KR20070106988A - 백신용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 약학적 조성물 분야에 관한 것으로서, 특히 백신 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 백신(또는 백신용 조성물)으로 유용한 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 백신용 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.

백신, 약학적 조성물

Description

백신용 약학적 조성물{NOVEL PHARMACEUTICAL COMPOSITION USEFUL FOR VACCINES}

본 발명은 약학적 조성물, 특히 백신 분야에 관한 것이다. 더 구체적으로는 본 발명은 백신(또는 백신 조성물)으로서 유용한 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 백신 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

백신 분야에서 백신 조성물의 효능은 실질적으로 사용되는 항원과 면역보강제(adjuvant)의 혼합물에 기인한다는 것이 널리 알려져 있다. 백신용 면역보강제는 오랫동안 사용되어 왔는데, 항원과 결합되었을 때, 단독항원이 사용될 때보다 강력한 면역반응을 일으키는 조성물이라고 정의된다.

일반적으로 면역보강제를 포함하지 않는 백신은 면역 반응을 일으키는 힘이 약하다. 이는 특히 불활성화된 바이러스가 포함되거나 항원이 단순히 펩티드 또는 단백질이어서 그 자체로는 면역 보호 반응을 일으킬 수 없는 경우에 그러하다.

성능이 만족스러운 면역보강제를 얻기 위하여 수많은 연구가 진행되었는데, 이상적인 면역보강제는 다음과 같은 성질을 가져야 한다.

* 대규모 면역 반응을 유도해야한다. 특히 최소량의 항원을 사용했을 때에도 그러해야 한다.

* 면역 기억을 촉진시키고 확립할 수 있도록 복합 면역 반응(체액성 및 세포성 면역 반응)을 일으켜야 한다.

* 완벽하게 체내에서 수용되며, 독성이 없어야 한다.

* 가능하면 약학 분야에서 일반적으로 사용되는 부형제로 구성되고, 더 구체적으로는 주사제로 구성되어야 한다.

* 예를 들어 주사기를 이용하는 경우처럼 투여가 용이해야하고, 가능하면 즉시 사용가능한 주사기에 직접 채워 넣기가 용이해야한다.

* 다양한 백신의 제조를 표준화할 수 있도록 다양한 항원과 결합시키기 쉬워야한다.

* 쉽게 익힐 수 있는 제조 공정을 이용하여 공업적 규모로 제조하기 용이해야한다.

다양한 유형 및 근원을 가지는 수많은 면역보강제가 선행 기술로 알려져 있다. 명반(明礬 alum, 인산알루미늄 및 수산화알루미늄)은 면역보강제로서 인간 및 동물용 백신에 널리 사용된다. 그 외 광물성 오일 및 사멸된 마이코박테리아의 혼합물로 이루어진 프로인트 면역보강제(Freund's adjuvant)와 같은 면역보강제가 알려져 있고 연구용으로 사용된다. 이 면역보강제는 매우 효과적이며 면역 반응을 현저하게 일으킨다. 그러나 체내 수용성이 나쁘기 때문에 실험 동물에 대한 연구에만 그 용도가 한정된다.

백신용 면역보강제 조성물은 다양한 특허에 기재되어 있다.

미국 특허 제 4,788,056호는 가축용으로 사용되는 헤르페스 및 대장균에 대한 혼합 백신을 기술하고 있다. 이 특허에서는 가능한 면역보강제를 다양하게 언급하고 있는데, 이 중에는 미글리올(등록상표, 중쇄 트리글리세리드류)과 같은 오일 또는 폴리소르베이트(polysorbate)와 같은 계면활성제를 주성분으로 하는 물/오일 에멀션 또는 오일/물 에멀션도 포함되어 있다. 그러나 상기 면역보강제의 정확한 조성은 전혀 제시하고 있지 않고, 분산된 상(相)이 입자형태로 존재하는 통상적인 에멀션(emulsion)이 포함되어 있다. 더욱이, 상기 면역보강제가 백신의 면역원성(immunogenic power)에 미치는 효과에 관한 기재도 전혀 없다.

미국 특허 제 5,688,761호는 물/오일(water-in-oil) 마이크로에멀션 제제를 기술하고 있는데, 이 제제는 수성 플루이드를 가해주면 오일/물(oil-in-water) 시스템으로 전환되어, 수상에 포함되어 있던 단백질을 방출시킨다. 마이크로에멀션의 장점은 자발적인 형성 및 물리적 안정성에 있다. 본 발명자들이 사용한 오일은 주사시 체내에서 잘 수용되는 중쇄 모노글리세리드 및 트리글리세리드류이다. 이 오일은 소르비탄 에스테르(sorbitan ester) 또는 폴리소르베이트와 같이 당업자에게 잘 알려져 있는 통상적인 계면 활성제를 사용함으로써 수상과 유화된다. 상기 오일은 주사되는 동안 생체 플루이드에 의하여 희석되어 유상과 수상 사이의 역전이 일어나고 그에 따라 수상에 포함되어 있던 생물학적 약제가 방출된다. 상기 제제의 몇몇 실시예에서는 상기 제제에 포함된 생물학적 약제의 활성이 증가되는 것을 볼 수 있다. 그러나 상기 제시된 예들은 백신 분야에 관한 것이 아니다.

미국 특허 제 5,744,137호에서는 에톡시화 피마자유(ethoxylated castor oil), 프로필렌글리콜 라우레이트(propylene glycol laurate), 프로필렌글리콜 카프릴레이트(propylene glycol caprylate) 및 이소스테릴 디글리세릴 숙시네이트(isosteryl diglyceryl succinate) 중에서 선택되는 둘 이상의 계면활성제의 혼합물을 포함하는 물/오일 에멀션 형태의 백신에 관한 기재에 추가하여, 비광물성 오일을 백신에 사용하는 것에 대하여 기술하고 있다. 상기 선택된 오일은 체내 수용성이 나쁜 광물성 오일을 투여하는 것과 관련된 조직 반응을 최대한 한정하기 위하여 동물 또는 식물 유래 오일로 한다.

미국 특허 제 5,961,960호는 유화제(인지질이 포함된), 비이온성 계면활성제 및 오일을 함유하는 오일/물 초마이크로에멀션(submicroemulsion) 형태의 백신 면역보강제를 기술한다. 그러나 인지질의 비싼 가격 때문에 이 발명의 응용은 한정된다.

미국 특허 출원 제 2003011977호는 항원에 의하여 유도되는 면역 반응을 개선할 수 있는 이상(二相) 지질 소포(vesicle)들로 이루어진 조성물을 기술한다.

미국 특허 출원 제 20030175309호는 레시틴, 오일 및 양친매성(amphiphilic) 계면활성제를 함유하는 면역보강제로서, 안정적인 오일/물 에멀션의 형태의 백신을 형성할 수 있는 면역보강제를 기술하고 있는데, 상기 면역보강제는 상기 백신이 주사된 동물 내에서의 국부적 반응을 최소화할 수 있게 해 준다.

국제출원 제 WO 99/61003호는 활성 물질을 운반하기 위한 시스템을 기술하고 있는데, 상기 시스템은 고체상태에서 등방성 구조를 취하는 빽빽하게 밀집된 고체 형태의 약물 저장(drug reserve)을 포함한다. 상기 시스템은 흡입방법으로 활성 물질들을 운반하는데 적합하다. 상기 활성 물질은 리포솜(liposome) 형태로 제공되어 있고, 상기 리포솜들은 상기 고형상의 운반 시스템을 이루기 위하여 밀집된다.

유럽 특허 출원 제0398287호는 하나 또는 여러 개의 활성 물질 및 20~80℃(특히 주위 온도(ambient temperature))에서 고형화되며 물에 녹는 매질을 함유하는 등방성 용액 형태의 약학적 조성물에 대하여 기술한다.

백신 산업 분야에서는 앞서 말한 특성을 나타내는 새로운 면역보강제의 필요성이 거듭하여 제기되며 여전히 남아 있는 실정이다. 특히 항원의 면역원성을 크게 향상시킬 수 있는 면역보강제에 대한 수요가 여전히 남아있다. 이러한 면역보강제들의 장점은 항원을 소량으로 투여할 수 있게 하면서 동시에 면역 반응을 만족스럽게 유지한다는 것에 있다.

특히 항원이 고가이거나 충분한 양으로 생산하기 어려운 것인 경우, 또는 재조합이나 합성을 통하여 얻은 단순한 펩티드 또는 항원을 사용하여야 하는 경우에 위와 같은 면역보강제 조성물을 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명자들은 오일/계면활성제/수상의 세 가지 성분 이상으로 구성된 혼합물이며 이때 상기 수상은 항원 물질을 함유하는 오일 형태의 등방체(等方體 isotrope) 약학적 조성물이, 에멀션 형태이고 비등방성인 종래 기술에 따른 3성분 조성물보다 월등하게 강한 면역원성을 나타낸다는 사실을 놀랍고 예측할 수 없던 방식으로 발견하였다. 더욱이, 등방체 약학적 조성물은 주사 투여 방식에 적합한 점도를 가질 수 있다.

이하 본 명세서에서 "등방체(isotrope)"란 본 발명에 따른 오일 형태의 등방체를 가리키는데, 즉 본 발명에 따른 오일/계면활성제/수상의 3성분 등방성 혼합물을 일컫는다. 마찬가지로 이하 본 명세서에서 "항원 물질을 함유하는 등방체"란 항원 물질이 오일 형태 등방체의 수상에 포함되어 있는 본 발명의 조성물을 가리킨다.

오일 형태의 등방체란 오일, 물 및 계면활성제의 혼합물로서, 상기 조제물이 맑고 투명하며 저점도성을 나타내도록 상기 성분들의 비율이 조절된 것을 말한다. 이와 같은 상기 조성물은 주사 투여될 수 있다. 이러한 유형의 조성물은 오일 속에 물이 녹은 형태, 또는 더 구체적으로는 미셀(micelle) 속에 물이 녹은 형태로서 그 자체가 오일 내에 있는 것 (오일 형태의 등방체)에 해당한다.

실제로 상기 등방체를 제조하는 과정에서 미셀로 알려진 계면활성제 분자들의 응집물 형태가 형성되는데, 이때 활성 성분이 미셀 내부로 포함된다.

등방체는 널리 알려져 있으며 등방체를 이해하는데 필요한 정보는 갈렌시아(Galencia) 통권 5(1983), 제5장 195~219쪽에서 찾을 수 있다. 특히 이 문헌에서는 물/오일/계면활성제의 3성분도를 나타내고 있는데, 일례로 203쪽에 파라핀/브리지 96(Brij 96)의 물/오일 성분도를 나타내고 있어 등방체를 얻는데 필요한 각 성분의 농도를 결정할 수 있게 해 준다.

더 구체적으로 등방체 조성물은 단일상 구조(monophasic structure)로도 알려진 연속적 3차원 구조를 나타낸다.

에멀션(emulsion)은 두 가지의 섞이지 않는 액체로부터 이루어지는 계인데, 상기 두 액체 중 하나는 나머지 속에서 방울이나 소포(vesicle) 형태로 미세하게 분산된다. 상기 분산된 상이 내부 또는 불연속 상이며, 상기 분산시키는 상이 외부 또는 연속상이다. 따라서 에멀션이란 2상 구조(biphasic structure)를 가지는 액체-액체 분산액이다.

등방체 조성물은 소포 형태의 조직이 없고 미셀이 존재한다는 점에서 에멀션과 구별된다.

본 발명에서 "소포 형태의 조직"이란, 계면활성제 유형의 성분으로 이루어지거나 계면활성제 유형의 성분을 함유하는 벽을 가지는 구조로서, 이때 상기 벽은 외부상이 소수성일 때 친수성 내부상을 함유하거나 친수성 내부상으로 이루어진(또는 그 반대 형태) 용적을 포함한다.

본 발명의 항원 물질을 포함하는 등방체 조성물을 가지고 동물 실험한 결과를 아래에 나타내었는바, 상기 항원과 종래의 면역보강제를 혼합하여 사용한 경우보다 본 발명의 등방체 조성물을 사용한 경우, 항원의 면역원성에 현저한 증가가 나타났다. 더욱이, 이 동물 실험에서 상기 등방체는 종래 기술의 물/오일 에멀션을 포함한 조제물보다 한 수준 위의 효과를 발휘하였다.

따라서 본 발명은 위와 같은 발견에서 얻어진 것이다. 본 발명의 주된 목적은 하나 이상의 오일, 하나 이상의 계면활성제 및 수상을 혼합한 하나 이상의 혼합물로서, 상기 수상은 하나 이상의 활성 물질을 포함하는 혼합물을 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이고, 상기 약학적 조성물은 오일 형태의 등방체인 조성물을 제공하는 것이다. 이러한 조성물은 등방체 형태이고 따라서 에멀션 형태가 아니다.

특히 상기 약학적 조성물은 주사 투여에 적합한 점도를 나타낸다.

본 발명에 따르면 상기 활성 물질은 모든 형태의 생물학적 활성 물질일 수 있는데, 예를 들어 살아 있거나, 독성이 약화되었거나(attenuated) 불활성화 처리된 항원일 수 있다. 살아 있는 항원이란 유전적으로 또는 실험적으로 독성을 약화시킨 박테리아 또는 바이러스, 및 벡터(재조합 박테리아 또는 바이러스)에 의하여 생체 내에서 발현된 단백질성(또는 당지질단백질성) 항원을 의미한다. 불활성화 처리된 항원이란 물리적 또는 화학적 방법에 의하여 불활성화된 박테리아 또는 바이러스, 또는 박테리아 또는 바이러스 추출물, 또는 유전자 재조합이나 화학 합성으로 얻은 단백질, 폴리펩티드나 펩티드, 또는 아미노산 서열을 포함하고 있고 생체 내에서 화합물을 생성할 수 있는 하나 이상의 물질을 의미한다.

매우 구체적으로 상기 생물학적 활성 물질은 비활성(inert)일 수 있다.

본 발명의 한 구체적 실시예에 의하면, 상기 약학적 조성물은 백신이다. 이러한 태양에서 상기 활성 물질은 항원이다. 상기 항원은 백신 접종 분야에서 널리 사용되는 모든 형태 또는 모든 근원을 가지는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 항원은 바이러스, 박테리아, 기생충 또는 종양에서 유래한 것일 수도 있다.

상기 항원은 자연계에서 유래한 것이거나 유전자 재조합을 통하여 얻은 것일 수 있다. 상기 항원은 필요한 경우 독성이 약화되거나 불활성 처리된 미생물(바이러스, 박테리아 또는 기생충), 또는 상기 미생물의 분획(fraction), 특히 비세포성 분획(정제된 항원, 고유 단백질 또는 고유 당단백질 또는 고유 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 특히 합성되었거나 유전공학적 방법으로 제조된 폴리뉴클레오티드)일 수 있고, 또는 수용성 또는 수분산성 항원에 기반한 것일 수도 있다.

본 발명에서 바람직하게는 상기 미생물에서 배출된 분자들로 이루어진 항원 상(相)이 사용되는데, 이 항원 상에 사용될 수 있는 물질에는 박테리아 세포벽의 성분들 또는 세포질의 성분도 포함된다.

본 발명의 조성물에서 활성 물질 및/또는 항원의 양은 목표하는 효과, 및 사용된 활성 물질 또는 항원의 성질에 따라 결정되는 함수이다. 당업자라면 사용된 활성 물질 또는 항원의 함수에 의해서 그 양을 결정할 수 있다.

본 발명의 등방체의 각 구성 성분의 비율은 전체 조성물이 오일 형태의 등방체가 되도록 조절된다. 더 구체적으로 상기 계면활성제 농도는 임계 미셀 농도(critical micelle concentration, CMC)보다 높을 수 있다. CMC보다 낮은 농도에서는 계면활성제의 실질적 부분이 단위체(monomer)로 존재한다. 이에 반하여 CMC보다 더 높은 농도에서는 미셀이 상당량 존재한다.

상기 CMC 값은 다양한 방법으로 결정할 수 있는데, 특히 도밍게즈(Dominguez) 등의 1997년 Journal of Chemical Education 논문 1227~1231 쪽에 기술된 바와 같이 전기 전도도법 또는 분광 광도법을 이용하여 결정할 수 있다. 일반적으로 상기 CMC 값은 예를 들어 전기 전도도나 흡광도와 같은 측정 파라미터의 변화 규칙이 갑자기 바뀌는 곳에 해당한다.

따라서 본 발명의 조성물은 임계 미셀 농도와 같거나 더 높은 농도로 계면활성제를 포함할 수 있다. 상기 임계 미셀 농도는 조성물 내 구성 성분의 특성과 그 함량을 포함하는 몇 가지 파라미터에 따라 달라진다. 따라서 본 발명의 조성물은 적어도 높은 농도의 계면활성제와 적은 양의 물을 함유할 것이다.

본 발명의 상기 조성물은 전체 조성물 중량에 대하여 10 내지 90% 오일을 함유할 수 있고, 바람직하게는 40 내지 75%의 오일을 함유한다.

본 발명의 약학적 조성물에서 물의 양은 전체 조성물 중량에 대하여 0.5 내지 20% 수준이며, 바람직하게는 3 내지 9%이다.

마지막으로 본 발명의 약학적 조성물에서 계면활성제의 양은 전체 조성물 중량에 대하여 1 내지 60%이며, 바람직하게는 16 내지 45%이다.

본 발명에 따르면, 물의 양에 대한 오일의 양의 비율은 1(물의 양과 오일의 양이 동일한 경우)보다 크거나 같아야 하고, 바람직하게는 5(오일의 양이 물의 양의 5배인 경우)보다 크거나 같아야 한다.

본 발명의 약학적 조성물에는 여러가지 오일이 사용될 수 있다. 그러나 상기 오일은 약학 용도로 적합한 것이어야 하고, 특히 비경구 경로로서 주사투여에 적합한 것이어야 한다. 상기 오일은 다음 중에서 선택될 수 있다:

-광물성 오일, 예를 들어 파라핀 오일, 바셀린 오일이 있으나 이에 한정되지 않는다,

-비광물성 오일, 예를 들어 대구 간유, 합성 지질, 식물성 오일(예를 들어 대두유, 올리브 오일, 옥수수 오일, 땅콩 오일, 면실유, 해바라기유, 참기름, 피마자유 및 아몬드오일이 있으나 이에 한정되지 않는다), 중쇄 및 장쇄 트리글리세리드류(예를 들어 스테아리너리 듀보아(Stearineries Dubois)社에서 판매하는 것 또는 다이너마이트 노벨(Dynamit Nobel)社에서 판매하는 미글리올(miglyol) 810, 812, 818(등록상표) 등의 카프릴릭/카프릭(caprylic/capric) 트리글리세리드류), 스쿠알란(squalane) 및 스쿠알렌(squalene) 등의 테르펜 오일, 및

-상기 오일의 혼합물.

본 발명에서는 스쿠알렌과 같은 오일 또는 트리글리세리드류의 오일을 사용하는 것이 바람직하며, 특히 바람직하게는 미글리올 810 유형의 중쇄 트리글리세리드류를 사용한다.

본 발명에서는 오일의 혼합물을 사용할 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서 사용할 수 있는 계면활성제는 음이온성, 양이온성, 비이온성 또는 양쪽성일 수 있다. 이중 바람직한 군은 비이온성 계면활성제군인데, 이는 이 계면활성제들이 가지는 훌륭한 안전성, 특히 주사시 안정성 때문이다. 바람직하게는 비이온성 계면활성제들 중에서 주사 경로로 투여할 수 있는 모든 것을 단독으로 또는 혼합물의 형태로 사용할 수 있다. 비이온성 계면활성제의 예로는 폴리소르베이트(polysorbates), 소르비탄(sorbitan) 에스테르, 특히 소르비탄과 지방산의 에스테르, 피마자유의 폴리옥시에틸렌화(polyoxyethylenated) 유도체, 스테아르산(stearic acid)의 폴리옥시에틸렌화 유도체, 에틸렌옥사이드와 프로필렌옥사이드의 공중합체 또는 폴록사머(poloxamer), 자당(Saccharose)과 지방산의 에스테르, 글리콜과 지방산의 에스테르, 지방산과 글리세롤의 모노에스테르, 디에스테르, 트리에스테르, 폴리에틸렌글리콜과 지방산의 에스테르, 및 자당과 지방산의 에스테르를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 바람직하게는 폴리소르베이트, 및 소르비탄 에스테르, 특히 소르비탄과 지방산의 에스테르가 사용된다.

본 발명에서는 두 종류 또는 여러 종류의 계면활성제의 혼합물을 사용할 수도 있다. 이 계면활성제들의 친수성-친유성 균형(hydrophilic-lipophilic balance, HLB)은 서로 같거나 다를 수 있는데, HLB는 계면활성제 분자의 구조에 관련된 계면활성제의 특성이다.

상기 계면활성제들은 사용된 유상의 임계 HLB값에 다가갈 수 있도록 서로 다른 HLB값을 가지는 것이 바람직하다. 임계 HLB값은 유화제(emulsifier)의 농도 및 계면활성제의 화학적 특성의 함수이다.

당업자라면 "Handbook of excipients" (Raymond C. Rowe, Paul J. Sheskey, Paul J. Weller 저 제4판(2003년))에서 쉽게 상기 계면활성제의 HLB값을 찾아 제조하고자 하는 혼합물의 조성에 적절한 계면활성제를 고를 수 있을 것이다.

본 발명의 약학적 조성물에서, 상기 수상은 수용성 또는 수분산성 항원 및 물 이외에도, 상기 항원의 방출을 지연시켜 효능이 오래 지속되도록 하기 위하여 상기 항원과 착물을 생성하도록 설계된 염류를 포함할 수 있다. 이러한 종류의 염류로서 알루미나 실리케이트(alumina silicate) 또는 인산칼슘을 예로 들 수 있다.

상기 수상은 또한 당업계에서 지질다당류(lipopolysaccharides) 또는 키토산(chitosan)으로 알려져 있는 비특이적 면역원성 물질을 선택적으로 함유할 수 있다. 마찬가지로 상기 수상은 고분자, 비이온성 고분자(예를 들어 폴록사머 등), 합성 클레이(예를 들어 라포나이트(Laponite, 등록상표), 키밀랩 에쏘(Chimilab Essor)), 사이토킨, 또는 면역 자극원성을 인정받고 있는 비타민 E와 같은 항산화제를 포함할 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 5 내지 150 mPa·s의 점도를 가지고, 바람직하게는 5 내지 100 mPa·s의 점도를 가진다.

상기 약학적 조성물의 점도는 주위 온도, 바람직하게는 25℃에서 레오(Rheo) 상표의 HAAK-VT500 점도계와 같은 로터-스테이터(rotor-stator) 유형의 점도계를 사용하여 제조 회사의 설명서에 따라서 측정한다.

본 발명의 약학적 조성물은 당업자에게 알려진 모든 제조 방법에 대하여 제조될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 약학적 조성물은 다음의 제조 방법에 의하여 제조할 수 있다.

-제1단계에서 항원은 수상에 용해되거나 분산하는데, 이때 상기 수상은 상기 기술한 추가 물질을 선택적으로 포함할 수 있다. 그리고 상기 혼합물은 예를 들어 물 중탕으로 30 내지 60℃, 바람직하게는 35 내지 45℃로 가열한다.

-제2단계는 제1단계와 동시에 진행될 수도 있는데, 이 단계에서 계면활성제가 오일을 혼합하고 상기 혼합물은 예를 들어 물 중탕으로 30 내지 60℃, 바람직하게는 35 내지 45℃로 가열한다.

-제3단계에서 상기 수상은 균질화기(예를 들어 Rayneri(등록상표) 33300 균질화기)를 이용하여 상기 유상에 혼입한다. 이러한 균질화기는 업계에서 널리 사용되고, 특히 에멀션 제조에서 널리 사용되므로 당업자라면 본 발명에 따라 혼합물을 제조하는데 어려움이 없을 것이다.

-마지막 단계에서, 상기 제조된 오일 형태의 등방체는 주위 온도로 식히고 멸균한다. 이 공정을 수행하는데 있어서, 문헌에 기재된 다양한 방법을 사용할 수 있는데, 그 예로 열에 의한 멸균, 이온화 방사선 조사에 의한 멸균, 또는 여과법에 의한 멸균을 들 수 있다. 여기서 바람직한 방법은 여과법에 의한 멸균이다.

또다른 실시예에서는 최종 멸균 공정을 수행하지 않아도 되도록 출발 물질 자체를 멸균된 것으로 사용하고 전체 제조 공정을 무균실(clean room) 내에서 수행할 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것이며 어떠한 형태로도 본 발명을 한정하지 않는다. 동일한 실시 방법을 이용한 다른 실시예도 있을 수 있다.

실시예 1. 항원 함유 상(相)의 조성

하기 세 개의 실시예에서는 항원을 함유하는 동일한 수상을 사용한다. 상기 수상은 Streptococcus suis 박테리아 균주의 배양 과정에서 배출된 항원으로 구성된 비세포성 항원 함유 상을 포함한다. 이 박테리아는 새끼 돼지들에게 광범위하게 발생하는 심각한 질병을 일으킨다.

상기 박테리아의 감염은 신경성 질환(운동 협응(motor coordination) 장애, 심한 몸 떨기(trembling) 및 경련) 및 관절 질환을 일으키는 특징이 있다. 폐의 병변과 더불어 패혈증 사례 또한 보고된 바 있다. 사람(도축장 인력, 수의과 인력)에 게 전염될 수도 있다.

본 실시예에서는 상기 배양액의 비세포성 상등액(supernatant)만을 사용한다. 여기에는 단백질 혼합물이 포함되는데, 그 중 하나는 활성 표지로 사용되는 뮤라미다제-방출 단백질(murmindase-released protein, MRP)이다. 상기 MRP의 역가(titre)는 효소면역측정법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)으로 결정할 수 있다. 이 방법에서는 항-MRP 단일클론 항체를 미량 역가판(microtiter plate)의 웰(well)에 고정한다. 그리고 비특이적 흡착을 방지하기 위하여 포화 단계를 거친 후, 상기 백신(분석 대상 항원을 포함)을 희석하여 각 웰에 가한다. 세척 후 MRP에 특이적이며 효소와 연결된 단일클론 항체를 각 웰에 가한다. 상기 효소의 기질/발색원과 상기 단일클론 항체에 연결된 효소가 반응하면 미량역가판 측정기(plate reader)로 측정할 수 있는 발색 반응 생성물을 얻는다. 상기 발색 강도는 백신 내의 항원의 양에 정비례한다.

일단 이렇게 1차 용액의 역가를 얻은 후에는, 당업자라면 백신을 제조할 때 사용할 상기 용액의 역가를 희석(예외적으로는 농축)의 방법으로 쉽게 조정할 수 있을 것이다.

본 발명에서 원하는 양의 항원을 함유하는 1차 용액은 백신 분야에서 일반적으로 사용되는 완충 용액, 예를 들어 인산염 완충 용액 등을 필요하고 충분한 분량으로 사용하여 희석할 수 있다.

실시예 2. 조성물 1

하기 표 1은 본 발명에 따른 조성물의 하나의 실시예를 나타낸다. 하기 표 1에서 분량은 그램 단위로 표시된다.

트리글리세리드류(미글리올 810)	51.50
폴리소르베이트 80 (트윈 80, Tween 80 등록상표)	14.95
소르비탄 올레이트(스판 80 Span 80 등록상표)	25.05
항원 함유 수상(실시예 1에서 제조)	8.50

상기 미글리올 810, 트윈 80 및 스판 80은 비이커에서 혼합한다. 이렇게 하여 얻은 유상은 물 중탕에서 섭씨 40도로 가열한다.

아울러 이와 병행하면서 별도로 상기 수상을 물 중탕에서 섭씨 40도로 가열한다. 상기 수상을 상기 유상에 적하하면서 터빈 혼합기(Rayneri 33300)를 분당 500 회전으로 회전시켜 균질화한다. 혼합하는 동안 상기 두 비이커는 섭씨 40도로 오일한다.

혼합이 끝나면 상기 유상과 수상의 혼합물을 상기 물 중탕에서 꺼내고 주위 온도에서 식힌다.

이 최종 생성물의 목표 MRP 역가는 1.6이다. 상기 목표 역가는 이론적이고 임의의 역가인 1을 역가로 가지는 표준 항원에 대한 상대적 역가이다(1.6은 상기 백신이 가지는 역가가 상기 표준 항원이 사용되는 때보다 1.6배 더 높음을 뜻한다).

실시예 3. 조성물 2

하기 표 2의 조성에 따른 조성물을 제조한다. 하기 표 2에서 분량은 그램 단위로 표시된다.

퍼하이드로스쿠알렌	73.0
소르비탄 올레이트 (스판 80)	8.4
에톡시화 소르비탄 올레이트(트윈 80)	9.6
항원 함유 수상(실시예 1에서 제조)	9.0

혼합물을 제조하는 공정은 실시예 2에서 기술한 것과 동일하다. 최종 생성물의 목표 MRP 역가는 1.6이다.

실시예 4. 조성물 3

하기 표 3의 조성에 따른 조성물을 제조한다. 하기 표 3에서 분량은 그램 단위로 표시된다.

트리글리세리드류(미글리올 810)	51.50
폴리소르베이트 80 (트윈 80)	25.05
소르비탄 올레이트 (스판 80)	14.95
항원 함유 수상(실시예 1에서 제조)	8.50

상기 미글리올 810, 트윈 80 및 스판 80은 비이커에서 혼합한다. 이 혼합물을 섭씨 120도에서 30분 동안 가열하여 멸균 처리하고 이어서 주위 온도에서 식힌다.

항원을 함유하는 수상은 공극 크기가 0.22 마이크로미터인 합성 멤브레인으로 여과하여 멸균 처리한다. 상기 획득된 유상은 이와 병행하면서 별도로 가열하고, 상기 수상은 실시예 1과 동일한 방식으로 섭씨 40도 물 중탕으로 가열하여 준비한다.

상기 유상과 수상이 같은 온도에 이르면, 상기 수상을 상기 유상에 적하하면서 터빈 혼합기(Rayneri 33300)를 분당 500 회전으로 회전시켜 균질화한다. 혼합하는 동안 상기 두 비이커는 상기 온도로 유지한다.

혼합물이 준비되면 상기 혼합물을 상기 물 중탕에서 꺼내고 주위 온도에서 식힌다.

이 최종 생성물의 목표 MRP 역가는 1.6이다.

실시예 5. 본 발명의 약학적 조성물 및 종래 기술에 따른 제제의 면역원성 비교

실시예 2의 조성물 1의 활성을 문헌에 기재되고 당업계에 알려진 종래 기술상의 면역보강제를 함유하는 다른 조성물들의 활성과 비교한다. 따라서 하기 조성과 제조 방법에 따라 4가지의 다른 제재(대조군) 를 제조한다.

대조군 제재 1 : 통상적인 오일/물 유형 에멀션

임계 HLB값이 11인 매우 미세한 에멀션을 제조할 수 있도록, 이 에멀션에는 실시예 2에서 오일 형태의 등방체에 대하여 기재된 것과 동일한 부형제를 다른 조성비로 사용하였다. 하기 표 4에서 분량의 단위는 그램이다.

중쇄 트리글리세리드류(미글리올 810)	20.0
폴리소르베이트 80 (트윈 80)	9.4
소르비탄 올레이트 (스판 80)	5.6
항원 함유 수상(실시예 1에서 제조)	65.0

사용한 제조 방법은 다음과 같다:

실시예 1에서 얻은 항원 함유 수상을 공극 크기가 0.22 마이크로미터인 합성 멤브레인으로 여과하여 멸균한다.

상기 미글리올 810, 트윈 80 및 스판 80은 비이커에서 혼합하고, 상기 혼합물을 섭씨 120도에서 30분 동안 가열하여 멸균 처리한 후, 이어서 주위 온도에서 식힌다.

상기 수상(항원 함유 상) 및 유상은 물 중탕에서 별도로 가열한다. 상기 유상과 수상이 같은 온도에 이르면 상기 수상을 유상에 적하하면서 분당 3000 회전의 속도로 교반한다.

상기 수상의 첨가가 끝나면 교반을 30분 더 수행한다.

대조군 제재 2 : 오일/물 형태의 상업적 면역보강제( Montanide IMS , SEPPIC 社)

SEPPIC社(프랑스 파리)에서 판매하는, 바로 사용 가능한 면역보강제 몬타니드(montanide) IMS를 두 번째 대조군 제재에 사용하였다. 하기 표 5의 분량은 그램 단위로 표시된다.

항원 함유 수상(실시예 1)	50.00
몬타니드 IMS	50.00

실시예 1에서 제조된 상기 수상과 상기 대조군의 면역보강제를 분당 회전수 150에서 Rayneri T33300 균질화기로 20 초 동안 교반하면서 혼합하였다. 상기 혼합물을 공극 크기가 0.22 마이크로미터인 합성 멤브레인으로 여과하여 멸균하였다.

대조군 제재 3 : 오일/물 형태의 상업적 면역보강제( 몬타니드 ISA 763 VG , SEPPIC 社)

SEPPIC社(프랑스 파리)에서 판매하는, 바로 사용 가능한 또다른 면역보강제 몬타니드 ISA 763 VG를 세 번째 대조군 제재에 사용하였다. 하기 표 6의 분량은 그램 단위로 표시된다.

항원 함유 수상(실시예 1)	30.00
몬타니드 ISA 763 VG	70.00

실시예 1에서 제조된 상기 수상은 공극 크기가 0.22 마이크로미터인 나일론 필터로 여과하였고, 상기 면역보강제는 공극 크기가 0.22 마이크로미터인 PTFE 필터로 여과한 다음, 상기 수상 및 면역보강제를 무균 조건에서 혼합하였다.

상기 면역보강제를 Rayneri T33300 균질화기를 이용하여 분당 800회전으로 교반하여 주면서 비이커로 옮겼다. 상기 항원 함유 수상은 분당 1200 회전으로 교반하여 주면서 한 번에 도입하였고, 30 분동안 더 교반하여 주었다.

대조군 제재 4 : 물/오일 형태의 상업적 면역보강제( 몬타니드 ISA 563 VG , SEPPIC 社)

SEPPIC社(프랑스 파리)에서 판매하는, 바로 사용 가능한 또 다른 면역보강제 몬타니드 ISA 563 VG를 네 번째 대조군 제재에 사용하였다. 하기 표 7의 분량은 그램 단위로 표시된다.

항원 함유 수상	50.00
몬타니드 ISA 563 VG	50.00

상기 대조군 제재의 수상은 공극 크기가 0.22 마이크로미터인 나일론 필터로 여과하였고, 상기 면역보강제는 공극 크기가 0.22 마이크로미터인 PTFE 필터로 여과한 다음, 상기 수상과 면역보강제를 무균 조건에서 혼합하였다.

상기 면역보강제를 Rayneri T33300 균질화기를 이용하여 분당 800회전으로 교반하여 주면서 비이커로 옮겼다. 상기 항원 함유 수상은 분당 1200 회전으로 교반하여 주면서 한 번에 도입하였고, 15 분동안 더 교반하여 주었다.

대조군 제재 5 : 국제특허출원 제 WO 01/40240호에 의한 LH 면역보강제

바로 사용 가능한 또 다른 면역보강제인 COVACCINE社(네덜란드 렐리슈타트)의 실험용 면역보강제 LH를 마지막 대조군 제재에 사용하였다. 상기 표 8의 분량은 밀리리터로 표시된다.

항원 함유 수상(실시예 1)	25.00
식염수(PBS)	25.00
LH	50.00

상기 수성 면역보강제 LH는 COVACCINE社에 의해 멸균된 것을 공급받았다.

무균 조건하에서 상기 항원 함유 수상과 식염수를 마그네틱 교반기로 5 내지 10분 동안 혼합해 준 다음, 상기 LH 면역보강제를 상기 항원 함유 수상-식염수 혼합물에 매우 천천히(아주 조금씩) 가하여 주었다. 교반은 10분동안 유지하였다.

MRP 역가의 비교

상기 대조군 제재들의 MRP 역가를 상기 기재한 대로 측정한 결과, 이들은 상대효능(relative potency) 단위로 약 4 정도의 값을 가졌다(상대효능 단위는 미국 농무성의 상대효능 계산 소프트웨어(Relative Potency Calculation Software) 3.0판에 의한 측정 단위이다).

본 발명의 약학적 조성물의 상대효능값은 1.01이었다.

실제로 본 발명의 약학적 조성물에 포함된 물의 양이 적은 것을 감안하면, 수상 내의 항원 농도를 높이는 방법을 제외하고는 본 발명의 약학적 조성물이 대조군 제재에서와 같이 많은 양의 항원을 함유할 수는 없는데, 상기 수상 내의 항원 농도를 높이는 경우에는 면역 반응의 측정에 오류가 생길 수 있다.

그러나 이렇게 현저히 낮은 항원 농도에도 불구하고, 놀랍게도 본 발명의 면역보강제는 하기 결과에 나타난 것처럼 훨씬 더 강력한 면역원성을 가진다.

대조군 조성물 및 본 발명의 약학적 조성물에 있어서의 면역원성 및 체내 수용성 비교 실험 방법

체내 수용성과 면역원성 비교 실험은 마우스를 가지고 수행하였다. 하기 실험 방법에 따라 본 발명 실시예 2의 조성물 1의 면역원성을 상기 대조군 조성물들의 면역원성과 비교하였다.

공급받은 18~22 g의 BALB/C 마우스(Charles River社)에게 2 주 간격으로 상기 두 조성물을 250 μl씩 2회 복강내 주사하였다. 상기 면역 기억(recall) 절차를 거친 후 1주일 뒤 마우스를 부검하면서 혈액 시료를 채취하였다. 혈청학적 관점으로부터 항-스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis) 항체의 체내 농도를 ELISA법으로 측정하였다.

상기 항원(상기 박테리아 배양액의 비세포성 상등액)으로 미량 역가판의 웰 표면을 덮은 후 포화량까지 항체와 결합시켰다. 상기 백신을 접종한 마우스의 혈청을 희석한 후 상기 미량 역가판에 가하였다. 이어서 효소가 접합되어 표지된 항마우스 항체를 미량 역가판에 가하고, 상기 효소의 기질/발색원을 주입한 후 발색 반응을 측정하였다. 각 조성물의 면역원성은 동일한 조성물을 투여받은 마우스들의 역가의 평균에 해당하는 평균 역가(titer)를 상대효능 단위로 표시한 것으로 정의하였다.

체내 수용성은 세 가지 기준에 따라 평가하였다. 상기 세 가지 기준은 치사율, 마우스의 활동성 및 마우스 피부털의 외관이다. 주사 부위의 잔류물(residue)의 존재도 확인하였다.

실험 결과

조성물의 면역원성

하기 표 9에 표시된 수치들은 상대적 수치이다. 하기 표 9에 나타낸 수치는 대조군 5번의 면역원성을 면역원성 평가를 위한 기준으로 정하였을 때, 본 발명의 약학적 조성물 및 각 대조군 조성물의 면역원성을 나타낸다.

A	B	C	D	E	F
26.8	0.60	0.33	15.33	8.53	1

A : 본 발명 실시예의 조성물 1

B : 대조군 1

C : 대조군 2

D : 대조군 3

E : 대조군 4

F : 대조군 5

위 결과는 대조군 조성물 1 및 대조군 조성물 4보다 항원 함유량이 4 배 내지 6배 더 적은 조성물 1 (표 9에서 A)이 상기 대조군 조성물들에 의해 유도된 면역반응에 비해 2 배 내지 80 배 정도 더 강력한 면역반응을 유도한다.

마우스 체내 수용성

A	B	C	D	E	F
++	+	+	±	±	++

++ : 우수한 체내 수용성(증상없음)

+ : 양호(부기가 없고, 백신 잔류물이 없으며, 피부털에는 주름이 잡힐 수 있음)

± : 불량(부기가 있고, 백신 잔류물이 있으며, 피부털에 주름이 잡힘)

위 결과는 조성물 1(표 10에서 A)은 대조군 조성물 5(표 10에서 F)와 동일하게, 마우스 내에서 국부적 수준 및 전신 수준으로 완전히 체내 수용되며, 나머지 4종류의 조성물에 비하여 마우스 체내에서 더욱 잘 수용된다는 것을 보여준다.

Claims (25)

1. 하나 이상의 오일, 하나 이상의 계면활성제 및 수상을 포함하는 한 종류 이상의 혼합물을 포함하고,

   상기 수상은 하나 이상의 활성 물질을 포함하며,

   에멀션 형태가 아닌 오일 형태의 등방체(isotrope)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서,

   상기 약학적 조성물은 주사 투여에 적합한 점도를 가지는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,

   상기 활성 물질은 생물학적 활성 물질이고, 특히 살아 있는 항원, 독성이 약화된 항원 또는 불활성화 처리된 항원인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 약학적 조성물은 백신인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
5. 제4항에 있어서,

   상기 활성 물질은 항원인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
6. 제5항에 있어서,

   상기 항원은 바이러스, 박테리아, 기생충 또는 종양에서 유래된 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
7. 제5항 또는 제6항에 있어서,

   상기 항원은 자연계에서 유래한 것 또는 재조합 기술로 얻은 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 항원은 미생물로 또는 상기 미생물의 분획(fraction)으로 이루어져 있고, 상기 미생물은 선택적으로는 필요에 따라 불활성화 처리된 미생물인 것을 특징 으로 하는 약학적 조성물.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 약학적 조성물은 높은 농도의 계면활성제 및 낮은 농도의 물을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 약학적 조성물은 전체 조성물 중량에 대하여 상기 오일을 10 내지 90 중량%, 바람직하게는 40 내지 75 중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 약학적 조성물은 전체 조성물 중량에 대하여 상기 물을 0.5 내지 20 중량%, 바람직하게는 3 내지 9 중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 약학적 조성물은 전체 조성물 중량에 대하여 상기 계면활성제를 1 내지 60 중량%, 바람직하게는 16 내지 45 중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 물의 양에 대한 오일의 양의 비율은 1 이상이고, 바람직하게는 5 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 오일은 광물성 오일, 비광물성 오일 및 그들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택된 것이고,

    상기 비광물성 오일은 대구 간유, 합성 지질, 식물성 오일, 중쇄 및 장쇄 트리글리세드류(medium and long-chain triglycerides), 또는 테르펜 오일(terpenic oils)을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
15. 제14항에 있어서,

    상기 광물성 오일은 파라핀 오일 및 바셀린 오일로 구성된 군으로부터 선택 된 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
16. 제15항에 있어서,

    상기 비광물성 오일은 대두유, 올리브 오일, 옥수수 오일, 땅콩 오일, 면실유, 해바라기유, 참기름, 피마자유 및 아몬드 오일로 이루어진 군으로부터 선택된 식물성 오일인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
17. 제15항에 있어서,

    상기 중쇄 및 장쇄 트리글리세리드류는 카프릴릭/카프릭 산(caprylic/capric acid)의 트리글리세리드류로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
18. 제15항에 있어서,

    상기 테르펜 오일은 스쿠알란 및 스쿠알렌으로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 약학적 조성물은 오일의 혼합물을 사용하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 계면활성제는 음이온성, 양이온성, 비이온성 및 양쪽성 계면활성제로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
21. 제20항에 있어서,

    상기 계면활성제는 비이온성 계면활성제인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
22. 제21항에 있어서,

    상기 계면활성제는 폴리소르베이트, 소르비탄 에스테르, 특히 소르비탄과 지방산의 에스테르, 스테아르산(stearic acid)의 폴리옥시에틸렌화 유도체, 에틸렌옥사이드와 프로필렌옥사이드의 공중합체 또는 폴록사머(poloxamer), 자당과 지방산의 에스테르, 글리콜과 지방산의 에스테르, 글리세롤과 지방산의 모노에스테르, 디에스테르, 트리에스테르, 폴리에틸렌글리콜과 지방산의 에스테르, 및 자당와 지방 산의 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 약학적 조성물은 계면활성제의 혼합물을 사용하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 약학적 조성물의 점도는 주위 온도 하에서 5 내지 100 mPa·s 이고, 바람직하게는 5 내지 100 mPa·s 인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 제조하는 방법으로서,

    (a) 상기 항원을 추가 물질이 필요에 따라 포함되어 있는 수상에 용해 또는 분산시키고, 획득한 혼합물을 물 중탕에서 30 내지 60℃로, 바람직하게는 35 내지 45℃로 가열하는 단계;

    (b) 상기 (a) 단계와 동시에, 또는 상기 (a) 단계에 이어서 상기 계면활성제 단독 또는 복수의 계면활성제를 상기 오일과 혼합한 후 그 혼합물을 물 중탕에서 30 내지 60℃로, 바람직하게는 35 내지 45℃로 가열하는 단계;

    (c) 균질화기를 이용하여 상기 (a) 단계에서 얻은 수상을 상기 (b) 단계에서 얻은 유상에 도입하는 단계; 및

    (d) 상기 (c) 단계에서 얻은 오일 형태의 등방체를 주위 온도로 식힌 후 멸균 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 제조 방법.