CN104961830A - 用于治疗ige介导的疾患的新组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于治疗IGE介导的疾患的新组合物和方法。本发明涉及以高亲和力结合IgE和FcγRIIb的免疫球蛋白,所述组合物包含能够抑制表达膜锚定IgE的细胞的免疫球蛋白。此类组合物用于治疗IgE介导的疾患,包括变态反应和哮喘。
Description
本申请为申请号为200980136559.4的分案申请,要求2008年9月17日的优先权。
相关申请
本申请根据35U.S.C.119(e)要求在此通过引用整体并入的2008年9月17日提交的美国临时申请序号61/097,819的权益,并且涉及在此通过引用整体并入的2008年5月30日提交的题为“Methods and Compositionsfor Inhibiting CD32b Expressing cells(抑制CD32b表达细胞的方法和组合物)”的USSN 12/156,183。
技术领域
本公开内容涉及以高亲和力结合IgE和FcγRIIb的免疫球蛋白组合物,所述组合物能够抑制表达膜锚定IgE的细胞。此类组合物用于治疗IgE介导的疾患,包括变态反应和哮喘。
发明背景
诸如哮喘、变应性鼻炎、特异性皮炎和食物变态反应等变态反应疾病和病症在过去数年间越来越流行,目前影响工业化国家人口的10-40%。变应性疾病严重影响生活质量,并且可以导致严重的并发症,包括可能在严重的哮喘和过敏病例中发生的死亡。变态反应是流行的,并且是损失工作和学习时间的最大原因,并且它们对个人生活的影响以及它们对于医疗系统和经济的直接和间接支出是巨大的。例如,变应性鼻炎(花粉症)影响美国人口的22%或更多,而据信,变应性哮喘影响至少2000万美国居民。变应性疾病在美国的经济影响,包括医疗支出和生产力损失,据估计仅在九十年代初就达到了64亿美元。
大部分变应性疾病由免疫球蛋白E(IgE)介导的超敏反应所引起。IgE是一类正常在血清中以很低浓度存在的抗体。其由在成熟的某个阶段在表面表达抗体的IgE分泌血浆细胞产生。过敏患者产生提高的水平的、对他们敏感的通常无害的抗原具有结合特异性的IgE。这些IgE分子在血液中循环并结合循环中的嗜碱性粒细胞表面上和沿黏膜表层和皮肤下的肥大细胞表面上的IgE特异性受体。抗原或变应原对肥大细胞、嗜碱性粒细胞和其他细胞类型上的IgE的结合交联IgE分子并聚集相关受体,从而引发细胞释放血管活性和神经元刺激介质,例如组胺、白三烯、前列腺素、缓激肽和血小板激活因子。与T细胞介导的迟发型或细胞介导的超敏反应不同,由抗体免疫复合物引起的免疫系统对抗原的快速反应导致了长期的直接或抗体介导的超敏反应。IgE介导的免疫反应特别称为I型超敏反应。
IgE的高亲和力受体(FcεRI)是介导变应性表现的关键介质。除了肥大细胞和嗜碱性粒细胞以外,变应性反应的主要介质FcεRI还见于许多其他细胞类型(包括嗜酸性粒细胞、血小板)和抗原呈递细胞(例如单核细胞和树突细胞)。IgE的其他受体是FcεRII,还称为CD23或低亲和力IgE Fc受体。FcεRII被广泛表达于B淋巴细胞、巨噬细胞、血小板和许多其他细胞类型,例如气道平滑肌。FcεRII可以在IgE表达以及随后FcεRII表面表达的反馈调节中起作用。
因为IgE在介导大部分变应性反应中起重要作用,设计治疗以控制体内IgE水平和调节IgE合成受到了极大关注。已经提出通过下调IgE水平来治疗IgE介导的变应性疾病的几个策略。一个策略包括通过结合Fc受体结合位点中或附近的IgE的ε链来中和IgE分子。例如,奥马珠单抗(Xolair)是结合与FcεR1相同的Fc位点上的IgE的重组人源化单克隆抗IgE抗体。奥马珠单抗导致过敏患者中总血清或循环IgE下降,这降低了可结合并敏化组织肥大细胞和嗜碱性粒细胞的抗原特异性IgE的量。这转而导致变应性疾病症状的减少。有趣的是,血清IgE水平在治疗开始后因为奥玛珠单抗-IgE复合物形成而增加,并且可以维持高水平至停止治疗后1年。结果,该问题可能导致诊断测试的假阴性,因此必须常规检查IgE水平。因此,存在对减少IgE介导的疾病和疾病症状的改良方法和组合物的需求。
示例性实施方案概述
本公开内容提供了以高亲和力结合IgE和FcγRIIb的新共衔接(co-engagement)分子,包含这种共衔接分子的组合物,以及使用所述新共衔接分子治疗IgE介导的疾患的方法。本发明共衔接分子能够抑制表达膜IgE和FcγRIIb的细胞,即IgE+FcγRIIb+细胞。本发明共衔接分子还优选能够结合循环IgE。本文公开的抑制方法包括使IgE+FcγRIIb+细胞与共衔接分子接触,所述共衔接分子共衔接所述细胞表面上的IgE和FcγRIIb。
本文公开的组合物包括能够以高亲和力共衔接细胞表面上的IgE和FcγRIIb的共衔接分子。在一个实施方案中,共衔接分子包括以高亲和力结合IgE和FcγRIIb的免疫球蛋白。本发明共衔接分子优选共衔接细胞表面上的膜γ锚定IgE和FcγRIIb,并且优选以低于约100nM的Kd结合FcγRIIb。在优选实施方案中,共衔接分子是免疫球蛋白,并且在其他优选实施方案中,免疫球蛋白是抗体,其中所述抗体的Fv区特异性结合IgE。在一个优选实施方案中,所述抗体结合循环IgE和膜锚定IgE。在替代实施方案中,所述抗体相对于循环IgE选择性结合膜锚定IgE。在另一实施方案中,共衔接分子是具有第一靶特异性区和第二靶特异性区的双特异性抗体,其中所述第一靶特异性区结合IgE并且所述第二靶特异性区以低于约100nM的Kd结合FcγRIIb。在一个优选实施方案中,第一和第二靶特异性区是Fv区,其中第一Fv区结合IgE,并且第二Fv区以低于约100nM的Kd结合FcγRIIb。在另一实施方案中,共衔接分子是包括Fc区的Fc融合体,其中所述Fc区以低于约100nM的Kd结合FcγRIIb。在该实施方案中,免疫球蛋白的Fc融合配偶体结合IgE。
在一个实施方案中,共衔接分子与FcγRIIb结合,其中所述结合的亲和力具有低于约100nM的Kd,例如低于或等于约95nM、低于或等于约90nM、低于或等于约85nM、低于或等于约80nM、低于或等于约75nM、低于或等于约74nM。
在一个实施方案中,以高亲和力共衔接IgE和FcγRIIb的共衔接分子包括相对于亲本免疫球蛋白的变体免疫球蛋白。在一个实施方案中,变体免疫球蛋白包括变体Fc区,其中所述变体Fc区相对于亲本Fc区包括一个或多个(例如,两个或多个)修饰,其中所述修饰在选自由234、235、236、237、239、265、266、267、268、298、325、326、327、328、329、330、331和332组成的组的位置,其中编号是根据EU指数。在另一实施方案中,修饰在选自由根据EU指数的234、235、236、237、266、267、268、327、328组成的组的位置。在另一实施方案中,修饰在选自由根据EU指数的235、236、266、267、268、328组成的组的位置。在另一实施方案中,修饰在选自由根据EU指数的235、236、239、266、267、268和328组成的组的位置。在另一实施方案中,修饰在选自由根据EU指数的234、235、236、237、266、267、268、327、328组成的组的位置。
在一个实施方案中,所述修饰是选自由以下组成的组的至少一个取代(例如,一个或多个取代、两个或多个取代、等):234F、234G、234I、234K、234N、234P、234Q、234S、234V、234W、234Y、234D、234E、235A、235E、235H、235I、235N、235P、235Q、235R、235S、235W、235Y、235D、235F、235T、236D、236F、236H、236I、236K、236L、236M、236P、236Q、236R、236S、236T、236V、236W、236Y、236A、236E、236N、237A、237E、237H、237K、237L、237P、237Q、237S、237V、237Y、237D、237N、239D、239E、239N、239Q、265E、266D、266I、266M、267A、267D、267E、267G、268D、268E、268N、268Q、298D、298E、298L、298M、298Q、325L、326A、326E、326W、326D、327D、327G、327L、327N、327Q、327E、328E、328F、328Y、328H、328I、328Q、328W、329E、330D、330H、330K、330S、331S和332E,其中编号是根据EU指数。在一个实施方案中,所述修饰是选自由以下组成的组的至少一个取代(例如,一个或多个取代、两个或多个取代、等):234N、234F、234D、234E、234W、235Q、235R、235W、235Y、235D、235F、235T、236D、236H、236I、236L、236S、236Y、236E、236N、237H、237L、237D、237N、239D、239N、239E、266I、266M、267A、267D、267E、267G、268D、268E、268N、268Q、298E、298L、298M、298Q、325L、326A、326E、326W、326D、327D、327L、327E、328E、328F、328Y、328H、328I、328Q、328W、330D、330H、330K和332E,其中编号是根据EU指数。在一个实施方案中,所述修饰是选自由以下组成的组的至少一个取代(例如,一个或多个取代、两个或多个取代、等):234D、234E、234W、235D、235F、235R、235Y、236D、236N、237D、237N、239D、239E、266M、267D、267E、268D、268E、327D、327E、328F、328W、328Y和332E,其中编号是根据EU指数。在一个实施方案中,所述修饰是选自由以下组成的组的至少一个取代(例如,一个或多个取代、两个或多个取代、等):234E、235Y、235R、236D、236N、237N、266M、267E、268E、268D、327D、327E、328F、328Y、328W,其中编号是根据EU指数。在一个实施方案中,所述修饰是选自由以下组成的组的至少一个取代(例如,一个或多个取代、两个或多个取代、等):235Y、236D、239D、266M、267E、268D、268E、328F、328W和328Y,其中编号是根据EU指数。在一个实施方案中,所述修饰是选自由以下组成的组的至少一个取代(例如,一个或多个取代、两个或多个取代、等):235Y、236D、266M、267E、268E、268D、328F、328Y和328W,其中编号是根据EU指数。
在一个实施方案中,所述修饰导致下述取代组合的至少一个:235Y/267E、236D/267E、239D/268D、239D/267E、239D/332E、267E/268D、267E/268E和267E/328F,其中编号是根据EU指数。
在一个实施方案中,本文公开的修饰相对于亲本免疫球蛋白降低了对至少一种受体的亲和力,其中所述受体选自由FcγRI、FcγRIIa和FcγRIIIa组成的组。在该实施方案中,本文公开的免疫球蛋白变体可以介导相对于亲本免疫球蛋白降低的ADCC或ADCP。在一个替代实施方案中,本文公开的修饰相对于亲本免疫球蛋白增加了对至少一种受体的亲和力,其中所述受体选自由FcγRI、FcγRIIa和FcγRIIIa组成的组。在该实施方案中,本文公开的免疫球蛋白变体可以介导相对于亲本免疫球蛋白增加的ADCC或ADCP。
本文还公开了工程化新共衔接分子(包括免疫球蛋白组合物)的方法。
本文还公开了编码共衔接分子(包括本文描述的免疫球蛋白)的分离的核酸。本文还公开了包含任选可操作连接至对照序列的核酸的载体。本文还公开了含有所述载体的宿主细胞以及用于产生和任选回收共衔接分子的方法。
本文还公开了包括本文公开的免疫球蛋白的共衔接分子。所述共衔接分子可用于治疗产品。在一个实施方案中,本文公开的共衔接分子可以是抗体。
还公开了包括本文描述的共衔接分子和生理上或药学上可接受的载体或稀释剂的组合物。
本文还公开了抑制IgE+FcγRIIb+细胞的方法。抑制本文描述的细胞的方法包括使IgE+FcγRIIb+细胞与共衔接分子接触,其中所述共衔接分子以低于约100nM的Kd结合FcγRIIb。在大部分优选实施方案中,所述共衔接分子共衔接细胞表面上的IgE和FcγRIIb。在优选实施方案中,抑制方法包括使IgE+FcγRIIb+细胞与抗体接触,其中所述抗体通过其Fv区结合IgE,并且其中所述抗体包含Fc区,其中所述Fc区以100nM或更低的Kd结合FcγRIIb。在其他实施方案中,所述Fc区以比天然IgG1更大的亲和力结合FcγRIIa和/或FcγRIIIa。在其他实施方案中,所述方法包括使IgE+FcγRIIb+细胞与共衔接分子接触,其中所述共衔接分子是包含第一Fv区和第二Fv区的双特异性抗体,其中所述第一Fv区结合IgE,并且所述第二Fv区以低于约100nM的Kd结合FcγRIIb。在替代实施方案中,所述方法包括使IgE+FcγRIIb+细胞与共衔接分子接触,其中所述共衔接分子是包含Fc区的Fc融合体,其中所述Fc区以低于约100nM的Kd结合FcγRIIb。
其他优选方法包括减少IgE分泌的方法。该方法包括使IgE+FcγRIIb+细胞与共衔接分子接触,其中所述共衔接分子以低于约100nM的Kd结合IgE和FcγRIIb。
还包括抑制B细胞成熟的方法。该方法包括使IgE+FcγRIIb+细胞与共衔接分子接触,其中所述共衔接分子以低于约100nM的Kd结合IgE和FcγRIIb。
还描述了本文公开的共衔接分子的治疗用途和诊断用途。在一个最优选实施方案中,本文公开的共衔接分子用于治疗一种或多种IgE介导的疾患,例如,由免疫球蛋白IgE介导的自身免疫疾病、炎性疾病等。在特定实施方案中,可由本文公开的组合物治疗的变应性疾患和特应性疾患包括但不限于:变应性和特应性哮喘、特异性皮炎和湿疹、变应性鼻炎、变应性结膜炎和鼻结膜炎、变应性脑脊髓炎、变应性鼻炎、变应性脉管炎、过敏性休克和对任何种环境的变态反应或食物变态反应。本文公开的治疗方法包括给需要这种施用的患者施用治疗有效量的共衔接细胞表面上的IgE和FcγRIIb的共衔接分子。
本发明涉及以下实施方式:
1.一种抗体,其包含:
a)重链,其包含:
i)重链可变区,其包含具有SEQ ID NO:18的vhCDR1、具有SEQ IDNO:19的vhCDR2和具有SEQ ID NO:20的vhCDR3;和
ii)人亲本IgG Fc多肽的Fc结构域变体,其包含氨基酸取代S267E,其中编号是根据Kabat的EU指数;和
b)轻链,其包含具有SEQ ID NO:22的vlCDR1、具有SEQ ID NO:23的vlCDR2和具有SEQ ID NO:24的vlCDR3。
2.第1项的抗体,其中所述Fc结构域变体进一步包含氨基酸取代L328F,其中编号是根据Kabat的EU指数。
3.第1项的抗体,其中所述重链可变区具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列和所述轻链可变区具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
4.第1项的抗体,其中所述重链具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列和轻链具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
5.一种制备抗体的方法,所述方法包括提供:
a)编码具有SEQ ID NO:42的重链的第一核酸;
b)编码具有SEQ ID NO:40的轻链的第二核酸;和
c)在其中产生所述重链和轻链的条件下,表达所述核酸。
附图简述
图1.抑制IgE+FcγRIIb+B细胞的新机制方法的示例说明。在适当的刺激下,幼稚B细胞可以分化成IgE+B细胞。抗原与IgE B细胞受体的衔接激活这些细胞,然后这些细胞可以分化成释放循环IgE的血浆细胞。循环IgE结合例如肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞上的FcεR的结合激活这些细胞。组胺、前列腺素和其他化学介质的释放最终导致变态反应和哮喘的临床症状。具有天然IgG1Fc区的奥马珠单抗能够阻断IgE与FcεR的结合。对FcγRIIb具有高亲和力的抗IgE抗体在途中被称为抗IgE-IIbE,能够不仅阻断IgE与FcεR的结合,还抑制mIgE FcγRIIb共衔接对IgE+B细胞的激活。
图2.显示Fc变体抗CD19抗体与人FcγRIIb的结合的Biacore表面等离子体共振传感图。
图3.通过Biacore测定的Fc变体抗体对人FcγR的亲和力。该图显示变体和WT IgG1抗体与人FcγRI(I)、H131FcγRIIa(H IIa)、FcγRIIb(IIb)和V158FcγRIIIa(V IIIa)结合的log(KA)。G236D/S267E和S267E/L328F与V158FcγRIIIa的结合是不可测的。G236R/L328R(Fc-KO)与所有测试受体的结合是不可测的。
图4.通过Biacore表面等离子体共振测定的Fc变体抗体对人FcγR的亲和力。该表提供了变体和WT IgG1抗体与人FcγRI、H131 FcγRIIa FcγRIIb和V158 FcγRIIIa结合的平衡KD,以及每一个相对于天然(WT)IgG1的倍数结合。n.d.=不可测的。
图5.抗IgE抗体的重链(VH)和轻链(VL)可变区和CDR的氨基酸序列。CDR边界如之前基于抗体可变区的结构比对所描述的来确定(Lazar等,2007,Mol Immunol 44:1986-1998)。
图6.重链WT和轻链WT和变体恒定区的氨基酸序列。
图7.可用于靶向IgE+B细胞的抗IgE全长抗体的氨基酸序列。
图8.有关WT和变体抗IgE抗体与IgEFc区和FcγRIIb结合的亲和力数据的表。
图9.有关WT和变体抗IgE抗体与IgEFc区和FcγRIIb结合的亲和力数据的图。
图10.使用商业的(MabTech)和实验室内(奥马珠单抗和MaE11)抗IgE抗体作为捕获试剂的IgE ELISA。
图11.在ELISA方案中,抗IgE抗体奥马珠单抗的可变区不与MabTech捕获抗体竞争IgE检测。
图12.FcγRIIb亲和力增强的变体抗IgE抗体抑制类别转换的IgE+B细胞,但是缺乏FcγR结合(Fc变体G236R/L328R)或缺乏与IgE结合(莫维珠单抗)的抗体不抑制。该图显示在用IL-4孵育12天后从PBMC释放的IgE的浓度、抗CD40(α-CD40)激动剂抗体以及所示抗体的不同浓度。
图13.变体抗IgE抗体不抑制类别转换的IgG2+B细胞。该图显示在用IL-4孵育12天后从PBMC释放的IgG2的浓度、α-CD40以及所示抗体的不同浓度。
图14.FcγRIIb亲和力增强的变体抗IgE抗体抑制类别转换的IgE+B细胞。该图显示在用IL-4孵育14天后从PBMC释放的IgE的浓度、抗CD40(α-CD40)激动剂抗体以及所示抗体的不同浓度。数据被标准化为抗体的最低浓度。
图15.FcγRIIb亲和力增强的变体抗IgE抗体抑制类别转换的IgE+B细胞。该图显示在用IL-4孵育14天后从PBMC释放的IgE的浓度、抗CD40(α-CD40)激动剂抗体、抗CD79b BCR交联抗体以及所示抗体的不同浓度。数据被标准化为抗体的最低浓度。
图16.FcγRIIb亲和力增强的变体抗IgE抗体抑制类别转换的IgE+B细胞。该图显示在用IL-4孵育14天后从PBMC释放的IgE的浓度、抗CD40(α-CD40)激动剂抗体、抗mu BCR交联抗体以及所示抗体的不同浓度。数据被标准化为抗体的最低浓度。
图17.ADCC和ADCP效应子功能增强的变体抗IgE抗体抑制类别转换的IgE+B细胞。该图显示在用IL-4孵育14天后从PBMC释放的IgE的浓度、抗CD40(α-CD40)激动剂抗体、抗CD79b BCR交联抗体以及所示抗体的不同浓度。
图18.ADCC和ADCP效应子功能增强的变体抗IgE抗体抑制类别转换的IgE+B细胞。该图显示在用IL-4孵育14天后从PBMC释放的IgE的浓度、抗CD40(α-CD40)激动剂抗体、抗mu BCR交联抗体以及所示抗体的不同浓度。
图19.测试抗IgE抗体活性的huPBL-SCID体内研究方案。所示天数反映对Der p 1特异性IgE抗体测试不作为(postive)的供体的PBMC植入后天数。Der p 1接种表示用Der p 1抗原接种。
图20.每个治疗组的huPBL-SCID体内模型的总血清IgG水平。所示天数(7、23和37)反映图19方案中所示的抽血。PBS指示未治疗的媒介物组,奥马珠单抗指示用奥马珠单抗_IgG1治疗的组,并且3 H1L1 MaE11组指示用人源化MaE11治疗的组,包括WT IgG1(IgG1)、S267E/L328F变体(IIbE)或G236R/L328R(Fc-KO)Fc区。
图21.每个治疗组的huPBL-SCID体内模型的总血清IgG水平。所示天数(7、23和37)反映图19方案中所示的抽血。PBS指示未治疗的媒介物组,奥马珠单抗指示用奥马珠单抗_IgG1治疗的组,并且3 H1L1 MaE11组指示用人源化MaE11治疗的组,包括WT IgG1(IgG1)、S267E/L328F变体(IIbE)或G236R/L328R(Fc-KO)Fc区。ELISA方法的定量限是31.6ng/mL,低于该限制的样品在图中被报告为31.6ng/mL。
示例性实施方案详述
本文描述了模拟B细胞上膜锚定IgE与FcγRIIb共衔接的抑制效应的共衔接分子。例如,本文描述了被设计为使Fc结构域以达~430倍更大亲和力结合FcγRIIb的变体抗IgE抗体。相对于天然IgG1,FcγRIIb结合增强的(IIbE)变体强烈抑制BCR诱导的钙动员和在原代人IgE+B细胞中的存活。使用单个分子,例如通过相关IgE BCR和FcγRIIb的共衔接来抑制B细胞功能的抗体,可以代表治疗IgE介导的疾病的新方法。IgE介导的疾病的非限制性实例包括变应性应答和哮喘并且在下文更详细描述。
根据本公开内容的共衔接分子可以采取如下文更详细描述的多种构型。在一个实施方案中,共衔接分子包括以高亲和力结合IgE和FcγRIIb的免疫球蛋白。在该实施方案中,所述免疫球蛋白优选共衔接细胞表面上的膜锚定IgE和FcγRIIb,并且以低于约100nM的Kd结合。在另一实施方案中,共衔接分子是具有第一靶特异性区和第二靶特异性区的双特异性分子,其中所述第一靶特异性区结合IgE并且所述第二靶特异性区以低于约100nM的Kd结合FcγRIIb,尽管在一些实施方案中,其可以低于约10nM的Kd或低于约1nM的Kd结合FcγRIIb,并且在一些实施方案中可以低于100pM的Kd结合。在一个优选实施方案中,共衔接分子是双特异性抗体,并且第一和第二特异性区是Fv区,其中第一Fv区结合IgE,并且第二Fv区以低于约100nM的Kd结合FcγRIIb。在另一实施方案中,共衔接分子是包含Fc区的Fc融合体,其中所述Fc区以低于约100nM的Kd结合FcγRIIb。在该实施方案中,免疫球蛋白的Fc融合配偶体结合IgE。
本文描述了几个定义。此类定义意思是涵盖语法等同物。
本文使用的″ADCC″或″抗体依赖性细胞介导的细胞毒性″意思是细胞介导的反应,其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上结合的抗体并随后引起靶细胞的溶胞。
本文使用的″ADCP″或抗体依赖性细胞介导的吞噬作用意思是细胞介导的反应,其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上结合的抗体并随后引起靶细胞的吞噬。
本文“氨基酸修饰”意思是多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。本文“氨基酸取代”或“取代”意思是亲本多肽序列中特定位置的氨基酸被另一种氨基酸所替代。例如,取代S267E指变体多肽,在此例中指其中位置267的丝氨酸被谷氨酸替代的恒定重链变体。本文使用的“氨基酸插入”或“插入”意思是在亲本多肽序列的特定位置添加氨基酸。本文使用的“氨基酸缺失”或“缺失”意思是去除在亲本多肽序列中特定位置的氨基酸。
本文″抗体″意思是由一个或多个多肽组成的蛋白,基本上由公知免疫球蛋白基因的全部或部分所编码。例如在人中的公知免疫球蛋白基因包括一起构成无数可变区基因的kappa(κ)、lambda(λ)和重链遗传基因座,以及分别编码IgM、IgD、IgG(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgE和IgA(IgA1和IgA2)同种型的恒定区基因mu(υ)、delta(δ)、gamma(γ)、sigma(σ)和alpha(α)。本文的抗体意思是包括全长抗体和抗体片段,并且可以指来自任何生物体的天然抗体、工程化抗体或为实验、治疗或其他目的而重组产生的抗体。
本文使用的″氨基酸″和″氨基酸身份″意思是可以在特定位置存在的20个天然存在的氨基酸之一或任何非天然类似物。
本文使用的″CD32b+细胞″或″FcγRIIb+细胞″意思是表达CD32b(FcγRIIb)的任何细胞或细胞类型。CD32b+细胞包括但不限于B细胞、血浆细胞、树突细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞或嗜酸性粒细胞。
本文使用的″IgE+细胞″意思是表达IgE的任何细胞或细胞类型。在本发明优选实施方案中,IgE+细胞表达膜锚定IgE(mIgE)。IgE+细胞包括但不限于B细胞和血浆细胞。
本文使用的″CDC″或″补体依赖性细胞毒性″意思是其中一个或多个补体蛋白组分识别靶细胞上结合的抗体并随后引起靶细胞溶胞的反应。
“共衔接分子”或语法等同物意思是能够结合IgE和FcγRIIb的双官能分子,其中所述分子与细胞表面上FcγRIIb结合的Kd低于约100nM,导致同时结合IgE和FcγRIIb。
本文定义的抗体“恒定区”意思是抗体中由轻链或重链免疫球蛋白恒定区基因之一编码的区域。本文使用的″恒定轻链″或″轻链恒定区″意思是抗体中由kappa(Cκ)或lambda(Cλ)轻链编码的区域。恒定轻链通常包含单个结构域,并且如本文定义指Cκ或Cλ的位置108-214,其中编号是根据EU指数。本文使用的″恒定重链″或″重链恒定区″意思是抗体中由分别确定抗体同种型为IgM、IgD、IgG、IgA或IgE的mu、delta、gamma、alpha或epsilon基因编码的区域。对于全长IgG抗体,本文定义的恒定重链指CH1结构域的N端至CH3结构域的C端,因此包括位置118-447,其中编号是根据EU指数。
本文使用的″效应子功能″意思是由抗体Fc区与Fc受体或配体的相互作用所产生的生化事件。效应子功能包括FcγR介导的效应子功能,例如ADCC和ADCP,补体介导的效应子功能例如CDC。
本文使用的″效应细胞″意思是表达一个或多个Fc和/或补体受体并介导一种或多种效应子功能的免疫系统的细胞。效应细胞包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、B细胞、大颗粒淋巴细胞、朗格汉斯细胞、天然杀伤细胞(NK)细胞和γδT细胞,并且可以来自任何生物体,包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。
本文使用的“Fab”或“Fab区”意思是包含VH、CH1、VH和CL免疫球蛋白结构域的多肽。Fab可以指分离的该区域,或者全长抗体或抗体片段环境中的该区域。
本文使用的″Fc″或″Fc区″意思是包含抗体恒定区的多肽(不包括第一恒定区免疫球蛋白结构域)和在一些情况下部分铰链。因此,Fc指IgA、IgD和IgG的后两个恒定区免疫球蛋白结构域和IgE和IgM的后三个恒定区免疫球蛋白结构域以及这些结构域N端的柔性铰链。对于IgA和IgM,Fc可以包括J链。对于IgG,Fc包含免疫球蛋白结构域Cgamma2和Cgamma3(Cγ2和Cγ3)以及Cgammal(Cγ1)和Cgamma2(Cγ2)之间的铰链。尽管Fc区的边界可以变化,但人IgG重链Fc区通常被定义为包含其羰基末端的残基C226或P230,其中编号是根据如Kabat的EU指数。Fc可以指分离的该区域,或者在Fc多肽环境中的该区域,如下文所述。
本文使用的″Fc多肽″意思是包括Fc区的全部或部分的多肽。Fc多肽包括抗体、Fc融合体、分离的Fc和Fc片段。免疫球蛋白可以是Fc多肽。
本文使用的″Fc融合体″意思是其中一个或多个多肽可操作连接于Fc的蛋白。Fc融合体在本文意思是与现有技术中使用的术语″免疫黏附素″、″Ig融合体″、″Ig嵌合体″和″受体球蛋白″(有时有破折号)(Chamow等,1996,Trends Biotechnol 14:52-60;Ashkenazi等,1997,Curr Opin Immunol9:195-200,两者通过引用整体并入本文)同义。Fc融合体组合了免疫球蛋白的Fc区与融合配偶体,融合配偶体一般可以是任何蛋白、多肽或小分子。Fc融合体的非Fc部分(即,融合配偶体)的作用是介导靶结合,因此其在功能上与抗体可变区类似。实际上任何蛋白或小分子可以连接至Fc以产生Fc融合体。蛋白融合配偶体可以包括但不限于受体的靶结合区、黏附分子、配体、酶、细胞因子、趋化因子或者一些其他蛋白或蛋白结构域。小分子融合配偶体可以包括使Fc融合体导向治疗靶的任何治疗剂。此类靶可以是疾病中涉及的任何分子,例如细胞外受体。
本文使用的“Fc gamma受体”或“FcγR”意思是结合IgG抗体Fc区并基本上由FcγR基因编码的蛋白家族的任何成员。人中,该家族包括但不限于FcγRI(CD64),包括同种型FcγRIa、FcγRib和FcγRIc;FcγRII(CD32),包括同种型FcγRIIa(包括异型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc;以及FcγRIII(CD16),包括同种型FcγRIIIa(包括异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)(Jefferis等,2002,Immunol Lett 82:57-65,通过引用整体并入),以及任何未发现的人FcγR或FcγR同种型或异型。FcγR可以来自任何生物体,包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。小鼠FcγR包括但不限于FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)和FcγRIII-2(CD16-2),以及任何未发现的小鼠FcγR或FcγR同种型或异型。
本文使用的“Fc配体”或“Fc受体”意思是来自任何生物体的结合抗体的Fc区以形成Fc-配体复合物的分子,例如多肽。Fc配体包括但不限于FcγR、FcγR、FcγR、FcRn、C1q、C3、甘露聚糖结合凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌蛋白A、链球菌蛋白G和病毒FcγR。Fc配体还包括Fc受体同系物(FcRH),其是与FcγR同源的Fc受体家族(Davis等,2002,ImmunologicalReviews 190:123-136)。Fc配体可以包括未发现的结合Fc的分子。
本文使用的″全长抗体″意思是构成抗体天然生物形式的结构,包括可变区和恒定区。例如,在大多数哺乳动物中,包括人和小鼠,IgG同种型的全长抗体是四聚体,并且由两个免疫球蛋白链的两个相同对组成,每对具有一个轻链和一个重链,每个轻链包含免疫球蛋白结构域VL和CL,并且每个重链包含免疫球蛋白结构域VH、Cγ1、Cγ2和Cγ3。在一些哺乳动物中,例如在骆驼和羊驼中,IgG抗体可以由仅两个重链组成,每个重链包含与Fc区连接的可变结构域。
本文″免疫球蛋白″意思是包含基本由免疫球蛋白基因编码的一个或多个多肽的蛋白。免疫球蛋白包括但不限于抗体(包括双特异性抗体)和Fc融合体。免疫球蛋白可以具有许多结构形式,包括但不限于全长抗体、抗体片段和个体免疫球蛋白结构域。
本文使用的″免疫球蛋白(Ig)结构域″意思是作为由蛋白结构领域技术人员确认的不同结构实体存在的免疫球蛋白。Ig结构域通常具有特征的β-夹心折叠拓扑结构。抗体的IgG同种型中已知的Ig结构域是VH Cγ1、Cγ2、Cγ3、VL和CL。
本文使用的″IgG″或″IgG免疫球蛋白″或“免疫球蛋白G”意思是属于基本上由公知免疫球蛋白gamma基因编码的抗体类别的多肽。在人中,该类包括亚类或同种型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
本文使用的″IgE″或″IgE免疫球蛋白″或“免疫球蛋白E”意思是属于基本上由公知免疫球蛋白epsilon基因编码的抗体类别的多肽。IgE可以是膜锚定的(mIgE),或非膜锚定的,本文还称为循环IgE。
细胞的“抑制”或语法等同物意思是预防或减少靶向细胞的激活、增殖、成熟或分化。
本文使用的″同种型″意思是由其恒定区的化学和抗原特征定义的免疫球蛋白的任何亚类。已知的人免疫球蛋白同种型有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD和IgE。
本文的“修饰”意思是蛋白、多肽、抗体或免疫球蛋白的物理、化学或序列性质的改变。本文描述的修饰包括氨基酸修饰和糖形修饰。
本文使用的“糖形修饰”或“修饰的糖形”或“工程化糖形”意思是与蛋白例如抗体共价连接的糖类组合物,其中所述糖类组合物化学上不同于亲本蛋白。修饰的糖形通常指不同的糖类或寡糖;因此,例如,Fc变体可以包括修饰的糖形。可选地,修饰的糖形可以指包括不同糖类或寡糖的Fc变体。
本文使用的″亲本多肽″、″亲本蛋白″、″亲本免疫球蛋白″、″前体多肽″、″前体蛋白″或″前体免疫球蛋白″意思是未修饰的多肽、蛋白或免疫球蛋白,其随后被修饰而产生变体,例如,用作本文描述的至少一种氨基酸修饰的模板和/或基础的任何多肽、蛋白或免疫球蛋白。亲本多肽可以是天然存在的多肽或者天然存在多肽的变体或工程化形式。亲本多肽可以指多肽本身、包括亲本多肽的组合物、或者编码其的氨基酸序列。因此,本文使用的″亲本Fc多肽″意思是被修饰而产生变体Fc多肽的Fc多肽,并且本文使用的″亲本抗体″意思是被修饰而产生变体抗体的抗体(例如,亲本抗体可以包括但不限于包括天然存在的Ig的恒定区的蛋白)。
本文使用的″位置″意思是蛋白序列中的定位。位置可以顺序编号或者根据已建立的形式编号,例如Kabat描述的EU指数。例如,位置297是人抗体IgG1的一个位置。
本文使用的″多肽″或″蛋白″意思是至少两个共价连接的氨基酸,其包括蛋白、多肽、寡肽和肽。
本文使用的″残基″意思是蛋白中的位置及其相关的氨基酸身份。例如,天冬酰胺297(还称为Asn297,也称为N297)是人抗体IgG1的一个残基。
本文使用的″靶抗原″意思是由给定抗体的可变区结合的分子,或者Fc融合体的融合配偶体。靶抗原可以是蛋白、糖类、脂质或其他化合物。据称抗体或Fc融合体对于给定靶抗原而言是“特异性的”,根据对所述靶抗原具有亲和力。
本文使用的″靶细胞″意思是表达靶抗原的细胞。
本文使用的″可变区″意思是包括一个或多个基本上由Vκ、Vλ和/或VH基因的任何一个编码的Ig结构域的免疫球蛋白,Vκ、Vλ和/或VH基因分别构成kappa、lambda和重链免疫球蛋白遗传基因座。
本文使用的″变体多肽″、″多肽变体″或″变体″意思是由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本多肽序列的多肽序列。亲本多肽可以是天然存在的或者是野生型(WT)的多肽,或者可以是WT多肽的修饰形式。变体多肽可以指多肽本身,包含多肽的组合物或者编码其的氨基序列。在一些实施方案中,本文公开的变体多肽(例如,变体免疫球蛋白)与亲本多肽相比可以具有至少一个氨基酸修饰,例如约1个至约10个氨基酸修饰、约1个至约5个氨基酸修饰,等等。本文的变体多肽可以具有与亲本多肽序列至少约80%的同源性,例如至少约90%的同源性、95%的同源性,等等。因此,本文使用的″Fc变体″或″变体Fc″意思是由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本Fc序列的Fc序列。Fc变体可以仅包括Fc区,或者可以存在于抗体、Fc融合体、分离的Fc、Fc片段或基本由Fc编码的其他多肽的环境中。Fc变体可以指Fc多肽本身、包含Fc变体多肽的组合物、或者编码其的氨基酸序列。本文使用的″Fc多肽变体″或″变体Fc多肽″意思是由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本Fc多肽的Fc多肽。本文使用的″蛋白变体″或″变体蛋白″意思是由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本蛋白的蛋白。本文使用的″抗体变体″或″变体抗体″意思是由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本抗体的抗体。本文使用的″IgG变体″或″变体IgG″意思是由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本IgG的抗体。本文使用的″免疫球蛋白变体″或″变体免疫球蛋白″意思是由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本免疫球蛋白序列的免疫球蛋白序列。
本文″野生型”或”WT″意思是天然存在的氨基酸序列或核苷酸序列,包括等位基因变异。WT蛋白、多肽、抗体、免疫球蛋白、IgG等具有没有被有意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。
共衔接分子
如本文所述,共衔接分子是双官能分子,能够结合细胞表面上的FcγRIIb和IgE。这些分子可以采取本文更详细描述的多种构型。优选地,共衔接分子是蛋白质性质的,尽管这不是必须的。在一些实施方案中,共衔接分子可以是双官能分子,其中FcγRIIb和/或IgE的特异性由例如小分子、核酸和/或多肽赋予。优选地,共衔接分子以低于约100nM的Kd结合FcγRIIb。在一个优选实施方案中,共衔接分子包括以高亲和力结合IgE和FcγRIIb的免疫球蛋白。在该实施方案中,免疫球蛋白优选共衔接细胞表面上的膜锚定IgE和FcγRIIb。在另一实施方案中,共衔接分子是具有第一靶特异性区和第二靶特异性区的双特异性分子,其中所述第一靶特异性区结合IgE,并且所述第二靶特异性区以低于约100nM的Kd结合FcγRIIb。在一个优选实施方案中,共衔接分子是双特异性抗体,并且第一和第二靶特异性区是Fv区,其中第一Fv区结合IgE,并且第二Fv区以低于约100nM的Kd结合FcγRIIb。在另一实施方案中,共衔接分子是包括Fc区的Fc融合体,其中所述Fc区以低于约100nM的Kd结合FcγRIIb。在该实施方案中,免疫球蛋白的Fc融合配偶体结合IgE。
在一个实施方案中,共衔接分子是双官能分子,其中第一区结合IgE,并且第二区以低于约100nM的Kd结合FcγRIIb。实际上,任何蛋白、小分子或核酸(例如适体)可以连接以产生双官能结合分子,并且可以包括本文所描述的连接体。在一个优选实施方案中,蛋白融合配偶体可以包括但不限于抗体的可变区、受体的靶结合区、黏附分子、配体、酶、细胞因子、趋化因子或一些其他蛋白或蛋白结构域。小分子融合配偶体可以包括使共衔接分子导向靶抗原的任何剂,例如IgE。例如,在优选实施方案中,共衔接分子可以包括FcγRI或FcγRII/CD23作为融合配偶体。在优选实施方案中,免疫球蛋白用作共衔接分子。
免疫球蛋白
如本文所述,免疫球蛋白是共衔接分子的一个优选组分并且可以是抗体、Fc融合体、分离的Fc、Fc片段或Fc多肽。在一个实施方案中,免疫球蛋白是抗体。如下文更详细描述的,免疫球蛋白用作双官能分子,其中Fv区结合IgE并且Fc区以低于约100nM的Kd结合FcγRIIb。此外,抗体用于Fc融合体或双官能抗体,如下所描述。
抗体是结合特异性抗原的免疫蛋白。在大多数哺乳动物(包括人和小鼠)中,抗体由成对的多肽重链和多肽轻链构成。轻链和重链可变区在不同抗体中显示显著的序列多样性,并且负责结合靶抗原。每个链由个体免疫球蛋白(Ig)结构域构成,因此,通用术语免疫球蛋白用于此类蛋白。
传统抗体结构单元通常包括四聚体。每个四聚体通常由相同的两对多肽链构成,每对具有一个“轻”(通常具有约25kDa的分子量)和一个“重”链(通常具有约50-70kDa的分子量)。人轻链被分类为kappa轻链和lambda轻链。重链被分类为mu、delta、gamma、alpha或epsilon,分别将抗体亚型确定为IgM、IgD、IgG、IgA或IgE。IgG具有几个亚类,包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有亚类,包括但不限于IgM1和IgM2。IgA具有几个亚类,包括但不限于IgA1和IgA2。因此,本文使用的“同种型”意思是由其恒定区的化学和抗原特征定义的免疫球蛋白的任何类和亚类。已知的人免疫球蛋白同种型有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM1、IgM2、IgD和IgE。
轻链和重链的每一个由两个不同的区组成,被称为可变区和恒定区。IgG重链由四个免疫球蛋白结构域组成,四个免疫球蛋白从N端到C端以顺序VH-CH1-CH2-CH3连接,分别称为重链可变结构域、重链恒定结构域1、重链恒定结构域2和重链恒定结构域3(还称为VH-Cγ1-Cγ2-Cγ3,分别称为重链可变结构域、恒定gamma 1结构域、恒定gamma 2结构域和恒定gamma 3结构域)。IgG轻链由两个免疫球蛋白结构域组成,两个免疫球蛋白从N端到C端以顺序VL-CL连接,分别称为轻链可变结构域和轻链恒定结构域。恒定区显示较少的序列多样性,并且负责结合许多天然蛋白以引发重要的生化事件。这些抗体类别之间的区别特征是它们的恒定区,尽管可变区可能存在细微差异。
抗体可变区含有分子的抗原结合决定簇,因此决定了抗体对其靶抗原的特异性。可变区如此命名是因为它是与相同类别内其他抗体的序列最不同的。每个链的氨基末端部分包括约100至110或更多氨基酸的可变区,主要负责抗原识别。在可变区中,重链和轻链V结构域的每一个有三个环聚集形成抗原结合位点。每个环被称为互补决定区(下文称为“CDR”),其中氨基酸序列变化是最显著的。共有6个CDR,每个重链和轻链各有三个,命名为H CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3。CDR外的可变区被称为构架区(FR)。尽管不如CDR多样,序列变化性也确实存在于不同抗体的FR区。总之,抗体的该特征结构提供了稳定的支架(FR区),在其基础上,实质的抗原结合多样性(CDR)可以由免疫系统发掘以获得对多种抗原的特异性。许多高分辨结构可用于来自不同生物体的多种可变区片段,一些是未结合的并且一些是与抗原复合的。抗体可变区的序列和结构特征公开于例如Morea等,1997,Biophys Chem68:9-16;Morea等,2000,Methods 20:267-279(在此通过引用并入),而抗体的保守特征公开于例如Maynard等,2000,Annu Rev Biomed Eng 2:339-376(在此通过引用并入)。
每个链的羧基末端部分确定了主要负责效应子功能的恒定区。在免疫球蛋白的IgG亚类中,重链中存在几个免疫球蛋白结构域。本文″免疫球蛋白(Ig)结构域″意思是具有不同四聚结构的免疫球蛋白区域。在本文描述的实施方案中感兴趣的是重链结构域,包括恒定重链(CH)结构域和铰链区。在IgG抗体上下文中,IgG同种型各自具有三个CH区。因此,IgG上下文中″CH″结构域如下:″CH1″指根据Kabat的EU指数的位置118-220。″CH2″指根据Kabat的EU指数的位置237-340,并且″CH3″指根据Kabat的EU指数的位置341-447。
重链的另一个重要区域是铰链区。本文“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”或“免疫球蛋白铰链区”意思是包含抗体的第一恒定结构域与第二恒定结构域之间的氨基酸的柔性多肽。结构上,IgG CH1结构域在EU位置220结束,而IgG CH2结构域在残基EU位置237结束。因此,对于IgG,抗体铰链在本文被定义为包括位置221(IgG1中D221)至236(IgG1中G236),其中编号是根据Kabat的EU指数。在一些实施方案中,例如在Fc区上下文中,包括“下铰链”,“下铰链”一般指位置226或230至236。
在本文描述的实施方案中,感兴趣的是Fc区。本文使用的″Fc″或″Fc区″意思是包括抗体恒定区的多肽(不包括第一恒定区免疫球蛋白结构域)和在一些情况下部分铰链。因此,Fc指IgA、IgD和IgG的后两个恒定区免疫球蛋白结构域和IgE和IgM的后三个恒定区免疫球蛋白结构域以及这些结构域N端的柔性铰链。对于IgA和IgM,Fc可以包括J链。对于IgG,Fc包含免疫球蛋白结构域Cgamma2和Cgamma3(Cγ2和Cγ3)以及Cgamma1(Cγ1)和Cgamma2(Cγ2)之间的低铰链区。尽管Fc区的边界可以变化,但人IgG重链Fc区通常被定义为包含其羰基末端的残基C226或P230,其中编号是根据如Kabat的EU指数。Fc可以指分离的该区域,或者在Fc多肽环境中的该区域,如下文所述。本文使用的″Fc多肽″意思是包括Fc区的全部或部分的多肽。Fc多肽包括抗体、Fc融合体、分离的Fc和Fc片段。
抗体的Fc区与许多Fc受体和配体相互作用,赋予一系列称为效应子功能的重要功能性能力。对于IgG Fc区,Fc包括Ig结构域Cγ2和Cγ3以及导入Cγ2的N端铰链。IgG类别的Fc受体的重要家族是Fc gamma受体(FcγR)。这些受体介导抗体与免疫系统细胞臂之间的通信(Raghavan等,1996,Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220;Ravetch等,2001,Annu RevImmunol 19:275-290,两者通过引用整体并入)。在人中,该蛋白家族包括FcγRI(CD64),包括异构体FcγRIa、FcγRib和FcγRIc;FcγRII(CD32),包括异构体FcγRIIa(包括异型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc;和FcγRIII(CD16),包括同种型FcγRIIIa(包括异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)(Jefferis等,2002,Immunol Lett 82:57-65,在此通过引用整体并入)。这些受体通常具有介导与Fc结合的细胞外结构域、跨膜区和可以介导细胞内一些信号传导事件的细胞内结构域。这些受体在许多免疫细胞中表达,包括单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、B细胞、大颗粒淋巴细胞、朗格汉斯细胞、天然杀伤细胞(NK)细胞和γγT细胞。Fc/FcγR复合体的形成将这些效应细胞募集到结合抗原的位点,通常导致细胞内信号传导事件和重要的随后免疫应答,例如释放炎症介质、B细胞激活、胞吞、吞噬和细胞毒性攻击。介导细胞毒性和吞噬效应子功能的能力是抗体破坏靶向细胞的潜在机制。其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上结合抗体并随后引起靶细胞溶胞的细胞介导的反应被称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)(Raghavan等,1996,Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220;Ghetie等,2000,Annu Rev Immunol18:739-766;Ravetch等,2001,Annu Rev Immunol 19:275-290,两者通过引用整体并入)。其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上结合抗体并随后引起靶细胞吞噬的细胞介导的反应被称为抗体依赖性细胞介导的吞噬(ADCP)。
不同的IgG亚类对FcγR具有不同的亲和力,IgG1和IgG3通常比IgG2和IgG4具有明显更好的对受体的结合(Jefferis等,2002,Immunol Lett82:57-65,在此通过引用并入本文)。FcγR以不同亲和力结合IgG Fc区。FcγRIIIa和FcγRIIIb的细胞外结构域是96%相同的,然而,FcγRIIIb不具有细胞内信号传导结构域。而且,FcγRI、FcγRIIa/c和FcγRIIIa是免疫复合物促发的激活的正调节物,特征为具有含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的细胞内结构域,而FcγRIIb具有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)并因此是抑制性的。因此,前者被称为激活受体,而FcγRIIb被称为抑制受体。不论亲和力和活性方面的这些差异,所有FcγR在Cγ2结构域的N末端和之前的铰链处结合Fc上相同的区域。这些相互作用是结构上被良好表征的(Sondermann等,2001,J Mol Biol 309:737-749,在此通过引用整体并入),已经分析了与人FcγRIIIb的细胞外结构域结合的人Fc的几种结构(pdb访问代码1E4K)(Sondermann等,2000,Nature406:267-273,在此通过引用整体并入)(pdb访问代码1IIS和1IIX)(Radaev等,2001,J Biol Chem 276:16469-16477,在此通过引用整体并入)。
Fc上重叠但分开的位点用作补体蛋白C1q的界面。以相同的方式,Fc/FcγR结合介导ADCC,Fc/C1q结合介导补体依赖性细胞毒性(CDC)。Cγ2与Cγ3结构域之间Fc上的位点介导与新生受体FcRn之间的相互作用,其结合将内吞的抗体从内体回收至血流(Raghavan等,1996,Annu Rev CellDev Biol 12:181-220;Ghetie等,2000,Annu Rev Immunol 18:739-766,两者通过引用整体并入)。该过程与由于全长分子的大尺寸而排除肾脏过滤相偶联,导致1至3周的有利的抗体血清半衰期。Fc与FcRn的结合还在抗体转运中起重要作用。Fc上FcRn的结合位点也是细菌蛋白A和G结合的位点。这些蛋白的紧密结合通常被开发为纯化抗体的工具,通常在蛋白纯化中采用蛋白A或蛋白G亲和色谱。这些区域、补体和FcRn/蛋白A结合区的保真性对于抗体的临床性质及其开发而言都是重要的。
Fc区的重要特征是发生在N297的保守的N连接糖基化。该糖类或有时被称为寡糖,对于抗体而言具有关键的结构合功能作用,并且是抗体必须使用哺乳动物表达系统来产生的主要原因之一。Fc与FcγR和C1q的有效结合需要该修饰,并且N297糖类的组成变化或其消除影响与这些蛋白的结合(Umana等,1999,Nat Biotechnol 17:176-180;Davies等,2001,Biotechnol Bioeng 74:288-294;Mimura等,2001,J Biol Chem276:45539-45547.;Radaev等,2001,J Biol Chem 276:16478-16483;Shields等,2001,J Biol Chem 276:6591-6604;Shields等,2002,J Biol Chem277:26733-26740;Simmons等,2002,J Immunol Methods263:133-147,全部在此通过引用整体并入)。
本文描述的实施方案的免疫球蛋白还可以是称为Fc融合体的抗体样蛋白(Chamow等,1996,Trends Biotechnol 14:52-60;Ashkenazi等,1997,CurrOpin Immunol 9:195-200,两者通过引用整体并入)。Fc融合体在本文意思是与现有技术中使用的术语″免疫黏附素″、″Ig融合体″、″Ig嵌合体″和″受体球蛋白″(有时有破折号)(Chamow等,1996,Trends Biotechnol 14:52-60;Ashkenazi等,1997,Curr Opin Immunol 9:195-200)同义。Fc融合体是其中一个或多个被称为“融合配偶体”的多肽可操作连接至Fc的蛋白。Fc融合体组合了抗体的Fc区及由此其有利的效应子功能和药代动力学与受体的靶结合区、配体或一些其他蛋白或蛋白结构域。后者的作用是介导靶识别,并因此其在功能上与抗体可变区类似。因此Fc融合体与抗体在结构和功能上的重叠,本公开内容中对抗体的讨论也延伸至Fc融合体。
实际上任何蛋白或小分子可以连接至Fc以产生Fc融合体。蛋白融合配偶体可以包括但不限于任何抗体的可变区、受体的靶结合区、黏附分子、配体、酶、细胞因子、趋化因子或者一些其他蛋白或蛋白结构域。小分子融合配偶体可以包括使Fc融合体导向靶抗原的任何剂。此类靶抗原可以是疾病中涉及的任何分子,例如细胞外受体。本文描述的实施方案的Fc融合体优选具有对IgE的特异性。例如,在优选实施方案中,本发明Fc融合体可以包括FcγRI or FcγRII/CD23作为融合配偶体。本发明Fc融合体优选在Fc区包含增强对FcγRIIb亲和力的一个或多个变体。
融合配偶体可以连接至Fc区的任何区,包括在N端或C端,或者在末端之间的一些残基。在一个实施方案中,融合配偶体在Fc区的N端或C端连接。许多连接体可以在本文描述的一些实施方案中用于将Fc区共价连接至融合配偶体。“连接体”、“连接体序列”、“间隔物”、“拴结序列”或其语法等同物在本文意思是连接两个分子并经常用于将两个分子置于构型的分子或分子组(例如单体或聚合物)。连接体是现有技术已知的;例如,同-或异-双官能连接体是公知的(参见,1994Pierce Chemical Company目录,有关交联剂的技术部分,155-200页,通过引用整体并入)。许多策略可以用于将分子共价连接在一起。这些包括但不限于蛋白或蛋白结构域的N端和C端之间的多肽连接,通过二硫键的连接,以及通过化学交联试剂的连接。在该实施方案的一个方面,连接体是肽键,通过重组技术活肽合成产生。连接体肽可以主要包括下述氨基酸残基:Gly、Ser、Ala或Thr。连接体肽应该具有足以连接两个分子的长度,连接方式使得它们保证相对彼此正确的构象,使得它们保持所需的活性。为此适合的长度包括至少一个但不超过50个氨基酸残基。在一个实施方案中,连接体长约1至30个氨基酸。在一个实施方案中,可以使用长为1至20个氨基酸的h连接体。有用的连接体包括甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n(提出为SEQ ID NO:1)、(GGGGS)n(提出为SEQ ID NO:2)和(GGGS)n(提出为SEQ ID NO:3),其中n是至少1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域技术人员知道的其他柔性连接体。可选地,许多非蛋白聚合物,包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物,可用作连接体,其可用于连接Fc区与融合配偶体。
还涵盖作为融合配偶体的Fc多肽。因此,本文描述的免疫球蛋白可以是多聚体Fc多肽,包括两个或多个Fc区。此类分子的优势在于为具有单个蛋白分子的Fc受体提供多个结合位点。在一个实施方案中,Fc区可以使用化学功能方法连接。例如,Fab和Fc可以通过源于铰链的半胱氨酸残基的硫醚键连接,产生诸如FabFc2的分子。Fc区可以使用二硫化物工程和/或化学交联来连接。在一个实施方案中,Fc区可以遗传连接。在一个实施方案中,免疫球蛋白中的Fc区遗传连接至产生的串联Fc区,描述于12/21/2004提交的题为“Fc polypeptides with novel Fc ligand binding sites”的USSN 11/022,289,通过引用整体并入。串联Fc多肽可以包括两个或多个Fc区,例如1至3个Fc区,两个Fc区。开发多个工程化构建体以获得具有最有利的结构和功能性质的同-或异-串联Fc区是有利的。串联Fc区可以是同-串联的Fc,即,一个同种型的Fc区与相同同种型的另一Fc区遗传融合。期望的是,因为在串联Fc多肽上存在多个FcγR、C1q和/或FcRn结合位点,可以增强效应子功能和/或药代动力学。在替代实施方案中,来自不同同种型的Fc区可以串联,称为异-串联Fc区。例如,因为靶向FcγR和FcαRI受体的能力,同时结合FcγR和FcαRI的免疫球蛋白可以提供显著的临床改善。
本文描述的实施方案的免疫球蛋白可以基本由属于任何抗体类别的免疫球蛋白基因编码。在某些实施方案中,本文公开的免疫球蛋白用于包括属于抗体IgG类别的序列的抗体或Fc融合体,包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。图1提供了这些人IgG序列的比对。在替代实施方案中,本文公开的免疫球蛋白用于包括属于IgA(包括亚类IgA1和IgA2)、IgD、IgE、IgG或IgM抗体类别的抗体或Fc融合体。本文公开的免疫球蛋白可以包括超过一个蛋白链,例如,可以是单体或寡聚体的抗体或Fc融合体,包括同-或异-寡聚体。
本文公开的免疫球蛋白可以基本上由来自任何生物体的基因编码,例如哺乳动物(包括但不限于人、啮齿类动物(包括但不限于小鼠和大鼠))、兔类(包括但不限于家兔和野兔)、骆驼属(包括但不限于骆驼、羊驼和单峰骆驼)和非人灵长类,包括但不限于原猴、阔鼻猴(新世界猴)、猕猴(旧世界猴)和类人动物,包括长臂猿和小猿和类人猿。在某些实施方案中,本文公开的免疫球蛋白可以基本上是人的。
如本领域公知的,人群中存在免疫球蛋白多态性。Gm多态性由IGHG1、IGHG2和IGHG3基因决定,IGHG1、IGHG2和IGHG3基因具有编码称为G1m、G2m和G3m异型的异型抗原决定簇的等位基因,G1m、G2m和G3m异型是人IgG1、IgG2和IgG3分子的标记(在gamma 4链上还没有发现Gm异型)。标记可以被分类为“异型(allotype)”和“同种异型(isoallotype)”。这些在不同血清学基础上是区别的,取决于同种型之间强序列同源性。异型是Ig基因等位基因形式规定的抗原决定簇。异型代表不同个体的重链或轻链的氨基酸序列的微笑差异。即使单个氨基酸差异可以产生异型决定簇,但在许多情况下,已经发生了几种氨基酸取代。异型是亚类等位基因之间的序列差异,抗血清藉以识别仅等位基因差异。同种异型是产生一个或多个其他同种型的非多态同源区共有的表位的一个同种型的等位基因并且因为该抗血清将与相关异型和相关同源同种型两者反应(Clark,1997,IgG effector mechanisms,Chem Immunol.65:88-110;Gorman&Clark,1990,Semin Immunol 2(6):457-66,两者通过引用整体并入)。
人免疫球蛋白的等位基因形式已经被良好表征(WHO Review of thenotation for the allotypic and related markers of human immunoglobulins.JImmunogen 1976,3:357-362;WHO Review of the notation for the allotypicand related markers of human immunoglobulins.1976,Eur.J.Immunol.6,599-601;Loghem E van,1986,Allotypic markers,Monogr Allergy 19:40-51,全部通过引用整体并入)。此外,其他多态性已经被表征(Kim等,2001,J.Mol.Evol.54:1-9,在此通过引用整体并入)。目前,18Gm异型是已知的:G1m(1,2,3,17)或G1m(a,x,f,z),G2m(23)或G2m(n),G3m(5,6,10,11,13,14,15,16,21,24,26,27,28)或G3m(b1,c3,b5,b0,b3,b4,s,t,g1,c5,u,V,g5)(Lefranc,等,The human IgG subclasses:molecular analysis of structure,function and regulation.Pergamon,Oxford,pp.43-78(1990);Lefranc,G.等,1979,Hum.Genet.:50,199-211,两者在此通过引用整体并入)。固定组合中固有的异型被称为Gm单元型。本文公开的免疫球蛋白可以基本上由任何免疫球蛋白基因的任何异型、同种异型或单元型编码。
本文公开的免疫球蛋白可以构成Fc多肽,包括但不限于抗体、分离的Fc、Fc片段和Fc融合体。在一个实施方案中,本文公开的免疫球蛋白是全长抗体,构成抗体的天然生物形式,包括可变区和恒定区。对于IgG同种型,全长抗体是四聚体并且由相同的两对免疫球蛋白链构成,每对具有一个轻链和一个重链,每个轻链包括免疫球蛋白结构域VL和CL,并且每个重链包括免疫球蛋白结构域VH、Cγ1、Cγ2和Cγ3。在另一实施方案中,本文公开的免疫球蛋白是分离的Fc区或Fc片段。
本文公开的免疫球蛋白可以是多种结构,包括但不限于抗体片段、双特异性抗体、微型抗体、结构域抗体、合成抗体(有时在本文称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、抗体融合体(有时称为“抗体缀合物”)以及各自的片段。
在一个实施方案中,抗体是抗体片段。特异性抗体片段包括但不限于(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段,(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段,(iii)由单个抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段;(iv)dAb片段,其由单个可变区组成,(v)分离的CDR区,(vi)F(ab′)2片段,包括两个连接的Fab片段的二价片段,(vii)单链Fv分子(scFv),其中VH结构域和VL结构域通过肽连接体连接,肽连接体允许两个结构域结合形成抗原结合位点,(viii)双特异性单链Fv二聚体,和(ix)″双抗体″或″三链抗体″,通过基因融合构建的多价或多特异性片段。抗体片段可以被修饰。例如,分子可以通过加入连接VH结构域和VL结构域的二硫键而被稳定。抗体形式和结构的实例描述于Holliger&Hudson,2006,NatureBiotechnology 23(9):1126-1136,和Carter 2006,Nature Reviews Immunology6:343-357以及其中引用的参考文献,全部明确通过引用并入。
在一个实施方案中,本文公开的抗体可以是多特异性抗体,由其是双特异性抗体,有时还称为“双抗体”。这些是结合两个(或多个)不同抗原的抗体。双抗体可以本领域已知的多种方式生产,例如化学制备或从杂交的杂交瘤制备。在一个实施方案中,抗体是微型抗体。微型抗体是最小化的抗体样蛋白,包括与CH3结构域结合的scFv。在一些情况下,scFv可以结合至Fc区,并且可以包括铰链的部分或全部。对于多特异性抗体的描述,参见Holliger&Hudson,2006,Nature Biotechnology23(9):1126-1136和其中引用的参考文献,全部明确通过引用并入。
非人抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体
如本领域公知的,抗体可变区可以构成来自多个物种的序列。在一些实施方案中,抗体可变区可以来自非人来源,包括但不限于小鼠、大鼠、家兔、骆驼、羊驼和猴。在一些实施方案中,支架组分可以是来自不同物种的混合物。这样,本文公开的抗体可以是嵌合抗体和/或人源化抗体。一般而言,“嵌合抗体”和“人源化抗体”指组合来自超过一个物种的区域的抗体。例如,“嵌合抗体”通常包括来自小鼠或其他非人物种的可变区和来自人的恒定区。
“人源化抗体”一般指已经将可变结构域构架区交换为人抗体中存在的序列的非人抗体。一般,在人源化抗体中,完整抗体,除了CDR,由人来源的多核苷酸编码或者与此类抗体相同,除了其CDR内。CDR的部分或全部由起源于非人生物体的核酸编码并被移植到人抗体可变区的β折叠构架中以产生抗体,其特异性由移植的CDR决定。此类抗体的产生描述于例如WO 92/11018,Jones,1986,Nature 321:522-525,Verhoeyen等,1988,Science 239:1534-1536。通常需要选择的接受体构架残基“回复突变”至相应的供体残基以重新获得在初始移植构建体中缺少的亲和力(美国专利No.5,693,762,通过引用整体并入。人源化抗体最佳地还包括至少一部分免疫球蛋白恒定区,通常是人免疫球蛋白的恒定区,因此通常包括人Fc区。人源化抗体还可以使用具有遗传工程免疫系统的小鼠产生。Roque等,2004,Biotechnol.Prog.20:639-654。用于人源化和重塑非人抗体的许多技术和方法是本领域公知的(参见Tsurushita&Vasquez,2004,Humanization ofMonoclonal Antibodies,Molecular Biology of B Cells,533-545,ElsevierScience(USA),以及其中引用的参考文献)。降低非人抗体可变区的免疫原性的人源化或其他方法可包括表面重构方法,如描述于例如Roguska等,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:969-973。在一个实施方案中,亲本抗体已经亲和力成熟,并且是本领域已知的。基于结构的方法可以用于人源化和亲合力成熟,例如描述于美国序列No.11/004,590。基于选择的方法可以用于人源化和/或亲和力成熟抗体可变区,即,增加可变区对其靶抗原的亲和力。其他人源化方法可以包括移植仅部分CDR,包括但不限于描述于USSN 09/810,502;Tan等,2002,J.Immunol.169:1119-1125;De Pascalis等,2002,J.Immunol.169:3076-3084中的方法。基于结构的方法可以用于人源化和亲合力成熟,例如描述于USSN 10/153,159和相关申请,全部通过引用整体并入。在某些变化中,抗体的免疫原性使用以下文献中描述的方法被减少:Lazar等,2007,Mol Immunol 44:1986-1998和2004年12月3日提交的题为″Methods of Generating Variant Proteins with Increased Host StringContent and Compositions Thereof″的USSN 11/004,590,通过引用整体并入。
在一个实施方案中,抗体是具有本文描述的至少一种修饰的全人抗体。″全人抗体″或″完全人抗体″指具有源于人染色体的抗体的基因序列的人抗体,具有本文描述的修饰。全人抗体可以例如使用转基因小鼠(Bruggemann等,1997,Curr Opin Biotechnol 8:455-458)或人抗体文库结合选择方法(Griffiths等,1998,Curr Opin Biotechnol 9:102-108)来获得。在一个实施方案中,人等价抗体可以如PCT/US09/41144所述计算机化产生,其通过引用并入本文。
抗IgE抗体
本文描述的免疫球蛋白结合IgE。本发明的抗IgE抗体可以包括已知或未知的任何可变区,其对IgE具有特异性。已知的抗IgE抗体包括但不限于鼠抗体MaE11、MaE13和MaE15,这些抗体的人源化和/或工程化形式,包括E25、E26和E27,特别是E25,还称为rhuMab-E25,还称为奥马珠单抗,例如在US6761889,US6329509,US20080003218A1,和Presta,LG等,1993,J Immunol 151:2623-2632(全部在此通过引用明确并入本文)中描述的那些。MaE11的优选工程化形式是本文实施例中描述的H1L1MaE11。可用于本发明的其他抗IgE包括鼠抗体TES-C21、嵌合TES-C21,还称为CGP51901(Corne,J等,1997,J Clin Invest 99:879-887;Racine-Poon,A等,1997,Clin Pharmcol Ther 62:675-690)和该抗体的人源化和/或工程化形式,包括但不限于CGP56901,还称为TNX-901,例如在Kolbinger,F等,1993,Protein Eng 6:971-980中描述的那些抗体。可用于本发明的其他抗IgE抗体描述于US6066718,US6072035,PCT/US04/02894,US5342924,US5091313,US5449760,US5543144,US5342924,和US5614611,其全部在此通过引用并入。其他有用的抗IgE抗体包括鼠抗体BSW17。可变区VH和VL结构域和这些抗体中一些的CDR的氨基酸序列提供于图5。
Fc变体和Fc受体结合性质
本文公开的免疫球蛋白可以包括Fc变体。Fc变体包括相对于亲本Fc多肽的一个或多个氨基酸修饰,其中氨基酸修饰提供一种或多种优化的性质。本文公开的Fc变体因为至少一个氨基酸修饰而在氨基酸序列上不同于其亲本。因此,本文公开的Fc变体与亲本相比具有至少一个氨基酸修饰。可选地,本文公开的Fc变体与亲本相比可以具有超过一个氨基酸修饰,例如与亲本相比具有约1至50个氨基酸修饰,例如约1至10个氨基酸修饰,约1至约5个氨基酸修饰,等等。因此,Fc变体的序列和亲本Fc多肽的序列基本上是同源的。例如,本文的变体Fc变体序列与亲本Fc变体序列将具有约80%的同源性,例如至少约90%同源性、至少约95%同源性、至少约98%同源性、至少约99%同源性,等等。本文公开的修饰包括氨基酸修饰,包括插入、缺失和取代。本文公开的修饰还包括糖形修饰。修饰可以使用分子生物学遗传进行,或者可以酶法或化学进行。
本文公开的Fc变体根据构成它们的氨基酸修饰来定义。因此,例如,S267E是相对于亲本Fc多肽具有取代S267E的Fc变体。同样,S267E/L328F定义了相对于亲本Fc多肽具有取代S267E和L328F的Fc变体。WT氨基酸的身份可以是未规定的,在这种情况下,前述变体被称为267E/328F。注意,取代被提供的顺序是任意的,也就是说,例如,267E/328F与328F/267E是相同的Fc变体,以此类推。除非另外指明,本文讨论的位置是根据EU指数或EU编号方案编号的(Kabat等,1991,Sequences of Proteinsof Immunological Interest,第5版,United States Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,在此通过引用整体并入)。EU指数或Kabat的EU指数或EU编号方案指EU抗体的编号(Edelman等,1969,ProcNatl Acad Sci USA 63:78-85,在此通过引用整体并入)。
在某些实施方案中,本文公开的Fc变体是基于人IgG序列,因此人IgG序列用作其他序列与之比较的“基础”序列,其他序列包括但不限于来自其他生物体的序列,例如啮齿类和灵长类序列。免疫球蛋白还可以包括来自其他免疫球蛋白类别例如IgA、IgE、IgGD、IgGM和类似物的序列。要考虑到,尽管本文公开的Fc变体在一种亲本IgG环境中被工程化,但是变体可以在另一种第二亲本IgG环境中被工程化或者被“转移”至另一种第二亲本IgG环境中。这是通过确定第一IgG和第二IgG之间“等同”或“相应”残基和取代来进行的,通常基于第一和第二IgG序列之间的序列或结构同源性。为了建立同源性,本文所列第一IgG的氨基酸序列与第二IgG的序列直接对比。使用本领域已知的同源比对程序的一种或多种(例如,使用物种之间的保守残基),允许必要的插入和缺失以保持比对(即,避免由于任意缺失和插入而消除保守残基),比对序列之后,确定了与第一免疫球蛋白的一级序列中特定氨基酸等同的残基。保守残基的比对可以保留100%的此类残基。然而,超过75%或少至50%的保守残基的比对也足以确定等同残基。等同残基还可以通过确定第一和第二IgG之间结构同源性来确定,结构同源性是在其结构已经确定的IgG的三级结构水平上。在这种情况下,等同残基被定义为亲本或前体的特定氨基酸残基的主链原子的两个或多个的原子坐标(N对N,CA对CA,C对C,和O对O)在比对之后在约0.13nm以内的那些。在另一实施方案中,等同残基在比对之后在约0.1nm以内。比对时在最佳模型已经被定向并定位以提供蛋白的非氢蛋白原子的原子坐标的最大重叠之后实现的。不论等同残基或对应残基如何被确定,并且不论其中制成IgG的亲本IgG的身份如何,所要表达的是本文公开的Fc变体可以被工程化入与Fc变体具有显著的序列或结构同源性的任何第二亲本IgG。因此,例如,如果变体抗体在亲本抗体是人IgG1的情况下被产生,通过使用上述方法或用于确定等同残基的其他方法,变体抗体可以被工程化于结合不同抗原的另一IgG1亲本抗体、人IgG2亲本抗体、人IgA亲本抗体、小鼠IgG2a或IgG2b亲本抗体及类似物中。同样,如上所述,亲本Fc变体的环境不影响将本文公开的Fc变体转移至其他亲本IgG的能力。
本文公开的Fc变体可以被优化多种Fc受体结合性质。被工程化或预测为表现一种或多种优化性质的Fc变体在本文称为“优化Fc变体”。可以被优化的性质包括但不限于增强或降低的对FcγR的亲和力。在一个实施方案中,本文公开的Fc变体被优化而具有增强的对抑制性受体FcγRIIb的亲和力。在其他实施方案中,本文公开的免疫球蛋白提供增强对FcγRIIb的亲和力,但对一种或多种激活FcγR降低的亲和力,包括例如FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa和/或FcγRIIIb。FcγR受体可以表达在来自任何生物体的细胞上,包括但不限于人、食蟹猴和小鼠。本文公开的Fc变体可以被优化而具有增强的对人FcγRIIb的亲和力。
如本文使用的,比亲本Fc多肽“更大的亲和力”或“提高的亲和力”或“增强的亲和力”或″更好的亲和力″意思是当结合测定中变体和亲本多肽的量基本相同时,Fc变体以比亲本Fc多肽显著更高的平衡结合常数(KA或Ka)或更低的平衡解离常数(KD或Kd)结合Fc受体。例如,具有提高的Fc受体结合亲和力的Fc变体与亲本Fc受体相比在Fc受体结合亲和力方面可以表现出约5倍至约1000倍,例如约10倍至约500倍的提高,其中Fc受体结合亲和力由本领域技术人员通过例如本文公开的结合方法测定,包括但不限于Biacore。因此,如本文使用的,与亲本Fc多肽相比“降低的亲和力”意思是Fc变体以比亲本Fc多肽显著更低的KA或更高的KD结合Fc受体。更大或降低的亲和力还可以相对于亲和力的绝对水平来确定。例如,根据本文数据,WT(天然)IgG1以约2μM或约2000nM的亲和力结合FcγRIIb。而且,本文描述的一些Fc变体以高于WT IgG1约10倍的亲和力结合FcγRIIb。如本文公开的,更大或增强的亲和力表示具有低于约100nM,例如约0nM-约100nM、约1-约100nM或低于约1nM的KD。
本发明抗IgE抗体优选具有对FcγRIIb的高亲和力。本文的高亲和力意思是抗体与FcγRIIb之间的相互作用亲和力强于100nM。也就是说,抗体与FcγRIIb结合的平衡解离常数Kd低于100nM。
在一个实施方案中,Fc变体提供相对于一种或多种激活受体选择性增强的对FcγRIIb的亲和力。选择性增强的亲和力意思是Fc变体与亲本Fc多肽相比对FcγRIIb具有相对于激活受体提高的亲和力,但是与亲本Fc多肽相比具有降低的对激活受体的亲和力,或者意思是Fc变体与亲本Fc多肽相比对FcγRIIb和激活受体两者具有提高的亲和力,然而,亲和力的提高对于FcγRIIb比对于激活受体更大。在替代实施方案中,Fc变体降低或消除对一种或多种激活FcγR的结合,降低或消除对一种或多种补体蛋白的结合,降低或消除一种或多种FcγR介导的效应子功能,和/或降低或消除一种或多种补体介导的效应子功能。
FcγR的不同多态形式的存在提供了另一种参数,其影响本文公开的Fc变体的治疗效用。而不同类别FcγR的给定Fc变体的特异性和选择性显著影响Fc变体靶向给定抗原以治疗给定疾病的能力,Fc变体对这些受体的不同多态形式的特异性或选择性可能部分地决定哪些研究或临床前实验可能适合试验,以及最终哪些患者群体可能或可能不响应于治疗。因此,本文公开的Fc变体对Fc受体多态形式(包括但不限于FcγRIIa、FcγRIIIa和类似物)的特异性或选择性可用于指导选择有效的研究和临床前实验、临床试验设计、患者选择、剂量依赖性和/或有关临床试验的其他方面。
本文公开的Fc变体可以包括调节与非FcγR的Fc受体(包括但不限于补体蛋白、FcRn和Fc受体同系物(FcRH))相互作用的修饰。FcRH包括但不限于FcRH1、FcRH2、FcRH3、FcRH4、FcRH5和FcRH6(Davis等,2002,Immunol.Reviews 190:123-136)。
决定给定Fc变体治疗给定疾病的最有益的选择性的重要参数是Fc变体的环境。因此,给定Fc变体的Fc受体选择性或特异性将提供不同的性质,取决于其是否与偶联的融合配偶体构成抗体、Fc融合体或Fc变体。在一个实施方案中,本文公开的Fc变体的Fc受体特异性将决定其治疗效用。给定Fc变体针对治疗目的的效用将取决于靶抗原的表位或形式以及治疗的疾病或适应症。对于一些靶和适应症,更大的FcγRIIb亲和力和降低的激活FcγR介导的效应子功能可能是有益的。对于其他靶抗原和治疗应用,增加对FcγRIIb的亲和力或者增加对FcγRIIb和激活受体的亲和力可能是有益的。
优化抗IgE抗体活性的方式
本文描述了用于改变对一种或多种FcγR的亲和力的方式。在一个优选实施方案中,对抑制性受体FcγRIIb的亲和力被改变,从而改变了免疫球蛋白介导一种或多种FcγRIIb介导的抑制性效应子功能的能力。本发明方式包括氨基酸修饰(例如,用于优化功能的位置方式,用于优化功能的取代方式,等)和糖形修饰(例如,用于糖形修饰的方式)。
氨基酸修饰
本文公开了包括氨基酸修饰的免疫球蛋白,其中所述修饰改变了对一种或多种FcγR的亲和力。优选地,所述氨基酸修饰提高了对FcγRIIb的亲和力。然而,在一些实施方案中,修饰可以提高对一种或多种激活受体的亲和力,所述激活受体例如FcγRI、FcγRIIa和FcγRIIIa。用于改变对FcγR结合的修饰描述于2005年5月5日提交的题为“Optimized Fc variants”的USSN 11/124,620和2008年5月30日提交的题为“Methods andCompositions for Inhibiting CD32b Expressing Cells”的USSN 12/156,183,两者在此通过引用并入本文。
如本文所述,用于优化抗IgE抗体的位置方式包括但不限于在一个或多个重链恒定区位置(例如,在位置:234、235、236、237、239、265、266、267、268、298、325、326、327、328、329、330、331和332)的氨基酸修饰,其允许免疫球蛋白FcγRIIb结合性质、效应子功能和抗体的潜在临床性质的修饰。
特别地,例如通过改变对FcγRIIb亲和力而优化抗IgE抗体活性的取代方式包括但不限于在一个或多个重链恒定区位置的取代,例如在下述重链恒定区位置的氨基酸取代的一个或多个:234、235、236、237、239、265、266、267、268、298、325、326、327、328、329、330、331和332,其中编号是根据EU指数。在一个实施方案中,取代方式包括与亲本Fc区相比至少一个(例如两个或三个)取代,其中所述修饰在选自由根据EU指数的234、235、236、237、239、266、267、268、325、326、327、328和332组成的组的位置。在一个实施方案中,取代方式包括在选自由根据EU指数的35、236、239、266、267、268和328组成的组的位置的一个或多个(例如两个或多个)取代。
在一个实施方案中,所述取代方式是选自由234F、234G、234I、234K、234N、234P、234Q、234S、234V、234W、234Y、234D、234E、235A、235E、235H、235I、235N、235P、235Q、235R、235S、235W、235Y、235D、235F、235T、236D、236F、236H、236I、236K、236L、236M、236P、236Q、236R、236S、236T、236V、236W、236Y、236A、236E、236N、237A、237E、237H、237K、237L、237P、237Q、237S、237V、237Y、237D、237N、239D、239E、239N、239Q、265E、266D、266I、266M、267A、267D、267E、267G、268D、268E、268N、268Q、298D、298E、298L、298M、298Q、325L、326A、326E、326W、326D、327D、327G、327L、327N、327Q、327E、328E、328F、328Y、328H、328I、328Q、328W、329E、330D、330H、330K、330S、331S和332E组成的组的至少一个取代(例如,一个或多个取代,两个或多个取代,等),其中编号是根据EU指数。在一个实施方案中,所述取代方式是选自由234N、234F、234D、234E、234W、235Q、235R、235W、235Y、235D、235F、235T、236D、236H、236I、236L、236S、236Y、236E、236N、237H、237L、237D、237N、239D、239N、239E、266I、266M、267A、267D、267E、267G、268D、268E、268N、268Q、298E、298L、298M、298Q、325L、326A、326E、326W、326D、327D、327L、327E、328E、328F、328Y、328H、328I、328Q、328W、330D、330H、330K和332E组成的组的至少一个取代(例如,一个或多个取代,两个或多个取代,等),其中编号是根据EU指数。在一个实施方案中,所述取代方式是选自由234D、234E、234W、235D、235F、235R、235Y、236D、236N、237D、237N、239D、239E、266M、267D、267E、268D、268E、327D、327E、328F、328W、328Y和332E组成的组的至少一个取代(例如,一个或多个取代,两个或多个取代,等),其中编号是根据EU指数。在一个实施方案中,所述取代方式是选自由235Y、236D、239D、266M、267E、268D、268E、328F、328W和328Y组成的组的至少一个取代(例如,一个或多个取代,两个或多个取代,等),其中编号是根据EU指数。
在一个实施方案中,所述取代方式是在选自由234/239、234/267、234/328、235/236、235/239、235/267、235/268、235/328、236/239、236/267、236/268、236/328、237/267、239/267、239/268、239/327、239/328、239/332、266/267、267/268、267/325、267/327、267/328、267/332、268/327、268/328、268/332、326/328、327/328和328/332组成的组的位置的至少两个取代(例如,修饰的组合),其中编号是根据EU指数。在一个实施方案中,所述取代方式是在选自由235/267、236/267、239/268、239/267、267/268和267/328组成的组的位置的至少两个取代(例如,修饰的组合),其中编号是根据EU指数。在一个实施方案中,所述取代方式是选自由234D/267E、234E/267E、234F/267E、234E/328F、234W/239D、234W/239E、234W/267E、234W/328Y、235D/267E、235D/328F、235F/239D、235F/267E、235F/328Y、235Y/236D、235Y/239D、235Y/267D、235Y/267E、235Y/268E、235Y/328F、236D/239D、236D/267E、236D/268E、236D/328F、236N/267E、237D/267E、237N/267E、239D/267D、239D/267E、239D/268D、239D/268E、239D/327D、239D/328F、239D/328W、239D/328Y、239D/332E、239E/267E、266M/267E、267D/268E、267E/268D、267E/268E、267E/325L、267E/327D、267E/327E、267E/328F、267E/328I、267E/328Y、267E/332E、268D/327D、268D/328F、268D/328W、268D/328Y、268D/332E、268E/328F、268E/328Y、327D/328Y、328F/332E、328W/332E和328Y/332E组成的组的至少两个取代(例如,取代的组合),其中编号是根据EU指数。
在一个实施方案中,所述取代方式导致下述取代或取代的组合的至少一个:234F/236N、234F/236D、236A/237A、236S/237A、235D/239D、234D/267E、234E/267E、234F/267E、235D/267E、235F/267E、235S/267E、235T/267E、235Y/267D、235Y/267E、236D/267E、236E/267E、236N/267E、237D/267E、237N/267E、239D/267D、239D/267E、266M/267E、234E/268D、236D/268D、239D/268D、267D/268D、267D/268E、267E/268D、267E/268E、267E/325L、267D/327D、267D/327E、267E/327D、267E/327E、268D/327D、239D/328Y、267E/328F、267E/328H、267E/328I、267E/328Q、267E/328Y、268D/328Y、239D/332E、328Y/332E、234D/236N/267E、235Y/236D/267E、234W/239E/267E、235Y/239D/267E、236D/239D/267E、235Y/267E/268E、236D/267E/268E、239D/267E/268E、234W/239D/328Y、235F/239D/328Y、234E/267E/328F、235D/267E/328F、235Y/267E/328F、236D/267E/328F、239D/267A/328Y、239D/267E/328F、234W/268D/328Y、235F/268D/328Y、239D/268D/328F、239D/268D/328W、239D/268D/328Y、239D/268E/328Y、267A/268D/328Y、267E/268E/328F、239D/326D/328Y、268D/326D/328Y、239D/327D/328Y、268D/327D/328Y、239D/267E/332E、234W/328Y/332E、235F/328Y/332E、239D/328F/332E、239D/328Y/332E、267A/328Y/332E、268D/328F/332E、268D/328W/332E、268D/328Y/332E、268E/328Y/332E、326D/328Y/332E、327D/328Y/332E、234W/236D/239E/267E、239D/268D/328F/332E、239D/268D/328W/332E和239D/268D/328Y/332E,其中编号是根据EU指数。在一个实施方案中,所述取代方式导致下述取代或取代的组合的至少一个:266D、234F/236N、234F/236D、236A/237A、236S/237A、235D/239D、234D/267E、234E/267E、234F/267E、235D/267E、235F/267E、235S/267E、235T/267E、235Y/267D、236D/267E、236E/267E、236N/267E、237D/267E、237N/267E、266M/267E、234E/268D、236D/268D、267D/268D、267D/268E、267E/268D、267E/268E、267E/325L、267D/327D、267D/327E、267E/327E、268D/327D、239D/328Y、267E/328F、267E/328H、267E/328I、267E/328Q、267E/328Y、268D/328Y、234D/236N/267E、235Y/236D/267E、234W/239E/267E、235Y/239D/267E、236D/239D/267E、235Y/267E/268E、236D/267E/268E、234W/239D/328Y、235F/239D/328Y、234E/267E/328F、235D/267E/328F、235Y/267E/328F、236D/267E/328F、239D/267A/328Y、239D/267E/328F、234W/268D/328Y、235F/268D/328Y、239D/268D/328F、239D/268D/328W、239D/268D/328Y、239D/268E/328Y、267A/268D/328Y、267E/268E/328F、239D/326D/328Y、268D/326D/328Y、239D/327D/328Y、268D/327D/328Y、234W/328Y/332E、235F/328Y/332E、239D/328F/332E、239D/328Y/332E、267A/328Y/332E、268D/328F/332E、268D/328W/332E、268D/328Y/332E、268E/328Y/332E、326D/328Y/332E、327D/328Y/332E、234W/236D/239E/267E、239D/268D/328F/332E、239D/268D/328W/332E和239D/268D/328Y/332E,其中编号是根据EU指数。在一个实施方案中,所述取代方式导致下述取代或取代的组合的至少一个:234N、235Q、235R、235W、235Y、236D、236H、236I、236L、236S、236Y、237H、237L、239D、239N、266I、266M、267A、267D、267E、267G、268D、268E、268N、268Q、298E、298L、298M、298Q、326A、326E、326W、327D、327L、328E、328F、330D、330H、330K、234F/236N、234F/236D、235D/239D、234D/267E、234E/267E、234F/267E、235D/267E、235F/267E、235T/267E、235Y/267D、235Y/267E、236D/267E、236E/267E、236N/267E、237D/267E、237N/267E、239D/267D、239D/267E、266M/267E、234E/268D、236D/268D、239D/268D、267D/268D、267D/268E、267E/268D、267E/268E、267E/325L、267D/327D、267D/327E、267E/327D、267E/327E、268D/327D、239D/328Y、267E/328F、267E/328H、267E/328I、267E/328Q、267E/328Y、268D/328Y、239D/332E、328Y/332E、234D/236N/267E、235Y/236D/267E、234W/239E/267E、235Y/239D/267E、236D/239D/267E、235Y/267E/268E、236D/267E/268E、239D/267E/268E、234W/239D/328Y、235F/239D/328Y、234E/267E/328F、235D/267E/328F、235Y/267E/328F、236D/267E/328F、239D/267A/328Y、239D/267E/328F、234W/268D/328Y、235F/268D/328Y、239D/268D/328F、239D/268D/328W、239D/268D/328Y、239D/268E/328Y、267A/268D/328Y、267E/268E/328F、239D/326D/328Y、268D/326D/328Y、239D/327D/328Y、268D/327D/328Y、239D/267E/332E、234W/328Y/332E、235F/328Y/332E、239D/328F/332E、239D/328Y/332E、267A/328Y/332E、268D/328F/332E、268D/328W/332E、268D/328Y/332E、268E/328Y/332E、326D/328Y/332E、327D/328Y/332E、234W/236D/239E/267E、239D/268D/328F/332E、239D/268D/328W/332E和239D/268D/328Y/332E。
在一个实施方案中,所述取代方式导致下述取代或取代的组合的至少一个:235Y/267E、236D/267E、239D/268D、239D/267E、267E/268D、267E/268E和267E/328F,其中编号是根据EU指数。
在本发明的一些实施方案中,免疫球蛋白可以包括用于同种型修饰的方式,即,亲本IgG中修饰为替代IgG中的氨基酸型。例如,IgG1/IgG3杂合变体可以通过在两个同种型不同的位置将CH2和/或CH3区中的IgG1位置取代为IgG3的氨基酸的取代方式而构建。因此,杂合变体IgG抗体可以被构建为包括一种或多种取代方式,例如274Q、276K、300F、339T、356E、358M、384S、392N、397M、422I、435R和436F。在本发明其他实施方案中,IgG1/IgG2杂合变体可以通过在两个同种型不同的位置将CH2和/或CH3区中的IgG2位置取代为IgG1的氨基酸的取代方式而构建。因此,杂合变体IgG抗体可以被构建为包括一种或多种取代方式,例如下述氨基酸取代的一个或多个:233E、234L、235L、-236G(指在位置236的甘氨酸插入),和327A.
糖形修饰
许多多肽,包括抗体,经受多种翻译后修饰,涉及糖类部分,例如用寡糖糖基化。有几种因素可以影响糖基化。已经显示物种、组织和细胞类型在糖基化发生方式方面是重要的。此外,细胞外环境,通过改变的培养条件,例如血清浓度,可能对糖基化具有直接影响(Lifely等,1995,Glycobiology 5(8):813-822)。
所有抗体在重链恒定区保守位置含有糖类。每个抗体同种型具有显著多样的N连接糖类结构。除了与重链连接的糖类以外,达30%的人IgG具有糖基化Fab区。IgG在CH2结构域的Asn297具有单个N连接双触角糖类。对于来自血清或在杂交瘤或工程化细胞中离体产生的IgG,IgG就Asn297连接的糖类而言是异源的(Jefferis等,1998,Immunol.Rev.163:59-76;Wright等,1997,Trends Biotech 15:26-32)。对于人IgG,核心寡糖正常由GlcNAc2Man3GlcNAc组成,具有不同的外部残基编号。
本文公开的免疫球蛋白的糖类部分将参考描述寡糖所普遍使用的命名法来描述。利用该命名法的糖类化学的综述见于Hubbard等1981,Ann.Rev.Biochem.50:555-583。该命名法包括例如代表甘露糖的Man;代表2-N-乙酰葡萄糖胺的GlcNAc;代表半乳糖的Gal;代表岩藻糖的Fuc;代表葡萄糖的Glc。唾液酸由简化符号描述,NeuNAc代表5-N-乙酰神经氨酸,而NeuNGc代表5-乙醇酰神经氨酸。
术语″糖基化″表示寡糖(含有两个或多个连接在一起的单糖,例如2至约12个连接在一起的单糖的糖类)与糖蛋白的连接。寡糖侧链通常通过N-或O-连接而连接至糖蛋白的主链。本文公开的免疫球蛋白的寡糖通常存在为与Fc区的CH2结构域连接为N连接的寡糖。″N连接糖基化″指糖类部分与糖蛋白链中天冬酰胺残基连接。技术人员将理解,例如,鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3和人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgD CH2结构域的每一个在氨基酸残基297具有N连接糖基化的单个位点(Kabat等Sequences of Proteins of Immunological Interest,1991)。
为了本文目的,“成熟核心糖类结构”指与Fc区连接的加工的核心糖类结构,一般由下述糖类结构组成:双触角寡糖典型的GlcNAc(Fucose)-GlcNAc-Man-(Man-GlcNAc)2。成熟核心糖类结构与糖蛋白的Fc区连接,一般通过N连接至Fc区的CH2结构域的Asn297。“二等分GlcNAc”是与成熟核心糖类结构的β1,4甘露糖连接的GlcNAc残基。二等分GlcNAc可以通过β(1,4)-N-乙酰葡萄糖氨基转移酶III酶(GnTIII)酶促连接至成熟核心糖类结构。CHO细胞正常不表达GnTIII(Stanley等,1984,J.Biol.Chem.261:13370-13378),但是可以被工程化为表达GnTIII(Umana等,1999,Nature Biotech.17:176-180)。
本文描述了包含修饰的糖形或工程化糖形的Fc变体。本文使用的“修饰的糖形”或“工程化糖形”意思是共价连接至蛋白例如抗体的糖类组合物,其中所述糖类组合物在化学上不同于亲本蛋白。工程化糖形可用于多种目的,包括但不限于增强或降低FcγR介导的效应子功能。在一个实施方案中,本文公开的免疫球蛋白被修饰为控制与Fc区共价连接的岩藻糖化和/或二等分寡糖的水平。
用于产生修饰糖形的多种方法是本领域公知的(等,1999,NatBiotechnol 17:176-180;Davies等,2001,Biotechnol Bioeng 74:288-294;Shields等,2002,J Biol Chem 277:26733-26740;Shinkawa等,2003,J BiolChem 278:3466-3473);(US 6,602,684;USSN 10/277,370;USSN 10/113,929;PCT WO 00/61739A1;PCT WO 01/29246A1;PCT WO 02/31140A1;PCTWO 02/30954A1);(PotelligentTM技术[Biowa,Inc.,Princeton,NJ];GlycoMAbTM糖基化工程技术[GLYCART biotechnology AG, Zürich,Switzerland];其全部通过引用明确并入)。这些技术控制与Fc区共价连接的岩藻糖化和/或二等分寡糖的水平,例如通过在各种生物体或工程化或其他方式形式的细胞系(例如,Lec-13CHO细胞或大鼠杂交瘤YB2/0细胞)中表达IgG,通过调节糖基化途径中涉及的酶(例如,FUT8[α1,6-岩藻糖基转移酶]和/或β1-4-N-乙酰葡萄糖氨基转移酶III[GnTIII]),或者通过在IgG被表达后修饰糖类。用于修饰本文公开的免疫球蛋白的糖形的其他方法包括使用酵母(Li等,2006,Nature Biotechnology 24(2):210-215)、苔藓(Nechansky等,2007,Mol Immunjol 44(7):1826-8)和植物(Cox等,2006,NatBiotechnol 24(12):1591-7)的糖工程化的品系。使用产生修饰糖形的特定方法不意味着将实施方案限制为该方法。而是,本文公开的实施方案包括具有修饰的糖形的Fc变体,而不考虑它们是如何产生的。
在一个实施方案中,本文公开的免疫球蛋白被糖工程化以改变唾液酸化水平。免疫球蛋白G分子中唾液酸化Fc聚糖的较高水平可以负面影响功能性(Scallon等,2007,Mol Immunol.44(7):1524-34),而Fc唾液酸化水平的差异可以导致改变的抗炎活性(Kaneko等,2006,Science 313:670-673)。因为抗体在Fc核心多糖唾液酸化之后获得抗炎性质,糖工程化本文公开的免疫球蛋白以获得更大或降低的Fc唾液酸含量是有利的。
工程化糖形通常指不同的糖类或寡糖;因此,例如,免疫球蛋白可以包括工程化糖形。可选地,工程化糖形可以指包括不同糖类或寡糖的免疫球蛋白。在一个实施方案中,本文公开的组合物包括具有Fc区的糖基化Fc变体,其中约51-100%的糖基化抗体,例如组合物中80-100%、90-100%、95-100%等的抗体包括缺少岩藻糖的成熟核心糖类结构。在另一实施方案中,组合物中的抗体包括缺少岩藻糖的成熟核心糖类结构,还包括在Fc区的至少一个氨基酸修饰。在一个替代实施方案中,组合物包括具有Fc区的糖基化Fc变体,其中约51-100%的糖基化抗体,组合物中80-100%或90-100%的抗体,包括缺少唾液酸的成熟核心糖类结构。在另一实施方案中,组合物中的抗体包括缺少唾液酸的成熟核心糖类结构,还包括在Fc区的至少一个氨基酸修饰。而在另一实施方案中,组合物包括具有Fc区的糖基化Fc变体,其中约51-100%的糖基化抗体,组合物中80-100%或90-100%的抗体,包括含有唾液酸的成熟核心糖类结构。在另一实施方案中,组合物中的抗体包括含有唾液酸的成熟核心糖类结构,还包括在Fc区的至少一个氨基酸修饰。在另一实施方案中,工程化糖形和氨基酸修饰的组合提供对抗体最佳的Fc受体结合性质。
其他修饰
本文描述的免疫球蛋白可以包括一个或多个修饰,其提供与FcγR-或补体-介导的效应子功能本身不特别相关的优化性质。所述修饰可以是氨基酸修饰,或者可以是酶学或化学进行的修饰。此类修饰可能提供免疫球蛋白的某些改善,例如稳定性、溶解度、功能或临床用途方面的增强。本文公开了可通过将本文公开的免疫球蛋白与其他修饰偶联而进行的多种改善。
在一个实施方案中,本文公开的抗体的可变区可以是亲和力成熟的,也就是说,氨基酸修饰已经在抗体的VH和/或VL结构域中进行以增强抗体对其靶抗原的结合。此类修饰的类型可以改善与靶抗原结合的结合和/或解离动力学。其他修饰包括相对于替代抗原提高对靶抗原的选择性的那些。这些包括相对于非靶细胞提高针对在靶细胞上表达的抗原的选择性。其他修饰可以提供对靶识别性质的其他改善。此类性质可以包括但不限于具体的动力学性质(即,结合和解离动力学)、相对于替代靶而对特定靶的选择性、以及相对于替代形式而对靶特定形式的选择性。实例包括全长变体与剪接变体、细胞表面形式与可溶形式、对各种多态变体的选择性、或对靶抗原的特定构象形式的选择性。本文公开的免疫球蛋白可以包括提供降低或增强的免疫球蛋白内化的一个或多个修饰。
在一个实施方案中,可以进行修饰以改善本文公开的免疫球蛋白的生物物理学性质,包括但不限于稳定性、溶解度和寡聚状态。修饰可以包括例如提供免疫球蛋白中更有利的分子内相互作用的取代,例如提供更大的稳定性,或者暴露的非极性氨基酸被极性氨基酸取代以获得更大的溶解度。对本文公开的免疫球蛋白的其他修饰包括能够特定形成同二聚体分子或同多聚体分子的那些。此类修饰包括但不限于工程化二硫化物以及化学修饰或聚集方法,其可以提供产生共价同二聚体或同多聚体的机制。对本文公开的变体的其他修饰包括能够特定形成异二聚体、异多聚体、双官能和/或多官能分子的那些。此类修饰包括但不限于,在CH3结构域中一个或多个氨基酸取代,其中所述取代减少同二聚体形成并增加异二聚体形成。其他修饰包括在铰链和CH3结构域中的修饰,其中所述修饰减少形成二聚体的倾向。
在进一步实施方案中,本文公开的免疫球蛋白包括去除蛋白降解位点的修饰。这些可以包括例如降低产量的蛋白酶位点以及降解体内施用的蛋白的蛋白酶位点。在一个实施方案中,可以进行其他修饰以去除共价降解位点,例如脱酰胺化(即,谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基脱酰胺为相应的谷氨酰基和天冬氨酰基)、氧化和蛋白降解位点。去除特别有用的脱酰胺化位点是增强脱酰胺倾向的那些,包括但不限于天冬酰胺酰基和谷氨酰胺酰基残基,随后是甘氨酸(分别是NG和QG基序)。在此类情况下,任一残基的取代可以显著降低脱酰胺化的倾向。普通氧化位点包括蛋氨酸和半胱氨酸残基。可以引入或去除的其他共价修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化、丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化、赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的-氨基的甲基化(T.E.Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman&Co.,San Francisco,pp.79-86(1983),通过引用整体并入)、N端胺的乙酰化以及任何C端羧基的酰胺化。其他修饰还可以包括但不限于翻译后修饰,例如N连接或O连接的糖基化和磷酸化。
修饰可以包括提高常用于产生生物质的宿主或宿主细胞的表达盒/或纯化收率的那些。这些包括但不限于各种哺乳动物细胞系(例如CHO)、酵母细胞系、细菌细胞系和植物。其他修饰包括去除或降低重链形成链间二硫键的能力的修饰。其他修饰包括去除或降低重链形成链内二硫键的能力的修饰。
本文公开的免疫球蛋白可以包括包括使用非天然氨基酸的修饰,非天然氨基酸使用例如Schultz及同事开发的技术掺入,包括但不限于如下描述的方法:Cropp&Shultz,2004,Trends Genet.20(12):625-30,Anderson等,2004,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101(2):7566-71,Zhang等,2003,303(5656):371-3,和Chin等,2003,Science 301(5635):964-7,全部通过引用整体并入。在一些实施方案中,这些修饰能够控制上文讨论的各种功能、生物物理、免疫学或生产性质。在其他实施方案中,这些修饰能够实现其他目的的化学修饰。本文包括其他修饰。例如,免疫球蛋白可以连接至多种非蛋白聚合物之一,例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物。可以进行其他氨基酸修饰以实现免疫球蛋白的特异性或非特异性化学或翻译后修饰。此类修饰包括但不限于PEG化和糖基化。可用于实现PEC化的特定取代包括但不限于引入新的半胱氨酸残基或非天然氨基酸,使得有效和特定的偶联化学可用于连接PEG或其他聚合体部分。特定糖基化位点的引入可通过将新的N-X-T/S序列引入本文公开的免疫球蛋白来实现。
减少免疫原性的修饰可以包括减少源自亲本序列的加工肽与MHC蛋白的结合的修饰。例如,氨基酸修饰可以被工程化,使得不存在或存在最小数目的被预测以高亲和力结合任何流行MHC等位基因的免疫表位。鉴定蛋白序列中MHC结合表位的几种方法是本领域已知的,并且可以用于对本文公开的抗体中的表位评分。参见例如USSN 09/903,378,USSN10/754,296,USSN 11/249,692,及其中引用的参考文献,全部通过引用明确并入。
在一些实施方案中,本文公开的免疫球蛋白可与改变FcRn结合的免疫球蛋白组合。此类变体可以为免疫球蛋白提供改善的药代动力学性质。增加与FcRn结合和/或改善药代动力学性质的优选变体包括但不限于在位置259、308、428和434的取代,包括但不限于例如259I、308F、428L、428M、434S、434H、434F、434Y和434M(2008年12月22日提交的题为“Fc variants with Alterned Binding to FcRn”的PCT/US2008/088053,通过引用整体并入)。增加Fc与FcRn结合的其他变体包括但不限于:250E、250Q、428L、428F、250Q/428L(Hinton等,2004,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216,Hinton等2006Journal of Immunology 176:346-356)、256A、272A、286A、305A、307A、311A、312A、376A、378Q、380A、382A、434A(Shields等,Journal of Biological Chemistry,2001,276(9):6591-6604,通过引用整体并入)、252F、252T、252Y、252W、254T、256S、256R、256Q、256E、256D、256T、309P、311S、433R、433S、433I、433P、433Q、434H、434F、434Y、252Y/254T/256E、433K/434F/436H、308T/309P/311S(Dall Acqua等Journal of Immunology,2002,169:5171-5180,Dall′Acqua等,2006,TheJournal of biological chemistry 281:23514-23524,通过引用整体并入)。
抗体的共价修饰包括在本文公开的免疫球蛋白范围内,一般但不总是在翻译后进行。例如,通过使抗体的特定氨基酸残基与有机衍生剂反应而将抗体的共价修饰的几种类型引入分子,所述有机衍生剂能够与选定的侧链或N-或C-端残基反应。
在一些实施方案中,本文公开的抗体的共价修饰包括一个或多个标记的添加。术语“标记基团”意思是任何可检测标记。在一些实施方案中,标记基团通过各种长度的间隔臂偶联至抗体以降低潜在的空间位阻。标记蛋白的各种方法是本领域已知的并且用于产生本文公开的免疫球蛋白。
缀合物
在一个实施方案中,本文描述的共衔接分子是抗体“融合蛋白”,在本文有时称为“抗体缀合物”。融合配偶体或缀合物配偶体可以是蛋白质的或非蛋白质的;后者一般使用抗体上或缀合物配偶体上的官能团产生。缀合物和融合配偶体可以是任何分子,包括小分子化合物和多肽。例如,许多抗体缀合物和方法描述于Trail等,1999,Curr.Opin.Immunol.11:584-588,通过引用整体并入。可能缀合物配偶体包括但不限于细胞因子、细胞毒性剂、毒素、放射同位素、化疗剂、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂和其他治疗活性剂。在一些实施方案中,缀合物配偶体可能更多考虑有效负载,也就是说,缀合物的目标是将缀合物配偶体靶向递送至免疫球蛋白靶向的细胞,例如癌细胞或免疫细胞。因此,例如,毒素与免疫球蛋白的缀合目的是将所述毒素递送至表达靶抗原的细胞。本领域技术人员将理解,现实中,融合体和缀合物的概念和定义是重叠的。融合体或缀合物的指定不是要将其限制于本文公开的的任何特定实施方案。而是,这些术语大致地用于传递本文公开的任何免疫球蛋白可以遗传学、化学或其他方式连接至一个或多个多肽或分子以提供某些期望性质的宽泛概念。
适合的缀合物包括但不限于下文描述的标记、药物和细胞毒性剂,包括但不限于细胞毒性药物(例如化疗剂)或毒素或此类毒素的活性片段。适合的毒素及其相应的片段包括白喉毒素A链、外毒素A、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、麻风树毒素、巴豆毒素、酚毒素、伊诺霉素及类似物。细胞毒性剂还包括通过将放射性同位素与抗体缀合或者使放射性同位素与已经共价连接至抗体的螯合剂结合而制成的放射性化学物质。其他实施方案利用加利车霉素、auristatins、格尔德霉素、美登素和倍癌霉素及类似物。
在一个实施方案中,本文公开的共衔接分子与细胞因子融合或缀合。本文使用的“细胞因子”意思是由一个细胞群释放的作为细胞内介质作用于另一细胞的蛋白的统称。例如,描述于Penichet等,2001,J.Immunol.Methods 248:91-101,通过引用整体并入,细胞因子可以与抗体融合以提供一系列期望的性质。此类细胞因子的实例有淋巴因子、单核因子和常规多肽激素。细胞因子还包括生长激素,例如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素;甲状旁腺激素;甲状腺素;胰岛素;胰岛素原;松弛素;松弛素原;糖蛋白激素,例如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体生成激素(LH);肝生长因子;成纤维细胞生长因子;促乳素;胎盘催乳激素;肿瘤坏死因子-α和-β;苗勒抑制物质;小鼠促性腺激素相关肽;抑制素;活化素;血管内皮生长因子;整联蛋白;血小板生成素(TPO);神经生长因子例如NGF-β;血小板生长因子;转化生长因子(TGF)例如TGF-α和TGF-β;胰岛素样生长因子-I和-II;促红细胞生成素(EPO);骨诱导因子;干扰素,例如干扰素-α、-β和-γ;集落刺激因子(CSF)例如巨噬细胞-CSF(M-CSF);粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF);和粒细胞-CSF(G-CSF);白介素(IL),例如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12;IL-15,肿瘤坏死因子例如TNF-α或TNF-β;C5a;和其他多肽因子,包括LIF和kit配体(KL)。如本文使用的,术语细胞因子包括天然来源的蛋白和来自重组细胞培养物的蛋白,以及天然序列细胞因子的生物活性等同物。
在另一实施方案中,本文公开的共衔接分子可以与“受体”(例如链霉亲和素)缀合,用于肿瘤预靶向,其中免疫球蛋白-受体缀合物被施用至患者,然后使用清除剂去除循环中未结合的缀合物,然后施用于细胞毒性剂缀合的“配体”(例如亲和素)。在一个替代实施方案中,免疫球蛋白缀合或可操作连接至酶以采用抗体依赖性酶介导的前药治疗(ADEPT)。ADEPT可以通过将免疫球蛋白缀合或可操作连接至前药活化酶而使用,前药活化酶转化前药(例如肽基化疗剂)。
当免疫球蛋白配偶体用作缀合物时,缀合物配偶体可以连接至本文公开的免疫球蛋白的任何区,包括在N端或C端,或者在末端之间的某个残基。许多连接体可用于本文公开的免疫球蛋白以共价连接缀合物配偶体与免疫球蛋白。“连接体”、“连接体序列”、“间隔物”、“拴结序列”或其语法等同物在本文意思是连接两个分子并经常用于使两个分子处于一种构型的分子或分子组(例如单体或聚合物)。连接体是本领域已知的;例如,同-或异-双官能连接体是公知的(参见,1994Pierce Chemical Company目录,有关交联剂的技术部分,第155-200页,通过引用整体并入)。许多策略可用于将分子共价连接在一起。这些包括但不限于蛋白或蛋白结构域的N端和C端之间的多肽连接,经由二硫键的连接,以及经由化学交联试剂的连接。在该实施方案的一个方面,连接剂是肽键,通过重组技术或肽合成而产生。连接体肽可以主要包括下述氨基酸残基:Gly、Ser、Ala或Thr。连接体肽应该具有足以使得两个分子采取相互间正确构象的方式连接的长度,使得它们保留所需的活性。适合该目的的长度包括至少一个和不超过50个氨基酸残基。在一个实施方案中,连接体长度为约1至30个氨基酸,例如,连接体长度可以是1至20个氨基酸。有用的连接体包括甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n(提出为SEQ ID NO:1)、(GGGGS)n(提出为SEQ ID NO:2)和(GGGS)n(提出为SEQ ID NO:3),其中n是至少1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域技术人员知道的其他柔性连接体。可选地,许多非蛋白聚合物,包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物,可用作连接体。
共衔接分子的制备
本文还公开了用于制备和实验测试共衔接分子的方法。公开的方法意思不是将实施方案限制于任何特定应用或操作理论。而是,提供的方法意思是一般性地示例说明,一种或多种免疫球蛋白可以被制备并实验测试以获得免疫球蛋白。抗体分子生物学、表达、纯化和筛选的一般方法描述于Antibody Engineering,Duebel&Kontermann编辑,Springer-Verlag,Heidelberg,2001;和Hayhurst&Georgiou,2001,Curr Opin Chem Biol5:683-689;Maynard&Georgiou,2000,Annu Rev Biomed Eng 2:339-76;Antibodies:A Laboratory Manual by Harlow&Lane,New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1988,全部通过引用并入本文。
在本文公开的一个实施方案中,制备编码共衔接分子的核酸,然后将其克隆入宿主细胞,表达,并且如果需要则被测定。因此,可以制成编码每种蛋白序列的核酸,特别是DNA。这些实践使用公知程序进行。例如,可用于制备本文公开的免疫球蛋白的许多方法描述于Molecular Cloning-A Laboratory Manual,第3版(Maniatis,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,New York,2001),和Current Protocols in Molecular Biology(JohnWiley&Sons),两者通过引用整体并入。本领域技术人员将理解,包括大量序列的文库的精确序列的产生可能是费钱费时的。“文库”在本文意思是任何形式的一组变体,包括但不限于一系列核酸或氨基酸序列,在可变位置的一系列核酸或氨基酸取代,包含编码文库序列的核酸的物理文库,或者包含纯化形式或未纯化形式的变体蛋白的物理文库。因此,有许多技术可用于有效产生本文公开的文库。此类方法包括但不限于:基因组装方法,基于PCR的方法和利用PCR变化的方法,基于连接酶链反应的方法,汇集寡聚体方法,例如用于合成改组、易错扩增方法和利用具有随机突变的寡聚体的方法中的那些,经典定点诱变方法,盒诱变,以及其他扩增和基因合成方法。如本领域已知的,存在许多商业可获得用于基因组装、诱变、载体亚克隆等的试剂盒和方法,并且此类商业化产品用于产生编码免疫球蛋白的核酸。
本文公开的共衔接分子可通过在适合诱导或引起蛋白表达的条件下培养经含有编码共衔接分子的核酸的核酸例如表达载体转化的宿主来产生。适合表达的条件将随着表达载体和宿主细胞的选择而变化,并且本领域技术人员通过常规实验容易确定。可以使用许多适合的宿主细胞,包括但不限于哺乳动物细胞、细菌、昆虫细胞和酵母。例如,可用于产生本文公开的免疫球蛋白的许多细胞系描述于细胞系目录,可获自美国典型培养物保藏中心。
在一个实施方案中,共衔接分子在哺乳动物表达系统中表达,包括其中表达构建体使用诸如逆转录病毒或腺病毒等病毒被引入哺乳动物细胞的系统。可以使用任何哺乳动物细胞,例如,人、小鼠、大鼠、仓鼠和灵长类细胞。适合的细胞还包括已知的研究细胞,包括但不限于Jurkat T细胞、NIH3T3、CHO、BHK、COS、HEK293、PER C.6、HeLa、Sp2/0、NSO细胞及其变体。在一个替代实施方案中,文库蛋白在细菌细胞中表达。细菌表达载体是本领域公知的,并且包括大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌、乳脂链球菌和Streptococcus lividans。在替代实施方案中,免疫球蛋白在昆虫细胞(例如Sf21/Sf9,粉纹夜蛾Bti-Tn5b1-4)或酵母细胞(例如酿酒酵母、毕赤酵母等)中产生。在一个替代实施方案中,共衔接分子使用无细胞翻译系统在体外表达。衍生自原核细胞(例如E.coli)和真核细胞(例如,小麦胚、兔网状细胞)的体外翻译系统是可获得的,并且可以根据感兴趣蛋白的表达水平和功能性来选择。例如,本领域技术人员理解,体外翻译是一些展示技术例如核糖体展示所需的。此外,免疫球蛋白可以通过化学合成方法产生。还有动物(例如,奶牛、绵羊或山羊奶,鸡胚胎蛋,全昆虫幼虫,等)和植物(例如,玉米、烟草、浮萍等)的转基因表达系统。
编码本文公开的共衔接分子的核酸可以被引入表达载体以表达蛋白。许多表达载体可用于蛋白表达。表达载体可以包括自我复制的染色体外载体或整合入宿主基因组的载体。表达载体被构建为与宿主细胞类型相容。因此,可用于产生本文公开的免疫球蛋白的表达载体包括但不限于实现在哺乳动物细胞、细菌、昆虫细胞、酵母和体外系统中蛋白表达的那些。如本领域已知的,可用于表达本文公开的共衔接分子的许多表达载体可商业或其他方式获得。
表达载体通常包括与对照控制或调控序列、选择性标记、任何融合配偶体和/或其他元件可操作连接的蛋白。“可操作连接”在本文意思是使核酸置于与另一核酸序列的功能关系。一般而言,表达载体包括与编码共衔接分子的核酸可操作连接的转录和翻译调控核酸,并且通常适合用于表达蛋白的宿主细胞。一般而言,转录和翻译调控序列可以包括启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强或激活序列。本领域还已知,表达载体通常含有选择基因或标记以允许选择含有表达载体的转化的宿主细胞。选择基因是本领域公知的并且将根据使用的宿主细胞而变化。
共衔接分子可以可操作连接至融合配偶体以实现表达蛋白的靶向、纯化、筛选、展示等。融合配偶体可以经由连接体序列连接至免疫球蛋白序列。连接体序列一般包括小量氨基酸,通常小于十个,但也可以使用较长的连接体。通常,选择柔性并抗降解的连接体序列。本领域技术人员将理解,许多序列的任何一个可用作连接体。例如,常用连接体序列包括氨基酸序列GGGGS。融合配偶体可以是使免疫球蛋白和任何相关融合配偶体导向期望的细胞位置或保外培养基的靶向序列或信号序列。如本领域已知的,某些信号传导序列可以指导蛋白分泌入生长培养基或位于细胞内膜和外膜之间的周质空间。融合配偶体还可以是编码实现纯化和/或筛选的肽或蛋白的序列。此类融合配偶体包括但不限于多聚组氨酸标签(His标签)(例如,H6和H10或用于固定化金属亲和色谱(IMAC)系统(例如Ni+2亲和柱)的其他标签)、GST融合体、MBP融合体、Strep标签、细菌酶BirA的BSP生物素酰化靶序列以及由抗体靶向的表位标签(例如c-myc标签、flag标签及类似物)。如本领域技术人员理解的,此类标签可用于纯化、用于筛选或两者。例如,免疫球蛋白可以利用His标签通过将其固定至Ni+2亲和柱来纯化,纯化后,使用相同的His标签将抗体固定至Ni+2涂布的板以进行ELISA或其他结合测定(如下所述)。融合配偶体可以使用选择方法来筛选免疫球蛋白(见下文)。实现多种选择方法的融合配偶体是本领域公知的。例如,通过将免疫球蛋白文库成员与基因III蛋白融合,可以采用噬菌体展示(Kay等,Phage display of peptides and proteins:a laboratory manual,Academic Press,San Diego,CA,1996;Lowman等,1991,Biochemistry30:10832-10838;Smith,1985,Science 228:1315-1317,通过引用整体并入)。融合配偶体可以使免疫球蛋白能够被标记。可选地,融合配偶体可以结合至表达载体上的特定序列,使得融合配偶体和相关的免疫球蛋白能够与编码它们的核酸共价或非共价连接。将外源核酸引入宿主细胞的方法是本领域公知的,并且会根据使用的宿主细胞而变化。技术包括但不限于右旋糖介导的转染、磷酸钙沉淀、氯化钙处理、凝聚胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、病毒或噬菌体感染、多肽包封于脂质体中、以及将DNA直接微注射入核。在哺乳动物细胞情况下,转染可以是瞬时的或稳定的。
在一个实施方案中,共衔接分子在表达后被纯化或分离。蛋白可以本领域技术人员已知的多种方式分离或纯化。标准的纯化方法包括色谱技术,包括离子交换色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、尺寸或凝胶过滤色谱以及反相色谱,使用诸如FPLC和HPLC的系统在常压或高压下进行。纯化方法还包括电泳技术、免疫技术、沉淀技术、透析技术和色谱聚焦技术。超滤和渗滤技术结合蛋白浓缩也是有用的。如本领域公知的,许多天然蛋白结合Fc和抗体,并且这些蛋白可用于纯化本文公开的免疫球蛋白。例如,细菌蛋白A和G结合Fc区。同样,细菌蛋白L结合一些抗体的Fab区,如同抗体靶抗原当然进行的。纯化通常可以通过特定融合配偶体来实现。例如,如果采用GST融合体,免疫球蛋白可以使用谷胱甘肽树脂纯化;如果采用His标签,免疫球蛋白可以使用Ni+2亲和色谱纯化;或者,如果采用flag标签,免疫球蛋白可以使用抗flag抗体纯化。有关适合的纯化技术的一般指导,参见例如通过引用整体并入,Protein Purification:Principlesand Practice,第3版,Scopes,Springer-Verlag,NY,1994,通过引用整体并入。必要的纯化程度将取决于免疫球蛋白的筛选或使用。在一些情况下,纯化不是必要的。例如,在一个实施方案中,如果免疫球蛋白被分泌,则可以直接从培养基进行筛选。如本领域公知的,一些选择方法不涉及蛋白的纯化。因此,例如,如果免疫球蛋白文库被制成噬菌体展示文库,则可以不进行蛋白纯化。
体外实验
共衔接分子可以使用多种方法筛选,包括但不限于体外测定、体内和基于细胞的测定、以及选择技术中使用的那些。自动和高通量筛选技术可以用于筛选程序。筛选可以采用融合配偶体或标记。上文已经讨论了融合配偶体的使用。“标记的”在本文意思是本文公开的免疫球蛋白具有被连接以实现筛选中检测的一个或多个元件、同位素或化合物。一般而言,标记分为三类:a)免疫标记,其可以是作为抗体识别的融合配偶体而加入的表位,b)同位素标记,其可以是放射性的或重同位素,和c)小分子标记,其可以包括荧光和比色染料,或者能够实现其他标记方法的分子例如生物素。标记可以被加入在化合物的任何位置,并且可以在蛋白表达过程中体外或体内加入。
在一个实施方案中,共衔接分子的功能和/或生物物理性质在体外测定中筛选。体外测定可以允许筛选感兴趣性质的宽的动态范围。可以被筛选的性质包括但不限于稳定性、溶解度和对Fc配体例如FcγR的亲和力。多种性质可以同时筛选或单独筛选。蛋白可以经纯化或未纯化,取决于测定的要求。在一个实施方案中,筛选是共衔接分子与已知或被认为与共衔接分子结合的蛋白或非蛋白分子结合的定性或定量测定。在一个实施方案中,筛选是用于测量与靶抗原结合的结合测定。在一个替代实施方案中,筛选是共衔接分子与Fc配体结合的测定,Fc配体包括但不限于FcγR家族、新生受体FcRn、补体蛋白C1q和细菌蛋白A和G。所述Fc配体可以来自任何生物体。在一个实施方案中,Fc配体来自人、小鼠、大鼠、兔和或猴。结合测定可以使用本领域已知的多种方法进行,包括但不限于基于FRET(荧光共振能量转移)和BRET(生物荧光共振能量转移)的测定、AScreenTM(扩增的荧光迫近均相测定)、闪烁迫近测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、SPR(表面等离子体共振,还称为)、等温滴定量热法、差示扫描量热法、凝胶电泳和色谱法,包括凝胶过滤。这些和其他方法可以利用免疫球蛋白的一些融合配偶体或标记。测定可以采用许多检测方法,包括但不限于生色标记、荧光标记、发光标记或同位素标记。
共衔接分子的生物物理性质,例如稳定性和溶解度,可以使用本领域已知的多种方法测试。蛋白稳定性可以通过测量折叠状态和解折叠状态之间的热力学平衡来确定。例如,本文公开的共衔接分子可以使用化学变性剂、热或pH来解折叠,并且该转变可以使用包括但不限于以下的方法来监测:圆二色谱法、荧光光谱法、吸收光谱法、NMR色谱法、量热法和蛋白酶解。本领域技术人员将理解,折叠和解折叠转变的动力学参数也可以使用这些和其他技术来监测。共衔接分子的溶解度和总体结构完整性可以使用本领域已知的多种方法定性或定量测定。可用于鉴定本文公开的共衔接分子的生物物理性质的方法包括凝胶电泳、等电聚焦、毛细管电泳、色谱,例如尺寸排阻色谱、离子交换色谱和反相高效液相色谱、肽作图、寡糖作图、质谱、紫外吸收光谱、荧光光谱、圆二色谱、等温滴定量热法、差示扫描量热法、分析超离心、动态光散射、蛋白酶解和交联、浊度测量、过滤阻滞测定、免疫学测定、荧光染料结合测定、蛋白染色测定、显微术、和经过ELISA或其他结合测定的聚集物检测。采用X射线晶体学技术和NMR光谱法的结构分析也可以使用。在一个实施方案中,稳定性和/或溶解度可以通过测定确定时间段之后蛋白溶解的量来测定。在该测定中,蛋白可以或可以不暴露于一些极端条件,例如升高的温度、低pH或变性剂的存在。因为功能通常需要稳定、可溶和/或良好折叠/结构化的蛋白,前述功能和结合测定还提供了进行此类测量的方式。例如,包含免疫球蛋白的溶液可以测量其结合靶抗原的能力,然后暴露于升高的温度持续一个或多个确定的时间段,然后再次分析抗原结合。因为不期望未折叠和聚集的蛋白能够结合抗原,保留的活性量提供了共衔接分子稳定性和溶解度的量度。
在一个实施方案中,共衔接分子可以使用一种或多种基于细胞或体外的测定来测量。对于此类测定,纯化或未纯化的免疫球蛋白通常被外源加入,使得细胞暴露于属于一个文库的单个变体或变体组。这些测定通常但不总是基于免疫球蛋白结合靶抗原并介导一些生化事件的能力,所述生化事件例如效应子功能,如细胞溶胞、吞噬、配体/受体结合抑制、生长和/或增殖抑制、凋亡等。此类测定通常涉及监测细胞对免疫球蛋白的应答,例如细胞存活、细胞死亡、细胞吞噬、细胞溶胞、细胞形态变化或转录激活,例如天然基因或报告基因的细胞表达。例如,此类测定可以测量共衔接分子引发ADCC、ADCP或CDC的能力。对于一些测定,除了靶细胞以外,其他细胞或组分也可能需要被添加,例如血清组分或效应细胞,例如外周血单核细胞(PBMC)、NK细胞、巨噬细胞等。此类其他细胞可以来自任何生物体,例如人、小鼠、大鼠、兔和猴。交联和单聚体抗体可以导致表达靶抗原的某些细胞系凋亡,或者它们可以介导已经被添加到测定中的免疫细胞对靶细胞的攻击。监测细胞死亡或存活力的方法是本领域已知的,并且包括染料、荧光团、免疫化学、细胞化学和放射性试剂的使用。例如半胱天冬酶测定或膜联蛋白-面粉缀合物可以实现凋亡的测量,并且放射性基质的吸收或释放(例如,铬-51释放测定)或荧光染料例如alamar蓝的代谢减少可以实现细胞生长、增殖或活化的监测。在一个实施方案中,使用基于EuTDA的细胞毒性测定(Perkin Elmer,MA)。可选地,死亡或受损的靶细胞可以通过测量一种或多种天然细胞内蛋白例如乳酸脱氢酶的释放来监测。转录激活也可用作在基于细胞的测定中测定功能的方法。在这种情况下,应答可以通过测定可被上调或下调的天然基因或蛋白来监测,例如,某些白介素的释放可以被测量,或者可选地,读数可以通过荧光酶或GFP受体构建体。基于细胞的测定还涉及作为对免疫球蛋白存在的应答的细胞形态变化的测量。此类测定的细胞类型可以是原核的或真核的,并且可以采用本领域已知的许多细胞系。可选地,基于细胞的筛选使用已经用编码共衔接分子的核酸转化或转染的细胞来进行。
体外测定包括但不限于结合测定、ADCC、CDC、细胞毒性、增殖、过氧化物/臭氧释放、效应细胞趋向性、此类测定受减少的效应子功能抗体的抑制;活性范围,例如>100x提高或>100x降低,受体混合物活化,和从此类受体概况预期的测定结果。
体内实验
本文公开的共衔接分子的生物性质可以在细胞、组织和全生物体实验中鉴定。如本领域已知的,药物经常在动物中测试,包括但不限于小鼠、大鼠、兔、狗、猫、猪和猴,以测量药物治疗疾病或疾病模型的功效,或者测量药物的药代动力学、毒性和其他性质。所述动物可以被称为疾病模型。就本文公开的共衔接分子而言,当使用动物模型来评估候选多肽对人的潜在功效时产生特定挑战,这至少部分地由于以下事实:对人Fc受体亲和力具有特定效应的共衔接分子可能不具有与直系同源动物受体相似的亲和力效应。这些问题可被以下进一步放大:与真正的直向同源物正确分配有关的不可避免的模糊性(Mechetina等,Immunogenetics,200254:463-468,通过引用整体并入),和一些直向同源物不单纯地存在于动物中的事实(例如,人具有FcγRIIa,而小鼠没有)。治疗剂通常在小鼠中测试,包括但不限于小鼠品系NZB、NOD、BXSB、MRL/lpr、K/BxN和转基因(包括敲入和敲除)。此类小鼠可以发生各种自身免疫病症,其类似于人器官特异性、系统性的自身免疫或炎性病变,例如系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿性关节炎(RA)。例如,用于自身免疫疾病的本文公开的免疫球蛋白可以在此类小鼠模型中测试,通过治疗小鼠以确定免疫球蛋白降低或抑制病变发展的能力。因为小鼠和人Fcγ受体系统之间的不相容性,替代方法是使用其中免疫缺陷小鼠被移植人PBL或PBMC的鼠SCID模型(huPBL-SCID,huPBMC-SCID),提供了具有人效应细胞和Fc受体的半功能性人免疫系统。在此类模型中,抗原激发(例如破伤风菌疫苗)激活B细胞分化成为血浆细胞并分泌免疫球蛋白,因此重构抗原特异性体液免疫性。因此,特异性结合B细胞上的IgE和FcγRIIb的本文公开的靶向免疫球蛋白可以被测试以检查特异性抑制B细胞分化的能力。此类实验可以提供用于确定所述免疫球蛋白用作治疗剂的潜力的有意义的数据。其他生物体例如哺乳动物也可以用于测试。例如,因为其与人的遗传相似性,猴可能是适合的治疗模型,并因此可用于测试本文公开的免疫球蛋白的效力、毒性、药代动力学或其他性质。本文公开的免疫球蛋白在人中的测试是批准作为药物所最终要求的,因此,当然涵盖这些实验。因此,本文公开的免疫球蛋白可以在人中测试以确定其治疗效力、毒性、药代动力学和/或其他临床性质。
本文公开的共衔接分子可以赋予含Fc的治疗剂在动物模型或人中的优良性能。如本说明书所述,此类免疫球蛋白的受体结合概况可以例如被选择来增加细胞毒性药物的效价或靶向特定效应子功能或效应细胞以提高药物作用的选择性。而且,可以选择可以减少一些或全部效应子功能的受体结合概况,从而减少此类含有Fc的药物的副作用或毒性。例如,可以选择对FcγRIIIa、FcγRI和FcγRIIa结合降低的免疫球蛋白以消除大部分细胞介导的效应子功能,或者选择对C1q结合降低的免疫球蛋白来限制补体介导的效应子功能。在一些情况下,已知此类效应子功能具有潜在的毒性效应。因此,消除它们可以增加含Fc药物的安全性,并且这种提高的安全性可以在动物模型中鉴定。在一些情况下,已知此类效应子功能介导期望的治疗活性。因此,增强它们可以增加含Fc药物的活性或效价,并且这种提高的活性或效价可以在动物模型中鉴定。
在一些实施方案中,本文公开的共衔接分子可以在各种人类疾病的临床相关动物模型中评估效力。在许多情况下,相关模型包括特定抗原和受体的各种转基因动物。
相关转基因模型,例如表达人Fc受体(例如CD32b)的那些,可以用于评估和测试免疫球蛋白和Fc-融合体的效力。通过在小鼠或其他啮齿类动物中引入直接或间接介导效应子功能的人基因来评估共衔接分子,可以实现对自身免疫疾患和RA的效力的生理学研究。人Fc受体例如FcγRIIb可以具有多态性,例如在基因启动子(-343从G至C)或受体187I或T的跨膜结构域,其将进一步实现特定和组合的人多态性引入啮齿类动物。涉及多态性特异性FcR的各种研究不限于该章节,而是包括一般如本申请中指出的FcR的所有讨论和应用。本文公开的免疫球蛋白可以赋予含有Fc的药物在此类转基因模型中的优良活性,特别是具有针对人FcγRIIb介导的活性而优化的结合概况的特定变体可以在转基因CD32b小鼠中显示优良活性。在其他人Fc受体例如FcγRIIa、FcγRI等转基因的小鼠中效力的类似提高可以见于具有针对各自受体优化的结合概况的共衔接分子。多种人受体转基因小鼠对于具有针对相应多种受体优化的结合概况的免疫球蛋白显示提高的活性。
因为与使用动物模型鉴定候选治疗性抗体在人患者中潜在效力的困难和模糊性,一些本文公开的变体多肽可以作为代理用于评估在人中的潜在效力。此类代理分子可以在动物系统中模拟相应候选人免疫球蛋白的FcR和/或补体生物学。这种模拟最可能通过特异性免疫球蛋白和动物与人受体之间相对结合亲和力证明。例如,如果使用小鼠模型来评估对抑制性人FcγRIIb具有降低的亲和力的Fc受体在人中的潜在效力,适当的代理变体将对小鼠FcγRII具有降低的亲和力。还应该注意,代理Fc变体可以在人Fc变体、动物Fc变体或两者的环境中产生。
在一个实施方案中,共衔接分子的测试可以包括在灵长类(例如,食蟹猴模型)中效力的研究,以帮助评估含有靶抗原的特定靶细胞的清除。其他灵长类模型包括但不限于使用猕猴在自身免疫、移植和癌症的治疗性研究中评价Fc多肽。
进行毒性研究以测定不能再标准药理学概况中评估或仅在药剂重复施用之后发生的抗体或Fc融合体相关的效应。大部分毒性测试在两个物种中进行:啮齿类动物和非啮齿类动物,以确保在新治疗剂实体被引入人之前没有忽略任何不期望的副作用。一般而言,这些模型可以测量许多毒性,包括遗传毒性、慢性毒性、免疫原性、再生/发展的毒性以及致癌性。前述参数包括食物消耗的标准测量、体重、抗体形成、临床化学和标准器官/组织的宏观和微观检查(例如,心脏毒性)。测量的其他参数是注射位点创伤的测量和中和抗体(如果有)的测量。常规地,裸或缀合的单克隆抗体治疗剂被评估与正常组织的交叉反应性、免疫原性/抗体生成、缀合物或连接体毒性和放射性标记物质的“旁观者”毒性。然而,此类研究必须个体化以解决具体关注并遵循ICH S6的指导(有关生物技术产品的安全性研究,还在上文提及)。这样,一般原则是产物被充分良好地表征,杂质/污染物被去除,测试材料在整个发展中相当,保持GLP顺从性。
本文公开的共衔接分子的药代动力学(PK)可以在多种动物系统中研究,最相关的是非人灵长类,例如食蟹猴和猕猴。6000倍剂量范围(0.05-300mg/kg)的单次或重复i.v./s.c.施用可以使用血浆浓度和清除率来评估半衰期(数天至数周)。还可以测量稳定状态时的分布容量和系统吸收水平。此类测量参数的实例一般包括观察的最大血浆浓度(Cmax),达到(Cmax)的时间(Tmax),从0时至无穷大的血浆浓度-时间曲线下面积[AUC(0-inf]和表观清除半衰期(T1/2)。其他测量的参数可以包括在i.V.施用之后获得的浓度-时间数据的区隔分析和生物利用率。
本文公开的共衔接分子可以孵育含Fc治疗剂在动物系统或人中优良的药代动力学。例如,增加的对FcRn的结合可以增加半衰期和含Fc药物的暴露。可选地,在降低的暴露时有利的情况下,例如当此类药物具有副作用时,降低的对FcRn的结合可以降低半衰期和含Fc药物的暴露。
本领域已知,多种Fc受体在各种免疫细胞类型以及不同组织中差异表达。Fc受体的差异组织分布可以最终对本文公开的共衔接分子的药效动力学(PD)和药代动力学(PK)有影响。因为呈递的共衔接分子对多种Fc受体具有不同的亲和力,根据PD和/或PK性质进一步筛选多肽可以特别用于确定每个候选多肽赋予的PD、PK和治疗效力的最佳平衡。
药效动力学研究可以包括但不限于:靶向特定细胞或阻断信号传导机制,测量抗原特异性抗体等的抑制。本文公开的共衔接分子可以靶向特定效应细胞群,从而指导含Fc的药物诱导某些活性以提高效价或增加穿入特别有利的生理区室。例如,中性粒细胞活性和定位可以由靶向FcγRIIIb的共衔接分子靶向。此类药代动力学效应可以在动物模型或人中证明。
用途
一经被制备,本文所述的共衔接分子可用于许多方法。在一个优选实施方案中,所述方法包括使共表达IgE和FcγRIIb的细胞与共衔接分子接触,使得IgE和FcγRIIb两者都被共衔接分子结合并且细胞被抑制。“抑制”在该上下文中意思是共衔接分子预防或减少IgE+B细胞的活化和/或增殖。
本文描述的共衔接分子可用于多种产品。在一个实施方案中,本文公开的共衔接分子是治疗、诊断或研究实际。共衔接分子可用于组合物中,是单克隆或多克隆的。本文公开的共衔接分子可以用于治疗目的。如本领域技术人员所理解的,本文公开的共衔接分子可用于该抗体及类似物可应用的任何治疗目的。共衔接分子可以被施用至患者以治疗疾患,包括但不限于自身免疫疾病和炎性疾病、感染疾病和癌症。
用于本文公开的目的的“患者”包括人和其他动物,例如其他哺乳动物。因此,本文公开的共衔接分子具有人疗法和兽医应用。本文公开的术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”意思是包括针对疾病或疾患的治疗性治疗以及预防性或抑制性措施。因此,例如,在疾病发病之前成功施用共衔接分子导致疾病的治疗。作为另一实施例,在疾病临床表现之后,成功施用优化的共衔接分子以对抗疾病症状,包括疾病的治疗。“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”还包括在疾病出现之后施用优化的免疫球蛋白以消除疾病。已经发展了在发病之后以及在临床症状之后的成功施用,可能减轻临床症状和可能缓解疾病,包括疾病的治疗。“需要治疗”的个体包括已经患有疾病或疾患的哺乳动物,以及易于患有该疾病或疾患的个体,包括其中要预防该疾病或疾患的那些个体。
在一个实施方案中,本文公开的共衔接分子被施用至患有涉及蛋白或其他分子的不当表达的患者。在本文公开的范围内,意味着包括特征为异常蛋白的疾病和疾患,异常蛋白是由于例如存在的蛋白量的改变、蛋白定位、翻译后修饰、构象状态、突变蛋白或病原体蛋白的存在等。类似地,疾病或疾患可以由改变分子表征,包括但不限于多糖和神经节苷脂。过剩可能是由于任何原因,包括但不限于分子水平上的过表达,作用位点处的延长或累积出现,相对于正常增加的蛋白活性。该定义包括特征为蛋白减少的疾病和疾患。这种减少可能是由于任何原因,包括但不限于分子水平上减少的表达,在作用位点处缩短或减少的出现,蛋白突变形式,或者相对于正常减少的蛋白活性。蛋白的这种过剩或减少可以相对于正常表达、出现或蛋白活性来测量,并且所述测量可以在本文公开的免疫球蛋白的发展和/或临床测试中起重要作用。
本文公开了治疗IgE介导的疾患例如食物和环境变态反应和变应性哮喘的新方法。在优选实施方案中,可以由本发明产品和方法治疗的变应性疾病包括变应性和特应性哮喘、特异性皮炎和湿疹、变应性鼻炎、变应性结膜炎和鼻结膜炎、变应性脑脊髓炎、变应性鼻炎、变应性脉管炎和过敏性休克。可以治疗的环境和食物变态反应包括对尘螨、蟑螂、猫和其他动物、花粉(包括豚草、狗牙草、俄国蓟、橡木、黑麦和其他)、霉菌和真菌(例如,链格孢、曲霉属和其他)、乳胶、虫螫(密封、黄蜂和其他)、青霉素和其他药物、草莓和其他水果和蔬菜、花生、大豆和其他豆类、核桃和其他树坚果、甲壳类动物和其他海产、奶和其他乳制品、小麦和其他谷类以及鸡蛋。实际上,任何食物变应原、空气源性变应原、职业性变应原或其他IgE介导的环境变应原可以由治疗量的本发明公开的产品治疗。有关常见变应原的实例,参见Arbes等,Prevalences of positive skin test responsesto 10common allergens in the US population:Results from the Third NationalHealth and Nutrition Examination Survey,Clinical Gastroenterology 116(2),377-383(2005)。
还公开了诊断测试,以鉴定可能显示对本文公开的共衔接分子的有利临床应答的患者或者在用本文公开的共衔接分子治疗时可能表现出比目前使用的治疗剂显著更好的应答的患者。可以使用本领域已知的用于确定人FcγR多态性的许多方法中的任何一种。还公开了对临床样品例如血液样品和组织样品进行的预后测试。此类测试可以测定活性,不论机制如何。此类信息可用于鉴定临床试验中加入或排除的患者,或者告知有关适当剂量和治疗方案的判断。此类信息还可以用于选择含有特定共衔接分子的药物,所述共衔接分子在此类测定中显示优良活性。
制剂
涵盖了药物组合物,其中本文公开的共衔接分子和一种或多种治疗活性剂被配制。本文公开的共衔接分子的制剂通过将具有期望纯度的所述免疫球蛋白与任选的药学可接受载体、赋形剂或稳定剂混合而制备以贮存(Remington′s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.,1980,通过引用整体并入),形式为冻干制剂或水溶液。可接受的载体、赋形剂或稳定剂以采用的剂量和浓度对接受者是无毒的,并且包括缓冲剂例如磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐和其他有机酸;抗氧化剂,包括抗坏血酸和甲硫氨酸;防腐剂(例如,十八烷基二甲基苄基氯化铵);氯化六甲双铵;苯扎氯铵、苯索氯铵;苯酚、丁醇或苄醇;尼泊金烷基酯,例如尼泊金甲酯或尼泊金丙酯;儿茶酚;间苯二酚;环己醇;3-戊醇;和间甲酚);低分子量(小于约10个残基)多肽;蛋白质,例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水聚合物,例如聚乙烯比咯烷酮;氨基酸,例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸;单糖、二糖和其他糖类,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合剂,例如EDTA;糖,例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇;甜味剂和其他调味剂;填充剂,例如微晶纤维素、乳糖、玉米淀粉和其他淀粉;粘合剂;添加剂;着色剂;成盐抗衡离子,例如钠;金属络合物(例如,Zn-蛋白络合物);和/或非离子型表面活性剂,例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。在一个实施方案中,包含本文公开的免疫球蛋白的药物组合物可以是水溶性形式,例如以药学可接受的盐存在,其意思是包括酸加成盐和碱加成盐。“药学可接受的酸加成盐”指保留游离碱的生物有效性并且不是生物学上或其他方面不期望的那些盐,用无机酸和有机酸生成,无机酸例如盐水、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及类似物,有机酸例如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对苯磺酸、水杨酸及类似物。“药学可接受的碱加成盐”包括衍生自无机碱的那些,例如钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐及类似物。一些实施方案包括铵、钾、钠、钙和镁盐中的至少一种。衍生自药学可接受的有机无毒碱的盐包括伯胺、仲胺和叔胺,取代胺,包括天然存在的取代胺、环胺和碱性离子交换树脂,例如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺和乙醇胺。用于体内施用的制剂可以是无菌的。这可以通过无菌过滤膜过滤或其他方法而容易地实现。
本文公开的共衔接分子还可以配制为免疫脂质体。脂质体是包括各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂的小囊,用于将治疗剂递送至哺乳动物。含有免疫球蛋白的脂质体通过本领域已知的方法制备。脂质体的组分通常以双层形成排列,类似于生物膜的脂质排列。特别有用的脂质体可以通过反相蒸发法产生,使用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物。脂质体被挤压通过确定孔径的滤器以产生具有期望直径的脂质体。
共衔接分子和其他治疗活性剂还可以被包裹在微胶囊中,微胶囊的制备方法包括但不限于凝聚技术、界面聚合(例如,使用羟甲基纤维素或明胶-微胶囊,或聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶体药物递送系统(例如,脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米粒子和纳米胶囊)和微乳。此类技术公开于Remington′s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.,1980,通过引用整体并入。持续释放制剂可以被制备。持续释放制剂的适当实例包括固体疏水聚合物的半透性基质,所述基质是成型品的形式,例如膜或微胶囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如,聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯、L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物例如Lupron(它是由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林构成的可注射微球)、聚-D-(-)-3-羟基丁酸和(可商业获自Alkermes),其是基于微球的递送系统,由结合入DL-丙交酯乙交酯共聚物(PLG)基质的期望的生物活性分子构成。
施用
例如以无菌水溶液形式施用包含本文公开的共衔接分子的药物组合物可以多种方式进行,包括但不限于口服、皮下、静脉内、鼻内、耳内、透皮、局部(例如,凝胶、油膏、洗剂、乳霜等)、腹膜内、肌肉内、肺内、阴道内、胃肠外、直肠或眼内。在一些情况下,例如治疗伤口、炎症等,免疫球蛋白可以作为溶液或喷雾剂直接应用。本领域已知,药物组合物可以根据引入方式来配制。
皮下施用可以用于其中患者可以自己施用药物组合物的情况。许多蛋白治疗剂不足够有效以允许配制皮下施用最大可接受体积的治疗有效剂量。该问题可以通过使用包含精氨酸-HCl、组氨酸和聚山梨醇酯的蛋白制剂而得到部分解决。本文公开的抗体可能更适合皮下施用,因为例如增加的效价、提高的血浆半衰期和提高的溶解度。
本领域已知,蛋白治疗剂常常通过IV输注或快速浓注来递送。本文公开的抗体也可以使用此类方法递送。例如,施用可以通过静脉内输注,0.9%氯化钠作为输注媒介物。
肺递送可以使用吸入器或喷雾器和包含雾化剂的制剂来实现。例如,可以使用可商业途径获自Aradigm的吸入技术,或者可商业途径获自Nektar Therapeutics的InhanceTM肺递送系统。本文公开的抗体可能更适合肺内递送。FcRn存在于肺中,并且可以促进从肺至血流的转运(例如Syntonix WO 04004798,Bitonti等(2004)Proc.Nat.Acad.Sci.101:9763-8,两者通过引用整体并入)。因此,在肺中更有效结合FcRn或者在血流中更有效释放的抗体可以在肺内施用之后具有提高的生物利用率。本文公开的抗体也可能更适合肺内施用,因为例如提高的溶解度或改变的等电点。
而且,本文公开的共衔接分子可以更适合口服递送,因为例如胃内pH下提高的稳定性和提高的对蛋白水解的抗性。而且,FeRn似乎在成人肠上皮细胞中表达,因此,具有提高的FeRn相互作用性质的本文公开的抗体可以显示在口服施用之后提高的生物利用率。FeRn介导的抗体转运还可以发生在其他粘膜,例如胃肠道、呼吸道和生殖道中的那些粘膜。
此外,许多递送系统的任何一种是本领域已知的,并且可以用于施用本文公开的抗体。实例包括但不限于包封于脂质体、微粒、微球(例如,PLA/PGA微球)及类似物。可选地,可以使用多孔、非多孔或明胶物质的植入剂,包括膜或纤维。持续释放系统可以包括聚合体材料或基质,例如聚酯、水凝胶、聚(乙烯醇)、聚交酯、L-谷氨酸与乙基-L-谷氨酸的共聚物、乙烯-乙酸乙烯酯、乳酸-乙醇酸共聚物,例如Lupron 和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。还可能施用编码本文公开的免疫球蛋白的核酸,例如通过逆转录病毒感染、直接注射或脂质包衣、细胞膜受体或其他转染剂。在所有情况下,控制释放系统可以用于在期望的作用位点或附近释放免疫球蛋白。
剂量给药
在一个实施方案中,给药量和施用频率被选择为治疗或预防上有效的。如本领域已知的,调节蛋白降解、系统与局部递送和新蛋白酶合成速率,以及年龄、体重、健康状况、性别、饮食、施用时间、药物相互作用和病症严重度可能是必需的,并且可由本领域技术人员通过常规实验确定。
制剂中治疗活性共衔接分子的浓度可以是约0.1至100重量%。在一个实施方案中,共衔接分子的浓度范围是0.003至1.0摩尔。为了治疗患者,可以施用治疗有效剂量的本文公开的免疫球蛋白。“治疗有效剂量”在本文意思是产生施用效应的剂量。精确剂量可基于治疗目的,并且可由本领域技术人员使用已知技术来确定。剂量范围可以是体重的0.0001至100mg/kg或更大,例如0.1、1、10或50mg/kg体重。在一个实施方案中,剂量范围是1至10mg/kg。
在一些实施方案中,仅使用共衔接分子的单剂。在其他实施方案中,施用共衔接分子的多剂。施用间隔时间可以不小于1小时、约1小时、约1-2小时、约2-3小时、约3-4小时、约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约2-4天、约4-6天、约1周、约2周或超过2周。
在其他实施方案中,本文公开的共衔接分子以节律给药方案施用,通过连续输注或无延长休息期的频繁施用。此类节律施用可以包括无休息期的恒定间隔给药。通常,此类方案包括长期低剂量或延长时段的连续输注,例如1-2天、1-2周、1-2月或最多6个月或更多。较低剂量的使用可以最大限度减小副作用和对休息期的需求。
在某些实施方案中,本文公开的共衔接分子和一种或多种其他预防或治疗剂循环施用至患者。循环疗法包括在一个时间施用第一剂、在第二时间施用第二剂、任选地在其他时间施用其他剂、任选地休息期,然后重复该施用顺序一次或多次。循环数通常为2-10。循环疗法可以减少对一种或多种剂的抗性的产生,并且可以最大限度减少副作用,或者可以提高治疗效力。
组合疗法
本文公开的共衔接分子可以伴随一种或多种其他治疗方案或治疗剂而施用。其他治疗方案或治疗剂可以用于治疗相同疾病,治疗并发症,或者可以用于提高免疫球蛋白的效力或安全性。
特别优选的组合疗法包括针对治疗IgE介导的疾患(例如变态反应和哮喘)被批准的或者经临床评价的那些。特别地,本发明的治疗组合物可与两个主要的药物组别抗炎剂(例如皮质类固醇)和/或支气管扩张剂(例如吸入式β2-激动剂)组合使用。吸入式皮质类固醇包括氟地松、布地奈德、氟尼缩松、莫米松、氢羟强的松龙和倍氯米松,而口服皮质类固醇包括强的松、甲基氢化泼尼松和强的松龙。其他类固醇包括糖皮质激素、地塞米松、可的松、羟基可的松、柳氮磺胺吡啶类十二烷酸(azulfidineicosanoids)例如前列腺素、凝血烷和白三烯,以及局部类固醇例如蒽啉、卡泊三烯、氯氟美松和他佐罗汀。支气管扩张剂增加了气道直径并且方便气流进出肺。可以与本发明疗法组合的支气管扩张剂包括短效支气管扩张剂(例如间羟异丙基肾上腺素、麻黄素、间羟叔丁基肾上腺素和沙丁胺醇)和长效支气管扩张剂(例如沙美特罗、间羟异丙基肾上腺素和茶碱)。
本发明疗法可以与非甾体抗炎药物(NSAID)组合,所述非甾体抗炎药物例如阿司匹林、布洛芬、塞来考昔、双氯芬酸、依托度酸、非诺洛芬、茚甲新、酮洛酸、噁丙嗪、萘丁美酮、舒林酸、托美汀、罗非考昔、甲氧萘丙酸、酮基布洛芬和萘普酮。组合疗法可以包括施用抗组胺药,例如氯雷他定、非索非那定、西替立嗪、苯海拉明、马来酸氯屈米、克立马丁和氮卓斯汀。组合疗法可以包括色甘酸盐、色甘酸钠和奈多罗米,以及decongestants、喷雾剂或口服剂,例如羟甲唑啉、苯福林和假麻黄碱。本发明疗法可以与称为白三烯受体拮抗剂的一类抗炎剂(例如普仑司特、扎鲁司特和孟鲁司特)和白三烯受体合成抑制剂(例如弃白通)组合。
本发明疗法可以与其他免疫疗法组合,包括脱敏(allergy shots)和IgE或FcεR的其他拮抗剂。本发明疗法可以与趋化因子或细胞因子的拮抗剂组合,包括但不限于抗体和Fc融合体,包括但不限于趋化因子CCR3、CCR4、CCR8和CRTH2和CCR5的抑制剂和细胞因子IL-13、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-19、IL-21、II类细胞因子受体家族、IL-22、IL-23、IL-25、IL-27、IL-31和IL-33的抑制剂。本发明疗法可以与附着、转录因子和/或细胞内信号传导的调节剂组合。例如,本发明免疫球蛋白可以与下述的调节剂组合:NF-κb、AP-1、GATA-3、Stat1、Stat-6、c-maf、NFAT、细胞因子信号传导抑制剂(SOCS)、过氧化物酶体增殖活化受体(PPAR)、MAP激酶、p38MAPK、JNK和鞘氨醇I-磷酸受体。本发明疗法可以与甲磺司特、磷酸二酯酶4(PDE4)抑制剂、钙通道阻断剂和肝素样分子施用。本发明可能的组合疗法进一步详细描述于Caramori等,2008,Journal of Occupational Medicine and Toxicology 3-S1-S6。
本发明疗法可以与一种或多种抗体、抗真菌剂或抗病毒剂联合使用。本文公开的抗体还可以与其他治疗方案例如外科手术组合。
实施例
下面提供的实施例仅为示例说明目的。这些实施例不是要将本文公开的任何实施方案限制为任何特定应用或操作理论。
实施例1.抑制IgE+FcγRIIb+细胞的新方法
免疫球蛋白IgE是受影响的组织中变应性应答的主要引发者和传播者。IgE结合IgE的高亲和受体(FcεRI),一种参与立即过敏表现的关键受体,表达在多种效应细胞上,包括肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞以及其他细胞类型。免疫复合的IgE-变应原对FcεRI的交联激活这些细胞,释放化学介质,例如组胺、前列腺素和白三烯,这可以导致I型超敏反应的发生。批准的单克隆抗体奥马珠单抗(Xolair)通过抑制IgE并阻断与FcεR的衔接而中和IgE。奥马珠单抗通过螯合而减少生物活性IgE,减少可以结合并敏化组织肥大细胞和嗜碱性粒细胞的抗原特异性IgE的量。游离循环IgE的这种中和导致变应性疾病症状的减少。感兴趣的是,血清IgE水平在治疗开始后因为奥马珠单抗-IgE复合物形成而增加,并可以在停止治疗后1年内保持高水平。因此,该问题可能导致诊断测试时的假阴性,因此,IgE水平必须被常规检查。
靶向IgE途径的新方法包括不仅阻断游离循环IgE衔接效应细胞上的FcεR,而且靶向IgE生成的来源。IgE由集中于淋巴结的IgE生成血浆细胞分泌,流到抗原进入部位或局部在变应性反应部位。IgE生成血浆细胞从IgE+B细胞分化。B细胞至IgE生成的类别转换由两个单独信号诱导,两个单独信号都是由TH2细胞提供。
存在两种形式的免疫球蛋白:分泌和膜锚定形式。膜锚定形式与分泌形式的区别在于前者具有从重链C端延伸的膜锚定肽。B细胞上的膜锚定免疫球蛋白海称为B细胞受体(BCR)复合物,对于B细胞功能是关键的。它可以转换信号以使静息B细胞分化成活化的成淋巴细胞和Ig分泌血浆细胞。
表达膜锚定IgE的分化B细胞在本文称为mIgE+B细胞,具有天然负调节反馈机制-抑制性Fc受体FcγRIIb。FcγRIIb表达在多种免疫细胞上,包括B细胞、树突细胞、单核细胞和巨噬细胞,其中它在免疫调节中起关键作用。在它对B细胞的正常作用中,FcγRIIb起反馈机制的作用以通过B细胞受体(BCR)调节B细胞活化。成熟B细胞上免疫复合抗原对BCR的衔接激活了细胞内信号传导级联,包括钙动员,这导致细胞增殖和分化。然而,当对抗原具有特异性的IgG抗体被产生时,相关免疫复合物(IC)可以交联BCR与FcγRIIb,其中BCR的激活受到FcγRIIb衔接和干扰BCR活化下游途径的相关细胞内信号传导途径的抑制。FcγRIIb在mIgE+B细胞(利用mIgE作为其BCR)上的表达用作这些细胞类型的负调节剂。
图1示例说明的用于抑制IgE介导的疾病的新策略是通过共衔接膜锚定IgE和抑制性受体FcγRIIb抑制IgE+B细胞(即,表达膜锚定IgE的B细胞)。在已经类别转换为表达IgE的B细胞中,mIgE用作BCR(在此称为mIgE BCR)。该方法将潜在地模拟B细胞活化的免疫复合物介导的抑制的天然生物机制,从而防止分化成为IgE生成血浆细胞。IgE生成血浆细胞位于骨髓并可能具有几周至几个月的寿命。因为IgE分泌血浆细胞在分化过程中经历mIgE表达B细胞阶段,如果它们的产生通过用该抗IgE处理抑制其B细胞前体而被废止,则现有血浆细胞将在数周至数月内死亡,因此,IgE的产生也将逐渐减少。重要的是,携带mIgE的IgE+记忆B细胞的抑制也将受到以高亲和力共衔接FcγRIIb的抗IgE免疫球蛋白的抑制。如果发生这种情况,则疗法对基本疾病具有长期影响。
实施例2.对FcγRIIb具有高亲和力的抗IgE抗体
在生理条件下,BCR与FcγRIIb桥连以及随后B细胞抑制通过IgG和同源抗原的免疫复合物而产生。设计策略是使用单交联抗体再现该效应。人IgG以弱亲和力(对于IgG1而言大于100nM)结合人FcγRIIb,并且FcγRIIb介导的抑制响应于免疫复合但非单体IgG而发生。推论,对该受体的高亲和力(低于100nM)是B细胞活化的最大抑制所需要的。为了增强本发明抗IgE抗体的抑制活性,Fc区用提高对FcγRIIb结合的变体工程化。已经描述了相对于天然IgG1以提高的亲和力结合FcγRIIb的工程化Fc变体(USSN 12/156,183,2008年5月30日提交,名称为“Methods andCompositions for Inhibiting CD32b Expressing cells”,在此通过引用明确并入)。
变体最初产生于靶向抗原CD19的抗体环境,抗原CD19是BCR共同受体复合物的调节组分。该抗体的Fv区是人源化的并且是抗体4G7的亲和力成熟形式,在本文被称为HuAM4G7。该抗体的Fv基因被亚克隆入哺乳动物表达载体pTT5(National Research Council Canada)。Fc结构域中的突变使用定点诱变引入(QuikChange,Stratagene,Cedar Creek,TX)。此外,产生对Fc受体亲和力丧失的对照敲除变体,包括取代G236R和L328R(G236R/L328R)。该变体被称为Fc-KO或Fc敲除。将重链和轻链构建体共转染入HEK293E细胞以表达,并且抗体使用蛋白A亲和色谱(PierceBiotechnology,Rockford,IL)纯化。
用于结合研究的重组人FcγRIIb蛋白获自R&D Systems(Minneapolis,MN)。编码FcγRIIa和FcγRIIIa受体蛋白的基因获自Mammalian GeneCollection(ATCC)并被亚克隆入含有6X His标签的pTT5载体(NationalResearch Council Canada)。使用QuikChange诱变产生受体的等位基因形式(FcγRIIa的H131和R131,和FcγRIIIa的V158和F158)。编码受体的载体被转染入HEK293T细胞,蛋白使用镍亲和色谱纯化。
使用Biacore技术(在本文还称为Biacore)测试变体的受体亲和力,Biacore技术是一种基于表面等离子体共振(SPR)用于实时研究生物分子相互作用的技术。SPR测量使用Biacore 3000仪器(Biacore,Piscataway,NJ)进行。使用标准伯胺偶联方案产生蛋白A/G(Pierce Biotechnology)CM5生物传感芯片(Biacore)。使用HBS-EP缓冲液(10mM HEPES pH 7.4,0.15MNaCl,3mM EDTA,0.005%vol/vol表面活性剂P20,Biacore)进行所有测量。在HBS-EP缓冲液中20nM或50nM的抗体被固定在蛋白A/G表面,并注射FcγR。在每次循环后,通过注射甘氨酸缓冲液(10mM,pH 1.5)再生表面。通过在注射FcγR之前时间和响应归零并减去适当的非特异性信号(参考通道和运行缓冲液的注射的响应)来处理数据。使用BIA评估软件(Biacore),通过结合数据与1∶1Langmuir结合模型的整体拟合来进行动态分析。
选择变体抗CD19抗体与FcγRIIb的结合的传感图的代表组示于图2.所有变体和WT(天然)IgG1与所有FcγR的亲和力(从Biacore结合数据的拟合获得)绘于图3,并以数字提供于图4。虽然WT IgG1Fc以μM亲和力(KD=1.8uM,图4)结合FcγRIIb,但是许多变体例如G236D/S267E、S239D/S267E和S267E/L328F已经被工程化,更紧密地结合抑制性受体。USSN 11/124,620中描述的S239D/I332E变体还提高对激活受体FcγRIIa和FcγRIIIa的亲和力,因此能够介导增强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和吞噬(ADCP)。G236R/L328R变体还称为Fc敲除或Fc-KO,缺乏对Fc受体的结合,用作本文描述的实验中的对照。
几种变体在靶向IgE的抗体中构建。抗IgE抗体的重链和轻链可变区(VH和VL)提供于图5。奥马珠单抗是人源化抗体,其目前被批准用于治疗变应性哮喘,并且以名称Xolair上市。MaE11是奥马珠单抗的鼠前体。H1L1_MaE11是MaE11的新型人源化形式。编码这些抗IgE抗体的重链和轻链VH和VL结构域的基因被商业合成(Blue Heron Biotechnologies)。还合成了抗呼吸道合胞病毒(RSV)抗体莫维珠单抗的可变区VH和VL基因,在实验中用作阴性对照。VL基因被亚克隆入哺乳动物表达载体pTT5(NRC-BRI,Canada),编码Ckappa恒定区。VH基因被亚克隆入pTT5载体,编码天然IgG1和变体恒定区。选择恒定区的氨基酸序列提供于图6。所有DNA被测序以证实序列的保真性。选择抗体的全长重链和轻链的氨基酸序列提供于图7。
含有重链和轻链基因的质粒使用脂质体(Invitrogen)被共转染入HEK293E细胞,并在FreeStyle 293培养基(Invitrogen)中培养。5天生长之后,使用MabSelect树脂(GE Healthcare)通过蛋白A亲和从培养上清液纯化抗体。
已经使用Biacore测试了天然IgG1抗IgE抗体对IgE和FcγRIIb的结合。编码含有使用的抗IgE抗体的结合位点的IgE的Fc区的DNA被合成(Blue Heron Biotechnologies)并亚克隆入pTT5载体。IgE Fc表达于293E细胞并如上所述使用蛋白A纯化。SPR测量使用上述蛋白A/抗体捕获方法进行,除了分析物是FcγRIIb或IgE的Fc区。数据采集和拟合如上所述。图8提供了通过这些结合实验获得的平衡结合常数(KD),以及相对于天然IgG1对FcγRIIb结合的倍亲和力。图9显示这些数据的图。结果证实了抗体对IgE的高亲和力,并且S267E/L328F变体对FcγRIIb的结合提高超过两个数量级,与之前结果一致。
特定变体例如S267E/L328F和S239D/I332E的使用在本文意思是对本文所述机制的概念验证,而不是要将本发明限制于其特定用途。USSN12/156,183和USSN 11/124,620中提供的数据表明,在特定Fc位置的许多工程化变体提供了靶向性质。增强FcγR亲和力(特别是对于FcγRIIb)的取代包括234、235、236、237、239、266、267、268、325、326、327、328、和332。在一些实施方案中,对非限制性的下述位置的至少一个或多个进行取代以增强对FcγRIIb的亲和力:235、236、239、266、267、268、和328。
进行取代以增强对FcγRIIb亲和力的位置的非限制性组合包括:234/239、234/267、234/328、235/236、235/239、235/267、235/268、235/328、236/239、236/267、236/268、236/328、237/267、239/267、239/268、239/327、239/328、239/332、266/267、267/268、267/325、267/327、267/328、267/332、268/327、268/328、268/332、326/328、327/328和328/332。在一些实施方案中,进行取代以增强对FcγRIIb亲和力的位置组合包括但不限于:235/267、236/267、239/268、239/267、267/268、和267/328。
增强对FcγRIIb亲和力的取代包括:234D、234E、234W、235D、235F、235R、235Y、236D、236N、237D、237N、239D、239E、266M、267D、267E、268D、268E、327D、327E、328F、328W、328Y、和332E。在一些实施方案中,进行取代以增强对FcγRIIb亲和力的位置组合包括但不限于:235Y、236D、239D、266M、267E、268D、268E、328F、328W、和328Y。
增强对FcγRIIb亲和力的取代组合包括:L234D/S267E、L234E/S267E、L234F/S267E、L234E/L328F、L234W/S239D、L234W/S239E、L234W/S267E、L234W/L328Y、L235D/S267E、L235D/L328F、L235F/S239D、L235F/S267E、L235F/L328Y、L235Y/G236D、L235Y/S239D、L235Y/S267D、L235Y/S267E、L235Y/H268E、L235Y/L328F、G236D/S239D、G236D/S267E、G236D/H268E、G236D/L328F、G236N/S267E、G237D/S267E、G237N/S267E、S239D/S267D、S239D/S267E、S239D/H268D、S239D/H268E、S239D/A327D、S239D/L328F、S239D/L328W、S239D/L328Y、S239D/I332E、S239E/S267E、V266M/S267E、S267D/H268E、S267E/H268D、S267E/H268E、S267E/N325L、S267E/A327D、S267E/A327E、S267E/L328F、S267E/L328I、S267E/L328Y、S267E/I332E、H268D/A327D、H268D/L328F、H268D/L328W、H268D/L328Y、H268D/I332E、H268E/L328F、H268E/L328Y、A327D/L328Y、L328F/I332E、L328W/I332E、和L328Y/I332E。在一些实施方案中,增强对FcγRIIb亲和力的取代组合包括但不限于:L235Y/S267E、G236D/S267E、S239D/H268D、S239D/S267E、S267E/H268D、S267E/H268E、和S267E/L328F。
实施例3.对FcγRIIb具有高亲和力的抗IgE抗体在体外抑制IgE+B
细胞
建立酶联免疫吸附测定(ELISA)以检测IgE。通过用pH 9.4碳酸氢钠缓冲液涂布,随后与10ug/ml的抗IgE捕获抗体在pH 9.4(0.1M碳酸氢钠缓冲液)粘附过夜,准备平地板。过夜后,将板用3%BSA/PBS封闭,添加3x至1ug/ml的IgE(来自人IgE ELISA试剂盒,Bethyl Laboratories)连续稀释液。3小时后,将板用TTBS洗涤3x(200ul),测量结合的IgE。HRP-缀合的山羊多克隆抗人IgE抗体(Bethyl Laboratories)以(1∶5000)添加于1%BSA/PBS中1小时。样品洗涤3x,用TMB过氧化物酶底物(KPL,Inc50-76-00)检测IgE。反应用50ul 2N H2SO4终止并在450nm读数。
图10显示IgE用各种抗人IgE抗体捕获,包括三种单克隆抗IgE抗体(MabTech;107/182/101)、MaE11_IgG1_G236R/L328R和奥马珠单抗_IgG1_G236R/L328R的混合物。数据显示商品化抗IgE抗体试剂(MabTech)、奥马珠单抗及其亲本嵌合抗体MaE11能够捕获IgE。为了使用该测定来检测IgE,有必要确定MaE11和奥马珠单抗抗体是否会干扰MabTech抗IgE试剂对IgE的捕获。如上所述重复测定,根据吸光度的IgE浓度使用标准曲线计算。图11显示,抗IgE抗体奥马珠单抗_G236R/L328R不与目前ELISA方案中MabTech抗IgE抗体竞争。
测试Fc变体抗IgE抗体抑制IgE+B细胞的能力。通过添加5ng/ml白介素-4(IL-4)和100ng/ml抗CD40抗体(克隆G28.5IgG1),人PBMC被诱导以分类转换为IgE生成B细胞。抗CD40抗体是CD40的激动剂,因此模拟共激活剂CD40L的活性。添加各种浓度的抗IgE抗体,并且样品被孵育12天。准备ELISA板,并如上所述封闭,使用5ug/ml Mabtech抗IgE作为捕获抗体。100ul PBMC样品被添加并孵育>3小时,然后用TTBS3x(200ul)洗涤。添加抗体-HRP缀合的抗体并如上检测。使用标准曲线将450nm的吸光度转换为IgE浓度。结果示于图12。缺乏FcγR结合的抗体(G236R/L328R变体)或对IgE无特异性的抗体(Motavizumab抗RSV抗体)对分化的B细胞产生IgE无影响。相反,对FcγRIIb具有更大亲和力的变体抗体抑制了IgE生成。这些数据显示,表面IgE和抑制性FcγR受体FcγRIIb的共衔接抑制该免疫球蛋白类型的类别转换的B细胞。IgE+B细胞的抑制减少IgE表达血浆细胞的数量,转而减少检测的IgE的量。为了评价该活性对IgE生成B细胞的选择性,使用IgG2ELISA(BethylLaboratories)从相同样品测量人IgG2。图13显示,IgG2分泌未受抑制,表明具有高FcγRIIb亲和力的抗IgE抗体的抑制活性对于IgE+类别转换细胞具有选择性。使用批准的抗IgE抗体奥马珠单抗的变体形式重复该实验,显示具有高FcγRIIb亲和力的变体的相似抑制结果(图14)。
具有高FcγRIIb亲和力的抗IgE抗体抑制IgE生成的能力在mIgE BCR刺激存在下评估。重复上述测定,通过IL-4和α-CD40激动剂抗体促进至IgE的类别转换,此外,使用抗mu或抗CD79b抗体活化B细胞。这些抗体交联BCR,从而提供与免疫复合抗原类似的信号。抗mu抗体交联膜锚定IgM,并且抗CD79b交联CD79b,其是BCR复合体的信号传导组分。PBMC用IL-4、α-CD40和抗CD79b或抗mu孵育14天,并且如上所述检测IgE。抗CD79b(图15)和抗mu(图16)的结果显示,当B细胞通过BCR交联刺激时,对FcγRIIb具有高亲和力的抗IgE抗体能够抑制IgE生成。
抑制IgE+B细胞的其他策略是清除它们。这可以使用抗IgE抗体进行,抗IgE抗体增强了效应子功能。变体S239D/I332E增加对激活受体FcγRIIa和FcγRIIIa(图3和图4)的结合,因此改善ADCC和ADCP效应子功能。使用抗IgE抗体奥马珠单抗的S239D/I332E变体进行上述B细胞测定。PBMC用IL-4、α-CD40和抗CD79b(图17)或抗mu(图18)孵育14天,IgE如上所述检测。结果(图17和18)显示,具有优化的效应子功能的抗IgE抗体能够抑制从类别转换的IgE+B细胞的IgE生成。
实施例4.对FcγRIIb具有高亲和力的抗IgE抗体体内抑制IgE+B细
胞
本文公开的免疫球蛋白使用作为人中治疗活性的代理的huPBL-SCID小鼠模型进行评估。该研究检查了本文描述的抗IgE抗体抑制B细胞活性和响应于常见人变应原-尘螨蛋白Der p 1的血浆细胞发展的能力。在该方法中,来自对Der p 1变应性应答的血液供体的人外周血白细胞(PBL)被移植入免疫缺陷SCID小鼠并用天然或变体抗IgE抗体治疗。小鼠用抗原激发以刺激免疫应答,测量免疫球蛋白的产生以检查B细胞发育成血浆细胞的过程。
基于针对Der p 1的抗IgE抗体的存在,筛选血液供体对尘螨抗原的变态反应。具有阳性反应性的供体被清除白细胞以获得外周血单核细胞(PBMC)。研究方案提供于图20。在PBMC注射前一天,小鼠腹膜内(i.p.)注射100ul抗唾液酸转基因抗体(Wako,Richmond,VA)以清除鼠天然杀伤(NK)细胞。第二天,小鼠腹膜内注射体积为0.5ml的3x107PBL。PBMC注射之后,小鼠被分为5个不同的小鼠组,每组7只小鼠。在PBMC注射后第7天,经眼窝窦/丛(OSP)穿刺从所有小鼠收集血液以通过ELISA(ZeptoMetrix,Buffalo,NY)测定人IgG和IgE水平。两天后(第9天),小鼠被腹膜内注射10mg/kg抗体或PBS。在第11天,小鼠被腹膜内注射15ug尘螨抗原Der p 1(LoTox Natural Der p 1,Indoor Biotechnologies,Charlottesville,VA)。第23天(抗原接种后12天),从所有小鼠收集血液以测定人IgG和IgE抗体。在同一天,小鼠接受第一次腹膜注射10mg/kg抗体或PBS。两天后(第25天),小鼠接受10ug尘螨抗原Der p 1的加强腹膜内接种。在第37天(抗原加强后12天),通过OSP收集血液以进行人免疫球蛋白测定。人IgG和IgE浓度使用与上述那些类似的ELISA方法测量。
结果显示于图20和21,分别是血清IgG和IgE水平。在抗原激发之前,人IgG和IgE抗体的水平在所有组中是低的。在Der p 1免疫之后,所有组显示高水平的人IgG,表明移植人B细胞对接种的Der p 1抗原或内源性小鼠抗原的强有力的免疫应答。与IgG应答相反,治疗组在其IgE抗体的生成方面差异显著。奥马珠单抗和H1L1 MaE11的IgG1形式在抑制人IgE生成方面等同于媒介物。然而,H1L1 MaE11的FcγRIIb增强(IIbE,S267E/L328F)形式显示没有可检测水平的人IgE。H1L1 MaE11的Fc-KO(变体G236R/L328R)形式缺乏对所有FcγR的结合,显示人IgE生成方面的增强。这可能是由于其交联人mIgE并因此活化IgE+B细胞的能力,但是其完全缺乏FcγRIIb抑制性或FcγRIIa/IIIa细胞毒性活性,例如抗体的IgG1和IIbE形式所具有的那些。这些体内数据显示,对FcγRIIb具有高亲和力的抗IgE抗体能够抑制人IgE+B细胞活化和免疫球蛋白分泌血浆细胞分化,并因此支持本文公开的免疫球蛋白治疗IgE介导的疾患的潜力。
本文引用的所有参考文献在此明确通过引用整体并入。
虽然上文已经为了示例说明目的而描述了具体实施方案,但是本领域技术人员应理解,可以做出许多细节变化而不背离所附权利要求描述的本发明。
Claims (5)
1.一种抗体,其包含:
a) 重链,其包含:
i) 重链可变区,其包含具有SEQ ID NO:18的vhCDR1、具有SEQ ID NO:19的vhCDR2和具有SEQ ID NO:20的vhCDR3;和
ii) 人亲本IgG Fc多肽的Fc结构域变体,其包含氨基酸取代S267E,其中编号是根据Kabat的EU指数;和
b) 轻链,其包含具有SEQ ID NO:22的vlCDR1、具有SEQ ID NO:23的vlCDR2和具有SEQ ID NO:24的vlCDR3。
2.权利要求1的抗体,其中所述Fc结构域变体进一步包含氨基酸取代L328F, 其中编号是根据Kabat的EU指数。
3.权利要求1的抗体,其中所述重链可变区具有SEQ ID NO: 17的氨基酸序列和所述轻链可变区具有SEQ ID NO: 21的氨基酸序列。
4.权利要求1的抗体,其中所述重链具有SEQ ID NO: 42的氨基酸序列和轻链具有SEQ ID NO: 40的氨基酸序列。
5.一种制备抗体的方法,所述方法包括提供:
a) 编码具有SEQ ID NO:42的重链的第一核酸;
b) 编码具有SEQ ID NO:40的轻链的第二核酸;和
c) 在其中产生所述重链和轻链的条件下,表达所述核酸。
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