CN101111262A - 可用于疫苗的新的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物组合物领域，尤其是疫苗领域。更准确地说，本发明涉及可用作疫苗的药物组合物(或疫苗组合物)。本发明还涉及用于制备本发明的疫苗组合物的方法。

Description

可用于疫苗的新的药物组合物

本发明涉及药物组合物领域，尤其是疫苗领域。更具体地说，本发明涉及可用作疫苗(或疫苗组合物)的药物组合物。

本发明还涉及用于制备根据本发明的疫苗组合物的方法。

在疫苗领域，众所周知，疫苗组合物的效率本质上应归功于与佐剂(adjuvant)一起使用的抗原混合物。用于疫苗的佐剂已经使用了多年并且定义为组合物，其与抗原联合时，产生的免疫反应大于单独抗原。

没有佐剂的疫苗产生免疫性的能力(le pouvoir immunogène)通常较弱，尤其当涉及未活化的疫苗或当抗原仅仅是肽或蛋白，其本身不可能诱导保护反应。

为了得到满意的佐剂进行了大量的研究，理想地，其应该具有如下的性质：

它们诱导大量的免疫反应，尤其是借助于最小剂量的抗原；

它们诱导混合的免疫反应(体液的和细胞的)以促进和建立记忆反应；

它们是完全耐受的并且无毒性；

如果可能，它们由通常用于制药领域，更具体地说用于注射药物领域的赋形剂组成；

它们易于给药，例如在注射器的帮助下，并且如果可能，易于直接装进立即使用的注射器；

它们易于与各种不同的抗原联合，以允许不同疫苗生产的标准化；

借助于易于控制的生产工艺，它们易于在工业规模上进行生产。

现有技术中已知大量的各种不同性质和来源的佐剂。

明矾(磷酸铝和氢氧化铝)是广泛应用于人类和兽医疫苗的佐剂。

还知道其它的佐剂并用于研究中，例如Freund佐剂，其由矿物油和灭活的分枝杆菌的混合物组成。这种佐剂非常有效并且产生显著的免疫反应。然而它较差的耐受性使其应用局限于试验动物的研究。

许多专利描述了用于疫苗的佐剂组合物。

美国专利第4,788,056号描述了一种用于牲畜疫苗接种的对付疱疹和大肠杆菌的联合疫苗。这个专利提到了各种不同的可能的佐剂，包括基于某些油如Miglyol^R(中链甘油三酯)或表面活性剂如聚山梨醇酯的油/水乳剂或水/油乳剂，然而没有指出佐剂的任何精确的配方。然而，涉及到传统的乳剂，其中分散相以小液滴的形式存在。此外，没有指出佐剂对疫苗的产生免疫的能力的影响。

美国专利第5688761号描述了一种油包水微乳液配方，其通过加入水性液体转变为水包油系统，其导致了水相中包含的蛋白质的释放。微乳液的优点是它们的自发形成和它们的物理稳定性。这些作者使用的油是那些通过注射途径耐受性很好的油，例如中链甘油单酸酯和甘油三酸酯。它们是通过使用本领域技术人员知道的传统的表面活性剂如山梨坦酯或聚山梨醇酯，在水相中乳化。在注射过程中它们被生物流体稀释导致了相转化并且因此释放了结合在水相中的生物制剂。一些配方的实例显示了加在所述配方中的生物制剂的活性增加。然而，提供的实例不涉及疫苗领域。

美国专利第5744137号描述了疫苗中非矿物油的使用，以及油包水乳剂形式的疫苗，其中乳剂包含至少两种表面活性剂的混合物，其中所述表面活性剂选自乙氧基化(éthoxylée)蓖麻油、丙二醇月桂酸酯、丙二醇辛酸酯和异硬脂基琥珀酸甘油二酯(succinate d’isostéryle diglycéryle)。所选择的油是动物或植物来源，以尽可能地限制与给予耐受性差的矿物油相关的组织反应。

美国专利第5,961,960号描述了一种以水包油亚微乳形式呈现的疫苗佐剂，其中亚微乳包含乳化剂(涉及磷脂)、非离子表面活性剂和油。然而磷脂的高成本限制了这个发明的应用。

美国专利申请第2003011977号描述了由双相脂囊泡组成的组合物，其可以提高抗原诱导的免疫反应。

美国专利申请第20030175309号描述了一种佐剂，其包含卵磷脂、油和两亲表面活性剂，能够形成稳定的水包油乳剂形式的疫苗，其使被注射动物的局部反应最小化。

国际申请WO99/61003描述了一种递送活性物质的系统，其包括一个紧密压缩的固体形式的药物储藏物，它具有固体状态的各向同性结构。这个系统适用于通过吸入来递送活性物质。活性物质以脂质体形式出现，脂质体接着被压缩以形成所描述的固体递送系统。

欧洲专利申请第0398287号描述了一种药物组合物，其为由一种或多种活性物质和一种在20℃到80℃之间凝固(尤其在环境温度)并且溶于水的介质组成的各向同性溶液的形式。

在疫苗工业中仍然存在对于表现出上面所列性质的新的佐剂的不断更新的需要。尤其，仍然需要提供使抗原的产生免疫的能力大幅提高的佐剂。这些佐剂的一个优点在于它们可以给予低剂量的抗原同时保持满意的免疫效果。

当抗原昂贵或难以足量生产时，或当涉及到通过合成或重组得到的简单的肽或抗原时，尤其希望可以得到这样的组合物。

惊人且出乎意料地，本发明人现在发现了一种药物组合物，其是含油均质体的形式，至少由油/表面活性剂/水相的三元混合物组成，所述水相包括抗原物质，此种药物组合物与现有技术中以乳剂、非均质形式的三元组合物相比，能够表现出明显更大的产生免疫性的能力。另外，均质形式的组合物可以具有适宜注射给药的粘度。

术语“均质体(isotrope)”此后将被用以表示根据本发明的含油均质体，即根据本发明的油/表面活性剂/水相的均质的三元混合物。同样地，“包含抗原物质的均质体”表示根据本发明的组合物，其中抗原物质包括在根据本发明的含油均质体的水相中。

含油均质体(isotrope huileux)指油、水和表面活性剂的混合物，其比例被调整，使得所得到的制备物是透明、清澈的并表现出低粘度。如此，这种组合物可以通过注射给药。这种类型的组合物对应于水在油中的溶解，或更具体地说是水在胶束中，而胶束本身在油中(含油均质体)。

事实上，在均质体形成的过程中，形成通常称为胶束的表面活性剂的分子聚集体，其中活性分子或深或浅地嵌入。

均质体是众所周知的并且可以在Galenica，1983，Vol.5，chapter5，page 195-219当中找到所有必要的信息。尤其是，该著作提供了水/油/表面活性剂三元图，例如在第203页的水/石蜡油/Brij 96的图，其使得确定为得到均质系统所需要的这些化合物各自的浓度。

更具体地，均质形式的组合物呈现连续的三维结构，也通称为单相结构。

就乳剂而言，它们是由两种不可混溶的液体的系统形成的，其中一种在另一种当中被细分为滴或囊泡。被分散相通称为内相或不连续相，而分散相通称为外相或连续相。因此乳剂是具有双相结构的液-液分散体系。

均质形式的组合物与乳剂的不同在于：没有囊泡形式的组织并且存在胶束。

在本发明意义上，“囊泡形式的组织”是指一种带有壁的结构，其中所述壁包含表面活性剂类型的组分或由表面活性剂类型的组分组成，所述壁包入(englober)一个容积，当外相为疏水时其包含亲水的内相或由亲水的内相组成，反之亦然。

下面显示的用根据本发明的包含抗原物质的均质体在实验动物试验过程中得到的结果表明，与抗原和传统的佐剂联合使用产生的免疫活性相比，用上述均质体可以获得显著增加的抗原的免疫活性。

另外，这些试验显示均质体远胜过包含传统的油包水乳剂的制剂。

因此，本发明源于这个发现。

因此，本发明的第一目的是一种药物组合物，其包含至少一种混合物，该混合物是至少一种油、至少一种表面活性剂和水相(其本身包含至少一种活性物质)的混合物，所述药物组合物是含油均质体的形式。该组合物是均质(均质体)的形式，因此它不是乳剂的形式。

尤其，该组合物呈现适宜注射给药的粘度。

根据本发明，活性物质可以是任何类型的生物活性物质，例如活的、减弱的或灭活的抗原。活的抗原表示：实验上或基因上减弱的细菌或病毒，在活的有机体内通过载体(重组的细菌或病毒)表达的蛋白质(或糖脂蛋白)抗原。灭活的抗原是指通过物理方法或通过化学方法灭活的细菌或病毒，或者细菌或病毒的提取物，或者通过基因重组或化学合成得到的蛋白质、多肽或肽，或者至少一种包含氨基酸序列的化合物的体内发生器(générateur)。

更具体地，生物活性物质可以是惰性的。

根据本发明的具体实施方式，该药物组合物是疫苗。在这种形式下，活性物质是抗原。所述抗原可以是任何来源以及具有在疫苗接种领域通常使用的任何形式。抗原可以来源于，例如，病毒、细菌、寄生物或甚至肿瘤。

抗原可以是天然的或重组的。

抗原可以由可选地减弱或灭活的微生物(病毒、细菌或寄生物)，或所述微生物的部分尤其是非细胞部分(纯化的抗原、天然蛋白质或糖蛋白或者肽、多核苷酸，尤其通过基因工程合成或制备的)组成，或基于水溶性或水分散性抗原。

优选地，根据本发明，将使用由所述微生物排泄的分子组成的抗原相，其是细菌壁的组分或者细胞质的组分。

根据本发明的组合物中的活性物质和/或抗原的量取决于期望的效果以及使用的活性物质或抗原的性质。本领域技术人员能够根据所用的活性物质或抗原来确定其量。

调整均质体的每一种组分的比例以使其整体形成含油均质体。

更具体地说，表面活性剂的浓度可以大于临界胶束浓度(CMC)。对于低于CMC的浓度，表面活性剂的主要部分是单体形式；相反地，对于高于CMC的浓度，则存在明显的胶束。

可以通过各种不同的方法来确定CMC的值，例如，电导测定法或分光光度测定法，特别如在Dominguez等人的文章(“Journal ofChemical Education”，1997，1227-1231)中所描述的。一般说来，CMC对应于测量参数(例如，电导率或吸收率)的变化规律中的突跃(突变，changement brusque)。

因此，根据本发明的组合物可以包含大于或等于临界胶束浓度的表面活性剂的含量。该临界胶束浓度取决于几个参数，包括组合物中所存在的组分的特性及其含量。

因此，根据本发明的组合物包含至少一种高浓度的表面活性剂以及少量的水。

根据本发明，相对于整个组合物的重量，该组合物可以包含重量为10％至90％之间的油，优选为在40％至75％之间。

此外，根据本发明，相对于整个组合物的重量，该组合物中水的量在0.5％和20％之间，优选为在3％和9％之间。

最后，根据本发明，相对于整个组合物的重量，该组合物中表面活性剂的量可以在1％和60％之间，优选为在16％和45％之间。

根据本发明，油的量相对于水的量的比率必须不小于1(油的量等于水的量)，优选地应为不小于5(油的量至少大于水的量的5倍)。

许多种油可用于根据本发明的组合物中。然而，所述油必须适合于药物用途，特别是通过肠外途径注射给予的用途。

该油可以选自：

-矿物油，例如但不限于石腊油、凡士林油，

-非矿物油，例如，(鳕)鱼肝油、合成类脂物、植物油(如但不限于，大豆油、橄榄油、玉米油、花生油、棉籽油、葵花油、芝麻油、蓖麻油和杏仁油)、中链和长链甘油三酯(例如，辛酸/癸酸甘油三酯(如Stearineries Dubois公司出售的那些辛酸/癸酸甘油三酯或由Dynamit Nobel公司出售的名为Miglyol 810^、812^和818^的那些辛酸/癸酸甘油三酯))、萜烯油(例如，角鲨烷和角鲨烯)，以及

-其混合物。

根据本发明，优选使用如角鲨烯的油，或优选使用甘油三酯系列的油，以及更优选使用Mygliol 810型的中链甘油三酯。

根据本发明，可以使用油的混合物。

根据本发明可用的表面活性剂可以是阴离子的、阳离子的、非离子的或两性的。

由于其特别是在注射过程中良好的耐受性(tolérance)，优选的类型是非离子表面活性剂类型。优选地，在非离子表面活性剂中，所有那些通过注射途径可用的非离子表面活性剂可单独使用或混合使用。将提及以下列表作为一个实例而不能认为该列表有限制性：聚山梨醇酯，山梨坦酯(尤其是山梨坦和脂肪酸的酯)，蓖麻油的聚氧乙烯(化)衍生物，硬脂酸的聚氧乙烯(化)衍生物，环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物，或泊洛沙姆(Poloxamère)，蔗糖和脂肪酸的酯，乙二醇和脂肪酸的酯，脂肪酸和甘油的单酯、二酯、三酯，聚乙二醇和脂肪酸的酯以及蔗糖和脂肪酸的酯。

根据本发明，优选使用聚山梨醇酯和山梨坦酯(les esters desorbitane，脱水山梨糖醇酯)，尤其是山梨坦和脂肪酸的酯。

根据本发明，可以使用两种或多种表面活性剂的混合物。这些表面活性剂可以具有相同的或不同的HLB(亲水性-亲脂性平衡，这是表面活性剂的一个特征，与它们的分子结构有关)。

优选地，这些表面活性剂具有不同的HLB以接近所用油相的临界HLB。临界HLB与乳化剂的浓度和表面活性剂的化学特性有关。

本领域技术人员在例如“Handbook of excipients”，(Raymond C.Rowe，Paul J.Sheskey，Paul J.Weller-4^th Edition，2003)中会很容易查到表面活性剂的HLB，因此可以根据希望制备的混合物的组成来选择合适的表面活性剂。

根据本发明，除了包含水溶性或水分散性抗原和水以外，水相还可以包含其它物质如用于复合抗原的盐以延迟它的释放并因此延长它的作用。可以提及水合硅酸铝或磷酸钙作为这种类型的盐的实例。

可选地，水相还可以包含本领域技术人员已知的非特异性的产生免疫性的物质(或称“免疫原性物质”)，例如，脂多糖或壳聚糖。同样地，水相可包含聚合物、非离子共聚物(如泊洛沙姆)、合成粘土(如Laponite^、Chimilab Essor)、细胞因子、或抗氧化剂(如维生素E)，由于它们的免疫刺激能力而被认可。

根据本发明，组合物具有的粘度在5至150mPa.s之间，并且优选在5至100mPa.s之间。

通过使用转子-定子类型的粘度计，如Rhéo牌的名为HAAK-VT500的仪器，根据制造商的规定，在室温下，优选在25℃测量组合物的粘度。

根据本发明的组合物可以通过本领域技术人员已知的任何操作方法进行制备。例如，根据本发明的组合物可以通过以下操作方法来制备：

-在初始阶段，将抗原溶解或分散在水相中，在其中可选地加入上述附加物质，并且在例如温度为30至60℃之间，优选35至45℃之间的水浴中加热该混合物；

-在第二阶段，其可以是伴随的情况，将表面活性剂与油混合，并且在例如温度为30至60℃之间，优选35至45℃之间的水浴中加热该混合物；

-在第三阶段，使用均化器(如Rayneri^33300均化器)，将水相并入油相。广泛使用这些装置，尤其在制备乳剂过程中，因此本领域技术人员将很容易制备根据本发明的混合物；以及

-在最后阶段，将得到的含油均质体冷却到室温并灭菌。文献资料中所述的各种不同的方法可用于该操作，例如通过高温、电离辐射、或过滤进行灭菌。优选的方法是过滤灭菌。

根据另一种实施方式，也可以使用本身无菌的原材料，并在清洁室中进行全部制备步骤，以避免不得不借助于最后的灭菌操作。

下面给出的实施例是用来说明本发明而不是限制本发明的范围。其他具体实施方式可以使用相同的实施方法。

实施例1：抗原相组合物

在下列三个实施例中，使用了包含抗原的相同的水相。其中涉及由在猪链球菌的细菌菌株培养过程中排泄的抗原组成的非细胞抗原相。这种细菌是造成小猪严重和非常普遍生病的原因。这种感染的特点在于神经错乱(运动失调、震颤和抽搐)和关节失调。还已经报导了败血症以及肺病变的病例。有传播给人(屠宰场工人、兽医人员)的可能。

仅仅使用培养物的非细胞上清液。涉及蛋白质混合物，其中一种用作活性标记：蛋白质MRP(溶菌酶释放蛋白质)，其滴定度可通过ELISA测试(酶联免疫吸附测定)来确定。将抗MRP的单克隆抗体装于微量滴定板的孔中。在饱和相(其可以避免非特异性吸附)以后，将疫苗(包含待测定抗原)稀释并放置于每个孔中。清洗后，加入针对MRP蛋白质并连接至酶的单克隆抗体。与酶的底物/色原的反应可以得到使用板读数器测量的着色反应。着色的强度与疫苗中抗原的量成正比例。

一旦获得母液的滴定度，本领域的技术人员通过稀释(例外地通过浓缩)可以很容易地调整将用于制备疫苗的溶液的滴定度。

根据本发明，将包含期望量抗原的等份母液稀释至疫苗领域通常使用的缓冲液(如磷酸盐缓冲液)的必需的和充分的量。

实施例2：组合物1

下表提供了根据本发明制成的组合物。各个量是以克给出的。

甘油三酯(Miglyol 810)	51.50
		聚山梨醇酯80(吐温80)	14.95
油酸山梨坦(司盘80)	25.05
		抗原的水相(实施例1中制备的)	8.50

Miglyol 810^、吐温80^和司盘80^在烧杯中进行混合。得到的油相在40℃的水浴中加热。

并行且分别地将水相在40℃的水浴中加热。

将水相逐滴加入到油相中，用以500rpm旋转的涡轮混合器(Rayneri 33300)进行均匀化处理。

在混合过程中，这两个烧杯保持在40℃。

一旦获得混合物，将其从水浴中取出并使其冷却至室温。

得到的产物的MRP蛋白质的目标滴定度为1.6。目标滴定度是相对于具有理论和任意单位的滴定度为1的参考抗原的滴定度。(1.6是指疫苗的滴定度比使用的参考滴定度大1.6倍)。

实施例3：组合物2

制备下列组合物。各个量是以克给出的：

全氢化角鲨烯(Cosbiol)	73.0
		油酸山梨坦(司盘80)	8.4
乙氧基(化)油酸山梨坦(吐温80)	9.6
		抗原的水相(实施例1中制备的)	9.0

用于制备混合物的方法与实施例2中描述的相同。得到的产物的MRP蛋白质的目标滴定度为1.6。

实施例4：组合物3

制备下列组合物。各个量是以克给出的：

甘油三酯(Miglyol 810)	51.50
		聚山梨醇酯80(吐温80)	25.05
油酸山梨坦(司盘80)	14.95
		抗原的水相(实施例1中制备的)	8.50

Miglyol 810^、吐温80^和司盘80^在烧杯中进行混合。将该混合物加热到120℃灭菌30分钟，随后使其在室温下冷却。

包含抗原的水相通过在孔隙率为0.22μm的合成膜上过滤进行灭菌。

在40℃的水浴中平行且分别对上述得到的油相和根据实施例1制备得到的水相进行加热。

一旦这两相处于相同的温度，将水相逐滴加入到油相中，用以500rpm旋转的涡轮混合器(Rayneri 33300)进行均匀化处理。

在混合过程中，这两个烧杯保持在上述温度。

一旦制得混合物，将其从水浴中取出并使其在室温下冷却。

得到的产物的MRP蛋白质目标滴定度为1.6。

实施例5：根据本发明的组合物的免疫原活性与根据现有技术的配方的免疫原活性的比较：

实施例2的组合物1的活性与现有技术的其它组合物的活性进行比较，其中现有技术的其它组合物包含在文献中描述的、并且对于本领域的技术人员是已知的一种或多种佐剂。

因此，根据下列组合物和操作方法可以制备其它4种配方(对照)：

对照配方1：传统的水包油乳剂

对于该乳剂，以不同的比例使用所述的用于实施例2中的含油均质体的相同的赋形剂，以得到临界HLB为11的非常精细的乳剂。各个量是以克给出的。

中链甘油三酯(Miglyol 810)	20.0
		聚山梨醇酯80(吐温80)	9.4
油酸山梨坦(司盘80)	5.6
		抗原的水相(实施例1中制备的)	65.0

使用的方法如下：

实施例1中得到的抗原相通过在孔隙率为0.22μm的合成膜上过滤进行灭菌。

Miglyol^、吐温80^和司盘80^在烧杯中进行混合，然后将该混合物加热到120℃灭菌30分钟并使其在室温下冷却。

水相(抗原相)和油相分别在40℃水浴中加热。一旦这两相处于相同的温度，将水相加入到油相中，同时以3000rpm进行搅拌。

加入水相后，继续搅拌30分钟。

对照配方2：水包油商业佐剂(Montanide IMS，SEPPIC)

在该第二个对照制剂中，使用一种随即可用的由SEPPIC公司(巴黎，法国)销售的佐剂Montanide IMS。各个量是以克给出的。

包含抗原的水相(实施例1)	50.00
		Montanide IMS	50.00

实施例1中得到的水相和佐剂进行混合，同时使用以150rpm旋转的Rayneri T33300均化器搅拌20秒。

通过在孔隙率为0.22μm的合成膜上过滤对整个溶液进行灭菌。

对照配方3：商业用水/油佐剂(Montanide ISA 763 VG，SEPPIC)

在该第三个对照配方中，使用另一种即时可用的由SEPPIC公司(巴黎，法国)销售的佐剂Montanide ISA 763 VG。各个量是以克给出的。

包含抗原的水相(实施例1)	30.00
		Montanide ISA 763 VG	70.00

实施例1中得到的水相通过0.22μm的尼龙过滤器过滤，而佐剂通过孔隙率为0.22μm的聚四氟乙烯(PTFE)过滤器过滤，整体被无菌装配。

将佐剂转移至烧杯中，同时使用Rayneri T33300均化器以800rpm进行搅拌。

一次性加入抗原的水相，同时以1200rpm持续搅拌30分钟。

对照配方4：油包水商业用佐剂(Montanide ISA 563 VG，SEPPIC)

在该第四个对照配方中，使用另一种随即可用的由SEPPIC公司(巴黎，法国)销售的佐剂Montanide ISA 563 VG。各个量是以克给出的。

包含抗原的水相	50.00
		Montanide ISA 563 VG	50.00

将配方的含水部分通过0.22μm的尼龙过滤器过滤，而佐剂通过孔隙率为0.22μm的PTFE过滤器过滤，整体被无菌装配。

将佐剂转移至烧杯中，同时使用Rayneri T33300均化器以800rpm进行搅拌。一次性加入抗原的水相，同时以1200rpm持续搅拌15分钟。

对照配方5：根据专利申请WO01/40240的LH佐剂

在该最后的对照配方中，使用另一种即时可用的COVACCINE公司(Lelystadt，荷兰)的实验佐剂LH。各个量是以毫升给出的。

包含抗原的水相(实施例1)	25.00
		盐水缓冲液(PBS)	25.00
LH	50.00

水性佐剂LH由供方进行灭菌并在这种情况下接收。

在无菌条件下，含水抗原相和含盐缓冲液通过磁性搅拌5至10分钟进行混合，随后将LH佐剂很缓慢地(“逐滴地(en filet，细流地)”)加入到抗原相-含盐缓冲液的混合物中。搅拌持续10分钟。

MRP滴定度的比较：

如上述进行测定得到的对照配方的MRP蛋白质滴定度大约为4(以RP(Relative Potency，相对效价)为单位(相对效价：通过版本3.0的相对效价计算软件的测量单位(unité de mesure)，美国农业部))。

根据本发明的组合物的滴定度为1.01。

实际上，考虑到根据本发明的组合物中很少量的水，则不能结合入与对照配方中一样多的抗原，除非增加其在水相中的浓度，而这可能会使免疫反应的测量有偏差。

然而，虽然这种浓度低很多，出乎意料地下面描述的结果却显示了根据本发明的佐剂具有明显更大的免疫原(immunogène)活性。

对照组合物和根据本发明的组合物的免疫原活性和耐受性的比较研究方案：

在小鼠中进行耐受性和免疫原活性的比较。

实施例2中根据本发明的组合物1的免疫原活性与对照组合物的免疫原活性的比较是按照以下实验方案进行：

接收时为18-22克的BALB/C小鼠(供应商：Charles River)，通过腹膜内途径，受到2次(相隔2周)250μl的注射。在重复(lerappel)的一周后在对小鼠尸体解剖期间，采集血样。从血清学的角度考虑，通过ELISA方法测定了抗猪链球菌的抗体水平。

用抗原(培养物的非细胞上清液)填充(tapisser)微量培养板的孔，然后使其饱和(satuer，充满)。稀释已经接受疫苗的小鼠的血清并加入(déposer)到板上。加入经标记的抗小鼠的抗体(与酶结合)。加入酶的底物/色原，并测量显色反应。然后用平均滴定度(以RP)(对应于成组小鼠的滴定度的平均值)确定每一种组合物的免疫原活性。

耐受性可根据以下三个标准评定：死亡率、动物活动性和毛皮外表。还检验了在注射部位残留物的存在。

结果

^*免疫原能力

显示的值是相对的(相对值)：显示的值表示，相对于对照5的免疫原能力，根据本发明的组合物的免疫原能力，其中对照5用作评价所试验的每个对照的免疫原能力的参考。

A	B	C	D	E	F
						26.8	0.60	0.33	15.33	8.53	1

A：根据本发明的组合物1

B：对照1

C：对照2

D：对照3

E：对照4

F：对照5

这些结果表明，包含比对照1至对照4少4至6倍的抗原的组合物1(配方A)诱导的免疫反应比通过这些对照诱导的免疫反应大2至80倍。

^*动物的耐受性

A	B	C	D	E	F
						++	+	+	±	±	++

++：极好的(无体征)

+：好的(无肿胀、无产物残留、毛皮可能散乱)

±：差的(肿胀、有产物残留、毛皮散乱)

这些结果表明完全类似于参考配方F(组合物5)的配方A(组合物1)在局部和全身都是极耐受的，并比4个对照配方更好地耐受。

Claims (25)

1.一种药物组合物，包含至少一种混合物，所述混合物包括至少一种油、至少一种表面活性剂和水相，其中所述水相本身包含至少一种活性物质，所述药物组合物不是乳剂的形式而是含油均质体的形式。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述组合物具有适宜注射给药的粘度。

3.根据权利要求1至2中任一项所述的组合物，其特征在于所述活性物质是生物活性物质，尤其是活的、减弱的或灭活的抗原。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其特征在于所述组合物是一种疫苗。

5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于所述活性物质是抗原。

6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于所述抗原来源于病毒、细菌、寄生物或肿瘤。

7.根据权利要求5或6中任一项所述的组合物，其特征在于所述抗原是天然的或重组的。

8.根据权利要求5至7中任一项所述的组合物，其特征在于所述抗原由可选被灭活的微生物，或所述微生物的部分组成。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其特征在于所述组合物包含至少一种高浓度的表面活性剂以及低浓度的水。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其特征在于，相对于整个所述组合物的重量，所述组合物包含按重量计10％至90％、优选40％至75％的油。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其特征在于，相对于整个所述组合物的重量，所述组合物包含按重量计0.5％至20％、优选3％至9％的水。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其特征在于，相对于整个所述组合物的重量，所述组合物包含按重量计1％至60％、优选为16％和45％的表面活性剂。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物，其特征在于所述油的量相对水的量的比率必须不小于1，优选为不小于5。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物，其特征在于，所述油选自矿物油，非矿物油，例如，鱼肝油、合成类脂物、植物油、中链和长链甘油三酯、或甚至萜烯油，以及其混合物。

15.根据权利要求14所述的组合物，其特征在于所述矿物油选自石腊油和凡士林油。

16.根据权利要求15所述的组合物，其特征在于所述非矿物油是植物油，所述植物油选自大豆油、橄榄油、玉米油、花生油、棉籽油、葵花油、芝麻油、蓖麻油和杏仁油。

17.根据权利要求15所述的组合物，其特征在于所述中链和长链甘油三酯选自辛酸/癸酸甘油三酯。

18.根据权利要求15所述的组合物，其特征在于所述萜烯油选自角鲨烷和角鲨烯。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的组合物，其特征在于，使用油的混合物。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其特征在于，所述表面活性剂选自阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂或两性表面活性剂。

21.根据权利要求20所述的组合物，其特征在于，所述表面活性剂是非离子表面活性剂。

22.根据权利要求21所述的组合物，其特征在于，所述表面活性剂选自：聚山梨醇酯，山梨坦酯，尤其是山梨坦和脂肪酸的酯，蓖麻油的聚氧乙烯衍生物，硬脂酸的聚氧乙烯衍生物，环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物，或泊洛沙姆，蔗糖和脂肪酸的酯，乙二醇和脂肪酸的酯，脂肪酸和甘油的单酯、二酯、三酯，聚乙二醇和脂肪酸的酯、蔗糖和脂肪酸的酯。

23.根据权利要求1至22中任一项所述的组合物，其特征在于，可以使用表面活性剂的混合物。

24.根据权利要求1至23中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物在室温下的粘度在5至150mPa.s之间，优选在5至100mPa.s之间。

25.一种制备根据权利要求1至24中任一项所述的组合物的制备方法，其特征在于：

-在初始阶段，将所述抗原溶解或分散在所述水相中，可选地在所述水相中加入以上所述的附加物质，并且通过例如在温度为30至60℃之间，优选35至45℃之间的水浴中加热所述混合物；

-在第二阶段，其可以伴随所述第一阶段，将所述表面活性剂的一种或多种与所述油混合，并且通过例如在温度为30至60℃之间，优选35至45℃之间的水浴中加热所述混合物；

-在第三阶段，使用均化器，将所述水相加入所述油相中；以及

-在最后阶段，将得到的所述含油均质体冷却到室温并灭菌。