ES2708842T3 - Composiciones y métodos para para tratar trastornos mediados por IgE - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo para usar en el tratamiento del asma alérgico en un sujeto que lo necesita, dicho anticuerpo comprende: a. una cadena pesada que tiene la SEQ ID NO:42; y b. una cadena ligera que tiene la SEQ ID NO:40.

Description

DESCRIPCION

Composiciones y metodos para para tratar trastornos mediados por IgE

Campo tecnico

La presente descripcion se refiere a composiciones de inmunoglobulina que unen IgE y FcyRIlb con alta afinidad, dichas composiciones pueden inhibir celulas que expresan IgE anclada a la membrana. Estas composiciones son utiles para tratar trastornos mediados por IgE, inclusive alergias y asma.

Antecedentes de la invencion

Las enfermedades y afecciones alergicas, como asma, rinitis alergica, dermatitis atopica y alergia a los alimentos, se han vuelto cada vez mas prevalentes en las ultimas decadas y ahora afectan al 10-40 % de la poblacion en pafses industrializados. Las enfermedades alergicas afectan profundamente la calidad de vida y pueden resultar en complicaciones graves, inclusive la muerte, como puede ocurrir en casos graves de asma y anafilaxis. Las alergias son dominantes y son la principal causa de tiempo perdido en el trabajo y la escuela y su impacto en la vida personal tambien, ya que sus costos directos e indirectos a los sistemas medicos y economfas son enormes. Por ejemplo, la rinitis alergica (fiebre del heno) afecta al 22 % o mas de la poblacion de e Ua , mientras que se considera que el asma alergica afecta al menos a 20 millones de residentes de EUA. Se ha estimado que el impacto economico de las enfermedades alergicas en Estados Unidos, incluidos los costos de cuidado de salud y productividad perdida, asciende a $6,4 mil millones a principios de los anos 90 solo.

La mayona de las enfermedades alergicas es provocada por reacciones de hipersensibilidad mediadas por inmunoglobulina E (IgE). IgE es una clase de anticuerpo normalmente presente en el suero en concentraciones mmimas. Es producida por celulas plasmaticas que secretan IgE que expresan el anticuerpo en su superficie en determinada etapa de su maduracion. Los pacientes alergicos producen niveles elevados de IgE con especificidad de union a antfgenos generalmente inocuos a los que son sensibles. Estas moleculas de IgE circulan en la sangre y se unen a receptores espedficos de IgE en la superficie de basofilos en la circulacion y mastocitos a lo largo del revestimiento de la mucosa y por debajo de la piel. La union del antfgeno o alergeno a IgE en mastocitos, basofilos y otros tipos celulares, reticula las moleculas de IgE y agrega los receptores subyacentes, impulsando asf a las celulas a liberar mediadores estimuladores neuronales y vasoactivos como histaminas, leucotrienos, prostaglandinas, bradiquinina y factor de activacion de plaquetas. La rapida reaccion del sistema inmunologico a antfgeno provocada por complejos inmunes de anticuerpo ha llevado al termino reaccion de hipersensibilidad inmediata o mediada por anticuerpo, en contraste a reacciones e hipersensibilidad retrasadas o mediadas por celulas que son mediadas por celulas T. Las reacciones inmunes mediadas por IgE se denominan espedficamente reacciones de hipersensibilidad tipo I.

El receptor de alta afinidad para IgE (FceRI) es un mediador clave para las manifestaciones alergicas inmediatas. Ademas de los mastocitos y los basofilos, mediadores principales de las reacciones alergicas, FceRI se encuentra en una cantidad de otros tipos de celulas que incluye eosinofilos, plaquetas y en celulas presentadoras de antfgenos como monocitos y celulas dendnticas. Un receptor adicional de IgE es FceRII, tambien denominado CD23 o el receptor Fc de baja afinidad a IgE. FceRII se expresa ampliamente en linfocitos B, macrofagos, plaquetas y muchos otros tipos celulares como musculo liso de las vfas respiratorias. FceRII puede tener una funcion en la regulacion por retroalimentacion de la expresion de IgE y posteriormente en la expresion superficial de FceRII.

Debido a que la IgE juega un papel central en la mediacion de la mayona de las reacciones alergicas, idear tratamientos para controlar los niveles de IgE en el cuerpo y regular la smtesis de IgE ha sido de gran interes. Se han propuesto varias estrategias para tratar las enfermedades alergicas mediadas por IgE mediante la regulacion por disminucion de los niveles de IgE. Una estrategia implica neutralizar las moleculas de IgE mediante la union de la cadena £ de IgE en el sitio de union al receptor Fc, o cerca de este. Por ejemplo, Omalizumab (Xolair) es un anticuerpo anti-IgE monoclonal humanizado recombinante que se une a IgE en el mismo sitio Fc que Fc£RI. Omalizumab provoca una reduccion en la IgE circulante o en suero total en pacientes atopicos, lo cual atenua la cantidad de IgE espedfica del antfgeno que se puede unir y sensibilizar los mastocitos y basofilos. Esto, a su vez, lleva a una reduccion de los smtomas de enfermedades alergicas. Cabe destacar que los niveles de IgE en suero aumentan despues del comienzo de la terapia debido a la formacion del complejo de omalizumab e IgE y pueden permanecer altos hasta un ano despues de detener la terapia. Por consiguiente, este problema puede llevar a falsos negativos en pruebas de diagnostico y por lo tanto los niveles de IgE se deben verificar de forma rutinaria. Por consiguiente, existe una necesidad de mejores metodos y composiciones para reducir las enfermedades y los smtomas de enfermedades mediadas por IgE.

US6037453 describe dos clases de polipeptidos derivados de IgE humana. WO 2004/065417 A2 describe metodos para producir anticuerpos humanizados y aumentar el rendimiento de los anticuerpos y/o fragmentos de union al antfgeno cuando se producen en el cultivo celular. US6037453 y WO 2004/065417 A2 describen versiones humanizadas del anticuerpo anti-IgE de raton MaE11. Chu et al, Mol Immunol. setiembre de 2008;45(15):3926-33); La publicacion electronica del 8 de agosto de 2008 describe la inhibicion de la activacion mediada por receptores de celulas B de celulas B humanas principales por coadhesion de CD19 y FcgammaRIIb con anticuerpos modificados geneticamente por Fc, por ejemplo, que comprende las sustituciones S267E y L328F.

Compendio de ejemplo de realizaciones

En un aspecto, la invencion proporciona un anticuerpo para usar en el tratamiento del asma alergica en un sujeto que lo necesita, dicho anticuerpo comprende:

a. una cadena pesada que tiene la SEQ ID NO:42; y

b. una cadena ligera que tiene la SEQ ID NO:40.

En la presente se describen moleculas de coadhesion novedosas que unen IgE y FcYRIIb con alta afinidad, composiciones que comprenden estas moleculas de coadhesion y metodos para usar dichas moleculas de coadhesion novedosas para tratar trastornos mediados por IgE. Las moleculas de coadhesion descritas son capaces de inhibir las celulas que expresan IgE de membrana y FcYRIIb, es decir celulas IgE FcYRIIb+. Las moleculas de coadhesion descritas tambien son preferentemente capaces de unirse a IgE circulante. Los metodos de inhibicion descritos en la presente comprenden poner en contacto las celulas IgE+ FcYRIIb+ con una molecula de coadhesion que coadhiere IgE y FcYRIIb en la superficie de la celula.

Las composiciones descritas en la presente incluyen moleculas de coadhesion capaces de coadherir IgE y FcYRllb con alta afinidad en la superficie celular. De manera adecuada, la molecula de coadhesion incluye una inmunoglobulina que une IgE y FcYRllb con alta afinidad. Las moleculas de coadhesion descritas preferentemente coadhieren IgE y FcYRllb anclados a la membrana en la superficie de una celula y preferentemente unen FcYRIIb con una Kd inferior a aproximadamente 100 nM. De manera adecuada, la molecula de coadhesion es una inmunoglobulina y en algunos casos, la inmunoglobulina es un anticuerpo, en donde la region Fv de dicho anticuerpo une espedficamente IgE. De manera adecuada, dicho anticuerpo une tanto IgE circulante como anclada a la membrana. De manera alternativa y adecuada, dicho anticuerpo une selectivamente la IgE anclada a la membrana con respecto a la IgE circulante. De manera adecuada, la molecula de coadhesion es un anticuerpo biespedfico que tiene una primera region espedfica objetivo y una segunda region espedfica objetivo, en donde la primera region espedfica objetivo une IgE y la segunda region espedfica objetivo une FcYRllb con una Kd inferior a aproximadamente 100 nM. De manera adecuada, la primera y segunda regiones espedficas objetivo son regiones Fv, en donde la primera region Fv une IgE y la segunda region Fv une FcYRllb con una Kd inferior a aproximadamente 100 nM. De manera adecuada, la molecula de coadhesion es una fusion Fc que comprende una region Fc, en donde dicha region Fc une FcYRIIb con una Kd inferior a aproximadamente 100 nM. De manera adecuada, el companero de fusion Fc de la inmunoglobulina une IgE.

De manera adecuada, la molecula de coadhesion se une con FcYRllb, en donde la afinidad de dicha union tiene una Kd inferior a aproximadamente 100 nM, p. ej., inferior o igual a aproximadamente 95 nM, inferior o igual a aproximadamente 90 nM, inferior o igual a aproximadamente 85 nM, inferior o igual a aproximadamente 80 nM, inferior o igual a aproximadamente 75 nM, inferior o igual a aproximadamente 74 nM.

De manera adecuada, la molecula de coadhesion que coadhiere IgE y FcYRIIb con alta afinidad incluye una inmunoglobulina variante con respecto a una inmunoglobulina original. De manera adecuada, la inmunoglobulina variante comprende una region Fc variante, en donde dicha region Fc variante comprende una o mas (p. ej., dos o mas) modificaciones en comparacion con una region Fc original, en donde dichas modificaciones estan en posiciones que se seleccionan del grupo que consiste en 234, 235, 236, 237, 239, 265, 266, 267, 268, 298, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331 y 332, en donde la numeracion es de acuerdo con un mdice EU. De manera adecuada, una o mas modificaciones estan en las posiciones que se seleccionan del grupo que consiste en 234, 235, 236, 237, 266, 267, 268, 327, 328, de acuerdo con el mdice EU. De manera adecuada, una o mas modificaciones estan en las posiciones que se seleccionan del grupo que consiste en 235, 236, 266, 267, 268, 328, de acuerdo con el mdice EU. De manera adecuada, una o mas modificaciones estan en las posiciones que se seleccionan del grupo que consiste en 235, 236, 239, 266, 267, 268 y 328, de acuerdo con el mdice EU. De manera adecuada, una o mas modificaciones estan en las posiciones que se seleccionan del grupo que consiste en 234, 235, 236, 237, 266, 267, 268, 327, 328, de acuerdo con el mdice EU.

De manera adecuada, dichas modificaciones son al menos una sustitucion (p. ej., una o mas sustituciones, dos o mas sustituciones, etc.) que se seleccionan del grupo que consiste en 234F, 234g , 234I, 234K, 234N, 234P, 234Q, 234S, 234V, 234W, 234Y, 234D, 234E, 235A, 235E, 235H, 235I, 235N, 235P, 235Q, 235R, 235S, 235W, 235Y, 235D, 235F, 235T, 236D, 236F, 236H, 236I, 236K, 236L, 236M, 236P, 236Q, 236R, 236S, 236T, 236V, 236W, 236Y, 236A, 236E, 236N, 237A, 237E, 237H, 237K, 237L, 237P, 237Q, 237S, 237V, 237Y, 237D, 237N, 239D, 239E, 239N, 239Q, 265E, 266D, 266I, 266M, 267A, 267D, 267E, 267G, 268D, 268E, 268N, 268Q, 298D, 298E, 298L, 298M, 298Q, 325L, 326A, 326E, 326W, 326D, 327D, 327G, 327L, 327N, 327Q, 327E, 328E, 328F, 328Y, 328H, 328I, 328Q, 328W, 329E, 330D, 330H, 330K, 330S, 331S y 332E, en donde la numeracion es de acuerdo con un mdice EU. De manera adecuada, dichas modificaciones son al menos una sustitucion (p. ej., una o mas sustituciones, dos o mas sustituciones, etc.) que se seleccionan del grupo que consiste en 234N, 234F, 234D, 234E, 234W, 235Q, 235R, 235W, 235Y, 235D, 235F, 235T, 236D, 236H, 236I, 236L, 236S, 236Y, 236E, 236N, 237H, 237L, 237D, 237N, 239D, 239N, 239E, 266I, 266M, 267A, 267D, 267E, 267G, 268D, 268E, 268N, 268Q, 298E, 298L, 298M, 298Q, 325L, 326A, 326E, 326W, 326D, 327D, 327L, 327E, 328E, 328F, 328Y, 328H, 328I, 328Q, 328W, 330D, 330H, 330K y 332E donde la numeracion es de acuerdo con un mdice EU. De manera adecuada, dichas modificaciones son al menos una sustitucion (p. ej., una o mas sustituciones, dos o mas sustituciones, etc.) que se seleccionan del grupo que consiste en 234D, 234E, 234W, 235D,235F, 235R, 235Y, 236D, 236N, 237D, 237N, 239D,239E, 266M, 267D, 267E, 268D, 268E,327D, 327E,328F, 328W, 328Y y 332E, en donde la numeracion es de acuerdo con un mdice EU. De manera adecuada, dichas modificaciones son al menos una sustitucion (p. ej., una o mas sustituciones, dos o mas sustituciones, etc.) que se seleccionan del grupo que consiste en 234E, 235Y, 235R, 236D, 236N, 237N, 266M, 267E, 268E, 268D, 327D, 327E, 328F, 328Y, 328W, en donde la numeracion es de acuerdo con un mdice EU. De manera adecuada, dichas modificaciones son al menos una sustitucion (p. ej., una o mas sustituciones, dos o mas sustituciones, etc.) que se seleccionan del grupo que consiste en 235Y, 236D, 239D, 266M, 267E, 268D, 268E, 328F, 328W y 328Y, en donde la numeracion es de acuerdo con un mdice EU. De manera adecuada, dichas modificaciones son al menos una sustitucion (p. ej., una o mas sustituciones, dos o mas sustituciones, etc.) que se seleccionan del grupo que consiste en 235Y, 236D, 266M, 267E, 268E, 268D, 328F, 328Y y 328W, en donde la numeracion es de acuerdo con un mdice EU.

De manera adecuada, dichas modificaciones resultan en al menos una de las siguientes combinaciones de sustituciones: 235Y/267E, 236D/267E, 239D/268D, 239D/267E, 239D/332E, 267E/268D, 267E/268E y 267E/328F, en donde la numeracion es de acuerdo con un mdice EU.

De manera adecuada, las modificaciones descritas en la presente reducen la afinidad al menos a un receptor con respecto a la inmunoglobulina original, en donde dicho receptor se selecciona del grupo que consiste en FcyRI, FcYRIla y FcYRIIIa. En este caso, las variantes de inmunoglobulina descritas en la presente pueden mediar ADCC o ADCP reducida respecto de la inmunoglobulina original. De manera adecuada, las modificaciones descritas en la presente aumentan la afinidad al menos a un receptor con respecto a la inmunoglobulina original, en donde dicho receptor se selecciona del grupo que consiste en FcyRI, FcYRIla y FcYRIIIa. De manera adecuada, las variantes de inmunoglobulina descritas en la presente pueden mediar ADCC o ADCP aumentada con respecto a la inmunoglobulina original.

La memoria descriptiva tambien describe metodos para modificar geneticamente las moleculas de coadhesion novedosas, inclusive composiciones de inmunoglobulina.

La memoria descriptiva tambien describe acidos nucleicos aislados que codifican las moleculas de coadhesion, incluisve las inmunoglobulinas descritas en la presente. La memoria descriptiva tambien describe vectores que comprenden los acidos nucleicos, opcionalmente, unidos operativamente a secuencias de control. La memoria descriptiva tambien describe celulas hospedadoras que contienen los vectores y metodos para producir y opcionalmente recuperar las moleculas de coadhesion.

La memoria descriptiva tambien describe moleculas de coadhesion que comprenden las inmunoglobulinas descritas en la presente. Las moleculas de coadhesion pueden ser utiles en un producto terapeutico. De manera adecuada, las moleculas de coadhesion descritas en la presente pueden ser anticuerpos.

La memoria descriptiva tambien describe composiciones que comprenden moleculas de coadhesion descritas en la presente y un portador o diluyente fisiologica o farmaceuticamente aceptable.

La memoria descriptiva tambien describe un metodo para inhibir las celulas IgE+ FcYRIIb+. Los metodos para inhibir celulas descritos en la presente comprenden poner en contacto una celula IgE+ FcYRIIb+ con una molecula de coadhesion, en donde dicha molecula de coadhesion une FcYRIIb con una Kd inferior a aproximadamente 100 nM. De manera adecuada, dicha molecula de coadhesion coadhiere IgE y FcYRIIb en la superficie celular. De manera adecuada, los metodos de inhibicion comprenden poner en contacto una celula IgE+ FcYRIIb+ con un anticuerpo, en donde dicho anticuerpo une IgE mediante su region Fv y en donde dicho anticuerpo comprende una region Fc, en donde dicha region Fc une FcYRIIb con una Kd de 100 nM o menor. De manera adecuada, dicha region Fc une FcYRlla y/o FcYRIIIa con una afinidad mayor con respecto a la IgG1 natural. De manera adecuada, los metodos comprenden poner en contacto las celulas IgE+ FcYRIIb+ con una molecula de coadhesion, en donde dicha molecula de coadhesion es un anticuerpo biespedfico que comprende una primera region Fv y una segunda region Fv, en donde dicha primera region Fv une IgE, y dicha segunda region Fv une FcYRIIb con una Kd inferior a aproximadamente 100 nM. Los metodos comprenden poner en contacto las celulas IgE+ FcYRIIb+ con una molecula de coadhesion, en donde dicha molecula de coadhesion es una fusion Fc que comprende una region Fc, en donde dicha region Fc une FcYRIIb con una Kd inferior a aproximadamente 100 nM.

La memoria descriptiva tambien describe un metodo para reducir la secrecion de IgE. El metodo incluye poner en contacto una celula IgE+ FcyRII b+ con una molecula de coadhesion, en donde dicha molecula de coadhesion une IgE y FcYRIIb con una Kd inferior a aproximadamente 100 nM.

La memoria descriptiva tambien describe un metodo para inhibir la maduracion de celulas B. Este metodo incluye poner en contacto una celula IgE+ FcYRIIb+ con una molecula de coadhesion, en donde dicha molecula de coadhesion une IgE y FcYRIIb con una Kd inferior a aproximadamente 100 nM.

La memoria descriptiva tambien describe usos terapeuticos y de diagnostico para las moleculas de coadhesion descritas en la presente. De manera adecuada, las moleculas de coadhesion descritas en la presente se usan para tratar uno o mas trastornos mediados por IgE, p. ej., enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias, etc. que son mediadas por inmunoglobulina IgE. De manera adecuada, los trastornos alergicos y atopicos que se pueden tratar con las composiciones descritas en la presente incluyen, pero no se limitan a, asma alergico y atopico, dermatitis atopica y eczema, rinitis alergica, conjuntivitis alergica y rinoconjuntivitis, encefalomielitis alergica, rinitis alergica, vascutlitis alergica, choque anafilactico y alergias a cualquier variedad de alergias ambientales o a los alimentos. Los metodos de tratamiento descritos en la presente comprenden la administracion a un paciente que necesita tal administracion de una cantidad terapeutica de una molecula de coadhesion que coadhiere IgE y FcYRIIb en la superficie celular.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1. Ilustracion del enfoque mecamstico novedoso para inhibir celulas B IgE+ FcYRIIb+. Con estfmulos apropiados, las celulas B naturales pueden diferenciarse en celulas B IgE+. La adhesion del antfgeno con el receptor de celulas B IgE activa estas celulas, que luego se pueden diferenciar en celulas plasmaticas que liberan la IgE circulante. La union de IgE circulante se une a FceR, por ejemplo, en mastocitos, basofilos y eosinofilos, y activa estas celulas. La liberacion de histamina, prostaglandinas y otros mediadores qrnmicos en ultima instancia resulta en los smtomas clmicos de alergia y asma. Omalizumab, que tiene una region Fc de IgG1 natural, es capaz de bloquear la union de IgE a anticuerpos anti-IgE FceR con alta afinidad para FcYRIIb, denominados Anfi-IgE-IIbE en la figura, son capaces no solo de bloquear la union de IgE a FceR, sino tambien de inhibir la activacion de celulas B IgE+ mediante coadhesion de FcYRIIb mlgE.

Figura 2. Sensogramas de resonancia de plasmones superficiales Biacore que muestran la union de anticuerpos anti-CD19 de variante Fc a FcYRIIb humano.

Figura 3. Afinidades de anticuerpos de variante Fc a FcyR humanos como se determina por Biacore. La grafica muestra el log(KA) para la union de anticuerpos IgG1 variantes y WT a FcyRI humano (I), H131 FcYRlla (HIIa), FcYRIIb (IIb) y V158 FcYRIIIa (V IIIa). La union de G236D/S267E y S267E/L328F a V158 FcYRIIIa no se pudo detectar. La union de G236R/L328R (Fc-KO) a todos los receptores evaluados no se pudo detectar.

Figura 4. Afinidades de anticuerpos de variante Fc a FcyR humanos como se determina por resonancia de plasmones superficiales Biacore. La tabla proporciona Kd de equilibrio para unir los anticuerpos IgG1 variantes y WT a FcyRI humano, H131 FcYRIIa FcYRIIb y V l58 FcYRIIIa, y la cantidad de uniones de cada uno con respecto al IgG1 natural (WT). n.d. = no detectable

Figura 5. Secuencias de aminoacidos de las regiones variables de cadena pesada (VH) y ligera (VL) y CDR de anticuerpos anti-IgE. Los lfmites de CDR se definieron como se describe anteriormente en funcion de una alineacion estructural de regiones variables de anticuerpo (Lazar et al., 2007, Mol Immunol 44:1986-1998).

Figura 6. Secuencias de aminoacidos de las regiones constantes WT y variantes de cadena pesada y ligera.

Figura 7. Secuencias de aminoacidos de anticuerpos anti-IgE de longitud completa que se pueden usar para dirigirse a celulas B IgE+.

Figura 8. Tabla de datos de afinidad para la union de anticuerpos anti-IgE WT y variantes a la region Fc IgE y FcYRIIb.

Figura 9. Tabla de datos de afinidad para la union de anticuerpos anti-IgE WT y variantes a la region Fc IgE y FcYRIIb.

Figura 10. ELISA de IgE usando anticuerpos anti-IgE comerciales (MabTech) e internos (Omalizumab y MaE11) como reactivos de captura.

Figura 11. La region variable del anticuerpo anti-IgE omalizumab no compite con el anticuerpo de captura MabTech para la deteccion de IgE en el protocolo ELISA.

Figura 12. Inhibicion de celulas B IgE+ de clase cambiada con anticuerpos anti-IgE variantes con mejor afinidad a FcYRIIb pero no los anticuerpos que no tienen union a FcyR (variante Fc G236R/L328R) o que no tienen union a IgE (motavizumab). La grafica muestra la concentracion de IgE liberado de PBMC despues de 12 dfas de incubacion con IL-4, anticuerpo agonista anti-CD40 (a-CD40) y concentraciones variables de los anticuerpos mostrados.

Figura 13. Los anticuerpos anti-IgE variantes no inhiben las celulas B IgG2+ con clase cambiada. La grafica muestra la concentracion de IgG2 liberado de PBMC despues de 12 dfas de incubacion con IL-4, a-CD40 y concentraciones variables de los anticuerpos mostrados.

Figura 14. Inhibicion de celulas B IgE+ de clase cambiada con anticuerpos anti-IgE variantes con mejor afinidad a FcYRIIb. La grafica muestra la concentracion de IgE liberado de PBMC despues de 14 dfas de incubacion con IL-4, anticuerpo agonista anti-CD40 (a-CD40) y concentraciones variables de los anticuerpos mostrados. Los datos se normalizaron a la menor concentracion de anticuerpo.

Figura 15. Inhibicion de celulas B IgE+ de clase cambiada con anticuerpos anti-IgE variantes con mejor afinidad a FcYRIIb. La grafica muestra la concentracion de IgE liberado de PBMC despues de 14 dfas de incubacion con IL-4, anticuerpo agonista anti-CD40 (a-CD40), anticuerpo de reticulacion BCR anti-mu y concentraciones variables de los anticuerpos mostrados. Los datos se normalizaron a la menor concentracion de anticuerpo.

Figura 16. Inhibicion de celulas B IgE+ de clase cambiada con anticuerpos anti-IgE variantes con mejor afinidad a FcYRIlb. La grafica muestra la concentracion de IgE liberado de PBMC despues de 14 d^as de incubacion con IL-4, anticuerpo agonista anti-CD40 (a-CD40), anticuerpo de reticulacion BCR anti-mu y concentraciones variables de los anticuerpos mostrados. Los datos se normalizaron a la menor concentracion de anticuerpo.

Figura 17. Inhibicion de celulas B IgE+ de clase cambiada con anticuerpos anti-IgE variantes con mejor funcion efectora ADCC y ADCP. La grafica muestra la concentracion de IgE liberado de PBMC despues de 14 dfas de incubacion con IL-4, anticuerpo agonista anti-CD40 (a-CD40), anticuerpo de reticulacion BCR anti-CD79b y concentraciones variables de los anticuerpos mostrados.

Figura 18. Inhibicion de celulas B IgE+ de clase cambiada con anticuerpos anti-IgE variantes con mejor funcion efectora ADCC y ADCP. La grafica muestra la concentracion de IgE liberado de PBMC despues de 14 dfas de incubacion con IL-4, anticuerpo agonista anti-CD40 (a-CD40), anticuerpo de reticulacion BCR anti-mu y concentraciones variables de los anticuerpos mostrados.

Figura 19. Protocolo para estudio in vivo de huPBL-SCID para evaluar la actividad de anticuerpos anti-IgE. Los dfas indicados reflejan la cantidad de dfas despues de injertar las PBMC de un donante con pruebas positivas por anticuerpos IgE espedficos para Der p 1. Vac. Derp1 indica vacunacion con antfgeno Der p 1.

Figura 20. Niveles totales de IgG en suero del modelo in vivo huPBL-SCID para cada grupo de tratamiento. Los dfas indicados (7, 23 y 37) reflejan las extracciones de sangre destacadas en el protocolo en la Figura 19. PBS indica el grupo de vehfculo no tratado, Omalizumab indica el grupo tratado con Omalizumab_IgG1 y los grupos 3 H1L1 MaE11 indican los grupos tratados con MaE11 humanizado que comprende una IgG1 WT (IgG1), variante S267E/L328F (IIbE) o region Fc G236R/L328R (Fc-KO).

Figura 21. Niveles totales de IgE en suero del modelo in vivo huPBL-SCID para cada grupo de tratamiento. Los dfas indicados (7, 23 y 37) reflejan las extracciones de sangre destacadas en el protocolo en la figura 19. PBS indica el grupo de vehfculo no tratado, Omalizumab indica el grupo tratado con Omalizumab_IgG1 y los grupos 3 H1L1 MaE11 indican los grupos tratados con MaE11 humanizado que comprende una IgG1 WT (IgG1), variante S267E/L328F (IIbE) o region Fc G236R/L328R (Fc-KO). El lfmite de cuantificacion del metodo ELISA fue 31,6 ng/mL; las muestras que estaban debajo de este lfmite se informan como 31,6 ng/mL en la grafica.

Descripcion detallada de ejemplos de realizaciones

En la presente se describen moleculas de coadhesion que imitan los efectos de inhibicion de la coadhesion de IgE anclado a la membrana con FcYRIIb en celulas B. Por ejemplo, en la presente se describen anticuerpos anti-IgE variantes modificados geneticamente de modo que el dominio Fc se une a FcYRIIb con una afinidad de hasta ~430 veces mas. Con respecto a IgG1 natural, las variantes de union mejorada a FcYRIIb (IIbE) inhiben fuertemente la movilizacion y viabilidad de calcio inducido por BCR en las celulas B IgE+ humanas principales. El uso de una unica molecula, como un anticuerpo para suprimir las celulas B funciona por coadhesion de b Cr IgE cognado y FcYRllb puede representar un enfoque novedoso en el tratamiento de enfermedades mediadas por IgE. Los ejemplos no taxativos de enfermedades mediadas por IgE incluyen respuestas alergicas y asma y se describen mas detalladamente a continuacion.

Las moleculas de coadhesion de acuerdo con la descripcion pueden adoptar una variedad de configuraciones como se describe mas detalladamente a continuacion. De manera adecuada, la molecula de coadhesion incluye una inmunoglobulina que une IgE y FcYRllb con alta afinidad. En este caso, la inmunoglobulina preferentemente coadhiere IgE y FcYRllb anclados a la membrana en la superficie de una celula y une con una Kd inferior a aproximadamente 100 nM. De manera adecuada, la molecula de coadhesion es una molecula biespedfica que tiene una primera region espedfica objetivo y una segunda region espedfica objetivo, en donde la primera region espedfica objetivo une IgE y la segunda region espedfica objetivo une FcYRIIb con una Kd inferior a aproximadamente 100 nM, pese a que de manera adecuada, puede unir FcYRIIb con una Kd inferior a aproximadamente 10 nM o una Kd inferior a aproximadamente 1 nM y en algunos casos puede unir con una Kd inferior a 100 pM. De manera adecuada, la molecula de coadhesion es un anticuerpo biespedfico y la primera y segunda regiones espedficas objetivo son regiones Fv, en donde la primera region Fv une IgE y la segunda region Fv une FcYRIIb con una Kd inferior a aproximadamente 100 nM. De manera adecuada, la molecula de coadhesion es una fusion Fc que comprende una region Fc, en donde dicha region Fc une FcYRIIb con una Kd inferior a aproximadamente 100 nM. En este caso, el companero de fusion Fc de la inmunoglobulina une IgE.

En la presente se describen varias definiciones. Se pretende que estas definiciones abarquen equivalentes gramaticales.

«ADCC» o «citotoxicidad mediada por celulas dependientes de anticuerpos», como se usa en la presente, se refiere a la reaccion mediada por celulas en la cual las celulas citotoxicas no espedficas que expresan FcvR reconocen el anticuerpo unido en una celula diana y, de esta forma, llevan a la lisis de la celula diana.

«ADCP» o fagocitosis mediada por celulas dependientes de anticuerpos, como se usa en la presente, se refiere a la reaccion mediada por celulas en la cual las celulas citotoxicas no espedficas que expresan FcyR reconocen el anticuerpo unido en una celula diana y, de esta forma, llevan a la fagocitosis de la celula diana.

«Modificacion de aminoacidos» en la presente se refiere a una sustitucion, insercion y/o eliminacion de aminoacidos en una secuencia de polipeptidos. «Sustitucion de aminoacido» o «sustitucion» en la presente se refiere al remplazo de un aminoacido en una posicion particular en una secuencia de polipeptidos original con otro aminoacido. Por ejemplo, la sustitucion S267E se refiere a un polipeptido variante, en este caso una variante de cadena pesada constante, en donde la serina en la posicion 267 es remplazada por acido glutamico. «Insercion de aminoacido» o «insercion», tal como se utiliza en la presente, se refiere a la adicion de un aminoacido en una posicion particular en una secuencia de polipeptidos original. «Eliminacion de aminoacido» o «eliminacion», tal como se utiliza en la presente, se refiere a la eliminacion de un aminoacido en una posicion particular en una secuencia de polipeptidos original.

«Anticuerpo» en la presente se refiere a una protema que consiste en uno o mas polipeptidos codificados sustancialmente por todos o parte de los genes de inmunoglobulina reconocidos. Los genes de inmunoglobulina reconocidos, por ejemplo, en seres humanos, incluyen la cadena kappa (k), lambda (A) y loci geneticos de cadena pesada, que juntos comprenden los innumerables genes de region variable y los genes de region constante mu (p), delta (8), gamma (y), sigma (a) y alfa (a) que codifican los isotipos IgM, IgD, IgG (lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4), IgE e IgA (lgA1 e lgA2), respectivamente. En la presente, el anticuerpo incluye anticuerpos de longitud completa y fragmentos de anticuerpo y puede referirse a un anticuerpo natural de cualquier organismo, un anticuerpo modificado geneticamente o un anticuerpo generado recombinantemente con fines experimentales, terapeuticos u otros.

«Aminoacido» e «identidad de aminoacido», como se usan en la presente, se refieren a uno de los 20 aminoacidos de origen natural o cualquier analogo no natural que puede estar presente en una posicion definida espedfica.

«Celula CD32b+» o «celula FcYRIIb+», como se usa en la presente, se refiere a cualquier celula o tipo celular que expresa CD32b (FcYRIIb). Las celulas CD32b+ incluyen, pero no se limitan a, celulas B, celulas plasmaticas, celulas dendnticas, macrofagos, neutrofilos, mastocitos, basofilos o eosinofilos.

«Celula IgE+», como se usa en la presente, se refiere a cualquier celula o tipo celular que expresa IgE. En casos preferidos, las celulas IgE+ expresan IgE anclada a la membrana (mIgE). Las celulas IgE+ incluyen, pero no se limitan a, celulas B y celulas plasmaticas.

«CDC» o «citotoxicidad dependiente del complemented, como se usa en la presente, se refiere a la reaccion en la cual uno o mas componentes de protema de complemento reconocen el anticuerpo unido en una celula diana y, de esta forma, provocan posteriormente la lisis de la celula diana.

«Molecula de coadhesion» o equivalentes gramaticales se refieren a una molecula bifuncional capaz de unir IgE y FcYRllb en donde la Kd de la union de la molecula a FcYRIIb es inferior a aproximadamente 100 nM en una superficie celular que resulta en la union simultanea de IgE y FcyRIIb.

«Region constante» de un anticuerpo como se define en la presente se refiere a la region del anticuerpo codificada por uno de los genes de region constante de inmunoglobulina de cadena ligera o pesada. «Cadena ligera constante» o «region constante de cadena ligera», como se usa en la presente, se refiere a la region de un anticuerpo codificada por las cadenas ligeras kappa (Ck) o lambda (CA). La cadena ligera constante tfpicamente comprende un unico dominio y como se define en la presente se refiere a las posiciones 108-214 de Ck o CA, en donde la numeracion es de acuerdo con el mdice EU. «Cadena pesada constante» o «region constante de cadena pesada» como se usa en la presente se refiere a la region de un anticuerpo codificada por los genes mu, delta, gamma, alfa o epsilon para definir el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA o IgE, respectivamente. Para los anticuerpos IgG de longitud completa, la cadena pesada constante, como se define en la presente, se refiere al extremo N del dominio CH1 al extremo C del dominio CH3, que comprende de este modo las posiciones 118-447, en donde la numeracion es de acuerdo con el mdice EU.

«Funcion efectora», como se usa en la presente, se refiere a un evento bioqmmico que resulta de la interaccion de una region Fc de anticuerpo con un receptor Fc o ligando. Las funciones efectoras incluyen funciones efectoras mediadas por FcyR como ADCC y ADCP y funciones efectoras mediadas por complemento como CDC.

«Celula efectora» como se usa en la presente se refiere a una celula del sistema inmunitario que expresa uno o mas receptores Fc y/o de complemento y media una o mas funciones efectoras. Las celulas efectoras incluyen, pero no se limitan a, monocitos, macrofagos, neutrofilos, celulas dendnticas, eosinofilos, mastocitos, plaquetas, celulas B, linfocitos granulares grandes, celulas de Langerhans, linfocitos citolfticos (NK) y linfocitos T y8 y pueden ser de cualquier organismo que incluye, pero no se limita a, seres humanos, ratones, ratas, conejos y monos.

«Fab» o «region Fab», como se usa en la presente, se refiere a los polipeptidos que comprenden los dominios VH, CH1, VL y Cl de immunoglobulina. Fab se puede referir a esta region sola o esta region en el contexto de un anticuerpo de longitud completa o fragmento de anticuerpo.

«Fc» o «region Fc», como se usa en la presente, se refiere al polipeptido que comprende la region constante de un anticuerpo que excluye el primer dominio de inmunoglobulina de region constante y en algunos casos, parte de la bisagra. Por lo tanto, Fc se refiere a los ultimos dos dominios de inmunoglobulina de region constante de IgA, IgD y IgG y los ultimos tres dominios de inmunoglobulina de region constante de IgE e IgM y el extremo N de bisagra flexible de estos dominios. Para IgA e IgM, Fc puede incluir la cadena J. Para IgG, Fc comprende dominios de inmunoglobulina Cgamma2 y Cgamma3 (Cy2 y Cy3) y la bisagra entre Cgammal (Cy1) y Cgamma2 (Cy2). Pese a que los lfmites de la region Fc pueden variar, la region Fc de cadena pesada de IgG humana se define generalmente como que comprende los residuos C226 o P230 a su extremo carboxilo, en donde la numeracion es de acuerdo con el mdice EU como en Kabat. Fc se puede referir a esta region sola o esta region en el contexto de un polipeptido Fc, como se describe a continuacion.

«Polipeptido Fc» como se usa en la presente se refiere a un polipeptido que comprende toda la region Fc o parte de esta. Los polipeptidos Fc incluyen anticuerpos, fusiones Fc, Fc aislados y fragmentos Fc. Las inmunoglobulinas pueden ser polipeptidos Fc.

«Fusion Fc» como se usa en la presente se refiere a una protema en donde uno o mas polipeptidos estan enlazados operativamente a Fc. En la presente, fusion Fc se usa como sinonimo de los terminos «inmunoadhesina», «fusion Ig», «quimera Ig» y «globulina receptora» (a veces con guiones) como se usa en la tecnica previa (Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14:52-60; Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9:195-200). Una fusion Fc combina la region Fc de una inmunoglobulina con un companero de fusion que en general puede ser cualquier protema, polipeptido o molecula pequena. El rol de la parte que no es Fc de una fusion Fc, es decir, el companero de fusion, es mediar la union a la diana, y por lo tanto es analoga en cuanto a funcion de las regiones variables de un anticuerpo. Practicamente cualquier protema o molecula pequena se puede enlazar a Fc para generar una fusion Fc. Los companeros de fusion de protema pueden incluir, pero no se limitan a, la region de union a una diana de un receptor, una molecula de adhesion, un ligando, una enzima, una citocina, una quimiocina o alguna otra protema o dominio de protema. Los companeros de fusion de molecula pequena pueden incluir cualquier agente terapeutico que dirija la fusion Fc a una diana terapeutica. Estas dianas pueden ser cualquier molecula, p. ej., un receptor extracelular implicado en una enfermedad.

«Receptor Fc gamma» o «FcyR», como se usa en la presente, se refiere a cualquier miembro de la familia de protemas que une la region Fc del anticuerpo IgG y esta sustancialmente codificado por los genes FcyR. En los seres humanos esta familia incluye, pero no se limita a FcyRI (CD64), inclusive las isoformas FcYRIa, FcYRIb y FcyRIc; FcyRII (CD32), inclusive las isoformas FcYRIIa (inclusive los alotipos H131 y R131), FcYRIIb (inclusive FcYRIIb-1 y FcYRIIb-2), y FcyRIIc; y FcyRIII (CD16), inclusive las isoformas FcYRIIIa (inclusive los alotipos V158 y F158) y FcYRIIIb (inclusive los alotipos FcyRIIIb-NA1 y FcyRIIIb-NA2) (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65), asf como cualquier FcyR humano no descubierto o isoformas o alotipos de FcyR. Un FcyR puede ser de cualquier organismo, inclusive, de modo no taxativo, humanos, ratones, conejos y monos. Los FcyR de raton incluyen, pero no se limitan a FcyRI (GD64), FcyRII (CD32), FcyRIII (CD16) y FcyRIII-2 (CD16-2), asf como cualquier FcyR de raton no descubierto o isoformas o alotipos de FcyR.

«Ligando Fc» o «receptor Fc», como se usa en la presente, se refiere a una molecula, p. ej., un polipeptido, de cualquier organismo que se une a la region Fc de un anticuerpo para formar un complejo de Fc y ligando. Los ligandos Fc incluyen pero no se limitan a FcyR, FcyR, FcyR, FcRn, C1q, C3, lectina de union a manano, receptor de manosa, protema A estreptococica, protema G estreptococica y FcyR viral. Los ligandos Fc tambien incluyen homologos del receptor Fc (FcRH), que son una familia de receptores Fc homologos a FcyR (Davis et al., 2002, Immunological Reviews 190:123-136). Los ligandos Fc pueden incluir moleculas no descubiertas que se unen a Fc.

«Anticuerpo de longitud completa», como se usa en la presente, se refiere a la estructura que constituye la forma biologica natural de un anticuerpo inclusive regiones variables y constantes. Por ejemplo, en la mayona de los mairnferos, inclusive seres humanos y ratones, el anticuerpo de longitud completa del isotipo IgG es un tetramero y consiste en dos pares identicos de dos cadenas de inmunoglobulinas, en donde cada par tiene una cadena ligera y una cadena pesada, cada cadena ligera comprende dominios de inmunoglobulina VL y CL y cada cadena pesada comprende dominios de inmunoglobulina VH, Cy1, Cy2 y Cy3. En algunos mamfferos, por ejemplo, en camellos y llamas, los anticuerpos IgG pueden consistir en solo dos cadenas pesadas, en donde cada cadena pesada comprende un dominio variable unido a la region Fc.

«Inmunoglobulina» en la presente se refiere a una protema que comprende uno o mas polipeptidos codificados sustancialmente por genes de inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas incluyen, pero no se limitan a anticuerpos (inclusive anticuerpos biespedficos) y fusiones Fc. Las inmunoglobulinas pueden tener una cantidad de formas estructurales que incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpo y dominios de inmunoglobulina individual.

«Dominio de inmunoglobulina (Ig)», como se usa en la presente, se refiere a una region de una inmunoglobulina que existe como una entidad estructural diferente como lo determinara un experto en la tecnica de estructura de protema. Los dominios de Ig tfpicamente tienen una topologfa de plegado tipo p-sandwich. Los dominios de Ig conocidos en el isotipo IgG de anticuerpos son VH, Cy1, Cy2, Cy3, VL, y CL.

«IgG» o «inmunoglobulina IgG» o «inmunoglobulina G», como se usa en la presente, se refiere a un polipeptido que pertenece a la clase de anticuerpos que se codifican sustancialmente por un gen de inmunoglobulina gamma reconocido. En los seres humanos esta clase comprende las subclases o isotipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

«IgE» o «inmunoglobulina IgE» o «inmunoglobulina E», como se usa en la presente, se refiere a un polipeptido que pertenece a la clase de anticuerpos que se codifican sustancialmente por un gen de inmunoglobulina gamma reconocido. IgE puede estar anclada a la membrana (mIgE) o no anclada a la membrana, tambien denominada en la presente IgE circulante.

«Inhibicion» de celulas o equivalentes gramaticales se refiere a evitar o reducir la activacion, proliferacion, maduracion o diferenciacion de celulas dirigidas.

«Isotipo», como se usa en la presente, se refiere a cualquiera de las subclases de inmunoglobulinas definidas por las caractensticas qmmicas y antigenicas de sus regiones constantes. Los isotipos de inmunoglobulina humana conocidos son IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM1, IgM2, IgD e IgE.

«Modificacion» en la presente se refiere a una alteracion en las propiedades ffsicas, qmmicas o de secuencia de una protema, polipeptido, anticuerpo o inmunoglobulina. Las modificaciones descritas en la presente incluyen modificaciones de aminoacido y modificaciones de glicoforma.

«Modificacion de glicoforma» o «glicoforma modificada» o «glicoforma modificada geneticamente», como se usa en la presente, se refiere a una composicion de carbohidratos que esta unida covalentemente a una protema, por ejemplo, un anticuerpo, en donde dicha composicion de carbohidrato difiere qmmicamente de la de la protema original. La glicoforma modificada se refiere tfpicamente al carbohidrato u oligosacarido diferente; por lo tanto, por ejemplo, una variante Fc puede comprender una glicoforma modificada. De manera alternativa, glicoforma modificada se puede referir a la variante Fc que comprende el carbohidrato u oligosacarido diferente.

«Polipeptido original», «protema original», «inmunoglobulina original», «polipeptido precursor», «protema precursora» o «inmunoglobulina precursora», tal como se usa en la presente, hacen referencia a un polipeptido, protema o inmunoglobulina no modificada que esta sustancialmente modificada para generar una variante, por ejemplo, cualquier polipeptido, protema o inmunoglobulina que sirva como una plantilla y/o base para al menos una modificacion de aminoacido descrita en la presente. El polipeptido original puede ser un polipeptido de origen natural, o una variante o version modificada geneticamente de un polipeptido de origen natural. Polipeptido de origen natural puede referirse al polipeptido en sf mismo, a composiciones que comprenden el polipeptido original o a la secuencia de aminoacidos que lo codifica. Por consiguiente, «polipeptido Fc original» como se usa en la presente se refiere a un polipeptido Fc que se modifica para generar un polipeptido Fc variante y por «anticuerpo variante» como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo que se modifica para generar un anticuerpo variante (p. ej., un anticuerpo original puede incluir, pero no se limita a, una protema que comprende la region constante de una Ig de origen natural).

«Posicion» como se usa en la presente se refiere a una ubicacion en la secuencia de una protema. Las posiciones se pueden enumerar secuencialmente o de acuerdo con un formato establecido, por ejemplo, el mdice de EU como se describe en Kabat. Por ejemplo, la posicion 297 es una posicion en la IgG1 de anticuerpo humano.

«Polipeptido» o «protema», como se usa en la presente, significa al menos dos aminoacidos unidos covalentemente, que incluye protemas, polipeptidos, oligopeptidos y peptidos.

«Residuo» como se usa en la presente se refiere a una posicion en una protema y su identidad de aminoacido asociada. Por ejemplo, la asparagina 297 (tambien referida como Asn297 o N297) es un residuo en el anticuerpo humano IgG1.

«Antfgeno diana» como se usa en la presente se refiere a la molecula que esta unida espedficamente por la region variable de un anticuerpo dado o el companero de fusion de una fusion Fc. Un antfgeno diana puede ser una protema, carbohidrato, lfpido u otro compuesto qmmico. Se dice que un anticuerpo o fusion Fc es «espedfico» de un antfgeno diana dado en funcion de que tiene afinidad por el antfgeno diana.

«Celula diana» como se usa en la presente se refiere a una celula que expresa un antfgeno diana.

«Region variable», tal como se utiliza en la presente, se refiere a la region de una inmunoglobulina que comprende uno o mas dominios Ig sustancialmente codificados por cualquiera de los genes Vk, VAy/o VH que conforman los loci geneticos de inmunoglobulina de cadena pesada, kappa y lambda, respectivamente.

«Polipeptido variante», «variante de polipeptido» o «variante» como se usa en la presente se refiere a una secuencia de polipeptidos que difiere de la de una secuencia de polipeptido original en virtud de al menos una modificacion de aminoacido. El polipeptido original puede ser un polipeptido de origen natural o de tipo salvaje (WT) o puede ser version modificada de un polipeptido WT. Polipeptido variante puede referirse al polipeptido en sf mismo, a composiciones que comprenden el polipeptido o a la secuencia de amino que lo codifica. De manera adecuada, los polipeptidos variantes descritos en la presente (p. ej., inmunoglobulinas variantes) pueden tener al menos una modificacion de aminoacido en comparacion con el polipeptido original, p. ej., de aproximadamente una a aproximadamente diez modificaciones de aminoacidos, de aproximadamente una a aproximadamente cinco modificaciones de aminoacidos, etc. en comparacion con el original. La secuencia de polipeptido variante en la presente puede poseer al menos aproximadamente 80 % de homologfa con una secuencia de polipeptido original, p. ej., al menos aproximadamente 90 % de homologfa, 95 % de homologfa, etc. Por consiguiente, «variante Fc» o «Fc variante» como se usa en la presente se refiere a una secuencia Fc que difiere de la de una secuencia Fc original en virtud de al menos una modificacion de aminoacido. Una variante Fc puede solo abarcar una region Fc o puede existir en el contexto de un anticuerpo, fusion Fc, Fc aislado, fragmento Fc u otro polipeptido que es sustancialmente codificado por Fc. Variante Fc puede referirse al polipeptido Fc en sf mismo, a composiciones que comprenden el polipeptido variante Fc o a la secuencia de aminoacidos que lo codifica. «Variante de polipeptido Fc» o «polipeptido Fc variante», como se usa en la presente, se refiere a un polipeptido Fc que difiere de un polipeptido Fc original en virtud de al menos una modificacion de aminoacido. «Variante de protema» o «protema variante», como se usa en la presente, se refiere a una protema que difiere de una protema original en virtud de al menos una modificacion de aminoacido. «Variante de anticuerpo» o «anticuerpo variante», como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo que difiere de un anticuerpo original en virtud de al menos una modificacion de aminoacido. «Variante de IgG» o «IgG variante», como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo que difiere de una IgG original en virtud de al menos una modificacion de aminoacido. «Variante de inmunoglobulina» o «inmunoglobulina variante» como se usa en la presente se refiere a una secuencia de inmunoglobulina que difiere de la de una secuencia de inmunoglobulina original en virtud de al menos una modificacion de aminoacido.

«Tipo salvaje» o «WT» en la presente se refiere a una secuencia de aminoacidos o una secuencia de nucleotidos que se encuentra en la naturaleza, inclusive variaciones alelicas. Una protema, polipeptido, anticuerpo, inmunoglobulina, IgG WT, etc. tiene una secuencia de aminoacidos o una secuencia de nucleotidos que no se modifico intencionalmente.

Moleculas de coadhesion

Como se describe en la presente, moleculas de coadhesion son moleculas bifuncionales capaces de unirse a FcYRIIb e IgE en la superficie de una celula. Estas moleculas pueden adoptar una variedad de configuraciones como se describe en mas detalle en la presente. Preferentemente las moleculas de coadhesion son proteinaceas, pese a que eso no es un requisito necesario. De manera adecuada, la molecula de coadhesion puede ser una molecula bifuncional en la que la especificidad por FcYRIIb y/o IgE es conferida por una molecula pequena, acido nucleico y/o polipeptido, por ejemplo. Preferentemente, la molecula de coadhesion se une a FcYRIIb con una Kd inferior a aproximadamente 100 nM. De manera adecuada, la molecula de coadhesion incluye una inmunoglobulina que une IgE y FcYRllb con alta afinidad. En este caso, la inmunoglobulina preferentemente coadhiere IgE y FcYRllb anclados a la membrana en la superficie de una celula. De manera adecuada, la molecula de coadhesion es un anticuerpo biespedfico que tiene una primera region espedfica objetivo y una segunda region espedfica objetivo, en donde la primera region espedfica objetivo une IgE y la segunda region espedfica objetivo une FcYRllb con una Kd inferior a aproximadamente 100 nM. De manera adecuada, la molecula de coadhesion es un anticuerpo biespedfico y la primera y segunda regiones espedficas objetivo son regiones Fv, en donde la primera region Fv une IgE y la segunda region Fv une FcYRIIb con una Kd inferior a aproximadamente 100 nM. De manera adecuada, la molecula de coadhesion es una fusion Fc que comprende una region Fc, en donde dicha region Fc une FcYRIIb con una Kd inferior a aproximadamente 100 nM. En este caso, el companero de fusion Fc de la inmunoglobulina une IgE.

De manera adecuada, la molecula de coadhesion es una molecula bifuncional en la que una primera region une IgE y una segunda region une FcYRllb con una Kd inferior que aproximadamente 100 nM. Practicamente toda protema, molecula pequena o acido nucleico, p. ej., aptameros, se puede unir para generar la molecula de union bifuncional y puede incluir enlazadores como se describe en la presente. De manera adecuada, los companeros de fusion de protema pueden incluir, pero no se limitan a, la region variable de un anticuerpo, la region de union a una diana de un receptor, una molecula de adhesion, un ligando, una enzima, una citocina, una quimiocina o alguna otra protema o dominio de protema. Los companeros de fusion de molecula pequena pueden incluir cualquier agente que dirige la molecula de coadhesion a un antfgeno diana, como IgE. De manera adecuada, la molecula de coadhesion puede comprender FceRI o FceRII/CD23 como un companero de fusion. De manera adecuada, las inmunoglobulinas son utiles como moleculas de coadhesion.

Inmunoglobulinas

Como se describe en la presente, una inmunoglobulina es un componente preferido de una molecula de coadhesion y puede ser un anticuerpo, una fusion Fc, un Fc aislado, un fragmento Fc o un polipeptido Fc. En algunas realizaciones, una inmunoglobulina es un anticuerpo. Como se describe en mas detalle a continuacion, la inmunoglobulina es util como molecula bifuncional en la que la region Fv une IgE y la region Fc une FcYRllb con una Kd inferior a aproximadamente 100 nM. Ademas, un anticuerpo es util en fusiones Fc o anticuerpos bifuncionales como se describe a continuacion.

Los anticuerpos son protemas inmunologicas que se unen a un antfgeno espedfico. En la mayona de los marnfferos, lo que incluye seres humanos y ratones, los anticuerpos se construyen de cadenas de polipeptidos pesada y ligera emparejadas. Las regiones variables de cadena ligera y pesada muestran una diversidad de secuencia considerable entre anticuerpos y son responsables de la union del antfgeno diana. Cada cadena esta conformada por dominios de inmunoglobulina (Ig) individuales y, por lo tanto, el termino generico inmunoglobulina se usa para tales protemas.

Las unidades estructurales de anticuerpos tradicionales tipicamente comprenden un tetramero. Cada tetramero esta compuesto tipicamente por dos pares identicos de cadenas polipeptidicas, cada par tiene una cadena «ligera» (que tipicamente tiene un peso molecular de alrededor de 25 kDa) y una «pesada» (que tipicamente tiene un peso molecular de alrededor de 50-70 kDa). Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa o epsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. La IgG tiene varias subclases que incluyen, pero no se limitan a, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. La IgM tiene subclases que incluyen, pero no se limitan a, IgM1 e IgM2. La IgA tiene varias subclases, que incluyen, pero no se limitan a, IgA1 y IgA2. Por lo tanto, «isotipo», como se usa en la presente, se refiere a cualquiera de las clases y subclases de inmunoglobulinas definidas por las caractensticas qmmicas y antigenicas de sus regiones constantes. Los isotipos de inmunoglobulina humana conocidos son IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM1, IgM2, IgD e IgE.

Cada una de las cadenas ligera y pesada esta hecha de dos regiones distintas, denominadas regiones variable y constante. La cadena pesada de IgG esta compuesta de cuatro dominios de inmunoglobulina enlazados dese el extremo N al C en el orden VH-CH1-CH2-CH3, que se refiere al dominio variable de cadena pesada, dominio constante de cadena pesada 1, dominio constante de cadena pesada 2 y dominio constante de cadena pesada 3, respectivamente (tambien denominada VH-Gy1-Cy2-Cy3, que se refiere al dominio variable de cadena, dominio constante gamma 1, dominio constante gamma 2 y dominio constante gamma 3 respectivamente). La cadena ligera de IgG esta compuesta de dos dominios de inmunoglobulina enlazados del extremo N al C en el orden VL-CL, que se refiere al dominio variable de cadena ligera y el dominio constante de cadena ligera, respectivamente. Las regiones constantes muestran menos diversidad de secuencia y son responsables por la union de una cantidad de protemas naturales para provocar eventos bioqmmicos importantes. Los rasgos distintivos entre estas clases de anticuerpos son sus regiones constantes, pese a que pueden existir diferencias mas sutiles en la region variable.

La region variable de un anticuerpo contiene las determinantes de union al antfgeno de la molecula y por lo tanto determina la especificidad de un anticuerpo por su antfgeno diana. La region variable se denomina asf debido a que es la que tiene secuencia mas distinta de otros anticuerpos en la misma clase. La parte de extremo amino de cada cadena incluye una region variable de aproximadamente 100 a 110 o mas aminoacidos principalmente responsables por el reconocimiento de antfgenos. En la region variable, se reunen tres bucles para cada uno de los dominios V de la cadena pesada y cadena ligera para formar un sitio de union al antfgeno. Cada uno de los bucles se denomina region determinante de complementariedad (en lo sucesivo denominada «CDR») donde la variacion en la secuencia de aminoacidos es lo mas significativo. Hay 6 CDR en total, tres por cada por cadena pesada y ligera, denominadas CDR1 VH, CDR2 VH, CDR3 VH, CDR1 VL, CDR2 VL y CDR3 VL. La region variable fuera de las CDR se denomina region marco (FR). Pese a que no son tan diversas como las CDR, la variabilidad de secuencia ocurre en la region FR entre diferentes anticuerpos. En su totalidad, esta arquitectura caractenstica de anticuerpos proporciona un andamiaje estable (la region FR) desde el cual se puede explorar la diversidad de union al antfgeno sustancial (las CDR) por el sistema inmune para obtener especificidad por un amplio conjunto de antfgenos. Una cantidad de estructuras de alta resolucion estan disponibles para una variedad de fragmentos de region variable de diferentes organismos, algunos no unidos y algunos en complejo con el antfgeno. Las caractensticas de estructura y secuencia de las regiones variables de anticuerpo se describen, por ejemplo, en Morea et al., 1997, Biophys Chem 68:9-16; Morea et al., 2000, Methods 20:267-279 y las caractensticas conservadas de anticuerpos se describen, por ejemplo, en Maynard et al., 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-376.

La parte de extremo carboxi de cada cadena define una region constante principalmente responsable de la funcion efectora. En la subclase IgG de inmunoglobulinas, hay varios dominios de inmunoglobulina en la cadena pesada. En la presente, «dominio de inmunoglobulina (Ig)» se refiere a una region de una inmunoglobulina que tiene una estructura terciaria diferente. De interes en los casos descritos en la presente son los dominios de cadena pesada que incluyen los dominios pesados constantes (CH) y la region bisagra. En el contexto de anticuerpos IgG, los isotipos IgG tienen tres regiones CH cada uno. Por consiguiente, los dominios “CH” en el contexto de IgG son los siguientes: «CH1» se refiere a las posiciones 118-220 de acuerdo con el mdice EU como en Kabat. «CH2» se refiere a las posiciones 237­ 340 de acuerdo con el mdice EU como en Kabat y «CH3» se refiere a las posiciones 341-447 de acuerdo con el mdice EU como en Kabat.

Otra region importante de la cadena pesada es la region bisagra. «Bisagra» o «region bisagra» o «region bisagra de anticuerpo» o «region bisagra de inmunoglobulina» en la presente se refiere al polipeptido flexible que comprende los aminoacidos entre el primer y segundo dominios constantes de un anticuerpo. Estructuralmente, el dominio CH1 de IgG termina en la posicion UE 220 y el dominio CH2 de IgG comienza en el residuo UE en la posicion 237. Por lo tanto, para la IgG, la bisagra del anticuerpo se define en la presente de forma que incluya las posiciones 221 (D221 en IgG1) a 236 (G236 en IgG1) donde la numeracion se hace de acuerdo con el mdice EU como en Kabat. En algunos casos, por ejemplo, en el contexto de una region Fc, se incluye la bisagra inferior, donde la «bisagra inferior» generalmente se refiere a las posiciones 226 o 230 a 236.

De interes en los casos descritos en la presente son las regiones Fc. «Fc» o «region Fc», como se usa en la presente, se refiere al polipeptido que comprende la region constante de un anticuerpo excluyendo el primer dominio de inmunoglobulina de region constante y en algunos casos, parte de la bisagra. Por lo tanto, Fc se refiere a los ultimos dos dominios de inmunoglobulina de region constante de IgA, IgD y IgG y los ultimos tres dominios de inmunoglobulina de region constante de IgE e IgM y el extremo N de bisagra flexible de estos dominios. Para IgA e IgM, Fc puede incluir la cadena J. Para IgG, Fc comprende dominios de inmunoglobulina Cgamma2 y Cgamma3 (Cy2 y Cy3) y la bisagra entre Cgammal (Cy1) y Cgamma2 (Cy2). Pese a que los lfmites de la region Fc pueden variar, la region Fc de cadena pesada de IgG humana se define generalmente que incluye los residuos C226 o P230 a su extremo carboxilo, en donde la numeracion es de acuerdo con el mdice EU como en Kabat. Fc se puede referir a esta region sola o esta region en el contexto de un polipeptido Fc, como se describe a continuacion. «Polipeptido Fc» como se usa en la presente se refiere a un polipeptido que comprende toda la region Fc o parte de esta. Los polipeptidos Fc incluyen anticuerpos, fusiones Fc, Fc aislados y fragmentos Fc.

La region Fc de un anticuerpo interactua con una cantidad de receptores y ligandos Fc, impartiendo un conjunto de capacidades funcionales importantes denominadas funciones efectoras. Para IgG la region Fc, Fc comprende dominios de Ig Cy2 y Cy3 y la bisagra de extremo N que lleva a Cy2. Una familia importante de receptores Fc para la clase de IgG son los receptores Fc gamma (FcyR). Estos receptores median la comunicacion entre anticuerpos y el lado celular del sistema inmune (Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290). En los seres humanos esta familia de protemas incluye FcyRI (CD64), inclusive las isoformas FcYRIa, FcYRIb y FcyRIc; FcyRII (CD32), inclusive las isoformas FcYRIIa (inclusive los alotipos H131 y R131), FcYRIIb (inclusive FcYRIIb-1 y FcyRllb-2), y FcyRIIc; y FcyRIII (CD16), inclusive las isoformas FcYRIIIa (inclusive los alotipos V158 y F158) y FcyRIIIb (inclusive los alotipos FcyRIIIb-NA1 y FcyRIIIb-NA2) (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65). Estos receptores tfpicamente tienen un dominio extracelular que media la union a Fc, una region que abarca la membrana, y un dominio intracelular que puede mediar algun evento de senalizacion en la celula. Estos receptores se expresan en una variedad de celulas inmunitarias que incluyen monocitos, macrofagos, neutrofilos, celulas dendnticas, eosinofilos, mastocitos, plaquetas, celulas B, linfocitos granulares grandes, celulas de Langerhans, linfocitos citolfticos (NK) y celulas T yy. La formacion del complejo Fc/FcyR recluta estas celulas efectoras a sitios de antfgeno unido, que resultan tfpicamente en eventos de senalizacion dentro de las celulas e importantes respuestas inmunes posteriores como la liberacion de mediadores de inflamacion, activacion de celulas B, endocitosis, fagocitosis y ataque citotoxico. La capacidad de mediar funciones efectoras citotoxica y fagodticas es un potencial mecanismo por el cual los anticuerpos destruyen celulas dirigidas. La reaccion mediada por celulas en donde celulas citotoxicas no espedficas que expresan FcyR reconocen el anticuerpo unido en una celula diana y posteriormente provocan lisis de la celula diana se denomina citotoxicidad mediada por celulas dependientes de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en ingles) (Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766; Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290). La reaccion mediada por celulas en donde las celulas citotoxicas no espedficas que expresan FcyR reconocen el anticuerpo unido en una celula diana y posteriormente provocan fagocitosis de la celula diana se denomina fagocitosis mediada por celulas dependiente de anticuerpo (Ad Cp ).

Las diferentes subclases de IgG tienen diferentes afinidades para los FcyR, en donde IgG1 e IgG3 tfpicamente se unen sustancialmente mejor a los receptores que la IgG2 e IgG4 (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65). Los FcyR unen la region Fc de IgG con diferentes afinidades. Los dominios extracelulares de FcYRIIIa y FcYRIIIb son 96 % identicos, sin embargo, FcYRIIIb no tiene un dominio de senalizacion intracelular. Ademas, mientras que FcyRI, FcYRIIa/c y FcvRIIIa son reguladores positivos de la activacion disparada por el complejo inmune, caracterizados por tener un dominio intracelular que tiene un motivo de activacion inmunoreceptora basado en tirosina (ITAM, por sus siglas en ingles), YRIIb tiene un motivo de inhibicion inmunoreceptora basado en tirosina (ITIM) y por lo tanto actua como inhibidor. Por lo tanto, los primeros se denominan receptores de activacion y FcYRIIb se denomina receptor inhibidor. Pese a estas diferencias en afinidades y actividades, todos los FcyR se unen en la misma region en Fc, en el extremo N terminal del dominio Cy2 y la bisagra anterior. Esta interaccion esta bien caracterizada estructuralmente (Sondermann et al., 2001, J Mol Biol 309:737-749), y varias estructuras del Fc humano unido al dominio extracelular de FcYRIIIb humano se han solucionado (codigo de acceso pdb 1E4K) (Sondermann et al., 2000, Nature 406:267-273) (codigos de acceso pdb 1IIS y 1IIX) (Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16469-16477).

Un sitio que se superpone pero separado en Fc sirve como la interface para la protema de complemento C1q. Del mismo modo que la union a Fc/FcyR media ADCC, la union a Fc/C1q media la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Un sitio en Fc entre los dominios Cy2 y Cy3 media la interaccion con el receptor neonatal FcRn, la union del cual recicla anticuerpos endocitosados desde el endosoma nuevamente hacia el flujo sangumeo (Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766). Este proceso, acoplado con la exclusion de filtracion del rinon debido al gran tamano de la molecula de longitud completa, da como resultado semividas en suero del anticuerpo favorables que oscilan de una a tres semanas. La union de Fc a FcRn tambien cumple un rol clave en el transporte de anticuerpos. El sitio de union de FcRn en Fc es tambien el sitio en el que las protemas bacterianas A y G se unen. La union estrecha por estas protemas es tfpicamente explotada como un medio para purificar anticuerpos empleando cromatograffa de afinidad a protema A o protema G durante la proteccion de protemas. La fidelidad de estas regiones, las regiones de complemento y de union FcRn/protema A son importantes tanto para las propiedades clmicas de los anticuerpos y su desarrollo.

Un rasgo clave de la region Fc es la glicosilacion unida a N conservada que ocurre en N297. Este carbohidrato, u oligosacarido como se denomina a veces, tiene un rol estructural y funcional cntico para el anticuerpo y es una de las razones principales por las que los anticuerpos se deben producir usando sistemas de expresion de mairnferos. La union eficaz de Fc a FcyR y C1q requiere de esta modificacion y las alteraciones en la composicion del carbohidrato N297 o su eliminacion afectan la union de estas protemas (Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Mimura et al., 2001, J Biol Chem 276:45539-45547.; Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16478-16483; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Simmons et al., 2002, J Immunol Methods 263:133-147).

Las inmunoglobulinas de los casos descritos en la presente tambien pueden ser una protema tipo anticuerpo denominada fusion Fc (Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14:52-60; Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9:195-200). En la presente, fusion Fc se usa como sinonimo de los terminos «inmunoadhesina», «fusion Ig», «quimera Ig» y «globulina receptora» (a veces con guiones) como se usa en la tecnica previa (Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14:52-60; Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9:195-200). Una fusion Fc es una protema en donde uno o mas polipeptidos, denominado en la presente «companero de fusion» esta unido operativamente a Fc. Una fusion Fc combina la region Fc de un anticuerpo y por lo tanto sus funciones efectoras favorables y farmacocinetica, con la region de union a la diana de un receptor, ligando o alguna otra protema o dominio de protema. El rol de la ultima es mediar el reconocimiento de la diana y por lo tanto tiene una funcionalidad analoga a la region variable del anticuerpo. Debido a la superposicion estructural y funcional de las fusiones Fc con anticuerpos, la discusion de anticuerpos en la presente descripcion tambien se extiende a fusiones Fc.

Practicamente cualquier protema o molecula pequena se puede enlazar a Fc para generar una fusion Fc. Los companeros de fusion de protema pueden incluir, pero no se limitan a, la region variable de cualquier anticuerpo, la region de union a una diana de un receptor, una molecula de adhesion, un ligando, una enzima, una citocina, una quimiocina o alguna otra protema o dominio de protema. Los companeros de fusion de molecula pequena pueden incluir cualquier agente que dirija la fusion Fc a un antfgeno diana. Tal antfgeno diana puede ser cualquier molecula, p. ej., un receptor extracelular implicado en una enfermedad. Las fusiones Fc descritas en la presente preferentemente tienen especificidad por IgE. Por ejemplo, en los casos preferidos, las fusiones Fc de la descripcion pueden incluir FceRI o FceRII/CD23 como un companero de fusion. Las fusiones Fc de la descripcion preferentemente comprenden una o mas variantes en la region Fc que mejoran la afinidad para FcYRIIb.

Los companeros de fusion se pueden enlazar a cualquier region de una region Fc, inclusive en el extremo N o C o en algun residuo entre los extremos. De manera adecuada, un companero de fusion esta unido al extremo N o C de la region Fc. Una variedad de enlazadores puede ser utiles en algunos casos descritos en la presente para unir covalentemente las regiones Fc a un companero de fusion. «Enlazador», «secuencia enlazadora», «espaciador», «secuencia de anclaje» o equivalentes gramaticales de estos, en la presente se refieren a una molecula o grupo de moleculas (como un monomero o polfmero) que conecta dos moleculas y frecuentemente sirve para colocar las dos moleculas en una configuracion. Los enlazadores son conocidos en la tecnica; por ejemplo, los enlazadores homo o hetero-bifuncionales tambien son conocidos (vease, catalogo de 1994 de Pierce Chemical Company, seccion tecnica acerca de reticuladores, paginas 155-200). Se puede usar una cantidad de estrategias para unir moleculas covalentemente entre sf. Estas incluyen, pero no se limitan a, enlaces de polipeptidos entre los extremos N y C de protemas y dominios de protemas, enlace mediante enlace disulfuro y enlace mediante reactivos de reticulacion qrnmica. De manera adecuada, el enlazador es una union peptfdica, generada por tecnicas recombinantes o smtesis peptfdica. El peptido enlazador puede incluir predominantemente los siguientes residuos de aminoacidos: Gly, Ser, Ala, o Thr. El peptido enlazador debena tener una longitud que es adecuada para enlazar dos moleculas de modo tal que asuman la conformacion correcta una respecto de la otra de modo que retengan la actividad deseada. Las longitudes adecuadas a estos efectos incluyen residuos de al menos uno y no mas de 50 aminoacidos. De manera adecuada, el enlazador tiene de aproximadamente 1 a 30 aminoacidos de longitud. De manera adecuada, se pueden usar enlazadores h de 1 a 20 aminoacidos de longitud. Los enlazadores utiles incluyen polfmeros de glicina-serina (inclusive, por ejemplo, (GS)n, (GSGGS)n (establecido como SEQ ID NO:1), (GGGGS)n (establecido como SEQ ID NO:2), y (GGGS)n (establecido como SEQ ID NO:3), en donde n es un entero de al menos uno), polfmeros glicinaalanina, polfmeros alanina-serina y otros enlazadores flexibles, como lo comprenderan los expertos en la tecnica. De manera alternativa, una variedad de polfmeros no protemaceos que incluyen, pero no se limitan a polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol, polioxialquilenos o copolfmeros de polietilenglicol y polipropilenglicol, pueden ser utiles como enlazadores, es decir, pueden ser utiles para enlazar una region Fc a un companero de fusion.

Tambien se contemplan como companeros de fusion los polipeptidos Fc. Por lo tanto, una inmunoglobulina como se describe en la presente puede ser un polipeptido Fc multimerico, que comprende dos o mas regiones Fc. La ventaja de tal molecula es que proporciona multiples sitios de union a los receptores Fc con una molecula de protema unica. De manera adecuada, las regiones Fc se pueden enlazar usando un enfoque de ingeniena qrnmica. Por ejemplo, las Fab y Fc se pueden enlazar por enlaces tioeter que se originan en residuos de cistema en las bisagras, generando moleculas como FabFc². Las regiones Fc se pueden enlazar usando ingeniena de disulfuro y/o reticulacion qrnmica. De manera adecuada, las regiones Fc pueden enlazarse geneticamente. De manera adecuada, las regiones Fc en una inmunoglobulina se enlazan geneticamente a regiones Fc generadas enlazadas en tandem como se describe en USSN 11/022,289 (US2005-0249723 A1), presentado el 21/12/2004, con el tftulo "Fc polypeptides with novel Fc ligand binding sites". Los polipeptidos Fc enlazados en tandem pueden comprender dos o mas regiones Fc, p. ej., una a tres regiones Fc, dos regiones Fc. Puede ser ventajoso explorar una cantidad de construcciones geneticamente modificadas para obtener regiones Fc enlazadas en homo- o hetero-tandems con las propiedades funcionales y estructuras mas favorables. Las regiones Fc enlazadas en tandem puede ser regiones Fc enlazadas por homo­ tandem, es decir una region Fc de un isotipo se fusiona geneticamente a otra region Fc del mismo isotipo. Se anticipa que debido a que hay multiples sitios de union a FcyR, C1q y/o FcRn en polipeptidos Fc enlazados en tandem, las funciones efectoras y/o farmacocinetica se pueden mejorar. De manera adecuada, las regiones Fc de diferentes isotipos se pueden enlazar en tandem, denominadas en la presente regiones Fc enlazadas en hetero-tandem. Por ejemplo, debido a que la capacidad de dirigirse a receptores FcyR y FcaRI, una inmunoglobulina que se une a FcyR y FcaRI puede proporcionar una mejora clmica considerable.

Las inmunoglobulinas de los casos descritos en la presente pueden codificarse sustancialmente por genes de inmunoglobulina que pertenecen a cualquiera de las clases de anticuerpo. En determinados casos, las inmunoglobulinas descritas en la presente son utiles en anticuerpos o fusiones Fc que comprenden secuencias pertenecientes a la clase IgG de anticuerpos, inclusive lgG1, IgG2, IgG3, o IgG4. La figura 1 proporciona una alineacion de estas secuencias IgG humanas. En casos alternativos, las inmunoglobulinas descritas en la presente son utiles en anticuerpos o fusiones Fc que comprenden secuencias pertenecientes a la clase IgA (incluidas las subclases IgA1 e IgA2), IgD, IgE, IgG o IgM de anticuerpos. Las inmunoglobulinas descritas en la presente pueden comprender mas de una cadena de protemas, p. ej., pueden ser un anticuerpo o fusion Fc que es un monomero o un oligomero, inclusive un homo-oligomero o un hetero-oligomero.

Las inmunoglobulinas descritas en la presente se pueden codificar sustancialmente por genes de cualquier organismo, p. ej., mairnferos (inclusive, pero sin limitarse a seres humanos, roedores (inclusive, pero sin limitarse a ratones y ratas), lagomorfos (inclusive, pero sin limitarse a conejos y liebres), camelidos (inclusive, pero sin limitarse a camellos, llamas y dromedarios) y primates no humanos, inclusive, pero sin limitarse a prosimios, platirrinos (monos del nuevo mundo), cercopitecidos (monos del viejo mundo) y hommidos que incluyen gibones y grandes simios y pequenos simios. En determinados casos, las inmunoglobulinas descritas en la presente pueden ser sustancialmente humanas.

Como se sabe en la tecnica, los polimorfismos de inmunoglobulinas existen en la poblacion humana. Los polimorfismos Gm se determinan por los genes IGHG1, IGHG2 e IGHG3 que tienen alelos que codifican determinantes antigenicos alotfpicos denominados G1m, G2m y G3m para marcadores de las moleculas de IgG1, IgG2 e IgG3 humanas (no se encontraron alotipos Gm en la cadena gamma 4). Los marcadores se pueden clasificar en «alotipos» e «isoalotipos». Estos se distinguen en diferentes bases serologicas dependiendo de la fuerte homologfa de secuencia entre los isotipos. Los alotipos son determinantes antigenicas especificados por formas alelicas de los genes Ig. Los alotipos representan leves diferencias en las secuencias de aminoacidos de cadenas pesada o ligera de diferentes individuos. Incluso una diferencia de un solo aminoacido puede dar lugar a una determinante alotfpica, pese a que en muchos casos ocurrieron sustituciones de varios aminoacidos. Los alotipos son diferencias de secuencia entre alelos de una subclase por las cuales el antisuero reconoce solo las diferencias alelicas. Un isoalotipo es un alelo en un isotipo que produce un epftopo que se comparte con una region homologa no polimorfica de uno o mas isotipos diferentes y debido a esto el antisuero reaccionara tanto con los alotipos relevantes como con los isotipos homologos relevantes (Clark, 1997, IgG effector mechanisms, Chem Immunol. 65:88-110; Gorman & Clark, 1990, Semin Immunol 2(6):457-66).

Las formas alelicas de inmunoglobulinas humanas se han caracterizado bien (WHO Review of the notation for the allotypic and related markers of human immunoglobulins. J Immunogen 1976, 3: 357-362; WHO Review of the notation for the allotypic and related markers of human immunoglobulins. 1976, Eur. J. Immunol. 6, 599-601; Loghem E van, 1986, Allotypic markers, Monogr Allergy 19: 40-51). Ademas, se han caracterizado otros polimorfismos (Kim et al., 2001, J. Mol. Evol. 54:1-9). Actualmente se conocen 18 alotipos G1m (1, 2, 3, 17) o G1m (a, x, f, z), G2m (23) o G2m (n), G3m (5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) o G3m (b1, c3, b5, b0, b3, b4, s, t, g1, c5, u, v, g5) (Lefranc, et al., The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Pergamon, Oxford, pags.

43-78 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199-211). Los alotipos que se injertan en combinaciones fijas se denominan haplotipos Gm. Las inmunoglobulinas descritas en la presente se pueden codificar sustancialmente por un alotipo, isoalotipo o haplotipo de cualquier gen de inmunoglobulina.

Las inmunoglobulinas descritas en la presente pueden componer un polipeptido Fc que incluye, pero no se limita a anticuerpos, Fc aisladas, fragmentos de Fc y fusiones Fc. En un caso, una inmunoglobulina descrita en la presente es un anticuerpo de longitud completa que constituye la forma biologica natural de un anticuerpo inclusive regiones variables y constantes. Para el isotipo IgG, el anticuerpo de longitud completa es un tetramero y consiste en dos pares identicos de dos cadenas de inmunoglobulinas, en donde cada par tiene una cadena ligera y una cadena pesada, cada cadena ligera comprende dominios de inmunoglobulina VL y CL y cada cadena pesada comprende dominios de inmunoglobulina VH, Cy1, Cy2 y Cy3. En otro caso, las inmunoglobulinas descritas en la presente son regiones Fc aisladas o fragmentos de Fc.

Las inmunoglobulinas descritas en la presente pueden tener una variedad de estructuras que incluyen, pero no se limitan a, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos biespedficos, minicuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos sinteticos (a veces se hace referencia a ellos en la presente como «anticuerpos mimeticos»), anticuerpos quimericos, anticuerpos humanizados, anticuerpos de fusion (a veces se hace referencia a estos como «conjugados de anticuerpos»), y fragmentos de cada uno, respectivamente.

En un caso, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo espedficos incluyen, de modo no taxativo, (i) el fragmento Fab que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1, (ii) el fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1, (iii) el fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un anticuerpo simple; (iv) el fragmento dAb que consiste en una variable unica, (v) regiones CDR aisladas, (vi) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos (vii) moleculas Fv de cadena simple (scFv), en donde un dominio VH y un dominio VL se unen por un enlazador peptfdico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de union al antigeno, (viii) dfmeros Fc de cadena simple biespedficos y (ix) «diacuerpos» o « triacuerpos», fragmentos multivalentes o multiespedficos construidos por fusion genetica. Los fragmentos de anticuerpo pueden modificarse. Por ejemplo, las moleculas pueden estabilizarse con la incorporacion de puentes disulfuro que unen los dominios VH y VL. Ejemplos de formatos y arquitecturas de anticuerpos se describen en Holliger & Hudson, 2006, Nature Biotechnology 23(9):1126-1136, y Carter 2006, Nature Reviews Immunology 6:343-357 y las referencias citadas allf

En un caso, un anticuerpo descrito en la presente puede ser un anticuerpo multiespedfico y, en particular, un anticuerpo biespedfico, a menudo denominado «diacuerpos». Estos son anticuerpos que se unen a dos (o mas) antigenos diferentes. Los diacuerpos se pueden fabricar en una variedad de formas conocidas en la tecnica, p. ej., preparados qmmicamente o a partir de hibridomas dbridos. En un caso, el anticuerpo es un minicuerpo. Los minicuerpos son protemas de tipo anticuerpo minimizadas que comprenden un scFv unido a un dominio CH3. En algunos casos, el scFv se puede unir a la region Fc y puede incluir algunas o todas las regiones bisagra. Para obtener una descripcion de anticuerpos multiespedficos vease Holliger & Hudson, 2006, Nature Biotechnology 23(9):1126-1136 y referencias citadas en la presente.

Anticuerpos no humanos, quimericos, humanizados y totalmente humanos

La region variable de un anticuerpo, como se conoce en la tecnica puede estar compuesta de secuencias de una variedad de especies. En algunos casos, la region variable de anticuerpo puede ser de una fuente no humana que incluye, pero no se limita a, ratones, ratas, conejos, camellos, llamas y monos. En algunos casos, los componentes de andamiaje pueden ser una mezcla de diferentes especies. Como tal, un anticuerpo descrito en la presente puede ser un anticuerpo quimerico y/o un anticuerpo humanizado. En general, tanto los «anticuerpos quimericos» como los «anticuerpos humanizados» se refieren a anticuerpos que combinan regiones de mas de una especie. Por ejemplo, los «anticuerpos quimericos» comprenden tradicionalmente region o regiones variables de un raton u otra especie no humana y la region o regiones constantes de un humano.

«Anticuerpos humanizados» se refieren generalmente a anticuerpos no humanos a los que se les intercambio las regiones marco de dominio variable por secuencias encontradas en anticuerpos humanos. Generalmente, en un anticuerpo humanizado, el anticuerpo total, excepto las CDR, esta codificado por un polinucleotido de origen humano o es identico a dicho anticuerpo excepto dentro de sus CDR. Las CDR, alguna o todas las cuales estan codificadas por acidos nucleicos que se originan en un organismo no humano se injertan en el marco de lamina beta de la region variable de un anticuerpo humano para crear un anticuerpo cuya especificidad se determina mediante las CDR injertadas. La creacion de dichos anticuerpos se describe en, p. ej., WO 92/11018, Jones, 1986, Nature 321:522-525, Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536. La «retromutacion» de residuos marco de aceptor seleccionados a los residuos de donante correspondientes se requiere frecuentemente para volver a ganar afinidad perdida en la construccion que se injerto inicialmente (patente estadounidense n.° 5,693,762. El anticuerpo humanizado opcionalmente tambien comprendera al menos una parte de una region constante de inmunoglobulina, tfpicamente la de una inmunoglobulina humana y por lo tanto tfpicamente comprendera una region Fc humana. Los anticuerpos humanizados tambien se pueden generar usando ratones con un sistema inmune geneticamente modificado. Roque et al., 2004, Bio-technol. Prog. 20:639-654. Una variedad de tecnicas y metodos para humanizar y remoldear anticuerpos no humanos se conocen en la tecnica (Vease Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (EUA) y las referencias citadas allf). La humanizacion u otros metodos para reducir la inmunogenicidad de regiones variables de anticuerpo no humano pueden incluir metodos de revestimiento como se describe, por ejemplo, en Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 91:969-973. En un caso, el anticuerpo original se maduro por afinidad, como se conoce en la tecnica. Los metodos basados en la estructura se pueden emplear para la humanizacion y maduracion por afinidad, por ejemplo, como se describe en la serie estadounidense n.° 11/004,590 (US 2006-0008883 A1). Los metodos basados en seleccion se pueden utilizar para humanizar y/o madurar por afinidad las regiones variables de anticuerpos, es decir, para aumentar la afinidad de la region variable por su antfgeno diana. Otros metodos de humanizacion pueden implicar injertar solo partes de las CDR inclusive, pero sin limitarse a, metodos descritos en USSN 09/810,502 (US 2002­ 0034765 A1); Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119-1125; De Pascalis et al., 2002, J. Immunol. 169:3076-3084. Los metodos basados en la estructura se pueden emplear para la humanizacion y maduracion por afinidad, por ejemplo, como se describe en USSN 10/153,159 (US 2002-0177170 A1) y en solicitudes relacionadas. En determinadas variaciones, la inmunogenicidad del anticuerpo se reduce usando un metodo descrito en Lazar et al., 2007, Mol Immunol 44:1986-1998 y USSN 11/004,590 (US 2006-0008883 A1), con el tttulo "Methods of Generating Variant Proteins with Increased Host String Content and Compositions Thereof1, presentada el 3 de diciembre de 2004.

En un caso, el anticuerpo es un anticuerpo totalmente humano con al menos una modificacion como se destaca en la presente. «Anticuerpo totalmente humano» o «anticuerpo humano completo» se refiere a un anticuerpo humano que tiene la secuencia de genes de un anticuerpo que deriva de un cromosoma humano con las modificaciones como se describen en la presente. Los anticuerpos totalmente humanos se pueden obtener, por ejemplo, usando ratones transgenicos (Bruggemann et al., 1997, Curr Opin Biotechnol 8:455-458) o bibliotecas de anticuerpos humanos acopladas con metodos de seleccion (Griffiths et al., 1998, Curr Opin Biotechnol 9:102-108). En un caso, los anticuerpos equivalentes humanos se pueden generar por computadora como se describe en PCT/US09/41144 (WO2009/129538 A2).

Anticuerpos anti-IgE

Las inmunoglobulinas descritas en la presente se unen a IgE. Los anticuerpos anti-IgE de la descripcion pueden comprender cualquier region variable, conocida o aun no conocida, que tiene especificidad para IgE. Los anticuerpos anti-IgE incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos murinos MaE11, MaE13 y MaE15, versiones humanizadas y/o modificadas geneticamente de estos anticuerpos inclusive E25, E26 y E27, particularmente E25, tambien conocido como rhuMab-E25, tambien conocido como Omalizumab, tal como los descritos en US6761889, US6329509, US20080003218A1, y Presta, LG et al., 1993, J Immunol 151:2623-2632. Una version modificada geneticamente preferida de MaE11 es MaE11 H1L1, descrita en los Ejemplos de la presente. Otros anti-IgE que pueden ser utiles incluyen anticuerpo murino TES-C21, quimerico TES-C21, tambien conocido como CGP51901 (Corne, J et al., 1997, J Clin Invest 99:879-887; Racine-Poon, A et al., 1997, Clin Pharmcol Ther 62:675-690) y versiones humanizadas y/o modificadas geneticamente de este anticuerpo que incluyen, pero no se limitan a CGP56901, tambien conocido como TNX-901, tal como los anticuerpos descritos en Kolbinger, F et al., 1993, Protein Eng 6:971-980. Otros anticuerpos anti-IgE se describen en US6066718, US6072035, PCT/US04/02894 (WO2004/070011 A2), US5342924, US5091313, US5449760, US5543144, US5342924 y US5614611. Otros anticuerpos anti-IgE utiles incluyen el anticuerpo murino BSW17. Las secuencias de aminoacidos de los dominios VH y VL de region variable y CDR de algunos de estos anticuerpos se proporcionan en la figura 5.

Variantes Fc y propiedades de union al receptor Fc

Las inmunoglobulinas descritas en la presente pueden comprender una variante Fc. Una variante Fc comprende una o mas modificaciones de aminoacidos respecto de un polipeptido Fc original, en donde la o las modificaciones de aminoacidos proporcionan una o mas propiedades optimizadas. Una variante Fc descrita en la presente difiere en secuencia de aminoacidos de su original en virtud de al menos una modificacion de aminoacido. Por lo tanto, las variantes Fc descritas en la presente tienen al menos una modificacion de aminoacido en comparacion con el original. De manera alternativa, las variantes Fc descritas en la presente pueden tener mas de una modificacion de aminoacidos en comparacion con el original, por ejemplo, de aproximadamente una a cincuenta modificaciones de aminoacidos, p. ej., de aproximadamente una a diez modificaciones de aminoacidos, de aproximadamente una a aproximadamente cinco modificaciones de aminoacidos, etc., en comparacion con el original. Por lo tanto, la secuencia de las variantes Fc y las del polipeptido Fc original son sustancialmente homologas. Por ejemplo, las secuencias de la variante Fc variantes en la presente tendran aproximadamente 80 % de homologfa con la secuencia de la variante Fc original, p. ej., al menos aproximadamente 90 % de homologfa, al menos aproximadamente 95 % de homologfa, al menos aproximadamente 98 % de homologfa, al menos aproximadamente 99 % de homologfa, etc. Las modificaciones descritas en la presente incluyen modificaciones de aminoacidos, lo que incluye inserciones, eliminaciones y sustituciones. Las modificaciones descritas en la presente tambien incluyen modificaciones de glicoforma. Las modificaciones se pueden hacer geneticamente usando biologfa molecular o se pueden hacer enzimatica o qmmicamente.

Las variantes Fc descritas en la presente se definen de acuerdo con las modificaciones de aminoacido que las componen. Por lo tanto, por ejemplo, S267E es una variante Fc con la sustitucion S267E respecto del polipeptido Fc original. Asimismo, S267E/L328F define una variante Fc con la sustitucion S267E y L328F respecto del polipeptido Fc original. La identidad del aminoacido WT puede ser inespedfica, en cuyo caso la variante antes mencionada es denominara 267E/328F. Cabe destacar que el orden en el que las sustituciones se proporcionan es arbitrario, es decir, por ejemplo, 267E/328F es la misma variante Fc que 328F/267E y asf sucesivamente. A menos que se indique otra cosa, las posiciones descritas en la presente se enumeran de acuerdo con el mdice EU o esquema de numeracion UE (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5° ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda). El mdice EU o mdice EU como en Kabat o esquema de numeracion EU se refiere a la enumeracion del anticuerpo EU (Edelman et al., 1969, Proc Natl Acad Sci EUA 63:78-85);

De manera adecuada, las variantes Fc descritas en la presente se basan en secuencias IgG humanas y por lo tanto las secuencias IgG humanas se usan como las secuencias “base” contra las cuales se comparan las otras secuencias que incluyen, pero no se limitan a secuencias de otros organismos, por ejemplo, secuencias de roedores y primates. Las inmunoglobulinas tambien pueden comprender secuencias de otras clases de inmunoglobulinas como IgA, IgE, IgGD, IgGM, y similares. Se contempla que, pese a que las variantes Fc descritas en la presente se modifican geneticamente en el contexto de una IgG original, las variantes se pueden modificar geneticamente o “transferirse” al contexto de la otra, segunda IgG original. Esto se hace determinando los residuos y sustituciones «equivalentes» o «correspondientes» entre la primera y segunda IgG, tfpicamente en funcion de homologfa de secuencia o estructural entre las secuencias de la primera y segunda IgG. Para establecer homologfa, la secuencia de aminoacidos de la primera IgG descrita en la presente se compara directamente con la secuencia de una segunda IgG. Despues de alinear las secuencias, usando uno o mas de los programas de alineacion de homologfa conocidos en la tecnica (por ejemplo, usando residuos conservados como entre especies), permitiendo inserciones y eliminaciones necesarias para mantener la alineacion (es decir, evitando la eliminacion de residuos conservados a traves de eliminacion e insercion arbitraria), se definen los residuos equivalentes a aminoacidos particulares en la secuencia principal de la primera inmunoglobulina. La alineacion de residuos conservados puede conservar 100 % de estos residuos. Sin embargo, la alineacion de mas de 75 % o como mmimo 50 % de residuos conservados tambien es adecuada para definir residuos equivalentes. Los residuos equivalentes tambien se pueden definir determinando homologfa estructural entre una primera y segunda IgG que esta a nivel de una estructura terciaria de IgG cuyas estructuras se determinaron. En este caso, los residuos equivalentes se definen como aquellos para los cuales las coordenadas atomicas de dos o mas de los atomos de cadena principal de un residuo de aminoacido particular del original o precursor (N en N, CA en CA, C en C y O en O) estan dentro de aproximadamente 0,13 nm, despues de la alineacion. De manera adecuada, los residuos equivalentes estan dentro de aproximadamente 0,1 nm despues de la alineacion. La alineacion se logra despues de orientar y posicionar el mejor modelo para dar la superposicion maxima de coordenadas atomicas de atomos de protema no hidrogeno de las protemas. Independientemente de como se determinan los residuos equivalentes o correspondientes, e independientemente de la identidad de la IgG original en que se hacen las IgG, lo que se pretende comunicar es que las variantes Fc descubiertas como descritas en la presente se pueden modificar geneticamente en cualquier segunda IgG original que tiene homologfa estructural o de secuencia significativa con la variante Fc. Por lo tanto, por ejemplo, si un anticuerpo variante se genera en donde el anticuerpo original es IgG1 de humano, usando los metodos descritos anteriormente u otros metodos para determinar residuos equivalentes, el anticuerpo variante puede modificarse geneticamente en otro anticuerpo original IgG1 que se une a un antfgeno diferente, un anticuerpo original IgG2 humano, un anticuerpo original IgA humano, un anticuerpo original IgG2a o IgG2b de raton y similares. Nuevamente, como se describe anteriormente, el contexto de la variante Fc original no afecta la capacidad de transferir las variantes Fc descritas en la presente a otros IgG originales.

Las variantes Fc descritas en la presente pueden optimizarse para una variedad de propiedades de union al receptor de Fc. Una variante Fc que se modifica geneticamente o que se predice que muestra una o mas propiedades optimizadas se denomina en la presente «variante Fc optimizada». Las propiedades que se pueden optimizar incluyen, pero no se limitan a, mejor o menor afinidad por un FcyR. De manera adecuada, las variantes Fc descritas en la presente se optimizan para que posean una mejor afinidad por un FcYRIIb receptor inhibidor. En otros casos, las inmunoglobulinas descritas en la presente proporcionan mejor afinidad para FcYRIIb, pero menor afinidad para una o mas FcyR de activacion, inclusive, por ejemplo, FcyRI, FcYRIIa, FcYRIIIa y/o FcYRIIIb. Los receptores FcyR se pueden expresar en celulas de cualquier organismo inclusive, pero sin limitarse a, seres humanos, monos cinomolgo y ratones. Las variantes Fc descritas en la presente se pueden optimizar para poseer una mejor afinidad para FcYRIIb humano.

«Mayor afinidad» o «afinidad mejorada» o «afinidad potenciada» o «mejor afinidad» que un polipeptido Fc original, como se usa en la presente se refiere a que una variante Fc se une a un receptor Fc con una constante de asociacion de equilibrio significativamente mayor (K^a o Ka) o constante de disociacion de menor equilibrio (K^d o Kd) que el polipeptido Fc original cuando las cantidades de polipeptido variante y original en el ensayo de union son esencialmente las mismas. Por ejemplo, la variante Fc con mejor afinidad de union al receptor Fc puede mostrar una mejora de aproximadamente 5 veces a aproximadamente 1000 veces, p. ej., de aproximadamente 10 veces a aproximadamente 500 veces en la afinidad de union al receptor Fc en comparacion con el polipeptido Fc original, en donde la afinidad de union del receptor Fc se determina, por ejemplo, por metodos de union descritos en la presente que incluyen, pero no se limitan a, Biacore, por un experto en la tecnica. Por consiguiente, «menor afinidad» en comparacion con un polipeptido Fc original como se usa en la presente se refiere a que una variante Fc se une a un receptor Fc con una K^a significativamente menor o una K^d mayor que el polipeptido Fc original. Mayor o menor afinidad tambien se puede definir respecto de un nivel absoluto de afinidad. Por ejemplo, segun los datos de la presente, IgG1 WT (natural) se une a FcYRIIb con una afinidad de aproximadamente 2 pM, o aproximadamente 2000 nM. Ademas, algunas variantes Fc descritas en la presente se unen a FcYRIIb con una afinidad de aproximadamente 10 veces mas a IgG1 WT. Como se describe en la presente, una afinidad mayor o mejorada se refiere a una Kd menor que aproximadamente 100 nM, por ejemplo, entre aproximadamente 10 nM y aproximadamente 100 nM, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100 nM, o menos que aproximadamente 1 nM.

Los anticuerpos anti-IgE de la invencion preferentemente tienen alta afinidad para FcYRIIb. Alta afinidad en la presente se refiere a que la afinidad de la interaccion entre el anticuerpo y FcYRIIb es mas resistente que 100 nM. Es decir, que la constante de disociacion de equilibrio Kd de union del anticuerpo a FcYRIIb es menor que 100 nM.

De manera adecuada, las variantes Fc proporcionan una afinidad selectivamente mejorada a FcYRIIb con respecto a uno o mas receptores de activacion. Afinidad selectivamente mejorada significa que la variante Fc tiene mejor afinidad por FcYRIIb con respecto al o los receptores de activacion en comparacion con el polipeptido Fc original pero tiene menor afinidad para uno o mas receptores de activacion en comparacion con el polipeptido Fc original, o significa que la variante Fc tiene mejor afinidad tanto para FcYRIIb y receptores de activacion en comparacion con el polipeptido Fc original, sin embargo, la mejora en la afinidad es mayor para FcYRIIb que lo es para los receptores de activacion. De manera adecuada, variantes Fc reducen o eliminan la union a uno o mas FcyR de activacion, reducen o eliminan la union a una o mas protemas de complemento, reducen o eliminan una o mas funciones efectoras mediadas por FcyR y/o reducen o eliminan una o mas funciones efectoras mediadas por complemento.

La presencia de diferentes formas polimorficas de FcyR proporciona aun otro parametro que impacta en la utilidad terapeutica de las variantes Fc descritas en la presente. Mientras que la especificidad y selectividad de una variante Fc dada por las diferentes clases de FcyR afecta significativamente la capacidad de una variante Fc de dirigirse a un antfgeno dado por tratamiento de una enfermedad dada, la especificidad o selectividad de una variante Fc por diferentes formas polimorficas de estos receptores puede determinar en parte que investigacion o experimentos preclmicos pueden ser apropiados para evaluar y en ultima instancia que poblaciones de pacientes pueden o no responder al tratamiento. Por lo tanto, la especificidad o selectividad de variantes Fc descritas en la presente a polimorfismos del receptor de Fc que icluyen, pero sin limitarse a, FcYRIIa, FcYRIIIa, y similares, se pueden usar para guiar la seleccion de investigacion valida y experimentos preclmicos, diseno de ensayo clmico, seleccion de pacientes, dependencia de dosificacion y/u otros aspectos relativos a los ensayos clmicos.

Las variantes Fc descritas en la presente pueden comprender modificaciones que modulan la interaccion con receptores Fc que no sean FcyR inclusive, pero sin limitarse a, protemas de complementos, FcRn y homologos de receptor Fc (FcRH). FcRH incluyen, pero no se limitan a FcRH1, FcRH2, FcRH3, FcRH4, FcRH5 y FcRH6 (Davis et al., 2002, Immunol. Reviews 190:123-136).

Un parametro importante que determina la selectividad mas beneficiosa de una variante Fc dada para tratar una enfermedad dada es el contexto de la variante Fc. Por lo tanto, la selectividad o especificidad de receptor Fc de una variante Fc dada proporcionara diferentes propiedades dependiendo de si compone un anticuerpo, fusion Fc o variantes Fc con un companero de fusion acoplado. De manera adecuada, la especificidad de receptor Fc de la variante Fc descrita en la presente determinara su utilidad terapeutica. La utilidad de una variante Fc dada a efectos terapeuticos dependera del epftopo o forma del antigeno diana y la enfermedad o indicacion que se esta tratando. Para algunas dianas e indicaciones, una mayor afinidad de FcYRIIb y una funcion efectora mediada por FcyR de activacion reducida puede ser beneficiosa. Para otros antfgenos diana y aplicaciones terapeuticas, puede resultar beneficioso aumentar la afinidad por FcYRllb o aumentar la afinidad por FcYRllb y receptores de activacion.

Medios para optimizar la actividad de anticuerpos anti-IgE

En la presente se describen medios para alterar la afinidad a uno o mas FcyR. En un caso preferido, la afinidad se altera con respecto al receptor inhibidor FcYRIIb, por lo cual se altera de este modo la capacidad de la inmunoglobulina para mediar una o mas funciones efectoras inhibidoras mediadas por FcYRIIb. Los medios incluyen modificaciones de aminoacidos (p. ej., medios de posicion para optimizar la funcion, medios de sustitucion para optimizar la funcion, etc.) y modificaciones de glicoforma (p. ej., medios para modificaciones de glicoforma.

Modificaciones de aminoacidos

En la presente se describen inmunoglobulinas que comprenden modificaciones de aminoacidos, en donde dichas modificaciones alteran la afinidad a uno o mas FcyR. Preferentemente, dichas modificaciones de aminoacidos mejoran la afinidad a FcYRIIb. Sin embargo, en algunos casos, las modificaciones pueden mejorar la afinidad a uno o mas receptores de activacion, por ejemplo, FcyRI, FcYRIIa y FcYRIIIa. Las modificaciones para alterar la union a FcyR se describen en USSN 11/124,620 (US2006-0024298 A1), presentada el 5 de mayo de 2005, con el tftulo "Optimized Fc Variants" y USSN 12/156,183 (US2009-0136485 A1), presentada el 30 de mayo de 2008, con el tftulo "Methods and Compositions for Inhibiting CD32b Expressing Cells".

Como se describe en la presente, los medios de posicion para optimizar la actividad de anticuerpos anti-IgE incluyen, pero no se limitan a, modificacion de un aminoacido en una o mas posiciones de region constante de cadena pesada (p. ej., en las posiciones: 234, 235, 236, 237, 239, 265, 266, 267, 268, 298, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331 y 332) que permiten la modificacion de las propiedades de union de inmunoglobulina FcYRllb, funcion efectora, y propiedades potencialmente clmicas de anticuerpos.

En particular, los medios de sustitucion para optimizar la actividad de anticuerpos anti-IgE, p. ej., alterando la afinidad a FcYRllb incluyen, pero no se limitan a, una sustitucion de un aminoacido en una o mas posiciones de region constante de cadena pesada, p. ej., una o mas de las sustituciones de aminoacidos en las siguientes posiciones de region constante de cadena pesada: 234, 235, 236, 237, 239, 265, 266, 267, 268, 298, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331 y 332, en donde la numeracion es de acuerdo con el mdice EU. De manera adecuada, los medios de sustitucion incluyen al menos una (p. ej., dos o mas) sustituciones en comparacion con una region Fc original, en donde dichas modificaciones estan en las posiciones que se seleccionan del grupo que consiste en 234, 235, 236, 237, 239, 266, 267, 268, 325, 326, 327, 328 y 332, de acuerdo con el mdice EU. De manera adecuada, los medios de sustitucion incluyen una o mas (p. ej., dos o mas) sustituciones en las posiciones que se seleccionan del grupo que consiste en 235, 236, 239, 266, 267, 268 y 328, de acuerdo con el mdice EU.

De manera adecuada, dichos medios de sustitucion son al menos una sustitucion (p. ej., una o mas sustituciones, dos o mas sustituciones, etc.) que se seleccionan del grupo que consiste en 234F, 234g , 234I, 234K, 234N, 234P, 234Q, 234S, 234V, 234W, 234Y, 234D, 234E, 235A, 235E, 235H, 235I, 235N, 235P, 235Q, 235R, 235S, 235W, 235Y, 235D, 235F, 235T, 236D, 236F, 236H, 236I, 236K, 236L, 236M, 236P, 236Q, 236R, 236S, 236T, 236V, 236W, 236Y, 236A, 236E, 236N, 237A, 237E, 237H, 237K, 237L, 237P, 237Q, 237S, 237V, 237Y, 237D, 237N, 239D, 239E, 239N, 239Q, 265E, 266D, 266I, 266M, 267A, 267D, 267E, 267G, 268D, 268E, 268N, 268Q, 298D, 298E, 298L, 298M, 298Q, 325L, 326A, 326E, 326W, 326D, 327D, 327G, 327L, 327N, 327Q, 327E, 328E, 328F, 328Y, 328H, 328I, 328Q, 328W, 329E, 330D, 330H, 330K, 330S, 331S y 332E, en donde la numeracion es de acuerdo con un mdice EU. De manera adecuada, dichos medios de sustitucion son al menos una sustitucion (p. ej., una o mas sustituciones, dos o mas sustituciones, etc.) que se seleccionan del grupo que consiste en 234N, 234F, 234D, 234E, 234W, 235Q, 235R, 235W, 235Y, 235D, 235F, 235T, 236D, 236H, 236I, 236L, 236S, 236Y, 236E, 236N, 237H, 237L, 237D, 237N, 239D, 239N, 239E, 266I, 266M, 267A, 267D, 267E, 267G, 268D, 268E, 268N, 268Q, 298E, 298L, 298M, 298Q, 325L, 326A, 326E, 326W, 326D, 327D, 327L, 327E, 328E, 328F, 328Y, 328H, 328I, 328Q, 328W, 330D, 330H, 330K y 332E donde la numeracion es de acuerdo con un mdice EU. De manera adecuada, dichos medios de sustitucion son al menos una sustitucion (p. ej., una o mas sustituciones, dos o mas sustituciones, etc.) que se seleccionan del grupo que consiste en 234D, 234E, 234W, 235D, 235F, 235R, 235Y, 236D, 236N, 237D, 237N, 239D, 239E, 266M, 267D, 267E, 268D, 268E, 327D, 327E, 328F, 328W, 328Y y 332E, en donde la numeracion es de acuerdo con un mdice EU. De manera adecuada, dichos medios de sustitucion son al menos una sustitucion (p. ej., una o mas sustituciones, dos o mas sustituciones, etc.) que se seleccionan del grupo que consiste en 235Y, 236D, 239D, 266M, 267E, 268D, 268E, 328F, 328W y 328Y, en donde la numeracion es de acuerdo con un mdice EU.

De manera adecuada, dichos medios de sustitucion son al menos dos sustituciones (p. ej., una combinacion de modificaciones) en posiciones que se seleccionan del grupo que consiste en 234/239, 234/267, 234/328, 235/236, 235/239, 235/267, 235/268, 235/328, 236/239, 236/267, 236/268, 236/328, 237/267, 239/267, 239/268, 239/327, 239/328, 239/332, 266/267, 267/268, 267/325, 267/327, 267/328, 267/332, 268/327, 268/328, 268/332, 326/328, 327/328 y 328/332, en donde la numeracion es de acuerdo con un mdice EU. De manera adecuada, dichos medios de sustitucion son al menos dos sustituciones (p. ej., una combinacion de modificaciones) en posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 235/267, 236/267, 239/268, 239/267, 267/268 y 267/328, en donde la numeracion es de acuerdo con un mdice EU. De manera adecuada, dichos medios de sustitucion son al menos dos sustituciones (p. ej., una combinacion de sustituciones) seleccionadas del grupo que consiste en 234D/267E, 234E/267E, 234F/267E, 234E/328F, 234W/239D, 234W/239E, 234W/267E, 234W/328Y, 235D/267E, 235D/328F, 235F/239D, 235F/267E, 235F/328Y, 235Y/236D, 235Y/239D, 235Y/267D, 235Y/267E, 235Y/268E, 235Y/328F, 236D/239D, 236D/267E, 236D/268E, 236D/328F, 236N/267E, 237D/267E, 237N/267E, 239D/267D, 239D/267E, 239D/268D, 239D/268E, 239D/327D, 239D/328F, 239D/328W, 239D/328Y, 239D/332E, 239E/267E, 266M/267E, 267D/268E, 267E/268D, 267E/268E, 267E/325L, 267E/327D, 267E/327E, 267E/328F, 267E/328I, 267E/328Y, 267E/332E, 268D/327D, 268D/328F, 268D/328W, 268D/328Y, 268D/332E, 268E/328F, 268E/328Y, 327D/328Y, 328F/332E, 328W/332E y 328Y/332E, en donde la numeracion es de acuerdo con un mdice EU.

De manera adecuada, dichos medios de sustitucion resultan en al menos una de las siguientes sustituciones o combinaciones de sustituciones: 234F/236N, 234F/236D, 236A/237A, 236S/237A, 235D/239D, 234D/267E, 234E/267E, 234F/267E, 235D/267E, 235F/267E, 235S/267E, 235T/267E, 235Y/267D, 235Y/267E, 236D/267E, 236E/267E, 236N/267E, 237D/267E, 237N/267E, 239D/267D, 239D/267E, 266M/267E, 234E/268D, 236D/268D, 239D/268D, 267D/268D, 267D/268E, 267E/268D, 267E/268E, 267E/325L, 267D/327D, 267D/327E, 267E/327D, 267E/327E, 268D/327D, 239D/328Y, 267E/328F, 267E/328H, 267E/328I, 267E/328Q, 267E/328Y, 268D/328Y, 239D/332E, 328Y/332E, 234D/236N/267E, 235Y/236D/267E, 234W/239E/267E, 235Y/239D/267E, 236D/239D/267E, 235Y/267E/268E, 236D/267E/268E, 239D/267E/268E, 234W/239D/328Y, 235F/239D/328Y, 234E/267E/328F, 235D/267E/328F, 235Y/267E/328F, 236D/267E/328F, 239D/267A/328Y, 239D/267E/328F, 234W/268D/328Y, 235F/268D/328Y, 239D/268D/328F, 239D/268D/328W, 239D/268D/328Y, 239D/268E/328Y, 267A/268D/328Y, 267E/268E/328F, 239D/326D/328Y, 268D/326D/328Y, 239D/327D/328Y, 268D/327D/328Y, 239D/267E/332E, 234W/328Y/332E, 235F/328Y/332E, 239D/328F/332E, 239D/328Y/332E, 267A/328Y/332E, 268D/328F/332E, 268D/328W/332E, 268D/328Y/332E, 268E/328Y/332E, 326D/328Y/332E, 327D/328Y/332E, 234W/236D/239E/267E, 239D/268D/328F/332E, 239D/268D/328W/332E y 239D/268D/328Y/332E, en donde la numeracion es de acuerdo con un mdice EU. De manera adecuada, dichos medios de sustitucion resultan en al menos una de las siguientes sustituciones o combinaciones de sustituciones: 266D, 234F/236N, 234F/236D, 236A/237A, 236S/237A, 235D/239D, 234D/267E, 234E/267E, 234F/267E, 235D/267E, 235F/267E, 235S/267E, 235T/267E, 235Y/267D, 236D/267E, 236E/267E, 236N/267E, 237D/267E, 237N/267E, 266M/267E, 234E/268D, 236D/268D, 267D/268D, 267D/268E, 267E/268D, 267E/268E, 267E/325L, 267D/327D, 267D/327E, 267E/327E, 268D/327D, 239D/328Y, 267E/328F, 267E/328H, 267E/328I, 267E/328Q, 267E/328Y, 268D/328Y, 234D/236N/267E, 235Y/236D/267E, 234W/239E/267E, 235Y/239D/267E, 236D/239D/267E, 235Y/267E/268E, 236D/267E/268E, 234W/239D/328Y, 235F/239D/328Y, 234E/267E/328F, 235D/267E/328F, 235Y/267E/328F, 236D/267E/328F, 239D/267A/328Y, 239D/267E/328F, 234W/268D/328Y, 235F/268D/328Y, 239D/268D/328F, 239D/268D/328W, 239D/268D/328Y, 239D/268E/328Y, 267A/268D/328Y, 267E/268E/328F, 239D/326D/328Y, 268D/326D/328Y, 239D/327D/328Y, 268D/327D/328Y, 234W/328Y/332E, 235F/328Y/332E, 239D/328F/332E, 239D/328Y/332E, 267A/328Y/332E, 268D/328F/332E, 268D/328W/332E, 268D/328Y/332E, 268E/328Y/332E, 326D/328Y/332E, 327D/328Y/332E, 234W/236D/239E/267E, 239D/268D/328F/332E, 239D/268D/328W/332E y 239D/268D/328Y/332E, en donde la numeracion es de acuerdo con un mdice EU. De manera adecuada, dichos medios de sustitucion resultan en al menos una de las siguientes sustituciones o combinaciones de sustituciones: 234N, 235Q, 235R, 235W, 235Y, 236D, 236H, 2361, 236L, 236S, 236Y, 237H, 237L, 239D, 239N, 2661, 266M, 267A, 267D, 267E, 267G, 268D, 268E, 268N, 268Q, 298E, 298L, 298M, 298Q, 326A, 326E, 326W, 327D, 327L, 328E, 328F, 330D, 330H, 330K, 234F/236N, 234F/236D, 235D/239D, 234D/267E, 234E/267E, 234F/267E, 235D/267E, 235F/267E, 235T/267E, 235Y/267D, 235Y/267E, 236D/267E, 236E/267E, 236N/267E, 237D/267E, 237N/267E, 239D/267D, 239D/267E, 266M/267E, 234E/268D, 236D/268D, 239D/268D, 267D/268D, 267D/268E, 267E/268D, 267E/268E, 267E/325L, 267D/327D, 267D/327E, 267E/327D, 267E/327E, 268D/327D, 239D/328Y, 267E/328F, 267E/328H, 267E/328I, 267E/328Q, 267E/328Y, 268D/328Y, 239D/332E, 328Y/332E, 234D/236N/267E, 235Y/236D/267E, 234W/239E/267E, 235Y/239D/267E, 236D/239D/267E, 235Y/267E/268E, 236D/267E/268E, 239D/267E/268E, 234W/239D/328Y, 235F/239D/328Y, 234E/267E/328F, 235D/267E/328F, 235Y/267E/328F, 236D/267E/328F, 239D/267A/328Y, 239D/267E/328F, 234W/268D/328Y, 235F/268D/328Y, 239D/268D/328F, 239D/268D/328W, 239D/268D/328Y, 239D/268E/328Y, 267A/268D/328Y, 267E/268E/328F, 239D/326D/328Y, 268D/326D/328Y, 239D/327D/328Y, 268D/327D/328Y, 239D/267E/332E, 234W/328Y/332E, 235F/328Y/332E, 239D/328F/332E, 239D/328Y/332E, 267A/328Y/332E, 268D/328F/332E, 268D/328W/332E, 268D/328Y/332E, 268E/328Y/332E, 326D/328Y/332E, 327D/328Y/332E, 234W/236D/239E/267E, 239D/268D/328F/332E, 239D/268D/328W/332E y 239D/268D/328Y/332E.

De manera adecuada, dichos medios de sustitucion resultan en al menos una de las siguientes sustituciones o combinaciones de sustituciones: 235Y/267E, 236D/267E, 239D/268D, 239D/267E, 267E/268D, 267E/268E y 267E/328F, en donde la numeracion es de acuerdo con un mdice EU.

De manera adecuada, la inmunoglobulina puede comprender medios para modificaciones isotipicas, es decir, modificaciones en una IgG original al tipo de aminoacido en una IgG alternativa. Por ejemplo, una variante hforida de IgG1/IgG3 puede construirse por un medio de sustitucion sustituyendo las posiciones de IgG1 en la region CH2 y/o CH3 con los aminoacidos de IgG3 en las posiciones en donde difieren los dos isotipos. Por lo tanto, se puede construir un anticuerpo IgG variante hforido que comprende uno o mas medios de sustitucion, p. ej., 274Q, 276K, 300F, 339T, 356E, 358M, 384S, 392N, 397M, 422I, 435R, y 436F. De manera adecuada, una variante hforida de IgG1/IgG2 puede construirse por un medio de sustitucion para sustituir las posiciones de IgG2 en la region CH2 y/o CH3 con los aminoacidos de IgG1 en las posiciones en donde difieren los dos isotipos. Por lo tanto, se puede construir un anticuerpo de IgG variante hforido que comprende uno o mas medios de sustitucion, p. ej., una o mas de las siguientes sustituciones de aminoacido: 233E, 234L, 235L, -236G (que refiere a una insercion de una glicina en la posicion 236), y 327A.

Modificaciones de glicoforma

Muchos polipeptidos, incluidos los anticuerpos, se someten a una variedad de modificaciones postraduccionales que implican restos de carbohidrato, como glicosilacion con oligosacaridos. Hay varios factores que pueden influir en la glicosilacion. Se ha demostrado que la especie, tejido y tipo celular son importantes en el modo en que ocurre la glicosilacion. Ademas, el ambiente extracelular, a traves de condiciones de cultivo alteradas como concentracion en suero, puede tener un efecto directo en la glicosilacion (Lifely et al., 1995, Glycobiology 5(8): 813-822).

Todos los anticuerpos contienen carbohidratos en posiciones conservadas en las regiones constantes de la cadena pesada. Cada isotipo de anticuerpo tiene una variedad distinta de estructuras de carbohidrato enlazado a N. Aparte del carbohidrato unido a la cadena pesada, hasta 30% de IgG humanas tienen una region Fab glicosilada. IgG tiene un unico carbohidrato de dos antenas enlazado a N en Asn297 del dominio CH2. Para IgG de suero o producida ex vivo en hibridomas o celulas modificadas geneticamente, las IgG son heterogeneas respecto del carbohidrato enlazado a Asn297 (Jefferis et al., 1998, Immunol. Rev. 163:59-76; Wright et al., 1997, Trends Biotech 15:26-32). Para IgG humana, el oligosacarido central consiste normalmente en GlcNAc²Man³GlcNAc, con diferentes numeros de residuos exteriores.

Los restos de carbohidrato de las inmunoglobulinas descritas en la presente se describiran respecto de la nomenclatura usada comunmente para la descripcion de oligosacaridos. Una revision de la qrnmica e carbohidratos que usa esta nomenclatura se encuentra en Hubbard et al. 1981, Ann. Rev. Biochem. 50:555-583. Esta nomenclatura incluye, por ejemplo, Man, que representa manosa; GlcNAc, que representa 2-N-acetilglucosamina; Gal que representa galactosa; Fuc para fucosa y Glc, que representa glucosa. Los acidos sialicos se describen por la notacion resumida NeuNAc, para acido 5-N-acetilneurammico y NeuNGc para acido 5-glicolilneurammico.

El termino «glicosilacion» se refiere a la union de oligosacaridos (carbohidratos que contienen dos o mas azucares simples unidas entre sf, p. ej., de dos o aproximadamente doce azucares simples unidos entre sp a una glicoprotema. Las cadenas laterales de oligosacaridos se enlazan tfpicamente a la estructura principal de la glicoprotema mediante enlaces N u O. Los oligosacaridos de inmunoglobulinas descritos en la presente ocurren generalmente unidos a un dominio CH2 de una region Fc como oligosacaridos enlazados a N. «Glicosilacion enlazada a N» se hace referencia a la union del resto carbohidrato a un residuo de asparagina en una cadena de glicoprotema. El experto en la tecnica reconocera que, por ejemplo, cada uno de IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3 murino, asf como dominios CH2 de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgD humanos tienen un unico sitio para la glicosilacion enlazada a N en el residuo de aminoacido 297 (Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 1991).

A los efectos de la presente, una «estructura de carbohidrato de nucleo maduro» se refiere a una estructura de carbohidrato de nucleo procesada unida a una region Fc que consiste generalmente en la siguiente estructura de carbohidrato GlcNAc(fucosa)-Glc-NAc-Man-(Man-GlcNAc)² tfpica de oligosacaridos de dos antenas. La estructura de carbohidrato de nucleo procesada esta unida a la region Fc de la glicoprotema, generalmente mediante un enlace N a Asn297 de un dominio CH2 de la region Fc. Un «GlcNAc bisecado» es un residuo de GlcNAc unido a la p1,4 manosa de la estructura de carbohidrato de nucleo maduro. El GlcNAc bisecado puede unirse enzimaticamente a la estructura de carbohidrato de nucleo maduro por una enzima p(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII). Las celulas CHO normalmente no expresan GnTIII (Stanley et al., 1984, J. Biol. Chem. 261:13370-13378), pero se pueden modificar geneticamente para hacerlo (Umana et al., 1999, Nature Biotech. 17:176-180).

En la presente se describen variantes Fc que comprenden glicoformas modificadas o glicoformas modificadas geneticamente. «Modificacion de glicoforma» o «glicoforma modificada geneticamente», como se usa en la presente, se refiere a una composicion que esta unida covalentemente a una protema, por ejemplo, un anticuerpo, en donde dicha composicion de carbohidrato difiere qmmicamente de la de la protema original. Las glicoformas modificadas geneticamente pueden ser utiles para diversos fines, lo que incluye, pero sin limitarse a, para potenciar o reducir la funcion efectora mediada por FcyR. En un caso, las inmunoglobulinas descritas en la presente se modifican para controlar el nivel de oligosacaridos fucosilados y/o bisecados que estan unidos covalentemente a la region Fc.

Una variedad de metodos se conocen en la tecnica para generar glicoformas modificadas (Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473); (US 6,602,684; USSN 10/277,370 (US 2003­ 0157108); USSN 10/113,929 (US 2003-0003097 A1); PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/29246A1; PCT WO 02/31140A1; PCT WO 02/30954A1); (tecnologfa Potelligent™ [Biowa, Inc., Princeton, NJ]; tecnologfa de ingeniena de glicosilacion GlycoMAb™ [biotecnolog^a GLYCART AG, Zurich, Suiza]). Estas tecnicas controlan el nivel de oligosacaridos fucosilados y/o bisecados que estan unidos covalentemente a la region Fc, por ejemplo, mediante la expresion de una IgG en varios organismos o lmeas celulares, modificados geneticamente o de otro modo (por ejemplo, celulas CHO Lec-13 o celulas YB2/0 de hibridoma de rata), mediante la regulacion de enzimas implicadas en la via de glicosilacion (por ejemplo, FUT8 [a 1,6-fucosiltranserasa] y/o (p1-4-N-acetilglucosaminiltransferasa III [GnTIll]), o mediante la modificacion del o los carbohidratos luego de que se expreso la IgG. Otros metodos para modificar glicoformas de las inmunoglobulinas descritas en la presente incluyen el uso de cepas modificadas geneticamente por glicosilacion de levadura (Li et al., 2006, Nature Biotechnology 24(2):210-215), moss (Nechansky et al., 2007, Mol Immunjol 44(7): 1826-8) y plantas (Cox et al., 2006, Nat Biotechnol 24(12): 1591-7). El uso de un metodo particular para generar una glicoforma modificada no pretende restringir los casos a ese metodo. Por el contrario, los casos descritos en la presente abarcan variantes Fc con glicoformas modificadas independientemente de como se producen.

De manera adecuada, las inmunoglobulinas descritas en la presente se modifican geneticamente para alterar el nivel de sialilacion. Mayores niveles de glicanos Fc sialilados en moleculas de inmunoglobulina G pueden impactar la funcionalidad negativamente (Scallon et al., 2007, Mol Immunol. 44(7):1524-34), y las diferencias en los niveles de sialilacion de Fc puede provocar actividad antiinflamatoria modificada (Kaneko et al., 2006, Science 313:670-673). Debido a que los anticuerpos pueden adquirir propiedades antiinflamatorias tras la sialilacion de polisacarido de nucleo Fc, puede ser ventajoso modificar geneticamente por glicosilacion las inmunoglobulinas descritas en la presente por un mayor o menor contenido de acido sialico Fc.

La glicoforma modificada geneticamente se refiere tfpicamente al carbohidrato u oligosacarido diferente; por lo tanto, por ejemplo, una inmunoglobulina puede comprender una glicoforma modificada geneticamente. De manera alternativa, glicoforma modificada geneticamente se puede referir a la inmunoglobulina que comprende el carbohidrato u oligosacarido diferente. De manera adecuada, una composicion descrita en la presente comprende una variante Fc glicosilada que tiene una region Fc, en donde aproximadamente 51-100% del anticuerpo glicosilado, p. ej., 80-100 %, 90-100 %, 95-100 %, etc. del anticuerpo en la composicion comprende una estructura de carbohidrato de nucleo madura que no tiene fucosa. De manera adecuada, el anticuerpo en la composicion comprende tanto una estructura de carbohidrato de nucleo madura que no tiene fucosa y adicionalmente comprende al menos una modificacion de aminoacido en la region Fc. En un caso alternativo, una composicion comprende una variante Fc glicosilada que tiene una region Fc, en donde aproximadamente 51-100 % del anticuerpo glicosilado, 80-100 % o 90-100 % del anticuerpo en la composicion comprende una estructura de carbohidrato de nucleo madura que no tiene acido sialico. En otro caso, el anticuerpo en la composicion comprende tanto una estructura de carbohidrato de nucleo madura que no tiene acido sialico y adicionalmente comprende al menos una modificacion de aminoacido en la region Fc. En aun otro caso, una composicion comprende una variante Fc glicosilada que tiene una region Fc, en donde aproximadamente 51­ 100% del anticuerpo glicosilado, 80-100 % o 90-100 % del anticuerpo en la composicion comprende una estructura de carbohidrato de nucleo madura que contiene acido sialico. De manera adecuada, el anticuerpo en la composicion comprende tanto una estructura de carbohidrato de nucleo madura que contiene acido sialico y adicionalmente comprende al menos una modificacion de aminoacido en la region Fc. De manera adecuada, la combinacion de glicoforma modificada geneticamente y la modificacion de aminoacido le proporciona propiedades optimas de union al receptor Fc al anticuerpo.

Otras modificaciones

Las inmunoglobulinas descritas en la presente pueden comprender una o mas modificaciones que proporcionan propiedades optimizadas que no se relacionan espedficamente con funciones efectoras mediadas por FcyR o complemento en sf mismas. Dichas modificaciones pueden ser modificaciones de aminoacido o pueden ser modificaciones que se hacen enzimatica o qmmicamente. Estas modificaciones probablemente proporcionen algo de mejora en la inmunoglobulina, por ejemplo, una mejora en su estabilidad, solubilidad, funcion o uso clmico. En la presente se describe una variedad de mejoras que se pueden hacer acoplando las inmunoglobulinas descritas en la presente con modificaciones adicionales.

De manera adecuada, la region variable de un anticuerpo descrito en la presente puede madurarse por afinidad, es decir, las modificaciones de aminoacido se convirtieron en los dominios VH y/o VL del anticuerpo para mejorar la union del anticuerpo a su antfgeno diana. Estos tipos de modificaciones pueden mejorar la cinetica de asociacion y/o disociacion para unirse al antfgeno diana. Otras modificaciones incluyen las que mejoran la selectividad por antfgeno diana en contraste con dianas alternativas. Estas incluyen modificaciones que mejoran la selectividad por el antfgeno expresado en celulas diana en contraste con las que no son diana. Otras mejoras a las propiedades de reconocimiento objetivas pueden proporcionarse por modificaciones adicionales. Estas propiedades pueden incluir, pero no se limitan a, propiedades cineticas espedficas (es decir, cinetica de asociacion y disociacion), selectividad por la diana particular en contraste con dianas alternativas y selectividad por una forma espedfica de diana en contraste con formas alternativas. Ejemplos incluyen variantes de longitud completa en contraste con las de corte y empalme, formas de superficie de celula en contraste con solubles, selectividad por varias variantes polimorficas o selectividad por formas conformacionales espedficas del antigeno diana. Las inmunoglobulinas descritas en la presente pueden comprender una o mas modificaciones que proporcionan una internalizacion reducida o mejorada de una inmunoglobulina.

De manera adecuada, las modificaciones se hacen para mejorar las propiedades bioffsicas de las inmunoglobulinas descritas en la presente que incluye, pero no se limita a, estabilidad, solubilidad y estado oligomerico. Las modificaciones pueden incluir, por ejemplo, sustituciones que proporcionan interacciones intramoleculares mas favorables en la inmunoglobulina como para proporcionar mayor estabilidad o sustitucion de aminoacidos no polares expuestos con aminoacidos polares por mayor solubilidad. Otras modificaciones a las inmunoglobulinas descritas en la presente incluyen las que permiten la formacion espedfica de moleculas homodimericas u homomultimericas. Estas modificaciones incluyen, pero no se limitan a, disulfuros modificados geneticamente, asf como modificaciones qrnmicas o metodos de agregacion que pueden proporcionar un mecanismo para generar moleculas homodimericas covalentes u homomultimericas. Modificaciones adicionales a las variantes descritas en la presente incluyen las que permiten la formacion espedfica de moleculas heterodimericas, heteromultimericas, bifuncioanles y/o multifuncionales. Estas modificaciones incluyen, pero no se limitan a, una o mas sustituciones de aminoacidos en el dominio CH3, en donde las sustituciones reducen la formacion de homodfmero y aumentan la formacion de heterodfmero. Modificaciones adicionales incluyen modificaciones en los dominios bisagra y CH3, en donde las modificaciones reducen la propension a formar dfmeros.

De manera adecuada, las inmunoglobulinas descritas en la presente comprenden modificaciones que retiran los sitios de degradacion proteolftica. Estas pueden incluir, por ejemplo, sitios de proteasa que reducen los rendimientos de produccion, asf como sitios de proteasa que degradan la protema administrada in vivo. En una realizacion, se hacen modificaciones adicionales para retirar los sitios de degradacion covalente como desamidacion (es decir, desamidacion de residuos de glutaminilo y asparaginilo a los residuos de glutamilo y aspartilo correspondientes), oxidacion y sitios de degradacion proteolftica. Los sitios de desamidacion que son de particular utilidad para ser retirados son los que tienen una mayor propension a la desamidacion que incluyen, pero no se limitan a, residuos asparaginilo y glutamino seguido de glicinas (motivos NG y QG, respectivamente). En estos casos, la sustitucion de cualquier residuo puede reducir significativamente la tendencia a la desamidacion. Los sitios de oxidacion comunes incluyen residuos de metionina y cistema. Otras modificaciones covalentes, que se pueden introducir o retirar, incluyen hidroxilacion de prolina y lisina, fosforilacion de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, metilacion de los grupos “-amino de cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pags. 79-86 (1983)), acetilacion de la amina de extremo N y amidacion de cualquier grupo carboxilo de extremo C. Modificaciones adicionales tambien pueden incluir, pero no se limitan a, modificaciones postraduccionales como glicosilacion y fosforilacion enlazada a N o enlazada a O.

Las modificaciones pueden incluir las que mejoran la expresion y/o rendimientos de purificacion de hospedadores o celulas hospedadoras comunmente usadas para la produccion de biologfas. Estas incluyen, pero no se limitan a, varias lmeas de celulas de mairnferos (p. ej., CHO), lmeas de celulas de levadura, lmeas de celulas bacterias y plantas Modificaciones adicionales incluyen modificaciones que eliminan o reducen la capacidad de las cadenas pesadas de formar enlaces disulfuro entre las cadenas. Modificaciones adicionales incluyen modificaciones que eliminan o reducen la capacidad de las cadenas pesadas de formar enlaces disulfuro dentro de las cadenas.

Las inmunoglobulinas descritas en la presente pueden comprender modificaciones que incluyen el uso de aminoacido no naturales incorporados usando, por ejemplo, las tecnologfas desarrolladas por Schultz y colegas que incluyen pero no se limitan a los metodos descritos por Cropp & Shultz, 2004, Trends Genet. 20(12):625-30, Anderson et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 101(2):7566-71, Zhang et al., 2003, 303(5656):371-3, y Chin et al., 2003, Science 301(5635):964-7. De manera adecuada, estas modificaciones permiten la manipulacion de varias propiedades funcionales, bioffsicas, inmunologicas o de fabricacion descritas anteriormente. De manera adecuada, estas modificaciones permiten modificacion qmmica adicional con otros fines. En la presente se contemplan otras modificaciones. Por ejemplo, la inmunoglobulina puede estar unida a uno de varios poffmeros no proteinaceos, p. ej., polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol, polioxialquilenos o copoffmeros de polietilenglicol y polipropilenglicol. Se pueden hacer modificaciones de aminoacido adicionales para permitir la modificacion qrnmica espedfica o no espedfica o postraduccional de las inmunoglobulinas. Dichas modificaciones incluyen, pero no se limitan a, PEGilacion y glicosilacion. Las sustituciones espedficas que se pueden utilizar para permitir la PEGilacion incluyen, pero no se limitan a, introduccion de residuos de cistema novedosos o aminoacidos no naturales de modo que las qrnmicas de acoplamiento eficaces y espedficas se puedan usar para unir una PEG o de otro modo un resto polimerico. La introduccion de sitios de glicosilacion espedficos se puede lograr introduciendo secuencias N-X-T/S novedosas en las inmunoglobulinas descritas en la presente.

Las modificaciones para reducir la inmunogenicidad pueden incluir modificaciones que reducen la union de peptidos procesados derivados de la secuencia original a protemas MHC. Por ejemplo, las modificaciones de aminoacidos se modificanan geneticamente de modo que haya epftopos inmunes, o solo una cantidad minima de estos, que se predice que se uniran, con alta afinidad, a cualquier alelo m Hc prevalente. Varios metodos para identificar epftopos de union a MHC en las secuencias de protema se conocen en la tecnica y se pueden usar para puntuar epftopos en un anticuerpo descrito en la presente. Vease, por ejemplo, USSN 09/903,378 (US 2002-0114492 A1), Us Sn 10/754,296 (US 2004-0230380 A1), USSN 11/249,692 (US 2006-0148009 A1) y referencias citadas alff.

De manera adecuada, las inmunoglobulinas descritas en la presente se pueden combinar con inmunoglobulinas que alteran la union a FcRn. Estas variantes pueden proporcionar mejores propiedades farmacocineticas a las inmunoglobulinas. Las variantes preferidas que aumentan la union a FcRn y/o mejoran las propiedades farmacocineticas incluyen, pero no se limitan a sustituciones en las posiciones 259, 308, 428 y 434, inclusive pero no limitado a, por ejemplo, 259I, 308F, 428L, 428M, 434S, 434H, 434F, 434Y y 434M (PCT/US2008/088053 (W02009086320 A1), presentada el 22 de diciembre de 2008, con el tftulo “Fc Variants with Alterned Binding to FcRn"). Otras variantes que aumentan la union de Fc a FcRn incluyen, pero no se limitan a: 250E, 250Q, 428L, 428F, 250Q/428L (Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216, Hinton et al. 2006 Journal of Immunology 176:346­ 356), 256A, 272A, 286A, 305A, 307A, 311A, 312A, 376A, 378Q, 380A, 382A, 434A (Shields et al., Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591-6604), 252F, 252T, 252Y, 252W, 254T, 256S, 256R, 256Q, 256E, 256D, 256T, 309P, 311S, 433R, 433S, 433I, 433P, 433Q, 434H, 434F, 434Y, 252Y/254T/256E, 433K/434F/436H, 308T/309P/311S (Dall Acqua et al. Journal of Immunology, 2002, 169:5171-5180, Dall'Acqua et al., 2006, The Journal of biological chemistry 281:23514--23524).

Las modificaciones covalentes de anticuerpos se incluyen dentro del alcance de las inmunoglobulinas descritas en la presente, y generalmente, aunque no siempre, se realizan postraduccionalmente. Por ejemplo, varios tipos de modificaciones covalentes del anticuerpo se introducen en la molecula al hacer reaccionar residuos de aminoacidos espedficos del anticuerpo con un agente derivatizante organico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas en los residuos de extremo N o C.

En algunos casos, la modificacion covalente de los anticuerpos descritos en la presente comprende la adicion de una o mas etiquetas. El termino «grupo de etiquetado» significa cualquier etiqueta detectable. En algunos casos, el grupo marcador se acopla al anticuerpo a traves de brazos espaciadores de varias longitudes para reducir el potencial impedimento esterico. En la tecnica se conocen varios metodos para etiquetar protemas y se pueden usar para generar inmunoglobulinas presentadas en la presente.

Conjugados

De manera adecuada, las moleculas de coadhesion descritas en la presente son «protemas de fusion» al anticuerpo, denominadas a veces en la presente «conjugados de anticuerpos». El companero de fusion o companero de conjugado puede ser proteinaceo o no proteinaceo; el ultimo se genera generalmente usando grupos funcionales en el anticuerpo y en el companero de conjugado. Los companeros de conjugado y fusion pueden ser cualquier molecula, inclusive compuestos y polipeptidos qmmicos de molecula pequena. Por ejemplo, una variedad de conjugados de anticuerpo y metodos se describen en Trail et al., 1999, Curr. Opin. Immunol. 11:584-588. Los posibles companeros de conjugacion incluyen, pero no se limitan a, citocinas, agentes citotoxicos, toxinas, radioisotopos, agente quimioterapeutico, agentes anti-angiogenicos, inhibidores de tirosina cinasa y otros agentes terapeuticamente activos. En algunos casos, los companeros de conjugacion se pueden considerar cargas utiles, es decir que el objetivo de un conjugado es la administracion dirigida del companero de conjugacion a una celula dirigida, por ejemplo, una celula cancengena o celula inmune, por la inmunoglobulina. Por lo tanto, por ejemplo, la conjugacion de una toxina a una inmunoglobulina se dirige a la administracion de dicha toxina a celulas que expresan el antfgeno diana. Como lo comprendera un experto en la tecnica, en realidad los conceptos y las definiciones de fusion y conjugados se superponen. La designacion de una funcion o conjugado no pretende restringirlo a ningun caso particular descrito en la presente. Por el contrario, estos terminos se usan en sentido general para transmitir el concepto amplio de que cualquier inmunoglobulina descrita en la presente puede enlazarse genetica, qmmicamente o de otro modo, a uno o mas polipeptidos o moleculas para proporcionar alguna propiedad deseada.

Los conjugados adecuados incluyen, pero no se limitan a, etiquetas como se describe a continuacion, farmacos y agentes citotoxicos que incluyen, pero no se limitan a, farmacos citotoxicos (p. ej., agentes quimioterapeuticos) o toxinas o fragmentos activos de estas toxinas. Las toxinas adecuadas y sus fragmentos correspondientes incluyen cadena difteria A, cadena exotoxina A, cadena ricina A, cadena abrina A, curcina, crotina, fenomicina, enomicina y similares. Agentes citotoxicos tambien incluyen radioqmmicos hechos por conjugacion de radioisotopos a anticuerpos o union de un radionuclido a un agente quelante que se une covalentemente al anticuerpo. Los casos adicionales utilizan caliqueamicina, auristatinas, geldanamicina, maitansina y duocarmicinas y analogos.

De manera adecuada, las moleculas de coadhesion descritas en la presente se fusionan o conjugan a una citocina. «Citocina», como se usa en la presente, es un termino generico para protemas liberadas por una poblacion celular que actua en otra celula como mediadores intercelulares. Por ejemplo, como se describe en Penichet et al., 2001, J. Immunol. Methods 248:91-101, las citocinas se pueden fusionar a un anticuerpo para proporcionar un conjunto de propiedades deseables. Los ejemplos de estas citocinas incluyen linfocinas, monocinas y hormonas polipeptfdicas tradicionales. Incluidas entre las citocinas se encuentran las hormonas de crecimiento tales como la hormona de crecimiento humana, la hormona de crecimiento humana de N-metionilo y la hormona de crecimiento bovino; la hormona paratiroides; la tiroxina; la insulina; la proinsulina; la relaxina; la prorelaxina; las hormonas de glicoprotema tales como la hormona folmuloestimulante (FSH, por sus siglas en ingles), la hormona estimulante de la tiroides (TSH, por sus siglas en ingles) y la hormona luteinizante (LH, por sus siglas en ingles); el factor de crecimiento hepatico; el factor de crecimiento de fibroblastos; la prolactina; el lactogeno placentario; la necrosis tumoral factor-alfa y beta; la sustancia inhibidora mulleriana; el peptido asociado a gonadotropina de raton; la inhibina; la activina; el factor de crecimiento endotelial vascular; la integrina; la trombopoyetina (TPO); los factores de crecimiento nervioso tales como NGF-beta; el factor de crecimiento de plaquetas; los factores de crecimiento transformadores (TGF) tales como TGF-alfa y TGF-beta; el factor de crecimiento insulinmico tipo -I y -II; la eritropoyetina (EPO); los factores osteoinductivos; los interferones tales como interferon -alfa, beta y gamma; los factores estimulantes de colonias (CSF) tales como macrofagos-CSF (M-CSF); granulocito-macrofago-CSF (GM-CSF); y granulocito-CSF (G-CSF); interleucinas (IL) tales como IL-1, IL-1alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15, un factor de necrosis tumoral tal como TNF-alfa o TNF-beta; C5a; y otros factores polipeptidos que incluyen LIF y ligando kit (KL). Tal como se usa en la presente, el termino citocina incluye protemas de ongenes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biologicamente activos de las citocinas de secuencia natural.

De manera adecuada, las moleculas de coadhesion descritas en la presente pueden conjugarse a un «receptor» (como estreptavidina) para el uso en la preseleccion del objetivo en tumoral donde el conjugado receptor-inmunoglobulina se administra al paciente, seguido por la eliminacion de un conjugado no unido de la circulacion utilizando un agente aclarador y luego la administracion de un “ ligando” (por ejemplo, avidina) que se conjuga a un agente citotoxico (por ejemplo, un radionucleotido). En un caso alternativo, la inmunoglobulina se conjuga o enlaza operativamente a una enzima para utilizar una terapia de profarmaco mediada por enzima dependiente de anticuerpo (ADEPT, por su sigla en ingles). ADEPT se puede usar conjugando o enlazando operativamente la inmunoglobulina a una enzima de activacion de profarmaco que convierte un profarmaco (p. ej., un agente quimioterapeutico peptidilo).

Cuando los companeros de inmunoglobulina se usan como conjugados, los companeros de conjugacion se pueden enlazar a cualquier region de una inmunoglobulina descrita en la presente que incluye, pero no se limita al extremo N o C o en algun residuo entre los extremos. Una variedad de enlazadores puede ser utiles en inmunoglobulinas descritas en la presente para enlazar covalentemente los companeros de conjugacion a una inmunoglobulina. «Enlazador», «secuencia enlazadora», «espaciador», «secuencia de anclaje» o equivalentes gramaticales de estos, en la presente se refieren a una molecula o grupo de moleculas (como un monomero o poffmero) que conecta dos moleculas y frecuentemente sirve para colocar las dos moleculas en una configuracion. Los enlazadores son conocidos en la tecnica; por ejemplo, los enlazadores homo o hetero-bifuncionales tambien son conocidos (vease, catalogo de 1994 de Pierce Chemical Company, seccion tecnica acerca de reticuladores, paginas 155-200). Se puede usar una cantidad de estrategias para unir moleculas covalentemente entre sf. Estas incluyen, pero no se limitan a, enlaces de polipeptidos entre los extremos N y C de protemas y dominios de protemas, enlace mediante enlace disulfuro y enlace mediante reactivos de reticulacion qmmica. En un caso, el enlazador es una union pepffdica, generada por tecnicas recombinantes o smtesis pepffdica. El peptido enlazador puede incluir predominantemente los siguientes residuos de aminoacidos: Gly, Ser, Ala, o Thr. El peptido enlazador debeffa tener una longitud que es adecuada para enlazar dos moleculas de modo tal que asuman la conformacion correcta una respecto de la otra de modo que retengan la actividad deseada. Las longitudes adecuadas a estos efectos incluyen residuos de al menos uno y no mas de 50 aminoacidos. De manera adecuada, el enlazador tiene de aproximadamente 1 a 30 aminoacidos de longitud, p. ej., un enlazador puede tener 1 a 20 aminoacidos de longitud. Los enlazadores utiles incluyen poffmeros de glicina-serina (inclusive, por ejemplo, (GS)n, (GSGGS)n (establecido como SEQ ID NO:1), (GGGGS)n (establecido como SEQ ID NO:2), y (GGGS)n (establecido como SEQ ID NO:3), en donde n es un entero de al menos uno), poffmeros glicina-alanina, poffmeros alanina-serina y otros enlazadores flexibles, como lo comprenderan los expertos en la tecnica. De manera alternativa, una variedad de poffmeros no protemaceos que incluyen, pero no se limitan a polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol, polioxialquilenos o copoffmeros de polietilenglicol y polipropilenglicol, pueden ser utiles como enlazadores.

Produccion de moleculas de coadhesion

Tambien se describen en la presente metodos para producir y evaluar experimentalmente las moleculas de coadhesion. Los metodos descritos no pretenden limitar los casos a ninguna aplicacion o teoffa de operacion particular. Por el contrario, los metodos proporcionados pretenden ilustrar generalmente que una o mas inmunoglobulinas se pueden producir y evaluar experimentalmente para obtener inmunoglobulinas. Los metodos generales para la biologfa molecular de anticuerpo, expresion, purificacion y tamizaje se describen en Antibody Engineering, editado por Duebel & Kontermann, Springer-Verlag, Heidelberg, 2001; y Hayhurst & Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5:683-689; Maynard & Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-76; Antibodies: A Laboratory Manual por Harlow & Lane, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988.

En un caso descrito en la presente, se crean acidos nucleicos que codifican las moleculas de coadhesion y que luego se pueden clonar en celulas hospedadoras, expresarse y ensayarse, si se desea. Por lo tanto, se pueden hacer acidos nucleicos, y particularmente ADN, que codifican cada secuencia de protema. Estas practicas se llevan a cabo usando procedimientos conocidos. Por ejemplo, una variedad de metodos que pueden ser utiles en la generacion de inmunoglobulinas descritas en la presente se describen en Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3a ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, 2001) y Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons). Como lo comprenderan los expertos en la tecnica, la generacion de secuencias exactas para una libreffa que comprende una gran cantidad de secuencias es potencialmente expansiva y consume mucho tiempo. «Biblioteca» en la presente se refiere a un conjunto de variantes en cualquier forma lo que incluye, pero sin limitarse a, una lista de secuencias de acido nucleico o aminoacido, una lista de sustituciones de acido nucleico o aminoacidos en posiciones variables, una biblioteca ffsica que comprende acidos nucleicos que codifican las secuencias de biblioteca o una biblioteca ffsica que comprende las protemas variantes, en forma purificada o no purificada. Por consiguiente, hay una variedad de tecnicas que se pueden usar para generar bibliotecas descritas en la presente de manera eficaz. Estos metodos incluyen, pero no se limitan a, metodos de ensamblaje genetico, metodo basado en PCR y metodos que usan variaciones de PCR, metodos a base de reaccion en cadena de ligasa, metodos oligo agrupados como los usados en transposicion sintetica, metodos de amplificacion propensos al error y metodos que usan oligos con mutaciones aleatorias, metodos clasicos de mutagenesis dirigida al sitio, mutagenesis de casete y otros metodos de amplificacion y smtesis genetica. Como se conoce en la tecnica, hay una variedad de kits comercialmente disponibles y metodos para ensamblaje genetico, mutagenesis, subclonacion de vectores y similares, y tales productos comerciales encuentran uso para generar acidos nucleicos que codifican inmunoglobulinas.

Las moleculas de coadhesion descritas en la presente se pueden producir cultivando una celula hospedadora transformada con acido nucleico, p. ej., un vector de expresion, que contiene acido nucleico que codifica las moleculas de coadhesion, en las condiciones apropiadas para inducir o provocar la expresion de la protema. Las condiciones apropiadas para la expresion variaran con la eleccion del vector de expresion y la celula hospedadora y se determinaran facilmente por un experto en la tecnica mediante experimentacion de rutina. Se pueda usar una amplia variedad de celulas hospedadoras apropiadas que incluye, pero no se limita a, celulas de mairnferos, bacterias, celulas de insectos y levadura. Por ejemplo, una variedad de lmeas celulares que pueden ser utiles en la generacion de inmunoglobulinas descritas en la presente se describen en el catalogo de lmeas celulares ATCC® disponibles de la Coleccion americana de cultivo tipo.

En una realizacion, las moleculas de coadhesion se expresan en sistemas de expresion de marnfferos que incluyen sistemas en los que las construcciones de expresion se introducen en las celulas de mamnfero usando virus tales como el retrovirus o el adenovirus. Se puede cualquier celula de mamnfero, p. ej., celulas de humano, raton, rata, hamster y primate. Las celulas adecuadas tambien incluyen celulas de investigacion que incluyen, pero no se limitan a, celulas T Jurkat, NIH3T3, CHO, BHK, COS, HEK293, PER C.6, HeLa, Sp2/0, celulas NSO y variantes de estas. En una realizacion alternativa, las protemas de biblioteca se expresan en celulas bacterianas. Los sistemas de expresion bacteriana son muy conocidos en la tecnica e incluyen Escherichia coli (E. colij, Bacillus subtilis, Streptococcus cremoris y Streptococcus lividans. En las realizaciones alternativas, las inmunoglobulinas se producen en celulas de insectos (p. ej. Sf21/Sf9, Trichoplusia ni Bti-Tn5b1-4) o celulas de levadura (p. ej. S. cerevisiae, Pichia, etc). En una realizacion alternativa, las moleculas de coadhesion se expresan in vitro usando sistemas de traduccion libres de celulas. Los sistemas de traduccion In vitro derivados de celulas procariotas (p. ej. E. coli) y eucariotas (p. ej. germen de trigo, reticulocitos de conejo) estan disponibles y se pueden elegir en funcion de los niveles de expresion y las propiedades funcionales de la protema de interes. Por ejemplo, tal como observaran los expertos en la tecnica, se requiere la traduccion in vitro para algunas tecnologfas de expresion, por ejemplo, la expresion en ribosomas. Ademas, las inmunoglobulinas se pueden producir por metodos de smtesis qmmica. Ademas, los sistemas de expresion transgenicos animales (p. ej., leche de vaca, oveja o cabra, huevo de gallina embrionado, larvas de insectos enteras, etc.) y vegetales (p. ej., mafz, tabaco, lenteja de agua, etc.).

Los acidos nucleicos que codifican las moleculas de coadhesion descritas en la presente se pueden incorporar en un vector de expresion para expresar la protema. Se puede utilizar una variedad de vectores de expresion para la expresion de protemas. Los vectores de expresion pueden comprender vectores extracromosomicos de autoreplicacion o vectores que se integran en un genoma hospedador. Los vectores de expresion se construyen para ser compatible con el tipo de celula hospedadora. Por lo tanto, los vectores de expresion son utiles en la generacion de inmunoglobulinas descritas en la presente incluyen, pero no se limitan a, los que permiten la expresion de protemas en celulas de marnfferos, bacterias, celulas de insectos, levadura y sistemas in vitro. Como se conoce en la tecnica, hay una variedad de vectores de expresion disponibles, comercialmente o de otro modo, que son utiles para expresar las moleculas de coadhesion descritas en la presente.

Los vectores de expresion tfpicamente comprenden una protema unida operativamente con secuencias de control o reguladoras, marcadores seleccionables, cualquier companero de fusion y/o elemento adicional. «Unido operativamente» en la presente significa que el acido nucleico se coloca en una relacion funcional con otra secuencia de acidos nucleicos. Generalmente, estos vectores de expresion incluyen acido nucleico reguladoras de la transcripcion y la traduccion unido operativamente al acido nucleico que codifica la molecula de coadhesion y son tfpicamente apropiados para la celula hospedadora usada para expresar la protema. En general, las secuencias reguladoras de la transcripcion y la traduccion pueden incluir secuencias promotoras, sitios de union ribosomicos, secuencias de inicio y detencion de la transcripcion, secuencias de inicio y detencion de la traduccion y secuencias potenciadoras o de activacion. Como tambien se sabe en la tecnica, los vectores de expresion tfpicamente contienen un marcador o gen de seleccion para permitir la seleccion de celulas hospedadoras transformadas que contienen el vector de expresion. Los genes de seleccion son ampliamente conocidos en la tecnica y variaran dependiendo de la celula hospedadora que se utilice.

Las moleculas de coadhesion se pueden enlazar operativamente a un companero de fusion para permitir el direccionamiento de la protema expresada, purificacion, tamizaje, visualizacion y similares. Los companeros de fusion se pueden enlazar a la secuencia de inmunoglobulina mediante secuencias enlazadoras. La secuencia enlazadora generalmente comprendera una pequena cantidad de aminoacidos, tfpicamente menos que diez, pese a que tambien se pueden usar enlazadores mas largos. Tfpicamente, las secuencias enlazadoras se seleccionar para ser flexibles y resistentes a la degradacion. Como lo comprendera un experto en la tecnica, cualquiera de una variedad e secuencias se puede usar como enlazadores. Por ejemplo, una secuencia enlazadora comun comprende la secuencia de aminoacidos GGGGS. Un companero de fusion puede ser una secuencia de direccionamiento o senal que dirige la inmunoglobulina y cualquier companero de fusion asociado a una ubicacion celular deseada o al medio extracelular. Como se conoce en la tecnica, determinadas secuencias de senalizacion pueden dirigirse a una protema para secretarse en el medio de crecimiento o en el espacio periplasmatico, ubicado entre la membrana interna y externa de la celula. Un companero de fusion tambien puede ser una secuencia que codifica un peptido o protema que permite la purificacion y/o tamizaje. Estos companeros de fusion incluyen, pero no se limitan a, etiquetas de polihistidina (etiquetas His) (por ejemplo H6 y H¹⁰ u otras etiquetas para usarse con sistemas de cromatograffa de afinidad por iones de metal inmovilizados (IMAc , por sus siglas en ingles) (p. ej. columnas de afinidad Ni+2)), fusiones GST, fusiones MBP, etiqueta Strep, la secuencia diana de biotinilacion BSP de la enzima bacteriana BirA y etiquetas de epftopo que son dirigidas por anticuerpos (por ejemplo, etiquetas c-myc, etiquetas flag y similares). Como se comprendera un experto en la tecnica, estas etiquetas pueden ser utiles para la purificacion, para el tamizaje o ambos. Por ejemplo, una inmunoglobulina se puede purificar usando una etiqueta His inmovilizandola a una columna de afinidad Ni2 y despues de la purificacion, la misma etiqueta His se puede usar para inmovilizar el anticuerpo a una placa recubierta con Ni2 para realizar un ensayo ELISA u otro ensayo de union (como se describe a continuacion). Un companero de fusion puede permitir el uso de un metodo de seleccion para tamizar inmunoglobulinas (vease a continuacion). Los companeros de fusion que permiten una variedad de metodos de seleccion se conocen en la tecnica. Por ejemplo, al fusionar los miembros de una biblioteca de inmunoglobulina a la protema genetica III, se puede emplear expresion en fagos (Kay et al., Phage display of peptides and proteins: a laboratory manual, Academic Press, San Diego, CA, 1996; Lowman et al., 1991, Biochemistry 30:10832-10838; Smith, 1985, Science 228:1315-1317). Los companeros de fusion pueden permitir etiquetar inmunoglobulinas. De manera alternativa, un companero de fusion puede unirse a una secuencia espedfica en el vector de expresion, permitiendo que el companero de fusion y la inmunoglobulina asociada se una covalentemente o no covalentemente al acido nucleico que los codifica. Los metodos para introducir acido nucleico exogeno en las celulas hospedadoras se conocen en la tecnica y variaran con la celula hospedadora usada. Las tecnicas incluyen, pero no se limitan a, transfeccion mediada por dextrano, precipitacion de fosfato en calcio, tratamiento de cloruro de calcio, transfeccion mediada por polibreno, fusion de protoplastos, electroporacion, infeccion viral o en fagos, encapsulacion de uno o mas polinucleoticos en liposomas y microinyeccion directa del ADN en nucleos. En el caso de celulas de mairftferos, la transfeccion puede ser transitoria o estable.

En un caso, las moleculas de coadhesion se purifican o afslan despues de la expresion. Las protemas pueden aislarse o purificarse de muchas maneras que los expertos en la tecnica conocen. Los metodos de purificacion estandares incluyen tecnicas de cromatograffa que incluyen intercambio ionico, interaccion hidrofobica, afinidad, calibrado o filtracion en gel, y la fase inversa, llevada a cabo a presion atmosferica o alta presion mediante sistemas tales como FPLC y HPLC. Los metodos de purificacion incluyen tambien las tecnicas electroforeticas, inmunologicas, precipitacion, dialisis y cromatoenfoque. Las tecnicas de ultrafiltracion y diafiltracion, junto con la concentracion de protemas, tambien son utiles. Como se conoce en la tecnica, una variedad de protemas naturales se une a Fc y a anticuerpos, y estas protemas pueden ser utiles para la purificacion de inmunoglobulina descritas en la presente. Por ejemplo, las protemas bacterianas A y G se unen a la region Fc. Asimismo, la protema bacteriana L se une a la region Fab de algunos anticuerpo, como lo hace el anffgeno diana de anticuerpo. La purificacion puede habilitarse a menudo mediante un companero de fusion particular. Por ejemplo, las inmunoglobulinas pueden purificarse usando resina de glutation si se utiliza una fusion GST, cromatograffa de afinidad Ni2 si se utiliza una etiqueta His o un anticuerpo anti­ flag inmovilizado si se utiliza una etiqueta flag. Para tener una grna general en cuanto a las tecnicas adecuadas de purificacion, vease, por ejemplo, lo siguiente, que se incorpora completamente mediante referencia: Protein Purification: Principles and Practice, 3.a ed., Scopes, Springer-Verlag, NY, 1994. El grado de purificacion necesario variara segun el analisis o uso de las inmunoglobulinas. En algunos casos no es necesaria ninguna purificacion. Por ejemplo, en un caso, si las inmunoglobulinas se secretan, el tamizaje se puede llevar a cabo directamente desde el medio. Como se conoce en la tecnica, algunos metodos de seleccion no implican la purificacion de protemas. Por lo tanto, por ejemplo, si una biblioteca de inmunoglobulinas se hace en una biblioteca de expresion en fagos, la purificacion de protemas puede no hacerse.

Experimentacion in vitro

Las moleculas de coadhesion se pueden tamizar usando una variedad de metodos, que incluyen, pero no se limitan a los que usan ensayos in vitro, in vivo y ensayos basados en celulas y tecnologfas de seleccion. Las tecnologfas de tamizaje de alto rendimiento y automatizacion se pueden utilizar en los procedimientos de tamizaje. El tamizaje puede emplear el uso de un companero de fusion o etiqueta. El uso de companeros de fusion se discutio anteriormente. «Etiquetado» en la presente se refiere a que las inmunoglobulinas descritas en la presente tienen uno o mas elementos, isotopos o compuestos qmmicos unidos para permitir la deteccion en un tamizaje. En general, las etiquetas pueden estar en una de tres clases: a) etiquetas inmunes, que pueden ser un epftopo incorporado como companero de fusion que se reconoce por un anticuerpo, b) etiquetas isotopicas, que pueden ser isotopos radioactivos o pesados y c) etiquetas de moleculas pequenas, que pueden incluir tintes fluorescentes y colorimetricos o moleculas como biotina que permite otros metodos de etiquetado. Las etiquetas se pueden incorporar en el compuesto en cualquier posicion y se pueden incorporar in vitro o in vivo durante la expresion de protemas.

De manera adecuada, las propiedades funcionales y/o bioffsicas de moleculas de coadhesion se tamizan en un ensayo in vitro. Los ensayos in vitro pueden permitir un intervalo dinamico amplio de propiedades de tamizaje de interes. Las propiedades que se pueden tamizar incluyen, pero no se limitan a, estabilidad, solubilidad y afinidad por ligandos Fc, por ejemplo, FcyR. Se pueden tamizar multiples protemas simultaneamente o individualmente. Las protemas pueden estar purificadas o no purificadas, dependiendo de los requisitos del ensayo. De manera adecuada, el tamizaje es un ensayo de union cualitativo o cuantitativo para unir las moleculas de coadhesion a una molecula de protema o no protema que se sabe o se cree que une la molecula de coadhesion. De manera adecuada, el tamizaje es un ensayo de union para medir la union al anffgeno diana. De manera adecuada, el tamizaje es un ensayo para unir las moleculas de coadhesion a un ligando Fc que incluyen, pero no se limitan a la familia de FcyR, el receptor neonatal FcRn, la protema de complemento C1q y las protemas bacterianas A y G. Dichos ligandos pueden ser de cualquier organismo. De manera adecuada, los ligandos Fc son de seres humanos, ratones, ratas, conejos y/o monos. Se pueden realizar ensayos de union usando una variedad de metodos conocidos en la tecnica que incluyen, pero no se limitan a ensayos basados en FRET (transferencia de energfa de resonancia fluorescente) y BRET ( transferencia de energfa de resonancia bioluminiscente) , AlphaScreen™ (Ensayo Homogeneo de Proximidad Luminiscente Amplificado), ensayo de proximidad de centelleo, ELISA (ensayo inmunoabsorbente unido a enzimas), SPR (resonancia de plasmones superficiales, tambien denominado BIACORE®), calorimetna de titulacion isotermica, calorimetna de barrido diferencial, electroforesis en gel y cromatograffa inclusive filtracion de gel. Estos y otros metodos pueden tomar ventaja de algun companero de fusion o etiqueta de la inmunoglobulina. Los ensayos pueden utilizar una variedad de metodos de deteccion que incluyen, pero no se limitan a, etiquetas cromogenicas, fluorescentes, luminiscentes o isotopicas.

Las propiedades bioffsicas de moleculas de coadhesion, por ejemplo, estabilidad y solubilidad, se pueden evaluar usando una variedad de metodos conocidos en la tecnica. La estabilidad de protema se puede determinar midiendo el equilibrio termodinamico entre los estados plegado y no plegado. Por ejemplo, las moleculas de coadhesion descritas en la presente pueden desplegarse usando desnaturalizante qmmico, calor o pH, y esta transicion se puede monitorear usando metodos que incluyen, pero no se limitan a, espectroscopfa de dicrofsmo circular, espectroscopfa de fluorescencia, espectroscopfa de absorbancia, espectroscopfa de NMR, calorimetna y proteolisis. Como los comprenderan los expertos en la tecnica, los parametros cineticos de las transiciones de plegado y desplegado tambien se pueden monitorear usando estas y otras tecnicas. La solubilidad e integridad estructural global de la molecula de coadhesion se puede determinar cuantitativa o cualitativamente usando un amplio rango de metodos conocidos en la tecnica. Los metodos que pueden ser utiles para caracterizar las propiedades bioffsicas de las moleculas de coadhesion descritas en la presente incluyen electroforesis en gel, enfoque isoelectrico, electroforesis capilar, cromatograffa como cromatograffa de exclusion de tamano, cromatograffa de intercambio de iones y cromatograffa ffquida de alto rendimiento y fase inversa, mapeo pepffdico, mapeo de oligosacaridos, espectrometna de masas, espectroscopfa de absorbancia ultravioleta, espectroscopfa de fluorescencia, espectroscopfa de dicrofsmo circular, calorimetna de titulacion isotermica, calorimetna de barrido diferencial, ultracentrifugacion anafftica, barrido de luz dinamica, proteolisis y reticulacion, medicion de turbidez, ensayos de retardo de filtro, ensayos inmunologicos, ensayos de union a tinte fluorescente, ensayos de tincion de protema, microscopia y deteccion de agregados mediante ELISA u otro ensayo de union. El analisis estructural que emplea tecnicas cristalograficas de rayos X y espectroscopfa de NMR tambien puede ser util. En un caso, la estabilidad y/o solubilidad se puede medir determinando la cantidad de solucion de protema despues de algun penodo definido de tiempo. En este ensayo, la protema puede o no exponerse a alguna condicion extrema, por ejemplo, temperatura elevada, pH bajo o presencia de desnaturalizante. Debido a que la funcion ffpicamente requiere una protema estable, soluble y/o bien plegada/estructurada, los ensayos de union y funcionales que anteceden tambien proporcionan formas de realizar tal medicion. Por ejemplo, una solucion que comprende una inmunoglobulina se podna someter a ensayo para determinar su capacidad de unirse a un anffgeno diana, luego exponerse a temperatura elevada por uno o mas penodos de tiempo definidos, luego someterse a ensayo para determina la union al anffgeno nuevamente. Debido a que no se espera que la protema no plegada y agregada sea capaz de unirse a un anffgeno, la cantidad de actividad restante proporciona una medicion de la estabilidad y solubilidad de la molecula de coadhesion.

De manera adecuada, las moleculas de coadhesion se pueden evaluar usando uno o mas ensayos basados en celulas o in vitro. Para estos ensayos, las inmunoglobulinas, purificadas o no purificadas, se agregan ffpicamente de manera exogena de modo que las celulas se expongan a variantes individuales o grupos de variantes que pertenecen a una biblioteca. Estos ensayos se basan ffpicamente, pero no siempre, en la biologfa de la capacidad de la inmunoglobulina de unirse al anffgeno diana y mediar algun evento bioqmmico, por ejemplo, funciones efectoras como lisis celular, fagocitosis, inhibicion de union al ligando/receptor, inhibicion de crecimiento y/o proliferacion, apoptosis y similares. Estos ensayos frecuentemente implican el monitoreo de la respuesta de las celulas a inmunoglobulina, por ejemplo, supervivencia celular, muerte celular, fagocitosis celular, lisis celular, cambio en la morfologfa celular o activacion transcripcional como expresion celular de un gen natural o gen indicador. Por ejemplo, estos ensayos pueden medir la capacidad de moleculas de coadhesion de provocar ADCC, ADCP o CDC. Para algunos ensayos puede ser necesario agregar celulas o componentes adicionales, es decir ademas de las celulas diana, por ejemplo, complemento serico o celulas efectoras como monocitos de sangre periferica (PBMC), celulas NK, macrofagos y similares. Estas celulas adicionales pueden ser de cualquier organismo, p. ej., seres humanos, ratones, ratas, conejos y mono. Los anticuerpos reticulados o monomericos pueden provocar apoptosis de determinadas lmeas celulares que expresan el anffgeno diana del anticuerpo o pueden mediar el ataque a las celulas diana por celulas inmunes que se agregaron al ensayo. Los metodos para monitorear la muerte o viabilidad celular se conocen en la tecnica e incluyen el uso de tintas, fluoroforos, reactivos inmunoqmmicos, citoqmmicos y radiactivos. Por ejemplo, ensayos de caspasa o conjugados de anexina y fluor pueden permitir medir la apoptosis y la absorcion o liberacion de sustancias radiactivas (p. ej., ensayos de liberacion de cromo-5l) o la reduccion metabolica de tintes fluorescentes como azul alamar puede permitir monitorear el crecimiento, proliferacion o activacion celular. En un caso, se usa el ensayo de citotoxicidad a base de EuTDA DELFIA® (Perkin Elmer, MA). De manera alternativa, las celulas diana muertas o danadas se pueden monitorear midiendo la liberacion de una o mas protemas intracelulares naturales, por ejemplo, lactato deshidrogenasa. La activacion transcripcional tambien puede servir como un metodo para ensayar la funcion en ensayos basados en celulas. En este caso, la respuesta se puede monitorear sometiendo a ensayo los genes naturales o protemas que se pueden regular por aumento o por disminucion, por ejemplo, se puede medir la liberacion de determinadas interleucinas o alternativamente la lectura puede ser mediante una construccion de indicador de luciferasa o GFP. Los ensayos basados en celulas tambien pueden implicar la medicion de cambios morfologicos de celulas en respuesta a la presencia de una inmunoglobulina. Los tipos de celulas para estos ensayos pueden ser procariotas o eucariotas y se puede emplear una variedad de lmeas celulares que se conocen en la tecnica. De manera alternativa, los tamizajes basados en celulas se realizan usando celulas que se transformaron o transfectaron con acidos nucleicos que codifican las moleculas de coadhesion.

Los ensayos in vitro incluyen, pero no se limitan a, ensayos de union, ADCC, CDC, citotoxicidad, proliferacion, liberacion e peroxido/ozono, quimiotaxis de celulas efectoras, inhibicion de tales ensayos por anticuerpos con menor funcion efectora; rangos de actividades como >100x de mejora o >100x de reduccion, mezclas de activacion de receptor y los resultados del ensayo que se esperan de tales perfiles de receptor.

Experimentacion in vivo

Las propiedades biologicas de las moleculas de coadhesion descritas en la presente pueden caracterizarse en experimentos de celulas, tejido y organismos enteros. Como es sabido en la tecnica, los farmacos se evaluan frecuentemente en animales lo que incluye, pero sin limitarse a ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y monos, para medir la eficacia de un farmaco para el tratamiento contra una enfermedad o modelo de enfermedad, o para medir la farmacocinetica, toxicidad u otras propiedades de un farmaco. Se puede hacer referencia a estos animales como modelos de enfermedad. Respecto de las moleculas de coadhesion descritas en la presente, un desaffo particular surge al usar modelos animales para evaluar el potencial de la eficacia en seres humanos de los polipeptidos candidatos; esto se debe, al menos en parte, al hecho de que las moleculas de coadhesion que tienen un efecto espedfico en la afinidad de un receptor Fc humano pueden no tener un efecto de afinidad similar con el receptor de animal ortologo. Estos problemas se pueden exacerbar mas por las inevitables ambiguedades asociadas con la asignacion correcta de ortologos verdaderos (Mechetina et al., Immunogenetics, 200254:463-468) y el hecho de que algunos ortologos simplemente no existen en el animal (p. ej., los seres humanos poseen un FcYRlla mientras que los ratones no). Los productos terapeuticos se evaluan frecuentemente en ratones que incluyen, pero sin limitarse a cepas de ratones NZB, NOD, BXSB, MRL/lpr, K/BxN y transgenicos (lo que incluye inactivaciones y activaciones). Estos ratones pueden desarrollar varias condiciones autoinmunes que se asemejan al organo humano, patologfas espedficas de enfermedad inflamatoria o autoinmune sistemica como lupus eritematoso sistemico (LES) y artritis reumatoide (AR). Por ejemplo, una inmunoglobulina descrita en la presente deseada para enfermedades autoinmunitarias puede evaluarse en tales modelos de raton al tratar los ratones para determinar la capacidad de la inmunoglobulina de reducir o inhibir el desarrollo de la patologfa de la enfermedad. Debido a la incompatibilidad entre el sistema de receptor Fcy de raton y humano, un enfoque alternativo es usar un modelo SCID murino en el que los ratones deficientes inmunes se injertan con PBL o PBMC humanas (huPBL- SCID, huPBMC-SCID) proporcionando un sistema inmune humano semifuncional con las celulas efectoras humanas y receptores Fc. En tal modelo, un desaffo de anffgeno (como toxoide tetanico) activa las celulas B para diferenciarlas en celulas plasmaticas y secretar inmunoglobulinas, reconstituyendo asf la inmunidad humoral espedfica de anffgeno. Por lo tanto, una inmunoglobulina de direccionamiento doble descrita en la presente que se une espedficamente a IgE y FcYRllb en celulas B se puede evaluar para examinar la capacidad de inhibir espedficamente la diferenciacion de celulas B. Esta experimentacion puede proporcionar datos significativos para la determinacion del potencial de dicha inmunoglobulina para usarse como producto terapeutico. Otros organismos, p. ej., mairffferos tambien se pueden usar para la evaluacion. Por ejemplo, debido a su similitud genetica a seres humanos, los monos pueden ser modelos terapeuticos adecuados y por lo tanto se pueden usar para evaluar la eficacia, toxicidad, farmacocinetica u otra propiedad de las inmunoglobulinas descritas en la presente. Las pruebas de las inmunoglobulinas descritas en la presente en seres humanos son necesarias en ultima instancia para su aprobacion como farmacos y por lo tanto por supuesto que estos experimentos se contemplan. Por lo tanto, las inmunoglobulinas descritas en la presente se pueden evaluar en seres humanos para determinar su eficacia terapeutica, toxicidad, farmacocinetica y/u otras propiedades clmicas.

Las moleculas de coadhesion descritas en la presente pueden conferir un rendimiento superior a los productos terapeuticos que contienen Fc en modelos animales o en seres humanos. Los perfiles de union al receptor de tales inmunoglobulinas, como se describe en la presente memoria descriptiva pueden, por ejemplo, seleccionarse para aumentar la potencia de farmacos citotoxicos o para dirigirse a funciones efectoras espedficas o celulas efectoras para mejorar la selectividad de la accion del farmaco. Ademas, se pueden seleccionar los perfiles de union al receptor que pueden reducir alguna o todas las funciones efectoras reduciendo asf los efectos laterales o la toxicidad de tal farmaco que contiene Fc. Por ejemplo, una inmunoglobulina con menor union a FcYRIIIa, FcyRI y FcYRIla se puede seleccionar para eliminar la mayoffa de la funcion efectora mediada por celulas o una inmunoglobulina con menor union a C1q se puede seleccionar para limitar las funciones efectoras mediadas por el complemento. En algunos contextos, estas funciones efectoras se conocen por tener potenciales efectos toxicos. Por lo tanto, eliminarlos puede aumentar la seguridad del farmaco con Fc y tal mejor seguridad se puede caracterizar en modelos animales. En algunos contextos, estas funciones efectoras se conocen por mediar la actividad terapeutica deseada. Por lo tanto, mejorarla puede aumentar la actividad o potencia del farmaco con Fc y tal mejor actividad o potencia se puede caracterizar en modelos animales.

De manera adecuada, las moleculas de coadhesion descritas en la presente se pueden evaluar para determinar la eficacia en modelos animales pertinentes clmicamente de diversas enfermedades humanas. En muchos casos, los modelos pertinentes incluyen varios anima transgenicos por antigenos o receptores espedficos.

Los modelos transgenicos relevantes como los que expresan receptores Fc humanos (p. ej., CD32b) se podnan usar para evaluar y probar la eficacia de las inmunoglobulinas y fusiones Fc. La evaluacion de las moleculas de coadhesion por la introduccion de genes humanos que median directa o indirectamente la funcion efectora en ratones u otros roedores puede permitir estudios fisiologicos de eficacia en trastornos autoinmunitarios y RA. Los receptores Fc humanos como FcYRIIb puede poseer polimorfismos como el del gen promotor (-343 de G a C) o dominio transmembrana del receptor 187 I o T que ademas permitina la introduccion de polimorfismos humanos espedficos y combinaciones de estos en roedores. Los diversos estudios que implican FcR espedficos de polimorfismos no se limitan a esta seccion, sin embargo, abarcan todas las discusiones y aplicaciones de FcR en general como se especifica en la presente solicitud. Las inmunoglobulinas descritas en la presente pueden conferir una actividad superior a los farmacos que contienen Fc en tales modelos transgenicos, en particular las variantes con perfiles de union optimizados para la actividad mediada por FcYRIIb humano pueden mostrar actividad superior en ratones CD32b transgenicos. Mejoras similares en la eficacia en ratones transgenicos para los otros receptores Fc humanos, p. ej., FcYRIla, FcyRI, etc., se puede observar para las moleculas de coadhesion con perfiles de union optimizados para los receptores respectivos. Los ratones transgenicos para multiples receptores humanos mostranan una mejor actividad para inmunoglobulina con perfiles de union optimizados para los receptores multiples correspondientes.

Debido a las dificultades y ambiguedades asociadas con el uso de modelos animales para caracterizar la potencial eficacia de anticuerpos terapeuticos candidatos en un paciente humano, algunos polipeptidos variantes descritos en la presente pueden ser utiles como agentes para evaluar el potencial de la eficacia en seres humanos. Estas moleculas intermediarias pueden imitar, en el sistema animal, la biologfa de FcR y/o complemento de una inmunoglobulina humana candidata correspondiente. Esta imitacion mas probablemente se manifieste por afinidades de asociacion relativas entre inmunoglobulinas espedficas y receptores animales en contraste con humanos. Por ejemplo, si se usara un modelo de raton para evaluar la potencial eficacia en seres humanos de una variante Fc que tiene menor afinidad por el FcYRllb humano inhibidor, una variante intermediaria apropiada tendna menor afinidad por FcyRII de raton. Tambien se debe destacar que las variantes Fc intermediarias se podnan crear en el contexto de una variante Fc humana, una variante Fc animal o ambas.

En una realizacion, la evaluacion de las moleculas de coadhesion puede incluir el estudio de la eficacia en primates (p. ej., modelo de mono cinomolgo) para facilitar la evaluacion del agotamiento de celulas diana espedficas que alojan el antfgeno diana. Los modelos de primate adicionales incluyen, pero no se limitan al uso del mono rhesus para evaluar los polipeptidos Fc en estudios terapeuticos de enfermedades autoinmunitarias, trasplantes y cancer.

Los estudios de toxicidad realizan para determinar los efectos relacionados con el anticuerpo o fusion Fc que no se pueden evaluar en perfiles de farmacologfa estandar o que ocurren solo despues de la administracion repetida del agente. La mayona de las pruebas de toxicidad se realizan en dos especies, un roedor y un no roedor, para asegurarse de no pasarse por alto ningun efecto adverso inesperado antes de que las nuevas entidades terapeuticas se introduzcan al hombre. En general, estos modelos pueden medir una variedad de toxicidades que incluyen genotoxicidad, toxicidad cronica, inmunogenicidad, toxicidad reproductiva/de desarrollo y carcinogenicidad. Dentro de los parametros que anteceden se incluyen la medicion estandar del consumo de alimentos, peso corporal, formacion de anticuerpos, qrnmica clmica y examinacion macro y microscopica de organos/tejidos estandar (p. ej., cardiotoxicidad). Parametros adicionales de medicion son traumatismo en el sitio de inyeccion y la medicion de anticuerpos neutralizantes, si existen. Tradicionalmente, los productos terapeuticos de anticuerpo monoclonal, desnudo o conjugado, se evaluan para la reactividad cruzada con tejidos normales, produccion de inmunogenicidad/anticuerpo, toxicidad de conjugado o enlazador y toxicidad «de espectador» de especies radiomarcadas. Sin embargo, estos estudios pueden tener que individualizarse para abordar preocupaciones espedficas y siguiendo las directrices establecidas por ICH S6 (estudios de seguridad de productos biotecnologicos, tambien descrito anteriormente) Como tal, los principios generales son que los productos estan lo suficientemente bien caracterizados, se retiraron las impurezas/contaminantes, que el material de prueba se puede comparar a traves del desarrollo, que el cumplimiento con GLP se mantiene.

La farmacocinetica (PK, por sus siglas en ingles) de las moleculas de coadhesion descritas en la presente se puede estudiar en una variedad de sistemas animales, donde los mas relevantes son los primates no humanos como los monos cinomolgo y rhesus. Las administraciones i.v./s.c. unicas o repetidas a lo largo de un rango de dosis de 6000 veces (0,05-300 mg/kg) puede evaluarse para la semivida (dfas a semanas) usando la concentracion plasmatica y depuracion. El volumen de distribucion en estado estacionario y el nivel de absorbancia sistemica tambien se pueden medir. Ejemplos de estos parametros de medicion incluyen generalmente la concentracion en plasma maxima observada (Cmax), el tiempo para alcanzar la Cmax (Tmax), el area bajo la curva de concentracion y tiempo en plasma desde tiempo 0 a la infinidad [AUC(0-inf] y la semivida de eliminacion aparente (T1/2). Otros parametros medidos podnan incluir analisis compartimental de datos de concentracion y tiempo obtenidos despues de la administracion i.v. y la biodisponibilidad.

Las moleculas de coadhesion descritas en la presente pueden conferir farmacocinetica superior a los productos terapeuticos que contienen Fc en sistemas animales o en seres humanos. Por ejemplo, una mayor union a FcRn puede aumentar la semivida y exposicion del farmaco que contiene Fc. De manera alternativa, una menor union a FcRn puede reducir la semivida y exposicion del farmaco que contiene Fc en casos en que la exposicion reducida es favorable tal como los casos en que tal farmaco tiene efectos secundarios.

Se sabe en la tecnica que el conjunto de receptores Fc se expresa de diferentes maneras en varios tipos celulares inmunes, asf como en diferentes tejidos. La distribucion de tejido diferencial de los receptores Fc puede tener en ultima instancia un impacto en las propiedades farmacodinamicas (PD) y farmacocineticas (PK) de las moleculas de coadhesion descritas en la presente. Debido a que las moleculas de coadhesion de la presentacion tienen afinidades variables para el conjunto de receptores Fc, un analisis adicional de los polipeptidos para propiedades PD y/o PK puede ser extremadamente util para definir el equilibrio optimo de PD, PK, y eficacia terapeutica conferida por cada polipeptido candidato.

Los estudios de farmacodinamica pueden incluir, pero no se limitan a, el direccionamiento de celulas espedficas o el bloqueo de mecanismos de senalizacion, medir la inhibicion de anticuerpos espedficos de antfgeno, etc. Las moleculas de coadhesion descritas en la presente pueden dirigirse a poblaciones de celulas efectoras particulares y asf dirigir los farmacos que contienen Fc a inducir determinadas actividades para mejorar la potencia o aumentar la penetracion en un compartimiento fisiologico particularmente favorable. Por ejemplo, la actividad neutrofila y localizacion puede dirigirse mediante una molecula de coadhesion que dirige FcYRIIIb. Dichos efectos farmacodinamicos se pueden demostrar en modelos de animales o en humanos.

Uso

Una vez hechas, las moleculas de coadhesion como se describe en la presente encuentran utilidad en una variedad de metodos. De manera adecuada, el metodo incluye poner en contacto una celula que coexpresa IgE y FcYRIIb con una molecula de coadhesion de modo que tanto IgE como FcyRllb esten unidos por la molecula de coadhesion y la celula se inhiba. «Inhibir» en este contexto se refiere a que la molecula de coadhesion evita o reduce la activacion y/o proliferacion de celulas B IgE+.

Las moleculas de coadhesion descritas en la presente pueden encontrar utilidad en un amplio rango de productos. De manera adecuada, una molecula de coadhesion descrita en la presente es un reactivo terapeutico, de diagnostico o de investigacion. La molecula de coadhesion puede encontrar utilidad en una composicion que es monoclonal o policlonal. Las moleculas de coadhesion descritas en la presente pueden usarse con fines terapeuticos. Como lo comprenderan los expertos en la tecnica, las moleculas de coadhesion descritas en la presente pueden usarse con cualquier fin terapeutico para el que los anticuerpos y similares se pueden usar. Las moleculas de coadhesion se pueden administrar a un paciente para tratar trastornos que incluyen, pero sin limitarse a, enfermedades autoinmunes e inflamatorias, enfermedades infecciosas y cancer.

Un «paciente» a los efectos descritos en la presente incluye seres humanos y otros animales, p. ej., otros mairnferos. Por lo tanto, las moleculas de coadhesion descritas en la presente tienen aplicaciones tanto en terapia de seres humanos como veterinaria. El termino «tratamiento» o «tratar» como se describe en la presente pretende incluir tratamiento terapeutico, asf como profilactico, o medidas supresoras para una enfermedad o trastorno. Por lo tanto, por ejemplo, la administracion exitosa de una molecula de coadhesion antes del inicio de la enfermedad resulta en el tratamiento de la enfermedad. A modo de otro ejemplo, la administracion exitosa de una molecula de coadhesion optimizada despues de la manifestacion clmica de la enfermedad para combatir los smtomas de la enfermedad comprende el tratamiento de la enfermedad. «Tratamiento» y «tratar» tambien abarcan la administracion de una inmunoglobulina optimizada despues de la aparicion de la enfermedad para erradicar la enfermedad. La administracion exitosa de un agente despues del inicio y despues de que se desarrollaron los smtomas clmicos, con posible remision de los smtomas clmicos y tal vez mejora de la enfermedad, comprende el tratamiento de la enfermedad. Aquellos «que necesitan tratamiento» incluyen mamfferos que ya presentan la afeccion o el trastorno, asf como a aquellos propensos a presentar la enfermedad o afeccion, inclusive aquellos en los que se debe prevenir la enfermedad o afeccion.

De manera adecuada, una molecula de coadhesion descrita en la presente se administra a un paciente que tiene una enfermedad que implica la expresion inadecuada de una protema u otra molecula. Dentro del alcance descrito en la presente esto incluye enfermedades y trastornos caracterizados por protemas aberrantes debido, por ejemplo, a alteraciones en la cantidad de una protema presente, localizacion de protema, modificacion postraduccional, estado de conformacion, la presencia de una protema mutante o patogenica, etc. De manera similar, la enfermedad o trastorno se puede caracterizar por moleculas de alteracion que incluyen, pero sin limitarse a, polisacaridos y gangliosidos. Una sobreabundancia puede deberse a cualquier causa que incluye, pero sin limitarse a, sobreexpresion a nivel molecular, aparicion prolongada o acumulada en el sitio de accion o mayor actividad de una protema respecto de lo normal. En esta definicion se incluyen enfermedades y trastornos caracterizados por una reduccion de una protema. Esta reduccion puede deberse a cualquier causa que incluye, pero sin limitarse a, expresion reducida a nivel molecular, aparicion acortada o reducida en el sitio de accion, formas mutantes de una protema o menor actividad de una protema respecto de lo normal. Esta sobreabundancia o reduccion de una protema puede medirse respecto de la expresion, aparicion o actividad normal de una protema, y dicha medicion puede tener un papel importante en el desarrollo y/o la evaluacion clmica de las inmunoglobulinas descritas en la presente.

En la presente se describen metodos novedosos para tratar trastornos mediados por IgE, p. ej., alergias a los alimentos y ambientales y asma alergica. En una realizacion, la enfermedad alergica que se puede tratar por medio de la invencion es el asma alergica. La memoria descriptiva describe tambien que las enfermedades alergicas que se pueden tratar por medio de productos y metodos de la invencion incluyen asma alergico y atopico, dermatitis atopica y eczema, rinitis alergica, conjuntivitis alergica y rinoconjuntivitis, encefalomielitis alergica, rinitis alergica, vascutlitis alergica y choque anafilactico. Las alergias ambientales y a los alimentos que se pueden tratar incluyen alergias al acaro del polvo, cucaracha, gato y otros animales, polen (inclusive ambrosia, grammeas de Bermuda, cardo de Rusia, roble, centeno y otros), moho y hongos (p. ej., Alternaria altemata, Aspergillus y otros), latex, picaduras de insectos (abeja, avispa y otros), penicilina y otras drogas, frutillas y otras frutas y vegetales, mam, soja y otras legumbres, nuez y otras nueces de arboles, crustaceos y otros mariscos, leche y otros productos lacteos, trigo y otros granos y huevos. De hecho, cualquier alergeno de alimentos, aeroalergeno, alergeno ocupacional u otro alergeno ambiental mediado por IgE se puede tratar por medio de una cantidad terapeutica de los productos descritos en la presente memoria descriptiva. Por ejemplos de alergenos comunes, vease Arbes et al., Prevalences of positive skin test responses to 10 common allergens in the US population: Results from the Third National Health and Nutrition Examination Survey, Clinical Gastroenterology 116(2), 377-383 (2005).

Tambien se describen pruebas de diagnostico para identificar pacientes que probablemente muestren una respuesta clmica favorable a una molecula de coadhesion descrita en la presente o que probablemente presenten una respuesta considerablemente mejor cuando se tratan con una molecula de coadhesion descrita en la presente en contraste con uno o mas productos terapeuticos usados actualmente. Se puede usar cualquiera de una cantidad de metodos conocidos en la tecnica para determinar polimorfismos de FcyR en seres humanos. Ademas, tambien se describen pruebas de diagnostico realizadas en muestras clmicas como muestras de sangre y tejido. Estas pruebas pueden estudiar la actividad, independientemente del mecanismo. Esta informacion se puede usar para identificar pacientes para la inclusion o exclusion en pruebas clmicas o para informar decisiones respecto de las dosificaciones y regfmenes de tratamiento apropiados. Tal informacion tambien se puede usar para seleccionar un farmaco que contiene una molecula de coadhesion particular que muestra actividad superior en tal ensayo.

Formulacion

Se contemplan composiciones farmaceuticas en donde se formula una molecula de coadhesion descrita en la presente y uno o mas agentes terapeuticamente activos. Las formulaciones de las moleculas de coadhesion descritas en la presente se preparan para almacenarse mezclando dicha inmunoglobulina con el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizantes farmaceuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16aedicion, Osol, A. Ed., 1980), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizantes aceptables no son toxicos para los destinatarios en las dosificaciones y las concentraciones empleadas e incluyen soluciones amortiguadoras tales como fosfato, citrato, acetato y otros acidos organicos; antioxidantes que incluyen acido ascorbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; alcohol fenolico, butflico o bendlico; alquilparabenos, tales como metilo o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol y m-cresol); polipeptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); protemas, tales como albumina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polfmeros hidrofflicos tales como polivinilpirrolidona; aminoacidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacaridos, disacaridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azucares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; endulzantes y otros agentes saborizantes; rellenos como celulosa microcristalina, lactosa, mafz y otros almidones; agentes aglutinantes; aditivos; agentes colorantes; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metalicos (por ejemplo, complejos de protema Zn) y/o tensioactivos no ionicos tales como TWEEN™, PLURONlCS™ o polietilenglicol (PEG). En un caso, la composicion farmaceutica que comprende la inmunoglobulina descrita en la presente puede estar en forma soluble en agua, tal como presente como sales farmaceuticamente aceptables, que pretende incluir tanto sales de adicion de acido como de base. «Sal de adicion de acido farmaceuticamente aceptable» hace referencia a aquellas sales que mantienen la eficacia biologica de las bases libres y que no son biologicamente o de otro modo indeseables, formadas con acidos inorganicos como acido clortndrico, acido bromddrico, acido sulfurico, acido mtrico, acido fosforico y similares, y acidos organicos como acido acetico, acido propionico, acido glicolico, acido piruvico, acido oxalico, acido maleico, acido malonico, acido sucdnico, acido fumarico, acido tartarico, acido dtrico, acido benzoico, acido cinamico, acido mandelico, acido metanosulfonico, acido etanosulfonico, acido p-toluenosulfonico, acido salidclico y similares. Las «sales de adicion de base farmaceuticamente aceptables» incluyen aquellas derivadas de bases inorganicas como sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio, magnesio, hierro, zinc, cobre, manganeso, aluminio y similares. Algunos casos incluyen al menos una de sales de amonio, potasio, sodio, calcio y magnesio. Las sales que derivan de bases no toxicas organicas farmaceuticamente aceptables incluyen sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas que incluyen aminas sustituidas de origen natural, aminas dclicas y resinas basicas de intercambio de iones como isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina y etanolamina. Las formulaciones a utilizar para la administracion in vivo pueden ser esteriles. Esto se logra facilmente mediante filtracion a traves de membranas de filtracion esteriles u otros metodos.

Las moleculas de coadhesion descritas en la presente tambien pueden formularse como inmunoliposomas. Un liposoma es una vesmula pequena que comprende varios tipos de lfpidos, fosfolfpidos y/o tensioactivo que es util para administrar un agente terapeutico a un mairnfero. Los liposomas que contienen la inmunoglobulina se preparan por metodos conocidos en la tecnica. Los componentes del liposoma se disponen comunmente en una formacion bicapa, similar a la disposicion lipfdica de las membranas biologicas. Es posible generar liposomas particularmente utiles mediante el metodo de evaporacion de fase inversa con una composicion de lfpidos que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruden a traves de filtros con un tamano de poros definido para proporcionar liposomas con el diametro deseado.

La molecula de coadhesion y otros agentes terapeuticamente activos tambien se pueden atrapar en microcapsulas preparadas por metodos que incluyen, pero no se limitan a, tecnicas de coacervacion, polimerizacion interfacial (por ejemplo usando microcapsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina o microcapsulas de poli-(metilmetacrilato), sistemas de administracion de farmacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albumina, microemulsiones, nanopartmulas y nanocapsulas) y macroemulsiones. Tales tecnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edicion, Oslo, A., ed., 1980. Se pueden preparar preparaciones de liberacion sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberacion sostenida incluyen matrices semipermeables de polfmero hidrofobico solido, donde dichas matrices estan en forma de artmulos moldeados, p. ej., pelmulas o microcapsulas. Algunos ejemplos de las matrices de liberacion sostenida incluyen poliesteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietilmetacrilato) o alcohol polivimlico), polilactidos, copoKmeros de acido L-glutamico y gamma-etil-L-glutamato, acetato de etilenvinilo no degradable, copolfmeros degradables de acido glicolico-acido lactico como Lupron Depot® (que son microesferas inyectables compuestas de copolfmero de acido glicolico-acido lactico y acetato de leuprolida), acido poli-D-(-)-3-hidroxibutmco y ProLease® (comercialmente disponible de Akermes), que es un sistema de administracion a base de microesferas compuesto de la molecula bioactiva deseada incorporada en una matriz de poli-DL-lactida-coglicolido (PLG).

Administracion

La administracion de la composicion farmaceutica que comprende una molecula de coadhesion descrita en la presente, p. ej., en la forma de una solucion acuosa esteril, se puede lograr de varios modos que incluyen, pero sin limitarse a, administracion oral, subcutanea, intravenosa, intranasal, intraaortica, transdermica, topica (p. ej., geles, pomadas, lociones, cremas, etc.), intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonar, vaginal, parenteral, rectal o intraocular. En algunos casos, por ejemplo, para el tratamiento de heridas, inflamacion, etc., la inmunoglobulina se puede aplicar directamente como una solucion o spray. Como se sabe en la tecnica, la composicion farmaceutica puede formularse conforme a esto dependiendo de la manera de introduccion.

La administracion subcutanea se puede usar en circunstancias donde el paciente puede autoadministrarse la composicion farmaceutica. Muchos productos terapeuticos de protema no son lo suficientemente potentes como para permitir la formulacion de una dosis terapeuticamente eficaz en el volumen maximo aceptado para administracion subcutanea. Este problema se puede abordar en parte por el uso de formulaciones de protema que comprenden arginina-HCl, histidina y polisorbato. Los anticuerpos descritos en la presente pueden ser mas adecuados para la administracion subcutanea debido, por ejemplo, a una mayor potencia, mejor semivida en suero o mejor solubilidad.

Como se sabe en la tecnica, los productos terapeuticos de protema se administran generalmente por infusion IV o bolo. Los anticuerpos descritos en la presente tambien se pueden administrar usando estos metodos. Por ejemplo, la administracion puede ser por infusion intravenosa con 0,9 % de cloruro de sodio como vehmulo de infusion.

La administracion pulmonar se puede lograr usando un inhalador o nebulizador y una formulacion que comprende un agente de formacion de aerosol. Por ejemplo, se puede usar la tecnologfa inhalable AERx® comercialmente disponible de Aradigm, o el sistema de administracion pulmonar Inhance™ comercialmente disponible de Nektar Therapeutics. Los anticuerpos descritos en la presente pueden ser mas adecuados para la administracion intrapulmonar. FcRn esta presente en el pulmon y puede promover el transporte desde el pulmon al torrente sangumeo (p. ej., Syntonix WO 04004798, Bitonti et al. (2004) Proc. Nat. Acad. Sci. 101:9763-8). Por consiguiente, los anticuerpos que unen FcRn mas eficazmente en el pulmon o que se liberan mas eficazmente en el torrente sangumeo pueden tener mejor biodisponibilidad despues de la administracion intrapulmonar. Los anticuerpos descritos en la presente tambien pueden ser mas adecuados para la administracion intrapulmonar debido, por ejemplo, a una mejor solubilidad o punto isoelectrico alterado.

Ademas, las moleculas de coadhesion descritas en la presente pueden ser mas adecuadas para la administracion oral debido, por ejemplo, a una mejor estabilidad a pH gastrico y mayor resistencia a la proteolisis. Ademas, FcRn parece expresarse en el epitelio intestinal de adultos, de modo que los anticuerpos descritos en la presente con mejores perfiles de interaccion de FcRn pueden mostrar una mejor biodisponibilidad despues de la administracion oral. El transporte de anticuerpos mediado por FcRn tambien puede ocurrir en otras membranas mucosas como las de los tractos gastrointestinal, respiratorio y genital.

Ademas, cualquiera de una cantidad de sistemas de administracion se conoce en la tecnica y se pueden usar para administrar los anticuerpos descritos en la presente. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, encapsulacion en liposomas, micropartmulas, microesferas (p. ej., microesferas PLA/PGA) y similares. De manera alternativa, se puede usar un implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, inclusive membranas o fibras. Los sistemas de liberacion sostenida pueden comprender un material o matriz polimerica como poliesteres, hidrogeles, poli(vinialcohol), polilactidos, copolfmeros de acido L-glutamico y etil-L-glutamato, acetato de etilen-vinilo, copolfmeros de acido lacticoacido glicolico como Lupron Depot® y acido poli-D-(-)-3-hidroxibutmco. Tambien es posible administrar un acido nucleico que codifica una inmunoglobulina descrita en la presente, por ejemplo, por infeccion retroviral, inyeccion directa o recubrimiento con Kpidos, receptores de superficie celular u otros agentes de transfeccion. En todos los casos, los sistemas de liberacion controlada se pueden usar para liberar la inmunoglobulina en la locacion de accion deseada o cerca de esta.

Dosificacion

Las cantidades de dosificacion y frecuencias de administracion se seleccionan, en un caso, para ser terapeutica o profilacticamente eficaces. Como se sabe en la tecnica, puede ser necesario hacer ajustes por degradacion de protema, administracion sistemica versus localizada y la velocidad de smtesis de nuevas proteasas, asf como edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, tiempo de administracion, interaccion con otros farmacos y la gravedad de la enfermedad, y se determinara mediante experimentacion de rutina por los expertos en la tecnica.

La concentracion de la molecula de coadhesion terapeuticamente eficaz en la formulacion puede variar de aproximadamente 0,1 a 100 % en peso. De manera adecuada, la concentracion de la molecula de coadhesion se encuentra en el intervalo de 0,003 a 1,0 molar. Para tratar a un paciente, se puede administrar una dosis terapeuticamente eficaz de la inmunoglobulina descrita en la presente. En la presente, «dosis terapeuticamente eficaz» se refiere a una dosis que produce los efectos para los cuales se administra. La dosis exacta dependera del proposito del tratamiento y sera determinada por un experto en la tecnica mediante tecnicas conocidas. Las dosificaciones pueden variar de 0,0001 a 100 mg/kg de peso corporal o mas, por ejemplo, 0,1, 1, 10, o 50 mg/kg de peso corporal. En un caso, las dosificaciones vanan de 1 a 10 mg/kg.

De manera adecuada, solo se usa una dosis unica de la molecula de coadhesion. En otros casos, se administrar multiples dosis de la molecula de coadhesion. El tiempo que pasa entre administraciones puede ser menor que 1 hora, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 1-2 horas, aproximadamente 2-3 horas, aproximadamente 3-4 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 48 horas, aproximadamente 2-4 dfas, aproximadamente 4-6 dfas, aproximadamente 1 semana, aproximadamente 2 semanas o mas de 2 semanas.

De manera adecuada, las moleculas de coadhesion descritas en la presente se administran en regfmenes de dosificacion metronomicos, ya sea por infusion continua o administracion frecuente sin penodos de reposo extendidos. Esta administracion metronomica puede implicar dosificacion en intervalos constantes sin penodos de reposo. Tfpicamente, estos regfmenes abarcan infusion cronica de baja dosis o continua por un penodo de tiempo extendido, por ejemplo 1-2 dfas, 1-2 semanas, 1-2 meses o hasta 6 meses o mas. El uso de dosis menores puede minimizar los efectos secundarios y la necesidad de penodos de reposo.

De manera adecuada, las moleculas de coadhesion descritas en la presente y uno o mas agentes terapeuticos o profilacticos adicionales se administran dclicamente al paciente. La terapia dclica implica la administracion de un primer agente en un momento, un segundo agente en un segundo momento, opcionalmente agentes adicionales en momentos adicionales, opcionalmente un penodo de reposo y luego repetir la secuencia de administracion una o mas veces. La cantidad de ciclos es tfpicamente de 2-10. La terapia dclica puede reducir el desarrollo de resistencia a uno o mas agentes, puede minimizar los efectos secundarios o puede mejorar la eficacia del tratamiento.

Terapias de combinacion

Las moleculas de coadhesion descritas en la presente se pueden administrar concomitantemente con uno o mas agentes o regfmenes terapeuticos diferentes. Agentes o regfmenes terapeuticos adicionales se pueden usar para tratar la misma enfermedad, para tratar una complicacion que la acompana o se pueden usar para mejorar la eficacia o seguridad de la inmunoglobulina.

Las coterapias particularmente preferidas incluyen las aprobadas o que estan siendo evaluadas clmicamente para el tratamiento de trastornos mediados por IgE como alergias y asma. En particular, las composiciones terapeuticas de la invencion se pueden usar en combinacion con antiinflamatorios como corticosteroides y/o broncodilatadores como agonistas p2 inhalados, los dos grupos principales de medicaciones. Los corticosteroides inhalados incluyen fluticasona, budesonida, flunisolida, mometasona, triamcinolona y beclometasona, mientras que los corticosteroides orales incluyen prednisona, metilprednisolona y prednisolona. Otros esteroides incluyen glucocorticoides, dexametasona, cortisona, hidroxicortisona, azulfidina eicosanoides como prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos, asf como esteroides topicos como antralina, calcipotrieno, clobetasol y tazaroteno. Los broncodilatadores aumentan el diametro de los pasajes de aire y facilitan el flujo hacia y desde los pulmones. Los broncodilatadores que se pueden combinar con las terapias de la invencion incluyen broncodilatadores de accion corta como metaproterenol, efedrina, terbutalina y albuterol y broncodilatadores de accion prolongada como salmeterol, metaproterenol y teofilina.

Las terapias de la invencion se pueden combinar con farmacos antiinflamatorios no esteroideos (AINES) como aspirina, ibuprofeno, celecoxib, diclofenac, etodolac, fenoprofeno, indometacina, ketoralac, oxaprozina, nabumentona, sulindac, tolmentina, rofecoxib, naproxeno, ketoprofeno y nabumetona. Las coterapias pueden incluir antihistaminas como loratadina, fexofenadina, cetirizina, difenhidramina, clorfeniramina maleato, clemastina y azelastina. La coterapia puede incluir cromoglicato, cromolin sodio y nedrocromil, asf como descongestivos, en spray u orales, como oximetazolina, fenilefrina y pseudoefedrina. Las terapias de la invencion se pueden combinar con una clase de antiinflamatorios denominados antagonistas del receptor de leucotrienos como pranlukast, zafirlukast y montelukast e inhibidores de la smtesis del receptor de leucotrieno como zileuton.

Las terapias de la descripcion se pueden combinar con otras inmunoterapias que incluyen vacunas antialergicas, as ^ como otros antagonistas de IgE o FceR. Las terapias de la descripcion se pueden combinar con antagonistas de quimiocinas o citocinas, lo que incluye, pero sin limitarse a anticuerpos y fusiones Fc, lo que incluye, pero sin limitarse a inhibidores de quimiocinas CCR3, CCR4, CCR8 y CRTH2 y Cc R5, e inhibidores de citocinas IL-l3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12, IL15, IL-18, IL-19, IL-21, familia de clase II de receptores de citocina IL-22, IL-23, IL-25, IL-27, IL-31 e IL-33. Las terapias de la descripcion se pueden combinar con moduladores de la adhesion, factores de transcripcion y/o senalizacion intracelular. Por ejemplo, las inmunoglobulinas de la invencion se pueden combinar con moduladores de NF-Kb, AP-1, GATA-3, Statl, Stat-6, c-maf, NFAT, supresores de la senalizacion de citocina (SOCS), receptores activados por el proliferador de peroxisoma (PPAR), cinasa MAP, p38 MAPK, JNK y receptores de fosfato de esfingosina I. Las terapias de la descripcion se pueden administrar con tolilato suplatast, inhibidores de fosfodiesterasa 4 (PDE4), bloqueadores del canal de calcio y moleculas tipo heparina. Las posibles coterapias de la descripcion se describen en mas detalle en Caramori et al., 2008, Journal of Occupational Medicine and Toxicology 3-S1-S6.

Las terapias de la descripcion tambien se pueden usar junto con uno o mas antibioticos, agentes antifungicos o agentes antivirales. Los anticuerpos descritos en la presente tambien se pueden combinar con otros regfmenes terapeuticos como cirugfa.

Ejemplos

A continuacion, se proporcionan ejemplos a efectos ilustrativos solamente. Estos ejemplos no pretenden limitar ninguna realizacion descrita en la presente a ninguna aplicacion o teona de operacion particular.

Ejemplo 1. Nuevos metodos para inhibir las celulas IgE+ FcyRIIB

La inmunoglobulina IgE es un iniciador central y propagador de respuesta alergica en tejido afectado. IgE une el receptor de alta afinidad de IgE (FceRI), un receptor clave implicado en manifestaciones alergicas inmediatas que se expresa en una variedad de celulas efectoras, que incluye mastocitos, basofilos, eosinofilos, asf como otros tipos de celulas. La reticulacion de FceRI por alergeno de IgE en complejo inmune activa estas celulas, liberando mediadores qrnmicos como histamina, prostaglandinas y leucotrienos, que pueden llevar al desarrollo de una reaccion de hipersensibilidad tipo I. El anticuerpo monoclonal aprobado Omalizumab (Xolair) neutraliza IgE uniendose a esta y bloqueando la adhesion con FceR. Omalizumab reduce la IgE bioactiva a traves del secuestro, atenuacion de la cantidad de IgE espedfica de antfgeno a la que puede unirse y sensibilizacion de los mastocitos y basofilos del tejido. Esta neutralizacion de IgE circulante libre, a su vez, lleva a una reduccion de los smtomas de enfermedades alergicas. Cabe destacar que los niveles de IgE en suero aumentan despues del comienzo de la terapia debido a la formacion del complejo de omalizumab e IgE y pueden permanecer altos hasta un ano despues de detener la terapia. Por consiguiente, este problema puede llevar a falsos negativos en pruebas de diagnostico y por lo tanto los niveles de IgE se deben verificar de forma rutinaria.

Un enfoque novedoso para dirigirse a la via de IgE implica no solo bloquear la IgE circulante libre de adherirse a FceR en celulas efectoras sino tambien dirigirse a la fuente de produccion de IgE. IgE es secretada por celulas plasmaticas que producen IgE ubicadas en ganglios linfaticos que drenan el sitio de entrada al antfgeno o localmente en los sitios de reacciones alergicas. Las celulas plasmaticas que producen IgE se diferencian de las celulas B IgE+. El cambio de clase de celulas B a produccion de IgE es inducido por dos senales separadas; ambas pueden ser proporcionadas por las celulas TH2.

Hay dos formas de inmunoglobulinas: las secretadas y las ancladas a la membrana. La forma anclada a la membrana difiere de la forma secretada en que la primera tiene un peptido de anclaje a la membrana que se extiende desde el extremo C de la cadena pesada. La inmunoglobulina anclada a la membrana en las celulas B, tambien denominado complejo del receptor de celulas B (BCR), es cntica para las funciones de las celulas B. Puede transducir senales a las celulas B en reposo para que se diferencien en linfoblastos activados y celulas plasmaticas que secretan Ig.

Las celulas B diferenciadas que expresan IgE anclada a la membrana, denominadas en la presente celulas B mIgE+, poseen un mecanismo natural de retroalimentacion por regulacion negativa, el receptor Fc inhibidor FcYRIIb. FcYRIIb se expresa en una variedad de celulas inmunitarias, que incluyen celulas B, celulas dendnticas, monocitos y macrofagos, donde cumple un rol importante en la regulacion inmunitaria. En su rol normal en las celulas B, FcYRIIb sirve como mecanismo de retroalimentacion para modular la activacion de celulas B mediante el receptor de celulas B (BCR). La adhesion de BCR por antfgeno en complejo inmune en celulas B maduras activa una cascada de senalizacion intracelular, inclusive movilizacion de calcio, que lleva a la proliferacion y diferenciacion celular. Sin embargo, debido a que se producen anticuerpos IgG con especificidad al antfgeno, los complejos inmunes asociados (IC) pueden reticular el BCR con FcYRIIb, tras lo cual la activacion de BCR es inhibida por la adhesion de FcYRIIb y vfas de senalizacion intracelular asociadas que interfieren con las vfas corriente abajo de la activacion de b Cr . La expresion de FcYRIIb en la superficie de celulas B mlgE+, que usan mIgE como su BCR, sirve como regulador negativo de estos tipos celulares.

Una estrategia novedosa para inhibir una enfermedad mediada por IgE, que se ilustra en la figura 1, es inhibir las celulas B IgE+ (es dedr, las celulas B que expresan IgE anclada a la membrana) mediante la coadhesion de IgE anclada a la membrana y el receptor inhibidor FcYRIIb. En celulas B a las que se les cambio la clase para expresar IgE, mIgE sirve como BCR (denominado en la presente mIgE BCR). Este enfoque potencialmente inhibina el mecanismo biologico natural de la supresion mediada por complejo inmune de la activacion de celulas B, evitando asf la diferenciacion en celulas plasmaticas que producen IgE. Las celulas plasmaticas que producen IgE residen en la medula osea y probablemente tienen una vida de varias semanas a varios meses. Debido a que las nuevas celulas plasmaticas que secretan IgE atraviesan etapas de celulas B que expresan mIgE durante la diferenciacion, si su generacion es abrogada por la inhibicion de sus precursores de celulas B mIgE+ con este tratamiento anti-IgE, las celulas plasmaticas existentes moriran en un penodo de semanas a meses y por lo tanto la produccion de IgE tambien se reducira gradualmente. Cabe destacar que la inhibicion de las celulas B de memoria IgE+, que tienen mIgE, tambien se inhibinan por inmunoglobulinas anti-IgE que coadhieren FcYRllb con alta afinidad. Si esto ocurre, la terapia puede tener un efecto de largo plazo en la enfermedad fundamental.

Ejemplo 2. Anticuerpos anti-IgE con alta afinidad a FcYRIIb

En condiciones fisiologicas, la union del BCR con FcYRIIb y posterior supresion de las celulas B ocurre mediante complejos inmunes de IgG y anffgeno cognado. La estrategia de diseno era reproducir este efecto usando un unico anticuerpo de reticulacion. La IgG humana se une a FcYRIIb con afinidad debil (mayor que 100 nM para IgG1) y la inhibicion mediada por FcYRIIb ocurre en respuesta a los complejos inmunes, pero no la IgG monomerica. Se razono que la alta afinidad a este receptor (menor que 100 nM) sena necesaria para la inhibicion maxima de la activacion de celulas B. Para mejorar la actividad inhibidora de los anticuerpos anti-IgE de la invencion, la region Fc se modifico geneticamente con variantes que mejoran la union a FcYRIIb. Se han descrito variantes Fc modificadas geneticamente que se unen a FcYRIIb con mejor afinidad con respecto a la IgG1 natural (USSN 12/156, 183, presentada el 30 de mayo de 2008, con el fftulo "Methods and Compositions for Inhibiting CD32b Expressing cells", publicada como US 2009-0136485 A1).

Las variantes se generaron originalmente en el contexto de un anticuerpo que se dirige al anffgeno CD19, un componente regulador del complejo co-receptor BCR. La region Fv de este anticuerpo es una version humanizada y madurada por afinidad del anticuerpo 4G7 y se denomina en la presente HuAM4G7. Los genes Fv de este anticuerpo se subclonaron en el vector de expresion de mairnfero pTT5 (National Research Council Canada). Las mutaciones en el dominio Fc se introdujeron usando mutagenesis dirigida al sitio (QuikChange, Stratagene, Cedar Creek, TX). Ademas, se generaron variantes con inactivacion de control con afinidad nula a los receptores Fc que comprenden las sustituciones G236R y L328R (G236R/L328R). Esta variante se denomina Fc-KO o inactivacion de Fc. Las construcciones de cadena pesada y ligera se cotransfectaron en celulas HEK293E para la expresion y los anticuerpos se purificaron usando cromatograffa de afinidad de protema A (Pierce Biotechnology, Rockford, IL).

La protema FcYRIIb recombinante humana para los estudios de union se obtuvo de R&D Systems (Minneapolis, MN). Se obtuvieron protemas receptoras de FcYRIIa y FcYRIIIa de codificacion de la coleccion de genes de mamfferos (ATCC) y se subclonaron en vector pTT5 (National Research Council Canada) que contiene etiquetas 6X His. Las formas alelicas de los receptores (H131 y R131 para FcyRIIa y V158 y F158 para FcYRIIIa) se generaron usando mutagenesis QuikChange. Los vectores que codifican los receptores se transfectaron con celulas HEK293T y las protemas se purificaron usando cromatograffa de afinidad de mquel.

Las variantes se evaluaron para determinar la afinidad al receptor usando tecnologfa Biacore, tambien denominada Biacore en la presente, una tecnologfa basada en resonancia de plasmones superficiales (SPR) para estudiar las interacciones biomoleculares en tiempo real. Se realizaron mediciones de SPR usando un instrumento Biacore 3000 (Biacore, Piscataway, NJ). Se genero un chip biosensor CM5 de protema A/G (Pierce Biotechnology) (Biacore) usando un protocolo de acoplamiento a la amina principal estandar. Todas las mediciones se realizaron usando amortiguador HBS-EP (10 mM de HEPES pH 7,4, 0,15 M de NaCI, 3 mM de EDTA, 0,005 % vol/vol de tensioactivo P20, Biacore). Los anticuerpos a 20 nM o 50 nM en amortiguador HBS-EP se inmovilizaron en la superficie de protema A/G y se inyectaron FcyRs. Despues de cada ciclo, la superficie se regenero por inyeccion de amortiguador de glicina (10 mM, pH 1,5). Los datos se procesaron poniendo a cero el tiempo y la respuesta antes de la inyeccion de FcyR y restando las senales no espedficas apropiadas (respuesta del canal de referencia e inyeccion del amortiguador en ejecucion). Los analisis cineticos se realizaron por ajuste global de datos de union con un modelo de union Langmuir 1:1 usando software BIAevaluation (Biacore)

Un conjunto representativo de sensogramas para la union de anticuerpos anti-CD19 variantes selectos a FcYRIIb se muestra en la figura 2. Las afinidades de todas las variantes e lgG1 WT (natural) a todos los FcyRs, obtenidas de ajustes de los datos de union Biacore, se grafican en la figura 3 y se proporcionan numericamente en la figura 4. Mientras que IgG1 Fc WT se une con FcYRIIb con afinidad mM (Kd= 1,8 uM en la figura 4), una cantidad de variantes, por ejemplo, G236D/S267E, S239D/S267E y S267E/L328F se han modificado geneticamente que se unen al receptor inhibidor mas estrechamente. La variante S239D/I332E, como se describe en USSN 11/124,620 (US 2006-0024298 A1), tambien tiene afinidad mejorada por los receptores de activacion FcYRIIa y FcYRIIIa, y por lo tanto es capaz de citotoxicidad mediada por celula dependiente del anticuerpo (ADCC) mejorada y mediada y fagocitosis (ADCP). La variante G236R/L328R, tambien denominada inactivacion de Fc o Fc-KO, no tiene union a los receptores Fc y se usa como control en los experimentos descritos en la presente.

Se construyeron variantes selectas en anticuerpos que se dirigen a IgE. Las regiones variables de cadena pesada y ligera (VH y VL) de anticuerpos anti-IgE se proporcionan en la figura 5. Omalizumab es un anticuerpo humanizado aprobado actualmente para el tratamiento de asma alergica y se comercializa con el nombre Xolair. MaE11 es el precursor murino de Omalizumab. H1L1_MaE11 es una version humanizada novedosa de MaE11. Los genes que codifican los dominios VH y VL de cadena pesada y ligera de estos anticuerpos anti-IgE se sintetizaron comercialmente (Blue Heron Biotechnologies). Tambien se sintetizaron los genes VH y VL de region variable del anticuerpo anti virus respiratorio sincitial (RSV, por sus siglas en ingles) motavizumab, usado en los experimentos descritos en la presente como control negativo. Los genes VL se subclonaron en el vector de expresion de mairnfero pTT5 (NRC-BRI, Canada) que codifica la cadena constante Ckappa. Los genes VH se subclonaron en el vector pTT5 que codifica la lgG1 natural y cadenas constantes variantes. Las secuencias de aminoacidos de cadenas constantes seleccionadas se proporcionan en la figura 6. Todo el ADN se secuencio para confirmar la fidelidad de las secuencias. Las secuencias de aminoacidos de las cadenas, pesada y ligera de longitud completa de anticuerpos selectos se proporcionan en la figura 7.

Los plasmidos que contienen genes de cadena pesada y ligera se cotransfectaron en celulas HEK293E usando lipofectamina (Invitrogen) y se cultivaron en medio Freestyle 293 (Invitrogen). Despues de 5 dfas de crecimiento, los anticuerpos se purificaron del sobrenadante de cultivo por afinidad de protema A usando resina MabSelect (GE Healthcare).

Los anticuerpos anti-IgE de IgG1 variantes y naturales se evaluaron para determinar la union a IgE y a FcYRIIb usando Biacore. El ADN que codifica la region Fc de IgE, que contiene el sitio de union de los anticuerpos anti-IgE usados, se sintetizo (Blue Heron Biotechnologies) y se subclono en el vector pTT5. Fc de IgE se expreso en celulas 293E y se purifico usando protema A como se describe anteriormente. Las mediciones de SPR se realizaron usando el metodo de captura de protema A/ anticuerpo descrito anteriormente, excepto que el analito era FcYRllb o la region Fc del IgE. La adquisicion y ajuste de datos se describen anteriormente. La figura 8 proporciona las constantes de union de equilibrio (Kds) resultantes obtenidas de estos experimentos de union, asf como la afinidad en veces con respecto a la IgG1 natural para unirse a FcYRIIb. La figura 9 muestra graficas de estos datos. Los resultados confirman el maximo de afinidad de los anticuerpos para IgE y que la variante S267E/L328F mejora la union a FcYRIIb por dos ordenes de magnitud, lo que es coherente con los resultados anteriores.

El uso de variantes particulares, por ejemplo, S267E/L328F y S239D/I332E, esta destinado en la presente como prueba de concepto de los mecanismos como se describe en la presente y no pretende restringir la invencion a su uso particular. Los datos suministrados en USSN 12/156,183 (US2009-0136485 A1) y USSN 11/124,620 (US2006-0024298 A1) indican que una cantidad de variantes modificadas geneticamente, en posiciones Fc espedficas, proporcionan las propiedades deseadas. Las sustituciones para mejorar la afinidad de FcyR, en particular a FcYRIIb, incluyen: 234, 235, 236, 237, 239, 266, 267, 268, 325, 326, 327, 328 y 332. De manera adecuada, las sustituciones se hacen al menos a una o mas de las siguientes posiciones no taxativas para mejorar la afinidad a FcYRIIb: 235, 236, 239, 266, 267, 268 y 328.

Las combinaciones no taxativas de posiciones para hacer sustituciones para mejorar la afinidad a FcYRllb incluyen: 234/239, 234/267, 234/328, 235/236, 235/239, 235/267, 235/268, 235/328, 236/239, 236/267, 236/268, 236/328, 237/267, 239/267, 239/268, 239/327, 239/328, 239/332, 266/267, 267/268, 267/325, 267/327, 267/328, 267/332, 268/327, 268/328, 268/332, 326/328, 327/328 y 328/332. De manera adecuada, las combinaciones de posiciones para hacer sustituciones para mejorar la afinidad a FcYRIIb incluyen, pero no se limitan a: 235/267, 236/267, 239/268, 239/267, 267/268 y 267/328.

Las sustituciones para mejorar la afinidad a FcYRIIb incluyen: 234D, 234E, 234W, 235D, 235F, 235R, 235Y, 236D, 236N, 237D, 237N, 239D, 239E, 266M, 267D, 267E, 268D, 268E, 327D, 327E, 328F, 328W, 328Y y 332E. De manera adecuada, la combinacion de posiciones para hacer sustituciones para mejorar la afinidad a FcYRIIb incluyen, pero no se limitan a: 235Y, 236D, 239D, 266M, 267E, 268D, 268E, 328F, 328W y 328Y.

Las combinaciones de sustituciones para mejorar la afinidad a FcYRIIb incluyen: L234D/S267E, L234E/S267E, L234F/S267E, L234E/L328F, L234W/S239D, L234W/S239E, L234W/S267E, L234W/L328Y, L235D/S267E, L235D/L328F, L235F/S239D, L235F/S267E, L235F/L328Y, L235Y/G236D, L235Y/S239D, L235Y/S267D, L235Y/S267E, L235Y/H268E, L235Y/L328F, G236D/S239D, G236D/S267E, G236D/H268E, G236D/L328F, G236N/S267E, G237D/S267E, G237N/S267E, S239D/S267D, S239D/S267E, S239D/H268D, S239D/H268E, S239D/A327D, S239D/L328F, S239D/L328W, S239D/L328Y, S239D/I332E, S239E/S267E, V266M/S267E, S267D/H268E, S267E/H268D, S267E/H268E, S267E/N325L, S267E/A327D, S267E/A327E, S267E/L328F, S267E/L328I, S267E/L328Y, S267E/I332E, H268D/A327D, H268D/L328F, H268D/L328W, H268D/L328Y, H268D/I332E, H268E/L328F, H268E/L328Y, A327D/L328Y, L328F/1332E, L328W/I332E y L328Y/I332E. En algunas realizaciones, las combinaciones de sustituciones para mejorar la afinidad a FcYRIIb incluyen, pero no se limitan a: L235Y/S267E, G236D/S267E, S239D/H268D, S239D/S267E, S267E/H268D, S267E/H268E y S267E/L328F.

Ejemplo 3. Inhibicion in vitro de celulas B IgE+ por anticuerpos anti-lgE con alta afinidad a FcYRIIb

Un ensayo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA) se establecio para detectar IgE. Las placas de fondo plano se prepararon recubriendo con amortiguador de Nabicarbonato pH 9,4, seguido de adherencia con anticuerpos de captura anti-IgE a 10 |jg/ml durante la noche en pH 9,4 (0,1 M de amortiguador NaBicarbonato). Despues de la noche, la placa se bloqueo con 3 % de BSA/PBS y diluciones en serie de IgE (de un kit ELISA de IgE humana, Bethyl Laboratories) se agregaron 3x a 1 ug/ml Despues de 3 horas, las placas se lavaron 3x (200 j l) con TTBS y se midio la Ige unida. El anticuerpo IgE antihumano policlonal de cabra conjugado con HRP (Bethyl Laboratories) se agrego a (1:5000) durante 1 hora en 1 % de BSA/PBS. Las muestras se lavaron 3x y el IgE se detecto con sustrato de peroxidasa TMB (KPL, Inc 50-76-00). Las reacciones se detuvieron con 50 j l de H²SO⁴2N y se leyeron a 450 nm.

La figura 10 muestra la captura de la IgE con diversos anticuerpos de IgE anti-humanos que incluyen un conjunto de tres anticuerpos anti-IgE monoclonales (MabTech; 107/182/101), MaE11_IgG1_G236R/L328R, y Omalizumab_IgG1_G236R/L328R. Los datos muestran que el reactivo de anticuerpo anti-IgE comercial (MabTech), Omalizumab, y su anticuerpo MaE11 quimerico original pueden capturar la IgE. Para usar este ensayo para detectar IgE, fue necesario determinar si los anticuerpos MaE¹¹ y omalizumab interferinan con la captura de IgE por reactivo anti-IgE MabTech. Este ensayo se repitio como se describe anteriormente y la concentracion de IgE de absorbancia se calculo usando una curva estandar. La figura 11 muestra que el anticuerpo anti-IgE omalizumab_G236R/L328R no compite con el anticuerpo anti-IgE de MabTech en el protocolo ELISA actual.

Los anticuerpos anti-IgE de variante Fc se evaluaron para determinar su capacidad de inhibir celulas B IgE+. Las PBMC humanas se indujeron a cambio de clase a celulas B que producen IgE agregando 5 ng/ml de interleucina-4 (IL-4) y 100 ng/ml de anticuerpo anti-CD40 (clon G28.5 IgG1). El anticuerpo anti-CD40 es un agonista de CD40 y por lo tanto imita la actividad del coactivador CD40L. Se agregaron varias concentraciones de anticuerpos anti-IgE y las muestras se incubaron durante 12 dfas. Las placas ELISA se prepararon y bloquearon como se describe anteriormente usando 5 ug/ml de anti-IgE Mabtech como anticuerpo de captura. 100 j l de las muestras de PBMC se agregaron e incubaron >3 horas y luego se lavaron con TTBS 3x (200 ul). El anticuerpo conjugado a HRP de anticuerpo se agrego y detecto como se describe anteriormente. La absorbancia a 450 nm se convirtio a concentracion de IgE usando una curva estandar. Los resultados se muestran en la figura 12. Los anticuerpos que no tienen union a FcyR (variantes G236R/L328R) o que no tienen especificidad por IgE (anticuerpo anti-RSV Motavizumab) no tuvieron efecto en la produccion de IgE de las celulas B diferenciadas. Por el contrario, los anticuerpos variantes con mayor afinidad a FcYRIIb inhibieron la produccion de IgE. Estos datos sugieren que la coadhesion de IgE de superficie y el receptor de FcyR inhibidor FcYRIIb inhibe las celulas B de clase cambiada de ese tipo de inmunoglobulina. La inhibicion de celulas B IgE+ reduce la cantidad de celulas plasmaticas que expresan IgE, que a su vez reducen la cantidad de IgE detectada. Para evaluar la selectividad de esta actividad por las celulas B que producen IgE, la IgG2 humana se midio para las mismas muestras usando un ELISA e IgG2 (Bethyl Laboratories). La figura 13 muestra que la secrecion de IgG2 no se inhibio, lo que indica que la actividad inhibidora de anticuerpos anti-IgE con alta afinidad para FcYRIIb es selectiva de las celulas de clase cambiada IgE+. La repeticion de este experimento usando versiones variantes del anticuerpo anti-IgE aprobado Omalizumab mostro resultados inhibidores similares por la variante con alta afinidad a FcYRIIb (figura 14).

La capacidad de anticuerpos anti-IgE con alta afinidad a FcYRIIb de inhibir la produccion de IgE se evaluo en presencia de estimulacion de BCR mlgE. El ensayo que antecede se repitio, con cambio de clase a IgE promovido por IL-4 y anticuerpo agonista a-CD40 y ademas las celulas B se activaron usando anticuerpo anti-mu o anti-CD79b. Estos anticuerpos reticulan el BCR, proporcionando asf una senal similar al antfgeno en complejo inmune. El anticuerpo antimu reticula IgM anclado a la membrana y anti-CD79b reticula Cd79b, que es un componente de senalizacion del complejo BCR. PBMC se incubaron durante 14 dfas con IL-4, a-CD40 y anti-CD79b o anti-mu y se detecto IgE como se describe anteriormente. Los resultados de anti-CD79b (figura 15) y anti-mu (figura 16) muestran que los anticuerpos anti-IgE con alta afinidad a FcYRIIb son capaces de inhibir la produccion de IgE cuando las celulas B se estimulan mediante reticulacion de BCR.

Una estrategia adicional para inhibir las celulas B IgE+ es vaciarlas. Esto se puede llevar a cabo usando un anticuerpo anti-IgE potenciado por funcion efectora. La variante S239D/I332E aumenta la union al receptor de activacion FcYRIIa y FcYRIIIa (figura 3 y figura 4) y por lo tanto mejora las funciones efectoras de ADCC y ADCP. El ensayo de celulas B que antecede se realizo usando una variante S239D/I332E del anticuerpo anti-lgE Omalizumab. PBMC se incubaron durante 14 dfas con IL-4, a-CD40 y anti-CD79b (figura 17) o anti-mu (figura 18) y se detecto IgE como se describe anteriormente. Los resultados (figuras 17 y 18) muestran que los anticuerpos anti-IgE con funcion efectora optimizada pueden inhibir la produccion de IgE de las celulas B IgE+ de clase cambiada.

Ejemplo 4. Inhibicion in vitro de celulas B IgE+ por medio de anticuerpos anti-IgE con alta afinidad a FcYRIIb

Las inmunoglobulinas descritas en la presente se evaluaron usando un modelo de raton huPBL-SCID como un intermediario para la actividad terapeutica en seres humanos. Este estudio examino la capacidad de los anticuerpos anti-IgE descritos en la presente de inhibir la actividad de las celulas B y el desarrollo de celulas plasmaticas en respuesta a un alergeno humano comun - protema de acaro del polvo Der p 1. En este metodo, los leucocitos de sangre periferica humana (PBL) de un donante de sangre con respuesta alergica a Der p 1 se injertaron en ratones SCID con deficiencia inmunitaria y se trataron con los anticuerpos anti-IgE naturales o variantes. Los ratones se expusieron a un antfgeno para estimular una respuesta inmunitaria y la produccion de inmunoglobulinas se midio para examinar el curso del desarrollo de celulas B en celulas plasmaticas.

Los donantes de sangre se estudiaron para detectar alergia al antfgeno del acaro del polvo segun la presencia de anticuerpos anti-IgE contra Der p 1. Un donante con reactividad positiva se sometio a leucoferesis para obtener celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC). El protocolo del estudio se proporciona en la figura 20. Un dfa antes de la inyeccion de PBMC, a los ratones se les dieron inyecciones intraperitoneales (i.p.) con 100 j l de anticuerpo antiasialo GM (Wako, Richmond, VA) para vaciar los linfocitos citolfticos (NK) de murino. Al dfa siguiente, los ratones se inyectaron i.p. 3x107 de PBL en un volumen de 0,5 ml. Despues de la inyeccion de PBMC, los ratones se asignaron a 5 grupos diferentes de ratones con 7 ratones en cada grupo. El dfa 7 despues de la inyeccion de PBMC, se recogio la sangre de todos los animales mediante puncion retroorbital de seno/plexo (OSP) para la determinacion de los niveles de IgG e IgE humana por ELISA (ZeptoMetrix, Buffalo, NY). Dos dfas despues (dfa 9), los ratones se inyectaron i.p. con 10 mg/kg de anticuerpo o PBS. El dfa 11, los ratones se inyectaron i.p. con 15 jg de antfgeno de acaro del polvo Der p 1 (LoTox Natural Der p 1, Indoor Biotechnologies, Charlottesville, VA). El dfa 23 (12 dfas despues de la vacunacion con antfgeno), se recogio sangre de todos los ratones para determinar los anticuerpos IgG e IgE humanos. El mismo dfa, los ratones recibieron una segunda inyeccion i.p. con 10 mg/kg de anticuerpo o PBS. Dos dfas despues (dfa 25), los ratones recibieron una vacunacion de refuerzo i.p. de 10 ug de antfgeno de acaro de polvo Der p 1. El dfa 37 (12 dfas despues del refuerzo de antfgeno), se recogio sangre por OSP para la determinacion de inmunoglobulina humana. Las concentraciones de IgG e IgE humana se midieron usando metodos ELISA similares a los descritos anteriormente.

Los resultados se muestran en las figuras 20 y 21 para los niveles de IgG e IgE en suero, respectivamente. Antes de la exposicion a alergenos, los niveles de anticuerpos IgG e IgE humanos eran bajos en todos los grupos. Despues de la inmunizacion con Der p 1, todos los grupos mostraron altos niveles de IgG humana, lo que indica una respuesta inmunitaria solida por celulas B de humano injertadas al antfgeno Der p 1 vacunado o antfgenos de raton endogeno. En contraste a la respuesta de IgG, los grupos de tratamiento teman leves diferencias en la produccion de anticuerpos IgE. Omalizumab y la version de IgG1 de H1L1 MaE11 eran equivalentes al vehfculo en su capacidad de inhibir la produccion de IgE humana. Sin embargo, la version mejorada por FcYRIIb (IIbE, S267E/L328F) de H1L1 MaE11 no mostro niveles detectables de IgE humana. La version Fc-KO (variante G236R/L328R) de H1L1 MaE11, que no tiene union a todos los FcyR, mostro una mejora en la produccion de IgE humana. Esto se debe posiblemente a su capacidad de reticular la mlgE humana y por lo tanto activar las celulas B de lgE+, pero su total falta de actividades inhibidoras de FcYRIIb o citotoxicas de FcYRIIa/IIIa como las que poseen las versiones de IgG1 e IIbE del anticuerpo. Estos datos in vivo muestran que los anticuerpos anti-IgE con alta afinidad a FcYRIIb pueden inhibir la activacion de celulas B IgE+ humanas y la diferenciacion de celulas plasmaticas que secretan inmunoglobulinas y por lo tanto soportan el potencial de las inmunoglobulinas descritas en la presente para tratar trastornos mediados por IgE.

La descripcion incluye ademas la materia de las reivindicaciones de WO2010/033736 de la cual deriva la presente solicitud, cuyo contenido se reproduce mas adelante como parrafos numerados.

Parrafo 1. Un metodo para inhibir una celula de IgE FcYRIIb+ que comprende poner en contacto la celula con una molecula de coadhesion, en donde dicha molecula de coadhesion se une a FcYRIIb con una Kd inferior a aproximadamente 100 nM, y en donde dicha molecula de coadhesion de coadhiere la IgE y FcYRIIb en la superficie de la celula.

Parrafo 2. El metodo del parrafo 1, en donde dicha molecula de coadhesion es un anticuerpo con especificidad para IgE.

Parrafo 3. El metodo del parrafo 1, en donde la molecula de coadhesion es un anticuerpo biespedfico que comprende una primera region Fv y una segunda region Fv, en donde dicha primera region Fv une IgE, y dicha segunda region Fv une FcYRIIb con una Kd inferior a aproximadamente 100 nM.

Parrafo 4. El metodo del parrafo 1, en donde dicha molecula de coadhesion es una fusion Fc que comprende una region Fc, en donde dicha region Fc une FcYRIIb con una Kd inferior a aproximadamente 100 nM.

Parrafo 5. El metodo del parrafo 1, en donde la celula es una celula B.

Parrafo 6. Una molecula de coadhesion que tiene especificidad para IgE, en donde dicha molecula de coadhesion comprende una variante Fc de un polipeptido Fc original, en donde dicha variante Fc tiene una afinidad de union mejorada a FcYRIIb con respecto al polipeptido Fc original.

Parrafo 7.La molecula de coadhesion del parrafo 6, en donde dicha variante Fc comprende al menos una modificacion de aminoacido en la region Fc en comparacion con un polipeptido Fc original, en donde dicha modificacion se selecciona del grupo que consiste en 234, 235, 236, 237, 239, 265, 266, 267, 268, 298, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331 y 332, en donde la numeracion es de acuerdo con un mdice EU.

Parrafo 8. La molecula de coadhesion del parrafo 6, en donde dicha modificacion es una sustitucion que se selecciona del grupo que consiste en L235Y, G236D, S239D, V266M, S267E, H268D, H268E, L328F, L328W y L328Y 267D y 267E.

Parrafo 9. La molecula de coadhesion del parrafo 8, en donde dicha modificacion es una sustitucion que se selecciona del grupo que consiste en 267D y 267E.

Claims (1)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo para usar en el tratamiento del asma alergico en un sujeto que lo necesita, dicho anticuerpo comprende:

a. una cadena pesada que tiene la SEQ ID NO:42; y

b. una cadena ligera que tiene la SEQ ID NO:40.