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CN1209068A - 作为基因治疗所用的dna载体的透明质酸及治疗异常视网膜血管化的vegf反义dna - Google Patents

作为基因治疗所用的dna载体的透明质酸及治疗异常视网膜血管化的vegf反义dna Download PDF

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CN1209068A
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CN
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vegf
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virus
sequence
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CN96199290A
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波罗斯卡·伊丽莎白·雷考茨
伊恩·杰弗里·康斯特伯
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Alchemia Oncology Pty Ltd
Original Assignee
Hyal Pharmaceutical Australia Ltd
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Abstract

本发明提供了用于基因治疗如反义治疗的方法和组合物。在一个实施方案中,所述的组合物包括透明质酸以促进靶细胞对核酸的吸收。本发明通过参照对由新生血管化所致视网膜病的治疗加以描述。

Description

作为基因治疗所用的DNA载体的透明质酸及治疗 异常视网膜血管化的VEGF反义DNA
本发明涉及在疾病的控制或治疗中使用透明质酸将活性因子导向靶基因以消除靶基因功能。在一个实施方案中，本发明涉及治疗眼疾特别是涉及脉络膜和/或视网膜的新生血管化的视网膜疾病的方法和组合物，其是利用眼睛中的特异细胞的细胞吞噬特征来提供一种有效的方法将活性因子运送至靶细胞，以进行新生血管化的短期和长期治疗。本发明的方法和组合物能用于将DNA、RNA、反义核苷酸、肽或其它治疗剂运送至吞噬细胞或周围细胞。
发明背景
A)作为佐剂或定向剂的透明质酸
透明质酸(HA)是由多达5000对碱性二糖葡糖醛酸-β(1-3)N-乙酰葡糖胺β(1-4)组成的大的复杂寡糖，在体内发现其是胞外基质的主要成分，其三级结构是直径约50nm的随机螺旋。
HA具有结合大量水的能力，这使得其在体内形成具有粘弹性性质的粘性水合凝胶。在哺乳动物眼睛的玻璃体和胞外基质中均发现了这一形式。
因为HA具有将活性因子导向疾病或状态所在部位的能力，所以HA已用于全身性和局部治疗人体的某些疾病和状态(国际专利申请WO91/04058和WO93/16733)。已显示HA例如在损伤的颈动脉(相对于未损伤的对侧动脉)，以及在实验动物的结肠直肠肿瘤中形成库(depot)并保留在这种动物的皮肤中。在所有这些情况中，沉积部位是高HA受体表达区，提示HA特异定位于表达高水平这些受体的组织，特别是正在异常增殖和迁移的组织，包括应答损伤、炎症、发育和肿瘤发生的组织。
对HA作为潜在的佐剂的作用非常重要的特征是其能同时结合其它分子和细胞膜。已鉴别了特异于HA的细胞表面受体，包括组织相容性抗原CD44、透明质酸介导的迁移的受体(RHAMM)、胞间粘附因子(ICAM)和CD44家族内的某些同源蛋白。由HA促进的病毒与细胞膜的结合将使通常的病毒摄取的胞溶机制更加有效。
B)眼疾
多种眼疾如斑点退化和糖尿病性视网膜病的特征均是脉络膜和/或视网膜的新生血管化，这一过程是患有这些疾病的患者失明的主要病因。
现有技术中的治疗
在年龄相关的斑点退化症中(ARMD)，视网膜下新生血管化膜(SRNVM)的形成和出血导致中心视觉的快速和大部分丧失。有多种治疗方法，但都是不可靠的。激光光致凝结法是最可接受的治疗法，但其仍有如下缺点，即激光光线可导致致密的永久性盲点(Schachet，1994；Ibanez等，1995和Hudson等，1995)，导致视力暂时丧失并且由于新生血管膜重复发生而不能长期防止病情的发展。
因此这一疗法的唯一优点是防止了深度视力丧失。
类似地，手术除去SRNVM或视网膜下血液或者通过旋转视网膜而重新定位视网膜中央凹也是不成功的，因为其存在手术后并发症并且视力的改善很小或是暂时性的。因此，这些侵入型疗法及相应并发症远远超出了得到的好处，因而用途受到限制。
也已证明给予具有某些抗血管生成活性的干扰素α2a(Fung，1991；Guyer等，1992和Engler等，1994)以及移植视网膜色素上皮(RPE)细胞(Algvere等，1994)的用途很有限，并且最初用小规模病人组获得的结果在较大规模试验中未得到证实。
除了激光光致凝结(如上所述，其具有许多缺点)之外，另一个治疗糖尿病性视网膜病的主要方法是控制血糖和血压。这种疗法的效果受限于患者的能动性和依从性。
年龄超过75岁的人群中约30％患有斑点退化症，且在1000个个体中有3个患有糖尿病性视网膜病。由于随着人口老龄化，这些数字将增加，并且糖尿病的发生几率也将增加，所以需一种更有效的方法治疗由新生血管化介导的这些和其它眼科疾病。
新生血管化机制
血管内皮细胞生长因子(VEGF)是一种二聚的二硫桥连接的糖蛋白，已知其能由各种正常细胞和肿瘤细胞合成并分泌。最近的观察显示VEGF通常在患糖尿病的患者的新生血管视网膜中检测到(Malecaze等，1994)，以及在患糖尿病性视网膜病或中央视网膜静脉闭锁的患者的眼液中检测到(Aiello等，1994)。最近发现在诸如中央静脉闭锁，视网膜脱落及眼内肿瘤等状态下诱导VEGF表达。在兔模型中，VEGFmRNA的水平在诱导视网膜静脉闭锁后在视网膜的供氧不足区升高(Pe’er等，1995)。供氧不足刺激的VEGF表达也在其它动物模型观察到(Pierce等，1995；Miller等，1994)，并且在所有类型的细胞培养物中也观察到(Simorre-Pinatel等，1994；Hata等，1995和Thiema等，1995)。
C)疾病治疗中的反义DNA和基因治疗
对编码介导不希望的活性的蛋白的基因表达的抑制通过在靶细胞中导入或原位产生“反义”DNA序列而在各种情况下完成。这些反义序列是当转录时导致合成其序列与编码蛋白的序列反平行的RNA的DNA序列。在各种病毒性疾病中已测试了这种反义序列。另外，反义寡脱氧核苷酸可导入靶细胞，这种短序列本身不转录，但是抑制靶细胞中相应有义DNA序列的转录和/或随后的翻译。
直到最近仍广泛认为实现基因表达的反义抑制所需的最小序列长度是12-14个核苷酸(Wagner，1994)。然而，现已表明结合靶序列的特异性可通过使用含C-5丙炔嘧啶和硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰的寡核苷酸而有效增强，并且短至7或8个核苷酸的序列也能提供有效的基因筛选、错配敏感、核糖核酸酶H依赖的抑制，其中靶RNA的旁侧序列对于决定特异性是重要的(Wagner等，1996)。
然而，用反义核苷酸体内阻止基因的表达这一应用的成功受以下因素的影响，例如需要特异抑制突变基因表达(Milan，1993；McInnes andBascom，1992)，或者需要高浓度的反义核苷酸(Akhtar and Ivinson，1993)。
目前，这种形式的治疗很多是应用包装在脂质体中的反义序列，或者直接将反义cDNA或寡核苷酸应用到疾病部位。因此通过将反义序列包在脂质体中以增加靶细胞对这些序列的摄入的尝试多数未成功，而且脂质体的定向也很困难，其摄入甚至比病毒还要低。
定向也可通过利用例如仙台病毒经病毒介导的DNA转移而实现。仙台病毒是一种RNA病毒，已证明其将DNA和蛋白质输送到细胞中的效率为95％以上(Kaneda等人，1987)。在这一基因转移系统中，通过仙台病毒的融合活性将在脂质体中的DNA核蛋白复合体直接导入到细胞质中，用核蛋白能将DNA快速输入细胞核。仙台病毒介导的基因转移通过病毒与细胞膜的融合而发生，并且绕过内吞途径。最近，已观察到仙台病毒能高效将反义或质粒DNA运送到靶细胞。反义和质粒DNA不仅在培养物中而且在体内均保持其活性(Kaneda等人，1987)。然而这一病毒的应用受这一事实的限制，即目前没有合适的构建体可用作载体。另外，转移的DNA仅能表达有限的一段时间，因为该基因转移是由融合介导的。
反转录病毒已广泛用于体细胞组织基因治疗(Boris-Lawrie andTemin，1993)，它们可以高效定位到并感染许多种类的宿主细胞，并且转基因DNA整合进宿主基因组。理论上说，DNA的整合将提供转基因的永久产生，这能导致细胞的永久补救。但是，反转录病毒不能感染不分裂的细胞(Salmons和Gunzburg，1993)。另外，反转录病毒颗粒在体内不稳定，这使得很难通过接种达到高病毒滴度。再者，对整合病毒的致癌性也有明显的忧虑。反转录病毒不能感染不分裂细胞意味着它们不能作为在眼睛中进行的基因转移的候选者，因为最重要的靶细胞如光受体和RPE细胞均是不分裂细胞。
单纯疱疹病毒载体的应用受到其低感染效率的限制(Culver等人，1992)。已开发了两种类型的载体，即复制缺陷型重组子和质粒衍生的扩增子，后者需要辅助病毒。尽管可克服困难从单纯疱疹病毒中除去毒性基因，但是构建体仍然是胞毒性的(Johnson等人，1992)。另外，目前插入序列的长期表达仍然是不成功的，存在着构建体的调控和稳定性问题。在基因治疗中将修饰的单纯疱疹病毒应用于眼睛中引起很大忧虑，因为它们的病原性。zoster疱疹病毒感染会导致眼内严重感染，经常导致失明，需要角膜移植。
腺病毒已广泛用于不分裂细胞和增殖性细胞中的基因转移。它们能携带高达7.5kb的DNA，并能提供有效的转染和高的病毒滴度。使用这些病毒而不是反转录病毒的主要优点是它们能感染许多不分裂靶细胞(Kozarsky和Wilson，1993)。复制缺陷型腺病毒据认为是相对安全的，因为这些病毒是人类中常见的病原体，通常引起相对温和的症状如感冒。这些载体携带具有缺失突变的肿瘤基因，降低了变为致癌性的可能性(Siegfried，1993)。在由美国国立健康研究院重组DNA顾问委员会批准的第一例实验性基因治疗试验中，就是使用了重组腺病毒治疗患有囊性纤维化的患者。
然而，腺病毒的主要缺点是它们的瞬时基因表达，这是由于转基因未整合到细胞基因组中所致。另外，仅有极少数将基因输送至不分裂细胞的成功尝试。1993年报道了使用腺病毒第一次将基因成功地转移至由不分裂细胞组成的大脑中的实验(Le Gal La Salle等人，1993)。
这些结果表明基因治疗是一种理论上可靠的治疗疾病的途径，但是需要克服有效定向和摄入的技术难题，可利用粘附靶细胞并被其吸收的病毒来克服这些技术难题。这一过程不是很有效，并且应用病毒可能导致不希望出现的医疗疾病的危险。然而已公布了阳性结果教导了用基因治疗调节生物学过程是可行的。
因此，目前需要用于治疗疾病的定向基因治疗的改进方法，以及需要合适的含透明质酸的组合物以用于这种治疗。
D)基因治疗和眼部疾病
在澳大利亚专利申请75168/94中(海布里登公司)，已证明通过与基于小鼠VEGF的19至21聚体反义寡核苷酸保温，可在COS-1或NB41细胞中抑制鼠VEGF的体外表达。已显示一种定位到翻译终止位点的21聚体反义核苷酸是有效的序列。但是没有披露或提示序列特异定向至眼睛中的任何组织，也没有披露或提示对除糖尿病性视网膜病之外的任何眼部症状的治疗。
在美国专利5,324,654中，公开了一种刺激非恶性细胞的增殖的方法，该方法包括用相应于成视网膜细胞瘤(Rb)基因的的反义核苷酸体外治疗细胞以抑制Rb基因产物的表达，导致抑制细胞生长的蛋白的表达受到抑制。以这种方式，促进了细胞增殖。然后如果需要可以重新植入增殖的细胞，并且在重新植入前可对细胞进行基因工程操作以替换一种特异基因。然而没有文献指出这一反义序列可用于治疗眼部疾病。US5324654的发明涉及建立能长期增殖的细胞系以及治疗由基因不表达所致的疾病如肌营养不良和糖尿病。
尚未尝试将特异基因定向到特异细胞，而且也没筛选出眼部类型的定向。预期很难仅用腺病毒进行特异定向，因为该病毒能转染许多类型的细胞。
对于治疗眼部疾病，而体内其它部位大多数或全部未被感染，希望的是将治疗剂选择性地输送至眼内的靶组织。对于反义DNA，重要的是该DNA应能被吸收进这些靶细胞。
上述基因治疗中的进展已导致对转基因输送至靶细胞并在其中表达的进一步研究，如使用重组腺病毒作为输送系统将β-半乳糖苷酶转基因输送进视网膜(Bennett，等人，1994，Li等人，1994和Mashmour等人，1994)。视网膜色素上皮(RPE)是眼内一层不更新的单细胞层，位于神经视网膜和脉络膜之间，RPE细胞是吞噬性神经上皮细胞，其形成了视网膜的最外层。很久以来就已知这些细胞的吞噬性质，并且已有综述(Bok和Young，1979)。在幼年动物中观察到在RPE层中在3天内有高水平转基因表达，在神经视网膜的光受体细胞中在2周内有高水平转基因表达。报道基因的表达多达9周。在较年长动物中，视网膜下或玻璃体内注射均不能诱导β-半乳糖苷酶转基因在光受体细胞中表达(Li等人，1994)。
澳大利亚专利申请61444/94显示在注射进前腔、玻璃体或后球空间后，复制缺陷型重组腺病毒被眼内各种组织吸收，并且报道基因β-半乳糖苷酶表达。然而，这一文献没有显示这种形式的病毒是否成功地将活性剂掺入到靶细胞或区域中，也没有披露或提示VEGF可用于治愈任何眼部症状。
使用反义核苷酸作为眼部治疗形式成功与否的一个特殊障碍是该核苷酸不能进入靶细胞，以及修饰后的寡核苷酸例如磷酸硫代寡核苷酸的稳定性有限(Helene 1991)。这些因素极大限制了体内基因治疗的成功率，特别是长期治疗的成功率。在视网膜疾病的治疗中，延迟病程进展约12个月的能力将极大地增加长期治疗的价值和有效率。
已观察到用腺病毒作为视网膜基因治疗的转运载体伴有细胞毒性，已证明这种细胞毒性是剂量依赖性的(Mashmour，1994)，从而引出使用这种载体的另一困难。为了降低给定载体的剂量但同时保持其转移效率，可以使用一种佐剂，已证明佐剂如脂转染试剂能增加细胞对“裸露”的DNA的吸收。
尽管HA在外科手术过程中被广泛用作玻璃体丧失的替代物，但是我们在现有技术中并未发现有任何提示HA能促进任何药剂被眼睛中的任何细胞或组织吸收。类似地，尽管在Norpharmco的澳大利亚专利申请52274/93中已提示HA能促进药剂如抗生素或抗癌剂的穿透，但是这一文献没有提示HA能促进何种细胞对何种药剂的吸收，更不用说对DNA或病毒有吸收。特别是这一文献未教导通过眼内注射来使用HA。
我们现已发现RPE细胞的吞噬性质能增加体内注射到玻璃体空间后的分子如寡核苷酸和病毒的吸收。这些RPE细胞显示出比其它类型细胞有增加的吸收。我们的发现使得能够在视网膜或脉络膜上皮细胞中诱导VEGF的长期和短期表达，因此能抑制视网膜的新生血管化或SRNVM的发育。
发明概述
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种组合物，其包括一种核酸和一种透明质酸或其衍生物，以及一种药物学可接受的载体。
所述的核酸可以是DNA或RNA，和/或可以是与靶序列呈反义方向的核苷酸序列，靶序列是病态的产生或恶化所涉及的核酸序列。这一靶核酸序列可以是基因组DNA、cDNA、信使RNA或寡核苷酸。当靶核酸序列是基因组DNA时，它可以存在于编码区或存在于调控区如启动子序列。
或者，所述的核酸可以存在于一种包含待转移进靶细胞中的核酸序列的载体中，同样该核酸序列可以是基因组DNA、cDNA、信使RNA或寡核苷酸。然而，在这种情况下，所述的核酸可以是提供给靶细胞的有义序列以引发一种功能，或者可以是反义序列以用于抑制存在于靶细胞中的核酸的功能。
包含待转移的DNA的载体可以是病毒如腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒或反转录病毒。现有技术中已深入研究了所有这些病毒作为用于基因治疗的载体的应用。另外所述的载体也可以是脂质体。
本发明还提供了治疗患者的病理状态的方法，包括给予患者有效剂量的本发明的组合物。
应理解的是给药剂量和途径取决于待治疗的状态，医生或熟练人员将很容易确定合适的剂量和途径，应理解的是本发明的组合物可以周身给予如通过静脉内或皮下注射，局部给予如吸附在凝胶或海绵上，或者直接给予待治疗的组织如通过眼内或玻璃体内注射。
待治疗的患者可以是人类或动物，特别是家养或宠物哺乳动物，如牛、马、绵羊、山羊、猫和狗。
在本发明的组合物中，核酸或载体可以简单地与透明质酸混合，或者可以任选地与透明质酸物理或化学偶联。将DNA与透明质酸相连的方法披露于“含有核酸碱基的磺化Hyaluronan衍生物的合成”，化学通信，1994，2027-2030，以及“通过与Hyaluronan缀合的核酸碱基进行的核苷的转移性质”，Chirachanchai，S.，Wada，T.，Inaki，Y.和Takemoto，K.，化学通信，1995 2121-122。
在一个优选的实施方案中，本发明的这一方面提供了用于治疗由异常血管化所致的视网膜病的方法，其中所述的核酸是对应于至少一部分血管内皮生长因子(VEGF)的编码序列的反义核酸序列，并且所述核酸与如下所述透明质酸一起给药。
许多形式的HA适用于本发明，低分子量和高分子量形式的HA均可使用，唯一的要求是HA的纯度和无菌程度应适于药用，优选地，HA也是无热原的。HA的高分子量制备物在使用前可能需要稀释。特别是，适用于本发明的市售HA产品是Hyal制药公司，Mississauga提供的产品，其是平均分子量约为225，000的HA 2％的溶液，也可以是LifeCoreTM生物医药公司生产的透明质酸钠，Pro Visc(Alcon实验室)，和“HEALON”(Pharmacia公司，Uppsala)。应理解的是本说明书中的术语HA的衍生物包括HA的同系物，类似物，复合物，酯和片段及亚基。
可以用于本发明的HA的衍生物包括其药物学可接受的盐，或HA的片段或亚基。本领域熟练技术人员能够确定给定的HA制备物，或HA的特定衍生物、复合物等是否适用于本发明。
根据第二个方面，本发明涉及用于治疗由异常血管化所致的视网膜病的组合物，包括对应于至少一部分血管内皮生长因子(VEGF)编码序列的反义核酸序列，以及一种药物学可接受载体，任选地该组合物还包括一或多种佐剂如透明质酸或树状化合物用以增加细胞吸收。Dendritech公司等的国际专利申请WO95/24221中公开了使用树状化合物将遗传材料运输进靶细胞。
VEGF最优选的是人视网膜色素上皮(RPE)VEGF或脉络膜内皮VEGF。
在各个实施方案中，本发明的这一方面涉及短期(约2个月)、长期(约1年)和无限期(患者一生)治疗这种视网膜病。在第一个实施方案中，对于短期治疗，本发明提供了与VEGF基因的相应区域具有100％互补性的一或多种反义寡核苷酸。这种寡核苷酸应具有16-50个核苷酸，优选地具有16-22个核苷酸，更优选地具有16-19个核苷酸。可以使用Wagner等人(1996)描述的修饰的寡核苷酸，从而使序列长度的下限降低为7个核苷酸。
对于长期抑制，本发明提供了一种重组病毒，其包括呈反义方向的VEGF DNA。这一VEGF DNA是一种长序列，在本说明书中是指长度超过20个核苷酸的VEGF序列，优选长度超过50个核苷酸，直至全长VEGF序列。在这一实施方案中，重组病毒在RPE细胞中积累，并原位产生反义VEGF，从而在RPE细胞中抑制VEGF表达。
对于无限期抑制，本发明提供了一种病毒，其包括呈反义方向的VEGF DNA，其中该病毒能够将反义序列整合进靶细胞的基因组。优选地，该病毒是腺伴随病毒或类似病毒。如在涉及长期治疗的实施方案中一样，这一VEGF DNA的长度至少为20个核苷酸，优选超过50个核苷酸。腺伴随病毒或类似病毒能促进反义VEGF DNA整合进RPE细胞基因组，从而只要细胞仍有功能就可保持表达反义的VEGF。
可用本发明的组合物和方法治疗的眼部疾病包括但不限于年龄相关的斑点退化症(ARMD)和糖尿病性视网膜病。其它发生新生血管化的眼部病态和组织，如分支或中央视网膜静脉闭锁、早产性视网膜病(也称作retrolental fibroplasia)、糖尿病性虹膜发红或角膜新生血管化均可用本发明治疗。
在另一方面，本发明提供了预防或消除由异常新生血管化所致的视网膜病的方法，包括将有效量的针对VEGF的反义核酸序列给予眼中，从而抑制新生血管化。
反义序列可以携带在作为载体的复制缺陷型重组病毒中，该载体优选包括携带如下启动子的复制缺陷型腺病毒，所述的启动子为呼吸合胞体病毒(RSV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子，腺病毒主要晚期蛋白(MLP)启动子，VAl polIII启动子或β-肌动蛋白启动子。载体还可包括聚腺苷化信号序列如SV40信号序列。在一特别优选的实施方案中，载体是pAd RSV，pAd.MLP或pAd.VAl。在更优选的实施方案中，载体是Ad.RSV.aVEGF或Ad.VAl.aVEGF。
在一优选的实施方案中，人VEGF被亚克隆进载体，以创建插入所需的限制性位点，形成携带反义方向的VEGF或其部分序列的腺病毒质粒，这一质粒随后可经限制性酶消化而线性化。该线性化的质粒随后可与线性化的复制缺陷型腺病毒共转染进合适的宿主细胞，如肾293细胞系。
本发明的组合物可以经玻璃体内或视网膜下注射输送进眼中，优选与合适的赋形剂或载体一起注射。这种给药方法和这种注射所用赋形剂或载体是本领域所知的。或者，通过从患者中取出RPE细胞，培养细胞并体外用上述复制缺陷型腺病毒或腺伴随病毒对细胞进行注射而实现本发明组合物的来自体内输送。然后将携带病毒的RPE细胞注射到患者眼中的视网膜下层。
尽管本发明参照眼的病态进行了特殊描述，但是本领域熟练技术人员会认识到有许多VEGF起重要作用的其它病理状态，本领域技术人员明白本发明的反义寡核苷酸和重组病毒适于治疗这些其它状态。类似地，熟练技术人员也明白尽管本发明参照VEGF进行了特殊描述。但是本文所述方法也适用于与其它蛋白进行应用。
附图的简要描述
图1a示出了在单次玻璃体内注射后，在视网膜内反义寡核苷酸的体内持续性的基因扫描分析结果。
图1b示出了在注射CATSCF后不同时间内RCS-rdy+大鼠的视网膜的共焦显微图象。
图2是Long-Evans大鼠的RPE层中吞噬体数目的图形表示。剂量如下：低：6.6μg CATSC反义寡核苷酸；中：66μg；高：132μg。每一栏显示了在大鼠视网膜中5个随机选择的区域中的平均吞噬体数和标准偏差。
图3是在RCS-rdy+大鼠的RPE层中吞噬体数目的图形表示。实验动物用66μg有义寡核苷酸(S1)和66μg反义寡核苷酸(CATSC)进行注射。
图4示出增加腺病毒载体的滴度对表达腺病毒转基因的细胞数的影响。在所有情况下保温时间均为16小时。RPE7代表来自7岁龄供体的人视网膜色素上皮细胞；F2000C代表F2000成纤维细胞。F2000的后缀C表示F2000细胞表达的计数已根据与RPE7细胞的直接比较而修正。
图5示出增加与腺病毒载体的保温时间对表达腺病毒转基因的细胞数的影响。在所有情况下，腺病毒载体的浓度均为2×106p.f.u/ml。F2000的后缀C表示F2000细胞表达的计数已根据与RPE7细胞的直接比较而修正。
图6示出透明质酸(HA)对于给定病毒滴度的表达腺病毒转基因的RPE7细胞数的影响。三个直方形代表0.001％HA，0.005％HA和无HA(对照)的作用。误差直方形代表标准偏差。
图8示出在RPE7和F2000成纤维细胞中的HA受体的免疫荧光染色。8a：在RPE7上的CD44染色；8b：在RPE7上的ICAM染色；8c在RPE7上的RHAMM染色；8d：在F2000成纤维细胞上的CD44染色；8e：在F2000成纤维细胞上的ICAM染色；8f：在F2000成纤维细胞上的RHAMM染色。
图9显示出从猪眼中分离出的脉络膜毛细血管内皮细胞的显微照片，示出它们的特征性表观(最上一幅)，因子VIII相关抗原(中间一幅)，以及将乙酰化低密度脂蛋白吸收进细胞质的能力(最下一幅)。
图10示出各种透明质酸制剂对脉络膜毛细血管内皮细胞管形成(tube formation)的作用。
图11示出视网膜色素上皮细胞中的CD44抗原的碱性磷酸酶染色，在每种情况下，上皮位于照片的下方，而脉络膜在上方。
A.未漂白的色素上皮层。
B.漂白除去黑色素颗粒的色素上皮层。
C.用碱性磷酸酶标记的抗CD44抗体染色的漂白的色素上皮。
图12示出用VEGF165转染的视网膜色素上皮细胞系的DNA PCR和RT-PCR分析。
图13示出由转染的RPE细胞产生的VEGF165对脉络膜毛细血管内皮细胞管形成的作用。
发明的详细描述
以下参照非限制性实施例描述本发明。在其中一些实施例中，使用互补于组织蛋白酶S(CATSC)的反义寡核苷酸验证本发明所用方法的可行性。
实施例1  反义寡核苷酸在RPE细胞层中的积累
培养人视网膜色素上皮细胞，在体外实验中使用第三次传代培养物。用牛柳外层(ROS)培养铺满的培养物以模拟体内环境。向这些细胞的培养基中加入互补于人组织蛋白酶S(CATSCF)的荧光素标记的反义寡核苷酸，培养7天后收获细胞。通过荧光计数法(FACS)检测RPE细胞内的荧光素标记的寡核苷酸的存在，用Gene Scan DNA分析仪测量细胞中寡核苷酸的存在和稳定性。培养的RPE细胞的荧光增加约100倍，表明RPE细胞中存在反义寡核苷酸。这些结果见表1。
                   表1
用互补CATSCF培养或未培养的人RPE细胞的荧光测定
       样品    FACS读数
    RPE+ROS     5.94
    RPE+ROS+CATSC     8.50
    RPE+ROS+CATSCF     461.50
尚不知晓荧光是由全长CATSC还是由降解的寡核苷酸释放出。用Gene Scan证明荧光大部分是由19聚体寡核苷酸所致，其位于与CATSCF相似的位置。使用类似的程序，观察到在培养7天后CATSC寡核苷酸仍然是完整的。
实施例2  将寡核苷酸注射进眼中后寡核苷酸在视网膜细胞中的细胞分布及稳定性
将1纳摩尔CATSFC注射进6周龄无色素RCS-rdy+大鼠的玻璃体液中，并用共焦荧光显微镜术跟踪寡核苷酸的迁移，还注射了1纳摩尔荧光素作为对照。注射后2小时、3天和7、14和56天使动物安乐死，安乐死后取出注射后的眼，冻干、切片并不经固定立即用于共焦显微镜术。
玻璃体内注射CATSFC2小时后在神经节细胞层中观察到寡核苷酸的穿透，在3天时在光受体和色素上皮层也观察到寡核苷酸的穿透。然而注射后7天，仅RPE层具有显著量的CATSCF。在14、28和56天，在RPE层仍保持荧光信号，在所有其它类型细胞中未观察到信号。这些结果显示出大部分CATSCF被吞噬性RPE细胞吸收。
如上所述玻璃体内注射后，解剖眼睛，取出视网膜并提取DNA，将纯化的DNA进行GENE Scan分析。如图1a所示，在注射后7、14、28和56天的大鼠视网膜中证明有未降解的荧光素标记的寡核苷酸。在56天信号强度明显消失。
将10nmolCATSCF单剂注射到无色素的RCS-rdy+大鼠中后进行共焦显微镜分析。注射后以一定间隔检查视网膜，结果示于图1b，其中g代表神经节细胞层，i代表内核层，o代表外核层，r代表视网膜色素上皮层。图中条带示出注射10nmol CATSCF后2小时(B)、3天(A)、7天(C)、28天(D)和56天(E)，以及注射作为对照的FITC后3天(F)的视网膜。
这些结果表明玻璃体内注射后，寡核苷酸在RPE细胞中积累。寡核苷酸在RPE层中存在达56天，并且在此期间保持为生物学活性形式。
实施例3  反义寡核苷酸的生物学活性
雌性60日龄Long Evans株系无色素大鼠得自Charles River育种实验室，Wilmington，MA。
60日龄无色素RCS-rdy+大鼠得自我们自己的繁殖。在实验前将动物置于12小时光照/12小时黑暗光循环，平均照明度为5lux，至少10天。
通过腹膜内注射戊巴比妥纳(50mg/kg体重)麻醉动物。使用32gauge针头通过pars plana进行玻璃体内注射。左眼作为对照，右眼用3μl150mM氯化钠(盐水)或3μl含6.6、66或132μg CATSC的盐水注射(CATSC是早期描述的反义寡核苷酸(Rakoczy等，1994))，或用含60μg与CATSC100％互补的有义寡核苷酸S1的3μl盐水注射。使注射的动物从麻醉中恢复，在注射后1周用过量戊巴比妥钠处死，并用于形态学检查。在一天的同一时间，即日出后约4小时，在半小时内杀死全部动物。每一剂量使用2-3只动物。
取出全眼浸入于0.125M卡可酸钠缓冲液，pH7.35中的2.5％戊二醛和1％仲甲醛中。将角膜和晶状体剥离并将眼杯修剪以定向。组织在4℃固定过夜，然后在1％四氧化锇中于室温进行后固定1小时。乙醇脱水后将组织包埋于环氧树脂中。如前所述制备用于透射电子显微镜观察的视网膜切片(Kennedyt，1994)。
通过光学显微镜获得组织学数据。用带有钻石刀的LKB2088Ultratome(LKB-Produkter，瑞典)切成半薄1μm切片并用甲苯胺蓝染色。测定用盐水、低剂量CATSC(6.6μg)、中等剂量CATSC(66μg)或高剂量CATSC(132μg)以及66μgSl有义寡核苷酸注射的每种样品的RPE细胞中积累的吞噬体数。在40倍放大倍数下从每只眼中获取5套计数并计算标准偏差，每套计数由来自6个不同的随机挑选区域的250μm长RPE中的总吞噬体数组成。分析了在对照眼、低、中和高剂量CATSC的RPE中积累的吞噬体数并以图形表示。根据SASR(第6版)统计学软件包(SAS研究所公司，美国)的通用线性模型程序用差异分析进行比较。
结果显示我们在两个株系的大鼠中成功地测试了反义寡核苷酸(CATSC)。在对照Long-Evans和RCS rdy+大鼠中存在的吞噬体样包涵体的数目没有明显不同，分别为35.8+11.6和47.29+14.8(平均值±标准偏差)。玻璃体内注射是非创伤性的。对盐水注射的眼视网膜的光学显微镜检测表明对视网膜外层没有损害，并且当与对照的未注射的动物相比时，在RPE层中的吞噬体样包涵体的数目没有增加。使用Long-Evans大鼠鉴定诱导RPE层中的生物学变化所需的CATSC最低量。在对照眼和用低剂量(6.6μg)CATSC注射的眼中，在RPE细胞中的吞噬体样包涵体的数目分别是35.8+11.6和35.0+7.4。在用较高剂量(66μg和132μg)注射的动物中，吞噬体样包涵体的数目分别是96.2+13.6和141.0+34.7，当与对照样品和低剂量样品相比时，差异是统计学上明显的(图2)。
用66μg CATSC注射的RCS-rdy+大鼠中的吞噬体样包涵体数目204.20+39.3与对照中的47.20+14.8相比也显示出统计学上明显的增加。相反，用66μg有义寡核苷酸(S1)注射没有增加存在于RPE层中的吞噬体数目(34.4+12.54)(图3)。
在CATSC注射的Long-Evans和RCS-rdy+动物的RPE中发现的包涵体呈球形，并能与存在于Long Evans大鼠中的非常暗的小椭圆形黑色颗粒清楚地区分开来。在存在66μg CATSC时，外层部分的尖端显示出解构的迹象，并且在外核层中存在一些小泡，但是这些变化在S1有义寡核苷酸注射的动物中未观察到。
对CATSC注射的眼的RPE层的电子显微镜检查显示RPE细胞形态学上无明显变化。由于区域差异黑色素颗粒变小变浅，在治疗组中个体线粒体轮廓变小，但是治疗动物的线粒体数比未治疗动物多。电子显微镜检查证实未消化材料的结构与吞噬体结构类似。在用CATSC处理的大鼠的RPE层中所见的许多吞噬体是副核的(paranuclear)，并主要含有致密的磷脂膜，代表未消化的光受体外层部分(POS)并证实它们来源于光受体。在POS层中未观察到其它形态学变化，除了在处理动物的外缘有解构表现。
实施例4  基因转移至RPE细胞层
检测了使用腺病毒载体的基因转移的性质和动力学，还研究了佐剂对于腺病毒的吸收的作用。
人RPE培养物(HRPE7)得自7岁高加索白人供体并如Rakoczy等(1992)所述进行制备。在补加10％FBS(MultiserTM，Trace Biosciences)Eagles基本培养基(MEM，MulticelTM Trace Biosciences，澳大利亚)中培养、收获并浓集人F2000成纤维细胞，其中每100ml培养基含125μl庆大霉素(Delta West，Bentley，澳大利亚)。将1ml等份的浓集细胞悬液加到24孔板的每个孔中，以保证各孔的等量接种。用铺满的细胞进行实验，并获得每个实验点的至少两套平行数据。
腺病毒转基因的表达
如Graham和Prevac，1991所述培养并纯化携带RSV启动子和β一半乳糖苷酶基因的复制缺陷型腺病毒5(Ad.RSV.βgal)(Stratford-Perricaudet，1992)。对于以时间为基础的试验，向每孔中加入1ml在MEM中的浓度为4×106p.f.u/ml的Ad.RSV.βgal，使之终浓度为2×106p.f.u/ml。对于以滴度为基础的试验，向孔中加入1ml等份的浓度为8×103，4×104，8×104，2.4×105，4×105p.f.u/ml的病毒，使每孔中的总体积为2ml(终浓度为所加浓度的一半)。所有这些检查增加病毒滴度的作用的试验均包括将培养物与病毒悬液保温16小时的固定时间。
通过从每孔中除去培养基并用0.5ml 0.5％戊二醛固定细胞而终止实验，5分钟后除去戊二醛，用磷酸缓冲盐水(PBS)洗一次细胞。之后向每孔中加入0.5mlX-gal染色剂(1ml溶液中含有：25μlX-Gal(0.5mg/ml，BioRad，Hercules，加利福尼亚)，44μl HEPES缓冲液(44mM)，100μl K4Fe(CN)6(3mM)，100μl NaCl(15mM)，100μlMgCl2(1.3mM)，无菌蒸馏水加至1ml(531μl)，所示浓度为终溶液中浓度)并在室温保温过夜(约16小时)。
细胞计数
使用200倍Olympus TO41相差显微镜(Olympus光学株式会社，日本东京)，计数由单人观察完成。然后由第2个观察者盲计样品的25％作为反查。当使用平均值时使用显微镜中的计数十字线限定计数区。
计数所有X-Gal染色阳性的细胞。当转基因低表达时(＜约2000个细胞/孔)，计数整个平板。当细胞计数较高时，使用平均值。计数5个标准区域中的细胞并用其平均值计算每个孔的总计数。
在比较HRPE7和F2000成纤维细胞的表达率的试验中，校正表达该基因的F2000细胞数的值，这一校正值反映了在24孔板中的铺满培养物中每种细胞的不同总细胞数。HRPE7的计数是3×105/孔，F2000的计数是2×105/孔。图形(图4和图5)也包含校正的计数以使得能直接对比。当细胞类型之间没有比较时，原始计数不进行改变。
在基于滴度的试验中，表达曲线在增加率和绝对表达方面明显不同，对于HRPE7细胞，表达率呈指数形式，而在F2000成纤维细胞中，曲线更线性化。在比较滴度的试验表达中有一宽的间断。在较高的病毒滴度下，HRPE7表达比F2000细胞高一数量级。对于在这一实验中测试的条件和滴度，随着载体滴度的增加，表达细胞数有一整体的和恒定的增加(图4)。
在保温时间对转基因表达模式的研究中，Adv.RSV.βgal的浓度恒定保持在2×106p.f.u/ml。转基因在两种细胞类型中的表达模式明显不同，在表达基因的细胞数的增加率和数量级上均不同。在表达基因的HRPE7和F2000成纤维细胞数的突然增加之间也存在一明显的延迟。对于HRPE7细胞，表达率的提高发生在4小时，而F2000成纤维细胞发生在24小时。在4到24小时之间有一“窗口”期，此时HRPE7表达比F2000细胞高一个数量级(图5)。
实施例5  HA作为佐剂对使用病毒载体的β-gal基因的吸收和表达的作用
将HRPE7和F2000细胞等份装入24孔板，如实施例4所述保温细胞，使之达到95％铺满。用MEM制备0.001％-0.005％的透明质酸钠(HA)(1％透明质酸来自鸡冠；HEALON，Pharmacia公司，Uppsala，瑞典)缓冲溶液。将浓度为4×106p.f.u的10μl病毒溶液加入到10ml每种稀HA溶液和10ml用作对照的MEM中，在25℃保温30分钟，其间间或轻轻振荡。向24孔板的各孔中加入1ml每种测试和对照溶液。每一测试浓度和对照各有4个平行样品，计数并取平均值。
将病毒/HA溶液与细胞培养物保温16小时，根据实施例4的程序终止实验。
                        表2
实验1：在HRPE7细胞中的表达
  1   2   3   4   平均
RPE7/HA(0.001％) 17114  20776  18730  17998  19168
 RPE7/HA(0.005％) 17688  22186  20258  22236  20592
RPE7/对照 10782  15480  16326  15266  14705
在仅含腺病毒的每孔中表达转基因的HRPE7细胞的平均数是14705(SD±2228)，对于加0.001％HA的腺病毒，表达细胞的平均数是19168/孔(SD1561)，而对于0.005％HA，平均数是20592(SD2143)(图6)。这表明0.001％HA使表达转基因的细胞数增加30.4％，0.005％HA使之增加40.0％。
用Student’s t测试评价，当使用0.005％HA时，与对照相比，表达基因的HRPE7细胞数增加的显著性几率是0.0097，表明显著性水平p＜0.01。这种显著性反映了平均值之间的巨大差异(20592(测试)对14705(对照)〕，并且平均值差异超过2个标准偏差。
当使用0.001％HA时，与对照相比，表达基因的RPE7细胞数的增加的显著性的t试验几率为0.02931，其显示显著性水平p＜0.05。下降的显著性反映在了平均值之间的较小的差异(19168(测试)对14705(对照))。
表3
实验2：在F2000细胞中的表达
    1     2     3     4   平均
 F2000/HA(0.001％)   4358   4620   4195   NA   4391
 F2000/HA(0.005％)   4506   3914   4759   4332   4378
 F2000对照   3844   3652   3875   3748   3780
检测HA对转基因在F2000成纤维细胞中的表达的作用的方案与HRPE7所用方案相同。表达转基因的细胞数明显低于HRPE7，这与实施例4的结果一致。在仅有腺病毒的每孔中表达的细胞的平均数是3780(SD±100)。对于加0.001％HA的腺病毒，表达细胞的平均数是4391/孔(SD±214)，而对于0.005％HA，平均数是4378(SD355)(图7)。这显示用0.001％HA使表达腺病毒转基因的细胞数增加15.8％，用0.005％HA，使表达细胞数增加15.5％。
二特制Student’s t测试被用来评价每套实验数据的平均值之间的差异的显著性。对于每一实验，给出平均值、平均值的差异的标准误差及t测试的p值。在两个实验中，HA给出非常显著的增加的吸收(p＜0.05)。
与对照相比，使用0.005％HA的表达转基因的F2000成纤维细胞的细胞数增加的显著性的t试验几率为0.0044，其显示显著性水平p＜0.01。此处的高显著性反映出平均值之间的巨大差异(4391(测试)对3790(对照))以及两样品之内的小差异。标准偏差是214(测试)和111(对照)。
与对照相比，使用0.001％HA的表达转基因的F2000成纤维细胞的细胞数的增加的显著性的t试验几率是0.0195，其显示显著性水平p＜0.05％。在原始数据中有较大差异，标准偏差高于0.005％的样品(355对214)，即有较高p值。
还进行了以硫酸软骨素和脂转胺试剂为佐剂的初步试验，以评价类似的效果，这些试剂对HRPE7细胞中的基因表达没有明显作用。
还使用了下述剂量的佐剂：
表4
HA浓度
    病毒溶液量   0.05％   0.01％   0.005％   0.001％   对照   对照
    5μl   176a     318     319     316     279     282
    10μl   305a     906     802     645     623     609
    25μl   -a     714b     1682     1822     1478     1184
    50μl   -a     2772     2692     3328     2250     1822
这些数字代表了HA浓度对β-gal转基因的吸收和表达的作用。增加的病毒浓度导致β-gal表达细胞数的增加。这些数字代表在一24孔板中在HA存在下与病毒保温16小时后β-gal染色阳性的RPE细胞数(cc2×1011pfu/ml)。
a这些溶液的粘度阻碍了HA的合适分布并使其很难操作。
b尚不清楚为何这一数字与其它结果的正常分布差距如此之大。
实施例6  HA分子量对使用病毒载体的β-gal基因的吸收和表达的作用
在K293人胚肾细胞系的细胞中培养带β-半乳糖苷酶标记基因和RSV启动子的腺病毒(AdV.RSV.βgal)。收集上清，经系列稀释且每一稀释度4个重复来确定病毒浓度。经计算病毒浓度为5×108pfu/ml。将病毒悬浮于含10％胎牛血清(FBS)和125μl/100ml庆大霉素的MEM培养基中。
人视网膜色素上皮细胞(HRPE)来自20岁供体并在如上所述的培养基中培养。从同一原液中将其等分至24孔板中并使之达到铺满。使用第4代细胞。
测试了下述HA制剂：
1、Hyal(MW约300000)
2、Provisc(MW约1900000)
3、Healon GV(MW约5000000)
用不加FBS的MEM将每种制剂稀释成0.002％溶液。
以1∶1的比例将如上所述病毒溶液与佐剂溶液混合，使终浓度为2.5×108pfu，HA浓度为0.001％。将两种溶液在这一混合物中于室温轻轻振荡保温30分钟。对照溶液为病毒与不加FBS的MEM的混合物且不存在HA。
向24孔板细胞中加入1ml病毒/HA混合物，在27℃CO2温箱(5％CO2)中保温24小时。通过除去病毒/HA混合物并向每孔加入0.5ml0.5％戊二醛5分钟来终止实验。用PBS洗孔一次并与Xgal染色剂反应。
全程使用100倍的Olympus TO41相差显微镜(Olympus光学株式会社，日本东京)。由单个观察者进行计数并由第2个不知情观察者计数样品的四分之一来检查。使用显微镜中的计数十字线限定计数区域。所有用X-gal染色剂阳性染成蓝色的细胞均作为阳性计数。计数在5个标准区中的细胞并用其平均值计算每孔中的总计数。在表5至表9中列出了结果和统计分析。
                    表5
(仅计数样品)  对照    Hyal   Provisc     Healon GV2043    2486    2424       2756
表达β-gal的细胞数
统计
                                    所有组之间Anova：单因子
                          表6总结
  组   计数     合计     平均     方差
对照HyalProvigcHealon GV     3333     6129745872718268     204324862423.6672756     15769422536677.3336928
表7
  偏差来源     SS   df       MS      F
    组间组内总计 777567.0187198.7964765.7 3811 25918923399.83 11.07653
Anova：单因子                              佐剂之间
                     表8
  组   计数   总计     平均     方差
 HyalProviscHealon GV     333     745872718268     24862423.6672756     422536677.3336928
                    表9ANOVA
偏差来源     SS  df     MS   F   P-值    Fcrit
组间组内总计     187230.9155660.7342891.6   268   93615.4425943.44   3.61     0.094     5.14
与对照相比在所有含HA样品中的转基因表达均有增加(p＜0.003)。Hyal、Provisc和Healon GV HA制剂的增加百分数分别是21.7％、18.6％和34.8％。在不同分子量的透明质酸的作用效果之间没有明显的差异(p＝0.09)。
这些结果表明透明质酸增加了病毒载体的吸收，说明其具有佐剂作用。另外，佐剂的作用与MW300000-5000000之间的透明质酸的分子量无关。
实施例7  HRPE7和F2000的细胞膜上的HA受体的证明
多克隆RHAMM(Hyaluronan介导的迁移性的受体)抗体由加拿大Manitoba细胞生物学研究所的E.Turley博士惠赠，该抗体以1∶75稀释度使用。单克隆胞间粘附分子1(ICAM-1)抗体(Boehringer-Mannheim)的使用浓度为4μg/ml，单克隆归巢受体CD44抗体(CD44)的使用浓度为4μg/ml(Boehringer Mannheim Biochemica，德国)。单克隆抗人IgG抗体和大鼠非免疫血清由澳大利亚Perth的Lions眼研究所的M.Baines博士惠赠，它们的使用浓度分别是4μg/ml和1∶75稀释度。抗小鼠IgG(Fab特异的)-FITC缀合二级抗体以1∶64稀释度使用，抗兔IgG(全分子)-FITC缀合二级抗体以1∶100稀释度使用(Sigma免疫化学品公司，密苏里州圣路易斯)。
在Lab Tek 8孔玻片槽(Nunc Inc.Naperville，Illinois)中培养HRPE7和F2000成纤维细胞，在免疫荧光染色前在-20℃用甲醇固定细胞培养物10分钟。所有初级抗体溶液保温1小时，对于两种细胞中的每一种所用的初级抗体是测试用的单抗ICAM-1，抗CD44以及作为对照的单抗人IgG，多克隆抗RHAMM和作为对照的非免疫兔血清。除去初级抗体后，用PBS洗孔三次并施加二级抗体1小时。抗单克隆抗体的二级抗体是抗小鼠IgG，多克隆抗体是抗兔IgG。将二级抗体加到无初级抗体的组织作为进一步的对照。最后，除去二级抗体后，在移去孔槽之前洗孔三次，玻片用Immuno Fluroe固定培养基(ICN生物医学品公司，Aurora，Ohio)固定。
如图8a和8b所示，用单克隆抗体针对CD44的免疫组织化学染色表明HRPE7细胞和F2000成纤维细胞均阳性染色。染色分布与细胞表面一致，因为染色图案与培养的组织的细胞轮廓相同。
一种单克隆人抗IgG用作对照，其对于HRPE7和F2000成纤维细胞均是阴性。使用不加初级抗体的二级荧光抗体的第二种对照对两种细胞类型也呈阴性。
使用ICAM-1的单克隆抗体的免疫组织化学染色对HRPE7和F2000成纤维细胞均呈阳性染色，如图8c和8d所示。该染色与CD44染色具有类似的分布，只是信号销弱。ICAM-1染色使用CD44染色的相同对照，其也是阴性的。
如图8e和8f所示，使用兔多克隆抗体对RHAMM受体的染色对于HRPE7和F2000成纤维细胞均呈阳性，然而在两种细胞类型中的染色分布却明显不同。在HRPE细胞中染色模式主要是细胞核，仅有微弱的胞质轮廓(图8e)。在F2000成纤维细胞中的染色分布与CD44和ICAM-1染色分布类似，相对于胞质或细胞轮廓模式没有观察到明显的核信号。
对照血清是兔未免疫血清，其对HRPE7呈阳性，但在F2000成纤维细胞中给出很弱的信号。在两种情况下，二级荧光抗体单独不能从两种细胞类型中的任一种给出阳性信号。
实施例8  不同分子量的透明质酸制剂对管形成的作用
试剂
不同钙或镁的Hank’s平衡盐溶液(Hank’s BSS)、培养基HamsF12、具有Earles盐的最小基本培养基(EMEM)、胎牛血清(FCS)、青霉素-链霉素、两性霉素B和胰蛋白酶-EDTA得自澳大利亚生物研究公司(Perth，西澳大利亚)。胶原酶A、内皮细胞生长补充物(ECGF)，针对因子VIII相关抗原的小鼠抗人单克隆抗体、以及抗小鼠Ig-荧光素得自Boehringer Mannheim澳大利亚有限公司(Perth，西澳大利亚)。明胶、肝素、抗坏血酸购自Sigma化学品公司(澳大利亚悉尼)，乙酰化低密度脂蛋白(DiI-ac-LDL，1，1’-二十八烷基-3，3，3’，3’-四甲基吲哚羰花青高氯酸)来自生物医学技术公司(Stoughton，马萨诸塞)，Matrigel来自Collaborative Research(Bedford，马萨诸塞)，重组人血管内皮细胞生长因子(VEGF)来自Pepro Tech EC公司(RockyHill，新泽西)，ProVisc(MW 1.9×106)来自Alcon实验室公司，Healon(MW 2.5×106)和Healon GV(MW 5.0×106)来自Pharmacia。
猪脉络膜毛细血管(choriocapillary)内皮细胞的分离和培养
猪眼在动物死亡之后2-4小时从当地屠宰场得到。如前所述分离脉络膜毛细血管内皮细胞(CEC)(Morse等，1990；Sakomoto等，1995)。简单地说，用不含钙和镁但含0.1％胶原酶A的Hank’s平衡盐溶液(Hank’s BSS)在37℃释放内皮细胞1小时。在Hank’s BSS中洗两次后，将细胞涂布在1％明胶涂覆的75cm2细胞培养瓶中，该培养瓶置于37℃5％CO2、95％空气中。生长培养基由Hams F12加10％胎牛血清(FCS)、100U青霉素-100μg链霉素/ml、2.5μg/ml两性霉素B、37.5μg/ml内皮细胞生长补充剂(ECGS)、肝素100μg/ml和抗坏血酸25μg/ml组成。涂布24或48小时后，毛细血管分段，显示鹅卵石表观的内皮细胞集落扁平化并扩散。在第三或第四天，识别非内皮集落并在75cm2培养瓶上用记号笔画圈。使用一种经火焰烧出球形头的玻璃吸管除去并捣碎在圈内的任何非内皮集落(Folkman等，1979)。这一技术是在一层状流罩中于相差显微镜(×10物镜)下进行。更换培养基两次以除去漂浮的细胞。重复这一程序3-5次以使内皮细胞初级细胞在铺满前得到富集。通过典型鹅卵石形态学，存在因子VIII相关抗原(Sakomoto等，1995)以及用DiI-ac-LDL呈阳性染色(吸收)鉴定这些细胞为血管内皮细胞。
透明质酸对管形成的作用
如前所述进行管形成分析(Haralabopoulos等，1994)，简单地说，根据产品说明用从Engelbreth-Holm Swarm tumour制备的Matrigel(16.1mg蛋白质/ml)包被24孔簇板(250μl/孔)。在CO2培养箱中于37℃使Matrigel聚合30分钟后，向Matrigel包被的孔中加入0.5ml培养基，该培养基含有在加10％FCS的MEM中的10或20μg/ml不同分子量的透明质酸制剂(Provisc，MW 1.9×106；Hyal MW 2.5×106；Healon GV MW 5.0×106)。在0.5ml MEM中的10％FCS用作管面积相对单位的对比。通过0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA从烧瓶中释出CEC(3-7代)，重悬于5％MEM中并加至包被的孔中(50,000个细胞/孔，在0.5ml培养基中)。为估计凝胶上的管状结构的面积，6小时后用相差显微镜拍照。在每一孔中随机取5-7个区域(×10物镜)用于定量研究。
脉络膜毛细血管内皮细胞
毛细血管内皮细胞的初级培养物具有与其它类型细胞不同的特征性表观，另外它们的特征还在于因子VIII相关抗原的染色，以及吞噬DiI-ac-LDL的能力的分析。超过95％的CEC显示与因子VIII相关抗原呈阳性反应，如图9所示，几乎每个细胞均显示将DiI-ac-LDL吸收进胞质。这表明至少95％的细胞是脉络膜毛细血管内皮细胞(CEC细胞)。
管形成的定量及统计学分析
用计算机成象分析系统(Professional Image Processing for Windows，Matrox Inspector)测定来自双份重复孔的管面积，将玻片照片扫描进行计算机并调节背景以获得管和Matrigel之间的最佳差别。然后通过测量每一照片的总管面积定量管形成，结果以7.5％FCS(终浓度)存在下的管面积的百分比的平均值和标准误差表示，对至少两个实验进行Student’st试验分析。
管形成
在接种至Matrigel上1小时，CEC开始附着，2-3小时之内CEC迅速迁移进列阵细胞的正方形网中，3小时后CEC开始扁平化并在Matrigel表面形成毛细血管状结构。6小时后毛细血管状结构非常明显，显示出类似血管的网结网状结构。6小时后评价在对照样品和含生物学活性浓度的不同透明质酸制剂的实验样品中的管形成，结果示于图10及表10-13。
                             表10
    Pro VisK(5μg/ml)   Pro Visk(10μg/ml)    Healon(5μg/ml)    Healon(10μg/ml)
    60.349.6490.0341.7859.04129.2     139.91122.9647.3836.199.4106.05     119.37134.0139.9637.12142.3272.63     118.33111.2247.4868.9126.36117.69
                   表11
    Healon GV(5μg/ml)     Healon GV(10μg/ml)     对照
    115.22111.57114.42105.0622.64104.08     86.1662.5778.88145.59136.12     155.09118.7185.0843.3494.91102.94
                     表12总结
  组   计数     合计     平均     方差
 Column 1Column 2Column 3Column 4Column 5Column 6Column 7     6666656     429.99551.8545.41589.98572.99509.32600.07     71.6791.9790.9098.3395.50101.86100.01   1062.861724.362226.801035.701295.741351.081370.50
                          表13
偏差来源     SS  df     MS   F   P-值   Fcrit
组间组内总计     3655.2548984.1052639.35   63440   609.211440.71   0.42     0.86     2.38
对照和含透明质酸样品之间的CEC管形成没有明显的统计学差异，表明分子量在300000-5000000之间的透明质酸在不存在另一试剂时不会诱导新生血管化。
实施例9  在人视网膜中存在CD44 HA受体的证明
制备人视网膜
除去角膜后解剖人眼库供体的眼睛，弃去外层，小心除去玻璃体，留下后面的神经视网膜的某些部分及附着于脉络膜的完整色素上皮层。眼cap填充2.5％戊二醛固定，取固定组织的切片进行石蜡包埋。切割石蜡块并将切片转移至组织化学玻片上，在二甲苯和乙醇中脱蜡，在蒸馏水和Tris缓冲盐水pH7.2(TBS)中洗。
切片的碱性磷酸酶染色
通过将眼切片在50μl 0.25％高锰酸钾中保温45分钟而后在50μl1.0％草酸中保温5分钟除去黑色素颗粒，与50μl/切片10％正常马血清/TBS(联邦血清实验室，Perth，澳大利亚)保温30分钟进行漂白。然后在TBS中洗切片两次，每次5分钟，并与50μl小鼠抗CD44单克隆抗体(Boehringer Mannheim Biochemica，Mannheim，德国)或50μl小鼠抗81-11单克隆抗体(未免疫对照)保温60分钟，保温后，再次在TBS中洗切片两次，每次5分钟，与50μl 1/250马抗小鼠IgG(H+L)(二级抗体)保温60分钟，而后在TBS中洗两次，每次5分钟，其中马抗小鼠IgG(H+L)与多克隆抗体用碱性磷酸酶缀合。在50μlFAST RED(Sigma Aldrich，St Louis，USA)中保温切片20分钟，用TBS洗两次，每次5分钟，在Meyer’s苏木精中负染10分钟，而后在自来水中5分钟。干燥切片，用甘油者喱固定。
如图10所示，成功地进行了黑色素的漂白而没有损坏组织切片。用小鼠对照单克隆抗体和FAST RED对戊二醛固定的眼切片的染色导致在未漂白的组织中的RPE层的清晰染色(图10A)，以及漂白后用10％正常马血清保温后RPE层的清晰染色(图10B)。在用抗CD44单克隆抗体染色的组织中观察到强峰信号，表明在视网膜色素上皮中特异性存在CD44 HA受体(图10C)。如在脉络膜中一样，在神经视网膜中未检测到信号。
这些结果表明视网膜色素上皮细胞优先表达HA受体，由此促进HA复合物吸收增加。
实施例10  在NIH 3T3细胞中正调节及负调节组织蛋白酶D表达
以有义和反义方向将人组织蛋白酶D的1620bp Hind III片段亚克隆进pHBAPr-l-neo载体中。选择阳性克隆，经EcoRI限制酶分析证实片段的方向。为转染NIH 3T3细胞，将携带反义和有义方向的组织蛋白酶D的克隆过氯化钙密度梯度。
以在2ml补加10％胎牛血清(FBS)的DMEM中的2×105的浓度将NIH 3T3细胞接种在6孔组织培养板中，37℃过夜培养细胞直至其达到70％铺满。达到铺满度后，用无血清和抗生素的培养基洗细胞两次。轻轻混合在100μl OPTI-MEM(GIBCO-BRL)中稀释的脂转染试剂(10μl)(GIBCO-BRL)并在室温保温15分钟。保温后向混合物中加入800μl OPTI-MEM，将这一稀释的混合物轻轻覆盖在洗涤后的NIH 3T3细胞上。保温细胞16-20小时后除去转染培养基，代之以补加10％FBS的DMEM。继续培养48小时后，将细胞胰酶化，并以1∶5在含10％FBS和1ng/ml遗传霉素418(GIBCO-BRL)的培养基中传代培养。在如上所述的补加FBS和遗传霉素418的培养基中保持用遗传霉素418选择的成功转染的细胞。冷冻贮存铺满的转化培养物并传代培养以进一步分析。使用传统的细胞化学技术经抗组织蛋白酶D的多克隆抗体和碱性磷酸酶标记的二级抗体检测转化的NIH3T3细胞中的组织蛋白酶D的存在。
用Hind III消化证实载体中存在组织蛋白酶D片段，阳性克隆显示存在1620kb片段。经EcoRI限制酶消化确定方向，反义方向得到5.7和5.9kb两个片段，有义方向得到4.3和7.3kb片段。所有经遗传霉素418选择存活的NIH 3T3细胞均携带组织蛋白酶D克隆，其是抗生素抗性的。转化的对照NIH 3T3细胞不能在选择程序中存活。免疫细胞化学结果提示携带有义方向的组织蛋白酶D的NIH 3T3细胞正调节组织蛋白酶D产生，而那些携带反义方向组织蛋白酶D的细胞负调节组织蛋白酶D的产生。
实施例11  表达VEGF165的RPE细胞系的产生
细胞培养
在含5％CO2的潮湿环境中于37℃保持人RPE细胞系407A(Davis等，1995)，培养基由补加10％FCS(Trace Biosciences，澳大利亚新南威尔士洲悉尼)和100 IU/ml青霉素/100μg/ml链霉素(P/S)(ICN制药公司，Costa Mesa，CA，USA)的最小基本培养基(MEM，Biosciences，澳大利亚新南威尔士州悉尼)组成。大约每隔5天用0.25％胰蛋白酶(Trace Bioscienccs，澳大利亚南威尔士州悉尼)/0.05％EDTA(BDH化学(澳大利亚)有限公司，Kilsyth，VTC，澳大利亚)传代1次。
将VEGF165克隆至表达载体中
在Bluescript KS中的小鼠VEGF165得自德国Max Planck研究所的Georg Breier博士(Breier等，1992)。将VEGF165插入pHβApr-l-neo的BamHI位点(图1)(Gunning等，1987)，这一克隆经pGem 7Zf(+)(Promega，Madison，WI，USA)进行以在VEGF165的3’末端添加-BamHI位点。用EcoRI消化鉴别有义VEGF-pHβApr-l-neo克隆(Promega，Madison，WI，USA)。用Qiagen Plasmid Midi试剂盒(QiagenGmbH，Hilden，德国)制备VEGF-pHβApr-l-neo DNA，如厂商方案进行抽提，将得到的沉淀重悬于500μl TE缓冲液(10mM Tris HCL，pH8.0，1mMEDTA)中。
根据厂商指导用脂转染试剂(Gibco BRL，Gaithersburg，MD，USA)将VEGF-pHβApr-l-neo DNA转染进407A细胞。简单地说，将在100μl OPTI-MEM(Gibco BRL，Gaithersburg，MD，USA)中的2mgVEGF-pHβApr-l-neo DNA与5μl脂转染试剂在100μl OPTI-MEM中混合，将混合物置于室温15分钟，然后加OPTI-MEM至1ml，并覆盖在60％铺满的407A细胞上。在5％CO2的潮湿环境中于37℃保温细胞过夜，然后加入含10％FCS和P/S的4ml MEM，再保温细胞24小时，然后向细胞培养基中加入1mg/ml遗传霉素(Gibco BRL，Gaithersburg，MD，USA)。一周后筛选一系列独立的集落，然后在1mg/ml遗传霉素中生长直到确立细胞系。然后将遗传霉素浓度降至300μg/ml细胞培养基。
还使用脂转染试剂产生了由仅用pHβApr-l-neo转染的407A细胞组成的对照细胞系(407A-pHβApr-l-neo)。两个细胞系均在含10％FCS、P/S和300μg/mnl遗传霉素的MEM中保持。
用于DNAPCR和RTPCR的引物的选择
选择引物以特异性扩增转染的小鼠VEGF165，而无来自人407A细胞系的人VEGF165的背景扩增。用IBI Pustell分析软件(IBI公司，英国剑桥)比较Gen Bank数据库中所列的小鼠VEGF165和人VEGF165的序列。从小鼠VEGF165中选择与人VEGF165具有小于70％同源性的19聚体区域。引物序列为“VEGFM01”，位于小鼠VEGF165的115-134bp，5’-AGG AGA GCA GAA GTC CCA T；“VEGFMO2”，位于小鼠VEGF165的300-318bp，5’-CGT CAG AGA GCA ACA TCA C。用BasicLocal Alignment Search Tool(BLAST，国家生物技术信息中心，Bethesda，MD，USA)对引物序列进行分析表明仅与小鼠VEGF形式有同源性。
DNAPCR
用0.25％胰蛋白酶/0.05％EDTA收获细胞。收集2×106个细胞的样品并用PBS洗，然后在100ng/ml蛋白酶K(Boehringer Mannheim，Mannheim，德国)和0.5％w/v十二烷基硫酸钠(SDS)(BDH ChemicalsAustralia Pty Ltd.Kilsyth，V1C，澳大利亚)存在下于37℃保温3小时。经苯酚/氯仿抽提和乙酸钠/乙醇沉淀分离DNA，将DNA沉淀重悬于100μl TE缓冲液中。
所有PCR试剂，包括超纯水均得自Biotech International Ltd.(Bentley，WA，澳大利亚)。PCR反应混合物由5μl 5x聚合缓冲液，25mM MgCl2，1U Tth Plus DNA聚合酶，50ng VEGFM01，50ng VEGFMO2组成，加超纯水至25μl。用1μl每种DNA样品进行PCR。对于所进行的每一系列PCR反应，均包括含20ng VEGF-pHβApr-l-neo DNA的阳性对照和含超纯水代替DNA的阴性对照。使用Perkin Elmer GeneAmpPCR系统2400热循环仪(Perkin-Elmer公司，Norwalk，CT，USA)进行PCR反应。所用循环为92℃5分钟、55℃1分钟、74℃1分钟1个循环；92℃1分钟、55℃1分钟、74℃1分钟35个循环；92℃1分钟、55℃1分钟、74℃10分钟1个循环。PCR产物在2％琼脂糖凝胶上电泳，溴乙锭染色观察。
逆转录PCR(RTPCR)
用RNAzolB(Biotecx Laboratories Inc.，Houston，Texas，USA)抽提RNA，根据厂商方案进行这一程序，直接从铺满的25cm3培养瓶的细胞(4×106个细胞/瓶)中抽提RNA。将得到的沉淀重悬于50μl焦碳酸二乙酯(DEPC)(BDH Ltd，Poole，Dorset，England)处理的水中。
用GeneAmp热稳定rTth反转录酶RNA PCR试剂盒(Perkin-Elmer公司，Norwalk，CT，USA)进行RT PCR，根据厂商指导进行反转录和PCR反应。每一反应用200ng RNA。所有反应所用的水均为超纯水。RT PCR阳性对照含20ng VEGF-pHβApr-l-neo DNA。阴性对照以超纯水代替RNA。DNA污染的对照是通过完成反转录步骤之后加入rTth DNA聚合酶而产生。用乙酸钠/乙醇沉淀RT PCR产物。在70％乙醇中洗样品并重悬于TE缓冲液至1/5 PCR反应体积。在2％琼脂糖凝胶上电泳PCR产物并经溴乙锭染色观察。
表达VEGF165的视网膜色素上皮细胞系的产生
将VEGF165成功地克隆到pHβApr-l-neo的BamHI位点，用BamHI消化证实克隆，所述消化产生2个片段，10.0kb片段相应于pHβApr-l-neo，656bp相应于小鼠VEGF165。用EcoRI消化VEGF-pHβApr-l-neo克隆产生两个片段，5.7kb和5.0kb，证实VEGF是有义方向。
用脂转染试剂将VEGF-pHβApr-l-neo转染进407A细胞系。用DNA PCR证实在转染的407A细胞系中存在小鼠VEGF165 DNA。从VEGF-pHβApr-l-neo转染的407A集落中抽提DNA，并从对照407A-pHβApr-1-neo细胞系中抽提DNA。对VEGF-pHβApr-l-neo转染的407A DNA进行PCR导致在每一测试集落中产生一200bp的DNA片段，这一片段与由引物在小鼠VEGF165基因上的位置预测的大小一致，并且与VEGF阳性对照所产生的片段大小相符合。选择一株已确立的转染细胞的集落以进行后续实验(407A-VEGF)。在407A-pHβApr-l-neo的PCR中未检测到信号。结果示于图11A。来自未转染的407A细胞的DNA也产生PCR信号，证实所用的引物特异于小鼠VEGF165。
用RT PCR证实由407A-VEGF产生的小鼠VEGF165 mRNA。对407A-VEGF总RNA进行RT PCR，产生一200bp片段，相应于由小鼠VEGF165引物的位置预测的片段大小。从407A-pHβApr-l-neo总RNA中未接收到信号。两种RNA样品均显示没有污染DNA，这是由于在RT PCR中省略了cDNA合成步骤。结果示于图11B。使用未转染的407A RNA的RT PCR不产生任何信号。
管形成分析
如实施例8所述进行该分析。在接种1小时内CEC附着于Matrigel支持物上。培养2-3小时后，CEC迅速迁移形成列阵细胞的方形网，随后开始在Matrigel表面上形成毛细管状结构。24小时后CEC具有网结网外观，这是典型的血小管。由计算机成象获得的管形成的定量分析见图13所示。
最深入的毛细血管网在存在100ng/ml人重组VEGF时培养的CEC中见到(图13B)。由407-VEGF条件培养基诱导的毛细血管管形成的量与人重组VEGF诱导的类似。相反，来自对照407A-pHβApr-l-neo细胞系的条件培养基的管形成水平显著下降，与含仅补加5％FCS和P/S的Ham’sF12培养基的对照培养物类似。
当与407A-pHβApr-l-neo相比时，407A-VEGF条件培养基诱导的管形成的量增加了100％，发现这一差异是显著的(p＝0.009，Student’s t试验)。在对照培养物和含100ng/ml人重组VEGF的培养物之间的差异也是显著的(p＝0.002，Student’st试验)。
实施例12  人RPE血管内皮生长因子(RPE-VEGF)的克隆和鉴定
将本实验室提供的人RPE细胞在组织培养物中培养。为正调节VEGF表达，将细胞培养物在供氧不足条件下处理。用免疫组织化学法监控VEGF表达的正调节。从107个RPE细胞中抽提mRNA，用现有技术已知方法建立携带在RPE/脉络膜中表达的所有基因的cDNA文库。
VEGF是一种高度保守的分子，其在不同物种之间高度同源。用本实验室提供的鼠VEGF cDNA克隆筛选人RPE cDNA文库以鉴别全长人RPE-VEGF克隆。通过限制酶分析阳性克隆，最终经DNA测序分析。分析全长RPE-VEGF克隆以阐明其基因组结构(起始序列、起始和终止密码子、推测的外显子等)。
以体外翻译分析携带全长RPE-VEGF的克隆对VEGF蛋白的表达。用鉴别的克隆衍生反义分子，用于插入载体系统，以及用于选择反义寡核苷酸。
实施例13  短期抑制VEGF表达的药剂
反义DNA技术使得能够序列特异性抑制靶分子，而不影响细胞的非靶功能。如上所述，我们在体内和体外均证明反义DNA可有效用于抑制反义寡核苷酸进入玻璃体。
从DNA序列5’和3’末端选择一系列与VEGF基因部分100％互补的16-19聚体寡核苷酸。有义和混杂序列用作对照。在DNA合成仪上合成硫代磷酸酯保护的寡核苷酸并纯化。
实施例14  用于长期抑制VEGF产生的反义制剂
制备VEGF-pAd.RSV用于同源重组
用在Bluescript II(Stratagene)中的VEGF165产生KpnI位点，经亚克隆在VEGF165的5’和3’端获得KpnI限制性酶位点。用XbaI(5’切割)/KpnI(3’切割)限制酶消化从BluescriptIIKS中除去VEGF165并将其克隆进pGem 7Zf(+)(Promega)。然后用HindIII(3’切割)/XbaI(5’切割)消化将VEGF165克隆进pGem 3Zf(+)(Promega)以在3’末端添加一KpnI位点。
用KpnI限制酶消化从pGem 3Zf(+)中除去VEGF并将克隆进pAd.RSV的唯一KpnI位点。这一质粒含有两个腺病毒基因组区段，这两个区段由用于插入外源DNA的克隆位点分隔开。筛选得到的克隆是否存在有义和反义克隆，以用于同源重组(VEGF-pAd.RSV)。经限制酶消化和测序分析显示在pAd.RSV中存在完整的VEGF165。
根据厂商指导，用Qiagen Plasmid Midi试剂盒制备VEGF-pAd.RSV。经XmnI限制酶消化线性化DNA，经乙酸钠/乙醇沉淀纯化，并重悬于TE缓冲液。然后在-20℃贮存DNA直到所需。
经同源重组产生Ad.RSV-VEGF或Ad.aVEGF
使用腺病毒5型缺失突变体d1324产生携带VEGF的重组腺病毒，由于缺失了E1区，d1324不能复制，另外其在E3区部分缺失。为产生病毒颗粒，在293细胞中繁殖这一突变体，293细胞反式提供缺失的E1区。将线性化的质粒DNA pAdRSV-VEGF或pAd.RSV-aVEGF与d1324病毒DNA一起共转染进293细胞，d1324病毒DNA的最左端序列经ClaI消化而除去，这降低了d1324的感染性并使得更容易鉴定重组子。用磷酸钙沉淀法转染后，筛选得到的噬斑，获得携带有义或反义方向的VEGF的重组AdRSV-VEGF病毒。
实施例15  用于永久表达靶分子的载体的构建
实施例14的载体适用于长期治疗是因为它提供了反义VEGF DNA分子的暂时(最多一年)表达，从而提供了抗新生血管化的保护。为实现无限期治疗，我们使用了这样一种载体系统，它能使用腺伴随病毒(AAV)载体将VEGF以反义方向整合进存在于RPE细胞中的人基因组，这意味着只要RPE细胞保持功能，则可以在患者一生提供抗新生血管化的保护作用。
腺伴随病毒是非病原性的，能感染不分裂细胞并具有高整合频率。我们使用AAV-2，其是复制缺陷型细小病毒，能够很容易感染其它细胞如RPE细胞，并整合进宿主细胞的基因组。最近的鉴定揭示出AAV-2特异地靶向人染色体19的长臂。
AAV构建体使用与报道基因结合的各种启动子序列。报道基因mRNA的表达用PCR扩增或原位PCR检测，报道基因的整合由RPE细胞的染色体分析鉴定。
使用合适的限制性位点，用反义VEGF DNA替换报道基因。将新的构建体与互补质粒(pAAV/ad)共转染进已用腺病毒5型感染的肾293细胞以制备rAAVaVEGF构建体。用所产生的构建体感染RPE细胞，通过PCR检测反义VEGF的表达。
实施例16  用于体外测试抑制作用的模型系统
将人VEGF克隆进COS细胞以产生一种培养系统(VEGF-COS)，其中可以测试VEGF表达的有效抑制作用。VEGF表达的抑制是用Northern和Western印迹分析测试并用免疫分析定量。
寡核苷酸浓度的增加对COS细胞的毒性用台盼蓝分析法测定。增加或不增加寡核苷酸的浓度来监控COS细胞的增殖。通过Northern和Western印迹分析、免疫细胞化学及定量免疫分析来监控对照中VEGF表达的抑制及在反义寡核苷酸存在下保持的培养物中VEGF表达的抑制。
在供氧不足条件下培养RPE细胞，在存在增加浓度的寡核苷酸时监控VEGF表达的正调节作用一段延长的时间。如上所述进行毒性、增殖分析及VEGF表达的监控。
在正常和供氧不足条件下增加或不增加寡核苷酸浓度培养CEC细胞。除了毒性、增殖分析和VEGF检测，反义寡核苷酸介导的对VEGF表达的抑制对于管形成的作用也进行了分析。在正常和供氧不足条件下产生的RPE/CEC双培养物将进行类似的试验。使用相同的模型系统评价本发明的长期和永久试剂。
实施例17  视网膜下新生血管膜(SRNVM)的体内模型
除了上述实施例之外，还开发了用于研究对SRNV发育的特定抑制作用的动物模型，该模型使用激光处理的大鼠以诱导类似于在人SRNV中观察到的症状。
肌内注射盐酸甲苯噻嗪(2mg/kg体重)、马来酸乙酰丙嗪(0.5mg/kg)及盐酸氯胺酮(100mg/kg体重)并且局部给予0.5％盐酸丙对卡因来麻醉体重约175-250g之间的色素大鼠(Dark Agouti，DA)。用2.5％盐酸苯福林扩张瞳孔。
用带有作为隐形眼镜的手持条状盖板(22c30mm)的Zeiss滑动灯(Coherent型号920 Photocoagulator，Palo Alto，Calif)进行氪激光照射(647nm)。所用激光参数如下：斑点大小100μm，电源150mW，接触时间0.1s。尝试去破坏Bruch’s膜，临床上可通过有或无视网膜内或脉络膜出血的中央泡形成证明。我们发现治疗电源为150mW最经常产生这一结果。
约40％的上述方式处理的动物会发生从脉络膜生长血管至视网膜，这一生长伴有VEGF表达的正调节，提供了一种优异的系统来测试我们的寡核苷酸和构建体。
实施例18  用反义寡核苷酸Ad.RSV.aVEGF和rAAVaVEGF在大鼠体内抑制RPE-VEGF表达
用囊式移植体可以在脉络膜或视网膜下层诱导新生血管化。这些模型的一个缺点是新生血管化的进程可能与在患有ARMD的人类中天然发生的生物学步骤不相同。为克服这些困难，我们使用了一种动物模型，在该模型中脉络膜新生血管化是由RPE细胞中的VEGF过量表达诱导的。使用携带VEGF的重组腺病毒，例如Ad.RSV.VEGF，使用上述所有动物模型以提供给我们广泛的信息。进行测试以验证VEGF表达超过一年。使用Northern和Western印迹分析监测VEGF负调节，并用免疫组织化学验证VEGF表达的负调节是细胞特异性方式。使用上述动物模型，经组织学和血管造影术监测脉络膜新生血管化。这些模型适用于本发明的所有实施方案。
应理解的是借助于成功的腺病毒基因转移至RPE，本发明特别适用于年龄相关的斑点退化症的研究、治疗或预防。不希望受观察到的优点的任何假设机制的限制，与F2000细胞相比，在HRPE7细胞中较高程度的基因表达可能提示RPE细胞能吞噬大分子，因此增加了腺病毒的吸收。转基因表达水平还可通过增加接触时间或病毒滴度来加以提高。
HRPE7细胞和F2000成纤维细胞之间的比较研究显示在相同条件下不同细胞类型之间表达模式有明显不同。这些差异可用来定向不同细胞，例如RPE。RPE细胞的时间/表达曲线(图5)的峰值在4小时，而F2000细胞的峰值在24小时。因此在RPE细胞吸收Ad.RSV.βgal时有一窗口，并且以比F2000成纤维细胞明显高的水平表达转基因。短于24小时的转染将能利用这一窗口作为定向工具(例如可在24小时后从视网膜底气泡或玻璃体中吸取病毒溶液)。滴度/表达曲线(图5)还显示细胞之间存在一种差异，RPE细胞以较低浓度即开始高表达。同样，低浓度可以优选地用于靶向RPE细胞。较低滴度及小于24小时的组合将组合两种作用，提供定向输送。
如在某些实施方案中所述，本发明还可与佐剂一起使用以通过降低实现基因转移和表达所需的滴度来保持病毒毒性的最低水平。
我们已证明使用HA作为腺病毒基因转移的佐剂的明显效果，这在吞噬细胞系和非吞噬细胞系中均是如此。HA的优点在于其是人玻璃体和胞外基质的正常组分，并且其作为外科手术的粘弹性助剂的治疗可接受性已有很长一段历史。
HA在其作为潜在的佐剂方面的重要特征是其能够同时结合细胞膜和其它分子。我们推测HA分子可以同时结合腺病毒和细胞膜，因此利用这一机制在细胞膜附近增加了病毒接触时间或病毒浓度。我们在F2000和RPE7细胞中鉴别了特异于HA的细胞表面受体，因为每一所测细胞相对于CD44、RHAMM和ICAM-1受体的存在均呈阳性。令人感兴趣的是，RPE上的RHAMM受体显示出细胞核分布，这可能是HA在RPE中的佐剂效果稍高于在F2000中的效果的原因。我们关于CD44的体内免疫荧光染色的初步研究显示在神经视网膜中没有信号，提示HA与腺病毒的结合也可能是体内RPE潜在定向机制。
对于本领域技术人员显而易见的是尽管在实施例中已描述了本发明，但是可以对本文所述的实施方案进行各种变化而不偏离本说明书所公开的发明概念的范围。
本文所引述的参考文献在下述几页中列出，并引入本文作参考。
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Claims (58)

1、一种组合物，包括一种核酸和一种透明质酸或其衍生物，以及一种药物学可接受载体。
2、权利要求1的组合物，其中所述的核酸是与一种靶序列呈反义方向的核苷酸序列。
3、权利要求2的组合物，其中所述的靶核酸序列是基因组DNA，cDNA，信使RNA或寡核苷酸。
4、权利要求1的组合物，其中所述的核酸存在于一种包含待转移进靶细胞的核酸序列的载体中。
5、权利要求4的组合物，其中所述的待转移的核酸序列是基因组DNA、cDNA、信使RNA或寡核苷酸。
6、权利要求5的组合物，其中所述的载体包括一种提供给靶细胞以产生一种功能的有义序列。
7、权利要求6的组合物，其中所述的载体包括一种提供给靶细胞以抑制靶细胞中存在的核酸的功能的反义序列。
8、权利要求1-7任一项所述的组合物，其中所述的载体是脂质体。
9、权利要求1-8任一项所述的组合物，其中所述的载体是病毒。
10、权利要求1-9任一项所述的组合物，其中所述的病毒是腺病毒，腺伴随病毒，疱疹病毒或反转录病毒。
11、权利要求9的组合物，其中所述的病毒是复制缺陷型腺病毒。
12、权利要求11的组合物，其中所述的病毒是复制缺陷型腺病毒，其包括选自呼吸合胞体病毒启动子、巨细胞病毒启动子、腺病毒主要晚期蛋白(MLP)，VAI po1III和β-肌动蛋白启动子组成的一组的启动子。
13、权利要求11的组合物，其中所述的载体为pAd.RSV，pAd.MLP或pAd.VAl。
14、权利要求11的组合物，其中所述的载体是Ad.RSV.aVEGF或Ad.VAl.aVEGF。
15、权利要求1O-14任一项所述的组合物，其中所述的载体还包括聚腺苷化信号序列。
16、权利要求15的组合物，其中聚腺苷化信号序列是SV40信号序列。
17、一种治疗患者的病态的方法，包括给予所述患者有效剂量的权利要求1-16中任一项所述的组合物的步骤。
18、权利要求17的方法，其中所述的组合物经注射而全身给药。
19、权利要求17的方法，其中所述的组合物经局部给药。
20、权利要求17的方法，其中所述的组合物经直接给予待治疗的组织。
21、制备权利要求1-16任一项所述组合物的方法，包括将核酸或载体与透明质酸或其衍生物结合，并分离由此形成的复合物的步骤。
22、一种用于治疗由异常血管化所致的视网膜病的组合物，包括
a)一种针对血管内皮生长因子(VEGF)的反义核酸序列，和
b)透明质酸，
以及一种药物学可接受载体。
23、权利要求22的组合物，其中反义核酸序列存在于一种包含待转移进靶细胞中的核酸序列的载体中。
24、权利要求23的组合物，其中所述的载体是病毒。
25、权利要求24的组合物，其中所述的病毒是腺病毒，腺伴随病毒，疱疹病毒或反转录病毒。
26、权利要求24或25的组合物，其中所述的病毒载体是复制缺陷型重组病毒。
27、权利要求26的组合物，其中所述的病毒是复制缺陷型腺病毒，其包括选自呼吸合胞体病毒启动子、巨细胞病毒启动子、腺病毒主要晚期蛋白(MLP)、VAL polIII和β-肌动蛋白启动子组成的一组的启动子。
28、权利要求27的组合物，其中所述的载体是pAd.RSV，pAd.MLP或pAd.VAl。
29、权利要求27的组合物，其中所述的载体是Ad.RSV.αVEGF或Ad.VAl.αVEGF。
30、权利要求1-29任一项所述的组合物，其中所述的载体还包括聚腺苷化信号序列。
31、权利要求30的组合物，其中聚腺苷化信号序列是SV40信号序列。
32、一种用于治疗由异常血管化所致的视网膜病的组合物，包括对应于至少一部分VEGF编码序列的反义核酸序列，以及任选地还包括一或多种用于增加细胞吸收的佐剂，和一种药物学可接受载体。
33、权利要求32的组合物，其中所述的反义序列与编码VEGF的基因的相应区域具有100％互补性。
34、用于短期治疗的权利要求32或33的组合物，其中反义序列长度为16-50个核苷酸。
35、权利要求34的用于短期治疗的组合物，其中反义序列长度为16-22个核苷酸。
36、权利要求34的用于短期治疗的组合物，其中反义序列长度为16-19个核苷酸。
37、权利要求33的组合物，其中使用了本文定义的修饰的寡核苷酸，反义序列长度为7-50个核苷酸。
38、权利要求32-37任一项所述的组合物，其中所述的佐剂是透明质酸或其衍生物。
39、一种用于长期治疗由异常血管化所致的视网膜病的组合物，包括一种重组病毒和一种药物学可接受的载体，所述的重组病毒包含对应于至少一部分VEGF编码序列的反义核酸序列，其中该反义序列的长度在20个核苷酸至全长VEGF编码序列之间。
40、权利要求39的组合物，其中该反义序列的长度在50个核苷酸至全长VEGF编码序列之间。
41、权利要求1-40任一项所述的组合物，其中该VEGF序列是来自人视网膜色素上皮细胞或脉络膜内皮细胞的VEGF的序列。
42、一种用于治疗由异常血管化所致的视网膜病的组合物，其中所述的治疗是无限期有效，该组合物包括一种病毒和一种药物学可接受的载体，该病毒包含对应于至少一部分VEGF编码序列的反义DNA，其中所述的病毒能将反义序列整合进靶细胞的基因组。
43、权利要求42的组合物，其中所述的病毒是腺伴随病毒。
44、权利要求42或43的组合物，其中反义序列的长度是20个核苷酸至全长VEGF序列之间。
45、权利要求44的组合物，其中反义序列的长度是50个核苷酸至全长VEGF序列之间。
46、一种治疗由异常新生血管化所致的视网膜病的方法，包括将有效量的对应于至少一部分VEGF编码序列的反义核酸序列给予需要这种治疗的患者的眼睛中，从而抑制新生血管化。
47、权利要求46的方法，其中反义序列长度为16-50个核苷酸。
48、权利要求46的方法，其中反义序列的长度为16-22个核苷酸。
49、权利要求46的方法，其中反义序列的长度为16-19个核苷酸。
50、权利要求46的方法，其中使用了本文中定义的修饰的寡核苷酸，反义序列的长度为7-50个核苷酸。
51、一种治疗由异常新生血管化所致的视网膜病的方法，包括将有效量的权利要求22-45任一项所述的组合物给予需要这种治疗的患者。
52、一种治疗由异常新生血管化所致的视网膜病的方法，包括将权利要求39-41任一项所述的组合物给予需要这种治疗的患者的眼睛中，从而长期抑制新生血管化。
53、一种治疗由异常新生血管化所致的视网膜病的方法，包括权利要求42-45任一项所述的组合物给予需要这种治疗的患者的眼睛中，从而无限期抑制新生血管化。
54、权利要求46-53任一项所述方法，其中视网膜病选自年龄相关的斑点退化症，糖尿病性视网膜病，分支或中央视网膜静脉闭锁，早产性视网膜病，糖尿病性虹膜发红和角膜新生血管化。
55、一种促进靶细胞对外源核酸序列的吸收的方法，包括在透明质酸或其衍生物存在下，将细胞与核酸或与含该核酸的病毒或载体接触。
56、权利要求55的方法，其中靶细胞是吞噬细胞。
57、权利要求55或56的方法，其中核酸和透明质酸是一起体外给予。
58、权利要求55或56的方法，其中核酸和透明质酸是一起体内给予。
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