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KR20100120289A - 분말상 단백질 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

분말상 단백질 조성물 및 이의 제조 방법 Download PDF

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KR20100120289A
KR20100120289A KR1020107017828A KR20107017828A KR20100120289A KR 20100120289 A KR20100120289 A KR 20100120289A KR 1020107017828 A KR1020107017828 A KR 1020107017828A KR 20107017828 A KR20107017828 A KR 20107017828A KR 20100120289 A KR20100120289 A KR 20100120289A
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KR
South Korea
Prior art keywords
protein
antibody
powder
composition
excipient
Prior art date
Application number
KR1020107017828A
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English (en)
Inventor
미하엘 아들러
한스-위르겐 크라우제
미하엘 지들러
페터 라쓰너
게오프라이 레
Original Assignee
애보트 게엠베하 운트 콤파니 카게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 애보트 게엠베하 운트 콤파니 카게 filed Critical 애보트 게엠베하 운트 콤파니 카게
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Abstract

예를 들면, 약 50mg/mL 이상의 단백질 또는 펩타이드(예를 들면, 항체 또는 이의 항원 결합 부위) 및 하나 이상의 부형제를 포함하는 용액을 분무 건조시킴을 포함하는 단백질 또는 펩타이드 분말의 제조 방법이 제공되어 있다. 또한, 예를 들면, 약 6% 미만의 잔류 수분을 갖는, 단백질 및 부형제를 포함하는 안정한 분말상 조성물이 제공되어 있다.

Description

분말상 단백질 조성물 및 이의 제조 방법{Powdered protein compositions and methods of making same}
관련 출원
본 출원은 2008년 1월 15일자로 출원된 미국 가특허원 제61/021,298호에 대한 우선권의 이익을 청구하며, 이의 내용은 전문이 본원에 참고로 인용되어 있다.
약제학적 단백질 제형화의 기본 원리는 특정 불안정성을 극복해야 한다는 것이다. 단백질의 분해 경로는 화학적 불안정성과 물리적 불안정성을 포함한 두 개의 명확한 부류로 분리할 수 있다. 화학적 불안정성은 결합 형성 또는 개열을 통한 단백질의 변성을 야기한다. 화학적 불안정성 문제의 예는 탈아미드화, 라세미화, 가수분해, 산화, 베타 제거 및 이황화물 교환을 포함한다. 다른 한편으로, 물리적 불안정성은 단백질의 공유결합적 변화를 야기하지 않는다. 오히려, 이들은 단백질의 고차 구조(2차 이상)에서의 변화에 관여한다. 이들은 변성, 표면에의 흡착, 응집 및 침강을 포함한다[문헌 참조; Manning et al., Pharm. Res. 6, 903 (1989)].
왓슨 및 크릭(Watson and Crick)(1953)에 의해 DNA-구조가 발견된 이후 사람 게놈 서열분석 프로젝트의 완료 후, 단백질 화학에 대한 관심이 매우 빠르게 커져 왔다. 질환, 조직 또는 성장에 있어서의 유전자와 이들의 단백질 산물 간의 관계가 특히 중요하였다[문헌 참조; Next generation pharmaceutical, Issue 6 (GDS publishing Ltd., 2006)]. 수십년 사이에, 단백질계 약제의 수는 매우 빠르게 증가하였다. 오늘날, 특정 장애 및 질환을 경감시키거나 치료하기 위해 특정 단백질 또는 펩타이드를 분리하거나 합성하고, 변성시키고, 전달할 수 있다. 단백질계 약제를 위한 주요 적용 경로는 여전히 액체 제형의 정맥내 주사이지만, 다른 경로가 또한 시험되고 사용되고 있다.
단백질 용액을 고체 형태로 전환시키기 위한 여러가지 노력이 이루어져 왔다. 분말상 조성물은 다수의 이점을 제공하며, 예를 들면, 저장 및 선적 동안 액체 제형의 냉각을 위해 요구되는 것보다 에너지 소모가 더 적고 훨씬 적은 공간 및 중량을 사용하여 다량의 단백질을 저장하거나 수송할 수 있다. 분말상 조성물은 또한 흡입(문헌 참조; Tzannis et al., 국제 공개공보 제WO 2005067898호) 또는 무침 주사(문헌 참조; Burkoth, The Drug Delivery Companies Report 76-78 (2001))와 같은 새로운 전달 경로를 용이하게 한다. 단백질 수용액으로부터 분말을 제조하기 위한 몇 가지 방법들이 사용되고 있으며, 이들 중에는 초임계 유체 또는 (부분) 유기 용액으로부터의 분무 건조, 분무-동결 건조, 동결 건조 또는 침전이 있다[문헌 참조; Winters et al., Journal of Pharm. Sci. 85(6): 586-594 (1996)]. 매우 고가이고 시간-소모적인 동결 건조와는 달리, 분무 건조는 흡입과 같은 생물의약(biopharmaceutical)을 위한 새로운 전달 형태의 개발을 위한 기회를 제공하는 단백질-부하된 고체를 생성하기 위한 효과적이고 능률적인 수단이다[문헌 참조; Maa et al., Pharm. Res. 16(2): 249-254 (1999)].
순수한 단백질 용액을 분무 건조시키는 것은 부분 불활성화를 야기할 위험이 있으며, 이는 자동적으로 저품질 약제를 초래한다. 불활성화는, 예를 들면, 고온으로 인한 공정 관련 물리적 응력, 전단 응력 및 큰 상 계면(액체/가스), 예를 들면, 변성 또는 응집에 의해 또는 화학적 반응, 예를 들면, 가스분해 또는 산화에 의해 야기될 수 있다.
본 발명은 단백질 및 부형제를 포함하는 단백질 제형을 분무 건조시키는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 방법 및 조성물은 관심 단백질 및 부형제를 함유하는 용액을 분무 건조시키는 분무 건조 공정을 기본으로 한다.
본 발명의 제형은 표준 용액 및 동결 건조된 제형을 능가하는 다수의 이점을 갖는다. 특히, 본 발명의 분무 건조법은 공정 관련 분해를 최소화시키고 주위 온도에서의 단백질 안정성을 증가시킨다(예를 들면, 동결 건조된 조성물과 비교하여). 추가로, 분무 건조된 제형은 또한 수송하기가 보다 용이하고, 고농도 제형을 제조하고, 단백질의 생체이용효율을 개선시키고, 국소 방출(예를 들면, 폐 전달) 및 서방출(예를 들면, 리포좀 및 (폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드)) PLGA-피복된 미소구체) 제형의 개발에 유용하다.
본 발명의 방법 및 조성물은 관심 단백질 및 부형제를 포함하는 안정한 분말상 조성물 또는 제형을 제공하는데 사용될 수 있다. 하나의 국면에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 생체내 및 시험관내 목적으로 사용되는 것을 포함하여, 항체 및 이의 단편에 사용된다. 추가의 양태에서, 항체 단편은 면역글로불린 G(IgG) 단편이다.
추가로, 단백질 및 펩타이드 제형을 제조하는데 필요한 다단계 정제 및 농축 공정은 종종 조성물에 변이성을 도입하여, 제형의 정확한 조성이 로트마다 다를 수 있다. 연방 기준에서는 약물 조성이 제조 위치 또는 로트 번호와 관계없이 제형에서 매우 일관적인 것을 요구한다. 본 발명의 방법은 부형제가 정확한 양으로 첨가되어 정확한 농도의 부형제를 갖는 단백질 제형을 생성할 수 있는 단백질의 분말상 제형을 제조하는데 사용될 수 있다.
하나의 국면에서, 본 발명은 약 50mg/mL 이상의 단백질 또는 펩타이드 및 하나 이상의 부형제를 포함하는 용액을 분무 건조시켜 단백질 또는 펩타이드 분말을 제조함을 포함하는 단백질 또는 펩타이드 분말의 제조 방법을 제공한다. 몇몇 양태에서, 상기 용액은 약 100mg/mL 이상의 단백질 또는 펩타이드를 포함한다. 단백질은 또한 이중 가변 결합 도메인(dual variable binding domain; DVD) 결합 단백질일 수 있다.
몇몇 양태에서, 상기 방법은 항체 분말을 제조함을 포함하며, 이는 약 50mg/mL 이상의 항체 또는 이의 항원 결합 부위 및 하나 이상의 부형제를 포함하는 용액을 분무 건조시켜 항체 분말을 제조함을 포함한다. 몇몇 양태에서, 용액은 약 100mg/mL 이상의 항체 또는 이의 항원 결합 부위를 포함한다. 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 면역글로불린 G(IgG), 예를 들면, MAK 195F, 아달리무마브(adalimumab), ABT-325, ABT-308 또는 ABT-147일 수 있다. 몇몇 양태에서, 분말은 적어도 3달 동안 주위 온도 및 습도에서 안정하고/하거나 적어도 3달 동안 40℃에서 안정하다.
부형제는, 예를 들면, 트레할로즈, 수크로즈, 소르비톨, 폴리에틸렌 글리콜, 하나 이상의 아미노산, 히스티딘, 알라닌, 아르기닌, 글리신 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 용액은 약 0.27:1.0 내지 약 2.8:1.0, 약 0.27:1.0 내지 약 1.4:1.0, 약 0.27:1.0 내지 약 0.7:1.0의 부형제:단백질 비 또는 약 0.7:1.0의 비를 포함한다. 몇몇 양태에서, 용액은 약 20 내지 약 30mM의 부형제 또는 약 25mM의 부형제를 포함한다.
몇몇 양태에서, 상기 방법은 약 100℃ 내지 약 180℃의 입구 공기 온도(inlet air temperature)(Tin) 및 약 60℃ 내지 약 110℃의 출구 공기 온도(outlet air temperature)(Tout)로 분무 건조시킴을 포함한다. 특정 양태에서, 상기 방법은 약 130℃의 Tin 및 약 80℃의 Tout으로 분무 건조시킴을 포함한다. 상기 방법은, 예를 들면, 용액을 분무화(atomizing)시켜 용액 액적(droplet)을 형성하고, 액적을 가스로 건조시켜 분말을 형성하고, 가스로부터 분말을 회수함을 포함할 수 있다. 상기 방법은 용액을 압력 노즐 분무기(pressure nozzle atomizer)로 분무화시키고/시키거나 사이클론을 사용하여 가스로부터 항체 분말을 분리하고 회수함을 포함할 수 있다.
상기 방법은 또한 약제학적으로 허용되는 담체 속에 항체 분말을 매봉시킴을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 비경구, 경구, 장내 및/또는 국소 투여에 허용 가능할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 물과 같은 액체를 포함할 수 있다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 유효량의 항체 또는 이의 항원 결합 부위를 포함하는 약제학적 제제에 관한 것이다. 또 다른 국면에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 유효량의 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 약제학적 제제에 관한 것이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 약 6% 미만의 잔류 수분, 몇몇 양태에서, 약 4% 또는 3% 미만의 잔류 수분을 포함하는, 단백질 또는 펩타이드 및 부형제를 포함하는 안정한 분말상 조성물을 제공한다. 단백질 또는 펩타이드는 항체 또는 이의 항원 결합 부위, 예를 들면, IgG 항체 또는 이의 항원 결합 부위, 예를 들면, MAK 195F, 아달리무마브, ABT-325, ABT-308 또는 ABT-147을 포함할 수 있다. 단백질은 또한 이중 가변 결합 도메인(DVD) 결합 단백질일 수 있다.
몇몇 양태에서, 분말상 조성물은 주위 온도 및 습도에서 적어도 3달 동안 안정하고/하거나 약 40℃에서 적어도 3달 동안 안정하다. 몇몇 양태에서, 단백질 또는 펩타이드, 또는 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 이의 생물학적 활성을 보유한다.
부형제는 트레할로즈, 수크로즈, 소르비톨, 폴리에틸렌 글리콜, 하나 이상의 아미노산, 히스티딘, 알라닌, 아르기닌, 글리신 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 조성물은 약 0.27:1.0 내지 약 2.8:1.0, 약 0.27:1.0 내지 약 1.4:1.0, 약 0.27:1.0 내지 약 0.7:1.0, 또는 약 0.7:1의 부형제(예를 들면, 트레할로즈 및/또는 수크로즈) 대 항체 또는 이의 항원 결합 부위의 질량 비를 가질 수 있다. 조성물은 약 0.27:1.0 내지 약 2.8:1.0, 약 0.27:1.0 내지 약 1.4:1.0, 약 0.27:1.0 내지 약 0.7:1.0, 또는 약 0.7:1, 또는 약 0.35:1의 부형제(예를 들면, 소르비톨) 대 항체 또는 이의 항원 결합 부위의 질량 비를 가질 수 있다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 본 발명의 유효량의 안정한 분말상 조성물을 약제학적으로 허용되는 담체, 예를 들면, 물과 같은 액체와 혼합함을 포함하는 약제학적 조성물의 제조 방법을 제공한다. 몇몇 양태에서, 약제학적 조성물은 비경구, 경구, 장내 또는 국소 투여에 적합하다. 상기 방법은 분말상 조성물의 안정성에 상당한 영향을 미치지 않으면서 주위 온도보다 상당히 높은 온도에서 안정한 분말상 조성물을 가공(예를 들면, 용융 압출)함을 추가로 포함할 수 있다.
특정 양태에서, 상기 방법은 분말상 조성물을, 예를 들면, PLGA와 같은 중합체로 피복시켜 서방출 또는 지연 방출 약제학적 조성물을 형성함을 포함한다. 추가로 또는 대안적으로, 상기 방법은 장용 제피제(enteric coating)로 피복시킴을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 단백질, 펩타이드, 항체 또는 이의 항원 결합 부위의 활성은 부형제에 의해 유기 용매, 예를 들면, PEG 400, 에탄올, DMSO, NMP 또는 빙초산에 의한 침전, 변성 또는 산화로부터 보호된다.
최근, 거의 모든 회사들이 동결된 벌크 약물 조성물을 사용하고 있으며, 동결 및 해동 조건의 재현성, 벌크 약물 성분 내에서의 부형제의 예기치 못한 결정화, 동결 동안의 완충액의 pH-변화 및 해동(예를 들면, 대략 37℃의 온도에서 2리터 용기)으로 인한 긴 지연 시간(lag time)과 같은 문제에 직면한다. 분무-건조된 벌크 약물 조성물을 사용하면 이러한 문제들을 피할 수 있다. 추가로, 분무 건조된 벌크 약물 조성물은 최종 의약품 조성물의 배합 동안 취급하기가 매우 편리하고, 광범위한 농도 범위에서 제조할 수 있다. 추가로, 분무 건조된 약물 조성물은, 단지 물만 첨가된 경우, 종래의 배합을 대신할 수 있으며, 이에 따라 출력 용량을 증가시키면서 의약품 제조 동안 위험을 감소시킨다. 추가로, 전장(full length)/완전 항체는 모노클로날 항체(mAb) 단편에 비해 물리적 분해 경향이 덜할 수 있다. 또한, 전형적으로 단백질 농도를 100mg/mL까지 증가시키면서도 물리적 또는 화학적 분해가 거의 증가하지 않거나 전혀 증가하지 않는다. 보다 농축된 용액이 공정의 효율을 증가시키기 때문에, 100mg/mL의 단백질 농도의 사용이 유익할 것이다.
본원에 기재된 방법 및 조성물의 이러한 및 기타의 특징 및 이점은 첨부된 도면과 함께 다음의 상세한 설명을 참조로 하여 보다 충분히 이해될 것이다.
도 1은 실시예에서 사용된 바와 같은 Buchi 분무 건조기 B-191을 나타낸다.
도 2는 상이한 소르비톨-MAK 혼합물의 수율 및 Tg를 나타낸다.
도 3은 상이한 소르비톨-MAK 혼합물의 응집, 결정화도 및 수분 함량을 나타낸다.
도 4는 소르비톨-MAK 혼합물 3000x의 주사 전자 현미경(scanning electron microscopy; SEM) 이미지를 제공한다. (a) 25mM (b) 100mM.
도 5는 상이한 트레할로즈-MAK 혼합물의 수율 및 Tg를 나타낸다.
도 6은 상이한 트레할로즈-MAK 혼합물의 응집, 결정화도 및 수분 함량을 나타낸다.
도 7은 트레할로즈 혼합물(3000x)의 SEM 이미지를 제공한다, (a) 10mM 트레할로즈, (b) 100mM 트레할로즈 및 (c) 순수한 트레할로즈 분무 건조된 트레할로즈.
도 8은 상이한 수크로즈-MAK 혼합물의 수율 및 Tg를 나타낸다.
도 9는 상이한 수크로즈-MAK 혼합물의 응집, 결정화도 및 수분 함량을 나타낸다.
도 10은 분무 건조된 MAK 195F 제형에 대한 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography; SEC) 물리적 안정성 데이터를 나타낸다: (A) 소르비톨, 트레할로즈 및 수크로즈의 효과 및 (B) 단백질 응집의 양에 대한 안정화제 농도의 효과.
도 11은 200mM 트레할로즈 용액 중의 분무-건조된 고농도 MAK 195F, 아달리무마브 및 ABT-325에 대한 (A) 물리적 안정성 및 (B) 화학적 안정성에 미치는 가공 및 3개월 저장의 효과를 나타낸다.
I. 정의
본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위해, 먼저 특정 용어들을 정의한다.
본원에서 사용되는 용어 "산성 성분"은 산성 pH, 즉, 7.0 미만의 pH를 갖는, 용액을 포함한 제제를 나타낸다. 산성 성분의 예는 인산, 염산, 아세트산, 시트르산, 옥살산, 석신산, 타르타르산, 락트산, 말산, 글리콜산 및 푸마르산을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "산화방지제"는 산화를 억제하거나 산화방지제 상승제로서 작용하여 산화적 공정에 의한 제제의 열화를 방지하는데 사용되는 제제를 의미하는 것으로 의도된다. 이러한 화합물은 예를 들자면 제한없이 알파 토코페롤(비타민 E), 아스코르브산, 아스코르빌 팔미테이트, 시트르산, 부틸화 하이드록시아니솔, 부틸화 하이드록시톨루엔, 에데트산(EDTA, 에데테이트) 및 이의 염, 하이드로인산, 말산, 모노티오글리세롤, 프로피온산, 프로필 갈레이트, 메티오닌, 아스코르산나트륨, 시트르산나트륨, 황화나트륨, 아황산나트륨, 나트륨 비설파이트, 나트륨 메타비설파이트 및 당해 기술 분야의 통상의 숙련가들에게 공지된 것들을 포함한다.
본원에 달리 제시되지 않는 한, 용어 "조성물" 및 "제형"은 상호교환 가능하게 사용된다.
용어 "부형제"는 목적하는 조도를 제공하고, 예를 들면, 벌크 특성을 변화시키고, 안정성을 개선시키고/시키거나 삼투압 농도를 조절하기 위해 제형에 첨가될 수 있는 제제를 나타낸다. 통상적으로 사용되는 부형제의 예는 안정화제, 당, 폴리올, 아미노산, 계면활성제, 킬레이트화제 및 중합체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
조성물, 예를 들면, 수성 제형과 관련하여 본원에 사용되는 용어 "약제"는 질환 또는 장애를 치료하는데 유용한 것이다.
용어 "단백질"은 쇄 길이가 보다 높은 수준의 2차 및/또는 3차 및/또는 4차 구조를 생성하기에 충분한 아미노산의 서열을 포함하는 것으로 의도된다. 이것은 "펩타이드" 또는 이러한 구조를 갖지 않는 다른 소분자량 분자와는 구분되는 것이다. 본원에 사용되는 정의내에 포함되는 단백질의 예는 치료학적 단백질을 포함한다. "치료학적 활성 단백질" 또는 "치료학적 단백질"은 치료 목적으로, 즉 대상체에서 장애 치료용으로 사용될 수 있는 단백질을 나타낸다. 치료학적 단백질이 치료 목적으로 사용될 수 있지만, 단백질이 또한 시험관내 연구에도 사용될 수 있는 바와 같이 본 발명은 이러한 용도에 제한되지 않음을 주지해야 한다. 바람직한 양태에서, 치료학적 단백질은 융합 단백질 또는 항체 또는 이의 항원-결합 부위이다. 하나의 양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 상이한 아미노산 서열을 갖는 두 개의 단백질로서 정의되는 적어도 2개의 상이한 단백질을 포함한다. 추가의 상이한 단백질은 단백질의 분해 생성물을 포함하지 않는다.
용어 "단백질 분말"은 본 발명의 분무 건조법에 따라 제조되는 단백질을 포함하는 조성물을 나타낸다. "항체 분말"은 본 발명의 분무 건조법에 따라 제조되는 항체 또는 이의 항원-결합 부위를 포함하는 조성물을 나타낸다.
용어 "약제학적 제형"은 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적으로 되도록 하는 형태로 존재하여 치료학적 용도를 위해 대상체에 투여될 수 있는 제제를 나타낸다.
용어 "용액"은 액체 내의 하나 이상의 부형제 또는 단백질 또는 펩타이드의 혼합물을 나타낸다. 용액은 액체 내의 용해된 단백질 분자, 콜로이드상 용해된 단백질 분자, 분산된 단백질 응집물 또는 결정 또는 침전물 또는 현탁액, 또는 이의 배합물을 포함할 수 있다.
"안정한" 조성물은 내부의 단백질이, 예를 들면, 필수적으로 가공 동안 및/또는 저장시 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 보유하는 것이다. 단백질 안정성을 측정하기 위한 다양한 분석 기술이 당업계에서 이용 가능하며, 예를 들면, 문헌[Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) 및 Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)]에 검토되어 있다. 하나의 양태에서, 단백질의 안정성은 낮은 퍼센트의 분해된(예를 들면, 단편화된) 및/또는 응집된 단백질을 갖는, 용액 중의 단량체 단백질의 비율(%)에 따라 결정된다. 예를 들면, 안정한 단백질을 포함하는 수성 조성물은 95% 이상의 단량체 단백질을 포함할 수 있다. 또는, 본 발명의 수성 조성물은 5% 이하의 응집된 및/또는 분해된 단백질을 포함할 수 있다.
용어 "안정화제"는 안정성을 개선시키거나 달리 증진시키는 부형제를 나타낸다. 안정화제는 α-리포산, α-토코페롤, 아스코르빌 팔미테이트, 벤질 알콜, 비설파이트, 붕소, 부틸화 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT), 아스코르브산 및 이의 에스테르, 카로티노이드, 칼륨 시트레이트, 아세틸-L-카르니틴, 킬레이트화제, 콘드로이틴, 콘드로이틴 설페이트, 시트르산, 조효소 Q-10, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산; 에데테이트 이나트륨), 에리토르브산, 푸마르산, 알킬 갈레이트, 글루코사민(키토산, 나트륨 히알루로네이트), 말산, 메타비설파이트, 프로필 갈레이트, 나트륨 비설파이트, 나트륨 메타비설파이트, 아황산나트륨, 아황산칼륨, 타르타르산, 티오설페이트, 티오글리세롤, 토코페롤 및 이의 에스테르, 예를 들면, 토코페롤 아세테이트, 토코페롤 석시네이트, 토코트리에날, d-α-토코페롤 아세테이트, 비타민 C 및 이의 에스테르, 비타민 E 및 이의 에스테르, 예를 들면, 비타민 E 아세테이트 및 이들의 배합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "장성 개질제(tonicity modifier)"는 액체 제형의 장성을 조절하기 위해 사용될 수 있는 화합물 또는 화합물들을 의미하는 것으로 의도된다. 적합한 장성 개질제는 글리세린, 락토즈, 만니톨, 덱스트로즈, 염화나트륨, 황산마그네슘, 염화마그네슘, 황산나트륨, 소르비톨, 트레할로즈, 수크로즈, 라피노즈, 말토즈 및 당해 기술분야의 통상의 숙련가들에게 공지된 기타의 것들을 포함한다. 하나의 양태에서, 액체 제형의 장성은 혈액 또는 혈장의 장성과 비슷하다.
본원에 나타낸 바와 같은 용어 "항체"는 전항체(whole antibody) 및 이의 항원 결합 단편(즉, "항원-결합 부위") 또는 단일 쇄를 포함한다. "항체"는 일반적으로 디설파이드 결합에 의해 상호-연결된 둘 이상의 중쇄(H) 및 두 개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질 또는 이의 항원 결합 부위를 나타낸다. 용어 "항체"는 또한 이의 분리된 천연 변이체를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 VH로서 약칭함) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 세 개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 VL로 약칭함) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL로 이루어진다. VH 및 VL 영역은 구조 영역(framework region; FR)이라고 하는 보다 보존된 영역과 산재된 상보성 결정 영역(complementarity determining region; CDR)이라고 하는 과가변성(hyper variability)의 영역으로 더욱 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 다음의 순서로 아미노-말단에서 카복시-말단으로 정렬된 세 개의 CDR 및 네 개의 FR로 이루어진다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄와 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들면, 효과기 세포) 및 전형적인 보체계의 1차 성분(C1q)을 포함한, 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 항체의 "항원-결합 부위"(또는 간단히 "항체 부위")는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편(예를 들면, TNFα, IL-12, IL-13)을 나타낸다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다. 용어 항체의 "항원-결합 부위" 내에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 힌지 영역(hinge region)에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 두 개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암(single arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 또는 VL 도메인으로 이루어진 dAb 단편(문헌 참조; Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 추가로, Fv 단편의 두 개의 도메인, VL 및 VH가 별도의 유전자에 의해 암호화되지만, 이들은 이들을 단일 단백질 쇄로서 만들어지도록 할 수 있는 합성 링커에 의해 재조합법을 사용하여 결합될 수 있으며, 여기서, VL 및 VH 영역은 쌍을 이루어 1가 분자[단일쇄 Fv(scFv)로서 공지됨; 예를 들면, 문헌(Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883) 참조]를 형성한다. 이러한 단일쇄 항체 또한 용어 항체의 "항원-결합 부위" 내에 포함되는 것으로 의도된다. 이러한 항체 단편은 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 통상의 기술을 사용하여 수득되며, 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체 단편은 Fab, Fd, Fd', 단일쇄 Fv(scFv), scFva 및 도메인 항체(dAb)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
추가로, 항체 또는 이의 항원-결합 부위는 항체 또는 항체 부위와 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩타이드의 공유결합적 또는 비공유결합적 연합에 의해 형성된 보다 큰 면역부착 분자의 일부일 수 있다. 이러한 다른 단백질 또는 펩타이드는 항체 또는 이의 항원-결합 부위를 정제하거나 서로 연합하거나 다른 분자와 연합하도록 하는 기능을 가질 수 있다. 따라서, 이러한 면역부착 분자의 예는 사량체성 단일쇄 가변 단편(scFv) 분자를 제조하기 위한 스트렙타비딘 코어 영역의 사용(문헌 참조; Kipriyanov et al. (1995) 사람 Antibodies and Hybridomas 6:93-101) 및 2가의 비오틴화 scFv 분자를 제조하기 위한 시스테인 잔기, 마커 펩타이드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그의 사용(문헌 참조; Kipriyanov et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058)을 포함한다. 항체 부위, 예를 들면, Fab 및 F(ab')2 단편은 종래의 기술, 예를 들면, 각각 전항체의 파파인 또는 펩신 분해를 사용하여 전항체로부터 제조할 수 있다. 더욱이, 항체, 항체 부위 및 면역부착 분자는 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 수득할 수 있다.
두 개의 항체 도메인은 동족체 쌍 또는 그룹을 형성하는 구조의 계열에 속하거나 이러한 계열로부터 유도되고 이러한 특징을 보유하는 경우 "상보적"이다. 예를 들면, 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인은 상보적이고; 두 개의 VH 도메인은 상보적이 아니며 두개의 VL 도메인은 상보적이 아니다. 상보적 도메인은 면역글로불린 상과(superfamily)의 다른 구성원들, 예를 들면, T-세포 수용체의 Vα 및 Vβ(또는 감마 및 델타) 도메인에서 발견할 수 있다.
용어 "도메인"은 단백질의 나머지와는 무관하게 이의 삼차 구조를 보유하는 접힌(folded) 단백질 구조를 나타낸다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 상이한 기능적 특성을 책임지며, 다수의 경우에 단백질 및/또는 도메인의 나머지의 기능을 손상시키지 않으면서 다른 단백질에 부가되거나 제거되거나 전이될 수 있다. 단일 항체 가변 도메인이란 항체 가변 도메인을 특징지우는 서열을 포함하는 접힌 폴리펩타이드 도메인을 의미한다. 따라서, 이것은 완전 항체 가변 도메인 및 변형된 가변 도메인(여기서, 예를 들면, 하나 이상의 루프(loop)는 항체 가변 도메인을 특징지우지 않는 서열로 대체된다) 또는 절두되거나(truncated) N- 또는 C-말단 연장부를 포함하는 항체 가변 도메인 뿐만 아니라 적어도 부분적으로 전장 도메인의 결합 활성 및 특이성을 보유하는 가변 도메인의 접힌 단편을 포함한다.
본 발명의 가변 도메인을 조합하여 도메인의 그룹을 형성할 수 있으며; 예를 들면, VL 도메인을 VH 도메인과 조합하는 것과 같이 상보적 도메인을 조합할 수 있다. 비-상보적 도메인을 또한 조합할 수 있다. 도메인은 공유결합적 또는 비-공유결합적 수단에 의한 도메인의 결합을 포함한 다수의 방법으로 조합할 수 있다.
"dAb" 또는 "도메인 항체"는 항원과 특이적으로 결합하는 단일 항체 가변 도메인(VH 또는 VL) 폴리펩타이드를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "항원 결합 영역" 또는 "항원 결합 부위"는 항원과 상호작용하고 항원에 대한 특이성 및/또는 친화성을 항체에 제공하는 아미노산 잔기를 함유하는 항체 분자의 부분(들) 또는 이의 항원 결합 부위를 나타낸다.
용어 "에피토프(epitope)"는 항체의 항원 결합 부위 중의 하나 이상에서 항체에 의해 인지되고 항체에 의해 결합될 수 있는 분자의 부분을 나타내는 것으로 의도된다. 본 발명의 문맥에서, 1차 및 2차 "에피토프"는 동일하지 않으며 단일의 단일특이성(monospecific) 항체 또는 이의 항원-결합 부위에 의해 결합되지 않는 에피토프인 것으로 이해된다.
어구 "재조합 항체"는 재조합 수단에 의해 제조되거나 발현되거나 생성되거나 분리되는 항체, 예를 들면, 숙주 세포로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체, 재조합 조합 항체 라이브러리(recombinant, combinatorial antibody library)로부터 분리된 항체, 사람 면역글로불린 유전자에 대해 유전자도입(transgenic) 동물(예를 들면, 마우스)로부터 분리된 항체[예를 들면, 문헌(Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) 참조] 또는 다른 DNA 서열에 대한 특정 면역글로불린 유전자 서열(예를 들면, 사람 면역글로불린 유전자 서열)의 스플라이싱을 포함하는 다른 수단에 의해 제조되거나 발현되거나 생성되거나 분리되는 항체를 나타낸다. 재조합 항체의 예는 키메라, CDR-이식 및 사람화 항체를 포함한다.
용어 "사람 항체"는, 예를 들면, 문헌(Kabat, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)에 기재된 바와 같이 사람 생식선 면역글로불린 서열에 상응하거나 이로부터 유도된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 나타낸다. 그러나, 본 발명의 사람 항체는 사람 생식선 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기(예를 들면, 시험관내 랜덤 또는 부위-특이적 돌연변이에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입되는 돌연변이), 예를 들면, CDR 및 특히 CDR3을 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 사람 항체는 가변 영역을 가지며, 또한 사람 생식선 면역글로불린 서열로부터 유도된 불변 영역을 포함할 수 있다(문헌 참조; Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). 그러나, 특정 양태에서, 이러한 재조합 사람 항체는 시험관내에서 돌연변이(또는, 사람 Ig 서열에 대해 유전자도입 동물이 사용되는 경우, 시험관내 체세포 돌연변이)되며, 이에 따라, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 사람 생식선 VH 및 VL 서열로부터 유도되고 이와 관련되기는 하지만 생체내에서 사람 항체 생식선 레퍼토리(repertoire) 내에 자연적으로 존재할 수 없는 서열이다. 그러나, 특정 양태에서, 이러한 재조합 항체는 선택적 돌연변이유발 또는 역돌연변이(backmutation) 또는 이들 둘 다의 결과이다.
용어 "역돌연변이"는 사람 항체의 체세포 돌연변이된 아미노산의 일부 또는 전부가 상동 생식선 항체 서열로부터의 상응하는 생식선 잔기로 대체되는 공정을 나타낸다. 본 발명의 사람 항체의 중쇄 및 경쇄 서열은 최고의 상동성을 갖는 서열을 확인하기 위해 VBASE 데이터베이스에서 생식선 서열과는 별도로 정렬된다. 본 발명의 사람 항체에서의 차이는 이러한 상이한 아미노산(들)을 암호화하는 정의된 뉴클레오타이드 위치를 돌연변이시킴으로써 생식선 서열로 되돌아간다. 따라서, 역돌연변이에 대한 후보물질(candidate)로서 확인된 각각의 아미노산의 역할을 항원 결합에 있어서의 직접 또는 간접적인 역할에 대해 조사하여야 하며, 사람 항체의 목적하는 특징에 영향을 미치는 돌연변이 후 발견된 아미노산은 최종 사람 항체에 포함시키지 않아야 한다. 역돌연변이되는 아미노산의 수를 최소화시키기 위해, 가장 가까운 생식선 서열과는 상이하지만 제2 생식선 서열에서의 상응하는 아미노산과 동일한 것으로 밝혀진 아미노산 위치는, 제2 생식선 서열이 해당 아미노산의 양측에서 본 발명의 사람 항체의 서열과 적어도 10개, 바람직하게는 12개의 아미노산에 대해 동일하고 공동선상인 한, 그대로 둘 수 있다. 역돌연변이는 항체 최적화의 어떠한 단계에서도 발생할 수 있다.
용어 "키메라 항체"는 하나의 종으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열과 다른 종으로부터의 불변 영역 서열을 포함하는 항체, 예를 들면, 사람 불변 영역에 연결된 쥐 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 나타낸다.
용어 "CDR-이식 항체"는 하나의 종으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만 VH 및/또는 VL의 CDR 영역 중의 하나 이상의 서열이 다른 종의 CDR 서열로 대체되는 항체, 예를 들면, 쥐 CDR(예를 들면, CDR3) 중의 하나 이상이 사람 CDR 서열로 대체되어 있는 쥐 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 나타낸다.
용어 "사람화 항체"는 비-사람 종(예를 들면, 마우스)로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만 VH 및/또는 VL 서열의 적어도 일부가 보다 "사람-유사", 즉, 사람 생식선 가변 서열과 보다 더 유사하도록 변화된 항체를 나타낸다. 사람화 항체의 한 가지 유형은 CDR-이식 항체이며, 여기서, 사람 CDR 서열이 비-사람 VH 및 VL 서열에 도입되어 상응하는 비사람 CDR 서열을 대체한다.
본 발명의 다양한 양태가 아래의 서브섹션에서 더욱 상세하게 기재되어 있다.
II. 본 발명의 방법
본 발명의 방법 및 본 발명의 생성된 조성물은 약물 성분 선적 및/또는 분배 동안 다수의 이점을 제공하며, 예를 들면, 제제가 경량이고 주위 온도에서 안정하다. 약물 배합 및/또는 제조시에도 이점이 있는데, 예를 들면, 조절된 속도로 벌크 용액을 길게 해동시키지 않아도 된다. 본 발명의 건조 단백질 분말을 목적하는농도에 충분한 양으로 용이하게 칭량하고, 목적하는 부형제, 예를 들면, 물과 혼합하거나 배합할 수 있다. 단백질 침전물 또는 단백질 결정 현탁액의 분리 및 건조 또한 종래의 제제에 대해 필요하지 않다. 고농도 제형, 개선된 생체이용효율, 국소 방출(예를 들면, 폐 전달), 서방출(예를 들면, 리포좀 및 PLGA-피복된 미소구체) 및 경구 및 국소를 포함한 다양한 방법으로 투여될 수 있는 새로운 고체 및 하이드로겔 단백질 투여 형태를 달성할 수 있는 능력에 관한 의약품 개발에 대해 추가의 이점이 있다. 따라서, 몇몇 양태에서, 당해 방법은 또한 추가의 가공, 예를 들면, 피복된 서방출 조성물, 리포좀, PLGA-피복된 미소구체로의 분말상 조성물의 혼입, 용융 압출에 의한 부형제내에서의 혼입 등을 포함한다. 생성된 조성물, 예를 들면, 서방출 또는 표적화된 조성물 및/또는 또 다른 투여 경로, 예를 들면, 경구, 피부 및 장내 투여가 가능한 조성물 또한 본 발명의 추가의 양태이다. 또 다른 이점은 본 발명의 조성물은 종래의 제제보다 더 높은 온도에서 가공할 수 있다는 것이다. 예를 들면, 분말을 용융 압출 기술, 예를 들면, MELTREX 용융 압출 기술에 의해 가공할 수 있다.
하나의 국면에서, 본 발명은 하나 이상의 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 안정한 분말을 효율적으로 및 효과적으로 제조하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 단백질 또는 펩타이드는 항체 및/또는 또는 이의 항원 결합 부위이다. 분말을 제조하는 방법은 단백질, 펩타이드, 항체 또는 이의 항원 결합 부위의 용액을 분무 건조시킴을 포함한다. 예를 들면, 용액은 약 50mg/mL 이상의 단백질, 펩타이드, 항체 또는 이의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 추가의 양태에서, 용액은 상이한 농도를 가질 수 있으며, 예를 들면, 더욱 농축될 수 있고, 예를 들면, 용액은 적어도 약 40mg/mL, 50mg/mL, 60mg/mL, 70mg/mL, 80mg/mL, 90mg/mL, 100mg/mL, 130mg/mL, 150mg/mL, 180mg/mL 등의 단백질, 펩타이드, 항체 또는 이의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 용액은 또한 하나 이상의 부형제를 포함할 수 있다. 상기 방법은 농축시키거나, 예를 들면, 한외여과를 포함한 공지된 방법에 의해 용액을 더욱 농축시킴을 포함할 수 있다. 단백질 또는 펩타이드는 어떠한 적합한 단백질 또는 펩타이드라도 가능하다. 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 부위, 예를 들면, 면역글로불린 G(IgG) 항체 또는 이의 항원 결합 부위일 수 있다. 특정 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 MAK 195F, 아달리무마브, ABT-325, ABT-308 또는 ABT-147이다.
몇몇 양태에서, 용액은 부형제를 포함한다. 적합한 부형제는 트레할로즈, 수크로즈, 소르비톨, 폴리에틸렌 글리콜, 하나 이상의 아미노산, 히스티딘, 알라닌, 아르기닌, 글리신 또는 이들의 혼합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 방법은 산성 성분, 산화방지제 및/또는 장성 개질제를 용액 또는 분말에 첨가함을 추가로 포함할 수 있다.
용액은 약 15 내지 약 140mM 또는 약 20 내지 약 30mM의 부형제를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 용액은 약 25mM의 부형제를 포함한다. 몇몇 양태에서, 용액은 약 0.27:1.0 내지 약 2.8:1.0, 약 0.27:1.0 내지 약 1.4:1.0, 또는 약 0.27:1.0 내지 약 0.7:1.0의 부형제:단백질 비를 포함한다. 특정 양태에서, 용액은 약 0.7:1.0의 부형제:단백질 비를 포함한다.
몇몇 양태에서, 용액은 고농도의 수성 단백질 제형임에도 불구하고 낮은 비율의 단백질 응집물을 갖는다. 하나의 양태에서, 물 및 고농도의 단백질, 예를 들면, 항체를 포함하는 수용액은 계면활성제 또는 다른 유형의 부형제의 부재하에서도 약 5% 미만의 단백질 응집물을 함유한다. 하나의 양태에서, 용액은 약 7.3% 이하의 단백질 응집물을 포함하거나; 용액은 약 5% 이하의 단백질 응집물을 포함하거나; 용액은 약 4% 이하의 단백질 응집물을 포함하거나; 용액은 약 3% 이하의 단백질 응집물을 포함하거나; 용액은 약 2% 이하의 단백질 응집물을 포함하거나; 용액은 약 1% 이하의 단백질 응집물을 포함한다. 하나의 양태에서, 용액은 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 단량체 단백질을 포함한다. 상기 언급한 농도 사이의 범위, 예를 들면, 적어도 약 98.6% 단량체 단백질, 약 4.2% 이하의 응집물 단백질 또한 본 발명의 일부인 것으로 의도된다. 또한, 상한치 및/또는 하한치로서의 상기 언급된 값의 조합을 사용한 값의 범위가 포함되는 것으로 의도된다.
몇몇 양태에서, 입구 공기 온도(Tin)는 약 105℃ 내지 약 175℃, 약 130℃ 내지 약 155℃, 약 120℃ 내지 약 160℃ 또는 약 125℃ 내지 약 160℃이다. 특정 양태에서, Tin은 약 130℃이다. 몇몇 양태에서, 출구 공기 온도(Tout)는 약 60℃ 내지 약 112℃, 약 60℃ 내지 약 90℃, 약 70℃ 내지 약 90℃ 또는 약 75℃ 내지 약 85℃이다. 특정 양태에서, Tout은 약 80℃이다.
몇몇 양태에서, 본 발명의 방법은 입구 공기 온도(Tin)를 약 100℃ 내지 약 180℃로 하고 출구 공기 온도(Tout)를 약 60℃ 내지 약 110℃로 하여 분무 건조시킴을 포함한다. 특정 양태에서, 상기 방법은 약 130℃의 Tin 및 약 80℃의 Tout으로 분무 건조시킴을 포함한다.
몇몇 양태에서, 생성된 분말상 조성물의 잔류 수분 함량은 약 1% 내지 약 3%, 약 1.5% 내지 2.5%, 약 1.4% 내지 약 2%, 약 4% 내지 약 6% 또는 약 4.5% 내지 약 5%이다. 또 다른 양태에서, 분말상 조성물은 약 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5% 또는 7%의 잔류 수분을 포함한다.
하나의 양태에서, 분말은 주위 온도 및 습도에서 적어도 3개월 동안 안정하다. 몇몇 양태에서, 분말은 주위 온도 및 습도에서 적어도 6개월, 9개월, 1년, 2년, 3년 또는 5년 동안 안정하다. 또 다른 양태에서, 분말은 40℃에서 적어도 3개월 동안 안정하다. 추가의 양태에서, 분말은 40℃에서 적어도 3개월, 6개월, 9개월, 1년, 2년 또는 5년 동안 안정하다.
몇몇 양태에서, 분무 건조는 용액을 분무화시켜 용액 액적을 형성하고, 액적을 가스로 건조시켜 분말을 형성하고, 가스로부터 분말을 회수함을 포함한다. 용액을, 예를 들면, 압력 노즐 분무기를 사용하여 분무화시킬 수 있다. 용액을, 예를 들면, 사이클론을 사용하여 회수할 수 있다. 예시적인 분무 건조법이 본원에 논의되고 예시되어 있다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 분말을 제조하기 위해 본원에 기재된 방법을 포함하고 분말을 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합(예를 들면, 매봉 또는 용해)함을 추가로 포함할 수 있는 약제학적 제제의 제조 방법을 제공한다. 약제학적으로 허용되는 담체는 비경구, 경구, 장내 또는 국소 투여용으로 허용 가능한 담체일 수 있다. 담체는 고체, 반고체 또는 액체(예를 들면, 물) 또는 이의 배합물일 수 있다.
몇몇 양태에서, 상기 방법은 항체 또는 이의 항원 결합 부위, 분말을 약제학적으로 허용되는 담체에 용해시킴을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체는, 예를 들면, 비경구 투여에 허용 가능할 수 있고, 예를 들면, 물을 포함할 수 있다. 상기 방법은 하나 이상의 산성 성분, 산화방지제 및/또는 장성 개질제를 약제학적 조성물에 첨가함을 추가로 포함할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 적합한 첨가제, 예를 들면, 완충제, 점도 개질제, 방향제, 착색제 등을 본 발명의 약제학적 조성물에 첨가할 수 있다.
상기 방법은 분말상 조성물의 안정성에 상당한 영향을 미치지 않으면서 본 발명의 안정한 분말상 조성물을 주위 온도보다 높은 온도에서 추가로 가공함을 포함할 수 있다. 예를 들면, 방법은 안정한 분말상 조성물을 용융 압출시킴을 포함할 수 있다.
몇몇 양태에서, 예를 들면, 이산 입자 또는 입자의 응집물이 피복되도록 및/또는 입자의 복합체, 예를 들면, 압축 정제가 피복되도록 하나 이상의 피막을 분말상 조성물에 도포한다. 피막은 당해 기술분야에서 통상적으로 사용되고 공지되어 있는 피막을 포함할 수 있다. 이러한 피막은 중합체, 예를 들면, PLGA를 포함하여 서방출 또는 지연 방출 약제학적 조성물을 형성할 수 있다. 피막은 장용 제피제이거나 이를 포함할 수 있다. 조성물은, 예를 들면, 젤라틴 캡슐에 캡슐화되거나 하이드로겔에 현탁될 수 있다. 특정 양태에서, 단백질, 펩타이드, 항체 또는 이의 항원 결합 부위의 활성은 유기 용매에 의한 침전, 변성 또는 산화로부터 부형제에 의해 보호되며, 이로써 유기 용매에서만 가용성인 PLGA와 같은 물질로 피복할 수 있다. 이러한 용매는 폴리에틸렌 글리콜(예를 들면, 저분자량, 예를 들면, PEG 400), 에탄올, 디메틸 설폭사이드(DMSO), N-메틸피롤리돈(NMP) 또는 빙초산을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 약제학적 제제에서 통상적으로 발견되는 용매를 포함할 수 있다.
분무 건조
분무 건조기에서, 펌핑 가능한 유체(용액, 현탁액, 에멀젼 또는 페이스트)는 건조된 미립자 형태로 전환된다. 당해 공정은 액체 공급물을 가열 건조 매질(통상적으로 공기 또는 불활성 가스)로 분무화시킴으로써 입자 형성과 건조를 1단계로 조합한다. 본 발명의 몇몇 양태에서, 농축된 단백질 용액은 분무 건조된다. 따라서, 본 발명의 방법은 적합한 방법을 사용하여 단백질 용액을 농축시킴을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 접선 유동 여과(Tangential Flow Filtration; TFF) 기술이 사용되는데, 그 이유는 이것이 매우 신속하고 적당한 방법이기 때문이다. 그러나, 추가로 또는 대안적으로, 정상 유동 여과(normal flow filtration) 또는 투석이 사용될 수 있다.
유체의 분무화는 액체의 표면적을 증가시키고, 이에 따라, 매우 짧은 건조 시간을 야기한다. 예를 들면, 액적 크기를 10㎛에서 1㎛로 감소시키면 표면적은 600에서 6000㎡로 증가하며, 건조 시간을 100배(0.01초에서 0.0001초로) 단축시킨다[문헌 참조; Stahl, Feuchtigkeit und Trocknen in der Pharmazeutischen Technologie. Dr. Dieter Steinkopf Verlag GmbH & Co. KG, Darmstadt (1999)].
액체 공급물과 건조 공기 사이의 접촉은 두 가지 상이한 모드로 발생할 수 있다. 병류식 시스템(co-current system)에서, 건조 공기 및 입자(액적)는 동일한 방향으로 건조 챔버를 통해 이동한다. 이것은 열 감응성 물질(예를 들면, 단백질)에 바람직한 모드이며, 그 이유는 가장 뜨거운 공기가 습한 액적과 접촉하기 때문이다. 건조 공기 및 액적이 반대 반향으로 이동하는 경우, 이것을 향류 모드(counter-current mode)라고 부른다. 향류 모드로 제조되는 입자는 통상적으로 배기(exhausting air)보다 더 높은 온도를 나타낸다. 배기 자체는 시스템을 떠나거나("개방-사이클") 재순환될 수 있다("폐쇄-사이클", 유기 용매를 불활성 가스로 증발시키는데 일반적으로 사용됨)[문헌 참조; Spray Drying Process Principles (<<www.niro.com>>, Feb. 2007)]. 다양한 분무 건조기 설계(크기, 분무기, 무균 조건 등)로부터 선택되고 상이한 공정 파라미터(건조 공기 유동, 건조 공기 온도 등)를 조절함으로써, 입자 크기, 형태 및 구조 또는 심지어 불모(sterility)와 같은 최종 분말 특성을 조절할 수 있다. 회수된 분말의 습도가 충분히 낮지 않으면, 예를 들면, 유동상 건조기 및 냉각기, 접촉 건조기 또는 심지어 마이크로파 건조기 형태에서 전처리가 필요할 수 있다[문헌 참조; Masters, Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS; Charlottenlund (2002)].
분무 건조 공정은 일반적으로 액체 공급물의 분무화; 액적의 건조; 및 건조된 생성물의 분리 및 회수를 포함한다. 각 단계는 생성되는 생성물에 대해 자체로 영향을 미치며, 또한 특히 단백질과 같은 민감성 물질을 다루는 경우 어려움을 제공한다.
단백질 또는 펩타이드를 분무 건조시키기 위해, 안정화 보조제를 사용하는 것이 종종 유리하다. 트레할로즈 및 수크로즈와 같은 당이 효과적인 단백질 안정화제이다. 이들은 분무 건조 공정 동안 단백질의 응집 및/또는 불활성화를 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라, 이의 유리 전이 온도 미만에서 저장하는 경우 생성된 분말의 저장 안정성에 긍정적인 효과를 가질 수 있다[문헌 참조; Lee, Rational Design of Stable Protein Formulations, Theory and Practice (Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2002)].
분무화는 액체에서 다수의 단일 액적으로의 단편화, 소위 분무이다. 분무화 장치의 선택은 생성물 품질 및 재료 처리량에 영향을 미친다[문헌 참조; Richter, Verfahrenstechnik, Sonderausgabe Martubersicht 11: 96-100 (1997)]. 모든 분무기에 공통인 것은 액체를 분해하기 위해 에너지를 사용한다는 것이다. 상이한 종류의 에너지가 상이한 분무기를 구분한다. 에너지는 방출 액체에서 와류(turbulence)를 야기한다. 적용된 공기 힘과 함께, 액체의 표면 장력 및 점도가 압도되고 붕해가 일어난다.
분무 건조 작업을 위해, 가장 적합한 스프레이는 다소 동일한 크기의 소 액적 중의 하나이다. 모든 분무화 시스템이 분무 건조된 분말에 좁은 입자 크기 분포를 제공할 수 있는 것은 아니다[문헌 참조; Masters, Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS; Charlottenlund (2002)]. 단백질은 매우 민감한 물질이어서, 분무화가 불안정성의 가능한 원인인 전단력과 연관됨에 따라 스트레스 인자를 나타낸다. 마흘러 등(Mahler et al.)은 높은 전단력(교반 및 진탕)과 IgG1 용액의 응집 증가 사이의 상관성을 밝혀냈다[문헌 참조; Mahler et al., Eur. Journal of Pharm. and Biopharm. 59: 407-417 (2005)]. 리소자임 용액 또한 분무화 동안 응집 및 활성의 손실을 나타내었다[문헌 참조; Yu et al., Eur. Journal of Pharm. Sci 27: 9-18 (2006)]. 액체/공기 계면의 전단 응력 및 갑작스런 확대가 이러한 종류의 단백질 열화의 원인이 되는 것으로 보인다[문헌 참조; Maa et al., Biotechnology and Bioengineering 54(6): 503-512 (1997)]. 그러나, 펌핑 과정에서 발생하는 전단력 조차도 단백질 용액을 응력화시키는데 충분할 수 있다[문헌 참조; Brennan et al., Diabetes 34, 353-359 (1985)]. 다수의 상이한 유형의 분무기가 분무 건조 과정에 이용 가능하다.
회전식 분무기는 액체 공급물이 공기/가스 대기로 방출되기 전에 액체 공급물을 원심적으로 가속시킨다. 액체 공급물은 회전 휠(spinning wheel), 디스크 또는 컵 위의 중심에 분포된다. 낮은 디스크 속도에서, 액적의 형성은 액체의 점도 및 표면 장력에 주로 의존한다. 디스크 속도가 높을수록, 더 많은 관성 및 공기 마찰이 작용하기 시작하고 액적 형성 메카니즘에 기여한다. 더욱이, 액적 크기는 액체 공급 소도, 이의 고체 함량 및 밀도, 분무기 디스크 직경 및 디자인에 의해 영향을 받는다. 상이한 디자인의 회전식 분무기가 이용 가능하다: 날개없는 디스크/볼/컵(vaneless disc/bowl/cup) 또는 곡선형 또는 직선형 날개를 가진 날개있는 휠(vaned wheel)[문헌 참조; Masters, Spray Drying Handbook (Wiley & Sons Inc., New York, 1991)].
회전식 분무기는 360°의 분무각을 가지며, 이에 따라 (벽 침착을 최소화하기 위해) 특정 직경의 건조 챔버를 필요로 한다. 이러한 시스템은 통상적으로 보다 높은 성능을 위해 사용된다.
압력 노즐 시스템은 압력 에너지를 동력 에너지로 전환시킴으로써 액체 자체로부터 액체를 방출하는데 필요한 모든 에너지를 수득한다. 가장 간단한 1유체 노즐(one-fluid nozzle)은 단일 액적을 점적하는데 사용되는 관형 모세관(tubular capillary)이다. 이러한 장치는 소량의 동일 액적을 생성하는데만 사용된다. 유속을 증가시킴으로써 분무화를 달성할 수 있으며, 여기서, 액체 제트는 난류(turbulence)를 통해 액적으로 단편화된다. 유체의 붕해는 액체를 편향, 회전 및 선회되도록 함으로써, 예를 들면, 노즐에 스월 인서트(swirl insert) 또는 스월 챔버를 제공함으로써 개선될 수 있다. 생성되는 액적 크기는 이전에 논의된 파라미터(점도, 유속 등) 이외에 인가된 압력 및 노즐 직경에 의해 영향을 받는다[문헌 참조; Richter, Verfahrenstechnik, Sonderausgabe Martubersicht 11: 96-100 (1997)]. 액체 공급물은 중공 원추형(hollow cone)으로서 오리피스를 떠나며, 즉, 압력 노즐은 낮은 직경의 건조 챔버를 갖는 작은 분무 건조 시설에서 사용될 수 있다. 다수의 상이한 노즐 디자인은 용액, 에멀젼 및 현탁액을 분무화하기 위한 가변적인 적용을 제공하며, 단지 입자 크기(현탁액) 및 점도(매우 높은 압력이 요구됨)에 의해서만 제한된다[문헌 참조; Masters, Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS; Charlottenlund (2002)].
공압식 노즐 분무화(pneumatic nozzle atomization)을 사용하는 경우, 고속 가스상 매질(통상적으로 공기)을 액체로 밀착(impaction)시키는 것은 액적 형성을 위한 에너지를 제공한다. 액체 및 가스가 충돌하는 장소에 따라, 내부-혼합 및 외부-혼합 시스템이 구분된다[문헌 참조; Richter, Verfahrenstechnik, Sonderausgabe Martubersicht 11: 96-100 (1997)]. 매우 점성인 유체를 미세한 크기의 액적으로 분해해야 하는 경우에는 두 개의 유체 노즐이 바람직하게 사용된다. 가스상 매질을 노즐내에서 가압시키며(7bar 이하), 노즐에는 종종 추가의 스월 인서트가 장착되어 있어 액체 공급물의 붕해를 촉진시키는 가스 난류를 발생시킨다. 후자는 통상적으로 기류-배출기 효과(air-flow ejector effect)를 지지하는 저압 펌프에 의해 펌핑된다. 공압식 노즐 시스템은 5 내지 75㎛ 범위의 액적을 생성한다. 단점은 압축된 가스/공기 및 건조 챔버내에서의 이의 냉각 효과에 대한 높은 비용이다. 매우 높은 속도로 액체를 취급하는 경우, 또한 노즐 오리피스가 막힐 위험이 있다[문헌 참조; Masters, Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS; Charlottenlund (2002)].
초음파 노즐은 분무화를 달성하기 위해 고주파 음파(high frequency sound wave)를 사용한다. 압전 변환기(piezoelectric transducer)가 초음파 발생기(Ultrasonic Generator)로부터 고주파 전기 에너지를 수신하고 이를 동일한 주파수에서 진동 기계 운동(vibratory mechanical motion)으로 전환시킨다. 액체는 노즐의 길이를 흐르면서 도입된다. 액체 공급물이 오리피스에 도달하는 경우, 이것이 진동 에너지를 흡수하여 분무화를 야기한다[문헌 참조; Sono Tek Corporation: Ultrasonic spray nozzle systems (SONO TEK Corporation, New York, 2007)].
음파 노즐(sonic nozzle)은 저압(특히 공압식 노즐과 비교하여)에서 작동하며, 생성되는 액적은 10 내지 50㎛의 직경을 갖는다. 초음파 분무기 사용의 큰 단점 중의 하나는 연속 작동의 예측불능성이며, 예를 들면, 고체-함유 공급원료(feedstock)에 사용되는 경우, 노즐 부위에서의 예비-건조 위험이 발생기/분무화 공정의 파울링(fouling)을 야기할 수 있다. 따라서, 이러한 시스템은 미세 스프레이를 발생하기 위한 실험실-규모의 파일럿 건조기(lab-scale and pilot dryer)에서 또는 비-뉴튼(non-Newtonian) 액체 또는 매우 점성인 액체가 다른 노즐 시스템에서 사용될 수 없는 경우에 보다 빈번하게 사용된다[문헌 참조; Masters, Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS; Charlottenlund (2002)].
분무 건조 동안 스프레이의 건조 동력학을 예측하는 것은 전체 스프레이의 거동을 모니터링하는데 있어서의 어려움 및 건조 챔버 내의 불균일한 조건 둘 다에 의해 복잡해진다. 그러나, 단일 액적의 건조 동력학은 이론적으로 및 실제로 연구될 수 있다[문헌 참조; Elversson et al., Journal of Pharm. Sci 94(9): 2049-2060 (2005)].
액체 공급물이 분무화되자마자, 이의 표면 대 질량 비(surface to mass ratio)는 증가하고 공기와 액적 사이의 열 전달이 가속화되며, 액적은 당장 매우 신속하게 건조될 수 있다. < 100㎛의 통상의 액적 크기에서는, 1초 미만내에 증발이 발생한다[문헌 참조; Nurnberg et al., Acta Pharmaceutica Technologica, 26 (1): 39-67, Tab 3-1 (1980)]. 두 개의 대류 공정이 관련된다: 열 전달(공기 → 액적) 및 수분의 질량 전달(액적 → 공기). 후자에서, 수분은 각각의 액적을 둘러싸고 있는 경계층을 통해 투과되어야 한다. 전달 속도는 온도, 습도, 둘러싸고 있는 공기의 전송 특성, 액적 직경 및 액적과 공기 사이의 상대적인 속도에 의해 영향을 받는다[문헌 참조; Masters, Spray Drying Handbook (Wiley & Sons Inc., New York, 1991)]. 처음에는, 증발이 일정한 속도로 발생한다(건조의 제1 단계 = 일정 속도 기간). 액적 내로부터의 수분의 확산은 포화된 표면 상태를 유지시킨다. 소위 "임계점"에서는, 수분 함량이 너무 낮아져 액적 표면에서 포화를 유지하지 못하며, 액적 표면에 건조 층이 형성되기 시작한다. 이때부터, 추가의 성장하는 차단막(barrier)이 확산에 의해 크로싱된다. 액적/입자의 조건을 영구적으로 변화시킨 결과로서, 증발 속도가 감소한다(속도 감소 기간(falling rate period) = 건조의 제2 단계)[문헌 참조; Masters, Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS; Charlottenlund (2002)]. 공정 동안의 액적/입자의 온도는 입구 건조 공기 온도(TIn) 및 액체 공급 속도(QLF)에 의해 주로 영향을 받고, 건조 공기 유속(QDA) 및 분무화 공기 유속(QAA)에 의해 어느 정도 영향을 받는다. 이러한 4개의 파라미터는 또한 TOut을 결정한다. 실제로, 노즐 오리피스 바로 아래의 온도는 TIn보다는 TOut에 훨씬 가까워서 TOut이 액적 건조 속도에 대한 우세한 변수인 것으로 보인다. 물론 액적 내부의 온도(Ti)는 이의 표면(Ts)보다 낮다. Ts는 곧 습구 온도(wet bulb temperature, Twb)에 도달하며, 일정 속도 기간 동안 거기에 머무른다. 속도 감소 기간에 액적 표면 위에서 성장하는 크러스트(crust)와 함께, Ts 및 Ti가 증가하기 시작한다[문헌 참조; Maa et al., Biotechnology and Bioengeneering 53 (6):503-512 (1997)]. 생성되는 입자 형태에 대해, 액적 크기 뿐만 아니라 크러스트의 텍스쳐가 중요한 역할을 한다. 엘버슨 등(Elversson et al.)은 액적 크기와 입자 크기 사이의 선형 상관성을 주장하였을 뿐만 아니라 액체 공급물 중의 고체 함량이 입자 크기에 강한 영향을 미침을 시사하였다[문헌 참조; Elversson et al., Journal of Pharm. Sci. 92(4): 900-910 (2003)].
건조는 단백질에 대한 둘 이상의 스트레스 인자를 수반한다: 열 및 탈수. 열 응력에 대한 단백질 안정성은 단백질 제형화에 있어서 중요한 변수이다. 분무 건조 공정 동안의 온도 변화는 단백질 안정성(예를 들면, 공정-안정성, 가속 안정화 시험 동안의 저장-수명)에 큰 영향을 미친다. 승온에 노출되는 경우, 단백질은 더욱 가요성으로 되어(수소 결합이 약해짐), 부분 풀림(partial unfolding)을 야기하고 충돌 빈도(collision frequency)가 증가한다[문헌 참조; Brange, Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins (Taylor & Francis Ltd., 2000)]. 이러한 공정은 통상적으로 가역적이지만, 일단 부분적으로 풀리면, 단백질이 응집 또는 부정확한 풀림과 같은 추가의 분해 경로에 매우 민감하며, 이것이 이들의 기능 및 장기간 안정성에 강한 영향을 미친다.
최대 안정성을 위한 온도는 대부분의 단백질의 경우 -10 내지 35℃이다[문헌 참조; Bummer et al., Protein Formulation and Delivery (Marcel Dekker AG, Basel, 2000)]. 무멘탈러 등(Mumenthaler et al.)은 건조 입자가 TOut보다 낮은 약 25℃의 최대 온도에 도달하는 것으로 추정하였다[문헌 참조; Mumenthaler et al., Pharm. Res. 11(1): 12-20 (1994)]. 본 발명에서, TOut은 약 60℃ 내지 대략 80℃에 이를 수 있다. 열 변성은 일반적으로 분무 건조 동안의 주요 불안정성 인자로 간주되지 않는다[문헌 참조; Maa et al., Current Pharmaceutical Biotechnology 1(3):283-302 (2000)].
단백질의 생물학적 활성은 이들의 본래의 3차원 구조에 따라 좌우된다. 수용액에서, 단백질은 이의 표면 상의 비공유결합된 물 분자에 의해 둘러싸임으로써 이들의 본래의 구조를 유지한다. 통상적으로 비극성 아미노산 잔기는 내부에 묻혀있고 극성 아미노산 잔기는 표면에 존재한다. 이것은 용액 중의 단백질의 매우 빽빽한 충전을 야기한다(유기 분자의 결정에서보다 더 놓은 충전 밀도)[문헌 참조; Brange, Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins (Taylor & Francis Ltd., 2000)]. 물을 제거하면 이러한 충전을 불안정화시킬 수 있으며, 형태학적 변화가 일어날 수 있다.
분무 건조 공정의 마지막 단계는 전형적으로 공기/가스로부터의 분말의 분리 및 건조된 생성물의 제거이다. 몇몇 양태에서, 이러한 단계는 높은 분말 수율을 수득하고 대기로의 분말 방출을 통한 공기 오염을 방지하는데 될 수 있는 대로 효과적이다. 이를 위해, 사이클론, 백 필터(bag filter) 또는 전기 집진기(electrostatic precipitator)와 같은 건식 및 흡식 수집 장치가 사용될 수 있다. 이러한 유니트의 조합도 설치할 수 있다[문헌 참조; Masters, Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS; Charlottenlund (2002)]. 단순한 설계 및 유효성 때문에, 사이클론 분리기가 가장 통상적인 분리기 중의 하나이며, 각종 산업에 사용되고 있다[문헌 참조; Coulson and Richardson, Chemical Engineering, 4th, Vol.2 (Butterworth-Heinemann, Oxford, 1991)]. 사이클론 내부에서의 입자 이동은 두 개의 대향하는 힘의 결과이다. 원심분리 힘은 입자를 사이클로 벽으로 이동시키는 반면, 공기/가스의 드래그 힘(drag force)은 입자를 중심 공기 코어로 전달하여 사이클론을 떠나도록 한다[문헌 참조; Masters, Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS; Charlottenlund (2002)]. 분말 및 공기는 접선으로 사이클론에 유입되고 사이클론(외부 볼텍스)의 바닥 아래 쪽으로 나선형으로 소용돌이친다. 이러한 시점에서, 대부분의 입자는 사이클론을 떠나 바닥에 장착된 용기에 수집되고, 단지 미립자 분획 및 분리할 수 없는 다른 입자를 함유하는 공기가 사이클론의 중심(내부 볼텍스)에서 상향으로 소용돌이치며 상부를 통해 통과한다. 실제로, 30㎛ 초과의 입자 크기는 회수되어야 하는데, 이것 또한 분무 건조기의 치수에 따라 좌우된다[문헌 참조; Masters, Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS; Charlottenlund (2002)]. 그러나, 사이클론 치수를 변화시킴으로써 수율을 최적화시킬 수 있다. 모리 등(Maury et al.)은 표준 사이클론과 비교하여 Buchi B-191 분무 건조기 상의 새로 개발된 사이클론 분리기를 사용하여 훨씬 더 높은 수율을 달성하였다[문헌 참조; Maury et al., Eur. Journal of Pharm. and Biopharm. 59(3): 565-573 (2005)]. 고성능 사이클론(작은 직경)이 심지어 매우 작은 입자(직경 1.5㎛ 미만)를 포함하여 더 많이 분리시켰다.
사이클론 효율을 계산하는데 대한 이론적 작업을 수행한다. 한가지 방법은, 예를 들면, 다음 수학식에 의해 소위 "컷-오프점(cut-off point)"을 계산하는 것이다.
Figure pct00001
위의 수학식 1에서,
dp *는 컷-오프 입자 직경이고,
η은 공기 점도이고,
ri은 내부 볼텍스의 직경을 나타내고,
vri는 공기 입구에서의 방사상 공기 속도이고,
ρs 및 ρg는 고체 및 가스의 밀도를 나타내고,
ui는 ri에서의 접선 입자 속도(tangential particle velocity)이다. 이 시점에서, (입자의 직경) 원심분리 힘과 드래그 힘은 동일한 값을 갖는다. 이러한 크기의 입자는 내부 또는 외부 볼텍스에 대한 경향 없이 회전하고, 보다 작은 입자는 배출되는 공기를 따라 씻겨 내리고, 보다 큰 입자는 수집 용기로 떨어진다[문헌 참조; Staudinger et al., VDI Berichte 1511: 1-23 (1999)].
비행시간(time-of-flight) 방법은 임계 입자 직경을 계산하기 위한 또 다른 방법이다. 이것은 입자가 사이클론 벽으로 이동하는데 얼마나 소요되는지를 고려한다. 이러한 방법에서, 수집 용기의 기하학적 형태를 고려할 수 있는데, 그 이유는 이것이 사이클론 내의 가스 스트림에 영향을 미치기 때문이다[문헌 참조; Qian et al., Chem. Eng. Technol. 29(6): 724-728 (2006)].
수성 단백질 용액을 보조제 없이 분무 건조시키는 것은 통상적으로 풀림, 응집 및 불활성화를 야기한다. 이는 각종 단백질: 옥시헤모글로빈(Labrude et al.), 트립시노겐(Tzannis et al.), IgG(Maury et al. 2005)에 대해 수회 시도되었으며, 모든 경우에 공정 불안정성이 관찰되었다[문헌 참조; Labrude et al., Journal of Pharm. Sci. 78 (3): 223-229 (1989), Tzannis, et al., Journal of Pharm. Sci. 88(3)　: 351-359 (1999), 및 Maury et al., Eur. Journal of Pharm. and Biopharm. 59(2):251-261 (2005)]. 따라서, 몇몇 양태에서, 본 발명의 조성물은 분무 건조 공정 동안 및 또한 저장 동안 약제학적 활성 성분(active pharmaceutical ingredient; API)을 보호한다. 단백질의 동결 건조시, 당(트레할로즈, 수크로즈), 아미노산(아르기닌) 또는 계면활성제(트윈)가 안정화제로서 사용되었다[문헌 참조; Lee, Rational Design of Stable Protein Formulations, Theory and Practice (Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2002)]. 폴리올, 이당류 및 아미노산의 사용을 위해, 몇 가지 안정화 이론이 제안되었다. 이들 중의 하나는 아라카와 및 미타쉐프(Arakawa and Timasheff)에 의해 확립된 소위 "우선-배제(preferential exclusion)" 이론이다[문헌 참조; Arakawa et al., Biochemistry 21: 6536-6544 (1982), Arakawa et al., Advanced Drug Delivery Reviews 46: 307-326 (2001), 및 Timasheff, Annual Reviews Biophys. Biomol. Struct. 22: 67-97 (1993)]. 이것은 단백질은 용액에서 우선적으로 수화되어 공-용질(co-solute)이 단백질 표면과의 접촉으로부터 배제된다는 전제를 기본으로 한다. 풀림이 더 큰 단백질 표면을 야기하기 때문에, 공-용매가 배제되어야 하는 영역이 마찬가지로 더 커진다. 이 경우에, 풀림이 열역학적으로 바람직하지 않은 상황을 야기하며, 따라서, 단백질은 접힌 천연 형태로 유지된다[문헌 참조; Arakawa et al., Advanced Drug Delivery Reviews 46: 307-326 (2001)]. 단백질은 또한 "물 교체(water replacement) 메카니즘에 의해 보호될 수 있다. 이러한 이론은 부형제가 증발된 물 대신에 건조된 단백질에 수소 결합함으로써 풀림을 방지하는 것이라고 한다[문헌 참조; Carpenter et al., Rational Design of Stable Protein Formulations, Theory and Practice (Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2002)]. 또한, 단백질을 고정시키는 유리질 매트릭스(glassy matrix)의 형성이 건조 및 저장시 단백질 안정성에 대한 이유일 수 있다[문헌 참조; Tzannis et al., Journal of Pharm. Sci. 88(3): 360-370 (1999)]. 따라서, 높은 유리 전이 온도(Tg), 예를 들면, 분자 운동을 방해하는 저장 온도보다 높은 Tg를 나타내는 제형이 요구된다. 계면활성제의 안정화 메카니즘은 계면(예를 들면, 액체/공기 계면)을 점유하기 위한 계면활성제와 단백질의 경쟁을 기초로 하며, 계면활성제에 대한 열역학적 가장자리를 보여준다. 단백질이 계면에 흡착되는 기회가 작아, 풀림 및 응집의 위험이 상당히 감소된다[문헌 참조; Adler et al., Journal of Pharm. Sci., 88 (2), 199-208 (1999)].
습도는 단백질 안정성, 특히 장기간 저장 동안의 단백질 안정성에 영향을 미치는 또 다른 인자이다. 단백질 분말에 대한 습기의 영향은 문헌에 잘 입증되어 있다. 통상적으로, 고체 단백질 제형의 화학적 안정성은 반응물로서 또는 반응물의 동원(mobilization)을 위한 매질로서 작용하는 물로 인해 수분 함량이 증가함에 따라 감소한다. 이것은 또한 단백질 구조의 배좌 변화의 원인이 될 수 있다. 이것 이외에, 분무 건조된 분말의 Tg는 또한 물에 의해 영향을 받는다. 물은 가소제로서 작용하는데, 이는 이것이 성분의 Tg를 낮춤을 의미한다. 물의 영향력은 이원 혼합물의 Tg(Tgmix)를 계산하기 위한 방정식인 고든 테일러 방정식(Gordon Taylor Equation)을 사용하여 계산할 수 있다.
Figure pct00002
위의 수학식 2에서,
ω, Tg 및 ρ는 각각 상이한 성분의 중량 분율, 유리 전이 온도 및 밀도이다. 대략 -138℃의 Tg를 갖는 물의 경우, 생성되는 분말의 물 함량이 낮음이 자명하다[문헌 참조; Hancock et al., Pharm. Res. 11(4): 471-477 (1994)]. 그러나, 물 함량과 안정성 사이의 상관성은 직선인 것으로 보이지는 않는다. 장 등(Chang et al.)은 2 내지 3%의 중간 물 함량에서 동결건조된 IgG의 최적 안정화를 수득하였다[문헌 참조; Chang et al., Journal of Pharm. Sci 94(7): 1427-1444 (2005)].
이러한 지식의 결과로서, 분무 건조 공정으로부터 생성된 분말은 낮은 잔류 수분을 나타내야 하고 또한 저장 동안 습기로부터 보호되어야 한다[문헌 참조; Maa et al., Pharm. Res.15(5): 768-775 (1998)]. 전자는 어느 정도는 공정 조건(입구 공기 온도(TIn), 유입 공기의 상대 습도(RH))에 의해 영향을 받을 수 있고; 후자는 누출-방지 바이알(leak-proof vial) 또는 제어 가능한 저장 조건의 문제이다.
III. 본 발명의 제형
어떠한 적합한 단백질, 펩타이드, 항체 또는 이의 항원 결합 부위라도 본 발명의 조성물을 제조하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 이것은 IgG 타입일 수 있다. 예시적인 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 MAK 195F, 아달리무마브 또는 ABT-325를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 따라 사용하기에 적합한 항-TNF 항체는 널리 공지되어 있다(예를 들면, 유럽 공개특허공보 제0 260 610호, 제0 351 789호, 제0 218 868호에 기재된 바와 같음). 폴리클로날 및 모노클로날 항체 둘 다가 사용될 수 있다. 추가로, TNF-결합 항체 단편, 예를 들면, Fab 또는 F(ab')2 단편 또는 단일-쇄 Fv 단편이 또한 적합하다. 적합한 모노클로날 항-hTNF-알파 항체가 유럽 공개특허공보 제0 260 610호에 기재되어 있으며, AM-195 또는 MAK-195라고 하는데, 이는 수탁번호 87 050803 하에 ECACC에 기탁된 하이드리도마 세포주에 의해 생성된다. MAK 195F(INN: 아펠리모마브)라고도 하는 쥐 항-TNF 항체 단편(F(ab')2)이 또한 적합하다.
하나의 양태에서, 본 발명의 제형은, 예를 들면, 아달리무마브(후미라(Humira) 또는 D2E7이라고도 함; 제조원: Abbott Laboratories)를 포함하는, 사람 TNFα에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부위를 포함한다. 하나의 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 1 x 10-8 M 이하의 Kd 및 1 x 10-3 s-1 이하의 Koff 속도 상수(여기서, 이들 둘 다는 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)에 의해 결정된다)로 사람 TNFα로부터 해리되며, 표준 시험관내 L929 분석에서 1 x 10-7 M 이하의 IC50로 사람 TNFα 세포독성을 중화시킨다. 항체의 서열을 포함한, 사람 TNFα에 대해 높은 친화도를 갖는 사람 중화 항체의 예 및 제조 방법이 본원에 참고로 인용되어 있는 미국 특허 제6,090,382호에 기재되어 있다.
하나의 양태에서, 본 발명의 제형은, 예를 들면, 항체 ABT-874(제조원; Abbott Laboratories)를 포함하는, 사람 인터루킨-12(IL-12)에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부위를 포함한다(미국 특허 제6,914,128호). ABT-874는 인터루킨-12 및 인터루킨-23을 표적화하고 중화시키도록 고안된 완전 완전 사람 모노클로날 항체이다. 하나의 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음의 특징들 중의 하나 이상을 갖는다: 3 x 10-7 M 이하의 KD로 사람 IL-1α로부터 해리되고; 5 x 10-5 M 이하의 KD로 사람 IL-1β로부터 해리되고; 마우스 IL-1α 또는 마우스 IL-1β와는 결합하지 않는다. 항체의 서열을 포함한, 사람 IL-12에 대해 높은 친화도를 갖는 사람 중화 항체의 예 및 제조 방법이 본원에 참고로 인용되어 있는 미국 특허 제6,914,128호에 기재되어 있다.
하나의 양태에서, 본 발명의 제형은, 예를 들면, 항체 ABT-325(제조원; Abbott Laboratories)를 포함한, 사람 IL-18에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부위를 포함한다(미국 특허원 제2005/0147610호 참조).
하나의 양태에서, 본 발명의 제형은 항체 ABT-147(제조원; Abbott Laboratories)과 같은, 사람 IL-12에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부위를 포함한다(2007년 1월 11일자로 공개된 국제 공개공보 제WO 2007/005608 A2호 참조).
하나의 양태에서, 본 발명의 제형은 항체 ABT-308(제조원; Abbott Laboratories)과 같은, 사람 IL-13에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부위를 포함한다(제PCT/US2007/19660호 참조).
분말상 제형에 포함될 수 있는 단백질의 예는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 상이한 유형의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 예는 키메라 키메라 항체, 사람 항체, 사람화 항체 및 도메인 항체(dAb)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 하나의 양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물에서 사용되는 항체는 항-TNFα 항체 또는 이의 항원-결합 부위, 또는 항-IL-12 항체, 또는 항-IL-13 항체 또는 이의 항원 결합 부위이다. 본 발명에서 사용될 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 또 다른 예는 ABT-147(제조원; Abbott Laboratories), ABT-325(항-IL-18; 제조원; Abbott Laboratories), ABT-308(제조원; Abbott Laboratories), ABT-874(항-IL-12; 제조원; Abbott Laboratories), 아펠리모마브(Fab 2 항-TNF; 제조원; Abbott Laboratories), 후미라(아달리무마브; 제조원; Abbott Laboratories), 캄파트(알렘투주마브), CEA-스칸 아르시투모마브(fab 단편), 에르비툭스(세툭시마브), 헤르셉틴(트라스투주마브), 마이오신트(임시로마브 펜테테이트), 프로스타신트(카프로마브 펜데타이드), 레미카드(인플릭시마브), 레오프로(압식시마브), 리툭산(리툭시마브), 시물렉트(바실릭시마브), 시나기스(팔리비주마브), 벌루마(노페투모마브), 엑소레어(오말리주마브), 제나팍스(다클리주마브), 제발린(이브리투모마브 티욱세탄), 오르토클론 OKT3(무로모나브-CD3), 파노렉스(에드레콜로마브) 및 마일로타르그(겜투주마브 오조가미신)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
하나의 대안에서, 단백질은 풀모자임(도르나제 알파), 레비프, 레그라넥스(베카플러민), 악티바제(알테플라제), 알두라자임(라로니다제), 아메비브(알레파셉트), 아라네스프(다르베포에틴 알파), 베카플러민 농축물, 베타세론(인터페론 베타-1b), BOTOX(보툴리눔 톡신 타입 A), 엘리텍(라스부리카제), 엘스파(아스파라기나제), 에포겐(에포에틴 알파), 엔브렐(에타너셉트), 파브라자임(아갈시다제 베타), 인퍼겐(인터페론 알파콘-1), 인트론 A(인터페론 알파-2a), 기네레트(아나킨라), MYOBLOC(보툴리눔 톡신 타입 B), 노이라스타(페그필그라스팀), 노이메가(오프렐베킨), 노이포겐(필그라스팀), 온탁(데닐루킨 디프티톡스), PEGASYS(페그인터페론 알파-2a), 프로로이킨(알데스루킨), 풀모자임(도르나제 알파), 레비프(인터페론 베타-1a), 레그라넥스(베카플러민), 레타바제(레테플라제), 로페론-A(인터페론 알파-2), TNKase(테넥테플라제) 및 엑시그리스(드로트레코긴 알파)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 융합 단백질이다.
본원에 기재된 방법 및 조성물에 포함될 수 있는 단백질의 또 다른 예는 재조합 단백질을 포함한 포유동물 단백질, 예를 들면, 사람 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬을 포함한 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지단백질; α-1-안티트립신; 인슐린 A-쇄; 인슐린 B-쇄; 프로인슐린; 여포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예를 들면, 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자 및 폰빌레브란드 인자(von Willebrands factor); 항-응고 인자, 예를 들면, 단백질 C; 심방성 나트륨 이뇨 인자(atrial natriuretic factor); 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성인자, 예를 들면, 우로키나제 또는 조직형 플라스미노겐 활성인자(t-PA); 봄바진; 트롬빈; 종양 괴사 인자-α 및 -β 엔케팔리나제; RANTES(Regulated on Activation Normally T-cell Expressed and Secreted); 사람 대식세포 염증 단백질(MIP-1-α); 혈청 알부민, 예를 들면, 사람 혈청 알부민; 물러리안-억제 물질(mullerian-inhibiting substance); 릴렉신 A-쇄; 릴렉신 B-쇄; 프로릴렉신; 마우스 고나도트로핀-관련 펩타이드; DNase; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor; VEGF); 호르몬 또는 성장 인자를 위한 수용체; 인테그린; 단백질 A 또는 D; 류마티즘 인자; 신경영양 인자, 예를 들면, 뼈-유도된 신경영양 인자(bone-derived neurotrophic factor; BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5 또는 -6(NT-3, NT4, NT-5 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예르 들면, NGF-β; 혈소판-유도된 형장 인자(platelet-derived growth factor; PDGF); 섬유 아세포 성장 인자, 예를 들면, aFGF 및 bFGF; 상피세포 성장 인자(epidermal growth factor; EGF); 전환 성장 인자(transforming growth factor; TGF), 예를 들면, TGFα 및 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5를 포함한 TGF-β; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II(IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I(뇌 IGF-I); 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질; CD 단백질, 예를 들면, CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD20; 에리트로포이에틴(EPO); 트롬보포이에틴(TPO); 골유도 인자(osteoinductive factor); 면역독소; 골 형태발생 단백질(bone morphogenetic protein; BMP); 성장 및 분화 인자, 인터페론, 예를 들면, 인터페론-α, -β 및 -γ; 콜로니 자극 인자(colony stimulating factor; CSF), 예를 들면, M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 인터루킨(IL), 예를 들면, IL-1 내지 IL-10; 슈퍼옥사이드 디스뮤타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 촉진 인자(decay accelerating factor; DAF); 바이러스 항원, 예를 들면, AIDS 외피의 일부; 수송 단백질; 호밍 리셉터(homing receptor); 어드레신; 조절 단백질; 면역부착체(immunoadhesin); 항체; 및 위에 열거된 폴리펩타이드의 생물학적 활성 단편 또는 이의 변이체를 포함한다.
폴리클로날 항체
폴리클로날 항체는 일반적으로 특정 항원에 특이적이지만 항원 상의 다른 에피토프에 결합하는 항체의 혼합물을 나타낸다. 폴리클로날 항체는 일반적으로 관련 항원 및 항원보조제(adjuvant)의 다중 피하(sc) 또는 복강내(ip) 주사에 의해 동물에서 야기된다. 이것은 이작용성 또는 유도성 제제, 예를 들면, 말레이미도벤조일 설포석신이미드 에스테르(시스테인 잔기를 통한 접합), N-하이드록시석신이미드(리신 잔기를 통해), 글루타르알데히드, 석신산 무수물, SOCl2 또는 R1NCNR(여기서, R 및 R1은 상이한 알킬 그룹이다)을 사용하여 관련 항원을 면역화시키고자 하는 종에서 면역원성인 단백질(예를 들면, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제)에 접합시키는데 유용할 수 있다. 폴리클로날 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면, 본원에 참고로 인용되어 있는 문헌[참조; Antibodies: A Laboratory Manual, Lane and Harlow (1988)]에 기재되어 있다.
모노클로날 항체
본원에서 사용되는 "모노클로날 항체"는 하이브리도마-유도된 항체(예를 들면, 하이브리도마 기술, 예를 들면, 표준 Kohler 및 Milstein 하이브리도마 방법에 의해 제조된 하이브리도마에 의해 분비된 항체)를 나타내는 것으로 의도된다. 예를 들면, 모노클로날 항체는 문헌[참조; Kohler et al., Nature, 256:495(1975)]에서 처음 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조하거나, 재조합 DNA법(미국 특허 제4,816,567호)에 의해 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명의 하이브리도마-유도된 이중-특이성 항체를 여전히 모노클로날 항체라고 하지만, 이것은 하나 이상의 단일 항원에 대해 항원 특이성을 갖는다.
모노클로날 항체는 실질적으로 동종인 항체(즉, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 군집을 구성하는 개별 항체가 동일함)의 군집으로부터 수득된다. 따라서, 수식어구 "모노클로날"은 개별 항체의 혼합물이 아닌 것으로서 항체의 특징을 나타낸다.
추가의 양태에서, 항체는 파지 라이브러리를 사용한 각각 쥐 및 사람 항체의 분리를 기재한 문헌[참조; McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 분리할 수 있다. 이후의 공보들은 쇄 셔플링(chain shuffling)[문헌 참조; Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)]에 의한 고친화도 (nM 범위) 사람 항체의 생산 뿐만 아니라 매우 큰 파지 라이브러리를 작제하기 위한 전략으로서의 조합 감염(combinatorial infection) 및 시험관내 재조합[문헌 참조; Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)]을 기재하고 있다. 따라서, 이러한 기술들은 모노클로날 항체의 분리를 위한 종래의 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 유용한 대안이다.
항체 및 항체 단편은 또한 미국 특허 제6,423,538호; 제6,696,251호; 제6,699,658호; 제6,300,065호; 제6,399,763호; 및 제6,114,147호에 기재된 바와 같이 발현 라이브러리를 사용하여 효모 및 기타 진핵 세포로부터 분리할 수 있다. 진핵 세포는 세포 표면에서의 디스플레이를 위한 조합 항체 라이브러리를 포함한 라이브러리 단백질을 발현하기 위해 가공되어, 선택 표적 분자에 대한 친화도를 갖는 항체를 위한 라이브러리 클론을 함유하는 특정 세포를 선택할 수 있도록 한다. 분리된 세포로부터의 회수 후, 관심 항체에 대해 암호화된 라이브러리 클론은 적당한 포유동물 세포주로부터 높은 수준으로 발현될 수 있다.
관심 항체를 개발하기 위한 또 다른 방법은 미국 특허 제7,195,880호; 제6,951,725호; 제7,078,197호; 제7,022,479호; 제6,518,018호; 제7,125,669호; 제6,846,655호; 제6,281,344호; 제6,207,446호; 제6,214,553호; 제6,258,558호; 제6,261,804호; 제6,429,300호; 제6,489,116호; 제6,436,665호; 제6,537,749호; 제6,602,685호; 제6,623,926호; 제6,416,950호; 제6,660,473호; 제6,312,927호; 제5,922,545호; 및 제6,348,315호에 기재된 바와 같은 핵산 디스플레이 기술(nucleic acid display technology)을 사용한 무세포 스크리닝(cell-free screening)을 포함한다. 이러한 방법은 단백질이 이들이 기원하는 핵산에 물리적으로 연합하거나 결합하도록 하는 방식으로 핵산으로부터 시험관내에서 단백질을 전사시키는데 사용될 수 있다. 표적 분자로 발현된 단백질을 선택함으로써 단백질을 암호화하는 핵산 또한 선택된다. 무세포 스크리닝 기술에 대한 하나의 변형에서, 면역계 세포로부터 분리된 항체 서열을 분리할 수 있고, 부분적으로 랜덤화된 폴리머라제 연쇄 반응 돌연변이 기술을 사용하여 항체 다양성을 증가시킬 수 있다. 그후, 이러한 부분적으로 랜덤화된 항체 유전자가 무세포 시스템에서 발현되며, 이와 동시에 핵산과 항체 사이에 물리적 연합이 생성된다.
DNA는 또한, 예를 들면, 상동성 쥐 서열 대신에 사람 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 암호화 서열을 치환시키거나(미국 특허 제4,816,567호; Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), 비-면역글로불린 폴리펩타이드에 대한 암호화 서열의 전부 또는 일부를 면역글로불린 암호화 서열에 공유결합적으로 결합시킴으로써 변형시킬 수 있다.
전형적으로 이러한 비-면역글로불린 폴리펩타이드는 항체의 불변 도메인을 치환하거나, 항체의 하나의 항원-조합 부위(antigen-combining site)의 가변 도메인을 치환하여 하나의 항원에 대한 특이성을 갖는 한개의 항원-조합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 또 다른 항원-조합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생성한다.
키메라 또는 하이브리드 항체는 또한 가교결합제를 필요로 하는 것을 포함하여, 합성 단백질 화학에서 공지된 방법을 사용하여 시험관내에서 제조할 수 있다. 예를 들면, 면역독소는 디설파이드-교환 반응을 사용하여 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 구성할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅포부티르이미데이트를 포함한다.
사람화 항체
비-사람 항체를 사람화시키는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 일반적으로, 사람화 항체는 비-사람인 공급원으로부터 이에 도입되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이러한 비-사람 아미노산 잔기를 종종 "임포트(import)" 잔기라고 하는데, 이는 전형적으로 "임포트" 가변 도메인으로부터 따온 것이다. 사람화(humanization)는 사람 항체의 상응하는 서열을 비-사람(예를 들면, 설치류) CDR 또는 CDR 서열로 치환시킴으로써 윈터 및 협력자(Winter and co-workers)의 방법에 따라 본질적으로 수행할 수 있다[문헌 참조; Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)]. 따라서, 이러한 "사람화" 항체는 키메라 항체(미국 특허 제4,816,567호)이고, 여기서, 실질적으로 더 적은 온전한 사람 가변 도메인이 비-사람 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된다. 실제로, 사람화 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 구조(FR) 잔기가 설치류 항체에서의 유사 위치로부터의 잔기로 치환되는 사람 항체이다. 사람화 공정을 기재하고 있는 추가의 참고 문헌은 각각 본원에 참고로 인용되어 있는 문헌[참조; Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987); Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)]을 포함한다.
사람 항체
대안적으로, 면역화시 내인성 면역글로불린 생성 부재시에도 사람 항체의 완전한 레퍼토리를 생성할 수 있는 유전자도입 동물(예를 들면, 마우스)을 생산하는 것일 현재 가능하다. 예를 들면, 키메라 및 생식선 돌연변이 마우스에서의 항체 중쇄 연결 영역(joining region; JH) 유전자의 동종접합성 결실(homozygous deletion)이 내인성 항체 생산의 완전 억제를 야기하는 것으로 기재되어 있다. 이러한 생식선 돌연변이 마우스에서의 사람 생식선 면역글로불린 유전자 어레이의 전이는 항원 시험감염(antigen challenge) 시에 사람 항체의 생산을 초래할 것이다[문헌 참조; 예를 들면, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)]. 사람 항체는 또한 파지-디스플레이 라이브러리(phage-display library)로부터 유도될 수 있다[문헌 참조; Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)].
이특이성 항체
이특이성 항체(BsAb)는 적어도 두 개의 상이한 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 항체이다. 이러한 항체는 전장 항체 또는 항체 단편(예를 들면, F(ab')2 이특이성 항체)으로부터 유도될 수 있다.
이특이성 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전장 이특이성 항체의 종래의 생산은 두 개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시발현을 기초로 하며, 여기서, 두 개의 쇄는 상이한 특이성을 갖는다(문헌 참조; Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류(random assortment) 때문에, 이러한 하이브리도마(콰드로마(quadroma))는 10개의 상이한 항체 분자(여기서, 이들 중의 단지 하나만이 적당한 이특이성 구조를 갖는다)의 가능한 혼합물을 생성한다. 친화력 크로마토그래피 단계에 의해 통상적으로 수행되는 적당한 분자의 정제는 다소 성가시며, 생산 수율이 낮다. 유사한 과정이 국제 공개공보 제WO 93/08829호 및 문헌[참조; Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]에 기재되어 있다.
상이한 방법에 따르면, 목적하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인(항체-항원 결합 부위)은 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다.
융합은 바람직하게는 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인에서 이루어진다. 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역(CH1)이 하나 이상의 융합에 존재하는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합을 암호화하는 DNA 및, 경우에 따라, 면역글로불린 경쇄가 별도의 발현 벡터로 삽입되고, 적합한 숙주 유기체에 동시-형질감염된다. 이것은 구조에 사용되는 동등하지 않은 비의 세 개의 폴리펩타이드 쇄가 최적의 수율을 제공하는 양태에서 세 개의 폴리펩타이드 단편의 상호 비율을 조절하는데 있어서 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비의 적어도 두 개의 폴리펩타이드 쇄의 발현이 높은 수율을 야기하는 경우 또는 비가 특별히 중요하지 않은 경우에 하나의 발현 벡터에서 두 개 또는 세 개 모두의 폴리펩타이드 쇄에 대해 암호화 서열을 삽입하는 것이 가능하다.
이러한 방법의 바람직한 양태에서, 이특이성 항체는 하나의 팔에는 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄 및 다른 팔에는 (제2 결합 특이성을 제공하는) 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍으로 이루어진다. 이특이성 분자의 단지 1/2에서의 면역글로불린 경쇄의 존재가 손쉬운 분리 방법을 제공하기 때문에 이러한 비대칭 구조가 원치않는 면역글로불린 쇄 조합으로부터의 목적하는 이특이성 화합물의 분리를 촉진시키는 것으로 밝혀졌다. 이러한 방법은 1994년 3월 3일자로 공개된 국제 공개공보 제WO 94/04690호에 기재되어 있다. 이특이성 항체의 생성에 대한 추가의 상세한 설명을 위해서는, 예를 들면, 문헌[참조; Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참고한다.
이특이성 항체는 가교결합된 또는 "이종접합체(heteroconjugate)" 항체를 포함한다. 예를 들면, 이종접합체에서의 항체 중의 하나는 아비딘에 커플링되고 나머지는 비오틴에 커플링될 수 있다. 이러한 항체는, 예를 들면, 면역계 세포를 원치않는 세포에 표적화시키고(미국 특허 제4,676,980), HIV 감염의 치료용(국제 공개공보 제WO 91/00360호, 제WO 92/200373호 및 유럽 특허 제03089호)으로 제안되었다. 이종접합체 항체는 통상의 가교결합법을 사용하여 제조할 수 있다. 적합한 가교결합제는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 다수의 가교결합 기술과 함께 미국 특허 제4,676,980호에 기재되어 있다.
항체 단편으로부터 이특이성 항체를 생성하기 위한 기술은 또한 문헌에도 기재되어 있다. 다음의 기술들이 또한 반드시 이특이성인 것은 아닌 2가 항체 단편의 생산에 사용될 수 있다. 예를 들면, 대장균(E. coli)으로부터 회수된 Fab' 단편을 시험관내에서 화학적으로 커플링시켜 2가 항체를 형성할 수 있다[문헌 참조; Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)].
재조합 세포 배양물로부터 직접 2가 항체 단편을 제조하고 분리하기 위한 다양한 기술들이 또한 기재되어 있다. 예를 들면, 2가 이종이량체(heterodimer)는 류신 지퍼(leucine zipper)를 사용하여 제조한다[문헌 참조; Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩타이드는 유전자 융합에 의해 상이한 두 개의 항체의 Fab' 부위에 결합된다. 항체 동종이량체(homodimer)는 힌지 영역에서 환원되어 단량체를 형성하고, 재산화되어 항체 이종이량체를 형성한다. 문헌[참조; Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디(diabody)" 기술은 이특이성/2가 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 메카니즘을 제공한다. 단편은, 너무 짧아서 동일한 쇄의 두 개의 도메인 사이에서 쌍을 이룰 수 없는 링커에 의해 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인을 또 다른 단편의 상보적 VL 및 VH 도메인과 강제로 쌍을 이루도록 함으로써, 두 개의 항원-결합 부위를 형성한다. 단일-쇄 Fv(sFv) 이량체를 사용함으로써 이특이성/2가 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 전략이 또한 보고되었다[문헌 참조; Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)].
하나의 양태에서, 본 발명의 제형은 IL-1(IL-1α 및 IL-1β 포함)에 대해 이특이성인 항체를 포함한다. 이특이성 IL-1 항체의 예 및 제조 방법은 2008년 7월 10일자로 공개된 국제 공개공보 제WO 08/082651호에서 찾아볼 수 있다.
이중 가변 도메인(dual variable domain; DVD) 결합 단백질
이중 가변 도메인(DVD) 결합 단백질은 둘 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 단백질이며, 4가 또는 다가 결합 단백질이다. DVD는 단일특이성(monospecific), 즉 하나의 항원에 결합할 수 있거나, 다중특이성, 즉 둘 이상의 항원에 결합할 수 있다. 두 개의 중쇄 DVD 폴리펩타이드 및 두 개의 경쇄 DVD 폴리펩타이드를 포함하는 DVD 결합 단백질을 DVD IgTM이라고 한다. DVD Ig의 각각의 절반은 중쇄 DVD 폴리펩타이드, 경쇄 DVD 폴리펩타이드 및 두 개의 항원 결합 부위를 포함한다. 각각의 결하 부위는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하며, 항원 결합 부위당 총 6개의 CDR이 항원 결합에 관여한다. 특정 양태에서, DVD는 본원에 참고로 인용되어 있는 2007년 3월 29일자로 공개된 우 등(Wu et al.)의 미국 특허공보 제20070071675호에 기재된 DVD를 포함할 수 있다.
DVD-Ig는 두 개의 상이한 표적을 동시에 차단하여 효능/안전성을 증진시키고/시키거나 환자 적용범위(patient coverage)를 증가시키기 위한 치료제로서 유용하다. 이러한 표적은 가용성 표적(IL-13 및 TNF) 및 세포 표면 수용체 표적(VEGFR 및 EGFR)을 포함할 수 있다. 이것은 또한 암 치료를 위해 종양 세포와 T 세포(Her2 및 CD3) 사이 또는 자가면역/이식을 위해 자가반응성 세포와 효과기 세포 사이 또는 소정의 질환에서 질환-유발 세포를 제거하기 위해 표적 세포와 효과기 세포 사이의 재지정된 세포독성(redirected cytotoxicity)을 유도하는데 사용될 수 있다.
또한, DVD-Ig는 동일한 수용체 상의 두 개의 상이한 에피토프를 표적화하도록 고안된 경우 수용체 클러스터링 및 활성화를 일으키는데 사용될 수 있다. 이것은 효능성 및 길항성 항-GPCR 치료제를 제조하는데 이로울 수 있다. 이러한 경우에, DVD-Ig는 클러스터링/시그널링(두 개의 세포 표면 분자) 또는 시그널링(하나의 세포 분자에서)를 위해 하나의 세포 상에 두 개의 상이한 에피토프를 표적화하는데 사용될 수 있다. 유사하게, DVD-Ig 분자는 CTLA4 세포외 도메인의 두 개의 상이한 에피토프(또는 동일한 에피토프의 2개의 카피)를 표적화함으로써 음성 신호(negative signal) 및 CTLA-4 연결을 일으키도록 설계되어 면역 반응의 하향 조절을 야기할 수 있다. 유사하게도, DVD-Ig는 세포 표면 수용체 복합체(예를 들면, IL-12R 알파 및 베타)의 두 개의 상이한 구성원을 표적으로 할 수 있다. 추가로, DVD-Ig는 CR1 및 가용성 단백질/병원균을 표적화하여 표적 가용성 단백질/병원균이 신속하게 제거되도록 할 수 있다.
추가로, 본 발명의 DVD-Ig는 세포내 전달(내재화 수용체(internalizing receptor) 및 세포내 분자를 표적화함), 뇌 내부로의 전달(뇌-혈관 장벽을 교차하기 위한 CNS 질환 매개체 및 트랜스페린 수용체를 표적화함)을 포함하여, 조직-특이적 전달(증진된 국소 PK, 이에 따른 보다 높은 호율 및/또는 낮은 독성을 위한 질환 매개체 및 조직 마커를 표적화함)에 사용될 수 있다. DVD-Ig는 또한 항원의 비-중화 에피토프로의 결합을 통해 해당 항원을 특정 위치로 전달하고 또한 항원의 반감기를 증가시키기 위한 캐리어 담체로서 작용할 수 있다.
본 발명은 본원에 기재되고 본원에 기재된 바와 같이 제조되는 것을 포함한 적합한 단백질을 포함하는 안정한 분말상 조성물을 제공한다. 예를 들면, 분말은 단백질 또는 펩타이드(예를 들면, 항체 또는 이의 항원 결합 부위) 및 부형제를 포함할 수 있으며, 여기서, 당해 조성물은 약 6% 미만의 잔류 수분을 포함한다. 특정 양태에서, 조성물은 약 5.5%, 5%, 4.4%, 4%, 3.5% 또는 3% 미만의 잔류 수분을 포함한다. 몇몇 양태에서, 조성물은 2% 또는 1% 미만의 잔류 수분을 포함한다. 또 다른 양태에서, 조성물은 상기 값에 의해 경계지어진 범위의 잔류 수분, 예를 들면, 약 4% 내지 6%, 약 4.5% 내지 5.5%, 또는 약 3% 내지 5%의 잔류 수분을 포함한다. 몇몇 양태에서, 생성되는 분말상 조성물의 잔류 수분 함량은 약 1% 내지 약 3%, 약 1.5% 내지 2.5%, 약 1.4% 내지 약 2%, 약 4% 내지 6%, 또는 약 4.5% 내지 약 5%이다. 또 다른 양태에서, 분말상 조성물은 약 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5% 또는 7%의 잔류 수분을 포함한다.
몇몇 양태에서, 단백질은 목적하는 기간 동안 생물학적 활성을 보유한다. 하나의 양태에서, 분말은 주위 온도 및 습도에서 적어도 3개월 동안 안정하다. 몇몇 양태에서, 분말은 주위 온도 및 습도에서 적어도 6개월, 9개월, 1년, 2년, 3년 또는 5년 동안 안정하다. 또 다른 양태에서, 분말은 40℃에서 적어도 3개월 동안 안정하다. 추가의 양태에서, 분말은 40℃에서 적어도 3개월, 6개월, 9개월, 1년, 2년 또는 5년 동안 안정하다. 추가의 양태에서, 분말은 40℃ 및 주위 습도에서 적어도 3개월, 6개월, 9개월, 1년, 2년 또는 5년 동안 안정하다.
본 발명의 분말상 조성물 및/또는 분말상 조성물을 포함하는 약제학적 조성물은 부형제를 포함할 수 있다. 적합한 부형제는 트레할로즈, 수크로즈, 소르비톨, 폴리에틸렌 글리콜, 하나 이상의 아미노산, 히스티딘, 알라닌, 아르기닌, 글리신 또는 이들의 혼합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 방법은 산성 성분, 산화방지제 및/또는 장성 개질제를 첨가함을 추가로 포함할 수 있다.
몇몇 양태에서, 조성물은 약 0.27:1.0 내지 약 2.8:1.0, 약 0.27:1.0 내지 약 1.4:1.0, 약 0.27:1.0 내지 약 0.7:1.0, 또는 약 0.7:1의 부형제 대 항체 또는 이의 항원 결합 부위의 질량비를 가지며, 부형제는 트레할로즈 또는 수크로즈이다. 또 다른 양태에서, 조성물은 약 0.27:1.0 내지 약 2.8:1.0, 약 0.27:1.0 내지 약 1.4:1.0, 약 0.27:1.0 내지 약 0.7:1.0, 약 0.7:1, 또는 약 0.35:1의 부형제 대 항체 또는 이의 항원 결합 부위의 질량비를 가지며, 부형제는 소르비톨이다.
추가로, 본 발명은 본원에 기재된 유효량의 분말을 포함하는 약제학적 제제를 제공한다. 약제학적으로 허용되는 담체는 비경구, 경구, 장내 또는 국소 투여에 허용 가능한 담체일 수 있다. 담체는 고체, 반고체 또는 액체(예를 들면, 물 또는 유기 액체) 또는 이들의 배합물일 수 있다.
분말을 약제학적으로 허용되는 담체에서 혼합(예를 들면, 용해 또는 매봉)시킬 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는, 예를 들면, 비경구 투여에 허용 가능할 수 있으며, 예를 들면, 물을 포함할 수 있다. 당해 방법은 하나 이상의 산성 성분, 산화방지제 및/또는 장성 개질제를 약제학적 조성물에 첨가함을 추가로 포함할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 적합한 첨가제, 예를 들면, 완충제, 점도 개질제, 방향제, 착색제 등을 본 발명의 약제학적 조성물에 첨가할 수 있다.
분말상 약제학적 조성물을 용융 압출, 압축 또는 달리 가공하여, 예를 들면, 정제 또는 다른 고체 또는 반고체 조성물을 형성할 수 있다. 분말을, 예를 들면, PLGA와 같은 중합체로 피복시켜 서방출 및/또는 지연방출 약제학적 조성물을 형성할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 조성물을, 예를 들면, 장용제피제로 캡슐화하거나 피복시킬 수 있다. 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(예를 들면, PEG 400), 에탄올, DMSO, NMP, 빙초산 등과 같은 유기 용매에 의한 침전, 변성 또는 산화로부터 약물을 보호하는데 피막 및/또는 부형제를 사용할 수 있다.
액체 조성물, 예를 들면, 수성 조성물이 또한 고려된다. 이러한 조성물은, 예를 들면, 경구 또는 정맥내 투여에 적합할 수 있으며, 적합한 부형제 또는 첨가제, 예를 들면, 장성 개질제 또는 완충제를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 액체 약제학적 조성물은 높은 농도의 수성 단백질 제형임에도 불구하고 낮은 비율의 단백질 응집물을 갖는다. 하나의 양태에서, 수성 조성물은 물 및 높은 농도의 단백질, 예를 들면, 계면활성제 또는 다른 유형의 부형제의 부재하에서도 약 5% 미만의 단백질 응집물을 함유하는 항체를 포함한다. 하나의 양태에서, 조성물은 약 7.3% 이상의 단백질 응집물을 포함하거나; 조성물은 약 5% 이하의 단백질 응집물을 포함하거나; 조성물은 약 4% 이하의 단백질 응집물을 포함하거나; 조성물은 약 3% 이하의 단백질 응집물을 포함하거나; 조성물은 약 2% 이하의 단백질 응집물을 포함하거나; 조성물은 약 1% 이하의 단백질 응집물을 포함한다. 하나의 양태에서, 조성물은 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 단량체 단백질을 포함한다. 상기 언급한 농도 사이의 범위, 예를 들면, 적어도 약 98.6% 단량체 단백질, 약 4.2% 이하의 응집물 단백질 또한 본 발명의 일부인 것으로 의도된다. 또한, 상한치 및/또는 하한치로서의 상기 언급된 값의 조합을 사용한 값의 범위가 포함되는 것으로 의도된다.
IV. 발명의 용도
본 발명의 조성물은 치료학적으로, 즉, 생체내에서 또는 시험관내 또는 동일 반응계내에서의 목적을 위한 시약으로서 둘 다로 사용될 수 있다. 본원에 기재되고 예시된 바와 같이, 분무 건조를 사용하여, 예를 들면: (a) 궤양성 대장염 치료용 ABT-874의 장내 제형, (b) 당뇨병성 궤양용 아달리무마브의 국소 제형; 및 (c) 천식 치료용 ABT-308의 폐 투여 형태의 개발/제조용 출발 물질로서 사용하기 위한 건조 단백질 분말을 제조할 수 있다. 또한, 분무 건조된 항체는 MELTREX 용융 압출 공정에 사용될 수 있는데, 그 이유는 유리질 부형제 매트릭스(예를 들면, 트레할로즈)내에 혼입된 모노클로날 항체(mAb)는 열 풀림/변성에 대해 보다 높은 안정성을 나타내기 때문이다. 이것은 다시 단백질의 경구 투여용의 새로운 고체 단백질 투여 형태의 개발을 위한 기회를 제공할 수 있다.
치료학적 용도
본 발명의 방법은 또한 치료학적 용도에 유리한 특징을 갖는 약제학적 조성물을 제조하는데 사용될 수 있다. 액체 또는 고체 조성물을 포함한 약제학적 조성물은 대상체에서 장애를 치료하기 위한 약제학적 조성물 또는 제형으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 치료학적 단백질, 펩타이드, 항체 또는 이의 항원 결합 부위가 치료를 위해 사용되는 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. "장애"는 항체로의 치료로부터 효험을 볼 수 있는 상태이다. 이것은 포유동물이 해당 장애에 걸리기 쉽게 하는 병리학적 상태를 포함한 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다. 항-TNFα 항체의 경우에, 치료학적 유효량의 항체를 투여하여 자가면역 질환, 예를 들면, 류마티스 관절염, 장관 장애, 예를 들면, 크론병, 척추관절병증, 예를 들면, 강직성 척추염, 또는 피부 장애, 예를 들면, 건선을 치료할 수 있다. 항-IL-12 항체의 경우, 치료학적 유효량의 항체를 투여하여 신경성 장애, 예를 들면, 다발성 경화증, 또는 피부 장애, 예를 들면, 건선을 치료할 수 있다. 본 발명의 조성물을 사용하여 치료할 수 있는 장애의 또 다른 예는 유방암, 백혈병, 림프종 및 결장암을 포함한 암을 포함한다.
용어 "대상체"는 살아있는 유기체, 예를 들면, 원핵생물 및 진핵생물을 포함하는 것으로 의도된다. 대상체의 예는 포유동물, 예를 들면, 사람, 개, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 고양이, 마우스, 토끼 및 유전자도입 비-사람 동물을 포함한다. 본 발명의 특별한 양태에서, 대상체는 사람이다.
용어 "치료"는 치료학적 치료 및 예방적 또는 방지적 조치 둘 다를 나타낸다. 치료를 필요로 하는 것은 이미 장애를 갖고 있는 것 뿐만 아니라 장애를 예방하고자 하는 것을 포함한다.
수성 또는 고체 조성물을 공지된 투여 방법에 따라 치료를 필요로 하는, 사람을 포함한 포유동물에 투여할 수 있다. 투여방법의 예는 정맥내 투여, 예를 들면, 일시주입 또는 일정 시간에 걸친 연속 주입, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활막내, 경막내, 피내, 경피, 경구, 국소 또는 흡입 투여를 포함한다.
하나의 양태에서, 조성물은 피하 투여에 의해 포유동물에게 투여된다. 이러한 목적을 위해, 조성물은 시린지 뿐만 아니라 주사 장치(예를 들면, Inject-eas 및 Genject 장치); 주사기 펜(예를 들면, GenPen); 무침 장치(예를 들면, MediJector 및 BioJector); 및 피하 패치 전달 시스템을 포함한 다른 장치를 사용하여 주사할 수 있다.
또한, 조성물을 수용하는 전달 장치가 또한 본 발명에 포함된다. 이러한 장치의 예는 시린지, 펜, 임플란트 및 패치를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 자동주사 펜의 예가 2007년 6월 29일자로 출원된 미국 특허원 제11/824,516호에 기재되어 있다.
단백질, 펩타이드, 항체 또는 이의 항원 결합 부위의 적당한 투여량("치료학적 유효량")은, 예를 들면, 치료하고자 하는 상태, 상태의 중증도 및 경과, 예방용으로 투여되는지 치료용으로 투여되는지, 이전의 치료법, 환자의 임상적 이력 및 단백질에 대한 반응, 사용되는 단백질의 유형 및 담당의의 재량에 따라 좌우될 것이다. 본 발명의 조성물은 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적절하게 투여하며, 진단 이후 어떠한 시간에라도 환자에게 투여할 수 있다. 조성물은 단독 치료로서 또는 해당 상태에서 치료에 유용한 다른 약물 또는 치료법과 함게 투여할 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명의 조성물, 예를 들면, 아펠리모마브 및/또는 다른 적합한 항체 또는 이의 항원 결합 부위를 포함한 조성물이 치료학적으로 사용된다. 하나의 양태에서, 조성물은 패혈증 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물이다.
패혈증, 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 및 아펠리모마브
패혈증은 감염에 대한 전신 염증성 반응으로서 정의된다. 감염은, 예를 들면, 바이러스성, 세균성, 진균성 또는 기생성일 수 있다. 패혈증은 마침내 면역적격 세포(immunocompetent cell)의 활성화 및 다수의 사이토킨(TNF-α, IL-1 등)의 방출과 관련된 전신 염증성 반응을 야기한다. ACCP(American College of Chest Physicians)에 의해 정의되는 바와 같이 상이한 단계/종류의 패혈증이 있다: SIRS(Systemic Inflammatory Response Syndrome; 전신 염증성 반응 증후군)(각종 기원의 전싱 염증성 반응(감염, 홍반 등); 패혈증(감염에 의해 유발된 SIRS); 심한 패혈증(기관 기능부전/기능장애를 갖는 패혈증); 및 패혈증성 쇼크(쇼크를 갖는 패혈증)). 이러한 종류의 패혈증을 진단하기 위해서는 상이한 기준을 충족해야 한다.
원발성 면역 반응은 각종 2차 매개체에 의해 조정되고 증폭된다. 유기체는 염증을 이들의 발생 장소(주로 폐 또는 혈액 순환)로 제한할 수 없다. 상이한 기관이 영향을 받을 수 있으며, 이것이 몇몇 체기능에 강한 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 패혈증의 가능한 신호는 이상고열, 빈호흡, 심박 급속증, 저혈압 및 정신착락(confusion)을 포함한다. 다양한 지표 때문에, 패혈증은 진단하기 매우 어렵고, 패혈증 환자에서 높은 사망률의 기여 인자이다.
패혈증 환자를 치료하기 위한 상이한 약제들이 공지되어 있으며, 이들 중에서 드로트레코긴(drotrecogin) α(활성화된 단백질 C) 및 안티트롬빈 III는 혈액 응고를 차단하고 코르티손(저 용량으로)은 염증을 약독화시킨다[문헌 참조; Bloos et al., Aktuelle Ernahrungsmedizin, 28:186-190 (2003)]. TNF-α가 패혈증의 주요 매개체 중의 하나이기 때문에, 패혈증을 다루는 한 가지 방법은 TNF-α를 차단하여 이의 작용을 피하는 것이다. TNF-α의 국소 방출은 혈류 및 혈관 투과성을 증가시킨다. 이것은 숙주 방어에 관여하는 체액, 세포 및 단백질이 감염된 조직으로 유입되도록 한다. 혈액으로 감염이 확산되는 것을 방지하기 위해, 작은 맥관들이 이후에 응고되고, 체액이 림프절로 흘려나가며, 여기서, 적응성 면역 반응이 개시된다. 전신 감염 동안, TNF-α가 유사한 방식으로 작용하여 쇼크 및 파종성 혈관내 응고를 야기한다. 결과는 응고 인자의 고갈, 연속 출혈 및 다장기 부전(multiple organ failure)이다[문헌 참조; Janeway et al., Immunobiology (Garland Publishing, 1994)]. TNF-α을 차단하는 것은 항-TNF-α-항체의 비경구 투여에 의해 달성될 수 있다. 항체 단편 아펠리모마브를 고안함으로써, 보다 낮은 면역원성 문제를 겸비한 보다 양호한 조직 투과가 달성될 수 있다.
몇몇 양태에서, 본 발명은 대상체(예를 들면, 사람)에게 단백질, 펩타이드, 항체 또는 이의 항원 결합 단백질을 투여하여 대상체에서의 이의 표적 또는 표적들의 활성이 억제되고 치료가 달성되도록 함을 포함한다. 몇몇 양태에서, 장애는 관절염, 골관절염, 소아 만성 관절염, 패혈증성 관절염, 라임 관절염, 건선 관절염, 반응성 관절염, 척추관절병증, 전신 홍반성 낭창, 크론병, 궤양성 대장염, 염증성 장 질환, 인슐린 의존성 당뇨병, 갑상선염, 천식, 알레르기 질환, 건선, 피부염 공피증, 이식편 대 숙주 질환, 기관 이식 거부, 기관 이식과 관련된 급성 또는 만성 면역 질환, 유육종증(sarcoidosis), 죽상경화증, 파종성 혈관내 응고, 가와사키병(Kawasaki's disease), 그레이브스 병(Grave's disease), 신증후군, 만성 피로 증후군, 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 헨노흐-쉔라인 자반증(Henoch-Schoenlein purpurea), 신장의 미시적 혈관염, 만성 활성 간염, 포도막염, 패혈증성 쇼크, 독소 쇼크 증후군, 패혈증 증후군, 악액질, 감염성 질환, 기생충 질환, 후천성 면역 결핍증, 급성 횡단 척수염, 헌팅턴 무도병(Huntington's chorea), 파킨슨병, 알츠하이머병, 뇌졸중, 원발성 담즙성 간경변, 용혈성 빈혈, 악성 종양, 심부전증, 심근 경색, 애디슨병(Addison's disease), 산발성, 타입 I 다중선 부전(polyglandular deficiency) 및 타입 II 다중선 부전, 슈미트 증후군(Schmidt's syndrome), 성인 (급성) 호흡 곤란 증후군, 탈모증, 탈모증 그레아타(alopecia greata), 혈청반응음성 관절병증(seronegative arthropathy), 관절병증, 라이터병(Reiter's disease), 건선 관절병증, 궤양성 대장염 관절병증, 장병원성 윤활막염(enteropathic synovitis), 클라미디아, 예르시니아 및 살모넬라 관련 관절병증, 척추관절병증, 죽상 질환/죽상경화증, 아토피성 알레르기, 자가면역 수포성 질환, 심상성 천포창, 낙엽상 천포창, 유사천포창(pemphigoid), 선상 IgA 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 쿰즈(Coombs) 양성 용혈성 빈혈, 후천성 악성 빈혈(pernicious anaemia), 소아 악성 빈혈, 근통성 뇌염(myalgic encephalitis)/로얄 프리 질환(Royal Free Disease), 만성 점막 피부 칸디다증, 거세포 동맥염(giant cell arteritis), 원발성 경화 간염, 잠재 자가면역 간염, 후천성 면역결핍증(Acquired Immunodeficiency Disease Syndrome), 후천성 면역결핍 관련 질환, B형 간염, C형 간염, 공통 가변성 면역결핍증(공통 가변성 저감마글로불린혈증), 확장심근병증, 여성 불임증, 난소부전, 조기 난소부전, 섬유성 폐 질환, 잠재 섬유성 폐포염(cryptogenic fibrosing alveolitis), 염증후 간질성 폐 질환, 간질성 폐렴(interstitial pneumonitis), 결합 조직 질환 관련 간질성 폐 질환, 혼합 결합 조직 질환 관련 폐 질환, 전신 경화증 관련 간질성 폐 질환, 류마티스 관절염 관련 간질성 폐 질환, 전신 홍반성 낭창 관련 폐 질환, 피부근염/다발근육염 관련 폐 질환, 쇼그렌병(Sjogren's disease) 관련 폐 질환, 강직성 척추염 관련 폐 질환, 혈관염성 확산 폐 질환, 헤모시데린 침착증(haemosiderosis) 관련 폐 질환, 약물-유도된 간질성 폐 질환, 섬유증, 방사선 섬유증, 폐쇄 세기관지염, 만성 호산구성 폐렴, 림프구 침윤성 폐 질환, 감염후 간질성 폐 질환, 통풍 관절염, 자가면역 간염, 타입-1 자가면역 간염(고전적 자가면역 또는 루포이드 간염), 타입-2 자가면역 간염(항-LKM 항체 간염), 자가면역 매개된 저혈당증, 흑색극세포증(acanthosis nigricans)을 갖는 타입 B 인슐린 내성, 부갑상선저하증, 기관 이식과 관련된 급성 면역 질환, 기관 이식과 관련된 만성 면역 질환, 골관절염, 원발성 경화성 담도염, 타입 1 건선, 타입 2 건선, 특발성 백혈구 감소증, 자가면역 호중성백혈구감소증, 신장 질환 NOS, 사구체신염, 신장의 미시적 혈관염, 라임 질환(lyme disease), 원판상 홍반 루푸스(discoid lupus erythematosus), 특발성 남성 불임증 또는 NOS, 정자 자가면역, 다발성 경화증(모든 아형), 교감성 안염, 결합 조직 질환에 따른 폐동맥 고혈압, 굿파스처 증후군(Goodpasture's syndrome), 결절성 다발성 동맥염의 폐 증상, 급성 류마티스 열, 류마티스 척추염, 스틸병(Still's disease), 전신 경화증, 쇼그렌 증후군, 다카야수병(Takayasu's disease)/동맥염, 자가면역 혈소판감소증, 특발성 혈소판감소증, 자가면역 갑상선 질환, 갑상선 기능항진증, 갑상선종성 자가면역 갑상선 기능저하증(하시모토병(Hashimoto's disease)), 위축성 자가면역 갑상선 기능저하증, 원발성 점액수종, 수정체성 포도막염, 원발성 혈관염, 백반증, 급성 간 질환, 만성 간 질환, 알콜성 간경화, 알콜-유도된 간 손상, 콜레오사타티스(choleosatatis), 특이 간 질환(idiosyncratic liver disease), 약물-유도된 간염, 비-알콜성 지방간성 간염(Steatohepatitis), 알레르기 및 천식, B군 스트렙토콕시(group B streptococci; GBS) 감염, 정신 장애(예를 들면, 우울증 및 정신분열증), Th2 타입 및 Th1 타입 매개된 질환, 급성 및 만성 통증(상이한 형태의 통증) 및 암, 예를 들면, 폐, 유방, 위, 방광, 결장, 췌장, 난소, 전립선 및 직장 암 및 조혈성 악성 종양(백혈병 및 림프종), 아베타리포프로테미아(Abetalipoprotemia), 말단청색증(Acrocyanosis), 급성 및 만성 기생충성 또는 감염성 프로세스, 급성 백혈병, 급성 림프모구 백혈병(acute lymphoblastic leukemia; ALL), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia; AML), 급성 또는 만성 세균 감염, 급성 췌장염, 급성 신부전, 선암종, 주기외심방박동(aerial ectopic beat), AIDS 치매 복합증, 알콜-유도된 간염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 접촉 피부염, 알레르기성 비염, 동종이식 거부, 알파-1-안티트립신 결핍, 근위축성 측삭 경화증, 빈혈, 협심증, 전각 세포 퇴행(anterior horn cell degeneration), 항 cd3 요법, 항인지질 증후군, 항-수용체 과민 반응, 흉부 및 말초 대동맥류, 대동맥 박리, 동맥 고혈압, 죽상경화증, 동정맥루, 실조, 심방세동(지속성 또는 발작성), 심방조동, 방실차단, B 세포 림프종, 골 이식편 거부, 골수 이식(bone marrow transplant; BMT) 거부, 다발 갈래 차단(bundle branch block), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 화상, 심장 부정맥, 심장 기절 증후군(cardiac stun syndrome), 심장 종양, 심근병증, 심폐우회술 염증 반응, 연골 이식 거부, 소뇌 피질 퇴행, 소뇌 장애, 혼돈 또는 다초점 심방빈맥(chaotic or multifocal atrial tachycardia), 화학요법 관련 장애, 만성 골수구성 백혈병(chronic myelocytic leukemia; CML), 만성 알콜중독, 만성 염증성 병리학, 만성 림프성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia; CLL), 만성 폐쇄성 폐 질환(chronic obstructive pulmonary disease; COPD), 만성 살리실레이트 중독, 결장직장 암종, 울혈성 심부전증, 결막염, 접촉 피부염, 폐심장증, 관상 동맥 질환, 크로이츠펠트야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease), 배양물 음성 패혈증, 낭성 섬유증, 사이토킨 요법 관련 장애, 권투선수 치매(Dementia pugilistica), 탈수초성 질환, 뎅기 출혈 열, 피부염, 피부 질환(dermatologic condition), 당뇨병, 진성당뇨병, 당뇨병성 죽상경화성 질환, 광범위 레비소체병(Diffuse Lewy body disease), 확장 울혈성 심근병증, 기저핵의 장애, 중년의 다운 증후군(Down's Syndrome in middle age), CNS 도파민 수용체를 차단하는 약물에 의해 야기되는 약물-유도된 운동 장애, 약물 민감성, 습진, 뇌척수염, 심내막염, 내분비병증, 후두개염, 엡스타인-바 바이러스 감염(epstein-barr virus infection), 지단홍통증, 추체외로 및 소뇌 장애, 가족성 적혈구 포식성 림프조직구 증식증(familial hematophagocytic lymphohistiocytosis), 태아 흉선 이식 거부, 프리이드라이히 운동실조증(Friedreich's ataxia), 기능성 말초 동맥 장애, 진균성 패혈증, 가스 괴사, 위궤양, 사구체 신염, 기관 또는 조직의 이식편 거부, 그램 음성 패혈증, 그램 양성 패혈증, 세포내 유기체로 인한 육아종, 털세포 백혈병, 할러포르텐-스파츠 병(Hallervorden-Spatz disease), 하시모토 갑상선염(hashimoto's thyroiditis), 건초열, 심장 이식 거부, 혈색소침착증, 혈액투석, 용혈 요독 증후군/혈전용해 혈소판감소 자색반병, 출혈, 간염 (A), 히스 다발 부정맥(His bundle arrythmia), HIV 감염/HIV 신경병증, 호지킨병(Hodgkin's disease), 운동과다 운동 장애, 과민 반응, 과민성 폐렴, 고혈압, 운동감소 운동 장애, 시상하부-뇌하수체-부신축 평가(hypothalamic-pituitary-adrenal axis evaluation), 특발성 애디슨병(Addison's disease), 특발성 폐 섬유증, 항체 매개된 세포독성, 무력증, 유아성 척수성 근육위축, 대동맥의 염증, 인플루엔자 a, 이온화 방사선 노출, 홍채섬모체염/포도막염/시 신경염, 허혈-재관류 손상, 허혈성 쇼크, 소아 류마티스 관절염, 소아 척수 근위축증, 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 신장 이식 거부, 레기오넬라, 리슈만편모충증, 나병, 피질척수계 병변, 지방부종, 간 이식 거부, 림프부종, 말라리아, 악성 림프종, 악성 조직구증, 악성 흑색종, 수막염, 수막구균혈증, 대사성/특발성, 편두통, 미토콘드리아 다발적 전신 장애(mitochondrial multisystem disorder), 혼합 결합 조직 질환, 모노클로날 감마글로불린병증, 다발성 골수종, 다발성 계통 퇴행(multiple systems degeneration)(멘셀 데제린-토마스 시-드라거 및 마카도-조셉(Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager and Machado-Joseph)), 중증근육무력증, 마이코박테리움 아비움 인트라셀룰라레(mycobacterium avium intracellulare), 결핵균, 골수이형성 증후군, 심근경색, 심근 허혈성 장애, 코인두 암종, 신생아 만성 폐 질환, 신장염, 신장증, 신경변성 질환, 신경성 I 근위축증, 호중구감소성 발열, 비-호지킨 림프종, 복부 대동맥 및 이의 가지의 폐색, 폐색성 동맥 장애, okt3 요법, 고환염/부고환염, 고환염/장관절제술 복원 처치(vasectomy reversal procedure), 장기 종대(organomegaly), 골다공증, 췌장 이식 거부, 췌장 암종, 부신생물 증후군/악성종양의 고칼슘혈증, 부갑상선 이식 거부, 골반염 질환, 통년성 알레르기비염, 심장막 질환, 말초 죽상경화성 질환, 말초 혈관 장애, 복막염, 악성 빈혈, 폐포 자충 폐렴, 폐렴, POEMS 증후군(다발신경병증, 장기 종대, 내분비병증, 모노클로날 감마글로불린병증 및 피부 변화 증후군), 관류후 증후군(post perfusion syndrome), 펌프후 증후군(post pump syndrome), MI 심장절개후 증후군, 자간전증, 진행성 핵상 마비, 원발성 폐동맥 고혈압, 방사선 요법, 레이노 현상 및 질환(Raynaud's phenomenon and disease), 레이노병(Raynoud's disease), 레프섬병(Refsum's disease), 규칙적인 좁은 QRS 빈맥, 신장혈관 고혈압, 재관류 손상, 제한 심근병증, 육종, 공피증, 노인성 무도병, 레비소체 타입 노인성 치매, 혈청반응음성 관절병증, 쇼크, 겸상적혈구 빈혈, 피부 동종이식 거부, 피부 변화 증후군, 소장 이식 거부, 고형 종양, 특이 부정맥, 척수성 운동실조증, 척수소뇌 변성, 스트렙토코커스 근육염, 소뇌의 구조적 병변, 아급성 경화성 범뇌염, 실신, 심혈관계의 매독, 전신 아나필락시스, 전신 염증 반응 증후군, 전신적으로 발생된 소아 류마티스 관절염, T-세포 또는 FAB ALL, 모세혈관확장증, 폐쇄성 혈전혈관염, 혈소판감소증, 독성, 이식, 외상/출혈, 타입 III 과민 반응, 타입 IV 과민성, 불안정한 협심증, 요독증, 요로성 패혈증, 두드러기, 판막성 심장 질환, 정맥류, 혈관염, 정맥 질환, 정맥 혈전증, 심실세동, 바이러스 및 진균 감염, 바이러스성 뇌염/무균 수막염, 바이러스-관련 혈구포식 증후군, 베르니케-코르사코프 증후군(Wernicke-Korsakoff syndrome), 윌슨병(Wilson's disease) 및 기관 또는 조직의 이종이식 거부를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
비-치료학적 용도
본 발명의 조성물은 또한 비-치료학적 용도, 즉 시험관내 목적으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 단백질 분말 및 관련 조성물은 유전체학, 단백질체학, 생물정보학, 세포 배양, 식물 생물학 및 세포 생물학에서의 사용을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 의학 및 생명공학에서 진단적 또는 실험적 방법에 사용될 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 조성물은 표지화 및 검지 방법에서 분자 프로브로서 요구되는 단백질을 제공하는데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 조성물에 대한 추가의 용도는 제조 목적을 위한 세포 성장 및 단백질 생산을 포함한, 세포 배양 시약용 보충제를 제공하는 것이다.
고농도의, 예를 들면, 항체를 함유하는 조성물이 실험실 용도를 위한 시약으로서 사용될 수 있다. 이러한 매우 농축된 형태의 항체는 실험실 실험의 현재의 한계를 확장시킬 것이다.
본 발명의 제형에 대한 또 다른 대안적인 용도는 식품에 첨가제를 제공하는 것이다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 조성물은 필수적으로 단백질 및 당으로 이루어지기 때문에, 이들은 고농도의 목적하는 단백질, 예를 들면, 영양 보충제를 식품에 전달하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 고농도의 단백질을 제공할 수 있다.
제품
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명의 단백질 분말 또는 관련 조성물을 함유하고 이의 사용을 위한 지침서를 제공하는 제품이 제공된다. 하나의 양태에서, 제품은 용기를 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들면, 하나 이상의 병, 바이알(예를 들면, 이중 챔버 바이알), 시린지(단일 및 이중 챔버 시린지 포함), 시린지를 함유하는 자동주사기 팬 및 시험 튜브를 포함한다. 용기는 각종 재료, 예를 들면, 유리, 플라스틱 또는 폴리카보네이트로부터 형성될 수 있다. 용기는 수성 제형을 보유하며, 용기 위의 또는 용기와 결합된 라벨이 사용법을 나타낼 수 있다. 예를 들면, 라벨은 조성물이 피하 투여에 유용하거나 피하 투여용으로 의도됨을 가리킬 수 있다. 라벨은, 예를 들면, 사용자가, 예를 들면, 주사에 의한 투여용 조성물을 제조하기 위해 액체, 예를 들면, 멸균수 또는 염수를 첨가하도록 가리킬 수 있다. 조성물을 보유하는 용기는, 예를 들면, 수성 제형의 반복 투여(예를 들면, 2 내지 6회 투여)를 가능케 하는 다용도 바이알일 수 있다. 제품은 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제품은 기타의 완충제, 희석제, 필터, 니들, 시린지 및 사용 지침서가 있는 포장 인서트를 포함한, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다음 재료를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 하기의 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이것은 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
당해 실시예에서, IgG 분자의 Fab 단편을 분무 건조시키고 분석하였다. 당해 연구의 영역은 저장 중간체로서 사용하기 위해 의도되는 바와 같이 높은 수율과 우수한 저장 안정성을 갖는 Fab 단편을 분무 건조시키기 위한 적합한 제형 및 가공 조건을 찾아내는 것이다. 분무 건조 공정 및 후속적인 저장 동안의 단백질의 안정화는 상이한 당의 첨가에 의해 달성되었다. 당해 연구의 경우, 트레할로즈, 수크로즈 및 소르비톨을 액체 단백질 농축물에 첨가하였다. 단백질 안정성은 각종 분석 방법, 이들 중에서 크기 배제 크로마토그래피, 동적 광 산란, 탁도 측정 및 등전성 집속(Isoelectric Focusing)으로부터의 데이터를 사용하여 분석하였다.
재료
MAK 195 F 농축물
당해 실시예에서 사용되는 단백질은 MAK 195 F(12.4mg/mL); NaCl(8.77mg/mL); Na3PO4(1.64mg/mL); 플루로닉® F68(0.1mg/mL); 및 물(q.s.)을 함유하는 수용액으로서 애보트 라보라토리즈(Abbott Laboratories)에 의해 제공된 아펠리모마브(MAK 195 F)이었다. MAK 195 F 농축물은 pH가 7.2이고 등장성(약 286mosmol/kg)에 가깝다. 이것은 0.981mPas의 점도(Schott Ubbelohde 점도계로 측정함) 및 1.0086g/cm3의 밀도(DMA 46(제조원; Chempro)으로 측정함)를 갖는다.
아펠리모마브 단백질은 대략적인 분자량이 100킬로달톤(kDa)인 쥐 항-TNF-알파 항체(IgG3)의 F(ab')2 단편이다. 이것은 각각 214개 아미노산을 포함하는 경쇄 및 233-241개 아미노산을 함유하는 중쇄를 야기하는 IgG3 모노클로날 항체의 펩신 분해에 의해 생산된다. Fd' 단편의 대략 30%는 SerH222에서 글리코실화된다. 상이한 글리코실화 패턴 때문에, 아펠리모마브는 7.5 내지 8.8의 등전점(isoelectric point; IEP)에서 7개 이하의 동종체(isoform)를 갖는다.
농축물은 드라이 아이스 하에서 약 400g의 양으로 수득되었다. 반복된 동결-해동-사이클 및 액체 상태에서의 장시간 저장을 피하기 위해, 농축물을 해동시키고 40-50mL 분획으로 분취하여 -80℃에서 저장하고 사용 전에 새로 해동시켰다.
부형제
3개의 상이한 당을 단백질을 안정화시키는데 사용하였다: D-소르비톨(제조원; Sigma, 제품: S-7547, 로트: 108H01461); 수크로즈(제조원; Sigma, 제품 S-7903, 로트 014K0010); 및 D-(+) 트레할로즈 디하이드레이트(제조원; Sigma, 제품: T5251, 로트: 113K3775).
모든 수용액은 이중-증류수(Fi-stream 4BD; Fisons)로 제조하였으며, 필요에 따라, 0.2㎛ 막 필터(제조원; Schleicher & Schuell)를 통해 여과시켰다.
방법
분무 건조
분무 건조 실험은 분말 회수를 위해 고성능 사이클론(1)을 사용하여 Buchi 미니-분무 건조기 B-191(도 1) 상에서 수행하였다. 건조 공기를 가열 장치(3) 및 건조 챔버에 도입하기 전에 800ℓ/분의 풍량(90% 흡인기 분말)에서 Luwa 한외여과기(2)(섬유 유리; 필터클래스: HEPA H13 고효율 입자 흡수체)를 통해 여과시켰다. 모든 액체 공급물은 연동 펌프(5)(QLF= 약 3mL/분; 실리콘 튜브 ø= 3mm)에 의해 건조 챔버(4)로 수송하기 전에 0.22㎛ 필터 유니트를 통해 여과시켰다. 분무화는 인-하우스 공급기(in-house supply)(QAA = 700ℓ/h)로부터 압축 공기를 사용하여 2개의 유체 노즐(6)(오리피스 직경 : 0.7mm)에 의해 수행하였다. 두 개의 유체 노즐에는 또한 압축 공기(4.5bar)를 사용하는 자동 세정 시스템 및 수냉 시스템이 장착되어 있다. 분무 건조 후, 생성된 분말을 건조 공기 글로브 박스(RH < 2%) 속에서 수집 용기(7)로부터 회수하고, 유리 바이알(클로로부틸 고무 마개)에 충전하고, 파라필름으로 밀봉하여 -80℃에서 저장하였다. 분말 수율은 수집 용기 내부의 분말 양을 액체 공급물 중의 총 고체로 나눈 것으로서 정의하였다. 사이클로 내부의 분말 침착물은 수집하지 않았다.
크기 배제 크로마토그래피(SEC)
크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 가용성 응집물을 검출하였다. 애머삼 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences)에서 구입한 트리콘 수퍼로즈(Tricorn Superose) 12/300 GL 컬럼(분리 범위 1-300 kDa)을 시리즈 200 LC 펌프, ISS 200 오토샘플러 및 235C 다이오드 어레이 검출기를 포함하는 퍼킨 엘머 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)에 연결하였다. 수퍼로즈 컬럼 이전에, 조립자(coarse particle)로의 오염을 피하기 위해 페노메넥스 보안 경비 예비-컬럼(phenomenex security guard pre-column)(AJ0-4489 카트리지로 하전)을 설치하였다. 이동상(완충액 A, 유량: 0.5mL/분)은 염화나트륨(0.5mol/l)을 첨가한 인산칼륨 완충액(pH 6.9)이며, 0.2㎛ 막 필터(제조원; Schleicher&Schuell, FP 30/0.2 CA)를 통해 여과하고, 헬륨을 사용하여 약 10분 동안 탈기시켰다. 모든 샘플은 직접 측정하거나(예를 들면, 액체 공급물), 1mg/mL의 단백질 농도로 되도록 완충액 A로 주의해서 재용해시키고(분무 건조된 (sd) 분말), 제조 직후에 분석하였다. 1회 수행당 주사 용량은 100㎕이며, 재현성있는 결과를 보장하기 위해 일반적으로 모든 샘플은 2회(액체 공급물) 또는 3회(sd 분말) 측정하였다. 모든 크로마토그램은 퍼킨 엘머 토탈크롬 네비게이터 소프트웨어(Perkin Elmer TotalChrom Navigator software), 버젼 6.2를 사용하여 수동으로 통합하였다.
시차 주사 열량계(Differential Scanning Calorimetry; DSC)
열 이벤트(thermal event)는 Mettler Toledo DSC 822e를 사용하여 조사하였다. 분말 5 내지 15mg을 건조-공기 상태하에서(글로브 박스) 알루미늄 팬에 칭량하였다(Mettler, AT DeltaRange®). 알루미늄 팬을 냉간-밀봉시키고, 열량계에 삽입하며, 여기서, 이들은 예상된 Tg(가열/냉각 속도: 10℃/분)를 통해 가열 및 냉각의 정의된 온도 프로그램(제형에 따라)에 노출되었다. 가열 단계 동안의 흡열성 전이의 중간점으로서 사전에 정의된 유리 전이 온도는 Mettler STARe 소프트웨어 V 6.10으로 추정하였다. 기타의 비가역적인 흡열성 이벤트의 간섭을 피하기 위해 단지 2차 및 3차 가열 사이클만을 고려하였다. 실험 전반에 걸쳐, 측정 셀을 건조시키고 N2 가스로 퍼징시켰다.
광각 X선 회절(Wide-Angle X-Ray Diffraction; WAXD)
분말의 결정화도는 40kV/40mA 및 25℃에서 Cu Kα 방사선(λ = 0.15418mm)으로 Philips model X`pert MPD를 사용하여 x선 분말 회절에 의해 조사하였다. 60 내지 80mg의 분말 양을 알루미늄 샘플 홀더에 충전하고 즉시 스캐닝하였다. 모든 스캔은 0.02°/s의 스텝 크기로 2θ = 0.5°- 40°의 범위에서 측정하였다. 샘플 결정화도(결정화 정도)는 블랙 및 로버링(Black and Lovering)의 방법을 기초로 한 방법을 사용함으로써 회절 다이아그램(아래 참조)의 결정형 및 무정형 면적으로부터 계산하였다[문헌 참조; Black, Lovering Journal of Pharmacy and Pharmacology 29:684-687 (1977)].
C = Ic/(Ic + Ia) = AUCcrystalline / AUCtotal = (AUCTotal-AUCamorphous)/AUCTotal
C는 결정화도(때때로 100을 곱할 경우, 결정화도(%)라고도 기재함)이고, Ic 및 Ia는 각각 피크 및 광역 헤일로(broad halo)의 곡선 아래 면적(area under the curve; AUC)과 동일한 결정형 또는 무정형 영역에 의해 산란된 X선의 강도를 나타낸다. AUCamorphous는 다이아그램으로부터 결정형 피크를 절단하고 곡선 피팅을 사용함으로써 계산하였다.
동적 광 산란
동적 광 산란(DLS) 측정은 가용성 뿐만 아니라 불용성 응집물을 검출하기 위해 Zetasizer Nano ZS(제조원; Malvern, Germany, 소프트웨어: DTS 버젼: 4.2)를 사용하여 수행하였다. 제타사이저(Zetasizer)는 633nm의 레이저 광을 사용하고, 173°에서의 산란을 검출한다(후방 산란 검출). 이것은 크기 측정을 위해 0.6 내지 6000nm의 측정 범위를 갖는다. 입자 크기는 샘플에서의 입자의 브라운 운동을 측정함으로써 결정하였다. Malvern 기기: 제타사이저 나노 시리즈 사용자 메뉴얼. MAN 0317, 이슈 2.0, 2004년 3월. 액체 제형은 첨가제 없이 시험하였으며, 분말을 원래의 단백질 농도로 되도록 이중-증류수(0.2㎛를 통해 여과함)로 희석시켰다. 저용적 큐벳(1회용 저용적 큐벳, 제조원; Malvern)을 사용함으로써, 측정당 단지 0.5mL의 용액이 요구되었다. 2mL 큐벳을 사용한 시험이 동일한 결과를 제공하였다(데이터는 나타나 있지 않음). 2분간의 평형 시간(25℃) 후, 각 샘플의 3회 측정을 각각 5회 수행으로 실시하였다(수행 지속시간: 30s, 수행 사이의 지연: 2s). 이러한 과정은 모든 분말/용액 샘플에 대해 3회 실시하였다. 생성된 다이아그램을 스코어 표로서 익스포트하고 MS 엑셀을 통해 다이아그램으로 변환시켜 크기-용적 및 크기-강도 분포를 보여주는 샘플당 3개의 플롯팅된 곡선을 생성한다.
주사 전자 현미경(Scanning Electron Microscopy; SEM)
입자 크기 및 형태는 20kV에서 Amray 1810 T 주사 전자 현미경을 사용하여 전자 현미경 사진을 통해 조사하였다. 작은 분말 샘플을 자가-접착 필름을 사용하여 Al 샘플 스터브(G301, 제조원; Plano) 위에 고정시켰다. 20mA/kV(Hummer JR Technics)에서 1.5분 동안 Au로 스퍼터링시킨 후, 샘플을 현미경 아래에 위치시키고, 상이한 배율(통상적으로 1000x, 2000x 및 3000x)의 사진을 촬영하였다. 일반적으로, 3000x의 배율에서 촬영한 사진을 평가하였다.
칼 피셔 적정법(Karl Fischer Titration)
분무 건조된(sd) 분말의 수분 함량은 미쓰비시(Mitsubishi) 수분 미터(CA-06 Coulometric) 및 미쓰비시 물 기화기(VA-06)로 측정하였다. 대략 70mg의 분말 샘플을 건조-공기 조건(글로브 박스) 하에서 특수 샘플 홀더에 충전하였다. 빈 샘플 홀더를 Mettler AT DeltaRange 분석용 천칭으로 칭량하였다. 샘플 홀더를 기화기 유니트에 연결함으로써, 가열된 오븐 유니트로 당겨져 있는 유리 보트(glass boat)에 분말을 충전하였다. 물을 기화시키고(150℃) 질소 가스 스트림(약 200mL/분)을 통해 적정 셀로 정량적으로 옮기면서, 샘플 홀더를 재칭량하여 실제 샘플 중량을 계산하였다. 적정은 ≤ 0.01㎍ H2O/분의 적정 속도로 시작하였다.
육안으로 볼 수 있는 것보다 작은 입자(Sub-Visible Particle)
예를 들면, 재용해된 sd 분말의 입자 오염을 컴퓨터-지원 입자 계수 장치 시린지(제조원; Klotz, Germany, 소프트웨어: SW-CA 버젼 1.2)로 관찰하였다. 액체를 레이저의 앞에서 250㎛의 직경으로 감소된 관류 셀(flow-through cell)을 통해 빨아들였다. 입자가 레이저 빔에 의해 부딪히는 경우, 이들의 검출된 강도가 감소하였다. 레이저 광의 감쇠(attenuation)가 입자 크기의 지표이었다. 모든 분말을 이중-증류수(0.2㎛를 통해 여과시킴)로 원래의 농도로 되도록 재구성하고, 0.8mL 용액을 시스템을 통해 펌핑시켰다(시스템을 수세하기 위해 1회, 입자 계산을 위해 3회). 결과를 용액 1mL에 대해 계산하였다. 약제학적 용도를 위해, 소프트웨어는 미국 약전(the United States Pharmacopoeia; USP) 또는 유럽 약전(the European Pharmacopoeia; Ph. Eur.)의 규정에 따라 8개의 상이한 크기 범위(1 내지 50㎛)로 입자를 등급화하였다.
등전성 집속(IEF)
아펠리모마브의 IEF 분리는 Fd' 단편 및 경쇄 변이체의 전하 차를 기초로 하였다. 이것은 주로 아펠리모마브를 위한 확인 시험(identity test)으로서 작용하지만, 안정성 시험을 위한 기구로서 사용될 수도 있다. 집속은 Serva Blue Power 3000 전력 공급기에 부착된 Pharmacia Multiphor II 챔버로 수행하였다. pH 구배가 6 내지 9인 즉시 사용가능한 겔(ready-to-use gel)(Servalyt Pr ecotes 6-9, 125x125mm, 두께 0.3mm; 제조원: Serva, Germany)을 냉각 플레이트(4℃, 열 전달 매체로서 몇몇 Bayol F로 덮혀있음) 위에 두었다. 모든 샘플을 약 4mg/mL의 단백질 농도로 되도록 희석시키고, 10㎕를 겔 위에 두었다. 집속 프로그램은 200V에서 시작하며, 약 195분이 소요되었다(종점 전압 2000V). 20분 동안 고정한 후, 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue)(20분)로 염색한 다음 수회 탈염색시켰다. 사용된 용액이 아래 표 1에 열거되어 있다.
Figure pct00003
물로 세정하고 실온에서 밤새 건조시킨 후, 겔을 검사하고 ProViDoc® 소프트웨어(버젼 3.20)가 있는 Desaga CAB UVIS VD 40 워크스테이션을 사용하여 스캐닝하였다.
탁도
탁도는 빛이 샘플을 통해 직선으로 투과되기 보다는 산란되고 흡수되도록 하는 광학 특성의 표현이다. 이것은 고체, 콜로이드 및 가스 버블을 포함한 현탁된 입자에 의해 야기될 수 있다. 탁도는 잘-정의된 파라미터는 아니기 때문에, 샘플을 유백광 표준(opalescence standard), 예를 들면, 하이드라진 겔과 비교함으로써 측정하였다. Hach Ratio XR 탁도계를 사용하여 샘플의 비탁 탁도 단위(nephelometric turbidity unit; NTU)를 추정하였다. 탁도계를 하이드라진 표준으로 검량하였다. Nessler-튜브의 블랭크-값을 측정한 후, 샘플을 원래의 단백질 농도로 되도록 이중-증류수(0.2㎛를 통해 여과시킴)로 희석시키거나 재구성한 다음 광 빔에 두었다. 유리 불균일성의 영향을 배제하기 위해 블랭크 측정 동안 튜브의 방향을 표시하고 튜브를 샘플 측정과 동일한 방향으로 사용하는 것이 중요하다.
착색
재용해된 sd 분말의 착색의 변화를 검출하기 위해, LICO 400(제조원; Hach Lange, Switzerland)을 사용하였으며, 이는 투명 액체의 색 측정을 위한 비색계이다. 이것은 샘플에 가장 가까운 기준 용액을 결정하고 샘플과 기준물 사이의 색 변화를 정량한다. 이러한 연구에서, 휘도(L, 흑색-백색) 및 색상(±a, 적색-녹색; ±b, 황색-청색)의 좌표로서 색을 정의하는 CIE-Lab 색 공간을 사용하였다(CIE는 Commission Internationale d`Eclairage의 약자이다). LICO 400을 Ph. Eur.로부터의 표준 용액을 사용하여 검량하였다(BG 5-7, 갈색을 띤 황색, 희석됨; B 5-9, 갈색). 모든 분말 샘플을 원래의 농도로 되도록 재구성하고, 200㎕를 소용적 석영 유리 큐벳에 충전하였다.
UV-분광분석법
농축물 또는 한외여과된 분취액의 단백질 농도를 측정하기 위해, Perkin Elmer Lambda 25 UV/VIS 분광기를 사용하였다. 샘플을 대략 0.6mg/mL의 단백질 농도로 되도록 희석시켰다. 3개의 석영 유리 큐벳을 샘플 용액으로 충전하고, 이들 각각을 파장(λ) = 280nm 및 λ = 320nm에서 3회 측정하였다. 흡광도 값(UV WinLab 5.0 소프트웨어(제조원; Perkin Elmer)에 의해 제공됨)을 사용하여, 다음의 방정식을 사용하여 단백질 농도를 계산하였다.
Figure pct00004
이러한 방정식에서, F는 희석 계수(dilution factor)이고, A는 측정된 흡광도이고, ε는 몰 흡광 계수(1cm 큐벳을 사용한 1mg/mL 용액의 흡광도)이고, V는 제1 희석 단계에서의 용적을 나타낸다.
교차 유동 여과(Cross Flow Filtration)
보다 농축된 아펠리모마브 용액을 달성하기 위해, 농축물을 Millipore Labscale® TFF 시스템을 사용하여 한외여과시켰다. 원래의 아펠리모마브 농축물을 분자량 컷 오프(molecular weight cut off; MWCO)가 30kDa인 필터 장치를 따라 영구히 펌핑시켰다. 단백질을 제외한 모든 성분들을 막을 통해 통과시키고, 외부 용기에 수집하였다. 단백질 자체는 순환 유동(circular flow)으로 되돌렸다. 전류 농도는 용적 스케일에 의해 대강 추정할 수 있다. 정확한 단백질 농도는 UV-분광분석법을 사용하여 여과 공정이 중단된 후 계산하였다.
결과
MAK 농축물의 특성화
새로 해동한 농축물은 통상적으로 약 0.9 내지 1%의 응집을 나타내며(분취액들 간의 차이가 있을 수 있으므로 모든 분취액은 해동 직후 SEC를 통해 실험하였다) 검지 가능한 단편화는 나타내지 않았다. 분자량 마커 키트(탄산 탈수효소, 분자량(Mr)=29kDa 및 β-아밀라제, Mr=200 kDa)를 사용한 실험에 따르면, 응집물은 주로 이량체이었다. DLS 다이아그램은 단량체가 약 10nm의 유체역학적 직경을 갖는 것을 보여주었다. 농축물은 육안으로 볼 수 있는 것보다 작은 입자 오염이 비교적 낮고 대략 5 NTU의 탁도 값을 나타내었다. 5개의 동종형의 전형적인 IEF 밴드 패턴이 보였다. 모든 추가의 IEF 실험에서, 순수한 농축물이 마커/표준으로서 사용되었으므로, 차이가 직접 검지되었다.
착색 측정에서, 농축물은 표준 용액 B9에 가장 가까웠는데, 이것은 약간의 갈색이 섞인 거의 무색 용액이었다. 농축물은 1.009g/cm3의 밀도 및 0.981mPas의 점도(둘 다 20℃에서 측정)를 가졌다.
MAK 농축물의 분무 건조
제1 분무 건조 실험은 추가의 안정화제를 함유하지 않는 순수한 농축물을 사용하여 이루어졌다. 건조 공정 동안의 단백질 손상 정도를 측정하였다.
MAK의 공정 안정성
단백질이 분무 건조 공정 동안 무엇을 겪는지를 측정하기 위해, 제1 실험에 대한 공정 파라미터를 Buchi 191에서의 현행 연구로부터 채택하여(예를 들면, Maury: Tin =130℃, QLF = 약 3 mL/분, QAA = 700ℓ/h, QDA = 800ℓ/분) 대략 80℃의 Tout을 야기하였다[문헌 참조; Maury et al., Eur. Journal of Pharm. and Biopharm. 59(3): 565-573 (2005)].
생성된 백색 분말(사이클론 수율: 약 60%)은 13㎛ 이하의 직경을 갖는 구형, 도넛형 또는 톱니형 입자로 구성되었다. 재용해된 분말(22.9mg 분말/mL 물)은 12 내지 13mg/mL의 단백질 농도를 갖는데, 이것은 분말의 손실이 분무 건조 공정 및 사이클론의 분리 성능에 의해 유발되었음을 시사한다. 분무 건조 후의 무정형 상태 때문에 단백질 용액으로부터의 단백질 또는 부형제의 우선적인 손실은 검지할 수 없었다. sd MAK 농축물의 X-선 회절 다이그램은 벌크 약물 물질의 다른 성분(예를 들면, 인산나트륨 및 염화나트륨)에 의해 야기되는 결정질 피크를 보여주었다. 피크 패턴은 sd 염화나트륨의 패턴에 매우 가까웠다. 분말의 잔류 수분 함량은 1.4 내지 2%이었으며, 공정 동안의 주위 조건(건조 공기의 RH, 실온 등)에 따라 좌우된다.
SEC에서, 재용해된 분말은 응집에 있어서 뚜렷한 증가(2.5 내지 3%)를 보였다. 그러나, 이것은 안정화제가 없는 단백질 용액에서보다 많진 않았다. 모리(Maury)는 분무 건조된, 투석된 IgG 용액의 경우 17% 이하임을 밝혀냈다[문헌 참조; Maury et al., Eur. Journal of Pharm. and Biopharm. 59(2):251-261 (2005)]. 이것은 단편이 전장 항체보다 분무 건조 동안 덜 민감하지만 이것이 동결-해동-유도된 응집에 대해서는 그렇지 않음을 나타낸다[문헌 참조; Wang et al., Journal of Pharm. Sci. 96(1):1-26 (2007)]. 또 다른 가능성은 염화나트륨의 존재에 의해 야기되는 안정화 효과가 있다는 것이다. 아라카와 등(Arakawa et al.)은 용액 중의 단백질과 염화나트륨 사이의 안정화 상호작용을 경험하였다; 그러나, 이들은 단지 여기서 사용되는 것보다 높은 염 농도를 조사하였다[문헌 참조; Arakawa et al., Biochemistry 21:6545-6551 (1982)]. 응집 증가는 DLS 및 IEF 결과에서도 보였다.
등전성 집속 동안, 집속의 출발 시점에서 새로운 밴드가 출현하였다. 이것은 겔로 침투할 수 없고 따라서 이들의 등전점에 따라 이동할 수 없는 큰 응집물에 기인할 수 있다(Serva GmbH에 따름, 이들의 IEF 겔의 기공은 약 200 내지 300kDa의 컷-오프를 가짐). DLS 결과는 ㎛-크기에서 추가의 피크를 보여주었다. 피크는 크기-용적 분포에서 보기는 어렵지만 크기-강도 분포에서는 분명하였다. 소수의 큰 입자는 다수의 작은 입자보다도 훨씬 더 많은 빛을 산란시키는데, 그 이유는 입자의 산란 강도가 이의 직경의 6제곱에 비례하기 때문이다[문헌 참조; Malvern Instruments: Zetasizer Nano Series User Manual. MAN 0317, Issue 2.0, March 2004]. 추가의 피크가 외관상 단백질에 의해 야기되는데, 그 이유는 플라시보 농축물(placebo concentrate)을 사용한 DLS 실험은 수력학적 직경의 피크를 나타내지 않았기 때문이다. 이러한 큰 응집물은 SEC에서 보이지 않았기 때문에 이들은 불용성임에 틀림없다. 재용해된 분말의 입자 오염은 모든 입자 분획 전반에 걸쳐 증가하였다. 그러나, 실험실 분무 건조기에서의 공정은 (입구 건조 공기를 여과시키더라도) 입자 오염을 완전히 배제시킬 수 없다. 추가로, 샘플을 채취하기 위해 바이알을 개방하는 것 또한 입자 공급원일 수 있다. 더욱이, 재용해된 분말의 탁도는 농축물에 비해 상당히 증가하였다(농축물: 5 NTU; 농축물 sd: 118 NTU).
적당한 Tin 찾기
130℃의 Tin가 아펠리모마브 단백질을 분무 건조시키는데 적합한지를 찾아내기 위해, 상이한 온도를 사용한 실험 시리즈를 수행하였다. 이러한 시리즈를 위한 QLF = 약 3mL/분에서의 Tin 및 야기된 Tout가 표 2에 열거되어 있다. 의도는 건조 효율 및 단백질 공정 안정성 사이의 만족스러운 절충안을 찾기 위한 것이었다.
Figure pct00005
180℃ 입자가 100℃ 입자보다 조금 더 주름지지만, 차이가 매우 경미하다는 것을 제외하고는 입자 형태에 있어서 차이가 관찰되지 않았다. 물 함량은 Tin이 증가함에 따라 감소하는 경향이 있으며, 100℃ 내지 130℃ 사이에서 상당한 하향 단계를 갖는다. 검지할 수 있는 응집에 있어서의 상당한 차이는 없었으며, 이에 따라 응집이 매우 온도 의존적인 것으로 보이지는 않았다. 분말 수율은 보다 높은 온도에서 약간의 개선을 나타내었다. 이러한 모든 결과는 높은 Tin의 사용을 권장하지만, 등전성 집속(IEF) 및 동적 광 산란(DLS) 결과는 아펠리모마브에 대해 적합한 Tin은 중간 범위에 있음을 나타내었다. IEF에서의 응집 밴드(aggregation band)의 강도는 건조 공기 입구 온도에 대해 직선으로 의존적이었다. 또한, DLS 다이아그램은 180℃에서 열등한 결과를 보여주었다. 단량체 피크는 보다 높은 수력학적 직경(약 16nm)에서 나타났다. 응집물은 IEF에서 추정되는 바와 같이 보다 다수인 것으로 보일 뿐만 아니라 더 컸다. 더욱이, 단량체 피크는 형태(보다 작은 분포 쪽으로) 및 크기가 바뀌는데, 이것은 단백질에 대한 상당한 손상을 나타낸다. 입자 오염은 180℃에서, 특히 작은 입자 분획(<15㎛)에서 더 높았다. 이러한 결과에 따르면, 단지 130℃ 및 155℃가 추가의 조사를 위해 허용 가능한 것으로 간주될 수 있다. 이러한 두 개의 입구 온도에 대한 결과가 유사하기 때문에 130℃의 Tin이 선택되었다. 이러한 온도에서의 작동은 제품 품질에 대한 전반적으로 허용 가능한 결과를 제공하면서 단백질에 대한 열 응력을 최소화시킬 것이다.
응집의 공급원
분무 건조 공정은 단백질에 대한 불활성의 다수의 공급원을 포함한다. 일부는 제형을 부형제로 개질시킴으로써 감소될 수 있는 반면, 불활성화의 다른 공급원은 영향을 받지 않을 수 있다. 공정 동안의 응집의 증가는 명백히 단일 응력 인자에 기인할 수는 없다. 정확한 Tin, 여기서는 약 130℃를 선택함으로써 열 응력을 어느 정도로 조절할 수 있다. 불가피한 응력 정도를 찾아내기 위해, 다음의 실험을 수행하였다.
연동 펌프의 영향
응집에 대한 연동 펌프의 전단 응력의 영향을 정량하기 위해, SEC를 사용하였다. 10mL의 아펠리모마브 농축물을 액체 공급물로서 사용하였다. 샘플을 튜빙(tubing) 및 Buchi B-191의 연동 펌프를 통해 펌핑시키고, 두 개의 유체 노즐로 도입되기 직전에 수집하였다. 액체 공급물을 펌핑 공정 전 및 후에 시험하였다. 응집에 있어서의 변화는 인지되지 않았다. 실험실용 분무 건조기의 연동 펌프는 아펠리모마브 단백질의 응집에 영향을 미치거나 증가시키지 않는 것으로 추정할 수 있다. 브레난 등(Brennan et al.)[문헌 참조; Diabetes 34, 353-359 (1985)]에 의해 관찰된 펌프 유도된 인슐린 응집은, 단지 장기간 펌핑 후 인슐린이 용액으로부터 나올 경우에 발생하였다. 당해 연구에서 튜빙을 통해 통과하는데 기껏해야 단지 수 분이 소요되기 때문에 손상 위험은 매우 작다.
분무화 공정의 영향
분무화 동안의 전단 응력의 정도를, 두 개 샘플의 농축물(2mL)을 분무화시킨 후 SEC 및 IEF를 통해 시험함으로써 시험하였다. IEF에서, 샘플들 간의 차이는 관찰되지 않았다(추가의 밴드 또는 밴드 패턴의 변화 없음). SEC 결과는 응집에 있어서의 약간의 증가를 나타내었다. 이러한 증가는 전체 분무 건조 공정 동안 만큼 높지는 않았다. 따라서, 응집의 작은 부분이 분무화에 의해 유도되지만, 마 등(Maa et al.)이 추정한 바와 같이, 단백질 손상은 전단력 뿐만 아니라 큰 공기/액체 계면의 결과일 수 있는 것으로 결론지을 수 있다[문헌 참조; Maa et al., Biotechnology and Bioengineering 54(6):503-512 (1997)].
열 응력의 영향
단백질은 열에 민감한 물질이지만, 모든 단백질이 열 응력에 동일하게 민감한 것은 아니다. 아펠리모마브 농축물이 온도(열 응력)로부터 얼마나 견딜 수 있는지를 측정하기 위해, 소량의 단백질 용액을 상이한 기간에 걸쳐 상이한 온도에 노출시켰다. 농축물의 안정성에 대한 기준은 SEC-데이터, IEF 결과 및 용액의 광학적 외관이었다. 응고가 나타난 후, 실험을 종료하였다. 결과가 아래 표 3에 나타나 있다.
Figure pct00006
농축물은 약 60℃보다 높은 온도는 견디지 못했다. IEF 겔에서, 탁도의 발생은 출발점에서의 추가의 밴드의 출현을 수반하였다. 원래의 밴드 패턴의 표백은 가용성 단백질의 손실을 나타낸다. 가용성 단백질의 손실은 또한 SEC-파일에서도 검출되었다. 단량체 피크는 온도 및 시간이 증가함에 따라 작아졌다(세로좌표 비례축소(ordinate scaling)). 40℃는 24시간에 걸쳐 적용하더라도 아펠리모마브 농축물에 영향을 미치지 않았다. 단백질의 열 응력 손상은 응력의 증가에 의해서가 아니라 단편의 출현에 의해 나타났다. 응집 피크는 거의 변하지 않았다. 따라서, 농축물에 적용된 열 응력은 단편화 및 응고를 야기하는 반면, sd 동안 분무화된 농축물에 적용된 열 응력은 주로 응집을 야기하였다. 아펠리모마브 농축물은 단시간 동안 약 50℃ 이하의 온도를 견딜 수 있다. 약 60℃에서는 단백질 손상이 신속하게 발생하였다. 분무 건조 공정 동안 액적은 통상적으로 Tout보다 25 내지 30℃ 낮은 습구 온도(Twb)(당해 연구에서는 통상적으로 80℃)에 노출되며, 노출 시간은 매우 짧았다[문헌 참조; Mumenthaler et al., Pharm. Res. 11(1):12-20 (1994)].
요약
응집은 펌핑 과정 동안 전단력에 의해 야기되지 않는 것으로 생각되었다. 분무화가 분무 건조 공정 동안의 응집 증가의 일부를 초래하였다. 열 응력이 단백질 안정성에 중요한 역할을 하지만, 농축물에 적용되는 경우, 이것은 단편화 및 불용성 응집물을 야기하였다. 액적이 sd 동안 약 55℃의 임계 온도(무멘탈러 등(Mumenthaler et al.)에 의해 주장됨, Tout보다 25 내지 30℃ 낮음, 매우 짧은 시간 동안)에 도달함에 따라, 응집 증가는 온도와 분무화의 상호작용에 의해 야기되는 것으로 보인다[문헌 참조; Mumenthaler 1994].
부형제를 사용한 분무 건조 실험
아펠리모마브 단백질의 안정화를 최적화시키기 위해, 상이한 부형제를 시험하였다. 목적은 건조 공정 및 후속적인 저장 동안의 충분한 안정성이었다.
10 내지 150mM 소르비톨의 첨가
당해 실시예에서, 10, 25, 50, 100 또는 150mM 소르비톨을 아펠리모마브 농축물에 가하여 표 4에 나타낸 바와 같이 안정화제 대 단백질의 최적의 몰 비를 결정하였다. 결과가 도 2 및 도 3에 도시되어 있다. 150mM 소르비톨 용액의 경우, Tg가 공정을 훨씬 넘어서 심지어 실온을 지나 강하하며, 매우 낮은 수율에서 알 수 있는 바와 같이 이러한 혼합물을 적당히 분무 건조시키는 것은 불가능하다. 혼합물은 건조 챔버를 통한 통과 동안 건조될 수 없으며, 사이클론 분리기로 도입될 때에도 여전히 끈적거려서 대부분이 사이클론 벽에 달라붙어 수집할 수 없다[문헌 참조; Maury et al., Eur. Journal of Pharm. and Biopharm. 59(3):565-573 (2005)].
Figure pct00007
작은 수율로 인해, 이들 샘플의 칼-피셔 적정(KF) 및 광각 x-선 회절(WAXD) 분석을 수행할 수 없었다. 10mM의 경우는 불충분하였다는 것을 제외하고는, 응집의 증가는 소르비톨의 양에 대단히 의존적인 것은 아니었다. 상이한 양의 소르비톨이 입자 형태학에 영향을 미치지 않았으며; 보다 많은 부형제가 혼합물에 존재하더라도, 보다 많은 입자는 원형을 취하였다(도 4 참조). 순수한 소르비톨 용액(대조물로서)을 분무 건조시키는 것은 가능하지 않지만, 상이한 소르비톨 농도의 플라시보 분말 모두는 구형 입자를 나타내었다.
결정화도는 소르비톨 순 중량(net weight)이 높을수록 감소하였다. IEF 결과는 추가의 밴드가 단지 모호하게 검출될 수 있다는 순수 농축물의 결과와 대부분 일치하였다. 10mM 혼합물은 또한 예상치못한 DLS 다이아그램을 나타내었다. 마이크로미터 크기에서의 뚜렷한 피크가 크기-용적 분포에서는 거의 검출되지 않았으므로 큰 응집물의 양을 매우 낮았다. 그러나, 25, 50 및 100mM의 첨가된 소르비톨은 거의 동일한 다이아그램을 나타내었다. 입자 오염은 소르비톨(고체)의 양에 직선적으로 의존적인 것으로 보이며, 이는 10mM 내지 25mM 사이의 최대 단계를 보여준다. 그러나, 차이는 보다 작은 입자 크기에 주로 제한되었다. 15㎛보다 큰 입자에 대한 값은 다소 동일하였다. 따라서, 아펠리모마브 농축물의 적절한 안정화는 25 또는 50mM 소르비톨의 첨가에 의해 실행 가능한 것으로 보인다. 이러한 두 개의 혼합물은 물 함량 및 그 결과로서 생성된 Tg를 제외하고는 큰 차이를 보이지 않았다.
10 내지 100mM 트레할로즈의 첨가
높은 소르비톨 양에서 밝혀진 결과 때문에, 트레할로즈 시험 시리즈는 150mM 혼합물을 배제하였다. 트레할로즈는 트레할로즈 이수화물로서 첨가되므로, 혼합물은 15mL의 아펠리모마브 농축물 중의 56.7 내지 567mg의 트레할로즈 이수화물로 이루어지며, 트레할로즈:MAK의 질량 비는 표 5에서 알 수 있다. 도 5 및 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 결과는 25mM 및 100mM 간에 유사하였다. 수율을 평균한 결과 소르비톨과 비교하여 전체 농도가 조금 더 높았다. 트레할로즈의 경우 매우 우수한 안정화가 수득되었으며, 또한 수율은 모든 농도에 걸쳐 안정하였다. 응집 증가가 최소이고, 단지 10mM 혼합물에 대해서만 SEC에서 응집의 작은 증가가 보였다(0.2%).
Figure pct00008
그럼에도 불구하고, DLS 다이아그램에서 볼 수 있는 바와 같이 불용성 응집이 모든 혼합물에서 발생하였다. 단량체의 양을 소르비톨 결과와 비교하였다. 입자의 결정화도 및 구형도(sphericity)는 트레할로즈의 양과 정비례하여 변하였다. 순수 트레할로즈의 분무 건조가 구형 입자를 제공함에 따라 트레할로즈의 첨가가 입자가 더 둥근 형태를 취하도록 야기하였다(도 7 참조). 소르비톨 실험에서 알 수 있는 바와 같이, 입자 오염은 부형제 농도에 의해 영향을 받는 것으로 보이지만, 이것은 다시 작은 입자 크기(≤15㎛)에 제한되었다. 트레할로즈의 높은 Tg(건조된 트레할로즈에 대한 Tg는 115℃임) 때문에, 트레할로즈 혼합물의 Tg 또한 높으며, 이것은 분말 안정성 연구에 대한 이점일 수 있다[문헌 참조; Adler et al., Journal of Pharm. Sci. 88(2):199-208 (1999)]. 25mM 및 50mM이, 적합한 공정 및 저장 안정성을 갖는 분말을 제조하기 위한 트레할로즈의 가장 유망한 비율인 것으로 보인다. 생성된 분말은 소르비톨 분말보다 덜한 잔류 수분을 나타내었다. 이러한 혼합물의 만족스러운 결과 때문에, 150mM 트레할로즈를 사용한 후속적인 시험의 선택은 포기하였다.
10 내지 100mM 수크로즈의 첨가
아펠리모마브 농축물로의 25mM 내지 100mM 수크로즈의 첨가를 시험하였다(표 6 참조). 25mM부터 100mM까지, 수크로즈의 첨가는 70 내지 80%의 높은 분말 수율을 제공하였다(도 8 및 9). Tg는 25mM에서 최적에 도달하였다. 응집 증가는 모든 농도 전반에 걸쳐 상당히 다르지 않았다. 다시 결정화도(C)는 수크로즈의 양에 직선적으로 감소하였다. 상이한 분말의 잔류 수분 함량을 평균한 결과 트레할로즈 혼합물에 대해 관찰된 것보다 약간 더 높았다. 입자의 구형도는 수크로즈의 양에 의해 영향을 받았다. 단백질은 톱니형 구체(indented sphere)를 형성하는 경향이 있는 반면, 수크로즈는 구형 입자를 형성하는 경향이 있었다.
Figure pct00009
DLS-파일에서, 단량체의 양은 10mM과 비교하여 100mM 수크로즈에서 더 낮았지만, 이러한 영향은 강도-크기 분포 다이아그램에 제한되었다. 100mM 수크로즈에 대한 용적-크기 분포에서, 응집 피크는 검출하지 어려웠다. 10mM 혼합물에서, 보다 큰 응집물을 볼 수 있었다(>1㎛). 이러한 추가의 피크는 수크로즈 혼합물의 나머지에서는 나타나지 않았다. IEF 겔은 상당한 불규칙성을 보이지 않았다. 추가의 밴드는 50 및 100mM에 대해 단지 모호하게 검출 가능하였으며, 농축물의 원래의 밴드 패턴을 분명히 볼 수 있었다. 입자 오염은 10mM에서 100mM로 감소하였으며, 이것은 10mM 내지 25mM의 최대 단계를 보여준다. 보다 큰 입자 크기에서는 차이가 보다 작아지므로 15㎛보다 큰 입자의 경우 모든 혼합물은 유사한 입자 양을 나타내었다. 이러한 모든 결과를 고려하면, 10mM 수크로즈를 아펠리모마브 농축물을 첨가하는 것은 부적당하며; 25mM 및 50mM에서 최선의 결과가 수득되었다.
요약
상이한 양의 세 가지 부형제에 대한 결과를 비교하면, 10mM의 부형제는 분무 건조 공정 동안 단백질 보존을 제공하기에 충분하지 못함이 자명하다. 따라서, 모든 부형제에 대한 가장 유리한 결과는 25mM 및 50mM에서 수득되었으며; 100mM 또는 심지어 150mM은 결과를 개선시키지 못했다(150mM 소르비톨의 경우 완전히 정반대임). 응집 증가에 대한 결과는 소르비톨의 경우 약간 더 높았으며; 나머지 결과(수크로즈 및 트레할로즈)는 대체로 유사하였다. 트레할로즈 및 수크로즈는 아펠리모마브 단백질를 동일한 정도로 보호하였으며, 소르비톨보다 우수하였다.
저장 안정성 연구
분무 건조된 분말을 3개월 동안 상이한 온도 및 잔류 습기 조건에 노출시켰다. 시험 조건은 다음과 같았다: 냉장고(5℃, 습기 없음); 60% 상대 습도에서 25℃(중유럽, 북미와 유사); 및 75% 상대 습도에서 40℃(동남 아시아와 유사).
제조 및 검사 계획
순수 농축물 뿐만 아니라 분무-건조된 플라시보를 저장하였다. 플라시보 분말은 아펠리모마브 단백질을 제외하고는 베룸(verum) 분말(분무 건조된 단백질-부형제 혼합물)과 동일한 고체로 이루어진다. 분석적 시험에 필요한 분말 양은 사전에 계산하여 액체 공급물의 배치 크기를 추정하였다. 50mL 액체 공급물의 3개 또는 4개 배치를 동일한 조건하에서 분무 건조시키고; 생성된 분말을 계산된 양이 Viton® 밀봉 플루오로엘라스토머 및 Duroplast®-스크류 캡이 달린 작은 Al-바이알에 충전되어 있는 하나의 벌크로서 함께 혼합하였다. Viton® 밀봉 플루오로엘라스토머가 있는 Al-바이알을 선택하는데, 그 이유는 이들이 예비 시험에서 단지 작은 수증기 투과성을 나타내기 때문이다(65% RH하에 실온에서 10일에 걸쳐 저장하는 경우 분무 건조된 락토즈의 물 함량의 변화가 관찰되지 않았음). 각각의 실험 시간(t = 1, 2 및 3개월)에, 각 혼합물의 두 개의 동일한 샘플(Al-바이알)을 상이한 냉난방 챔버로부터 제거하였다. 하나는 분석을 위해 사용하고; 다른 하나는 동결기로 옮겨 -80℃에서 저장하였다(가능한 추가의 시험을 위한 예비(reserve)로서). 이것은 총 152개의 바이알을 제공하였으며, 매달 챔버로부터 제거하기 위한 48개(모든 온도를 위한 4개 베룸, 4개 베룸 예비, 4개의 플라시보, 4개의 플라시보 예비) + 추가의 열 처리 없이 -80℃에서 저장한 8개의 바이알(순수 농축물 또는 새로 분무 건조된 분말).
아펠리모마브 농축물
SEC 결과(표 7 참조). SEC 크로마토그램은 5℃에서 농축물이 응집에 의해 단지 경미한 손상을 입는 것으로 나타났지만 이러한 응집물은 주로 이량제가 아닌 것으로 보인다. 응집물 피크의 광범위한 평탄역(broad plateau)은 삼량체/올리고머의 존재를 나타내었다. 보다 높은 온도 및 보다 긴 저장 기간은, 단편화 및 크로마토그램의 감소하는 AUC의 발생에 의해 보여지는 심한 분해를 초래한다.
Figure pct00010
상이한 분획의 저장 안정성 동력학을 연구하였다. 단량체의 양이 모든 온도에서 일정하게 감소하므로, 응집은 25℃ 및 40℃에서 약 2개월 후 단편화로 바뀌는 것으로 보인다. 40℃에서 응집은 더 이상 크로마토그램에서 별도의 피크로서 검지되지 않으며, 3개월 후 피크 패턴은 단편화 피크가 우위를 차지하였다. 40℃에서의 심한 손상은 샘플을 거시적으로 분석함으로써 이미 관찰할 수 있다. 1개월 후, 40℃에서 저장한 농축물은 탁도를 나타내는 반면, 5℃ 및 25℃ 샘플은 육안으로는 보이지 않는 착색에 있어서의 단지 작은 변화를 나타내었다.
탁도 측정은 필적하는 결과를 나타내었다. 탁도에 있어서의 명확한 변화는 베룸(단백질을 함유하는 샘플)에서 뿐만 아니라 플라시보 농축물에서 단지 40℃에서 검출 가능하였다. 1개월 후, 농축물은 150 NTU 이상의 값을 나타내었으며 다음 달에도 여전히 증가하였다. 광학 탁도 때문에, DLS 측정을 40℃ 샘플에 대해 종료하였다. 보다 낮은 온도에서는 변화가 검출되지 않았다. 입자 측정은 단편화 및 응집에 대한 추가의 정보를 제공하였다. 미세 입자 분획은 감소한 반면(입자 < 25㎛), 큰 입자의 수는 끊임없이 증가하며, 이것은 아마 SEC에 의해 검출되지 않는 불용성 응집물을 나타낸다(크로마토그램의 감소하는 AUC에 의해 추정되는 바와 같이). 이들은 또한 샘플의 가시적인 탁도를 초래하는 입자일 수 있다.
지금까지, 25℃에서의 손상은 매우 심각한 것으로 보이지 않았다. 그러나, 이러한 결과는 IEF 겔을 분석하는 경우에 반증되었다. 1개월 후 이미 밴드 강도에 있어서의 작은 변화를 볼 수 있으며, 3개월 후 밴드 패턴은 원래의 것과는 명확히 다르다. 최고 등전점(IEP)(pH 8.6 내지 8.7)을 갖는 동형체에 대한 밴드는 완전히 소멸되었다. 40℃ 저장은 1개월 후 심한 손상을 야기하였으며, 안정성 시험 동안 더욱 악화되었다.
따라서, 아펠리모마브 농축물은 냉온에서 저장하는 경우 비교적 안정하였다. 그러나, 농축물이 고온으로 되자마자, 상이한 경로를 통해 분해를 일으켰다. 장기간에 걸친 저장시 심지어 실온(25℃)도 응력 인자이었다.
분무 건조된 분말의 안정성
분무 건조를 통해 장기간 안정화를 제공하기 위해서는, 추가의 부형제를 갖는 아펠리모마브 농축물이 25℃에서 저장한 농축물에 대한 결과보다 나쁘지 않은 분해를 나타내야 한다. 추가의 시험으로서, 분무 건조 공정 직후 및 3개월 저장 후 칼 피셔 적정을 수행하여 Al-바이알의 밀봉(단시간 동안 시험하는 한) 및/또는 분무 건조된 분말의 안정성에 대한 수분의 영향을 실험하였다.
농축물 + 25mM 소르비톨
5℃ 및 25℃에서 저장한 샘플은 3개월에 걸쳐 우수한 안정성을 나타낸다(표 8에 나타낸 바와 같음). SEC 결과에서, 뚜렷한 변화는 찾을 수 없었다(△응집은 1% 미만임). 40℃에서 상당한 분해가 일어나며, 응집이 현저한 증가를 보이며, 이량체 피크 이외에 큰 다량체가 출현하였다. 3개월 후 뚜렷한 단편 피크를 검출할 수 있었다.
Figure pct00011
5℃ 및 25℃에서 저장한 샘플은 착색에 있어서 변화를 보이지 않는 반면, 40℃ 샘플(재용해된)의 색은 1개월 후 약간 변하였으며, 시간이 지나면 심지어 가시적인 탁도를 보였다. 이러한 탁도는 단백질에 의해 야기되는데, 그 이유는 플라시보 샘플은 어떠한 시간 또는 온도에서도 착색이 변하지 않았기 때문이다. 탁도 측정 동안의 가장 두드러진 결과는 또한 40℃에서 수득되었다. 분무 건조 직후 약 20 NTU에서 출발하여, 3개월 후 40℃ 샘플은 120 NTU 이상의 값에 도달하였다. 그러나, 순수 농축물이 나타내는 것보다 주목할 정도로 20 NTU가 더 많았다. 40℃는 소르비톨 혼합물에 대한 임계 파라미터인데, 그 이유는 이것은 Tg보다 높으므로 유리질 상태가 더 이상 유지될 수 없기 때문이다.
입자 오염은 유사한 결과를 보였다. 5℃ 및 25℃에서 검출 가능한 단지 작은 변화가 있었다. 40℃/75% RH에서 저장한 샘플은, 특히 작은 입자에 대해, 주목할만한 증가를 보였다. 이것은, 분말은 약간의 탁도를 유지하지 않으면서 재용해될 수 없다는 사실로 인한 것이다. 플라시보 샘플에서 입자의 수는 구형 입자 크기에 제한되지 않는 베룸 샘플에서보다 훨씬 더 낮았다. 분말의 저장에 사용되는 Al-바이알은, 예비 연구가 그렇게 시사하기는 하였지만, 절대적인 수증기 불투과성을 보장하지 않았다.
칼 피셔 적정을 분무 건조 공정 직후 및 3개월의 저장 후 수행하였다. 수분 흡수(water uptake)는 단백질 의존적이지 않은데, 그 이유는 플라시보 샘플이, 약간 높은 초기 값은 별도로 하고서, 동일한 결과를 나타내었기 때문이다. 5℃ 분말만이 습도에 있어서 작은 변화를 보이기 때문에, 수분 흡수는 냉난방 챔버의 RH에 의존적이었다. 플라시보 샘플에 대한 값이 베룸 샘플에 대한 값보다 약간 더 높으므로, 소르비톨과 MAK의 배합물은 순수한 부형제보다 더 흡습성이다. 바이알의 온도, 잔류 습기 및 수증기 투과성은 x-선 회절 다이아그램에 영향을 미치지 않았다. 3개월 후, 초기 다이아그램(t=0)과 비교하여 회절 패턴에 있어서 여전히 차이가 없었다.
분말의 거시적 외관조차도 습도에 의해 영향을 받는다. 대부분의 샘플은 여전히 유동 가능한 벌크 물질이었지만, 40℃ 샘플은 융합되었다(특히 플라시보 샘플). 40℃ 샘플에서 보여지는 응집의 증가는 DLS 결과로 확인되었다. 5℃ 및 25℃는 여전히 전형적인 패턴(10nm에서의 단량체 피크 및 ㎛-크기에서의 작은 응집 피크)을 보이는데 반해, 40℃ 샘플의 경우에는 뚜렷한 패턴이 보인다. 심지어 크기-용적 분포에서도, 단량체 피크에서 작은 숄더(small shoulder)가 발생하는데, 이것은 3개월 후에 훨씬 더 뚜렷한 다량체 피크를 나타낸다. IEF 겔에서, 40℃에서 2개월 동안 저장한 후 변화를 검출할 수 있으며, 저온에서는 보이지 않았던 추가의 밴드가 출발점에서 나타난다.
농축물 + 25mM 트레할로즈
트레할로즈 혼합물은 우수한 안정성을 나타낸다(표 9). 5℃ 및 25℃/60% RH에서의 저장 동안 전체 분석 전반에 걸쳐 상당한 변화를 검지할 수 없었다. 단지 40℃/75% RH에서 분말이 약간 다른 결과를 나타내었다. 응집은 단지 40℃에서 증가하였다. 3개월 후, 약 2%의 총 응집의 증가가 검지되었다. 저온은 단백질에 대한 상당한 손상을 야기하지 않았다. 그러나, 40℃에서도, 3개월 후 단량체의 양은 여전히 95% 초과이었다. 트레할로즈를 안정화제로서 사용하는 경우, 단편의 형성이 관찰되지 않았으며, 적어도 크로마토그램에 존재하는 뚜렷한 피크는 없었다. IgG 단편은 완전 항체보다 저장 동안 온도 유도된 응집에 덜 민감할 수 있다.
Figure pct00012
유사한 결과가 탁도 측정 동안 수득되었다. 5℃ 및 25℃에서 저장하는 동안 탁도의 변화는 볼 수 없었으며, 심지어 40℃ 샘플만이 탁도에 있어서의 작은 증가를 보였다. 대부분의 탁도는 다시 단백질에 의해 야기되는데, 그 이유는 플라시보 샘플이 0에 가까운 NTU 값을 갖기 때문이다. 입자 오염은 높은 온도 또는 높은 잔류 습기에 의해 영향을 받지 않았다. 베룸 및 플라시보 샘플 간의 차이를 별도로 하고서, 입자의 수는 3개월의 저장에 걸쳐 주로 동일한 수준에 머물렀다. 이것 또한 재용해된 분말의 광학적 외관에 의해 확인되었다. 모든 샘플은 투명한 용액을 야기하며, 심지어 착색 측정은 저장 동안 어떠한 차이도 나타내지 않았다.
안정성 시험에 사용되는 Al-바이알은 분말로부터 습기를 완전히 배제시킬 수 없었다. 따라서, 25℃ 및 40℃에서의 높은 습도 조건은 분말의 습기의 증가를 야기한다. 5℃에서 저장한 분말은 변하지 않은 물 함량을 나타냈다. 응력 인자인 온도 및 증가된 RH 둘 다는 분말 샘플의 결정화도에 어떠한 영향도 미치지 않았다. 회절 다이아그램은 변하지 않았다. 염화나트륨 피크 패턴이 여전히 WAXD 다이아그램의 우위를 차지하였다. SEC 및 탁도 측정 결과는 DLS를 통해 수득된 결과를 확인시켰다. 낮은 온도 및 낮은 잔류 습기는 단백질 부하된 분말을 훼손시키지 않았다. 모든 샘플은 동일한 패턴을 나타냈으며, 심지어 40℃에서 저장한 혼합물도 이상 피크(extraordinary peak) 또는 피크 숄더를 나타내지 않았다. 이것은 약 10nm에서의 큰 피크 및 ㎛-크기에서의 추가의 피크에서 보여지는 통상의 패턴을 나타내었다.
IEF 결과에서, 집속의 출발점에서 추가의 밴드를 나타내는 유일한 겔은 40℃/75% RH 샘플을 갖는 것이었다. 여기에서도, 3개월 후 약간 청색인 반점이 보였다("40℃" 바로 아래). 모든 온도 및 습도 조건에 걸쳐, 트레할로즈는 아펠리모마브 단백질에 대한 매우 우수한 안정화 능력을 입증하였다.
농축물 + 25mM 수크로즈
아펠리모마브 농축물 중의 수크로즈의 용액은 특히 5℃ 및 25℃/60% RH에서의 우수한 저장 안정성을 나타낸다(표 10). 이러한 조건에서 응집에 있어서의 변화는 관찰되지 않았다. 5℃ 및 25℃에 대한 모든 크로마토그램은 유사하였다. 상이한 결과는 단지 40℃/75% RH 샘플에 대해서만 볼 수 있으며, 여기서는 3개월에 걸쳐 약 2.5%의 응집 증가가 검지되었다. 그러나 여전히, 이때의 단량체의 양은 약 95%이었다.
Figure pct00013
모든 재용해된 분말은 아펠리모마브 농축물 또는 액체 공급물로부터 구분할 수 없게 광학적으로 투명하고 무색을 나타내었다. 착색 측정은 고온 저장(40℃) 후에도 3개월에 걸쳐 어떠한 색 변화도 나타내지 않았다. 용액은 여전히 기준 용액 R6 또는 B5에 가장 가까우며, 이것은 시각 교구(visual aid)로 겨우 동일함을 확인할 수 있는 적색 또는 갈색이 섞인 매우 희석된 액체이었다. 탁도계의 도움으로, 광범위한 변화는 관찰되지 않았다. 40℃/75% RH에서 저장후 초기에 12 NTU에서 20 NTU로 탁도가 증가하였지만, 탁도 결과는 소르비톨 및 트레할로즈에 비해 보다 더 양호하였으며, 이것은 분무 건조 직후 이미 20 NTU를 나타내었다. 플라시보 샘플만이 전체 안정성 시험 기간에 걸쳐 유의적인 변화 없이 매우 낮은 탁도를 나타내었다.
베룸 샘플에 대한 육안으로 볼 수 있는 것보다 작은 입자 오염은, 탁도에서와 같이, 플라시보 샘플에 비해 상당히 더 높았다. 그러나, 큰 입자 분획(10㎛보다 큰 입자)에서, 단지 작은 변화가 관찰되었다. 40㎛보다 큰 입자의 수는 통상적으로 0에 가까우며, 10㎛보다 큰 입자의 계수는 100보다 작거나 대략 100이므로(용액 mL당), 전반적인 입자 오염은 그다지 높지 않았다. 고온 저장에서의 모든 분해는 칼 피셔 분석의 결과에 합치하였다. 컨디셔닝된 저장 챔버에서의 잔류 습기가 높을수록, 분말에 의해 흡수된 물의 양은 높아진다. 수크로즈 샘플은 베룸 및 플라시보 분말 사이에 큰 차이를 보이지 않았다.
물 함량이 보다 높은 잔류 습기 조건하에서 증가하기는 하지만, 물의 흡수는 분말의 결정화도에 어떠한 영향도 미치지 않았다. 3개월 후의 WAXD 다이아그램은 모든 온도에 대해 동일한 회절 패턴을 나타내었으며, 분무 건조 직후(t=0) 취한 WAXD 다이아그램과 동일하였다. DLS 다이아그램 및 IEF 겔에서는 단지 최소의 분해가 검지되었다. 40℃ 및 75% RH에서 3개월 후 수크로즈 샘플은 분무 건조 직후의 것과 매우 유사한 광 산란 다이아그램을 나타내었다. 뚜렷한 단량체 피크는 10nm의 수력학적 직경이며, ㎛ 크기의 매우 작은 피크이다(줌 부분(zoomed section)에서 보임). 40℃ 및 75% RH 또한 농축물의 것과는 상이한 IEF 밴드 패턴을 야기하는 유일한 조건이었다. 집속의 출발점에서의 경미한 밴드가 약간의 큰 응집물을 나타내지만, DLS 다이아그램에서 볼 수 있는 바와 같이, 이들의 수는 상당히 중요하지는 않다.
비교 및 요약
안정성 실험은 상이한 안정화제가 상이한 결과를 초래함을 입증한다. 부형제 또는 저장 조건을 변화시키는 것이 입자 형태학에 영향을 미치는 것으로 보이지 않았다. 분무 건조 직후의 sd 소르비톨 혼합물의 SEM 이미지는 40℃ 및 75% RH 하에서 3개월 동안 저장한 트레할로즈 샘플과 거의 구분할 수 없었다. 5℃는 심한 단백질 손상을 야기하지 않았으며; 심지어 아펠리모마브 농축물도 이러한 조건하에서 3개월에 걸쳐 상당한 분해를 나타내지 않았다. 25℃ 60% RH 또는 40℃ 75% RH에서 저장하는 경우, 순수 농축물은 응집 및 단편화를 나타냄으로써 반응하였다.
트레할로즈 및 수크로즈는 매우 균일한 결과를 나타내었다. 분말은 매우 우수한 안정성을 갖는다. 심지어 40℃ 및 75% RH에서도, 단지 작은 변화만이 검지되었다. 그러나, 흡습성이 트레할로즈 및 수크로즈에 대한 상이한 결과를 보이는 파라미터 중의 하나이다. 트레할로즈를 포함하는 sd 분말은 전반적으로 수크로즈 혼합물에 비해 분무 건조 후 보다 낮은 물 함량을 나타내었다. 안정성 시험에 사용되는 Al-바이알이 수증기에 대해 완전히 불투과성이지 않기 때문에, 수크로즈 분말 또한, 수크로즈가 트레할로즈보다 더 흡습성이라는 사실로 인해, 3개월 후 보다 높은 물 함량을 갖는다.
수크로즈와 트레할로즈 간의 또 다른 차이는 탁도 측정에서 보여진다. 수크로즈 혼합물은 트레할로즈 분말보다 분무 건조 직후 보다 적은 NTU를 나타내었다. 탁도 측정은 또한 또 다른 예기치 않은 특징을 드러냈다. 분무 건조 공정은 승온에서의 저장보다 단백질-부형제 혼합물에 대해 더욱 스트레스가 많은 것으로 보인다. 분무 건조되는 경우, 분말은 적어도 sd 분말의 Tg 미만에서 저장할 때에 충분한 안정성을 나타내었다.
소르비톨 또한 안정화 가능성을 갖는다. 이것은 5℃ 및 25℃에서 우수한 결과를 나타내었다. 그러나, 소르비톨을 포함하는 sd 분말은 장시간에 걸쳐 높은 온도를 견디지 못하였다. 이러한 결과에 대한 중요한 파라미터는 소르비톨의 낮은 Tg인 것으로 보인다. 이 온도를 초과하면(40℃ 저장에 대한 결과에서 보여지는 바와 같이) 유리질 제형이 점성 액체로 전환되고, 이의 이동성이 증진되며, 각종 분해 경로가 개방된다.
분무 건조 공정 동안 탁도 증가를 감소시키기 위한 시도
탁도가 분무 건조 공정 동안의 변화성을 나타내는 파라미터인 것으로 밝혀짐에 따라, 건조 공정 후의 탁도 값을 최소 수준으로 감소시키기 위한 시도로 공정 파라미터를 다시 바꾸었다. 이러한 실험을 위해, 아펠리모마브 단백질에 대해 최소의 손상을 야기하는 것으로 이미 판명된 이전의 건조 실험으로부터의 공정 파라미터를 사용하였다. 이러한 목적으로, 부형제 트레할로즈 및 수크로즈의 25mM 및 50mM 첨가를 사용한 분무 건조 실험을 130℃ 및 100℃의 TIn을 사용하여 수행하였다. 앞서 논의한 바와 같이, 100℃의 TIn은 130℃의 TIn에서 수득된 것과 유사한 분석 결과를 나타내었다. TIn을 감소시키면 단백질에 대한 열 응력이 감소하므로, NTU 값을 낮출 수 있다. 유사한 고려사항을 50mM 및 25mM 부형제의 첨가에 적용하였다. 제형 둘 다는 이전 시험에서와 유사한 결과를 나타내었다. 부형제의 양을 증가시키면 보다 양호한 NTU 값을 초래할 수 있다. 공정 구성에 있어서의 변화 둘 다가 이전 시험에서 상당한 변화를 입증하지 않았기 때문에, 이러한 실험에 사용되는 유일한 분석적 방법은 탁도 측정이었다.
트레할로즈의 첨가
25mM 및 50mM 트레할로즈를 포함하는 아펠리모마브 농축물을 100℃ 및 130℃의 TIn에서 분무 건조시켰다. 모든 제형을 여러 개로 분무 건조시켜 각 실험으로부터의 적어도 3개의 sd 분말을 탁도에 대해 시험할 수 있었다. 분말 수율은 TIn에 따라서도 부형제의 양에 따라서도 상당한 차이를 보이지 않았다. 평균 수율은 약 70%이며, 130℃ TIn 및 부형제의 25mM 첨가에 비해 보다 높은 값을 나타내었다. 탁도 측정의 결과는 보다 다양하였다.
부형제의 양은 25mM 및 50mM 트레할로즈에 대한 NTU 값이 크게 차이가 없었기 때문에 탁도에 대해 큰 영향을 미치지 않았다. 그러나, 상이한 TIn은 다른 탁도를 야기한다. 130℃의 TIn은 보다 낮은 NTU 값 및 표준 편차를 야기한다. 100℃의 TIn에서 NTU 값은 일반적으로 더 높으며 또한 더 큰 변화성을 보였다. 130℃ 및 25mM 트레할로즈 첨가에 대한 값 또한 안정성 시험 동안 수득된 탁도 값에 합치하였다.
수크로즈의 첨가
25mM 및 50mM 수크로즈를 첨가한 아펠리모마브 농축물의 혼합물을 100℃ 및 130℃의 TIn에서 분무 건조시켰다. 수크로즈의 상이한 농도는 분무 건조 공정의 분말 수율에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 보인다. 모든 혼합물은 약 70%의 분말 수율을 제공하였으며, 130℃ 분말은 약간 더 작은 표준 편차를 보였다. 탁도 측정으로부터의 결과가 훨씬 더 상이하였다. 25mM 및 50mM에 대한 NTU 값은 매우 가까우며, 100℃의 TIn에서는 약간 50mM 수크로즈쪽으로 향하고(보다 낮은 탁도를 보임), TIn=130℃의 경우에는 수크로즈의 25mM 첨가쪽으로 향하는 경향이 있다. 이러한 경향이 크지 않기 때문에, 부형제의 양은 분무 건조된 분말의 탁도에 큰 영향을 미치지 않았다. TIn에 관한 결정이 훨씬 더 분명하였다. 100℃는 실질적으로 보다 높은 NTU 값, 때때로 50 NTU를 초과하는 값을 제공하며, 이것은 130℃ 분말의 경우 40℃에서 3개월의 저장 동안에도 도달하지 못한다. 더욱이, 100℃의 TIn에서 수득되는 큰 표준 편차는 재현성있는 결과를 보장하지 못했다. 130℃의 TIn에서 분무 건조시키는 경우, 재용해된 분말은 재현성있는 낮은 탁도 및 대략 20 NTU를 나타낸다. 이러한 값 또한 안정성 시험 동안 수득된 결과와 일치한다.
요약
분무 건조 공정 동안의 탁도 증가는 TIn을 낮춤으로서 감소시킬 수 없다. 트레할로즈 함유 분말 뿐만 아니라 수크로즈 혼합물은 100℃에서 보다 높은 NTU 값을 나타내었다. TIn로서 130℃를 사용하는 경우, 25mM 부형제의 첨가가 50mM보다 약간 더 낮은 탁도 값을 제공하였다. 따라서, 이전 실험으로부터 결정된 공정 파라미터(130℃ 및 25mM 첨가제)가 아펠리모마브 단백질의 분무 건조를 위해 최적인 것으로 보인다. 탁도에 관해, 수크로즈는 트레할로즈보다 약간 더 양호하게 작용하였다. 25mM 수크로즈를 함유하는 아펠리모마브 농축물로부터 분무 건조된 분말은 평균 15 NTU를 나타내는 반면, 유사한 트레할로즈 혼합물은 평균 17 NTU를 나타낸다.
보다 농축된 MAK 195F 용액의 분무 건조
12.4mg/mL MAK 195F를 포함하는 아펠리모마브 농축물을 트레할로즈, 수크로즈 또는 소르비톨을 사용하여 실험실 규모로 성공적으로 분무 건조시켜 안정한 분말을 생성하였다. 대량 건조 공정을 위해서는, 공정 시간이 매우 중요한 인자이다[문헌 참조; Masters, Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS; Charlottenlund (2002)]. 보다 큰 로트를 위한 공정 시간을 줄이기 위해서는, 액체 공급물 중의 보다 높은 단백질 농도가 다른 공정 파라미터에 대한 상당한 영향없이 분무 건조기의 단백질 처리량을 증진시킨다. 보다 농축된 MAK 195F 용액을 달성하기 위해, 아펠리모마브 농축물을 한외여과하였다. 이러한 여과 공정 동안 물, 염 및 계면활성제는 감소하는 반면, 단백질은 막을 가로지를 수 없다. 이것이 단백질 농도의 증가를 야기하지만, 다른 용질의 농도를 변화시키지는 않았다.
아펠리모마브 농축물 50.6mg/mL
제1 한외여과 공정에서, 농축물은 (UV-분광분석법을 사용하여 추정하여) mL당 50.6mg/mL 단백질의 농도에 도달하였다. 용액은 광학적으로 투명하며 거의 무색(약간 갈색을 띰)이고, 거시적으로 원래의 아펠리모마브 농축물(12.4mg/mL)과 거의 구분할 수 없었다. SEC 및 DLS는 원래의 농축물로부터의 변화를 보이지 않았다.
응집은 여전히 원래의 농축물(약 1%)에 가까우며 DLS 프로파일은 단지 약 10nm에서 단일 피크를 나타내는 원래의 농축물의 것과 정확하게 매칭되었다. 단백질은 이의 농도를 증가시킴으로써 훼손되지 않았다. 보다 높은 단백질 농도에서는, 일부 측정 가능한 물리적 특성들이 변할 수 있다. 농축물 50.6mg/mL는 1.017g/cm3의 밀도와 1.375mPas의 점도(둘 다 20℃에서 측정함)를 나타내었으며, 둘 다 원래의 농축물과 비교하여 약간 더 높았다. 또한, 농축물 50.6mg/mL에 대한 탁도 값은 원래의 용액에 비해 보다 더 높았다: 각각 118 NTU 및 약 5 NTU. 용액 중의 거대분자(단백질)의 양이 증가함에 따라 보다 많은 거대분자가 빛을 산란 또는 흡수시켜 광 강도를 감소시킬 수 있기 때문에 이러한 증가는 예상되었다.
입자 측정은 한외여과 공정 동안 상당한 변화를 나타내지 않았다. 농축물 50.6mg/mL의 모든 입자 분획은 농축물 12.4mg/mL과 동일하거나 덜한 입자 오염을 나타내었다. 또한, IEF 겔은 추가의 밴드를 나타내지 않았다. 용액 중의 MAK 195F의 농도를 50.6mg/mL로 증가시키는 것이 상당한 손상 또는 단백질 및 이의 기능에 대한 다른 변화를 야기하지 않는 것으로 추정할 수 있다.
부형제가 없는 분무 건조 농축물 50.6mg/mL sd
농축물 50.6mg/mL는 분무 건조되는 경우 농축물 12.4mg/mL만큼 손상에 민감하였다. 분무 건조 공정 동안 응집이 1% 증가하여 약 2%로 증가하였다. 분말 수율은 약 55%이지만, 물 함량은 비교적 높다(3.5%). 더욱이, 분말은 이들의 높은 정전하 때문에 취급(충전 등) 상에 약간의 어려움을 나타낸다.
DLS 다이아그램은 뚜렷한 단량체 피크 및 작은 응집물(올리고머)를 나타내는 작은 숄더를 보였다. 분무 건조된 원래의 농축물(12.4mg/mL)과는 달리, ㎛-크기의 피크 형태의 큰 응집물은 감지되지 않았다. 단지 작은 응집물만이 검지 가능하기 때문에, IEF 겔에서의 상당한 변화는 분무 건조 공정 동안 보이지 않았다.
한외여과 공정 동안 단백질 농도는 증가하는 반면, 다른 모든 용질(NaCl, Na3PO4 및 Pluronic® F68)은 원래의 농도를 유지하였다. 이러한 변화의 한 가지 영향을 분무 건조된 제형의 X-선 회절 패턴에서 볼 수 있다. 단백질은 분무 건조 후 충분히 무정형이므로, 염화나트륨에 의해 야기되는 결정성 피크는 상당히 축소되었다. 액적 중의 보다 높은 양의 고체에 의해 야기되는, 보다 큰 입자에 대한 경향을 제외하고는 입자 형태학에 미치는 영향은 검지되지 않았다.
부형제가 없는 분무 건조 농축물 50.6mg/mL은 또한 매우 높은 입자 오염을 야야기한다. 농축물 12.4mg/mL sd에 비해, 25㎛ 미만의 모든 입자 분획이 보다 높은 양의 입자를 함유하였다.
분무 건조 전에 부형제를 첨가함으로써 이러한 결과가 개선될 수 있다. 안정성 시험에서와 같이, 부형제를 농축물 12.4mg/mL에 대한 25mM 혼합물과 동일한 질량 비로 가하였다.
소르비톨의 첨가
소르비톨을 농축물 12.4mg/mL에 대한 25mM 혼합물에 따라 0.35:1의 소르비톨:MAK 195F 질량 비로 가하였다. 분무 건조된 혼합물의 분말 수율은 약 60%이었다. 분말은 20℃의 Tg 및 2.3%의 물 함량을 갖는다. 이러한 값은 광범위하게는 농축물 12.4mg/mL를 갖는 유사한 혼합물에 대해 수득된 결과(67% 분말 수율, 2.0% RH, Tg = 19℃)와 일치하였다. sd 분말의 재용해는 초기 MAK 195F 농축물 50.6mg/mL와 마찬가지로 기준 용액 B2와 가장 가까운 착색(약간 갈색을 띰)을 갖는 투명한, 거의 무색인 용액을 야기한다.
분무 건조 후, 재용해된 분말은 응집에 있어서 작은 증가를 나타내었다. SEC는 순수 농축물 50.6mg/mL에 대한 약 1%와 비교하여 1.3%의 응집 수준을 나타내었다. 다시, 이것은 소르비톨 25mM이 첨가된 분무 건조된 농축물 12.4mg/mL와 비교하여 상당한 변화는 아니었다.
불용성 응집물의 양은 DLS 결과에서 보여지는 바와 같이 실질적으로 증가하지 않았다. 10nm의 수력학적 직경에서 뚜렷한 단량체 피크가 검지되었을 뿐만 아니라 ㎛-크기에서 응집 피크가 검지되었다. 액체 공급물의 고체 함량이 2.8의 계수로 증가하기 때문에, 재용해된 분말의 육안으로 볼 수 있는 것보다 작은 입자 오염이 증가하였다. 특히, 작은 입자 분획(<10㎛)은 매우 높은 오염 수준을 나타내는 반면에, 큰 입자(>10㎛)의 수는 보다 낮은 농축 용액에서와 유사한 수준에 머물렀다.
액체 공급물 중의 단백질 농도를 변화시키는 것은 입자 형태학에 단지 작은 영향을 미쳤다. 입자는 전형적인 톱니형 구체 형태를 나타내지만, 보다 큰 입자로의 경향을 보였다. mL당 12.4mg의 아펠리모마브를 함유하는 용액에 대한 입자 직경이 약 2.5 내지 13㎛이기 때문에, 보다 농축된 용액을 분무 건조시키는 것은 부분적으로 15㎛보다 큰 입자를 야기한다.
트레할로즈의 첨가
농축물 12.4mg/mL에 대한 25mM 부형제 첨가를 사용하여 0.7:1의 부형제:MAK 105F 비를 안정성 시험 시리즈로부터 채택하였다. 부형제의 양은 소르비톨 실험에서보다 당해 실험에서 더 높은데, 그 이유는 이당류로서의 트레할로즈가 단당류로서의 소르비톨의 약 2배 정도로 높은 분자량을 갖기 때문이다. 액체 공급물 용액 중의 고체 함량의 이러한 증가는 이전의 분무 건조 실험에서만큼 높은 분말 수율을 수득하기 어렵게 만든다. 높은 고체 함량을 갖는 분무 건조 용액은 고성능 사이클론의 분말 배출구를 막을 위험이 있고 수율을 50% 미만으로 감소시킨다(당해 실험에서 약 45%). 분말은 높은 정전하 때문에 취급하기가 어렵다. 이것은 3.6%의 물 함량 및 약 66℃의 Tg를 가지며, 유사한 저농도 혼합물과 다소 일치한다(3.3% RH, Tg=56℃). 재용해된 sd 분말은 약간 갈색을 띤 기준 용액 B2에 가장 가까운 착색을 갖는다.
트레할로즈의 안정화 가능성은 우수하였다. 가용성 응집물의 증가는 SEC 크로마토그램에서 검지할 수 없었으며; 응집은 1%의 수준에서 유지되어 원래의 농축물 50.6mg/mL과 구분할 수 없었다. 단량체 피크 및 ㎛-크기의 피크에 의해 나타내어지는 소량의 큰 입자를 보이는 DLS 파일에서 알 수 있는 바와 같이 불용성 응집물의 양 또한 매우 낮았다.
육안으로 볼 수 있는 것보다 작은 입자 오염은 보다 낮은 농도의 혼합물(트레할로즈를 갖는 농축물 12.4mg/mL)에 비해 더 높았다. 이것은 높은 고체 함량에 의해 설명할 수 있는데, 이는 MAK 195K 농축물 12.4mg/mL를 사용하는 혼합물의 약 3배 정도로 높다.
액체 공급물 중의 단백질 농도 및 고체 함량을 변화시키는 것은 입자 형태학에 큰 영향을 미치지 않았다. 보다 농축된 분말에서의 분리된 큰 입자의 출현을 제외하고는, 입자 형태는 상당한 변화를 보이지 않았다.
수크로즈의 첨가
0.7:1의 수크로즈:MAK 195F의 질량비를 유지하기 위해(농축물 12.4mg/mL 및 25mM 부형제와 유사하게) 모든 분무 건조 실험을 위한 수크로즈의 양을 4.08의 계수로 증가시켜야 한다(50.6/12.4). 이러한 질량 비를 사용하여 위에서 볼 수 있는 바와 같이, 분무 건조 공정 동안 거의 완전한 단백질 보존이 달성되었다. 이러한 높은 양의 고체를 포함하는 용액의 분무 건조는 매우 작은 직경을 갖는 사이클론, 특히 고성능 사이클론의 분말 출구를 막을 위험이 있다. 따라서, 분말 수율은 때때로 공정 안정성에 어떠한 영향도 미치지 않으면서 50% 미만으로 감소된다.
농축물 50.6mg/mL가 원래의 농축물 12.4mg/mL와는 다른 착색을 갖기 때문에, 보다 높은 농축된 단백질 용액을 기본으로 하는 재용해된 sd 분말 또한 착색을 나타내는 것으로 예상된다. 트레할로즈 혼합물은 약간을 갈색을 띤 기준 용액 B1에 가장 가까운 착색을 갖는다.
응집은 1%의 수준에 머물며, 액체 농축물 50.6mg/mL 또는 심지어 원래의 농축물 12.4mg/mL과 실제로 다르지 않다.
DLS 분석은 약 10nm 수력학적 직경에서의 단량체 피크 및 소수의 큰 응집물을 나타내는 ㎛-크기의 널리 공지된 작은 응집 피크를 보였다. 육안으로 볼 수 있는 것보다 작은 입자 오염은 모든 입자 크기 분획 전반에 걸쳐 저농축 혼합물에 비해 약간 더 높았다.
입자 형태학은 동일한 부형제:MAK 195F 비를 포함하는 이전의 실험에서 수득된 결과와 다르지 않았다. 액체 공급물 중의 보다 높은 고체 함량의 결과로서, 저농축 제형에는 존재하지 않는 약간의 분리된 보다 큰 입자가 보였다. 분말의 잔류 수분은 2.6%이고, 제형의 Tg는 약 60℃이었다. 이러한 값 둘 다는 안정성 시험에서 유사한 저농도 제형에 대해 수득된 것(2.6% RH, Tg=63℃)에 필적한다.
요약
액체 공급물의 단백질 농도를 50.6mg/mL로 증가시키는 것은 생성되는 분말에 상당한 영향을 미치지 않았다. 거의 모든 분석적 시험이 부형제:MAK 195F에 대해 동일한 질량 비를 갖는 농축물 12.4mg/mL를 사용한 분무 건조 실험에 필적하는 결과를 야기하였다. 따라서, 부형제의 안정화 가능성은 몰 비가 아니라 부형제:MAK 195F의 질량비에 의존적이었다.
저농도 액체 공급물(12.4mg/mL)을 사용한 실험에서와 마찬가지로 트레할로즈 및 수크로즈는 아펠리모마브의 분무 건조 동안 공정 안정성에 관해 거의 동일한 결과를 야기하였다. 항체 단편을 안정화시키기 위해 소르비톨을 사용하는 것은 특히 응집에 있어서 약간 열악한 결과를 나타내었다. 고농도 분말의 IEF 비교는 상당한 차이를 보이지 않았으며, 모든 혼합물이 추가의 밴드(큰 응집물) 없이 원래의 아펠리모마브 밴드 패턴을 나타내었다.
상이한 양의 부형제에 따라 WAXD 다이아그램에서 두드러진 차이가 있었다. (단백질 뿐만 아니라) 사용된 모든 당이 분무 건조 후 충분히 무정형이기 때문에, 주된 결정성 성분으로서의 염화나트륨의 양이 결정성 피크의 출현을 조절하였다. 아펠리모마브 농축물 12.4mg/mL은 (고체에 관해) 38% w/w의 염화나트륨 농도를 가지며, 32의 °2 세타에서 뚜렷한 염화나트륨 피크를 나타낸다. 분무 건조된 농축물에서, 염화나트륨 농도는 약 14% w/w이며, 이것은 결정성 피크 높이의 감소를 야기한다. 부형제로서 트레할로즈 및 수크로즈를 첨가함으로써 염화나트륨 농도가 9%의 값으로 감소하였다. 그 결과, 결정성 피크는 단백질 및 안정화제에 의해 야기되는 무정형 헤일로를 더 이상 가리지 않았다. 소르비톨의 질량비가 이당류의 질량비보다 낮기 때문에, 염화나트륨의 결정성 피크는 소르비톨 혼합물의 WAXD 다이아그램에서 여전히 볼 수 있다.
장성( tonicity ) 계산
아펠리모마브 농축물은 원래 비경구 투여를 위해 개발되고 제형화되었기 때문에, 등장성이 중요한 인자이다[문헌 참조; Reinhart et al., Crit Care Medicine 29(4):765-769 (2001)]. 정맥내 적용을 위한 용액은 혈액과 대략 동일한 삼투압을 가져야 한다(286mosmol/kg)[문헌 참조; Kommentar zum Europaischen Arzneibuch, Wiss. Verlagsgesellschaft Stuttgart mbH, Band 2 (5.2) (2006)]. 삼투압은 문헌[참조; Deutscher Arzneimittelcodex, dt. Apotheker Verlag Stuttgart, Band 1 (Anlage B), 1-6 (2006)]으로부터의 다음의 방정식을 사용하여 동결점 강하(freezing point depression)를 통해 계산할 수 있다:
1% (w/V) 용액의 동결점 강하의 계산:
Figure pct00014
혼합물의 △T의 계산:
Figure pct00015
혼합물의 삼투압의 계산:
Figure pct00016
상기 방정식에서, △T는 순수한 물과 비교하여 물질의 1% (w/V) 용액의 동결점 강하를 나타내고, Liso는 등장 농도에서의 동결점 강하이고, Mr은 분자량이다. Liso 값은 상이한 전해질에 대해 다르다(표 11 참고). 혈청의 동결점 강하는 0.52℃(286mosmol/kg의 삼투압과 동일함)이므로, 순수한 물과 비교한 혼합물의 1% 용액의 동결점 강하에 대한 값(△Tmix)이 0.52℃를 초과해서는 안된다. 높은 분자량을 갖는 아펠리모마브는 제형의 동결점 강하에 상당한 영향을 미치지 않으므로, 계산에 포함시키지 않았다.
Figure pct00017
이러한 방정식을 사용하여, 상이한 농축물 및 혼합물은 표 12에 제공된 삼투압의 계산치를 초래한다.
Figure pct00018
생리학적 삼투압을 유지하기 위해, 보다 농축된 MAK 195F 용액을 사용하는 경우 염화나트륨의 양을 감소시킬 필요가 있다. 원래의 염화나트륨 농도는 8.8mg/mL이었다. 당해 연구에서 추정된 부형제:MAK 195F 질량비를 사용하여(농축물 12.4mg/mL 중의 25mM 부형제), 단백질 농도를 약 130mg/mL로 상승시킬 수 있으며, 단 모든 염화나트륨은 제형으로부터 제거하였다. 이것은 약 300mosmol/kg의 삼투압을 야기하였다.
요약
당해 연구는 분무 건조를 포함하는 항체 분말의 예시적인 제조 방법을 입증한다. 구체적으로, 당해 실시예에서, IgG 단편; 아펠리모마브=MAK 195F 용액을 건조 벌크 물질로 전환시켰다. 각종 부형제 및 공정 조건을 스크리닝함으로써, 저장 안정성을 겸비한 공정 안정성을 제공하는 분무 건조 공정이 개발되었다.
단백질의 물리적 또는 화학적 분해를 검지할 수 있는 각종 방법, 예를 들면, SEC 및 DLS를 통한 가용성 및 불용성 응집, DSC를 통한 열 이벤트 및 칼 피셔 적정을 통한 sd 분말의 습도를 사용함으로써 안정성을 분석하였다. 분해는 몇 가지 응력 인자에 의해 야기되는 바와 같이 건조 공정 동안 발생하거나, 승온에서의 장시간 저장의 결과이었다. IgG 단편은 당을 단백질에 첨가하여 안정화시켰다. 트레할로즈, 수크로즈 및 소르비톨을 건조 및 후속적인 저장 동안의 이들의 안정화 가능성에 대해 연구하였다.
연구의 제1 부분에서, 단백질 농축물을 특성화한 다음 부형제 없이 분무 건조시켜 건조 공정 동안의 농축물의 민감성을 확인하였다. 추가로, 적당한 공정 파라미터를 찾기 위한 시험 시리즈를 수행하였다. 순수한 농축물을 분무 건조시키면 단백질에 손상을 야기하였다. 응집의 증가는, 특히 후속적인 저장이 계획되어 있는 경우에 상당하였다(약 2%). TIn을 변화시키는 것이 응집을 감소시키거나 최소의 응집이 발생하는 공정 파라미터를 찾는데 도움이 되어야 한다.
분무 건조 공정 동안의 단백질 손상은 상이한 응력 인자(예를 들면, 열, 분무화, 전단력)의 상호작용에 의해 야기되는 것으로 보인다. 이러한 응력 인자 중의 어떤 것도 단독으로 분무 건조 공정에 필적하는 단백질의 열화를 야기할 수는 없다.
안정화 당을 10mM 내지 150mM의 다양한 농도로 단백질 농축물에 가하였다. 150mM은 적합하지 않은 것으로 보이는데, 그 이유는 액체 공급물의 고체 함량이 너무 높아 사이클론 분리기가 막히는 경향이 있고 이것이 낮은 분말 수율을 초래하기 때문이다. 부형제의 10mM 첨가는 시험된 모든 당에 대해 불충분하였다. 최선의 결과는 트레할로즈 및 수크로즈에 대해 부형제:MAK 195F = 0.7:1 및 소르비톨에 대해 0.35:1의 질량비와 동일한 25mM의 첨가에 의해 수득되었다. 50mM은 필적하는 결과를 야기하지만 목적은 첨가제의 양을 가능한 정도로 최소화시키는 것이다. 분무 건조 공정을 위한 안정화 가능성을 비교하면, 트레할로즈 및 수크로즈는 유사한 결과를 야기하였다. 소르비톨은 이당류보다 조금 열화되는 것으로 보인다. 그러나, 이것은 작은 질량비에서는 발견되지 않았으며, 이 경우 보다 많은 소르비톨의 첨가가 결과를 개선시키지 못했다. 공정 안정성에 관해, 바람직하게는 트레할로즈 또는 수크로즈의 25mM의 첨가가 권장된다.
25mM 혼합물이 공정 안정성을 위해 가장 효과적이기 때문에, 이들을 단기간 안정성 시험(3개월)에 사용하였다. 유사한 플라시보 혼합물 및 액체 농축물과 함께, sd 분말을 3개의 상이한 통상적으로 사용되는 기후(냉장고: 5℃, 중유럽: 25℃/60% RH, 동남아시아: 45℃/75% RH)에 노출시켰다. 예상한 바와 같이, 액체 농축물은 승온을 견디지 못하였으며, 1개월 후 심한 단백질 손상(응집, 단편화 및 광학 탁도)을 초래하였다. 부형제를 갖는 sd 분말은 3개월에 걸쳐 우수한 안정성을 나타내었다. 트레할로즈 뿐만 아니라 수크로즈 제형은 40℃/75% RH에서 저장하는 경우 단지 상당한 손상을 입었다(2%의 응집 증가). 심지어 25℃/60% RH는 응집에 있어서의 작은 증가(0.5%)를 제외하고는 분말에 영향을 미치지 않았다. 공정 안정성에 대한 결과가 의미하는 바와 같이, 소르비톨 또한 저장 동안 가장 불량한 안정화제이다. 5℃ 및 25℃에서 저장한 혼합물은 다른 부형제와 유사하게 안정하지만, 40℃는 소르비톨-단백질 혼합물에 대한 중요한 파라미터이다. 40℃는 혼합물의 Tg를 초과하므로, 단백질 고정에 의해 야기되는 저장 안정성이 더 이상 보장될 수 없다. 이것은 약 12%의 응집 증가를 야기하는데, 이는 당해 연구의 예비 시험에서는 관찰되지 않았다. 육안으로 볼 수 있는 것보다 작은 입자 및 탁도 측정은 만족스럽지 못한 결과를 초래하였다. 이러한 샘플은 대개 가시적인 탁도 또는 심지어 응고를 나타내었다. 안정성 연구의 주요 문제점은 분말을 저장하는데 사용되는 Al-바이알이었다. 이들은 완전한 수증기 불투과성을 나타내지 않으므로, 흡습성 분말의 잔류 수분 함량을 일정하게 유지할 수 없다.
적절한 제형에서는, 거의 모든 단백질 변화가 최소 수준으로 감소할 수 잇다. 여전히 상당한 변화를 보이는 유일한 파라미터는 탁도이다. 저장이 아니라 분무 건조 공정이 탁도의 증가를 야기한다. 더 많은 부형제의 첨가 또는 더 낮은 건조 온도의 사용에 의해 이러한 증가를 낮추려는 시도가 실패하였다. 약 5 NTU(농축물) 내지 15-20 NTU(sd 혼합물)의 탁도 증가를 피할 수 없다. 다른 분석 방법은 단백질-당 제형의 분무 건조 동안 상당한 변화를 보이지 않았다.
당해 연구의 마지막 부분에서, 분무 건조기의 보다 높은 처리량을 달성하기 위한 목적으로 액체 공급물 중의 단백질 농도를 증가시켰다. 50.6mg/mL의 단백질 농도를 사용한 실험이 이루어졌다. 보다 농축된 단백질 용액의 한외여과 뿐만 아니라 분무 건조의 공정(당 첨가제의 확인된 최선의 질량비를 가짐)은 아펠리모마브 단백질의 안정성에 상당한 영향을 미치지 않았다. 대부분의 결과(보다 높은 고체 함량에 따른 입자 오염 또는 탁도 제외)는 농축물 12.4mg/mL를 사용한 유사한 실험에 필적하였다. 사이클론 출구의 막힘을 방지할 수 있다면 100mg/mL의 농도의 분무 건조가 실행 가능할 것이다. 훨씬 더 농축된 분말을 저장성 또는 고장성(hypertony)의 위험없이 비경구적으로 투여할 수 있는데, 그 이유는 원래의 완충액이 충분한 염화나트륨을 함유하고 있고, 이것이 안정화제 교체시 제거될 수 있기 때문이다. 130mg/mL 이하의 단백질 농도가 가능할 수 있다.
항체 제형의 조성
분무 건조 실험을 앞서 기재한 바와 같이 Buchi 미니-분무 건조기 B-191에서 수행하였다. 간단히, 건조 공기를 가열 장치 및 건조 챔버에 도입하기 전에 Luwa 한외여과기 2(섬유 유리; 필터클래스: HEPA H13)를 통해 여과하였다. 모든 액체 공급물을 연동 펌프(QLF = 약 3mL/분; 실리콘 튜브 ø = 3mm)에 의해 건조 챔버로 옮기기 전에 0.22㎛ 필터 유니트를 통해 여과하였다. 분무화를 건조 질소를 사용하여 두 개의 유체 노즐에 의해 수행하였다(QAA = 700ℓ/h). 분무 건조 후, 생성된 분말을 수집 용기로부터 회수하고, 파라필름으로 밀봉된 유리 바이알(브로모부틸 고무 마개)에 충전하였다. 조성이 표 13에 요약되어 있다. 단백질 특성화를 UV/VIS, SEC, IEC, PCS, DSC, XRD & 칼-피셔법을 사용하여 수행하였다.
Figure pct00019
파라미터를 12mg/mL의 농도를 사용하는 MAK 195 F를 모델 화합물로서 사용하여 평가하였다. 도 10은 분무 건조된 MAK 195F 제형에 대한 SEC 물리적 안정성 데이터를 나타내는 두 개의 막대 그래프를 포함한다: (A) 소르비톨, 트레할로즈 및 수크로즈 (c = 25mM)의 효과 및 (B) 40℃/75% RH에서 3개월 저장한 후의 단백질 응집의 양에 대한 안정화제 농도의 효과. 도 10A에 주어진 데이터는 트레할로즈 및 수크로즈가 가장 안정한 생성물을 제공하는 반면 소르비톨은 적합한 장기간 단백질 안정성을 제공하지 못함을 나타낸다. 안정화제의 최소량은 25mM인 것으로 결정되었으며, 이는 부형제:단백질 = 0.7:1의 질량비와 같다(도 10B 참고). 도 10A에서, 각 그룹의 막대는 왼쪽에서 오른쪽으로 각각 MAK 195F(벌크), MAK 195F + 소르비톨, MAK 195F + 트레할로즈, 및 MAK 195F + 수크로즈를 나타낸다. 도 10B에서, 각 그룹의 막대는 왼쪽에서 오른쪽으로 각각 소르비톨, 트레할로즈 및 수크로즈를 나타낸다.
이러한 파라미터는 12, 50 및 100mg/mL에 이르는 단백질 농도를 사용함으로써 재현하였다. 모든 제형은 허용 가능한 분말을 제공하였다. 표 14에 나타낸 평균 잔류 수분은 4.6중량%(MAK 195 F) 내지 5.5중량%(아달리무마브)이며, 이에 따라 1% 미만의 전형적인 값을 갖는 동결건조된 제형에 비해 상당히 더 높다. 그럼에도 불구하고, 유리 전이 온도는 MAK 195F에 대해 60℃ 및 완전 항체 둘 다에 대해 대략 70℃에서 측정되었으며, 이는 적어도 5℃ 저장 온도에서 적합한 안정성을 시사한다. 이러한 고농도(100mg/mL) 분무 건조된 MAK 195F, 아달리무마브 및 ABT-325 제형의 예비 분석 데이터가 도 11에 제시되어 있다. 도 11은 200mM 트레할로즈 용액 중의 분무-건조된 고농도 MAK 195F, 아달리무마브 및 ABT-325에 대한, (A) SEC법을 사용함으로써 물리적 안정성 및 (B) IEC 방법에 의해 측정되는 화학적 안정성(가공 후 100% 표준화됨)에 대한 40℃/75% RH에서의 가공 및 3개월 저장의 효과를 나타내는 두 개의 막대 그래프를 갖는다. 도 11A에서, 각 그룹의 막대는 왼쪽에서 오른쪽으로 각각 MAK 195F(95mg/mL, 분무 건조), 아달리무마브(100mg/mL, 분무 건조); ABT-325(100mg/mL, 분무 건조); 및 ABT-325(100mg/mL, 동결건조)를 나타낸다(ABT-325(100mg/mL, 동결건조)에 대한 1개월 저장 데이터는 없으며, MAK 195F(95mg/mL, 분무 건조)에 대한 3개월 저장 데이터도 없음을 제외함).
Figure pct00020
시험된 모든 제형에 대한 데이터는 ABT-325 동결건조물에 상당하는, 40℃에서 3개월 이하의 동안 저장 및 저장 동안의 단백질의 허용 가능한 물리적 안정성을 입증한다. 그러나, 상응하는 PCS-데이터(도시되지 않음)는 단백질 특징에 대한 영향을 시사하고 있으며, 이것은 보다 상세하게 분석해야 한다. 화학적 안정성에 관해, 도 11B의 데이터는 표준 동결건조된 제형과 비교하여 분무 건조된 제형에 대한 필적하는 결과를 입증한다. 도 11B에서, 각 그룹의 막대는 왼쪽에서 오른쪽으로 각각 ABT-325(100mg/mL, 분무 건조), ABT-325(100mg/mL, 동결건조) 및 아달리무마브(100mg/mL, 분무 건조)를 나타낸다.
요약
이것은 100mg/mL 이하의 농도를 갖는 mAb 용액으로부터 분무-건조된 항체 분말을 성공적으로 제조할 수 있는 일반적인 실행 가능성을 입증한다. MAK 195F, 아달리무마브 및 ABT-325에 대해 제시된 데이터는 가공 동안 및 단백질의 물리적 또는 화학적 안정성에 관한 가속된 안정성 연구 동안 상당한 영향을 나타내지 않는다. 그러나, 분무-건조된 단백질의 관찰된 다분산(polydispersion)은 보다 상세하게 분석해야 한다.
추가로, 장기간 저장을 달성하기 위해 제형 내에 충분한 양의 안정화제가 요구된다. 그럼에도 불구하고, 당해 기술의 다용도로 인해, 이것은 벌크 약물 성분 제형에 관해서 뿐만 아니라 새로운 투여 형태 및 투여경로에 대한 흥미로운 전망을 제공한다.
참고 인용
본 출원 전반에 걸쳐 인용될 수 있는 모든 인용 문헌(참고 문헌, 특허, 특허 출원 및 웹 사이트 포함)의 내용은 명백히 본원에 참고로 인용된다. 발명의 실시는, 달리 언급하지 않는 한, 당해 널리 공지된 분무 건조 및 단백질 제형화의 통상적인 기술을 사용할 것이다.
등가물
당해 기술분야의 숙련가들은 단지 일상적인 실험을 사용하여 본원에 기재된 발명의 특별한 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 다음의 실시예에 의해 포함되는 것으로 의도된다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고 문헌, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용은 본원에 참고로 인용된다.

Claims (49)

  1. 약 50mg/mL 이상의 단백질 또는 펩타이드 및 하나 이상의 부형제를 포함하는 용액을 분무 건조시켜 단백질 또는 펩타이드 분말이 제조되도록 하는 단계를 포함하는, 단백질 또는 펩타이드 분말의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 용액이 약 100mg/mL 이상의 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 약 50mg/mL 이상의 항체 또는 이의 항원 결합 부위 및 하나 이상의 부형제를 포함하는 용액을 분무 건조시켜 항체 분말이 제조되도록 함을 포함하여 항체 분말을 제조함을 포함하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 용액이 약 100mg/mL 이상의 항체 또는 이의 항원 결합 부위를 포함하는 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 부위가 면역글로불린 G(IgG)인 방법.
  6. 제3항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 부위가 MAK 195F, 아달리무마브(Adalimumab), ABT-325, ABT-308 또는 ABT-147인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 분말이 주위 온도 및 습도에서 적어도 3개월 동안 안정한 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 분말이 40℃에서 적어도 3개월 동안 안정한 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 부형제가 트레할로즈, 수크로즈, 소르비톨, 폴리에틸렌 글리콜, 하나 이상의 아미노산, 히스티딘, 알라닌, 아르기닌, 글리신 또는 이들의 혼합물인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 용액이 약 0.27:1.0 내지 약 2.8:1.0의 부형제:단백질 비를 포함하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 용액이 약 0.27:1.0 내지 약 1.4:1.0의 부형제:단백질 질량 비를 포함하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 용액이 약 0.27:1.0 내지 약 0.7:1.0의 부형제:단백질 질량 비를 포함하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 용액이 약 0.7:1.0의 부형제:단백질 질량 비를 포함하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 용액이 약 20 내지 약 30mM의 부형제를 포함하는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 용액이 약 25mM의 부형제를 포함하는 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 약 100℃ 내지 약 180℃의 입구 공기 온도(Tin) 및 약 60℃ 내지 약 110℃의 출구 공기 온도(Tout)에서 분무 건조시킴을 포함하는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 약 130℃의 Tin 및 약 80℃의 Tout에서 분무 건조시킴을 포함하는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, 분무 건조가
    용액을 분무화(atomizing)시켜 용액 액적을 형성하는 단계;
    상기 액적을 가스로 건조시켜 분말을 형성하는 단계; 및
    상기 가스로부터 상기 분말을 회수하는 단계
    를 포함하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 용액을 압력 노즐 분무기(pressure nozzle atomizer)로 분무화시킴을 포함하는 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 사이클론을 사용하여 가스로부터 항체 분말을 분리하고 회수함을 포함하는 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 따라 분말을 제조하는 단계 및 항체 분말을 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 단계를 포함하는, 약제학적 조성물의 제조 방법.
  22. 제21항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체가 비경구, 경구, 장내 또는 국소 투여에 허용 가능한 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체가 액체를 포함하는 방법.
  24. 제21항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체가 물을 포함하는 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중의 어느 한 항에 따라 제조된, 유효량의 항체 또는 이의 항원 결합 부위를 포함하는 약제학적 제제.
  26. 제1항 내지 제24항 중의 어느 한 항에 따라 제조된, 유효량의 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 약제학적 제제.
  27. 약 6% 미만의 잔류 수분을 포함하는, 단백질 또는 펩타이드 및 부형제를 포함하는 안정한 분말상 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 단백질 또는 펩타이드가 항체 또는 이의 항원 결합 부위를 포함하는 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 부위가 IgG 항체인 조성물.
  30. 제27항 내지 제29항 중의 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 부위가 MAK 195F, 아달리무마브, ABT-325, ABT-308 또는 ABT-147인 조성물.
  31. 제27항 내지 제30항 중의 어느 한 항에 있어서, 주위 온도 및 습도에서 적어도 3개월 동안 안정한 조성물.
  32. 제27항 내지 제31항 중의 어느 한 항에 있어서, 40℃에서 적어도 3개월 동안 안정한 조성물.
  33. 제27항 내지 제32항 중의 어느 한 항에 있어서, 부형제가 트레할로즈, 수크로즈, 소르비톨, 폴리에틸렌 글리콜, 하나 이상의 아미노산, 히스티딘, 알라닌, 아르기닌, 글리신 또는 이들의 혼합물인 조성물.
  34. 제27항 내지 제33항 중의 어느 한 항에 있어서, 약 0.27:1.0 내지 약 2.8:1.0, 약 0.27:1.0 내지 약 1.4:1.0, 약 0.27:1.0 내지 약 0.7:1.0, 또는 약 0.7:1의 부형제 대 항체 또는 이의 항원 결합 부위의 질량 비를 갖고, 상기 부형제가 트레할로즈 또는 수크로즈인 조성물.
  35. 제27항 내지 제34항 중의 어느 한 항에 있어서, 약 0.27:1.0 내지 약 2.8:1.0, 약 0.27:1.0 내지 약 1.4:1.0, 약 0.27:1.0 내지 약 0.7:1.0, 약 0.7:1, 또는 약 0.35:1의 부형제 대 항체 또는 이의 항원 결합 부위의 질량 비를 갖고, 상기 부형제가 소르비톨인 조성물.
  36. 제27항 내지 제35항 중의 어느 한 항에 있어서, 분말의 잔류 수분 함량이 약 3% 미만인 조성물.
  37. 제27항 내지 제36항 중의 어느 한 항에 있어서, 단백질 또는 펩타이드, 또는 항체 또는 이의 항원 결합 부위가 이의 생물학적 활성을 유지하는 조성물.
  38. 제27항 내지 제37항 중의 어느 한 항에 따르는 유효량의 안정한 분말상 조성물을 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 단계를 포함하는, 약제학적 조성물의 제조 방법.
  39. 제38항에 있어서, 담체가 액체를 포함하는 방법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 담체가 물을 포함하는 방법.
  41. 제38항 내지 제40항 중의 어느 한 항에 있어서, 약제학적 조성물이 비경구, 경구, 장내 또는 국소 투여에 적합한 방법.
  42. 제38항 내지 제41항 중의 어느 한 항에 있어서, 분말상 조성물의 안정성에 상당한 영향을 미치지 않으면서 주위 온도보다 높은 온도에서 안정한 분말상 조성물을 추가로 가공함을 포함하는 방법.
  43. 제38항 내지 제42항 중의 어느 한 항에 있어서, 안정한 분말상 조성물을 용융 압출시킴을 포함하는 방법.
  44. 제38항 내지 제43항 중의 어느 한 항에 있어서, 분말상 조성물을 피복시킴을 포함하는 방법.
  45. 제38항 내지 제44항 중의 어느 한 항에 있어서, 분말상 조성물을 PLGA로 피복시켜 서방출 또는 지연방출 약제학적 조성물을 형성함을 포함하는 방법.
  46. 제38항 내지 제45항 중의 어느 한 항에 있어서, 장용 제피제로 피복시킴을 포함하는 방법.
  47. 제38항 내지 제46항 중의 어느 한 항에 있어서, 단백질, 펩타이드, 항체 또는 이의 항원 결합 부위의 활성이, 유기 용매에 의한 침전, 변성 또는 산화로부터 부형제에 의해 보호되는 방법.
  48. 제38항 내지 제47항 중의 어느 한 항에 있어서, 단백질, 펩타이드, 항체 또는 이의 항원 결합 부위의 활성이, PEG 400, 에탄올, DMSO, NMP 또는 빙초산에 의한 침전, 변성 또는 산화로부터 부형제에 의해 보호되는 방법.
  49. 제38항 내지 제48항 중의 어느 한 항에 따라 제조되는 약제학적 조성물.
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