CN102906245B - 高起泡性志贺氏菌菌株 - Google Patents

Abstract

通过破坏Tol‑pal系统的一种或多种组分产生高起泡性志贺氏菌菌株。源自这些菌株的突泡是疫苗中有用的免疫原。在这些突泡中存在的单独的蛋白质也可用作免疫原。

Description

高起泡性志贺氏菌菌株

技术领域

本发明属于抗志贺氏菌的免疫法领域。

背景技术

志贺氏菌属是革兰氏阴性非运动性兼性厌氧菌，其可分为4种血清群：痢疾志贺氏菌(S.dysenteriae)、福氏志贺氏菌(S.flexneri)、鲍氏志贺氏菌(S.boydii)、宋内志贺氏菌(S.sonnei)。它们造成志贺氏菌痢(杆菌性痢疾)。

临床上志贺氏菌痢的标志是急性直肠结肠炎，其伴随有发烧、恶心、食欲减退、脱水、粘液脓性和血性腹泻以及里急后重。志贺氏菌导致的痢疾是地方病，可在发展中国家中导致成百万例的发病。例如，每年约有1.65亿例志贺氏菌痢，其中的99%发生在发展中国家，69%发生在5岁以下的儿童中。志贺氏菌痢造成的发病率和死亡率在发展中国家的儿童中尤其高。

参考文献1中对志贺氏菌疫苗的现有途径进行了综述，这些途径基于活减毒菌株，其用于口服免疫法、与O糖偶联用于注射、用于鼻内的蛋白体(连接有志贺氏菌LPS的脑膜炎球菌外膜囊泡)、用于鼻内的侵袭复合物(invaplexes，包含IpaB、IpaC和LPS的志贺氏菌属亚细胞提取物)、以及由具有去毒LPS的msbB^-ve菌株制得的核蛋白-核糖体复合物。虽然这些疫苗中的一些已在实地试验中显效，但是没有一种疫苗可提供对抗多种志贺氏菌血清型的保护。

本发明的一个目的是提供在志贺氏菌疫苗制备中进一步提供和改进有用组分，尤其是可提供对抗多种志贺氏菌血清型的保护的疫苗。

发明内容

由于细胞被膜的膨压，志贺氏菌在生长期间自发地释放外膜突泡(bleb)。如参考文献2中所揭示，突泡的释放高度依赖于细菌外膜的结构。本发明人已经采用志贺氏菌的突变株来干扰外膜的结构，该突变株中的Tol-Pal系统已被破坏。在正常生长期间，这些突变株将大量突泡释放到其培养基中，这些突泡富含免疫原性外膜蛋白，因此这些突泡可被用作免疫原。

由此，本发明提供了表达TolA、TolB、TolQ、TolR和Pal蛋白中不多于4种蛋白质的志贺氏菌。因此，天然的五蛋白Tol-Pal系统中的至少一种蛋白质是缺失的，导致了细菌在培养基中的生长过程中，与表达全部五种Tol-Pal蛋白的相同细菌相比，将更多量的外膜突泡释放到培养基中。优选TolR不表达，但可表达其它四种蛋白质。

本发明还提供一种不表达TolR蛋白的志贺氏菌。本发明还提供一种志贺氏菌的ΔtolR株，例如ΔtolRΔgalU菌株。

本发明还提供一种志贺氏菌，其表达TolA、TolB、TolQ、TolR和Pal蛋白，其中所述TolA、TolQ、TolR和/或Pal蛋白(a)位于细菌的内膜或外膜内，且(b)包含一个或多个氨基酸序列突变，由此使得该细菌与不含所述突变的相同细菌相比，在培养基中生长时释放更大量的外膜突泡。

本发明还提供一种志贺氏菌，该细菌中的Tol-Pal系统中的一种或多种组分具有修饰，从而使得该细菌与缺乏修饰的相同细菌相比，在培养基中生长时将更大量的外膜突泡释放到培养基中，并且该细菌不表达：(i)天然志贺氏菌的脂多糖和/或(ii)志贺氏菌的肠毒素。

本发明还提供一种制备高起泡性志贺氏菌的方法，所述方法包括修饰编码起始细菌(starting bacterium)的Tol-Pal系统一种或多种组分的基因的步骤，所述修饰得到所述细菌与起始细菌相比，在培养基中生长时将更大量的外膜突泡释放到培养基中，且其中所述修饰涉及使得起始菌的tolA、tolB、tolQ、tolR和/或pal基因发生一种或多种突变。该突变步骤可为所述基因的缺失。该方法还可涉及编码合成该菌的脂多糖或肠毒素所需的蛋白质的基因的修饰。

本发明还提供一种分离或获自本发明的细菌的突泡。这些突泡可用作志贺氏菌疫苗的组分。

本发明还提供一种制备志贺氏菌突泡的方法，所述方法包括从包含本发明细菌的培养基中分离所述突泡的步骤，其中本发明细菌已在允许该细菌将突泡释放到所述培养基中的条件下生长。通过该方法制备的突泡可用作志贺氏菌疫苗的组分。

本发明还提供一种包含本发明细菌的培养基，所述细菌已在允许该细菌将突泡释放到所述培养基中的条件下生长。可从该培养基中纯化所述突泡。

本发明还提供一种包含突泡的组合物，所述突泡在本发明细菌的培养过程中释放入培养基。该组合物不含任何活的和/或完整细菌。该组合物和/或其组分可用于志贺氏菌疫苗的制备。

本发明还提供一种包含突泡的组合物，其中所述突泡存在于过滤液中，所述过滤液是将本发明细菌生长的培养基通过0.22μm滤器后获得的。该组合物和/或其组分可用于志贺氏菌疫苗的制备。

本发明还提供一种志贺氏菌突泡，其包含以下的一种或多种(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60种)：(a)由选自SEQ ID NO:8-67中的一种氨基酸序列组成的蛋白质；(b)包含与SEQ IDNO:8-67中的一种具有至少j％的相同性的氨基酸序列的蛋白质，其中j为50或更高(例如60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99)和/或包含SEQ IDNO:8-67中任一种中至少n个连续氨基酸的片段的蛋白质，其中n为7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多个)。优选的片段包含来自SEQ IDNO:8-67之一的抗原表位。其它优选的片段缺失所述SEQ ID NO:的C-末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或N-末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，但保留该SEQ ID NO:的至少一个表位。其它片段缺漏一个或多个蛋白质结构域，例如缺失信号肽等。

已确认本发明的突泡中存在60种蛋白质，这些蛋白质对于抗所述突泡制备的血清具有免疫反应性。因此，从突泡分离出的、以纯化形式存在的各种蛋白质可用作免疫原性组分。由此，本发明还提供包含突泡蛋白但不含突泡的免疫原性组合物，所述突泡蛋白包含：(a)氨基酸序列SEQ ID NO：8-67中的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60种)；(b)与SEQ ID NO:8-67之一具有至少j％相同性的氨基酸序列，其中j为50或更高(例如60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99)和/或包含SEQID NO:8-67中任一种的至少n个连续氨基酸的片段，其中n为7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。优选的片段包含来自SEQ ID NO:8-67之一的抗原表位，更优选的片段为免疫原性片段。其它优选的片段缺失SEQ ID NO:的C-末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或N-末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，但保留该SEQID NO:的至少一个抗原表位。其它片段缺漏一个或多个蛋白结构域，例如缺失跨膜结构域、信号肽等。

本发明还提供一种志贺氏菌突泡，其包含以下的一种或多种(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128或129种)：

(a)由选自SEQ ID NO:8-136中的一种氨基酸序列组成的蛋白质；(b)包含与SEQIDNO:8-136中的一种具有至少j％的相同性的氨基酸序列的蛋白质，其中j为50或更高(例如60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99)和/或包含SEQ ID NO:8-136中任一种中至少n个连续氨基酸的片段的蛋白质，其中n为7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多个)。优选的片段包含来自SEQID NO:8-136之一的抗原表位。其它优选的片段缺失所述SEQ ID NO:的C-末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或N-末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，但保留该SEQID NO:的至少一个抗原表位。其它片段缺漏一个或多个蛋白质结构域，例如缺失信号肽等。

已确认本发明的突泡中存在129种蛋白质，这些蛋白质对于抗所述突泡制备的血清具有免疫反应性。因此，从突泡分离出的、以纯化形式存在的各种蛋白质可用作免疫原性组分。由此，本发明还提供包含突泡蛋白但不含突泡的免疫原性组合物，所述突泡蛋白包含：(a)氨基酸序列SEQ ID NO：8-136中的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128或129种)；

(b)与SEQ ID NO:8-136之一具有至少j％相同性的氨基酸序列，其中j为50或更高(例如60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99)和/或包含SEQ ID NO:8-136中任一种的至少n个连续氨基酸的片段的氨基酸序列，其中n为7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。优选的片段包含来自SEQ ID NO:8-136之一的抗原表位，更优选的片段为免疫原性片段。其它优选的片段缺失SEQ ID NO:的C-末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或N-末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，但保留该SEQ ID NO:的至少一个抗原表位。其它片段缺漏一个或多个蛋白结构域，例如缺失跨膜结构域、信号肽等。

在SEQ ID NO:8-136中，与福氏志贺氏菌相关的优选亚组是下表1的“亚组1”中所列的SEQ ID NO。在SEQ ID NO:8-136中，与宋内志贺氏菌相关的优选亚组是下表1的“亚组2”中所列的SEQ ID NO。

Tol-Pal系统

与许多革兰氏阴性菌类似，志贺氏菌天然具有由TolA、TolB、TolQ、TolR和Pal蛋白构成的Tol-Pal系统。根据本发明，天然Tol-Pal系统被破坏，从而导致细菌在细菌复制过程中将更大量的外膜突泡释放到其培养基中。可进行各种破坏。

在一些实施方式中，去除五种Tol-Pal蛋白中的至少一种，例如通过使得编码该蛋白的基因缺失或失活。因此，细菌可表达TolA、TolB、TolQ、TolR和Pal蛋白中的0、1、2、3或4种蛋白质。去除五种蛋白质中的一种可能已足够，在该情况下该细菌仅表达这些蛋白质中的四种。优选去除TolR蛋白，例如通过使得起始菌株的tolR基因失活。由此，该细胞可为tolA⁺tolB⁺tolQ⁺TolR^-Pal⁺。

在一些实施方式中，该细菌表达全部五种Tol-Pal蛋白，但至少一种蛋白质发生突变而导致高起泡性。例如，TolA、TolQ、TolR和/或Pal蛋白可发生突变，从而使得蛋白质保留其膜定位，但其与其它Tol-Pal系统成员的相互作用被破坏。由此，该细菌将把作为跨膜蛋白的TolA、TolQ和TolR保留在内膜中，把作为向周质(periplasm-facing)脂蛋白的Pal蛋白保留在外膜中，但TolA、TolQ、TolR和/或Pal蛋白中的至少一种是突变的。

野生型志贺氏菌的TolA、TolB、TolQ、TolR和Pal蛋白的氨基酸序列的例子作为SEQID NO:1-5示于序列表中。

志贺氏菌

本发明可采用痢疾志贺氏菌(S.dysenteriae)、福氏志贺氏菌(S.flexneri)、鲍氏志贺氏菌(S.boydii)、宋内志贺氏菌(S.sonnei)的任何血清群。

除了具有被破坏的Tol-Pal系统而使得细菌在细菌复制期间将更大量的外膜突泡释放到其培养基中，本发明的志贺氏菌可有利地包含相对于野生型菌株而言的一种或多种其它改变。这些改变尤其可用于从该细菌中去除在人疫苗中可具有毒性或不为所需的组分。

例如，细菌可不表达天然志贺氏菌的脂多糖(LPS)，因此内毒素活性降低。可进行各种修饰以避免天然LPS的合成，这些修饰可破坏天然脂质A的结构、寡糖核心或外膜O抗原。例如，参考文献3报道了通过rfe和galU基因失活导致的LPS突变体，参考文献4报道了通过yihE、galE、galK、galM和galT失活导致的突LPS突变体。类似地，参考文献5报道了因rfc、rfaL或galU突变导致的LPS缺陷。参考文献6报道了因msbBl和msbB2失活导致的LPS突变体，其减少了脂质A的酰化作用。如本文所示，可通过htrB的失活产生脂质A酰化减少的另一种LPS突变体[7,8]。

优选缺少LPS中的O抗原，从而避免血清型特异性的应答。在宋内志贺氏菌中，当毒性质粒被去除时，则缺少O抗原(见下文)。galU基因编码尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-葡萄糖)焦磷酸化酶，该基因的失活导致所合成的LPS不含附着的(attached)O抗原。galU的失活有利于提供不具有尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性的志贺氏菌。rfbF和/或rftG基因的失活可用于提供不具有鼠李糖基转移酶活性的志贺氏菌。rfc的失活可用于提供不具有O抗原聚合酶活性的志贺氏菌。rfbF、rfbG和rfc这三种基因都失活可提供有用的菌株。

优选缺少LPS中的六-酰化脂质A。失去毒性质粒(见下文)自动导致失去msbB2基因，染色体的msbBl基因可被失活，从而去除肉豆蔻酰基转移酶活性，并在LPS中提供五-酰化脂质A。HtrB月桂酰基转移酶的失活可提供主要含四-酰化脂质A的志贺氏菌。优选的菌株具有五-或四-酰化LPS。

优选菌株的galU和msbBl均失活，且还缺少毒性质粒，由此提供LPS为五-酰化且缺少附着的O抗原的菌株。

一些有用的菌株具有五-或四-酰化LPS，所述LPS包含附着的O抗原。然而更常规而言，优选菌株具有具有五-或四-酰化LPS，所述LPS缺少附着的O抗原。具有tolR、rfbG和htrB敲除(以及任选的rfbF和/或rfc失活)的福氏志贺氏菌菌株是有用的。一种有用的宋内志贺氏菌菌株具有tolR突变且缺少毒性质粒。

细菌可不表达肠毒素。例如，福氏志贺氏菌菌株(具体为2a菌株)可不表达全部的志贺氏菌肠毒素1(ShET-1)亚单位，例如可使得setlA和/或setlB基因失活。痢疾志贺氏菌菌株可不表达全部两种志贺氏菌毒素亚单位，例如可使得stxA和/或stxB基因中的一种或两种失活。志贺氏菌，尤其是宋内志贺氏菌或福氏志贺氏菌，可不表达肠毒素2(ShET-2)，例如可使得ospD3基因失活，或缺少毒性质粒。优选的菌株不编码ShET-1、ShET-2和志贺氏菌毒素。

可通过常规的诱变技术，从野生型或其它起始菌株方便地制备本发明的志贺氏菌，例如参见参考文献9-11。λRed重组系统(lambda red recombination system)是用于志贺氏菌的尤为有利的系统。可采用各种途径获得基因失活，例如通过其启动子的缺失或突变，通过其起始密码子的缺失或突变，通过导入提早形成终止密码子(prematurestopcodon)，通过缺失整个编码区域，通过敲除等。优选等基因敲除突变体。在所得的志贺氏菌中，缺少编码所需基因的mRNA和/或其翻译被抑制(例如抑制为少于野生型水平的1％)。

本发明的志贺氏菌可包含代替失活基因的标记物基因，例如抗生素抗性标记物。其可通过同源重组完成。然而优选使用未标记的缺失(即不引入标记物基因的缺失)。

毒性志贺氏菌菌株具有220kb的质粒，该质粒介导毒性性质。已显示该"毒性质粒"编码涉及志贺氏菌毒性的数个方面的基因，这些方面包括用于靶向上皮细胞的细菌细胞表面配基、侵袭质粒抗原、virF、virG等。本发明的志贺氏菌可具有毒性质粒，但优选其不具有毒性质粒。缺少该质粒可使得菌株在工业化培养中稳定、通过去除毒性因素而减毒(从而提高生产安全性)、破坏脂多糖(O抗原的生物合成基因位于志贺氏菌中的质粒上)、避免存在ShET-2肠毒素(由质粒上的ospD3或sen基因编码)，以及避免存在msbB2，该基因是负责脂质A酰化的msbB基因的第二拷贝。

本发明的志贺氏菌可表达一种或多种异源蛋白，例如志贺氏菌中天然不存在的蛋白质。如果该异源蛋白是外膜蛋白，则来自该菌株的突泡可用作将非志贺氏菌抗原递呈到免疫系统的递送系统。

使志贺氏菌生长的培养条件是本领域中熟知的，例如参见参考文献12-14。例如，它们的培养可采用有机氮源(例如氨基酸混合物，如包含Ala、Arg、Asn、Asp；可使用酪蛋白氨基酸)，以丙三醇为碳源等等。在培养基中加入L-天冬氨酸尤为有利，其可同时作为氮源和碳源。

可在限铁(iron-limiting)条件下有利地培养本发明的志贺氏菌，已显示这些条件可上调志贺氏菌属中具有免疫原性且高度保守的铁调蛋白。例如，可在诸如去铁灵(desferal)或2,2'-联吡啶基或8-羟基喹啉的化合物存在下培养细菌。在这些条件下，细菌可提高蛋白质(例如FepA外膜受体、大肠杆菌素I受体(CirA)和/或铁嗜铁素受体(FhuA))的表达。

突泡和高起泡性

本发明的志贺氏菌与其相应的野生型菌株相比，具有高起泡性，即它们把与野生型菌株相比更大量的突泡释放到其培养基中。这些突泡可用作志贺氏菌疫苗的组分。

由电子显微镜测得的突泡直径通常为35-120nm，例如50nm的直径。

突泡在细菌培养过程中自发释放，并可从该培养基中纯化。理想的纯化包括从活的和/或完整的志贺氏菌中分离突泡，例如通过采用过滤器(例如0.22μm的过滤器)的基于大小的过滤，该过滤器允许突泡通过但不允许完整细菌通过，或通过使用低速离心使细胞沉淀而将突泡留在悬液中。

因此，与培养基不同，本发明的含突泡组合物通常基本上不含活的或死的全菌。突泡的大小意味着它们可通过过滤(例如象通常用于过滤灭菌的过滤)简便地与全菌分离。虽然突泡可滤过标准的0.22μm过滤器，它们会很快被其它物质阻塞，因此在使用0.22μm过滤器之前进行滤过一系列具有降低的孔径的过滤器的过滤除菌循序步骤是有利的。之前过滤器的例子包括具有0.8μm、0.45μm等孔径的过滤器。

从培养基中分离自发释放的突泡比涉及故意破坏外膜(例如通过去污剂除了处理或超声作用)以形成外膜小囊泡的方法更为简便。此外，它们基本上不含内膜和细胞质污染物。

本发明的突泡包含脂质和蛋白质。已分析了突泡的蛋白质内容物，它们包括表1中所列和下文所讨论的蛋白质。

志贺氏菌外膜蛋白

表1列出了本发明的志贺氏菌突泡中检测到的129种蛋白质的GenBank名称和GI号。这127种蛋白质可从突泡中分离、以纯化的形式用作免疫原性成分。这129种蛋白质中的优选亚组是表中的前60种(“亚组3”)。

可通过多种方式制备多肽，例如通过化学合成(至少部分合成)，通过用蛋白酶消化较长的多肽，通过RNA翻译，通过从细胞培养物纯化(例如从重组表达或从志贺氏菌培养物)等等。在大肠杆菌宿主中进行异源表达是优选的表达途径。

本发明的多肽可附着于或固定于固相载体。本发明的多肽可包含可检测标记物，例如放射性标记物、荧光标记物、或生物素标记物。这在免疫分析技术中尤为有用。

多肽可以各种形式存在(例如天然的、融合的、糖基化的、非糖基化的、脂化的、具有二硫桥等等)。多肽优选为志贺氏菌多肽。

优选以基本上纯或基本上分离的形式(即基本上不含其它志贺氏菌或宿主细胞多肽)或基本上分离的形式制备多肽。总体而言，所提供的多肽处于非自然存在环境，例如它们从其天然存在环境中分离。在某些实施方式中，对象肽存在于与对照相比富含该多肽的组合物中。由此，提供了纯化的多肽，其中“纯化的”是指该多肽存在于基本上不含其它表达的多肽的组合物中，且其中“基本上不含”是指该组合物的少于50%，通常少于30%，更通常少于10%是由其它表达的多肽构成的。

术语“多肽”是指任何长度的氨基酸聚合物。该聚合物可为线性或分支的，其可包含修饰的氨基酸，且其可被插入有非氨基酸。该术语还包括已被天然修饰或被干扰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、酰化、磷酸化或其它操作或修饰，例如与标记组分偶联。在该定义中还包括例如，含一个或多个氨基酸类似物(包括例如，非天然氨基酸等)以及本领域中已知的其它修饰的多肽。多肽可作为单链存在或作为相结合的链存在。

药物组合物

本发明提供了一种药物组合物，其包含：(a)本发明的突泡；以及(b)药学上可接受的载体。本发明还提供一种制备该组合物的方法，所述方法包括将本发明的突泡与药学上可接受的载体混合的步骤。

本发明还提供了一种药物组合物，其包含：(a)如上所定义的不含突泡的免疫原性组合物；以及(b)药学上可接受的载体。

免疫原性组合物可包含药学上可接受的载体，所述载体可为本身不会诱导产生对接受该组合物的患者有害的抗体的任何物质，且在给予时不会产生过度的毒性。药学上可接受的载体可包括液体，例如水、盐水、丙三醇和乙醇。在此类载体中还可存在辅助物质，例如润湿剂或乳化剂，pH缓冲物质等。关于适合的载体的全面讨论可参见参考文献15。

志贺氏菌感染可影响身体的各种区域，因此可将本发明的组合物制成各种形式。例如，可将该组合物制成作为液态溶液或悬浮液的可注射形式。还可制备适于在注射前溶于或悬浮于液体载剂中的固体形式。可将该组合物制成用于局部给药，例如制成软膏、乳膏或粉末。可将该组合物制成用于口服给药，例如制成片剂或胶囊，或制成糖浆(任选经调味)。可将该组合物制成用于肺部给药，例如制成吸入剂，使用细粉或喷雾器。可将该组合物制成栓剂或阴道栓。可将该组合物制成用于经鼻、经耳或经眼给药，例如制成滴剂。

优选该组合物是无菌的。优选其无热原。优选其经缓冲，例如pH为6-8，通常为pH7左右。用于人时，本发明的组合物可为等渗组合物。

免疫原性组合物包含免疫有效量的免疫原，以及所需的任何其它特定组分。“免疫有效量”是指将该量以单剂量或系列中的部分给予个体可有效治疗或预防。该量的变化取决于待治疗个体的健康和生理状况、年龄、待治疗个体的分类群(例如非人灵长类，灵长类等)、个体免疫系统对综合抗体的容量、所需的保护程度、疫苗的制剂、治疗医师对医疗情况的评估、以及其它相关因素。预期该量的范围较宽，该范围可通过常规试验确定。

采用小囊泡疫苗(例如用于脑膜炎球菌)的早先工作为突泡给药提供了药学、剂量学和制剂指导。本发明组合物中突泡的浓度通常为10-500μg/ml，优选25-200μg/ml，更优选约50μg/ml或约100μg/ml(就突泡中的总蛋白而言)。用于注射的剂量体积通常为0.5ml。

该组合物可与其它免疫调节剂联合给药。

可用于本发明组合物(尤其是无突泡组合物)中的佐剂包括但不限于：

A.含无机物组合物

适于用作本发明中的佐剂的含无机物组合物包括：无机盐，例如铝盐和钙盐。本发明包括无机盐，例如氢氧化物(如氢氧化合物)、磷酸盐(例如羟基磷酸盐，正磷酸盐)、硫酸盐等[例如参见参考文献19的第8和9章]，或不同无机化合物的混合物，其中化合物可为任何形式(例如凝胶、结晶、无定形等)，优选吸附。还可将含无机物组合物配制为金属盐颗粒。

被称为“氢氧化铝”的佐剂是常规的氢氧化铝氧化物的盐，其通常至少部分结晶化。氢氧化铝氧化物(可由式AlO(OH)表示)可通过红外(IR)光谱与其它铝化合物(例如氢氧化铝Al(OH)₃)区分开，尤其可通过1070cm^-1处的吸收带和3090-3100cm^-1处的强肩峰的存在来区分[参考文献19第9章]。半峰高处的衍射带宽度(WHH)反映出氢氧化铝佐剂的结晶度，结晶差的颗粒由于具有较小的微晶尺寸而显示出较大的谱线增宽。当WHH增加，表面积增加，具有较高WHH值的佐剂已显示出具有较大的抗原吸附容量。氢氧化铝佐剂通常呈纤维形态(fibrous morphology，例如在透射电子显微照片中所见)。氢氧化铝佐剂的pI通常为11，即在生理pH下，该佐剂本身具有表面正电荷。已报道氢氧化铝佐剂在pH7.4时的吸附容量为1.8-2.6mg蛋白质/mgAl⁺⁺⁺。

称为“磷酸铝”的佐剂通常是羟基磷酸铝，常还含有少量硫酸盐(即羟基磷酸硫酸铝)。其可通过沉淀获得，沉淀期间的反应条件和浓度影响磷酸根取代所述盐中羟基的程度。羟基磷酸盐中PO₄/Al摩尔比通常在0.3-1.2之间。羟基磷酸盐因存在羟基而有别于严格的AlPO₄。例如，3164cm^-1处的IR谱带(例如在200°C)表明结构性羟基的存在[参考文献19第9章]。

磷酸铝佐剂的PO₄/Al³⁺摩尔比通常为0.3-1.2，优选为0.8-1.2，更优选为0.95±0.1。磷酸铝通常是无定形的，尤其是羟基磷酸盐。典型的佐剂是PO₄/Al摩尔比为0.84-0.92的无定形的羟基磷酸铝，包含0.6mg Al³⁺/ml。磷酸铝通常是颗粒状(如在透射电子显微照片上观察到的片状形态)。在任何抗原吸附后，颗粒的典型直径为0.5-20μm(例如约5-10μm)。已报道氢氧化铝佐剂在pH7.4时的吸附容量为0.7-1.5mg蛋白质/mgAl⁺⁺⁺。

磷酸铝的零电点(PZC)与磷酸根取代羟基的程度逆相关，这种取代程度可根据用于通过沉淀制备盐的反应条件和反应物浓度而变化。也通过改变溶液中游离磷酸根离子的浓度(更多磷酸根=更酸性的PZC)或加入缓冲剂(如组氨酸缓冲剂)(使PZC碱性更强)改变PZC。本发明所用的磷酸铝的PZC通常为4.0-7.0，更优选为5.0-6.5，例如约为5.7。

用于制备本发明组合物的铝盐悬浮液可以含有缓冲液(如磷酸盐或组氨酸或Tris缓冲液)，但这并不一直是必需的。该悬浮液优选无菌且无热原。悬浮液可含有游离的水性磷酸根离子，如存在浓度为1.0-20mM，优选5-15mM，更优选约10mM。该悬浮液也可含有氯化钠。

在一个实施方式中，佐剂组分包括氢氧化铝和磷酸铝的混合物。在该情况下，磷酸铝的量多于氢氧化铝，例如重量比至少为2:1，例如≥5:1、≥6:1、≥7:1、≥8:1、≥9:1等。

给予患者的组合物中Al⁺⁺⁺的浓度优选小于10mg/ml，例如，≤5mg/ml、≤4mg/ml、≤3mg/ml、≤2mg/ml、≤1mg/ml等。优选范围是0.3-1mg/ml。优选最大值是<0.85mg/剂。

B.油乳剂

适用作本发明的佐剂的油乳剂组合物包括鲨烯-水乳剂，例如MF59[参考文献19的第10章；还可参见参考文献16](5%鲨烯、0.5%吐温80、和0.5%司盘85，用微流化床配制成亚微米颗粒)。也可以使用完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。

已知各种适合的水包油乳剂，它们通常包括至少一种油和至少一种表面活性剂，所述油和表面活性剂是可生物降解(可代谢)和生物相容的。乳剂中油滴的直径通常小于5μm，优选乳剂包含具有亚微米直径的油滴，通过微流化床实现这种小尺寸以提供稳定乳剂。优选尺寸小于220nm的液滴，因为可对其进行过滤灭菌。

本发明可使用油，例如来自动物(如鱼)或植物来源的油。植物油的来源包括坚果、种籽和谷物。最常用的花生油、大豆油、椰子油和橄榄油是坚果油的示例。也可使用获自(例如)霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物类中，最常用的是玉米油，但也可以使用其它谷类的油，如小麦、燕麦、黑麦、稻、画眉草、黑小麦等。可从坚果和种籽油开始，通过水解、分离和酯化合适物质制备甘油和1,2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯，其不是种籽油中天然存在。来自哺乳动物乳汁的脂肪和油类是可代谢的，因此可以用于实施本发明。获得动物来源纯油所必需的分离、纯化、皂化和其它方法的过程为本领域熟知。大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和鲸油(例如鲸蜡)是可以用于本发明的几种鱼油的示例。通过生化途径用5-碳异戊二烯单位合成许多支链油，其总称为萜类。鲨鱼肝油含有称为鲨烯的支链不饱和萜类化合物，即2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯。其它优选油是生育酚(见下文)。包含鲨烯的水包油乳剂是特别优选的。可以使用油的混合物。

可通过'HLB'(亲水/亲脂平衡)对表面活性剂分类。本发明优选的表面活性剂的HLB为至少10，优选至少15，更优选至少16。本发明可与表面活性剂一起使用，所述表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80；以商品名DOWFAXTM出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，如直链EP/PO嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧-1,2-乙二基)数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇9(曲通(Triton)X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂，如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；衍生自十二烷醇、十六烷醇、十八烷醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为苄泽(Brij)表面活性剂)，如三乙二醇单月桂基醚(苄泽30)；以及去水山梨糖醇酯(总称为司盘(Span))，如去水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和去水山梨糖醇单月桂酸酯。乳剂中包含的优选表面活性剂是吐温80(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85(脱水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。如上所述，吐温80等去污剂可提供下文实施例所见的热稳定性。

可使用表面活性剂的混合物，如吐温80/司盘85混合物。聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯，吐温80)和辛苯聚醇(如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇，曲通X-100)的组合也适合。另一种有用的组合包含月桂醇聚醚-9(laureth 9)加聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。

表面活性剂的优选量(重量%)为：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如吐温80)0.01-1%，特别是约0.1%；辛基-或壬基-苯氧基聚氧乙醇(如曲通X-100或曲通系列的其它去污剂)0.001-0.1%，特别是0.005-0.02%；聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9)0.1-20%，优选0.1-10%，特别是0.1-1%或约0.5%。

可用于本发明的特定水包油乳剂佐剂包括但不限于：

·鲨烯、吐温80和司盘85的亚微米乳剂。所述乳剂的体积组成可以是约5%鲨烯、约0.5%聚山梨酯80和约0.5%司盘85。以重量计，这些比例为4.3%鲨烯、0.5%聚山梨酯80和0.48%司盘85。这种佐剂称为‘MF59’[16-18]，参考文献19的第10章和参考文献20的第12章更详细地描述了该佐剂。MF59乳剂优选包含柠檬酸根离子，如10mM柠檬酸钠缓冲液。

·包含鲨烯、α-生育酚和聚山梨酯80的乳剂。这些乳剂可含有2-10%鲨烯、2-10%生育酚和0.3-3%吐温80，鲨烯:生育酚的重量比优选≤1(例如0.90)，因为这能使乳剂更稳定。鲨烯和吐温80的体积比可以约为5:2，或者重量比约为11:5。可通过下述方法制备一种这样的乳剂：将吐温80溶解于PBS得到2%溶液，然后将90ml该溶液与(5g DL-α-生育酚和5ml鲨烯)的混合物混合，然后使该混合物微流体化。所得乳剂可含有亚微米油滴，如平均直径为100-250nm，优选约180nm的亚微米油滴。

·鲨烯、生育酚和曲通去污剂(如曲通X-100)的乳剂。所述乳剂还可包含3d-MPL(见下文)。所述乳剂可包含磷酸盐缓冲液。

·含有聚山梨酯(如聚山梨酯80)、曲通去污剂(如曲通X-100)和生育酚(如琥珀酸α-生育酚)的乳剂。所述乳剂可包含比例为75:11:10(例如750μg/ml聚山梨酯80，110μg/ml曲通X-100和100μg/ml的琥珀酸α-生育酚)的这三种成分，且这些浓度可包含由抗原中的这些组分做出的任何贡献。所述乳剂还可包含鲨烯。所述乳剂还可包含3d-MPL(见下文)。水相可包含磷酸盐缓冲液。

·鲨烯、聚山梨酯80和泊洛沙姆401(“普朗尼克(Pluronic)^TML121”)的乳剂。所述乳剂可用pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水配制。该乳剂是一种有用的胞壁酰二肽递送载体，且已与含苏氨酰基-MDP一起在“SAF-1”佐剂中使用[21](0.05-1%Thr-MDP、5%鲨烷、2.5%普朗尼克L121和0.2%聚山梨酸酯80)。也可不与Thr-MDP一起使用，如在“AF”佐剂中[22](5%鲨烯、1.25%普朗尼克L121和0.2%聚山梨酸酯80)。优选进行微流体化。

·含有鲨烯、水性溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子表面活性剂(例如聚氧乙烯(12)鲸蜡硬脂醚)和疏水性非离子表面活性剂(例如脱水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯，例如去水山梨糖醇单油酸酯或“司盘80”)。乳剂优选为热可逆的和/或至少90%的油滴(以体积计)的尺寸小于200nm[23]。乳剂还可包含一种或多种如下物质：醛糖醇；低温防护剂(例如糖，如十二烷基麦芽糖苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷。可冷冻干燥该乳剂。

·含有0.5～50%油、0.1～10%磷脂和0.05～5%非离子表面活性剂的乳剂。如参考文献24所述，优选的磷脂组分是：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心肌磷脂。亚微米的微滴尺寸是有利的。

·不可代谢的油(例如轻质矿物油)和至少一种表面活性剂(例如卵磷脂、吐温80或司盘80)的亚微米水包油乳剂。可加入添加剂，例如皂树A皂甙(QuilA saponin)、胆固醇、皂甙-亲脂性偶合物(例如GPI-0100，描述于参考文献25，通过葡萄糖醛酸的羧基将脂族胺添加到脱乙酰基皂甙而产生)、溴化二甲基双十八烷基铵和/或N,N-双十八烷基-N,N-(2-羟乙基)丙二胺。

·包含矿物油、非离子亲脂性乙氧基化脂肪醇、非离子亲水表面活性剂(例如乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳剂[26]。

·包含矿物油、非离子亲水性乙氧基化脂肪醇、和非离子亲脂性表面活性剂(例如乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳剂[26].

·所含皂甙(例如QuilA或QS21)和固醇(例如胆固醇)结合成螺旋状胶束的乳剂[27]。

通常，在递送给病人时，组合物中的抗原和佐剂是混合的。乳剂可以在生产过程中与抗原混合，或是在递送时将该乳剂与抗原临时混合。因此，在包装或出售的疫苗中，该佐剂和抗原可分开保存，使用时配制成最终制剂。所述抗原通常是水性形式，从而最终通过混合两种液体制备疫苗。用于混合的两种液体的体积比是可变的(例如5:1至1:5)，但通常约为1:1。

C.皂苷制剂[参考文献19的第22章]

皂苷制剂也可以用作本发明的佐剂。皂苷是在许多种类植物的树皮、叶、茎干、根/甚至花中发现的甾醇糖苷和三萜葡萄糖苷的异质群体。已广泛研究了作为佐剂的得自皂皮树(Quillaia saponaria Molina)树皮的皂苷。皂苷也可商业化获自丽花菝葜(Smilaxornata)(墨西哥菝葜)、满天星(Gypsophilla paniculata)(婚纱花)和肥皂草(Saponariaofficianalis)(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化的制剂，如QS21，以及脂质制剂，如ISCOM。QS21以商标Stimulon^TM出售。

已采用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。已鉴定了用这些技术纯化的特定组分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。所述皂苷优选为QS21。制备QS21的方法参见参考文献28。皂苷制剂也可包含甾醇，如胆固醇[29]。

皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒(参见参考文献19的第23章；也可参见参考文献30和31)。ISCOM通常还包含磷脂，如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷均可用于ISCOM中。ISCOM优选包含QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。任选地，ISCOM可不含其它去污剂[32]。

关于基于皂苷的佐剂开发的综述可参见参考文献33和34。

D.细菌或微生物衍生物

适用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，例如肠细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物。

LPS的无毒衍生物包括单磷酰脂质A(MPL)和3-O-脱酰基MPL(3dMPL)。3dMPL是3脱-O-酰基单磷酰脂质A与4、5或6条酰化链的混合物。3脱-O-酰基单磷酰脂质A的优选“小颗粒”形式见参考文献35中所述。3dMPL的此类“小颗粒”小到足以在过滤除菌时通过0.22μm的膜[35]。其它无毒LPS衍生物包括单磷酰脂质A模拟物，如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸盐衍生物，例如RC-529[36,37]。

脂质A衍生物包括大肠杆菌的脂质A衍生物，如OM-174。例如参考文献38和39中描述了OM-174。

适合用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序的核苷酸序列(含有通过磷酸键与鸟苷连接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)。含回文结构或聚(dG)序列的双链RNA和寡核苷酸也显示具有免疫刺激作用。

CpG可包含核苷酸修饰/类似物，如硫代磷酸酯修饰，可以是双链或单链。参考文献40、41和42公开了可能的类似取代，例如用2'-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献43-48中进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂作用。

CpG序列可能导向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[49]。CpG序列可特异性诱导Th1免疫应答，例如CpG-A ODN，或更特异地诱导B细胞应答，例如CpG-BODN。参考文献50-52中讨论了CpG-A和CpG-B ODN。优选CpG为CpG-A ODN。

优选构建CpG寡核苷酸，从而使得5'末端易被受体识别。任选使两个CpG寡核苷酸序列在3'末端连接以形成“免疫聚体(immunomer)”。参见，例如参考文献53-55。

基于免疫刺激性寡核苷酸的特别有用的佐剂被称为IC-31^TM[56-58]。因此，本发明使用的佐剂可以包含(i)和(ii)的混合物：(i)含有至少一个(优选多个)CpI基序(即胞嘧啶与肌苷相连形成二核苷酸)的寡核苷酸(例如15-40个核苷酸)，和(ii)聚阳离子聚合物，如含有至少一个(优选多个)Lys-Arg-Lys三肽序列的寡肽(如5-20个氨基酸)。所述寡核苷酸可以是包含26-聚体序列5'-(IC)₁₃-3'(SEQ ID NO:7)的脱氧核苷酸。聚阳离子聚合物可以是含有11-聚体氨基酸序列KLKLLLLLKLK的肽(SEQ ID NO:6)。SEQ IDNO:6和7的组合提供了IC-31^TM佐剂。

细菌ADP-核糖基化毒素及其去毒衍生物可以用作本发明的佐剂。优选所述蛋白质衍生自大肠杆菌(大肠杆菌不耐热肠毒素“LT”)、霍乱菌(“CT”)或百日咳菌(“PT”)。参考文献59中描述了将脱毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐剂，参考文献60中描述了将其用作胃肠道外佐剂。所述毒素和类毒素优选全毒素形式，包含A和B亚单位。A亚单位优选含有脱毒突变；B亚单位优选不突变。所述佐剂优选为脱毒的LT突变体，如LT-K63、LT-R72和LT-G192。参考文献61-68中描述了将ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物，尤其是LT-K63和LT-R72用作佐剂。一种有用的CT突变体是CT-E29H[69]。氨基酸取代的编号优选基于参考文献70中提出的ADP-核糖基化毒素的A和B亚单位的比对，该参考文献的全部内容特别纳入本文作为参考

E.人免疫调节剂

适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，如白介素(例如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[71]等)[72]、干扰素(例如干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。优选的免疫调节剂是IL-12。

F.生物粘着剂和粘膜粘着剂

生物粘着剂和粘膜粘着剂也可以用作本发明的佐剂。合适的生物粘着剂包括酯化透明质酸微球[73]或粘膜粘着剂，如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素、聚(丙烯酸)的交联衍生物。壳聚糖及其衍生物也可用作本发明的佐剂[74]。

G.微粒

微粒也可以用作本发明的佐剂。微粒(即直径为~100nm至~150μm，更优选直径~200nm至~30μm，最优选直径~500nm至~10μm的颗粒)由生物可降解的无毒材料(例如，聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己内酯等)形成，优选聚丙交酯乙交酯共聚物，并任选经处理而具有带负电表面(例如用SDS处理)或带正电表面(例如用阳离子去污剂如CTAB处理)。

H.脂质体(参考文献19的第13和14章)

适于用作佐剂的脂质体制剂的例子见参考文献75-77所述。

I.咪唑并喹诺酮(Imidazoquinolone)化合物

适合用作本发明佐剂的咪唑并喹诺酮化合物的例子包括咪喹莫特及其同系物(例如，"瑞喹莫德3M")，见参考文献78和79所述。

本发明也可包含以上说明的一种或多种佐剂各方面的组合。例如，可将以下佐剂组合物用于本发明：(1)皂苷和水包油乳剂[80]；(2)皂苷(如QS21)+无毒LPS衍生物(如3dMPL)[81]；(3)皂苷(如QS21)+无毒LPS衍生物(如3dMPL)+胆固醇；(4)皂苷(如QS21)+3dMPL+IL12(任选+固醇)[82]；(5)3dMPL与(例如)QS21和/或水包油乳剂的组合[83]；(6)SAF，含有10%鲨烯、0.4%吐温80^TM、5%普朗尼克-嵌段聚合物L121和thr-MDP，微流体化成为亚微米乳剂或涡旋振荡产生粒度较大的乳剂；(7)Ribi^TM佐剂系统(RAS)(瑞比免疫化学公司(Ribi Immunochem))，含有2%鲨烯、0.2%吐温80和一种或多种细菌细胞壁组分，所述组分选自单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)或细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(Detox^TM)；和(8)一种或多种无机盐(如铝盐)+LPS的无毒衍生物(如3dMPL)。

用作免疫刺激剂的其它物质可参见参考文献19的第7章。

可用氢氧化铝佐剂，抗原通常吸附在该盐上。还优选包含鲨烯的水包油乳液，其具有亚微米油滴，尤其是在年长者中。有用的佐剂组合包括Th1和Th2佐剂的组合，如CpG和铝盐，或瑞喹莫德和铝盐。可使用铝盐和3dMPL的组合。

免疫法

除提供上述免疫原性组合物外，本发明还提供一种在哺乳动物中引起抗体应答的方法，包括将本发明的免疫原性组合物给予所述哺乳动物。所述抗体应答优选地为保护性抗体应答。本发明还提供用于这类方法中的本发明组合物。

本发明还提供了一种保护哺乳动物免受志贺氏菌感染和/或疾病(例如志贺氏菌痢、赖特综合征和/或溶血性尿毒症综合征)的方法，包含将本发明中的免疫原性组合物给予所述哺乳动物。

本发明提供用作药物(例如，用作免疫原性组合物或疫苗)的本发明组合物。本发明还提供本发明的囊泡在制备防止哺乳动物中志贺氏菌感染的药物中的应用，例如用于预防志贺氏菌痢、赖特综合征和/或溶血性尿毒症综合征。还提供本发明的突泡蛋白(如前所述)在制备防止哺乳动物中志贺氏菌感染的无突泡药物中的应用，例如用于预防志贺氏菌痢。

哺乳动物优选为人。所述人可以是成人，或优选是儿童。当预防性使用疫苗时，人优选为儿童(如幼童或婴儿)；当疫苗用于治疗用途时，人优选为成人。准备给予儿童的疫苗也可给予成年人，例如用以评估安全性、剂量、免疫原性等。

所述用途和方法特别适用于预防/治疗疾病，这些疾病包括但并不限于：志贺氏菌痢、赖特综合征和/或溶血性尿毒症综合征。

治疗性措施的功效可以通过在给予本发明中的组合物后对志贺氏菌感染进行监测来测试。可通过监测在施用组合物后针对突泡中免疫原性蛋白或其它抗原的免疫应答来测试预防性治疗的效力。本发明组合物的免疫原性可通过以下方法测定：将其给予受试对象(如12-16个月大的儿童)，然后测定标准血清学参数。这些免疫应答通常在给予该组合物后约4周测定，并与给予该组合物之前测定的值作比较。当给予一剂以上的组合物时，可以进行一次以上的给药后测定。

本发明的组合物通常直接给予患者。可以通过胃肠外注射(例如，皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或给予到组织间隙)，或通过直肠、口服、阴道、局部、透皮、鼻内、眼部、耳部、肺部或其它粘膜给药途径完成直接递送。优选在大腿或上臂进行肌肉内给药。注射可以通过针头(例如皮下针头)进行，但也可以采用无针注射。通常的肌肉内剂量约为0.5ml。

本发明可用来引发全身和/或粘膜免疫。

剂量治疗可采用单剂量方案或多剂量方案。多剂量可以用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。初次给药方案之后，可以进行加强给药方案。可以常规地确定初次剂量之间(例如4-16周)以及初次和加强剂量之间的适当时机。

概述

术语“包含”涵盖“含有”以及“由……组成”，例如“包含”X的组合物可仅由X组成或可含有其它物质，例如X+Y。

与数值x相关的术语“约”是任选的，其表示(例如)x±10%。

词语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。在必要时，词语“基本上”可从本发明的定义中省略。

两条氨基酸序列间的序列相同性百分数表示进行比对时，所比较的两条序列中相同氨基酸的百分数。利用本领域所知软件程序，例如参考文献84的7.7.18部分所描述的软件程序，可进行比对并确定同源性百分数或序列相同性百分数。优选通过史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)同源性搜索算法进行比对，该算法使用仿射缺口搜索(affine gapsearch)，其中缺口开放罚12分，缺口延伸罚2分，BLOSUM矩阵计62分。参考文献85中公开了史密斯-沃特曼同源性搜索算法。

上文使用“GI”编号。GI号或者“基因信息识别号”(GenInfo Identifier)是NCBI将序列加入其数据库时，连续对每一序列记录指定的一串数字。GI编号与序列记录登录号没有相似之处。序列更新(如纠正或加入更多注释或信息)后，将接受新GI编号。因此与给定GI编号相关的序列是不变的。

当本发明涉及“表位”时，该表位可以是B细胞表位和/或T细胞表位。可凭经验鉴定此类表位(如使用PEPSCAN[86，87]或相似方法)，或可对其进行预测(如使用詹姆森-沃尔夫抗原性指数(Jameson-Wolf antigenic index)[88]、基于矩阵的方法[89]、MAPITOPE[90]、TEPITOPE[91，92]、神经网络[93]、OptiMer和EpiMer[94，95]、ADEPT[96]、T位点[97]、亲水性[98]、抗原性指数[99]或参考文献100-101中公开的方法等)。表位是抗体或T细胞受体的抗原结合位点识别并结合的抗原的某部分，它们也称作“抗原决定簇”。

附图简述

图1显示了从培养基中纯化的本发明突泡的电子显微镜照片。

图2显示了来自宋内志贺氏菌ΔtolRΔgalU的突泡的2D SDS-PAGE。

图3显示了不同所示菌株突泡的LPS(用抗核心抗体染色)。

图4显示了用被免疫小鼠的血清2D分离的突泡蛋白质的免疫斑点印迹。

图5显示了不同条件下生长的细菌的SDS-PAGE。

图6显示了突泡中的吸附蛋白。从左到右的泳道为：1)蛋白质分子量标记物，2)SsOMB 10μg，3)Ss OMB 2μg，4)吸附在明矾上1个月的Ss OMB 10μg。

图7显示了所示菌株的FACS数据。

本发明的具体实施方式

宋内志贺氏菌突变体的制备

采用λRed系统，使得野生型宋内志贺氏菌53G的tolR基因缺失[11,102]。制备用λRed质粒转化的感受态细胞，然后通过同源重组，用设计以抗生素抗性基因替换tolR基因的线性片段转化。通过对抗生素的抗性选择已整合该片段的克隆，通过PCR或其它技术验证tolR的缺失。然后可通过在37°C培养新克隆，去除温度敏感性λRed质粒。

已确证了在该ΔtolR突变体中TolR表达的缺少，与原先的野生型分离物相比，已验证该突变体在生长过程中将更多的突泡释放到培养基中。

用类似的途径使得galU基因缺失，以提供ΔgalU单突变体和ΔtolRΔgalU双突变体。经验证突变体释放的突泡具有缺少O抗原的缺陷型LPS。

用相同的方法制备带有修饰LPS的ΔtolRΔmsbB双突变株。

还从ΔtolR和ΔtolRΔmsbB菌株中去除了毒性质粒。

福氏志贺氏菌突变体的制备

如上针对宋内志贺氏菌所述，采用λRed系统使得福氏志贺氏菌的tolR基因缺失。福氏志贺氏菌中O抗原的生物合成通过包含部分rfbF和rfc以及完整rfbG基因的染色体片段的缺失(该缺失导致这三种基因全部失活)而被彻底破坏。采用λRed系统产生缺失，并缩写为ΔrfbG。

以相同的方式产生ΔtolRΔrfbG双突变体。

以相同的方式产生包含修饰的LPS的ΔtolRΔhtrB双突变体。

已从这些菌株中去除了毒性质粒。

突泡的纯化

在以下条件下进行双突变体ΔtolRΔgalU菌株的发酵：pH 7.1，37°C，通过受控的搅拌和设置最大充气量将溶氧保持在30％的饱和度。通过加入4M氢氧化铵控制pH。通过在发酵过程中加入10％PPG控制泡沫。培养基由以下组分组成：KH₂PO₄5g/l，K₂HPO₄20g/l和酵母提取物30g/l。采用高压灭菌对培养基进行灭菌后，加入甘油15g/l和MgSO₄2mM，然后进行接种。培养接种物为发酵罐体积的5％。发酵过程进行约13个小时，以600nm下的光学密度确定细胞浓度。

采用以下所定义的培养基进行宋内志贺氏菌ΔtolRΔmsbB双突变株的发酵过程：甘油30g/1，KH₂PO₄13.3g/1，(NH₄)₂HPO₄4g/1，MgSO₄·7H₂O(1M)2ml，柠檬酸1.7g/1，CoCl₂·6H₂O 2.5mg/1，MnCl₂·4H₂O 15mg/1，CuCl₂·2H₂O 1.5mg/1，H₃BO₃3mg/1，Na2MoO₄·2H₂O2.5mg/1，Zn(CH₃COO)₂·2H₂O 13mg/1，柠檬酸铁2μΜ，硫胺素50mg/1，烟酸10mg/1，L-天冬氨酸2.5g/l。

采用两个连续TFF(正切流动过滤)步骤纯化在发酵液中产生的小囊泡：以0.22μm进行微过滤，然后以0.1μm进行第二次微过滤。在第一次过滤步骤中，通过经0.22μm孔径过滤盒的TFF从生物质中分离出小囊泡。先将该生物质浓缩4倍，用PBS进行5次透析过滤步骤后，在过滤液中收集小囊泡。在第二次过滤步骤中，使得从0.22μmTFF获得的过滤液进一步经0.1μm截留过滤盒进行微过滤，以从溶解蛋白质中纯化小囊泡。小囊泡不能通过过滤盒。经过5次透析过滤步骤后，收集含有小囊泡的保留物。

用TEM观察最终纯化产物(图1)。突泡具有约50nm直径的均一尺寸。

在与培养宋内志贺氏菌ΔtolRΔgalU相同的酵母提取物培养基中培养各种菌株，然后以相同的方式纯化来自福氏志贺氏菌突变体的突泡。

突泡的表征

通过蛋白质组方法证实了突泡为基本上纯的外膜。与通过破坏外膜获得的常规外膜囊泡(OMV)不同，所述突泡保留亲脂蛋白且基本上不含细胞质和内膜组分，.

用去污剂使得来自宋内志贺氏菌和福氏志贺氏菌菌株的突泡变性，并用LC-MS/MS方法鉴别蛋白质。或者，用SDS PAGE电泳或2D凝胶电泳分离突泡(图2)。从凝胶上切取可见条带和斑点，通过蛋白质质量指纹分析鉴定蛋白质。用密度计分析SDA-PAGE条带或来自2D凝胶的斑点研究不同蛋白质的相对量。

图3显示了ΔgalU突变株与野生型志贺氏菌和大肠杆菌(所有菌株均为ΔtolR背景)相比的LPS迁移率的改变。

采用基于表面消化的第二蛋白质组方法来表征膜蛋白的暴露部分。鉴定了与经突泡免疫的小鼠的血清反应的一系列蛋白质，已发现其中有多种蛋白质在许多菌株中是保守的。对于大部分完整外膜蛋白所知甚少。如下研究突泡的表在蛋白质组(surfome)：用蛋白酶处理，回收，然后通过LC-MS/MS鉴定释放的肽。由于突泡应代表了活的整菌细胞的表面，该图谱可代表宋内志贺氏菌表面上暴露的蛋白质。

通过这些方法和其它方法，在突泡中发现了表1中所列的129种蛋白质。

突泡的免疫原性

如图4所示，用来自ΔtolRΔgalU菌株的突泡免疫的小鼠产生的血清与该突泡的2D凝胶发生反应。因此，该突泡具有免疫原性。

小鼠接受2μg或10μg宋内志贺氏菌ΔtolRΔgalU突泡(以总蛋白质为基准测定)，加或不加佐剂(氢氧化铝或完全弗氏佐剂)。进行经典的ELISA方法以分析获自免疫研究的血清中的IgG的生产。所有小鼠组的血清均显示突泡特异性IgG的高水平生产。单独使用突泡或与佐剂联用时，未检测到IgG生产中的显著差异。用2μg的低剂量免疫的组与用10μg免疫的组显示出相同的突泡特异性IgG水平，这表明可采用低剂量疫苗，即每美元更多剂量。来自其它宋内志贺氏菌和福氏志贺氏菌菌株的突泡也类似地具有免疫原性。

测定抗突泡产生的血清与三种不同菌的反应性：宋内志贺氏菌G53、福氏志贺氏菌2a 2457T或福氏志贺氏菌5M90T。然后用标记的二抗对样品进行染色，并通过流式细胞法进行分析。如图7中所示，宋内志贺氏菌和福氏志贺氏菌菌株与血清发生交叉反应。

因此，该突泡方法在产生有效的低成本疫苗中具有很大的潜力，且可扩展到不同志贺氏菌菌株以产生广谱疫苗。

突泡吸附

将突泡与氢氧化铝(2mg/ml)组合进行吸附。将吸附材料储存在4°C下1天、1周或1个月。1天后突泡完全吸附，且甚至在1个月后都未显现出解吸附迹象(图6)。

限铁生长

图5显示在不同条件下生长的志贺氏菌表达的蛋白质。在第4泳道中，细菌在200μΜFeSO₄的存在下生长，在第5泳道中，培养物包含200μΜ联吡啶(dypiridyl)。插入的小图显示在限铁条件下三种蛋白质上调。这三种蛋白质鉴定为FepA外膜受体(GI 74311118)、大肠杆菌素I受体(GI 74312677)和推定铁嗜铁素受体(GI 74313972)。这些蛋白质在志贺氏菌属和肠杆菌科中非常保守，并具有潜在的高免疫原性。因此，在限铁条件下生长的志贺氏菌能导致突泡的释放，该突泡与正常生长条件下产生的突泡相比富含这些蛋白质。

应理解，仅以举例的方式描述了本发明，可对之进行修改而仍在本发明的范围和构思内。

表1

SEQ ID NO:70、71、73、74、76、111、112、114-129和131-135鉴别自宋内志贺氏菌ΔtolR突泡。SEQ ID NO:8-15和17-58鉴别自宋内志贺氏菌ΔtolRΔgalU突泡。SEQ ID NO:83、94、97和107鉴别自福氏志贺氏菌ΔtolR突泡。SEQ ID NO:68、69、72、75、77-82、84-93、95、96、98-106、108-10、113、130和136鉴别自福氏志贺氏菌ΔtolRΔrfbG突泡。SEQ ID NO:60-67鉴别自宋内志贺氏菌的表面消化物。

亚组1：SEQ ID NO:68、69、72、75、77-110、113、130和136。

亚组2：SEQ ID NO:8-15、17-58、60-67、70、71、73、74、76、111、112、114-129和131-135。

亚组3：SEQ ID NO:1-60。

NB：SEQ ID NO:18与SEQ ID NO:5相同；SEQ ID NO:33与SEQ ID NO:2相同；SEQ IDNO:9和16相关(约97%相同性)；SEQ ID NO:23和59相关(约98%相同性)。

参考文献

[1]Kweon(2008)Curr Opin Infect Dis.21(3):313-8.

[2]Henry等，(2004)Res Microbiol 155:437-46.

[3]Sandlin等，(1995)Infect.Immun.，63:229-37.

[4]Edwards-Jones等，(2004)Microbiol 150:1079-84.

[5]等，(2002)Infect Immun 70:1150-8.

[6]d'Hauteville等，(2002)J Immunol.168:5240-51.

[7]Clementz等，(1997)J.Biol.Chem.16:10353-60.

[8]Nichols等，(1997)J.Endotoxin Res.4:163-72.

[9]Liu等，(2005)Sci China C Life Sci.48(3):228-40.

[10]Beloin等，(2003)Mol Genet Genomics.270(l):66-77.

[11]Day等，(2001)Infect Immun 69:7471-80.

[12]Erlandson & Mackey(1958)J Bacteriol 75(3):253-7.

[13]US-5681736.

[14]Uyttendaele等，(2001)International journal of food microbiology 70(3):255-65.

[15]Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy(《雷明顿药物科学和实践》，第20版),ISBN:0683306472.

[16]WO90/14837.

[17]Podda & Del Giudice(2003)Expert Rev Vaccines 2:197-203.

[18]Podda(2001)Vaccine 19:2673-2680.

[19]Vaccine Design:The Subunit and Adjuvant Approach(《疫苗设计：亚单位和佐剂进展》)(Powell&Newman编)，Plenum Press(普莱能出版公司)1995(ISBN0-306-44867-X).

[20]Vaccine Adjuvants:Preparation Methods and Research Protocols(《疫苗佐剂：制备方法和研究方案》)，《分子药物中的方法丛书》中的卷42(Volume 42 ofMethodsin Molecular Medicine series).ISBN:1-59259-083-7.O'Hagan.编

[21]Allison&Byars(1992)Res Immunol 143:519-25.

[22]Hariharan等，(1995)Cancer Res 55:3486-9.

[23]US-2007/014805.

[24]WO95/11700.

[25]US专利6,080,725.

[26]WO2006/113373.

[27]WO2005/097181.

[28]US 5,057,540.

[29]W096/33739.

[30]EP-A-0109942.

[31]W096/11711.

[32]WO00/07621.

[33]Barr等，(1998)AdvancedDrugDelivery Reviews 32:247-271.

[34]Sjolanderet等，(1998)AdvancedDrug Delivery Reviews 32:321-338.

[35]EP-A-0689454.

[36]Johnson等，(1999)Bioorg Med Chem Lett 9:2273-2278.

[37]Evans等，(2003)Expert Rev Vaccines 2:219-229.

[38]Meraldi等，(2003)Vaccine 21:2485-2491.

[39]Pajak等，(2003)Vaccine 21:836-842.

[40]Kandimalla等，(2003)Nucleic Acids Research 31:2393-2400.

[41]WO02/26757.

[42]WO99/62923.

[43]Krieg(2003)Nature Medicine 9:831-835.

[44]McCluskie等，(2002)FEMS Immunology and Medical Microbiology 32:179-185.

[45]WO98/40100.

[46]US 6,207,646.

[47]US 6,239,116.

[48]US 6,429,199.

[49]Kandimalla等，(2003)Biochemical Society Transactions 31(part 3):654-658.

[50]Blackwell等，(2003)J Immunol170:4061-4068.

[51]Krieg(2002)Trends Immunol23:64-65.

[52]WO01/95935.

[53]Kandimalla等，(2003)BBRC306:948-953.

[54]Bhagat等，(2003)BBRC300:853-861.

[55]WO03/035836.

[56]Schellack等，(2006)Vaccine 24:5461-72.

[57]Lingnau等，(2007)Expert Rev Vaccines 6:741-6.

[58]WO2004/084938.

[59]WO95/17211.

[60]WO98/42375.

[61]Beignon等，(2002)Infect Immun 70:3012-3019.

[62]Pizza等，(2001)Vaccine 19:2534-2541.

[63]Pizza等，(2000)Int J Med Microbiol 290:455-461.

[64]Scharton-Kersten等，(2000)Infect Immun 68:5306-5313.

[65]Ryan等，(1999)Infect Immun 67:6270-6280.

[66]Partidos等，(1999)Immunol Lett 67:209-216.

[67]Peppoloni等，(2003)Expert Rev Vaccines 2:285-293.

[68]Pine等，(2002)J Control Release 85:263-270.

[69]Tebbey等，(2000)Vaccine 18:2723-34.

[70]Domenighini等，(1995)Mol Microbiol 15:1165-1167.

[71]WO99/40936.

[72]WO99/44636.

[73]Singh等，(2001)J Cont Release 70:267-276.

[74]WO99/27960.

[75]US 6,090,406.

[76]US 5,916,588.

[77]EP-A-0626169.

[78]Stanley(2002)Clin Exp Dermatol 27:571-577.

[79]Jones(2003)Curr Opin Investig Drugs 4:214-218.

[80]WO99/11241.

[81]WO94/00153.

[82]WO98/57659.

[83]欧洲专利申请0835318、0735898和0761231.

[84]Current Protocols in Molecular Biology(《分子生物学中的现有方案》)(F.M.Ausubel等编.,1987)，附录30.

[85]Smith&Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482-489.

[86]Geysen等，(1984)PNAS USA 81:3998-4002.

[87]Carter(1994)Methods Mol Biol 36:207-23.

[88]Jameson,BA等，1988,CASIOS 4(1):181-186.

[89]Raddrizzani&Hammer(2000)Brief Bioinform 1(2):179-89.

[90]Bublil等，(2007)Proteins 68(l):294-304.

[91]De Lalla等，(1999)J.Immunol.163:1725-29.

[92]Kwok等，(2001)Trends Immunol22:583-88.

[93]Brusic等，(1998)Bioinformatics 14(2):121-30

[94]Meister等，(1995)Vaccine 13(6):581-91.

[95]Roberts等，(1996)AIDS Res Hum Retroviruses 12(7):593-610.

[96]Maksyutov&Zagrebelnaya(1993)Comput Appl Biosci 9(3):291-7.

[97]Feller&de la Cruz(1991)Nature 349(6311):720-1.

[98]Hopp(1993)Peptide Research 6:183-190.

[99]Welling等，(1985)FEBS Lett.188:215-218.

[100]Davenport等，(1995)Immunogenetics 42:392-297.

[101]Chen等，(2007)Amino Acid 33(3):423-8.

[102]Murphy&Campellone(2003)BMC Molecular Biology 4:11.

Claims (20)

1.一种志贺氏菌，其表达TolA、TolB、TolQ和Pal蛋白中的4种或更少种蛋白质而不表达TolR，其中所述细菌不表达天然志贺氏菌脂多糖，且msbB1和/或msbB2基因失活。

2.如权利要求1所述的细菌，其特征在于，所述细菌表达所述蛋白质中的4种，而不表达TolR。

3.如权利要求1或2所述的细菌，其为志贺氏菌的ΔtolR菌株。

4.如权利要求1或2所述的细菌，其特征在于，所述细菌不表达天然志贺氏菌O抗原。

5.如权利要求1或2所述的细菌，其中，天然脂质A结构被破坏。

6.如权利要求1或2所述的细菌，其特征在于，所述细菌是ΔtolRΔmsbB或ΔtolRΔhtrB菌株。

7.如权利要求3所述的细菌，其特征在于，所述细菌是ΔtolRΔgalU菌株。

8.如权利要求1或2所述的细菌，其特征在于，stxA和/或stxB基因是失活的。

9.一种表达TolA、TolB、TolQ、TolR和Pal蛋白且不表达天然志贺氏菌脂多糖的志贺氏菌，其特征在于，所述TolA、TolQ、TolR和/或Pal蛋白：(a)位于该细菌的内膜或外膜，且(b)包括一个或多个氨基酸序列突变，从而使得与不含所述突变的相同细菌相比，所述细菌在培养基中生长的过程中，释放更大量的外膜突泡，且msbB1和/或msbB2基因失活，且所述细菌在TolR蛋白中有突变和/或不表达TolR蛋白。

10.一种志贺氏菌，其Tol-Pal系统中的一种或多种组分具有修饰，从而使得所述细菌与不含所述修饰的相同细菌相比，所述细菌在培养基中生长的过程中，将更大量的外膜突泡释放到培养基中，且所述细菌在TolR蛋白中有修饰和/或不表达TolR蛋白，所述细菌不表达天然志贺氏菌脂多糖，且msbB1和/或msbB2基因失活。

11.如权利要求10所述的志贺氏菌，其特征在于，所述细菌不表达志贺氏菌肠毒素。

12.一种制备志贺氏菌突泡的方法，所述方法包括从包含如权利要求1-10中任一项所述的细菌的培养基中分离所述突泡的步骤，所述细菌已在允许该细菌将突泡释放到所述培养基中的条件下生长。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述细菌已在限铁条件下生长。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述限铁条件是在去铁灵或2,2'-联吡啶或8-羟基喹啉的存在下进行培养。

15.一种制备如权利要求1-10中任一项所述高起泡性志贺氏菌的方法，所述方法包括如下步骤：对编码起始细菌Tol-Pal系统的一种或多种组分的基因进行修饰，从而使得该修饰导致所述细菌与起始细菌相比，在培养基中生长时，将更大量的外膜突泡释放到培养基中，且其中所述修饰包括使得所述起始细菌的tolA、tolB、tolQ、tolR和/或pal基因中的一种或多种发生突变，且还包括对合成细菌脂多糖所需蛋白质的编码基因进行修饰的步骤，其中所述细菌在TolR蛋白中有修饰和/或不表达TolR蛋白。

16.一种突泡，其从如权利要求1-10中任一项所述的细菌中分离或获得、或从用如权利要求15所述的方法获得的细菌中分离或获得、或通过如权利要求12或13所述的方法分离或获得。

17.一种包含突泡的组合物，在培养如权利要求1-10中任一项所述的细菌的过程中或通过如权利要求15的方法获得突泡的过程中，所述突泡被释放到培养基中。

18.如权利要求17所述的组合物，其不含任何活菌和/或全菌。

19.一种包含突泡的组合物，其中所述突泡存在于经0.22μm过滤器过滤培养基而获得的滤出液中，其中如权利要求1-10中任一项所述的细菌或通过权利要求15所述的方法获得的细菌已在所述培养基中生长。

20.一种培养基，其包含如权利要求1-10中所述的细菌或包含通过如权利要求15所述的方法获得的细菌，所述细菌已在允许所述细菌将突泡释放到所述培养基中的条件下生长。