KR20110061616A

KR20110061616A - ＩｇＥ-매개된 장애를 치료하기 위한 신규 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20110061616A
Application number: KR1020117008155A
Authority: KR
Inventors: 존 알. 데스자르라이스; 승 와이. 추; 홀리 엠. 호튼
Original assignee: 젠코어 인코포레이티드
Priority date: 2008-09-17
Filing date: 2009-09-17
Publication date: 2011-06-09
Also published as: EP2853545B8; EP2331578A1; US9540451B2; CN102292353B; CN104961830B; CY1121204T1; JP2012503007A; US20230272114A1; CA2736511C; DK2853545T3; US20130203966A1; US20200332024A1; EP2853545A1; PL3190128T3; ES2742419T3; JP5785493B2; EP2331578B1; AU2009293143B2; EP2796469B1; EP2796469A2

Abstract

본 발명은 IgE 및 FcγRIIb를 고친화성으로 결합하며, 막-고정된 IgE를 발현하는 세포를 억제할 수 있는, 면역글로불린 조성물에 관한 것이다. 이러한 조성물은 알러지 및 천식을 포함하여 IgE-매개된 장애를 치료하는데 유용하다.

Description

ＩｇＥ-매개된 장애를 치료하기 위한 신규 조성물 및 방법{NOVEL COMPOSITONS AND METHODS FOR TREATING IGE-MEDIATED DISORDERS}

연관 출원

본원은 35 U.S.C. 119(e) 하에 2008년 9월 17일자로 출원된 미국 가출원 제61/097,819호 (전부 본원에 참조로 삽입됨)를 우선권으로 주장하며, 발명의 명칭 "CD32b 발현 세포를 억제하는 방법 및 조성물"의 2008년 5월 30일자로 출원된 미국 출원 제12/156,183호 (전부 본원에 참조로 삽입됨)와 관련된다.

본 발명은 IgE 및 FcγRIIb를 고친화성으로 결합하며, 막-고정된 (membrane-anchored) IgE를 발현하는 세포를 억제할 수 있는, 면역글로불린 조성물에 관한 것이다. 이러한 조성물은 알러지 및 천식을 포함하여 IgE-매개된 장애를 치료하는데 유용하다.

천식, 알러지성 비염, 아토피성 피부염 및 음식 알러지와 같은 알러지 질환 및 상태는 지난 수십 년에 걸쳐 증가 속도로 널리 퍼지고 있으며, 현재 산업화된 나라 인구의 10 내지 40%에 영향을 끼치고 있다. 알러지 질환은 삶의 질에 깊이 영향을 끼치며, 심각한 경우의 천식 및 아나필락시스에 나타날 수 있는 바와 같이, 죽음을 포함한 심각한 합병증을 초래할 수 있다. 알러지는 널리 퍼져 있으며, 노동 및 학업으로부터의 시간 손실에 대한 가장 커다란 원인이고, 개인 삶에 대한 영향 및 의학계 및 경제 활동에 대한 직접 및 간접 비용이 막대하다. 예를 들어, 알러지성 천식은 미국의 적어도 20,000,000명 거주자에 영향을 끼치는 것으로 생각되는 반면, 알러지성 비염 (건초열)은 미국 인구의 22% 이상에 영향을 끼친다. 건강 관리 비용 및 손실 생산성을 포함한, 미국에서의 알러지 질환의 경제학상 영향은 초기 90년대에만 $ 6,400,000,000으로 평가되었다.

대부분의 알러지 질환은 면역글로불린 E (IgE)-매개된 과민 반응에 의해 야기된다. IgE는 정상적으로는 혈청 중에 아주 낮은 농도로 존재하는 일 부류의 항체이다. IgE는 특정 성숙 단계에서 세포 표면에 항체를 발현하는 IgE-분비 혈장 세포에 의해 생성된다. 알러지 환자는, 일반적으로는 무해하나 알러지 환자는 민감한 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 IgE를 증가된 수준으로 생성한다. 이들 IgE 분자는 혈액 중에서 순환하며, 순환 중인 호염기구 및 점막 내층을 따르고 피부 밑에 있는 비만 세포의 표면에 있는 IgE-특이적 수용체에 결합한다. 항원 또는 알러지항원의 비만 세포, 호염기구 및 기타 세포 유형에의 결합은, IgE 분자를 교차결합시키고, 기저 수용체를 모음으로써 세포에 의한 혈관작용성 및 뉴우론 자극 매개자, 예를 들어 히스타민, 류코트리엔, 프로스타글란딘, 브라디키닌 및 혈소판-활성화 인자의 방출을 유도한다. 항체 면역 컴플렉스에 의해 야기되는 항원에 대한 면역계의 신속한 반응은, T 세포에 의해 매개되는 지연된 또는 세포-매개된 과민 반응과는 대조적인, 즉각적 또는 항체-매개된 과민 반응을 이끈다. IgE-매개된 면역 반응은 특별히 제I형 과민 반응으로 불린다.

IgE에 대한 고친화성 수용체 (FcεRI)는 즉각적 알러지 증상에 대한 주요 매개자이다. 비만 세포 및 호염기구에 추가하여, 알러지 반응의 주요 매개자인 FcεRI은 호염기구, 혈소판을 포함한 많은 다른 세포 유형 및 항원-제시 세포, 예를 들어 단핵구 및 수지상 세포에서 발견된다. IgE에 대한 추가의 수용체는, CD23 또는 저친화성 IgE Fc 수용체로도 알려진, FcεRII이다. FcεRII는 B 림프구, 대식세포, 혈소판 및 많은 다른 세포 유형, 예를 들어 기도 평활근에서 광범위하게 발현된다. FcεRII는 IgE 발현의 피드백 조절 및 그 결과로서 FcεRII 표면 발현에 역할을 맡을 수 있다.

IgE는 대부분의 알러지 반응을 매개하는데 중추적 역할을 하므로, 신체의 IgE 수준을 조절하기 위한 처리를 고안하고 IgE 합성을 조절하는 것이 크게 중요하였다. IgE 수준을 하향조절함으로써 IgE-매개된 알러지 질환을 치료하기 위한 수개의 방법이 제안되었다. 하나의 방법은 Fc-수용체 결합 부위 내 또는 근처에 있는 IgE의 ε-쇄를 결합함으로써 IgE 분자를 중화하는 것을 포함한다. 예를 들어, 오말리주마브 (Xolair)는 FcεRI와 동일한 Fc 부위에서 IgE에 결합하는 재조합의 사람화된 모노클로날 항-IgE 항체이다. 오말리주마브는 아토피 환자에서 총 혈청 또는 순환 IgE의 감소를 야기하여, 조직 비만 세포 및 호염기구에 결합하고 감작화할 수 있는 항원-특이적 IgE의 양을 줄인다. 이는 결국 알러지 질환의 증상을 감소시킨다. 흥미롭게도, 혈청 IgE 수준은 오말리주마브-IgE 컴플렉스 형성 때문에 치료 시작 후 증가하며, 치료를 중단한 후 1년까지 높을 수 있다. 그 결과, 진단 시험 시 거짓-음성이 되게 할 수 있으므로, IgE 수준을 관례대로 점검해야 한다. 따라서, IgE-매개된 질환 및 질환 증상을 감소시키기 위한 개선된 방법 및 조성물이 필요하다.

예시적 양태의 요약

본 발명은 IgE 및 FcγRIIb를 고친화성을 결합하는 신규한 공동구속 (coengagement) 분자, 이러한 공동구속 분자를 포함하는 조성물, 및 IgE-매개된 장애를 치료하기 위해 상기 신규한 공동구속 분자를 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명의 공동구속 분자는 막 IgE 및 FcγRIIb를 발현하는 세포, 즉 IgE+ FcγRIIb+ 세포를 억제할 수 있다. 또한, 본 발명의 공동구속 분자는 바람직하게는 순환 IgE를 결합할 수 있다. 본원에 기술된 억제 방법은 IgE+ FcγRIIb+ 세포를 이의 표면의 IgE 및 FcγRIIb를 공동구속하는 공동구속 분자와 접촉시키는 것을 포함한다.

본원에 기술된 조성물은 세포 표면의 IgE 및 FcγRIIb를 고친화성으로 공동구속할 수 있는 공동구속 분자를 포함한다. 하나의 양태에서, 공동구속 분자는 IgE 및 FcγRIIb를 고친화성으로 결합하는 면역글로불린을 포함한다. 본 발명의 공동구속 분자는 바람직하게는 세포 표면의 막-고정된 IgE 및 FcγRIIb를 공동구속하며, 바람직하게는 약 100 nM 미만의 Kd로 FcγRIIb를 결합한다. 바람직한 양태에서, 공동구속 분자는 면역글로불린이며, 추가의 바람직한 양태에서, 면역글로불린은 항체이고, 이 항체의 Fv 영역은 IgE를 특이적으로 결합한다. 바람직한 양태에서, 상기 항체는 순환 및 막-고정 IgE 모두를 결합한다. 다른 양태에서, 상기 항체는 순환 IgE에 비해 막-고정 IgE를 선택적으로 결합한다. 또 다른 양태에서, 공동구속 분자는 제1의 표적물 특이적 영역 및 제2 표적물 특이적 영역을 갖는 이특이적 항체이며, 상기 제1의 표적물 특이적 영역은 IgE를 결합하고 제2의 표적물 특이적 영역은 약 100 nM 미만의 Kd로 FcγRIIb를 결합한다. 바람직한 양태에서, 제1 및 제2의 표적물 특이적 영역은 Fv 영역이며, 상기 제1의 Fv 영역은 IgE를 결합하고 제2의 Fv 영역은 약 100 nM 미만의 Kd로 FcγRIIb를 결합한다. 또 다른 양태에서, 공동구속 분자는 Fc 영역을 포함하는 Fc 융합물이며, 상기 Fc 영역은 약 100 nM 미만의 Kd로 FcγRIIb를 결합한다. 이러한 양태에서, 면역글로불린의 Fc 융합 파트너는 IgE를 결합한다.

하나의 양태에서, 공동구속 분자는 FcγRIIb와 결합하며, 상기 결합의 친화도는 Kd가 약 100 nM 미만, 예를 들어 약 95 nM 이하, 약 90 nM 이하, 약 85 nM 이하, 약 80 nM 이하, 약 75 nM 이하, 약 74 nM 이하이다.

하나의 양태에서, IgE 및 FcγRIIb를 고친화성으로 공동구속하는 공동구속 분자는 모 면역글로불린에 비해 변이 면역글로불린을 포함한다. 하나의 양태에서, 변이 면역글로불린은 변이 Fc 영역을 포함하며, 상기 변이 Fc 영역은 모 Fc 영역과 비교하여 하나 이상의 (예: 2개 이상의) 변형(들)을 포함하며, 상기 변형(들)은 234, 235, 236, 237, 239, 265, 266, 267, 268, 298, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 및 332로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치에 존재한다 (번호매김은 EU 색인에 따른다). 또 다른 양태에서, 변형(들)은 234, 235, 236, 237, 266, 267, 268, 327, 및 328로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치에 존재한다 (번호매김은 EU 색인에 따른다). 또 다른 양태에서, 변형(들)은 235, 236, 266, 267, 268, 및 328로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치에 존재한다 (번호매김은 EU 색인에 따른다). 또 다른 양태에서, 변형(들)은 235, 236, 239, 266, 267, 268, 및 328로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치에 존재한다 (번호매김은 EU 색인에 따른다). 또 다른 양태에서, 변형(들)은 234, 235, 236, 237, 266, 267, 268, 327, 및 328로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치에 존재한다 (번호매김은 EU 색인에 따른다).

하나의 양태에서, 상기 변형(들)은 하기로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 치환 (예: 하나 이상의 치환(들), 2개 이상의 치환(들) 등)이다: 234F, 234G, 234I, 234K, 234N, 234P, 234Q, 234S, 234V, 234W, 234Y, 234D, 234E, 235A, 235E, 235H, 235I, 235N, 235P, 235Q, 235R, 235S, 235W, 235Y, 235D, 235F, 235T, 236D, 236F, 236H, 236I, 236K, 236L, 236M, 236P, 236Q, 236R, 236S, 236T, 236V, 236W, 236Y, 236A, 236E, 236N, 237A, 237E, 237H, 237K, 237L, 237P, 237Q, 237S, 237V, 237Y, 237D, 237N, 239D, 239E, 239N, 239Q, 265E, 266D, 266I, 266M, 267A, 267D, 267E, 267G, 268D, 268E, 268N, 268Q, 298D, 298E, 298L, 298M, 298Q, 325L, 326A, 326E, 326W, 326D, 327D, 327G, 327L, 327N, 327Q, 327E, 328E, 328F, 328Y, 328H, 328I, 328Q, 328W, 329E, 330D, 330H, 330K, 330S, 331S, 및 332E (번호매김은 EU 색인에 따른다). 하나의 양태에서, 상기 변형(들)은 하기로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 치환 (예: 하나 이상의 치환(들), 2개 이상의 치환(들) 등)이다: 234N, 234F, 234D, 234E, 234W, 235Q, 235R, 235W, 235Y, 235D, 235F, 235T, 236D, 236H, 236I, 236L, 236S, 236Y, 236E, 236N, 237H, 237L, 237D, 237N, 239D, 239N, 239E, 266I, 266M, 267A, 267D, 267E, 267G, 268D, 268E, 268N, 268Q, 298E, 298L, 298M, 298Q, 325L, 326A, 326E, 326W, 326D, 327D, 327L, 327E, 328E, 328F, 328Y, 328H, 328I, 328Q, 328W, 330D, 330H, 330K, 및 332E (번호매김은 EU 색인에 따른다). 하나의 양태에서, 상기 변형(들)은 하기로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 치환 (예: 하나 이상의 치환(들), 2개 이상의 치환(들) 등)이다: 234D, 234E, 234W, 235D, 235F, 235R, 235Y, 236D, 236N, 237D, 237N, 239D, 239E, 266M, 267D, 267E, 268D, 268E, 327D, 327E, 328F, 328W, 328Y, 및 332E (번호매김은 EU 색인에 따른다). 하나의 양태에서, 상기 변형(들)은 하기로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 치환 (예: 하나 이상의 치환(들), 2개 이상의 치환(들) 등)이다: 234E, 235Y, 235R, 236D, 236N, 237N, 266M, 267E, 268E, 268D, 327D, 327E, 328F, 328Y, 328W (번호매김은 EU 색인에 따른다). 하나의 양태에서, 상기 변형(들)은 하기로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 치환 (예: 하나 이상의 치환(들), 2개 이상의 치환(들) 등)이다: 235Y, 236D, 239D, 266M, 267E, 268D, 268E, 328F, 328W, 및 328Y (번호매김은 EU 색인에 따른다). 하나의 양태에서, 상기 변형(들)은 하기로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 치환 (예: 하나 이상의 치환(들), 2개 이상의 치환(들) 등)이다: 235Y, 236D, 266M, 267E, 268E, 268D, 328F, 328Y, 및 328W (번호매김은 EU 색인에 따른다).

하나의 양태에서, 상기 변형(들)은 하기 조합의 치환 중 적어도 하나이다: 235Y/267E, 236D/267E, 239D/268D, 239D/267E, 239D/332E, 267E/268D, 267E/268E, 및 267E/328F (번호매김은 EU 색인에 따른다).

하나의 양태에서, 본원에 기술된 변형은 모 면역글로불린에 비해 적어도 하나의 수용체에 대한 친화성을 감소시키며, 상기 수용체는 FcγRI, FcγRIIa, 및 FcγRIIIa로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 이러한 양태에서, 본원에 기술된 면역글로불린 변이체는 모 면역글로불린에 비해 감소된 ADCC 또는 ADCP를 매개할 수 있다. 또 다른 양태에서, 본원에 기술된 변형은 모 면역글로불린에 비해 적어도 하나의 수용체에 대한 친화성을 증가시키며, 상기 수용체는 FcγRI, FcγRIIa, 및 FcγRIIIa로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 이러한 양태에서, 본원에 기술된 면역글로불린 변이체는 모 면역글로불린에 비해 증가된 ADCC 또는 ADCP를 매개할 수 있다.

또한, 본원에는 면역글로불린 조성물을 포함하여 신규한 공동구속 분자를 조작하는 방법이 기술된다.

또한, 본원에는 이에 기술된 면역글로불린을 포함하여 공동구속 분자를 암호화하는 분리된 핵산이 기술된다. 또한, 본원에는 임의로 조절 서열에 작동적으로 연결된 핵산을 포함하는 벡터가 기술된다. 또한, 본원에는 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포, 및 공동구속 분자를 생성 및 임의로 회수하는 방법이 기술된다.

또한, 본원에는 이에 기술된 면역글로불린을 포함하는 공동구속 분자가 기술된다. 공동구속 분자는 치료 제품에의 이용을 가질 수 있다. 하나의 양태에서, 본원에 기술된 공동구속 분자는 항체일 수 있다.

또한, 본원에는 이에 기술된 공동구속 분자 및 생리학적으로나 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물이 기술된다.

또한, 본원에는 IgE+ FcγRIIb+ 세포를 억제하는 방법이 기술된다. 본원에 기술된 세포 억제 방법은 IgE+ FcγRIIb+ 세포를 공동구속 분자와 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 공동구속 분자는 약 100 nM 미만의 Kd로 FcγRIIb를 결합한다. 가장 바람직한 양태에서, 공동구속 분자는 세포 표면의 IgE 및 FcγRIIb를 공동구속한다. 바람직한 양태에서, 억제 방법은 IgE+ FcγRIIb+ 세포를 항체와 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 항체는 이의 Fv 영역을 통해 IgE를 결합하고, 상기 항체는 100 nM 이하의 Kd로 FcγRIIb를 결합하는 Fc 영역을 포함한다. 다른 양태에서, 상기 Fc 영역은 천연 IgG1에 비해 보다 큰 친화성으로 FcγRIIa 및/또는 FcγRIIIa를 결합한다. 다른 양태에서, 상기 방법은 IgE+ FcγRIIb+ 세포를 공동구속 분자와 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 공동구속 분자는 IgE를 결합하는 제1의 Fv 영역 및 약 100 nM 미만의 Kd로 FcγRIIb를 결합하는 제2의 Fv 영역을 포함하는 이특이적 항체이다. 다른 양태에서, 상기 방법은 IgE+ FcγRIIb+ 세포를 공동구속 분자와 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 공동구속 분자는 약 100 nM 미만의 Kd로 FcγRIIb를 결합하는 Fc 영역을 포함한다.

다른 바람직한 방법은 IgE 분비를 감소시키는 방법을 포함한다. 이 방법은 IgE+ FcγRIIb+ 세포를 공동구속 분자를 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 공동구속 분자는 약 100 nM 미만의 Kd로 IgE 및 FcγRIIb를 결합한다.

또한, B-세포의 성숙을 억제하는 방법이 포함된다. 이 방법은 IgE+ FcγRIIb+ 세포를 공동구속 분자를 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 공동구속 분자는 약 100 nM 미만의 Kd로 IgE 및 FcγRIIb를 결합한다.

또한, 본원에는 이에 기술된 공동구속 분자에 대한 치료 및 진단 이용이 기술된다. 가장 바람직한 양태에서, 본원에 기술된 공동구속 분자는 하나 이상의 IgE-매개된 장애, 예를 들어 면역글로불린 IgE에 의해 매개되는 자가면역 질환, 염증 질환 등을 치료하는데 사용된다. 특정 양태에서, 본원에 기술된 조성물로 치료될 수 있는 알러지 및 아토피 장애는, 이로 제한됨이 없이, 알러지 및 아토피성 천식, 아토피성 피부염 및 습진, 알러지성 비염, 알러지성 결막염 및 비결막염, 알러지성 뇌척수염, 알러지성 비염, 알러지성 혈관염, 아나필락시스 쇼크 및 임의의 다양한 환경 또는 음식 알러지를 포함한다. 본원에 기술된 치료 방법은 이러한 치료가 필요한 환자에게 세포 표면의 IgE 및 FcγRIIb를 공동구속하는 공동구속 분자의 치료량을 투여하는 것을 포함한다.

도 1은 IgE+ FcγRIIb+ B 세포를 억제하기 위한 새로운 기작의 접근을 도시한다. 순수 (naive) B 세포는 적당한 자극 하에 IgE+ B 세포로 분화할 수 있다. 항원과 IgE+ B 세포 수용체와의 연결은 이들 세포를 활성화시켜 순환 IgE를 방출하는 혈장 세포로 분화할 수 있다. 순환 IgE의, 예를 들어 비만 세포, 호염기구 및 호산구 상의 FcεR에의 결합은 이들 세포를 활성화시킨다. 히스타민, 프로스타글란딘 및 다른 화학적 매개자를 방출시켜 결국 알러지 및 천식의 임상 증상을 초래한다. 천연 IgG1 Fc 영역을 갖는 오말리주마브는 IgE의 FcεR에의 결합을 차단할 수 있다. 이 도면에서 항-IgE-IIbE로 나타내는, FcγRIIb에 대해 고친화성인 항-IgE 항체는 IgE의 FcεR에의 결합을 차단할 뿐만 아니라 mIgE FcγRIIb 공동구속에 의해 IgE+ B 세포의 활성화를 억제할 수 있다.
도 2는 Fc 변이체 항-CD19 항체의 사람 FcγRIIb에의 결합을 나타내는 비아코어 표면 플라스몬 공명 센서그램 (Biacore surface plasmon resonance sensorgram)을 도시한다.
도 3은, 비아코어에 의해 측정된, 사람 FcγR에 대한 Fc 변이 항체의 친화성을 도시한다. 이 그래프는 사람 FcγRI (I), H131 FcγRIIa (H IIa), FcγRIIb (IIb), 및 V158 FcγRIIIa (V IIIa)에 대한 변이 및 WT IgG1 항체의 결합에 대한 log(K_A)를 나타낸다. V158 FcγRIIIa에 대한 G236D/S267E 및 S267E/L328F의 결합은 검출할 수 없었다. 시험된 모든 수용체에 대한 G236R/L328R (Fc-KO)의 결합은 검출할 수 없었다.
도 4는, 비아코어 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된, 사람 FcγR에 대한 Fc 변이 항체의 친화성을 도시한다. 표는 변이 및 WT IgG1 항체의 사람 FcγRI, H131 FcγRIIa FcγRIIb, 및 V158 FcγRIIIa에의 결합에 대한 평형 K_D, 및 천연 (WT) IgG1과 비교한 각각에 대한 결합 폴드(fold)을 제공한다. n.d.=검출불가.
도 5는 항-IgE 항체의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL) 및 CDR의 아미노산 서열을 도시한다. CDR 범위는 항체 가변 영역의 구조적 정렬에 기초하여 이미 기술된 바와 같이 정의되었다 (Lazar et al., 2007, Mol Immunol 44:1986-1998).
도 6은 WT 및 변이체의 중쇄 및 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 도시한다.
도 7은 IgE+ B 세포를 표적하는데 사용될 수 있는 항-IgE 전체 길이 항체의 아미노산 서열을 도시한다.
도 8은 IgE Fc 영역 및 FcγRIIb에 대한 WT 및 변이 항-IgE 항체의 결합에 대한 친화도 자료의 표를 도시한다.
도 9는 IgE Fc 영역 및 FcγRIIb에 대한 WT 및 변이 항-IgE 항체의 결합에 대한 친화도 자료의 플롯을 도시한다.
도 10은 캡쳐 시약으로서 시판 (MabTech) 및 인-하우스 (오말리주마브 및 MaE11) 항-IgE 항체를 사용한 IgE ELISA를 도시한다.
도 11은 항-IgE 항체 오말리주마브의 가변 영역이 ELISA 프로토콜에서 IgE 검출을 위한 MabTech 캡쳐 항체와 경쟁하지 않는다는 것을 도시한다.
도 12는 FcγRIIb 친화성이 증진된 변이 항-IgE 항체에 의한 클래스-스위칭된 (class-switched) IgE+ B 세포의 억제를 도시하며, FcγR 결합이 결여된 항체 (Fc 변이체 G236R/L328R) 또는 IgE에 대한 결합이 결여된 항체 (모타비주마브)는 상기 세포를 억제하지 않는다. 이 플롯은 IL-4, 항-CD40 (α-CD40) 아고니스트 항체, 및 도시된 다양한 농도의 항체와 함께 12일 동안 인큐베이션한 후 PBMC로부터 방출된 IgE의 농도를 나타낸다.
도 13은 변이 항-IgE 항체가 클래스-스위칭된 IgG2+ B 세포를 억제하지 않는다는 것을 도시한다. 이 플롯은 IL-4, α-CD40, 및 도시된 다양한 농도의 항체와 함께 12일 동안 인큐베이션한 후 PBMC로부터 방출된 IgG2의 농도를 나타낸다.
도 14는 FcγRIIb 친화도가 증진된 변이 항-IgE 항체에 의한 클래스-스위칭된 IgE+ B 세포의 억제를 도시한다. 이 플롯은 IL-4, 항-CD40 (α-CD40) 아고니스트 항체, 및 도시된 다양한 농도의 항체와 함께 14일 동안 인큐베이션한 후 PBMC로부터 방출된 IgE의 농도를 나타낸다. 자료는 최저 농도의 항체에 대해 표준화되었다.
도 15는 FcγRIIb 친화도가 증진된 변이 항-IgE 항체에 의한 클래스-스위칭된 IgE+ B 세포의 억제를 도시한다. 이 플롯은 IL-4, 항-CD40 (α-CD40) 아고니스트 항체, 항-CD79b BCR 가교-결합 항체, 및 도시된 다양한 농도의 항체와 함께 14일 동안 인큐베이션한 후 PBMC로부터 방출된 IgE의 농도를 나타낸다. 자료는 최저 농도의 항체에 대해 표준화되었다.
도 16은 FcγRIIb 친화도가 증진된 변이 항-IgE 항체에 의한 클래스-스위칭된 IgE+ B 세포의 억제를 도시한다. 이 플롯은 IL-4, 항-CD40 (α-CD40) 아고니스트 항체, 항-mu BCR 가교-결합 항체, 및 도시된 다양한 농도의 항체와 함께 14일 동안 인큐베이션한 후 PBMC로부터 방출된 IgE의 농도를 나타낸다. 자료는 최저 농도의 항체에 대해 표준화되었다.
도 17은 ADCC 및 ADCP 이펙터 기능이 증진된 변이 항-IgE 항체에 의한 클래스-스위칭된 IgE+ B 세포의 억제를 도시한다. 이 플롯은 IL-4, 항-CD40 (α-CD40) 아고니스트 항체, 항-CD79b BCR 가교-결합 항체, 및 도시된 다양한 농도의 항체와 함께 14일 동안 인큐베이션한 후 PBMC로부터 방출된 IgE의 농도를 나타낸다.
도 18은 ADCC 및 ADCP 이펙터 기능이 증진된 변이 항-IgE 항체에 의한 클래스-스위칭된 IgE+ B 세포의 억제를 도시한다. 이 플롯은 IL-4, 항-CD40 (α-CD40) 아고니스트 항체, 항-mu BCR 가교-결합 항체, 및 도시된 다양한 농도의 항체와 함께 14일 동안 인큐베이션한 후 PBMC로부터 방출된 IgE의 농도를 나타낸다.
도 19는 항-IgE 항체의 활성을 시험하기 위한 huPBL-SCID 생체내 조사용 프로토콜을 도시한다. 표시일 (day)은 Der p 1에 대해 특이적인 IgE 항체에 대해 양성인 공여자로부터의 PBMC의 이식 후 일수를 반영한다. Derp1 vacc.는 Der p 1 항원으로의 백신접종을 나타낸다.
도 20은 각각의 처리 그룹에 대한 huPBL-SCID 생체내 모델로부터의 총 혈청 IgG 수준을 도시한다. 표시일 (7, 23 및 37)은 도 19의 프로토콜에 개요된 채혈을 반영한다. PBS는 비처리된 비히클 그룹을 나타낸다. 오말리주마브는 오말리주마브_IgG1으로 처리된 그룹을 나타내고, 3H1L1 MaE11 그룹은 WT IgG1 (IgG1), S267E/L328F 변이체 (IIbE), 또는 G236R/L328R (Fc-KO) Fc 영역을 포함하는 사람화된 MaE11로 처리된 그룹을 나타낸다.
도 21은 각각의 처리 그룹에 대한 huPBL-SCID 생체내 모델로부터의 총 혈청 IgE 수준을 도시한다. 표시일 (7, 23 및 37)은 도 19의 프로토콜에 개요된 채혈을 반영한다. PBS는 비처리된 비히클 그룹을 나타낸다. 오말리주마브는 오말리주마브_IgG1으로 처리된 그룹을 나타내고, 3H1L1 MaE11 그룹은 WT IgG1 (IgG1), S267E/L328F 변이체 (IIbE), 또는 G236R/L328R (Fc-KO) Fc 영역을 포함하는 사람화된 MaE11로 처리된 그룹을 나타낸다. ELISA 방법을 위한 정량 한계는 31.6 ng/mL였으며; 이 한계 이하인 샘플은 플롯에서 31.6 ng/mL로 보고되었다.

본원에는 막-고정된 IgE의 B 세포 상의 FcγRIIb와의 공동구속에 의한 억제 효과를 모방하는 공동구속 분자가 기술된다. 예를 들어, 본원에는 Fc 도메인이 약 430배 이상의 친화도로 FcγRIIb에 결합하도록 조작된 변이 항-IgE 항체가 기술된다. FcγRIIb 결합-증진된 (IIbE) 변이체는 천연 IgG1에 비해 일차적 사람 IgE+ B 세포에서 BCR-유도된 칼슘 유동 및 생존력을 강력하게 억제한다. 단일 분자의 사용, 예를 들어 인지체 IgE BCR 및 FcγRIIb를 공동구속함으로써 B 세포 기능을 억제하기 위한 항체의 사용은 IgE-매개된 질환의 치료에 있어 신규한 접근법에 해당할 수 있다. IgE-매개된 질환에 대한 비제한적 예는 알러지 반응 및 천식을 포함하며, 하기에 더욱 상세히 기술된다.

본 기술에 따른 공동구속 분자는 하기에서 보다 상세히 개요하는 바와 같이 다양한 배열을 취할 수 있다. 하나의 양태에서, 공동구속 분자는 고친화성으로 IgE 및 FcγRIIb를 결합하는 면역글로불린을 포함한다. 이러한 양태에서, 면역글로불린은 바람직하게는 세포 표면의 막-고정된 IgE 및 FcγRIIb를 공동구속하며 약 100 nM 미만의 Kd로 결합한다. 또 다른 양태에서, 공동구속 분자는, 일부의 양태에서는 약 10 nM 미만의 Kd 또는 약 1 nM 미만의 Kd로 FcγRIIb를 결합할 수 있고 일부 양태에서는 100 pM 미만의 Kd로 결합할 수 있지만, IgE를 결합하는 제1의 표적물 특이적 영역 및 약 100 nM 미만의 Kd로 FcγRIIb를 결합하는 제2의 표적물 특이적 영역을 갖는 이특이적 분자이다. 바람직한 양태에서, 공동구속 분자는 이특이적 항체이고, 제1 및 제2의 표적물 특이적 영역은 Fv 영역이며, 상기 제1의 Fv 영역은 IgE를 결합하고, 제2의 Fv 영역은 약 100 nM 미만의 Kd로 FcγRIIb를 결합한다. 또 다른 양태에서, 공동구속 분자는 Fc 영역을 포함하는 Fc 융합물이며, 상기 Fc 영역은 약 100 nM 미만의 Kd로 FcγRIIb를 결합한다. 이 양태에서, 면역글로불린의 Fc 융합물 파트너는 IgE를 결합한다.

본원에는 수개의 정의가 기술된다. 이러한 정의는 문법적 대등표현(equivalent)을 포함하는 것으로 의도된다.

본원에서 사용되는 용어 "ADCC" 또는 "항체 의존적 세포-매개된 세포독성"은 FcγR를 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고 그 후 표적 세포의 용해를 야기하는 세포-매개된 반응을 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "ADCP" 또는 항체 의존적 세포-매개된 포식작용은 FcγR를 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고 그 후 표적 세포의 포식을 야기하는 세포-매개된 반응을 의미한다.

본원에서 "아미노산 변형"은 폴리펩타이드 서열에 있는 아미노산의 치환, 삽입, 및/또는 결실을 의미한다. 본원에서 "아미노산 치환" 또는 "치환"은 모 폴리펩타이드 서열의 특정 위치에 있는 아미노산이 또 다른 아미노산으로 대체되는 것을 의미한다. 예를 들어, 치환체 S267E는 위치 267의 세린이 글루탐산으로 대체된 변이 폴리펩타이드, 이 경우 불변 중쇄 변이체를 나타낸다. 본원에서 사용된 "아미노산 삽입" 또는 "삽입"은 모 폴리펩타이드 서열의 특정 위치에서의 아미노산의 첨가를 의미한다. 본원에서 사용된 "아미노산 결실" 또는 "결실"은 모 폴리펩타이드 서열의 특정 위치에서의 아미노산의 제거를 의미한다.

본원에서 "항체"는 실질적으로 인지된 면역글로불린 유전자의 전부 또는 일부에 의해 암호화되는 하나 이상의 폴리펩타이드로 이루어진 단백질을 의미한다. 예를 들어, 사람에서 인지된 면역글로불린 유전자는 카파 (κ), 람다 (λ), 및 중쇄 유전자 자리 (이는 동시에 다수의 가변 영역 유전자를 포함한다), 및 불변 영역 유전자 뮤 (υ), 델타 (δ), 감마 (γ), 시그마 (σ), 및 알파 (α) (각각 IgM, IgD, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4), IgE, 및 IgA (IgA1 및 IgA2) 이소타입을 암호화한다)를 포함한다. 본원에서 항체는 전체 길이의 항체 및 항체 단편을 포함하는 것을 의미하며, 임의의 유기체로부터의 천연 항체, 조작된 항체, 또는 실험적, 치료적 또는 다른 목적상 재조합적으로 생성된 항체를 나타낼 수 있다.

본원에서 사용되는 "아미노산" 및 "아미노산 정체"는 20개의 천연 발생 아미노산 또는 구체적인 한정된 위치에 존재할 수 있는 임의의 비-천연 동족체 중의 하나를 의미한다.

본원에서 사용되는 "CD32b+ 세포" 또는 "FcγRIIb+ 세포"는 CD32b (FcγRIIb)를 발현하는 임의의 세포 또는 세포 유형을 의미한다. CD32b+ 세포는, 이로 제한됨이 없이, B 세포, 혈장 세포, 수지상 세포, 대식세포, 호중구, 비만 세포, 호염기구 또는 호산구를 포함한다.

본원에서 사용되는 "IgE+ 세포"는 IgE를 발현하는 임의의 세포 또는 세포 유형을 의미한다. 본 발명의 바람직한 양태에서, IgE+ 세포는 막-고정된 IgE (mIgE)를 발현한다. IgE+ 세포는, 이로 제한됨이 없이, B 세포 및 혈장 세포를 포함한다.

본원에서 사용되는 "CDC" 또는 "보체 의존적 세포독성"은 하나 이상의 보체 단백질 성분이 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고 그 후 표적 세포의 용해를 야기하는 반응을 의미한다.

"공동구속 분자" 또는 문법적 대등표현은, 이 분자의 FcγRIIb에 대한 결합 상수 Kd가 세포 표면에서 약 100 nM 미만이어서 IgE와 FcγRIIb 둘 다를 동시에 결합하는, IgE와 FcγRIIb 둘 다를 결합할 수 있는 이작용성 분자를 의미한다.

본원에서 정의되는 바와 같은 항체의 "불변 영역"은 경쇄 또는 중쇄 면역글로불린 불변 영역 유전자 중 하나에 의해 암호화되는 항체의 영역을 의미한다. 본원에서 사용되는 "불변 경쇄" 또는 "경쇄 불변 영역"은 카파 (Cκ) 또는 람다 (Cλ) 경쇄에 의해 암호화되는 항체의 영역을 의미한다. 불변 경쇄는 전형적으로 단일 도메인을 포함하며, 본원에서 정의되는 바와 같이 Cκ 또는 Cλ의 위치 108 내지 214를 나타낸다 (번호매김은 EU 색인에 따른다). 본원에서 사용되는 "불변 중쇄" 또는 "중쇄 불변 영역"은 IgM, IgD, IgG, IgA 또는 IgE와 같은 항체 이소타입을 정의하기 위해 각각 뮤, 델타, 감마, 알파 또는 엡실론 유전자에 의해 암호화되는 항체의 영역을 의미한다. 전체 길이의 IgG 항체에 대해, 본원에서 정의되는 바와 같은 불변 중쇄는 CH1 도메인의 N-말단 내지 CH3 도메인의 C-말단 (따라서 위치 118 내지 447을 포함)을 나타낸다 (번호매김은 EU 색인에 따른다).

본원에서 사용되는 "이펙터 기능(effector function)"은 항체 Fc 영역과 Fc 수용체 또는 리간드와의 상호작용으로부터 생기는 생화학적 사건을 의미한다. 이펙터 기능은 FcγR-매개된 이펙터 기능, 예를 들어 ADCC 및 ADCP, 및 보체-매개된 이펙터 기능, 예를 들어 CDC를 포함한다.

본원에서 사용되는 "이펙터 세포"는 하나 이상의 Fc 및/또는 보체 수용체를 발현하고 하나 이상의 이펙터 기능을 매개하는 면역계의 세포를 의미한다. 이펙터 세포는, 이로 제한됨이 없이, 단핵구, 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 호산구, 비만 세포, 혈소판, B 세포, 거대 과립 림프구, 랑게르한스 세포, 천연 킬러 (NK) 세포 및 γδ T 세포를 포함하며, 이로 제한됨이 없이 사람, 마우스, 래트, 래비트 및 멍키를 포함한 임의의 유기체일 수 있다.

본원에서 사용되는 "Fab" 또는 "Fab 영역"은 V_H, CH1, V_H, 및 C_L 면역글로불린 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. Fab는 분리물에서의 이러한 영역, 또는 전체 길이 항체 또는 항체 단편에서의 이러한 영역을 나타낼 수 있다.

본원에서 사용되는 "Fc" 또는 "Fc 영역"은, 제1의 불변 영역 면역글로불린 도메인 및, 일부의 경우, 힌지 부분을 제외한, 항체의 불변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. 따라서, Fc는 IgA, IgD, 및 IgG의 마지막 2개의 불변 영역 면역글로불린 도메인, 및 IgE 및 IgM의 마지막 3개의 불변 영역 면역글로불린 도메인, 및 이들 도메인에 대한 유연한 힌지 N-말단을 나타낸다. IgA 및 IgM에 대해, Fc는 J쇄를 포함할 수 있다. IgG에 대해, Fc는 면역글로불린 도메인 Cgamma2 및 Cgamma3 (Cγ2 및 Cγ3) 및 Cgamma1 (Cγ1)과 Cgamma2 (Cγ2) 사이의 힌지를 포함한다. Fc 영역의 범위는 다양할 수 있으나, 사람 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상 이의 카복실-말단에 잔기 C226 또는 P230을 포함하는 것으로 정의된다 (번호매김은 Kabat어서의 EU 색인에 따른다). Fc는 분리물에서의 이러한 영역, 또는 Fc 폴리펩타이드에서의 이러한 영역을 나타낼 수 있다.

본원에서 사용되는 "Fc 폴리펩타이드"는 Fc 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. Fc 폴리펩타이드는 항체, Fc 융합물, 분리된 Fc 및 Fc 단편을 포함한다. 면역글로불린은 Fc 폴리펩타이드일 수 있다.

본원에서 사용되는 "Fc 융합물"은 하나 이상의 폴리펩타이드가 Fc에 작동적으로 연결된 단백질을 의미한다. 본원에서 Fc 융합물은, 선행 기술 (Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14:52-60; Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9:195-200, 두 문헌 모두 본원에 참조로 전부 삽입됨)에서 사용되는 바와 같은 용어 "이뮤노어드헤신 (immunoadhesin)", "Ig 융합물", "Ig 키메라" 및 "수용체 글로불린" (때때로 - 사용)과 동의어를 의미한다. Fc 융합물은 면역글로불린의 Fc 영역을 일반적으로 임의의 단백질, 폴리펩타이드 또는 소분자일 수 있는 융합 파트너와 조합한다. Fc 융합물의 비-Fc 부분, 즉 융합 파트너의 역할은 표적물 결합을 매개하는 것이며, 따라서, 항체의 가변 영역과 기능적으로 유사하다. 실제로, 임의의 단백질 또는 소분자가 Fc에 연결되어 Fc 융합물을 생성할 수 있다. 단백질 융합 파트너는, 이로 제한됨이 없이, 수용체의 표적물-결합 영역, 부착 분자, 리간드, 효소, 사이토킨, 케모카인, 또는 일부 다른 단백질 또는 단백질 도메인을 포함할 수 있다. 소분자 융합 파트너는 Fc 융합물을 치료적 표적물로 유도하는 임의의 치료제를 포함할 수 있다. 이러한 표적물은 임의의 분자, 예를 들어 질환과 연루된 세포외 수용체일 수 있다.

본원에서 사용되는 "Fc 감마 수용체" 또는 "FcγR"는 실질적으로 IgG 항체 Fc 영역을 결합하고 FcγR 유전자에 의해 암호화된 단백질 부류의 임의의 구성원을 의미한다. 사람에서, 이러한 부류는, 이로 제한됨이 없이, FcγRIa, FcγRIb, 및 FcγRIc를 포함하는 FcγRI (CD64); 이소형 FcγRIIa (동종이형 H131 및 R131을 포함), FcγRIIb (FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2를 포함), 및 FcγRIIc를 포함하는 FcγRII (CD32); 이소형태 FcγRIIIa (동종이형 V158 및 F158을 포함) 및 FcγRIIIb (동종이형 FcγRIIIb-NA1 및 FcγRIIIb-NA2를 포함) (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65, 전부 참조로 삽입됨)를 포함하는 FcγRIII (CD16), 및 임의의 미발견된 사람 FcγR 또는 FcγR 이소형 또는 동종이형을 포함한다. FcγR은, 이로 제한됨이 없이, 사람, 마우스, 래트, 래비트 및 멍키를 포함한 임의의 유기체일 수 있다. 마우스 FcγR은, 이로 제한됨이 없이, FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), FcγRII) (CD16), 및 FcγRIII-2 (CD16-2), 및 임의의 미발견된 마우스 FcγR 또는 FcγR 이소형 또는 동종이형을 포함한다.

본원에서 사용되는 "Fc 리간드" 또는 "Fc 수용체"는 항체의 Fc 영역에 결합하여 Fc-리간드 컴플렉스를 형성하는 임의의 유기체로부터의 분자, 예를 들어 폴리펩타이드를 의미한다. Fc 리간드는, 이로 제한됨이 없이, FcγR, FcγR, FcγR, FcRn, C1q, C3, 만난 결합 렉틴, 만노즈 수용체, 스타필로코커스 단백질 A, 스트렙토코커스 단백질 G 및 바이러스 FcγR를 포함한다. 또한, Fc 리간드는, FcγR와 상동성인 Fc 수용체의 일 부류인, Fc 수용체 상동체 (FcRH)를 포함한다 (Davis et al., 2002, Immunological Reviews 190:123-136). Fc 리간드는 Fc를 결합하는 미발견의 분자를 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 "전체 길이의 항체"는 가변 및 불변 영역을 포함한 항체에 대한 천연의 생물학적 형태를 구성하는 구조물을 의미한다. 예를 들어, 사람 및 마우스를 포함한 대부분의 포유동물에서, IgG 이소타입의 전체 길이의 항체는 사량체이며, 2개의 면역글로불린 쇄의 2개의 동일한 쌍으로 이루어지며, 이때 각각의 쌍은 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄를 갖고, 각각의 경쇄는 면역글로불린 도메인 VL 및 CL을 포함하며, 각각의 중쇄는 면역글로불린 도메인 VH, Cγ1, Cγ2, 및 Cγ3을 포함한다. 일부 포유동물, 예를 들어 락타 및 라머에서, IgG 항체는 단지 2개의 중쇄로 이루어질 수 있으며, 이때 각각의 중쇄는 Fc 영역에 부착된 가변 도메인을 포함한다.

본원에서 "면역글로불린"은 실질적으로 면역글로불린 유전자에 의해 암호화되는 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 단백질을 의미한다. 면역글로불린은, 이로 제한됨이 없이, 항체 (이특이적 항체 포함) 및 Fc 융합물을 포함한다. 면역글로불린은 다수의 구조적 형태, 이로 제한됨이 없이, 전체 길이의 항체, 항체 단편 및 개별적 면역글로불린 도메인을 가질 수 있다.

본원에서 사용되는 "면역글로불린 (Ig) 도메인"은 단백질 구조 분야의 전문가에게 명백한 바와 같이, 독특한 구조적 실체로서 존재하는 면역글로불린의 영역을 의미한다. Ig 도메인은 전형적으로 특징적인 β-샌드위치 폴딩 위상을 갖는다. IgG 이소타입 항체에서의 공지된 Ig 도메인은 VH Cγ1, Cγ2, Cγ3, VL, 및 CL이다.

본원에서 사용되는 "IgG" 또는 "IgG 면역글로불린" 또는 "면역글로불린 G"는 실질적으로 인지된 면역글로불린 감마 유전자에 의해 암호화되는 항체 부류에 속하는 폴리펩타이드를 의미한다. 사람에서, 이러한 부류는 아부류 또는 이소타입 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함한다.

본원에서 사용되는 "IgE" 또는 "IgE 면역글로불린" 또는 "면역글로불린 E"는 실질적으로 인지된 면역글로불린 엡실론 유전자에 의해 암호화되는 항체 부류에 속하는 폴리펩타이드를 의미한다. IgE는 막-고정된 IgE (mIgE), 또는 본원에서 순환 IgE로도 불리는 비-막-고정된 IgE일 수 있다.

세포의 "억제" 또는 문법적 대등표현은 표적 세포의 활성화, 증식, 성숙 또는 분화를 방지 또는 감소하는 것을 의미한다.

본원에서 사용되는 "이소타입"은 불변 영역의 화학적 및 항원적 특성에 의해 정의되는 임의의 아부류의 면역글로불린을 의미한다. 공지된 사람 면역글로불린 이소타입은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD, 및 IgE이다.

본원에서 "변형"은 단백질, 폴리펩타이드, 항체 또는 면역글로불린의 물리적, 화학적 또는 서열 특성의 변화를 의미한다. 본원에 기술된 변형은 아미노산 변형 및 당형태 변형을 포함한다.

본원에서 사용되는 "당형태 변형" 또는 "변형된 당형태" 또는 "조작된 당형태"는 단백질, 예를 들어 항체에 공유적으로 부착된 탄수화물 조성물을 의미하며, 상기 탄수화물 조성물은 모 단백질과는 화학적으로 상이하다. 변형된 당형태는 전형적으로 상이한 탄수화물 또는 올리고사카라이드을 나타내며; 따라서, 예를 들어 Fc 변이체는 변형된 당형태를 포함할 수 있다. 달리, 변형된 당형태는 상이한 탄수화물 또는 올리고사카라이드를 포함하는 Fc 변이체를 나타낼 수 있다.

본원에서 사용되는 "모 폴리펩타이드", "모 단백질", "모 면역글로불린", "전구체 폴리펩타이드", "전구체 단백질", 또는 "전구체 면역글로불린"은 본원에서 기술되는 적어도 하나의 변형을 위한 템플레이트 및/또는 토대로서 역할을 하는 변이체, 예를 들어 임의의 폴리펩타이드, 단백질 또는 면역글로불린을 생성하기 위해 후속적으로 변형되는 비변형된 폴리펩타이드, 단백질 또는 면역글로불린을 의미한다. 모 폴리펩타이드는 천연 발생 폴리펩타이드, 또는 천연 발생 폴리펩타이드의 변이체 또는 조작된 버젼일 수 있다. 모 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 그 자체, 모 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 또는 이를 암호화하는 아미노산 서열을 나타낼 수 있다. 따라서, 본원에서 사용되는 "모 Fc 폴리펩타이드"는 변이 Fc 폴리펩타이드를 생성하도록 변형되는 Fc 폴리펩타이드를 의미하며, 본원에서 사용되는 "모 항체"는 변이 항체를 생성하도록 변형되는 항체를 의미한다 (예를 들어, 모 항체는, 이로 제한됨이 없이, 천연 발생 Ig의 불변 영역을 포함하는 단백질을 포함할 수 있다).

본원에서 사용되는 "위치"는 단백질 서열에서의 장소를 의미한다. 위치는 순차적으로 또는 확립된 포맷에 따라, 예를 들어 Kabat에 기술되는 바와 같은 EU 색인에 따라 번호매김될 수 있다. 예를 들어, 위치 297은 사람 항체 IgG1에서의 위치이다.

본원에서 사용되는 "폴리펩타이드" 또는 "단백질"은 적어도 2개의 공유적으로 부착된 아미노산을 의미하며, 단백질, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드 및 펩타이드를 포함한다.

본원에서 사용되는 "잔기"는 단백질 및 이의 관련된 아미노산 정체에서의 위치를 의미한다. 예를 들어, 아스파라긴 297 (또한 Asn297로도 나타냄)은 사람 항체 IgG1에서의 잔기이다.

본원에서 사용되는 "표적 항원"은 소정의 항체의 가변 영역 또는 Fc 융합물의 융합 파트너에 의해 결합되는 분자를 의미한다. 표적 항원은 단백질, 탄수화물, 지질 또는 다른 화학적 화합물일 수 있다. 항체 또는 Fc 융합물은 표적 항원에 대해 친화성을 갖는 것에 기초하여 소정의 표적 항원에 대해 "특이적"이라고 표현된다.

본원에서 사용되는 "표적 세포"는 표적 항원을 발현하는 세포를 의미한다.

본원에서 사용되는 "가변 영역"은 실질적으로 각각 카파, 람다 및 중쇄 면역글로불린 유전자 자리를 만드는 Vκ, Vλ, 및/또는 VH 유전자 중 임의의 것에 의해 암호화되는 하나 이상의 Ig 도메인을 포함하는 면역글로불린의 영역을 의미한다.

본원에서 사용되는 "변이 폴리펩타이드", "폴리펩타이드 변이체" 또는 "변이체"는 하나 이상의 아미노산 변형에 의해 모 폴리펩타이드 서열과 상이한 폴리펩타이드 서열을 의미한다. 모 폴리펩타이드는 천연 발생 또는 야생형 (WT) 폴리펩타이드일 수 있거나, WT 폴리펩타이드의 변형된 버젼일 수 있다. 변이 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 자체, 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 또는 이를 암호화하는 아미노 서열을 나타낼 수 있다. 일부 양태에서, 본원에서 기술되는 변이 폴리펩타이드 (예: 변이 면역글로불린)은 모 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 변형, 예를 들어 모와 비교하여 약 1 내지 약 10개의 아미노산 변형, 약 1 내지 약 5개의 아미노산 변형 등을 가질 수 있다. 본원에서 변이 폴리펩타이드 서열은 모 폴리펩타이드 서열과 적어도 약 80% 상동성, 예를 들어 적어도 약 90% 상동성, 95% 상동성 등을 가질 수 있다. 따라서, 본원에서 사용되는 "Fc 변이체" 또는 "변이체 Fc"는 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 모 Fc 서열과 상이한 Fc 서열을 의미한다. Fc 변이체는 단지 Fc 영역만을 포함하거나, 실질적으로 항체, Fc 융합물, 분리된 Fc, Fc 단편, 또는 Fc에 의해 암호화되는 다른 폴리펩타이드와 연관지어 존재할 수 있다. 본원에서 사용되는 "Fc 폴리펩타이드 변이체" 또는 "변이체 Fc 폴리펩타이드"는 하나 이상의 아미노산 변형에 의해 모 Fc 폴리펩타이드와 상이한 Fc 폴리펩타이드를 의미한다. 본원에서 사용되는 "단백질 변이체" 또는 "변이체 단백질"은 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 모 단백질과 상이한 단백질을 의미한다. 본원에서 사용되는 "항체 변이체" 또는 "변이 항체"는 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 모 항체와 상이한 항체를 의미한다. 본원에서 사용되는 "IgG 변이체" 또는 "변이체 IgG"는 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 모 IgG와 상이한 항체를 의미한다. 본원에서 사용되는 "면역글로불린 변이체" 또는 "변이체 면역글로불린"은 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 모 면역글로불린 서열과 상이한 면역글로불린 서열을 의미한다.

본원에서 "야생형" 또는 "WT"는 대립유전자 변이를 포함하여 자연에서 발견되는 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. WT 단백질, 폴리펩타이드, 항체, 면역글로불린, IgG 등은 의도적으로 변형되지 않은 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.

공동구속 분자

본원에서 기술되는 공동구속 분자는 세포 표면의 FcγRIIb 및 IgE를 결합할 수 있는 이작용성 분자이다. 이들 분자는 본원에서 더욱 상세히 개요되는 다양한 배치를 취할 수 있다. 바람직하게는, 공동구속 분자는, 비록 반드시 요구되는 것은 아니나, 단백질이다. 일부 양태에서, 공동구속 분자는 FcγRIIb 및/또는 IgE에 대한 특이성이, 예를 들어 소분자, 핵산 및/또는 폴리펩타이드에 의해 부여되는 이작용성 분자일 수 있다. 바람직하게는, 공동구속 분자는 약 100 nM 미만의 Kd로 FcγRIIb를 결합한다. 바람직한 양태에서, 공동구속 분자는 고친화성으로 IgE 및 FcγRIIb를 결합하는 면역글로불린을 포함한다. 이러한 양태에서, 면역글로불린은 바람직하게는 세포 표면의 막-고정된 IgE 및 FcγRIIb를 공동구속한다. 또 다른 양태에서, 공동구속 분자는 IgE를 결합하는 제1의 표적물 특이적 영역 및 약 100 nM 미만의 Kd로 FcγRIIb를 결합하는 제2의 표적물 특이적 영역을 갖는 이특이적 분자이다. 바람직한 양태에서, 공동구속 분자는 이특이적 항체이고, 제1 및 제2의 표적물 특이적 영역은 Fv 영역이며, 상기 제1의 Fv 영역은 IgE를 결합하고, 제2의 Fv 영역은 100 nM 미만의 Kd로 FcγRIIb를 결합한다. 또 다른 양태에서, 공동구속 분자는 Fc 영역을 포함하는 Fc 융합물이며, 상기 Fc 영역은 약 100 nM의 Kd로 FcγRIIb를 결합한다. 이러한 양태에서, 면역글로불린의 Fc 융합물 파트너는 IgE를 결합한다.

하나의 양태에서, 공동구속 분자는 이작용성 분자이며, 이때 제1의 영역은 IgE를 결합하고, 제2의 영역은 약 100 nM 미만의 Kd로 FcγRIIb를 결합한다. 실제로, 임의의 단백질, 소분자 또는 핵산, 예를 들어 압타머(apatamer)를 연결하여 이작용성 결합 분자를 생성할 수 있으며, 본원에서 개요되는 바와 같은 링커를 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, 단백질 융합물 파트너는, 이로 제한됨이 없이, 항체의 가변 영역, 수용체의 표적물-결합 영역, 부착 분자, 리간드, 효소, 사이토카인, 케모카인, 또는 일부 다른 단백질 또는 단백질 도메인을 포함한다. 소분자 융합물 파트너는 공동구속 분자를 표적 항원, 예를 들어 IgE로 유도하는 임의의 제제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 바람직한 양태에서, 공동구속 분자는 융합물 파트너로서 FcεRI 또는 FcεRII/CD23을 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, 면역글로불린은 공동구속 분자로서 사용된다.

면역글로불린

본원에서 기술되는 바와 같이, 면역글로불린은 공동구속 분자의 바람직한 성분이며, 항체, Fc 융합물, 분리된 Fc, Fc 단편 또는 Fc 폴리펩타이드일 수 있다. 하나의 양태에서, 면역글로불린은 항체이다. 하기에서 더욱 상세히 개요되는 바와 같이, 면역글로불린은 Fv 영역은 IgE를 결합하고, Fc 영역은 약 100 nM 미만의 Kd로 FcγRIIb를 결합하는 이작용성 분자로 이용된다. 또한, 항체는 하기에서 개요되는 바와 같이 Fc 융합물 또는 이작용성 항체로 이용된다.

항체는 특정 항원을 결합하는 면역글로불린 단백질이다. 사람 및 마우스를 포함한 대부분의 포유동물에서, 항체는 짝지은 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드로부터 제작된다. 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 항체 사이에 상당한 서열 다양성을 나타내며, 표적 항원을 결합하는데 책임이 있다. 각각의 쇄는 개별적인 면역글로불린 (Ig) 도메인으로 이루어지므로 이러한 단백질에 대해 유전적 용어 면역글로불린이 사용된다.

전통적인 항체 구조 단위는 전형적으로 4량체를 포함한다. 각각의 4량체는 전형적으로 2개의 동일한 쌍의 폴리펩타이드 쇄로 구성되며, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄" (전형적으로 약 25 kDa의 분자량을 갖는다) 및 하나의 "중쇄" (전형적으로 약 50 내지 70 kDa의 분자량을 갖는다)를 갖는다. 사람 중쇄는 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 중쇄는 뮤, 델타, 감마, 알파 또는 엡실론으로 분류되며, 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 항체 이소타입을 정의한다. IgE는, 이로 제한됨이 없이, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함한 수개의 아부류를 갖는다. IgM은, 이로 제한됨이 없이, IgM1 및 IgM2를 포함한 아부류를 갖는다. IgA는, 이로 제한됨이 없이, IgA1 및 IgA1를 포함한 수개의 아부류를 갖는다. 따라서, 본원에서 사용되는 "이소타입"은 이들의 불변 영역의 화학적 및 항원적 특성에 의해 정의되는 면역글로불린에 대한 임의의 부류 및 아부류를 의미한다. 공지된 사람 면역글로불린 이소타입은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM1, IgM2, IgD, 및 IgE이다.

경쇄 및 중쇄 각각은 가변 및 불변 영역으로 불리는 2개의 상이한 영역으로 구성된다. IgG 중쇄는, 각각 중쇄 가변 도메인, 중쇄 불변 도메인 1, 중쇄 불변 도메인 2 및 중쇄 불변 도메인 3으로 불리는 순서 VH-CH1-CH2-CH3의 N-말단으로부터 C-말단으로 연결된 4개의 면역글로불린 도메인 (또한, 각각 중쇄 가변 도메인, 불변 감마 1 도메인, 불변 감마 2 도메인 및 불변 감마 3 도메인으로 불리는 VH-Cγ1-Cγ2-Cγ3으로도 나타냄)으로 구성된다. IgG 경쇄는, 각각 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인으로 불리는 순서 VL-CL의 N-말단부터 C-말단으로 연결된 2개의 면역글로불린 도메인으로 구성되며, 중요한 생화학적 사건을 유도하기 위해 다수의 천연 단백질을 결합하는데 책임이 있다. 비록 가변 영역에 더욱 미묘한 차이가 존재할 수는 있지만, 이들 항체 부류 사이의 구별되는 특징은 이들의 불변 영역이다.

항체의 가변 영역은 분자의 항원 결합 결정자를 포함하며, 따라서 이의 표적 항원에 대한 항체의 특이성을 결정한다. 가변 영역은 동일한 부류에 속하는 다른 항체와 서열이 가장 다르기 때문에, 가변 영역이라 불린다. 각각의 쇄의 아미노-말단부는 주로 항원 인식에 책임이 있는 약 100 내지 110개 이상 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 가변 영역에서, 3개의 루프는 중쇄 및 경쇄의 V 도메인 각각이 항원-결합 부위를 형성하도록 집결한다. 각각의 루프는 상보성-결정 영역 (이하, "CDR"로 나타냄)으로 나타내며, 상보성-결정 영역의 아미노산 서열 변화는 매우 중요하다. 총 6개의 CDR이 있으며, 중쇄 및 경쇄 당 각각 3개씩이며, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3로 표시된다. CDR의 가변 영역 바깥은 프레임웍 (FR) 영역이라 불린다. 비록 CDR과 같이 다양하지는 않지만, FR 영역에도 서열 다양성이 상이한 항체 간에 발생한다. 일반적으로, 항체의 이러한 특징적 구조는, 광범위한 항원에 대한 특이성을 수득하도록 실질적인 항원 결합 다양성 (CDR)이 면역계에 의해 개발될 수 있는 안정한 스캐폴드 (FR 영역)을 제공한다. 일부는 항원과 비결합되고 일부는 항원과 컴플렉스를 이룬, 다수의 고해상 구조가 상이한 유기체로부터의 다양한 가변 영역 단편에 대해 이용가능하다. 항체 가변 영역의 서열 및 구조적 특징이 문헌 (Morea et al., 1997, Biophys Chem 68:9-16; Morea et al., 2000, Methods 20:267-279, 본원에 참조로 전부 삽입됨)에 기술되어 있으며, 항체의 보존된 특성이 문헌 (Maynard et al., 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-376, 본원에 참조로 전부 삽입됨)에 기술되어 있다.

각각의 쇄의 카복시-말단부는 주로 이펙터 기능에 책임이 있는 불변 영역을 정의한다. 면역글로불린의 IgG 아부류에서는, 중쇄에 수개의 면역글로불린 도메인이 있다. 본원에서 "면역글로불린 (Ig) 도메인"은 상이한 3차 구조를 갖는 면역글로불린의 영역을 의미한다. 불변 중쇄 (CH) 도메인 및 힌지 영역을 포함한 중쇄 도메인이 본원에 기술된 양태에서 중요하다. IgG 항체에서, 각각의 IgG 이소타입은 3개의 CH 영역을 갖는다. 따라서, IgG에 대해 "CH" 도메인은 하기와 같다: "CH1"은 Kabat에서의 EU 색인에 따른 위치 118 내지 220을 나타내며, "CH2"은 Kabat에서의 EU 색인에 따른 위치 237 내지 340을 나타내며, "CH3"은 Kabat에서의 EU 색인에 따른 위치 341 내지 447을 나타낸다.

중쇄의 또 다른 중요한 영역은 힌지 영역이다. 본원에서 "힌지" 또는 "힌지 영역" 또는 "항체 힌지 영역" 또는 "면역글로불린 힌지 영역"은 항체의 제1 불변 도메인과 제2 불변 도메인 사이의 아미노산을 포함하는 유연한 폴리펩타이드를 의미한다. 구조적으로, IgG CH1 도메인은 EU 위치 220에서 끝나고, IgG CH2 도메인은 잔기 EU 위치 237에서 시작한다. 따라서, IgG에 대해, 본원에서 항체 힌지는 위치 221 (IgG1에서 D221) 내지 236 (IgG1에서 G236)을 포함하는 것으로 정의된다 (번호매김은 Kabat에서의 EU 색인에 따른다). 일부 양태에서, 예를 들어 Fc 영역과 관련하여, "하부 힌지 (lower hinge)"가 포함되며, "하부 힌지"는 일반적으로 위치 226 또는 230 내지 236을 나타낸다.

Fc 영역이 본원에 기술되는 양태에서 중요하다. 본원에서 사용되는 "Fc" 또는 "Fc 영역"은 제1의 불변 영역 면역글로불린을 제외한 항체의 불변 영역 및, 일부의 경우, 힌지의 일부를 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. 따라서, Fc는 IgA, IgD, 및 IgG의 마지막 2개의 불변 영역 면역글로불린 도메인, 및 IgE 및 IgM의 마지막 3개의 불변 영역 면역글로불린 도메인, 및 이들 도메인에 대해 유연한 힌지 N-말단을 나타낸다. IgA 및 IgM에 있어, Fc는 J 쇄를 포함할 수 있다. IgG에 대해, Fc는 면역글로불린 도메인 Cgamma2 및 Cgamma3 (Cγ2 및 Cγ3), 및 Cgamma1 (Cγ1)과 Cgamma2 (Cγ2) 사이의 하부 힌지 영역을 포함한다. 비록 Fc 영역의 경계가 다양할 수 있지만, 사람 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로 이의 카복실-말단에 대해 잔기 C226 또는 P230을 포함하는 것으로 정의된다 (번호매김은 Kabat에서의 EU 색인에 따른다). Fc는 분리된 이러한 영역, 또는, 후술하는 바와 같이, Fc 폴리펩타이드에서의 이러한 영역을 나타낼 수 있다. 본원에서 사용되는 "Fc 폴리펩타이드"는 Fc 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. Fc 폴리펩타이드는 항체, Fc 융합물, 분리된 Fc 및 Fc 단편을 포함한다.

항체의 Fc 영역은 다수의 Fc 수용체 및 리간드와 상호작용하며, 이펙터 기능으로 불리는 일련의 중요한 작용 성능을 부여한다. IgG에 있어, Fc 영역은 Ig 도메인 Cγ2 및 Cγ3, 및 Cγ2에 이르는 N-말단 힌지를 포함한다. IgG 부류에 있어 Fc 수용체의 중요한 패밀리는 Fc 감마 수용체 (FcγR)이다. 이들 수용체는 항체와 면역계의 세포성 암 사이의 소통을 매개한다 (Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290, 모두 본원에 전부 참조로 삽입됨). 사람에서, 이러한 단백질 패밀리는 이소형태 FcγRIa, FcγRIb, 및 FcγRIc를 포함한 FcγRI (CD64); 이소형태 FcγRIIa (동종이형 H131 및 R131을 포함), FcγRIIb (FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2를 포함), 및 FcγRIIc를 포함한 FcγRII (CD32); 이소형태 FcγRIIIa (동종이형 V158 및 F158으 포함) 및 FcγRIIIb (동종이형 FcγRIIIb-NA1 및 FcγRIIIb-NA2를 포함)를 포함한 FcγRIII (CD16)를 포함한다 (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65, 본원에 전부 참조로 삽입됨). 이들 수용체는 전형적으로 Fc, 막 스패닝 영역, 및 세포 내의 일부 시그널화 사건을 매개할 수 있는 세포내 도메인에 대한 결합을 매개하는 세포외 도메인을 갖는다. 이들 수용체는 단핵구, 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 호산구, 비만 세포, 혈소판, B 세포, 거대 과립 림프구, 랑게르한스 세포, 천연 킬러 (NK) 세포 및 γγ T 세포를 포함한 다양한 면역 세포에서 발현된다. Fc/FcγR 컴플렉스의 형성은 결합된 항원의 부위로 이들 이펙터 세포를 소집하여, 전형적으로 세포 내에서의 시그널화 사건 및 염증 매개자의 방출, B 세포 활성화, 세포내이입, 포식작용 및 세포독성 공격과 같은 중요한 후속적 면역 반응을 일으킨다. 세포독성 및 포식작용 이펙터 기능을 중재하는 능력은, 항체가 표적 세포를 파괴하는 포텐션 기작이다. FcγR를 발현하는 일특이적 세포독성 세포가 인식하는 세포-매개된 반응은 표적 세포 상의 항체를 결합하며, 이어서 항체 의존적 세포-매개된 세포독성 (ADCC)라 불리는 표적 세포의 용해를 일으킨다 (Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766; Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290, 모두 본원에 전부 참조로 삽입됨). FcγR를 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 인식하는 세포-매개된 반응은 표적 세포 상의 항체를 결합하고, 이어서 항체 의존적 세포-매개된 포식작용 (ADCP)라 불리는 표적 세포의 포식작용을 일으킨다.

상이한 IgG 아부류는 FcγR에 대해 상이한 친화성을 가지며, 전형적으로 IgG1 및 IgG3은 실질적으로 IgG2 및 IgG4 보다 수용체에 대해 우수하게 결합한다 (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65, 본원에 전부 참조로 삽입됨). FcγR은 상이한 친화도로 IgG Fc 영역에 결합한다. FcγRIIIa 및 FcγRIIIb의 세포외 도메인은 96% 동일하나, FcγRIIIb는 세포내 시그널화 도메인을 갖지 않는다. 또한, FcγRI, FcγRIIa/c, 및 FcγRIIIa는 면역수용체 타이로신-기초된 활성화 모티프 (ITAM)을 갖는 세포내 도메인을 갖는 것으로 특징지어지는 면역 컴플렉스-유도된 활성화의 양성 조절자인 반면, FcγRIIb는 면역수용체 타이로신-기초된 활성화 모티프 (ITAM)을 가지므로 억제성이다. 따라서, 전자는 활성화 수용체로 나타내고, FcγRIIb는 억제성 수용체로 나타낸다. 모든 FcγR는, 친화성 및 활성의 차이에도 불구하고, Cγ2 도메인의 N-말단 및 전술한 힌지에서 Fc 상의 동일한 영역을 결합한다. 이러한 상호작용은 구조적으로 널리 특징분석되었으며 (Sondermann et al., 2001, J Mol Biol 309:737-749, 본원에 참조로 전부 삽입됨), 사람 FcγRIIIb의 세포외 도메인에 결합된 사람 Fc의 수개의 구조가 밝혀졌다 (pdb 취득 코드 1E4K) (Sondermann et al., 2000, Nature 406:267-273, 본원에 참조로 전부 삽입됨) (pdb 취득 코드 1IIS 및 1IIX) (Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16469-16477, 본원에 참조로 전부 삽입됨).

Fc 상의 중첩되나 분리된 부위가 보체 단백질 C1q에 대한 경계면 역할을 한다. 동일한 방식으로, Fc/FcγR 결합은 ADCC를 매개하고, Fc/C1q 결합은 보체 의존적 세포독성 (CDC)를 매개한다. Cγ2와 Cγ3 도메인 사이의 Fc 상의 부위는 신생아 수용체 FcRn과의 상호작용을 매개하며, 이의 결합은 세포내이입 항체를 엔도솜으로부터 다시 혈류로 재순환한다 (Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766, 모두 본원에 참조로 삽입됨). 전체 길이의 분자의 큰 크기에 의한 신장 여과의 방해와 커플링된 이러한 과정은 1 내지 3주의 유리한 항체 혈청 반감기를 초래한다. Fc의 FcRn에의 결합은 또한 항체 수송에 중요한 역할을 한다. Fc 상의 FcRn에 대한 결합 부위는 또한 세균 단백질 A 및 G가 결합하는 부위이다. 이들 단백질에 의한 단단한 결합은 전형적으로 단백질 정제 동안 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피를 사용함으로써 항체를 정제하기 위한 수단으로 개발된다. 이러한 영역, 보체 및 FcRn/단백질 A 결합 영역의 충실도가 항체의 임상 특성 및 이들의 개발 모두에 중요하다.

Fc 영역의 주요 특징은 N297에서 발생하는 보존된 N-연결된 글리코실화이다. 이러한 탄수화물 또는 올리고사카라이드 (이따금 언급됨)는 항체에 대해 중요한 구조적 및 기능적 역할을 하며, 항체가 포유동물 발현 시스템을 사용하여 생성되어야 하는 본질적 원인 중의 하나이다. FcγR 및 C1q에 대한 효과적인 Fc 결합은 이러한 변형을 필요로 하며, N297 탄수화물의 조성 변화 또는 이의 제거는 이들 단백질에 대한 결합에 영향을 끼친다 (Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Mimura et al., 2001, J Biol Chem 276:45539-45547; Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16478-16483; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Simmons et al., 2002, J Immunol Methods 263:133-147, 모두 본원에 참조로 전부 삽입됨).

본원에 기술된 양태의 면역글로불린은 또한 Fc 융합물로서 언급되는 항체-유사 단백질일 수 있다 (Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14:52-60; Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9:195-200, 모두 참조로 전부 삽입됨). 본원에서 "Fc 융합물"은 앞서 사용된 바와 같이 용어 "이뮤노어드헤신", "Ig 융합물", "Ig 키메라" 및 "수용체 글로불린" (때로는 - 를 사용)과 동의어이다 (Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14:52-60; Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9:195-200). Fc 융합물은 본원에서 "융합 파트너"로 나타내는 하나 이상의 폴리펩타이드가 Fc에 작동적으로 연결된 단백질이다. Fc 융합물은 항체의 Fc 영역 및 따라서 이의 유리한 이펙터 기능 및 약동학을 수용체, 리간드 또는 일부 다른 단백질 또는 단백질 도메인의 표적물-결합 영역과 조합한다. 후자의 역할은 표적물 인식을 매개하는 것이며, 따라서 항체 가변 도메인과 기능적으로 유사하다. Fc 융합물은 항체와 구조적 및 기능적으로 겹치기 때문에, 본원에서의 항체에 대한 논의는 또한 Fc 융합물에도 적용된다.

사실상, 임의의 단백질 또는 소분자가 Fc에 연결되어 Fc 융합물을 생성할 수 있다. 단백질 융합 파트너는, 이로 제한됨이 없이, 임의의 항체의 가변 영역, 수용체의 표적물-결합 영역, 부착 분자, 리간드, 효소, 사이토카인, 케모카인, 또는 일부 다른 단백질 또는 단백질 도메인을 포함할 수 있다. 소분자 융합 파트너는 Fc 융합물을 표적 항원으로 유도하는 임의의 제제를 포함할 수 있다. 이러한 표적 항원은 임의의 분자, 예를 들어 질환에 연루된 세포외 수용체일 수 있다. 본원에서 기술되는 양태의 Fc 융합물은 바람직하게는 IgE에 대해 특이성을 갖는다. 예를 들어, 바람직한 양태에서, 본 발명의 Fc 융합물은 융합 파트너로서 FcεRI 또는 FcεRII/CD23을 포함할 수 있다. 본 발명의 Fc 융합물은 바람직하게는 FcγRIIb에 대한 친화성을 증진시키는 Fc 영역에 하나 이상의 변이체를 포함한다.

융합 파트너는 N-말단 또는 C-말단 또는 말단 내-사이의 일부 잔기를 포함하여 Fc 영역의 임의의 영역에 연결될 수 있다. 하나의 양태에서, 융합 파트너는 Fc 영역의 N-말단 또는 C-말단에 연결된다. 다양한 링커가 Fc 영역을 융합 파트너에 공유적으로 연결하기 위해 본원에 기술된 일부 양태에서 사용될 수 있다. 본원에서 "링커", "링커 서열", "스페이서", "결박 서열" 또는 이의 문법적 대등표현은 2개의 분자를 연결하고 종종 2개의 분자를 일 배치로 위치시키는 역할을 하는 분자 또는 분자 그룹 (예: 단량체 또는 중합체)를 의미한다. 링커는 당해 기술 분야에 공지되어 있다: 예를 들어, 호모- 또는 헤테로-이작용성 링커가 널리 공지되어 있다 (1994 Pierce Chemical Company catalog, technical section on cross-linkers, pages 155-200, 참조로 전부 삽입됨). 다수의 방법을 이용하여 분자들을 서로 공유적으로 연결할 수 있다. 이들은, 이로 제한됨이 없이, 단백질 또는 단백질 도메인의 N-말단과 C-말단 사이의 폴리펩타이드 연결, 디설파이드 결합을 통한 연결, 및 화학적 가교결합 시약을 사용한 연결을 포함한다. 이러한 양태의 하나의 측면에서, 링커는 재조합 기술 또는 펩타이드 합성에 의해 생성되는 펩타이드 결합이다. 링커 펩타이드는 주로 하기 아미노산 잔기를 포함할 수 있다: Gly, Ser, Ala, 또는 Thr. 링커 펩타이드는 2개의 분자가 목적하는 활성을 보유하도록 서로에 대해 정확한 배치를 갖는 방식으로 2개의 분자를 연결하는데 적합한 길이를 갖는다. 이러한 목적에 적합한 길이는 1개 이상 50개 미만의 아미노산 잔기를 포함한다. 하나의 양태에서, 링커는 약 1 내지 30개 아미노산 길이이다. 하나의 양태에서, 1 내지 20개 아미노산 길이의 링커가 사용될 수 있다. 유용한 링커는 글리신-세린 중합체 (예를 들어, (GS)n, (GSGGS)n (서열 번호 1), (GGGGS)n (서열 번호 2), 및 (GGGS)n (서열 번호 3)를 포함, 여기서 n은 적어도 1의 정수이다), 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체 및 당업자에 의해 인식될 수 있는 기타 유연성 링커를 포함한다. 달리, 이로 제한됨이 없이, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체를 포함한 비단백질성 중합체가 Fc 영역을 융합 파트너에 연결시키는데 사용될 수 있는 링커로서 사용될 수 있다.

또한, 융합 파트너로서 Fc 폴리펩타이드가 고려된다. 따라서, 본원에서 기술되는 바와 같은 면역글로불린은 2개 이상의 Fc 영역을 포함하는 다량체성 Fc 폴리펩타이드일 수 있다. 이러한 분자의 이점은 Fc 수용체에 대한 다수의 결합 부위에 단일 단백질 분자를 제공한다는 것이다. 하나의 양태에서, Fc 영역은 화학적 조작법을 이용하여 연결될 수 있다. 예를 들어, Fab 및 Fc는 힌지의 시스테인 잔기에서 유래하는 티오에테르 결합에 의해 연결되어 FabFc₂와 같은 분자를 생성할 수 있다. Fc 영역은 디설파이드 조작 및/또는 화학적 가교결합을 이용하여 연결될 수 있다. 하나의 양태에서, Fc 영역은 유전자적으로 연결될 수 있다. 하나의 양태에서, 면역글로불린의 Fc 영역은 문헌 (USSN 11/022,289, 출원일: 2004년 12월 21일, 발명의 명칭: "Fc polypeptides with novel Fc ligand binding sites," 참조로 전부 삽입됨)에 기술되는 바와 같이 일렬로 연결된 Fc 영역을 만들도록 유전적으로 연결된다. 일렬로 연결된 Fc 폴리펩타이드는 2개 이상의 Fc 영역, 예를 들어 1 내지 3개의 Fc 영역, 2개의 Fc 영역을 포함할 수 있다. 이는 가장 유리한 구조 및 기능적 특성을 갖는 호모- 또는 헤테로-일렬 연결 Fc 연결을 수득하기 위하여 다수의 조작된 제작물을 개발하는데 유리할 수 있다. 일렬로 연결된 Fc 영역은 호모-일렬 연결 Fc 영역일 수 있으며, 이는 하나의 이소타입의 Fc 영역이 동일한 이소타입의 또 다른 Fc 영역에 유전적으로 융합된다. 일렬로 연결된 Fc 폴리펩타이드 상에는 다수의 FcγR, C1q, 및/또는 FcRn 결합 부위가 있기 때문에 이펙터 기능 및/또는 약동학이 증진될 것으로 기대된다. 또 다른 양태에서는, 상이한 이소타입의 Fc 영역이 일렬로 연결될 수 있으며, 헤테로-일렬 연결 Fc 영역이라 불린다. 예를 들어, FcγRs 및 FcαRI 모두를 결합하는 면역글로불린은 FcγR 및 FcαRI 수용체를 표적하는 능력 때문에, 상당한 임상적 개선을 제공할 수 있다.

본원에 기술된 양태의 면역글로불린은 실질적으로 임의의 항체 부류에 속하는 면역글로불린 유전자에 의해 암호화될 수 있다. 특정 양태에서, 본원에 기술된 면역글로불린은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4를 포함한 IgG 부류의 항체에 속하는 서열을 포함하는 항체 또는 Fc 융합물에 사용된다. 도 1은 이들 사람 IgG 서열의 정렬을 제공한다. 다른 양태에서, 본원에 기술된 면역글로불린은 IgA (IgA1 및 IgA2 포함), IgD, IgE, IgG 또는 IgM 부류의 항체에 속하는 서열을 포함하는 항체 또는 Fc 융합물에 사용된다. 본원에 기술된 면역글로불린은 하나 초과의 단백질 쇄를 포함할 수 있으며, 예를 들어 단량체 또는 호모- 또는 헤테로-올리고머를 포함한 올리고머인 항체 또는 Fc 융합물일 수 있다.

본원에 기술된 면역글로불린은 실질적으로 임의의 유기체, 예를 들어 포유동물 (이로 제한됨이 없이, 사람, 설치류 (이로 제한됨이 없이, 마우스 및 래트를 포함), 토끼목 (이로 제한됨이 없이, 래비트 또는 헤어를 포함), 낙타과 (이로 제한됨이 없이, 낙타, 라마 및 단봉낙타를 포함), 및 비사람 영장류 (이로 제한됨이 없이, 프로시미안 (Prosimian), 플라티리니 (Platyrrhini) (New World monkey), 서코피테코이대 (Cercopithecoidea) (Old World monkey), 및 호미노이대 (Hominoidea) (기번, 작은 원숭이 (Lesser Ape) 및 큰 원숭이 (Great Ape) 포함)을 포함)로부터의 유전자에 의해 암호화될 수 있다.

당해 기술 분야에 널리 공지된 바와 같이, 사람 집단에서는 면역글로불린 다형이 존재한다. Gm 다형은 사람 IgG1, IgG2 및 IgG3 분자의 마커에 대한 G1m, G2m, 및 G3m 동종이형으로 나타내는 동종이형 항원 결정자를 암호화하는 대립유전자를 갖는 IGHG1, IGHG2 및 IGHG3 유전자에 의해 결정된다 (Gm 동종이형은 감마 4 쇄에서는 발견되지 않았다). 마커는 '동종이형' 및 '이소동종이형'으로 분류될 수 있다. 이들은 이소타입 사이의 강력한 서열 상동성에 의존적인 상이한 혈청학적 근거에 따라 구분된다. 동종이형은 Ig 유전자의 동종이형 형태로 구체화되는 항원 결정자이다. 동종이형은 상이한 개체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노산 서열에서 약간의 차이를 나타낸다. 비록 많은 경우에서는 치환된 수개의 아미노산을 갖지만, 단일 아미노산 차이라도 동종이형 결정자를 야기할 수 있다. 동종이형은 아부류의 대립유전자 간에 서열 차이가 있으며, 이로써 항혈청은 단지 대립유전자 차이라도 인식한다. 이소동종이형은 하나 이상의 다른 이소타입의 비-다형 상동성 영역과 공유되는 에피토프를 생성하는 하나의 이소타입에서의 대립유전자이며, 이로 인해 항혈청은 관련 동종이형 및 관련 상동성 이소타입 모두와 반응할 것이다 (Clark, 1997, IgG effector mechanisms, Chem. Immunol. 65:88-110; Gorman & Clark, 1990, Semin Immunol 2(6):457-66, 모두 본원에 참조로 전부 삽입됨).

사람 면역글로불린의 동종이형 형태는 잘 규명되어 있다 (사람 면역글로불린의 동종이형 및 관련 마커에 대한 표기의 WHO 검토. J Immunogen 1976, 3: 357-362; 사람 면역글로불린의 동종이형 및 관련 마커에 대한 표기의 WHO 검토. 1976, Eur. J. Immunol. 6, 599-601; Loghem E van, 1986, Allotypic markers, Monogr Allergy 19: 40-51, 모두 본원에 참조로 전부 삽입됨). 또한, 다른 다형도 규명되어 있다 (Kim et al., 2001, J. Mol. Evol. 54:1-9, 본원에 전부 참조로 삽입됨). 현재, 18개의 Gm 동종이형이 공지되어 있다: G1m (1, 2, 3, 17) 또는 G1m (a, x, f, z), G2m (23) 또는 G2m (n), G3m (5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) 또는 G3m (b1, c3, b5, b0, b3, b4, s, t, g1, c5, u, v, g5) (Lefranc, et al., The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Pergamon, Oxford, pp. 43-78 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199-211, 모두 본원에 참조로 전부 삽입됨). 확정된 조합으로 유전되는 동종이형은 Gm 일배체형으로 불린다. 본원에 기술된 면역글로불린은 실질적으로 임의의 동종이형, 이소동종이형 또는 임의의 면역글로불린 유전자의 일배체형에 의해 암호화될 수 있다.

본원에서 기술되는 면역글로불린은, 이로 제한됨이 없이, 분리된 Fc, Fc 단편 및 Fc 융합물을 포함하는, Fc 폴리펩타이드를 구성할 수 있다. 하나의 양태에서, 본원에서 기술되는 면역글로불린은, 가변 및 불변 영역을 포함하는, 항체의 천연 생물학적 형태를 구성하는, 전체 길이의 항체이다. Ig 이소타입에 대해, 전체 길이 항체는 4량체이며, 2개의 면역글로불린 쇄의 2개의 동일한 쌍으로 이루어지며, 각각의 쌍은 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄를 갖고, 각각의 경쇄는 면역글로불린 도메인 VL 및 CL을 포함하며, 각각의 중쇄는 면역글로불린 도메인 VH, Cγ1, Cγ2, 및 Cγ3을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본원에서 기술되는 면역글로불린은 분리된 Fc 영역 또는 Fc 단편이다.

본원에서 기술되는 면역글로불린은, 이로 제한됨이 없이, 항체 단편, 이특이적 항체, 미니바디, 도메인 항체, 합성 항체 (때때로 본원에서 "항체 유사물"로 나타냄), 키메릭 항체, 사람화 항체, 항체 융합물 (때때로 "항체 컨주게이트"로 나타냄), 및 각각의 단편을 포함하는, 다양한 구조물일 수 있다.

하나의 양태에서, 항체는 항체 단편이다. 특이적 항체 단편은, 이로 제한됨이 없이, (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fab 단편, (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편, (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (iv) 단일 가변으로 이루어진 dAb 단편, (v) 분리된 CDR 영역, (vi) F(ab')2 단편 (2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편), (vii) 단쇄 Fv 분자 (scFv) (여기서, VH 도메인 및 VL 도메인은 항원 결합 부위를 형성하도록 2개의 도메인을 결합시키는 펩타이드 링커에 의해 연결된다), (viii) 이특이적 단쇄 Fv 이량체, 및 (ix) "디아바디" 또는 "트리아바디" (유전자 융합에 의해 제작된 다가 또는 다특이적 단편)를 포함한다. 항체 단편을 변형될 수 있다. 예를 들어, 분자는 VH와 VL 도메인을 연결하는 디설파이드 브릿지 연결을 삽입함으로써 안정화될 수 있다. 항체 포맷 및 구성에 대한 예가 문헌 (Holliger & Hudson, 2006, Nature Biotechnology 23(9):1126-1136, Carter 2006, Nature Reviews Immunology 6:343-357 및 이에 인용된 참조문, 모두 특별히 참조로 삽입됨)에 기술되어 있다.

하나의 양태에서, 본원에서 기술되는 항체는 다특이적 항체 및 특히 이특이적 항체 (때때로 "디아바디"로도 나타냄)일 수 있다. 이들은 2개의 (또는 그 이상의) 상이한 항원을 결합하는 항체이다. 디아바디는 당해 기술 분야에 공지된 다양한 방법으로, 예를 들어 화학적으로 제조되거나 하이브리드 하이브리도마로부터 제조될 수 있다. 하나의 양태에서, 항체는 미니바디이다. 미니바디는 CH3 도메인에 연결된 scFv를 포함하는 최소화된 항체-유사 단백질이다. 일부의 경우, scFv는 Fc 영역에 연결될 수 있으며, 힌지 영역의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. 다특이적 항체의 기술에 대해 문헌 (Holliger & Hudson, 2006, Nature Biotechnology 23(9):1126-1136 및 이에 인용된 참조문, 모두 특별히 참조로 삽입됨)을 참조한다.

비사람, 키메릭 , 사람화 및 완전 사람 항체

당해 기술 분야에 널리 알려진 항체의 가변 영역은 다양한 종으로부터의 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 항체 가변 영역은, 이로 제한됨이 없이, 마우스, 래트, 래비트, 낙타, 라마, 및 멍키를 포함한, 비사람 공급원으로부터의 것일 수 있다. 일부 양태에서, 스캐폴드 성분은 상이한 종으로부터의 혼합물일 수 있다. 그러한 것으로서, 본원에 기술된 항체는 키메릭 항체 및/또는 사람화 항체일 수 있다. 일반적으로, "키메릭 항체" 및 "사람화된 항체" 모두 하나 초과의 종으로부터의 영역을 조합한 항체를 말한다. 예를 들어, "키메릭 항체'는 전통적으로 마우스 또는 다른 비사람 종으로부터의 가변 영역(들) 및 사람으로부터의 불변 영역(들)을 포함한다.

"사람화 항체"는 일반적으로 사람 항체에서 발견되는 서열로 맞바꾼 가변-도메인 프레임웍 영역을 갖는 비-사람 항체를 말한다. 일반적으로, 사람화 항체에서, CDR을 제외한 전체 항체는 사람 기원의 폴리펩타이드에 의해 암호화되거나 이의 CDR을 제외하고는 그러한 항체와 동일하다. CDR (이의 일부 또는 전부가 비-사람 유기체에서 기원하는 핵산에 의해 암호화된다)은 사람 항체 가변 영역의 베타-시트 프레임웍으로 이식되어, 항체의 특이성이 이식된 CDR에 의해 결정되는 항체를 생성한다. 이러한 항체의 생성이, 예를 들어 문헌 (WO 92/11018, Jones, 1986, Nature 321:522-525, Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536)에 기술되어 있다. 선택된 수용체 프레임웍 잔기의 상응하는 공여 잔기로의 "백돌연변이(Backmutation)"는 종종 초기에 이식된 제작물에서 상실된 친화성을 회복하는데 필요하다 (U.S. Pat. No. 5,693,762, 참조로 전부 삽입됨). 또한, 사람화 항체는 최적으로 면역글로불린 불변 영역, 전형적으로는 사람 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이므로, 전형적으로 사람 Fc 영역을 포함할 것이다. 또한, 사람화 항체는 유전적으로 조작된 면역계를 갖는 마우스를 사용하여 생성될 수 있다 (Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654). 비-사람 항체를 사람화하고 재성형하는 다양한 기술 및 방법이 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있다 (Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (USA), 및 이에 인용된 참조문). 사람화 또는 비사람 항체 가변 영역의 면역원성을 감소시키는 다른 방법은, 예를 들어 문헌 (Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973)에 기술되어 있는 바와 같은, 재포장 (resurfacing) 방법을 포함할 수 있다. 하나의 양태에서, 모 항체는, 당해 기술 분야에 공지되어 있는 바와 같이, 친화도 성숙되었다. 구조에 기초하는 방법이, 예를 들어 문헌 (U.S. Ser. No. 11/004,590)에 기술되어 있는 바와 같이, 사람화 및 친화도 성숙에 이용될 수 있다. 선별 기초 방법이 항체 가변 영역을 사람화 및/또는 친화도 성숙을 위해, 즉 이의 표적 항원에 대한 가변 영역의 친화도를 증가시키기 위해 이용될 수 있다. 다른 사람화 방법은, 이로 제한됨이 없이, 문헌 (USSN 09/810,502; Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119-1125; De Pascalis et al., 2002, J. Immunol. 169:3076-3084)에 기술된 방법을 포함하여, 단지 CDR 부분들의 이식을 수반할 수 있다. 구조-기초 방법이, 예를 들어 문헌 (USSN 10/153,159 및 관련 출원, 모두 본원에 참조로 삽입됨)에 기술되어 있는 바와 같이, 사람화 및 친화성 성숙에 이용될 수 있다. 특정 변형에서, 항체의 면역원성은 문헌 (Lazar et al., 2007, Mol Immunol 44:1986-1998 및 USSN 11/004,590, 제목: "Methods of Generating Variant Proteins with Increased Host String Content and Compositions Thereof", 출원일: 2004.12.3., 참조로 전부 삽입됨)에 기술된 방법으로 감소된다.

하나의 양태에서, 항체는 본원에 개요되는 바와 같은 적어도 하나의 변형을 갖는 완전 사람 항체이다. "완전 사람 항체"는 본원에 개요된 변형과 함께 사람 염색체로부터 유도된 항체의 유전자 서열을 갖는 사람 항체를 나타낸다. 완전 사람 항체는, 예를 들어 트렌스제닉 마우스 (Bruggemann et al., 1997, Curr Opin Biotechnol 8:455-458) 또는 선별 방법과 커플링된 사람 항체 라이브러리를 사용하여 수득될 수 있다. 하나의 양태에서, 사람 상당 항체는 문헌 (PCT/US09/41144, 본원에 참조로 삽입됨)에서 개요되는 바와 같이 컴퓨터조작으로 생성될 수 있다.

항- IgE 항체

본원에서 기술되는 면역글로불린은 IgE를 결합한다. 본 발명의 항-IgE 항체는 IgE에 대해 특이성을 갖는, 공지되거나 공지되지 않은, 임의의 가변 영역을 포함할 수 있다. 공지된 항-IgE 항체는, 이로 제한됨이 없이, 뮤린 항체 MaE11, MaE13, 및 MaE15, 이들 항체의 사람화 및/또는 조작 버젼 (E25, E26, 및 E27, 특히 rhuMab-E25로도 공지되고 오말리주마브로도 공지된 E25 포함), 예를 들어 문헌 (U.S. Pat. No. 6,761,889, U.S. Pat. No. 6,329,509, US20080003218A1, Presta, L G et al., 1993, J Immunol 151:2623-2632, 모두 특별히 참조로 삽입됨)에 기술된 항체를 포함한다. MaE11의 바람직한 조작 버젼은, 본원의 실시예에서 기술되는 H1L1 MaE11이다. 본 발명에 유용할 수 있는 다른 항-IgE는 뮤린 항체 TES-C21, CGP51901로도 공지된 키메릭 TES-C21 (Corne, J et al., 1997, J Clin Invest 99:879-887; Racine-Poon, A et al., 1997, Clin Pharmcol Ther 62:675-690), 및 TNX-901로도 공지된, 이로 제한되지 않는, CGP56901을 포함한, 이러한 항체의 사람화 및/또는 조작 버젼, 예를 들어 문헌 (Kolbinger, F et al., 1993, Protein Eng 6:971-980)에 기술된 항체를 포함한다. 본 발명에서 사용할 수 있는 다른 항-IgE 항체가 문헌 (U.S. Pat. No. 6,066,718, U.S. Pat. No. 6,072,035, PCT/US04/02894, U.S. Pat. No. 5,342,924, U.S. Pat. No. 5,091,313, U.S. Pat. No. 5,449,760, U.S. Pat. No. 5,543,144, U.S. Pat. No. 5,342,924, 및 U.S. Pat. No. 5,614,611, 모두 참조로 본원에 삽입됨)에 기술되어 있다. 다른 유용한 항-IgE 항체는 뮤린 항체 BSW17을 포함한다. 이들 항체의 가변 영역 VH 및 VL의 아미노산 서열이 도 5에 제공된다.

Fc 변이체 및 Fc 수용체 결합 특성

본원에서 기술되는 면역글로불린은 Fc 변이체를 포함할 수 있다. Fc 변이체는 모 Fc 폴리펩타이드에 비해 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하며, 상기 아미노산 변형은 하나 이상의 최적화된 특성을 제공한다. 본원에서 기술되는 Fc 변이체는 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 이의 모와 아미노산 서열이 상이하다. 따라서, 본원에서 기술되는 Fc 변이체는 모와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 변형을 갖는다. 달리, 본원에서 기술되는 Fc 변이체는 모와 비교하여 하나 초과의 아미노산 변형, 예를 들어 모와 비교하여 약 1 내지 50개 아미노산 변형, 예를 들어 약 1 내지 10개 아미노산 변형, 약 1 내지 약 5개 아미노산 변형을 가질 수 있다. 따라서, Fc 변이체의 서열 및 모 Fc 폴리펩타이드의 서열은 실질적으로 상동성이다. 예를 들어, 본원에서 변이체 Fc 변이 서열은 모 Fc 변이 서열과 약 80% 상동성, 예를 들어 적어도 약 90% 상동성, 적어도 약 95% 상동성, 적어도 약 98% 상동성, 적어도 약 99% 상동성 등을 가질 것이다. 본원에서 기술되는 변형은 삽입, 결실 및 치환을 포함한 아미노산 변형을 포함한다. 또한, 본원에서 기술되는 변형은 당형태 변형을 포함한다. 변형은 분자 생물학을 이용하여 유전적으로 만들어지거나 효소적으로 또는 화학적으로 만들어질 수 있다.

본원에서 기술되는 Fc 변이체는 이들을 구성하는 아미노산 변형에 따라 정의된다. 따라서, 예를 들어 S267E는 모 Fc 폴리펩타이드와 비교하여 치환 S267E를 갖는 Fc 변이체이다. 마찬가지로, S267E/L328F는 모 Fc 폴리펩타이드와 비교하여 치환 S267E 및 L328F를 갖는 Fc 변이체이다. WT 아미노산의 정체가 구체화되지 않을 수 있으며, 이러한 경우 상기 변이체는 267E/328F로 나타낸다. 치환이 제공되는 순서는 임의적이다. 즉, 예를 들어 267E/328F는 328F/267E와 동일한 Fc 변이체이다. 달리 주목되지 않는 한, 본원에서 논의되는 위치는 EU 색인 또는 EU 번호매김 설계에 따라 번호를 붙이다 (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, 본원에 전부 참조로 삽입됨). EU 색인 또는 Kabat 또는 EU 번호매길 설계에서의 EU 색인은 EU 항체의 번호매김을 나타낸다 (Edelman et al., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85, 본원에 전부 참조로 삽입됨).

특정 양태에서, 본원에서 기술되는 Fc 변이체는 사람 IgG 서열에 기초하며, 따라서 사람 IgG 서열은, 이로 제한됨이 없이, 다른 유기체로부터의 서열, 예를 들어 설치류 및 영장류 서열을 포함하여 다른 서열이 비교되는 "기초" 서열로서 사용된다. 면역글로불린은 또한 다른 면역글로불린 부류, 예를 들어 IgA, IgE, IgGD, IgGM 등으로부터의 서열을 포함할 수 있다. 비록 본원에서 기술되는 Fc 변이체가 하나의 모 IgG와 관련하여 조작되지만, 변이체는 다른 제2의 모 IgG와 관련하여 조작되거나 "변형"될 수 있다. 이는, 전형적으로 제1 및 제2의 IgG 서열 사이의 서열 또는 구조적 상동에 기초하여, 제1 및 제2의 IgG 사이의 "동등" 또는 "상응" 잔기 및 치환을 결정함으로써 수행된다. 상동성을 확립하기 위해서, 본원에서 개요되는 제1 IgG의 아미노산 서열은 제2 IgG의 서열과 직접적으로 비교된다. 서열을 정렬하고, 당해 기술 분야에 공지된 상동성 정렬 프로그램 중 하나 이상을 이용하며 (예를 들어, 종간의 보존된 잔기를 이용하며), 정렬을 유지하는데 필요한 삽입 및 결실을 감안한 후 (즉, 임의의 결실 및 삽입을 통해 보존된 잔기의 제거를 피한 후), 제1 면역글로불린의 일차 서열에서의 특정 아미노산과 동등한 잔기가 정의된다. 보존된 잔기의 정렬은 이러한 잔기의 100%를 보존할 수 있다. 그러나, 보존된 잔기의 75%보다 많거나 50%와 같은 적은 정렬도 동등한 잔기를 정의하는데 적합하다. 또한, 동등한 잔기는 구조가 결정된 IgG에 대한 3차 구조의 수준에서 제1 및 제2 IgG 사이의 구조적 상동성을 결정함으로써 정의될 수 있다. 이러한 경우, 동등한 잔기는 모 또는 전구체의 특정 아미노산 잔기의 2개 이상의 주쇄 원자에 대한 원자 배위 (N on N, CA on CA, C on C 및 O on O)가 정렬 후 약 0.13 nm 이내인 잔기로 정의된다. 또 다른 양태에서, 동등한 잔기는 정렬 후 약 1 nm 이내이다. 최상의 모델이 단백질의 비-수소 단백질 원자의 원자 배위가 최대로 겹치도록 배향되고 위치된 후 정렬이 이루어진다. 동등 또는 상당 잔기가 어떻게 결정되는 가에 무관하고, IgG가 만들어지는 모 IgG의 정체와 무관하게, 전달하고자 하는 것은 본원에서 기술되는 바와 같이 발견되는 Fc 변이체가 Fc 변이체와 상당한 서열 또는 구조적 상동성을 갖는 임의의 제2의 모 IgG로 조작될 수 있다는 것이다. 따라서, 예를 들어, 모 항체가 사람 IgG1인 항체의 변이 항체가 상술된 방법 또는 동등한 잔기를 결정하기 위한 다른 방법을 이용하여 제조되는 경우, 변이 항체는 상이한 항원을 결합하는 또 다른 IgG1 모항체, 사람 IgG2 모 항체, 사람 IgA 모 항체, 마우스 IgG2a 또는 IgG2b 모 항체 등에서 조작될 수 있다. 또한, 상술된 바와 같이, 모 Fc 변이체의 상황은 본원에서 기술되는 Fc 변이체를 다른 모 IgG에 전달하는 능력에 영향을 끼치지 않는다.

본원에서 기술되는 Fc 변이체는 다양한 Fc 수용체 결합 특성에 대해 최적화될 수 있다. 하나 이상의 최적화된 특성을 나타내도록 조작되거나 예측되는 Fc 변이체가 본원에서는 "최적화된 Fc 변이체"로 언급된다. 최적화될 수 있는 특성은, 이로 제한됨이 없이, FcγR에 대한 증진되거나 감소된 친화성을 포함한다. 하나의 양태에서, 본원에서 기술되는 Fc 변이체는 억제 수용체 FcγRIIb에 대한 증진된 친화성을 갖도록 최적화된다. 다른 양태에서, 본원에서 기술되는 면역글로불린은 FcγRIIb에 대해서는 증진된 친화성을 제공하나, 예를 들어 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa, 및/또는 FcγRIIIb를 포함한 하나 이상의 활성화 FcγR에 대해서는 감소된 친화성을 제공한다. FcγR 수용체는, 이로 제한됨이 없이, 사람, 시노몰구스 멍키 및 마우스를 포함한 임의의 유기체로부터의 세포에서 발현될 수 있다. 본원에서 기술되는 Fc 변이체는 사람 FcγRIIb에 대해 증진된 친화성을 갖도록 최적화될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어인 모 Fc 폴리펩타이드 보다 "큰 친화성" 또는 "개선된 친화성" 또는 "증진된 친화성" 또는 "우수한 친화성"은, 결합 검정에서 변이체 및 모 폴리펩타이드의 양이 본질적으로 동일한 경우, Fc 변이체가 모 Fc 폴리펩타이드보다 상당히 높은 결합 평형 상수 (K_A 또는 Ka) 또는 낮은 해리 평형 상수 (K_D 또는 Kd)로 Fc 수용체에 결합하는 것을 의미한다. 예를 들어, 개선된 Fc 수용체 결합 친화성을 갖는 Fc 변이체는, Fc 수용체 친화성이, 예를 들어, 이로 제한됨이 없이, 비아코어 (Biacore)를 포함한 본원에서 기술되는 결합 방법에 의해 당업자에 의해 측정되는 경우, 모 Fc 폴리펩타이드에 비해 Fc 수용체 친화성이 약 5배 내지 약 1000배, 예를 들어 약 10배 내지 약 500배의 개선을 나타낼 수 있다. 따라서, 본원에서 사용되는 용어인 모 Fc 폴리펩타이드에 비해 "감소된 친화성"은, Fc 변이체가 모 Fc 폴리펩타이드보다 상당히 낮은 K_A 또는 높은 K_D로 Fc 수용체를 결합한다는 것을 의미한다. 더욱 크거나 감소된 친화성은 또한 절대 수준의 친화성과 비교하여 정의될 수 있다. 예를 들어, 본원에서의 자료에 따라, WT (천연) IgG1은 약 2 μM 또는 약 2000 nM의 친화성으로 FcγRIIb를 결합한다. 또한, 본원에서 기술되는 일부 Fc 변이체는 WT IgG1에 대해 약 10배 큰 친화성으로 FcγRIIb를 결합한다. 본원에서 기술되는 바와 같이, 더욱 크거나 증진된 친화성은 약 100 nM 미만의 K_D, 예를 들어 약 10 nM 내지 약 100 nM, 약 1 nM 내지 약 100 nM 또는 약 1 nM 미만의 K_D를 갖는 것을 의미한다.

본 발명의 항-IgE 항체는 바람직하게는 FcγRIIb에 대해 고친화성을 갖는다. 본원에서 고친화성은 항체와 FcγRIIb 사이의 상호작용에 대한 친화성이 100 nM보다 강력하다는 것을 의미한다. 즉, 항체가 FcγRIIb에 결합하는 것에 대한 해리 평형 상수 Kd가 100 nM보다 낮다는 것이다.

하나의 양태에서, Fc 변이체는 하나 이상의 활성화 수용체에 비해 FcγRIIb에 대해 선택적으로 증진된 친화성을 제공한다. 선택적으로 증진된 친화성은, Fc 변이체가 모 Fc 폴리펩타이드와 비교해 활성화 수용체(들)에 비해 FcγRIIb에 대해 개선된 친화성을 가지나 모 Fc 폴리펩타이드와 비교해 활성화 수용체(들)에 대해 감소된 감소된 친화성을 갖는 것을 의미하거나, Fc 변이체가 모 Fc 폴리펩타이드와 비교해 FcγRIIb 및 활성화 수용체(들) 모두에 대해 개선된 친화성을 가지나 친화성의 개선이 활성화 수용체(들)에 대한 것보다 FcγRIIb에 대해 더욱 큰 것을 의미한다. 다른 양태에서, Fc 변이체는, 하나 이상의 활성화 FcγR에 대한 결합이 감소 또는 제거되고/되거나, 하나 이상의 보체 단백질에 대한 결합이 제거 또는 감소되고/되거나, 하나 이상의 FcγR-매개된 이펙터 기능이 감소 또는 제거되고/되거나 하나 이상의 보체-매개된 이펙터 기능이 감소 또는 제거된다.

상이한 다형 형태의 FcγR의 존재는 본원에서 기술되는 Fc 변이체의 치료학적 유용성에 영향을 끼치는 또 다른 변수를 제공한다. 상이한 부류의 FcγR에 대한 소정의 Fc 변이체의 특이성 및 선택성은 소정의 질환을 치료하기 위한 소정의 항원을 표적하는 Fc 변이체의 능력에 영향을 끼치고, 이러한 수용체의 상이한 다형 형태에 대한 Fc 변이체의 특이성 또는 선택성은 어떠한 연구 또는 전임상 실험이 시험에 적합할 수 있는지 및 종국적으로는 어떠한 환자군이 처리에 반응할 수 있는지 또는 할 수 없는지를 부분적으로 결정할 수 있다. 따라서, 이로 제한됨이 없이, FcγRIIa, FcγRIIIa 등을 포함한 Fc 수용체 다형에 대한 본원에서 기술되는 Fc 변이체의 특이성 또는 선택성은 타당한 연구 및 전임상 실험, 임상 시험 고안, 환자 선별, 복용 의존성 및/또는 임상 시험에 관한 기타 측면에 대한 선별을 유도하는데 이용될 수 있다.

본원에서 기술되는 Fc 변이체는, 이로 제한됨이 없이, 보체 단백질, FcRn, 및 Fc 수용체 상동체 (FcRH)를 포함한 FcγR 이외의 Fc 수용체와의 상호작용을 조절하는 변형을 포함할 수 있다. FcRH는, 이로 제한됨이 없이, FcRH1, FcRH2, FcRH3, FcRH4, FcRH5, 및 FcRH6을 포함한다 (Davis et al., 2002, Immunol. Reviews 190:123-136).

소정의 질환을 치료하기 위한 소정의 Fc 변이체의 가장 유리한 선택성을 결정하는 중요한 변수는 Fc 변이체의 상황이다. 따라서, 소정의 Fc 변이체의 Fc 수용체 선택성 또는 특이성은 Fc 변이체가 항체, Fc 융합물 또는 커플링된 융합 파트너를 갖는 Fc 변이체를 구성하는지의 여부에 따라 상이한 특성을 제공할 것이다. 하나의 양태에서, 본원에서 기술되는 Fc 변이체의 Fc 수용체 특이성은 이의 치료적 이용성을 결정할 것이다. 치료적 목적을 위한 소정의 Fc 변이체의 이용은 표적 항원의 에피토프 또는 형태 및 치료될 질환 또는 증상에 의존적일 것이다. 일부 표적물 및 증상에 대해서는 더욱 큰 FcγRIIb 친화성 및 감소된 활성화 FcγR-매개된 이펙터 기능이 유리할 수 있다. 다른 표적 항원 및 치료적 적용을 위해, FcγRIIb에 대한 친화성을 증가시키거나 FcγRIIb와 활성화 수용체 모두에 대한 친화성을 증가시키는 것이 유리할 수 있다.

항- IgE 항체의 활성을 최적화하기 위한 수단

하나 이상의 FcγR에 대한 친화성을 변화시키기 위한 수단이 본원에 기술된다. 바람직한 양태에서, 친화성은 억제 수용체 FcγRIIb를 변화시켜 하나 이상의 FcγRIIb-매개된 억제 이펙터 기능을 매개할 면역글로불린의 능력을 변화시킨다. 본 발명의 수단은 아미노산 변형 (예: 기능을 최적화하기 위한 위치적 수단, 기능을 최적화하기 위한 치환적 수단 등) 및 당형태 변형 (예: 당형태 변형을 위한 수단)을 포함한다.

아미노산 변형

하나 이상의 FcγR에 대한 친화성을 변화시키는 아미노산 변형을 포함하는 면역글로불린이 본원에 기술된다. 바람직하게는, 상기 아미노산 변형은 FcγRIIb에 대한 친화성을 개선한다. 그러나, 일부의 경우, 변형은 하나 이상의 활성화 수용체, 예를 들어 FcγRI, FcγRIIa, 및 FcγRIIIa에 대한 친화성을 개선할 수 있다. FcγR에 대한 결합을 변화시키기 위한 변형이 문헌 (USSN 11/124,620, 출원일: 2005.5.5. 명칭: "Optimized Fc Variants", 및 USSN 12/156,183, 출원일: 2008.5.30, 명칭: "Methods and Compositions for Inhibiting CD32b Expressing Cells", 모두 특별히 본원에 참조로 삽입됨)에 기술되어 있다.

본원에서 기술되는 바와 같이, 항-IgE 항체의 활성을 최적화하기 위한 위치적 수단은, 이로 제한됨이 없이, 면역글로불린 FcγRIIb 결합 특성, 이펙터 기능 및 항체의 잠재적인 임상 특성을 변형시키는, 하나 이상의 중쇄 불변 영역 위치 (예를 들어, 위치 234, 235, 236, 237, 239, 265, 266, 267, 268, 298, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 및 332)에서의 아미노산 변형을 포함한다.

특히, 예를 들어, FcγRIIb에 대한 친화성을 변화시킴으로써, 항-IgE 항체의 활성을 최적화하기 위한 치환적 수단은, 이로 제한됨이 없이, 하나 이상의 중쇄 불변 여역 위치에서의 아미노산의 치환, 예를 들어 하기 중쇄 불변 영역 위치에서의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다: 234, 235, 236, 237, 239, 265, 266, 267, 268, 298, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 및 332 (번호매김은 EU 색인에 따른다). 하나의 양태에서, 치환적 수단은 모 Fc 영역과 비교하여 적어도 하나의 (예를 들어, 2개 이상의) 치환(들)을 포함하며, 상기 변형(들)은 234, 235, 236, 237, 239, 266, 267, 268, 325, 326, 327, 328, 및 332로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 위치에서 수행된다 (번호매김은 EU 색인에 따른다). 하나의 양태에서, 치환적 수단은 235, 236, 239, 266, 267, 268, 및 328로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 위치에서의 하나 이상의 (예를 들어, 2개 이상의) 치환(들)을 포함한다 (번호매김은 EU 색인에 따른다).

하나의 양태에서, 상기 치환적 수단은 하기로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 치환 (예: 하나 이상의 치환(들), 2개 이상의 치환(들) 등)이다: 234F, 234G, 234I, 234K, 234N, 234P, 234Q, 234S, 234V, 234W, 234Y, 234D, 234E, 235A, 235E, 235H, 235I, 235N, 235P, 235Q, 235R, 235S, 235W, 235Y, 235D, 235F, 235T, 236D, 236F, 236H, 236I, 236K, 236L, 236M, 236P, 236Q, 236R, 236S, 236T, 236V, 236W, 236Y, 236A, 236E, 236N, 237A, 237E, 237H, 237K, 237L, 237P, 237Q, 237S, 237V, 237Y, 237D, 237N, 239D, 239E, 239N, 239Q, 265E, 266D, 266I, 266M, 267A, 267D, 267E, 267G, 268D, 268E, 268N, 268Q, 298D, 298E, 298L, 298M, 298Q, 325L, 326A, 326E, 326W, 326D, 327D, 327G, 327L, 327N, 327Q, 327E, 328E, 328F, 328Y, 328H, 328I, 328Q, 328W, 329E, 330D, 330H, 330K, 330S, 331S, 및 332E (번호매김은 EU 색인에 따른다). 하나의 양태에서, 상기 치환적 수단은 하기로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 치환 (예: 하나 이상의 치환(들), 2개 이상의 치환(들) 등)이다: 234N, 234F, 234D, 234E, 234W, 235Q, 235R, 235W, 235Y, 235D, 235F, 235T, 236D, 236H, 236I, 236L, 236S, 236Y, 236E, 236N, 237H, 237L, 237D, 237N, 239D, 239N, 239E, 266I, 266M, 267A, 267D, 267E, 267G, 268D, 268E, 268N, 268Q, 298E, 298L, 298M, 298Q, 325L, 326A, 326E, 326W, 326D, 327D, 327L, 327E, 328E, 328F, 328Y, 328H, 328I, 328Q, 328W, 330D, 330H, 330K, 및 332E (번호매김은 EU 색인에 따른다). 하나의 양태에서, 상기 치환적 수단은 하기로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 치환 (예: 하나 이상의 치환(들), 2개 이상의 치환(들) 등)이다: 234D, 234E, 234W, 235D, 235F, 235R, 235Y, 236D, 236N, 237D, 237N, 239D, 239E, 266M, 267D, 267E, 268D, 268E, 327D, 327E, 328F, 328W, 328Y, 및 332E (번호매김은 EU 색인에 따른다). 하나의 양태에서, 상기 치환적 수단은 하기로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 치환 (예: 하나 이상의 치환(들), 2개 이상의 치환(들) 등)이다: 235Y, 236D, 239D, 266M, 267E, 268D, 268E, 328F, 328W, 및 328Y (번호매김은 EU 색인에 따른다).

하나의 양태에서, 상기 치환적 수단은 하기로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 위치에서의 적어도 2개의 치환 (예를 들어, 변형의 조합)이다: 234/239, 234/267, 234/328, 235/236, 235/239, 235/267, 235/268, 235/328, 236/239, 236/267, 236/268, 236/328, 237/267, 239/267, 239/268, 239/327, 239/328, 239/332, 266/267, 267/268, 267/325, 267/327, 267/328, 267/332, 268/327, 268/328, 268/332, 326/328, 327/328, 및 328/332 (번호매김은 EU 색인에 따른다). 하나의 양태에서, 상기 치환적 수단은 하기로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 위치에서의 적어도 2개의 치환 (예를 들어, 변형의 조합)이다: 235/267, 236/267, 239/268, 239/267, 267/268, 및 267/328 (번호매김은 EU 색인에 따른다). 하나의 양태에서, 상기 치환적 수단은 하기로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 위치에서의 적어도 2개의 치환 (예를 들어, 변형의 조합)이다: 234D/267E, 234E/267E, 234F/267E, 234E/328F, 234W/239D, 234W/239E, 234W/267E, 234W/328Y, 235D/267E, 235D/328F, 235F/239D, 235F/267E, 235F/328Y, 235Y/236D, 235Y/239D, 235Y/267D, 235Y/267E, 235Y/268E, 235Y/328F, 236D/239D, 236D/267E, 236D/268E, 236D/328F, 236N/267E, 237D/267E, 237N/267E, 239D/267D, 239D/267E, 239D/268D, 239D/268E, 239D/327D, 239D/328F, 239D/328W, 239D/328Y, 239D/332E, 239E/267E, 266M/267E, 267D/268E, 267E/268D, 267E/268E, 267E/325L, 267E/327D, 267E/327E, 267E/328F, 267E/328I, 267E/328Y, 267E/332E, 268D/327D, 268D/328F, 268D/328W, 268D/328Y, 268D/332E, 268E/328F, 268E/328Y, 327D/328Y, 328F/332E, 328W/332E, 및 328Y/332E (번호매김은 EU 색인에 따른다).

하나의 양태에서, 상기 치환적 수단으로 적어도 하나의 하기의 치환 또는 치환의 조합이 생긴다: 234F/236N, 234F/236D, 236A/237A, 236S/237A, 235D/239D, 234D/267E, 234E/267E, 234F/267E, 235D/267E, 235F/267E, 235S/267E, 235T/267E, 235Y/267D, 235Y/267E, 236D/267E, 236E/267E, 236N/267E, 237D/267E, 237N/267E, 239D/267D, 239D/267E, 266M/267E, 234E/268D, 236D/268D, 239D/268D, 267D/268D, 267D/268E, 267E/268D, 267E/268E, 267E/325L, 267D/327D, 267D/327E, 267E/327D, 267E/327E, 268D/327D, 239D/328Y, 267E/328F, 267E/328H, 267E/328I, 267E/328Q, 267E/328Y, 268D/328Y, 239D/332E, 328Y/332E, 234D/236N/267E, 235Y/236D/267E, 234W/239E/267E, 235Y/239D/267E, 236D/239D/267E, 235Y/267E/268E, 236D/267E/268E, 239D/267E/268E, 234W/239D/328Y, 235F/239D/328Y, 234E/267E/328F, 235D/267E/328F, 235Y/267E/328F, 236D/267E/328F, 239D/267A/328Y, 239D/267E/328F, 234W/268D/328Y, 235F/268D/328Y, 239D/268D/328F, 239D/268D/328W, 239D/268D/328Y, 239D/268E/328Y, 267A/268D/328Y, 267E/268E/328F, 239D/326D/328Y, 268D/326D/328Y, 239D/327D/328Y, 268D/327D/328Y, 239D/267E/332E, 234W/328Y/332E, 235F/328Y/332E, 239D/328F/332E, 239D/328Y/332E, 267A/328Y/332E, 268D/328F/332E, 268D/328W/332E, 268D/328Y/332E, 268E/328Y/332E, 326D/328Y/332E, 327D/328Y/332E, 234W/236D/239E/267E, 239D/268D/328F/332E, 239D/268D/328W/332E, 및 239D/268D/328Y/332E (번호매김은 EU 색인에 따른다). 하나의 양태에서, 상기 치환적 수단으로 적어도 하나의 하기의 치환 또는 치환의 조합이 생긴다: 266D, 234F/236N, 234F/236D, 236A/237A, 236S/237A, 235D/239D, 234D/267E, 234E/267E, 234F/267E, 235D/267E, 235F/267E, 235S/267E, 235T/267E, 235Y/267D, 236D/267E, 236E/267E, 236N/267E, 237D/267E, 237N/267E, 266M/267E, 234E/268D, 236D/268D, 267D/268D, 267D/268E, 267E/268D, 267E/268E, 267E/325L, 267D/327D, 267D/327E, 267E/327E, 268D/327D, 239D/328Y, 267E/328F, 267E/328H, 267E/328I, 267E/328Q, 267E/328Y, 268D/328Y, 234D/236N/267E, 235Y/236D/267E, 234W/239E/267E, 235Y/239D/267E, 236D/239D/267E, 235Y/267E/268E, 236D/267E/268E, 234W/239D/328Y, 235F/239D/328Y, 234E/267E/328F, 235D/267E/328F, 235Y/267E/328F, 236D/267E/328F, 239D/267A/328Y, 239D/267E/328F, 234W/268D/328Y, 235F/268D/328Y, 239D/268D/328F, 239D/268D/328W, 239D/268D/328Y, 239D/268E/328Y, 267A/268D/328Y, 267E/268E/328F, 239D/326D/328Y, 268D/326D/328Y, 239D/327D/328Y, 268D/327D/328Y, 234W/328Y/332E, 235F/328Y/332E, 239D/328F/332E, 239D/328Y/332E, 267A/328Y/332E, 268D/328F/332E, 268D/328W/332E, 268D/328Y/332E, 268E/328Y/332E, 326D/328Y/332E, 327D/328Y/332E, 234W/236D/239E/267E, 239D/268D/328F/332E, 239D/268D/328W/332E, 및 239D/268D/328Y/332E (번호매김은 EU 색인에 따른다). 하나의 양태에서, 상기 치환적 수단으로 적어도 하나의 하기의 치환 또는 치환의 조합이 생긴다: 234N, 235Q, 235R, 235W, 235Y, 236D, 236H, 236I, 236L, 236S, 236Y, 237H, 237L, 239D, 239N, 266I, 266M, 267A, 267D, 267E, 267G, 268D, 268E, 268N, 268Q, 298E, 298L, 298M, 298Q, 326A, 326E, 326W, 327D, 327L, 328E, 328F, 330D, 330H, 330K, 234F/236N, 234F/236D, 235D/239D, 234D/267E, 234E/267E, 234F/267E, 235D/267E, 235F/267E, 235T/267E, 235Y/267D, 235Y/267E, 236D/267E, 236E/267E, 236N/267E, 237D/267E, 237N/267E, 239D/267D, 239D/267E, 266M/267E, 234E/268D, 236D/268D, 239D/268D, 267D/268D, 267D/268E, 267E/268D, 267E/268E, 267E/325L, 267D/327D, 267D/327E, 267E/327D, 267E/327E, 268D/327D, 239D/328Y, 267E/328F, 267E/328H, 267E/328I, 267E/328Q, 267E/328Y, 268D/328Y, 239D/332E, 328Y/332E, 234D/236N/267E, 235Y/236D/267E, 234W/239E/267E, 235Y/239D/267E, 236D/239D/267E, 235Y/267E/268E, 236D/267E/268E, 239D/267E/268E, 234W/239D/328Y, 235F/239D/328Y, 234E/267E/328F, 235D/267E/328F, 235Y/267E/328F, 236D/267E/328F, 239D/267A/328Y, 239D/267E/328F, 234W/268D/328Y, 235F/268D/328Y, 239D/268D/328F, 239D/268D/328W, 239D/268D/328Y, 239D/268E/328Y, 267A/268D/328Y, 267E/268E/328F, 239D/326D/328Y, 268D/326D/328Y, 239D/327D/328Y, 268D/327D/328Y, 239D/267E/332E, 234W/328Y/332E, 235F/328Y/332E, 239D/328F/332E, 239D/328Y/332E, 267A/328Y/332E, 268D/328F/332E, 268D/328W/332E, 268D/328Y/332E, 268E/328Y/332E, 326D/328Y/332E, 327D/328Y/332E, 234W/236D/239E/267E, 239D/268D/328F/332E, 239D/268D/328W/332E, 및 239D/268D/328Y/332E.

하나의 양태에서, 상기 치환적 수단으로 적어도 하나의 하기 치환 또는 치환의 조합이 생긴다: 235Y/267E, 236D/267E, 239D/268D, 239D/267E, 267E/268D, 267E/268E, 및 267E/328F (번호매김은 EU 색인에 따른다).

본 발명의 일부 양태에서, 면역글로불린은 이소타입 변형, 즉 모 IgG에서 대체 IgG의 아미노산 타입으로의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, IgG1/IgG3 하이브리드 변이체는 2개의 이소타입이 상이한 위치에서 CH2 및/또는 CH3 영역에서의 IgG1 위치를 IgG3로부터의 아미노산으로 치환하기 위한 치환적 수단에 의해 제작될 수 있다. 따라서, 하나 이상의 치환적 수단, 예를 들어 274Q, 276K, 300F, 339T, 356E, 358M, 384S, 392N, 397M, 422I, 435R, 및 436F를 포함하는 하이브리드 변이 IgG 항체가 제작될 수 있다. 본 발명의 하나의 양태에서, IgG1/IgG2 하이브리드 변이체는 2개의 이소타입이 상이한 위치에서 CH2 및/또는 CH3 영역에서의 IgG2 위치를 IgG1으로부터의 아미노산으로 치환하기 위한 치환적 수단에 의해 제작될 수 있다. 따라서, 하나 이상의 치환적 수단, 예를 들어 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함하는 하이브리드 변이 IgG 항체는 제작될 수 있다: 233E, 234L, 235L, -236G (위치 236에서 글리신의 삽입을 나타냄), 및 327A.

당형태 변형

항체를 포함한 많은 폴리펩타이드는 탄수화물 잔기를 필요로 하는 다양한 해독후 변형, 예를 들어 올리고사카라이드로 글리코실화된다. 글리코실화에 영향을 끼칠 수 있는 수개의 요인이 있다. 종, 조직 및 세포 유형이 글리코실화 발생에 중요한 것으로 밝혀졌다. 또한, 변화된 배양 조건, 예를 들어 혈청 농도를 통한 세포외 환경이 글리코실화에 직접적 영향을 끼칠 수 있다 (Lifely et al., 1995, Glycobiology 5(8): 813-822).

모든 항체가 중쇄 불변 영역의 보존된 위치에서 탄수화물을 포함한다. 각각의 항체 이소타입은 별개의 상이한 N-연결된 탄수화물 구조를 갖는다. 중쇄에 부착된 탄수화물과는 별도로, 30% 이사의 사람 IgG가 글리코실화된 Fab 영역을 갖는다. IgG는 CH2 도메인의 Asn297에 단일의 N-연결된 비안테나리 (biantennary) 탄수화물을 갖는다. 혈청으로부터 또는 하이브리도마 또는 조작된 세포에서 생체외로 생성된 IgG에 있어, IgG는 Asn297 연결된 탄수화물에 대해 이질이다 (Jefferis et al., 1998, Immunol. Rev. 163:59-76; Wright et al., 1997, Trends Biotech 15:26-32). 사람 IgG에 있어, 코어 올리고사카라이드는 통상적으로 GlcNAc₂Man₃GlcNAc로 이루어지며, 바깥 잔기의 번호는 상이하다.

본원에서 기술되는 면역글로불린의 탄수화물 잔기는 올리고사카라이드의 기술을 위해 통상 사용된 명명법과 관련하여 기술될 것이다. 이러한 명명법을 이용하는 탄수화물 화학에 대한 검토가 문헌 (Hubbard et al. 1981, Ann. Rev. Biochem. 50:555-583)에 나타나 있다. 이러한 명명법은, 예를 들어 Man (만노즈를 나타낸다); GlcNAc (2-N-아세틸글루코사민을 나타낸다); Gal (갈락토즈를 나타낸다); Fuc (프럭토즈를 나타낸다); Glc (글루코즈를 나타낸다)를 포함한다. 시알산은 5-N-아세틸뉴라민산에 대해서는 속기 표시 NeuNac로 기술되고, 글리콜릴뉴라민산에 대해서는 NeuNGcf 기술된다.

용어 "글리코실화"는 올리고사카라이드 (함께 연결된 2개 이상의 단순 슈가, 예를 들어 함께 연결된 2 내지 약 12개 단순 슈가를 포함하는 탄수화물)의 당단백질에의 부착을 의미한다. 올리고사카라이드 측쇄는 전형적으로 N- 또는 O-연결을 통해 당단백질의 골격에 연결된다. 본원에서 기술되는 면역글로불린의 올리고사카라이드는 N-연결된 올리고사카이드로서 Fc 영역의 CH2 도메인에 부착된다. "N-연결된 글리코실화"는 탄수화물 잔기가 당단백질 쇄의 아스파라긴 잔기에 부착하는 것을 나타낸다. 당업자는, 예를 들어 뮤린 IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3, 및 사람 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgD CH2 도메인 각각이 아미노산 잔기 297에서 N-연결된 글리코실화를 위한 단일 부위를 갖는다는 것을 인식할 것이다 (Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 1991).

본원에서의 목적상, "성숙 코어 탄수화물 구조"는 Fc 영역에 부착되는 프로세싱된 코어 탄수화물 구조를 나타내며, 일반적으로 비안테나리 올리고사카라이드의 전형인 탄수화물 구조 GlcNAc(푸코즈)-GlcNAc-Man-(Man-GlcNAc)₂로 이루어진다. 성숙 코어 탄수화물 구조는, 일반적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-연결을 통해, 당단백질의 Fc 영역에 부착된다. "이등분 (bisecting) GlcNAc"는 성숙 코어 탄수화물 구조의 β1,4 만노즈에 부착되는 GlcNAc 잔기이다. 이등분 GlcNAc는 β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스페라제 III 효소 (GnTIII)에 의해 성숙 코어 탄수화물 구조에 효소적으로 부착될 수 있다. CHO 세포는 통상적으로는 GnTIII를 발현하지 않지만 (Stanley et al., 1984, J. Biol. Chem. 261:13370-13378), GnTIII를 발현하도록 조작될 수 있다 (Umana et al., 1999, Nature Biotech. 17:176-180).

변형된 당형태 또는 조작된 당형태를 포함하는 Fc 변이체가 본원에 기술된다. 본원에서 사용되는 "변형된 당형태" 또는 "조작된 당형태"는 단백질, 예를 들어 항체에 공유적으로 부착되는 탄수화물 조성물을 의미하며, 상기 탄수화물 조성물은 모 단백질과는 화학적으로 상이하다. 조작된 당형태는, 이로 제한됨이 없이, FcγR-매개된 이펙터 기능을 증진 또는 감소시키는 것을 포함하여 다양한 목적에 유용할 수 있다. 하나의 양태에서, 본원에서 기술되는 면역글로불린은 Fc 영역에 공유적으로 부착되는 푸코실화 및/또는 이등분 올리고사카라이드의 수준을 조절하기 위해 변형된다.

변형된 당형태를 생성하기 위한 다양한 방법이 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있다 (Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473); (U.S. Pat. No. 6,602,684; USSN 10/277,370; USSN 10/113,929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/29246A1; PCT WO 02/31140A1; PCT WO 02/30954A1); (Potelligent^TM technology [Biowa, Inc., Princeton, N.J.]; GlycoMAb^TM glycosylation engineering technology [GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland]; 모두 특별히 참조로 삽입됨). 이들 기술은, 예를 들어 다양한 유기체 또는 세포주 (조작되거나 달리 처리됨) (예를 들어, Lec-13 CHO 세포 또는 래트 하이브리도마 YB2/0 세포)에서 IgG를 발현하거나, 글리코실화 경로에 수반되는 효소 (예를 들어, FUT8 [α1,6-푸코실트랜스퍼라제] 및/또는 β1-4-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III [GnTIII])를 조절하거나, IgG가 발현된 후 탄수화물(들)을 변형시킴으로써, Fc 영역에 공유적으로 부착되는 푸코실화 및/또는 이등분 올리고사카라이드의 수준을 조절한다. 본원에서 기술되는 면역글로불린의 당형태를 변형시키기 위한 다른 방법은 효모 (Li et al., 2006, Nature Biotechnology 24(2):210-215), 이끼 (Nechansky et al., 2007, Mol Immunjol 44(7):1826-8), 및 식물 (Cox et al., 2006, Nat Biotechnol 24(12):1591-7)의 당조작된 스트레인을 이용하는 것을 포함한다. 변형된 당형태를 생성하기 위한 특정 방법의 이용이 다른 방법에 대한 양태를 제한하려는 것은 아니다. 오히려, 본원에서 기술되는 양태는 이들이 어떻게 생성되는 가와 무관하게 변형된 당형태를 갖는 Fc 변이체를 포함한다.

하나의 양태에서, 본원에서 기술되는 면역글로불린은 시알릴화 수준을 변화시키기 위해 당조작된다. 면역글로불린 G 분자 중 고수준의 시알릴화된 Fc 글리칸은 작용적으로 불리하게 영향을 끼칠 수 있으며 (Scallon et al., 2007, Mol. Immunol. 44(7):1524-34), Fc 시알릴화 수준의 차이로 변형된 소염 활성을 초래할 수 있다 (Kaneko et al., 2006. Science 313:670-673). 항체는 Fc 코어 폴리펩타이드의 시알릴화 시 소염 특성을 수득할 수 있으므로, 더욱 크거나 감소된 Fc 시알산 함량을 위해 본원에서 기술되는 면역글로불린을 당조작하는 것이 유리할 수 있다.

조작된 당형태는 전형적으로 상이한 탄수화물 또는 올리고사카라이드을 언급하며, 예를 들어 면역글로불린은 조작된 당형태를 포함할 수 있다. 달리, 조작된 당형태는 상이한 탄수화물 또는 올리고사카라이드를 포함하는 면역글로불린을 언급할 수 있다. 하나의 양태에서, 본원에서 기술되는 조성물은 Fc 영역을 갖는 글리코실화된 Fc 변이체를 포함하며, 조성물 중 약 51 내지 100%의 글리코실화 항체, 예를 들어 80 내지 100%, 90 내지 100%, 95 내지 100% 등의 항체가 푸코즈가 결여된 성숙 코어 탄수화물 구조를 포함한다. 또 다른 양태에서, 조성물 중의 항체는 모두 푸코즈가 결여된 성숙 코어 탄수화물 구조를 포함하고, 추가로 Fc 영역에 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다. 다른 양태에서, 조성물은 Fc 영역을 갖는 글리코실화된 Fc 변이체를 포함하며, 조성물 중 글리코실화 항체의 약 51 내지 100%, 항체의 80 내지 100% 또는 90 내지 100%가 시알산이 결여된 성숙 코어 탄수화물 구조를 포함한다. 또 다른 양태에서, 조성물의 항체는 모두 시알산이 결여된 성숙 코어 탄수화물 구조물을 포함하고, 추가로 Fc 영역에 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다. 또 다른 양태에서, 조성물은 Fc 영역을 갖는 글리코실화된 Fc 변이체를 포함하며, 조성물 중 글리코실화된 항체의 약 51 내지 100%, 항체의 80 내지 100% 또는 90 내지 100%가 시알산을 함유하는 성숙 코어 탄수화물 구조를 포함한다. 또 다른 양태에서, 조성물 중의 항체는 모두 시알산을 포함하는 성숙 코어 탄수화물 구조를 포함하고, 추가로 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 또 다른 양태에서, 조작된 당형태와 아미노산 변형의 조합이 항체에 대한 최적의 Fc 수용체 결합 특성을 제공한다.

기타 변형

본원에서 기술되는 면역글로불린은 구체적으로 FcγR- 또는 보체-매개된 이펙터 기능 그 자체와는 관련되지 않는 최적화된 특성을 제공하는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 상기 변형은 아미노산 변형일 수 있으며, 효소적으로나 화학적으로 만들어진 변형일 수 있다. 이러한 변형(들)은 마찬가지로 면역글로불린에서 상당한 개선, 예를 들어 안정성, 용해도, 기능 또는 임상 사용의 증진을 제공한다. 본원에는 이에 기술되는 면역글로불린을 추가의 변형과 커플링함으로써 달성될 수 있는 다수의 개선이 기술된다.

하나의 양태에서, 본원에서 기술되는 항체의 가변 영역은 친화성 성숙될 수 있다. 즉, 아미노산 변형이 표적 항원에 대한 항체의 결합을 증진시키기 위해 항체의 VH 및/또는 VL 도메인에 가해진다. 이러한 유형의 변형은 표적 항원에 대한 결합을 위한 결합 및/또는 해리 역학을 개선할 수 있다. 기타 변형은 표적 항원 대 대안적 표적물에 대한 선택성을 개선하는 것을 포함한다. 이들은 표적 세포 상에서 발현되는 항원 대 비-표적 세포 상에서 발현되는 항원에 대한 선택성을 개선하는 변형을 포함한다. 표적물 인식 특성에 대한 기타 개선이 추가의 변형에 의해 제공될 수 있다. 이러한 특성은, 이로 제한됨이 없이, 특정 역학 특성 (즉, 결합 및 해리 역학), 특정 표적물 대 대안적 표적물에 대한 선택성, 및 표적물의 특정 형태 대 대안적 형태에 대한 선택성을 포함할 수 있다. 예로는 전체 길이 대 스플라이스 변이체, 세포-표면 대 가용성 형태, 다양한 다형 변이체에 대한 선택성, 또는 표적 항원의 특정한 구조적 형태에 대한 선택성을 포함한다. 본원에서 기술되는 면역글로불린은 면역글로불린의 감소되거나 증진된 내재화를 포함할 수 있다.

하나의 양태에서, 변형은, 이로 제한됨이 없이, 안정성, 용해도 및 올리고머 상태를 포함한, 본원에서 기술되는 면역글로불린의 생물물리적 특성을 개선하기 위해 이루어진다. 변형은, 예를 들어 더욱 큰 안정성을 제공하는 것과 같이 면역글로불린에서 보다 유리한 분자내 상호작용을 제공하는 치환, 또는 더욱 높은 용해도를 위해 노출된 비극성 아미노산의 극성 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다. 본원에서 기술되는 면역글로불린에 대한 기타 변형은 호모이량체 또는 호모다량체 분자의 특수한 형성을 가능하게 하는 변형을 포함한다. 이러한 변형은, 이로 제한됨이 없이, 조작된 디설파이드, 및 공유적 호모이량체 또는 호모다량체를 생성하기 위한 기작을 제공할 수 있는 화학적 변형 또는 집성 방법을 포함한다. 본원에서 기술되는 변이체에 대한 추가의 변형은 헤테로이량체, 헤테로다량체, 이작용성 및/또는 다작용성 분자의 특수한 형성을 가능하게 하는 변형을 포함한다. 이러한 변형은, 이로 제한됨이 없이, CH3 도메인에서의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하며, 이때 치환은 호모이량체 형성을 감소시키고 헤테로이량체 형성을 증가시킨다. 추가의 변형은 힌지 및 CH3 도메인에서의 변형을 포함하며, 이때 변형은 이량체 형성 경향을 감소시킨다.

추가의 양태에서, 본원에서 기술되는 면역글로불린은 단백질분해 부위를 제거하는 변형을 포함한다. 이들은, 예를 들어 생산 수율을 감소시키는 부위, 및 생체내에서 투여된 단백질을 분해하는 프로테아제 부위를 포함할 수 있다. 하나의 양태에서, 추가의 변형은 공유적 분해 부위, 예를 들어 탈아미드화 (즉, 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 상응하는 글루타밀 및 아스파틸 잔기로의 탈아미드화), 산화 및 단백질분해 부위를 제거하도록 가해진다. 제거할 특히 유용한 탈아미드화 부위는, 이로 제한됨이 없이, 아스파라기닐 및 글루타밀 잔기에 이어 글리신 (각각 NG 및 QG 모티프)을 포함하는, 탈아미드화에 대해 증대된 경향을 갖는 부위이다. 이러한 경우, 잔기의 치환은 탈아미드화 경향을 상당히 감소시킬 수 있다. 일반적인 산화 부위는 메티오닌 및 시스테인 잔기를 포함한다. 도입되거나 제거될 수 있는 다른 공유적 변형은 프롤린 및 리신의 하이드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 하이드록실 그룹의 포스포릴화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 아미노 그룹의 메틸화 (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983), 참조로 전부 삽입됨), N-말단 아민의 아세틸화, 및 임의의 C-말단 카복실 그룹의 아미드화를 포함한다. 또한, 추가의 변형은, 이로 제한됨이 없이, 해독후 변형, 예를 들어 N-연결된 또는 O-연결된 글리코실화 및 포스포릴화를 포함할 수 있다.

변형은 생물제제의 생성을 위해 통상 사용되는 숙주 또는 숙주 세포로부터 발현 및/또는 정제 수율을 개선하는 변형을 포함할 수 있다. 이는, 이로 제한됨이 없이, 다양한 포유동물 세포주 (예: CHO), 효소 세포주, 세균 세포주 및 식물을 포함한다. 추가의 변형은 쇄간 디설파이드 연결을 형성할 중쇄의 능력을 제거하거나 감소시키는 변형을 포함한다. 추가의 변형은 쇄내 디설파이드 연결을 형성할 중쇄의 능력을 제거하거나 감소시키는 변형을 포함한다.

본원에서 기술되는 면역글로불린은, 이로 제한됨이 없이, 문헌 (Cropp & Shultz, 2004, Trends Genet. 20(12):625-30, Anderson et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(2):7566-71, Zhang et al., 2003, 303(5656):371-3, Chin et al., 2003, Science 301(5635):964-7, 모두 참조로 전부 삽입됨)에 기술된 방법을 포함하여 슐츠 (Schultz) 및 동료에 의해 개발된 기술을 이용하여 삽입되는 비천연 아미노산의 사용을 포함하는 변형을 포함할 수 있다. 일부의 양태에서, 이들 변형은 상기 기술된 다양한 기능적, 생물물리적, 면역학적 또는 제조적 특성의 조작을 가능하게 할 수 있다. 추가의 양태에서, 이들 변형은 다른 목적을 위한 추가의 화학적 변형을 가능하게 할 수 있다. 다른 변형도 본원에서 고려된다. 예를 들어, 면역글로불린은 다양한 비단백질성 중합체 중의 하나, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체에 연결될 수 있다. 추가의 아미노산 변형이 면역글로불린의 특수한 또는 비특수한 화학적 또는 해독후 변형을 가능하게 할 수 있도록 가해질 수 있다. 이러한 변형은, 이로 제한됨이 없이, 페길화 (PEGylation) 및 글리코실화를 포함한다. 페길화를 가능하게 하기 위해 이용될 수 있는 특정 치환은, 이로 제한됨이 없이, PEG 또는 다른 중합체 잔기를 부착하기 위해 효과적인 특정한 커플링 화학이 이용될 수 있도록 새로운 시스테인 잔기 또는 비천연 아미노산을 도입하는 것을 포함한다. 특정 글리코실화 부위의 도입은 새로운 N-X-T/S 서열을 본원에서 기술되는 면역글로불린에 도입함으로써 달성될 수 있다.

면역원성을 감소시키기 위한 변형은 모 서열로부터 유도되는 프로세싱된 펩타이드의 MHC 단백질에 대한 결합을 감소시키는 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 변형은, 임의의 보편적인 MHC 대립형질에 고친화성으로 결합할 것으로 예상되는 면역 에피토프가 없거나 최소의 수를 갖도록 조작된다. 단백질 서열 중 MHC-결합 에피토프를 확인하는 수개의 방법이 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 본원에서 기술되는 항체에서 에피토프를 스코어링하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 (USSN 09/903,378, USSN 10/754,296, USSN 11/249,692, 이에 인용된 문헌, 모두 특별히 참조로 삽입됨)을 참조한다.

일부 양태에서, 본원에서 사용되는 면역글로불린은 FcRn 결합을 변화시키는 면역글로불린과 조합될 수 있다. 이러한 변이체는 면역글로불린에 대해 개선된 약동학적 특성을 제공할 수 있다. FcRn에 대한 결합을 증진시키고/시키거나 약동학적 특성을 개선하는 바람직한 변이체는, 이로 제한됨이 없이, 예를 들어 259I, 308F, 428L, 428M, 434S, 434H, 434F, 434Y, 및 434M을 포함하여, 위치 259, 308, 428, 및 434에서의 치환을 포함한다 (PCT/US2008/088053, 출원일: 2008. 12.22. 명칭: "Fc Variants with Alterned Binding to FcRn", 모두 참조로 삽입됨). FcRn에 대한 Fc의 결합을 증진시키는 다른 변이체는, 이로 제한됨이 없이, 250E, 250Q, 428L, 428F, 250Q/428L (Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216, Hinton et al. 2006 Journal of Immunology 176:346-356), 256A, 272A, 286A, 305A, 307A, 311A, 312A, 376A, 378Q, 380A, 382A, 434A (Shields et al, Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591-6604, 전부 참조로 삽입됨), 252F, 252T, 252Y, 252W, 254T, 256S, 256R, 256Q, 256E, 256D, 256T, 309P, 311S, 433R, 433S, 433I, 433P, 433Q, 434H, 434F, 434Y, 252Y/254T/256E, 433K/434F/436H, 308T/309P/311 S (Dall Acqua et al. Journal of Immunology, 2002, 169:5171-5180, Dall'Acqua et al., 2006, The Journal of biological chemistry 281:23514-23524, 전부 참조로 삽입됨)를 포함한다.

항체의 공유적 변형은 본원에서 기술되는 면역글로불린의 범위에 속하며, 항상은 아니나 일반적으로 해독후 변형으로 수행된다. 예를 들어, 항체의 특정 아미노산 잔기를 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시킴으로써 항체의 공유적 변형에 대한 수개의 유형이 분자에 도입된다.

일부 양태에서, 본원에서 기술되는 항체의 공유적 변형은 하나 이상의 표지물 첨가를 포함한다. 용어 "표지 그룹"은 임의의 검출가능한 표지물을 의미한다. 일부 양태에서, 표지 그룹은 잠재적 입체 방해를 감소시키기 위한 다양한 길이의 스페이서 암을 통해 항체에 커플링된다. 단백질을 표지하기 위한 다양한 방법이 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 본원에서 기술되는 면역글로불린을 생성하는데 사용될 수 있다.

컨주게이트

하나의 양태에서, 본원에서 기술되는 공동구속 분자는, 이따금 본원에서 "항체 컨주게이트"로 언급되는, 항체 "융합 단백질"이다. 융합 파트너 또는 컨주게이트 파트너는 단백질 또는 비단백질일 수 있으며, 후자는 일반적으로 항체 및 컨주게이트 파트너 상의 작용 그룹을 사용하여 생성된다. 컨주게이트 및 융합 파트너는 소분자 화합물 및 폴리펩타이드를 포함하는 임의의 분자일 수 있다. 예를 들어, 다양한 항체 컨주게이트 및 방법이 문헌 (Trail et al., 1999, Curr. Opin. Immunol. 11:584-588, 참조로 전부 삽입됨)에 기술되어 있다. 가능한 컨주게이트 파트너는, 이로 제한됨이 없이, 사이토킨, 세포독성제, 독소, 방사성동위원소, 화학치료제, 항-혈관형성제, 타이로신 키나제 억제제 및 기타 치료학적 활성제를 포함한다. 일부 양태에서, 컨주게이트 파트너는 페일로드에 따라 더해지는 것으로 생각될 수 있다. 즉, 컨주게이트의 목표는 면역글로불린에 의해 표적 세포, 예를 들어 암 세포 또는 면역 세포에 컨주게이트 파트너를 표적 전달하는 것이다. 따라서, 예를 들어 독소의 면역글로불린으로의 컨주게이션은 독소를 표적 항원을 발현하는 세포로 전달하는 것을 표적한다. 당업자라면 알 수 있는 바와 같이, 실제로 융합 및 컨주게이트의 개념 및 정의가 겹친다. 융합 또는 컨주게이트의 명칭은 이를 본원에 기술된 임의의 특정 양태로 제한하려는 것은 아니다. 오히려, 이들 용어는 본원에 기술되는 임의의 면역글로불린이 얼마간의 바람직한 특성을 제공하기 위해 하나 이상의 폴리펩타이드 또는 분자에 유전적으로, 화학적으로 또는 달리 연결될 수 있다는 광범위한 개념을 전달하기 위해 엄격하지 않게 사용된다.

적합한 컨주게이트는, 이로 제한됨이 없이, 후술되는 바와 같은 표지물, 약물 및, 이로 제한됨이 없이, 세포독성 약물 (예: 화학요법제) 또는 독소 또는 이러한 독소의 활성 단편을 포함하는, 세포독성제를 포함한다. 적합한 독소 및 이의 상응하는 단편은 디페테리아 A 쇄 외독소 A 쇄, 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 쿠르신, 크로틴, 페노마이신, 에노마이신등을 포함한다. 또한, 세포독성제는 방사성동위원소를 항체에 컨주게이션시키거나, 방사성핵종을 항체에 공유적으로 부착된 킬레이트화제에 결합시킴으로써 제조되는 방사성화학물을 포함한다. 추가의 양태는 칼리케아미신, 아우리스타틴, 겔다나마이신, 마이탄신 및 두오카르마이신 및 동족체를 사용한다.

하나의 양태에서, 본원에서 기술되는 공동구속 분자는 사이토킨에 융합되거나 컨주게이션된다. 본원에서 사용되는 "사이토킨"은 세포간 매개자로서 또 다른 세포에 작용하는 하나의 세포군에 의해 방출되는 단백질에 대한 일반적인 용어를 의미한다. 예를 들어, 문헌 (Penichet et al., 2001, J. Immunol. Methods 248:91-101, 참조로 전부 삽입됨)에 기술되어 있는 바와 같이, 사이토킨은 일군의 바람직한 특성을 제공하도록 항체에 융합될 수 있다. 이러한 사이토킨의 예는 림포카인, 모노카인 및 전형적 폴리펩타이드 호르몬이다. 사이토킨에는 성장 호르몬, 예를 들어 사람 성장 호르몬, N-메티오닐 사람 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 프로렐락신; 당단백질 호르몬, 예를 들어 여포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH) 및 황체 형성 호르몬 (LH); 간 성장 인자; 섬유아세포 성장 인자; 프롤락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 뮬러관-억제 물질; 마우스 고나도트로핀-결합 펩타이드; 인히빈; 악티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); 신경 성장 인자, 예를 들어 NGF-베타; 혈소판-성장 인자; 형질전환 성장 인자 (TGF), 예를들어 TGF-알파 및 TGF-베타; 인슐린-유사 성장 인자-I 및-II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도 인자; 인터페론, 예를 들어 인터페론-알파, 베타 및 -감마; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어 대식구-CSF (M-CSF); 과립구-대식구-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF (G-CSF); 인터루킨 (IL), 예를 들어 IL-1, IL-1알파, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15, 종양 괴사 인자, 예를 들어 TNF-알파 또는 TNF-베타; C5a; 및 LIF 및 키트 리단드 (KL)를 포함한 다른 폴리펩타이드가 포함된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 사이토킨은 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단밸질 및 천연 서열 사이토킨의 생물학적 활성 대등표현을 포함한다.

또 다른 양태에서, 본원에서 기술되는 공동구속 분자는 종양 예비표적 (pretargeting)에 이용하기 위해 "수용체" ((예: 스트렙트아비딘)에 컨주게이션될 수 있으며, 이때 면역글로불린-수용체 컨주게이트는 환자에게 투여된 후 소거제를 사용한 순환되는 비결합된 컨주게이트의 제거 및 세포독성제 (예: 방사성뉴클레오타이드)에 컨주게이션된 "리간드" (예: 아비딘)의 투여가 이어진다. 다른 양태에서, 면역글로불린은 항체 의존적 효소 매개된 프로드럭 치료 (ADEPT)를 이용하기 위해 효소에 컨주게이션되거나 작동적으로 연결된다. ADEPT는 프로드럭 (예: 펩티딜 화학치료제)을 전환시키는 프로드럭-활성화 효소에 면역글로불린을 컨주게이션시키거나 작동적으로 연결함으로써 이용될 수 있다.

면역글로불린 파트너가 컨주게이트로 사용되는 경우, 컨주게이트 파트너는, N- 또는 C-말단 또는 말단 내-사이의 (in-between) 일부 잔기를 포함하여, 본원에서 기술되는 면역글로불린의 임의의 영역에 연결될 수 있다. 다양한 링커가 컨주게이트 파트너를 면역글로불린에 공유적으로 연결하기 위해 본원에서 기술되는 면역글로불린에서 사용될 수 있다. 본원에서 "링커", "링커 서열", "스페이서", "결박 서열" 또는 이의 문법적 대등표현은 2개의 분자를 연결하고 종종 2개의 분자를 일 배치로 위치시키는 역할을 하는 분자 또는 분자 그룹 (예: 단량체 또는 중합체)를 의미한다. 링커는 당해 기술 분야에 공지되어 있다: 예를 들어, 호모- 또는 헤테로-이작용성 링커가 널리 공지되어 있다 (1994 Pierce Chemical Company catalog, technical section on cross-linkers, pages 155-200, 참조로 전부 삽입됨). 다수의 방법을 이용하여 분자들을 서로 공유적으로 연결할 수 있다. 이들은, 이로 제한됨이 없이, 단백질 또는 단백질 도메인의 N-말단과 C-말단 사이의 폴리펩타이드 연결, 디설파이드 결합을 통한 연결, 및 화학적 가교결합 시약을 사용한 연결을 포함한다. 이러한 양태의 하나의 측면에서, 링커는 재조합 기술 또는 펩타이드 합성에 의해 생성되는 펩타이드 결합이다. 링커 펩타이드는 주로 하기 아미노산 잔기를 포함할 수 있다: Gly, Ser, Ala, 또는 Thr. 링커 펩타이드는 2개의 분자가 목적하는 활성을 보유하도록 서로에 대해 정확한 배치를 갖는 방식으로 2개의 분자를 연결하는데 적합한 길이를 갖는다. 이러한 목적에 적합한 길이는 1개 이상 50개 미만의 아미노산 잔기를 포함한다. 하나의 양태에서, 링커는 약 1 내지 30개 아미노산 길이이며, 예를 들어 링커는 1 내지 20개 아미노산 길이일 수 있다. 유용한 링커는 글리신-세린 중합체 (예를 들어, (GS)n, (GSGGS)n (서열 번호 1), (GGGGS)n (서열 번호 2), 및 (GGGS)n (서열 번호 3)를 포함, 여기서 n은 적어도 1의 정수이다), 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체 및 당업자에 의해 인식될 수 있는 기타 유연성 링커를 포함한다. 달리, 이로 제한됨이 없이, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체를 포함한 비단백질성 중합체가 링커로서 사용될 수 있다.

공동구속 분자의 생성

또한, 본원에는 공동구속 분자를 생성하고 실험적으로 시험하는 방법이 기술된다. 기술된 방법은 임의의 특정 적용 또는 작동 원리에 양태들을 제한하려는 것이 아니다. 오히려, 본원에 제공되는 방법은 하나 이상의 면역글로불린이 면연글로불린을 수득하기 위해 생성되고 실험적으로 시험될 수 있음을 일반적으로 기술하고자 하는 것이다. 항체 분자 생물학, 발현, 정제 및 스크리닝을 위한 일반적 방법이 문헌 (Antibody Engineering, edited by Duebel & Kontermann, Springer-Verlag, Heidelberg, 2001; Hayhurst & Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5:683-689; Maynard & Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-76; Antibodies: A Laboratory Manual by Harlow & Lane, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988, 모두 참조로 전부 삽입됨)에 기술되어 있다.

본원에서 기술되는 하나의 양태에서, 공동구속 분자를 암호화하는 핵산은 생성된 후, 숙주 세포로 클로닝되고, 발현되며, 필요한 경우, 검정될 수 있다. 따라서, 각각의 단백질 서열을 암호화하는 핵산, 특히 DNA가 제조될 수 있다. 이들 실시는 널리 공지된 절차를 이용하여 수행된다. 예를 들어, 본원에서 기술되는 면역글로불린을 생성하는데 이용될 수 있는 다양한 방법이 기술되어 있다 (Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001), 및 Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons), 모두 참조로 전부 삽입됨). 당업자라면 알 수 있는 바와 같이, 다수의 서열을 포함하는 라이브러리의 정확한 서열 생성은 잠재적으로 비용이 많이 들고 시간 소모적이다. 본원에서 "라이브러리"는, 이로 제한됨이 없이, 일련의 핵산 또는 아미노산 서열, 다양한 위치에서의 일련의 핵산 또는 아미노산 치환, 라이브러리 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 물질적 라이브러리 또는 정제되거나 비정제된 형태의 변이 단백질을 포함하는 물질적 라이브러리를 포함하는 임의의 형태의 일 세트의 변이체를 의미한다. 따라서, 본원에서 기술되는 라이브러리를 효과적으로 생성하는데 이용될 수 있는 다양한 기술이 있다. 이러한 방법은, 이로 제한됨이 없이, 유전자 조립 방법, PCR-기본 방법 및 PCR 변형을 이용하는 방법, 리가제 쇄 반응-기본 방법, 푸울링된 올리고 방법, 예를 들어 합성 셔플링 (shuffling)에 이용되는 방법, 오류 발생이 쉬운 증폭 방법 및 램덤 돌연변이를 갖는 올리고를 사용하는 방법, 전형의 부위-지시된 돌연변이유발법, 카세트 돌연변이유발, 및 기타 증폭 및 유전자 합성 방법을 포함한다. 당해 기술 분야에 공지되어 있는 바와 같이, 유전자 조립, 돌연변이유발, 벡터 서브클로닝 등을 위한 다양한 시판 키트 및 방법이 있으며, 이러한 시판 제품은 면역글로불린을 암호화하는 핵산을 생성하는데 사용된다.

본원에서 기술되는 공동구속 분자는 공동구속 분자를 암호화하는 핵산, 예를 들어 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 단백질의 발현을 유도하거나 야기시키는 적합한 조건 하에서 배양함으로써 생성될 수 있다. 발현에 적합한 조건은 발현 벡터 및 숙주 세포의 선택에 따를 것이며, 통상의 실험을 통해 당업자에게 쉽게 확인될 것이다. 이로 제한됨이 없이, 포유동물 세포, 세균, 곤충 세포 및 효모를 포함한 매우 다양한 적합한 숙주 세포가 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 기술되는 면역글로불린을 생성하는데 사용될 수 있는 다양한 세포주가 ATCC® 세포주 카달로그 (American Type Culture Collection에서 입수 가능)에 기술되어 있다.

하나의 양태에서, 공동구속 분자는, 발현 제작물이 레트로바이러스 또는 아데노바이러스와 같은 바이러스를 사용하여 포유동물 세포에 도입되는 시스템을 포함하는 포유동물 발현 시스템에서 발현된다. 임의의 포유동물 세포, 예를 들어 사람, 마우스, 래트, 햄스터 및 영장류 세포가 사용될 수 있다. 또한, 적합한 세포는, 이로 제한됨이 없이, 주르캐트 (Jurkat) T 세포, NIH3T3, CHO, BHK, COS, HEK293, PER C.6, HeLa, Sp2/0, NS0 세포 및 이의 변이체를 포함하는 공지된 연구 세포를 포함한다. 다른 양태에서, 라이브러리 단백질은 세균 세포에서 발현된다. 세균 발현 시스템은 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있으며, 에쉐리키아 콜라이 (Escherichia coli : E. coli), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 스트렙토코커스 크레모리스 (Streptococcus cremoris) 및 스트렙토코커스 리비단스 (Streptococcus lividans)를 포함한다. 다른 양태에서, 면역글로불린은 곤충 세포 (예: Sf21/Sf9, 트리초플루시아 니 (Trichoplusia ni) Bti-Tn5b1-4) 또는 효모 세포 (예: 에스. 세레비지애 (S. cerevisiae), 피치아 (Pichia) 등)에서 생성된다. 다른 양태에서, 공동구속 분자는 세포 비함유 해독 시스템을 사용하여 시험관내에서 발현된다. 원핵 세포 (예: 이. 콜라이) 및 진핵 세포 (예: 맥아, 래비트 망상적혈구) 모두로부터 유도되는 시험관내 해독 시스템이 이용가능하며, 목적 단백질의 발현 수준 및 작용 특성에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 시험관내 해독이 일부 디스플레이 기술, 예를 들어 리보좀 디스플레이에 필요하다. 또한, 면역글로불린은 화학적 합성 방법에 의해 생성될 수 있다. 또한, 트랜스제닉 발현 시스템이 이용될 수 있으며, 동물 (예: 소, 양 또는 염소 우유, 닭의 수정란, 모든 곤충 유충 등) 및 식물 (예: 옥수수, 담배, 좀개구리밥 등) 모두가 이용될 수 있다.

본원에서 기술되는 공동구속 분자를 암호화하는 핵산은 단백질을 발현하기 위해 발현 벡터로 삽입될 수 있다. 다양한 발현 벡터가 단백질 발현에 사용될 수 있다. 발현 벡터는 자가-복제하는 염색체 이외의 벡터 또는 숙주 게놈으로 통합되는 벡터를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 숙주 세포 유형에 적합하도록 제작된다. 따라서, 본원에서 기술되는 면역글로불린을 생성하는데 사용되는 발현 벡터는, 이로 제한됨이 없이, 포유동물, 세균, 곤충 세포, 효모 및 시험관내 시스템에서 단백질 발현을 가능하게 하는 것을 포함한다. 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이, 본원에서 기술되는 공동구속 분자를 발현하는데 사용할 수 있는 다양한 발현 벡터가 이용가능하거나 시판된다.

발현 벡터는 전형적으로 제어 또는 조절 서열, 선별 마커, 임의의 융합 파트너 및/또는 추가의 성분과 작동적으로 연결된 단백질을 포함한다. 본원에서 "작동적으로 연결된"은 핵산이 다른 핵산 서열과 작용적 관계로 위치된다는 것을 의미한다. 일반적으로, 이들 발현 벡터는 공동구속 분자를 암호화하는 핵산에 작동적으로 연결된 전사 및 해독 조절 핵산을 포함하며, 전형적으로 단백질을 발현하는데 사용되는 숙주 세포에 적합하다. 일반적으로, 전사 및 해독 조절 서열은 프로모터 서열, 리보좀 결합 부위, 전사 개시 및 정지 서열, 해독 개시 및 정지 서열 및 인핸서 또는 활성화 서열을 포함할 수 있다. 또한, 당해 기술 분야에 공지되어 있는 바와 같이, 발현 벡터는 전형적으로 발현 벡터를 포함하는 형질전환된 숙주 세포의 선별을 가능하게 하는 선별 유전자 또는 마커를 포함한다. 선별 유전자는 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있으며, 사용되는 숙주 세포에 따라 다양할 것이다.

공동구속 분자는 발현되는 단백질의 표적화, 정제, 스크리닝, 디스플레이 등을 가능하게 하는 융합 파트너에 작동적으로 연결될 수 있다. 융합 파트너는 링커 서열을 통해 면역글로불린 서열에 연결될 수 있다. 보다 긴 링커가 사용될 수는 있으나, 일반적으로 링커 서열은 소수의 아미노산, 전형적으로 10개 미만의 아미노산을 포함할 것이다. 전형적으로, 링커 서열은 유연할 수 있고 분해에 내성이도록 선택된다. 당업자에 의해 인식될 수 있는 바와 같이, 임의의 다양한 서열이 링커로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 일반적인 링커 서열은 아미노산 서열 GGGGS를 포함한다. 융합 파트너는 면역글로불린 및 임의의 화합된 융합 파트너를 목적하는 세포 위치 또는 세포외 매질로 지시하는 표적화 또는 시그널화 서열일 수 있다. 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이, 특정 시그널화 서열은 단백질이 성장 배지 또는 세포의 내막 및 외막 사이에 위치된 원형질막주위공간으로 분비되도록 할 수 있다. 또한, 융합 파트너는 정제 및/또는 스크리닝을 가능하게 하는 펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 서열일 수 있다. 이러한 융합 파트너는, 이로 제한됨이 없이, 폴리히스티딘 태그 (Hig-태그) (예: H₆ 및 H₁₀ 또는 고정된 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC) 시스템 (예: Ni⁺² 친화성 컬럼)과 함께 사용하기 위한 다른 태그), GST 융합물, MBP 융합물, Strep-태그, 세균 효소 BirA의 BSP 바이오티닐화 표적 서열 및 항체에 의해 표적되는 에피토프 태그 (예: c-myc 태그, flag-태그 등)를 포함한다. 당업자에 의해 인식될 수 있는 바와 같이, 이러한 태그는 정제, 스크리닝 또는 이둘 모두에 유용할 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린은 Hig-태그를 Ni⁺² 친화성 컬럼에 고정시킴으로써 Hig-태그를 사용하여 정제될 수 있으며, 정제 후, 동일한 Hig-태그는 ELISA 또는 다른 결합 검정 (후술함)을 수행하기 위해 항체를 Ni⁺² 코팅된 플레이트에 고정화하는데 사용될 수 있다. 융합 파트너는 면역글로불린을 스크리닝 (후술함)하기 위한 선별 방법의 이용을 가능하게 할 수 있다. 다양한 선별 방법을 가능하게 하는 융합 파트너가 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 면역글로불린 라이브러리의 구성원을 유전자 III 단백질에 융합시킴으로써, 파아지 디스플레이가 이용될 수 있다 (Kay et al., Phage display of peptides and proteins: a laboratory manual, Academic Press, San Diego, Calif., 1996; Lowman et al., 1991, Biochemistry 30:10832-10838; Smith, 1985, Science 228:1315-1317, 참조로 전부 삽입됨). 융합 파트너는 면역글로불린이 표지되도록 할 수 있다. 달리, 융합 파트너는 발현 벡터 상의 특정 서열에 결합하여 융합 파트너 및 결합된 면역글로불린이 이들을 암호화하는 핵산과 공유적으로나 비공유적으로 연결되게 할 수 있다. 외인성 핵산을 숙주 세포에 도입하는 방법은 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있으며, 사용되는 숙주 세포에 따라 다양할 것이다. 이러한 기술은, 이로 제한됨이 없이, 덱스트란-매개된 트랜스펙션, 인산칼슘 침전, 염화칼슘 처리, 폴리브렌 매개된 트랜스펙션, 원형질체 융합, 전기천공, 바이러스 또는 파아지 감염, 림포좀에 폴리뉴클레오타이드(들)의 캡슐화 및 핵으로 DNA의 직접적 미세주입을 포함한다. 포유동물 세포의 경우, 트랜스펙션은 일시적이거나 안정할 수 있다.

하나의 양태에서, 공동구속 분자는 발현 후 정제되거나 분리된다. 단백질은 당업자에게 공지된 다양한 방식으로 분리되거나 정제될 수 있다. 표준 정제 방법은, 이온 교환, 소수성 상호작용, 친화성, 사이징 또는 겔 여과, 및 FPLC 및 HPLC와 같은 시스템을 이용하여 대기압 또는 고압 하에서 수행되는 역상을 포함하는 크로마토그래피 기술을 포함한다. 또한, 정제 방법은 전기영동 기술, 면역학적 가슐, 침전, 투석 및 크로마토포커싱 기술을 포함한다. 또한, 단백질 농축과 함께 한외여과 및 투석여과가 유용하다. 당해 기술 분야에 널리 공지된 바와 같이, 다양한 천연 단백질이 Fc 및 항체를 결합하며, 이들 단백질은 본원에서 기술되는 면역글로불린의 정제를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 세균성 단백질 A 및 G는 Fc 영역에 결합한다. 마찬가지로, 세균성 단백질 L은, 항체의 표적 항원에서와 같이, 일부 항체의 Fab 영역에 결합한다. 정제는 종종 특정 융합 파트너에 의해 가능할 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린은, GST 융합물이 사용되는 경우에는 글루타티온 수지를 이용하고, His-태그가 사용되는 경우에는 Ni⁺² 친화성 크로마토그래피를 이용하고, flag-태그가 사용되는 경우에는 고정된 항-flag 항체를 사용하여 정제될 수 있다. 적합한 정제 기술의 일반적 지침을 위해 문헌 (Protein Purification: Principles and Practice, 3.sup.rd Ed., Scopes, Springer-Verlag, NY, 1994, 참조로 전부 삽입됨)을 참조한다. 정제의 필요성은 스크린 또는 면역글로불린의 사용에 따라 다양할 것이다. 일부 예에서는, 어떠한 정제도 필요하지 않다. 예를 들어, 하나의 양태에서, 면역글로불린이 분비되는 경우, 스크리닝은 매질로부터 직접적으로 일어날 수 있다. 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있는 바와 같이, 선별에 대한 일부 방법은 단백질 정제를 포함하지 않는다. 따라서, 예를 들어 일 라이브러리의 면역글로불린이 파아지 디스플레이 라이브러리에 만들어지는 경우, 단백질 정제는 수행될 수 없다.

시험관내 실험

공동구속 분자는, 이로 제한됨이 없이, 시험관내 검정, 생체내 및 세포-기초된 검정, 및 선별 기술에서 사용하는 것을 포함하여, 다양한 방법을 이용하여 스크리닝될 수 있다. 자동화 및 고처리량 스크리닝 기술이 스크리닝 절차에 이용될 수 있다. 스크리닝은 융합 파트너 또는 표지물의 사용을 이용할 수 있다. 융합 파트너의 사용은 상술되어 있다. 본원에서 "표지된"은 본원에서 기술되는 면역글로불린이 스크린에서의 검출을 가능하게 하도록 부착된 하나 이상의 요소, 동위원소 또는 화학적 화합물을 갖는다는 것을 의미한다. 일반적으로, 표지물은 3가지 부류로 나뉜다: a) 항체의 의해 인식되는 융합 파트너로서 삽입되는 에피토프일 수 있는 면역 표지물, b) 방사능 또는 무거운 동위원소일 수 있는 동위원소성 표지물, 및 c) 형광 및 비색 염료, 또는 다른 표지화 방법을 가능하게 하는 바이오틴과 같은 분자. 표지물은 임의의 위치에서 화합물에 도입될 수 있으며, 단백질 발현 동안 시험관내 또는 생체내에서 삽입될 수 있다.

하나의 양태에서, 공동구속 분자의 기능적 및/또는 생물물리적 특성은 시험관내 검정으로 스크리닝된다. 시험관내 검정은 목적하는 특성을 스크리닝하기 위한 광범위한 동적 범위를 가능하게 할 수 있다. 스크리닝될 수 있는 특성은, 이로 제한됨이 없이, 안정성, 용해도, 및 Fc 리간드, 예를 들어 FcγR에 대한 친화도를 포함한다. 다수의 특성이 동시에 또는 개별적으로 스크리닝될 수 있다. 단백질은 검정의 필요에 따라 정제되거나 정제되지 않을 수 있다. 하나의 양태에서, 스크린은 공동구속 분자를 결합하는 것으로 공지되거나 생각되는 단백질 또는 비단백질성 분자에 공동구속 분자를 결합하기 위한 정성적 또는 정량적 결합 검정이다. 하나의 양태에서, 스크린은 표적 항원에 대한 결합을 측정하기 위한 결합 검정이다. 다른 양태에서, 스크린은, 이로 제한됨이 없이, FcγR 패밀리, 신생아 수용체 FcRn, 보체 단백질 C1q 및 세균 단백질 A 및 G를 포함하는 Fc 리간드에 공동구속 분자를 결합하기 위한 검정이다. 상기 Fc 리간드는 임의의 유기체로부터의 것일 수 있다. 하나의 양태에서, Fc 리간드는 사람, 마우스, 래트, 래비트 및/또는 멍키로부터의 것이다. 결합 검정은, 이로 제한됨이 없이, 형광 공명 에너지 전달 (Fluorescence Resonance Energy Transfer: FRET) 및 생물발광 공명 에너지 전달 (Bioluminescence Resonance Energy Transfer: BRET)-기본 검정, AlphaScreen^TM (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay), 섬광 근접 검정, 효소-결합된 면역흡착 검정 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: ELISA), 표면 플라즈몬 공명 (Surface Plasmon Resonance: SPR, BIACORE®로도 공지됨), 등온 적정 열량계, 시차 주사 열량측정, 겔 전기영동 및 겔 여과를 포함한 크로마토그래피를 포함하는 당해 기술 분야의 공지된 다양한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 이들 방법 및 기타 방법은 면역글로불린에 대한 일부 융합 파트너 또는 표지물의 이점을 취한다. 검정은, 이로 제한됨이 없이, 발색, 형광, 발광 또는 동위원소 표지물을 포함하여 다양한 검출 방법을 이용할 수 있다.

공동구속 분자의 생물물리적 특성, 예를 들어 안정성 및 용해도는 당해 기술 분야에 공지된 다양한 방법을 이용하여 시험될 수 있다. 단백질 안정성은 폴딩 상태와 비폴딩 상태 사이의 열역학 평형을 측정함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 기술되는 공동구속 분자는 화학적 변성제, 열 또는 pH를 사용하여 비폴딩될 수 있으며, 이러한 이행은, 이로 제한됨이 없이, 원형 이색성 분광법, 형광 분광법, 흡수 분광법, NMR 분광법, 열량측정법 및 단백질분해를 포함하는 방법을 이용하여 모니터링될 수 있다. 당업자에의 인식될 수 있는 바와 같이, 폴딩 및 비폴딩 변화에 대한 동적 변수는 또한 이들 기술 및 기타 기술을 이용하여 모니터링될 수 있다. 공동구속 분자의 용해도 및 전체적인 구조적 통합성은 당해 기술 분야에 공지된 다양한 방법을 이용하여 정성적으로 또는 정량적으로 결정될 수 있다. 본원에서 기술되는 공동구속 분자의 생물물리적 특성을 특징 분석하기 위해 이용될 수 있는 방법은 겔 전기영동, 등전점 포커싱, 모세관 전기영동, 크로마토그래피, 예를 들어 크기 배척 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 및 역상 고성능 액체 크로마토그래피, 펩타이드 맵핑, 올리고사카라이드 맵핑, 매쓰 분광법, 자외선 흡수 분광법, 형광 분광법, 원형 이색성 분광법, 등온 적정 열량측정법, 시차 주사 열량측정법, 분석적 한외여과, 동적 광 산란, 단백질분해, 및 가교, 혼탁도 측정, 여과 지연 검정, 면역학적 검정, 형광 염료 결합 분석, 단백질-염색 검정, 현미경검사, 및 ELISA 또는 다른 결합 검정을 통한 응집체의 검출을 포함한다. 하나의 양태에서, 안정성 및/또는 용해도는 얼마간의 한정된 시간 이후에 단백질 용액의 양을 결정함으로써 측정될 수 있다. 이러한 검정에서, 단백질은 다소 극한 상태, 예를 들어 승온, 낮은 pH 또는 변성제의 존재에 노출되거나 노출되지 않을 수 있다. 기능은 전형적으로 안정하고/하거나, 가용성이고/이거나, 폴딩/구성이 잘된 단백질을 필요로 하므로, 상술된 기능 및 결합 검정은 또한 이러한 측정을 수행할 방법을 제공한다. 예를 들어, 면역글로불린을 포함하는 용액은 표적 항원을 결합하는 능력에 대해 검정되고, 이어서 하나 이상의 제한된 시간 동안 승온에 노출된 후, 항원 결합에 대해 다시 검정될 수 있었다. 비폴딩 및 응집된 단백질은 항원을 결합할 수 있는 것으로 예상되지 않기 때문에, 잔류 활성의 양은 공동구속 분자의 안정성 및 용해도의 측정을 제공한다.

하나의 양태에서, 공동구속 분자는 하나 이상의 세포-기본 또는 시험관내 검정을 이용하여 시험될 수 있다. 이러한 검정에 대해, 정제되거나 정제되지 않은 면역글로불린은 전형적으로 세포가 개별적 변이체 또는 라이브러리가 속하는 변이체 그룹에 노출되도록 외생적으로 가해진다. 이러한 검정은, 항상은 아니나, 전형적으로 표적 항원에 결합하고 일부 생화학적 사건, 예를 들어 세포 용해와 같은 이펙터 기능, 포식작용, 리간드/수용체 결합 억제, 성장 및/또는 증식 억제, 면역글로불린의 능력, 아폽토시스 등을 매개하는 면역글로불린의 능력에 대한 생물학에 기초한다. 이러한 검정은 종종 면역글로불린에 대한 세포의 반응, 예를 들어 세포 생존, 세포 죽음, 세포의 포식작용, 세포 용해, 세포 형태의 변화, 또는 전사 활성화, 예를 들어 천연 유전자 또는 리포터 유전자의 세포 발현을 모니터링하는 것을 수반한다. 예를 들어, 이러한 검정은 ADCC, ADCP, 또는 CDC를 유도하는 공동구속 분자의 능력을 측정할 수 있다. 일부 검정에 대해서는, 표적 세포에 추가하여 추가의 세포 또는 성분, 예를 들어 혈청 보체 또는 이펙터 세포, 예를 들어 말초혈 단핵구 (PBMC), NK 세포, 대식구 등을 가할 필요가 있을 수 있다. 이러한 추가의 세포는 임의의 유기체, 예를 들어 사람, 마우스, 래트, 래비트 및 멍키로부터의 것일 수 있다. 가교된 또는 단량체성 항체는 항체 표적 항원을 발현하는 특정 세포주의 아폽토시스를 야기하거나, 검정물에 가해진 면역 세포에 의한 표적 세포의 공격을 매개할 수 있다. 세포 죽음 또는 생존을 모니터링하는 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 염료, 형광단, 면역화학, 세포화학 및 방사성 시약의 사용을 포함한다. 예를 들어, 카스파제 검정 또는 아넥신-플루오르컨주게이트는 아폽토시스의 측정을 가능하게 할 수 있으며, 방사성 기질의 흡수 또는 방출 (예: 크롬-51 방출 검정) 또는 알라마르 블루와 같은 형광 염료의 대사적 감소는 세포 성장, 증식 또는 활성화의 모니터링을 가능하게 할 수 있다. 하나의 양태에서, DELFIA® EuTDA-기초 세포독성 검정 (Perkin Elmer, MA)이 이용된다. 달리, 죽거나 손상된 표적 세포는 하나 이상의 천연 세포내 단백질, 예를 들어 락테이트 디하이드로게나제의 방출을 측정함으로써 모니터링될 수 있다. 또한, 전사 활성화는 세포-기초 검정에서 기능을 검정하기 위한 방법으로 역할을 할 수 있다. 이러한 경우, 반응은 상향조절되거나 하향조절될 수 있는 천연 유전자 또는 단백질을 검정함으로써 모니터링될 수 있으며, 예를 들어 특정 인터루킨 방출이 측정될 수 있으며, 달리 판독정보는 루시페라제 또는 GFP-리포터 제작물을 통할 수 있다. 세포-기초 검정은 또한 면역글로불린의 존재에 대한 반응으로서 세포의 형태 변화를 측정하는 것을 수반한다. 이러한 검정을 위한 세포 유형은 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있으며, 당해 기술 분야에 공지된 다양한 세포주가 사용될 수 있다. 달리, 세포-기초 스크린은 공동구속 분자를 암호화하는 핵산으로 형질전환되거나 트랜스펙션된 세포를 사용하여 수행된다.

시험관내 검정은, 이로 제한됨이 없이, 결합 검정, ADCC, CDC, 세포독성, 증식, 퍼옥사이드/오존 방출, 이펙터 세포의 화학주성, 감소된 이펙터 기능 항체에 의한 이러한 검정의 억제; 100배 초과의 개선 또는 100배 초과의 감소와 같은 활성 범위, 수용체 활성화의 블렌드 및 이러한 수용체 프로필로부터 예측되는 검정 결과를 포함한다.

생체내 실험

본원에서 기술되는 공동구속 분자의 생물학적 특성은 세포, 조직 및 전체 유기체 실험으로 특징지어질 수 있다. 당해 기술 분야에 공지되어 있는 바와 같이, 약물은 종종, 이로 제한됨이 없이, 마우스, 래트, 래비트, 개, 고양이, 돼지 및 멍키를 포함한 동물에서 질환 또는 질환 모델에 대한 약물의 치료 효능을 측정하거나 약물의 약동학, 독성 및 기타 특성을 측정하기 위해 시험된다. 상기 동물은 질환 모델로 불린다. 본원에서 기술되는 공동구속 분자에 있어, 후보 폴리펩타이드의 사람에서의 효능에 대한 포텐셜을 평가하기 위해 동물 모델을 이용하는 경우 특별한 챌린지가 발생한다 - 이는 적어도 부분적으로는 사람 Fc 수용체에 대한 친화성에 특정 효과를 갖는 공동구속 분자가 이종상동성 (orthologous) 동물 수용체와 유사한 친화성 효과를 가질 수 없다는 사실에 기인한다. 이러한 문제는 진정한 이종상동체의 정확한 정렬과 연관된 불가피한 다의성 (Mechetina et al., Immunogenetics, 2002 54:463-468, 참조로 전부 삽입됨), 및 일부 이종상동체가 단지 동물에서는 존재하지 않는다는 사실 (예: 사람은 FcγRIIa를 가지나 마우스는 FcγRIIa를 갖지 않는다)에 의해 더욱 커질 수 있다. 치료는 종종, 이로 제한됨이 없이, 마우스 스트레인 NZB, NOD, BXSB, MRL/Ipr, K/BxN 및 트렌스제닉 (녹인 및 녹아웃을 포함)을 포함한 마우스에서 시험된다. 이러한 마우스는 사람 기관 특이적, 전신적 자가면역 또는 염증 질환 병리, 예를 들어 전시 홍반성 낭창 (SLE) 및 류마티성 관절염 (RA)과 닮은 다양한 자가면역 상태를 전개시킬 수 있다. 예를 들어, 자가면역 질환에 대해 본원에서 기술되는 면역글로불린은 질환 병리의 전개를 감소 또는 억제하는 면역글로불린의 능력을 결정하기 위해 마우스를 처리함으로써 이러한 마우스 모델에서 시험될 수 있다. 마우스와 사람 Fcγ 수용체 시스템 간의 부적합 때문에, 택일적 접근은, 면역 결핍 마우스를 사람 PBL 또는 PBMC (huPBL-SCID, huPBMC-SCID)와 접목한 뮤린 SCID 모델을 사용하여 반-기능성 사람 면역계에 사람 이펙터 세포 및 Fc 수용체를 제공하는 것이다. 이러한 모델에서, 항원 챌린지 (예: 파상풍 톡소이드)는 B 세포를 혈장 세포로 분화하고 면역글로불린을 분비하도록 활성화시킴으로써 항원 특이적 체액성 면역을 재구성한다. 따라서, B 세포 상의 IgE 및 FcγRIIb에 특이적으로 결합하는 본원에서 기술되는 이중 표적화 면역글로불린이 B 세포 분화를 특이적으로 억제하는 능력을 조사하기 위해 시험될 수 있다. 이러한 실험은 치료제로서 사용될 면역글로불린의 포텐셜을 결정하기 위한 유의한 자료를 제공할 수 있다. 기타 동물, 예를 들어 포유동물도 시험에 사용될 수 있다. 예를 들어, 멍키는 사람과의 유전적 유사성 때문에, 적합한 치료 모델일 수 있으며, 따라서 본원에서 기술되는 면역글로불린의 효능, 독성, 약동학 또는 기타 특성을 시험하는데 사용될 수 있다. 사람에서 본원에서 기술되는 면역글로불린의 시험은 궁극적으로는 약물로서의 승인에 필요하며, 따라서 이들 실험이 고려된다. 따라서, 본원에서 기술되는 면역글로불린은 이들의 치료 효능, 독성, 약동학 및/또는 기타 임상 특성을 결정하기 위해 사람에서 시험될 수 있다.

본원에서 기술되는 공동구속 분자는 동물 모델 또는 사람에서 Fc-포함 치료제에 대한 우수한 성능을 부여할 수 있다. 본 명세서에서 기술되는 바와 같이, 이러한 면역글로불린의 수용체 결합 프로필은, 예를 들어 세포독성 약물의 효능을 증가시키거나 특정 이펙터 기능 또는 약물 작용의 선택성을 개선할 이펙터 세포를 표적하도록 선택될 수 있다. 또한, 일부 또는 모든 이펙터 기능을 제거하여 이러한 Fc-포함 약물의 부작용 또는 독성을 감소시킬 수 있는 수용체 결합 프로필이 선택될 수 있다. 예를 들어, FcγRIIIa, FcγRI 및 FcγRIIa에 대해 감소된 결합을 갖는 면역글로불린은 대부분의 세포-매개된 이펙터 기능을 제거하도록 선택될 수 있거나, C1q에 대해 감소된 결합을 갖는 면역글로불린은 보체-매개된 이펙터 기능을 제한하도록 선택될 수 있다. 일부 상황에서, 이러한 이펙터 기능은 잠재적인 독성 효과를 갖는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 이들의 제거는 Fc-포함 약물의 안전성을 증가시킬 수 있으며, 이러한 개선된 안전성은 동물 모델에서 특징지어질 수 있다. 일부 상황에서, 이러한 이펙터 기능은 바람직한 치료 활성을 매개하는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 이들을 증진시키는 것은 Fc-포함 약물의 활성 또는 효능을 증가시킬 수 있으며, 이러한 개선된 활성 또는 효능은 동물 모델에서 특징지어질 수 있다.

일부 양태에서, 본원에서 기술되는 공동구속 분자는 다양한 사람 질환의 임상 관련 동물 모델에서 효능을 평가할 수 있다. 많은 경우에, 관련 모델은 특정 항원 및 수용체를 위한 다양한 트랜스제닉 동물을 포함한다.

관련 트랜스제닉 동물, 예를 들어 사람 Fc 수용체 (예: CD32b)를 발현하는 모델은 면역글로불린 및 Fc-융합물의 효능을 평가 및 시험하는데 사용될 수 있었다. 마우스 또는 기타 설치류에서 이펙터 기능을 직접적으로 또는 간접적으로 매개하는 사람 유전자를 도입하는 것에 의한 공동구속 분자의 평가는 자가면역 장애 및 RA에서의 효능에 대한 생리학적 조사를 가능하게 할 수 있다. 사람 Fc 수용체, 예를 들어 FcγRIIb는 다형, 예를 들어 유전자 프로모터 (-343 G로부터 C까지) 또는 수용체 187 I 또는 T의 트랜스막 도메인에서의 다형을 가질 수 있으며, 이는 사람 다형의 특정 조합을 설치류에 도입하는 것을 추가로 가능하게 할 것이다. 다형-특이적 FcR을 수반하는 다양한 조사는 이 부분에만 제한되지 않으며, 일반적으로 본 명세서를 통해 구체화되는 바와 같은 FcR에 대한 모든 논의 및 적용을 포함한다. 본원에서 기술되는 면역글로불린은 이러한 트랜스제닉 모델에서 Fc-포함 약물에 우수한 활성을 제공할 수 있으며, 특히 사람 FcγRIIb 매개된 활성에 대해 최적화된 결합 프로필을 갖는 변이체는 트랜스제닉 CD32b 마우스에서 우수한 활성을 나타낼 수 있다. 다른 사람 Fc 수용체, 예를 들어 FcγRIIa, FcγRI 등에 대한 마우스 트랜스제닉에서의 유사한 효능 개선이 각각의 수용체에 대해 최적화된 결합 프로필을 갖는 공동구속 분자에 대해 관측될 수 있다. 다수의 사람 수용체에 대한 마우스 트랜스제닉은 상응하는 다수의 수용체에 대해 최적화된 결합 프로필을 갖는 면역글로불린에 대해 개선된 활성을 나타낼 것이다.

사람 환자에서 후보 치료 항체의 잠재적 효능을 특징짓기 위해 동물을 사용하는 것과 관련된 어려움 및 다의성 때문에, 본원에서 기술되는 일부 변이 폴리펩타이드는 잠재적인 사람에서의 효능을 평가하기 위한 대용물로서 활용될 수 있다. 이러한 대용 분자는 - 동물 시스템에서 - 상응하는 후보 사람 면역글로불린의 FcR 및/또는 보체 생물학을 모방할 수 있다. 이러한 모방은 특정 면역글로불린과 사람에 대비한 동물 수용체 사이의 상대적 결합 친화성에 의해 가장 그럴듯하게 입증된다. 예를 들어, 억제성 사람 FcγRIIb에 대해 감소된 친화성을 갖는 Fc 변이체의 잠재적인 사람에서의 효능을 평가하기 위해 마우스 모델을 사용하는 경우, 적합한 대용 변이체는 마우스 FcγRII에 대해 감소된 친화성을 가질 것이다. 또한, 대용 Fc 변이체는 사람 Fc 변이체, 동물 Fc 변이체 또는 이둘 모두와 관련하여 만들어질 수 있다는 것에 주목해야 한다.

하나의 양태에서, 공동구속 분자의 시험은 표적 항원을 갖는 특정 표적 세포의 결핍에 대한 평가를 용이하게 하기 위해 영장류 (예: 시노몰거스 원숭이 모델)에서의 효능 조사를 포함할 수 있다. 추가의 영장류 모델은, 이로 제한됨이 없이, 자가면역, 이식 및 암에 대한 치료 조사에서 Fc 폴리펩타이드를 평가하기 위해 시노몰거스 원숭이를 사용하는 것을 포함한다.

독성 조사는 표준 약리학 프로필에서는 평가될 수 없거나 단지 제제의 반복 투여 후에만 일어나는 항체 또는 Fc-융합물 관련-효과를 측정하기 위해 수행된다. 대부분의 독성 시험은, 새로운 치료 실체가 사람에게 도입되기 전 어떠한 예기치않은 부작용도 간과되지 않도록 하기 위해 2가지의 종 (설치류 및 비-설치류)에서 수행된다. 일반적으로, 이들 모델은 유전독성, 임상 독성, 면역원성, 생식/발달 독성 및 발암성을 포함한 다양한 독성을 측정할 수 있다. 음식 소모, 체중, 항체 형성, 임상 화학, 및 표준 기관/조직의 육안 조사 및 현미경 조사 (예: 심독성)의 표준 측정이 상술된 변수에 포함된다. 추가의 측정 변수는 주사 부위 외상 및, 존재하는 경우, 중화 항체의 측정이다. 통상적으로, 네이키드 (naked) 또는 컨주게이션된 모노클로날 항체 치료제는 정상 조직과의 교차-반응성, 면역원성/항체 생산, 컨주게이트 또는 링커 독성 및 방사선표지된 종의 "방관자 (bystander)" 독성에 대해 평가된다. 그런데도, 이러한 조사는 특정 관심사에 초점을 맞추기 위해 ICH S6 (Safety studies for biotechnological product, 상기에서도 주목됨)에 의해 지정된 지침을 따라 개별적으로 고찰되어야 할 수 있다. 따라서, 일반적 원칙은 제품이 충분히 특징지어지고, 불순물/오염물이 제거되며, 시험 물질이 개발 동안 비교가능하고, GLP가 준수되는 것이다.

본원에서 기술되는 공동구속 분자의 약동학 (PK)은 다양한 동물 시스템에서 조사될 수 있으며, 가장 관련되는 동물은 시노몰거스 원숭이 및 리서스 원숭이와 같은 비-사람 영장류이다. 6000배의 용량 범위 (0.05 내지 300 kg/kg)에 걸친 단일 또는 반복된 i.v./s.c. 투여에 대해 혈장 농도 및 제거를 이용하여 반감기 (수일 내지 수주)를 평가할 수 있다. 또한, 정상 상태에서의 분포 용적 및 전신 흡수 수준도 측정될 수 있다. 이러한 측정 변수의 예는 일반적으로 최대 관측 혈장 농도 (Cmax), Cmax에 도달하는 시간 (Tmax), 시간 0부터 무한대까지의 혈장 농도-시간 곡선 하의 면적 [AUC(0-inf)] 및 겉보기 제거 반감기 (T1/2)를 포함한다. 추가의 측정 변수는 i.v. 투여 후 수득되는 농도-시간 자료의 구획 분석 및 생물이용성을 포함할 수 있다.

본원에서 기술되는 공동구속 분자는 동물계 또는 사람에서 Fc-포함 치료제에 우수한 약동학을 부여할 수 있다. 예를 들어, FcRn에 대한 증가된 결합은 반감기 및 Fc-포함 약물의 노출을 증가시킬 수 있다. 달리, FcRn에 대한 감소된 결합은 Fc-포함 약물이 부작용을 갖는 경우와 같이 감소된 노출이 유리한 경우 반감기 및 Fc-포함 약물의 노출을 감소시킬 수 있다.

일련의 Fc 수용체가 상이한 면역 세포 유형 및 상이한 조직에서 차별적으로 발현된다는 것은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. Fc 수용체의 차별적 조직 분포는 궁극적으로 본원에서 기술되는 공동구속 분자의 약력학 (PD) 및 약동학 (PK) 특성에 영향을 끼칠 수 있다. 프리젠테이션의 공동구속 분자가 일련의 Fc 수용체에 대해 다양한 친화성을 가지기 때문에, PD 및/또는 PK 특성에 대해 폴리펩타이드를 더욱 스크리닝하는 것이 최적 균형의 PD, PK 및 각각의 후보 폴리펩타이드에 의해 부여되는 치료 효능을 규정하는데 매우 유용할 수 있다.

약력학 조사는, 이로 제한됨이 없이, 특정 세포 표적화, 시그널화 기작 차단, 항원-특이적 항체의 억제 측정 등을 포함할 수 있다. 본원에서 기술되는 공동구속 분자는 특정 이펙터 세포 집단을 표적함으로써 Fc-포함 약물로 하여금 효능을 개선하거나 특히 유리한 생리학적 구획으로의 투과를 증가시키는 특정 활성을 유도하게 할 수 있다. 예를 들어, 호중구 활성 및 국소화는 FcγRIIIb를 표적하는 공동구속 분자에 의해 표적될 수 있다. 이러한 약력학적 효과는 동물 모델 또는 사람에서 입증될 수 있다.

이용

본원에서 기술되는 바와 같은 공동구속 분자가 제조되면, 이는 다양한 방법에 사용될 수 있다. 바람직한 양태에서, 이 방법은, IgE 및 FcγRIIb 모두가 공동구속 분자에 의해 결합되고 세포가 억제되도록 IgE 및 FcγRIIb를 공동발현하는 세포를 공동구속 분자와 접촉시키는 것을 포함한다. 이러한 맥락에서 "억제되는"는 공동구속 분자가 IgE+ B 세포의 활성화 및/또는 증식을 방지 또는 감소시키는 것을 의미한다.

본원에서 기술되는 공동구속 분자는 넓은 범위의 제품에 사용될 수 있다. 하나의 양태에서, 본원에서 기술되는 공동구속 분자는 치료, 진단 또는 연구 시약이다. 공동구속 분자는 모노클로날 또는 폴리클로날인 조성물에서 사용될 수 있다. 본원에서 기술되는 공동구속 분자는 치료 목적으로 사용될 수 있다. 당업자에 의해 인식될 수 있는 바와 같이, 본원에서 기술되는 공동구속 분자는 항체 등이 사용될 수 있는 어떠한 치료 목적에 대해서도 사용될 수 있다. 공동구속 분자는, 이로 제한됨이 없이, 자가 며역 및 염증 질환, 감염 질환, 및 암을 포함하는 장애를 치료하기 위해 투여될 수 있다.

본원에서 기술되는 목적상 "환자"는 사람 및 다른 동물, 예를 들어 다른 포유동물 모두를 포함한다. 따라서, 본원에서 기술되는 공동구속 분자는 사람 치료 및 가축 적용 모두를 갖는다. 본원에서 기술되는 바와 같은 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 질환 또는 장애에 대한 치료적 처치 및 예방적 또는 억제 수단을 포함하려는 것이다. 따라서, 예를 들어, 질환이 발병하기 전에 공동구속 분자의 성공적인 투여는 질환을 치료하게 된다. 또 다른 예로서, 질환의 증상에 맞서 싸우기 위한, 질환의 임상적 표시 후 최적화된 공동구속 분자의 성공적 투여는, 질환 치료를 포함한다. 또한, "치료" 및 "치료하는"은 질환을 제거하기 위해 질환이 나타난 후 최적화된 면역글로불린을 투여하는 것을 포함한다. 발병 후 및 임상적 증상이 전개된 후 임상적 증상의 가능한 감소 및 아마도 질환의 개선을 갖는 제제의 성공적인 투여는 질환의 치료를 포함한다. "치료가 필요한" 환자는 질환 또는 장애를 이미 갖는 포유동물 및 질환 또는 장애가 예방되어야 할 사람을 포함하여 질한 또는 장애를 갖기 쉬운 환자를 포유동물을 포함한다.

하나의 양태에서, 본원에서 기술되는 공동구속 분자는 단백질 또는 기타 분자의 부적절한 발현을 수반하는 질환을 갖는 환자에게 투여된다. 본 발명에서, 이는, 예를 들어 존재하는 단백질 양의 변화, 단백질 국소화, 해독후 변형, 구조적 상태, 돌연변이체 또는 병원체 단백질의 존재 등에 기인하는, 비정상적인 단백질에 의해 특징지어지는 질환 및 장애를 포함하려는 것이다. 유사하게, 질환 또는 장애는, 이로 제한됨이 없이, 폴리사카라이드 및 강글리오사이드를 포함하는 변화 분자에 의해 특징지어질 수 있다. 과다는, 이로 제한됨이 없이, 분자 수준에서의 과다발현, 작용 부위에서의 지연된 또는 축적된 출현 또는 정상에 비해 증가된 단백질 활성을 포함하는 모든 원인에 기인할 수 있다. 이러한 정의에는 단백질 감소로 특징지어지는 질환 및 장애가 포함된다. 이러한 감소는, 이로 제한됨이 없이, 분자 수준에서이 감소된 발현, 작용 부위에서의 단축되거나 감소된 출현, 단백질의 돌연변이 형태, 또는 정상에 비해 감소된 단백질 활성을 포함하는 모든 원인에 기인할 수 있다. 이러한 단백질의 과다 또는 감소는 단백질의 정상적 발현, 출현 또는 활성과 비교하여 측정될 수 있으며, 이러한 측정은 본원에서 기술되는 면역글로불린의 개발 및/또는 임상 시험에서 중요한 역할을 할 수 있다.

IgE-매개된 장애, 예를 들어 음식 및 환경 알러지 및 알러지성 천식을 치료하는 신규한 방법이 본원에 기술된다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 생성물 및 방법에 의해 치료될 수 있는 알러지 질환은 알러지성 및 아토피성 천식, 아토피성 피부염 및 습진, 알러지성 비염, 알러지성 결막염 및 비결막염, 알러지성 뇌척수염, 알러지성 비염, 알러지성 혈관염, 및 아나필락시스 쇼크를 포함한다. 치료될 수 있는 환경 및 음식 알러지는 집먼지 진드기, 바퀴벌레, 고양이 및 다른 동물, 꽃가루 (돼지풀, 버뮤다 그래스, 러시아 엉겅퀴, 오크, 호밀 등 포함), 사상균 및 진균 (알터나리아 알터나타 (Alternaria alternata), 아스퍼길러스 등), 라텍스, 곤충 침 (꿀벌, 말벌 등), 페니실린 및 기타 약물, 딸기 및 기타 과일 및 야채, 땅콩, 콩 및 기타 콩과식물, 호두 및 기타 트리너트, 조개류 및 기타 바다음식, 우유 및 기타 유제품, 밀 및 기타 곡물, 및 알을 포함한다. 실제로, 어떠한 음식 알러지항원, 공기 알러지항원, 직업 알러지항원 또는 기타 IgE-매개된 환경적 알러지항원도 본원 발명에서 기술되는 생성물의 치료량에 의해 치료될 수 있다. 일반적 알러지항원에 대해 문헌 (Arbes et al., Prevalences of positive skin test responses to 10 common allergens in the US population: Results from the Third National Health and Nutrition Examination Survey, Clinical Gastroenterology 116(2), 377-383 (2005))을 참조한다.

또한, 본원에서 기술되는 공동구속 분자에 대해 유리한 임상 반응을 나타낼 것 같은 환자 또는 하나 이상의 통용되는 치료제에 비해 본원에서 기술되는 공동구속 분자로 처리 시 상당히 우수한 반응을 나타낼 것 같은 환자를 확인하는 진단 시험이 기술된다. 사람에서의 FcγR 다형을 측정하기 위한 당해 기술 분야에 공지된 다수의 방법이 이용가능하다. 또한, 임상 샘플, 예를 들어 혈액 및 조직 샘플에 대해 수행되는 예후 시험이 기술된다. 이러한 시험은 기작과는 무관하게 활성을 검정할 수 있다. 이러한 정보를 이용하여 임상 시험에 포함시키거나 배제시킬 환자를 확인하거나, 적합한 용량 및 치료 요법에 관한 판단을 알릴 수 있다. 이러한 정보는 이러한 검정에서 우수한 활성을 나타내는 특정 공동구속 분자를 포함하는 약물을 선별하는데도 이용될 수 있다.

제형

본원에서 기술되는 공동구속 분자 및 하나 이상의 치료학적 활성제가 제형화되는 약제학적 조성물이 고려된다. 본원에서 기술되는 공동구속 분자의 제형은 저장을 위해 목적하는 정도의 순도를 갖는 상기 면역글로불린을 임의의 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed., 1980, 참조로 전부 삽입됨)와 혼합함으로써 동결건조된 제형 또는 수성 용액의 형태로 제조된다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 용량 및 농도에서 수령자에게 무독성이며, 완충제, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트, 아세테이트 및 기타 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예: 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA; 슈가, 예를 들어 슈크로즈, 만니톨, 트레할로즈 또는 소르비톨; 감미제 및 기타 향미제; 충전제, 예를 들어 미세결정성 셀룰로즈, 락토즈, 옥수수 및 기타 전분; 결합제; 첨가제; 착색제; 염-형성 카운터-이온, 예를 들어 나트륨; 금속 컴플렉스 (예: Zn-단백질 컴플렉스); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEEN^TM, PLURONICS^TM 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)를 포함한다. 하나의 양태에서, 본원에서 기술되는 면역글로불린을 포함하는 약제학적 조성물은 수용성 형태, 예를 들어 약제학적으로 허용되는 염으로 존재하는 형태일 수 있으며, 이는 산 및 염기 부가염 모두를 포함하려는 것이다. "약제학적으로 허용되는 산부가염"은 유리 염기의 생물학적 효과를 보유하고 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않지 않는 염을 나타내며, 무기산, 예를 들어 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등, 및 유기산, 예를 들어 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말레산, 말론산, 숙신산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨로엔설폰산, 살리실산 등으로 형성된다. "약제학적으로 허용되는 염기 부가염"은 무기 염기, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 철, 아연, 구리, 망간, 알루미늄 염 등으로부터 유도되는 것을 포함한다. 일부 양태는 암모늄, 칼륨, 나트륨, 칼슘 및 마그네슘 염 중 하나 이상을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 유기 무독성 염기로부터 유도되는 염은 일차, 이차 및 3차 아민, 천연 발생의 치환된 아민을 포함하는 치환된 아민, 사이클릭 아민 및 염기 이온 교환 수지, 예를 들어 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 및 에탄올아민을 포함한다. 생체내 투여를 위해 사용될 제형은 멸균될 수 있다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과 또는 기타 방법을 통해 쉽게 달성된다.

또한, 본원에서 기술되는 공동구속 분자는 면역리포좀으로 제형화될 수 있다. 리포좀은 치료제를 포유동물에 전달하는데 유용한 다양한 유형의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제를 포함하는 작은 비히클이다. 면역글로불린을 포함하는 리포좀은 당해 기술 분야에 공지된 방법으로 제조된다. 리포좀의 성분은 일반적으로, 생물막의 지질 배열과 유사하게, 이중층 형성으로 배열된다. 특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)를 포함하는 지질 조성물로 역상 증발시켜 제조될 수 있다. 리포좀은 한정된 세공 크기의 필터를 통해 밀어냄으로써 목적하는 직경을 갖는 리포좀을 수득한다.

또한, 공동구속 분자 및 다른 치료학적 활성제는, 이로 제한됨이 없이, 코아세르베이션 기술, 계면 중합화 (예를 들어, 하이드록시메틸셀룰로즈 또는 젤라틴-마이크로캡슐, 또는 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 사용)를 포함하는 방법에 의해 제조되는 마이크로캡슐, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예: 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐), 및 마크로에멀젼에 포착될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed., 1980, 참조로 전부 삽입됨)에 기술되어 있다. 지연-방출 제제가 제조될 수 있다. 지연-방출 제제의 적합한 예는 고형의 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스 (이 매트릭스는 성형 제품의 형태이다), 예를 들어 필름, 또는 마이크로캡슐을 포함한다. 지연-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 하이드로겔 (예: 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알콜), 폴리락타이드, L-글루탐산과 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합테, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 Lupron Depot® (이는 락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로스피어이다), 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산 및 ProLease® (시판사: Alkermes) (이는 폴리-DL-락타이드-코-글리콜라이드 (PLG)의 매트릭스로 삽입된 목적하는 생물활성 분자로 구성된 마이크로스피어-기본 전달 시스템이다)을 포함한다.

투여

예를 들어, 멸균 수성 용액 형태의 본원에서 기술되는 공동구속 분자를 포함하는 약제학적 조성물의 투여는, 이로 제한됨이 없이, 경구, 피하, 정맥내, 비강내, 귀내, 경피, 국소 (예: 젤, 연고, 로션, 크림 등), 복강내, 근육내, 폐내, 질, 비경구, 직장 또는 안내를 포함한 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 일부 예에서, 예를 들어 상처, 염증 등의 치료를 위해, 면역글로불린은 용액 또는 스프레이로서 직접적으로 적용될 수 있다. 당해 기술 분야에 공지되어 있는 바와 같이, 약제학적 조성물은 도입 방식에 따라 제형화될 수 있다.

피하 투여는 환자가 약제학적 조성물을 자가-투여할 수 있는 환경에서 이용될 수 있다. 많은 단백질 치료제는 피하 투여를 위한 최대의 허용가능 용적으로 치료학적 유효 용량의 제형을 가능하게 하기에는 충분히 강력하지 않다. 이러한 문제는 부분적으로는 아르기닌-HCl, 히스티딘 및 폴리소르베이트를 포함하는 단백질 제형을 사용함으로써 대처할 수 있다. 본원에서 기술되는 항체는, 예를 들어 증가된 효능, 개선된 혈청 반감기 또는 증진된 용해도 때문에, 피하 투여를 더욱 잘 받아들일 수 있다.

당해 기술 분야에 공지되어 있는 바와 같이, 단백질 치료제는 종종 IV 주입 또는 볼루스로 전달된다. 또한, 본원에서 기술되는 항체도 이러한 방법을 이용하여 전달될 수 있다. 예를 들어, 주입 비히클로서 0.9% 염화나트륨을 갖는 정맥내 주입물로서 투여될 수 있다.

폐 전달은 흡입기 또는 분무기 및 에어로졸화제를 포함하는 제형을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, Aradigm에서 시판되는 AERx® 흡입가능 기계 또는 Nektar Therapeutics로부터 시판되는 Inhance^TM 폐 전달 시스템이 사용될 수 있다. 본원에서 기술되는 항체는 폐내 전달을 더욱 잘 받아들일 수 있다. FcRn은 폐에 존재하며, 폐로부터 혈류로의 수송을 촉진할 수 있다 (Syntonix WO 04004798, Bitonti et al. (2004) Proc. Nat. Acad. Sci. 101:9763-8, 모두 참조로 전부 삽입됨). 따라서, 폐에서 더욱 효과적으로 FcRn을 결합하거나 혈류에 더욱 효과적으로 방출되는 항체는 폐내 투여 후 증진된 생물이용성을 가질 수 있다. 또한, 본원에서 기술되는 항체는, 예를 들어 개선된 용해도 또는 변화된 등전점 때문에, 폐내 투여를 더욱 잘 받아들일 수 있다.

또한, 본원에서 기술되는 공동구속 분자는, 예를 들어 위 pH에서의 개선된 안정성 및 단백질분해에 대한 증가된 내성 때문에, 경구 전달이 더욱 잘 수용될 수 있다. 또한, FcRn은 성인의 장 상피에서 발현되는 것으로 보이므로, 개선된 FcRn 상호작용을 갖는 본원에서 기술되는 항체는 경구 투여 후 증진된 생물이용성을 보일 수 있다. 또한, 항체의 FcRn 매개된 수송은 다른 점막, 예를 들어 위장, 호흡 및 생식관에서의 점막에서 일어날 수 있다.

또한, 다수의 전달 시스템이 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 본원에서 기술되는 항체를 투여하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 이로 제한됨이 없이, 리포좀, 마이크로입자, 마이크로스피어 (예: PLA/PGA 마이크로스피어) 등에서의 캡슐화를 포함한다. 달리, 막 또는 섬유를 포함한 다공성, 비-다공성 또는 젤라틴화 물질의 이식물을 사용할 수 있다. 지연 방출 시스템은 중합체 물질 또는 매트릭스, 예를 들어 폴리에스테르, 하이드로겔, 폴리(비닐알콜), 폴리락타이드, L-글루탐산과 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 에틸렌-비닐 아세테이트, 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 Lupron Depot®, 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함할 수 있다. 또한, 본원에서 기술되는 면역글로불린을 암호화하는 핵산을, 예를 들어 레트로바이러스 감염, 직접 주사, 또는 지질, 세포 표면 수용체 또는 다른 트랜스펙션제로의 코팅에 의해 투여할 수 있다. 모든 경우에서, 조절 방출 시스템은 목적하는 작용 부위에 또는 인접하게 면역글로불린을 방출하기 위해 이용될 수 있다.

복용

복용량 및 투여 횟수는, 하나의 양태에서, 치료학적으로 또는 예방학적으로 효과적이도록 선택된다. 당해 기술 분야에 공지되어 있는 바와 같이,나이, 체중, 일반적 건강, 성별, 식사, 투여 시간, 약물 상호작용 및 상태의 중증도뿐만 아니라 단백질 분해, 전신 대 국소 전달, 새로운 프로테아제 합성 속도의 조절이 필요할 수 있으며, 당업자에 의해 통상의 실험으로 확인가능할 것이다.

제형 중 치료학적 활성 공동구속 분자의 농도는 약 0.1 내지 100중량%로 다양할 수 있다. 하나의 양태에서, 공동구속 분자의 농도는 0.003 내지 1 molar의 범위이다. 환자를 치료하기 위해서, 본원에서 기술되는 면역글로불린의 치료학적 유효량이 투여될 수 있다. 본원에서 "치료학적 유효량"은 투여시 의도한 효과를 나타내는 용량을 의미한다. 정확한 용량은 치료 목적에 따를 것이며, 당업자에 의해 공지의 기술을 이용하여 확인가능할 것이다. 용량은 체중 kg 당 0.0001 내지 100 mg 또는 그 이상, 예를 들어 체중 kg 당 0.1, 1, 10, 또는 50 mg일 수 있다. 하나의 양태에서, 용량은 1 내지 10 mg/kg이다.

일부 양태에서는, 공동구속 분자의 단지 단일 용량이 사용된다. 다른 양태에서는 공동구속 분자의 다수 용량이 투여된다. 투여 사이의 경과 시간은 1시간 미만, 약 1시간, 약 1 내지 2시간, 약 2 내지 3시간, 약 3 내지 4시간, 약 6시간, 약 12시간, 약 24시간, 약 48시간, 약 2 내지 4일, 약 4 내지 6일, 약 1주, 약 2주 또는 2주 이상일 수 있다.

다른 양태에서, 본원에서 기술되는 공동구속 분자는 연장된 휴식 기간 없이 연속적 주입 또는 빈번한 투입에 의해 규칙적인 복용 요법으로 투여된다. 이러한 규칙적인 투여는 휴식 기간 없이 일정한 간격으로 복용하는 것을 포함할 수 있다. 전형저으로, 이러한 요법은 연장된 시간 동안, 예를 들어 1 내지 2일, 1 내지 2주, 1 내지 2개월, 6개월 이하 또는 그 이상 동안 장기간의 저용량 또는 연속 주입을 포함한다.

특정 양태에서, 본원에서 기술되는 공동구속 분자 및 하나 이상의 다른 예방제 또는 치료제는 환자에게 주기적으로 투여된다. 주기적 요법은 처음에 제1 작용제의 투여, 두 번째에 제2 작용제의 투여, 임의로 추가되는 때에 추가의 작용제의 투여, 임의로 휴식 기간, 이어서 한번 이상의 이러한 투여 순서의 반복을 포함한다. 주기의 수는 통상적으로 2 내지 10회이다. 주기적 요법은 하나 이상의 제제에 대한 내성 전개를 감소시킬 수 있거나, 부작용을 최소화할 수 있거나, 치료 효율을 개선할 수 있다.

병용 요법

본원에서 기술되는 공동구속 분자는 하나 이상의 다른 치료 요법 또는 작용제와 함께 투여될 수 있다. 추가의 치료 요법 또는 작용제는 동일한 질환을 치료하거나, 수반되는 합병증을 치료하거나, 면역글로불린의 효능 또는 안전성을 개선하기 위해 사용될 수 있다.

특히 바람직한 공동-요법은 IgE-매개된 장애, 예를 들어 알러지 및 천식의 치료를 위해 승인되거나 임상적으로 평가된 것들을 포함한다. 특히, 본 발명의 치료 조성물은, 2개의 주요한 그룹의 약물인, 소염제, 예를 들어 코르티코스테로이드, 및/또는 기관지확장제, 예를 들어 흡입되는 β2-아고니스트과 병용하여 사용될 수 있다. 흡입되는 코르티코스테로이드는 플루티카손, 부데소나이드, 플루니솔리드, 모메타손, 트리암시놀론 및 베클로메타손을 포함하고, 경구 코르티코스테로이드는 프레드니손, 메틸프레드니손 및 프레드니소론을 포함한다. 다른 스테로이드는 글루코코르티코이드, 덱사메타손, 코르티손, 하이드록시코르티손, 아줄피디네이코사노이드, 예를 들어 프로스타글란딘, 트롬복산 및 류코트리엔, 및 국소 스테로이드, 예를 들어 안트랄린, 칼시포트리엔, 클로베타솔 및 타자로텐을 포함한다. 기관지확장제는 공기 통과 직경을 넓히고 폐로 및 폐로부터의 유동을 쉽게 한다. 본 발명의 요법과 병용될 수 있는 기관지확장제는 단기-작용 기관지확장제, 예를 들어 메타프로테레놀, 에페드린, 테르부탈린 및 알부테롤, 및 장기-작용 기관지확장제, 예를 들어 살메테롤, 메타프로테레놀 및 테오필린을 포함한다.

본 발명의 요법은 비-스테로이드성 소염 약물 (NSAID), 예를 들어 아스피린, 이부프로펜, 셀레콕시브, 디클로페낙, 에토돌락, 페노프로펜, 인도메타신, 케토락락, 옥사프로진, 나부멘톤, 술린닥, 톨멘틴, 로페콕시브, 나프록센, 케토프로펜 및 나부메톤과 병용될 수 있다. 공동-요법은 항히스타민제, 예를 들어 로라타딘, 펙소페나딘, 세티리진, 디펜하이드라민, 클로르페니라민, 말레에이트, 클레마스틴 및 젤라스틴을 포함할 수 있다. 공동-요법은 크로모글리케이트, 크로몰린 나트륨 및 네드로크로밀, 및 충혈완화제, 스프레이 또는 경구제, 예를 들어 옥시메타졸린, 페닐레프린 및 슈도에페드린을 포함할 수 있다. 본 발명의 요법은 류코트리엔-수용체 길항제로 불리는 일 부류이 소염제, 예를 들어 프란루카스트, 자피르루카스트 및 멘테루카스트, 및 류코트리엔-수용체 합성-억제제, 예를 들어 질류톤을 병용될 수 있다.

본 발명의 요법은, 알러지 쇼트를 포함하는 다른 면역요법, 및 IgE 또는 FcεR의 다른 길항제와 병용될 수 있다. 본 발명의 요법은, 이로 제한됨이 없이, 항체 및 Fc 융합물을 포함하여, 케모카인 또는 사이토킨의 길항제와 병용될 수 있으며, 이로 제한됨이 없이, 케모카인 CCR3, CCR4, CCR8, 및 CRTH2, 및 CCR5의 억제제, 및 사이토카인 IL-13, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, IL-19, IL-21, 제II 부류의 사이토카인 수용체, IL-22, IL-23, IL-25, IL-27, IL-31, 및 IL-33의 억제제를 포함한다. 본 발명의 요법은 부착, 전사 인자 및/또는 세포내 시그널화의 조절제와 병용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 면역글로불린은 NF-κb, AP-1, GATA-3, Stat1, Stat-6, c-maf, NFAT, 사이토킨 시그널화 억제제 (SOCS), 퍼옥시좀 확산자-활성화된 수용체 (PPAR), MAP 키나제, p38 MAPK, JNK, 및 스핑고신 I-포스페이트 수용체의 조절제와 병용될 수 있다. 본 발명의 요법은 수플라타스트 톨릴레이트, 포스포디에스테라제 4의 억제제 (PDE4), 칼슘 채널 억제제 및 헤파린-유사 분자와 함께 투여될 수 있다. 본 발명의 가능한 공동-요법은 문헌 (Caramori et al., 2008, Journal of Occupational Medicine and Toxicology 3-S1-S6)에서 더욱 상세히 기술된다.

본 발명의 요법은 하나 이상의 항생제, 항진균제 또는 항바이러스제와 병용하여 사용될 수 있다. 본원에서 기술되는 항체는 다른 치료 요법, 예를 들어 수술과 병용될 수 있다.

실시예

하기 제공되는 실시예는 단지 설명을 위한 것이다. 이들 실시예는 본원에서 기술되는 특정 양태를 특정 적용 또는 작동 이론에 제한하려는 것이 아니다.

실시예 1: IgE + Fc γ RIIb + 세포를 억제하기 위한 새로운 억제 방법

면역글로불린 IgE는 영향을 받은 조직에서 알러지 반응의 중추적 개시자 및 증식자이다. IgE는 비만 세포, 호염기구, 호산구 및 다른 세포 유형을 포함하는 다양한 이펙터 세포에서 발현되는 즉각적 알러지 증상에 수반되는 주요 수용체인 IgE에 대한 고친화성 수용체 (FcεRI)를 결합한다. 면역-컴플렉스 IgE-알러지항원에 의한 FcεRI의 가교결합은 화학적 매개자, 예를 들어 히스타민, 프로스타글란딘, 및 류코트리엔을 방출하는 이들 세포를 활성화시켜, 제I형 과민 반응의 전개를 이끌수 있다. 승인된 모노클로날 항체 오말리주마브 (Xolair)은 이에 결합하고 FcεR와의 구속을 차단함으로써 IgE를 중화시킨다. 오말리주마브는 격리를 통해 생물활성 IgE를 감소시키므로, 조직 비만 세포 및 호염기구에 결합하고 감작화시킬 수 있는 항원-특이적 IgE의 양을 감소시킨다. 그 결과, 자유 순환 IgE에 대한 이러한 중화는 알러지 질환의 증상 감소를 이끈다. 흥미롭게도, 혈청 IgE 수준은 오말리주마브-IgE 컴플렉스 형성 때문에 치료 개시 후 증가하며, 치료 중지 후 1년까지 높게 유지될 수 있다. 결과적으로, 이러한 이슈는 진단 시험에서 거짓-음성을 이끌 수 있고, 따라서 IgE 수준은 통례적으로 점검되어야 한다.

IgE 경로를 표적하기 위한 새로운 접근은, 자유 순환 IgE가 이펙터 세포 상의 FcεR를 구속하는 것을 차단하는 것뿐만 아니라 IgE 생성 공급원을 표적하는 것을 포함한다. IgE는 항원 도입 부위를 드레이닝하는 림프절 내에 위치되거나 국소적으로는 알러지 반응 부위에 위치되는 IgE-생성 혈장 세포에 의해 분비된다. IgE-생성 혈장 세포는 IgE+ B 세포로부터 분화된다. B 세포의 IgE 생성으로의 클래스 스위칭은 2개의 서로 다른 시그널에 의해 유도되며, 이둘 모두 TH2 세포에 의해 제공될 수 있다.

2가지 형태의 면역글로불린이 있다: 분비 형태 및 막-고정 형태. 막-고정 형태는 중쇄의 C 말단으로부터 연장되는 막-고정 펩타이드를 갖는다는 점에서 분비 형태와 다르다. B 세포 수용체 (BCR) 컴플렉스로도 불리는, B-세포 상의 막-고정된 면역글로불린이 B-세포 기능에 중요하다. 이는 휴지 B 세포가 활성화된 림프모구 및 Ig-분비 혈장 세포로 분화되도록 시그널을 변환시킬 수 있다.

본원에서 mIgE+ B 세포로도 불리는, 막-고정된 IgE를 발현하는 분화된 B 세포는 천연적인 음성적 조절 피드백 기작 - 억제성 Fc 수용체 FcγRIIb - 를 갖는다. FcγRIIb는 B 세포, 수지상 세포, 단핵구 및 대식구를 포함하는 다양한 면역 세포에서 발현되며, 면역 조절에 중요한 역할을 한다. B 세포 상에서 정상적 역할을 수행하는 경우, FcγRIIb는 B 세포 수용체 (BCR)을 통한 B 세포 활성화를 조절하는 피드백 기구로서 역할을 한다. 성숙한 B 세포 상의 면역 컴플렉스 항원에 의한 BCR의 구속은 칼슘 유동을 포함한 세포내 시그널화 케스케이드를 활성화시켜, 세포 증식 및 분화를 이끈다. 그러나, 항원에 대해 특이성를 갖는 IgG 항체가 생성되는 경우, 연합된 면역 컴플렉스 (IC)는 BCR을 FcγRIIb와 가교결합할 수 있으며, 이 경우 BCR의 활성화는 FcγRIIb 및 BCR 활성화의 다운스트림 경로를 방해하는 연합된 세포내 시그널화 경로를 구속함으로써 억제된다. mIgE를 BCR로 사용하는 mIgE+ B 세포의 표면에서 FcγRIIb의 발현은 이들 세포 유형의 음성적 조절자로서 역할을 한다.

도 1에 도시되는 바와 같이, IgE-매개된 질환을 억제하기 위한 새로운 접근은, 막 고정된 IgE 및 억제성 수용체 FcγRIIb를 공동구속함으로써 IgE+ B 세포 (즉, 막 고정된 IgE를 발현하는 B 세포)를 억제하는 것이다. IgE를 발현하도록 클래스-스위칭된 B 세포에서, mIgE는 BCR (본원에서는 mIgE BCR로 불림)로서 역할을 한다. 이러한 접근은 잠재적으로는 B 세포 활성화의 면역 컴플렉스-매개된 억제에 대한 천연 생물학적 기작을 모방하므로, IgE-생성 혈장 세포로의 분화를 막는다. IgE-생성 혈장 세포는 골수에 있으며, 아마도 수주 내지 수개월의 수명을 가진다. 새로운 IgE-분비 혈장 세포는 분화 동안 mIgE-발현 B-세포 단계를 통해 진행하므로, 항-IgE 처리로 mIgE+ B 세포 전구체를 억제함으로써 이들의 생성을 방해하는 경우, 기존의 혈장 세포는 수주 내지 수개월 내에 죽을 것이므로 IgE의 생성도 점진적으로 약해질 것이다. 중요하게도, mIgE를 갖는 IgE+ 기억 B 세포의 억제는 또는 FcγRIIb를 고친화성으로 공동구속하는 항-IgE 면역글로불린에 의해 억제될 것이다. 이러한 것이 발생하는 경우, 치료는 기본적인 질환에 대한 장기간 영향을 가질 수 있다.

실시예 2: Fc γ RIIb 에 대해 고친화성을 갖는 항- IgE 항체

생리학적 조건 하에서, BCR의 FcγRIIb와의 브릿징 및 후속적으로 B 세포의 억제는 IgG 및 인지체 항원의 면역 컴플렉스를 통해 발생한다. 디자인 전략은 단일 가교결합 항체를 사용하여 이러한 효과를 발생시키는 것이었다. 사람 IgG는 약한 친화성 (IgG1에 대해 100 nM 초과)으로 사람 FcγRIIb를 결합하며, FcγRIIb-매개된 억제는 면역-컴플렉스에는 반응하여 발생하고 단량체성 IgG에 대해서는 발생하지 않는다. 이러한 수용체에 대한 고친화성 (100 nM 미만)이 B 세포 활성화의 최대 억제에 필요할 것이라고 판단되었다. 본 발명의 항-IgE 항체의 억제 활성을 증진시키기 위해, Fc 영역을 FcγRIIb에 대한 결합을 개선하는 변이체로 조작하였다. 천연 IgG1에 비해 개선된 친화성으로 FcγRIIb에 결합하는 조작된 Fc 변이체가 기술되어 있다 (USSN 12/156,183, 출원일: 2008년 5월 30일, 명칭: "Methods and Compositions for Inhibiting CD32b Expressing cells", 본원에 특별히 참조로 삽입됨).

먼저, BCR 공동수용체 컴플렉스의 조절 성분인 항원 CD19를 표적하는 항체와 관련하여 변이체를 생성하였다. 이 항체의 Fv 영역은 항체 4G7의 사람화 및 친화성 성숙된 버젼이며, 본원에서는 HuAM4G7로 불린다. 이 항체의 Fv 유전자를 포유동물 발현 벡터 pTT5 (National Research Council Canada)에 서브클로닝하였다. Fc 도메인에서의 돌연변이를 부위-지시된 돌연변이유발 (QuikChange, Stratagene, Cedar Creek, Tex.)을 이용하여 도입하였다. 또한, 치환 G236R 및 L328R (G236R/L328R)을 포함하는, Fc 수용체에 대해 친화성을 없앤 대조군 녹아웃 변이체는 생성하였다. 이 변이체는 Fc-KO 또는 Fc 녹아웃으로 불린다. 중쇄 및 경쇄 제작물을 발현을 위해 HEK293E 세포에 공동트랜스펙션하고, 항체를 단백질 A 친화성 크로마토그래피 (Pierce Biotechnology, Rockford, IL)를 이용하여 정제하였다.

결합 조사를 위한 재조합 사람 FcγRIIb 단백질은 R&D Systems (Minneapolis, MN)으로부터 구입하였다. FcγRIIa 및 FcγRIIIa 수용체 단백질을 암호화하는 유전자는 Mammalian Gene Collection (ATCC)로부터 구입하고, 6X His 태그를 포함하는 pTT5 벡터 (National Research Council Canada)로 서브클로닝하였다. 수용체의 대립형질 형태 (FcγRIIa에 대해 H131 및 R131 및 FcγRIIIa에 대해 V158 및 F158)를 QuikChange 돌연변이유발로 생성하였다. 수용체를 암호화하는 벡터를 HEK293T 세포로 트랜스펙션하고, 단백질을 니켈 친화성 크로마토그래피로 정제하였다.

변이체를, 실시간으로 생물분자 상호작용을 조사하기 위한 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 기초한 기술인, 본원에서 비아코어로 불리는, 비아코어 기술을 이용하여 수용체 친화도에 대해 시험하였다. SPR 측정은 Biacore 3000 기구 (Biacore, Piscataway, N.J.)를 사용하여 수행하였다. 단백질 A/G (Pierce Biotechnology) CM5 바이오센서 칩 (Biacore)을 표준 일차 아민 커플링 프로토콜을 이용해 생성하였다. 모든 측정은 HBS-EP 완충액 (10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% vol/vol 계면활성제 P20, Biacore)을 사용하여 수행하였다. HBS-EP 완충액 중 20 nM 또는 50 nM의 항체를 단백질 A/G 표면에 고정시키고, FcγR를 주입하였다. 각각의 사이클 후, 글리신 완충액 (10 mM, pH 1.5)을 주입하여 표면을 재생하였다. 제로화 시간 및 FcγR 주입 전 반응 및 적합한 비특이적 시그널 제거 (참조 채널의 반응 및 러닝 완충액의 주입)에 의해 자료를 처리하였다. BIAevaluation 소프트웨어 (Biacore)를 사용하여 1:1 Langmuir 결합 모델로 결합 자료를 글로벌 피팅 (global fitting)함으로써 동역학 분석을 수행하였다.

FcγRIIb에 대한 변이체 항-CD19 항체의 결합에 대한 대표적인 세트의 센서그램 (sensorgram)이 도 2에 도시된다. 비어코어 결합 자료의 피트로부터 수득된, 모든 변이체 및 WT (천연) IgG1의 모든 FcγR에 대한 친화도가 도 3에 플로팅되어 있으며, 도 4에서는 수치적으로 제시된다. WT IgG1 Fc는 μM 친화도 (K_D=1.8 uM, 도 4)로 FcγRIIb와 결합하는데 반해, 억제성 수용체와 더욱 견고히 결합하는 다수의 변이체, 예를 들어 G236D/S267E, S239D/S267E, 및 S267E/L328F가 조작되었다. 문헌 (USSN 11/124,620)에 기술되어 있는 바와 같이, S239D/I332E 변이체는 활성화 수용체 FcγRIIa 및 FcγRIIIa에 대해 개선된 친화성을 가지므로, 증진된 항체-의존적 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 및 포식작용 (ADCP)를 매개할 수 있다. Fc-녹아웃 또는 Fc-KO로도 불리는, G236R/L328R 변이체는 Fc 수용체에 대한 결합이 결여되며, 본원에서 기술되는 실험에서 대조군으로 사용된다.

IgE를 표적하는 항체에서 선택 변이체를 제작하였다. 항-IgE 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 (VH 및 VL)이 도 5에 도시된다. 오말리주마브는 알러지성 천식을 치료하기 위해 현재 승인된 사람화 항체이며, 상품명 Xolair로 시판되고 있다. MaE11는 오말리주마브의 뮤린 전구체이다. H1L1_MaE11은 MaE11의 새로운 사람화 버젼이다. 이들 항-IgE 항체의 중쇄 및 경쇄 VH 및 VL 도메인을 암호화하는 유전자가 합성되었으며 시판된다 (Blue Heron Biotechnologies). 또한, 음성 대조물로서 본원에서 기술되는 실험에 사용되는 항-호흡기 합포체 바이러스 (RSV) 항체 모타비주마브의 가변 영역 VH 및 VL 유전자도 합성되었다. VL 유전자는 C카파 불변쇄를 암호화하는 포유동물 발현 벡터 pTT5 (NRC-BRI, Canada)에 서브클로닝하였다. VH 유전자는 천연 IgG 및 변이 불변 영역을 암호화하는 pTT5 벡터로 서브클로닝하였다. 선택된 불변 영역의 아미노산 서열이 도 6에 도시된다. 모든 DNAs를 서열분석하여 서열의 정확도를 확인하였다. 선택된 항체의 전장 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열이 도 7에 도시된다.

중쇄 및 경쇄를 포함하는 플라스미드를 리포펙타민 (Invitrogen)을 사용하여 HEK293E 세포로 트랜스펙션하고, FreeStyle 293 배지 (Invitrogen)에서 성장시켰다. 성장 5일 후, MabSelect 수지 (GE Healthcare)를 사용하는 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 배양 상등액으로부터 항체를 정제하였다.

변이체 및 천연 IgG1 항-IgE 항체를 비아코어를 이용하여 IgE 및 FcγRIIb에 대한 결합에 대해 시험하였다. 사용된 항-IgE 항체에 대한 결합 부위를 포함하는 IgE의 Fc 영역을 암호화하는 DNA를 합성하고 (Blue Heron Biotechnologies), pTT5 벡터로 서브클로닝하였다. IgE Fc를 293E 세포에서 발현시켰으며, 상술된 바와 같이 단백질 A를 사용하여 정제하였다. SPR 측정은, 분석물이 FcγRIIb 또는 IgE의 Fc 영역이라는 것을 제외하고는, 상술된 단백질 A/항체 포착 방법을 이용하여 수행하였다. 자료 수집 및 피팅은 상술된 바와 같다. 도 8은 이들 결합 실험으로부터 얻은 평형 결합 상수 (K_Ds), 및 FcγRIIb에 대한 결합에 대해 천연 IgG1과 비교한 친화성 (배수: fold)을 제공한다. 도 9는 이들 자료의 플롯을 도시한다. 이러한 결과는 IgE에 대한 항체의 높은 친화성을 입증하며, FcγRIIb 변이체가 이전 결과와 일치하게 두자릿수 이상으로 FcγRIIb에 대한 결합을 개선한다는 것을 입증한다.

특정 변이체, 예를 들어 S267E/L328F 및 S239D/I332E의 이용은 상술된 기작에 대한 개념을 입증하려는 것이며, 이들의 특정한 사용으로 본 발명을 제한하려는 것이 아니다. 문헌 (USSN 12/156,183 및 USSN 11/124,620)에 제공된 자료는 특정 위치에서 다수의 조작된 변이체가 표적된 특성을 제공한다는 것을 나타낸다. FcγR에 대한 친화성, 특히 FcγRIIb에 대한 친화성을 증진시키기 위한 치환은 다음을 포함한다: 234, 235, 236, 237, 239, 266, 267, 268, 325, 326, 327, 328, 및 332. 일부 양태에서, 치환은 FcγRIIb에 대한 친화성을 증진시키기 위해 비제한적인 하기 위치 중 적어도 하나의 위치에서 이루어진다: 235, 236, 239, 266, 267, 268, 및 328.

FcγRIIb에 대한 친화성을 증진시키기 위해 치환시킬 위치의 비제한적 조합은 다음을 포함한다: 234/239, 234/267, 234/328, 235/236, 235/239, 235/267, 235/268, 235/328, 236/239, 236/267, 236/268, 236/328, 237/267, 239/267, 239/268, 239/327, 239/328, 239/332, 266/267, 267/268, 267/325, 267/327, 267/328, 267/332, 268/327, 268/328, 268/332, 326/328, 327/328, 및 328/332. 일부 양태에서, FcγRIIb에 대한 친화성을 증진시키기 위해 치환시킬 위치의 비제한적 조합은, 이로 제한됨이 없이, 다음을 포함한다: 235/267, 236/267, 239/268, 239/267, 267/268, 및 267/328.

FcγRIIb에 대한 친화성을 증진시키기 위한 치환은 다음을 포함한다: 234D, 234E, 234W, 235D, 235F, 235R, 235Y, 236D, 236N, 237D, 237N, 239D, 239E, 266M, 267D, 267E, 268D, 268E, 327D, 327E, 328F, 328W, 328Y, 및 332E. 일부 양태에서, FcγRIIb에 대한 친화성을 증진시키기 위해 치환시킬 위치에 대한 조합은, 이로 제한됨이 없이, 다음을 포함한다: 235Y, 236D, 239D, 266M, 267E, 268D, 268E, 328F, 328W, 및 328Y.

FcγRIIb에 대한 친화성을 증진시키기 위한 치환의 조합은 다음을 포함한다: L234D/S267E, L234E/S267E, L234F/S267E, L234E/L328F, L234W/S239D, L234W/S239E, L234W/S267E, L234W/L328Y, L235D/S267E, L235D/L328F, L235F/S239D, L235F/S267E, L235F/L328Y, L235Y/G236D, L235Y/S239D, L235Y/S267D, L235Y/S267E, L235Y/H268E, L235Y/L328F, G236D/S239D, G236D/S267E, G236D/H268E, G236D/L328F, G236N/S267E, G237D/S267E, G237N/S267E, S239D/S267D, S239D/S267E, S239D/H268D, S239D/H268E, S239D/A327D, S239D/L328F, S239D/L328W, S239D/L328Y, S239D/I332E, S239E/S267E, V266M/S267E, S267D/H268E, S267E/H268D, S267E/H268E, S267E/N325L, S267E/A327D, S267E/A327E, S267E/L328F, S267E/L328I, S267E/L328Y, S267E/I332E, H268D/A327D, H268D/L328F, H268D/L328W, H268D/L328Y, H268D/I332E, H268E/L328F, H268E/L328Y, A327D/L328Y, L328F/I332E, L328W/I332E, 및 L328Y/I332E. 일부 양태에서, FcγRIIb에 대한 친화성을 증진시키기 위한 치환의 조합은, 이로 제한됨이 없이, 다음을 포함한다: L235Y/S267E, G236D/S267E, S239D/H268D, S239D/S267E, S267E/H268D, S267E/H268E, 및 S267E/L328F.

실시예 3: Fc γ RIIb 에 대해 고친화성을 갖는 항- IgE 항체에 의한 IgE + B 세포의 시험관내 억제

효소-결합된 면역흡착 검정 (ELISA)를 IgE를 검출하기 위해 확립하였다. 평저 플레이트를 pH 9.4 중탄산나트륨 완충액으로 코팅한 후 pH 9.4 (0.1 M 중탄산나트륨 완충액)에서 밤새 10 ug/ml의 항-IgE 포착 항체와 부착시켰다. 밤샌 후, 플레이트를 3% BSA/PBS로 차단하고, (사람 IgE ELISA 키트 (Bethyl Laboratories)로부터의) 일련의 IgE 희석물을 1 ug/ml에 3회 가하였다. 3시간 후, 플레이트를 TTBS로 3회 (200 ul) 세척하고, 결합된 IgE를 측정하였다. HRP-컨주게이션된 염소 폴리클로날 항-사람 IgE 항체 (Bethyl Laboratories)를 1% BSA/PBS 중에서 1시간 동안 (1:5000)로 가하였다. 샘플을 3회 세척하고, IgE를 TMB 퍼옥시다제 기질 (KPL, Inc 50-76-00)로 검출하였다. 반응은 50 ul 2N H₂SO₄로 정지시키고, 450 nm에서 판독하였다.

도 10은 3개의 모노클로날 항-IgE 항체 (MabTech; 107/182/101), MaE11_IgG1_G236R/L328R, 및 오말리주마브_IgG1_G236R/L328R의 푸울을 포함하는 다양한 항-사람 IgE 항체를 사용한 IgE 포착을 도시한다. 이 자료는 시판되는 항-IgE 항체 시약인 (MabTech) 오말리주마브 및 이의 모 키메릭 항체 MaE11이 IgE를 포착할 수 있다는 것을 보인다. IgE를 검출하기 위한 이러한 검정의 이용을 위해, MaE11 및 오말리주마브 항체가 MabTech 항-IgE 시약에 의한 IgE 포착을 방해하는지의 여부를 결정하는 것이 필요하였다. 검정은 상술된 바와 같이 반복되었으며, 흡광도에 의한 IgE의 농도는 표준 곡선을 이용하여 계산하였다. 도 11은 항-IgE 항체 오말리주마브_G236R/L328R가 현 ELISA 프로토콜에서 MabTech 항-IgE 항체와 경쟁하지 않는다는 것을 나타낸다.

Fc 변이체 항-IgE 항체를 IgE+ B 세포를 억제하는 능력에 대해 시험하였다. 사람 PBMC에 5 ng/ml 인터루킨-4 (IL-4) 및 100 ng/ml 항-CD40 항체 (클론 G28.5 IgG1)를 가함으로써 IgE 생성 B 세포로의 클래스 스위칭을 유도하였다. 항-CD40 항체는 CD40의 아고니스트이므로, 공동-활성화제 CD40L의 활성을 모방한다. 다양한 농도의 항-IgE 항체를 가한 후, 샘플을 12일 동안 인큐베이션하였다. ELISA 플레이트를 준비하고, 상술된 바와 같이, 포착 항체로서 5 ug/ml Mabtech 항-IgE를 사용하여 차단하였다. 100 ul의 PBMC 샘플을 가하고, 3시간 초과 동안 인큐베이션 한 후, TTBS로 3회 (200 ul) 세척하였다. 항체-HRP 컨주게이션된 항체를 가하고, 상술된 바와 같이 검추하였다. 450 nm에서의 흡광도를 표준 곡선을 이용하여 IgE 농도로 전환하였다. 그 결과가 도 12에 도시되어 있다. FcγR 결합이 결여된 항체 (G236R/L328R 변이체) 또는 IgE에 대해 특이성을 갖지 않는 항체 (모타비주마브 항-RSV 항체)는 분화된 B 세포로부터의 IgE 생성에 영향이 없었다. 이와는 대조적으로, FcγRIIb에 대해 높은 친화성을 갖는 변이 항체는 IgE 생성을 억제하였다. 이들 자료는 표면 IgE 및 억제성 FcγR 수용체인 FcγRIIb의 공동구속이 이러한 며역글로불린 유형의 클래스-스위칭된 B 세포를 억제한다는 것을 제시한다. IgE+ B 세포의 억제는 IgE 발현 혈장 세포의 수를 감소시키며, 이는 결국 검출되는 IgE의 양을 감소시킨다. IgE 생성 B 세포에 대한 이러한 활성의 선택성을 평가하기 위해서, IgG2 ELISA (Bethyl Laboratories)를 이용하여 동일한 샘플로부터 사람 IgG2를 측정하였다. 도 13은 IgG2 분비가 억제되지 않았다는 것을 도시하며, 이는 높은 FcγRIIb 친화성을 갖는 항-IgE 항체의 억제 활성이 IgE+ 클래스-스위칭된 세포에 대해 선택적이라는 것을 나타낸다. 승인된 항-IgE 항체인 오말리주마브의 변이체 버젼을 이용하여 이러한 실험을 반복한 결과, 높은 FcγRIIb 친화성을 갖는 변이체와 유사한 억제 결과를 나타내었다 (도 14).

IgE 생성을 억제할 높은 FcγRIIb 친화성을 갖는 항-IgE 항체의 능력을 mIgE BCR 자극 존재 하에 평가하였다. IL-4 및 α-CD40 아고니스트 항체에 의해 촉진되는 IgE로의 클래스-스위칭과 함께 상기 검정을 반복하였으며, B 세포를 항-mu 또는 항-CD79b 항체를 사용하여 활성화시켰다. 이들 항체는 BCR을 가교결합하므로, 면역-컴플렉스 항원과 유사한 시그널을 제공하였다. 항-mu 항원은 막-고정된 IgM을 가교결합하고, 항-CD79b는 BCR 컴플렉스의 시그널화 성분인 CD79b를 가교결합한다. PBMC를 IL-4, α-CD40, 및 항-CD79b 또는 항-mu와 함께 14일 동안 인큐베이션하고, IgE를 상술된 바와 같이 검출하였다. 항-CD79b (도 15) 및 항-mu (도 16)에 대한 결과는, B 세포를 BCR 가교결합으로 자극시 FcγRIIb에 대해 고친화성을 갖는 항-IgE 항체가 IgE 생성을 억제할 수 있다는 것을 나타낸다.

IgE+ B 세포를 억제하기 위한 추가의 전략은 이들을 고갈시키는 것이다. 이는 이펙터 기능이 증진된 항-IgE 항체를 사용하여 수행할 수 있다. 변이체 S239D/I332E는 활성화 수용체 FcγRIIa 및 FcγRIIIa (도 3 및 도 4)에 대한 결합을 증가시키므로, ADCC 및 ADCP 이펙터 기능을 개선한다. 상기 B 세포 검정을 항-IgE 항체인 오말리주마브의 S239D/I332E 변이체를 사용하여 수행하였다. PBMC를 IL-4, α-CD40, 및 항-CD79b (도 17) 또는 항-mu (도 18)과 14일 동안 인큐베이션하고, IgE를 상술된 바와 같잉 검출하였다. 그 결과 (도 17 및 18), 최적화된 이펙터 기능을 갖는 항-IgE 항체가 클래스-스위칭된 IgE+ B 세포로부터 IgE 생성을 억제할 수 있음을 입증한다.

실시예 4: Fc γ RIIb 에 대해 고친화성을 갖는 항- IgE 항체에 의한 IgE + B 세포의 생체내 억제

본원에서 기술되는 면역글로불린을 사람에서의 치료 활성을 위한 대용물로서 huPBL-SCID 마우스 모델을 사용하여 평가하였다. 이 조사는, 일반적인 사람 알러지 항원인 집먼지 진드기 단백질 Der p 1에 반응시 B 세포 활성 및 혈장 세포 발달을 억제하는 본원에서 기술되는 항-IgE 항체의 능력을 조사한다. 이 방법에서, Der p 1에 대해 알러지 반응을 갖는 혈액 공여자로부터의 사람 말초혈 림프구 (PBL)을 면역-결핍 SCID 마우스에 이식하고, 천연 또는 변이 항-IgE 항체로 처리하였다. 마우스를 항원으로 처리하여 면역 반응을 자극하고, 면역글로불린 생성을 측정하여 혈장 세포로의 B 세포 발달 과정을 조사하였다.

혈액 공여자를 Der p 1에 대한 항-IgE 항체의 존재에 기초하여 집먼지 진드기 항원에 대한 알러지에 대해 스크리닝하였다. 양성 반응을 갖는 공여자에 대해 백혈구성분을 채집하여 말초혈 단핵구 세포 (PBMC)를 수득하였다. 이 조사의 프로토콜이 도 20에 도시된다. PBMC를 주사하기 1일 전, 마우스에게 100 ul의 항-아시알로 GM 항체 (Wako, Richmond, VA)를 복강내 (i.p.) 주사하여 뮤린 천연 킬러 (NK) 세포를 제거하였다. 다음날, 마우스에게 0.5 ml 용적의 3 X 10⁷ PBL을 i.p. 주사하였다. PBMC 주사 후, 마우스를 각 그룹당 7마리의 마우스를 갖는 5개의 상이한 그룹으로 나누었다. PBMC 주사 7일 후, ELISA (ZeptoMetrix, Buffalo, N.Y.)에 의한 사람 IgG 및 IgE를 측정하기 위해 레트로-오비탈 시누스/플렉서스 (OSP) 펑크를 통해 모두 마우스로부터 채혈하였다. 2일 후 (9일), 마우스에 10 mg/kg의 항체 또는 PBS를 i.p. 주사하였다. 11일에, 마우스에 15 ug의 집먼지 진드기 항원 Der p 1 (LoTox Natural Der p 1, Indoor Biotechnologies, Charlottesville, VA)을 i.p. 주사하였다. 23일 (항원 백신접종 후 12일)에 사람 IgG 및 IgE 항체를 측정하기 위해 모든 마우스로부터 채혈하였다. 동일한 날에, 마우스에 10 mg/kg 항체 또는 PBS를 i.p. 이차 주사하였다. 2일 후 (25일)에, 마우스에 10 ug 집먼지 진드기 항원 Der p 1을 i.p. 부스트 백신접종하였다. 37일 (항원 부스팅 후 12일)에, 사람 면역글로불린 측정을 위해 OSP로 채혈하였다. 사람 IgG 및 IgE 농도를 상술된 바와 유사한 ELISA 방법으로 측정하였다.

그 결과가 혈청 IgG 및 IgE 수준 각각에 대해 도 20 및 21에 도시되어 있다. 알러지항원 챌린지 전, 사람 IgG 및 IgE 항체의 수준은 모든 그룹에서 낮았다. Der p 1 면역화 후, 모든 그룹은 높은 수준의 사람 IgG를 나타내었으며, 이는 백신접종된 Der p 1 항원 또는 내인성 마우스하원에 대한 이식된 사람 B 세포에 의한 강력한 면역 반응을 나타낸다. IgG 반응과는 대조적으로, 처리 그룹들은 IgE 항체의 생성에 있어 상당히 차이가 났다. 오말리주마브 및 H1 L1 MaE11의 IgG1 버젼은 사람 IgE의 생성을 억제하는 능력에 있어 비히클과 동등하였다. 그러나, H1L1 MaE11의 FcγRIIb-증진된 (IIbE, S267E/L328F) 버젼은 검출가능한 수준의 사람 IgE를 나타내지 않았다. 모든 FcγR에 대한 결합이 결여된 H1L1 MaE11의 Fc-KO (변이체 G236R/L328R) 버젼은 사람 IgE 생성에 있어 증가를 나타내었다. 이는 아마도 사람 mIgE를 가교결합하고 IgE+ B 세포를 활성화하는 능력, 그러나 IgG1 및 이 항체의 IIbE 버젼에 의해 전개되는 바와 같은 FcγRIIb 억제 또는 FcγRIIa/IIIa 세포독성 활성의 완전한 결여에 기인한 듯하다. 이러한 생체내 자료는 FcγRIIb에 대해 고친화성을 갖는 항-IgE 항체가 사람 IgE+ B 세포 활성화 및 면역글로불린 분비 혈장 세포 분화를 억제할 수 있다는 것을 입증하며, 따라서 IgE-매개된 장애를 치료하기 위한 본원에서 기술되는 면역글로불린의 잠재력을 지지한다.

모든 인용 문헌은 전부 참조로 본원에 특별히 삽입된다.

특정 양태를 설명을 위해 상기와 같이 기술하였으나, 당업자라면 첨부된 특허청구범위에서 기술되는 바와 같은 발명을 벗어나지 않으면서 다양한 변화가 가해질 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Xencor, Inc. Desjarlais, John R. Chu, Seung Y Horton, Holly M. <120> Novel Compositions and Methods for Treating IgE-Mediated Disorders <130> 067461-5143-WO <140> PCT/US2009/057366 <141> 2009-09-17 <150> US 61/097,819 <151> 2008-09-17 <160> 45 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Omalizumab VH Humanized <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Ser Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His Trp His Phe Ala Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Tyr Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Ser Trp 1 5 <210> 3 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Claims

IgE+ FcγRIIb+ 세포를 공동구속 분자와 접촉시키는 것을 포함하는 IgE+ FcγRIIb+ 세포를 억제하는 방법으로서, 상기 공동구속 분자가 약 100 nM 미만의 Kd로 FcγRIIb를 결합하고, 상기 공동구속 분자가 상기 세포 표면에 IgE 및 FcγRIIb를 공동구속하는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 공동구속 분자가 IgE에 대해 특이성을 갖는 항체인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 공동구속 분자가 제1의 Fv 영역 및 제2의 Fv 영역을 포함하는 이특이적 항체이고, 상기 제1의 Fv 영역이 IgE를 결합하고, 상기 제2의 Fv 영역이 약 100 nM 미만의 Kd로 FcγRIIb를 결합하는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 공동구속 분자가 Fc 영역을 포함하는 Fc 융합물이고, 상기 Fc 영역이 약 100 nM 미만의 Kd로 FcγRIIb를 결합하는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 세포가 B 세포인 방법.
IgE에 대해 특이성을 갖는 공동구속 분자로서, 상기 공동구속 분자가 모 Fc 폴리펩타이드의 Fc 변이체를 포함하며, 상기 Fc 변이체가 상기 모 Fc 폴리펩타이드에 비해 FcγRIIb에 대해 증진된 결합 친화성을 갖는 공동구속 분자.
청구항 6에 있어서, 상기 Fc 변이체가 상기 모 Fc 폴리펩타이드와 비교하여 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하고, 상기 변형이 234, 235, 236, 237, 239, 265, 266, 267, 268, 298, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 및 332로 이루어진 그룹 중에서 선택되며, 상기 번호매김은 EU 색인에 따른 것인, 공동구속 분자.
청구항 6에 있어서, 상기 변형이 L235Y, G236D, S239D, V266M, S267E, H268D, H268E, L328F, L328W, 및 L328Y 267D 및 267E로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 치환인 공동구속 분자.
청구항 8에 있어서, 상기 변형이 267D 및 267E로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 치환인 공동구속 분자.
청구항 9에 있어서, 328F, 325D, 325Y, 239D, 332E, 268D, 268E, 236D, 236N, 328W, 328Y, 234D, 234E, 234W, 237D, 237N, 327D, 327E, 235F, 235R, 239E, 및 266M으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 치환을 추가로 포함하고, 상기 번호매김은 EU 색인에 따른 것인, 공동구속 분자.
가변 영역과 Fc 영역을 포함하는 항체로서, 상기 가변 영역이 막 고정된 IgE를 결합하고, 상기 Fc 영역이 약 100 nM 미만의 Kd로 FcγRIIb를 결합하는 항체.
청구항 11에 있어서, 상기 가변 영역 VH 도메인이 서열 번호 2의 CDR1, 서열 번호 3의 CDR2 및 서열 번호 4의 CDR3, 또는 서열 번호 18의 CDR1, 서열 번호 19의 CDR2 및 서열 번호 20의 CDR3을 포함하는 항체.
청구항 11에 있어서, 상기 가변 영역 VL 도메인이 서열 번호 6의 CDR1, 서열 번호 7의 CDR2 및 서열 번호 8의 CDR3, 또는 서열 번호 22의 CDR1, 서열 번호 23의 CDR2 및 서열 번호 24의 CDR3를 포함하는 항체.