 바람직하게는 2.0 내지 5.0체적%의 양으로 백신 조성물의 최종 체적에 존재한다. 계면활성제, 또는 둘 이상의 계면활성제가 사용되는 경우, 계면활성제의 조합은 0.1 내지 20체적%의 양으로, 바람직하게는 0.15 내지 10체적%의 양으로, 보다 바람직하게는 0.2 내지 6.0체적%의 양으로 백신 조성물의 최종 체적에 존재한다.

항원 및 수중유 유화액에 추가하여, 백신 조성물은 수중유 유화액과 관련하여 상기 개시된 바와 같은, 방부제, 등장화제, 생물학적 접착 분자 및 면역자극 분 자, 예를 들면 퀼(Quil) A, 콜레스테롤, GPI-0100, 다이메틸다이옥타데실암모늄 브로마이드(DDA)를 포함하는 적절하고 바람직한 기타 성분을 포함할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 또한 수의학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 용어 "수의학적으로 허용가능한 담체"는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 보조약, 안정화제, 희석제, 방부제, 항생제, 항진균제, 등장화제, 흡착 지연제 등을 포함한다. 희석제는 물, 염수, 덱스트로즈, 에탄올, 글리세롤 등을 포함할 수 있다. 등장화제는 다른 것들 중에서도 염화 나트륨, 덱스트로즈, 만니톨, 소르비톨 및 락토즈를 포함한다. 안정화제는 다른 것들 중에서도 알부민을 포함한다.

바람직한 양태에서, 본 발명은 1㎛ 미만의 소적 크기, 바람직하게는 0.8㎛ 미만의 평균 소적 크기, 보다 바람직하게는 0.5㎛미만, 보다 바람직하게는 약 0.5㎛의 평균 소적 크기를 갖는 수중유 유화액에 내재적으로 혼입된, BVDV I형 또는 BVDV II형 항원중 하나 이상을 포함하는 백신 조성물을 제공한다. BVDV I형 및/또는 II형 항원은 바람직하게는 불활성화된 바이러스 제제의 형태이다. 마이크론 미만 크기의 수중유 유화액은 바람직하게는 암피겐(등록상표) 제제(즉, 경질 광유, 레시틴, 트윈(등록상표) 80 및 스판(등록상표) 80을 함유하는 제제)로 구성된다. 백신 조성물은 바람직하게는 또한 퀼 A, 콜레스테롤 및 티메르졸을 포함한다.

다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 수중유 유화액중의 BVDV I형 또는 BVDV II형 항원중 하나 이상 및 렙토스피라 항원을 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 바람직하게는 불활성화된 세포 또는 바이러스 제제의 형태인 항원은 1㎛ 미만의 소적 크기, 바람직하게는 0.8㎛ 미만의 평균 소적 크기, 보다 바람직하게는 0.5㎛미 만, 보다 바람직하게는 약 0.5㎛의 평균 소적 크기를 갖는 수중유 유화액에 내재적으로 혼입되어 있다. 마이크론 미만 크기의 수중유 유화액은 바람직하게는 암피겐(등록상표) 제제(즉, 경질 광유, 레시틴, 트윈(등록상표) 80 및 스판(등록상표) 80을 함유하는 제제)로 구성된다. 백신 조성물은 바람직하게는 또한 퀼 A, 콜레스테롤, DDA, GPI-100 및 알루미늄 하이드록사이드(AlOH)에서 선택되는 하나 이상의 면역자극 분자를 포함한다.

또다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 수중유 유화액 중에 하나 이상의 박테리아 항원, 예를 들면 재조합 스트렙토코커스 우베리스 PauA 단백질 또는 이. 콜라이의 세포 제제 또는 이들 둘의 조합을 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 항원은 1㎛ 미만의 소적 크기, 바람직하게는 0.8㎛ 미만의 평균 소적 크기, 보다 바람직하게는 0.5㎛미만, 보다 더 바람직하게는 약 0.25㎛의 평균 소적 크기를 갖는 수중유 유화액과 내재적으로 조합되어 있다. 마이크론 미만 크기의 수중유 유화액은 바람직하게는 암피겐(등록상표) 제제(즉, 경질 광유, 레시틴, 트윈(등록상표) 80 및 스판(등록상표) 80을 함유하는 제제)로 구성된다. 백신 조성물은 바람직하게는 또한 퀼 A, DDA 및 GPI-100에서 선택되는 하나 이상의 면역자극 분자를 포함한다.

본 발명의 백신 조성물은 경구, 비강내, 점막, 국소, 경피 및 비경구(예를 들면 정맥내, 복강내, 피내, 피하 또는 근육내) 경로를 포함하는 공지된 경로에 의해 동물에 투여될 수 있다. 처음에는 비경구 경로를 이용한 후, 점막 경로를 이용하여 후속 투여하는 것과 같이 경로를 조합하여 투여할 수도 있다.

백신 조성물의 제조 방법

추가의 양태에서, 본 발명은 항원 또는 항원들과 마이크론 미만 크기의 수중유 유화액을 함유하는 백신 조성물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 백신 조성물의 제조에 있어서, 항원은 수중유 유화액의 성분과 내재적으로 또는 외부적으로 조합될 수 있다. 바람직하게는, 항원은 수중유 유화액의 성분과 내재적으로 조합된다.

항원은 오일, 하나 이상의 계면활성제, 수성 성분 및 임의의 다른 적절한 성분을 포함하는 유화액의 다양한 성분과 조합되어 혼합물을 형성할 수 있다. 혼합물은 먼저 전형적으로 하나 이상의 균질화기나 유화기를 1회 이상 통과시키는 제 1 블렌딩 가공되어 항원을 함유하는 수중유 유화액을 형성한다. 이 목적을 위해서, 임의의 상업적으로 이용가능한 균질화기 또는 유화기, 예를 들면 로스(Ross) 유화기(뉴욕주 하우포즈), 가울린(Gaulin) 균질화기(매사추세츠주 에버레트) 또는 마이크로플루이딕스(매사추세츠주 뉴톤 소재)를 이용할 수 있다. 다르게는, 균질화기나 유화기를 이용하여 오일, 하나 이상의 계면활성제 및 수성 성분을 포함하는 유화액 보조약의 다양한 성분을 먼저 조합하여 수중유 유화액을 형성한 후, 항원을 이 유화액에 첨가할 수 있다. 1차 블렌딩 후의 수중유 유화액의 평균 소적 크기는 약 1.0 내지 1.2마이크론이다.

그런 다음, 항원을 함유하는 유화액을 미세유체화시켜 소적 크기가 마이크론 미만 범위가 되게 한다. 상업적인 미세유체화기, 예를 들면 매사추세츠주 뉴톤 소재의 마이크로플루이딕스(Microfluidics)의 모델 번호 11OY; 가울린 모델 30CD(매사추세츠주 에버레트 소재의 가울린 인코포레이티드(Gaulin Inc.); 및 라니 미니 랩(Rainnie Minilab) 유형 8.30H(위스콘신주 허드슨 소재의 미로 아토마이저 푸드 앤드 데어리 인코포레이티드(Miro Atomizer Food and Dairy Inc.)를 이용함으로써 미세유체화를 달성할 수 있다.

소적 크기는 시판되는 크기 분석 장치를 이용하여 당 분야에 공지된 다양한 방법, 예를 들면 레이저 회절에 의해 측정될 수 있다. 크기는 사용되는 계면활성제의 유형, 계면활성제 대 오일의 비율, 작동 압력, 온도 등에 따라 다양할 수 있다. 당 분야의 숙련자는 이들 변수를 바람직하게 조합하여 과도한 실험없이도 원하는 소적 크기를 갖는 유화액을 수득할 수 있다. 본 발명의 유화액의 소적은 직경이 1㎛ 미만이고, 바람직하게는 소적의 평균 크기가 0.8㎛ 미만이고, 보다 바람직하게는 소적의 평균 크기가 0.5㎛ 미만이다. 보다 더 바람직하게는, 평균 소적 크기는 약 0.1 내지 0.3㎛이다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 드라케올 레시틴 오일 용액(이는 경질 광유중에 25% 레시틴을 함유한다)은 계면활성제인 트윈 80 및 스판 80뿐만 아니라 염수와 함께 조합되고 혼합되어 40%의 경질 광유, 레시틴, 0.18% 트윈(등록상표) 80 및 0.08% 스판 80을 함유하는 혼합물을 형성한다. 그런 다음, 혼합물을 로스(등록상표)(뉴욕주 11788 하우포즈) 유화기를 이용하여 약 3400rpm에서 유화시켜 유화액 생성물을 형성하고, 이를 또한 "암피겐(등록상표) 제제" 또는 "암피겐(등록상표) 용액"이라 부른다. 그런 다음, 유화기, 예를 들면 로스 균질화기의 도움을 받아 바람직한 항원을 암피겐 용액 및 임의의 다른 적절한 성분(예를 들면 면역자극 분자)과 조합하여 항원을 함유하는 수중유 유화액을 형성한다. 이런 유화액을 약 10000±500psi에서 작동되는 미세유체화기에 1회 통과시킨다. 미세유체화된 수중유 유화액은 1㎛ 미만의 소적 크기를 갖고, 약 0.25㎛의 평균 소적 크기를 갖는다. 다른 바람직한 양태에서는, 수중유 유화액(예를 들면 암피겐(등록상표) 제제)를 바람직한 항원과 조합하기 전에, 항원을 사포닌 글리코사이드, 예를 들면 퀼 A와 조합하여 혼합물을 형성한다. 이 항원-사포닌 혼합물을 예를 들면 균질화 용기에서 균질화시킨다. 그런 다음, 스테롤, 예를 들면 콜레스테롤을 균질화된 항원-사포닌 혼합물에 첨가한다. 그런 다음, 항원, 사포닌 및 스테롤을 함유하는 혼합물을 추가로 균질화시킨다. 그런 다음, 균질화된 항원-사포닌-스테롤 혼합물을 균질화기의 도움을 받아 수중유 유화액(예를 들면 암피겐(등록상표) 제제)과 조합한다. 그런 다음, 항원, 사포닌 및 스테롤을 함유하는 균질화된 수중유 유화액을 고압 균질화, 예를 들면 미세유체화시킨다.

마이크론 미만 크기의 수중유 유화액중에 캡슐화된 항원을 함유하는 백신 조성물 및 이의 제조 방법

또다른 양태에서, 본 발명은 마이크로입자에 캡슐화된 항원(또는 "마이크로캡슐화된 항원")을 함유하는 백신 조성물을 제공하고, 여기서, 마이크로캡슐화된 항원은 상기 개시된 바와 같은 마이크론 미만 크기의 수중유 유화액에 외부적으로 혼입된다.

입자상 담체에 항원을 흡착 또는 포획하는 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 문헌[Pharmaceutical Particulate Carriers: Therapeutic Applications (Justin Hanes, Masatoshi Chiba and Robert Langer. Polymer microspheres for vaccine delivery. In: Vaccine design. The subunit and adjuvant approach. Eds. Michael F. Powell and Mark J. Newman , 1995 Plenum Press, New York and London)]을 참조할 수 있다. 입자상 담체는 동물 대상의 면역 시스템에 여러 카피의 선택된 항원을 제시하여 국소 림프절에 항원이 포획되어 잔류하는 것을 촉진시킨다. 입자는 대식세포에 의해 식균작용화될 수 있고, 사이토카인 분비를 통해 항원 제시를 개선시킬 수 있다. 입자상 담체 또한 문헌에 개시되어 있고, 예를 들면 PLG로 공지된 폴리(락타이드-코-글리콜라이드) 및 폴리(락타이드)뿐만 아니라, 폴리메틸 메타크릴레이트 중합체로부터 유도된 것들을 포함한다. 폴리메틸 메타크릴레이트 중합체는 비-생분해성이고, PLG 입자는 에스터 결합의 무작위 비-효소적 가수분해에 의해 락트산과 글리콜산으로 생분해되어, 정상적인 대사 경로를 통해 배출된다.

생분해성 미세구 또한 백신의 제어 방출을 위해 이용되어 왔다. 예를 들면 장기간동안 항원을 연속적으로 방출할 수 있다. 중합체의 분자량과 중합체중의 락트산과 글리콜산의 비율에 따라, PLGA 중합체는 며칠 또는 몇주 내지 여러달 내지 1년의 가수분해 속도를 가질 수 있다. 느리고, 제어된 방출은 여러회 주사한 후에 관찰되는 것과 유사한 높은 수준의 항체를 형성시킬 수 있다. 다르게는, 서로 다른 가수분해 속도를 갖는 중합체를 선택함으로써 백신 항원의 박동성 방출을 달성할 수 있다. 중합체의 가수분해 속도는 전형적으로 중합체의 분자량과 중합체중의 락트산 대 글리콜 산의 비에 의존한다. 다양한 비율의 항원 방출을 갖는 둘 이상의 서로 다른 중합체로 제조된 마이크로입자는 항원의 박동성 방출을 제공하고, 여러번 투여하는 접종 방식을 흉내낸다.

본 발명에 따르면, 상기 개시된 바와 같은 임의의 것을 포함하는 항원은 당 분야에 공지된 임의의 방법(예를 들면 실시예 17에 개시된 것)을 이용하여 입자상 중합체 담체, 예를 들면 PLG 중합체에 흡착되어 마이크로캡슐화된 항원 제제를 형성한다. 그런 다음, 마이크로캡슐화된 항원 제제를 상기 개시된 바와 같은 마이크론 미만 크기의 수중유 유화액과 혼합하고, 여기에 분산시켜, 백신 조성물을 형성한다.

바람직한 양태에서, 본 발명은 PLG 중합체에 캡슐화된 항원을 함유하는 백신 조성물을 제공하고, 여기서 마이크로캡슐화된 항원은 경질 광유, 레시틴, 트윈 80, 스판 80 및 염수로 구성되고 1.0㎛ 미만의 평균 소적 크기를 갖는 미세유체화된 수중유 유화액에 외부적으로 분산되어 있다.

사포닌과 스테롤에 의해 형성된 복합체

한 양태에서, 본 발명은 사포닌과 스테롤을 함유하는 조성물을 제공하고, 여기서 사포닌과 스테롤은 나선 미셀 형태의 복합체를 형성한다. 본 발명에 따르면, 이들 복합체는 면역자극 활성을 갖는다.

"면역자극"이란 복합체가 항원 성분에 의해 유도되는 면역 반응을 증가시킬 수 있거나, 복합체가 개별적인 항원 성분과는 독립적인 면역 반응을 유도할 수 있음을 의미한다.

본 발명에 따르면 본 발명의 조성물에 사용하기에 바람직한 사포닌은 퀼 A이다.

본 발명의 보조약 조성물에 사용하기에 바람직한 스테롤은 베타-시토스테롤, 스티그마스테롤, 에르고스테롤, 에르고칼시페롤 및 콜레스테롤을 포함한다. 이들 스테롤은 당분야에 공지되어 있고, 예를 들면 콜레스테롤은 메르크 인덱스(Merck Index) 11판 제341면에 동물 지방에서 발견되는 천연 스테롤로서 개시되어 있다. 가장 바람직한 스테롤은 콜레스테롤이다.

조성물중의 사포닌:스테롤의 비는 전형적으로 1:100 내지 5:1 중량 대 중량이다. 바람직하게는 비는 1:1이다.

다른 양태에서, 본 발명은 사포닌, 스테롤 및 항원을 함유하는 백신 조성물을 제공하고, 여기서, 사포닌과 스테롤은 나선 미셀 형태의 복합체를 형성하고, 항원은 나선 미셀과 혼합되지만 이로 혼입되지는 않는다.

본 발명의 마이크로미터 미만의 수중유 유화액은 이와 함께 혼합된 항원의 면역원성을 개선시켰다.

하기는 본 발명을 수행하기 위한 특별한 양태의 예이다. 본 실시예는 단지 예시 목적으로 제공된 것이지, 어떤 방식으로든 본 발명을 한정하고자 함은 아니다.

실시예 1

암피겐(등록상표) 제제의 제조

임피겐(등록상표) 제제는 2단계 공정으로 제조되었다. 제 1 단계에서, 80리터의 드라케올 레시틴 오일 용액, 116리터의 테타누스 톡소이드(Tetanus Toxoid) 염수, 1.2리터의 스판 80 및 2.8리터의 트윈 80을 함께 혼합하고 로스 유화기를 이용하여 유화시켰다. 드라케올 레시틴 오일 용액은 25%의 콩 레시틴 및 75%의 광유를 함유하였다. 유화된 생성물은 최소 5 체적 또는 최소 10분동안 로스 유화기로 재순환되었다. 유화된 생성물을 최대 24시간동안 추가 가공을 위해 2 내지 7℃에서 저장하였다. 유화액을 로스 유화기 탱크에서 가울린 균질화기로 이동시키고 4500psi의 압력하에서 20분동안 균질화시켰다. 그런 다음, 생성된 40% 드라케올 레시틴 오일 용액(이후로는 "암피겐(등록상표) 제제" 또는 "암피겐(등록상표) 용액"이라 부른다)을 멸균된 폴리프로필렌 카복시 용기에 분배하였다. 클래스 10,000 제어된 환경에 위치한 클래스 100 분배 후드 내부에서 분배하였다. 용기를 2 내지 7℃에서 저장하였다. 달리 지시되지 않은 한, 이 암피겐(등록상표) 제제를 하기 개시된 바와 같은 실험에서 사용하였다.

실시예 2

BVD 백신의 플래쉬블렌드(flashblend) 균질화에 의한 1차 블렌딩

본 균질화 공정을 위해 사용되는 장치가 도 1에 도시되어 있다. 무균 기법 또는 스팀 크로스 밸브를 이용하여 BVD I형 항원(불활성화된 BVD I형 바이러스 제제)을 함유한 병을 블렌드 용기의 바닥 부 포트에 부착시켰다. 필요한 체적의 BVD I형 항원의 이동이 종결된 후, BVD I형 병을 불활성화된 BVD II형 바이러스 제제(불활성화된 BVD II형 바이러스 제제)를 함유한 병으로 대체하였다. 필요한 양의 BVD II형 항원의 이동이 종결된 후, 로스 균질화기를 이동식 용기에 부착시키고, 최대 rpm(3000rpm)에서 재순환을 개시하였다. 용기 진탕을 중간 속도에서 유지하였다.

무균 기법 또는 스팀 크로스 밸브를 이용하여 50mg/ml 농도의 퀼 A를 함유하는 병을 블렌드 용기의 균질화기 인-라인 포트에 부착하였다. 필요한 양의 퀼-A 용액이 라인 흡인에 의해 용기로 들어갔다. 퀼-A 용액의 이동이 종결된 후에, 병을 제거하였다. 같은 방식으로 에탄올 용액중의 콜레스테롤(18mg/ml)의 필요한 양이 블렌드 용기로 이동되었다. 그런 다음, 필요한 양의 암피겐(등록상표) 제제, 10% 티메르졸 용액 및 염기성 개질된 이글 배지(BME, Basic Modified Eagles) 증량제 용액을 블렌드 용기에 첨가하였다.

일단 모든 첨가가 종료되면, 추가 15분동안 계속 혼합하였다. 생성된 제제를 2ml 투여량으로 분획하고, 비-미세유체화된 암피겔(등록상표)제제-계 BVD 백신으로 표시하였다. 백신의 각각의 투여량은 500㎍의 퀼-A, 500㎍의 콜레스테롤, 2.5%의 암피겔(등록상표) 제제 및 0.009% 티메로졸을 함유하였다. 2개의 서로 다른 BVD 균주에 대한 항원 농도를 gp53에 대한 ELISA 역가의 측면에서 측정하였다.

실시예 3

미세유체화에 의한 2차 블렌딩

도 2는 미세유체화를 통한 2차 블렌딩에 이용되는 공정을 예시하고 있다. 미세유체화기는 증기 멸균되었다. 먼저, 보조 가공 모듈 챔버를 유니트에 장착하고, 블랭크 챔버를 제 2 챔버 위치에 장착하였다. 공급 용기 배수 밸브로부터 미 세유체화기 주입구로 이동 라인을 부착함으로써, 실시예 2에 개시된 바와 같이 제조된 완전히 보조약된 BVD 백신을 함유하는 용기를 미세유체화기에 연결시켰다. 질소 기체를 공급 용기 공기 필터 주입구에 연결시키고, 용기 압력 설정을 20±5 PSI로 조절하였다. 수집 용기 배수 밸브를 미세유체화기 출구에서 나오는 이동 관에 연결시켰다. 모든 필요한 연결을 완료한 후, 밸브를 열고 미세유체화기를 10,000±500 psi의 작동 압력에서 개시하였다. 백신의 전체 내용물을 미세유체화기에 1회 통과시키고, 후-미세유체화기 챔버에서 수집하였다. 이 제제를 2ml 투여량으로 분획하고, 미세유체화된 암피겐(등록상표) 제제계 BVD 백신으로 표시하였다.

실시예 4

벤치 블렌드(bench blend)를 통한 백신 조성물의 제조

실시예 1에 개시된 바와 같이 제조된 암피겐(등록상표) 제제를 BVD 항원과 증량제를 첨가하여 2.5%로 희석시켰다. 생성된 용액을 균질화기를 이용하는 대신 교반 바를 이용하여 벤치에서 블렌딩하였다. 최종 제제는 하기 성분을 함유하였다: BVD 1형 및 2형 항원, 2.5% 암피겐(등록상표)제제(이는 실시예 1에 개시된 바와 같이 오일, 레시틴, 스판 및 트윈을 함유한다) 및 염수. 트윈 80 및 스판 80은 최종 백신 제제에 각각 0.18체적% 및 0.08체적%의 양으로 존재한다.

실시예 5

비-미세유체화된 암피겐(등록상표) 제제-계 백신 제제와 미세유체화된 암피겐(등록상표) 제제-계 백신 제제의 소적 크기 분포의 비교

실시예 2에 개시된 바와 같이 제조된 비-미세유체화된 암피겐(등록상표) 제제-계 백신, 실시예 3에 개시된 바와 같이 제조된 미세유체화된 암피겐(등록상표) 제제-계 백신, 및 실시예 4에 개시된 바와 같이 벤치 블렌드를 통해 제조된 백신을 이용하여 백신 제제의 소적 크기를 비교하였다. 각각의 제제의 시료 2ml를 맬번(Malvern) 2000 레이져 회절계에 첨가하고, 소적 크기 분포를 측정하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 결과는 미세유체화된 암피겐(등록상표) 제제-계 백신 제제가 0.1마이크론 근처의 최대 입자 체적을 갖고, 비-미세유체화된 암피겐(등록상표) 제제-계 백신 제제가 1마이크론 근처의 최대 입자 분포 체적을 가짐을 나타낸다.

실시예 6

백신 상 분리의 감소

3개의 서로 다른 백신 제제: 실시예 2에 개시된 바와 같이 제조된 비-미세유체화된 암피겐(등록상표) 제제-계 백신, 실시예 3에 개시된 바와 같이 제조된 미세유체화된 암피겐(등록상표) 제제-계 백신, 및 실시예 4에 개시된 바와 같이 벤치 블렌드를 통해 제조된 백신을 나란히 비교하여 장기간 저장시 상 분리 성질을 측정하였다. 모든 이들 제제를 4℃에서 약 한달간 정치시켰고, 백신 제제 상부에 크림 층이 나타나는 측면에서 상 분리를 모니터링하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 미세유체화된 암피겐(등록상표) 제제-계 백신의 경우, 다른 2가지 제제와 비교하였을 때, 상 분리가 없었다.

실시예 7

소의 바이러스성 설사 바이러스에 대한 미세유체화된 소 백신과 비-미세유체화된 소 백신의 제조

소의 바이러스성 설사 바이러스 항원을 미세유체화를 통해 암피겐(등록상표) 제제에 내재적으로 혼입시켰다. 용어 "내재적으로 혼입"은 이에 의해 항원이 미세유체화 전에 암피겐(등록상표) 제제로 첨가되는 공정을 의미한다. 보조약 제제의 성분과 함께 항체에 미세유체화 공정의 물리적 힘을 가했다. 대조군 비-미세유체화 군에서는, 항원 제제를 블렌딩을 통해 암피겐(등록상표) 제제에 분산시켰다.

대조군과 미세유체화된 제제 둘모두의 최종 조성은 다음과 같았다: gp53에 대한 불활성화 후 ELISA 역가가 2535RU/투여량인 BVD I형, gp53에 대한 불활성화 후 ELISA 역가가 3290RU/투여량인 BVD II형, 1.25mg/투여량의 농도인 퀼-A, 1.25mg/투여량의 농도인 콜레스테롤, 2.5%의 최종 농도의 암피겐(등록상표) 제제 및 0.009%의 최종 농도인 티메르졸. 백신 투여량은 5ml였다.

실시예 8

미세유체화된 암피겐(등록상표) 제제-계 백신 제제에 내재적으로 혼입된 BVD 바이러스 항원의 장기간 안정성

이 실험은 장기간 저장동안 내재적으로 혼입된 항원의 안정성을 측정하기 위해 수행되었다. 죽인 BVD II형 바이러스 항원을 미세유체화 공정동안 암피겐(등록상표) 제제에 내재적으로 혼입하여 미세유체화된 백신 제제(A907505)를 수득하였다. 비-미세유체화된 암피겐(등록상표) 제제 중의 동일한 항원을 함유하는 3개의 다른 백신 제제(A904369, A904370 및 A901371)는 대조군으로 작용하였다. 비-미세유체화된 제제에서는, 항원을 암피겐(등록상표) 제제와 혼합하고, 로스 균질화기를 이용한 블렌딩을 통해 혼합하였다. 모든 4개의 백신 제제를 2년동안 4℃에서 보관하였다. 저장기간동안 서로 다른 시점에서(0, 6달, 12달 또는 24달), 모든 4개의 제제를 이용하여 3달된 소에게 접종하였다.

제0일 및 제21일에 3달된 소에게 2ml의 백신 제제를 피하 경로로 접종하였다. 접종된 동물의 혈청을 제35일에 수집하여, 백신에 대한 혈청 반응을 BVDV-E2 ELISA를 통한 항체 역가의 측면에서 결정하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, 미세유체화된 백신 제제는 모든 시험 시점(0, 6달, 12달 또는 24달)에서 더 높은 항체 역가를 나타내었고, 이는 항원 제제의 안정성이 미세유체화 공정동안의 항원의 내재적 혼입에 의해 손실되지 않았음을 나타낸다. 더욱이, 놀랍게도 미세유체화된 백신 제제가 모든 시점에서 개선된 면역 반응을 유도함을 발견하였다.

실시예 9

미세유체화 후 백신에 의한 직장 온도 증가의 감소

실시예 7에 개시된 바와 같이 제조된 미세유체화되고 비-미세유체화된 백신 제제를 이용하여 제0일에 소에 접종하고, 접종 하루전부터 접종 4일후까지의 기간동안 직장 온도를 모니터링하였다. 백신 투여량은 2ml였다. 그룹에 1배 또는 2배 투여량의 백신을 접종하였다. 직장온도를 제-1일부터 제4일까지 측정하고 기록하였다. 제0일의 직장 온도를 시험 제품을 투여하기 전에 측정하였다.

도 6에 도시된 바와 같이, 결과는 비-미세유체화된 백신 제제를 1배 또는 2배 투여량 접종한 동물의 경우 접종 후 약 24시간에 직장 온도가 가파르게 상승함을 나타내었다. 그러나, 미세유체화된 형태의 백신이 접종된 동물의 경우, 접종후 의 직장 온도의 상승은 단지 최소한이었고, 비-미세유체화된 제제가 접종된 동물보다 상당히 더 낮았다(도 6).

실시예 10

미세유체화된 백신 제제로 접종한 경우 주사 부위 반응 체적이 더 빨리 해결되었다

실시예 7에 개시된 바와 같이 제조된 미세유체화된 백신 제제와 비-미세유체화된 백신 제제를 이용하여 제0일에 소에 접종하였다. 이 연구에 포함된 동물은 교배종 육우이었다. 위약 처리 군(T01 및 T02) 각각은 3마리의 동물로 구성되었다. T03 내지 T06의 군은 각각 6마리의 동물로 구성되었다. 백신 투여량은 2ml였고, 군에 제0일에 1배 또는 2배 투여량의 백신을 접종하였다. 제0일에, 시험 제품을 오른쪽 목에 투여하였다. 2배 투여량(4ml)의 시험 제품이 투여된 동물(T02, T04 및 T06)의 경우 한쪽 면에 1배 투여량의 2배 투여량 전체가 투여되었다. 제0일 내지 제4일 및 제6일, 제9일 및 제14일에 주사 부위에서의 반응 부위 측정을 포함한 주사 부위의 관찰을 목의 오른쪽 측면에서 수행하였다. 제0일에, 시험 제품을 투여하기 전에 주사 부위를 관찰하였다. 1배 또는 2배 투여량의 위약이 접종된 군은 주사 부위 반응 체적에 임의의 유의한 증가를 나타내지 않았고, 따라서, 이들 자료는 도 7에 도시하지 않았다. 비-미세유체화된 백신 제제의 경우, 1배 투여량 접종과 2배 투여량 접종 사이에 주사 부위 반응 체적이 비례 증가하였다. 한편, 미세유체화된 백신 제제의 경우, 비록 1배 투여량이 더 큰 주사 반응 체적을 유도하긴 하였지만, 2배 투여량의 주사가 임의의 추가의 증가를 야기하지 않았다. 더욱이, 미세유체화된 백신 제제가 주사된 동물의 경우, 주사 부위 반응 부위 체적 이, 비-미세유체화된 백신 제제가 주사된 동물에 비해, 더 빠른 속도로 해결되었다. 이들 결과가 도 7에 도시되어 있다.

실시예 11

내재적으로 혼입된 BVD 바이러스 및 렙토스피라 항원과 면역자극 분자, 예를 들면 퀼 A 및 DDA를 갖는 미세유체화된 암피겐(등록상표) 제제-계 백신 제제의 제조

포르말린-불활성화된 렙토스피라 하드요-보비스(hardjo-bovis) 균주 CSL을 투여량 5ml당 약 1.4x10⁹미생물의 직접 계수로 적절한 보조약에 배합하였다. 포르말린-불활성화된 렙토스피라 포모나 균주 T262를 투여량 5ml당 약 2400 네팔로메릭 유니트(Nephalomeric unit)로 배합하였다. 네팔로메릭 유니트를 가공-전 발효 유체의 네팔로메릭 측정에 근거하여 계산하였다. BVD 바이러스 1형을 5ml 투여량당 약 3000 상대 유니트의 E2 ELISA 역가로 배합하였다. BVD 바이러스 2형을 5ml 투여량당 약 3500 상대 유니트의 E2 ELISA 역가로 배합하였다. 상대 유니트는 미리 조합된 불활성화-후 벌크 유체의 E2 ELISA 역가를 기준으로 계산되었다. 퀼-A 및 콜레스테롤 둘 모두 투여량당 0.5mg의 농도로 사용하였다. 티메르졸 및 암피겐(등록상표) 제제를 각각 0.009% 및 2.5%의 최종 농도로 사용하였다. 알루미늄 하이드록사이드(리하이드라겔(Rehydragel) LV)를 2.0%의 최종 농도로 사용하였다. DDA를 면역자극제로서 사용하는 경우, DDA를 암피겐(등록상표) 제제 내에 포함시켰다. 암피겐(등록상표) 제제(즉, 40%의 드라케올-레시틴 저장 용액)은 1.6mg/ml의 DDA를 함유하고, 적절하게 희석된 경우, 최종 백신 제제는 2.5%의 암피겐(등록상표) 제제 및 0.1mg/ml의 DDA를 함유하였다.

다른 백신 제제의 제조에서, BVD 분획, 렙토스(Leptos), 퀼-A, 콜레스테롤, 티메르졸, 암피겐(등록상표) 제제 및 증량제로서의 염수를 실버슨(Silverson) 균질화기에 첨가하고 15분동안 10,000±500rpm에서 혼합하였다. 그런 다음, 성분을 10,000psi에서 200 마이크론 스크린을 통해 미세유체화시켰다.

백신 제제가 수산화 알루미늄을 함유하는 경우, 미세유체화를 수산화 알루미늄 없이 진행시켰다. 미세유체화가 종결된 후, 수산화 알루미늄을 첨가하고, 교반 바를 이용하여 4℃에서 하룻밤동안 혼합하였다.

실시예 12

항원투여 연구를 위한 BVD 바이러스 백신의 제조

이 실험에 이용된 백신 제제는 BVD 바이러스 1형 및 BVD 바이러스 2형 둘모두에서 나온 항원을 함유하였다. BVD1-5960 항원을 투여량 당 gp53에 대한 불활성화 후 ELISA 역가가 2535RU이도록 사용하였다. BVD-890 항원을 투여량 당 gp53에 대한 불활성화 후 ELISA 역가가 3290RU이도록 사용하였다. 퀼 A 및 콜레스테롤을 0.5mg/ml의 농도에서 사용하였다. 티메르졸 및 암피겐(등록상표) 제제를 각각 0.009% 및 2.5%의 최종 농도에서 사용하였다. DDA를 면역자극제로서 사용한 경우, DDA를 암피겐(등록상표) 제제 내부에 포함시켰다. 암피겐(등록상표) 저장 용액(40% 드라케올-레시틴 용액)은 다양한 양의 DDA를 함유하였고, 적절하게 희석된 경우, 최종 백신 제제는 2.5%의 암피겐(등록상표) 제제 및 0.5mg/투여량 내지 2.0mg/투여량의 농도의 DDA를 함유하였다. 알루미늄 겔(리하이드라겔(Rehydragel) LV)을 2.0%의 최종 농도에서 사용하였다. GPI-0100을 2, 3 및 5mg/투여량의 범위에서 사용하였다.

모든 성분을 실버슨 균질화기에 첨가하고 10,500rpm에서 15분간 블렌딩한 후, 10,000 psi에서 200 마이크론 챔버를 통과시켜 미세유체화시켰다. 백신 제제가 수산화 알루미늄을 함유하는 경우, 수산화 알루미늄 없이 미세유체화를 수행하였다. 미세유체화가 종결된 후, 수산화 알루미늄을 첨가하고, 교반 바를 이용하여 4℃에서 하룻밤동안 혼합하였다.

실시예 13

렙토스피라 항원이 있는 미세유체화된 암피겐 백신 제제를 이용한 접종 후, 렙토스피라 항원투여에 대한 보호

상기 표 1은 본 연구에서 시험되는 백신 제제의 보조약 배합의 조성을 나타낸다. 백신 제제는 실시예 11에 개시된 바와 같이 제조되었다. 각각의 군에는 6마리의 동물이 있었다. 약 7달된 교배종 암소를 본 연구에 이용하였다. 제0일 및 제21일에 피하 경로를 통해 5ml의 백신 체적을 접종하였다. NADC(국립 농업 질병 센터)에서 제공된 L. 하드요-보비스 균주 203를 이용하여 항원투여하였다. 1ml의 접종을 이용하여 제57일 내지 제59일동안 항원투여하였다. 눈과 질의 연합 투여에 의해 항원 투여하였다. 항원 투여 물질은 1ml당 5.0x10⁶ 렙토스피라를 함유하였다. 렙토스피라 배양, FA 및 PCR을 위해 매주 뇨를 수집하였다. 제112일 및 제113일에 신장을 수집하였다.

표 2는 렙토스피라 항원투여 연구에서 나온 자료를 보여준다. 항원투여된 동물에서 렙토스피라 감염의 비율(%)을 측정하기 위해, 다음의 기준을 이용하였다. 신장 배양물이 단 하나의 시료에서만 양성인 경우, 동물은 렙토스피라에 대해 양성인 것으로 간주되었다. 동물이 단 하나의 시료에서 FA 또는 PCR중 어느 하나에 대해 양성이면, 동물은 음성인 것으로 간주되었다. 시료가 단 하나의 시료에서 FA와 PCR 둘 모두에 대해 양성인 경우, 이는 렙토스피라에 대해 양성인 것으로 간주되었다.

표 2에서 도시된 결과는 3가지 분석 모두에 근거하여 모든 백신 군에서 뇨 발산 기간이 상당히 더 짧아졌음을 나타냈다. 뇨 및 신장 배양에 관한 한, AlOH가 없는 QAC- 및 DDA-함유 제제의 효능은 유사하였다. AlOH는 항원투여 연구에서 QAC- 및 DDA-함유 백신의 효능을 개선시키지도 심지어 감소시키지도 않았다.

백신 제제중의 렙토스피라 항원 둘 모두에 대한 혈청 반응이 접종 동물에게서 검출되었고 제35일에 피크 반응이 기록되었다. 혈청 반응과 항원투여에 대한 보호사이에는 아무 연관성이 없었다. 백신 중의 알루미늄 겔의 존재로 인해 혈청 반응이 개선되었지만, 백신 제제중에 알루미늄 겔이 존재하면 보호 수준이 감소되었다.

실시예 14

암피겐(등록상표) 제제 및 DDA를 함유하는 미세유체화된 백신 제제를 이용한 면역화 후 BVD 2형 바이러스 항원투여에 대한 보호 및 BVD 바이러스 항원에 대한 면역 반응의 유도

4 내지 7달된 혈청음성 송아지를 이 실험에 이용하였다. 6개의 서로 다른 군이 있었고 각각의 군은 10마리의 동물로 구성되었다(표 4). 제0일 및 제21일에 각각의 동물에 백신 또는 위약 2ml를 견갑골과 머리의 대략 중간인 옆쪽 목에 접종하였다.

항원 투여 바이러스 제제 5ml 투여량(대략 콧구멍당 약 2.5ml)를 연구 제44일에 비강내 투여하였다. 본 연구에서는 항원투여 균주로서 비-세포변성 BVD 바이러스 2형, 단리물 #24515(엘리스(Ellis) 균주), 로트 # 46325-70을 이용하였다. 항원투여 물질의 보유된 시료의 역가를 항원투여를 시작할 때와 종결된 직후에 측정하였다(역가측정당 2벌씩). 5ml 투여량당 살아있는 바이러스의 평균 역가는 항원투여 전에는 5.3log₁₀FAID₅₀/5ml이고, 항원투여 후에는 5.4log₁₀FAID₅₀/5ml(FAID는 TCID₅₀과 등가이다)였다.

동물을 제-3일부터 제58일까지 매일 모니터링하였다. BVD2 감염에 기인하는 임상 신호에 근거하여 0, 1, 2 또는 3의 임상 질병 점수를 제42일 내지 제58일동안 매 동물에게 매겼다. 제44일의 점수를 항원투여 전에 기록하였다. BVD 1형 및 BVD 2형 바이러스 중화 항체의 혈청 역가를 측정하기 위해, 혈액 시료(2개의 13ml 혈청 분리 튜브, SST)를 제0일, 제21일, 제35일, 제44일 및 제58일에 각각의 동물에 대해 수집하였다.

제42일 내지 제58일에 각각의 동물로부터 혈액 시료를 수집하고, 갈색 코트 세포중의 BVD 바이러스의 존재를 측정하였다. 제44일에 항원투여 전에 시료를 수득하였다.

백혈구를 계수하기 위해, 혈액 시료(1개의 4ml EDTA 튜브)를 제42일 내지 제58일동안 각각의 동물에게서 수집하였다. 제44일에, 항원투여 전에 시료를 수집하였다.

백혈구감소증은 기저선(항원투여 이틀전과 항원투여일의 항원투여전의 WBC 계수의 평균)으로부터 WBC 계수가 40% 이상 감소하는 것으로 정의된다.

임상 질병 점수를 이용하여 질병 상태를 다음과 같이 정의하였다: 점수가 1점 이하이면 질병이 없고, 점수가 2점 초과이면 질병이 있다.

표 5 및 6에 도시된 바와 같이, 암피겐(등록상표) 제제, 퀼 A 또는 DDA와 함께 BVD 바이러스 항원을 함유하고 미세유체화된 백신이 접종된 군은 BVD 1형 및 BVD 2형 바이러스 둘 모두에 대해 상당한 혈청 바이러스 중화 역가로 혈청전환되었다. 또한 대조군에서는 100%의 동물이 바이러스 혈증을 나타내었지만, 이들 군에서는 항원투여후 바이러스 혈증을 나타내는 동물의 비율이 상당히 감소하였다(표 7). 또한, 이들 접종된 군에서는 질병의 빈도가 상당히 감소되었다(표 8). 유사하게, 백혈구 감소증을 나타내는 동물의 비율이 백신 군에서는 감소되었고, 퀼 A를 함유하는 군에서보다 DDA를 함유하는 군에서 백혈구 감소증의 감소가 보다 명확하였다(표 9). 접종된 군과 비교하였을 때, 대조군에서는, 체중 증가가 상당히 감소되었다(표 10).

혈청학

제0일에 접종하기 전에, 연구중인 모든 동물은 BVD 바이러스 1형 및 2형에 대한 항체에 대해 혈청음성(SVN <1:2)이었다(자료는 도시되지 않음). 2차 접종한지 14일 후에(제35일), 위약이 투여된 모든 동물(T01)은 BVD 바이러스 1형 및 2형에 대한 항체에 대해 여전히 혈청 음성이었고, ITA(연구용 신약 시험 항체)(T02, T03, T04, T05 및 T06)이 접종된 모든 동물은 BVD 바이러스 1형 및 2형에 대한 항체에 대해 혈청 양성(SVN ≥1:8)이었다. 2mg/투여량의 DDA에서 암피겐(등록상표) 제제로 보조약된 백신이 투여된 동물중 한 마리는 제35일에 BVD 바이러스 2형에 대한 항체에 대해 3의 SVN 역가를 가졌다(표 11 및 12).

제44일에 항원투여하기 전에 1마리를 제외한 모든 대조군(T01)은 BVD 바이러스 1형 및 2형에 대한 항체에 대해 혈청 음성(SVN <1:2)이었다(자료는 도시되지 않음). 1마리의 대조군(#2497)은 BVD 바이러스 1형에 대한 항체에 대해 혈청 양성(SVN=10)이었고, BVD 바이러스 2형에 대한 항체에 대해 혈청 음성이었다. 항원투여한지 14일 후에, 연구중인 모든 동물은 BVD 바이러스 1형 및 2형에 대한 항체에 대해 혈청 음성이었다.

바이러스 단리

표 13에 도시된 바와 같이 항원투여 기간(제44일 내지 제58일)동안, 대조군(T01)의 10마리 동물 모두는 바이러스혈증(BVD 바이러스가 하루이상동안 단리되었다)이었다. ITA가 투여된 군의 경우, 바이러스혈증 동물의 빈도는 각각의 군의 10마리중에서 1, 0, 3, 2 및 2였다(T02, T03, T04, T05 및 T06 각각). 대조군과 ITA가 투여된 군과의 차이는 통계적으로 유의하다(P≤0.05). 바이러스혈증의 최소 제곱법 평균 일수 또한 ITA가 투여된 군(0.0 내지 0.5일)에 비해 대조군의 경우 상당히 더 컸다(10.4일).

임상 질병

2 또는 3의 임상 증후 점수를 받은 동물들은 BVD 질병의 증후를 나타내는 것으로 간주되었다. 표 14에 도시된 바와 같이 BVD 바이러스 질병의 임상 증후를 가진 동물의 빈도는 대조군(T01)에서 10마리중 9마리였고, ITA가 투여된 군의 각각에서는 10마리중 1, 2, 0, 0 및 0마리였다(T02, T03, T04, T05 및 T06 각각). 대조군과 ITA가 투여된 군과의 차이는 통계적으로 유의하다(P≤0.05).

백혈구 감소증

표 15에 도시된 바와 같이, 항원투여 기간(제44일 내지 제58일)동안, 대조군(T01)의 10마리 동물 모두는 백혈구 감소증(항원투여전 기본선에 비해 백혈수 계수가 40% 감소, 제42일 내지 제44일)이었다. 백혈구 감소증을 가진 동물의 빈도는 ITA가 투여된 군의 각각에서는 10마리중 6, 2, 4, 3 및 2마리였다(T02, T03, T04, T05 및 T06 각각). 대조군과 0.5mg/투여량의 암피겐(등록상표) 제제 및 수산화알루미늄(T03)으로 보조약 처리된 백신이 투여된 군의 차이는 통계적으로 유의하다(P≤0.05). 백혈구 감소증의 최소 제곱법 평균 일수 또한 ITA가 투여된 군(0.2 내지 1.2일)에 비해 대조군의 경우 상당히 더 컸다(7.8일).

실시예 15

GPI-0100을 함유하는 미세유체화된 백신 제제를 이용하여 면역된 후 BVD 2형 바이러스 항원투여에 대한 보호와 BVD 바이러스 항원에 대한 면역 반응의 유도

실시예 14에 개시된 바와 같은 일련의 실험 조건에 따라, 퀼 A와 GPI-0100을 직접 비교하였다. 표 11 및 12에 나타난 바와 같이 퀼 A와 GPI-0100중 하나를 함유하는 미세유체화된 암피겐(등록상표) 제제-계 제제중의 BVD 항원으로 접종된 동물은 BVD 1형 및 BVD 2형 바이러스 둘 모두에 대해 상당한 항체 역가를 가졌다. BVD 1형 바이러스에 대한 항체 역가는 BVD 2형 바이러스에 대한 항체 역가보다 훨신 더 높다. 그러나, BVD 2형 바이러스를 이용한 후속적인 항원투여는 강한 보호를 나타내었고, GPI-0100을 함유하는 미세유체화된 암피겐(등록상표) 제제-계 백신 제제를 이용하여 접종된 송아지의 경우 질병 발생이 상당히 감소되었다.

결론적으로, 각각의 백신의 안정성은 접종된 동물에서 부작용이나 사망이 없는 것으로 입증되었다. 각각의 백신의 효능은 접종된 동물의 100%가 혈청전환됨(BVD-1 및 BVD-2에 대한 VSN 항체 역가 >1:8)으로써 입증되었다. 2mg GPI-0100만으로 보조약된 백신에 의해 항원투여에 대한 만족스러운 저항이 입증되었다.

실시예 16

미세유체화된 수중유 유화액중의 마이크로캡슐화된 항원을 함유하는 백신 제제

3g의 트레할로즈(플루카(Fluka))를 물에 첨가하여 333mg/ml의 트레할로즈 용액의 저장액을 수득하였다. 0.8% SDS 용액에 안정화된 재조합 PauA 항원(SDS/rPauA)을 트레할로즈 용액에 첨가하여 494rPauA㎍/ml의 최종 농도를 수득하였다. 다음 단계에서 10g의 폴리락타이드 글리콜산(PLG-레조머 RE 503H, 뵈링거 잉겔하임(Boeringher Ingelheim))을 200ml의 메틸렌 클로라이드(MeCl₂)에 용해시켰다. 생성된 PLG/MeCl₂ 용액을 제 1 단계에서 제조된 SDS-rPauA/트레할로즈 용액과 조합하였다. 조합된 용액을 마이크로플루이딕 모델 M110EH를 이용하여 미세유체화시키고, 미세유체화된 제제를 템코 스프레이 드라이어(Temco Spray Dryer) 모델 SD-05를 이용하여 분무 건조시켰다. 분무 건조된 물질을 500 마이크론 스크린을 이용하여 수집하였다.

이 분무 건조된 물질중의 rPauA의 농도를 웨스턴 블롯 분석에 의해 정량하였다. 1.04mg의 분무 건조된 물질을 50㎕의 아세톤에 용해시키고, 13,200rpm에서 실온에서 10분동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하였다. 상층액과 펠렛 분획을 2.5시간동안 생물학적 안전성 후드에서 건조시켰다. 펠렛을 47.43㎕의 시료 용액(25㎕의 시료 완충액 + 10㎕의 환원제 + 65㎕의 물)에 재현탁시켰다. 건조된 상층액 분획을 20㎕의 시료 용액에 재현탁시켰다. 웨스턴 분석에서, 정제된 PauA를 표준물질로 사용하여 분무 건조된 물질의 rPauA 함량을 정량하였다.

100g의 만니톨(시그마)을 500ml의 주사용 물(WFI)에 용해시킴으로써 20% 만니톨 저장 용액을 준비하였다. 용액을 고온 플레이트/교반기를 이용하여 40℃로 가열하고 30℃로 냉각시켰다. 용액을 0.22마이크론 멸균 필터(밀리포어(Millipore))를 통과시켜 멸균시켰다. 12.5g의 카복시메틸셀룰로즈(시그마)를 500ml의 WFI에 용해시키고 하룻밤동안 4℃에서 혼합함으로써 2.5%의 카복시메틸셀룰로즈 용액을 제조하였다. 용액을 121℃에서 오토클레이브 처리하였다.

분무 건조로 생성된 분말을 5% 만니톨, 0.3% 카복시메틸 셀룰로즈 및 1:5000의 티메로졸을 함유하는 용액에서 재구성하였다. 최종 용액을 3ml들이 바이얼에 분획하고, 동결건조기(USIFROID)를 이용하여 동결건조시켰다. 동결건조된 분말은 마이크로캡슐화된 rPauA로 표시된다. 마이크로캡슐화된 서브유니트 단백질 항원을 암피겐(등록상표) 제제(예를 들면 실시예 20에 개시된 미세유체화된 유화액)을 함유하는 미세유체화된 수중유 유화액 2ml에 재현탁시키고 백신으로 사용하였다.

실시예 17

수중유 유화액중에 박테리아 전체 세포 항원 및 재조합 단백질 항원 둘 모두를 함유한 미세유체화된 백신 제제의 제조

실시예 2 및 3에 개시된 바와 같은 수중유 유화액에 내재적으로 첨가된, 재조합 스트렙토코커스 우베리스 PauA 단백질 및 에스케리치아 콜리 박테리아 세포 둘 모두를 함유하는 2개의 백신을 제조하였다. 재조합 PauA 항원은 투여량당 100㎍의 농도였고, 이. 콜라이 세포는 투여량당 4x10⁹의 최종 계수였다. 2개의 백신 제제의 유화액 보조약 조성은 하기 표 16에 도시된 바와 같다.

실시예 18

수중유 유화액에 rPauA와 전체 세포 박테리아 약원을 함유하는 미세유체화된 백신에 대한 면역 반응

이 실험에는 성숙한 젖소를 이용하였다. 등록시 동물은 첫 번째나 두 번째 수유기간의 끝이었다. 각각의 백신 제제 2ml를 3회 피하 투여하였고, 한번은 젖 말리는 기간(D-0), 28일 후(D=28)이고, 새끼를 낳은 지 4일 및 10일 후(C+4 - C+10)에 또다시 투여하였다. 제 1 및 제 3 투여는 목의 왼쪽에 투여되었고, 제 2 투여는 목의 오른쪽에 투여되었다. 각각의 접종 전, 그리고, 제 3 접종한지 약 14일 및 32일 후에 혈액을 접종하였다. 이. 콜라이 및 rPauA 항원에 대한 항체 역가를 ELISA를 통해 측정하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, 결과는 면역 자극제로서 rPauA에 대한 항체 역가가 GPI-0100을 함유한 백신 제제로 접종한 군에서 더 높고 초기 접종한 지 70일후에 피크를 이룸을 나타낸다. 이. 콜라이 항원에 대한 항체 역가는 도 9에 나타나 있다. 이. 콜라이 항원에 대한 항체 역가는 2가지 백신 제제 모두 유사하였지만, 면역자극제로서 DDA를 갖는 제제와 비교하였을 때, 면역자극제로서 GPI-0100의 존재가 비교적 더 높은 항체 역가를 유도하였다.

실시예 19

미세유체화된 암피겐(등록상표) 제제-계 백신 제제의 살-바이러스 활성의 평가

미세유체화가 바이러스를 불활성시키는지를 측정하기 위해서, 3가지 미세유체화된 암피겐(등록상표) 제제-계 백신 제제의 살-바이러스 활성을 측정하였다.

3가지 제제는 3가지의 서로 다른 소의 감염성 바이러스, 즉, 소의 허피스 바이러스(BHV), 파라인플루엔자 바이러스 3(PI3) 및 소의 호흡기 신티얼(synctial) 바이러스(BRSV)를 함유하였다.

3가지 백신 제제의 살-바이러스 활성의 검출은 USDA 9CFR.113.35 요구조건에 따라 수행되었다.

표 17에 도시된 결과는 암피겐(등록상표) 제제-계 백신 제제의 미세유체화가 백신 제제에 어떠한 유의한 불활성화도 야기하지 않음을 나타낸다.

실시예 20

미세유체화된 암피겐(등록상표) 제제의 제조

드라케올 레시틴 오일 용액(25% 레시틴이 있는 경질 광유)을 트윈 80(0.18%의 최종 농도) 및 스판 80(0.08%의 최종 농도)와 36±1℃에서 8 내지 22시간동안 혼합하면서 조합하여 암피겐(등록상표) 제제를 제조하였다. 그런 다음, 약 3400rpm에서 로스(등록상표)(뉴욕주 11788 하우포즈) 유화기를 이용하여 오일 혼합물에 염수를 첨가하였다. 그런 다음, 혼합물을 약 4500±500psi에서 200㎛의 상호작용 챔버를 갖는 미세유체화기에 1회 통과시켰다. 하기 도 10a 및 10b는 미세유체화된 암피겐(등록상표) 제제의 안정성을 나타낸다. 출발시, 초기 시점에 레이저 회절에 의해 측정된 입자 크기 분포(도 10a)는 4℃에서 22달 저장한 후의 입자 크기 분포(도 10b)와 거의 동일하였다.

실시예 21

퀼 A-콜레스테롤 면역원 복합체의 전자 현미경 분석

퀼 A와 콜레스테롤에 의해 형성되는 면역원 복합체의 성질을 측정하기 위해, 이들 2 성분의 혼합물을 항원의 존재 또는 부재 하에서 제조하였다.

자기 바로 용액을 교반하면서 50ml의 KR-할스(KR-Hals) 완충액을 함유한 비이커에 BVD I형 항원을 첨가하였다. 그런 다음, 퀼 A의 농축된 저장 용액(50mg/ml)을 용액을 교반하면서 적가하여 50㎍/ml의 최종 농도를 수득하였다. 퀼 A를 첨가한 후 에탄올중의 콜레스테롤의 저장 용액(18mg/ml)을 50㎍/ml의 최종 농도로 첨가하였다.

2번째 비이커에서, 퀼 A와 콜레스테롤을 동일한 방식으로 완충액 50ml에 임의의 BVD I형 항원 없이 첨가하였다.

투과 전자 현미경의 경우, 각각의 시료 10㎕를 폼바(formvar)/탄소 지지 플랫폼이 있는 400메쉬 구리 눈금(펜실바니아주 포트 와싱턴 소재의 엘렉트론 마이크로스코피 사이언시즈 인코포레이티드(Electron Microscopy Sciences, Inc.)상에 흡착시켰다. 컨스트라스트 시약으로서 10㎕의 여과된 2% 포스포텅스텐산, pH 2을 이용하여 시료를 음각 현상하였다. 시료를 JEOL 1230 투과 전자 현미경(일본 도쿄 소재의 제올 인코포레이티드(JEOL Inc.))를 이용하여 80kV 가속 전압에서 조사하였다. 가탄 바이오스캔(Gatan BioScan) 792 카메라상에서 디지털 영상화를 수행하였다. 필름 현미경 검사를 4489 EM 필름상에서 수행하였고 코다브롬(Kodabrome) II RC F3 종이(뉴욕주 로체스터 소재의 이스트만 코닥 캄파니)에 인쇄하였다.

임의의 BVD I형 항원없이 콜레스테롤과 퀼 A만을 함유한 용액에서, 퀼 A 미셀 및 콜레스테롤 결정과 함께 나선형 미셀이 검출되었다(도 11). 나선형 미셀은 서로 얽혀있고 그물눈처럼 보였다. BVD I형 항원을 함유하는 시료에서는, 나선형 미셀이 무작위의 일부 밀집 영역을 감싸고 있는 것으로 발견되었다(도 12). 밀집 영역은 BVD I형 항원을 나타내고, 퀼 A와 콜레스테롤의 결합으로 생성된 면역원 복합체가 BVD I형 항원의 표면에 흡착된 것으로 발견되었다.

도 1은 비-미세유체화된 백신 조성물의 배치 제조 방법을 나타낸다. 이 방법에서 다양한 백신 성분이 왼쪽의 첨가 용기에 첨가되어 궁극적으로 블렌드 용기로 펌핑되어, 거기서 성분이 단순한 기계적 수단에 의해 함께 혼합된다.

도 2는 내재적으로 혼입된 항원을 함유하는 미세유체화된 백신 조성물의 제조 방법을 나타낸다. 다양한 백신 성분은 첨가 용기로 첨가되어 단순한 기계적 수단에 의해 혼합되기 위해 유화-전 블렌딩 유니트로 이동된다. 그런 다음, 유화액을 미세유체화기를 통과시켜 후-미세유체화기 챔버에 수집한다.

도 3은 비-미세유체화된 암피겐(등록상표) 제제-계 백신, 미세유체화된 암피겐(등록상표) 제제-계 백신 및 벤치 블렌드 백신 제제의 소적 크기 분포를 나타낸다.

도 4는 미세유체화된 백신 제제에서 상 분리가 없음을 나타낸다.

도 5는 미세유체화된 암피겐(등록상표) 제제-계 백신 제제(A907505)와 3개의 대조군, 즉, 비-미세유체화된 암피겐(등록상표) 제제-계 백신 제제(A904369, A904370 및 A904371)에 내재적으로 혼입된 항원의 안정성을 비교하여 나타낸다. 4개의 백신 제제를 모두 4℃에서 2년간 저장하였다. 저장동안 서로 다른 시점에서(0, 6, 12 또는 24개월), 4개의 제제를 모두 3개월된 소에게 접종하였다. 제0일 및 제21일에 2ml의 백신 투여량을 접종하였고, 제 2 접종후 2주 후에 혈청을 수집하였다. BVD II형 바이러스에 대한 중화 항체 역가를 각각의 혈청 시료로부터 수집하였다. 자료를 5마리의 동물의 기하 평균으로 나타내었다.

도 6은 미세유체화된 백신과 비-미세유체화된 백신의 투여 전과 후의 소의 직장 온도의 최소 제곱법 평균을 나타낸다. TO1: 위약 군 - 단일 투여; O02: 위약 군 - 2배 투여; T03: 비-미세균질화된 제제 - 단일 투여; T04: 비-미세균질화된 제제 - 2배 투여; T05: 미세균질화된 제제 - 단일 투여; T06: 미세균질화된 제제 - 2배 투여.

도 7은 비-미세유체화된 백신 제제와 미세유체화된 백신 제제의 투여 후 소에서 관찰된 주사 부위 반응 체적의 최소 제곱법 평균값을 나타낸다. T03: 비-미세균질화된 제제 - 단일 투여; T04: 비-미세균질화된 제제 - 2배 투여; T05: 미세균질화된 제제 - 단일 투여; T06: 미세균질화된 제제 - 2배 투여.

도 8은 재조합 PauA 항원 및 이. 콜라이 전체 세포 항원 둘 모두를 함유하는 다양한 백신 제제로 접종한 후의 스트렙토코커스 우베리스(Streptococcus uberis)의 재조합 PauA 항원에 대한 IgG 역가의 기하 평균값을 나타낸다.

도 9는 재조합 PauA 항원 및 이. 콜라이 전체 세포 항원 둘 모두를 함유하는 다양한 백신 제제로 접종한 후의 스트렙토코커스 우베리스(Streptococcus uberis)의 이. 콜라이 전체 세포 항원에 대한 IgG 역가의 기하 평균값을 나타낸다.

도 10a 및 10b는 처음 생산시(도 10a) 및 생산한지 22달 지난 후(도 10b)의 미세유체화된 암피겐 제제의 입자 크기 분포를 나타낸다.

도 11은 퀼(Quil) A 미셀 및 콜레스테롤 결정을 이용하여 형성된 나선형 미셀을 나타내는 전자 현미경 사진이다.

도 12는 BVD I형 항원 상에서 퀼 A와 콜레스테롤에 의해 형성된 나선형 면역 원성 복합체를 보여주는 전자 현미경 사진이다.

Claims (3)

1:100 내지 5:1의 사포닌 대 스테롤의 중량비의 사포닌 글리코사이드와 스테롤, 및 수 중 오일 조성물(oil-in-water composition)을 포함하고 추가로 면역학적 유효량의 항원을 포함하는 백신으로서, 상기 사포닌 글리코사이드와 상기 스테롤이 서로 결합하여 면역자극 활성을 갖는 나선형 미셀 형태의 복합체를 형성하고 상기 나선형 미셀은 항원에 흡착되어 가축의 면역반응을 증강시키며, 상기 오일이 광유, 파라핀유 및 사이클로파라핀으로 구성된 군으로부터 선택된 비-대사가능한 오일이고, 상기 항원이 상기 나선형 미셀과 혼합되지만, 그 내부에 일체화되지 않으며, 상기 나선형 미셀이 수 중 오일 조성물과 미세유체화되어 수 중 오일 유화액을 형성하는 백신.

수의학적으로 허용가능한 담체 중에 퀼(quil) A 및 콜레스테롤을 1:100 내지 5:1의 사포닌 대 스테롤의 중량비로 포함하는 수 중 오일 보조약(oil-in-water adjuvant)으로서,

상기 퀼 A와 콜레스테롤이 서로 결합하여 면역자극 활성을 갖는 나선형 미셀 형태의 복합체를 형성하고 상기 나선형 미셀은 항원에 흡착되어 가축의 면역반응을 증강시키며, 상기 오일이 광유, 파라핀유 및 사이클로파라핀으로 구성된 군으로부터 선택된 비-대사가능한 오일이며, 상기 나선형 미셀이 수의학적으로 허용가능한 담체와 미세유체화되어 마이크론 미만(submicron)의 수 중 오일 유화액을 형성하는 수 중 오일 보조약.

사포닌 글리코사이드, 스테롤, 수 중 오일 조성물 및 항원을 포함하며, 상기 사포닌 글리코사이드와 상기 스테롤이 서로 결합하여 나선형 미셀 형태의 복합체를 형성하고, 상기 항원이 상기 나선형 미셀과 혼합되지만, 그 내부에 일체화되지는 않은 백신을 제조하는 방법으로서,

(a) 완충액 중의 항원 조성물을 제조하고,

(b) 상기 단계 (a)의 조성물에 사포닌을 첨가하며,

(c) 상기 단계 (b)의 조성물에 스테롤을 첨가하고,

(d) 상기 단계 (c)의 조성물에 수 중 오일 조성물을 첨가하되, 상기 오일은 광유, 파라핀유 및 사이클로파라핀으로 구성된 군으로부터 선택된 비-대사가능한 오일이며,

(e) 상기 단계 (d)에서 형성된 조성물을 미세유체화시켜 상기 백신을 생성하는 것을

포함하는 방법.

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