KR20080016794A - 신규한 항-ｐｌｇｆ 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 병리학적 혈관형성을 치료 및/또는 예방하는데 사용하기 위한, PlGF에 대해 유도된 신규한 모노클로날 항체 및 그의 단편 및 유도체, 보다 특히 인간화 항체 및 그의 단편을 제공한다.

태반 성장 인자 (PlGF), 항-PlGF 항체, 병적 상태의 바람직하지 못한 혈관형성, 폐 고혈압

Description

신규한 항-ＰＬＧＦ 항체 {Novel anti-PLGF antibody}

본 발명은 병적 상태의 혈관형성 (angiogenesis)을 억제하는데 특히 적합한 신규 항체, 및 그의 단편 및 유도체에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 이러한 특이적 항체를 생산하는 세포주에 관한 것이다. 본 발명은 본 발명의 항체, 단편 및/또는 유도체를 포함하는 제약 조성물을 제공하고; 혈관형성 및/또는 혈관 누출이 종양 형성, 안과 질환, 폐 고혈압 및 염증 장애에서와 같이 바람직하지 못한 경우에 이러한 혈관형성 및/또는 혈관 누출을 예방 및 치료하는 방법, 및 골 장애, 예를 들어 골다공증을 예방 및 치료하는 방법을 제공한다.

비정상적인 혈관 형성은 발병률과 사망률이 높은 수 많은 질환의 발병 기전에 일조한다. 혈관 성장을 진행하고 있는 기전을 밝혀냄으로써, 허혈성 조직에서의 혈관 성장을 자극하거나 또는 종양에서의 그들의 형성을 저해하는 치료 전략을 개발할 수도 있다. 최근에 배아에서의 유전자 표적화 연구 결과, 내피 채널의 초기 형성 (혈관형성)과, 평활근 세포와 망라한 그들의 후속 성숙 (동맥형성)에 관여하는 기전 일부를 확인하였다. 별개의 분자상 기전이 병적 상태 동안 혈관의 성장을 매개할 수도 있다는 명백한 증거가 대두되고 있지만, 이러한 분자 플레이어는 대개 여전히 결정되지 않고 있다.

혈관 내피 성장 인자 (VEGF)가 혈관계의 성장과 병리학적 성장에 밀접한 영향을 미치는 것으로 확립되었다 [참고: Ferrara N. et al, 1999, Curr Top Microbiol Immunol 237, 1-30]. 더우기, VEGF의 상동체인 태반 성장 인자 (PlGF)가 각종 병적 상태, 예를 들어 허혈성 망막병증, 종양형성, 염증 장애, 및 부종 동안 VEGF의 특이적 조정인자인 것으로 또한 밝혀졌다. PlGF^-/- 마우스는 병든 상태에서는 손상된 혈관형성과 동맥형성을 나타내지만 [참고: Carmeliet P. et al., 2000, J. Pathol. 190, 387 - 405], 건강한 정상 상태에서의 생리적 혈관형성은 병에 걸리지 않은 채로 있다는 사실이 밝혀졌다. 따라서, PlGF의 억제제는 혈관형성 또는 동맥형성이 해당 질병의 발병성에 일조하는 질환을 치료하는데 상당한 효능이 있다.

PlGF에 대한 억제제는 당해 분야에 공지되어 있는데, 예를 들면 인간 PlGF에 대항한 염소 폴리클로날 항체 (공급처: R&D pharmaceuticals, Abingdon, UK) 및 치킨 폴리클로날 항체 [참고: Gassmann et al., 1990, Faseb J. 4, 2528]이다. 이들 항체를 웨스턴 블롯팅 (Western blotting), 조직화학 및 면역침전 연구에 사용하고 있다. WO O1/85796에는 종양 형성과 같은 질병을 치료 또는 예방하기 위한 PlGF의 억제제 (모노클로날 항-PlGF 항체 포함)의 용도가 기재되어 있다. 보다 구체적으로 언급하면, 뮤린 PlGF-2가 그의 수용체 Flt-1과 결합하는 것을 완전히 억제시키는 뮤린 모노클로날 항체의 제조가 기재되어 있는데, 이로써 항체 Mab-PL5D11이 가장 효율적인 억제 활성을 지닌 것으로 선별된다. 병리학적 혈관형성의 동물 모델 에 상기 항체를 사용하는 것이 기재되어 있다.

동물에서 생성된 항체는 이들을 인간 요법에 사용하는 것이 극도로 제한될 수 있는 특징을 지니고 있다. 외래 단백질로서, 이들은 문헌 [참고: Jaffers et al., 1986 (Transplantation 1986 41:572)]에 교시된 바와 같이 환자에게서 알레르기성 또는 과민성 반응을 유발시키고/시키거나 그들의 치료 효능을 경감 또는 파괴시키는 항-면역글로불린 반응 (마우스 항체의 경우, 이는 인간 항-마우스 항체 또는 HAMA로서 지칭된다)을 유발시킬 수 있다. 이러한 한계점에 역점을 두고 인간 모노클로날 항체를 사용하긴 하였지만, 다량의 인간 항-인간 항체를 통상적인 하이브리도마 기술에 의해 생성시키는 것이 어려운 것으로 입증되었다. 따라서, 당해 분야에서는 동물의 높은 결합 친화도는 유지시켜 주지만 인간에게서의 면역원성은 저하된 "인간화" 항체, 예를 들어 뮤린 모노클로날 항체를 구축하기 위해 재조합 기술을 사용하여 왔다. 특히, 비-인간 항체의 가변 영역 (V)을 인간 항체의 불변 (C) 영역과 합한 키메라 항체가 제안되었다. 이러한 키메라 면역글로불린을 수득하는 방법이 미국 특허 제5,770,198에 상세히 기재되어 있다. 뮤린 항체의 면역원성을 저하시키기 위한 또다른 시도에서는, 전체 V 도메인이 아닌 단지 상보성 결정 영역 (CDR), 즉 V 영역 중의 초가변성 영역 만을 인간 항체에 이식한다. 이러한 인간화 항체는 CDR-이식된 항체로서 공지되어 있다. 보다 복잡한 항원을 인식하는 CDR-이식된 항체를 구축하면, 본래의 비-인간화 항체 보다 상당히 더 낮은 결합 활성을 지닌 항체가 생성되었다. 수 많은 경우에서, 비-인간 CDR을 인간 항체 주쇄에 단순히 도입하는 것 만으로는 완전한 결합 활성을 유지시키는데 불충분한 것으 로 입증되었다. 인간화 항체를 설계하는데 있어 고려될 중요한 아미노산을 확인 (동정)하기 위해서는 관심있는 뮤린 항체의 정교한 컴퓨터 모델이 요구되고 이러한 설계를 위해 일반적인 이론적 지침이 제안되긴 하였지만, 모든 경우에 있어서 관심있는 특별한 비-인간 항체에 맞게 하고 최적화시킨 과정들을 수행해야만 한다.

그 결과로서, 인간 PlGF가 그의 수용체와 결합하는 것을 최적으로 억제시키는 (모노클로날) 항체가 여전히 필요하다. 더우기, 이러한 항체는 이들이 HAMA를 유발시킬 수 없다는 점에서 (또는 그렇게 할 경향이 낮다는 점에서) 비-면역원성일 필요가 있다.

발명의 요약

본 발명은 PlGF가 그의 수용체와 결합하는 것을 억제할 수 있고 PlGF에 대해 유도된 신규한 모노클로날 항체 및 그의 유도체에 관한 것이다. 본 발명은 생체내 병적 상태에서 인간 PlGF를 억제하는 것을 처음으로 입증하였다. 보다 구체적으로 언급하면, 본 발명에 따르는 항체 및 그의 유도체는 생체내 인간 종양 조직의 혈관화와 종양 크기를 저하시킬 수 있다. 본 발명의 항체는 현재 사용되고 있는 VEGF를 표적으로 하는 항혈관형성 요법에 대한 대안으로서, 이들 요법과 연관된 생리적 혈관형성의 억제에 의해 유발된 부작용을 상당히 저하시키는 중요한 이점을 지니고 있다.

본 발명은 본원에서 16D3으로서 지칭된 항체와 동일한 PlGF의 에피토프와 결합하는 항원 결합성 분자, 특히 모노클로날 항체, 그의 단편 또는 유도체 (인간화 항체 및 항체 단편 포함)에 관한 것이다.

본 발명의 첫 번째 목적은 PlGF와 결합할 수 있고 PlGF의 기능을 억제할 수 있는 능력을 지닐 수 있는 신규한 모노클로날 항체, 보다 구체적으로는 그들의 중쇄 가변 영역이 서열 2의 서열을 포함하거나 또는 CDR 영역 내에서 이러한 서열과의 서열 동일성이 80％ 이상, 보다 특히 90％ 이상, 가장 특히 95％ 이상인 서열을 포함하고/하거나 그들의 경쇄 가변 영역이 서열 4의 서열을 포함하거나 또는 CDR 영역 내에서 이러한 서열과의 서열 동일성이 80％ 이상, 특히 85％ 이상, 보다 특히 90％ 이상, 가장 특히 95％ 이상인 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체, 예를 들어 항체 16D3 또는 그의 유도체를 제공하는 것이다. 부가적으로 또는 또 다른 한편, 추가 양태에서 본 발명의 항원 결합성 분자는 CDR 영역을 벗어난 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 내에서 서열 2 및 서열 4 각각의 서열과의 서열 동일성이 70％ 이상, 특히 80％ 이상, 보다 특히 90％ 이상, 가장 특히 95％ 이상이다.

본 발명의 특정한 양태에 따르면, 상기 항체가 인간화 항체, 보다 특히 하이브리드 항체, 가장 특히 마우스/인간 하이브리드 항체, 보다 특히 하이브리드 마우스 16D3/인간 IgG1κ 또는 IgG4κ이다. 또 다른 한편, 인간화 항체는 인간 항체의 주쇄 상으로 이식된, PlGF와 결합할 수 있는 본 발명의 마우스 16D3 항체의 CDR 영역을 포함하는 것이다.

본 발명의 추가 양태는 마우스 16D3 항체 또는 그의 유도체의 항원 결합성 단편, 예를 들어 그의 인간화 항체에 관한 것인데, 예를 들면 Fab, Fab' 또는 F(ab')₂, 2개 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)의 조합물, 가용성 또는 막-고정된 단 일 쇄 가변 영역, 또는 단일 가변 도메인이 있지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 항원 결합성 단편의 특정 양태에는 16D3 또는 그의 유도체의 2개 이상의 CDR, 또는 보다 특히 서열 17 (GYTFTDYY), 서열 18 (IYPGSGNT), 서열 19 (VRDSPFFDY), 서열 20 (QSLLNSGMRKSF), 서열 21 (WAS) 및 서열 22 (KQSYHLFT)로 이루어진 군 중에서 선택된 2개 이상의 CDR를 포함하거나, 또는 이들과의 서열 동일성이 80％ 이상, 특히 85％ 이상, 보다 특히 90％ 이상, 가장 특히 95％ 이상인 2개 이상의 서열을 포함하는 단편이 포함된다. 본 발명의 특정 양태는 PlGF 활성을 억제할 수 있는 인간화 단일 쇄 가변 단편 (scFvs) 및 마우스 16D3 항체의 scFvs를 제공하는 것에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 서열 24 또는 서열 26의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 PlGF와 결합할 수 있는 CDR 내에서 상기 아미노산 서열과의 서열 동일성이 80％ 이상, 특히 85％ 이상, 보다 특히 90％ 이상, 가장 특히 95％ 이상인 서열을 포함하는 scFvs를 제공한다.

본 발명의 추가의 목적은 본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 세포주, 보다 특히 16D3 항체를 생산하는 세포주 16D3 뿐만 아니라, 예를 들어 재조합 기술의 결과로서 16D3 또는 그의 단편으로부터 유래된 항원 결합성 분자를 생산할 수 있는 또다른 세포주를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 추가의 목적은 PlGF에 대항한 항체, 즉 16D3 또는 그의 단편 또는 유도체, 보다 특히 16D3의 인간화 버젼 또는 그의 항원 결합성 단편을, 제약상 허용 가능한 담체와 함께 포함하는, 포유류에게서 병적 상태 또는 장애의 (바람직하지 못한) 혈관형성을 예방 또는 치료하기 위한, 또는 골 흡수를 예방 또는 치료하기 위한 제약 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 구체적 양태는 Fab, Fab' 또는 F(ab')₂, 가용성 또는 막-고정된 단일 쇄 가변부 또는 단일 가변 도메인으로 이루어진 군 중에서 선택되는, 16D3 또는 그의 유도체의 항원 결합성 단편을 포함하는 제약 조성물이다. 본 발명의 가장 특정한 양태는 서열 17 (GYTFTDYY), 서열 18 (IYPGSGNT); 서열 19 (VRDSPFFDY), 서열 20 (QSLLNSGMRKSF), 서열 21 (WAS) 및 서열 22 (KQSYHLFT)로 이루어진 군 중에서 선택된 2개 이상의 CDR, 또는 서열 17 내지 22로 이루어진 군 중에서 선택된 2개의 상이한 서열과의 서열 동일성이 80％ 이상, 특히 85％ 이상, 보다 특히 90％ 이상, 가장 특히 95％ 이상인 2개 이상의 서열을 포함하는 항원 결합성 단편을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 그의 특정한 양태는 본 발명의 16D3 항체의 scFv, 보다 특히 서열 17 (GYTFTDYY), 서열 18 (IYPGSGNT); 서열 19 (VRDSPFFDY), 서열 20 (QSLLNSGMRKSF), 서열 21 (WAS) 및 서열 22 (KQSYHLFT)로 이루어진 군 중에서 선택된 2개 이상의 CDR, 또는 서열 17 내지 22로 이루어진 군 중에서 선택된 2개의 상이한 서열과의 서열 동일성이 80％ 이상, 특히 85％ 이상, 보다 특히 90％ 이상, 가장 특히 95％ 이상인 2개 이상의 서열을 포함하는 scFv, 예를 들어 서열 24를 포함하는 scFv를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 가장 특히, 본 발명의 제약 조성물은 16D3의 인간화 scFv, 예를 들어 서열 26, 또는 PlGF와 결합할 수 있는 CDR 내에서 상기 서열과의 서열 동일성이 80％ 이상, 특히 85％ 이상, 보다 특히 90％ 이상, 가장 특히 95％ 이상인 서열을 포함하는 인간화 scFv를 포함한다.

본 발명에 따르는 제약 조성물의 또 다른 특정한 양태에서는, 본 발명의 PlGF와 결합할 수 있는 항원 결합성 분자 이외에도, 치료상 유효량의 또 다른 항혈관형성제가 포함된다. 이러한 국면에서 가장 특히, VEGF- 및 bFGF-억제제와 같은 항혈관형성제가 고려되고, 가장 특히는 항-VEGF 항체가 고려된다.

본 발명의 또 다른 목적은 본원에 기재된 PlGF와 결합하는 항체의 항원 결합성 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 보다 특히 세포주 16D3에 의해 생산된 16D3의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 것이다. 가장 구체적으로는, 서열 2 및 서열 4의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 고려된다. 부가적으로, 16D3의 2개 이상의 CDR를 포함하는 항원 결합성 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 보다 구체적으로는 서열 17 (GYTFTDYY), 서열 18 (IYPGSGNT); 서열 19 (VRDSPFFDY), 서열 20 (QSLLNSGMRKSF), 서열 21 (WAS) 및 서열 22 (KQSYHLFT)로 이루어진 군 중에서 선택된 2개 이상의 CDR을 코딩하거나, 또는 서열 17 내지 22와의 서열 동일성이 80％ 이상, 특히 85％ 이상, 보다 특히 90％ 이상, 가장 특히 95％ 이상인 2개 이상의 CDR을 포함하는 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 고려된다. 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 구체적 양태가 서열 1, 3, 5 및 6에 제공된다. 추가의 구체적 양태에는 16D3 및 그의 인간화 버젼의 scFv를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 보다 특히 서열 23 및 서열 25의 서열, 및 보다 특히 scFv의 CDR 영역을 코딩하는 영역 내에서 상기 서열과의 서열 동일성이 80％ 이상, 특히 85％ 이상, 보다 특히 90％ 이상, 가장 특히 95％ 이상인 서열이 포함된다. 그러나, 유전자 암호의 중복 결과로서 본 발명의 범위에 해당하는 다수의 뉴클레오티드 서열이 존재한다는 것을 인지해야 할 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 치료 또는 예방이 필요한 포유류에게, 본 발명의 항체 16D3 또는 그의 항원 결합성 단편 또는 유도체, 가장 특히 본원에 기재된 바와 같은 scFv인 활성 성분의 치료상 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유류에게서 병적 상태의 바람직하지 못한 (또는 병리학적) 혈관형성을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 방법에 특히 적합한 것은 인간화 항체 및 항체 단편, 예를 들어 16D3 또는 그의 유도체의 scFvs이다. 본 발명의 방법의 특정한 양태는 병적 상태, 예를 들어 암, 염증, 안과 질환, 폐 고혈압 및 혈관 누출 등을 치료 및/또는 예방하는 것에 관한 것이다. 본 발명의 특정한 목적은 포유류, 보다 특히 인간에게서 병리학적 혈관형성, 보다 특히 종양 성장, 염증, 안과 질환 또는 혈관 누출에 대한 유효하고도 안전한 요법 (즉, 부작용이 없음)을 제공하는 것이다. 가장 특히 본 발명의 방법은 고형 종양, 보다 특히 결장암, 유방암, 췌장암 및 흑색종을 치료 및/또는 예방하는데 적합하다.

본 발명의 항체 및 항원 결합성 단편의 추가의 용도는 인간 샘플 중에서의 PlGF를 면역학적으로 탐지하고, 진단 방법에서 표지된 표적화 부분으로서, 및 암을 치료하는데 있어서 PlGF 억제에 대한 부가 효과를 지닌 화합물을 스크리닝하기 위한 것에 관한 것이다.

본 발명은 PlGF를 극히 효율적으로 억제하는 신규한 리간드, 즉 신규한 뮤린 및 인간화 모노클로날 항체, 및 그의 단편, 유도체 및 동족체의 놀라운 결정에 근거한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 종양 성장을 저하시킬 수 있는, 가장 특히 종 양 크기를 20％ 내지 50％ 감소시킬 수 있는 리간드를 입증하고 있다.

본 발명을 본원에 기재된 구체적 양태들로 제한하지 않는 다음 설명은 본원에 참고로 도입된 첨부된 도면과 연계해서 이해될 수 있다.

도 1: 본 발명의 특정 양태에 따라서 ELISA 시험을 이용한, 인간 PlGF-2 [피치아 (Pichia)에서 생성됨]에 대한 항체 16D3 (A) 또는 인간화 항체 16D3 (hul6D3) (B)의 결합도.

도 2: 본 발명의 특정 양태에 따라서 ELISA 시험을 이용한, 항체 16D3 (사각형) 또는 인간화 항체 16D3 (삼각형)에 의한 인간 Flt-1 수용체에 대한 PlGF-2 결합의 억제.

도 3: 본 발명의 특정 양태에 따르는 시험에서 항체 16D3 및 그의 Fab 단편의 억제 능력을 연구하기 위해 rhuPlGF-2를 CM5 칩 상에 고정화시킨 비아코어 (Biacore) 실험 결과.

도 4: 모노클로날 항체 16D3은 피하 인간 췌장 DanG 이종이식편 종양 모델에서 종양 성장을 억제한다. 본 발명의 특정 양태에 따라서, 대략 60 ㎣의 종양이 있는 nu/nu 마우스를 항-tPA ('대조군 IgG') (1C8; 50 mg/kg 체중; n=10), 항-hPlGF 16D3 ('항-hPlGF') (50 mg/kg 체중; n=10), 항-mPlGF [PL5D11D4 (WO 01/85796에 기재된 바와 같이 수득함); 50 mg/kg 체중; n=10], 항-hPlGF 16D3과 항-mPIGF PL5D11D4의 조합물 ('항-hPlGF/항-mPlGF') (각각 25 mg/kg 체중; n=10) 및 '비히클' (n=10)로 처리하였다. 종양 접종 후 18일 간의 (A) 종양 크기 및 (B) 종 양 중량.

도 5: 모노클로날 항체 16D3은 피하 인간 췌장 DanG 이종이식편 종양 모델에서 종양 성장을 용량 의존적 방식으로 억제한다. 본 발명의 특정 양태에 따라서, 대략 60 ㎣의 종양이 있는 nu/nu 마우스를 항-hPlGF 16D3 (50 mg/kg = 'lOOO ㎍'/'C', 37.5 mg/kg = '750 ㎍'/'D', 25 mg/kg = '500 ㎍'/'E', 12.5 mg/kg = '250 ㎍/'F'; 각 농도에 대한 n=10), 대조군 IgG ('1C8'/'B'; 50 mg/kg) 및 '비히클'/'A' (n=10)으로 처리하였다. A: 종양 세포 접종 후 평균 종양 크기의 발달 결과; B: 20일 째의 평균 종양 크기.

도 6: 모노클로날 항체 16D3은 피하 인간 유방 MDA-MB 이종이식편 종양 모델에서 종양 성장을 억제한다. 본 발명의 특정 양태에 따라서, 대략 60 ㎣의 종양이 있는 nu/nu 마우스를 항-hPlGF 16D3 (50 mg/kg 체중; n=10) 또는 비히클로 1주 3회 처리하였다. 접종 후 32일 째에 결정된 바와 같은, A: 종양 중량 및 B: 종양 용적.

도 7: 모노클로날 항체 16D3은 피하 인간 결장 LOVO 이종이식편 종양 모델에서 종양 성장을 억제한다. 본 발명의 특정 양태에 따라서, 대략 60 ㎣의 종양이 있는 nu/nu 마우스를 항-hPlGF 16D3 (50 mg/kg 체중; n=10) 또는 비히클로 1주 3회 처리하였다. 접종 후 30일 째에 결정된 바와 같은, A: 종양 중량 및 B: 종양 용적.

도 8: 모노클로날 항체 16D3은 피하 인간 흑색종 Me12a 이종이식편 종양 모델에서 종양 성장을 억제한다. 본 발명의 특정 양태에 따라서, 대략 60 ㎣의 종양 이 있는 nu/nu 마우스를 항-hPlGF 16D3 (50 mg/kg 체중; n=10) 또는 비히클로 1주 3회 처리하였다. 접종 후 53일 째에 결정된 바와 같은 종양 중량.

도 9: 모노클로날 항체 16D3은 피하 인간 췌장 DanG 이종이식편 종양 모델에서 체중 손실을 예방한다. 본 발명의 특정 양태에 따라서, 대략 60 ㎣의 종양이 있는 nu/nu 마우스를 항-hPlGF 16D3 (50 mg/kg 체중; n=10), 대조군 IgG, 항-hPlGF와 항-mPlGF의 조합물 (각각 25 mg/kg 체중; n=10) 및 비히클 (n=10)로 처리하였다. 체중 손실률을 계산하기에 앞서 체중으로부터 종양 중량을 감수하였다. 흰색 막대: 처리 첫 날의 체중; 검은색 막대: 처리 마지막 날의 체중.

도 10: 모노클로날 항체 16D3 및 아바스틴 (Avastin)은 피하 인간 췌장 DanG에서 종양 성장 억제에 대한 부가 효과를 발휘한다. 본 발명의 특정 양태에 따라서, 대략 60 ㎣의 종양이 있는 nu/nu 마우스를 항-hPlGF 16D3 (37.5 mg/kg, 25 mg/kg, 12.5 mg/kg 체중; 각 농도에 대해 n=10), 대조군 IgG (1C8; 50 mg/kg), 아바스틴 (15 mg/kg 및 5 mg/kg 체중, 1주 2회 복강내, 각각 n=10) 및 항-hPlGF (12.5 mg/kg 체중)와 아바스틴 (5 mg/kg 체중; n=10)의 조합물로 처리하였다. 종양 접종한지 20일 후에 마우스를 희생시키고, 종양 용적을 결정하였다.

도 11: 본 발명의 특정 양태에 따르는 뮤린 항체 16D3의 가변부의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열. A: 중쇄의 가변부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; B: 경쇄의 가변부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; C:중쇄의 가변부의 아미노산 서열; D: 경쇄의 가변부의 아미노산 서열. 본 발명의 한 양태에 따라서 인간화 목적을 위해 변형시킬 수 있는 뉴클레오티드 또는 아미노산이 밑줄쳐져 있다.

도 12: 본 발명의 특정 양태에 따르는 16D3의 인간화 가변부의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열. A: 중쇄의 인간화 가변부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; B: 경쇄의 인간화 가변부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; C:중쇄의 인간화 가변부의 아미노산 서열; D: 경쇄의 인간화 가변부의 아미노산 서열. 인간화 목적을 위해 변형시킨 뉴클레오티드 또는 아미노산이 밑줄쳐져 있다.

도 13: 293 세포에서 인간화 16D3 scFv를 발현하기 위한 벡터의 예시.

도 14: A: PlGF에 대한 scFvl6D3 및 인간화 scFvl6D3의 결합도; B: scFvl6D3 및 인간화 scFvl6D3에 의한, huPlGF-2가 그의 수용체 huFlt-1과 결합하는 것의 억제.

도 15: A: 뮤린 항체 16D3의 scFv의 아미노산 서열; B: 항체 16D3의 인간화 scFv의 아미노산 서열. 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 벗어난 영역이 밑줄쳐져 있다.

도 16: 본 발명의 특정 양태에 따라서, 293 세포에서 인간화 16D3 Fab를 발현하기 위한 벡터의 예시.

도 17: A: 본 발명의 특정 양태에 따라서 ELISA 시험을 이용한, huPlGF에 대한 인간화 Fab l6D3의 결합도; B: 인간화 Fab l6D3에 의한, huPlGF-2가 그의 수용체 huFlt-1과 결합하는 것의 억제.

정의

본원에 사용된 바와 같은 용어 '16D3'는 BCCM/LMBP에 번호 LMBP 6399CB로 기탁된 세포주에 의해 생산된 PlGF에 대항한 모노클로날 항체를 지칭한다.

용어 "항체 단편"은 단독으로 또는 또다른 단편과 병용해서, 그에 대항하여 상응하는 항체를 생성시킨 항원과 결합할 수 있는 항체 분자의 일부분을 지칭한다. 전형적인 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv 또는 scFv인데, 이들은 완전한 항체에 필적하는 항원 친화성을 종종 보유하고 있다. 보다 작은 단편에는 중쇄 또는 경쇄의 상보성 결정 영역 또는 CDR, 예를 들어 CDRl, CDR2 및 CDR3, 및/또는 그들의 2개 이상의 조합물이 포함된다.

용어 "유도체"는 항원에 대한 결합성에 상당한 영향을 미치지 않으면서 본래의 항체 (예를 들어, 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 바와 같음) 또는 그의 단편을 변형시킨 항원 결합성 분자를 지칭한다. 전형적인 변형에는 본래의 항체 또는 그의 단편을 또다른 분자 (예: 표지 또는 비드)와 결합시키기 위해, 또는 당화를 변형시키기 위해, 예를 들어 인간화 맥락에서 아미노산 서열 상에 존재하는 관능기를 변형시키거나 또는 본래의 항체의 아미노산 서열을 변형시키는 것이 포함된다. 따라서, 유도체에는 본래의 항체의 가변 영역 및/또는 CDR 중의 하나 이상을, 동일하거나 상이한 종의 또 다른 항체 또는 단편의 주쇄 상에 이식 또는 도입함으로써 수득한 항체 또는 또다른 항원 결합성 분자, 인간화 항체, 또는 하이브리드 항체가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 특정 항체의 유도체에는 항원 결합성 분자 (예: 합성 폴리펩티드)를 생성시키는, 이러한 항체의 하나 이상의 CDR의 대체 구조물이 포함된다.

본원에 사용된 바와 같은 "인간화 항체 또는 항체 단편"은 본래의 항체와 비교해서, 인간 항체와 보다 근접하게 닮도록 하기 위해 아미노산을 대체시킨 항체 또는 그의 단편을 치칭한다. 이들 치환의 대부분은 항체 또는 항체 단편의 주쇄, 즉 비-항원 결합성 영역 내에서 일어날 것이다. 그러나, CDR 내에서는 항원과의 결합에 전혀 참여하지 않거나 거의 참여하지 않는 아미노산을 치환시킬 수도 있는 것으로 고려된다.

본원에 사용된 바와 같은 "다시 만든 (reshaped)" 항체 또는 항체 단편 또는 "하이브리드 항체"는 2가지 이상 상이한 항체 (이는 임의로, 동일하거나 상이한 종으로부터 유래될 수 있다)의 일부를 포함하는 항체를 지칭한다. 전형적으로, 인간 하이브리드 항체는 또 다른 항체 (이는 관심있는 항원에 대항하여 유도된다)의 인간화 가변 영역과 연결된 하나의 항체의 인간 불변 영역일 수 있거나, 또는 항원 결합성 영역 중의 아미노산 서열을 또 다른 항체, 예를 들어 관심있는 인간 항원에 대항하여 유도시킨 비-인간 항체로부터의 서열로 대체시킨 하나의 항체의 인간 항체 주쇄일 수 있다. 보다 특히, 관심있는 항원에 대한 친화성을 지닌 하나의 (통상 비-인간) 항체의 항원 결합성 영역, 예를 들어 하나 이상의 CDR 또는 그의 가변 영역 또는 가변부를, 또 다른 (통상 인간) 항체 (예: CDR-이식된 항체)의 주쇄 내로 도입한다.

본 발명의 2가지 이상의 항원 결합성 분자와 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "상동성"은 동일한 항원, 보다 특히 동일한 에피토프와 결합할 수 있는 항원 결합성 분자의 능력을 지칭한다. 동일한 에피토프와 결합할 수 있는 2가지 항원 결합성 분자의 능력은 이러한 항원 결합성 분자가, 예를 들어 경쟁적 결합 검정에서 동일한 항원과의 결합을 놓고 서로 경쟁할 수 있는지를 결정함으로써 평가할 수 있다. 이러한 항원에 대한 상동성 항원 결합성 분자의 결합은 유사한 특이성을 지녀야 한다.

본원에 사용된 바와 같은 두 서열의 "서열 동일성"은 이러한 두 서열을 정렬한 경우에, 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산을 갖는 위치 수를 보다 짧은 서열 내의 뉴클레오티드 또는 아미노산 수로 나눈 것에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 서열 동일성이 70 내지 80％ 초과, 바람직하게는 81 내지 85％, 보다 바람직하게는 86 내지 90％, 특히 바람직하게는 91 내지 95％, 가장 바람직하게는 96 내지 100％, 보다 구체적으로는 100％이다. 가변 영역의 주쇄가 항원과의 결합성에 기여하는 바가 일반적으로 제한된다는 관점에서 보면, 서열 동일성은 상보성 결정 영역 또는 CDR 내의 서열과 관련하여, 즉 CDR에 기여하는 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 관련하여 본원에서 가장 흔히 명시된다. 따라서, 특정 서열이 'CDR 내에서의' 특이적 서열 전반에 걸쳐, 예를 들어 80％ 서열 동일성을 갖는다고 명시한 경우에는, CDR를 구성하고 있는 서열과 관련해서만 두 서열 간의 서열 동일성을 제공해야 한다.

용어 "PlGF"는 태반 성장 인자를 지칭하기 위해 본원에 사용된다. PlGF는 주로 2가지 스플라이스 변이체 또는 이소형, 즉 149개 아미노산의 PlGF-1 및 170개 아미노산의 PlGF-2으로 존재하는 것으로 밝혀졌는데, 이들은 카복시 말단 영역에 21개 아미노산 삽입물을 포함하고 있고, 또다른 이소형 또한 밝혀졌다.

PlGF에 대한 항체 또는 그의 단편 또는 유도체를 지칭하는 경우의 용어 '억제성'은 해당 항체, 단편 또는 유도체가, PlGF가 그의 수용체 Flt-1과 결합하는 것을 억제할 수 있다는 것을 나타내기 위해 사용된다.

상세한 설명

본 발명은 특정 양태들 및 특정 도면들을 참고로 하여 기재될 것이지만, 본 발명은 이들로 제한되지 않고 단지 청구의 범위에 의해서만 제한된다.

본 발명은 본원에서 항체 16D3으로서 지칭된 항체와 동일한 PlGF의 에피토프와 결합하는 항원 결합성 분자, 특히 모노클로날 항체, 그의 단편 또는 유도체에 관한 것이다. 세포주 LMBP 6399CB에 의해 생산된 "항체 16D3"은 인간 기원의 PlGF에 대항하여 생성되었고, 이는 인간 PlGF (양 이소형 PlGF-1 및 PlGF-2)과 결합한다. 항체 16D3는 인간 PlGF가 그의 수용체 flt-1과 결합하는 것을 억제하여, PlGF-활성을 억제한다. 따라서, 16D3 항체 자체 및 그의 단편 또는 유도체 뿐만 아니라 이러한 항체, 단편 또는 유도체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 치료 맥락에서, 그리고 시험 또는 스크리닝을 위한 동물 모델에서 PlGF를 억제하기 위해 사용할 수 있다. 또 다른 한편으론, 상기 항체를 생체내, 생체외 또는 시험관 내에서 PlGF를 탐지하고/하거나 정량화하는데 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 항원 결합성 분자 및 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 상이한 적용을 제공한다. 본 발명은 추가로, 본 발명의 항원 결합성 분자의 생성 방법, 및 이들 항원 결합성 분자를 생산할 수 있는 세포주에 관한 것이다.

본 발명의 제1 국면은 본 발명의 항원 결합성 분자를 생산하는 세포주, 보다 특히 16D3과 동일한 항원과 결합할 수 있는 모노클로날 항체, 또는 그의 단편 또는 유도체를 생산하는 세포주에 관한 것이다. 이러한 본 발명의 국면의 특정 양태는 모노클로날 항체 16D3을 생산하고, 트롬보 (Thromb)-X에 의해 2005년 3월 29일자로 BCCM/LMBP (Belgian Co-ordinated Collections of Microorganisms/Plasmid Collection Laboratorium voor Moleculaire Biologie, University of Ghent K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Ghent, BE)에 기탁 번호 LMBP 6399CB로서 기탁된, '세포주 16D3'으로서 지칭되기도 하는 하이브리도마 세포주이다. 본 발명은 추가로, 모노클로날 항체 16D3으로부터 유래된 모노클로날 항체를 생산하는 세포주를 제공한다. 이러한 세포주는 모노클로날 항체 16D3에 대한 코딩 서열, 가장 특히 16D3의 비-항원 결합성 영역을 코딩하는 코딩 서열을 변형시킴으로써 수득할 수 있다. 만들어질 변형물의 성질을 결정하는 방법과, 적합한 변형물의 예가 본원에 기재되어 있다.

본 발명의 제2 국면은 항체 16D3과 동일한 항원과 결합할 수 있는 항원 결합성 분자에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 PlGF와 결합할 수 있고 PlGF 활성을 억제할 수 있는, 상기 언급된 세포주 16D3에 의해 생산된 항체 16D3, 및 그의 상동체, 단편 및 유도체에 관한 것이다.

따라서, 본 발명의 특정한 양태는 세포주 LMBP 6399CB에 의해 생산된 바와 같은 항-인간 PlGF 항체 모노클로날 항체 16D3, 및 이러한 항체의 단편을 제공한다. 모노클로날 항체 16D3는 서열 2 및 서열 4에 각각 기재된 바와 같은 그의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열을 특징으로 한다.

구체적 양태에 따르면, 본 발명은 항체 16D3의 단편, 보다 특히 항원 결합성 단편에 관한 것이다. 이러한 단편에는 Fab, Fab', F(ab')₂, CDR's, 항체의 일부 또는 그의 CDR의 서열을 갖는 펩티드, 단일 가변 도메인 및 이들의 조합물이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. Fab, Fab' 및 F(ab')₂ 단편은 당해 분야에 널리 공지된 방법, 예를 들어 문헌 [참고: Stanworth et al., Handbook of Experimental Immunology (1978), vol.l chapter 8 (Blackwell Scientific Publications)]에 기재된 방법을 사용하여 모노클로날 항체를 단백질 분해적 분해시킴으로써 생성시킬 수 있다. 항원과 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있는 이러한 단편은 모 항체의 수 많은 특성, 예를 들어 보체 활성화 또는 Fc 감마 수용체와 결합할 수 있는 능력은 상실하였다. 보다 구체적으로 언급하면, 본 발명은 서열 2 및 서열 4에 각각 상응하는 16D3의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 포함하는 단편을 제공한다. 본 발명의 추가의 특정한 양태는 16D3 및 그의 유도체의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 단편에 관한 것이다. CDR를 확인하기 위해 가장 흔히 수행되고 있는 2가지 방법은 IMGT와 KABAT이고, 16D3의 어느 한 유형의 CDR 중의 하나 이상을 포함하는 단편 뿐만 아니라 이들 단편 또는 CDR을 포함하는 16D3의 유도체가 본 발명의 맥락 내에서 고려된다. CDR를 IMGT 확인하는 방법에 따르면, 16D3의 가변 영역 내의 CDR 영역은 서열 17 (GYTFTDYY), 서열 18 (IYPGSGNT); 서열 19 (VRDSPFFDY), 서열 20 (QSLLNSGMRKSF), 서열 21 (WAS) 및 서열 22 (KQSYHLFT)에 상응한다. 따라서, 본 발명은 서열 17 내지 22에 제공된 바와 같은 16D3의 CDR 중의 하나 이상을 포함하는 항체 16D3의 단편을 제공해준다.

본 발명의 추가의 구체적 양태는 16D3의 가용성 또는 막-고정된 단일 쇄 가변부인 16D3의 단편을 제공한다. 단일 쇄 가변 단편 (scFv)은 가요성 펩티드 링커에 의해 함께 연결된, 면역글로불린의 가변 중쇄 (VH)와 경쇄 (VL), 또는 그의 일부로 통상 이루어진, 유전 공학적으로 처리시킨 항체 단편이다. 임의로, scFvs는 관심있는 항체의 CDR 영역과, 또 다른 항체의 골격 영역을 포함한다. 이러한 scFv 골격 및/또는 CDR 영역의 아미노산을 임의로 인간화하여, 인간에게서 제약으로서 사용하기 위해 항원성을 저하시킨다. 본 발명은 서열 24 및 서열 26을 각각 포함하는, 16D3 및 그의 인간화 버젼의 scFv를 제공한다. 항체의 단일 쇄 가변부를 수득하는 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 본원 실시예 6에 기재되어 있다. 예를 들어, 상기 방법은 인간 중쇄 및 경쇄의 가변부의 DNA 서열을 별개의 반응으로 증폭시키고 클로닝한 다음, 15개 아미노산 링커 서열, 예를 들어 (Gly4 Ser)3을 2-단계 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) [참고: 예를 들어, Dieffenbach and Dveksler, "PCR Primer, a laboratory manual" (1995), Cold Spring Harbour Press, Plainview, NY, USA]에 의해 VH와 VL 사이에 삽입하는 것을 포함할 수 있다. 이어서, 이로써 생성된 단편을, 단일 쇄 가변 단편을 가용성 또는 파아지-디스플레이된 폴리펩티드로서 발현하기에 적합한 벡터 내로 삽입할 수 있다. 이는 당업자에게 널리 공지된 방법, 예를 들어 문헌 [참고: Gilliland et al., Tissue Antigens (1996) 47: 1-20]에 기재된 방법에 의해 달성할 수 있다.

본 발명은 또한 항체 16D3의 초가변 영역 또는 그의 조합물의 대표적인 항원 결합성 펩티드인, 16D3의 단편을 제공한다. 이러한 펩티드는 어플라이드 바이오시스템 (applied biosystem) 합성기, 예를 들어 폴리펩티드 합성기 [예: Milligen (USA)으로부터 입수 가능한 모델 9050, 또는 관련된 기술로부터의 모델]를 사용하여 합성함으로써 수득할 수 있다.

본 발명의 추가의 양태는 항체 16D3의 유도체 또는 그의 단편에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 서열 2 및 서열 4에 각각 기재된 바와 같은 가변 중쇄 영역 및/또는 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체에 관한 것이지만, 이들의 불변 영역은 16D3에서의 불변 영역과 상이하다. 부가적으로 또는 또 다른 한편, 본 발명의 항체 16D3의 유도체는 서열 17 (GYTFTDYY), 서열 18 (IYPGSGNT); 서열 19 (VRDSPFFDY), 서열 20 (QSLLNSGMRKSF), 서열 21 (WAS) 및 서열 22 (KQSYHLFT)에 제공된 바와 같은 16D3의 CDR 중의 2개 이상을 포함하지만, CDR 간의 골격 영역 및/또는 불변 영역은 상이하다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 서열 2 및 서열 4에 각각 제공된 16D3의 중쇄 및 경쇄 가변 영역과의 서열 동일성이 80％ 이상, 특히 85％ 이상, 보다 특히 90％ 이상, 가장 특히 95％ 이상인 항체 16D3의 유도체 또는 그의 단편이 제공된다. 가장 특히, 본 발명은 CDR 영역 내에서 서열 2 및 서열 4 각각과의 서열 동일성이 80％ 이상, 특히 85％ 이상, 보다 특히 90％ 이상, 가장 특히 95％ 이상인 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 16D3의 유도체 또는 그의 단편을 제공한다. 골격 영역 내에서의 서열 동일성은 80％ 미만일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 또한, 서열 17 내지 22의 서열 각각과의 서열 동일성이 80％ 이상, 특히 85％ 이상, 보다 특히 90％ 이상, 가장 특히 95％ 이상인 2개 이상의 CDR를 포함하는 유도체가 고려된다.

추가의 양태에 따르면, 본 발명은 가장 특히는 CDR 영역 내에서 서열 24와의 서열 동일성이 80％ 이상, 특히 85％ 이상, 보다 특히 90％ 이상, 가장 특히 95％ 이상인 서열, 및 서열 26과의 서열 동일성이 80％ 이상, 특히 85％ 이상, 보다 특히 90％ 이상, 가장 특히 95％ 이상인 서열을 포함하는 16D3의 scFv의 유도체를 제공한다.

또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 인간화되는 16D3의 유도체 또는 그의 단편을 제공한다. 이러한 16D3의 인간화 유도체는 이들이 PlGF에 대한 결합 친화성을 보유하고 있다는 점에서 상동성이다. 특정한 양태에 따르면, 16D3의 인간화 유도체는 PlGF 활성을 억제할 수 있는 능력을 보유하기도 한다. 비-인간 항체를 인간화시키는 것은 이러한 항체의 주쇄 중의 하나 이상의 아미노산, 즉 항체와 항원 간의 결합에 관여하지 않는 아미노산을 대체시켜 인간 항체의 주쇄와 보다 근접하게 닮도록 함으로써 달성한다. 상이한 유형 또는 수준의 인간화가 고려된다. 본 발명의 특정한 양태는 비-인간 항체 또는 단편의 전체 영역, 보다 특히 불변 영역(들)을 인간 항체의 불변 영역(들)으로 대체시켜 키메라 (예: 인간/뮤린) 항체 또는 단편이 생성되도록 한 항체 또는 단편에 관한 것이다. 추가의 특정한 양태는 PlGF에 대항한 비-인간 항체의 항원 결합성 아미노산 (예: 2개 이상의 CDR)을 인간 항체 (예: CDR-이식된 항체)의 주쇄 내로 도입한 항체이다. 비-인간 모노클로날 항체로부터의 결합성 상보성 결정 영역 ("CDR")을 인간 골격 영역, 특히 인간 유전자의 불변 C 영역과 연합시키는 방법는 당업자에게 공지되어 있는데, 예를 들어 문헌 [참고: Jones et al. in Nature (1986) 321:522 or Riechmann in Nature (1988) 332:323]에 기재되어 있다. 또 다른 한편, 본 발명의 비-인간 항-PlGF 항체의 보다 제한된 수의 아미노산을 대체시키는 것이 또한 고려된다. 본 발명의 특정한 양태는 도 9의 인간화 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역 또는 그의 일부를 포함하는 항체; 및 서열 17 내지 22의 CDR 중의 2개 이상, 보다 특히 3개 내지 5개, 가장 특히 6개 모두를 포함하는 항체에 관한 것이다. 본 발명의 추가의 양태는 서열 6 및 서열 8 각각과의 서열 동일성이 80％ 이상, 특히 85％ 이상, 보다 특히 90％ 이상, 가장 특히 95％ 이상인 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역을 포함하는 인간화 항체에 관한 것이다. 또 다른 한편, 본 발명은 서열 17 내지 22 각각과의 서열 동일성이 80％ 이상, 특히 85％ 이상, 보다 특히 90％ 이상, 가장 특히 95％ 이상인 CDR를 2개 이상, 보다 특히 3개 내지 5개, 가장 특히 6개 포함하는 인간화 항체를 제공한다.

따라서 본 발명은 뮤린 항체 16D3으로부터 유래된 인간화 및/또는 키메라 또는 하이브리드 항체에 관한 것이다. 특정한 양태에서는, 뮤린 항체 16D3의 특이적 아미노산을 돌연변이시켜 면역원성 아미노산을 제거한다. 따라서 특정한 양태에서, 본 발명은 서열 2에 따르는 중쇄 가변부 아미노산 서열 (여기서, 다음 아미노산 중의 하나 이상을 변화시켰다: I2V, P9A, K40A 및/또는 T111L)을 포함하는 항원 결합성 분자에 관한 것이다. 부가적으로 또는 또 다른 한편, 항체 16D3으로부터 유래된 인간화 항체는 서열 4에 따르는 경쇄 가변부 아미노산 서열 (여기서, 다음 아미노산 중의 하나 이상을 변화시켰다: S5T, S9D, A15L, K18R, R22N 및/또는 L89V)을 포함하는 항원 결합성 분자이다. 따라서 특정한 양태에 따르면, 본 발명은 서열 2에 따르는 중쇄 가변부 아미노산 서열 (여기서, 다음 아미노산 중의 하나 이상을 변화시켰다: I2V, P9A, K40A 및/또는 T111L)과 서열 4에 따르는 경쇄 가변부 아미노산 서열 (여기서, 다음 아미노산 중의 하나 이상을 변화시켰다: S5T, S9D, A15L, K18R, R22N 및/또는 L89V) 둘 다를 포함하는 항원 결합성 분자를 제공한다.

또 다른 양태에서는, 뮤린 항체 16D3의 (인간화) 가변 경쇄 및/또는 중쇄를 인간 면역글로불린 프레임에 이식시키거나 또는 인간 항체의 불변 영역, 보다 특히 인간 IgG 불변 영역과 커플링시킴으로써, 상기 항체를 추가로 인간화시킨다. 이러한 측면에서 특히 적합한 것은 체내에서 천연 킬러 세포를 활성화시킬 수 있는 IgG1κ (IgG1-카파)이다. 따라서 특정한 양태에서, 본 발명은 하이브리드 Hul6D3 - IgG1κ에 관한 것이다. 본 발명의 대체 양태는 하이브리드 Hul6D3 - IgG4κ 하이브리드이다. 인간 IgG 항체 (및 따라서, 인간 IgG 주쇄 및/또는 불변 영역을 사용하여 수득한 하이브리드 항체)는 연장된 반감기를 나타내므로, 극히 안정한 혈장 수준을 제공하고, 투여 횟수를 현저하게 감소시켜줄 수 있다. 추가로, 인간화 항체 또는 유도체를 사용하는 것이 면역 반응 유도 위험을 최소화시켜 준다.

본 발명의 추가의 양태는 항체 16D3 또는 그의 단편과 상동성인 항원 결합성 분자, 즉 항체 16D3와 동일한 에피토프와 결합하는 항원 결합성 분자에 관한 것이다. 한 양태에서는 상동성 항원 결합성 분자가, 예를 들어 마우스에 PlGF를 주사한 다음 비장 림프구를 마우스 골수종 세포주와 융합한 후, 항-PlGF 항체를 생산하는 세포 배양물을 확인하고 (예를 들어, PlGF와의 결합에 대해 스크리닝함으로써 수행함) 이들을 클로닝함으로써, 동물 (특히, 마우스)에게서의 면역시 생성된다. 임의로, 항체의 추가 선별은 16D3 에피토프와의 반응성에 기초하거나, 또는 항체 16D3 또는 그의 단편과의 경쟁에 기초하여 수행한다.

따라서 본 발명의 또 다른 국면은 본 발명의 항원 결합성 분자를 생성하는 방법에 관한 것이다. 이들 방법에는 본원 실시예 섹션에 제공된 바와 같이 항체 16D3으로의 인간화 방법이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 국면은 본 발명의 항원 결합성 분자, 가장 특히 그의 항원 결합성 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 것에 관한 것이다. 본 발명의 특정한 양태는 서열 2 및 서열 4로써 각각 규정된 가변 중쇄 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 항체 16D3의 중쇄 및 경쇄 영역을 코딩하는 세포주 16D3의 서열에 상응하는 서열 1 및 서열 3의 뉴클레오티드 서열 등에 관한 것이다. 또한 본 발명의 맥락에서 서열 17 내지 22에서 확인된 바와 같은 모노클로날 항체 16D3의 CDR 영역 하나 이상을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 제공된다. 본 발명의 특정한 양태에는 16D3의 scFvs 및 인간화 scFvs를 코딩하는 서열, 예를 들어 각각 서열 23 및 서열 25가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 본 발명은 또한, 본원에 기재된 16D3의 유도체 및 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 본 발명은 또한, 상기 지칭된 뉴클레오티드 서열과 특이적으로 혼성화할 수 있는 프로브 및 프라이머, 예를 들어 본 실시예 섹션에 기재된 프라이머 등을 제공한다.

본 발명에는 또한, 본원에 기재된 모노클로날 항체, 그의 단편 또는 유도체를 코딩하는 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열이 포함된다.

본 발명의 또 다른 국면은 본 발명의 항원 결합성 분자의 치료적 적용에 관한 것이다. 따라서 본 발명은 약물로서의 본 발명의 항원 결합성 분자의 용도를 제공한다. 이와 관련하여, 본 발명은 혈관형성이 해당 질병 또는 장애의 병리상태에 일조하는 질병 또는 장애를 예방하거나 치료하기 위한, 본 발명의 하나 이상의 항원 결합성 분자를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 따라서, 혈관형성이 해당 질병 또는 장애의 병리상태에 일조하는 질병을 치료하고/하거나 예방하는 방법은 이러한 치료 또는 예방을 필요로 하는 포유류에게, 본원에 기재된 하나 이상의 항원 결합성 분자를 포함하는 조성물의 치료상 유효량을 투여하는 것을 포함한다.

상기 질병에서는, 혈관형성이 '병리학적 혈관형성'으로서 지칭되기도 한다. 이러한 병리학적 혈관형성의 예에는 혈관의 병리상태 (아테롬성 경화증, 혈관종, 혈관내피종), 뼈 및 관절의 병리상태 [류마티스성 관절염, 활막염, 뼈 및 연골 파괴, 골수염, 판누스 (pannus) 성장, 골돌기체 (osteophyte) 형성, 신생물 및 전이], 피부의 병리상태 [사마귀, 화농성 육아종, 모발 성장, 카포시 (Kaposi) 육종, 켈로이드성 반흔 (흉터), 알레르기성 부종, 신생물], 간, 신장, 폐, 귀 및 기타 상피의 병리상태 [염증성 및 감염성 과정, 예를 들어 간염, 사구체신염, 폐렴, 천식, 비 용정 (nasal polyp), 이염, 및 이들 기관에서의 이식, 재생, 신생물 및 전이], 자궁, 난소 및 태반의 특정한 병리상태 [예를 들어, 자궁내 피임 장치로 인한 기능이상 자궁 출혈, 난포낭 형성, 난소 과자극 증후군, 자궁내막증, 신생물], 뇌 또는 신경의 병리상태 (신생물 및 전이), 특정의 심장 및 골격근 통증 (예를 들어, 과로로 인함), 지방 조직의 병적 상태 (비만) 및 내분비 기관의 병적 상태 (갑상선염, 갑상선 비대, 췌장 이식)에서 관찰된 혈관형성이 포함된다. 병리학적 혈관형성은 조혈 질병 (AIDS, 카포시), 혈액학적 악성 종양 (백혈병 등)의 원인이 될 수도 있다.

수 많은 안과 질환에서는 병리학적 혈관형성이 중요한 요인인 것으로 여겨지고 있으므로, 본 발명의 항원 결합성 분자를 이용한 치료가 고려된다. '망막 허혈성 질환'에서는 망막에 혈액과 산소 공급이 저하되고, 망막의 말초 부분에 있는 영양 공급원이 상실됨에 따라 그의 기능이 중단된다. 망막병증의 통상적인 원인은 중추 망막 정맥 폐색증, 경동맥 동맥 협착증, 당뇨병 (당뇨병성 망막병증) 및 빈혈 (겸상적혈구 망막병증)이다. 망막병증은 미숙아에게서도 관찰된다 (미숙아 망막병증). 당뇨병성 망막병증은 당뇨병 환자의 시력 상실의 주요 원인이다. 허혈성 망막에서는 새로운 혈관 성장이 일어난다 (신생혈관증식). 이들 혈관은 종종, 망막 표면 상에서, 광신경에서, 또는 홍채 상의 안구 정면에서 성장한다. 새로운 혈관은 필요한 영양분의 유동을 대체시킬 수 없고, 대신 유리체 출혈, 망막 박리, 및 제어되지 않은 녹내장과 같은 많은 문제점을 유발시킬 수 있다. 이들 문제점은 새로운 혈관이 허약하고 출혈되기 쉽기 때문에 일어난다. 증식성 당뇨병성 망막병증을 그의 초기 단계에서 포착한 경우에는, 이를 범망막 광응고 (panretinal photocoagulation)를 이용하여 종종 저지할 수 있다. 그러나, 몇몇 경우에는 유리체절제 수술 만이 유일한 선택권이다. 혈관형성이 결정적 역할을 하는 것으로 여겨지는 기타 안과 질환은 맥락막 및 기타 안내 장애, 백질연화증 (leukomalacia), 및 신생물 및 전이이다. 맥락막 신생혈관증식은 브루크막 (Bruch membrane) 파열로 인해 맥락막으로부터 새로운 혈관이 성장하여 망막하 색소 상피 (sub-RPE) 또는 망막하 공간 내로 유입되는 것이다. CNV의 위치, 성장 패턴 및 유형 (1 또는 2)은 환자의 연령과 진행되고 있는 질병에 좌우된다. 가시적 증상을 고려하면, 추가 성장과 함께 출혈과 삼출이 일어난다. 맥락막 신생혈관증식 (CNV)는 시력 상실의 주요 원인이다. CNV는 근시환자의 5 내지 10％에게서 발생하고 치유기 동안 거의 모든 맥락막 파열에서 발생하는 것으로 추정되는데; 환자의 15 내지 30％에서는 대부분이 자발적으로 원 상태로 돌아가지만, CNV는 재발될 수 있고 시력 상실을 동반하면서 출혈성 또는 장액성 황반 박리를 유발시킬 수도 있다.

용어 '폐 고혈압'은 폐 동맥 내의 혈압이 비정상적으로 높은 장애를 지칭한다. 기타 심장 또는 폐 질환이 없는 경우에는 이를 원발성 폐 고혈압으로 지칭한다. 병적 동맥형성의 결과로서 폐 세동맥의 확산성 협소화가 일어난 다음, 혈류에 대한 저항 증가에 대한 반응으로서 폐 고혈압이 발생한다. 발병률은 100,000명당 8명이다. 그러나, 폐 고혈압은 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 예를 들어 폐기종, 만성 기관지염 또는 확산성 간질성 섬유증의 합병증으로서 발생할 수도 있고 천식형 (asthmatiform) COPD 환자에게서 발생할 수도 있다. COPD의 발병률은 10,000명당 대략 5명이다.

혈관형성이 질병의 병리상태에 일조하고 본 발명의 항원 결합성 분자를 사용하여 치료하는 것이 고려되는 질병의 추가 예는 염증 장애군이다. 본원에 사용된 바와 같은 '염증'은 살아있는 조직을 손상시키는 제어되지 않은 국소 반응 (즉, 물리적 반응, 화학적 반응 또는 감염 결과로서의 반응), 특히 소혈관, 그들의 내용물 및 이와 관련된 구조물의 국소 반응을 의미한다. 혈액 구성분이 혈관벽을 통과하여 조직 내로 유입되는 것이 염증이 특징이고, 이로써 형성된 조직 콜렉션 (collection)이 삼출액 또는 부종으로 불리운다. 살아있는 조직에 손상을 가하는 모든 유해 과정, 예를 들어 세균 감염, 과도한 열, 냉기, 기계적 손상, 예를 들면 압박, 산, 알칼리, 자외선 또는 바이러스 감염은 이에 관여한 기관이나 조직에 상관없이 염증을 유발시킬 수 있다. 이러한 '염증 질환'에는 화상에서 부터 폐렴까지의 반응, 나병, 결핵 및 류마티스성 관절염이 포함된다.

수술 후 유착 형성 (POA)은 여성생식계, 골반 및 심장 수술시 자주 발생하는 외과적 합병증이다. 조직에 대한 외과적 외상은 영구적 반흔 형성을 종종 유발시키는데, 이는 외상성 조직을 또 다른 기관으로 연결시켜 준다. 따라서 이러한 손상 부위에서는, 정상적으로는 별개로 유지되어야 하는 내부 조직이 종종 함께 연결되어 있다. 부착 형성으로부터 비롯되는 합병증은 장 폐쇄증, 소장 폐쇄증, 만성 골반 통증, 및 여성 불임이다. 의학적 의미에서의 용어 "유착 형성"은 교착 (conglutination), 즉 두 표면 또는 부분의 유착 또는 결합 과정을 지칭한다. 예를 들어, 상처 반대면이나 복막 반대면이 결합한다. 또한 복수형 유착은 장액 반대면을 연결시켜 주는 염증 밴드를 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 유착에는 또한, 섬유소성 유착이 포함되는데, 이는 혈장 또는 림프의 삼출이나 혈액의 혈관외 유출로부터 비롯되는 피브린의 가느다란 실로 이루어진 유착이다. 손상 부위에서 발생하거나 종종 자발적으로 발생하는 섬유모세포 조직의 평활한 과잉발육인 켈로이드 (keloid) 또한 유착의 한 형태이다. 태반 성장 인자 (PlGF)를 억제시키면 수술 후 유착 형성이 현저하게 저해된다는 사실이 밝혀졌다 [참고: WO03063904].

더우기, 골 흡수를 특징으로 하는 질병, 예를 들어 골다공증 등이 PlGF 억제로부터 이득을 볼 수 있는 것으로 입증되었다 [참고: WO2004002524].

따라서, 구체적 양태에 따르면 본 발명의 항원 결합성 분자는 종양 성장과 전이, 안과 질환, 염증, 유착 형성, 및 폐 고혈압의 치료 및/또는 예방에 특히 적합하다.

본 발명의 추가의 특정한 양태는 암, 예를 들어 유방암, 폐암, 전립선암, 뇌암, 간암, 췌장암, 결장암, 신장암, 자궁암 또는 골수암 등을 예방하고/하거나 치료하기 위한, 본 발명의 항원 결합성 분자의 용도에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 고형 종양, 예를 들어 결장암, 유방암, 췌장암 및 흑색종 등을 예방하고/하거나 치료하기 위한, 본 발명의 항원 결합성 분자의 용도에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명의 항체가 인간 췌장 종양의 퇴행을 획득하는데 특히 적합하다는 사실을 입증하는 데이터가 본원에 제공된다. 본 발명의 항체는 생체내 종양 크기를 상당히 저하시키는 것으로 입증되었는데, 약 50％ 까지의 크기 감소를 나타낸다. 따라서 본 발명은 종양 크기를 20％ 이상, 보다 특히 30％ 이상, 가장 특히 50％ 이상 감소시키기 위한 방법 및 제약 조성물을 제공한다.

본 발명의 추가의 특정한 양태는 골 장애의 치료 또는 예방에 있어서, 및 보다 구체적으로는 골 흡수가 증강되는 질환, 예를 들어 골다공증 또는 골연화증을 치료하기 위한, 본 발명의 항원 결합성 분자의 용도에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 상기 언급된 질환들을 치료하기 위한 약물을 제조하기 위한, 본 발명의 항원 결합성 분자의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 중요한 국면은, 본 발명의 항체, 그의 단편 및 유도체가 또다른 항혈관형성 치료, 보다 특히 VEGF와 같은 혈관형성성 인자를 표적으로 하는 대체 요법을 이용한 경우에 예상되거나 유발되는 부작용 없이 상기 언급된 질환들을 치료 및/또는 예방할 수 있게 해준다는 것이다. 1999년 정도 빠른 시기에 재조합 인간 항-VEGF 항체를 이용하여 전임상 안전성 시험을 수행한 결과, VEGF를 억제하면 생리적 혈관형성이 억제되는 것으로, 보다 특히는 세로 길이로 뼈 성장하는 신생혈관증식과 황체 (corpora lutea) 형성이 일어나는 것으로 입증되었다 [참고: (Ryan et al., 1999) Toxicologic pathology 27(l):78-86]. 최근의 연구는 VEGF 억제제가 건강한 기관 및 갑상선에서 혈관 퇴행을 유발시켜 기관 기능이상을 야기시킬 수 있다고 보고하였다 [참고: Baffert et al, 2004, Circ Res 94:984-992; Inai et al., 2004 Am J Pathol 165:35-52]. 그럼에도 불구하고, 항-인간 VEGF 항체인 베바시주마브 (bevacizumab)는 상처 치유, 혈압 및 혈전증 위험에 대해 관찰된 그의 영향력에도 불구하고 종양 퇴행에 대한 이러한 항혈관형성 접근방식의 전반적인 효능때문에, 현재 혈관형성 억제제로서 시판되고 있다. 본 발명의 항-PlGF 항체 및 유도체는 혈압, 상처 치유, 혈전증 위험, 및 건강한 기관에서의 혈관 퇴행에 대한 상기 관찰된 부작용없이 바람직하지 못한 혈관형성을 억제시킬 수 있다.

본 발명의 특정한 양태는 활성 성분으로서 모노클로날 항체 16D3 또는 그의 단편 또는 유도체를, 제약상 허용 가능한 담체와 함께 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 제약 조성물은 치료상 유효량의 하나 이상의 항원 결합성 분자를 포함한다. 유사하게, 본 발명은 치료상 유효량의 본 발명의 하나 이상의 항원 결합성 분자를 투여하는 것을 포함하는, 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다.

본원에 사용된 바와 같은 치료상 유효량은 치료하고자 하는 포유류 체중 kg당 약 0.5 mg 내지 약 50 mg, 보다 바람직하게 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 범위 내의 양을 의미한다. 대부분의 IgG 인간 항체의 반감기가 길다는 측면에서 보면, 이러한 부류의 모노클로날 항체인 본 발명의 항원 결합성 분자는 환자의 위안에 참여하는 치료 주기성을 누릴 것이란 사실을 인지해야 할 것이다.

본 발명의 또 다른 국면에 따르면, 본 발명의 항원 결합성 분자와 또 다른 항혈관형성제를 포함하는 제약 조성물 뿐만 아니라 본 발명의 항원 결합성 분자와 또 다른 항혈관형성제를 동시에 또는 순차적으로 투여하는 치료 방법이 제공된다. 실제로, 본 발명은 종양 성장의 억제에 대한 본 발명의 항원 결합성 분자와 항혈관형성제 (예: 항-VEGF 항체)의 부가 효과를 입증해준다. 보다 특히, 본 발명의 16D3 항체와 아바스틴 (Avastin^®)을 병용해서 사용하는 것이 종양 크기를 약 70％ 정도까지 감소시킬 수 있지만, 아바스틴 단독 또는 항-PlGF 항체의 투여량을 증가시키면 동일한 질환에서 종양 크기를 55％ 초과해서 감소시키지 못한다는 사실이 입증되었다. 적합한 또다른 항혈관형성제 뿐만 아니라 이들이 속하는 부류에 따라서 그들의 통상적인 투여량은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 항혈관형성제의 예에는 VEGF에 대해 직접 작용하는 VEGF의 억제제, 예를 들어 아바스틴 (Avastin™)이란 상표명으로 시판되고 있는 VEGF에 대항하여 유도된 항체, 또는 VEGF 수용체 상에서 작용하는 항체가 포함된다. 본 발명의 항체를 사용하여, 상기 언급된 바와 같은 수 많은 부작용을 유도시키는 것으로 공지되어 있는 VEGF 억제성 항혈관형성제의 투여량을 감소시킬 수 있다.

본 발명의 제약 조성물은 치료하고자 하는 질병에 대항하여 활성인 또다른 화합물/약물, 보다 특히 종양 성장, 염증, 안과 질환 및 폐 고혈압을 치료하는데 유용한 또다른 화합물/약물의 치료상 유효량을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 제약 조성물에 사용하기 적합한 제약 담체는, 예를 들어 문헌 [참고: Remington's Pharmaceutical Sciences 16^th ed. (1980)]에 기재되어 있고, 이들의 제형화는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 이에는 모든 용매, 분산 매질, 피복제, 항균제 및 항진균제 (예를 들어, 페놀, 소르브산, 클로로부타놀), 등장성제 (예를 들어, 당 또는 염화나트륨) 등이 포함된다. 해당 조성물 중의 모노클로날 항체 활성 성분의 작용 기간을 제어하기 위한 부가의 성분을 포함할 수도 있다. 따라서, 적당한 중합체 담체, 예를 들어 폴리에스테르, 폴리아미노산, 폴리비닐 피롤리돈, 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체, 메틸셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스, 프로타민 설페이트 등을 선택함으로써 제어 방츨 조성물을 달성할 수 있다. 약물 방출 속도와 작용 기간은 또한, 모노클로날 항체 활성 성분을 중합체성 물질, 예를 들어 히드로겔, 폴리락트산, 히드록시메틸셀룰로스, 폴리메틸 메타크릴레이트 및 상기 언급된 다른 중합체의 입자 (예: 미소캡슐) 내로 도입함으로써 제어할 수 있다. 이러한 방법에는 리포솜, 미소구, 마이크로에멀션, 나노입자, 나노캡슐 등과 같은 콜로이드성 약물 전달 시스템이 포함된다. 투여 경로에 따라서, 활성 성분을 포함하는 제약 조성물은 보호 피막을 요구할 수도 있다. 주사용으로 적합한 제약 형태에는 멸균성 수성 용제 또는 분산제, 및 그의 즉석 제조를 위한 멸균성 산제가 포함된다. 따라서, 전형적인 담체에는 생체적합성 수성 완충제, 에탄올, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 그들의 혼합물이 포함된다.

본 발명의 항원 결합성 분자는 당해 분야에 널리 공지된 모든 수단, 즉 경구, 비내, 피하, 근육내, 피내, 정맥내, 동맥내, 비경구 또는 카테터삽입에 의해 환자에게 제공될 수 있다.

본 발명의 특정한 국면에 따르면, 본 발명의 항원 결합성 분자를 유전자 요법에 의해 투여한다. 항체에 의거한 유전자 요법으로 인해, 항체 투여와 연관된 수 많은 잠재적 한계사항, 예를 들어 대규모 생산, 생체내 분포, 신속한 혈액 청소 및 1가 항체의 불량한 정체를 극복할 수 있게 된다. 생체내 생성으로 인해, 해당 항체는 덜 면역원성이 되고 보다 잘 관용되므로, 효과적이고 지속적인 수준의 본 발명의 항원 결합성 분자 또는 그의 단편이 생성된다. 더우기, 유전적 접근 방식은 새로운 기능을 수반한 항원 결합성 분자를 제공해줄 수 있다. 생체내 생성의 실현 가능성과 상이한 세포/조직에 의한 모노클로날 항체의 전신 전달은 바이러스성 벡터에 의한 생체내 유전자 전이를 이용하여 입증되었다 [참고: Pelegrin et al., 2004, Gene Ther 4: 347-356]. 섬유육종 세포를 항혈관형성 활성을 지닌 항-라미닌 (anti-laminin) 항체로 유전자-변형시킴으로써 시험관내 및 생체 내에서 종양 성장을 저하시킨다는 것이 또한 입증되었다 [참고: Sanz et al. 2001, Cancer Immunol Immunother 50:557-565].

따라서, 이러한 양태에 따르면 본 발명은 본원에 기재된 병리학적 혈관형성을 특징으로 하는 질병을 치료하는데 있어서 유전자 요법에 사용하기 위한, 본 발명의 항원 결합성 분자를 코딩하는 뉴클레오티드를 제공한다. 특히 본 발명은 유전자 요법에 사용하기 위한, 서열 2로써 규정된 가변 중쇄 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및/또는 서열 4로써 규정된 가변 경쇄 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물을 제공한다. 보다 특히, 본 발명은 항체 16D3의 중쇄 및 경쇄 영역을 코딩하는 세포주 16D3의 서열에 상응하는, 서열 1 및/또는 서열 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물을 제공한다. 또한 본 발명의 맥락 내에서, 서열 17 내지 22에서 확인된 바와 같은 모노클로날 항체 16D3의 CDR 영역 중의 하나 이상을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물이 제공된다. 본 발명의 특정한 양태에는 16D3의 scFvs 및 인간화 scFvs를 코딩하는 서열, 예를 들어 각각 서열 23 및 서열 25가 포함된다.

본 발명에 따르는 치료 및/또는 예방 방법은, 제약 조성물 표제 하에 상기 언급된 바와 같은 항혈관형성제 또는 항종양제의 치료상 유효량을 환자에게 투여, 바람직하게는 순차적으로 투여함으로써 동일한 병리학적 혈관형성 질환을 추가로 치료하거나 예방하는 것을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 '순차적으로'란 본 발명의 리간드와 공지된 항혈관형성제를 환자에게 동시가 아닌 순차적으로 투여하는 것을 의미한다.

본 발명의 또 다른 국면은 인간 샘플 중에서의 PlGF를 면역학적 탐지하기 위한, 및 이러한 탐지에 적합한 키트의 구성분으로서의, 본 발명의 항원 결합성 분자의 용도에 관한 것이다. 항원의 면역학적 탐지 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 이에는 EIA, ELISA 및 RIA 및 면역조직화학적 방법이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 본 발명의 뮤린 항체가 PlGF 항원과 결합하는지는, 예를 들어 표지된 항-마우스 항체를 통하여 간접적으로 탐지할 수 있다. 또 다른 한편, 상기 항체 또는 그의 단편을 직접 표지시킬 수 있다. 이러한 본 발명의 국면의 구체적 양태는 항-PlGF를 이용한 치료에 대해 감수성인 환자를 확인하는데 있어서의, PlGF에 대항한 항체 및 그의 항원 결합성 단편의 용도에 관한 것이다. 이는 암을 치료하는 데에 있어 특히 흥미롭다.

본 발명의 또 다른 국면은 진단 도구로서의, 본 발명의 항원 결합성 분자의 용도에 관한 것이다. 수 많은 병적 상태에서는 PlGF 발현이 상향 조절되는 것으로 당해 분야에서 밝혀졌다. 보다 특히, 수 많은 종양은 PlGF를 과발현하는 것으로 입증되었다. 본 발명의 인간화 항체 또는 항체 단편은, 예를 들어 본 발명의 항체 또는 항원 결합성 단편을 표지시키고 생체 내에서 가시화시키는 영상화 기술에 의해 상기 병적 상태를 진단하는데 사용할 수 있다. 생체 내에서 본 발명의 항원 결합성 분자의 결합을 영상화하기 위한 각종 표지가 당해 분야에 공지되어 있고, 이에는 광학 (예: 형광성), 금속 및 자기 표지가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다 [이들 각각은 특수 (방사선 및) 탐지 장치를 필요로 한다]. 이러한 본 발명의 국면의 특정한 양태는 질병 예후를 예측하고 치료 섭생을 결정하는데 있어서의, 본 발명의 항체의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 국면은 항-PlGF 요법과 병용해서 사용하기 위한 화합물을 스크리닝하기 위한 동물 모델에 있어서의, 본 발명의 항원 결합성 분자의 용도에 관한 것이다. 이러한 모델에는 종양 모델이 포함되므로, nu/nu 마우스에서의 인간 종양 세포의 성장과 발생이 고려된다. 시험하고자 하는 화합물과 본 발명의 항체 또는 단편을 병용 투여함으로써, 이러한 화합물이 본 발명의 항체 또는 단편을 단독으로 투여하는 경우에 관찰된 효과에 대한 부가 효과를 지니고 있는지를 확인할 수 있다. 기타 국면, 예를 들어 항-PlGF 항체와 병용한 특정 화합물의 반대-유효성 또는 독성을 이러한 방식으로 결정할 수도 있다.

상기 언급된 치료적 적용 이외에도, 상기 언급된 본 발명의 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어 재조합 방법에 의해 항체 및 또다른 항원 결합성 단편을 생성하는데 유용하다. 따라서 본 발명은 항체 유전자의 클로닝 및 조작, 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열을 이용한 scFv 및 또다른 항원 결합성 단편의 생성을 포함한, 재조합 항체 및 항체 단편의 생성 방법을 추가로 제공한다. 이들 방법의 프로토콜은 당해 분야에서 입수 가능하다. 부가적으로, 본 발명의 뉴클레오티드 서열과 특이적으로 혼성화하는 프로브를 사용하여 본 발명의 항체 및 항체 단편의 발현에 대해 스크리닝할 수 있다.

본 발명은 단지 예시 목적으로만 제공되는 다음 실시예에 의해 추가로 기재된다.

실시예 1 - 뮤린 항- 인간 PlGF 항체 (16D3)의 생성 및 성상 확인

1. 마우스의 면역 및 융합

인간 PlGF에 대항한 모노클로날 항체는 본질적으로 문헌 [참고: Galfre F, Milstein C. Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures. Method Enzymol 1981; 73: 3-46]에 기재된 바와 같이 생성하였다. 간략하게 설명하면, PlGF 녹아웃 (knock-out) 마우스 [참고: Luttun et al., 2002, Biochem Biophys Res Comm 295(2):428-34, Carmeliet et al. (2001), Nat Med 7:575-593 or WO01/85796]에게 완전 프로인트 아주반트 (Complete Freund's adjuvant) 중의 50 ㎍ 재조합 인간 P1GF-2 (Pichia에서 생성됨)를 피하 주사한 다음, 2주 후에 불완전 프로인트 아주반트 중의 50 ㎍ 재조합 인간 P1GF를 피하 주사함으로써, 상기 마우스를 면역시켰다. 10일 후 상기 마우스의 꼬리로부터 혈액 샘플 (약 100 ㎕)을 수집하였다. 혈청을 대상으로 하여, 포획물로서 인간 P1GF로 피복시킨 미세역가 판을 사용하여 ELISA함으로써 항-huP1GF 항체에 대해 시험하였고, 희석된 혈청 (1/500 내지 1/8000)을 적용하며, 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)-접합된 염소-항-마우스 IgG를 태그화하였다.

6주 이상의 간격 후, 세포 융합하기 4일 및 2일 전에 식염수 중의 50 ㎍ 재조합 인간 P1GF를 상기 마우스 (고 양성 반응을 나타냄)에게 복강내 투여함으로써 추가 면역시켰다.

비장 세포를 분리하고, 이를 Sp2/0-Agl4 골수종 세포와 융합하였다. 히포크 산틴, 아미노프테린, 티미딘 배지에서 선별한 후, 배양 상등액을 상기 언급된 바와 같은 ELISA 내로 적용함으로써 양성 클론을 선별하였다.

2. ProSep vA Ultra 상에서의 항체 정제

항체를 제조업자의 프로토콜에 따라서 ProSep vA Ultra (공급처: Millipore) 상에서 친화 크로마토그래피함으로써 세포 배양 상등액으로부터 정제하였다. 간략하게 언급하면, 150 mM NaCl을 상기 상등액에 가하고, 상등액을, PBS로 예비평형시킨 ProSep vA Ultra 칼럼 상으로 부하하였다. 이 칼럼을 PBS로 세척하고, 결합된 단백질을 0.1 M 글리신 pH 2.8으로 용출시켰다. 용출된 단백질을 BPS로 ON 투석시켰다. SDS-PAGE에 의해 환원성 및 비-환원성 조건 하에, 용출된 단백질의 순도를 검사하였다.

3. PlGF에 대한 16D3/hul6D3 (실시예 2에 기재된 바와 같이 수득함)의 결합도 (도 1 참고)

ELISA 판을 4℃에서 PBS 중의 1 ㎍/ml huPlGF-2 (Pichia) (100 ㎕/웰)로 ON 피복시켰다. 실온에서 1시간 동안 1％ BSA로 차단시킨 후, 16D3/hul6D3의 희석 시리즈를 가하고 (100 ㎕/웰), 항체를 실온에서 1시간 동안 결합시켜 두었다. 결합된 16D3은 실온에서 1시간 동안 염소-항-인간 또는 염소-항-뮤린 IgG-HRP (공급처: Sigma) (100 ㎕/웰)로 탐지하였다. 본 검정을 OPD로 전개하였다.

4. huFlt-1 수용체에 대한 PlGF 결합의 억제 (도 2 참고)

ELISA 판을 4℃에서 1 ㎍/ml huFlt-1 (공급처: R&D Systems) (200 ㎕/웰)로 ON 피복시켰다. 실온에서 1시간 동안 1％ BSA로 차단시킨 후, 16D3/hul6D3의 희석 시리즈를 가하고 (100 ㎕/웰), 100 ㎕/웰의 huPlGF-2를 더 가하였다. 실온에서 2시간 동안 항온 배양한 후, 결합된 PlGF를 실온에서 1시간 동안 염소-항-huPlGF (공급처: R&D Systems), 180 ㎕/웰로 탐지한 다음, 실온에서 1시간 동안 RAG-HRP (공급처: DAKO)와 함께 항온 배양하였다. 본 검정을 OPD로 전개하였다.

5. 비아코어 실험을 이용한 16D3 및 Fab 16D3의 추가의 성상 확인

● 억제: EDC/NHS 화학 (아민 커플링 키트, Biacore)을 이용하여 CM5 칩 상에 rhuPlGF-2 (공급처: Pichia, TX)를 고정화시켜 412 RU를 수득하였다. 16D3을 주사한 다음, rhuFlt-1/Fc 키메라 (공급처: R&D Systems)를 주사하였다. 이를 또한, 마우스 항체 대신 완충제를 사용하여 수행하였다. 이들을 또한 음성 대조군 유동 채널 상으로 주사하였는데, 이들 값은 이미 감수하였다. 이 검정을 pH 9.6 하의 인산염 완충제 중에서 수행하였다.

rhuPlGF-2에 대한 rhuFlt-1의 최대 결합과 비교해서, 처음 16D3 또는 16D3Fab를 주사한 경우에는 rhuFlt-1의 신호가 감소하였다 (도 3).

6. 16D3의 마우스 가변 영역의 클로닝 및 서열 분석

● mRNA 분리: 퀵프렙 (QuickPrep™) 마이크로 mRNA 정제용 키트 (공급처: Amersham Biosciences)를 사용하여, 16D3의 하이브리도마 세포의 mRNA를 분리하였다. 이러한 mRNA를 사용하고, 제1-가닥 cDNA 합성용 키트 (공급처: Amersham Biosciences)를 사용하여 (이 키트에서 이용 가능한 pd(N)₆ 프라이머를 이용함) cDNA를 만들었다.

● PCR: 다음 프라이머 콜렉션을 이용하여 PCR을 수행함으로써, 중쇄 및 경쇄의 가변부의 서열을 밝혀내었다: 리더 서열에서 출발하는 8개 프라이머와 중쇄의 불변 영역 중의 2개, 리더 서열에서 출발하는 11개 프라이머 및 경쇄의 불변 영역 중의 1개. 상이한 프라이머 조합을 이용하여 8가지 및 11가지 PCR 반응을 수행하였다.

항체 16D3의 중쇄에 대해 사용된 프라이머:

MHVR3 5'-ATG GRA TGG AGC TGK ATC WTT HTC-3' (서열 9 )

MHCRl 5'-CAS AYM CAG GGG CCA GTG GAT AGA C-3' (서열 10)

항체 16D3의 경쇄에 대해 사용된 프라이머:

MKVR3 5'-ATG RAG TCA CAK ACY CAG GTC TTY RTA-3' (서열 11)

MKCRl 5'-GCT CAC TGG ATG GTG GGA AGA TGG-3' (서열 12)

PCR 설정: 94℃에서 10분간 변성, 94℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 1분간 연장, 72℃에서 5분간 연장, 주기 수 30회.

서열 9 내지 11의 서열에서의 중복성은 통상적인 약어를 이용하여 표시하였다: R = A 또는 G, K = G 또는 T, W = A 또는 T, H = A 또는 C 또는 T, S = C 또는 G, Y = C 또는 T, M = A 또는 C.

● 클로닝 및 서열 분석: PCR 생성물을 아가로스 겔 상에 부하하고, 우측 밴드를 선별하며, 정제 (QIAquick^® 겔 추출용 키트; 공급처: Qiagen GmbH)한 다음, 서열 분석용 키트 (Zero Blunt^® TOPO^® PCR Cloning Kit) (공급처: Invitrogen™ life technologies)에 제공된 pCR^®4Blunt-TOPO^® 벡터에서 클로닝하였다. 고 순수 플라스미드 분리용 키트 (공급처: Roche Diagnostics GmbH)를 사용하여 플라스미드 DNA를 제조하고, ABI PRISM™ 310 (공급처: PE Applied Biosystems) 상에서 T7 및 M13 역배향 프라이머를 사용하여 삽입물을 서열 분석하였다.

● 항체 16D3의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 서열 1, 2, 3 및 4에 제시되었다 (도 11 참고).

실시예 2 - 인간화 항-인간 PlGF 항체 (16D3)의 생성 및 성상 확인

1. 인간화 16D3의 구축

가변 영역의 인간화

● 돌연변이: 마우스 항체 16D3의 가변부를 인간화시키기 위해 다음 돌연변이를 만들었다:

중쇄: I2V

P9A

K40A

T111L

경쇄: S5T

S9D

A15L

K18R

R22N

L89V

● QuickChange^® 다중 부위-지시된 돌연변이 유발용 키트 (공급처: Stratagene^®)를 사용함으로써 돌연변이를 만들었다. 이러한 돌연변이를 포함하는 1 내지 5개 프라이머를 1 PCR에 사용할 수 있었다. 형질전환 후, 집락을 골라내고 DNA을 서열 분석하여 가장 점 돌연변이를 수반한 클론을 결정하였다. 이 클론을 취하여, 모든 돌연변이가 해당 서열에 존재할 때까지 상기 과정을 반복하였다.

가변 영역을 인간 IgG 불변 영역과 연결함:

PCR을 수행함으로써, 적당한 제한 부위를 부가한 중쇄 및 경쇄의 인간화 가변부를 수득하였다.

경쇄의 가변부에 대한 프라이머:

프라이머 1: 5'-CCACCGGT GAC ATT GTG CTG ACC CAG TCT CC-3' (서열 13)

프라이머 2: 5'-CACCGTACG TTT TAT TTC CAA CTT TGT CCC CGA G-3' (서열 14)

중쇄의 가변부에 대한 프라이머:

프라이머 3: 5'-CAG GTC CAG CTG CAG CAG TCT G-3' (서열 15)

프라이머 4: 5'-GATGGGCCCTTGGTCGACGC TGA GGA GAC TGT GAG CAG GG-3' (서열 16)

PCR 설정: 94℃에서 5분간 변성, 94℃에서 30초간 변성, 60℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 30초간 연장, 72℃에서 5분간 연장, 주기 수 25회.

PCR 생성물을 아가로스 겔 상에 부하하고, 밴드를 선별한 다음, 정제하였다 (QIAquick^® 겔 추출용 키트; 공급처: Qiagen GmbH). 16D3의 중쇄의 가변부의 PCR 생성물을 SalI, 즉 인간 항체 (IgG4)의 중쇄의 완전한 불변부를 함유하는 벡터 pKANEO-MCS50-Hleu-var #24, 및 Eco47III 및 SalI로 분해시킨 다음 연결하였다. 경쇄의 가변부의 PCR 생성물은 서열 분석용 키트 (Zero Blunt^® TOPO^® PCR Cloning Kit) (공급처: Invitrogen™ life technologies)에 제공된 pCR^®4Blunt-TOPO^® 벡터에서 처음으로 클로닝하였다. 이러한 경쇄의 가변부를 AgeI 및 BsiWI에 의해 절단시키고, 이를 인간 카파 경쇄의 불변부를 이미 함유하고 있는 벡터 pKANEO-CM30-L-var #7 내로 클로닝하였다. PmeI 및 PacI를 사용하여 상기 벡터로부터 경쇄의 발현 카세트를 취하고 이를 중쇄 함유 벡터에 부가함으로써, 양 벡터를 하나의 벡터로 어셈블리하였다.

인간화 항체 16D3의 중쇄 및 경쇄의 가변부의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 서열 5, 6, 7 및 8에 제시되었다 (도 12 참고).

2. hul6D3의 일시적 발현

제조업자의 지시에 따라서 프리스타일 (FreeStyle) 293 발현 시스템 (공급처: Invitrogen)을 사용하여, Hul6D3 IgG4κ를 HEK 293 세포에서 일시적으로 발현시켰다. Hul6D3을 proSep vA Ultra 상에서 친화 크로마토그래피를 이용하여 상등액으로부터 정제하였다. 정제된 hul6D3를 대상으로 하여, 환원성 및 비-환원성 조건 하에 SDS-PAGE함으로써 순도에 대해 검사하였다. Hu16D3을 대상으로 하여, huPlGF와 결합하였는지에 대해 추가로 시험하고, ELISA를 통하여 HuPlGF/huFLT-1 결합의 억제에 대해 추가로 시험하였다 (도 1 및 2 참고).

실시예 3 - 항-PLGF 항체를 이용한 종양 성장의 억제에 관한 생체내 연구

1. 재료 및 방법에 관한 일반적인 설명

세포 배양액

뮤린 췌장 세포주 PancO2 및 인간 췌장 세포주 DanG는 다음 공급처 [S. Rosewicz (Charite-Universitatsmedizin Berlin, Germany)]로부터 제공된 것이다. 인간 유방 MDA-MB, 결장 LOVO 및 흑색종 Mel2a 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 [American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA)]로부터 구입하였다. 모든 세포는 권장된 바와 같이 배양하였다. 뮤린 16D3 항-PlGF 항체를 모든 생체내 실험에 사용하여 이러한 항체에 대한 면역 반응을 피하였다.

동물 실험

모든 동물 과정은 시설내 동물 보호 및 사용 위원회에 의해 전부 승인되었다. 암컷 NMRI nu/nu 마우스를 반-멸균성 조건 하에 사육하고, 통상적으로 8주 내지 10주생 (체중 약 25 g)을 사용하였다. 종양 공급원을 제조하기 위해, 종양 세포를 트립신으로 처리하여 단일 세포 현탁액을 제조하고, 이를 PBS로 세척하였다. 원심분리시킨 펠릿을 200 ㎕ PBS에 재현탁시키고, 마우스의 우측 옆구리에 피하 주사하였다. 동소 (같은 자리) 췌장 종양 모델에 대해서는, 30 ㎕ PBS 중의 1 x 10⁶개 종양 세포를 9 내지 10주생 암컷 C57B16 마우스의 복측 개복술을 통하여 췌장 상단 내로 주사하였다. 과정 전에, 마우스를 케타민 (90 mg/kg 체중) 및 크실라진 (9 mg/kg 체중)으로 마취시켰다.

약물 (즉, 항체, 비히클 등) 투여

종양 크기가 대략 60 ㎣에 도달하면, 항체 또는 비히클 대조군을 이용한 치료를 개시하였다. 항체 P15D11D4 [참고: WO01/85796], 16D3, 1C8 또는 비히클을 표시된 용량으로 격일로 복강내 투여하였다. 아바스틴을 표시된 용량으로 1주 2회 복강내 주사하였다.

종양 측정

피하 성장성 종양은 칼리버 (caliber)를 이용하여 격일로 측정하고, 식 p/6 (wl x w2 x w2) [여기서, 'wl' 및 'w2'는 각각 가장 큰 종양 직경과 가장 작은 종양 직경을 나타낸다]을 사용하여 계산하였다. 마우스를 희생시킨 경우에는, 동일한 방법을 사용하여 복측 개복술 후에 췌장의 동소 성장성 종양을 측정하였다.

통계적 분석

그래프패드 (GraphPad) 통계 소프트웨어 (공급처: GraphPad Software Inc., San-Diego, CA)를 사용하여 대응표본 관찰을 위해 양측 스튜던트 t-시험에 의해 통계적 분석을 수행하였다. 모든 데이터는 달리 표시되지 않는 한 평균 ±SEM으로 표현하였고, 달리 표시되지 않는 한 *p<0.5, **p<0.01이다.

2. 뮤린 항-hPlGF 항체 16D3을 사용하여 피하 인간 췌장 DanG 이종이식편 종양 모델에서 종양 성장을 억제함

1 x 10⁶개 종양 세포를 11주생 암컷 NMRI nu/nu 마우스의 우측 옆구리에 피하 주사하였다. 종양 크기가 대략 60 ㎣에 도달한 후, 항-hPlGF (16D3, 50 mg/kg 체중; n=10), 항-mPlGF [PL5D11D4 (WO O1/85796에 기재된 바와 같이 수득함); 50 mg/kg 체중; n=10], 대조군 IgG (1C8; 50 mg/kg 체중; n=10), 항-hPlGF과 항-mPlGF의 조합물 (각각 25 mg/kg 체중; n=10) 및 비히클 (n=10)로 처리하기 시작하였다. 항체를 격일로 복강내 주사하였다. (A) 종양을 격일로 측정하고 종양 용적을 식 WlxW2xW2xp/2 [여기서, Wl은 가장 긴 직경을 나타내고, W2는 가장 작은 직경을 나타낸다]을 사용하여 계산하였다. (B) 종양 접종한지 18일 후에 마우스를 희생시키고, 종양 절제하여 칭량하였다. 평균 종양 용적: 비히클: 915 ± 90 ㎣, IgG: ± 89 ㎣, PL5D11D4: 832 ± 118 ㎣, 16D3: 521 ± 83 ㎣, PL5D11D4 + 16D3: 497 ± 86 ㎣.

도 4에 도시된 바와 같은 결과는 항-인간 PLGF 항체 16D3을 투여하는 것이 종양 중량과 크기에 명백한 영향을 미친다는 사실을 보여준다.

3. 항-hPlGF는 피하 인간 췌장 DanG 이종이식편 종양 모델에서 종양 성장을 용량 의존적 방식으로 억제한다.

1 x 10⁶개 종양 세포를 11주생 암컷 NMRI nu/nu 마우스의 우측 옆구리에 피하 주사하였다. 종양 크기가 대략 60 ㎣에 도달한 후, 항-hPlGF, IgG (1C8; 50 mg/kg), 16D3 (50 mg/kg, 37.5 mg/kg, 25 mg/kg, 12.5 mg/kg 체중; 각 농도에 대해 n=10) 및 비히클 (n=10)로 처리하였다. (B) 종양 접종한지 18일 후에 마우스를 희 생시켰다.

그 결과가 도 5에 도시되었다. 평균 종양 용적 ± SEM: 16D3, 50 mg/kg 체중: 450 ± 37 ㎣; 37.5 mg/kg 체중: 469 ± 97 ㎣; 25 mg/kg 체중: 493 ± 107 ㎣; 12.5 mg/kg 체중: 693 ± 107 ㎣; 1C8: 865 ± 109 ㎣; 비히클: 889 ± 100 ㎣.

4. 항-huPlGF는 피하 인간 유방 MDA-MB 이종이식편 종양 모델에서 종양 성장을 억제한다.

1 x 10⁷개 종양 세포를 11주생 암컷 NMRI nu/nu 마우스의 우측 옆구리에 피하 주사하였다. 종양 크기가 대략 60 ㎣에 도달한 후, 항-hPlGF, 16D3 (50 mg/kg 체중; n=10) 및 비히클 (n=10)로 처리하였다. 그 결과가 도 6 (및 하기 표 1)에 제시되었다.

5. 항-huPlGF는 피하 인간 결장 LOVO 이종이식편 종양 모델에서 종양 성장을 억제한다.

1 x 10⁷개 종양 세포를 11주생 암컷 NMRI nu/nu 마우스의 우측 옆구리에 피하 주사하였다. 종양 크기가 대략 60 ㎣에 도달한 후, 항-hPlGF, 16D3 (50 mg/kg 체중; n=10) 및 비히클 (n=10)로 처리하였다. 그 결과가 도 7 및 하기 표 2에 제시되었다.

6. 항-huPlGF는 피하 인간 흑색종 Mel2a 이종이식편 종양 모델에서 종양 성장을 억제한다.

4 x 10⁶개 종양 세포를 11주생 암컷 NMRI nu/nu 마우스의 우측 옆구리에 피하 주사하였다. 종양 크기가 대략 60 ㎣에 도달한 후, 항-hPlGF, 16D3 (50 mg/kg 체중; n=10) 및 비히클 (n=10)로 처리하였다. 그 결과가 도 8 및 하기 표 3에 제시되었다.

실시예 4: 체중 손실에 대한, 16D3 항체를 이용한 치료 효과에 관한 생체내 연구

재료와 방법은 실시예 3에 대해 기재된 바와 같다.

1 x 10⁶개 종양 세포를 11주생 암컷 NMRI nu/nu 마우스의 우측 옆구리에 피하 주사하였다. 종양 크기가 대략 60 ㎣에 도달한 후, 항-hPlGF (16D3, 50 mg/kg 체중; n=10), 항-mPlGF (PL5D11D4; 50 mg/kg 체중; n=10), 대조군 IgG (1C8; 50 mg/kg 체중; n=10), 항-hPlGF과 항-mPlGF의 조합물 (각각 25 mg/kg 체중; n=10) 및 비히클 (n=10)로 처리하기 시작하였다. 항체를 격일로 복강내 주사하였다. 항체 치료 첫날과 마지막 날에 마우스의 체중을 측정하였다. 체중 손실률을 계산하기에 앞서, 체중으로부터 종양 중량을 감수하였다.

그 결과가 도 9에 도시되었다. 항-hPlGF가 상기 피하 인간 췌장 DanD 이종이식편 종양 모델에서 체중 손실을 예방하는 것으로 밝혀졌다.

실시예 5: 종양 성장을 치료하기 위한 항-hPlGF와 항-VEGF 항체의 조합물

재료와 방법은 실시예 3에 대해 기재된 바와 같다.

1 x 10⁶개 종양 세포를 11주생 암컷 NMRI nu/nu 마우스의 우측 옆구리에 피하 주사하였다. 종양 크기가 대략 60 ㎣에 도달한 후, 항-hPlGF (16D3, 50 mg/kg, 37.5 mg/kg, 12.5 mg/kg 체중, 격일 복강내; 각 농도에 대해 n=10), 아바스틴 (15 mg/kg 및 5 mg/kg 체중, 1주 2회 복강내, 각각 n=10) 및 항-hPlGF (12.5 mg/kg 체중)와 아바스틴 (5 mg/kg 체중; n=10)의 조합물로 처리하였다. 종양 접종한지 20일 후에 마우스를 희생시켰다.

그 결과가 도 10에 도시되었다. 평균 종양 용적 ± SEM: 1C8, 37; 37.5 mg/kg 체중: 954 ± 164 ㎣; 12.5 mg/kg 체중: 1398 ± 236 ㎣; IgG: 1789 ± 231 ㎣; 아바스틴: 15 mg/kg 체중: 828 ± 186 ㎣; 5 mg/kg 체중: 926 ± 202 ㎣; 아바스틴 + 16D3: 569 ± 94 ㎣. 항-hPlGF와 아바스틴이 피하 인간 췌장 DanG에서의 종양 성장 억제에 대해 부가의 효과를 발휘하는 것으로 관찰되었다.

실시예 6: 16D3의 scFv 생성

적당한 제한 결합 부위와 링커를 수반한 프라이머를 사용하여 PCR함으로써, 중쇄 및 경쇄의 가변부 서열 (실시예 1에 기재된 바와 같이 수득된, 각각 서열 2 및 서열 4)를 증폭시켰다. SOE PCR (중복 연장에 의한 유전자 스플라이싱) 후, scFv를 pEE14.4 (HindIII-EcoRI 클로닝 부위) (도 12)에서 클로닝하였다.

이러한 scFvhpl6D3/pEE14.4를, 푸젠 (Fugene) 6 (공급처: Boehringer Mannheim)을 사용하여 BamHI로 선형화한 후에 CHO-KI 세포에 형질감염시킨 다음, 희석시킴으로써 2회 아클로닝하였다. 모노클로날 scFv hpl6D3, 6C5D4를 수득하고 생성시켰다. 이 클론을 scFv hpl6D3/pKANEO-MCS50-dhfrl (Nhel-NotI 클로닝 부위) (도 13)와 병행해서 프로듀셀 (Producell)에 의해 293 세포에서 일시적으로 형질감염시켰다.

16D3 scFv의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 각각 서열 23 및 서열 24로서 제공되었다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역, 링커 서열 및 HA-태그 및 His 태그를 입증하는 아미노산 서열이 또한 도 15에 제공되었다.

실시예 7: scFv 16D3의 인간화

scFv의 가변 영역의 인간화는 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행하였다. 16D3의 인간화 scFv의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 각각 서열 25 및 서열 26으로서 제공되었다. 인간화 scFv의 중쇄 및 경쇄 가변 영역, 링커 서열 및 HA-태그 및 His 태그를 입증하는 아미노산 서열이 또한 도 15에 제공되었다.

실시예 8: 인간화 Fab 16D3의 생성

1. 인간화 scFvl6D3 로부터 VH 및 VL 단편을 증폭함

인간화 scFvl6D3의 VH 단편 증폭용 프라이머

인간화 scFvl6D3 의 VL 단편 증폭용 프라이머

2. 중쇄 및 경쇄 벡터의 구축

경쇄의 PCR 생성물을 먼저, pCR4blunt-TOPO 벡터 내로 클로닝하였다. 서열 분석한 후, AgeI 및 BsiWI 분해함으로써 경쇄를 제거하고, 이를 pKANEO-CM30-Lvar#7 벡터 내로 클로닝하였다. 중쇄의 PCR 생성물을 분해 후, pKANEO-MCS50-Fabvar#3에 직접 클로닝하였다.

3. 중쇄 구조물과 경쇄 구조물의 결합

경쇄 절편과 중쇄 절편을 함유하는 양 벡터 (상기 언급됨)는, 경쇄 절편을 함유하는 카세트를 제거하고, 이를 효소 PmeI 및 PacI를 사용함으로써 중쇄 절편을 함유하는 벡터에 부가함으로써 함께 결합시켜 최종 구조물인 hpl6D3mutcmplFab/pKANEO-MCS50-Fabvar#3을 수득하였다 (도 16 참고).

실시예 9. scFv 16D3 및 인간화 scFvl6D3에 의한 PlGF/flt-1 상호 작용의 억제 및 항원 결합성에 관한 분석 (도 14)

1. 항원 결합성 ELISA

ELISA 판을 4℃에서 PBS 중의 1 ㎍/ml huPlGF-1 (200 ㎕/웰)로 ON 피복시켰다. 실온에서 1시간 동안 1％ BSA로 차단시킨 후, scFv16D3/인간화 scFvl6D3의 희석 시리즈를 가하고 (200 ㎕/웰), 항체 단편을 실온에서 1시간 동안 결합시켜 두었다. 결합된 scFv16D3을 실온에서 1시간 동안 뮤린 항-HA (180 ㎕/웰)로 탐지한 다음, 실온에서 1시간 동안 염소-항-뮤린 IgG-HRP (공급처: Sigma) (170 ㎕/웰)와 함께 항온 배양하였다. 본 검정을 OPD로 전개하였다.

2. ELISA를 통한 PlGF/Flt-1 상호 작용의 억제

ELISA 판을 4℃에서 1 ㎍/ml huFlt-1 (공급처: R&D Systems) (200 ㎕/웰)로 ON 피복시켰다. 실온에서 1시간 동안 1％ BSA로 차단시킨 후, scFv16D3/인간화 scFvl6D3의 희석 시리즈를 가하고 (100 ㎕/웰), 100 ㎕/웰의 huPlGF-2를 더 가하였다. 실온에서 2시간 동안 항온 배양한 후, 결합된 PlGF를 실온에서 1시간 동안 염소-항-huPlGF (공급처: R&D Systems), 180 ㎕/웰로 탐지한 다음, 실온에서 1시간 동안 RAG-HRP (공급처: DAKO)와 함께 항온 배양하였다. 본 검정을 OPD로 전개하였다.

실시예 10. 인간화 Fabl6D3에 의한 PlGF/Flt-1 상호 작용의 억제 및 항원 결합성에 관한 분석

1. 항원 결합성 ELISA

ELISA 판을 4℃에서 PBS 중의 1 ㎍/ml huPlGF-1 (100 ㎕/웰)로 ON 피복시켰다. 실온에서 1시간 동안 1％ BSA로 차단시킨 후, 인간화 Fabl6D3의 희석 시리즈를 가하고 (100 ㎕/웰), 항체 단편을 실온에서 1시간 동안 결합시켜 두었다. 결합된 인간화 Fab16D3을 실온에서 1시간 동안 항-huIgG-HRP (Fab 특이적) (100 ㎕/웰)로 탐지하였다. 본 검정을 OPD로 전개하였다. 그 결과가 도 17A에 제공되었다.

2. ELISA를 통한 PlGF/Flt-1 상호 작용의 억제

ELISA 판을 4℃에서 1 ㎍/ml huFlt-1 (공급처: R&D Systems) (200 ㎕/웰)로 ON 피복시켰다. 실온에서 1시간 동안 1％ BSA로 차단시킨 후, 인간화 Fabl6D3의 희석 시리즈를 가하고 (100 ㎕/웰), 100 ㎕/웰의 huPlGF-2를 더 가하였다. 실온에서 2시간 동안 항온 배양한 후, 결합된 PlGF를 실온에서 1시간 동안 염소-항-huPlGF (공급처: R&D Systems), 180 ㎕/웰로 탐지한 다음, 실온에서 1시간 동안 RAG-HRP (공급처: DAKO)와 함께 항온 배양하였다. 본 검정을 OPD로 전개하였다. 그 결과가 도 17B에 제공되었다.

실시예 11. K _D 값의 결정

16D3, 인간화 16D3 IgG4, 인간화 scFvl6D3 및 인간화 Fabl6D3에 대한 K_D 값을 비아코아에 의해 결정하였다. 그 결과가 다음 표 4에 제공되었다.

16D3, 인간화 16D3 IgG4, 인간화 Fab l6D3 및 인간화 scFvl6D3에 대한 K_D 값.

SEQUENCE LISTING <110> Thromb-X nv Collen Research Foundation vzw Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie (VIB) <120> Novel PLGF antibody <130> T3326-KR <150> US 60/664,768 <151> 2005-03-24 <160> 30 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 348 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(348) <223> mouse variable part of the heavy chain of 16D3 <400> 1 cag atc cag ctg cag cag tct gga cct gag ctg gtg aag cct ggg gct 48 Gln Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag ata tcc tgc aag gcc tct ggc tac acc ttc act gac tac 96 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 tat ata aac tgg gtg aag ttg aag cct gga cag gga ctt gag tgg att 144 Tyr Ile Asn Trp Val Lys Leu Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga tgg att tat cct gga agc ggt aat act aag tac aat gag aag ttc 192 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 aag ggc aag gcc aca ttg act ata gac aca tcc tcc agc aca gcc tac 240 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg cag ctc agc agc ctg aca tct gag gac act gct gtc tat ttc tgt 288 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 gta aga gac agc cct ttc ttt gac tac tgg ggc caa ggc acc act ctc 336 Val Arg Asp Ser Pro Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 100 105 110 aca gtc tcc tca 348 Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Gln Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Lys Leu Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Val Arg Asp Ser Pro Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <223> mouse variable part of the light chain of 16D3 <400> 3 gac att gtg ctg tca cag tct cca tcc tcc ctg gct gtg tca gca gga 48 Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 gag aag gtc act atg cgc tgc aaa tcc agt cag agt ctg ctc aac agt 96 Glu Lys Val Thr Met Arg Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 gga atg cga aag agt ttc ttg gct tgg tac cag cag aaa cca ggg cag 144 Gly Met Arg Lys Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 tct cct aag ctg ctg atc tac tgg gca tcc act agg gaa tct ggg gtc 192 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 cct gat cgc ttc aca ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc 240 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 atc agc agt gtg cag gct gaa gac ctg gca gtt tat tac tgc aag caa 288 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 tct tat cat cta ttc acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gaa ata aaa 336 Ser Tyr His Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 4 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Arg Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Met Arg Lys Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr His Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 5 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Humanised antibody fragment <220> <221> CDS <222> (1)..(348) <223> humanised variable part of the heavy chain of 16D3 <400> 5 cag gtc cag ctg cag cag tct gga gcc gag ctg gtg aag cct ggg gct 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag ata tcc tgc aag gcc tct ggc tac acc ttc act gac tac 96 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 tat ata aac tgg gtg aag ttg gcc cct gga cag gga ctt gag tgg att 144 Tyr Ile Asn Trp Val Lys Leu Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga tgg att tat cct gga agc ggt aat act aag tac aat gag aag ttc 192 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 aag ggc aag gcc aca ttg act ata gac aca tcc tcc agc aca gcc tac 240 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg cag ctc agc agc ctg aca tct gag gac act gct gtc tat ttc tgt 288 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 gta aga gac agc cct ttc ttt gac tac tgg ggc caa ggc acc ctg ctc 336 Val Arg Asp Ser Pro Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Leu 100 105 110 aca gtc tcc tca 348 Thr Val Ser Ser 115 <210> 6 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Lys Leu Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Val Arg Asp Ser Pro Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Leu 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 7 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Humanised antibody fragment <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <223> humanised variable part of the light chain of 16D3 <400> 7 gac att gtg ctg acc cag tct cca gac tcc ctg gct gtg tca ctg gga 48 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 gag cgg gtc act atg aac tgc aaa tcc agt cag agt ctg ctc aac agt 96 Glu Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 gga atg cga aag agt ttc ttg gct tgg tac cag cag aaa cca ggg cag 144 Gly Met Arg Lys Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 tct cct aag ctg ctg atc tac tgg gca tcc act agg gaa tct ggg gtc 192 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 cct gat cgc ttc aca ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc 240 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 atc agc agt gtg cag gct gaa gac gtc gca gtt tat tac tgc aag caa 288 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 tct tat cat cta ttc acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gaa ata aaa 336 Ser Tyr His Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 8 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Met Arg Lys Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr His Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 9 atggratgga gctgkatcwt thtc 24 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 10 casaymcagg ggccagtgga tagac 25 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 11 atgragtcac akacycaggt cttyrta 27 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 12 gctcactgga tggtgggaag atgg 24 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 13 ccaccggtga cattgtgctg acccagtctc c 31 <210> 14 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 14 caccgtacgt tttatttcca actttgtccc cgag 34 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 15 caggtccagc tgcagcagtc tg 22 <210> 16 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 16 gatgggccct tggtcgacgc tgaggagact gtgagcaggg 40 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> misc <222> (1)..(8) <223> CDR1 heavy chain 16D3 <400> 17 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr 1 5 <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(8) <223> CDR2 heavy chain 16D3 <400> 18 Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(9) <223> CDR3 heavy chain 16D3 <400> 19 Val Arg Asp Ser Pro Phe Phe Asp Tyr 1 5 <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> misc <222> (1)..(12) <223> CDR1 light chain 16D3 <400> 20 Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Met Arg Lys Ser Phe 1 5 10 <210> 21 <211> 3 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> misc <222> (1)..(3) <223> CDR2 ligth chain 16D3 <400> 21 Trp Ala Ser 1 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(8) <223> CDR3 light chain 16D3 <400> 22 Lys Gln Ser Tyr His Leu Phe Thr 1 5 <210> 23 <211> 786 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> 16D3 ScFv <220> <221> CDS <222> (1)..(786) <220> <221> misc <222> (1)..(348) <223> Heavy chain <220> <221> misc <222> (349)..(393) <223> Linker <220> <221> misc <222> (394)..(729) <223> Light chain <220> <221> misc <222> (736)..(762) <223> HA-Tag <220> <221> misc <222> (769)..(786) <223> His-Tag <400> 23 cag atc cag ctg cag cag tct gga cct gag ctg gtg aag cct ggg gct 48 Gln Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag ata tcc tgc aag gcc tct ggc tac acc ttc act gac tac 96 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 tat ata aac tgg gtg aag ttg aag cct gga cag gga ctt gag tgg att 144 Tyr Ile Asn Trp Val Lys Leu Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga tgg att tat cct gga agc ggt aat act aag tac aat gag aag ttc 192 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 aag ggc aag gcc aca ttg act ata gac aca tcc tcc agc aca gcc tac 240 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg cag ctc agc agc ctg aca tct gag gac act gct gtc tat ttc tgt 288 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 gta aga gac agc cct ttc ttt gac tac tgg ggc caa ggc acc act ctc 336 Val Arg Asp Ser Pro Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 100 105 110 aca gtc tcc tca ggt ggt ggt ggt tct ggc ggc ggc ggc tcc ggt gga 384 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 ggt ggt tct gac att gtg ctg tca cag tct cca tcc tcc ctg gct gtg 432 Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val 130 135 140 tca gca gga gag aag gtc act atg cgc tgc aaa tcc agt cag agt ctg 480 Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Arg Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu 145 150 155 160 ctc aac agt gga atg cga aag agt ttc ttg gct tgg tac cag cag aaa 528 Leu Asn Ser Gly Met Arg Lys Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys 165 170 175 cca ggg cag tct cct aag ctg ctg atc tac tgg gca tcc act agg gaa 576 Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu 180 185 190 tct ggg gtc cct gat cgc ttc aca ggc agt gga tct ggg aca gat ttc 624 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 195 200 205 act ctc acc atc agc agt gtg cag gct gaa gac ctg gca gtt tat tac 672 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr 210 215 220 tgc aag caa tct tat cat cta ttc acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg 720 Cys Lys Gln Ser Tyr His Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu 225 230 235 240 gaa ata aaa ggt tct tac cca tac gac gtc cca gac tac gct ggt tct 768 Glu Ile Lys Gly Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ser 245 250 255 cat cat cac cat cac cat 786 His His His His His His 260 <210> 24 <211> 262 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 24 Gln Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Lys Leu Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Val Arg Asp Ser Pro Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 100 105 110 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val 130 135 140 Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Arg Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu 145 150 155 160 Leu Asn Ser Gly Met Arg Lys Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys 165 170 175 Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu 180 185 190 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 195 200 205 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr 210 215 220 Cys Lys Gln Ser Tyr His Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu 225 230 235 240 Glu Ile Lys Gly Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ser 245 250 255 His His His His His His 260 <210> 25 <211> 786 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> 16D3 ScFv Humanised <220> <221> CDS <222> (1)..(786) <220> <221> misc <222> (1)..(348) <223> Heavy chain <220> <221> misc <222> (349)..(393) <223> linker <220> <221> misc <222> (394)..(729) <223> Light chain <220> <221> misc <222> (736)..(762) <223> HA-tag <220> <221> misc <222> (769)..(786) <223> HA-tag <400> 25 cag gtc cag ctg cag cag tct gga gcc gag ctg gtg aag cct ggg gct 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag ata tcc tgc aag gcc tct ggc tac acc ttc act gac tac 96 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 tat ata aac tgg gtg aag ttg gcc cct gga cag gga ctt gag tgg att 144 Tyr Ile Asn Trp Val Lys Leu Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga tgg att tat cct gga agc ggt aat act aag tac aat gag aag ttc 192 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 aag ggc aag gcc aca ttg act ata gac aca tcc tcc agc aca gcc tac 240 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg cag ctc agc agc ctg aca tct gag gac act gct gtc tat ttc tgt 288 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 gta aga gac agc cct ttc ttt gac tac tgg ggc caa ggc acc ctg ctc 336 Val Arg Asp Ser Pro Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Leu 100 105 110 aca gtc tcc tca ggt ggt ggt ggt tct ggc ggc ggc ggc tcc ggt gga 384 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 ggt ggt tct gac att gtg ctg acc cag tct cca gac tcc ctg gct gtg 432 Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val 130 135 140 tca ctg gga gag cgg gtc act atg aac tgc aaa tcc agt cag agt ctg 480 Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu 145 150 155 160 ctc aac agt gga atg cga aag agt ttc ttg gct tgg tac cag cag aaa 528 Leu Asn Ser Gly Met Arg Lys Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys 165 170 175 cca ggg cag tct cct aag ctg ctg atc tac tgg gca tcc act agg gaa 576 Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu 180 185 190 tct ggg gtc cct gat cgc ttc aca ggc agt gga tct ggg aca gat ttc 624 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 195 200 205 act ctc acc atc agc agt gtg cag gct gaa gac gtc gca gtt tat tac 672 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr 210 215 220 tgc aag caa tct tat cat cta ttc acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg 720 Cys Lys Gln Ser Tyr His Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu 225 230 235 240 gaa ata aaa ggt tct tac cca tac gac gtc cca gac tac gct ggt tct 768 Glu Ile Lys Gly Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ser 245 250 255 cat cat cac cat cac cat 786 His His His His His His 260 <210> 26 <211> 262 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 26 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Lys Leu Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Val Arg Asp Ser Pro Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Leu 100 105 110 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val 130 135 140 Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu 145 150 155 160 Leu Asn Ser Gly Met Arg Lys Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys 165 170 175 Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu 180 185 190 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 195 200 205 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr 210 215 220 Cys Lys Gln Ser Tyr His Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu 225 230 235 240 Glu Ile Lys Gly Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ser 245 250 255 His His His His His His 260 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 27 caggtccagc tgcagcagtc tg 22 <210> 28 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 28 gatgggccct tggtcgacgc tgaggagact gtgagcaggg 40 <210> 29 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 29 ccaccggtga cattgtgctg acccagtctc c 31 <210> 30 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 30 caccgtacgt tttatttcca actttgtccc cgag 34

Claims (29)

1. 서열 17 내지 22로 이루어진 군 중에서 선택된 2개 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하거나 또는 이들 서열과의 서열 동일성이 90％ 이상인 2개 이상의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 태반 성장 인자 (PlGF)와 결합할 수 있는 항원 결합성 분자.
2. 제1항에 있어서, 서열 17 내지 서열 22의 서열에 상응하는 CDR 영역을 포함하거나 또는 이들 서열과의 서열 동일성이 90％ 이상인 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항원 결합성 분자.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂, 2개 이상의 CDR의 조합물, 가용성 또는 막-고정된 단일 쇄 가변부, 또는 단일 가변 도메인의 군 중에서 선택되는 항원 결합성 분자.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 2의 서열, 또는 CDR 영역 내에서 이러한 서열과의 서열 동일성이 90％ 이상인 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고; 서열 4의 서열, 또는 CDR 영역 내에서 이러한 서열과의 서열 동일성이 80％ 이상인 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항원 결합성 분 자.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, LMBP 6399CB로서 기탁된 세포주에 의해 생산된 항체 16D3 또는 그의 단편인 항원 결합성 분자.
6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화 항체 또는 항체 단편인 항원 결합성 분자.
7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 인간/마우스 하이브리드 항체또는 항체 단편인 항원 결합성 분자.
8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, CDR 영역을 인간 항체의 주쇄 상에 이식시킨 항원 결합성 분자.
9. 제8항에 있어서, 인간 항체가 IgG1κ 또는 IgG4κ인 항원 결합성 분자.
10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 17 내지 22의 군 중에서 선택된 2개 이상의 CDR을 포함하거나 또는 이들 서열과의 서열 동일성이 80％ 이상인 2개 이상의 서열을 포함하는, PlGF와 결합하는 단일 쇄 가변 단편인 항원 결합성 분자.
11. 제10항에 있어서, 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합성 분자.
12. 제11항에 있어서, 인간화 항원 결합성 분자인 항원 결합성 분자.
13. 제12항에 있어서, 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합성 분자.
14. 제1항 또는 제2항에 따른 항원 결합성 분자를 생산하는 세포주.
15. 제14항에 있어서, LMBP 6399CB로서 기탁된 세포주.
16. 활성 성분으로서의 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 PlGF-결합성 분자를, 제약상 허용 가능한 담체와 함께 포함하는, 포유류에게서 병적 상태의 바람직하지 못한 혈관형성을 예방하거나 치료하기 위한 제약 조성물.
17. 제16항에 있어서, 치료상 유효량의 또 다른 항혈관형성제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
18. 제17항에 있어서, 또다른 항혈관형성제가 VEGF 및 bFGF 억제제로 이루어진 군 중에서 선택되는 제약 조성물.
19. 제18항에 있어서, VEGF 억제제가 항-VEGF 항체인 제약 조성물.
20. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합성 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
21. 치료 또는 예방을 필요로 하는 포유류에게, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 항원 결합성 분자인 활성 성분의 치료상 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유류에게서 병적 상태의 바람직하지 못한 혈관형성을 예방하고/하거나 치료하는 방법.
22. 제21항에 있어서, 병적 상태가 암, 염증, 유착 형성, 안과 질환, 폐 고혈압 및 혈관 누출로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
23. 제22항에 있어서, 암이 결장암, 유방암, 췌장암 및 흑색종으로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
24. 인간 샘플 중에서의 PlGF를 면역학적으로 탐지하기 위한, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합성 분자의 용도.
25. 암을 치료하는데 있어서 PlGF 억제에 대한 부가 효과를 지닌 화합물을 스크 리닝하기 위한, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합성 분자의 용도.
26. 시험관내 진단 도구로서의, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합성 분자의 용도.
27. 포유류에게서 병적 상태의 바람직하지 못한 혈관형성을 치료 및/또는 예방하기 위한 약물을 제조하기 위한, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합성 분자의 용도.
28. 제27항에 있어서, 병적 상태가 암, 염증, 유착 형성, 안과 질환, 폐 고혈압 및 혈관 누출로 이루어진 군 중에서 선택되는 용도.
29. 제28항에 있어서, 암이 결장암, 유방암, 췌장암 및 흑색종으로 이루어진 군 중에서 선택되는 용도.

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